EA042136B1 - FGFR3-BINDING MOLECULES - Google Patents
FGFR3-BINDING MOLECULES Download PDFInfo
- Publication number
- EA042136B1 EA042136B1 EA201992349 EA042136B1 EA 042136 B1 EA042136 B1 EA 042136B1 EA 201992349 EA201992349 EA 201992349 EA 042136 B1 EA042136 B1 EA 042136B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- cancer
- fgfr3
- binding
- Prior art date
Links
Description
Предпосылки к созданию изобретенияPrerequisites for the invention
FGFR3 является одним из четырех представителей семейства FGFR трансмембранных тирозинкиназных рецепторов, которые принимают участие во внутриклеточных сигнальных путях. Было показано, что активация FGFR посредством взаимодействия с факторами роста фибробластов (FGF) играет важную роль как в эмбриогенезе, так и у взрослых с плейотропным спектром последствий, в том числе пролиферацией и выживаемостью клеток, их миграцией, дифференцировкой и задержкой роста [1].FGFR3 is one of four members of the FGFR family of transmembrane tyrosine kinase receptors that are involved in intracellular signaling pathways. Activation of FGFR through interaction with fibroblast growth factors (FGFs) has been shown to play an important role both in embryogenesis and in adults, with a pleiotropic spectrum of consequences, including cell proliferation and survival, cell migration, differentiation, and growth retardation [1].
Молекулы FGFR состоят из внеклеточной лигандсвязывающей области с двумя или тремя иммуноглобулиноподобными доменами (IgD1-3), однопроходной трансмембранной областью и цитоплазматическим расщепленным тирозинкиназным доменом.FGFR molecules consist of an extracellular ligand-binding region with two or three immunoglobulin-like domains (IgD1-3), a single-pass transmembrane region, and a cytoplasmic cleaved tyrosine kinase domain.
У людей передача сигналов осуществляется с помощью 1 из 22 лигандов FGF, и специфичность рецептора в отношении лиганда контролируется дифференциальной клеточной экспрессией рецепторов, секрецией белков клеточной поверхности, которые модулируют взаимодействие и альтернативный сплайсинг этих рецепторов [1]. Каждый из FGFR1, 2 и 3 имеет две основные, получаемые в результате альтернативного сплайсинга изоформы, обозначенные IIIb и IIIc. Эти изоформы отличаются приблизительно 50 аминокислотами во второй половине IgD3 и имеют различное распределение в тканях и различную специфичность в отношении лиганда. Лиганды FGF обусловливают димеризацию FGFR, что приводит к активации и фосфорилированию внутриклеточного тирозинкиназного домена. Это приводит к активации нескольких ключевых путей, участвующих в передаче онкогенных сигналов, в том числе путей с участием митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и PI3K-AKT.In humans, signaling is mediated by 1 of 22 FGF ligands, and the specificity of the receptor for the ligand is controlled by differential cellular expression of the receptors, secretion of cell surface proteins that modulate the interaction and alternative splicing of these receptors [1]. Each of FGFR1, 2, and 3 has two major alternatively spliced isoforms, designated IIIb and IIIc. These isoforms differ by approximately 50 amino acids in the second half of IgD3 and have different tissue distributions and different ligand specificities. FGF ligands cause FGFR dimerization, which leads to activation and phosphorylation of the intracellular tyrosine kinase domain. This leads to the activation of several key pathways involved in oncogenic signaling, including pathways involving mitogen-activated protein kinase (MAPK) and PI3K-AKT.
Аберрантно активированные FGFR принимают участие в развитии отдельных злокачественных новообразований у человека [2]. В частности, у приблизительно 15-20% пациентов с множественной миеломой встречается хромосомная транслокация t(4;14) (p16.3;q32), которая приводит к сверхэкспрессии FGFR3 и коррелирует с более короткой общей выживаемостью [2]. FGFR3 также принимает участие в придании клеточным линиям миеломы в культуре устойчивости к химическому воздействию [3], что согласуется со слабым клиническим ответом у t(4; 14) пациентов на традиционную химиотерапию [4]. Сверхэкспрессии активированного в результате мутации FGFR3 достаточно для индукции онкогенной трансформации гематопоэтических клеток и фибробластов [5-8] у трансгенных мышиных моделей [9] и у мышиных моделей трансплантации костного мозга [9, 10].Aberrantly activated FGFRs are involved in the development of certain malignant neoplasms in humans [2]. In particular, approximately 15-20% of patients with multiple myeloma have a t(4;14) (p16.3;q32) chromosomal translocation that results in FGFR3 overexpression and correlates with shorter overall survival [2]. FGFR3 is also involved in conferring chemical resistance to myeloma cell lines in culture [3], consistent with poor clinical response in t(4; 14) patients to conventional chemotherapy [4]. Overexpression of mutated FGFR3 is sufficient to induce oncogenic transformation of hematopoietic cells and fibroblasts [5–8] in transgenic mouse models [9] and in mouse models of bone marrow transplantation [9, 10].
Соответственно, FGFR3 был предложен в качестве потенциальной терапевтической мишени при множественной миеломе. Действительно, для нескольких низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на FGFR, хотя и не селективных в отношении FGFR3 и обладающих перекрестной ингибирующей активностью в отношении некоторых других киназ, была продемонстрирована цитотоксичность в отношении FGFR3-положительных клеток миеломы в культуре и у мышиных моделей [11-15].Accordingly, FGFR3 has been proposed as a potential therapeutic target in multiple myeloma. Indeed, several small molecular weight inhibitors targeting FGFR, although not selective for FGFR3 and having cross-inhibitory activity for several other kinases, have been shown to be cytotoxic to FGFR3-positive myeloma cells in culture and in mouse models [11-15] .
Сверхэкспрессия FGFR3 также была задокументирована у высокой доли случаев рака мочевого пузыря [16, 17]. Кроме того, соматические активирующие мутации в FGFR3 были выявлены в 60-70% случаев папиллярной и в 16-20% случаев мышечно-инвазивной карциномы мочевого пузыря [17, 18]. В экспериментах с клеточными культурами РНК-интерференция [19] или одноцепочечный Fv-фрагмент антитела к FGFR3 ингибировали пролиферацию клеток рака мочевого пузыря [20]. Недавнее исследование продемонстрировало, что конъюгат антитела к FGFR3 и токсина ослабляет рост ксенотрансплантата линии клеток рака мочевого пузыря за счет FGFR3-опосредованной доставки токсина в опухоли [21]. Публикации, имеющие отношение к FGFR3 и антителам к FGFR3, включают US 2005/0147612; WO 2010/111367; Rauchenberger et al, J Biol Chem 278 (40):38194-38205 (2003)[22]; WO 2006/048877; Martinez-Torrecuadrada et al, (2008) Mol Cancer Ther 7(4): 862-873; WO 2007/144893; Trudel et al. (2006) 107(10): 4039-4046; Martinez-Torrecuadrada et al (2005) Clin Cancer Res 11 (17): 6280-6290; Gomez-Roman et al (2005) Clin Cancer Res 11:459-465 и WO 2010/002862.FGFR3 overexpression has also been documented in a high proportion of bladder cancers [16, 17]. In addition, somatic activating mutations in FGFR3 have been identified in 60-70% of cases of papillary and 16-20% of cases of muscle-invasive bladder carcinoma [17, 18]. In experiments with cell cultures, RNA interference [19] or a single-stranded Fv fragment of an antibody to FGFR3 inhibited the proliferation of bladder cancer cells [20]. A recent study demonstrated that an anti-FGFR3 antibody-toxin conjugate attenuated xenograft growth of a bladder cancer cell line through FGFR3-mediated delivery of the toxin to the tumor [21]. Publications related to FGFR3 and anti-FGFR3 antibodies include US 2005/0147612; WO2010/111367; Rauchenberger et al, J Biol Chem 278(40):38194-38205(2003)[22]; W02006/048877; Martinez-Torrecuadrada et al, (2008) Mol Cancer Ther 7(4): 862-873; WO 2007/144893; Trudel et al. (2006) 107(10): 4039-4046; Martinez-Torrecuadrada et al (2005) Clin Cancer Res 11 (17): 6280-6290; Gomez-Roman et al (2005) Clin Cancer Res 11:459-465 and WO 2010/002862.
Эти антитела характеризуются одним или несколькими из следующих недостатков: они обладают способностью распознавать лишь одну из изоформ или демонстрируют значительную разницу в значениях аффинности к различным изоформам.These antibodies are characterized by one or more of the following disadvantages: they have the ability to recognize only one of the isoforms or show a significant difference in affinity values for different isoforms.
Таким образом, остается потребность в молекулах, которые могут связывать оба сплайс-варианта FGFR3b и FGFR3c с высокой аффинностью и специфичностью и которые, в то же время, способны хорошо интернализироваться в клетку. Эта потребность осуществляется с помощью настоящего изобретения.Thus, there remains a need for molecules that can bind both FGFR3b and FGFR3c splice variants with high affinity and specificity, and which, at the same time, are able to internalize well into the cell. This need is met by the present invention.
Описание изобретенияDescription of the invention
По результатам нескольких различных скринингов был выявлен набор финомерных полипептидов с неожиданным сочетанием свойств, в том числе высокой аффинностью как к FGFR3b, так и к FGFR3c и способностью к хорошей интернализации в клетки, причем этот набор полипептидов превзошел большое количество других кандидатов в отношении комбинации этих свойств. В данном документе раскрыты последовательности этих полипептидов. Помимо самих полипептидов, настоящим изобретением также предусмотрены слитые конструкции, содержащие такие полипептиды, в том числе их слияния с антителами. Настоящим изобретением дополнительно предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды или слитые конструкции по настоящему изобретению. Дополнительно предусмотрены фармацевтические или диагностические композиции, содержащие полипептиды или слитые конст- 1 042136 рукции по настоящему изобретению, а также такие фармацевтические композиции для применения в лечении рака или опосредованных Т-клетками заболеваний.Several different screens have identified a set of finomeric polypeptides with an unexpected combination of properties, including high affinity for both FGFR3b and FGFR3c and the ability to internalize well into cells, and this set of polypeptides outperformed a large number of other candidates in terms of the combination of these properties. . This document discloses the sequences of these polypeptides. In addition to the polypeptides themselves, the present invention also contemplates fusion constructs containing such polypeptides, including their fusions with antibodies. The present invention further provides nucleic acid molecules encoding the polypeptides or fusion constructs of the present invention. Further provided are pharmaceutical or diagnostic compositions containing the polypeptides or fusion constructs of the present invention, as well as such pharmaceutical compositions for use in the treatment of cancer or T-cell mediated diseases.
Настоящее изобретение относится в первом аспекте к полипептиду, связывающемуся с изоформами 3b и 3c рецептора 3 фактора роста фибробластов (FGFR3b и FGFR3c), где полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQIL (X1) (X2) (X3) (X4) GPYWEARSL (X5) TGETG ( X6) IPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), где аминокислотные положения от (X1) до (X6) могут представлять собой любую аминокислотную последовательность; (b) аминокислотной последовательности, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности из (a), где при определении идентичности исключаются аминокислотные положения от (X1) до (X6), и при условии, что аминокислотная последовательность EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) в аминокислотных положениях 12-19 из SEQ ID NO: 1 является консервативной, и аминокислоты Р и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 из SEQ ID NO: 1 являются консервативными; (с) GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSPHGQYWEARSLTTGETG (X6) IPSNYVAPVDS IQ (SEQ ID NO: 19), где аминокислотное положение (X6) может представлять собой любую аминокислоту; (d) аминокислотной последовательности, которая на по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности из (с), где при определении идентичности исключается аминокислотное положение (X6), и при условии, что аминокислотные последовательности EVMSTTA (SEQ ID NO: 20) в аминокислотных положениях 12-18 из SEQ ID NO: 19 и SQSPH (SEQ ID NO: 21) в аминокислотных положениях 31-35 из SEQ ID NO: 19 являются консервативными, и аминокислоты Q и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 из SEQ ID NO: 19 являются консервативными.The present invention relates in a first aspect to a polypeptide binding to fibroblast growth factor receptor 3 isoforms 3b and 3c (FGFR3b and FGFR3c), wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: (a) GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQIL (X 1 ) (X 2 ) (X 3 ) (X 4 ) GPYWEARSL (X 5 ) TGETG (X 6 ) IPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), where the amino acid positions (X 1 ) to (X 6 ) can be any amino acid sequence; (b) an amino acid sequence that is at least 95% identical to the amino acid sequence of (a), where the determination of identity excludes amino acid positions (X 1 ) to (X 6 ), and provided that the amino acid sequence EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) at amino acid positions 12-19 of SEQ ID NO: 1 is conservative, and amino acids P and Y at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 1 are conservative; (c) GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSPHGQYWEARSLTTGETG (X 6 ) IPSNYVAPVDS IQ (SEQ ID NO: 19), where the amino acid position (X 6 ) can be any amino acid; (d) an amino acid sequence that is at least 95% identical to the amino acid sequence of (c), where the determination of identity excludes the amino acid position (X 6 ), and provided that the amino acid sequences EVMSTTA (SEQ ID NO: 20) in the amino acids positions 12-18 of SEQ ID NO: 19 and SQSPH (SEQ ID NO: 21) at amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 19 are conserved, and amino acids Q and Y at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 19 are conservative.
Используемый в данном документе термин полипептид описывает линейные молекулярные цепи из аминокислот, в том числе одноцепочечные белки или их фрагменты, содержащие более чем приблизительно 60 аминокислот. Полипептиды могут дополнительно формировать мультимеры, например олигомеры, состоящие из по меньшей мере двух одинаковых или различных молекул. Соответствующие структуры более высокого порядка таких мультимеров, соответственно, называют гомо- или гетеродимерами, гомо- или гетеротримерами и т.д. Более того, пептидомиметики таких полипептидов, у которых аминокислота(ы) и/или пептидная(ые) связь(и) были заменены функциональными аналогами, также охватываются настоящим изобретением. Такие функциональные аналоги включают все известные аминокислоты, кроме 20 аминокислот, закодированных в генах, таких как селеноцистеин. Термин полипептид также относится к природным образом модифицированным полипептидам, где модификация осуществляется, например, с помощью гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и схожих модификаций, которые хорошо известны из уровня техники.As used herein, the term polypeptide describes linear molecular chains of amino acids, including single chain proteins or fragments thereof, containing more than about 60 amino acids. Polypeptides can further form multimers, such as oligomers, consisting of at least two of the same or different molecules. The corresponding higher order structures of such multimers are respectively referred to as homo- or heterodimers, homo- or heterotrimers, etc. Moreover, peptidomimetics of such polypeptides in which the amino acid(s) and/or peptide(s) bond(s) have been replaced by functional analogs are also covered by the present invention. Such functional analogs include all known amino acids except for the 20 amino acids encoded in genes such as selenocysteine. The term polypeptide also refers to naturally modified polypeptides, where the modification is carried out, for example, by glycosylation, acetylation, phosphorylation and similar modifications, which are well known in the art.
Полипептид по настоящему изобретению представляет собой Fyn SH3-производный полипептид или финомер. Fyn SH3-производные полипептиды или финомеры хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204; WO 2008/022759; Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2): 57-68 и Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13: 245-255. Термин Fyn SH3-производный полипептид, используемый в данном документе взаимозаменяемо с термином финомер, относится к не являющемуся производным иммуноглобулина связывающему полипептиду (например, так называемый остов, который описан в Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13: 245-255), полученному из SH3-домена Fyn человека. Финомеры представляют собой небольшие глобулярные полипептиды размером приблизительно 7 кДа. SH3-домен киназы Fyn человека успешно использовался для конструирования белков (Fyn SH3-производных связывающих белков, называемых финомерами), которые с высокой аффинностью и специфичностью связываются с различными целевыми белками (wO 2008/022759, WO 2011/023685, WO 2013/135588, WO 2014/170063, Grabulovski D. et al., (2007) J Biol Chem 282, p. 3196-3204, Bertschinger J. et al. (2007) Protein Eng Des Sel, 20, p.57-68 и Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50).The polypeptide of the present invention is a Fyn SH3 derived polypeptide or finomer. Fyn SH3-derived polypeptides or finomers are well known in the art and are described, for example, in Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204; W02008/022759; Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2): 57-68 and Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13: 245-255. The term Fyn SH3-derived polypeptide, used interchangeably herein with the term finomer, refers to a non-immunoglobulin-derived binding polypeptide (e.g., the so-called backbone as described in Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13: 245-255 ) derived from the human Fyn SH3 domain. Finomers are small globular polypeptides approximately 7 kDa in size. The human Fyn kinase SH3 domain has been successfully used to construct proteins (Fyn SH3-derived binding proteins called finomers) that bind with high affinity and specificity to various target proteins (wO 2008/022759, WO 2011/023685, WO 2013/135588, WO 2014/170063, Grabulovski D. et al., (2007) J Biol Chem 282, p.3196-3204, Bertschinger J. et al.(2007) Protein Eng Des Sel, 20, p.57-68 and Schlatter et al (2012) mAbs, 4(4) pp. 497-50).
Фраза связывающийся с изоформами 3b и 3c рецептора 3 фактора роста фибробластов (FGFR3b и FGFR3c или FGFR3b и 3c) при использовании означает, что полипептиды по настоящему изобретению формируют связывающие взаимодействия (in vivo и/или in vitro) с FGFR3b и FGFR3c. Изоформы 3b (FGFR3b) и 3c (FGFR3c) образуются в результате альтернативного сплайсинга. Сплайс-варианты получают с помощью двух альтернативных экзонов, 3b и 3c, кодирующих С-концевую половину домена 3 Ig. В эпителиальных клетках наблюдаются исключительно транскрипты 3b, тогда как в фибробластных клетках наблюдается смесь транскриптов 3b и 3c. Аминокислотная последовательность FGFR3b показана под SEQ ID NO: 9, и аминокислотная последовательность FGFR3c показана под SEQ ID NO: 10. Полипептиды по настоящему изобретению предпочтительно связываются с изоформами 3b и 3c рецептора 3 фактора роста фибробластов человека. Предпочтительно, полипептиды по настоящему изобретению связываются с обеими изоформами, FGFR3b и FGFR3c, с KD от 10-7 до 10-12 М, более предпочтительно от 10-8 до 10-12 М, наиболее предпочтительно от 10-9 до 10-12 М. В этой связи предпочтительно, чтобы полипептиды по настоящему изобретению специфически связывались с FGFR3, предпочтительно специфически с обеими изоформами FGFR3b и FGFR3c и, следовательно, существенно не связывались с другими родственными белками, такими как FGFR1, FGFR2 или FGFR4. В данном отношении существенное связывание предпочтительно означает связывание с KD>5x10’6 М.The phrase binding to fibroblast growth factor receptor 3 isoforms 3b and 3c (FGFR3b and FGFR3c or FGFR3b and 3c) when used means that the polypeptides of the present invention form binding interactions (in vivo and/or in vitro) with FGFR3b and FGFR3c. Isoforms 3b (FGFR3b) and 3c (FGFR3c) result from alternative splicing. Splice variants are generated using two alternative exons, 3b and 3c, encoding the C-terminal half of Ig domain 3. In epithelial cells, only 3b transcripts are observed, while in fibroblast cells, a mixture of 3b and 3c transcripts is observed. The amino acid sequence of FGFR3b is shown under SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of FGFR3c is shown under SEQ ID NO: 10. The polypeptides of the present invention preferentially bind to human fibroblast growth factor receptor 3 isoforms 3b and 3c. Preferably, the polypeptides of the present invention bind to both isoforms, FGFR3b and FGFR3c, with a KD of 10 -7 to 10 -12 M, more preferably 10 -8 to 10 -12 M, most preferably 10 -9 to 10 -12 M In this regard, it is preferred that the polypeptides of the present invention bind specifically to FGFR3, preferably specifically to both isoforms of FGFR3b and FGFR3c, and therefore do not substantially bind to other related proteins such as FGFR1, FGFR2 or FGFR4. In this regard, substantial binding preferably means binding to a KD>5x10' 6 M.
- 2 042136- 2 042136
SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 19, которые показаны выше в данном документе, являются производными от аминокислотной последовательности SH3-домена киназы Fyn человека (SEQ ID NO: 11; аминокисл. 83-145 киназы Fyn, о которых сообщали Kawakami et al. и Semba et al. в 1986 году). SEQ ID NO: 11 имеет следующую формуSEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 19, which are shown above herein, are derived from the amino acid sequence of the human Fyn kinase SH3 domain (SEQ ID NO: 11; amino acids 83-145 of the Fyn kinase reported by Kawakami et al and Semba et al in 1986). SEQ ID NO: 11 has the following form
GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 11). В SEQ ID NO: 11, которая показана выше, последовательности RT и петли src соответственно подчеркнуты и дважды подчеркнуты. Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204, исследовали влияние мутаций в петлях RT и src SH3-доменов Fyn и продемонстрировали, что мутации в этих петлях, которые являются смежными с гидрофобной поверхностью, могут определять способность этого домена принимать участие в межмолекулярных связях. Более того, в ЕР 2054432 показано, что мутации в RT и/или петле src и смежно с ними определяют специфичность связывания SH3-домена. Аминокислотная последовательность SH3-домена Fyn полностью консервативна у человека, мыши, крысы и обезьяны (гиббона). SH3 Fyn курицы отличается одним, а у Xenopus laevis двумя аминокислотными положениями от соответствующего домена человека. Как и другие SH3-домены, SH3-домен Fyn состоит из двух антипараллельных β-листов и содержит две гибкие петли (называемые RT- и src-петлями) для взаимодействия с другими белками.GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 11). In SEQ ID NO: 11 shown above, the RT sequences and src loops are respectively underlined and double underlined. Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204, investigated the effect of mutations in the RT and src loops of Fyn SH3 domains and demonstrated that mutations in these loops, which are adjacent to a hydrophobic surface, can determine the ability of this domain to participate in intermolecular bonds. Moreover, EP 2054432 shows that mutations in and around the RT and/or src loop determine the binding specificity of the SH3 domain. The amino acid sequence of the Fyn SH3 domain is completely conserved in humans, mice, rats, and monkeys (gibbons). Chicken Fyn SH3 differs by one and in Xenopus laevis by two amino acid positions from the corresponding human domain. Like other SH3 domains, the Fyn SH3 domain consists of two antiparallel β-sheets and contains two flexible loops (called RT and src loops) for interaction with other proteins.
Более подробно, SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность, полученную в результате выравнивания SEQ ID NO: 3-8 (см. фиг. 1). Как видно из фиг. 1, положения от (X1) до (X4) из SEQ ID NO: 1 соответствуют src-петле SH3-домена киназы Fyn из SEQ ID NO: 11. Среди SEQ ID NO 3-8 аминокислоты в src-петле отличаются друг от друга. С другой стороны, второе и третье положение в направлении Сконца относительно src-петли представляют собой DW в последовательности дикого типа, тогда как соответствующие аминокислоты во всех SEQ ID NO 3-8 представляют собой PY. Как дополнительно видно из фиг. 1, положения, соответствующие RT-петле SH3-домена киназы Fyn из SEQ ID NO: 11 (т.е. подчеркнутая последовательность и смежный D), изменены по сравнению с последовательностью SH3 Fyn дикого типа, однако сохранены у SEQ ID NO: 3-8 и имеют последовательность EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2). Аминокислотные положения в RT- и src-петле, в том числе аминокислоты, находящиеся смежно с этими петлями, определяют специфичность связывания с FGFR3b и 3с.In more detail, SEQ ID NO: 1 is the sequence resulting from the alignment of SEQ ID NO: 3-8 (see Fig. 1). As can be seen from FIG. 1, positions (X 1 ) to (X 4 ) of SEQ ID NO: 1 correspond to the src loop of the Fyn kinase SH3 domain of SEQ ID NO: 11. Among SEQ ID NOs 3 to 8, the amino acids in the src loop differ from each other. friend. On the other hand, the second and third positions in the C-terminal direction relative to the src loop are DW in the wild-type sequence, while the corresponding amino acids in all of SEQ ID NOs 3-8 are PY. As further seen from FIG. 1, the positions corresponding to the RT loop of the Fyn kinase SH3 domain of SEQ ID NO: 11 (i.e., the underlined sequence and adjacent D) are changed from the wild-type SH3 Fyn sequence, but retained in SEQ ID NO: 3- 8 and have the sequence EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2). Amino acid positions in the RT and src loops, including the amino acids adjacent to these loops, determine the specificity of binding to FGFR3b and 3c.
В соответствии с SEQ ID NO: 1 любая аминокислота может находиться не только в аминокислотных положениях от (X1) до (X4), но также в аминокислотных положениях (X5) и (X6). Как можно понять из фиг. 1, аминокислоты в положениях (X5) и (X6) могут отличаться среди SEQ ID NO: 3-8 или от SH3домена Fyn дикого типа SEQ ID NO: 11. Считается, что различия аминокислот в этих положениях не являются важными для специфичности связывания SEQ ID NO: 3-8. Таким образом, аминокислотные положения (X5) и (X6) могут быть заменены или удалены, или могут быть добавлены дополнительные аминокислоты, практически не влияя на специфичность связывания с FGFR3b и 3с. При замене аминокислот в сравнении с аминокислотами, которые можно найти в SEQ ID NO: 1-8 в аминокислотных положениях от (X5) до (X6), предпочтительными являются консервативные замены. SEQ ID NO: 19 представляет собой последовательность, полученную из полипептида, связывающего FGFR3b и FGFR3c, под SEQ ID NO: 22. Аминокислотные положения 12-18 из SEQ ID NO: 22 (EVMSTTA (SEQ ID NO: 20)) соответствуют RT-петле SH3-домена киназы Fyn из SEQ ID NO: 11, и аминокислотные положения 31-35 из SEQ ID NO: 22 (SQSPH (SEQ ID NO: 21)) соответствуют src-петле SH3-домена киназы Fyn из SEQ ID NO: 11. Второе и третье положение в направлении С-конца относительно src-петли представляют собой DW в последовательности дикого типа, тогда как соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 22 представляют собой QY. Также в SEQ ID NO: 22 аминокислотные положения в RT-и src-петле, в том числе аминокислоты, находящиеся смежно с этими петлями, определяют специфичность связывания с FGFR3b и 3с.According to SEQ ID NO: 1, any amino acid can be found not only at amino acid positions (X 1 ) to (X 4 ), but also at amino acid positions (X 5 ) and (X 6 ). As can be understood from FIG. 1, the amino acids at positions (X 5 ) and (X 6 ) may differ among SEQ ID NOs: 3-8 or from the wild type Fyn SH3 domain of SEQ ID NO: 11. Differences in amino acids at these positions are not considered to be important for binding specificity. SEQ ID NO: 3-8. Thus, the amino acid positions (X 5 ) and (X 6 ) can be changed or deleted, or additional amino acids can be added, with little effect on the binding specificity for FGFR3b and 3c. When substituting amino acids compared to amino acids that can be found in SEQ ID NO: 1-8 at amino acid positions (X 5 ) to (X 6 ), conservative substitutions are preferred. SEQ ID NO: 19 is the sequence derived from the FGFR3b and FGFR3c binding polypeptide under SEQ ID NO: 22. Amino acid positions 12-18 of SEQ ID NO: 22 (EVMSTTA (SEQ ID NO: 20)) correspond to the RT loop The Fyn kinase SH3 domain of SEQ ID NO: 11 and amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 22 (SQSPH (SEQ ID NO: 21)) correspond to the src loop of the Fyn kinase SH3 domain of SEQ ID NO: 11. The second and third positions in the direction of the C-terminus relative to the src-loop are DW in the wild-type sequence, while the corresponding amino acids in SEQ ID NO: 22 are QY. Also in SEQ ID NO: 22 amino acid positions in the RT and src loops, including amino acids adjacent to these loops, determine the specificity of binding to FGFR3b and 3c.
В соответствии с SEQ ID NO: 19 в аминокислотном положении (X6) может находиться любая аминокислота. Аминокислотное положение (X6) из SEQ ID NO: 19 соответствует аминокислотному положению (X6) из SEQ ID NO: 1. В SEQ ID NO 1 и 19 аминокислота (X6) отличается от SH3-домена Fyn дикого типа из SEQ ID NO: 11. Соответствующей аминокислотой является Y в SEQ ID NO: 11, W в SEQ ID NO: 19 и L в SEQ ID NO: 3-8.According to SEQ ID NO: 19, the amino acid position (X 6 ) can be any amino acid. The amino acid position (X 6 ) of SEQ ID NO: 19 corresponds to the amino acid position (X 6 ) of SEQ ID NO: 1. In SEQ ID NOs 1 and 19, the amino acid (X 6 ) differs from the wild-type Fyn SH3 domain of SEQ ID NO: : 11. The corresponding amino acid is Y in SEQ ID NO: 11, W in SEQ ID NO: 19, and L in SEQ ID NO: 3-8.
В соответствии с настоящим изобретением, термин процент (%) идентичности последовательностей описывает число совпадений (хитов) идентичных нуклеотидов/аминокислот в двух или более выровненных последовательностях нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностях относительно числа нуклеотидов или аминокислотных остатков, составляющих общую длину последовательностей матричной нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей. Другими словами, применяя выравнивание в отношении двух или более последовательностей или подпоследовательностей можно определять процентную долю аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, 95, 97 или 98% идентичности), в случае если (под)последовательности сравнивают и выравнивают для максимального соответствия на протяжении интервала сравнения или на протяжении обозначенной области, измеряемого с применением алгоритма сравнения последовательностей, известного из уровня техники, или в случае если их выравнивают вручную и проверяют визуально. Таким образом, последовательности, которые сравнивают для определения идентичности последовательностей, могут отличатьсяIn accordance with the present invention, the term percent (%) sequence identity describes the number of identical nucleotide/amino acid hits in two or more aligned nucleic acid or amino acid sequences relative to the number of nucleotides or amino acid residues that make up the total length of the template nucleic acid or amino acid sequences. sequences. In other words, by applying an alignment to two or more sequences or subsequences, the percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (e.g., 95%, 97%, or 98% identity) can be determined if the (sub)sequences are compared and aligned for maximum match. over a comparison interval, or over a designated area, as measured using a sequence comparison algorithm known in the art, or if manually aligned and visually inspected. Thus, sequences that are compared to determine sequence identity may differ.
- 3 042136 замещением(ями), добавлением(ями) или делецией(-ями) нуклеотидов или аминокислот. Это определение также применимо к комплементарной цепи исследуемой последовательности.- 3 042136 substitution(s), addition(s) or deletion(s) of nucleotides or amino acids. This definition also applies to the complementary strand of the sequence under study.
Специалисту в данной области техники также известны подходящие программы для выравнивания полипептидных последовательностей. Процент идентичности последовательностей у полипептидных последовательностей можно, например, определить с помощью таких программ, как описанные выше программы CLUSTLAW, FASTA и BLAST. Предпочтительно применяют программу BLAST, a именно алгоритм BLAST NCBI (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schoffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).Suitable programs for aligning polypeptide sequences are also known to those skilled in the art. The percent sequence identity of polypeptide sequences can, for example, be determined using programs such as the CLUSTLAW, FASTA and BLAST programs described above. Preferably, a BLAST program is used, namely the BLAST NCBI algorithm (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schoffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
Что касается идентичности последовательностей, то, как указано в разделе (b) в данном документе выше, предпочтительно, чтобы идентичность последовательностей составляла по меньшей мере 98%. В данном отношении следует дополнительно отметить, что идентичность последовательностей, составляющая по меньшей мере 95%, как указано в разделе (b), допускает две аминокислотные замены, тогда как предпочтительная идентичность по меньшей мере 98% допускает лишь одну аминокислотную замену. Следовательно, раздел (b), который указан в данном документе выше, также относится к аминокислотной последовательности, которая отличается двумя аминокислотными заменами и предпочтительно одной аминокислотной заменой от аминокислотной последовательности из раздела (a), который указан в данном документе выше, где аминокислотная(ые) замена(ы) может(могут) встречаться в аминокислотных положениях SEQ ID NO: 1, отличных от таковых от (X1) до (X6) аминокислотной последовательности EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) в аминокислотных положениях 12-19 из SEQ ID NO: 1, и в аминокислотах Р и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 из SEQ ID NO: 1. Полагают, что аминокислоты в SEQ ID NO: 1, отличной от таковых от (X1) до (X6) аминокислотной последовательности EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) в аминокислотных положениях 12-19 из SEQ ID NO: 1 и в аминокислотах Р и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 из SEQ ID NO: 1, не важны для специфичности связывания SEQ ID NO: 3-8. Таким образом, в этих положениях аминокислоты могут быть заменены или удалены, или может быть добавлена аминокислота, практически не влияя на специфичность связывания с FGFR3b и 3с. Эти аминокислотные положения предпочтительно заменены. При замене аминокислот предпочтительны консервативные замены.With regard to sequence identity, as indicated in section (b) herein above, it is preferred that the sequence identity is at least 98%. In this regard, it should be further noted that sequence identity of at least 95%, as indicated in section (b), allows two amino acid substitutions, while a preferred identity of at least 98% allows only one amino acid substitution. Therefore, section (b) as referred to herein above also refers to an amino acid sequence that differs by two amino acid substitutions, and preferably by one amino acid substitution, from the amino acid sequence of section (a) as referred to herein above, wherein the amino acid(s) ) the substitution(s) may occur at amino acid positions of SEQ ID NO: 1 other than those of (X 1 ) to (X 6 ) of the amino acid sequence EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) at amino acid positions 12-19 of SEQ ID NO: 1, and in the amino acids P and Y at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 1. The amino acids in SEQ ID NO: 1 are believed to be different from those of (X 1 ) to (X 6 ) amino acid sequence EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) at amino acid positions 12-19 of SEQ ID NO: 1 and at amino acids P and Y at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 1 are not important for the binding specificity of SEQ ID NO: 3- 8. Thus, at these positions, amino acids can be changed or deleted, or an amino acid can be added, with little or no effect on the binding specificity for FGFR3b and 3c. These amino acid positions are preferably substituted. When replacing amino acids, conservative substitutions are preferred.
Что касается идентичности последовательностей, то как указано в разделе (d) в данном документе выше, предпочтительно, чтобы идентичность последовательностей составляла по меньшей мере 97%. В данном отношении следует дополнительно отметить, что идентичность последовательностей, составляющая по меньшей мере 95%, как указано в разделе (d), допускает две аминокислотные замены, тогда как предпочтительная идентичность, составляющая по меньшей мере 97%, допускает лишь одну аминокислотную замену. Следовательно, раздел (d), который указан в данном документе выше, также относится к аминокислотной последовательности, которая отличается двумя аминокислотными заменами и предпочтительно одной аминокислотной заменой от аминокислотной последовательности из раздела (с), который указан в данном документе выше, где аминокислотная(ые) замена(ы) может(могут) встречаться в аминокислотных положениях SEQ ID NO: 19, отличных от аминокислотных последовательностей EVMSTTA (SEQ ID NO: 20) в аминокислотных положениях 12-18 из SEQ ID NO: 19 и SQSPH (SEQ ID NO: 21) в аминокислотных положениях 31-35 из SEQ ID NO: 19 и в аминокислотах Q и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 из SEQ ID NO: 19. Полагают, что аминокислоты в SEQ ID NO: 19, отличной от аминокислотных последовательностей EVMSTTA (SEQ ID NO: 20) в аминокислотных положениях 1218 из SEQ ID NO: 19 и SQSPH (SEQ ID NO: 21) в аминокислотных положениях 31-35 из SEQ ID NO: 19 и в аминокислотах Q и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 из SEQ ID NO: 19, не важны для специфичности связывания SEQ ID NO: 22. Таким образом, в этих положениях аминокислоты могут быть заменены или удалены, или может быть добавлена аминокислота, практически не влияя на специфичность связывания с FGFR3b и 3с. Эти аминокислотные положения предпочтительно заменены. При замене аминокислот предпочтительны консервативные замены.With regard to sequence identity, as indicated in section (d) herein above, it is preferred that the sequence identity is at least 97%. In this regard, it should be further noted that sequence identity of at least 95%, as indicated in section (d), allows two amino acid substitutions, while a preferred identity of at least 97% allows only one amino acid substitution. Therefore, section (d), which is referred to herein above, also refers to an amino acid sequence that differs by two amino acid substitutions, and preferably one amino acid substitution, from the amino acid sequence of section (c), which is referred to herein above, where the amino acid(s) ) the substitution(s) may occur at amino acid positions of SEQ ID NO: 19 other than the amino acid sequences of EVMSTTA (SEQ ID NO: 20) at amino acid positions 12-18 of SEQ ID NO: 19 and SQSPH (SEQ ID NO: 21) at amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 19 and at amino acids Q and Y at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 19. The amino acids in SEQ ID NO: 19 are believed to be different from the amino acid sequences EVMSTTA ( SEQ ID NO: 20) at amino acid positions 1218 of SEQ ID NO: 19 and SQSPH (SEQ ID NO: 21) at amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 19 and at amino acids Q and Y at amino acid positions 37 and 38 of SEQID NO: 19 are not important for the binding specificity of SEQ ID NO: 22. Thus, at these positions, amino acids can be changed or deleted, or an amino acid can be added, with little effect on the binding specificity for FGFR3b and 3c. These amino acid positions are preferably substituted. When replacing amino acids, conservative substitutions are preferred.
Фраза при определении идентичности исключаются аминокислотные положения от (X1) до (X6), используемая в данном документе в сочетании с SEQ ID NO: 1, уточняет, что вычисление идентичности последовательностей в отношении SEQ ID NO: 1 не принимает во внимание аминокислотные положения от (X1) до (X6). Аналогично, фраза при определении идентичности исключается аминокислотное положение (X6), используемая в данном документе в сочетании с SEQ ID NO: 19, уточняет, что вычисление идентичности последовательностей в отношении SEQ ID NO: 19 не принимает во внимание аминокислотное положение (X6).The phrase in determining identity excludes amino acid positions (X 1 ) to (X 6 ), used herein in conjunction with SEQ ID NO: 1, clarifies that the calculation of sequence identity with respect to SEQ ID NO: 1 does not take into account amino acid positions from (X 1 ) to (X 6 ). Similarly, the phrase identity excludes amino acid position (X 6 ), used herein in conjunction with SEQ ID NO: 19, clarifies that the calculation of sequence identity with respect to SEQ ID NO: 19 does not take into account the amino acid position (X 6 ) .
Условие при условии, что аминокислотная последовательность EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) в аминокислотных положениях 12-19 из SEQ ID NO: 1 является консервативной, используемое в данном документе, уточняет, что какие-либо замены аминокислот не могут вводиться в аминокислотные положения 12-19 из SEQ ID NO: 1. Аналогично, условие при условии, что аминокислоты Р и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 из SEQ ID NO: 1 являются консервативными, используемое в данном документе, уточняет, что какая-либо замена аминокислоты не может вводиться в аминокислотные положения 37 и 38 из SEQ ID NO: 1. Другими словами, аминокислотные положения, соответствующие аминокис- 4 042136 лотным положениям 12-19 SEQ ID NO: 1, имеют последовательность EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2), и аминокислоты в положениях 37 и 38 представляют собой соответственно Р и Y во всех полипептидах, подпадающих под действие разделов (a) и (b) первого варианта осуществления настоящего изобретения и его предпочтительных примеров.The condition provided that the amino acid sequence of EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2) at amino acid positions 12-19 of SEQ ID NO: 1 is conservative as used herein specifies that no amino acid substitutions may be made at amino acid positions 12 -19 of SEQ ID NO: 1. Similarly, the condition provided that amino acids P and Y at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 1 are conservative, as used herein, clarifies that any amino acid substitution cannot be introduced at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 1. In other words, the amino acid positions corresponding to amino acid positions 12-19 of SEQ ID NO: 1 have the sequence EVYGPTPM (SEQ ID NO: 2), and the amino acids in positions 37 and 38 are respectively P and Y in all polypeptides covered by sections (a) and (b) of the first embodiment of the present invention and its preferred examples.
Условие при условии, что аминокислотные последовательности EVMSTTA (SEQ ID NO: 20) в аминокислотных положениях 12-18 из SEQ ID NO: 19 и SQSPH (SEQ ID NO: 21) в аминокислотных положениях 31-35 из SEQ ID NO: 19 являются консервативными, используемое в данном документе, уточняет, что какие-либо замены аминокислот не могут вводиться в аминокислотные положения 12-18, а также 31-35 из SEQ ID NO: 19. Аналогично, условие при условии, что аминокислоты Q и Y в аминокислотных положениях 37 и 38 в SEQ ID NO: 19 являются консервативными, используемое в данном документе, уточняет, что какая-либо замена аминокислоты не может вводиться в аминокислотные положения 37 и 38 из SEQ ID NO: 19. Другими словами, аминокислотные положения, соответствующие аминокислотным положениям 12-18 из SEQ ID NO: 19, имеют последовательность EVMSTTA (SEQ ID NO: 20), аминокислотные положения, соответствующие аминокислотным положениям 31-35 из SEQ ID NO: 19, имеют последовательность SQSPH (SEQ ID NO: 21), и аминокислоты в положениях 37 и 38 представляют собой соответственно Q и Y во всех полипептидах, подпадающих под действие разделов (с) и (d) первого варианта осуществления настоящего изобретения и его предпочтительных примеров.Provided that the amino acid sequences of EVMSTTA (SEQ ID NO: 20) at amino acid positions 12-18 of SEQ ID NO: 19 and SQSPH (SEQ ID NO: 21) at amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 19 are conserved , as used herein, specifies that no amino acid substitutions may be made at amino acid positions 12-18 as well as 31-35 of SEQ ID NO: 19. Similarly, the condition provided that amino acids Q and Y at amino acid positions 37 and 38 in SEQ ID NO: 19 are conservative, as used herein, specifies that any amino acid substitution cannot be introduced at amino acid positions 37 and 38 of SEQ ID NO: 19. In other words, the amino acid positions corresponding to the amino acid positions 12-18 of SEQ ID NO: 19 have the sequence EVMSTTA (SEQ ID NO: 20), amino acid positions corresponding to amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 19 have the sequence SQSPH (SEQ ID NO: 21), and amino acids to the floor Codes 37 and 38 are respectively Q and Y in all polypeptides covered by sections (c) and (d) of the first embodiment of the present invention and its preferred examples.
Как уже упоминалось, любое аминокислотное замещение в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 19 предпочтительно является консервативным аминокислотным замещением. Консервативное замещение указывает на замену аминокислоты другой аминокислотой, имеющей химическое свойство, сходное с заменяемой аминокислотой. Предпочтительно, консервативное замещение, упоминаемое в данном документе, представляет собой замещение, выбранное из группы, состоящей из: (i) замещения основной аминокислоты другой основной аминокислотой; (ii) замещения кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой; (iii) замещения ароматической аминокислоты другой ароматической аминокислотой; (iv) замещения неполярной алифатической аминокислоты другой неполярной алифатической аминокислотой и (v) замещения полярной незаряженной аминокислоты другой полярной незаряженной аминокислотой. Основными аминокислотами являются аргинин, гистидин и лизин. Кислыми аминокислотами являются аспартат и глутамат. Ароматическими аминокислотами являются фенилаланин, тирозин и триптофан. Неполярными алифатическими аминокислотами являются глицин, аланин, валин, лейцин, метионин, изолейцин и пролин. Полярными незаряженными аминокислотами являются серин, треонин, цистеин, аспарагин и глутамин. В отличие от консервативного аминокислотного замещения, неконсервативное аминокислотное замещение представляет собой замену одной аминокислоты любой аминокислотой, которая не подпадает под указанные выше консервативные замещения (i)-(v).As already mentioned, any amino acid substitution in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 19 is preferably a conservative amino acid substitution. Conservative substitution refers to the replacement of an amino acid with another amino acid having a chemical property similar to the amino acid being replaced. Preferably, a conservative substitution referred to herein is a substitution selected from the group consisting of: (i) substitution of a basic amino acid with another basic amino acid; (ii) replacing an acidic amino acid with another acidic amino acid; (iii) replacing an aromatic amino acid with another aromatic amino acid; (iv) replacing a non-polar aliphatic amino acid with another non-polar aliphatic amino acid; and (v) replacing a polar uncharged amino acid with another polar uncharged amino acid. The main amino acids are arginine, histidine and lysine. The acidic amino acids are aspartate and glutamate. Aromatic amino acids are phenylalanine, tyrosine and tryptophan. Non-polar aliphatic amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, methionine, isoleucine and proline. The polar uncharged amino acids are serine, threonine, cysteine, asparagine, and glutamine. Unlike conservative amino acid substitution, non-conservative amino acid substitution is the replacement of one amino acid with any amino acid that does not fall within the above conservative substitutions (i)-(v).
Раскрытые в данном документе финомеры, связывающие FGFR3, преимущественно характеризуются превосходной аффинностью связывания с FGFR3c и 3b и, кроме того, особенно подходят для интернализации в клетки, где они могут оказывать диагностический или терапевтический эффект. Как можно понять из примеров, приведенных в данном документе ниже, при скрининге большой библиотеки финомеров был обнаружен финомер, связывающий FGFR3, из SEQ ID NO: 3. Было доказано, что финомеры, связывающие FGFR3, из SEQ ID NO: 3 и 19 обладают выдающимися свойствами в том, что касается их аффинности связывания с изоформами 3b и 3c FGFR3, а также их свойств интернализации клеток; см. примеры 1 и 7. Следовательно, финомер под SEQ ID NO: 19 является альтернативой финомерам под SEQ ID NO: 1. Неожиданно и преимущественно, оба финомера обладают схожей комбинацией преимущественных свойств. Финомер, связывающий FGFR3, из SEQ ID NO: 3 использовали в качестве матрицы для созревания аффинности, и даже была возможность дополнительно улучшить аффинность связывания с FGFR3b и 3с. Более подробно, среди большого пула полипептидов, полученных в результате процесса созревания аффинности, было обнаружено, что финомер, связывающий FGFR3, из SEQ ID NO: 4-8 еще сильнее связывается с FGFR3b и 3с, чем финомер, связывающий FGFR3, из SEQ ID NO: 3. Более того, в примерах, приведенных в данном документе ниже, показано, что финомеры, связывающие FGFR3, из SEQ ID NO: 3-8 и 22 можно получить рекомбинантно, и они имеют благоприятные технологические свойства, а следовательно могут быть получены в большом масштабе, например для терапевтических и диагностических путей применения. Дополнительно, финомер, связывающий FGFR3, из SEQ ID NO: 3-8 и 22 связывается не только с FGFR3c и 3b человека, но и с FGFR3c (и возможно также с 3b) мыши и обезьяны. Такое межвидовое связывание обладает рядом преимуществ для доклинических испытаний. Эти молекулы можно применять для диагностических целей, а также они пригодны в качестве исходной точки для разработки дополнительных терапевтических средств против опухолевых клеток, которые экспрессируют FGFR3 на своей поверхности, например, которые описаны более подробно в данном документе. Ни один из остальных финомеров, связывающих FGFR3, выявленных в результате первоначальных скринингов или в последующем процессе созревания аффинности, не обладал такой же преимущественной комбинацией свойств, как финомеры, связывающие FGFR3, из SEQ ID NO: 3-8 и 22. Удивительная и непредсказуемая преимущественная комбинация свойств финомеров, связывающих FGFR3, из SEQ ID NO: 3-8 и 22 будет дополнительно видна из примеров, приведенных в данном документе ниже.The FGFR3-binding finomers disclosed herein advantageously have excellent binding affinity for FGFR3c and 3b, and furthermore are particularly suitable for internalization into cells where they may have a diagnostic or therapeutic effect. As can be understood from the examples provided herein below, when screening a large library of finomers, the FGFR3 binding finomer of SEQ ID NO: 3 was found. properties in terms of their binding affinity for FGFR3 isoforms 3b and 3c, as well as their cell internalization properties; see examples 1 and 7. Therefore, the finomer of SEQ ID NO: 19 is an alternative to the finomers of SEQ ID NO: 1. Surprisingly and advantageously, both finomers have a similar combination of advantageous properties. The FGFR3 binding finomer of SEQ ID NO: 3 was used as a template for affinity maturation, and it was even possible to further improve the binding affinity for FGFR3b and 3c. In more detail, among a large pool of polypeptides resulting from the affinity maturation process, it was found that the FGFR3 binding finomer of SEQ ID NO: 4-8 binds even more strongly to FGFR3b and 3c than the FGFR3 binding finomer of SEQ ID NO. : 3. Moreover, the examples provided herein below show that FGFR3 binding finomers from SEQ ID NOs: 3-8 and 22 can be obtained recombinantly and have favorable processing properties, and therefore can be obtained in on a large scale, for example for therapeutic and diagnostic applications. Additionally, the FGFR3 binding finomer of SEQ ID NOs: 3-8 and 22 binds not only to human FGFR3c and 3b, but also to mouse and monkey FGFR3c (and possibly also 3b). Such cross-species binding has a number of advantages for preclinical testing. These molecules can be used for diagnostic purposes and are also useful as a starting point for the development of additional therapeutics against tumor cells that express FGFR3 on their surface, such as those described in more detail herein. None of the other FGFR3-binding finomers identified from initial screens or subsequent affinity maturation had the same advantageous combination of properties as the FGFR3-binding finomers of SEQ ID NOS: 3-8 and 22. A surprising and unpredictable advantage the combination of properties of FGFR3 binding finomers from SEQ ID NOs: 3-8 and 22 will be further apparent from the examples provided herein below.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления первого аспекта настоящего изобре- 5 042136 тения (X1) представляет собой N, R или K и предпочтительно представляет собой R или K; (X2) представляет собой S, G, K или R и предпочтительно представляет собой G, K или R; (X3) представляет собойAccording to a preferred embodiment of the first aspect of the present invention (X 1 ) is N, R or K, and preferably is R or K; (X 2 ) is S, G, K or R and preferably is G, K or R; (X 3 ) is
S или G и предпочтительно представляет собой G; и (X4) представляет собой Е, Q, D, S или K и предпочтительно представляет собой Q, D, S или K.S or G and preferably is G; and (X 4 ) is E, Q, D, S or K and preferably is Q, D, S or K.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления первого аспекта настоящего изобретения (X1) представляет собой N, R или K и предпочтительно представляет собой R или K; (X2) представляет собой S, G, K или R и предпочтительно представляет собой G, K или R; (X3) представляет собой S или G и предпочтительно представляет собой G; (X4) представляет собой Е, Q, D, S или K и предпочтительно представляет собой Q, D, S или K; (X5) представляет собой Т или А; и (X6) представляет собой Y, W или L и предпочтительно представляет собой L или W.According to another preferred embodiment of the first aspect of the present invention (X 1 ) is N, R or K, and preferably is R or K; (X 2 ) is S, G, K or R and preferably is G, K or R; (X 3 ) is S or G and preferably is G; (X 4 ) is E, Q, D, S or K and preferably is Q, D, S or K; (X 5 ) is T or A; and (X 6 ) is Y, W or L and preferably is L or W.
Аминокислотные положения от (X1) до (X4) в SEQ ID NO: 1 представляют собой аминокислотные положения, соответствующие аминокислотам, образующим src-петлю SH3-домена человеческой Fyn дикого типа. В примерах, приведенных в данном документе ниже, показано, что аминокислоты, перечисленные для аминокислотных положений от (X1) до (X4), придают специфичность связывания с FGFR3b и FGFR3c, в частности с FGFR3b, имеющим SeQ ID NO: 9, и с FGFR3c, имеющим SEQ ID NO: 10. Более подробно, из результатов выравнивания последовательностей SEQ ID NO: 3-8 по настоящему изобретению, показанных на фиг. 1, видно, что в финомерах, связывающих FGFR3, из SEQ ID NO: 3-8 могут встречаться аминокислоты, которые перечислены для аминокислотных положений от (X1) до (X4) в вышеуказанном предпочтительном варианте осуществления. Предпочтительные аминокислоты, которые перечислены для аминокислотных положений от (X1) до (X4) в вышеуказанном предпочтительном варианте осуществления, могут встречаться в соответствующих аминокислотных положениях SEQ ID NO: 48, при этом следует отметить, что SEQ ID NO: 4-8 были получены из SEQ ID NO: 3 путем созревания аффинности. Можно ожидать, что специфичность связывания с FGFR3b и 3c также придают и другие аминокислотные последовательности, выбранные из таковых от (X1) до (X4), как определено выше, помимо конкретных аминокислотных комбинаций для таковых от (X1) до (X4), которые представлены в SEQ ID NO: 3-8, предпочтительно в SEQ ID NO: 4-8.Amino acid positions (X 1 ) to (X 4 ) in SEQ ID NO: 1 are the amino acid positions corresponding to the amino acids forming the src loop of the wild-type human Fyn SH3 domain. The examples provided herein below show that the amino acids listed for amino acid positions (X 1 ) to (X 4 ) confer binding specificity to FGFR3b and FGFR3c, in particular FGFR3b having SeQ ID NO: 9, and with FGFR3c having SEQ ID NO: 10. In more detail, from the results of the alignment of the sequences of SEQ ID NO: 3-8 of the present invention shown in FIG. 1, it can be seen that the FGFR3 binding finomers of SEQ ID NO: 3-8 may contain the amino acids listed for amino acid positions (X 1 ) to (X 4 ) in the above preferred embodiment. The preferred amino acids that are listed for amino acid positions (X 1 ) to (X 4 ) in the above preferred embodiment may occur at the corresponding amino acid positions of SEQ ID NO: 48, it should be noted that SEQ ID NO: 4-8 were obtained from SEQ ID NO: 3 by affinity maturation. Other amino acid sequences selected from (X 1 ) to (X 4 ) as defined above, in addition to the specific amino acid combinations for (X 1 ) to (X 4 ) which are shown in SEQ ID NOs: 3-8, preferably in SEQ ID NOs: 4-8.
Как рассмотрено выше, аминокислотное положение (X5) в SEQ ID NO: 1 и аминокислотное положение (X6) в SEQ ID NO: 1 и 19 представляют собой аминокислотные положения, которые не соответствуют ни аминокислотам из RT и src-петли SH3-домена человеческой Fyn дикого типа, ни аминокислотам, которые являются смежными с одной из этих петель. В связи с этим полагают, что в этих положениях аминокислоты могут быть заменены или удалены, или может быть добавлена дополнительная аминокислота, практически не влияя на специфичность связывания с FGFR3b и 3с. Аминокислоты в положениях (X5) и (X6) предпочтительно заменены. Более предпочтительно, чтобы (X5) представляло собой Т или А; и (X6) представляло собой Y, W или L и наиболее предпочтительно представляло собой L или W. Как можно понять из фиг. 1, эти аминокислоты для (X5) из SEQ ID NO: 1 и (X6) из SEQ ID NO: 1 и 19 можно найти либо в SEQ ID NO: 3-8 и 22 или в SH3-домене человеческой Fyn дикого типа (SEQ ID NO: 11), либо в другом финомере, связывающемся с FGFR3b и 3с. В случае наиболее предпочтительной аминокислоты для положения (X6) эту аминокислоту можно найти в SEQ ID NO: 3-8.As discussed above, the amino acid position (X 5 ) in SEQ ID NO: 1 and the amino acid position (X 6 ) in SEQ ID NO: 1 and 19 are amino acid positions that do not correspond to any amino acids from the RT and src loop of the SH3 domain. wild-type human Fyn, nor amino acids that are adjacent to one of these loops. In this regard, it is believed that at these positions, amino acids can be replaced or deleted, or an additional amino acid can be added, with little effect on the binding specificity for FGFR3b and 3c. The amino acids at positions (X 5 ) and (X 6 ) are preferably replaced. More preferably, (X 5 ) is T or A; and (X 6 ) is Y, W or L, and most preferably is L or W. As can be understood from FIG. 1, these amino acids for (X 5 ) of SEQ ID NOs: 1 and (X 6 ) of SEQ ID NOs: 1 and 19 can be found either in SEQ ID NOs: 3-8 and 22 or in the wild-type human Fyn SH3 domain. (SEQ ID NO: 11), or in another finomer that binds to FGFR3b and 3c. In the case of the most preferred amino acid for position (X 6 ), that amino acid can be found in SEQ ID NOs: 3-8.
В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления первого аспекта настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из любой из SEQ ID NO: 3-8 и 22, предпочтительно из любой из SEQ ID NO: 4-8 или 22.According to a more preferred embodiment of the first aspect of the present invention, the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of any of SEQ ID NOs: 3-8 and 22, preferably from any of SEQ ID NOs: 4-8 or 22.
Как можно понять из примеров, приведенных в данном документе ниже, SEQ ID NO: 3-8 и 22 представляют собой последовательности конкретных финомеров, связывающих FGFR3b и Зс, которые были созданы и испытаны.As can be understood from the examples provided herein below, SEQ ID NOs: 3-8 and 22 are sequences of specific finomers that bind FGFR3b and 3c that have been designed and tested.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления первого аспекта настоящего изобретения полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 22. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, является особенно предпочтительным. Другим особенно предпочтительным вариантом осуществления является полипептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.According to an even more preferred embodiment of the first aspect of the present invention, the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 22. A polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is particularly preferred. Another particularly preferred embodiment is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
Было довольно неожиданно получить финомер с низкой наномолярной аффинностью уже при первом скрининге. Финомер, имеющий SEQ ID NO: 3, был выделен из библиотеки финомеров в виде финомера, обладающего наиболее выдающимися свойствами аффинности связывания FGFR3b и 3c и интернализации. Финомеры с SEQ ID NO: 4-8 были получены из SEQ ID NO: 3, и аффинность связывания с FGFR3b и 3c у финомеров, имеющих SEQ ID NO: 4-8, еще более улучшена.It was rather unexpected to obtain a low nanomolar affinity finomer already at the first screening. The finomer having SEQ ID NO: 3 was isolated from the finomer library as the finomer having the most outstanding FGFR3b and 3c binding affinity and internalization properties. The finomers of SEQ ID NO: 4-8 were derived from SEQ ID NO: 3, and the binding affinity for FGFR3b and 3c of the finomers of SEQ ID NO: 4-8 is further improved.
К удивлению, финомер с SEQ ID NO: 22 также имел очень хорошие свойства, сравнимые с таковыми у SEQ ID NO: 4-8, хотя первоначально он был получен из другого семейства финомеров.Surprisingly, the finomer of SEQ ID NO: 22 also had very good properties, comparable to those of SEQ ID NO: 4-8, although it was originally derived from a different family of finomers.
Настоящее изобретение во втором аспекте относится к слитой конструкции, содержащей полипептид по настоящему изобретению, слитый с дополнительным соединением.The present invention in its second aspect relates to a fusion construct comprising a polypeptide of the present invention fused to an additional compound.
Используемый в данном документе термин слитая конструкция определяет слияние полипептида по настоящему изобретению с дополнительным соединением. Соединение может представлять собой либо белковое соединение, либо небелковое соединение. В случае если соединение представляет собойAs used herein, the term fusion construct defines the fusion of a polypeptide of the present invention with an additional compound. The compound may be either a proteinaceous compound or a non-proteinaceous compound. If the connection is
- 6 042136 белковое соединение (например, цитокин, или хемокин, или антитело, или фрагмент антитела, как описано в данном документе ниже), слитая конструкция также может быть обозначена как слитый белок. Используемый в данном документе термин слитый белок в общих чертах относится к полипептидной конструкции, созданной посредством связывания и экспрессии двух или более генов, которые кодируют отдельные полипептиды или полипептид и пептид. Другими словами, трансляция этого слитого гена приводит к получению одного полипептида с функциональными свойствами, полученными от каждого из исходных полипептидов. Полипептиды могут быть слиты либо непосредственно, либо через линкер, т.е. короткую пептидную последовательность. Как правило, слитые белки создают искусственно с помощью технологии рекомбинантной ДНК, хорошо известной специалисту в данной области техники (например, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th ed. Garland Science, p. 518-519). Тем не менее, полипептиды и слитые белки по настоящему изобретению можно получить с помощью любой из многих традиционных и хорошо известных методик, таких как стратегии простого органического синтеза, методики твердофазного синтеза или с помощью коммерчески доступных автоматических синтезаторов. Слитые белки можно применять в биологическом исследовании, методах диагностики или терапии.- 6 042136 protein compound (for example, a cytokine, or chemokine, or an antibody, or an antibody fragment, as described herein below), a fusion construct may also be referred to as a fusion protein. As used herein, the term fusion protein generally refers to a polypeptide construct created by linking and expressing two or more genes that code for separate polypeptides or a polypeptide and a peptide. In other words, translation of this fusion gene results in a single polypeptide with functional properties derived from each of the original polypeptides. The polypeptides can be fused either directly or through a linker, i. short peptide sequence. Typically, fusion proteins are artificially created using recombinant DNA technology well known to one of skill in the art (eg, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th ed. Garland Science, p. 518-519). However, the polypeptides and fusion proteins of the present invention may be prepared using any of many conventional and well known techniques, such as simple organic synthesis strategies, solid phase synthesis techniques, or commercially available automated synthesizers. Fusion proteins can be used in biological research, diagnostic methods or therapy.
Примерами небелковых соединений в качестве дополнительного соединения являются, например, небольшие органические молекулы, такие как полиэтиленгликоль (PEG), или Alexa Fluor, или радионуклиды. Дополнительные конкретные примеры небелковых дополнительных соединений рассмотрены в данном документе ниже.Examples of non-protein compounds as an additional compound are, for example, small organic molecules such as polyethylene glycol (PEG) or Alexa Fluor, or radionuclides. Additional specific examples of non-protein supplemental compounds are discussed herein below.
В соответствии с определенными вариантами осуществления второго аспекта настоящего изобретения дополнительное соединение представляет собой фармацевтически активное соединение, пролекарство, фармацевтически приемлемый носитель, диагностически активное соединение, усилитель проникновения в клетку и/или соединение, модулирующее период полужизни в сыворотке.According to certain embodiments of the second aspect of the present invention, the additional compound is a pharmaceutically active compound, a prodrug, a pharmaceutically acceptable carrier, a diagnostically active compound, a cell entry enhancer, and/or a compound that modulates serum half-life.
Фармацевтически активное соединение представляет собой соединение, обладающее биологической активностью при введении субъекту, которая оказывает благоприятный эффект в отношении субъекта. Пролекарство представляет собой соединение, которое вводят субъекту в неактивной (или менее чем полностью активной) форме и которое впоследствии превращается в фармацевтически активное или полностью фармацевтически активное соединение в результате метаболических процессов у субъекта. Фармацевтически (полностью) активное соединение предпочтительно представляет собой соединение, подходящее для лечения или предупреждения любого из конкретных заболеваний, определенных в данном документе ниже.A pharmaceutically active compound is a compound that has biological activity when administered to a subject that has a beneficial effect on the subject. A prodrug is a compound that is administered to a subject in an inactive (or less than fully active) form and which is subsequently converted to a pharmaceutically active or fully pharmaceutically active compound by metabolic processes in the subject. The pharmaceutically (fully) active compound is preferably a compound suitable for the treatment or prevention of any of the specific diseases defined herein below.
Диагностически активное соединение представляет собой соединение, обладающее активностью при введении субъекту, которая дает возможность (помогает) определять или идентифицировать заболевание или нарушение, если индивидуум страдает таким заболеванием или нарушением. Примеры диагностически активных соединений включают выявляемые маркеры, такие как флуоресцентные красители, радионуклиды или контрастные средства для медицинской визуализации. Конкретные примеры флуоресцентных красителей, радионуклидов и контрастных средств для медицинской визуализации описаны в данном документе ниже. Диагностически активное соединение, слитое с полипептидом по настоящему изобретению, можно, в частности, применять для облегчения определения или идентификации или для определения или идентификации любого из конкретных заболеваний, определенных в данном документе ниже, которые имеют общий признак в том, что их происхождение и/или симптом(ы) связаны с FGFR3, в частности связаны с FGFR3b и 3с. Пораженные таким заболеванием участки в организме субъекта можно выявлять или идентифицировать с помощью полипептида по настоящему изобретению, слитого с диагностически активным соединением по настоящему изобретению.A diagnostically active compound is a compound having activity, when administered to a subject, that enables (helps) to detect or identify a disease or disorder if the individual suffers from such a disease or disorder. Examples of diagnostically active compounds include detectable markers such as fluorescent dyes, radionuclides, or medical imaging contrast agents. Specific examples of fluorescent dyes, radionuclides, and medical imaging contrast agents are described herein below. A diagnostically active compound fused to a polypeptide of the present invention may in particular be used to facilitate detection or identification, or to identify or identify any of the specific diseases defined herein below that have a common feature in that their origin and/ or symptom(s) associated with FGFR3, in particular associated with FGFR3b and 3c. Affected by such a disease sites in the body of the subject can be detected or identified using the polypeptide of the present invention, fused with a diagnostically active compound of the present invention.
Усилитель проникновения в клетку представляет собой соединение, облегчающее доставку полипептида по настоящему изобретению в (in vitro, ex vivo или in vivo) клетку.A cell penetration enhancer is a compound that facilitates delivery of a polypeptide of the present invention into (in vitro, ex vivo or in vivo) a cell.
Соединение, модулирующее период полужизни в сыворотке, представляет собой соединение, которое дает возможность увеличить период полужизни in vivo полипептидов по настоящему изобретению, в частности в системе кровообращения. Компонентом, модулирующим период полужизни в сыворотке, предпочтительно является полиэтиленгликоль (PEG).A compound that modulates serum half-life is a compound that makes it possible to increase the in vivo half-life of the polypeptides of the present invention, in particular in the circulatory system. The serum half-life modulating component is preferably polyethylene glycol (PEG).
Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой соединение, которое облегчает или улучшает, например, доставку и/или эффективность полипептида по настоящему изобретению при введении субъекту. Подходящие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны из уровня техники и включают, например, стабилизаторы, антиоксиданты, рН-регулирующие вещества и т.д.A pharmaceutically acceptable carrier is a compound that facilitates or improves, for example, the delivery and/or efficacy of a polypeptide of the present invention when administered to a subject. Suitable pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art and include, for example, stabilizers, antioxidants, pH adjusting agents, and the like.
В соответствии с одним вариантом осуществления второго аспекта настоящего изобретения дополнительное соединение представляет собой токсичное соединение.According to one embodiment of the second aspect of the present invention, the additional compound is a toxic compound.
Токсичное соединение предпочтительно представляет собой небольшое органическое соединение или полипептид, например токсичное соединение, выбранное из группы, состоящей из калихеамицина, майтансиноида, неокарзиностатина, эсперамицина, динемицина, кедарцидина, мадуропептина, доксорубицина, даунорубицина, ауристатина, ацистатина, цепи рицина А, модессина, укороченного эндотоксина A Pseudomonas, дифтеротоксина и рекомбинантного гелонина.The toxic compound is preferably a small organic compound or polypeptide, for example a toxic compound selected from the group consisting of calicheamicin, maytansinoid, neocarzinostatin, esperamycin, dinemycin, kedarcidin, maduropeptin, doxorubicin, daunorubicin, auristatin, acistatin, ricin A chain, modesin, truncated Pseudomonas endotoxin A, difterotoxin and recombinant gelonin.
В соответствии с другим вариантом осуществления второго аспекта настоящего изобретения, дополнительное соединение по настоящему изобретению выбрано из группы, состоящей из (a) флуорес- 7 042136 центного красителя, (b) фотосенсибилизатора, (с) радионуклида, (d) контрастного средства для медицинской визуализации, (е) цитокина, (f) хемокина, (g) прокоагулянтного фактора, (h) фермента для активации пролекарства, (i) связывающейся с альбумином молекулы, (j) альбумина, (k) связывающейся с IgG молекулы или (l) полиэтиленгликоля.According to another embodiment of the second aspect of the present invention, the additional compound of the present invention is selected from the group consisting of (a) a fluorescent dye, (b) a photosensitizer, (c) a radionuclide, (d) a medical imaging contrast agent , (e) cytokine, (f) chemokine, (g) procoagulant factor, (h) enzyme for prodrug activation, (i) albumin-binding molecule, (j) albumin, (k) IgG-binding molecule, or (l) polyethylene glycol .
Примерами флуоресцентного красителя являются красители Alexa Fluor и Су.Examples of a fluorescent dye are the Alexa Fluor and Cy dyes.
Примерами фотосенсибилизатора являются фототоксичный красный флуоресцентный белок KillerRed и гематопорфирин.Examples of a photosensitizer are the phototoxic red fluorescent protein KillerRed and hematoporphyrin.
Примерами радионуклидов являются гамма-излучающие изотопы, например 99mTc, 123I, 1nIn, излучатели позитронов, например 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I, бета-излучатели, например 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu, и альфа-излучатели, например 213Bi, 211At.Examples of radionuclides are gamma emitting isotopes such as 99m Tc, 123 I, 1n In, positron emitters such as 18 F, 64 Cu, 68 Ga, 86 Y, 124 I, beta emitters such as 131 I, 90 Y, 177 Lu , 67 Cu, and alpha emitters, such as 213 Bi, 211 At.
Контрастное средство, используемое в данном документе, представляет собой вещество, применяемое для контрастирования структур или жидкостей в организме при медицинской визуализации. Обычные контрастные средства работают на основе ослабления рентгеновского излучения и усиления сигнала магнитного резонанса.A contrast agent as used herein is a substance used to contrast structures or fluids in the body in medical imaging. Conventional contrast agents work by attenuating X-rays and amplifying the magnetic resonance signal.
Цитокин, например, может быть выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-12, TNF-альфа, IFNальфа, IFN-бета, IFN-гамма, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, В70, TNF-бета, LT-бета, лиганда CD-40, лиганда Fas, TGF-бета, IL-1-альфа и IL-1-бета. Как хорошо известно из уровня техники, цитокины могут способствовать провоспалительному или противовоспалительному ответу иммунной системы. Таким образом, в зависимости от подлежащего лечению заболевания преимущественными могут быть конструкции, слитые с провоспалительным или противовоспалительным цитокином. Например, для лечения воспалительных заболеваний, в целом, предпочтительными являются слитые конструкции, содержащие противовоспалительные цитокины, тогда как для лечения рака, в целом, предпочтительными являются слитые конструкции, содержащие провоспалительные цитокины.The cytokine, for example, may be selected from the group consisting of IL-2, IL-12, TNF-alpha, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF-beta, LT-beta, CD-40 ligand , Fas ligand, TGF-beta, IL-1-alpha and IL-1-beta. As is well known in the art, cytokines can promote a pro-inflammatory or anti-inflammatory response of the immune system. Thus, depending on the disease being treated, constructs fused with a pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokine may be advantageous. For example, for the treatment of inflammatory diseases, fusion constructs containing anti-inflammatory cytokines are generally preferred, while for the treatment of cancer, fusion constructs containing pro-inflammatory cytokines are generally preferred.
Хемокин можно выбрать, например, из группы, состоящей из IL-8, GRO-альфа, GRO-бета, GROгамма, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1-альфа/бета, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1-альфа, MIP-1-бета, MDC, TECK, TARC, RANTES, НСС-1, НСС-4, DC-CK1, MIP-3альфа, MIP-3-бета, МСР-1-5, эотаксина, эотаксина-2, I-309, MPIF-1, 6C-кина, CTACK, МЕС, лимфотактина и фракталкина.The chemokine can be selected, for example, from the group consisting of IL-8, GRO-alpha, GRO-beta, GRO-gamma, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1-alpha /beta, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1-alpha, MIP-1-beta, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP -3alpha, MIP-3-beta, MCP-1-5, eotaxin, eotaxin-2, I-309, MPIF-1, 6C-kin, CTACK, MEC, lymphotactin and fractalkine.
Примерами прокоагулянтного фактора являются тканевый фактор (TF) и раковый прокоагулянт (СР).Examples of a procoagulant factor are tissue factor (TF) and cancer procoagulant (CP).
Примерами фермента для активации пролекарства являются такие ферменты, как карбоксипептидазы, глюкуронидазы или глюкозидазы.Examples of an enzyme for activating a prodrug are enzymes such as carboxypeptidases, glucuronidases or glucosidases.
Примеры связывающейся с альбумином молекулы и связывающейся с IgG молекулы описаны в Gebauer and Skerra (2009), Curr Opin Chem Biol., 13(3):245-255. Соответственно, примерами связывающихся с альбумином молекул и связывающихся с IgG молекул являются отдельные домены Ig человека (сдвоенные Dab альбумина), нанотела, встречающийся в природе альбуминсвязывающий домен (ABD), полученный из стрептококкового белка G, и домен, который связывается с IgG. Такие слитые конструкции, например, увеличивают период полужизни полипептида по настоящему изобретению при введении пациенту, в частности в системе кровообращения.Examples of an albumin-binding molecule and an IgG-binding molecule are described in Gebauer and Skerra (2009), Curr Opin Chem Biol., 13(3):245-255. Accordingly, examples of albumin-binding molecules and IgG-binding molecules are single human Ig domains (albumin twin Dab), nanobodies, a naturally occurring albumin-binding domain (ABD) derived from streptococcal G protein, and a domain that binds to IgG. Such fusion constructs, for example, increase the half-life of the polypeptide of the present invention when administered to a patient, particularly in the circulatory system.
В соответствии с другими вариантами осуществления второго аспекта настоящего изобретения дополнительное соединение по настоящему изобретению содержит легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела, Fc-домен антитела, антитело или их комбинацию.According to other embodiments of the second aspect of the present invention, an additional compound of the present invention comprises an antibody light chain, an antibody heavy chain, an antibody Fc domain, an antibody, or a combination thereof.
Термин антитело включает моноклональные антитела, одноцепочечные антитела или их фрагменты, также в том числе биспецифические антитела, синтетические антитела, фрагменты антител, сохраняющие способность связывания, отличные от тяжелых и легких цепей, такие как Fab, F(ab2)', фрагменты Fv или scFv и т.д. или химически модифицированное производное любого из них. Антитела или их фрагменты, например, можно получить с помощью способов, которые описаны, например, в Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. В случае если получают производные указанных антител с помощью методики фагового дисплея, то для повышения эффективности фаговых антител, которые связываются с эпитопом пептида или полипептида по настоящему изобретению, можно применять поверхностный плазмонный резонанс, используемый в системе BIAcore (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Получение химерных антител описано, например, в WO 89/09622. Дополнительным источником антител, подлежащих использованию в соответствии с настоящим изобретением, являются так называемые ксеногенные антитела. Общая идея получения ксеногенных антител, таких как человеческие антитела у мышей, описан, например, в WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 96/33735. Антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, или их соответствующую(ие) иммуноглобулиновую(ые) цепь(и) можно дополнительно модифицировать с помощью традиционных методик, известных из уровня техники, например, с помощью делеции(й), вставки(ок), замещения(ий), добавления(ий) аминокислот, и/или рекомбинации(й), и/или любой(ых) другой(их) модификации(й), известных из уровня техники, либо отдельно, либо в комбинации. Способы введения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащую в основе аминокислотной последовательности цепи иммуноглобулина, хорошоThe term antibody includes monoclonal antibodies, single chain antibodies, or fragments thereof, also including bispecific antibodies, synthetic antibodies, antibody fragments that retain binding ability other than heavy and light chains, such as Fab, F(ab 2 )', Fv fragments, or scFv etc. or a chemically modified derivative of any of them. Antibodies or fragments thereof, for example, can be obtained using methods that are described, for example, in Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. In the event that derivatives of these antibodies are obtained using a phage display technique, then to improve the efficiency of phage antibodies that bind to an epitope of a peptide or polypeptide of the present invention, surface plasmon resonance used in the BIAcore system can be used (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). The production of chimeric antibodies is described, for example, in WO 89/09622. An additional source of antibodies to be used in accordance with the present invention are the so-called xenogeneic antibodies. The general idea of obtaining xenogeneic antibodies, such as human antibodies in mice, is described, for example, in WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 and WO 96/33735. The antibodies used in accordance with the present invention, or their corresponding immunoglobulin(s) chain(s), can be further modified using conventional techniques known in the art, for example, using deletion(s), insertion(s), substitution(s), addition(s) of amino acids, and/or recombination(s), and/or any(s) other(s) modification(s) known in the art, either alone or in combination. Methods for introducing such modifications to the DNA sequence underlying the amino acid sequence of an immunoglobulin chain are well
- 8 042136 известны специалисту в данной области техники; см., например, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.- 8 042136 known to a person skilled in the art; see, for example, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Термин антитело также относится к производным указанных антител, которые сохраняют или фактически сохраняют свою специфичность связывания. Тогда как особенно предпочтительные варианты осуществления указанных производных дополнительно указаны в данном документе ниже, другими предпочтительными производные таких антител являются химерные антитела, содержащие, например, вариабельную область мыши или крысы и константную область человека.The term antibody also refers to derivatives of said antibodies that retain or actually retain their binding specificity. While particularly preferred embodiments of these derivatives are further specified herein below, other preferred derivatives of such antibodies are chimeric antibodies containing, for example, a mouse or rat variable region and a human constant region.
Антитело может представлять собой гуманизированное антитело. Термин гуманизированное антитело означает, в соответствии с настоящим изобретением, антитело нечеловеческого происхождения, белковые последовательности которого были модифицированы для увеличения его сходства с вариантами антител, которые в норме вырабатываются у людей. Создание гуманизированного антитела можно осуществить, например, путем вставки соответствующих сегментов, кодирующих CDR (отвечающих за требуемые свойства связывания), таких как CDR 3 и предпочтительно все 6 CDR, в каркас человеческого антитела. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, в ЕР-А1 0239400 и WO 90/07861.The antibody may be a humanized antibody. The term humanized antibody means, in accordance with the present invention, an antibody of non-human origin, the protein sequences of which have been modified to increase its similarity to antibody variants that are normally produced in humans. The creation of a humanized antibody can be accomplished, for example, by inserting appropriate CDR-encoding segments (responsible for desired binding properties), such as CDR 3 and preferably all 6 CDRs, into a human antibody framework. Methods for making humanized antibodies are described, for example, in EP-A1 0239400 and WO 90/07861.
Термин легкая цепь антитела означает малую полипептидную субъединицу антитела, тогда как термин тяжелая цепь антитела означает большую полипептидную субъединицу антитела. Типичное антитело состоит из двух тяжелых цепей иммуноглобулина (Ig) и двух легких цепей Ig. Каждая легкая цепь состоит из двух тандемных доменов иммуноглобулина: одного константного (CL) домена и одного вариабельного домена (VL), который важен для связывания антигена. Тяжелая цепь определяет класс или изотип антитела. Каждая тяжелая цепь имеет две области, а именно, константную область (которая одинакова для всех иммуноглобулинов одного и того же класса, но различается в разных классах) и вариабельную область, которая отличается между разными В-клетками, но одинакова для всех иммуноглобулинов, вырабатываемых одной и той же В-клеткой или одним и тем же клоном В-клетки. Вариабельный домен любой тяжелой цепи состоит из одного домена иммуноглобулина.The term antibody light chain means the small polypeptide subunit of an antibody, while the term antibody heavy chain means the large polypeptide subunit of an antibody. A typical antibody consists of two immunoglobulin (Ig) heavy chains and two Ig light chains. Each light chain consists of two tandem immunoglobulin domains: one constant (CL) domain and one variable domain (VL), which is important for antigen binding. The heavy chain defines the class or isotype of the antibody. Each heavy chain has two regions, namely, a constant region (which is the same for all immunoglobulins of the same class, but differs between classes) and a variable region, which differs between different B cells, but is the same for all immunoglobulins produced by one and the same B cell or the same B cell clone. The variable domain of any heavy chain consists of a single immunoglobulin domain.
Функциональный Fc-домен антитела является термином, хорошо известным специалисту в данной области техники, и определяется по расщеплению антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей, иммуноглобулины делят на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. В соответствии с константными областями тяжелой цепи различные классы иммуноглобулинов соответственно называются [альфа], [дельта], [эпсилон], [гамма] и [мю]. Функциональный Fc-домен антитела непосредственно вовлечен в ADCC (антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность), в основе которых лежит активация комплемента, связывание C1q и связывание Fc-рецептора. Четыре изотипа IgG человека связывают различные рецепторы, такие как неонатальный Fc-рецептор, активирующие Fcгамма рецепторы, FcyRI, FcyRIIa и FcyRIIIa, ингибиторный рецептор FcyRIIb и Clq с различными значениями аффинности, что приводит к очень разным активностям. Известно, что значения аффинности к активирующим и ингибирующим рецепторам Fc-домена человеческого антитела можно задать путем конструирования и модифицировать (см. Strohl W. (2009) Curr Opin Biotechnol, 20, p. 685-691).The functional Fc domain of an antibody is a term well known to one of skill in the art and is determined by cleavage of antibodies with papain. Depending on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chains, immunoglobulins are divided into classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and some of them can be further divided into subclasses (isotypes), for example, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, IgA1 and IgA2. According to the heavy chain constant regions, the various classes of immunoglobulins are respectively named [alpha], [delta], [epsilon], [gamma], and [mu]. The functional Fc domain of an antibody is directly involved in ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) and CDC (complement dependent cytotoxicity), which are based on complement activation, C1q binding and Fc receptor binding. The four human IgG isotypes bind different receptors such as the neonatal Fc receptor, the activating Fcgamma receptors, FcyRI, FcyRIIa and FcyRIIIa, the inhibitory receptor FcyRIIb and Clq with different affinities resulting in very different activities. It is known that the affinity values for the activating and inhibitory receptors of the Fc domain of a human antibody can be designed and modified (see Strohl W. (2009) Curr Opin Biotechnol, 20, p. 685-691).
Предпочтительно, Fc-домен представляет собой один или несколько функциональных Fc-доменов человека, которые дают возможность продлевать период полужизни in vivo полипептидов по настоящему изобретению, и некоторые из которых направляют иммунный ответ млекопитающего к участку специфического связывания мишени полипептидным компонентом по настоящему изобретению в слитом белке, например, в терапевтических, профилактических и/или диагностических путях применения, как описано в данном документе ниже. Более предпочтительно, такой человеческий функциональный Fc-домен получен из антитела IgG1. Полипептиды по настоящему изобретению могут быть слиты либо с N-или С-концом одного или нескольких функциональных Fc-доменов, либо как с N-, так и с С-концом одного или нескольких Fc-доменов. В определенных вариантах осуществления слитые белки по настоящему изобретению также могут содержать мультимеры, например тетрамеры, тримеры или димеры полипептидов по настоящему изобретению, слитых на по меньшей мере одной стороне, например с N-концом Fc-домена.Preferably, the Fc domain is one or more functional human Fc domains that allow for the extension of the in vivo half-life of the polypeptides of the present invention, and some of which direct the mammalian immune response to the specific target binding site of the polypeptide component of the present invention in the fusion protein. , for example, in therapeutic, prophylactic and/or diagnostic applications, as described herein below. More preferably, such a human functional Fc domain is derived from an IgG1 antibody. The polypeptides of the present invention may be fused to either the N- or C-terminus of one or more functional Fc domains, or to both the N- and C-terminus of one or more Fc domains. In certain embodiments, the fusion proteins of the invention may also contain multimers, eg tetramers, trimers, or dimers, of the polypeptides of the invention fused at at least one side, eg, the N-terminus of the Fc domain.
Fc-домен может представлять собой один или несколько сконструированных функциональных Fcдоменов человека IgG1 с активирующими или молчащими эффекторными функциями, например один или несколько сконструированных функциональных Fc-доменов человека IgG1 с молчащими эффекторными функциями, например один или несколько сконструированных функциональных Fc-доменов человека IgG1 с молчащими эффекторными функциями с мутацией в L234 и L235, нумерация в соответствии с EU-системой согласно Kabat (см. Johnson G. and Wu Т.Т. (2000) Nucleic Acids Res. 28, p. 214-218), например с мутацией L234A и L235A.An Fc domain may be one or more engineered functional human IgG1 Fc domains with activating or silencing effector functions, e.g. one or more engineered functional human IgG1 Fc domains with silencing effector functions, e.g. one or more engineered functional human IgG1 Fc domains with silent effector functions with a mutation in L234 and L235, numbering according to the EU system according to Kabat (see Johnson G. and Wu T.T. (2000) Nucleic Acids Res. 28, p. 214-218), for example with the L234A mutation and L235A.
Полипептид по настоящему изобретению может быть расположен ниже С-конца указанного дополнительного соединения, содержащего легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела, Fc-домен антитела, антитело или их комбинацию. Как альтернатива, полипептид по настоящему изобретению может быть расположен ниже N-конца указанного дополнительного соединения, содержащего легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела, Fc-домен антитела, антитело или их комбинацию.The polypeptide of the present invention may be located downstream of the C-terminus of said additional compound comprising an antibody light chain, an antibody heavy chain, an antibody Fc domain, an antibody, or a combination thereof. Alternatively, the polypeptide of the present invention may be located downstream of the N-terminus of said additional compound comprising an antibody light chain, an antibody heavy chain, an antibody Fc domain, an antibody, or a combination thereof.
- 9 042136- 9 042136
В случае если слитая конструкция по настоящему изобретению содержит полипептид по настоящему изобретению, слитый с антителом, - слитая конструкция по настоящему изобретению предпочтительно содержит две копии полипептида по настоящему изобретению. Две копии могут являться двумя копиями одного и того же полипептида по настоящему изобретению или разных полипептидов по настоящему изобретению и предпочтительно являются двумя копиями одного и того же полипептида по настоящему изобретению. Более предпочтительно, две копии полипептида по настоящему изобретению могут быть слиты с N-концом двух легких цепей антитела, С-концом двух легких цепей антитела, Nконцом двух тяжелых цепей антитела или С-концом двух тяжелых цепей антитела. Примеры финомеров, которые слиты с моноклональными антителами, что дает так называемые финомабы, которые обладают двойной специфичностью, и их получение подробно было описано, к примеру, в (например, Silacci et al, 2016, mAbs 8: 1, 141-149; Brack et al, 2014, Mol Cancer Ther 13(8): p. 2030-9; WO 2014/044758 A1; WO 2014/170063 A1; WO 2015/141862 A1).In case the fusion construct of the present invention contains a polypeptide of the present invention fused to an antibody, the fusion construct of the present invention preferably contains two copies of the polypeptide of the present invention. The two copies may be two copies of the same polypeptide of the present invention or different polypeptides of the present invention, and preferably are two copies of the same polypeptide of the present invention. More preferably, two copies of a polypeptide of the present invention may be fused to the N-terminus of two antibody light chains, the C-terminus of two antibody light chains, the N-terminus of two antibody heavy chains, or the C-terminus of two antibody heavy chains. Examples of finomers that are fused to monoclonal antibodies, giving rise to the so-called finomabs, which have dual specificity, and their production has been described in detail, for example, in (e.g., Silacci et al, 2016, mAbs 8: 1, 141-149; Brack et al, 2014, Mol Cancer Ther 13(8): p.2030-9; WO 2014/044758 A1; WO 2014/170063 A1; WO 2015/141862 A1).
Слитую конструкцию в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит полипептид по настоящему изобретению, слитый с антителом, можно получить ex vivo или in vitro путем сведения вместе в подходящих условиях тяжелых и легких цепей антитела, при этом следует отметить, что полипептид по настоящему изобретению слит по меньшей мере с одной из этих цепей. Специалист в данной области осведомлен о подходящих условиях. Такое сведение вместе в подходящих условиях обеспечивает нековалентную сборку, запускаемую взаимодействиями между легкими цепями антитела и тяжелыми цепями антитела. Предпочтительно, в такой конструкции по настоящему изобретению присутствуют дисульфидные связи, поскольку они повсеместно встречаются в антителах. Дисульфидные связи обычно присутствуют в непосредственной близости от шарнирной области и соединяют две тяжелые цепи и/или легкую цепь и тяжелую цепь. Например, такие конструкции можно получить путем стандартной рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих, а затем из этих клеток, как правило, секретируются интактные слитые белки по настоящему изобретению, содержащие интактные спаренные антитела.A fusion construct according to the present invention, which comprises a polypeptide of the present invention fused to an antibody, can be prepared ex vivo or in vitro by bringing together, under suitable conditions, heavy and light chains of an antibody, it being noted that the polypeptide of the present invention is fused at at least one of these chains. One skilled in the art is aware of suitable conditions. This bringing together under the right conditions provides for a non-covalent assembly triggered by interactions between antibody light chains and antibody heavy chains. Preferably, disulfide bonds are present in such a construct of the present invention, as they are ubiquitous in antibodies. Disulfide bonds are typically present in close proximity to the hinge region and link two heavy chains and/or a light chain and a heavy chain. For example, such constructs can be obtained by standard recombinant expression in mammalian cells, and then from these cells, as a rule, intact fused proteins of the present invention containing intact paired antibodies are secreted.
В соответствии с некоторыми неограничивающими вариантами осуществления второго аспекта настоящего изобретения антитело направлено к мишени, выбранной из группы, состоящей из GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, ВСМА, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, ЕРСАМ, TROP-2, B7H3 и СЕАСАМ-1.In accordance with some non-limiting embodiments of the second aspect of the present invention, the antibody is directed to a target selected from the group consisting of GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, BCMA, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, EPCAM, TROP-2, B7H3 and CEACAM-1.
Так, дополнительное соединение по настоящему изобретению также может содержать легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела или антитело, направленное против мишени, выбранной из группы, состоящей из GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, ВСМА, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, ЕРСАМ, TROP-2, B7H3 или СЕАСАМ-1.Thus, an additional compound of the present invention may also contain an antibody light chain, an antibody heavy chain, or an antibody directed against a target selected from the group consisting of GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR- 1, CD20, BAFF, BCMA, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, EPCAM, TROP-2, B7H3, or SEACAM-1.
Как рассмотрено в данном документе выше, сверхэкспрессия FGFR3 была задокументирована при нескольких типах рака. Также при нескольких типах рака была задокументирована сверхэкспрессия GM2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, ВСМА, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, ЕРСАМ, TROP-2, B7H3 и СЕАСАМ-1. По этой причине ожидают, что биспецифические слитые конструкции, способные связывать FGFR3b/3c в качестве первой мишени, а также в качестве второй мишени, которая представляет собой соединение, выбранное из GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, BCMA, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, EPCAM, TROP-2, B7H3 и СЕАСАМ-1, будут особенно пригодными для лечения рака и связанных с ним заболеваний.As discussed herein above, FGFR3 overexpression has been documented in several types of cancer. Also, overexpression of GM2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, BCMA, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, EPCAM, TROP-2, B7H3 and SEASAM-1. For this reason, it is expected that bispecific fusion constructs capable of binding FGFR3b/3c as a first target as well as a second target which is a compound selected from GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, BCMA, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, EPCAM, TROP-2, B7H3 and CEACAM-1 will be particularly useful in the treatment of cancer and related diseases.
Описанное в данном документе выше дополнительное соединение может быть либо непосредственно слито с полипептидом по настоящему изобретению, либо слито через линкер. Соответственно, полипептид может быть (непосредственно) слит, например, с С-концом дополнительного соединения, более конкретно путем образования пептидной связи между карбоксигруппой С-концевой аминокислоты и аминогруппой N-концевой аминокислоты, или может быть соединен с С-концом цепи дополнительного соединения через линкер.The additional compound described herein above can either be fused directly to the polypeptide of the present invention or fused through a linker. Accordingly, the polypeptide may be (directly) fused to, for example, the C-terminus of the complementary compound, more particularly by forming a peptide bond between the carboxyl group of the C-terminal amino acid and the amino group of the N-terminal amino acid, or may be joined to the C-terminus of the complementary compound chain via linker.
Подходящие линкеры доступны для специалиста в данной области техники. Линкер в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран, например, из группы, состоящей из алкила с 1-30 атомами углерода, полиэтиленгликоля с 1-20 этиленовыми группами, полиаланина с 1-20 остатками, капроновой кислоты, замещенного или незамещенного поли-п-фенилена и триазола. Предпочтение отдают пептидным линкерам, более конкретно олигопептидам, имеющим длину от 1 до 30 аминокислот. Предпочтительные диапазоны длин составляют от 5 до 15 аминокислот.Suitable linkers are available to those skilled in the art. The linker in accordance with the present invention may be selected, for example, from the group consisting of alkyl with 1-30 carbon atoms, polyethylene glycol with 1-20 ethylene groups, polyalanine with 1-20 residues, caproic acid, substituted or unsubstituted poly-p- phenylene and triazole. Preference is given to peptide linkers, more specifically oligopeptides, having a length of 1 to 30 amino acids. Preferred length ranges are 5 to 15 amino acids.
Особенно предпочтительными являются линкеры, которые представляют собой пептиды, которые состоят на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90 или 100% из небольших аминокислот, таких как глицин, серин и аланин. Особенно предпочтительными являются линкеры, состоящие только из глицинов и серинов. Неограничивающим примером подходящего линкера является линкер (G4S)3 (3 повтора Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).Particularly preferred are linkers which are peptides which consist of at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90 or 100% small amino acids, such as glycine, serine and alanine. Especially preferred are linkers consisting only of glycines and serines. A non-limiting example of a suitable linker is the (G 4 S) 3 (3 repeat Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) linker.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по настоящему изобретению, или слитую конструкцию по настоящему изобретению, или одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих слитую конструкцию по настоящему изобретению.In a third aspect, the present invention relates to a nucleic acid molecule encoding a polypeptide of the present invention, or a fusion construct of the present invention, or one or more nucleic acid molecules encoding a fusion construct of the present invention.
Одна или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих конструкцию по настоящему изо- 10 042136 бретению, могут представлять собой, например, две молекулы нуклеиновой кислоты, где одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует легкую цепь антитела, и другая молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь антитела. Как рассмотрено выше, полипептид по настоящему изобретению в этом случае можно слить либо с легкой, либо с тяжелой цепью на С-конце или N-конце.One or more nucleic acid molecules encoding a construct of the present invention may be, for example, two nucleic acid molecules, where one nucleic acid molecule encodes an antibody light chain and the other nucleic acid molecule encodes an antibody heavy chain. As discussed above, the polypeptide of the present invention in this case can be fused to either the light or heavy chain at the C-terminus or N-terminus.
Молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением включают ДНК, такую как cDNA, и mRNA, а также PNA. Дополнительно включены имитирующие нуклеиновую кислоту молекулы, известные в данной области техники, такие как синтетические или полусинтетические производные ДНК или РНК и смешанные полимеры, как смысловые, так и антисмысловые цепи. Они могут содержать дополнительные неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания, что будет совершенно понятно специалистам в данной области техники. В предпочтительных вариантах осуществления полинуклеотид или молекула(ы) нуклеиновой кислоты представляет/представляют собой ДНК. Такие имитирующие нуклеиновую кислоту молекулы или производные нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением включают фосфоротиоатную нуклеиновую кислоту, фосфорамидатную нуклеиновую кислоту, 2'-O-метоксиэтилрибонуклеиновую кислоту, морфолинонуклеиновую кислоту, гекситолнуклеиновую кислоту (HNA) и запертую нуклеиновую кислоту (LNA) (см., например, Braasch and Corey, Chemistry & Biology 8, 1-7 (2001)). LNA представляет собой производное РНК, в котором рибозное кольцо ограничено метиленовой связью между 2'-кислородом и 4'-углеродом.Nucleic acid molecules according to the present invention include DNA such as cDNA and mRNA as well as PNA. Further included are nucleic acid mimetic molecules known in the art, such as synthetic or semi-synthetic derivatives of DNA or RNA, and mixed polymers, both sense and antisense strands. They may contain additional non-natural or derivatized nucleotide bases, as will be readily understood by those skilled in the art. In preferred embodiments, the polynucleotide or nucleic acid molecule(s) is/are DNA. Such nucleic acid mimetic molecules or nucleic acid derivatives according to the present invention include phosphorothioate nucleic acid, phosphoramidate nucleic acid, 2'-O-methoxyethylribonucleic acid, morpholino nucleic acid, hexitol nucleic acid (HNA), and locked nucleic acid (LNA) (see, for example, Braasch and Corey, Chemistry & Biology 8, 1-7 (2001)). LNA is an RNA derivative in which the ribose ring is terminated by a methylene bond between the 2'-oxygen and the 4'-carbon.
В тех вариантах осуществления, где молекула нуклеиновой кислоты содержит (а не состоит из нее) указанную последовательность, по конкретной последовательности простираются дополнительные нуклеотиды либо на 5'-конце или 3'-конце, либо на обоих концах.In those embodiments where the nucleic acid molecule contains (and does not consist of) the indicated sequence, additional nucleotides extend along the particular sequence either at the 5' end or 3' end, or at both ends.
Дополнительные гетерологичные последовательности могут включать гетерологичные промоторы, которые функционально связаны с кодирующими последовательностями вышеупомянутых молекул. Следовательно, молекула нуклеиновой кислоты может быть функционально связана с промотором. Промоторы хорошо известны специалисту в данной области техники и повседневно используются в данной области техники. Неограничивающим примером является немедленно-ранний промотор CMV, который обычно управляет сильной экспрессией в клетках млекопитающих.Additional heterologous sequences may include heterologous promoters that are operably linked to the coding sequences of the aforementioned molecules. Therefore, a nucleic acid molecule can be operably linked to a promoter. Promoters are well known to the person skilled in the art and are routinely used in the art. A non-limiting example is the CMV immediate early promoter, which typically drives strong expression in mammalian cells.
Настоящее изобретение также относится к одному или нескольким векторам, содержащим одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, а также к одной или нескольким клеткам-хозяевам, содержащим одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или один или несколько векторов по настоящему изобретению.The present invention also relates to one or more vectors containing one or more nucleic acid molecules of the present invention, as well as one or more host cells containing one or more nucleic acid molecules of the present invention or one or more vectors of the present invention.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к клетке, предпочтительно выделенной клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или вектор по настоящему изобретению. Эту клетку также называют клеткой-хозяином.Additionally, the present invention relates to a cell, preferably an isolated cell, containing the nucleic acid molecule or vector of the present invention. This cell is also called the host cell.
Векторы и выделенные клетки, в частности клетки-хозяева, могут быть любого традиционного типа, который подходит для этой цели, например, для получения полипептидов, и/или слитых конструкций по настоящему изобретению, и/или терапевтически пригодных векторов и клеток-хозяев. Специалист в данной области техники сможет подобрать такие векторы и клетки-хозяева из уровня техники и подтвердить их особую пригодность для требуемого назначения с помощью стандартных способов и без излишних трудностей.The vectors and isolated cells, in particular host cells, may be of any conventional type suitable for this purpose, for example, for the production of polypeptides and/or fusion constructs of the present invention and/or therapeutically useful vectors and host cells. One of ordinary skill in the art will be able to select such vectors and host cells from the prior art and confirm their particular suitability for the desired purpose using standard methods and without undue difficulty.
Один или несколько векторов по настоящему изобретению содержат одну или несколько нуклеиновых кислот по настоящему изобретению и предпочтительно способны производить полипептид или слитый белок по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления такие векторы выбраны из группы, состоящей из векторов pQE, векторов рЕТ, векторов pFUSE, векторов pUC, векторов YAC, фагмидных векторов, фаговых векторов, векторов, применяемых для генной терапии, таких как ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы. Методики модификации векторов см. в Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Обычно векторы могут содержать одну или несколько точек начала репликации (ori) и систем наследования для клонирования или экспрессии, один или несколько маркеров для отбора у хозяина, например устойчивости к антибиотику, и одну или несколько кассет экспрессии. К подходящим точкам начала репликации (ori) относятся, например, точки начала репликации Col E1 вирусов SV40 и М13.One or more vectors of the present invention contain one or more nucleic acids of the present invention and are preferably capable of producing a polypeptide or fusion protein of the present invention. In certain embodiments, such vectors are selected from the group consisting of pQE vectors, pET vectors, pFUSE vectors, pUC vectors, YAC vectors, phagemid vectors, phage vectors, gene therapy vectors such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses. For vector modification techniques, see Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. In general, vectors may contain one or more origins of replication (ori) and inheritance systems for cloning or expression, one or more markers for host selection, such as antibiotic resistance, and one or more expression cassettes. Suitable origins of replication (ori) include, for example, Col E1 origins of SV40 and M13 viruses.
Одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также можно вставить в один или несколько векторов так, чтобы образовывалось трансляционное слияние с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Другая молекула нуклеиновой кислоты может, например, кодировать легкую и/или тяжелую цепь антитела и/или линкер, предпочтительные примеры которых описаны в данном документе выше.One or more nucleic acid molecules of the present invention can also be inserted into one or more vectors so that a translational fusion is formed with another nucleic acid molecule. Another nucleic acid molecule may, for example, encode an antibody light and/or heavy chain and/or a linker, preferred examples of which are described herein above.
Одну или несколько клеток-хозяев можно получить путем введения одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты или одного или нескольких векторов по настоящему изобретению в одну или несколько клеток-хозяев, которые при их наличии опосредуют экспрессию полипептидов, кодируемых указанными молекулами нуклеиновой кислоты или векторами. Клетки-хозяева предпочтительно представляют собой выделенные клетки-хозяева, что означает то, что клетки не находятся в среде живого организма. Хозяином может являться любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Подходящим эукариотическим хозяином может являться клетка млекопитающего, клетка амфибии, клетка рыбы,One or more host cells can be obtained by introducing one or more nucleic acid molecules or one or more vectors of the present invention into one or more host cells, which, if present, mediate the expression of polypeptides encoded by said nucleic acid molecules or vectors. The host cells are preferably isolated host cells, which means that the cells are not in the environment of a living organism. The host may be any prokaryotic or eukaryotic cell. A suitable eukaryotic host may be a mammalian cell, an amphibian cell, a fish cell,
- 11 042136 клетка насекомого, клетка гриба или клетка растения. Эукариотическая клетка может являться клеткой насекомого, такой как клетка Spodoptera frugiperda, клеткой дрожжей, такой как клетка Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris, клеткой гриба, такой как клетка Aspergillus, или клеткой позвоночного. В последнем случае предпочтительно, чтобы клетка представляла собой клетку млекопитающего, такую как, например, клетка человека, клетка хомяка или клетка обезьяны. Клетка может быть частью клеточной линии.- 11 042136 insect cell, fungus cell or plant cell. The eukaryotic cell may be an insect cell such as a Spodoptera frugiperda cell, a yeast cell such as a Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris cell, a fungal cell such as an Aspergillus cell, or a vertebrate cell. In the latter case, it is preferred that the cell is a mammalian cell, such as, for example, a human cell, a hamster cell or a monkey cell. The cell may be part of a cell line.
Подходящими примерами прокариот/бактерий являются обычно используемые для клонирования, такие как Е. coli (например, штаммы Е coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 и JM101).Suitable examples of prokaryotes/bacteria are commonly used for cloning, such as E. coli (eg E coli strains HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 and JM101).
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической или диагностической композиции, содержащей полипептид по настоящему изобретению, слитую конструкцию по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или любую их комбинацию.In a fourth aspect, the present invention provides a pharmaceutical or diagnostic composition comprising a polypeptide of the present invention, a fusion construct of the present invention, a nucleic acid molecule of the present invention, or any combination thereof.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно могут содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Под фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем подразумевают нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное средство для составления любого типа. Примеры фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей описаны, например, в Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999.The pharmaceutical compositions of the present invention may preferably contain a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. By pharmaceutically acceptable carrier or excipient is meant a non-toxic solid, semi-solid or liquid excipient, diluent, encapsulating material or formulation aid of any kind. Examples of pharmaceutically acceptable carriers or excipients are described, for example, in Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999.
Как более подробно рассмотрено в данном документе выше, FGFR3 вовлечен в патогенез многих заболеваний и, в частности, в патогенез рака. Соответственно, полипептид, слитая конструкция, молекула нуклеиновой кислоты, вектор по настоящему изобретению или любая их комбинация полезны в качестве лекарственного препарата. В указанной фармацевтической композиции полипептид, слитая конструкция, молекулы нуклеиновой кислоты, вектор по настоящему изобретению или любая их комбинация могут являться единственным активным средством, однако как альтернатива они также могут быть объединены с другими активными средствами, как например в комбинированных продуктах. Фармацевтическую композицию можно, к примеру, вводить млекопитающим, таким как домашние и ручные животные, мыши, крысы, кролики, нечеловекоподобные приматы и др. Предпочтительно ее вводят людям. Описанные в данном документе фармацевтические композиции будут вводить субъекту в подходящей дозе.As discussed in more detail herein above, FGFR3 has been implicated in the pathogenesis of many diseases and, in particular, in the pathogenesis of cancer. Accordingly, a polypeptide, fusion construct, nucleic acid molecule, vector of the present invention, or any combination thereof, is useful as a drug. In said pharmaceutical composition, the polypeptide, fusion construct, nucleic acid molecules, vector of the present invention, or any combination thereof, may be the sole active agent, however, as an alternative, they may also be combined with other active agents, such as in combination products. The pharmaceutical composition can, for example, be administered to mammals such as domestic and tame animals, mice, rats, rabbits, non-human primates, etc. It is preferably administered to humans. The pharmaceutical compositions described herein will be administered to a subject at a suitable dose.
Фармацевтическую композицию для применения в соответствии с настоящим изобретением можно составить традиционным образом в соответствии со способами, известными из уровня техники, с применением одного или нескольких физиологических носителей или наполнителей, см., например, Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. Соответственно, фармацевтическую композицию можно вводить перорально, парентерально, например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, интратекально, чрескожно, трансмукозально, субдурально, локально или местно с помощью ионофореза, сублингвально, посредством ингаляционного спрея, аэрозоля или ректально и т.д. в составах, разделенных на единицы дозирования, необязательно содержащих традиционные фармацевтически приемлемые наполнители. Также, диагностические композиции по настоящему изобретению можно изготовлять любым традиционным образом.A pharmaceutical composition for use in accordance with the present invention can be formulated in a conventional manner according to methods known in the art using one or more physiological carriers or excipients, see, for example, Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems , 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. Accordingly, the pharmaceutical composition may be administered orally, parenterally, e.g. inhalation spray, aerosol or rectally, etc. in dosage unit formulations, optionally containing conventional pharmaceutically acceptable excipients. Also, the diagnostic compositions of the present invention can be manufactured in any conventional manner.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в виде единственного активного ингредиента или в сочетании с другим активным ингредиентом, таким как иммунодепрессивные или иммуномодулирующие средства или другие противовоспалительные средства, например, для лечения или предупреждения упомянутых выше заболеваний. Например, полипептиды, слитые конструкции и конструкции по настоящему изобретению можно применять в комбинации с моноклональными антителами, например, моноклональными антителами с аффинностью к GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, BCMA, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, EPCAM, TROP-2, B7H3 или СЕАСАМ-1.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as the sole active ingredient or in combination with another active ingredient such as immunosuppressive or immunomodulatory agents or other anti-inflammatory agents, for example, to treat or prevent the diseases mentioned above. For example, the polypeptides, fusions, and constructs of the present invention may be used in combination with monoclonal antibodies, e.g., monoclonal antibodies with affinity for GM-2, CD38, ICAM-1, SLAMF7, CD45, CD40, CD74, IGFR-1, CD20, BAFF, BCMA, CD66, GRP78, CXCR4, EGFR, EPCAM, TROP-2, B7H3, or SEACAM-1.
Диагностическая композиция по настоящему изобретению полезна для выявления нежелательного физиологического уровня FGFR3, в частности из-за нежелательной сверхэкспрессии FGFR3. Указанное выявление обычно предусматривает приведение образца в контакт с полипептидом, слитой конструкцией, конструкцией, молекулой нуклеиновой кислоты, вектором, клеткой-хозяином по настоящему изобретению или любой их комбинацией и выявления наличия в образце FGFR3b и Зс, в частности FGFR3b и 3c с SEQ ID NO: 9 и 10. Соответственно, диагностическую композицию по настоящему изобретению можно применять для оценки начала или статуса заболевания и, в частности, рака или связанного с ним заболевания, ассоциированного со сверхэкспрессией FGRF3.The diagnostic composition of the present invention is useful in detecting an undesirable physiological level of FGFR3, in particular due to undesired overexpression of FGFR3. Said detection typically involves bringing the sample into contact with a polypeptide, fusion construct, construct, nucleic acid molecule, vector, host cell of the present invention, or any combination thereof, and detecting the presence of FGFR3b and 3c in the sample, in particular FGFR3b and 3c with SEQ ID NO : 9 and 10. Accordingly, the diagnostic composition of the present invention can be used to assess the onset or status of a disease, and in particular cancer or a related disease associated with FGRF3 overexpression.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, описанном в данном документе выше, полипептид по настоящему изобретению связан с флуоресцентным красителем, фотосенсибилизатором, радионуклидом или контрастным средством для медицинской визуализации. Такие слитые конструкции особенно подходят для диагностических путей применения. Это обусловлено тем, что FGFR3, например, сверхэкспрессируется при раке, так что меченный выявляемой меткой полипептид по настоящему изобретению можно применять для визуализации пораженного заболеванием участка организма, диагностируя таким образом наличие рака у субъекта.In one embodiment of the present invention described herein above, the polypeptide of the present invention is associated with a fluorescent dye, photosensitizer, radionuclide, or medical imaging contrast agent. Such fusion constructs are particularly suitable for diagnostic applications. This is because FGFR3, for example, is overexpressed in cancer, so that the detectably labeled polypeptide of the present invention can be used to image a diseased area of the body, thereby diagnosing the presence of cancer in a subject.
- 12 042136- 12 042136
Дозировка диагностических и фармацевтических композиций по настоящему изобретению будет варьировать в зависимости от конкретного полипептида, слитой конструкции, конструкции, одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, одного или нескольких векторов по настоящему изобретению или любой их комбинации, группы отдельных пациентов или пациента, необязательного наличия дополнительных активных с точки зрения диагностики или медицины соединений и природы и тяжести подлежащего диагностике или лечению заболевания. Как правило, диагностическую или фармацевтическую композицию применяют в дозировках от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг на килограмм веса тела, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мг на килограмм веса тела. Диагностические или фармацевтические композиции можно вводить более чем один раз, например, для отслеживания течения заболевания в случае диагностической композиции или для продления лечения в случае фармацевтической композиции. Например, частота введения диагностической или фармацевтической композиции может находиться в диапазоне от одного раза в сутки до приблизительно одного раза в 3 месяца, например, от приблизительно одного раза в 2 недели до приблизительно одного раза в 10 недель, например один раз в 4-8 недель. В определенных вариантах осуществления режим дозирования предусматривает введение диагностических или фармацевтических композиций по настоящему изобретению от одного раза в месяц до одного раза в 2-3 месяца или реже.The dosage of diagnostic and pharmaceutical compositions of the present invention will vary depending on the particular polypeptide, fusion construct, construct, one or more nucleic acid molecules, one or more vectors of the present invention, or any combination thereof, group of individual patients or patient, optional presence of additional active in terms of diagnosis or medicine of the compounds and the nature and severity of the disease to be diagnosed or treated. Typically, the diagnostic or pharmaceutical composition is administered at dosages of about 0.01 to about 20 mg per kilogram of body weight, such as about 0.1 to about 5 mg per kilogram of body weight. Diagnostic or pharmaceutical compositions may be administered more than once, for example to monitor the course of a disease in the case of a diagnostic composition or to prolong treatment in the case of a pharmaceutical composition. For example, the frequency of administration of the diagnostic or pharmaceutical composition may range from once a day to about once every 3 months, for example, from about once every 2 weeks to about once every 10 weeks, for example, once every 4-8 weeks. . In certain embodiments, the implementation of the dosing regimen provides for the introduction of diagnostic or pharmaceutical compositions of the present invention from once a month to once every 2-3 months or less.
В соответствии с определенными вариантами осуществления фармацевтическая или диагностическая композиция согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предназначена для применения в лечении рака или опосредованного Т-клетками заболевания.In accordance with certain embodiments, the pharmaceutical or diagnostic composition according to the fourth aspect of the present invention is for use in the treatment of cancer or a T cell mediated disease.
Как рассмотрено в данном документе выше, сообщалось о сверхэкспрессии FGFR3 при нескольких типах рака, так что эти фармацевтические или диагностические композиции особенно подходят для лечения и диагностики рака. Таким образом, рак предпочтительно представляет собой рак, при котором раковая клетка экспрессирует FGFR3 на своей поверхности, или рак, ассоциированный со сверхэкспрессией FGRF3.As discussed herein above, FGFR3 overexpression has been reported in several types of cancer, so that these pharmaceutical or diagnostic compositions are particularly suitable for the treatment and diagnosis of cancer. Thus, the cancer is preferably a cancer in which the cancer cell expresses FGFR3 on its surface, or a cancer associated with FGRF3 overexpression.
Вследствие известной роли экспрессии FGFR3 при раке, фармацевтическую или диагностическую композицию по настоящему изобретению также можно применять в лечении новообразований в целом, в том числе доброкачественных и злокачественных опухолей.Because of the known role of FGFR3 expression in cancer, the pharmaceutical or diagnostic composition of the present invention can also be used in the treatment of neoplasms in general, including benign and malignant tumors.
В US 2008/044419 сообщалось, что ингибирование активности FGFR3 является способом лечения опосредованных Т-клетками заболеваний, в частности опосредованных Т-клетками воспалительных и аутоиммунных заболеваний.US 2008/044419 reported that inhibition of FGFR3 activity is a method for treating T cell mediated diseases, in particular T cell mediated inflammatory and autoimmune diseases.
В соответствии с определенными вариантами осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения рак выбран из рака молочной железы, рака шейки матки, колоректального рака, эндометриального рака, глиомы, рака головы и шеи, рака печени, рака легкого, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака яичка и уротелиального рака.In accordance with certain embodiments of the fourth aspect of the present invention, the cancer is selected from breast cancer, cervical cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, skin cancer, testicular cancer and urothelial cancer.
В соответствии с Атласом белков человека (см. http://www.proteinatlas.org/ENSG00000068078FGFR3/cancer), экспрессия FGFR3 была обнаружена при следующих типах рака: раке молочной железы, раке шейки матки, колоректальном раке, эндометриальном раке, глиоме, раке головы и шеи, раке печени, раке легкого, раке яичника, раке поджелудочной железы, раке кожи, раке яичка и уротелиальном раке. Следовательно, можно ожидать, что экспрессия FGFR3 оказывает влияние при развитии этих типов рака.According to the Human Protein Atlas (see http://www.proteinatlas.org/ENSG00000068078FGFR3/cancer), FGFR3 expression has been found in the following types of cancer: breast cancer, cervical cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, glioma, cancer head and neck, liver cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, skin cancer, testicular cancer and urothelial cancer. Therefore, FGFR3 expression can be expected to have an impact in the development of these types of cancer.
В соответствии с определенными вариантами осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения рак выбран из множественной миеломы, рака мочевого пузыря, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, плоскоклеточного рака легкого и колоректального рака.In accordance with certain embodiments of the fourth aspect of the present invention, the cancer is selected from multiple myeloma, bladder cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, squamous cell lung cancer, and colorectal cancer.
Выше в данном документе было рассмотрено, что о сверхэкспрессии FGFR3 сообщалось при множественной миеломе, а также при раке мочевого пузыря. Экспрессия FGFR3 также задействована в раке шейки матки (Capellen et al., Nat Genet. 1999 Sep; 23(1): 18-20.), раке поджелудочной железы (Lafitte et al., Mol Cancer, 2013, 12: 83) и колоректальном раке (Sonvilla et al., Br J Cancer, 2010; 102(7):1145-1156). Более того, экспрессию FGFR3 наблюдали при плоскоклеточном раке легких (Liao et al (2013), Cancer Research, 73(16): 5195-5205).It was discussed above in this document that FGFR3 overexpression has been reported in multiple myeloma as well as in bladder cancer. FGFR3 expression is also involved in cervical cancer (Capellen et al., Nat Genet. 1999 Sep; 23(1): 18-20.), pancreatic cancer (Lafitte et al., Mol Cancer, 2013, 12: 83) and colorectal cancer (Sonvilla et al., Br J Cancer, 2010; 102(7):1145-1156). Moreover, FGFR3 expression has been observed in squamous cell lung cancer (Liao et al (2013), Cancer Research, 73(16): 5195-5205).
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения, опосредованное Т-клетками заболевание выбрано из ревматоидного артрита (RA), индуцированного коллагеном II артрита, рассеянного склероза (MS), системной красной волчанки (SLE), псориаза, ювенильного диабета, болезни Шегрена, заболевания щитовидной железы, саркоидоза, аутоиммунного увеита, воспалительного заболевания кишечника (болезни Крона и язвенного колита), целиакии и тяжелой миастении.According to some embodiments of the fourth aspect of the present invention, the T cell mediated disease is selected from rheumatoid arthritis (RA), collagen II induced arthritis, multiple sclerosis (MS), systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, juvenile diabetes, Sjögren's disease, thyroid disease, sarcoidosis, autoimmune uveitis, inflammatory bowel disease (Crohn's disease and ulcerative colitis), celiac disease, and myasthenia gravis.
Вышеперечисленные заболевания являются неограничивающими примерами конкретных опосредованных Т-клетками заболеваний, которые можно лечить путем ингибирования FGFR3.The above diseases are non-limiting examples of specific T-cell mediated diseases that can be treated by FGFR3 inhibition.
В данном описании упомянут ряд документов, в том числе патентные заявки и руководства пользователя от производителя. Раскрытие этих документов, при этом не считающихся релевантными в отношении патентоспособности настоящего изобретения, включено в данный документ посредством ссылки во всей его полноте. Более конкретно, все указанные в ссылках документы включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный документ был специально и отдельно указан, как включенный посредством ссылки.This description refers to a number of documents, including patent applications and user manuals from the manufacturer. The disclosure of these documents, while not considered relevant to the patentability of the present invention, is incorporated herein by reference in its entirety. More specifically, all referenced documents are incorporated by reference to the same extent as if each individual document were specifically and separately indicated as being incorporated by reference.
- 13 042136- 13 042136
Для всего настоящего изобретения термин включающий означает, что охватываются все перечисленные элементы. При использовании данного термина также могут присутствовать дополнительные, безымянные элементы. Таким образом, включающий может означать состоящий из (т.е. присутствуют только перечисленные элементы) или он может означать содержащий (т.е. также присутствуют другие элементы помимо всех перечисленных элементов). Так, полипептид, включающий SEQ ID NO: x, может либо состоять только из SEQ ID NO: x, либо может в других вариантах осуществления содержать дополнительные аминокислоты, как например в слитом белке, например, в вариантах осуществления, где SEQ ID NO: x слит с тяжелой или легкой цепью антитела.For the entire present invention, the term including means that all listed elements are covered. When using this term, additional, unnamed elements may also be present. Thus, including can mean consisting of (i.e., only the elements listed are present) or it can mean containing (i.e., other elements besides all of the listed elements are also present). Thus, a polypeptide comprising SEQ ID NO: x may either consist of only SEQ ID NO: x, or may in other embodiments contain additional amino acids, such as in a fusion protein, for example, in embodiments where SEQ ID NO: x fused to the heavy or light chain of the antibody.
Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понятны специалисту обычной квалификации в данной области, к которой относится настоящее изобретение. В случае противоречий патентное описание, в том числе определения, будет иметь преимущественную силу.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as would normally be understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. In the event of conflict, the patent specification, including definitions, shall prevail.
Что касается вариантов осуществления, охарактеризованных в данном описании, в частности в формуле изобретения, то предполагается, что каждый вариант осуществления, упомянутый в зависимом пункте формулы изобретения, объединен с каждым вариантом осуществления каждого пункта (независимого или зависимого) формулы изобретения, от которого зависит указанный зависимый пункт формулы изобретения. Например, в случае независимого пункта 1 формулы изобретения, в котором указаны 3 альтернативы А, В и С, в зависимом пункте 2 формулы изобретения, в котором указаны 3 альтернативы D, Е и F, и в пункте 3 формулы изобретения, который зависит от пунктов 1 и 2 формулы изобретения и в котором указаны 3 альтернативы G, H и I, следует понимать, что описание однозначно раскрывает варианты осуществления, соответствующие комбинациям A, D, G; A, D, Н; А, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; В, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, если конкретно не указано иное.With respect to the embodiments described in this specification, and in particular in the claims, it is intended that each embodiment mentioned in a dependent claim be combined with each embodiment of each claim (independent or dependent) on which said claim depends. dependent claim. For example, in the case of an independent claim 1 that specifies 3 alternatives A, B and C, a dependent claim 2 that specifies 3 alternatives D, E and F, and a claim 3 that depends on the claims 1 and 2 of the claims and in which 3 alternatives G, H and I are indicated, it should be understood that the description unambiguously discloses embodiments corresponding to combinations of A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, unless specifically stated otherwise.
Аналогично, а также в тех случаях, когда в независимых и/или зависимых пунктах формулы изобретения не указаны альтернативы, подразумевают, что если зависимые пункты формулы изобретения ссылаются на большинство предыдущих пунктов формулы изобретения, любая комбинация объекта изобретения, охватываемая ими, считается явно раскрытой. Например, в случае независимого пункта 1 формулы изобретения, зависимого пункта 2, ссылающегося на пункт 1, и зависимого пункта 3, ссылающегося на оба пункта 2 и 1 формулы изобретения, следует, что комбинация объекта изобретения согласно пунктам 3 и 1 является ясной и недвусмысленно раскрытой, как и комбинация объекта изобретения согласно пунктов 3, 2 и 1 формулы изобретения. В случае наличия дополнительного зависимого пункта 4 формулы изобретения, который ссылается на любой из пунктов 1-3, следует, что четко и однозначно раскрыта комбинация объекта изобретения согласно пунктам 4 и 1, пунктам 4, 2 и 1, пунктам 4, 3 и 1, а также пунктам 4, 3, 2 и 1 формулы изобретения.Similarly, and where alternatives are not indicated in the independent and/or dependent claims, it is understood that if the dependent claims refer to most of the preceding claims, any combination of subject matter covered by them is considered to be expressly disclosed. For example, in the case of independent claim 1, dependent claim 2 referring to claim 1, and dependent claim 3 referring to both claims 2 and 1, it follows that the combination of the subject matter of claims 3 and 1 is clear and unambiguously disclosed , as well as the combination of the object of the invention according to paragraphs 3, 2 and 1 of the claims. If there is an additional dependent claim 4 of the claims that refers to any of claims 1-3, it follows that the combination of the subject matter of the invention according to clauses 4 and 1, clauses 4, 2 and 1, clauses 4, 3 and 1 is clearly and unambiguously disclosed, as well as paragraphs 4, 3, 2 and 1 of the claims.
Приведенные выше соображения с соответствующими поправками применимы ко всем прилагаемым пунктам формулы изобретения.The above considerations, mutatis mutandis, apply to all appended claims.
На фигурах показано.The figures are shown.
Фиг. 1 - выравнивание финомеров, связывающих FGFR3, из SEQ ID NO: 3-8.Fig. 1 - Alignment of FGFR3 binding finomers from SEQ ID NOs: 3-8.
Фиг. 2 - свойства интернализации финомеров, связывающих FGFR3.Fig. 2 - internalization properties of finomers binding FGFR3.
Фиг. 3 - графики эксклюзионной хроматографии по размеру для Fyn SH3-производных FGFR3связывающих полипептидов: A) FF2L4C3 -SEQ ID NO: 3; В) FF44L65G12 - SEQ ID NO: 4; С) FF44L65G7 - SEQ ID NO: 5; D) FF48L66G7 - SEQ ID NO: 6; E) FF43L65D5 - SEQ ID NO: 7; F) FF44L65B7 - SEQ ID NO: 8.Fig. 3 is size exclusion chromatography plots for Fyn SH3-derived FGFR3 binding polypeptides: A) FF2L4C3 - SEQ ID NO: 3; B) FF44L65G12 - SEQ ID NO: 4; C) FF44L65G7 - SEQ ID NO: 5; D) FF48L66G7 - SEQ ID NO: 6; E) FF43L65D5 - SEQ ID NO: 7; F) FF44L65B7 - SEQ ID NO: 8.
Фиг. 4 - FACS-связывание Fyn SH3-производных полипептидов, связывающихся с FGFR3, с: А) FGFR3-положительными клетками KMS-11 и В) FGFR3-отрицательными клетками N87.Fig. 4 - FACS binding of Fyn SH3 derived FGFR3 binding polypeptides to: A) FGFR3 positive KMS-11 cells and B) FGFR3 negative N87 cells.
Фиг. 5 - ELISA в отношении специфичности для Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов: A) FF2L4C3 - SEQ ID NO: 3; В) FF44L65G12 - SEQ ID NO: 4; С) FF44L65G7 - SEQ ID NO: 5; D) FF48L66G7 - SEQ ID NO: 6; E) FF43L65D5 - SEQ ID NO: 7; F) FF44L65B7 - SEQ ID NO: 8. Протестированные антигены: huFGFR3b=сплайс-вариант b FGFR3 человека; huFGFR3c=сплайс-вариант с FGFR3 человека; cyFGFR3c=сплайс-вариант с FGFR3 яванского макака; muFGFR3c=сплайс-вариант с мышиного FGFR3; huFGFR3-D1=домен 1 FGFR3 человека; huFGFR3-D2=домен 2 FGFR3 человека; huFGFR3D1D2=домен 1 и домен 2 FGFR3 человека; IgG=смесь поликлональных IgG человека; PBS=фосфатносолевой буферный раствор.Fig. 5 - ELISA for specificity for Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides: A) FF2L4C3 - SEQ ID NO: 3; B) FF44L65G12 - SEQ ID NO: 4; C) FF44L65G7 - SEQ ID NO: 5; D) FF48L66G7 - SEQ ID NO: 6; E) FF43L65D5 - SEQ ID NO: 7; F) FF44L65B7 - SEQ ID NO: 8. Antigens tested: huFGFR3b = human FGFR3 splice variant b; huFGFR3c=splice variant with human FGFR3; cyFGFR3c=splice variant with cynomolgus FGFR3; muFGFR3c=splice variant from mouse FGFR3; huFGFR3-D1=human FGFR3 domain 1; huFGFR3-D2=human FGFR3 domain 2; huFGFR3D1D2=domain 1 and domain 2 of human FGFR3; IgG=mixture of polyclonal human IgG; PBS=phosphate buffered saline solution.
Фиг. 6 - анализ интернализации, демонстрирующий цитотоксический эффект Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов.Fig. 6 is an internalization assay demonstrating the cytotoxic effect of Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides.
Настоящее изобретение иллюстрируют примеры.The present invention is illustrated by examples.
Пример 1. Fyn SH3-производные полипептиды, связывающиеся с FGFR3b и FGFR3c.Example 1 Fyn SH3 Derived Polypeptides Binding to FGFR3b and FGFR3c.
Для возможности целенаправленного воздействия на FGFR3 была предпринята попытка получить конкретные Fyn SH3-производные связывающие молекулы к ним. Поскольку распределение и экспрессия двух разных сплайс-вариантов (FGFR3b и FGFR3c) на разных опухолевых клетках до конца не изучены, важно, чтобы Fyn SH3-производные полипептиды могли связывать их оба.In order to be able to target FGFR3, an attempt was made to obtain specific Fyn SH3-derived binding molecules to them. Since the distribution and expression of two different splice variants (FGFR3b and FGFR3c) on different tumor cells is not fully understood, it is important that Fyn SH3-derived polypeptides can bind them both.
С применением рекомбинантного FGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12) и FGFR3c-Fc человека (SEQ ID NO:Using recombinant human FGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12) and human FGFR3c-Fc (SEQ ID NO:
- 14 042136- 14 042136
13) в качестве мишеней, успешно были отобраны и выделены несколько семейств Fyn SH3-производных связывающих белков, которые были способны связываться с обоими сплайс-вариантами FGFR3 человека (SEQ ID NO: 9 и 10). Дальнейшие исследования продолжали с наиболее перспективным семействомкандидатом.13) as targets, several families of Fyn SH3-derived binding proteins were successfully selected and isolated that were able to bind to both splice variants of human FGFR3 (SEQ ID NOS: 9 and 10). Further studies continued with the most promising candidate family.
Интересно то, что Fyn SH3-производный полипептид, также называемый FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3), несущий последовательность RT-петли EVYGPTP (SEQ ID NO: 2), увеличивался в содержании в процессе отбора и демонстрировал наиболее перспективные свойства интернализации среди 29 протестированных финомеров, связывающих FGFR3 (см. фиг. 2). Более подробно, 5 других семейств последовательностей были исключены из дальнейшего анализа. Финомеры, принадлежащие к наиболее перспективному семейству последовательностей, демонстрировали наилучшие значения аффинности и свойства интернализации.Interestingly, the Fyn SH3-derived polypeptide, also referred to as FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3), bearing the RT-loop sequence of EVYGPTP (SEQ ID NO: 2), increased in abundance during selection and showed the most promising internalization properties among the 29 tested finomers that bind FGFR3 (see Fig. 2). In more detail, 5 other sequence families were excluded from further analysis. Finomers belonging to the most promising family of sequences showed the best affinity values and internalization properties.
Для получения Fyn SH3-производных связывающихся с FGFR3 молекул с более высокими значениями аффинности и улучшенными свойствами интернализации использовали FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3) в качестве матрицы для созревания аффинности. Последовательность RT-петли EVYGPTP (SEQ ID NO: 2) сохраняли неизменной и объединяли с рандомизированным репертуаром n-src-петель (где отрезок из 4-6 рандомизированных аминокислотных остатков был введен в положения от (X1) до (X4) в SEQ ID NO: 1). Процесс создания библиотеки для созревания аффинности был фактически таким же, как описано для клонирования не подвергавшейся воздействию библиотеки с рандомизированной n-src-петлей (библиотека 0, которая описана в [25]).To obtain Fyn SH3 derivatives of FGFR3 binding molecules with higher affinity values and improved internalization properties, FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3) was used as an affinity maturation template. The sequence of the RT loop of EVYGPTP (SEQ ID NO: 2) was kept unchanged and combined with a randomized repertoire of n-src loops (where a stretch of 4-6 randomized amino acid residues was introduced at positions (X 1 ) to (X 4 ) in SEQ ID NO: 1). The process for creating a library for affinity maturation was essentially the same as described for cloning an unaffected library with a randomized n-src loop (library 0, which is described in [25]).
После отборов не подвергавшихся воздействию молекул и молекул для созревания аффинности увеличенные в содержании Fyn SH3-производные полипептиды подвергали скринингу на связывание с FGFR3 с помощью ELISA лизата. ДНК, кодирующие Fyn SH3-производные связывающие белки, клонировали в бактериальный вектор экспрессии pQE12 (Qiagen) так, чтобы полученные конструкции несли Сконцевую myc-гексагистидиновую метку, как описано в Grabulovski et al. [26]. Полипептиды экспрессировались в цитозоле бактерий E.coli в 96-луночном формате, и 200 мкл осветленного лизата на лунку получали так, как описано в Bertschinger et al. [27]. Вкратце, трансформированные бактериальные колонии брали из чашки с агаром и выращивали в круглодонном 96-луночном планшете (Nunc, кат. № 163320) в 200 мкл среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% (вес./об.) глюкозы. Экспрессию белка индуцировали после роста в течение 3 ч при 37°C и вихревом встряхивания на 200 об/мин, путем добавления 1 мМ IPTG (Applichem, Германия). Белки экспрессировались в течение ночи на роторном шейкере (200 об/мин., 30°C). Затем 96-луночный планшет центрифугировали при 1800 g в течение 10 мин. и удаляли надосадочную жидкость. Бактериальные осадки лизировали с помощью BugBuster® плюс Benzonase® (Millipore 70750-3), а затем лизаты осветляли центрифугированием в течение 10 мин. при 1800xg. Смешивали 60 мкл лизата со 170 мкл PBS и фильтровали через фильтровальную пластину Multiscreen с размером пор 0,45 мкм (Millipore MSHVN4510) для удаления какого-либо оставшегося бактериального дебриса.After selections for naive and affinity maturation molecules, the Fyn-enhanced SH3-derived polypeptides were screened for FGFR3 binding by a lysate ELISA. DNA encoding Fyn SH3-derived binding proteins were cloned into the bacterial expression vector pQE12 (Qiagen) such that the resulting constructs carried the C-terminal myc-hexahistidine tag as described in Grabulovski et al. [26]. The polypeptides were expressed in the cytosol of E. coli bacteria in a 96-well format, and 200 μl of clarified lysate per well was prepared as described in Bertschinger et al. [27]. Briefly, transformed bacterial colonies were taken from an agar plate and grown in a round bottom 96-well plate (Nunc, cat. no. 163320) in 200 µl of 2xYT medium containing 100 µg/ml ampicillin and 0.1% (w/v) glucose. Protein expression was induced after growth for 3 h at 37°C and vortexing at 200 rpm by adding 1 mM IPTG (Applichem, Germany). Proteins were expressed overnight on a rotary shaker (200 rpm, 30°C). The 96-well plate was then centrifuged at 1800 g for 10 minutes. and the supernatant was removed. Bacterial pellets were lysed with BugBuster® plus Benzonase® (Millipore 70750-3) and then the lysates were clarified by centrifugation for 10 minutes. at 1800xg. Mix 60 µl of lysate with 170 µl of PBS and filter through a 0.45 µm Multiscreen filter plate (Millipore MSHVN4510) to remove any remaining bacterial debris.
Лизаты из моноклональных бактерий использовали для ELISA. Для ELISA на планшеты Maxisorp наносили покрытие в течение ночи посредством либо 5 мкг/мл huFGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12), 5 мкг/мл huFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 13), либо 5 мкг/мл поли-IgG и блокировали в течение по меньшей мере 1 ч. посредством 2% MPBS. Осветленные лизаты, содержащие растворимый финомер с С-концевой меткой myc и гексагистидиновой пептидной меткой, вносили в 2% MPBS, содержащий мышиное моноклональное антитело к метке myc, клон 9Е10 (Roche Applied Science 11 667 203 001), в планшеты Maxisorp. Связанный финомер выявляли посредством 9Е10 с помощью конъюгата пероксидазы хрена и антитела лошади к IgG мыши (Sigma-Aldrich A2554). Выявление активности пероксидазы осуществляли добавлением субстрата ВМ blue POD (Roche), и реакцию останавливали добавлением 1 М H2SO4.Lysates from monoclonal bacteria were used for ELISA. For ELISA, Maxisorp plates were coated overnight with either 5 μg/ml huFGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12), 5 μg/ml huFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 13), or 5 μg/ml poly-IgG and blocked for at least 1 hour with 2% MPBS. Clarified lysates containing a soluble finomer with a myc C-terminal tag and a hexahistidine peptide tag were loaded into 2% MPBS containing a mouse anti-myc monoclonal antibody, clone 9E10 (Roche Applied Science 11 667 203 001), in Maxisorp plates. Bound finomer was detected by 9E10 with horseradish peroxidase conjugate and horse anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich A2554). Peroxidase activity was detected by adding BM blue POD substrate (Roche) and the reaction was stopped by adding 1 M H 2 SO 4 .
Последовательность ДНК специфических связывающих молекул подтверждали секвенированием ДНК.The DNA sequence of specific binding molecules was confirmed by DNA sequencing.
Результаты.Results.
Аминокислотные последовательности положительных по результатам ELISA предпочтительных Fyn SH3-производных полипептидов, связывающихся с FGFR3b и FGFR3c, представлены под SEQ ID NO: 3-8, которые прилагаются в перечне последовательностей. Fyn SH3-производные полипептиды SEQ ID NO: 4-8 были следствием отбора связывающих молекул из большого пула молекул, которые были получены после созревания аффинности FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3), и представлены в данном примере изза их улучшенных значений аффинности и свойств интернализации (как показано в примерах 2 и 5).The amino acid sequences of the ELISA-positive Fyn SH3-derived FGFR3b and FGFR3c-binding polypeptides are shown under SEQ ID NOs: 3-8, which are appended in the sequence listing. The Fyn SH3-derived polypeptides of SEQ ID NO: 4-8 were the result of a selection of binding molecules from a large pool of molecules that were generated after affinity maturation of FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3) and are presented in this example due to their improved affinity values and internalization properties. (as shown in examples 2 and 5).
Более подробно, для более чем 80 финомеров, полученных из SEQ ID NO: 3, проводили анализ характеристик в отношении их биофизических свойств, значений аффинности и свойств интернализации. SEQ ID NO: 4-8 являлись связывающими молекулами с наилучшим набором свойств с точки зрения биофизики, аффинности и интернализации.In more detail, more than 80 finomers derived from SEQ ID NO: 3 were subjected to a characterization analysis with respect to their biophysical properties, affinity values, and internalization properties. SEQ ID NO: 4-8 were binding molecules with the best set of properties in terms of biophysics, affinity and internalization.
Пример 2. Экспрессия Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов по настоящему изобретению.Example 2 Expression of Fyn SH3 Derived FGFR3 Binding Polypeptides of the Invention.
В данном примере показаны выходы в результате экспрессии предпочтительных Fyn SH3- 15 042136 производных FGFR3-связывающих полипептидов и результаты анализа характеристик этих полипептидов с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру.This example shows the expression yields of the preferred Fyn SH3-15 042136 derived FGFR3 binding polypeptides and the results of characterization of these polypeptides by size exclusion chromatography.
Способы.Ways.
а) Выходы в результате экспрессии Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов.a) Expression yields of Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides.
Fyn SH3-производные FGFR3-связывающие полипептиды экспрессировали в цитозоле бактерий TGI E.coli и очищали так, как описано у Grabulovski et al. [2].Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides were expressed in the cytosol of E. coli TGI bacteria and purified as described in Grabulovski et al. [2].
b) Эксклюзионная хроматография по размеру (SEC).b) Size exclusion chromatography (SEC).
Образцы анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру (TOSOH TSKgel PW G3000PWxL; Agilent 1260 Infinity HPLC; подвижная фаза: PBS, pH 7,4). 10 мкл неразбавленного образца вводили инъекцией в колонку и анализировали полученные профили.Samples were analyzed by size exclusion chromatography (TOSOH TSKgel PW G3000PWxL; Agilent 1260 Infinity HPLC; mobile phase: PBS, pH 7.4). 10 μl of the undiluted sample was injected into the column and the resulting profiles were analyzed.
Результаты.Results.
а) Выходы экспрессии.a) Expression outputs.
Выходы экспрессии для мономерных Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов по настоящему изобретению варьировали в диапазоне от 15 до 51 мг/литр бактериальной культуры в неоптимизированных условиях во встряхиваемых колбах (табл. 1) и находились в типичном диапазоне для полученного из SH3 Fyn полипептида.Expression yields for the monomeric Fyn SH3 derived FGFR3 binding polypeptides of the present invention ranged from 15 to 51 mg/liter bacterial culture under non-optimized shake flask conditions (Table 1) and were in the typical range for the SH3 derived Fyn polypeptide.
Таблица 1. Выходы экспрессии Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов, полученных в бактериях TGI E.coliTable 1. Expression yields of Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides produced in E. coli TGI bacteria
b) Эксклюзионная хроматография по размеру (SEC).b) Size exclusion chromatography (SEC).
Профили эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) продемонстрировали, что все конструкции элюировались преимущественно в виде одиночных мономерных пиков (фиг. 3). Обычно это свидетельствовало о хороших биофизических свойствах, что является преимуществом с точки зрения производства финомеров (Fyn SH3-производных связывающих молекул, в том числе финомабов, которые представляют собой слитые белки с антителами), и согласовывалось с более ранними наблюдениями для Fyn SH3-производных молекул.Size exclusion chromatography (SEC) profiles demonstrated that all constructs eluted predominantly as single monomeric peaks (FIG. 3). This generally indicated good biophysical properties, which is an advantage in terms of the production of finomers (Fyn SH3-derived binding molecules, including finomabs, which are fusion proteins with antibodies), and was consistent with earlier observations for Fyn SH3-derived molecules. .
Пример 3. Fyn SH3-производные полипептиды по настоящему изобретению связываются с FGFR3b и FGFR3c человека с высокими значениями аффинности.Example 3 The Fyn SH3 derived polypeptides of the present invention bind to human FGFR3b and FGFR3c with high affinities.
В данном примере показан анализ характеристик предпочтительных Fyn SH3-производных FGFR3связывающих полипептидов с помощью экспериментов с поверхностным плазмонным резонансом и проточной цитометрией.This example shows characterization of preferred Fyn SH3-derived FGFR3 binding polypeptides using surface plasmon resonance and flow cytometry experiments.
Способы.Ways.
а) Измерения аффинности с помощью BIAcore.a) Affinity measurements using BIAcore.
Значения аффинности измеряли с помощью устройства BIAcore Т200. Одну проточную ячейку на чипе S серии СМ5 (GE Healthcare BR-1005-30) покрывали антителом 9Е10 к тус (Roche 1166203001; плотность покрытия в диапазоне от 6000 до 8000 RU) с помощью набора для аминного связывания (GE Healthcare BR100633).Affinity values were measured using a BIAcore T200 device. One flow cell on a CM5 series S chip (GE Healthcare BR-1005-30) was coated with 9E10 anti-myc antibody (Roche 1166203001; coating density ranging from 6000 to 8000 RU) using an amine coupling kit (GE Healthcare BR100633).
Исходный финомер FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3) в концентрации 500 нМ и финомеры с SEQ ID NO: 4-8 в концентрации 100 нМ захватывали на поверхности 9Е10 с последующими инъекциями различных концентраций huFGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12), huFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 13) или cynoFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 14) (0 нМ, 3,9 нМ, 7,8 нМ, 15,6 нМ, 31,25 нМ, 62,5 нМ, 125 нМ, 250 нМ и 500 нМ для измерений исходного финомера FF2L4C3, 0 нМ, 0,046 нМ, 0,14 нМ, 0,41 нМ, 1,2 нМ, 3,7 нМ, 11,1 нМ, 33,3 нМ и 100 нМ для финомеров с SEQ ID NO: 4-8). Регистрировали сенсограммы, и кажущиеся константы кинетики определяли путем подбора аппроксимирующей кривой с использованием модели взаимодействия Ленгмюра 1.1 в программном обеспечении BIAevaluation 2.1.The original finomer FF2L4C3 (SEQ ID NO: 3) at a concentration of 500 nM and finomers with SEQ ID NO: 4-8 at a concentration of 100 nM were captured on the surface of 9E10, followed by injections of various concentrations of huFGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12), huFGFR3c- Fc (SEQ ID NO: 13) or cynoFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 14) (0 nM, 3.9 nM, 7.8 nM, 15.6 nM, 31.25 nM, 62.5 nM, 125 nM , 250 nM and 500 nM for measurements of the parent finomer FF2L4C3, 0 nM, 0.046 nM, 0.14 nM, 0.41 nM, 1.2 nM, 3.7 nM, 11.1 nM, 33.3 nM and 100 nM for finomers with SEQ ID NO: 4-8). Sensorgrams were recorded and apparent kinetic constants were determined by fitting a curve fitting using the Langmuir interaction model 1.1 in BIAevaluation 2.1 software.
b) Измерения аффинности с помощью проточной цитометрии.b) Affinity measurements by flow cytometry.
Связывание финомеров с huFGFR3 на клетках анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием клеток KMS-11 (JCRB1179) в качестве FGFR3-положительных клеток и N87 (АТСС, CRL-5822) в качестве контрольной линии FGFR3-отрицательных клеток. Клетки как KMS-11, так и N87 поддерживали в среде RPMI 1640 (Invitrogen 52400-25). Все среды дополняли 25 ед./мл пенициллина, 25 мкг/мл стрептомицина и 10% FCS. Для сбора наполовину прикрепившихся клеток KMS-11 из колбы Т150 надосадочную жидкость забирали в пробирку Falcon объемом 50 мл, и клетки промывали посредством 10 мл PBS, который также добавляли в пробирку Falcon. В колбу вносили 2 мл аккутазы (SigmaThe binding of finomers to huFGFR3 on cells was analyzed by flow cytometry using KMS-11 (JCRB1179) cells as FGFR3 positive cells and N87 (ATCC, CRL-5822) as a control FGFR3 negative cell line. Both KMS-11 and N87 cells were maintained in RPMI 1640 medium (Invitrogen 52400-25). All media were supplemented with 25 U/ml penicillin, 25 μg/ml streptomycin and 10% FCS. To collect semi-adherent KMS-11 cells from the T150 flask, the supernatant was withdrawn into a 50 ml Falcon tube and the cells were washed with 10 ml PBS, which was also added to the Falcon tube. 2 ml of accutase (Sigma
- 16042136- 16042136
A6964) и инкубировали в течение 10 мин. при 37°С. Аккутазу инактивировали добавлением 10 мл среды и вносили в пробирку Falcon, которую затем центрифугировали (250xg, 5 мин.) для осаждения клеток. Клетки ресуспендировали в буфере для FACS (PBS+1% FCS+0,2% азида натрия) до концентрации клеток 1x106 клеток/мл и использовали 100 мкл на лунку (1x105 клеток/лунка) для окрашивания при проточной цитометрии в 96-луночном круглодонном планшете (Nunc 163320). В случае прикрепившихся клеток N87 забирали надосадочную жидкость и смыв, и собирали и получали только клетки, открепленные с помощью аккутазы.A6964) and incubated for 10 min. at 37°C. Accutase was inactivated by adding 10 ml of medium and added to a Falcon tube which was then centrifuged (250xg, 5 min.) to pellet the cells. Cells were resuspended in FACS buffer (PBS+1% FCS+0.2% sodium azide) to a cell concentration of 1x106 cells/ml and used 100 µl per well (1x105 cells/well) for flow cytometry staining in a 96-well round bottom plate (Nunc 163320). In the case of adherent N87 cells, the supernatant and lavage were collected and only cells detached with accutase were harvested.
Финомеры совместно инкубировали с антителом мыши к тус (клон 9Е10; Roche 11667149001) для обеспечения сшивания меченых посредством тус финомеров перед связыванием с клетками. Финомеры разбавляли до 1 мкМ и совместно инкубировали с 667 нМ антитела 9Е10 к тус (молярное соотношение 3:2) в буфере для FACS в течение примерно 10 мин на льду.The finomers were co-incubated with a mouse anti-myc antibody (clone 9E10; Roche 11667149001) to allow cross-linking of the tyc-labeled finomers prior to cell binding. The finomers were diluted to 1 μM and co-incubated with 667 nM anti-myc antibody 9E10 (3:2 molar ratio) in FACS buffer for about 10 minutes on ice.
Эту смесь серийно разбавляли 1 к 4 до концентрации финомеров 0,06 нМ (всего 8 концентраций). Контроли включали только вторичное антитело 9Е10 (без финомера; 667 нМ 9Е10), только клетки (только буфер для FACS) и антитело к FGFR3 (R&D systems; кат. № МАВ766) в концентрации 10 нМ. Клетки центрифугировали в 96-луночном планшете (250 мкг, 5 мин.) и ресуспендировали с указанными выше образцами перед инкубацией на льду в течение 1 ч. Планшет центрифугировали и промывали (PBS+0,2% азида натрия) перед повторным центрифугированием. Затем 50 мкл вторичного антитела к mlgG с Alexa488 (Life Technologies А21202) добавляли к клеткам в концентрации 4 мкг/мл перед инкубацией в темноте на льду в течение 45 мин. Планшет центрифугировали и дважды промывали PBS+0,2% азида натрия перед ресуспендированием в буфере для FACS и FACS-анализом (Millipore Guava easyCyte 8НТ).This mixture was serially diluted 1:4 to a finomer concentration of 0.06 nM (8 concentrations in total). Controls included 9E10 secondary antibody only (no finomer; 667 nM 9E10), cells only (FACS buffer only), and anti-FGFR3 antibody (R&D systems; cat. no. MAB766) at 10 nM. Cells were centrifuged in a 96-well plate (250 μg, 5 min) and resuspended with the above samples before incubation on ice for 1 hour. The plate was centrifuged and washed (PBS+0.2% sodium azide) before centrifuging again. Then, 50 μl of an anti-mlgG secondary antibody with Alexa488 (Life Technologies A21202) was added to the cells at a concentration of 4 μg/ml before incubation in the dark on ice for 45 minutes. The plate was centrifuged and washed twice with PBS+0.2% sodium azide before resuspension in FACS buffer and FACS analysis (Millipore Guava easyCyte 8HT).
Анализ данных FACS проводили с помощью Prism 6. Данные преобразовывали (X=logX) и анализировали с помощью нелинейной аппроксимации log(aroHHCT) относительно ответа - переменный угловой коэффициент (4 параметра).Analysis of FACS data was performed using Prism 6. Data were transformed (X=logX) and analyzed using a non-linear fit of log(aroHHCT) with respect to response - variable slope (4 parameters).
Результаты.Results.
а) Измерения аффинности с помощью BIAcore.a) Affinity measurements using BIAcore.
Свойства связывания анализировали с помощью анализа взаимодействий в режиме реального времени на чипе BIАсоге с выявлением следующих констант диссоциации (KD) для выбранных FGFR3связывающих полипептидов.Binding properties were analyzed by real-time interaction analysis on a BIAcoge chip, revealing the following dissociation constants (KD) for selected FGFR3 binding polypeptides.
Таблица 2. Кажущиеся константы кинетики связывания Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов с рекомбинантными FGFR3b человека, FGFR3c человека и FGFR3c яванского макакаTable 2 Apparent binding kinetic constants of Fyn SH3-derived FGFR3 binding polypeptides to recombinant human FGFR3b, human FGFR3c, and cynomolgus FGFR3c
Измеренные кажущиеся значения аффинности (табл. 2) Fyn SH3-производных полипептидов (SEQ ID NO: 3-8), связывающихся с FGFR3b и FGFR3c (SEQ ID NO: 9 и 10), были на удивление высокими, если учитывать тот факт, что субнаномолярные значения были получены лишь после одного цикла созревания аффинности. Более того, эти результаты измерений подтверждали сравнимые свойства связывания у Fyn SH3-производных полипептидов (SEQ ID NO: 3-8) с обеими человеческими изоформами FGFR3 (FGFR3b и FGFR3c; SEQ ID NO: 9 и 10), и с FGFR3c яванского макака (связывание с FGFR3b яванского макака не тестировали).The measured apparent affinities (Table 2) of the Fyn SH3-derived polypeptides (SEQ ID NOs: 3-8) binding to FGFR3b and FGFR3c (SEQ ID NOs: 9 and 10) were surprisingly high considering the fact that subnanomolar values were obtained after only one cycle of affinity maturation. Moreover, these measurement results confirmed comparable binding properties of Fyn SH3-derived polypeptides (SEQ ID NOs: 3-8) to both human FGFR3 isoforms (FGFR3b and FGFR3c; SEQ ID NOs: 9 and 10), and to cynomolgus monkey FGFR3c ( binding to cynomolgus monkey FGFR3b was not tested).
Ь) Измерения аффинности с помощью проточной цитометрии.b) Affinity measurements by flow cytometry.
Свойства связывания анализировали с помощью проточной цитометрии с применением FGFR3положительных клеток KMS-11 и FGFR3-отрицательных клеток N87 в качестве отрицательного контроля. Приведенные далее значения ЕС50 для избранных FGFR3-связывающих полипептидов измеряли так, как показано в табл. 3 и на фиг. 4.Binding properties were analyzed by flow cytometry using FGFR3 positive KMS-11 cells and FGFR3 negative N87 cells as a negative control. The following EC50 values for selected FGFR3 binding polypeptides were measured as shown in Table 1. 3 and in FIG. 4.
- 17 042136- 17 042136
Таблица 3. Значения ЕС50, определенные на FGFR3-положительных клетках KMS-11 для Fyn 8Н3-производныхTable 3. EC50 values determined on FGFR3-positive KMS-11 cells for Fyn 8H3-derivatives
FGFR3-связыβающих полипептидовFGFR3-binding β polypeptides
Значения ЕС50 в низком наномолярном диапазоне (табл. 3), измеренные на линии клеток, экспрессирующих FGFR3 (фиг. 4А, KMS-11), подтверждали высокие значения кажущейся аффинности, измеренные с помощью поверхностного плазмонного резонанса (табл. 2), и демонстрировали связывания с FGFR3 в природном контексте клеточной поверхности. Все Fyn SH3-производные полипептиды (SEQ ID NO: 3-8), связывающиеся с FGFR3, не демонстрировали неспецифического связывания на линии клеток, не экспрессирующей FGFR3 (фиг. 4В).EC50 values in the low nanomolar range (Table 3) measured on a cell line expressing FGFR3 (Fig. 4A, KMS-11) confirmed the high apparent affinity values measured by surface plasmon resonance (Table 2) and demonstrated binding with FGFR3 in the natural context of the cell surface. All Fyn SH3-derived polypeptides (SEQ ID NOs: 3-8) binding to FGFR3 did not show non-specific binding in a cell line not expressing FGFR3 (FIG. 4B).
Пример 4. Fyn SH3-производные полипептиды по настоящему изобретению, специфичные к FGFR3, не препятствуют связыванию с лигандом.Example 4 Fyn SH3-derived FGFR3-specific polypeptides of the present invention do not interfere with ligand binding.
Было бы предпочтительно, чтобы Fyn SH3-производные полипептиды для связывания с обеими изоформами FGFR3b и FGFR3c не препятствовали связыванию с лигандом (например, FGF1), поскольку сайт связывания с лигандом расположен вблизи сайта сплайсинга, который дает в результате либо FGFR3b, либо FGFR3c.It would be preferable that Fyn SH3-derived polypeptides for binding to both FGFR3b and FGFR3c isoforms do not interfere with binding to a ligand (e.g., FGF1), since the ligand-binding site is located near the splicing site that results in either FGFR3b or FGFR3c.
С целью проверки способности Fyn SH3-производных полипептидов связываться с FGFR3 в присутствии одного из его лигандов ставили эксперимент с BIAcore для измерения аффинности финомеров к FGFR3 в условиях присутствия или отсутствия FGF1 (фактор 1 роста фибробластов является одним из основных лигандов FGFR3).In order to test the ability of Fyn SH3-derived polypeptides to bind to FGFR3 in the presence of one of its ligands, an experiment was set up with BIAcore to measure the affinity of finomers for FGFR3 in the presence or absence of FGF1 (fibroblast growth factor 1 is one of the main ligands of FGFR3).
По аналогии со способом, использованным для измерения значений аффинности (который описан в примере 3), финомеры в концентрации 100 нМ (за исключением FF2L4C3 - SEQ ID NO: 3, который использовали в концентрации 500 нМ) захватывали на поверхности 9Е10 с последующими инъекциями различных концентраций huFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 13) (0 нМ, 11 нМ, 33 нМ, 100 нМ) в условиях присутствия или в отсутствия 200 нМ FGF1 (R&D systems 232-FA-025/CF). Регистрировали сенсограммы и рассчитывали кажущиеся константы кинетики с помощью программного обеспечения BIAevaluation 2.1.Similar to the method used to measure affinity values (which is described in Example 3), finomers at a concentration of 100 nM (except for FF2L4C3 - SEQ ID NO: 3, which was used at a concentration of 500 nM) were captured on the surface of 9E10 followed by injections of various concentrations huFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 13) (0 nM, 11 nM, 33 nM, 100 nM) in the presence or absence of 200 nM FGF1 (R&D systems 232-FA-025/CF). Sensorgrams were recorded and apparent kinetic constants were calculated using BIAevaluation 2.1 software.
Результаты.Results.
Независимо от присутствия или отсутствия 200 нМ FGF1 в растворе, связывание Fyn SH3 производных полипептидов с huFGFR3c оставалось неизменным, что демонстрировало то, что связывание финомеров с FGFR3 не препятствовало связыванию с лигандом.Regardless of the presence or absence of 200 nM FGF1 in solution, the binding of Fyn SH3 derived polypeptides to huFGFR3c remained unchanged, demonstrating that binding of finomers to FGFR3 did not interfere with ligand binding.
Таблица 4. Показаны константы кинетики, полученные в условиях присутствия или отсутствия 200 нМ FGF1Table 4. Kinetic constants obtained in the presence or absence of 200 nM FGF1 are shown.
Даже несмотря на то, что из-за погрешности анализа значения RD кажущ. в отсутствие FGF1 слегка отличались от значений, полученных в эксперименте, показанном в примере 2 (табл. 2), этот экспери мент продемонстрировал, что Fyn SH3-производные полипептиды способны связываться с FGFR3, даже если лиганд связан с сайтом связывания с лигандом (в данном случае FGF1).Even despite the fact that, due to the analysis error, the values of RD are apparent . in the absence of FGF1 were slightly different from the values obtained in the experiment shown in Example 2 (Table 2), this experiment demonstrated that Fyn SH3-derived polypeptides were able to bind to FGFR3 even if the ligand was bound to the ligand binding site (in this case of FGF1).
Из этого авторы изобретения сделали вывод о том, что эпитоп, связываемый Fyn SH3производными полипептидами, описанными в данном документе, расположен в константной области FGFR3.From this, the inventors concluded that the epitope bound by the Fyn SH3 derivative polypeptides described herein is located in the FGFR3 constant region.
- 18 042136- 18 042136
Пример 5. Fyn SH3-производные полипептиды по настоящему-изобретению связываются с доменами D1-D2 у FGFR3.Example 5 The Fyn SH3 derived polypeptides of the present invention bind to the D1-D2 domains of FGFR3.
Специфичность Fyn SH3-производных полипептидов, связывающихся с FGFR3, тестировали с помощью ELISA.The specificity of Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides was tested by ELISA.
На планшет (планшет Maxisorp; Nunc 439454) наносили различные антигены: huFGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12), huFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 13), cyFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 14), muFGFR3c-His (SEQ ID NO: 15), huD1-Fc (SEQ ID NO: 16), huD2-Fc (SEQ ID NO: 17), huD1-D2-Fc (SEQ ID NO: 18).The plate (Maxisorp plate; Nunc 439454) was coated with various antigens: huFGFR3b-Fc (SEQ ID NO: 12), huFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 13), cyFGFR3c-Fc (SEQ ID NO: 14), muFGFR3c-His ( SEQ ID NO: 15), huD1-Fc (SEQ ID NO: 16), huD2-Fc (SEQ ID NO: 17), huD1-D2-Fc (SEQ ID NO: 18).
На планшет наносили покрытие со 100 мкл антигена в концентрации 5 мкг/мл (0,5 мкг/лунка) и инкубировали при 4°C в течение ночи. Лунки промывали 3x посредством PBS, а затем блокировали 200 мкл 4% MPBS в течение 1 ч. при к.т. Лунки снова промывали и добавляли 20 мкл 10% MPBS, содержащего 15 мкг/мл 9Е10, перед добавлением 80 мкл финомера в количестве 250 нМ (конечная концентрация финомера 200 нМ). Лунки инкубировали в течение 45 мин при к.т. перед промыванием и добавлением 100 мкл антитела к IgG мыши-HRP (Sigma A2554), разбавленного 1:1000 в 2% MPBS. Лунки инкубировали в течение 30 мин при к.т. перед промыванием 3х с помощью 0,1% Tween-20 в PBS, а затем 3x PBS. Вносили 100 мкл субстрата ВМ POD Blue (Roche 11484281001) в каждую лунку с последующим добавлением 50 мкл 1 М H2SO4 для остановки реакции. Поглощение в диапазоне 450-650 нм регистрировали с помощью устройства Tecan M1000.The plate was coated with 100 μl of antigen at a concentration of 5 μg/ml (0.5 μg/well) and incubated at 4°C overnight. The wells were washed 3x with PBS and then blocked with 200 μl 4% MPBS for 1 hour at rt. The wells were washed again and 20 μl of 10% MPBS containing 15 μg/ml 9E10 was added before adding 80 μl of 250 nM finomer (200 nM final concentration of finomer). The wells were incubated for 45 min at rt. before washing and adding 100 µl of anti-mouse IgG-HRP (Sigma A2554) diluted 1:1000 in 2% MPBS. The wells were incubated for 30 min at rt. before washing 3x with 0.1% Tween-20 in PBS followed by 3x PBS. 100 µl of BM POD Blue substrate (Roche 11484281001) was added to each well followed by 50 µl of 1 M H 2 SO 4 to stop the reaction. Absorption in the range of 450–650 nm was recorded using a Tecan M1000 device.
Результаты.Results.
Как показано на фиг. 5 A-F, все Fyn SH3-производные полипептиды были перекрестнореактивными с FGFR3c яванского макака и мышиных. Что интересно, все связывающие молекулы были специфичными к эпитопу, присутствующему только в случае если домены D1 и D2 физически связаны (см. фиг. 5, A-F, столбец huFGFR3-D1D2), фактически связывание не наблюдалось, если на планшете для ELISA были иммобилизованы отдельные домены D1 или D2 (hFGFR3-D1 или huFGFR3-D2).As shown in FIG. 5A-F, all Fyn SH3-derived polypeptides were cross-reactive with cynomolgus and murine FGFR3c. Interestingly, all binding molecules were specific for an epitope present only if the D1 and D2 domains are physically linked (see Fig. 5, A-F, column huFGFR3-D1D2), in fact, no binding was observed if individual D1 or D2 domains (hFGFR3-D1 or huFGFR3-D2).
Пример 6. Fyn SH3-производные полипептиды по настоящему изобретению обусловливали эффективную интернализацию FGFR3.Example 6 The Fyn SH3 derived polypeptides of the present invention conferred efficient internalization of FGFR3.
Интернализация является центральным признаком Fyn SH3-производных полипептидов, описанных в данном документе, и обеспечивает возможность применять эти связывающие молекулы для внутриклеточной доставки токсичных полезных грузов и/или слитых белков, таких как антитела.Internalization is a central feature of the Fyn SH3-derived polypeptides described herein and allows these binding molecules to be used for intracellular delivery of toxic payloads and/or fusion proteins such as antibodies.
Для оценки способности Fyn SH3-производных полипептидов, связывающихся с FGFR3, интернализироваться при связывании с мишенью, проводили анализ интернализации по внутриклеточной доставке цитотоксического средства.To assess the ability of Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides to internalize upon binding to a target, an internalization assay for intracellular delivery of a cytotoxic agent was performed.
С помощью этого анализа на клетках KMS-11 измеряли цитотоксический эффект финомеров, связывающих FGFR3, сшитых с MMAF (монометилауристатин F), который конъюгирован с 9Е10. MMAF представляет собой антимитотическое средство (блокирует полимеризацию тубулина) и активен только при интернализации в клетки. Следовательно, этот анализ свидетельствовал о том, насколько хорошо финомер способствует интернализации MMAF. Высевали 50 мкл клеток KMS-11 в количестве 2x105 клеток/мл в 96-луночный плоскодонный планшет (Corning Costar 3610) с получением 10000 клеток на лунку. Клетки инкубировали в течение 4 ч, давая возможность клеткам прикрепиться (37°C, 5% СО2). Финомеры и 9E10-MMAF смешивали в соотношении 3:1. Получали 4x исходный раствор финомера (4 мкМ) и 4x исходный раствор 9E10-MMAF (1,33 мкМ) в средах RPMI (см. раздел 5.4.1) и смешивали 1:1 (40 мкл+40 мкл). Затем эту смесь последовательно разбавляли 1 к 3 с получением диапазона концентраций 1000 нМ-50 пМ. Добавляли 50 мкл образца к 50 мкл клеток (которые были высеяны ранее) и инкубировали в течение 5 дней (37°C, 5% СО2). Были включены соответствующие контроли: финомер дикого типа FynSH3, MMAF-9E10 без финомера, а также клетки без добавления каких-либо реагентов. Все образцы получали в двух повторностях. Спустя 5 дней 100 мкл клеточного титра glo (Promega G7573) добавляли в каждую лунку и инкубировали при легком встряхивании в течение 10 мин. в темноте. В качестве показаний считывания для жизнеспособности клеток измеряли люминесценцию с помощью устройства Tecan M1000. Анализ проводили с помощью Prism 6. Данные преобразовывали (X=logX) и анализировали с помощью нелинейной аппроксимации log(ингибитор) относительно ответа переменный угловой коэффициент (4 параметра).This assay measured the cytotoxic effect of FGFR3-binding finomers crosslinked to MMAF (monomethylauristatin F) conjugated to 9E10 in KMS-11 cells. MMAF is an antimitotic agent (blocks tubulin polymerization) and is active only when internalized into cells. Therefore, this analysis was indicative of how well the finomer promotes MMAF internalization. 50 μl of KMS-11 cells were seeded at 2x105 cells/ml in a 96-well flat-bottomed plate (Corning Costar 3610) to obtain 10,000 cells per well. Cells were incubated for 4 h, allowing the cells to attach (37°C, 5% CO 2 ). Finomers and 9E10-MMAF were mixed in a ratio of 3:1. Prepare 4x finomer stock solution (4 µM) and 4x 9E10-MMAF stock solution (1.33 µM) in RPMI media (see section 5.4.1) and mix 1:1 (40 µl+40 µl). This mixture was then serially diluted 1 to 3 to give a concentration range of 1000 nM-50 pM. Added 50 μl of the sample to 50 μl of cells (which were seeded earlier) and incubated for 5 days (37°C, 5% CO 2 ). Appropriate controls were included: FynSH3 wild-type finomer, MMAF-9E10 without finomer, and cells without addition of any reagents. All samples were obtained in duplicate. After 5 days, 100 µl of cell titer glo (Promega G7573) was added to each well and incubated with gentle shaking for 10 minutes. In the dark. As a readout for cell viability, luminescence was measured using a Tecan M1000 device. The analysis was performed using Prism 6. The data was transformed (X=logX) and analyzed using a non-linear approximation of log(inhibitor) versus response variable slope (4 parameters).
Результаты.Results.
Все описанные в данном документе Fyn SH3-производные FGFR3-связывающие полипептиды продемонстрировали повышенную цитотоксичность (например, интернализацию) в сравнении с клетками, обработанными только MMAF-меченым вторичным антителом (9Е10 на фиг. 6А) или финомером дикого типа FynSH3 в комбинации с MMAF-меченым 9Е10, показанным во всех 3 экспериментах (фиг. 6 А-С, указано как FynSH3), который демонстрировал цитотоксичность только в наиболее высокой протестированной концентрации, вероятно из-за токсичности собственно MMAF. На фиг. 6 показаны профили цитотоксичности, полученные в различных экспериментах, и в табл. 5 показаны ЕС50, полученные для различных Fyn SH3-производных FGFR3-связывающих полипептидов.All of the Fyn SH3-derived FGFR3-binding polypeptides described herein showed increased cytotoxicity (eg, internalization) when compared to cells treated with MMAF-labeled secondary antibody alone (9E10 in Figure 6A) or wild-type FynSH3 finomer in combination with MMAF- labeled with 9E10, shown in all 3 experiments (FIGS. 6A-C, indicated as FynSH3), which showed cytotoxicity only at the highest concentration tested, probably due to the toxicity of MMAF itself. In FIG. 6 shows the cytotoxicity profiles obtained in various experiments, and in table. 5 shows the EC50s obtained for various Fyn SH3 derived FGFR3 binding polypeptides.
- 19 042136- 19 042136
Таблица 5. Значения ЕС50, определенные в анализах интернализации с использованием FGFR3+ клеток KMS-11, для Fyn ЗНЗ-производных FGFR3-связывающих полипептидовTable 5. EC50 values determined in internalization assays using FGFR3+ KMS-11 cells for Fyn 3H3-derived FGFR3-binding polypeptides
Примечание: для FF2L4C3 указаны 3 значения, полученные в 3 экспериментах, показанных на фиг. 6.Note: For FF2L4C3, 3 values are given from the 3 experiments shown in FIG. 6.
Данные, показанные на фиг. 6 ив табл. 5, демонстрируют, что повышенная аффинность также приводит к более эффективной интернализации.The data shown in FIG. 6 willow table. 5 demonstrate that increased affinity also leads to more efficient internalization.
Пример 7. Альтернативный Fyn ЗНЗ-производный полипептид, который продемонстрировал превосходные свойства связывания и интернализации и который получен из другого семейства.Example 7 Alternative Fyn 3H3-derived polypeptide which has shown excellent binding and internalization properties and which is derived from a different family.
Помимо предпочтительного семейства последовательностей (SEQ ID NO: 1) был выявлен один альтернативный финомер FF40L54A5 (SEQ ID NO: 22), который неожиданно также продемонстрировал превосходные свойства связывания и интернализации и имел сходные технологические свойства и свойства перекрестной реактивности с финомерами, полученными из SEQ ID NO: 1 (см. табл. 6). Не ожидалось, что финомер FF40L54A5 будет обладать превосходными свойствами интернализации, поскольку его последовательность получена из финомера, который продемонстрировал лишь очень слабые свойства интернализации.In addition to the preferred sequence family (SEQ ID NO: 1), one alternative finomer FF40L54A5 (SEQ ID NO: 22) was identified, which unexpectedly also showed excellent binding and internalization properties and had similar processing and cross-reactivity properties to finomers derived from SEQ ID NO: 1 (see Table 6). The FF40L54A5 finomer was not expected to have excellent internalization properties since its sequence was derived from a finomer that showed only very poor internalization properties.
В табл. 6 подытожены свойства финомера FF40L54A5.In table. 6 summarizes the properties of finomer FF40L54A5.
Таблица 6Table 6
* различия из-за экспериментальной погрешности.*differences due to experimental error.
- 20 042136- 20 042136
СсылкиLinks
1. Turner, N. and R. Grose, Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer, 2010. 10 (2) : p. 116-29.1. Turner, N. and R. Grose, Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nat Rev Cancer, 2010. 10(2): p. 116-29.
2. Kalff, A. and A. Spencer, The t(4;14) translocation and FGFR3 overexpression in multiple myeloma: prognostic implications and current clinical strategies. Blood Cancer J, 2012. 2: p. e89.2. Kalff, A. and A. Spencer, The t(4;14) translocation and FGFR3 overexpression in multiple myeloma: prognostic implications and current clinical strategies. Blood Cancer J, 2012. 2: p. e89.
3. Follett, J.B., et al., Overexpression of the myelomaassociated oncogene fibroblast growth factor receptor 3 confers dexamethasone resistance. Blood, 2002. 100(10): p. 3819-21.3. Follett, J.B., et al., Overexpression of the myelomaassociated oncogene fibroblast growth factor receptor 3 confers dexamethasone resistance. Blood, 2002. 100(10): p. 3819-21.
4. Fonseca, R., et al., Clinical and biologic implications of recurrent genomic aberrations in myeloma. Blood, 2003. 101(11): p. 4569-75.4. Fonseca, R., et al., Clinical and biologic implications of recurrent genomic aberrations in myeloma. Blood, 2003. 101(11): p. 4569-75.
5. Agazie, Y.M., et al., The phosphotyrosine phosphatase SHP2 is a critical mediator of transformation induced by the oncogenic fibroblast growth factor receptor 3. Oncogene, 2003. 22 (44) : p. 6909-18.5. Agazie, Y.M., et al., The phosphotyrosine phosphatase SHP2 is a critical mediator of transformation induced by the oncogenic fibroblast growth factor receptor 3. Oncogene, 2003. 22 (44) : p. 6909-18.
6. Ronchetti, D., et al., Deregulated FGFR3 mutants in multiple myeloma cell lines with t(4;14): comparative analysis of T373C, K650E and the novel G384D mutations. Oncogene, 2001. 20 (27) : p. 3553-62.6. Ronchetti, D., et al., Deregulated FGFR3 mutants in multiple myeloma cell lines with t(4;14): comparative analysis of T373C, K650E and the novel G384D mutations. Oncogene, 2001. 20 (27): p. 3553-62.
7. Chesi, M., et al., Activated fibroblast growth factor receptor 3 is an oncogene that contributes to tumor progression in multiple myeloma. Blood, 2001. 97(3): p. 729-36.7. Chesi, M., et al., Activated fibroblast growth factor receptor 3 is an oncogene that contributes to tumor progression in multiple myeloma. Blood, 2001. 97(3): p. 729-36.
- 21 042136- 21 042136
8. Plowright, E.E., et al., Ectopic expression of fibroblast growth factor receptor 3 promotes myeloma cell proliferation and prevents apoptosis. Blood, 2000. 95(3): p.8. Plowright, E.E., et al., Ectopic expression of fibroblast growth factor receptor 3 promotes myeloma cell proliferation and prevents apoptosis. Blood, 2000. 95(3): p.
992-8.992-8.
9. Chen, J., et al., Constitutively activated FGFR3 mutants signal through PLCgamma-dependent and -independent pathways for hematopoietic transformation. Blood, 2005. 106(1): p. 328-37.9. Chen, J., et al., Constitutively activated FGFR3 mutants signal through PLCgamma-dependent and -independent pathways for hematopoietic transformation. Blood, 2005. 106(1): p. 328-37.
10. Li, Z., et al., The myeloma-associated oncogene fibroblast growth factor receptor 3 is transforming in hematopoietic cells. Blood, 2001. 97(8): p. 2413-9.10. Li, Z., et al., The myeloma-associated oncogene fibroblast growth factor receptor 3 is transforming in hematopoietic cells. Blood, 2001. 97(8): p. 2413-9.
11. Trudel, S., et al., Inhibition of fibroblast growth factor receptor 3 induces differentiation and apoptosis in t(4;14) myeloma. Blood, 2004. 103(9): p. 3521-8.11. Trudel, S., et al., Inhibition of fibroblast growth factor receptor 3 induces differentiation and apoptosis in t(4;14) myeloma. Blood, 2004. 103(9): p. 3521-8.
12. Trudel, S., et al., CHIR-258, a novel, multitargeted tyrosine kinase inhibitor for the potential treatment of t(4;14) multiple myeloma. Blood, 2005. 105(7): p. 2941-8.12. Trudel, S., et al., CHIR-258, a novel, multitargeted tyrosine kinase inhibitor for the potential treatment of t(4;14) multiple myeloma. Blood, 2005. 105(7): p. 2941-8.
13. Chen, J., et al., FGFR3 as a therapeutic target of the small molecule inhibitor PKC412 in hematopoietic malignancies. Oncogene, 2005. 24(56): p. 8259-67.13. Chen, J., et al., FGFR3 as a therapeutic target of the small molecule inhibitor PKC412 in hematopoietic malignancies. Oncogene, 2005. 24(56): p. 8259-67.
14. Paterson, J.L., et al., Preclinical studies of fibroblast growth factor receptor 3 as a therapeutic target in multiple myeloma. Br J Haematol, 2004. 124(5): p. 595-603.14. Paterson, J.L., et al., Preclinical studies of fibroblast growth factor receptor 3 as a therapeutic target in multiple myeloma. Br J Haematol, 2004. 124(5): p. 595-603.
15. Grand, E.K., et al., Targeting FGFR3 in multiple myeloma: inhibition of t (4; 14)-positive cells by SU5402 and PD173074. Leukemia, 2004. 18(5): p. 962-6.15. Grand, E.K., et al., Targeting FGFR3 in multiple myeloma: inhibition of t(4;14)-positive cells by SU5402 and PD173074. Leukemia, 2004. 18(5): p. 962-6.
16. Gomez-Roman, J.J., et al., Fibroblast growth factor receptor 3 is overexpressed in urinary tract carcinomas and modulates the neoplastic cell growth. Clin Cancer Res, 2005. 11(2 Pt 1): p. 459-65.16. Gomez-Roman, J.J., et al., Fibroblast growth factor receptor 3 is overexpressed in urinary tract carcinomas and modulates the neoplastic cell growth. Clin Cancer Res, 2005. 11(2 Pt 1): p. 459-65.
17. Tomlinson, D.C., et al., FGFR3 protein expression and its relationship to mutation status and prognostic variables in bladder cancer. J Pathol, 2007. 213(1): p. 91-8.17. Tomlinson, D.C., et al., FGFR3 protein expression and its relationship to mutation status and prognostic variables in bladder cancer. J Pathol, 2007. 213(1): p. 91-8.
18. van Rhijn, B.W., et al., Frequent FGFR3 mutations in urothelial papilloma. J Pathol, 2002. 198(2): p. 245-51.18. van Rhijn, B.W., et al., Frequent FGFR3 mutations in urothelial papilloma. J Pathol, 2002. 198(2): p. 245-51.
19. Tomlinson, D.C., C.D. Hurst, and M.A. Knowles, Knockdown by shRNA identifies S249C mutant FGFR3 as a potential therapeutic target in bladder cancer. Oncogene, 2007. 26(40): p. 5889-99.19. Tomlinson, D.C., C.D. Hurst, and M.A. Knowles, Knockdown by shRNA identifies S249C mutant FGFR3 as a potential therapeutic target in bladder cancer. Oncogene, 2007. 26(40): p. 5889-99.
20. Martinez-Torrecuadrada, J., et al., Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with20. Martinez-Torrecuadrada, J., et al., Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with
- 22 042136 human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clin Cancer Res, 2005. 11(17): p. 6280-90.- 22 042136 human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clin Cancer Res, 2005. 11(17): p. 6280-90.
21. Martinez-Torrecuadrada, J.L., et al., Antitumor activity of fibroblast growth factor receptor 3-specific immunotoxins in a xenograft mouse model of bladder carcinoma is mediated by apoptosis. Mol Cancer Ther, 2008. 7(4): p. 862-73.21. Martinez-Torrecuadrada, J.L., et al., Antitumor activity of fibroblast growth factor receptor 3-specific immunotoxins in a xenograft mouse model of bladder carcinoma is mediated by apoptosis. Mol Cancer Ther, 2008. 7(4): p. 862-73.
22. Rauchenberger, R., et al., Human combinatorial Fab library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3. J Biol Chem, 2003. 278 (40) : p. 38194-205.22. Rauchenberger, R., et al., Human combinatorial Fab library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3. J Biol Chem, 2003. 278 (40) : p. 38194-205.
23. Brack, S., et al., A bispecific HER2-targeting FynomAb with superior antitumor activity and novel mode of action. Mol Cancer Ther, 2014. 13(8): p. 2030-9.23. Brack, S., et al., A bispecific HER2-targeting FynomAb with superior antitumor activity and novel mode of action. Mol Cancer Ther, 2014. 13(8): p. 2030-9.
24. Silacci, M., et al., Discovery and characterization of C0VA322r a clinical-stage bispecific TNF/IL-17A inhibitor for the treatment of inflammatory diseases. MAbs, 2016. 8(1) : p. 141-9.24. Silacci, M., et al., Discovery and characterization of C0VA322 r a clinical-stage bispecific TNF/IL-17A inhibitor for the treatment of inflammatory diseases. MAbs, 2016. 8(1) : p. 141-9.
25. Schlatter, D., et al., Generation, characterization and structural data of chymase binding proteins based on the human Fyn kinase SH3 domain. MAbs, 2012. 4(4): p. 497-508.25. Schlatter, D., et al., Generation, characterization and structural data of chymase binding proteins based on the human Fyn kinase SH3 domain. MAbs, 2012. 4(4): p. 497-508.
26. Grabulovski, D., M. Kaspar, and D. Neri, A novel, nonimmunogenic Fyn SH3-derived binding protein with tumor vascular targeting properties. J Biol Chem, 2007. 282(5): p. 3196-204.26. Grabulovski, D., M. Kaspar, and D. Neri, A novel, nonimmunogenic Fyn SH3-derived binding protein with tumor vascular targeting properties. J Biol Chem, 2007. 282(5): p. 3196-204.
27. Bertschinger, J., D. Grabulovski, and D. Neri, Selection of single domain binding proteins by covalent DNA display. Protein Eng Des Sei, 2007. 20(2): p. 57-68.27. Bertschinger, J., D. Grabulovski, and D. Neri, Selection of single domain binding proteins by covalent DNA display. Protein Eng Des Sei, 2007. 20(2): p. 57-68.
Claims (16)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17164482.6 | 2017-04-03 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA042136B1 true EA042136B1 (en) | 2023-01-18 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210198380A1 (en) | Anti-cancer fusion polypeptide | |
EP3221357B1 (en) | Common light chains and methods of use | |
JP6694808B2 (en) | Novel bispecific binding molecule with antitumor activity | |
EP3253795B1 (en) | Novel binding proteins comprising a ubiquitin mutein and antibodies or antibody fragments | |
TWI671318B (en) | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof | |
US20220056136A1 (en) | Anti-pd-l1/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof | |
KR101862236B1 (en) | Anti-cxcl13 antibodies and methods of using the same | |
JP7482488B2 (en) | A novel fusion protein specific for CD137 and PD-L1 | |
KR20200074137A (en) | CTLA-4 variant immunomodulatory protein and uses thereof | |
JP2024508709A (en) | Anti-CD123 binding molecules and methods of use thereof | |
US11351267B2 (en) | FGFR3 binding molecules | |
US20240279343A1 (en) | Multi-specific antibodies and methods of use | |
JP2021525537A (en) | Trimeric polypeptide complex and its use | |
EA042136B1 (en) | FGFR3-BINDING MOLECULES | |
WO2024064713A1 (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and cd228 | |
TW202428603A (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and cd228 | |
CN118434768A (en) | Agonistic LTBR antibodies and bispecific antibodies comprising them | |
AU2015282844A1 (en) | Human-derived anti-human IL-20 antibodies and assay for the identification of anti-cytokine antibodies |