EA041624B1 - PRAME-SPECIFIC T-CELL RECEPTOR AND ITS APPLICATIONS - Google Patents
PRAME-SPECIFIC T-CELL RECEPTOR AND ITS APPLICATIONS Download PDFInfo
- Publication number
- EA041624B1 EA041624B1 EA201892452 EA041624B1 EA 041624 B1 EA041624 B1 EA 041624B1 EA 201892452 EA201892452 EA 201892452 EA 041624 B1 EA041624 B1 EA 041624B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- tcr
- cells
- seq
- prame
- amino acid
- Prior art date
Links
Description
Уровень техникиState of the art
Т-лимфоциты (или Т-клетки), которые образуют часть клеточно-опосредованной иммунной системы, играют основную роль в уничтожении патогенов. Т-клетки развиваются в тимусе и экспрессируют молекулы Т-клеточных рецепторов на своей поверхности, которые способствуют распознаванию пептидов, презентируемых на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС), которые экспрессируются на ядросодержащих клетках (презентация антигена). Антигены патогенов, т.е. чужеродные антигены, презентируемые молекулами МНС, будут вызывать выраженный Т-клеточный ответ, в то время как аутоантигены обычно не вызывают Т-клеточный ответ благодаря негативному отбору Т-клеток, специфичных к аутоантигенам, в тимусе во время развития таких Т-клеток. Таким образом, иммунная система может различать ядросодержащие клетки, презентирующие чужеродные антигены и аутоантигены, и специфично нацеливаться на инфицированные клетки и уничтожать их за счет активного высвобождения цитокинов и за счет механизмов клеточной цитотоксичности Т-клеток.T lymphocytes (or T cells), which form part of the cell-mediated immune system, play a major role in the destruction of pathogens. T cells develop in the thymus and express T-cell receptor molecules on their surface that facilitate recognition of peptides presented on major histocompatibility complex (MHC) molecules that are expressed on nucleated cells (antigen presentation). Pathogen antigens, i.e. foreign antigens presented by MHC molecules will elicit a pronounced T cell response, while self antigens usually do not elicit a T cell response due to negative selection of self antigen specific T cells in the thymus during the development of such T cells. Thus, the immune system can distinguish between nucleated cells presenting foreign antigens and self antigens, and specifically target and destroy infected cells through the active release of cytokines and through T cell cellular cytotoxicity mechanisms.
Потенциал иммунной системы был признан в качестве перспективного средства для терапии рака в будущем. В последнее десятилетие были начаты исследования относительно использования уникальных свойств Т-клеток с помощью адаптивного переноса клеток (ACT), который включает введение полученных от доноров лимфоцитов, экспансированных ex vivo. ACT представляет собой перспективную концепцию лечения рака, поскольку для нее не требуется иммунокомпетентность у пациентов, а специфичность переносимых лимфоцитов может быть направлена против немутировавших и таким образом недостаточно иммуногенных опухолевых антигенов, которые обычно неспособны эффективно запускать аутологичные Т-клеточные ответы. Несмотря на то что ACT зарекомендовала себя в качестве перспективного лечения различных типов рака, ее широкое применение в качестве клинического лечения было приостановлено необходимостью индивидуального выделения и определения характеристик опухолеспецифических Т-клеток у каждого пациента - процесс, который может быть не только сложным и требующим много времени, но который также зачастую не приводит к получению высокоавидных Т-клеток (Xue et al. Clin Exp Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum Gene Ther. 2009 Nov; 20(11): 1240-1248).The potential of the immune system has been recognized as a promising tool for cancer therapy in the future. In the last decade, research has begun on exploiting the unique properties of T cells using adaptive cell transfer (ACT), which involves the introduction of donor-derived lymphocytes expanded ex vivo. ACT is a promising cancer treatment concept because it does not require immunocompetence in patients, and the specificity of the transferred lymphocytes can be directed against non-mutated and thus insufficiently immunogenic tumor antigens, which are usually unable to effectively trigger autologous T-cell responses. Although ACT has proven to be a promising treatment for various types of cancer, its widespread use as a clinical treatment has been halted by the need to individually isolate and characterize tumor-specific T cells from each patient, a process that can be not only complex and time-consuming , but which also often does not produce highly avid T cells (Xue et al. Clin Exp Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum Gene Ther. 2009 Nov; 20(11) : 1240-1248).
Генетический перенос опухолевых антигенспецифических Т-клеточных рецепторов (TCR) в первичные Т-клетки может преодолевать имеющиеся в настоящее время ограничения в ACT, поскольку он обеспечивает возможность быстрого получения опухолереактивных Т-клеток с определенной специфичностью к антигену даже у пациентов с ослабленным иммунитетом. Однако идентификация подходящих клонов Т-клеток, несущих TCR, которые специфично распознают опухолевые антигены и проявляют необходимые противоопухолевые эффекты in vivo, по-прежнему является задачей текущих исследований. Учитывая, что в 2012 г. в мире возникло приблизительно 14,1 млн новых случаев рака и что рак в настоящее время является причиной приблизительно 14,6% всех смертей людей в мире, незамедлительно требуются новые и эффективные варианты лечения. Целью настоящего изобретения является удовлетворение требований, изложенных выше.Genetic transfer of tumor antigen-specific T cell receptors (TCRs) into primary T cells may overcome the current limitations in ACT, as it allows the rapid generation of tumor-reactive T cells with defined antigen specificity, even in immunocompromised patients. However, the identification of suitable TCR-bearing T cell clones that specifically recognize tumor antigens and exhibit desirable antitumor effects in vivo remains an ongoing research challenge. With approximately 14.1 million new cancer cases worldwide in 2012, and with cancer currently responsible for approximately 14.6% of all human deaths worldwide, new and effective treatment options are urgently required. The purpose of the present invention is to satisfy the requirements set forth above.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
В настоящем изобретении предусмотрены антигенспецифические Т-клеточные рецепторы, а также нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева, содержащие их; и различные варианты их использования и применения.The present invention provides antigen-specific T-cell receptors, as well as nucleic acids, vectors, host cells containing them; and various options for their use and application.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к PRAME-специфическому Т-клеточному рецептору (TCR), содержащему: (i) вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и (ii) вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее, при этом указанный TCR способен связываться с PRAME-специфическим эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) или ее МНС-связанной форме.In a first aspect, the present invention relates to a PRAME-specific T cell receptor (TCR) comprising: (i) a TCR alpha chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and (ii) ) a beta chain variable region of a TCR comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, wherein said TCR is capable of binding to a PRAME-specific epitope contained in the amino acid sequence of VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32), or its MHC-bound form.
В частности, PRAME-специфический TCR, предусмотренный в данном документе, может содержать: (i) альфа-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, или состоящую из нее, и (ii) бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее.In particular, a PRAME-specific TCR provided herein may comprise: (i) a TCR alpha chain comprising an amino acid sequence that is at least 80% identical to SEQ ID NO: 7, 9, 11, or 13, or consisting of from it, and (ii) a TCR beta chain containing an amino acid sequence that is at least 80% identical to SEQ ID NO: 8, 10, 12 or 14, or consisting of it.
PRAME-специфический TCR по настоящему изобретению может представлять собой TCRконструкцию. В данном документе предусмотрены гетеродимеры и мультимеры, содержащие альфа- и бета-цепи TCR, ковалентно связанные друг с другом, а также TCR-конструкции, содержащие один или более слитых компонентов. Применимая TCR-конструкция содержит, например, альфа-цепь TCR, бетацепь TCR (обе ковалентно связанные друг с другом) и антитело или фрагмент антитела, такой как svFv, которые направлены против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов (например, CD3, CD28, CD5, CD16 или CD56) и слит с цепями TCR посредством линкера.The PRAME-specific TCR of the present invention may be a TCR construct. Provided herein are heterodimers and multimers containing TCR alpha and beta chains covalently linked to each other, as well as TCR constructs containing one or more fusion components. A useful TCR construct contains, for example, a TCR alpha chain, a TCR beta chain (both covalently linked to each other), and an antibody or antibody fragment, such as svFv, that is directed against an antigen or epitope on the surface of lymphocytes (e.g., CD3, CD28, CD5 , CD16 or CD56) and fused to the TCR chains via a linker.
Другие применимые фрагменты, которые могут быть ковалентно связаны с TCR по настоящему изобретению, содержат различные метки. PRAME-специфический TCR по настоящему изобретению также может быть представлен в растворимой форме.Other applicable fragments that can be covalently linked to the TCR of the present invention contain various labels. The PRAME-specific TCR of the present invention may also be provided in a soluble form.
- 1 041624- 1 041624
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена нуклеиновая кислота, кодирующая PRAMEспецифический TCR, представленный в данном документе, при этом указанная нуклеиновая кислота, например, содержит последовательность нуклеиновой кислоты из любой из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26,Furthermore, the present invention provides a nucleic acid encoding the PRAME-specific TCR provided herein, said nucleic acid, for example, comprising a nucleic acid sequence from any of SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29 или 30 или состоит из нее.27, 28, 29 or 30 or consists of it.
Кроме того, в данном документе предусмотрен вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением. Иллюстративные векторы включают вирусные векторы, например, лентивирусные или гамма-ретровирусные векторы.In addition, this document provides an expression vector containing a nucleic acid in accordance with the present invention. Illustrative vectors include viral vectors, such as lentiviral or gamma retroviral vectors.
В данном документе также предусмотрена клетка-хозяин, содержащая PRAME-специфический TCR, нуклеиновую кислоту или вектор по настоящему изобретению. Применимая клетка-хозяин включает лимфоциты, такие как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/дельта-Т-клетки.This document also provides a host cell containing a PRAME-specific TCR, nucleic acid or vector of the present invention. Useful host cell includes lymphocytes such as cytotoxic T lymphocytes (CTL), CD8+ T cells, CD4+ T cells, natural killer (NK) cells, natural killer (NKT) T cells, gamma/delta T cells .
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ получения PRAME-специфического TCR по настоящему изобретению.In addition, the present invention provides a method for obtaining a PRAME-specific TCR of the present invention.
Также в данном документе предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая PRAMEспецифический TCR и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества) по настоящему изобретению. Также в данном документе предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества) по настоящему изобретению. Также в данном документе предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяина и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества) по настоящему изобретению. Также в данном документе предусмотрена диагностическая композиция, содержащая PRAME-специфический TCR и одно или более диагностических средств. Также предусмотрено применение разработанных PRAME-специфического TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции в качестве лекарственного препарата или диагностического средства, и, в частности, для выявления, диагностики, прогнозирования, предупреждения и/или лечения PRAME-экспрессирующего рака. Применимый способ предупреждения или лечения PRAMEэкспрессирующего рака предусматривает следующие стадии: (а) обеспечения одного или более из PRAME-специфического TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции, раскрываемых в данном документе, и (b) введения одного или более из вышеупомянутого нуждающемуся в этом субъекту. Настоящее изобретение также охватывает следующее: (а) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит лимфоциты, (b) обеспечение одного или более из PRAME-специфического TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции, раскрываемых в данном документе, и (с) их введение в лимфоциты, полученные на стадии (а), за счет чего получают модифицированные лимфоциты, (d) введение модифицированных на стадии (с) лимфоцитов нуждающимся в этом субъекту или пациенту.Also provided herein is a pharmaceutical composition comprising a PRAME-specific TCR and a pharmaceutically acceptable excipient(s) of the present invention. Also provided herein is a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid and a pharmaceutically acceptable excipient(s) of the present invention. Also provided herein is a pharmaceutical composition comprising a host cell and a pharmaceutically acceptable excipient(s) of the present invention. Also provided herein is a diagnostic composition comprising a PRAME-specific TCR and one or more diagnostic agents. Also provided is the use of the developed PRAME-specific TCR, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition as a drug or diagnostic tool, and, in particular, for the detection, diagnosis, prognosis, prevention and/or treatment of PRAME-expressing cancer. A useful method for preventing or treating a PRAME-expressing cancer comprises the steps of: (a) providing one or more of the PRAME-specific TCR, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition disclosed herein, and (b) administering one or more of the above to a subject in need. The present invention also encompasses the following: (a) providing a sample from a subject, said sample containing lymphocytes, (b) providing one or more of a PRAME-specific TCR, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition disclosed in herein, and (c) introducing them into the lymphocytes obtained in step (a), thereby obtaining modified lymphocytes, (d) administering the modified lymphocytes in step (c) to a subject or patient in need thereof.
Настоящее изобретение также относится к способу выявления in vitro наличия PRAMEэкспрессирующего рака у субъекта in vitro, предусматривающему: (а) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток, (b) приведение указанного образца в контакт с PRAME-специфическим TCR, нуклеиновой кислотой, вектором или клеткой-хозяином, за счет образуется комплекс, и (с) выявление комплекса, где выявление комплекса свидетельствует о наличии PRAME-экспрессирующего рака у субъекта.The present invention also relates to a method for in vitro detection of the presence of a PRAME-expressing cancer in a subject in vitro, comprising: (a) providing a sample from the subject, said sample containing one or more cells, (b) bringing said sample into contact with a PRAME-specific TCR , nucleic acid, vector or host cell, by forming a complex, and (c) detection of the complex, where detection of the complex is indicative of the presence of a PRAME-expressing cancer in the subject.
Описание графических материаловDescription of graphic materials
На фиг. 1 изображен схематический обзор подхода на основе примирования с использованием зрелых дендритных клеток. PRAME-трансфицированные зрелые дендритные клетки использовали для de novo индукции PRAME-специфических CD8 Т-клеток в репертуаре аутологичного здорового донора.In FIG. 1 is a schematic overview of the priming approach using mature dendritic cells. PRAME-transfected mature dendritic cells were used to de novo induce PRAME-specific CD8 T cells in the autologous healthy donor repertoire.
На фиг. 2 изображен мультиплексный анализ секреции нитокинов (IFN-гамма, IL-2, TNF-альфа, IL5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4, IL-1-бета) клона PRAME100.108-специфических Т-клеток Т4.8-1-29, совместно культивируемых с нагруженными пептидом Т2-клетками (PRAME100_108 VLD-пептидом или PRAME300_ 309 ALY-пептидом в качестве отрицательного контроля, н.о. = не выявлено). Клон Т4.8-1-29 характеризуется наличием CDR3 в своем вариабельном участке альфа-цепи TCR, как показано в SEQ ID NO: 1, и/или наличием CDR3 в своем вариабельном участке бета-цепи TCR, как показано в SEQ ID NO: 2.In FIG. 2 shows a multiplex analysis of the secretion of nitokines (IFN-gamma, IL-2, TNF-alpha, IL5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4, IL-1-beta) of the PRAME 100 clone. 108 -specific T4.8-1-29 T cells co-cultured with peptide-loaded T2 cells (PRAME 100 _ 108 VLD peptide or PRAME 300 _ 309 ALY peptide as a negative control, n.d. = not detected ). Clone T4.8-1-29 is characterized by having CDR3 in its TCR alpha chain variable region as shown in SEQ ID NO: 1 and/or having CDR3 in its TCR beta chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2.
На фиг. 3 изображено высвобождение IFN-гамма из клона PRAME100.108-специфических Т-клеток Т4.8-1-29, совместно культивируемых с различными линиями опухолевых клеток человека, экспрессирующими HLA-A*02:01, где, как указано в подписи к фиг. 3, некоторые из линий опухолевых клеток экспрессируют PRAME (столбцы зеленого цвета). Линии опухолевых клеток, не экспрессирующих PRAME, служат в качестве отрицательного контроля (столбцы красного цвета). Положительный контроль: Т2-клетки, нагруженные VLD-пептидом (столбец черного цвета), фоновый уровень Т-клеток без стимуляции указан с помощью столбцов белого цвета (н.в. = не выявлено).In FIG. 3 shows the release of IFN-gamma from clone PRAME 100 . 108 T4.8-1-29 specific T cells co-cultured with various human tumor cell lines expressing HLA-A*02:01, where, as indicated in the caption to FIG. 3, some of the tumor cell lines express PRAME (green bars). Tumor cell lines not expressing PRAME serve as a negative control (red bars). Positive control: T2 cells loaded with VLD peptide (black bar), baseline T cells without stimulation indicated by white bars (n.h. = not detected).
На фиг. 4 изображено высвобождение IFN-гамма клоном PRAME100.108-специфических Т-клеток Т4.8-1-29, совместно культивируемых с клетками Т2-клетками, нагруженными титруемыми количествами PRAME100.108-пептида. Пунктирная линия указывает концентрацию пептида, которая приводит к полумаксимальной секреции IFN-гамма, составляющей 10-9-10-10 моль/л [М] в качестве показателя функциональной авидности исследуемого клона Т-клеток.In FIG. 4 shows the release of IFN-gamma by the PRAME 100 clone. 108 specific T4.8-1-29 T cells co-cultured with T2 cells loaded with titratable amounts of PRAME 100 . 108 -peptide. The dotted line indicates the peptide concentration that results in a half-maximal IFN-gamma secretion of 10-9-10 -10 mol/l [M] as an indication of the functional avidity of the T cell clone under study.
- 2 041624- 2 041624
Фиг. 5. Для доказательства образования пар и функциональности трансгенного TCR специфическое высвобождение IFN-гамма PRAME100.108-специфическими TCR Т4.8-1-29-трансфицированными реципиентными CD8+ Т-клетками (клон реципиентных Т-клеток + Т4.8-1-29 ivtPHK) при совместном культивировании с PRAME100_108 (VLD)-nеnтuд-нагруженнымu Т2-клетками или Т2-клетками, нагруженными нерелевантным пептидом, измеряли с помощью стандартного ELISA.Fig. 5. To prove pairing and functionality of the transgenic TCR, specific release of IFN-gamma PRAME 100 . 108 -specific TCR T4.8-1-29-transfected recipient CD8+ T-cells (clone of recipient T-cells + T4.8-1-29 ivtRNA) when co-cultivated with PRAME 100 _ 108 (VLD)-nentud-loaded T2 β-cells or T2-cells loaded with irrelevant peptide were measured using standard ELISA.
На фиг. 6 изображено специфическое высвобождение IFN-гамма из PRAME100.108-специфических CD8+ обогащенных РВМС, сконструированных в целях экспрессии PRAME100.108-специфического TCR T4.8-1-29 при совместном культивировании с аутопептид-нагруженными (в общей сложности 131 универсальный аутопептид, связывающийся с кодируемыми HLA-A*02:01 молекулами) Т2-клетками, измеренное с помощью стандартного ELISA.In FIG. 6 shows the specific release of IFN-gamma from PRAME 100 . 108 -specific CD8+ enriched PBMCs designed to express PRAME 100 . 108 -specific TCR T4.8-1-29 when co-cultured with autopeptide-loaded (total of 131 universal autopeptides binding to HLA-A*02:01 encoded molecules) T2 cells measured by standard ELISA.
На фиг. 7 изображен лизис Т2-клеток, нагруженных PRAME100.108-пептидом (VLD-пептидом) или нерелевантным пептидом SLLQHLIGL (SLL-пептидом) с помощью CD8+ обогащенных РВМС, сконструированных для экспрессии PRAME100.108-специфического TCR T4.8-1-29.In FIG. 7 shows the lysis of T2 cells loaded with PRAME 100 . 108 peptide (VLD peptide) or irrelevant SLLQHLIGL peptide (SLL peptide) with CD8+ enriched PBMCs engineered to express PRAME 100 . 108 -specific TCR T4.8-1-29.
На фиг. 8 изображен лизис PRAME100.108-экспрессирующих целевых клеток с помощью человеческих РВМС, экспрессирующих PRAME100.108-специфический TCR T4.8-1-29. (А) Лизис HLA-A*02:01трансфицированных эндогенно PRAME-положительных человеческих K562 опухолевых клеток, дополнительно нагруженных PRAME100.108-пептидом (VLD-пептидом). (В) HLA-A*02 отрицательные эндогенно PRAME-положительные человеческие K562-клетки, дополнительно трансфицированные ivtPHK, кодирующей PRAME, в качестве отрицательного контроля не лизируются. (С) Изображен лизис HLAА*02-трансфицированных эндогенно PRAME-положительных человеческих K562-клеток, дополнительно трансфицированных ivtPHK, кодирующей PRAME. (D) Изображен лизис НЕА-А*02трансфицированных эндогенно PRAME-положительных человеческих K562-клеток.In FIG. 8 shows the lysis of PRAME 100 . 108 expressing target cells with human PBMC expressing PRAME 100 . 108 - specific TCR T4.8-1-29. (A) Lysis of HLA-A*02:01 endogenously transfected PRAME-positive human K562 tumor cells additionally loaded with PRAME 100 . 108 -peptide (VLD-peptide). (B) HLA-A*02 negative endogenously PRAME positive human K562 cells additionally transfected with ivtRNA encoding PRAME are not lysed as a negative control. (C) Lysis of HLAA*02-transfected endogenously PRAME-positive human K562 cells further transfected with ivtRNA encoding PRAME is depicted. (D) Lysis of HEA-A*02 transfected endogenously PRAME-positive human K562 cells is depicted.
На фиг. 9 изображены аминокислотные последовательности из применяемого примера альфа- и бета-цепи Т-клеточного рецептора (SEQ ID NO: 11 и 12) и аминокислотная последовательность человеческого PRAME (SEQ ID NO. 33). В альфа- и бета-цепи последовательности CDR1 и CDR2 подчеркнуты, а последовательности CDR3 выделены серым цветом и жирным шрифтом, вариабельные участки - обычным шрифтом, константные участки - курсивом.In FIG. 9 shows the amino acid sequences from the T cell receptor alpha and beta chain example used (SEQ ID NOS: 11 and 12) and the amino acid sequence of human PRAME (SEQ ID NOS: 33). In the alpha and beta chains, the CDR1 and CDR2 sequences are underlined, the CDR3 sequences are in gray and bold, the variable regions are in normal font, and the constant regions are in italics.
На фиг. 10 изображено распознание различных HLA-A*02- и PRAME-положительных линий опухолевых клеток CD8+ обогащенными РВМС, экспрессирующими TCR T4.8-1-29HLA-A*02, о чем свидетельствует индуцированное активацией высвобождение IFN-гамма и которое измерено с помощью стандартного ELISA.In FIG. 10 depicts the recognition of various HLA-A*02- and PRAME-positive CD8+ tumor cell lines enriched in PBMCs expressing TCR T4.8-1-29HLA-A*02 as evidenced by activation-induced IFN-gamma release as measured by a standard ELISA.
На фиг. 11 изображены нетрансдуцированные РВМС здорового донора и те же РВМС здорового донора, трансдуцированные плазмидой, содержащей конструкцию ТСТ Т4.8-1-29, описанную в данном документе.In FIG. 11 shows untransduced healthy donor PBMCs and the same healthy donor PBMCs transduced with a plasmid containing the TCT construct T4.8-1-29 described herein.
На фиг. 12 изображена функциональная авидность Т-клеток по отношению к PRAME100_108 (VLD)пептиду, измеряемая с помощью выявления секреции IFN-гамма после совместного культивирования либо с клоном Т-клеток Т4.8-1-29 (пунктирная кривая), либо с эффекторными РВМС, трансдуцированными Т4.8-1-29 (сплошная кривая) с помощью пептид-нагруженных Т2-клеток.In FIG. 12 shows the functional avidity of T cells for PRAME 100 _ 108 (VLD) peptide as measured by detection of IFN-gamma secretion after co-cultivation with either T4.8-1-29 T cell clone (dashed curve) or effector PBMCs transduced with T4.8-1-29 (solid curve) using peptide-loaded T2 cells.
На фиг. 13 изображен анализ специфичности к антигену Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторных РВМС и нетрансдуцированных контрольных РВМС. Линии опухолевых клеток ОРМ-2 и U937 (HLA-А2-отрицательные и PRAME-отрицательные) исследовали либо немодифицированными, либо трансфицированными ivtPHK, кодирующей HLA-A2.In FIG. 13 shows the T4.8-1-29 antigen specificity analysis of transduced effector PBMCs and non-transduced control PBMCs. The tumor cell lines ORM-2 and U937 (HLA-A2 negative and PRAME negative) were examined either unmodified or transfected with ivtRNA encoding HLA-A2.
На фиг. 14 изображен анализ специфичности к антигену, Т4.8-1-29-трансдуцированные эффекторные РВМС и нетрансдуцированные контрольные РВМС совместно культивировали с различными линиями целевых клеток. Тестировали линии опухолевых клеток K562 (HLA-A2- отрицательные и PRAME-положительные), а также K562_A2 и Mel 624.38 (HLA-A-положительные и PRAMEположительные) и 647-V (HLA-А2-положительные и PRAME-отрицательные).In FIG. 14 depicts an antigen specificity assay, T4.8-1-29 transduced effector PBMCs and non-transduced control PBMCs were co-cultured with different target cell lines. Tumor cell lines K562 (HLA-A2-negative and PRAME-positive), as well as K562_A2 and Mel 624.38 (HLA-A-positive and PRAME-positive) and 647-V (HLA-A2-positive and PRAME-negative) were tested.
На фиг. 15 изображен анализ цитотоксической активности Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторов в отношении опухолевых клеток с помощью системы для анализа живых клеток IncuCyte ZOOM® (Essenbiosciences), системы на основе микроскопа, которая позволяет визуализацию живых клеток.In FIG. 15 shows an analysis of the cytotoxic activity of T4.8-1-29-transduced effectors on tumor cells using the IncuCyte ZOOM® live cell assay system (Essenbiosciences), a microscope-based system that allows visualization of live cells.
На фиг. 16 изображен анализ профиля безопасности Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС.In FIG. 16 depicts an analysis of the safety profile of T4.8-1-29-expressing PBMCs.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Авторы настоящего изобретения идентифицировали клоны Т-клеток, которые способны специфически распознавать клетки, экспрессирующие опухолеассоциированный антиген (ТАА) PRAME; и которые характеризуются преимущественными эффекторными функциями, такими как продуцирование цитокинов и цитолиз целевых клеток. Таким образом, указанные клоны Т-клеток и их Т-клеточные рецепторы являются перспективными средствами для высокоспецифичного и эффективного лечения рака. Таким образом, идентифицированные PRAME-специфические TCR являются подходящими для адаптивной Т-клеточной терапии рака. Таким образом, идентификация TCR, который способен связываться с PRAME высокоспецифичным образом, обеспечивает возможность вооружения Т-клеток ex vivo и повторное их введение донору, где они могут эффективно распознавать и специфически элиминировать PRAME-экспрессирующие раковые клетки. Кроме того, антигенсвязывающие участки нового TCR, пре- 3 041624 дусмотренные в данном документе, могут быть использованы для разработки растворимых конструкций, содержащих дополнительные функциональные фрагменты (такие как, лекарственные средства, метки или дополнительные связывающие домены, притягивающие другие иммунные клетки), которые легко доступны для прямого введения.The authors of the present invention identified clones of T cells that are able to specifically recognize cells expressing tumor associated antigen (TAA) PRAME; and which are characterized by advantageous effector functions such as cytokine production and target cell cytolysis. Thus, these T cell clones and their T cell receptors are promising agents for highly specific and effective cancer treatment. Thus, the identified PRAME-specific TCRs are suitable for adaptive T-cell therapy for cancer. Thus, the identification of a TCR that is able to bind to PRAME in a highly specific manner allows T cells to be armed ex vivo and reintroduced to a donor where they can efficiently recognize and specifically eliminate PRAME-expressing cancer cells. In addition, the novel TCR antigen-binding sites provided herein can be used to design soluble constructs containing additional functional moieties (such as drugs, labels, or additional binding domains that attract other immune cells) that are readily available for direct administration.
Вариабельный участок CDR3-домены.Variable region of the CDR3 domain.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к Т-клеточному рецептору (TCR), содержащему: (i) CDR3 альфа-цепи Т-клеточного рецептора, содержащий последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) или состоящий из нее, и/или (ii) CDR3 бета-цепи Т-клеточного рецептора, содержащий аминокислотную последовательность CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO. 2), или состоящий из нее.Thus, in a first aspect, the present invention provides a T cell receptor (TCR) comprising: (i) a T cell receptor alpha chain CDR3 comprising or consisting of the sequence CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1), and/or (ii) a T cell receptor beta chain CDR3 comprising or consisting of the amino acid sequence CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO. 2).
В данном документе дополнительно предусмотрены варианты последовательности TCR, содержащие альфа-цепь CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 1, или состоящую из нее, и/или бета-цепь CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 2, или состоящую из нее, при условии, что TCR сохраняет предпочтительные способности TCR, оцениваемые в прилагаемых примерах, т.е. способен связываться с антигенной мишенью, определенной в данном документе.This document further provides TCR sequence variants comprising a CDR3 alpha chain comprising an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 1, or consisting of it, and/or a CDR3 beta chain containing an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 2, or consisting of it, provided that the TCR retains the preferred TCR capabilities evaluated in the attached examples, i.e. capable of binding to an antigenic target as defined herein.
Термин Т-клеточный рецептор или TCR, используемый в данном документе, включает нативные TCR, а также варианты, фрагменты и конструкции TCR. Таким образом, данный термин включает гетеродимеры, содержащие альфа- и бета-цепи TCR, а также мультимеры и одноцепочечные конструкции, необязательно содержащие дополнительные домены и/или фрагменты.The term T cell receptor or TCR as used herein includes native TCRs as well as TCR variants, fragments and constructs. Thus, the term includes heterodimers containing TCR alpha and beta chains, as well as multimers and single chain constructs, optionally containing additional domains and/or fragments.
В своей нативной форме TCR существует в виде комплекса из нескольких белков на поверхности Тклеток. Т-клеточный рецептор состоит из двух (отдельных) белковых цепей, которые продуцируются в результате функционирования генов альфа- и бета-цепей Т-клеточного рецептора (TCRa и TCRe) и называются альфа-(а-) и бета-(в-)цепями. Каждая цепь TCR имеет один N-концевой иммуноглобулинподобный (^-вариабельный (V) домен/участок, один подобный Ig-подобный-константный (С) домен/участок, трансмембранный/клеточномембранный-перекрывающий участок, заякоривающий цепь в плазматической мембране, и короткий цитоплазматический хвост на С-конце.In its native form, TCR exists as a complex of several proteins on the surface of T cells. The T-cell receptor consists of two (separate) protein chains, which are produced as a result of the functioning of the T-cell receptor alpha and beta chain genes (TCRa and TCRe) and are called alpha (a-) and beta (b-) chains. . Each TCR chain has one N-terminal immunoglobulin-like (N-variable (V) domain/region, one Ig-like constant (C) domain/region, a transmembrane/cell membrane-spanning region anchoring the chain in the plasma membrane, and a short cytoplasmic tail at C-terminus.
Специфичность к антигену придается вариабельными участками альфа- и бета-цепи. Оба вариабельных домена альфа-цепи и бета-цепи TCR содержат три гипервариабельных или определяющих комплементарность участка (CDR1-альфа/бета, CD2-альфа/бета и CDR3-альфа/бета), окруженные каркасными (FR) участками. CDR3 представляет собой примированную детерминанту распознавания антигена и специфичности к нему (т.е. способность распознавать и взаимодействовать со специфическим антигеном), в то время как CDR1 и CDR2 главным образом взаимодействуют с молекулой МНС, презентирующей антигенный пептид.Specificity for an antigen is conferred by the variable regions of the alpha and beta chains. Both the TCR alpha chain and beta chain variable domains contain three hypervariable or complementarity determining regions (CDR1-alpha/beta, CD2-alpha/beta and CDR3-alpha/beta) surrounded by framework (FR) regions. CDR3 is a primed determinant of antigen recognition and specificity (ie, the ability to recognize and interact with a specific antigen), while CDR1 and CDR2 primarily interact with the MHC molecule presenting the antigenic peptide.
Нативные TCR распознают антигенные пептиды, связанные (презентированные/отображающиеся на) с молекулами (молекулами/молекулах) главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Антигенный пептид, презентированный на молекуле МНС, также обозначается в данном документе как пептид:комплекс МНС. Существует два различных класса молекул МНС: МНС I и МНС II, которые презентируют пептиды из различных клеточных компартментов. Молекулы МНС I класса экспрессируются на поверхности всех ядросодержащих клеток во всем организме человека и отображают пептидные или белковые фрагменты из внутриклеточных компартментов цитотоксическим Т-клеткам. У человека МНС также называется человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA). Существует три основных типа МНС I класса: HLA-A, HLA-B и HLA-C. При связывании TCR со своим специфическим пептидом комплексом МНС Т-клетка активируется и проявляет биологические эффекторные функции.Native TCRs recognize antigenic peptides associated with (presented/displayed on) molecules (molecules/molecules) of the major histocompatibility complex (MHC) on the surface of the antigen-presenting cell. An antigenic peptide presented on an MHC molecule is also referred to herein as a peptide:MHC complex. There are two distinct classes of MHC molecules, MHC I and MHC II, which present peptides from different cellular compartments. Class I MHC molecules are expressed on the surface of all nucleated cells throughout the human body and display peptide or protein fragments from intracellular compartments to cytotoxic T cells. In humans, MHC is also called human leukocyte antigen (HLA). There are three main types of MHC class I: HLA-A, HLA-B and HLA-C. When the TCR binds to its specific peptide, the MHC complex, the T cell is activated and exhibits biological effector functions.
TCR, предусмотренные в данном документе, предпочтительно способны (специфично) распознавать PRAME, в частности PRAME100_108, в своей МНС-связанной форме, как будет подробно рассмотрено ниже. Считается, что антигенный пептид присутствует в своей МНС-связанной форме, если он образует комплекс с молекулой МНС (которая может присутствовать на поверхности антигенпрезентирующей клетки, такой как дендритная клетка или опухолевая клетки, или он может быть иммобилизован, например, путем нанесения с осаждением на гранулу или планшет).The TCRs provided herein are preferably capable of (specifically) recognizing PRAME, in particular PRAME 100_108 , in its MHC-linked form, as will be discussed in detail below. An antigenic peptide is said to be present in its MHC-bound form if it forms a complex with an MHC molecule (which may be present on the surface of an antigen-presenting cell, such as a dendritic cell or tumor cell, or it may be immobilized, for example, by depositing onto granule or tablet).
CDR1- и CDR2-домены.CDR1 and CDR2 domains.
Как изложено ранее, TCR по настоящему изобретению особенно предусмотрены для распознавания их антигенной мишени PRAME100_108 при презентации на молекуле МНС, в частности молекуле MHC-I, и, в частности, HLA-A, предпочтительно HLA-A*02, и, в частности, молекулах HLA-A2, кодируемых аллелем HLA-A*02:01 (считается, что Т-клетка или TCR ограничены определенной молекулой МНС). Не исключена вероятность того, что TCR по настоящему изобретению распознают свою антигенную мишень, презентированную другими аллелями HLA-A*02. Как отмечено ранее, считается, что CDR1 иAs previously stated, the TCRs of the present invention are particularly designed to recognize their antigenic target PRAME 100_108 when presented on an MHC molecule, in particular an MHC-I molecule, and in particular HLA-A, preferably HLA-A*02, and, in particular, HLA-A2 molecules encoded by the HLA-A*02:01 allele (it is believed that the T cell or TCR is limited to a specific MHC molecule). It is possible that the TCRs of the present invention recognize their antigenic target presented by other HLA-A*02 alleles. As noted earlier, it is believed that CDR1 and
- 4 041624- 4 041624
CDR2 альфа- и бета-цепей TCR главным образом вовлечены в распознавание МНС. Существует ограниченный пул последовательностей CDR1 и CDR2, которые, как известно, вовлечены в распознавание HLA-А*02-ограниченного антигена, и предполагается, что CDR3-домены по настоящему изобретению могут в принципе сочетаться с любым из CDR1- и CDR2-доменов, представленных в SEQ ID NO: 34-224, при условии, что TCR сохраняет свою способность распознавать свою антигенную мишень, предпочтительно в его HLA-А*02-связанной форме, в аналогичной, такой же самой или даже более высокой степени, что и TCR, оцениваемую в прилагаемых примерах. Применимые примеры CDR1- и CDR2-доменов включают CDR1-альфа, содержащий последовательность VSGLRG, представленную в SEQ ID NO: 5, или состоящий из нее, CDR2-альфа, содержащий последовательность LYSAGEE, представленную в SEQ ID NO: 3, или состоящий из нее, CDR1-бета, содержащий последовательность SGDLS, представленную в SEQ ID NO: 6, или состоящий из нее, и CDR2-бета, содержащий последовательность YYNGEE, представленную в SEQ ID NO: 4, или состоящий из нее. Указанные последовательности CDR также показаны на фиг. 9.The CDR2 alpha and beta chains of the TCR are mainly involved in MHC recognition. There is a limited pool of CDR1 and CDR2 sequences known to be involved in the recognition of the HLA-A*02 restricted antigen, and it is contemplated that the CDR3 domains of the present invention could in principle be combined with any of the CDR1 and CDR2 domains provided. in SEQ ID NO: 34-224, provided that the TCR retains its ability to recognize its antigenic target, preferably in its HLA-A*02-linked form, to a similar, the same or even higher degree as the TCR, evaluated in the attached examples. Useful examples of CDR1 and CDR2 domains include CDR1 alpha comprising or consisting of the VSGLRG sequence shown in SEQ ID NO: 5, CDR2 alpha containing or consisting of the LYSAGEE sequence shown in SEQ ID NO: 3 , a CDR1-beta containing or consisting of the SGDLS sequence shown in SEQ ID NO: 6, and a CDR2-beta containing or consisting of the YYNGEE sequence shown in SEQ ID NO: 4. These CDR sequences are also shown in FIG. 9.
В соответствии с вышеизложенным в настоящем изобретении, в частности, предусмотрены TCR, содержащие две полипептидные цепи, каждая из которых содержит человеческий вариабельный участок, содержащий по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (т.е., в частности, CDR3, и предпочтительно CDR1, и/или CDR2) TCR. TCR с определенными предпочтительными свойствами (показанными в прилагаемых примерах) содержит первую полипептидную цепь, содержащую CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR 1-альфа), или состоящий из нее, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR2-альфа), или состоящий из нее, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR3-альфа), или состоящий из нее, и вторую полипептидную цепь, содержащую CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR1-бета), или состоящий из нее, CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR2-бета), или состоящий из нее, и CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR3-бета), или состоящий из нее.In accordance with the foregoing, the present invention specifically provides TCRs comprising two polypeptide chains, each containing a human variable region containing at least one complementarity determining region (i.e., in particular, CDR3, and preferably CDR1, and/or CDR2) TCR. A TCR with certain preferred properties (shown in the attached examples) contains a first polypeptide chain containing a CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (CDR 1-alpha), or consisting of it, a CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 ( CDR2-alpha), or consisting of it, and a CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (CDR3-alpha), or consisting of it, and a second polypeptide chain containing CDR1, containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (CDR1 -beta), or consisting of it, a CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CDR2-beta), or consisting of it, and a CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (CDR3-beta), or consisting of her.
Полные вариабельные участки.complete variable regions.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен TCR, содержащий вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и/или вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее. Указанные последовательности альфа- и бета-цепи также показаны на фиг. 9 (обычный шрифт).The present invention further provides a TCR comprising a TCR alpha chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 and/or a TCR beta chain variable region comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. NO: 16, or consisting of it. These alpha and beta chain sequences are also shown in FIG. 9 (regular font).
Варианты последовательности TCR, содержащие вариабельные участки альфа-цепи, содержащие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 15, и/или вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее, также предусмотрены в данной документе, при условии, что TCR сохраняет предпочтительные способности TCR, оцениваемые в прилагаемых примерах, т.е. способен связываться с антигенной мишенью, определенной в данном документе.TCR sequence variants comprising alpha chain variable regions comprising an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 15, and/ or a TCR beta chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 16, also provided herein, provided that the TCR retains the preferred TCR capabilities as evaluated in the accompanying examples, i.e. capable of binding to an antigenic target as defined herein.
Константный участок.Constant area.
TCR может дополнительно содержать константный (С) участок в своей альфа- и/или бета-цепи. Константный участок может представлять собой человеческий константный участок или происходить от других видов, образуя химерный TCR. Например, человеческие альфа- и/или бета-цепи могут быть замещены своими мышиными аналогами (муринизация), что, как было выявлено, усиливает поверхностную экспрессию человеческих TCR путем поддерживающего предпочтительного образования пар альфа- и бета-цепей TCR и более стабильной ассоциации с CD3 корецептором. Подходящие константные участки альфа-цепи, например, могут быть выбраны из SEQ ID NO: 17 (человеческой), 19 (минимально муринизированной) и 21 (мышиной). Подходящие константные участки бета-цепи могут быть выбраны из SEQ ID NO: 18 (человеческой), 20 (минимально муринизированной) и 22 (мышиной). Вместо замены полных человеческих участков их мышиными аналогами, также можно заменять лишь некоторые аминокислоты в человеческих константных участках на соответствующие аминокислоты мышиного константного участка (минимальная муринизация), как дополнительно поясняется в разделе Варианты последовательности TCR в данном документе.The TCR may further comprise a constant (C) region in its alpha and/or beta chain. The constant region may be a human constant region or be derived from other species to form a chimeric TCR. For example, human alpha and/or beta chains can be replaced by their murine counterparts (murinization), which has been shown to enhance surface expression of human TCRs by maintaining preferential TCR alpha and beta chain pairing and more stable association with CD3. co-receptor. Suitable alpha chain constant regions, for example, can be selected from SEQ ID NOs: 17 (human), 19 (minimal murine) and 21 (mouse). Suitable beta chain constant regions can be selected from SEQ ID NOs: 18 (human), 20 (minimal murine) and 22 (mouse). Instead of replacing entire human regions with their murine counterparts, it is also possible to replace only some of the amino acids in the human constant regions with the corresponding amino acids in the murine constant region (minimal murinization), as further explained in the TCR Sequence Variants section of this document.
Альфа- и бета-цепи.Alpha and beta chains.
Применимые примеры TCR по настоящему изобретению включают такие, которые содержат альфацепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрен, в частности, TCR, содержащий альфа-цепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, или состоящую из нее,Useful examples of TCRs of the present invention include those comprising or consisting of an alpha chain comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, 9, 11, or 13, and a beta chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. : 8, 10, 12 or 14, or consisting of it. Thus, the present invention specifically provides a TCR comprising or consisting of an alpha chain, comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a beta chain comprising the amino acid sequence shown in in SEQ ID NO: 8, or consisting of it,
- 5 041624- 5 041624
TCR, содержащий альфа-цепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, или состоящую из нее, TCR, содержащий альфацепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, или состоящую из нее (обе также показаны на фиг. 9); и TCR, содержащий альфа-цепь, или состоящий из нее, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, или состоящую из нее, и бета-цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, или состоящую из нее.TCR containing or consisting of an alpha chain, containing or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and a beta chain containing or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 , a TCR containing or consisting of an alpha chain, containing or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and a beta chain containing or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 ( both are also shown in Fig. 9); and a TCR comprising or consisting of an alpha chain comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a beta chain containing or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 her.
Варианты последовательности TCR, содержащие альфа-цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, или состоящую из нее, и/или бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее, также предусмотрены в данной документе, при условии, что TCR сохраняет предпочтительные способности TCR, оцениваемые в прилагаемых примерах, т.е. способен связываться с антигенной мишенью, определенной в данном документе.TCR sequence variants containing alpha chains containing an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 7, 9, 11 or 13, or consisting of it, and/or a TCR beta chain containing an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 8, 10, 12, or 14, or consisting of it, are also provided herein, provided that the TCR retains the preferred TCR capabilities evaluated in the attached examples, ie. capable of binding to an antigenic target as defined herein.
Антигенная мишень.antigenic target.
TCR, предусмотренные в данном документе, предпочтительно способны связываться с (человеческим) PRAME. PRAME (антиген меланомы, предпочтительно экспрессируемый в опухолях, номер доступа в Uniprot P78395), также обозначаемый как МАРЕ (антиген меланомы, предпочтительно экспрессируемый в опухолях) и OIP4 (ОРА-взаимодействующий белок 4), был описан в качестве раковотестикулярного антигена (СТА) с неизвестной функцией.The TCRs provided herein are preferably capable of binding to (human) PRAME. PRAME (melanoma antigen preferentially expressed in tumors, Uniprot accession number P78395), also referred to as MARE (melanoma antigen preferentially expressed in tumors) and OIP4 (OPA-interacting protein 4), has been described as a cancer testicular antigen (CTA) with unknown function.
В частности, в настоящем изобретении предусмотрены TCR, которые способны (специфично) связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 100-108 аминокислотной последовательности PRAME, представленной в SEQ ID NO: 33 (фиг. 9) жирным шрифтом. Пептид PRAME, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 32, также обозначается в данном документе как PRAME100_108 или антигенная мишень или VLD-пептид. Как изложено в других разделах данного документа, TCR по настоящему изобретению будет предпочтительно распознавать PRAME100_108 при связывании МНС, в частности HLA-A*02.In particular, the present invention provides TCRs that are capable of (specifically) binding to an epitope contained in the amino acid sequence corresponding to amino acid positions 100-108 of the PRAME amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 (FIG. 9) in bold type. The PRAME peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 is also referred to herein as PRAME 100 - 108 or antigenic target or VLD peptide. As set forth elsewhere in this document, the TCR of the present invention will preferentially recognize PRAME 100 _ 108 when binding MHC, in particular HLA-A*02.
Термин положение при использовании в соответствии с настоящим изобретением означает либо положение аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в данном документе, либо положение нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе. Термин соответствующий, используемый в данном документе, также включает то, что положение не только определяется количеством предшествующих нуклеотидов/аминокислот, а скорее рассматривается в контексте прилегающей части последовательности. Соответственно положение определенной аминокислоты или нуклеотида в соответствии с настоящим раскрытием, может варьироваться за счет делеции или добавления аминокислот или нуклеотидов в других участках в последовательности. Таким образом, когда положение обозначается как соответствующее положение в соответствии с настоящим раскрытием, следует понимать, что нуклеотиды/аминокислоты могут отличаться с точки зрения обозначенного номера, но могут все еще иметь аналогичные соседние нуклеотиды/аминокислоты. Чтобы определить, соответствует ли аминокислотный остаток (или нуклеотид) в определенной последовательности определенному положению в аминокислотной последовательности родительской аминокислотной/нуклеотидной последовательности, специалист в данной области может использовать средства и способы, хорошо известные в данной области, например, выравнивание последовательности, либо вручную, либо с помощью компьютерных программ, таких как приведенных в качестве примера в данном документе.The term position when used in accordance with the present invention means either the position of an amino acid in the amino acid sequence described herein, or the position of a nucleotide in the nucleic acid sequence described herein. The term appropriate as used herein also includes that the position is not only determined by the number of preceding nucleotides/amino acids, but rather is considered in the context of the adjacent part of the sequence. Accordingly, the position of a particular amino acid or nucleotide in accordance with the present disclosure may vary by deletion or addition of amino acids or nucleotides at other locations in the sequence. Thus, when a position is designated as the corresponding position in accordance with the present disclosure, it should be understood that nucleotides/amino acids may differ in terms of the designated number, but may still have similar neighboring nucleotides/amino acids. To determine whether an amino acid residue (or nucleotide) in a particular sequence corresponds to a particular position in the amino acid sequence of the parent amino acid/nucleotide sequence, one skilled in the art can use means and methods well known in the art, such as sequence alignment, either manually or using computer programs such as those exemplified in this document.
Термин эпитоп в целом относится к сайту в антигене, как правило, к (поли)пептиду, который распознает связывающий домен. Термин связывающий домен в своем наиболее широком смысле относится к антигенсвязывающему участку, т.е. характеризует домен молекулы, которая связывает специфичный эпитоп/взаимодействует с ним в антигенной мишени. Антигенная мишень может содержать один эпитоп, однако, как правило, содержит по меньшей мере два эпитопа и может включать любое количество эпитопов в зависимости от размера, конформации и типа антигена. Термин эпитоп в целом охватывает линейные эпитопы и конформационные эпитопы. Линейные эпитопы представляют собой смежные эпитопы, содержащиеся в аминокислотной первичной последовательности и, как правило, включают по меньшей 2 аминокислоты или больше. Конформационные эпитопы образуются несмежными аминокислотами, соединенными за счет фолдинга целевого антигена, и, в частности, определенного целевого (поли)пептида.The term epitope generally refers to a site in an antigen, typically a (poly)peptide, that recognizes a binding domain. The term binding domain in its broadest sense refers to an antigen-binding site, ie. characterizes the domain of a molecule that binds/interacts with a specific epitope in an antigenic target. An antigenic target may contain one epitope, however, as a rule, contains at least two epitopes and may include any number of epitopes depending on the size, conformation and type of antigen. The term epitope generally encompasses linear epitopes and conformational epitopes. Linear epitopes are contiguous epitopes contained in an amino acid primary sequence and typically include at least 2 amino acids or more. Conformational epitopes are formed by non-contiguous amino acids linked by the folding of a target antigen, and in particular a specific target (poly)peptide.
В контексте настоящего изобретения термин связывающий домен, в частности, относится к вариабельному участку альфа- и/или бета-цепи TCR и, в частности, CDR3-альфа и CDR3-бета TCR.In the context of the present invention, the term binding domain specifically refers to the variable region of the alpha and/or beta chain of the TCR, and in particular the CDR3 alpha and CDR3 beta of the TCR.
- 6 041624- 6 041624
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что минимальная аминокислотная последовательность, распознаваемая TCR по настоящему изобретению, соответствует аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31), при этом X выбрано из любой аминокислоты. В частности, было показано, что TCR по настоящему изобретению (специфично) распознают аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32), или состоящую из нее, показанную в прилагаемых примерах. Таким образом, TCR по настоящему изобретению способны связываться с аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31), или состоящую из нее, предпочтительно содержащую аминокислотную последовательность VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) или ее МНС-связанную форму, или состоящую из нее. Например, предусмотрено, что распознаваемый пептид может содержать дополнительные С-аминокислоты, расположенные на С- и/или N-конце мотива распознавания, представленного в SEQ ID NO: 31, и, в частности, SEQ ID NO: 32. В частности, TCR, описанный в данном документе, предусмотрен для распознавания по меньшей мере одного эпитопа в вышеупомянутых аминокислотных последовательностях. Термины связывающийся с и распознающий во всех грамматических формах используются в данном документе взаимозаменяемо. Предусмотрено, что антигенная мишень, в частности, подлежит распознаванию TCR по настоящему изобретению при связывании молекулой МНС I класса, в частности молекулой HLA-A, и предпочтительно молекулой HLA-A*02, в частности молекулой HLA-A*02:01. Указанная молекула МНС, в частности молекулы HLA-A и HLA-A*02, может присутствовать на поверхности клетки, например опухолевой клетки, или на (твердом) носителе.The present inventors found that the minimum amino acid sequence recognized by the TCR of the present invention corresponds to the amino acid sequence X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31), with X selected from any amino acid. In particular, the TCRs of the present invention have been shown to (specifically) recognize an amino acid sequence comprising or consisting of the amino acid sequence VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) shown in the accompanying examples. Thus, the TCRs of the present invention are capable of binding to an amino acid sequence comprising or consisting of the amino acid sequence X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31), preferably comprising the amino acid sequence VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) or an MHC-linked form thereof, or consisting of it. For example, it is envisaged that the recognition peptide may contain additional C-amino acids located at the C- and/or N-terminus of the recognition motif shown in SEQ ID NO: 31, and in particular SEQ ID NO: 32. In particular, TCR , described herein, is provided for the recognition of at least one epitope in the above amino acid sequences. The terms linking to and recognizing in all grammatical forms are used interchangeably in this document. It is envisaged that the antigenic target is particularly to be recognized by the TCR of the present invention when bound by an MHC class I molecule, in particular an HLA-A molecule, and preferably an HLA-A*02 molecule, in particular an HLA-A*02:01 molecule. Said MHC molecule, in particular HLA-A and HLA-A*02 molecules, may be present on the surface of a cell, such as a tumor cell, or on a (solid) support.
Предпочтительно TCR по настоящему изобретению специфично связываются со своей антигенной мишенью. Термин специфическое(специфично) связывание(связывающийся), как правило, указывает на то, что TCR связывается с помощью своего антигенсвязывающего участка более легко со своей предполагаемой антигенной мишенью, чем со случайным неродственным нецелевым антигеном. В частности, термин специфически связывается указывает на то, что специфичность связывания TCR будет по меньшей мере приблизительно в 5 раз, предпочтительно в 10 раз, более предпочтительно в 25 раз, еще более предпочтительно в 50 раз и наиболее предпочтительно в 100 раз больше со своей антигенной мишенью, чем его связывание с нецелевым антигеном.Preferably, the TCRs of the present invention bind specifically to their antigenic target. The term specific binding generally indicates that the TCR binds via its antigen-binding site more readily to its putative antigenic target than to random unrelated non-target antigen. In particular, the term specifically binds indicates that the binding specificity of the TCR will be at least about 5-fold, preferably 10-fold, more preferably 25-fold, even more preferably 50-fold, and most preferably 100-fold greater than its antigenic target than its binding to a non-target antigen.
Эффекторные клетки-хозяева, экспрессирующие нативный TCR, описанный в данном документе, предусмотрены для связывания своей антигенной мишени (т.е. предпочтительно PRAME100_108, презентированого HLA-A*02 с помощью антигенпрезентирующих клеток) с высокой функциональной авидностью. Термин функциональная авидность относится к способности TCR-экспрессирующих клеток (в частности, Т-клеток, экспрессирующих нативные TCR, описанные в данном документе) отвечать in vitro на определенную концентрацию лиганда и, как считается, коррелировать с эффекторной способностью TCR-экспрессирующих клеток in vivo. По определению TCR-экспрессирующие клетки с высокой функциональной авидностью отвечают в исследованиях in vitro на очень низкие дозы антигена, в то время как такие клетки с более низкой функциональной авидностью требуют более высоких количеств антигена перед тем, как они вызывают иммунный ответ, аналогичный такому TCR-экспрессирующих клеток с высокой авидностью. Таким образом, функциональная авидность может рассматриваться в качестве количественной детерминанты порога активации TCR-экспрессирующей клетки. Это определено в результате воздействия на такие клетки in vitro различных количеств когнатного антигена. TCRэкспрессирующие клетки с высокой функциональной авидностью отвечают на низкие дозы антигена. Например, будет считаться, что в типичных случаях TCR-экспрессирующая клетка связывается с высокой функциональной авидностью со своей антигенной мишенью, если она секретирует по меньшей мере приблизительно 200 пг/мл или больше (например, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 1000, 5000, 7000, 10000 или 20000 пг/мл или больше) интерферона гамма (IFN-гамма) при совместном культивировании с антиген-отрицательными HLA-А*02-экспрессирующими целевыми клетками, нагруженными PRAME100_108 пептидом в низкой концентрации, варьирующей в диапазоне от приблизительно 10-5 до приблизительно 10’11 М (т.е. от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 нг/мл, 0,05, 0,1, 0,5, 1 или 5 нг/мл), при этом молекулярная масса PRAME100_108 пептида составляет 956 г/моль.Effector host cells expressing the native TCR described herein are provided to bind their antigenic target (ie, preferably PRAME 100 - 108 presented by HLA-A*02 using antigen presenting cells) with high functional avidity. The term functional avidity refers to the ability of TCR-expressing cells (in particular, T-cells expressing native TCRs described herein) to respond in vitro to a given concentration of ligand and is believed to correlate with the effector ability of TCR-expressing cells in vivo. By definition, TCR-expressing cells with high functional avidity respond in vitro to very low doses of antigen, while those cells with lower functional avidity require higher amounts of antigen before they elicit an immune response similar to that of TCR- expressing cells with high avidity. Thus, functional avidity can be considered as a quantitative determinant of the activation threshold of a TCR-expressing cell. This has been determined by exposing such cells in vitro to varying amounts of the cognate antigen. TCR-expressing cells with high functional avidity respond to low doses of the antigen. For example, a TCR-expressing cell will typically be considered to bind with high functional avidity to its antigenic target if it secretes at least about 200 pg/ml or more (e.g., 200, 300, 400, 500, 600, 700 , 1000, 5000, 7000, 10000 or 20000 pg/ml or more) interferon gamma (IFN-gamma) when co-cultivated with antigen-negative HLA-A*02-expressing target cells loaded with PRAME 100 _ 108 peptide at low concentration, ranging from about 10 -5 to about 10' 11 M (i.e., from about 0.05 to about 5 ng/ml, 0.05, 0.1, 0.5, 1, or 5 ng/ml) , while the molecular weight of the PRAME 100 _ 108 peptide is 956 g/mol.
Другие способы определения специфического связывания TCR по настоящему изобретению включают в себя анализа высвобождения 51Cr, описанный Gertner-Dardenne et al. J Immunol 188(9): 4701-4708, мобилизацию CD107a/b, описанную Leisegang et al., Clin. Cancer Res 2010. 16. 2333-2343 и анализы связывания пептида:мультимера МНС, описанные Wilde et al., J Immunol 2012; 189:598-605.Other methods for determining specific TCR binding of the present invention include the 51 Cr release assay described by Gertner-Dardenne et al. J Immunol 188(9): 4701-4708, CD107a/b mobilization described by Leisegang et al., Clin. Cancer Res 2010. 16. 2333-2343 and peptide:MHC multimer binding assays described by Wilde et al., J Immunol 2012; 189:598-605.
Варианты.Options.
Как отмечено ранее, термин TCR охватывает варианты TCR, которые включают варианты последовательности, фрагменты TCR и TCR-конструкции. Предусмотрено, что все варианты TCR являются функциональными вариантами TCR по настоящему изобретению. Термин функциональный вариант, используемый в данном документе, относится к TCR, полипептиду или белку, имеющему существенную или значительную идентичность или сходство последовательности с родительским TCR, его вариабельными участками или его антигенсязывающими участками, и сохраняющему его биологическую активность, т.е. его способность специфично связываться с антигенной мишенью, к которому родительский TCR по настоящему изобретению имеет антигенную специфичность, в аналогичной, той же самой илиAs noted earlier, the term TCR encompasses TCR variants, which include sequence variants, TCR fragments, and TCR constructs. All TCR variants are intended to be functional TCR variants of the present invention. The term functional variant as used herein refers to a TCR, polypeptide, or protein that has substantial or significant sequence identity or similarity to the parent TCR, its variable regions, or its antigen-binding regions, and retains its biological activity, i. its ability to specifically bind to an antigenic target for which the parent TCR of the present invention has an antigenic specificity similar, the same or
- 7 041624 даже большей степени, как и TCR, раскрываемый в данном документе, и оцениваемую в прилагаемых примерах.- 7 041624 to an even greater extent, as well as the TCR disclosed in this document and evaluated in the attached examples.
Варианты последовательности.Sequence options.
Термин варианты TCR включает варианты последовательности TCR, раскрываемых в данном документе, т.е. варианты, которые фактически содержат аминокислотную последовательность TCR по настоящему изобретению, описанного выше (также обозначаемую как родительский TCR), но содержащие по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (т.е. замену, делению или вставку) по сравнению с аминокислотной последовательностью родительского TCR, при условии, что вариант предпочтительно сохраняет антигенную специфичность родительского TCR по настоящему изобретению. Варианты последовательности TCR по настоящему изобретению, как правило, получают с помощью осуществления соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновых кислотах, кодирующих родительский TCR, или с помощью пептидного синтеза. Как правило, вышеупомянутые аминокислотные модификации могут быть введены в вариабельный участок или константный участок TCR или могут присутствовать в таких, и могут служить для модуляции свойств, например, силы и специфичности связывания, посттрансляцинного процессинга (например, гликозилирования), термодинамической стабильности, растворимости, поверхностной экспрессии или сборки TCR.The term TCR variants includes TCR sequence variants disclosed herein, ie. variants that actually contain the amino acid sequence of the TCR of the present invention described above (also referred to as the parent TCR), but contain at least one amino acid modification (i.e., substitution, deletion, or insertion) compared to the amino acid sequence of the parent TCR, when provided that the variant preferably retains the antigenic specificity of the parental TCR of the present invention. The TCR sequence variants of the present invention are typically generated by making appropriate nucleotide changes in the parental TCR encoding nucleic acids or by peptide synthesis. Generally, the aforementioned amino acid modifications may be introduced into or present in the TCR variable region or constant region and may serve to modulate properties such as binding strength and specificity, post-translational processing (e.g., glycosylation), thermodynamic stability, solubility, surface expression or assembly of the TCR.
Как изложено ранее, аминокислотные модификации включают, например, делеции остатков, и/или вставки в остатки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях родительского TCR. Иллюстративные варианты TCR со вставками по настоящему изобретению включают слитые продукты указанного TCR, а также фермент или другой функциональный полипептид. Иллюстративные TCR с заменами по настоящему изобретению представляют собой такие, которые включают аминокислотные замены в вариабельных участках или CDR альфа- и/или бета-цепи, каркасном участке или константном участке. В частности, в данном документе предусмотрены консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены известны в данной области и включают аминокислотные замены, в которых одна аминокислота, имеющая определенные физические и/или химические свойства, заменена на другую аминокислоту, которая имеет те же самые химические или физические свойства. Например, консервативная аминокислотная замена может быть в аминокислоте, замещенной на другую аминокислоту (например, Asp или Glu), аминокислоте с неполярной боковой цепью, замещенной на другую аминокислоту с неполярной боковой цепью (например, Ala, Gly, Val, Не, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val и пр.), основной аминокислоте, замещенной на другую основную аминокислоту (Lys, Arg и пр.), аминокислоте с полярной боковой цепью, замещенной на другую аминокислоту с полярной боковой цепью (Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr и пр.) и др., что может быть выполнено, например, на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы включенных остатков.As previously discussed, amino acid modifications include, for example, deletions of residues and/or insertions into residues and/or substitutions of residues in the amino acid sequences of the parental TCR. Illustrative variants of TCRs with inserts of the present invention include fusion products of said TCR, as well as an enzyme or other functional polypeptide. Exemplary TCRs with substitutions of the present invention are those that include amino acid substitutions in the variable regions or alpha and/or beta chain CDRs, framework region or constant region. In particular, conservative amino acid substitutions are contemplated herein. Conservative amino acid substitutions are known in the art and include amino acid substitutions in which one amino acid having certain physical and/or chemical properties is replaced with another amino acid that has the same chemical or physical properties. For example, a conservative amino acid substitution may be in an amino acid substituted with another amino acid (e.g., Asp or Glu), an amino acid with a non-polar side chain substituted with another amino acid with a non-polar side chain (e.g., Ala, Gly, Val, He, Leu, Met , Phe, Pro, Trp, Val, etc.), a basic amino acid substituted for another basic amino acid (Lys, Arg, etc.), an amino acid with a polar side chain substituted for another amino acid with a polar side chain (Asn, Cys, Gin , Ser, Thr, Tyr, etc.), etc., which can be done, for example, based on the similarity of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the included residues.
Модификация цистеина.modification of cysteine.
Было описано, что добавление дисульфидной связи в константном участке способствует надлежащему образованию пар альфа- и бета-цепей TCR (Kuball J. et al. Blood. 2007 Mar 15; 109(6):2331-8.). Таким образом, добавление одной или более цистеиновых связей в константном участке также предусмотрено в данном документе.The addition of a disulfide bond in the constant region has been described to promote proper pairing of TCR alpha and beta chains (Kuball J. et al. Blood. 2007 Mar 15; 109(6):2331-8.). Thus, the addition of one or more cysteine bonds in the constant region is also contemplated herein.
Муринизация.Murinization.
Как отмечено ранее, муринизация TCR (т.е. замена человеческих константных участков в альфа- и бета-цепях их мышиными аналогами) представляет собой методику, которая широко используется в целях повышения экспрессии TCR клеточной поверхностью в клетках-хозяевах. Не ограничиваясь определенной теорией, считается, что муринизированные TCR ассоциируются более эффективно с CD3корецепторами; и/или, что предпочтительно, образуют пары друг с другом и менее подвержены образованию смешанных TCR на человеческих Т-клетках, сконструированных ex vivo, для экспрессии TCR с необходимой антигенной специфичностью, однако все еще сохраняющих и экспрессирующих свои оригинальные TCR.As noted previously, TCR murinization (ie, replacement of human constant regions in the alpha and beta chains with their murine counterparts) is a technique that is widely used to increase cell surface expression of TCR in host cells. Without wishing to be bound by theory, it is believed that murinated TCRs associate more efficiently with CD3 receptors; and/or, preferably, pair with each other and are less likely to form mixed TCRs on ex vivo engineered human T cells to express TCRs with the desired antigen specificity, yet still retain and express their original TCRs.
Недавно были идентифицированы девять аминокислот, ответственных за повышенную экспрессию муринизированных TCR (Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jim 1; 184(11):6223-31), и предусмотрена замена одного или всех аминокислотных остатков в константном участке альфа- и/или бета-цепи TCR на их мышиные остатки-аналоги. Эта методика также называется как минимальная муринизация и обеспечивает преимущество, связанное с усилением экспрессии на клеточной поверхности, при этом одновременно снижается количество чужеродных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности и тем самым риск проявления иммуногенности.Recently, nine amino acids responsible for the increased expression of murinated TCRs have been identified (Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jim 1; TCR beta chains to their mouse counterparts. This technique is also referred to as minimal murinization and provides the advantage of increased expression on the cell surface, while simultaneously reducing the number of foreign amino acid residues in the amino acid sequence and thus the risk of immunogenicity.
Как правило, предусмотрены варианты последовательности TCR, которые содержат по меньшей мере одно из CDR1, CDR2, CDR3, вариабельных участков альфа-цепи, вариабельных участков бета-цепи, альфа-цепи и/или бета-цепи, раскрываемых в данном документе, или содержащие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80, приблизительно на 85, приблизительно на 90, приблизительно на 95, приблизительно на 96, приблизительно на 97, приблизительно на 98, приблизительно на 99% идентична аминокислотным последовательностям, раскрываемым в данном документе, при условии, что указанные варианты характеризуются сопоставимыми, такими же самыми илиGenerally, TCR sequence variants are provided that contain at least one of CDR1, CDR2, CDR3, alpha chain variable regions, beta chain variable regions, alpha chain and/or beta chain disclosed herein, or containing an amino acid sequence that is at least about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99% identical to the amino acid sequences disclosed herein, provided that these variants are characterized by comparable, the same or
- 8 041624 улучшенными характеристиками связывания по сравнению с TCR, оцениваемыми в прилагаемых примерах.- 8 041624 improved binding characteristics compared to TCR, evaluated in the attached examples.
Используемый в данном документе термин идентичность последовательности указывает на степень, в которой две (нуклеотидные или аминокислотные) последовательности имеют идентичные остатки в тех же самых положениях при выравнивании, и часто выражается в виде процента. Предпочтительно идентичность определяют по всей длине последовательностей, подлежащих сравнению. Таким образом, две копии точно такой же последовательности характеризуются 100% идентичностью, но последовательности, которые в меньшей степени высоко консервативны и имеют делеции, добавления или замещения, могут характеризоваться меньшей степенью идентичности. Специалистам в данной области будет понятно, что для определения идентичности последовательностей с использованием стандартных параметров доступны несколько алгоритмов, например, Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), Смита-Уотермана (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197) и ClustalW.As used herein, the term sequence identity indicates the degree to which two (nucleotide or amino acid) sequences have identical residues at the same positions when aligned, and is often expressed as a percentage. Preferably, identity is determined over the entire length of the sequences to be compared. Thus, two copies of exactly the same sequence are 100% identical, but sequences that are less highly conserved and have deletions, additions, or substitutions may have less identity. Those skilled in the art will appreciate that several algorithms are available for determining sequence identity using standard parameters, e.g. Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197) and ClustalW.
Соответственно, например, аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 могут служить в качестве последовательности для сравнения или эталонной последовательности, в то время как аминокислотная последовательность CDR3, отличная от них, может служить в качестве искомой последовательности.Accordingly, for example, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 or 2 may serve as a comparison sequence or reference sequence, while an amino acid sequence of CDR3 other than these may serve as a search sequence.
Конструкции и фрагменты.structures and fragments.
Термин TCR, используемый в данном документе, дополнительно подразумевает TCRконструкции. Термин конструкция включает белки или полипептиды, содержащие по меньшей мере один антигенсвязывающий домен TCR по настоящему изобретению, однако они не обязательно имеют общую структуру с нативным TCR (т.е. вариабельными доменами, включенными в альфа-цепь TCR и бета-цепь TCR, образующими гетеродимер). Конструкции и фрагменты TCR получают, как правило,с помощью стандартных способов генной инженерии, и их часто конструируют искусственно для того, чтобы они содержали дополнительные функциональные белковые или полипептидные домены. В соответствии с вышеизложенным предусмотрены конструкции и фрагменты TCR по настоящему изобретению, содержащие по меньшей мере один CDR3-альфа и/или по меньшей мере один CDR3-бета, описанные в других разделах данного документа. В данном документе предусмотрены дополнительные конструкции и фрагменты, содержащие по меньшей мере один CDR1-альфа, CDR2-альфа, CDR1-бета, CDR2бета, вариабельный участок альфа-цепи, вариабельный участок бета-цепи, альфа-цепь и/или бета-цепь или их комбинации, необязательно в сочетании с дополнительными белковыми доменами или фрагментами, приведенными в качестве примеров в данном документе. Предусмотрено, что конструкции и фрагменты TCR, предусмотренные в данном документе, способны специфично связываться с той же самой антигенной мишенью, что и TCR по настоящему изобретению, описанные выше и оцениваемые в прилагаемых примерах.The term TCR as used herein further implies TCR constructs. The term construct includes proteins or polypeptides containing at least one TCR antigen-binding domain of the present invention, however, they do not necessarily have a common structure with native TCR (i.e., variable domains included in the alpha chain of the TCR and the beta chain of the TCR, forming heterodimer). TCR constructs and fragments are typically generated using standard genetic engineering techniques and are often artificially engineered to contain additional functional protein or polypeptide domains. In accordance with the foregoing, TCR constructs and fragments of the present invention containing at least one CDR3-alpha and/or at least one CDR3-beta are provided, as described elsewhere in this document. Provided herein are additional constructs and fragments comprising at least one CDR1-alpha, CDR2-alpha, CDR1-beta, CDR2beta, alpha chain variable region, beta chain variable region, alpha chain and/or beta chain, or combinations thereof, optionally in combination with additional protein domains or fragments exemplified herein. It is contemplated that the TCR constructs and fragments provided herein are capable of specifically binding to the same antigenic target as the TCRs of the present invention described above and evaluated in the accompanying examples.
Мультимеры.Multimers.
Термин TCR-конструкция охватывает гетеродимеры и мультимеры, в которых по меньшей мере один варибельный участок альфа-цепи TCR или альфа-цепь TCR и по меньшей мере один вариабельный участок бета-цепи TCR ковалентно связаны друг с другом. В наиболее простой форме мультивалентная конструкция TCR в соответствии с настоящим изобретением содержит мультимер из двух, или трех, или четырех или больше TCR, ассоциированных (например, ковалентно или иным образом связанных) друг с другом, предпочтительно с помощью линкерной молекулы.The term TCR construct encompasses heterodimers and multimers in which at least one TCR alpha chain variable region or TCR alpha chain and at least one TCR beta chain variable region are covalently linked to each other. In its simplest form, a multivalent TCR construct according to the present invention comprises a multimer of two, or three, or four or more TCRs associated (eg, covalently or otherwise linked) to each other, preferably via a linker molecule.
Подходящие линкерные молекулы включают без ограничения мультивалентные соединяющие молекулы, такие как авидин, стрептавидин, нейтравидин и экстравидин, каждая из которых имеет четыре связывающих сайта для биотина. Таким образом, биотинилированные TCR могут быть превращены в мультимеры, имеющие множество TCR-связывающих участков. Количество TCR в мультимере будет зависеть от количества TCR по отношению к количеству линкерных молекул, используемых для получения мультимеров, и также от присутствия или отсутствия любых других биотинилированных молекул. Иллюстративные мультимеры представляют собой димерные, тримерные, тетрамерные или пентамерные TCR-конструкции или такие конструкции более высокого порядка. Мультимеры по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные функциональные фрагменты, такие как метки, или лекарственные средства, или (твердые) носители.Suitable linker molecules include, but are not limited to, multivalent linking molecules such as avidin, streptavidin, neutravidin, and extravidin, each of which has four biotin binding sites. Thus, biotinylated TCRs can be converted into multimers having multiple TCR binding sites. The amount of TCR in the multimer will depend on the amount of TCR relative to the number of linker molecules used to form the multimers, and also on the presence or absence of any other biotinylated molecules. Exemplary multimers are dimeric, trimeric, tetrameric, or pentameric TCR constructs, or higher order such constructs. The multimers of the present invention may also contain additional functional moieties such as labels or drugs or (solid) carriers.
Термин конструкция на основе TCR также охватывает молекулы TCR, которые связаны с помощью подходящего линкера со сферическим объектом, предпочтительно однородной гранулой, более предпочтительно полистирольной гранулой, наиболее предпочтительно биосовместимой полистирольной гранулой. Такие конструкции на основе TCR также могут содержать TCR по настоящему изобретению и гранулу, имеющую предварительно определенный флуоресцентный краситель, включенный в гранулу.The term TCR construct also encompasses TCR molecules that are linked via a suitable linker to a spherical entity, preferably a homogeneous bead, more preferably a polystyrene bead, most preferably a biocompatible polystyrene bead. Such TCR-based constructs may also contain the TCR of the present invention and a bead having a predetermined fluorescent dye incorporated into the bead.
Слитые белки.Drained proteins.
Термин TCR-конструкция также относится к слитым белка или полипептидам, содержащим по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, вариабельный участок альфа-цепи TCR или CDR3-альфа и/или по меньшей мере одну бета-цепь TCR, вариабельный участок бета-цепи TCR или CDR3-бета; и дополни- 9 041624 тельно один или более слитых компонентов. Применимые компоненты включают Fc-рецепторы; Fcдомены (происходящие из IgA, IgD, IgG, IgE и IgM); цитокины (такие как IL-2 или IL-15); токсины; антитела или их антигенсвязывающие фрагменты (такие как антитела к CD3, антитела к CD28, антитела кThe term TCR construct also refers to fusion proteins or polypeptides comprising at least one TCR alpha chain, TCR alpha chain variable region, or CDR3 alpha and/or at least one TCR beta chain, TCR beta chain variable region or CDR3-beta; and additionally one or more fused components. Applicable components include Fc receptors; Fc domains (derived from IgA, IgD, IgG, IgE and IgM); cytokines (such as IL-2 or IL-15); toxins; antibodies or antigen-binding fragments thereof (such as antibodies to CD3, antibodies to CD28, antibodies to
CD5, антитела к CD16 или антитела к CD56 или их антигенсвязывающие фрагменты); CD247 (CD3дзета), CD28-, CD137-, CD134-домены; или любые их комбинации.CD5, anti-CD16 antibodies or anti-CD56 antibodies or antigen-binding fragments thereof); CD247 (CD3zeta), CD28-, CD137-, CD134-domains; or any combination of them.
Иллюстративные фрагменты антител, которые можно использовать в качестве слитых компонентов, включают фрагменты или полноразмерные антитела, такие как (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 или r IgG (полуантитело); модифицированные фрагменты антител, такие как scFv, di-scFv или bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-молния, scFab, Fab2, Fab3, диатела, одноцепочечные диатела, тандемные диатела (Tandab), тандемные di-scFv, тандемные tri-scFv, минитела, мультитела, такие как триатела или тетратела, и одно доменные антитела, такие как нанотела или антитела с одним вариабельным доменом, содержащие только один вариабельный домен, который может представлять собой VHH, VH или VL.Illustrative antibody fragments that can be used as fusion components include fragments or full length antibodies such as (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 or r IgG (half-body); modified antibody fragments such as scFv, di-scFv or bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zipper, scFab, Fab2, Fab3, diabodies, single chain diabodies, tandem diabodies (Tandab), tandem di-scFv, tandem tri-scFv, minibodies, multibodies such as triabodies or tetrabodies, and single domain antibodies such as nanobodies or single variable domain antibodies containing only one variable domain, which may be VHH, VH or VL.
TCR-конструкции по настоящему изобретению могут быть слиты с одним или более антителами или фрагментами антитела, что приводит к образованию моновалентных, бивалентных и поливалентных/мультивалентных конструкций и таким образом моноспецифических конструкций, специфично связывающихся только с одним целевым антигеном, а также биспецифических и полиспецифиических/мультиспецифических конструкций, которые специфически связываются более чем с одним целевым антигеном, например, двумя, тремя или больше, с помощью различающихся антигенсвязывающих участков.The TCR constructs of the present invention can be fused to one or more antibodies or antibody fragments, resulting in monovalent, bivalent and polyvalent/multivalent constructs and thus monospecific constructs that specifically bind to only one target antigen, as well as bispecific and polyspecific/ multispecific constructs that specifically bind to more than one target antigen, eg two, three or more, via distinct antigen-binding sites.
Необязательно линкер может быть введен между одним или более из доменов или участков TCRконструкции по настоящему изобретению, т.е. между CDR3 альфа-цепи TCR, вариабельным участком альфа-цепи TCR и/или альфа-цепью TCR, CDR3 бета-цепи TCR, вариабельным участком бета-цепи TCR и/или бета-цепью TCR, и/или одним или более слитыми компонентами, описанными в данном документе. Линкеры известны в данной области и были описаны в обзоре, в частности, в Chen et al. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369. Как правило, линкеры включают подвижные, расщепляемые и жесткие линкеры и могут быть выбраны в зависимости от типа конструкции и предполагаемого использования/применения. Например, для терапевтического применения неимуногенные подвижные линкеры часто являются предпочтительными с тем, чтобы обеспечить определенную степень гибкости или взаимодействия между доменами, при этом снижается риск побочных иммуногенных реакций. Такие линкеры, как правило, состоят из небольших неполярных (например, Gly) или полярных (например, Ser или Thr) аминокислот и включают в себя GS-линкеры, состоящие из участков Gly- и Ser-остатков. В примере наиболее широко используемого гибкого линкера, который, как предусмотрено, также используется для применения в TCR-конструкции по настоящему изобретению, имеется последовательность (Gly-GlyGly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 225). Другие подходящие линкеры включают в себя, например, KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 226) и EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 227) и GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 228).Optionally, a linker may be inserted between one or more of the domains or regions of the TCR construct of the present invention, ie. between TCR alpha chain CDR3, TCR alpha chain variable region and/or TCR alpha chain, TCR beta chain CDR3, TCR beta chain variable region and/or TCR beta chain, and/or one or more fusion components, described in this document. Linkers are known in the art and have been reviewed in particular by Chen et al. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369. Typically, linkers include movable, cleavable, and rigid linkers, and may be selected depending on the type of construction and intended use/application. For example, for therapeutic applications, non-immunogenic movable linkers are often preferred in order to allow a degree of flexibility or interaction between domains while reducing the risk of immunogenic side reactions. Such linkers typically consist of small non-polar (eg, Gly) or polar (eg, Ser or Thr) amino acids and include GS linkers composed of Gly and Ser residue regions. In an example of the most widely used flexible linker, which is also contemplated for use in the TCR construct of the present invention, is the sequence (Gly-GlyGly-Gly-Ser) n (SEQ ID NO: 225). Other suitable linkers include, for example, KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 226) and EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 227) and GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 228).
Особенно применимыми TCR-конструкциями, предусмотренными в соответствии с настоящим изобретением, являются такие, которые содержат по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, вариабельный участок альфа-цепи TCR или CDR3-альфа, определенные в данном документе, по меньшей мере одну бета-цепь TCR, вариабельный участок бета-цепи TCR или CDR3-бета, определенные в данном документе, необязательно связанные друг с другом или слитые необязательно с помощью линкера по меньшей мере с одним антителом или фрагментом антитела (таким как, фрагмент одноцепочечного антитела (scFv)), направленными против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов. Применимые антигенные мишени, распознаваемые антителом или фрагментом антитела (например, scFv), включают CD3, CD28, CD5, CD16 и CD56. Указанная конструкция в целом может иметь любую структуру в тех условиях, когда участок TCR (т.е. альфа- и бета-цепь TCR или их CDR3) сохраняет свою способность распознавать антигенную мишень, определенную в данном документе, а участок антитела связывается с необходимым поверхностным антигеном или эпитопом, за счет чего осуществляется рекрутинг соответствующего лимфоцита и его нацеливание на клетку-мишень. Такие конструкции могут предпочтительно выступать в качестве адаптеров, соединяющих вместе антигенпрезентирующую клетку, демонстрирующую антигенную мишень (такую как опухолевая клетка), и лимфоцит (такой как цитотоксическая Тклетка или NK-клетка). Примером такого слитого белка является конструкция, разработанная в соответствии с принципом привлекающего Т-клетки биспецифического активатора (BiTE®), состоящего из двух одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) различных антител, на одной пептидной цепи, размером приблизительно 55 килодальтон (кД). Соответственно TCR-конструкция по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один антигенсвязывающий домен TCR, описанный в данном документе (к примеру, вариабельный домен альфа-цепи и вариабельный домен бета-цепи TCR, слитые друг с другом), связанный с scFv (или другим связывающим доменом) с необходимой специфичностью связывания, например, CD3 или CD56. scFv (или другой связывающий домен) связывается с Т-клетками, например, посредством CD3-рецептора, или с CD56 в случае NK-клеточной активации, а другой с опухолевой клеткой с помощью антигенной мишени, специфично экспрессируемой на опухолевой клетке. Также в данном документе предусмотрены триатела, содержащие по меньшей мере один антигенсвязы- 10 041624 вающий домен TCR, описанный в данном документе, scFv (или другой связывающий домен) и дополнительный домен, например, для целенаправленного воздействия конструкции на сайт воздействия в организме (например, Fc-домен).Particularly useful TCR constructs provided in accordance with the present invention are those containing at least one TCR alpha chain, TCR alpha chain variable region, or CDR3 alpha as defined herein, at least one beta chain TCR, TCR beta chain variable region or CDR3-beta as defined herein, optionally linked to each other or fused optionally via a linker to at least one antibody or antibody fragment (such as a single chain antibody fragment (scFv)), directed against an antigen or epitope on the surface of lymphocytes. Useful antigenic targets recognized by an antibody or antibody fragment (eg, scFv) include CD3, CD28, CD5, CD16, and CD56. Said construct may generally be of any structure, as long as the TCR region (i.e., the TCR alpha and beta chain or their CDR3) retains its ability to recognize the antigenic target as defined herein, and the antibody region binds to the desired surface an antigen or epitope, thereby recruiting the appropriate lymphocyte and targeting it to the target cell. Such constructs may preferably act as adapters connecting together an antigen presenting cell displaying an antigenic target (such as a tumor cell) and a lymphocyte (such as a cytotoxic T cell or NK cell). An example of such a fusion protein is a T-cell-attracting bispecific activator (BiTE®) construct consisting of two single-chain variable fragments (scFv) of different antibodies on a single peptide chain, approximately 55 kilodaltons (kDa) in size. Accordingly, a TCR construct of the present invention may comprise at least one TCR antigen-binding domain as described herein (e.g., a TCR alpha chain variable domain and a TCR beta chain variable domain fused to each other) associated with an scFv (or other binding domain) with the desired binding specificity, eg CD3 or CD56. scFv (or other binding domain) binds to T cells, for example via the CD3 receptor, or to CD56 in the case of NK cell activation, and the other to the tumor cell via an antigenic target specifically expressed on the tumor cell. Also contemplated herein are tribodies comprising at least one TCR antigen-binding domain described herein, an scFv (or other binding domain) and an additional domain, e.g., to target the construct to a target site in the body (e.g., Fc domain).
Выделенная форма.Dedicated form.
TCR по настоящему изобретению могут быть предусмотрены в выделенной или фактически чистой форме. Термины выделенный или фактически чистый при использовании в данном документе означает, что TCR были идентифицированы отделенными от и/или извлеченными из компонента своей среды продуцирования, так что выделенный TCR не содержит или фактически не содержит других контаминирующих компонентов из своей среды продуцирования, которые могут нарушить его терапевтическое или диагностическое применение. Контаминирующие компоненты могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Таким образом, выделенные TCR будут получены с помощью по меньшей мере одной стадии очистки, удаляющей или фактически удаляющей эти контаминирующие компоненты. Вышеупомянутое определение в равной степени применимо к выделенным полинуклеотидам/нуклеиновым кислотам с соответствующими поправками.The TCRs of the present invention may be provided in isolated or substantially pure form. The terms isolated or substantially pure as used herein means that the TCRs have been identified separated from and/or removed from a component of their production environment such that the isolated TCR does not or does not actually contain other contaminants from its production environment that could interfere with it. therapeutic or diagnostic use. Contaminant components may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. Thus, isolated TCRs will be obtained by at least one purification step removing or actually removing these contaminating components. The above definition applies equally to isolated polynucleotides/nucleic acids, mutatis mutandis.
Растворимые формы.soluble forms.
TCR по настоящему изобретению могут быть предусмотрены в растворимой форме. Растворимые TCR применимы в качестве диагностических средств и носителей или адаптеров, которые специфически нацеливают терапевтические средства или эффекторные клетки, например, на раковую клетку, экспрессирующую антигенную мишень, распознаваемую растворимым TCR. Растворимые TCR (sTCR), как правило, будут представлять собой фрагменты или конструкции, содержащие альфа- и/или бета-цепи TCR или их вариабельные участки или CDR, и необязательно стабилизированы с помощью дисульфидных связей или ковалентно связаны с помощью линкерной молекулы, например, описанной выше в контексте TCR-конструкций по настоящему изобретению. Например, в типичном случае они не будут содержать трансмембранный участок. При некоторых обстоятельствах аминокислотные модификации в полипептидной последовательности могут быть введены с целью усиления растворимости молекул, и/или коррекции фолдинга и образования пар альфа- и бета-цепей (при необходимости), в частности, при продуцировании в рекомбинантном хозяине, который не обеспечивает вышеупомянутые характеристики. Например, при использовании Е. coli в качестве клеток-хозяев для продуцирования, фолдинг и образование пар альфа- и бета-цепей TCR, как правило, осуществляется in vitro. Таким образом, TCR в соответствии с настоящим изобретением могут содержать, например, дополнительные цистеиновые остатки, описанные в других разделах в данном документе.The TCRs of the present invention may be provided in soluble form. Soluble TCRs are useful as diagnostics and carriers or adapters that specifically target therapeutics or effector cells, for example, to a cancer cell expressing an antigenic target recognized by a soluble TCR. Soluble TCRs (sTCRs) will typically be fragments or constructs containing the TCR alpha and/or beta chains or their variable regions or CDRs, and are optionally disulfide stabilized or covalently linked via a linker molecule, for example, described above in the context of the TCR constructs of the present invention. For example, they will typically not contain a transmembrane region. In some circumstances, amino acid modifications to the polypeptide sequence may be introduced to enhance the solubility of the molecules, and/or correct the folding and pairing of alpha and beta chains (if necessary), in particular when produced in a recombinant host that does not provide the aforementioned characteristics. . For example, when using E. coli as host cells for production, the folding and pairing of TCR alpha and beta chains is typically done in vitro. Thus, TCR in accordance with the present invention may contain, for example, additional cysteine residues described in other sections in this document.
Помимо дополнительных цистеиновых мостиков, другие применимые модификации включают, например, добавление лейциновых змеек и/или последовательностей ухода с рибосомы, например, последовательности 2А из пикорнавируса, описанной в Walseng et al. (2015), PLoS ONE 10(4): e0119559, в целях повышения фолдинга, экспрессии и/или спаривания альфа- и/или бета-цепей TCR.In addition to additional cysteine bridges, other useful modifications include, for example, the addition of leucine snakes and/or ribosome escape sequences, such as the 2A sequence from picornavirus described in Walseng et al. (2015), PLoS ONE 10(4): e0119559, to increase the folding, expression and/or pairing of TCR alpha and/or beta chains.
Модификации.Modifications.
TCR по настоящему изобретению могут дополнительно содержать одну или более модификаций, описанных ниже. Модификации, описанные ниже, как правило, будут представлять собой ковалентные модификации и могут быть выполнены с помощью стандартных методик, известных в данной области. При некоторых обстоятельствах аминокислотные модификации в TCR могут потребоваться с целью облегчения введения указанных модификаций.The TCRs of the present invention may further comprise one or more of the modifications described below. The modifications described below will typically be covalent modifications and can be made using standard techniques known in the art. Under some circumstances, amino acid modifications to the TCR may be required to facilitate the introduction of these modifications.
Метки.Tags.
TCR, в частности (растворимые) TCR по настоящему изобретению, могут быть мечеными. Применимые метки известны в данной области и могут быть связаны с TCR или вариантом TCR с помощью стандартных способов, необязательно с помощью линкеров различной длины. Термин метка или группа для мечения относится к любой детектируемой метке. Как правило, метки разделяются на несколько классов, в зависимости от анализа, в котором они подлежат выявлению; следующие примеры включают без ограничения изотопные метки, которые могут представлять собой радиоактивные или тяжелые изотопы, такие как радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I); магнитные метки (например, магнитные частицы); редокс-активные фрагменты; оптические красители (в том числе без ограничения хромофоры, фосфоры и флуорофоры), такие как флуоресцентные группы (например, FITC, родамин, соединения лантаноидов с фосфором), хемилюминесцентные группы и флуорофоры, которые могут представлять собой как низкомолекулярные флуорофоры, так и белковые флуорофоры; ферментативные группы (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу; биотинилированные группы; или предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парными последовательностями с лейциновыми застежками, связывающими сайтами для вторичных антител, металл-связывающими доменами, эпитопными метками и т.д.). В частности, мечение предусмотрено в том случае, когда TCR, варианты TCR или особенно растворимые TCR-конструкпии (такие как конструкции, содержащие по меньшей мере одну альфа-цепь TCR и/или бета-цепь TCR, описанные в данном документе), предназначены для диагностического применения.TCRs, in particular the (soluble) TCRs of the present invention, may be labeled. Useful labels are known in the art and can be linked to a TCR or TCR variant using standard techniques, optionally using linkers of various lengths. The term label or labeling group refers to any detectable label. As a rule, labels are divided into several classes, depending on the analysis in which they are to be detected; the following examples include, without limitation , isotopic labels, which may be radioactive or heavy isotopes such as radioisotopes or radionuclides (e.g., 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 89 Zr, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131I ); magnetic marks (for example, magnetic particles); redox active fragments; optical dyes (including, but not limited to, chromophores, phosphors, and fluorophores) such as fluorescent groups (eg, FITC, rhodamine, lanthanide-phosphorus compounds), chemiluminescent groups, and fluorophores, which can be both low molecular weight fluorophores and protein fluorophores; enzymatic groups (eg, horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase; biotinylated groups; or predefined polypeptide epitopes recognized by a secondary reporter (eg, paired leucine zipper sequences, binding sites for secondary antibodies, metal-binding domains, epitope labels, etc.) In particular, labeling is contemplated when TCRs, TCR variants, or particularly soluble TCR constructs (such as constructs containing at least one TCR alpha chain and/or TCR beta chain, described in this document) are intended for diagnostic use.
- 11 041624- 11 041624
Функциональные фрагменты.functional snippets.
TCR, в частности растворимые TCR по настоящему изобретению, могут быть модифицированы с помощью присоединения дополнительных функциональных фрагментов, например, для снижения иммуногенности, повышения гидродинамического размера (размера в растворе), растворимости и/или стабильности (например, в результате повышенной защиты к протеолитическому разрушению) и/или увеличения периода полужизни в сыворотке.TCRs, in particular the soluble TCRs of the present invention, can be modified by adding additional functional moieties, e.g., to reduce immunogenicity, increase hydrodynamic size (size in solution), solubility and/or stability (e.g., resulting in increased protection against proteolytic degradation). ) and/or increased serum half-life.
Иллюстративные функциональные фрагменты для применения в соответствии с настоящим изобретением включают пептидные или белковые домены, связывающиеся с другими белками в организме человека (такими как сывороточный альбумин, Fc-участок иммуноглобулина или неонатальный Fcрецептор (FcRn), полипептидные цепи различной длины (например, технология XTEN или ПАСилирование®), небелковые полимеры, в том числе без ограничения различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль (ПЕГилирование), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, или углеводов, таких как гидроксиэтиловый крахмал (например, ГЭСилирование®), или полисиаловая кислота (например, технология PolyXen®).Exemplary functional fragments for use in accordance with the present invention include peptide or protein domains that bind to other proteins in the human body (such as serum albumin, immunoglobulin Fc region or neonatal Fc receptor (FcRn), polypeptide chains of various lengths (for example, XTEN technology or PASylation®), non-protein polymers, including, without limitation, various polyols such as polyethylene glycol (PEGylation), polypropylene glycol, polyoxyalkylenes or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, or carbohydrates such as hydroxyethyl starch (e.g., HESylation®), or polysialic acid (e.g. , PolyXen® technology).
Другие применимые функциональные фрагменты включают суицидальные или предохранительные выключатели, которые могут быть использованы для отключения эффекторных клеток-хозяев, несущих TCR по настоящему изобретению в организме пациента. Примером является предохранительный выключатель индуцибельной каспазы 9 (iCasp9), описанный Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235. Вкратце эффекторные клетки-хозяева модифицируют с помощью хорошо известных способов с целью экспрессии домена каспазы 9, димеризация которого зависит от низкомолекулярного димеризующего препарата, такого как AP1903/CIP, и приводит к быстрой индукции апоптоза в модифицированных эффекторных клетках. Такая система, например, описана в ЕР2173869 (А2). Примеры других суицидальных и предохранительных выключателей известны в данной области, например, тиамидинкиназа простого вируса герпеса (HSV-TK), экспрессия CD20 и последующее истощение с помощью антитела к CD20 или тус-метки (Kieback et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jan 15; 105(2):623-8).Other useful functional fragments include suicide or safety switches, which can be used to turn off the effector host cells carrying the TCR of the present invention in the patient's body. An example is the inducible caspase 9 (iCasp9) safety switch described by Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5:235 Briefly, effector host cells are modified using well known methods to express a caspase 9 domain whose dimerization is dependent on a small molecule dimerizing drug such as AP1903/CIP and results in a rapid induction of apoptosis in the modified effector cells. Such a system is, for example, described in EP2173869 (A2). Examples of other suicidal and safety switches are known in the art, such as herpes simplex virus thiamidine kinase (HSV-TK), CD20 expression and subsequent depletion by anti-CD20 antibody or tys tag (Kieback et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jan 15; 105(2):623-8).
Гликозилирование.Glycosylation.
В данном документе также предусмотрены TCR с измененным паттерном гликозилирования. Как известно в данной области, паттерны гликозилирования могут зависеть от аминокислотной последовательности (например, присутствия или отсутствия определенных аминокислотных остатков, рассматриваемых ниже) и/или клетки-хозяина или организма, в котором белок продуцируется. Гликозилирование полипептидов, как правило, является либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное относится к связыванию углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Добавление N-связанных сайтов гликозилирования к связывающей молекуле легко осуществляется путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более трипептидных последовательностей, выбранных из аспарагин-Х-серина и аспарагин-Х-треонина (где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина). Сайты О-связанного гликозилирования могут быть введены путем добавления или замены одного или более треониновых остатков в исходной последовательности.This document also provides TCR with an altered glycosylation pattern. As is known in the art, glycosylation patterns may depend on the amino acid sequence (eg, the presence or absence of certain amino acid residues discussed below) and/or the host cell or organism in which the protein is produced. Glycosylation of polypeptides is typically either N-linked or O-linked. N-linked refers to the linking of a carbohydrate moiety to the side chain of an aspartic residue. The addition of N-linked glycosylation sites to the binding molecule is easily accomplished by changing the amino acid sequence so that it contains one or more tripeptide sequences selected from asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine (where X is any amino acid other than proline ). O-linked glycosylation sites can be introduced by adding or replacing one or more threonine residues in the original sequence.
Другим средством гликозилирования TCR является химическое или ферментативное связывание гликозидов к белку. В зависимости от используемого способа связывания, сахар(сахара) может(могут) быть присоединен(присоединены) к: (а) аргинину и гистидину, (b) свободным карбоксильным группам, (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, (d) свободным гидроксильным группам, таким как, группы серина, треонина или гидроксипролина, (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глутамина.Another means of TCR glycosylation is the chemical or enzymatic binding of glycosides to the protein. Depending on the binding method used, the sugar(s) may(may) be attached to: (a) arginine and histidine, (b) free carboxyl groups, (c) free sulfhydryl groups such as cysteine groups, (d ) free hydroxyl groups such as serine, threonine or hydroxyproline groups, (e) aromatic residues such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan residues, or (f) glutamine amide group.
Аналогично дегликозилирование (т.е. удаление углеводных фрагментов, присутствующих на связывающей молекуле) можно осуществлять химически, например, в результате воздействия на TCR трифторметансульфоновой кислоты, или ферментативно в результате использования эндо- или экзогликозидаз.Similarly, deglycosylation (ie removal of carbohydrate moieties present on the binding molecule) can be carried out chemically, for example by exposing the TCR to trifluoromethanesulfonic acid, or enzymatically by using endo- or exoglycosidases.
Лекарственные конъюгаты.drug conjugates.
К TCR, в частности к растворимым TCR по настоящему изобретению, также можно добавить лекарственное средство, такое как низкомолекулярное соединение. Связывание можно осуществить с помощью ковалентных связей или нековалентных взаимодействий, например, с помощью электростатических сил. Различные линкеры, известные в данной области, могут быть использованы в целях образования лекарственных конъюгатов.A drug, such as a small molecule, can also be added to the TCRs, in particular the soluble TCRs of the present invention. The bonding can be carried out using covalent bonds or non-covalent interactions, for example, using electrostatic forces. Various linkers known in the art can be used to form drug conjugates.
Метки.Tags.
TCR, в частности растворимые TCR по настоящему изобретению, могут быть модифицированы с введением дополнительных доменов, которые способствуют идентификации, трекингу, очистке и/или выделению соответствующей молекулы (меток). Неограничивающие примеры таких меток включают пептидные мотивы известные как Мус-метка, НАТ-метка, НА-метка, ТАР-метка, GST-метка, хитинсвязывающий домен (CBD-tag), мальтоза-связывающий домен (MBP-tag), Flag-метка, Strep-метка и их варианты (например, Strep II-метка), His-метка, CD20, Her2/neu метки, myc-метка, FLAG-метка, Т7метка, НА(геммаглютинин)-метка или GFP-метка.The TCRs, in particular the soluble TCRs of the present invention, can be modified to include additional domains that aid in the identification, tracking, purification and/or isolation of the relevant molecule(s). Non-limiting examples of such tags include peptide motifs known as Myc tag, HAT tag, HA tag, TAP tag, GST tag, chitin binding domain (CBD tag), maltose binding domain (MBP tag), Flag tag , Strep tag and variants thereof (eg, Strep II tag), His tag, CD20, Her2/neu tags, myc tag, FLAG tag, T7 tag, HA(hemaglutinin) tag, or GFP tag.
- 12 041624- 12 041624
Эпитопные метки являются применимыми примерами меток, которые могут быть включены в TCR по настоящему изобретению. Эпитопные метки представляют собой короткие последовательности аминокислот, которые способствуют связыванию специфического антитела и тем самым обеспечивают идентификацию и трекинг связывания и движения растворимых TCR или клеток-хозяев в организме пациента или культивируемых клетках (хозяевах). Выявление эпитопной метки и, следовательно, меченого TCR может быть достигнуто с помощью ряда различных методик. Примеры таких методик включают иммуногистохимический анализ, иммунопреципитацию, проточную цитометрию, иммунофлуоресцентную микроскопию, ELISA, иммуноблоттинг (вестерн) и аффинную хроматографию. Эпитопные метки, например, могут иметь длину от 6 до 15 аминокислот, в частности от 9 до 11 аминокислот. Также можно включать более одной эпитопной метки в TCR по настоящему изобретению.Epitope tags are useful examples of tags that can be included in the TCR of the present invention. Epitope tags are short sequences of amino acids that facilitate the binding of a specific antibody and thereby allow identification and tracking of the binding and movement of soluble TCRs or host cells in the patient or cultured cells (hosts). Detection of an epitope tag, and therefore a labeled TCR, can be achieved using a number of different techniques. Examples of such techniques include immunohistochemical analysis, immunoprecipitation, flow cytometry, immunofluorescence microscopy, ELISA, Western blotting, and affinity chromatography. Epitope tags, for example, may be 6 to 15 amino acids in length, in particular 9 to 11 amino acids. It is also possible to include more than one epitope tag in a TCR of the present invention.
Метки могут быть дополнительно использованы для стимуляции и экспансии клеток-хозяев, несущих TCR по настоящему изобретению, с помощью культивирования клеток в присутствии связывающих молекул (антител), специфических для указанной метки. Нуклеиновая кислотаLabels can be further used to stimulate and expand host cells bearing the TCR of the present invention by culturing the cells in the presence of binding molecules (antibodies) specific for said label. Nucleic acid
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, описанные в данном документе. В частности, в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие альфа- или бета-цепи TCR, вариабельные участки альфа- или бета-цепей TCR и CDR3-альфа и CDR3-бета TCR, а также варианты, конструкции и фрагменты TCR по настоящему изобретению.The present invention further provides the TCR encoding nucleic acids described herein. In particular, provided herein are polynucleotides encoding TCR alpha or beta chains, TCR alpha or beta chain variable regions, and TCR CDR3 alpha and CDR3 beta, as well as TCR variants, constructs, and fragments of the present invention.
Термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота, используемые в данном документе, включает последовательность полирибонуклеотидов и полидезоксирибонуклеотидов, например, модифицированные или немодифицированные РНК или ДНК, каждую в однонитевой и/или двунитевой форме, линейную или кольцевую, или их смеси, в том числе гибридные молекулы. Таким образом, нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением содержат ДНК (такую как днРНК, онДНК, кДНК), РНК (такую как днРНК, онРНК, мРНК, ivtPHK), их комбинации и их производные (такие как ПНК).The term polynucleotide or nucleic acid as used herein includes a sequence of polyribonucleotides and polydeoxyribonucleotides, e.g., modified or unmodified RNA or DNA, each in single-stranded and/or double-stranded form, linear or circular, or mixtures thereof, including hybrid molecules. Thus, the nucleic acids of the present invention comprise DNA (such as lncRNA, ssRNA, cDNA), RNA (such as lncRNA, sRNA, mRNA, ivtPHK), combinations thereof, and derivatives thereof (such as PNA).
Полинуклеотид может содержать стандартную фосфодиэфирную связь или нестандартную связь (например, амидную связь, такую как встречается в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут также содержать одно или более модифицированных оснований, таких как, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Другие модификации, в том числе химические, ферментативные или метаболические модификации, также допустимы в том случае, если только связывающая молекула по настоящему изобретению может быть экспрессирована из полинуклеотида. Полинуклеотид может быть обеспечен в выделенной форме, описанной в других разделах данного документа. Полинуклеотид может включать регуляторные последовательности, такие как элементы контроля транскрипции (в том числе промоторы, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции), участок связывания рибосомы, интроны и т.п.The polynucleotide may contain a standard phosphodiester bond or a non-standard bond (eg, an amide bond such as occurs in peptide nucleic acids (PNA)). The polynucleotides of the present invention may also contain one or more modified bases such as, for example, tritylated bases and unusual bases such as inosine. Other modifications, including chemical, enzymatic or metabolic modifications, are also acceptable as long as the binding molecule of the present invention can be expressed from a polynucleotide. The polynucleotide may be provided in isolated form as described elsewhere in this document. The polynucleotide may include regulatory sequences such as transcriptional control elements (including promoters, enhancers, operators, repressors, and transcription termination signals), ribosome binding site, introns, and the like.
В частности, в настоящем изобретении предусмотрен полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая по меньшей мере на приблизительно 80, на приблизительно 85, на приблизительно 90, на приблизительно 91, на приблизительно 92, на приблизительно 93, на приблизительно 94, на приблизительно 95, на приблизительно 96, на приблизительно 97, на приблизительно 98, на приблизительно 99 или на 100% идентична эталонной полинуклеотидной последовательности, или состоящий из нее, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.In particular, the present invention provides a polynucleotide comprising a nucleic acid that is at least about 80, about 85, about 90, about 91, about 92, about 93, about 94, about 95, about 96, about 97, about 98, about 99, or 100% identical to, or consisting of, a reference polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30.
Полинуклеотиды, описанные выше, могут содержать или могут не содержать дополнительные или измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие, например, измененные аминокислотные остатки, сигнальный пептид для управления секрецией кодируемого TCR, константных участков или других гетерологичных полипептидов, описанных в данном документе. Таким образом, такие полинуклеотиды могут кодировать слитые полипептиды, фрагменты, варианты и другие производные связывающих молекул, описанных в данном документе.The polynucleotides described above may or may not contain additional or altered nucleotide sequences encoding, for example, altered amino acid residues, a signal peptide to control secretion of the encoded TCR, constant regions, or other heterologous polypeptides described herein. Thus, such polynucleotides may encode fusion polypeptides, fragments, variants, and other derivatives of the binding molecules described herein.
Кроме того, настоящее изобретение включает композиции, содержащие один или более из полинуклеотидов, описанных выше. В данном документе также предусмотрены композиции, содержащие первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, где указанный первый полинуклеотид кодирует вариабельный участок альфа-цепи TCR, описанный в данном документе, и где второй полинуклеотид кодирует вариабельный участок бета-цепи TCR, описанный в данном документе.In addition, the present invention includes compositions containing one or more of the polynucleotides described above. Also provided herein are compositions comprising a first polynucleotide and a second polynucleotide, wherein said first polynucleotide encodes the TCR alpha chain variable region described herein and wherein the second polynucleotide encodes the TCR beta chain variable region described herein.
Последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть кодоноптимизированными для оптимальной экспрессии в требуемой клетке-хозяине, например, лимфоците человека; или для экспрессии в клетках бактерий, дрожжей или насекомых, которые особенно предпочтительны для экспрессии растворимых TCR по настоящему изобретению. Кодон-оптимизация относится к замене в представляющей интерес последовательности кодонов, которые, как правило, редко встречаются в высокоэкспрессируемых генах определенного вида, на кодоны, которые, как правило, часто встречаются в высокоэкспрессируемых генах таких видов, при этом такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и кодоны, которые заменяются. Таким образом, выбор оптимальных кодонов зависит от использования кодонов генома хозяина и присутствия нескольких желательных и нежелательных мотивов последовательности.The nucleic acid sequences of the present invention can be codon-optimized for optimal expression in the desired host cell, eg, a human lymphocyte; or for expression in bacterial, yeast or insect cells, which are particularly preferred for the expression of soluble TCRs of the present invention. Codon optimization refers to the substitution of a sequence of interest for codons that are typically rare in highly expressed genes of a particular species with codons that are typically frequent in highly expressed genes of that species, such codons encoding the same amino acids as the codons that are replaced. Thus, the choice of optimal codons depends on the codon usage of the host genome and the presence of several desirable and undesirable sequence motifs.
Вектор.Vector.
В данном документе дополнительно предусмотрен вектор, содержащий один или более из полинук- 13 041624 леотидов, описанных в данном документе. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, используемую для переноса (чужеродного) генетического материала в клетку-хозяина, где он может, например, быть реплицирован и/или экспрессирован.This document further provides a vector containing one or more of the polynucleotides described herein. A vector is a nucleic acid molecule used to transfer (foreign) genetic material into a host cell where it can, for example, be replicated and/or expressed.
Термин вектор охватывает без ограничения плазмиды, вирусные векторы (в том числе ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе вируса полиомиелита и аденовирус-ассоциированные векторы (AAV)), фаги, фагмиды, космиды и искусственные хромосомы (в том числе ВАС и YAC). Собственно вектор, как правило, представляет собой нуклеотидную последовательность, обычно последовательность ДНК, которая содержит вставку (трансген) и более длинную последовательность, которая выступает в качестве остова вектора. Сконструированные векторы, как правило, содержат точку начала репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах (если требуется стабильная экспрессия полинуклеотида), селективные маркеры и сайты для расщепления рестриктазами (например, сайт множественного клонирования, MCS). Вектор может дополнительно содержать промоторы, генетические маркеры, репортерные гены, нацеливающие последовательности и/или метки для очистки белка. Как известно специалистам в данной области, большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области и многие являются коммерчески доступными. Примеры подходящих векторов предусмотрены в J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012) и включают в себя следующие.The term vector includes, without limitation, plasmids, viral vectors (including retroviral vectors, lentiviral vectors, adenovirus vectors, vaccinia virus vectors, polio virus vectors, and adenovirus-associated vectors (AAV)), phages, phagemids, cosmids, and artificial chromosomes (including BAC and YAC). The vector itself is typically a nucleotide sequence, usually a DNA sequence, that contains an insert (transgene) and a longer sequence that acts as the backbone of the vector. Constructed vectors typically contain an origin of replication for autonomous replication in host cells (if stable expression of the polynucleotide is desired), selectable markers, and restriction enzyme cleavage sites (eg, multiple cloning site, MCS). The vector may further contain promoters, genetic markers, reporter genes, targeting sequences, and/or protein purification tags. As is known to those skilled in the art, a large number of suitable vectors are known to those skilled in the art and many are commercially available. Examples of suitable vectors are provided in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012) and include the following.
Направленные векторы.Directional vectors.
Направленные векторы можно использовать для интеграции полинуклеотида в хромосому клеткихозяина с помощью способов, известных в данной области, таких как описаны J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012). Вкратце, подходящие средства включают в себя гомологическую рекомбинацию или использование гибридной рекомбиназы, которая специфически целенаправленно воздействует на последовательности в участках интеграции. Направленные векторы, как правило, являются кольцевыми или линеаризованными перед использованием для гомологической рекомбинации. В качестве альтернативы чужеродные полинуклеотиды могут представлять собой фрагменты ДНК, соединенные с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами, или синтетически сконструированные фрагменты ДНК, которые затем рекомбинируют в клетку-хозяина. Также можно использовать гетерологическую рекомбинацию, которая приводит к случайной или нецелевой интеграции.Targeted vectors can be used to integrate a polynucleotide into a host cell chromosome using methods known in the art such as those described by J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press , New York (2012). Briefly, suitable means include homologous recombination or the use of a hybrid recombinase that specifically targets sequences at integration sites. Targeted vectors are typically circular or linearized before being used for homologous recombination. Alternatively, the foreign polynucleotides can be DNA fragments linked by PCR with overlapping primers or synthetically engineered DNA fragments that are then recombined into the host cell. You can also use heterologous recombination, which leads to random or non-targeted integration.
В настоящем изобретении также предусмотрен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе.The present invention also provides a vector containing the nucleic acid described in this document.
Векторы экспрессии.Expression vectors.
Вектор по настоящему изобретению может также представлять собой вектор экспрессии. Векторы экспрессии или конструкции для экспрессии можно применять для транскрипции гетерологичных нуклеотидных последовательностей, например, таких последовательностей, которые кодируют TCR по настоящему изобретению, и трансляции своей мРНК в подходящей клетке-хозяине. Этот процесс также называется как экспрессия TCR по настоящему изобретению.The vector of the present invention may also be an expression vector. Expression vectors or expression constructs can be used to transcribe heterologous nucleotide sequences, such as those that encode the TCRs of the present invention, and translate their mRNA in a suitable host cell. This process is also referred to as TCR expression of the present invention.
Помимо точки начала репликации, селективных маркеров и участков расщепления рестриктазами, векторы экспрессии, как правило, включают в себя одну или более регуляторных последовательностей, функционально связанных с гетерологичным полинуклеотидом, подлежащим экспрессии.In addition to the origin of replication, selectable markers, and restriction cleavage sites, expression vectors typically include one or more regulatory sequences operably linked to the heterologous polynucleotide to be expressed.
Термин регуляторная последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, необходимой для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности (гетерологичного) полинуклеотида в определенных организме-хозяине или клетке-хозяине, и таким образом включает регуляторные последовательности транскрипции и трансляции. Как правило, регуляторные последовательности, требующиеся для экспрессии гетерологичных полинуклеотидных последовательностей в прокариотах, включают в себя промотор(промоторы), необязательно последовательность(последовательности) оператора(операторов) и участок(участки) связывания рибосом. У эукариот, как правило, требуются промоторы, сигналы полиаденилирования, энхансеры и необязательно сигналы сплайсинга. Кроме того, специфические сигналы инициации и секреторные сигналы могут быть введены в вектор для обеспечения секреции полипептида, представляющего интерес, в среду для культивирования.The term regulatory sequence refers to a nucleic acid sequence necessary for the expression of an operably linked (heterologous) polynucleotide coding sequence in a specified host organism or host cell, and thus includes transcriptional and translational regulatory sequences. Typically, regulatory sequences required for the expression of heterologous polynucleotide sequences in prokaryotes include promoter(s), optional operator(s) sequence(s), and ribosome binding site(s). Eukaryotes generally require promoters, polyadenylation signals, enhancers, and optional splicing signals. In addition, specific initiation and secretory signals may be introduced into the vector to allow secretion of the polypeptide of interest into the culture medium.
Нуклеиновая кислота является функционально связанной, если она размещена в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, в частности на одной и той же полинуклеотидной молекуле. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью гетер ологичного гена, если он способен воздействовать на экспрессию этой кодирующей последовательности. Промотор, как правило, расположен выше гена, кодирующего полинуклеотид, представляющий интерес, и регулирует экспрессию указанного гена.A nucleic acid is operably linked if it is placed in an operative relationship with another nucleic acid sequence, in particular on the same polynucleotide molecule. For example, a promoter is operably linked to the coding sequence of a heterologous gene if it is capable of affecting the expression of that coding sequence. The promoter is usually located upstream of the gene encoding the polynucleotide of interest, and regulates the expression of the specified gene.
Иллюстративные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вируса обезьян 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и вируса полиомиелита. Как изло- 14 041624 жено ранее, векторы экспресии также могут включать точки начала репликации и селективные маркеры.Exemplary regulatory sequences for expression in a mammalian host cell include viral elements that drive high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and/or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) (such as the CMV promoter/enhancer), monkey virus 40 (SV40) (such as the SV40 promoter/enhancer), adenovirus (eg, adenovirus major late promoter (AdMLP)) and poliovirus. As previously discussed, expression vectors may also include origins of replication and selectable markers.
Как упомянуто ранее, векторы по настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или более селективных маркеров. Подходящие селективные маркеры для применения с эукариотическими клетками-хозяевами включают без ограничения гены тимидинкиназы (tk) простого вируса герпеса, гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (hgprt) и аденинфосфорибозилтрансферазы (aprt). Другие гены включают в себя dhfr (ген устойчивости к метотрексату), gpt (ген устойчивости к микофеноловой кислоте), пео (ген устойчивости к G-418) и hygro (ген устойчивости к гидромицину). Для повышения уровней экспрессии можно использовать амплификацию вектора. Как правило, ген селективного маркера можно быть либо непосредственно связан с полинуклеотидными последовательностями, подлежащими экспрессии, либо введен в ту же клетку-хозяину в результате совместной трансформации.As mentioned earlier, the vectors of the present invention may additionally contain one or more selectable markers. Suitable selectable markers for use with eukaryotic host cells include, but are not limited to, the herpes simplex virus thymidine kinase (tk), hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (hgprt) and adenine phosphoribosyl transferase (aprt) genes. Other genes include dhfr (methotrexate resistance gene), gpt (mycophenolic acid resistance gene), peo (G-418 resistance gene) and hygro (hydromycin resistance gene). Vector amplification can be used to increase expression levels. Typically, the selectable marker gene can either be directly linked to the polynucleotide sequences to be expressed, or introduced into the same host cell by co-transformation.
В связи с вышеизложенным, в настоящем изобретении также дополнительно предусмотрены одна или более нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, вставленных в вектор (т.е. содержащихся в векторе). В частности, в настоящем изобретении предусмотрены (реплицируемые) векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую TCR по настоящему изобретению, или его альфа- или бета-цепь, или вариабельный домен альфа- или бета-цепи, или CDR3-альфа или CDR3-бета, функционально связанные с промотором.In connection with the foregoing, the present invention also additionally provides one or more of the nucleotide sequences described herein, inserted into a vector (ie contained in the vector). In particular, the present invention provides (replicable) vectors containing the nucleotide sequence encoding the TCR of the present invention, or its alpha or beta chain, or the variable domain of the alpha or beta chain, or CDR3-alpha or CDR3-beta, functionally linked to the promoter.
Специалист в данной области сможет легко выбрать подходящий вектор экспрессии на основе, например, клетки-хозяина, предусмотренной для экспрессии TCR. Примеры подходящих векторов экспрессии представляют собой вирусные векторы, такие как ретровирусные векторы, например, векторы на основе МР71 или SIN-векторы на основе ретровирусов; и лентивирусные векторы или SIN-векторы на основе лентивирусов. Вирусные векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие TCR по настоящему изобретению, например, способны инфицировать лимфоциты, которые, как предусмотрено, затем экспрессируют гетерологичный TCR. Другим примером подходящего вектора экспрессии является плазмидная система ДНК транспозазы транспозона Sleeping Beauty (SB), плазмида ДНК SB. Нуклеиновые кислоты и/или, в частности, конструкции экспрессии по настоящему изобретению также могут быть перенесены в клетки в результате транзиентной трансфекции РНК.A person skilled in the art will be able to easily select a suitable expression vector based on, for example, the host cell provided for TCR expression. Examples of suitable expression vectors are viral vectors such as retroviral vectors, eg MP71-based vectors or retrovirus-based SIN vectors; and lentiviral vectors or lentivirus-based SIN vectors. Viral vectors containing the polynucleotides encoding the TCRs of the present invention are, for example, capable of infecting lymphocytes, which, as intended, then express the heterologous TCR. Another example of a suitable expression vector is the Sleeping Beauty transposon (SB) transposon DNA plasmid system, DNA plasmid SB. The nucleic acids and/or in particular the expression constructs of the present invention can also be transferred into cells by transient RNA transfection.
В настоящее время вирусные векторы для нативной экспрессии TCR в типичном случае связывают гены альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR в одном векторе либо с помощью последовательности внутреннего участка связывания рибосомы (IRES), либо последовательности 2А-пептида, происходящего из тесковируса свиней, приводя к экспрессии в одной молекуле матричной РНК (мРНК) под контролем промотора вируса в трансдуцированной клетке.Currently, viral vectors for native expression of TCR typically bind the TCR alpha chain and TCR beta chain genes in a single vector, either with an internal ribosome binding site (IRES) sequence or a porcine tescovirus-derived 2A peptide sequence, resulting in to expression in one molecule of messenger RNA (mRNA) under the control of the virus promoter in the transduced cell.
Клетка-хозяин.Host cell.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена клетка-хозяин, содержащая TCR, нуклеиновую кислоту или вектор, описанный в данном документе.The present invention further provides a host cell containing the TCR, nucleic acid or vector described herein.
Множество клеток-хозяев может быть использовано в соответствии с настоящим изобретением. Используемый в данном документе термин клетка-хозяин охватывает клетки, которые могут представлять собой реципиентов полинуклеотидов или векторов, описанных в данном документе, или были такими, и/или экспрессируют (и необязательно секретируют) TCR по настоящему изобретению. Термины клетка и клеточная культура используются взаимозаменяемо для определения источника TCR, если четко не указано иное. Термин клетка-хозяин также включает линии клеток-хозяевов.Many host cells can be used in accordance with the present invention. As used herein, the term host cell encompasses cells that may or have been recipients of the polynucleotides or vectors described herein and/or express (and optionally secrete) the TCRs of the present invention. The terms cell and cell culture are used interchangeably to define the source of the TCR unless clearly stated otherwise. The term host cell also includes host cell lines.
Как правило, термин клетка-хозяин включает прокариотические или эукариотические клетки, а также включает без ограничения бактериальные клетки, клетки дрожжей, растительные клетки и клетки животных, такие как клетки насекомых и клетки млекопитающих, например, клетки мыши, крысы, макаки или человека.Generally, the term host cell includes prokaryotic or eukaryotic cells, and also includes, without limitation, bacterial cells, yeast cells, plant cells, and animal cells such as insect cells and mammalian cells, such as mouse, rat, macaque, or human cells.
В связи с вышеизложенным, таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены, в частности, клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид или вектор, например, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую TCR или TCR-конструкцию, описанную в данном документе.In connection with the foregoing, therefore, the present invention provides, in particular, host cells containing a polynucleotide or a vector, for example, an expression vector containing a polynucleotide sequence encoding a TCR or a TCR construct described herein.
Полинуклеотиды и/или векторы по настоящему изобретению можно вводить в клетки-хозяева с помощью стандартных способов, известных в данной области, например, трансфекции, трансформации и т.п.The polynucleotides and/or vectors of the present invention can be introduced into host cells using standard methods known in the art, eg, transfection, transformation, and the like.
Трансфекция представляет собой процесс намеренного введения молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (в том числе векторов) в целевые клетки. Пример представляет собой трансфекцию РНК, т.е. процесс введения РНК (такой как транскрибированной in vitro РНК, ivtPHK) в клетку-хозяина. Термин главным образом используется для невирусных способов в эукариотических клетках. Термин трансдукция часто используется для описания опосредованного вирусом переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов. Трансфекция клеток животных, как правило, включает открытие транзиентных пор или отверстий в клеточной мембране для обеспечения захвата материала. Трансфекцию можно проводить с использованием фосфата кальция, путем электропорации, путем сжатия клетки или с использованием катионного липида с материалом для получения липосом, которые сливаются с клеточной мембраной и депонируют свой груз внутри. Иллюстративные методики переноса в эукариотические клетки-хозяева включают опосредованный липидными пузырьками захват, опосредованный теп- 15 041624 ловым шоком захват, опосредованная фосфатом кальция трансфекция (фосфат кальция/копреципитапияTransfection is the process of intentionally introducing nucleic acid molecules or polynucleotides (including vectors) into target cells. An example is RNA transfection, ie. the process of introducing an RNA (such as in vitro transcribed RNA, ivtRNA) into a host cell. The term is mainly used for non-viral methods in eukaryotic cells. The term transduction is often used to describe the virus-mediated transfer of nucleic acid molecules or polynucleotides. Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or holes in the cell membrane to allow material to be entrapped. Transfection can be carried out using calcium phosphate, by electroporation, by cell compression, or by using a cationic lipid with material to produce liposomes that fuse with the cell membrane and deposit their cargo inside. Exemplary techniques for transfer into eukaryotic host cells include lipid vesicle-mediated uptake, heat shock-mediated uptake, calcium phosphate-mediated transfection (calcium phosphate/coprecipitapy
ДНК), микроинъекцию и электропорацию.DNA), microinjection and electroporation.
Термин трансформация используется для описания невирусного переноса молекул нуклеиновой кислоты или полинуклеотидов (в том числе векторов) в бактерии, а также в эукариотические клетки помимо животных, в том числе растительные клетки. Таким образом, трансформация представляет собой генетическое изменение бактериальной или эукариотической клетки, происходящей не от животного, полученное в результате прямого переноса через клеточную(клеточные) мембрану(мембраны) из ее окружения и последующего включения экзогенного генетического материала (молекул нуклеиновой кислоты). На трансформацию можно воздействовать различными искусственными средствами. Чтобы трансформация произошла, клетки или бактерии должны пребывать в состоянии компетентности, которое может происходить в виде ограниченного во времени ответа на условия окружающей среды, такие как голодание или плотность клеток. В случае прокариотической трансформации методики могут включать опосредованный тепловым шоком захват, слияние бактериального протопласта с интактными клетками, микроинъекцию и электропорацию. Методики в случае растительной трансформации включают опосредованный Agrobacterium перенос, например, A. tumefaciens, быстро двигающиеся микрочастицы вольфрама или золота, электропорацию, микроинъекцию и опосредованный полиэтиленгликолем захват.The term transformation is used to describe the non-viral transfer of nucleic acid molecules or polynucleotides (including vectors) into bacteria, as well as into eukaryotic cells other than animals, including plant cells. Thus, transformation is a genetic change in a non-animal bacterial or eukaryotic cell resulting from direct transfer through the cell membrane(s) from its environment and subsequent incorporation of exogenous genetic material (nucleic acid molecules). Transformation can be influenced by various artificial means. For transformation to occur, cells or bacteria must be in a state of competence, which can occur as a time-limited response to environmental conditions such as starvation or cell density. In the case of prokaryotic transformation, techniques may include heat shock-mediated capture, fusion of the bacterial protoplast with intact cells, microinjection, and electroporation. Techniques for plant transformation include Agrobacterium mediated transfer, eg A. tumefaciens, fast moving tungsten or gold microparticles, electroporation, microinjection, and polyethylene glycol mediated capture.
Таким образом, ввиду вышеизложенного в настоящем изобретении дополнительно предусмотрены клетки-хозяева, содержащие, по меньшей мере, полинуклеотидную последовательность и/или вектор, описываемые в данном документе.Thus, in view of the foregoing, the present invention further provides host cells comprising at least the polynucleotide sequence and/or vector described herein.
В случае экспрессии TCR по настоящему изобретению клетку-хозяина можно выбрать таким образом, что она модулирует экспрессию встроенных полинуклеотидных последовательностей, и/или модифицирует и осуществляет процессинг генного продукта (т.е. РНК и/или белка), если это необходимо. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) генных продуктов могут быть важными для функции TCR. Различные клетки-хозяева имеют характеристики и определенные механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы-хозяева могут быть выбраны с целью обеспечения надлежащих модификации и процессинга продукта. В связи с этим можно применять эукариотические клеткихозяева, которые обладают клеточным аппаратом для надлежащих процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта.In the case of TCR expression of the present invention, the host cell can be chosen to modulate the expression of the inserted polynucleotide sequences, and/or modify and process the gene product (i.e., RNA and/or protein), if necessary. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of gene products may be important for TCR function. Various host cells have characteristics and specific mechanisms for post-translational processing and modification of gene products. Suitable cell lines or host systems may be selected to ensure proper modification and processing of the product. In this regard, eukaryotic host cells that possess the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation, and phosphorylation of the gene product can be used.
В данном документе предусмотрено обеспечение: (а) клеток-хозяев для экспрессии и получения TCR по настоящему изобретению, в частности, в растворимой форме (клетки-хозяева для продуцирования) и (b) клеток-хозяев, экспрессирующих TCR по настоящему изобретению и имеющих эффекторную функцию (эффекторные клетки-хозяева). Такие эффекторные клетки-хозяева являются особенно пригодными для применений в терапии и предусмотрены для введения нуждающемуся в этом субъекту. Предпочтительные эффекторные клетки-хозяева включают лимфоциты, такие как цитотоксические Тлимфоциты (CTL), CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/дельта-Т-клетки.Provided herein are: (a) host cells for expressing and producing the TCR of the present invention, particularly in soluble form (producing host cells) and (b) host cells expressing the TCR of the present invention and having an effector function (effector host cells). Such effector host cells are particularly suitable for therapeutic applications and are contemplated for administration to a subject in need thereof. Preferred effector host cells include lymphocytes such as cytotoxic T lymphocytes (CTL), CD8+ T cells, CD4+ T cells, natural killer (NK) cells, natural killer (NKT) T cells, gamma/delta T cells.
Клетка-хозяин для продуцирования.Production host cell.
Клетки.Cells.
Клетки-хозяева для продуцирования, используемые для экспрессии растворимых TCR по настоящему изобретению, предпочтительно способны экспрессировать высокие количества рекомбинантного белка.The production host cells used to express the soluble TCRs of the present invention are preferably capable of expressing high amounts of the recombinant protein.
Иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих, которые могут быть использованы в качестве клеток-хозяев для продуцирования включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО), в том числе дефектные по DHFR клетки СНО, такие как клетки DG44 и DUXB1 1, NSO, COS (производное CVI с Т-антигеном SV40), HEK293 (почка человека) и SP2 (миелома мыши). Другие иллюстративные линии клеток-хозяев включают без ограничения HELA (карцинома шейки матки человека), CVI (линия клеток почки обезьян), VERY, ВНК (почка новорожденного хомячка), MDCK, 293, WI38, R1610 (фибробласт китайского хомячка), BALBC/3T3 (фибробласт мыши), HAK (линия клеток почки хомячка), P3x63-Ag3.653 (миелома мыши), BFA-IcIBPT (эндотелиальные клетки крупного рогатого скота) и RAJI (лимфоциты человека). Линии клеток-хозяев, как правило, доступны из коммерческих служб, Американской коллекции тканевых культур (АТСС) или из опубликованной литературы.Exemplary mammalian host cells that can be used as host cells for production include Chinese Hamster Ovary (CHO cells), including DHFR-defective CHO cells such as DG44 and DUXB1 1 cells, NSO, COS (derived from CVI with T-antigen SV40), HEK293 (human kidney) and SP2 (mouse myeloma). Other illustrative host cell lines include, without limitation, HELA (human cervical carcinoma), CVI (monkey kidney cell line), VERY, BHK (newborn hamster kidney), MDCK, 293, WI38, R1610 (Chinese hamster fibroblast), BALBC/3T3 (mouse fibroblast), HAK (hamster kidney cell line), P3x63-Ag3.653 (mouse myeloma), BFA-IcIBPT (bovine endothelial cells), and RAJI (human lymphocytes). Host cell lines are generally available from commercial services, the American Tissue Culture Collection (ATCC) or from the published literature.
Клетки, отличные от клеток млекопитающих, такие как клетки бактерий, дрожжей, насекомых или растений также легко доступны и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев для продуцирования, описанных в данном документе. Иллюстративные бактериальные клетки-хозяева включают Enterobacteriaceae, такие как Escherichia coli, Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenza. Другие клетки-хозяева включают клетки дрожжевых грибов, такие как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Клетки насекомых включают без ограничения клетки Spodoptera frugiperda.Cells other than mammalian cells such as bacterial, yeast, insect or plant cells are also readily available and can be used as host cells for the production described herein. Exemplary bacterial host cells include Enterobacteriaceae such as Escherichia coli, Salmonella; Bacillaceae such as Bacillus subtilis; pneumococcus; Streptococcus and Haemophilus influenzae. Other host cells include yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris. Insect cells include, without limitation, Spodoptera frugiperda cells.
В соответствии с вышеизложенным приемлемые системы экспрессии (т.е. клетки-хозяева, содержащие вышеописанный вектор экспрессии) включают микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli, В. subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, векторами экспрессии наAccording to the above, suitable expression systems (i.e., host cells containing the expression vector described above) include microorganisms such as bacteria (e.g., E. coli, B. subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, expression vectors on
- 16 041624 основе плазмидной ДНК плазмиды или космидной ДНК; дрожжевые клетки (например, Saccharomyces, Pichia), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжевых клеток; системы на основе клеток насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловируса); системы на основе растительных клеток, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Ti-плазмиды). Часто предпочтительными являются системы экспрессии млекопитающих, несущие рекомбинантные конструкции для экспрессии, содержащие промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; 7.5К-промотор вируса осповакцины, главный промотор немедленно раннего ответа (CMV) цитомегаловируса (MIEP)). Подходящие клетки-хозяева млекопитающих могут быть выбраны из известных клеточных линий (например, клеток COS, CHO, BLK, 293, 3Т3), однако также приемлемо использовать лимфоциты, такие как цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), CD8+ Тклетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/ дельта-Т-клеток.- 16 041624 based on plasmid DNA plasmid or cosmid DNA; yeast cells (eg Saccharomyces, Pichia) transformed with recombinant yeast cell expression vectors; insect cell systems infected with recombinant viral expression vectors (eg, baculovirus); plant cell systems infected with recombinant viral expression vectors (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or transformed with recombinant plasmid expression vectors (eg, Ti plasmids). Often preferred are mammalian expression systems carrying recombinant expression constructs containing promoters derived from the mammalian genome (e.g. metallothionein promoter) or from mammalian viruses (e.g. adenovirus late promoter; vaccinia virus 7.5K promoter, immediate early response major promoter (CMV) cytomegalovirus (MIEP)). Suitable mammalian host cells may be selected from known cell lines (e.g., COS, CHO, BLK, 293, 3T3 cells), however, it is also acceptable to use lymphocytes such as cytotoxic T lymphocytes (CTL), CD8+ T cells, CD4+ T cells , natural killer (NK) cells, natural killer (NKT) T cells, gamma/delta T cells.
В соответствии с вышеизложенными в настоящем изобретении также предусмотрен способ продуцирования и получения TCR, описанного в данном документе, предусматривающий стадии (i) инкубации клетки-хозяина (т.е. клетки-хозяина для продуцирования) в условиях, вызывающих экспрессию указанного TCR, и (ii) очистки указанного TCR.In accordance with the foregoing, the present invention also provides a method for producing and obtaining a TCR described herein, comprising the steps of (i) incubating a host cell (i.e., a host cell for production) under conditions that cause the expression of said TCR, and ( ii) purifying said TCR.
Культивирование.Cultivation.
Клетки-хозяева, несущие вектор экспрессии, выращивают в условиях, подходящих для продуцирования TCR, предусмотренных в данном документе, в частности альфа-цепей и/или бета-цепей, описанных в других разделах данного документа, и проводят анализ на предмет синтеза белков альфа- и/или бета-цепи. В случае экспрессии двуцепочечных TCR векторы, кодирующие как альфа-, так и бета-цепи, могут быть совместно экспрессированы в клетке-хозяине для экспрессии целой молекулы.Host cells carrying the expression vector are grown under conditions suitable for the production of TCRs provided herein, in particular the alpha chains and/or beta chains described elsewhere in this document, and analyzed for the synthesis of alpha- and/or beta chains. In the case of expression of double-stranded TCRs, vectors encoding both the alpha and beta chains can be co-expressed in the host cell to express the entire molecule.
Очистка.Cleaning.
После экспрессии TCR по настоящему изобретению он может быть очищен с помощью любого способа очистки, известного в данной области, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной хроматографии (например, хроматографии с гидроксиапатитом), аффинной хроматографии, в частности аффинной хроматографии на основе связывания с белком А, белком G или лектином, эксклюзионной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости, хроматографии с гидрофобным взаимодействием или с помощью любой другой стандартной методики для очистки белков. Специалисты в данной области смогут легко выбрать подходящий способ очистки на основе индивидуальных характеристик TCR, подлежащего извлечению.Once the TCR of the present invention has been expressed, it can be purified by any purification method known in the art, such as chromatography (e.g., ion exchange chromatography (e.g., hydroxyapatite chromatography), affinity chromatography, in particular affinity chromatography based on binding to protein A, protein G, or lectin, size exclusion chromatography), centrifugation, differential solubility, hydrophobic interaction chromatography, or any other standard technique for protein purification. Those skilled in the art will readily be able to select an appropriate purification method based on the individual characteristics of the TCR to be recovered.
Эффекторная клетка-хозяин.effector host cell.
Как упоминалось ранее, в настоящем изобретении также предусмотрены эффекторные клеткихозяева, содержащие нуклеотидную последовательность, вектор или TCR по настоящему изобретению. Указанные эффекторные клетки-хозяева модифицируют с помощью стандартных способов для того, чтобы они содержали последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR по настоящему изобретению, и они предусмотрены для экспрессии TCR, описанного в данном документе, в частности, на поверхности клеток. Для целей настоящего изобретения термин модифицированные клетки-хозяева, экспрессирующие TCR по настоящему изобретению, как правило, относится к клеткам-хозяева (эффекторным или для продуцирования), обработанным или измененным с целью экспрессии TCR в соответствии с настоящим изобретением, например, с помощью РНК-трансфекции, описанной в прилагаемых примерах. Также предусмотрены другие способы модификации, или трансфекции, или трансдукции, такие как описанные в других разделах данного документа. Таким образом, термин модифицированная клетка-хозяин включает трансфицированные, трансдуцированные и генетически сконструированные клетки-хозяева, предпочтительно экспрессирующие TCR по настоящему изобретению.As previously mentioned, the present invention also provides host effector cells comprising the nucleotide sequence, vector, or TCR of the present invention. Said effector host cells are modified by standard methods to contain the nucleic acid sequences encoding the TCR of the present invention and are designed to express the TCR described herein, in particular on the cell surface. For the purposes of the present invention, the term modified host cells expressing the TCR of the present invention generally refers to host cells (effector or for production) treated or altered to express the TCR in accordance with the present invention, for example, with RNA- transfection described in the attached examples. Other methods of modification, or transfection, or transduction are also contemplated, such as those described elsewhere in this document. Thus, the term modified host cell includes transfected, transduced and genetically engineered host cells preferably expressing the TCR of the present invention.
Предпочтительно такие (модифицированные) эффекторные клетки-хозяева (в частности, (модифицированные) эффекторные лимфоциты) способны опосредовать эффекторные функции за счет внутриклеточной передачи сигнала при связывании TCR со своей специфической антигенной мишенью. Такие эффекторные функции включают, например, высвобождение перфорина (которые создает отверстия в мембране клетки-мишени), гранзимов (которые представляют собой протеазы, действующие внутри клетки с активацией апоптоза), экспрессию Fas-лиганда (который активирует апоптоз в Fas-несущей клетке-мишени) и высвобождение цитокинов, предпочтительно цитокинов Th1/Tc1, таких как IFN-γ, IL-2 и TNF-α. Таким образом, эффекторная клетка-хозяин, сконструированная для экспрессии TCR по настоящему изобретению, которая способна распознавать и связываться со своей антигенной мишенью у субъекта, подлежащего лечению, предусмотрена для осуществления вышеупомянутых эффекторных функций, за счет чего уничтожаются клетки-мишени (например, раковые). Цитолиз целевых клеток можно оценить, например, с помощью флуоресцентного киллинг-анализа CTL (CTL, США), выявляюще- 17 041624 го исчезновение флуоресцентно меченых целевых клеток в ходе совместного культивирования с TCRтрансфицированными реципиентными Т-клетками.Preferably, such (modified) effector host cells (in particular, (modified) effector lymphocytes) are capable of mediating effector functions by intracellular signaling when the TCR binds to its specific antigenic target. Such effector functions include, for example, the release of perforin (which creates holes in the membrane of the target cell), granzymes (which are proteases that act inside the cell to activate apoptosis), Fas ligand expression (which activates apoptosis in the Fas-bearing target cell ) and release of cytokines, preferably Th1/Tc1 cytokines such as IFN-γ, IL-2 and TNF-α. Thus, an effector host cell engineered to express the TCR of the present invention, which is capable of recognizing and binding to its antigenic target in the subject to be treated, is provided to perform the above effector functions, whereby target cells (e.g., cancer cells) are destroyed. . Cytolysis of target cells can be assessed, for example, using the CTL fluorescent killing assay (CTL, USA), which detects the disappearance of fluorescently labeled target cells during co-culturing with TCR-transfected recipient T cells.
В связи с вышеизложенным эффекторные клетки-хозяева предпочтительно экспрессируют функциональный TCR, т.е. который, как правило, содержит альфа- и бета-цепь TCR, описанные в данном документе; а также субъединицы для трансдуцирования сигнала CD3-гамма, дельта, эпсилон и зета (CD3комплекс). Кроме того, также может потребоваться экспрессия корецепторов CD4 или CD8. Как правило, лимфоциты, несущие требуемые гены, вовлеченные в связывание антигена, активацию рецептора и нисходящую передачу сигнала (например, Lck, FYN, CD45 и/или Zap70) Т-клетки, являются особенно подходящими в качестве эффекторных клеток-хозяев. Однако в данном документе также предусмотрены эффекторные клетки-хозяева, экспрессирующие TCR по настоящему изобретению в качестве связывающего домена без субъединицы трансдуцирования сигнала CD3 и/или вышеупомянутых нисходящих сигнальных молекул (т.е. способных распознавать антигенную мишень, описанную в данном документе, но, не влияя на функции, опосредуемые CD3 и/или вышеупомянутыми нисходящими сигнальными молекулами). Такие эффекторные клетки предусмотрены для возможности распознавания антигенной мишени, описанной в данном документе, и необязательного воздействия на другие функции, не ассоциированные с передачей сигнала с помощью CD3 и/или передачей сигнала вышеупомянутыми нисходящими сигнальными молекулами. Примеры включают NK- или NKT-клетки, экспрессирующие TCR по настоящему изобретению, способные, например, высвобождать цитотоксические гранулы при распознавании своей антигенной мишени.In connection with the foregoing, effector host cells preferentially express a functional TCR, ie. which, as a rule, contains the alpha and beta chain of the TCR described in this document; as well as subunits for signal transduction CD3-gamma, delta, epsilon and zeta (CD3 complex). In addition, the expression of CD4 or CD8 co-receptors may also be required. In general, lymphocytes carrying the desired genes involved in antigen binding, receptor activation, and downstream signaling (eg, Lck, FYN, CD45 and/or Zap70) T cells are particularly suitable as effector host cells. However, this document also provides effector host cells expressing the TCR of the present invention as a binding domain without the CD3 signal transduction subunit and/or the aforementioned downstream signaling molecules (i.e., capable of recognizing the antigenic target described herein, but not affecting functions mediated by CD3 and/or the aforementioned downstream signaling molecules). Such effector cells are provided to allow recognition of the antigenic target described herein and optionally affect other functions not associated with signaling by CD3 and/or signaling by the aforementioned downstream signaling molecules. Examples include NK or NKT cells expressing the TCR of the present invention capable of, for example, releasing cytotoxic granules upon recognition of their antigenic target.
Таким образом, цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), CD8+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, естественные киллерные (NK) клетки, естественные киллерные (NKT) Т-клетки, гамма/дельта-Т-клетки считаются применимыми лимфоцитарными эффекторными клетками-хозяевами. Такие лимфоциты, экспрессирующие рекомбинантный TCR по настоящему изобретению, также обозначены в данном документе как модифицированные эффекторные лимфоциты. Однако специалист в данной области легко признает, что, как правило, любой компонент пути сигнального пути TCR, приводящий к необходимой эффекторной функции, может быть введен в подходящую клетку-хозяина с помощью способов рекомбинантной генной инженерии, известных в данной области.Thus, cytotoxic T lymphocytes (CTL), CD8+ T cells, CD4+ T cells, natural killer (NK) cells, natural killer (NKT) T cells, gamma/delta T cells are considered to be useful lymphocytic effector cells- hosts. Such lymphocytes expressing the recombinant TCR of the present invention are also referred to herein as modified effector lymphocytes. However, one of ordinary skill in the art will readily recognize that, in general, any component of the TCR signaling pathway leading to the desired effector function can be introduced into a suitable host cell using recombinant genetic engineering techniques known in the art.
Эффекторные клетки-хозяева, в частности лимфоциты, такие как Т-клетки, могут быть аутологичными клетками-хозяевами, которые получены от подлежащего лечению субъекта, и трансформированы или трансдуцированы для экспрессии TCR по настоящему изобретению. Как правило, рекомбинантная экспрессия TCR будет осуществляться с помощью вирусного вектора, описанного в прилагаемых примерах. Методики получения и выделения клеток от пациента, хорошо известны в данной области.Effector host cells, in particular lymphocytes such as T cells, may be autologous host cells that are derived from the subject to be treated and transformed or transduced to express the TCR of the present invention. As a rule, recombinant expression of the TCR will be carried out using the viral vector described in the attached examples. Techniques for obtaining and isolating cells from a patient are well known in the art.
Как упоминалось ранее, эффекторные клетки-хозяева, предусмотренные в данном документе, особенно предпочтительны для применений в терапии. Дополнительные генетические модификации клеткихозяина могут быть необходимыми для повышения терапевтической эффективности. Например, при использовании аутологичных CD8+ Т-клеток в качестве эффекторных клеток-хозяев подходящие дополнительные модификации включат снижение эндогенной экспрессии TCR, CTLA-4 и/или PD-1; и/или амплификации костимулирующих молекул, таких как CD28, CD134, CD137. В данной области были описаны средства и способы достижения вышеупомянутых генетических модификаций.As previously mentioned, the effector host cells provided herein are particularly preferred for therapeutic applications. Additional genetic modifications to the host cell may be necessary to improve therapeutic efficacy. For example, when using autologous CD8+ T cells as effector host cells, suitable additional modifications include reducing endogenous expression of TCR, CTLA-4 and/or PD-1; and/or amplifications of costimulatory molecules such as CD28, CD134, CD137. Means and methods for achieving the aforementioned genetic modifications have been described in the art.
Способы целевого геномного конструирования клеток-хозяев известны в данной области и включат в себя, помимо нокдауна гена с помощью миРНК, применение так называемых программируемых нуклеаз, таких как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатором транскрипции (TALEN), и направляемые РНК сконструированные нуклеазы (RGEN), происходящие из систем бактериальных коротких палиндромных повторов, регулярно расположенными группами (CRISPR)-Cas (CRISPR-ассоциированных), как, в частности, описано в Kim & Kim Nature Reviews Genetics 15, 321-334 (2014). Например, программируемые нуклеазы, такие как TALEN, могут быть использованы для разрезания участков ДНК, которые кодируют нежелательные белки, такие как PD-1, CTLA-4 или эндогенный TCR, за счет чего снижается их экспрессия. Если Т-клетки используются в качестве (эффекторных) клеток-хозяев, снижение экспрессии эндогенного TCR имеет преимущество, проявляющееся в снижении нежелательного ошибочного спаривания эндогенных и экзогенных альфа-/бетацепей TCR.Methods for targeted genomic engineering of host cells are known in the art and include, in addition to gene knockdown by siRNA, the use of so-called programmable nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), effector nucleases like transcription activator (TALEN), and RNA-guided engineered nucleases (RGEN) derived from regularly spaced (CRISPR)-Cas (CRISPR-associated) bacterial short palindromic repeat systems, as specifically described in Kim & Kim Nature Reviews Genetics 15, 321-334 (2014 ). For example, programmable nucleases such as TALEN can be used to cut sections of DNA that encode unwanted proteins such as PD-1, CTLA-4, or endogenous TCR, thereby reducing their expression. When T cells are used as (effector) host cells, downregulation of endogenous TCR has the advantage of reducing unwanted mismatching of endogenous and exogenous TCR alpha/beta chains.
Фармацевтическая композиция/диагностика.Pharmaceutical composition/diagnostics.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена фармацевтическая композиция в виде одного или нескольких активных средств, TCR, нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки-хозяина, описанных в данном документе, и необязательно одного или нескольких фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Соответственно применение указанных TCR, нуклеиновой кислоты, вектора и клетки-хозяина для изготовления фармацевтической композиции или лекарственного препарата также предусмотрено в данном документе.The present invention further provides a pharmaceutical composition in the form of one or more active agents, TCR, nucleic acid, vector and/or host cell described herein, and optionally one or more pharmaceutically acceptable excipients. Accordingly, the use of said TCR, nucleic acid, vector, and host cell for the manufacture of a pharmaceutical composition or medicament is also contemplated herein.
Термин фармацевтическая композиция, в частности, относится к композиции, подходящей для введения человеку. Однако композиции, подходящие для введения животным, отличным от человека, как правило, также охвачены данным термином.The term pharmaceutical composition specifically refers to a composition suitable for administration to a human. However, compositions suitable for administration to non-human animals are generally also encompassed by the term.
Фармацевтическая композиция и ее компоненты (т.е. активные средства и необязательно вспомогаPharmaceutical composition and its components (i.e. active agents and optional auxiliary
- 18 041624 тельные вещества) являются предпочтительно фармацевтически приемлемыми, т.е. способными вызывать необходимый терапевтический эффект, не вызывая нежелательные местные или системные эффекты у реципиента. Фармацевтически приемлемые композиции по настоящему изобретению, например, могут быть стерильными. В частности, термин фармацевтически приемлемый может обозначать одобренный регуляторным органом или другой общепризнанной фармакопеей для применения у животных и более конкретно у человека.- 18 041624 body substances) are preferably pharmaceutically acceptable, i.e. capable of producing the desired therapeutic effect without causing undesirable local or systemic effects in the recipient. Pharmaceutically acceptable compositions of the present invention, for example, may be sterile. In particular, the term pharmaceutically acceptable may mean approved by a regulatory authority or other generally accepted pharmacopoeia for use in animals, and more particularly in humans.
Активное средство, описанное в вышеизложенном (например, клетка-хозяин или TCR), предпочтительно присутствует в фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве. Под терапевтически эффективным количеством понимается количество активного средства, которое вызывает необходимый терапевтический эффект. Терапевтическая эффективность и токсичность могут быть определены с помощью стандартных процедур, например, в клеточной культуре или у исследуемых животных, например, ED50 (доза, терапевтически эффективная у 50% популяции) и LD50 (доза, летальная для 50% популяции). Соотношение дозы терапевтических и токсических эффектов представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено в виде соотношения ED50/LD50. Фармацевтические композиции, которые характеризуются высокими терапевтическими индексами, являются предпочтительными.The active agent described above (eg, host cell or TCR) is preferably present in the pharmaceutical composition in a therapeutically effective amount. By a therapeutically effective amount is meant the amount of the active agent which produces the desired therapeutic effect. Therapeutic efficacy and toxicity can be determined using standard procedures, eg in cell culture or in test animals, eg ED50 (therapeutically effective dose in 50% of the population) and LD 50 (dose lethal in 50% of the population). The ratio of dose of therapeutic and toxic effects is a therapeutic index and can be expressed as the ratio of ED 50 /LD 50 . Pharmaceutical compositions that have high therapeutic indices are preferred.
Дозировка.Dosage.
Точная дозировка полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина для TCR будет установлено специалистом в данной области с помощью известных методик. В подходящих дозировках предусмотрены достаточные количества активного средства по настоящему изобретению, и они предпочтительно являются терапевтически эффективными, т.е. вызывают необходимый терапевтический эффект.The precise dosage of the TCR polynucleotide, vector or host cell will be determined by those skilled in the art using known techniques. Suitable dosages provide sufficient amounts of the active agent of the present invention and are preferably therapeutically effective, i. produce the desired therapeutic effect.
Как известно в данной области, может потребоваться корректировка с целью лечения (например, для поддержания ремиссии или лечения острого приступа заболевания), пути, времени и частоты введения, времени и частоты введения состава, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, питания, тяжести патологического состояния, лекарственной(лекарственных) комбинации(комбинаций), реакций чувствительности и переносимости/устойчивости к терапии. Подходящие диапазоны дозировок, например, в случае растворимых TCR, могут быть определены с помощью данных, полученных на основе анализа клеточных культур и исследований на животных, и могут включать ED50. Как правило, дозы могут варьироваться от 0,1 до 100000 микрограмм, до общей дозы, составляющей приблизительно 2 г, в зависимости от способа введения. Иллюстративные дозировки активного средства по настоящему изобретению находятся в диапазоне от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 1 мг/кг или от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 1 мг/кг. Руководство касательно конкретных дозировок и способов доставки приведено в литературе. Следует признать, что для лечения может потребоваться одно введение терапевтически эффективной дозы или несколько введений терапевтически эффективной дозы активного средства по настоящему изобретению. Например, некоторые фармацевтические композиции можно вводить каждые 3-4 дня, каждую неделю или один раз в две недели, или один раз в месяц в зависимости от состава, периода полужизни и скорости выведения определенной композиции.As is known in the art, adjustments may be required for the purpose of treatment (e.g., to maintain remission or treat an acute attack of a disease), route, time and frequency of administration, time and frequency of administration of the formulation, age, body weight, general health, sex, nutrition , severity of the pathological condition, drug(s) combination(s), sensitivity reactions and tolerability/resistance to therapy. Suitable dosage ranges, for example in the case of soluble TCRs, may be determined from data obtained from cell culture analysis and animal studies and may include the ED 50 . Typically, doses can range from 0.1 to 100,000 micrograms, up to a total dose of about 2 g, depending on the route of administration. Exemplary dosages of the active agent of the present invention range from about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg, from about 0.1 mg/kg to about 10 mg/kg, from about 1 mg/kg to about 10 mg /kg, from about 1 mg/kg to about 5 mg/kg, from about 0.01 mg/kg to about 1 mg/kg, or from about 0.1 mg/kg to about 1 mg/kg. Guidance regarding specific dosages and delivery methods is provided in the literature. It should be recognized that treatment may require a single administration of a therapeutically effective dose or multiple administrations of a therapeutically effective dose of the active agent of the present invention. For example, some pharmaceutical compositions may be administered every 3-4 days, every week, or once every two weeks, or once a month, depending on the formulation, half-life, and rate of elimination of the particular composition.
Как изложено ранее, фармацевтическая композиция может необязательно содержать одно или несколько вспомогательных веществ и/или одно или несколько дополнительных активных средств.As previously stated, the pharmaceutical composition may optionally contain one or more excipients and/or one or more additional active agents.
Вспомогательные вещества.Excipients.
Термин вспомогательное вещество включает наполнители, связывающие вещества, разрыхлители, покрывающие вещества, сорбенты, вещества, препятствующие склеиванию, скользящие вещества, консерванты, антиоксиданты, ароматизаторы, красители, подсластители, растворители, сорастворители, буферные средства, хелатирующие средства, средства, придающие вязкость, поверхностно-активные вещества, разбавители, смачивающие средства, носители, консерванты, эмульгаторы, стабилизиторы и регуляторы тоничности. Выбор подходящих вспомогательных веществ для получения необходимой фармацевтической композиции по настоящему изобретению находится в пределах компетенции специалиста в данной области. Иллюстративные носители для применения в фармацевтической композиции по настоящему изобретению включают солевой раствор, буферный солевой раствор, декстрозу и воду. Как правило, выбор подходящих вспомогательных веществ, в частности, зависит от используемого активного средства, заболевания, подлежащего лечению, и необходимого состава лекарственного композиции.The term excipient includes fillers, binders, disintegrants, coating agents, sorbents, anti-tack agents, lubricants, preservatives, antioxidants, flavors, colorants, sweeteners, solvents, co-solvents, buffering agents, chelating agents, viscosifying agents, surface -active substances, diluents, wetting agents, carriers, preservatives, emulsifiers, stabilizers and tonicity regulators. The choice of suitable excipients to obtain the desired pharmaceutical composition of the present invention is within the skill of the art. Exemplary carriers for use in the pharmaceutical composition of the present invention include saline, buffered saline, dextrose, and water. As a rule, the choice of suitable excipients depends in particular on the active agent used, the disease to be treated and the desired composition of the medicinal composition.
Дополнительные активные средства.Additional active agents.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько активных средств по настоящему изобретению, описанные выше (например, клетку-хозяина или TCR-конструкцию), и одно или несколько дополнительных активных средств, которые подходят для лечения и/или профилактики заболевания, подлежащего лечению. Предпочтительные примеры активных ингредиентов, подходящих для комбинаций, включают противоопухолевые препараты, такие как цисплатин, производные майтансина, рахелмицин, калихеамецин, доцетаксел, этопозид, гемцитабин, ифосфамид, иринотекан, мельфалан, митоксантрон, сорфимер натрия фотофрин II, темозоломид, топотекан, триметреат глюкуронат, ауристатин Е, винкристин и доксорубицин; и пептидные циThe present invention further provides pharmaceutical compositions comprising one or more active agents of the present invention as described above (for example, a host cell or TCR construct) and one or more additional active agents that are suitable for the treatment and/or prevention of a disease, to be treated. Preferred examples of active ingredients suitable for combinations include anticancer drugs such as cisplatin, maytansin derivatives, rachelmicin, calicheamethin, docetaxel, etoposide, gemcitabine, ifosfamide, irinotecan, melphalan, mitoxantrone, photofrin II sodium sorbimer, temozolomide, topotecan, trimetreate glucuronate, auristatin E, vincristine and doxorubicin; and peptide qi
- 19 041624 тотоксины, такие как рицин, дифтерийный токсин, бактериальный экзотоксин синегнойной палочки А, ДНКазу и РНКазу; радионуклиды, такие как йод 131, рений 186, индий 111, иттрий 90, висмут 210 и 213, актиний 225 и астат 213; про лекарства, такие как антитело-направленные ферментативные пролекарства; иммуностимуляторы, такие как IL-2, хемокины, такие как IL-8, тромбоцитарный фактор 4, белок, стимулирующий рост меланомы, и т.д., антитела или их фрагменты, такие как антитела к CD3 или их фрагменты, активаторы комплемента, домены ксеногенных белков, домены аллогенных белков, вирусные/бактериальные белковые домены и вирусные/бактериальные пептиды.- 19 041624 totoxins such as ricin, diphtheria toxin, Pseudomonas aeruginosa A bacterial exotoxin, DNase and RNase; radionuclides such as iodine 131, rhenium 186, indium 111, yttrium 90, bismuth 210 and 213, actinium 225 and astatine 213; pro drugs, such as antibody-directed enzymatic prodrugs; immunostimulants such as IL-2, chemokines such as IL-8, platelet factor 4, melanoma growth promoting protein, etc., antibodies or fragments thereof such as anti-CD3 antibodies or fragments thereof, complement activators, domains xenogeneic proteins, allogeneic protein domains, viral/bacterial protein domains, and viral/bacterial peptides.
Введение.Introduction.
Множество путей применимы для введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, введение будет выполняться парентерально. Способы парентеральной доставки включают местное, интраартериальное, внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, внутривенное, интраперитонеальное, внутриматочное, интравагинальное, подъязычное или интраназальное введение.Many ways are applicable for the introduction of the pharmaceutical composition in accordance with the present invention. As a rule, the introduction will be performed parenterally. Methods for parenteral delivery include topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, intrauterine, intravaginal, sublingual, or intranasal administration.
Получение препарата.Getting the drug.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены в различных формах в зависимости, в частности, от используемого активного средства (например, растворимого TCR), например, в твердой, жидкой, газообразной или лиофилизированной форме, и могут быть представлены, в частности, в форме мази, крема, трансдермальных пластырей, геля, порошка, таблетки, раствора, аэрозоля, гранул, пилюль, суспензий, эмульсий, капсул, сиропов, жидкостей, эликсиров, экстрактов, настойки или жидких экстрактов или в форме, которая является особенно подходящей для необходимого способа введения. Сами способы, известные для получения лекарственных препаратов, представлены в 22-м изд. Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012) и могут включать, например, способы стандартного смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофизизация. Фармацевтические композиции, содержащие, например, клетки-хозяева или растворимый TCR, описанные в данном документе, как правило, будут представлены в жидкой форме, и предпочтительно содержать фармацевтически приемлемый буфер.The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in various forms depending in particular on the active agent used (e.g. soluble TCR), e.g. in solid, liquid, gaseous or lyophilized form, and may be presented in particular in the form ointments, creams, transdermal patches, gel, powder, tablet, solution, aerosol, granules, pills, suspensions, emulsions, capsules, syrups, liquids, elixirs, extracts, tinctures or liquid extracts, or in a form which is particularly suitable for the desired method introductions. The methods themselves known for the preparation of drugs are presented in the 22nd ed. Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012) and may include, for example, conventional mixing, dissolving, granulating, panning, triturating, emulsifying, encapsulating, trapping, or lyophizing methods. Pharmaceutical compositions containing, for example, host cells or soluble TCR described herein will generally be in liquid form, and preferably contain a pharmaceutically acceptable buffer.
После получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению они могут быть помещены в соответствующий контейнер и маркированы этикеткой, как предназначенные для лечения указанного состояния. Такая этикетка, будет включать, например, указание количества, частоты и способа введения.Once the pharmaceutical compositions of the present invention have been prepared, they may be placed in an appropriate container and labeled as intended for the treatment of the condition in question. Such a label would include, for example, an indication of the amount, frequency and route of administration.
Лечение.Treatment.
Таким образом, в свете вышеизложенного в настоящем изобретении предусмотрены TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяина, описанные в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.Thus, in light of the foregoing, the present invention provides the TCR, nucleic acid, vector and/or host cell described herein for use as a drug.
TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин, как правило, могут быть использованы для выявления, диагностики, прогнозирования, предупреждения и/или лечения заболеваний или нарушений. Термин лечение во всех своих грамматических формах включает терапевтическое или профилактическое лечение нуждающегося в этом субъекта. Термин терапевтическое или профилактическое лечение подразумевает профилактическое лечение, направленное на полное предупреждение клинических и/или патологических проявлений, или терапевтическое лечение, направленное на нормализацию или ремиссию клинических и/или патологических проявлений. Таким образом, термин лечение также включает нормализацию или предупреждение заболеваний.TCR, nucleic acid, vector and/or host cell, as a rule, can be used to detect, diagnose, predict, prevent and/or treat diseases or disorders. The term treatment in all its grammatical forms includes the therapeutic or prophylactic treatment of a subject in need thereof. The term therapeutic or prophylactic treatment means prophylactic treatment aimed at complete prevention of clinical and/or pathological manifestations, or therapeutic treatment aimed at normalization or remission of clinical and/or pathological manifestations. Thus, the term treatment also includes the normalization or prevention of diseases.
Термины субъект, или индивидуум, или животное, или пациент используются взаимозаменяемо в данном документе для обозначения любого субъекта, особенно субъекта-млекопитающего, которому необходима терапия. Субъекты-млекопитающие, как правило, включают человека, приматов, отличных от человека, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, крупный рогатый скот, коров и т.п. Однако легко будет понять, что TCR, нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и фармацевтические композиции, представленные в данном документе, особенно предусмотрены для лечения субъектов-людей, в частности таких, которые являются HLA-A2-положительными.The terms subject or individual or animal or patient are used interchangeably herein to refer to any subject, especially a mammalian subject, in need of therapy. Mammalian subjects typically include humans, non-human primates, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and the like. However, it will be readily understood that the TCRs, nucleic acids, vectors, host cells, and pharmaceutical compositions provided herein are especially intended for the treatment of human subjects, in particular those that are HLA-A2 positive.
Прямое введение.Direct introduction.
В случае терапии с использованием TCR, в частности растворимыми TCR по настоящему изобретению, нуклеиновые кислоты, векторы (такие как вирусные векторы) или клетки-хозяева по настоящему изобретению можно вводить непосредственно нуждающемуся в этом субъекту. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены TCR, нуклеиновая кислота, вектор или клетки-хозяева для применения в способе выявления, диагностики, прогнозирования, предупреждения и/или лечения субъекта. Такой способ может предусматривать стадии (а) обеспечения одного или более из: (i) TCR, (ii) нуклеиновой кислоты, (iii) вектора, (iv) клетки-хозяина и/или (v) фармацевтической композиции по настоящему изобретению, и (b) введения одного или более из (i)-(v) нуждающемуся в этом субъекту. Необязательно способ предусматривает дополнительную стадию терапии рака, например лучевую терапию или введение одного или более противоопухолевых средств.In the case of therapy using TCRs, in particular soluble TCRs of the present invention, the nucleic acids, vectors (such as viral vectors) or host cells of the present invention can be administered directly to a subject in need thereof. Thus, the present invention provides a TCR, nucleic acid, vector, or host cells for use in a method for detecting, diagnosing, predicting, preventing, and/or treating a subject. Such a method may include the steps of (a) providing one or more of: (i) a TCR, (ii) a nucleic acid, (iii) a vector, (iv) a host cell, and/or (v) a pharmaceutical composition of the present invention, and ( b) administering one or more of (i)-(v) to a subject in need. Optionally, the method includes an additional step in cancer therapy, such as radiation therapy or administration of one or more antitumor agents.
- 20 041624- 20 041624
Лечение ex vivo.Treatment ex vivo.
Лечение в соответствии с настоящим изобретением может также предусматривать стадии: (а) обеспечения образца субъекта, при этом указанный образец содержит лимфоциты; (b) обеспечения одного или более TCR, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению; (с) введения одного или более (i)-(v) из стадии (b) в лимфоциты из стадии (а), за счет чего получают модифицированные лимфоциты; (d) введения модифицированных лимфоцитов из стадии (с) нуждающимся в этом субъекту или пациенту.Treatment according to the present invention may also include the steps of: (a) providing a sample of a subject, said sample containing lymphocytes; (b) providing one or more TCR, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention; (c) introducing one or more of (i)-(v) from step (b) into lymphocytes from step (a), whereby modified lymphocytes are obtained; (d) administering the modified lymphocytes from step (c) to a subject or patient in need thereof.
Лимфоциты, полученные на стадии (а), в частности, предусмотрены в качестве эффекторных клеток-хозяев, описанных в вышеизложенных разделах, и предпочтительно выбраны из Т-клеток, NKклеток и/или NKT-клеток, особенно CD8+ Т-клеток; и могут быть получены на предыдущей стадии (а') из образца, в частности образца крови, субъекта с помощью стандартных способов, известных в данной области. Однако также приемлемо применение лимфоцитов, которые предпочтительно способны экспрессировать TCR по настоящему изобретению и проявлять необходимые биологические эффекторные функции, описанные в данном документе. Кроме того, указанные лимфоциты, как правило, будут выбраны для совместимости с иммунной системой субъекта, т.е. они не будут предпочтительно вызывать иммуногенный ответ. Например, приемлемо использовать универсальные реципиентные клетки, т.е. универсально совместимые лимфоциты, проявляющие необходимые биологические эффекторные функции, которые могут быть выращены и размножены in vitro. Таким образом, применение таких клеток будет устранять необходимость в получении и предоставлении собственных клеток субъекта на стадии (а).The lymphocytes obtained in step (a) are specifically provided as the effector host cells described in the sections above and are preferably selected from T cells, NK cells and/or NKT cells, especially CD8+ T cells; and can be obtained in the previous step (a') from a sample, in particular a blood sample, of a subject using standard methods known in the art. However, it is also acceptable to use lymphocytes which are preferably capable of expressing the TCR of the present invention and exhibiting the desired biological effector functions described herein. In addition, said lymphocytes will generally be selected for compatibility with the subject's immune system, i.e. they will not preferably elicit an immunogenic response. For example, it is acceptable to use universal recipient cells, ie. universally compatible lymphocytes that exhibit the necessary biological effector functions that can be grown and propagated in vitro. Thus, the use of such cells will eliminate the need to obtain and provide the subject's own cells in step (a).
Введение ex vivo на стадии (с) может быть проведено путем введения нуклеиновой кислоты или вектора, описанных в данном документе, с помощью электропорации в лимфоциты, или путем инфицирования лимфоцитов вирусным вектором, таким как лентивирусный или ретровирусный вектор, описанные ранее в контексте эффекторной клетки-хозяина. Другие приемлемые способы включают применение реагентов для трансфекции, таких как липосомы, или транзиентной РНК-трансфекции. Перенос генов антигенспецифических TCR в (первичные) Т-клетки с помощью (ретро)вирусных векторов или транзиентной трансфекции РНК представляет собой перспективное средство для генерации опухольассоциированных антигенспецфических Т-клеток, которые затем могут быть повторно введены в донора, где они специфически нацеливаются на опухолевые клетки, экспрессирующие указанный антиген, и разрушают их. В настоящем изобретении указанный опухолеассоциированынй антиген представляет собой PRAME10o-io8, в частности в своей HLA-A*02 связанной форме.The ex vivo administration in step (c) can be carried out by introducing the nucleic acid or vector described herein by electroporation into lymphocytes, or by infecting lymphocytes with a viral vector such as a lentiviral or retroviral vector, as previously described in the context of an effector cell- owner. Other suitable methods include the use of transfection reagents such as liposomes or transient RNA transfection. Transfer of antigen-specific TCR genes into (primary) T cells using (retro)viral vectors or transient RNA transfection is a promising means to generate tumor-associated antigen-specific T cells, which can then be reintroduced into the donor, where they specifically target tumor cells. expressing the specified antigen, and destroy them. In the present invention, said tumor-associated antigen is PRAME 10 o-io 8 , in particular in its HLA-A*02 bound form.
В связи с вышеизложенным в дополнительном аспекте настоящего изобретения предусмотрено применение TCR, последовательности нуклеиновой кислоты, вектора и/или клетки-хозяина, описанных в других разделах данного документа, для получения модифицированных лимфоцитов. Средства и способы введения, например, нуклеиновой кислоты и вектора в лимфоциты, были описаны в других разделах данного документа.In connection with the foregoing, in a further aspect of the present invention, the use of a TCR, a nucleic acid sequence, a vector, and/or a host cell described elsewhere in this document is contemplated for the production of modified lymphocytes. Means and methods for introducing, for example, the nucleic acid and the vector into lymphocytes have been described elsewhere in this document.
Диагностическая композиция.diagnostic composition.
В настоящем изобретении предусмотрена диагностическая композиция, содержащая одно или более диагностических средств, TCR, нуклеиновую кислоту, вектор и/или клетку-хозяина, описанные в данном документе. Как правило, указанное диагностическое средство будет предусматривать средства для выявления своего связывания со своей антигенной мишенью, например меткой, описанной в контексте TCR-конструкций по настоящему изобретению. Что касается клетки-хозяина, например, считается приемлемым использование модифицированных клеток-хозяев, содержащих краситель или контрастное средство, которое высвобождается (вместо цитотоксических гранул) при распознавании антигена.The present invention provides a diagnostic composition comprising one or more diagnostic agents, a TCR, a nucleic acid, a vector, and/or a host cell as described herein. Typically, said diagnostic tool will provide a means to detect its binding to its antigenic target, such as a label as described in the context of the TCR constructs of the present invention. With regard to the host cell, for example, it is considered acceptable to use modified host cells containing a dye or contrast agent that is released (instead of cytotoxic beads) upon recognition of the antigen.
Применение.Application.
В настоящем изобретении предусмотрено применение диагностических средств, описанных выше, для выявления, диагностики и/или прогнозирования рака у субъекта, которое может быть осуществлено in vivo или in vitro.The present invention contemplates the use of the diagnostic tools described above for detecting, diagnosing and/or predicting cancer in a subject, which can be performed in vivo or in vitro.
Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена диагностическая композиция для применения в выявлении, диагностике и/или прогнозировании рака у субъекта in vivo, при этом указанная композиция содержит в качестве диагностического средства TCR, нуклеиновую кислоту, вектор и/или клетку-хозяина по настоящему изобретению. Способ, как правило, предусматривает (а) введение указанного диагностического средства субъекту и (b) выявление связывания указанного диагностического средства с его антигенной мишенью.Thus, the present invention provides a diagnostic composition for use in detecting, diagnosing and/or predicting cancer in a subject in vivo, said composition comprising, as a diagnostic agent, a TCR, a nucleic acid, a vector and/or a host cell of the present invention. The method typically involves (a) administering said diagnostic agent to a subject, and (b) detecting binding of said diagnostic agent to its antigenic target.
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ выявления, диагностики и/или прогнозирования рака у субъекта in vitro. В соответствии с настоящим изобретением также предусмотрен способ выявления наличия рака у субъекта, предусматривающий стадии: (а) обеспечения образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток; (b) приведения указанного образца в контакт с TCR, нуклеиновой кислотой, вектором и/или клеткой-хозяином по настоящему изобретению, за счет чего образуется комплекс; и (с) выявления комплекса. Предусмотрено, что указанный комплекс является показателем связывания диагностического средства с его антигенной мишенью и наличия (раковой) клетки, экспрессирующей указанную антигенную мишень.In addition, the present invention provides a method for detecting, diagnosing and/or predicting cancer in a subject in vitro. The present invention also provides a method for detecting the presence of cancer in a subject, comprising the steps of: (a) providing a sample from the subject, said sample containing one or more cells; (b) bringing said sample into contact with a TCR, nucleic acid, vector and/or host cell of the present invention, whereby a complex is formed; and (c) detecting the complex. It is envisaged that said complex is indicative of the binding of a diagnostic agent to its antigenic target and the presence of a (cancer) cell expressing said antigenic target.
В обоих способах связывания диагностического средства со своей антигенной мишенью можетIn both methods of binding a diagnostic agent to its antigenic target,
- 21 041624 быть определен с помощью стандартных способов, известных в данной области, и будет, в частности, зависеть от конкретного используемого диагностического средства. Подходящие метки, которые могут быть связаны с диагностическим средством по настоящему изобретению, приведены в качестве примера в разделе, относящемуся к меченым TCR-конструкциям. Применение для получения модифицированных лимфоцитов- 21 041624 be determined using standard methods known in the art and will in particular depend on the specific diagnostic tool used. Suitable labels that can be associated with the diagnostic tool of the present invention are given as an example in the section relating to labeled TCR constructs. Application for production of modified lymphocytes
Следует отметить, что используемые в данном документе формы единственного числа включают ссылки во множественном числе, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например, упоминание реагента включает один или более таких различных реагентов, и упоминание способа включает упоминание эквивалентных стадий и способов, известных специалистам в данной области, которые могут быть модифицированы или заменены способами, описанными в данном документе.It should be noted that the singular forms used herein include plural references unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to a reagent includes one or more of these different reagents, and reference to a method includes reference to equivalent steps and methods known to those skilled in the art, which may be modified or replaced by the methods described herein.
Если не указано иное, выражение по меньшей мере, предшествующее ряду элементов, следует понимать как относящееся к каждому элементу в данном ряду. Специалистам в данной области будут понятны многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе, или с помощью проведения только лишь обычных экспериментов они будут способны определить такие эквиваленты. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.Unless otherwise indicated, an expression at least preceding a series of elements is to be understood as referring to each element in that series. Those skilled in the art will recognize many equivalents to the specific embodiments of the present invention described herein, or through routine experimentation alone, they will be able to determine such equivalents. Such equivalents are intended to be covered by the present invention.
Выражение и/или, где бы оно не использовалось, включает значение и, или и все или любая комбинация из элементов, связанных указанным термином.The expression and/or, wherever used, includes the meaning of and, or and all or any combination of the elements associated with the specified term.
Выражение приблизительно или примерно, используемое в данном документе, означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% от конкретного значения или диапазона. Однако он также включает конкретное число, например, приблизительно 20 включает 20.The expression about or about as used herein means within 20%, preferably within 10%, and more preferably within 5% of a particular value or range. However, it also includes a specific number, for example approximately 20 includes 20.
Выражение менее или более включает конкретное число. Например, менее 20 означает менее чем 20 или равно 20. Аналогично более чем или выше чем означает более чем или равно или выше чем или равно соответственно.The expression less or more includes a specific number. For example, less than 20 means less than 20 or equal to 20. Likewise, greater than or greater than means greater than or equal to or greater than or equal, respectively.
По всему настоящему описанию и в нижеследующей формуле изобретения, если контекст не подразумевает иное, слово содержать и варианты, такие как содержит и содержащий, будут подразумевать включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, а не исключение какого-либо другого целого числа или стадии или группы целых чисел или шагов. При использовании в данном документе термин содержащий можно заменить термином включающий или включающий в себя или иногда при использовании в данном документе термином имеющий.Throughout the present description and in the following claims, unless the context implies otherwise, the word contain and variations such as contains and comprising will be intended to include the specified integer or step or group of integers or steps, and not the exclusion of any other integer. numbers or stages or groups of integers or steps. As used herein, the term containing may be replaced by the term including or including, or sometimes as used herein, by the term having.
При использовании в данном документе состоящий из исключает любые элемент, стадию или ингредиент, не указанные в элементе пункта формулы изобретения. При использовании в данном документе состоящий фактически из не исключает материалы или стадии, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики пункта формулы изобретения.As used herein, consisting of excludes any element, step, or ingredient not listed in the claim element. As used herein, consisting in fact of does not exclude materials or steps that do not materially affect the essential and new characteristics of a claim.
В каждом случае в данном документе любые из выражений содержащий, состоящий фактически из и состоящий из можно заменить любым из других двух выражений.In each case in this document, any of the expressions containing, actually consisting of, and consisting of can be replaced by any of the other two expressions.
Необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничено определенной методологией, протоколами, материалом, реагентами и веществами и т.д., описанными в данном документе, и таким образом может варьироваться. Терминология, используемая в данном документе, предназначена лишь для описательных целей конкретных вариантов осуществления, но не предполагает ограничение объема настоящего изобретения, который определен исключительно формулой изобретения.It is to be understood that the present invention is not limited to the particular methodology, protocols, material, reagents and materials, etc. described herein, and thus may vary. The terminology used herein is for descriptive purposes of specific embodiments only, and is not intended to limit the scope of the present invention, which is defined solely by the claims.
Все публикации и патенты, цитируемые в тексте данного описания (в том числе все патенты, заявки на патент, научные публикации, технические паспорта, инструкции и т.д.), будь то выше или ниже, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Ничего в данном документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права преподносить такое изобретение в силу предшествующего изобретения. В той степени, в которой материал, включенный посредством ссылки, противоречит настоящему описанию или несовместим с ним, настоящее описание будет превалировать над любым таким материалом.All publications and patents cited in the text of this specification (including all patents, patent applications, scientific publications, technical data sheets, manuals, etc.), whether above or below, are incorporated herein by reference in their entirety. . Nothing in this document should be construed as an admission that the present invention is not entitled to represent such an invention by virtue of a prior invention. To the extent that material incorporated by reference conflicts or is inconsistent with the present disclosure, the present disclosure will take precedence over any such material.
Лучшее понимание настоящего изобретения и его преимуществ будет получено, исходя из следующего примера, представленного только с иллюстративными целями. Данный пример никоим образом не предусматривает ограничение объема настоящего изобретения.A better understanding of the present invention and its advantages will be obtained from the following example, presented for illustrative purposes only. This example is not meant to limit the scope of the present invention in any way.
Настоящее изобретение также характеризуется следующими пунктами.The present invention is also characterized by the following items.
1. Т-клеточный рецептор (TCR), содержащий:1. T-cell receptor (TCR), containing:
(i) CDR3 вариабельного участка альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 1, или состоящий из нее, и/или (ii) CDR3 вариабельного участка бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 2, или состоящий из нее.(i) a TCR alpha chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) or an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to or consisting of SEQ ID NO: 1 and/or (ii) a CDR3 of the TCR beta chain variable region containing the amino acid sequence CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2) or an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 2, or consisting of it.
- 22 041624- 22 041624
2. TCR по п.1, где указанный TCR способен связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31) или ее МНС-связанной форме, предпочтительно эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности VLDGLDVLL (SEQ ID NO:2. The TCR of claim 1, wherein said TCR is capable of binding to an epitope contained in the amino acid sequence X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31) or an MHC-linked form thereof, preferably an epitope contained in the amino acid sequence VLDGLDVLL (SEQ ID NO:
32) или ее МНС-связанной форме.32) or its MHC-bound form.
3. TCR по любому из пп. 1 или 2, содержащий:3. TCR according to any one of paragraphs. 1 or 2 containing:
(i) вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и/или (ii) вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее.(i) a TCR alpha chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and/or (ii) a TCR beta chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, or consisting of it.
4. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий: (i) константный участок альфа-цепи TCR и/или (ii) константный участок бета-цепи TCR.4. A TCR according to any one of the preceding claims, further comprising: (i) a TCR alpha chain constant region and/or (ii) a TCR beta chain constant region.
5. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:5. TCR according to any of the preceding paragraphs, containing:
(i) альфа-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 7, 11,9 или 13, или состоящую из нее, и/или (ii) бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее.(i) a TCR alpha chain comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13, or an amino acid sequence that is at least 80% identical , more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to or consisting of SEQ ID NO: 7, 11.9 or 13, and/or (ii) a TCR beta chain containing the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 8, 10, 12 or 14, or consisting of it.
6. TCR по любому из предыдущих пунктов, при этом указанный TCR выбран из нативного TCR, варианта TCR, фрагмента TCR или TCR-конструкции.6. A TCR according to any one of the preceding claims, wherein said TCR is selected from a native TCR, a TCR variant, a TCR fragment, or a TCR construct.
7. TCR-конструкция по п.6, содержащая по меньшей мере одну альфа-цепь(цепи)TCR и по меньшей мере одну бета-цепь(цепи)TCR, ковалентно связанные друг с другом с образованием гетеродимеров или мультимеров TCR.7. The TCR construct of claim 6, comprising at least one TCR alpha chain(s) and at least one TCR beta chain(s) covalently linked to each other to form TCR heterodimers or multimers.
8. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий один или более слитых компонентов, необязательно выбранных из Fc-рецепторов; Fc-доменов, в том числе IgA, IgD, IgG, IgE и IgM; цитокинов, в том числе IL-2 или IL-15; токсинов; антител или их антигенсвязывающих фрагментов, в том числе антител к CD3, к CD28, к CD5, к CD16 или к CD56 или их антигенсвязывающих фрагментов; CD247- (CD3-дзета), CD28-, CD137-, CD134-домена или их комбинаций, необязательно дополнительно содержащих по меньшей мере один линкер.8. TCR according to any one of the preceding paragraphs, additionally containing one or more fused components, optionally selected from Fc receptors; Fc domains including IgA, IgD, IgG, IgE and IgM; cytokines, including IL-2 or IL-15; toxins; antibodies or antigen-binding fragments thereof, including anti-CD3, anti-CD28, anti-CD5, CD16 or CD56 antibodies or antigen-binding fragments thereof; CD247- (CD3-zeta), CD28-, CD137-, CD134-domain or combinations thereof, optionally additionally containing at least one linker.
9. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:9. TCR according to any of the preceding paragraphs, containing:
(i) по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, определенную в любом из пп.1-4, и (ii) по меньшей мере одну бета-цепь TCR, определенную в любом из пп.1-4, (iii) антитело или фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), которые направлены против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов, где альфа-цепь(цепи) TCR и бета-цепь(цепи) TCR связаны друг с другом и слиты с указанным антителом или scFv необязательно посредством линкера.(i) at least one TCR alpha chain as defined in any one of claims 1-4, and (ii) at least one TCR beta chain as defined in any one of claims 1-4, (iii) an antibody, or a single chain antibody fragment (scFv) that is directed against an antigen or epitope on the surface of lymphocytes, wherein the TCR alpha chain(s) and TCR beta chain(s) are linked to each other and fused to said antibody or scFv, optionally via a linker.
10. TCR по п.9, где указанный антиген выбран из CD3, CD28, CD5, CD16 или CD56.10. TCR according to claim 9, wherein said antigen is selected from CD3, CD28, CD5, CD16, or CD56.
11. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий по меньшей мере одну метку.11. A TCR according to any one of the preceding claims, further comprising at least one label.
12. TCR по любому из предыдущих пунктов, который является растворимым.12. TCR according to any of the preceding claims, which is soluble.
13. Нуклеиновая кислота, кодирующая TCR по любому из предыдущих пунктов.13. A nucleic acid encoding a TCR according to any one of the preceding claims.
14. Нуклеиновая кислота по п.13, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.14. Nucleic acid according to claim 13, containing the nucleic acid sequence under SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30.
15. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.13 или 14.15. A vector containing a nucleic acid according to any one of claims 13 or 14.
16. Клетка-хозяин, содержащая TCR по любому из пп.1-12, последовательность нуклеиновой кислоты по п.12 или 13 или вектор по п.14.16. A host cell comprising a TCR according to any one of claims 1 to 12, a nucleic acid sequence according to claim 12 or 13, or a vector according to claim 14.
17. Клетка-хозяин по п.16, которая выбрана из лимфоцитов, в том числе без ограничения цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, естественных киллерных (NK) клеток, естественных киллерных (NKT) Т-клеток, гамма/дельта-Т-клеток.17. The host cell of claim 16, which is selected from lymphocytes, including, but not limited to, cytotoxic T lymphocytes (CTL), CD8+ T cells, CD4+ T cells, natural killer (NK) cells, natural killer (NKT) cells T cells, gamma/delta T cells.
18. Способ получения TCR по любому из пп.1-12, предусматривающий:18. A method for producing TCR according to any one of claims 1 to 12, comprising:
(i) инкубацию клетки-хозяина по п.17 в условиях, вызывающих экспрессию указанного TCR, (ii) очистку указанного TCR.(i) incubating the host cell according to claim 17 under conditions causing the expression of said TCR, (ii) purifying said TCR.
19. Фармацевтическая или диагностическая композиция, содержащая одно или более из:19. Pharmaceutical or diagnostic composition containing one or more of:
(i) TCR по любому из пп.1-12, (ii) нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-14;(i) a TCR according to any one of paragraphs 1-12, (ii) a nucleic acid according to any one of paragraphs 13-14;
(iii) вектора по п.15 и/или (iv) клетки-хозяина по любому из пп.16 или 17,(iii) a vector according to claim 15 and/or (iv) a host cell according to any one of claims 16 or 17,
- 23 041624 и необязательно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество(вещества).- 23 041624 and optionally a pharmaceutically acceptable excipient(s).
20. TCR по любому из пп.1-12, нуклеиновая кислота по любому из пп.13 или 14, вектор по п.15 и/или клетка-хозяин по п.16 или 17 для применения в качестве лекарственного препарата.20. A TCR according to any one of claims 1 to 12, a nucleic acid according to any one of claims 13 or 14, a vector according to claim 15 and/or a host cell according to claim 16 or 17 for use as a drug.
21. TCR по любому из пп.1-12, нуклеиновая кислота по любому из пп.13 или 14, вектор по п.15 и/или клетка-хозяин по п.16 или 17 для применения в выявлении, диагностике, прогнозировании, предупреждении и/или лечении рака.21. A TCR according to any one of claims 1 to 12, a nucleic acid according to any one of claims 13 or 14, a vector according to claim 15 and/or a host cell according to claim 16 or 17 for use in detection, diagnosis, prognosis, prevention and/or cancer treatment.
22. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п.21, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:22. TCR, nucleic acid, vector and/or host cell for use according to claim 21, where the prevention and/or treatment of cancer includes:
(a) обеспечение одного или более из (i) TCR по любому из пп.1-12, (ii) нуклеиновой кислоты по любому из пп.13 или 14, (iii) вектора по п.15 и/или (iv) клетки-хозяина по любому из пп.16 или 17, (v) фармацевтической композиции по п.19, и (b) введение по меньшей мере одного из (i)-(v) нуждающемуся в этом субъекту.(a) providing one or more of (i) a TCR according to any one of claims 1 to 12, (ii) a nucleic acid according to any one of claims 13 or 14, (iii) a vector according to claim 15, and/or (iv) cells a host according to any one of claims 16 or 17, (v) a pharmaceutical composition according to claim 19, and (b) administering at least one of (i) to (v) to a subject in need thereof.
23. TCR, нуклеиновая кислота, вектор и/или клетка-хозяин для применения по п.21, где предупреждение и/или лечение рака предусматривает:23. TCR, nucleic acid, vector and/or host cell for use according to claim 21, where the prevention and/or treatment of cancer involves:
(a) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит лимфоциты, (b) обеспечение одного или более из (i) TCR по любому из пп.1-12, (ii) нуклеиновой кислоты по любому из пп.13 или 14, (iii) вектора по п.15 и/или (iv) клетки-хозяина по любому из пп.16 или 17, (v) фармацевтической композиции по п.19, (c) применение одного или более из (i)-(v) из стадии (b) по отношению к лимфоцитам из стадии (а), за счет чего обеспечивается получение модифицированных лимфоцитов, (d) введение модифицированных лимфоцитов из стадии (с) нуждающимся в этом субъекту или пациенту.(a) providing a sample from a subject, said sample containing lymphocytes, (b) providing one or more of (i) a TCR according to any one of claims 1 to 12, (ii) a nucleic acid according to any one of claims 13 or 14, (iii) a vector according to claim 15 and/or (iv) a host cell according to any one of claims 16 or 17, (v) a pharmaceutical composition according to claim 19, (c) the use of one or more of (i)-(v ) from step (b) with respect to the lymphocytes from step (a), thereby obtaining modified lymphocytes, (d) administering the modified lymphocytes from step (c) to a subject or patient in need thereof.
24. Способ выявления наличия рака у субъекта in vitro, предусматривающий:24. A method for detecting the presence of cancer in a subject in vitro, comprising:
(a) обеспечение образца от субъекта, при этом указанный образец содержит одну или более клеток, (b) приведение указанного образца в контакт с:(a) providing a sample from a subject, said sample containing one or more cells, (b) bringing said sample into contact with:
(i) TCR по любому из пп.1-12, (ii) нуклеиновой кислотой по любому из пп.13 или 14, (iii) вектором по п.15 и/или (iv) клеткой-хозяином по любому из пп.16 или 17, (v) фармацевтической композицией по п.19, за счет чего образуется комплекс, и (c) выявление комплекса, где выявление комплекса свидетельствует о наличии рака у субъекта.(i) a TCR according to any one of paragraphs 1 to 12, (ii) a nucleic acid according to any one of paragraphs 13 or 14, (iii) a vector according to paragraph 15 and/or (iv) a host cell according to any one of paragraphs 16 or 17, (v) a pharmaceutical composition according to claim 19, whereby a complex is formed, and (c) detection of the complex, where detection of the complex is indicative of the presence of cancer in the subject.
25. Применение TCR по любому из пп.1-12, нуклеиновой кислоты по любому из пп.13 или 14 и/или вектора по п.15 для получения модифицированных лимфоцитов.25. Use of a TCR according to any one of claims 1 to 12, a nucleic acid according to any one of claims 13 or 14 and/or a vector according to claim 15 to obtain modified lymphocytes.
- 24 041624- 24 041624
ПримерыExamples
Аббревиатуры и синонимы:Abbreviations and synonyms:
Концентрация молярная [моль/л]Molar concentration [mol/l]
РВМС Мононуклеарная клетка периферической крови, т. е.PBMC Peripheral blood mononuclear cell, i.e.
ядросодержащие клетки в периферической крови; представляют собой PBL (лимфоциты периферической крови), такие как Т-клетки.nucleated cells in peripheral blood; are PBL (peripheral blood lymphocytes) such as T cells.
Пример 1. Выделение PRAME-специфического клона Т-клеток.Example 1 Isolation of a PRAME-specific T cell clone.
Авторы настоящего изобретения использовали подход примирования in vitro для выделения клонов Т-клеток с любым требуемым ограничением по МНС и специфичностью к антигену. В системе примирования используются зрелые дендритные клетки (mDC) в качестве антигенпрезентирующих клеток и аутологические CD8+-обогащенные Т-клетки в качестве клеток-респондеров. In vitro транскрибированная РНК (ivtPHK), кодирующая полноразмерную аминокислотную последовательность PRAME человека в качестве эталонной в SEQ ID NO: 33, служит в качестве источника специфического антигена. После электропорации в mDC ivtPHK транслируется в полноразмерный белок, который затем процессируется и презентируется в виде пептидов молекулами МНС mDC.The present inventors used an in vitro priming approach to isolate T cell clones with any desired MHC restriction and antigen specificity. The priming system uses mature dendritic cells (mDC) as antigen presenting cells and autologous CD8 + rich T cells as responder cells. An in vitro transcribed RNA (ivtRNA) encoding the full length human PRAME amino acid sequence as a reference in SEQ ID NO: 33 serves as the source of the specific antigen. After electroporation in mDC, ivtRNA is translated into a full-length protein, which is then processed and presented as peptides by mDC MHC molecules.
Совместное культивирование in vitro Т-клеток с ivtPHK-трансфицированными mDC от одного и того же донора приводит к индукции de novo антигенспецифических Т-клеток, которые служат в качестве источника соответствующих TCR. Антигенспецифические Т-клетки могут быть обогащены с помощью ряда способов и клонированы путем предельного разведения или выращивания отдельных клеток на основе FACS.In vitro co-cultivation of T cells with ivtRNA-transfected mDCs from the same donor results in de novo induction of antigen-specific T cells that serve as the source of the respective TCRs. Antigen-specific T cells can be enriched in a number of ways and cloned by limiting dilution or single cell growth based on FACS.
Пример 1.1. Подход примирования с использованием зрелых дендритных клеток.Example 1.1. Priming approach using mature dendritic cells.
Примирование Т-клеток с помощью DC высокоаффинным TCR осуществляли с использование пептидной презентации аутологичными молекулами МНС в соответствии со следующими протоколом (фиг. 1): примирование HLA-A*02:01/PRAME, через 8 дней получали mDC с использованием подходящих смесей для DC, загрузка АРС: ivtPHK, обогащение с помощью мультимера HLA-A*02:01 PRAME100-108, сортировка одиночных клеток с использованием технологии FACS.T cell priming with DC high affinity TCR was performed using peptide presentation with autologous MHC molecules according to the following protocol (FIG. 1): HLA-A*02:01/PRAME priming, after 8 days mDC was generated using appropriate mixtures for DC , APC loading: ivtPHK, enrichment with HLA-A*02:01 PRAME 100-108 multimer, single cell sorting using FACS technology.
Пример 2. Анализ функций/специфичности.Example 2 Function/Specificity Analysis.
После идентификации кандидатного клона Т-клеток (клон Т-клеток Т4.8-1-29), который распознает необходимый эпитоп PRAME (PRAME100-108), выполняли полное определение характеристик относительно функции и специфичности. Анализы включали определение паттерна секреции цитокинов выделенного клона Т-клеток (клона Т-клеток Т4.8-1-29) при совместном культивировании с разными линиями опухолевых клеток человека, способности клона специфически распознавать разные клетки-мишени, функциональной авидности клона и цитотоксичности в отношении Т2 и опухолевых клеток.After identifying a candidate T cell clone (T4.8-1-29 T cell clone) that recognizes the desired PRAME epitope (PRAME 100-108 ), full characterization with respect to function and specificity was performed. The analyzes included determination of the cytokine secretion pattern of the isolated T-cell clone (T-cell clone T4.8-1-29) when co-cultivated with different lines of human tumor cells, the ability of the clone to specifically recognize different target cells, the functional avidity of the clone, and cytotoxicity in relation to T2 and tumor cells.
Пример 2.1. Анализ исходного клона Т-клеток Т4.8-1-29.Example 2.1. Analysis of the original T-cell clone T4.8-1-29.
Пример 2.1.1. Анализ полицитокинов.Example 2.1.1. Analysis of polycytokines.
Схема эксперимента: стимуляция нагруженными пептидом Т2-клетками.Experimental scheme: stimulation with peptide-loaded T2 cells.
Высвобождение цитокинов измеряли в соответствии со следующим протоколом:Cytokine release was measured according to the following protocol:
анализ цитокинов Multiplex® выполняли с выявлением IFN-гамма, IL-2, TNF-альфа, IL-5, IL-10, IL6, IL12p70, IL-4 и IL-1-бета, стимулирующие клетки: Т2-клетки (HLA-А*02полож), нагруженные насыщающими количествами (10-5 М) PRAME100-108 пептида (VLD-пептида) или нерелевантного PRAME300-309, т.е. пептида ALYVDSLFFL (ALY-пептида, SEQ ID NO: 230),Multiplex® cytokine assays were performed to detect IFN-gamma, IL-2, TNF-alpha, IL-5, IL-10, IL6, IL12p70, IL-4 and IL-1beta, stimulatory cells: T2 cells (HLA- A*02 positive ) loaded with saturating amounts (10 -5 M) of PRAME 100-108 peptide (VLD peptide) or irrelevant PRAME300-309, i.e. ALYVDSLFFL peptide (ALY-peptide, SEQ ID NO: 230),
- 25 041624 супернатанты Т-клеточных совместных культур с Т2-клетками, нагруженными релевантным и нерелевантным пептидом, собирали через 24 ч и затем измеряли с помощью анализа цитокинов Multiplex®.- 25 041624 Supernatants of T-cell co-cultures with T2-cells loaded with relevant and irrelevant peptide were collected after 24 hours and then measured using the Multiplex® cytokine assay.
Результаты.Results.
Кандидатный клон секретировал IFN-гамма, IL-2 и TNF-альфа (цитокины Th1/Tc1) выше фоновых уровней. Паттерн экспрессии цитокинов отражает фенотип Th1, который связан с высокой противоопухолевой эффекторной функцией (фиг. 2).The candidate clone secreted IFN-gamma, IL-2 and TNF-alpha (Th1/Tc1 cytokines) above background levels. The cytokine expression pattern reflects the Th1 phenotype, which is associated with high antitumor effector function (Fig. 2).
Секрецию IL-5 и IL-13 (цитокины Th2/Tc2) не определяли (н.о.).The secretion of IL-5 and IL-13 (Th2/Tc2 cytokines) was not determined (n.d.).
Пример 2.2. Распознание опухолевых клеток.Example 2.2. Recognition of tumor cells.
Схема эксперимента: стимуляция линиями опухолевых клеток.Scheme of the experiment: stimulation of tumor cell lines.
ELISA IFN-гамма использовали для оценки секреции цитокинов после стимуляции группой линий опухолевых клеток человека (статус экспрессии PRAME выявляли с помощью анализа NanoString nCounter®).An IFN-gamma ELISA was used to evaluate cytokine secretion following stimulation with a panel of human tumor cell lines (PRAME expression status was determined by NanoString nCounter® analysis).
Супернатанты собирали через 24 ч после совместного культивирования клона Т-клеток Т4.8-1-29 с К562-А2, Me1-624.38, Colo-678, 647-V и SuDHL-6 (все НЬА-А*02полож). Специфическую секрецию IFNгамма оценивали с помощью стандартного ELISA.Supernatants were harvested 24 hours after co-culture of T4.8-1-29 T cell clone with K562-A2, Me1-624.38, Colo-678, 647-V and SuDHL-6 (all HLA-A*02 positive ). Specific secretion of IFNgamma was assessed using a standard ELISA.
Клетки-мишениtarget cells
К562-А2 (НГА-А*02ПОЛОЖ, PRAME1™),K562-A2 (NGA-A*02 POS , PRAME 1 ™),
Mel-624.38 (НЕА-А*02ПОЛОЖ, PRAME1™),Mel-624.38 (HEA-A*02 POS , PRAME 1 ™),
Colo-678 (НЕА-А*02ПОЛОЖ, РКАМЕотриц), 647-V (НЕА-А*02ПОЛОЖ, РКАМЕотриц), SuDHL-б (НЕА-А*02ПОЛОЖ, РКАМЕотриц).Colo-678 (NEA-A*02 POS , RKAME negative ), 647-V (NEA-A*02 POS , RKAME negative ), SuDHL-b (NEA-A*02 POS , RKAME negative ).
Результаты.Results.
Клон Т-клеток Т4.8-1-29 характеризовался высокой секрецией IFN-гамма при совместном культивировании с PRAME™™^ линиями НЬА-А*02полож опухолевых клеток K562-A2 и Mel-624.38 (положительный контроль: активированные пептидами Т2-клетки), линии PRAMEотриц, HLA-A*02ΠOΛOЖ опухолевых клеток не распознавались клоном Т-клеток Т4.8 (отрицательные контроли; н.о., не определено), только линии опухолевых клеток, экспрессирующие HLAA*02 и PRAME, распознавались самоограниченным клоном Т-клеток Т4.8-1-29, свидетельствуя о специфичности к антигену (фиг. 3).T4.8-1-29 T cell clone was characterized by high secretion of IFN-gamma when co-cultivated with PRAME™™^ HLA-A*02 tumor cell lines K562-A2 and Mel-624.38 (positive control: peptide-activated T2 cells ), PRAME negative , HLA-A*02 ΠOΛOJ tumor cell lines were not recognized by T4.8 T cell clone (negative controls; n.d., not determined), only tumor cell lines expressing HLAA*02 and PRAME were recognized by self-limiting clone of T-cells T4.8-1-29, indicating specificity for the antigen (Fig. 3).
Пример 2.3. Функциональная авидность.Example 2.3. functional avidity.
Схема эксперимента: стимуляция активированных пептидом Т2-клеток.Experimental scheme: stimulation of T2-cells activated by the peptide.
Функциональную авидность Т-клеток в отношении распознавания PRAME100.108 (VLD)-пептида измеряли путем выявления секреции IFN-гамма после совместного культивирования клона Т4.8-1-29 с нагруженными пептидом Т2-клетками.Functional T cell avidity for PRAME 100 recognition. 108 (VLD)-peptide was measured by detecting the secretion of IFN-gamma after co-cultivation of clone T4.8-1-29 with peptide-loaded T2 cells.
Клетки-мишени: Т2-клетки (НЬА-А*02полож, PRAMEотриц), нагруженные титруемыми количествами экзогенного PRAME100.108 (VLD)-пептuдα (от 10-5 М до 10-12 М).Target cells: T2 cells (HLA-A*02 positive , PRAME negative ) loaded with titratable amounts of exogenous PRAME 100 . 108 (VLD)-peptideα (from 10 -5 M to 10 - 12 M).
Соотношение эффектор-мишень (Е:Т) составляет 1:1.The effector-target ratio (E:T) is 1:1.
Относительное высвобождение IFN-гамма выражено в процентах от максимального высвобождения. Полумаксимальная секреция IFN-гамма, определяющая функциональную авидность, указана штрихпунктирными линиями.The relative release of IFN-gamma is expressed as a percentage of the maximum release. Half-maximal secretion of IFN-gamma, which determines functional avidity, is indicated by dash-dotted lines.
Супернатанты культур собирали через ~24 ч после совместного культивирования и оценивали с помощью стандартного ELISA.Culture supernatants were harvested ˜24 h after co-cultivation and evaluated by standard ELISA.
Результаты.Results.
Клон Т4.8-1-29 характеризовался полумаксимальной секрецией IFN-гамма при концентрации от приблизительно 1x10'9 до 1x10'9 моль/л [М] PRAME100.108 пептида (среднее значение из двух независимых экспериментов), что лежит в пределах физиологического диапазона для вирус-специфических Тклеток и, как сообщается, представляет собой необходимую функциональную авидность для высокой противоопухолевой эффективности (Aleksic, M. et al. Eur. J. Immunol.; 42 (12):3174-3179).Clone T4.8-1-29 was characterized by half-maximal secretion of IFN-gamma at a concentration of approximately 1x10'9 to 1x10'9 mol/l [M]PRAME 100 . 108 peptide (mean of two independent experiments), which is within the physiological range for virus-specific T cells and reportedly represents the necessary functional avidity for high antitumor efficacy (Aleksic, M. et al. Eur. J. Immunol. ; 42(12):3174-3179).
^ TCR T4.8-1-29: ~1x10-9 моль/л [М] (фиг. 4).^ TCR T4.8-1-29: ~1x10 -9 mol/l [M] (Fig. 4).
Пример 2.3. Анализ трансгенного Т-клеточного рецептора: TCR T4.8-1-29.Example 2.3. Transgenic T cell receptor assay: TCR T4.8-1-29.
После идентификации PRAME100'108-специфического клона Т-клеток Т4.8-1-29 следующая стадия включала выделение последовательности ДНК, кодирующей информацию о соответствующих цепях TCR, перенос клонированного TCR в соответствующие реципиентные Т-клетки и последующий функциональный анализ TCR-сконструированных Т-клеток.After the identification of the PRAME 100 ' 108 -specific clone of T4.8-1-29 T cells, the next step included isolation of the DNA sequence encoding information about the corresponding TCR chains, transfer of the cloned TCR into the appropriate recipient T cells, and subsequent functional analysis of the TCR-engineered T -cells.
Пример 2.3.1. Анализ последовательности Т-клеточного рецептора.Example 2.3.1. T-cell receptor sequence analysis.
Последовательности ДНК альфа- и бета-цепей TCR исходного клона Т4.8-1-29 анализировали в собственной лаборатории с помощью секвенирования нового поколения (NGS-TCRseq). Соответствующие последовательности ДНК альфа- и бета-цепей TCR реконструировали с помощью синтеза генов на основе ДНК (GeneArt, Регенсбург) и клонировали в каркасы вектора pGEM для продуцирования ivtPHK, а также ретровирусные векторы для стабильной трансдукции.The DNA sequences of the TCR alpha and beta chains of the original T4.8-1-29 clone were analyzed in-house using next generation sequencing (NGS-TCRseq). The corresponding DNA sequences of the TCR alpha and beta chains were reconstructed by DNA-based gene synthesis (GeneArt, Regensburg) and cloned into pGEM vector scaffolds for ivtRNA production, as well as retroviral vectors for stable transduction.
- 26 041624- 26 041624
Пример 2.3.2. Функциональная проверка трансгенного TCR.Example 2.3.2. Functional verification of transgenic TCR.
Перенос последовательности TCR клона Т-клеток Т4.8-1-29 в реципиентные клетки.Transfer of the TCR sequence of the T4.8-1-29 T-cell clone into recipient cells.
Последовательности ДНК TCR исходного клона Т-клеток Т4.8-1-29 либо транскрибировали in vitro в РНК, кодирующую полноразмерные последовательности Т4.8-1-29 TCR для транзиентной трансфекции реципиентных эффекторых клеток путем электропорации, либо использовали для стабильной трансдукции эффекторных клеток с помощью конструкций на основе ретровирусных векторов, также кодирующих последовательность полного TCR T4.8-1-29.The TCR DNA sequences of the original T4.8-1-29 T cell clone were either transcribed in vitro into RNA encoding full-length T4.8-1-29 TCR sequences for transient transfection of recipient effector cells by electroporation, or used to stably transduce effector cells with using constructs based on retroviral vectors, also encoding the sequence of the complete TCR T4.8-1-29.
Схема эксперимента: стимуляция активированных пептидом Т2-клеток.Experimental scheme: stimulation of T2-cells activated by the peptide.
Специфическую секрецию IFN-гамма TCR Т4.8-1-29-трансфицированными реципиентными Тклетками (клон CD8n0Λ0ж реципиентных Т-клеток + Т4.8-1-29 ivtPHK) при совместном культивировании с активированными PRAME100_108 (VLD)-пептидом Т2-клетками, измеряли с помощью стандартного ELISA.Specific secretion of IFN-gamma TCR T4.8-1-29-transfected recipient T-cells (clone CD8 n0Λ0g of recipient T-cells + T4.8-1-29 ivtRNA) when co-cultivated with activated PRAME 100 _ 108 (VLD)-peptide T2 -cells, measured using a standard ELISA.
Клетки-мишени: Т2-клетки (HLA-А*02nолож, PRAME0TpuY активированные 10-5 М VLD (релевантным) или ELA-пептидом (нерелевантным) (ELAGIGILTV, MelanA, SEQ IDNO: 231).Target cells: T2 cells (HLA-A*02 null , PRAME 0Tpu Y activated with 10 -5 M VLD (relevant) or ELA peptide (irrelevant) (ELAGIGILTV, MelanA, SEQ IDNO: 231).
Результаты.Results.
TCR Т4.8-1-29-трансфицированные реципиентные Т-клетки характеризовались высоким распознаванием Т2-клеток, нагруженных релевантным пептидом, однако распознавание в том случае, когда Т2клетки нагружали нерелевантным пептидом, отсутствовало.TCR T4.8-1-29 transfected recipient T cells showed high recognition of T2 cells loaded with the relevant peptide, but no recognition when T2 cells were loaded with an irrelevant peptide.
Последовательности ДНК альфа- и бета-цепей TCR T4.8-1-29 реконструировали корректным образом и они характеризовались высокой эффективностью в качестве трансгенов (фиг. 5).TCR T4.8-1-29 alpha and beta chain DNA sequences were correctly reconstructed and were highly efficient as transgenes (FIG. 5).
Пример 2.4. Анализ распознавания аутопептидов.Example 2.4. Autopeptide recognition assay.
Схема эксперимента: секреция INF-гамма CD8+ обогащенными РВМС, экспрессирующими TCR T4.8-1-29 при совместном культивировании с нагруженными пептидом Т2-клеткамиExperimental design: INF-gamma secretion by CD8+ enriched PBMCs expressing TCR T4.8-1-29 when co-cultured with peptide-loaded T2 cells
Секрецию INF-гамма CD8+ обогащенными РВМС, экспрессирующими Т-клеточный рецептор клона Т4.8-1-29, совместно культивированных с клетками-мишенями Т2 (HLA-А*02nолож, PRAMEотрuц), нагруженными 10-5 М PRAME100_108 VLD-пептида или универсальными аутопептидами, элюированными из HLA-A*02 (131 аутопептид), определяли с помощью анализа ELISA.Secretion of INF-gamma by CD8+ enriched PBMCs expressing the T-cell receptor clone T4.8-1-29 co-cultured with T2 target cells (HLA-A*02 negative, PRAME negative ) loaded with 10 -5 M PRAME 100 _ 108 VLD peptide or universal autopeptides eluted from HLA-A*02 (131 autopeptides) were determined by ELISA analysis.
Результаты.Results.
CD8 обогащенные РВМС, экспрессирующие Т-клеточный рецептор клона Т4.8-1-29, характеризовались отсутствием секреции INF-гамма в случае совместного культивирования с Т2-клетками (HLAА*02полож PRAMEотрuц), нагруженными универсальными аутопептидами (положительный контроль: нагруженные PRAME100_108 Т2-клетки), отражающей высокую специфичность TCR 4.8-1-29 (фиг. 6).CD8-enriched PBMCs expressing the T-cell receptor clone T4.8-1-29 were characterized by the absence of INF-gamma secretion when co-cultured with T2 cells (HLAA*02 positive PRAME negative ) loaded with universal autopeptides (positive control: loaded PRAME 100 _ 108 T2 cells), reflecting the high specificity of TCR 4.8-1-29 (Fig. 6).
Пример 2.5. Анализ цитотоксичности.Example 2.5. Cytotoxicity assay.
Схема эксперимента: лизис активированных пептидом Т2-клеток.Experimental scheme: lysis of peptide-activated T2 cells.
Лизис активированных PRAME100_108 (VLD) пептидом Т2-клеток измеряли с помощью флуоресцентного киллинг-анализа TVA™ (CTL, Cellular Technology Limited, США), определяющего исчезновение флуоресцентно меченых клеток-мишеней в ходе совместного культивирования с CD8 обогащенными РВМС, экспрессирующими Т4.8-1-29 TCR.The lysis of activated PRAME 100 _ 108 (VLD) T2 peptide cells was measured using the TVA™ fluorescent killing assay (CTL, Cellular Technology Limited, USA), which determines the disappearance of fluorescently labeled target cells during co-cultivation with CD8 enriched PBMC expressing T4 .8-1-29 TCR.
Клетки-мишени: Т2-клетки (HLA-A*02nолож, PRAMEотрuц), активированные 10-5 М PRAME100_108 VLD (релевантным) или SLL (SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 229), PRAME, нерелевантным) пептидом, совместно культивируемым с TCR Т4.8-1-29, экспрессирующими РВМС при оцененных соотношениях Е:Т.Target cells: T2 cells (HLA-A*02 negative , PRAME negative ) activated with 10 -5 M PRAME 100 - 108 VLD (relevant) or SLL (SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 229), PRAME, irrelevant) peptide, co-cultured with TCR T4.8-1-29 expressing PBMC at estimated E:T ratios.
Результаты.Results.
T4.8-1-29, экспрессирующие РВМС, характеризовались эффективным лизисом Т2-клеток, нагруженных релевантным (VLD) пептидом даже при низких соотношениях Е:Т.T4.8-1-29 expressing PBMCs were characterized by efficient lysis of T2 cells loaded with the relevant (VLD) peptide even at low E:T ratios.
Т2-клетки, нагруженные нерелевантным SLL-пептидом (PRAME), не лизировались (отрицательный контроль) при любом соотношении Е:Т (фиг. 7).T2 cells loaded with irrelevant SLL peptide (PRAME) did not lyse (negative control) at any E:T ratio (FIG. 7).
Схема эксперимента: лизис опухолевых клеток.Experimental scheme: lysis of tumor cells.
Цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток анализировали с помощью флуоресцентного киллинг-анализа TVA™ (CTL, Cellular Technology Limited, США), выявляющего исчезновение флуоресцентно меченых клеток-мишеней в ходе совместного культивирования с РВМС, экспрессирующими трансгенный TCR клона Т-клеток Т4.8-1-29.Cytotoxic activity against tumor cells was analyzed using the TVA™ fluorescent killing assay (CTL, Cellular Technology Limited, USA), which detects the disappearance of fluorescently labeled target cells during co-cultivation with PBMCs expressing the transgenic TCR of T-cell clone T4.8- 1-29.
Клетки-мишени: для экспериментов использовали линию опухолевых клеток человека K562. Клетки K562 трансфицировали с использованием ivtPHK, кодирующей HLA-A*02:01 человека, и/или РНК, кодирующей PRAME человека. Клетки K562 человека характеризуются эндогенной экспрессией PRAME (определенной с помощью Nanonstring и описанной в литературе). Кроме того, экспрессия PRAME повышалась в результате трансфекции клеток K562 ivtPHK, кодирующей PRAME человека, или в результате загрузки PRAME100.108 VLD- пептида.Target cells: Human tumor cell line K562 was used for experiments. K562 cells were transfected with ivtRNA encoding human HLA-A*02:01 and/or RNA encoding human PRAME. Human K562 cells are characterized by endogenous PRAME expression (determined by Nanonstring and described in the literature). In addition, PRAME expression was upregulated by transfection of K562 cells with ivtRNA encoding human PRAME or by loading with PRAME 100 . 108 VLD peptide.
K562, трансфицированные ivtPHK, кодирующей HLA-A*02:01, или нагруженные PRAME100-108 (VLD)-пептидом: K562- (PRAME+/A2’)+A2-ivtPHK+VLD пептид (фиг. 8А).K562 transfected with ivtRNA encoding HLA-A*02:01 or loaded with PRAME 100-108 (VLD)-peptide : K562-(PRAME+/A2')+A2-ivtPHK+VLD peptide (FIG. 8A).
K562, трансдуцированные ivtPHK, кодирующие PRAME: K562-(PRAME+/A2’)+PRAME-ivtPHKK562 transduced ivtPHK encoding PRAME: K562-(PRAME+/A2')+PRAME-ivtPHK
- 27 041624 (фиг. 8В).- 27 041624 (Fig. 8B).
K562, трансфицированные ivtPHK, кодирующей PRAME, и ivtPHK, кодирующей HLA-A*02: K562(PRAME+/A2')+A2-ivtPHK (фиг. 8С).K562 transfected with ivtRNA encoding PRAME and ivtRNA encoding HLA-A*02: K562(PRAME + /A2')+A2-ivtRNA (Fig. 8C).
K562, трансфицированные ivtPHK, кодирующей HLA-A*02 ivtPHK: K562-(PRAME+/A2-)+A2ivtPHK + PRAME ivtPHK (фиг. 8D).K562 transfected with ivtPHK encoding HLA-A*02 ivtPHK: K562-(PRAME + /A2 - )+A2ivtPHK + PRAME ivtPHK (Fig. 8D).
Опухолевые клетки, кокультивируемые с TCR T4.8-1-29-экспрессирующими РВМС в оцененных соотношениях Е:Т.Tumor cells co-cultured with TCR T4.8-1-29 expressing PBMCs at estimated E:T ratios.
Результаты.Results.
Трансфекция PRAME ivtPHK, а также VLD-пептидом, нагруженным HLA-A*O2:O1экспрессирующими К562-клетками, повышала специфический лизис РВМС, экспрессирующих трансгенный TCR T4.8-1-29 (фиг. 8A-D).Transfection with PRAME ivtRNA as well as VLD peptide loaded with HLA-A*O2:O1 expressing K562 cells increased the specific lysis of PBMCs expressing the transgenic TCR T4.8-1-29 (Fig. 8A-D).
Пример 2.5. Распознавание опухолевых клеток CD8+ обогащенными РВМС-экспрессирующими TCR T4.8-1-29.Example 2.5. Recognition of CD8 + tumor cells enriched in PBMC-expressing TCR T4.8-1-29.
Схема эксперимента: стимуляция линиями опухолевых клетокExperimental scheme: stimulation of tumor cell lines
ELISA IFN-гамма использовали для оценки секреции цитокинов после стимуляции группой линий опухолевых клеток человека (статус экспрессии PRAME выявляли с помощью анализа NanoString nCounter®).An IFN-gamma ELISA was used to evaluate cytokine secretion following stimulation with a panel of human tumor cell lines (PRAME expression status was determined by NanoString nCounter® analysis).
Супернатанты собирали через 24 ч совместного культивирования CD8 обогащенных РВМС, экспрессирующих Т-клеточный рецептор Т4.8-1-29 с К562-В35, К562-А2, Mel-624.38, Colo-678 и SKMEL23. Специфическую секрецию IFN-гамма оценивали с помощью стандартного ELISA.Supernatants were harvested after 24 hours of co-cultivation of CD8 enriched PBMCs expressing the T-cell receptor T4.8-1-29 with K562-B35, K562-A2, Mel-624.38, Colo-678 and SKMEL23. Specific secretion of IFN-gamma was assessed using a standard ELISA.
Клетки-мишениtarget cells
К562-В35 (НЕА-А*02отриц, PRAME™),K562-B35 (NEA-A*02 negative , PRAME™),
К562-А2 (HLA-A*02™, PRAME™),K562-A2 (HLA-A*02™, PRAME™),
К562-А2 (НЕА-А*02ПОЛОЖ, PRAME1™), нагруженные VLD-пептидом,K562-A2 (HEA-A*02 POS , PRAME 1 ™) loaded with VLD peptide,
Mel-624.38 (HLA-A*02™, PRAME™),Mel-624.38 (HLA-A*02™, PRAME™),
SkMEL23 (HLA-A*02™, PRAME010').SkMEL23 (HLA-A*02™, PRAME 010 ').
Результаты.Results.
CD8+ обогащенные РВМС, экспрессирующие Т-клеточный рецептор Т4.8-1-29, характеризовались высокой секрецией IFN-гамма при совместном культивировании с PRAMEpos, линиями HLA-A*02pos опухолевых клеток К562-А2, К562-А2, дополнительно нагруженными VLD-пептидом, промежуточной секрецией INF-гамма при совместном культивировании с PRAMEполож, HLA-А*02полож Mel-624.38 и SkMEL23.CD8 + enriched PBMCs expressing T-cell receptor T4.8-1-29 were characterized by high secretion of IFN-gamma when co-cultivated with PRAME pos , HLA-A*02 pos tumor cell lines K562-A2, K562-A2, additionally loaded VLD-peptide, intermediate secretion of INF-gamma when co-cultivated with PRAME pos , HLA-A*02 pos Mel-624.38 and SkMEL23.
Экспрессия PRAMEполож K562 с HLA-B*35 не индуцировала секрецию INF-гамма, что подтверждало ограничение HLA-A*02 TCR T4.8-1-29 (фиг. 10).Expression of PRAME pos K562 with HLA-B*35 did not induce INF-gamma secretion, confirming HLA-A*02 TCR T4.8-1-29 restriction (FIG. 10).
Пример 2.6. Трансдукция РВМС TCR T4.8-1-29.Example 2.6. Transduction of PBMC TCR T4.8-1-29.
CD8-обогащенные РВМС здорового донора трансдуцировали плазмидой, содержащей конструкцию TCR T4.8-1-29. Для анализа эффективности трансдукции TCR осуществляли FACS-анализ после окрашивания нетрансдуцированных и TCR Т4.8-1-29-трансдуцированных РВМС. Клетки окрашивали антителами, специфическими к CD8 и к вариабельному участку TCR β-цепи TCR (TRBV9). В популяции контрольных эффекторных клеток присутствовало 8% эндогенно TRBV9-экспрессирующих Т-клеток, в то время как после трансдукции 60% Т-клеток экспрессировали TRBV9. Это указывает на эффективность трансдукции, которая составляла более 50% (фиг. 11).Healthy donor CD8-rich PBMCs were transduced with a plasmid containing the TCR T4.8-1-29 construct. To analyze the efficiency of TCR transduction, FACS analysis was performed after staining of non-transduced and TCR T4.8-1-29-transduced PBMCs. Cells were stained with antibodies specific for CD8 and for the TCR variable region of the TCR β chain (TRBV9). In the control effector cell population, 8% of endogenously TRBV9-expressing T cells were present, while after transduction, 60% of T cells expressed TRBV9. This indicates a transduction efficiency that was over 50% (FIG. 11).
Пример 2.7. Функциональная авидность Т-клеток по отношению к PRAME100.108 (VLD) пептиду с использованием клона Т-клеток Т4.8-1-29 и РВМС, трансдуцированных TCR T4.8-1-29.Example 2.7. Functional avidity of T cells in relation to PRAME 100 . 108 (VLD) peptide using T4.8-1-29 T-cell clone and PBMC transduced with TCR T4.8-1-29.
Функциональную авидность Т-клеток по отношению к распознаванию PRAME100.108 (VLD)-пептида измеряли путем выявления секреции IFN-гамма после совместного культивирования либо с клоном Тклеток Т4.8-1-29 (сплошная кривая), либо с эффекторными РВМС, трансдуцированными Т4.8-1-29 (пунктирная кривая) с помощью нагруженных пептидом Т2-клеток. Т2-клетки нагружали титруемыми количествами пептида, концентрация которого варьировала от 10-5 М до 10-12 М. Супернатанты совместной культуры собирали через ~24 ч после совместного культивирования и оценивали с помощью стандартного ELISA, при этом относительное высвобождение IFN-гамма выражено в процентах от максимального высвобождения. Полумаксимальная секреция IFN-гамма (ЕС50), определяющая функциональную авидность, указана штрих-пунктирной линией. Функциональная авидность клона исходных Тклеток и трансгенных TCR является весьма схожей (фиг. 12). Пример 2.8. Анализ специфичности к антигену РВМС, трансдуцированных TCR T4.8-1-29, и нетрансдуцированных контрольных РВМС с различными целевыми клетками (ОРМ-2 и U937)Functional avidity of T cells in relation to PRAME 100 recognition. 108 (VLD)-peptide was measured by detection of IFN-gamma secretion after co-culture with either T4.8-1-29 T cell clone (solid curve) or effector PBMCs transduced with T4.8-1-29 (dashed curve) with using peptide-loaded T2 cells. T2 cells were loaded with titratable amounts of the peptide, the concentration of which ranged from 10 -5 M to 10 -12 M. Co-culture supernatants were harvested ˜24 h after co-culture and evaluated using standard ELISA, with the relative release of IFN-gamma expressed as a percentage from maximum release. Half-maximal secretion of IFN-gamma (EC50), which determines functional avidity, is indicated by a dash-dotted line. The functional avidity of the original T cell clone and the transgenic TCR is very similar (FIG. 12). Example 2.8. Antigen specificity analysis of PBMCs transduced with TCR T4.8-1-29 and non-transduced control PBMCs with different target cells (OPM-2 and U937)
Для анализа специфичности к антигену, Т4.8-1-29-трансдуцированные эффекторные РВМС и нетрансдуцированные контрольные РВМС совместно культивировали с различными целевыми клетками. Линии опухолевых клеток ОРМ-2 и U937 (HLA-А2-отрицательные и PRAME-отрицательные) тестировали либо немодифицированными, либо трансфицированными ivtPHK, кодирующей HLA-A2. Кроме того, клетки также тестировали после трансфекции комбинацией ivtPHK, кодирующей HLA-A2 и PRAME, илиFor antigen specificity analysis, T4.8-1-29-transduced effector PBMCs and non-transduced control PBMCs were co-cultured with different target cells. The tumor cell lines ORM-2 and U937 (HLA-A2 negative and PRAME negative) were tested either unmodified or transfected with ivtRNA encoding HLA-A2. In addition, cells were also tested after transfection with a combination of ivtRNA encoding HLA-A2 and PRAME, or
- 28 041624- 28 041624
HLA-A2 и нерелевантного антигена. В качестве контроля эффекторные клетки также совместно культивировали с Т2-клетками, нагруженными PRAMEVLD пептидом (10-5М) или нерелевантным PRAMESLL пептидом (10-5М). Через 24 ч совместного культивирования супернатанты собирали и секретированные количества IFN-гамма измеряли с помощью стандартного ELISA. Высокие количества IFN-гамма измеряли в случае TCR-трансдуцированных РМВС в совместной культуре с VLD-нагруженными Т2клетками. Кроме того, обе из линий опухолевых клеток, трансфицированные HLA-A2 и антигеном PRAME, индуцировали секрецию IFN-гамма TCR-трансдуцированными РВМС. Таким образом, лишь опухолевые клетки, экспрессирующие HLA-A2 в качестве необходимого элемента ограничения МНС, в комбинации с антигеном PRAME, распознавались и приводили к активации Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС (фиг. 13).HLA-A2 and irrelevant antigen. As a control, effector cells were also co-cultured with T2 cells loaded with PRAME VLD peptide (10 -5 M) or irrelevant PRAMESLL peptide (10 -5 M). After 24 hours of co-culture, supernatants were collected and secreted amounts of IFN-gamma were measured using a standard ELISA. High amounts of IFN-gamma were measured in the case of TCR-transduced PBMCs in co-culture with VLD-loaded T2 cells. In addition, both of the tumor cell lines transfected with HLA-A2 and PRAME antigen induced IFN-gamma secretion from TCR-transduced PBMCs. Thus, only tumor cells expressing HLA-A2 as a necessary element of MHC restriction, in combination with the PRAME antigen, were recognized and resulted in the activation of T4.8-1-29-expressing PBMCs (Fig. 13).
Пример 2.9. Анализ специфичности к антигену РВМС, трансдуцированных TCR T4.8-1-29, и нетрансдуцированных контрольных РВМС с различными клетками-мишенями (K562, К562_А2 и Mel 624.38).Example 2.9. Antigen specificity analysis of PBMCs transduced with TCR T4.8-1-29 and non-transduced control PBMCs with different target cells (K562, K562_A2 and Mel 624.38).
Для анализа специфичности к антигену, Т4.8-1-29-трансдуцированные эффекторные РВМС и нетрансдуцированные контрольные РВМС совместно культивировали с различными линиями клетокмишеней. Тестировали линии опухолевых клеток K562 (HLA-A2- отрицательные и PRAMEположительные), а также К562_А2 и Mel 624.38 (HLA-A-положительные и PRAME-положительные) и 647-V (HLA-А2-положительные и PRAME-отрицательные). В качестве контроля эффекторные клетки также совместно культивировали с Т2-клетками, нагруженными PRAMEVLD пептидом (10-5 М) или нерелевантным PRAMESLL пептидом (10-5М). Через 24 ч совместного культивирования супернатанты собирали и секретированные количества IFN-гамма измеряли с помощью стандартного ELISA. Высокие количества IFN-гамма измеряли в случае TCR-трансдуцированных РМВС в совместной культуре с VLDнагруженными Т2-клетками.For antigen specificity analysis, T4.8-1-29-transduced effector PBMCs and non-transduced control PBMCs were co-cultured with different target cell lines. Tumor cell lines K562 (HLA-A2-negative and PRAME-positive), as well as K562_A2 and Mel 624.38 (HLA-A-positive and PRAME-positive) and 647-V (HLA-A2-positive and PRAME-negative) were tested. As a control, effector cells were also co-cultured with T2 cells loaded with PRAME VLD peptide (10 -5 M) or irrelevant PRAMESLL peptide (10 -5 M). After 24 hours of co-culture, supernatants were collected and secreted amounts of IFN-gamma were measured using a standard ELISA. High amounts of IFN-gamma were measured in the case of TCR-transduced PBMCs in co-culture with VLD-loaded T2 cells.
Измеренные значения IFN-гамма указывали на активацию TCR T4.8-1-29-трансдуцированных РВМС Т2-клетками, нагруженными VLD-пептидом, и линиями опухолевых клеток К562_А2 и Mel624.38. Таким образом, только HLA-А2-положительные эндогенно PRAME-экспрессирующие линии опухолевых клеток распознавались трансдуцированными РВМС, в то время как отсутствие либо HLAA2, либо антигена предупреждало активацию (фиг. 14).The measured IFN-gamma values indicated TCR activation of T4.8-1-29-transduced PBMCs by VLD-peptide-loaded T2 cells and tumor cell lines K562_A2 and Mel624.38. Thus, only HLA-A2-positive endogenously PRAME-expressing tumor cell lines were recognized by transduced PBMCs, while the absence of either HLAA2 or antigen prevented activation (FIG. 14).
Пример 2.10. Анализ цитотоксической активности Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторов в отношении опухолевых клеток.Example 2.10. Analysis of the cytotoxic activity of T4.8-1-29-transduced effectors against tumor cells.
Цитотоксическую активность Т4.8-1-29-трансдуцированных эффекторов в отношении опухолевых клеток анализировали с помощью системы для анализа живых клеток IncuCyte ZOOM® (Essenbiosciences), системы на основе микроскопа, которая позволяет визуализацию живых клеток. TCR Т4.8-1-29-трансдуцированные и нетрансдуцированыне эффекторные РВМС совместно культивировали с HLA-А2-положительной, PRAME-положительной клеточной линией меланомы Mel624.38. Клетки меланомы высевали в 96-луночный планшет и при достижении конфлюентности, составляющей ~60%, добавляли эффекторные клетки. Для визуализации гибели клеток также добавляли красный V-краситель аннексин и изображения снимали ежедневно в течение 4 дней. Линию клеток меланомы Mel624.38 в совместной культуре с нетрансдуцированными эффекторами (верхний ряд) выращивали в динамике, и при этом могли отмечаться только редкие случаи гибели клеток, в то время как TCR-трансдуцированные эффекторы предупреждали разрастание опухолевых клеток и приводили к образованию скоплений клеток с высоким количеством погибающих клеток. Это указывает на то, что Т4.8-1-29-экспрессирующие эффекторные клетки могут эффективно лизировать PRAME-экспрессирующие опухолевые клетки и предупреждать рост опухолевых клеток в течение нескольких дней.The cytotoxic activity of T4.8-1-29-transduced effectors against tumor cells was analyzed using the IncuCyte ZOOM® live cell assay system (Essenbiosciences), a microscope-based system that allows visualization of live cells. TCR T4.8-1-29-transduced and non-transduced non-effector PBMCs were co-cultured with the HLA-A2 positive, PRAME positive melanoma cell line Mel624.38. Melanoma cells were seeded in a 96-well plate and upon reaching a confluence of ~60%, effector cells were added. Annexin red V-dye was also added to visualize cell death and images were taken daily for 4 days. The melanoma cell line Mel624.38 in co-culture with non-transduced effectors (upper row) was grown dynamically, and only rare cases of cell death could be observed, while TCR-transduced effectors prevented the growth of tumor cells and led to the formation of clusters of cells with high number of dead cells. This indicates that T4.8-1-29-expressing effector cells can effectively lyse PRAME-expressing tumor cells and prevent tumor cell growth within days.
Пример 2.11. Анализ профиля безопасности Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС.Example 2.11. Analysis of the safety profile of T4.8-1-29-expressing PBMCs.
Для анализа профиля безопасности Т4.8-1-29-экспрессирующих РВМС, необходимо было исключить распознавание нормальных тканей человека. Таким образом, Т4.8-1-29-трансдуцированные РВМС, происходящие от двух различных доноров, совместно культивировали с клетками, происходящими из нормальных тканей HLA-A2-положительных доноров. В качестве примера трансдуцированные, а также нетрансдуцированные РВМС совместно культивировали с эпителиальными клетками капилляров почек человека (HRCEpC). В качестве контроля клетки HRCEp дополнительно нагружали VLD-пептидом (10-5 М). Через 24 ч совместного культивирования супернатанты собирали и секретированные количества IFN-гамма измеряли с помощью стандартного ELISA. TCR-трансдуцированные РВМС активировались только при совместном культивировании с нагруженными пептидом целевыми клетками, в то время как распознавание немодифицированных клеток HRCEp отсутствовало.To analyze the safety profile of T4.8-1-29-expressing PBMCs, recognition of normal human tissues had to be excluded. Thus, T4.8-1-29-transduced PBMCs derived from two different donors were co-cultured with cells derived from normal tissues of HLA-A2 positive donors. As an example, transduced as well as non-transduced PBMCs were co-cultured with human renal capillary epithelial cells (HRCEpC). As a control, HRCEp cells were additionally loaded with VLD peptide (10 -5 M). After 24 hours of co-culture, supernatants were collected and secreted amounts of IFN-gamma were measured using a standard ELISA. TCR-transduced PBMCs were only activated when co-cultured with peptide-loaded target cells, while recognition of unmodified HRCEp cells was absent.
Основные признаки настоящего изобретения перечислены в следующих пунктах.The main features of the present invention are listed in the following paragraphs.
1. Т-клеточный рецептор (TCR), содержащий:1. T-cell receptor (TCR), containing:
(i) CDR3 вариабельного участка альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 1, или состоящий из нее, и/или (ii) CDR3 вариабельного участка бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность(i) a TCR alpha chain variable region CDR3 comprising the amino acid sequence CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) or an amino acid sequence that is at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 1, or consisting of it, and/or (ii) a CDR3 of the variable region of the TCR beta chain, containing the amino acid sequence
- 29 041624- 29 041624
CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 2, или состоящий из нее, при этом указанный TCR способен связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31) или ее МНС-связанной форме, предпочтительно эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) или ее МНС-связанной форме.CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2) or an amino acid sequence that is at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to or consisting of SEQ ID NO: 2, wherein said TCR is capable of binding to an epitope contained in the amino acid sequence X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31) or its MHC-linked form, preferably an epitope contained in the amino acid sequence VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) or its MHC-linked form.
2. TCR по п.1, содержащий:2. TCR according to claim 1, containing:
(i) вариабельный участок альфа-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, или состоящий из нее, и/или (ii) вариабельный участок бета-цепи TCR, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, или состоящий из нее.(i) a TCR alpha chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and/or (ii) a TCR beta chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, or consisting of it.
3. TCR по любому из пп.1 или 2, дополнительно содержащий:3. TCR according to any one of claims 1 or 2, further comprising:
(i) константный участок альфа-цепи TCR и/или (ii) константный участок бета-цепи TCR.(i) a TCR alpha chain constant region; and/or (ii) a TCR beta chain constant region.
4. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:4. TCR according to any of the preceding paragraphs, containing:
(i) альфа-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 7, 11, 9 или 13, или состоящую из нее, и/или (ii) бета-цепь TCR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно на 90 или 95% идентична SEQ ID NO: 8, 10, 12 или 14, или состоящую из нее.(i) a TCR alpha chain comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 13, or an amino acid sequence that is at least 80% identical , more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to or consisting of SEQ ID NO: 7, 11, 9 or 13, and/or (ii) a TCR beta chain containing the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85% identical, more preferably 90 or 95% identical to SEQ ID NO: 8, 10, 12 or 14, or consisting of it.
5. TCR по любому из предыдущих пунктов, при этом указанный TCR выбран из нативного TCR, варианта TCR, фрагмента TCR или TCR-конструкции.5. A TCR according to any of the preceding claims, wherein said TCR is selected from a native TCR, a TCR variant, a TCR fragment, or a TCR construct.
6. TCR-конструкция по п.5, содержащая по меньшей мере одну альфа-цепь(цепи) TCR и по меньшей мере одну бета-цепь(цепи) TCR, ковалентно связанные друг с другом с образованием гетеродимеров или мультимеров TCR.6. The TCR construct of claim 5, comprising at least one TCR alpha chain(s) and at least one TCR beta chain(s) covalently linked to each other to form TCR heterodimers or multimers.
7. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий один или более слитых компонентов, необязательно выбранных из Fc-рецепторов; Fc-доменов, в том числе IgA, IgD, IgG, IgE и IgM; цитокинов, в том числе IL-2 или IL-15; токсинов; антител или их антигенсвязывающих фрагментов, в том числе антител к CD3, к CD28, к CD5, к CD16 или к CD56 или их антигенсвязывающих фрагментов; CD247- (CD3-дзета), CD28-, CD137-, CD134-домена или их комбинаций, необязательно дополнительно содержащих по меньшей мере один линкер.7. TCR according to any one of the preceding paragraphs, additionally containing one or more fused components, optionally selected from Fc receptors; Fc domains including IgA, IgD, IgG, IgE and IgM; cytokines, including IL-2 or IL-15; toxins; antibodies or antigen-binding fragments thereof, including anti-CD3, anti-CD28, anti-CD5, CD16 or CD56 antibodies or antigen-binding fragments thereof; CD247- (CD3-zeta), CD28-, CD137-, CD134-domain or combinations thereof, optionally additionally containing at least one linker.
8. TCR по любому из предыдущих пунктов, содержащий:8. TCR according to any of the preceding paragraphs, containing:
(i) по меньшей мере одну альфа-цепь TCR, определенную в любом из пп.1-3, и (ii) по меньшей мере одну бета-цепь TCR, определенную в любом из пп.1-3, (iii) антитело или фрагмент одноцепочечного антитела (scFv), которые направлены против антигена или эпитопа на поверхности лимфоцитов, где альфа-цепь(цепи) TCR и бета-цепь(цепи) TCR связаны друг с другом и слиты с указанным антителом или scFv необязательно посредством линкера.(i) at least one TCR alpha chain as defined in any one of claims 1-3, and (ii) at least one TCR beta chain as defined in any one of claims 1-3, (iii) an antibody, or a single chain antibody fragment (scFv) that is directed against an antigen or epitope on the surface of lymphocytes, wherein the TCR alpha chain(s) and TCR beta chain(s) are linked to each other and fused to said antibody or scFv, optionally via a linker.
9. TCR по п.8, где указанный антиген выбран из CD3, CD28, CD5, CD16 или CD56.9. TCR according to claim 8, wherein said antigen is selected from CD3, CD28, CD5, CD16, or CD56.
10. TCR по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий по меньшей мере одну метку.10. A TCR according to any one of the preceding claims, further comprising at least one label.
11. TCR по любому из предыдущих пунктов, который является растворимым.11. TCR according to any of the preceding paragraphs, which is soluble.
12. Нуклеиновая кислота, кодирующая TCR по любому из предыдущих пунктов.12. A nucleic acid encoding a TCR according to any one of the preceding claims.
13. Нуклеиновая кислота по п.12, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.13. Nucleic acid according to claim 12, containing the nucleic acid sequence under SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30.
14. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.12 или 13.14. A vector containing a nucleic acid according to any one of claims 12 or 13.
15. Клетка-хозяин, содержащая TCR по любому из пп.1-11, последовательность нуклеиновой кислоты по п.12 или 13 или вектор по п.14.15. A host cell comprising a TCR according to any one of claims 1 to 11, a nucleic acid sequence according to claim 12 or 13, or a vector according to claim 14.
16. Клетка-хозяин по п.15, которая выбрана из лимфоцитов, в том числе без ограничения цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, естественных киллерных (NK) клеток, естественных киллерных (NKT) Т-клеток, гамма/дельта-Т-клеток.16. The host cell of claim 15, which is selected from lymphocytes, including, but not limited to, cytotoxic T lymphocytes (CTL), CD8+ T cells, CD4+ T cells, natural killer (NK) cells, natural killer (NKT) cells T cells, gamma/delta T cells.
17. Способ получения TCR по любому из пп.1-11, предусматривающий:17. A method for producing TCR according to any one of claims 1 to 11, comprising:
(i) инкубацию клетки-хозяина по п.15 или 16 в условиях, вызывающих экспрессию указанного TCR, (ii) очистку указанного TCR.(i) incubating the host cell according to claim 15 or 16 under conditions causing the expression of said TCR, (ii) purifying said TCR.
18. Фармацевтическая или диагностическая композиция, содержащая одно или более из:18. Pharmaceutical or diagnostic composition containing one or more of:
(i) TCR по любому из пп.1-11, (ii) нуклеиновой кислоты по любому из пп.12 или 13, (iii) вектора по п.14 и/или (iv) клетки-хозяина по любому из пп.15 или 16,(i) a TCR according to any one of claims 1 to 11, (ii) a nucleic acid according to any one of claims 12 or 13, (iii) a vector according to claim 14 and/or (iv) a host cell according to any one of claims 15 or 16
--
Claims (4)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LU93112 | 2016-06-17 | ||
EP17160260.0 | 2017-03-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA041624B1 true EA041624B1 (en) | 2022-11-15 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20240083967A1 (en) | T cell receptors and uses thereof | |
US20220401484A1 (en) | Prame TCR Receptors And Uses Thereof | |
WO2017064084A1 (en) | Novel chimeric antigen receptors | |
CA3082410A1 (en) | Multifunctional immune cell therapies | |
EP3293199B1 (en) | Chimeric antigen receptors | |
JP7412006B2 (en) | Inducible T cell receptors and their uses | |
US20230340065A1 (en) | Prame specific t-cell receptors and uses thereof | |
WO2019161133A1 (en) | Foxp3 targeting agent compositions and methods of use for adoptive cell therapy | |
EA041624B1 (en) | PRAME-SPECIFIC T-CELL RECEPTOR AND ITS APPLICATIONS | |
US20230348560A1 (en) | Chimeric ilt receptor compositions and methods |