EA041758B1 - FGF21 MUTANTS AND THEIR APPLICATIONS - Google Patents

Description

Уровень техникиState of the art

1. Область техники.1. Field of technology.

Данное изобретение касается молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих FGF21 мутантные полипептиды, FGF21 мутантных полипептидов, фармацевтических композиций, включающих FGF21 мутантные полипептиды, и способов лечения метаболических расстройств с использованием таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.This invention relates to nucleic acid molecules encoding FGF21 mutant polypeptides, FGF21 mutant polypeptides, pharmaceutical compositions comprising FGF21 mutant polypeptides, and methods for treating metabolic disorders using such nucleic acids, polypeptides or pharmaceutical compositions.

2. Уровень техники.2. State of the art.

FGF21 является секретированным полипептидом, который принадлежит к подсемейству факторов роста фибробластов (FGFs), включающему FGF19, FGF21 и FGF23 (Itoh et al., 2004, Trend Genet. 20: 56369). FGF21 является атипичным FGF в том, что он является гепариннезависимым и действует как гормон в регуляции глюкозного, липидного и энергетического метаболизма.FGF21 is a secreted polypeptide that belongs to the subfamily of fibroblast growth factors (FGFs), including FGF19, FGF21 and FGF23 (Itoh et al., 2004, Trend Genet. 20: 56369). FGF21 is atypical FGF in that it is heparin-independent and acts as a hormone in the regulation of glucose, lipid and energy metabolism.

FGF21 был выделен из печеночной кДНК библиотеки как печеночный секретированный фактор. Он сильно экспрессирован в печени и поджелудочной железе и является единственным членом FGF семейства, экспрессированным, главным образом, в печени. Трансгенные мыши, гиперэкспрессирующие FGF21, обнаруживают метаболические фенотипы замедленного роста, низких уровней глюкозы и триглицеридов в плазме и отсутствие возрастного диабета типа 2, островковой гиперплазии и ожирения. Фармакологическое применение рекомбинантного FGF21 протеина в моделях диабетических грызунов дало нормализованные уровни глюкозы в плазме, сниженные уровни триглицеридов и холестерина и улучшенные толерантность к глюкозе и чувствительность к инсулину. Кроме того, FGF21 снижает вес тела и ожирение путем увеличения расхода энергии, физической активности и интенсивности обмена веществ. Экспериментальные исследования подтверждают фармакологическое применение FGF21 для лечения диабета типа 2, ожирения, дислипидемии и других метаболических состояний или расстройств у людей.FGF21 was isolated from a hepatic cDNA library as a hepatic secreted factor. It is highly expressed in the liver and pancreas and is the only member of the FGF family expressed primarily in the liver. Transgenic mice overexpressing FGF21 show metabolic phenotypes of slow growth, low plasma glucose and triglyceride levels, and the absence of age-related type 2 diabetes, islet hyperplasia, and obesity. Pharmacological use of the recombinant FGF21 protein in diabetic rodent models resulted in normalized plasma glucose levels, reduced triglyceride and cholesterol levels, and improved glucose tolerance and insulin sensitivity. In addition, FGF21 reduces body weight and obesity by increasing energy expenditure, physical activity, and metabolic rate. Experimental studies support the pharmacological use of FGF21 for the treatment of type 2 diabetes, obesity, dyslipidemia, and other metabolic conditions or disorders in humans.

Человеческий FGF21 имеет короткий период полураспада in vivo. У мышей и обезьян cynomolgus эффективный период полураспада человеческого FGF21 составляет от 1 до 2 ч. При разработке FGF21 протеина для использования в качестве терапевтического препарата при лечении диабета типа 2 увеличение периода полураспада было бы желательным. FGF21 протеины с увеличенным периодом полураспада могли бы обеспечить пациентам, которым назначен данный протеин, менее частую дозировку.Human FGF21 has a short half-life in vivo. In cynomolgus mice and monkeys, the effective half-life of human FGF21 is 1 to 2 hours. In developing the FGF21 protein for use as a therapeutic drug in the treatment of type 2 diabetes, an increase in the half-life would be desirable. FGF21 proteins with an extended half-life could provide patients prescribed this protein with less frequent dosing.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

В одном варианте настоящее изобретение представляет изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 4, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой: (а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179; (с) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122; (d) глициновый остаток в положении 170; (е) глициновый остаток в положении 17; и комбинации (а)-(е).In one embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule that includes a nucleotide sequence encoding a polypeptide of SEQ ID NO: 4 having at least one amino acid substitution, which is: (a) a lysine residue at one or more positions 36, 72, 77, 126 and 175; (b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179; (c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122; (d) a glycine residue at position 170; (e) a glycine residue at position 17; and combinations (a)-(e).

В другом варианте настоящее изобретение представляет изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, которая имеет по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой: (а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179; (с) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122; (d) глициновый остаток в положении 170; (е) глициновый остаток в положении 17; и комбинации (а)-(е), и включающую добавки, делеции или дополнительные субституции, которые делают данный полипептид по меньшей мере на 85% идентичным SEQ ID NO: 4, при условии, что по меньшей мере одна аминокислотная субституция п.1(а)-(е) не является дополнительно модифицированной.In another embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which has at least one amino acid substitution, which is: (a) a lysine residue at one or more positions 36, 72, 77, 126 and 175; (b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179; (c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122; (d) a glycine residue at position 170; (e) a glycine residue at position 17; and combinations (a)-(e), and comprising additions, deletions, or additional substitutions that make the polypeptide at least 85% identical to SEQ ID NO: 4, provided that at least one amino acid substitution of claim 1( a)-(e) is not further modified.

Настоящее изобретение представляет также векторы и клетки-хозяева, включающие молекулы нуклеиновой кислоты данного изобретения.The present invention also provides vectors and host cells comprising the nucleic acid molecules of the present invention.

В еще одном варианте настоящее изобретение представляет изолированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой: (а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179; (с) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122; (d) глициновый остаток в положении 170; (е) глициновый остаток в положении 17; и комбинации (а)-(е).In yet another embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 having at least one amino acid substitution which is: (a) a lysine residue at one or more positions 36, 72, 77, 126 and 175 ; (b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179; (c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122; (d) a glycine residue at position 170; (e) a glycine residue at position 17; and combinations (a)-(e).

В еще одном варианте настоящее изобретение представляет изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой: (а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179; (с) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122; (d) глициновый остаток в положении 170; (е) глициновый остаток в положении 17; и комбинации (а)-(е), и включающую добавки,In another embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, having at least one amino acid substitution, which is: (a) a lysine residue at one or more positions 36, 72, 77 , 126 and 175; (b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179; (c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122; (d) a glycine residue at position 170; (e) a glycine residue at position 17; and combinations (a)-(e), and including additives,

- 1 041758 делеции или дополнительные субституции, которые делают данный полипептид по меньшей мере на- 1 041758 deletions or additional substitutions that make this polypeptide at least

85% идентичным SEQ ID NO: 4, при условии, что по меньшей мере одна аминокислотная субституция85% identical to SEQ ID NO: 4, provided that at least one amino acid substitution

п. 1 (а)-(е) не является дополнительно модифицированной.paragraph 1 (a)-(e) is not further modified.

В еще одном варианте настоящее изобретение представляет изолированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой: (а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179; (с) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122; (d) глициновый остаток в положении 170; (е) глициновый остаток в положении 171; и комбинации (а)-(е), и включающий добавки, делеции или дополнительные субституции, которые делают данный полипептид по меньшей мере на 85% идентичным SEQ ID NO: 4, при условии, что по меньшей мере одна аминокислотная субституция п.1(а)-(е) не является дополнительно модифицированной.In yet another embodiment, the present invention provides an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 having at least one amino acid substitution which is: (a) a lysine residue at one or more positions 36, 72, 77, 126 and 175 ; (b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179; (c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122; (d) a glycine residue at position 170; (e) a glycine residue at position 171; and combinations (a)-(e), and comprising additions, deletions, or additional substitutions that make the polypeptide at least 85% identical to SEQ ID NO: 4, provided that at least one amino acid substitution of claim 1( a)-(e) is not further modified.

Кроме того, настоящее изобретение представляет композицию, включающую первый полипептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую при необходимости по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой: (а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179; (с) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122; (d) глициновый остаток в положении 170; (е) глициновый остаток в положении 171; и комбинации (а)-(е), соединенный линкером со вторым полипептидом, включающим полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, которая имеет при необходимости по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, представляющую собой: (а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179; (с) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69, и 122; (d) глициновый остаток в положении 170; (е) глициновый остаток в положении 17; и комбинации (а)-(е).In addition, the present invention provides a composition comprising a first polypeptide that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, optionally having at least one amino acid substitution, which is: (a) a lysine residue at one or more positions 36, 72, 77, 126 and 175; (b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179; (c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122; (d) a glycine residue at position 170; (e) a glycine residue at position 171; and combinations (a)-(e) connected by a linker to a second polypeptide comprising a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which, if necessary, has at least one amino acid substitution, which is: (a) a lysine residue in one or several provisions 36, 72, 77, 126 and 175; (b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179; (c) an arginine residue at one or more of positions 56, 59, 69, and 122; (d) a glycine residue at position 170; (e) a glycine residue at position 17; and combinations (a)-(e).

Настоящее изобретение также представляет химически модифицированные формы полипептидов настоящего изобретения. Химически модифицированные формы данных полипептидов включают полимер, присоединенный к N-концу, и/или сайту присоединения природного или неприродного полимера. Настоящее изобретение также представляет фармацевтические композиции и способы лечения метаболических расстройств, таких как ожирение и диабет, включающие назначение фармацевтических композиций настоящего изобретения пациенту, который в этом нуждается.The present invention also provides chemically modified forms of the polypeptides of the present invention. Chemically modified forms of these polypeptides include a polymer attached to the N-terminus and/or site of attachment of a natural or non-natural polymer. The present invention also provides pharmaceutical compositions and methods for treating metabolic disorders such as obesity and diabetes, comprising administering the pharmaceutical compositions of the present invention to a patient in need thereof.

Специфические варианты настоящего изобретения станут очевидными из последующего более детального описания некоторых вариантов и пунктов формулы изобретения.Specific embodiments of the present invention will become apparent from the following more detailed description of certain embodiments and claims.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Фиг. 1 представляет собой чертеж, изображающий молекулу FGF21 с двумя полимерами (например, молекулы полиэтиленгликоля (ПЕГ)), присоединенными к данной последовательности.Fig. 1 is a drawing depicting an FGF21 molecule with two polymers (eg polyethylene glycol (PEG) molecules) attached to this sequence.

Фиг. 2 включает четыре SDS-PAGE (додецилсульфат натрия-полиакриламидных) геля, показывающих степень ПЭГилирования девяти FGF21 мутантов с единственным созданным способами генной инженерии сайтом присоединения полимера, химически модифицированным ПЭГ, а именно Е37С, R77C и Н125С (вверху слева), D38C, D46C и D79C (вверху справа), Н87С, Е91С, G113C (внизу слева) и G120C, R126C, N121C (внизу справа).Fig. 2 includes four SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide) gels showing the degree of PEGylation of nine FGF21 mutants with a single genetically engineered PEG chemically modified polymer attachment site, namely E37C, R77C and H125C (upper left), D38C, D46C and D79C (top right), H87C, E91C, G113C (bottom left) and G120C, R126C, N121C (bottom right).

Фиг. 3 включает SDS-PAGE гель, показывающий степень ПЭГилирования трех FGF21 мутантов, имеющих единственный созданный способами генной инженерии сайт присоединения полимера, химически модифицированный молекулой 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты, а именно К69С, R175C и Y179C.Fig. 3 includes an SDS-PAGE gel showing the degree of PEGylation of three FGF21 mutants having a single genetically engineered polymer attachment site chemically modified with a 20 kD maleic acid imide methoxy PEG molecule, namely K69C, R175C and Y179C.

Фиг. 4 включает два графика, представляющих результаты ELK-люциферазной пробы, проведенной на FGF21 мутантных полипептидах с единственными созданными способами генной инженерии сайтами присоединения полимера, химически модифицированными путем присоединения молекулы 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты, а именно Е37С, R77C, Е91С, FGF21 дикого типа и ПЭГилированного по N-концу FGF21 (верхний график) и G113C, N121C, D46C, FGF21 дикого типа и ПЭГилированного по N-концу FGF21 (нижний график).Fig. 4 includes two graphs representing the results of an ELK-luciferase assay performed on FGF21 mutant polypeptides with the only genetically engineered polymer attachment sites chemically modified by the addition of a 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecule, namely E37C, R77C, E91C, FGF21 wild type and N-terminally PEGylated FGF21 (upper panel) and G113C, N121C, D46C, FGF21 wild-type and N-terminally PEGylated FGF21 (lower panel).

Фиг. 5 включает два графика, представляющих результаты ELK-люциферазной пробы, проведенной на FGF21 мутантных полипептидах с единственными созданными способами генной инженерии сайтами присоединения полимера, химически модифицированными путем присоединения молекулы 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты, а именно Н125С, G120C, R126C, FGF21 дикого типа и ПЭГилированного по N-концу FGF21 (верхний график) и D79C, D38C, FGF21 дикого типа и ПЭГилированного по N-концу FGF21 (нижний график).Fig. 5 includes two graphs representing the results of an ELK-luciferase assay performed on FGF21 mutant polypeptides with the only genetically engineered polymer attachment sites chemically modified by the attachment of a 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecule, viz. type and N-terminally PEGylated FGF21 (upper graph) and D79C, D38C, FGF21 wild-type and N-terminally PEGylated FGF21 (lower graph).

Фиг. 6 включает два графика, представляющих результаты ELK-люциферазной пробы, проведенной на полипептидах FGF21 дикого типа и FGF21 мутантных полипептидах с единственным созданным способами генной инженерии сайтом присоединения полимера, химически модифицированным путем при- 2 041758 соединения молекулы 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты, а именно К69С, D79C, FGF21 дикого типа и ПЭГилированного по N-концу FGF21 (верхний график), и R175C, Y179C, FGF21 дикого типа и ПЭГилированного по N-концу FGF21 (нижний график).Fig. 6 includes two graphs representing the results of an ELK-luciferase assay performed on wild type FGF21 and FGF21 mutant polypeptides with a single genetically engineered polymer attachment site chemically modified by the addition of a 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecule, and namely K69C, D79C, FGF21 wild-type and N-terminally PEGylated FGF21 (upper panel), and R175C, Y179C, FGF21 wild-type and N-terminally PEGylated FGF21 (lower panel).

Фиг. 7 представляет собой чертеж, изображающий связанную молекулу настоящего изобретения.Fig. 7 is a drawing depicting a linked molecule of the present invention.

Фиг. 8 представляет собой график, изображающий процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей во времени (от 0 времени) после единичной инъекции наполнителя (физиологического раствора с фосфатным буфером), FGF21 дикого типа или N-терминально ПЭГилированного FGF21 дикого типа.Fig. 8 is a graph depicting the percentage change in blood glucose levels in mice over time (from time 0) after a single injection of vehicle (phosphate buffered saline), wild-type FGF21, or wild-type N-terminally PEGylated FGF21.

Фиг. 9 представляет собой график, изображающий процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (физиологического раствора с фосфатным буфером), или FGF21 дикого типа, который был N-терминально ПЭГилирован молекулами 20, 30 или 40 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты.Fig. 9 is a graph depicting the percentage change in blood glucose levels in mice from time 0 after a single injection of vehicle (phosphate buffered saline), or wild-type FGF21 that was N-terminally PEGylated with 20, 30, or 40 kDa methoxy PEG imide molecules. maleic acid.

Фиг. 10 включает два графика, изображающих процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей на протяжении девятисуточного периода от 0 времени после единичной инъекции физиологического раствора с фосфатным буфером или N-терминально ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих мутации R77C или R126K, которые были дополнительно ПЭГилированы по этим введенным сайтам присоединения полимера молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты, и слияние, включающее Fc молекулу и G170E FGF21 мутантный полипептид (верхний график); или N-терминально ПЭГилированный FGF21 мутантный полипептид, включающий мутации R77C, дополнительно ПЭГилированные по этому введенному сайту присоединения полимера молекулой 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты, и P171G (нижний график).Fig. 10 includes two graphs depicting the percentage change in blood glucose levels in mice over a nine-day period from time 0 after a single injection of phosphate buffered saline or N-terminally PEGylated FGF21 mutant polypeptides comprising R77C or R126K mutations that were further PEGylated at these introduced polymer attachment sites with 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecules, and a fusion involving an Fc molecule and a G170E FGF21 mutant polypeptide (top graph); or an N-terminally PEGylated FGF21 mutant polypeptide comprising the R77C mutations, further PEGylated at this introduced polymer attachment site with a 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecule, and P171G (lower graph).

Фиг. 11 представляет собой график, изображающий процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (10 мМ фосфата калия, 5% сорбита, рН 8) или FGF21 мутантных полипептидов, которые были дважды ПЭГилированы молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно Е91С/Н125С, E91C/R175C, E37C/G120C, Е37С/Н125С, и E37C/R175C; было исследовано также слияние, включающее Fc молекулу и P171G FGF21 мутантный полипептид.Fig. 11 is a graph depicting the percentage change in blood glucose levels in mice from time 0 after a single injection of vehicle (10 mM potassium phosphate, 5% sorbitol, pH 8) or FGF21 mutant polypeptides that were double-pegylated with 20 kDa methoxy PEG maleic imide molecules. acids at introduced polymer attachment sites, namely E91C/H125C, E91C/R175C, E37C/G120C, E37C/H125C, and E37C/R175C; a fusion involving an Fc molecule and a P171G FGF21 mutant polypeptide was also investigated.

Фиг. 12 представляет собой график, изображающий процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (10 мМ фосфата калия, 5% сорбита, рН 8) или FGF21 мутантных полипептидов, которые были дважды ПЭГилированы молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно Е91С/Н121С, G120C/H125C, или E37C/R77C; исследовано также слияние, включающее Fc молекулу и G170E FGF21 мутантный полипептид.Fig. 12 is a graph depicting the percentage change in blood glucose levels in mice from time 0 after a single injection of vehicle (10 mM potassium phosphate, 5% sorbitol, pH 8) or FGF21 mutant polypeptides that were double-pegylated with 20 kDa methoxy PEG maleic imide molecules. acids at introduced polymer attachment sites, namely E91C/H121C, G120C/H125C, or E37C/R77C; a fusion involving an Fc molecule and a G170E FGF21 mutant polypeptide was also investigated.

Фиг. 13 представляет собой график, изображающий процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (10 мМ фосфата калия, 5% сорбита, рН 8) или FGF21 мутантными полипептидами, которые были дважды ПЭГилированы молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно E37C/R77C, E91C/R175C, Е37С/Н125С, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G и E37C/R125C/P171G.Fig. 13 is a graph depicting the percentage change in blood glucose levels in mice from time 0 after a single injection of vehicle (10 mM potassium phosphate, 5% sorbitol, pH 8) or FGF21 mutant polypeptides that were double-pegylated with 20 kDa methoxy PEG maleic imide molecules. acids at introduced polymer attachment sites, namely E37C/R77C, E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G and E37C/R125C/P171G.

Фиг. 14 представляет собой график, изображающий процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей от 0 времени после введения единичной инъекции наполнителя (10 мМ фосфата калия, 5% сорбита, рН 8), FGF21 мутантных полипептидов, которые были дважды ПЭГилированы молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно E37C/R77C/P171G и E91C/R125C/P171G, или связанными молекулами, включающими два идентичных FGF21 мутантных полипептида, имеющих одинаковые введенные мутации, а именно R77C/P171G (2х) и R78C/P172G (2х), которые были соединены через молекулы 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты.Fig. 14 is a graph depicting the percentage change in blood glucose levels in mice from time 0 following a single injection of vehicle (10 mM potassium phosphate, 5% sorbitol, pH 8), FGF21 mutant polypeptides that were double-pegylated with 20 kDa methoxy PEG imide molecules. maleic acid at the introduced polymer attachment sites, namely E37C/R77C/P171G and E91C/R125C/P171G, or linked molecules comprising two identical FGF21 mutant polypeptides having the same introduced mutations, namely R77C/P171G (2x) and R78C/P172G (2x) that were linked via 20 kD methoxy PEG maleic acid imide molecules.

Фиг. 15 представляет собой график, изображающий процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей в зависимости от дозы от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (10 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, pH 8,5), или FGF21 мутантного полипептида, который был дважды ПЭГилирован молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты, а именно E37C/R77C/P171G, и применялись при дозах 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 или 1 мг/кг.Fig. 15 is a graph depicting the percentage change in blood glucose levels in mice as a function of dose from time 0 after a single injection of vehicle (10 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 8.5), or FGF21 mutant polypeptide that was double-PEGylated molecules of 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide, namely E37C/R77C/P171G, and were used at doses of 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 or 1 mg/kg.

Фиг. 16 представляет собой график, изображающий изменение веса тела у мышей от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (10 мМ фосфата калия, 5% сорбита, рН 8) или FGF21 мутантных полипептидов, которые были дважды ПЭГилированы молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно E37C/R77C, E91C/R175C, Е37/Н125С, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G и E37C/R125C/P171GFig. 16 is a graph depicting the change in body weight in mice from time 0 after a single injection of vehicle (10 mM potassium phosphate, 5% sorbitol, pH 8) or FGF21 mutant polypeptides that were double-pegylated with 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecules at the injected polymer attachment sites, namely E37C/R77C, E91C/R175C, E37/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G and E37C/R125C/P171G

Фиг. 17 представляет собой график, изображающий изменение веса тела у мышей от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (10 мМ фосфата калия, 5% сорбита, рН 8), FGF21 мутантных полипептидов, которые были дважды ПЭГилированы молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно E37C/R77C/P171G и E91C/R125C/P171G, или связанными молекулами, включающими два FGF21 мутантных полипептида, имеющих одинаковые введенные мутации, а именно R37C/P171G (2х) и R77C/P171G (2х), которые были соединены через молекулу 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты.Fig. 17 is a graph depicting the change in body weight in mice from time 0 after a single injection of vehicle (10 mM potassium phosphate, 5% sorbitol, pH 8), FGF21 mutant polypeptides that were double-PEGylated with 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecules at the injected polymer attachment sites, namely E37C/R77C/P171G and E91C/R125C/P171G, or linked molecules comprising two FGF21 mutant polypeptides having the same introduced mutations, namely R37C/P171G (2x) and R77C/P171G (2x), which were linked through a 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide molecule.

- 3 041758- 3 041758

Фиг. 18 представляет собой график, изображающий изменение веса тела у мышей в зависимости от дозы от 0 времени после единичной инъекции наполнителя (10 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, рН 8.5), илиFig. 18 is a graph depicting the change in body weight in mice as a function of dose from time 0 after a single injection of vehicle (10 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 8.5), or

FGF21 мутантного полипептида, который был дважды ПЭГилирован молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно E37C/R77C/P171G, и применялся при пяти разных дозах.A FGF21 mutant polypeptide that was double-pegylated with 20 kDa maleic acid imide methoxy PEG molecules at the introduced polymer attachment sites, namely E37C/R77C/P171G, and was administered at five different doses.

Фиг. 19A-19F представляют собой серию из шести графиков, изображающих изменение веса тела у мышей на протяжении восьминедельных исследований почечных вакуолей при дозировке раз в неделю наполнителя (квадраты), 5 мг/кг (треугольники) и 25 мг/кг (не заштрихованные кружочки) ПЭГилированных FGF21 молекул. Мыши, которым вводили дозы дважды цистеин ПЭГилированных FGF21 молекул, обнаруживали непрерывную потерю веса, тогда как мыши, которым вводили связанные молекулы, выявляли, главным образом, временную потерю веса.Fig. 19A-19F are a series of six graphs depicting change in body weight in mice over eight weeks of renal vacuole studies at weekly dosing of vehicle (squares), 5 mg/kg (triangles), and 25 mg/kg (open circles) PEGylated FGF21 molecules. Mice dosed with doubly cysteine PEGylated FGF21 molecules showed continuous weight loss, while mice dosed with the coupled molecules showed mostly transient weight loss.

Фиг. 20 включает две гистограммы, изображающие результаты восьминедельного исследования почечных вакуолей у мышей, которым вводили инъекции наполнителя или FGF21 мутантного полипептида, который был дважды ПЭГилирован молекулами 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты по введенным сайтам присоединения полимера, а именно E37C/R77C/P171G; E37/H125C/P171G; E91C/H125C/P171G; E37C/P171G; R77C/P171G; и R77C/ P171G; испытывали две разные дозы.Fig. 20 includes two bar graphs depicting the results of an eight-week study of renal vacuoles in mice injected with vehicle or FGF21 mutant polypeptide that was double-PEGylated with 20 kDa maleic acid methoxy PEG molecules at the introduced polymer attachment sites, namely E37C/R77C/P171G; E37/H125C/P171G; E91C/H125C/P171G; E37C/P171G; R77C/P171G; and R77C/P171G; tested two different doses.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Человеческий FGF21 протеин с улучшенными свойствами, такими как увеличенный период полураспада, может быть получен с использованием способов, раскрытых в данной заявке, и стандартных способов молекулярной биологии. Известно, что путем связывания одного или нескольких водорастворимых полимеров, таких как молекулы ПЭГ, с протеином период полураспада данного протеина может быть расширен. Так, в различных вариантах период полураспада природного FGF21 может быть расширен путем введения аминокислотных субституций в данный протеин с образованием точек, в которых полимер может быть присоединен к данному FGF21 протеину. На такие модифицированные протеины здесь ссылаются как на FGF21 мутанты, и они составляют варианты настоящего изобретения. Полимеры могут быть также введены в N-конец FGF21 молекулы в сочетании с введением сайта присоединения неприродного полимера.Human FGF21 protein with improved properties, such as increased half-life, can be obtained using the methods disclosed in this application and standard methods of molecular biology. It is known that by linking one or more water-soluble polymers, such as PEG molecules, to a protein, the half-life of that protein can be extended. Thus, in various embodiments, the half-life of natural FGF21 can be extended by introducing amino acid substitutions into a given protein to form points at which a polymer can be attached to a given FGF21 protein. Such modified proteins are referred to herein as FGF21 mutants and constitute variants of the present invention. Polymers can also be introduced at the N-terminus of the FGF21 molecule in combination with the introduction of a non-natural polymer attachment site.

Использованные здесь способы рекомбинантных нуклеиновых кислот, включая примеры, в целом, отвечают тем, что представлены в работах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) или Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), на которые в данной заявке сделаны ссылки.The recombinant nucleic acid methods used herein, including examples, generally correspond to those presented in the works of Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) or Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. ., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), to which reference is made in this application.

1. Общие определения.1. General definitions.

Как здесь используется, термин а означает один или несколько, если специально не оговорено иное.As used here, the term a means one or more, unless specifically stated otherwise.

Термин изолированная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты данного изобретения, которая: (1) была отделена от по меньшей мере приблизительно 50% протеинов, липидов, углеводов или других материалов, с которыми она находится в природе, когда полная нуклеиновая кислота выделяется из клеток-источников, (2) не связана со всем полинуклеотидом или его частью, с которым изолированная молекула нуклеиновой кислоты связана в природе, (3) связана действующим образом с полинуклеотидом, с которым она не связана в природе, или (4) не встречается в природе как часть большей полинуклеотидной последовательности. Лучше, когда изолированная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в значительной мере свободна от молекул любых других загрязняющих нуклеиновых кислот или других контаминантов, которые находятся в ее природной окружающей среде, которые могут помешать ее использованию в производстве полипептидов или в ее терапевтическом, диагностическом, профилактическом или исследовательском применении.The term isolated nucleic acid molecule refers to a nucleic acid molecule of the present invention that: (1) has been separated from at least about 50% of the proteins, lipids, carbohydrates or other materials with which it is found in nature when the complete nucleic acid is isolated from cells -sources, (2) is not linked to all or part of the polynucleotide to which the isolated nucleic acid molecule is naturally linked, (3) is operably linked to a polynucleotide to which it is not naturally linked, or (4) is not naturally occurring as part of a larger polynucleotide sequence. Preferably, the isolated nucleic acid molecule of the present invention is substantially free of any other contaminating nucleic acid molecules or other contaminants found in its natural environment that may interfere with its use in the production of polypeptides or in its therapeutic, diagnostic, prophylactic, or research applications. application.

Термин изолированный полипептид касается полипептида настоящего изобретения, который (1) отделен от по меньшей мере приблизительно 50% полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он находится в природе, когда выделяется из клетки-источника, (2) не связан (путем ковалентного или нековалентного взаимодействия) со всем полипептидом или его частью, с которым изолированный полипептид связан в природе, (3) связан действующим образом (путем ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (4) не встречается в природе. Лучше, когда изолированный полипептид настоящего изобретения в значительной мере свободен от любых других загрязняющих полипептидов или других контаминантов, которые находятся в его природной окружающей среде, которые могут помешать его терапевтическому, диагностическому, профилактическому или исследовательскому применению.The term isolated polypeptide refers to a polypeptide of the present invention that is (1) separated from at least about 50% of the polynucleotides, lipids, carbohydrates, or other materials with which it occurs naturally when isolated from a source cell, (2) is not bound (by covalent or non-covalent interaction) with all or part of the polypeptide to which the isolated polypeptide is naturally associated, (3) is operatively associated (by covalent or non-covalent interaction) with a polypeptide to which it is not naturally associated, or (4) does not occur in nature. Preferably, the isolated polypeptide of the present invention is substantially free of any other contaminating polypeptides or other contaminants found in its natural environment that may interfere with its therapeutic, diagnostic, prophylactic, or research use.

Термин вектор, использующийся здесь, касается любой молекулы (например, нуклеиновой кислоты, плазмиды или вируса) используемой для переноса кодирующей информации в клетку-хозяина.The term vector as used herein refers to any molecule (eg, nucleic acid, plasmid, or virus) used to transfer coding information into a host cell.

Термин экспрессирующий вектор касается вектора, который подходит для трансформации клетки-хозяина и содержит нуклеиновокислотные последовательности, направляющие и/или контролирующие экспрессию внедренных гетерологических нуклеиновокислотных последовательностей. Экспрессия включает, однако, не ограничиваясь этим, процессы, такие как транскрипция, трансляция и РНК сплайсинг, если присутствуют интроны.The term expression vector refers to a vector that is suitable for transformation of a host cell and contains nucleic acid sequences that direct and/or control the expression of the introduced heterologous nucleic acid sequences. Expression includes, but is not limited to, processes such as transcription, translation, and RNA splicing if introns are present.

- 4 041758- 4 041758

Термин клетка-хозяин используется в отношении клетки, которая трансформирована или способна трансформироваться нуклеиновокислотной последовательностью и затем экспрессировать выбранный ген, представляющий интерес. Данный термин включает потомство родительской клетки, независимо от того, является ли данное потомство идентичным по морфологии или генетической конструкции с оригинальным родителем, при условии присутствия данного выбранного гена.The term host cell is used to refer to a cell that is transformed or capable of transforming a nucleic acid sequence and then expressing the selected gene of interest. The term includes the progeny of the parent cell, whether or not that progeny is identical in morphology or genetic construct to the original parent, provided that the selected gene is present.

Термин природный, при использовании в связи с биологическими материалами, такими как молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, клетки-хозяева и такое подобное, относится к материалам, которые находятся в природе и не поддавались каким-либо манипуляциям, осуществляемым человеком. Подобно этому, термин неприродный, использующийся здесь, относится к материалу, который отсутствует в природе или был структурно модифицирован или синтезирован человеком. При использовании в связи с нуклеотидами, термин природный касается оснований - аденин (А), цитозин (С), гуанин (G), тимин (Т) и урацил (U). При использовании в связи с аминокислотами термин природный касается 20 аминокислот - аланин (А), цистеин (С), аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е), фенилаланин (F), глицин (G), гистидин (Н), изолейцин (I), лизин (K), лейцин (L), метионин (М), аспарагин (N), пролин (Р), глутамин (Q), аргинин (R), серин (S), треонин (Т), валин (V), триптофан (W) и тирозин (Y).The term natural, when used in connection with biological materials such as nucleic acid molecules, polypeptides, host cells, and the like, refers to materials that are found in nature and have not been subject to any manipulation by man. Likewise, the term non-natural as used herein refers to a material that is not found in nature or has been structurally modified or synthesized by man. When used in connection with nucleotides, the term natural refers to the bases adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T), and uracil (U). When used in connection with amino acids, the term natural refers to 20 amino acids - alanine (A), cysteine (C), aspartic acid (D), glutamic acid (E), phenylalanine (F), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), asparagine (N), proline (P), glutamine (Q), arginine (R), serine (S), threonine (T), valine (V), tryptophan (W) and tyrosine (Y).

Термин FGF21 полипептид касается любого природного полипептида дикого типа, экспрессированного в людях. Для целей этой заявки термин FGF21 полипептид может использоваться взаимозаменяемо и относиться к FGF21 полипептиду полной длины, который состоит из 209 аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 2) и который кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1; и зрелой форме данного полипептида, которая состоит из 181 аминокислотного остатка (SEQ ID NO: 4), которая кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, и в которой 28 аминокислотных остатков в аминотерминальном конце FGF21 полипептида полной длины (т.е. которые составляют сигнальный пептид) были удалены. FGF21 полипептид может быть экспрессирован с или без N-концевого метионинового остатка; как здесь отмечалось, N-концевой метиониновый остаток может быть добавлен путем конструирования или как функция бактериальной системы экспрессии.The term FGF21 polypeptide refers to any natural wild-type polypeptide expressed in humans. For the purposes of this application, the term FGF21 polypeptide may be used interchangeably and refer to a full length FGF21 polypeptide which consists of 209 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) and which is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and the mature form of this polypeptide, which consists of 181 amino acid residues (SEQ ID NO: 4), which is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and in which 28 amino acid residues at the amino terminal end of the FGF21 full-length polypeptide (i.e., which constitute signal peptide) were removed. The FGF21 polypeptide may be expressed with or without an N-terminal methionine residue; as noted here, the N-terminal methionine residue can be added by design or as a function of the bacterial expression system.

Термин биологически активный применительно к FGF21 полипептиду, включая описанные здесь FGF21 мутантные полипептиды, касается природной активности FGF21 полипептида дикого типа, такой как способность снижать глюкозу в крови, инсулин, триглицерид или холестерин; снижать вес тела; и улучшать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину. Что касается FGF21 мутантного полипептида, данный термин не зависит от типа или числа модификаций, введенных в FGF21 мутантный полипептид. Например, некоторые FGF21 мутантные полипептиды обладают несколько сниженным уровнем FGF21 активности по отношению к полипептиду FGF21 дикого типа, но, тем не менее, рассматриваются как биологически активные FGF21 мутантные полипептиды. Различия в активности конкретного мутантного полипептида FGF21 могут наблюдаться между in vivo и in vitro пробами; любые такие различия связаны с конкретными использованными пробами. Такое наблюдение, однако, не влияет на значение термина биологически активный и FGF21 мутантные полипептиды, которые выявляют природную активность полипептида FGF21 дикого типа, такую как способность снижать глюкозу в крови, инсулин, триглицерид или холестерин; снижать вес тела; и улучшать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину, в любой in vivo или in vitro пробе являются биологически активными.The term "bioactive" in relation to an FGF21 polypeptide, including the FGF21 mutant polypeptides described herein, refers to the natural activity of a wild-type FGF21 polypeptide, such as the ability to lower blood glucose, insulin, triglyceride, or cholesterol; reduce body weight; and improve glucose tolerance, energy expenditure, or insulin sensitivity. With respect to an FGF21 mutant polypeptide, the term is independent of the type or number of modifications introduced to the FGF21 mutant polypeptide. For example, some FGF21 mutant polypeptides have a slightly reduced level of FGF21 activity relative to the wild-type FGF21 polypeptide, but are nevertheless considered biologically active FGF21 mutant polypeptides. Differences in the activity of a particular FGF21 mutant polypeptide can be observed between in vivo and in vitro assays; any such differences are related to the specific samples used. This observation, however, does not affect the meaning of the term biologically active and FGF21 mutant polypeptides, which elicit natural activity of the wild-type FGF21 polypeptide, such as the ability to lower blood glucose, insulin, triglyceride, or cholesterol; reduce body weight; and improve glucose tolerance, energy expenditure or insulin sensitivity, in any in vivo or in vitro assay are biologically active.

Термины эффективное количество и терапевтически эффективное количество используются взаимозаменяемо и касаются количества FGF21 мутантного полипептида, используемого для поддержания наблюдаемого уровня одной или нескольких биологических активностей полипептида FGF21 дикого типа, такой как способность снижать глюкозу в крови, инсулин, триглицерид или уровни холестерина; снижать вес тела; или улучшать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину.The terms effective amount and therapeutically effective amount are used interchangeably and refer to the amount of an FGF21 mutant polypeptide used to maintain an observed level of one or more biological activities of a wild-type FGF21 polypeptide, such as the ability to lower blood glucose, insulin, triglyceride, or cholesterol levels; reduce body weight; or improve glucose tolerance, energy expenditure, or insulin sensitivity.

Термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель, использующийся здесь, касается одного или нескольких материалов композиции, пригодных для реализации или усиления доставки FGF21 мутантного полипептида. Примеры таких материалов можно найти в работе Remington, supra, на которую в данной заявке сделана ссылка.The term "pharmaceutically acceptable carrier" or "physiologically acceptable carrier" as used herein refers to one or more composition materials suitable for realizing or enhancing delivery of an FGF21 mutant polypeptide. Examples of such materials can be found in Remington, supra, to which reference is made in this application.

Термин связанная молекула касается конструкта, включающего две или несколько FGF21 молекул, связанных молекулой линкера. Связанная молекула включает по меньшей мере два FGF21 полипептида, по меньшей мере один из которых является FGF21 мутантным полипептидом, описанным здесь, но может включать три, четыре или больше FGF21 или FGF21 мутантных полипептида, соединенных с помощью линкеров. Таким образом, термин связанная молекула не ограничивается молекулой, включающей комбинации только одного или двух FGF21 или FGF21 мутантных полипептидов.The term linked molecule refers to a construct comprising two or more FGF21 molecules linked by a linker molecule. The associated molecule includes at least two FGF21 polypeptides, at least one of which is the FGF21 mutant polypeptide described herein, but may include three, four or more FGF21 or FGF21 mutant polypeptides linked by linkers. Thus, the term linked molecule is not limited to a molecule comprising combinations of only one or two FGF21 or FGF21 mutant polypeptides.

Термин сайт присоединения полимера касается области главной аминокислотной последовательности полипептида (например, FGF21 полипептида), которая химически адаптируема к ковалентной ассоциации с полимером (например, молекулой ПЭГ всех молекулярных весов, полимерной маннозой, гликанами и т.д.). Сайт присоединения полимера может означать отдельную аминокислоту (например, цистеин, лизин, аргинин или приемлемую неприродную аминокислоту), или данный термин может относиться к двум или большему количеству аминокислот, которые находятся по соседству одна с другойThe term polymer attachment site refers to a region of the main amino acid sequence of a polypeptide (eg, FGF21 polypeptide) that is chemically adaptable to covalent association with a polymer (eg, PEG molecule of all molecular weights, polymeric mannose, glycans, etc.). A polymer attachment site may refer to a single amino acid (e.g., cysteine, lysine, arginine, or a suitable non-natural amino acid), or the term may refer to two or more amino acids that are adjacent to one another.

- 5 041758 или в последовательности или в пространстве.- 5 041758 or in sequence or in space.

Термин химически модифицированный, используемый в отношении FGF21 дикого типа или FGF21 мутантного полипептида, описаного здесь, касается FGF21 полипептида, который был модифицирован из своего природного состояния путем ковалентного присоединения одной или нескольких гетерологических молекул. Примеры гетерологических молекул включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(К-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, полипропилен оксид/этилен оксид сополимеры, полиоксиэтилированные полиолы, гидроксилэтил крахмал (ГЭК), и поливиниловый спирт. Примеры химически модифицированных FGF21 полипептидов включают ПЭГилированные FGF21 полипетиды дикого типа и FGF21 мутантные полипептиды.The term chemically modified, as used in relation to a wild-type FGF21 or FGF21 mutant polypeptide described herein, refers to an FGF21 polypeptide that has been modified from its natural state by covalent attachment of one or more heterologous molecules. Examples of heterologous molecules include polyethylene glycol (PEG), monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(K-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, polypropylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols, hydroxyl ethyl starch (HES), and polyvinyl alcohol. Examples of chemically modified FGF21 polypeptides include PEGylated wild-type FGF21 polypeptides and FGF21 mutant polypeptides.

2. FGF21 мутантные полипептиды.2. FGF21 mutant polypeptides.

В различных аспектах настоящее изобретение раскрывает ряд способов для сайт-направленного ПЭГилирования FGF21 и FGF21 мутантных полипептидов, которое может усилить фармакокинетические свойства FGF21 молекулы при минимизации влияния на in vitro активность. Усиленный фармакокинетический профиль этих ПЭГилированных FGF21 молекул оказывает воздействие на in vivo эффективность данной молекулы путем увеличения экспозиции по отношению к данному терапевтическому агенту. Кроме того, описанные здесь стратегии совместимы с созданием множественных сайтов ПЭГилирования, которые могут дополнительно усилить фармакокинетические свойства данной молекулы и снизить их вакуолеформирующий потенциал. Для реализации этого были применены две главные стратегии, описанные здесь.In various aspects, the present invention discloses a number of methods for site-directed PEGylation of FGF21 and FGF21 mutant polypeptides, which can enhance the pharmacokinetic properties of the FGF21 molecule while minimizing the effect on in vitro activity. The enhanced pharmacokinetic profile of these PEGylated FGF21 molecules affects the in vivo efficacy of that molecule by increasing exposure to that therapeutic agent. In addition, the strategies described here are compatible with the creation of multiple PEGylation sites, which can further enhance the pharmacokinetic properties of a given molecule and reduce their vacuole-forming potential. To accomplish this, two main strategies have been applied, described here.

В одном аспекте, настоящее изобретение касается FGF21 последовательностей, в которые были введены одна или несколько модификаций. Таким образом, термины FGF21 мутантный полипептид и FGF21 мутант, которые могут использоваться взаимозаменяемо, относятся к FGF21 полипептиду, в котором аминокислотная последовательность FGF21 дикого типа (например, SEQ ID номера 2 или 4) была модифицирована. Такие модификации включают, однако, не ограничиваясь этим, одну или несколько аминокислотных субституций, включая субституции неприродными аминокислотными аналогами, инсерции и процессинг. Так, FGF21 полипептидные мутанты включают, однако, не ограничиваясь этим, сайт-направленные FGF21 мутанты, такие как вводящие сайт присоединения неприродного полимера, или которые влияют на степень сопротивления протеолизу, как здесь описано. Для идентификации специфических аминокислотных субституций FGF21 мутантов настоящего изобретения нумерация усеченных или мутированных остатков отвечает нумерации зрелого 181-остаточного FGF21 полипептида (т.е. N-конец данной последовательности начинается HPIPD, и эти остатки обозначены как остатки 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно). N-Концевой метиониновый остаток может присутствовать, но в этом нет потребности; этот N-концевой метиониновый остаток не включен в схему нумерации данного протеина.In one aspect, the present invention relates to FGF21 sequences that have been introduced one or more modifications. Thus, the terms FGF21 mutant polypeptide and FGF21 mutant, which can be used interchangeably, refer to an FGF21 polypeptide in which the wild-type FGF21 amino acid sequence (eg, SEQ ID number 2 or 4) has been modified. Such modifications include, but are not limited to, one or more amino acid substitutions, including substitutions with non-natural amino acid analogs, insertions, and processing. Thus, FGF21 polypeptide mutants include, but are not limited to, site-directed FGF21 mutants, such as those that introduce a non-natural polymer attachment site, or that affect the degree of resistance to proteolysis, as described herein. To identify specific amino acid substitutions of the FGF21 mutants of the present invention, the numbering of the truncated or mutated residues corresponds to the numbering of the mature 181-residue FGF21 polypeptide (i.e., the N-terminus of this sequence begins HPIPD, and these residues are designated as residues 1, 2, 3, 4 and 5 respectively). An N-terminal methionine residue may be present but need not be; this N-terminal methionine residue is not included in the numbering scheme for this protein.

Как указывалось, FGF21 мутанты, включая усеченные формы FGF21, включающие одну или несколько субституций или инсерций, которые содержат неприродные аминокислоты, составляют вариант данного изобретения. Такие инсерции или субституции могут влиять на различные свойства, включая их действие как сайтов для присоединения полимера. В таких случаях неприродные аминокислоты могут быть введены в FGF21 последовательность в дополнение к описанным здесь различным мутациям. Соответственно FGF21 мутант может включать одну или несколько мутаций, описанных здесь, и может дополнительно включать одну или несколько неприродных аминокислот. Неполный список примеров неприродных аминокислот, которые могут быть внедрены в FGF21 последовательность или могут замещать остаток дикого типа в FGF21 последовательности, включают β-аминокислоты, гомоаминокислоты, циклические аминокислоты и аминокислоты с дериватизированными боковыми цепями. Примеры включают (в L-форме или D-форме; сокращения как в скобках): пара-ацетилфенилаланин, пара-азидофенилаланин, пара-бромо-фенилаланин, пара-йодо-фенилаланин и пара-этинилфенилаланин, цитруллин (Cit), гомоцитруллин (hCit), Na-метилцитруллин (NMeCit), Na-метилгомоцитруллин (Na-MeHoCit), орнитин (Orn), Na-метилорнитин (Na-MeOrn или NMeOrn), саркозин (Sar), гомолизин (hLys или hK), гомоаргинин (hArg или hR), гомоглутамин (hQ), Na-метиларгинин (NMeR), Na-метиллейцин (Na-MeL или NMeL), N-метилгомолизин (NMeHoK), Na-метилглутамин (NMeQ), норлейцин (Nle), норвалин (Nva), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (Tic), октагидроиндол-2-карбоновая кислота (Oic), 3-(1-нафтил)аланин (1Nal), 3-(2-нафтил)аланин (2-Nal), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (Tic), 2-инданилглицин (IgI), парайодофенилаланин (pI-Phe), пара-аминофенилаланин (4AmP или 4-Amino-Phe), 4-гуанидино фенилаланин (Guf), глициллизин (сокращенно K(Nε-glycyl) или K(glycyl) или K(gly)), нитрофенилаланин (нитроф), аминофенилаланин (аминоф или Amino-Phe), бензилфенилаланин (бензилфе), γ-карбоксиглутаминовая кислота (γ-карбоксиглу), гидроксипролин (гидроксипро), р-карбоксилфенилаланин (Сра), α-аминоадипиновая кислота (Aad), Na-метилвалин (NMeVal), N-a-метиллейцин (NMeLeu), Naметилнорлейцин (NMeNle), циклопентилглицин (Cpg), циклогексилглицин (Chg), ацетиларгинин (ацетиларг), α, β-диаминопропионовая кислота (Dpr), α,γ-диаминомасляная кислота (Dab), диаминопропионовая кислота (Dap), циклогексилаланин (Cha), 4-метилфенилаланин (MePhe), β,β-дифенил-аланин (BiPhA), аминомасляная кислота (Abu), 4-фенилфенилаланин (или бифенилаланин; 4Bip), α-аминоизомаслянаяAs indicated, FGF21 mutants, including truncated forms of FGF21 that include one or more substitutions or insertions that contain non-natural amino acids, constitute a variant of the present invention. Such insertions or substitutions can affect a variety of properties, including their function as polymer attachment sites. In such cases, non-natural amino acids may be introduced into the FGF21 sequence in addition to the various mutations described here. Accordingly, an FGF21 mutant may include one or more of the mutations described herein, and may additionally include one or more unnatural amino acids. A non-exhaustive list of examples of non-natural amino acids that can be introduced into the FGF21 sequence or can replace a wild-type residue in the FGF21 sequence include β-amino acids, homoamino acids, cyclic amino acids, and amino acids with derivatized side chains. Examples include (in L-form or D-form; abbreviations as in brackets): para-acetylphenylalanine, para-azidophenylalanine, para-bromo-phenylalanine, para-iodo-phenylalanine and para-ethynylphenylalanine, citrulline (Cit), homocitrulline (hCit ), Na-methylcitrulline (NMeCit), Na-methylhomocitrulline (Na-MeHoCit), ornithine (Orn), Na-methylornithine (Na-MeOrn or NMeOrn), sarcosine (Sar), homolysin (hLys or hK), homoarginine (hArg or hR), homoglutamine (hQ), Na-methylarginine (NMeR), Na-methylleucine (Na-MeL or NMeL), N-methylhomolisin (NMeHoK), Na-methylglutamine (NMeQ), norleucine (Nle), norvaline (Nva), 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline (Tic), octahydroindole-2-carboxylic acid (Oic), 3-(1-naphthyl)alanine (1Nal), 3-(2-naphthyl)alanine (2-Nal), 1 ,2,3,4-tetrahydroisoquinoline (Tic), 2-indanylglycine (IgI), para-iodophenylalanine (pI-Phe), para-aminophenylalanine (4AmP or 4-Amino-Phe), 4-guanidino-phenylalanine (Guf), glycillisine (abbreviated K(Nε-glycyl) or K(glycyl) or K(gly)), nitrophenylalanine (nitrof), aminophenylalanine (aminoph or Amino- Phe), benzylphenylalanine (benzylphe), γ-carboxyglutamic acid (γ-carboxyglu), hydroxyproline (hydroxypro), p-carboxyphenylalanine (Cpa), α-aminoadipic acid (Aad), Na-methylvaline (NMeVal), N-a-methylleucine (NMeLeu ), Namethylnorleucine (NMeNle), cyclopentylglycine (Cpg), cyclohexylglycine (Chg), acetylarginine (acetylarg), α,β-diaminopropionic acid (Dpr), α,γ-diaminobutyric acid (Dab), diaminopropionic acid (Dap), cyclohexylalanine ( Cha), 4-methylphenylalanine (MePhe), β,β-diphenyl-alanine (BiPhA), aminobutyric acid (Abu), 4-phenylphenylalanine (or biphenylalanine; 4Bip), α-aminoisobutyric

- 6 041758 кислота (Aib), бета-аланин, бета-аминопропионовая кислота, пиперидиновая кислота, аминокапроновая кислота, аминогептановая кислота, аминопимелиновая кислота, десмозин, диаминопимелиновая кислота, N-этилглицин, N-этиласпаргин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, изодесмозин, аллоизолейцин, Nметилглицин, N-метилизолейцин, N-метилвалин, 4-гидроксипролин (Hyp), γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,Nтриметиллизин, ε-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, ω-метиларгинин, 4-амино-О-фталевая кислота (4АРА), и другие подобные аминокислоты, и дериватизированные формы всех конкретно перечисленных соединений.- 6 041758 acid (Aib), beta-alanine, beta-aminopropionic acid, piperidic acid, aminocaproic acid, aminoheptanoic acid, aminopimelic acid, desmosine, diaminopimelic acid, N-ethylglycine, N-ethylaspargine, hydroxylysine, allohydroxylysine, isodesmosine, alloisoleucine, N-methylglycine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, 4-hydroxyproline (Hyp), γ-carboxyglutamate, ε-N,N,N-trimethyllysine, ε-N-acetylysine, O-phosphoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine, 3-methylhistidine , 5-hydroxylysine, ω-methylarginine, 4-amino-O-phthalic acid (4APA), and other similar amino acids, and derivatized forms of all specifically listed compounds.

В других вариантах настоящего изобретения FGF21 мутантный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 85% идентична аминокислотной последовательности FGF21 дикого типа (например, SEQ ID NOs: 2 или 4), но где специфические остатки, вводящие сайты присоединения неприродного полимера в FGF21 мутантном полипептиде, не были дополнительно модифицированы. Другими словами, за исключением остатков в FGF21 мутантной последовательности, которые были модифицированы для введения сайта присоединения неприродного полимера, или мутации для повышения резистентности к протеолизу, около 15% всех других аминокислотных остатков в FGF21 мутантной последовательности могут быть модифицированы. Например, в FGF21 мутантном полипептиде G170C, до 15% всех аминокислотных остатков, отличных от глицинового остатка в положении 170, могут быть модифицированы. В еще других вариантах, FGF21 полипептидный мутант включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 90% или приблизительно 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности FGF21 дикого типа (например, SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8), но где специфические остатки, которые были модифицированы для введения сайта присоединения неприродного полимера или усиления резистентности к протеолизу, дополнительно не модифицировались. Такие FGF21 мутантные полипептиды обладают по меньшей мере одной активностью полипептида FGF21 дикого типа.In other embodiments of the present invention, the FGF21 mutant polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least about 85% identical to the amino acid sequence of wild-type FGF21 (e.g., SEQ ID NOs: 2 or 4), but where specific residues introducing non-natural polymer attachment sites in FGF21 mutant polypeptide have not been further modified. In other words, with the exception of residues in the FGF21 mutant sequence that have been modified to introduce a non-natural polymer attachment site, or a mutation to increase resistance to proteolysis, about 15% of all other amino acid residues in the FGF21 mutant sequence can be modified. For example, in the FGF21 mutant G170C polypeptide, up to 15% of all amino acid residues other than the glycine residue at position 170 may be modified. In still other embodiments, the FGF21 polypeptide mutant comprises an amino acid sequence that is at least about 90% or about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of wild-type FGF21 (e.g., SEQ ID NOS: 2, 4, 6 or 8), but where specific residues that have been modified to introduce a non-natural polymer attachment site or enhance resistance to proteolysis have not been further modified. Such FGF21 mutant polypeptides have at least one wild-type FGF21 polypeptide activity.

FGF21 мутантные полипептиды могут быть генерированы путем введения аминокислотных субституций, консервативных или неконсервативных по своей природе, и с использованием природных или неприродных аминокислот, в особых положениях FGF21 полипептида. Такие субституции могут быть сделаны в дополнение к субституциям, сконструированным (или наблюдаемым) для придания желательного свойства FGF21 полипептиду. В качестве примера, FGF21 мутантный полипептид может включать субституцию, сконструированную для получения желательного свойства, такого как введение сайта присоединения неприродного полимера или усиления резистентности к протеолизу, и может дополнительно включать одну или несколько консервативных или неконсервативных субституций, которые могут, но это не обязательно, поддерживать биологическую активность полипептида FGF21 дикого типа.FGF21 mutant polypeptides can be generated by introducing amino acid substitutions, either conservative or non-conservative in nature, and using natural or non-natural amino acids, at specific positions in the FGF21 polypeptide. Such substitutions may be made in addition to substitutions designed (or observed) to confer the desired property on the FGF21 polypeptide. As an example, an FGF21 mutant polypeptide may include a substitution designed to provide a desired property, such as introducing a non-natural polymer attachment site or enhancing proteolysis resistance, and may further include one or more conservative or non-conservative substitutions that may, but need not, maintain the biological activity of the wild-type FGF21 polypeptide.

FGF21 мутации могут быть консервативными или неконсервативными. Консервативная аминокислотная субституция может включать субституцию остатка природной аминокислоты (т.е. остатка, который находится в данном положении полипептидной последовательности FGF21 дикого типа) с неприродным остатком (т.е. остатком, который не находится в данном положении полипептидной последовательности FGF21 дикого типа), таким образом, что это оказывает малое влияние или вообще не оказывает влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка в этом положении. Консервативные аминокислотные субституции также охватывают остатки неприродных аминокислот, которые обычно вводятся путем химического пептидного синтеза, а не синтезом в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие обратные или инвертированные формы аминокислотных составляющих.FGF21 mutations can be conservative or non-conservative. Conservative amino acid substitution may include substitution of a naturally occurring amino acid residue (i.e., a residue that is at a given position in the wild-type FGF21 polypeptide sequence) with a non-natural residue (i.e., a residue that is not at that position in the wild-type FGF21 polypeptide sequence), such that it has little or no effect on the polarity or charge of the amino acid residue at that position. Conservative amino acid substitutions also encompass unnatural amino acid residues that are typically introduced by chemical peptide synthesis rather than synthesis in biological systems. These include peptidomimetics and other reversed or inverted forms of amino acid moieties.

Природные остатки могут быть разделены на классы, основываясь на общих свойствах боковых цепей:Natural residues can be divided into classes based on the general properties of the side chains:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;(1) hydrophobic: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr;(2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr;

(3) кислотные: Asp, Glu;(3) acidic: Asp, Glu;

(4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg;(4) basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.(5) residues that affect chain orientation: Gly, Pro; and (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe.

Консервативные субституции могут включать обмен члена одного из этих классов на другой член из того же класса. Неконсервативные субституции могут включать обмен члена одного из этих классов на член из другого класса.Conservative substitutions may involve the exchange of a member of one of these classes for another member of the same class. Non-conservative substitutions may involve exchanging a member of one of these classes for a member from another class.

Желательные аминокислотные субституции (консервативные или неконсервативные) могут быть определены специалистами в данной области в то время, когда они необходимы. Иллюстративный (но не ограничивающий) список аминокислотных субституций представлен в табл. 1.Desired amino acid substitutions (conservative or non-conservative) can be determined by those skilled in the art at the time they are needed. An illustrative (but not limiting) list of amino acid substitutions is presented in Table. 1.

- 7 041758- 7 041758

Таблица 1Table 1

Аминокислотные субституцииAmino acid substitutions

Оригинальный остаток original balance Иллюстративные субституции Illustrative substitutions Ala Ala Vai, Leu, He Vai, Leu, He Arg Arg Lys, Gin, Asn Lys, Gin, Asn Asn Asn Gin gin Asp asp Glu Glu Cys Cys Ser, Ala Ser, Ala Gin gin Asn Asn Glu Glu Asp asp Gly gly Pro,Ala Pro,Ala His His Asn, Gin, Lys, Arg Asn, Gin, Lys, Arg He He Leu, Vai, Met, Ala, Phe Leu, Vai, Met, Ala, Phe Leu Leu lie, Vai, Met, Ala, Phe lie, Vai, Met, Ala, Phe Lys Lys Arg, Gin, Asn Arg, Gin, Asn Met Met Leu, Phe, He Leu, Phe, He Phe Phe Leu, Vai, He, Ala, Tyr Leu, Vai, He, Ala, Tyr Pro Pro Ala Ala Ser Ser Thr, Ala, Cys Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp trp Tyr, Phe Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Trp, Phe, Thr, Ser Vai Vai He, Met, Leu, Phe, Ala He, Met, Leu, Phe, Ala

2.A. FGF21 мутантные полипептиды, включающие протеолизрезистентную мутацию.2.A. FGF21 mutant polypeptides comprising a proteolysis-resistant mutation.

Было установлено, что зрелая форма FGF21 (т.е. форма с 181 остатком) претерпевает in vivo деградацию, что, как было определено, обусловлено протеолитическим воздействием. Было найдено, что in vivo деградация зрелого FGF21 приводит к более короткому периоду эффективного полураспада, что может отрицательным образом влиять на терапевтический потенциал данной молекулы. Соответственно было проведено направленное исследование для идентификации FGF21 мутантов, которые проявляют резистентность к протеолизу. В результате этого исследования сайты в зрелом FGF21 полипептиде, которые, как было найдено, особенно склонны к протеолизу, включают пептидную связь между аминокислотными остатками в положениях 4-5, 20-21, 151-152 и 171-172.The mature form of FGF21 (ie, the 181 residue form) was found to be degraded in vivo, which was determined to be due to proteolytic action. It has been found that in vivo degradation of mature FGF21 leads to a shorter effective half-life, which may adversely affect the therapeutic potential of this molecule. Accordingly, a targeted study was conducted to identify FGF21 mutants that exhibit resistance to proteolysis. As a result of this study, sites in the mature FGF21 polypeptide found to be particularly prone to proteolysis include a peptide bond between amino acid residues at positions 4-5, 20-21, 151-152 and 171-172.

Неограничивающий перечень иллюстративных субституций, которые устраняют протеолитический эффект, наблюдавшийся в зрелом FGF21, и не оказывают значительного воздействия на биологическую активность данного протеина, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, представлен в табл. 2. Табл. 2 носит лишь иллюстративный характер, и в настоящем изобретении могут быть идентифицированы и применены другие протеолиз-резистентные субституции. Эти протеолиз-резистентные субституции могут быть сделаны в дополнение к субституциям, которые вводят один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров, генерируя тем самым FGF21 мутантный полипептид, проявляющий необходимые свойства, которые вносятся каждым типом мутации.A non-limiting list of illustrative substitutions that abolish the proteolytic effect observed in mature FGF21 and do not significantly affect the biological activity of this protein, which can be used in the present invention, is presented in table. 2. Tab. 2 is illustrative only and other proteolysis-resistant substitutions can be identified and used in the present invention. These proteolysis-resistant substitutions can be made in addition to substitutions that introduce one or more non-natural polymer attachment sites, thereby generating an FGF21 mutant polypeptide that exhibits the desired properties that each type of mutation introduces.

Таблица 2table 2

Репрезентативные субституции, которые обеспечивают резистентность к протеолизуRepresentative substitutions that confer resistance to proteolysis

Аминокислотное положение Amino acid position Природный остаток natural residue Мутации Mutations 19 19 Arg Arg Gin, He, Lys Gin, He, Lys 20 20 Туг Tugh His, Leu, Phe His, Leu, Phe 21 21 Leu Leu lie, Phe, Tyr, Vai lie, Phe, Tyr, Vai 22 22 Туг Tugh lie, Phe, Vai lie, Phe, Vai 150 150 Pro Pro Ala, Arg Ala, Arg 151 151 Gly gly Ala, Vai Ala, Vai 152 152 lie lie His, Leu, Phe, Vai His, Leu, Phe, Vai 170 170 Gly gly Ala, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Pro, Ser Ala, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Pro, Ser 171 171 Pro Pro Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Lys, Ser, ir, Trp, Tyr Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Lys, Ser, ir, Trp, Tyr 172 172 Ser Ser Leu, Thr Leu, Thr 173 173 Gin gin Arg, Glu Arg, Glu

Предпочтительно, но необязательно, когда FGF21 мутантные полипептиды, включающие протеолиз-резистентную мутацию, имеют биологическую активность, существенно такую же, или более высокую, чем активность FGF21 дикого типа. Поэтому другой вариант настоящего изобретения направлен на FGF21 мутантные полипептиды, которые включают один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров и резистентны к протеолизу, и все еще сохраняют биологическую активность, которая отвечает биологической активности или больше, чем таковая у FGF21 дикого типа. Хотя это менее желательно в некоторых случаях, FGF21 мутанты, которые включают один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров и резистентны к протеолизу, но проявляют несколько сниженную биологическую активность, составляют еще один вариант настоящего изобретения. В некоторых случаях может быть желательным сохранять некоторую степень протеолиза, и как следствие, FGF21 мутанты, включающие один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров, и которые резистентны к протеолизу, но все же позволяют осуществлять некоторую степень протеолиза, также составляют еще один вариант настоящего изобретения.Preferably, but not necessarily, the FGF21 mutant polypeptides comprising the proteolysis resistance mutation have a biological activity substantially the same as or greater than that of wild-type FGF21. Therefore, another embodiment of the present invention is directed to FGF21 mutant polypeptides that include one or more non-natural polymer attachment sites and are resistant to proteolysis and still retain a biological activity that matches or is greater than that of wild-type FGF21. Although less desirable in some instances, FGF21 mutants that include one or more non-natural polymer attachment sites and are resistant to proteolysis but exhibit somewhat reduced biological activity constitute another embodiment of the present invention. In some cases, it may be desirable to retain some degree of proteolysis, and as a consequence, FGF21 mutants comprising one or more non-natural polymer attachment sites that are resistant to proteolysis but still allow some degree of proteolysis also constitute another embodiment of the present invention.

Как и все FGF21 мутантные полипептиды настоящего изобретения, протеолиз-резистентные FGF21 мутантные полипептиды, включающие один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеAs with all FGF21 mutant polypeptides of the present invention, proteolysis-resistant FGF21 mutant polypeptides comprising one or more non-natural polymer attachment sites

- 8 041758 ров, могут быть получены, как здесь описано. Обычные специалисты в данной области, например, знакомые со стандартными способами молекулярной биологии, могут применить эти знания, совместно с настоящей заявкой, для получения и использования протеолиз-резистентных FGF21 мутантов, включающих один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров настоящего изобретения. Стандартные способы могут быть использованы для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, культивирования тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция); см., например, работу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на которую в данной заявке сделана ссылка. Ферментативные реакции и способы очистки могут быть реализованы в соответствии со спецификациями производителя, как обычно делается в данной области, или как описано в данной заявке. Если не сделаны специальные оговорки, номенклатура, использованная в связи с лабораторными процедурами и способами аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, описанными здесь, хорошо известна и обычно применяется в данной области. Стандартные способы могут быть использованы для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов и их составления, и доставки; и лечения пациентов.- 8 041758 ditch, can be obtained as described here. Those of ordinary skill in the art, such as those familiar with standard molecular biology techniques, can apply this knowledge, in conjunction with the present application, to generate and use proteolysis-resistant FGF21 mutants comprising one or more attachment sites for the non-natural polymers of the present invention. Standard methods can be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, tissue culture and transformation (eg, electroporation, lipofection); see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, to which reference is made in this application. Enzymatic reactions and purification methods may be carried out according to the manufacturer's specifications, as is commonly done in the art, or as described herein. Unless otherwise noted, the nomenclature used in connection with the laboratory procedures and methods of analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein is well known and commonly used in the art. Standard methods can be used for chemical synthesis, chemical analysis, pharmaceuticals and their formulation and delivery; and treatment of patients.

Протеолиз-резистентные FGF21 мутанты, включающие один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров, которые резистентны к протеолизу, могут быть химически модифицированы с использованием способов, известных в данной области и описанных здесь. Химическое модифицирование (например, ПЭГилирование) протеолиз-резистентного FGF21 мутантного полипептида, включающего один или несколько сайтов присоединения неприродного полимера, может сгенерировать молекулы, которые проявляют как резистентность к протеолизу так и необходимые фармакокинетические и фармакодинамические свойства.Proteolysis-resistant FGF21 mutants comprising one or more non-natural polymer attachment sites that are resistant to proteolysis can be chemically modified using methods known in the art and described here. Chemical modification (eg, PEGylation) of a proteolysis-resistant FGF21 mutant polypeptide comprising one or more non-natural polymer attachment sites can generate molecules that exhibit both resistance to proteolysis and desirable pharmacokinetic and pharmacodynamic properties.

2.В. FGF21 мутантные полипептиды, включающие сайт присоединения неприродного полимера.2.B. FGF21 mutant polypeptides containing a non-natural polymer attachment site.

В различных аспектах настоящего изобретения раскрыты FGF21 мутантные полипептиды. В другом аспекте, FGF21 мутантные полипептиды настоящего изобретения включают FGF21 полипептиды, в которые введен сайт(ы) присоединения неприродного полимера (например, ПЭГилирование). В еще одном аспекте настоящего изобретения раскрыты усеченные формы FGF21 мутантных полипептидов, в которые введен сайт(ы) присоединения неприродного полимера (например, ПЭГ). FGF21 мутантные полипептиды, включающие сайт присоединения неприродного полимера и одну или несколько консервативных или неконсервативных субституций, которые могут, но необязательно, поддерживать биологическую активность FGF21 дикого типа, составляют еще один аспект данного изобретения. Различные FGF21 полипептидные мутанты настоящего изобретения могут быть приготовлены, как описано здесь и как описано в работах, на которые в настоящей заявке сделаны ссылки.FGF21 mutant polypeptides are disclosed in various aspects of the present invention. In another aspect, the FGF21 mutant polypeptides of the present invention include FGF21 polypeptides into which a non-natural polymer attachment site(s) (eg, PEGylation) has been introduced. In yet another aspect of the present invention, truncated forms of FGF21 mutant polypeptides are provided into which a non-natural polymer (eg, PEG) attachment site(s) is introduced. FGF21 mutant polypeptides comprising a non-natural polymer attachment site and one or more conserved or non-conserved substitutions that may, but need not, maintain the biological activity of wild-type FGF21 constitute another aspect of the present invention. Various FGF21 polypeptide mutants of the present invention can be prepared as described here and as described in the works to which reference is made in this application.

В одном варианте FGF21 полипептидные мутанты настоящего изобретения модифицированы путем введения сайта присоединения неприродного полимера. Действительно, в одном аспекте это является целью FGF21 мутантов настоящего изобретения, а именно введение одного или нескольких сайтов присоединения неприродных полимеров, такое, что полимеры с расширенным периодом полураспада могут быть присоединены к FGF21 полипептидному мутанту в необходимых положениях. Выбранный полимер является, обычно, но не обязательно, водорастворимым, так что протеин, к которому он присоединен, не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. В объем приемлемых полимеров включена смесь полимеров. Лучше, когда для терапевтического использования конечного препарата данный полимер является фармацевтически приемлемым, такой как ПЭГ приемлемого молекулярного веса. Полимеры, которые не являются водорастворимыми, такие как блоксополимеры ПЭГ и жирной кислоты, также могут быть конъюгированы с FGF21 полипептидными мутантами настоящего изобретения и составляют отдельный аспект данного изобретения.In one embodiment, the FGF21 polypeptide mutants of the present invention are modified by introducing a non-natural polymer attachment site. Indeed, in one aspect, it is the goal of the FGF21 mutants of the present invention, namely to introduce one or more attachment sites for non-natural polymers, such that polymers with extended half-life can be attached to the FGF21 polypeptide mutant at the desired positions. The selected polymer is usually, but not necessarily, water-soluble, so that the protein to which it is attached does not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. The scope of acceptable polymers includes a mixture of polymers. It is better when for the therapeutic use of the final product, this polymer is pharmaceutically acceptable, such as PEG of acceptable molecular weight. Polymers that are not water soluble, such as PEG-fatty acid block copolymers, can also be conjugated to the FGF21 polypeptide mutants of the present invention and constitute a separate aspect of the present invention.

Активность FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения может быть проанализирована разнообразными способами, например, с использованием in vitro ELK-люциферазного анализа, как описано в примере 10.The FGF21 activity of the mutant polypeptides of the present invention can be analyzed in a variety of ways, for example, using the in vitro ELK-luciferase assay as described in Example 10.

Активность FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения может также быть оценена in vivo пробе, такой как на ob/ob мышах, как показано в примере 12. В общем, оценить in vivo активность одного или нескольких из этих полипептидов можно, введя интраперитонеально данный полипептид тестовому животному. Через некоторый желательный период времени или несколько таких периодов может быть взята проба крови, и могут быть измерены уровни глюкозы в крови.The FGF21 activity of the mutant polypeptides of the present invention can also be assessed in vivo assay, such as in ob/ob mice as shown in Example 12. In general, in vivo activity of one or more of these polypeptides can be assessed by administering the polypeptide intraperitoneally to a test animal. After some desired period of time or several such periods, a blood sample may be taken and blood glucose levels may be measured.

Как и для всех FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения, эти полипептиды могут, при необходимости, включать аминоконцевой метиониновый остаток, который может быть введен путем направленной мутации или как результат бактериального экспрессионного процесса.As with all FGF21 mutant polypeptides of the present invention, these polypeptides may optionally include an amino-terminal methionine residue, which may be introduced by site-directed mutation or as a result of a bacterial expression process.

FGF21 мутантные полипептиды настоящего изобретения могут быть получены, как описано в примере 7. Обычные специалисты в данной области, например, знакомые со стандартными способами молекулярной биологии, могут применить эти знания, совместно с настоящей заявкой, для получения и использования FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения. Стандартные способы могут быть использованы для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, культивирования тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция); см., например, работу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на которую в данной заявке сделана ссылка. Ферментативные реакции иFGF21 mutant polypeptides of the present invention can be prepared as described in Example 7. Those of ordinary skill in the art, such as those familiar with standard molecular biology techniques, can apply this knowledge, in conjunction with the present application, to prepare and use the FGF21 mutant polypeptides of the present invention. Standard methods can be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, tissue culture and transformation (eg, electroporation, lipofection); see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, to which reference is made in this application. enzymatic reactions and

- 9 041758 способы очистки могут быть реализованы в соответствии со спецификациями производителя, как обычно делается в данной области, или как описано в данной заявке. Если не сделаны специальные оговорки, номенклатура, использованная в связи с лабораторными процедурами и способами аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, описанными здесь, хорошо известна и обычно применяется в данной области. Стандартные способы могут быть использованы для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов и их составления, и доставки; и лечения пациентов.- 9 041758 cleaning methods can be implemented in accordance with the manufacturer's specifications, as is commonly done in this area, or as described in this application. Unless otherwise noted, the nomenclature used in connection with the laboratory procedures and methods of analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein is well known and commonly used in the art. Standard methods can be used for chemical synthesis, chemical analysis, pharmaceuticals and their formulation and delivery; and treatment of patients.

После получения FGF21 мутантного полипептида он может быть химически модифицирован путем присоединения полимера, как описано в примере 9 данной заявки.After obtaining FGF21 mutant polypeptide, it can be chemically modified by adding a polymer, as described in example 9 of this application.

3. Усеченные FGF21 мутантные полипептиды, включающие сайт присоединения неприродного полимера.3. Truncated FGF21 mutant polypeptides comprising a non-natural polymer attachment site.

Один вариант настоящего изобретения направлен на усеченные формы мутантного FGF21 полипептида, включающего один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров. Такие усеченные мутантные полипептиды могут, но не обязательно, быть химически модифицированными.One embodiment of the present invention is directed to truncated forms of a mutant FGF21 polypeptide comprising one or more non-natural polymer attachment sites. Such truncated mutant polypeptides may, but need not, be chemically modified.

Используемый здесь термин усеченный FGF21 мутантный полипептид касается FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида, в котором один или несколько аминокислотных остатков удалены из амино(концевого) терминального (или Nтерминального) конца данного FGF21 полипептида, один или несколько аминокислотных остатков удалены из карбоксил-терминального (или С-терминального) конца данного FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 полипептида, или один или несколько аминокислотных остатков удалены из как N-терминального так и С-терминального концов FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 полипептида.The term truncated FGF21 mutant polypeptide as used herein refers to an FGF21 mutant polypeptide or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide in which one or more amino acid residues are removed from the amino (terminal) terminal (or N-terminal) end of the FGF21 polypeptide, one or more amino acid residues are removed from the carboxyl- terminal (or C-terminal) end of the FGF21 mutant polypeptide or chemically modified FGF21 polypeptide, or one or more amino acid residues are removed from both the N-terminal and C-terminal ends of the FGF21 mutant polypeptide or chemically modified FGF21 polypeptide.

Активность N-терминально усеченного мутанта FGF21, С-терминально усеченного мутанта FGF21 и молекул мутанта FGF21, усеченного как по N- так и по С-терминальным концам данной молекулы, также как и химически модифицированных форм этих мутантов, может быть проанализирована разнообразными способами, например, с использованием in vitro ELK-люциферазной пробы, описаного здесь в примере 10.The activity of the N-terminally truncated FGF21 mutant, the C-terminally truncated FGF21 mutant, and FGF21 mutant molecules truncated at both the N- and C-terminal ends of this molecule, as well as chemically modified forms of these mutants, can be analyzed in a variety of ways, for example , using the in vitro ELK-luciferase assay described here in Example 10.

Активность усеченных мутантных FGF21 полипептидов и химически модифицированных усеченных мутантных FGF21 полипептидов настоящего изобретения может быть также оценена с помощью in vivo пробы, такой как на ob/ob мышах, как показано в примере 12. В общем, оценить in vivo активность одного или нескольких из этих полипептидов можно, введя интраперитонеально данный полипептид тестовому животному. Через некоторый желательный период времени или несколько таких периодов может быть взята проба крови, и могут быть измерены уровни глюкозы в крови.The activity of truncated FGF21 mutant polypeptides and chemically modified truncated FGF21 mutant polypeptides of the present invention can also be assessed using an in vivo assay, such as in ob/ob mice, as shown in Example 12. In general, assess the in vivo activity of one or more of these polypeptides can be administered intraperitoneally this polypeptide to the test animal. After some desired period of time or several such periods, a blood sample may be taken and blood glucose levels may be measured.

Как и для всех FGF21 мутантов настоящего изобретения, усеченные мутантные FGF21 и химически модифицированые усеченные мутантные FGF21 полипептиды могут, при необходимости, включать аминоконцевой метиониновый остаток, который может быть введен путем направленной мутации или как результат бактериального экспрессионного процесса.As with all FGF21 mutants of the present invention, FGF21 truncated mutants and chemically modified FGF21 truncated mutants polypeptides may optionally include an amino-terminal methionine residue, which may be introduced by site-directed mutation or as a result of a bacterial expression process.

Усеченные мутантные FGF21 полипептиды настоящего изобретения могут быть получены, как описано в примере 7. Обычные специалисты в данной области, например, знакомые со стандартными способами молекулярной биологии, могут применить эти знания, совместно с настоящей заявкой, для получения и использования усеченных мутантных FGF21 полипептидов настоящего изобретения. Стандартные способы могут быть использованы для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, культивирования тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция); см., например, работу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на которую в данной заявке сделана ссылка. Ферментативные реакции и способы очистки могут быть реализованы в соответствии со спецификациями производителя, как обычно делается в данной области, или как описано в данной заявке. Если не сделаны специальные оговорки, номенклатура, использованная в связи с лабораторными процедурами и способами аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, описанными здесь, хорошо известна и обычно применяется в данной области. Стандартные способы могут быть использованы для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов и их составления, и доставки; и лечения пациентов.The truncated FGF21 mutant polypeptides of the present invention can be prepared as described in Example 7. Those of ordinary skill in the art, for example those familiar with standard molecular biology techniques, can apply this knowledge, in conjunction with the present application, to prepare and use the truncated FGF21 mutant polypeptides of the present invention. inventions. Standard methods can be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, tissue culture and transformation (eg, electroporation, lipofection); see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, to which reference is made in this application. Enzymatic reactions and purification methods may be carried out according to the manufacturer's specifications, as is commonly done in the art, or as described herein. Unless otherwise noted, the nomenclature used in connection with the laboratory procedures and methods of analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein is well known and commonly used in the art. Standard methods can be used for chemical synthesis, chemical analysis, pharmaceuticals and their formulation and delivery; and treatment of patients.

После получения усеченного мутантного FGF21 полипептида он может быть химически модифицирован путем присоединения полимера, как описано в примере 9 данной заявки.After obtaining a truncated mutant FGF21 polypeptide, it can be chemically modified by attaching a polymer, as described in example 9 of this application.

4. Кэппированные и C-концевые FGF21 мутантные полипептиды.4. Capped and C-terminal FGF21 mutant polypeptides.

В другом варианте, настоящее изобретение направлено на мутантные FGF21 полипептиды, включающие один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров, которые были кэппированы путем добавления другого одного или нескольких остатков к С-концу данного полипептида, расширяя данную аминокислотную последовательность за пределы протеина дикого типа. В еще одном варианте, настоящее изобретение направлено на FGF21 мутантные полипептиды, включающие один или несколько сайтов присоединения неприродных полимеров, которые дополнительно включают одну или несколько С-концевых мутаций. Такие кэппированные и С-терминально мутированные FGF21 мутантные полипептиды могут, но это необязательно, быть химически модифицированы.In another embodiment, the present invention is directed to FGF21 mutant polypeptides comprising one or more non-natural polymer attachment sites that have been capped by adding another one or more residues to the C-terminus of the polypeptide, extending the amino acid sequence beyond the wild-type protein. In yet another embodiment, the present invention is directed to FGF21 mutant polypeptides comprising one or more non-natural polymer attachment sites, which further comprise one or more C-terminal mutations. Such capped and C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptides may, but need not, be chemically modified.

- 10 041758- 10 041758

Используемый здесь термин кэппированный FGF21 мутантный полипептид касается FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида, в котором один или несколько аминокислотных остатков были добавлены к С-концу FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида. Любая природная или неприродная аминокислота может быть использована для кэппирования FGF21 мутантного полипептида, включая один или несколько пролиновых остатков и один или несколько глициновых остатков. Хотя последовательность FGF21 дикого типа имеет длину лишь в 181 остаток, кэппированный FGF21 мутантный полипептид увеличивает длину данного полипептида на один остаток для каждого добавленного кэппирующего остатка; в соответствии со схемой нумерации настоящей заявки кэппирующие остатки нумеруются, начиная со 182. Так, один пролиновый кэппирующий остаток обозначается как Р182. Возможны более длинные шапочки и они нумеруются соответственно (например, X182, Y183, Z184, где X, Y и Z отвечают любой природной или неприродной аминокислоте). Кэппирующие остатки могут быть добавлены к мутантному FGF21 полипептиду с использованием любого удобного способа, такого как химический, в котором ковалентное присоединение аминокислоты к С-концу данного полипептида осуществляется с помощью химической реакции. Как альтернатива, кодон, кодирующий кэппирующий остаток, может быть добавлен к кодирующей последовательности FGF21 мутантного полипептида с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Любой из описанных здесь мутантных FGF21 полипептидов может быть, при необходимости, кэппирован одним или несколькими остатками.The term capped FGF21 mutant polypeptide as used herein refers to an FGF21 mutant polypeptide or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide in which one or more amino acid residues have been added to the C-terminus of the FGF21 mutant polypeptide or the chemically modified FGF21 mutant polypeptide. Any natural or non-natural amino acid may be used to cap the FGF21 mutant polypeptide, including one or more proline residues and one or more glycine residues. Although the wild type FGF21 sequence is only 181 residues long, the FGF21 capped mutant polypeptide increases the length of the polypeptide by one residue for each added capping residue; in accordance with the numbering scheme of the present application, capping residues are numbered starting from 182. Thus, one proline capping residue is designated as P182. Longer caps are possible and are numbered accordingly (eg X182, Y183, Z184 where X, Y and Z correspond to any natural or non-natural amino acid). Capping residues can be added to the mutant FGF21 polypeptide using any convenient method, such as chemically, in which the covalent attachment of an amino acid to the C-terminus of the polypeptide is accomplished by a chemical reaction. Alternatively, a codon encoding a capping residue can be added to the FGF21 mutant polypeptide coding sequence using standard molecular biology techniques. Any of the mutant FGF21 polypeptides described herein may be capped with one or more residues, if desired.

С-концевые мутации составляют еще один аспект настоящего изобретения. Используемый здесь термин С-концевая мутация касается одной или нескольких альтераций в области остатков 91-181 (или дальше, если данный полипептид кэппирован) мутантного FGF21 полипептида. С-концевая мутация, введенная в FGF21 мутантную полипептидную последовательность, будет служить дополнением к одной или нескольким мутациям, которые вводят сайт присоединения неприродного полимера. Хотя Сконцевые мутации могут быть введены в любую точку в области 91-181 FGF21 мутантной полипептидной последовательности, иллюстративные положения для С-концевых мутаций включают положения 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 и 181. С-концевые мутации могут быть введены с использованием стандартных способов молекулярной биологии, таких как описанные в данной заявке. Любой из описанных здесь мутантных FGF21 полипептидов может включать С-концевую мутацию.C-terminal mutations constitute another aspect of the present invention. As used herein, the term C-terminal mutation refers to one or more alterations in the region of residues 91-181 (or beyond if the polypeptide is capped) of a mutant FGF21 polypeptide. A C-terminal mutation introduced into the FGF21 mutant polypeptide sequence will complement one or more mutations that introduce a non-natural polymer attachment site. Although C-terminal mutations can be introduced at any point in the FGF21 region 91-181 of the mutant polypeptide sequence, exemplary positions for C-terminal mutations include positions 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, and 181. C-terminal mutations can be introduced using standard molecular biology techniques such as those described herein. Any of the mutant FGF21 polypeptides described herein may include a C-terminal mutation.

Примеры положений и идентичностей для кэппированных и/или С-концевых мутаций приведены в табл. 3.Example positions and identities for capped and/or C-terminal mutations are shown in Table 1. 3.

Таблица 3Table 3

Примеры положений для кэппирования и/или С-концевых мутацийExample positions for capping and/or C-terminal mutations

Активность кэппированных и/или С-терминально мутированных FGF21 мутантных полипептидов так же как и химически модифицированных форм этих мутантов может быть проанализирована разнообразными способами, например, с использованием in vitro ELK-люциферазной пробы, как описано в примере 10 данной заявки.The activity of capped and/or C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptides as well as chemically modified forms of these mutants can be analyzed in a variety of ways, for example using the in vitro ELK-luciferase assay as described in Example 10 of this application.

Активность кэппированных и/или С-терминально мутированных FGF21 мутантных полипептидов, и химически модифицированных кэппированных и/или С-терминально мутированных FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения может быть также оценена in vivo пробе, такой как на ob/ob мышах, как показано в примере 12. В общем, оценить in vivo активность одного или нескольких из этих полипептидов можно, введя интраперитонеально данный полипептид тестовому животному. Через некоторый желательный период времени или несколько таких периодов может быть взята проба крови, и могут быть измерены уровни глюкозы в крови.The activity of capped and/or C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptides, and chemically modified capped and/or C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptides of the present invention can also be assessed in vivo assay, such as in ob/ob mice, as shown in Example 12 In general, the in vivo activity of one or more of these polypeptides can be assessed by intraperitoneally administering the polypeptide to a test animal. After some desired period of time or several such periods, a blood sample may be taken and blood glucose levels may be measured.

Как и для всех FGF21 мутантов настоящего изобретения, кэппированные и/или С-терминально мутированные FGF21 мутантные полипептиды, и химически модифицированые кэппированные и/или Стерминально мутированные FGF21 мутантные полипептиды могут, при необходимости, включать аминоконцевой метиониновый остаток, который может быть введен путем направленной мутации или какAs with all FGF21 mutants of the present invention, capped and/or C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptides, and chemically modified capped and/or terminally mutated FGF21 mutant polypeptides may, if desired, include an amino-terminal methionine residue, which can be introduced by directed mutation. or how

- 11 041758 результат бактериального экспрессионного процесса.- 11 041758 the result of a bacterial expression process.

Кэппированные и/или С-терминально мутированные FGF21 мутантные полипептиды настоящего изобретения могут быть получены, как описано в примере 7. Обычные специалисты в данной области, например, знакомые со стандартными способами молекулярной биологии, могут применить эти знания, совместно с настоящей заявкой, для получения и использования кэппированных и/или С-терминально мутированных FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения. Стандартные способы могут быть использованы для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, культивирования тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция); см., например, работу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на которую в данной заявке сделана ссылка. Ферментативные реакции и способы очистки могут быть реализованы в соответствии со спецификациями производителя, как обычно делается в данной области, или как описано в данной заявке. Если не сделаны специальные оговорки, номенклатура, использованная в связи с лабораторными процедурами и способами аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, описанными здесь, хорошо известна и обычно применяется в данной области. Стандартные способы могут быть использованы для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов и их составления, и доставки; и лечения пациентов.Capped and/or C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptides of the present invention may be prepared as described in Example 7. Those of ordinary skill in the art, for example those familiar with standard molecular biology techniques, may apply this knowledge, in conjunction with the present application, to obtain and the use of capped and/or C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptides of the present invention. Standard methods can be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, tissue culture and transformation (eg, electroporation, lipofection); see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, to which reference is made in this application. Enzymatic reactions and purification methods may be carried out according to the manufacturer's specifications, as is commonly done in the art, or as described herein. Unless otherwise noted, the nomenclature used in connection with the laboratory procedures and methods of analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein is well known and commonly used in the art. Standard methods can be used for chemical synthesis, chemical analysis, pharmaceuticals and their formulation and delivery; and treatment of patients.

После получения кэппированного и/или С-терминально мутированного FGF21 мутантного полипептида он может быть химически модифицирован путем присоединения полимера, как это описано в данной заявке в примере 9.After obtaining a capped and/or C-terminally mutated FGF21 mutant polypeptide, it can be chemically modified by adding a polymer, as described in this application in example 9.

5. FGF21 мутантные полипептиды, содержащие неприродные цистеиновые остатки.5. FGF21 mutant polypeptides containing unnatural cysteine residues.

В еще одном аспекте настоящего изобретения могут быть получены FGF21 мутантные полипептиды, в которых оба цистеиновых остатка в полипептидной последовательности FGF21 дикого типа заменены остатками, которые не образуют дисульфидных связей и не служат сайтами присоединения полимера, такими как аланин или серин. Затем могут быть сделаны субституции в FGF21 мутантной полипептидной последовательности, которые вводят сайты присоединения неприродных полимеров, в форме тиолсодержащих остатков (например, цистеиновых остатков или неприродных аминокислот, имеющих тиоловые группы) или свободных аминогрупп (например, лизиновых или аргининовых остатков, или неприродных аминогрупп, имеющих свободные аминогруппы). Полимеры, в которых для присоединения используются тиоловые группы или свободные аминогруппы, такие как ПЭГ, затем могут быть нацелены на цистеиновый, лизиновый или аргининовый остатки, которые были введены в FGF21 мутантную полипептидную последовательность в известных положениях. Эта стратегия может облегчить более эффективное и контролируемое размещение полимера.In yet another aspect of the present invention, FGF21 mutant polypeptides can be made in which both cysteine residues in the wild-type FGF21 polypeptide sequence are replaced by residues that do not form disulfide bonds and do not serve as polymer attachment sites, such as alanine or serine. Substitutions can then be made in the FGF21 mutant polypeptide sequence that introduce attachment sites for non-natural polymers, in the form of thiol-containing residues (e.g., cysteine residues or non-natural amino acids having thiol groups) or free amino groups (e.g., lysine or arginine residues, or non-natural amino groups, having free amino groups). Polymers that use thiol groups or free amino groups for attachment, such as PEG, can then be targeted to cysteine, lysine, or arginine residues that have been introduced into the FGF21 mutant polypeptide sequence at known positions. This strategy may facilitate more efficient and controlled placement of the polymer.

В одном подходе два природных цистеиновых остатка в полипептиде FGF21 дикого типа, которые расположены в положениях 75 и 93, могут быть замещены остатками, не содержащими тиол. Затем цистеиновый остаток может быть введен в известное местоположение. FGF21 мутантный полипептид может также включать другие мутации, которые могут вводить еще больше сайтов присоединения полимеров (например, цистеиновые остатки) или могут быть сконструированы для получения некоторого другого необходимого свойства. Примеры таких FGF21 мутантных полипептидов включают C75A/E91C/C93A/H125C/P171G и C75S/E91C/C93S/H125C/P171G. В этих примерах природные цистеины в положениях 75 и 93 были мутированы в аланиновый или сериновый остатки, сайты присоединения полимера были введены в положения 91 и 125 (в этом случае для тиол-реакционного полимера, такого как ПЭГ), и дополнительная мутация была сделана в положении 171, т.е. субституция пролина 171 глициновым остатком.In one approach, the two naturally occurring cysteine residues in the wild-type FGF21 polypeptide, which are located at positions 75 and 93, can be replaced with thiol-free residues. The cysteine residue can then be introduced at a known location. The FGF21 mutant polypeptide may also include other mutations that may introduce more polymer attachment sites (eg, cysteine residues) or may be engineered to provide some other desired property. Examples of such FGF21 mutant polypeptides include C75A/E91C/C93A/H125C/P171G and C75S/E91C/C93S/H125C/P171G. In these examples, natural cysteines at positions 75 and 93 were mutated into alanine or serine residues, polymer attachment sites were introduced at positions 91 and 125 (in this case for a thiol-reactive polymer such as PEG), and an additional mutation was made at position 171, i.e. substitution of proline 171 by glycine residue.

Подобно всем FGF21 мутантным полипептидам, которые здесь раскрыты, активность FGF21 мутантных полипептидов, которые не содержат цистеинов, находящихся в полипептидной последовательности FGF21 дикого типа, но вместо этого включают сайт присоединения полимера и, при необходимости, одну или несколько дополнительных мутаций, также как химически модифицированные формы этих мутантов, может быть проанализирована разнообразными способами, например, с использованием in vitro ELK-люциферазной пробы, как описано в примере 10. In vivo активность этих полипептидов может быть оценена in vivo пробе, такой как на ob/ob мышах, как показано в примере 12 и описанной здесь.Like all FGF21 mutant polypeptides disclosed herein, the activity of FGF21 mutant polypeptides that do not contain the cysteines found in the wild-type FGF21 polypeptide sequence, but instead include a polymer attachment site and, if necessary, one or more additional mutations, as well as chemically modified forms of these mutants can be analyzed in a variety of ways, for example, using the in vitro ELK-luciferase assay as described in Example 10. In vivo activity of these polypeptides can be assessed in vivo assay, such as in ob/ob mice, as shown in example 12 and described here.

Как и для всех FGF21 мутантов настоящего изобретения, активность FGF21 мутантных полипептидов, которые не содержат цистеинов, находящихся в полипептидной последовательности FGF21 дикого типа, но вместо этого включают сайт присоединения полимера и, при необходимости, одну или несколько дополнительных мутаций, также как химически модифицированные формы этих FGF21 мутантных полипептидов, может, при необходимости, включать аминоконцевой метиониновый остаток, который может быть введен путем направленной мутации или как результат бактериального экспрессионного процесса.As with all FGF21 mutants of the present invention, the activity of FGF21 mutant polypeptides that do not contain the cysteines found in the wild-type FGF21 polypeptide sequence, but instead include a polymer attachment site and, if necessary, one or more additional mutations, as well as chemically modified forms these FGF21 mutant polypeptides may optionally include an amino-terminal methionine residue, which may be introduced by site-directed mutation or as a result of a bacterial expression process.

FGF21 мутантные полипептиды, которые не содержат цистеинов, находящихся в полипептидной последовательности FGF21 дикого типа, но вместо этого включают введенный сайт присоединения полимера и, при необходимости, одну или несколько дополнительных мутаций, могут быть получены как описано здесь, например, в примере 7. Обычные специалисты в данной области, например, знакомые со стандартными способами молекулярной биологии, могут применить эти знания, совместно с настоящейFGF21 mutant polypeptides that do not contain the cysteines found in the wild-type FGF21 polypeptide sequence, but instead include an introduced polymer attachment site and, if necessary, one or more additional mutations can be generated as described herein, for example, in Example 7. those skilled in the art, such as those familiar with standard molecular biology techniques, can apply this knowledge, in conjunction with this

- 12 041758 заявкой, для получения и использования этих FGF21 мутантных полипептидов. Стандартные способы могут быть использованы для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, культивирования тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция); см., например, работу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на которую в данной заявке сделана ссылка. Ферментативные реакции и способы очистки могут быть реализованы в соответствии со спецификациями производителя, как обычно делается в данной области, или как описано в данной заявке. Если не сделаны специальные оговорки, номенклатура, использованная в связи с лабораторными процедурами и способами аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, описанными здесь, хорошо известна и обычно применяется в данной области. Стандартные способы могут быть использованы для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов и их составления, и доставки; и лечения пациентов.- 12 041758 application, for the production and use of these FGF21 mutant polypeptides. Standard methods can be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, tissue culture and transformation (eg, electroporation, lipofection); see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, to which reference is made in this application. Enzymatic reactions and purification methods may be carried out according to the manufacturer's specifications, as is commonly done in the art, or as described herein. Unless otherwise noted, the nomenclature used in connection with the laboratory procedures and methods of analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein is well known and commonly used in the art. Standard methods can be used for chemical synthesis, chemical analysis, pharmaceuticals and their formulation and delivery; and treatment of patients.

После получения FGF21 мутантных полипептидов, которые не содержат цистеинов, находящихся в полипептидной последовательности FGF21 дикого типа, но вместо этого включают введенный сайт присоединения полимера и, при необходимости, одну или несколько дополнительных мутаций, они могут быть химически модифицированы путем присоединения полимера, как описано в примере 9 данной заявки.After generating FGF21 mutant polypeptides that do not contain the cysteines found in the wild-type FGF21 polypeptide sequence, but instead include an introduced polymer attachment site and, if necessary, one or more additional mutations, they can be chemically modified by polymer attachment, as described in example 9 of this application.

6. Связанные молекулы.6. Related molecules.

В еще одном аспекте настоящего изобретения связанная молекула может быть получена, как здесь описано. Связанная молекула представляет собой молекулу, включающую два FGF21 полипептида, связанных линкерной молекулой. Путем соединения двух FGF21 полипептидов эффективный период полураспада и активность связанной молекулы могут быть расширены за рамки периода полураспада и активности отдельного FGF21 полипептида.In yet another aspect of the present invention, the associated molecule can be obtained as described here. A linked molecule is a molecule comprising two FGF21 polypeptides linked by a linker molecule. By linking two FGF21 polypeptides, the effective half-life and activity of the associated molecule can be extended beyond the half-life and activity of a single FGF21 polypeptide.

Связанная молекула настоящего изобретения включает линкер и два FGF21 полипептида, которые могут представлять собой два природных FGF21 полипептида, в которые мутации не вводились, два FGF21 мутантных полипептида, имеющих сайт присоединения линкера, введенный в FGF21 полипептиды, или комбинация одного природного FGF21 полипептида и одного FGF21 мутантного полипептида. Предусмотрены также связанные молекулы, включающие по меньшей мере один FGF21 полипептид, имеющий сайт присоединения неприродного линкера и одну или несколько дополнительных мутаций, что составляет еще один аспект данного изобретения. Таким образом, такие связанные молекулы могут включать мутацию, которая образует сайт для присоединения молекулы линкера, также как и еще одну мутацию для придания еще одного желательного свойства указанной связанной молекуле.The associated molecule of the present invention comprises a linker and two FGF21 polypeptides, which may be two naturally occurring FGF21 polypeptides that have not been mutated, two FGF21 mutant polypeptides having a linker attachment site introduced into FGF21 polypeptides, or a combination of one naturally occurring FGF21 polypeptide and one FGF21 mutant polypeptide. Linked molecules are also contemplated, comprising at least one FGF21 polypeptide having a non-natural linker attachment site and one or more additional mutations, which constitutes another aspect of the present invention. Thus, such linked molecules may include a mutation that provides a site for attachment of the linker molecule, as well as another mutation to confer yet another desired property on said linked molecule.

Используемый здесь термин сайт присоединения линкера означает природную или неприродную аминокислоту, имеющую функциональную группу, с которой может быть ассоциирован линкер. В одном примере сайт присоединения линкера представляет собой остаток, содержащий тиоловую группу, которая может быть ассоциирована с молекулой ПЭГ.As used herein, the term linker attachment site means a natural or non-natural amino acid having a functional group with which a linker can be associated. In one example, the linker attachment site is a residue containing a thiol group that can be associated with a PEG molecule.

.A. FGF21 полипептиды в связанной молекуле..A FGF21 polypeptides in a linked molecule.

Когда связанная молекула включает два FGF21 мутантных полипептида, данные FGF21 мутантные полипептиды могут включать один или несколько мутантов, введенных в эту последовательность, но нет необходимости в том, чтобы эти мутации находились в том же самом аминокислотном положении в каждом из FGF21 мутантных полипептидов. Например, если связанная молекула включает два FGF21 мутантных полипептида, один FGF21 мутантный полипептид может содержать Н125С мутацию, которая может образовывать точку присоединения для молекулы линкера. Напротив, другой FGF21 мутантный полипептид может содержать мутацию в положении, отличном от Н125, что может служить точкой присоединения для линкера, связывающего вместе данные два FGF21 мутантных полипептида. Даже если используются один или два FGF21 мутантных полипептида, линкер может быть присоединен к Nтерминальному концу FGF21 мутантного полипептида; необязательно, чтобы использовались введенные точки присоединения.When the linked molecule includes two FGF21 mutant polypeptides, these FGF21 mutant polypeptides may include one or more mutants introduced in this sequence, but these mutations do not need to be at the same amino acid position in each of the FGF21 mutant polypeptides. For example, if the linked molecule includes two FGF21 mutant polypeptides, one FGF21 mutant polypeptide may contain an H125C mutation that may form an attachment point for the linker molecule. Conversely, another FGF21 mutant polypeptide may contain a mutation at a position other than H125, which may serve as a point of attachment for a linker linking the two FGF21 mutant polypeptides together. Even if one or two FGF21 mutant polypeptides are used, a linker may be attached to the N-terminal end of the FGF21 mutant polypeptide; it is not necessary that the entered attachment points be used.

Когда связанная молекула включает один или два природных FGF21 полипептида, линкер может быть присоединен в точке FGF21 полипептида, которая отвечает химии присоединения. Например, природные дисульфидные связи могут быть восстановлены, и цистеиновые остатки могут служить точками присоединения для линкера, такого как ПЭГ. В другом варианте, линкер может быть присоединен к FGF21 полипептиду в N-конце или на лизиновых боковых цепях.When the linked molecule includes one or two naturally occurring FGF21 polypeptides, the linker can be attached at a point on the FGF21 polypeptide that corresponds to the attachment chemistry. For example, natural disulfide bonds can be reduced and cysteine residues can serve as points of attachment for a linker such as PEG. Alternatively, the linker may be attached to the FGF21 polypeptide at the N-terminus or on the lysine side chains.

Один или оба FGF21 мутантных полипептида связанной молекулы могут включать усеченный FGF21 мутантный полипептид. Как описано здесь, усеченный FGF21 мутантный полипептид может быть получен путем удаления любого количества остатков как на N-конце, С-конце, так и на обоих N- и Сконцах.One or both FGF21 mutant polypeptides of the associated molecule may include a truncated FGF21 mutant polypeptide. As described here, a truncated FGF21 mutant polypeptide can be obtained by deleting any number of residues at both the N-terminus, C-terminus, and both N- and C-termini.

Связанные молекулы могут также включать один или оба FGF21 полипептида, которые содержат мутацию в полипептидной последовательности, которая может и не быть предпочтительной как сайт присоединения линкера, но вместо этого может придавать некоторое другое желательное свойство данной связанной молекуле. Таким образом, связанные молекулы, включающие один или несколько FGF21 мутантных полипептидов с мутацией, придающей необходимое свойство связанной молекуле, составляют еще один аспект настоящего изобретения.Linked molecules may also include one or both FGF21 polypeptides that contain a mutation in the polypeptide sequence that may not be preferred as a linker attachment site, but may instead confer some other desired property on the linked molecule. Thus, linked molecules comprising one or more FGF21 mutant polypeptides with a mutation conferring the desired property on the linked molecule constitute another aspect of the present invention.

- 13 041758- 13 041758

Активность связанных молекул может быть проанализирована различными способами, например, с использованием in vitro ELK-люциферазной пробы, как описано здесь в примере 10.The activity of the bound molecules can be analyzed in various ways, for example, using the in vitro ELK-luciferase assay as described here in Example 10.

Активность связанных молекул настоящего изобретения может быть также оценена in vivo пробе, такой как на ob/ob мышах, как показано в примере 12. В общем, оценить in vivo активность одного или нескольких из этих полипептидов можно, введя интраперитонеально данный полипептид тестовому животному. Через некоторый желательный период времени или несколько таких периодов может быть взята проба крови, и могут быть измерены уровни глюкозы в крови.The activity of the associated molecules of the present invention can also be assessed in vivo assay, such as in ob/ob mice, as shown in Example 12. In general, the in vivo activity of one or more of these polypeptides can be assessed by administering the polypeptide intraperitoneally to a test animal. After some desired period of time or several such periods, a blood sample may be taken and blood glucose levels may be measured.

Как и для всех FGF21 мутантов настоящего изобретения, FGF21 полипептиды, включающие связанную молекулу, которые могут быть FGF21 мутантными полипептидами, FGF21 полипептидами дикого типа или комбинацией того и другого, могут, при необходимости, включать аминоконцевой метиониновый остаток, который может быть введен путем направленной мутации или как результат бактериального экспрессионного процесса.As with all FGF21 mutants of the present invention, FGF21 polypeptides comprising a linked molecule, which may be FGF21 mutant polypeptides, wild-type FGF21 polypeptides, or a combination of both, may optionally include an amino-terminal methionine residue which may be introduced by site-directed mutation. or as a result of the bacterial expression process.

Обычные специалисты в данной области, например, знакомые со стандартными способами молекулярной биологии, могут применить эти знания, совместно с настоящей заявкой, для получения и использования связанных молекул настоящего изобретения. Стандартные способы могут быть использованы для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, культивирования тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция); см., например, работу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на которую в данной заявке сделана ссылка. Ферментативные реакции и способы очистки могут быть реализованы в соответствии со спецификациями производителя, как обычно делается в данной области, или как описано в данной заявке. Процессы для связывания линкеров с FGF21 полипептидами будут зависеть от природы данного линкера, но они известны специалистам в данной области. Примеры химии присоединения линкеров описаны в данной заявке. Руководство относительно получения связанной молекулы настоящего изобретения приведено в настоящей заявке, например, в примере 9.Those of ordinary skill in the art, such as those familiar with standard molecular biology techniques, can apply this knowledge, in conjunction with the present application, to prepare and use the related molecules of the present invention. Standard methods can be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, tissue culture and transformation (eg, electroporation, lipofection); see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, to which reference is made in this application. Enzymatic reactions and purification methods may be carried out according to the manufacturer's specifications, as is commonly done in the art, or as described herein. Processes for binding linkers to FGF21 polypeptides will depend on the nature of the given linker, but are known to those skilled in the art. Examples of linker addition chemistry are described in this application. Guidance on how to obtain a linked molecule of the present invention is given in this application, for example, in example 9.

Если не сделаны специальные оговорки, номенклатура, использованная в связи с лабораторными процедурами и способами аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, описанными здесь, хорошо известна и обычно применяется в данной области. Стандартные способы могут быть использованы для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов и их составления, и доставки; и лечения пациентов.Unless otherwise noted, the nomenclature used in connection with the laboratory procedures and methods of analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein is well known and commonly used in the art. Standard methods can be used for chemical synthesis, chemical analysis, pharmaceuticals and their formulation and delivery; and treatment of patients.

.В. Линкеры в связанных молекулах..IN. Linkers in linked molecules.

Любой линкер может быть использован в связанной молекуле для связывания вместе двух FGF21 мутантных полипептидов. Молекулы линкера могут быть разветвленными или неразветвленными и могут быть присоединены к FGF21 мутантному полипептиду с использованием различных известных химических способов, таких как описанные здесь. Химическая структура линкера не является критической, поскольку он служит, главным образом, спейсером. Данный линкер может быть, независимо, таким же самым или отличным от любого другого линкера или линкеров, которые могут присутствовать в связанной молекуле (например, связанная молекула, включающая три или более FGF21 мутантов полипептидов дикого типа). В одном варианте линкер может состоять из аминокислот, сцепленных между собой пептидными связями.Any linker can be used in a linked molecule to link two FGF21 mutant polypeptides together. The linker molecules can be branched or straight and can be attached to the FGF21 mutant polypeptide using various known chemical methods such as those described here. The chemical structure of the linker is not critical as it serves primarily as a spacer. A given linker may independently be the same or different from any other linker or linkers that may be present in the linked molecule (eg, a linked molecule comprising three or more FGF21 wild-type polypeptide mutants). In one embodiment, the linker may consist of amino acids linked together by peptide bonds.

Некоторые из этих аминокислот могут быть гликозилированными, как это хорошо известно специалистам в данной области. Например, полезной линкерной последовательностью, составляющей сайт сиалилирования, является X1X₂NX₄X₅G (SEQ ID NO: 5), где X1, X₂, Х₄ и X₅ представляют собой, независимо, любой аминокислотный остаток. В другом варианте молекула линкера может быть молекулой ПЭГ любого размера, такого как 20, 30 или 40 кДа.Some of these amino acids may be glycosylated, as is well known to those skilled in the art. For example, a useful linker sequence constituting the sialylation site is X1X ₂ NX ₄ X ₅ G (SEQ ID NO: 5), where X1, X ₂ , X ₄ and X ₅ are, independently, any amino acid residue. In another embodiment, the linker molecule may be a PEG molecule of any size, such as 20, 30 or 40 kDa.

В вариантах, в которых присутствует пептидиловый линкер (т.е. образованный из аминокислот, связанных пептидными связями), его длина составляет преимущественно от 1 до приблизительно 40 аминокислотных остатков, лучше от 1 до приблизительно 20 аминокислотных остатков и лучше всего от 1 до приблизительно 10 аминокислотных осадков. В одном варианте аминокислотные остатки в линкере выбираются из любой из двадцати канонических аминокислот. В другом варианте аминокислотные остатки в линкере выбираются из цистеина, глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина, и/или серина. В еще одном варианте пептидиловый линкер сформирован из большинства аминокислот, которые являются стерически неограниченными, таких как глицин, серин и аланин, сцепленные пептидной связью. Часто бывает необходимым, чтобы пептидиловый линкер, если он присутствует, выбирался бы таким образом, чтобы избежать быстрого протеолитического оборота при циркуляции in vivo. Так, предпочтительные пептидиловые линкеры включают полиглицины, в частности (Gly)₄ (SEQ ID NO: 6); (Gly)₅ (SEQ ID NO: 7); поли(Gl·y-Ala); и полиаланины. Другие предпочтительные пептидиловые линкеры включают GGGGS (SEQ ID NO: 8); GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ГО NO: 10) и любые линкеры, использованные в представленных здесь примерах. Однако описанные здесь линкеры являются иллюстративными; линкеры, которые входят в объем данного изобретения могут быть гораздо длиннее и могут включать другие остатки.In embodiments in which a peptidyl linker is present (i.e., formed from amino acids linked by peptide bonds), its length is preferably 1 to about 40 amino acid residues, preferably 1 to about 20 amino acid residues, and most preferably 1 to about 10 amino acid precipitation. In one embodiment, the amino acid residues in the linker are selected from any of the twenty canonical amino acids. In another embodiment, the amino acid residues in the linker are selected from cysteine, glycine, alanine, proline, asparagine, glutamine, and/or serine. In yet another embodiment, the peptidyl linker is formed from most amino acids that are sterically unrestricted, such as glycine, serine, and alanine, linked by a peptide bond. It is often necessary that the peptidyl linker, if present, be chosen so as to avoid rapid proteolytic turnover during in vivo circulation. Thus, preferred peptidyl linkers include polyglycines, in particular (Gly) ₄ (SEQ ID NO: 6); (Gly) ₅ (SEQ ID NO: 7); poly(Gl y-Ala); and polyalanines. Other preferred peptidyl linkers include GGGGS (SEQ ID NO: 8); GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10) and any linkers used in the examples presented here. However, the linkers described herein are illustrative; linkers that are within the scope of this invention may be much longer and may include other residues.

В вариантах связанной молекулы, включающих пептидную линкерную составляющую, кислотные остатки, например глутаминовый или аспартатовый остатки, помещены в аминокислотную последо- 14 041758 вательность линкерной составляющей. Примеры включают следующие пептидные линкерные последовательности:In variants of the linked molecule that include a peptide linker moiety, acidic residues, such as glutamine or aspartate residues, are placed in the amino acid sequence of the linker moiety. Examples include the following peptide linker sequences:

GGEGGG (SEQ ID NO: 11);GGEGGG (SEQ ID NO: 11);

GGEEEGGG (SEQ ID NO: 12);GGEEEGGG (SEQ ID NO: 12);

GEEEG (SEQ ID NO: 13);GEEEG (SEQ ID NO: 13);

GEEE (SEQ ID NO: 14);GEEE (SEQ ID NO: 14);

GGDGGG (SEQ ID NO: 15);GGDGGG (SEQ ID NO: 15);

GGDDDGG (SEQ ID NO: 16);GGDDDGG (SEQ ID NO: 16);

GDDDG (SEQ ID NO: 17);GDDDG (SEQ ID NO: 17);

GDDD (SEQ ID NO: 18);GDDD (SEQ ID NO: 18);

GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO: 19);GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO: 19);

WEWEW (SEQ ID NO: 20);WEWEW (SEQ ID NO: 20);

FEFEF (SEQ ID NO: 21);FEFEF (SEQ ID NO: 21);

EEEWWW (SEQ ID NO: 22);EEEWWW (SEQ ID NO: 22);

EEEFFF (SEQ ID NO: 23);EEEFFF (SEQ ID NO: 23);

WWEEEWW (SEQ ID NO: 24) илиWWEEEWW (SEQ ID NO: 24) or

FFEEEFF (SEQ ID NO: 25).FFEEEFF (SEQ ID NO: 25).

В других вариантах пептидный линкер образует сайт фосфорилирования, например X1X2YX3X4G (SEQ ID NO: 26), где X1, Х₂, X₃ и Х₄ представляют собой, каждый независимо, любой аминокислотный остаток; X1X2SX3X4G (SEQ ID NO: 27), где X1, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой, каждый независимо, любой аминокислотный остаток; или X1X2TX3X4G (SEQ ID NO: 28), где X1, Х₂, X₃ и Х4 представляют собой, каждый независимо, любой аминокислотный остаток.In other embodiments, the peptide linker forms a phosphorylation site, for example X1X2YX3X4G (SEQ ID NO: 26), where X1, X ₂ , X ₃ and X ₄ are each independently any amino acid residue; X1X2SX3X4G (SEQ ID NO: 27), where X1, X ₂ , X ₃ and X ₄ are each independently any amino acid residue; or X1X2TX3X4G (SEQ ID NO: 28), where X1, X ₂ , X ₃ and X4 are each independently any amino acid residue.

В связанной молекуле могут также использоваться непептидные линкеры. Например, алкильные линкеры, такие как -NH-(CH₂)s-C(O)-, где может использоваться s = 2-20. Эти алкильные линкеры могут быть дополнительно замещены любой пространственно неограничивающей группой, такой как низший алкил (например, С₁-С₆), низший ацил, галоген (например, Cl, Br), CN, NH2, фенил, и т.д.Non-peptide linkers can also be used in the linked molecule. For example, alkyl linkers such as -NH-(CH ₂ )sC(O)-, where s = 2-20 can be used. These alkyl linkers may be further substituted with any sterically non-limiting group such as lower alkyl (eg C ₁ -C ₆ ), lower acyl, halogen (eg Cl, Br), CN, NH2, phenyl, etc.

Любой подходящий линкер может быть применен в настоящем изобретении для формирования связанных молекул. В одном примере линкер, использованный для формирования связанных молекул, описанных здесь, представляет гомобифункциональные бис-малеинимидные ПЭГ молекулы общей структуры:Any suitable linker can be used in the present invention to form linked molecules. In one example, the linker used to form the linked molecules described herein is homobifunctional bis-maleimide PEG molecules with the general structure:

X-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-X, где X представляет собой группу имида малеиновой кислоты. В других вариантах X может представлять собой ортопиридилдисульфид, йодоацетамид, винилсульфон или любую другую реакционную составляющую, которая, как известно в данной области, специфична для тиоловых групп. В еще одном варианте X может представлять собой аминоспецифическую реакционную составляющую, используемую для связывания двух мутантных полипептидов через N-конец или созданную способами генной инженерии лизильную группу (см., например, Pasut and Veronese, 2006, PEGylation of Proteinsas Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates, Adv. Polym. Sci. 192:95-134).X-(CH ₂ CH ₂ O) _n CH ₂ CH ₂ -X, where X is a maleic acid imide group. In other embodiments, X may be orthopyridyl disulfide, iodoacetamide, vinyl sulfone, or any other reactive moiety known in the art to be specific for thiol groups. In yet another embodiment, X may be an amino-specific reactive moiety used to link two mutant polypeptides via the N-terminus, or a genetically engineered lysyl group (see, e.g., Pasut and Veronese, 2006, PEGylation of Proteinsas Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates, Adv. Polym. Sci. 192:95-134).

В еще одном варианте линкер может иметь общую структуруIn yet another embodiment, the linker may have the general structure

X-(CH2CH2O)nCH2CH2-Y, где X и Y представляют собой различные реакционные составляющие, выбранные из вышеуказанных групп. Такой линкер обеспечит конъюгацию различных мутантных полипептидов с генерацией связанных гетеродимеров или гетероолигомеров.X-(CH2CH2O)nCH2CH2-Y, where X and Y are different reactive species selected from the above groups. Such a linker will allow conjugation of various mutant polypeptides to generate linked heterodimers or heterooligomers.

В еще одном варианте, линкер может представлять собой ПЭГ молекулу, которая может иметь молекулярный вес от 1 до 100 кДа, предпочтительно от 10 до 50 кДа (например, 10, 20, 30 или 40 кДа) и еще более предпочтительно 20 кДа. Пептидные линкеры могут быть изменены с образованием производных тем же способом, что описан выше.In yet another embodiment, the linker may be a PEG molecule which may have a molecular weight of 1 to 100 kDa, preferably 10 to 50 kDa (eg 10, 20, 30 or 40 kDa) and even more preferably 20 kDa. Peptide linkers can be derivatized in the same manner as described above.

Другие примеры полезных линкеров включают аминоэтилоксиэтилокси-ацетильные линкеры, как описано в международной публикации No. WO 2006/042151, на которую в данной заявке сделана полная ссылка.Other examples of useful linkers include aminoethyloxyethyloxyacetyl linkers as described in International Publication No. WO 2006/042151, to which full reference is made in this application.

При формировании связанной молекулы настоящего изобретения могут быть применены стандартные химические способы для связывания линкера с FGF21 молекулой дикого типа или мутантной молекулой. Конкретный способ связывания будет зависеть от сайта присоединения (например, аминокислотных боковых цепей) и природы данного линкера. Когда линкер является ПЭГ молекулой, присоединение может быть достигнуто путем применения стандартных химических способов и свободной сульфгидрильной или аминогруппы, такой как найденные на цистеиновых остатках (которые могут быть введены в FGF21 полипептидную последовательность с помощью мутации или могут быть природными) или на лизиновой группе (которая может быть введена в FGF21 полипептидную последовательность с помощью мутации или может быть природной), или N-концевой аминогруппе.When forming a linked molecule of the present invention, standard chemistry can be used to link a linker to a wild-type FGF21 molecule or a mutant molecule. The specific linking method will depend on the site of attachment (eg, amino acid side chains) and the nature of the linker. When the linker is a PEG molecule, attachment can be achieved using standard chemistry and a free sulfhydryl or amino group such as those found on cysteine residues (which may be introduced into the FGF21 polypeptide sequence by mutation or may be natural) or on a lysine group (which may be introduced into the FGF21 polypeptide sequence by mutation or may be natural), or the N-terminal amino group.

7. Химическая модификация FGF21 мутантов.7. Chemical modification of FGF21 mutants.

В одном из аспектов настоящего изобретения FGF21 мутантные полипептиды являются химически модифицированными. Термин химически модифицированный касается полипептида (например, FGF21In one aspect of the present invention, the FGF21 mutant polypeptides are chemically modified. The term chemically modified refers to a polypeptide (for example, FGF21

- 15 041758 мутантный полипептид), который был модифицирован путем добавления полимера в один или несколько сайтов на этом полипептиде. Примеры химически модифицированных форм FGF21 мутантного полипептида включают ПЭГилированные и гликозилированные формы FGF21 мутантного полипептида.- 15 041758 mutant polypeptide) that has been modified by adding a polymer to one or more sites on this polypeptide. Examples of chemically modified forms of the FGF21 mutant polypeptide include PEGylated and glycosylated forms of the FGF21 mutant polypeptide.

Химически модифицированные FGF21 мутантные полипептиды настоящего изобретения могут содержать любой тип полимера, включая водорастворимые полимеры, такие как ПЭГ. Каждый из иллюстративных полимеров может быть полимером любого молекулярного веса и может быть разветвленным или неразветвленным. Каждый тип полимера имеет обычно средний молекулярный вес от приблизительно 2 до приблизительно 100 кДа (термин приблизительно указывает, что в препаратах водорастворимого полимера некоторые молекулы имеют больший вес и некоторые меньший вес, чем указанный молекулярный вес). Средний молекулярный вес каждого полимера лежит предпочтительно в области приблизительно от 5 до 50 кДа, более предпочтительно приблизительно от 10 до 40 кДа и наиболее предпочтительно приблизительно от 10 до 20 кДа.The FGF21 chemically modified mutant polypeptides of the present invention may contain any type of polymer, including water soluble polymers such as PEG. Each of the exemplary polymers may be of any molecular weight and may be branched or unbranched. Each type of polymer typically has an average molecular weight of from about 2 to about 100 kDa (the term roughly indicates that in water-soluble polymer formulations, some molecules weigh more and some less than the indicated molecular weight). The average molecular weight of each polymer is preferably in the range of about 5 to 50 kD, more preferably about 10 to 40 kD, and most preferably about 10 to 20 kD.

Подходящие водорастворимые полимеры или их смеси включают, однако не ограничиваясь этим, углеводы, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (включая формы ПЭГ, которые были использованы для дериватизации протеинов, включая моно-(С₁-С₁₀), алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль), монометоксиполиэтиленгликоль, декстран (такой как декстран низкого молекулярного веса, например около 6 кДа), целлюлозу, или другие полимеры на основе углеводов, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), и поливиниловый спирт. Также охвачены настоящим изобретением бифункциональные структурированные молекулы, которые могут использоваться для получения ковалентно присоединенных FGF21 полипептидных мутантных мультимеров. Также охвачены настоящим изобретением FGF21 мутанты, ковалентно присоединенные к полисиаловой кислоте.Suitable water-soluble polymers or mixtures thereof include, but are not limited to, carbohydrates, polyethylene glycol (PEG) (including forms of PEG that have been used to derivatize proteins, including mono-(C ₁ -C ₁₀ ), alkoxy or aryloxy polyethylene glycol), monomethoxy polyethylene glycol, dextran (such as low molecular weight dextran, e.g. about 6 kDa), cellulose, or other carbohydrate based polymers, poly(N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols (e.g. glycerol), and polyvinyl alcohol. Also encompassed by the present invention are bifunctional structured molecules that can be used to generate covalently attached FGF21 polypeptide mutant multimers. Also covered by the present invention are FGF21 mutants covalently attached to polysialic acid.

В некоторых вариантах настоящего изобретения FGF21 мутантный полипептид ковалентно модифицирован и содержит один или несколько водорастворимых полимеров, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль; см., например, патенты США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192; и 4179337. В некоторых вариантах настоящего изобретения FGF21 мутант содержит один или несколько полимеров, включая, но не ограничиваясь этим, монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, другой полимер на основе углевода, поли(К-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы, например глицерин), поливиниловый спирт, или смеси таких полимеров.In some embodiments of the present invention, the FGF21 mutant polypeptide is covalently modified and contains one or more water-soluble polymers, including, but not limited to, polyethylene glycol (PEG), polyoxyethylene glycol, or polypropylene glycol; see, for example, US Pat. Nos. 4,640,835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192; and 4,179,337. In some embodiments of the present invention, the FGF21 mutant comprises one or more polymers, including, but not limited to, monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose, another carbohydrate-based polymer, poly(K-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, polypropylene oxide copolymer/ ethylene oxide, polyoxyethylene polyols such as glycerol), polyvinyl alcohol, or mixtures of such polymers.

В еще одних вариантах настоящего изобретения пептид или протеин могут быть конъюгированы с FGF21 сайт-направленным способом, через вышеупомянутые остатки, полученные способами генной инженерии, с целью придать подходящие свойства FGF21 (например, активность, устойчивость, селективность). Таким образом, настоящее изобретение охватывает FGF21 мутантные полипептиды, конъюгированные с гетеропротеином или гетеропептидом на введенном сайте присоединения полимера. Примеры подходящих протеинов включают ЧСА (человеческий сывороточный альбумин) и антитела, которые не связываются с FGF21.In yet other embodiments of the present invention, the peptide or protein may be conjugated to FGF21 in a site-directed manner, via the aforementioned genetically engineered residues, to confer suitable FGF21 properties (eg, activity, stability, selectivity). Thus, the present invention encompasses FGF21 mutant polypeptides conjugated to a heteroprotein or heteropeptide at an introduced polymer attachment site. Examples of suitable proteins include HSA (human serum albumin) and antibodies that do not bind to FGF21.

7. А. ПЭГилированные FGF21 мутантные полипептиды.7. A. PEGylated FGF21 mutant polypeptides.

В некоторых вариантах настоящего изобретения FGF21 мутантный полипептид ковалентномодифицирован ПЭГ субъединицами. В некоторых вариантах один или несколько водорастворимых полимеров присоединены в одном или нескольких специфических положениях (например, в N-конце) FGF21 мутанта. В некоторых вариантах один или несколько водорастворимых полимеров присоединены к одной или нескольким боковым цепям FGF21 мутанта; эти боковые цепи могут быть природными или могут образовывать компонент сайта присоединения полимера, сформированного способами генной инженерии. В некоторых вариантах ПЭГ использован для улучшения терапевтической активности FGF21 мутантного полипептида. Некоторые такие способы обсуждены, например, в патенте США No. 6133426, на который в настоящей заявке сделана ссылка.In some embodiments of the present invention, the FGF21 mutant polypeptide is covalently modified with PEG subunits. In some embodiments, one or more water-soluble polymers are attached at one or more specific positions (eg, the N-terminus) of the FGF21 mutant. In some embodiments, one or more water-soluble polymers are attached to one or more side chains of the FGF21 mutant; these side chains may be naturally occurring or may form a component of a genetically engineered polymer attachment site. In some embodiments, PEG is used to improve the therapeutic activity of the FGF21 mutant polypeptide. Some such methods are discussed, for example, in US Patent No. 6133426, to which reference is made in this application.

В вариантах настоящего изобретения, где данный полимер является ПЭГ, ПЭГ группа может иметь любой удобный молекулярный вес и может быть линейной или разветвленной. Средний молекулярный вес данной ПЭГ группы варьируется предпочтительно приблизительно от 2 до 100 кДа и более предпочтительно приблизительно от 5 до 50 кДа, например 10, 20, 30, 40 или 50 кДа. ПЭГ группы обычно присоединены к FGF21 мутанту посредством ацилирования или восстановительного алкилирования через реакционную группу на ПЭГ составляющей (например, альдегид, NHS, или имид малеиновой кислоты, винилсульфон, алкилгалогенид) к реакционной группе на FGF21 мутанте (например, амино или тиоловой группе).In embodiments of the present invention where the polymer is PEG, the PEG group may be of any convenient molecular weight and may be linear or branched. The average molecular weight of a given PEG group preferably ranges from about 2 to 100 kDa, and more preferably from about 5 to 50 kDa, such as 10, 20, 30, 40 or 50 kDa. PEG groups are typically attached to the FGF21 mutant via acylation or reductive alkylation via a reactive group on the PEG moiety (eg, aldehyde, NHS, or maleic acid imide, vinyl sulfone, alkyl halide) to a reactive group on the FGF21 mutant (eg, amino or thiol group).

Когда полимер(ы), присоединенные к FGF21 мутантному полипептиду, представляют собой ПЭГ, ПЭГилирование FGF21 мутантного полипептида настоящего изобретения может быть проведено с использованием любой из реакций ПЭГилирования, известных в данной области. Такие реакции описаны, например, в следующих работах: Zalipsky, 1995, Functionalized Poly(ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates, Bioconjugate Chemistry 6:150-165; Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; Европейские патенты Nos. 0154316 и 0401384 и патенте США No. 4179337. Например, когдаWhen the polymer(s) attached to the FGF21 mutant polypeptide is PEGylation, the FGF21 mutant polypeptide of the present invention can be PEGylated using any of the PEGylation reactions known in the art. Such reactions are described, for example, in the following works: Zalipsky, 1995, Functionalized Poly(ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates, Bioconjugate Chemistry 6:150-165; Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; European Patents Nos. 0154316 and 0401384 and US Pat. 4179337. For example, when

- 16 041758 остаток-мишень является лизиновым остатком (т.е. остатком с реакционной аминогруппой), ПЭГилирование может быть проведено посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с аминореакционной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичным реакционным водорастворимым полимером), как описано здесь. Для реакций ацилирования выбранный полимер может иметь одну реакционную эфирную группу. Для восстановительного алкилирования выбранный полимер может иметь отдельную реакционную альдегидную группу. Реакционным альдегидом является, например, полиэтиленгликоль пропиональдегид, который устойчив в воде, или его моно Ci-Сю алкокси или арилокси производные (см. патент США No. 5252714). Различные реакционные ПЭГ полимеры, активированные различными аминоспецифическими составляющими, также известны обычным специалистам в данной области и могут также быть применены, как это диктуют обстоятельства.- 16 041758 the target residue is a lysine residue (ie, a residue with a reactive amino group), PEGylation can be carried out via an acylation reaction or an alkylation reaction with an amino-reactive polyethylene glycol molecule (or similar reactive water-soluble polymer) as described here. For acylation reactions, the selected polymer may have one reactive ester group. For reductive alkylation, the selected polymer may have a separate reactive aldehyde group. The reactive aldehyde is, for example, polyethylene glycol propionaldehyde, which is stable in water, or its mono Ci-Cu alkoxy or aryloxy derivatives (see US Pat. No. 5,252,714). Various PEG reactive polymers activated with various amino-specific moieties are also known to those of ordinary skill in the art and may also be used as circumstances dictate.

В другом примере, когда остатком-мишенью является цистеиновый остаток (т.е. остаток с реакционной сульфгидрильной группой), ПЭГилирование может быть осуществлено посредством стандартной химии имида малеиновой кислоты. Для этой реакции выбранный полимер может содержать одну или несколько реакционных малеинимидных групп или другую тиол-реакционную составляющую, такую как винилсульфон, ортопиридилдисульфид или йодоацетамид; см., например, работы Pasut & Veronese, 2006, PEGylation of Proteins as Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates, Adv. Polym. Sci. 192:95-134; Zalipsky, 1995, Functionalized Poly(ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates, Bioconjugate Chemistry 6:150-165 и Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2^nd Ed., Academic Press, 2008, на каждую из которых в данной заявке сделана ссылка.In another example, when the target residue is a cysteine residue (ie, a residue with a reactive sulfhydryl group), PEGylation can be accomplished by standard maleic acid imide chemistry. For this reaction, the selected polymer may contain one or more reactive maleimide groups or another thiol-reactive moiety such as vinyl sulfone, orthopyridyl disulfide, or iodoacetamide; see, for example, Pasut & Veronese, 2006, PEGylation of Proteins as Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates, Adv. Polym. sci. 192:95-134; Zalipsky, 1995, Functionalized Poly(ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates, Bioconjugate Chemistry 6:150-165 and Hermanson, Bioconjugate Techniques, ^2nd Ed., Academic Press, 2008, to which reference is made to each of these in this application.

В некоторых вариантах настоящего изобретения полезная стратегия для присоединения ПЭГ группы к FGF21 мутанту включает объединение посредством образования конъюгатной связи в растворе FGF21 мутанта и ПЭГ составляющей, каждый несет специальную функциональную группу, которая реакционна по отношению к другой. FGF21 мутант является предварительно активированным соответствующей функциональной группой на специфическом сайте. Предшественники поддаются очистке и полностью характеризуются перед реагированием с ПЭГ составляющей. Сшивание FGF21 мутанта и ПЭГ обычно имеет место в водной фазе и может легко контролироваться способом SDS-PAGE (см. выше) или аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой. Подробный анализ может быть проведен способом пептидного картирования на основе жидкостной хроматографии-массспектроскопии.In some embodiments of the present invention, a useful strategy for attaching a PEG group to an FGF21 mutant involves bringing together, via conjugate bond formation in solution, the FGF21 mutant and a PEG moiety, each bearing a specific functional group that is reactive with the other. The FGF21 mutant is pre-activated with the appropriate functional group at a specific site. The precursors are purifiable and fully characterized before reacting with the PEG moiety. Crosslinking of the FGF21 mutant and PEG usually takes place in the aqueous phase and can be easily monitored by SDS-PAGE (see above) or analytical reverse phase HPLC. Detailed analysis can be carried out by the method of peptide mapping based on liquid chromatography-mass spectroscopy.

7. В. Полисахаридные FGF21 мутантные полипептиды.7. B. FGF21 polysaccharide mutant polypeptides.

Полисахаридные полимеры представляют собой другой тип водорастворимого полимера, который может быть использован для модификации протеина. Таким образом, FGF21 мутантные полипептиды настоящего изобретения могут быть присоединены к полисахаридному полимеру, и это составляет варианты данного изобретения. Так, созданный способами генной инженерии сайт присоединения неприродного полимера в FGF21 мутантном полипептиде может включать остаток, к которому присоединен полисахарид. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, которые связаны преимущественно альфа 1-6 связями. Сам декстран имеет различные молекулярные веса в широкой области и легкодоступен в виде вещества с молекулярным весом приблизительно от 1 до 70 кДа. Декстран является подходящим водорастворимым полимером для использования в качестве наполнителя как самого по себе или в комбинации с другим наполнителем (например, Fc); см., например, международную публикацию No. WO 96/11953. Сообщается об использовании декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами; см., например, европейскую патентную публикацию No. 0315456, на которую здесь сделана ссылка. Настоящее изобретение также охватывает использование декстрана с молекулярными весами в области от приблизительно 1 до приблизительно 20 кДа.Polysaccharide polymers are another type of water soluble polymer that can be used to modify a protein. Thus, FGF21 mutant polypeptides of the present invention can be attached to a polysaccharide polymer, and this constitutes embodiments of the present invention. Thus, a genetically engineered non-natural polymer attachment site in an FGF21 mutant polypeptide may include a residue to which a polysaccharide is attached. Dextrans are polysaccharide polymers composed of individual glucose subunits that are predominantly linked by alpha 1-6 bonds. Dextran itself has a wide range of molecular weights and is readily available as a molecular weight material from about 1 to 70 kDa. Dextran is a suitable water soluble polymer for use as an excipient alone or in combination with another excipient (eg Fc); see, for example, international publication no. WO 96/11953. The use of dextran conjugated with therapeutic or diagnostic immunoglobulins has been reported; see, for example, European Patent Publication No. 0315456 referenced here. The present invention also encompasses the use of dextran with molecular weights in the range of about 1 to about 20 kDa.

7. С. Способы химического модифицирования FGF21 мутантного полипептида.7. C. Methods for chemically modifying an FGF21 mutant polypeptide.

В общем, химическая модификация (например, ПЭГилирование или гликозилирование) может быть осуществлена при любом подходящем условии, которое используется при реакции протеина с активированной полимерной молекулой. Способы получения химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов обычно включают стадии: (а) реакции данного полипептида с активированной полимерной молекулой (такой как реакционный эфир, имид малеиновой кислоты или альдегидная производная данной полимерной молекулы) при условиях, при которых FGF21 мутантный полипептид становится присоединенным к одной или нескольким молекулам полимера, и (б) получения продуктов реакции. Оптимальные условия реакции будут определяться, исходя из известных параметров и необходимого результата. Например, чем больше отношение молекул полимера к протеину, тем больше процент присоединенных молекул полимера. В одном варианте настоящего изобретения химически модифицированные FGF21 мутантные полипептиды могут иметь единственную полимерную молекулу в аминоконце, тогда как в других вариантах FGF21 мутантный полипептид может иметь два или несколько полимеров, ассоциированных с главной последовательностью, например один полимер в N-конце данного полипептида и второй в другом остатке полипептида. Как альтернатива, FGF21 мутант может иметь два или более полимера, ассоциированных в двух разных остатках в главной последовательности, но не в N-конце.In general, chemical modification (eg, PEGylation or glycosylation) can be carried out under any suitable condition that is used in the reaction of a protein with an activated polymer molecule. Methods for producing chemically modified FGF21 mutant polypeptides typically include the steps of: (a) reacting the polypeptide with an activated polymer molecule (such as a reactive ester, maleic acid imide, or an aldehyde derivative of the polymer molecule) under conditions under which the FGF21 mutant polypeptide becomes attached to one or several polymer molecules, and (b) obtaining reaction products. Optimum reaction conditions will be determined based on known parameters and the desired result. For example, the greater the ratio of polymer molecules to protein, the greater the percentage of attached polymer molecules. In one embodiment of the present invention, chemically modified FGF21 mutant polypeptides may have a single polymeric molecule at the amino terminus, while in other embodiments, the FGF21 mutant polypeptide may have two or more polymers associated with the main sequence, for example, one polymer at the N-terminus of the polypeptide and a second at another residue of the polypeptide. Alternatively, an FGF21 mutant may have two or more polymers associated at two different residues in the main sequence, but not at the N-terminus.

В общем, условия, которые могут быть смягчены или модулированы путем применения химическиIn general, conditions that can be mitigated or modulated by the application of chemical

- 17 041758 модифицированных FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения, включают описанные здесь для природного FGF21 полипептида. Однако химически модифицированные FGF21 мутантные полипептиды, раскрытые здесь, могут иметь дополнительные активности, такие как увеличенный период полураспада, в сравнении с FGF21 дикого типа и FGF21 мутантами.- 17,041,758 modified FGF21 mutant polypeptides of the present invention include those described herein for a natural FGF21 polypeptide. However, the chemically modified FGF21 mutant polypeptides disclosed herein may have additional activities, such as increased half-life, compared to wild-type FGF21 and FGF21 mutants.

8. Терапевтические композиции FGF21 мутантов их использование.8. Therapeutic compositions of FGF21 mutants and their use.

Терапевтические композиции, включающие FGF21 мутантные полипептиды, подпадают под рамки настоящего изобретения и специально предусмотрены в свете идентификации связанных молекул, FGF21 мутантных полипептидов и химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов, которые проявляют улучшенные свойства. Такие терапевтические композиции из связанных молекул, FGF21 мутантных полипептидов и химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов могут включать терапевтически эффективное количество связанных молекул, FGF21 мутантных полипептидов или химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов, которые могут быть химически модифицированы, в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым композиционным агентом, выбранным для соответствия со способом использования.Therapeutic compositions comprising FGF21 mutant polypeptides fall within the scope of the present invention and are specifically contemplated in light of the identification of related molecules, FGF21 mutant polypeptides, and chemically modified FGF21 mutant polypeptides that exhibit improved properties. Such therapeutic compositions of linked molecules, FGF21 mutant polypeptides and chemically modified FGF21 mutant polypeptides may include a therapeutically effective amount of linked molecules, FGF21 mutant polypeptides or chemically modified FGF21 mutant polypeptides, which can be chemically modified, in admixture with a pharmaceutically or physiologically acceptable compositional agent, selected to suit the intended use.

Приемлемые композиционные материалы являются предпочтительно нетоксичными для реципиентов при используемых дозах и концентрациях.Acceptable composite materials are preferably non-toxic to recipients at the doses and concentrations used.

Данная фармацевтическая композиция может содержать композиционные материалы для модифицирования, поддержания или сохранения, например, рН, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или выделения, абсорбции или проникновения данной композиции. Подходящие композиционные материалы включают, но не ограничиваясь этим, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные вещества, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или бисульфит натрия), буферы (такие как борат, бикарбонат, Tris-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), наполнители (такие как маннит или глицин), хелатообразующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), комплексообразователи (такие как кофеин, поливинилпирродидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), протеины (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красители, ароматизаторы и разбавители, эмульсификаторы, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидин), полипептиды низкого молекулярного веса, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как бензалконий хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (такие как маннит или сорбит), суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (такие как плюроники; ПЭГ; сорбитановые эфиры; полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80; тритон; трометамин; лецитин; холестерин или тилоксапал), агенты, усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит), агентыусилители тонуса (такие как галогениды щелочных металлов - предпочтительно натрий или калий хлорид - или маннит сорбит), носители, разбавители, наполнители и/или фармацевтические адъюванты (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), и последующие издания этой книги, на которые в данной заявке сделана ссылка).A given pharmaceutical composition may contain composite materials to modify, maintain or maintain, for example, pH, osmotic pressure, viscosity, clarity, color, isotonicity, odor, sterility, stability, dissolution or release rate, absorption or permeation of the composition. Suitable composite materials include, but are not limited to, amino acids (such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine), antimicrobials, antioxidants (such as ascorbic acid, sodium sulfite or sodium bisulfite), buffers (such as borate, bicarbonate, Tris-HCl, citrates, phosphates, or other organic acids), bulking agents (such as mannitol or glycine), chelating agents (such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), complexing agents (such as caffeine, polyvinyl pyrrhodidon, beta-cyclodextrin, or hydroxypropyl-beta-cyclodextrin , monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (such as glucose, mannose or dextrins), proteins (such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins), dyes, flavors and diluents, emulsifiers, hydrophilic polymers (such as polyvinylpyrrolidine), low molecular weight polypeptides, salt-forming counterions (such as sodium), preservatives (such as benzalkonium chloride, ben zoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide), solvents (such as glycerol, propylene glycol or polyethylene glycol), sugar alcohols (such as mannitol or sorbitol), suspending agents, surface active substances or wetting agents (such as pluronics; PEG; sorbitan esters; polysorbates such as polysorbate 20 or polysorbate 80; triton; tromethamine; lecithin; cholesterol or tyloxapal), stability enhancing agents (such as sucrose or sorbitol), tonicity enhancing agents (such as alkali metal halides - preferably sodium or potassium chloride - or mannitol sorbitol), carriers, diluents, excipients and/or pharmaceutical adjuvants (see , for example, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), and subsequent editions of this book to which reference is made in this application).

Оптимальная фармацевтическая композиция будет определяться опытным специалистом в зависимости от, например, предполагаемой схемы использования, формата доставки и необходимой дозы (см., например, работу Remington's Pharmaceutical Science). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость in vivo выделения и скорость in vivo клиренса связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида (который может быть усеченным, кэппированным или С-терминально мутированным) или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида.The optimal pharmaceutical composition will be determined by one of skill in the art depending on, for example, the intended use, delivery format, and dosage required (see, for example, Remington's Pharmaceutical Science). Such compositions can affect the physical condition, stability, in vivo release rate, and in vivo clearance rate of the associated molecule, FGF21 mutant polypeptide (which may be truncated, capped, or C-terminally mutated), or chemically modified FGF21 mutant polypeptide.

Основной носитель в фармацевтической композиции может быть водным или неводным по своей природе. Например, подходящим носителем для инъекции может быть вода, физиологический солевой раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, дополненная, возможно, другими материалами, обычными в композициях для парентерального использования. Нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, служат дополнительными иллюстративными носителями. Другие иллюстративные фармацевтические композиции включают Tris буфер с рН приблизительно 7,0-8,5, или ацетатный буфер с величиной рН около 4,0-5,5, который дополнительно может содержать сорбит или подходящий заместитель. В одном варианте настоящего изобретения композиции с применением связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида и химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида могут быть приготовлены для хранения путем смешения выбранной композиции, которая имеет требуемую степень чистоты, с дополнительными композиционными агентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) в форме лиофилизованной лепешки или водного раствора. Кроме того, связанная молекула, FGF21 мутантный полипептид и химически модифицированный FGF21 мутантный полипептидный продукт могут быть составлены в виде лиофилизата с использованием соответствующих наполнителей, таких как сахароза.The main carrier in the pharmaceutical composition may be aqueous or non-aqueous in nature. For example, a suitable injectable vehicle may be water, physiological saline, or artificial cerebrospinal fluid, optionally supplemented with other materials common in parenteral compositions. Neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin serve as additional illustrative carriers. Other illustrative pharmaceutical compositions include a Tris buffer with a pH of about 7.0-8.5, or an acetate buffer with a pH of about 4.0-5.5, which may additionally contain sorbitol or a suitable substituent. In one embodiment of the present invention, compositions using the linked molecule, the FGF21 mutant polypeptide, and the chemically modified FGF21 mutant polypeptide can be prepared for storage by mixing the selected composition, which is of the desired purity, with additional compositional agents (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) in the form of lyophilized lozenges or aqueous solution. In addition, the linked molecule, the FGF21 mutant polypeptide and the chemically modified FGF21 mutant polypeptide product can be formulated as a lyophilisate using appropriate excipients such as sucrose.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть выбраны для парентеральнойPharmaceutical compositions of the present invention may be selected for parenteral

- 18 041758 доставки. Как альтернатива, данные композиции могут быть выбраны для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, перорально. Приготовление таких фармацевтически приемлемых композиций находится в пределах навыков специалистов в данной области.- 18 041758 delivery. Alternatively, these compositions can be chosen for inhalation or for delivery through the digestive tract, for example, orally. The preparation of such pharmaceutically acceptable compositions is within the skill of those skilled in the art.

Компоненты композиций присутствуют в концентрациях, которые приемлемы для локального использования. Например, буферы используются для поддержания данной композиции при физиологическом уровне рН или при несколько более низком рН, обычно, в области рН приблизительно от 5 до 8.The components of the compositions are present in concentrations that are acceptable for topical use. For example, buffers are used to maintain a given composition at physiological pH or at a slightly lower pH, typically in the pH range of about 5 to 8.

Когда предусмотрено парентеральное использование, данные терапевтические композиции для применения в настоящем изобретении могут быть в форме апирогенного, парентерально приемлемого, водного раствора, включающего необходимые связанную молекулу, FGF21 мутантный полипептид или химически модифицированный FGF21 мутантный полипептид в фармацевтически приемлемом носителе. Особенно приемлемым носителем для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в которой связанная молекула, FGF21 мутантный полипептид или химически модифицированный FGF21 мутантный полипептид образуют стерильный, изотонический раствор, сохраняемый соответствующим образом. Еще один препарат может включать композицию необходимой молекулы с агентом, таким как инъектируемые микросферы, подверженные биодеградации частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), бусинки или липосомы, которые вводятся для контролируемого и пролонгированного выделения данного продукта, который может быть затем доставлен посредством депо инъекции. Гиалуроновая кислота также может быть использована, и это может иметь эффект промотирования замедленного выделения в кровоток. Другие подходящие средства для введения необходимой молекулы включают имплантируемые устройства для доставки лекарств.When parenteral use is contemplated, these therapeutic compositions for use in the present invention may be in the form of a pyrogen-free, parenterally acceptable, aqueous solution comprising the desired bound molecule, FGF21 mutant polypeptide, or chemically modified FGF21 mutant polypeptide, in a pharmaceutically acceptable carrier. A particularly suitable carrier for parenteral injection is sterile distilled water in which the bound molecule, the FGF21 mutant polypeptide, or the chemically modified FGF21 mutant polypeptide form a sterile, isotonic, suitably maintained solution. Another formulation may include the composition of the desired molecule with an agent such as injectable microspheres, biodegradable particles, polymeric compounds (such as polylactic acid or polyglycolic acid), beads or liposomes that are administered to control and sustain the release of the product, which can then be delivered via depot injection. Hyaluronic acid may also be used and this may have the effect of promoting a sustained release into the bloodstream. Other suitable means for administering the desired molecule include implantable drug delivery devices.

В одном варианте фармацевтическая композиция может быть составлена для ингаляции. Например, связанная молекула, FGF21 мутантный полипептид или химически модифицированный FGF21 мутантный полипептид могут быть составлены в виде сухого порошка для ингаляции. Ингаляционные растворы могут быть составлены с пропеллантом для аэрозольной доставки препарата. В еще одном варианте растворы могут быть подвержены распылению. Пульмонарное использование описано более подробно в международной публикации No. WO 94/20069, которая описывает пульмонарную доставку химически модифицированных протеинов.In one embodiment, the pharmaceutical composition may be formulated for inhalation. For example, the linked molecule, FGF21 mutant polypeptide, or chemically modified FGF21 mutant polypeptide can be formulated as a dry powder for inhalation. Inhalation solutions can be formulated with a propellant for aerosol delivery of the drug. In yet another embodiment, the solutions may be sprayable. Pulmonary use is described in more detail in International Publication No. WO 94/20069 which describes pulmonary delivery of chemically modified proteins.

Также предусмотрено, что некоторые композиции могут использоваться перорально. В одном варианте настоящего изобретения связанная молекула, FGF21 мутантный полипептид (который может быть усеченным, кэппированным или С-терминально мутированным) или химически модифицированный FGF21 мутантный полипептид, которые используются по указанной схеме, могут быть составлены с или без тех носителей, которые обычно используются в компаундировании твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, может быть сконструирована капсула для выделения активной части данной композиции в данной точке желудочно-кишечного тракта, когда биодоступность максимизирована а предсистемная деградация минимизирована. Дополнительные агенты могут быть включены для облегчения абсорбции связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида (который может быть усеченным, кэппированным или С-терминально мутированным) или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида. Могут также применяться разбавители, ароматизаторы, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, смазочные вещества, суспендирующие агенты, таблеточные дезинтеграторы и связующие вещества.It is also contemplated that certain compositions may be used orally. In one embodiment of the present invention, a linked molecule, an FGF21 mutant polypeptide (which may be truncated, capped or C-terminally mutated) or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide, which is used according to this scheme, can be formulated with or without those carriers that are commonly used in compounding solid dosage forms such as tablets and capsules. For example, a capsule can be designed to release the active portion of a given composition at a given point in the gastrointestinal tract when bioavailability is maximized and pre-systemic degradation is minimized. Additional agents may be included to facilitate absorption of the bound molecule, the FGF21 mutant polypeptide (which may be truncated, capped, or C-terminally mutated), or the chemically modified FGF21 mutant polypeptide. Diluents, flavors, low melting waxes, vegetable oils, lubricants, suspending agents, tablet disintegrators, and binders may also be used.

Еще одна фармацевтическая композиция может включать терапевтически эффективное количество связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида (который может быть усеченным, кэппированным или С-терминально мутированным) или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида в смеси с нетоксичными наполнителями, которые подходят для производства таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или другом подходящем носителе могут быть приготовлены растворы в однодозовой форме. Пригодные наполнители включают, однако, не ограничиваясь этим, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связывающие агенты, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик; или смазочные агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.Another pharmaceutical composition may include a therapeutically effective amount of a bound molecule, an FGF21 mutant polypeptide (which may be truncated, capped or C-terminally mutated) or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide, in admixture with non-toxic excipients suitable for tablet manufacture. By dissolving the tablets in sterile water or other suitable vehicle, solutions can be prepared in single dose form. Suitable fillers include, but are not limited to, inert diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate or sodium bicarbonate, lactose or calcium phosphate; or binding agents such as starch, gelatin or gum arabic; or lubricants such as magnesium stearate, stearic acid or talc.

Дополнительные фармацевтические композиции с использованием связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида будут очевидны специалистам в данной области, включая композиции, содержащие связанную молекулу, FGF21 мутантный полипептид или химически модифицированный FGF21 мутантный полипептид, в препаратах с замедленной или контролируемой доставкой. Способы для создания различных других средств с замедленной или контролируемой доставкой, таких как липосомные носители, биодеградируемые микрочастицы или пористые бусинки и депо инъекции, также известны специалистам в данной области (см., например, международную публикацию No. WO 93/15722, которая описывает контролируемое выделение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций).Additional pharmaceutical compositions using a linked molecule, an FGF21 mutant polypeptide, or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide will be apparent to those skilled in the art, including compositions containing the linked molecule, an FGF21 mutant polypeptide, or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide, in delayed or controlled delivery formulations. Methods for making various other sustained or controlled delivery agents such as liposome carriers, biodegradable microparticles or porous beads and injection depots are also known to those skilled in the art (see, for example, International Publication No. WO 93/15722 which describes controlled isolation of porous polymeric microparticles for the delivery of pharmaceutical compositions).

Дополнительные примеры препаратов с пролонгированным выделением включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме фасонных изделий, например пленок или микрокапсул. Матрицы с пролонгированным выделением могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США No. 3773919 и европейский патент No. 0058481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма этил-L- 19 041758 глутамата (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Langer et al., supra) или поли-D(-)-3-оксимаслянαя кислота (европейский патент No. 0 133 988). Композиции пролонгированного выделения могут также включать липосомы, которые могут быть получены с использованием любого из нескольких известных в данной области способов; см., например, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92 и европейские патенты Nos. 0036676, 0088046 и 0143949.Additional examples of sustained release formulations include semipermeable polymeric matrices in the form of molded articles such as films or microcapsules. Sustained release matrices may include polyesters, hydrogels, polylactides (US Pat. No. 3,773,919 and EP No. 0058481), copolymers of L-glutamic acid, and gamma ethyl-L- 19 041758 glutamate (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), ethylene vinyl acetate ( Langer et al., supra) or poly-D(-)-3-hydroxybutyric acid (EP 0 133 988). Sustained release compositions may also include liposomes, which can be prepared using any of several methods known in the art; see, for example, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 82: 3688-92 and EP Nos. 0036676, 0088046 and 0143949.

Фармацевтическая композиция с применением связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида, которую предполагается использовать для in vivo применения, обычно должна быть стерильной. Это может быть достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. В том случае, где данная композиция лиофилизирована, стерилизация с использованием этого способа может проводиться или до или после лиофилизации и воссоздания. Композиция для парентерального использования может сохраняться в лиофилизированной форме или в растворе. Кроме того, парентеральные композиции, в общем, помещаются в контейнер, снабженный стерильным портом доступа, например контейнер для внутривенного раствора или флакон, имеющие пробку, которая прокалывается иголкой для подкожных инъекций.A pharmaceutical composition using a linked molecule, an FGF21 mutant polypeptide, or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide to be used for in vivo use will generally need to be sterile. This can be achieved by filtration through sterile filter membranes. Where the composition is lyophilized, sterilization using this method may be carried out either before or after lyophilization and reconstitution. The composition for parenteral use may be stored in lyophilized form or in solution. In addition, parenteral compositions are generally placed in a container provided with a sterile access port, such as an intravenous solution container or vial having a stopper that is pierced with a hypodermic needle.

Когда данная фармацевтическая композиция составлена, она может храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или как обезвоженный или лиофилизированный порошок. Такие композиции могут сохраняться или в готовой к применению форме или в форме (например, лиофилизированной), требующей воссоздания перед использованием.Once the pharmaceutical composition is formulated, it may be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, or as a dehydrated or lyophilized powder. Such compositions may be stored either in a ready-to-use form or in a form (eg, lyophilized) requiring reconstitution prior to use.

В специфическом варианте настоящее изобретение направлено на наборы для приготовления однодозовой единицы использования. Каждый из таких наборов может содержать как первый контейнер, имеющий сухой протеин, так и второй контейнер, имеющий водный препарат. Кроме того, в объем данного изобретения входят наборы, содержащие одноразовые и многокамерные предварительно наполненные шприцы (например, жидкостные шприцы и лиошприцы).In a specific embodiment, the present invention is directed to kits for the preparation of a single dose unit of use. Each of such kits may contain both a first container having a dry protein and a second container having an aqueous formulation. In addition, kits containing disposable and multi-chamber pre-filled syringes (eg, liquid syringes and lyosyringes) are included within the scope of this invention.

Терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции с использованием связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида (который может быть усеченным, кэппированным или С-терминально мутированным) или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида, которую предполагается использовать в терапевтических целях, будет зависеть, например, от терапевтического контекста и целей. Специалисту в данной области понятно, что соответствующие уровни дозировки для лечения будут варьировать частично в зависимости от показаний доставляемой молекулы, по которым используется связанная молекула, FGF21 мутантный полипептид или химически модифицированный FGF21 мутантный полипептид, схемы использования и размеров (веса тела, поверхности тела или размера органа), и состояния (возраст и общее состояние здоровья) пациента. Соответственно клиницист может изменить дозировку и модифицировать схему использования для получения оптимального терапевтического эффекта. Типичная дозировка может варьировать приблизительно от 0,1 до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. В других вариантах дозировка может варьировать от 0,01 до приблизительно 10 мг/кг, например 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг.The therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition using the linked molecule, FGF21 mutant polypeptide (which may be truncated, capped or C-terminally mutated) or chemically modified FGF21 mutant polypeptide that is intended to be used for therapeutic purposes will depend, for example, on the therapeutic context and goals. . One of skill in the art will recognize that appropriate dosage levels for treatment will vary in part depending on the indication of the molecule being delivered, for which the associated molecule, FGF21 mutant polypeptide or chemically modified FGF21 mutant polypeptide is used, patterns of use, and dimensions (body weight, body surface area, or size organ), and the condition (age and general health) of the patient. Accordingly, the clinician can change the dosage and modify the regimen of use to obtain the optimal therapeutic effect. A typical dosage may vary from about 0.1 to 100 mg/kg or more, depending on the factors mentioned above. In other embodiments, the dosage may vary from 0.01 to about 10 mg/kg, for example 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mg/kg.

Частота дозировки будет зависеть от фармакокинетических параметров связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида в используемой композиции. Обычно клиницист назначает данную композицию до тех пор, пока не достигается доза, дающая желательный эффект. Поэтому данная композиция может назначаться в виде единичной дозы, в виде двух или больше доз (которые могут или могут не содержать одинаковое количество необходимой молекулы) в течение определенного периода времени, или как непрерывная инфузия через имплантированное устройство или катетер. Дополнительное уточнение соответствующей дозировки делается обычно рядовыми специалистами в данной области и входит в круг их обязанностей. Подходящие дозы могут быть установлены на основании соответствующих данных относительно реакции пациента на использованные дозы.The frequency of dosage will depend on the pharmacokinetic parameters of the associated molecule, FGF21 mutant polypeptide or chemically modified FGF21 mutant polypeptide in the composition used. Typically, the clinician will prescribe the composition until the desired dose is reached. Therefore, the composition may be administered as a single dose, as two or more doses (which may or may not contain the same amount of the desired molecule) over a period of time, or as a continuous infusion through an implanted device or catheter. Additional refinement of the appropriate dosage is usually done by ordinary experts in this field and is part of their responsibilities. Appropriate doses can be established on the basis of relevant data regarding the patient's response to the doses used.

Схема использования данной фармацевтической композиции согласуется с известными способами, например перорально; путем инъекции по внутривенной, интраперитонеальной, интрацеребральной (интрапаренхимальной), интрацеребровентрикулярной, внутримышечной, внутриглазной, внутриартериальной, интрапортальной или интралезиональной схемам; с помощью систем пролонгированного выделения; или с помощью имплантированных устройств. При необходимости, данные композиции могут использоваться с применением болюсной инъекции или непрерывной инфузии, или имплантированного устройства.The scheme of use of this pharmaceutical composition is consistent with known methods, for example orally; by injection according to intravenous, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal or intralesional schemes; with the help of systems of prolonged release; or with implanted devices. If necessary, these compositions can be used using a bolus injection or continuous infusion, or an implanted device.

Как альтернатива или дополнение, данная композиция может применяться локально путем имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором необходимая молекула была абсорбирована или инкапсулирована. Когда применяется имплантированное устройство, оно может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, и доставка необходимой молекулы может осуществляться путем диффузии, болюсом с заданным временем выделения или путем непрерывного введения.Alternatively or in addition, the composition may be applied locally by implantation of a membrane, sponge or other suitable material onto which the desired molecule has been absorbed or encapsulated. When an implantable device is used, it may be implanted in any suitable tissue or organ and delivery of the desired molecule may be by diffusion, timed release bolus, or continuous administration.

- 20 041758- 20 041758

10. Терапевтические применения FGF21 полипептидных мутантов.10. Therapeutic applications of FGF21 polypeptide mutants.

Связанные молекулы, FGF21 мутантные полипептиды (которые могут быть усеченными, кэппированными или С-терминально мутированными) и химически модифицированные FGF21 мутантные полипептиды настоящего изобретения могут быть использованы для лечения, диагностирования, ослабления или предупреждения ряда болезней, расстройств или состояний, включая, но не ограничиваясь этим, метаболические расстройства. В одном варианте метаболическое расстройство, которое предполагается лечить, представляет собой диабет. В другом варианте данное метаболическое расстройство является ожирением. Другие варианты включают метаболические состояния или расстройства, такие как дислипидемия; гипертензия; гепатостеатоз, такой как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ); сердечнососудистое заболевание, такое как атеросклероз; и старение.The related molecules, FGF21 mutant polypeptides (which may be truncated, capped, or C-terminally mutated), and chemically modified FGF21 mutant polypeptides of the present invention can be used to treat, diagnose, ameliorate, or prevent a number of diseases, disorders, or conditions, including, but not limited to this, metabolic disorders. In one embodiment, the metabolic disorder to be treated is diabetes. In another embodiment, the metabolic disorder is obesity. Other options include metabolic conditions or disorders such as dyslipidemia; hypertension; hepatosteatosis such as non-alcoholic steatohepatitis (NASH); cardiovascular disease such as atherosclerosis; and aging.

Что касается применения, расстройство или состояние, такое как диабет или ожирение, могут лечиться путем назначения связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида, описаных здесь, пациенту, который нуждается в этом, в количестве эффективной терапевтической дозы. Использование может осуществляться, как описано здесь, например, с помощью внутривенной инъекции, или перорально, в форме таблетки или жидкого препарата. В большинстве ситуаций необходимая доза может быть определена клиницистом, как описано здесь, и может представлять терапевтически эффективную дозу связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида. Специалистам в данной области очевидно, что терапевтически эффективная доза связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида будет зависеть, inter alia, от схемы использования, единичной дозы назначенного антигена, того, использовалась ли молекула нуклеиновой кислоты или полипептида в комбинации с другими терапевтическими агентами, иммунологического статуса и здоровья реципиента. Термин терапевтически эффективная доза, используемый здесь, означает то количество связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида, которое вызывает данную биологическую или медицинскую реакцию в тканевой системе, животном или человеке, которую ожидает исследователь, медицинский доктор или другой клиницист, которая включает ослабление симптомов болезни или расстройства, которые поддаются лечению.With respect to use, a disorder or condition such as diabetes or obesity can be treated by administering the related molecule, FGF21 mutant polypeptide or chemically modified FGF21 mutant polypeptide described herein to a patient in need thereof in an effective therapeutic dose amount. The use can be carried out as described here, for example, by intravenous injection, or orally, in the form of a tablet or liquid preparation. In most situations, the required dose can be determined by the clinician, as described herein, and may represent a therapeutically effective dose of the associated molecule, FGF21 mutant polypeptide, or chemically modified FGF21 mutant polypeptide. It will be apparent to those skilled in the art that the therapeutically effective dose of the coupled molecule, FGF21 mutant polypeptide, or chemically modified FGF21 mutant polypeptide will depend, inter alia, on the regimen of use, the single dose of antigen administered, whether the nucleic acid molecule or polypeptide was used in combination with other therapeutic agents, immunological status and health of the recipient. The term "therapeutically effective dose" as used herein means that amount of a bound molecule, FGF21 mutant polypeptide, or chemically modified FGF21 mutant polypeptide, that elicits a given biological or medical response in a tissue system, animal, or human that is expected by a researcher, medical doctor, or other clinician that involves the reduction of symptoms of a disease or disorder that is treatable.

11. Антитела.11. Antibodies.

Антитела и фрагменты антител, которые специфическим образом связываются со связанной молекулой, FGF21 мутантным полипептидом или химически модифицированными FGF21 мутантными полипептидами настоящего изобретения, но не связываются специфически с полипептидами FGF21 дикого типа, предусмотрены в настоящем изобретении. Антитела могут быть поликлональными, включая моноспецифические поликлональные; моноклональными (МАТ); рекомбинантными; химерными; гуманизированными, такими как привитые к гипервариабельному участку ((CDR)-grafted); человеческими; одноцепочечными и/или биспецифическими; так же как и фрагменты; варианты или их химически модифицированные молекулы. Фрагменты антител включают те участки данного антитела, которые специфически связаны с эпитопом на FGF21 мутантном полипептиде. Примеры таких фрагментов включают Fab и F(ab') фрагменты, сгенерированные путем ферментативного расщепления антител полной длины. Другие связывающие фрагменты включают те, что сгенерированы способами рекомбинантной ДНК, такими как экспрессия рекомбинантных плазмид, которые содержат нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие вариабельные участки антитела.Antibodies and antibody fragments that specifically bind to the associated molecule, FGF21 mutant polypeptide, or chemically modified FGF21 mutant polypeptides of the present invention, but do not specifically bind to wild-type FGF21 polypeptides, are contemplated by the present invention. Antibodies can be polyclonal, including monospecific polyclonal; monoclonal (MAT); recombinant; chimeric; humanized, such as hypervariable region grafted ((CDR)-grafted); human; single-stranded and/or bispecific; as well as fragments; variants or their chemically modified molecules. Antibody fragments include those portions of a given antibody that are specifically associated with an epitope on the FGF21 mutant polypeptide. Examples of such fragments include Fab and F(ab') fragments generated by enzymatic digestion of full length antibodies. Other binding fragments include those generated by recombinant DNA techniques, such as the expression of recombinant plasmids, which contain nucleic acid sequences encoding antibody variable regions.

Поликлональные антитела, направленные на связанную молекулу, FGF21 мутантный полипептид или химически модифицированный FGF21 мутантный полипептид, вырабатываются, в общем, в животных (например, кроликах или мышах) посредством множественных подкожных или интраперитонеальных инъекций FGF21 мутантного полипептида и адъюванта. Может быть полезным конъюгировать FGF21 мутантный полипептид с протеином-носителем, иммуногенным в видах, которые предстоит иммунизировать, таким как гемоцианин кольцевой структуры в виде замочной скважины, сыворотка, альбумин, бычий тироглобулин или соевый трипсиновый ингибитор. Кроме того, используются агрегирующие агенты, такие как квасцы, для усиления иммунной реакции. После иммунизации животным делают кровопускание, и сыворотка анализируется на титр антитела против связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида.Polyclonal antibodies directed to the associated molecule, an FGF21 mutant polypeptide or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide, are generally produced in animals (eg, rabbits or mice) by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections of the FGF21 mutant polypeptide and an adjuvant. It may be useful to conjugate the FGF21 mutant polypeptide to a carrier protein that is immunogenic in the species to be immunized, such as keyhole ring hemocyanin, serum, albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor. In addition, aggregating agents such as alum are used to enhance the immune response. After immunization, the animals are bled and the serum is analyzed for antibody titer against the bound molecule, the FGF21 mutant polypeptide, or the chemically modified FGF21 mutant polypeptide.

Моноклональные антитела, направленные на связанную молекулу, FGF21 мутантные полипептиды или химически модифицированные FGF21 мутантные полипептиды, могут быть получены с использованием любого способа, который предусматривает выработку молекул антитела с помощью непрерывных клеточных линий в культуре. Примеры приемлемых способов для приготовления моноклональных антител включают гибридомные способы Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-97 и способ В-клеточной гибридомы человека (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). Также настоящее изобретение представляет линии клеточной гибридомы, которые вырабатывают моноклональные антитела, реактивные со связанной молекулой, FGF21 мутантными полипептидами или химически модифицированными FGF21 мутантными полипептидами.Monoclonal antibodies directed to the associated molecule, FGF21 mutant polypeptides or chemically modified FGF21 mutant polypeptides can be produced using any method that involves the production of antibody molecules using continuous cell lines in culture. Examples of suitable methods for preparing monoclonal antibodies include the hybridoma methods of Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-97 and the human B-cell hybridoma method (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987) The present invention also provides cell hybridoma lines that produce monoclonal antibodies reactive with a bound molecule, FGF21 mutant polypeptides, or chemically modified FGF21 mutant polypeptides.

- 21 041758- 21 041758

Ahtu-FGF21 мутантные антитела данного изобретения могут использоваться в любом известном способе анализа, таком как конкурентно-связывающие анализы, прямой и непрямой сэндвичевые анализы и иммунопреципитационные анализы (см., например, работу Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), на которую в данной заявке сделана полная ссылка) для обнаружения и количественного определения FGF21 мутантных полипептидов. Данные антитела будут связывать FGF21 мутантные полипептиды со сродством, подходящим для применения данного способа анализа.Ahtu-FGF21 mutant antibodies of the present invention can be used in any known assay method, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays (see, for example, Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 ( CRC Press, Inc., 1987) to which full reference is made in this application) for the detection and quantification of FGF21 mutant polypeptides. These antibodies will bind FGF21 mutant polypeptides with an affinity suitable for the application of this assay.

Для диагностических приложений, в некоторых вариантах, антитела против связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида могут быть мечены обнаружимой составляющей. Обнаружимая составляющая может быть любой составляющей, которая способна давать, прямо или косвенно, обнаружимый сигнал. Например, обнаружимая составляющая может быть радиоизотопом, таким как ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S, ¹²⁵I, ⁹⁹Тс, ⁿ¹In или ⁶⁷Ga; флуоресцентным или хемилюминесцентным соединением, таким как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или люцифераза; или ферментом, таким как щелочная фосфатаза, Р-галактозидаза или пероксидаза хрена обыкновенного (Bayer et al., 1990, Meth. Enz. 184: 138-63).For diagnostic applications, in some embodiments, antibodies against a related molecule, an FGF21 mutant polypeptide, or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide may be labeled with a detectable moiety. A detectable component can be any component that is capable of producing, directly or indirectly, a detectable signal. For example, the detectable constituent may be a radioisotope such as ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, ¹²⁵ I, ⁹⁹ Tc, ⁿ¹ In, or ⁶⁷ Ga; a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferase; or an enzyme such as alkaline phosphatase, P-galactosidase or horseradish peroxidase (Bayer et al., 1990, Meth. Enz. 184: 138-63).

Конкурентно-связывающие анализы основаны на способности меченого эталона (например, FGF21 мутантного полипептида или его иммунологически реакционной части) конкурировать с испытываемой пробой анализируемого вещества (например, связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида) на связывание с ограниченным количеством антитела против связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида, в зависимости от анализируемого вещества. Количество связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида в испытываемой пробе обратно пропорционально количеству эталона, который становится связанным с данными антителами. Для облегчения определения количества эталона, который становится связанным, данные антитела обычно инсолюбилизируются перед или после конкурентной борьбы, так что эталон и анализируемое вещество, которые связаны с антителами, могут легко быть отделены от эталона и анализируемого вещества, которые остались несвязанными.Competitive binding assays rely on the ability of a labeled reference (for example, a FGF21 mutant polypeptide or an immunologically reactive portion thereof) to compete with a test sample of an analyte (for example, a bound molecule, an FGF21 mutant polypeptide, or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide) to bind to a limited amount of an antibody against a linked molecule, an FGF21 mutant polypeptide, or a chemically modified FGF21 mutant polypeptide, depending on the analyte. The amount of bound molecule, FGF21 mutant polypeptide, or chemically modified FGF21 mutant polypeptide in a test sample is inversely proportional to the amount of reference that becomes bound to those antibodies. To facilitate the determination of the amount of a reference that becomes bound, these antibodies are usually insolubilized before or after competition so that the reference and analyte that are bound to the antibodies can be easily separated from the reference and analyte that remain unbound.

Сэндвичевые анализы обычно включают использование двух антител, каждое способно связываться с отдельной иммуногенной частью или эпитопом протеина, который предполагается обнаружить и/или подвергнуть количественному анализу. В сэндвичевом анализе испытываемая проба анализируемого вещества обычно связывается первым антителом, которое иммобилизовано на твердой подложке, и после этого второе антитело связывается с анализируемым веществом, образуя, таким образом, нерастворимый трехчастичный комплекс, см., например, патент США No. 4376110. Второе антитело само может быть мечено обнаружимой составляющей (прямой сэндвичевый анализ) или может определяться с использованием антитела к иммуноглобулину, меченого обнаружимой составляющей (косвенный сэндвичевый анализ). Например, одним типом сэндвичевого анализа является иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), в котором обнаружимой составляющей является фермент.Sandwich assays typically involve the use of two antibodies, each capable of binding to a separate immunogenic portion or epitope of the protein to be detected and/or quantified. In a sandwich assay, the analyte sample to be tested is typically bound by a first antibody that is immobilized on a solid support, and thereafter a second antibody binds to the analyte, thus forming an insoluble three-body complex, see, for example, U.S. Patent No. No. 4,376,110. The second antibody may itself be labeled with a detectable moiety (direct sandwich assay) or may be detected using an anti-immunoglobulin antibody labeled with a detectable moiety (indirect sandwich assay). For example, one type of sandwich assay is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in which the detectable moiety is an enzyme.

Антитела против связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида настоящего изобретения также полезны для in vivo визуализации. Антитело, меченное обнаружимой составляющей, может вводиться животному предпочтительно в кровоток, и присутствие и месторасположение меченого антитела в хозяине анализируется. Данное антитело может метиться любой составляющей, которая обнаружима в животном, либо способом ядерного магнитного резонанса, радиологическим способом или другими средствами обнаружения, которые известны в данной области.Antibodies against the associated molecule, FGF21 mutant polypeptide or chemically modified FGF21 mutant polypeptide of the present invention are also useful for in vivo imaging. An antibody labeled with a detectable moiety can be administered to the animal, preferably into the blood stream, and the presence and location of the labeled antibody in the host is analyzed. The antibody may be labeled with any moiety that is detectable in the animal, either by nuclear magnetic resonance, radiological, or other means of detection that are known in the art.

Данное изобретение также относится к набору, включающему связанные молекулы, FGF21 мутантные полипептиды или химически модифицированные FGF21 мутантные полипептидные антитела и другие реагенты, полезные для обнаружения уровней связанной молекулы, FGF21 мутантного полипептида или химически модифицированного FGF21 мутантного полипептида в биологических пробах. Такие реагенты могут включать обнаружимую метку, блокирующую сыворотку, положительную и отрицательную контрольные пробы и реактивы для обнаружения.The invention also provides a kit comprising linked molecules, FGF21 mutant polypeptides or chemically modified FGF21 mutant polypeptide antibodies, and other reagents useful for detecting levels of the linked molecule, FGF21 mutant polypeptide or chemically modified FGF21 mutant polypeptide in biological samples. Such reagents may include a detectable label, blocking serum, positive and negative controls, and detection reagents.

ПримерыExamples

Следующие примеры иллюстрируют специфические варианты данного изобретения и их разнообразные применения. Они представлены только с целью объяснения и не должны рассматриваться как ограничивающие в той или иной мере объем данного изобретения.The following examples illustrate specific embodiments of the present invention and their various applications. They are presented for the purpose of explanation only and should not be construed as limiting in any way the scope of this invention.

Пример 1. Получение FGF21 полипептидных экспрессирующих конструктов.Example 1 Preparation of FGF21 polypeptide expression constructs.

Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая зрелый FGF21 полипептид, была получена способом ПЦР (полимеразная цепная реакция) амплификации с использованием праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности, соответствующие 5'- и 3'-концам зрелой FGF21 последовательности. В табл. 4 перечислены праймеры, которые были использованы для амплификации зрелой FGF21 последовательности.The nucleic acid sequence encoding the mature FGF21 polypeptide was obtained by PCR (polymerase chain reaction) amplification using primers having nucleotide sequences corresponding to the 5' and 3' ends of the mature FGF21 sequence. In table. 4 lists the primers that were used to amplify the mature FGF21 sequence.

- 22 041758- 22 041758

Таблица 4Table 4

ПЦР праймеры для получения FGF21 конструктаPCR primers to obtain the FGF21 construct

Праймер primer Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: Смысл. Meaning. 5’-AGGAGGAATAACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCC-3’ 5'-AGGAGGAATAACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCC-3' 33 33 Антисмысл. Antisense. 5’-TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3’ 5'-TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3' 34 34

Праймеры, использованные для приготовления FGF21 экспрессирующего конструкта, включали рестрикционные эндонуклеазные сайты для направленного клонирования данной последовательности в подходящий экспрессирующий вектор (например, рЕТ30 (Novagen/EMD Biosciences; San Diego, CA) или pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA)). Экспрессирующий вектор pAMG33 содержит малокопийный (low-copy) R-100 репликатор, модифицированный lac промотор и канамицин-резистентный ген. Экспрессирующий вектор рЕТ30 содержит полученный из pBR322 репликатор, индуцированый Т7 промотор и канамицин-резистентный ген. Хотя экспрессия от pAMG33, как было найдено, была выше, рЕТ30, как было установлено, является более надежным клонирующим вектором. Таким образом, большинство конструктов, описанных в данной заявке, сначала генерировалось в рЕТ30 и потом подвергалось скринингу, в отношении эффективности. Выбранные последовательности затем переносились в pAMG33 для дальнейшей амплификации.The primers used to prepare the FGF21 expression construct included restriction endonuclease sites for targeted cloning of the sequence into a suitable expression vector (eg, pET30 (Novagen/EMD Biosciences; San Diego, CA) or pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA)). The pAMG33 expression vector contains a low-copy R-100 replicator, a modified lac promoter, and a kanamycin-resistant gene. The pET30 expression vector contains a pBR322-derived replicator, an inducible T7 promoter, and a kanamycin-resistant gene. Although expression from pAMG33 was found to be higher, pET30 was found to be a more reliable cloning vector. Thus, most of the constructs described in this application were first generated in pET30 and then screened for efficacy. The selected sequences were then transferred to pAMG33 for further amplification.

FGF21 последовательность была амплифицирована в реакционной смеси, содержащей 40,65 мкл dH₂O, 5 мкл PfuUltra II реакционного буфера (10х), 1,25 мкл dNTP Mix (40 мМ - 4x10 мМ), 0,1 мкл Template (100 нг/мл), 1 мкл Primerl (10 мкМ), 1 мкл Primer2 (10 мкМ) и 1 мкл PfuUltra II fusion HS ДНК полимеразы (Stratagene; La Jolla, СА). Реакции амплификации проводились путем нагревания в течение 2 мин при 95 °С; затем десятью циклами при 95°С в течение 20 с, 60°С в течение 20 с (при дополнительном вычитании 1°С на цикл), и 72°С в течение 15 с/килобазу (тысяча гетероциклических оснований нуклеиновой кислоты) необходимого продукта; с последующими 20 циклами при 94°С в течение 20 с, 55°С в течение 20 с, и 72°С в течение 15 с/килобазу необходимого продукта; затем при 72°С в течение 3 мин. Продукты амплификации расщеплялись рестрикционными эндонуклеазами NdeI и EcoRI; вшивались в подходящий вектор и потом трансформировались в компетентные клетки.The FGF21 sequence was amplified in a reaction mixture containing 40.65 µl dH ₂ O, 5 µl PfuUltra II reaction buffer (10x), 1.25 µl dNTP Mix (40 mM - 4x10 mM), 0.1 µl Template (100 ng/ ml), 1 µl Primerl (10 µM), 1 µl Primer2 (10 µM), and 1 µl PfuUltra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene; La Jolla, CA). Amplification reactions were carried out by heating for 2 min at 95°C; then ten cycles at 95°C for 20 s, 60°C for 20 s (with an additional subtraction of 1°C per cycle), and 72°C for 15 s/kilobase (thousand heterocyclic nucleic acid bases) of the desired product; followed by 20 cycles at 94°C for 20 s, 55°C for 20 s, and 72°C for 15 s/kilobase of desired product; then at 72°C for 3 min. The amplification products were digested with restriction endonucleases NdeI and EcoRI; were inserted into a suitable vector and then transformed into competent cells.

Как результат использования бактериальной экспрессирующей системы, экспрессированный зрелый FGF21 полипептид включал N-концевой метиониновый остаток или переменный метиониновый остаток, такой как fMet или глюконилированный Met.As a result of using a bacterial expression system, the expressed mature FGF21 polypeptide included an N-terminal methionine residue or a variable methionine residue such as fMet or gluconylated Met.

Пример 2. Очистка FGF21 полипептидов дикого типа от бактерий.Example 2 Purification of wild-type FGF21 polypeptides from bacteria.

В последующих примерах полипептиды FGF21 дикого типа были экспрессированы в бактериальной экспрессирующей системе. После экспрессирования, описанного ниже, полипептиды FGF21 дикого типа были подвергнуты очистке, как описано в этом примере, если не указано другое.In the following examples, wild-type FGF21 polypeptides were expressed in a bacterial expression system. Following expression as described below, wild-type FGF21 polypeptides were purified as described in this example unless otherwise noted.

Для очистки полипептида FGF21 дикого типа от бактериальных включений дважды промытые включения (DWIBs) были солюбилизированы в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и дитиотреитол (DTT) в Tris буфере при рН 8,5, и потом смешивались в течение 1 ч при комнатной температуре, и данная солюбилизационная смесь добавлялась к восстановленному буферу, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамин гидрохлорид при рН 9,5, и смешивалась в течение 24 ч при 5°С (см., например, работы Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, Folding proteins, in Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press), pp. 57-99; and Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 16).To purify the wild-type FGF21 polypeptide from bacterial inclusions, double-washed inclusions (DWIBs) were solubilized in a solubilization buffer containing guanidine hydrochloride and dithiothreitol (DTT) in Tris buffer at pH 8.5, and then mixed for 1 h at room temperature, and this solubilization mixture was added to a reconstituted buffer containing urea, arginine, cysteine and cystamine hydrochloride at pH 9.5 and mixed for 24 hours at 5°C (see, for example, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. Rudolph et al., 1997, Folding proteins, in Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press), pp. 57-99; and Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 16).

После солюбилизации и рефолдинга данную смесь фильтровали через 0,45-микронный фильтр. Данный пул затем концентрировали приблизительно 10-кратно с помощью кассеты Pall Omega с граничным молекулярным весом 10 кДа при трансмембранном давлении (ТМД) 20 фунт/кв.дюйм, подвергали диалитическому фильтрованию 3 колонковыми объемами 20 мМ Tris, рН 8,0 при ТМД 20 фунт/кв.дюйм.After solubilization and refolding, this mixture was filtered through a 0.45 micron filter. This pool was then concentrated approximately 10-fold using a Pall Omega cassette with a cutoff molecular weight of 10 kDa at a transmembrane pressure (TMP) of 20 psi, subjected to dialytic filtration with 3 column volumes of 20 mM Tris, pH 8.0 at TMP of 20 lb. / sq. inch

Осветленный образец затем подвергался анионообменной хроматографии (АОХ) с использованием Q Sepharose HP смолы. Была проведена серия опытов с использованием линейного солевого градиента от 0 до 250 мМ NaCl в 20 мМ Tris при рН 8,0 и 5°С. Пиковые фракции анализировались способом SDSPAGE и собирались.The clarified sample was then subjected to anion exchange chromatography (AOX) using Q Sepharose HP resin. A series of experiments was carried out using a linear salt gradient from 0 to 250 mm NaCl in 20 mm Tris at pH 8.0 and 5°C. Peak fractions were analyzed by the SDSPAGE method and collected.

Затем АОХ элюатный пул подвергался гидрофобной хроматографии (ГХ) с использованием Phenyl Sepharose HP смолы. Протеин элюировали с использованием уменьшающегося линейного градиента от 0,7 до 0 М сульфата аммония при рН 8,0 и комнатной температуре. Пиковые фракции анализировались способом SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) и собирались.The AOX eluate pool was then subjected to hydrophobic chromatography (GC) using Phenyl Sepharose HP resin. The protein was eluted using a decreasing linear gradient from 0.7 to 0 M ammonium sulfate at pH 8.0 and room temperature. Peak fractions were analyzed by SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) and collected.

ГХ пул концентрировался с помощью 0,2 м² кассеты Pall Omega с граничным молекулярным весом 10 кДа до 7 мг/мл при трансмембранном давлении (ТМД) 20 фунт/кв.дюйм. Концентрат подвергался диалитическому фильтрованию 5 об. 10 мМ KPO4, 5% сорбита, рН 8,0 при ТМД 20 фунт/кв.дюйм, и восстановленный концентрат разбавлялся до 5 мг/мл. В завершение, раствор фильтровали через мембрану Pall mini-Kleenpac 0,2 мкМ Posidyne.The GC pool was concentrated using a 0.2 m ² Pall Omega cassette with a cutoff molecular weight of 10 kDa to 7 mg/ml at a transmembrane pressure (TMP) of 20 psi. The concentrate was subjected to dialytic filtration 5 vol. 10 mM KPO4, 5% sorbitol, pH 8.0 at 20 psi TMW, and the reconstituted concentrate was diluted to 5 mg/mL. Finally, the solution was filtered through a Pall mini-Kleenpac 0.2 μM Posidyne membrane.

Пример 3. Идентификация FGF21 мутантов.Example 3 Identification of FGF21 mutants.

FGF21 дикого типа имеет относительно короткий период полураспада, и в некоторых случаях это может быть нежелательным для применения FGF21 дикого типа как терапевтического средства. КромеWild-type FGF21 has a relatively short half-life, and in some cases this may not be desirable for wild-type FGF21 to be used as a therapeutic agent. Except

- 23 041758 того, традиционные способы расширения периода полураспада, такие как ПЭГилирование данного полипептида, ограничены числом и расположением приемлемых сайтов ПЭГилирования в FGF21 последовательности. В полипептидной последовательности FGF21 дикого типа имеется семь природных сайтов ПЭГилирования, а именно альфа аминогруппа, четыре лизиновых остатка и два цистеиновых остатка. Эти сайты не являются идеальными для ПЭГилирования, поскольку молекула ПЭГ может негативно влиять на способность FGF21 приобретать свою природную структуру или может негативно влиять на взаимодействие между FGF21 и своим рецептором или бета-клото (klotho). Кроме того, за исключением альфа аминогруппы, эти реактивные остатки не учитывают сайт-специфическое ПЭГилирование в единственном целенаправленном положении. Соответственно было предпринято направленное и специальное исследование для идентификации остатков в полипептиде FGF21 дикого типа, которые могли бы мутировать в остаток, подходящий для химической модификации. Соображения в данном исследовании касались расположения остатка в FGF21 последовательности, также как и его расположения на протеиновой поверхности.In addition, conventional methods for extending the half-life, such as PEGylating a given polypeptide, are limited by the number and location of acceptable PEGylation sites in the FGF21 sequence. There are seven natural PEGylation sites in the wild type FGF21 polypeptide sequence, namely an alpha amino group, four lysine residues, and two cysteine residues. These sites are not ideal for PEGylation, as the PEG molecule can negatively affect the ability of FGF21 to assume its natural structure, or can negatively affect the interaction between FGF21 and its receptor or beta-clotho (klotho). In addition, with the exception of the alpha amino group, these reactive residues do not allow for site-specific PEGylation at a single targeted position. Accordingly, a targeted and specific study was undertaken to identify residues in the wild-type FGF21 polypeptide that could mutate into a residue suitable for chemical modification. Considerations in this study concerned the location of the residue in the FGF21 sequence as well as its location on the protein surface.

В попытке идентифицировать отдельные остатки в полипептиде FGF21 дикого типа, которые подходили бы для мутации в остаток, пригодный для химической модификации, использовались описанные здесь две разные стратегии.In an attempt to identify individual residues in the wild-type FGF21 polypeptide that would be suitable for mutation into a residue suitable for chemical modification, two different strategies described here were used.

Пример 3.А. Кандидатуры на мутирование, идентифицированные с использованием гомологической модели.Example 3.A. Mutation candidates identified using a homology model.

В первой стратегии была применена гомологическая модель в систематическом рациональном протеиновом инжиниринговом подходе к идентификации остатков, имеющих с высокой вероятностью выступающие на поверхность боковые цепи, которые, вероятно, могут выдержать ПЭГилирование без ущерба для FGF21 активности. Поскольку опубликованные рентгеновские или ЯМР структуры FGF21, которые могли бы быть использованы для идентификации таких остатков, отсутствуют, была использована рентгеновская кристаллическая структура FGF19 (1PWA) высокого разрешения (1,3 А), полученная из банка данных по протеинам Protein Databank (PDB), для создания трехмерной гомологической модели FGF21 с использованием программного обеспечения для моделирования МОЕ (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canada). FGF19 был выбран как матрица, поскольку среди протеинов, депонированных в указанном банке данных по протеинам, FGF19 является самым близким протеином к FGF21 в рамках гомологии аминокислотной последовательности.The first strategy applied a homology model in a systematic rational protein engineering approach to identify residues with a high probability of protruding side chains that are likely to survive PEGylation without compromising FGF21 activity. Since there are no published X-ray or NMR structures of FGF21 that could be used to identify such residues, a high-resolution (1.3 A) X-ray crystal structure of FGF19 (1PWA) obtained from the Protein Databank (PDB) was used. to generate a 3D homology model of FGF21 using MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canada) modeling software. FGF19 was chosen as the template because, among the proteins deposited in the protein database, FGF19 is the closest protein to FGF21 in terms of amino acid sequence homology.

Затем FGF21 гомологическая модель была расширена до представления связи FGF-21 с FGF рецептором. Эта модель была использована для идентификации остатков, которые, вероятно, выступают на поверхность молекулы FGF21 и доступны для реакции с активированной полимерной (например, ПЭГ) составляющей, избегая при этом тех остатков, которые могут помешать взаимодействию FGF21 с рецептором. Принимались во внимание также соображения в отношении сохранения остатков в данной последовательности между видами, также как и биохимические свойства природной боковой цепи. Остатки, идентифицированные как хорошие кандидатуры с помощью этого скрининга, ранжировались в соответствии с оцененной вероятностью успешного ПЭГилирования этого сайта при минимальном нарушении активности. Остатки в группе А отражают наилучшие кандидатуры, и остатки в группе D отражают жизнеспособные, но менее предпочтительные кандидатуры. Группа А включает N121, H125, H112, R77, Н87, Е37 и K69. Группа В включает R126, G113, D79, Е91, D38, D46 и G120. Группа С включает S71, D89, L86, Т70, G39, Т40, R36, Р49, S48, S123, К122, А81, А111, Е110 и R96. Наконец, группа D включает Q18, R19, А26, Q28, Е34, А44, А45, Е50, L52, Q54, L55, К59, G61, L66, V68, R72, Р78, G80, Y83, S85, F88, Р90, А92, S94, L98, Е101, D102, Q108, L114, Н117, Р119, Р124, D127, Р128, А129, Р130, R131 и P140.The FGF21 homology model was then extended to represent the association of FGF-21 with the FGF receptor. This model was used to identify residues that are likely to protrude from the surface of the FGF21 molecule and are available for reaction with an activated polymeric (eg, PEG) moiety, while avoiding those residues that may interfere with the interaction of FGF21 with the receptor. Considerations were also taken into account regarding the conservation of residues in a given sequence between species, as well as the biochemical properties of the natural side chain. Residues identified as good candidates by this screen were ranked according to the estimated probability of successful PEGylation of that site with minimal disruption of activity. Residuals in group A reflect the best candidates, and those in group D reflect viable but less preferred candidates. Group A includes N121, H125, H112, R77, H87, E37 and K69. Group B includes R126, G113, D79, E91, D38, D46 and G120. Group C includes S71, D89, L86, T70, G39, T40, R36, P49, S48, S123, K122, A81, A111, E110 and R96. Finally, group D includes Q18, R19, A26, Q28, E34, A44, A45, E50, L52, Q54, L55, K59, G61, L66, V68, R72, P78, G80, Y83, S85, F88, P90, A92 , S94, L98, E101, D102, Q108, L114, H117, P119, P124, D127, P128, A129, P130, R131 and P140.

Кроме того, были идентифицированы сайты ПЭГилирования внутри амино- и карбоксиконцевых сегментов данной молекулы, исходя из выпрямления последовательности и биохимических свойств боковых цепей, поскольку для этих частей молекулы трехмерные структурные данные отсутствуют. Остатки, которые, как полагали, наиболее подходили для мутации, были идентифицированы и затем сгруппированы в соответствии с тем, насколько хорошо они отвечают ряду выбранных критериев. Остатки 1-13 были оценены в отношении N-конца FGF21 полипептидной последовательности, и D5 был определен как наилучшая кандидатура для мутации, а остатки H1, Р2, I3, Р4 и S6 были также определены как жизнеспособные. В отношении С-конца FGF21 полипептидной последовательности были оценены остатки 141181, и остатки Y179 и R175 были определены как наилучшие кандидатуры для мутации, а остатки Р143, Р171, S172, Q173, G174, S176, Р177, S178, А180 и S181, образовали вторую группу кандидатов, и остатки Р144, А145, Р147, Е148, Р149, Р150, I152 А154, Q156 и G170 образовали третью группу кандидатур для мутации.In addition, PEGylation sites within the amino and carboxy terminal segments of this molecule were identified based on sequence straightening and biochemical properties of the side chains, as three dimensional structural data are not available for these portions of the molecule. The residues that were thought to be most suitable for mutation were identified and then grouped according to how well they met a set of selected criteria. Residues 1-13 were evaluated against the N-terminus of the FGF21 polypeptide sequence and D5 was determined to be the best candidate for mutation, and residues H1, P2, I3, P4 and S6 were also determined to be viable. With respect to the C-terminus of the FGF21 polypeptide sequence, residues 141181 were evaluated, and residues Y179 and R175 were determined to be the best candidates for mutation, and residues P143, P171, S172, Q173, G174, S176, P177, S178, A180 and S181 formed the second group of candidates, and the residues P144, A145, P147, E148, P149, P150, I152 A154, Q156 and G170 formed a third group of candidates for the mutation.

Пример 3.В. FGF21 мутанты, генерированные путем удаления нежелательных сайтов присоединения природных полимеров.Example 3.B. FGF21 mutants generated by deletion of unwanted sites of attachment of natural polymers.

Вторая стратегия использовала аминоспецифическую химию конъюгации для сопряжения ПЭГ и FGF21. Сайт-селективное двойное ПЭГилирование потенциально вакуолегенных конъюгатов может значительно снизить их вакуолегенный потенциал (см., например, патент США No. 6420339). Соответственно в одном аспекте настоящего изобретения сайт-селективное двойное ПЭГилирование осуществляется путем мутирования данного протеина, так что только две первичных аминогруппы остаются дляThe second strategy used amino-specific conjugation chemistry to couple PEG and FGF21. Site-selective double PEGylation of potentially vacuologenic conjugates can significantly reduce their vacuologenic potential (see, for example, US patent No. 6420339). Accordingly, in one aspect of the present invention, site-selective double PEGylation is accomplished by mutating the protein so that only two primary amino groups remain for

- 24 041758- 24 041758

ПЭГ илирования.PEGylation.

FGF21 протеин содержит четыре лизиновых и десять аргининовых остатков, как выделено жирным шрифтом (R и K остатки), и подчеркиванием (K остатки) последовательности FGF21 дикого типа (SEQThe FGF21 protein contains four lysine and ten arginine residues, as shown in bold (R and K residues) and underlined (K residues) of the wild type FGF21 sequence (SEQ

ID NO: 4). Два природных цистеиновых остатка выделены жирным шрифтом и курсивомID NO: 4). The two naturally occurring cysteine residues are in bold and italic

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQL KALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSE AHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPL SMVGPSQGRSPSYAS SEQ ID NO:4HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQL KALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSE AHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPL SMVGPSQGRSPSYAS SEQ ID NO:4

Четыре природных лизина были сначала мутированы в аргинины для создания родительской молекулы, содержащей только одну первичную аминогруппу как α-аминогруппу в N-конце. Она тестировалась на in vitro активность, и, как было найдено, была полностью активной. Затем селективные аргинины были пошагово заменены лизином для создания до десяти аналогов, содержащих вторую первичную аминогруппу для ПЭГилирования в различных положениях на FGF21 молекуле. Изучение гомологической модели FGF21, связанного со своим рецептором (как описано в примере 3.А), позволило провести ранжирование предлагаемых сайтов конъюгации в зависимости от их близости к предполагаемому интерфейсу рецептора. Сайты, которые предполагались скрытыми, не рассматривались.The four natural lysines were first mutated into arginines to create a parent molecule containing only one primary amino group as an α-amino group at the N-terminus. It was tested for in vitro activity and was found to be fully active. The selective arginines were then replaced step by step with lysine to create up to ten analogues containing a second primary amino group for PEGylation at various positions on the FGF21 molecule. Examination of the homology model of FGF21 bound to its receptor (as described in Example 3.A) allowed the proposed conjugation sites to be ranked according to their proximity to the putative receptor interface. Sites that were supposed to be hidden were not considered.

Различные положения ранжировались и характеризовались следующим образом: (а) сайты, доступные растворителю и удаленные от интерфейса рецептора: R36, R77, K122 & R126; (б) сайты, доступные растворителю и близкие к интерфейсу рецептора: K56, K59, K69, R72 & R175; и (в) сайты, которые скрыты: R17, R19, R131 & R135.The various positions were ranked and characterized as follows: (a) sites accessible to solvent and remote from the receptor interface: R36, R77, K122 &R126; (b) solvent-accessible sites close to the receptor interface: K56, K59, K69, R72 &R175; and (c) sites that are hidden: R17, R19, R131 & R135.

Концевые конструкты, каждый из которых содержит единственную α-амино и ε-аминогруппу, очищали и испытывали на активность перед и после конъюгации с ПЭГ, как описано в примере 9 (конъюгация) и 10 (in vitro проба на активность).The terminal constructs, each containing a single α-amino and ε-amino group, were purified and tested for activity before and after PEG conjugation as described in Example 9 (conjugation) and 10 (in vitro activity assay).

Пример 4. Идентификация FGF21 мутантов, включающих единичную мутацию.Example 4 Identification of FGF21 mutants containing a single mutation.

Сводка FGF21 мутантов, включающих единственную мутацию, которые генерировались с помощью рационального протеинового инжинирингового подхода, описанных выше в примере 3.А и 3.В, дана в табл. 3. Эти отдельные мутанты вводят и включают сайт присоединения неприродного полимера, в особенности цистеиновый или лизиновый остаток. Боковые цепи этих остатков особенно подходят для химической модификации путем присоединения полимера, такого как молекулы ПЭГ. Было признано, что в дополнение к введенному сайту присоединения неприродного полимера, полимер может быть присоединен, при необходимости, к N-концу данного протеина, если в этом есть потребность.A summary of the FGF21 mutants containing a single mutation that were generated using the rational protein engineering approach described in Example 3.A and 3.B above is given in Table 1. 3. These individual mutants are introduced and include a non-natural polymer attachment site, especially a cysteine or lysine residue. The side chains of these residues are particularly suitable for chemical modification by polymer attachment, such as PEG molecules. It has been recognized that in addition to the introduced non-natural polymer attachment site, the polymer can be attached, if necessary, to the N-terminus of the protein, if desired.

Поскольку введенные остатки были сконструированы с целью поддерживать уровни биологической активности FGF21 дикого типа, эти FGF21 мутантные полипептиды, как ожидается, поддерживают FGF21 биологическую активность и все еще вводят один или несколько сайтов присоединения неприродного полимера. После химической модификации (например, ПЭГилирования) эти мутанты, как ожидается, имеют более продолжительный in vivo период полураспада, чем FGF21 дикого типа, сохраняя в то же время значительные in vivo уровни биологической активности дикого типа.Because the introduced residues were designed to maintain wild type FGF21 biological activity levels, these FGF21 mutant polypeptides are expected to maintain FGF21 biological activity and still introduce one or more non-natural polymer attachment sites. After chemical modification (eg, PEGylation), these mutants are expected to have a longer in vivo half-life than wild-type FGF21, while maintaining significant levels of wild-type biological activity in vivo.

Номера положений, заданные для мутагенеза, приведены в табл. 5 и отвечают положению остатка в зрелом FGF21 протеине, который состоит из 181 аминокислотного остатка. Нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие FGF21 мутантные полипептиды, перечисленные в табл. 5 ниже, были приготовлены с использованием описанных ниже способов.The position numbers specified for mutagenesis are given in table. 5 and correspond to the position of the residue in the mature FGF21 protein, which consists of 181 amino acid residues. Nucleic acid sequences encoding FGF21 mutant polypeptides listed in table. 5 below were prepared using the methods described below.

Таблица 5Table 5

FGF21 мутантные полипептиды, включающие единичную мутациюFGF21 mutant polypeptides comprising a single mutation

Номер остатка Balance number Дикий тип wild type Мутация Mutation 36 36 R R К TO R36K R36K 37 37 Е E С WITH Е37С E37C 38 38 D D с With D38C D38C 46 46 D D с With D46C D46C 56 56 К TO R R K56R K56R 60 60 К TO R R K60R K60R 91 91 Е E С WITH Е91С E91C 69 69 К TO С WITH К69С K69S 69 69 К TO R R K69R K69R 72 72 R R К TO R72K R72K 77 77 R R С WITH R77C R77C 77 77 R R к To R77K R77K 79 79 D D с With D79C D79C 86 86 Н H с With Н86С H86S 91 91 Е E с With Е91С E91C 112 112 Н H с With Н112С H112C 113 113 G G с With G113C G113C 120 120 G G с With G120C G120C 121 121 N N с With N121C N121C 122 122 К TO R R K122R K122R 125 125 Н H С WITH Н125С H125C 126 126 R R С WITH R126C R126C 126 126 R R к To R126K R126K 171 171 Р R G G P171G P171G 175 175 R R с With R175C R175C 175 175 R R к To R175K R175K 170 170 G G с With G170C G170C 179 179 γ γ с With Y179C Y179C

- 25 041758- 25 041758

Пример 5. Идентификация FGF21 мутантов, включающих две мутации.Example 5 Identification of FGF21 mutants comprising two mutations.

Дополнительный анализ гомологической модели и данных, полученных от отдельных цистеиновых мутантов, был проведен с целью идентифицировать комбинации мутантов, которые могли бы ввести два сайта присоединения неприродного полимера. После химической модификации эти FGF21 мутанты имеют два полимера (например, молекулы ПЭГ), присоединенных к данному полипептиду в необходимых положениях. Как и для всех FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения, полимер может также быть присоединен к N-концу данного полипептида, в зависимости от природы самого этого полимера. Рисунок, изображающий дважды ПЭГилированный FGF21 мутант, представлен на фиг. 1.Additional analysis of the homology model and data from individual cysteine mutants was performed to identify combinations of mutants that could introduce two non-natural polymer attachment sites. After chemical modification, these FGF21 mutants have two polymers (eg, PEG molecules) attached to the given polypeptide at the required positions. As with all FGF21 mutant polypeptides of the present invention, a polymer may also be attached to the N-terminus of a given polypeptide, depending on the nature of the polymer itself. A drawing depicting the double-PEGylated FGF21 mutant is shown in FIG. 1.

Сводка FGF21 мутантов, включающих две мутации, которые были генерированы с помощью рационального протеинового инжинирингового подхода, представлена в табл. 6. Эти двойные мутанты включают сайт присоединения неприродного полимера, в особенности, цистеина. Боковые цепи этих остатков особенно подходят для химической модификации путем присоединения полимера, такого как молекула ПЭГ. Было признано, что в дополнение к введенному сайту присоединения неприродного полимера, полимер может быть, при необходимости, присоединен к N-концу данного протеина, если в этом есть потребность.A summary of FGF21 mutants containing two mutations that were generated using a rational protein engineering approach is presented in Table. 6. These double mutants include a non-natural polymer attachment site, especially cysteine. The side chains of these residues are particularly suitable for chemical modification by the addition of a polymer, such as a PEG molecule. It has been recognized that, in addition to the introduced non-natural polymer attachment site, the polymer can optionally be attached to the N-terminus of the protein, if desired.

Поскольку введенные остатки были сконструированы для поддержания биологической активности FGF21, эти FGF21 мутанты, как предполагается, сохраняют биологическую активность FGF21 и еще вводят один или несколько сайтов присоединения неприродного полимера. После химического модифицирования (например, ПЭГилирования) эти мутанты, как предполагается, имеют более продолжительный период полураспада, чем FGF21 дикого типа, и в то же время поддерживают значительную in vivo активность.Because the introduced residues were designed to maintain FGF21 biological activity, these FGF21 mutants are expected to retain FGF21 biological activity and still introduce one or more non-natural polymer attachment sites. After chemical modification (eg, PEGylation), these mutants are expected to have a longer half-life than wild-type FGF21 while maintaining significant in vivo activity.

Номера положений, приведенные в табл. 6, соответствуют положению остатка в зрелом FGF21 протеине, который состоит из 181 аминокислотного остатка. Нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие FGF21 мутантные полипептиды, перечисленные в табл. 6 ниже, были приготовлены с использованием способов, описанных ниже.The position numbers given in Table. 6 correspond to the position of the residue in the mature FGF21 protein, which consists of 181 amino acid residues. Nucleic acid sequences encoding FGF21 mutant polypeptides listed in table. 6 below were prepared using the methods described below.

Таблица 6Table 6

FGF21 мутантные полипептиды, включающие две мутацииFGF21 mutant polypeptides containing two mutations

Остаток 1 Remainder 1 Дик. тип Dick. type Мутация Mutation Остаток 2 Remainder 2 Дик.тип wild type Мутация Mutation 37 37 Е E С WITH 77 77 R R С WITH E37C,R77C E37C,R77C 120 120 G G С WITH 125 125 Н H С WITH G120C, Н125С G120C, H125C 77 77 R R С WITH 91 91 Е E С WITH R77C, Е91С R77C, E91C 77 77 R R с With 125 125 Н H с With R77C, Н125С R77C, H125C 91 91 Е E с With 125 125 Н H с With Е91С, Н125С E91C, H125C 77 77 R R с With 120 120 G G с With R77C, G120C R77C, G120C 37 37 Е E с With 91 91 Е E с With Е37С, Е91С E37C, E91C 91 91 Е E с With 175 175 R R с With Е91С, R175C E91C, R175C 37 37 Е E с With 175 175 R R с With Е37С, R175C E37C, R175C 91 91 Е E с With 120 120 G G с With Е91С, G120C E91C, G120C 37 37 Е E с With 120 120 G G с With Е37С, G120C E37C, G120C 77 77 R R с With 175 175 R R с With R77C, R175C R77C, R175C 37 37 Е E с With 125 125 Н H с With Е37С, Н125С E37C, H125C 37 37 Е E с With 69 69 К TO с With Е37С, К69С E37S, K69S 69 69 К TO с With 91 91 Е E с With К69С, Е91С K69S, E91S 120 120 G G с With 175 175 R R с With G120C, R175C G120C, R175C 69 69 К TO с With 120 120 G G с With К69С, G120C K69C, G120C 69 69 К TO с With 125 125 Н H с With К69С, Н125С K69S, N125S 69 69 К TO с With 77 77 R R с With К69С, R77C K69C, R77C 125 125 н n с With 175 175 R R с With Н125С, R175C H125C, R175C 69 69 к To с With 175 175 R R с With К69С, R175C K69C, R175C 37 37 Е E с With 170 170 G G с With Е37С, G170C E37C, G170C

Пример 6. Идентификация FGF21 мутантов, включающих три мутации.Example 6 Identification of FGF21 mutants comprising three mutations.

Как описано выше, сайты присоединения неприродного полимера могут быть введены в полипептидную последовательность FGF21 дикого типа. Это предоставляет возможность для сайт-селективной химической модификации в желательных положениях в данном полипептиде. Кроме того, ранее было определено, что остаток Р171 в последовательности FGF21 дикого типа подвержен протеолитической деградации. Соответственно путем введения комбинаций вышеуказанных модификаций, плюс мутации в положении Р171, могут быть сгенерированы FGF21 молекулы, имеющие как повышенную протеолитиAs described above, non-natural polymer attachment sites can be introduced into the wild-type FGF21 polypeptide sequence. This allows for site-selective chemical modification at desired positions in a given polypeptide. In addition, the P171 residue in the wild-type FGF21 sequence was previously determined to be subject to proteolytic degradation. Accordingly, by introducing combinations of the above modifications, plus mutations at position P171, FGF21 molecules can be generated having both increased proteolytic

- 26 041758 ческую устойчивость, так и сайты присоединения сайт-специфического полимера.- 26 041758 chesky resistance, and attachment sites of the site-specific polymer.

Дополнительный анализ данной гомологической модели был проведен с целью идентификации комбинаций мутантов, которые могут ввести два сайта присоединения неприродных полимеров. После химической модификации эти мутанты будут иметь два полимера (например, молекулы ПЭГ), присоединенные к данному полипептиду в желательных местах. Как и для всех FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения, полимер может также быть присоединен к N-концу данного полипептида, в зависимости от природы самого данного полимера. Анализ включал оценку мутации в положении Р171, в дополнение к двум введенным сайтам присоединения полимера, что было сделано для повышения протеолитической стабильности FGF21 мутантного полипептида и введения селективных сайтов присоединения полимера и повышенной протеолитической стабильности, при сохранении или усилении в то же время in vivo биологической активности FGF21 дикого типа.Additional analysis of this homology model was performed to identify combinations of mutants that could introduce two attachment sites for non-natural polymers. After chemical modification, these mutants will have two polymers (eg, PEG molecules) attached to the given polypeptide at the desired locations. As with all FGF21 mutant polypeptides of the present invention, a polymer may also be attached to the N-terminus of a given polypeptide, depending on the nature of the given polymer itself. The analysis included the evaluation of a mutation at position P171, in addition to the two introduced polymer attachment sites, which was done to increase the proteolytic stability of the FGF21 mutant polypeptide and introduce selective polymer attachment sites and increased proteolytic stability, while maintaining or enhancing in vivo biological activity. FGF21 wild type.

В параллельном исследовании выбранное подмножество отдельных мутаций из табл. 5, представленных в примере 4, комбинировалось с мутацией Р171, повышающей стабильность, с целью селективного ПЭГилирования сайта как в α-амино N-конце так и во введенной цистеиновой мутации, с использованием сайт-селективных смешанных химических способов, описанного ранее (см. патент США No. 6420339, на который здесь сделана ссылка). Эти двойные мутации были обозначены как R77C/P171G и H125C/P171G и являются примером любых других комбинаций, которые могут быть предусмотрены с использованием мутаций, раскрытых в табл. 5 примера 4.In a parallel study, a selected subset of individual mutations from Table. 5 presented in Example 4 was combined with the P171 stability enhancing mutation to selectively PEGylate the site at both the α-amino N-terminus and the introduced cysteine mutation, using the site-selective mixed chemistry methods described previously (see Pat. US No. 6420339, to which reference is made here). These double mutations have been designated R77C/P171G and H125C/P171G and exemplify any other combinations that can be contemplated using the mutations disclosed in Table 1. 5 example 4.

Сводка FGF21 мутантов, включающих две мутации, в дополнение к мутации на сайте Р171, которые генерировались с помощью указанного рационального протеинового инжинирингового подхода, представлена в табл. 7. Эти мутанты включают два сайта присоединения неприродных полимеров, конкретно, цистеин. Боковые цепи этих остатков особенно подходят для химической модификации путем присоединения полимера, такого как ПЭГ молекула. Было признано, что в дополнение к введенному сайту присоединения неприродного полимера, полимер мог бы быть присоединен, при необходимости, к Nконцу данного протеина. Тройные описанные FGF21 мутанты включают не только введенные сайты присоединения полимера, описанные выше, но также и мутацию в положение 171, индуцирующую протеолитическую стабильность. После химической модификации FGF21 тройного мутанта эта комбинация мутаций служит функцией увеличения периода полураспада FGF21 через ассоциацию двух полимеров (например, молекул ПЭГ) с полипептидной последовательностью, также как и увеличения периода полураспада через элиминацию сайта протеолитического расщепления.A summary of FGF21 mutants containing two mutations, in addition to the mutation at the P171 site, that were generated using this rational protein engineering approach is shown in Table 1. 7. These mutants include two non-natural polymer attachment sites, specifically cysteine. The side chains of these residues are particularly suitable for chemical modification by the addition of a polymer, such as a PEG molecule. It was recognized that in addition to the introduced non-natural polymer attachment site, the polymer could be attached, if necessary, to the N-terminus of the protein. The triple described FGF21 mutants include not only the introduced polymer attachment sites described above, but also a mutation at position 171 inducing proteolytic stability. Upon chemical modification of the FGF21 triple mutant, this combination of mutations functions to increase the half-life of FGF21 through the association of two polymers (eg, PEG molecules) with the polypeptide sequence, as well as to increase the half-life through elimination of the proteolytic cleavage site.

Поскольку введенные остатки были сконструированы для поддержания in vivo уровней биологической активности FGF21 дикого типа, эти FGF21 мутанты, как предполагается, поддерживают биологическую активность FGF21 и вводят также уникальные сайты присоединения неприродного полимера. После химической модификации (например, ПЭГилирования) эти мутанты, как ожидается, имеют больший период полураспада, чем FGF21 дикого типа, сохраняя при этом существенные in vivo уровни биологической активности дикого типа.Because the introduced residues were designed to maintain in vivo levels of wild-type FGF21 biological activity, these FGF21 mutants are expected to maintain FGF21 biological activity and also introduce unique non-natural polymer attachment sites. After chemical modification (eg, PEGylation), these mutants are expected to have a longer half-life than wild-type FGF21 while retaining significant in vivo levels of wild-type biological activity.

Номера положений, приведенные в табл. 7, соответствуют положению остатка в зрелом FGF21 протеине, который состоит из 181 аминокислотного остатка. Нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие FGF21 мутантные полипептиды, перечисленные в табл. 7, были получены с использованием описанных здесь способов.The position numbers given in Table. 7 correspond to the position of the residue in the mature FGF21 protein, which consists of 181 amino acid residues. Nucleic acid sequences encoding FGF21 mutant polypeptides listed in table. 7 were obtained using the methods described here.

- 27 041758- 27 041758

Таблица 7Table 7

FGF21 мутантные полипептиды, включающие три мутацииFGF21 mutant polypeptides containing three mutations

Остаток 1 Remainder 1 Дик. тип Dick. type Мутация Mutation Остаток 2 Remainder 2 Дик. тип Dick. type Мутация Mutation Остаток 3 Remainder 3 Дик. тип Dick. type Мутация Mutation 37 37 Е E С WITH 77 77 R R С WITH 171 171 Р R G G Е37С, R77C, P171G E37C, R77C, P171G 91 91 Е E С WITH 125 125 Н H С WITH 171 171 Р R G G Е91С, Н125С, P171G E91C, H125C, P171G 77 77 R R С WITH 120 120 G G С WITH 171 171 Р R G G R77C, G120C, P171G R77C, G120C, P171G 37 37 Е E с With 91 91 Е E С WITH 171 171 Р R G G Е37С, Е91С, P171G E37C, E91C, P171G 91 91 Е E с With 175 175 R R С WITH 171 171 Р R G G Е91С, R175C, P171G E91C, R175C, P171G 37 37 Е E с With 175 175 R R С WITH 171 171 Р R G G Е37С, R175C, P171G E37C, R175C, P171G 91 91 Е E с With 120 120 G G С WITH 171 171 Р R G G Е91С, G120C, P171G E91C, G120C, P171G 37 37 Е E с With 120 120 G G С WITH 171 171 Р R G G Е37С, G120C, P171G E37C, G120C, P171G 77 77 R R с With 175 175 R R С WITH 171 171 Р R G G R77C, R77C, R175C, P171G R175C, P171G 37 37 Е E с With 125 125 Н H С WITH 171 171 Р R G G Е37С, Н125С, P171G E37C, H125C, P171G

Пример 7. Получение и экспрессия FGF21 мутантных полипептидов.Example 7 Production and expression of FGF21 mutant polypeptides.

Конструкты, кодирующие FGF21 мутанты, перечисленные в табл. 3 (отдельные мутанты), 4 (двойные мутанты) и 5 (тройные мутанты, т.е. двойные мутации + P171G), в целом, FGF21 мутанты в этом примере, были получены посредством ПЦР амплификации экспрессирующего вектора FGF21 дикого типа, как описано ниже (конструкция экспрессирующего вектора FGF21 дикого типа описана в примере 1). Целью этих экспериментов было сгенерировать FGF21 мутанты, которые включают один или несколько сайтов присоединения неприродного полимера и в некоторых случаях резистентны к протеолизу. Химически модифицированные формы этих FGF21 мутантов, как предполагается, будут проявлять более длительные периоды полураспада и в некоторых случаях также будут резистентны к протеолизу.Constructs encoding FGF21 mutants listed in table. 3 (single mutants), 4 (double mutants) and 5 (triple mutants, i.e. double mutations + P171G), in total, the FGF21 mutants in this example were generated by PCR amplification of the wild-type FGF21 expression vector as described below. (the wild-type FGF21 expression vector construct is described in Example 1). The aim of these experiments was to generate FGF21 mutants that include one or more non-natural polymer attachment sites and in some cases are resistant to proteolysis. Chemically modified forms of these FGF21 mutants are expected to exhibit longer half-lives and in some cases also be resistant to proteolysis.

FGF21 мутантные конструкты были приготовлены с использованием праймеров, имеющих последовательности, которые являются гомологами участков вверх и вниз от кодона (или кодонов), который предполагается мутировать. Праймеры, использованные в таких реакциях амплификации, также дали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности для учета рециркуляризации амплифицированного продукта, т.е. всего вектора, обладающего теперь нужным мутантом.FGF21 mutant constructs were prepared using primers having sequences that are homologues up and down from the codon(s) to be mutated. The primers used in these amplification reactions also gave approximately 15 nucleotides of overlap to account for recycling of the amplified product, i.e. of the entire vector, which now has the desired mutant.

Иллюстративный FGF21 мутантный конструкт, кодирующий FGF21 мутант, имеющий остаток глутаминовой кислоты в положении 170 вместо природного глицинового остатка (т.е. G170E FGF21 мутантный полипептид), был приготовлен с использованием праймеров, показанных в табл. 8.An exemplary FGF21 mutant construct encoding an FGF21 mutant having a glutamic acid residue at position 170 instead of a native glycine residue (i.e., a G170E FGF21 mutant polypeptide) was prepared using the primers shown in Table 1. 8.

Таблица 8Table 8

ПЦР праймеры для получения иллюстративного FGF21 мутантаPCR primers to generate an exemplary FGF21 mutant

Праймер Смысл.Primer Meaning.

Последовательность___________________________________Subsequence___________________________________

5’-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC-3’5'-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC-3'

CTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCACTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA

GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGTGAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT

Антисмысл.Antisense.

5’-GGAAGGTTCCACCATGCTCAGAGGGTCCGA-35'-GGAAGGTTCCACCATGCTCAGAGGGTCCGA-3

SEQSEQ

ID NO:ID NO:

Праймеры, показанные в табл. 6, учитывают замещение глицинового остатка остатком глутаминовой кислоты, как показано ниже, где верхняя последовательность является смысловым праймером (SEQ ID NO: 29), вторая и третья последовательности (SEQ ID NOs: 30 и 31) являются частями FGF21 экспрессирующего конструкта и четвертая последовательность является антисмысловым праймером (SEQ ID NO: 32)The primers shown in table. 6 allow for the replacement of a glycine residue with a glutamic acid residue as shown below, where the upper sequence is the sense primer (SEQ ID NOs: 29), the second and third sequences (SEQ ID NOs: 30 and 31) are parts of the FGF21 expression construct, and the fourth sequence is antisense primer (SEQ ID NO: 32)

- 28 041758- 28 041758

5’-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC5'-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC

CTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCACTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA

GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGTGAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT

AGCCTGGGAGACTCGTACCACCTTGGAAGG-5'AGCCTGGGAGACTCGTACCACCTTGGAAGG-5'

FGF21 мутантные конструкты были получены с использованием, по сути, ПЦР условий, описанных в примере 1. Продукты амплификации расщеплялись рестрикционной эндонуклеазой DpnI и затем трансформировались в компетентные клетки. Результирующие клоны были секвенированы для подтверждения отсутствия генерированных полимеразой ошибок.FGF21 mutant constructs were generated using essentially the PCR conditions described in Example 1. Amplification products were digested with restriction endonuclease DpnI and then transformed into competent cells. The resulting clones were sequenced to confirm the absence of polymerase-generated errors.

FGF21 мутанты были экспрессированы путем трансформирования компетентных BL21 (DE3) или BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) клеток конструктом, кодирующим отдельный мутант. Трансформанты выращивались в течение ночи при ограниченной аэрации в ТВ среде, дополненной 40 мкг/мл канамицина, подвергались аэрации на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировались в 0,4 мМ IPTG. FGF21 мутантные полипептиды собирались путем центрифугирования через 18-20 ч после индукции.FGF21 mutants were expressed by transforming competent BL21 (DE3) or BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) cells with a construct encoding a single mutant. Transformants were grown overnight under limited aeration in TB medium supplemented with 40 μg/ml kanamycin, aerated the next morning, and after a short recovery period, induced in 0.4 mM IPTG. FGF21 mutant polypeptides were harvested by centrifugation 18-20 hours after induction.

В результате использования бактериальной экспрессирующей системы FGF21 мутантные полипептиды были экспрессированы с N-концевым метиониновым остатком.As a result of using the FGF21 bacterial expression system, mutant polypeptides were expressed with an N-terminal methionine residue.

Пример 8. Очистка FGF21 и FGF21 мутантных полипептидов от бактерий.Example 8 Purification of FGF21 and FGF21 mutant polypeptides from bacteria.

В последующих примерах FGF21 мутантные полипептиды были экспрессированы в бактериальной экспрессирующей системе. После экспрессии, которая описана в примере 7, FGF21 мутантные полипептиды очищались, как описано в этом примере, если не указано иное.In the following examples, the FGF21 mutant polypeptides were expressed in a bacterial expression system. Following expression as described in Example 7, the FGF21 mutant polypeptides were purified as described in this example unless otherwise noted.

Для очистки FGF21 мутантного полипептида от внутриклеточных бактериальных включений дважды промытые внутриклеточные включения (DWIBs) были солюбилизированы в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и дитиотреитол DTT in Tris буфере при рН 8,5, и затем смешивались в течение 1 ч при комнатной температуре, и данная солюбилизационная смесь добавлялась к восстановленному буферу, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамин гидрохлорид при рН 9,5, и смешивалась в течение 24 ч при 5°С (см., например, работы Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, Folding proteins, in Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press), pp. 57-99; and Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).To purify the FGF21 mutant polypeptide from intracellular bacterial inclusions, double-washed intracellular inclusions (DWIBs) were solubilized in a solubilization buffer containing guanidine hydrochloride and dithiothreitol DTT in Tris buffer at pH 8.5, and then mixed for 1 h at room temperature, and this the solubilization mixture was added to a reconstituted buffer containing urea, arginine, cysteine and cystamine hydrochloride at pH 9.5 and mixed for 24 hours at 5°C (see, for example, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9 : 157-63, Mannall et al., 2007, Biotechnol Bioeng 97: 1523-34, Rudolph et al., 1997, Folding proteins, in Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press ), pp. 57-99; and Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).

После солюбилизации и рефолдинга данную смесь фильтровали через 0,45-микронный фильтр. Данный пул затем концентрировали приблизительно 10-кратно с помощью кассеты Pall Omega с граничным молекулярным весом 10 кДа при трансмембранном давлении (ТМД) 20 фунт/кв.дюйм, подвергали диалитическому фильтрованию 3 колонковыми объемами 20 мМ Tris, рН 8,0 при ТМД 20 фунт/кв.дюйм.After solubilization and refolding, this mixture was filtered through a 0.45 micron filter. This pool was then concentrated approximately 10-fold using a Pall Omega cassette with a cutoff molecular weight of 10 kDa at a transmembrane pressure (TMP) of 20 psi, subjected to dialytic filtration with 3 column volumes of 20 mM Tris, pH 8.0 at TMP of 20 lb. / sq. inch

Осветленный образец затем подвергался анионообменной хроматографии (АОХ) с использованием Q Sepharose HP смолы. Была проведена серия опытов с использованием линейного солевого градиента от 0 до 250 мМ NaCl в 20 мМ Tris при рН 8,0 и 5°С. Пиковые фракции анализировались способом SDSPAGE и собирались.The clarified sample was then subjected to anion exchange chromatography (AOX) using Q Sepharose HP resin. A series of experiments was carried out using a linear salt gradient from 0 to 250 mm NaCl in 20 mm Tris at pH 8.0 and 5°C. Peak fractions were analyzed by the SDSPAGE method and collected.

Затем АОХ элюатный пул подвергался гидрофобной хроматографии (ГХ) с использованием Phenyl Sepharose HP смолы. Протеин элюировали с использованием уменьшающегося линейного градиента от 0,6 до 0 М сульфата аммония при 20 мМ TRIS рН 8,0 и комнатной температуре. Пиковые фракции анализировались способом SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) и собирались.The AOX eluate pool was then subjected to hydrophobic chromatography (GC) using Phenyl Sepharose HP resin. The protein was eluted using a decreasing linear gradient from 0.6 to 0 M ammonium sulfate at 20 mM TRIS pH 8.0 and room temperature. Peak fractions were analyzed by SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) and collected.

ГХ пул концентрировался с помощью 0,2 м² кассеты Pall Omega с граничным молекулярным весом 5 кДа до 7 мг/мл при трансмембранном давлении (ТМД) 20 фунт/кв.дюйм. Концентрат подвергался диалитическому фильтрованию 5 об. 20 мМ TRIS, рН 8,0 при ТМД 20 фунт/кв.дюйм, и восстановленный концентрат разбавлялся до 5 мг/мл. В завершение, раствор фильтровали через 0,22 мкм целлюлозноацетатный фильтр.The GC pool was concentrated using a 0.2 m ² Pall Omega cassette with a cutoff molecular weight of 5 kDa to 7 mg/ml at a transmembrane pressure (TMP) of 20 psi. The concentrate was subjected to dialytic filtration 5 vol. 20 mM TRIS, pH 8.0 at 20 psi TMW, and the reconstituted concentrate was diluted to 5 mg/mL. Finally, the solution was filtered through a 0.22 µm cellulose acetate filter.

Пример 9. Химическая модификация FGF21 мутантов.Example 9 Chemical modification of FGF21 mutants.

Варианты FGF21, имеющие цистеин, замещенный в выбранных положениях, что представлено в табл. 3-5, были получены, как описано в примере 7, и потом данные молекулы подвергались реакции ПЭГилирования 20 кДа метокси-ПЭГ-имидом малеиновой кислоты. Если не указано иное, все ПЭГилированные FGF21 полипептиды дикого типа и мутантные полипептиды, раскрытые здесь, включают один или несколько 20 кДа метокси ПЭГ малеинимидных полимеров.FGF21 variants having cysteine substituted at selected positions as shown in Table 1. 3-5 were prepared as described in Example 7, and then these molecules were subjected to a PEGylation reaction with 20 kDa methoxy-PEG-maleic acid imide. Unless otherwise noted, all PEGylated FGF21 polypeptides of the wild type and mutant polypeptides disclosed herein include one or more 20 kDa methoxy PEG maleimide polymers.

Затем частично очищенные FGF21 молекулы восстанавливались с использованием 5 молярных эквивалентов ТСЕР в течение 30 мин при 25°С. Восстановленный FGF21 затем подвергался буферному обмену на 10 мМ имидазола, рН 7,5 с использованием колонки GE Healthcare Sephadex G25M. Подвергнутый буферному обмену FGF21 затем реагировал с 5 мол.экв. 20 кДа метокси-ПЭГ-малеинимида в течение 30 мин при 25°С. Результирующая реакционная смесь затем подвергалась ионообменной хроматографии для отделения моно-ПЭГилированных частиц от мульти-ПЭГилированных и неПЭГилированных молекул. Большинство FGF21 мутантных полипептидов хорошо реагировало с метокси-ПЭГ-малеинимидом и давало, главным образом, моно-ПЭГилированные продукты с высоким выходом (фиг. 2 и 3).The partially purified FGF21 molecules were then reduced using 5 molar equivalents of TCEP for 30 minutes at 25°C. The reduced FGF21 was then buffer exchanged with 10 mM imidazole, pH 7.5 using a GE Healthcare Sephadex G25M column. Buffered FGF21 was then reacted with 5 mol.eq. 20 kDa methoxy-PEG-maleimide for 30 min at 25°C. The resulting reaction mixture was then subjected to ion exchange chromatography to separate mono-PEGylated species from multi-PEGylated and non-PEGylated molecules. Most of the FGF21 mutant polypeptides reacted well with methoxy-PEG-maleimide and produced mainly mono-PEGylated products in high yield (FIGS. 2 and 3).

Для получения связанных молекул частично очищенные FGF21 молекулы восстанавливались сTo obtain bound molecules, partially purified FGF21 molecules were reduced with

- 29 041758 использованием 5 молярных эквивалентов ТСЕР в течение 30 мин при 25°С. Восстановленный FGF21 затем подвергался буферному обмену на 10 мМ имидазола, рН 7,5 с использованием колонки GE Healthcare Sephadex G25M. Подвергнутый буферному обмену FGF21 затем реагировал с 0,45 молярного эквивалента 20 кДа ПЭГ бис-малеинимида в течение 60 мин при 4 °С. Результирующая реакционная смесь затем подвергалась ионообменной хроматографии для отделения связанной молекулы от других нежелательных продуктов реакции. Часто требовалась дополнительная стадия ионообменной очистки, которая проводилась путем разбавления первого ионообменного пула в приблизительно 4 об. воды и повторного введения в ионообменную колонку.- 29 041758 using 5 molar equivalents of TCEP for 30 minutes at 25°C. The reduced FGF21 was then buffer exchanged with 10 mM imidazole, pH 7.5 using a GE Healthcare Sephadex G25M column. The buffered FGF21 was then reacted with 0.45 molar equivalent of 20 kDa bis-maleimide PEG for 60 min at 4°C. The resulting reaction mixture was then subjected to ion exchange chromatography to separate the bound molecule from other unwanted reaction products. Often an additional ion exchange purification step was required, which was carried out by diluting the first ion exchange pool at approximately 4 vol. water and reintroduction into the ion exchange column.

Как альтернатива, аминоспецифическое сопряжение с N-концом достигалось путем восстановительного алкилирования с использованием метокси-ПЭГ-пропиональдегида, как описано ранее (см. патент США No. 5824784). Вкратце, мутантный FGF21 приблизительно при 2 мг/мл реагировал в течение ночи при 4 градусах С, с 5-кратным молярным избытком 20 кДа мПЭГ-пропиональдегида в ацетатном буфере, рН 5,5, и 10 мМ цианоборогидрида натрия. N-концевое ПЭГилирование любых молекул FGF21 дикого типа и мутантных молекул, описанное здесь, может быть достигнуто с использованием этой стратегии.Alternatively, amino-specific conjugation to the N-terminus was achieved by reductive alkylation using methoxy-PEG-propionaldehyde, as described previously (see US patent No. 5824784). Briefly, the mutant FGF21 at approximately 2 mg/ml was reacted overnight at 4° C., with a 5-fold molar excess of 20 kD mPEG-propionaldehyde in acetate buffer, pH 5.5, and 10 mM sodium cyanoborohydride. N-terminal PEGylation of any wild-type and mutant FGF21 molecules described herein can be achieved using this strategy.

Когда аминоспецифическое двойное ПЭГилирование требовалось как в N-конце так и мутантном лизине, использовался метоксиПЭГ-NHS (N-гидроксисукцинимидиловый эфир). Вкратце, мутантный FGF21 приблизительно при 2 мг/мл реагировал примерно в течение 2 ч при 4°С с 5-кратным молярным избытком (ПЭГ:аминогруппа) 20 кДа мПЭГ-NHS в бициновом буфере, рН 7,5.When amino-specific double PEGylation was required at both the N-terminus and the mutant lysine, methoxyPEG-NHS (N-hydroxysuccinimidyl ether) was used. Briefly, mutant FGF21 at approximately 2 mg/ml was reacted for approximately 2 hours at 4° C. with a 5-fold molar excess of (PEG:amino group) 20 kDa mPEG-NHS in bicine buffer, pH 7.5.

При применении смешанно-химического подхода к двойному ПЭГилированию FGF21 мутантов как в N-конце так и мутантном Cys положении последовательно использовались как метокси-ПЭГпропиональдегид так и метокси-ПЭГ-малеинимид, как описывалось ранее (см. патент США No. 6420339). Вкратце, мутантный FGF21 приблизительно при 2 мг/мл реагировал приблизительно в течение 2 ч с 1,5-кратным молярным избытком 20 кДа мПЭГ-малеинимида в фосфатном буфере при рН 6,5 и 4°С, затем величину рН устанавливали на уровне около 5, и добавляли 5-кратный избыток 20 кДа мПЭГпропиональдегида с 10 мМ цианоборогидрида натрия. Конечная реакция продолжалась при 4°С на протяжении ночи.When applying a mixed chemistry approach to double PEGylation of FGF21 mutants at both the N-terminus and the mutant Cys position, both methoxy-PEG propionaldehyde and methoxy-PEG maleimide were used sequentially as previously described (see US Pat. No. 6,420,339). Briefly, mutant FGF21 at approximately 2 mg/mL was reacted for approximately 2 hours with a 1.5-fold molar excess of 20 kDa mPEG-maleimide in phosphate buffer at pH 6.5 and 4°C, then the pH was adjusted to about 5 , and a 5-fold excess of 20 kDa mPEGpropionaldehyde with 10 mM sodium cyanoborohydride was added. The final reaction was continued at 4° C. overnight.

Очистка всех различных реакционных смесей проводилась способом анионообменной хроматографии в Tris буфере при рН 8, как описано ранее.Purification of all different reaction mixtures was carried out by the method of anion exchange chromatography in Tris buffer at pH 8, as described previously.

Пример 10. In vitro активность FGF21 мутантных полипептидов и химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов.Example 10 In vitro activity of FGF21 mutant polypeptides and chemically modified FGF21 mutant polypeptides.

ПЭГилированные FGF21 мутантные полипептиды подвергались затем in vitro анализу для оценки их активности, в сравнении с не-ПЭГилированной формой FGF21 мутантного полипептида и Nтерминально ПЭГилированного FGF21.The PEGylated FGF21 mutant polypeptides were then subjected to an in vitro assay to evaluate their activity, in comparison to the non-PEGylated form of the FGF21 mutant polypeptide and the N-terminally PEGylated FGF21.

Одной из целей этих экспериментов было идентифицировать FGF21 мутантные полипептиды и химически модифицированные FGF21 мутантные полипептиды, которые сохраняют FGF21 активность в ELK-люциферазной in vitro пробе. ELK-люциферазные пробы проводились с использованием рекомбинантной человеческой 293Т почечной клеточной системы, в которой 293Т клетки гиперэкспрессируют бета-клото и люциферазные репортерные конструкты. Бета-клото является ко-рецептором, который необходим FGF21 для активации его FGF рецепторов. FGF рецепторы, использованные в этой пробе, представляют собой эндогенные уровни FGF рецепторов, экспрессированных в почечной клетке 293Т. Люциферазные репортерные конструкты содержат последовательности, кодирующие GAL4-ELK1, и люциферазный репортер, управляемый промотором, который содержит пять тандемных копий Gal4 связывающего сайта (5xUAS-Luc). Активность люциферазы регулируется уровнем фосфорилированного Erk/ELK1, и используется для косвенного мониторинга и количественного определения FGF21 активности.One of the goals of these experiments was to identify FGF21 mutant polypeptides and chemically modified FGF21 mutant polypeptides that retain FGF21 activity in an in vitro ELK-luciferase assay. ELK-luciferase assays were performed using a recombinant human 293T renal cell system in which 293T cells overexpress beta-clotho and luciferase reporter constructs. Beta-clotho is a co-receptor that is required by FGF21 to activate its FGF receptors. The FGF receptors used in this assay represent endogenous levels of FGF receptors expressed on the 293T renal cell. Luciferase reporter constructs contain sequences encoding GAL4-ELK1 and a promoter-driven luciferase reporter that contains five tandem copies of the Gal4 binding site (5xUAS-Luc). Luciferase activity is regulated by the level of phosphorylated Erk/ELK1, and is used to indirectly monitor and quantify FGF21 activity.

ELK-люциферазные пробы проводились путем культивирования 293Т клеток в присутствии различных концентраций FGF21 дикого типа или FGF21 мутантного полипептида в течение 6 ч, и последующего анализа клеточных лизатов на активность люциферазы. Фиг. 4-6 и табл. 3-5 дают сводку in vitro результатов, полученных для нескольких иллюстративных FGF21 мутантных полипептидов, включая и те, которые имеют одну, две или три мутации.ELK-luciferase assays were performed by culturing 293T cells in the presence of various concentrations of wild-type FGF21 or FGF21 mutant polypeptide for 6 hours, and then analyzing cell lysates for luciferase activity. Fig. 4-6 and tab. 3-5 provide a summary of the in vitro results obtained for several exemplary FGF21 mutant polypeptides, including those with one, two, or three mutations.

Пример 10.А. ЕС50 значения для ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих одну мутацию.Example 10.A. EC50 values for PEGylated FGF21 mutant polypeptides containing one mutation.

В табл. 9 ниже дана сводка ЕС50 значений разных FGF21 мутантных полипептидов, включающих две мутации, которые вводят один сайт присоединения неприродного полимера в специфическом, известном положении.In table. 9 below is a summary of the EC50 values of various FGF21 mutant polypeptides comprising two mutations that introduce one non-natural polymer attachment site at a specific, known position.

Были генерированы различные FGF21 мутантные полипептиды, и их активность определялась в in vitro ELK-люциферазной пробе, описанной в данной заявке. В табл. 9 дана сводка полученных данных.Various FGF21 mutant polypeptides were generated and their activity was determined in the in vitro ELK-luciferase assay described in this application. In table. 9 is a summary of the findings.

- 30 041758- 30 041758

Таблица 9Table 9

Сводка данных по ЕС50 для ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих одну мутациюSummary of EC50 Data for PEGylated FGF21 Mutant Polypeptides Containing One Mutation

Мутация Mutation ЕС50 (нМ) EC50 (nM) Дик.тип ЕС50 (нМ) Wild type EC50 (nM) N-PEG20 ЕС50 (нМ) N-PEG20 EC50 (nM) Н125С H125C 4.5 4.5 2.8 2.8 36.7 36.7 R77C R77C 4.9 4.9 3.9 3.9 43.3 43.3 К69С K69S 5.3 5.3 2.8 2.8 36.7 36.7 G120C G120C 6.0 6.0 2.8 2.8 36.7 36.7 Е37С E37C 6.9 6.9 3.9 3.9 43.3 43.3 R175C R175C 7.9 7.9 0.9 0.9 21.5 21.5 Е91С E91C 8.3 8.3 3.9 3.9 43.3 43.3 N121C N121C 9.2 9.2 3.9 3.9 43.3 43.3 R126C R126C 10.0 10.0 2.8 2.8 36.7 36.7 G113C G113C 12.0 12.0 3.9 3.9 43.3 43.3 D38C D38C 13.1 13.1 2.8 2.8 36.7 36.7 D79C D79C 20.4 20.4 3.4 3.4 40.0 40.0 D46C D46C 27.8 27.8 3.9 3.9 43.3 43.3 Y179C Y179C 287. 1 287. 1 1.1 1.1 21.5 21.5

В табл. 9 дана сводка по влиянию ПЭГилирования на in vitro активность некоторых из различных FGF21 мутантных полипептидов настоящего изобретения.In table. 9 provides a summary of the effect of PEGylation on the in vitro activity of some of the various FGF21 mutant polypeptides of the present invention.

Фиг. 4-6 графически изображают результаты и значения ЕС50 для нескольких ПЭГилированных FGF21 мутантов, включающих одноточечную мутацию. Фиг. 4 и 5 содержат данные по нескольким из FGF21 мутантов, для которых данные представлены в табл. 9. Более конкретно, верхний график фиг. 4 показывает результаты ERK-люциферазной пробы, выполненной на ПЭГилированных Е37С, R77C, Е91С мутантах и N-терминально ПЭГилированном FGF21 дикого типа, также как и не-ПЭГилированном FGF21. В нижней части графика на фиг. 4 представлены данные по ПЭГилированным G113C, N121C, D46C мутантам и N-терминально-ПЭГилированному FGF21 дикого типа, также как и по неПЭГилированному FGF21 дикого типа.Fig. 4-6 graphically depict the results and EC50 values for several PEGylated FGF21 mutants involving a single point mutation. Fig. 4 and 5 contain data for several of the FGF21 mutants for which data are presented in Table. 9. More specifically, the top graph of FIG. 4 shows the results of an ERK-luciferase assay performed on PEGylated E37C, R77C, E91C mutants and N-terminally PEGylated wild-type FGF21 as well as non-PEGylated FGF21. At the bottom of the graph in Fig. 4 shows data for PEGylated G113C, N121C, D46C mutants and N-terminal PEGylated wild-type FGF21 as well as non-PEGylated wild-type FGF21.

Что касается фиг. 5, на верхнем графике представлены данные для Н125С, G120C, R126C мутантов и N-терминально ПЭГилированного FGF21 дикого типа, также как и не-ПЭГилированного FGF21 дикого типа. На нижнем графике представлены данные для D79C, D38C мутантов и N-терминально ПЭГилированного FGF21 дикого типа, также как и не-ПЭгилированного FGF21 дикого типа.With regard to FIG. 5, the top graph shows data for H125C, G120C, R126C mutants and N-terminally PEGylated wild type FGF21 as well as non-PEGylated wild type FGF21. The lower graph shows data for D79C, D38C mutants and N-terminally PEGylated wild type FGF21 as well as non-PEgylated wild type FGF21.

В продолжение верхнего графика на фиг. 6, графические данные представлены для ПЭГилированных К69С и D79C мутантов, также как и N-терминально ПЭГилированного FGF21 дикого типа, и для неПЭГилированного FGF21 дикого типа. На нижнем графике фиг. 6 представлены данные для ПЭГилированных R175C и Y179C мутантов и N-терминально ПЭГилированного FGF21 дикого типа, также как и не-ПЭГилированного FGF21 дикого типа. Удивительно, но многие из этих молекул имеют in vitro активность, близкую к таковой для не-ПЭГилированной молекулы.Continuing the top plot in FIG. 6, plots are for PEGylated K69C and D79C mutants as well as N-terminally PEGylated wild type FGF21 and non-PEGylated wild type FGF21. In the bottom graph of Fig. 6 shows data for PEGylated R175C and Y179C mutants and N-terminally PEGylated wild type FGF21 as well as non-PEGylated wild type FGF21. Surprisingly, many of these molecules have in vitro activity close to that of the non-PEGylated molecule.

Пример 10.В. ЕС50 значения для выбранных Arg/Lys FGF21 мутантов.Example 10.B. EC50 values for selected Arg/Lys FGF21 mutants.

Как описано в примере 3, был генерирован ряд FGF21 мутантных полипептидов, в которых сайты присоединения природного полимера (например, сайты ПЭГилирования) были удалены путем мутагенеза. В этих FGF21 мутантах реактивные Lys группы были сначала мутированы в аргинин, оставляя в наличии лишь N-концевую α-аминогруппу для ПЭГилирования. Затем выбранные аргининовые остатки как природные, так и мутантные были конвертированы один за другим в лизин, вводя тем самым вторичный сайт ПЭГилирования в определенных положениях на поверхности FGF21. Одной из целей этой стратегии было сгенерировать FGF21 мутантные полипептиды, в которых полимер (например, молекула ПЭГ) был бы конъюгирован в одном или нескольких специфических, известных местоположениях.As described in Example 3, a number of FGF21 mutant polypeptides were generated in which natural polymer attachment sites (eg, PEGylation sites) were removed by mutagenesis. In these FGF21 mutants, reactive Lys groups were first mutated to arginine, leaving only the N-terminal α-amino group available for PEGylation. Then, selected arginine residues, both natural and mutated, were converted one by one to lysine, thereby introducing a secondary PEGylation site at certain positions on the surface of FGF21. One of the goals of this strategy was to generate FGF21 mutant polypeptides in which a polymer (eg, a PEG molecule) would be conjugated at one or more specific, known locations.

Были генерированы различные аргинин/лизиновые FGF21 мутантные полипептиды, и активность определялась в in vitro ELK-люциферазной пробе, описанной в настоящей заявке. В табл. 10 представлена сводка полученных данных.Various arginine/lysine FGF21 mutant polypeptides were generated and activity was determined in the in vitro ELK-luciferase assay described herein. In table. 10 is a summary of the data obtained.

- 31 041758- 31 041758

Таблица 10Table 10

Сводка данных по ЕС50 для ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих лизин/аргининовые мутацииSummary of EC50 Data for PEGylated FGF21 Mutant Polypeptides Including Lysine/Arginine Mutations

Конструкт construct Тип ПЭГ PEG type In Vitro активность ECso (hM) In Vitro ECso activity (hM) Природный FGF21 Natural FGF21 ПЭГ отсутств. PEG is absent. 3 3 Природный FGF21 (Nконец) Natural FGF21 (N-terminal) 1 х 20k 1 x 20k 43.3 43.3 Природный FGF21 (произвольн.) Natural FGF21 (arbitrary) 2 x20k 2x20k 200 200 FGF21(Bce К ко всем R) FGF21(All K to all R) 1 х 20k 1 x 20k Nd Nd FGF21(Bce К ко всем! R, R36K) FGF21(All To All! R, R36K) 2 х 20k 2 x 20k 73 73 FGF21(Bce К ко всем R, R77K) FGF21(All K to all R, R77K) 2 x 20k 2x20k 175 175 FGF21(K56/59/69R) FGF21(K56/59/69R) 2 x 20k 2x20k 500 500 FGF21(K_Bce R, R126K)FGF21(K _B ce R, R126K) 2 x 20k 2x20k 38 38 FGF21 (К5 9R/K69R/K122R) FGF21 (K5 9R/K69R/K122R) 2 x 20k 2x20k 499 499 FGF21 (К5 6R/K69R/K122R) FGF21 (K5 6R/K69R/K122R) 2 x 20k 2x20k 215 215 FGF21(K56R/K59R/K122R) FGF21(K56R/K59R/K122R) 2 x 20k 2x20k 531 531 FGF21(Bce К ко всем R, R72K) FGF21(All K to all R, R72K) 2 x 20k 2x20k >1000 >1000 FGF21(Bce К ко всем R, R175K) FGF21(All K to all R, R175K) 2 x 20k 2x20k >1000 >1000

Пример 10.С. ЕС50 значения для выбранных ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих две мутации.Example 10.C. EC50 values for selected PEGylated FGF21 mutant polypeptides comprising two mutations.

Активность ряда FGF21 мутантных полипептидов, включающих две мутации, также изучалась в ERK-люциферазной пробе, описанной здесь. Эти мутанты были созданы способами генной инженерии для введения двух сайтов присоединения неприродных полимеров (в форме цистеинового остатка) и мутации, дающей повышенную протеолитическую стабильность (P171G) в FGF21 последовательности дикого типа.The activity of a number of FGF21 mutant polypeptides comprising two mutations was also studied in the ERK-luciferase assay described here. These mutants were genetically engineered to introduce two non-natural polymer attachment sites (in the form of a cysteine residue) and a mutation conferring increased proteolytic stability (P171G) in the wild-type FGF21 sequence.

Были генерированы различные FGF21 мутантные полипептиды, и активность определялась в in vitro ELK-люциферазной пробе, описанной здесь. ЕС50 значения из этих экспериментов приведены ниже в табл. 11.Various FGF21 mutant polypeptides were generated and activity was determined in the in vitro ELK-luciferase assay described here. EC50 values from these experiments are shown in Table 1 below. eleven.

Таблица 11Table 11

ЕС50 значения для выбранных химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих две мутацииEC50 values for selected chemically modified FGF21 mutant polypeptides comprising two mutations

Мутации Mutations EC50 (hM) EC50(hM) Природный FGF21 Natural FGF21 3 3 N-конц. PEG20K N-con. PEG20K 37 37 E37C, R77C E37C, R77C 21 21 G120C, H125C G120C, H125C 23 23 R77C, E91C R77C, E91C 26 26 R77C, H125C R77C, H125C 30 thirty E91, H125C E91, H125C 32 32

- 32 041758- 32 041758

R77C, G120C R77C, G120C 34 34 Е37С, Е91С E37C, E91C 36 36 Е91С, R175C E91C, R175C 46 46 Е37С, R175C E37C, R175C 50 50 Е91С, G120C E91C, G120C 54 54 Е37С, G120C E37C, G120C 55 55 R77C, R175C R77C, R175C 62 62 Е37С, Н125С E37C, H125C 64 64 Е37С, К69С E37S, K69S 67 67 К69С, Е91С K69S, E91S 69 69 G120C, R175C G120C, R175C 118 118 К69С, G120C K69C, G120C 119 119 К69С, Н125С K69S, N125S 164 164 К69С, R77C K69C, R77C 180 180 Н125С, R175C H125C, R175C 200 200 К69С, R175C K69C, R175C 318 318 Е37С, G170C E37C, G170C 163 163

Параллельно были приготовлены дважды-ПЭГилированные FGF21 мутанты с использованием отдельных цистеиновых мутантов, полученных в примере 10А, но несущие также усиливающую стабильность P171G мутацию. Эти мутанты были сайт-селективно ПЭГилированы как в N-конце, так и полученном способом генной инженерии цистеине с использованием смешанных химических способов ПЭГ илирования, как описано ранее (см. патент США No. 6420339). Поскольку смешанная химия ПЭГилирования позволяет делать различение между N-концом и цистеиновыми сайтами конъюгации, возможно также сайт-селективным образом присоединить разные полимеры к разным сайтам. В этом случае был приготовлен ряд конъюгатов, где комбинации 5, 10 и 20 кДа полимеров были сопряжены с N-концом, и 20 кДа полимер был согласованным образом сопряжен с цистеиновым мутантом. Это позволило оценить влияние N-концевого ПЭГилирования на FGF21 in vitro активность. Все эти конъюгаты испытывались в in vitro ELK-люциферазной пробе, описанной в настоящей заявке. Результаты представлены в табл. 12.In parallel, double-PEGylated FGF21 mutants were prepared using the individual cysteine mutants obtained in Example 10A, but carrying also the P171G stability-enhancing mutation. These mutants were site-selectively PEGylated at both the N-terminus and the genetically engineered cysteine using mixed chemistries PEGylation as previously described (see US Pat. No. 6,420,339). Because the mixed chemistry of PEGylation allows discrimination between the N-terminus and cysteine conjugation sites, it is also possible to attach different polymers to different sites in a site-selective manner. In this case, a series of conjugates were prepared where combinations of 5, 10 and 20 kD polymers were N-terminally conjugated and the 20 kD polymer was conjugated to the cysteine mutant. This made it possible to evaluate the effect of N-terminal PEGylation on FGF21 in vitro activity. All of these conjugates were tested in the in vitro ELK-luciferase assay described in this application. The results are presented in table. 12.

Таблица 12Table 12

ЕС50 значения для выбранных химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих цистеиновую мутацию и мутацию P171GEC50 values for selected chemically modified FGF21 mutant polypeptides, including cysteine mutation and P171G mutation

Мутация Mutation Тип ПЭГ PEG type EC50 (нМ) EC50 (nM) R77C, P171G R77C, P171G 2 x20k 2x20k 64 64 Н125С, P171G H125C, P171G 2 х 20k 2 x 20k 152 152 Н125С, P171G H125C, P171G 1 х 10k, 1 x 20k 1 x 10k, 1 x 20k 65 65 Н125С, P171G H125C, P171G 1 x 5k, 1 x 20k 1 x 5k, 1 x 20k 30 thirty

Пример 10.D. ЕС50 значения для выбранных химически модифицированных FGF21 мутантных по липептидов, включающих три мутации.Example 10.D. EC50 values for selected chemically modified FGF21 mutant polypeptides comprising three mutations.

Активность ряда FGF21 мутантных полипептидов, включающих три мутации, также изучалась в ERK-люциферазной пробе, описанной в данной заявке. Эти мутанты были получены способами генной инженерии для введения двух сайтов присоединения неприродных полимеров (в форме цистеинового остатка) и мутации, дающей усиленную протеолитическую стабильность (P171G) в FGF21 последовательности дикого типа.The activity of a number of FGF21 mutant polypeptides, including three mutations, was also studied in the ERK-luciferase assay described in this application. These mutants were genetically engineered to introduce two non-natural polymer attachment sites (in the form of a cysteine residue) and a mutation conferring enhanced proteolytic stability (P171G) in the wild-type FGF21 sequence.

Были генерированы различные FGF21 мутантные полипептиды, и активность определялась в in vitro ELK-люциферазной пробе, описанной здесь. Сводка полученных данных приведена в табл. 13.Various FGF21 mutant polypeptides were generated and activity was determined in the in vitro ELK-luciferase assay described here. A summary of the data obtained is given in table. 13.

Таблица 13Table 13

ЕС50 значения для выбранных химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих три мутацииEC50 values for selected chemically modified FGF21 mutant polypeptides comprising three mutations

Мутации Mutations Тип ПЭГ PEG type EC50 (нМ) EC50 (nM) E37C, R77C, P171G E37C, R77C, P171G 2X 20 кДа 2X 20 kDa 27 27 E91, H125C , P171G E91, H125C, P171G 2X 20 кДа 2X 20 kDa 37 37 R77C, G120C , P171G R77C, G120C, P171G 2X 20 кДа 2X 20 kDa 35 35 E37C, E91C , P171G E37C, E91C, P171G 2X 20 кДа 2X 20 kDa 30 thirty E91C, R175C , P171G E91C, R175C, P171G 2X 20 кДа 2X 20 kDa 155 155 E37C, R175C , P171G E37C, R175C, P171G 2X 20 кДа 2X 20 kDa 162 162

- 33 041758- 33 041758

Е91С, G120C , P171G E91C, G120C, P171G 2Х 20 кДа 2X 20 kDa 34 34 Е37С, G120C , P171G E37C, G120C, P171G 2Х 20 кДа 2X 20 kDa 35 35 R77C, R175C,P171G R77C, R175C, P171G 2Х 20 кДа 2X 20 kDa ND ND Е37С, Н125С , P171G E37C, H125C, P171G 2Х 20 кДа 2X 20 kDa 37 37

Удивительно, но полученные данные указывают, что большинство этих дважды ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов имеют активность, превышающую таковую у N-терминально моноПЭГилированной молекулы.Surprisingly, the data obtained indicate that the majority of these doubly PEGylated FGF21 mutant polypeptides have activity greater than that of the N-terminally monoPEGylated molecule.

Пример 11. ЕС50 значения для выбранных FGF21 связанных молекул.Example 11 EC50 values for selected FGF21 related molecules.

Связанные молекулы настоящего изобретения включают две FGF21 полипептидных последовательности, связанные вместе молекулой линкера. Фиг. 7 графически изображает пример связанной молекулы. Как описано здесь, предполагалось, что эти связанные молекулы дадут более продолжительные периоды полураспада, сохраняя в то же время желательный уровень биологической активности.Linked molecules of the present invention comprise two FGF21 polypeptide sequences linked together by a linker molecule. Fig. 7 is a graphical representation of an example of a bound molecule. As described here, it was expected that these associated molecules will give longer half-lives, while maintaining the desired level of biological activity.

Были генерированы различные связанные молекулы, и активность определялась в in vitro ELKлюциферазной пробе, описанной в настоящей заявке. Данные генерированные связанные молекулы включают FGF21 мутанты, в которых данная мутация вводит сайт присоединения линкера. Несколько FGF21 мутантов были двойными мутантами, и они включают P171G мутацию для повышения протеолитической стабильности. Условия и процедуры для этого in vitro исследования были такими же, как и в примере 10. Полученные данные приведены в табл. 14:Various related molecules were generated and activity was determined in the in vitro ELKluciferase assay described herein. These generated linked molecules include FGF21 mutants in which this mutation introduces a linker attachment site. Several FGF21 mutants were double mutants, and these include the P171G mutation to increase proteolytic stability. Conditions and procedures for this in vitro study were the same as in example 10. The data obtained are shown in table. 14:

Таблица 14Table 14

ЕС50 значения для выбранных FGF21 связанных молекулEC50 values for selected FGF21 related molecules

Мутации Mutations Линкер Linker ЕС50 (нМ) EC50 (nM) Н125С, P171G H125C, P171G 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.21 0.21 R77C, P171G R77C, P171G 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.25 0.25 G120C, P171G G120C, P171G 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.51 0.51 Е37С, P171G E37C, P171G 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.36 0.36 R175C, P171G R175C, P171G 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.36 0.36 Е91С, P171G E91C, P171G 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.20 0.20 G170C G170C 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.47 0.47 Р171С R171C 20 кДа ПЭГ 20 kDa PEG 0.21 0.21

Из данных табл. 14 видно, что указанные связанные молекулы обладают удивительно высокой in vitro активностью, равной или превышающей таковую для не-ПЭГилированной молекулы, которая для ссылки была найдена равной 0,63.From the data in Table. 14 shows that these coupled molecules have surprisingly high in vitro activity, equal to or greater than that of the non-PEGylated molecule, which for reference was found to be 0.63.

Пример 12. In vivo активность химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов.Example 12 In vivo activity of chemically modified FGF21 mutant polypeptides.

FGF21 обладает рядом биологических активностей, включая способность снижать уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови; уменьшать вес тела; или увеличивать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину. После первоначальной in vitro оценки, описанной в примере 10, ПЭГилированные FGF21 мутантные полипептиды были дополнительно проанализированы на in vivo FGF21 активность. ПЭГилированные FGF21 полипептиды вводились инсулинрезистентным ob/ob мышам, и измерялась способность конкретного ПЭГилированного FGF21 полипептида снижать уровень глюкозы в крови. Процедура для in vivo исследования была следующей.FGF21 has a number of biological activities, including the ability to lower blood glucose, insulin, triglyceride or cholesterol levels; reduce body weight; or increase glucose tolerance, energy expenditure, or insulin sensitivity. After the initial in vitro evaluation described in Example 10, the PEGylated FGF21 mutant polypeptides were further analyzed for in vivo FGF21 activity. PEGylated FGF21 polypeptides were administered to insulin resistant ob/ob mice and the ability of a particular PEGylated FGF21 polypeptide to lower blood glucose levels was measured. The procedure for the in vivo study was as follows.

Испытываемый ПЭГилированный FGF21 полипептид вводили в виде инъекции интраперитонеально 8 недельным ob/ob мышам (лаборатория Jackson), и пробы крови отбирались в разные моменты времени после единичной инъекции, например 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровни глюкозы в крови измерялись с помощью глюкометра OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA), и результаты выражались как процентное изменение уровня глюкозы в крови относительно базового уровня (т.е. в 0 момент времени).The PEGylated FGF21 polypeptide to be tested was injected intraperitoneally into 8 week old ob/ob mice (Jackson Laboratories) and blood samples were taken at different time points after a single injection, for example 0, 6, 24, 72, 120 and 168 hours post injection. Blood glucose levels were measured using a OneTouch glucometer (LifeScan, Inc. Milpitas, CA) and the results were expressed as the percentage change in blood glucose from baseline (ie, at time 0).

FGF21 мутанты генерировались, как здесь описано, и химически модифицировались путем добавления двух 20 кДа метокси ПЭГ малеинимидных молекул, по одной в каждый из введенных сайтов присоединения полимера, которые обычно были цистеиновыми остатками. Данные мутации были выбраны, чтобы ввести дискретные, известные точки присоединения для двух молекул ПЭГ. ПЭГилирование FGF21 мутантов достигалось с использованием описанных здесь способов.FGF21 mutants were generated as described here and chemically modified by adding two 20 kDa methoxy PEG maleimide molecules, one at each of the introduced polymer attachment sites, which were typically cysteine residues. These mutations were chosen to introduce discrete, known attachment points for two PEG molecules. PEGylation of FGF21 mutants was achieved using the methods described here.

Пример 12.А. In vivo активность N-терминально ПЭГилированных FGF21 дикого типа.Example 12.A. In vivo activity of N-terminally PEGylated wild-type FGF21.

FGF21 дикого типа, который был химически модифицирован путем ПЭГилирования в N-конце данного полипептида, изучался на модели ob/ob мыши. Не-ПЭГилированный FGF21 дикого типа также изучался в том же эксперименте, и в качестве контроля использовался фосфатно-солевой буферный раствор. Для N-терминального ПЭгилирования FGF21A дикого типа использовалась единичная молекула 20 кДа метокси ПЭГ имида малеиновой кислоты. Фиг. 8 демонстрирует результаты этого эксперимента.Wild-type FGF21, which has been chemically modified by PEGylation at the N-terminus of this polypeptide, has been studied in an ob/ob mouse model. Non-PEGylated wild-type FGF21 was also studied in the same experiment, and phosphate buffered saline was used as a control. For the N-terminal PEGylation of wild-type FGF21A, a single molecule of 20 kDa methoxy PEG maleic acid imide was used. Fig. 8 shows the results of this experiment.

Как природный, так и N-терминально ПЭГилированный FGF21 дикого типа снижал уровни глюко- 34 041758 зы в крови на 30-40% после единичной инъекции. Однако уровни глюкозы в крови возвращались на базисный уровень через 24 ч после инъекции природного FGF21 дикого типа. В противоположность этому,Both native and N-terminally PEGylated wild-type FGF21 reduced blood glucose levels by 30-40% after a single injection. However, blood glucose levels returned to baseline 24 hours after the injection of natural wild-type FGF21. In contrast to this,

N-терминально ПЭГилированный FGF21 дикого типа поддерживал снижающую уровень глюкозы в крови активность на протяжении по меньшей мере 72 ч. Результаты этого исследования указывают, что ПЭГилирование FGF21 дикого типа пролонгирует фармакодинамические эффекты природной молекулы.N-terminally PEGylated wild type FGF21 maintained blood glucose lowering activity for at least 72 hours. The results of this study indicate that PEGylation of wild type FGF21 prolongs the pharmacodynamic effects of the natural molecule.

Что касается фиг. 9, исследование типа доза-реакция было проведено на модели ob/ob мыши с использованием FGF21 дикого типа, который был ПЭГилирован в N-конце 20, 30 или 40 кДа ПЭГ молекулой. Фиг. 9 демонстрирует, что молекулы 30 и 40 кДа ПЭГ имеют большую и более длительную снижающую глюкозу активность, чем ПЭГ молекула 20 кДа, что предполагает, что размер молекулы ПЭГ положительно коррелирует с in vivo фармакодинамическими эффектами.With regard to FIG. 9, a dose-response study was performed in an ob/ob mouse model using wild-type FGF21 that was N-terminal PEGylated with a 20, 30, or 40 kDa PEG molecule. Fig. 9 demonstrates that the 30 and 40 kD PEG molecules have greater and longer lasting glucose lowering activity than the 20 kD PEG molecule, suggesting that PEG molecule size is positively correlated with in vivo pharmacodynamic effects.

Пример 12.А.1. In vivo активность выбранных химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов, конъюгированных как в N-конце так и во введенном сайте присоединения полимера.Example 12.A.1. In vivo activity of selected chemically modified FGF21 mutant polypeptides conjugated both at the N-terminus and at the introduced polymer attachment site.

Несколько химически модифицированных мутантов FGF21, которые были сайт-селективно ПЭГилированы как в N-конце так и во втором сайте, созданном способами генной инженерии, изучались на модели ob/ob мыши. Эти дважды-ПЭГилированные FGF21 конструкты были все ПЭГилированы в Nконце и во втором сайте, включающем либо созданный способами генной инженерии лизин, как описано в примере 4, или созданный способами генной инженерии цистеин, как описано в примере 6.Several chemically modified FGF21 mutants that were site-selectively PEGylated at both the N-terminus and the genetically engineered second site were studied in the ob/ob mouse model. These double-PEGylated FGF21 constructs were all PEGylated at the N-terminus and at a second site comprising either a genetically engineered lysine as described in Example 4 or a genetically engineered cysteine as described in Example 6.

Подобный эксперимент был проведен с использованием другой группы ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов. Фиг. 10 включает два графика, показывающих процентное изменение уровней глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили наполнитель (фосфатно-солевой буферный раствор), или ПЭГилированные формы FGF21 мутантов, включающие мутации присоединения полимеров, т.е. FGF21 R77C, который также был N-терминально ПЭГилирован, и FGF21 R126K, который также был N-терминально ПЭГилирован (верхний график), и N-терминально ПЭГилированный F77/P171G (нижний график), которые также были ПЭГилированы на введенных сайтах присоединения полимера. Были использованы 20 кДа молекулы метокси ПЭГ малеинимида. Результаты этого эксперимента вновь подтверждают, что дважды ПЭГилированные FGF21 мутанты демонстрируют усиленную фармакодинамику относительно протеина FGF21 дикого типа при сохранении снижения глюкозы в течение по меньшей мере 120 ч.A similar experiment was performed using another group of PEGylated FGF21 mutant polypeptides. Fig. 10 includes two graphs showing the percentage change in blood glucose levels in mice injected with vehicle (phosphate buffered saline) or PEGylated forms of FGF21 mutants including polymer attachment mutations, i.e. FGF21 R77C, which was also N-terminally PEGylated, and FGF21 R126K, which was also N-terminally PEGylated (upper panel), and N-terminally PEGylated F77/P171G (lower panel), which were also PEGylated at the introduced polymer attachment sites. 20 kDa methoxy PEG maleimide molecules were used. The results of this experiment again confirm that double-PEGylated FGF21 mutants exhibit enhanced pharmacodynamics relative to the wild-type FGF21 protein while maintaining glucose reduction for at least 120 hours.

Пример 12.В. In vivo активность выбранных химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов, включающих две или три мутации.Example 12.B. In vivo activity of selected chemically modified FGF21 mutant polypeptides comprising two or three mutations.

Ряд химически модифицированных FGF21 мутантных полипептидов изучался на модели ob/ob мышей. Эти мутанты были химически модифицированы путем добавления двух 20 кДа метокси ПЭГ малеинимидных молекул, по одной в каждый из введенных цистеиновых остатков, и в случае FGF21 мутантных полипептидов, включающих отдельную мутацию, в N-конце данного полипептида. Данные мутации выбирались таким образом, чтобы ввести дискретные, известные точки присоединения для одной или нескольких молекул ПЭГ. Некоторые FGF21 мутанты также включали P171G мутацию для усиления протеолитической резистентности. ПЭГилированые FGF21 мутантные полипептиды вводились путем инъекции мышам, и мышам делали кровопускание через некоторые интервалы времени на протяжении 9- суточного исследования.A number of chemically modified FGF21 mutant polypeptides have been studied in the ob/ob mouse model. These mutants were chemically modified by adding two 20 kDa methoxy PEG maleimide molecules, one to each of the introduced cysteine residues, and in the case of FGF21 mutant polypeptides, comprising a single mutation at the N-terminus of that polypeptide. These mutations were chosen to introduce discrete, known attachment points for one or more PEG molecules. Some FGF21 mutants also included the P171G mutation to enhance proteolytic resistance. The PEGylated FGF21 mutant polypeptides were injected into mice and the mice were bled at intervals throughout the 9 day study.

Пример 12.В.1. Влияние на уровни глюкозы.Example 12.B.1. Effect on glucose levels.

Был проведен эксперимент с использованием еще одной группы ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов. Фиг. 11 представляет собой график, показывающий процентное изменение уровней глюкозы в крови мышей, которым делались инъекции наполнителя (фосфатно-солевой буферный раствор), или дважды ПЭГилированных форм FGF21 мутантов, включающих мутации, а именно E91/H125C, E91C/R175C, E37C/G120C, Е37С/Н125С, E37C/R175C; изучался также не-ПЭГилированный Fc-G170E FGF21. Использовали 20 кДа молекулы метокси ПЭГмалеинимида. Результаты этого эксперимента вновь подтверждают, что дважды ПЭГилированные мутанты демонстрируют усиленную фармакодинамику относительно протеина FGF21 дикого типа.An experiment was conducted using yet another group of PEGylated FGF21 mutant polypeptides. Fig. 11 is a graph showing the percentage change in blood glucose levels of mice injected with vehicle (phosphate buffered saline) or double-PEGylated forms of FGF21 mutants including mutations, namely E91/H125C, E91C/R175C, E37C/G120C, E37C/H125C, E37C/R175C; non-PEGylated Fc-G170E FGF21 was also studied. A 20 kDa methoxy PEGmaleimide molecule was used. The results of this experiment again confirm that the double-PEGylated mutants show enhanced pharmacodynamics relative to the wild-type FGF21 protein.

Схожий эксперимент был проведен с использованием еще одной группы ПЭГилированных FGF21 мутантных полипептидов. Фиг. 12 представляет собой график, показывающий процентное изменение уровней глюкозы в крови мышей, которым делались инъекции наполнителя (фосфатно-солевой буферный раствор), или дважды ПЭГилированных форм FGF21 мутантов, включающих мутации, а именно Nтерминально ПЭГилированного R77C, который также был ПЭГилирован во введенном полимеризационном сайте, N-терминально ПЭГилированного R126K, который также был ПЭГилирован на введенном полимеризационном сайте, E91/G120C, G120C/H125C, и E37C/R77C; также исследовался неПЭГилированный Fc-G170E FGF21. Были использованы молекулы 20 кДа метокси ПЭГ малеинимида. Результаты этого эксперимента подтверждают, что дважды ПЭГилированные FGF21 мутанты демонстрируют усиленную фармакодинамику относительно FGF21 протеина дикого типа.A similar experiment was performed using yet another group of PEGylated FGF21 mutant polypeptides. Fig. 12 is a graph showing the percentage change in blood glucose levels of mice injected with vehicle (phosphate buffered saline) or double-PEGylated forms of FGF21 mutants including mutations, namely N-terminally PEGylated R77C, which was also PEGylated at the introduced polymerization site , N-terminally PEGylated R126K, which was also PEGylated at the introduced polymerization site, E91/G120C, G120C/H125C, and E37C/R77C; non-PEGylated Fc-G170E FGF21 was also investigated. 20 kDa methoxy PEG maleimide molecules were used. The results of this experiment confirm that the double-PEGylated FGF21 mutants exhibit enhanced pharmacodynamics relative to the wild-type FGF21 protein.

В другом эксперименте фиг. 13 показывает влияние ПЭГилированных FGF21 мутантов на уровни глюкозы в крови мышей в течение 9-суточного исследования. Эти данные демонстрируют, что ПЭГилированные молекулы имеют увеличенную in vivo активность, по сравнению с таковой для природной молекулы. На фиг. 13 результаты были получены с ПЭГилированными E37C/R77C, E91C/R175C,In another experiment, Fig. 13 shows the effect of PEGylated FGF21 mutants on blood glucose levels in mice during a 9 day study. These data demonstrate that PEGylated molecules have increased in vivo activity compared to that of the natural molecule. In FIG. 13 results were obtained with PEGylated E37C/R77C, E91C/R175C,

- 35 041758- 35 041758

Е37С/Н125С, E37C/R77C/P171G, E91C/R175C/P171G, и E37C/H125C/P171G FGF21 мутантами, которые были дважды ПЭГилированы на введенных сайтах присоединения полимеров. FGF21 мутанты были модифицированы двумя молекулами 20 кДа метокси ПЭГ малеинимида в этом исследовании, и использованный наполнитель представлял 10 мМ фосфат калия, 5% сорбит, рН 8.E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R175C/P171G, and E37C/H125C/P171G FGF21 mutants that were double-PEGylated at the introduced polymer attachment sites. FGF21 mutants were modified with two molecules of 20 kDa methoxy PEG maleimide in this study, and the vehicle used was 10 mM potassium phosphate, 5% sorbitol, pH 8.

Как показано на фиг. 13, данные три двойные мутантные дважды ПЭГилированные молекулы E37C/R77C; E91C/R175C; Е37С/Н125С уменьшали уровни глюкозы в крови, и данные эффекты сохранялись в течение 72 ч после единичной инъекции. Интересно, что введение P171G мутации дополнительно пролонгировало эти in vivo действия, и максимальные снижающие глюкозу действия сохранялись в течение еще 2 суток при полной продолжительности действия 120 ч.As shown in FIG. 13, these are three double mutant double PEGylated E37C/R77C molecules; E91C/R175C; E37C/H125C reduced blood glucose levels and these effects persisted for 72 hours after a single injection. Interestingly, the introduction of the P171G mutation further prolonged these in vivo effects, and the maximum glucose-lowering effects were maintained for another 2 days at a total duration of action of 120 h.

Кроме того, параллельно с несколькими связанными молекулами изучалась способность к снижению глюкозы нескольких FGF21 полипептидов, включающих три мутации. Тройными использованными мутантами были E37C/R77C/P171G и E91C/H125C/P171G; указанные связанные молекулы включали два идентичных FGF21 мутантных полипептида, включающих две мутации, а именно E37C/P171G и R77C/P171G. 20 кДа метокси ПЭГ малеинимидные молекулы использовались для дважды ПЭГилированных форм FGF21, также как и для молекулы линкера в связанной молекуле. Результаты этого эксперимента приведены на фиг. 14. По сравнению со связанными FGF21 мутантами, дважды ПЭГилированные мутанты имели дополнительно усиленную фармакодинамику. Снижающая глюкозу активность дважды ПЭГилированных мутантов сохранялась в течение по меньшей мере 168 ч, по сравнению со 120 ч для связанных FGF21 мутантов.In addition, in parallel with several related molecules, the glucose-lowering ability of several FGF21 polypeptides containing three mutations was studied. The triple mutants used were E37C/R77C/P171G and E91C/H125C/P171G; these associated molecules included two identical FGF21 mutant polypeptides, including two mutations, namely E37C/P171G and R77C/P171G. 20 kDa methoxy PEG maleimide molecules were used for the doubly PEGylated forms of FGF21 as well as for the linker molecule in the linked molecule. The results of this experiment are shown in Fig. 14. Compared to FGF21-linked mutants, the double-PEGylated mutants had an additional enhanced pharmacodynamics. The glucose-lowering activity of the double-PEGylated mutants was maintained for at least 168 hours, compared to 120 hours for FGF21-linked mutants.

Фиг. 15 представляет собой график процентного изменения глюкозы в крови в зависимости от дозы в ob/ob мышах, которым вводились инъекции наполнителя (10 мМ TRIS, 150 мМ NaCl, pH 8,5) или различные дозы дважды ПЭГилированного E37C/R77C/P171G FGF21 мутантного полипептида в течение девятисуточного периода. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что дважды ПЭГилированный тройной мутант E37C/R77C/P171G снижал уровни глюкозы в крови в ob/ob мышах в зависимости от дозы. Уровень дозы 0,3 мг/кг давал почти максимальную снижающую глюкозу активность, и эти эффекты сохранялись в течение по меньшей мере 5 суток. Дальнейшее повышение in vivo активности и продолжительности действия наблюдались, когда уровень дозы повышался до 1 мг/кг.Fig. 15 is a plot of percent change in blood glucose versus dose in ob/ob mice injected with vehicle (10 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 8.5) or various doses of doubly PEGylated E37C/R77C/P171G FGF21 mutant polypeptide over a nine day period. The results of this experiment demonstrate that the double-PEGylated E37C/R77C/P171G triple mutant reduced blood glucose levels in ob/ob mice in a dose dependent manner. The dose level of 0.3 mg/kg gave near maximal glucose lowering activity and these effects were maintained for at least 5 days. A further increase in in vivo activity and duration of action was observed when the dose level was increased to 1 mg/kg.

Пример 12.В.2. Влияние на вес тела.Example 12.B.2. Effect on body weight.

Диабет 2 типа часто сопровождается повышенным ожирением и избыточным весом тела. Поэтому, лучше, когда терапевтическая молекула дает желательный эффект по снижению веса тела, также как и желательный эффект в отношении снижения уровней глюкозы в крови. Соответственно многие из описанных здесь ПЭГилированных FGF21 мутантов оценивались в отношении их влияния на вес тела мышей.Type 2 diabetes is often accompanied by increased obesity and overweight. Therefore, it is advantageous for the therapeutic molecule to have the desired effect of reducing body weight as well as the desired effect of lowering blood glucose levels. Accordingly, many of the PEGylated FGF21 mutants described herein have been evaluated for their effect on body weight in mice.

Для изучения влияния различных FGF21 мутантных полипептидов на вес тела ПЭГилированные дикого типа и FGF21 мутантные полипептиды вводились путем интраперитонеальной инъекции 8недельным ob/ob мышам (лаборатория Jackson), и вес тела контролировался в разные моменты времени после одноразовой инъекции, например 0, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции.To study the effects of various FGF21 mutant polypeptides on body weight, wild-type PEGylated and FGF21 mutant polypeptides were administered by intraperitoneal injection to 8 week old ob/ob mice (Jackson lab) and body weight was monitored at different time points after a single injection, e.g., 0, 24, 72, 120 and 168 hours after injection.

Фиг. 16 показывает влияние ПЭГилированных FGF21 мутантов на вес мышей на протяжении периода исследования. Результаты были получены с использованием дважды ПЭГилированных E37C/R77C, E91C/R175C, Е37С/Н125С, E37C/R77C/P171G, E91C/R175C/P171G, и E37C/H125C/P171G FGF21 мутантных полипептидов. FGF21 мутанты были модифицированы в этом исследовании молекулами 20 кДа метокси ПЭГ малеинимида. Эти FGF21 мутанты также изучались в отношении изменений уровней глюкозы, и эти результаты представлены на фиг. 13. Совместно эти данные демонстрируют, что мыши, получающие ПЭГилированные FGF21 мутанты, набирали меньший вес, относительно контрольного наполнителя, и что FGF21 мутантные полипептиды, включающие резистентную к протеолизу мутацию P171G, более эффективны, чем их Р171 двойники дикого типа.Fig. 16 shows the effect of PEGylated FGF21 mutants on mouse weight over the study period. Results were obtained using doubly PEGylated E37C/R77C, E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R175C/P171G, and E37C/H125C/P171G FGF21 mutant polypeptides. FGF21 mutants were modified in this study with 20 kD methoxy PEG maleimide molecules. These FGF21 mutants were also studied for changes in glucose levels and the results are shown in FIG. 13. Together, these data demonstrate that mice receiving PEGylated FGF21 mutants gained less weight relative to vehicle control, and that FGF21 mutant polypeptides containing the proteolysis-resistant P171G mutation are more potent than their wild-type P171 counterparts.

Фиг. 17 представляет собой график, показывающий изменение веса тела мышей, инъектированных носителем или дважды ПЭГилированными формами FGF21 мутанта, включающего мутации, а именно E37C/R77C/P171G; E91C/H125C/P171G; R77C/P171G; и связанными молекулами, включающими в одном случае два E37C/P171G FGF21 мутантных полипептида, и в другом случае два R77C/P171G FGF21 мутантных полипептида. В ПЭГилированных формах FGF21 использовались 20 кДа метокси ПЭГ малеинимидные молекулы, тогда как для связанных молекул использовались 20 кДа ПЭГ бисмалеинимидные молекулы. Эти FGF21 мутанты также изучались в отношении изменений уровней глюкозы, и результаты приведены на фиг. 14. Совместно эти данные демонстрируют, что мыши, получающие ПЭГилированные FGF21 мутанты, набирали меньший вес, по сравнению с контрольным наполнителем. Наблюдалось также, что дважды ПЭГилированные FGF21 мутантные полипептиды были более эффективными в снижении веса тела, чем изученные связанные молекулы.Fig. 17 is a graph showing the change in body weight of mice injected with vehicle or double-PEGylated forms of the FGF21 mutant containing mutations, namely E37C/R77C/P171G; E91C/H125C/P171G; R77C/P171G; and related molecules, including in one case two E37C/P171G FGF21 mutant polypeptides, and in the other case two R77C/P171G FGF21 mutant polypeptides. The PEGylated forms of FGF21 used 20 kDa methoxy PEG maleimide molecules, while the bound molecules used 20 kDa PEG bismaleimide molecules. These FGF21 mutants were also studied for changes in glucose levels and the results are shown in FIG. 14. Together, these data demonstrate that mice receiving PEGylated FGF21 mutants gained less weight compared to vehicle control. It was also observed that double-PEGylated FGF21 mutant polypeptides were more effective in reducing body weight than the linked molecules studied.

Влияние дважды ПЭГилированного FGF21 мутантного полипептида на вес тела также изучалось в многодозовом исследовании. Фиг. 18 представляет собой график, показывающий изменение веса тела в зависимости от дозы в ob/ob мышах, инъектированных наполнителем или разными дозами дважды ПЭГилированного E37C/R77C/P171G на протяжении девятисуточного периода. Этот FGF21 мутант изучался также в отношении изменений уровней глюкозы, и результаты представлены на фиг. 15. Совместно,The effect of the doubly PEGylated FGF21 mutant polypeptide on body weight was also studied in a multi-dose study. Fig. 18 is a graph showing body weight versus dose in ob/ob mice injected with vehicle or different doses of double-PEGylated E37C/R77C/P171G over a nine day period. This FGF21 mutant was also studied for changes in glucose levels and the results are shown in FIG. 15. Together,

- 36 041758 эти данные демонстрируют, что дозовый уровень 0,3 мг/кг достаточен для снижения веса тела ob/ob мышей после единичной инъекции.- 36 041758 these data demonstrate that the dose level of 0.3 mg/kg is sufficient to reduce the body weight of ob/ob mice after a single injection.

Пример 13. Исследование почечных вакуолей мышей.Example 13 Examination of mouse renal vacuoles.

Одним соображением в плане использования ПЭГ и других полимеров для расширения периода полураспада терапевтического протеина является возможность того, что ПЭГилированная молекула будет образовывать почечные вакуоли. Это свойство ПЭГ хорошо документировано (см., например, работы Bendele, et al. 1998, Short Communication: Renal Tubular Vacuolation in Animals Treated with Polyethyleneglycol-conjugated Proteins, Toxicological Sciences, 42:152-157 и Conover et al., 1996, Transitional Vacuole Formation Following a Bolus Infusion of PEG-hemoglobin in the Rat, Art. Cells, Blood Subs., and Immob. Biotech. 24:599-611) и может быть непредсказуемым. ПЭГилированная молекула, которая индуцирует образование почечных вакуолей, обычно, но не обязательно, делает данную молекулу менее желательной в качестве терапевтического протеина. При некоторых обстоятельствах вакуолизация почек вызывает меньшее беспокойство и с ней можно мириться. Соответственно на мышах было проведено продолжительное исследование почечных вакуолей.One consideration in using PEG and other polymers to extend the half-life of a therapeutic protein is the possibility that the PEGylated molecule will form renal vacuoles. This property of PEG is well documented (see, for example, Bendele, et al. 1998, Short Communication: Renal Tubular Vacuolation in Animals Treated with Polyethyleneglycol-conjugated Proteins, Toxicological Sciences, 42:152-157 and Conover et al., 1996, Transitional Vacuole Formation Following a Bolus Infusion of PEG-hemoglobin in the Rat, Art Cells, Blood Subs., and Immob Biotech 24:599-611) and can be unpredictable. A PEGylated molecule that induces renal vacuole formation usually, but not necessarily, makes the molecule less desirable as a therapeutic protein. In some circumstances, kidney vacuolization is less of a concern and can be tolerated. Accordingly, a long-term study of renal vacuoles was carried out in mice.

FGF21 мутантные полипептиды были генерированы, как описано здесь. Одно исследование было спланировано и проведено следующим образом. Множественно ПЭГилированные FGF21 молекулы вводились один раз в день на протяжении 7 последовательных дней посредством подкожной инъекции самкам C57BL/6 мышей (3/группу) при дозе 10 мг/кг; таким же способом вводились контрольный наполнитель (10 мМ KHPO₄, 150 мМ NaCl, pH 8) и 2 позитивных контроля. Перед введением каждой дозы все животные подвергались детальным клиническим наблюдениям, и спустя 1-2 ч после введения дозы на 1, 3 и 6 сутки; наблюдения извне клетки собирались спустя 1-2 ч после введения дозы во все другие дни дозировки. Данные по весу тела собирались перед каждым введением дозы и при аутопсии. Почки и печень отбирались у всех животных для гистологического анализа. Сводка результатов данного исследование представлена в табл. 15.FGF21 mutant polypeptides were generated as described here. One study was designed and conducted as follows. Multi-PEGylated FGF21 molecules were administered once daily for 7 consecutive days by subcutaneous injection to female C57BL/6 mice (3/group) at a dose of 10 mg/kg; the control filler (10 mm KHPO ₄ , 150 mm NaCl, pH 8) and 2 positive controls were introduced in the same way. Before the introduction of each dose, all animals were subjected to detailed clinical observations, and 1-2 hours after the dose on days 1, 3 and 6; out-of-cell observations were collected 1-2 hours post-dose on all other dosing days. Body weight data were collected before each dose and at autopsy. Kidneys and livers were taken from all animals for histological analysis. A summary of the results of this study is presented in Table. 15.

Таблица 15Table 15

Сводка данных по исследованию почечных вакуолейSummary of data on the study of renal vacuoles

Молекула Molecule Почка Bud Печень Liver Носитель Carrier 0.0 0.0 0.0 0.0 Позитивный контроль Positive control 3.7 3.7 0.0 0.0 FGF21 -1Χ-ΝΤ(Π3Γ20Κ) FGF21-1Χ-ΝΤ(Π3Γ20Κ) 2.0 2.0 0.0 0.0 Н126С 1Х-ПЭГ20К N126S 1H-PEG20C 2.3 2.3 0.0 0.0 R78C 1Х-ПЭГ20К R78C 1X-PEG20C 2.3 2.3 0.0 0.0 К70С 1Х-ПЭГ20К K70S 1H-PEG20K 2.0 2.0 0.0 0.0 G121C 1Х-ПЭГ20К G121C 1X-PEG20C 2.0 2.0 0.0 0.0 Е38С 1Х-ПЭГ20К E38S 1H-PEG20C 2.0 2.0 0.0 0.0 R176C 1Х-ПЭГ20К R176C 1X-PEG20C 3.0 3.0 0.0 0.0 Е92С 1Х-ПЭГ20К E92S 1H-PEG20C 2.7 2.7 0.0 0.0 N122C 1Х-ПЭГ20К N122C 1X-PEG20C 2.0 2.0 0.0 0.0 R127C 1Х-ПЭГ20К R127C 1X-PEG20C 3.0 3.0 0.0 0.0 G114C 1Х-ПЭГ20К G114C 1X-PEG20C 2.7 2.7 0.0 0.0 D80C 1Х-ПЭГ20К D80C 1X-PEG20C 2.0 2.0 0.0 0.0 D47C 1Х-ПЭГ20К D47C 1X-PEG20C 3.0 3.0 0.0 0.0 Н112С 1Х-ПЭГ20К N112S 1H-PEG20C 2.6 2.6 0.0 0.0 K56R, K59R, K69R, K122R, R175K 2Х-ПЭГ20К K56R, K59R, K69R, K122R, R175K 2X-PEG20K 0.0 0.0 0.0 0.0 K56R, K59R, K69R, K122R, R77K 2Х-ПЭГ20К K56R, K59R, K69R, K122R, R77K 2X-PEG20K 0.0 0.0 0.0 0.0 K56R, K59R, K69R, K122R, R72K 2Х-ПЭГ20К K56R, K59R, K69R, K122R, R72K 2X-PEG20K 0.0 0.0 0.0 0.0

Табл. 15 демонстрирует результаты 7-суточного исследования мышиных вакуолей, проведенного с использованием наполнителя (10 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 8,5), N-терминально ПЭГилированной формы FGF21, также как и ПЭГилированных форм FGF21 мутантов, включающих мутации Н125С, R77C, К69С, G120C, Е37С, R175, Е91С, N121C, R126C, G113C, D79C, D46C и Н112С. Как указано в таблице, использовалась либо одна, либо две 20 кДа метокси ПЭГ малеинимидные молекулы. Вакуольные показатели находятся в пределах от 0, отвечающего отсутствию наблюдаемых изменений в вакуолях относительно контроля, до 4, что отвечает интенсивному образованию вакуолей. Как очевидно из табл. 15, все моно-ПЭГилированные FGF21 мутанты индуцировали образование почечных вакуолей. Однако ни один из дважды-ПЭГилированных FGF21 мутантов не индуцировал образования вакуолей. Отмечалось также, что в печени мышей вакуолизация не наблюдалась.Tab. 15 shows the results of a 7-day study of mouse vacuoles, carried out using a vehicle (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5), N-terminally PEGylated form of FGF21, as well as PEGylated forms of FGF21 mutants, including mutations H125C, R77C, K69C, G120C, E37C, R175, E91C, N121C, R126C, G113C, D79C, D46C and H112C. As indicated in the table, either one or two 20 kDa methoxy PEG maleimide molecules were used. The vacuole scores ranged from 0, corresponding to the absence of observed changes in vacuoles relative to control, to 4, which corresponds to the intensive formation of vacuoles. As is obvious from Table. 15, all mono-PEGylated FGF21 mutants induced renal vacuole formation. However, none of the double-PEGylated FGF21 mutants induced vacuole formation. It was also noted that no vacuolization was observed in the liver of mice.

После однонедельного исследования было предпринято 8 недельное хроническое исследование. В этом исследовании различные ПЭГилированные FGF21 молекулы вводились один раз в неделю путем подкожной инъекции на протяжении 8 недель самкам C57BL/6 мышей (5/группу) при дозах либо 5 либо 25 мг/кг; таким же способом вводился контрольный наполнитель (10 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 8,5). Все животные наблюдались в отношении клинических признаков раз в день перед введением дозы, и спустяAfter a one week study, an 8 week chronic study was undertaken. In this study, various PEGylated FGF21 molecules were administered once a week by subcutaneous injection for 8 weeks to female C57BL/6 mice (5/group) at doses of either 5 or 25 mg/kg; the control filler (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5) was introduced in the same way. All animals were observed for clinical signs once a day before dosing, and thereafter.

- 37 041758- 37 041758

1-2 ч после введения дозы в дни дозировки. Данные по весу тела собирались перед каждым введением дозы, начиная с дня 1 и затем на 3 день после каждой дозы, и при аутопсии. Почки, печень и селезенку отбирали у всех животных (умирающих и подвергнутых конечной эутаназии) для проведения гистологической оценки.1-2 hours after dosing on dosing days. Body weight data were collected before each dose, starting on day 1 and then on day 3 after each dose, and at autopsy. Kidneys, livers and spleens were taken from all animals (dying and subjected to final euthanasia) for histological evaluation.

Фиг. 19A-19F представляют собой ряд графиков, где приведены результаты изменения веса тела, наблюдаемого в процессе восьминедельного исследования вакуолей, с использованием наполнителя (квадраты) и двух доз дважды ПЭГилированных FGF21 мутантов, а именно 5 мг/кг (треугольники) и 25 мг/кг (незаштрихованные кружки). Изученные FGF21 мутанты включали R77C, P171G (фиг. 19А); Е37С, R77C, P171G (фиг. 19В); Е37С, Н125С, P171G (фиг. 19С); Е91С, Н125С, P171G (фиг. 19D); Е37С, P171G (фиг. 19Е) и R77C, P171G (фиг. 19F). На фиг. 19А был использован подход смешанных химических способов, ведущий к N-концевому ПЭГилированию FGF21 мутанта, также как и ПЭГилированию на введенном сайте присоединения полимера, неприродного цистеина в положении 77. На фиг. 19B-19D был использован подход одного химического способа, ведущий к ПЭГилированию на введенных сайтах присоединения полимера, неприродных цистеиновых остатков (цистеины в положениях 37 и 77 на фиг. 19В, положениях 37 и 125 на фиг. 19С, и положениях 91 и 125 на фиг. 19D). Наконец, на фиг. 19D и 19Е была использована одна бис-малеинимидная ПЭГ молекула для соединения двух FGF21 мутантов на неприродных цистеиновых остатках (цистеин в положении 37 на фиг. 21E и положении 77 на фиг. 19F).Fig. 19A-19F are a series of graphs showing the results of body weight change observed during an eight-week vacuole study using vehicle (squares) and two doses of double-PEGylated FGF21 mutants, namely 5 mg/kg (triangles) and 25 mg/kg (open circles). FGF21 mutants studied included R77C, P171G (Fig. 19A); E37C, R77C, P171G (Fig. 19B); E37C, H125C, P171G (Fig. 19C); E91C, H125C, P171G (Fig. 19D); E37C, P171G (FIG. 19E) and R77C, P171G (FIG. 19F). In FIG. 19A, a mixed chemistry approach was used leading to N-terminal PEGylation of the FGF21 mutant as well as PEGylation at the introduced polymer attachment site, a non-natural cysteine at position 77. FIG. 19B-19D, a single chemistry approach was used leading to PEGylation at introduced polymer attachment sites of non-natural cysteine residues (cysteines at positions 37 and 77 in FIG. 19B, positions 37 and 125 in FIG. 19C, and positions 91 and 125 in FIG. .19D). Finally, in FIG. 19D and 19E, a single bis-maleimide PEG molecule was used to join two FGF21 mutants at unnatural cysteine residues (cysteine at position 37 in FIG. 21E and position 77 in FIG. 19F).

Фиг. 20 включает две гистограммы, изображающие средний показатель почечных вакуолей, наблюдаемых в процессе восьминедельного исследования почечных вакуолей для двух доз, 5 и 25 мг/кг, шести однократно или дважды ПЭГилированных FGF21 мутантов. Показатель 0 указывает, что образования новых вакуолей, помимо тех, что были найдены в контрольных животных, не наблюдалось, тогда как показатель 4 указывает на интенсивное образование вакуолей относительно контроля. FGF21 мутанты были теми самыми, что описаны на фиг. 19А-19Е. Таким образом, для одного конструкта был использован подход смешанных химических способов, ведущий к N-концевому ПЭГилированию FGF21 мутанта, также как и ПЭГилированию на введенном сайте присоединения полимера, неприродного цистеина в положении 77. Для трех других конструктов был использован подход одного химического способа, ведущий к ПЭГилированию на введенных сайтах присоединения полимера, неприродных цистеиновых остатков (цистеины в положениях 37 и 77 в одном конструкте, положениях 37 и 125 во втором конструкте или положениях 91 и 125 в третьем конструкте). Наконец, была использована одна бис-малеинимидная ПЭГ молекула для соединения двух FGF21 мутантов на неприродных цистеиновых остатках (цистеин в положении 37 или положении 77). P171G мутация вводилась в каждый из шести конструктов.Fig. 20 includes two bar graphs depicting the mean renal vacuoles observed during an eight-week study of renal vacuoles for two doses, 5 and 25 mg/kg, of six singly or doubly PEGylated FGF21 mutants. A score of 0 indicates that the formation of new vacuoles other than those found in the control animals was not observed, while a score of 4 indicates an intense formation of vacuoles relative to the control. The FGF21 mutants were the same as those described in FIG. 19A-19E. Thus, for one construct, a mixed chemistry approach was used leading to N-terminal PEGylation of the FGF21 mutant, as well as PEGylation at the introduced polymer attachment site, of a non-natural cysteine at position 77. For the other three constructs, a single chemistry approach was used, leading to PEGylation at the introduced polymer attachment sites of unnatural cysteine residues (cysteines at positions 37 and 77 in one construct, positions 37 and 125 in a second construct, or positions 91 and 125 in a third construct). Finally, a single bis-maleimide PEG molecule was used to link two FGF21 mutants at unnatural cysteine residues (cysteine at position 37 or position 77). The P171G mutation was introduced into each of the six constructs.

Хотя настоящее изобретение описано в рамках разных вариантов, для специалистов в данной области понятна возможность и других вариаций и модификаций. Поэтому предполагается, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие эквивалентные вариации, которые, как заявлено, входят в объем данного изобретения. Кроме того, использованные здесь заголовки разделов предназначены лишь для организационных целей, и их не следует рассматривать как ограничивающие предмет описанного изобретения.Although the present invention has been described in terms of various embodiments, those skilled in the art will appreciate the possibility of other variations and modifications. Therefore, the appended claims are intended to cover all such equivalent variations as claimed to be within the scope of this invention. In addition, the section headings used herein are for organizational purposes only and should not be construed as limiting the subject matter of the invention described.

На все цитируемые в этой заявке работы сделаны четкие ссылки.All works cited in this application are clearly cited.

Варианты изобретения предусматривают следующие изобретения.Embodiments of the invention provide for the following inventions.

1. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 4, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой:1. An isolated nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide of SEQ ID NO: 4 having at least one amino acid substitution, which is:

(a) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 36, 72, 77, 126 and 175;

(b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179;(b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179;

(c) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122;(c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122;

(d) глициновый остаток в положении 170;(d) a glycine residue at position 170;

(e) глициновый остаток в положении 171; и комбинации (а)-(е).(e) a glycine residue at position 171; and combinations (a)-(e).

2. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.1.2. A vector comprising a nucleic acid molecule according to claim 1.

3. Клетка-хозяин, включающая вектор согласно п.2.3. A host cell comprising the vector according to claim 2.

4. Клетка-хозяин по п.3, отличающаяся тем, что является эукариотной клеткой.4. A host cell according to claim 3, characterized in that it is a eukaryotic cell.

5. Клетка-хозяин по п.3, отличающаяся тем, что является прокариотной клеткой.5. The host cell according to claim 3, characterized in that it is a prokaryotic cell.

6. Способ получения полипептида, кодированного вектором согласно п.2, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор согласно п.2, при приемлемых условиях, для экспрессии данного полипептида, и выделение, при необходимости, данного полипептида.6. A method for producing a polypeptide encoded by the vector according to claim 2, comprising culturing a host cell containing the vector according to claim 2, under acceptable conditions, to express this polypeptide, and isolating, if necessary, this polypeptide.

7. Полипептид, полученный способом по п.6.7. The polypeptide obtained by the method according to claim 6.

8. Полипептид по п.7, отличающийся тем, что дополнительно включает пролиновый или глициновый остаток, добавленный к С-концу данного полипептида.8. The polypeptide according to claim 7, characterized in that it additionally includes a proline or glycine residue added to the C-terminus of this polypeptide.

9. Изолированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой:9. An isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 having at least one amino acid substitution, which is:

(а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 36, 72, 77, 126 and 175;

- 38 041758 (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112,- 38 041758 (b) a cysteine residue at one or more positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112,

113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179;113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179;

(c) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122;(c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122;

(d) глициновый остаток в положении 170;(d) a glycine residue at position 170;

(e) глициновый остаток в положении 171; и комбинации (а)-(е).(e) a glycine residue at position 171; and combinations (a)-(e).

10. Полипептид по п.9, отличающийся тем, что дополнительно включает пролиновый или глициновый остаток, добавленный к С-концу данного полипептида.10. A polypeptide according to claim 9, characterized in that it additionally includes a proline or glycine residue added to the C-terminus of this polypeptide.

11. Изолированный полипептид по п.9, отличающийся тем, что ковалентно связан с одним или несколькими полимерами.11. An isolated polypeptide according to claim 9, characterized in that it is covalently linked to one or more polymers.

12. Изолированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что ковалентно связан с одним полимером.12. An isolated polypeptide according to claim 11, characterized in that it is covalently linked to one polymer.

13. Изолированный полипептид по п.12, отличающийся тем, что данный полимер является водорастворимым.13. An isolated polypeptide according to claim 12, characterized in that the polymer is water soluble.

14. Изолированный полипептид по п.13, отличающийся тем, что данный водорастворимый полимер является полиэтиленгликолем (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликолем, гликолем, декстраном, целлюлозой, поли(№винилпирролидон)полиэтиленгликолем, пропиленгликолевыми гомополимерами, сополимерами пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированными полиолами или поливиниловым спиртом.14. An isolated polypeptide according to claim 13, characterized in that this water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG), monomethoxy-polyethylene glycol, glycol, dextran, cellulose, poly(N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols or polyvinyl alcohol.

15. Изолированный полипептид по п.14, отличающийся тем, что данный водорастворимый полимер является ПЭГ.15. An isolated polypeptide according to claim 14, characterized in that the water-soluble polymer is PEG.

16. Изолированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что данный полимер является разветвленным полимером.16. An isolated polypeptide according to claim 11, characterized in that the polymer is a branched polymer.

17. Изолированный полипептид по п.9, отличающийся тем, что имеет ПЭГ составляющую, ковалентно связанную с его аминоконцом.17. An isolated polypeptide according to claim 9, characterized in that it has a PEG moiety covalently linked to its amino terminus.

18. Изолированный полипептид по п.9, отличающийся тем, что ковалентно связан с двумя полимерами.18. An isolated polypeptide according to claim 9, characterized in that it is covalently linked to two polymers.

19. Изолированный полипептид по п.18, отличающийся тем, что один или два полимера являются водорастворимыми полимерами.19. An isolated polypeptide according to claim 18, wherein one or two of the polymers are water-soluble polymers.

20. Изолированный полипептид по п.19, отличающийся тем, что водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(№винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт.20. An isolated polypeptide according to claim 19, wherein the water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG), monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylene polyols, or polyvinyl alcohol.

21. Изолированный полипептид по п.20, отличающийся тем, что данный водорастворимый полимер является ПЭГ.21. An isolated polypeptide according to claim 20, wherein the water-soluble polymer is PEG.

22. Изолированный полипептид по п.18, отличающийся тем, что один из полимеров является разветвленным.22. An isolated polypeptide according to claim 18, characterized in that one of the polymers is branched.

23. Изолированный полипептид по п.18, отличающийся тем, что оба полимера являются разветвленными.23. An isolated polypeptide according to claim 18, characterized in that both polymers are branched.

24. Изолированный полипептид по п.9, отличающийся тем, что имеет ПЭГ составляющую, ковалентно связанную с его аминоконцом.24. An isolated polypeptide according to claim 9, characterized in that it has a PEG moiety covalently linked to its amino terminus.

25. Фармацевтическая композиция, включающая изолированный полипептид согласно п.9 и фармацевтически приемлемый агент.25. A pharmaceutical composition comprising the isolated polypeptide according to claim 9 and a pharmaceutically acceptable agent.

26. Фармацевтическая композиция по п.25, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый агент является носителем, адъювантом, солюбилизатором, стабилизатором или антиоксидантом.26. A pharmaceutical composition according to claim 25, characterized in that the pharmaceutically acceptable agent is a carrier, adjuvant, solubilizer, stabilizer or antioxidant.

27. Способ лечения метаболического расстройства, включающий назначение пациенту-человеку, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции по п.26.27. A method of treating a metabolic disorder, comprising administering to a human patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 26.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что метаболическое расстройство представляет собой диабет.28. The method of claim 27 wherein the metabolic disorder is diabetes.

29. Способ по п.27, отличающийся тем, что метаболическое расстройство представляет собой ожирение.29. The method of claim 27, wherein the metabolic disorder is obesity.

30. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющая по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой:30. An isolated nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, having at least one amino acid substitution, which is:

(а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 36, 72, 77, 126 and 175;

(b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179;(b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179;

(c) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122;(c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122;

(d) глициновый остаток в положении 170;(d) a glycine residue at position 170;

(e) глициновый остаток в положении 171; и комбинации (а)-(е);(e) a glycine residue at position 171; and combinations (a)-(e);

и которая включает добавки, делеции или дополнительные субституции, которые делают данныйand which includes additions, deletions or additional substitutions that make this

- 39 041758 полипептид по меньшей мере на 85% идентичным SEQ ID NO: 4, при условии, что по меньшей мере одна аминокислотная субституция п.1(а)-(е) не является дополнительно модифицированной.- 39 041758 polypeptide at least 85% identical to SEQ ID NO: 4, provided that at least one amino acid substitution of paragraph 1(a)-(e) is not further modified.

31. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.30.31. A vector comprising a nucleic acid molecule according to claim 30.

32. Клетка-хозяин, включающая вектор по п.31.32. A host cell comprising the vector of claim 31.

33. Клетка-хозяин согласно п.32, отличающаяся тем, что является эукариотной клеткой.33. A host cell according to claim 32, characterized in that it is a eukaryotic cell.

34. Клетка-хозяин по п.32, отличающаяся тем, что является прокариотной клеткой.34. A host cell according to claim 32, characterized in that it is a prokaryotic cell.

35. Способ получения полипептида, кодированного вектором по п.30, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор по п.30, при приемлемых условиях, для экспрессии данного полипептида, и выделение, при необходимости, данного полипептида.35. A method for producing a polypeptide encoded by the vector of claim 30, comprising culturing a host cell containing the vector of claim 30 under suitable conditions to express the polypeptide, and isolating the polypeptide if necessary.

36. Полипептид, полученный способом по п.35.36. A polypeptide obtained by the method of claim 35.

37. Полипептид по п.36, отличающийся тем, что дополнительно включает пролиновый или глициновый остаток, добавленный к С-концу данного полипептида.37. The polypeptide of claim 36, further comprising a proline or glycine residue added to the C-terminus of the polypeptide.

38. Изолированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой:38. An isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 having at least one amino acid substitution, which is:

(а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 36, 72, 77, 126 and 175;

(b) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179;(b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179;

(c) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122;(c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122;

(d) глициновый остаток в положении 170;(d) a glycine residue at position 170;

(e) глициновый остаток в положении 171; и комбинации (а)-(е);(e) a glycine residue at position 171; and combinations (a)-(e);

и включающий добавки, делеции или дополнительные субституции, которые делают данный полипептид по меньшей мере на 85% идентичным SEQ ID NO: 4, при условии, что по меньшей мере одна аминокислотная субституция п.1(а)-(е) не является дополнительно модифицированной.and comprising additions, deletions, or additional substitutions that make the polypeptide at least 85% identical to SEQ ID NO: 4, provided that at least one amino acid substitution of paragraph 1(a)-(e) is not further modified .

39. Полипептид по п.38, отличающийся тем, что дополнительно включает пролиновый или глициновый остаток, добавленный к С-концу данного полипептида.39. The polypeptide of claim 38, further comprising a proline or glycine residue added to the C-terminus of the polypeptide.

40. Изолированный полипептид по п.38, отличающийся тем, что ковалентно связан с одним полимером.40. An isolated polypeptide according to claim 38, characterized in that it is covalently linked to one polymer.

41. Изолированный полипептид по п.40, отличающийся тем, что данный полимер является водорастворимым полимером.41. An isolated polypeptide according to claim 40, characterized in that the polymer is a water-soluble polymer.

42. Изолированный полипептид по п.41, отличающийся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт.42. An isolated polypeptide according to claim 41, characterized in that this water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG), monomethoxy-polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols or polyvinyl alcohol.

43. Изолированный полипептид по п.42, отличающийся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой ПЭГ.43. An isolated polypeptide according to claim 42, characterized in that the water-soluble polymer is PEG.

44. Изолированный полипептид по п.40, отличающийся тем, что данный полимер является разветвленным.44. An isolated polypeptide according to claim 40, characterized in that the polymer is branched.

45. Изолированный полипептид по п.38, отличающийся тем, что имеет одну ПЭГ составляющую, ковалентно связанную с его аминоконцом.45. An isolated polypeptide according to claim 38, characterized in that it has one PEG moiety covalently linked to its amino terminus.

46. Изолированный полипептид по п.38, отличающийся тем, что ковалентно связан с двумя полимерами.46. An isolated polypeptide according to claim 38, characterized in that it is covalently linked to two polymers.

47. Изолированный полипептид по п.46, отличающийся тем, что один или два данных полимера представляют собой водорастворимый полимер.47. An isolated polypeptide according to claim 46, wherein one or two of these polymers are a water-soluble polymer.

48. Изолированный полипептид по п.47, отличающийся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт.48. An isolated polypeptide according to claim 47, characterized in that this water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG), monomethoxy-polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols or polyvinyl alcohol.

49. Изолированный полипептид по п.48, отличающийся тем, что данный водорастворимый полимер является ПЭГ.49. An isolated polypeptide according to claim 48, characterized in that the water-soluble polymer is PEG.

50. Изолированный полипептид по п.46, отличающийся тем, что оба данных полимера являются водорастворимыми полимерами.50. An isolated polypeptide according to claim 46, wherein both of these polymers are water-soluble polymers.

51. Изолированный полипептид по п.50, отличающийся тем, что данные водорастворимые полимеры представляют собой, независимо, полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт и их комбинации.51. An isolated polypeptide according to claim 50, characterized in that these water-soluble polymers are, independently, polyethylene glycol (PEG), monomethoxy-polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene copolymers oxide, polyoxyethylene polyols, or polyvinyl alcohol; and combinations thereof.

52. Изолированный полипептид по п.46, отличающийся тем, что оба водорастворимых полимера представляют собой ПЭГ.52. An isolated polypeptide according to claim 46, wherein both water-soluble polymers are PEG.

53. Изолированный полипептид по п.46, отличающийся тем, что в нем один из данных полимеров является разветвленным.53. An isolated polypeptide according to claim 46, characterized in that one of these polymers is branched.

54. Изолированный полипептид по п.46, отличающийся тем, что в нем оба данных полимера явля-54. An isolated polypeptide according to claim 46, characterized in that in it both of these polymers are

- 40 041758 ются разветвленными.- 40 041758 are branched.

55. Фармацевтическая композиция, включающая изолированный полипептид по п.38 и фармацевтически приемлемый агент.55. A pharmaceutical composition comprising the isolated polypeptide of claim 38 and a pharmaceutically acceptable agent.

56. Фармацевтическая композиция по п.55, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый агент является носителем, адъювантом, солюбилизатором, стабилизатором или антиоксидантом.56. The pharmaceutical composition according to claim 55, characterized in that the pharmaceutically acceptable agent is a carrier, adjuvant, solubilizer, stabilizer or antioxidant.

57. Способ лечения метаболического расстройства, включающий назначение пациенту-человеку, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции по п.56.57. A method of treating a metabolic disorder, comprising administering to a human patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 56.

58. Способ по п.57, отличающийся тем, что в нем метаболическое расстройство представляет собой диабет.58. The method of claim 57 wherein the metabolic disorder is diabetes.

59. Способ по п.57, отличающийся тем, что в нем метаболическое расстройство представляет собой ожирение.59. The method of claim 57, wherein the metabolic disorder is obesity.

60. Композиция, включающая первый полипептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, имеющую при необходимости по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, которая представляет собой:60. A composition comprising a first polypeptide that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, optionally having at least one amino acid substitution, which is:

(а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 36, 72, 77, 126 and 175;

(б) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179;(b) a cysteine residue at one or more positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179;

(в) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122;(c) an arginine residue at one or more of positions 56, 59, 69 and 122;

(г) глициновый остаток в положении 170;(d) a glycine residue at position 170;

(д) глициновый остаток в положении 171;(e) a glycine residue at position 171;

и комбинации (а)-(д), соединенный линкером со вторым полипептидом, включающим полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, которая имеет при необходимости по меньшей мере одну аминокислотную субституцию, представляющую собой:and combinations (a)-(e) connected by a linker to a second polypeptide comprising a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which, if necessary, has at least one amino acid substitution, which is:

(а) лизиновый остаток в одном или нескольких положениях 36, 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 36, 72, 77, 126 and 175;

(б) цистеиновый остаток в одном или нескольких положениях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 и 179;(b) a cysteine residue at one or more positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 and 179;

(в) аргининовый остаток в одном или нескольких положениях 56, 59, 69 и 122;(c) an arginine residue at one or more positions 56, 59, 69 and 122;

(г) глициновый остаток в положении 170;(d) a glycine residue at position 170;

(д) глициновый остаток в положении 171; и комбинации (а)-(д).(e) a glycine residue at position 171; and combinations (a)-(e).

61. Полипептид по п.60, отличающийся тем, что первый, второй или оба полипептида дополнительно включают пролиновый или глициновый остаток, присоединенный к С-концу данного полипептида.61. The polypeptide of claim 60, wherein the first, second, or both polypeptides further comprise a proline or glycine residue attached to the C-terminus of the polypeptide.

62. Композиция по п.60, отличающаяся тем, что данный линкер представляет собой пептид.62. The composition of claim 60, wherein the linker is a peptide.

63. Композиция по п.60, отличающаяся тем, что данный линкер является водонерастворимым полимером.63. The composition according to claim 60, characterized in that the linker is a water insoluble polymer.

64. Композиция по п.63, отличающаяся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(Nвинилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт.64. The composition according to claim 63, characterized in that the water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG), monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(Nvinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylene polyols or polyvinyl alcohol.

65. Композиция по п.64, отличающаяся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой ПЭГ.65. The composition according to claim 64, characterized in that the water-soluble polymer is PEG.

66. Композиция по п.60, отличающаяся тем, что первый, второй или оба полипептида дополнительно ковалентно связаны с одним полимером, кроме линкера.66. The composition according to claim 60, characterized in that the first, second or both polypeptides are additionally covalently linked to one polymer other than the linker.

67. Композиция по п.66, отличающаяся тем, что данный полимер является водорастворимым полимером.67. The composition according to claim 66, characterized in that the polymer is a water-soluble polymer.

68. Композиция по п.67, отличающаяся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(Nвинилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт.68. The composition according to claim 67, characterized in that the water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG), monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(Nvinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols or polyvinyl alcohol.

69. Композиция по п.68, отличающаяся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой ПЭГ.69. The composition according to claim 68, characterized in that the water-soluble polymer is PEG.

70. Композиция по п.63, отличающаяся тем, что данный полимер является разветвленным.70. The composition according to claim 63, characterized in that the polymer is branched.

71. Композиция по п.60, отличающаяся тем, что имеет одну ПЭГ составляющую, ковалентно связанную с аминоконцом.71. The composition according to claim 60, characterized in that it has one PEG moiety covalently linked to the amino terminus.

72. Композиция по п.60, отличающаяся тем, что ковалентно связана с двумя полимерами.72. The composition according to claim 60, characterized in that it is covalently linked to two polymers.

73. Композиция по п.72, отличающаяся тем, что один или два данных полимера представляют собой водорастворимые полимеры.73. The composition according to claim 72, characterized in that one or two of these polymers are water-soluble polymers.

74. Композиция по п.73, отличающаяся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(Nвинилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт.74. The composition according to claim 73, characterized in that this water-soluble polymer is polyethylene glycol (PEG), monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(Nvinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylene polyols, or polyvinyl alcohol.

--

Claims (9)

75. Композиция по п.74, отличающаяся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой ПЭГ.75. The composition according to claim 74, characterized in that the water-soluble polymer is PEG. 76. Композиция по п.72, отличающаяся тем, что оба данных полимера являются водорастворимыми полимерами.76. The composition according to claim 72, characterized in that both of these polymers are water-soluble polymers. 77. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что водорастворимые полимеры представляют собой, независимо, полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, поли(Nвинилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры пропилен оксид/этилен оксида, полиоксиэтилированные полиолы или поливиниловый спирт и их комбинации.77. The composition according to claim 76, characterized in that the water-soluble polymers are, independently, polyethylene glycol (PEG), monomethoxy-polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly(Nvinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, propylene oxide/ethylene oxide copolymers, polyoxyethylene polyols or polyvinyl alcohol; and combinations thereof. 78. Композиция по п.77, отличающаяся тем, что в ней оба данных водорастворимых полимера представляют собой ПЭГ.78. The composition according to claim 77, characterized in that both of these water-soluble polymers are PEG. 79. Изолированный полипептид по п.72, отличающийся тем, что один из данных полимеров является разветвленным.79. An isolated polypeptide according to claim 72, characterized in that one of these polymers is branched. 80. Изолированный полипептид по п.72, отличающийся тем, что оба данных полимера являются разветвленными.80. An isolated polypeptide according to claim 72, characterized in that both of these polymers are branched. 81. Фармацевтическая композиция, включающая композицию по п.60 и фармацевтически приемлемый агент.81. A pharmaceutical composition comprising the composition of claim 60 and a pharmaceutically acceptable agent. 82. Фармацевтическая композиция по п.81, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый агент является носителем, адъювантом, солюбилизатором, стабилизатором или антиоксидантом.82. A pharmaceutical composition according to claim 81, wherein the pharmaceutically acceptable agent is a carrier, adjuvant, solubilizer, stabilizer, or antioxidant. 83. Способ лечения метаболического расстройства, включающий назначение пациенту-человеку, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции по п.81.83. A method for treating a metabolic disorder, comprising administering to a human patient in need thereof a pharmaceutical composition according to claim 81. 84. Способ по п.83, отличающийся тем, что метаболическое расстройство представляет собой диабет.84. The method of claim 83 wherein the metabolic disorder is diabetes. 85. Способ по п.83, отличающийся тем, что метаболическое расстройство представляет собой ожирение.85. The method of claim 83, wherein the metabolic disorder is obesity. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую мутантный полипептид FGF21, имеющий последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную SEQ ID NO: 4, имеющий замену на глициновый остаток в положении 171 и одну или несколько следующих аминокислотных замен:1. An isolated nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding a mutant FGF21 polypeptide having a sequence at least 85% identical to SEQ ID NO: 4, having a substitution for a glycine residue at position 171 and one or more of the following amino acid substitutions: (a) лизиновый остаток в одном или нескольких из положений 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 72, 77, 126 and 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких из положений 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 или 179;(b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, or 179; (c) аргининовый остаток в одном или нескольких из положений 56, 59, 69 и 122 или (d) комбинация (а)-(с).(c) an arginine residue at one or more of positions 56, 59, 69 and 122 or (d) a combination of (a)-(c). 2. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.2. A vector comprising a nucleic acid molecule according to claim 1. 3. Клетка-хозяин, включающая вектор по п.2.3. A host cell comprising the vector of claim 2. 4. Клетка-хозяин по п.3, являющаяся эукариотической клеткой.4. The host cell according to claim 3, which is a eukaryotic cell. 5. Способ получения полипептида, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты по п.1, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор по п.2, в условиях, обеспечивающих экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты, и выделение полипептида.5. A method for obtaining a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule according to claim 1, including culturing a host cell containing a vector according to claim 2, under conditions that ensure the expression of said nucleic acid molecule, and isolating the polypeptide. 6. Изолированный мутантный полипептид FGF21, имеющий последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную SEQ ID NO: 4, и содержащий замену на глициновый остаток в положении 171 и одну или несколько следующих аминокислотных замен:6. An isolated mutant FGF21 polypeptide having a sequence at least 85% identical to SEQ ID NO: 4 and containing a substitution for a glycine residue at position 171 and one or more of the following amino acid substitutions: (a) лизиновый остаток в одном или нескольких из положений 72, 77, 126 и 175;(a) a lysine residue at one or more of positions 72, 77, 126 and 175; (b) цистеиновый остаток в одном или нескольких из положений 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170 или 179;(b) a cysteine residue at one or more of positions 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, or 179; (c) аргининовый остаток в одном или нескольких из положений 56, 59, 69 и 122 или (d) комбинация (а)-(с).(c) an arginine residue at one or more of positions 56, 59, 69 and 122 or (d) a combination of (a)-(c). 7. Фармацевтическая композиция для лечения метаболического расстройства, выбранного из диабета, ожирения, дислипидемии, гипертензии, гепатостеатоза, сердечнососудистого заболевания, и метаболического расстройства или состояния, связанного со старением, включающая изолированный полипептид по п.6 и фармацевтически приемлемый агент.7. A pharmaceutical composition for the treatment of a metabolic disorder selected from diabetes, obesity, dyslipidemia, hypertension, hepatosteatosis, cardiovascular disease, and a metabolic disorder or condition associated with aging, comprising the isolated polypeptide of claim 6 and a pharmaceutically acceptable agent. 8. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый композиционный агент является носителем, адъювантом, солюбилизатором, стабилизатором или антиоксидантом.8. Pharmaceutical composition according to claim 7, characterized in that the pharmaceutically acceptable compositional agent is a carrier, adjuvant, solubilizer, stabilizer or antioxidant. 9. Фармацевтическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что гепатостеатоз представляет собой неалкогольный стеатогепатит или сердечно-сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз.9. Pharmaceutical composition according to claim 7, characterized in that the hepatosteatosis is non-alcoholic steatohepatitis or the cardiovascular disease is atherosclerosis. --