EA041789B1

EA041789B1 - CD73 INHIBITORS

Info

Publication number: EA041789B1
Application number: EA202091821
Authority: EA
Inventors: Роберт Дин Дэлли; Паредес Мария Кристина Гарсия; Лоуренс Джозеф II Хайнц; Дженнифер Мари Хоувелл; Фрэнк Джордж Нджородж; Ян Ванг; Гэньши Чжао
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2018-03-01
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2022-12-02

Description

Данное изобретение относится к соединениям 5-[5]-[2-циклоалкил]-6-пиридазин-3-ил]-1Hпиримидин-2,4-диона или их фармацевтически приемлемым солям, а также к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, которые ингибируют активность CD73 и пригодны для лечения рака.This invention relates to compounds of 5-[5]-[2-cycloalkyl]-6-pyridazin-3-yl]-1Hpyrimidin-2,4-dione or their pharmaceutically acceptable salts, as well as to pharmaceutical compositions containing these compounds, which inhibit CD73 activity and are useful in the treatment of cancer.

CD73, также известный как 5'-нуклеотидаза или экто-5'-нуклеотидаза (ЕС 3.1.3.5), представляет собой фермент, который превращает 5'-мононуклеотиды в нуклеозиды. CD73 экспрессируется во многих тканях и активируется в раковых тканях, а каскад CD73 промотирует рост опухоли вследствие лимитирования противоопухолевого Т-клеточного иммунитета посредством передачи сигналов через аденозиновый рецептор (Zhang В, Cancer Research 2010; 70: 6407-6411; Antonioli L, et al., Drug Discovery Today 2017; 22: 1686-1696).CD73, also known as 5'-nucleotidase or ecto-5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5), is an enzyme that converts 5'-mononucleotides into nucleosides. CD73 is expressed in many tissues and upregulated in cancerous tissues, and the CD73 cascade promotes tumor growth by limiting antitumor T-cell immunity through adenosine receptor signaling (Zhang B, Cancer Research 2010; 70: 6407-6411; Antonioli L, et al. , Drug Discovery Today 2017;22:1686-1696).

У мышей с дефицитом CD73 повышен противоопухолевый иммунитет, и они резистентны к экспериментальному метастазу (Stagg J, et al., Cancer Research 2011; 71: 2892-2900). Внеклеточный аденозин, выработанный опухолевым CD73, накапливается в микроокружении опухоли, нарушает противоопухолевый Т-клеточный иммунитет (Zhang В, Cancer Research 2010; 70: 6407-6411; Antonioli L, et al., Drug Discovery Today 2017; 22: 1686-1696) и связан с ускользанием опухолей от иммунного ответа, пролиферацией, миграцией, неоваскуляризацией, метастазом и химиорезистентностью опухолевых клеток (Inoue Y, et al., Oncotarget 2017; 8: 8738-8751).CD73-deficient mice have increased antitumor immunity and are resistant to experimental metastasis (Stagg J, et al., Cancer Research 2011; 71: 2892-2900). Extracellular adenosine produced by tumor CD73 accumulates in the tumor microenvironment, impairs antitumor T-cell immunity (Zhang B, Cancer Research 2010; 70: 6407-6411; Antonioli L, et al., Drug Discovery Today 2017; 22: 1686-1696) and is associated with tumor escape from the immune response, proliferation, migration, neovascularization, metastasis, and tumor cell chemoresistance (Inoue Y, et al., Oncotarget 2017; 8: 8738-8751).

Описано также, что повышенная экспрессия CD73 связана с повышенным угнетением иммунитета (Jin D, et al., Cancer Res. 70: 2245-2255 (2010); Beavis PA, et al., Trends Immunol 33: 231-7 (2012); Beavis, PA, et al., Cancer Immunol Res. 3: 506-17 (2015); Loi S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 11091-11096 (2013)).Increased CD73 expression has also been reported to be associated with increased immune suppression (Jin D, et al., Cancer Res. 70: 2245-2255 (2010); Beavis PA, et al., Trends Immunol 33: 231-7 (2012); Beavis, PA, et al., Cancer Immunol Res. 3: 506-17 (2015); Loi S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 11091-11096 (2013)).

Таким образом, каскад CD73 оказывает иммуносупрессивное действие, и сделано предположение, что блокирование пути CD73 может быть пригодно для лечения рака (Antonioli L, et al., Oncoimmunol. 2016; 5: е1216292, doi: 10.1080/2162402X.2016.1216292; Antonioli L, et al., Trends in Cancer 2016; 2: 95109; Allard D, et al., Immunotherapy 2016; 8: 145-163). Ингибиторы CD73 проходят клинические испытания для лечения рака (Hay CM, et al., Oncoimmunol. 2016; 5(8): е1208875; Allard D, et al., Immunotherapy 2016; 8: 145-163).Thus, the CD73 cascade has an immunosuppressive effect, and it has been suggested that blocking the CD73 pathway may be useful for cancer treatment (Antonioli L, et al., Oncoimmunol. 2016; 5: e1216292, doi: 10.1080/2162402X.2016.1216292; Antonioli L, et al., Trends in Cancer 2016; 2: 95109; Allard D, et al., Immunotherapy 2016; 8: 145-163). CD73 inhibitors are in clinical trials for the treatment of cancer (Hay CM, et al., Oncoimmunol. 2016; 5(8): e1208875; Allard D, et al., Immunotherapy 2016; 8: 145-163).

Сохраняется потребность в обеспечении альтернативных ингибиторов CD73, более конкретно, для лечения рака. В частности, сохраняется потребность в перорально доступных низкомолекулярных ингибиторах CD73, которые демонстрируют более полное ингибирование мишени в микроокружении опухоли.There remains a need to provide alternative CD73 inhibitors, more specifically for the treatment of cancer. In particular, there remains a need for orally available small molecule CD73 inhibitors that exhibit more complete target inhibition in the tumor microenvironment.

Соответственно в данном изобретении предложены соединения-ингибиторы CD73, которые могут быть пригодны для лечения рака. В данном изобретении предложено соединение формулы I ^Rl _н о С(СН₂)_п Accordingly, the present invention provides CD73 inhibitor compounds that may be useful in the treatment of cancer. This invention provides a compound of formula I ^R l _n o C(CH ₂ ) _p

М O-^r2 M O- ^r2

N—N=NN—N=N

Н где n равен 0-3;H where n is 0-3;

где R¹ представляет собой -Н, -F, -гем-дифтор, -гем-диметил, -C_1-4алкил, -CHF2, -CF2CH3 или -CH2CH2F; иwhere R ¹ represents -H, -F, -gem-difluoro, -gem-dimethyl, -C _1-4 alkyl, -CHF2, -CF2CH3 or -CH2CH2F; And

R² выбран из -Н, -CH₃, -F, -Cl, -CN или -ОСН₃;R ² is selected from -H, -CH ₃ , -F, -Cl, -CN or -OCH ₃ ;

или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено соединение формулы I, где n равен 0, R¹ представляет собой -C_1-4 алкил, и R² представляет собой -CH3, или его фармацевтически приемлемая соль.In another embodiment, this invention provides a compound of formula I wherein n is 0, R ¹ is -C _1-4 alkyl, and R ² is -CH3, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации предложенное соединение представляет собойIn another embodiment, the proposed connection is

- 1 041789- 1 041789

или его фармацевтически приемлемую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

- 2 041789- 2 041789

или его фармацевтически приемлемаяую соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

- 3 041789- 3 041789

В одном варианте реализации соединение формулы I имеет формулуIn one embodiment, a compound of formula I has the formula

где R¹ представляет собой -CH2CH3 или -СН(СН3)2, или его фармацевтически приемлемая соль. В другом варианте реализации R¹ представляет собой -CH2CH₃, или его фармацевтически приемлемая соль. В другом варианте реализации R¹ представляет собой -СН(СН₃)₂, или его фармацевтически приемлемая соль.where R ¹ represents -CH2CH3 or -CH(CH3)2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In another embodiment, R ¹ is -CH2CH ₃ , or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In another embodiment, R ¹ is —CH(CH ₃ ) ₂ , or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации соединение формулы I имеет формулу или где R¹ In another embodiment, a compound of formula I has the formula or where R ¹

представляет собой CH2CH₃ или СН(СН₃)2, или его фармацевтически приемлемая соль.is CH2CH ₃ or CH(CH ₃ )2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации соединение формулы I имеет формулуIn another embodiment, a compound of formula I has the formula

- 4 041789 где R¹ представляет собой -CH2CH3 или -СН(СН3)2, или его фармацевтически приемлемая соль.- 4 041789 where R ¹ represents -CH2CH3 or -CH(CH3)2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено соединениеIn another embodiment of the present invention, a connection is provided

В одном варианте реализации данного изобретения предложено соединениеIn one embodiment of the present invention, a compound is provided

Н у?Well?

Ν—γ у—( °=< 7/^/N—γ y—( °=< 7/^/

N—N = N Н или его фармацевтически приемлемая соль.N—N=N H or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Н ,?N,?

N—N=N Н или его фармацевтически приемлемая соль.N—N=N H or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено соединение н о /.....(In another embodiment of the present invention, a compound n o /.....(

Ν—ν=ν Η или его фармацевтически приемлемая соль.Ν—ν=ν Η or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено соединение, которое представляет собой 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-uл]-1H-пиримидин-2,4-дион, или его фар мацевтически приемлемая соль.In one embodiment, this invention provides a compound that is 5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-ul]-1H-pyrimidine-2,4-dione, or its a pharmaceutically acceptable salt.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено соединение, которое представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метuлпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-дион, или его фармацевтически приемлемая соль.In another embodiment, this invention provides a compound which is 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione, or its pharmaceutically acceptable salt.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.In one embodiment, this invention provides a pharmaceutical composition comprising 5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione or a pharmaceutically acceptable thereof a salt; and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропuл]-6-метuлпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-дион и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.In another embodiment, this invention provides a pharmaceutical composition comprising 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропuл]6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона или его фармацевтически приемлемой соли.In one embodiment, the invention provides a method of treating cancer comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of 5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin- 2,4-dione or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества 5-[5-[(1S,2R)-2изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона или его фармацевтически приемлемой соли.In another embodiment, this invention provides a method of treating cancer comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of 5-[5-[(1S,2R)-2isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2 ,4-dione or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-6метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.In one embodiment, this invention provides 5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in therapy.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен 5-[5-[(1S,2R)-2изопропилциклопропил]-6-метилпирид азин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.In another embodiment, this invention provides 5-[5-[(1S,2R)-2isopropylcyclopropyl]-6-methylpyride azin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in therapy .

В одном варианте реализации данного изобретения предложен 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-6метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-дион или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака.In one embodiment, this invention provides 5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the treatment of cancer .

- 5 041789- 5 041789

В другом варианте реализации данного изобретения предложен 5-[5-[(1S,2R)-2изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения рака.In another embodiment, this invention provides 5-[5-[(1S,2R)-2isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the treatment of cancer .

В одном варианте реализации данного изобретения предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]Ш-пиримидин-2,4-дион или его фармацевтически приемлемую соль.In one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer, comprising or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион или его фармацевтически приемлемую соль.In another embodiment, this invention provides a pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer, comprising 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3yl]-1H-pyrimidine-2,4-dione or its pharmaceutically acceptable salt.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено применение 5-[5-[(1S,2S)-2этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона или его фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для лечения рака.In one embodiment, this invention provides the use of 5-[5-[(1S,2S)-2ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено применение 5-[5-[(1S,2R)-2изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-Ш-пиримидин-2,4-диона или его фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для лечения рака.In another embodiment, this invention provides the use of 5-[5-[(1S,2R)-2isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-III-pyrimidin-2,4-dione or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено получение и применение 4-хлор-6(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазина, который может быть структурно представлен как \In one embodiment, this invention provides the preparation and use of 4-chloro-6(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazine, which can be structurally represented as

О CIAbout CI

который пригоден для производства соединения или лекарственного средства для лечения рака.which is suitable for the production of a compound or drug for the treatment of cancer.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен 4-хлор-6-(2,4-диметоксипиримидин-5ил)-3-метилпиридазин для применения в производстве соединения или лекарственного средства.In another embodiment, this invention provides 4-chloro-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5yl)-3-methylpyridazine for use in the manufacture of a compound or drug.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено получение и применение 4,4,5,5тетраметил-2-(2-замещенный циклопропил)-1,3,2-диоксаборолана, который может быть структурно представлен какIn one embodiment, this invention provides the preparation and use of 4,4,5,5-tetramethyl-2-(2-substituted cyclopropyl)-1,3,2-dioxaborolane, which can be structurally represented as

где R1=CH2CH₃ или СН(СН₃)₂, который пригоден для производства лекарственного средства для лечения рака. В одном варианте реализации R=CH2CH₃. В другом варианте реализации R=CH(CH₃)₂. В другом варианте реализации данного изобретения предложен 4,4,5,5-тетраметил-2-(2-замещенный циклопропил)-1,3,2-диоксаборолан для применения в производстве соединения или лекарственного средства.where R1=CH2CH ₃ or CH(CH ₃ ) ₂ which is suitable for the manufacture of a drug for the treatment of cancer. In one embodiment, R=CH2CH ₃ . In another embodiment, R=CH(CH ₃ ) ₂ . In another embodiment, this invention provides 4,4,5,5-tetramethyl-2-(2-substituted cyclopropyl)-1,3,2-dioxaborolane for use in the manufacture of a compound or drug.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено получение и применение 2[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана, который может быть структурно представлен какIn one embodiment, this invention provides the preparation and use of 2[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane, which can be structurally represented as

В другом варианте реализации данного изобретения предложен 2-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан для применения в производстве соединения или лекарственного средства.In another embodiment, this invention provides 2-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane for use in the manufacture of a compound or drug.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено получение и применение 2[(1S,2S)-2-изопропилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана, который может быть структурно представлен какIn one embodiment, this invention provides the preparation and use of 2[(1S,2S)-2-isopropylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane, which can be structurally represented as

В другом варианте реализации данного изобретения предложен 2-[(1S,2S)-2изопропилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан для применения в производстве соединения или лекарственного средства.In another embodiment, this invention provides 2-[(1S,2S)-2isopropylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane for use in the manufacture of a compound or drug.

- 6 041789- 6 041789

В одном варианте реализации данного изобретения предложен хиральный синтез 2-[(1S,2S)-2этилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана с применением (1,3-диоксоизоиндолин-2ил)-(1S,2S)-2-этилциклопропанкарбоксилата, который может быть структурно представлен какIn one embodiment, this invention provides a chiral synthesis of 2-[(1S,2S)-2ethylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane using (1,3-dioxoisoindolin-2yl)- (1S,2S)-2-ethylcyclopropanecarboxylate, which can be structurally represented as

где R1=CH2CH₃ или СН(СН₃)₂, который пригоден для производства соединения или лекарственного средства для лечения рака. В другом варианте реализации данного изобретения предложен (1,3диоксоизоиндолин-2-ил)-(1S,2S)-2-этилциклопропанкарбоксилат для применения в производстве соеди нения или лекарственного средства.where R1=CH2CH ₃ or CH(CH ₃ ) ₂ which is suitable for the production of a compound or drug for the treatment of cancer. In another embodiment, the present invention provides (1,3dioxoisoindolin-2-yl)-(1S,2S)-2-ethylcyclopropanecarboxylate for use in the manufacture of a compound or drug.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен хиральный синтез 2-[(1S,2S)-2изопропилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана с применением (1,3-диоксоизоиндолин2-ил)-(1S,2R)-2-изопропилциклопропанкарбоксилата, который может быть структурно представлен какIn one embodiment, this invention provides a chiral synthesis of 2-[(1S,2S)-2isopropylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane using (1,3-dioxoisoindolin2-yl)- (1S,2R)-2-isopropylcyclopropanecarboxylate, which can be structurally represented as

В другом варианте реализации данного изобретения предложен (1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)(1S,2R)-2-изопропилциклопропанкарбоксилат для применения в производстве соединения или лекарственного средства.In another embodiment, this invention provides (1,3-dioxoisoindolin-2-yl)(1S,2R)-2-isopropylcyclopropanecarboxylate for use in the manufacture of a compound or drug.

Белок CD73 экспрессируется во многих тканях, включая головной мозг, щитовидную железу, надпочечники, костный мозг, лимфоузлы, миндалины, селезенку, сердечную мышцу, гладкие мышцы, легкие, носоглотку, печень, желчный пузырь, поджелудочную железу, слюнные железы, слизистую оболочку рта, пищевод, желудок, двенадцатиперстную кишку, тонкий кишечник, толстую кишку, прямую кишку, почки, мочевой пузырь, семенники, предстательную железу, фаллопиевы трубы, влагалище, молочные железы, шейку матки, матку, эндометрий, яичники, мягкие ткани и кожу (proteinatlas.org/ENSG00000135318-NT5E/tissue). CD73 сверхэкспрессируется во многих видах опухолей (Antonioli L, et al., Nat. Rev. Cancer 13, 842-857 (2013); Antonioli L, et al., Trends Cancer 2: 95-109 (2016). CD73 также экспрессируется в нормальных и патологических гепатобилиопанкреатических тканях, включая гепатоциты, аденокарциному протоков поджелудочной железы и внепеченочную холангиоцеллюлярную карциному (Sciarra, A., et al., Cancer ImmunolImmunother 2019; doi.org/10.1007/s00262-0182290-1).The CD73 protein is expressed in many tissues, including the brain, thyroid, adrenal glands, bone marrow, lymph nodes, tonsils, spleen, cardiac muscle, smooth muscles, lungs, nasopharynx, liver, gallbladder, pancreas, salivary glands, oral mucosa, esophagus, stomach, duodenum, small intestine, large intestine, rectum, kidneys, bladder, testes, prostate, fallopian tubes, vagina, breasts, cervix, uterus, endometrium, ovaries, soft tissues, and skin (proteinatlas. org/ENSG00000135318-NT5E/tissue). CD73 is overexpressed in many types of tumors (Antonioli L, et al., Nat. Rev. Cancer 13, 842-857 (2013); Antonioli L, et al., Trends Cancer 2: 95-109 (2016). CD73 is also expressed in normal and pathological hepatobiliopancreatic tissues, including hepatocytes, pancreatic ductal adenocarcinoma, and extrahepatic cholangiocellular carcinoma (Sciarra, A., et al., Cancer ImmunolImmunother 2019; doi.org/10.1007/s00262-0182290-1).

Повышенная экспрессия и активность CD73 связаны с инвазивностью и метастазом опухоли, а также с более коротким периодом выживания пациентов (Jin D, et al., Cancer Research 2010; 70: 2245-2255). Повышенная экспрессия CD73 ассоциируется с неблагоприятным прогнозом (Inoue K, et al., Oncotarget 8: 8738-8751 (2017); Turcotte K, et al., Cancer Res. 5: 4494-4503 (2015); Lu YT, et al., World J. Gastroenterol. 19: 1912-1918 (2013); Wu XR, et al., J. Surg. Oncol. 106: 130-137 (2012); Buisseret S, et al., Ann. Oncol. 29: 1056-1062 (2017); Leclerc R, et al., Clin. Cancer Res. 22: 158-66 (2016)).Increased CD73 expression and activity are associated with tumor invasiveness and metastasis, as well as shorter patient survival (Jin D, et al., Cancer Research 2010; 70: 2245-2255). Overexpression of CD73 is associated with poor prognosis (Inoue K, et al., Oncotarget 8: 8738-8751 (2017); Turcotte K, et al., Cancer Res. 5: 4494-4503 (2015); Lu YT, et al. , World J. Gastroenterol 19: 1912-1918 (2013); Wu XR, et al., J. Surg. Oncol. 106: 130-137 (2012); Buisseret S, et al., Ann. Oncol. 29: 1056-1062 (2017); Leclerc R, et al., Clin Cancer Res. 22: 158-66 (2016)).

Сверхэкспрессия CD73 в трижды негативном раке молочной железы связана с худшими клиническими исходами и повышенной резистентностью к антрациклиновой химиотерапии (Allard В, et al., Expert Opin. Ther. Targets 2014; 18: 863-881). CD73 ассоциируется с неблагоприятным прогнозом при плоскоклеточной карциноме головы и шеи (Ren Z-H, et al., Oncotargets 2016; 7: 61690-61702). Сверхэкспрессия CD73 также связана с прогрессированием почечноклеточной карциномы (Yu Y, et al., Oncol. Lett. 2015] 9: 2485-2494).CD73 overexpression in triple negative breast cancer is associated with worse clinical outcomes and increased resistance to anthracycline chemotherapy (Allard B, et al., Expert Opin. Ther. Targets 2014; 18: 863-881). CD73 is associated with poor prognosis in head and neck squamous cell carcinoma (Ren Z-H, et al., Oncotargets 2016; 7: 61690-61702). Overexpression of CD73 is also associated with the progression of renal cell carcinoma (Yu Y, et al., Oncol. Lett. 2015] 9: 2485-2494).

CD73 сверхэкспрессируется в опухолях эндометрия (Aliagas E, et al., Mediators of Inflammation 2014; doi: 10.1155/2014/509027), в ткани опухоли предстательной железы (Leclerc BG, et al., Clin. Cancer Res. 2016; 22: 158-166), в ткани немелкоклеточного рака легких (Inoue Y, et al., Oncotarget 2017; 8: 8738-8751). Описано, что CD73 сверхэкспрессируется в опухолях, включая рак молочной железы, рак толстой и прямой кишок, рак яичников, рак желудка и рак желчного пузыря (Gao Z-W and Zhang H-Z, Biomed Res. Int. 2014; doi: 10.1155/2014/460654). Описано, что CD73 сверхэкспрессируется в раковых клеточных линиях, включая клеточные линии глиобластомы, меланомы, рака молочной железы, рака яичников, медуллобластомы и рака мочевого пузыря (Gao Z-W and Zhang H-Z, Biomed Res.Int. 2014; doi: 10.1155/2014/460654).CD73 is overexpressed in endometrial tumors (Aliagas E, et al., Mediators of Inflammation 2014; doi: 10.1155/2014/509027), in prostate tumor tissue (Leclerc BG, et al., Clin. Cancer Res. 2016; 22: 158 -166), in non-small cell lung cancer tissue (Inoue Y, et al., Oncotarget 2017; 8: 8738-8751). CD73 has been described to be overexpressed in tumors including breast cancer, colon and rectal cancer, ovarian cancer, gastric cancer, and gallbladder cancer (Gao Z-W and Zhang H-Z, Biomed Res. Int. 2014; doi: 10.1155/2014/460654) . CD73 has been described to be overexpressed in cancer cell lines, including glioblastoma, melanoma, breast cancer, ovarian cancer, medulloblastoma, and bladder cancer cell lines (Gao Z-W and Zhang H-Z, Biomed Res. Int. 2014; doi: 10.1155/2014/460654 ).

Описано, что CD73-аденозин снижает иммунный ответ и выживаемость у пациентов с раком яичников (Gaudreau P-O, et al., Oncoimmunology 2016; 5(5): e1127496).CD73-adenosine has been reported to reduce immune response and survival in patients with ovarian cancer (Gaudreau P-O, et al., Oncoimmunology 2016; 5(5): e1127496).

Описано, что блокада CD73 in vivo селективным ингибитором CD73 а,в-метиленаденозин-5'дифосфатом замедляет рост опухоли у сингенных мышей с подкожной инъекцией опухолевых клетокBlockade of CD73 in vivo by the selective CD73 inhibitor α,β-methyleneadenosine-5'diphosphate has been reported to retard tumor growth in syngeneic mice with subcutaneous injection of tumor cells.

- 7 041789- 7 041789

EG7 (лимфома), МС38 (рак толстой кишки), АТ-3 (рак молочной железы) и В16F10 (меланома) (Stagg J, et al., Cancer Research 2011; 71: 2892-2900; Forte G, et al., J. Immunol. 2012; 189: 2226-2233). Описано, что терапия с анти-CD73 антителами подавляет рост опухоли и метастаз молочной железы (Stagg J, et al.,PNAS2010; 107: 1547-1552; Teip MG, J. Immunol. 2013; 191: 4165-4173).EG7 (lymphoma), MC38 (colon cancer), AT-3 (breast cancer), and B16F10 (melanoma) (Stagg J, et al., Cancer Research 2011; 71: 2892-2900; Forte G, et al., J. Immunol. 2012;189: 2226-2233). Therapy with anti-CD73 antibodies has been reported to inhibit tumor growth and breast metastasis (Stagg J, et al., PNAS2010; 107: 1547-1552; Teip MG, J. Immunol. 2013; 191: 4165-4173).

Кроме того, описано, что активность аденозина и фермента CD73 повышена у онкологических пациентов (Huang N, et al., Cancer Res. 75:1538 (2015), а также описано, что пациенты, которые не отвечают на ингибиторы иммунных контрольных точек, имеют более высокий уровень аденозина, чем пациенты, отвечающие на них (Giannakis HX, et al., J. Clin. Oncol. 35: 15 Suppl. 3036-3036 (2017)).In addition, adenosine and CD73 enzyme activity has been reported to be elevated in cancer patients (Huang N, et al., Cancer Res. 75:1538 (2015), and patients who do not respond to immune checkpoint inhibitors have also been reported to have higher adenosine levels than responding patients (Giannakis HX, et al., J. Clin. Oncol. 35: 15 Suppl. 3036-3036 (2017)).

Описано, что онкогенная активация и потеря эстрогеновых рецепторов ассоциированы с повышенной экспрессией CD73 (Reinhardt J, et al., Cancer Res. 77: 4697-4709 (2017); Spychala J, et al., Clin. Cancer Res. 70:708-17 (2004); Ascierto and McArthur J., Transl. Med. 15: 173 (2017); Young A, et al., Cancer Res. 77:4684-4696 (2017)).It has been described that oncogenic activation and loss of estrogen receptors are associated with increased expression of CD73 (Reinhardt J, et al., Cancer Res. 77: 4697-4709 (2017); Spychala J, et al., Clin. Cancer Res. 70:708- 17 (2004); Ascierto and McArthur J., Transl. Med. 15: 173 (2017); Young A, et al., Cancer Res. 77:4684-4696 (2017)).

Субъекты, для которых лечение ингибитором CD73 является эффективным, включают субъектов с опухолями, резистентными или невосприимчивыми к анти-PD1/PDL-1 ингибиторам, такими как немелкоклеточный рак легких, рак мочевого пузыря и меланома; субъектов с раковыми заболеваниями с мутацией EGFR/BRAF/Kras, такими как немелкоклеточный рак легких, рак мочевого пузыря, меланома, рак толстой кишки и поджелудочной железы; субъектов с раком, отрицательным (-) по эстрогеновому рецептору, таким как трижды негативный рак молочной железы; субъектов с высоким уровнем экспрессии CD73, например, с раком поджелудочной железы и раком толстой и прямой кишок. При необходимости такой субъект может быть выбран для терапии с применением соединения, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, на основании наличия высоких уровней экспрессии CD73 в их опухолях, по результатам иммуногистохимического (ИГХ) анализа; или на основании наличия мутаций EGFR и BRAF в их опухолях, обнаруженных в анализе ПЦР-РВ; или на основании потери эстрогенового рецептора в их опухолях, по результатам ИГХ или ПЦР-РВ анализа; или на основании наличия высоких уровней аденозина и АМФ в их опухолях или в плазме, по результатам ЖХ-МС анализа. Для фармакодинамической оценки можно использовать ex vivo анализ на основе ЖХ-МС, описанный в данном документе, для измерения влияния ингибитора CD73 на превращение АМФ в аденозин в крови.Subjects for whom treatment with a CD73 inhibitor is effective include those with tumors that are resistant or refractory to anti-PD1/PDL-1 inhibitors, such as non-small cell lung cancer, bladder cancer, and melanoma; subjects with EGFR/BRAF/Kras mutated cancers such as non-small cell lung cancer, bladder cancer, melanoma, colon and pancreatic cancer; subjects with estrogen receptor negative (-) cancer, such as triple negative breast cancer; subjects with a high level of expression of CD73, for example, with pancreatic cancer and cancer of the colon and rectum. If necessary, such a subject may be selected for therapy with a compound described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, based on the presence of high levels of CD73 expression in their tumors as determined by immunohistochemical (IHC) analysis; or based on the presence of EGFR and BRAF mutations in their tumors detected in RT-PCR analysis; or based on the loss of the estrogen receptor in their tumors, according to the results of IHC or PCR-RT analysis; or based on the presence of high levels of adenosine and AMP in their tumors or in plasma as determined by LC-MS analysis. For pharmacodynamic evaluation, the ex vivo LC-MS assay described herein can be used to measure the effect of a CD73 inhibitor on the conversion of AMP to adenosine in the blood.

В данном изобретении также предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.The present invention also provides a method of treating cancer in a patient comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a compound of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В данном изобретении также предложен способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, при этом рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек. В одном варианте реализации рак молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы. В другом варианте реализации рак легких представляет собой немелкоклеточный рак легких.The present invention also provides a method of treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a compound of formula I described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the cancer is bladder cancer, breast cancer, cholangiocarcinoma, cancer colon and rectum, colon cancer, stomach cancer, gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, or kidney cancer. In one embodiment, the breast cancer is triple negative breast cancer. In another embodiment, the lung cancer is non-small cell lung cancer.

В одном предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5[5-[(1 S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3 -ил] -1 Н-пиримидин-2,4-дион.In one preferred embodiment, the proposed compound is 5[5-[(1 S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1 H-pyrimidin-2,4-dione.

В одном варианте реализации пациентом является пациент, у которого определена активность CD73 в сыворотке. В одном предпочтительном варианте реализации определение активности CD73 означает определение факта наличия активности CD73. Способы определения уровня экспрессии CD73 или активности CD73 известны специалистам в данной области техники, например, см. S Morello, et al., J. Trans. Med. 2017; 15:244. В другом предпочтительном варианте реализации определение активности CD73 означает количественное определение степени превращения АМФ в аденозин под действием CD73, и в данном документе предложен анализ на основе ЖХ-МС, облегчающий количественное определение уровня активности CD73.In one embodiment, the patient is a patient whose serum CD73 activity has been determined. In one preferred embodiment, determining CD73 activity means determining whether CD73 activity is present. Methods for determining the level of CD73 expression or CD73 activity are known to those skilled in the art, for example, see S Morello, et al., J. Trans. Med. 2017; 15:244. In another preferred embodiment, the determination of CD73 activity means to quantify the degree of conversion of AMP to adenosine by CD73, and this document provides an LC-MS based assay to facilitate quantification of the level of CD73 activity.

В другом варианте реализации пациентом является пациент, у которого определена экспрессия CD73 в ткани. В другом варианте реализации ткань представляет собой опухолевую ткань. Способы определения уровня экспрессии CD73 в ткани известны специалистам в данной области техники, например, с применением вестерн-блоттинга или иммуногистохимии (X-R Wu, et al., J. Surg. Oncol. 2012; 106: 130137).In another embodiment, the patient is a patient whose tissue expression of CD73 has been determined. In another embodiment, the tissue is tumor tissue. Methods for determining the level of CD73 expression in a tissue are known to those skilled in the art, for example using Western blotting or immunohistochemistry (X-R Wu, et al., J. Surg. Oncol. 2012; 106: 130137).

В данном изобретении также предложен способ, включающий определение экспрессии CD73 в ткани пациента, которому введено соединение по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемая соль. В предпочтительном варианте реализации ткань представляет собой опухолевую ткань.The present invention also provides a method comprising determining the expression of CD73 in the tissue of a patient to whom a compound according to any one of claims 1 to 12 or a pharmaceutically acceptable salt thereof has been administered. In a preferred embodiment, the tissue is a tumor tissue.

В данном изобретении также предложен способ, включающий определение активности CD73 в сыворотке, полученной от пациента, которому введено соединение формулы I, описанное в данном документе, или его фармацевтически приемлемая соль. Предложенный способ является чувствительным, не включает биопсию опухоли, не включает использование антител или иммуногистохимии, облегчает количественное определение активности CD73 (например, посредством облегчения расчета EC₅₀). В одномThe invention also provides a method comprising determining CD73 activity in serum obtained from a patient administered a compound of formula I as described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The proposed method is sensitive, does not involve tumor biopsy, does not involve the use of antibodies or immunohistochemistry, and facilitates the quantification of CD73 activity (eg, by facilitating the calculation of EC ₅₀ ). In one

- 8 041789 предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион. В другом предпочтительном варианте реализации предложенный способ дополнительно включает оценку активности CD73 с применением аденозинмонофосфата (АМФ) с радиоактивной меткой и определение концентрации АМФ с радиоактивной меткой с помощью масс-спектрометрии. В другом предпочтительном варианте реализации АМФ с радиоактивной меткой представляет собой ¹³С5_¹⁵К5-АМФ.In a preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1S,2R)-2isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione. In another preferred embodiment, the proposed method further comprises evaluating CD73 activity using radioactively labeled adenosine monophosphate (AMP) and determining the radiolabeled AMP concentration by mass spectrometry. In another preferred embodiment ^, the radiolabeled AMP is ^13C5_15K5 -AMP.

В другом предпочтительном варианте реализации предложенный способ включает (a) получение сыворотки от пациента в каждом из множества контейнеров (например, микротитровальный планшет), выполненных с возможностью вмещения различных концентраций соединения, введенного пациенту, (b) введение ¹³C10_¹⁵N5_АМФ в каждый контейнер в указанном множестве контейнеров, (с) инкубацию множества контейнеров в условиях, способствующих смешиванию (например, при встряхивании), (d) центрифугирование указанного множества контейнеров, (е) перенос надосадочного раствора из каждого контейнера в новый соответствующий контейнер, (f) введение экстракционного раствора, содержащего внутренний стандарт, в каждый из новых соответствующих контейнеров, (g) центрифугирование новых соответствующих контейнеров, (h) перенос надосадочного раствора из каждого нового соответствующего контейнера в соответствующий аналитический контейнер, (i) анализ надосадочного раствора в каждом соответствующем аналитическом контейнере на содержание ¹³С10_¹⁵N5_аденозина, ¹³С10_¹⁵N4_инозина и ¹⁵N₄ гипоксантина с помощью ЖХ/МС, как описано в данном документе (Масс-спектроскопия для определения аденозина и очистка оденазина), (j) расчет EC₅₀.In another preferred embodiment, the proposed method includes (a) obtaining serum from a patient in each of a plurality of containers (for example, a microtiter plate) configured to accommodate different concentrations of the compound administered to the patient, (b) introducing ¹³ C10_ ¹⁵ N5_AMP into each container in said plurality of containers, (c) incubating the plurality of containers under conditions conducive to mixing (e.g., shaking), (d) centrifuging said plurality of containers, (e) transferring the supernatant from each container to a new corresponding container, (f) introducing the extraction solution containing an internal standard into each of the new appropriate containers, (g) centrifuging the new appropriate containers, (h) transferring the supernatant from each new appropriate container to the appropriate assay container, (i) analyzing the supernatant in each appropriate assay container for content of ¹³ C10_ ¹⁵ N5_adenosine, ¹³ C10_ ¹⁵ N4_inosine and ¹⁵ N ₄ hypoxanthine by LC/MS as described in this document (Mass Spectroscopy for Determination of Adenosine and Purification of Odenazine), (j) calculation of EC ₅₀ .

В одном предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5[5-[(1 S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3 -ил] -1 Н-пиримидин-2,4-дион. В предпочтительном варианте реализации внутренний стандарт представляет собой 13С5-АМФ, ¹³С5-аденозин, ¹⁵N4инозин и ¹³С₅-гипоксантин.In one preferred embodiment, the proposed compound is 5[5-[(1 S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1 H-pyrimidin-2,4-dione. In a preferred embodiment, the internal standard is 13C5-AMP, ^13C5 -adenosine, ^15N4inosine , and ^13C5 _- hypoxanthine.

В данном изобретении также предложено применение соединения формулы I, предложенного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли в терапии. В одном варианте реализации терапия представляет собой лечение рака. В другом варианте реализации рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек. В одном варианте реализации рак молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы. В другом варианте реализации рак легких представляет собой немелкоклеточный рак легких. В одном предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1 S,2R)-2-изопропилциклопропил] -6-метилпиридазин-3 -ил] -1 Н-пиримидин-2,4-дион.This invention also provides the use of a compound of formula I as provided herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in therapy. In one embodiment, the therapy is a cancer treatment. In another embodiment, the cancer is bladder cancer, breast cancer, cholangiocarcinoma, colon and rectal cancer, colon cancer, gastric cancer, gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma , melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, or kidney cancer. In one embodiment, the breast cancer is triple negative breast cancer. In another embodiment, the lung cancer is non-small cell lung cancer. In one preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1 S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1 H-pyrimidin-2,4-dione.

В данном изобретении также предложено применение соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рака. В одном варианте реализации рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек. В одном варианте реализации рак молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы. В другом варианте реализации рак легких представляет собой немелкоклеточный рак легких. В одном предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2изопропилциклопропил] -6-метилпиридазин-3-ил] - 1Н-пиримидин-2,4-дион.The present invention also provides the use of a compound of formula I described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer. In one embodiment, the cancer is bladder cancer, breast cancer, cholangiocarcinoma, colon and rectal cancer, colon cancer, gastric cancer, gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma , melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, or kidney cancer. In one embodiment, the breast cancer is triple negative breast cancer. In another embodiment, the lung cancer is non-small cell lung cancer. In one preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1S,2R)-2isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с одним или более противоопухолевыми агентами. Неограничивающие примеры противоопухолевых агентов включают рамуцирумаб, нецитумумаб, оларатумаб, гемцитабин, пеметрексед, галунисертиб, абемациклиб, гефитиниб, вемурафениб, дабрафениб, траметиниб, цисплатин, карбоплатин, дакарбазин, липосомный доксорубицин, доцетаксел, циклофосфамид и доксорубицин, навельбин, эрибулин, паклитаксел, частицы связанного с белком паклитаксела для инъекционной суспензии, иксабепилон, капецитабин, FOLFOX (лейковорин, фторурацил и оксалиплатин), FOLFIRI (лейковорин, фторурацил и иринотекан), цетуксимаб и ингибитор EGFR, ингибитор Raf, ингибитор B-Raf, ингибитор ERK, ингибитор CDK4/6, ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы, ингибитор TGFe и ингибитор рецептора TGFe.In one embodiment, the invention provides a method of treating cancer comprising administering an effective amount of a compound of Formula I as described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with one or more anticancer agents. Non-limiting examples of anticancer agents include ramucirumab, necitumumab, olaratumab, gemcitabine, pemetrexed, galunisertib, abemaciclib, gefitinib, vemurafenib, dabrafenib, trametinib, cisplatin, carboplatin, dacarbazine, liposomal doxorubicin, docetaxel, cyclophosphamide and doxorubicin, bound, naxolubicin, particles with paclitaxel protein for injection suspension, ixabepilone, capecitabine, FOLFOX (leucovorin, fluorouracil and oxaliplatin), FOLFIRI (leucovorin, fluorouracil and irinotecan), cetuximab and EGFR inhibitor, Raf inhibitor, B-Raf inhibitor, ERK inhibitor, CDK4/6 inhibitor, an indolamine 2,3-dioxygenase inhibitor, a TGFe inhibitor, and a TGFe receptor inhibitor.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации сIn another embodiment, the present invention provides a method of treating cancer comprising administering an effective amount of a compound of Formula I as described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with

- 9 041789 одним или более иммуноонкологическими агентами. В одном предпочтительном варианте реализации иммуноонкологический агент представляет собой анти-PD-1 антитело, анти-PD-L1 антитело, антителоагонист анти-CD137 или анти-CTLA4 антитело. Неограничивающие примеры иммуноонкологических агентов включают ниволумаб, ипилимумаб, пидилизумаб, пембролизумаб, тремелимумаб, урелумаб, лирилумаб, атезолизумаб, дурвалумаб и анти-PD-L1 антитело LY3300054 (последовательности тяжелой и легкой цепей которого описаны в WO 2017/034916 и US 2017/0058033 как SEQ ID NO: 10 и 11 соответственно). В одном предпочтительном варианте реализации иммуноонкологический агент представляет собой анти-PD-1 антитело. В другом предпочтительном варианте реализации иммуноонкологический агент представляет собой анти-PD-L1 антитело. В другом предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциkлопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Нпиримидин-2,4-дион, и иммуноонкологический агент представляет собой LY3300054.- 9 041789 one or more immuno-oncological agents. In one preferred embodiment, the immuno-oncological agent is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-CD137 antibody agonist, or an anti-CTLA4 antibody. Non-limiting examples of immuno-oncological agents include nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab, durvalumab, and the anti-PD-L1 antibody LY3300054 (whose heavy and light chain sequences are described in WO 2017/034916 and US 2017/0058033 ID NO: 10 and 11, respectively). In one preferred embodiment, the immuno-oncological agent is an anti-PD-1 antibody. In another preferred embodiment, the immuno-oncological agent is an anti-PD-L1 antibody. In another preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1Hpyrimidin-2,4-dione and the immuno-oncological agent is LY3300054.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения немелкоклеточного рака легких, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с другим агентом. В одном предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой осимертиниб, цетуксимаб или абемациклиб. В другом предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой осимертиниб. В другом предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой цетуксимаб. В другом предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой абемациклиб.In one embodiment, the invention provides a method of treating non-small cell lung cancer comprising administering an effective amount of a compound of formula I described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with another agent. In one preferred embodiment, the other agent is osimertinib, cetuximab, or abemaciclib. In another preferred embodiment, the other agent is osimertinib. In another preferred embodiment, the other agent is cetuximab. In another preferred embodiment, the other agent is abemaciclib.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения меланомы, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с другим агентом. В одном предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой ингибитор BRAF, анти-PD-1 антитело или анти-PD-L1 антитело. В другом предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой ингибитор BRAR В другом предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой анти-PD-1 антитело. В другом предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой анти-PD-L1 антитело. В другом предпочтительном варианте реализации анти-PD-L1 антитело представляет собой LY3300054. В другом предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион, и другой агент представляет собой αнтu-PD-L1 антитело, представляющее собой LY3300054.In another embodiment, this invention provides a method of treating melanoma, comprising administering an effective amount of a compound of formula I described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with another agent. In one preferred embodiment, the other agent is a BRAF inhibitor, an anti-PD-1 antibody, or an anti-PD-L1 antibody. In another preferred embodiment, the other agent is a BRAR inhibitor. In another preferred embodiment, the other agent is an anti-PD-1 antibody. In another preferred embodiment, the other agent is an anti-PD-L1 antibody. In another preferred embodiment, the anti-PD-L1 antibody is LY3300054. In another preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione and the other agent is αntu- PD-L1 antibody, which is LY3300054.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения рака толстой и прямой кишок, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с другим агентом. В одном предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой абемациклиб. В другом предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциkлопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Нпиримидин-2,4-дион, а другой агент представляет собой абемациклиб.In another embodiment, the present invention provides a method of treating colon and rectal cancer comprising administering an effective amount of a compound of formula I described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with another agent. In one preferred embodiment, the other agent is abemaciclib. In another preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1Hpyrimidin-2,4-dione and the other agent is abemaciclib.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения рака поджелудочной железы, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с другим агентом. В одном предпочтительном варианте реализации другой агент представляет собой абемациклиб. В другом предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Hпиримидин-2,4-дион, а другой агент представляет собой абемациклиб.In another embodiment, the present invention provides a method of treating pancreatic cancer comprising administering an effective amount of a compound of Formula I as described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with another agent. In one preferred embodiment, the other agent is abemaciclib. In another preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1Hpyrimidin-2,4-dione and the other agent is abemaciclib.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения трижды негативного рака молочной железы, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с другим агентом. В одном предпочтительном варианте реализации предложенное соединение представляет собой 5-[5-[(1S,2R)-2-изоnропилциклоnропил]-6-метилпиридазин3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион.In another embodiment, the present invention provides a method of treating triple negative breast cancer, comprising administering an effective amount of a compound of formula I described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with another agent. In one preferred embodiment, the proposed compound is 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione.

В данном изобретении также предложен способ ингибирования ферментативной активности CD73 у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. В данном изобретении также предложен способ ингибирования превращения АМФ в аденозин у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.The present invention also provides a method for inhibiting CD73 enzymatic activity in a patient, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a compound of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The present invention also provides a method for inhibiting the conversion of AMP to adenosine in a patient, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a compound of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение эффективного количества соединения формулы I, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, в одновременной, раздельной или последовательной комбинации с одним или более агентами, модулирующими аденозин. Неограничивающие примеры агентов, модулирующих аденозин, включают анти-CD73 антитело и антагонист рецептора аденозина.In another embodiment, the invention provides a method of treating cancer comprising administering an effective amount of a compound of Formula I as described herein, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in simultaneous, separate or sequential combination with one or more adenosine modulating agents. Non-limiting examples of adenosine modulating agents include an anti-CD73 antibody and an adenosine receptor antagonist.

- 10 041789- 10 041789

В данном изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. В данном изобретении дополнительно предложен способ получения фармацевтической композиции, включающий смешивание соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. Данное изобретение также включает новые промежуточные соединения и способы синтеза соединений формулы I.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof, with one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients. The present invention further provides a process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising admixing a compound of formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, with one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients. This invention also includes new intermediates and methods for the synthesis of compounds of formula I.

Следует понимать, что следующие термины, упомянутые выше и во всем описании данного изобретения, если не указано иное, имеют следующие значения.It should be understood that the following terms mentioned above and throughout the description of this invention, unless otherwise indicated, have the following meanings.

Фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество представляет собой среду, общепринятую в данной области техники для доставки биологически активных агентов млекопитающим, например людям.A pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient is a vehicle generally accepted in the art for the delivery of biologically active agents to mammals, such as humans.

Термины лечение, лечить, лечащий и т.п. включают замедление или реверсирование прогрессирования расстройства. Указанные термины включают также облегчение, улучшение, снижение, исключение или ослабление одного или более симптомов расстройства или патологического состояния, даже если указанное расстройство или патологическое состояние фактически не исключено и даже если прогрессирование расстройства или патологического состояния само по себе не замедлено или не реверсировано.Terms treatment, treat, treating, etc. include slowing or reversing the progression of the disorder. Said terms also include amelioration, improvement, reduction, elimination, or amelioration of one or more symptoms of a disorder or condition, even if said disorder or condition is not actually eliminated, and even if the progression of the disorder or condition is not itself retarded or reversed.

Эффективное количество означает такое количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли по данному изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединение или его фармацевтически приемлемую соль по данному изобретению, которое вызывает биологический или медицинский ответ или требуемый терапевтический эффект у пациента, наблюдаемый лечащим клиницистом. В одном варианте реализации предложенное соединение или его фармацевтически приемлемая соль ингибирует превращение АМФ в аденозин в анализе фермента CD73 in vitro или ex vivo. В другом варианте реализации предложенное соединение или его фармацевтически приемлемая соль ингибирует превращение АМФ в аденозин в цельной крови мышей, полученной от животных, которым введены различные дозы указанного соединения.An effective amount means that amount of a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof of this invention or a pharmaceutical composition containing a compound or a pharmaceutically acceptable salt of this invention that elicits a biological or medical response or desired therapeutic effect in a patient as observed by the attending clinician. In one embodiment, the proposed compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, inhibits the conversion of AMP to adenosine in an in vitro or ex vivo CD73 enzyme assay. In another embodiment, the implementation of the proposed connection or its pharmaceutically acceptable salt inhibits the conversion of AMP to adenosine in whole blood of mice obtained from animals that have been administered various doses of the specified connection.

Гем-дифтор относится к двум атомам фтора, связанным с одним и тем же атомом углерода.Heme difluoro refers to two fluorine atoms bonded to the same carbon atom.

Гем-диметил относится к двум метальным группам, связанным с одним и тем же атомом углерода.Gem-dimethyl refers to two methyl groups linked to the same carbon atom.

В данном контексте термин пациент относится к человеку.In this context, the term patient refers to a person.

Эффективное количество может быть без труда установлено лечащим врачом-диагностом как специалистом в данной области техники, с использованием известных технологий и посредством наблюдения результатов, полученных при аналогичных обстоятельствах. При определении эффективного для пациента количества наблюдающий врач-диагностик учитывает множество факторов, включая, но не ограничиваясь ими: биологический вид пациента; его размер, возраст и общее состояние здоровья; конкретное вовлеченное заболевание или расстройство; степень вовлеченности или тяжесть заболевания или расстройства; реакция отдельного пациента; конкретное введенное соединение; способ введения; характеристики биодоступности введенного препарата; выбранная схема лечения; применение сопутствующих лекарственных препаратов; и другие релевантные обстоятельства.An effective amount can be readily ascertained by the attending physician-diagnostician as one skilled in the art, using known techniques and by observing results obtained under similar circumstances. In determining the effective amount for the patient, the observing diagnostician takes into account many factors, including, but not limited to: the biological species of the patient; its size, age and general health; the specific disease or disorder involved; the degree of involvement or severity of the disease or disorder; individual patient response; the specific compound introduced; method of administration; characteristics of the bioavailability of the administered drug; the chosen treatment regimen; the use of concomitant medications; and other relevant circumstances.

Соединения по данному изобретению можно использовать в широком диапазоне доз. Например, суточные дозы обычно составляют от около 0,01 до около 50 мг/кг массы тела.The compounds of this invention can be used over a wide dosage range. For example, daily doses typically range from about 0.01 to about 50 mg/kg of body weight.

Соединения по данному изобретению предпочтительно составляют в фармацевтические композиции, которые вводят любым способом, обеспечивающим биодоступность соединения, включая пероральный, внутривенный и трансдермальный способы. Наиболее предпочтительно, указанные композиции предназначены для перорального введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. (См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, ред., 21^е издание, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).The compounds of this invention are preferably formulated into pharmaceutical compositions that are administered by any route that ensures the bioavailability of the compound, including oral, intravenous and transdermal routes. Most preferably, said compositions are for oral administration. Such pharmaceutical compositions and methods for their preparation are well known in the art. (See, for example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (DB Troy, ed., ^21st edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

Специалистам в данной области техники понятно, что соединения по данному изобретению могут образовывать соли. Соединения по данному изобретению содержат основные гетероциклы и соответственно вступают в реакцию с любыми из множества неорганических и органических кислот с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Такие фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и общие методики их получения известны в данной области техники. См., например, Р. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008).Those skilled in the art will appreciate that the compounds of this invention may form salts. The compounds of this invention contain basic heterocycles and accordingly react with any of a variety of inorganic and organic acids to form pharmaceutically acceptable acid addition salts. Such pharmaceutically acceptable acid addition salts and general procedures for their preparation are known in the art. See, for example, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008).

Фармацевтически приемлемые соли или фармацевтически приемлемая соль относится к относительно нетоксичной неорганической и органической соли и солям соединения по данному изобретению (S.M. Berge, et al., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, том 66, № 1, январь, 1977).Pharmaceutically acceptable salts or pharmaceutically acceptable salt refers to a relatively non-toxic inorganic and organic salt and salts of the compounds of this invention (S.M. Berge, et al., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 66, no. 1, January, 1977).

Обозначение изомер 1 в названии соединения означает, что соответствующее промежуточное соединение или соединение по данному изобретению представляет собой первый из двух элюированных энантиомеров при разделении пары энантиомеров хиральной хроматографией в условиях, описанных ниже в разделе Подготовительные синтезы и примеры. Обозначение изомер 2 в названии соединения означает, что соответствующее промежуточное соединение или соединение по данному изобретениюThe designation of isomer 1 in the name of a compound means that the corresponding intermediate or compound of this invention is the first of two enantiomers eluted upon separation of a pair of enantiomers by chiral chromatography under the conditions described below in the Preparatory Syntheses and Examples section. The designation of isomer 2 in the name of the compound means that the corresponding intermediate compound or compound according to this invention

- 11 041789 представляет собой второй из двух элюированных энантиомеров при разделении пары энантиомеров хиральной хроматографией в условиях, описанных ниже в разделе Подготовительные синтезы и примеры.- 11 041789 is the second of two enantiomers eluted upon separation of a pair of enantiomers by chiral chromatography under the conditions described below in the Preparatory Syntheses and Examples section.

Соединения по данному изобретению могут быть получены синтетическими способами, известными и признанными в данной области техники. Пригодные условия реакций для различных стадий указанных реакций известны в данной области техники, и соответствующие замены растворителей и совместных реагентов общеизвестны в данной области техники. Также специалистам в данной области техники понятно, что синтетические промежуточные соединения могут быть выделены и/или очищены различными известными технологиями, по необходимости или по желанию, и что часто можно использо вать различные промежуточные соединения на следующих стадиях синтеза напрямую, с незначительной очисткой или без очистки. Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что в некоторых случаях порядок введения фрагментов не является критичным. Конкретный порядок стадий, необходимых для получения соединений по данному изобретению, зависит от конкретного синтезируемого соединения, исходного соединения и относительной подвижности замещенных фрагментов, и это известно опытным химикам. Все заместители, если не указано иное, являются такими, как описано выше, и все реагенты являются общеизвестными и общепризнанными в данной области техники.The compounds of this invention may be prepared by synthetic methods known and recognized in the art. Suitable reaction conditions for the various steps of these reactions are known in the art, and appropriate substitutions of solvents and co-reagents are well known in the art. It will also be understood by those skilled in the art that synthetic intermediates can be isolated and/or purified by various known techniques, as needed or desired, and that various intermediates can often be used directly in subsequent synthetic steps with little or no purification. . In addition, those skilled in the art will appreciate that in some cases the order in which fragments are introduced is not critical. The specific order of steps required to prepare the compounds of this invention depends on the particular compound being synthesized, the parent compound, and the relative mobility of the substituted moieties, and is known to experienced chemists. All substituents, unless otherwise indicated, are as described above, and all reagents are well known and generally recognized in the art.

В данном контексте следующие термины имеют указанные значения: ACN относится к ацетонитрилу; DAST относится к трифториду диэтиламиносеры, DCM относится к дихлорметану; DMAP относится к 4-диметиламинопиридину; дмсо или ДМСО относится к диметилсульфоксиду э.и. относится к энантиомерному избытку; ЭР/МС относится к масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением; EtOAc относится к этилацетату; Et2O относится к диэтиловому эфиру; FBS относится к эмбриональной бычьей сыворотке; ГХ-МС относится к газовой хроматомасс-спектрометрии; HBSS относится к сбалансированному солевому раствору Хэнкса; IC₅₀ относится к полумаксимальной ингибирующей концентрации; LAH относится к алюмогидриду лития; ЖХ-ЭР/МС относится к жидкостной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электроспреем; МС относится к массспектрометрии; MeOH относится к метанолу; МТБЭ относится к метил-трет-бутиловому эфиру; nBuLi относится к н-бутиллитию; нм относится к нанометру или нанометрам; ЯМР относится к ядерному магнитному резонансу; ОАс относится к ацетату; фунт/кв.дюйм относится к фунтам на квадратный дюйм; комн. т-ра относится к комнатной температуре или к температуре окружающей среды; СКО относится к сильному катионообмену; СЖХ относится к сверхкритической жидкостной хроматографии; S_NAr относится к нуклеофильному ароматическому замещению; ТЭА относится к триэтиламину; ТГФ относится к тетрагидрофурану; t_R относится к времени удерживания, и мас./мас. относится к масса/массовым отношениям в растворе.In this context, the following terms have the meanings indicated: ACN refers to acetonitrile; DAST refers to diethylaminosulfur trifluoride, DCM refers to dichloromethane; DMAP refers to 4-dimethylaminopyridine; DMSO or DMSO refers to dimethyl sulfoxide e.i. refers to enantiomeric excess; ER/MS refers to electrospray ionization mass spectrometry; EtOAc refers to ethyl acetate; Et2O refers to diethyl ether; FBS refers to fetal bovine serum; GC-MS refers to gas chromatography-mass spectrometry; HBSS refers to Hanks' balanced salt solution; IC ₅₀ refers to the half-maximal inhibitory concentration; LAH refers to lithium aluminum hydride; LC-ER/MS refers to liquid chromatography-mass spectrometry with electrospray ionization; MS refers to mass spectrometry; MeOH refers to methanol; MTBE refers to methyl tert-butyl ether; nBuLi refers to n-butyllithium; nm refers to nanometer or nanometers; NMR refers to nuclear magnetic resonance; OAc refers to acetate; psi refers to pounds per square inch; room t-ra refers to room temperature or ambient temperature; RMS refers to strong cation exchange; SLC refers to supercritical liquid chromatography; S _N Ar refers to nucleophilic aromatic substitution; TEA refers to triethylamine; THF refers to tetrahydrofuran; t _R refers to the retention time, and wt./wt. refers to mass/mass ratios in solution.

Соединения по данному изобретению можно синтезировать так, как показано на следующих схемах.Compounds of this invention can be synthesized as shown in the following schemes.

Схема 1Scheme 1

На схеме 1 показано получение соединений формулы Ia. Используя общеизвестные условия реакции Сузуки, доступную в продаже (2,4-диметоксипиримидин-5-ил)бороновую кислоту 1 можно конденсировать с 4,6-дихлор-3-метилпиридазином. Можно выполнить следующее сочетание Сузуки хлорфрагмента соединения 3 с транс-циклопропилборонатом, замещенным соответствующим образом, с получением соединения 4. Опытным специалистам понятно, что энантиомеры соединения 4 можно разделить с помощью технологий хирального разделения, известных в данной области техники. СоединенияScheme 1 shows the preparation of compounds of formula Ia. Using well-known Suzuki reaction conditions, commercially available (2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)boronic acid 1 can be condensed with 4,6-dichloro-3-methylpyridazine. One can perform the following Suzuki coupling of the chloro moiety of compound 3 with an appropriately substituted trans-cyclopropylboronate to give compound 4. Those skilled in the art will recognize that the enantiomers of compound 4 can be resolved using chiral resolution techniques known in the art. Connections

- 12 041789 формулы Ia могут быть получены посредством снятия защитных метокси-групп в соединении 4 в ряде условий деметилирования, подробно описанных в известном уровне техники.- 12 041789 formula Ia can be obtained by removing the protective methoxy groups in compound 4 in a number of demethylation conditions, described in detail in the prior art.

Схема 2 ^R—^н и оЛScheme 2 ^R - ⁿ and oL

6 76 7

Формула ПFormula P

R¹ = СН₂СН₃₌ 01(0¾ 01,01(0¾R ¹ \u003d CH ₂ CH _{3 \u003d} 01 (0¾ 01.01 (0¾

На схеме 2 показаны обязательные циклопропилбороновые сложные эфиры, необходимые для получения соединений формулы II. Специалистам в данной области техники понятно, что гидроборирование соответствующим образом замещенного алкина 5 может быть осуществлено в ряде условий, в частности, в присутствии катализатора на основе переходного металла, такого как Cu или Zr, с получением алкенилбороната 6. Алкенилборонат можно подвергать циклопропанированию в условиях получения стабилизированных карбеноидов, известных в данной области техники, например, циклопропанирования Симмонса-Смита, реакции Кори-Чайковского и способа циклопопанирования с диазометаном (или диазосоединениями), как с катализаторами на основе переходных металлов (например, Cu, Pd или Ni), так и без них (например, термически или фотохимически), с получением соответствующим образом замещенного транс-циклопропилбороната 7. Специалистам в данной области техники понятно, что термодинамический благоприятный продукт циклопропанирования представляет собой смесь транс-энантиомеров в соединении 7.Scheme 2 shows the mandatory cyclopropylboronic esters needed to prepare compounds of formula II. It will be understood by those skilled in the art that the hydroboration of an appropriately substituted alkyne 5 can be carried out under a number of conditions, in particular in the presence of a transition metal catalyst such as Cu or Zr, to give the alkenylboronate 6. The alkenylboronate can be cyclopropanated under the conditions for producing stabilized carbenoids known in the art, such as the Simmons-Smith cyclopropanation, the Corey-Tchaikovsky reaction, and the cyclopopanation process with diazomethane (or diazo compounds), both with and without transition metal catalysts (e.g., Cu, Pd, or Ni). them (e.g., thermally or photochemically) to give an appropriately substituted trans-cyclopropylboronate 7. Those skilled in the art will appreciate that the thermodynamically favorable cyclopropanation product is a mixture of trans-enantiomers in compound 7.

Схема 3Scheme 3

б Формула 1bb Formula 1b

R¹ =СН_;СН_Г R ¹ =CH _; CH _G

СН(СН₃)₂, CHjCHfCH^CH(CH ₃ ) ₂ , CHjCHfCH^

На схеме 3 показан хиральный синтез соединений формулы Ib. Диазотирование соответствующим образом замещенной аминокислоты 8 в модифицированных условиях Зандмейера (радикальное SNAr), приводящее к образованию соединения 9, известно в данное области техники. Последующее восстановление до спирта 10 можно провести с использованием ряда восстановительных агентов, известных в данной области техники, включая гидриды алюминия и диборан в качестве восстановительных агентов. Циклизация до хирального эпоксида 11 в щелочных условиях подробно описана в известном уровне техники. Можно использовать стереоселективную реакцию Хорнера-Вадсворта-Эммонса с обработкой хирального эпоксида 11 пригодным фосфонатным сложным эфиром (например, этил-2диэтоксифосфорилацетатом или триэтилфосфоноацетатом) и пригодным основанием (например, алкиллитием, алкоксидами металлов или гидридами металлов) для получения транс-циклопропанового производного 12 (см., например, L. Delhaye; A. Merschaert; P. Delbeke;W. Brione. Org. Proc. Res. & Dev. 2007, 77, 689-692). Гидролиз соединения 12 до соответствующей кислоты 13 можно осуществлять в широком диапазоне основных условий, подробно описанных в данной области техники. Последующее связывание кислоты 13 с соответствующим образом замещенным N-гидроксифталимидом подробно описано в данной области техники, с применением пригодного агента для активации кислоты, например, карбонилдиимидазола, в присутствии слабого ненуклеофильного основания, с получением соединения 14. Декарбоксилирующее борилирование N-гидроксифталимидного сложного эфира 14 можно осуществлять вScheme 3 shows the chiral synthesis of compounds of formula Ib. Diazotization of an appropriately substituted amino acid 8 under modified Sandmeyer conditions (radical SNAr) leading to the formation of compound 9 is known in the art. Subsequent reduction to alcohol 10 can be carried out using a number of reducing agents known in the art, including aluminum hydrides and diborane as reducing agents. Cyclization to chiral epoxide 11 under alkaline conditions is described in detail in the prior art. A stereoselective Horner-Wadsworth-Emmons reaction with treatment of the chiral epoxide 11 with a suitable phosphonate ester (e.g. ethyl 2-diethoxyphosphoryl acetate or triethylphosphonoacetate) and a suitable base (e.g. alkyllithium, metal alkoxides or metal hydrides) can be used to give the trans-cyclopropane derivative 12 (see ., for example, L. Delhaye; A. Merschaert; P. Delbeke; W. Brione. Org. Proc. Res. & Dev. 2007, 77, 689-692). Hydrolysis of compound 12 to the corresponding acid 13 can be carried out under a wide range of basic conditions detailed in the art. The subsequent coupling of acid 13 with an appropriately substituted N-hydroxyphthalimide is described in detail in the art, using a suitable acid activating agent, e.g. carbonyldiimidazole, in the presence of a weak non-nucleophilic base, to give compound 14. implement in

- 13 041789 различных условиях, известных в данной области техники, в том числе в присутствии катализатора на основе переходного металла (например, по реакции Сузуки-Мияура), в фотолитических условиях, или посредством реакций с переносом одного электрона, включая, например, образование комплекса Nгидроксифталимидного сложного эфира с дибором по реакции радикальной конденсации, ускоряемой радикалом пиридин-бора, с получением транс-циклопропанбороната 15. (См., например, W.-M. Cheng; S. Rui; В. Zhao; W.-L. Xing; Y. Fu. Org. Lett. 2017, 19, 4291-4294). Связывание бороната 15 с арилхлоридом 4 и последующее деметилирование можно осуществлять таким же образом, как описано на схеме 1, с получением типов хиральных соединений формулы Ib.- 13 041789 various conditions known in the art, including in the presence of a transition metal catalyst (for example, the Suzuki-Miyaura reaction), under photolytic conditions, or through single electron transfer reactions, including, for example, the formation of a complex N-hydroxyphthalimide ester with diboron by a radical condensation reaction accelerated by a pyridine-boron radical to give trans-cyclopropaneboronate 15. (See, for example, W.-M. Cheng; S. Rui; B. Zhao; W.-L. Xing ; Y. Fu. Org. Lett. 2017, 19, 4291-4294). Coupling of boronate 15 with aryl chloride 4 and subsequent demethylation can be carried out in the same manner as described in Scheme 1 to give types of chiral compounds of formula Ib.

Схема 4Scheme 4

На схеме 4 показан синтез соединений формулы Ic. Нуклеофильное замещение дихлорпиридазина 17 можно осуществлять в радикальных условиях (например, по реакции Миниши), известных в данной области техники, с получением замещенного пиридазина 19. Связывание бороната 20 с арилхлоридом 19 и последующее деметилирование можно осуществлять таким же образом, как описано на схеме 1, с получением типов соединений формулы Ic.Scheme 4 shows the synthesis of compounds of formula Ic. Nucleophilic substitution of dichloropyridazine 17 can be carried out under radical conditions (e.g. the Minishi reaction) known in the art to give substituted pyridazine 19. Coupling of boronate 20 to aryl chloride 19 and subsequent demethylation can be done in the same manner as described in Scheme 1, with obtaining types of compounds of formula Ic.

Схема 5Scheme 5

На схеме 5 представлен синтез соединений формулы Id. Замещение 2-хлорпиридазина 21 можно осуществлять в нуклеофильных условиях, широко известных в данной области техники, с получением метоксипиридазина 22. Последующее деметилирование соединения 22 можно осуществлять таким же образом, как описано на схеме 1, с получением типов соединений формулы Id.Scheme 5 shows the synthesis of compounds of formula Id. Substitution of 2-chloropyridazine 21 can be carried out under nucleophilic conditions well known in the art to give methoxypyridazine 22. Subsequent demethylation of compound 22 can be done in the same manner as described in Scheme 1 to give types of compounds of formula Id.

Схема 6Scheme 6

- 14 041789- 14 041789

На схеме 6 показан синтез соединений формулы Ie. Цианирование соединений формулы Ic можно осуществлять в различных условиях, известных в данной области техники, включая реакции, катализируемые переходными металлами (например, Pd, Cu, Rh), с получением соединений формулы Ie.Scheme 6 shows the synthesis of compounds of formula Ie. Cyanation of compounds of formula Ic can be carried out under various conditions known in the art, including reactions catalyzed by transition metals (eg, Pd, Cu, Rh), to obtain compounds of formula Ie.

Схема 7Scheme 7

На схеме 7 представлен синтез соединений формулы If. Алкенилборонат можно подвергать циклопропанированию таким же образом, как описано на схеме 2. Связывание бороната 25 с арилхлоридом 3 можно осуществлять таким же образом, как описано на схеме 1, с получением хирального соединения 26. Демаскирование диэтилацеталя 26 до альдегида 27 можно осуществлять посредством обработки соответствующей кислотой. Обработка альдегида 27 различными фторирующими реагентами (например, DAST, XtalFluor®, Fluolead™ или Deoxo-Fluor®) может обеспечивать получение дифторметилсоединения 28. Последующее деметилирование соединения 28 можно осуществлять таким же образом, как описано на схеме 1, с получением типов соединений формулы If.Scheme 7 shows the synthesis of compounds of the formula If. The alkenylboronate can be subjected to cyclopropanation in the same manner as described in Scheme 2. The coupling of the boronate 25 with the aryl chloride 3 can be carried out in the same manner as described in Scheme 1 to give the chiral compound 26. . Treatment of aldehyde 27 with various fluorinating reagents (e.g., DAST, XtalFluor®, Fluolead™, or Deoxo-Fluor®) can provide difluoromethyl compound 28. Subsequent demethylation of compound 28 can be carried out in the same manner as described in Scheme 1 to give types of compounds of formula If .

Схема 8Scheme 8

На схеме 8 представлен синтез соединений формулы Ig. Метансульфонат 29 можно превращать во фторид 30 с помощью технологий замещения, известных специалистам в данной области техники, с применением таких реагентов, как фторид калия или фторид трет-бутиламмония. Последующее деметилирование можно осуществлять таким же образом, как описано на схеме 1, с получением хирального соединения формулы Ig.Scheme 8 shows the synthesis of compounds of formula Ig. Methanesulfonate 29 can be converted to fluoride 30 using displacement techniques known to those skilled in the art using reagents such as potassium fluoride or t-butylammonium fluoride. Subsequent demethylation can be carried out in the same manner as described in Scheme 1 to give a chiral compound of formula Ig.

Синтезы и примерыSyntheses and examples

Следующие синтезы и примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение и представляют типичные способы синтеза соединений по данному изобретению, но их никоим образом не следует толковать как ограничение объема данного изобретения. Реагенты и исходные материалы без труда доступны или могут быть легко синтезированы специалистами в данной области техники. Следует понимать, что приведенные ниже подготовительные синтезы и примеры представлены с целью иллюстрации, но не ограничения, и что специалисты в данной области техники могут делать различные модификации.The following syntheses and examples further illustrate the invention and represent typical methods for synthesizing the compounds of this invention, but should in no way be construed as limiting the scope of the invention. Reagents and starting materials are readily available or readily synthesized by those skilled in the art. It should be understood that the following preparatory syntheses and examples are provided by way of illustration and not limitation, and that various modifications may be made by those skilled in the art.

ЖХ-ЭР/МС проводили на жидкостной хроматографической системе Agilent HP1100. Измерения масс-спектрометрии с электрораспылением (записанные в положительном и/или отрицательном режиме) проводили на квадрупольном масс-спектрометре с масс-селективным детектором, подключенном к системе ВЭЖХ РН1100. Условия для ЖХ-МС (низкий pH): колонка: PHENOMENEX® GEMINI® NX C-18 2,1x50 мм, 3,0 мкм; градиент: 5-100% В за 3 мин, затем 100% В в течение 0,75 мин, температура колонки: 50±10°С; скорость потока: 1,2 мл/мин; растворитель А: деионизированная вода с 0,1% НСООН, растворитель В: ACN с 0,1% муравьиной кислоты; длина волны 214 нм. Альтернативные условия для ЖХ-МС (высокий pH): колонка: колонки WATERS™ XTERRA® MS C-18, 2,1x50 мм, 3,5 мкм; градиент: 5% растворителя А в течение 0,25 мин, градиент от 5% до 100% растворителя В за 3 мин и 100% растворителя ВLC-ER/MS was performed on an Agilent HP1100 liquid chromatography system. Electrospray mass spectrometry measurements (recorded in positive and/or negative mode) were performed on a quadrupole mass spectrometer with a mass selective detector connected to a PH1100 HPLC system. Conditions for LC-MS (low pH): column: PHENOMENEX® GEMINI® NX C-18 2.1x50 mm, 3.0 µm; gradient: 5-100% B over 3 min, then 100% B over 0.75 min, column temperature: 50±10°C; flow rate: 1.2 ml/min; solvent A: deionized water with 0.1% HCOOH, solvent B: ACN with 0.1% formic acid; wavelength 214 nm. Alternative conditions for LC/MS (high pH): column: WATERS™ XTERRA® MS C-18, 2.1x50 mm, 3.5 µm columns; gradient: 5% solvent A over 0.25 min, gradient from 5% to 100% solvent B over 3 min and 100% solvent B

- 15 041789 в течение 0,5 мин, или от 10 до 100% растворителя В за 3 мин и при 100% растворителя В в течение- 15 041789 for 0.5 min, or 10 to 100% solvent B for 3 min and 100% solvent B for

0,75 мин; температура колонки: 50±10°С; скорость потока: 1,2 мл/мин; растворитель А: 10 мМ NH₄HCO₃ pH 9; растворитель В: ACN; длина волны: 214 нм.0.75 min; column temperature: 50±10°C; flow rate: 1.2 ml/min; solvent A: 10 mM NH ₄ HCO ₃ pH 9; solvent B: ACN; wavelength: 214 nm.

Препаративную обращенно-фазовую хроматографию проводили на системе ЖХ-ЭР/МС Agilent 1200, оснащенной масс-спектрометром с масс-селективным детектором и автоматическим пробоотборником Leap. Методы при высоком pH осуществляли на колонке 75x30 мм PHENOMENEX® GEMINI®NX с размером частиц 5 мкм с защитой 10x20 мм. Скорость потока 85 мл/мин. В качестве элюента использовали 10 мМ бикарбонат аммония (pH 10) в ACN.Preparative reverse phase chromatography was performed on an Agilent 1200 LC-ER/MS system equipped with a mass spectrometer with a mass selective detector and a Leap autosampler. High pH methods were performed on a 75x30 mm PHENOMENEX® GEMINI®NX column with a particle size of 5 µm with a 10x20 mm shield. Flow rate 85 ml/min. 10 mM ammonium bicarbonate (pH 10) in ACN was used as eluent.

Спектры ЯМР записывали на ЯМР спектрометре Bruker AVIII HD при 400 МГц, образцы получали в виде растворов в CDCl₃ или (CD₃)₂SO, результаты записывали в м.д., используя остаточный растворитель [CDCl₃, 7,26 м.д.; (CD₃)₂SO, 2,50 м.д.] в качестве эталонного стандарта. При записи мультиплетности пиков могут быть использованы следующие сокращения: с (синглет), д (дублет), т (триплет), к (квартет), м (мультиплет), шс (широкий синглет), дд (дублет дублетов), дт (дублет триплетов). Константы связывания (J), в случае их указания, записаны в герцах (Гц).NMR spectra were recorded on a Bruker AVIII HD NMR spectrometer at 400 MHz, samples were obtained as solutions in CDCl ₃ or (CD ₃ ) ₂ SO, the results were recorded in ppm using the residual solvent [CDCl ₃ , 7.26 ppm .; (CD ₃ ) ₂ SO, 2.50 ppm] as a reference standard. When recording peak multiplicity, the following abbreviations can be used: s (singlet), d (doublet), t (triplet), k (quartet), m (multiplet), ws (wide singlet), dd (doublet of doublets), dt (doublet triplets). Coupling constants (J), when specified, are in hertz (Hz).

Синтез 1. Рац-транс-2-(2-этилциклопропил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан.Synthesis 1. Rac-trans-2-(2-ethylcyclopropyl)-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane.

К раствору 2-[(E)-бут-1-енил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана (1,65 г, 9,06 ммоль) в Et₂O (45,30 мл) добавляли Pd(OAc)₂ (0,20 г, 0,90 ммоль). Обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин и охлаждали до -5°С.To a solution of 2-[(E)-but-1-enyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane (1.65 g, 9.06 mmol) in Et ₂ O (45 .30 ml) Pd(OAc) ₂ (0.20 g, 0.90 mmol) was added. Was treated with ultrasound for 5 min and cooled to -5°C.

В колбу Эрленмейера объемом 250 мл добавляли 40% водный раствор КОН (162 мл), затем Et₂O (245 мл). Охлаждали двухфазную смесь до -5°С на бане изо льда/насыщенного водного раствора NaCl. По частям добавляли N-нитрозо-N-метилмочевину (36,1 г, 350 ммоль) в течение 10 мин. Перемешивали 15 мин и помещали на баню из сухого льда/ацетона. Декантировали эфирный слой в мерный цилиндр и добавляли смесь Et₂O (71 мл, ~10 экв. CH2N2) к раствору, описанному выше, при -5°С. Через 2 ч отфильтровывали содержимое реакционной смеси через диатомовую землю, сушили над MgSO₄ и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (1,08 г, 58%). 1Н ЯМР (d₆-ДМСО) δ: -0,51 (дт, J=9,3, 5,7 Гц, 1H), 0,33-0,37 (м, 1H), 0,50-0,54 (м, 1H), 0,76-0,84 (м, 1H), 0,91 (т, J=7,4 Гц, 3Н), 1,14 (с, 12Н), 1,21-1,30 (м, 2Н).A 40% aqueous KOH solution (162 ml) was added to a 250 ml Erlenmeyer flask followed by Et ₂ O (245 ml). The biphasic mixture was cooled to -5° C. in an ice/saturated aqueous NaCl bath. N-nitroso-N-methylurea (36.1 g, 350 mmol) was added in portions over 10 minutes. Stirred for 15 min and placed in a dry ice/acetone bath. The ether layer was decanted into a graduated cylinder and a mixture of Et ₂ O (71 ml, ~10 equiv. CH2N2) was added to the solution described above at -5°C. After 2 h, filter the contents of the reaction mixture through diatomaceous earth, dry over MgSO ₄ and concentrate in vacuo to give the title compound (1.08 g, 58%). 1 H NMR (d ₆ -DMSO) δ: -0.51 (dt, J=9.3, 5.7 Hz, 1H), 0.33-0.37 (m, 1H), 0.50-0, 54 (m, 1H), 0.76-0.84 (m, 1H), 0.91 (t, J=7.4 Hz, 3H), 1.14 (s, 12H), 1.21-1 .30 (m, 2H).

Альтернативный способ подготовительного синтеза 1.Alternative method of preparatory synthesis 1.

Добавляли 1 М раствор триэтилборгидрида лития в ТГФ (41,3 мл, 41,3 ммоль) к раствору бис(пентаметилциклопентадиенил)циркония дихлорида (11,1 г, 25,5 ммоль) в ТГФ (3,4 л) в атмосфере азота, охлаждали при 0°С. Нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч, защищая колбу от света алюминиевой фольгой.A 1 M solution of lithium triethylborohydride in THF (41.3 mL, 41.3 mmol) was added to a solution of bis(pentamethylcyclopentadienyl)zirconium dichloride (11.1 g, 25.5 mmol) in THF (3.4 L) under a nitrogen atmosphere, cooled at 0°C. Warmed to room temperature and stirred for 1 h, protecting the flask from light with aluminum foil.

В отдельной колбе, охлажденной в атмосфере азота при -78°С, конденсировали 1-бут-1-ин (50,6 г, 936 ммоль) и добавляли пинаколборан (55,0 г, 425 ммоль). Перемешивали полученную смесь при -78°С в течение 30 мин и через канюлю добавляли содержимое первой колбы. Добавляли ТЭА (5,93 мл, 42,6 ммоль) и перемешивали реакционную смесь, нагревая до комнатной температуры, в течение 20 ч. Гасили реакцию посредством добавления через канюлю смеси льда/воды (1,5 л), добавляли EtOAc (300 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Разделяли полученные слои и повторно экстрагировали водную фазу EtOAc (2x200 мл). Объединяли органические экстракты, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением 2-[(Е)-бут-1-енил]-4,4,5,5-тетраметил1,3,2-диоксаборолана (53 г, 65%) в виде желтого маслянистого вещества. ГХ-МС (m/z): 182 (М⁺).In a separate flask cooled under nitrogen at -78° C., 1-but-1-yne (50.6 g, 936 mmol) was condensed and pinacolborane (55.0 g, 425 mmol) was added. The resulting mixture was stirred at -78°C for 30 min and the contents of the first flask were added via cannula. TEA (5.93 ml, 42.6 mmol) was added and the reaction mixture was stirred while warming to room temperature for 20 h. ) and stirred at room temperature for 30 min. The resulting layers were separated and the aqueous phase was re-extracted with EtOAc (2x200 ml). The organic extracts were combined, dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and concentrated in vacuo to give 2-[(E)-but-1-enyl]-4,4,5,5-tetramethyl1,3,2-dioxaborolane (53 g , 65%) as a yellow oily substance. GC-MS (m/z): 182 (M ⁺ ).

Добавляли раствор диэтилцинка в толуоле (15% мас./мас., 550 мл, 611 ммоль) к хлориодметану (55 мл, 755 ммоль) при -20°С за 10 мин и перемешивали 35 мин. По каплям добавляли раствор 2-[(Е)-бут1-енил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана (53 г, 277 ммоль) в толуоле (100 мл) за 20 мин, поддерживая внутреннюю температуру реакции при -20°С. Перемешивали смесь в течение 2 ч, нагревая до 0°С. Гасили реакцию, медленно добавляя насыщенный водный раствор NH₄Cl (750 мл). Отделяли органический слой и повторно экстрагировали водную фазу EtOAc (2x250 мл). Объединяли органические экстракты, сушили над MgSO₄, фильтровали и выпаривали с получением указанного в заголовке соединения (48 г, 84%) в виде маслянистого вещества, пригодного для использования без дополнительной очистки. ГХ-МС (m/z): 180 (М-16).A solution of diethylzinc in toluene (15% w/w, 550 ml, 611 mmol) was added to chloroiodomethane (55 ml, 755 mmol) at -20° C. over 10 minutes and stirred for 35 minutes. A solution of 2-[(E)-but1-enyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane (53 g, 277 mmol) in toluene (100 ml) was added dropwise over 20 min, maintaining the internal temperature of the reaction at -20°C. The mixture was stirred for 2 h, warming to 0°C. Quenched the reaction by slowly adding a saturated aqueous solution of NH ₄ Cl (750 ml). The organic layer was separated and the aqueous phase was re-extracted with EtOAc (2x250 ml). The organic extracts were combined, dried over MgSO ₄ , filtered and evaporated to give the title compound (48 g, 84%) as an oil, usable without further purification. GC-MS (m/z): 180 (M-16).

Синтез 2. 4,4,5,5-Тетраметил-2-[(Е)-3-метилбут-1-енил]-1,3,2-диоксаборолан.Synthesis 2. 4,4,5,5-Tetramethyl-2-[(E)-3-methylbut-1-enyl]-1,3,2-dioxaborolane.

- 16 041789- 16 041789

В течение 5 мин по каплям добавляли пинаколборан (9,5 мл, 64 ммоль) к ледяному 3-метилбут-1ину (4,91 г, 72,0 ммоль). Закрывали емкость для работы под давлением, нагревали до комнатной температуры и перемешивали 18 ч. Добавляли хлорид-гидрид бис(циклопентадиенил)циркония (IV) (2,0 г, 7,4 ммоль) и ТЭА (1,1 мл, 7,9 ммоль). Закрывали емкость для работы под давлением, помещали на масляную баню при 60°С и перемешивали 10 мин. Охлаждали полученный красный раствор до комнатной температуры в течение 2,5 ч. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (200 мл), промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃ (100 мл), насыщенным водным раствором NaCl (50 мл), сушили над MgSO₄, фильтровали через слой силикагеля (150 мл), промывали силикагель ДХМ (700 мл) и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (11,5 г, 82%). ЭР/МС (m/z): 196 (М+Н). 1Н ЯМР (CDCl3) δ: 1,03 (д, J=6,7 Гц, 6Н), 1,29 (с, 12Н), 2,37 (м, 1H), 5,40 (дд, 1H), 6,64 (дд, 1H).Pinacolborane (9.5 ml, 64 mmol) was added dropwise to ice-cold 3-methylbut-1ine (4.91 g, 72.0 mmol) over 5 min. The pressure vessel was closed, warmed to room temperature and stirred for 18 hours. mmol). The pressure vessel was closed, placed in an oil bath at 60° C. and stirred for 10 minutes. Cool the resulting red solution to room temperature over 2.5 hours. The reaction mixture was diluted with DCM (200 ml), washed with saturated aqueous NaHCO ₃ (100 ml), saturated aqueous NaCl (50 ml), dried over MgSO ₄ , filtered through silica gel layer (150 ml), washed silica gel with DCM (700 ml) and concentrated in vacuo to give the title compound (11.5 g, 82%). ER/MS (m/z): 196 (M+H). 1H NMR (CDCl3) δ: 1.03 (d, J=6.7 Hz, 6H), 1.29 (s, 12H), 2.37 (m, 1H), 5.40 (dd, 1H), 6.64 (dd, 1H).

Синтез 3. Рац-транс-2-[2-изопропилциклопропил]-4,4,5,5 -тетраметил-1,3,2-диоксаборолан.Synthesis 3. Rac-trans-2-[2-isopropylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane.

По частям добавляли N-нитрозо-N-метилмочевину к ледяной двухфазной смеси Et₂O (70 мл) и водного раствора КОН (30,5 г, 435 ммоль, 70 мл H2O). Перемешивали до растворения твердого вещества (<5 мин). Пипеткой переносили полученный раствор диазометана в быстро перемешиваемую ледяную суспензию Pd(OAc)2 (237 мг, 1,05 ммоль) и 4,4,5,5-тетраметил-2-[(Е)-3-метилбут-1-енил]-1,3,2диоксаборолана (4,00 г, 20,4 ммоль) в Et₂O (70 мл). После завершения добавления нагревали реакционную смесь до комнатной температуры, фильтровали через диатомовую землю и концентрировали фильтрат in vacuo. Растворяли полученный остаток в ДХМ, фильтровали через слой силикагеля (25 г) и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (4,32 г, >99%). ЭР/МС (m/z): 210 (М+Н). 1Н ЯМР (CDCl3) δ: -0,35 (м, 1H), 0,45 (м, 1H), 0,65 (м, 1H), 0,78 (м, 1H), 0,98 (м, 7Н), 1,23 (с, 12Н).N-nitroso-N-methylurea was added in portions to an ice-cold biphasic mixture of Et ₂ O (70 mL) and aqueous KOH (30.5 g, 435 mmol, 70 mL H2O). Stir until solid dissolves (<5 min). The resulting diazomethane solution was pipetted into a rapidly stirred ice-cold suspension of Pd(OAc)2 (237 mg, 1.05 mmol) and 4,4,5,5-tetramethyl-2-[(E)-3-methylbut-1-enyl] -1,3,2dioxaborolane (4.00 g, 20.4 mmol) in Et ₂ O (70 ml). After completion of the addition, warm the reaction mixture to room temperature, filter through diatomaceous earth and concentrate the filtrate in vacuo. Dissolve the resulting residue in DCM, filter through a plug of silica gel (25 g) and concentrate in vacuo to give the title compound (4.32 g, >99%). ER/MS (m/z): 210 (M+H). 1H NMR (CDCl3) δ: -0.35 (m, 1H), 0.45 (m, 1H), 0.65 (m, 1H), 0.78 (m, 1H), 0.98 (m, 7H), 1.23 (s, 12H).

Синтез 4. 4-Хлор-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин.Synthesis 4. 4-Chloro-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazine.

\\

О CIAbout CI

В колбе для работы под давлением смешивали 2,4-диметокси-5-пиримидинилбороновую кислоту (6,75 г, 36,7 ммоль), 4,6-дихлор-3-метилпиридазин (5,98 г, 36,7 ммоль), [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий (II) (0,55 г, 0,73 ммоль), Cs₂CO₃ (29,9 г, 91,8 ммоль) в 4:1 смеси 1,4-диоксан/Н2О (151 мл). Откачивали воздух и закачивали N2. Закрывали емкость и нагревали при 70°С в течение 3 ч. Фильтровали остаток через диатомовую землю и промывали EtOAc. Промывали органическую смесь водой, затем насыщенным водным раствором NaCl, сушили над MgSO4 и выпаривали досуха. Очищали полученный черный остаток хроматографией на силикагеле, используя 330 г колонку REDISEP® с градиентом 0-30% ДХМ/(33% MeOH в ДХМ) за 15 мин при скорости потока 200 мл/мин, с получением указанного в заголовке соединения (6,2 г, 63%) после выпаривания хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z) (³⁵Cl/³⁷Cl) 267/269 [М+1]⁺ 1Н ЯМР ^-ДМСО) δ: 2,74 (с, 3Н), 4,00 (с, 3Н), 4,03 (с, 3Н), 8,20 (с, 1H), 8,87 (с, 1H).In a pressure flask were mixed 2,4-dimethoxy-5-pyrimidinylboronic acid (6.75 g, 36.7 mmol), 4,6-dichloro-3-methylpyridazine (5.98 g, 36.7 mmol), [1,1'bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium (II) (0.55 g, 0.73 mmol), Cs ₂ CO ₃ (29.9 g, 91.8 mmol) in 4:1 mixture 1.4 -dioxane/H2O (151 ml). The air was evacuated and N2 was pumped in. The container was closed and heated at 70°C for 3 hours. Filter the residue through diatomaceous earth and wash with EtOAc. The organic mixture was washed with water, then with saturated aqueous NaCl, dried over MgSO4 and evaporated to dryness. Purify the resulting black residue by silica gel chromatography using a 330 g REDISEP® column with a 0-30% DCM/(33% MeOH in DCM) gradient over 15 min at a flow rate of 200 mL/min to give the title compound (6.2 g, 63%) after evaporation of the chromatographic fractions. ER/MS (m/z) ( ³⁵ Cl/ ³⁷ Cl) 267/269 [M+1] ⁺ 1H NMR ^-DMSO) δ: 2.74 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 4.03 (s, 3H), 8.20 (s, 1H), 8.87 (s, 1H).

Альтернативный способ синтеза 4.Alternative synthesis route 4.

Поток азота пропускали через смесь (2,4-диметоксипиримидин-5-ил)бороновой кислоты (85 г, 439 ммоль), 4,6-дихлор-3-метилпиридазина (75 г, 437 ммоль) и Cs₂CO₃ (358 г, 1099 ммоль) в 1,4-диоксане (1175 мл) и H2O (340 мл) в течение 5 мин. Добавляли [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий (II) (6,6 г, 8,7 ммоль) и перемешивали полученную смесь при 75°С в течение 16 ч. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры, фильтровали смесь через диатомовую землю и промывали осадок на фильтре EtOAc. Разделяли полученные слои и дважды промывали органическую фазу насыщенным водным раствором NaCl, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали in vacuo. К полученному остатку добавляли воду (500 мл), перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре и отфильтровывали полученное твердое вещество. Промывали собранное твердое вещество H₂O и сушили под вакуумом в течение 16 ч с получением требуемого соединения (70 г, 54%) в виде коричневого твердого вещества. ЭР/МС (m/z) (³⁵Cl/³⁷Cl) 267/269 [М+1]⁺ A stream of nitrogen was passed through a mixture of (2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)boronic acid (85 g, 439 mmol), 4,6-dichloro-3-methylpyridazine (75 g, 437 mmol) and Cs ₂ CO ₃ (358 g , 1099 mmol) in 1,4-dioxane (1175 ml) and H2O (340 ml) for 5 min. Added [1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium (II) (6.6 g, 8.7 mmol) and stirred the resulting mixture at 75°C for 16 h. Cooled the reaction mixture to room temperature, filtered the mixture through diatomaceous earth and the filter cake was washed with EtOAc. The resulting layers were separated and the organic phase was washed twice with saturated aqueous NaCl, dried over MgSO4, filtered and concentrated in vacuo. Water (500 ml) was added to the resulting residue, stirred for 16 hours at room temperature, and the resulting solid was filtered off. Wash the collected solid with H ₂ O and dry under vacuum for 16 h to give the desired compound (70 g, 54%) as a brown solid. ER/MS (m/z) ( ³⁵ Cl/ ³⁷ Cl) 267/269 [M+1] ⁺

Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в подготовительном синтезе 4.The following examples can be prepared essentially as described in Preparatory Synthesis 4.

- 17 041789- 17 041789

№ подготовительного синтеза No. of preparatory synthesis Химическое название chemical name Химическая структура Chemical structure ЭР/МС (m/z) (³⁵С1/³⁷С1)ER/MS (m/z) ( ³⁵ C1/ ³⁷ C1) 5 5 5-(5-хлорпиридазин-3-ил)-2,4диметоксипиримидин 5-(5-chloropyridazin-3-yl)-2,4dimethoxypyrimidine \ О CI N=< /—7 9~(\ —( /^-н / N—' N=N\ O CI N=< /—7 9~(\ —( / ^-n / N—' N=N 253/255 253/255

Синтез 6. Транс-5-[2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-2,4-Диметоксипиримидин.Synthesis 6. Trans-5-[2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4-dimethoxypyrimidine.

В колбу для работы под давлением объемом 20 мл добавляли 4-хлор-6-(2,4-диметоксипиримидин-5ил)-3-метилпиридазин (0,6 г, 2,0 ммоль), бис(ди-трет-бутил-(4-диметиламинофенил)фосфин)дихлорпалладий (II) (114 мг, 0,16 ммоль), К₂СОз (0,69 г, 4,9 ммоль), Н₂О (2,25 мл) и рацемический транс-2-[2-этилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (0,66 г, 3,37 ммоль). Вакуумировали колбу и закачивали N₂. Закрывали емкость и нагревали при 90°С в течение ночи. Фильтровали реакционную смесь через диатомовую землю, промывали органический слой водой, затем насыщенным водным раствором NaCl, сушили над MgSO4 и концентрировали in vacuo. Очищали полученный остаток обращенно-фазовой хроматографией, используя 275 г колонку REDISEP® Gold Cl8, элюируя градиентом 30-50% 10 мМ NH4HCO3/ACN в течение 20 мин при скорости потока 150 мл/мин, с получением указанного в заголовке соединения, по существу рацемической смеси изомеров (475 мг, 70%), в виде белого твердого вещества после выпаривания хроматографических фракций.To a 20 ml pressure flask was added 4-chloro-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5yl)-3-methylpyridazine (0.6 g, 2.0 mmol), bis(di-tert-butyl-( 4-dimethylaminophenyl) phosphine) dichloropalladium (II) (114 mg, 0.16 mmol), K ₂ CO3 (0.69 g, 4.9 mmol), H ₂ O (2.25 ml) and racemic trans-2- [2-ethylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane (0.66 g, 3.37 mmol). The flask was evacuated and N ₂ was pumped in. Closed the container and heated at 90°C during the night. Filter the reaction mixture through diatomaceous earth, wash the organic layer with water then saturated aqueous NaCl, dry over MgSO4 and concentrate in vacuo. Purify the resulting residue by reverse phase chromatography using a 275 g REDISEP® Gold Cl8 column eluting with a gradient of 30-50% 10 mM NH4HCO3/ACN over 20 min at a flow rate of 150 ml/min to give the title compound, essentially racemic mixtures of isomers (475 mg, 70%), as a white solid after evaporation of the chromatographic fractions.

Полученные изомеры подвергали очистке СЖХ (колонка: PHENOMENEX® LUX® Cellulose-4, 4,6x150 мм; изократическое элюирование 40% МеОН/СО₂; скорость потока: 5 мл/мин, УФ 250 нм) с получением 0,197 г изомера 1: t_R=2,71 мин (УФ); и 0,195 г изомера 2: t_R 3,55 мин (УФ), оба с >98% э.и. ЭР/МС (m/z): 301 (М+Н).The resulting isomers were purified by SLC (column: PHENOMENEX® LUX® Cellulose-4, 4.6x150 mm; isocratic elution 40% MeOH/CO ₂ ; flow rate: 5 ml/min, UV 250 nm) to give 0.197 g of isomer 1: t _R = 2.71 min (UV); and 0.195 g of isomer 2: t _R 3.55 min (UV), both with >98% ee. ER/MS (m/z): 301 (M+H).

Синтез 7. Транс-5-[2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-2,4-диметоксипиримидин.Synthesis 7. Trans-5-[2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4-dimethoxypyrimidine.

Объединяли 4-хлор-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин (1,97 г, 7,39 ммоль), рацтранс- 2-[2-изопропилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (3,32 г, 15,8 ммоль), бис(дитрет-бутил(4-диметиламинофенил)фосфин)дихлорпалладий (II) (1,35 г, 1,85 ммоль), 1,4-диоксан (37 мл) и 1 М водный раствор Na₂CO₃ (18 мл, 18 ммоль). Продували реакционную емкость N₂ и нагревали до 90°С в течение 18 ч. Охлаждали до комнатной температуры, разбавляли EtOAc (150 мл) и разделяли слои. Органический слой последовательно промывали 1 М водным раствором Na₂CO₂, насыщенным водным раствором NaCl, сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали фильтрат in vacuo. Полученный остаток очищали хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 60-100% EtOAc/ДХМ, с получением указанного в заголовке соединения в виде по существу рацемической смеси изомеров (1,48 г, 64%) после выпаривания хроматографических фракций.Combined 4-chloro-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazine (1.97 g, 7.39 mmol), ractrans-2-[2-isopropylcyclopropyl]-4,4,5, 5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane (3.32g, 15.8mmol), bis(ditert-butyl(4-dimethylaminophenyl)phosphine)dichloropalladium (II) (1.35g, 1.85mmol) , 1,4-dioxane (37 ml) and 1 M aqueous Na ₂ CO ₃ solution (18 ml, 18 mmol). Flushed the reaction vessel with N ₂ and heated to 90°C for 18 hours Cooled to room temperature, diluted with EtOAc (150 ml) and separated the layers. The organic layer was washed successively with 1 M aqueous Na ₂ CO ₂ , saturated aqueous NaCl, dried over MgSO ₄ , filtered, and the filtrate was concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by silica chromatography eluting with a gradient of 60-100% EtOAc/DCM to give the title compound as an essentially racemic mixture of isomers (1.48 g, 64%) after evaporating the chromatographic fractions.

Изомеры подвергали очистке СЖХ (колонка: PHENOMENEX® LUX® Cellulose-4, 4,6x150 мм; изократическое элюирование 40% МеОН/СО₂; скорость потока: 5 мл/мин, УФ 250 нм) с получением 647 мг изомера 1: t_R=2,56 мин и 647 мг изомера 2: t_R=3,75 мин. ЭР/МС (m/z): 315 (М+Н).The isomers were purified by SLC (column: PHENOMENEX® LUX® Cellulose-4, 4.6x150 mm; isocratic elution with 40% MeOH/CO ₂ ; flow rate: 5 ml/min, UV 250 nm) to give 647 mg of isomer 1: t _R =2.56 min and 647 mg of isomer 2: t _R =3.75 min. ER/MS (m/z): 315 (M+H).

Подготовительный синтез 8. Этил-(18,28)-2-этилциклопропанкарбоксилат.Preparatory synthesis 8. Ethyl-(18,28)-2-ethylcyclopropanecarboxylate.

К раствору этил-2-диэтоксифосфорилацетата (62,2 г, 277 ммоль) в 1,4-диоксане (400 мл), охлажденному на ледяной бане (внутренняя температура: 8°С), по каплям добавляли 2,5 М раствор nBuLi в гексанах (110 мл, 280 ммоль) за 10 мин. Убирали охлаждающую баню и перемешивали 30 мин при комнатной температуре. Через канюлю переносили раствор в колбу для работы под давлением объемом 1 л и добавляли (2К)-2-этилоксиран (20 г, 280 ммоль). Перемешивали полученную смесь при 150°С (давление 50 фунт/кв.дюйм (345 кПа)) в течение 17 ч. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры иTo a solution of ethyl 2-diethoxyphosphoryl acetate (62.2 g, 277 mmol) in 1,4-dioxane (400 ml) cooled in an ice bath (internal temperature: 8° C.) was added dropwise a 2.5 M solution of nBuLi in hexanes (110 ml, 280 mmol) for 10 min. The cooling bath was removed and stirred for 30 minutes at room temperature. The solution was cannulated into a 1 L pressure flask and (2K)-2-ethyloxirane (20 g, 280 mmol) was added. Stir the resulting mixture at 150° C. (pressure 50 psi (345 kPa)) for 17 h. Cool the reaction mixture to room temperature and

- 18 041789 добавляли воду (250 мл). Отделяли органическую фазу и повторно экстрагировали водную фазу МТБЭ (2x200 мл). Объединяли органические экстракты, промывали насыщенным водным раствором NaCl (2x150 мл), сушили над MgSO₄ и концентрировали in vacuo с получением неочищенного указанного в заголовке соединения (49,1 г, количественно) в виде желтого маслянистого вещества, пригодного для использования без дополнительной очистки. ГХ-МС (m/z): 142 (М⁺), 97 (М-45).- 18 041789 water (250 ml) was added. The organic phase was separated and the aqueous phase was re-extracted with MTBE (2x200 ml). The organic extracts were combined, washed with saturated aqueous NaCl (2x150 ml), dried over MgSO ₄ and concentrated in vacuo to give the crude title compound (49.1 g, quant) as a yellow oil, usable without further purification. GC-MS (m/z): 142 (M ⁺ ), 97 (M-45).

Подготовительный синтез 9. (1S,2S)-2-этилциклопропанкарбоновая кислота.Preparatory synthesis 9. (1S,2S)-2-ethylcyclopropanecarboxylic acid.

Перемешивали смесь этил-(1S,2S)-2-этилциклопропанкарбоксилата (39,44 г, 277,4 ммоль), 1,4диоксана (315 мл) и 25% водного раствора гидроксида натрия (315 мл) при 100°С в течение 16 ч. Охлаждали смесь до комнатной температуры, экстрагировали МТБЭ (2x300 мл) и отбрасывали органическую фазу. Водную фазу подкисляли 37% водным раствором HCl до pH ~1-2, экстрагировали МТБЭ (3x300 мл), разделяли слои, органический слой промывали насыщенным водным раствором NaCl, сушили над MgSO4 и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (25,1 г, 75%) в виде маслянистого вещества янтарного цвета. 1Н ЯМР (400 МГц, (CDCl₃) δ: 0,79-0,85 (м, 1H), 1,00 (т, J=7,5 Гц, 3Н), 1,22-1,26 (м, 1H), 1,32-1,42 (м, 3 Н), 1,43-1,48 (м, 1H), 9,0-12,0 (шс, 1H).A mixture of ethyl-(1S,2S)-2-ethylcyclopropanecarboxylate (39.44 g, 277.4 mmol), 1,4dioxane (315 ml) and 25% aqueous sodium hydroxide solution (315 ml) was stirred at 100°C for 16 hours Cooled the mixture to room temperature, extracted with MTBE (2x300 ml) and discarded the organic phase. The aqueous phase was acidified with 37% aqueous HCl to pH ~1-2, extracted with MTBE (3x300 ml), layers were separated, the organic layer was washed with saturated aqueous NaCl, dried over MgSO4 and concentrated in vacuo to give the title compound (25.1 g, 75%) as an amber-colored oily substance. 1 H NMR (400 MHz, (CDCl ₃ ) δ: 0.79-0.85 (m, 1H), 1.00 (t, J=7.5 Hz, 3H), 1.22-1.26 (m , 1H), 1.32-1.42(m, 3H), 1.43-1.48(m, 1H), 9.0-12.0(brs, 1H).

Подготовительный синтез 10. (1,3-Диоксоизоиндолин-2-ил)-(1S,2S)-2-этилциклопропанкарбоксилат.Preparatory Synthesis 10. (1,3-Dioxoisoindolin-2-yl)-(1S,2S)-2-ethylcyclopropanecarboxylate.

Перемешивали суспензию (1S,2S)-2-этилциклопропанкарбоновой кислоты (25,1 г, 209 ммоль), 2гидроксиизоиндолин-1,3-диона (34,8 г, 209 ммоль) и DMAP (2,58 г, 20,9 ммоль) в ДХМ (360 мл) при 0°С и по каплям добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (29,3 г, 230 ммоль). Убирали охлаждающую баню и перемешивали реакционную смесь в течение 2 ч при комнатной температуре. Фильтровали суспензию через слой силикагеля, элюируя ДХМ. Выпаривали растворитель и очищали полученный остаток хроматографией на силикагеле, элюируя 15% смесью гексан/ацетон, с получением указанного в заголовке соединения (51,56 г, 84%) в виде бледно-желтого твердого вещества после удаления растворителя из хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): 260 (М+1).A suspension of (1S,2S)-2-ethylcyclopropanecarboxylic acid (25.1 g, 209 mmol), 2hydroxyisoindoline-1,3-dione (34.8 g, 209 mmol) and DMAP (2.58 g, 20.9 mmol) was stirred. ) in DCM (360 mL) at 0° C. and N,N'-diisopropylcarbodiimide (29.3 g, 230 mmol) was added dropwise. The cooling bath was removed and the reaction mixture was stirred for 2 h at room temperature. Filter the suspension through a pad of silica gel eluting with DCM. The solvent was evaporated and the resulting residue was purified by silica gel chromatography eluting with 15% hexane/acetone to give the title compound (51.56 g, 84%) as a pale yellow solid after removing the solvent from the chromatographic fractions. ER/MS (m/z): 260 (M+1).

Подготовительный синтез 11. 2-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан.Preparatory synthesis 11. 2-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane.

Пропускали поток N2 через раствор (1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)-(1S,2S)-2-этилциклопропанкарбоксилата (51 г, 173,1 ммоль) и бис(пинаколато)дибора (87,9 г, 346 ммоль) в EtOAc (1 л) в течение 5 мин. Добавляли этилизоникотинат (5,34 г, 35 ммоль) и перемешивали смесь при 85°С в течение 24 ч. Полученную суспензию охлаждали, фильтровали и удаляли твердое вещество, и концентрировали коричневый фильтрат при пониженном давлении. Полученный неочищенный остаток фильтровали через слой силикагеля, элюируя 2% смесью EtOAc/гексаны. Из фильтрата удаляли растворитель и повторно очищали полученный остаток хроматографией на силикагеле, элюируя 3% смесью EtOAc/гексаны, с получением указанного в заголовке соединения (17,1 г, 49%) в виде бесцветного маслянистого вещества после удаления растворителя из хроматографических фракций. ГХ-МС (m/z): 180 (М-16).Pass a stream of N2 through a solution of (1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-(1S,2S)-2-ethylcyclopropanecarboxylate (51 g, 173.1 mmol) and bis(pinacolato)diboron (87.9 g, 346 mmol) in EtOAc (1 L) for 5 min. Ethylisonicotinate (5.34 g, 35 mmol) was added and the mixture was stirred at 85°C for 24 h. The resulting suspension was cooled, filtered and the solid was removed, and the brown filtrate was concentrated under reduced pressure. The resulting crude residue was filtered through a plug of silica gel, eluting with 2% EtOAc/hexanes. The solvent was removed from the filtrate and the resulting residue was repurified by silica gel chromatography eluting with 3% EtOAc/hexanes to give the title compound (17.1 g, 49%) as a colorless oil after removing the solvent from the chromatographic fractions. GC-MS (m/z): 180 (M-16).

Подготовительный синтез 12. (2S)-2-Хлор-3-метилбутановая кислота.Preparatory synthesis 12. (2S)-2-Chloro-3-methylbutanoic acid.

Охлаждали раствор L-валина (286 г, 2,44 моль) и 5 М водного раствора HCl (3,25 л, 16,3 моль) при 0°С. По каплям добавляли 4 М водный раствор NaNO₂ (1 л, 4 моль) за 2 ч, поддерживая внутреннюю температуру ниже 5°С. Перемешивали реакционную смесь в течение 2 ч, нагревая до комнатной температуры, и перемешивали еще 16 ч при комнатной температуре. В течение 30 мин по частям добавляли Na₂CO₃ (242 г, 2,28 моль). Полученный раствор экстрагировали МТБЭ (3x1000 мл), промывали объединенные органические экстракты насыщенным водным раствором NaCl (500 мл), органические экстракты сушили над MgSO₄ и концентрировали in vacuo. Полученный остаток очищали вакуумной перегонкой (15 мбар (1,5 кПа)/140°С) с получением указанного в заголовке соединения (248 г, 68%) в виде маслянистого вещества. 1Н ЯМР (400 МГц, (CDCl₃) δ: 1,1 (дт, J=6,6, 2,6 Гц, 6Н), 2,34-2,42 (м, 1H), 4,19-4,23 (м,A solution of L-valine (286 g, 2.44 mol) and 5 M aqueous HCl solution (3.25 L, 16.3 mol) was cooled at 0°C. A 4 M NaNO ₂ aqueous solution (1 L, 4 mol) was added dropwise over 2 h while maintaining the internal temperature below 5°C. The reaction mixture was stirred for 2 h while warming to room temperature and stirred for another 16 h at room temperature. Na ₂ CO ₃ (242 g, 2.28 mol) was added in portions over 30 min. The resulting solution was extracted with MTBE (3x1000 ml), the combined organic extracts were washed with saturated aqueous NaCl (500 ml), the organic extracts were dried over MgSO ₄ and concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by vacuum distillation (15 mbar (1.5 kPa)/140° C.) to give the title compound (248 g, 68%) as an oily substance. 1 H NMR (400 MHz, (CDCl ₃ ) δ: 1.1 (dt, J=6.6, 2.6 Hz, 6H), 2.34-2.42 (m, 1H), 4.19-4 .23 (m,

- 19 041789- 19 041789

1H), 10,0-12,0 (шс, 1H).1H), 10.0-12.0 (sh, 1H).

Подготовительный синтез 13. (28)-2-Хлор-3-метилбутан-1-ол.Preparatory synthesis 13. (28)-2-Chloro-3-methylbutan-1-ol.

^γ^ΟΗ^γ^ΟΗ

ClCl

Охлаждали раствор (28)-2-хлор-3-метилбутановой кислоты (137 г, 1 моль) в 2-метилтетрагидрофуране (500 мл) до 0°С. По каплям добавляли 2,3 М раствор LAH в метилтетрагидрофуране (480 мл, 1,1 моль) в течение 2,5 ч, поддерживая внутреннюю температуру ниже 10°С. Нагревали до комнатной температуры и перемешивали смесь 1 ч при комнатной температуре и 1 ч при 50°С. Охлаждали реакционную смесь до 0°С и последовательно и медленно добавляли H₂O (1,48 мл), 15% водный раствор NaOH (1,48 мл) и H₂O (4,46 мл). Оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры, фильтровали через слой диатомовой земли и выпаривали растворитель in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (110 г, 81%) в виде бесцветного маслянистого вещества. 1Н ЯМР (400 МГц, (CDC13) δ: 0,97- 1,1 (м, 6Н), 1,94-2,18 (м, 1H), 2,60-3,09 (шс, 1H), 3,71-3,78 (м, 1H), 3,80-3,85 (м, 1H), 3,90-3,96 (м, 1H).A solution of (28)-2-chloro-3-methylbutanoic acid (137 g, 1 mol) in 2-methyltetrahydrofuran (500 ml) was cooled to 0°C. A 2.3 M solution of LAH in methyltetrahydrofuran (480 ml, 1.1 mol) was added dropwise over 2.5 h while maintaining the internal temperature below 10°C. Warmed to room temperature and stirred the mixture for 1 h at room temperature and 1 h at 50°C. Cool the reaction mixture to 0°C and sequentially and slowly add H ₂ O (1.48 ml), 15% aqueous NaOH solution (1.48 ml) and H ₂ O (4.46 ml). The mixture was allowed to warm to room temperature, filtered through a pad of diatomaceous earth and the solvent was evaporated in vacuo to give the title compound (110 g, 81%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, (CDC13) δ: 0.97-1.1 (m, 6H), 1.94-2.18 (m, 1H), 2.60-3.09 (br, 1H), 3.71-3.78 (m, 1H), 3.80-3.85 (m, 1H), 3.90-3.96 (m, 1H).

Подготовительный синтез 14. (2R)-2-Изопропилоксиран.Preparatory synthesis 14. (2R)-2-Isopropyloxirane.

Охлаждали раствор KOH (195 г, 3,48 моль) в H2O (195 мл) до 0°С и в течение 20 мин добавляли неразбавленный (28)-2-хлор-3-метилбутан-1-ол (110 г, 801 ммоль), поддерживая внутреннюю температуру ниже 5°С. Оставляли реакционную смесь нагреваться до комнатной температуры. Реакционную смесь очищали вакуумной перегонкой при 100 мбар (10 кПа), нагревая с 23°С до 50°С, с получением указанного в заголовке соединения (47 г, 64%) в виде бесцветного маслянистого вещества. 1Н ЯМР (400 МГц, (CDC1₃) δ: 0,98 (д, J=6,9 Гц, 3Н), 1,05 (д, J=6,9 Гц, 3Н), 1,51 (о, J=6,9 Гц, 1H), 2,52-2,54 (м, 1H), 2,70-2,75 (м, 2Н).Cool a solution of KOH (195 g, 3.48 mol) in H2O (195 ml) to 0°C and undiluted (28)-2-chloro-3-methylbutan-1-ol (110 g, 801 mmol) is added over 20 min. ), keeping the internal temperature below 5°C. The reaction mixture was allowed to warm to room temperature. The reaction mixture was purified by vacuum distillation at 100 mbar (10 kPa) while heating from 23° C. to 50° C. to give the title compound (47 g, 64%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, (CDC1 ₃ ) δ: 0.98 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.05 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.51 (o, J=6.9 Hz, 1H), 2.52-2.54 (m, 1H), 2.70-2.75 (m, 2H).

Подготовительный синтез 15. Этил-(18,2R)-2-изопропилциклопропанкарбоксилат.Preparatory synthesis 15. Ethyl-(18,2R)-2-isopropylcyclopropanecarboxylate.

°х/°x/

2,5 М раствор nBuLi в гексанах (310 мл, 780 ммоль) по каплям в течение 25 мин добавляли к раствору этил-2-диэтоксифосфорилацетата (153 мл, 772 ммоль) в 1,4-диоксане (870 мл), охлажденному на ледяной бане (внутренняя температура 8°С). Нагревали до комнатной температуры и перемешивали 40 мин. Через канюлю переносили раствор в колбу для работы под давлением объемом 3 л и добавляли (2R)-2-изопропилоксиран (70 г, 772 ммоль) в 1,4-диоксане (180 мл). Перемешивали реакционную смесь при 150°С при давлении 50 фунт/кв.дюйм (345 кПа) в течение 14 ч. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры и добавляли H₂O (700 мл). Разделяли слои и повторно экстрагировали водную фазу МТБЭ (2x500 мл). Объединяли органические фазы, промывали насыщенным водным раствором NaCl (2x350 мл), сушили над Mg8O4 и концентрировали in vacuo с получением неочищенного указанного в заголовке соединения (107,7 г, >99%) в виде желтого маслянистого вещества, пригодного для дальнейшего использования без дополнительной очистки. ГХ-МС (m/z): 156 (М⁺).A 2.5 M solution of nBuLi in hexanes (310 mL, 780 mmol) was added dropwise over 25 min to a solution of ethyl 2-diethoxyphosphoryl acetate (153 mL, 772 mmol) in 1,4-dioxane (870 mL) cooled on ice bath (internal temperature 8°C). Warmed to room temperature and stirred for 40 min. The solution was cannulated into a 3 L pressure flask and (2R)-2-isopropyloxirane (70 g, 772 mmol) in 1,4-dioxane (180 mL) was added. The reaction mixture was stirred at 150° C. at a pressure of 50 psi (345 kPa) for 14 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature and H ₂ O (700 ml) was added. The layers were separated and the aqueous phase was re-extracted with MTBE (2x500 ml). The organic phases were combined, washed with saturated aqueous NaCl (2x350 ml), dried over Mg8O4 and concentrated in vacuo to give the crude title compound (107.7 g, >99%) as a yellow oil, suitable for further use without additional cleaning. GC-MS (m/z): 156 (M ⁺ ).

Подготовительный синтез 16. (18,2R)-2-Изопропилциклопропанкарбоновая кислота.Preparatory synthesis 16. (18,2R)-2-Isopropylcyclopropanecarboxylic acid.

С°С°

I ОНI OH

Перемешивали смесь этил-(18,2R)-2-изопропилциклопропанкарбоксилата (107,7 г, 482,6 ммоль) в 1,4-диоксане (800 мл), содержащем 25% водный раствор NaOH (800 мл), при 100°С в течение 7 ч. Охлаждали смесь до комнатной температуры, добавляли воду (300 мл), экстрагировали МТБЭ (2x500 мл) и отбрасывали органическую фазу. Водную фазу подкисляли 37% водным раствором HCl (приблизительно 500 мл) до pH ~1-2.A mixture of ethyl (18,2R)-2-isopropylcyclopropanecarboxylate (107.7 g, 482.6 mmol) in 1,4-dioxane (800 ml) containing 25% aqueous NaOH solution (800 ml) was stirred at 100°C for 7 hours Cool the mixture to room temperature, add water (300 ml), extract with MTBE (2x500 ml) and discard the organic phase. The aqueous phase was acidified with 37% aqueous HCl solution (approximately 500 ml) to pH ~1-2.

Подкисленную водную смесь экстрагировали МТБЭ (2x600 мл), органический слой промывали насыщенным водным раствором NaCl, сушили над Mg8O4 и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (54,2 г, 75%) в виде маслянистого вещества янтарного цвета. 1Н ЯМР (400 МГц, (CDC13) δ: 0,81-0,86 (м, 1H), 1,01 (дд, J=5,9, 3,7 Гц, 6Н), 1,04-1,13 (м, 1H), 1,20-1,24 (м, 1H), 1,28-1,37 (м, 1H), 1,39-1,44 (м, 1H).The acidified aqueous mixture was extracted with MTBE (2x600 ml), the organic layer was washed with saturated aqueous NaCl, dried over Mg8O4 and concentrated in vacuo to give the title compound (54.2 g, 75%) as an amber oil. 1 H NMR (400 MHz, (CDC13) δ: 0.81-0.86 (m, 1H), 1.01 (dd, J=5.9, 3.7 Hz, 6H), 1.04-1, 13 (m, 1H), 1.20-1.24 (m, 1H), 1.28-1.37 (m, 1H), 1.39-1.44 (m, 1H).

Подготовительный синтез 17. (1,3-Диоксоизоиндолин-2-ил)-(18,2R)-2-изопропилциклопропанкарбоксилат.Preparatory Synthesis 17. (1,3-Dioxoisoindolin-2-yl)-(18,2R)-2-isopropylcyclopropanecarboxylate.

- 20 041789- 20 041789

Перемешивали суспензию (1S,2R)-2-изопропилциклопропанкарбоновой кислоты (54,2 г, 359 ммоль), 2-гидроксиизоиндолин-1,3-диона (59,8 г, 359 ммоль) и DMAP (4,44 г, 35,9 ммоль) в ДХМ (690 мл) при 0°С. По каплям добавляли N,N'-диизопропилкарбодиимид (50,4 г, 395 ммоль), нагревали до комнатной температуры и перемешивали полученную реакционную смесь в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляли H2O (600 мл) и разделяли фазы. Водную фазу экстрагировали ДХМ (2x300 мл), объединяли органические фазы, сушили над MgSO₄, фильтровали и выпаривали. Полученный твердый остаток очищали хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 100% ДХМ, с получением указанного в заголовке соединения (96 г, 88%) в виде бледно-желтого твердого вещества, после выпаривания хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): 274 (М+1).A suspension of (1S,2R)-2-isopropylcyclopropanecarboxylic acid (54.2 g, 359 mmol), 2-hydroxyisoindoline-1,3-dione (59.8 g, 359 mmol) and DMAP (4.44 g, 35.0 mmol) was stirred. 9 mmol) in DCM (690 ml) at 0°C. N,N'-diisopropylcarbodiimide (50.4 g, 395 mmol) was added dropwise, warmed to room temperature and the resulting reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature. H2O (600 ml) was added and the phases were separated. The aqueous phase was extracted with DCM (2x300 ml), the organic phases were combined, dried over MgSO ₄ , filtered and evaporated. The resulting solid was purified by silica chromatography eluting with 100% DCM to give the title compound (96 g, 88%) as a pale yellow solid after evaporating the chromatographic fractions. ER/MS (m/z): 274 (M+1).

Подготовительный синтез 18. 2-[(1S,2S)-2-Изопропилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2диоксаборолан.Preparatory Synthesis 18. 2-[(1S,2S)-2-Isopropylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2dioxaborolane.

Пропускали поток азота через раствор (1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)-(1S,2S)-2изопропилциклопропанкарбоксилата (96 г, 316 ммоль) и бис(пинаколато)дибора (160 г, 630 ммоль) в EtOAc (480 мл) в течение 15 мин. Перемешивали смесь при 85°С и по каплям добавляли этилизоникотинат (24,38 г, 157 ммоль) за 10 мин. Полученную смесь перемешивали при 85°С в течение 16 ч. Полученную суспензию охлаждали, фильтровали и отбрасывали твердое вещество, выпаривали коричневый фильтрат при пониженном давлении. Неочищенный остаток фильтровали через слой силикагеля, элюируя 2% смесью EtOAc/гексаны. Из фильтрата удаляли растворитель и повторно очищали полученный остаток хроматографией на силикагеле, элюируя 3% смесью EtOAc/гексаны, с получением указанного в заголовке соединения (25,3 г, 38%) в виде бесцветного маслянистого вещества после удаления растворителя из хроматографических фракций. 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl₃): -0,33 - -0,38 (м, 1H), 0,42-0,47 (м, 1H), 0,63-0,67 (м, 1H), 0,75-0,82 (м, 1H), 0,89-1,02 (м, 1H), 0,98 (м, 6Н), 1,24 (с, 12Н).A stream of nitrogen was passed through a solution of (1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-(1S,2S)-2isopropylcyclopropanecarboxylate (96 g, 316 mmol) and bis(pinacolato)diboron (160 g, 630 mmol) in EtOAc (480 ml) within 15 min. The mixture was stirred at 85°C and ethylisonicotinate (24.38 g, 157 mmol) was added dropwise over 10 minutes. The resulting mixture was stirred at 85° C. for 16 hours. The resulting suspension was cooled, filtered and the solid was discarded, the brown filtrate was evaporated under reduced pressure. The crude residue was filtered through a pad of silica gel eluting with 2% EtOAc/hexanes. The solvent was removed from the filtrate and the resulting residue was repurified by silica gel chromatography eluting with 3% EtOAc/hexanes to give the title compound (25.3 g, 38%) as a colorless oil after removing the solvent from the chromatographic fractions. 1H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): -0.33--0.38 (m, 1H), 0.42-0.47 (m, 1H), 0.63-0.67 (m, 1H) , 0.75-0.82 (m, 1H), 0.89-1.02 (m, 1H), 0.98 (m, 6H), 1.24 (s, 12H).

Подготовительный синтез 19. 4,4,5,5-Тетраметил-2-[(Е)-4-метилпент-1-енил]-1,3,2-диоксаборолан.Preparatory synthesis 19. 4,4,5,5-Tetramethyl-2-[(E)-4-methylpent-1-enyl]-1,3,2-dioxaborolane.

Растворяли [(Е)-4-метилпент-1-енил]бороновую кислоту (0,975 г, 7,62 ммоль) и пинакол (1,11 г, 9,14 ммоль) в сухом ДХМ (9,7 мл). Добавляли MgSO₄ (0,7313 г, 6,05 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Отфильтровывали нерастворимое твердое вещество и удаляли растворитель при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде прозрачного маслянистого вещества (1,6 г, 100%). 1H ЯМР (400,13 МГц, ДМСО): 0,86 (д, J=6,6 Гц, 6Н), 1,08 (с, 6Н), 1,19 (с, 12Н), 1,62-1,72 (м, 1H), 2,01 (тд, J=6,9, 1,4 Гц, 2Н), 3,92 (с, 1H), 5,31 (дт, J=17,9, 1,3 Гц, 1H), 6,47 (дт, J=17,9, 6,9 Гц, 1H).Dissolve [(E)-4-methylpent-1-enyl]boronic acid (0.975 g, 7.62 mmol) and pinacol (1.11 g, 9.14 mmol) in dry DCM (9.7 ml). MgSO ₄ (0.7313 g, 6.05 mmol) was added and stirred at room temperature for 3 days. An insoluble solid was filtered off and the solvent was removed under reduced pressure to give the title compound as a clear oil (1.6 g, 100%). 1H NMR (400.13 MHz, DMSO): 0.86 (d, J=6.6 Hz, 6H), 1.08 (s, 6H), 1.19 (s, 12H), 1.62-1 .72 (m, 1H), 2.01 (td, J=6.9, 1.4 Hz, 2H), 3.92 (s, 1H), 5.31 (dt, J=17.9, 1 .3 Hz, 1H), 6.47 (dt, J=17.9, 6.9 Hz, 1H).

Подготовительный синтез 20. трет-Бутил-[[(2S)-оксиран-2-ил]метокси]дифенилсилан.Preparatory synthesis of 20. tert-Butyl-[[(2S)-oxiran-2-yl]methoxy]diphenylsilane.

К ледяному раствору [(2R)-оксиран-2-ил]метанола (15,0 г, 202,6 ммоль) в ДМФА (135 мл) добавляли имидазол (33,34 г, 489,8 ммоль) и перемешивали в течение 15 мин. По каплям добавляли трет-бутилхлордифенилсилан (77 мл, 302,5 ммоль) за 30 мин и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Разбавляли гексанами (1 л), эфиром (500 мл) и водой (1 л). Разделяли слои и экстрагировали водный слой эфиром (2x1 л). Органические слои объединяли и промывали водой (3x750 мл), насыщенным раствором NaHCO₃, насыщенным водным раствором NaCl и сушили над MgSO₄. Растворитель выпаривали при пониженном давлении. Очищали хроматографией на силикагеле: элюент 0-10% EtOAc в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (11,77 г, 18%) в виде маслянистого вещества, после удаления растворителя из хроматографической фракции. 1H ЯМР (400,13 МГц, CDCl₃): 1,08 (с, 9Н),To an ice-cold solution of [(2R)-oxiran-2-yl]methanol (15.0 g, 202.6 mmol) in DMF (135 mL) was added imidazole (33.34 g, 489.8 mmol) and stirred for 15 min. tert-Butylchlorodiphenylsilane (77 ml, 302.5 mmol) was added dropwise over 30 minutes and stirred overnight at room temperature. Dilute with hexanes (1 L), ether (500 ml) and water (1 L). The layers were separated and the aqueous layer was extracted with ether (2x1 L). The organic layers were combined and washed with water (3x750 ml), saturated NaHCO ₃ solution, saturated aqueous NaCl solution and dried over MgSO ₄ . The solvent was evaporated under reduced pressure. Purify by chromatography on silica gel 0-10% EtOAc in hexanes to give the title compound (11.77 g, 18%) as an oil after removal of the solvent from the chromatographic fraction. 1H NMR (400.13 MHz, CDCl ₃ ): 1.08 (s, 9H),

- 21 041789- 21 041789

2,64 (дд, J=2,6, 5,1 Гц, 1H), 2,77 (т, J=4,6 Гц, 1H), 3,15 (квинтет, J=3,5 Гц, 1H), 3,73 (дд, J=4,7, 11,8 Гц,2.64 (dd, J=2.6, 5.1 Hz, 1H), 2.77 (t, J=4.6 Hz, 1H), 3.15 (quintet, J=3.5 Hz, 1H ), 3.73 (dd, J=4.7, 11.8 Hz,

1H), 3,88 (дд, J=3,2, 11,9 Гц, 1H), 7,40-7,48 (м, 6Н), 7,71 (м, 4Н).1H), 3.88 (dd, J=3.2, 11.9 Hz, 1H), 7.40-7.48 (m, 6H), 7.71 (m, 4H).

Подготовительный синтез 21. Этил-(1S,2S)-2-(гидроксиметил)циклопропанкарбоксилат.Preparatory synthesis 21. Ethyl-(1S,2S)-2-(hydroxymethyl)cyclopropanecarboxylate.

О >...../ °АO >...../ °A

Медленно добавляли триэтилфосфоноацетат (7,5 мл, 38 ммоль) к суспензии трет-бутоксида натрия (3,67 г, 37,82 ммоль) в 1,4-диоксане (40 мл) при комнатной температуре. Через 1 ч добавляли трет-бутил[[(2S)-оксиран-2-ил]метокси]дифенилсилан (11,77 г, 33,76 ммоль) и нагревали при 140°С в течение ночи в закрытой емкости для работы под давлением. Добавляли дополнительное количество триэтилфосфоноацетата (2 мл) и нагревали при 160°С в течение часа. Смесь оставляли остывать и разбавляли ДХМ (300 мл) и водой (150 мл). Разделяли слои, экстрагировали водный слой ДХМ (3x150 мл). Органические слои объединяли и промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃, насыщенным водным раствором NaCl и сушили над MgSO₄. Фильтровали через диатомовую землю и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением этил-(1S,2S)-2-[[трет-бутил(дифенил)силил]оксиметил]циклопропанкарбоксилата (18,45 г) в виде маслянистого вещества. Растворяли в ТГФ (75 мл) и добавляли фторид тетрабутиламмония (1M в ТГФ, 67 мл, 67 ммоль, 1,0 М) при комнатной температуре. Перемешивали в течение 48 ч и удаляли растворитель при 130 мбар (13 кПа) и 30°С. Очищали хроматографией на силикагеле, элюент: 0-50% EtOAc в гексанах, с выделением указанного в заголовке соединения (3,35 г, 62%) в виде маслянистого вещества, после удаления растворителя из хроматографической фракции. ЭР/МС (m/z): 142 (М+1). 1H ЯМР (400,13 МГц, CDCl₃): 0,90-0,86 (м, 1H), 1,23 (дд, J=4,5, 8,9 Гц, 1H), 1,28 (т, J=7,2 Гц, 4Н), 1,561,60 (м, 1H), 1,69-1,77 (м, 2Н), 2,06 (с, 2Н), 3,50 (дд, J=6,9, 11,5 Гц, 1H), 3,64 (дд, J=6,0, 11,4 Гц, 1H), 4,14 (кд, J=7,l, 2,9 Гц, 3Н).Triethylphosphonoacetate (7.5 ml, 38 mmol) was added slowly to a suspension of sodium tert-butoxide (3.67 g, 37.82 mmol) in 1,4-dioxane (40 ml) at room temperature. After 1 hour, tert-butyl[[(2S)-oxiran-2-yl]methoxy]diphenylsilane (11.77 g, 33.76 mmol) was added and heated at 140° C. overnight in a sealed pressure vessel. Added additional amount of triethylphosphonoacetate (2 ml) and heated at 160°C for one hour. The mixture was left to cool and diluted with DCM (300 ml) and water (150 ml). The layers were separated, the aqueous layer was extracted with DCM (3x150 ml). The organic layers were combined and washed with saturated aqueous NaHCO ₃ , saturated aqueous NaCl and dried over MgSO ₄ . Filter through diatomaceous earth and evaporate the solvent under reduced pressure to give ethyl (1S,2S)-2-[[tert-butyl(diphenyl)silyl]oxymethyl]cyclopropanecarboxylate (18.45 g) as an oily substance. Dissolved in THF (75 ml) and tetrabutylammonium fluoride (1M in THF, 67 ml, 67 mmol, 1.0 M) was added at room temperature. Stirred for 48 h and removed the solvent at 130 mbar (13 kPa) and 30°C. Purify by chromatography on silica gel, eluent: 0-50% EtOAc in hexanes, isolating the title compound (3.35 g, 62%) as an oil after removing the solvent from the chromatographic fraction. ER/MS (m/z): 142 (M+1). 1H NMR (400.13 MHz, CDCl ₃ ): 0.90-0.86 (m, 1H), 1.23 (dd, J=4.5, 8.9 Hz, 1H), 1.28 (t , J=7.2 Hz, 4H), 1.561.60 (m, 1H), 1.69-1.77 (m, 2H), 2.06 (s, 2H), 3.50 (dd, J= 6.9, 11.5 Hz, 1H), 3.64 (dd, J=6.0, 11.4 Hz, 1H), 4.14 (cd, J=7, l, 2.9 Hz, 3H ).

Подготовительный синтез 22. Этил-(1S,2S)-2-формилциклопропанкарбоксилат.Preparatory synthesis 22. Ethyl-(1S,2S)-2-formylcyclopropanecarboxylate.

К охлажденному на ледяной бане раствору этил-(1S,2S)-2-(гидроксиметил)циклопропанкарбоксилата (12,25 г, 84,9 ммоль) в ДХМ (425 мл) одной порцией добавляли хлорхромат пиридиния (26,09 г, 118,6 ммоль). Через 30 мин убирали ледяную баню и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Добавляли воду (200 мл) и фильтровали через диатомовую землю. Промывали дополнительным количеством воды (100 мл) и ДХМ (800 мл). Суспендировали отфильтровальнный диатомовой землей слой в ДХМ и отфильтровывали. Указанный прием повторяли дважды. Объединяли органические слои, отделяли водный слой, и фильтровали органические слои через слой диоксида кремния. Промывали дополнительным количеством ДХМ и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (11,0 г, 91%) в виде маслянистого вещества. 1Н ЯМР (400,13 МГц, CDCl3): 1,30 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,57-1,50 (м, 1H), 1,60-1,65 (м, 2Н), 2,26-2,30 (м, 1H), 2,45 (тд, J=9,0, 4,2 Гц, 1H), 4,13-4,22 (м, 3Н), 9,32 (д, J=4,2 Гц, 1H).Pyridinium chlorochromate (26.09 g, 118 6 mmol). After 30 minutes, the ice bath was removed and stirred at room temperature for 4 hours. Water (200 ml) was added and filtered through diatomaceous earth. Washed with additional water (100 ml) and DCM (800 ml). The diatomaceous earth filtered layer was suspended in DCM and filtered. This procedure was repeated twice. The organic layers were combined, the aqueous layer was separated, and the organic layers were filtered through a pad of silica. Wash with more DCM and evaporate the solvent under reduced pressure to give the title compound (11.0 g, 91%) as an oil. 1H NMR (400.13 MHz, CDCl3): 1.30 (t, J=7.3 Hz, 3H), 1.57-1.50 (m, 1H), 1.60-1.65 (m, 2H), 2.26-2.30 (m, 1H), 2.45 (td, J=9.0, 4.2 Hz, 1H), 4.13-4.22 (m, 3H), 9 .32 (d, J=4.2 Hz, 1H).

Подготовительный синтез 23. Этил-(1S,2S)-2-(дифторметил)циклопропанкαрбоксилат.Preparatory synthesis 23. Ethyl-(1S,2S)-2-(difluoromethyl)cyclopropane α carboxylate.

Трифторид диэтиламиносеры (24 мл, 172,3 ммоль) добавляли к охлажденному на ледяной бане раствору этил-(1S,2S)-2-формилциклопропанкαрбоксилата (11,00 г, 77,38 ммоль) в ДХМ (220 мл) за 3 мин. Через 1 ч снимали с ледяной бани и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли трифторид диэтиламиносеры (3,5 мл) и перемешивали еще один час. Смесь охлаждали на ледяной бане и осторожно выливали в насыщенный водный раствор NaHCO₃. Разделяли слои и экстрагировали водный слой ДХМ (2x50 мл).Diethylaminosulfur trifluoride (24 mL, 172.3 mmol) was added to an ice-bath cooled solution of ethyl (1S,2S)-2-formylcyclopropanecarboxylate (11.00 g, 77.38 mmol) in DCM (220 mL) over 3 minutes. After 1 hour, it was removed from the ice bath and stirred at room temperature for 2 hours. Diethylaminosulfur trifluoride (3.5 ml) was added and stirred for another hour. The mixture was cooled in an ice bath and carefully poured into a saturated aqueous solution of NaHCO ₃ . The layers were separated and the aqueous layer was extracted with DCM (2x50 ml).

Объединяли органические слои и сушили над MgSO₄. Фильтровали образец через небольшой слой диоксида кремния и выпаривали растворитель при пониженном давлении (250 мбар (25 кПа) и 30°С) с получением указанного в заголовке соединения (11,10 г, 87%) в виде маслянистого вещества. 1H ЯМР (400,13 МГц, CDCl3): 1,14-1,19 (м, 1H), 1,29 (м, 1H), 1,30 (т, J=7,2 Гц, 3Н), 1,97-1,89 (м, 2Н), 4,22 (к, J=7,2 Гц, 3Н), 5,79 (тд, JH-F=56,8 Гц, J=3,6 Гц, 1H).The organic layers were combined and dried over MgSO ₄ . Filter the sample through a small pad of silica and evaporate the solvent under reduced pressure (250 mbar (25 kPa) and 30° C.) to give the title compound (11.10 g, 87%) as an oil. 1H NMR (400.13 MHz, CDCl3): 1.14-1.19 (m, 1H), 1.29 (m, 1H), 1.30 (t, J=7.2 Hz, 3H), 1 .97-1.89 (m, 2H), 4.22 (k, J=7.2 Hz, 3H), 5.79 (td, JH-F=56.8 Hz, J=3.6 Hz, 1H).

Подготовительный синтез 24. (1S,2S)-2-(Дифторметил)циклопропанкарбоновая кислота.Preparatory synthesis 24. (1S,2S)-2-(Difluoromethyl)cyclopropanecarboxylic acid.

- 22 041789- 22 041789

н. раствор NaOH (75 мл) добавляли к раствору этил-(^^)-2-(дифторметил)циклопропанкарбоксилата (11,10 г, 67,62 ммоль) в MeOH (75 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли ДХМ (70 мл) и разделяли слои. Водный слой экстрагировали ДХМ (70 мл). Водный слой охлаждали на ледяной бане и доводили до pH 1 посредством добавления 35% HCl. Добавляли ДХМ (50 мл) и разделяли два слоя. Водный слой экстрагировали ДХМ. Объединяли органические слои, сушили над MgSO₄ и выпаривали растворитель при пониженном давлении (200 мбар (20 кПа), 30°С) с получением указанного в заголовке соединения (6,25 г, 68%) в виде маслянистого вещества. 1H ЯМР (400,13 МГц, CDCl₃): 1,26 (дт, J=8,4, 5,9 Гц, 1H), 1,34-1,39 (м, 1H), 1,92-1,96 (м, 1H), 2,01-2,07 (м, 1H), 5,82 (тд, JH-F=59 Гц, J=3,2 Гц, 1H).n. a solution of NaOH (75 ml) was added to a solution of ethyl-(^^)-2-(difluoromethyl)cyclopropanecarboxylate (11.10 g, 67.62 mmol) in MeOH (75 ml) and stirred at room temperature overnight. DCM (70 ml) was added and the layers were separated. The aqueous layer was extracted with DCM (70 ml). The aqueous layer was cooled in an ice bath and brought to pH 1 by adding 35% HCl. DCM (50 ml) was added and the two layers were separated. The aqueous layer was extracted with DCM. The organic layers were combined, dried over MgSO ₄ and the solvent was evaporated under reduced pressure (200 mbar (20 kPa), 30° C.) to give the title compound (6.25 g, 68%) as an oily substance. 1H NMR (400.13 MHz, CDCl ₃ ): 1.26 (dt, J=8.4, 5.9 Hz, 1H), 1.34-1.39 (m, 1H), 1.92-1 .96 (m, 1H), 2.01-2.07 (m, 1H), 5.82 (td, JH-F=59Hz, J=3.2Hz, 1H).

Подготовительный синтез 25. Транс-бензил-2-ацетилциклопропанкарбоксилат.Preparatory synthesis 25. Trans-benzyl-2-acetylcyclopropanecarboxylate.

K₂CO₃ (36,2 г, 261,93 ммоль) к смеси бензилбромацетата (40 г, 174,618 ммоль), метилвинилкетона (43 мл, 523,85 ммоль), 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (2,3 г, 20,9 ммоль) в ацетонитриле (400 мл). Перемешивали в атмосфере N₂ при 80°С в течение ночи. Оставляли остывать, фильтровали и выпаривали растворитель при пониженном давлении. Очищали хроматографией на силикагеле, элюент 0-50% EtOAc/гексан, с получением указанного в заголовке соединения (13,4 г, 35%), после удаления растворителя из хроматографических фракций. 1H ЯМР (400,13 МГц, d₆-ДМСО): 1,33-1,39 (м, 2Н), 2,08-2,13 (м, 1H), 2,24 (с, 3Н), 2,54-2,59 (м, 2Н), 5,13 (с, 2Н), 7,39-7,37 (м, 6Н).K ₂ CO ₃ (36.2 g, 261.93 mmol) to a mixture of benzyl bromoacetate (40 g, 174.618 mmol), methyl vinyl ketone (43 ml, 523.85 mmol), 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (2 .3 g, 20.9 mmol) in acetonitrile (400 ml). Was stirred in an atmosphere of N ₂ at 80°C during the night. Left to cool, filtered and the solvent was evaporated under reduced pressure. Purify by silica gel chromatography eluting with 0-50% EtOAc/hexane to give the title compound (13.4 g, 35%) after removing the solvent from the chromatographic fractions. 1H NMR (400.13 MHz, d ₆ -DMSO): 1.33-1.39 (m, 2H), 2.08-2.13 (m, 1H), 2.24 (s, 3H), 2 .54-2.59 (m, 2H), 5.13 (s, 2H), 7.39-7.37 (m, 6H).

Подготовительный синтез 26. Транс-бензил-2-(1,1-дифторэтил)циклопропанкарбоксилат.Preparatory synthesis 26. Trans-benzyl-2-(1,1-difluoroethyl)cyclopropanecarboxylate.

EtOH (0,05 экв.) добавляли к смеси транс-бензил-2-ацетилциклопропанкарбоксилата (2,76 г, 12,6 ммоль) и трифторида бис(2-метоксиэтил)аминосеры (23,2 мл, 126 ммоль) при 0°С. Оставляли нагреваться до комнатной температуры и нагревали при 50°С в течение 40 ч. Разбавляли ДХМ и охлаждали смесь на ледяной бане, медленно добавляли насыщенный водный раствор NaHCO3. Разделяли слои и экстрагировали водный слой ДХМ (2x100 мл). Объединяли органические слои и сушили над безводным Na₂SO₄. Растворитель выпаривали при пониженном давлении. Очищали хроматографией на силикагеле, элюент: 10% МТБЭ/гексан, с получением указанного в заголовке соединения (2,30 г, 76%) в виде бесцветного маслянистого вещества, после удаления растворителя из хроматографических фракций. ¹H ЯМР (400,13 МГц, d₆-ДМСО): 1,19 (т, J=7,5 Гц, 2Н), 1,67 (т, J H-F=16 Гц, 3Н), 1,93-1,98 (м, 1H), 2,00-2,08 (м, 1H), 5,13 (с, 2Н), 7,38-7,40 (м, 5Н).EtOH (0.05 eq.) was added to a mixture of trans-benzyl-2-acetylcyclopropanecarboxylate (2.76 g, 12.6 mmol) and bis(2-methoxyethyl)aminosulfur trifluoride (23.2 ml, 126 mmol) at 0° WITH. Allowed to warm to room temperature and heated at 50° C. for 40 h. Dilute with DCM and cool the mixture in an ice bath, saturated aqueous NaHCO3 was added slowly. The layers were separated and the aqueous layer was extracted with DCM (2x100 ml). The organic layers were combined and dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ . The solvent was evaporated under reduced pressure. Purify by chromatography on silica gel, eluent: 10% MTBE/hexane, to give the title compound (2.30 g, 76%) as a colorless oil after removing the solvent from the chromatographic fractions. ¹ H NMR (400.13 MHz, d ₆ -DMSO): 1.19 (t, J=7.5 Hz, 2H), 1.67 (t, J HF=16 Hz, 3H), 1.93- 1.98 (m, 1H), 2.00-2.08 (m, 1H), 5.13 (s, 2H), 7.38-7.40 (m, 5H).

Подготовительный синтез 27. Транс-2-(1,1-дифторэтил)циклопропанкарбоновая кислота.Preparatory synthesis 27. Trans-2-(1,1-difluoroethyl)cyclopropanecarboxylic acid.

Добавляли 10% Pd/C (1,53 г, 14,4 ммоль) к раствору транс-бензил-2-(1,1-дифторэтил)циклопропанкарбоксилата (6,56 г, 27,3 ммоль) в EtOAc (136 мл, 0,2 М). Перемешивали при комнатной температуре в атмосфере H₂ из баллона в течение 3 ч. Фильтровали через диатомовую землю и промывали EtOAc. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (4,03 г, 98%) в виде бесцветного маслянистого вещества. 1H ЯМР (400,13 МГц, d₆-ДМСО): 1,10 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 1,66 (т, JH-F=18,4 Гц, 3Н), 1,72-1,77 (м, 1H), 1,96-1,99 (м, 1H), 12,49 (с, 1H).10% Pd/C (1.53 g, 14.4 mmol) was added to a solution of trans-benzyl-2-(1,1-difluoroethyl)cyclopropanecarboxylate (6.56 g, 27.3 mmol) in EtOAc (136 ml, 0.2 M). Stir at room temperature under H ₂ from a balloon for 3 hours. Filter through diatomaceous earth and wash with EtOAc. The solvent was evaporated under reduced pressure to give the title compound (4.03 g, 98%) as a colorless oil. 1H NMR (400.13 MHz, d ₆ -DMSO): 1.10 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.66 (t, JH-F=18.4 Hz, 3H), 1, 72-1.77 (m, 1H), 1.96-1.99 (m, 1H), 12.49 (s, 1H).

Подготовительный синтез 28. 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-2,4диметоксипиримидин.Preparatory synthesis 28. 5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4dimethoxypyrimidine.

Дегазировали смесь 4-хлор-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазина (16 г, 54,0 ммоль), 2-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолана (17 г, 83,22 ммоль), 2 М водного раствора Na₂CO₃ (70 мл, 140 ммоль) и 1,4-диоксана (290 мл), пропуская через смесь газообразный N₂ вA mixture of 4-chloro-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazine (16 g, 54.0 mmol), 2-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-4.4 was degassed ,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane (17 g, 83.22 mmol), 2 M aqueous Na ₂ CO ₃ solution (70 ml, 140 mmol) and 1,4-dioxane (290 ml), passing gaseous N ₂ through the mixture in

- 23 041789 течение 10 мин. Добавляли бис(ди-трет-бутил(4-диметиламинофенил)фосфин)дихлорпалладий (II) (2,0 г, 2,74 ммоль) и перемешивали полученную смесь при 90°С в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли H₂O и экстрагировали EtOAc. Разделяли полученные фазы, органическую фазу сушили над безводным MgSO₄ и концентрировали in vacuo. Полученный остаток очищали хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 60-100% смесью гексаны/EtOAc, с получением указанного в заголовке соединения (12,95 г, 77%) в виде маслянистого вещества янтарного цвета после удаления растворителя из хроматографических фракций. Маслянистое вещество затвердевало при стоянии при комнатной температуре до грязновато-белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 301 (М+1).- 23 041789 for 10 min. Bis(di-tert-butyl(4-dimethylaminophenyl)phosphine)dichloropalladium (II) (2.0 g, 2.74 mmol) was added and the resulting mixture was stirred at 90° C. for 16 h. The reaction mixture was cooled to room temperature, diluted with H ₂ O and extracted with EtOAc. The resulting phases were separated, the organic phase was dried over anhydrous MgSO ₄ and concentrated in vacuo. The resulting residue was purified by chromatography on silica eluting with a gradient of 60-100% hexanes/EtOAc to give the title compound (12.95 g, 77%) as an amber oil after removal of the solvent from the chromatographic fractions. The oil solidified on standing at room temperature to an off-white solid. ER/MS (m/z): 301 (M+1).

Подготовительный синтез 29. 5-[5-[(1S,2R)-2-Изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-2,4диметоксипиримидин.Preparatory synthesis 29. 5-[5-[(1S,2R)-2-Isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4-dimethoxypyrimidine.

о )>.....( / N—' N=No )>.....( / N—' N=N

Смешивали 4-хлор-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин (19,1 г, 70,6 ммоль), K₃PO₄(45,9 г, 212 ммоль), 1,4-диоксан (300 мл) и H2O (75 мл) и дегазировали смесь с помощью N2 в течение 10 мин. Добавляли [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий (II) (7,98 г, 10,6 ммоль). Еще 2 мин пропускали газообразный азот и одной порцией добавляли 2-[(1S,2S)-2-изопропилциклопропил]-4,4,5,5тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (22,2 г, 106 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 80°С в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли H₂O и экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили над безводным MgSO₄ и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 85% смесью гексаны/EtOAc, с выделением указанного в заголовке соединения (21,5 г, 92%) в виде маслянистого вещества янтарного цвета после удаления растворителя из хроматографической фракции. Маслянистое вещество затвердевало при выстаивании при комнатной температуре до грязновато-белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 315 (М+1).4-Chloro-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazine (19.1 g, 70.6 mmol), K ₃ PO ₄ (45.9 g, 212 mmol), 1, 4-dioxane (300 ml) and H2O (75 ml) and the mixture was degassed with N2 for 10 min. [1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium (II) (7.98 g, 10.6 mmol) was added. Nitrogen gas was passed through for another 2 minutes and 2-[(1S,2S)-2-isopropylcyclopropyl]-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane (22.2 g, 106 mmol) was added in one portion. The resulting mixture was stirred at 80°C for 16 hours the Reaction mixture was cooled to room temperature, was added H ₂ O and was extracted with EtOAc. The organic layer was separated, dried over anhydrous MgSO ₄ and concentrated under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography on silica eluting with 85% hexanes/EtOAc to afford the title compound (21.5 g, 92%) as an amber oil after removal of the solvent from the chromatographic fraction. The oil solidified on standing at room temperature to an off-white solid. ER/MS (m/z): 315 (M+1).

Подготовительный синтез 30. 4-[(1S,2S)-2-(Дифторметuл)циклопропил]-6-(2,4-диметоксипиримидин5-ил)-3-метилпиридазин.Preparatory Synthesis 30 4-[(1S,2S)-2-(Difluoromethyl)cyclopropyl]-6-(2,4-dimethoxypyrimidin5-yl)-3-methylpyridazine.

Диметилцинк (2M в толуоле, 1,5 мл, 3,0 ммоль) добавляли к дегазированной суспензии 3-хлор-4[(1S,2S)-2-(дифторметил)циклопропил]-6-(2,4-диметоксипuримидин-5-ил)пuридαзина (502 мг, 1,46 ммоль) и дихлорида 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен-палладия (II) (53 мг, 0,07 ммоль) в ТГФ (6 мл). Нагревали при 60°С в закрытой пробирке в течение 2 ч. Оставляли остывать до комнатной температуры. Добавляли насыщенный водный раствор NH4Cl и экстрагировали ДХМ (3х). Органические слои объединяли, сушили над безводным MgSO4 и удаляли растворитель при пониженном давлении. Очищали хроматографией на силикагеле, элюент: EtOAc, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого остатка (433 мг, 91,8%), после удаления растворителя из хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): 323 (М+1).Dimethylzinc (2M in toluene, 1.5 mL, 3.0 mmol) was added to the degassed suspension of 3-chloro-4[(1S,2S)-2-(difluoromethyl)cyclopropyl]-6-(2,4-dimethoxypyrimidine-5 -yl)pyridazine (502 mg, 1.46 mmol) and 1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene-palladium (II) dichloride (53 mg, 0.07 mmol) in THF (6 ml). It was heated at 60°C in a closed tube for 2 hours. It was left to cool to room temperature. Saturated aqueous NH4Cl was added and extracted with DCM (3x). The organic layers were combined, dried over anhydrous MgSO4 and the solvent was removed under reduced pressure. Purify by chromatography on silica gel, eluent: EtOAc, to give the title compound as a yellow residue (433 mg, 91.8%) after removal of the solvent from the chromatographic fractions. ER/MS (m/z): 323 (M+1).

Подготовительный синтез 31. 3,6-Дихлор-4-циклопропилпиридазин.Preparatory synthesis 31. 3,6-Dichloro-4-cyclopropylpyridazine.

N=NN=N

К суспензии 3,6-дихлорпиридазина (10,00 г, 67,12 ммоль) в воде (300 мл) добавляли 10 мл концентрированной H2SO4 и циклопропанкарбоновую кислоту (5,85 мл, 73,7 ммоль), нагревали при 70°С и дегазировали с помощью N₂. За 30 с добавляли раствор AgNO₃ (2,28 г, 13,4 ммоль) в 10 мл H2O, затем по каплям добавляли раствор (NH₄)₂S₂O₈ (46 г, 201,577 ммоль) в 150 мл H2O за 30 мин. Через час оставляли смесь остывать до комнатной температуры и выливали на лед, доводили до pH 9, добавляя концентрированный раствор NH4OH. Разбавляли EtOAc и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали дополнительным количеством EtOAc. Объединяли органические слои, сушили над безводным Na2SO4 и выпаривали растворитель при пониженном давлении. Очищали обращенно-фазовой хроматографией (С18 Gold 415 г, градиент 25-100% ACN в 10 мМ растворе бикарбоната аммония; 150 мл/мин, за 30 мин) с выделением указанного в заголовке соединения (6,83 г, 54%) в виде белого твердого вещества после удаления растворителя из хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): (³⁵Cl/³⁷Cl) 189/191. Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в синтезе 22.To a suspension of 3,6-dichloropyridazine (10.00 g, 67.12 mmol) in water (300 ml) was added 10 ml of concentrated H2SO4 and cyclopropanecarboxylic acid (5.85 ml, 73.7 mmol), heated at 70°C and degassed with N ₂ . A solution of AgNO ₃ (2.28 g, 13.4 mmol) in 10 ml H2O was added over 30 s, then a solution of (NH ₄ ) ₂ S ₂ O ₈ (46 g, 201.577 mmol) in 150 ml H2O was added dropwise over 30 min. After an hour, the mixture was left to cool to room temperature and poured onto ice, adjusted to pH 9 by adding concentrated NH4OH solution. Dilute with EtOAc and separate the organic layer. The aqueous layer was extracted with more EtOAc. The organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and the solvent was evaporated under reduced pressure. Purify by reverse phase chromatography (C18 Gold 415 g, gradient 25-100% ACN in 10 mM ammonium bicarbonate solution; 150 ml/min, over 30 min) to isolate the title compound (6.83 g, 54%) as white solid after removal of the solvent from the chromatographic fractions. ER/MS (m/z): ( ³⁵ Cl/ ³⁷ Cl) 189/191. The following examples can be prepared essentially as described in Synthesis 22.

- 24 041789- 24 041789

№ синтеза No. of synthesis Химическое название chemical name Химическая структура Chemical structure ЭР/МС (m/z) (³⁵C1/³⁷C1)ER/MS (m/z) ( ³⁵ C1/ ³⁷ C1) 32 32 Рац-/иранс-Ъ, 6 -дихлор-4 -(2 изопропилциклопропил)пиридазин Rac-/irans-b, 6-dichloro-4-(2 isopropylcyclopropyl)pyridazine N=N N=N 231/233 231/233 33 33 Рац-/ираис-3,6 -дихлор-4 -(2 этилциклопропил)пиридазин Rac-/irais-3,6-dichloro-4-(2 ethylcyclopropyl)pyridazine N=N N=N 217/219 217/219 34 34 3,6-дихлор-4-(2,2дифторциклопропил)пиридазин 3,6-dichloro-4-(2,2difluorocyclopropyl)pyridazine F F Cl—Cl N=N F F Cl—Cl N=N 225/227 225/227 35 35 Рац-/ираис-3,6 -дихлор-4 - [2 (дифторметил)цикло пропил] пиридазин Rac-/irais-3,6-dichloro-4-[2(difluoromethyl)cyclopropyl]pyridazine F у F Cl—Cl N=N F at F Cl—Cl N=N 239/241 239/241 36 36 Рац-/иранс-3,6-дихлор-4-[2-( 1,1дифторэтил)цикло пропил] пиридазин Rac-/irans-3,6-dichloro-4-[2-(1,1difluoroethyl)cyclopropyl]pyridazine Cl—Cl N=N Cl—Cl N=N 253/255 253/255 37 37 3,6-дихлор-4-циклобутилпиридазин 3,6-dichloro-4-cyclobutylpyridazine CI^^CI N=N CI^^CI N=N 203/205 203/205 38 38 3,6-дихлор-4-(3,3диметилциклобутил)пиридазин 3,6-dichloro-4-(3,3dimethylcyclobutyl)pyridazine ci^^ N=N ci^^ N=N 231/233 231/233

- 25 041789- 25 041789

39 39 3,6-дихлор-4-(3,3дифторциклобутил)пиридазин 3,6-dichloro-4-(3,3difluorocyclobutyl)pyridazine F U-F Cl—/ Cl N=N F U-F Cl—/ Cl N=N 239/241 239/241 40 40 3,6-дихлор-4-циклопентилпиридазин 3,6-dichloro-4-cyclopentylpyridazine ci— N=N ci— N=N 217/219 217/219 41 41 3,6-дихлор-4-(3,3дифторциклопентил)пиридазин 3,6-dichloro-4-(3,3difluorocyclopentyl)pyridazine F F Cl—/ Cl N=N F F Cl—/ Cl N=N 253/255 253/255 42 42 3,6-дихлор-4-циклогексилпиридазин 3,6-dichloro-4-cyclohexylpyridazine N=N N=N 231/233 231/233

Подготовительный синтез 43. 3-Хлор-4-циклопропил-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)пиридазин.Preparatory synthesis 43. 3-Chloro-4-cyclopropyl-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)pyridazine.

Смешивали (2,4-диметоксипиримидин-5-ил)бороновую кислоту (4,60 г, 25,0 ммоль), 3,6-дихлор-4циклопропилпиридазин (5,2 г, 28 ммоль) и K₂CO₃ (4,4 г, 32 ммоль), 1,4-диоксан (125 мл) и H₂O (42 мл) и дегазировали смесь с помощью N2 в течение 10 мин. Добавляли комплекс [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия (II) с дихлорметаном (1,5 г, 1,8 ммоль) и дополнительно дегазировали с помощью N2. Полученную смесь перемешивали при 60°С в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли H2O и экстрагировали EtOAc. Отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали дополнительным количеством EtOAc. Объединяли органические слои, сушили над безводным Na₂SO₄ и выпаривали растворитель при пониженном давлении. Полученный остаток очищали хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 70% смесью гексаны/(3:2 ацетон :ДХМ), с выделением указанного в заголовке соединения (2,4 г, 33%) в виде светло-желтого твердого вещества после удаления растворителя из хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): (³⁵Cl/³⁷Cl) 293/295 [М+1]+Mixed (2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)boronic acid (4.60 g, 25.0 mmol), 3,6-dichloro-4-cyclopropylpyridazine (5.2 g, 28 mmol) and K ₂ CO ₃ (4, 4 g, 32 mmol), 1,4-dioxane (125 ml) and H ₂ O (42 ml) and the mixture was degassed with N 2 for 10 min. [1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II) complex with dichloromethane (1.5 g, 1.8 mmol) was added and further degassed with N2. The resulting mixture was stirred at 60°C for 1 h. The reaction mixture was cooled to room temperature, H2O was added and extracted with EtOAc. The organic layer was separated. The aqueous layer was extracted with more EtOAc. The organic layers were combined, dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ and the solvent was evaporated under reduced pressure. The resulting residue was purified by chromatography on silica eluting with 70% hexanes/(3:2 acetone:DCM) to afford the title compound (2.4 g, 33%) as a light yellow solid after removal of the solvent from the chromatographic fractions. ER/MS (m/z): ( ³⁵ Cl/ ³⁷ Cl) 293/295 [M+1]+

Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в подготовительном синтезе 6.The following examples can be prepared essentially as described in Preparatory Synthesis 6.

- 26 041789- 26 041789

№ синтеза No. of synthesis Химическое название chemical name Структура Structure ЭР/МС (m/z) (³⁵C1/³⁷C1)ER/MS (m/z) ( ³⁵ C1/ ³⁷ C1) 44 44 Рац-/и/?анс-3-хлор-6-(2,4диметоксипиримидин-5-ил)-4(2изопропилциклопропил)пирид азин Rac-/i/?ans-3-chloro-6-(2,4dimethoxypyrimidin-5-yl)-4(2isopropylcyclopropyl)pyride azine \ IX__/ ⁰ / \ N=Z рЧ / N—У N=N\ IX__/ ⁰ / \ N=Z rCh / N—U N=N 335/337 335/337 45 45 Рац-3-хлор-4-(2,2дифторциклопропил)-6-(2,4диметоксипиримидин-5 ил)пиридазин Rac-3-chloro-4-(2,2difluorocyclopropyl)-6-(2,4dimethoxypyrimidin-5yl)pyridazine F P >f N=< / N—У N=N F P>f N=< / N—U N=N 329/331 329/331 46 46 Рац-транс-3-хлор-4-[2(дифторметил)цикло пропил] 6-(2,4-диметоксипиримидин-5ил)пиридазин Rac-trans-3-chloro-4-[2(difluoromethyl)cyclopropyl]6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5yl)pyridazine F \ IX__/ P Z¥ ^N=\ /=\ p——v 4^CI / N—N-NF \ IX__/ PZ¥ ^N= \ /=\ p——v 4 ^CI / N—NN 343/345 343/345 47 47 Рац-транс-З -хлор-4-[2-( 1,1дифторэтил)цикло пропил] -6(2,4 -димето ксипиримидин-5 ил)пиридазин Rac-trans-3 -chloro-4-[2-(1,1difluoroethyl)cyclopropyl]-6(2,4-dimetho xypyrimidin-5yl)pyridazine ' cZP ⁰ к \ N=/ / N—N=N' cZP ⁰ to \ N=/ / N—N=N 357/359 357/359 48 48 3 -Хлор-4-циклобутил-6-(2,4димето ксипиримидин-5 ил)пиридазин 3-Chloro-4-cyclobutyl-6-(2,4dimetho xypyrimidin-5 yl)pyridazine ⁰ / N=/ p4 / N—N=N ⁰ / N=/ p4 / N—N=N 307/309 307/309 49 49 3-Хлор-6-(2,4диметоксипиримидин-5-ил)-4(3,3диметилциклобутил)пиридази н 3-Chloro-6-(2,4dimethoxypyrimidin-5-yl)-4(3,3dimethylcyclobutyl)pyridazine n \ \\ ⁰ / N=< -V p4 p/V^cl/ N—N=N\ \\ ⁰ / N=< -V p4 p/V ^cl / N—N=N 335/337 335/337 50 50 3-Хлор-4-(3,3дифторциклобутил)-6-(2,4димето ксипиримидин-5 ил)пиридазин 3-Chloro-4-(3,3difluorocyclobutyl)-6-(2,4dimetho xypyrimidin-5yl)pyridazine F V-F \ \\ ⁰ / N=( p4 / N—У N=NF VF \ \\ ⁰ / N=( p4 / N—U N=N 343/345 343/345 51 51 3 -Хлор-4-циклопентил-6-(2,4димето ксипиримидин-5 ил)пиридазин 3-Chloro-4-cyclopentyl-6-(2,4dimetho xypyrimidin-5 yl)pyridazine ⁰ /-N=( °ч р-Л~^а / N=N ⁰ /-N=( °h r-L~ ^a / N=N 321/323 321/323

Подготовительный синтез 52. 4-Циклобутил-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метоксипиридазин.Preparatory synthesis 52. 4-Cyclobutyl-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methoxypyridazine.

3-Хлор-4-циклобутил-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)пиридазин получали способами подготовительных синтезов 21 и 33 из циклобутилкарбоновой кислоты.3-Chloro-4-cyclobutyl-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)pyridazine was prepared by preparatory syntheses 21 and 33 from cyclobutylcarboxylic acid.

3-Хлор-4-циклобутил-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)пиридазин (0,42 г, 1,4 ммоль) добавляли к раствору NaOMe, полученному растворением Na (0,16 г, 6,8 ммоль) в MeOH (12 мл). Нагревали смесь в колбе, закрытой пробкой, при 60°С в течение ночи. Оставляли смесь остывать до комнатной температу- 27 041789 ры, добавляли 50% насыщенный водный раствор NaCl и экстрагировали ДХМ (3х). Объединяли органические слои и сушили над безводным MgSO₄. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (0,38 г, 93%) в виде белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z):3-Chloro-4-cyclobutyl-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)pyridazine (0.42 g, 1.4 mmol) was added to a NaOMe solution prepared by dissolving Na (0.16 g, 6.8 mmol) in MeOH (12 ml). The mixture was heated in a stoppered flask at 60° C. overnight. Allow the mixture to cool to room temperature, add 50% saturated aqueous NaCl and extract with DCM (3x). The organic layers were combined and dried over anhydrous MgSO ₄ . The solvent was removed under reduced pressure to give the title compound (0.38 g, 93%) as a white solid. ER/MS (m/z):

303 (М+1).303 (M+1).

Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в подготовительном синтезе 52.The following examples can be prepared essentially as described in Preparatory Synthesis 52.

№ синтеза No. of synthesis Химическое название chemical name Структура Structure ЭР/МС (m/z) (М+Н) ER/MS (m/z) (M+H) 53 53 4-Циклопропил-6-(2,4диметоксипиримидин-5 -ил)-3 метоксипиридазин 4-Cyclopropyl-6-(2,4dimethoxypyrimidin-5-yl)-3 methoxypyridazine \ ⁰ / N=Z ,=/ / ,^о—(\ #—/ / N—N-N\ ⁰ / N=Z ,=/ / , ^o— (\ #—/ / N—NN 289 289 54 54 5 - [5 -(3,3 -диметилциклобутил)6-метоксипиридазин-З -ил] 2,4-диметоксипиримидин 5 - [5 - (3,3 -dimethylcyclobutyl) 6-methoxypyridazin-3 -yl] 2,4-dimethoxypyrimidine \ Г\ ⁰ / °А /УК>-о' / N—N=N\ G\ ⁰ / °A /UK>-o' / N—N=N 331 331 55 55 4-(3,3 -дифторциклобутил)-6(2,4-диметоксипиримидин-5ил)-3 -метоксипиридазин 4-(3,3-difluorocyclobutyl)-6(2,4-dimethoxypyrimidin-5yl)-3-methoxypyridazine F F \ \\ ° / очУУ-о⁷/ N—у N=NFF \ \\ ° / ouchuu-o ⁷ / N—y N=N 339 339 56 56 4-(3,3 -дифторцикло пентил)-6(2,4-диметоксипиримидин-5ил)-3 -метоксипиридазин (изомер 1) 4-(3,3-difluorocyclopentyl)-6(2,4-dimethoxypyrimidin-5yl)-3-methoxypyridazine (isomer 1) F F \ \ / ° )— / Ν—N=N F F \ \ / ° )— / N—N=N 353 353 57 57 4-(3,3 -дифторцикло пентил)-6(2,4-диметоксипиримидин-5ил)-3 -метоксипиридазин (изомер 2) 4-(3,3-difluorocyclopentyl)-6(2,4-dimethoxypyrimidin-5yl)-3-methoxypyridazine (isomer 2) F F \ ξ 7 / Ν—7 Ν=Ν F F \ ξ 7 / N—7 N=N 353 353 58 58 4-Циклогексил-6-(2,4диметоксипиримидин-5 -ил)-3 метоксипиридазин 4-Cyclohexyl-6-(2,4dimethoxypyrimidin-5-yl)-3 methoxypyridazine \ \ / ⁰ /— рЛ Г~/ %° / Ν=Ν\ \ / ⁰ / — pL G~/ %° / N=N 331 331

Подготовительный синтез 59. Транс-трет-бутилдиметил-[2-[2-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан2-ил)циклопропил]этокси]силан.Preparatory synthesis 59. Trans-tert-butyldimethyl-[2-[2-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan2-yl)cyclopropyl]ethoxy]silane.

Может быть получен по существу так, как описано в синтезе 3 из доступного в продаже третбутилдиметил-[(Е)-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бут-3-енокси]силана. 1H ЯМР (400,13 МГц, CDCl₃): 3,70-3,66 (м, 2Н), 1,51-1,38 (м, 2Н), 1,23 (с, 12Н), 1,04-0,96 (м, 1H), 0,91 (с, 9Н), 0,71-0,67 (м, 1H), 0,46-0,41 (м, 1H), 0,07 (с, 6Н), -0,38 (дт, J=9,3, 5,8 Гц, 1H).Can be prepared essentially as described in Synthesis 3 from commercially available tert-butyldimethyl-[(E)-4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)but- 3-enoxy]silane. 1H NMR (400.13 MHz, CDCl ₃ ): 3.70-3.66 (m, 2H), 1.51-1.38 (m, 2H), 1.23 (s, 12H), 1.04 -0.96 (m, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.71-0.67 (m, 1H), 0.46-0.41 (m, 1H), 0.07 (s , 6H), -0.38 (dt, J=9.3, 5.8 Hz, 1H).

Подготовительный синтез 60. Транс-трет-бутилдиметил-[2-[2-(4,4,5,5-тетраметил-2,4-диоксаборолан5-ил)циклопропил]этокси]силан.Preparatory Synthesis 60. Trans-tert-butyldimethyl-[2-[2-(4,4,5,5-tetramethyl-2,4-dioxaborolan5-yl)cyclopropyl]ethoxy]silane.

- 28 041789- 28 041789

Может быть получен по существу так, как описано в синтезе 4. ЭР/МС (m/z): 417 (М+1).Can be prepared essentially as described in Synthesis 4. ER/MS (m/z): 417 (M+1).

Подготовительный синтез 61. Транс-2-[2-[6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин-4ил]циклопропил]этанол.Preparatory Synthesis 61. Trans-2-[2-[6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazin-4yl]cyclopropyl]ethanol.

Добавляли фторид тетрабутиламмония (5 мл, 5 ммоль, 1M в ТГФ) и транс-трет-бутилдиметил-[2-[2[6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин-4-ил]циклопропил]этокси]силан (1,15 г, 8,9 ммоль) в ДХМ (3 мл) и перемешивали при 60°С в течение 1 ч. Охлаждали до комнатной температуры. Разбавляли ДХМ (80 мл) и промывали насыщенным раствором NH₄Cl (3x30 мл). Органические слои объединяли, сушили над безводным Na₂SO₄ и удаляли растворитель при пониженном давлении. Очищали хроматографией на силикагеле, элюент 0-30% MeOH/EtOAc, с получением указанного в заголовке соединения (0,53 г, 53%) в виде белого твердого вещества, после удаления растворителя из хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): 317 (М+1). 1H ЯМР (399,80 МГц, CDCl₃): 8,92 (с, 1H), 7,29 (м, 1H), 4,03 (с, 3Н), 4,02 (с, 3Н), 3,81 (т, J=6,2 Гц, 2Н), 2,76 (с, 3Н), 1,73-(м, 3Н), 1,26 (м, 2Н), 1,03 (м, 2Н).Tetrabutylammonium fluoride (5 mL, 5 mmol, 1M in THF) and trans-tert-butyldimethyl-[2-[2[6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazin-4-yl]cyclopropyl were added ]ethoxy]silane (1.15 g, 8.9 mmol) in DCM (3 ml) and stirred at 60° C. for 1 h. Cooled to room temperature. Dilute with DCM (80 ml) and wash with saturated NH ₄ Cl solution (3x30 ml). The organic layers were combined, dried over anhydrous Na ₂ SO ₄ and the solvent was removed under reduced pressure. Purify by silica gel chromatography eluting with 0-30% MeOH/EtOAc to give the title compound (0.53 g, 53%) as a white solid after removal of the solvent from the chromatographic fractions. ER/MS (m/z): 317 (M+1). 1H NMR (399.80 MHz, CDCl ₃ ): 8.92 (s, 1H), 7.29 (m, 1H), 4.03 (s, 3H), 4.02 (s, 3H), 3, 81 (t, J=6.2 Hz, 2H), 2.76 (s, 3H), 1.73-(m, 3H), 1.26 (m, 2H), 1.03 (m, 2H) .

Подготовительный синтез 62. Транс-2-[2-[6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин-4ил]циклопропил]этилметансульфонат.Preparatory Synthesis 62. Trans-2-[2-[6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazin-4yl]cyclopropyl]ethylmethanesulfonate.

ммоль)mmol)

Метансульфонилхлорид (0,2 мл, 3 добавляли к раствору транс-2-[2-[6-(2,4 диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин-4-ил]циклопропил]этанола (0,390 г, 1,22 ммоль) и N,Nдиизопропилэтиламина (0,4 мл, 2 ммоль) в ДХМ (8 мл) при 0°С в атмосфере N2. Перемешивали при 0°С в течение 40 мин. Разбавляли 50 мл ДХМ и промывали 5% NaHCO₃ (2x30 мл) и водой (30 мл). Объединяли органические слои, сушили над безводным Na₂SO₄ и выпаривали растворитель при пониженном давлении. Очищали хроматографией на силикагеле, элюент: 0-20% MeOH/EtOAc, с получением указанного в заголовке соединения в виде коричневого твердого вещества (0,280 г, 58%), после удаления растворителя из хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): 395 (М+1). 1H ЯМР (399,80 МГц, CDCl₃): 8,98 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 4,37 (т, J=6,2 Гц, 2Н), 4,07 (с, 3Н), 4,05 (с, 3Н), 3,01 (с, 3Н), 2,81 (с, 3Н), 2,04 (м, 1H), 1,90-1,78 (м, 2Н), 1,27 (м, 1H), 1,06 (т, J=7,1 Гц, 2Н).Methanesulfonyl chloride (0.2 ml, 3 was added to a solution of trans-2-[2-[6-(2,4-dimethoxy-pyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazin-4-yl]-cyclopropyl]-ethanol (0.390 g, 1.22 mmol) and N,Ndiisopropylethylamine (0.4 ml, 2 mmol) in DCM (8 ml) at 0° C. under N2 Stir at 0° C. for 40 min. Dilute with 50 ml DCM and wash with 5% NaHCO ₃ ( 2x30 ml) and water (30 ml) Combine the organic layers, dry over anhydrous Na ₂ SO ₄ and evaporate the solvent under reduced pressure Purify by silica gel chromatography eluting with 0-20% MeOH/EtOAc to give the title compound in as a brown solid (0.280 g, 58%) after removal of the solvent from the chromatographic fractions ER/MS (m/z): 395 (M+1) 1H NMR (399.80 MHz, CDCl ₃ ): 8.98 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 4.37 (t, J=6.2 Hz, 2H), 4.07 (s, 3H), 4.05 (s, 3H), 3 .01 (s, 3H), 2.81 (s, 3H), 2.04 (m, 1H), 1.90-1.78 (m, 2H), 1.27 (m, 1H), 1, 06 (t, J=7.1 Hz, 2H).

Подготовительный синтез пил] пиридазин-3 -ил] пиримидин.Preparatory synthesis of pyl]pyridazin-3-yl]pyrimidine.

63. Транс-2,4-диметокси-5-[6-метил-5-[2-(2-фторэтил)циклопро-63. Trans-2,4-dimethoxy-5-[6-methyl-5-[2-(2-fluoroethyl)cyclopro-

Гидрат фторида тетрабутиламмония (3 мл, 3 ммоль, 1M в ТГФ) добавляли к раствору транс-2-[2-[6(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3-метилпиридазин-4-ил]циклопропил]этилметансульфоната (0,280 г, 0,71 ммоль) в ТГФ (3 мл). Нагревали при 70°С в течение 2 ч. Охлаждали до комнатной температуры. Разбавляли EtOAc, промывали насыщенным водным раствором NaCl, сушили над безводным Na₂SO₄ и удаляли растворитель при пониженном давлении. Очищали хроматографией на силикагеле, элюент: 020% MeOH/EtOAc, с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого маслянистого вещества (0,170 г, 71 %), после удаления растворителя из хроматографических фракций. ЭР/МС (m/z): 319 (М+1). 1H ЯМР (399,80 МГц, CDCl₃): 9,01 (м, 1H), 7,39 (с, 1H), 4,67-4,52 (дт, J H-F 48 Гц, J=6,7 Гц, 2Н), 4,08 (с, 3Н), 4,07 (с, 3Н), 2,83 (с, 3Н), 2,00-1,94 (м, 3Н), 1,27 (м, 1H), 1,06 (м, 2Н).Tetrabutylammonium fluoride hydrate (3 mL, 3 mmol, 1M in THF) was added to a solution of trans-2-[2-[6(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3-methylpyridazin-4-yl]cyclopropyl]ethylmethanesulfonate ( 0.280 g, 0.71 mmol) in THF (3 ml). Heated at 70°C for 2 hours Cooled to room temperature. Dilute with EtOAc, wash with saturated aqueous NaCl, dry over anhydrous Na ₂ SO ₄ and remove the solvent under reduced pressure. Purify by chromatography on silica gel, eluent: 020% MeOH/EtOAc, to give the title compound as a pale yellow oil (0.170 g, 71%) after removal of the solvent from the chromatographic fractions. ER/MS (m/z): 319 (M+1). 1H NMR (399.80 MHz, CDCl ₃ ): 9.01 (m, 1H), 7.39 (s, 1H), 4.67-4.52 (dt, J HF 48 Hz, J=6.7 Hz, 2H), 4.08 (s, 3H), 4.07 (s, 3H), 2.83 (s, 3H), 2.00-1.94 (m, 3H), 1.27 (m , 1H), 1.06 (m, 2H).

- 29 041789- 29 041789

Хиральное разделение: колонка Lux Cellulose-4, 250x21 мм, скорость потока 70 г/мин., элюент: 40%Chiral separation: Lux Cellulose-4 column, 250x21 mm, flow rate 70 g/min, eluent: 40%

MeOH/СО₂.MeOH/CO ₂ .

Энантиомер 1 >99% э.и., Rt 2,59 мин. (Lux Cellulose-4, 4,6x150 мм, 40% MeOH/СО₂, 5 мл/мин, 225 нм).Enantiomer 1 >99% ee, Rt 2.59 min. (Lux Cellulose-4, 4.6x150 mm, 40% MeOH/CO ₂ , 5 ml/min, 225 nm).

Энантиомер 2 >99% э.и., R_t 3,34 мин (Lux Cellulose-4, 4,6 x150 мм, 40% MeOH/СО₂, 5 мл/мин, 225 нм).Enantiomer 2 >99% ee, R _t 3.34 min (Lux Cellulose-4, 4.6 x 150 mm, 40% MeOH/CO ₂ , 5 mL/min, 225 nm).

Пример 1.Example 1

5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-дион.5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione.

Растворяли изомер 1 5-[5-[(-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-2,4-диметоксипиримидина (197 мг, 0,66 ммоль) в 1 М водном растворе HCl (4 мл) и нагревали полученную смесь до 70°С в течение ночи. Охлаждали реакционную смесь до комнатной температуры, замораживали на бане из ацетона/сухого льда при -78°С и удаляли растворитель лиофилизацией с получением указанного в заголовке соединения (0,176 г, 97%) в виде бледно-желтого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 273 (М+Н). ¹H ЯМР (d₆-ДМСО) δ: 1,00 (т, J=7,3 Гц, 3Н), 1,11-1,16 (м, 1H), 1,27-1,33 (м, 2Н), 1,47-1,52 (м, 2Н), 1,92-1,96 (м, 1H), 2,80 (с, 3Н), 8,00 (с, 1H), 8,41 (д, J=5,5 Гц, 1H), 11,73 (с, 1H), 11,99-11,91 (м, 1H).Dissolve isomer 1 of 5-[5-[(-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4-dimethoxypyrimidine (197 mg, 0.66 mmol) in 1 M aqueous HCl (4 ml) and heated the resulting mixture to 70° C. overnight Cooled the reaction mixture to room temperature, froze in an acetone/dry ice bath at -78° C. and removed the solvent by lyophilization to give the title compound (0.176 g, 97%) as pale yellow solid ER/MS (m/z): 273 (M+H) ¹ H NMR (d ₆ -DMSO) δ: 1.00 (t, J=7.3 Hz, 3H), 1 .11-1.16 (m, 1H), 1.27-1.33 (m, 2H), 1.47-1.52 (m, 2H), 1.92-1.96 (m, 1H) , 2.80 (s, 3H), 8.00 (s, 1H), 8.41 (d, J=5.5 Hz, 1H), 11.73 (s, 1H), 11.99-11, 91 (m, 1H).

Альтернативный способ получения примеров 1-5.Alternative way to obtain examples 1-5.

Перемешивали суспензию 5-[5-[(1 S,2S)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил] -2,4диметоксипиримидина (16,2 г, 51,5 ммоль) и 1 М водного раствора HCl (135 мл, 135 ммоль) при 45°С в течение 16 ч. Охлаждали до комнатной температуры, добавляли 2 М водный раствор K3PO4 до pH ~6 (приблизительно 150 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Отфильтровывали и собирали полученное твердое вещество, промывали водой и сушили в вакуумной печи при 45°С в течение 16 ч с получением указанного в заголовке соединения (13,8 г, 93%) в виде белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 273 (М+1).A suspension of 5-[5-[(1 S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4-dimethoxypyrimidine (16.2 g, 51.5 mmol) and 1 M aqueous HCl ( 135 ml, 135 mmol) at 45°C for 16 h. Cooled to room temperature, added 2 M aqueous K3PO4 solution to pH ~6 (approximately 150 ml) and stirred at room temperature for 16 h. Filtered and collected the resulting solid material, washed with water and dried in a vacuum oven at 45° C. for 16 hours to give the title compound (13.8 g, 93%) as a white solid. ER/MS (m/z): 273 (M+1).

Кристаллизация 5-[5-[(1S,2S)-2-этилциклопропил] -6-метилпиридазин-3 -ил] -1 Н-пиримидин-2,4-диона.Crystallization of 5-[5-[(1S,2S)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1 H-pyrimidin-2,4-dione.

5-[5-[(1S,2S)-2-Этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-дион растворяли в метаноле, перемешивали при 50°С в течение 1 ч и оставляли остывать до комнатной температуры, при этом происходила его кристаллизация из раствора. Твердое вещество выделяли вакуумной фильтрацией и недолго сушили под вакуумом при 70°С.5-[5-[(1S,2S)-2-Ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione was dissolved in methanol, stirred at 50°C for 1 h and left cooled to room temperature, while it crystallized from the solution. The solid was isolated by vacuum filtration and briefly dried under vacuum at 70°C.

Пример 2.Example 2

5-[5-[(1S,2R)-2-Изоnроnuлцuклоnроnuл]-6-метилnирuдазuн-3-ил]-1Н-nирuмuдuн-2,4-дuон.5-[5-[(1S,2R)-2-Isopronulcyclonronul]-6-methylpiridazin-3-yl]-1H-nirimudin-2,4-dione.

Изомер 1 транс-5-[5-[2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-2,4-диметоксипиримидина (628 мг, 2,00 ммоль) растворяли в MeOH (3 мл). Добавляли 1 М водный раствор HCl (5 мл) и нагревали до 70°С в течение 3 ч. Охлаждали до комнатной температуры, загружали реакционную смесь на СКО колонку, промытую MeOH (20 г, Silicycle SILIABOND-п-толуолсульфоновая кислота), промывали СКО колонку MeOH (140 мл) и элюировали требуемый продукт, используя 2 М NH₃/MeOH (140 мл). Концентрировали фракции NH₃/MeOH с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества кремового цвета (546 мг, 95%). ЭР/МС (m/z): 287 (М+Н). 1Н ЯМР (d₆-ДМСО) δ: 0,99 (м, 9Н), 1,24 (м, 1H), 1,81 (м, 1H), 2,72 (с, 3Н), 7,67 (с, 1H), 8,23 (с, 1H), 11,43 (шс, 2Н).Isomer 1 trans-5-[5-[2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4-dimethoxypyrimidine (628 mg, 2.00 mmol) was dissolved in MeOH (3 ml). 1 M HCl aqueous solution (5 ml) was added and heated to 70°C for 3 h. Cooled to room temperature, loaded reaction mixture onto a RTO column washed with MeOH (20 g, Silicycle SILIABOND-p-toluenesulfonic acid), washed with RTO column MeOH (140 ml) and the desired product was eluted using 2 M NH ₃ /MeOH (140 ml). Concentrate the NH ₃ /MeOH fractions to give the title compound as an off-white solid (546 mg, 95%). ER/MS (m/z): 287 (M+H). 1H NMR (d ₆ -DMSO) δ: 0.99 (m, 9H), 1.24 (m, 1H), 1.81 (m, 1H), 2.72 (s, 3H), 7.67 ( s, 1H), 8.23 (s, 1H), 11.43 (br, 2H).

Перемешивали суспензию 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-2,4диметоксипиримидина (21,5 г, 65,6 ммоль) и 1 М водного раствора HCl (165 мл, 135 ммоль) при 45°С в течение 16 ч. Охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали МТБЭ. Отбрасывали органическую фазу, а к водной фазе добавляли 2 М водный раствор K3PO4 до pH ~6 (приблизительно 150 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Отфильтровывали и собирали полученное твердое вещество, промывали водой и сушили в вакуумной печи при 45°С в течение 16 ч с получением указанного в заголовке соединения (14,3 г, 76%) в виде белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 287 (М+1).A suspension of 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-2,4dimethoxypyrimidine (21.5 g, 65.6 mmol) and 1 M aqueous HCl solution (165 ml, 135 mmol) at 45°C for 16 hours. Cooled to room temperature and extracted with MTBE. The organic phase was discarded, and a 2 M aqueous solution of K3PO4 was added to the aqueous phase to pH ~6 (approximately 150 ml). The resulting mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Filtered and collected the resulting solid, washed with water and dried in a vacuum oven at 45° C. for 16 hours to give the title compound (14.3 g, 76%) as white solid. ER/MS (m/z): 287 (M+1).

Пример 3.Example 3

5-[5-[2-(Дифторметил)циклопропил] -6-метилпиридазин-3-ил] -1 Н-пиримидин-2,4-дион.5-[5-[2-(Difluoromethyl)cyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1 H-pyrimidin-2,4-dione.

- 30 041789- 30 041789

5-[5-[2-(Дифторметил)циклопропил] -6-метилпиридазин-3-ил] -1 Н-пиримидин-2 ,4-дион может быть получен по существу так, как описано в примере 1.5-[5-[2-(Difluoromethyl)cyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1 H-pyrimidin-2,4-dione can be prepared essentially as described in Example 1.

Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в примере 1.The following examples can be prepared essentially as described in example 1.

№ Пример а No. Example a Химическое название chemical name Структура Structure ЭР/МС (m/z) (Μ+Η) ER/MS (m/z) (M+H) 4 4 5-[6-метил-5-[ге1-(18,28)-2изобутилциклопропил] пири дазин-3 -ил] - 1Н-пиримидин2,4-дион 5-[6-methyl-5-[re1-(18.28)-2isobutylcyclopropyl] pyridazin-3-yl] - 1H-pyrimidine 2,4-dione к.....А Ν—Ν=Ν Н to ..... A Ν—Ν=Ν H 301 301 5 5 5-[6-метил-5-[ге1-(18,28)-2(1,1- дифторэтил)цикло пропил] и иридазин-3 -ил] - 1Нпиримидин-2,4-дион 5-[6-methyl-5-[re1-(18.28)-2(1.1- difluoroethyl) cyclopropyl] and iridazin-3 -yl] - 1Hpyrimidin-2,4-dione Н О N—N=N Η BUT N—N=N Η 309 309 6 6 5-[5-[(lS,2S)-2- (Дифторметил)циклопропил ] пиридазин-3 -ил] - 111пир имидин-2,4-дион 5-[5-[(lS,2S)-2- (Difluoromethyl) cyclopropyl] pyridazin-3 -yl] - 111 pyr imidin-2,4-dione F Η ° ...../ ^Ν \ /=\ ⁰⁼^ А у Ν—Ν-Ν ΗF Η ° ...../ ^Ν \ /=\ ⁰⁼ ^ A y Ν—Ν-Ν Η 281 281

Пример 7.Example 7

5-(6-Хлор-5-циклопропилпиридазин-3-ил)-1Н-пиримидин-2,4-дион.5-(6-Chloro-5-cyclopropylpyridazin-3-yl)-1H-pyrimidin-2,4-dione.

М HCl (14 мл, 14 ммоль) добавляли к раствору 3-хлор-4-циклопропил-6-(2,4-диметоксипиримидин5-ил)пиридазина (1,0 г, 3,4 ммоль) в MeOH (17 мл) и перемешивали при 50°С в течение ночи. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (0,9 г, 100%) в виде белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): (³⁵Cl/³⁷Cl) 265/267.M HCl (14 ml, 14 mmol) was added to a solution of 3-chloro-4-cyclopropyl-6-(2,4-dimethoxypyrimidin5-yl)pyridazine (1.0 g, 3.4 mmol) in MeOH (17 ml) and stirred at 50° C. overnight. The solvent was removed under reduced pressure to give the title compound (0.9 g, 100%) as a white solid. ER/MS (m/z): ( ³⁵ Cl/ ³⁷ Cl) 265/267.

Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в примере 7.The following examples can be prepared essentially as described in example 7.

- 31 041789- 31 041789

№ Примера No. example Химическое название chemical name Структура Structure ЭР/МС (m/z) (³⁵C1/³⁷C1)ER/MS (m/z) ( ³⁵ C1/ ³⁷ C1) 8 8 5-[6-Хлор-5-[ге1-(18,2К)-2изо пропилцикло пропил] пиридаз ин-3 -ил] - 1Н-пиримидин-2,4дион 5-[6-Chloro-5-[re1-(18.2K)-2isopropylcyclopropyl]pyridase in-3-yl] - 1H-pyrimidin-2,4dione н ° .....( /гА О=( А—CI N—7 N=N Н n ° .....( /hA O=(A-CI N—7 N=N H 307/309 307/309 9 9 5-[6-Хлор-5-[ге1-(1И)-2,2дифторцикло пропил] пиридазин3 -ил] - 1Н-пиримидин-2,4-дион 5-[6-Chloro-5-[re1-(1I)-2,2difluorocyclopropyl] pyridazin3 -yl] - 1H-pyrimidin-2,4-dione F Н /9 /F О=( Л—у—CI N—N=N Η F H /9 /F O=( A—y—CI N—N=N Η 301/303 301/303 10 10 5-[6-Хлор-5-[(18,28)-2(дифторметил)циклопропил] пир идазин-3 -ил] - 1Н-пиримидин-2,4дион 5-[6-Chloro-5-[(18.28)-2(difluoromethyl)cyclopropyl]pyridazin-3-yl] - 1H-pyrimidin-2,4dione F Η 0 Ή..... УЧ У^с| N—N-N HF Η 0 Ή ^..... N—NN H 315/317 315/317 И AND 5-[6-Хлор-5-[ге1-(18,28)-2-(1,1дифторэтил)цикло пропил] пирид азин-3 -ил] - 1Н-пиримидин-2,4дион 5-[6-Chloro-5-[re1-(18.28)-2-(1,1difluoroethyl)cyclopropyl]azin-3-yl pyride]-1H-pyrimidin-2,4dione HO J>V o=( #—\ 7—^Cl N—N=N HHO J>V o=( #—\ 7— ^Cl N—N=NH 329/331 329/331 12 13 14 12 13 14 5-(6-Хлор-5циклобутилпиридазин-3 -ил) - 1Нпиримидин-2,4-дион; гидрохлорид 5-[6-Хлор-5-(3,3диметилциклобутил)пиридазин3 -ил] - 1Н-пиримидин-2,4-дион 5-[6-Хлор-5-(3,3дифторциклобутил)пир идазин-3 ил] - 1Н-пиримидин-2,4-дион 5-(6-Chloro-5cyclobutylpyridazin-3-yl)-1Hpyrimidin-2,4-dione; hydrochloride 5-[6-Chloro-5-(3,3dimethylcyclobutyl)pyridazin3-yl] - 1H-pyrimidin-2,4-dione 5-[6-Chloro-5-(3,3difluorocyclobutyl)pyridazin-3yl] - 1H-pyrimidine-2,4-dione H ,9 г 0=( \{ y-CI N-^ N=N HCI H H 0 P °=( \y—Cl N=N H F Ϊ-F H o P ⁰⁼( —\ ^Cl N—7 N=N HH ,9 g 0=( \{ y-CI N-^ N=N HCI H H 0 P °=( \y-Cl N=N H F Ϊ-F H o P ⁰⁼ (-\ ^Cl N-7 N=N H 279/281 307/309 315/317 279/281 307/309 315/317 15 15 5-(6-Хлор-5циклопентилпиридазин-3 -ил)1Н-пиримидин-2,4-дион 5-(6-Chloro-5cyclopentylpyridazin-3-yl)1H-pyrimidin-2,4-dione h 0 °=( Л—(f y—Cl N=N H h 0 °=( L—(f y—Cl N=N H 293/295 293/295

Пример 16.Example 16

4-Циклопропил-6-(2,4-диоксо-Ш-пиримидин-5-ил)пиридазин-3-карбонитрил.4-Cyclopropyl-6-(2,4-dioxo-III-pyrimidin-5-yl)pyridazine-3-carbonitrile.

- 32 041789- 32 041789

Раствор 5-(6-хлор-5-циклопропилпиридазин-3-ил)-Ш-пиримидин-2,4-диона (А, 57 мг, 0,22 ммоль, 100 мас.%) в ДМФА (1 мл, 12,9 ммоль) дегазировали с помощью N2. Добавляли Zn(CN)₂ (20 мг, 0,22 ммоль), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (5 мг, 0,0054 ммоль) и 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен (6 мг, 0,011 ммоль) и дополнительно дегазировали с помощью N2. Плотно закрывали крышкой и нагревали при 120°С в течение ночи. Охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через диатомовую землю. Очищали обращенно-фазовой хроматографией (С18 Gold 15,5 г, градиент 5-20% ACN в 10 мМ растворе бикарбоната аммония; 20 об. кол.) с выделением указанного в заголовке соединения (0,032 г, 58%) в виде бледно-желтого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 256 (М+1).Solution of 5-(6-chloro-5-cyclopropylpyridazin-3-yl)-III-pyrimidin-2,4-dione (A, 57 mg, 0.22 mmol, 100 wt.%) in DMF (1 ml, 12, 9 mmol) was degassed with N2. Zn(CN) ₂ (20 mg, 0.22 mmol), tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0) (5 mg, 0.0054 mmol) and 1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene (6 mg, 0.011 mmol) were added ) and further degassed with N2. The lid was tightly closed and heated at 120° C. overnight. Cooled to room temperature and filtered through diatomaceous earth. Purified by reverse phase chromatography (C18 Gold 15.5 g, gradient 5-20% ACN in 10 mM ammonium bicarbonate solution; 20 vol. col.) to isolate the title compound (0.032 g, 58%) as a pale yellow solid. ER/MS (m/z): 256 (M+1).

Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в примере 16.The following examples can be prepared essentially as described in example 16.

№ Пример а No. Example a Химическое название chemical name Структура Structure ЭР/МС (m/z) (Μ+Η) ER/MS (m/z) (M+H) 17 17 6-(2,4-диоксо-1Н-пиримидин-5ил)-4-[(18,2К)-2изопропилцикло пропил] пиридаз ин-3 -карбонитрил 6-(2,4-dioxo-1H-pyrimidin-5yl)-4-[(18.2K)-2isopropylcyclopropyl] pyridase in-3-carbonitrile н о .....( /гЛ О=( —ΞΝ Ν— N=N Н But .....( /gL O=( -ΞΝ Ν— N=N H 298 298 18 18 6-(2,4-диоксо-1Н-пиримидин-5ил)-4-[ге1-(18,28)-2(дифторметил)цикло пропил] пир идазин-3 -карбонитрил 6-(2,4-dioxo-1H-pyrimidin-5yl)-4-[re1-(18.28)-2(difluoromethyl)cyclopropyl]pyridazine-3-carbonitrile F н о У..... о=( Ъ—(/ ΞΝ Ν—Ν=Ν Η F n o U..... o=( b—(/ ΞΝ Ν—Ν=Ν Η 306 306 19 19 4-Циклобутил-6-(2,4-диоксо1Н-пиримидин-5-ил)пиридазин3 -карбонитрил 4-Cyclobutyl-6-(2,4-dioxo1H-pyrimidin-5-yl)pyridazine3-carbonitrile О Ζ^>ι и II ζ About Z^>ι And II z 270 270 20 20 4-Цикло пентил-6-(2,4-диоксо1Н-пиримидин-5-ил)пиридазин3 -карбонитрил 4-Cyclopentyl-6-(2,4-dioxo1H-pyrimidin-5-yl)pyridazine3-carbonitrile ο ГП II ζ ο GP II z 284 284 21 21 4-[(lS)-2,2- дифторциклопропил]-6-(2,4диоксо- 1Н-пиримидин-5 ил)пиридазин-3 -карбонитрил 4-[(lS)-2,2- difluorocyclopropyl]-6-(2,4dioxo-1H-pyrimidin-5 yl)pyridazine-3-carbonitrile F F—Ζ Η ° Λ ^Ν \ /=\ °=< УЧ Ν—Ν-Ν ΗFF—Ζ Η ° Λ ^Ν \ /=\ °=< UCH Ν—Ν-Ν Η 292 292 22 22 6-(2,4-диоксо-1Н-пиримидин-5ил)-4-[(18,28)-2этилцикло пропил] пиридазин-3 карбонитрил 6-(2,4-dioxo-1H-pyrimidin-5yl)-4-[(18.28)-2ethylcyclopropyl]pyridazine-3carbonitrile \ ζ ? II ο \z ? II ο 284 284

Пример 23.Example 23.

5-(5-Циклобутил-6-метоксипиридазин-3-ил)-1Н-пиримидин-2,4-дион.5-(5-Cyclobutyl-6-methoxypyridazin-3-yl)-1H-pyrimidin-2,4-dione.

- 33 041789- 33 041789

М HCl (5,2 мл, 5,2 ммоль) добавляли к 4-циклобутил-6-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-3метоксипиридазину (0,39 г, 1,3 ммоль) и перемешивали при 50°С в течение 6 ч, затем при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Очищали на СКО картридже (10 г, элюенты 60 мл ДХМ, 60 мл 50% MeOH в ДХМ и 120 мл 50% 7 М NH₃ в MeOH в ДХМ) с получением указанного в заголовке соединения (0,337 г, 96%) в виде белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 275 (М+1).M HCl (5.2 ml, 5.2 mmol) was added to 4-cyclobutyl-6-(2,4-dimethoxypyrimidin-5-yl)-3methoxypyridazine (0.39 g, 1.3 mmol) and stirred at 50° C for 6 h, then at room temperature overnight. The solvent was removed under reduced pressure. Purified on a DCM cartridge (10 g, eluting with 60 ml DCM, 60 ml 50% MeOH in DCM, and 120 ml 50% 7 M NH ₃ in MeOH in DCM) to give the title compound (0.337 g, 96%) as white solid. ER/MS (m/z): 275 (M+1).

Следующие примеры могут быть получены по существу так, как описано в примере 23.The following examples can be prepared essentially as described in example 23.

№ Примера No. example Химическое название chemical name Структура Structure ЭР/МС (m/z) (M+H) ER/MS (m/z) (M+H) 24 24 5 -(5 -Цикло пропил-6метоксипиридазин-3 -ил)- 1Нпиримидин-2,4-дион 5 - (5 - Cyclo propyl-6 methoxypyridazin-3 -yl) - 1H pyrimidin-2,4-dione Н О Р* ,^N4 /=Ч / УЧ /У° Ν—N-N НH O R * , ^N 4 / \u003d H / UCH / U ° Ν - NN N 261 261 25 25 5 - [5 -(3,3 -диметилциклобутил)-6метоксипиридазин-3 -ил] - 1Нпиримидин-2,4-дион 5 - [5 - (3,3 - dimethylcyclobutyl) -6 methoxypyridazin-3 -yl] - 1H pyrimidin-2,4-dione н У Р /^N4 ' /УЧ⁷ N—N=N Ηn U R / ^N 4 '/UCH ⁷ N—N=N Η 303 303 26 26 5-[5-(3,3-дифторциклобутил)-6метоксипиридазин-3 -ил] - 1Нпиримидин-2,4-дион 5-[5-(3,3-difluorocyclobutyl)-6methoxypyridazin-3-yl] - 1Hpyrimidin-2,4-dione F H /,° P Ул⁷ У⁰ N—N=N HF H /,° P Ul ⁷ U ⁰ N—N=N H 311 311 27 27 5 - [5 -(3,3 -дифторцикло пентил) -6метоксипиридазин-3 -ил] - 1Нпиримидин-2,4-дион (изомер 1) 5 - [5 - (3,3 - difluorocyclopentyl) -6 methoxypyridazin-3 -yl] - 1H pyrimidin-2,4-dione (isomer 1) F F H /,° P /УЧ⁷ y° N—у N=N HFF H /,° P /UCH ⁷ y° N—y N=NH 325 325 28 28 5 - [5 -(3,3 -дифторцикло пентил) -6метоксипиридазин-3 -ил] - 1Нпиримидин-2,4-дион (изомер 2) 5 - [5 - (3,3 -difluorocyclopentyl) -6methoxypyridazin-3 -yl] - 1Hpyrimidin-2,4-dione (isomer 2) F F H У P ^оР^учР-^о/ N—N=N HFF H Y P ^o P^uchP- ^o/ N—N=NH 325 325 29 29 5-(5 -Циклогексил-6метоксипиридазин-3 -ил)- 1Нпиримидин-2,4-дион 5-(5-Cyclohexyl-6methoxypyridazin-3-yl)- 1Hpyrimidin-2,4-dione H У N—N=N H H N—N=N H 303 303

Пример 30.Example 30.

5-[5-[(1S,2R)-2-(2-Фторэтил)циклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-дион.5-[5-[(1S,2R)-2-(2-Fluoroethyl)cyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione.

- 34 041789- 34 041789

HCl (1M в Н2О, 2 мл, 2 ммоль) добавляли к энантиомеру 1 транс-2,4-диметокси-5-[6-метил-5-[2-(2фторэтил)циклопропил]пиридазин-3-ил]пиримидина (0,043 г, 0,14 ммоль) и нагревали при 50°С в течение ночи. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Очищали на СКО картридже (12 г, элюенты 70 мл MeOH, 70 мл 2 М NH₃ в MeOH) с получением указанного в заголовке соединения (0,037 г, 89%) в виде белого твердого вещества. ЭР/МС (m/z): 291 (М+1).HCl (1M in H2O, 2 ml, 2 mmol) was added to enantiomer 1 of trans-2,4-dimethoxy-5-[6-methyl-5-[2-(2fluoroethyl)cyclopropyl]pyridazin-3-yl]pyrimidine (0.043 g, 0.14 mmol) and heated at 50° C. overnight. The solvent was removed under reduced pressure. Purified on a COC cartridge (12 g, 70 ml MeOH, 70 ml 2M NH ₃ in MeOH) to give the title compound (0.037 g, 89%) as a white solid. ER/MS (m/z): 291 (M+1).

Биологические анализыBiological analyzes

В следующих анализах показано, что приведенные в качестве примера соединения по данному изобретению являются ингибиторами активности CD73 и пригодны для лечения рака.The following assays show that the exemplary compounds of this invention are inhibitors of CD73 activity and are useful in the treatment of cancer.

Экспрессия и очистка белка CD73.Expression and purification of the CD73 protein.

Человеческий CD73 с С-концевой меткой 6-HIS (аминокислоты 1-547) экспрессировали в клетках млекопитающих HEK293F посредством временной трансфекции клеток геном CD73 и очищали с использованием М²⁺-аффинной и эксклюзионной хроматографии на Superdex 200. Мышиный CD73 с Сконцевой меткой 6-HIS (аминокислоты 1-549) экспрессировали и очищали так, как описано выше. Крысиный CD73 с С-концевой меткой 6-HIS (аминокислоты 1-549) экспрессировали и очищали так, как описано ранее.Human CD73 with a 6-HIS C-terminal tag (amino acids 1-547) was expressed in mammalian HEK293F cells by transient cell transfection with the CD73 gene and purified using M ²⁺ affinity and size exclusion chromatography on Superdex 200. Mouse CD73 with C-terminal 6- HIS (amino acids 1-549) were expressed and purified as described above. Rat CD73 with C-terminal tag 6-HIS (amino acids 1-549) was expressed and purified as previously described.

Масс-спектроскопия для определения аденозина и очистка аденозина.Mass spectroscopy for determination of adenosine and purification of adenosine.

Использовали автоматизированную систему экстракции Agilent 300 RapidFire (Agilent, Санта-Клара, штат Калифорния) с тремя ВЭЖХ насосами для четырехкомпонентных смесей, подключенную к трехквадрупольному масс-спектрометру Sciex 6500 (АВ Sciex, Фремингем, штат Массачусетс) с поверхностным источником электрораспылительной ионизации (ИЭР). В систему масс-спектрометра RapidFire устанавливали многоразовый картридж (G9203-80109) для твердофазной экстракции (SPE) RapidFire HILIC (H1).An Agilent 300 RapidFire automated extraction system (Agilent, Santa Clara, CA) with three HPLC pumps for quaternary mixtures was used, connected to a Sciex 6500 triple quadrupole mass spectrometer (AB Sciex, Framingham, MA) with a surface electrospray ionization source (ESI) . A reusable cartridge (G9203-80109) for solid phase extraction (SPE) RapidFire HILIC (H1) was installed in the RapidFire mass spectrometer system.

Растворитель А, использованный для загрузки и промывания образцов, представлял собой 50 мМ формиат аммония с pH 4,0, содержащий 5% (об./об.) ACN. Растворитель В, использованный для элюирования образцов, представлял собой 0,3% раствор муравьиной кислоты + 2% гидроксида аммония в смеси 70% ACN/30% MeOH. Образцы последовательно анализировали посредством отбора 10 мкл на заборную петлю под вакуумом непосредственно из многолуночных планшетов. Загружали 10 мкл образца на картридж HILIC и промывали с помощью насоса 1 для четырехкомпонентных смесей, используя растворитель А при скорости потока 1,25 мл/мин, в течение 3000 мс. Задержанный аналит элюировали в массспектрометр с помощью насоса 3 для четырехкомпонентных смесей, используя растворитель В при скорости потока 1,25 мл/мин, в течение 3000 мс. Систему повторно уравновешивали с помощью насоса 1 для четырехкомпонентных смесей, используя растворитель А при скорости потока 1,25 мл/мин, в течение 3000 мс.Solvent A used to load and wash the samples was 50 mM ammonium formate pH 4.0 containing 5% (v/v) ACN. Solvent B used to elute the samples was 0.3% formic acid + 2% ammonium hydroxide in 70% ACN/30% MeOH. Samples were analyzed sequentially by withdrawing 10 μl per suction loop under vacuum directly from the multiwell plates. Loaded 10 µl of sample onto a HILIC cartridge and washed with quaternary pump 1 using solvent A at a flow rate of 1.25 ml/min for 3000 ms. The retained analyte was eluted into the mass spectrometer using a quaternary pump 3 using solvent B at a flow rate of 1.25 ml/min for 3000 ms. The system was re-equilibrated with quaternary pump 1 using solvent A at a flow rate of 1.25 ml/min for 3000 ms.

Трехквадрупольный масс-спектрометр оснащали источником электрораспылительной ионизации (ИЭР) и изучали аналиты, используя контроль селективных реакций (SRM) в положительном режиме (М+Н)⁺. Регистрировали аденозин при m/z 268,05/136,0 и аденозинмонофосфат при m/z 348,1/136,0. Рассчитывали значения отношения площадей для аденозина и аденозинмонофосфата, используя ¹³С₅аденозин и 15N5-AMO в качестве внутренних стандартов, соответственно.A triple quadrupole mass spectrometer was equipped with an electrospray ionization source (ESI) and analytes were studied using selective reaction control (SRM) in positive mode (M+H) ⁺ . Adenosine was recorded at m/z 268.05/136.0 and adenosine monophosphate at m/z 348.1/136.0. Area ratio values for adenosine and adenosine monophosphate were calculated using ¹³ C ₅ adenosine and 15N5-AMO as internal standards, respectively.

Биохимический анализ человеческого CD73.Biochemical analysis of human CD73.

Целью данного анализа является идентификация и характеристика ингибиторов активности фермента CD73. Добавляли реакционные смеси (20 мкл), содержащие 2 мкМ аденозинмонофосфат (Sigma, №01930), 10 мМ Tris pH 7,5, 100 MMNaCl, 0,01% BSA, 0,2 мМ октилглюкозид и 50 пМ белок CD73, в 384-луночный планшет (Nunc, №264573). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре останавливали реакцию посредством добавления 20 мкл стоп-раствора, содержащего 2% муравьиной кислоты и 10 мкМ ¹³С5-аденозина (рибозы с меткой ¹³С5) (Cambridge Isotope Laboratories, №CLM-3678-0), затем добавляли 40 мкл dH₂O. Уровни аденозин- и аденозинрибозы-¹³С₅ (внутреннего стандарта) определяли с помощью масс-спектрометрии, как описано выше. Для количественной оценки каждой реакции использовали отношение сигналов (интегрирование пика аденозина/интегрирование пика внутреннего стандарта аденозина). Процентное ингибирование рассчитывали по уравнению {% ингибирование=100х[1-(ХMIN)/(MAX- MIN)]}, где X равен отношению сигналов в лунке, МАХ равен среднему отношению сигналов контрольного образца с ДМСО, и MIN равен отношению сигналов активности фермента в присутствии >10xIC₅₀ известного конкурентного ингибитора. Для проведения скрининга каждое соединение испытывали в концентрации 50 мкм в 1% ДМСО. Для каждого соединения определяли IC₅₀, испытывая каждое соединение в 10 концентрациях от 0,0025 до 50 мкМ (используя схему разбавления 1:3).The purpose of this assay is to identify and characterize inhibitors of CD73 enzyme activity. Reaction mixtures (20 µl) containing 2 µM adenosine monophosphate (Sigma, No. 01930), 10 mM Tris pH 7.5, 100 MMNaCl, 0.01% BSA, 0.2 mM octylglucoside and 50 pM CD73 protein were added, in 384- well plate (Nunc, #264573). After 30 min incubation at room temperature, the reaction was stopped by adding 20 µl of a stop solution containing 2% formic acid and 10 µM ¹³ C5-adenosine (ribose labeled ¹³ C5) (Cambridge Isotope Laboratories, no. CLM-3678-0), then 40 μl dH ₂ O was added. Adenosine and adenosine ribose ¹³ C ₅ (internal standard) levels were determined by mass spectrometry as described above. Signal ratio (adenosine peak integration/adenosine internal standard peak integration) was used to quantify each reaction. Percent inhibition was calculated using the equation {% inhibition=100x[1-(XMIN)/(MAX-MIN)]}, where X is the ratio of signals in the well, MAX is the average ratio of signals from the control sample with DMSO, and MIN is the ratio of signals of enzyme activity in the presence of >10xIC ₅₀ known competitive inhibitor. For screening, each compound was tested at a concentration of 50 μm in 1% DMSO. For each compound, the IC ₅₀ was determined by testing each compound at 10 concentrations from 0.0025 to 50 μM (using a 1:3 dilution scheme).

IC₅₀ для 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклоnроnил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дионаIC ₅₀ for 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclonronyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione

- 35 041789 составила 0,028 мкМ.- 35 041789 was 0.028 μM.

IC₅₀ для 5-[5-[(^^)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона составила 0,043 мкМ.The IC ₅₀ for 5-[5-[(^^)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione was 0.043 μM.

Все соединения из примеров, описанных в данном документе, демонстрировали значения IC₅₀ менее 0,062 мкМ.All of the compounds from the examples described herein exhibited IC ₅₀ values of less than 0.062 μM.

Анализ механизма человеческого CD73.Analysis of the mechanism of human CD73.

Целью данного анализа является определения механизма действия рассматриваемого соединения. Анализ проводили так, как описано выше для биохимического анализа человеческого CD73. Каждое соединение испытывали в 8 разных концентрациях от 0,023 до 50 мкМ, используя схему разбавления 1:3, но при 8 различных концентрациях АМФ от 0,023 до 50 мкМ, используя схему 3-кратного разбавления. Отношения площади для различных концентраций ингибитора и субстрата наносили на график с помощью программы GraphPad Prism 7.00, и проводили сглаживание с использованием специальной смешанной модели ингибирования для определения значений V_max, K_m, Ki и альфа для ингибирования ^{(Vmax app ^Vmax^{/(1 + [I]/(альфа}^^Ki⁾⁾;The purpose of this analysis is to determine the mechanism of action of the compound in question. The analysis was carried out as described above for the biochemical analysis of human CD73. Each compound was tested at 8 different concentrations from 0.023 to 50 μM using a 1:3 dilution scheme, but at 8 different concentrations of AMP from 0.023 to 50 μM using a 3-fold dilution scheme. Area ratios for various concentrations of inhibitor and substrate were plotted using GraphPad Prism 7.00 software and smoothed using a custom mixed inhibition model to determine V _max , K _m , Ki and alpha values for inhibition ^{(V max app ^V max ^{/( 1 + [I]/(alpha} ^ ^K i ⁾⁾ ;

Km app=KmX(1+[I]/Ki)/(1+[I]/(альфаxKi));Km app=KmX(1+[I]/Ki)/(1+[I]/(alphaxKi));

Y=V max app где альфа, Vmax,Y=V max app where alpha, Vmax,

K_m и Ki являются общими для каждого соединения}.K _m and Ki are common for each compound}.

Каждый из 5-[5-[(18,28)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-Ш-пиримидин-2,4-диона и 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-диона является неконкурентным ингибитором, который связывается с комплексом фермент-фосфат, но не с самим апо ферментом.Each of 5-[5-[(18,28)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-III-pyrimidin-2,4-dione and 5-[5-[(1S,2R)- 2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione is a non-competitive inhibitor that binds to the enzyme-phosphate complex but not to the apo enzyme itself.

Увеличение концентраций субстрата АМФ усиливает действие неконкурентных ингибиторов, например 5-[5-[(1 S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1 Н-пиримидин-2,4-диона, поскольку снижается его значение IC₅₀, как показано в табл. 1.An increase in AMP substrate concentrations enhances the action of noncompetitive inhibitors, for example, 5-[5-[(1 S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1 H-pyrimidin-2,4-dione, its IC ₅₀ value, as shown in Table. 1.

Таблица 1Table 1

АМФ (мкМ) AMP (µM) IC50 (мкМ) IC50 (µM) 50,0 50.0 0,008327 0.008327 16,7 16.7 0,006557 0.006557 5,6 5.6 0,008799 0.008799 1,9 1.9 0,02028 0.02028 0,61 0.61 0,06279 0.06279 0,21 0.21 0,1513 0.1513 0,069 0.069 0,2903 0.2903 0,023 0.023 0,4094 0.4094

Анализ механизма мышиного CD73.Mechanism analysis of murine CD73.

Целью данного анализа является оценка ингибиторов в отношении подавления ими активности мышиного фермента CD73. Анализ проводили так, как описано выше для биохимического анализа человеческого CD73, за исключением того, что использовали 3 мкМ АМФ и 50 пМ мышиный фермент CD73.The purpose of this assay is to evaluate inhibitors for their inhibition of mouse CD73 enzyme activity. The assay was performed as described above for the human CD73 biochemical assay, except that 3 μM AMP and 50 pM mouse CD73 enzyme were used.

IC₅₀ для 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-диона составила 0,175 мкМ.The IC ₅₀ for 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione was 0.175 μM.

Анализ человеческих клеток Calu6.Analysis of human Calu6 cells.

Целью данного анализа является испытание соединений против CD73 в клеточном анализе. Клетки Calu6 (1500 клеток/лунка) выращивали в 96-луночном планшете, покрытом поли-D-лизином (BD, №356640), содержащем 100 мкл среды (MEM (Gibco, №11095-072)+1% пирувата натрия (Gibco, №11360070)+1% NEAA (Gibco, №11140-050)+10% FBS (Hyclone, №SH30071). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем инкубировали в течение ночи при 37°С/5% CO2. Клетки дважды промывали аналитическим буфером (10 мМ Tris-HCl pH 7,2, 10 мМ D-глюкозы, 1 мМ KCl, 125 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂)(90 мкл/лунка). Затем в каждую лунку добавляли 90 мкл аналитического буфера, затем добавляли 10 мкл на лунку АМФ и предварительной смеси соединения (50 мкМ АМФ, различные концентрации соединения в 1% ДМСО). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем удаляли 10 мкл надосадочного раствора из каждой лунки и помещали в новый планшет, затем добавляли 20 мкл стоп-раствора (2% муравьиной кислоты, 1,2 мкМ аденозинрибозы-¹³С5 (Cambridge Isotope Laboratories, №CLM-3678-0) и 90 мкл ddH2O для масс-спектроскопического анализа. Уровни аденозин- и аденозинрибозы-¹³С5 (внутреннего стандарта) определяли с помощью массспектрометрии (Agilent RapidFire), как описано выше для биохимического анализа человеческого CD73. Процентное ингибирование также рассчитывали так, как описано выше.The purpose of this assay is to test compounds against CD73 in a cellular assay. Calu6 cells (1500 cells/well) were grown in a 96-well poly-D-lysine coated plate (BD, no. 356640) containing 100 µl of medium (MEM (Gibco, no. No. 11360070) + 1% NEAA (Gibco, No. 11140-050) + 10% FBS (Hyclone, No. SH30071) Plates were incubated at room temperature for 30 minutes, then incubated overnight at 37°C/5% CO2. Cells were washed twice with assay buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.2, 10 mM D-glucose, 1 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM MgCl ₂ ) (90 μl/well). buffer, then 10 µl per well of AMP and compound pre-mix (50 µM AMP, various concentrations of compound in 1% DMSO) were added.The plates were incubated at room temperature for 60 min.Then, 10 µl of the supernatant solution was removed from each well and placed in a new plate, then 20 µl stop solution (2% formic acid, 1.2 µM adenosine ribose ^-13 C5 (Cambridge Isotope Laboratories, no. CLM-3678-0) and 90 µl d dH2O for mass spectroscopic analysis. Adenosine- and adenosine-ribose- ¹³ C5 (internal standard) levels were determined by mass spectrometry (Agilent RapidFire) as described above for human CD73 chemistry. Percent inhibition was also calculated as described above.

IC₅₀ для 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-диона составила 0,0073 мкМ (соединение из примера 2).IC ₅₀ for 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione was 0.0073 μM (compound from example 2).

- 36 041789- 36 041789

IC50 для 5-[5-[(^^)-2-этилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона составила 0,028 мкМ.The IC50 for 5-[5-[(^^)-2-ethylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione was 0.028 µM.

Ex Vivo анализ ингибирования мишени.Ex Vivo target inhibition assay.

Целью данного анализа является испытание соединений против мышиного CD73 в крови мышей в ex vivo анализе. Животным (6 на группу) перорально вводили дозу каждого соединения, составленного в 20% HPBCD (2-гидроксипропил-в-циклодекстрин), pH 2, по достижении объема опухоли приблизительно 400 мм³. После лечения собирали кровь в гепариновые пробирки и использовали для ex vivo анализа превращения ¹³С10-¹⁵N5-АМФ в меченый аденозин, инозин и гипоксантин, как описано для ex vivo анализа, с использованием цельной крови, взятой у животных, подверженных лечению посредством перорального введения дозы соединения.The purpose of this assay is to test compounds against mouse CD73 in the blood of mice in an ex vivo assay. Animals (6 per group) were dosed orally with each compound formulated in 20% HPBCD (2-hydroxypropyl-v-cyclodextrin), pH 2, upon reaching a tumor volume of approximately 400 mm ³ . After treatment, blood was collected in heparin tubes and used for ex vivo analysis of the conversion of ¹³ ^C10-15 N5-AMP to labeled adenosine, inosine and hypoxanthine, as described for ex vivo analysis, using whole blood taken from animals treated by oral administration compound dose.

5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион ингибировал превращение АМФ в аденозин, инозин и гипоксантин в цельной крови мышей, взятой у животных, которым вводили различные дозы указанного соединения, как показано в табл. 2.5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione inhibited the conversion of AMP to adenosine, inosine and hypoxanthine in whole blood taken from mice in animals that were administered various doses of the specified connection, as shown in table. 2.

Таблица 2. Ингибирование превращения АМФ в аденозинTable 2. Inhibition of the conversion of AMP to adenosine

IC₅₀ для 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона составила 0,0073 мкМ.The IC ₅₀ for 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione was 0.0073 μM.

In vivo анализ ингибирования человеческого CD73 в опухоли Calu6.In vivo human CD73 inhibition assay in Calu6 tumor.

Целью данного анализа является испытание соединений против человеческого CD73 в ксенотрансплантатных опухолях, полученных из раковых клеток Calu6 человека в анализе in vivo ингибирования мишени. Клетки Calu6 (ATCC) выращивали в среде HBSS с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Собирали субконфлюэнтные клетки с помощью трипсина и дважды промывали питательной средой без сыворотки. Инициировали рост подкожной опухоли посредством инъекции 5х10⁶ клеток в 1:1 смеси HBSS и MATRIGEL® (BD Biosciences, Франклин Лэйкс, штат Нью-Джерси) в заднюю боковую область голых мышей (The Harlon Laboratory). По достижении среднего объема опухоли приблизительно 400-500 мм³, животных случайным образом разделяли по размеру опухоли и массе тела и помещали в соответствующие указанные экспериментальные группы. После лечения собирали образцы опухоли (50-80 мг каждая) и перерабатывали в 1 мл ледяного экстракционного буфера, содержащего внутренние стандарты, как описано ниже.The purpose of this assay is to test compounds against human CD73 in xenograft tumors derived from human Calu6 cancer cells in an in vivo target inhibition assay. Calu6 cells (ATCC) were grown in HBSS medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Collected subconfluent cells using trypsin and washed twice with nutrient medium without serum. Subcutaneous tumor growth was initiated by injecting 5×10 ⁶ cells in a 1:1 mixture of HBSS and MATRIGEL® (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) into the posterior lateral region of nude mice (The Harlon Laboratory). Upon reaching an average tumor volume of approximately 400-500 mm ³ , animals were randomly divided according to tumor size and body weight and placed in the appropriate indicated experimental groups. After treatment, tumor samples (50-80 mg each) were collected and processed into 1 ml ice-cold extraction buffer containing internal standards as described below.

В ступку для предварительного охлаждения добавляли полоску фольги и жидкий N2. Каплю опухолевой ткани помещали на полоску фольги и добавляли жидкий N2. Другую полоску фольги помещали поверх опухолевой ткани и отбивали пестиком до полного измельчения опухоли. 50-100 мг опухолевой ткани помещали в пробирки (Fishers Scientific, кат. № 02-681-302) и ставили на сухой лед. В пробирки добавляли одну гранулу металла (Qiagen, кат. № 69989) и 1 мл 80% метанола, содержащего внутренние стандарты ¹³С5-аденозина, ¹³С5-АМФ, ¹⁵Ν5-ΓΤΦ, ¹⁵N4-инозин-5'-монофосфата и ¹³C-¹⁵N-гипоксантина (Cambridge Isotope Lab и Cayman Chemical), и хранили образцы при -80°С до использования для анализа ЖХ/МС.A strip of foil and liquid N2 were added to the mortar for pre-cooling. A drop of tumor tissue was placed on a foil strip and liquid N2 was added. Another strip of foil was placed over the tumor tissue and beaten with a pestle until the tumor was completely crushed. 50-100 mg of tumor tissue were placed in tubes (Fishers Scientific, cat. no. 02-681-302) and placed on dry ice. One metal granule (Qiagen, cat. no. 69989) and 1 ml of 80% methanol containing internal standards ¹³ C5-adenosine, ¹³ C5-AMP, ¹⁵ Ν5-ΓΤΦ, ¹⁵ N4-inosine-5'-monophosphate and ¹³ C- ¹⁵ N-hypoxanthine (Cambridge Isotope Lab and Cayman Chemical) and stored samples at -80° C. until used for LC/MS analysis.

Также собирали кровь в гепариновые пробирки и использовали для ex vivo анализа превращения ¹³C5-¹⁵N5-АМФ в меченый аденозин, инозин и гипоксантин, как описано для ex vivo анализа, с использованием цельной крови, взятой у животных, подверженных лечению посредством перорального введения дозы соединения.Blood was also collected in heparin tubes and used for an ex vivo ^assay for the conversion of ^13C5-15N5 -AMP to labeled adenosine, inosine, and hypoxanthine as described for the ex vivo assay, using whole blood from animals treated by oral dosing connections.

Как показано в табл. 3, 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1H-пиримидин-2,4-дион ингибировал превращение АМФ в аденозин в опухолях Calu6, обработанных различными дозами соединения.As shown in Table. 3,5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione inhibited the conversion of AMP to adenosine in Calu6 tumors treated with various doses of the compound .

- 37 041789- 37 041789

Таблица 3. Ингибирование превращения АМФ в аденозинTable 3. Inhibition of the conversion of AMP to adenosine

Группа лечения соединением (мг/кг) Compound Treatment Group (mg/kg) Ингибирование (%) Inhibition (%) р-значение p-value 0,0 0.0 0 0 1,000 1,000 1,0 1.0 39,1 39.1 0,0057* 0.0057* 2,5 2.5 68,5 68.5 <0,0001* <0.0001* 6,4 6.4 64,3 64.3 <0,0001* <0.0001* 16,0 16.0 77,5 77.5 <0,0001* <0.0001* 40,0 40.0 82,1 82.1 <0,0001* <0.0001* 100,0 100.0 89,3 89.3 <0,0001* <0.0001*

*: статистическая значимость*: statistical significance

Анализ подавления Т-клеток.T cell suppression assay.

Карбоксифлуоресцеин диацетат-сукцинимидиловый эфир (CFSE) использовали в качестве маркирующего агента. Человеческие РВМС или выделенные клетки CD4 (0,5x10⁶ - 1 х10⁸ клеток) промывали маркировочным буфером (RPMI 1640 с L-глутамином, GIBCO, кат. № 11875), содержащим 5% HI FBS (Gibco, № 10082), и суспендировали в 1 мл маркировочного буфера. Клетки смешивали с 110 мкл PBS, содержащей 50 мкМ CFSE (Biolegend, кат. № 423801), и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Меченые клетки один раз промывали PBS, содержащим 5% HI FBS (Gibco, № 10082), и один раз нормальной средой для выращивания Т-клеток (X-Vivo 15, Lonza, кат. № 04-744Q), содержащей 1х пенициллина/стрептомицина, и суспендировали в питательной среде, использованной для клеток РМВС и CD4.Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ether (CFSE) was used as the labeling agent. Human PBMCs or isolated CD4 cells (0.5 x 10 ⁶ - 1 x 10 ⁸ cells) were washed with labeling buffer (RPMI 1640 with L-glutamine, GIBCO cat. no. 11875) containing 5% HI FBS (Gibco, no. 10082) and suspended in 1 ml of labeling buffer. Cells were mixed with 110 µl PBS containing 50 µM CFSE (Biolegend cat. no. 423801) and incubated at room temperature for 5 min. Labeled cells were washed once with PBS containing 5% HI FBS (Gibco, no. 10082) and once with normal T cell growth medium (X-Vivo 15, Lonza, cat. no. 04-744Q) containing 1x penicillin/streptomycin , and suspended in the nutrient medium used for PMBC and CD4 cells.

Активация и обработка Т-клеток.Activation and processing of T cells.

Человеческие РВМС с меткой CFSE (600000 клеток/мл) или клетки CD4 (500000 клеток/мл) смешивали с активатором человеческих Т-клеток Dynabeads® CD3/CD28 (Gibco, кат. № 11131D) в соотношении 1:1 клетки/гранулы и с человеческим IL-2 (60 МЕ/мл, Roche, кат. №: 11011456001). Клетки помещали на водяную баню при 37°С на 10 мин для предварительной активации Т-клеток. РВМС (125 мкл/лунка) или клетки CD4 (100 мкл/лунка) переносили в 96-луночный планшет (Costar 3799, Coming Inc.). Для испытания соединений с помощью РВМС, получали различные концентрации экспериментальных соединений в нормальной среде для выращивания клеток (125 мкл), содержащей 400-600 мкМ АМФ. Для испытания соединений с помощью клеток CD4, получали различные концентрации экспериментальных соединений в нормальной среде для выращивания клеток (100 мкл), содержащей 200-250 мкМ АМФ. Обработанные клетки выращивали при 37°С, 5% СО₂ в течение 68-70 ч.CFSE-labeled human PBMCs (600,000 cells/mL) or CD4 cells (500,000 cells/mL) were mixed with Dynabeads® CD3/CD28 human T cell activator (Gibco, cat. no. 11131D) in a 1:1 cell/bead ratio and with human IL-2 (60 IU/ml, Roche, cat. no.: 11011456001). Cells were placed in a water bath at 37°C for 10 min for preliminary activation of T cells. PBMCs (125 μl/well) or CD4 cells (100 μl/well) were transferred to a 96-well plate (Costar 3799, Coming Inc.). To test compounds with PBMC, different concentrations of test compounds were prepared in normal cell growth medium (125 μl) containing 400-600 μM AMP. To test compounds using CD4 cells, different concentrations of experimental compounds were prepared in normal cell growth medium (100 μl) containing 200-250 μM AMP. The treated cells were grown at 37°C, 5% CO ₂ for 68-70 h.

Среду (160 мкл), содержащую обработанные РВМС, переносили на планшет, а оставшуюся среду, которую использовали для анализа цитокинов, переносили на планшеты АсгоРгер 96 (фильтровальные планшеты АсгоРгер 96, Omega ЗК NTRL, лунки по 350 мкл, Pall Life Science, кат. № 8033) для получения образцов для ЖХ-МС анализа метаболитов.The medium (160 µl) containing the treated PBMCs was transferred to the plate and the remaining medium, which was used for cytokine assay, was transferred to Accorger 96 plates (ActroProger 96 filter plates, Omega 3K NTRL, 350 µl wells, Pall Life Science, cat. No. 8033) to obtain samples for LC-MS analysis of metabolites.

Среду (100 мкл), содержащую клетки CD4, переносили и фильтровали через планшеты АсгоРгер в другой планшет посредством центрифугирования при 1500 g в течение 2 ч. Отфильтрованную среду (50 мкл/лунка) смешивали с таким же объемом 80% метанола, 1% NH₄OH и внутренних стандартов (250 нг/мл ¹³С5-АМФ и 250 нг/мл ¹³С5-аденозина) для ЖХ-МС анализа метаболитов.Medium (100 µl) containing CD4 cells was transferred and filtered through Acgorger plates into another plate by centrifugation at 1500 g for 2 h. Filtered medium (50 µl/well) was mixed with the same volume of 80% methanol, 1% NH ₄ OH and internal standards (250 ng/ml ¹³ C5-AMP and 250 ng/ml ¹³ C5-adenosine) for LC-MS analysis of metabolites.

Обработанные РВМС или клетки CD4 собирали и окрашивали для проточной цитометрии для количественного определения пролиферации Т-клеток.Treated PBMCs or CD4 cells were harvested and stained for flow cytometry to quantify T cell proliferation.

Проточная цитометрия.flow cytometry.

РВМС или клетки CD4 окрашивали красителем Zombie Aqua (Biolegend, кат. № 423102, партия № В195875) в разбавлении 1:200 в DPBS в течение 15 мин с последующим блокированием с помощью ингибитора связывания человеческого рецептора Fc (eBioscience, кат. № 14-9161-73) в разбавлении 1:5 в течение 15 мин в буфере для проточного окрашивания (DPBS-2%HIFBS-0,5%BSA) на льду. РВМС окрашивали коктейлем окрашенного АРС/Су7 анти-человеческого CD3 (Biolegend, кат. № 300426, разбавление 1:20), окрашенного АРС античеловеческого CD4 (Biolegend, кат. № 317416, разбавление 1:20) и окрашенного красителем Pacific Blue античеловеческого CD8a (Biolegend, кат. № 300927, разбавление 1:20), а клетки CD4 окрашивали окрашенным АРС античеловеческим CD4 (Biolegend, кат. № 317416, разбавление 1:20) в буфере для проточного окрашивания в течение 30 мин на льду.PBMCs or CD4 cells were stained with Zombie Aqua (Biolegend, cat. no. 423102, lot no. B195875) at a 1:200 dilution in DPBS for 15 min, followed by blocking with a human Fc receptor binding inhibitor (eBioscience, cat. no. 14-9161 -73) at a 1:5 dilution for 15 min in flow staining buffer (DPBS-2%HIFBS-0.5%BSA) on ice. PBMCs were stained with a cocktail of APC/Cy7 stained anti-human CD3 (Biolegend, cat. no. 300426, diluted 1:20), APC-stained anti-human CD4 (Biolegend, cat. no. 317416, diluted 1:20), and Pacific Blue stained anti-human CD8a ( Biolegend, Cat. No. 300927, 1:20 dilution), and CD4 cells were stained with APC-stained anti-human CD4 (Biolegend, Cat. No. 317416, 1:20 dilution) in flow staining buffer for 30 minutes on ice.

Проточные данные регистрировали с помощью BD FACS Verse. Каждый канал флуоресценции соответствующим образом компенсировали. Данные обрабатывали на FloJo версии 7.6.5 со следующей стратегией гейтирования: лимфоциты гейтировали на точечном графике зависимости FSC от SSC; жизнеспособные клетки лимфоцитов гейтировали на точечном графике зависимости SSC от Zombie Aqua; клетки CD3 жизнеспособных лимфоцитов гейтировали на точечном графике зависимости АРС-Су7 от Zombie Aqua; клетки CD4 и клетки CD8 клеток CD3 гейтировали на точечном графике зависимости АРС от Pacific Blue; клетки CD4 и CD8 дополнительно гейтировали на точечных графиках зависимости АРСFlow data was recorded using BD FACS Verse. Each fluorescence channel was appropriately compensated. Data were processed on FloJo version 7.6.5 with the following gate strategy: lymphocytes were gated on a scatter plot of FSC versus SSC; viable lymphocyte cells were gated on a scatter plot of SSC versus Zombie Aqua; viable lymphocyte CD3 cells were gated in a scatter plot of APC-Cy7 versus Zombie Aqua; CD4 cells and CD8 cells of CD3 cells were gated on a scatter plot of APC versus Pacific Blue; CD4 and CD8 cells were additionally gated on dot plots of APC dependence

-38041789 от CFSE(FITC) и Pacific Blue от CFSE(FITC). Пролиферацию клеток CD4 и CD8 анализировали с помощью инструмента для определения пролиферации. Индекс пролиферации (PI) определяли как общее количество клеток/исходное количество клеток, и % восстановления под действием соединения рассчитывали как ^(PI без АМФ без соед.^-PI образца)^/(PI без АМФ без соед.^-PIc АМФ без соед.)* ^{1 00.} -38041789 from CFSE(FITC) and Pacific Blue from CFSE(FITC). The proliferation of CD4 and CD8 cells was analyzed using a proliferation tool. Proliferation index (PI) was defined as total cells/baseline cells, and % compound recovery was calculated as ^(PI without AMP without compound ^-PI sample) ^/(PI without AMP without compound ^-PI with AMP without compound) * ^100.

Как показано в табл. 4, ингибирование CD73 под действием 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]As shown in Table. 4, CD73 inhibition by 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]

6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона обеспечивает восстановление опосредованного аденозином ингибирования Т-клеточной пролиферации, которое коррелирует с дозозависимым снижением уровней аденозина в питательной среде.6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione provides restoration of adenosine-mediated inhibition of T-cell proliferation, which correlates with a dose-dependent decrease in adenosine levels in the nutrient medium.

Таблица 4. Восстановление опосредованного аденозином ингибирования пролиферации Т-клетокTable 4. Recovery of adenosine-mediated inhibition of T cell proliferation

Соединение (мкМ) Compound (µM) Восстановление пролиферации Т-клеток (%) Recovery of T cell proliferation (%) Аденозин (мкМ) Adenosine (µM) 5,00 5.00 107 107 0,017 0.017 1,66667 1.66667 106 106 0,027 0.027 0,55556 0.55556 104 104 0,046 0.046 0,18519 0.18519 95 95 0,086 0.086 0,06173 0.06173 37 37 0,15 0.15 0,02058 0.02058 -2 -2 0,21 0.21 0,00686 0.00686 -3 -3 0,28 0.28 0,00229 0.00229 -6 -6 0,28 0.28 0,00 0.00 0 0 0,30 0.30

Анализ цитокинов.Cytokine analysis.

Культуральную среду из обработанных РВМС разбавляли 1:7,5, 1:2,5 и 1:50 1х разбавителем ELISA/ELISPOT из наборов для твердофазного иммуноферментного анализа цитокинов и анализировали на TNFa, используя набор для твердофазного иммуноферментного анализа TNF-альфа человека ReadySET-GO! (eBioscience, кат. № 88-7346-22), Κ-1β, используя набор для твердофазного иммуноферментного анализа IL-1e человека Ready-SET-GO! (2-е поколение) (eBioscience, кат. № 88-7261-22), и IFNy, используя набр для твердофазного иммуноферментного анализа IFN человека Ready-SET-GO! (eBioscience, кат. № 88-7316-22), по инструкциям производителя.Culture media from treated PBMCs were diluted 1:7.5, 1:2.5, and 1:50 with 1x ELISA/ELISPOT diluent from cytokine ELISA kits and analyzed for TNFa using ReadySET- human TNF-alpha ELISA kit. GO! (eBioscience cat. no. 88-7346-22), Κ-1β using Ready-SET-GO! (2nd generation) (eBioscience cat. no. 88-7261-22), and IFNy using the Ready-SET-GO! (eBioscience cat. no. 88-7316-22), according to the manufacturer's instructions.

Как показано в табл. 5, ингибирование CD73 под действием 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона увеличивает уровни TNF-α в Т-клетках CD4+.As shown in Table. 5, Inhibition of CD73 by 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione increases TNF-α levels in CD4+ T cells .

Таблица 5. Высвобождение TNF-aTable 5. Release of TNF-a

Как показано в табл. 6, ингибирование CD73 под действием 5-[5-[(1S,2R)-2-изопропилциклопропил]6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона увеличивает уровни TNF-α в Т-клетках CD4+.As shown in Table. 6, Inhibition of CD73 by 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione increases TNF-α levels in CD4+ T cells .

- 39 041789- 39 041789

Таблица 6. Высвобождение INF-γTable 6. INF-γ release

In Vivo модели.in vivo models.

При необходимости можно осуществить доклиническое моделирование ингибирующего действия соединения по данному изобретению или его фармацевтически приемлемой соли в отношении CD73, например, в соответствии со способами, описанными в данной области техники, например, в публикации Rongvaux A, et al., Annual Rev. Immunology 2013] 31: 635-74, и в литературных источниках, цитированных в указанном документе; Sanmamed MF, et al., Annals of Oncology 2016; 27: 1190-1198, и в литературных источниках, цитированных в указанном документе.If necessary, pre-clinical modeling of the CD73 inhibitory effect of a compound of this invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be performed, for example, in accordance with methods described in the art, for example, in Rongvaux A, et al., Annual Rev. Immunology 2013] 31: 635-74, and in the literature cited in said document; Sanmamed MF, et al., Annals of Oncology 2016; 27: 1190-1198, and in the literature cited in said document.

ЖХ/МС анализ для измерения активности CD73 в сыворотке человека Свежую кровь здорового человека центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин при комнатной температуре и собирали верхнюю фракцию, содержащую сыворотку. Собранную сыворотку (25 мкл/лунка) переносили в 96-луночный планшет с глубокими лунками (DWP, Analytical Sales & Services Inc., кат. № 968820), содержащими различные концентрации соединения из примера 2 и фиксированную концентрацию левамизоля (1500 мкМ). После инкубации на льду в течение 60 мин в каждую лунку на планшете добавляли ¹³C5¹⁵Ν5-ΑΜΦ (50 мкМ) и инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем планшет ставили на сухой лед с добавлением 200 мкл на лунку 17.3 ТСА, после чего встряхивали при 26 к/с в течение 3 мин на приборе для встряхивания планшетов (Qiagen). Затем планшет центрифугировали при 2940 g в течение 20 мин при 4°С. После центрифугирования переносили 100 мкл на лунку надосадочного раствора из каждого раствора в новый 96-луночный планшет с глубокими лунками и смешивали с 18,4 мкл на лунку 2,5 М Na₂CO₃ на льду, затем добавляли 200 мкл экстракционного раствора, содержащего внутренний стандарт (внутр.ст.: ¹³С5-АМФ, ¹³С5-аденозин, ¹³С5-гипоксантин и ¹⁵N4-uho3uh). После дополнительного центрифугирования при 2940 g в течение 20 мин при 4°С использовали 200 мкл на лунку надосадочного раствора для анализа ¹³С10-¹⁵N5-аденозина, ¹³С10-¹⁵N5-инозина и ¹⁵N₅гипоксантина с помощью ЖХ/МС, как описано выше. Для расчета ЕС₅₀ делали поправку концентраций ингибитора CD73 в сыворотке на несвязанную фракцию (%), полученную в компьютерных моделях или экспериментально.LC/MS analysis to measure CD73 activity in human serum Fresh blood from a healthy human was centrifuged at 1500 g for 15 min at room temperature and the upper fraction containing serum was collected. The pooled serum (25 µl/well) was transferred into a 96-well deep well plate (DWP, Analytical Sales & Services Inc., Cat # 968820) containing various concentrations of the compound from Example 2 and a fixed concentration of levamisole (1500 µM). After incubation on ice for 60 min, ¹³ C5 ¹⁵ Ν5-ΑΜΦ (50 μM) was added to each well on the plate and the plate was incubated at room temperature for 15 min. The plate was then placed on dry ice with the addition of 200 μl per well of 17.3 TCA, followed by shaking at 26 fps for 3 min on a plate shaker (Qiagen). Then the tablet was centrifuged at 2940 g for 20 min at 4°C. After centrifugation, transfer 100 µl per well of the supernatant from each solution to a new 96-well deep well plate and mix with 18.4 µl per well of 2.5 M Na ₂ CO ₃ on ice, then add 200 µl of the extraction solution containing internal standard (int.st.: ¹³ C5-AMP, ¹³ C5-adenosine, ¹³ C5-hypoxanthin and ¹⁵ N4-uho3uh). After additional centrifugation at 2940 g for 20 min at 4° C., 200 μl per well of supernatant was used to analyze ¹³ C10-15 ^N5 -adenosine, ¹³ ^C10-15 N5-inosine and ¹⁵ N ₅ hypoxanthine by LC/MS as described above. To calculate EC ₅₀ , serum CD73 inhibitor concentrations were adjusted for the unbound fraction (%) obtained from computer models or experimentally.

В табл. 7 представлены данные об ингибировании активности CD73 в сыворотке человека под действием 5-[5-[(1S,2R)-2-изопроnилциклопропил]-6-метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-диона (соединения из примера 2).In table. 7 shows data on inhibition of CD73 activity in human serum by 5-[5-[(1S,2R)-2-isopropylcyclopropyl]-6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione (compounds from example 2).

Таблица 7Table 7

Соединение из примера 2 (мкМ) Compound from Example 2 (µM) Ингибирование (%) Inhibition (%) 4,6800 4.6800 76,9 76.9 1,5600 1.5600 71,1 71.1 0,5200 0.5200 56,8 56.8 0,1733 0.1733 39,6 39.6 0,0578 0.0578 25,4 25.4 0,0193 0.0193 15,4 15.4 0,0064 0.0064 8,4 8.4 0,0021 0.0021 3,7 3.7 0,0007 0.0007 0,7 0.7 0 0 0,0 0.0

В табл. 8 представлены данные об ингибировании активности CD73 в сыворотке человека под действием некоторых соединений, описанных в данном документе.In table. 8 shows inhibition of CD73 activity in human serum by some of the compounds described herein.

--

Claims

1. Соединение формулы1. Compound formula

Н где n равен 0-3;H where n is 0-3;

R¹ представляет собой -Н, -F, -гем-дифтор, -гем-диметил, -С_1-4алкил, -CHF2, -CF2CH₃ или -CH2CH2F; иR ¹ is -H, -F, -hem-difluoro, -hem-dimethyl, -C _1-4 alkyl, -CHF2, -CF2CH ₃ or -CH2CH2F; And

R2 выбран из -Н, -CH₃, -F, -Cl, -CN или -ОСН₃;R2 is selected from -H, -CH ₃ , -F, -Cl, -CN or -OCH ₃ ;

2. Соединение по п.1, представляющее собой2. The compound according to claim 1, which is

3. Соединение по п.1 или 2, представляющее собой3. The compound according to claim 1 or 2, which is

4. Соединение по любому из пп.1, 2, представляющее собой4. The compound according to any one of claims 1, 2, which is

5. Соединение по любому из пп.1-4, представляющее собой5. A compound according to any one of claims 1 to 4, which is

6. Соединение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что n равен 0,6. The compound according to any one of claims 1 to 5, characterized in that n is 0,

R¹ представляет собой -C_1-4 алкил,R ¹ is -C _1-4 alkyl,

R² представляет собой -CH3, или его фармацевтически приемлемая соль.R ² is -CH3, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

7. Соединение по п.6, отличающееся тем, что R¹ представляет собой изопропил, или его фармацевтически приемлемая соль.7. A compound according to claim 6, wherein R ¹ is isopropyl, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

- 41 041789- 41 041789

8. Соединение по п.1, представляющее собой8. The compound according to claim 1, which is

9. Соединение по любому из пп.1, 2, 6 и 7, представляющее собой9. The compound according to any one of claims 1, 2, 6 and 7, which is

- 42 041789 или его фармацевтически приемлемая соль.- 42 041789 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

10. Соединение по любому из пп.1-9, представляющее собой 5-[5-[(18,2К)-2-изопропилциклопропил]6-метилпиридазин-З-ил]-1Н-пиримид ин-2,4-дион, или его фармацевтически приемлемая соль.10. The compound according to any one of claims 1 to 9, which is 5-[5-[(18.2K)-2-isopropylcyclopropyl]6-methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimide in-2,4-dione, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

11. Соединение по любому из пп.1, 2, 6 и 7, представляющее собой11. The compound according to any one of claims 1, 2, 6 and 7, which is

12. Соединение по любому из пп.1-8 или 11, представляющее собой 5-[5-[(18,28)-2-этилциклопропил]-6метилпиридазин-3-ил]-1Н-пиримидин-2,4-дион, или его фармацевтически приемлемая соль.12. The compound according to any one of claims 1-8 or 11, which is 5-[5-[(18.28)-2-ethylcyclopropyl]-6methylpyridazin-3-yl]-1H-pyrimidin-2,4-dione, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пи. 1-12 или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.13. A pharmaceutical composition containing a compound according to any of pi. 1-12 or a pharmaceutically acceptable salt thereof and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients.

14. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемой соли, причем рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек.14. A method of treating cancer, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a compound according to any one of claims 1 to 12, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the cancer is bladder cancer, breast cancer, cholangiocarcinoma, colon and rectal cancer , colon cancer, stomach cancer, gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, or kidney cancer.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что пациент представляет собой пациента, в сыворотке которого определена активность CD73.15. The method according to claim 14, characterized in that the patient is a patient in whose serum CD73 activity is determined.

16. Способ по п.14, отличающийся тем, что пациент представляет собой пациента, в ткани которого определена экспрессия CD73.16. The method according to claim 14, characterized in that the patient is a patient in whose tissue CD73 expression is determined.

17. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемой соли, причем пациент представляет собой пациента, в сыворотке которого определена активность CD73, причем рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек.17. A method of treating cancer, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a compound according to any one of claims 1 to 12, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the patient is a patient whose serum has CD73 activity detected, wherein the cancer is a urinary cancer. bladder, breast cancer, cholangiocarcinoma, colon and rectal cancer, colon cancer, stomach cancer, gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer , prostate cancer, or kidney cancer.

18. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемой соли, причем пациент представляет собой пациента, в ткани которого определена экспрессия CD73, причем рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек.18. A method of treating cancer, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a compound according to any one of claims 1 to 12, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the patient is a patient in whose tissue CD73 expression is determined, wherein the cancer is urinary cancer. bladder, breast cancer, cholangiocarcinoma, colon and rectal cancer, colon cancer, stomach cancer, gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer , prostate cancer, or kidney cancer.

19. Применение соединения по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака, отличающееся тем, что рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек.19. Use of a compound according to any one of claims 1 to 12 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the treatment of cancer, characterized in that the cancer is bladder cancer, breast cancer, cholangiocarcinoma, colon and rectal cancer, colon cancer, gastric cancer , gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, or kidney cancer.

20. Применение соединения по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рака, отличающееся тем, что рак представляет собой рак мочевого пузыря, рак молочной железы, холангиокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак толстой кишки, рак желудка, рак желчного пузыря, глиобластому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, медуллобластому, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы или рак почек.20. The use of a compound according to any one of claims 1 to 12 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer, characterized in that the cancer is bladder cancer, breast cancer, cholangiocarcinoma, colon and rectal cancer, colon cancer colon, stomach cancer, gallbladder cancer, glioblastoma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, medulloblastoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, or kidney cancer.

Евразийская патентная организация, ЕАПВEurasian Patent Organization, EAPO

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2Russia, 109012, Moscow, Maly Cherkassky per., 2