EA041859B1 - ANTIGEN-BINDING PROTEINS THAT ACTIVATE THE LEPTIN RECEPTOR - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретениеThe field of technology to which the present invention relates

Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые связывают лептиновый рецептор человека (LEPR), а также терапевтическим и диагностическим способам применения таких антител.The present invention relates to antibodies and antigen-binding antibody fragments that bind the human leptin receptor (LEPR), as well as therapeutic and diagnostic uses of such antibodies.

Перечень последовательностейSequence listing

Официальная копия перечня последовательностей подана одновременно с настоящим описанием в электронном виде посредством EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII в файле под названием 2016_10_11_10178WO01_Sequence_Listing_as_Filed_ST25.TXT, дата создания 11 октября 2016 г., размер приблизительно 99,6 килобайт. Перечень последовательностей, содержащийся в документе формата ASCII, является частью настоящего описания и включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.An official copy of the sequence listing is filed simultaneously with this disclosure electronically via EFS-Web as an ASCII sequence listing in a file called 2016_10_11_10178WO01_Sequence_Listing_as_Filed_ST25.TXT, created on October 11, 2016, approximately 99.6 kilobytes in size. The sequence listing contained in the ASCII document is part of the present disclosure and is incorporated herein by reference in its entirety.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBackground of the Invention

Лептин представляет собой полипептидный гормон, экспрессируемый главным образом жировой тканью, который участвует в регуляции метаболизма, энергетического баланса и потребления пищи. Активность лептина опосредована взаимодействием с лептиновым рецептором и передачей сигнала посредством такового. Лептиновый рецептор (также известный как LEPR, WSX, рецептор OB, OB-R и CD295) является однопроходным трансмембранным рецептором семейства рецепторов цитокинов I класса с большим (818 аминокислот) внеклеточным доменом. Недостаточность лептина, устойчивость к лептину и определенные мутации с дефектом передачи сигнала/нарушением передачи сигнала посредством LEPR, ассоциированы с ожирением, диабетом 2 типа, дислипидемией, липодистрофиями, стеатозом печени, неалкогольной жировой дистрофией печени и алкогольной жировой дистрофией печени, тяжелой невосприимчивостью к инсулину, лепречаунизмом/синдромом Донохью, синдромом РабсонаМенденхолла и соответствующими осложнениями. Терапевтические подходы, связанные с решением проблем устойчивости к лептину, недостаточности лептина и гиполептинемии (например, липодистрофии), преимущественно были направлены на доставку дополнительного лептина или аналогов лептина пораженным индивидуумам. Однако такие подходы в целом показали ограниченную эффективность, особенно у индивидуумов с устойчивостью к лептину, и часто связаны с нежелательными побочными эффектами. Таким образом, в данной области существует необходимость в альтернативных подходах к лечению устойчивости к лептину и других состояний, ассоциированных с устойчивостью к лептину или гиполептинемией.Leptin is a polypeptide hormone expressed primarily in adipose tissue that is involved in the regulation of metabolism, energy balance, and food intake. The activity of leptin is mediated by interaction with the leptin receptor and signal transmission through it. The leptin receptor (also known as LEPR, WSX, OB receptor, OB-R, and CD295) is a single-pass transmembrane receptor of the class I cytokine receptor family with a large (818 amino acids) extracellular domain. Leptin deficiency, leptin resistance, and certain LEPR-defective/impaired signaling mutations are associated with obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, lipodystrophies, hepatic steatosis, non-alcoholic fatty liver disease and alcoholic fatty liver disease, severe insulin resistance, leprechaunism/Donoghue syndrome, Rabson-Mendenhall syndrome and related complications. Therapeutic approaches to address leptin resistance, leptin deficiency, and hypoleptinemia (eg, lipodystrophy) have predominantly focused on delivering supplemental leptin or leptin analogs to affected individuals. However, such approaches have generally shown limited efficacy, especially in leptin resistant individuals, and are often associated with unwanted side effects. Thus, there is a need in the art for alternative approaches to the treatment of leptin resistance and other conditions associated with leptin resistance or hypoleptinemia.

Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief summary of the present invention

Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают лептиновый рецептор человека (LEPR). Антитела по настоящему изобретению представляют собой агонистические антитела, т.е. связывание антител к LEPR по настоящему изобретению с LEPR вызывает, в числе прочего, активацию передачи сигнала посредством лептинового рецептора в клетках. В соответствии с определенными вариантами осуществления антитела по настоящему изобретению не конкурируют с лептином за связывание с LEPR. Антитела по настоящему изобретению применимы, например, для имитации, замещения или дополнения нормальной биологической активности лептина у субъекта. Таким образом, антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению применимы при терапевтическом лечении заболеваний или нарушений, ассоциированных с устойчивостью к лептину и недостаточностью лептина.The present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind the human leptin receptor (LEPR). The antibodies of the present invention are agonistic antibodies, i.e. binding of the anti-LEPR antibodies of the present invention to LEPR causes, inter alia, activation of signaling through the leptin receptor in cells. In certain embodiments, the antibodies of the present invention do not compete with leptin for binding to LEPR. The antibodies of the present invention are useful, for example, to mimic, replace, or supplement the normal biological activity of leptin in a subject. Thus, the antibodies and antigen-binding fragments of the present invention are useful in the therapeutic treatment of diseases or disorders associated with leptin resistance and leptin deficiency.

Антитела по настоящему изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут содержать только антигенсвязывающий участок (например, Fab-, F(ab')₂- или scFvфрагмент), и могут быть модифицированы с целью воздействия на функциональные свойства, например, устранения остаточных эффекторных функций (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).Antibodies of the present invention may be full-length (eg, IgG1 or IgG4 antibody) or may contain only an antigen-binding site (eg, Fab-, F(ab') ₂ - or scFv fragment), and may be modified to affect functional properties, for example , elimination of residual effector functions (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

Иллюстративные антитела к LEPR по настоящему изобретению представлены в табл. 1 и 2 настоящего документа. В табл. 1 изложены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных участков тяжелой цепи (HCVR), вариабельных участков легкой цепи (LCVR), определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и определяющих комплементарность областей легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) иллюстративных антител к LEPR. В табл. 2 изложены идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 иллюстративных антител к LEPR.Illustrative antibodies to LEPR of the present invention are presented in table. 1 and 2 of this document. In table. 1 sets forth the amino acid sequence identifiers for the heavy chain variable regions (HCVR), the light chain variable regions (LCVR), the heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2, and HCDR3), and the light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2, and LCDR3) of exemplary anti-LEPR antibodies. . In table. 2 sets forth the nucleic acid sequence identifiers HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 of exemplary anti-LEPR antibodies.

Настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие HCVR, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCVR, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention provides antibodies or antigennegative fragments thereof that specifically bind LEPR containing HCVR, containing an amino acid sequence selected from any of the HCVR amino acid sequences presented in table. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие LCVR, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCVR, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPRs containing LCVRs containing an amino acid sequence selected from any of the LCVR amino acid sequences shown in Table 1. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

- 1 041859- 1 041859

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), содержащую любую из аминокислотных последовательностей HCVR, представленных в таблице, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCVR, представленных в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, содержащуюся в любом из иллюстративных антител к LEPR, представленных в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 и 82/66.The present invention also provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that specifically bind LEPR, comprising a pair of HCVR and LCVR amino acid sequences (HCVR/LCVR) comprising any of the HCVR amino acid sequences shown in Table 1 in pair with any of the LCVR amino acid sequences shown in Table 1. tab. 1. In accordance with certain variants of implementation of the present invention provides antibodies or their antigennegative fragments containing a pair of amino acid sequences HCVR/LCVR contained in any of the exemplary antibodies to LEPR presented in table. 1. In certain embodiments, a pair of HCVR/LCVR amino acid sequences is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/ 66, 74/66 and 82/66.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR1 (HCDR1) тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR1, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPRs containing a heavy chain CDR1 (HCDR1) containing an amino acid sequence selected from any of the HCDR1 amino acid sequences shown in Table 1. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR2 (HCDR2) тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR2, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPRs containing a heavy chain CDR2 (HCDR2) containing an amino acid sequence selected from any of the HCDR2 amino acid sequences shown in Table 1. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR3 (HCDR3) тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR3, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPRs containing a heavy chain CDR3 (HCDR3) containing an amino acid sequence selected from any of the HCDR3 amino acid sequences shown in Table 1. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR1 (LCDR1) легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR1, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPRs containing a light chain CDR1 (LCDR1) containing an amino acid sequence selected from any of the LCDR1 amino acid sequences shown in Table 1. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR2 (LCDR2) легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR2, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPRs containing a light chain CDR2 (LCDR2) containing an amino acid sequence selected from any of the LCDR2 amino acid sequences shown in Table 1. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие CDR3 (LCDR3) легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, представленных в табл. 1, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPRs containing a light chain CDR3 (LCDR3) containing an amino acid sequence selected from any of the LCDR3 amino acid sequences shown in Table 1. 1, or a sequence actually similar to it, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCDR3 и LCDR3 (HCDR3/LCDR3), содержащую любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, представленных в таблице, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, представленных в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, содержащуюся в любом из иллюстративных антител к LEPR, представленных в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3 выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/72, 80/72 и 88/72.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPR, comprising an HCDR3 and LCDR3 amino acid sequence pair (HCDR3/LCDR3) comprising any of the HCDR3 amino acid sequences shown in Table 1 in pair with any of the LCDR3 amino acid sequences shown in Table 1. tab. 1. In accordance with certain variants of implementation of the present invention provides antibodies or antigennegative fragments containing a pair of amino acid sequences HCDR3/LCDR3 contained in any of the exemplary antibodies to LEPR presented in table. 1. In accordance with certain embodiments, a pair of HCDR3/LCDR3 amino acid sequences is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/ 72, 80/72 and 88/72.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связывают LEPR, содержащие совокупность из шести CDR (т.е. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащихся в любом из иллюстративных антител к LEPR, представленных в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления совокупность аминокислотных последовательностей HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12,The present invention also provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that specifically bind LEPR, comprising an array of six CDRs (i.e., HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3) contained in any of the exemplary anti-LEPR antibodies shown in Table 1. . 1. In accordance with certain variants of implementation of the set of amino acid sequences HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12

- 2 041859- 2 041859

14, 16; 44, 46, 48, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 68, 70, 72; 76, 78, 80, 68, 70, 72; и 84, 86, 88, 68, 70, 72.14, 16; 44, 46, 48, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 68, 70, 72; 76, 78, 80, 68, 70, 72; and 84, 86, 88, 68, 70, 72.

В соответствии со связанным вариантом осуществления настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связывают LEPR, содержащие совокупность из шести CDR (т.е. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, как определено с помощью любого из иллюстративных антител к LEPR, представленных в табл. 1. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают LEPR, содержащие совокупность аминокислотных последовательностей HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 и 82/66. Способы и методики выявления CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны в данной области и могут быть использованы для идентификации CDR в определенных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR, раскрываемых в настоящем документе. Иллюстративные соглашения, которые можно использовать для идентификации границ CDR, включают, например, определение по Кабат, определение по Чотиа и определение по AbM. В целом, определение по Кабат основано на вариабельности последовательностей, определение по Чотиа основано на положении областей структурных петель и определение по AbM является компромиссным решением между подходами Кабат и Чотиа. См., например, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:9268-9272 (1989). Общедоступные базы данных также доступны для идентификации последовательностей CDR в антителе.According to a related embodiment, the present invention also provides antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that specifically bind LEPR, comprising an array of six CDRs (i.e., HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3) contained within the HCVR amino acid sequence pair. /LCVR, as determined using any of the illustrative antibodies to LEPR presented in table. 1. For example, the present invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind LEPR, comprising a plurality of amino acid sequences HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 contained in an HCVR/LCVR amino acid sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 and 82/66. Methods and techniques for detecting CDRs in HCVR and LCVR amino acid sequences are well known in the art and can be used to identify CDRs in certain HCVR and/or LCVR amino acid sequences disclosed herein. Exemplary conventions that can be used to identify CDR boundaries include, for example, the Kabat definition, the Chothia definition, and the AbM definition. In general, the Kabat definition is based on sequence variability, the Chothia definition is based on the position of structural loop regions, and the AbM definition is a compromise between the Kabat and Chothia approaches. See, for example, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA 56:9268-9272 (1989). Public databases are also available for identifying CDR sequences in an antibody.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к LEPR или их участки. Например, настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCVR, представленных в табл. 1; в соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCVR, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding anti-LEPR antibodies or portions thereof. For example, the present invention provides nucleic acid molecules encoding any of the HCVR amino acid sequences shown in Table. 1; in accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the HCVR nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCVR, представленных в табл. 1; в соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCVR, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCVR amino acid sequences shown in Table. 1; in accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCVR nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR1, представленных в табл. 1; в соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCDR1, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR1 amino acid sequences shown in Table. 1; in accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the HCDR1 nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR2, представленных в табл. 1; в соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCDR2, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR2 amino acid sequences shown in Table. 1; in accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the HCDR2 nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, представленных в табл. 1; в соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCDR3, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR3 amino acid sequences shown in Table. 1; in accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the HCDR3 nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR1, представленных в табл. 1; в соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCDR1, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCDR1 amino acid sequences shown in Table 1. 1; in accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR1 nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR2, представленных в табл. 1; в соответствии с опреThe present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCDR2 amino acid sequences shown in Table 1. 1; according to definition

- 3 041859 деленными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCDR2, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.- 3 041859 divided embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR2 nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR3, представленных в табл. 1; в соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCDR3, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCDR3 amino acid sequences shown in Table 1. 1; in accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR3 nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие HCVR, где HCVR содержит совокупность из трех CDR (т.е. HCDR1, HCDR2, HCDR3), где совокупность аминокислотных последовательностей HCDR1, HCDR2, HCDR3 определена с помощью любой из иллюстративных антител к LEPR, представленных в табл. 1.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding HCVR, where HCVR contains a set of three CDRs (i.e. HCDR1, HCDR2, HCDR3), where the set of amino acid sequences HCDR1, HCDR2, HCDR3 is determined using any of the exemplary anti-LEPR antibodies provided in table. 1.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие LCVR, где LCVR содержит совокупность из трех CDR (т.е. LCDR1, LCDR2, LCDR3), где совокупность аминокислотных последовательностей LCDR1, LCDR2, LCDR3 определена с помощью любой из иллюстративных антител к LEPR, представленных в табл. 1.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding an LCVR, wherein the LCVR comprises a set of three CDRs (i.e., LCDR1, LCDR2, LCDR3), where the set of amino acid sequences of LCDR1, LCDR2, LCDR3 is determined using any of the exemplary anti-LEPR antibodies provided in table. 1.

Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие как HCVR, так и LCVR, где HCVR содержит аминокислотную последовательность любой из аминокислотных последовательностей HCVR, представленных в табл. 1, и где LCVR содержит аминокислотную последовательность любой из аминокислотных последовательностей LCVR, представленных в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновой кислоты HCVR, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность, и полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновой кислоты LCVR, представленных в табл. 2, или фактически аналогичную ей последовательность, на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную ей последовательность. В соответствии с определенными вариантами осуществления в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR и LCVR, где как HCVR, так и LCVR происходят из одного и того же антитела к LEPR, представленного в табл. 1.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding both HCVR and LCVR, where HCVR contains the amino acid sequence of any of the HCVR amino acid sequences presented in table. 1, and where LCVR contains the amino acid sequence of any of the LCVR amino acid sequences presented in table. 1. In accordance with certain embodiments, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the HCVR nucleic acid sequences shown in Table. 2, or a sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it, and a polynucleotide sequence selected from any of the LCVR nucleic acid sequences represented by in table. 2, or a sequence that is actually at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to it. In certain embodiments of this aspect of the present invention, the nucleic acid molecule encodes for HCVR and LCVR, wherein both HCVR and LCVR are derived from the same anti-LEPR antibody shown in Table 1. 1.

Настоящее изобретение также предусматривает рекомбинантные векторы экспрессии, способные экспрессировать полипептид, содержащий вариабельный участок тяжелой или легкой цепи антитела к LEPR. Например, настоящее изобретение предусматривает рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие любую из молекул нуклеиновой кислоты, упомянутых выше, например, молекул нуклеиновых кислот, кодирующих любую из последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, изложенных в табл. 1. Также в объем настоящего изобретения включены клетки-хозяева, в которые такие векторы были введены, а также способы получения антител или их частей в результате культивирования клеток-хозяев в условиях, способствующих получению антител или фрагментов антител, и извлечения антител или фрагментов антител, полученных таким образом.The present invention also provides recombinant expression vectors capable of expressing a polypeptide containing the heavy or light chain variable region of an anti-LEPR antibody. For example, the present invention provides recombinant expression vectors containing any of the nucleic acid molecules mentioned above, for example, nucleic acid molecules encoding any of the HCVR, LCVR and/or CDR sequences set forth in Table. 1. Also included within the scope of the present invention are host cells into which such vectors have been introduced, as well as methods for producing antibodies or parts thereof by culturing host cells under conditions conducive to the production of antibodies or antibody fragments, and recovering antibodies or antibody fragments, obtained in this way.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантное человеческое антитело или его фрагмент, который специфически связывает LEPR, и фармацевтически приемлемый носитель. В соответствии со связанным аспектом настоящее изобретение предусматривает композицию, которая представляет собой комбинацию антитела к LEPR и второго терапевтического средства. В соответствии с одним вариантом осуществления второе терапевтическое средство представляет собой любое средство, которое предпочтительно комбинируется с антителом к LEPR.According to another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a recombinant human antibody or fragment thereof that specifically binds LEPR and a pharmaceutically acceptable carrier. According to a related aspect, the present invention provides a composition that is a combination of an anti-LEPR antibody and a second therapeutic agent. According to one embodiment, the second therapeutic agent is any agent that is preferably combined with an anti-LEPR antibody.

В соответствии с еще одним аспектом настоящее изобретение предусматривает терапевтические способы усиления или стимуляции передачи сигнала посредством LEPR с помощью антитела к LEPR или антигенсвязывающей части антитела по настоящему изобретению. Терапевтические способы в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предусматривают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. Нарушение, подлежащее лечению, представляет собой любое заболевание или состояние, которое нормализуется, ослабляется, подавляется или предупреждается в результате стимуляции или активации передачи сигнала посредством LEPR, или иной имитации природной активности лептина in vitro или in vivo.According to yet another aspect, the present invention provides therapeutic methods for enhancing or stimulating LEPR signaling with an anti-LEPR antibody or an antigen-binding portion of an antibody of the present invention. Therapeutic methods in accordance with this aspect of the present invention provide for the introduction of a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition containing the antibody or antigen-binding antibody fragment of the present invention to a subject in need thereof. A disorder to be treated is any disease or condition that is normalized, ameliorated, suppressed, or prevented by stimulating or activating signaling by LEPR, or otherwise mimicking natural leptin activity in vitro or in vivo.

Другие варианты осуществления будут очевидны из обзора последующего подробного описания.Other embodiments will be apparent from a review of the following detailed description.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фиг. 1 представлено связывание димерного LEPR человека с лептином человека в присутствии возрастающих концентраций исследуемых антител к LEPR или контрольных молекул, измеряемых с поIn FIG. 1 shows the binding of dimeric human LEPR to human leptin in the presence of increasing concentrations of test anti-LEPR antibodies or control molecules measured from to

- 4 041859 мощью ELISA (поглощение при 450 нм).- 4 041859 by ELISA power (absorption at 450 nm).

На фиг. 2А-С представлена степень передачи сигнала посредством LEPR в клетках HEK293, экспрессирующих либо LEPR дикого типа (кружки), либо мутант LEPR с дефектом передачи сигнала (А409Е, квадратики), либо мутант LEPR с нарушением передачи сигнала (Р316Т, треугольники). Передача сигнала посредством LEPR экспрессируется в виде соотношения pSTAT3-Y705/STAT3, измеряемого с помощью денситометрии на основе вестерн-блотов, полученных из клеток, обработанных возрастающими концентрациями лептина (фиг. 2А), Н4Н16650 (фиг. 2В) или Н4Н16679 (фиг. 2С).In FIG. 2A-C show the extent of signaling by LEPR in HEK293 cells expressing either wild-type LEPR (circles), a signaling-defective LEPR mutant (A409E, squares), or a signaling-defective LEPR mutant (P316T, triangles). LEPR signaling is expressed as pSTAT3-Y705/STAT3 ratio measured by densitometry from Western blots obtained from cells treated with increasing concentrations of leptin (FIG. 2A), H4H16650 (FIG. 2B), or H4H16679 (FIG. 2C). ).

На фиг. 3 показано среднее суточное потребление пищи мышами с недостаточностью лептина, которым вводили либо антитело изотипического контроля при 3 мг/кг, либо антитело к LEPR, выбранное из Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при 3 мг/кг.In FIG. 3 shows the mean daily food intake of leptin-deficient mice treated with either an isotype control antibody at 3 mg/kg or an anti-LEPR antibody selected from H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2, or H4H17321P2 at 3 mg/kg.

На фиг. 4 показан средний процент изменения массы тела мышей с недостаточностью лептина, которым вводили либо антитело изотипического контроля при 3 мг/кг, либо антитело к LEPR, выбранное из Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при 3 мг/кг.In FIG. 4 shows the mean percent change in body weight of leptin-deficient mice treated with either an isotype control antibody at 3 mg/kg or an anti-LEPR antibody selected from H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2, or H4H17321P2 at 3 mg/kg.

На фиг. 5 показана средняя масса жировой ткани у животных в каждой группе обработки антителами, представленная количественно в виде μСТ за 1 день до (столбики не закрашены) и через 6 дней после обработки антителами (закрашенные столбики), выраженная в виде среднего ±SEM.In FIG. 5 shows the mean body fat mass of animals in each antibody treatment group, quantified as μCT 1 day before (open bars) and 6 days after antibody treatment (solid bars), expressed as mean±SEM.

На фиг. 6 показан средний процент изменения массы тела мышей, получавших с пищей 30 мг/кг антитела, выбранного из н4н18482Р2, Н4Н18487Р2, Н4Н18492Р2 или изотипического контроля.In FIG. 6 shows the mean percentage change in body weight of mice fed with 30 mg/kg of an antibody selected from H4H18482P2, H4H18487P2, H4H18492P2, or an isotype control.

Фиг. 7А, В. На фиг. 7А показана масса жировой ткани мышей до введения антител к LEPR Н4Н18482Р2, Н4Н18487Р2 или Н4Н18492Р2. На фиг. 7В показана масса жировой ткани мышей, обработанных 30 мг/кг Н4Н18482Р2, Н4Н18487Р2 или Н4Н18492Р2.Fig. 7A, B. FIG. 7A shows the adipose tissue mass of mice prior to administration of anti-LEPR antibodies H4H18482P2, H4H18487P2, or H4H18492P2. In FIG. 7B shows the adipose tissue mass of mice treated with 30 mg/kg H4H18482P2, H4H18487P2, or H4H18492P2.

Фиг. 8. На фиг. 8 показано, что исследуемые антитела к LEPR активировали LEPR мыши (Mf) в клеточной линии IMR-32/STAT3-luc/Mf LEPR.Fig. 8. In FIG. 8 shows that the tested anti-LEPR antibodies activated mouse (Mf) LEPR in the IMR-32/STAT3-luc/Mf LEPR cell line.

Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed disclosure of the present invention

Перед описанием настоящего изобретения необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и условиями экспериментов, поскольку такие способы и условия могут меняться. Также необходимо понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления и не носит ограничительный характер, поскольку область настоящего изобретения будет ограничиваться лишь прилагаемой формулой изобретения.Before describing the present invention, it should be understood that the present invention is not limited to the specific experimental methods and conditions described, as such methods and conditions may vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments only and is not intended to be limiting, as the scope of the present invention will only be limited by the appended claims.

Если не определено иное, все технические и научные выражения, применяемые в настоящем документе, имеют такое же значение, как обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Используемое в настоящем документе выражение приблизительно, при отсылке на конкретное описываемое числовое значение, означает, что значение может отличаться от описываемого значения не более чем на 1%. Например, используемое в настоящем документе выражение приблизительно 100 включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и др.).Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs. As used herein, approximately, when referring to a specific numerical value being described, means that the value may differ from the value being described by no more than 1%. For example, as used herein, approximately 100 includes 99 and 101 and all values in between (eg, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).

Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения, ниже описаны предпочтительные способы и материалы.While any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, preferred methods and materials are described below.

ОпределенияDefinitions

Выражение лептиновый рецептор, LEPR и т.п., используемое в настоящем документе, относится к лептиновому рецептору человека, содержащему аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO:113 (см. также номер доступа в UniProtKB/Swiss-Prot P48357). Альтернативные названия LEPR, используемые в научной литературе, включают рецептор OB, OB-R и CD295. LEPR также называется WSX (см., например, патент США № 7524937). Выражение LEPR включает как мономерные, так и мультимерные (например, димерные) молекулы LEPR. Используемое в настоящем документе выражение мономерный LEPR человека означает белок LEPR или его часть, которая не содержит или не имеет никаких доменов, способных к мультимеризации, и который существует в нормальных условиях в виде одиночной молекулы LEPR без прямой физической связи с другой молекулой LEPR. Иллюстративной мономерной молекулой LEPR является молекула, называемая в настоящем документе hLEPR.mmh, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:114 (см., например, пример 3 настоящего документа). Используемое в настоящем документе выражение димерный LEPR человека означает конструкцию, содержащую две молекулы LEPR, соединенные друг с другом с помощью линкера, ковалентной связи, нековалентной связи или с помощью домена, способного к мультимеризации, такого как Fc-домен антитела. Иллюстративной димерной молекулой LEPR является молекула, называемая в настоящем документе hLEPR.mFc, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:115 (см., например, пример 3 настоящего документа), или молекула, называемая hLEPR.hFc, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:116. Используемые в настоящем документе выражения антитело к LEPR, антитело, которое специфически связывает LEPR, LEPR-специфический связывающий белок и т.п., если особым образом не указано иное, относятся к молекулам, которые связывают полноразмерный LEPR человека, мономерный LEPR человека, димерный LEPR человека или другиеThe expression leptin receptor, LEPR, and the like as used herein refers to a human leptin receptor comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:113 (see also UniProtKB/Swiss-Prot accession number P48357). Alternative names for LEPR used in the scientific literature include OB receptor, OB-R, and CD295. LEPR is also referred to as WSX (see, for example, US Pat. No. 7,524,937). The LEPR expression includes both monomeric and multimeric (eg, dimeric) LEPR molecules. As used herein, monomeric human LEPR refers to a LEPR protein or portion thereof that does not contain or has no multimerizable domains and that exists under normal conditions as a single LEPR molecule without a direct physical association with another LEPR molecule. An exemplary monomeric LEPR molecule is referred to herein as hLEPR.mmh, containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:114 (see, for example, Example 3 of this document). As used herein, dimeric human LEPR refers to a construct containing two LEPR molecules connected to each other by a linker, a covalent bond, a non-covalent bond, or a multimerizable domain such as the Fc domain of an antibody. An exemplary dimeric LEPR molecule is a molecule referred to herein as hLEPR.mFc containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:115 (see, for example, Example 3 herein) or a molecule referred to as hLEPR.hFc containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 116. As used herein, the terms anti-LEPR antibody, antibody that specifically binds LEPR, LEPR-specific binding protein, and the like, unless specifically stated otherwise, refer to molecules that bind full-length human LEPR, monomeric human LEPR, dimeric LEPR person or others

- 5 041859 конструкции, которые содержат или состоят из внеклеточного домена LEPR.- 5 041859 constructs that contain or consist of an extracellular LEPR domain.

Все ссылки на белки, полипептиды и фрагменты белков в настоящем документе относятся к человеческому варианту соответствующего белка, полипептида или фрагмента белка, если явным образом не указано, что он происходит от отличных от человека видов. Таким образом, выражение LEPR означает LEPR человека, если не указано, что он происходит от отличных от человека видов, например LEPR мыши, LEPR обезьяны и др.All references to proteins, polypeptides, and protein fragments herein refer to the human variant of the corresponding protein, polypeptide, or protein fragment, unless explicitly stated to be from a non-human species. Thus, the expression LEPR means human LEPR, unless it is indicated that it comes from non-human species, for example, mouse LEPR, monkey LEPR, etc.

Используемое в настоящем документе выражение экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR означает один или несколько белков LEPR, или их внеклеточный домен, который (которые) экспрессируется (экспрессируются) на поверхности клетки in vitro или in vivo таким образом, что по меньшей мере часть белка LEPR обращена к внеклеточной стороне клеточной мембраны и является доступной для антигенсвязывающей части антитела. Экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR может содержать белок LEPR или состоять из такового, экспрессируемого на поверхности клетки, которая обычно (например, в нативном состоянии или в состоянии дикого типа) экспрессирует белок LEPR. Альтернативно экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR может содержать белок LEPR или состоять из такового, экспрессируемого на поверхности клетки, которая обычно не экспрессирует LEPR человека на своей поверхности, однако была искусственно сконструирована в целях экспрессии LEPR на своей поверхности.As used herein, cell surface expressed LEPR refers to one or more LEPR proteins, or their extracellular domain, that is(are) expressed on the cell surface in vitro or in vivo such that at least a portion of the LEPR protein faces the extracellular side of the cell membrane and is accessible to the antigen-binding portion of the antibody. Cell surface expressed LEPR may comprise or consist of a LEPR protein expressed on the surface of a cell that normally (eg, native or wild type) expresses the LEPR protein. Alternatively, a cell surface-expressed LEPR may comprise or consist of a LEPR protein expressed on the surface of a cell that does not normally express human LEPR on its surface but has been artificially engineered to express LEPR on its surface.

Используемые в настоящем документе выражения, такие как антитело к LEPR или антитело, которое связывает лептиновый рецептор человека, включают как моновалентные антитела с единственной специфичностью, так и биспецифические антитела, содержащие первый фрагмент, который связывает LEPR, и второй фрагмент, который связывает второй (целевой) антиген, где фрагмент антитела к LEPR содержит любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, изложенных в табл. 1 настоящего документа.As used herein, expressions such as an antibody to LEPR or an antibody that binds the human leptin receptor include both monovalent antibodies with a single specificity and bispecific antibodies containing a first fragment that binds LEPR and a second fragment that binds a second (target ) antigen, where the fragment of the antibody to LEPR contains any of the sequences HCVR/LCVR or CDR set forth in table. 1 of this document.

Термин антитело, используемый в настоящем документе, означает любую антиген-связывающую молекулу или молекулярный комплекс, содержащий по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR), которая специфически связывается с или взаимодействует с определенным антигеном (например, LEPR). Термин антитело включает молекулы иммуноглобулинов, содержащие четыре полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (в данном документе имеет аббревиатуру HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена, CH1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (в данном документе имеет аббревиатуру LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен (CL1). Участки V_H и V_L могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждый V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения FR антитела к LEPR (или его антигенсвязывающего участка) могут быть идентичными последовательностям зародышевой линии человека или могут быть естественно или искусственно изменены. Аминокислотная консенсусная последовательность может быть определена на основании анализа бок о бок двух или более CDR.The term antibody as used herein means any antigen-binding molecule or molecular complex containing at least one complementarity determining region (CDR) that specifically binds to or interacts with a particular antigen (eg, LEPR). The term antibody includes immunoglobulin molecules containing four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains linked by disulfide bonds, as well as their multimers (eg, IgM). Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains, CH1, C _H 2 and C _H 3. Each light chain contains a light chain variable region (herein abbreviated LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one domain (CL1). The V _H and V _L regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs) interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs). Each V _H and V _L consists of three CDRs and four FRs, arranged from amino to carboxy in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. In accordance with various embodiments of the present invention, the FR of an anti-LEPR antibody (or antigen-binding site thereof) may be identical to human germline sequences, or may be naturally or artificially altered. The amino acid consensus sequence can be determined based on a side-by-side analysis of two or more CDRs.

Термин антитело, используемый в настоящем документе, также включает антигенсвязывающие фрагменты целых молекул антител. Термины антигенсвязывающий участок антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и тому подобное, используемые в настоящем документе, включают любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или получаемый методами генной инженерии полипептид или гликопротеин, специфически связывающий антиген с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из целых молекул антител при помощи любых подходящих стандартных методик, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантные методики генной инженерии, включающие манипуляцию с ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антител, и ее экспрессию. Такая ДНК известна и/или легкодоступна, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (в том числе, например, библиотек фаг-антитело) или может быть синтезирована. ДНК может быть секвенирована и с ней можно манипулировать химически или при помощи методик молекулярной биологии, например, для упорядочения одного или нескольких вариабельных и/или константных доменов в подходящую конфигурацию, или для введения кодов, создания цистеиновых остатков, модификации, присоединения или удаления аминокислот и т.д.The term antibody as used herein also includes antigen-binding fragments of whole antibody molecules. The terms antibody antigen-binding site, antibody antigen-binding fragment, and the like as used herein include any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic, or genetically engineered polypeptide or glycoprotein that specifically binds an antigen to form a complex. Antigen-binding fragments of an antibody can be obtained, for example, from whole antibody molecules using any suitable standard techniques, such as proteolytic cleavage or recombinant genetic engineering techniques, including the manipulation of DNA encoding variable and optionally constant domains of antibodies, and its expression. Such DNA is known and/or readily available, for example from commercial sources, DNA libraries (including, for example, phage-antibody libraries), or can be synthesized. DNA can be sequenced and manipulated chemically or by molecular biology techniques, for example, to arrange one or more variable and/or constant domains into a suitable configuration, or to introduce codes, create cysteine residues, modify, add or remove amino acids, and etc.

Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) Fab-фрагменты; (ii) F(ab')₂-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) dAb-фрагменты и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельный участок антитела (например, выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR), такой как пептид CDR3), или пептид с ограниченной конформационной своNon-limiting examples of antigen-binding fragments include: (i) Fab fragments; (ii) F(ab') ₂ fragments; (iii) Fd fragments; (iv) Fv fragments; (v) single chain Fv molecules (scFv); (vi) dAb fragments; and (vii) minimal recognition units consisting of amino acid residues that mimic an antibody hypervariable region (e.g., a distinct complementarity determining region (CDR), such as a CDR3 peptide), or a peptide with restricted conformational freedom.

- 6 041859 бодой FR3-CDR3-FR4. Другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфические антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленным доменом, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные антитела, бивалентные антитела и т.д.), иммунопрепараты на основе модульного белка с малым размером молекул (SMIP) и вариабельные домены IgNAR акулы, также включены в выражение антигенсвязывающий фрагмент, используемое в настоящем документе.- 6 041859 Baud FR3-CDR3-FR4. Other engineered molecules such as domain-specific antibodies, single-domain antibodies, domain-deleted antibodies, chimeric antibodies, CDR-grafted antibodies, diabodies, tribodies, tetrabodies, minibodies, nanobodies (e.g., monovalent antibodies, bivalent antibodies, etc.) , small molecule modular protein (SMIP) immunotherapies, and shark IgNAR variable domains are also included in the expression antigen-binding fragment used herein.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела, как правило, содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может быть любого размера или аминокислотного состава и будет, как правило, содержать по меньшей мере одну CDR, которая прилегает или находится в рамке считывания с одной или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен V_H, связанный с доменом V_L, домены VH и V_L могут располагаться относительно другу друга в любом подходящем порядке. Например, вариабельный участок может быть димерным и содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. Альтернативно антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен VH или VL.An antigen binding fragment of an antibody typically contains at least one variable domain. The variable domain may be of any size or amino acid composition and will typically contain at least one CDR that is contiguous or in-frame with one or more framework sequences. In antigen-binding fragments having a V _H domain associated with a V _L domain, the VH and V _L domains can be arranged relative to each other in any suitable order. For example, the variable region may be dimeric and contain V _H -V _H , V _H -V _L or V _L -V _L dimers. Alternatively, an antigen-binding fragment of an antibody may comprise a VH or VL monomeric domain.

В соответствии с определенными вариантами осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный с по меньшей мере одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые можно найти в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) V_l-C_h2-C_h3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе иллюстративных конфигурациях, изложенных выше, вариабельные и константные домены могут быть либо непосредственно связаны друг с другом, либо могут быть связаны с помощью всего или части шарнира или линкерного участка. Шарнирная область может состоять из по меньшей мере 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, которые приводят к образованию гибкой или полугибкой связи между прилегающими вариабельными и/или константными доменами в одной молекуле полипептида. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультидимер) из любых конфигураций вариабельных и константных доменов, изложенных выше, в нековалентной ассоциации друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами V_H или V_L (например, при помощи дисульфидной (дисульфидных) связи (связей)).In accordance with certain embodiments, an antigen-binding fragment of an antibody may comprise at least one variable domain covalently linked to at least one constant domain. Non-limiting exemplary variable and constant domain configurations that can be found in an antigen-binding fragment of an antibody of the present invention include: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) V _H -C _H 1 -C _H 2 -C _H 3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) V _l -C _h 2 -C _h 3; and (xiv) V _L -C _L . In any configuration of the variable and constant domains, including the exemplary configurations set forth above, the variable and constant domains may either be directly linked to each other, or may be linked through all or part of a hinge or linker region. The hinge region may be composed of at least 2 (e.g., 5, 10, 15, 20, 40, 60 or more) amino acids that result in a flexible or semi-flexible bond between adjacent variable and/or constant domains in a single polypeptide molecule. In addition, an antigen-binding fragment of an antibody of the present invention may comprise a homodimer or heterodimer (or other multidimer) of any of the variable and constant domain configurations set forth above in non-covalent association with each other and/or with one or more V _H or V _L monomeric domains. (for example, via disulfide(s) bond(s)).

Как и в случае с целыми молекулами антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела будет обычно содержать по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связываться с отдельным антигеном или с другим эпитопом того же самого антигена. Любой формат мультиспецифических антител, в том числе форматы иллюстративных биспецифических антител, раскрываемых в настоящем документе, могут быть адаптированы для применения в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению при помощи стандартных методик, доступных в данной области.As with whole antibody molecules, antigen binding fragments can be monospecific or multispecific (eg, bispecific). A multispecific antigen-binding fragment of an antibody will typically contain at least two different variable domains, where each variable domain is capable of specifically binding to a separate antigen or to a different epitope on the same antigen. Any multispecific antibody format, including the exemplary bispecific antibody formats disclosed herein, can be adapted for use in the context of an antigen-binding fragment of an antibody of the present invention using standard techniques available in the art.

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения антитела к LEPR по настоящему изобретению представляют собой человеческие антитела. Термин человеческое антитело, используемое в настоящем документе, включает антитела, имеющие вариабельные и константные участки, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Человеческие антитела по настоящему изобретению могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, вводимые в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например в CDR и в частности CDR3. Однако термин человеческое антитело, используемое в настоящем документе, не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающего, такого как мышь, привиты на каркасные последовательности человека.In accordance with certain embodiments of the present invention, the anti-LEPR antibodies of the present invention are human antibodies. The term human antibody as used herein includes antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies of the present invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by in vitro random or site-specific mutagenesis or in vivo somatic mutation), such as in CDRs and in particular CDR3. However, the term human antibody as used herein does not include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, are grafted onto human framework sequences.

Антитела по настоящему изобретению могут в соответствии с определенными вариантами осуществления быть рекомбинантными человеческими антителами. Термин рекомбинантное человеческое антитело, используемый в настоящем документе, включает все антитела, получаемые, экспрессируемые, создаваемые или выделяемые рекомбинантным способом, такие как антитела, экспрессируемые с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (описанные далее), антитела, выделяемые из комбинаторной библиотеки рекомбинантных человеческих антител (описанные далее), антитела, выделяемые из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам человеческих иммуноглобулинов (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, получаемые, экспрессируемые, создаваемые или выделяемые любым другим способом, включающим соединение последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные участки, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. ОднакоThe antibodies of the present invention may, in certain embodiments, be recombinant human antibodies. The term recombinant human antibody as used herein includes all antibodies produced, expressed, generated or isolated by a recombinant method, such as antibodies expressed using a recombinant expression vector transfected into a host cell (described below), antibodies isolated from a combinatorial recombinant human antibody libraries (described below), antibodies isolated from an animal (e.g., mouse) that is transgenic for human immunoglobulin genes (see, e.g., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 ), or antibodies obtained, expressed, generated or isolated by any other method, including the connection of human immunoglobulin gene sequences with other DNA sequences. Such recombinant human antibodies have variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. However

- 7 041859 в соответствии с определенными вариантами осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела претерпевают мутагенез in vitro (или в случае использования животного, трансгенного по последовательностям человеческого Ig, соматический мутагенез in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-участков рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя происходят из последовательностей VH и V_L зародышевой линии человека и связаны с последовательностями VH и V_L зародышевой линии человека, могут не встречаться в природе в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.- 7 041859 according to certain embodiments, such recombinant human antibodies undergo in vitro mutagenesis (or in the case of an animal transgenic for human Ig sequences, somatic in vivo mutagenesis) and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences which, although derived from human germline VH and V _L sequences and linked to human germline VH and V _L sequences, may not occur naturally in the in vivo human germline antibody repertoire.

Настоящее изобретение охватывает антитела с одной или несколькими мутациями в шарнире, CH2или CH3- участок может быть предпочтительным, например в условиях производства, для повышения выхода предпочтительной формы антитела.The present invention encompasses antibodies with one or more mutations in the hinge, the CH2 or CH3 region may be preferred, eg under manufacturing conditions, to increase the yield of the preferred antibody form.

Антитела по настоящему изобретению могут быть выделенными антителами. Термин выделенное антитело, используемый в настоящем документе, означает антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из по меньшей мере одного компонента своего естественного окружения. Например, антитело, которое было отделено или удалено из по меньшей мере одного компонента организма, или из ткани или клетки, в которой антитело встречается естественным путем или образуется естественным путем, представляет собой выделенное антитело для целей настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела представляют собой антитела, которые подвергаются по меньшей мере одному этапу очистки или выделения. В соответствии с определенными вариантами осуществления выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного вещества и/или химических соединений.The antibodies of the present invention may be isolated antibodies. The term isolated antibody as used herein means an antibody that has been identified and isolated and/or recovered from at least one component of its natural environment. For example, an antibody that has been separated or removed from at least one component of an organism, or from a tissue or cell in which the antibody occurs naturally or is naturally formed, is an isolated antibody for the purposes of the present invention. An isolated antibody also includes an antibody in situ in a recombinant cell. Isolated antibodies are antibodies that have undergone at least one purification or isolation step. In accordance with certain embodiments, the isolated antibody may be substantially free of other cellular material and/or chemical compounds.

Настоящее изобретение предусматривает варианты антител к LEPR, раскрываемых в настоящем документе, содержащих одну или несколько аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных областях и/или областях CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых антитела произошли. Такие мутации можно легко определить сравнением аминокислотных последовательностей, раскрываемых в настоящем документе, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из публичных баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые происходят из аминокислотных последовательностей, раскрываемых в настоящем документе, где одна или несколько аминокислот в одной или нескольких каркасных областях и/или областях CDR мутируют до соответствующего (соответствующих) остатка (остатков) последовательности зародышевой линии, из которой антитело произошло, или до соответствующего (соответствующих) остатка (остатков) последовательности другой зародышевой линии, или до консервативной аминокислотной замены соответствующего (соответствующих) остатка (остатков) зародышевой линии (такие изменения последовательностей называются в настоящем документе собирательно как мутации зародышевой линии). Специалист в данной области, начиная с последовательностей вариабельных участков тяжелой и легкой цепи, раскрытых в данном документе, может легко создать несколько антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат одну или несколько отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В соответствии с определенными вариантами осуществления все из каркасных остатков и/или остатков CDR в доменах V_H и/или V_L являются обратно мутировавшими до остатков, встречающихся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой антитело произошло. В соответствии с другими вариантами осуществления лишь определенные остатки обратно мутируют до исходной последовательности зародышевой линии, например, лишь мутировавшие остатки, обнаруженные в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или лишь мутировавшие остатки, обнаруженные в CDR1, CDR2 или CDR3. В соответствии с другими вариантами осуществления одна или несколько из каркасных областей и/или один или несколько из остатка (остатков) CDR мутируют до соответствующего (соответствующих) остатка (остатков) последовательности другой зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой антитело изначально произошло). Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или более мутаций зародышевых линий в каркасных областях и/или областях CDR, например, где определенные отдельные остатки мутируют до соответствующего остатка последовательности определенной зародышевой линии, в то время как определенные другие остатки, которые отличаются от последовательности исходной зародышевой линии, сохраняются или мутируют до соответствующего остатка последовательности другой зародышевой линии. Сразу после получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько мутаций зародышевых линий, могут быть легко исследованы на одно или несколько предпочтительных свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные биологические антагонистические или агонистические свойства (в случае необходимости), сниженная иммуногенность и т.п. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные этим общим способом, охвачены в настоящем изобретении.The present invention provides variants of the anti-LEPR antibodies disclosed herein containing one or more amino acid substitutions, insertions and/or deletions in the framework regions and/or CDR regions of the heavy and light chain variable domains, as compared to the corresponding germline sequences from which the antibodies happened. Such mutations can be readily identified by comparing the amino acid sequences disclosed herein with germline sequences available, for example, from public antibody sequence databases. The present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that are derived from the amino acid sequences disclosed herein, wherein one or more amino acids in one or more framework regions and/or CDR regions are mutated to the corresponding germline sequence residue(s), from which the antibody originated, or up to the corresponding germline residue(s), or to a conservative amino acid substitution of the corresponding germline residue(s) (such sequence changes are referred to herein collectively as germline mutations). One of skill in the art, starting from the heavy and light chain variable region sequences disclosed herein, can easily generate multiple antibodies and antigen-binding fragments that contain one or more individual germline mutations, or combinations thereof. In certain embodiments, all of the framework and/or CDR residues in the V _H and/or V _L domains are back-mutated to residues occurring in the original germline sequence from which the antibody originated. In other embodiments, only certain residues are back-mutated back to the original germline sequence, for example, only mutated residues found in the first 8 amino acids of FR1 or the last 8 amino acids of FR4, or only mutated residues found in CDR1, CDR2, or CDR3. In accordance with other embodiments, one or more of the framework regions and/or one or more of the CDR residue(s) are mutated to the corresponding residue(s) of another germline sequence (i.e., a germline sequence that differs from the germline sequence from which the antibody originally originated). In addition, the antibodies of the present invention may contain any combination of two or more germline mutations in the framework regions and/or CDR regions, for example, where certain individual residues mutate to the corresponding residue of the specified germline sequence, while certain other residues, that differ from the original germline sequence are retained or mutated to the corresponding residue of the other germline sequence. Once produced, antibodies and antigen-binding fragments that contain one or more germline mutations can be readily tested for one or more preferred properties, such as improved binding specificity, increased binding affinity, improved or enhanced biological antagonist or agonist properties (if necessary). ), reduced immunogenicity, and the like. Antibodies and antigen-binding fragments obtained by this general method are covered by the present invention.

Настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат аминокислотные последовательности, которые фактически аналогичны или фактически идентичны одной или нескольких аминокислотным последовательностям вариабельных доменовThe present invention provides anti-LEPR antibodies and antigen-binding fragments thereof, which contain amino acid sequences that are substantially similar or substantially identical to one or more amino acid sequences of the variable domains.

- 8 041859 или CDR, как встречается в любом из иллюстративных антител к LEPR, раскрываемых в настоящем документе.- 8 041859 or CDR as found in any of the exemplary anti-LEPR antibodies disclosed herein.

Применительно к полипептидам термин фактическая аналогия или фактически аналогичный означает, что две пептидные последовательности, в случае оптимального выравнивания, например, с помощью компьютерных программ GAP или BESTFIT с применением штрафов за открытие гэпа по умолчанию, на по меньшей мере 95% идентичны по последовательности, даже более предпочтительно на по меньшей мере 98 или 99% идентичны по последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (R-группу) с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислотная замена значительно не изменит функциональные свойства белка. В случаях, где две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности последовательности или степень сходства можно регулировать в сторону повышения в целях коррекции консервативной природы замены. Средства для выполнения такой поправки хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, включают (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; (3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат, и (7) серосодержащие боковые цепи представляют собой цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамин-аспартат и аспарагин-глутамин. Альтернативно консервативная замена представляет собой любое изменение, имеющее положительное значение в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Умеренно консервативная замена представляет собой любое изменение, имеющее неотрицательное значение в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250.When applied to polypeptides, the term actual analogy or virtually similar means that two peptide sequences, when optimally aligned, for example, using the GAP or BESTFIT computer programs with default gap opening penalties, are at least 95% identical in sequence, even more preferably at least 98% or 99% identical in sequence. Preferably, positions of residues that are not identical are distinguished by conservative amino acid substitutions. A conservative amino acid substitution is one in which an amino acid residue is replaced with another amino acid residue having a side chain (R-group) with similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity). Generally, a conservative amino acid substitution will not significantly alter the functional properties of a protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent sequence identity or degree of similarity may be adjusted upward to correct for the conservative nature of the substitution. Means for making such an adjustment are well known to those skilled in the art. See, for example, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331. Examples of groups of amino acids that have side chains with similar chemical properties include (1) aliphatic side chains: glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine; (2) aliphatic hydroxyl side chains: serine and threonine; (3) amide-containing side chains: asparagine and glutamine; (4) aromatic side chains: phenylalanine, tyrosine and tryptophan; (5) main side chains: lysine, arginine and histidine; (6) acidic side chains: aspartate and glutamate, and (7) sulfur-containing side chains are cysteine and methionine. Preferred groups of conservative amino acid substitutions are valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamine-aspartate, and asparagine-glutamine. Alternatively, a conservative substitution is any change that has a positive value in the PAM250 log-likelihood matrix disclosed in Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. A moderately conservative substitution is any change that has a non-negative value in the PAM250 log-likelihood matrix.

Сходство последовательностей в случае полипептидов, которое также называется идентичностью последовательностей, обычно измеряется с помощью компьютерной программы для анализа последовательностей. Компьютерная программа для анализа белков совмещает аналогичные последовательности с помощью показателей сходства, присваиваемых различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное средство GCG содержит программы, такие как Gap и Bestfit, которые можно использовать с параметрами по умолчанию в целях определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между тесно связанными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды от различных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, версию 6.1 GCG. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с помощью FASTA с применением параметров по умолчанию или рекомендованных параметров, программного средства в версии 6.1 GCG. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) предусматривает выравнивания и процент идентичности участков наилучшего перекрытия между запрашиваемой и найденной последовательностями (Pearson (2000), выше). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности по настоящему изобретению с базой данных, содержащей большое число последовательностей от различных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно BLASTP или TBLASTN, с применением параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.Sequence similarity in the case of polypeptides, also referred to as sequence identity, is usually measured using a sequence analysis computer program. A protein analysis computer program combines similar sequences using similarity scores assigned to various substitutions, deletions, and other modifications, including conservative amino acid substitutions. For example, the GCG tool contains programs such as Gap and Bestfit that can be used with default parameters to determine sequence homology or sequence identity between closely related polypeptides, such as homologous polypeptides from different species, or between a wild-type protein and its mutein. See, for example, version 6.1 of the GCG. Polypeptide sequences can also be compared using FASTA using the default parameters or recommended parameters, the software tool in version 6.1 of the GCG. FASTA (eg, FASTA2 and FASTA3) provides for alignments and percent identity of the regions of best overlap between a query and a found sequence (Pearson (2000), supra). Another preferred algorithm for comparing a sequence of the present invention with a database containing a large number of sequences from different organisms is the BLAST computer program, especially BLASTP or TBLASTN, using default parameters. See, for example, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Антитела к LEPR, содержащие варианты FcAnti-LEPR antibodies containing Fc variants

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR, содержащие Fc-домен, содержащий одну или несколько мутаций, которые усиливают или уменьшают связывание антител с FcRn-рецептором, например, при кислом значении рН по сравнению с нейтральным значением рН. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, содержащие мутацию в CH2- или C_H3-участке Fc-домена, где мутация(мутации) повышает(повышают) аффинность Fc-домена к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где значение рН варьирует от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут приводить к повышению времени полужизни в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например, модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В соответствии с одним вариантом осуществления модификация представляет собой модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 4ззК (например, Н433К) и 434In accordance with certain embodiments of the present invention, anti-LEPR antibodies are provided that contain an Fc domain containing one or more mutations that increase or decrease antibody binding to the FcRn receptor, for example, at acidic pH versus neutral pH. For example, the present invention provides antibodies to LEPR containing a mutation in the CH2 or C _H 3 region of the Fc domain, where the mutation(s) increases(increases) the affinity of the Fc domain for FcRn in an acidic environment (for example, in the endosome, where the value pH ranges from about 5.5 to about 6.0). Such mutations can lead to increased serum half-life when administered to an animal. Non-limiting examples of such Fc modifications include, for example, a modification at position 250 (eg, E or Q); 250 and 428 (for example, L or F); 252 (eg L/Y/F/W or T), 254 (eg S or T) and 256 (eg S/R/Q/E/D or T); or a modification at position 428 and/or 433 (eg H/L/R/S/P/Q or K) and/or 434 (eg H/F or Y); or a modification at position 250 and/or 428; or a modification at position 307 or 308 (eg, 308F, V308F) and 434. In one embodiment, the modification is a modification of 428L (eg, M428L) and 434S (eg, N434S); modification 428L, 259I (for example, V259I) and 308F (for example, V308F); modification 4zzK (for example, H433K) and 434

- 9 041859 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).- 9 041859 (for example, 434Y); modification 252, 254 and 256 (for example, 252Y, 254T and 256E); modification 250Q and 428L (for example, T250Q and M428L); and modification 307 and/or 308 (eg, 308F or 308P).

Например, настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, содержащие Fc-домен, содержащий одну или несколько пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е); 428L и 434S (например, M428L и N434S); и 433K и 434F (например, Н433К и N434F). Все возможные комбинации вышеизложенных мутаций Fc-домена и других мутаций в вариабельных доменах антитела, раскрываемых в настоящем документе, предусмотрены в объеме настоящего изобретения.For example, the present invention provides antibodies to LEPR containing an Fc domain containing one or more pairs or groups of mutations selected from the group consisting of 250Q and 248L (eg, T250Q and M248L); 252Y, 254T and 256E (eg M252Y, S254T and T256E); 428L and 434S (eg M428L and N434S); and 433K and 434F (eg H433K and N434F). All possible combinations of the above Fc domain mutations and other mutations in the variable domains of an antibody disclosed herein are contemplated within the scope of the present invention.

Антитела к LEPR по настоящему изобретению могут содержать модифицированный Fc-домен, имеющий ослабленную эффекторную функцию. Используемый в настоящем документе термин модифицированный Fc-домен, имеющий ослабленную эффекторную функцию означает любой Fc-участок иммуноглобулина, который был модифицирован, мутирован, усечен и др., по отношению к встречающемуся в природе Fc-домену дикого типа таким образом, что молекула, содержащая модифицированный Fc, характеризуется ослаблением тяжести или снижением по меньшей мере одного эффекта, выбранного из группы, состоящей из уничтожения клеток (например, ADCC и/или CDC), активации комплемента, фагоцитоза и опсонизации, по отношению к молекуле сравнения, содержащей встречающийся в природе вариант Fc-участка дикого типа. В соответствии с определенными вариантами осуществления модифицированный Fc-домен, имеющий ослабленную эффекторную функцию представляет собой Fc-домен с ослабленным или уменьшенным связыванием с Fc-рецептором (например, FcyR).Anti-LEPR antibodies of the present invention may contain a modified Fc domain having a reduced effector function. As used herein, the term modified Fc domain having reduced effector function means any Fc region of an immunoglobulin that has been modified, mutated, truncated, etc., relative to a naturally occurring wild-type Fc domain in such a way that a molecule containing a modified Fc is characterized by a reduction in the severity or reduction of at least one effect selected from the group consisting of cell killing (e.g., ADCC and/or CDC), complement activation, phagocytosis, and opsonization, relative to a reference molecule containing a naturally occurring variant Fc region of the wild type. In certain embodiments, the modified Fc domain having reduced effector function is an Fc domain with reduced or reduced Fc receptor binding (eg, FcyR).

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения модифицированный Fc-домен представляет собой вариантный Fc IgG1 или вариантный Fc IgG4, содержащий замену в шарнирной области. Например, модифицированный Fc для применения в контексте настоящего изобретения может содержать вариантный Fc IgG1, где по меньшей мере одна аминокислота шарнирной области Fc IgG1 замещена соответствующей аминокислотой из шарнирной области Fc IgG2. Альтернативно модифицированный Fc для применения в контексте настоящего изобретения может содержать вариантный Fc IgG4, где по меньшей мере одна аминокислота шарнирной области Fc IgG4 замещена соответствующей аминокислотой из шарнирной области Fc IgG2. Неограничивающие иллюстративные модифицированные Fc-участки, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, изложены, например, в публикации заявки на патент США № 2014/0243504.In accordance with certain embodiments of the present invention, the modified Fc domain is an IgG1 variant Fc or an IgG4 variant Fc containing a hinge substitution. For example, a modified Fc for use in the context of the present invention may comprise a variant IgG1 Fc wherein at least one IgG1 Fc hinge amino acid is substituted with a corresponding IgG2 Fc hinge amino acid. Alternatively, a modified Fc for use in the context of the present invention may comprise a variant IgG4 Fc wherein at least one IgG4 Fc hinge amino acid is substituted with a corresponding IgG2 Fc hinge amino acid. Non-limiting illustrative modified Fc regions that can be used in the context of the present invention are set forth, for example, in US Patent Application Publication No. 2014/0243504.

Другие модифицированные Fc-домены и модификации Fc, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают любые из модификаций, изложенных в US 2014/0171623; US 8697396; US 2014/0134162; WO 2014/043361. Способы конструирования антител или других антигенсвязывающих слитых белков, содержащих модифицированный Fc-домен, описанный в настоящем документе, известны в данной области.Other modified Fc domains and Fc modifications that can be used in the context of the present invention include any of the modifications set forth in US 2014/0171623; US 8697396; US 2014/0134162; WO 2014/043361. Methods for constructing antibodies or other antigen-binding fusion proteins containing the modified Fc domain described herein are known in the art.

Биологические характеристики антителBiological characteristics of antibodies

Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают LEPR человека и активируют передачу сигнала посредством LEPR. Такие антитела могут называться агонистические антитела. В контексте настоящего изобретения активация передачи сигнала посредством LEPR означает стимуляцию внутриклеточного эффекта, который обычно происходит в результате взаимодействия лептина с LEPR в клетках, которые экспрессируют LEPR. В соответствии с определенными вариантами осуществления активация передачи сигнала посредством LEPR означает транскрипционную активность STAT3, которую можно выявить с помощью любого способа, с помощью которого можно измерять или идентифицировать, прямо или косвенно, активность STAT3, например, с помощью меченого варианта STAT3, экспрессируемого в репортерной клеточной линии. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые активируют передачу сигнала посредством LEPR в клеточном репортерном анализе, например, при применении формата клеточного анализа, определенного в примере 7 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа. Клеточные репортерные анализы, с помощью которых выявляют активацию LEPR, такие как анализ, изложенный в примере 7 настоящего документа, могут приводить к образованию подлежащего выявлению сигнала, который может быть экспрессирован в контексте значения EC₅₀ (например, концентрации антитела, необходимой для получения полумаксимальной передачи сигнала) и/или процента максимальной передачи сигнала, наблюдаемой в присутствии лептина. В соответствии с определенными иллюстративными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR, которые активируют передачу сигнала посредством LEPR при значении EC₅₀, составляющем менее приблизительно 12,0 нМ в клеточном репортерном анализе, например, при применении формата анализа, определенного в примере 7 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа. В соответствии с определенными иллюстративными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR, которые активируют передачу сигнала посредством LEPR при максимальном проценте активации по отношению к передаче сигнала посредством лептина, составляющем более чем приблизительно 65% в клеточном репортерном анализе, например, при применении формата анализа, определенного в примере 7 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа.The present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind human LEPR and activate signaling through LEPR. Such antibodies may be referred to as agonistic antibodies. In the context of the present invention, activation of signaling by LEPR means the stimulation of an intracellular effect that normally results from the interaction of leptin with LEPR in cells that express LEPR. In certain embodiments, activation of signaling by LEPR means STAT3 transcriptional activity that can be detected by any method that can measure or identify, directly or indirectly, STAT3 activity, such as a labeled STAT3 variant expressed in a reporter cell. cell line. For example, the present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that activate signaling by LEPR in a cellular reporter assay, eg, using the cellular assay format defined in Example 7 of this document, or a substantially similar assay. Cellular reporter assays that detect LEPR activation, such as the assay set forth in Example 7 of this document, may result in a detectable signal that can be expressed in the context of an EC ₅₀ value (e.g., antibody concentration required to obtain half-maximal transmission signal) and/or the percentage of maximum signal transmission observed in the presence of leptin. In accordance with certain illustrative embodiments of the present invention, anti-LEPR antibodies are provided that activate signaling by LEPR at an EC ₅₀ value of less than about 12.0 nM in a cellular reporter assay, for example, using the assay format defined in Example 7 of this document. , or actually similar analysis. In accordance with certain exemplary embodiments of the present invention, anti-LEPR antibodies are provided that activate signaling by LEPR at a maximum percentage of activation relative to signaling by leptin of greater than about 65% in a cellular reporter assay, e.g., using an assay format, as defined in example 7 of this document, or an actually similar analysis.

Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которыеThe present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof, which

- 10 041859 связывают мономерный LEPR человека с высокой аффинностью. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, которые связывают мономерный LEPR человека (например, hLEPR.mmh, SEQ ID NO:114) с KD, составляющей менее чем приблизительно 150 нМ, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают мономерный LEPR человека при 25°С с K_D, составляющей менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 140 нМ, менее чем приблизительно 130 нМ, менее чем приблизительно 120 нМ, менее чем приблизительно 110 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 90 нМ, менее чем приблизительно 80 нМ, менее чем приблизительно 70 нМ, менее чем приблизительно 60 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 40 нМ, менее чем приблизительно 30 нМ, менее чем приблизительно 20 нМ, менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 9 нМ, менее чем приблизительно 8 нМ, менее чем приблизительно 7 нМ, менее чем приблизительно 6 нМ, менее чем приблизительно 5 нМ, менее чем приблизительно 4 нМ, менее чем приблизительно 3 нМ, менее чем приблизительно 2 нМ, менее чем приблизительно 1 нМ, менее чем приблизительно 900 пМ, менее чем приблизительно 800 пМ, менее чем приблизительно 700 пМ, менее чем приблизительно 600 пМ, менее чем приблизительно 500 пМ, менее чем приблизительно 400 пМ или менее чем приблизительно 300 пМ, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа.- 10 041859 bind monomeric human LEPR with high affinity. For example, the present invention provides anti-LEPR antibodies that bind monomeric human LEPR (e.g., hLEPR.mmh, SEQ ID NO:114) with a KD of less than about 150 nM as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C. , for example, when applying the analysis format defined in example 3 of this document, or actually similar analysis. In certain embodiments, anti-LEPR antibodies are provided that bind monomeric human LEPR at 25° C. with a K _D of less than about 150 nM, less than about 140 nM, less than about 130 nM, less than about 120 nM, less than less than about 110 nM, less than about 100 nM, less than about 90 nM, less than about 80 nM, less than about 70 nM, less than about 60 nM, less than about 50 nM, less than about 40 nM, less than about 30 nM, less than about 20 nM, less than about 10 nM, less than about 9 nM, less than about 8 nM, less than about 7 nM, less than about 6 nM, less than about 5 nM, less than about 4 nM , less than about 3 nM, less than about 2 nM, less than about 1 nM, less than about 900 pM, less than about 800 pM, less than about 700 pM, less than about 600 pM, less than about 500 pM, less than about 400 pM, or less than about 300 pM, as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format defined in Example 3 of this document, or actually similar analysis.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают мономерный LEPR человека (например, hLEPR.mmh, SEQ ID NO:114) с полупериодом диссоциации (t1/₂), составляющим более чем приблизительно 50 мин, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°С, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают мономерный LEPR человека при 25°С с t¹/₂, составляющим более чем приблизительно 50 мин, более чем приблизительно 55 мин, более чем приблизительно 60 мин, более чем приблизительно 65 мин или дольше, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа.The present invention also provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind monomeric human LEPR (e.g., hLEPR.mmh, SEQ ID NO:114) with a dissociation half-life (t1/ ₂ ) of greater than about 50 min as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the analysis format defined in example 3 of this document, or actually similar analysis. In certain embodiments, anti-LEPR antibodies are provided that bind monomeric human LEPR at 25° C. with a t ¹ / ₂ of greater than about 50 minutes, greater than about 55 minutes, greater than about 60 minutes, greater than about 65 minutes. or longer as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format defined in Example 3 of this document, or a virtually similar assay.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают димерный LEPR человека (например, hLEPR.mFc, SEQ ID NO:115) с высокой аффинностью. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, которые связывают димерный LEPR человека с K_D, составляющей менее чем приблизительно 1,5 нМ, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°С, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают димерный LEPR человека при 25°С с K_D, составляющей менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 130 нМ, менее чем приблизительно 110 нМ, менее чем приблизительно 80 нМ, менее чем приблизительно 70 нМ, менее чем приблизительно 60 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 40 нМ, менее чем приблизительно 30 нМ, менее чем приблизительно 20 нМ или менее чем приблизительно 10 нМ, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа.The present invention also provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind dimeric human LEPR (eg, hLEPR.mFc, SEQ ID NO:115) with high affinity. For example, the present invention provides anti-LEPR antibodies that bind dimeric human LEPR with a K _D of less than about 1.5 nM as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the assay format defined in example 3 of this document, or an actually similar analysis. In certain embodiments, anti-LEPR antibodies are provided that bind dimeric human LEPR at 25° C. with a K _D of less than about 150 nM, less than about 130 nM, less than about 110 nM, less than about 80 nM, less than less than about 70 nM, less than about 60 nM, less than about 50 nM, less than about 40 nM, less than about 30 nM, less than about 20 nM, or less than about 10 nM, as measured by surface plasmon resonance, for example , when applying the analysis format defined in Example 3 of this document, or a virtually similar analysis.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают димерный LEPR человека (например, hLEPR.mFc, SEQ ID NO:115) с полупериодом диссоциации (VA), составляющим более чем приблизительно 10 мин, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°С, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа. В соответствии с определенными вариантами осуществления предусмотрены антитела к LEPR, которые связывают димерный LEPR человека при 25°С с t¹/₂, составляющим более чем приблизительно 10 мин, более чем приблизительно 15 мин, более чем приблизительно 20 мин, более чем приблизительно 25 мин, более чем приблизительно 30 мин, более чем приблизительно 40 мин, более чем приблизительно 50 мин, более чем приблизительно 60 мин, более чем приблизительно 70 мин или дольше, как измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, при применении формата анализа, определенного в примере 3 настоящего документа, или фактически аналогичного анализа.The present invention also provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind dimeric human LEPR (e.g., hLEPR.mFc, SEQ ID NO:115) with a dissociation half-life (VA) of greater than about 10 minutes, as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the analysis format defined in example 3 of this document, or actually similar analysis. In certain embodiments, anti-LEPR antibodies are provided that bind dimeric human LEPR at 25° C. with a t ¹ / ₂ of greater than about 10 minutes, greater than about 15 minutes, greater than about 20 minutes, greater than about 25 minutes. , more than about 30 minutes, more than about 40 minutes, more than about 50 minutes, more than about 60 minutes, more than about 70 minutes, or longer, as measured by surface plasmon resonance, for example, using the assay format defined in example 3 of this document, or an actually similar analysis.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают LEPR в комплексе с лептином человека (LEPR в комплексе с лептином человека может также быть представлен в виде выражения лептин:LEPR). Например, настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны связываться с предварительно образованным комплексом, содержащим hLEPR и лептин человека. То есть в соответствии с определенными вариантами осуществления взаимодействие между антителами к LEPR и LEPR не поThe present invention also provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind LEPR in complex with human leptin (LEPR in complex with human leptin can also be represented as the expression leptin:LEPR). For example, the present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that are capable of binding to a preformed complex containing hLEPR and human leptin. That is, in accordance with certain embodiments, the interaction between anti-LEPR and LEPR antibodies is not

- 11 041859 давляется присутствием лептина в комплексе с LEPR; аналогично взаимодействие между лептином и LEPR в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения не подавляется присутствием антитела к LEPR. Иллюстративный формат анализа для определения того, связывается ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с LEPR в комплексе с лептином человека, изложен в примере 4 настоящего документа.- 11 041859 is suppressed by the presence of leptin in combination with LEPR; similarly, the interaction between leptin and LEPR according to this aspect of the present invention is not inhibited by the presence of an anti-LEPR antibody. An exemplary assay format for determining whether an antibody or antigen-binding fragment thereof binds to LEPR in complex with human leptin is set forth in Example 4 of this document.

Аналогично настоящее изобретение также предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают LEPR и не блокируют взаимодействие LEPR:лептин. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны связывать LEPR, тем самым приводя к образованию комплекса антитело:LEPR, где образующийся комплекс антитело:LEPR способен взаимодействовать с лептином с образованием трехчленного комплекса, содержащего антитело, LEPR и лептин. Иллюстративный формат анализа для определения того, способно ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывать LEPR так, что не блокирует или не мешает взаимодействию между LEPR и лептином, изложен в примере 5 настоящего документа.Similarly, the present invention also provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind LEPR and do not block the LEPR:leptin interaction. For example, the present invention provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that are capable of binding to LEPR, thereby leading to the formation of an antibody:LEPR complex, where the resulting antibody:LEPR complex is able to interact with leptin to form a three-membered complex containing antibody, LEPR and leptin. An exemplary assay format for determining whether an antibody or antigen-binding fragment thereof is capable of binding LEPR without blocking or interfering with the interaction between LEPR and leptin is set forth in Example 5 of this document.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают экспрессируемые на клеточной поверхности LEPR в присутствии и/или отсутствии лептина человека. Экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR означает LEPR или его участок (например, внеклеточный участок LEPR), экспрессируемый на поверхности клетки, либо естественным путем либо в сконструированной клеточной линии, таким образом, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способен связываться в молекулой LEPR. В соответствии с определенными вариантами осуществления экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR включает рекомбинантные комплексы, содержащие внеклеточный домен LEPR, соединенный с клеткой посредством метки или якоря (например, GPI-якоря, как представлено в примере 6 настоящего документа). В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предусмотрены антитела, которые способны связывать экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR в отсутствии лептина, и которые также способны связывать экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR в присутствии лептина (т.е. в условиях, когда лептин способен связываться с экспрессируемым на клеточной поверхности лептиновым рецептором). То есть в соответствии с определенными вариантами осуществления взаимодействие между антителами к LEPR и экспрессируемым на клеточной поверхности LEPR не ингибируется присутствием лептина в комплексе с экспрессируемым на клеточной поверхности LEPR. Антитела в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения способны образовывать трехчленный комплекс на поверхности клетки, содержащий антитело, экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR и лептин. Иллюстративный формат анализа для определения того, способно ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывать экспрессируемый на клеточной поверхности LEPR в присутствии или отсутствии лептина человека, изложен в примере 6 настоящего документа.The present invention also provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind cell surface expressed LEPRs in the presence and/or absence of human leptin. Cell surface expressed LEPR means LEPR or a portion thereof (e.g., the extracellular region of LEPR) expressed on the cell surface, either naturally or in an engineered cell line, such that an antibody or antigen-binding fragment thereof is capable of binding to a LEPR molecule. In certain embodiments, cell-surface expressed LEPR comprises recombinant complexes comprising an extracellular LEPR domain linked to a cell via a tag or anchor (eg, a GPI anchor, as shown in Example 6 herein). In accordance with this aspect of the present invention, antibodies are provided that are capable of binding cell surface expressed LEPR in the absence of leptin, and that are also capable of binding cell surface expressed LEPR in the presence of leptin (i.e., under conditions where leptin is able to bind to cell surface expressed LEPR). cell surface leptin receptor). That is, in accordance with certain embodiments, the interaction between anti-LEPR antibodies and cell surface expressed LEPR is not inhibited by the presence of leptin in complex with cell surface expressed LEPR. Antibodies in accordance with this aspect of the present invention are capable of forming a three-membered complex on the cell surface containing an antibody expressed on the cell surface of LEPR and leptin. An exemplary assay format for determining whether an antibody or antigen-binding fragment thereof is capable of binding cell surface-expressed LEPR in the presence or absence of human leptin is set forth in Example 6 of this document.

Антитела по настоящему изобретению могут характеризоваться одной или несколькими из вышеупомянутых биологических характеристик или любой их комбинацией. Вышеизложенный перечень биологических характеристик антител по настоящему изобретению не претендует на исчерпывающий характер. Другие биологические характеристики антител по настоящему изобретению будут очевидны специалисту в данной области из обзора настоящего раскрытия, в том числе демонстрационных примеров настоящего документа.The antibodies of the present invention may have one or more of the aforementioned biological characteristics, or any combination thereof. The above list of biological characteristics of the antibodies of the present invention does not claim to be exhaustive. Other biological characteristics of the antibodies of the present invention will be apparent to a person skilled in the art from a review of the present disclosure, including illustrative examples of this document.

Картирование эпитопа и соответствующие технологииEpitope mapping and related technologies

Настоящее изобретение также предусматривает антитела к LEPR, содержащие варианты любых из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрываемых в настоящем документе, с одной или несколькими консервативными заменами. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR с аминокислотными последовательностями HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.п. консервативными аминокислотными заменами по отношению к любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, изложенных в табл. 1 настоящего документа. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, содержащие вариантные аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR по отношению к последовательностям, изложенным в табл. 1 настоящего документа (например, содержащие консервативные аминокислотные замены), где такие вариантные антитела, тем не менее, характеризуются одной или несколькими функциями и/или свойствами иллюстративных антител к LEPR, раскрываемых в настоящем документе.The present invention also provides antibodies to LEPR containing variants of any of the HCVR, LCVR and/or CDR amino acid sequences disclosed herein with one or more conservative substitutions. For example, the present invention provides antibodies to LEPR with the amino acid sequences of HCVR, LCVR, and/or CDR, eg, 10 or less, 8 or less, 6 or less, 4 or less, and the like. conservative amino acid substitutions with respect to any of the amino acid sequences of HCVR, LCVR and/or CDR set forth in table. 1 of this document. In accordance with certain variants of implementation of the present invention provides antibodies to LEPR containing variant amino acid sequences of HCVR, LCVR and/or CDR in relation to the sequences set forth in table. 1 of this document (eg, containing conservative amino acid substitutions), where such variant antibodies nonetheless share one or more of the functions and/or properties of the exemplary anti-LEPR antibodies disclosed herein.

Внеклеточный домен LEPR человека содержит N-концевой домен гомологии цитокинового рецептора (CRH-1), иммуноглобулин-подобный домен (Ig) и второй домен CRH (CRH-2), который называется лептин-связывающий домен (LBD) (Carpenter et al. (2012) Structure 20:487-97). Кроме того, LEPR характеризуется наибольшей гомологией и аналогичным размером и организацией внеклеточных доменов с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (GCSF) и гликопротеином 130 (gp13) (Haniu et al. (1998) J Biol Chem 273(44): 28691-699).The extracellular domain of human LEPR contains an N-terminal cytokine receptor homology domain (CRH-1), an immunoglobulin-like domain (Ig), and a second CRH domain (CRH-2) called the leptin-binding domain (LBD) (Carpenter et al. ( 2012) Structure 20:487-97). In addition, LEPR is characterized by the highest homology and similar size and organization of extracellular domains with granulocyte colony stimulating factor (GCSF) and glycoprotein 130 (gp13) (Haniu et al. (1998) J Biol Chem 273(44): 28691-699).

Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим участком в вариабельном участке молекулы антитела, известным как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связыThe term epitope refers to an antigenic determinant that interacts with a specific antigen-binding site in the variable region of an antibody molecule known as a paratope. One antigen may have more than one epitope. Thus, different antibodies can bind

- 12 041859 вать различные области на антигене и могут иметь различные биологические эффекты. Эпитоп может быть либо конформационным либо линейным. Конформационный эпитоп образуется с помощью пространственно размещенных аминокислот из различных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образуемый прилегающими аминокислотными остатками в полипептидной цепи. При определенных условиях эпитоп может включать фрагменты сахаридов, фосфорильных групп или сульфонильных групп антигена.- 12 041859 different regions on the antigen and may have different biological effects. An epitope can be either conformational or linear. A conformational epitope is formed by spatially arranged amino acids from different segments of a linear polypeptide chain. A linear epitope is an epitope formed by adjacent amino acid residues in a polypeptide chain. Under certain conditions, the epitope may include fragments of saccharides, phosphoryl groups or sulfonyl groups of the antigen.

Настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR, которые взаимодействуют с одним или несколькими эпитопами, встречающимися в аминокислотах M1-D839 LEPR человека (SEQ ID NO: 113). Как изложено в примере 11, 201 пептид из LEPR человека значительно снижал захват дейтерия при связывании с антителом Н4Н16650Р2. Пептиды, соответствующие аминокислотам 162-169 (аминокислоты LYVLPEVL LEPR человека, SEQ ID NO: 113) и 170-191 (аминокислоты EDSPLVPQKGSF LEPR человека, SEQ ID NO: 113) характеризовались более медленными скоростями захвата дейтерия при связывании с Н4Н16650Р2, указывая на то, что это антитело связывает по меньшей мере два эпитопа LEPR человека, имеющих последовательности LYVLPEVL или EDSPLVPQKGSF (аминокислоты 162-169 или 170-191 соответственно SEQ ID NO: 113).The present invention provides antibodies to LEPR that interact with one or more epitopes occurring in the human LEPR amino acids M1-D839 (SEQ ID NO: 113). As described in Example 11, the 201 peptide from human LEPR significantly reduced deuterium uptake when bound to the H4H16650P2 antibody. Peptides corresponding to amino acids 162-169 (human LYVLPEVL LEPR amino acids, SEQ ID NO: 113) and 170-191 (human EDSPLVPQKGSF LEPR amino acids, SEQ ID NO: 113) had slower deuterium uptake rates when bound to H4H16650P2, indicating that that this antibody binds at least two human LEPR epitopes having the sequences LYVLPEVL or EDSPLVPQKGSF (amino acids 162-169 or 170-191 respectively SEQ ID NO: 113).

Эпитоп, с которым антитела по настоящему изобретению связываются, могут состоять из одной смежной последовательности из 3 или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) аминокислот белка LEPR. Альтернативно эпитоп может состоять из множества несмежных аминокислот (или аминокислотных последовательностей) LEPR. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эпитоп расположен на или возле лептин-связывающего домена LEPR. В соответствии с другими вариантами осуществления эпитоп расположен в участке, отдаленном от лептинсвязывающего домена LEPR, например, в месте на поверхности LEPR, в котором антитело при связывании с таким эпитопом не нарушает связывания лептина с LEPR.The epitope to which antibodies of the present invention bind may consist of one contiguous sequence of 3 or more (e.g., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20 or more) amino acids of the LEPR protein. Alternatively, an epitope may be composed of a plurality of non-contiguous amino acids (or amino acid sequences) of the LEPR. In some embodiments, the epitope is located on or near the leptin-binding domain of LEPR. In other embodiments, the epitope is located at a site remote from the leptin-binding domain of LEPR, for example, at a location on the surface of the LEPR where the antibody, when bound to such an epitope, does not interfere with leptin binding to LEPR.

Различные методики, известные специалистам в данной области, можно использовать для идентификации аминокислот в эпитопе, распознаваемом определенным антителом. Иллюстративные методики включают, например, мутационный анализ на основе сканирования аланином, пептидный блот-анализ и анализ пептидного расщепления. Кроме того, можно использовать способы, такие как вырезание эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Другой способ, который можно использовать для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым антитело взаимодействует, является водородно-дейтериевый обмен, выявляемый с помощью массспектрометрии. В общем виде способ на основе водородно-дейтериевого обмена предусматривает мечение дейтерием белка, представляющего интерес, с последующим связыванием антитела с меченым дейтерием белком. Затем комплекс белок-антитело переносят в воду в целях содействия водороднодейтериевого обмену во всех остатках, кроме остатков, защищенных антителом (которые остаются меченые дейтерием). После диссоциации антитела целевой белок подвергают расщеплению протеазами и масс-спектрометрическому анализу, тем самым выявляя меченые дейтерием остатки, которые соответствуют конкретным аминокислотам, с которыми антитело взаимодействует. См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Рентгенокристаллографический анализ антитела в комплексе со своим антигеном также можно использовать для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым антитело взаимодействует.Various techniques known to those skilled in the art can be used to identify amino acids in an epitope recognized by a particular antibody. Illustrative techniques include, for example, alanine-based mutation analysis, peptide blot analysis, and peptide cleavage analysis. In addition, techniques such as epitope excision, epitope extraction, and chemical modification of antigens can be used (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Another method that can be used to identify the amino acids in the polypeptide with which the antibody interacts is hydrogen-deuterium exchange, detected using mass spectrometry. In general, the method based on hydrogen-deuterium exchange involves labeling with deuterium a protein of interest, followed by binding of the antibody to the deuterium labeled protein. The protein-antibody complex is then transferred to water to promote hydrogen-deuterium exchange in all residues except for antibody-protected residues (which remain labeled with deuterium). After dissociation of the antibody, the target protein is subjected to protease digestion and mass spectrometric analysis, thereby identifying deuterium-labeled residues that correspond to the specific amino acids with which the antibody interacts. See, for example, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. X-ray crystallographic analysis of an antibody in complex with its antigen can also be used to identify the amino acids in the polypeptide with which the antibody interacts.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает антитела к LEPR, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и любое из конкретных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе (например, антитела, содержащие любые из аминокислотных последовательностей, изложенных в табл. 1 настоящего документа). Аналогично настоящее изобретение также предусматривает антитела к LEPR, которые конкурируют за связывание с LEPR любого из конкретных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе (например, антитела, содержащие любые из аминокислотных последовательностей, изложенных в табл. 1 настоящего документа).The present invention further provides anti-LEPR antibodies that bind to the same epitope as any of the specific exemplary antibodies described herein (eg, antibodies comprising any of the amino acid sequences set forth in Table 1 of this document). Similarly, the present invention also provides anti-LEPR antibodies that compete for binding to LEPR of any of the specific exemplary antibodies described herein (eg, antibodies comprising any of the amino acid sequences set forth in Table 1 of this document).

Можно определить, связывается ли антитело с одним и тем же эпитопом, что и эталонное антитело к LEPR, или конкурирует за связывание с ним, с помощью стандартных способов, известных в данной области и приведенных в качестве примера в настоящем документе. Например, для определения того, связывается ли исследуемое антитело с тем же самым эпитопом, что и эталонное антитело к LEPR по настоящему изобретению, эталонное антитело связывают с белком LEPR. Затем оценивают способность исследуемого антитела связываться с молекулой LEPR. Если исследуемое антитело способно связываться с LEPR после насыщающего связывания с эталонным антителом к LEPR, можно сделать вывод, что исследуемое антитело связывается с другим эпитопом по сравнению с эталонным антителом к LEPR. С другой стороны, если исследуемое антитело не способно связываться с молекулой LEPR после насыщающего связывания с эталонным антителом к LEPR, то исследуемое антитело может связываться с тем же самым эпитопом, что и эпитоп, связываемый эталонным антителом к LEPR по настоящему изобретению. Дополнительные стандартные экспериментальные работы (например, анализ пептидных мутаций и связывания) можно выполнять для подтверждения того, происходит ли наблюдаемое отсутствие связывания исследуемого антитела по сути благодаря связыванию с тем же самым эпитопом, что и эталонное антитело, или пространственное блокирование (или другое явление) является причиной отсутствия наWhether an antibody binds to or competes for binding to the same epitope as a reference LEPR antibody can be determined using standard methods known in the art and exemplified herein. For example, to determine if an antibody of interest binds to the same epitope as a reference anti-LEPR antibody of the present invention, the reference antibody is bound to a LEPR protein. The ability of the test antibody to bind to the LEPR molecule is then evaluated. If the test antibody is able to bind to LEPR after saturation binding to a reference anti-LEPR antibody, it can be concluded that the test antibody binds to a different epitope compared to the reference anti-LEPR antibody. On the other hand, if the test antibody is unable to bind to the LEPR molecule after saturation binding to the reference anti-LEPR antibody, then the test antibody can bind to the same epitope as the epitope bound by the reference anti-LEPR antibody of the present invention. Additional routine experimental work (e.g., peptide mutation and binding assays) can be performed to confirm whether the observed lack of binding of the antibody of interest is essentially due to binding to the same epitope as the reference antibody, or spatial blocking (or other phenomenon) is reason for the absence

- 13 041859 блюдаемого связывания. Эксперименты этого рода можно выполнять с помощью ELISA, RIA, Biacore, проточной цитометрии или другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступных в данной области. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения два антитела связываются с тем же самым (или перекрывающимся) эпитопом, если, например, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратное превышение одного антитела ингибирует связывание другого на по меньшей мере 50%, но предпочтительно 75, 90 или даже 99%, как измеряется в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Альтернативно два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если практически все аминокислотные мутации в антигене, которые ослабляют или устраняют связывание одного антитела, снижают или устраняют связывание другого. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если только подсовокупность аминокислотных мутаций, которые ослабляют или устраняют связывание одного антитела, ослабляют или устраняют связывание другого.- 13 041859 observed binding. Experiments of this kind can be performed using ELISA, RIA, Biacore, flow cytometry, or other quantitative or qualitative antibody binding assays available in the art. In accordance with certain embodiments of the present invention, two antibodies bind to the same (or overlapping) epitope if, for example, 1-, 5-, 10-, 20-, or 100-fold excess of one antibody inhibits the binding of the other by at least 50%, but preferably 75, 90 or even 99% as measured in a competition binding assay (see, for example, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternatively, two antibodies bind to the same epitope if substantially all amino acid mutations in the antigen that reduce or eliminate the binding of one antibody reduce or eliminate the binding of the other. Two antibodies have overlapping epitopes unless a subset of amino acid mutations that impair or abolish the binding of one antibody impair or abolish the binding of the other.

Для определения того, конкурирует ли антитело за связывание (или конкурирует ли перекрестно за связывание) с эталонным антителом к LEPR, выполняют вышеописанную методику связывания в двух ориентациях. В первой ориентации эталонное антитело связывают с белком LEPR в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания исследуемого антитела с молекулой LEPR. Во второй ориентации исследуемое антитело связывают с молекулой LEPR в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания эталонного антитела с молекулой LEPR. Если в обеих ориентациях лишь первое (связывающее) антитело способно связываться с молекулой LEPR, то делают вывод, что исследуемое антитело и эталонное антитело конкурируют за связывание с LEPR. Как будет понятно специалисту в данной области, антитело, которое конкурирует за связывание с эталонным антителом, может необязательно связываться с одним и тем же эпитопом, что и эталонное антитело, однако может пространственно блокировать эталонное антитело в результате связывания перекрывающегося или прилегающего эпитопа.To determine if an antibody competes for binding (or cross-competes for binding) with a reference anti-LEPR antibody, the binding procedure described above is performed in two orientations. In the first orientation, the reference antibody is bound to the LEPR protein under saturating conditions, followed by evaluation of the binding of the test antibody to the LEPR molecule. In the second orientation, the test antibody is bound to the LEPR molecule under saturating conditions, followed by evaluation of the binding of the reference antibody to the LEPR molecule. If in both orientations only the first (binding) antibody is able to bind to the LEPR molecule, then it is concluded that the test antibody and the reference antibody compete for binding to LEPR. As one of skill in the art will appreciate, an antibody that competes for binding with a reference antibody may optionally bind to the same epitope as the reference antibody, but may spatially block the reference antibody by binding to an overlapping or contiguous epitope.

Получение человеческих антителObtaining human antibodies

Антитела к LEPR по настоящему изобретению могут быть полностью человеческими антителами. Способы получения моноклональных антител, в том числе полностью человеческих моноклональных антител, известны в данной области. Любые такие известные способы можно использовать в контексте настоящего изобретения для создания человеческих антител, которые специфически связываются с LEPR.Anti-LEPR antibodies of the present invention may be fully human antibodies. Methods for making monoclonal antibodies, including fully human monoclonal antibodies, are known in the art. Any such known methods can be used in the context of the present invention to generate human antibodies that specifically bind to LEPR.

Например, с помощью технологии VELOCIMMUNE™ или любого другого аналогичного известного способа получения полностью человеческих моноклональных антител химерные антитела к LEPR с высокой аффинностью изначально выделяют из человеческого вариабельного участка и мышиного константного участка. Как и в экспериментальном разделе далее, антитела характеризуют и выбирают в отношении желательных характеристик, в том числе аффинности, блокирующей активности по отношению к лигандам, избирательности, эпитопа и др. При необходимости мышиные константные участки замещают желательным человеческим константным участком, например, IgG1 или IgG4 дикого типа или модифицированными IgG1 или IgG4, с получением полностью человеческого антитела к LEPR. В то время как выбранный константный участок может меняться в зависимости от конкретного применения, в вариабельном участке сохраняются характеристики связывания с антигеном с высокой аффинностью или специфичности мишеней. В определенных примерах полностью человеческие антитела к LEPR выделяют непосредственно из антиген-позитивных В-клеток.For example, using VELOCIMMUNE™ technology or any other similar known method for producing fully human monoclonal antibodies, high affinity chimeric anti-LEPR antibodies are initially isolated from a human variable region and a murine constant region. As in the experimental section below, antibodies are characterized and selected for desirable characteristics, including affinity, ligand blocking activity, selectivity, epitope, and others. wild-type or modified IgG1 or IgG4 to produce a fully human anti-LEPR antibody. While the constant region chosen may vary depending on the particular application, the variable region retains high affinity antigen binding or target specificity characteristics. In certain instances, fully human anti-LEPR antibodies are isolated directly from antigen-positive B cells.

БиоэквивалентыBioequivalents

Антитела к LEPR и фрагменты антител по настоящему изобретению охватывают белки, имеющие аминокислотные последовательности, которые отличаются от таковых описанных антител, однако которые сохраняют способность связывать LEPR человека. Такие вариантные антитела и фрагменты антител содержат одно или несколько присоединений, делеций или замещений аминокислот по сравнению с родительской последовательностью, однако характеризуются биологической активностью, которая фактически эквивалентна таковой желаемых антител. Аналогично последовательности ДНК по настоящему изобретению, кодирующие антитело к LEPR, охватывают последовательности, которые содержат одно или несколько присоединений, делеций или замещений аминокислот по сравнению с раскрываемой последовательностью, однако которые кодируют антитело к LEPR или фрагмент антитела, который фактически эквивалентен антителу к LEPR или фрагменту антитела по настоящему изобретению. Примеры таких вариантных аминокислот и последовательностей ДНК раскрыты выше.Anti-LEPR antibodies and antibody fragments of the present invention encompass proteins having amino acid sequences that differ from those of the described antibodies, but which retain the ability to bind human LEPR. Such variant antibodies and antibody fragments contain one or more additions, deletions, or substitutions of amino acids compared to the parent sequence, yet have biological activity that is substantially equivalent to that of the desired antibodies. Similarly, the DNA sequences of the present invention encoding an anti-LEPR antibody encompass sequences that contain one or more amino acid additions, deletions, or substitutions compared to the disclosed sequence, but which encode an anti-LEPR antibody or antibody fragment that is substantially equivalent to an anti-LEPR antibody or fragment. antibodies of the present invention. Examples of such variant amino acids and DNA sequences are disclosed above.

Два антигенсвязывающих белка или антитела считаются биоэквивалентными, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, скорость и степень всасывания которых не отличается значимой разницей при введении в той же самой молярной дозе в аналогичных экспериментальных условиях, либо в виде однократной дозы либо многократной дозы. Некоторые антитела будут считаться эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они являются эквивалентными по степени всасывания, но не по скорости всасывания, и, кроме того, могут считаться биоэквивалентными, поскольку такие различия в скорости всасывания являются целенаправленными и отражаются в маркировке, не являются необходимыми для достижения эффективных концентраций лекарственных средств в организме, например, при хроническом применении, и считаются неTwo antigen-binding proteins or antibodies are considered to be bioequivalent if, for example, they are pharmaceutical equivalents or pharmaceutical alternatives, the rate and extent of absorption of which does not differ significantly when administered at the same molar dose under similar experimental conditions, either as a single dose or a multiple dose . Some antibodies will be considered equivalents or pharmaceutical alternatives if they are equivalent in absorption but not in absorption rate, and in addition may be considered bioequivalent because such differences in absorption rate are targeted and reflected in the labeling, are not necessary to achieve effective concentrations of drugs in the body, for example, with chronic use, and are not considered

- 14 041859 значимыми в медицинском отношении для определенного изучаемого лекарственного продукта.- 14 041859 medically significant for a particular investigational medicinal product.

В соответствии с одним вариантом осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если отсутствуют клинически значимые различия в их безопасности, чистоте и активности.In one embodiment, two antigen-binding proteins are bioequivalent if there are no clinically significant differences in their safety, purity, and potency.

В соответствии с одним вариантом осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентыми, если лечение пациента можно переключать один или несколько раз между эталонным продуктом и биологическим продуктом без предполагаемого повышения риска нежелательных эффектов, в том числе клинически значимого изменения иммуногенности или сниженной эффективности, по сравнению с непрерывной терапией без такого переключения.In one embodiment, two antigen-binding proteins are bioequivalent if the patient's treatment can be switched one or more times between a reference product and a biological product without an expected increase in the risk of adverse effects, including a clinically significant change in immunogenicity or reduced efficacy, compared to continuous therapy. without such a switch.

В соответствии с одним вариантом осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если они оба действуют в соответствии с общим механизмом или механизмами действия для условия или условий применения до той степени, когда такие механизмы известны.In one embodiment, two antigen-binding proteins are bioequivalent if they both act according to a common mechanism or mechanisms of action for the condition or conditions of use, to the extent that such mechanisms are known.

Биоэквивалентность можно продемонстрировать с помощью способов in vivo и in vitro. Показатели биоэквивалентности включают, например, (а) исследование in vivo у человека или других млекопитающих, в котором концентрация антитела или его метаболитов измеряется в крови, плазме, сыворотке или другой биологической жидкости как функция от времени; (b) исследование in vitro, которое коррелировало с данными по биоэквивалентности у человека in vivo и является надежным прогнозом таковых; (с) исследование in vivo у человека или других млекопитающих, в котором подходящий острый фармакологический эффект антитела (или его мишени) измеряется как функция от времени; и (d) строго контролируемое клиническое исследование, в котором устанавливают безопасность, эффективность и биодоступность или биоэквивалентность антитела.Bioequivalence can be demonstrated using in vivo and in vitro methods. Indicators of bioequivalence include, for example, (a) an in vivo study in humans or other mammals, in which the concentration of an antibody or its metabolites is measured in blood, plasma, serum, or other body fluid as a function of time; (b) an in vitro study that has been correlated with in vivo human bioequivalence data and is a reliable predictor of such; (c) an in vivo study in humans or other mammals, in which the appropriate acute pharmacological effect of the antibody (or its target) is measured as a function of time; and (d) a strictly controlled clinical trial that establishes the safety, efficacy and bioavailability or bioequivalence of the antibody.

Биоэквивалентные варианты антител к LEPR по настоящему изобретению могут быть сконструированы, например, в результате выполнения различных замен остатков или последовательностей или удаления концевых или внутренних остатков или последовательностей, не являющихся необходимыми для биологической активности. Например, остатки цистеина, не являющиеся необходимыми для биологической активности, можно удалить или заменить другими аминокислотами в целях предупреждения образования необязательных или ошибочных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела могут включать варианты антител к LEPR, содержащие аминокислотные изменения, которые модифицируют характеристики гликозилирования антител, например, мутации, которые устраняют или удаляют гликозирование.Bioequivalent variants of the anti-LEPR antibodies of the present invention can be constructed, for example, by making various residue or sequence substitutions or deleting terminal or internal residues or sequences not necessary for biological activity. For example, cysteine residues not essential for biological activity can be removed or replaced with other amino acids to prevent the formation of unnecessary or erroneous intramolecular disulfide bridges during renaturation. In other contexts, bioequivalent antibodies may include anti-LEPR antibody variants containing amino acid changes that modify the glycosylation characteristics of the antibodies, such as mutations that abrogate or remove glycosylation.

Видовая избирательность и видовая перекрестная реактивность Настоящее изобретение в соответствии с определенными вариантами осуществления предусматривает антитела к LEPR, которые связываются с LEPR человека, но не с LEPR от других видов. Настоящее изобретение также предусматривает антитела к LEPR, которые связываются с LEPR человека и с LEPR от одного или нескольких отличных от человека видов. Например, антитела к LEPR по настоящему изобретению могут связываться с LEPR человека и могут связываться или не связываться, в зависимости от ситуации, с одним или несколькими из LEPR мыши, крысы, морской свинки, хомяка, песчанки, свиньи, кошки, собаки, кролика, козы, овцы, коровы, лошади, верблюда, макака-крабоеда, игрунки, макака резус или шимпанзе. В соответствии с определенными иллюстративными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела к LEPR, которые специфически связывают LEPR человека и LEPR макака-крабоеда (например, Масаса fascicularis). Другие антитела к LEPR по настоящему изобретению связывают LEPR человека, но не связываются или только незначительно связываются с LEPR макака-крабоеда.Species selectivity and species cross-reactivity The present invention, in accordance with certain embodiments, provides anti-LEPR antibodies that bind to human LEPR but not to LEPR from other species. The present invention also provides anti-LEPR antibodies that bind to human LEPR and to LEPR from one or more non-human species. For example, the anti-LEPR antibodies of the present invention may bind to human LEPR and may or may not bind, as appropriate, to one or more of the mouse, rat, guinea pig, hamster, gerbil, porcine, cat, dog, rabbit, goats, sheep, cows, horses, camels, crabeater monkeys, marmosets, rhesus monkeys or chimpanzees. In accordance with certain exemplary embodiments of the present invention, anti-LEPR antibodies are provided that specifically bind human LEPR and cynomolgus monkey (eg, Macaca fascicularis) LEPR. Other anti-LEPR antibodies of the present invention bind human LEPR but do not bind or only slightly bind to cynomolgus monkey LEPR.

Мультиспецифические антителаMultispecific antibodies

Антитела по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифические антитела могут быть специфическими по отношению к разным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенспецифические домены, специфические по отношению к более чем одному целевому полипептиду. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Антитела к LEPR по настоящему изобретению могут быть связаны с или коэкспрессироваться вместе с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, с помощью химической связи, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иного) с одним или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, с образованием биспецифического или мультиспецифического антитела со второй связывающей специфичностью.The antibodies of the present invention may be monospecific or multispecific (eg, bispecific). Multispecific antibodies may be specific for different epitopes of the same target polypeptide or may contain antigen-specific domains specific for more than one target polypeptide. See, for example, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Anti-LEPR antibodies of the present invention may be linked to or co-expressed with another functional molecule, such as another peptide or protein. For example, an antibody or antibody fragment may be operably linked (e.g., by chemical bonding, genetic fusion, non-covalent association, or otherwise) to one or more other molecular entities, such as another antibody or antibody fragment, to form a bispecific or multispecific antibody with a second binding specificity.

Настоящее изобретение предусматривает биспецифические антитела, где одно плечо иммуноглобулина связывает LEPR человека, а другое плечо иммуноглобулина является специфическим по отношению к второму антигену. LEPR-связывающее плечо может содержать любую из аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR или CDR, изложенных в табл. 1 настоящего документа.The present invention provides for bispecific antibodies wherein one immunoglobulin arm binds human LEPR and the other immunoglobulin arm is specific for a second antigen. The LEPR binding arm may comprise any of the HCVR/LCVR or CDR amino acid sequences set forth in Table 1. 1 of this document.

Иллюстративный формат биспецифического антитела, которое можно использовать в контексте настоящего изобретения предусматривает применение первого C_H3-домена иммуноглобулина (Ig) и второго C_H3-домена Ig, где первый и второй C_H3-домены Ig отличаются друг от друга по меньшей мере одной аминокислотой, и где по меньшей мере отличие в одном аминокислотном остатке ослабляет связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом, не имеющим отAn exemplary format for a bispecific antibody that can be used in the context of the present invention provides for the use of a first C _H 3 immunoglobulin (Ig) domain and a second C _H 3 Ig domain, wherein the first and second Ig C _H 3 domains differ from each other by at least one amino acid, and where at least one amino acid residue difference weakens the binding of the bispecific antibody to protein A compared to a bispecific antibody that does not have

- 15 041859 личия в аминокислотном остатке. В соответствии с одним вариантом осуществления первый С_н3-домен Ig связывает белок А и второй C_H3-домен Ig содержит мутацию, которая ослабляет или устраняет связывание белка А, такую как модификация H95R (в соответствии с нумерацией экзонов IMGT; H435R - в соответствии с нумерацией EU). Второй CH3 может дополнительно содержать модификацию Y96F (в соответствии с IMGT; Y436F - в соответствии с EU). Дополнительные модификации, которые можно обнаружить во втором CH3, включают D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (в соответствии с IMGT: D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I - в соответствии с EU) в случае антител IgG1; N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I - в соответствии с EU) в случае антител IgG2; и Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (в соответствии с IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I - в соответствии с EU) в случае антител IgG4. Вариации формата биспецифических антител, описанных выше, предусмотрены объемом настоящего изобретения.- 15 041859 lychee in the amino acid residue. In one embodiment, the first Ig _C H 3 domain binds protein A and the second Ig C _H 3 domain contains a mutation that reduces or abolishes protein A binding, such as an H95R modification (according to IMGT exon numbering; H435R in according to the EU numbering). The second CH3 may additionally contain the modification Y96F (in accordance with IMGT; Y436F in accordance with EU). Additional modifications that can be found in the second CH3 include D16E, L18M, N44S, K52N, V57M and V82I (according to IMGT: D356E, L358M, N384S, K392N, V397M and V422I - according to EU) in the case of IgG1 antibodies; N44S, K52N and V82I (IMGT; N384S, K392N and V422I - according to EU) in the case of IgG2 antibodies; and Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q and V82I (as per IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q and V422I as per EU) for IgG4 antibodies. Variations in the format of the bispecific antibodies described above are within the scope of the present invention.

Другие иллюстративные биспецифические форматы, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, включают без ограничения, например, биспецифические форматы на основе scFv или биспецифические форматы на основе диател, слияния IgG-scFv, двойной вариабельный домен (DVD)-Ig, квадрому, выступы-во-впадины, обычную легкую цепь (например, обычную легкую цепь с выступами-во-впадины и т.п.), CrossMab, CrossFab, (SEED)-тело, лейциновую застежку, Duobody, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG двойного действия и Mab² биспецифические форматы (см., например, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, и источники, упоминаемые в настоящем документе, для изучения вышеизложенных форматов). Биспецифические антитела также можно сконструировать с помощью конъюгации пептидов и нуклеиновых кислот, например, где не встречающиеся в природе аминокислоты с ортогональной химической реакционной способностью применяют для получения сайт-специфических конъюгатов антитело-нуклеотид, которые затем самособираются в мультимерные комплексы с определенным составом, валентностью и геометрией (См., например, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).Other illustrative bispecific formats that can be used in the context of the present invention include, without limitation, for example, scFv-based bispecific formats or diabody-based bispecific formats, IgG-scFv fusions, dual variable domain (DVD)-Ig, quadroma, overhangs-in -cavities, conventional light chain (e.g., conventional light chain with ledge-in-cavities, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)-body, leucine zipper, Duobody, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG dual action and Mab ² bispecific formats (see, for example, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, and references cited herein for an examination of the above formats). Bispecific antibodies can also be constructed using peptide-nucleic acid conjugation, for example, where non-naturally occurring amino acids with orthogonal chemical reactivity are used to generate site-specific antibody-nucleotide conjugates that then self-assemble into multimeric complexes with specific composition, valency, and geometry. (See, for example, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).

Терапевтический состав и введениеTherapeutic composition and administration

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, содержащие антитела к LEPR или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению составляют с подходящими носителями, вспомогательными средствами и другими средствами, которые обеспечивают улучшенный перенос, доставку, переносимость и тому подобное. Множество подходящих составов можно обнаружить в справочнике, известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воска, масла, липиды, липидсодержащие (катионные или анионные) пузырьки (такие как LIPOFECTIN™, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), конъюгаты ДНК, безводные абсорбционные пасты, эмульсии типа масло в воде и вода в масле, эмульсии карбовакс (полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами), полужидкие гели и полужидкие смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.The present invention provides pharmaceutical compositions containing antibodies to LEPR or their antigennegative fragments of the present invention. Pharmaceutical compositions of the present invention are formulated with suitable carriers, adjuvants, and other agents that provide improved transfer, delivery, tolerability, and the like. Many suitable formulations can be found in the reference book known to all pharmaceutical chemists: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. These formulations include, for example, powders, pastes, ointments, jellies, waxes, oils, lipids, lipid-containing (cationic or anionic) vesicles (such as LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA conjugates, anhydrous absorption pastes, emulsions such as oil in water and water in oil, carbovax emulsions (polyethylene glycols of various molecular weights), semi-liquid gels and semi-liquid mixtures containing carbovax. See also Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

Доза антитела, вводимого пациенту, может варьировать в зависимости от возраста и размерных характеристик пациента, целевого заболевания, состояний, пути введения и тому подобного. Предпочтительную дозу обычно рассчитывают в соответствии с весом тела или площадью поверхности тела. В случае взрослого пациента может быть предпочтительным внутривенное введение антитела по настоящему изобретению, обычно в однократной дозе, составляющей от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг массы тела, более предпочтительно от приблизительно 0,02 до 7, от приблизительно 0,03 до приблизительно 5 или от приблизительно 0,05 до приблизительно 3 мг/кг массы тела. В зависимости от тяжести состояния частоту и продолжительность лечения можно корректировать. Эффективные дозы и схемы введения антител к LEPR могут быть определены эмпирически; например, динамику состояния пациента можно наблюдать с помощью периодической оценки и, соответственно, можно корректировать дозу. Кроме того, межвидовое приведение доз можно выполнять с помощью хорошо известных в данной области способов (например, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).The dose of antibody administered to a patient may vary depending on the age and size characteristics of the patient, the target disease, conditions, route of administration, and the like. The preferred dose is usually calculated according to body weight or body surface area. In the case of an adult patient, intravenous administration of an antibody of the present invention may be preferred, typically in a single dose of from about 0.01 to about 20 mg/kg body weight, more preferably from about 0.02 to 7, from about 0.03 to about 5 or about 0.05 to about 3 mg/kg body weight. Depending on the severity of the condition, the frequency and duration of treatment can be adjusted. Effective doses and regimens for administering anti-LEPR antibodies can be determined empirically; for example, the evolution of a patient's condition can be monitored by periodic evaluation and the dose can be adjusted accordingly. In addition, cross-species dosing can be performed using methods well known in the art (eg, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

Известны различные системы доставки и их можно применять для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению, например, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения предусматривают без ограничения внутрикожные, внутримышечные, интраперитонеальные, внутривенные, подкожные, интраназальные, эпидуральные и пероральные пути. Композицию можно вводить любым удобным способом, например, с помощью инфузии или болюсной инъекции, всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые покровы (например, слизистую ротовой полости, слизистую прямой кишки и кишечника и др.) и можно вводить совместно с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или локальным.Various delivery systems are known and can be used to administer the pharmaceutical composition of the present invention, such as encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing mutant viruses, receptor-mediated endocytosis (see, for example, Wu et al., 1987, J Biol Chem 262:4429-4432). Routes of administration include, without limitation, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The composition can be administered by any convenient method, for example, by infusion or bolus injection, absorption through the epithelial or mucocutaneous integument (for example, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.) and can be administered together with other biologically active agents. The introduction can be systemic or local.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставить подкожно или внутривенно с помощью стандартной иглы и шприца. Кроме того, в случае подкожной доставки при доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению широко применяется шприц-ручка.The pharmaceutical composition of the present invention can be delivered subcutaneously or intravenously using a standard needle and syringe. In addition, in the case of subcutaneous delivery, a pen is widely used to deliver the pharmaceutical composition of the present invention.

- 16 041859- 16 041859

Такой шприц-ручка может быть многоразовым и одноразовым. В многоразовом шприце-ручке, как правило, используется заменяемый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. После того, как все из фармацевтической композиции в картридже было введено и картридж стал пустым, картридж можно легко утилизировать и заменить новым картриджем, который содержит фармацевтическую композицию. Затем шприц-ручку можно использовать повторно. В одноразовом шприце-ручке заменяемый картридж отсутствует. Вместо этого одноразовый шприц-ручку выпускают предварительно наполненным фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре в изделии. После того, как резервуар освобождается от фармацевтической композиции, все изделие утилизируют.Such a syringe pen can be reusable and disposable. A reusable pen typically uses a replaceable cartridge that contains a pharmaceutical composition. Once all of the pharmaceutical composition in the cartridge has been entered and the cartridge is empty, the cartridge can be easily disposed of and replaced with a new cartridge that contains the pharmaceutical composition. The pen can then be reused. There is no replaceable cartridge in the disposable syringe pen. Instead, the disposable pen is delivered pre-filled with a pharmaceutical composition contained in a reservoir in the article. Once the reservoir is emptied of the pharmaceutical composition, the entire product is discarded.

Многочисленные многоразовые шприцы-ручки и изделия для автоинжекторной доставки применяются при подкожной доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Примеры включают без ограничения шприц-ручку AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Вудсток, Великобритания), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Бургдорф, Швейцария), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Индианаполис, Индиана), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Франклин-Лэйкс, Нью-Джерси), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Франкфурт, Германия), не говоря уже о других. Примеры многоразовых шприцев-ручек, применяемых при подкожном введении фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают без ограничения шприц-ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинжектор SURECLICKTM (Amgen, Таузанд-Окс, Калифорния), PENLETTM (Haselmeier, Штутгарт, Германия), EPIPEN (Dey, L.P.) и шприц-ручку HUMIRATM (Abbott Labs, Эббот-Парк, Иллинойс), не говоря уже о других.Numerous reusable pens and autoinjector delivery devices are used in the subcutaneous delivery of the pharmaceutical composition of the present invention. Examples include, without limitation, AUTOPEN™ pen (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burgdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, syringe - HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, Indiana), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), syringe pen BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ and OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), to name a few. Examples of reusable pens for use in the subcutaneous administration of the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to SOLOSTAR™ pen (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) and KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ autoinjector (Amgen, Towsand Oaks, CA), PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.) and the HUMIRATM pen (Abbott Labs, Abbott Park, Illinois), to name a few.

В определенных ситуациях фармацевтическую композицию можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В соответствии с одним вариантом осуществления можно использовать насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Согласно другому варианту осуществления можно использовать полимерные материалы; см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Согласно еще одному варианту осуществления систему с контролируемым высвобождением можно поместить вблизи от мишени композиции, при этом требуется лишь часть системной дозы (см., например, Goodson, 1984, в Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Другие системы с контролируемым высвобождением описаны в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.In certain situations, the pharmaceutical composition may be delivered in a controlled release system. According to one embodiment, a pump may be used (see Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). According to another embodiment, polymeric materials can be used; see Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. In another embodiment, the controlled release system can be placed close to the target of the composition, requiring only a fraction of the systemic dose (see, for example, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115- 138). Other controlled release systems are reviewed by Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Инъекционные формы могут включать лекарственные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельниц и т.п. Эти инъекционные формы можно получать общеизвестными способами. Например, инъекционные формы можно получать, например, растворением, суспендированием или эмульгированием антитела или его соли, описанных выше, в стерильной водной среде или масляной среде, обычно используемой для инъекций. Водной средой для инъекций, является, например, физиологический раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные средства и т.п., например, которые можно использовать в комбинации с подходящим растворителем, таким как спирт (например, этанол), полиспирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80, НСО-50 (полиоксиэтиленовый (50 моль) аддукт гидрогенизированного касторового масла)) и т.п. В качестве масляной среды используют, например, кунжутное масло, арахисовое масло и т.п., которые можно использовать в комбинации с растворителем, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.п. Приготовленную таким способом инъекцию предпочтительно заполняют в подходящую ампулу.Injectable forms may include intravenous, subcutaneous, intradermal and intramuscular injection dosage forms, droppers, and the like. These injection forms can be obtained by well-known methods. For example, injectable forms can be prepared, for example, by dissolving, suspending, or emulsifying an antibody or salt thereof, as described above, in a sterile aqueous or oily medium commonly used for injection. An aqueous injection medium is, for example, saline, an isotonic solution containing glucose and other excipients, and the like, for example, which can be used in combination with a suitable solvent such as an alcohol (for example, ethanol), a polyalcohol (for example, , propylene glycol, polyethylene glycol), a non-ionic surfactant (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) hydrogenated castor oil adduct)) and the like. As the oil medium, for example, sesame oil, peanut oil and the like are used, which can be used in combination with a solvent such as benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like. The injection thus prepared is preferably filled into a suitable ampoule.

Предпочтительно фармацевтические композиции для перорального или парентерального применения, описанные выше, получают в лекарственных формах в унифицированной дозе, подходящей для соответствия дозы активных компонентов. Такие лекарственные формы в унифицированной дозе включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и др. Вышеупомянутое антитело содержится, как правило, в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 500 мкг на лекарственную форму; особенно в форме инъекции предпочтительно, чтобы вышеуказанное антитело содержалось в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг и от приблизительно 10 до приблизительно 250 мг - в случае других лекарственных форм.Preferably, the pharmaceutical compositions for oral or parenteral administration described above are formulated into unit dosage forms suitable to match the dosage of the active ingredients. Such unit dosage forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, and the like. especially in the form of an injection, it is preferred that the above antibody is present in an amount of from about 5 to about 100 mg, and from about 10 to about 250 mg in the case of other dosage forms.

Терапевтические применения антителTherapeutic applications of antibodies

Настоящее изобретение предусматривает способы, предусматривающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, содержащей антитело к LEPR (например, антитело к LEPR, содержащее любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, изложенных в табл. 1 настоящего документа). Терапевтическая композиция может содержать любое из антител к LEPR, раскрываемых в настоящем документе, или их антигенсвязывающих фрагментов, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.The present invention provides methods comprising administering to a subject in need thereof a therapeutic composition comprising an anti-LEPR antibody (eg, an anti-LEPR antibody comprising any of the HCVR/LCVR or CDR sequences set forth in Table 1 of this document). The therapeutic composition may contain any of the LEPR antibodies disclosed herein, or antigen-binding fragments thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Антитела по настоящему изобретению применимы, в числе прочего, для лечения, предупреждения и/или облегчения любого заболевания или нарушения, ассоциированного с или опосредованного недосThe antibodies of the present invention are useful, inter alia, for the treatment, prevention and/or amelioration of any disease or disorder associated with or mediated by malnutrition.

- 17 041859 таточностью лептина, устойчивостью к лептину, гиполептинемией или иным образом подлежащего лечению в результате стимуляции или активации передачи сигнала посредством LEPR или имитацией природной активности лептина in vitro или in vivo. Например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению применимы для лечения липодистрофических состояний. Иллюстративные липодистрофические состояния, которые подлежат лечению с помощью антител и антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, включают, например, врожденную генерализованную липодистрофию, приобретенную генерализованную липодистрофию, семейную парциальную липодистрофию, приобретенную парциальную липодистрофию, центрифужную абдоминальную липодистрофию, кольцевидную липоатрофию, локализованную липодистрофию и ВИЧ-ассоциированную липодистрофию.- 17 041859 leptin deficiency, leptin resistance, hypoleptinemia or otherwise being treated as a result of stimulation or activation of signaling by LEPR or mimicking natural leptin activity in vitro or in vivo. For example, the antibodies and antigen-binding fragments thereof of the present invention are useful in the treatment of lipodystrophic conditions. Exemplary lipodystrophy conditions to be treated with the antibodies and antigen-binding fragments of the present invention include, for example, congenital generalized lipodystrophy, acquired generalized lipodystrophy, familial partial lipodystrophy, acquired partial lipodystrophy, centrifugal abdominal lipodystrophy, annular lipodystrophy, localized lipodystrophy, and HIV-associated lipodystrophy.

Настоящее изобретение также предусматривает антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, которые применимы для восстановления передачи сигнала посредством лептина к клеткам, тканям и органам, экспрессирующим одну или несколько мутаций LEPR, ассоциированных с ожирением. Например, были идентифицированы определенные мутанты LEPR, которые характеризуются отсутствием или ослабленной передачей сигнала в присутствии лептина и ассоциированы с ожирением и связанными нарушениями. Используемый в настоящем документе мутант LEPR, который характеризуется отсутствием передачи сигнала в присутствии лептина, называется мутантом LEPR с дефектом передачи сигнала. Иллюстративной мутацией LEPR с дефектом передачи сигнала является LEPR-A409E (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). Используемый в настоящем документе мутант LEPR, который характеризуется ослабленной передачей сигнала в присутствии лептина (по сравнению с LEPR дикого типа), называется мутантом LEPR с нарушением передачи сигнала. Иллюстративной мутацией LEPR с нарушением передачи сигнала является LEPR-P316T (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464). Таким образом, настоящее изобретение предусматривает антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты, которые применимы для лечения, предупреждения и/или ослабления заболеваний и нарушений, вызванных или ассоциированных с одним или несколькими мутантами LEPR с дефектом передачи сигнала (например, А409Е) и/или нарушением передачи сигнала (например, Р316Т).The present invention also provides anti-LEPR antibodies and antigen-binding fragments thereof, which are useful for restoring leptin signaling to cells, tissues and organs expressing one or more obesity-associated LEPR mutations. For example, certain LEPR mutants have been identified that are characterized by the absence or attenuation of signaling in the presence of leptin and are associated with obesity and related disorders. As used herein, a LEPR mutant that lacks signal transduction in the presence of leptin is referred to as a signal transduction defective LEPR mutant. An exemplary LEPR mutation with a signaling defect is LEPR-A409E (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). As used herein, a LEPR mutant that exhibits impaired signaling in the presence of leptin (compared to wild type LEPR) is referred to as a signaling impaired LEPR mutant. An exemplary LEPR signal-disrupting mutation is LEPR-P316T (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464). Thus, the present invention provides anti-LEPR antibodies and antigen-binding fragments thereof, which are useful in the treatment, prevention and/or amelioration of diseases and disorders caused by or associated with one or more LEPR mutants with a signal transduction defect (e.g., A409E) and/or signal transmission (for example, P316T).

Антитела к LEPR и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению также применимы для лечения или предупреждения одного или нескольких заболеваний или нарушений, выбранных из группы, состоящей из ожирения, метаболического синдрома, вызванной диетой тяги к определенному виду пищи, функциональной гипоталамической аменореи, диабета 1 типа, диабета 2 типа, устойчивости к инсулину, тяжелой устойчивости, в том числе тяжелой устойчивости к инсулину в результате мутации инсулинового рецептора, тяжелой устойчивости к инсулину, не вызванной мутацией инсулинового рецептора, тяжелой устойчивостью к инсулину, вызванной мутацией нисходящих путей передачи сигнала или вызванной другими причинами, неалкогольной и алкогольной жировой дистрофии печени, болезни Альцгеймера, недостаточности лептина, устойчивости к лептину, лепречаунизма/синдрома Донохью и синдрома Рабсона-Менденхолла.The anti-LEPR antibodies and antigen-binding fragments thereof of the present invention are also useful in the treatment or prevention of one or more diseases or disorders selected from the group consisting of obesity, metabolic syndrome, dietary cravings, functional hypothalamic amenorrhea, type 1 diabetes, type 2 diabetes, insulin resistance, severe resistance, including severe insulin resistance due to insulin receptor mutation, severe insulin resistance not due to insulin receptor mutation, severe insulin resistance due to downstream mutation or other causes , non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease, Alzheimer's disease, leptin deficiency, leptin resistance, leprechaunism/Donoghue syndrome, and Rabson-Mendenhall syndrome.

В контексте способов лечения, описанных в настоящем документе, антитело к LEPR можно вводить в виде монотерапии (например, в виде только одного терапевтического средства) или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами (примеры таковых описаны в других разделах настоящего документа).In the context of the treatments described herein, an anti-LEPR antibody may be administered as monotherapy (eg, as a single therapeutic agent) or in combination with one or more additional therapeutic agents (examples of which are described elsewhere herein).

Комбинированные препараты и составыCombined drugs and formulations

Настоящее изобретение предусматривает композиции и терапевтические составы, содержащие любое из антител к LEPR, описанных в настоящем документе, в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, и способы лечения, предусматривающие введение таких комбинаций субъектам, нуждающимся в этом.The present invention provides compositions and therapeutic formulations comprising any of the anti-LEPR antibodies described herein in combination with one or more additional therapeutically active ingredients, and methods of treatment comprising administering such combinations to subjects in need thereof.

Антитела к LEPR по настоящему изобретению можно составлять совместно с и/или вводить в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, такими как, например, фармацевтические продукты, выписываемые для лечения ожирения, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, диабета 2 типа, диабета 1 типа, контроля аппетита, бесплодия и др. Примеры таких дополнительных терапевтически активных компонентов включают, например, рекомбинантный лептин человека (например, метрелептин (MYALEPT)), ингибиторы PCSK9 (например, антитела к PCSK9 (алирокумаб, эволокумаб, бокоцизумаб, лоделцизумаб, ралпанцизумаб и др.)), статины (аторвастатин, розувастатин, церивастатин, питавастатин, флувастатин, симвастатин, ловастатин, правастатин и др.), эзетемиб, инсулин, варианты инсулина, секретогены инсулина, метформин, сульфонилмочевину, ингибиторы натрий-глюкозного котранспортера 2 (SGLT2) (например, дапаглифлозин, канаглифлозин, эмпаглифлозин и др.), агонисты/аналоги GLP-1 (например, экстендин-4, эксенатид, лираглутид, ликсисенатид, альбиглутид, дулаглутид и др.), ингибиторы глюкагона (GCG) (например, антитела к GCG), ингибиторы глюкагонового рецептора (GCGR) (например, антитела к GCGR), низкомолекулярные антагонисты GCGR, GCGR-специфические антисмысловые олигонуклеотиды, аптамеры к GCGR (например, шпигельмеры) и др.), ингибиторы ангиопоэтин-подобного белка (ANGPTL) (например, антитела к ANGPTL3, антитела к ANGPTL4, антитела к ANGPTL8 и др.), фентермин, орлистат, топирамат, бупропион, топирамат/фентермин, бупропион/налтрексон, бупропион/зонизамид, прамлинтид/метрелептин, лоркасерин,Anti-LEPR antibodies of the present invention may be formulated with and/or administered in combination with one or more additional therapeutically active ingredients such as, for example, pharmaceutical products prescribed for the treatment of obesity, hypercholesterolemia, hyperlipidemia, type 2 diabetes, type 1 diabetes, appetite control, infertility, etc. Examples of such additional therapeutically active components include, for example, recombinant human leptin (for example, metreleptin (MYALEPT)), PCSK9 inhibitors (for example, antibodies to PCSK9 (alirocumab, evolocumab, bococizumab, lodelcizumab, ralpancizumab, etc.). )), statins (atorvastatin, rosuvastatin, cerivastatin, pitavastatin, fluvastatin, simvastatin, lovastatin, pravastatin, etc.), ezetemib, insulin, insulin variants, insulin secretogens, metformin, sulfonylurea, sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) inhibitors (e.g. , dapagliflozin, canagliflozin, empagliflozin, etc.), GLP-1 agonists/analogs (eg, extendin-4, exenatide, liraglutide, lixisenatide, albiglutide, dulaglutide, etc.), glucagon inhibitors (GCG) (eg, anti-GCG antibodies), glucagon receptor (GCGR) inhibitors (eg, anti-GCGR antibodies), small molecule GCGR antagonists, GCGR -specific antisense oligonucleotides, aptamers to GCGR (for example, Spiegelmers), etc.), inhibitors of angiopoietin-like protein (ANGPTL) (for example, antibodies to ANGPTL3, antibodies to ANGPTL4, antibodies to ANGPTL8, etc.), phentermine, orlistat, topiramate , bupropion, topiramate/phentermine, bupropion/naltrexone, bupropion/zonisamide, pramlintide/metreleptin, lorcaserin,

- 18 041859 цетилистат, тезофензин, велнеперит и др.- 18 041859 cetilistat, tesofensine, wellneperite, etc.

Дополнительный терапевтически активный компонент (дополнительные терапевтически активные компоненты), например, любое из средств, приведенных выше, или их производных, можно вводить непосредственно перед, совместно с введением или вскоре после введения антитела к LEPR по настоящему изобретению (для целей настоящего раскрытия такие режимы введения представляют собой введение антитела к LEPR в комбинации с дополнительным терапевтически активным компонентом). Настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции, в которых антитело к LEPR по настоящему изобретению составляют совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, как описано в других разделах настоящего документа.The additional therapeutically active ingredient(s), e.g., any of the agents above or derivatives thereof, may be administered immediately before, concurrently with, or shortly after administration of an anti-LEPR antibody of the present invention (for the purposes of this disclosure, such administration regimens is the administration of an anti-LEPR antibody in combination with an additional therapeutically active component). The present invention provides pharmaceutical compositions wherein an anti-LEPR antibody of the present invention is formulated with one or more additional therapeutically active ingredients as described elsewhere herein.

Режимы введенияModes of administration

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения многократные дозы антитела к LEPR (или фармацевтической композиции, содержащей комбинацию антитела к LEPR и любого из дополнительных терапевтически активных средств, упомянутых в настоящем документе) можно вводить субъекту в течение определенного периода времени. Способы в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предусматривают последовательное введение субъекту многократных доз антитела к LEPR по настоящему изобретению. Используемое в настоящем документе выражение последовательное введение означает, что каждую дозу антитела к LEPR вводят субъекту в разный момент времени, например, в разные дни, разделенные предварительно определенным интервалом (например, часами, днями, неделями или месяцами). Настоящее изобретение предусматривает способы, которые предусматривают последовательное введение пациенту одной начальной дозы антитела к LEPR, затем одной или нескольких вторых доз антитела к LEPR, а затем необязательно одной или нескольких третьих доз антитела к LEPR.In accordance with certain embodiments of the present invention, multiple doses of an anti-LEPR antibody (or a pharmaceutical composition comprising a combination of an anti-LEPR antibody and any of the additional therapeutically active agents mentioned herein) may be administered to a subject over a period of time. Methods in accordance with this aspect of the present invention provide for sequential administration of multiple doses of an anti-LEPR antibody of the present invention to a subject. As used herein, sequential administration means that each dose of an anti-LEPR antibody is administered to a subject at a different point in time, eg, on different days separated by a predetermined interval (eg, hours, days, weeks, or months). The present invention provides methods that sequentially administer to a patient one initial dose of an anti-LEPR antibody, followed by one or more second doses of an anti-LEPR antibody, and then optionally one or more third doses of an anti-LEPR antibody.

Термины начальная доза, вторые дозы и третьи дозы относятся к временной последовательности введения антитела к LEPR по настоящему изобретению. Таким образом, начальная доза представляет собой дозу, которую вводят в начале терапевтического режима (также называется доза исходного уровня, ударная доза, начальная доза и т.п.); вторые дозы представляют собой дозы, которые вводят после введения начальной дозы; и третьи дозы представляют собой дозы, которые вводят после вторых доз. Все из начальных, вторых и третьих доз могут содержать одинаковое количество антитела к LEPR, но, как правило, могут отличаться друг от друга по частоте введения. В соответствии с определенными вариантами осуществления количество антитела к LEPR, содержащегося в начальных, вторых и/или третьих дозах, отличается друг от друга (например, при необходимости корригируется в сторону повышения или снижения) в ходе курса лечения. В соответствии с определенными вариантами осуществления две или более (например, 2, 3, 4 или 5) дозы вводят в начале терапевтического режима в виде ударных доз, затем последующие дозы вводят на менее частой основе (например, поддерживающие дозы).The terms initial dose, second doses, and third doses refer to the time sequence of administration of an anti-LEPR antibody of the present invention. Thus, the starting dose is the dose that is administered at the start of a therapeutic regimen (also called baseline dose, loading dose, initial dose, etc.); the second doses are doses administered after the initial dose; and the third doses are doses administered after the second doses. All of the initial, second, and third doses may contain the same amount of LEPR antibody, but generally may differ from each other in frequency of administration. In certain embodiments, the amount of anti-LEPR antibody contained in the initial, second, and/or third doses varies from one another (eg, adjusted upwards or downwards as necessary) during the course of treatment. In certain embodiments, two or more (eg, 2, 3, 4, or 5) doses are administered at the start of the therapeutic regimen as bolus doses, then subsequent doses are administered on a less frequent basis (eg, maintenance doses).

Диагностические и аналитические применения антителDiagnostic and analytical applications of antibodies

Антитела к LEPR по настоящему изобретению можно также использовать для выявления и/или измерения LEPR или LEPR-экспрессирующих клеток в образце, например, для диагностических целей. Например, антитело к LEPR или его фрагмент можно использовать для диагностики состояния или заболевания, характеризующегося аномальной экспрессией (например, сверхэкспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и др.) LEPR. Иллюстративные диагностические анализы в случае LEPR могут предусматривать, например, приведение в контакт образца, полученного от пациента, с антителом к LEPR по настоящему изобретению, где антитело к LEPR метят подлежащей выявлению меткой или репортерной молекулой. Альтернативно немеченое антитело к LEPR можно использовать в диагностических применениях в комбинации с вторичным антителом, которое само по себе является подлежащим выявлению образом меченым. Подлежащая выявлению метка или репортерная молекула может представлять собой радиоизотоп, такой как ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S или ¹²⁵I; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеина изотиоцианат или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Конкретные иллюстративные анализы, которые можно применять для выявления или измерения LEPR в образце, включают иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA), сортировку флуоресцентноактивированных клеток (FACS) и сканирование на основе позитронно-эмиссионной томографии (PET).Anti-LEPR antibodies of the present invention can also be used to detect and/or measure LEPR or LEPR-expressing cells in a sample, for example, for diagnostic purposes. For example, an anti-LEPR antibody, or fragment thereof, can be used to diagnose a condition or disease characterized by abnormal expression (eg, overexpression, underexpression, lack of expression, etc.) of LEPR. Exemplary diagnostic assays for LEPR may involve, for example, contacting a sample obtained from a patient with an anti-LEPR antibody of the present invention, wherein the anti-LEPR antibody is labeled with a detectable label or reporter molecule. Alternatively, an unlabeled anti-LEPR antibody can be used in diagnostic applications in combination with a secondary antibody that is itself detectably labeled. The label or reporter molecule to be detected may be a radioisotope such as ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S or ¹²⁵ I; a fluorescent or chemiluminescent moiety such as fluorescein isothiocyanate or rhodamine; or an enzyme such as alkaline phosphatase, beta-galactosidase, horseradish peroxidase or luciferase. Specific exemplary assays that can be used to detect or measure LEPR in a sample include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence activated cell sorting (FACS), and positron emission tomography (PET) scanning.

Образцы, которые можно использовать в диагностических анализах LEPR в соответствии с настоящим изобретением, включают любой образец ткани или жидкости, получаемый от пациента, который содержит подлежащие выявлению количества белка LEPR или его фрагментов, в нормальных или патологических условиях. Как правило, уровни LEPR в определенном образце, полученном от здорового пациента (например, пациента, не пораженного заболеванием или состоянием, ассоциированным с аномальными уровнями или активностью LEPR), будут измерять в целях изначального установления исходного уровня или стандартного уровня LEPR. Этот исходный уровень LEPR затем можно сравнивать с уровнями LEPR, измеренными в образцах, полученных от индивидуумов, предположительно имеющих связанное с LEPR заболевание или состояние.Samples that can be used in LEPR diagnostic assays according to the present invention include any tissue or fluid sample obtained from a patient that contains detectable amounts of LEPR protein or fragments thereof, under normal or pathological conditions. Typically, LEPR levels in a specific sample obtained from a healthy patient (eg, a patient not affected by a disease or condition associated with abnormal LEPR levels or activity) will be measured to initially establish a baseline or standard LEPR level. This baseline LEPR level can then be compared with LEPR levels measured in samples obtained from individuals suspected of having a LEPR-related disease or condition.

ПримерыExamples

Следующие примеры изложены в целях предоставления специалистам в данной области полногоThe following examples are provided for the purpose of providing those skilled in the art with a complete

- 19 041859 раскрытия и описания того, как получать и применять способы и композиции по настоящему изобретению, а не в целях ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Были приложены усилия для обеспечения точности по отношению к используемым числам (например, количеству, температуре и т.п.), однако необходимо учитывать некоторые ошибки и отклонения экспериментов. Если не указано иное, то части являются массовыми частями, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура представлена в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.- 19 041859 disclosures and descriptions of how to make and use the methods and compositions of the present invention, and not for the purpose of limiting the scope of what the authors of the present invention consider as their invention. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to the numbers used (eg quantity, temperature, etc.), however, some experimental errors and deviations must be taken into account. Unless otherwise indicated, parts are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is atmospheric or near atmospheric.

Пример 1. Получение антигенсвязывающих белков, которые специфически связывают лептиновый рецептор (LEPR).Example 1 Preparation of antigen-binding proteins that specifically bind the leptin receptor (LEPR).

Антитела к LEPR получали в результате иммунизации мыши VELOCIMMUNE® (например, сконструированной мыши, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные участки тяжелой и легкой цепи каппа человеческих иммуноглобулинов) иммуногеном, содержащим внеклеточный домен LEPR. Иммунный ответ на антитело контролировали с помощью LEPR-специфического иммуноанализа. С помощью ранее описанных методик полностью человеческие антитела к LEPR выделяли и очищали.Anti-LEPR antibodies are generated by immunizing a VELOCIMMUNE® mouse (eg, an engineered mouse containing DNA encoding human kappa heavy and light chain variable regions of human immunoglobulins) with an immunogen containing the LEPR extracellular domain. The immune response to the antibody was monitored using a LEPR-specific immunoassay. Using previously described techniques, fully human anti-LEPR antibodies were isolated and purified.

Определенные биологические свойства иллюстративных антител к LEPR, полученных в соответствии с этим примером, подробно описаны в разделе Примеры, изложенном далее.Certain biological properties of exemplary anti-LEPR antibodies prepared according to this example are detailed in the Examples section below.

Пример 2. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот вариабельных участков тяжелой и легкой цепи.Example 2 Heavy and Light Chain Variable Region Amino Acid and Nucleic Acid Sequences.

В табл. 1 изложены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных участков и CDR тяжелой и легкой цепи некоторых антител к LEPR по настоящему изобретению. Идентификаторы соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот изложены в табл. 2.In table. 1 sets out the amino acid sequence identifiers for the variable regions and the heavy and light chain CDRs of some of the anti-LEPR antibodies of the present invention. Identifiers of the corresponding nucleic acid sequences are set out in table. 2.

Таблица 1. Идентификаторы аминокислотных последовательностейTable 1. Amino acid sequence identifiers

SEQ ID NO: SEQID NO: Обозначение антител Designation of antibodies HCVR HCVR HCDR1 HCDR1 HCDR2 HCDR2 HCDR3 HDDR3 LCVR LCVR LCDR1 LCDR1 LCDR2 LCDR2 LCDR3 LCDR3 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 18 18 20 20 22 22 24 24 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 26 26 28 28 30 thirty 32 32 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 34 34 36 36 38 38 40 40 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 42 42 44 44 46 46 48 48 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 50 50 52 52 54 54 56 56 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 58 58 60 60 62 62 64 64 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 66 66 68 68 70 70 72 72 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 74 74 76 76 78 78 80 80 10 10 12 12 14 14 16 16 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 82 82 84 84 86 86 88 88 90 90 92 92 94 94 96 96 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 98 98 100 100 102 102 104 104 90 90 92 92 94 94 96 96 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 106 106 108 108 ПО BY 112 112 90 90 92 92 94 94 96 96

- 20 041859- 20 041859

Таблица 2. Идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислотTable 2. Nucleic acid sequence identifiers

SEQ ID NO: SEQID NO: Обозначение антител Designation of antibodies HCVR HCVR HCDR1 HCDR1 HCDR2 HCDR2 HCDR3 HDDR3 LCVR LCVR LCDR1 LCDR1 LCDR2 LCDR2 LCDR3 LCDR3 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 17 17 19 19 21 21 23 23 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 25 25 27 27 29 29 31 31 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 33 33 35 35 37 37 39 39 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 41 41 43 43 45 45 47 47 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 49 49 51 51 53 53 55 55 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 57 57 59 59 61 61 63 63 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 65 65 67 67 69 69 71 71 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н18449Р2 H4H18449R2 73 73 75 75 77 77 79 79 9 9 11 eleven 13 13 15 15 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 81 81 83 83 85 85 87 87 89 89 91 91 93 93 95 95 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 97 97 99 99 101 101 103 103 89 89 91 91 93 93 95 95 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 105 105 107 107 109 109 111 111 89 89 91 91 93 93 95 95

Антитела обычно обозначат в настоящем документе в соответствии со следующей номенклатурой: префикс Fc (например, Н4Н, H1M, H2M и др.), затем числовой идентификатор (например, 16650, 16679 и др.), затем суффикс Р или N. Таким образом, в соответствии с этой номенклатурой, антитело может называться в настоящем документе как, например, Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2 и др. Префикс Fc в обозначениях антитела, используемый в настоящем документе (Н4Н, H1M и Н2М), указывает определенный изотип Fc-участка антитела. Например, антитело Н4Н представляет собой Fc IgG4 человека, в то время как H1M имеет Fc IgG1 мыши (все вариабельные участки являются полностью человеческими, как обозначается по первому символу Н в обозначении антитела). Как будет понятно специалисту в данной области, антитело, имеющее определенный изотип Fc, можно превратить в антитело с другим изотипом Fc (например, антитело с Fc IgG1 мыши можно превратить в антитело с IgG4 человека и т.д.), однако в любом случае вариабельные домены (в том числе CDR), которые указываются числовыми идентификаторами, показанными в табл. 1 и 2, будут оставаться одинаковыми, и предполагается, что связывающие свойства будут идентичными или фактически аналогичными независимо от природы Fcдомена.Antibodies are usually designated herein according to the following nomenclature: Fc prefix (e.g., H4H, H1M, H2M, etc.), then a numeric identifier (e.g., 16650, 16679, etc.), then a P or N suffix. Thus, in accordance with this nomenclature, an antibody may be referred to herein as, for example, H4H16650P2, H4H16679P2, etc. The Fc prefix in antibody designations used herein (H4H, H1M, and H2M) indicates the specific isotype of the Fc region of the antibody. For example, antibody H4H is a human IgG4 Fc while H1M is a mouse IgG1 Fc (all variable regions are fully human, as indicated by the first H in the antibody designation). As will be appreciated by one of skill in the art, an antibody having a particular Fc isotype can be converted into an antibody with a different Fc isotype (e.g., a mouse IgG1 Fc antibody can be converted into a human IgG4 antibody, etc.), however, in either case, the variable domains (including CDRs), which are indicated by the numerical identifiers shown in Table. 1 and 2 will remain the same and the binding properties are expected to be identical or substantially similar regardless of the nature of the Fc domain.

mAb сравнения, как используется в примерах в настоящем документе, относится к Fab9F8, описанному в Fazeli et al. (2006) J Immunol Methods 312:190-200, и Carpenter et al. (2012) Structure 20(3):487-97.The reference mAb as used in the examples herein refers to Fab9F8 as described in Fazeli et al. (2006) J Immunol Methods 312:190-200, and Carpenter et al. (2012) Structure 20(3):487-97.

Пример 3. Аффинности связывания и константы скорости реакции человеческих моноклональных антител к LEPR, полученные на основе поверхностного плазмонного резонанса.Example 3 Binding affinities and reaction rate constants of human anti-LEPR monoclonal antibodies derived from surface plasmon resonance.

Равновесные константы диссоциации (значения K_D) в случае связывания LEPR с очищенными моноклональными антителами к LEPR определяли с помощью биосенсора поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени с помощью инструмента Biacore 4000. Все анализы связывания выполняли в поверхностном буфере на основе мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05 об.% поверхностноактивного вещества Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET) при 25 и 37°С. Сенсорную поверхность Biacore вначале дериватизировали с помощью связывания амина с моноклональным мышиным антителом к Fc человека (GE, № BR-1008-39) в целях захвата моноклональных антител к LEPR. Исследования связывания выполняли со следующими реагентами для LEPR: внеклеточным доменом LEPR человека, экспрессируемым с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), внеклеточным доменом LEPR Macaca fascicularis, экспрессируемым с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (mfLEPR.mmh; SEQ ID NO: 117), внеклеточным доменом LEPR человека, экспрессируемым с Сконцевой меткой Fc gG2a мыши (hLEPR.mFc; SEQ ID NO: 115), внеклеточным доменом LEPR мыши, экспрессируемым с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (mLEPR.mmh; SEQ ID NO: 118) и внеклеточным доменом LEPR крысы, экспрессируемым с С-концевой гексагистидиновой меткой mycmyc (rLEPR.mmh; SEQ ID NO: 119). Различные концентрации реагентов для LEPR сначала получали в поверхностном буфере HBS-ET (100-3,7 нМ; 3-х-кратное серийное разведение) и инъецировали на поверхность моноклонального антитела к LEPR, захваченного антителом к Fc человека, в течение 4 мин со скоростью потока 30 мкл/мин, в то время как диссоциацию связанного с моноклональным антителомEquilibrium dissociation constants (K _D values) for LEPR binding to purified anti-LEPR monoclonal antibodies were determined using a real-time surface plasmon resonance biosensor using the Biacore 4000 instrument. All binding assays were performed in mM HEPES surface buffer, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.05 vol% Tween-20 surfactant, pH 7.4 (HBS-ET) at 25 and 37°C. The Biacore touch surface was first derivatized by coupling an amine to a monoclonal mouse antibody to human Fc (GE, no. BR-1008-39) in order to capture the monoclonal antibodies to LEPR. Binding studies were performed with the following reagents for LEPR: human LEPR extracellular domain expressed with myc-myc C-terminal hexahistidine tag (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), Macaca fascicularis LEPR extracellular domain expressed with myc C-terminal hexahistidine tag -myc (mfLEPR.mmh; SEQ ID NO: 117), human LEPR extracellular domain expressed with mouse gG2a Fc C-terminal tag (hLEPR.mFc; SEQ ID NO: 115), mouse LEPR extracellular domain expressed with C-terminal hexahistidine tag myc-myc (mLEPR.mmh; SEQ ID NO: 118) and the rat LEPR extracellular domain expressed with the mycmyc C-terminal hexahistidine tag (rLEPR.mmh; SEQ ID NO: 119). Various concentrations of LEPR reagents were first prepared in HBS-ET surface buffer (100-3.7 nM; 3-fold serial dilution) and injected onto the surface of an anti-LEPR monoclonal antibody captured by anti-human Fc antibody for 4 min at a rate of flow 30 µl/min, while the dissociation associated with the monoclonal antibody

- 21 041859 реагента для LEPR контролировали в течение 10 мин в поверхностном буфере HBS-ET. Константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) определяли подгонкой сенсограмм связывания в реальном времени к модели связывания 1:1 с ограничением массопереноса с помощью компьютерной программы подбора кривых Scrubber 2.0с. Константы равновесия при диссоциации после связывания (KD) и полупериоды диссоциации (tV₂) рассчитывали исходя из констант скорости реакции в виде _z kd ln(2)- 21 041859 LEPR reagent was monitored for 10 min in HBS-ET surface buffer. Association rate constants (ka) and dissociation rate constants (kd) were determined by fitting real-time binding sensorgrams to a mass transfer limited 1:1 binding model using Scrubber 2.0c curve fitting software. Post-binding dissociation equilibrium constants (KD) and dissociation half-lives (tV ₂ ) were calculated from the reaction rate constants as _z kd ln(2)

Kd (Μ) = -— , и 1½ (мин) =---— ka 6G*kdKd (M) = -— , and 1½ (min) =---— ka 6G*kd

Параметры кинетики связывания в случае связывания hLEPR.mmh, mfLEPR.MMH или hLEPR.mFc с различными моноклональными антителами к LEPR по настоящему изобретению при 25 и 37°С показаны в табл.3-8.Binding kinetic parameters for binding hLEPR.mmh, mfLEPR.MMH or hLEPR.mFc to various anti-LEPR monoclonal antibodies of the present invention at 25 and 37°C are shown in Tables 3-8.

Таблица 3. Параметры кинетики связывания при связывании hLEPR-MMH с моноклональными антителами к LEPR при 25°СTable 3. Binding kinetic parameters for hLEPR-MMH binding to anti-LEPR monoclonal antibodies at 25°C

Захваченное mAb Captured mAb Уровень захвата mAb (RU) mAb capture level (RU) Связанн ый 100 нм hLEPRMMH (RU) Linked 100 nm hLEPRMMH (RU) (1/Ms) (1/Ms) kd (1/s) kd (1/s) Kd (М) kd (M) 1½ (мин) 1½ (min) Н4Н16650Р2 H4H16650R2 167 + 0,3 167+0.3 51 51 2,81Е+04 2.81E+04 2,23Е-04 2.23E-04 7,93Е-09 7.93E-09 52 52 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 192 + 0,7 192+0.7 39 39 2,34Е+04 2.34E+04 2Д6Е-04 2D6E-04 1,05Е-08 1.05Е-08 47 47 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 163 ± 0,4 163±0.4 28 28 6Д4Е+04 6D4E+04 7,90Е-03 7.90E-03 1,29Е-07 1.29E-07 1,5 1.5 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 166 + 0,4 166+0.4 22 22 3,00Е+04 3.00E+04 2,26Е-03 2.26E-03 7,54Е-08 7.54Е-08 5Д 5D Н4Н18445Р2 H4H18445R2 194+ 1,1 194+ 1.1 45 45 4,42Е+04 4.42E+04 4,78Е-03 4.78E-03 1,08Е-07 1.08E-07 2,4 2.4 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 163 + 2,4 163 + 2.4 16 16 1,81Е+04 1.81E+04 9,51Е-04 9.51Е-04 5,25Е-08 5.25E-08 12 12 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 176+1,3 176+1.3 54 54 2,91Е+04 2.91E+04 2Д5Е-04 2D5E-04 8,08Е-09 8.08Е-09 49 49 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 163 ± 0,4 163±0.4 47 47 6,31Е+04 6.31E+04 6J7E-03 6J7E-03 1,07Е-07 1.07Е-07 1,7 1.7 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 190+1,2 190+1.2 42 42 4,73Е+04 4.73E+04 7, ОЗЕ-ОЗ 7, OZE-OZ 1Д8Е-07 1D8E-07 1,6 1.6 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 167 + 3,1 167+3.1 87 87 8Д0Е+04 8D0E+04 8,98Е-04 8.98E-04 1Д1Е-08 1D1E-08 13 13 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 200 ± 0,4 200±0.4 36 36 2,61Е+04 2.61E+04 5,29Е-04 5.29E-04 2,ОЗЕ-08 2,OSE-08 22 22 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 221 + 0,5 221+0.5 32 32 2,36Е+04 2.36E+04 1,96Е-04 1.96E-04 8,31Е-09 8.31Е-09 59 59 mAb изотипического контроля mAb isotype control 171 + 0,4 171+0.4 4 4 Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.*

*н.с. указывает, что наблюдали отсутствие связывания при текущих экспериментальных условиях*n.s. indicates that no binding was observed under current experimental conditions

- 22 041859- 22 041859

Таблица 4. Параметры кинетики связывания при связывании hLEPR-MMH с моноклональными антителами к LEPR при 37°СTable 4. Binding kinetic parameters for binding hLEPR-MMH to anti-LEPR monoclonal antibodies at 37°C

Захваченное mAb Captured mAb Уровень захвата mAb (RU) mAb capture level (RU) Связанн ый 100 нм hLEPRMMH (RU) Coupled 100 nm hLEPRMMH (RU) ка (1/Ms) ka (1/Ms) kd (1/s) kd (1/s) K_D (М)K _D (M) 1½ (мин) 1½ (min) Н4Н16650Р2 H4H16650R2 210 ±2,5 210±2.5 77 77 4,85Е±04 4.85E±04 9,58Е-04 9.58Е-04 1,98Е-08 1.98E-08 12 12 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 239 ±2 239±2 61 61 3,84Е±04 3.84Е±04 8,42Е-04 8.42E-04 2,19Е-08 2.19E-08 14 14 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 206 ± 3,2 206±3.2 22 22 7,70Е±04 7.70E±04 1,80Е-02 1.80E-02 2,ЗЗЕ-07 2,ZZE-07 0,6 0.6 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 206 ± 2,4 206±2.4 32 32 3,38Е±04 3.38E±04 5,76Е-03 5.76Е-03 1,70Е-07 1.70E-07 2,0 2.0 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 234 ±2 234±2 38 38 5,13Е±04 5.13E±04 1,68Е-02 1.68E-02 3,26Е-07 3.26E-07 0,7 0.7 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 188 ±3,4 188±3.4 21 21 2,12Е±04 2.12E±04 2,56Е-03 2.56Е-03 1,21Е-07 1.21E-07 4,5 4.5 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 206 ±2,1 206±2.1 73 73 3,94Е±04 3.94Е±04 8,15Е-04 8.15Е-04 2,07Е-08 2.07Е-08 14 14 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 188 ±0,8 188±0.8 38 38 9,53Е±04 9.53Е±04 1,93Е-02 1.93E-02 2,03Е-07 2.03Е-07 0,6 0.6 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 219 ± 1,7 219±1.7 30 thirty 6,51Е±04 6.51Е±04 1,86Е-02 1.86E-02 2,86Е-07 2.86E-07 0,6 0.6 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 192 ± 2,2 192±2.2 93 93 1,17Е±05 1.17E±05 4,18Е-03 4.18E-03 3,59Е-08 3.59Е-08 2,8 2.8 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 264 ± 0,3 264±0.3 44 44 3,54Е±04 3.54Е±04 3,41Е-03 3.41Е-03 9,63Е-08 9.63Е-08 3,4 3.4 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 290 ± 0,4 290±0.4 61 61 2,95Е±04 2.95E±04 4,38Е-04 4.38E-04 1,48Е-08 1.48Е-08 26 26 mAb изотипического контроля mAb isotype control 193 ± 1,5 193±1.5 6 6 Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.*

*н.с. указывает, что наблюдали отсутствие связывания при текущих экспериментальных условиях*n.s. indicates that no binding was observed under current experimental conditions

- 23 041859- 23 041859

Таблица 5. Параметры кинетики связывания при связывании mfLEPR.MMH с моноклональными антителами к LEPR при 25°СTable 5. Binding kinetic parameters for mfLEPR.MMH binding to anti-LEPR monoclonal antibodies at 25°C

Захваченное mAb Captured mAb Уровень захвата mAb (RU) mAb capture level (RU) Связанн ый 100 нм mfLEP. ММН (RU) Bound 100 nm mfLEP. MMN (RU) ка (1/Ms) ka (1/Ms) kd (1/s) kd (1/s) K_D (М)K _D (M) 1½ (мин) 1½ (min) Н4Н16650Р2 H4H16650R2 166 ±0,6 166±0.6 93 93 6,02Е±04 6.02Е±04 1,37Е-04 1.37Е-04 2,27Е-09 2.27Е-09 84 84 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 191 ±0,7 191±0.7 66 66 4,37Е±04 4.37E±04 1,41Е-04 1.41Е-04 3,22Е-09 3.22E-09 82 82 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 162 ± 0,3 162±0.3 33 33 8,83Е±04 8.83Е±04 1,23Е-02 1.23E-02 1,39Е-07 1.39E-07 0,9 0.9 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 166 ±0,6 166±0.6 5 5 IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* Н4Н18445Р2 H4H18445R2 193 ± 0,6 193±0.6 58 58 5,90Е±04 5.90E±04 4,86Е-03 4.86E-03 8,24Е-08 8.24Е-08 2,4 2.4 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 163 ±2,8 163±2.8 23 23 1,93Е±04 1.93Е±04 1,12Е-03 1.12E-03 5,83Е-08 5.83Е-08 10 10 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 175 ± 0,5 175±0.5 6 6 IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* Н4Н18482Р2 H4H18482R2 163 ± 0,8 163±0.8 63 63 1,01Е±05 1.01Е±05 6,74Е-03 6.74Е-03 6,66Е-08 6.66Е-08 1,7 1.7 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 189 ±0,5 189±0.5 59 59 7,37Е±04 7.37E±04 6,79Е-03 6.79Е-03 9,21Е-08 9.21Е-08 1,7 1.7 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 165 ± 2,4 165±2.4 52 52 1,10Е±05 1.10E±05 1,20Е-02 1.20E-02 1,10Е-07 1.10E-07 1,0 1.0 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 213 ±0,5 213±0.5 83 83 4,00Е±04 4.00E±04 4,63Е-04 4.63E-04 1,16Е-08 1.16E-08 25 25 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 236 ± 0,4 236±0.4 75 75 3,26Е±04 3.26E±04 1,ЗЗЕ-04 1,ZZE-04 4,07Е-09 4.07Е-09 87 87 mAb изотипического контроля mAb isotype control 171 ±0,4 171±0.4 0 0 Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.*

*н.с. указывает, что наблюдали отсутствие связывания при текущих экспериментальных условиях *IC указывает, что наблюдаемое связывание было инклюзивным и на основе него было невозможно подгонять данные о связывании в реальном времени при текущих экспериментальных условиях*n.s. indicates that no binding was observed under current experimental conditions *IC indicates that the observed binding was inclusive and it was not possible to fit real-time binding data based on it under current experimental conditions

- 24 041859- 24 041859

Таблица 6. Параметры кинетики связывания при связывании mfLEPR.MMH с моноклональными антителами к LEPR при 37°СTable 6. Binding kinetic parameters for mfLEPR.MMH binding to anti-LEPR monoclonal antibodies at 37°C

Захваченное mAb Captured mAb Уровень захвата mAb (RU) mAb capture level (RU) Связанн ый 100 нм mfLEPR .ММН (RU) Bound 100 nm mfLEPR .MMH (RU) ка (1/Ms) ka (1/Ms) kd (1/s) kd (1/s) K_D (М)K _D (M) 1½ (мин) 1½ (min) Н4Н16650Р2 H4H16650R2 204 ± 1,7 204±1.7 134 134 1,22Е±05 1.22Е±05 7,00Е-04 7.00Е-04 5,76Е-09 5.76Е-09 16 16 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 232 ± 1,1 232 ± 1.1 104 104 6,49Е±04 6.49Е±04 6,77Е-04 6.77Е-04 1,04Е-08 1.04Е-08 17 17 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 202 ± 1,3 202±1.3 28 28 1,22Е±05 1.22Е±05 2,63Е-02 2.63E-02 2,17Е-07 2.17E-07 0,4 0.4 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 203 ± 1,3 203±1.3 7 7 IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* Н4Н18445Р2 H4H18445R2 232 ± 0,9 232±0.9 48 48 7,17Е±04 7.17E±04 1,90Е-02 1.90E-02 2,64Е-07 2.64Е-07 0,6 0.6 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 188 ±2,9 188±2.9 30 thirty 2,53Е±04 2.53Е±04 3,54Е-03 3.54Е-03 1,40Е-07 1.40E-07 3,3 3.3 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 202 ± 1 202±1 6 6 IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* IC* Н4Н18482Р2 H4H18482R2 187 ± 1,2 187 ± 1.2 52 52 1,52Е±05 1.52Е±05 2,04Е-02 2.04Е-02 1,34Е-07 1.34Е-07 0,6 0.6 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 216 ±0,7 216±0.7 44 44 1,10Е±05 1.10E±05 1,95Е-02 1.95E-02 1,78Е-07 1.78E-07 0,6 0.6 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 191 ± 1,4 191 ± 1.4 34 34 2,34Е±05 2.34Е±05 3,94Е-02 3.94Е-02 1,69Е-07 1.69Е-07 0,3 0.3 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 274 ± 0,5 274±0.5 113 113 5,39Е±04 5.39E±04 3,24Е-03 3.24Е-03 6,01Е-08 6.01Е-08 3,6 3.6 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 304 ± 0,7 304±0.7 143 143 4,97Е±04 4.97E±04 2,57Е-04 2.57Е-04 5,18Е-09 5.18E-09 45 45 mAb изотипического контроля mAb isotype control 190 ± 1 190±1 1 1 Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.*

*н.с. указывает, что наблюдали отсутствие связывания при текущих экспериментальных условиях *IC указывает, что наблюдаемое связывание было инклюзивным и на основе него было невозможно подгонять данные о связывании в реальном времени при текущих экспериментальных условиях*n.s. indicates that no binding was observed under current experimental conditions *IC indicates that the observed binding was inclusive and it was not possible to fit real-time binding data based on it under current experimental conditions

- 25 041859- 25 041859

Таблица 7. Параметры кинетики связывания при связывании hLEPR.mFc с моноклональными антителами к LEPR при 25°СTable 7. Binding kinetic parameters for binding hLEPR.mFc to anti-LEPR monoclonal antibodies at 25°C

Захваченное mAb Captured mAb Уровень захвата mAb (RU) mAb capture level (RU) Связанн ый 100 нм hLEPRmFc (RU) Bound 100 nm hLEPRmFc (RU) ка (1/Ms) ka (1/Ms) kd (1/s) kd (1/s) K_D (M)K _D (M) 1½ (мин) 1½ (min) Н4Н16650Р2 H4H16650R2 165 ± 0,2 165±0.2 102 102 1,06Ε±05 1.06Ε±05 8,32E-05 8.32E-05 7,85E-10 7.85E-10 139 139 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 190 ± 1,2 190±1.2 78 78 5,84E±04 5.84E±04 9,68E-05 9.68E-05 l,66E-09 l,66E-09 119 119 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 162 ± 0,6 162±0.6 90 90 l,40E±05 l,40E±05 5,63E-04 5.63E-04 4,04E-09 4.04E-09 21 21 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 165 ± 1,2 165±1.2 51 51 5,19E±04 5.19E±04 2,44E-04 2.44E-04 4,70E-09 4.70E-09 47 47 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 192 ± 0,4 192±0.4 76 76 l,22E±05 l,22E±05 4,92E-04 4.92E-04 4,03E-09 4.03E-09 23 23 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 162 ±2,8 162±2.8 20 20 3,20E±04 3.20E±04 2,08E-04 2.08E-04 6,48E-09 6.48E-09 56 56 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 174 ± 0,6 174±0.6 116 116 7,05E±04 7.05E±04 6,82E-05 6.82E-05 9,64E-10 9.64E-10 169 169 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 162 ± 0,5 162±0.5 88 88 l,44E±05 l,44E±05 4,91E-04 4.91E-04 3,42E-09 3.42E-09 24 24 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 188 ±0,6 188±0.6 85 85 l,06E±05 l,06E±05 6,03E-04 6.03E-04 5,70E-09 5.70E-09 19 19 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 166 ±3,2 166±3.2 129 129 2,27E±05 2.27E±05 l,39E-04 l,39E-04 6,13E-10 6.13E-10 83 83 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 200 ± 0,5 200±0.5 69 69 4,77E±04 4.77E±04 l,64E-04 l,64E-04 3,45E-09 3.45E-09 70 70 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 221 ±0,4 221±0.4 65 65 4,10E±04 4.10E±04 8,93E-05 8.93E-05 2,18E-09 2.18E-09 129 129 mAb изотипического контроля mAb isotype control 170 ±0,7 170±0.7 -2 -2 H.C.* H.C.* H.C.* H.C.* H.C.* H.C.* H.C.* H.C.*

*н.с. указывает, что наблюдали отсутствие связывания при текущих экспериментальных условиях*n.s. indicates that no binding was observed under current experimental conditions

- 26 041859- 26 041859

Таблица 8. Параметры кинетики связывания при связывании hLEPR.mFc с моноклональными антителами к LEPR при 37°СTable 8. Binding kinetic parameters for binding hLEPR.mFc to anti-LEPR monoclonal antibodies at 37°C

Захваченное mAb Captured mAb Уровень захвата mAb (RU) mAb capture level (RU) Связанн ый 100 нм hLEPRmFc (RU) Bound 100 nm hLEPRmFc (RU) ка (1/Ms) ka (1/Ms) kd (1/s) kd (1/s) K_D (М)K _D (M) tVl (мин) tvl (min) Н4Н16650Р2 H4H16650R2 199 ± 1,9 199 ± 1.9 145 145 1,57Ε±05 1.57Ε±05 2,80Е-04 2.80E-04 1,79Е-09 1.79Е-09 41 41 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 229 ± 2,3 229±2.3 116 116 1,21Е±05 1.21Е±05 3,10Е-04 3.10E-04 2,56Е-09 2.56Е-09 37 37 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 199 ± 1,1 199±1.1 111 111 1,85Е±05 1.85E±05 1,05Е-03 1.05Е-03 5,64Е-09 5.64Е-09 11 eleven Н4Н18438Р2 H4H18438R2 199 ±0,6 199±0.6 82 82 7,02Е±04 7.02E±04 5,98Е-04 5.98E-04 8,53Е-09 8.53Е-09 19 19 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 229 ±2 229±2 104 104 1,56Е±05 1.56Е±05 6,08Е-04 6.08Е-04 3,89Е-09 3.89Е-09 19 19 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 186 ±2,5 186±2.5 34 34 4,27Е±04 4.27E±04 5,48Е-04 5.48E-04 1,28Е-08 1.28E-08 21 21 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 198 ± 1,6 198±1.6 148 148 1,ЗЗЕ±05 1,3E±05 1,68Е-04 1.68Е-04 1,26Е-09 1.26E-09 69 69 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 185 ± 1,3 185±1.3 109 109 1,89Е±05 1.89Е±05 7,26Е-04 7.26E-04 3,84Е-09 3.84Е-09 16 16 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 215 ± 1,5 215±1.5 99 99 1,23Е±05 1.23Е±05 6,06Е-04 6.06Е-04 4,93Е-09 4.93Е-09 19 19 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 189 ± 1,8 189±1.8 160 160 4,ЗЗЕ±05 4,3E±05 5,00Е-04 5.00Е-04 1,16Е-09 1.16E-09 23 23 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 262 ± 0,5 262±0.5 100 100 8,51Е±04 8.51Е±04 6,52Е-04 6.52E-04 7,66Е-09 7.66Е-09 18 18 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 289 ± 0,4 289±0.4 ПО BY 5,53Е±04 5.53Е±04 1,74Е-04 1.74Е-04 3,15Е-09 3.15E-09 66 66 mAb изотипического контроля mAb isotype control 188 ±0,8 188±0.8 1 1 Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.* Н.С.* N.S.*

*н.с. указывает, что наблюдали отсутствие связывания при текущих экспериментальных условиях*n.s. indicates that no binding was observed under current experimental conditions

При 25°C моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-MMH со значениями KD, варьирующими от 7,9 до 148 нМ, как показано в табл. 5. При 37°C моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-MMH со значениями KD, варьирующими от 14,8 до 326 нМ, как показано в табл. 4.At 25° C., anti-LEPR monoclonal antibodies bound hLEPR-MMH with KD values ranging from 7.9 to 148 nM, as shown in Table 1. 5. At 37° C., anti-LEPR monoclonal antibodies bound hLEPR-MMH with KD values ranging from 14.8 to 326 nM, as shown in Table 5. 4.

из 12 моноклональных антител к LEPR по настоящему изобретению связывались к mfLEPR.MMH. При 25°C моноклональные антитела к LEPR связывались с mfLEPR.MMH со значениями KD, варьирующими от 2,27 до 139 нМ, как показано в табл. 7. При 37°C моноклональные антитела к LEPR связывались с mfLEPR.MMH со значениями KD, варьирующими от 5,18 до 264 нМ, как показано в табл. 8.of the 12 anti-LEPR monoclonal antibodies of the present invention bound to mfLEPR.MMH. At 25° C., anti-LEPR monoclonal antibodies bound mfLEPR.MMH with KD values ranging from 2.27 to 139 nM, as shown in Table 1. 7. At 37°C, monoclonal antibodies to LEPR contacted mfLEPR.MMH with KD values ranging from 5.18 to 264 nm, as shown in table. 8.

При 25°C моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-mFc со значениями KD, варьирующими от 613 пМ до 5,7 нМ, как показано в табл. 7. При 37°C моноклональные антитела к LEPR связывались с hLEPR-mFc со значениями KD, варьирующими от 1,16 до 12,8 нМ, как показано в табл. 8.At 25° C., anti-LEPR monoclonal antibodies bound hLEPR-mFc with KD values ranging from 613 pM to 5.7 nM, as shown in Table 1. 7. At 37° C., anti-LEPR monoclonal antibodies bound hLEPR-mFc with KD values ranging from 1.16 to 12.8 nM as shown in Table 7. 8.

Никакие из моноклональных антител к LEPR по настоящему изобретению не связывались с mLEPR.MMH или rLEPR.MMH при 25 или при 37°C (данные не показаны).None of the anti-LEPR monoclonal antibodies of the present invention bind to mLEPR.MMH or rLEPR.MMH at 25 or 37°C (data not shown).

Пример 4. Антитела к LEPR по настоящему изобретению связывают LEPR при присутствии связывания комплекса лептин:LEPR.Example 4 Anti-LEPR antibodies of the present invention bind LEPR in the presence of leptin:LEPR complex binding.

Блокирование антител к LEPR от связывания с LEPR с помощью лептина человека оценивали с помощью биосенсора плазмонного поверхностного резонанса в реальном времени на инструменте Biacore T200. Все исследование выполняли в 10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05 об.% поверхностно-активного вещества Tween-20 (поверхностный буфер HBS-ET) при 25°C. Поверхность сенсора Biacore CM5 сначала дериватизировали с помощью связывания амина с лептином человека (R&D Systems, № 398-LP) с помощью стандартной поверхностной химической структуры EDC/NHS. Комплекс LEPR человека и лептина человека образовывался в результате инъекции 20 нМ внеклеточного домена LEPR человека, экспрессируемого с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (hLEPR-MMH; SEQ ID NO: xx), на сенсорной поверхности Biacore с иммобилизованным лептином человека при скорости потока 10 мкл/мин или 25 мкл/мин в течение 4 мин, с получением ответа при связывании, составляющего примерно 200 RU. Для оценки того, блокируется ли связывание антитела с hLEPR-MMH лептином чело- 27 041859 века, 200 нМ моноклональных антител к LEPR инъецировали на предварительно образованный комплекс hLEPR-MMH:лептин человека при скорости потока 50 мкл/мин или 25 мкл/мин в течение 4-5 мин. Все антитела к LEPR по настоящему изобретению, связанные с комплексом hLEPR-MMH и лептином человека (лептин:LEPR) с почти аналогичной силой сигнала и наблюдаемым связыванием, экспрессируемым в RU, описаны в табл. 9. Этот результат указывал на то, что лептин человека не блокировал связывание hLEPR-MMH с исследуемыми антителами к LEPR.Blocking of anti-LEPR antibodies from binding to LEPR by human leptin was assessed using a real-time plasmon surface resonance biosensor on the Biacore T200 instrument. The entire assay was performed in 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05 vol% Tween-20 surfactant (HBS-ET surface buffer) at 25°C. The Biacore CM5 sensor surface was first derivatized with amine coupling to human leptin (R&D Systems, No. 398-LP) using a standard EDC/NHS surface chemistry. The complex of human LEPR and human leptin was formed by injecting 20 nM of the extracellular domain of human LEPR expressed with the myc-myc C-terminal hexahistidine tag (hLEPR-MMH; SEQ ID NO: xx) onto a Biacore sensor surface with immobilized human leptin at a flow rate of 10 μl/min or 25 μl/min for 4 min, resulting in a binding response of approximately 200 RU. To assess whether antibody binding to hLEPR-MMH is blocked by human leptin, 200 nM anti-LEPR monoclonal antibody was injected into a preformed hLEPR-MMH:human leptin complex at a flow rate of 50 μl/min or 25 μl/min for 4-5 min. All anti-LEPR antibodies of the present invention bound to the hLEPR-MMH complex and human leptin (leptin:LEPR) with nearly similar signal strength and observed binding expressed in RU are described in Table 1. 9. This result indicated that human leptin did not block hLEPR-MMH binding to the anti-LEPR antibodies under study.

Таблица 9. Связывание моноклональных антител к LEPR с предварительно _____образованным комплексом hLEPR-MMH и лептином человека_____Table 9. Binding of anti-LEPR monoclonal antibodies to pre-complexed hLEPR-MMH and human leptin_____

Антитело Antibody Связанный hLEPR-MMH (RU) Related hLEPR-MMH (RU) Связанное 200 нМ mAb (RU) Bound 200 nM mAb (RU) Н4Н16650Р2 H4H16650R2 196 196 81 81 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 195 195 90 90 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 196 196 92 92

Пример 5. ELISA при блокировании лептинового рецептора человека.Example 5 ELISA in blocking the human leptin receptor.

При проведении ELISA лептин человека (hLeptin; R&D Systems, № 398-LP-O1M) покрывали при концентрации 5 мкг/мл в PBS в 96-луночном микротитрационном планшете в течение ночи при 4°C. Затем участки неспецифического связывания блокировали с помощью 0,5% (мас./об.) раствора BSA в PBS. Постоянное количество 10 нМ участка внеклеточного домена белка LEPR, который экспрессировали с Сконцевой меткой Fc человека (hLEPR.hFc; SEQ ID NO: 116), титровали антителами к LEPR, белком hLeptin или антителом изотипического контроля в диапазоне от 8,5 пМ до 500 нМ в серийном разведении. Эти комплексы антитело-белок или белок-белок затем инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре (RT). Затем комплексы переносили в микротитрационные планшеты, покрытые hLeptin и инкубировали в течение 2 ч при RT, лунки промывали и связанный с планшетом hLEPR.hFc выявляли с помощью поликлонального антитела к IgG человека, конъюгированного с пероксидазой редьки (Jackson ImmunoResearch Inc, №109-035-098). Образцы разводили с помощью раствора ТМВ (BD Biosciences, № 555214; субстрат А и В, смешанные в отношении 1:1, в соответствии с инструкциями производителя) с получением колориметрической реакции и затем нейтрализовали 1 М серной кислотой перед измерением поглощения при 450 нм на планшет-ридере Victor X5.In an ELISA, human leptin (hLeptin; R&D Systems, no. 398-LP-O1M) was coated at 5 μg/ml in PBS in a 96-well microtiter plate overnight at 4°C. The non-specific binding sites were then blocked with a 0.5% (w/v) solution of BSA in PBS. A constant amount of a 10 nM region of the extracellular domain of the LEPR protein that was expressed with a C-terminal human Fc (hLEPR.hFc; SEQ ID NO: 116) was titrated with anti-LEPR antibodies, hLeptin protein, or an isotype control antibody ranging from 8.5 pM to 500 nM in serial breeding. These antibody-protein or protein-protein complexes were then incubated for 1.5 hours at room temperature (RT). The complexes were then transferred to microtiter plates coated with hLeptin and incubated for 2 h at RT, the wells were washed and plate-bound hLEPR.hFc was detected using a polyclonal anti-human IgG antibody conjugated with radish peroxidase (Jackson ImmunoResearch Inc, no. 109-035- 098). Samples were diluted with TMB solution (BD Biosciences, #555214; substrate A and B mixed 1:1 according to manufacturer's instructions) to give a colorimetric reaction and then neutralized with 1 M sulfuric acid before absorbance was measured at 450 nm on a plate -reader Victor X5.

Анализ данных выполняли с помощью сигмоидальной функции доза-ответ в компьютерной программе Prism™ (GraphPad). Процент блокады при максимальной концентрации исследуемого антитела рассчитывали в виде показателя способности антител блокировать связывание 10 нМ hLEPR.hFc с лептином человека в планшете. При расчете связывающий сигнал от 10 нМ hLEPR.hFc без присутствия антитела представляли в виде 100% связывания или 0% блокирования; и сигнал исходного уровня буфера в отдельности без присутствия hLEPR.hFc представляли в виде 0% связывания или 100% блокирования. Данные о блокировании при концентрации антител 500 нМ обобщали в табл. 10.Data analysis was performed using a sigmoidal dose-response function in the Prism™ computer program (GraphPad). Percent blockade at the maximum concentration of test antibody was calculated as a measure of the ability of antibodies to block the binding of 10 nM hLEPR.hFc to human leptin in the plate. When calculating the binding signal from 10 nm hLEPR.hFc without the presence of antibodies was presented as 100% binding or 0% blocking; and baseline buffer signal alone without the presence of hLEPR.hFc was represented as 0% binding or 100% blocking. Data on blocking at an antibody concentration of 500 nm summarized in table. 10.

Как показано в табл. 10, никакие из антител к LEPR по настоящему изобретению не характеризовались >28% блокированием связывания hLEPR.hFc с поверхностью, покрытой hLeptin. В то же время антитело сравнения и hLeptin, в качестве положительного контроля, были способны блокировать 99% связывания hLEPR.hFc с поверхностью, покрытой hLeptin. Антитело изотипического контроля не проявляло никакого подлежащего измерению блокирования при концентрациях до 500 нМ.As shown in Table. 10, none of the anti-LEPR antibodies of the present invention exhibited >28% blocking of hLEPR.hFc binding to the hLeptin coated surface. At the same time, the reference antibody and hLeptin as a positive control were able to block 99% of the binding of hLEPR.hFc to the surface coated with hLeptin. The isotype control antibody showed no measurable blocking at concentrations up to 500 nM.

- 28 041859- 28 041859

Таблица 10. Результаты ELISA при блокировании связывания hLEPR.hFc с hLeptin антителами к LEPRTable 10 ELISA results blocking hLEPR.hFc binding to hLeptin anti-LEPR antibodies

Антитело Antibody Блокирование 500 нМ АЬ связывания 10 нМ hLEPR.hFc с hLeptin (% блокады) Blocking of 500 nM AB binding of 10 nM hLEPR.hFc to hLeptin (% blockade) Н4Н18487Р2 H4H18487R2 5 5 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 16 16 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 25 25 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 -3 -3 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 28 28 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 -5 -5 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 8 8 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 15 15 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 -7 -7 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 7 7 Н4Н173319Р2 Н4Н173319Р2 9 9 Н4Н173321Р2 H4H173321R2 6 6 Контроли controls Антитело изотипического контроля Isotype control antibody -3 -3 Лептин человека Human leptin 99 99 Антитело сравнения Reference antibody 99 99 Изотипический контроль IgG2a мыши Isotype control of mouse IgG2a 32 32

Пример 6. Связывание клеток при анализе FACS в случае HEK293/Мусх2-hLepR(ecto)-GPI заякоренных клеток.Example 6 Cell Binding in FACS Analysis of HEK293/Myx2-hLepR(ecto)-GPI Anchored Cells.

Лептиновый рецептор, LEPR, представляет собой однопроходный трансмембранный рецептор семейства рецепторов цитокинов I класса (Tartaglia et al. (1997) J Biol Chem 7:272(10):6093-6). LEPR может связываться с лептином, белком, преимущественно экспрессируемым жировой тканью, который участвует в регуляции потребления пищи и метаболизма (Friedman et al. (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8).The leptin receptor, LEPR, is a single-pass transmembrane receptor of the class I cytokine receptor family (Tartaglia et al. (1997) J Biol Chem 7:272(10):6093-6). LEPR can bind to leptin, a protein predominantly expressed by adipose tissue that is involved in the regulation of food intake and metabolism (Friedman et al. (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8).

В целях оценки связывания клеток антителами к LEPR получали стабильные клеточные линии HEK293. Одна клеточная, известная далее в настоящем документе как HEK293/hLEPR-GPI, стабильно экспрессировала внеклеточный домен LEPR человека (аминокислоты 22-839 с № доступа Р48357 (SEQ ID NO: 113), изоформа В) с N-концевой меткой myc-myc и С-концевой пептидной последовательностью от карбоксипептидазы человека М, которая управляет добавлением GPI (гликозилфосфатидилинозитола) (Deddish et al. (1990) J. Biological Chemistry 265:25:15083-89) таким образом, что белок может быть GPIзаякоренным по отношению к мембране. Другую клеточную линию HEK293 получали с целью стабильной экспрессии полноразмерного LEPR человека (аминокислоты 1-1165 с № доступа P48357(SEQ ГО NO: 113), изоформа В) совместно с люциферазным репортером (Stat3-люцифераза, Stat3-luc, SA Bioscience, № CLS-6028L), и она известна далее в настоящем документе как HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL. Клетки HEK293 только с Stat3-люциферазным репортером (HEK293/Stat3-luc) также получали в качестве контрольной клеточной линии.Stable HEK293 cell lines were obtained to evaluate cell binding by anti-LEPR antibodies. One cell, hereinafter referred to as HEK293/hLEPR-GPI, stably expressed the human LEPR extracellular domain (amino acids 22-839 with accession number P48357 (SEQ ID NO: 113), isoform B) with a myc-myc N-terminal tag and A C-terminal peptide sequence from human carboxypeptidase M which directs the addition of GPI (glycosylphosphatidylinositol) (Deddish et al. (1990) J. Biological Chemistry 265:25:15083-89) such that the protein can be GPI anchored to the membrane. Another HEK293 cell line was generated to stably express full-length human LEPR (amino acids 1-1165 accession no. P48357 (SEQ GO NO: 113), isoform B) together with a luciferase reporter (Stat3-luciferase, Stat3-luc, SA Bioscience, no. CLS -6028L) and is known hereinafter as HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL. HEK293 cells with only the Stat3-luciferase reporter (HEK293/Stat3-luc) were also generated as a control cell line.

При выполнении анализа FACS родительские клетки HEK293 и клетки HEK293/hLEPR-GPI разъединяли и помещали в 96-луночные планшеты с V-образным дном по 5x105 клеток/лунку в PBS, содержащем 2% FBS (буфер FACS). В целях исследования того, влияет ли на способность антител к hLEPR связываться с клетками присутствие лептина, буфер FACS с или без 1 мкМ лептина человека (R&D Systems, № 398-LP) инкубировали с клетками в течение 30 мин при 4°C с последующим добавлением антител к LEPR или контрольных антител при 10 нМ в буфере FACS. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин при 4°C с последующим промыванием и затем инкубацией с 16 мкл/мл конъюгированного с Alexa Fluor®-647 вторичного антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., № 109-547-003) в течение 30 минут при 4°C. Затем клетки фиксировали с помощью BD CytoFix™ (Becton Dickinson, № 554655), фильтровали и анализировали на проточном цитометре HyperCyt (Beckman Coulter). Контроли в видеWhen performing a FACS assay, HEK293 parental cells and HEK293/hLEPR-GPI cells were dissociated and plated in 96-well V-bottomed plates at 5x105 cells/well in PBS containing 2% FBS (FACS buffer). To investigate whether the ability of anti-hLEPR antibodies to bind to cells is affected by the presence of leptin, FACS buffer with or without 1 μM human leptin (R&D Systems, No. 398-LP) was incubated with cells for 30 min at 4°C followed by addition anti-LEPR antibodies or control antibodies at 10 nM in FACS buffer. Cells were then incubated for 30 min at 4°C followed by washing and then incubation with 16 μl/ml Alexa Fluor®-647 conjugated secondary antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., no. 109-547-003) for 30 minutes at 4°C. Cells were then fixed with BD CytoFix™ (Becton Dickinson, no. 554655), filtered and analyzed on a HyperCyt flow cytometer (Beckman Coulter). Controls in the form

- 29 041859 неокрашенных и вторичных антител в отдельности также исследовали по отношению ко всем клеточным линиям. Результаты анализировали с помощью компьютерной программы ForeCyt (IntelliCyt) и Flow Jo, версия 10, с определением геометрических средних флуоресценции для жизнеспособных клеток. Геометрическое среднее флуоресценции для каждого образца затем нормализовали по отношению к геометрическому среднему неокрашенных клеток с получением относительного связывания на условие, называемое коэффициентами связывания, и эти коэффициенты связывания отмечали для каждого исследуемого антитела.- 29 041859 unstained and secondary antibodies separately were also examined in relation to all cell lines. The results were analyzed with the ForeCyt software (IntelliCyt) and Flow Jo, version 10, with the determination of geometric mean fluorescence for viable cells. The geometric mean of fluorescence for each sample was then normalized with respect to the geometric mean of unstained cells to give relative binding to a condition called binding coefficients, and these binding coefficients were noted for each antibody tested.

Как показано в табл. 11, 9 антител к LEPR по настоящему изобретению, исследуемых при 10 нМ, характеризовались связыванием с клетками HEK293/hLEPR-GPI с коэффициентами связывания в диапазоне от 824 до 3374 без лептина. Антитела к LEPR также связывались в присутствии 1 мкМ лептина с коэффициентами связывания в диапазоне от 398 до 4184. Как показано в табл. 11, антитело сравнения, исследуемое при 10 нМ, характеризовалось связыванием с клетками HEK293/hLEPR-GPI с коэффициентом связывания 2349 без лептина, однако характеризовалось значительно меньшим связыванием с клетками в присутствии 1 мкМ лептина с коэффициентом связывания 112. Антитела к LEPR не проявляли никакого значимого связывания с родительскими клетками HEK293, при этом коэффициенты связывания с и без 1 мкМ лептина находились в диапазоне от 1 до 9. Образцы антител изотипического контроля и вторичных антител в отдельности также не характеризовались значимым связыванием ни с клеточной линией с лептином, ни с таковой без лептина, при этом коэффициенты связывания находились в диапазоне от 1 до 6.As shown in Table. 11, 9 anti-LEPR antibodies of the present invention tested at 10 nM exhibited binding to HEK293/hLEPR-GPI cells with binding ratios ranging from 824 to 3374 without leptin. Anti-LEPR antibodies also bind in the presence of 1 μM leptin with binding ratios ranging from 398 to 4184. As shown in Table. 11, the reference antibody tested at 10 nM had binding to HEK293/hLEPR-GPI cells with a binding factor of 2349 without leptin, but significantly less binding to cells in the presence of 1 μM leptin with a binding factor of 112. Anti-LEPR antibodies did not show any significant binding to parental HEK293 cells, with binding coefficients with and without 1 μM leptin ranging from 1 to 9. Isotype control and secondary antibody samples alone also did not show significant binding to either the leptin-containing or non-leptin cell line. , while the binding coefficients were in the range from 1 to 6.

Как показано в табл. 12, 4 антитела по настоящему изобретению, исследуемых при 70 нМ без лептина, характеризовались связыванием с клетками HEK293/hLEPR-GPI с коэффициентами связывания в диапазоне от 707 до 1131 и с клетками HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL с коэффициентами связывания в диапазоне от 42 до 51. Антитела к LEPR не проявляли никакого значимого связывания с родительскими клетками HEK293/Stat3-luc, при этом коэффициенты связывания находились в диапазоне от 1 до 8. Образцы антител изотипического контроля и вторичных антител в отдельности также не характеризовались значимым связыванием ни с какой из исследуемых клеточных линий, при этом коэффициенты связывания находились в диапазоне от 1 до 2.As shown in Table. 12, 4 antibodies of the present invention, tested at 70 nM without leptin, were characterized by binding to HEK293/hLEPR-GPI cells with binding coefficients ranging from 707 to 1131 and to HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL cells with binding coefficients in the range 42 to 51. Anti-LEPR antibodies did not show any significant binding to parental HEK293/Stat3-luc cells, with binding ratios ranging from 1 to 8. Samples of isotype control antibodies and secondary antibodies alone also did not show significant binding to either which of the studied cell lines, while the binding coefficients were in the range from 1 to 2.

- 30 041859- 30 041859

Таблица 11. Связывание 10 нМ антител к LEPR с клетками HEK293/hLEPR-GPI и родительскими клетками НЕК293 ± 1 мкМ лептина человекаTable 11. Binding of 10 nM anti-LEPR antibody to HEK293/hLEPR-GPI cells and parental HEK293 cells ± 1 µM human leptin

Коэффициент связывания: нормализованный к неокрашенному образцу каждой клеточной линии Binding coefficient: normalized to unstained sample of each cell line Без добавления лептина No added leptin 1 мкМ лептина 1 μM leptin Тип антитела Type of antibody Антитело Antibody Родительс кие клетки parent cells НЕК293/ hLEPRGPI HEK293/ hLEPRGPI Родител ьские клетки parental cells НЕК293/ hLEPR-GPI HEK293/ hLEPR-GPI Коэффициент связывания: нормализованный к неокрашенному образцу каждой клеточной линии Binding coefficient: normalized to unstained sample of each cell line Без добавления лептина No added leptin 1 мкМ лептина 1 µM leptin Тип антитела Type of antibody НЕК293 HEK293 НЕК293 HEK293 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 5 5 2420 2420 4 4 3124 3124 Агонистическое Agonistic Н4Н16679Р2 H4H16679R2 5 5 2058 2058 8 8 2223 2223 Агонистическое Agonistic Н4Н18417Р2 H4H18417R2 1 1 1835 1835 2 2 2604 2604 Потенцирующее Potentiating Н4Н18438Р2 H4H18438R2 2 2 1486 1486 3 3 2414 2414 Потенцирующее Potentiating Н4Н18445Р2 H4H18445R2 2 2 2016 2016 3 3 2488 2488 Потенцирующее Potentiating Н4Н18449Р2 H4N18449R2 5 5 3374 3374 9 9 3113 3113 Потенцирующее Potentiating Н4Н18482Р2 H4H18482R2 1 1 1966 1966 3 3 2704 2704 Потенцирующее Potentiating Н4Н18487Р2 H4H18487R2 1 1 2422 2422 3 3 2670 2670 Потенцирующее Potentiating Н4Н18492Р2 H4N18492R2 3 3 2603 2603 7 7 4184 4184 Потенцирующее Potentiating Антитело сравнения Antibody comparisons 6 6 2349 2349 3 3 112 112 н./о. But. Антитело изотипического контроля Isotype control antibody 1 1 6 6 2 2 4 4 н./о. But. Вторичное антитело в отдельности Secondary antibody alone 1 1 3 3 2 2 3 3 н./о. But. Неокрашенное unpainted 1 1 1 1 1 1 1 1 н./о. But.

*Классификация антител в виде агонистического или потенцирующего основано отчасти на результатах, наблюдаемых в примерах 7 и 8 настоящего документа*The classification of antibodies as agonist or potentiator is based in part on the results observed in Examples 7 and 8 of this document.

-31 041859-31 041859

Таблица 12. Связывание 70 нМ антител к LEPR с клетками HEK293/hLEPR-GPI, HEK293/Stat3-hLEPR-FL и родительскими клетками HEK293/Stat3-lucTable 12. Binding of 70 nM anti-LEPR antibodies to HEK293/hLEPR-GPI, HEK293/Stat3-hLEPR-FL cells and HEK293/Stat3-luc parental cells

Коэффициент связывания: нормализованный к неокрашенному образцу каждой клеточной линии Binding coefficient: normalized to unstained sample of each cell line Тип антитела Type of antibody Антитело Antibody НЕК293/ Stat3-luc HEK293/ stat3-luc НЕК293/ hLEPRGPI HEK293/ hLEPRGPI HEK293/Stat3-luc hLEPR-FL HEK293/Stat3-luc hLEPR-FL Н4Н16650Р2 H4H16650R2 6 6 707 707 42 42 Агонистическое Agonistic Н4Н16679Р2 H4H16679R2 8 8 1078 1078 51 51 Агонистическое Agonistic Н4Н17319Р2 H4H17319R2 7 7 1131 1131 47 47 Агонистическое Agonistic Н4Н17321Р2 H4H17321R2 7 7 1126 1126 46 46 Агонистическое Agonistic Антитело изотипического контроля Isotype control antibody 2 2 2 2 2 2 Вторичное антитело в отдельности Secondary antibody alone 1 1 1 1 1 1 Неокрашенное unpainted 1 1 1 1 1 1

Пример 7. Антитела к LEPR по настоящему изобретению активируют передачу сигнала посредством LEPR в присутствии или отсутствии лептина.Example 7 Anti-LEPR antibodies of the present invention activate LEPR signaling in the presence or absence of leptin.

Разработали биоанализ в целях выявления транскрипционной активности STAT3 в результате активации LEPR с помощью репортерной клеточной линии, которая стабильно экспрессировала полноразмерный LEPR человека (hLEPR; аминокислоты с 1 по 1165 под номером доступа NP_002294.2) совместно с люциферазным репортером (STAT3-Luc; Qiagen, # CLS-6028L) в клеточной линии IMR-32, клеточной линии нейробластомы человека. Образующуюся стабильную клеточную линию, называемую IMR32/STAT3-Luc/hLEPR, выделяли и поддерживали в среде МЕМ-Эрла с добавкой 10% FBS, NEAA, 1 мкг/мл пуромицина, 100 мкг/мл гигромицина В и пенициллина/стрептомицина/L-глутамина (полная среда).A bioassay was developed to detect transcriptional activity of STAT3 as a result of LEPR activation using a reporter cell line that stably expressed full-length human LEPR (hLEPR; amino acids 1 to 1165 accession number NP_002294.2) in conjunction with a luciferase reporter (STAT3-Luc; Qiagen, #CLS-6028L) in the IMR-32 cell line, a human neuroblastoma cell line. The resulting stable cell line, termed IMR32/STAT3-Luc/hLEPR, was isolated and maintained in MEM-Earl medium supplemented with 10% FBS, NEAA, 1 μg/ml puromycin, 100 μg/ml hygromycin B, and penicillin/streptomycin/L-glutamine (full environment).

Полученный биоанализ использовали для измерения влияния антител к LEPR по настоящему изобретению на передачу сигнала посредством LEPR в присутствии или отсутствии лептина. При применении биоанализа клетки IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR помещали в планшет при плотности 20000 клеток/100 мкл/лунку в 96-луночном формате в полной среде, а на следующий день заменяли соответствующим объемом среды Opti-МЕМ с добавкой 1% BSA и 0,1% FBS (аналитический буфер) в течение 30 мин. Для измерения влияния антител по настоящему изобретению в отсутствии лептина антитела к LEPR или антитело изотипического контроля и лептин человека (hLeptin; R&D Systems, № 398-LP) полулогарифмическим путем серийно разводили до конечных концентраций в диапазоне от 100 нМ до 300 фМ в аналитическом буфере, которые добавляли к клеткам и затем инкубировали в течение ночи при 37°C в 5% CO2.The resulting bioassay was used to measure the effect of the anti-LEPR antibodies of the present invention on LEPR signaling in the presence or absence of leptin. When using the bioassay, IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR cells were plated at a density of 20,000 cells/100 μl/well in a 96-well format in complete medium and replaced with an appropriate volume of Opti-MEM supplemented with 1% BSA the following day. and 0.1% FBS (assay buffer) for 30 min. To measure the effect of the antibodies of the present invention in the absence of leptin, an anti-LEPR antibody or an isotype control antibody and human leptin (hLeptin; R&D Systems, No. 398-LP) were serially diluted semilogarithmically to final concentrations ranging from 100 nM to 300 fM in assay buffer, which were added to the cells and then incubated overnight at 37°C in 5% CO2.

Для измерения влияния антител по настоящему изобретению в присутствии лептина фиксированную концентрацию лептина человека при 200 пМ в аналитическом буфере добавляли к клеткам, незамедлительно с последующим добавлением антител к LEPR или антитела изотипического контроля, которые полулогарифмическим путем серийно разводили до конечным концентраций в диапазоне от 100 нМ до 300 фМ. Затем образцы инкубировали в течение ночи при 37°C в 5% CO2. Затем реагент OneGlo (Promega, № Е6051) добавляли к образцам и люциферазную активность измеряли на многоканальном планшет-ридере Envision (Perkin Elmer) в люминесцентном режиме. Получали значения относительных световых единиц (RLU) и результаты анализировали с помощью нелинейной регрессии с применением компьютерной программы GraphPad Prism (GraphPad). Максимальное значение RLU, полученное из кривой доза-эффект для hLeptin определяли в виде 100% активации в анализе IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR.To measure the effect of the antibodies of the present invention in the presence of leptin, a fixed concentration of human leptin at 200 pM in assay buffer was added to cells, immediately followed by the addition of anti-LEPR antibodies or isotype control antibodies that were serially diluted semilogarithmically to final concentrations ranging from 100 nM to 300 fM. The samples were then incubated overnight at 37°C in 5% CO2. The OneGlo reagent (Promega, #E6051) was then added to the samples and luciferase activity was measured on an Envision multichannel plate reader (Perkin Elmer) in luminescent mode. Relative light units (RLU) values were obtained and the results were analyzed by non-linear regression using the computer program GraphPad Prism (GraphPad). The maximum RLU value derived from the dose-response curve for hLeptin was determined as 100% activation in the IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR assay.

Как показано в табл. 13, в исследовании 1 в отсутствии hLeptin, все из исследуемых антител к LEPR оказывали слабую стимуляцию на клетки IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, при этом значения EC50 находились в диапазоне от 134 пМ до 11,9 нМ, а максимальная активация в диапазоне от 5% до 13% соответственно по отношению к максимальной активации, наблюдаемой из кривой доза-эффект для hLeptin. В исследовании 2 в отсутствии hLeptin, 4 исследуемых антитела к LEPR оказывали стимуляцию на клетки IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, при этом значения EC50 находились в диапазоне от 61,9 до 206,9 пМ, а максимальная активация в диапазоне от 65 до 68% по отношению к максимальной активации, наблюдаемой из кривой доза-эффект для hLeptin. В исследовании 1 в присутствии 200 пМ hLeptin, все из исследуемыхAs shown in Table. 13, in study 1, in the absence of hLeptin, all of the tested anti-LEPR antibodies had weak stimulation on IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR cells, with EC50 values ranging from 134 pM to 11.9 nM, and maximum activation in range from 5% to 13%, respectively, in relation to the maximum activation observed from the dose-response curve for hLeptin. In study 2, in the absence of hLeptin, 4 anti-LEPR antibodies studied stimulated IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR cells with EC50 values ranging from 61.9 to 206.9 pM and maximum activation ranging from 65 up to 68% of the maximum activation observed from the hLeptin dose-response curve. In study 1, in the presence of 200 pM hLeptin, all of the study

- 32 041859 антител к LEPR оказывали стимуляцию на клетки IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, при этом значения ЕС50 находились в диапазоне от 20,2 до 523 пМ, а максимальная активация в диапазоне от 66 до 107% по отношению к максимальной активации, наблюдаемой из кривой доза-эффект для hLeptin. Поскольку эти антитела усиливали индуцированную лептином передачу сигнала посредством LEPR, эти антитела классифицировали в качестве потенцирующих средств, как определено в настоящем документе. В исследовании 2 в присутствии hLeptin, четыре 200 пМ исследуемых антитела к LEPR оказывали стимуляцию на клетки IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, при этом значения EC₅₀ находились в диапазоне от 51,9 до 257,3 пМ, а максимальная активация в диапазоне от 76 до 88% по отношению к максимальной активации, наблюдаемой из кривой доза-эффект для hLeptin. Передачу сигнала посредством LEPR ощутимо не усиливали с помощью этих антител в присутствии лептина. Антитело изотипического контроля не оказывало никакой подлежащей измерению стимуляции на клетки IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR ни в каком из анализов.- 32 041859 anti-LEPR antibodies stimulated IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR cells with EC50 values ranging from 20.2 to 523 pM and maximum activation ranging from 66 to 107% of maximum activation observed from the dose-response curve for hLeptin. Because these antibodies enhanced leptin-induced signaling by LEPR, these antibodies were classified as potentiators as defined herein. In study 2, in the presence of hLeptin, four 200 pM anti-LEPR antibodies of interest stimulated IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR cells with EC ₅₀ values ranging from 51.9 to 257.3 pM and maximum activation at range from 76 to 88% relative to the maximum activation observed from the dose-response curve for hLeptin. LEPR signaling was not significantly enhanced by these antibodies in the presence of leptin. The isotype control antibody did not exert any measurable stimulation on IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR cells in any of the assays.

Таблица 13. Активация hLEPR антителами к LEPRTable 13. Activation of hLEPR by Anti-LEPR Antibodies

IMR-32/LEPR без лептина человека IMR-32/LEPR without human leptin IMR-32/LEPR с 200 пМ лептина человека IMR-32/LEPR with 200 pM human leptin Антитело Antibody ЕС₅₀ (М)EU ₅₀ (M) % активации % activation ЕС₅₀ (М)EU ₅₀ (M) % активации % activation Исследование 1 Study 1 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 1Д9Е-08 1D9E-08 5 5 4,10Е-10 4.10E-10 97 97 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 3,73Е-10 3.73E-10 6 6 3,42Е-11 3.42E-11 68 68 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 2Д2Е-10 2D2E-10 13 13 5,23Е-11 5.23E-11 66 66 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 1,49Е-09 1.49Е-09 5 5 2,02Е-11 2.02E-11 76 76 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 2,69Е-10 2.69Е-10 7 7 1,69Е-10 1.69Е-10 94 94 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 8,01Е-10 8.01Е-10 6 6 4,10Е-10 4.10E-10 107 107 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 1,34Е-10 1.34Е-10 5 5 2,74Е-11 2.74Е-11 94 94 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 1,53Е-10 1.53Е-10 5 5 5,23Е-10 5.23E-10 87 87 Исследование 2 Study 2 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 6,19Е-11 6.19E-11 68 68 5,19Е-11 5.19E-11 88 88 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 8,62Е-11 8.62E-11 65 65 7,37Е-11 7.37E-11 88 88 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 1,867Е-10 1.867E-10 68 68 1,914Е-10 1.914E-10 76 76 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 2,069Е-10 2.069E-10 66 66 2,573Е-10 2.573E-10 76 76

Пример 8. Антитела к LEPR по настоящему изобретению активируют передачу сигнала в клетках, экспрессирующих мутанты LEPR с дефектом передачи сигнала или с нарушением передачи сигнала.Example 8 The anti-LEPR antibodies of the present invention activate signal transduction in cells expressing LEPR mutants with a defect in signal transduction or with impaired signal transduction.

Идентифицировали мутанты LEPR, которые характеризовались опосредованным лептином дефектом или нарушением передачи сигнала и их ассоциировали с ожирением на ранней стадии. Например, LEPR-A409E представлял собой мутантный белок LEPR с дефектом передачи сигнала, который не передавал сигналы посредством лептина к STAT3; мутант А409Е изначально выявляли как моногенную причину ожирения на ранней стадии (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). LEPR-P316T представлял собой мутантный белок LEPR с нарушением передачи сигнала, который также, как было показано, ассоциирован с ожирением на ранней стадии (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464).LEPR mutants were identified that were characterized by a leptin-mediated defect or signal transduction disorder and were associated with early obesity. For example, LEPR-A409E was a signaling defective mutant LEPR protein that did not signal via leptin to STAT3; the A409E mutant was initially identified as a monogenic cause of early obesity (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). LEPR-P316T was a mutant LEPR protein with impaired signaling that has also been shown to be associated with early stage obesity (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464).

В этом примере оценивали способность антител к LEPR по настоящему изобретению стимулировать передачу сигнала посредством LEPR в клеточных линиях, экспрессирующих мутанты LEPR с дефектом передачи сигнала или нарушением передачи сигнала. В частности, конструировали репортерные клеточные линии (HEK293), экспрессирующие либо LEPR дикого типа, либо LEPR-A409E (с дефектом передачи сигнала), либо LEPR-P316T (с нарушением передачи сигнала). Клетки обрабатывали либо только основой, рекомбинантным лептином человека, контрольным IgG либо агонистическими антителами к LEPR по настоящему изобретению (Н4Н16650 или Н4Н16679), и определяли степень передачи сигнала посредством LEPR (как измеряется с помощью выявления при вестерн-блоттинге экспрессии pSTAT3-Y705 по отношению к экспрессии STAT3).In this example, the ability of the anti-LEPR antibodies of the present invention to stimulate signaling by LEPR in cell lines expressing LEPR mutants with signaling defect or signal transduction was evaluated. In particular, reporter cell lines (HEK293) were constructed to express either wild-type LEPR or LEPR-A409E (signal defect) or LEPR-P316T (signal defect). Cells were treated with either base alone, recombinant human leptin, control IgG, or the anti-LEPR agonist antibodies of the present invention (H4H16650 or H4H16679) and the degree of LEPR signaling was determined (as measured by Western blot detection of pSTAT3-Y705 expression against STAT3 expression).

Было показано, что агонистические антитела к LEPR по настоящему изобретению (Н4Н16650 и Н4Н16679) стимулировали передачу сигнала посредством LEPR в клетках, экспрессирующих мутант LEPR-A409E или мутант LEPR-P316T (как измеряется с помощью экспрессии STAT3) дозозависимымThe LEPR agonist antibodies of the present invention (H4H16650 and H4H16679) were shown to stimulate LEPR signaling in cells expressing the LEPR-A409E mutant or the LEPR-P316T mutant (as measured by STAT3 expression) in a dose dependent manner.

- 33 041859 образом (фиг. 2, панели В и С). В отличие от этого, обработка лептином индуцировала лишь незначительную передачу сигнала в клетках, экспрессирующих мутант LEPR-P316T, и не индуцировала передачу сигнала в клетках, экспрессирующих LEPR-A409E (фиг. 2, панель А). Более того, передачи сигнала посредством LEPR не выявляли ни в какой из клеточных линий, обработанных основой или контрольным антителом IgG (данные не показаны). Другие мутанты LEPR с дефектом передачи сигнала или нарушением передачи сигнала исследовали в этом анализе, но не активировали мутантами к LEPR (данные не показаны), указывая на то, что этот вспомогательный эффект мог быт зависимым от мутантов.- 33 041859 way (Fig. 2, panels B and C). In contrast, leptin treatment induced only negligible signaling in cells expressing the LEPR-P316T mutant and did not induce signaling in cells expressing LEPR-A409E (FIG. 2, panel A). Moreover, signaling by LEPR was not detected in any of the cell lines treated with base or control IgG antibody (data not shown). Other LEPR mutants with defective signaling or impaired signaling were explored in this assay, but were not activated with mutants to LEPR (data not shown), indicating that this accessory effect might be mutant dependent.

Результаты этого примера указывали на то, что агонистические антитела к LEPR по настоящему изобретению могут быть применимы в лечении заболеваний и нарушений (например, ожирения на ранней стадии), которые вызваны или ассоциированы с мутантами LEPR с дефектом передачи сигнала или нарушением передачи сигнала (например, LEPR-P316T или LEPR-A409E).The results of this example indicated that the anti-LEPR agonist antibodies of the present invention may be useful in the treatment of diseases and disorders (e.g., early stage obesity) that are caused by or associated with LEPR mutants with a signal transduction defect or aberration (e.g., LEPR-P316T or LEPR-A409E).

Пример 9. Перекрестная конкуренция в Octet между различными моноклональными антителами к LEPR.Example 9 Octet cross-competition between different anti-LEPR monoclonal antibodies.

Конкуренцию за связывание панели различных моноклональных антител к LEPR определяли с помощью безмаркерного интерферометрического анализа биослоев в реальном времени на биосенсорной платформе Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Весь эксперимент выполняли при 25°C в буфере, содержащем 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05 об.% поверхностно-активного вещества Tween-20, 1 мг/мл BSA, рН 7,4 (HBS-EBT) при встряхивании планшета со скоростью 1000 об/мин. Для оценки того, способны ли два антитела конкурировать друг с другом за связывание со своими соответствующими эпитопами на рекомбинантном LEPR человека, экспрессируемом с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), около 0,25 нм или 0,34 нм hLEPR-MMH сначала захватывали на биосенсорные кончики Octet, покрытые антителом к пента-His (Fortebio Inc, № 18-5122) в результате погружения биосенсорных кончиков в течение 5 мин в лунки, содержащие 20 мкг/мл hLEPRMMH. Биосенсорные кончики с захваченным антигеном затем насыщали первым моноклональным антителом к LEPR (впоследствии называемым mAb-1) погружением в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора mAb-1 в течение 210 с. Затем биосенсорные кончики погружали в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора второго моноклонального антитела к LEPR (впоследствии называемого mAb-2) в течение 150 с. Биосенсорные кончики промывали в буфере HBS-EBT в промежутке между каждой стадией эксперимента. Ответ при связывании в реальном времени контролировали в течение всего хода эксперимента и ответ при связывании в конце каждой стадии фиксировали. Ответ при связывании mAb-2 с hLEPR-MMH, предварительно образующим комплекс с mAb-1, сравнивали и конкурентное/неконкурентное поведение моноклональных антител к LEPR определяли, как показано в табл. 14 и 15.Competition for panel binding of different monoclonal antibodies to LEPR was determined using real-time marker-free interferometric analysis of biolayers on the Octet HTX biosensor platform (Pall ForteBio Corp.). The entire experiment was performed at 25° C. in buffer containing 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.05 vol% Tween-20 surfactant, 1 mg/ml BSA, pH 7.4 (HBS- EBT) by shaking the plate at 1000 rpm. To assess whether two antibodies are able to compete with each other for binding to their respective epitopes on recombinant human LEPR expressed with a myc-myc C-terminal hexahistidine tag (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), about 0.25 nm or 0.34 nm hLEPR-MMH was first captured on Octet biosensor tips coated with anti-penta-His antibody (Fortebio Inc, no. 18-5122) by immersing the biosensor tips for 5 min in wells containing 20 μg/ml hLEPRMMH. Antigen-captured biosensor tips were then saturated with the first anti-LEPR monoclonal antibody (hereinafter referred to as mAb-1) by immersion in wells containing 50 μg/ml mAb-1 solution for 210 seconds. The biosensor tips were then immersed in wells containing a 50 μg/ml solution of a second anti-LEPR monoclonal antibody (hereinafter referred to as mAb-2) for 150 seconds. Biosensor tips were washed in HBS-EBT buffer between each step of the experiment. The real-time binding response was monitored throughout the course of the experiment and the binding response at the end of each step was recorded. The mAb-2 binding response to hLEPR-MMH previously complexed with mAb-1 was compared and the competitive/non-competitive behavior of anti-LEPR monoclonal antibodies was determined as shown in Table 1. 14 and 15.

- 34 041859- 34 041859

Таблица 14. Перекрестная конкуренция между различными моноклональными антителами к LEPRTable 14. Cross-competition between different monoclonal antibodies to LEPR

Связывание первого антитела (mAb-1) с захваченным hLEPR-MMH Н4Н18492Р2 Binding of the first antibody (mAb-1) to captured hLEPR-MMH H4N18492R2 Второе антитело (mAb-2), конкурирующее с шАЬ-1 Н4Н18417Р2 Н4Н18438Р2 Second antibody (mAb-2) competing with mAb-1 H4H18417R2 H4H18438R2 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 Н4Н18438Р2 H4H18438R2 Н4Н18492Р2 H4N18492R2 Н4Н18417Р2 H4H18417R2 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 Н4Н18446Р2 H4H18446R2 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 Н4Н18487Р2 H4H18487R2 Н4Н18445Р2 H4H18445R2 Н4Н18482Р2 H4H18482R2 Н4Н18449Р2 H4N18449R2 Отсутствует Absent Антитело сравнения Reference antibody Отсутствует Absent

Таблица 15. Перекрестная конкуренция между различными моноклональными антителами к LEPRTable 15. Cross-competition between different monoclonal antibodies to LEPR

шАЬ-1 SHAL-1 шАЬ-2, которое конкурирует с шАЬ-1 wal-2, which competes with wal-1 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 Н4Н16650Р2 H4H16650R2

- 35 041859- 35 041859

Пример 10. Эффективность in vivo агонистических антител к LEPR Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 и Н4Н17321Р2 в индуцибельной мышиной модели недостаточности лептина.Example 10 In vivo efficacy of anti-LEPR agonist antibodies H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 and H4H17321P2 in an inducible mouse model of leptin deficiency.

Эффекты четырех специфических агонистических антител к LEPR по настоящему изобретению, Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 и Н4Н17321Р2, на потребление пищи, массу тела и отложение жира определяли в индуцибельной модели недостаточности лептина у генетически сконструированных мышей LEPR^Hu/Hu, которые экспрессировали лептиновый рецептор, который состоит из последовательности эктодомена LEPR человека вместо мышиной последовательности эктодомена LEPR. Модель недостаточности лептина индуцировали с помощью гидродинамической доставки ДНК (HDD) плазмиды, кодирующей hFc-меченый эктодомен LEPR мыши (называемый в настоящем документе mLEPR.hFc или лептиновая ловушка; SEQ ID NO: 120). Лептиновая ловушка при экспрессии секретировалась и связывала циркулирующий лептин. После HDD 50 мкг конструкции ДНК, кодирующей лептиновую ловушку, мыши характеризовались повышенным потреблением пищи, повышенным отложением жира и массой тела.The effects of the four specific anti-LEPR agonist antibodies of the present invention, H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 and H4H17321P2, on food intake, body weight, and fat deposition were determined in an inducible model of leptin deficiency in genetically engineered ^Hu/Hu LEPR mice that expressed the leptin receptor, which consists from a human LEPR ectodomain sequence instead of a mouse LEPR ectodomain sequence. The leptin deficiency model was induced by hydrodynamic DNA delivery (HDD) of a plasmid encoding the hFc-tagged mouse LEPR ectodomain (herein referred to as mLEPR.hFc or leptin trap; SEQ ID NO: 120). The leptin trap, when expressed, was secreted and bound circulating leptin. After HDD 50 μg of the DNA construct encoding the leptin trap, mice were characterized by increased food intake, increased fat deposition and body weight.

Суточное потребление пищи на исходном уровне измеряли между 7-м и 4-м днями перед введением лептиновой ловушки (-7-й и -4-й дни). На 0-й день, 35 самцов мышей LEPR^Hu/Hu в возрасте от 13 до 17 недель успешно подвергали воздействию HDD с лептиновой ловушкой. На 6-й и 13-й дни после HDD собирали образцы крови из ретроорбитального синуса и состав тела, в том числе отложение жира, определяли количественно с помощью μCT. На 7-й день после HDD мышей рандомизировали в 5 групп по 7 мышей на основе процента изменения массы тела начиная с 0-го дня. Каждая группа получала посредством подкожной инъекции либо однократную дозы антитела изотипического контроля при 3 мг/кг, либо Н4Н16650Р2 при 3 мг/кг, либо Н4Н16679Р2 при 3 мг/кг, либо Н4Н17319Р2 при 3 мг/кг, либо Н4Н17321 при 3 мг/кг. Антитело изотипического контроля не связывало никакого известного белка мыши. Потребление пищи и массу тела измеряли для каждого животного во время исследования. На фиг. 3 обобщено среднее суточное потребление пищи для каждой группы обработки. На фиг. 3 пунктирная линия представляет среднее потребление пищи на исходном уровне перед инъекцией в виде HDD. Процентное изменение массы тела от 0-го дня рассчитывали для каждого животного в каждой временной точке. На фиг. 4 обобщен средний процент изменения массы тела для животных в каждой группе обработки антителами. На фиг. 5 обобщена средняя масса жировой ткани для животных в каждой группе обработки, определенная количественно с помощью μCT за 1 день до и через 6 дней после обработки антителами. Все результаты выражали в виде среднего ± SEM.Daily food intake at baseline was measured between days 7 and 4 before the administration of the leptin trap (-7 and -4 days). On day 0, 35 male ^Hu/Hu LEPR mice aged 13 to 17 weeks were successfully exposed to leptin trap HDD. On days 6 and 13 after HDD, retroorbital sinus blood samples were collected and body composition, including fat deposition, was quantified by μCT. On day 7 after HDD, mice were randomized into 5 groups of 7 mice based on the percentage change in body weight since day 0. Each group received by subcutaneous injection either a single dose of isotype control antibody at 3 mg/kg, or H4H16650P2 at 3 mg/kg, or H4H16679P2 at 3 mg/kg, or H4H17319P2 at 3 mg/kg, or H4H17321 at 3 mg/kg. The isotype control antibody did not bind any known mouse protein. Food intake and body weight were measured for each animal during the study. In FIG. 3 summarizes the average daily food intake for each treatment group. In FIG. 3, the dotted line represents mean food intake at baseline before HDD injection. The percentage change in body weight from day 0 was calculated for each animal at each time point. In FIG. 4 summarizes the mean percentage change in body weight for animals in each antibody treatment group. In FIG. 5 summarizes the mean body fat mass for animals in each treatment group, quantified by µCT 1 day before and 6 days after antibody treatment. All results were expressed as mean ± SEM.

Как показано на фиг. 3 и 4, после HDD лептиновой ловушкой аналогичные повышения потребления пищи и процента изменения массы тела наблюдали в группах мышей перед обработкой антителами. Как показано на фиг. 3, мыши, обработанные антителами Н4Н16650Р2 или Н4Н16679Р2 при 3 мг/кг, характеризовались значимыми снижениями потребления пищи через один день после обработки антителами (8-й день после HDD) и в последующие временные точки, измеренные по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию антитела изотипического контроля. Мыши, обработанные антителами Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при 3 мг/кг, характеризовались значимым снижением потребления пищи через два дня после обработки антителами (9-й день после HDD) и в другие последующие временные точки, измеренные по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию антитела изотипического контроля. Как показано на фиг. 4, мыши, обработанные антителом Н4Н16650Р2 при 3 мг/кг, характеризовались значимым снижением процента изменения массы тела через один день после обработки антителами (8-й день после HDD) и в другие последующие временные точки, измеренные по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию антитела изотипического контроля. Через один день после обработки антителами, на 8-й день, мыши, обработанные изотипическим контролем, характеризовались повышением массы тела на 21,16±1,27% начиная с 0-го дня, в то время как мыши, обработанные Н4Н16650Р2, характеризовались повышением массы тела на 15,57 ± 0,9% начиная с 0-го дня. Мыши, обработанные антителами Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при 3 мг/кг, характеризовались значимым снижением процента изменения массы тела через два дня после обработки антителами (9-й день после HDD) и в другие последующие временные точки, измеренные по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию антитела изотипического контроля.As shown in FIG. 3 and 4, after leptin trap HDD, similar increases in food intake and percentage change in body weight were observed in the groups of mice before antibody treatment. As shown in FIG. 3, mice treated with antibodies H4H16650P2 or H4H16679P2 at 3 mg/kg had significant decreases in food intake one day after antibody treatment (day 8 post-HDD) and at subsequent time points measured compared to mice injected with antibody. isotype control. Mice treated with antibodies H4H17319P2 or H4H17321P2 at 3 mg/kg had a significant decrease in food intake two days after antibody treatment (day 9 after HDD) and at other subsequent time points measured compared to mice injected with isotype antibody. control. As shown in FIG. 4, mice treated with antibody H4H16650P2 at 3 mg/kg had a significant reduction in percent body weight change one day after antibody treatment (day 8 post-HDD) and at other subsequent time points measured compared to mice injected with isotype control antibodies. One day after antibody treatment, on day 8, mice treated with isotype control showed a 21.16 ± 1.27% increase in body weight from day 0, while mice treated with H4H16650P2 showed an increase body weight by 15.57 ± 0.9% starting from day 0. Mice treated with antibodies H4H16679P2, H4H17319P2, or H4H17321P2 at 3 mg/kg showed a significant reduction in percent body weight change two days after antibody treatment (day 9 post-HDD) and at other subsequent time points measured compared to mice treated with was injected with an isotype control antibody.

На 9-й день % изменений массы тела начиная с 0-го дня составлял 23,18±1,22, 13,17±1,05, 12,95±1,26, 15,98±1,78 и 15,83±2,01 в случае мышей, обработанных изотопическим контролем, Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 соответственно. Как показано на фиг. 5, мыши, обработанные изотипическим контролем при 3 мг/кг, характеризовались значимым повышением массы жировой ткани через 6 дней после обработки антителами (13-й день после HDD) по сравнению с 1-м днем до обработки антителами (6-й день после HDD). Мыши, обработанные антителами Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2, Н4Н17319Р2 или Н4Н17321Р2 при 3 мг/кг не прибавляли в массе жировой ткани после обработки антителами по сравнению с предварительной обработкой антителами. Через 6 дней после обработки (13-й день после HDD) мыши, обработанные антителами Н4Н16650Р2, Н4Н16679Р2 или Н4Н17319Р2 при 3 мг/кг, характеризовались значимыми снижениями массы жировой ткани по сравнению с мышами, обработанными антителом изотипического контроля при 3 мг/кг.On day 9, the % change in body weight since day 0 was 23.18±1.22, 13.17±1.05, 12.95±1.26, 15.98±1.78, and 15. 83 ± 2.01 for mice treated with isotopic control, H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2, or H4H17321P2, respectively. As shown in FIG. 5, mice treated with isotype control at 3 mg/kg had a significant increase in adipose tissue mass 6 days after antibody treatment (day 13 after HDD) compared to day 1 before antibody treatment (day 6 after HDD). ). Mice treated with antibodies H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2, or H4H17321P2 at 3 mg/kg did not gain in body fat after antibody treatment compared to antibody pretreatment. At 6 days post-treatment (day 13 post-HDD), mice treated with H4H16650P2, H4H16679P2, or H4H17319P2 antibodies at 3 mg/kg had significant reductions in body fat mass compared to mice treated with isotype control antibody at 3 mg/kg.

- 36 041859- 36 041859

Пример 11. Картирование эпитопов при связывании Н4Н16650Р2 с лептиновым рецептором человека (hLEPR.mmh) с помощью водородно-дейтериевого обмена.Example 11 Epitope mapping of H4H16650P2 binding to the human leptin receptor (hLEPR.mmh) by hydrogen-deuterium exchange.

Эксперименты проводили в целях определения аминокислотных остатков hLEPR.mmh (аминокислоты M1-D839 SEQ ID NO: 114), с которыми взаимодействует Н4Н16650Р2. Для этой цели проводили картирование эпитопов масс-спектрометрией с помощью H/D обмена. Общее описание способа H/D обмена изложено, например, в Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; и Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.Experiments were performed to determine the amino acid residues hLEPR.mmh (amino acids M1-D839 SEQ ID NO: 114) with which H4H16650P2 interacts. For this purpose, epitope mapping was performed by mass spectrometry using H/D exchange. A general description of the H/D exchange method is set forth in, for example, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; and Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.

Экспериментальная процедура.experimental procedure.

Эксперименты HDX-MS выполняли на интегрированной платформе Waters HDX/MS, состоящей из системы HDX PAL Leaptec для мечения дейтерием, Acquity M-Class Waters (вспомогательное устройство для растворителей) для переваривания и загрузки образцов, Acquity M-Class Waters (устройство для растворителей μBinary) для аналитического градиента колонки и масс-спектрометра Synapt G2-Si для измерения массы пептидов после пептического гидролиза.HDX-MS experiments were performed on an integrated Waters HDX/MS platform, consisting of Leaptec's HDX PAL system for deuterium labeling, Acquity M-Class Waters (solvent accessory) for sample digestion and loading, Acquity M-Class Waters (μBinary solvent device). ) for the analytical column gradient and the Synapt G2-Si mass spectrometer for measuring the mass of peptides after peptic hydrolysis.

Метящий раствор получали в 10 мМ PBS буфере в D₂O при pD 7,0 (эквивалент рН 6,6). Для мечения дейтерия 3,8 мкл hLEPR.mmh (8 пмоль/мкл) или hLEPR.mmh, предварительно смешанного с антителом в молярном соотношении 2:1, инкубировали с 56,2 мкл D2O метящего раствора в течение различных временных точек (например, недейтерированный контроль = 0 с, меченый в течение 1 мин и 20 мин). Дейтерирование останавливали в результате переноса 50 мкл образца к 50 мкл предварительно охлажденного охлаждающего буфера (0,2 М ТСЕР, 6 М гуанидина хлорида в 100 мМ фосфатного буфера, рН 2,5) и смешанный образец инкубировали при 1,0°C в течение двух минут. Образец с приостановленной реакцией затем вводили в устройство HDX Waters для онлайн переваривания пепсином/протеазой XIII. Переваренные пептиды захватывали на предварительную колонку VanGuard ACQUITY UPLC ВЕН С18 1,7мкм, 2,1x5 мм, при 0°C и элюировали в аналитическую колонку ACQUITY UPLC ВЕН С18 1,7-мкм, 1,0x50 мм, в течение 9-минутного градиентного разделения 5-40% В (подвижная фаза А: 0,1% муравьиная кислота в воде, подвижная фаза В: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Масс-спектрометр устанавливали при напряжении на конусе, составляющем 37 В, времени сканирования, составляющем 0,5 секунд, и диапазоне масса/заряд, составляющем 50-1700 Th.The labeling solution was prepared in 10 mM PBS buffer in D ₂ O at pD 7.0 (equivalent to pH 6.6). For deuterium labeling, 3.8 µl of hLEPR.mmh (8 pmol/µl) or hLEPR.mmh premixed with antibody at a 2:1 molar ratio was incubated with 56.2 µl of D2O labeling solution for various time points (e.g., non-deuterated control = 0 s, labeled for 1 min and 20 min). Deuteration was stopped by transferring 50 µl of the sample to 50 µl of pre-chilled cooling buffer (0.2 M TCEP, 6 M guanidine chloride in 100 mM phosphate buffer, pH 2.5) and the mixed sample was incubated at 1.0°C for two minutes. The paused sample was then injected into an HDX Waters online pepsin/protease XIII digester. Digested peptides were captured onto a VanGuard ACQUITY UPLC VEN C18 1.7 µm, 2.1x5 mm pre-column at 0°C and eluted onto an ACQUITY UPLC VEN C18 analytical column 1.7-µm, 1.0x50 mm, over a 9-minute gradient separation 5-40% B (mobile phase A: 0.1% formic acid in water, mobile phase B: 0.1% formic acid in acetonitrile). The mass spectrometer was set up with a cone voltage of 37 V, a scan time of 0.5 seconds, and a mass/charge range of 50-1700 Th.

Для идентификации пептидов из LEPR человека данные LC-MSE, полученные на основе недейтерированного образца, обрабатывали и проводили поиск по отношению к базе данных, в том числе LEPR человека, пепсина и других рандомизированных последовательностей с помощью компьютерной программы Waters ProteinLynx Global Server (PLGS). Идентифицированные пептиды импортировали в компьютерную программу DynamX и фильтровали с помощью двух критериев: 1) минимальные продукты на аминокислоту: 0,2, и 2) предел повтора в файле: 3. Компьютерная программа DynamX затем автоматически определяла захват каждого пептида на основе времени удерживания и высокой точности массы (<10 ppm) во многих временных точках с 3 повторами в каждое время.To identify peptides from human LEPR, LC-MSE data derived from a non-deuterated sample was processed and searched against a database including human LEPR, pepsin, and other randomized sequences using the Waters ProteinLynx Global Server (PLGS) computer program. The identified peptides were imported into the DynamX software and filtered using two criteria: 1) minimum products per amino acid: 0.2, and 2) file repeat limit: 3. The DynamX software then automatically determined the capture of each peptide based on retention time and high mass accuracy (<10 ppm) at multiple time points with 3 repetitions at each time.

Результаты. С помощью онлайн колонки пепсин/протеаза XIII с получением данных MSE, всего 201 пептид от LEPR воспроизводимо идентифицировали при отсутствии или присутствии антитела, представляющего 70% охват последовательности. Пять пептидов характеризовались значимо сниженным захватом дейтерия (центроидные дельта-значения > 0,4 дальтон при р-значениях < 0,05) при связывании с Н4Н16650Р2, как показано в табл. 16. Зафиксированная масса пептидов соответствовала среднему значению центроидной МН+ массы из трех повторов. Эти пептиды, соответствующие аминокислотам 162169 (аминокислоты LYVLPEVL LEPR человека; SEQ ID NO: 113), и аминокислотам 170-181 (аминокислоты EDSPLVPQKGSF LEPR человека; SEQ ID NO: 113), характеризовались более медленной скоростью дейтеризации при связывании с Н4Н16650Р2. Эти идентифицированные остатки также соответствовали остатками аминокислот 162-169 и 170-181 LEPR человека, как определено с помощью входного значения в Uniprot P48357 (SEQ ID NO: 113; лептиновый рецептор человека).Results. Using an online pepsin/protease XIII column with MSE data acquisition, a total of 201 peptides from LEPR were reproducibly identified in the absence or presence of an antibody representing 70% sequence coverage. Five peptides showed significantly reduced deuterium uptake (centroid delta values > 0.4 daltons at p values < 0.05) when bound to H4H16650P2, as shown in Table 1. 16. The recorded mass of peptides corresponded to the average value of the centroid MH+ mass from three repetitions. These peptides, corresponding to amino acids 162169 (human LYVLPEVL LEPR amino acids; SEQ ID NO: 113) and amino acids 170-181 (human EDSPLVPQKGSF LEPR amino acids; SEQ ID NO: 113), were characterized by a slower rate of deuterization when bound to H4H16650P2. These identified residues also corresponded to amino acid residues 162-169 and 170-181 of human LEPR as determined by the entry value in Uniprot P48357 (SEQ ID NO: 113; human leptin receptor).

Таблица 16. Пептиды лептинового рецептора человека со значительной защитой при связывании с антителом Н4Н16650Р2Table 16. Human leptin receptor peptides with significant protection when bound to antibody H4H16650P2

Остатки Remains Дейтерирование в течение 1 минуты Deuteration for 1 minute Дейтерирование в течение 20 минут Deuteration for 20 minutes hLEPR.m mh hLEPR.m mh hLEPR.mmh + Н4Н16650Р2 hLEPR.mmh + H4H16650R2 А A hLEPR.mmh hLEPR.mmh hLEPR.mmh + Н4Н16650Р2 hLEPR.mmh + H4H16650R2 А A 162-169 162-169 949,03±0,03 949.03±0.03 947,99±0,02 947.99±0.02 -1,04 -1.04 949,23±0,02 949.23±0.02 948,16±0,02 948.16±0.02 -1,03 -1.03 163-169 163-169 835,82±0,03 835.82±0.03 834,79±0,02 834.79±0.02 -1,03 -1.03 836,03±0,02 836.03±0.02 834,94±0,02 834.94±0.02 -1,08 -1.08 170-181 170-181 1310,02±0,05 1310.02±0.05 1309,12±0,03 1309.12±0.03 -0,89 -0.89 1309,77±0,02 1309.77±0.02 1309,38±0,02 1309.38±0.02 -0,39 -0.39

Пример 12. Исследование эффективности in vivo потенцирующих антител к LEPR у мышей с гуманизированным LEPR.Example 12 In vivo efficacy study of anti-LEPR potentiating antibodies in mice with humanized LEPR.

Эффекты трех специфических потенцирующих антител к LEPR по настоящему изобретению, Н4Н18482Р2, Н4Н18487Р2 и Н4Н18492Р2, на массу тела и отложение жира определяли у содержащихся по одной генетически сконструированных мышей LEPR^Hu/Hu, которые экспрессировали лептиновый реThe effects of the three specific anti-LEPR potentiating antibodies of the present invention, H4H18482P2, H4H18487P2, and H4H18492P2, on body weight and fat deposition were determined in single housed ^Hu/Hu genetically engineered LEPR mice that expressed leptin re

- 37 041859 цептор, который состоял из последовательности эктодомена LEPR человека вместо мышиной последовательности эктодомена LEPR (mLEPR.hFc, SEQ ID NO: 120).- 37 041859 receptor, which consisted of the human LEPR ectodomain sequence instead of the mouse LEPR ectodomain sequence (mLEPR.hFc, SEQ ID NO: 120).

На -19-й день состав тела, в том числе отложение жира, определяли количественно с помощью μCT. На 0-й день 48 самок мышей LEPR^Hu/Hu в возрасте от 14 до 16 недель рандомизировали на четыре группы по 12 мышей на основании массы тела. На 0-й и 11-й дни мыши из каждой группы получали посредством подкожной инъекции однократную дозу антитела изотипического контроля при 30 мг/кг, Н4Н18482Р2 при 30 мг/кг, Н4Н18487Р2 при 30 мг/кг или Н4Н18492Р2 при 30 мг/кг. Антитело изотипического контроля не связывало никакого известного белка мыши. Массу тела измеряли во время исследования для каждого животного. Процентное изменение массы тела от 0-го дня рассчитывали для каждого животного в каждой временной точке. На фиг. 6 обобщен средний процент изменения массы тела для животных в каждой группе обработки. На фиг. 6 обобщена средняя масса жировой ткани для животных в каждой группе обработки, определенная количественно с помощью μСТ за 19 дней до и через 11 дней после обработки антителами. Все результаты выражали в виде среднего ± SEM.At day -19, body composition, including fat deposition, was quantified by µCT. On day 0, 48 female LEPR ^Hu/Hu mice aged 14 to 16 weeks were randomized into four groups of 12 mice based on body weight. On days 0 and 11, mice from each group received, by subcutaneous injection, a single dose of isotype control antibody at 30 mg/kg, H4H18482P2 at 30 mg/kg, H4H18487P2 at 30 mg/kg, or H4H18492P2 at 30 mg/kg. The isotype control antibody did not bind any known mouse protein. Body weight was measured during the study for each animal. The percentage change in body weight from day 0 was calculated for each animal at each time point. In FIG. 6 summarizes the mean percentage change in body weight for animals in each treatment group. In FIG. 6 summarizes the mean body fat mass for animals in each treatment group, quantified by μCT 19 days before and 11 days after antibody treatment. All results were expressed as mean ± SEM.

Как показано на фиг. 6, снижение процентного изменения массы тела наблюдали после введения потенцирующих антител к LEPR, но не антитела изотипического контроля. Как показано на фиг. 6, мыши, обработанные Н4Н18482Р2 при 30 мг/кг, характеризовались значимым снижением процента изменения массы тела начиная через два дня после обработки (2-й день) и в другие временные точки по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию антитела изотипического контроля. Мыши, обработанные Н4Н18487Р2 при 30 мг/кг, характеризовались значимым снижением процента изменения массы тела начиная со 2-го дня и в другие временные точки по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию антитела изотипического контроля. Мыши, обработанные Н4Н18492Р2 при 30 мг/кг, характеризовались снижением процента изменения массы тела на 4-й, 5-й и 17-й дни, но не в другие временные точки по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию антитела изотипического контроля. Мыши, обработанные Н4Н18482Р2 при 30 мг/кг, характеризовались значимым снижением процента изменения массы тела начиная с 6-го дня и в последующие дни, но не на 7-й, 14-й и 17-й дни по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию Н4Н18492Р2. Мыши, обработанные Н4Н18487Р2 при 30 мг/кг, характеризовались значимым снижением процента изменения массы тела начиная с 3-го дня и в другие временные точки, но не на 4-й и 5-й дни по сравнению с мышами, которым вводили инъекцию Н4Н18492Р2.As shown in FIG. 6, a reduction in percentage change in body weight was observed after administration of potentiating anti-LEPR antibodies, but not isotype control antibodies. As shown in FIG. 6, mice treated with H4H18482P2 at 30 mg/kg showed a significant reduction in percent change in body weight starting two days after treatment (Day 2) and at other time points compared to mice injected with isotype control antibody. Mice treated with H4H18487P2 at 30 mg/kg showed a significant reduction in percent change in body weight from day 2 and at other time points compared to mice injected with the isotype control antibody. Mice treated with H4H18492P2 at 30 mg/kg showed a reduction in percentage change in body weight at days 4, 5 and 17, but not at different time points, compared to mice injected with isotype control antibody. Mice treated with H4H18482P2 at 30 mg/kg showed a significant reduction in percent change in body weight from day 6 onwards, but not on days 7, 14, and 17, compared with mice treated with injection of H4H18492P2. Mice treated with H4H18487P2 at 30 mg/kg showed a significant reduction in percent change in body weight from day 3 and at other time points, but not on days 4 and 5, compared with mice injected with H4H18492P2.

Как показано на фиг. 7А, различия в массе жировой ткани между группами до лечения отсутствовали (-19-й день). Как показано на фиг. 7В, мыши, обработанные антителами Н4Н18482 и Н4Н18487, но не Н4Н18492, при 30 мг/кг характеризовалась статистически значимым снижением массы жировой ткани через 17 дней после обработки (12-й день) по сравнению с антителом изотипического контроля.As shown in FIG. 7A, there were no differences in adipose tissue mass between groups before treatment (-19 days). As shown in FIG. 7B, mice treated with antibodies H4H18482 and H4H18487, but not H4H18492, at 30 mg/kg showed a statistically significant reduction in body fat mass 17 days post-treatment (day 12) compared to the isotype control antibody.

Настоящее изобретение не ограничено по объему конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, кроме описанных в настоящем документе, будут очевидны специалистам в данной области из вышеизложенного описания и сопровождающих фигур. Такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.The present invention is not limited in scope to the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the present invention other than those described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying figures. Such modifications are within the scope of the appended claims.

Пример 13. Влияние антител к LEPR по настоящему изобретению на передачу сигнального пути посредством LEPR обезьяны.Example 13 Effect of Anti-LEPR Antibodies of the Invention on Signaling Transmission by Monkey LEPR.

В целях оценки транскрипционной активности лептинового рецептора обезьяны разрабатывали стабильную клеточную линию. Клетки IMR-32 (АТСС нейробластомы человека) получали в целях стабильной экспрессии внеклеточного домена LEPR Macaca fascicularis (MfLEPR; аминокислоты с 22 по 837 с номером доступа ХР_005543194.1, при этом треонин в положении 827 заменен на аланин), слитого с трансмембранным и цитозольным доменами LEPR человека (hLEPR; аминокислоты с 840 по 1165 с номером доступа NP_002294.2) совместно с люциферазным репортером (STAT3-Luc; SABiosciences, № CLS-6028L). Полученную клеточную линию, называемую далее в настоящем документе IMR-32/STAT3Luc/MfLEPR, выделяли и поддерживали в среде МЕМ-Эрла с добавкой 10% FBS, NEAA, 1 мкг/мл пуромицина, 100 мкг/мл гигромицина В и пенициллина/стрепромицина/L-глутамина.In order to evaluate the transcriptional activity of the monkey leptin receptor, a stable cell line was developed. IMR-32 (human neuroblastoma ATCC) cells were generated to stably express the Macaca fascicularis LEPR extracellular domain (MfLEPR; amino acids 22 to 837, accession number XP_005543194.1, with threonine at position 827 replaced by alanine) fused to the transmembrane and cytosolic human LEPR domains (hLEPR; amino acids 840 to 1165, accession number NP_002294.2) together with a luciferase reporter (STAT3-Luc; SABiosciences, no. CLS-6028L). The resulting cell line, hereinafter referred to as IMR-32/STAT3Luc/MfLEPR, was isolated and maintained in MEM-Earl medium supplemented with 10% FBS, NEAA, 1 μg/ml puromycin, 100 μg/ml hygromycin B and penicillin/strepromycin/ L-glutamine.

Биоанализ выполняли в целях измерения влияния антител к LEPR по настоящему изобретению на передачу сигнала с помощью LEPR обезьяны при отсутствии лептина. При выполнении анализа клетки IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR помещали на планшет по 10000 клеток/лунку в 96-луночном планшете в 0,1% FBS в Optimem с пенициллином/стрептомицином (аналитический буфер) и инкубировали в течение ночи при 37°C в 5% СО₂. На следующий день лептин человека (hLeptin), антитела к LEPR или антитело изотипического контроля серийно разводили от 50 нМ до 0,8 пМ в аналитическом буфере (совместно с образцом, содержащим буфер в отдельности без исследуемой молекулы) и добавляли к клеткам. Через 5,5 ч при 37°C в 5% _CO2 люциферазную активность измеряли с помощью реагента OneGlo™ (Promega, № Е6031) и многоканального планшет-ридера Victor™ X (Perkin Elmer). Результаты анализировали с помощью нелинейной регрессии (4-параметрическая логистика) с помощью компьютерной программы Prism™6 (GraphPad) с получением значений EC₅₀. Процент активации антител рассчитывали в виде максимального диапазона RLU, достигаемого антителом по отношению к максимальному диапазону RLU, достигаемому hLeptin.A bioassay was performed to measure the effect of the anti-LEPR antibodies of the present invention on signaling by monkey LEPR in the absence of leptin. When performing the assay, IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR cells were plated at 10,000 cells/well in a 96-well plate in 0.1% FBS in Optimem with penicillin/streptomycin (assay buffer) and incubated overnight at 37° C in 5% CO ₂ . The next day, human leptin (hLeptin), anti-LEPR antibody, or isotype control antibody was serially diluted from 50 nM to 0.8 pM in assay buffer (together with the sample containing the buffer alone without test molecule) and added to the cells. After 5.5 hours at 37° C. in 5% _CO2, luciferase activity was measured using OneGlo™ reagent (Promega, #E6031) and a Victor™ X multichannel plate reader (Perkin Elmer). The results were analyzed by non-linear regression (4-parameter logistics) using the computer program Prism™6 (GraphPad) to obtain EC ₅₀ values. Percent antibody activation was calculated as the maximum RLU range achieved by the antibody relative to the maximum RLU range achieved by hLeptin.

- 38 041859- 38 041859

Как показано в табл. 17, при отсутствии hLeptin все из исследуемых антител к LEPR характеризовались активацией передачи сигнала посредством LEPR обезьяны в клетках IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR со значениями ЕС50 в диапазоне от 266 до 368 пМ и максимальной активацией в диапазоне от 76 до 82%, при этом 100% активацию получали в результате действия hLeptin. hLeptin активировал при значении ЕС50, составляющем 333 пМ. Антитело изотипического контроля не характеризовалось никакой подлежащей измерению стимуляцией клеток IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR.As shown in Table. 17, in the absence of hLeptin, all of the tested anti-LEPR antibodies were characterized by signaling activation by monkey LEPR in IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR cells with EC50 values ranging from 266 to 368 pM and maximum activation ranging from 76 to 82%. while 100% activation was obtained as a result of the action of hLeptin. hLeptin activated at an EC50 value of 333 pM. The isotype control antibody showed no measurable stimulation of IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR cells.

Таблица 17. Активация LEPR Масаса fascicularis антителами к LEPRTable 17. Activation of LEPR by Macaca fascicularis with Anti-LEPR Antibodies

Лептин или антитело Leptin or antibody ЕС₅₀ (М)EU ₅₀ (M) % активации % activation Лептин человека Human leptin 3,ЗЗЕ-11 3,ZZE-11 100 100 Н4Н16650Р2 H4H16650R2 2,66Е-10 2.66E-10 82 82 Н4Н16679Р2 H4H16679R2 2,49Е-10 2.49Е-10 80 80 Н4Н17319Р2 H4H17319R2 3,65Е-10 3.65E-10 76 76 Н4Н17321Р2 H4H17321R2 3,68Е-10 3.68E-10 78 78 Антитело изотипического контроля Isotype control antibody Без активации Without activation Без активации Without activation

Пример 14. Связывание эпитопа с полноразмерным внеклеточным доменом LEPR человека с помощью сигнала MFI в Luminex.Example 14 Epitope Binding to Full Length Human LEPR Extracellular Domain by MFI Signal in Luminex.

В целях определения эпитопа LEPR человека, с которыми антитела к LEPR по настоящему изобретению связываются, анализ на основе проточной цитометрии FLEXMAP Luminex (FM3DD, LuminexCorp) использовали для характеристики взаимодействия антител к LEPR с белковыми доменами рекомбинантных LEPR человека. Для анализа примерно 3 миллиона карбоксилированных микросфер Microplex^R (Luminex, № по каталогу LC1000A) промывали, перемешивали на вортексе и разрушали ультразвуком в 0,1 М NaPO₄, pH 6,2 (активационный буфер) и затем центрифугировали с удалением супернатанта. Микросферы ресуспендировали в 120 мкл активационного буфера и карбоксилатные группы (-СООН) активировали в результате добавления 15 мкл 50 мг/мл N-гидроксисукцинимида (NHS, Thermo Scientific, № по каталогу 24500) с последующим добавлением 15 мкл 50 мг/мл 1-этил-3-[3диметиламинопропил] карбо диимида (EDC, ThermoScientific, № по каталогу 22980) при 25°С. Через 10 мин значение pH реакционной смеси снижали до 5,0 в результате добавления 600 мкл 50 мМ MES, pH 5 (связывающий буфер), микросферы перемешивали на вортексе и центифигуровали с удалением супернатанта. Активированные гранулы незамедлительно смешивали с 500 мкл 20 мг/мл моноклональных антител к тус либо с мышиным IgG либо с IgG человека в связывающем буфере и инкубировали в течение 2 ч при 25°С. Реакцию связывания останавливали в результате добавления 50 мкл 1 М Трис-НС1, pH 8,0, и микросферы быстро перемешивали на вортексе, центрифугировали и промывали четыре раза 1 мл DPBS с удалением несвязанных белков и других компонентов реакционной смеси.In order to determine the human LEPR epitope to which the anti-LEPR antibodies of the present invention bind, a FLEXMAP Luminex flow cytometry assay (FM3DD, LuminexCorp) was used to characterize the interaction of anti-LEPR antibodies with the protein domains of recombinant human LEPRs. For analysis, approximately 3 million carboxylated Microplex ^R microspheres (Luminex, catalog # LC1000A) were washed, vortexed and sonicated in 0.1 M NaPO ₄ , pH 6.2 (activation buffer) and then centrifuged to remove the supernatant. The microspheres were resuspended in 120 µl of activation buffer and the carboxylate groups (-COOH) were activated by adding 15 µl of 50 mg/ml N-hydroxysuccinimide (NHS, Thermo Scientific, Cat # 24500) followed by the addition of 15 µl of 50 mg/ml 1-ethyl -3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimide (EDC, ThermoScientific, Cat # 22980) at 25°C. After 10 minutes, the pH of the reaction mixture was lowered to 5.0 by adding 600 μl of 50 mM MES, pH 5 (binding buffer), the microspheres were vortexed and centrifuged to remove the supernatant. The activated beads were immediately mixed with 500 μl of 20 mg/ml anti-myc monoclonal antibodies with either mouse IgG or human IgG in binding buffer and incubated for 2 h at 25°C. The binding reaction was stopped by adding 50 μl 1 M Tris-HCl, pH 8.0, and the microspheres were rapidly vortexed, centrifuged and washed four times with 1 ml DPBS to remove unbound proteins and other components of the reaction mixture.

Транзиентно экспрессируемые белки LEPR, в том числе внеклеточный домен LEPR человека, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (LEPR человека-ММН, SEQ ID NO: 113), CRH1 (DI) LEPR человека, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (CRH1 (DI) LEPR человека-ММН, аминокислоты 1-208 SEQ ID NO: 113 с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 209-236), домен CRH1 (D1,D2) LEPR человека, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (CRH1 (D1,D2) LEPR человека-ММН, аминокислоты 1-318 SEQ ID NO: 113 с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 319-346), домен CRH1 (D1,D2,D3) LEPR человека-Ig, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (CRH1 (D1,D2,D3) LEPR человека-ММН, аминокислоты 1-278 SEQ ID NO: ИЗ с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 279-306), домен CRH1 (D2,D3) LEPR человека-Ig, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (CRH1 (D2,D3) LEPR человека-MMH-Ig, аминокислоты 1-198 SEQ ID NO: 113 с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 199-226), домен LEPR человека (D3)-Ig, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (LEPR (D3) человека-MMH-Ig, аминокислоты 1-88 SEQ ID NO: ИЗ с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 89-116), домен CRH2 LEPR человека, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (CRH2 LEPR человекаММН, аминокислоты 1-207 SEQ ID NO: 113 с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 208235), домен FNIII LEPR человека, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (FNIII LEPR человека-ММН, аминокислоты 1-204 SEQ ID NO: 113 с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 205-232), и домен CRH2-FNIII LEPR человека-Ig, экспрессируемый с С-концевой гексагистидиновой меткой myc-myc (CRH2-FNIII LEPR человека-MMH-Ig, аминокислоты 1-510 SEQ ID NO: 113 с гексагистидиновой меткой myc-myc, аминокислоты 511-538) суспендировали в бессывороточной среде CHO-S-SFM II (Thermo Fisher, № по каталогу 31033020) и затем очищали с помощью центрифугирования. Аликвоты микросфер с иммобилизованными моноклональными антителами к тус, полученными,Transiently expressed LEPR proteins, including human LEPR extracellular domain expressed with C-terminal hexahistidine tag myc-myc (human LEPR-MMH, SEQ ID NO: 113), CRH1 (DI) human LEPR expressed with C-terminal hexahistidine tag myc-myc (CRH1 (DI) human MMH LEPR, amino acids 1-208 SEQ ID NO: 113 with myc-myc hexahistidine tag, amino acids 209-236), CRH1 (D1,D2) domain of human LEPR expressed from C-terminal myc-myc hexahistidine tag (CRH1 (D1,D2) human MMH LEPR, amino acids 1-318 SEQ ID NO: 113 with myc-myc hexahistidine tag, amino acids 319-346), human LEPR CRH1 domain (D1,D2,D3) -Ig expressed with C-terminal myc-myc hexahistidine tag (CRH1 (D1,D2,D3) human MMH LEPR, amino acids 1-278 SEQ ID NO: IZ with myc-myc hexahistidine tag, amino acids 279-306), domain CRH1 (D2,D3) human LEPR-Ig expressed with C-terminal myc-myc hexahistidine tag (CRH1 (D2,D3) human LEPR-MMH-Ig, amino acids 1-198 SEQ ID NO: 113 with myc-myc hexahistidine tag, amino acids 199-226), human LEPR domain (D3)-Ig expressed with myc-myc C-terminal hexahistidine tag (human LEPR (D3)-MMH-Ig, amino acids 1 -88 SEQ ID NO: IZ with myc-myc hexahistidine tag, amino acids 89-116), human CRH2 LEPR domain expressed with C-terminal myc-myc hexahistidine tag (human CRH2 LEPR MMH, amino acids 1-207 SEQ ID NO: 113c myc-myc hexahistidine tag, amino acids 208235), human FNIII LEPR domain expressed with C-terminal myc-myc hexahistidine tag (human FNIII LEPR-MMH, amino acids 1-204 SEQ ID NO: 113 with myc-myc hexahistidine tag, amino acids 205 -232), and a human-Ig CRH2-FNIII LEPR domain expressed with a myc-myc C-terminal hexahistidine tag (human CRH2-FNIII LEPR-MMH-Ig, amino acids 1-510 of SEQ ID NO: 113 with a myc-myc hexahistidine tag , amino acids 511-538) were suspended in CHO-S-SFM II serum-free medium (Thermo Fisher, cat. no. gu 31033020) and then purified by centrifugation. Aliquots of microspheres with immobilized anti-myc monoclonal antibodies obtained

-39041859 как описано выше, добавляли отдельно к 1 мл каждого из этих супернатантов белка. Микросферы осторожно смешивали, инкубировали в течение двух часов при 25°C, промывали дважды 1 мл DBPS, центрифугировали с удалением супернатанта и ресуспендировали в 1 мл буфера DPBS. 48 мкл микросфер со связанным IgG к myc из отдельных реакционных смесей с полноразмерными LEPR человека и с каждым из доменных белков LEPR человека извлекали и смешивали вместе в 3,6 мл PBS + 20 мг/мл BSA+0,05% азида натрия (блокирующий буфер).-39041859 as described above was added separately to 1 ml of each of these protein supernatants. The microspheres were mixed gently, incubated for two hours at 25°C, washed twice with 1 ml DBPS, centrifuged to remove the supernatant and resuspended in 1 ml DPBS buffer. 48 µl of anti-myc IgG bound microspheres from separate reactions with full-length human LEPRs and with each of the human LEPR domain proteins were recovered and mixed together in 3.6 ml PBS + 20 mg/ml BSA + 0.05% sodium azide (blocking buffer ).

Из этого смешанного пула 75 мкл микросфер помещали в лунку 96-луночного фильтровального планшета (Millipore, № по каталогу MSBVN1250) и смешивали с 25 мкл отдельных моноклональных антител к LEPR человека (0,5 или 5 мкг/мл), инкубировали в течение двух часов при 25°C и затем промывали дважды 200 мкл DPBS с 0,05% Tween 20 (отмывочный буфер). Для выявления и количественного определения содержания связанных антител к LEPR с отдельными микросферами либо 100 мкл 2,5 мкг/мл конъюгированного с R-фикоэритрином козьего F(ab')₂ к человеческой каппа-цепи (Southern Biotech, № по каталогу 2063-09) в блокирующем буфере либо 100 мкл 1,25 мкг/мл конъюгированного с R-фикоэритрином AffiniPure козьего F(ab')₂-фрагмента к мышиному IgG, специфического по отношению к F(ab')₂-фрагменту (Jackson Immunoresearch, № по каталогу 115-116-072), в блокирующем буфере добавляли и инкубировали в течение 30 мин при 25°C. Через 30 мин образцы промывали дважды 200 мкл отмывочного буфера и ресуспендировали в 150 мкл отмывочного буфера. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) микросфер измеряли в анализаторе Luminex.From this mixed pool, 75 µl of microspheres were placed in a well of a 96-well filter plate (Millipore, catalog # MSBVN1250) and mixed with 25 µl of individual anti-human LEPR monoclonal antibodies (0.5 or 5 µg/ml), incubated for two hours at 25°C and then washed twice with 200 μl DPBS with 0.05% Tween 20 (wash buffer). For detection and quantitation of bound anti-LEPR antibodies with single microspheres or 100 µl 2.5 µg/ml R-phycoerythrin-conjugated goat F(ab') ₂ to the human kappa chain (Southern Biotech, cat. no. 2063-09) in blocking buffer or 100 µl 1.25 µg/ml AffiniPure R-phycoerythrin conjugated goat F(ab') ₂ fragment to mouse IgG specific for F(ab') ₂ fragment (Jackson Immunoresearch, catalog # 115-116-072) in blocking buffer was added and incubated for 30 min at 25°C. After 30 min, the samples were washed twice with 200 µl wash buffer and resuspended in 150 µl wash buffer. The mean fluorescence intensity (MFI) of the microspheres was measured in a Luminex analyzer.

Таблица 18. Сигнал MFI в Luminex при связывании антител к LEPR с захваченным меткой myc полноразмерным внеклеточным доменом LEPR человека и выделенными доменами LEPR человекаTable 18. MFI signal in Luminex when anti-LEPR antibodies bind to myc-tagged full-length extracellular human LEPR domain and isolated human LEPR domains

Антитело Antibody CRH 1 (D1) CRH 1 (D1) CRH1 (D1,D 2) CRH1 (D1,D2) CRH1-Ig (D1,D2,D 3) CRH1-Ig (D1,D2,D3) CRH1Ig (D2,D3) CRH1Ig (D2,D3) ig (D3 ) ig (D3) CR H2 CR H2 FNIII FNIII ig- CRH2FNIII ig- CRH2FNIII Полнораз мерный внеклето чный домен Full length extracellular domain Вероятный участок связывани я Probable binding site Н4Н18445 Р2 H4H18445 R2 12 12 30 thirty 22 22 40 40 19 19 17 17 230 230 14544 14544 6573 6573 FNIII FNIII Н4Н18446 Р2 H4H18446 R2 17 17 682 682 205 205 645 645 25 25 65 65 32 32 16852 16852 10536 10536 Ig-CRH2FNIII Ig-CRH2FNIII Н4Н18482 Р2 H4H18482 R2 13 13 40 40 21 21 52 52 27 27 23 23 167 167 15316 15316 7311 7311 Ig-CRH2FNIII Ig-CRH2FNIII Н4Н18487 Р2 H4H18487 R2 12 12 51 51 29 29 62 62 22 22 27 27 174 174 16320 16320 7329 7329 Ig-CRH2FNIII Ig-CRH2FNIII Н4Н18417 Р2 H4H18417 R2 10 10 16048 16048 3334 3334 5502 5502 17 17 39 39 14 14 37 37 4887 4887 CRH1D2 CRH1D2 Н4Н18438 Р2 H4H18438 R2 13 13 18931 18931 6572 6572 8884 8884 30 thirty 165 165 25 25 468 468 6251 6251 CRH1D2 CRH1D2 Н4Н18492 Р2 H4H18492 R2 11 eleven 19371 19371 6354 6354 8685 8685 19 19 18 18 16 16 186 186 6382 6382 CRH1D2 CRH1D2 Н4Н18449 Р2 H4H18449 R2 20 20 2934 2934 2056 2056 42 42 24 24 15 15 13 13 43 43 7976 7976 CRHl(Dl-2) CRHl(Dl-2) Н4Н16650 Р2 H4H16650 R2 8 8 4722 4722 2562 2562 74 74 10 10 16 16 6 6 110 110 7603 7603 CRHl(Dl-2) CRHl(Dl-2) Н4Н16679 Р2 H4H16679 R2 12 12 4388 4388 2797 2797 34 34 14 14 33 33 10 10 42 42 7507 7507 CRHl(Dl-2) CRHl(Dl-2) Н4Н17319 Р2 H4H17319 R2 8 8 1246 1246 938 938 14 14 8 8 91 91 20 20 8 8 3305 3305 CRHl(Dl-2) CRHl(Dl-2) Н4Н17321 Р2 H4H17321 R2 9 9 2649 2649 1752 1752 15 15 7 7 116 116 40 40 14 14 4696 4696 CRH1(D1- 2) CRH1(D1- 2) mAb сравнения mAb comparisons -14 -14 19 19 -57 -57 27 27 10 10 9404 9404 73 73 7112 7112 3908 3908 CRH2 CRH2

--

Claims (20)

Результаты анализа на основе Luminex представлены в табличном виде в табл. 18. Интенсивности сигналов MFI в Luminex указывали на то, что двенадцать антител к LEPR по настоящему изобретению связывались с полным внеклеточным доменом LEPR человека. Антитела к LEPR H4H18417P2, Н4Н18438Р2 и Н4Н18492Р2 связывались с эпитопами в домене CRH1 D2 LEPR человека. Антитела к LEPR Н4Н18449Р2, Н4Н16650Р и Н4Н16679Р связывались с доменом CRH1(D1-2) LEPR человека. mAB сравнения антитела к LEPR связывалось с эпитопами в домене CRH2 LEPR человека. Антитело к LEPR H4H18445P2 связывалось с эпитопами в домене FNIII LEPR человека. Антитела к LEPR H4H18446P2, Н4Н18482Р2 и Н4Н18487Р2 связывались с доменом Ig-CRH2-FNIII LEPR человека.The results of the analysis based on Luminex are presented in tabular form in table. 18. The MFI signal intensities in Luminex indicated that the twelve anti-LEPR antibodies of the present invention bound to the entire extracellular domain of human LEPR. Anti-LEPR antibodies H4H18417P2, H4H18438P2, and H4H18492P2 bind to epitopes in the CRH1 D2 domain of human LEPR. Anti-LEPR antibodies H4H18449P2, H4H16650P and H4H16679P bound to the CRH1(D1-2) domain of human LEPR. The anti-LEPR antibody comparison mAB bound epitopes in the human LEPR CRH2 domain. The anti-LEPR antibody H4H18445P2 bound to epitopes in the FNIII domain of human LEPR. Anti-LEPR antibodies H4H18446P2, H4H18482P2 and H4H18487P2 bind to the Ig-CRH2-FNIII domain of human LEPR. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает лептиновый рецептор человека (LEPR) и активирует передачу сигнала посредством LEPR, которое содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий определяющие комплементарность области (CDR) легкой цепи вариабельного участка легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10; и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRs тяжелой цепи вариабельного участка тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 34.1. An isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that binds the human leptin receptor (LEPR) and activates signaling through LEPR that contains a light chain variable region containing complementarity determining regions (CDRs) of a light chain variable region that contains an amino acid sequence, set forth in SEQ ID NO: 10; and a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDRs of the heavy chain variable region which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 34. 2. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:2. The isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof contains: (i) вариабельный участок легкой цепи, который содержит LCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12; LCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 14; и LCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16; и (ii) вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит HCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4; HCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6; и HCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8; или вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит HCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20; HCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 22; и HCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 24; или вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит HCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 28; HCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 30; и HCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 32; или вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит HCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 36; HCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 38; и HCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 40.(i) a light chain variable region that contains an LCDR1 that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12; LCDR2, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and LCDR3, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and (ii) a heavy chain variable region that contains HCDR1 that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; HCDR2, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; and HCDR3, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8; or a heavy chain variable region that contains HCDR1 that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20; HCDR2, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22; and HCDR3, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24; or a heavy chain variable region that contains HCDR1 that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28; HCDR2, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30; and HCDR3, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32; or a heavy chain variable region that contains HCDR1 that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36; HCDR2, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38; and HCDR3 which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40. 3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10; и вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 34.3. Selected antibody or antigennegative fragment according to claim 1 or 2, where the antibody or antigennegative fragment contains a variable region of the light chain, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10; and a heavy chain variable region that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 34. 4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий определяющие комплементарность области легкой цепи вариабельного участка легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10; и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий определяющие комплементарность области тяжелой цепи вариабельного участка тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 26.4. The isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region containing complementarity-determining light chain regions of a light chain variable region that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10; and a heavy chain variable region comprising the heavy chain variable region complementarity determining regions, which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26. 5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает лептиновый рецептор человека (LEPR), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, который содержит LCDR1, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 12; LCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 14; и LCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16; и вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит HCDR1, которая содержит аминокислот5. An isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that binds the human leptin receptor (LEPR), wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof contains a light chain variable region that contains an LCDR1 that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12; LCDR2, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; and LCDR3, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and the heavy chain variable region, which contains HCDR1, which contains amino acids - 41 041859 ную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 28; HCDR2, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 30; и HCDR3, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 32.- 41 041859 the sequence set forth in SEQ ID NO: 28; HCDR2, which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30; and HCDR3 which contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32. 6. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает лептиновый рецептор человека (LEPR), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10; и вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 26.6. Selected antibody or antigennegative fragment that binds the human leptin receptor (LEPR), where the antibody or antigennegative fragment contains a light chain variable region that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10; and a heavy chain variable region that contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26. 7. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где вариабельный участок тяжелой цепи связан с константным доменом тяжелой цепи IgG1 человека, а вариабельный участок легкой цепи связан с константным доменом легкой цепи каппа человека.7. The isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 6, wherein the heavy chain variable region is linked to a human IgG1 heavy chain constant domain and the light chain variable region is linked to a human kappa light chain constant domain. 8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где вариабельный участок тяжелой цепи связан с константным доменом тяжелой цепи IgG4 человека, а вариабельный участок легкой цепи связан с константным доменом легкой цепи каппа человека.8. The isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 6, wherein the heavy chain variable region is linked to a human IgG4 heavy chain constant domain and the light chain variable region is linked to a human kappa light chain constant domain. 9. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6, которое представляет собой полноразмерное антитело, содержащее две тяжелые цепи, содержащие указанный вариабельный участок тяжелой цепи, и две легкие цепи, содержащие указанный вариабельный участок легкой цепи, соединенные между собой дисульфидными связями.9. The isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 6, which is a full-length antibody containing two heavy chains containing the specified heavy chain variable region, and two light chains containing the specified light chain variable region, interconnected by disulfide bonds. 10. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6, где антитело представляет собой рекомбинантное человеческое антитело.10. The isolated antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 6, wherein the antibody is a recombinant human antibody. 11. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с или вызванного недостаточностью лептина или устойчивостью к лептину, или для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с мутацией LEPR в результате дефекта передачи сигнала или нарушения передачи сигнала или вызванного таковой, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.11. Pharmaceutical composition for the treatment of a disease or condition associated with or caused by leptin deficiency or leptin resistance, or for the treatment of a disease or condition associated with a LEPR mutation as a result of a signal transduction defect or signal transduction disorder or caused by such, containing an antibody or its antigen-binding a fragment according to any one of claims 1 to 10; and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. 12. Способ лечения заболевания или состояния, ассоциированного с или вызванного недостаточностью лептина или устойчивостью к лептину, при этом способ предусматривает введение фармацевтической композиции по п.11 субъекту, нуждающемуся в этом.12. A method of treating a disease or condition associated with or caused by leptin deficiency or leptin resistance, the method comprising administering the pharmaceutical composition of claim 11 to a subject in need thereof. 13. Способ по п.12, где заболевание или состояние, ассоциированное с или вызванное недостаточностью лептина или устойчивостью к лептину, выбирают из группы, состоящей из липодистрофии, ожирения, метаболического синдрома, вызванной диетой тяги к определенному виду пищи, функциональной гипоталамической аменореи, диабета 1 типа, диабета 2 типа, устойчивости к инсулину, тяжелой устойчивости к инсулину в результате мутации инсулинового рецептора, болезни Альцгеймера, недостаточности лептина, устойчивости к лептину, лепречаунизма/синдрома Донохью и синдрома РабсонаМенденхолла.13. The method of claim 12 wherein the disease or condition associated with or caused by leptin deficiency or leptin resistance is selected from the group consisting of lipodystrophy, obesity, metabolic syndrome, diet-induced food cravings, functional hypothalamic amenorrhea, diabetes Type 1, type 2 diabetes, insulin resistance, severe insulin resistance due to insulin receptor mutation, Alzheimer's disease, leptin deficiency, leptin resistance, leprechaunism/Donoghue syndrome, and Rabson-Mendenhall syndrome. 14. Способ лечения липодистрофического состояния у пациента, при этом способ предусматривает введение фармацевтической композиции по п.11 пациенту, нуждающемуся в этом, где липодистрофическое состояние выбирают из группы, состоящей из врожденной генерализованной липодистрофии, приобретенной генерализованной липодистрофии, семейной парциальной липодистрофии, приобретенной парциальной липодистрофии, центрифужной абдоминальной липодистрофии, кольцевидной липоатрофии, локализованной липодистрофии и ВИЧ-ассоциированной липодистрофии.14. A method of treating a lipodystrophy condition in a patient, the method comprising administering the pharmaceutical composition of claim 11 to a patient in need thereof, wherein the lipodystrophy condition is selected from the group consisting of congenital generalized lipodystrophy, acquired generalized lipodystrophy, familial partial lipodystrophy, acquired partial lipodystrophy , centrifugal abdominal lipodystrophy, annular lipoatrophy, localized lipodystrophy, and HIV-associated lipodystrophy. 15. Способ лечения заболевания или состояния, ассоциированного с мутацией LEPR в результате дефекта передачи сигнала или нарушения передачи сигнала или вызванного таковой, при этом способ предусматривает введение фармацевтической композиции по п.11 субъекту, нуждающемуся в этом.15. A method of treating a disease or condition associated with a LEPR mutation resulting from or caused by a signal transduction defect or signal transduction disorder, the method comprising administering the pharmaceutical composition of claim 11 to a subject in need thereof. 16. Способ по п.15, где мутация LEPR в результате дефекта передачи сигнала или нарушения передачи сигнала представляет собой LEPR-A409E или LEPR-P316T.16. The method of claim 15, wherein the LEPR mutation resulting from a signaling defect or signaling disorder is LEPR-A409E or LEPR-P316T. 17. Способ по п.15 или 16, где заболевание или состояние, ассоциированное с или вызванное мутацией LEPR в результате дефекта передачи сигнала или нарушения передачи сигнала, представляет собой ожирение на ранней стадии.17. The method of claim 15 or 16 wherein the disease or condition associated with or caused by a LEPR mutation resulting from a signal transduction defect or signal transduction disorder is early stage obesity. 18. Способ по любому из пп.12-17, дополнительно предусматривающий введение второго терапевтического средства субъекту, где второе терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из рекомбинантного лептина человека, ингибитора PCSK9, статина, эзетимиба, инсулина, варианта инсулина, секретогена инсулина, метформина, сульфонилмочевины, ингибитора натрий-глюкозного котранспортера 2 (SGLT2), агониста/аналога GLP-1, ингибитора глюкагона (GCG), ингибитора глюкагонового рецептора (GCGR), ингибитора ангиопоэтин-подобного белка (ANGPTL), фентермина, орлистата, топирамата, бупропиона, топирамата/фентермина, бупропиона/налтрексона, бупропиона/зонизамида, прамлинтида/метрелептина, лоркасерина, цетилистата, тезофензина и велнеперита.18. The method of any one of claims 12-17, further comprising administering the second therapeutic agent to the subject, wherein the second therapeutic agent is selected from the group consisting of recombinant human leptin, PCSK9 inhibitor, statin, ezetimibe, insulin, insulin variant, insulin secretogen, metformin , sulfonylurea, sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) inhibitor, GLP-1 agonist/analog, glucagon inhibitor (GCG), glucagon receptor inhibitor (GCGR), angiopoietin-like protein inhibitor (ANGPTL), phentermine, orlistat, topiramate, bupropion, topiramate/phentermine, bupropion/naltrexone, bupropion/zonisamide, pramlintide/metreleptin, lorcaserin, cetilistat, tesofensine, and wellneperite. 19. Шприц-ручка для доставки антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10, содержащая фармацевтическую композицию по п.11.19. A pen for delivering an antibody or an antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 10, containing a pharmaceutical composition according to claim 11. 20. Комбинация, содержащая выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент со вторым терапевтическим средством для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с мутацией 20. Combination containing an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof with a second therapeutic agent for the treatment of a disease or condition associated with a mutation --