EA041915B1

EA041915B1 - MONOCLONAL ANTIBODY TO PD-L1

Info

Publication number: EA041915B1
Application number: EA201992206
Authority: EA
Inventors: Андрей Борисович Улитин; Виктория Михайловна Екимова; Екатерина Владимировна Софронова; Юлия Сергеевна Черных; Сергей Андреевич Агеев; Анна Константиновна Владимирова; Алексей Александрович Александров; Павел Алексеевич Гребнев; Валерий Владимирович Соловьев; Яков Юрьевич Устюгов; Павел Андреевич Яковлев; Тимофей Александрович Неманкин; Дмитрий Валентинович Морозов
Original assignee: Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date: 2017-04-17
Filing date: 2018-04-11
Publication date: 2022-12-15

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое специфически связывается с PD-L1 (CD274, В7-Н1, лиганд 1 рецептора программируемой гибели клеток). Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для усиления функции Т-клеток для повышающей регуляции клеточно-опосредованных иммунных реакций и для лечения связанных с дисфункцией Т-клеток нарушений, например, иммунитета опухоли и для лечения рака.The present invention relates to the field of biotechnology, namely to antibodies or their antigen-binding fragments, as well as their use. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically binds to PD-L1 (CD274, B7-H1, programmed cell death receptor ligand 1). The invention also relates to a nucleic acid encoding the antibody or an antigen-binding fragment thereof, an expression vector, a method for producing the antibody, and the use of the antibody to enhance T cell function, to upregulate cell-mediated immune responses, and to treat disorders associated with T cell dysfunction, e.g. , tumor immunity and for cancer treatment.

Уровень техникиState of the art

Развитие и активация лимфоцитовDevelopment and activation of lymphocytes

Двумя основными типами лимфоцитов у человека являются Т-тип (тимоциты) и В-тип (костномозговые). Эти клетки образуются из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге и эмбриональной печени, которые запрограммированы на лимфоидный путь развития. Потомство этих стволовых клеток различными путями созревает до В- или Т-лимфоцитов. Развитие В-лимфоцитов человека происходит исключительно в костном мозге. Т-клетки, с другой стороны, развиваются из незрелых предшественников, которые покидают костный мозг и перемещаются через кровоток в тимус, где они размножаются и дифференцируются в зрелые Т-лимфоциты.The two main types of lymphocytes in humans are T-type (thymocytes) and B-type (bone marrow). These cells are derived from hematopoietic stem cells in the bone marrow and fetal liver, which are programmed for the lymphoid developmental pathway. The offspring of these stem cells mature in various ways to B- or T-lymphocytes. The development of human B-lymphocytes occurs exclusively in the bone marrow. T cells, on the other hand, develop from immature progenitors that leave the bone marrow and travel through the bloodstream to the thymus, where they proliferate and differentiate into mature T lymphocytes.

Зрелые лимфоциты, источником которых является тимус или костный мозг, пребывают в неактивном или покоящемся состоянии, т.е. они являются митотически неактивными. Когда они рассредоточиваются в кровотоке, эти необученные или наивные лимфоциты перемещаются в различные вторичные или периферические лимфоидные органы, такие, как селезенка, лимфатические узлы или миндалины. Для большинства наивных лимфоцитов характерна короткая продолжительность жизни, и они погибают за несколько дней после того, как покидают костный мозг или тимус. Однако если такая клетка получает сигналы, указывающие на присутствие антигена, она может активироваться и претерпевать последовательные циклы деления клеток. Некоторые клетки из полученного в результате потомства затем возвращаются в покоящееся состояние и становятся лимфоцитами памяти - В- и Т-клетками, которые по сути обучены для следующей встречи со стимулирующим аллергеном. Другим потомством активированных наивных лимфоцитов являются эффекторные клетки, живущие лишь несколько дней, но выполняющие определенные виды защитной активности.Mature lymphocytes, the source of which is the thymus or bone marrow, are in an inactive or dormant state, i.e. they are mitotically inactive. When they disperse in the bloodstream, these untrained or naive lymphocytes migrate to various secondary or peripheral lymphoid organs such as the spleen, lymph nodes, or tonsils. Most naive lymphocytes have a short lifespan and die within days of leaving the bone marrow or thymus. However, if such a cell receives signals indicating the presence of an antigen, it can become activated and undergo successive cycles of cell division. Some of the cells from the resulting offspring then return to a dormant state and become memory lymphocytes - B and T cells, which are essentially trained for the next encounter with a stimulating allergen. Another offspring of activated naive lymphocytes are effector cells that live only a few days but perform certain types of protective activity.

Активация лимфоцитов представляет собой упорядоченную последовательность событий, которую проходит покоящийся лимфоцит после стимуляции к делению и производству потомства, из которого некоторые клетки становятся эффекторными клетками. Полный ответ включает как индукцию пролиферации клеток (митогенез), так и проявление иммунологических функций. Лимфоциты активируются, когда специфические лиганды связываются с рецепторами на их поверхностях. Лиганды отличаются от Т-клеток и В-клеток, однако конечные внутриклеточные физиологические механизмы сходны.Lymphocyte activation is an ordered sequence of events that a quiescent lymphocyte goes through after being stimulated to divide and produce progeny, from which some cells become effector cells. The complete response includes both the induction of cell proliferation (mitogenesis) and the manifestation of immunological functions. Lymphocytes are activated when specific ligands bind to receptors on their surfaces. Ligands differ from T cells and B cells, however, the ultimate intracellular physiological mechanisms are similar.

Сами же некоторые инородные антигены могут вызывать активацию лимфоцитов, в частности, большие полимерные антигены, сшивающие поверхностные иммуноглобулины на В-клетках или другие гликопротеины на Т-клетках. Однако большинство антигенов не являются полимерными, и даже прямое связывание с В- клетками в больших количествах не обеспечивает активации. Эти более распространенные антигены активируют В-клетки, когда они стимулируются совместно с активированными поблизости хелперными Т-лимфоцитами. Такая стимуляция может происходить от лимфокинов, секретируемых Т-клеткой, однако наиболее эффективно она передается путем прямого контакта В-клетки с поверхностными белками Т-клеток, взаимодействующими с определенными поверхностными рецепторами В-клеток для создания вторичного сигнала.Some foreign antigens themselves can cause activation of lymphocytes, in particular, large polymeric antigens that cross-link surface immunoglobulins on B cells or other glycoproteins on T cells. However, most antigens are not polymeric, and even direct binding to B cells in large quantities does not provide activation. These more common antigens activate B cells when they are stimulated in conjunction with nearby activated helper T lymphocytes. This stimulation can come from lymphokines secreted by the T cell, but is most effectively transmitted by direct contact of the B cell with T cell surface proteins that interact with certain B cell surface receptors to create a secondary signal.

Т-клеткиT cells

Т-лимфоциты не экспрессируют иммуноглобулины, однако обнаруживают присутствие инородных веществ при помощи поверхностных белков, называемых рецепторами Т-клеток (TCR). Эти рецепторы распознают антигены либо через прямой контакт, либо воздействуя на активность других иммунных клеток. Вместе с макрофагами Т-клетки являются основным типом клеток, вовлеченных в клеточноопосредованный иммунитет.T-lymphocytes do not express immunoglobulins, but detect the presence of foreign substances using surface proteins called T-cell receptors (TCRs). These receptors recognize antigens either through direct contact or by influencing the activity of other immune cells. Together with macrophages, T cells are the main cell type involved in cell-mediated immunity.

В отличие от В-клеток, Т-клетки могут обнаруживать инородные вещества только в конкретных условиях. В частности, Т-лимфоциты распознают инородный белок, только если он расщепляется на малые пептиды, которые затем выявляются на поверхности второй клетки-хозяина, называемой антигенпрезентирующей клеткой (АРС). Многие типы клеток-хозяев могут представлять антигены в некоторых условиях, однако определенные типы более специфично адаптированы для этой и являются особенно важными для регулирования активности Т-клеток, включая макрофаги и другие В-клетки. Представление антигена частично зависит от определенных белков, называемых белками главного комплекса гистосовместимости (МНС), на поверхности представляющих клеток. Таким образом, для стимуляции клеточноопосредованного иммунитета инородные пептиды должны быть представлены Т-клеткам в комбинации с пептидами МНС, и эта комбинация должна распознаваться рецептором Т-клеток.Unlike B cells, T cells can only detect foreign substances under specific conditions. In particular, T-lymphocytes recognize a foreign protein only if it is cleaved into small peptides, which are then detected on the surface of a second host cell, called an antigen-presenting cell (APC). Many types of host cells can present antigens under some conditions, however, certain types are more specifically adapted to this and are especially important in regulating the activity of T cells, including macrophages and other B cells. Antigen presentation depends in part on certain proteins, called major histocompatibility complex (MHC) proteins, on the surface of the presenting cells. Thus, to stimulate cell-mediated immunity, foreign peptides must be presented to T cells in combination with MHC peptides, and this combination must be recognized by the T cell receptor.

Существует две значительных субпопуляции Т-клеток: цитотоксичные Т-лимфоциты (Тц-клеткиThere are two significant subpopulations of T cells: cytotoxic T lymphocytes (Tc cells

- 1 041915 или CTL) и хелперные Т-клетки (Тх), которые ориентировочно идентифицируются по экспрессии на клеточной поверхности маркера CD8 и CD4. Тц-клетки важны для защиты от вирусов и способны уничтожать вирусы непосредственно путем распознавания некоторых экспрессируемых на поверхности клеток вирусных пептидов. Тх-клетки способствуют пролиферации, созреванию и иммунологической функции других типов клеток, например, секреции лимфокинов для регулирования активности В-клеток, макрофагов и цитотоксичных Т-клеток. И наивные Т-лимфоциты, и Т-лимфоциты памяти обычно остаются в покоящемся состоянии, и в этом состоянии они не демонстрируют значительной хелперной или цитотоксичной активности. В активированном состоянии эти клетки претерпевают несколько циклов митотического деления для образования дочерних клеток. Некоторые из этих дочерних клеток возвращаются в покоящееся состояние как клетки памяти, а другие становятся эффекторными клетками, активно проявляющими хелперную или цитотоксичную активность. Эти дочерние клетки подобны их родительским клеткам: CD4+ клетки могут образовывать только CD4+ потомство, a CD8+ клетки дают только CD8+ потомство. Эффекторные Т-клетки экспрессируют маркеры поверхности клеток, которые не экспрессируются на покоящихся Т-клетках, таких как CD25, CD28, CD29, CD40L, рецепторы трансферрина и белки МНС II класса. При устранении активирующих стимулов цитотоксичная или хелперная активность постепенно снижается в течение нескольких дней, поскольку эффекторные клетки либо отмирают, либо возвращаются в покоящееся состояние.- 1 041915 or CTL) and helper T cells (Tx), which are tentatively identified by cell surface expression of the CD8 and CD4 marker. TC cells are important in defense against viruses and are able to destroy viruses directly by recognizing some of the viral peptides expressed on the cell surface. Th cells contribute to the proliferation, maturation, and immunological function of other cell types, such as the secretion of lymphokines to regulate the activity of B cells, macrophages, and cytotoxic T cells. Both naive T-lymphocytes and memory T-lymphocytes usually remain in a dormant state, and in this state they do not show significant helper or cytotoxic activity. When activated, these cells undergo several cycles of mitotic division to form daughter cells. Some of these daughter cells return to their dormant state as memory cells, while others become effector cells that actively exhibit helper or cytotoxic activity. These daughter cells are similar to their parent cells: CD4+ cells can only produce CD4+ progeny, and CD8+ cells only produce CD8+ progeny. Effector T cells express cell surface markers that are not expressed on resting T cells, such as CD25, CD28, CD29, CD40L, transferrin receptors, and class II MHC proteins. With the removal of activating stimuli, cytotoxic or helper activity gradually declines over several days as effector cells either die or return to a dormant state.

Подобно активации В-клеток реакция Т-лимфоцитов на большинство антигенов также требует двух типов одновременных стимулов. Первым является антиген, который, будучи соответствующим образом экспонированным белками МНС на антигенпрезентирующей клетке, может распознаваться и связываться рецепторами Т- клеток. Поскольку этот комплекс антиген-МНС не посылает сигнал внутрь клетки, он обычно бывает недостаточным для того, чтобы привести к активации Т-клетки. Полная активация, такая, как та, что происходит с хелперными Т-клетками, требует костимуляции другими специфическими лигандами, называемыми костимуляторами, которые экспрессируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки. С другой стороны, активация цитотоксичной Т-клетки обычно требует IL-2 - цитокина, секретируемого активированными хелперными Т-клетками.Similar to B-cell activation, the response of T-lymphocytes to most antigens also requires two types of simultaneous stimuli. The first is an antigen which, when properly displayed by MHC proteins on an antigen presenting cell, can be recognized and bound by T cell receptors. Because this antigen-MHC complex does not send a signal into the cell, it is usually insufficient to result in T cell activation. Full activation, such as that which occurs with helper T cells, requires costimulation by other specific ligands, called co-stimulators, which are expressed on the surface of the antigen-presenting cell. On the other hand, activation of a cytotoxic T cell usually requires IL-2, a cytokine secreted by activated helper T cells.

Путь PD-1Path PD-1

Важные отрицательный костимулирующий сигнал, регулирующий активацию Т-клеток, обеспечивается рецептором запрограммированной гибели-1 (PD-1, CD279) и его партнерами по связыванию с лигандом PD-L1 (В7-Н1, CD274) и PD-L2 (B7-DC, CD273). Отрицательная регулирующая роль PD-1 была обнаружена при помощи нокаутов PD-1 (Pdcd1 -/-), которые склонны к аутоиммунности. (Nishimura et al, Immunity JJ: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)). PD-1 связан с CD28 и CTLA-4, но в нем отсутствует ближний к мембране цистеин, обеспечивающий возможность гомодимеризации. Цитоплазматический домен PD-1 содержит иммунорецепторный тирозинсвязывающий ингибирующий мотив (ITIM, V/IxYxxL/V). PD-1 связывается только с PD-L1 и PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365 - 1369 (1999); Latchman et al., Nature Immunol 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)).An important negative costimulatory signal regulating T cell activation is provided by the programmed death receptor-1 (PD-1, CD279) and its ligand-binding partners PD-L1 (B7-H1, CD274) and PD-L2 (B7-DC, CD273). A negative regulatory role for PD-1 has been found with PD-1 (Pdcd1 -/-) knockouts that are prone to autoimmunity. (Nishimura et al, Immunity JJ: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)). PD-1 is associated with CD28 and CTLA-4, but it lacks a cysteine closest to the membrane, which allows homodimerization. The cytoplasmic domain of PD-1 contains an immunoreceptor tyrosine-binding inhibitory motif (ITIM, V/IxYxxL/V). PD-1 binds only to PD-L1 and PD-L2 (Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999) ; Latchman et al., Nature Immunol 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)).

PD-1 может экспрессироваться на Т-клетках, В-клетках, природных киллерных Т-клетках, активированных моноцитах и дендритных клетках (DC). PD-1 экспрессируется активированными, не нестимулированными человеческими Т- клетками CD4+ и CD8+, В-клетками и миелоидными клетками. В этом состоит отличие от более ограниченной экспрессии CD28 и CTLA-4 (Nishimura et al, Int. Immunol. 8: 77380 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)). Существует как минимум 4 варианта PD-1, которые были клонированы из активированных человеческих Т-клеток, включая транскрипты, в которых отсутствуют (i) экзон 2, (ii) экзон 3, (iii) экзоны 2 и 3 или (iv) экзоны с 2 по 4 (Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)). За исключением PD-lAex3, все варианты экспрессируются в такой же мере, как и PD-1 полной длины в покоящихся мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС). Экспрессия всех вариантов в значительной мере индуцируется после активации человеческих Т-клеток антителами против CD3 и против CD28. В вариантах PD-lAex3 отсутствует трансмембранный домен, и они подобны растворимому CTLA-4, играющему важную роль в аутоиммунности (Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)). Этим вариантом богата синовиальная жидкость и сыворотка пациентов с ревматоидным артритом (Wan et al, J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)). Два лиганда PD-1 отличаются по характеру экспрессии. PD-L1 конститутивно экспрессируется на мышиных Т- и В-клетках, CD, макрофагах, мезенхимальных стволовых клетках и мастоцитах костного мозга (Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)). PD-L1 экспрессируется на многих различных негемопоэтических клетках (например, клетках роговицы, легких, сосудистого эпителия, непаренхиматозных клетках печени, мезенхимальных стволовых клетках, панкреатических островках, плацентарных синцитиотрофобластах, кератиноцитах и т.п.) [Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)] и подвергается повышенной регуляции на многих типах клеток после активации. Интерфероны IFN как типа I, так и типа II вызывают повышение PD-L1 (Eppihimer et al, Microcirculation 9: 133-45 (2002)); Schreiner et al., J. Neuroimmunol 155: 172-82 (2004). Экспрессия PD-L1 в линиях клеток снижается при ингибировании MyD88, TRAF6 и МЕК (Liu et al, Blood НО: 296-304 (2007)). JAK2 также участвует в 30 индукции PD-L1 (Lee et al., FEBS Lett, 580: 755-62 (2006); Liu et al.,PD-1 can be expressed on T cells, B cells, natural killer T cells, activated monocytes, and dendritic cells (DC). PD-1 is expressed by activated, unstimulated human CD4+ and CD8+ T cells, B cells, and myeloid cells. This is in contrast to the more limited expression of CD28 and CTLA-4 (Nishimura et al, Int. Immunol. 8: 77380 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)). There are at least 4 variants of PD-1 that have been cloned from activated human T cells, including transcripts that lack (i) exon 2, (ii) exon 3, (iii) exons 2 and 3, or (iv) exons with 2 to 4 (Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)). With the exception of PD-lAex3, all variants are expressed to the same extent as full-length PD-1 in resting peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Expression of all variants is largely induced upon activation of human T cells with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Variants of PD-lAex3 lack a transmembrane domain and are similar to soluble CTLA-4, which plays an important role in autoimmunity (Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)). This variant is rich in the synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis (Wan et al, J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)). The two PD-1 ligands differ in their expression patterns. PD-L1 is constitutively expressed on mouse T and B cells, CDs, macrophages, mesenchymal stem cells, and bone marrow mast cells (Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)). PD-L1 is expressed on many different non-hematopoietic cells (eg, corneal, lung, vascular epithelial cells, non-parenchymal liver cells, mesenchymal stem cells, pancreatic islets, placental syncytiotrophoblasts, keratinocytes, etc.) [Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)] and is upregulated in many cell types after activation. Both type I and type II IFN interferons cause an increase in PD-L1 (Eppihimer et al, Microcirculation 9: 133-45 (2002)); Schreiner et al., J. Neuroimmunol 155: 172-82 (2004). Expression of PD-L1 in cell lines is reduced by inhibition of MyD88, TRAF6 and MEK (Liu et al, Blood HO: 296-304 (2007)). JAK2 is also involved in 30 PD-L1 induction (Lee et al., FEBS Lett, 580: 755-62 (2006); Liu et al.,

- 2 041915- 2 041915

Blood HO: 296-304 (2007)). Потеря или ингибирование гомолога фосфатазы и тензина (PTEN), клеточной фосфатазы, которая модифицирует фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K) и сигнал Akt, повышала посттранскрипционную экспрессию PD-L1 при раке (Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007)).Blood HO: 296-304 (2007)). Loss or inhibition of phosphatase homologue and tensin (PTEN), a cellular phosphatase that modifies phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and the Akt signal, increased post-transcriptional expression of PD-L1 in cancer (Parsa et al., Nat. Med. 13:84- 88 (2007)).

Экспрессия PD-L2 более ограничена по сравнению с PD-L1. PD-L2 индуцибельно экспрессируется на DC, макрофагах и мастоцитах костного мозга. PD-L2 также экспрессируется приблизительно на половине, а то и двух третях покоящихся брюшинных В1-клетках, но не на традиционных В2 В-клетках (Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)). PD-L2+ B1 клетки связывают фосфатидилхолин и могут быть важны для природного иммунного ответа на бактериальные антигены. Индукция PD-L2 со стороны IFN-γ частично зависит от NF-kB (Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)). PD-L2 также может индуцироваться на моноцитах и макрофагах GM-CF, IL-4 и IFN-γ (Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100: 5336-41 (2003)).Expression of PD-L2 is more limited compared to PD-L1. PD-L2 is inducibly expressed on DCs, macrophages, and bone marrow mast cells. PD-L2 is also expressed on about half to two-thirds of resting peritoneal B1 cells, but not on traditional B2 B cells (Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)). PD-L2+ B1 cells bind phosphatidylcholine and may be important in the natural immune response to bacterial antigens. PD-L2 induction by IFN-γ is partly dependent on NF-kB (Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)). PD-L2 can also be induced on monocytes and macrophages by GM-CF, IL-4 and IFN-γ (Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100: 5336- 41 (2003)).

Сигнал PD-1, как правило, больше влияет на выработку цитокина, чем на пролиферацию клеток, со значительным влиянием на выработку IFN-γ, TNF-α и IL-2. Опосредованный PD-1 ингибиторный сигнал также зависит от силы сигнала TCR, причем большее ингибирование обеспечивается при более низких уровнях стимуляции TCR. Это снижение может быть преодолено путем костимуляции через CD28 [Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)] или присутствие IL-2 [Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)].The PD-1 signal tends to influence cytokine production more than cell proliferation, with significant effects on IFN-γ, TNF-α, and IL-2 production. The PD-1 mediated inhibitory signal also depends on the strength of the TCR signal, with more inhibition provided at lower levels of TCR stimulation. This decrease can be overcome by costimulation via CD28 [Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)] or the presence of IL-2 [Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)].

Появляется все больше свидетельств того, что сигнал через PD-L1 и PD-L2 может быть двунаправленным. То есть, помимо модификации сигнала TCR или BCR, сигнал также может доставляться обратно к клеткам, экспрессирующим PD-L1 и PD-L2. Хотя обработка дендритных клеток природным человеческим антителом против PD-L2, выделенным из организма пациента с макроглобулинемией Вальденстрема, не обнаружила повышающей регуляции МНС II или костимулирующих молекул В7, такие клетки вырабатывали большее количество провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-α и IL-6, и стимулировали пролиферацию Т-клеток (Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)). Лечение мышей этим антителом также (1) повышало сопротивление пересаженной меланоме b16 и быстро индуцировало опухолеспецифические CTL (Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)); (2) блокировало развитие воспалительной болезни дыхательных путей в мышиной модели аллергической астмы (Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. UJy. 668-74 (2005)).There is growing evidence that the signal through PD-L1 and PD-L2 can be bidirectional. That is, in addition to modifying the TCR or BCR signal, the signal can also be delivered back to cells expressing PD-L1 and PD-L2. Although treatment of dendritic cells with natural human anti-PD-L2 antibody isolated from a patient with Waldenström's macroglobulinemia did not upregulate MHC II or B7 costimulatory molecules, such cells produced more pro-inflammatory cytokines, in particular TNF-α and IL-6, and stimulated T cell proliferation (Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)). Treatment of mice with this antibody also (1) increased resistance to transplanted b16 melanoma and rapidly induced tumor-specific CTLs (Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004) Heckman et al., Eur J Immunol 37:1827-35 (2007)); (2) blocked the development of inflammatory airway disease in a mouse model of allergic asthma (Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. UJy. 668-74 (2005)).

Еще одно свидетельство обратного сигнала в дендритные клетки (DC) было получено по результатам исследований костномозговых DC, культивированных с растворимым PD-1 (домен PD-1 ЕС, слитый с константной областью Ig - s-PD-1) (Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)). Этот sPD-1 ингибировал активацию DC и повышал выработку IL-10 обратимым способом благодаря введению антитела против PD-1. Кроме того, некоторые исследования выявили рецептор для PD-L1 или PD-L2, независимый от PD-1. В7.1 уже был определен как партнер по связыванию для PD-L1 (Butte et al, Immunity 27: 111 - 22 (2007)). Исследования химического сшивания показывают, что PD-L1 и В7.1 могут взаимодействовать через их IgV-подобные домены. Взаимодействие B7.1:PD-L1 может вызывать ингибиторный сигнал в Т-клетки. Сшивание PD-L1 на CD4+ Т-клетках при помощи В7.1 или сшивание В7.1 на CD4+ Тклетках при помощи PD-L1 обеспечивает ингибиторный сигнал. Т-клетки с отсутствующими CD28 и CTLA-4 демонстрируют сниженную пролиферацию и выработку цитокинов при стимулировании шариками, покрытыми антителом против CD3 плюс В7.1. В Т-клетках с отсутствием всех рецепторов для В7.1 (т.е. CD28, CTLA-4 и PD-L1) ингибирование пролиферации Т-клеток и выработки цитокинов шариками, покрытыми антителом против CD3 плюс В7.1, прекращалось. Это указывает на то, что В7.1 специфично действует через PD-L1 на Т-клетку в отсутствие CD28 и CTLA-4. Подобным образом Т-клетки с отсутствующим PD-1 демонстрировали сниженную пролиферацию и выработку цитокинов при стимулировании в присутствии шариков, покрытых антителом против CD3 плюс PD-L1, демонстрируя ингибирующее воздействие сшивания PD-L1 на В7 .1 на Т-клетки. При отсутствии в Т-клетках всех известных рецепторов для PD-L1 (т.е. при отсутствии PD-1 и В7.1) ослабление пролиферации Т-клеток шариками, покрытыми антителом против CD3 плюс PD-L1, прекращается. Таким образом, PD-L1 может оказывать ингибиторное воздействие на Т- клетки через В7.1 или PD-1.Further evidence of signaling back to dendritic cells (DCs) came from studies of bone marrow DCs cultured with soluble PD-1 (PD-1 EU domain fused to Ig-s-PD-1 constant region) (Kuipers et al., Eur J Immunol 36: 2472-82 (2006)). This sPD-1 inhibited DC activation and increased IL-10 production in a reversible manner by administration of an anti-PD-1 antibody. In addition, some studies have identified a receptor for PD-L1 or PD-L2 independent of PD-1. B7.1 has already been identified as a binding partner for PD-L1 (Butte et al, Immunity 27: 111-22 (2007)). Chemical crosslinking studies show that PD-L1 and B7.1 can interact through their IgV-like domains. The B7.1:PD-L1 interaction can induce an inhibitory signal in T cells. Cross-linking of PD-L1 on CD4+ T cells with B7.1 or cross-linking of B7.1 on CD4+ T cells with PD-L1 provides an inhibitory signal. T cells lacking CD28 and CTLA-4 show reduced proliferation and cytokine production when stimulated with anti-CD3 plus B7.1 coated beads. In T cells lacking all receptors for B7.1 (ie, CD28, CTLA-4, and PD-L1), inhibition of T cell proliferation and cytokine production by anti-CD3 plus B7.1 coated beads was abolished. This indicates that B7.1 specifically acts through PD-L1 on the T cell in the absence of CD28 and CTLA-4. Similarly, PD-1 deficient T cells showed reduced proliferation and cytokine production when stimulated in the presence of anti-CD3 plus PD-L1 antibody coated beads, demonstrating an inhibitory effect of PD-L1 crosslinking at B7.1 on T cells. In the absence of all known receptors for PD-L1 in T cells (ie, in the absence of PD-1 and B7.1), the attenuation of T cell proliferation by anti-CD3 plus PD-L1 antibody-coated beads stops. Thus, PD-L1 may have an inhibitory effect on T cells through B7.1 or PD-1.

Прямое взаимодействие между В7.1 и PD-L1 указывает на то, что нынешнее понимание костимуляции является неполным и подчеркивает значение для экспрессии этих молекул на Т-клетках. Исследования PD-L1 ~/~ Т-клеток показывают, что PD-L1 на Т-клетках может снижать выработку цитокинов Тклеткой. (Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)). Поскольку и PD-L1, и В7.1 экспрессируются на Т-клетках, В-клетках, DC и макрофагах, существует потенциал для направленного взаимодействия между В7.1 и PD-L1 на этих типах клеток. Кроме того, PD-L1 на негемопоэтических клетках может взаимодействовать с В7.1, а также PD-1 на Т- клетках, что вызывает вопрос: участвует ли PD-L1 в их регуляции. Одним из возможных объяснений ингибиторного влияния взаимодействия В7.1 : PD-L1 является то, что PD-L1 Т-клеток может улавливать или изолировать АРС В7.1 от взаимодействия с CD28.The direct interaction between B7.1 and PD-L1 indicates that the current understanding of costimulation is incomplete and highlights the implications for the expression of these molecules on T cells. Studies on PD-L1 ~/~ T cells show that PD-L1 on T cells can reduce cytokine production by the T cell. (Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)). Because both PD-L1 and B7.1 are expressed on T cells, B cells, DCs, and macrophages, there is potential for a targeted interaction between B7.1 and PD-L1 on these cell types. In addition, PD-L1 on nonhematopoietic cells can interact with B7.1 as well as PD-1 on T cells, raising the question of whether PD-L1 is involved in their regulation. One possible explanation for the inhibitory effect of the B7.1:PD-L1 interaction is that T cell PD-L1 can trap or isolate B7.1 APCs from interacting with CD28.

В результате антагонизм сигнала через PD-L1, включающий блокирование взаимодействия PD-L1 сAs a result, signal antagonism through PD-L1, including blocking the interaction of PD-L1 with

- 3 041915- 3 041915

PD-1, B7.1, или и с тем, и с другим, таким образом, не давая PD-L1 отправить отрицательный костимулирующий сигнал на Т-клетки и другие антиген-представляющие клетки, возможно, повышает иммунитет в ответ на инфекцию (например, острую или хроническую) и иммунитет опухоли. Кроме того, антитела против PD-L1 согласно настоящему изобретению могут комбинироваться с антагонистами других компонентов сигнала PD-1: PD-L1, например, антагониста антител против PD-1 и против PD-L2.PD-1, B7.1, or both, thus preventing PD-L1 from sending a negative costimulatory signal to T cells and other antigen presenting cells, possibly boosting immunity in response to infection (e.g. , acute or chronic) and tumor immunity. In addition, the anti-PD-L1 antibodies of the present invention can be combined with antagonists of other components of the PD-1 signal: PD-L1, for example an anti-PD-1 and anti-PD-L2 antibody antagonist.

В частности, ингибирование сигнала PD-L1 было предложено в качестве средства повышения иммунитета Т-клетки для лечения рака (например, иммунитета опухоли) и к инфекциям, включая как острые, так и хронические (например, устойчивые) инфекции.In particular, inhibition of the PD-L1 signal has been proposed as a means of enhancing T cell immunity to cancer treatment (eg, tumor immunity) and to infections, including both acute and chronic (eg, resistant) infections.

Ингибиторы, блокирующие взаимодействие PD-L1: PD-1, известны, помимо прочих источников, из документов WO 2001014557, WO 2002086083, WO 2007005874, WO 2010036959, WO 2010077634 и WO 2011066389.Inhibitors that block the PD-L1:PD-1 interaction are known, among other sources, from WO 2001014557, WO 2002086083, WO 2007005874, WO 2010036959, WO 2010077634 and WO 2011066389.

В настоящее время на ранних стадиях клинических исследований находятся более 10 моно- и биспецифических препаратов с анти-PD-L1 компонентом.Currently, more than 10 mono- and bispecific drugs with an anti-PD-L1 component are in the early stages of clinical trials.

Одно моноспецифическое анти-PD-L1 антитело, MPDL3280A (atezolizumab, Roche), успешно прошло клинические испытания (КИ) и применяется в клинической практике. Атезолизумаб одобрен FDA к применению у пациентов с метастатическим уротелиальным раком, продолжаются КИ III фазы у пациентов с немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), почечно-клеточным раком, колоректальный рак (КРР), раком молочной железы (РМЖ). Препарат представляет собой Ig1 антитело с модифицированным Fcрегионом (с целью элиминации ADCC - эффекта). Атезолизумаб описан в документе WO 2010077634.One monospecific anti-PD-L1 antibody, MPDL3280A (atezolizumab, Roche), has successfully passed clinical trials (CTs) and is being used in clinical practice. Atezolizumab is FDA approved for use in patients with metastatic urothelial cancer, phase III CTs are ongoing in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), renal cell carcinoma, colorectal cancer (CRC), and breast cancer (BC). The drug is an Ig1 antibody with a modified Fc region (to eliminate the ADCC effect). Atezolizumab is described in WO 2010077634.

Другими анти-PD-Ll препаратами, находящимися на заключительной фазе КИ, являются препараты avelumab (Pfizer) и durvalumab (AZ). Дурвалумабом (Durvalumab, MEDI-4736) описан в документе WO 2011066389. Авелумаб (Avelumab) описан в документе WO 2013079174. Основным отличием препарата авелумаб является наличие у антитела ADCC-эффекта, более того, его можно усиливать с помощью IFNg или IL12 (NCT 01772004). При этом профиль безопасности препарата авелумаб соответствует таковому других анти-PD-1/PD-L1 препаратов (Cancer Immunol Res; 3(10) October 2015; Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Activity of a Novel Anti-PD-L1 Antibody Avelumab on Human Tumor Cells; Benjamin Boyerinas).Other anti-PD-Ll drugs in the final phase of CT are avelumab (Pfizer) and durvalumab (AZ). Durvalumab (MEDI-4736) is described in document WO 2011066389. Avelumab (Avelumab) is described in document WO 2013079174. The main difference of avelumab is that the antibody has an ADCC effect, moreover, it can be enhanced with IFNg or IL12 (NCT 01772004 ). At the same time, the safety profile of avelumab is consistent with that of other anti-PD-1/PD-L1 drugs (Cancer Immunol Res; 3(10) October 2015; Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Activity of a Novel Anti-PD-L1 Antibody Avelumab on Human Tumor Cells; Benjamin Boyerinas).

Таким образом, существует необходимость в создание эффективного ингибитора PD-L1 (лиганда 1 рецептора программируемой гибели клеток).Thus, there is a need to create an effective inhibitor of PD-L1 (programmed cell death receptor ligand 1).

В связи с вышесказанным, актуальным является создание новых антител, которые эффективно связываются с PD-L1.In connection with the foregoing, it is important to create new antibodies that effectively bind to PD-L1.

Антитело BCD-135 селективно связывается с PD-L1 и является эффективным ингибитором лиганда 1 рецептора программируемой гибели клеток.The BCD-135 antibody selectively binds to PD-L1 and is an effective inhibitor of programmed cell death receptor ligand 1.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, в частности антителам, направленным для связывания с PD-L1. Такие антитела могут быть использованы для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1.The present invention relates to binding molecules, in particular antibodies directed to bind to PD-L1. Such antibodies can be used to treat a disease or disorder mediated by PD-L1.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфично связывается с PD-L1, включающее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 7.In one aspect, the present invention relates to a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to PD-L1, comprising a heavy chain variable domain containing an amino acid sequence at least 90% homologous to the sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain containing an amino acid sequence at least 90% homologous to the sequence of SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contains a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contains a light chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contains a heavy chain variable domain that contains amino acid sequences that are at least 90% homologous to the sequences of SEQ ID NOs: 1-3.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности, представленные последовательностями SEQ ID NO: 1-3.In some embodiments, the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1-3.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 5-7.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contains a light chain variable domain that contains amino acid sequences that are at least 90% homologous to the sequences of SEQ ID NOs: 5-7.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности, представленные последовательностями SEQ ID NO: 5-7.In some embodiments, the monoclonal antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprises a light chain variable domain that contains the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 5-7.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям SEQ ID NO: 1-3, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности по меньшей мере на 90% гомологичные после- 4 041915 довательностям SEQ ID NO: 5-7.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains amino acid sequences at least 90% homologous to the sequences of SEQ ID NOs: 1-3, and a light chain variable domain that contains at least 90 amino acid sequences. % homologous to SEQ ID NOs: 5-7.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO:In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contains a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequences of SEQ ID NO:

1-3, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотные последовательности SEQ ID1-3 and a light chain variable domain which contains the amino acid sequences of SEQ ID

NO: 5-7.NO: 5-7.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contains a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof contains a light chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a light chain variable domain that contains an amino acid sequence that is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный домен легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.In some embodiments, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain variable domain that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 10.In some embodiments, the monoclonal antibody contains a heavy chain containing an amino acid sequence at least 90% homologous to the sequence of SEQ ID NO: 9, and a light chain containing an amino acid sequence at least 90% homologous to the sequence of SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах моноклональное антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.In some embodiments, the monoclonal antibody includes a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах моноклональное антитело, специфичное к PD-L1, представляет собой полноразмерное антитело IgG.In some embodiments, the PD-L1 specific monoclonal antibody is a full length IgG antibody.

В некоторых вариантах полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека.In some embodiments, the full length IgG antibody is of the human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 isotype.

В некоторых вариантах моноклональное антитело относится к изотипу IgG1 человека.In some embodiments, the monoclonal antibody is of the human IgG1 isotype.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоты, которая кодирует любое вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.In one aspect, the present invention relates to a nucleic acid that encodes any of the above antibody or antigennegative fragment.

В некоторых вариантах нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.In some embodiments, the nucleic acid is DNA.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору содержащему любую вышеуказанную нуклеиновую кислоту.In one aspect, the present invention relates to an expression vector containing any of the above nucleic acids.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает трансформирование клетки вышеуказанным вектором.In one aspect, the present invention relates to a method for obtaining a host cell for obtaining any of the above antibodies or antigen-binding fragment, which includes transforming the cell with the above vector.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке-хозяину для получения любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которая содержит любую вышеуказанную нуклеиновую кислоту.In one aspect, the present invention relates to a host cell for obtaining any of the above antibodies or antigennegative fragment, which contains any of the above nucleic acid.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который заключается в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.In one aspect, the present invention relates to a method for producing any of the above antibodies or antigen-binding fragment, which consists in culturing the above host cell in a culture medium under conditions sufficient to obtain the specified antibody, if necessary, followed by isolation and purification of the resulting antibody.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, которая содержит любое вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1, which contains any of the above antibody or antigennegative fragment in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, выбранного из группы: ПРГШ, рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ, рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР.In some embodiments, the pharmaceutical composition is for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1 selected from the group: HNCH, cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, которая содержит любое вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно терапевтиче- 5 041915 ски активное противоопухолевое соединение.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical combination for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1, which contains any of the above antibody or antigen-binding fragment and at least one therapeutically active antitumor compound.

В некоторых вариантах фармацевтическая комбинация предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1, выбранного из группы: ПРГШ, рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ, рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР.In some embodiments, the pharmaceutical combination is for the prevention or treatment of a disease or disorder mediated by PD-L1 selected from the group: HNCH, cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.

В некоторых вариантах фармацевтическая комбинация содержит терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое выбирают из химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.In some embodiments, the pharmaceutical combination contains a therapeutically active anticancer compound that is selected from a chemotherapeutic agent, an antibody, or an antihormonal agent.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности PD-L1 у субъекта, нуждающемуся в таком ингибировании, который включает введение субъекту эффективного количества любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.In one aspect, the present invention provides a method for inhibiting PD-L1 biological activity in a subject in need of such inhibition, which comprises administering to the subject an effective amount of any of the foregoing antibodies or antigen-binding fragment thereof.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого PD-L1.In one aspect, the present invention relates to the use of any of the aforementioned antibodies, or an antigen-binding fragment thereof, or the aforementioned pharmaceutical composition, for the treatment of a PD-L1 mediated disease or disorder in a subject in need of such treatment.

В некоторых вариантах изобретение относится к применению любого вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, выбранного из группы: ПРГШ, рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ, рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР.In some embodiments, the invention relates to the use of any of the above antibodies or its antigen-binding fragment or the above pharmaceutical composition for the treatment of a disease or disorder selected from the group: HNCH, cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Фиг. 1 - схема синтеза комбинаторной наивной библиотеки человека;Fig. 1 - scheme for the synthesis of a combinatorial naive human library;

фиг. 2 - карта фагмиды для клонирования Fab фаговых дисплейных библиотек;fig. 2 - phagemid map for cloning Fab phage display libraries;

фиг. 3 - карта экспрессионной плазмиды для наработки Fab;fig. 3 - map of the expression plasmid for Fab production;

фиг. 4А - электрофореграмма BCD-135 в восстанавливающих условиях, 12% SDS-PAGE;fig. 4A is an electropherogram of BCD-135 under reducing conditions, 12% SDS-PAGE;

фиг. 4Б - электрофореграмма BCD-135 в невосстанавливающих условиях, 8% SDS-PAGE;fig. 4B - electropherogram of BCD-135 under non-reducing conditions, 8% SDS-PAGE;

фиг. 5 - иммуноферментный анализ взаимодействия BCD-135 с PD-L1 и другими антигенами;fig. 5 - ELISA analysis of the interaction of BCD-135 with PD-L1 and other antigens;

фиг. 6 - реактивация NFAT-сигналинга анти-PD-Ll антителами в репортерной клеточной линии Jurkat-NFAT-PD-1;fig. 6 - reactivation of NFAT signaling by anti-PD-Ll antibodies in the reporter cell line Jurkat-NFAT-PD-1;

фиг. 7 - анализ взаимодействий BCD-135 с FcRn и Fcγ-рецепторами на приборе Octet RED 96;fig. 7 - analysis of interactions of BCD-135 with FcRn and Fcγ receptors on the Octet RED 96 instrument;

фиг. 8 - иммуноферментный анализ взаимодействий BCD-135 с PD-L1 разных видов организмов;fig. 8 - enzyme immunoassay of interactions of BCD-135 with PD-L1 of different types of organisms;

фиг. 9 - анализ взаимодействий BCD-135 с PD-L1 человека и обезьяны циномолгуса на приборе Octet RED 96;fig. 9 - analysis of interactions of BCD-135 with human and cynomolgus monkey PD-L1 on the Octet RED 96 instrument;

фиг. 10 - анализ конформационной стабильности BCD-135;fig. 10 - conformational stability analysis of BCD-135;

фиг. 11 - анализ коллоидной стабильности BCD-135;fig. 11 - analysis of the colloidal stability of BCD-135;

фиг. 12А - анализ термической стабильности BCD-135 в фосфатном буфере. По оси X - время, по оси Y - поглощение;fig. 12A is a thermal stability analysis of BCD-135 in phosphate buffer. On the X-axis - time, on the Y-axis - absorption;

фиг. 12Б - анализ термической стабильности BCD-135 в ацетатном буфере. По оси X - время, по оси Y - поглощение;fig. 12B Thermal stability analysis of BCD-135 in acetate buffer. On the X-axis - time, on the Y-axis - absorption;

фиг. 12В. Анализ термической стабильности BCD-135 в гистидиновом буфере. По оси X - время, по оси Y - поглощение;fig. 12V. Thermal stability analysis of BCD-135 in histidine buffer. On the X-axis - time, on the Y-axis - absorption;

фиг. 13А. Анализ стабильности BCD-135 в сыворотке крови человека. Калибровочная кривая отражающую зависимость оптической плотности от концентрации добавленного в лунку BCD-135;fig. 13A. Stability analysis of BCD-135 in human serum. Calibration curve reflecting the dependence of optical density on the concentration of BCD-135 added to the well;

фиг. 13Б. Анализ стабильности BCD-135 в сыворотке крови человека. Результирующая таблица показывающая зависимость концентрации BCD-135 при инкубации в сыворотке человека от времени инкубации;fig. 13B. Stability analysis of BCD-135 in human serum. The resulting table showing the dependence of the concentration of BCD-135 during incubation in human serum on the time of incubation;

фиг. 14А. 3D пространственная модель комплекса BCD-135 и N-terminus Ig домена PD-L1 антигена. Общий вид 3D модели;fig. 14A. 3D spatial model of the BCD-135 and N-terminus Ig complex of the PD-L1 antigen domain. General view of the 3D model;

фиг. 14Б. 3D пространственная модель комплекса BCD-135 и N-terminus Ig домена PD-L1 антигена. Детализированная модель в районе прямых контактов антиген антитело (см. табл. в примере 18).fig. 14B. 3D spatial model of the BCD-135 and N-terminus Ig complex of the PD-L1 antigen domain. Detailed model in the area of direct contacts antigen-antibody (see table in example 18).

Описание изобретенияDescription of the invention

Определения и общие методыDefinitions and Common Methods

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области. Примерные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут также использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе. Все публикации и другие ссылочные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены во всей их полноте путем отсылки. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет превалировать. Хотя в настоящем документе цитируется ряд документов, такое цитирование не является признанием того, что любой из этих документов образует часть общеизвестных знаний в данной области.Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention will have meanings that are commonly understood by those skilled in the art. Exemplary methods and materials are described below, although methods and materials similar or equivalent to those described herein may also be used in the practice or testing of the present invention. All publications and other references mentioned in this document are incorporated in their entirety by reference. In the event of conflict, the present description, including definitions, shall prevail. Although a number of documents are cited in this document, such citation is not an admission that any of these documents form part of the generally known knowledge in this field.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины вIn addition, unless the context otherwise requires, singular terms include plural terms, and plural terms include terms in

- 6 041915 единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.- 6 041915 singular. The generally used classification and methods of cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, organic synthesis chemistry, medicinal and pharmaceutical chemistry, as well as hybridization and protein and nucleic acid chemistry described in this document are well known. specialists and are widely used in this field. Enzymatic reactions and purification methods are carried out according to the manufacturer's instructions, as is commonly done in the art, or as described herein.

В этом описании и вариантах осуществления изобретения слова иметь и содержать или их вариации, такие как имеет, имеющий, содержит или содержащий, следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.In this description and embodiments of the invention, the words have and contain, or variations thereof, such as has, having, contains, or containing, should be understood to include the specified integer or group of integers, but not the exclusion of any other integer or group of integers.

Определения, связанные с антителомAntibody Related Definitions

PD-L1 (лиганд 1 рецептора программируемой гибели клеток), также известный как кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 В7 (В7-Н1), является трансмембранным белком 1 типа, массой 40 кДа. Состоит из 3 доменов: внеклеточного, представленного Ig V и С-подобными доменами (220), трансмембранного (21) и внутриклеточного (31). Он играет важную роль в супрессии иммунной системы в период беременности, при пересадке чужеродной ткани, некоторых заболеваниях, например, при гепатите. В нормальных условиях, в ответ на собственные антигены, в лимфатических узлах и селезенке аккумулируется некоторое количество антиген-специфичных CD8+ Т-эффекторных клеток, с целью предотвращения аутоиммунного процесса, формируются PD-1/PD-L1 или B7-1/PD-L1 комплексы, это приводит к передаче ингибиторного сигнала, снижающего пролиферацию данных CD8+ Т - клеток в лимфоузлах. Таким образом PD-1/PD-L-взаимодействие является одним из ключевых в развитии иммунной толерантности.PD-L1 (programmed cell death receptor ligand 1), also known as cluster of differentiation 274 (CD274) or B7 homologue 1 (B7-H1), is a 40 kDa type 1 transmembrane protein. It consists of 3 domains: extracellular, represented by Ig V and C-like domains (220), transmembrane (21) and intracellular (31). It plays an important role in the suppression of the immune system during pregnancy, in transplantation of foreign tissue, and in certain diseases, such as hepatitis. Under normal conditions, in response to self antigens, a certain amount of antigen-specific CD8 + T-effector cells accumulate in the lymph nodes and spleen, in order to prevent the autoimmune process, PD-1 / PD-L1 or B7-1 / PD-L1 complexes are formed , this leads to the transmission of an inhibitory signal that reduces the proliferation of these CD8+ T cells in the lymph nodes. Thus, the PD-1/PD-L interaction is one of the key in the development of immune tolerance.

Дисфункция в контексте иммунной дисфункции означает состояние снижения иммунной реакции на антигенную стимуляцию. Термин включает общие элементы истощения и/или анергии, при которых может происходить распознавание антигена, однако вызываемая иммунная реакция неэффективна для контроля над инфекцией или ростом опухоли.Dysfunction in the context of immune dysfunction means a state of decreased immune response to antigenic stimulation. The term includes the general elements of exhaustion and/or anergy in which antigen recognition may occur, but the immune response elicited is ineffective in controlling infection or tumor growth.

Усиление функции Т-клеток означает индукцию, вызывание или стимулирование устойчивой или усиленной биологической функции Т-клетки или восстановление или реактивацию истощенных или неактивных Т-клеток. Примерами усиления функции Т-клеток являются повышенная секреция γинтерферона из CD8+ Т- клеток, повышенная пролиферация, повышенная реакция на антиген (например, элиминация вируса или патогена) относительно показателей до вмешательства. В одном варианте воплощения уровень усиления составляет как минимум 50%, в альтернативном варианте - 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Способ измерения этого усиления известен специалистам в данной области.Enhancement of T cell function means the induction, induction or stimulation of sustained or enhanced biological function of a T cell, or the recovery or reactivation of depleted or inactive T cells. Examples of enhanced T cell function are increased interferon-γ secretion from CD8+ T cells, increased proliferation, increased antigen response (eg, virus or pathogen clearance) relative to pre-intervention levels. In one embodiment, the gain level is at least 50%, alternatively 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. A method for measuring this gain is known to those skilled in the art.

Связанное с дисфункцией Т-клеток нарушение представляет собой нарушение или состояние Тклеток, характеризующееся сниженной реакцией на антигенную стимуляцию. В конкретном варианте воплощения связанным с Т-клетками дисфункциональным нарушением является нарушение, конкретно связанное с неприемлемо повышенным сигналом через PD-1. В другом варианте воплощения связанным с дисфункцией Т-клеток нарушением является нарушение, при котором Т- клетки являются энергическими или обладают сниженной способностью к секретированию цитокинов, пролиферации или цитолитической активности. В конкретном аспекте снижение реакции приводит к неэффективности контроля над патогеном или опухолью, экспрессирующей иммуноген. Примерами связанных с дисфункцией Тклеток нарушений, характеризующихся дисфункцией Т-клеток, могут быть неразрешенная острая инфекция, хроническая инфекция и иммунитет опухоли.A T cell dysfunction-associated disorder is a T cell disorder or condition characterized by a reduced response to antigen challenge. In a specific embodiment, a T cell-associated dysfunctional disorder is a disorder specifically associated with unacceptably increased signaling through PD-1. In another embodiment, a disorder associated with T cell dysfunction is a disorder in which T cells are energized or have a reduced ability to secrete cytokines, proliferate, or have cytolytic activity. In a specific aspect, the decrease in response results in ineffective control of the pathogen or tumor expressing the immunogen. Examples of T cell dysfunction-related disorders characterized by T cell dysfunction include unresolved acute infection, chronic infection, and tumor immunity.

Иммунитет опухоли означает процесс, при котором опухоли уклоняются от иммунного распознавания и элиминации. Таким образом, как терапевтическое понятие, иммунитет опухоли поддается лечению, когда такое уклонение ослабляется, и опухоли распознаются и атакуются иммунной системой. Примерами распознавания опухолей являются связывание опухоли, уменьшение размеров опухоли и элиминация опухоли.Tumor immunity refers to the process by which tumors evade immune recognition and elimination. Thus, as a therapeutic concept, tumor immunity is treatable when such evasion is attenuated and tumors are recognized and attacked by the immune system. Examples of tumor recognition are tumor binding, tumor downsizing, and tumor elimination.

Термин вакцина в контексте данного описания включает любой непатогенный иммуноген, который, будучи инокулированным в организм-хозяин, вызывает защитный иммунитет против конкретного патогена. Вакцины могут приобретать различные формы. Вакцины могут быть целыми организмами, имеющими общие антигены с патогеном, но сами не являются патогенными (например, коровья оспа). Вакцины также могут быть приготовлены из убитых (например, вакцина против полиомиелита Salk) или ослабленных (с потерей способности к вызыванию болезни - например, вакцина против полиомиелита Sabin). Вакцины также могут приготавливаться из очищенных макромолекул, выделенных из патогенного организма. Например, токсоидные вакцины (например, столбняка и дифтерии), содержащие неактивную форму растворимого бактериального токсина и обеспечивающие в результате выработку антител против токсина, но не иммунитет к интактной бактерии. Субъединичные вакцины (например, гепатит В) содержат только один иммуногенный белок, выделенный из нужного патогена. Гаптеновые конъюгатные вакцины присоединяют некоторые углеводные или полипептидные эпитопы, выделенные из нужного патогена, к иммуногенным носителям, таким, как столбнячный токсоид. Эти методики предусматриваютThe term vaccine as used herein includes any non-pathogenic immunogen which, when inoculated into a host organism, elicits protective immunity against a particular pathogen. Vaccines can take many forms. Vaccines can be whole organisms that share antigens with a pathogen but are not themselves pathogenic (eg vaccinia). Vaccines can also be prepared from dead (eg, Salk polio vaccine) or weakened (with no ability to cause disease - eg, Sabin polio vaccine). Vaccines can also be prepared from purified macromolecules isolated from a pathogenic organism. For example, toxoid vaccines (eg, tetanus and diphtheria) containing an inactive form of a soluble bacterial toxin and resulting in the production of antibodies against the toxin, but not immunity to the intact bacterium. Subunit vaccines (eg hepatitis B) contain only one immunogenic protein isolated from the desired pathogen. Hapten conjugate vaccines attach certain carbohydrate or polypeptide epitopes isolated from the desired pathogen to immunogenic carriers such as tetanus toxoid. These methods provide

- 7 041915 главным образом применение эпитопов, таких, как гаптены, для индукции выработки антитела, которые затем распознают один эпитоп в природном патогене. Однако для максимальной эффективности такие вакцины должны включать В- и Т-клеточные эпитопы, и должны выбираться Т-клеточные для гарантии возможности их распознавания, презентации и реакции на них со стороны иммунных систем организмовхозяев. В ДНК-вакцинах используется способность клеток-хозяев к захвату и экспрессии ДНК, кодирующей патогенные белки, которую вводят внутримышечно. Реакция хозяина на иммуногены может усиливаться при введении в форме смеси с адъювантами. Иммунные адъюванты функционируют одним или несколькими из следующих способов: (1) продления удерживания иммуногена, (2) увеличения эффективного размера иммуногена (и, следовательно, активации фагоцитоза и презентации макрофагам), (3) стимуляции притока макрофагов других иммунных клеток к месту инъекции или (4) активации местной выработки цитокинов и других видов иммунологической активности. Примерами адъювантов могут быть: полный адъювант Фрейнда (CFA), соли алюминия и белки на основе микобактерий, такие, как мурамилди- или трипептиды.- 7 041915 mainly the use of epitopes, such as haptens, to induce the production of antibodies, which then recognize a single epitope in a natural pathogen. However, to be most effective, such vaccines should include B and T cell epitopes, and T cells should be chosen to ensure that they can be recognized, presented and responded to by the immune systems of the hosts. DNA vaccines exploit the ability of host cells to capture and express DNA encoding pathogenic proteins, which is administered intramuscularly. The host response to immunogens can be enhanced when administered as a mixture with adjuvants. Immune adjuvants function in one or more of the following ways: (1) prolonging the retention of the immunogen, (2) increasing the effective size of the immunogen (and hence activating phagocytosis and presentation to macrophages), (3) stimulating the macrophage influx of other immune cells to the injection site, or ( 4) activation of local production of cytokines and other types of immunological activity. Examples of adjuvants can be: complete Freund's adjuvant (CFA), aluminum salts and proteins based on mycobacteria, such as muramyl di - or tripeptides.

Амплификация этого гена и/или сверхэкспрессия его белка были обнаружены при многих раковых заболеваниях, в том числе при ПРГШ, раке шейки матки, раке без выявленного первоисточника, глиобластома, раке пищевода, раке мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ, раке почки, раке яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР.Amplification of this gene and/or overexpression of its protein have been found in many cancers, including HNCH, cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC , kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.

Термин связывающая молекула включает в себя антитела и иммуноглобулины.The term binding molecule includes antibodies and immunoglobulins.

Термин антитело или иммуноглобулин (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающую часть) или его отдельные цепи. Термин антитело относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), разбросанные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками), и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.The term antibody or immunoglobulin (Ig) as used herein includes whole antibodies and any antigen-binding fragment (ie, antigen-binding portion) or individual chains thereof. The term antibody refers to a glycoprotein containing at least two heavy (H) chains and two light (L) chains linked by disulfide bonds, or an antigen-binding portion thereof. Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region consists of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain consists of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region consists of a single domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDRs), scattered between regions that are more conserved, called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, arranged from amino to carboxy in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. Antibody constant regions can mediate immunoglobulin binding to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells), and the first component (Clq) of the classical complement system.

Термин антигенсвязывающая часть антитела или антигенсвязывающий фрагмент (или просто часть антитела или фрагмент антитела), как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин антигенсвязывающая часть антитела включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR). Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин антигенсвязывающая часть антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.The term antigen-binding antibody portion or antigen-binding fragment (or simply antibody portion or antibody fragment) as used herein refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full length antibody. Examples of binding fragments included in the term antigen-binding portion of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CH1 domains; (ii) F(ab') ₂ fragment, divalent fragment containing two Fab-fragment connected by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of VL and VH domains in a single antibody arm, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) which consists of a VH/VHH domain; and (vi) a dedicated complementarity determining region (CDR). In addition, the two regions of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by different genes, they can be connected using recombinant methods using a synthetic linker, which makes it possible to obtain them as a single protein chain, in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 -5883). It is contemplated that such single chain molecules are also included in the term antigen-binding portion of an antibody. Such antibody fragments are obtained using conventional methods known to those skilled in the art, and these fragments are screened in the same manner as intact antibodies.

Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет происхождение из мыши, ламы или донорской человеческой библиотеки или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными, например, замещенными разными аминокислотными остатками с тем, чтобы оптимизировать конкретные свойства антитела, например KD, koff, IC50, ЕС50, ED50. Предпочтительно каркасные участки антитела по изобретению имеют человеческое происхождение или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческое происхождение).Preferably, the CDR of the antigen-binding site or the entire antigen-binding site of the antibodies of the invention is of mouse, llama, or human donor library origin, or is essentially of human origin with certain amino acid residues modified, e.g. , koff, IC50, EC50, ED50. Preferably, the framework regions of an antibody of the invention are of human origin or substantially human origin (at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% human origin).

В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок антитела по изобретению можетIn other embodiments, the antigen-binding site of an antibody of the invention may

- 8 041915 происходить из других нечеловеческих видов, включая мыши, ламы, кролика, крысу или хомяка, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, антигенсвязывающий участок может происходить из человеческих видов.- 8 041915 originate from other non-human species, including but not limited to mice, llamas, rabbits, rats or hamsters. Alternatively, the antigen binding site may be from a human species.

Термин вариабельный относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых гипервариабельными областями или CDR или HVR или HV. Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC).The term variable refers to the fact that certain segments of the variable domains vary widely in sequence among antibodies. The V domain mediates antigen binding and determines the specificity of a particular antibody for its particular antigen. However, the variability is unevenly distributed over the 110 amino acid variable domain region. In contrast, V regions are composed of invariant fragments called framework regions (FRs) of 15-30 amino acids separated by shorter regions of extreme variability called hypervariable regions or CDRs or HVRs or HVs. Each native heavy and light chain variable domain contains four FRs, generally assuming a beta-sheet configuration linked by three hypervariable regions that form binding loops and in some cases are part of a beta sheet structure. The hypervariable regions in each chain are held together in close proximity by FRs and with the hypervariable regions of the other chain contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, M.D. (1991)). The constant domains are not directly involved in the binding of the antibody to the antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).

Термин гипервариабельная область (HVR или HV) по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из области, определяющей комплементарность или CDR, и/или такие остатки из гипервариабельной петли.The term hypervariable region (HVR or HV) as used herein refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding. Typically, the hypervariable region contains amino acid residues from the complementarity determining region or CDR and/or such residues from the hypervariable loop.

В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно как созревание аффиности и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).In some cases, it may also be preferable to change one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity for the target epitope. This is known as affinity maturation, and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where humanization of an antibody results in a decrease in binding specificity or affinity, and it is not possible to sufficiently improve binding specificity or affinity by backmutations alone. Various affinity maturation methods are known in the art, such as the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), and the stepwise in vitro affinity maturation method proposed by Wu et al. al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).

Каркасные области (FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от CDR остатков. Обычно каждый вариабельный домен имеет четыре FR, определяемые как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяются согласно Kabat, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно в области остатков 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) в тяжелой цепи. Если участки CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в остатках 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, a FR остатки тяжелой цепи локализуются, примерно, в остатках 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. В некоторых примерах когда CDR содержит аминокислоты как из CDR по Kabat, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, FR соответствующим образом корректируются. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты Н26-Н35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в положениях 1-25, а остатки FR2 находятся в положениях 36-4 9.Framework regions (FRs) are variable domain residues other than CDR residues. Typically, each variable domain has four FRs, defined as FR1, FR2, FR3, and FR4. If CDRs are determined according to Kabat, FR residues of the light chain are located approximately in the region of residues 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) and 98-107 (LCFR4), and FR residues of the heavy chain are localized , approximately in the region of residues 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) and 103-113 (HCFR4) in the heavy chain. If CDR regions contain amino acid residues from hypervariable loops, light chain FR residues are located approximately at residues 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) and 97-107 (LCFR4) in the light chain , a FR heavy chain residues are located approximately at residues 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) and 102-113 (HCFR4) in heavy chain residues. In some instances, when the CDR contains amino acids from both the Kabat CDR and amino acids from the hypervariable loop, the FRs are adjusted accordingly. For example, when CDRH1 includes amino acids H26-H35, heavy chain FR1 residues are at positions 1-25 and FR2 residues are at positions 36-49.

Антитело по данному изобретению, которое связывает целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку или ткань, экспрессирующую антиген, и в незначительной степени перекрестно реагирует с другими белками. По данным аналитических методов: сортинга флуоресцентно-активированных клеток (FACS), радиоиммунопреципитации (RIA) или ИФА (ELISA), в таких вариантах изобретения степень связывания антитела с белком, не являющимся мишенью (с нецелевым белком), составляет менее 10% от связывания антитела с конкретным белком-мишенью. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин специфическое связывание или выражения специфически связывается с или специфический к конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия (например, в случае bH1-44 или bH1-81 неспецифическое взаимодействие представляет собой связывание с бычьим сывороточным альбумином, казеином, фетальной бычьей сывороткой или нейтравидином). Специфическое связывание можно определять количественно, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание можно определять конкурентной реакцией с другой молекулой, аналогичной мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание указывается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентноAn antibody of this invention that binds a target antigen is an antibody that binds an antigen with sufficient affinity such that the antibody can be used as a diagnostic and/or therapeutic agent when targeted to a protein or cell or tissue expressing the antigen, and to a small extent cross-reacts with other proteins. According to analytical methods: fluorescence-activated cell sorting (FACS), radioimmunoprecipitation (RIA) or ELISA (ELISA), in such embodiments of the invention, the degree of binding of the antibody to the non-target protein (to the non-target protein) is less than 10% of the binding of the antibody with a specific target protein. In relation to the binding of an antibody to a target molecule, the term specific binding or expression specifically binds to or specific to a particular polypeptide or epitope on a particular target polypeptide means a binding that is markedly (measurably) different from a non-specific interaction (for example, in the case of bH1-44 or bH1-81 non-specific interaction is binding to bovine serum albumin, casein, fetal bovine serum or neutravidin). Specific binding can be quantified, for example, by determining the binding of the molecule compared to the binding of a control molecule. For example, specific binding can be determined by a competitive reaction with another molecule similar to the target, for example, with an excess of unlabeled target. In this case, specific binding is indicated if binding of the labeled target to the probe is competitive.

- 9 041915 ингибируется избытком немеченой мишени. В данном описании термин специфическое связывание или выражения специфически связывается с или специфический к конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени можно характеризовать на примере молекулы, имеющей Kd к мишени по меньшей мере около 200 нМ или же по меньшей мере около 150 нМ, или же по меньшей мере около 100 нМ, или же по меньшей мере около 60 нМ, или же по меньшей мере около 50 нМ, или же по меньшей мере около 40 нМ, или же по меньшей мере около 30 нМ, или же по меньшей мере около 20 нМ, или же по меньшей мере около 10 нМ, или же по меньшей мере около 8 нМ, или же по меньшей мере около 6 нМ, или же по меньшей мере около 4 нМ, или же по меньшей мере около 2 нМ, или же по меньшей мере около 1 нМ или выше. В одном варианте изобретения термин специфическое связывание относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, практически не связываясь с каким-либо другим полипептидом или эпитопом на полипептиде.- 9 041915 is inhibited by an excess of unlabeled target. As used herein, the term specific binding or expression specifically binds to or specific to a particular polypeptide or epitope on a particular target polypeptide can be characterized by a molecule having a Kd to the target of at least about 200 nM, or at least about 150 nM, or at least about 100 nM, or at least about 60 nM, or at least about 50 nM, or at least about 40 nM, or at least about 30 nM, or at least about 20 nM, or at least about 10 nM, or at least about 8 nM, or at least about 6 nM, or at least about 4 nM, or at least about 2 nM, or at least about 1 nM or higher. In one embodiment, the term specific binding refers to a binding in which a molecule binds to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide without substantially binding to any other polypeptide or epitope on a polypeptide.

Термин Ka, как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин или Kd относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.The term Ka, as used herein, refers to the rate of association of a particular antibody-antigen interaction, while the term or Kd refers to the rate of dissociation of a particular antibody-antigen interaction.

Аффинность связывания обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, аффинность связывания относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1: 1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно можно представить константной диссоциации (Kd). Желательно, чтобы величина Kd составляла примерно 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения.Binding affinity generally refers to the strength of the cumulative non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Unless otherwise stated, binding affinity refers to intrinsic (intrinsic, intrinsic) binding affinity, which reflects a 1:1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). The affinity of a molecule X for its partner Y can usually be represented by a dissociation constant (Kd). Desirably, the Kd value is about 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM or less . Affinity can be measured by conventional methods known in the art, including the methods described herein. Low affinity antibodies usually bind antigen slowly and tend to dissociate easily, while high affinity antibodies usually bind antigen faster and tend to stay bound longer. Various methods for measuring binding affinity are known in the art, any of these methods can be used for the purposes of the present invention.

В одном варианте изобретения Kd или величину Kd по данному изобретению измеряют методами поверхностного плазменного резонанса на приборе BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU). Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ), а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/мин до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% Tween 20 (PBST) при 25°С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (kon) и скорости ассоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один (BIAcore Evaluation Software версия 3.2), с помощью одновременного получения сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазмонного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М^-1 с^-1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение=295 нм; эмиссия (излучение)=340 нм, полоса 16 нм) при 25°С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, рН 7.2, в присутствии увеличивающихся концентрации антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco (ThermoSpectronie) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.In one embodiment, the Kd or Kd value of this invention is measured by surface plasma resonance methods on a BIAcore™-2000 or BIAcore™-3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25°C using CM5 antigen immobilized chips at ~ 10 relative units (response units, RU). Briefly, carboxymethyldextran biosensor chips (CM5, BIAcore Inc.) are activated with N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the manufacturer's instructions. The antigen is diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to a concentration of 5 μg/mL (~0.2 μM) and then injected at a flow rate of 5 μL/min until about 10 relative units (RU) of bound protein is reached. After the introduction of the antigen, a 1 M solution of ethanolamine is injected to block the unreacted groups. For kinetic measurements, two-fold serial dilutions of Fab (eg, 0.78 nM to 500 nM) are injected into PBS with 0.05% Tween 20 (PBST) at 25° C. at a flow rate of about 25 μl/min. Association rate (kon) and association rate (koff) values are calculated using a simple Langmuir model for one-plus-one binding (BIAcore Evaluation Software version 3.2) by simultaneously obtaining an association and dissociation sensorgram. The equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the ratio koff/kon. See, for example, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. If, according to the above surface plasmon resonance method, the association rate exceeds 106 M ^-1 s ^-1 , then it can be determined by the fluorescence quenching method, which measures the increase or decrease in the intensity of fluorescent emission (excitation = 295 nm; emission (emission) = 340 nm, band 16 nm) at 25° C. in a 20 nM anti-antigen antibody solution (Fab form) in PBS, pH 7.2, in the presence of increasing concentrations of antigen measured with a spectrometer such as a stopped flow spectrophotometer (Aviv Instruments) or an SLM-Aminco spectrophotometer (ThermoSpectronie) 8000 series with stirred cell.

Термин Koff относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff + можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™. Скорость ассоциации (on-rate) или kon по данному изобретению можно также определять тем же самым описанным выше методом поверхностного плазменного резонанса на приборе BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU). Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N- гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ), а затем вводят (инжекция)The term Koff refers to the dissociation rate constant of a particular interaction between a binding molecule and an antigen. The dissociation rate constant koff + can be measured by biolayer interferometry, for example using the Octet™ system. The association rate (on-rate) or kon of this invention can also be determined by the same surface plasma resonance method described above on a BIAcore™-2000 or BIAcore™-3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25°C, using chips with immobilized CM5 antigen at ~10 relative units (response units, RU). Briefly, carboxymethyldextran biosensor chips (CM5, BIAcore Inc.) are activated with N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the manufacturer's instructions. The antigen is diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to a concentration of 5 µg/ml (~0.2 µM) and then injected (injection)

- 10 041915 при скорости потока 5 мкл/мин до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% Tween 20 (PBST) при 25°С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (kon) и скорости ассоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один (BIAcore Evaluation Software версия 3.2), одновременно получая сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Однако, если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазменного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М^-1 с^-1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение=2 95 нм; эмиссия (излучение)=340 нм, полоса 16 нм) при 25°С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, рН 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco (ThermoSpectronic) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.- 10 041915 at a flow rate of 5 μl/min until approximately 10 relative units (RU) of bound protein are reached. After the introduction of the antigen, a 1 M solution of ethanolamine is injected to block the unreacted groups. For kinetic measurements, two-fold serial dilutions of Fab (eg, 0.78 nM to 500 nM) are injected into PBS with 0.05% Tween 20 (PBST) at 25° C. at a flow rate of about 25 μl/min. Association rate (kon) and association rate (koff) values are calculated using a simple Langmuir model for one-plus-one binding (BIAcore Evaluation Software version 3.2) while obtaining association and dissociation sensorgrams. The equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the ratio koff/kon. See, for example, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. However, if the association rate exceeds 106 M ^-1 s ^-1 according to the above surface plasma resonance method, then it can be determined by the fluorescence quenching method, which measures the increase or decrease in the intensity of fluorescent emission (excitation = 2 95 nm; emission (emission) = 340 nm, 16 nm band) at 25° C. of a 20 nM anti-antigen antibody (Fab form) solution in PBS, pH 7.2, in the presence of increasing concentrations of antigen measured with a spectrometer such as a stopped-flow spectrophotometer (Aviv Instruments) or a spectrophotometer SLM-Aminco (ThermoSpectronic) 8000 series with stirred cell.

Если специально не указано иначе, выражения биологически активный, и биологическая активность, и биологические характеристики, по отношению к полипептиду по данному изобретению, означают обладание способностью связываться с биологической молекулой.Unless specifically stated otherwise, the terms "bioactive" and "biological activity" and "biological characteristics" in relation to a polypeptide of this invention means having the ability to bind to a biological molecule.

Выражение биологическая молекула относится к нуклеиновой кислоте, белку, углеводу, липиду и их комбинации. В одном варианте изобретения биологическая молекула существует в природе.The expression biological molecule refers to a nucleic acid, protein, carbohydrate, lipid, and combinations thereof. In one embodiment of the invention, the biological molecule exists in nature.

Участки антител, такие как Fab- и F(ab')₂-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе.Antibody regions such as Fab and F(ab') ₂ fragments can be prepared from whole antibodies using conventional methods such as papain or pepsin digestion of whole antibodies. Moreover, antibodies, antibody moieties, and immunoadhesion molecules can be prepared using standard recombinant DNA techniques, for example, as described herein.

Термин рекомбинантное антитело означает антитело, которое экспрессируется из клетки или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности), которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе.The term recombinant antibody means an antibody that is expressed from a cell or cell line containing a nucleotide sequence(s) that encodes antibodies, said nucleotide sequence(s) not naturally associated with the cell.

Термин вариантное антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его родительского антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков относительно последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеций и/или замены осуществляются на CDRучастках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела.The term variant antibody as used herein refers to an antibody having an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of its parent antibody by adding, deleting, and/or substituting one or more amino acid residues relative to the sequence of the parent antibody. In a preferred embodiment, the variant antibody contains at least one or more (e.g., one to twelve, e.g., two, three, four, five, six, seven, eight, or nine, ten, eleven, or twelve; and in some embodiments implementation of the invention from one to about ten) additions, deletions and/or substitutions of amino acids relative to the parent antibody. In some embodiments, additions, deletions, and/or substitutions are made to the CDR regions of a variant antibody. Sequence identity or homology to a variant antibody is defined herein as the percentage of amino acid residues in a variant antibody sequence that are identical to those of the parent antibody, after sequence alignment and gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity. The variant antibody retains the ability to bind to the same antigen, and preferably epitope, to which the parent antibody binds, and in some embodiments of the invention, at least one property or biological activity is superior to that of the parent antibody. For example, a variant antibody may have, for example, greater binding affinity, a longer half-life, a lower IC50 value, or an increased ability to inhibit the biological activity of an antigen compared to the parent antibody. Of particular interest herein is a variant antibody exhibiting biological activity greater than at least 2-fold (preferably at least 5-fold, 10-fold, or 20-fold) that of the parent antibody.

Термин биспецифичное антитело означает антитело, содержащее антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее двойной специфичностью или как являющееся антителом с двойной специфичностью.The term bispecific antibody means an antibody containing an antigen-binding domain or antigen-binding domains that are capable of specific binding to two different epitopes on the same biological molecule, or capable of specific binding to epitopes on two different biological molecules. A bispecific antibody is also referred to herein as being dual specific or as being a dual specific antibody.

Термин химерное антитело относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предThe term chimeric antibody refers broadly to an antibody that contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibodies, typically an antibody of part human and part non-human origin, i.e. derived in part from a non-human animal such as a mouse, rat or other rodent or camelid such as a llama or alpaca. Chimeric antibodies are

- 11 041915 почтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных тел у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела.- 11 041915 respectful compared to non-human antibodies in order to reduce the risk of an immune response directed against antibodies in humans, for example, a response directed against mouse bodies in humans in the case of a mouse antibody. An example of a typical chimeric antibody is one in which the variable region sequences are murine while the constant region sequences are human. In the case of a chimeric antibody, the non-human portions may be further modified to humanize the antibody.

Термин гуманизация относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, в частности, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR-участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDRучастков. Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела в каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно гуманизировать нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека, на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека.The term humanization refers to the fact that when an antibody is of wholly or partly non-human origin, such as a mouse or llama antibody obtained by immunizing mice or llamas, respectively, with an antigen of interest, or is a chimeric antibody based on such a mouse or llama antibody, one can to replace certain amino acids, in particular in the framework regions and constant domains of the heavy and light chains, in order to avoid or minimize the immune response in humans. The specificity of the interaction of the antibody with the target antigen is mainly inherent in the amino acid residues located in the six CDR regions of the heavy and light chains. Therefore, the amino acid sequences within the CDRs are much more variable between individual antibodies than those outside the CDRs. Because CDR sequences are responsible for most antibody-antigen interactions, it is possible to express recombinant antibodies that mimic the properties of a specific natural antibody, or more generally any specific antibody with a given amino acid sequence, for example, by constructing expression vectors that express the CDR sequences. -plots from a specific antibody to the framework sequences of another antibody. As a result, it is possible to humanize a non-human antibody and retain the binding specificity and affinity of the original antibody to a large extent. Although it is not possible to accurately predict the immunogenicity, and thus the immune response directed against an antibody in humans, to a particular antibody, non-human antibodies are generally more immunogenic than human antibodies. Chimeric antibodies in which foreign (eg, rodent or camel) constant regions have been replaced with sequences of human origin have shown generally lower immunogenicity than antibodies of completely foreign origin, and there is a tendency to use humanized or fully human antibodies in therapeutic antibodies. Chimeric antibodies or other antibodies of non-human origin can thus be humanized to reduce the risk of an immune response directed against the antibody in humans.

Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR участков), чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR-участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. Nсвязанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N-гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как рН и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, в частности, Asn-Gly в последовательности CDR-участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.For chimeric antibodies, humanization typically involves modification of the framework regions of the variable region sequences. Amino acid residues that are part of the complementarity determining regions (CDRs) will most often not be changed due to humanization, although in some cases it may be desirable to change individual amino acid residues of the CDR region, for example, to remove the glycosylation site, a deamidation site, an aspartate isomerization site, or an unwanted cysteine or methionine residue. N-linked glycosylation occurs by attaching an oligosaccharide chain to an asparagine residue in the tripeptide sequence Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, where X can be any amino acid other than Pro. Removal of the N-glycosylation site can be achieved by mutating the Asn or Ser/Thr residue with another residue, preferably by conservative substitution. Deamidation of asparagine and glutamine residues can occur depending on factors such as pH and surface exposure. Asparagine residues are particularly susceptible to deamidation, especially if they are present in the Asn Gly sequence, and to a lesser extent in other dipeptide sequences such as Asn-Ala. In the presence of such a deamidated site, in particular Asn-Gly in the sequence of the CDR region, it may be preferable to remove this site, usually by a conservative substitution to remove one of the residues involved.

В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела; см., например, обзор Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008). Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR-участков, например, когда химерные антитела мышиного происхождения задействуют идентификацию человеческих зародышевых генных эквивалентов к мышиным генам вариабельного участка и трансплантацию последовательностей мышиных CDR-участков в этот каркас. Трансплантация CDR участка может быть основана на определениях CDRучастков по Kabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210 225 (2007)) предполагается, что определение по IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). В некоторых случаях, трансплантация CDR-участкка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR-участки. Обратные мутации (иногда именуемые ремонт каркасного участка), могут применяться в выбранных положениях CDR трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, дляNumerous methods are known in the art for humanizing an antibody sequence; see, for example, a review by Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008). One of the most commonly used methods is CDR transplantation, for example, where murine-derived chimeric antibodies involve identifying human germline gene equivalents to mouse variable region genes and transplanting mouse CDR sequences into this scaffold. The transplantation of the CDR region may be based on the Kabat CDR region definitions, although a more recent publication (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210 225 (2007)) suggests that the IMGT® definition (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) can improve humanization outcome (see Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). In some cases, transplantation of the CDR region can reduce the specificity and binding affinity, and hence the biological activity, in the CDR transplanted non-human antibody, compared to the parent antibody from which the CDR regions are derived. Back mutations (sometimes referred to as frame repairs) can be applied at selected CDR positions of the transplanted antibody, typically in the framework regions, to

- 12 041915 того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки.- 12 041915 in order to restore the specificity and binding affinity of the parent antibody. Determination of positions for possible backmutations can be performed using information available in the literature and in antibody databases. Amino acid residues that are candidates for backmutation are typically located on the surface of the antibody molecule, while residues that are recessed or have low surface exposure will typically not be affected. An alternative humanization method to CDR grafting and backmutation is surface alteration in which non-human residues that are not exposed on the surface are retained while surface-exposed residues are changed into human residues.

Существует две технологии получения полностью человеческих антител: с использованием in vitro собранных фаговых библиотек или in vivo иммунизацией гуманизированных животных (мышей, крыс и т.д.).There are two technologies for obtaining fully human antibodies: using in vitro assembled phage libraries or in vivo immunization of humanized animals (mice, rats, etc.).

Фаговый дисплей является первой и самой широко распространенной in vitro технологией для поиска антител. В 1985 году Смит обнаружил, что последовательности чужеродной ДНК могут быть клонированы в нитевидный бактериофаг М13 таким образом, что клонированные последовательности генов экспрессируются на поверхности фаговых частиц как слитые белки (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317.). Таким образом, можно проводить селекцю интересующих нас слитых белков на основе их способности связывать другие белки. Это открытие было скомбинировано с методами ПЦР-амплификации, что позволило клонировать кДНК репертуар генов иммуноглобулинов для создания разнообразных фаговых библиотек, содержащих вариабельные домены, которые могут быть использованы для быстрого поиска мишень-специфичных моноклональных антител. Репертуар фаговых библиотек отражает репертуар антител В-лимфоцитов каждого человека или животного, кровь которого была использована при создании библиотеки. В 1995 году две статьи сообщили о создании генетически сконструированных мышей, которые экспрессировали полностью человеческие антитела, репертуар которых может быть соспоставим с полученных гибридомной технологией (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859; Green LL, Hardy MC, Maynard-Currie CE, Tsuda H, Louie DM, Mendez MJ, Abderrahim H, Noguchi M, Smith DH, Zeng Y et al.:Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet 1994, 7:13-21.) У этих животных были целенаправленно разрушены гены своих собственных эндогенных тяжелых и к легких цепей иммунноглобулинов и введены трансгены, представляющие собой сегменты генов тяжелых и к легких цепей человека. Оказалось, что репертуар генов человека может быть использован мышиной иммунной системой для создания высокоспецифичных и высокоаффинных антител ко большему разнообразию антигенов. Несмотря на то, что трансгенные мыши экспрессируют В-клеточные рецепторы, которые по существу являются гибридными мышиных и человеческих (человеческий иммуноглобулин, мышиные Iga, Ige и другие сигнальные молекулы), их В-клетки нормально развиваются и созревают. В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно как созревание аффиности и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).Phage display is the first and most widely used in vitro antibody detection technology. In 1985, Smith discovered that foreign DNA sequences could be cloned into the M13 filamentous bacteriophage in such a way that the cloned gene sequences were expressed as fusion proteins on the surface of phage particles (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface Science 1985, 228:1315-1317.). Thus, fusion proteins of interest can be selected based on their ability to bind other proteins. This discovery has been combined with PCR amplification techniques to clone the cDNA repertoire of immunoglobulin genes to create a variety of variable domain-containing phage libraries that can be used to rapidly search for target-specific monoclonal antibodies. The repertoire of phage libraries reflects the antibody repertoire of B-lymphocytes of each person or animal whose blood was used to create the library. In 1995, two papers reported the creation of genetically engineered mice that expressed fully human antibodies with a repertoire comparable to that obtained by hybridoma technology (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications Nature 1994, 368:856-859;Green LL, Hardy MC, Maynard-Currie CE, Tsuda H, Louie DM, Mendez MJ, Abderrahim H, Noguchi M, Smith DH, Zeng Y et al.: Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs Nat Genet 1994, 7:13-21.) the genes of their own endogenous heavy and k light chains of immunoglobulins were purposefully destroyed and transgenes were introduced, which are segments of the human heavy and k light chain genes. It turned out that the repertoire of human genes can be used by the mouse immune system to create highly specific and high affinity antibodies to a greater variety of antigens. Although transgenic mice express B cell receptors that are essentially a hybrid of mouse and human (human immunoglobulin, mouse Iga, Ige, and other signaling molecules), their B cells develop and mature normally. In some cases, it may also be preferable to change one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity for the target epitope. This is known as affinity maturation, and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where humanization of an antibody results in a decrease in binding specificity or affinity, and it is not possible to sufficiently improve binding specificity or affinity by backmutations alone. Various methods of affinity maturation are known in the art, for example, the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), and the stepwise in vitro affinity maturation method proposed by Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998).

Термин моноклональное антитело или mAb относится к антителу, которые синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.The term monoclonal antibody or mAb refers to an antibody that is synthesized and isolated from a single clonal population of cells. The clonal population may be a clonal population of immortalized cells. In some embodiments, the immortalized cells in the clonal population are hybrid cells, hybridomas, which are typically obtained by fusing individual B lymphocytes from immunized animals with individual lymphocytic tumor cells. Hybridomas are an engineered cell type and do not occur naturally.

Нативные антитела обычно являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен сNative antibodies are usually heterotetrameric glycoproteins with a molecular weight of about 150,000 daltons, consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to the heavy chain by a single covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds between heavy chains varies between immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has evenly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by several constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at the other end. The light chain constant domain is aligned with

- 13 041915 первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.- 13 041915 the first heavy chain constant domain, and the light chain variable domain is aligned with the heavy chain variable domain. I believe that specific amino acid residues form the interface between the variable domains of the light chain and the heavy chain.

Определение выделенный (изолированный), применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, при использовании секвенатора с вращающейся стеклянной чашечкой (секвенатора Эдмана), или (2) до гомогенности методом SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитела in situ внутри рекомбинантных клеток, так как по меньшей мере один компонент природной среды полипептида отсутствует. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.The term isolated (isolated) used to describe the various antibodies as described herein means an antibody that has been identified and isolated and/or regenerated from a cell or cell culture in which it is expressed. Impurities (contaminants) from the natural environment are materials that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. In preferred embodiments, the antibody is purified (1) to a degree sufficient to obtain at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence using a rotating glass cup sequencer (Edman sequencer), or (2) to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie brilliant blue or preferably silver stain. An isolated antibody includes antibodies in situ within the recombinant cells, since at least one component of the natural environment of the polypeptide is missing. Typically, an isolated polypeptide is obtained by at least one purification step.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислотыпримеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия антитела, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.An isolated nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one nucleic acid molecule of the contaminant with which it is normally associated in the natural source of an antibody nucleic acid. An isolated nucleic acid molecule is different from the form or set in which it occurs naturally. Thus, an isolated nucleic acid molecule is different from a nucleic acid molecule that exists naturally in cells. However, an isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule found in cells in which the antibody is normally expressed, for example, if the nucleic acid molecule has a different chromosomal localization from its natural cell localization.

Термин эпитоп при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула). Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи Сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть линейным или конформационным. В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном.The term epitope as used herein refers to the portion (determinant) of an antigen that specifically binds to a binding molecule (eg, and an antibody or related molecule, such as a bispecific binding molecule). Epitopic determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or carbohydrates or sugar side chains and typically have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. An epitope may be linear or conformational. In a linear epitope, all points of interaction between a protein (such as an antigen) and an interacting molecule (such as an antibody) occur linearly along the protein's primary amino acid sequence. In a conformational epitope, points of interaction occur through amino acid residues on the protein separated from each other in the primary amino acid sequence. Once the desired antigen epitope has been determined, antibodies to that epitope can be generated using techniques well known in the art. In addition, the generation and characterization of antibodies or other binding molecules may shed light on information about desirable epitopes. Based on this information, binding molecules can then be competitively screened for binding to the same or similar epitopes, for example by conducting competition studies to find binding molecules that compete for antigen binding.

Термин пептидный линкер в настоящем документе означает любой пептид с возможностью соединения доменов с длиной в зависимости от доменов, которые он связывает между собой, содержащий любую аминокислотную последовательность.The term peptide linker as used herein means any peptide with the ability to connect domains of length depending on the domains it links together, containing any amino acid sequence.

Предпочтительно пептидный линкер имеет длину более 5 аминокислот и состоит из любого набора аминокислот, выбранного из G, A, S, Р, Е, Т, D, K.Preferably, the peptide linker is greater than 5 amino acids in length and is comprised of any set of amino acids selected from G, A, S, P, E, T, D, K.

Понятие эффекторная функция антитела относится к видам биологической активности, связанным с Fc-областью (нативной последовательностью Fc-области или с вариантами аминокислотной последовательности Fc-области) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: Clq - связывание; комплементзависимая цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и В-клеточная активация.The term antibody effector function refers to the biological activities associated with the Fc region (native sequence Fc region or Fc region amino acid sequence variants) of an antibody, and vary depending on the isotype of the antibody. Examples of antibody effector functions are: Clq - binding; complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody-mediated cell-dependent cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; down regulation of cell surface receptors (eg B cell receptor, BCR) and B cell activation.

Зависимая от антител опосредованная клетками цитотоксичность и ADCC относятся к опосредованному клетками ответу, при котором неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в табл. 3 на странице 464 в публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Чтобы оценить активность в ADCC представляющей интерес молекулы можно осуществить анализы ADCC in vitro, такиеAntibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and ADCC refer to a cell-mediated response in which non-specific cytotoxic cells that express Fc receptors (FcRs) (e.g., natural killer (NK) cells, neutrophils, and macrophages) recognize the bound antibody on the target cell. and then cause lysis of the target cell. The primary cells for mediating ADCC, NK cells, only express FcyRIII, while monocytes express FcyRI, FcyRII and FcyRIII. FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 1. 3 on page 464 in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). To evaluate the ADCC activity of a molecule of interest, in vitro ADCC assays can be performed, such as

- 14 041915 как анализы, описанные в патентах США № 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клеткикиллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как модель, описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).- 14 041915 as the assays described in US Pat. Nos. 5,500,362 or 5,821,337. Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and natural killer (NK) cells. Alternatively or additionally, the ADCC activity of a molecule of interest can be assessed in vivo, for example, in an animal model such as that described in Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

Эффекторными клетками человека являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcyRIH и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительны РВМС и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из крови или РВМС, как описано в настоящей публикации.Human effector cells are leukocytes that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcyRIH and perform an ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils; with PBMC and NK cells being preferred. Effector cells can be isolated from their natural source, such as blood or PBMC, as described in this publication.

Термины Fc-рецептор и FcR используют для описания рецептора, который связывается с Fcобластью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор), и к предпочтительным рецепторам относятся рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсируемые формы указанных рецепторов. Рецепторы FcyRII включают FcyRIIA (активирующий рецептор) и FcyRIIB (ингибирующий рецептор), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcyRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив активации иммунорецептора (ITAM). Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив ингибирования иммунорецептора (ITIM) (см. обзор в Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Обзор, посвященный FcR, представлен в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в настоящем описании в термин FcR. Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).The terms Fc receptor and FcR are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody. A preferred FcR is a native sequence human FcR. In addition, a preferred FcR is an FcR that binds an IgG antibody (gamma receptor), and preferred receptors include the FcyRI, FcyRII, and FcyRIII subclasses, including allelic variants and alternatively splicable forms of these receptors. FcyRII receptors include FcyRIIA (activating receptor) and FcyRIIB (inhibiting receptor), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains. The activating receptor FcyRIIA contains an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain. The inhibitory receptor FcyRIIB contains in its cytoplasmic domain a tyrosine-based immunoreceptor inhibition motif (ITIM) (reviewed in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). For an overview of FcR, see Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al. Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Other FcRs, including FcRs that will be identified in the future, are included in the present description in the term FcR. The term also includes the neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

Комплементзависимая цитотоксичность и CDC относятся к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с молекулой (например, антителом) в комплексе со своим антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента можно осуществить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).Complement dependent cytotoxicity and CDC refer to the ability of a molecule to lyse a target in the presence of complement. The complement activation pathway is initiated by the binding of the first component of the complement system (Clq) to a molecule (eg, antibody) in complex with its antigen. To evaluate complement activation, a CDC assay can be performed, for example, as described in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Термин идентичность или гомологичность следует толковать как означающее процентное содержание остатков аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после сравнения последовательностей и введения брешей, если необходимо достичь максимального процента идентичности для полной последовательности и не учитывая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Ни N- или С-концевой удлиняющей, ни инсерционные сегменты не следует толковать как уменьшающие идентичность или гомологичность. Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны. Идентичность последовательности можно определить, используя программное обеспечение для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). Данное программное обеспечение подходит для подобных последовательностей путем определения степени гомологичности для разнообразных замещений, делеций (элиминирований) и других модификаций.The term identity or homology should be interpreted as meaning the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to those of the corresponding sequence to which it is being compared, after comparing sequences and introducing gaps, if it is necessary to achieve the maximum percent identity for the overall sequence and disregarding any conservative substitutions as part of the sequence identity. Neither the N- or C-terminal extension nor insertion segments should be interpreted as reducing identity or homology. Methods and computer programs for comparison are well known. Sequence identity can be determined using sequence analysis software (eg, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). This software is suitable for such sequences by determining the degree of homology for a variety of substitutions, deletions (eliminations) and other modifications.

Фразу гомологичный, что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих по крайней мере 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты.The phrase homologous, with respect to the polypeptide sequence of an antibody, should be interpreted as an antibody showing at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% and most preferably 95% sequence identity relative to the polypeptide sequence. A term in relation to a nucleic acid sequence should be interpreted as a sequence of nucleotides showing at least 85%, preferably 90%, more preferably 95% and most preferably 97% sequence identity relative to the nucleic acid sequence.

Предлагается модификация(и) аминокислотных последовательностей антител, описанных в настоящей публикации. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают введением соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеций, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Осуществляют любое сочетание делеций, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы в антителе, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования.Proposed modification(s) of the amino acid sequences of the antibodies described in this publication. For example, it may be desirable to improve the binding affinity and/or other biological properties of an antibody. Amino acid sequence variants of an antibody are generated by introducing appropriate nucleotide changes into the antibody nucleic acid or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions and/or insertions and/or substitutions of residues in the amino acid sequences of the antibody. Any combination of deletions, insertions, and substitutions is carried out to produce the final construct, provided that the final construct has the desired characteristics. Amino acid changes can also change post-translational processes in the antibody, such as changing the number or position of glycosylation sites.

- 15 041915- 15 041915

Вариант модификации аминокислотных последовательностей антител с помощью аминокислотных замен. Такой вариант представляет собой замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка в молекуле антитела на другой остаток. Места, представляющие наибольший интерес для мутагенеза путем замен, включают гипервариабельные области или CDR, но также предполагаются изменения и в области FR или Fc. Консервативные замены показаны в табл. 1 под заголовком предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены дополнительные существенные изменения, названные примерами заменам в табл. А, или изменения, дополнительно описанные ниже при описании классов аминокислот, и может быть проведен скрининг про дуктов.Modification of the amino acid sequences of antibodies using amino acid substitutions. Such a variant is the replacement of at least one amino acid residue in the antibody molecule with another residue. The sites of greatest interest for substitution mutagenesis include the hypervariable regions or CDRs, but changes in the FR or Fc regions are also contemplated. Conservative substitutions are shown in table. 1 under the heading preferred replacements. If such substitutions lead to a change in biological activity, then additional significant changes can be introduced, called examples of substitutions in table. A, or changes further described below in the description of amino acid classes, and product screening may be performed.

Таблица АTable A

Исходный остаток original remainder Примеры замены Replacement examples Предпочтительные замены Preferred Substitutions Ala (А) Ala (A) Vai; Leu; He wai; Leu; He Vai Vai Arg(R) Asn(Ν) Asp (D) Cys (C) Gln(Q) Glu (E) Gly(G) His (H) He (I) Leu (L) Lys (K) Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C)Gln(Q) Glu(E) Gly(G) His(H) He(I) Leu(L) Lys (K) Lys; Gin; Asn Gin; His; Asp, Lys; Arg Glu; Asn Ser; Ala Asn; Glu Asp; Gin Ala Asn; Gin; Lys; Arg Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Норлейцин Норлейцин; lie; Vai; Met; Ala; Phe Arg; Gin; Asn Lys; gin; Asn gin; His; Asp, Lys; Arg Glu; Asn Ser; Ala asn; Glu asp; gin Ala asn; gin; Lys; Arg Leu; wai; met; Ala; Ph; Norleucine Norleucine; lie; wai; met; Ala; Phe Arg; gin; Asn Lys Gin Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu He Arg Lys gin Glu Ser Asn asp Ala Arg Leu He Arg Met (M) Met(M) Leu; Phe; He Leu; Ph; He Leu Leu Phe(F) Phe(F) Trp; Leu; Vai; He; Ala; Tyr trp; Leu; wai; He; Ala; Tyr Tyr Tyr Pro (P) Pro (P) Ala Ala Ala Ala Ser(S) Ser(S) Thr Thr Thr Thr Thr (T) Thr(T) Vai; Ser wai; Ser Ser Ser Trp(W) Trp(W) Tyr; Phe Tyr; Phe Tyr Tyr Tyr(Y) Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser trp; Ph; Thr; Ser Phe Phe Vai (V) Wai (V) He; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин He; Leu; met; Ph; Ala; Norleucine Leu Leu

Термины нуклеиновая кислота, нуклеиновая последовательность или нуклеиновокислотная последовательность, полинуклеотид, олигонуклеотид, полинуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность, которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двуцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.The terms nucleic acid, nucleic sequence or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, and nucleotide sequence, as used interchangeably in this specification, refer to a distinct sequence of nucleotides, whether or not modified, defining a fragment or region of a nucleic acid, whether or not containing unnatural nucleotides. and being either double-stranded DNA or RNA, or single-stranded DNA or RNA, or transcription products of said DNA.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии.It should also be mentioned here that the present invention does not apply to nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, i.e. in a natural state.

Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например путем копирования, при этом их среда была, по меньшей мере, частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клетокхозяев), или полученные путем химического синтеза.The sequences of the present invention have been isolated and/or purified, i. were taken directly or indirectly, for example by copying, while their environment was at least partially modified. Thus, isolated nucleic acids obtained by genetic recombination, for example by host cells, or obtained by chemical synthesis, are also to be understood here.

Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.The reference to the nucleotide sequence covers its compliment unless otherwise noted. Thus, reference to a nucleic acid having a particular sequence is to be understood as encompassing its complementary strand with its complementary sequence.

Выражение контролирующие последовательности относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариоThe expression control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. Control sequences suitable for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator, and a ribosome binding site. It is well known that in eukaryotes

- 16 041915 тических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.- 16 041915 tic cells contain promoters, polyadenylation signals and enhancers.

Нуклеиновая кислота функционально связана, если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связавают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, функционально связан обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем встраивания лигированием в существующие сайты рестрикции. Если такие сайты не существуют, то согласно известной практике применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.A nucleic acid is operably linked if it is operably linked to another nucleotide sequence. For example, a DNA presequence or secretory leader sequence is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is located such that it can facilitate translation. In general, operably linked means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, are contiguous and in read phase. However, enhancers do not need to be contiguous. Linking is accomplished by insertion by ligation into existing restriction sites. If such sites do not exist, it is known practice to use synthetic oligonucleotide adapters or linkers.

Термин вектор при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как рекомбинантные экспрессирующие векторы (или просто экспрессирующие векторы).The term vector as used herein means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked. In some embodiments, the vector is a plasmid, i.e. a circular double-stranded piece of DNA into which additional DNA segments can be ligated. In some embodiments, the vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome. In some embodiments, the vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and mammalian episomal vectors). In other embodiments, the vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) can be integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell, and thus replicate along with the host's genome. Moreover, some vectors are capable of directing the expression of the genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as recombinant expression vectors (or simply expression vectors).

Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткамхозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена триспецифичной связывающей молекулы по данному изобретению. Следует понимать, что рекомбинантная клетка-хозяин и клетка-хозяин означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина клетка-хозяин при использовании в настоящем документе.The term recombinant host cell (or simply host cell) as used herein means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced. The present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above. The present invention also provides host cells that include, for example, a nucleotide sequence encoding a heavy chain or antigen-binding portions thereof, a nucleotide sequence encoding a light chain or antigen-binding portions thereof, or both, a first binding domain and/or a second binding domain of a trispecific binding molecules of this invention. It should be understood that recombinant host cell and host cell mean not only the specific claimed cell, but also the progeny of such a cell. Since modifications can take place in subsequent generations due to mutation or environmental influences, such progeny may not actually be identical to the parent cell, but such cells are still included within the scope of the term host cell as used herein.

Термин эксципиент используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличающегося от соединения(ий) по данному изобретению.The term excipient is used herein to describe any ingredient other than the compound(s) of this invention.

Фармацевтическая композиция обозначает композицию, включающую в себя антитело согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубриканPharmaceutical composition means a composition comprising an antibody according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, solvents, diluents, carriers, auxiliary, distributing and receiving agents, delivery vehicles, such as preservatives, stabilizers, fillers, grinders, humectants, emulsifiers, suspending agents, thickeners, sweeteners, flavors, flavors, antibacterial agents, fungicides, lubricants, sustained delivery regulators, the choice and proportion of which depends on the nature and method of administration and dosage. Examples of suspending agents are ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene, sorbitol and sorbitol ether, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, as well as mixtures of these substances. Protection against the action of microorganisms can be provided with a variety of antibacterial and antifungal agents, such as parabens, chlorobutanol, sorbic acid, and the like. The composition may also include isotonic agents such as sugars, sodium chloride and the like. Prolonged action of the composition can be provided with agents that slow down the absorption of the active principle, for example, aluminum monostearate and gelatin. Examples of suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols and mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil) and injectable organic esters (such as ethyl oleate). Examples of fillers are lactose, milk sugar, sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate and the like. Examples of grinders and spreaders are starch, alginic acid and its salts, silicates. Examples of lubricants

- 17 041915 тов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.- 17 041915 Commodities are magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, talc, and polyethylene glycol with a high molecular weight. A pharmaceutical composition for oral, sublingual, transdermal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, topical or rectal administration of the active principle, alone or in combination with another active principle, can be administered to animals and humans in standard form of administration as a mixture with conventional pharmaceutical carriers. Suitable unit administration forms include oral forms such as tablets, gelatin capsules, pills, powders, granules, chewing gums and oral solutions or suspensions, sublingual and buccal administration forms, aerosols, implants, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular administration forms and rectal administration forms.

Лекарственное средство (препарат) - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции) в виде таблеток, капсул, инъекций, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.Medicinal product (preparation) - a substance (or a mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition) in the form of tablets, capsules, injections, ointments and other finished forms, intended to restore, correct or change physiological functions in humans and animals, as well as for the treatment and disease prevention, diagnostics, anesthesia, contraception, cosmetology and other.

Термин заболевание или нарушение, опосредованное PD-L1 подразумевает все заболевания или нарушения, которые либо прямо, либо косвенно связаны с PD-L1, включая этиологию, развитие, прогресс, персистентность или патологию заболевания или нарушения.The term PD-L1 mediated disease or disorder refers to all diseases or disorders that are either directly or indirectly related to PD-L1, including the etiology, development, progression, persistence or pathology of the disease or disorder.

Лечить, лечение и терапия относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, чтобы облегчить болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на лечение включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.Treat, cure and therapy refer to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and/or at least one of its accompanying symptoms. As used herein to alleviate a disease, disease, or condition, means to reduce the severity and/or frequency of occurrence of symptoms of the disease, disorder, or condition. In addition, references to treatment contained herein include references to curative, palliative, and prophylactic therapy.

В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом.In one aspect, the subject of treatment or patient is a mammal, preferably a human subject.

Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского возраста любого возраста.The above subject may be male or female of any age.

Термин нарушение означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения. Неограничивающие примеры подлежащих лечению заболеваний включают в себя доброкачественные и злокачественные опухоли; лейкозы и лимфоидные злокачественные новообразования, в частности рак молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы, предстательной железы или мочевого пузыря; нейронные, глиальные, астроцитальные, гипоталамусные и другие гландулярные, макрофаговые, эпителиальные, стромальные и бластоцельные нарушения; воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения. Предпочтительным подлежащим лечению нарушением согласно изобретению являются рак.The term disorder means any condition that can be improved as a result of the treatment of the present invention. The definition of this term includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that predispose a mammal to the occurrence of this disorder. Non-limiting examples of diseases to be treated include benign and malignant tumors; leukemias and lymphoid malignancies, in particular cancer of the breast, ovary, stomach, endometrium, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas, prostate or bladder; neuronal, glial, astrocytic, hypothalamus and other glandular, macrophage, epithelial, stromal and blastocele disorders; inflammatory, angiogenic and immunological disorders. The preferred disorder to be treated according to the invention is cancer.

Термины рак или раковый относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым(ой) ростом/пролиферацией клеток. Это определение охватывает доброкачественные и злокачественные раковые заболевания. Примеры раковых заболеваний включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая рак ЖКТ, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, цервикальный рак, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки (почечноклеточную карциному), рак предстательной железы (рак простаты), рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, карциному анального канала, карциному пениса, меланому и различные типы рака головы и шеи.The terms cancer or cancerous refer to or describe a physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth/proliferation. This definition covers benign and malignant cancers. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell lung carcinoma, peritoneal cancer, hepatic cell carcinoma, gastric cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, cancer ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial and uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer (renal cell carcinoma), prostate cancer (prostate cancer), cancer of the external female genital organs, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma, melanoma, and various types of head and neck cancer.

Термины иммунный ответ, аутоиммунная реакция, аутоиммунное воспаление относятся, например, к действию лимфоцитов, антиген-представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, вырабатываемых указанными клетками или клетками печени (включая антитела, цитокины и комплемент, образующиеся в результате селективного повреждения, разрушения или элиминации из человеческого организма инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей).The terms immune response, autoimmune reaction, autoimmune inflammation refer, for example, to the action of lymphocytes, antigen presenting cells, phagocytic cells, granulocytes, and soluble macromolecules produced by said or liver cells (including antibodies, cytokines, and complement resulting from selective injury, destruction or elimination from the human body of invasive pathogens, pathogen-infected cells or tissues, cancer cells or, in cases of autoimmunity or pathological inflammation, normal human cells or tissues).

Терапевтически эффективным количеством считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.A therapeutically effective amount is the amount of a therapeutic agent administered during treatment that relieves to some extent one or more of the symptoms of the disease being treated.

Понятие хроническое применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента(ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживатьThe term chronic use refers to the continuous (long-term) use of the agent(s) as opposed to the acute (short-term) route of administration so as to maintain

- 18 041915 первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.- 18 041915 initial therapeutic effect (activity) over a long period of time.

Прерывистое применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.Intermittent use refers to a treatment that is not carried out sequentially without interruption, but which is rather intermittent in nature.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова иметь, включать и содержать или их вариации, такие как имеет, имеющий, включает, включающий, содержит или содержащий, следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.In the present description and in the following claims, unless the context otherwise requires, the words have, include, and contain, or variations thereof, such as has, having, includes, including, contains, or containing, should be understood to include the specified whole or group of integers, but not the exclusion of any other integer or group of integers.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

АнтителоAntibody

Настоящее изобретение относится к антителам или антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1 (лиганд 1 протеина программируемой смерти).The present invention relates to antibodies or antigennegative fragment that bind PD-L1 (programmed death protein ligand 1).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат:In one embodiment, the present invention provides an isolated antibody, or antigen-binding fragment thereof, that binds PD-L1 and contains:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).(a) a heavy chain variable region comprising a CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence homologous or identical APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), and (b) a light chain variable region containing a CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99% homologous or identical to the sequence of ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1 и содержат:In one embodiment, the present invention provides an isolated antibody, or antigen-binding fragment thereof, that binds PD-L1 and contains:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).(a) a heavy chain variable region containing a CDR3 with the amino acid sequence APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), and (b) a light chain variable region containing a CDR3 with the amino acid sequence ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связывают PD-L1, и содержат: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:In one embodiment, the present invention provides an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that binds PD-L1 and contains: (a) a heavy chain variable region comprising:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности DYAMS (SEQ ID NO: 1), (ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности DISWSGSNTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2), (iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую:(i) a CDR1 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous or identical to the DYAMS sequence (SEQ ID NO: 1), (ii) a CDR2 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous or identical to the DISWSGSNTNYADSVKG sequence (SEQ ID NO: 2), (iii) a CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous or identical to the sequence APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), and (b) a light chain variable region comprising:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности GLSSGTVTAINYPG (SEQ ID NO: 5), (ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности NTNTRHS (SEQ ID NO: 6), (iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).(i) a CDR1 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous or identical to the GLSSGTVTAINYPG sequence (SEQ ID NO: 5), (ii) a CDR2 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homologous or identical to the NTNTRHS sequence (SEQ ID NO: 6), (iii) a CDR3 with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous or identical to the sequence ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:(a) a heavy chain variable region comprising:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью DYAMS (SEQ ID NO: 1), (ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью DISWSGSNTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2), (iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3) и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую:(i) CDR1 with the amino acid sequence DYAMS (SEQ ID NO: 1), (ii) CDR2 with the amino acid sequence DISWSGSNTNYADSVKG (SEQ ID NO: 2), (iii) CDR3 with the amino acid sequence APLLLAMTFGVGS (SEQ ID NO: 3), and (b ) a light chain variable region containing:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью GLSSGTVTAINYPG (SEQ ID NO: 5), (ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью NTNTRHS (SEQ ID NO: 6), (iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).(i) CDR1 with the amino acid sequence GLSSGTVTAINYPG (SEQ ID NO: 5), (ii) CDR2 with the amino acid sequence NTNTRHS (SEQ ID NO: 6), (iii) CDR3 with the amino acid sequence ALYMGNGGHM (SEQ ID NO: 7).

(а) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности(a) a heavy chain variable region with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence homologous or identical

- 19 041915- 19 041915

EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYADEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD

SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4) и (b) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательностиSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4) and (b) a light chain variable region with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homologous or identical sequence

QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPDQTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPD

RFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTK (SEQ ID NO: 8).RFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTK (SEQ ID NO: 8).

(а) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью(a) a heavy chain variable region with the amino acid sequence

SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4), и (b) вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностьюSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4), and (b) a light chain variable region with an amino acid sequence

QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPEQTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPE

RFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTK (SEQ ID NO: 8)RFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTK (SEQ ID NO: 8)

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое связывает PD-L1 и содержит:In one embodiment, the present invention provides an isolated antibody that binds PD-L1 and contains:

(а) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательности(a) a heavy chain with an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous or identical sequence

EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9) и (b) легкую цепь с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичной или идентичной последовательностиEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9) и (b) легкую цепь с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% or 99% homologous or identical sequence

QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPD RFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP SSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 10).QTWTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTRHSGVPD RFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP SSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTP EQWKSHRSYSCQVTHEGSEKTVID.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое связывает PD-L1, и содержат:In one embodiment, the present invention provides an isolated antibody that binds PD-L1 and contains:

(а) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью(a) a heavy chain with the amino acid sequence

EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9), и (b) легкую цепь с аминокислотной последовательностьюEVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9), и (b) легкую цепь с аминокислотной последовательностью

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело, которое свя- 20 041915 зывает PD-L1, представляет собой моноклональное антитело.In one embodiment of the present invention, the isolated antibody that binds PD-L1 is a monoclonal antibody.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения моноклональное антитело, которое связывает PD-L1, представляет собой полноразмерное антитело IgG.In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody that binds PD-L1 is a full length IgG antibody.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека.In one embodiment, the full-length IgG antibody is of the human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 isotype.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1.In one embodiment, the full length IgG antibody is of the IgG1 isotype.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7.In one embodiment of the present invention, the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and contains a heavy chain variable region containing a CDR3 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region containing a CDR3 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR 1-3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1-3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR 1-3 с соответствующими аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 5-7.In one embodiment of the present invention, the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and contains a heavy chain variable region containing CDRs 1-3 with the corresponding amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-3, and a light chain variable region, containing CDR 1-3 with the corresponding amino acid sequences of SEQ ID NO: 5-7.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4 и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8.In one embodiment of the present invention, the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and contains a heavy chain variable region with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенное антитело представляет собой антитело BCD135, которое связывает PD-L1, и содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.In one embodiment of the present invention, the isolated antibody is a BCD135 antibody that binds PD-L1 and contains a heavy chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

Молекулы нуклеиновых кислотNucleic acid molecules

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, и последовательностям, кодирующим антитело к PD-L1 по данному изобретению, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения различные молекулы нуклеиновых кислот кодируют первый домен и второй домен аминокислотной последовательности антитела к PD-L1. Там, где первый домен и/или второй домен содержит тяжелую цепь и легкую цепь, в некоторых вариантах осуществления изобретения различные нуклеиновые кислоты кодируют тяжелую цепь и аминокислотные последовательности легкой цепи. В других вариантах осуществления изобретения та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность тяжелой цепи и аминокислот легкой цепи. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать любую комбинацию из аминокислотных последовательностей (например, последовательности тяжелой и легкой цепи) первого и второго домена. В конкретной варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты может кодировать аминокислотную последовательность первого связывающего домена и аминокислотную последовательность легкой цепи второго связывающего домена, необязательно включающей любую последовательность соединяющего их пептидного линкера. Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин полинуклеотид, упоминаемый в данном документе, означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% гомологичны или идентичны одной или нескольким нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NO: 1-3, 5-7. В определенных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичны или идентичны нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или 8. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичны одной или нескольким из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-10.The present invention also relates to nucleic acid molecules and sequences encoding the antibody to PD-L1 according to this invention, described in this document. In some embodiments, different nucleic acid molecules encode the first domain and the second domain of the amino acid sequence of an anti-PD-L1 antibody. Where the first domain and/or the second domain comprises a heavy chain and a light chain, in some embodiments, different nucleic acids encode the heavy chain and light chain amino acid sequences. In other embodiments, the same nucleic acid molecule encodes a heavy chain and light chain amino acid sequence. In certain embodiments, the nucleic acid molecule may encode any combination of amino acid sequences (eg, heavy and light chain sequences) of the first and second domains. In a specific embodiment of the invention, the nucleic acid molecule may encode the amino acid sequence of the first binding domain and the amino acid sequence of the light chain of the second binding domain, optionally including any sequence of the peptide linker connecting them. The reference to the nucleotide sequence covers its compliment unless otherwise noted. Thus, reference to a nucleic acid having a particular sequence is to be understood as encompassing its complementary strand with its complementary sequence. The term polynucleotide as used herein means a polymeric form of nucleotides, at least 10 bases in length, either ribonucleotides or deoxynucleotides, or a modified form of any type of nucleotide. The term includes single- and double-stranded forms. The present invention also relates to nucleotide sequences that are at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% homologous or identical to one or more nucleotide sequences encoding the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-3, 5-7. In certain embodiments, the nucleotide sequences are at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homologous or identical to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 8. The present invention also relates to nucleotide sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identical to one or more of the aforementioned nucleotide sequences encoding an amino acid a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9-10.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-10. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать любую комбинацию указанных нуклеотидных последовательностей. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную по- 21 041915 следовательность SEQ ID NO: 1-3 и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5-7. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 и нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.In one aspect, the present invention relates to a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-10. The nucleic acid molecule may also contain any combination of these nucleotide sequences. In one embodiment, the nucleic acid molecule contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another embodiment, the nucleic acid molecule contains nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of 21 041915 the sequence of SEQ ID NO: 1-3 and nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5-7. In one embodiment, the nucleic acid molecule contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In one embodiment, the nucleic acid molecule contains a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.In any of the above embodiments, the nucleic acid molecules may be isolated.

Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует антитело к PD-L1 или ее часть. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена.The nucleic acid molecule of the invention may be isolated from any source that produces an anti-PD-L1 antibody or a portion thereof. In certain embodiments, the nucleic acid molecule of the invention may be synthesized rather than isolated.

В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VH домен из первого или второго домена антитела к PD-L1 по данному изобретению, соединенного в рамках считывания с нуклеотидной последовательности, кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VL домен из первой или второй области антитела к PD-L1 по данному изобретению, объединеной в рамках считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника.In some embodiments, a nucleic acid molecule of the invention may comprise a nucleotide sequence encoding a VH domain from the first or second domain of an anti-PD-L1 antibody of the invention fused at readout to a nucleotide sequence encoding a heavy chain constant domain from any source. Likewise, a nucleic acid molecule of the invention may comprise a nucleotide sequence encoding a VL domain from the first or second region of an anti-PD-L1 antibody of the invention combined in readout with a nucleotide sequence encoding a light chain constant domain from any source.

В еще одном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей первого или второго связывающего домена, могут преобразовываться по всей длине генов антитела. В одном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены VH или VL преобразуются в гены антитела по всей длине путем вставки в экспрессионный вектор, уже кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН) или легкой цепи (CL), соответственно, так что VH сегмент функционально соединен с СН сегментом(ами) в векторе и/или VL сегмент оперативно соединен с CL сегментом в векторе. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL домены преобразуются в гены по всей длине антитела путем соединения, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH и/или VL домены, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или CL домены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие по всей длине тяжелую и/или легкую цепи, могут затем экспрессироваться из клетки, в которую они были введены.In another aspect of the present invention, nucleic acid molecules encoding the variable domain of the heavy (VH) and/or light (VL) chains of the first or second binding domain can be converted throughout the genes of the antibody. In one embodiment of the invention, nucleic acid molecules encoding VH or VL domains are converted into antibody genes over their entire length by insertion into an expression vector already encoding heavy chain (CH) or light chain (CL) constant domains, respectively, such that the VH segment is functionally connected to the CH segment(s) in the vector; and/or the VL segment is operatively connected to the CL segment in the vector. In another embodiment of the invention, nucleic acid molecules encoding VH and/or VL domains are converted into genes along the entire length of the antibody by joining, for example, ligating, a nucleic acid molecule encoding VH and/or VL domains to a nucleic acid molecule encoding CH and /or CL domains using standard molecular biology techniques. Nucleic acid molecules encoding the full length of the heavy and/or light chain can then be expressed from the cell into which they have been introduced.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии большого количества рекомбинантных антител к PD-L1.Nucleic acid molecules can be used to express a large number of recombinant anti-PD-L1 antibodies.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для получения человеческих антител, гуманизированных антител, химерных антител, биспецифических антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, диател, мутированных антител и производных антител, как описано в настоящем документе.Nucleic acid molecules can be used to generate human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, bispecific antibodies, single chain antibodies, immunoadhesins, diabodies, mutated antibodies, and antibody derivatives as described herein.

ВекторVector

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.In yet another aspect, the present invention relates to a vector suitable for the expression of any of the nucleotide sequences described herein.

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей антител к PD-L1 или их частей (например, последовательностей тяжелой цепи первого и/или тяжелой и/или легкой цепи второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител.The present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode any of the amino acid sequences of antibodies to PD-L1 or parts thereof (for example, the heavy chain sequences of the first and/or the heavy and/or light chain of the second binding domain) as described herein . The present invention further relates to vectors containing nucleic acid molecules encoding fusion proteins, modified antibodies, antibody fragments.

В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот и векторы могут быть использованы для изготовления мутировавших антител к PD-L1. Антитела могут мутировать в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей первого и/или тяжелой и/или легкой цепей второго связывающего домена, например, для изменения связывающей способности антител к PD-L1. Например, мутация может произойти в одном или нескольких CDR-участках, чтобы увеличить или уменьшить K_Dантител к PD-L1, чтобы увеличить или уменьшить ko_ff или изменить специфичность связывания антитела в отношении к PD-L1. В другом варианте осуществления изобретения одной или более мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в антителе, соответствующем первому или второму связывающему домену антитела к PD-L1 по данному изобретению. Эти мутации могут быть сделаны в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена, или в константном домене. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутации произведены в вариабельном домене. В другом варианте осуществления изобретения одной или не- 22 041915 скольким мутациям подвергнут аминокислотный остаток, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена антитела к PD-L1 по данному изобретению.In another embodiment, nucleic acid molecules and vectors can be used to make mutated anti-PD-L1 antibodies. Antibodies can be mutated in the heavy and/or light chain variable domains of the first and/or heavy and/or light chains of the second binding domain, for example, to change the binding ability of antibodies to PD-L1. For example, a mutation can occur in one or more CDR regions to increase or decrease the K _D of an anti-PD-L1 antibody, to increase or decrease _koff , or to change the binding specificity of an antibody for PD-L1. In another embodiment, one or more mutations are made on an amino acid residue known to be altered from the germline in an antibody corresponding to the first or second binding domain of an anti-PD-L1 antibody of the invention. These mutations can be made in the CDR or framework region of the variable domain, or in the constant domain. In a preferred embodiment of the invention, the mutations are in the variable domain. In another embodiment, one or more mutations are made to an amino acid residue known to be altered from the germline in the CDR or framework region of the variable domain of an anti-PD-L1 antibody of the invention.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитела к PD-L1 по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК, кодирующей частично или полностью последовательность первого и второго связывающего домена (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательности тяжелой и легкой цепи), полученный, как описано выше, в экспрессионных векторах таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).In some embodiments, the anti-PD-L1 antibodies of the invention are expressed by inserting DNA encoding part or all of the first and second binding domain sequences (e.g., heavy and light chain sequences, where the binding domain comprises heavy and light chain sequences) obtained , as described above, in expression vectors such that the genes are operably linked to the necessary expression control sequences, such as transcriptional and translational control sequences. Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAVs), plant viruses such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic viruses, cosmids, YAC, EBV derived episomes, and the like. The DNA molecules can be ligated into the vector such that transcription and translation control sequences in the vector perform their intended function of regulating transcription and translation of the DNA. The expression vector and expression control sequences can be chosen to be compatible with the expression host cell used. DNA molecules encoding part or all of the first and second binding domain sequences (eg, heavy and light chain sequences, where the binding domain contains the heavy and light chain sequence) can be introduced into separate vectors. In one embodiment of the invention, any combination of the above DNA molecules is introduced into the same expression vector. DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (eg, ligation of complementary restriction sites on the gene fragment of the antibody and the vector, or blunt-end ligation if no restriction sites are present).

Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС - и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации соответствующей мРНК. Интронные последовательности находятся в окружении сплайс-донора и сплайс-акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов. Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы).A suitable vector is one that encodes operably completed human immunoglobulin CH or CL sequences, with the appropriate restriction site designed such that any VH or VL sequence can be easily incorporated and expressed as described above. The HC- and LC-coding of genes in such vectors may contain intron sequences that result in an overall increase in antibody protein products by stabilizing the corresponding mRNA. The intron sequences are surrounded by splice-donor and splice-acceptor sites that determine where RNA splicing will occur. The location of the intron sequences can be either in the variable or constant regions of the antibody chains, or in both the variable and constant regions when multiple introns are used. Termination of polyadenylation and transcription can occur downstream of the native chromosome site of the encoded regions. The recombinant expression vector may also encode a signal peptide that facilitates production of the antibody chain by the host cell. The antibody chain gene can be cloned into a vector such that the signal peptide is linked to the amino terminus of the immunoglobulin chain. The signal peptide can be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (ie, a signal peptide of a non-immunoglobulin protein).

Помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промотеры и/или энхансеры полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотера/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотера/энхансера), аденовируса, (например, аденовирус большого позднего промотора (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промотеров млекопитающих, таких как нативный иммуноглобулин и актин промотеров. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, патенты США 5168062, 4510245 and 4968615. Способы экспрессии связывающих молекул, таких как антитела растений, в том числе описание промотеров и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области техники. См., например, патент США 6517529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.In addition to the antibody gene chain, recombinant expression of the vectors of this invention can carry regulatory sequences that control the expression of antibody chain genes in the host cell. Those skilled in the art will appreciate that the design of the expression vector, including the choice of regulatory sequences, may depend on such factors as the selection of the host cell for transformation, the level of expression of the desired protein, and so on. Preferred regulatory sequences for a mammalian expression host cell include viral elements that provide high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and/or enhancers derived from retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (e.g., CMV promoter/enhancer), simian virus 40 ( SV40) (eg SV40 promoter/enhancer), adenovirus (eg adenovirus large late promoter (AdMLP)), polyoma virus, and strong mammalian promoters such as native immunoglobulin and actin promoters. For further descriptions of viral regulatory elements and their sequences, see, for example, US Pat. Nos. 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. . See, for example, US Pat. No. 6,517,529. Methods for expressing polypeptides in bacterial or fungal cells, such as yeast cells, are also well known in the art.

В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418,In addition to the antibody chain genes and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the invention may carry additional sequences, such as sequences that regulate the replication of the vector in host cells (eg, origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, for example, US Pat. For example, typically a selectable marker gene confers resistance to drugs such as G418,

- 23 041915 гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах при селекции/амплификации метотрексата), ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.- 23 041915 hygromycin or methotrexate, to the host cell into which the vector is introduced. For example, selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr host cells in methotrexate selection/amplification), the neo gene (for G418 selection), and the glutamate synthetase gene.

Термин последовательность контроля экспрессии, используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотер рибосомального сайта связывания, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промотеры и последовательности терминации транскрипции. Термин контролирующие последовательности включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.The term expression control sequence as used herein means polynucleotide sequences that are necessary to affect the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated. Expression control sequences include the appropriate transcription initiation, termination, promoter, and enhancer sequences; efficient RNA processing signals such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (ie Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, optionally, sequences that enhance protein secretion. The nature of such control sequences varies depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a ribosomal binding site promoter as well as transcription termination sequences; in eukaryotes, such control sequences typically include promoters and transcription termination sequences. The term control sequences includes, at a minimum, all components whose presence is essential for expression and processing, and may also include additional components whose presence is beneficial, such as leader sequences and fused cell sequences.

Клетки-хозяеваHost cells

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способам получения антител к PD-L1 по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения антител к PD-L1, как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать антитело к PD-L1, культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продукции антитела к PD-L1 и выделение полученного антитела к PD-L1. Антитело к PD-L1, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах упоминается в данном документе как рекомбинантные антитела к PD-L1. Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и антителам к PD-L1, получаемым аналогично.An additional aspect of the present invention relates to methods for producing antibodies to PD-L1 according to this invention. One embodiment of the invention relates to a method for producing antibodies to PD-L1 as defined herein, comprising obtaining a recombinant host cell capable of expressing an antibody to PD-L1, culturing said host cell under conditions suitable for the production of an antibody to PD-L1 L1 and isolation of the resulting anti-PD-L1 antibody. An anti-PD-L1 antibody produced by such expression in such recombinant host cells is referred to herein as recombinant anti-PD-L1 antibodies. The invention also relates to cell progeny of such host cells and antibodies to PD-L1 obtained similarly.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к PD-L1 по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клеткихозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран-опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибренопосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области.Nucleic acid molecules encoding the anti-PD-L1 antibodies of the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or cell, plant or cell, bacterial or yeast host cell. Transformation can take place by any known method for introducing polynucleotides into a host cell. Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, transfection with a nucleic acid-positively charged polymer complex, transfection with a nucleic acid-calcium phosphate precipitate, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, transfection with liposome-encapsulated polynucleotides, and direct microinjection. DNA in the nucleus. In addition, nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells with viral vectors. Methods for transfecting cells are well known in the art. See, for example, US Pat. Nos. 4,399,216; 4,912,040; Techniques for transforming bacterial and yeast cells are also well known in the art.

Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, в частности, клетки яичников китайского хомячка (СНО), NS0 клетки, клетки SP2, HEK293T клетки, 293 Фристайл клетки (Invitrogen), NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК), клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие антитела к PD-L1, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антител в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения антител в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела к PD-L1 могут быть выделены из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды E.coli и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immortalized cell lines available. These include, but are not limited to, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, NS0 cells, SP2 cells, HEK293T cells, 293 Freestyle cells (Invitrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, Hamster Kidney (BHK) cells, African Green Kidney cells marmoset (COS), human hepatocellular carcinoma cells (eg, Hep G2), A549 cells, and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the desired characteristics of the protein produced. Other cell lines that can be used are insect cell lines such as Sf9 or Sf21 cells. When recombinant expression vectors encoding anti-PD-L1 antibodies are introduced into mammalian host cells, antibodies are produced by culturing the host cells for a time sufficient to express the antibodies in the host cells or, preferably, isolating the antibodies into a culture medium in which host cells are grown. Anti-PD-L1 antibodies can be isolated from culture media using standard protein purification methods. Plant host cells, for example, include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potato, and so on. Host bacterial cells include E. coli and Streptomyces species. Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.

Кроме того, уровень продукции антител к PD-L1 по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии генаIn addition, the level of production of antibodies to PD-L1 according to this invention from the producing cell line can be enhanced using a number of known methods. For example, a gene expression system

- 24 041915 глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846,- 24 041915 glutamine synthetase (GS system) is common enough to enhance expression under certain conditions. The GS system is discussed in whole or in part in connection with patents EP 0216846,

0256055,0323997 и 0338841.0256055.0323997 and 0338841.

Вполне вероятно, что антитела к PD-L1 различных клеточных линий или трансгенные животные будут отличаться друг от друга профилем гликозилирования. Однако все антитела к PD-L1, кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащими аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, являются частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций.It is likely that antibodies to PD-L1 of different cell lines or transgenic animals will differ from each other in the glycosylation profile. However, all anti-PD-L1 antibodies encoded by the nucleic acid molecules described herein, or containing the amino acid sequences described herein, are part of this invention, regardless of the glycosylation state of the binding molecules, and in general, regardless of the presence or absence of post- translation modifications.

Изобретение относится также к способам и процессам получения антител к PD-L1 и их антигенсвязывающих фрагментов.The invention also relates to methods and processes for producing anti-PD-L1 antibodies and antigen-binding fragments thereof.

Моноклональные антителаMonoclonal antibodies

Моноклональные антитела можно создавать, например, с помощью метода на основе гибридом, который впервые описан Kohler и др., Nature, 256, 1975, с. 495, или с помощью методов рекомбинантной ДНК (US 4816567).Monoclonal antibodies can be generated, for example, using the hybridoma-based method first described by Kohler et al., Nature, 256, 1975, p. 495, or using recombinant DNA techniques (US 4816567).

При использовании метода на основе гибридом мышь или другое пригодное животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют согласно описанной выше методике, для того, чтобы вызывать образование лимфоцитов, которые продуцируют или могут продуцировать антитела, обладающие способностью специфически связываться с белком, применяемым для иммунизации. Согласно другому варианту лимфоциты можно получать в результате иммунизации in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и затем сливают с клеточной линией миеломы с помощью приемлемого связывающего агента, такого как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, изд-во Academic Press, 1986, cc. 59-103).In the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal such as a hamster is immunized as described above to induce the production of lymphocytes that produce or can produce antibodies capable of specifically binding to the protein used for immunization. In another embodiment, lymphocytes can be obtained from in vitro immunization. After immunization, lymphocytes are isolated and then fused to a myeloma cell line using a suitable binding agent such as polyethylene glycol to form a hybridoma cell (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, pp. 59-103).

Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не содержат фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом, как правило, должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда), т.е. вещества, которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT.The hybridoma cells thus obtained are seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused parental myeloma cells. For example, if parental myeloma cells do not contain the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), then culture media for hybridomas would typically include hypoxanthine, aminopterine, and thymidine (HAT media), i.e. substances that interfere with the growth of HGPRT-deficient cells.

Предпочтительными применяемые в качестве компонента для слияния клетками миеломы являются клетки, которые легко поддаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень производства антител выбранными продуцирующими антитела клетками и чувствительны к избирательной среде, на которой происходит отбор несвязанных родительских клеток. Предпочтительными линиями клеток миелом являются линии мышиной миеломы, такие как созданные на основе мышиных линий опухолевых клеток линии МОРС-21 и МРС-11, которые можно получать из Salk Institite Cell Disrtibution Center, СанДиего, шт. Калифорния, США, и линии SP-2 или Х63-Ag8-653, которые можно получать из Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт. Мэриленд, США. Описано также применение линий клеток человеческой миеломы и гетеромиеломы типа мышь-человек для производства моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001 и Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker Inc., Нью-Йорк, 1987, cc. 51-63).Preferred myeloma cells used as a fusion component are those that are easily fused, maintain a stable high level of antibody production by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a selective medium in which unbound parental cells are selected. Preferred myeloma cell lines are mouse myeloma lines, such as the mouse tumor cell lines MOPC-21 and MPC-11, which are available from the Salk Institite Cell Disrtibution Center, San Diego, CA. California, USA, and lines SP-2 or X63-Ag8-653, available from the American Type Culture Collection, Rockville, CA. Maryland, USA. The use of human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for the production of monoclonal antibodies has also been described (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, p. 3001 and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, 1987, pp. 51-63).

Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, полученных с использованием клеток гибридомы, определяют методом иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (РИА) или твердофазный имммуноферментный анализ (ELISA).Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced using hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определять с помощью Скэтчард-анализа, описанного у Munson и др., Anal. Biochem., 107, 1980, с. 220.The binding affinity of a monoclonal antibody can, for example, be determined using the Scatchard assay described in Munson et al., Anal. Biochem., 107, 1980, p. 220.

После выявления клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с помощью метода лимитирующих разведений и выращивать стандартными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, издво Academic Press, 1986, cc. 59-103). Пригодные для этой цели среды включают, например, среду DMEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гидрибомы можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в организме животных, например, путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции клеток мышам.Once hybridoma cells have been identified that produce antibodies of the desired specificity, affinity, and/or activity, clones can be subcloned using the limiting dilution method and grown by standard methods (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, pp. 59-103 ). Suitable media for this purpose include, for example, DMEM media or RPMI-1640. In addition, hydriboma cells can be grown in vivo as ascitic tumors in animals, for example, by intraperitoneal (i.p.) injection of cells into mice.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделять от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных методов очистки антител, например, аффинной хроматографией (например, с использованием протеин А- или протеин Q-сефарозы), или ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатитах, гель-электрофореза, диализа и т.д.Monoclonal antibodies secreted by subclones can be separated from the culture medium, ascitic fluid or serum using conventional antibody purification methods, for example, affinity chromatography (for example, using protein A- or protein Q-sepharose), or ion exchange chromatography, chromatography on hydroxylapatites, gel electrophoresis, dialysis, etc.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). В качестве предпочтительного источника такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения ДНК можно включать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, обезьяньи COS- клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки ми- 25 041915 еломы, которые без трансфекции не продуцируют белок антитела, что приводит к синтезу моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзор статей о рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, см. у Skerra и др., Curr. Opinion in Imunol., 5, 1993, сс. 256-262 и Pliickthun, Immunol. Revs. 130, 1992, cc. 151-188.DNA encoding monoclonal antibodies can be easily isolated and sequenced using conventional procedures (eg, using oligonucleotide probes that have the ability to specifically bind to the genes encoding heavy and light chains of mouse antibodies). Hybridoma cells serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be incorporated into expression vectors that are then transfected into host cells, such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, or myeloma cells, which do not produce the antibody protein without transfection. , which leads to the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. For a review of articles on recombinant expression in bacteria of DNA encoding an antibody, see Skerra et al., Curr. Opinion in Imunol., 5, 1993, pp. 256-262 and Pliickthun, Immunol. Revs. 130, 1992, pp. 151-188.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методов, описанных у McCafferty и др., Nature, 348, 1990, сс. 552-554. У Clackson и др., Nature, 352, 1991, сс. 624- 628 и Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581-597 описано выделение мышиных и человеческих антител соответственно с помощью фаговых библиотек. В последующих публикациях было описано производство высокоаффинных (нМ-диапазон) человеческих антител с помощью перестановки цепи (Marks и др., Bio/Technology, 10, 1992, сс. 779-783), а также комбинаторная инфекция и рекомбинация in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и др., Nucl. Acids. Res., 21, 1991, cc. 2265-2266). Таким образом, эти методы представляют собой реальную альтернативу традиционным методам выделения моноклональных антител на основе гибридом моноклональных антител.According to another embodiment of the invention, monoclonal antibodies or antibody fragments can be isolated from antibody phage libraries created using the methods described in McCafferty et al., Nature, 348, 1990, ss. 552-554. In Clackson et al., Nature, 352, 1991, pp. 624-628 and Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 1991, pp. 581-597 describe the isolation of mouse and human antibodies, respectively, using phage libraries. Subsequent publications have described the production of high-affinity (nM-range) human antibodies by strand shuffling (Marks et al., Bio/Technology, 10, 1992, pp. 779-783), as well as combinatorial infection and in vivo recombination as a strategy. construction of very large phage libraries (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21, 1991, pp. 2265-2266). Thus, these methods represent a real alternative to traditional methods for the isolation of monoclonal antibodies based on hybridomas of monoclonal antibodies.

ДНК, кодирующую антитело, можно также модифицировать, например таким образом, чтобы получать химерные или слитые полипептиды антител, например, путем замены последовательностей константных областей тяжелой и легкой цепи (CH и CL) на гомологичные мышиные последовательности (US 4816567 и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, с. 6851) или с помощью ковалентного связывания кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей или с частью кодирующей последовательности полипептида, не относящегося к иммуноглобулинам (гетерологичного полипептида). Не относящиеся к иммуноглобулинам полипептидные последовательности можно заменять на константные области антитела или заменять на вариабельные области антигенсвязывающего центра антитела, создавая химерное бивалентное антитело, которое содержит один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.The DNA encoding an antibody can also be modified, for example, in such a way as to obtain chimeric or fused antibody polypeptides, for example, by replacing the sequences of the heavy and light chain constant regions (CH and CL) with homologous murine sequences (US 4816567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, p. 6851) or by covalently linking an immunoglobulin coding sequence to all or part of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide (heterologous polypeptide). Non-immunoglobulin polypeptide sequences can be replaced with antibody constant regions or replaced with variable regions of an antibody antigen-binding site, creating a chimeric bivalent antibody that contains one antigen-binding site that is specific for an antigen and another antigen-binding site that is specific for a different antigen.

Гуманизированные антителаHumanized antibodies

Методы создания гуманизированных антител животных, кроме человека, известны в данной области. Предпочтительно гуманизированное антитело имеет один или несколько встроенных в него аминокислотных остатков, полученных из источника, отличного от человека. Эти полученные из источника, отличного от человека, аминокислотные остатки часто называют импортными остатками, поскольку их обычно получают из импортной вариабельной области. Гуманизацию в целом можно осуществлять согласно методу Winter с соавторами (Jones и др., Nature, 321, 1986, сс. 522-525; Riechmann и др., Nature, 332, 1988, сс. 323-327; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, сс. 1534-1536) путем замены последовательностей гипервариабельного участка на соответствующие последовательности человеческого антитела. Таким образом, гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела (US 4816567), в которых участок, существенно меньший, чем интактная человеческая вариабельная область, заменен соответствующей последовательностью, полученной из видов кроме человека. На практике гуманизированные антитела представляют собой, как правило, человеческие антитела, в которых часть остатков гипервариабельного участка и возможно часть остатков FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.Methods for generating humanized non-human antibodies are known in the art. Preferably, the humanized antibody has one or more amino acid residues inserted into it from a non-human source. These non-human derived amino acid residues are often referred to as import residues because they are usually derived from an import variable region. Humanization can generally be carried out according to the method of Winter et al. Science, 239, 1988, pp. 1534-1536) by replacing the hypervariable region sequences with the corresponding human antibody sequences. Thus, humanized antibodies are chimeric antibodies (US 4,816,567) in which a region substantially smaller than the intact human variable region has been replaced with a corresponding sequence derived from a non-human species. In practice, humanized antibodies are generally human antibodies in which part of the hypervariable region residues and possibly part of the FR residues are replaced by residues from similar regions of rodent antibodies.

Выбор человеческих вариабельных областей как легкой, так и тяжелой цепи, предназначенных для получения гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности и HAMA-ответа (человеческое антимышиное антитело), когда антитело предназначено для лечения человека. Согласно так называемому методу наилучшего подбора последовательность вариабельной области антитела грызунов подвергают скринингу относительно полной библиотеки известных последовательностей человеческих вариабельных областей. Человеческую последовательность V-области, которая наиболее близка к последовательности из организма грызунов, идентифицируют и внутри нее выбирают человеческий каркасный участок (FR), пригодный для применения в гуманизированном антителе (Sims и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2296); Chothia и др., J. Mol. Biol., 196, 1987, с. 901). В другом методе используют определенный каркасный участок, полученный из консенсусной последовательности определенной подгруппы легких или тяжелых цепей всех человеческих антител. Один и тот же каркасный участок можно применять для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 1992, с. 4285; Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623).The choice of human variable regions, both light and heavy chain, intended for the production of humanized antibodies is very important to reduce antigenicity and HAMA response (human anti-mouse antibody) when the antibody is intended for human treatment. According to the so-called best fit method, a rodent antibody variable region sequence is screened against a complete library of known human variable region sequences. The human V-region sequence that is closest to that from the rodent organism is identified and within it a human framework region (FR) suitable for use in a humanized antibody is selected (Sims et al., J. Immunol., 151, 1993, p. 2296); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196, 1987, p. 901). Another method uses a specific framework region derived from the consensus sequence of a specific subset of the light or heavy chains of all human antibodies. The same framework region can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 1992, p. 4285; Presta et al., J. Immunol., 151, 1993 , p. 2623).

Также важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой связывающей способности к антигену и других важных биологических свойств. Для решения этой задачи согласно предпочтительному способу гуманизированные антитела получают с помощью анализа родительских последовательностей и различных гуманизированных продуктов с использованием умозрительных трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и хорошо известны специалистам в данной области. Известны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных перспективных последовательностей иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет осуществлять анализ возможной роли остатков в функции перспективной последовательности им- 26 041915 муноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность перспективного иммуноглобулина связываться с антигеном. Таким путем можно выбирать остатки в FR и объединять с реципиентными и импортными последовательностями для достижения требуемых характеристик антитела, таких как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени(ням). Как правило, остатки гипервариабельного участка оказывают непосредственное и наиболее существенное влияние на связывание антигена.It is also important that the antibodies be humanized while retaining high antigen binding capacity and other important biological properties. To achieve this goal, in a preferred method, humanized antibodies are generated by analyzing parental sequences and various humanized products using speculative 3D models of parental and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are publicly available and well known to those skilled in the art. Computer programs are known that illustrate and display possible three-dimensional conformational structures of selected prospective immunoglobulin sequences. The study of these images allows one to analyze the possible role of the residues in the function of the prospective immunoglobulin sequence, i.e. analysis of residues that affect the ability of a prospective immunoglobulin to bind to an antigen. In this way, residues in the FR can be selected and combined with recipient and import sequences to achieve desired antibody characteristics, such as increased affinity for the target antigen(s). As a rule, hypervariable region residues have a direct and most significant effect on antigen binding.

Гуманизированное антитело может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab-фрагмент, необязательно конъюгированный с одним или несколькими цитотоксическим(ими) агентом(ами) для создания иммуноконъюгата. В альтернативном варианте гуманизированное антитело может представлять собой полноразмерное антитело, например, полноразмерное антитело в виде IgG1.The humanized antibody may be an antibody fragment, such as a Fab fragment, optionally conjugated to one or more cytotoxic agent(s) to create an immunoconjugate. Alternatively, the humanized antibody may be a full length antibody, eg a full length IgG1 antibody.

Человеческие антитела и методика, основанная на применении фаговой дисплейной библиотекиHuman antibodies and a technique based on the use of a phage display library

В качестве альтернативы гуманизации можно получать человеческие антитела. Например, в настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации могут продуцировать полный спектр человеческих антител без производства эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция областей стыка гена тяжелой цепи антитела (JH-сегмента) в организме химерных мышей и мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию производства эндогенного антитела. Перенос набора зародышевой линии гена человеческого иммуноглобулина в такую мутантную зародышевую линию мышей приводит к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (см., например, Jakobovis и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 90, 1993, с. 2551; Jakobovis и др., Nature, 362, 1993, сс. 25-258; Bruggermann и др., Year in Immuno., 7, 1993, с. 33 и US 5545806, 5569825, 5591669 (все на имя фирмы GenPharm); 5545807 и WO 97/17852)As an alternative to humanization, human antibodies can be generated. For example, it is currently possible to obtain transgenic animals (eg, mice) that, after immunization, can produce the full range of human antibodies without endogenous immunoglobulin production. For example, it has been described that homozygous deletion of antibody heavy chain gene (JH segment) junction regions in chimeric and germline mutated mice results in complete inhibition of endogenous antibody production. Transfer of the human immunoglobulin germline gene array into such germline mutant mice results in the production of human antibodies upon antigen challenge (see, e.g., Jakobovis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 90, 1993, p. 2551 ; Jakobovis et al., Nature 362, 1993, pp. 25-258; Bruggermann et al., Year in Immuno. 5545807 and WO 97/17852)

В альтернативном варианте для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из спектра генов вариабельной области (V) иммуноглобулина из организма иммунизированных доноров можно использовать фаговую дисплейную технологию (McCafferty и др., Nature, 348, 1990, сс. 552-553). Согласно этой методике гены V-области антитела клонируют в рамке считывания либо с основным, либо с минорным геном оболочечного белка нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и презентируют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекции по признаку функциональных свойств антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, которое обладает указанными свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговую презентацию можно осуществлять в различных форматах (обзор которых см., например Johnson Kevin S. и Chiswell David J., Current Opinion in Structural Biology, 3, 1993, cc. 564-571). Для фаговой презентации можно использовать различные источники сегментов V-генов. Clackson и др., Nature, 352, 1991, сс. 624-628 выделили различные наборы антител к оксазолону из небольшой произвольной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированных мышей. Можно конструировать спектр V-генов, полученных из организма иммунизированных людей-доноров, и антитела к различному набору антигенов (включая аутоантигены) можно выделять в целом согласно методам, описанным у Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581-597 или у Griffith и др., EMBO J., 12, 1993, сс. 725-734) (см. также US 5565323 и 5537905).Alternatively, phage display technology can be used to generate human antibodies and antibody fragments in vitro from the immunoglobulin variable region (V) gene spectrum from immunized donors (McCafferty et al., Nature, 348, 1990, pp. 552-553). In this technique, antibody V region genes are cloned in-frame with either the major or minor coat protein gene of a filamentous bacteriophage, such as M13 or fd, and presented as functional antibody fragments on the surface of the phage particle. Since the filamentous particle contains a copy of the single-stranded DNA of the phage genome, selections for the functional properties of an antibody also result in the selection of a gene encoding an antibody that has these properties. Thus, the phage mimics some of the properties of the B cell. Phage presentation can be done in a variety of formats (for a review see, for example, Johnson Kevin S. and Chiswell David J., Current Opinion in Structural Biology, 3, 1993, pp. 564-571). Various sources of V gene segments can be used for phage presentation. Clackson et al., Nature, 352, 1991, pp. 624-628 isolated various sets of anti-oxazolone antibodies from a small random combinatorial library of V genes derived from the spleen of immunized mice. A spectrum of V genes derived from immunized human donors can be constructed and antibodies to a different set of antigens (including self antigens) can be isolated generally according to the methods described in Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 1991, pp. 581-597 or Griffith et al., EMBO J., 12, 1993, ss. 725-734) (see also US 5,565,323 and 5,537,905).

Как описано выше, человеческие антитела могут продуцироваться также in vitro активированными В-клетками (см. US 5567610 и 5229275).As described above, human antibodies can also be produced in vitro by activated B cells (see US 5567610 and 5229275).

Фрагменты антителAntibody fragments

В определенных обстоятельствах целесообразно применять фрагменты антител, а не полные антитела. Меньший размер фрагментов способствует их быстрому клиренсу и может способствовать лучшему проникновению в плотные опухоли.In certain circumstances, it is appropriate to use antibody fragments rather than complete antibodies. The smaller size of the fragments facilitates their rapid clearance and may contribute to better penetration into solid tumors.

Для получения фрагментов антител разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24, 1992, cc. 107-117 и Brennan и др., Science, 229, 1985, с. 81). Однако в настоящее время эти фрагменты можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител можно экспрессировать и секретировать из E.coli, что позволяет облегчать производство больших количеств указанных фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из описанных выше фаговых библиотек антител. Согласно другому варианту Fab'SH-фрагменты можно непосредственно выделять из E.coli и химически сшивать с получением F(ab')₂фрагментов (Carter и др., Bio/Technology, 10, 1992, сс. 163-167). Согласно другому подходу F(ab')₂- фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-и F(ab')₂фрагмент с повышенным временем полужизни in vivo, в которых сохранены остатки эпитопсвязывающего рецептора, описаны в US 5869046.Специалистам в данной области должны быть очевидны другие методики получения фрагментов антител. В других вариантах осуществления изобретения выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv- фрагмент (scFv) (см. WO 93/16185; US 5571894 и US США 5587458). Fv и sFv представляют собой единственные виды с интактными связывающими сайтами, лишенные константных областей; в результате их можно применять для пониженного неспецифического связывания при применении in vivo. Слитые белки, несущие sFv, можно конструировать для полученияVarious methods have been developed to obtain antibody fragments. Traditionally, these fragments have been prepared by proteolytic cleavage of intact antibodies (see, for example, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24, 1992, pp. 107-117 and Brennan et al., Science, 229, 1985, p. 81). However, at present, these fragments can be obtained directly using recombinant host cells. Fab, Fv and scFv antibody fragments can be expressed and secreted from E. coli, facilitating the production of large amounts of these fragments. Antibody fragments can be isolated from the antibody phage libraries described above. Alternatively, Fab'SH fragments can be directly isolated from E. coli and chemically linked to form F(ab') ₂ fragments (Carter et al., Bio/Technology, 10, 1992, pp. 163-167). According to another approach F(ab') ₂ - fragments can be isolated directly from the culture of recombinant host cells. Fab- and F(ab') ₂ fragments with increased in vivo half-life that retain epitope-binding receptor residues are described in US 5,869,046. Other techniques for generating antibody fragments will be apparent to those skilled in the art. In other embodiments, the antibody of choice is a single chain Fv fragment (scFv) (see WO 93/16185; US 5571894 and US US 5587458). Fv and sFv are the only species with intact binding sites lacking constant regions; as a result, they can be used for reduced non-specific binding when used in vivo. sFv-bearing fusion proteins can be engineered to produce

- 27 041915 слияния эффекторного белка либо на N-, либо на С-конце sFv (см. Antibody Engineering, под ред. Borrebaeck, выше). Фрагмент антитела может представлять собой также линейное антитело, например, описанное в US 5641870. Такие фрагменты линейного антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.- 27 041915 effector protein fusion at either the N- or C-terminus of the sFv (see Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra). An antibody fragment may also be a linear antibody, such as that described in US 5,641,870. Such linear antibody fragments may be monospecific or bispecific.

Биспецифические антителаBispecific antibodies

Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью к связыванию с двумя различными эпитопами. Например, биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами белка PD-L1. Другие биспецифические антитела могут нести сайт связывания с PD-L1 в сочетании с сайтом связывания другого белка. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')₂-фрагментов биспецифических антител).Bispecific antibodies are antibodies that have specificity for binding to two different epitopes. For example, bispecific antibodies can bind to two different epitopes of the PD-L1 protein. Other bispecific antibodies may carry a PD-L1 binding site in combination with another protein binding site. Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments (eg, F(ab') ₂ bispecific antibody fragments).

Методы создания биспецифических антител известны в данной области. Общепринятое получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, где обе цепи имеют различную специфичность (Millstein и др., Nature, 305, 1983, сс. 537-539). Из-за случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) потенциально могут продуцировать смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно осуществляют в несколько стадий с помощью аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта - низким. Аналогичные процессы описаны в WO 93/08829 и у Traunecker и др., EMBO J., 10, 1991, сс. 3655-3659. Согласно другому подходу вариабельные области антитела с требуемой специфичностью связывания (антигенсвязывающие центры антитела) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константной областью тяжелой цепи Ig, которая включает по меньшей мере часть шарнирных CH2- и C_H3-областей. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из слияний присутствовала первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и при необходимости легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в различные экспрессионные векторы и ими совместно трансфектируют приемлемый организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в подборе общих пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда в конструкции используют неравные соотношения трех полипептидных цепей с целью оптимизации выходов. Однако можно также встраивать кодирующие последовательности в две или во все три полипептидные цепи в одном экспрессионном векторе, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных пропорциях обеспечивает высокие выходы или когда соотношения не имеют решающего значения.Methods for creating bispecific antibodies are known in the art. The conventional production of full length bispecific antibodies is based on the co-expression of two pairs of immunoglobulin heavy and light chains, where both chains have different specificities (Millstein et al., Nature, 305, 1983, pp. 537-539). Due to the random selection of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) can potentially produce a mixture of 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule, which is usually carried out in several steps using affinity chromatography, is rather laborious and the product yield is low. Similar processes are described in WO 93/08829 and Traunecker et al., EMBO J., 10, 1991, ss. 3655-3659. In another approach, antibody variable regions with the desired binding specificity (antibody antigen binding sites) are fused to immunoglobulin constant region sequences. The fusion is preferably performed with an Ig heavy chain constant region that includes at least a portion of the CH2 and C _H 3 hinge regions. Preferably, at least one of the fusions has a first heavy chain constant region (CH1) containing the site required for light chain binding. DNA encoding immunoglobulin heavy chain fusions and, optionally, immunoglobulin light chain fusions are inserted into various expression vectors and co-transfected into an acceptable host organism. This provides more flexibility in selecting the overall proportions of the three polypeptide fragments in cases where unequal ratios of the three polypeptide chains are used in the construct in order to optimize yields. However, it is also possible to insert coding sequences into two or all three polypeptide chains in the same expression vector, when the expression of at least two polypeptide chains in equal proportions provides high yields or when the ratios are not critical.

В предпочтительном варианте осуществления указанного подхода биспецифические антитела представляют собой гибрид тяжелой цепи иммуноглобулина, обеспечивающий первую специфичность связывания в первом плече, и гибрид пары тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (что обеспечивает вторую специфичность связывания) во втором плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение требуемой биспецифической молекулы от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Этот подход описан в WO 94/04690. Дополнительное подробное описание получения биспецифических антител см., например у Suresh и др., Methods in Enzymology, 121, 1986, с. 210.In a preferred embodiment of this approach, the bispecific antibodies are an immunoglobulin heavy chain hybrid providing a first binding specificity in the first arm, and an immunoglobulin heavy chain-light chain pair hybrid (providing a second binding specificity) in the second arm. This asymmetric structure has been found to facilitate separation of the desired bispecific molecule from unwanted combinations of immunoglobulin chains, since the presence of an immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule facilitates separation. This approach is described in WO 94/04690. For additional detailed description of the preparation of bispecific antibodies, see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121, 1986, p. 210.

Согласно следующему подходу, описанному в патенте US 5731168, можно сконструировать область контакта между парой молекул антител с целью повышения до максимального уровня процентного содержания гетеродимеров, которые получают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область контакта включает по меньшей мере часть C_H3-области. Согласно этому методу одну или несколько небольших аминокислот с боковыми цепями из области контакта первой молекулы антитела заменяют на молекулы с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан). Уравновешивающие полости, идентичные или близкие по размеру большой(им) боковой(ым) цепи(ям) создают в области контакта второй молекулы антитела путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с более мелкими боковыми цепями (например, на аланин или треонин). Это обеспечивает механизм, способствующий повышению выхода гетеродимера относительно других нежелательных конечных продуктов, такихAccording to the following approach, described in US Pat. No. 5,731,168, a contact area between a pair of antibody molecules can be designed to maximize the percentage of heterodimers that are obtained from recombinant cell culture. The preferred contact area includes at least a portion of the C _H 3 region. According to this method, one or more small amino acids with side chains from the contact area of the first antibody molecule are replaced with molecules with larger side chains (for example, tyrosine or tryptophan). Balancing cavities identical or similar in size to the large side chain(s)(s) are created at the interface of the second antibody molecule by replacing amino acids with large side chains with amino acids with smaller side chains (for example, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of the heterodimer relative to other undesirable end products such as

Биспецифические антитела включают перекрестно-сшитые антитела или гетероконъюгаты. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть сшито с авидином, а другое с биотином.Bispecific antibodies include cross-linked antibodies or heteroconjugates. For example, one of the antibodies in the heteroconjugate can be crosslinked with avidin and the other with biotin.

Такие антитела можно использовать, например, для направленного переноса клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (US 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Антитела-гетероконъюгаты можно создавать с помощью любого из обычных методов введения перекрестных сшивок. Приемлемые кросс-линкеры хорошо известны в данной области и описаны в US 4676980 наряду с различными методами введения перекрестных сшивок.Such antibodies can be used, for example, to target cells of the immune system to unwanted cells (US 4676980) and to treat HIV infection (WO 91/00360, WO 92/200373 and EP 03089). Heteroconjugate antibodies can be generated using any of the usual crosslinking techniques. Suitable crosslinkers are well known in the art and are described in US 4,676,980 along with various methods for introducing crosslinks.

Методы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать с помощью химического связывания. Brennan иMethods for obtaining bispecific antibodies from antibody fragments are also described in the literature. For example, bispecific antibodies can be generated by chemical linkage. Brennan and

- 28 041915 др., Science, 229, 1985, с. 81 описали методику, согласно которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению, получая F(ab')₂-фрагменты. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиолом, такого как арсенит натрия, для стабилизации соседних дитиолов и предупреждения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab'фрагменты затем превращают в тионитробензоатное (TNB) производное. Одно из Fab'-TNB-производных затем повторно превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab'-TNB-производного, получая биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела можно применять в качестве агентов для избирательной иммобилизации ферментов.- 28 041915 dr., Science, 229, 1985, p. 81 described a procedure in which intact antibodies are subjected to proteolytic cleavage to obtain F(ab') ₂ fragments. These fragments are reduced in the presence of a dithiol complexing agent, such as sodium arsenite, to stabilize adjacent dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfide bonds. The resulting Fab' fragments are then converted to the thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab'-TNB derivatives is then reconverted to Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of the other Fab'-TNB derivative to form a bispecific antibody. The obtained bispecific antibodies can be used as agents for selective immobilization of enzymes.

Достигнутый в настоящее прогресс позволяет облегчать непосредственное выделение из E.coli Fab'SH-фрагментов, которые можно химически сшивать с образованием биспецифических антител. Shalaby и др., J. Ехр. Med., 175, 1992, сс. 217-225 описали получение F(ab')₂-фрагмента молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент по отдельности секретировался из E.coli и его подвергали непосредственному химическому связыванию in vitro с получением биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладало способностью связываться с клетками, для которых характерна сверхэкспрессия рецептора ErbB2, и с обычными человеческими Т-клетками, а также стимулировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, мишенью которых является опухоль молочной железы человека.The progress made so far makes it possible to facilitate the direct isolation from E. coli of Fab'SH fragments that can be chemically ligated to form bispecific antibodies. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175, 1992, pp. 217-225 describe the preparation of the F(ab') ₂ fragment of a fully humanized bispecific antibody molecule. Each Fab' fragment was separately secreted from E. coli and subjected to direct chemical linkage in vitro to obtain a bispecific antibody. The bispecific antibody thus obtained was able to bind to cells overexpressing the ErbB2 receptor and normal human T cells, and to stimulate the lytic activity of human cytotoxic lymphocytes that target human breast tumors.

Описаны также различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с помощью лейциновых застежек-молний (Kostelny и др., J. Immunol., 148(5), 1992, сс. 1547-1553). Пептиды лейциновых застежек-молний из белков Fos и Jun связывали с Fab' -фрагментами двух различных антител путем генного слияния. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем путем повторного окисления получали гетеродимеры антител. Этот метод можно применять также для получения гомодимеров антител. Технология на основе двойных антител, описанная Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, сс. 6444-6448, представляет собой другой механизм получения фрагментов биспецифических антител. Фрагменты содержат VH-область, связанную с VL-областью линкером, который является слишком коротким, для того чтобы позволить произойти спариванию двух доменов одной и той же цепи. Таким образом, VH- и VL-области одного фрагмента должны спариваться с комплементарными VL- и VH-областями другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих центра. Описана также другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител, основанная на применении одноцепочечных (Fv)- (sFv) димеров (см. Gruber и др., J. Immunol, 152, 1994, с. 5368).Various methods for obtaining and isolating fragments of bispecific antibodies directly from recombinant cell cultures are also described. For example, bispecific antibodies have been generated using leucine zippers (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5), 1992, pp. 1547-1553). The leucine zipper peptides from the Fos and Jun proteins were linked to the Fab' fragments of two different antibodies by gene fusion. Antibody homodimers were reduced at the hinge region to give monomers and then antibody heterodimers were obtained by re-oxidation. This method can also be used to obtain antibody homodimers. The dual antibody technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 90, 1993, p. 6444-6448 is another mechanism for obtaining bispecific antibody fragments. The fragments contain a VH region linked to a VL region by a linker that is too short to allow pairing of two domains on the same strand to occur. Thus, the VH and VL regions of one fragment must pair with the complementary VL and VH regions of the other fragment, thereby forming two antigen-binding centers. Another strategy for obtaining bispecific antibody fragments has also been described, based on the use of single chain (Fv)-(sFv) dimers (see Gruber et al., J. Immunol, 152, 1994, p. 5368).

Под объем изобретения подпадают также антитела, имеющие более двух валентностей. Например, можно получать триспецифические антитела (Tutt и др., J. Immunol., 147, 1991, с. 60).Antibodies having more than two valences also fall within the scope of the invention. For example, you can get trispecific antibodies (Tutt and others, J. Immunol., 147, 1991, p. 60).

Поливалентные антителаPolyvalent antibodies

Поливалентное антитело может интернализоваться (и/или диссимилироваться) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело, быстрее, чем бивалентное антитело.A multivalent antibody can be internalized (and/or dissimilated) by a cell expressing the antigen to which the antibody binds faster than a bivalent antibody.

Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой поливалентные антитела (отличные от класса IgM) с тремя или большим количеством антигенсвяызвающих центров (например, тетравалентные антитела), которые можно легко получать путем рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать димеризованный домен и три или большее количество антигенсвязывающих центров. Предпочтительный димеризованный домен содержит (или состоит из) Fc-фрагмент или шарнирную область. В таком случае антитело должно содержать Fc-фрагмент и три или большее количество антигенсвязывающих центров, расположенных на N-конце относительно Fc- фрагмента. Согласно настоящему описанию предпочтительное поливалентное антитело содержит (или состоит из) от 3 до примерно 8, но предпочтительно 4, антигенсвязывающих центров. Поливалентное антитело содержит, про меньшей мере, одну полипептидную цепь (и предпочтительно две полипептидные цепи), при этом полипептидная(ые) цепь(и) содержит(ат) две или большее количество вариабельных областей. Например полипептидная(ые) цепь(и) может(ут) содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 обозначает первую вариабельную область, VD2 обозначает вторую вариабельную область, Fc обозначает одну полипептидную цепь Fcфрагмента, X1 и Х2 обозначают аминокислоту или полипептид и n обозначает 0 или 1. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может(ут) содержать следующую цепь: VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fcфрагмент; или VH-CH1-VH-CH1-Fc-фрагмент. Поливалентное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере 2 (и предпочтительно 4) полипептида вариабельной области легкой цепи. Поливалентное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может, например, содержать от примерно 2 до примерно 8 полипептидов вариабельной области легкой цепи. В контексте настоящего описания подразумевается, что полипептиды вариабельной области легкой цепи содержат вариабельную область легкой цепи и необязательно дополнительно содержит CLобласть.The antibodies of the present invention may be polyvalent antibodies (other than the IgM class) with three or more antigen-binding sites (e.g., tetravalent antibodies) that can be easily generated by recombinant expression of a nucleic acid encoding antibody polypeptide chains. A multivalent antibody may contain a dimerized domain and three or more antigen binding sites. The preferred dimerized domain contains (or consists of) an Fc fragment or a hinge region. In such a case, the antibody must contain an Fc fragment and three or more antigen binding sites located at the N-terminus relative to the Fc fragment. According to the present description, the preferred multivalent antibody contains (or consists of) from 3 to about 8, but preferably 4, antigennegative centers. A polyvalent antibody contains at least one polypeptide chain (and preferably two polypeptide chains), while the polypeptide(s) chain(s) contains(at) two or more variable regions. For example, the polypeptide(s) chain(s) may contain VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, where VD1 denotes the first variable region, VD2 denotes the second variable region, Fc denotes one polypeptide chain of the Fc fragment, X1 and X2 are an amino acid or polypeptide and n is 0 or 1. For example, the polypeptide(s) chain(s) may contain the following chain: VH-CH1 flexible linker-VH-CH1-Fc fragment; or VH-CH1-VH-CH1-Fc fragment. The multivalent antibody of the present invention preferably further comprises at least 2 (and preferably 4) light chain variable region polypeptides. A multivalent antibody of the present invention may, for example, comprise from about 2 to about 8 light chain variable region polypeptides. As used herein, light chain variable region polypeptides are intended to comprise a light chain variable region and optionally further comprise a CL region.

- 29 041915- 29 041915

Фармацевтические композицииPharmaceutical compositions

Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента (или в качестве единственного активного ингредиента) антитело, которое специфично к PD-L1. Фармацевтическая композиция может включать любое антитело к PD-L1, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые могут быть связаны с активностью PD-L1.Another aspect of the invention is a pharmaceutical composition containing as an active ingredient (or as the sole active ingredient) an antibody that is specific for PD-L1. The pharmaceutical composition may include any anti-PD-L1 antibody as described herein. In some embodiments, the compositions are intended to improve, prevent, or treat disorders that may be associated with PD-L1 activity.

Как правило, антитела к PD-L1 по данному изобретению пригодны для применения в виде лекарственных форм в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемым эксципиентом, например, как описано далее.In general, the anti-PD-L1 antibodies of this invention are suitable for use in dosage forms in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients, for example, as described below.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут содержать по меньшей мере одно антитело к PD-L1 и одну или более дополнительных связывающих молекул (например, антител), которые нацелены на один или более соответствующих поверхностных рецепторов.The pharmaceutical compositions of this invention may contain at least one anti-PD-L1 antibody and one or more additional binding molecules (eg, antibodies) that target one or more of the respective surface receptors.

Фармацевтическая композиция является стерильной, если она асептична, т.е. свободная от микроорганизмов и их спор.A pharmaceutical composition is sterile if it is aseptic, i. free from microorganisms and their spores.

Фармацевтическая композиция является стабильной, если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течении всего срока годности при температуре хранения, например, при температуре 2-8°C. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильность при ускоренном и естественном хранении.A pharmaceutical composition is stable if the active agent maintains its physical stability and/or chemical stability and/or biological activity throughout its shelf life at a storage temperature, for example, at a temperature of 2-8°C. Preferably, the active agent retains both physical and chemical stability as well as biological activity. The storage period is selected based on the results of an accelerated and natural storage stability study.

Термин эксципиент используется в данном документе для описания любого ингредиента, отличающегося от соединения(ий) по данному изобретению. Выбор инертного эксципиента будет в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения, действие эксципиента на растворимость и стабильность и характер лекарственной формы. При использовании в данном документе фармацевтически приемлемый эксципиент включает все без исключения растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и подобные физиологически совместимые вещества. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых эксципиентов являются вода, физиологический раствор, фосфатный буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительным включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбит, или хлорид натрия. Дополнительными примерами фармацевтически приемлемых веществ являются увлажняющие агенты или небольшое количество вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, которые увеличивают продолжительность хранения или эффективность антитела.The term excipient is used herein to describe any ingredient other than the compound(s) of this invention. The choice of an inert excipient will largely depend on factors such as the particular route of administration, the effect of the excipient on solubility and stability, and the nature of the dosage form. As used herein, a pharmaceutically acceptable excipient includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and similar physiologically compatible substances. Some examples of pharmaceutically acceptable excipients are water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, and combinations thereof. In many cases it will be preferable to include isotonic agents, for example sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, or sodium chloride, in the composition. Additional examples of pharmaceutically acceptable substances are wetting agents or small amounts of adjuvants such as wetting or emulsifying agents, preservatives or buffers that increase the shelf life or effectiveness of the antibody.

Под буферным агентом понимается раствор, способный сохранять значение рН благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав. В общем случае преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,5 до 7,0. Примеры буферов, которые известны специалистам и могут быть найдены в литературе, включают, но не ограничиваются ими, гистидиновые, цитратные, сукцинатные, ацетатные, фосфатные, фосфатно-солевой, цитратно-фосфатный буферы, а также буферы на основе трометамина и тому подобное или их подходящие смеси.A buffering agent is understood as a solution capable of maintaining the pH value due to the interaction of the acidic and alkaline components that make up its composition. Generally, pH values of the pharmaceutical composition are between 4.5 and 7.0. Examples of buffers that are known to those skilled in the art and can be found in the literature include, but are not limited to, histidine, citrate, succinate, acetate, phosphate, phosphate-salt, citrate-phosphate buffers, as well as buffers based on tromethamine and the like, or their suitable mixtures.

Под изотоническими агентами понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают изотоническое осмотическое давление раствора. Изотоническим счетается раствор создающий осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими. Термином гипотоническая характеризуют композицию с осмотическим давлением ниже осмотического давления крови человека. Соответственно, термин гипертоническая характеризует композицию с осмотическим давлением выше осмотического давления крови человека.By isotonic agents is meant an excipient or a mixture of two or more excipients that provide the isotonic osmotic pressure of the solution. An isotonic solution is one that produces an osmotic pressure of about 250 to 350 mOsm/kg. As isotonic agents, polyols, mono- and disaccharides, amino acids, metal salts such as sodium chloride, and the like can be used, but not limited to. The term hypotonic characterizes a composition with an osmotic pressure lower than the osmotic pressure of human blood. Accordingly, the term hypertonic characterizes a composition with an osmotic pressure higher than the osmotic pressure of human blood.

Термин поверхностно-активное вещество (другое название сурфактант или детергент, или ПАВ) в том виде, как он здесь использован, относится к эксципиенту, который может изменять поверхностное натяжение жидкого препарата антитела. В определенных воплощениях данное поверхностно-активное вещество снижает поверхностное натяжение жидкого препарата антитела. В других воплощениях поверхностно-активное вещество может способствовать улучшению коллоидной стабильности или растворимости любого антитела в данном препарате. Поверхностно-активное вещество может снижать агрегацию приготовленного препарата антитела, и/или минимизировать образование частиц в данном препарате, и/или уменьшать адсорбцию. Поверхностно-активное вещество также может улучшать стабильность антитела во время, в том числе после замораживания/оттаивания и при встряхивании. Поверхностно-активные вещества могут быть ионными или неионными. Иллюстративные неионные поверхностноактивные вещества, которые можно включать в составы по настоящему изобретению, включают, например, алкилполи(этиленоксид), алкилполиглюкозиды (например, октилглюкозид и децилмальтозид), жирные спирты, такие как цетиловый спирт и олеиловый спирт, кокамид-МЕА, кокамид-DEA и кокамидТЕА. Конкретные неионные поверхностно-активные вещества, которые можно включать в составы поThe term surfactant (also known as a surfactant or detergent or surfactant) as used herein refers to an excipient that can change the surface tension of a liquid antibody preparation. In certain embodiments, the surfactant reduces the surface tension of the liquid antibody preparation. In other embodiments, the surfactant may help improve the colloidal stability or solubility of any antibody in the formulation. The surfactant may reduce aggregation of the formulated antibody preparation and/or minimize the formation of particles in the preparation and/or reduce adsorption. The surfactant can also improve the stability of the antibody during, including after freezing/thawing and shaking. Surfactants may be ionic or non-ionic. Exemplary non-ionic surfactants that may be included in the compositions of the present invention include, for example, alkyl poly(ethylene oxide), alkyl polyglucosides (eg, octyl glucoside and decyl maltoside), fatty alcohols such as cetyl alcohol and oleyl alcohol, cocamide-MEA, cocamide-DEA and cocamideTEA. Specific non-ionic surfactants that may be included in formulations

- 30 041915 настоящему изобретению, включают, например, полисорбаты, такие как полисорбат 20 (Tween 20), полисорбат 28, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80 (Tween 80), полисорбат 81 и полисорбат 85; полоксамеры, такие как полоксамер 188 (Kolliphor P188), полоксамер 407; полиэтиленполипропиленгликоль или полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этилен- и пропиленгликоля (например, плюроники PF68 и т.д.).- 30 041915 of the present invention include, for example, polysorbates such as polysorbate 20 (Tween 20), polysorbate 28, polysorbate 40, polysorbate 60, polysorbate 65, polysorbate 80 (Tween 80), polysorbate 81 and polysorbate 85; poloxamers such as poloxamer 188 (Kolliphor P188), poloxamer 407; polyethylene polypropylene glycol or polyethylene glycol (PEG), copolymers of ethylene and propylene glycol (eg Pluronics PF68, etc.).

Под стабилизатором понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например, полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтиленполипропиленгликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, ЭДТА, ДТПА, цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.A stabilizer is understood to be an excipient or a mixture of two or more excipients which provide the physical and/or chemical stability of the active agent. As stabilizers, amino acids can be used, for example, arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline, but not limited to; surfactants such as polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxaner, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS), but , not limited to; antioxidants, such as methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, salts of sulfuric acids, and the like, but not limited to; chelating agents such as, but not limited to, EDTA, DTPA, sodium citrate, and the like.

Фармацевтически приемлемая кислота включает неорганические и органические кислоты, которые являются нетоксичными в концентрации и форме, в которых они включены в состав. Например, к подходящим неорганическим кислотам относятся хлористоводородная, перхлорная, бромистоводородная, йодистоводородная, азотная, серная, сульфоновая, сульфаниловая, фосфорная, карбоновая и т.п. К подходящим органическим кислотам относятся линейные или разветвленные алкильные, ароматические, циклические, циклоалифатические, арилалифатические, гетероциклические, насыщенные, ненасыщенные, моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, включая, например, муравьиную, уксусную, 2гидроксиуксусную, трифтороуксусную, фенилуксусную, триметилуксусную, t-бутилуксусную, антраниловую, пропановую, 2-гидроксипропановую, 2-оксопропановую, малоновую, циклопентанпропионовую, 3-фенилпропионовую, бутановую, бутандиоевую, бензойную, 3-(4-гидроксибензоил)бензойную, 2ацетоксибензойную, аскорбиновую, коричную, лаурилсерную, стеариновую, муконовую, миндальную, янтарную, эмбоновую, фумаровую, яблочную, малеиновую, гидроксималеиновую, малоновую, молочную, лимонную, виннокаменную, гликолевую, гликоновую, глюконовую, пировиноградную, глиоксаловую, щавелевую, мезиловую, янтарную, салициловую, фталевую, пальмовую, пальмеиновую, тиоциановую, метансульфоновую, этансульфоновую, 1,2-этандисульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, бензолсульфоновую, 4-хлоробензолсульфоновую, нафталин-2-сульфоновую, р-толуолсульфоновую, камфорсульфонов, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновую, глюкогептоновую, 4,4'-4,4'-метиленбис-3(гидрокси-2-ен-1-карбоновую), гидроксинафтоевую.A pharmaceutically acceptable acid includes inorganic and organic acids that are non-toxic in the concentration and form in which they are formulated. For example, suitable inorganic acids include hydrochloric, perchloric, hydrobromic, hydroiodic, nitric, sulfuric, sulfonic, sulfanilic, phosphoric, carboxylic, and the like. Suitable organic acids include linear or branched alkyl, aromatic, cyclic, cycloaliphatic, arylaliphatic, heterocyclic, saturated, unsaturated, mono-, di-, and tricarboxylic acids, including, for example, formic, acetic, 2-hydroxyacetic, trifluoroacetic, phenylacetic, trimethylacetic, t -butylacetic, anthranilic, propanoic, 2-hydroxypropanoic, 2-oxopropanoic, malonic, cyclopentanepropionic, 3-phenylpropionic, butanoic, butanedioic, benzoic, 3-(4-hydroxybenzoyl)benzoic, 2-acetoxybenzoic, ascorbic, cinnamic, laurylsulfuric, stearic, muconic, almond, succinic, embonic, fumaric, malic, maleic, hydroxymaleic, malonic, lactic, citric, tartaric, glycolic, glyconic, gluconic, pyruvic, glyoxalic, oxalic, mesyl, succinic, salicylic, phthalic, palmic, palmeic, thiocyanic, methanesulfonic, ethanesulfonic, 1,2-ethanedisulfonic, 2-hydroxyethanesulfo new, benzenesulfonic, 4-chlorobenzenesulfonic, naphthalene-2-sulfonic, p-toluenesulfonic, camphorsulfones, 4-methylbicyclo[2.2.2]-oct-2-en-1-carboxylic, glucoheptonic, 4,4'-4,4' -methylenebis-3(hydroxy-2-en-1-carboxylic), hydroxynaphthoic.

Фармацевтически приемлемые основания включают неорганические и органические основания, которые являются нетоксичными в концентрации и форме, в которых они включены в состав. Например, пригодные основания включают основания, образованные образующими неорганическое основание металлами, такими как литий, натрий, калий, магний, кальций, аммоний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий, N-метилглюкамин, морфолин, пиперидин, и органические нетоксические основания, включая первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы [например, N(R')4+ (где R' независимо представляет собой Н или См алкил, например, аммоний, Tris)], например, изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, 2-диэтиламиноэтанол, триметамин, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, N-этилпиперидин, полиаминовые смолы и т.п. Особенно предпочтительными органическими нетоксическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметамин, дициклогексиламин, холин и кофеин. Дополнительные фармацевтически приемлемые кислоты и основания, применимые с настоящим изобретением, включают кислоты и основания, которые образованы из аминокислот, например, гистидина, глицина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина и аспарагина.Pharmaceutically acceptable bases include inorganic and organic bases which are non-toxic in the concentration and form in which they are formulated. For example, suitable bases include those derived from inorganic base metals such as lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium, ammonium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum, N-methylglucamine, morpholine, piperidine, and organic non-toxic bases, including primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines, cyclic amines, and basic ion exchange resins [e.g., N(R')4+ (wherein R' is independently H or Cm alkyl, e.g., ammonium, Tris)], e.g., isopropylamine , trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, 2-diethylaminoethanol, trimetamine, dicyclohexylamine, lysine, arginine, histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucamine, theobromine, purines, piperazine, piperidine, N -ethylpiperidine, polyamine resins, and the like. Particularly preferred organic non-toxic bases are isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimetamine, dicyclohexylamine, choline and caffeine. Additional pharmaceutically acceptable acids and bases useful with the present invention include acids and bases that are derived from amino acids, such as histidine, glycine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, and asparagine.

Разбавитель, представляющий интерес согласно настоящему изобретению, представляет собой разбавитель, который является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и пригодным для получения жидкой композиции, такой, как композиция, разбавленная после лиофилизации. Типичные разбавители включают воду, бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), рН-буферный раствор (например, фосфатно-солевой буфер), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. В альтернативном варианте воплощения разбавители могут включать водные растворы солей и/или буферов.The diluent of interest according to the present invention is a diluent which is pharmaceutically acceptable (safe and non-toxic for human administration) and suitable for the preparation of a liquid composition, such as a composition diluted after lyophilization. Typical diluents include water, bacteriostatic water for injection (BWFI), pH buffer (eg, phosphate buffered saline), sterile saline, Ringer's solution, or dextrose solution. In an alternative embodiment, diluents may include aqueous solutions of salts and/or buffers.

Консервант представляет собой соединение, которое может добавляться к представленным в данном документе композициям для снижения бактериальной активности. Добавление консерванта может, например, облегчать получение композиции для многократного применения (с многократной дозой). Примеры потенциальных консервантов включают хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, в которых алкильные группы представляют собой соединения с длинной цепью) и хлорид бензэтония. Другие типы консерван- 31 041915 тов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол. Наиболее предпочтительным консервантом, представленным в настоящем документе, является бензиловый спирт.A preservative is a compound that can be added to the compositions provided herein to reduce bacterial activity. The addition of a preservative may, for example, facilitate the preparation of a multi-dose (multi-dose) composition. Examples of potential preservatives include octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride (a mixture of alkylbenzyldimethylammonium chlorides in which the alkyl groups are long chain compounds) and benzethonium chloride. Other types of preservatives include aromatic alcohols such as phenol, butyl and benzyl alcohol, alkyl parabens such as methyl or propyl paraben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol. The most preferred preservative provided herein is benzyl alcohol.

Термин лиофилизованный, используемый в настоящем документе, относится к препарату, который был подвергнут процессу, известному в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающему в себя замораживание препарата и последующее удаление льда из замороженного содержимого.The term lyophilized as used herein refers to a formulation that has been subjected to a process known in the art as freeze drying, which involves freezing the formulation and then removing ice from the frozen contents.

Термин аминокислота, используемый в настоящем документе, означает аминокислоту (свободную аминокислоту, т.е. не аминокислоту в пептиде или в белковой последовательности). Аминокислоты, используемые в настоящем изобретении, включают в себя, но не ограничиваются ими, например, аргинин, глицин, лизин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, триптофан, серин, цистеин, метионин и пролин.The term amino acid as used herein means an amino acid (a free amino acid, ie not an amino acid in a peptide or protein sequence). The amino acids used in the present invention include, but are not limited to, for example, arginine, glycine, lysine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, isoleucine, leucine, alanine, phenylalanine, tryptophan, serine, cysteine, methionine, and proline.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Такие композиции и способы их изготовления можно найти, например, в Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Troy, Beringer., Lippincott Williams and Wilkins., Philadelphia, PA 2006. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики).The pharmaceutical compositions of the present invention and methods for their manufacture will be undeniably obvious to those skilled in the art. Such compositions and methods for their manufacture can be found, for example, in Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Troy, Beringer., Lippincott Williams and Wilkins., Philadelphia, PA 2006. The manufacture of pharmaceutical compositions should preferably comply with the requirements of GMP (good industrial practice).

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться, в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз. Используемый в данном документе термин единичная стандартная доза означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащего заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.The pharmaceutical composition of this invention may be formulated, packaged or widely sold as a single unit dose or multiple unit dose units. As used herein, the term unit dosage unit means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of an active ingredient. The amount of active ingredient is usually equal to the dosage of the active ingredient to be administered to the subject, or a convenient fraction of such dosage, for example, half or one third of such dosage.

Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела к PD-L1 по данному изобретению.Any method of administering peptides, proteins, or antibodies accepted in the art can be appropriately used for the anti-PD-L1 antibody of this invention.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения. Используемый в данном документе термин парентеральное введение фармацевтической композиции включает любой способ введения, для которого характерно физическое нарушение целостности ткани субъекта и введение фармацевтической композиции через нарушение в ткани, что обычно приводит к прямому попаданию в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Таким образом, парентеральное введение включает, помимо прочего, введение фармацевтической композиции путем инъекции композиции посредством введения композиции через хирургический разрез, путем нанесения композиции с помощью проникающей в ткани нехирургической раны и т.п. В частности, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную инъекцию или инфузии; и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может оказаться полезной. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути.The pharmaceutical compositions of the present invention are generally suitable for parenteral administration. As used herein, the term parenteral administration of a pharmaceutical composition includes any route of administration that physically disrupts the tissue of the subject and introduces the pharmaceutical composition through the tissue disruption, typically resulting in direct entry into the bloodstream, muscle, or internal organ. Thus, parenteral administration includes, but is not limited to, administering the pharmaceutical composition by injecting the composition, by administering the composition through a surgical incision, by applying the composition through a tissue-penetrating non-surgical wound, and the like. In particular, parenteral administration is intended to include, but is not limited to, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrathecal, intraventricular, intraurethral, intracranial, intraarticular injection or infusion; and renal dialysis infusion techniques. Intratumoral delivery, such as intratumoral injection, may also be useful. Regional perfusion is also provided. Preferred embodiments of the invention include intravenous and subcutaneous routes.

Лекарственные формы фармацевтических композиций, подходящие для парентерального введения, обычно содержат активный ингредиент в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем/эксципиентом, например, стерильной водой или стерильным изотоническим раствором. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или проданы в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Инъекционные лекарственные формы могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, или в многодозовых контейнерах, содержащих консервант. Лекарственные формы для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное. Такие лекарственные формы могут также содержать один или более дополнительных ингредиентов, включая, помимо прочего, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном варианте осуществления изобретения композиции для парентерального введения активный ингредиент предоставляется в сухой форме (т.е. порошок или гранулы) для растворения с подходящей основой (например, стерильная апирогенная вода) до парентерального введения восстановленного состава.Dosage forms of pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration usually contain the active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier/excipient, for example, sterile water or sterile isotonic saline. Such dosage forms may be formulated, packaged or sold in a form suitable for bolus administration or for continuous administration. Injectable dosage forms may be prepared, packaged or sold in unit dosage form, for example in ampoules, or in multi-dose containers containing a preservative. Dosage forms for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous bases, pastes, and the like. Such dosage forms may also contain one or more additional ingredients, including but not limited to suspending, stabilizing or dispersing agents. In one embodiment of the parenteral formulation, the active ingredient is provided in dry form (ie powder or granules) for reconstitution with a suitable vehicle (eg sterile pyrogen-free water) prior to parenteral administration of the reconstituted formulation.

Парентеральные лекарственные формы и также включают водные растворы, которые могут содержать наполнители, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно рН от 3 до 9, еще более предпочтительно рН от 4,5 до 7), но для некоторых видов применения более подходящей лекарственной формой может являться стерильный неводный раствор или сухая форма для использования в сочетании с подходящей основой, такой как стерильная апирогенная вода. Примером формы для парентерального введения являются растворы или взвеси в стерильных водных растворах, например, водные растворы пропиленгликоля или декстрозы. Такие лекарственные формы при необходимости могут бытьParenteral dosage forms and also include aqueous solutions which may contain excipients such as salts, carbohydrates and buffering agents (preferably pH 3 to 9, even more preferably pH 4.5 to 7), but for some uses a more appropriate dosage the form may be a sterile non-aqueous solution or a dry form for use in combination with a suitable base such as sterile, pyrogen-free water. An example of a form for parenteral administration are solutions or suspensions in sterile aqueous solutions, for example, aqueous solutions of propylene glycol or dextrose. Such dosage forms, if necessary, can be

- 32 041915 буферными.- 32 041915 buffer.

Другие подходящие лекарственные формы для парентерального введения могут включать те, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме или в липосомальном препарате. Лекарственные формы для парентерального введения могут быть выполнены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Лекарственные формы с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.Other suitable dosage forms for parenteral administration may include those containing the active ingredient in microcrystalline form or in a liposomal formulation. Dosage forms for parenteral administration can be made for immediate and/or modified release. Modified release dosage forms include delayed, sustained, pulsatile, controlled, targeted, and programmed release.

Например, в одном из аспектов стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения антитела к PD-L1 в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей фильтрационной стерилизацией. Обычно дисперсии получают введением активного соединения в стерильный растворитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов, способы получения представляют собой сушку вымораживанием (лиофилизацию), которая дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, применением материалов покрытия, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть осуществлено путем включения в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, моностеараты и желатин, и/или путем покрытий с модифицированным высвобождением (например, покрытий с медленным высвобождением).For example, in one aspect, sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the required amount of anti-PD-L1 antibody in an appropriate solvent with one or a combination of the ingredients listed above, as needed, followed by filtration sterilization. Typically, dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile solvent which contains the basic dispersion medium and the other necessary ingredients listed above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the methods of preparation are freeze-drying (lyophilization) which yields a powder of the active ingredient plus any additional desired ingredient from its previously filter-sterilized solution. Proper fluidity of the solution can be maintained, for example, by the use of coating materials such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants. Prolonged absorption of injectable compositions can be achieved by including in the composition an agent that delays absorption, such as monostearates and gelatin, and/or by modified release coatings (eg, slow release coatings).

Антитело к PD-L1 по данному изобретению могут также вводиться интраназально или ингаляционно, обычно в форме сухого порошка (самостоятельно, в виде смеси или в виде частиц со смешанными компонентами, например, смешанными с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем) из ингалятора с сухим порошком, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель (предпочтительно распылитель, в котором использован принцип электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана) или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель.The anti-PD-L1 antibody of this invention may also be administered intranasally or by inhalation, usually in the form of a dry powder (alone, as a mixture, or as particles with mixed components, for example, mixed with a suitable pharmaceutically acceptable excipient) from a dry powder inhaler such as as a pressurized aerosol container, pump, spray, nebulizer (preferably a nebulizer that uses the principle of electrohydrodynamics to produce a fine mist) or nebulizer with or without a suitable propellant, or as nasal drops.

Контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель или небулайзер обычно содержит раствор или суспензию связывающей молекулы по данному изобретению, включая, например, подходящее вещество для диспергирования, растворения или продления высвобождения активного вещества, пропеллент в качестве растворителя.The pressurized container, pump, spray, nebulizer or nebulizer typically contains a solution or suspension of the binding molecule of this invention, including, for example, a suitable agent for dispersing, dissolving or prolonging the release of the active agent, a propellant as solvent.

До использования в виде сухого порошка или суспензии, лекарственный препарат обычно микронизируют до размера подходящего для доставки путем ингаляции (обычно менее 5 микрон). Этого можно достичь любым подходящим способом измельчения, таким как размол на спиральной струйной мельнице, размол на струйной мельнице с кипящим слоем, сверхкритическая очистка жидкости для формирования наночастиц, гомогенизация высоким давлением или распылительная сушка.Prior to use as a dry powder or suspension, the drug is usually micronized to a size suitable for delivery by inhalation (usually less than 5 microns). This can be achieved by any suitable grinding method such as spiral jet milling, fluidized bed jet milling, supercritical fluid purification to form nanoparticles, high pressure homogenization, or spray drying.

Капсулы, блистеры и картриджи для использования в ингаляторе или инсуфляторе могут выполнены так, чтобы содержать порошковую смесь соединения по данному изобретению, подходящей порошковой основы и модификатор активности.Capsules, blisters, and cartridges for use in an inhaler or insufflator may be formulated to contain a powder mixture of a compound of this invention, a suitable powder base, and an activity modifier.

Подходящая формула раствора для использования в распылителе, в котором использован принцип электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана, может содержать подходящую дозу антитела к PD-L1 по данному изобретению на одно нажатие, и объем на нажатие может варьироваться, например, от 1 до 200 мкл, более предпочтительно от 1 до 100 мкл.A suitable solution formula for use in a nebulizer that uses the principle of electrohydrodynamics to produce a fine mist may contain a suitable dose of the anti-PD-L1 antibody of this invention per pump, and the volume per pump may vary, for example, from 1 to 200 µl, more preferably from 1 to 100 µl.

В лекарственные формы по данному изобретения, предназначенные для ингаляции/интраназального введения, могут быть добавлены подходящие ароматизаторы, такие как ментол и левоментол, или подсластители, такие как сахарин или натрия сахарин.Suitable flavoring agents such as menthol and levomenthol or sweeteners such as saccharin or sodium saccharin may be added to dosage forms of the present invention intended for inhalation/nasal administration.

Лекарственные формы для парентерального введения могут быть выполнены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Лекарственные формы с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.Dosage forms for parenteral administration can be made for immediate and/or modified release. Modified release dosage forms include delayed, sustained, pulsatile, controlled, targeted, and programmed release.

В случае порошковых ингаляторов и аэрозолей, единица дозирования устанавливается посредством клапана, который доставляет отмеренное количество. Единицы в соответствии с данным изобретением обычно устанавливают для введения отмеренной дозы или впрыска связывающей молекулы по данному изобретению. Общая суточная доза будет обычно вводиться в виде однократной дозы или еще чаще в виде разделенных доз в течение суток.In the case of powder inhalers and aerosols, the dosage unit is set by a valve that delivers a metered amount. Units in accordance with this invention are usually set to administer a metered dose or injection of a binding molecule according to this invention. The total daily dose will usually be administered as a single dose, or even more commonly as divided doses throughout the day.

Антитело к PD-L1 по данному изобретению также могут быть выполнены в лекарственной форме для перорального введения. Пероральное введение может включать глотание, так что соединение поступает в желудочно-кишечный тракт и/или буккально, лингвально или сублингвально поступает в кровоток непосредственно из полости рта.The anti-PD-L1 antibody of this invention can also be formulated for oral administration. Oral administration may include swallowing such that the compound enters the gastrointestinal tract and/or buccally, lingually or sublingually enters the blood stream directly from the oral cavity.

Лекарственные формы, пригодные для перорального введения, включают твердые, полутвердые и жидкие системы, такие как таблетки; мягкие или твердые капсулы, содержащие мульти- или наночасти- 33 041915 цы, жидкости или порошки; пастилки (включая заполненные жидкостью); жевательные формы; гели;Dosage forms suitable for oral administration include solid, semi-solid and liquid systems such as tablets; soft or hard capsules containing multi- or nanoparticles, liquids or powders; lozenges (including those filled with liquid); chewable forms; gels;

быстро растворимые лекарственные формы; пленки; суппозитории; спреи; и щечные/мукоадгезивные пластыри.fast-dissolving dosage forms; films; suppositories; sprays; and buccal/mucoadhesive patches.

Жидкие лекарственные формы включают суспензии, растворы, сиропы и эликсиры. Такие лекарственные формы могут быть использованы как наполнители в мягких или жестких капсулах (например, из желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы) и обычно содержат носитель, например, воду, этанол, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу или подходящее масло и один или более эмульгаторов и/или суспендирующих агентов. Жидкие лекарственные формы могут быть также изготовлены путем восстановления твердого вещества, например, из саше.Liquid dosage forms include suspensions, solutions, syrups and elixirs. Such dosage forms may be used as fillers in soft or hard capsules (e.g. gelatin or hydroxypropyl methylcellulose) and typically contain a carrier such as water, ethanol, polyethylene glycol, propylene glycol, methyl cellulose or a suitable oil and one or more emulsifying and/or suspending agents. . Liquid dosage forms can also be prepared by solid reconstitution, for example from sachets.

Терапевтическое применение антитела к PD-L1 по данному изобретениюTherapeutic Use of Anti-PD-L1 Antibody of the Invention

В одном аспекте антитело к PD-L1 по данному изобретению применяется в лечении заболеваний и нарушений, которые связаны с активностью PD-L1, например заболевание или нарушение выбрано из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью).In one aspect, an anti-PD-L1 antibody of the invention is used in the treatment of diseases and disorders that are associated with PD-L1 activity, e.g., the disease or disorder is selected from the group: HNSC (head and neck squamous cell carcinoma), cervical cancer, cancer without primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC ( colorectal cancer with high microsatellite instability).

Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола и любого возраста.The aforementioned subject may be male or female and of any age.

В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела (например, антитела или фрагмента антитела, которое специфически связывает к PD-L1) может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками периферических органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных расстройством. Антитело или фрагмент антитела может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая продолжительность жизни, время до прогрессирования заболевания (ТТР), частоту ответа опухоли на лечение (RR), продолжительность ответа и/или качество жизни.In the case of a tumor (eg, a cancerous tumor), a therapeutically effective amount of an antibody or antibody fragment (eg, an antibody or antibody fragment that specifically binds to PD-L1) can reduce the number of cancer cells; reduce the initial size of the tumor; inhibit (ie, slow down to some extent and preferably stop) cancer cell infiltration of peripheral organs; inhibit (ie, slow down to some extent and preferably stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and/or alleviate, to some extent, one or more of the symptoms associated with the disorder. The antibody or antibody fragment may, to some extent, prevent the growth and/or kill existing cancer cells, it may cause a cytostatic and/or cytotoxic effect. In cancer therapy, in vivo efficacy can be determined, for example, by evaluating survival, time to disease progression (TTR), tumor response rate (RR), duration of response, and/or quality of life.

Используемые в данном документе термины совместное назначение, совместно назначенный и в сочетании с относящиеся антителу к PD-L1 с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, ссылаются или включают:As used herein, the terms co-administration, co-administration, and in combination with referring to an anti-PD-L1 antibody with one or more other therapeutic agents are intended to mean, refer to, or include:

1) одновременное введение такой комбинации антитела к PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,1) simultaneous administration of such a combination of an anti-PD-L1 antibody of the present invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated together in a single dosage form from which said components are released substantially simultaneously to said patient,

2) одновременное введение такой комбинации антитела к PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,2) simultaneous administration of such a combination of an anti-PD-L1 antibody of this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated separately in different dosage forms, the administration of which occurs at almost the same time to said patient, after which said the components are released almost simultaneously to the specified patient,

3) последовательное введение такой комбинации антитела к PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также3) sequential administration of such a combination of an anti-PD-L1 antibody of this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated separately from each other in separate dosage forms that are taken in sequential time by said patient with a significant time interval between each administration, after which said components are released at substantially different times to said patient; and

4) последовательное введение такой комбинации антитела к PD-L1 по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.4) sequential administration of such a combination of an anti-PD-L1 antibody of this invention and a therapeutic agent to a patient in need of treatment, when such components are formulated together in a single dosage form from which the release of these components occurs in a controlled manner, after which they are simultaneously, sequentially or jointly released at the same time and/or different times to the specified patient, where each part can be entered in one or different ways.

Антитело к PD-L1 по данному изобретению могут назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение антителом к PD-L1 по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к PD-L1 может вводиться совместно или быть сформулировано с другим медикаментом/препаратом для лечения рака.The anti-PD-L1 antibody of this invention can be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as a standalone therapy. In addition, treatment with an anti-PD-L1 antibody of the present invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy). In some embodiments, the anti-PD-L1 antibody may be co-administered or formulated with another cancer medication/drug.

Термин цитотоксическое средство в используемом в настоящем описании смысле относится кThe term cytotoxic agent as used herein refers to

- 34 041915 веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰,- 34 041915 to a substance that inhibits or prevents the functioning of cells and/or causes destruction of cells. The term is intended to include radioactive isotopes (eg At ²¹¹ , I ¹³¹ , I ¹²⁵ , Y ⁹⁰ ,

Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты.Re ¹⁸⁶ , Re ¹⁸⁸ , Sm ¹⁵³ , Bi ²¹² , P ³² and Lu radioactive isotopes), chemotherapeutic agents and toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins originating from bacteria, fungi, plants or animals, including their fragments and/ or options.

Химиотерапевтическим средством является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); дельта-9тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6диазо-5-оксоА-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин, доксорубицино-HCl в инъецируемых липосомах (DOXOL®), липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®), пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабин (XELODA®), эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (ara-С); тиотепа; таксоид, например паклитаксел (TAXOL®), препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел (TAXOTERE®); хлорамбуцил; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN®), винкристин (ONCOVIN®), виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®); этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN®); бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®), тилудронат (SKELID®) или ризендронат (ACTONEL®); троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, такихA chemotherapeutic agent is a chemical compound useful in the treatment of cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN®); alkylsulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquinone, meturedopa and uredopa; ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide and trimethylmelamine; acetogenins (particularly bullatacin and bullatacinone); delta-9tetrahydrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; camptothecin (including the synthetic analogue of topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetylcamptothecin, scopolectin and 9-aminocamptothecin); bryostatin; callistatin; CC-1065 (including its synthetic analogues adozelesin, carzelesin and bizelesin); podophyllotoxin; podophyllic acid; teniposide; cryptophycins (in particular, cryptophycin 1 and cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (including synthetic analogues of KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobin; pancratistatin; sarcodictyin; spongistatin; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornaphasine, holofosfamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembihin, phenesterin, prednimustine, trofosfamide, uramustine; nitrosoureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine and ranimnustine; antibiotics such as enediine antibiotics (for example, calicheamicin, in particular calicheamicin gamma II and calicheamicin omega II (see, for example, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dynemycin, including dynemycin A; esperamycin; as well as neocarzinostatin chromophore and related chromoprotein chromophores enediin antibiotics, aclacinomysins, actinomycin, autramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carsinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-oxo-oxo-oxo doxorubicin (including ADRIAMICIN®, morpholinodoxorubicin, cyanomorpholinodoxorubicin, 2-pyrrolinodoxorubicin, doxorubicino-HCl in injectable liposomes (DOXOL®), TLC D-99 liposomal doxorubicin (MYOCET®), pegylated liposomal doxorubicin (CAELYX®) and dezoxide, esorubicin), epirubicin , idarubicin, marcellomycin, mitomycins such as mitomycin C, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin , rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate, gemcitabine (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabine (XELODA®), epothilone, and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogs such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprin, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluridine, enocytabine, floxuridine; adrenal suppressants such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid compensator such as folinic acid; aceglatone; aldofosfamide glycoside; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraksat; defofamine; demecolcin; diazichon; elfornitin; elliptinium acetate; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainin; maytansinoids such as maytansine and ansamitocins; mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; phenamet; pyrarubicin; losoxantrone; 2-ethylhydrazide; procarbazine; polysaccharide complex PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rhizoxin; sisofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2,2',2-trichlorotriethylamine; trichothecenes (particularly T-2 toxin, verracurin A, roridin A, and anguidin); urethane; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; hacytosine; arabinoside (ara-C); thiotepa; a taxoid, eg paclitaxel (TAXOL®), an engineered albumin-bound nanoparticle formulation of paclitaxel (ABRAXANETM) and docetaxel (TAXOTERE®); chlorambucil; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum-based agents such as cisplatin, oxaliplatin and carboplatin; vinca alkaloids that prevent the polymerization of tubulin from nascent microtubules, including vinblastine (VELBAN®), vincristine (ONCOVIN®), vindesine (ELDISINE®, FILDESIN®) and vinorelbine (NAVELBINE®); etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; leucovorin; novantron; edatrexate; daunomycin; aminopterin; ibandronate; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO); retinoids such as retinoic acid, including bexarotene (TARGRETIN®); bisphosphonates such as clodronate (e.g. BONEFOS® or OSTAC®), etidronate (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronic acid/zoledronate (ZOMETA®), alendronate (FOSAMAX®), pamidronate (AREDIA®), tiludronate (SKELID® ) or risedronate (ACTONEL®); troxcitabine (1,3-dioxolane nucleoside analog of cytosine); antisense oligonucleotides, in particular oligonucleotides that inhibit gene expression in signaling pathways involved in aberrant cell proliferation, such

- 35 041915 как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®); rmRH (например, ABARELIX®); BAY439006 (сорафениб; Bayer); SU-11248 (Pfizer); перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®); CCI-779; типифарниб (811577); орафениб, АВТ510; ингибитор Bcl-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®); пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже); ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.- 35 041915 such as PKC-alpha, Raf, H-Ras and epidermal growth factor receptor (EGF-R); vaccines such as THERATOPE® vaccine and gene therapy vaccines such as ALLOVECTIN® vaccine, LEUVECTIN® vaccine and VAXID® vaccine; a topoisomerase 1 inhibitor (eg, LURTOTECAN®); rmRH (eg ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (Pfizer); perifosin, COX-2 inhibitor (eg celecoxib or etoricoxib), proteasome inhibitor (eg PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (811577); orafenib, ABT510; a Bcl-2 inhibitor such as sodium oblimersen (GENASENSE®); pixantrone; EGFR inhibitors (see definition below); tyrosine kinase inhibitors (see definition below); and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above; as well as combinations of two or more of the above, such as CHOP, short for combination therapy with cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisolone, and FOLFOX, short for oxaliplatin (ELOXATINTM) in combination with 5-FU and leucovorin.

Также в указанное определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX®), 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON®); идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®), триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена (ER), ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER); ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан (AROMASIN®), и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®), летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR®), ацетат мегестрола (MEGASE®), фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®), гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD); антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.Also included in this definition are antihormonal agents that act to regulate or inhibit the action of hormones on tumors, such as antiestrogen with a mixed agonist/antagonist profile, including tamoxifen (NOLVADEX®), 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, toremifene (FARESTON®); idoxifene, droloxifene, raloxifene (EVISTA®), trioxifene, keoxifene, and selective estrogen receptor modulators (SERMs) such as SERM3; pure antiestrogen without agonist properties such as fulvestrant (FASLODEX®) and EM800 (such agents can block estrogen receptor (ER) dimerization, inhibit DNA binding, increase ER metabolism and/or decrease ER levels); aromatase inhibitors, including steroidal aromatase inhibitors such as formestane and exemestane (AROMASIN®), and non-steroidal aromatase inhibitors such as anastrozole (ARIMIDEX®), letrozole (FEMARA®) and aminoglutethimide and other aromatase inhibitors, including vorozol (RIVISOR®), megestrol acetate (MEGASE®), fadrozole, imidazole; luteinizing hormone-releasing hormone agonists, including leuprolide (LUPRON® and ELIGARD®), goserelin, buserelin, and tripterelin; sex steroids, including progestins such as megestrol acetate and medroxyprogesterone acetate, estrogens such as diethylstilbestrol and premarin, and androgens/retinoids such as fluoxymesterone, all-trans retinoic acid and fenretinide; onapriston; antiprogesterones; estrogen receptor downregulators (ERDs); antiandrogens such as flutamide, nilutamide and bicalutamide; testolactone; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above; as well as combinations of two or more of the above means.

Другими терапевтическими средствами, которые могут применяться в комбинации с антителами против PD-L1 согласно изобретению могут быть ингибиторы функции фактора роста, например, такие ингибиторы включают антитела фактора роста и антитела рецептора фактора роста (например, антиerbB2 антитело трастузумаб [Herceptin], анти-EGFR антитело панитумумаб, анти-erbB1 антитело цетуксимаб [Erbitux, C225] и любые антитела факторов роста или рецепторов фактора роста, раскрытые Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29); антиангиогенные агенты, такие как ингибирующие эффекты сосудистого эндотелиального фактора роста, [например, антитело против фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток бевацизумаб (Avastin)], антитела против рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста, такие как анти-KDR антитела и анти-flt1 антитела; антисмысловые терапии, например, направленные на вышеперечисленные мишени, такие как ISIS 2503, анти-ras антисмысловые средства или G3139 (Genasense), анти-bcl2 антисмысловые средства; подходами генной терапии, включая, например, подходы с заменой аберрантных генов, таких как аберрантный р53 или аберрантный BRCA1 или BRCA2, GDEPT (ген-направленная ферментная пролекарственная терапия) подходы с использованием цитозиндеаминазы, тимидинкиназы или фермента бактериальной нитроредуктазы, и подходы, направленные на повышение толерантности пациента к химиотерапии или лучевой терапии, такие как генная терапия мультилекарственной резистентности; иммунотерапевтические подходы, включая, например, лечение Алемтузумабом (campath-1H), моноклональным антителом, направленным на CD52, или лечение антителами, направленными на CD22, ex vivo и in vivo подходы по повышению иммуногенности опухолевых клеток пациента, трансфекцию цитокинами, такими как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор, подходы, направленные на снижение анергии Т-клеток, такие как лечение моноклональными антителами, ингибирующими функцию CTLA-4, подходы с использованием трансфицированных иммунных клеток, таких как цитокин-трансфицированные дендритные клетки, подходы с использованием цитокин-трансфицированных опухолевых клеточных линий и подходы, использующие анти-идиотипические антитела, адаптивный перенос Т-клеток с использованием Т-клеток, подвергнутых неспецифической активации или нацеленных на конкретный антиген, представляющий интерес, ex vivo; ингибиторы деградации белка, такие как ингибитор протеасом, такой как Велкаде (бортезомид); биотерапевтические терапевтические подходы, например, использующие пептиды или белки (такие как антитела или растворимые конструкты внешних рецепторных доменов), которые секвестируют рецепторы лигандов, блокируют связывание лиганда с рецептором или ослабляют сигнализацию рецептора (например, вследствие повышенной деградации рецептора или сниженных уровней экспрессии).Other therapeutic agents that may be used in combination with anti-PD-L1 antibodies of the invention may be inhibitors of growth factor function, for example, such inhibitors include growth factor antibodies and growth factor receptor antibodies (eg, anti-erbB2 antibody trastuzumab [Herceptin], anti-EGFR panitumumab antibody, cetuximab anti-erbB1 antibody [Erbitux, C225] and any growth factor or growth factor receptor antibodies disclosed by Stern et al Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol 54, pp11-29); anti-angiogenic agents such as inhibitory effects of vascular endothelial growth factor [eg, anti-vascular endothelial growth factor antibody bevacizumab (Avastin)], antibodies against vascular endothelial growth factor receptors such as anti-KDR antibodies and anti-flt1 antibodies; antisense therapies, for example, directed to the above targets, such as ISIS 2503, anti-ras antisense agents or G3139 (Genasense), anti-bcl2 antisense agents; gene therapy approaches, including, for example, aberrant gene replacement approaches such as aberrant p53 or aberrant BRCA1 or BRCA2, GDEPT (Gene Targeted Enzyme Prodrug Therapy) approaches using cytosine deaminase, thymidine kinase, or the bacterial nitroreductase enzyme, and approaches aimed at increasing patient tolerance to chemotherapy or radiotherapy, such as multidrug resistance gene therapy; immunotherapeutic approaches, including, for example, treatment with Alemtuzumab (campath-1H), a monoclonal antibody directed to CD52, or treatment with antibodies directed to CD22, ex vivo and in vivo approaches to increase the immunogenicity of the patient's tumor cells, transfection with cytokines such as interleukin 2 , interleukin 4 or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, approaches to reduce T cell anergy, such as treatment with monoclonal antibodies that inhibit CTLA-4 function, approaches using transfected immune cells, such as cytokine-transfected dendritic cells, approaches using cytokine-transfected tumor cell lines and approaches using anti-idiotypic antibodies, adaptive T cell transfer using T cells subjected to non-specific activation or targeted to a specific antigen of interest, ex vivo; protein degradation inhibitors such as a proteasome inhibitor such as Velcade (bortezomide); biotherapeutic therapeutic approaches, for example, using peptides or proteins (such as antibodies or soluble external receptor domain constructs) that sequester ligand receptors, block ligand binding to the receptor, or attenuate receptor signaling (eg, due to increased receptor degradation or reduced expression levels).

- 36 041915- 36 041915

Дозы и пути введенияDoses and routes of administration

Антитело к PD-L1 по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение антитела к PD-L1 самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных антиаутоиммунных или противовоспалительных методов лечения.The anti-PD-L1 antibody of this invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result. The therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the particular condition being treated, the age, sex, and weight of the patient, and whether administration of the anti-PD-L1 antibody is a stand-alone treatment or in combination with one or more additional anti-autoimmune or anti-inflammatory therapies.

Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (b) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.Drug regimens can be adjusted to provide the optimal desired response. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally reduced or increased depending on the severity of the therapeutic situation. Especially useful is the formulation of parenteral compositions in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosing. Unit dosage form, as used herein, refers to physically discrete units suitable as unit doses for patients/subjects to be treated; each unit contains a predetermined amount of the active compound calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the required pharmaceutical carrier. The specification for unit dosage forms of the present invention is generally dictated by and directly dependent on (a) the unique characteristics of the chemotherapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved, and (b) the limitations inherent in the technique of compounding such an active compound to sensitivity treatment in subjects.

Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.Thus, those skilled in the art will appreciate from the disclosure provided herein that doses and dosing regimens are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field. This means that the maximum tolerated dose can be easily set and the effective amount that provides a detectable therapeutic effect for the patient can also be determined, as well as the time requirements for the administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient. Thus, although some doses and regimens of administration are given as examples in this document, these examples in no way limit the doses and regimens of administration that may be needed for a patient in the practice of the present invention.

Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело к PD-L1. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.It should be noted that dosage values may vary depending on the type and severity of the condition to be alleviated and may include one or more doses. In addition, it should be understood that for any particular patient, specific administration schedules will need to be adjusted over time according to individual need and at the discretion of the healthcare professional who administers or supervises the administration of the compositions, and that the concentration ranges given in this specification are only by way of example and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions. In addition, the dosage regimen with the compositions of this invention may be based on various factors, including the type of disease, age, weight, sex, health status of the patient, severity of the condition, route of administration, and the particular anti-PD-L1 antibody used. Thus, the dosing regimen may vary widely, but may be determined regularly using standard methods. For example, doses may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects such as toxic effects or laboratory values. Thus, the present invention encompasses individual dose escalation as determined by the skilled artisan. Determination of the required dose and modes are well known in the relevant field of technology and will be clear to a person skilled in the art after reading the ideas disclosed in this document.

Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.Examples of suitable routes of administration are provided above.

Предполагается, что подходящая доза антитела к PD-L1 по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например около 1-20 мг/кг. Антитело к PD-L1 может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например по меньшей мере 1,5 мг/кг, например также как не менее 2 мг/кг, например по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.It is contemplated that a suitable dose of an anti-PD-L1 antibody of this invention will be in the range of 0.1-200 mg/kg, preferably 0.1-100 mg/kg, including about 0.5-50 mg/kg, e.g. about 1-20 mg/kg. Anti-PD-L1 antibody can be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg/kg, for example, at least 0.5 mg/kg, including at least 1 mg/kg, for example, at least 1 .5 mg/kg, such as also at least 2 mg/kg, such as at least 3 mg/kg, including at least 4 mg/kg, such as at least 5 mg/kg; and for example up to a maximum of 50 mg/kg, including up to a maximum of 30 mg/kg, for example up to a maximum of 20 mg/kg, including up to a maximum of 15 mg/kg. The administration will be repeated usually at suitable intervals, for example, once a week, once every two weeks, once every three weeks or once every four weeks, and for as long as is deemed appropriate by the physician in charge, who may in some cases increase or reduce dose if necessary.

Изделие (продукты) и наборыProduct(s) and kits

Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты,The following embodiment of the invention is an article that contains products,

- 37 041915 применяемые для лечения рака, в частности ПРГШ, рака шейки матки, рака без выявленного первоисточника, глиобластомы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, НМРЛ, рака почки, рака яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковке, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело к PDL1, предлагаемое в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту.- 37 041915 used for the treatment of cancer, in particular HNPC, cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI KRR. The product is a container and a label or leaflet in the package, which are placed on the container or enclosed in it. Acceptable containers are, for example, jars, vials, syringes, etc. Containers can be made from various materials such as glass or plastic. The container contains a composition effective for the treatment of a particular condition and may have a sterile inlet (for example, the container may be an intravenous solution bag or a vial fitted with a stopper that can be pierced with a hypodermic needle). At least one active ingredient in the composition is an anti-PDL1 antibody of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used to treat a specific condition. The label or package insert should additionally contain instructions for administering the antibody composition to the patient.

Листовка-вкладыш в упаковке содержит обычные инструкции, которые включают в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, в том числе примерную информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовкевкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения рака, в частности ПРГШ, рака шейки матки, рака без выявленного первоисточника, глиобластомы, рака пищевода, рака мочевого пузыря, ТНРМЖ, КРР, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, НМРЛ, рака почки, рака яичника, лимфомы Ходжкина, MSI КРР.The package insert contains the usual instructions that are included in commercial packages of therapeutic products, including exemplary information about the indications, use, dose, route of administration, contraindications and/or precautions regarding the use of such therapeutic products. In one of the embodiments of the invention, the leaflet in the package indicates that the composition is used for the treatment of cancer, in particular HNCH, cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC, CRC, hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC, kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC.

Кроме того, изделие может дополнительно содержать второй контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.In addition, the article may further comprise a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer such as bacteriostatic water for injection (BAVI), phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution. In addition, it may include other products required from a commercial and consumer point of view, in particular other buffers, diluents, filters, needles and syringes.

Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей, например, для детектирования PD-L1 в тканях, клетках или жидкостях организма млекопитающего. Такой набор будет пригодным для скрининга ассоциированных с PD-L1 болезней. Набор включает специфический связывающий агент или антитело по изобретению и средства, указывающие на протекание реакции специфического связывающего агента или антитела с PD-L1, в случае его присутствия. В одном варианте воплощения антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном варианте воплощения антитело, связывающее PD-L1, является меченым. В другом варианте воплощения антитело представляет собой немеченое первичное антитело, и набор дополнительно включает средства детектирования первичного антитела. В одном варианте воплощения средства детектирования включают меченое второе антитело, представляющее собой анти-иммуноглобулин. Антитело может быть меченым с помощью маркера, выбранного из группы, состоящей из флуорохрома, фермента, радионуклида и радионепрозрачного материала. Набор может представлять собой набор, который содержит антитела для выявления и количественной оценки PD-L1 in vitro, например при осуществлении ELISA или Вестерн-блоттинга. Также, как и в случае изделия, набор содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковке, расположенные на поверхности или внутри контейнера. Контейнер содержит композицию, которая включает по меньшей мере одно антитело к PD-L1, предлагаемое в изобретении. Дополнительные контейнеры могут содержать, например разбавители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или листовка-вкладыш в упаковке могут содержать описание композиции, а также инструкции по их применению in vitro или для целей диагностики.The invention also relates to kits that can be used for various purposes, for example, for the detection of PD-L1 in tissues, cells or body fluids of a mammal. Such a kit would be useful for screening for PD-L1 associated diseases. The kit includes a specific binding agent or antibody of the invention and means indicating the reaction of the specific binding agent or antibody with PD-L1, if present. In one embodiment, the antibody is a monoclonal antibody. In one embodiment, the PD-L1 binding antibody is labeled. In another embodiment, the antibody is an unlabeled primary antibody and the kit further includes means for detecting the primary antibody. In one embodiment, the detection means comprise a labeled second antibody that is an anti-immunoglobulin. The antibody may be labeled with a marker selected from the group consisting of a fluorochrome, an enzyme, a radionuclide, and a radioopaque material. The kit may be a kit that contains antibodies for the detection and quantification of PD-L1 in vitro, such as when performing ELISA or Western blotting. Also, as in the case of the product, the kit contains a container and a label or package insert located on the surface or inside the container. The container contains a composition that includes at least one anti-PD-L1 antibody of the invention. Additional containers may contain, for example, diluents and buffers, control antibodies. The label or package insert may contain a description of the composition, as well as instructions for their use in vitro or for diagnostic purposes.

Диагностическое использование и композицииDiagnostic use and compositions

Антитело к PD-L1 по настоящему изобретению также используются в диагностических процессах (например, in vitro, ex vivo). Например, антитело к PD-L1 может использоваться для обнаружения или измерения уровня PD-L1 в образцах, полученных от пациента (например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкость кишечника, слюна или моча). Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы (например, диагностические наборы), содержащие антитела к PD-L1, описанные в данном документе.Anti-PD-L1 antibodies of the present invention are also used in diagnostic processes (eg, in vitro, ex vivo). For example, an anti-PD-L1 antibody can be used to detect or measure the level of PD-L1 in samples obtained from a patient (for example, a tissue sample or a body fluid sample such as inflammatory exudate, blood, serum, intestinal fluid, saliva, or urine) . Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescent assay, radioimmunoassay, and immunohistology. The invention further includes kits (eg, diagnostic kits) containing the anti-PD-L1 antibodies described herein.

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.For a better understanding of the invention, the following examples are given. These examples are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any form.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантовAll publications, patents, and patent applications referenced in this specification are incorporated herein by reference. Although the above invention has been described in some detail by way of illustration and example in order to avoid ambiguous interpretation, it will be quite clear to those skilled in the art based on the ideas disclosed in this invention that certain changes and modifications can be made without deviating from the essence and scope of the attached options.

- 38 041915 осуществления изобретения.- 38 041915 implementation of the invention.

ПримерыExamples

Пример 1.Example 1

Продукция рекомбинантных антигенов и антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих.Production of recombinant antigens and antibodies in suspension culture of mammalian cells.

Антитела и антигены продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СНО-К1), согласно опубликованным протоколам [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6):670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun;28(11):843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84(3):332-342]. Использовали клетки, конститутивно экспрессирующие ген белка EBNA1 (Epstein-Barrvirus nuclear antigen 1). Суспензионное культивирование осуществляли в колбах на орбитальном шейкере, с использованием бессывороточных сред производства компании Life Technologies Corporation и согласно инструкциям производителя. Для транзиентной экспрессии клетки в концентрации 2х10⁶/мл трансфецировали с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ МАХ, компания Polysciences).Antibodies and antigens were produced in cells of a permanent cell line derived from Chinese hamster ovary cells (CHO-K1 line) according to published protocols [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6):670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun;28(11):843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84(3):332-342]. Cells constitutively expressing the EBNA1 (Epstein-Barrvirus nuclear antigen 1) protein gene were used. Suspension culture was performed in flasks on an orbital shaker using serum-free media manufactured by Life Technologies Corporation and according to the manufacturer's instructions. For transient expression, cells at a concentration of 2x10 ⁶ /ml were transfected with linear polyethyleneimine (PEI MAX, Polysciences).

Соотношение ДНК/ПЭИ составляло 1:3/1:10. Через 5-7 дней после трансфекции культуральную среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 мин и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии.The DNA/PEI ratio was 1:3/1:10. 5-7 days after transfection, the culture medium was centrifuged at 2000 g for 20 min and filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm. Target proteins were isolated from the culture liquid using affinity chromatography.

Рекомбинантный белок PD-L1, содержащий EPEA-tag (glutamic acid-proline-glutamic acid-alanine) на С-конце белка, выделяли и очищали из культуральной жидкости, используя сорбент CaptureSelect C-tag Affinity Matrix. Культуральную жидкость пропускали через хроматографическую колонку, предварительно заполненную 5 мл C-tag сорбента, затем промывали колонку 25 мл ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающиеся компоненты. Связанный антиген элюировали в мягких условиях, используя 20 mM Tris, 2M MgCl₂ рН7,0-7,4. Далее белок переводили в ФСБ (рН 7,4) с помощью диализа, используя полупроницаемую диализную мембрану, фильтровали (0,22 мкм), переносили в пробирки и хранили при -70°С.The recombinant PD-L1 protein containing the EPEA-tag (glutamic acid-proline-glutamic acid-alanine) at the C-terminus of the protein was isolated and purified from the culture liquid using the CaptureSelect C-tag Affinity Matrix sorbent. The culture fluid was passed through a chromatographic column pre-filled with 5 ml of C-tag sorbent, then the column was washed with 25 ml of PBS to wash out non-specifically binding components. Bound antigen was eluted under mild conditions using 20 mM Tris, 2M MgCl ₂ pH 7.0-7.4. Next, the protein was transferred to PBS (pH 7.4) by dialysis using a semi-permeable dialysis membrane, filtered (0.22 μm), transferred to test tubes and stored at -70°C.

Рекомбинантные белки PD-1 и PD-L1-Fc из культуральной жидкости выделяли и очищали, используя колонку для аффинной хроматографии протеин А. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку HiTrap rProtein A Sepharose FF объемом 5 мл (GE Healthcare), уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН 7,4). Затем колонку промывали 5 колоночными объемами ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антиген элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер рН 3. Главный протеиновый пик элюции собирали и доводили его рН до нейтральности с помощью 1 М буфера Tris (рН 8). Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (рН 7,4) с помощью диализа, используя технологию SnakeSkin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм), переносили в пробирки и хранили при -70°С.Recombinant PD-1 and PD-L1-Fc proteins were isolated from the culture broth and purified using a protein A affinity column. The clarified culture broth was passed through a 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF column (GE Healthcare) equilibrated with PBS (PBS, pH 7.4). The column was then washed with 5 column volumes of PBS to wash out the non-specific binding components. Bound antigen was eluted using 0.1 M glycine buffer pH 3. The major protein elution peak was collected and adjusted to pH neutral with 1 M Tris buffer (pH 8). All stages were carried out at a flow rate of 110 cm/h. Next, the protein was transferred to PBS (pH 7.4) using dialysis using SnakeSkin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 μm), transferred to test tubes and stored at -70°C.

Антитела IgG1 очищали на колонке Hi Trap rProteinA FF объемом 1 мл (GE Healthcare) согласно методике, описанной выше для антигенов. Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза (фиг. 4А и 4Б).IgG1 antibodies were purified on a 1 ml Hi Trap rProteinA FF column (GE Healthcare) as described above for antigens. The purity of the resulting protein solution was assessed by SDS gel electrophoresis (FIGS. 4A and 4B).

Пример 2. Создание наивной Fab-библиотеки человеческих антител MeganLibTMExample 2 Creation of a Naive MeganLib™ Human Antibody Fab Library

Суммарную РНК В-лимфоцитов из индивидуальных образцов крови более тысячи человеческих доноров выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit согласно предлагаемому протоколу (от QIAGEN). Концентрацию РНК определяли с помощью набора Nanovue (от GE Healthcare) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.Total B-lymphocyte RNA from individual blood samples from more than a thousand human donors was isolated using the RNeasy Mini Kit according to the proposed protocol (from QIAGEN). RNA concentration was determined using a Nanovue kit (from GE Healthcare) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis on a 1.5% agarose gel.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit (от Evrogen) согласно рекомендуемому протоколу с использованием обратной транскриптазы MMuLV и рандомгексамерных олигонуклеотидов в качестве затравки.The reverse transcription reaction was performed using the MMLV RT kit (from Evrogen) according to the recommended protocol using MMuLV reverse transcriptase and random hexamer oligonucleotides as a primer.

Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции для получения генов вариабельных доменов, фланкированных сайтами рестрикции, с использованием набора олигонуклеотидов по протоколам авторов [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30].Reverse transcription products were used as a template in a two-step polymerase chain reaction to obtain variable domain genes flanked by restriction sites using a set of oligonucleotides according to the protocols of the authors [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30].

Полученный ДНК препарат VL-CK-VH (фиг. 1) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI/Eco91I и лигировали в оригинальную фагмиду рН5 (фиг. 2). Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки штамма SS320, приготовленные согласно протоколам [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]. Репертуар комбинаторной фаговой Fab-дисплейной библиотеки MeganLibTM составлял 10¹¹ трансформантов. Препараты фага Fab-библиотек готовили согласно процедуре, описанной ранее [J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-97].The resulting VL-CK-VH DNA preparation (Fig. 1) was treated with NheI/Eco91I restriction endonucleases and ligated into the original pH5 phagemid (Fig. 2). The ligation products were transformed into electrocompetent cells of strain SS320, prepared according to the protocols [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]. The combinatorial phage Fab display library MeganLibTM had a repertoire of 10 ¹¹ transformants. Phage Fab library preparations were prepared according to the procedure previously described [J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-97].

Пример 3. Селекция Fab-библиотек фаговых антител.Example 3 Selection of Phage Antibody Fab Libraries.

Специфичные фаговые Fab-антитела человека против PD-L1 получали из комбинаторной фаговой Fab-дисплейной библиотеки MeganLibTM. Селекцию проводили на PD-L1 человека методом фагового дисплея [Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14(3): 309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97], но с использованием магнитных частиц и прибора KingFisher Flex, так как использование данной методики позволяет проводить параллельно до 96 различных схем и вариантов биопэннинга.Specific human phage Fab antibodies against PD-L1 were obtained from the combinatorial phage Fab display library MeganLibTM. The selection was carried out on human PD-L1 by the phage display method [Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14(3): 309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97], but using magnetic particles and the KingFisher Flex device, since the use of this technique allows up to 96 different schemes and variants of biopanning to be carried out in parallel.

В селекции методом биопэннинга биотинилированный PD-L1-Fc в концентрации 10 мкг/мл иммоIn biopanning selection, biotinylated PD-L1-Fc at a concentration of 10 µg/ml immo

- 39 041915 билизовали на поверхности стрептавидиновых магнитных частиц, инкубировав белок с частицами в течение 1 ч при комнатной температуре на ротаторе. Далее частицы отмывали ФСБ (рН 7,4), затем блокировали частицы раствором 2% обезжиренного молока на ФСБ (рН 7,4) в течение 1 ч. Затем добавляли к магнитным частицам со связанным антигеном раствор фагов в ФСБ (рН 7,4) с 2% обезжиренным молоком, концентрация фаговых частиц составляла 2,5х10¹² на мл. Инкубировали данную смесь в течение 40 мин при перемешивании. Несвязавшиеся фаги удаляли в ходе нескольких отмывок магнитных частиц раствором ФСБ (рН 7,4) с 0,1% Твин 20. Количество отмывок увеличивали от раунда к раунду (на 1-ом раунде 10 отмывок, на 2-ом - 20 и на 3-ем - 30). Фаги, связавшиеся с антигеном на поверхности магнитных частиц, элюировали с частиц 100 мМ раствором Gly-HCl (pH 2,2) в течение 15 мин при перемешивании, после элюции нейтрализовали раствор 1М TRIS-HCl (рН 7.6). Бактерии штамма E.coli TG1 инфицировали полученными фагами, нарабатывали в них фаги, выделяли их и использовали в следующем раунде селекции. После двух-трех раундов из фагов выделяли их ДНК (фагмиды), и гены вариабельных доменов антител клонировали в экспрессионные вектора (фиг. 3) для наработки Fab в клетках Е.coli.- 39 041915 were bilized on the surface of streptavidin magnetic particles by incubating the protein with particles for 1 h at room temperature on a rotator. Next, the particles were washed with PBS (pH 7.4), then the particles were blocked with a solution of 2% skimmed milk on PBS (pH 7.4) for 1 h. Then a solution of phages in PBS (pH 7.4) was added to the magnetic particles with antigen bound with 2% skim milk, the concentration of phage particles was 2.5 x 10 ¹² per ml. This mixture was incubated for 40 min with stirring. Unbound phages were removed during several washes of magnetic particles with a PBS solution (pH 7.4) with 0.1% Tween 20. -em - 30). Phages bound to the antigen on the surface of the magnetic particles were eluted from the particles with a 100 mM Gly-HCl solution (pH 2.2) for 15 min with stirring; after elution, the 1M TRIS-HCl solution (pH 7.6) was neutralized. Bacteria of the E. coli TG1 strain were infected with the obtained phages, phages were produced in them, isolated and used in the next round of selection. After two to three rounds, their DNA (phagemids) was isolated from the phages, and the antibody variable domain genes were cloned into expression vectors (FIG. 3) to generate Fab in E. coli cells.

Пример 4. Скрининг Fab, специфически связывающих PD-L1 человекаExample 4 Screening for Fabs Specifically Binding Human PD-L1

ИФА (ELISA) использовали для поиска Fab, связывающих PD-L1 человека. В качестве позитивного контроля использовали Fab с опубликованной последовательностью Atezolizumab (Genentech). Для анализа специфического связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл PD-L1-FE (0,2 мкг/мл в 1 х карбонатном буфере), герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan). Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре. После отмывок ФСБ-Твином добавляли по 50 мкл на лунку тестируемого клеточного супернатанта, содержащего исследуемый Fab, смешанного с равным объемом ВВ. Планшеты снова инкубировали, встряхивая, один час при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) античеловеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-ThermoScientific) в соотношении 1:5000 в ФСБ-Твин. Планшеты встряхивали на ротационном шейкере (50 мин, комнатная температура) и промывали три раза буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшетридер Tecan-Sunrise (от Tecan). Степень связывания антитела была пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, у которых цветовой сигнал превышал сигнал от контрольного антитела, проверяли в ИФА на неспецифическое связывание.ELISA was used to search for Fabs that bind human PD-L1. A Fab with the published sequence of Atezolizumab (Genentech) was used as a positive control. For specific binding assay, wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) were coated with 50 μl of PD-L1-FE (0.2 μg/ml in 1 x carbonate buffer), sealed and incubated overnight at 4°C. All subsequent steps were performed according to a standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on robotic systems Genetix Qpix2xt (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan). Blocking buffer BB (200 µl 0.5% skimmed milk in PBS) was added to block non-specific binding. The plates were incubated on a shaker for one hour at room temperature. After washes with PBS-Tween, 50 μl per well of the test cell supernatant containing the test Fab, mixed with an equal volume of explosive, was added. The plates were again incubated with shaking for one hour at room temperature, after which each well of the plates was washed three times with PBS-Tween buffer. After washing was added (50 μl/well) anti-human Fab HRP-conjugated secondary antibody (from Pierce-ThermoScientific) at a ratio of 1:5000 in PBS-tween. The plates were shaken on a rotary shaker (50 min, room temperature) and washed three times with PBS-Tween buffer as described above. The colorimetric signal was developed by adding TMB (50 µl/well) until saturation (average 3-5 min), then further development was stopped by adding a stop solution (30 µl/well, 10% sulfuric acid). The color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise plate reader (from Tecan). The degree of antibody binding was proportional to the production of a color signal. Clones whose color signal exceeded the signal from the control antibody were tested in ELISA for non-specific binding.

Пример 5. Анализ неспецифического связывания отобранных Fab с другими антигенамиExample 5 Non-Specific Binding Assay of Selected Fabs to Other Antigens

ИФА (ELISA) использовали также анализа неспецифического связывания исследуемых Fabфрагментов с другими антигенами. Исследование проводили, как описано выше, но в качестве антигенов для иммобилизации использовали IL6R-Fc, INFa2b, PCSK9-VG-FE, PD-1-Fc (2,5 мкг/мл в 1 х карбонатном буфере). В качестве контроля специфического связывания использовали PD-L1-Fc (0,2 мкг/мл в 1 х карбонатном буфере). Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan). Клоны, у которых цветовой сигнал неспецифического связывания не превышал сигнал от специфического связывания, проверяли в конкурентном ИФА анализе для выявления антагонистических Fab, блокирующих взаимодействие лиганда и рецептора.ELISA (ELISA) also used the analysis of non-specific binding of the investigated Fab fragments with other antigens. The study was carried out as described above, but IL6R-Fc, INFa2b, PCSK9-VG-FE, PD-1-Fc (2.5 μg/ml in 1 x carbonate buffer) were used as antigens for immobilization. PD-L1-Fc (0.2 μg/ml in 1 x carbonate buffer) was used as a specific binding control. All subsequent steps were performed according to a standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on robotic systems Genetix Qpix2xt (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan). Clones in which the color signal of non-specific binding did not exceed the signal from specific binding were tested in a competitive ELISA assay to identify antagonistic Fabs blocking the interaction of the ligand and receptor.

Пример 6. Конкурентный ИФА анализ блокирования взаимодействия PD-L1 с его рецептором PD-1.Example 6 Competitive ELISA assay blocking the interaction of PD-L1 with its PD-1 receptor.

Конкурентный ИФА (ELISA) использовали для проверки отобранных ранее специфичных Fab против PD-L1 человека на способность блокировать взаимодействие с рецептором PD-1. В качестве позитивного контроля антагониста использовали Fab с опубликованной последовательностью Atezolizumab (Genentech).Competitive ELISA was used to test previously selected anti-human PD-L1 specific Fabs for their ability to block interaction with the PD-1 receptor. A Fab with the published sequence of Atezolizumab (Genentech) was used as a positive antagonist control.

PD-1-Fc иммобилизовали в лунках планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) по 50 мкл с концентрацией 1 мкг/мл в 1 х карбонатном буфере и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартным ИФА протоколам с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan). Для блокирования неспецифического связывания добавляли блокирующий буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре.PD-1-Fc was immobilized in the wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) at 50 μl at a concentration of 1 μg/ml in 1 x carbonate buffer and incubated overnight at 4°C. All subsequent steps were performed according to standard ELISA protocols using a high-performance automated platform based on robotic systems Genetix Qpix2xt (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan). Blocking buffer BB (200 µl 0.5% skimmed milk in PBS) was added to block non-specific binding. The plates were incubated on a shaker for one hour at room temperature.

Параллельно в несорбирующих планшетах смешивали в соотношении 1: 1 клеточный супернатант, содержащий тестируемый Fab и PD-L1-Fc (в конечной концентрации 2 мкг/мл в ФСБ-Твин), инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре и шейкинге при 500 об/мин.In parallel, the cell supernatant containing the tested Fab and PD-L1-Fc (at a final concentration of 2 μg/ml in PBS-Tween) was mixed in a 1:1 ratio in non-sorbing plates, incubated for 45 min at room temperature and shaking at 500 rpm. min.

- 40 041915- 40 041915

После отмывок от ВВ планшета, содержащего PD-1 рецептор, туда переносили смесь Fab и PD-L1, инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре и шейкинге при 500 об/мин. После чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин, добавляли по 50 мкл/лунку античеловеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от PierceThermoScientific) в соотношении 1:5000 в ФСБ-Твин. Инкубировали 45 мин при комнатной температуре и встряхивании 500 об./мин, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер Tecan-Sunrise (от Tecan). Степень связывания Fab была обратно пропорциональна продуцированию цветового сигнала. Клоны, показавшие блокирование на уровне контрольного Fab антитела Atezolizumab, отмечали как позитивные и использовали в дальнейших анализах. Гены вариабельных доменов позитивных клонов секвенировали, согласно стандартным протоколам на аппарате Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) и анализировали.After washes from the BB plate containing the PD-1 receptor, a mixture of Fab and PD-L1 was transferred there, incubated for 45 min at room temperature and shaking at 500 rpm. After that, each well of the plates was washed three times with PBS-Tween buffer, 50 μl/well of anti-human Fab HRP-conjugated secondary antibody (from PierceThermoScientific) was added at a ratio of 1:5000 in PBS-Tween. Incubated for 45 min at room temperature with 500 rpm shaking, after which each well of the plates was washed three times with PBS-Tween buffer as described above. The colorimetric signal was developed by adding TMB (50 µl/well) until saturation (average 3-5 min), then further development was stopped by adding a stop solution (30 µl/well, 10% sulfuric acid). The color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise plate reader (from Tecan). The extent of Fab binding was inversely proportional to color signal production. Clones showing blocking at the control Fab level of the Atezolizumab antibody were marked as positive and used in further assays. The variable domain genes of the positive clones were sequenced according to standard protocols on an Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) and analyzed.

Пример 7. Сравнительный скрининг анти-PD-L1 Fab кандидатов человека по koff.Example 7 Comparative screening of human anti-PD-L1 Fab candidates by koff.

Koff-скрининг производили с использованием прибора Pall Forte Bio Octet Red 96. Анти FABCH1биосенсоры в течение 30 мин регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ ФСБ, рН 7.2-7.4, 0.1% Твин-20, 0,1% БСА. В исследуемые образцы супернатантов E.coli добавляли рабочий буфер до конечной концентрации 1х. Затем анти FABCH1-биосенсоры погружали в супернатанты E.coli, содержащие Fab-фрагменты кандидатов антител, на 12 ч при 4°С. Сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab -фрагментами переносили в лунки с рабочим буфером, где прописывали базовую линию (60 с.). Далее сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (PD-L1, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген-антитело (300 с.). Затем сенсоры возвращали в лунки, содержащие рабочий буфер, для последующей стадии диссоциации (600 с.). После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (Gly-HCl, рН 1,7) после чего использовали в следующем эксперименте. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре по модели взаимодействия 1:1.Koff screening was performed using a Pall Forte Bio Octet Red 96 instrument. Anti FABCH1 biosensors were rehydrated for 30 min in working buffer containing 10 mM PBS, pH 7.2–7.4, 0.1% Tween-20, 0.1% BSA. Working buffer was added to the test samples of E. coli supernatants to a final concentration of 1x. Then, anti FABCH1 biosensors were immersed in E. coli supernatants containing Fab fragments of candidate antibodies for 12 h at 4°C. Sensors with Fab fragments immobilized on the surface were transferred to wells with working buffer, where a baseline (60 s) was written. Next, the sensors were transferred into wells with analyte solution (PD-L1, 30 µg/mL) for association of the antigen-antibody complex (300 s). The sensors were then returned to the wells containing working buffer for the subsequent dissociation step (600 s). After each experiment, the used sensors were regenerated by placing them in regeneration buffer (Gly-HCl, pH 1.7) three times and then used in the next experiment. The obtained curves were analyzed using the Octet Data Analysis software (version 7.0) according to the standard procedure using a 1:1 interaction model.

Пример 8. Иммуноферментный анализ взаимодействия анти-PD-L1 антитела с PD-L1 и другими антигенами.Example 8 Enzyme immunoassay for the interaction of an anti-PD-L1 antibody with PD-L1 and other antigens.

ИФА (ELISA) использовали для измерения сравнительной аффинности антител к PD-L1 и другим антигенам. Для анализа связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл PD-L1-Fc, fPCSK9-EPEA, Ang2-H6F, GM-CSF-FE, CD3-ED-FC, IL17a, CD38-Fc, IL6R-Fc (1 мкг/мл в 1 x карбонатном буфере), герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному ИФА протоколу. Для блокирования неспецифического связывания добавляли буфер ВВ (200 мкл 0,5% нежирного молока в ФСБ). Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре. После отмывок ФСБ-Твином добавляли по 50 мкл на лунку тестируемого антитела BCD-135 в концентрации от 5 мкг/мл в ФСБ-Твин. Планшеты снова инкубировали, встряхивая, 1 ч при комнатной температуре, после чего каждую лунку планшетов три раза промывали буфером ФСБ-Твин. После промывания добавляли (50 мкл/лунку) анти-человеческого Fab HRP-конъюгированного вторичного антитела (от Pierce-ThermoScientific) в соотношении 1:5000 в ФСБТвин. Планшеты встряхивали на ротационном шейкере (50 мин, комнатная температура) и промывали три раза буфером ФСБ-Твин, как описано выше. Колориметрический сигнал развивали добавлением ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), затем дальнейшее развитие останавливали добавлением стопового раствора (30 мкл/лунку, 10% серная кислота). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер Tecan-Sunrise (от Tecan). Степень связывания антитела была пропорциональна продуцированию цветового сигнала (фиг. 5). Анти-PD-LI антитело специфически связывалось с PD-L1 и не связывалось с другими исследуемыми антигенами.ELISA was used to measure the relative affinity of antibodies for PD-L1 and other antigens. For binding assay, wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) were coated with 50 µl of PD-L1-Fc, fPCSK9-EPEA, Ang2-H6F, GM-CSF-FE, CD3-ED-FC, IL17a, CD38-Fc, IL6R -Fc (1 μg/ml in 1 x carbonate buffer), sealed and incubated overnight at 4°C. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol. Buffer BB (200 µl 0.5% skimmed milk in PBS) was added to block non-specific binding. The plates were incubated on a shaker for one hour at room temperature. After washes with PBS-Tween, 50 μl per well of the tested BCD-135 antibody was added at a concentration of 5 μg/ml in PBS-Tween. The plates were again incubated with shaking for 1 h at room temperature, after which each well of the plates was washed three times with PBS-Tween buffer. After washing was added (50 μl/well) anti-human Fab HRP-conjugated secondary antibody (from Pierce-ThermoScientific) at a ratio of 1:5000 in PBSTween. The plates were shaken on a rotary shaker (50 min, room temperature) and washed three times with PBS-Tween buffer as described above. The colorimetric signal was developed by adding TMB (50 µl/well) until saturation (average 3-5 min), then further development was stopped by adding a stop solution (30 µl/well, 10% sulfuric acid). The color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise plate reader (from Tecan). The degree of antibody binding was proportional to the production of a color signal (FIG. 5). The anti-PD-LI antibody specifically binds to PD-L1 and does not bind to other antigens tested.

Пример 9. Реактивация NFAT-сигналинга анти-PD-L1 антителами в репортерной клеточной линии Jurkat-NFAT-PD-1Example 9 Reactivation of NFAT signaling by anti-PD-L1 antibodies in the Jurkat-NFAT-PD-1 reporter cell line

Проводили инжиниринг человеческой линии Т-клеточного происхождения Jurkat путем внедрения в ее геном двух генетических конструкций. Одна конструкция кодировала ген рецептора PD-1 человека. Вторая конструкция кодировала ген люциферазы, находящийся под контролем NFAT-чувствительного генетического элемента. В результате получали репортерную клеточную линию Jurkat-NFAT-PD-1, которая экспрессировала на поверхностной мембране рецептор PD-1 и содержала NFAT-зависимый промотор, который направлял транскрипцию гена люциферазы. Синтез фермента люциферазы в клетках этой линии пропорционален уровню активности NFAT, которая, в свою очередь, отражала общий уровень активации Т-лимфоцита.The human line of T-cell origin Jurkat was engineered by introducing two genetic constructs into its genome. One construct encoded the human PD-1 receptor gene. The second construct encoded a luciferase gene under the control of an NFAT-sensitive genetic element. As a result, a reporter cell line Jurkat-NFAT-PD-1 was obtained, which expressed the PD-1 receptor on the surface membrane and contained an NFAT-dependent promoter that directed the transcription of the luciferase gene. The synthesis of the luciferase enzyme in the cells of this line is proportional to the level of NFAT activity, which, in turn, reflects the overall level of T-lymphocyte activation.

Анализ активности анти-PD-L1 антител с помощью этой клеточной линии осуществляли следующим образом: активация TCR-рецепторов с помощью анти-CD3 и анти-CD28 антител запускала внутриклеточный каскад, в результате которого активировался NFAT-промотор. PD-L1 представлен на поверх- 41 041915 ности клеток MDA-MB-231, активированных интерфероном. Взаимодействие PD-L1 с PD-1 ингибировало передачу сигнала с TCR-рецепторов на NFAT-промотор. Антитела анти-PD-L1 разобщали взаимодействие PD-L1-PD-1 и происходила реактивация внутриклеточной сигнализации.Analysis of the activity of anti-PD-L1 antibodies using this cell line was carried out as follows: activation of TCR receptors by anti-CD3 and anti-CD28 antibodies triggered an intracellular cascade, which resulted in the activation of the NFAT promoter. PD-L1 is present on the surface of MDA-MB-231 cells activated with interferon. The interaction of PD-L1 with PD-1 inhibited signal transduction from TCR receptors to the NFAT promoter. Anti-PD-L1 antibodies uncoupled the PD-L1-PD-1 interaction and reactivation of intracellular signaling occurred.

Клетки MDA-MB-231 активировали на продукцию PD-L1 раствором интерферона гамма, для этого за 72 ч до анализа к клеточной суспензии добавляли интерферон гамма до концентрации 20 нг/мл, затем сеяли клетки в 96-луночные культуральные планшеты из расчета 10000 кл/лунку.MDA-MB-231 cells were activated for the production of PD-L1 with a solution of gamma interferon; for this, interferon gamma was added to the cell suspension to a concentration of 20 ng/ml 72 h before analysis, then the cells were seeded in 96-well culture plates at a rate of 10,000 cells/ml. hole.

Через 72 ч активации удаляли среду роста из планшетов с клетками MDA-MB-231 и добавляли к ним разведения анализируемых антител, контрольного антитела и изотипического контроля в среде роста клеток от 10 мкг/мл до 0,001 мкг/мл, инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.After 72 hours of activation, the growth medium was removed from the plates with MDA-MB-231 cells and dilutions of the analyzed antibodies, control antibody and isotype control in cell growth medium from 10 μg/ml to 0.001 μg/ml were added to them, incubated for 30 minutes at room temperature.

Далее добавляли в каждую лунку суспензию клеток Jurkat-NFAT-PD-1 и раствор активирующих антител aCD3/aCD28/a-mouseIgG. Ставили планшет в CO₂ инкубатор на 6 ч.Next, a suspension of Jurkat-NFAT-PD-1 cells and a solution of activating aCD3/aCD28/a-mouseIgG antibodies were added to each well. The plate was placed in a _CO2 incubator for 6 hours.

Заранее подготовленный субстрат к люциферазе Bio-Glo Luciferase assay system (Promega) добавляли из расчета V клеток/V субстрата. Измеряли уровень люминесценции на Fluoroscan Ascent (фиг. 6). Анти-PD-LI антитела реактивировали уровень люминесценции в репортерной линии Jurkat-PD-1-NFAT.A pre-prepared substrate for the Bio-Glo Luciferase assay system (Promega) was added at the rate of V cells/V substrate. The luminescence level was measured on a Fluoroscan Ascent (FIG. 6). Anti-PD-LI antibodies reactivated the luminescence level in the reporter line Jurkat-PD-1-NFAT.

Пример 10. Анализ взаимодействий анти-PD-L1 антитела с FcRn и Fcγ-рецепторами при помощи Octet RED 96.Example 10 Analysis of interactions of anti-PD-L1 antibody with FcRn and Fcγ receptors using Octet RED 96.

Для анализа взаимодействия антител с рецепторами FcgRIIIaV, FcgRIa, FcRn использовали прибор Fortebio Octet RED96. Использовали рецепторы, биотинилированные по С-концу, и покрытые стрептавидином биосенсоры (SA-Streptavidin).To analyze the interaction of antibodies with the FcgRIIIaV, FcgRIa, and FcRn receptors, a Fortebio Octet RED96 device was used. Receptors biotinylated at the C-terminus and streptavidin-coated biosensors (SA-Streptavidin) were used.

Биотинилированные рецепторы иммобилизовали на поверхности сенсоров. Далее проводили стадию ассоциации: сенсоры со связанным антигеном погружали в растворы антитела с различной концентрацией (подготовили заранее серию разведений антитела в рабочем буфере и поместили в соответствующие лунки 96-луночного планшета). После этого проводили стадию диссоциации: сенсоры из раствора антитела перемещали в лунки с рабочим буфером.Biotinylated receptors were immobilized on the sensor surface. Next, the association stage was carried out: the sensors with the bound antigen were immersed in antibody solutions with different concentrations (a series of dilutions of the antibody was prepared in advance in working buffer and placed in the appropriate wells of a 96-well plate). After that, the dissociation stage was carried out: the sensors were transferred from the antibody solution into the wells with the working buffer.

Для оценки константы аффинности антитела к FcgRIIIaV, и FcgRIa использовали фосфатный буфер РН7.4, для FcRn - фосфатный буфер РН6.0.Phosphate buffer PH7.4 was used to evaluate the affinity constant of the antibody to FcgRIIIaV and FcgRIa, and phosphate buffer PH6.0 was used for FcRn.

Анализ полученных кривых проводили используя программное обеспечение прибора Forte Bio Data Analysis 8.2 и модели связывания 1:1. Результаты представлены на фиг. 7. Не детектировали связывания с Fcg-рецепторами модифицированного антитела IgG1 в сравнении с вариантом дикого типа, что предполагало отсутствие эффекторных функций анализируемого антитела. Константа аффинности к FcRn анализируемого анти-PD-L1 антитела составляла 1.69Е-08 1/М.Analysis of the obtained curves was performed using the instrument software Forte Bio Data Analysis 8.2 and 1:1 binding models. The results are shown in FIG. 7. No binding to Fcg receptors of the modified IgG1 antibody was detected compared to the wild-type variant, suggesting the absence of effector functions of the analyzed antibody. The affinity constant for FcRn of the analyzed anti-PD-L1 antibody was 1.69E-08 1/M.

Пример 11. Иммуноферментный анализ взаимодействий анти-PD-L1 антитела с PD-L1 разных организмовExample 11 Enzyme ImmunoAssay of Anti-PD-L1 Antibody Interactions with PD-L1 from Various Organisms

ИФА (ELISA) использовали для измерения сравнительной аффинности антител к PD-L1 разных организмов. Для анализа связывания лунки планшетов ELISA (medium binding от Greiner bio one) покрывали 50 мкл PD-L1-Fc человека, циномолгуса, мыши, крысы, собаки, кролика, (0,5 мкг/мл в 1 х карбонатном буфере), герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартному ИФА протоколу, описанному выше. Анти-PD-LI антитело специфически связывалось с PD-L1 человека и обезьяны циномолгус и не связывалось с другими исследуемыми рецепторами (фиг. 8).ELISA was used to measure the comparative affinity of antibodies to PD-L1 of different organisms. For binding assay, wells of ELISA plates (medium binding from Greiner bio one) were coated with 50 μl of human, cynomolgus, mouse, rat, dog, rabbit PD-L1-Fc (0.5 μg/ml in 1 x carbonate buffer), sealed and incubated overnight at 4°C. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol described above. The anti-PD-LI antibody specifically bound to human and cynomolgus PD-L1 and did not bind to the other receptors tested (FIG. 8).

Пример 12. Анализ взаимодействий анти-PD-L1 антител с PD-L1 человека и циномолгуса на приборе Octet RED 96Example 12. Analysis of interactions of anti-PD-L1 antibodies with human PD-L1 and cynomolgus on the Octet RED 96 instrument

Константы аффинности связывания антитела с PD-L1 человека и циномолгуса измеряли с помощью прибора OctetRed 96 (от ForteBio). Антитело BCD-135 в концентрации 30 мкг/мл неспецифически иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30°С с использованием PBS, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% BSA в качестве рабочего буфера. Анализировали связывание растворов PD-L1 человека и обезьяны со связанным на сенсоре антителом в рабочем буфере с концентрацией антигенов от 10 мкг/мл до 1 мкг/мл.The binding affinity constants of the antibody to human PD-L1 and cynomolgus were measured using an OctetRed 96 instrument (from ForteBio). The BCD-135 antibody at a concentration of 30 µg/mL was nonspecifically immobilized on the surface of second-generation amino-reactive sensors (ForteBio, AR2G) according to the standard protocol according to the manufacturer's instructions for the preparation and immobilization of AR2G sensors. The analysis was carried out at 30°C using PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as working buffer. The binding of human and monkey PD-L1 solutions to sensor-bound antibody in running buffer at antigen concentrations from 10 μg/mL to 1 μg/mL was analyzed.

Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Анти-PD-LI антитело специфически и аффинно связывается с антигеном PD-L1 человека и обезьяны циномолгус (фиг. 9) с константами <1.0Е-12 и 5.55Е-10 1\М соответственно.Binding curves with subtraction of the base signal were analyzed using Octet Data Analysis software (version 8.2) according to the standard procedure using a 1:1 interaction model. The anti-PD-LI antibody specifically and affinity binds to the human and cynomolgus monkey PD-L1 antigen (FIG. 9) with constants <1.0E-12 and 5.55E-10 1/M, respectively.

Пример 13. Определение стабильности анти-PD-L1 антителаExample 13 Determination of Anti-PD-L1 Antibody Stability

Конформационную стабильность BCD-135 оценивали по точке агрегации белка методом динамического светорассеяния (DLS). Определение точки агрегации исследуемых белков (1 мг/мл) осуществляли на приборе Zetasizer Nano ZSP. Для этого 0.5 мл раствора помещали в кварцевую обеспыленную кювету, которую постепенно нагревали от 50 до 90°C в установке при постоянном измерении интенсивности рассеянного света. Антитело BCD-135 демонстрировало высокую конформационную стабильность в 20 мМ ацетатном буфере, точка плавления более 80°С (фиг. 10).The conformational stability of BCD-135 was assessed by the aggregation point of the protein by dynamic light scattering (DLS). The determination of the aggregation point of the studied proteins (1 mg/ml) was carried out on a Zetasizer Nano ZSP instrument. For this, 0.5 mL of the solution was placed in a dust-free quartz cell, which was gradually heated from 50 to 90°C in a setup with constant measurement of the scattered light intensity. The BCD-135 antibody showed high conformational stability in 20 mM acetate buffer, melting point over 80°C (FIG. 10).

Коллоидную стабильность кандидатов оценивали методом ПЭГ агрегации белка. Для экспериментаThe colloidal stability of the candidates was assessed by the PEG protein aggregation method. For experiment

- 42 041915 использовали образцы с концентрацией белка 5 мг/мл. В планшеты для УФ-спектрофотометрии переносили расчетное количество образца, раствора плацебо и раствора ПЭГ 6000. Все полученные в лунках растворы хорошо перемешивали, пипетируя. После этого оценивали степень мутности растворов визуально, а также измеряли оптическую плотность растворов при λ=320 нм. Антитело BCD-135 демонстрировало высокую коллоидную стабильность (фиг. 11).- 42 041915 used samples with a protein concentration of 5 mg/ml. The calculated amount of the sample, the placebo solution and the PEG 6000 solution were transferred to the plates for UV spectrophotometry. All the solutions obtained in the wells were mixed well by pipetting. After that, the degree of turbidity of the solutions was evaluated visually, and the optical density of the solutions was measured at λ=320 nm. The BCD-135 antibody showed high colloidal stability (FIG. 11).

Термическую стабильность антитела оценивали методом термостресса при 50°С в течение 48 ч в трех разных буферах: 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,0 (фиг. 12А), 20 мМ ацетатном буфере при рН 5,0 (фиг. 12Б) и 20 мМ гистидиновом буфере рН 5,5 (фиг. 12В). Контроль гомогенности проводили методом ГФ ВЭЖХ (SEC HPLC).____________________________________________The thermal stability of the antibody was assessed by thermostress at 50°C for 48 h in three different buffers: 20 mM phosphate buffer at pH 6.0 (Fig. 12A), 20 mM acetate buffer at pH 5.0 (Fig. 12B) and 20 mM histidine buffer pH 5.5 (Fig. 12B). Homogeneity control was carried out by the GP HPLC method (SEC HPLC).____________________________________________

Название Name Испытуемые буферы Test buffers Изменение содержания основного пика за 48 ч Change content main peak in 48 hours BCD-135 BCD-135 20 мМ фосфатный буфер pH 6.0 20 mM phosphate buffer pH 6.0 Δ=-0.126% Δ=-0.126% BCD-135 BCD-135 20 мМ ацетатный буфер pH 5.0 20 mM acetate buffer pH 5.0 Δ=-2.04% Δ=-2.04% BCD-135 BCD-135 20 мМ гистидиновый буфер pH 5.5 20 mM histidine pH buffer 5.5 Δ=-1.55% Δ=-1.55%

Исследуемые образцы в концентрации белка ~ 5 мг/мл разделяли на 2 части и помещали в отдельные пробирки: по 1 пробирке на каждый состав откладывали в холодильник на хранение при 4°С, остальные устанавливали в термостат и инкубировали при 50°С в течение 72 ч. После окончания прогрева пробирки убирали из термостата и передавали на анализ (на фиг. 12А, 12Б и 12В красным обозначен контроль, хранившийся на +4, синим - образец после термостресса). Анти-PD-LI антитело демонстрировало высокую термическую стабильность во всех трех буферах (разница между содержанием агрегатов в растворе до термостресса и после составила не более 5%):The test samples at a protein concentration of ~5 mg/ml were divided into 2 parts and placed in separate test tubes: 1 test tube for each composition was placed in a refrigerator for storage at 4°C, the rest were placed in a thermostat and incubated at 50°C for 72 h After the end of heating, the tubes were removed from the thermostat and transferred for analysis (in Figs. 12A, 12B and 12C, the control stored at +4 is indicated in red, the sample after thermal stress is blue). The anti-PD-LI antibody demonstrated high thermal stability in all three buffers (the difference between the content of aggregates in solution before and after thermal stress was no more than 5%):

Также оценивали стабильность BCD-135 в нормальной сыворотке крови человека в течение 7 дней при 37°C. Для этого рекомбинантный PDL1 (по 100 мкл, 2,5 мкг/мл в 1 х карбонатном буфере) вносили в лунки 96-ти луночного ИФА планшета высокой сорбции. Инкубировали при 4°С в течение 18 ч. Далее содержимое лунок удаляли и вносили туда блокирующий буфер (200 мкл 0,5% нежирного молока в ТБСТ).Also evaluated the stability of BCD-135 in normal human serum for 7 days at 37°C. To do this, recombinant PDL1 (100 μl, 2.5 μg/ml in 1 x carbonate buffer) was added to the wells of a 96-well high sorption ELISA plate. Incubated at 4°C for 18 hours Then the contents of the wells were removed and blocking buffer (200 μl of 0.5% skimmed milk in TBST) was added there.

Планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 30 мин, после чего промывали 2 раза раствором ТБСТ.The plates were incubated at 37°C for 30 min, after which they were washed 2 times with TBST solution.

В лунки первого вертикального ряда вносили по 100 мкл растворов для построения калибровочного графика, содержащих BCD-135 в концентрации 0; 7,8; 15,6; 31,25; 62,5; 125,0; 250,0 нг/мл, разведенных в блокирующем буфере.In the wells of the first vertical row, 100 μl of solutions were added to build a calibration graph containing BCD-135 at a concentration of 0; 7.8; 15.6; 31.25; 62.5; 125.0; 250.0 ng/ml diluted in blocking buffer.

Планшеты инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С, далее планшеты 3 раза промывали раствором ТБСТ. После этого вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора конъюгата поликлональных антител козы к Fc фрагменту IgG человека с пероксидазой хрена. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С. Далее планшеты 4-5 раз промывали раствором ТБСТ. В отмытые и осушенные лунки вносили по 100 мкл раствора ТМБ для развития окраски. Планшеты помещали в защищенное от света место и инкубировали при температуре 22°С в течение 20-25 мин для развития окраски. Реакцию останавливали, добавляя в лунки по 50 мкл стопового раствора 0,9М серной кислоты. Оптическую плотность раствора в лунках измеряли на микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм.The plates were incubated for 30 min at 37°C, then the plates were washed 3 times with TBST solution. After that, 100 μl of a solution of a conjugate of goat polyclonal antibodies to the Fc fragment of human IgG with horseradish peroxidase was added to each well. The plates were incubated for 30 min at 37°C. Next, the plates were washed 4-5 times with TBST solution. Washed and dried wells were filled with 100 µl of TMB solution for color development. The plates were placed in a place protected from light and incubated at 22°C for 20-25 min for color development. The reaction was stopped by adding 50 μl of a 0.9 M sulfuric acid stop solution to the wells. The optical density of the solution in the wells was measured on a microplate spectrophotometer at a wavelength of 450 nm.

На основании полученных данных строили калибровочную кривую (фиг. 13А), отражающую зависимость оптической плотности от концентрации добавленного в лунку BCD-135. Для построения кривой используют среднее арифметическое значение оптической плотности растворов. На основании калибровочной кривой, находили значение концентрации BCD-135 в образце, соответствующее полученным в эксперименте значениям оптической плотности.Based on the obtained data, a calibration curve was built (Fig. 13A), reflecting the dependence of optical density on the concentration of BCD-135 added to the well. To plot the curve, the arithmetic mean value of the optical density of the solutions is used. Based on the calibration curve, the concentration of BCD-135 in the sample was found, corresponding to the optical density values obtained in the experiment.

По итогам исследования через 7 дней хранения при 37°С в сыворотке человека определяемая концентрация BCD-135 достоверно не отличалась от концентрации, определяемой в образцах сыворотки, приготовленных непосредственно перед анализом (фиг. 13Б), что свидетельствовало о стабильности антитела.According to the results of the study, after 7 days of storage at 37°C in human serum, the determined concentration of BCD-135 did not significantly differ from the concentration determined in serum samples prepared immediately before analysis (Fig. 13B), which indicated the stability of the antibody.

Пример 14. Конструирование библиотеки BCD-135 мутантных антител, специфичных к PD-L1Example 14 Construction of a Library of BCD-135 Mutant Antibodies Specific to PD-L1

Для создания BCD-135 мутантных антител, специфичных к PD-L1, был проведен структурный анализ на основе 3D моделирования с использованием программного пакета YLab компании БИОКАД и модели PD-L1 (PDB 4ZQK, PDB 4Z18) (см. также пример 18). На основе расчетный моделей были синтезированы библиотеки генов BCD-135, имеющие частично вырожденные кодоны (FUH G ET AL.), Improving antibody binding affinity and specificity for therapeutic development, Methods Mol Biol., 2009, 525, 353-376) в позициях в первом и третьем CDR регионах вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 4 и третьем CDR вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 8. Полученная ДНК рандомизированного гена была клонирована в фаговую дисплейную плазмиду рН5 (фиг. 2), согласно протоколу описанному в примере 2. Трансформация, указанных конструкций в штамм SS320 дала на выходе от 5*10е7 неза- 43 041915 висимых трансформантов для библиотеки, согласно процедуре [Methods Enzymol. 2000;328:333-63].To create BCD-135 mutant antibodies specific to PD-L1, a structural analysis was performed based on 3D modeling using the BIOCAD YLab software package and the PD-L1 model (PDB 4ZQK, PDB 4Z18) (see also example 18). Based on the calculation models, libraries of BCD-135 genes were synthesized with partially degenerate codons (FUH G ET AL.), Improving antibody binding affinity and specificity for therapeutic development, Methods Mol Biol., 2009, 525, 353-376) in positions in the first and third CDRs of the heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 4 and the third CDR of the light chain variable domain of SEQ ID NO: 8. The resulting randomized gene DNA was cloned into the phage display plasmid pH5 (Fig. 2) according to the protocol described in Example 2 Transformation of these constructs into strain SS320 yielded 5*10e7 independent transformants for the library according to the procedure [Methods Enzymol. 2000;328:333-63].

Препараты фага мутантных VH BCD-135 библиотек были приготовлены согласно процедуре, описанной ранее [Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-97].Phage preparations of mutant VH BCD-135 libraries were prepared according to the procedure described previously [Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-97].

Селекции полученных фаговых мутантных BCD-135 Fab библиотек проводили в условиях аналогичных, описанных выше (пример 3).The selection of the resulting phage mutant BCD-135 Fab libraries was carried out under conditions similar to those described above (example 3).

После третьего раунда селекции описанных выше библиотек на препарате рекомбинантного PD-L1Fc человека, проведенный ИФА анализ препаратов поликлонального фага показал значительное обогащение и превышение более 10 раз над фоном неспецифического связывания. Пулы генов из обогащенных фаговых библиотек BCD-135 мутантных Fab антител, специфичных к PD-L1-Fc человека, были реклонированы в экспрессионную плазмиду pLL (фиг. 3), содержащую myc-tag пептид на С-конце для ELISA детекции.After the third round of selection of the libraries described above on a preparation of recombinant human PD-L1Fc, the ELISA analysis of polyclonal phage preparations showed a significant enrichment and an excess of more than 10 times over the background of non-specific binding. Gene pools from enriched phage libraries of BCD-135 mutant Fab antibodies specific for human PD-L1-Fc were recloned into the pLL expression plasmid (FIG. 3) containing the myc-tag peptide at the C-terminus for ELISA detection.

Пример 15. Сравнительный ИФА анализ BCD-135 мутантных Fab антител, специфичных к PD-L1Example 15 Comparative ELISA Analysis of BCD-135 Mutant Fab Antibodies Specific to PD-L1

ИФА (ELISA) используют для измерения связывания исследуемых мутантных Fab антител с PD-L1 человека, аналогично описываемому в примере 4. Количество тестируемых клонов, продуцентов BCD135 мутантных Fab антител, составило 400 штук. В качестве позитивного контроля использовали дикий вариант BCD-135 Fab антитела с последовательностью SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 8.ELISA was used to measure the binding of the tested mutant Fab antibodies to human PD-L1, as described in Example 4. The number of clones tested producing BCD135 mutant Fab antibodies was 400. The wild variant of the BCD-135 Fab antibody with the sequence of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8 was used as a positive control.

В результате было отобрано 85 позитивных клонов, давших сигнал выше или аналогичный контрольному дикому BCD-135 Fab антителу (значения в интервале 0,7-1,2 отн.ед.).As a result, 85 positive clones were selected that gave a signal higher than or similar to the control wild BCD-135 Fab antibody (values in the range of 0.7-1.2 relative units).

Пример 16. Характеризация BCD-135 мутантных Fab антител, специфичных против PD-L1Example 16 Characterization of BCD-135 mutant Fab antibodies specific against PD-L1

Восемьдесят пять отобранных в результате ИФА скрининга (пример 15) кандидатов позитивных клонов, давших сигнал выше или аналогичный контрольному дикому BCD-135 Fab антителу были секвенированы на секвенаторе Applied Biosystems 3130, согласно протоколам рекомендуемым компанией производителем. В результате было получено 25 уникальных по последовательности клона. Восемь мутантных Fab антитела уникальных клонов были далее проанализированы по количественной характеристике кинетической константы диссоциации на приборе Octet Red 96, согласно примеру 7.Eighty-five candidate positive clones selected from the ELISA screening (Example 15) that gave a signal greater than or similar to the control wild BCD-135 Fab antibody were sequenced on an Applied Biosystems 3130 sequencer, according to protocols recommended by the manufacturer. As a result, 25 sequence-unique clones were obtained. Eight mutant Fab antibodies of unique clones were further analyzed for quantitative characterization of the kinetic dissociation constant on the instrument Octet Red 96, according to example 7.

Koff-скрининг производили с использованием прибора Pall Forte Bio Octet Red 96, аналогично указанному в примере 7. Анти FABCH1-биосенсоры в течение 30 мин регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ ФСБ, рН 7.2-7.4, 0.1% Твин-20, 0,1% БСА. В исследуемые образцы супернатантов E.coli добавляли рабочий буфер до конечной концентрации 1х. Затем анти FABCH1-биосенсоры погружали в супернатанты E.coli, содержащие Fab-фрагменты кандидатов антител, на 12 ч при 4°С. Сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab-фрагментами переносили в лунки с рабочим буфером, где прописывали базовую линию (60 с.). Далее сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (PD-L1, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген-антитело (300 с.). Затем сенсоры возвращали в лунки, содержащие рабочий буфер, для последующей стадии диссоциации (600 с.). После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (GlyHCl, рН 1,7) после чего использовали в следующем эксперименте. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре по модели взаимодействия 1:1.Koff-screening was performed using a Pall Forte Bio Octet Red 96 device, similar to that indicated in example 7. Anti-FABCH1 biosensors were rehydrated for 30 min in working buffer containing 10 mM PBS, pH 7.2-7.4, 0.1% Tween-20.0 .1% BSA. Working buffer was added to the test samples of E. coli supernatants to a final concentration of 1x. Then, anti FABCH1 biosensors were immersed in E. coli supernatants containing Fab fragments of candidate antibodies for 12 h at 4°C. Sensors with Fab fragments immobilized on the surface were transferred to wells with working buffer, where a baseline (60 s) was written. Next, the sensors were transferred into wells with analyte solution (PD-L1, 30 µg/mL) for association of the antigen-antibody complex (300 s). The sensors were then returned to the wells containing working buffer for the subsequent dissociation step (600 s). After each experiment, the used sensors were regenerated by placing them in regeneration buffer (GlyHCl, pH 1.7) three times and then used in the next experiment. The obtained curves were analyzed using the Octet Data Analysis software (version 7.0) according to the standard procedure using a 1:1 interaction model.

В результате были получены кинетические константы диссоциации мутантных Fab антител, которые продемонстрировали сравнимые характеристики с диким вариантом BCD-135 Fab, и таким образом толерантность до 8% замен по трем CDR вариабельных доменов. Anti—PDL1 VH of BCD-135 BCD-135 VHAs a result, kinetic dissociation constants of mutant Fab antibodies were obtained that showed comparable characteristics to the wild variant BCD-135 Fab, and thus a tolerance of up to 8% substitutions across the three CDRs of the variable domains. Anti-PDL1 VH of BCD-135 BCD-135 VH

20 30 40 50 60 70 SO20 30 40 50 60 70 SO

100 110 120100 110 120

12345676901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567690123456 789012345678901234567890123456789012 E VQjLVE SGGGWRPGGSLRLSCAASGFT FDEYAMSWVRQAPGKGLEWVS DI S WS G3NTN YADS VKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSL RAE DTAL YHCARAPLLLAMT FGVGSWGQGTL VT VS S E VQLVE SGGGWRPGGSLRL SCAA3G FT FXXYAX SW VR.QAPGK.GLEWVS D13 W3 GSNTN YADS VKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSL RAE DTALYHCAXAPLXXXXT FGVGSWGQGTIl· VT VS S BCD-135 VL 10 20 30 40 50 60 70 8012345676901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567690123456 789012345678901234567890123456789012 E VQjLVE SGGGWRPGGSLRLSCAASGFT FDEYAMSWVRQAPGKGLEWVS DI S WS G3NTN YADS VKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSL RAE DTAL YHCARAPLLLAMT FGVGSWGQGTL VT VS S E VQLVE SGGGWRPGGSLRL SCAA3G FT FXXYAX SW VR.QAPGK.GLEWVS D13 W3 GSNTN YADS VKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSL RAE DTALYHCAXAPLXXXXT FGVGSWGQGTIl· VT VS S BCD-135 VL 10 20 30 40 50 60 70 80

100100

12345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456 78901234567890123456 QT WT QE P SL SVS PGGTVTLTCGL Ξ HGTVTAI NY PGWYQQTPGQAPRPLIΪΝΤΝΤ RHSGVPDRFSGSIS GNKAALTITGAQAEDEA DYYCALYMGNGGHMFGGGTK QTWTQE P SL SVS PGGTVTLTCGL S SGTVTAI NY PGWYQQTPGQAPRTLIYNTNT RHSGVPDRFSGSIS GNKAALTITGAQAEDEA DYYCALYXGXGXHMFGGGTK12345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456 78901234567890123456 QT WT QE P SL SVS PGGTVTLTCGL Ξ HGTVTAI NY PGWYQQTPGQAPRPLIΪΝΤΝΤ RHSGVPDRFSGSIS GNKAALTITGAQAEDEA DYYCALYMGNGGHMFGGGTK QTWTQE P SL SVS PGGTVTLTCGL S SGTVTAI NY PGWYQQTPGQAPRTLIYNTNT RHSGVPDRFSGSIS GNKAALTITGAQAEDEA DYYCALYXGXGXHMFGGGTK

- 44 041915- 44 041915

Название Name Сикввнс положительных по сигналу ак мутантов BCD—135 Sequences of signal-positive BCD-135 ac-mutants HCDR1 HCDR1 HCDR2 HCDR2 HCDR3 HDDR3 LCDR3 LCDR3 Response Response koff koff Wild- BCD135VH Wild- BCD135VH FDDYAMS FDDYAMS DI SWS GSNOT YADSVKG DI SWS GSNOT YADSVKG CARAPltLIAMT FGVGS CARAPltLIAMT FGVGS CADYMGNGGHM CADYMGNGGHM 0.0903 0.0903 0.001313 0.001313 lm-BCD- 135VH lm-BCD- 135VH FANYAMS FANYAMS DI SH3 GS№CNYADSVKG DI SH3 GS#CNYADSVKG CAKAPIdjlAT T FGVGS CAKAPIdjlAT T FGVGS CAIiYVGTGSHM CAIiYVGTGSHM 0.0971 0.0971 0.005323 0.005323 2m-BCD- 13 5VH 2m-BCD- 135VH FNDYAMS FNDYAMS DISWSGSNTNYADSVKG DISWSGSNTNYADSVKG CAKARLPIAT T FGVGS CAKARLPIAT T FGVGS CADYTGTGSHM CADYTGTGSHM 0.0505 0.0505 0.006534 0.006534 Зт-BCD135VH ZT-BCD135VH FNNYAMS FNNYAMS DISWSGSNTWYADSVKG DISWSGSNTWYADSVKG CAFAFLLIAT T FGVGS CAFAFLLIAT T FGVGS CA1YTGTGSHM CA1YTGTGSHM 0.0719 0.0719 0.006463 0.006463 4m-BCD- 135VH 4m-BCD- 135VH FANYAMS FANYAMS DISWSGSNINYADSVKG DISWSGSNINYADSVKG CAKARLPLAT T FGVGS CAKARLPLAT T FGVGS CALYVGTG3HM CALYVGTG3HM 0.0637 0.0637 0.00594 0.00594 5m-BCD- 13 5VH 5m-BCD- 135VH FKSYAIS FKSYAIS DISWSGSNTNYADSVKG DISWSGSNTNYADSVKG CAKAPTiMLAAT FGVGS CAKAPTiMLAAT FGVGS CA1YYGTGSHM CA1YYGTGSHM 0.0623 0.0623 0.003241 0.003241 6m-BCD- 135VH 6m-BCD- 135VH FSTYAMS FSTYAMS DIEWSGSNENYADSVKG DIEWSGSNENYADSVKG CAKARIiVIiAI T FGVGS CAKARIiVIiAI T FGVGS CAbxTGTGSHM CAbxTGTGSHM 0.0945 0.0945 0.001475 0.001475 7m-BCD135VH 7m-BCD135VH FADYAMS FADYAMS DISWSGSNTNYADSVKG DISWSGSNTNYADSVKG CAKAPLP SAI T FGVGS CAKAPLP SAI T FGVGS CA1YEGTGSHM CA1YEGTGSHM 0.0637 0.0637 0.00594 0.00594 8m-BCD- 135VH 8m-BCD- 135VH FNNYAMS FNNYAMS DISWSGSWENYADSVKG DISWSGSWENYADSVKG CAKAPLLIjAT T FGVGS CAKAPLLIJAT T FGVGS CA1YTGTG3HM CA1YTGTG3HM 0.0548 0.0548 0.001831 0.001831

Пример 17. Создание стабильной клеточной линии, продукция и очистка анти-PD-Ll антитела.Example 17 Establishment of a Stable Cell Line, Production and Purification of Anti-PD-Ll Antibody.

Стабильную клеточную линию продуцента моноклонального антитела BCD-135 получали путем трансфекции методом электропорации с использованием прибора Neon Transfection System (Life Technologies) родительской суспензионной клеточной линии CHO-S векторными конструкциями, содержащими легкие и тяжелые цепи антитела в оптимизированном соотношении. Клональные линии с высоким уровнем продуктивности (более 1000 мг/л) получали с использованием роботизированной платформы ClonePix (Molecular Devices) и предварительных этапов селекции минипулов с использованием антибиотиков в разных форматах культивирования. Анализ продуктивности проводили с использованием аналитической системы Octet RED96 (Pall Life Sciences). DOE по подбору базовой среды и схемы культивирования осуществляли на базе автоматизированной системы Biomek FX robotics (Beckman Coulter). Для культивирования продуцента использовали бессывороточные среды и фидинги, не содержащие белков животного происхождения. Наработку препарата BCD-135 для предклинических исследований проводили в ферментере HyClone single-use bioreactor (Thermo Fisher Scientific) рабочим объемом 50 л.A stable cell line producing the monoclonal antibody BCD-135 was obtained by transfection by electroporation using the Neon Transfection System (Life Technologies) of the parental suspension cell line CHO-S with vector constructs containing light and heavy chains of the antibody in an optimized ratio. Clonal lines with high productivity levels (over 1000 mg/L) were obtained using the ClonePix robotic platform (Molecular Devices) and preliminary minipool selection steps using antibiotics in different culture formats. Productivity analysis was performed using an Octet RED96 analytical system (Pall Life Sciences). DOE for the selection of the base medium and the cultivation scheme was carried out on the basis of the Biomek FX robotics automated system (Beckman Coulter). Serum-free media and feeds containing no proteins of animal origin were used for the cultivation of the producer. The production of the BCD-135 preparation for preclinical studies was carried out in a HyClone single-use bioreactor fermenter (Thermo Fisher Scientific) with a working volume of 50 L.

Осветление культуральной жидкости проводили на глубинном фильтре Millistak COHC (MerckMillipore). Первичную очистку антитела из осветленной КЖ проводили на аффинном сорбенте с белком А. Специфическую элюцию целевого белка проводили в кислых условиях рН 3.3-3.8 в глициновом буфере. Полученный элюат выдерживали в кислом рН в течение 30-60 мин для вирусной инактивации, а затем нейтрализовали 1М раствором Tris-OH до значения рН 6.5-7.0. Финальую хроматографическую очистку в режиме проскока проводили на сорбенте CaptoAdhere (GE Healthcare LifeSciences) для удаления остаточных ДНК, белков клеток продуцента, отщепленного лиганда аффинного сорбента, агрегатов и фрагментов антител. Для этого раствор белка пропускали через подготовленный сорбент, в рН 6,5-7,0 при низком значении кондуктивности (<3 мС/см²). Очищенный белок подвергали противовирусной фильтрации с использованием набора фильтров Viresolve PRO (Millipore), концентрированию и диафильтрации против конечного буфера, содержащего ацетатный буфер (рН 5,0-5,5) и трегалозу. Концентрация полученного белка составляла 50 мг/мл и более.The culture liquid was clarified on a Millistak COHC depth filter (MerckMillipore). Primary purification of antibodies from clarified CL was performed on an affinity sorbent with protein A. Specific elution of the target protein was carried out under acidic conditions pH 3.3–3.8 in glycine buffer. The resulting eluate was kept in acidic pH for 30-60 min for viral inactivation, and then neutralized with 1M Tris-OH solution to pH 6.5-7.0. The final chromatographic purification in the breakthrough mode was performed on a CaptoAdhere sorbent (GE Healthcare LifeSciences) to remove residual DNA, producer cell proteins, cleaved affinity sorbent ligand, aggregates, and antibody fragments. To do this, the protein solution was passed through the prepared sorbent at pH 6.5-7.0 at a low conductivity value (<3 mS/cm ² ). The purified protein was subjected to antiviral filtration using a Viresolve PRO filter kit (Millipore), concentration and diafiltration against a final buffer containing acetate buffer (pH 5.0-5.5) and trehalose. The concentration of the resulting protein was 50 mg/ml or more.

Пример 18. In silico моделирование комплекса BCD-135 антитела и PD-L1 человекаExample 18 In silico Simulation of the BCD-135 Antibody and Human PD-L1 Complex

Для создания BCD-135 мутантных антител, специфичных против PD-L1 был проведен структурный анализ на основе 3D моделирования с использованием программных пакетов Schrodinger Suite компании Schrodinger и пакета YLab компании БИОКАД. В качестве кристаллической структуры мишени была выбрана PDB 5C3T, так как она имеет больше кристаллизованных аминокислот, чем классическая структура 4ZQK, в которой упор сделан на PD-1. Докинг осуществлялся с помощью инструмента HEDGE (часть пакета YLab компании БИОКАД). Выбор оптимальных позиций был проведен с помощью оценки свободной энергии на 10 наносекундном интервале молекулярной динамики (инструмент Desmond, часть пакета Schrodinger Suite). Визуализация полученной структуры создана с помощью инструмента PyMOL компании Schrodinger. Модель включающая вариабельные домены BCD-135 представлена на фиг. 14А, тогда как на фиг. 14Б приведена область взаимодействия антигена и антитела с выделенными аминокислотными остатками, образующими плотный межбелковый контакт.To create BCD-135 mutant antibodies specific against PD-L1, a structural analysis was carried out based on 3D modeling using the Schrodinger Suite software packages from Schrodinger and the YLab package from BIOCAD. PDB 5C3T was chosen as the target crystal structure because it has more crystallized amino acids than the classic 4ZQK structure, which focuses on PD-1. Docking was carried out using the HEDGE tool (part of the BIOCAD YLab package). The choice of the optimal positions was carried out using free energy estimation on a 10 ns interval of molecular dynamics (Desmond tool, part of the Schrodinger Suite). Visualization of the resulting structure was created using the PyMOL tool from Schrodinger. The model including BCD-135 variable domains is shown in FIG. 14A, while in FIG. 14B shows the area of interaction between an antigen and an antibody with isolated amino acid residues forming a tight protein-to-protein contact.

В табл. В представлены ключевые аминокислотные остатки как антитела, так и антигена, обуславливающие плотны межбелковые взаимодействия.In table. The key amino acid residues of both the antibody and the antigen are presented in the figure, causing dense protein-to-protein interactions.

Табл. В. В среднем столбце представлены аминокислотные остатки BCD-135 антитела, образующие взаимодействие с PD-L1 человека. В правом столбце приведены соответсвующие аминокислотные остатки антигена PD-L1, взаимодействющие с антителом BCD-135.Tab. B. The middle column shows the amino acid residues of the BCD-135 antibody forming an interaction with human PD-L1. The right column shows the corresponding amino acid residues of the PD-L1 antigen interacting with the BCD-135 antibody.

- 45 041915- 45 041915

Позиции учавствующие во взаимодействии с PD-L1 человека Positions involved in interaction with human PD-L1 Позиции PD-L1 человека, учавствующие во взаимодействии с BCD-135 Human PD-L1 positions involved in interaction with BCD-135 VH BCD135 vh BCD135 N55 N55 G33 G33 L99 L99 К105 K105 МЮОа MOA D103 D103 TIOOb TIOOb Q83 Q83 VL BCD135 VL BCD135 N50 N50 N94 N94 N35 N35 Y32 Y32 А8 5 A8 5 ТЗОа TZOa К89 K89 N94 N94 Q100 Q100

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с PD-L1, включающее:1. A monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to PD-L1, comprising:

(a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий:(a) a heavy chain variable domain comprising:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13;(i) a CDR1 with an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 13;

(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2;(ii) CDR2 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;

(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18; и (b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий:(iii) a CDR3 with an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18; and (b) a light chain variable domain comprising:

(i) CDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5;(i) CDR1 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;

(ii) CDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6;(ii) CDR2 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;

(iii) CDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22.(iii) a CDR3 with an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, or SEQ ID NO: 22.

2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR1-3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1-3 соответственно.2. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the heavy chain variable domain comprises CDR1-3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1-3, respectively.

3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный домен легкой цепи содержит CDR1-3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 5-7 соответственно.3. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the light chain variable domain comprises CDR1-3 with the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 5-7, respectively.

4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR1-3 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 1-3 соответственно; вариабельный домен легкой цепи содержит CDR13 с аминокислотными последовательностями, представленными последовательностями SEQ ID NO: 5-7 соответственно.4. Monoclonal antibody or antigennegative fragment according to claim 1, where the variable domain of the heavy chain contains CDR1-3 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 1-3, respectively; the light chain variable domain contains CDR13 with the amino acid sequences represented by the sequences of SEQ ID NO: 5-7, respectively.

5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.5. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the heavy chain variable domain contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.6. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 5, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.7. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the light chain variable domain contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.12, где вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.8. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 12, wherein the light chain variable domain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.9. Monoclonal antibody or antigennegative fragment according to claim 1, where the variable domain of the heavy chain contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; the light chain variable domain contains an amino acid sequence at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

10. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.9, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.10. Monoclonal antibody or antigennegative fragment according to claim 9, where the variable domain of the heavy chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; the light chain variable domain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

11. Моноклональное антитело по п.1, включающее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 9; легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 10.11. Monoclonal antibody according to claim 1, including a heavy chain containing an amino acid sequence of at least 90% homologous to the sequence of SEQ ID NO: 9; a light chain containing an amino acid sequence at least 90% homologous to the sequence of SEQ ID NO: 10.

- 46 041915- 46 041915

12. Моноклональное антитело по п.11, включающее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ12. Monoclonal antibody according to claim 11, including a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9; a light chain containing the amino acid sequence SEQ

ID NO: 10.ID NO: 10.

13. Моноклональное антитело по любому из п.1, где антитело, специфичное к PD-L1, представляет собой полноразмерное антитело IgG.13. A monoclonal antibody according to any one of claim 1, wherein the PD-L1 specific antibody is a full-length IgG antibody.

14. Моноклональное антитело по п.13, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека.14. The monoclonal antibody of claim 13, wherein the full length IgG antibody is of the human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 isotype.

15. Моноклональное антитело по п.14, где полноразмерное антитело IgG относится к изотипу IgG1 человека.15. The monoclonal antibody of claim 14, wherein the full length IgG antibody is of the human IgG1 isotype.

16. Нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15.16. A nucleic acid that encodes an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-15.

17. Нуклеиновая кислота по п.16, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.17. The nucleic acid of claim 16, wherein the nucleic acid is DNA.

18. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.16, 17.18. An expression vector containing a nucleic acid according to any one of claims 16, 17.

19. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15, включающий трансформирование клетки вектором по п.18.19. A method for obtaining a host cell for obtaining an antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 15, including transforming the cell with a vector according to claim 18.

20. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.16, 17.20. A host cell for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 15, containing a nucleic acid according to any one of claims 16, 17.

21. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п.20 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.21. A method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 15, which consists in culturing the host cell according to claim 20 in a culture medium under conditions sufficient to obtain said antibody, followed by isolation and purification of the resulting antibody.

22. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований различных локализаций, опосредуемых PD-L1, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15 в терапевтически эффективном количестве, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.22. Pharmaceutical composition for the treatment of malignant neoplasms of various localizations mediated by PD-L1, containing an antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 15 in a therapeutically effective amount, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.

23. Фармацевтическая композиция по п.22, предназначенная для лечения злокачественных новообразований различных локализаций, опосредуемых PD-L1, выбранных из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI KPP (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью).23. Pharmaceutical composition according to claim 22, intended for the treatment of malignant neoplasms of various localizations mediated by PD-L1, selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, cancer of the esophagus, cancer bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI KPP (colorectal cancer with high microsatellite instability).

24. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований различных локализаций, опосредуемых PD-L1, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15 в терапевтически эффективном количестве и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение в терапевтически эффективном количестве.24. Pharmaceutical composition for the treatment of malignant neoplasms of various localizations mediated by PD-L1, containing an antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1-15 in a therapeutically effective amount and at least one therapeutically active antitumor compound in a therapeutically effective amount.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, предназначенная для лечения злокачественных новообразований различных локализаций, опосредуемых PD-L1, выбранных из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью).25. Pharmaceutical composition according to claim 24, intended for the treatment of malignant neoplasms of various localizations mediated by PD-L1, selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, cancer of the esophagus, cancer bladder, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC (colorectal cancer with high microsatellite instability).

26. Фармацевтическая композиция по любому из пп.24, 25, где терапевтически активное противоопухолевое соединение выбирают из химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.26. A pharmaceutical composition according to any one of claims 24, 25, wherein the therapeutically active anticancer compound is selected from a chemotherapeutic agent, an antibody, or an antihormonal agent.

27. Способ ингибирования биологической активности PD-L1 у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15.27. A method of inhibiting the biological activity of PD-L1 in a subject in need of such inhibition, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-15.

28. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 или фармацевтической композиции по п.22 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, злокачественных новообразований различных локализаций, опосредуемых PD-L1.28. The use of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 15, or a pharmaceutical composition according to claim 22, for the treatment of PD-L1 mediated cancers in a subject in need of such treatment.

29. Применение по п.28, где злокачественные новообразования различных локализаций, опосредуемых PD-L1, выбраны из группы: ПРГШ (плоскоклеточный рак головы и шеи), рак шейки матки, рак без выявленного первоисточника, глиобластома, рак пищевода, рак мочевого пузыря, ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), КРР (колоректальный рак), гепатоцеллюлярная карцинома, меланома, НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого), рак почки, рак яичника, лимфома Ходжкина, MSI КРР (колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью).29. Use according to claim 28, where malignant neoplasms of various localizations mediated by PD-L1 are selected from the group: HNSCC (squamous cell carcinoma of the head and neck), cervical cancer, cancer without an identified primary source, glioblastoma, esophageal cancer, bladder cancer, TNBC (triple negative breast cancer), CRC (colorectal cancer), hepatocellular carcinoma, melanoma, NSCLC (non-small cell lung cancer), kidney cancer, ovarian cancer, Hodgkin's lymphoma, MSI CRC (colorectal cancer with high microsatellite instability).