EA041577B1 - Связывающиеся с сывороточным альбумином домены фибронектина типа iii - Google Patents

Связывающиеся с сывороточным альбумином домены фибронектина типа iii Download PDF

Info

Publication number
EA041577B1
EA041577B1 EA201892796 EA041577B1 EA 041577 B1 EA041577 B1 EA 041577B1 EA 201892796 EA201892796 EA 201892796 EA 041577 B1 EA041577 B1 EA 041577B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
domain
seq
isolated
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
EA201892796
Other languages
English (en)
Inventor
Майкл Дим
Стивен Джекобс
Карин О'Нил
Томас Руткоски
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of EA041577B1 publication Critical patent/EA041577B1/ru

Links

Description

Подробное описание иллюстративных вариантов осуществления Определения
Различные термины, относящиеся к аспектам описания, используются на протяжении описания и формулы изобретения. Такие термины должны иметь свое обычное значение в данной области техники, если не указано иное. Другие специально определенные термины должны толковаться таким образом, чтобы соответствовать приведенным здесь определениям.
Используемые в этом описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа a, an и the включают множественные объекты ссылки, если содержание явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на клетку включает комбинацию из двух или более клеток и т.п.
Используемый здесь термин приблизительно, когда он относится к измеряемому значению, такому как количество, продолжительность по времени и т.п., предназначен для охвата отклонений от заданного значения до ±10%, поскольку такие отклонения являются соответствующими для выполнения раскрытых способов. Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, такие свойства, как молекулярная масса, условия реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях с помощью термина приблизительно. Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, изложенные в следующем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближениями, которые могут варьировать в зависимости от желаемых свойств, которые пытаются получить с помощью настоящего изобретения. Хотя бы, а не как попытка ограничить применение доктрины эквивалентов в отношении объема формулы изобретения, каждый числовой параметр должен, по крайней мере, истолковываться с учетом числа сообщаемых значимых цифр и путем применения обычных методов округления. Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, определяющие широкий объем настоящего изобретения, являются приблизительными, числовые значения, указанные в конкретных примерах, сообщаются с максимально возможной точностью. Однако любое числовое значение по своей природе содержит определенные ошибки, неизбежно возникающие в результате стандартного отклонения, обнаруживаемого в их соответствующих тестовых измерениях.
Выделенный означает, что биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота, пептид или белок) был в значительной степени отделен, произведен отдельно или очищен от других биологических компонентов организма, в котором этот компонент встречается в природе, т.е. других хромосомных и экстрахромосомных ДНК и РНК, а также белков. Таким образом, нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, которые были выделены, включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Выделенные нуклеиновые кислоты, пептиды и белки могут быть частью
- 3 041577 композиции и все же быть выделенными, если такая композиция не является частью естественной среды нуклеиновой кислоты, пептида или белка. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, полученные путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты.
Выделенный домен FN3, как здесь используется, предназначен для обозначения домена FN3, который по существу не содержит других доменов FN3, имеющих различные антигенные специфичности (например, выделенный домен FN3, который специфически связывается с человеческим сывороточным альбумином, по существу не содержит домены FN3, которые специфически связывают антигены, отличные от человеческого сывороточного альбумина). Однако выделенный домен FN3, который специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого сывороточного альбумина, может обладать перекрестной реактивностью с другими родственными антигенами, например, от других видов (например, гомологами видов сывороточного альбумина).
Используемый здесь термин домен фибронектина типа III (FN3) (домен FN3) относится к домену, часто встречающемуся в белках, включающих фибронектины, тенасцин, внутриклеточные белки цитоскелета, рецепторы цитокинов и прокариотические ферменты (Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:1565915665, 1990). Приводимыми в качестве примера доменами FN3 являются 15 различных доменов FN3, присутствующих в тенасцине С человека, 15 различных доменов FN3, присутствующих в фибронектине (FN) человека, и неприродные синтетические домены FN3, описанные, например, в патенте США с № 8278419. Отдельные домены FN3 обозначаются по номеру домена и названию белка, например, третий домен FN3 тенасцина (TN3) или десятый домен FN3 фибронектина (FN10).
Используемый здесь термин специфически связывается или специфическое связывание относится к способности домена FN3 настоящего изобретения к связыванию с заранее определенным антигеном с константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 1x10’6 M или менее, например, приблизительно 1х10’7 М или менее, приблизительно 1x10’8 M или менее, приблизительно 1x10’9 M или менее, приблизительно 1x10’10 M или менее, приблизительно 1x10’11 M или менее, приблизительно 1x10’12 M или менее или приблизительно 1x10’13 M или менее. Как правило, описанный домен FN3 связывается с заранее определенным антигеном (т.е. человеческим сывороточным альбумином) с KD, которая по крайней мере в десять раз меньше, чем его KD для неспецифического антигена (например, казеина), что определяется с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием, например, инструмента Proteon (BioRad). Однако описанные домены FN3, которые специфически связываются с человеческим сывороточным альбумином, могут обладать перекрестной реактивностью с другими родственными антигенами, например, с тем же заранее определенным антигеном из других видов (гомологами), таких как Масаса fascicularis (яванский макак) или Pan troglodytes (шимпанзе).
Период полужизни в сыворотке, как здесь используется, обычно можно определить как время, необходимое для снижения концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида в сыворотке на 50% in vivo, например, из-за деградации последовательность или соединение и/или выведения или секвестрации последовательности или соединения с помощью естественных механизмов. Период полужизни in vivo аминокислотной последовательности, соединения или полипептида настоящего изобретения может быть определен любым известным способом, например, с помощью фармакокинетического анализа. Подходящие методики будут понятны специалисту в данной области техники и могут, например, обычно включать стадии подходящего введения теплокровному животному (т.е. человеку или другому подходящему млекопитающему, такому как мышь, кролик, крыса, свинья, собака или примат, например обезьянам из рода Масаса (таким как, в частности, яванские макаки (Масаса flavicularis) и/или макаки-резус (Масаса mulatto)) и бабуин (Papio ursinus)), подходящей дозы аминокислотной последовательности, соединения или полипептида настоящего изобретения; сбора образцов крови или других образцов от указанного животного; определения уровня или концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида настоящего изобретения в указанном образце крови и вычисления из (графика) полученных таким образом данных, времени до тех пор, пока уровень или концентрация аминокислотной последовательности, соединения или полипептида настоящего изобретения не будет снижен на 50% по сравнению с начальным уровнем после введения дозы. Ссылка приводится, например, на экспериментальную часть ниже, а также на стандартные справочники, такие как Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Ссылка также приводится на Pharmacokinetics, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982).
Как также будет понятно специалисту в данной области техники (смотрите, например, стр. 6 и 7 WO 04/003019 и в других ссылках, приведенных в ней), период полужизни может быть представлен, используя такие параметры, как t1/2-альфа, t1/2-бета и площадь под кривой (AUC). В настоящем описании период полужизни относится к уменьшению любого из этих параметров, например любых двух из этих параметров, или, по существу, всех трех из этих параметров.
Термин фармакокинетика или фармакокинетика используется в соответствии с его принятым в
- 4 041577 области техники значением и относится к изучению действия лекарственных средств в организме, например эффекта и продолжительности действия лекарственных средств, скорости их всасывания, распределения, метаболизма и элиминации из организма и т.д.
Используемый здесь термин замещающий или замещенный или мутирующий или мутированный относится к изменению, удалению вставки одной или более аминокислот или нуклеотидов в полипептидной или полинуклеотидной последовательности для получения варианта этой последовательности.
Используемый здесь термин рандомизирующий или рандомизированный или с введением разнообразия или вводящий разнообразие относится к выполнению по крайней мере одной замены, вставки или делеции в полинуклеотидной или полипептидной последовательности.
Вариант, как здесь используется, относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или эталонного полинуклеотида одной или несколькими модификациями, например заменами, вставками или делециями.
Термин библиотека относится к совокупности вариантов. Библиотека может состоять из вариантов полипептида или полинуклеотида.
Используемый здесь термин Tencon относится к синтетическому домену фибронектина типа III (FN3), имеющему последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 и описанную в публикации заявки на патент США с № US 2010/0216708.
Полинуклеотид, синонимично именуемый молекулой нуклеиновой кислоты, нуклеотидами или нуклеиновыми кислотами, относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может быть немодифицированной РНК или ДНК или модифицированной РНК или ДНК. Полинуклеотиды включают, без ограничения, одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей, одно- и двухцепочечную РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, обычнее, двухцепочечными или смесью одноцепочечных и двухцепочечных областей. К тому же полинуклеотид относится к трехцепочечным областям, содержащим РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Термин полинуклеотид также включает ДНК или РНК, содержащие одно или более модифицированных оснований, и ДНК или РНК с остовами, модифицированными для стабильности или по другим причинам. Модифицированные основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Различные модификации могут быть осуществлены в ДНК и РНК; таким образом, полинуклеотид охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, которые обычно встречаются в природе, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток. Полинуклеотид также охватывает относительно короткие цепи нуклеиновых кислот, часто называемые олигонуклеотидами.
Вектор представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг, космида или вирус, в который может быть функционально встроен другой сегмент нуклеиновой кислоты, чтобы вызвать репликацию или экспрессию этого сегмента.
Используемый здесь термин клетка-хозяин может представлять собой клетку любого типа, например, первичную клетку, клетку в культуре или клетку из клеточной линии. В конкретных вариантах осуществления термин клетка-хозяин относится к клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может не быть идентичным родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, например, из-за мутаций или влияний окружающей среды, которые могут возникнуть в последующих поколениях, или интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина. Термины экспрессия и продуцирование используются здесь как синонимы и относятся к биосинтезу продукта гена. Эти термины охватывают транскрипцию гена в РНК. Эти термины также охватывают трансляцию РНК в один или более полипептидов и, кроме того, охватывают все встречающиеся в природе посттранскрипционные и посттрансляционные модификации. Экспрессия или продуцирование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может происходить в цитоплазме клетки или в экстраклеточной среде, такой как среда для выращивания клеточной культуры. Значение по существу тот же может различаться в зависимости от контекста, в котором используется этот термин. Из-за того, что природная вариация последовательности, вероятно, существует среди тяжелых и легких цепей и кодирующих их генов, можно ожидать нахождения некоторого уровня вариации в аминокислотных последовательностях или генах, кодирующих антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные здесь, с небольшим влиянием на их уникальные свойства связывания (например, специфичность и сродство) или без него. Такое ожидание отчасти обусловлено вырожденностью генетического кода, а также эволюционным успехом консервативных вариаций аминокислотной последовательности, которые существенно не изменяют природу кодируемого белка.
Обзор раскрытых доменов FN3
Tencon (SEQ ID NO: 1) представляет собой не встречающийся в природе домен фибронектина типа III (FN3), сконструированный из консенсусной последовательности из пятнадцати доменов FN3 тенасци- 5 041577 на-С человека (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; публикация заявки на патент США с № 2010/0216708). Кристаллическая структура Tencon выявляет шесть петель, выставленных на поверхность, которые соединяют семь бета-цепей, что характерно для доменов FN3, бетацепей, обозначаемых А, В, С, D, E, F и G, и петли, обозначаемые как АВ-, ВС-, CD-, DE-, EF- и FG-петли (Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; патент США с № 6673901). Эти петли, или выбранные остатки в каждой петле, могут быть подвергнуты рандомизации для конструирования библиотек доменов фибронектина типа III (FN3), которые могут использоваться для отбора новых молекул, которые связываются с сывороточным альбумином. В табл. 1 приведены положения и последовательности каждой петли и бета-цепи в Tencon (SEQ ID NO: 1).
Библиотека, сконструированная на основе последовательности Tencon, такая как описанные ниже библиотеки TCL1 или TCL2, может, таким образом, содержать рандомизированную FG-петлю или рандомизированные ВС- и FG-петли. ВС-петля Tencon имеет длину 7 аминокислот, таким образом, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот могут быть подвергнуты рандомизации в библиотеке с введенным разнообразием в ВС-петле и сконструированной на основе последовательности Tencon. FG-петля Tencon имеет длину 7 аминокислот, таким образом, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот могут быть подвергнуты рандомизации в библиотеке с введенным разнообразием в FG-петле и, сконструированной на основе последовательности Tencon. Дополнительное разнообразие в петлях в библиотеках Tencon может быть достигнуто путем вставки и/или делеций остатков в петлях. Например, FG- и/или ВС-петли могут быть удлинены на 1-22 аминокислоты или уменьшены на 1-3 аминокислоты. FG-петля в Tencon имеет длину 7 аминокислот, тогда как соответствующая петля в тяжелых цепях антител находится в диапазоне 4-28 остатков. Для обеспечения максимального разнообразия, разнообразие может быть введено в последовательность FGпетли, а также в длину, чтобы соответствовать диапазону 4-28 остатков для длин CDR3 антител. Например, FG-петля может быть дополнительно разноображена по длине путем удлинения петли на еще 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот.
Библиотека, сконструированная на основе последовательности Tencon, может также иметь рандомизированные альтернативные поверхности, которые образуются на стороне домена FN3 и включают две или более бета-цепей и по крайней мере одну петлю. Одна такая альтернативная поверхность образована аминокислотами в бета-цепях С и F, а также в CD- и FG-петлях (поверхность C-CD-F-FG). Конструкция библиотеки на основе альтернативной поверхности C-CD-F-FG Tencon описана в публикации заявки на патент США с № US 2013/0226834. Библиотека, сконструированная на основе последовательности Tencon, также включает библиотеки, сконструированные на основе вариантов Tencon, таких как варианты Tencon, которые содержат замены в положениях остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86 (нумерация остатков, соответствующая SEQ ID NO:1) и которые демонстрируют увеличенную термостабильность. Приводимые в качестве примера варианты Tencon описаны в публикации заявки на патент США с № 2011/0274623, и включают Tencon27 (SEQ ID NO:4), содержащий замены E11R, L17A, N46V и E86I по сравнению с Tencon SEQ ID NO:1.
Таблица 1
Домен FN3
A-цепь
АВ-петля
В-цепь
ВС-петля
С-цепь
CD-петля
D-цепь
DE-петля
Е-цепь
ЕЕ-петля
Е-цепь
ЕС-петля
G-цепь
Tencon (SEQ ID NO :1)
1-12
13-16
17-21
22-28
29-37
38-43
44-50
51-54
55-59
60-64
65-74
75-81
82-89
Библиотеки на основе Tencon или других последовательностей FN3 могут быть подвергнуты рандомизации в выбранных положениях остатков с использованием случайной или определенной совокупности аминокислот. Например, варианты в библиотеке, содержащие случайные замены, могут быть созданы с использованием кодонов NNK, которые кодируют все 20 встречающихся в природе аминокислот. В других схемах введения разнообразия могут использоваться кодоны DVK для кодирования аминокислот Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys. Альтернативно, могут использоваться кодоны NNS для получения всех 20 аминокислотных остатков и одновременного снижения частоты стоп-кодонов. Библиотеки доменов FN3 со смещенным распределением аминокислот в положениях, подлежащих введению разнообразия, можно синтезировать, например, с использованием технологии
- 6 041577
Slonomics® (http:_//www_sloning_com). В случае этой технологии используется библиотека готовых двухцепочечных триплетов, которые действуют как универсальные строительные блоки, достаточные для тысяч процессов синтеза генов. Библиотека триплетов представляет все возможные комбинации последовательностей, необходимые для построения любой желаемой молекулы ДНК. Обозначения кодонов соответствуют хорошо известному коду IUB.
Домены FN3, специфически связывающиеся с человеческим сывороточным альбумином, описанные здесь, могут быть выделены путем получения библиотеки FN3, такой как библиотека Tencon, с использованием цис-дисплея для лигирования фрагментов ДНК, кодирующих каркасные белки, с фрагментом ДНК, кодирующим RepA, для создания пула комплексов белок-ДНК, образуемых после трансляции in vitro, в которых каждый белок стабильно связан с кодирующей его ДНК (патент США с № 7842476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004), и анализа библиотеки на специфическое связывание с человеческим сывороточным альбумином любым способом, известным в данной области техники и описанным в разделе Примеры. Приводимыми в качестве примера, хорошо известными способами, которые могут использоваться, являются ELISA, сэндвич-иммуноанализ и конкурентные и неконкурентные анализы (смотрите, например, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Идентифицированные домены FN3, специфически связывающиеся с человеческим сывороточным альбумином, дополнительно характеризуют в соответствии с желаемыми характеристиками.
Описанные здесь домены FN3, специфически связывающиеся с человеческим сывороточным альбумином, могут быть получены с использованием любого домена FN3 в качестве матрицы для создания библиотеки и скрининга библиотеки на предмет молекул, специфически связывающихся с человеческим сывороточным альбумином, используя предусмотренные способы. Приводимыми в качестве примера доменами FN3, которые могут использоваться, являются третий домен FN3 тенасцина С (TN3) (SEQ ID NO:68), фибкон (SEQ ID NO: 69146) и десятый домен FN3 фибронектина (FN10) (SEQ ID NO:70) Стандартные методы клонирования и экспрессии используются для клонирования библиотек в вектор или для синтеза кассет в виде двухцепочечных кДНК библиотеки, для экспрессии или трансляции библиотек in vitro. Например, рибосомный дисплей (Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), мРНК дисплей (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997) или другие бесклеточные системы (патент США с № 5643768) могут использоваться. Библиотеки вариантов домена FN3 могут быть экспрессированы в виде слитых белков, представляемых на поверхности, например, любого подходящего бактериофага. Способы представления слитых полипептидов на поверхности бактериофага хорошо известны (публикация заявки на патент США № 2011/0118144; публикация международной заявки на патент США № WO 2009/085462; патент США № 6969108; патент США № 6172197; патент США № 5223409; патент США № 6582915; патент США № 6472147).
В некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, домен FN3, специфически связывающийся с человеческим сывороточным альбумином, основан на последовательности Tencon SEQ ID NO:1 или последовательности Tencon27 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, необязательно содержащей замены в положениях остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 и/или 86.
Домены FN3, специфически связывающиеся с человеческим сывороточным альбумином, настоящего изобретения могут быть модифицированы для улучшения их свойств, например, увеличения термостабильности и обратимости свертывания и развертывания под действием тепла. Несколько методов были применены для увеличения кажущейся термостабильности белков и ферментов, включая конструктивный расчет, основанный на сравнении с очень похожими термостабильными последовательностями, конструирование стабилизирующих дисульфидных мостиков, мутации для увеличения склонности к образованию альфа-спиралей, конструирование солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию и составление консенсусных последовательностей (Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001). Высокая термостабильность может увеличивать выход экспрессированного белка, улучшать растворимость или активность, снижать иммуногенность и минимизировать потребность в холодовой цепи при производстве. Остатки, которые могут быть замещены для увеличения термостабильности Tencon (SEQ ID NO:1), представляют собой положения остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86 и описаны в публикации заявки на патент США № 2011/0274623. Замены, соответствующие этим остаткам, могут быть включены в содержащие домен FN3 молекулы настоящего изобретения.
Определение стабильности белка и неустойчивости белка можно рассматривать как одинаковые или различные аспекты целостности белка. Белки являются чувствительными или неустойчивыми к денатурации, вызванной теплом, ультрафиолетовым или ионизирующим излучением, изменениями осмолярности и рН окружающей среды, если в жидком растворе, при фильтрации через узкие поры, ультрафиолетовым излучением, ионизирующим излучением, таким как гамма-излучением, химической или тепловой сушкой или любым другим действием или силой, создается механическое сдвиговое усилие, которое может вызвать нарушение структуры белка. Стабильность молекулы можно определить с помощью стандартных методов. Например, стабильность молекулы может быть определена путем измерения температуры плавления (Tm), температуры в °C, при которой половина молекул разворачивается, используя стандартные методы. Как правило, чем выше Tm, тем стабильнее молекулы. Помимо тепла хи- 7 041577 мическая среда также изменяет способность белка поддерживать определенную трехмерную структуру.
В одном варианте осуществления домен FN3, специфически связывающийся с человеческим сывороточным альбумином, настоящего изобретения может проявлять стабильность, повышенную по крайней мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% или более по сравнению с тем же доменом до разработки, что определяется по увеличению Tm.
Химическая денатурация также может быть определена различными методами. Химические денатурирующие вещества включают гидрохлорид гуанидиния, тиоцианат гуанидиния, мочевину, ацетон, органические растворители (ДМФА, бензол, ацетонитрил), соли (сульфат аммония, бромид лития, хлорид лития, бромид натрия, хлорид кальция, хлорид натрия); восстановители (например, дитиотрейтол, бета-меркаптоэтанол, динитротиобензол и гидриды, такие как борогидрид натрия), неионные и ионные детергенты, кислоты (например, соляную кислоту (HCl), уксусную кислоту (СН3СООН), галогенированные уксусные кислоты), гидрофобные молекулы (например, фосфофолипиды) и целевые денатурирующие вещества. Количественная оценка степени денатурации может основываться на потере функциональных свойств, таких как способность к связыванию молекулы-мишени, или по физико-химическим свойствам, таким как склонность к агрегации, воздействию недоступных ранее остатков растворителей или разрыву или образованию дисульфидных связей.
Домен FN3 настоящего изобретения может быть сконструирован в виде мономеров, димеров или мультимеров, например, в качестве средства для увеличения валентности и, соответственно, авидности связывания молекулы-мишени или для создания би- или полиспецифических каркасов, одновременно связывающих две или более различных молекул-мишеней. Димеры и мультимеры могут быть созданы путем связывания моноспецифических, би- или полиспецифических белковых каркасов, например, путем включения аминокислотного линкера, например линкера, содержащего полиглицин, глицин и серин или аланин и пролин. Приводимые в качестве примера линкеры включают (GS)2 (SEQ ID NO: 54), (GGGS)2 (SEQ ID NO:55), (GGGGS)5 (SEQ ID NO:56), (AP)2 (SEQ ID NO:57), (AP)5 (SEQ ID NO:58), (AP)W (SEQ ID NO:59), (AP)20 (SEQ ID NO:60) и A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO:61). Димеры и мультимеры могут быть связаны друг с другом в направлении от N-конца к С-концу. Использование встречающихся в природе, а также искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые связанные слитые полипептиды хорошо известно в литературе (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; патент США № 5856456).
Связующие для человеческого сывороточного альбумина
Домены FN3 быстро выводятся из кровотока посредством фильтрации в почках и деградации благодаря их небольшому размеру, составляющему ~10 кДа. В определенных аспектах в настоящем изобретении предоставляются домены FN3, которые специфически связываются с сывороточным альбумином, например человеческим сывороточным альбумином (HSA), для продления периода полужизни домена FN3.
Описанные альбумин-специфические домены FN3 связываются с доменом I или III человеческого сывороточного альбумина и имеют период полужизни в сыворотке, превышающий по крайней мере в 10 раз период полужизни в сыворотке последовательности Tencon SEQ ID NO: 67, тем самым обеспечивая эффективный способ продления in vivo периода полужизни в сыворотке лекарственных средств или белков, конъюгированных с ними.
В некоторых вариантах осуществления выделенный домен FN3 специфически связывается с доменом I человеческого сывороточного альбумина SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления выделенный домен FN3 специфически связывается с доменом III человеческого сывороточного альбумина SEQ ID NO: 62. В некоторых варианты осуществления альбуминспецифические антитела имеют период полужизни в сыворотке, превышающий по крайней мере в 10 раз период полужизни в сыворотке последовательности Tencon SEQ ID NO: 67.
В некоторых вариантах осуществления описанные домены FN3 перекрестно реагируют с альбумином сыворотки Масаса fascicularis (яванского макака) SEQ ID NO: 63.
В некоторых вариантах осуществления домены FN3, связывающиеся с человеческим сывороточным альбумином, включают инициатор метионин (Met), связанный с N-концом молекулы.
В некоторых вариантах осуществления домены FN3, связывающиеся с человеческим сывороточным альбумином, включают цистеин (Cys), связанный с С-концом домена FN3.
Добавление N-концевого Met и/или С-концевого Cys может облегчать экспрессию и/или конъюгирование молекул, продлевающих период полужизни.
В некоторых вариантах осуществления выделенный домен FN3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, 52 или 53.
В некоторых вариантах осуществления выделенный домен FN3 включает аминокислотную последовательность, которая на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51.
В некоторых вариантах осуществления выделенный домен FN3 включает аминокислотную последовательность, которая содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 замен по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 51.
- 8 041577
В некоторых вариантах осуществления выделенный домен FN3, который специфически связывается с человеческим сывороточным альбумином, включает остаток цистеина по крайней мере в одном положении остатка, соответствующем положениям остатков 6, 11, 22, 25, 26, 52, 53, 61 SEQ ID NO: 1, или на С-конце.
В некоторых вариантах осуществления выделенный домен FN3, описанный здесь, может включать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51-53, в которой С-цепь, CD-петля, F-цепь и FGпетли заменены соответствующей совокупностью, состоящей из указанных С-цепи, CD-петли, F-цепи и FG-петель из любой из описанных последовательностей альбумин-специфических доменов FN3 (т.е. SEQ ID NO: 51-53) или последовательностей, идентичных на по крайней мере 85, 90, 95, 97, 98 или 99% последовательностям С-цепи, CD-петле, F-цепи и FG-петле четырех основных последовательностей домена FN3.
В некоторых вариантах осуществления выделенные альбумин-специфические домены FN3 включают последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51. Этот альбуминспецифический домен FN3 может связываться с доменом I или III человеческого сывороточного альбумина. Этот альбуминспецифический домен FN3 может иметь период полужизни в сыворотке, превышающий по крайней мере в 10 раз период полужизни в сыворотке последовательности Tencon SEQ ID NO: 67.
В некоторых вариантах осуществления выделенные альбумин-специфические домены FN3 включают последовательность, представленную SEQ ID NO: 52. Этот альбуминспецифический домен FN3 может связываться с доменом I или III человеческого сывороточного альбумина. Этот альбуминспецифический домен FN3 может иметь период полужизни в сыворотке, превышающий по крайней мере в 10 раз период полужизни в сыворотке последовательности Tencon SEQ ID NO: 67.
В некоторых вариантах осуществления выделенные альбумин-специфические домены FN3 включают последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53. Этот альбуминспецифический домен FN3 может связываться с доменом I или III человеческого сывороточного альбумина. Этот альбуминспецифический домен FN3 может иметь период полужизни в сыворотке, превышающий по крайней мере в 10 раз период полужизни в сыворотке последовательности Tencon SEQ ID NO: 67.
Слияния специфических в отношении человеческого сывороточных альбумина доменов FN3
В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены конъюгаты, включающие домен FN3, связывающийся с сывороточным альбумином, и по крайней мере одну дополнительную составляющую. Дополнительная составляющая может быть полезна для любой диагностической цели, визуализации или терапевтической цели.
В некоторых вариантах осуществления период полужизни в сыворотке составляющей, слитой с описанным доменом FN3, увеличена относительно периода полужизни в сыворотке этой составляющей, если она не конъюгирована с доменом FN3. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в сыворотке слияния с доменом FN3 длиннее на по крайней мере 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1500, 1800, 1900, 2000, 2500 или 3000% периода полужизни в сыворотке составляющей, если она не слита с описанным доменом FN3. В других вариантах осуществления период полужизни в сыворотке слияния с доменом FN3 длиннее в по крайней мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 15, 17, 20, 22, 25, 27, 30, 35, 40 или 50 раз периода полужизни в сыворотке этой составляющей, если она не слита с описанным доменом FN3. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в сыворотке слияния с доменом FN3 составляет по крайней мере 2, 2,5 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 ч у яванских макак.
Соответственно, описанные здесь молекулы слияния с доменом FN3 полезны для увеличения периода полужизни терапевтической составляющей путем создания слияния между терапевтической составляющей и описанным доменом FN3. Такие слитые молекулы могут использоваться для лечения состояний, которые реагируют на биологическую активность терапевтической составляющей, содержащейся в слиянии. В настоящем изобретении предусматривается использование описанных молекул слияния с доменом FN3 при заболеваниях, вызванных нарушением регуляции любого из следующих белков или молекул.
Гетерологичная составляющая
В некоторых вариантах осуществления описанные домены FN3 сливаются со второй составляющей, которая представляет собой небольшую органическую молекулу, нуклеиновую кислоту или белок. В некоторых вариантах осуществления описанные домены FN3 сливаются с терапевтической составляющей, мишенью которой являются рецепторы, лиганды рецепторов, белки вирусной оболочки, белки иммунной системы, гормоны, ферменты, антигены или белки, передающие сигналы в клетке. Слияние может быть образовано путем присоединения второй составляющей к любому концу описанных доменов FN3, т.е. расположений домен FN3-терапевтическαя молекула или терапевтическая молекула-домен FN3.
В других приводимых в качестве примера вариантах осуществления описанный домен FN3 сливается с одним или более дополнительных доменов FN3. Например, описанный домен FN3 может быть слит с одним, двумя, тремя, четырьмя или более дополнительных доменов FN3. Дополнительные домены FN3 могут связываться с одинаковыми или разными мишенями, отличными от сывороточного альбумина.
- 9 041577
В некоторых вариантах осуществления в заявке предоставляется слияние FN3-Y, которое может быть представлено формулой FN3-Xi-Y или Y-Xi-FN3, где FN3 представляет собой описанный здесь домен FN3 (включающий любые N-концевые и/или С-концевые удлинения), Xi представляет собой полипептидный линкер (подходящие линкеры включают, например, любую из SEQ ID NO: 54-61) и Y представляет собой терапевтическую составляющую, описанную здесь.
В некоторых вариантах осуществления в заявке предоставляется слияние FN3-Y, которое может быть представлено формулой FN3-Xi-Cys-X2-Y или Y-Xi-Cys-X2-FN3, где FN3 представляет собой выделенный домен FN3, описанный здесь (включающий любые N-концевые и/или С-концевые удлинения), Xi представляет собой необязательный полипептидный линкер (подходящие линкеры включают, например, любую из SEQ ID NO:54-61), Cys представляет собой остаток цистеина, Х2 представляет собой химически полученный спейсер и Y представляет собой терапевтическую составляющую, описанную здесь. В приводимых в качестве примера вариантах осуществления химически полученный спейсер содержит малеимидный фрагмент, который может использоваться для конъюгирования терапевтической составляющей с С-концевым Cys описанных доменов FN3 или для конъюгирования описанных доменов FN3 с С-концевым Cys терапевтической составляющей, с помощью реакции Майкла, как описано здесь далее. В других аспектах описанный домен FN3 может быть связан с двумя или более терапевтическими составляющими. Например, две составляющие могут быть связаны с описанными доменами FN3 в различных схемах расположения, таких как, например, от N-конца к С-концу последовательности слияния, следующим образом: X-Y-FN3, X-FN3-Y или FN3-X-Y, где X и Y представляют две различные терапевтические составляющие. Две различные терапевтические составляющие могут быть выбраны из любой из раскрытых здесь составляющих.
Деиммунизация связывающих полипептидов
Аминокислотные последовательности связующих для сывороточного альбумина и их слияний могут быть изменены для удаления одного или более В- или Т-клеточных эпитопов. Белок, включая описанные слияния с доменом FN3, описанные здесь, может быть подвергнут деиммунизации, чтобы сделать его неиммуногенным или менее иммуногенным для конкретного вида. Деиммунизация может быть достигнута путем структурных изменений белка. Может быть использован любой метод деиммунизации, известный специалистам в данной области, см., например, WO 00/34317, раскрытие которой полностью включено сюда.
В одном варианте осуществления последовательности связующих для сывороточного альбумина и их слияний можно проанализировать на наличие мотивов связывания МНС класса II. Например, сравнение может быть выполнено с базами данных МНС-связывающих мотивов, например, путем перебора базы данных motifs во всемирной сети по адресу wehil.wehi.edu.au. В качестве альтернативы, пептиды, связывающие МНС класса II, могут быть идентифицированы с использованием методов с использованием потока вычислений, таких как методы, разработанные Altuvia et al. (J. Mol. Biol. 249, 244-250 (1995)), посредством чего последовательные перекрывающиеся пептиды из полипептида проверяют на предмет силы их связывания с белками МНС класса II. Вычислительные алгоритмы прогнозирования связывания включают iTope™, Tepitope, SYFPEITHI, EpiMatrix (EpiVax) и MHCpred. Чтобы способствовать идентификации пептидов, связывающих МНС класса II, можно искать ассоциированные признаки последовательности, которые относятся к успешно представленным пептидам, такие как амфипатичность и мотивы Ротбарда, а также сайты расщепления катепсином В и другими ферментами процессирования.
Выявив потенциальные (например, человеческие) Т-клеточные эпитопы, эти эпитопы затем удаляют путем изменения одной или более аминокислот, как требуется для удаления Т-клеточного эпитопа. Обычно это будет включать изменение одной или более аминокислот внутри самого Т-клеточного эпитопа. Это может включать изменение аминокислоты рядом с эпитопом относительно первичной структуры белка или аминокислоты, которая не является смежной в первичной структуре, но является смежной во вторичной структуре молекулы. Предполагаемое обычное изменение будет заменой аминокислоты, но возможно, что в некоторых случаях добавления или удаления аминокислот будут подходящими. Все изменения могут быть осуществлены с помощью технологии рекомбинантных ДНК, так что конечная молекула может быть получена путем экспрессии в рекомбинантном хозяине, например, с помощью хорошо известных методов, но также может использоваться химия белка или любые другие способы изменения молекулы.
После удаления идентифицированных Т-клеточных эпитопов деиммунизированную последовательность можно снова проанализировать, чтобы убедиться в том, что не были созданы новые Тклеточные эпитопы, и, если они есть, эпитоп(ы) можно удалить.
Не все Т-клеточные эпитопы, идентифицированные путем вычислений, должны быть удалены. Специалист в данной области техники поймет значение силы или, точнее, потенциальной иммуногенности конкретных эпитопов. В различных вычислительных методах создаются оценки для потенциальных эпитопов. Специалист в данной области техники поймет, что могут быть удалены только эпитопы с высокой оценкой. Специалист также поймет, что существует баланс между удалением потенциальных эпитопов и поддержанием сродства связывания или другой биологической активности белка. Поэтому одна стратегия состоит в том, чтобы последовательно вводить замены в описанные домены FN3 или сли- 10 041577 тый с доменом FN3 белок, а затем проверять на связывание с мишенью или другую биологическую активность и иммуногенность.
Дополнительные модификации
В некоторых вариантах осуществления связующие для сывороточного альбумина и их слияния могут, кроме того, включать посттрансляционные модификации. Приводимые в качестве примера посттрансляционные модификации белков включают фосфорилирование, ацетилирование, метилирование, ADP-рибозилирование, убиквитинирование, гликозилирование, карбонилирование, сумоилирование, биотинилирование или добавление полипептидной боковой цепи или гидрофобной группы. В результате модифицированные связующие для сывороточного альбумина и их слияния могут содержать неаминокислотные элементы, такие как липиды, поли- или моносахарид и фосфаты. Предпочтительной формой гликозилирования является сиалилирование, которое конъюгирует одну или более составляющих в виде сиаловой кислоты с полипептидом. Составляющие в виде сиаловой кислоты увеличивают растворимость и время полужизни в сыворотке, а также уменьшают возможную иммуногенность белка. См., например, Raju et al. Biochemistry. 2001 Jul 31; 40(30): 8868-76. Эффекты таких неаминокислотных элементов на функциональность связующих для сывороточного альбумина или их слияний могут быть проверены по их способности к связыванию конкретного сывороточного альбумина (например, HSA или RhSA) и/или функциональной роли, придаваемой специфической составляющей, не являющейся доменом FN3, в случае слияния (например, эффект FGF21 на поглощение глюкозы).
Варианты векторов и полинуклеотидов
Также в настоящее описание включены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие любой из описанных здесь белков.
Как понятно специалистам в данной области техники, из-за вырожденности третьего основания почти каждая аминокислота может быть представлена более чем одним кодоном-триплетом в кодирующей нуклеотидной последовательности. Кроме того, незначительные изменения пар оснований могут привести к консервативной замене в кодируемой аминокислотной последовательности, но не ожидается, что они существенно изменят биологическую активность продукта гена. Следовательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая описанный здесь белок, может быть слегка модифицирована в последовательности и все же кодировать ее соответствующий продукт гена. Некоторые приводимые в качестве примера нуклеиновые кислоты, кодирующие связующие для сывороточного альбумина и их слияния, описанные здесь, включают нуклеиновые кислоты, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 69-72.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из различных белков или полипептидов, раскрытых здесь, могут быть синтезированы химически. Частота использования кодонов может быть выбрана, чтобы улучшить экспрессию в клетке. Такая частота использования кодонов будет зависеть от выбранного типа клеток. Специализированные системы частот использования кодонов были разработаны для Е.coli и других бактерий, а также клеток млекопитающих, клеток растений, дрожжевых клеток и клеток насекомых. См., например: Mayfield et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2003 100 (2):438-42; Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 (l): 96-105; Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001(5):446-9; Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 60 (3): 512-38 и Sharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78.
Общие методы манипулирования нуклеиновой кислотой находятся в компетенции специалиста в данной области и также описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989, или F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987) и периодических обновлениях, включенных сюда посредством ссылки. ДНК, кодирующая белок, функционально связана с подходящими регулирующими транскрипцию или трансляцию элементами, происходящими из генов млекопитающих, вирусов или насекомых. Такие регуляторные элементы включают транскрипционный промотор, необязательную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосом на мРНК, и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Способность к репликации в хозяине, обычно придаваемая началом репликации, и селективный ген для облегчения распознавания трансформантов включают дополнительно. Подходящие регуляторные элементы хорошо известны в данной области техники.
Описанные здесь белки и слитые белки могут быть получены в виде белка, слитого с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно является сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность предпочтительно представляет собой последовательность, которая распознается и процессируется (т.е. расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную сигнальную последовательность, сигнальная последовательность заменяется прокариотической сигнальной последовательностью, выбираемой, например из группы лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллиназы, 1рр или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции дрожжами нативная сигнальная последовательность может быть заменена, например, лидерной последовательностью дрожжевой инвертазы, лидерной последовательностью α-фактора (в том числе лидерными после- 11 041577 довательностями альфа-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces) или лидерной последовательностью кислой фосфатазы, лидерной последовательностью глюкоамилазы С. albicans или сигнальной последовательностью, описанной в публикации РСТ № WO 90/13646. При экспрессии в клетках млекопитающих доступны сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например, сигнальная последовательность gD простого герпеса. ДНК для таких областей предшественников может быть лигирована в рамке считывания с ДНК, кодирующей белок.
Экспрессионные векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (например, дрожжевых клетках, клетках грибов, насекомых, растений, животных, человеке или ядросодержащих клетках других многоклеточных организмов), также будут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны из 5', а иногда и из 3', нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей поливалентное антитело. Одним из полезных компонентов терминации транскрипции является область полиаденилирования бычьего гормона роста. См. публикацию РСТ № WO 94/11026 и экспрессионный вектор, раскрытый в ней.
Рекомбинантная ДНК может также включать любой тип последовательности метки для белков, который может быть полезен для очистки белка. Примеры меток для белков включают, но без ограничения ими, гистидиновую метку, метку FLAG, метку myc, метку НА или метку GST. Векторы для клонирования и экспрессии, подходящие для использования с клетками-хозяевами бактерий, грибов, дрожжей и млекопитающих, можно найти в Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevier, New York, 1985), соответствующее раскрытие которого включено таким образом посредством ссылки. Экспрессионная конструкция вводится в клетку-хозяина с использованием способа, подходящего для клетки-хозяина, что будет очевидно специалисту в данной области техники. В данной области техники известен ряд способов введения нуклеиновых кислот в клетки-хозяева, включая, но без ограничения ими, электропорацию; трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфицирование (в случае которой вектором является инфекционный агент).
Подходящие клетки-хозяева включают прокариоты, дрожжи, клетки млекопитающих или бактериальные клетки. Подходящие бактерии включают грамотрицательные или грамположительные организмы, например, E.coli или Bacillus spp. Дрожжи, предпочтительно из видов Saccharomyces, таких как S. cerevisiae, также могут использоваться для продукции полипептидов. Различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых также могут использоваться для экспрессии рекомбинантных белков. Бакуловирусные системы для продукции гетерологичных белков в клетках насекомых рассмотрены Luckow и Summers (Bio/Technology, 6:47, 1988). В некоторых случаях будет желательно продуцировать белки в клетках позвоночных, например, для гликозилирования, и размножение клеток позвоночных в культуре (культура ткани) стало обычной процедурой. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают эндотелиальные клетки, клетки почки обезьяны COS-7, клетки CV-1, Lклетки, С127, 3T3, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки почки эмбриона человека, клетки HeLa, 293, 293Т и клетки BHK. Для многих применений небольшой размер белковых мультимеров, описанных здесь, сделает E.coli предпочтительным способом экспрессии.
Продуцирование белка
Клетки-хозяева трансформируются описанными здесь векторами для экспрессии или клонирования с целью продуцирования белков и культивируются в обычных питательных средах, модифицированных в зависимости от необходимости для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности.
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования белков настоящего изобретения, могут культивироваться в ряде сред. Коммерчески доступные среды, такие как среда F10 Ham (Sigma), минимальная питательная среда ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma), подходят для культивирования клеток-хозяев. Кроме того, любая из сред, описанных в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102: 255 (1980), патентах США с №№ 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195 или патенте США № Re. 30985, может использоваться в качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любая из этих сред может при необходимости быть дополнена гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (например, лекарственным средством GENTAMYCIN™), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне), а также глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки также могут быть включены в соответствующих концентрациях, которые известны специалистам в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., являются такими, которые ранее использовались с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны специалисту со средним уровнем компетентности.
- 12 041577
Раскрытые здесь белки также могут быть получены с использованием бесклеточных трансляционных систем. Для таких целей нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, должны быть модифицированы для допуска транскрипции in vitro с продукцией мРНК и допуска бесклеточной трансляцию мРНК в конкретной используемой бесклеточной системе. Приводимые в качестве примера эукариотические бесклеточные трансляционные системы включают, например, имеющие отношения к млекопитающим или дрожжевые бесклеточные трансляционные системы, а приводимые в качестве примера прокариотические бесклеточные трансляционные системы включают, например, бактериальные бесклеточные трансляционные системы.
Раскрытые здесь белки также могут быть получены путем химического синтеза (например, с помощью способов, описанных в Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Модификации белка также могут быть получены путем химического синтеза.
Раскрытые здесь белки могут быть очищены способами выделения/очистки белков, общеизвестных в области химии белка. Неограничивающие примеры включают экстракцию, перекристаллизацию, высаливание (например, сульфатом аммония или сульфатом натрия), центрифугирование, диализ, ультрафильтрацию, адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, нормально-фазовую хроматография, хроматографию с обращенной фазой, гель-фильтрацию, гельпроникающую хроматографию, аффинную хроматографию, электрофорез, противоточное распределение или любые их комбинации. После очистки белки могут быть подвергнуты замене буфера на различные буферы и/или сконцентрированы любым из множества способов, известных в данной области, включая, но без ограничения ими, фильтрацию и диализ.
Очищенные белки предпочтительно имеют степень чистоты, составляющую по крайней мере 85%, более предпочтительно по крайней мере 95% и наиболее предпочтительно по крайней мере на 98%. Независимо от точного численного значения степени чистоты, белки являются достаточно чистыми для применений в качестве фармацевтического продукта.
Визуализация, диагностика и другие применения
Предоставленные здесь слияния с доменами FN3 могут использоваться для лечения ряда заболеваний и нарушений, основываясь на наименовании гетерогенной молекулы, слитой с описанными доменами FN3. Применения слияний с доменами FN3 могут быть определены квалифицированным специалистом на основе знаний в данной области техники и предоставленной здесь информации. Применение различных слитых с доменами FN3 белков подробно описано здесь. Слияния с доменами FN3 могут вводиться любому являющемуся млекопитающим субъекту или пациенту, в том числе как в организм человека, так и в организм не человека.
Связующие для сывороточного альбумина и слитые молекулы, описанные здесь, могут быть помечены детектируемым образом и использованы для контактирования с клетками, экспрессирующими, например, белок, связываемый слитой молекулой, для визуализации или диагностики. Может использоваться любой известный в данной области техники способ конъюгирования белка с детектируемой составляющей, в том числе те способы, которые описаны Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981) и Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).
В некоторых вариантах осуществления связующие для сывороточного альбумина и слитые молекулы, описанные здесь, дополнительно присоединяются к метке, которая может быть детектирована (например, метка может представлять собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента). Метка может представлять собой радиоактивный агент, такой как: радиоактивные тяжелые металлы, такие как хелаты железа, радиоактивные хелаты гадолиния или марганца, позитронные излучатели кислорода, азота, железа, углерода или галлия, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 1231, 1251, 13T, 132I или 99Тс. Связующее для сывороточного альбумина и слитая молекула, присоединенная к такой составляющей, может использоваться в качестве средства визуализации и вводиться в количестве, эффективном для диагностического использования у млекопитающего, такого как человек, а затем детектируют локализацию и накопление агента для визуализации. Локализацию и накопление агента для визуализации можно детектировать с помощью радиосцинтиграфии, ядерного магнитного резонанса, компьютерной томографии или позитронно-эмиссионной томографии. Как будет очевидно квалифицированному специалисту, количество вводимого радиоизотопа зависит от радиоизотопа. Специалисты со средним уровнем компетентности в данной области могут легко составить количество вводимого агента для визуализации на основе удельной активности и энергии конкретного радионуклида, используемого в качестве активной составляющей.
Связующие для сывороточного альбумина и слитые молекулы также полезны в качестве агентов для аффинной очистки. В этом процессе белки иммобилизуются на подходящей подложке, такой как смола Sephadex или фильтровальная бумага, с использованием хорошо известных в данной области техники способов. Белки могут использоваться в любом известном методе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
- 13 041577
Терапевтические препараты и способы введения
В настоящем изобретении предоставляются способы введения терапевтической составляющей, слитой с описанным доменом FN3, причем период полужизни терапевтической составляющей продлевается при слиянии с описанными доменами FN3. Методы и дозы для введения слитых конструкций будут варьировать в зависимости от типа терапевтической составляющей, слитой с описанными доменами FN3, и конкретного состояния, подвергаемого лечению, но может быть легко определены квалифицированным специалистом. В целом, регулирующие органы требуют, чтобы белковый реагент, используемый в качестве терапевтического средства, был приготовлен так, чтобы он имел приемлемо низкие уровни пирогенов. Соответственно, терапевтические препараты будут, как правило, отличаться от других составов тем, что они по существу не содержат пирогенов или, по крайней мере, содержат не более чем приемлемые уровни пирогена, как определено соответствующим регулирующим органом (например, FDA Управлением по контролю за продуктами и медикаментами). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические препараты описанных доменов FN3 и слитых с ними молекул включают, например, 1-20 мМ янтарную кислоту, 2-10% сорбита и 1-10% глицина при рН 4,0-7,0. В приводимом в качестве примера варианте осуществления фармацевтические препараты описанных доменов FN3 и слитых с ними молекул включают, например, 10 мМ янтарную кислоту, 8% сорбита и 5% глицина при рН 6,0.
В некоторых вариантах осуществления описанные домены FN3 и их слияния являются фармацевтически приемлемыми для млекопитающего, в частности человека. Фармацевтически приемлемый полипептид относится к полипептиду, который вводят животному без значительных неблагоприятных медицинских последствий. Примеры фармацевтически приемлемых доменов FN3, раскрытых здесь, и их слияний включают домены FN3, в которых отсутствует интегринсвязывающий домен (RGD), и композиции, которые по существу не содержат эндотоксинов или имеют очень низкие уровни эндотоксинов.
Терапевтические композиции могут вводиться с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем в стандартной лекарственной форме. Введение может быть парентеральным (например, внутривенным, подкожным), пероральным или местным, в качестве неограничивающих примеров. Композиция может быть в форме пилюли, таблетки, капсулы, жидкости или таблетки с замедленным высвобождением в случае перорального введения; жидкости в случае внутривенного, подкожного или парентерального введения; или геля, лосьона, мази, крема или полимера или другого носителя с замедленным высвобождением в случае местного применения.
Способы, хорошо известные в данной области техники для приготовления препаратов, можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Препараты для парентерального введения могут, например, содержать наполнители, стерильную воду, физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения или гидрированные нафталины. Биосовместимый, биоразлагаемый полилактид, сополимер лактида и гликолида или сополимеры оксиэтилена с оксипропиленом могут использоваться для контролирования высвобождения соединений. Препараты в виде наночастиц (например, биоразлагаемых наночастиц, твердых липидных наночастиц, липосом) могут использоваться для контролирования биораспределения соединений. Другие потенциально применимые системы парентеральной доставки включают частицы сополимера этилена с винилацетатом, осмотические насосы, имплантируемые инфузионные системы и липосомы. Концентрация соединения в препарате варьирует в зависимости от ряда факторов, включающего дозу вводимого лекарственного средства и путь введения.
Полипептид может необязательно вводиться в виде фармацевтически приемлемой соли, такой как нетоксичные соли присоединения кислоты или комплексы металлов, которые обычно используются в фармацевтической промышленности. Примеры кислотно-аддитивных солей включают органические кислоты, такие как уксусная, молочная, памоевая, малеиновая, лимонная, яблочная, аскорбиновая, янтарная, бензойная, пальмитиновая, субериновая, салициловая, винная, метансульфоновая, толуолсульфоновая или трифторуксусная кислоты и т.п.; полимерные кислоты, такие как дубильная кислота, карбоксиметилцеллюлоза или т.п.; и неорганические кислоты, такие как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота или т.п. Комплексы металлов включают цинк, железо и т.п. В одном примере полипептид готовят в присутствии ацетата натрия для увеличения термостабильности. Препараты для перорального применения включают таблетки, содержащие активный ингредиент(ы) в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми наполнителями. Этими наполнителями могут быть, например, инертные разбавители или наполнители (например, сахароза и сорбит), смазывающие агенты, способствующие скольжению вещества и антиадгезивы (например, стеарат магния, стеарат цинка, стеариновая кислота, диоксид кремния, гидрогенизированные растительные масла или тальк).
Препараты для перорального применения также могут быть предоставлены в виде жевательных таблеток или в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой.
Терапевтически эффективная доза относится к дозе, которая вызывает терапевтические эффекты, ради которых она вводится. Точная доза будет зависеть от нарушения, подвергаемого лечению, и может
- 14 041577 быть установлена специалистом в данной области техники с использованием известных методов. Обычно слияние с доменом FN3 вводят в количестве от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мг/кг в день, предпочтительно от 0,01 до приблизительно 30 мг/кг в день, наиболее предпочтительно от 0,1 до приблизительно 20 мг/кг в день. Полипептид может вводиться ежедневно (например, один, два, три раза или четыре раза в день) или реже (например, через день, один или два раза в неделю или ежемесячно). Кроме того, как известно в данной области техники, могут потребоваться подборы по возрасту, а также по весу тела, общему состоянию здоровья, полу, рациону питания, времени введения, взаимодействию с лекарственными средствами и тяжести заболевания, и это можно будет осуществить с помощью проведения обычных экспериментов специалистами в данной области техники.
Наборы для обнаружения человеческого сывороточного альбумина
Здесь предоставляются наборы для обнаружения человеческого сывороточного альбумина в биологическом образце. Эти наборы включают один или более из специфических в отношении сывороточного альбумина доменов FN3, описанных здесь, и инструкции по применению набора.
Предоставленный специфический в отношении сывороточного альбумина домен FN3 может находиться в растворе; быть лиофилизированным; нанесенным на подложку, носитель или пластину; или детектируемым образом помечен.
Описанные наборы также могут включать дополнительные компоненты, применимые для выполнения описанных здесь способов. Например, наборы могут включать средства для получения образца от субъекта, контроль или контрольный образец, например, образец от субъекта с медленно прогрессирующим раком и/или субъекта, не имеющего рака, один или более отсеков для образцов, и/или инструктивный материал, который описывает выполнение способа настоящего изобретения, и специфические для ткани контроли или стандарты.
Средства для определения уровня сывороточного альбумина могут, кроме того, включать, например, буферы или другие реагенты для использования в анализе для определения уровня сывороточного альбумина. Инструкции могут быть, например, печатными инструкциями для выполнения анализа и/или инструкциями для оценки уровня сывороточного альбумина.
Описанные наборы могут также включать средства для выделения образца из субъекта. Эти средства могут включать один или более элементов оборудования или реагентов, которые могут использоваться для получения жидкости или ткани от субъекта. Средства для получения образца от субъекта также могут включать средства для выделения компонентов крови, таких как сыворотка, из образца крови. Предпочтительно набор предназначен для применения являющимся человеком субъектом.
Примеры
Следующие примеры предоставлены для дополнения предшествующего раскрытия и для обеспечения лучшего понимания описанного здесь объекта. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие описанный объект. Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные здесь, предназначены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения в их свете будут очевидны специалистам в данной области техники и должны быть включены в истинный объем настоящего изобретения и могут быть выполнены без отхода от указанного объема.
Пример 1. Конструирование библиотек Tencon с рандомизированными петлями
Tencon (SEQ ID NO:1) представляет собой иммуноглобулиноподобный каркас, домен фибронектина типа III (FN3), сконструированный из консенсусной последовательности пятнадцати доменов FN3 из тенасцина-С человека (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; патент США с № 8278199). Кристаллическая структура Tencon выявляет шесть петель, выставленных на поверхность, которые соединяют семь бета-цепей. Эти петли, или выбранные остатки в каждой петле, могут быть подвергнуты рандомизации для конструирования библиотек доменов фибронектина типа III (FN3), которые могут использоваться для отбора новых молекул, которые связываются со специфическими мишенями.
Tencon:
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO :1)
Различные библиотеки были созданы с использованием каркаса Tencon и различных стратегий конструирования. В общем, библиотеки TCL1 и TCL2 дали хорошие связующие. Создание библиотек TCL1 и TCL2 подробно описано в публикации международной заявки на патент с № WO 2014081944 A2.
Конструирование библиотеки TCL1
Библиотека, сконструированная для рандомизации только FG-петли Tencon (SEQ ID NO:1), TCL1, была создана для использования с системой цис-дисплея (Jacobs et al., Protein Engineering, Design and Selection, 25: 107-117, 2012). В случае этой системы получают двухцепочечную ДНК, включающую последовательности для промотора Тас, кодирующую библиотеку Tencon последовательность, кодирующую RepA последовательность, цис-элемент и элемент ori. При экспрессии в системе транскрипции/трансляции in vitro образуется комплекс слитого белка Tencon-RepA, связанного в цис-положении с ДНК, с которой он кодируется. Комплексы, которые связываются с молекулой-мишенью, затем выделяют и амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано ниже.
- 15 041577
Конструирование библиотеки TCL1 для использования с цис-дисплеем было достигнуто с помощью последовательных циклов ПЦР для получения конечных линейных двухцепочечных молекул ДНК в двух половинах; 5'-фрагмент содержит промотор и последовательности Tencon, в то время как 3’фрагмент содержит ген repA и цис-элемент и элемент ori. Эти две половины объединяют путем рестрикционного расщепления для получения всей конструкции. Библиотека TCL1 была сконструирована для включения случайных аминокислот только в FG-петлю Tencon, KGGHRSN (SEQ ID NO:32). Кодоны NNS были использованы при конструировании этой библиотеки, что привело к возможному включению всех 20 аминокислот и одного стоп-кодона в FG-петлю. Библиотека TCL1 содержит шесть отдельных подбиблиотек, каждая из которых содержит рандомизированную FG-петлю различной длины, от 7 до 12 остатков, для дальнейшего увеличения разнообразия.
Библиотека TCL1 (SEQ ID NO:2)
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGVX7-12PLSAEFTT;
где
X1, X2, Х3, Х4, Х5, Х6, Х7 представляют собой любую аминокислоту и
Х8, Х9, X10, Хц и X12 представляют собой любую аминокислоты или делетированы.
Конструирование библиотеки TCL2
Была сконструирована библиотека TCL2, в которой ВС- и FG-петли Tencon были подвергнуты рандомизации, а распределение аминокислот в каждом положении строго контролировалось. В табл. 2 продемонстрировано распределение аминокислот в желаемых положениях петель в библиотеке TCL2. Спроектированное распределение аминокислот имело две цели. Во-первых, библиотека была смещена в сторону остатков, которые, по прогнозам, были структурно важными для свертывания и стабильности Tencon на основе анализа кристаллической структуры Tencon и/или моделирования гомологии. Например, в положении 29, как было определено, должно быть только подмножество гидрофобных аминокислот, поскольку этот остаток был спрятан в гидрофобной основе складки Tencon. Второй уровень конструирования включал смещение распределения аминокислот в сторону распределения остатков, преимущественно обнаруживаемых в HCDR3 тяжелой цепи антител, для эффективного получения связующих с высоким сродством (Birtalan et al., J Mol Biol 377: 1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16: 476-84, 2007). Для достижения этой цели спроектированное распределение в табл. 1 относится к следующему распределению: 6% аланина, 6% аргинина, 3,9% аспарагина, 7,5% аспарагиновой кислоты, 2,5% глютаминовой кислоты, 1,5% глютамина, 15% глицина, 2,3% гистидина, 2,5% изолейцина, 5% лейцина, 1,5% лизина, 2,5% фенилаланина, 4% пролина, 10% серина, 4,5% треонина, 4% триптофана, 17,3% тирозина и 4% валина. В случае этого распределения нет метионина, цистеина и стоп-кодонов.
Библиотека TCL2 (SEQ ID NO:3)
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWXiX2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSER
SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
где
X1 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X2 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
Х3 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X4 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X5 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X6 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X7 представляет собой Phe, Ile, Leu, Val или Tyr;
X8 представляет собой Asp, Glu или Thr;
X9 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X10 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
Xn представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X12 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X13 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X14 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr
- 16 041577 или Val и
X15 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val.
Таблица 2
Положение остатка Остатки WT Распределение в библиотеке TCL2
22 Т спроектированное распределение
23 А спроектированное распределение
24 Р 50% Р+спроектированное распределение
25 D спроектированное распределение
26 А 20% А+20% 6=спроектированное распределение
27 А спроектированное распределение
28 F 20% F, 20% I, 20% L, 20% Vr 20% Y
29 D 33% D, 33% Е, 33% Т
75 К спроектированное распределение
76 G спроектированное распределение
77 G спроектированное распределение
78 Н спроектированное распределение
79 R спроектированное распределение
80 S 100%
81 N спроектированное распределение
82 Р 50% Р+спроектированное распределение
* нумерация остатков основана на последовательности Tencon SEQ ID NO:1
Впоследствии эти библиотеки были улучшены различными способами, включая создание библиотек на стабилизированном каркасе Tencon (патент США № 8569227), который включает замены E11R/L17A/N46V/E86I (Tencon27; SEQ ID NO: 4) по сравнению с Tencon дикого типа, а также изменения положений, рандомизированных в ВС- и FG-петлях. Tencon27 описан в публикации международной заявки на патент с № WO 2013049275. Исходя из этого, были созданы новые библиотеки, предназначенные для рандомизации только FG-петли Tencon (библиотека TCL9) или комбинации ВС- и FG-петель (библиотека TCL7). Эти библиотеки были сконструированы для использования с системой цис-дисплея (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-2810, 2004). Детали этого конструирования представлены ниже:
Стабилизированный Tencon (Tencon27) (SEQ ID NO:4)
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
TCL7 (рандомизированные FG- и ВС-петли) (SEQ ID NO:5)
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWX1X2X3X4X5X6X7X8X9FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAIFTT;
где
X1, Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, X10, X11, X12, Х13, Х14, Х15 и X16 представляет собой A, D, E, F, G, Н, I, K, L, N, P, Q, R, S, Т, V, W или Y; и
Х7, Х8, Х9, Х17, Х18 и Х19 представляет собой A, D, E, F, G, Н, I, K, L, N, P, Q, R, S, Т, V, W, Y или делетирован.
TCL9 (рандомизированная FG-петля) (SEQ ID NO:6)
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGV Х1Х2ХзХ4Х5ХбХ7ХаХ9 X10X11X12SNPLSAI FTT ;
Х1, Х2, Х3, Х4, Х5, Х6 и Х7 представляет собой A, D, E, F, G, Н, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y и
X8, X9, X10, X11 и X12 представляет собой A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y или делетирован.
Для конструирования библиотеки фрагменты ДНК, кодирующие рандомизированные ВС-петли (с длинами 6-9 положений) или FG-петли (с длинами 7-12 положений), были синтезированы с использованием технологии Slonomics (Sloning Biotechnology GmbH), чтобы контролировать распределение аминокислот в библиотеке и удалить стоп-кодоны. Две различные совокупности молекул ДНК, рандомизирующие либо ВС-петлю, либо FG-петлю, были синтезированы независимо и позднее объединены с использованием ПЦР для получения продукта в виде полной библиотеки.
Конструирование библиотек FG-петли (TCL9)
Была получена совокупность синтетических молекул ДНК, состоящих из 5' промотора Тас, за которым следует полная последовательность гена Tencon, за исключением рандомизированных кодонов в FG-петле (SEQ ID NO:26-31). Для рандомизации FG-петли все аминокислоты, кроме цистеина и метионина, были закодированы в равных процентах. Длины части с введенным разнообразием таковы, что они кодируют 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислот в FG-петле. Подбиблиотеки каждой вариации длины были
- 17 041577 синтезированы по отдельности в масштабе 2 мкг, а затем амплифицированы с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов Sloning-FOR (SEQ ID NO: 9) и Sloning-Rev (SEQ ID NO: 10).
3'-фрагмент библиотеки представляет собой константную последовательность ДНК, содержащую элементы для дисплея, включая сайт рестрикции PspOMI, кодирующую область гена repA и cis-элемент и элемент ori. Реакции ПЦР проводили для амплификации этого фрагмента с использованием плазмиды (pCR4Blunt) (Invitrogen) в качестве матрицы с праймерами М13 прямого и М13 обратного. Полученные продукты ПЦР расщепляли PspOMI в течение ночи и очищали в геле. Чтобы лигировать 5'-часть ДНК библиотеки с 3'-ДНК, содержащей ген repA, 2 пмоль (от ~540 до 560 нг) 5' ДНК лигировали с равным молярным количеством (~1,25 мкг) 3' ДНК repA в присутствии фермента NotI и PspOMI и лигазы Т4 при 37°C в течение ночи. Лигированный продукт библиотеки амплифицировали, используя 12 циклов ПЦР с использованием олигонуклеотидов РОР2250 (SEQ ID NO: 11) и DigLigRev (SEQ ID NO:12). Для каждой подбиблиотеки полученную ДНК из 12 реакций ПЦР объединяли и очищали с помощью спин-колонки Qiagen. Выход для каждой подбиблиотеки TCL9 составлял от 32 до 34 мкг.
Конструирование библиотек FG/BC-петель (TCL7)
Библиотека TCL7 предоставляет библиотеку с рандомизированными ВС- и FG-петлями Tencon. В этой библиотеке ВС-петли длиной 6-9 аминокислот были смешаны комбинаторно с рандомизированными FG-петлями длиной 7-12 аминокислот.
Синтетические фрагменты Tencon BC6, ВС7, ВС8 и ВС9 (SEQ ID NO:13-16) были получены для включения гена Tencon, кодирующего N-концевую часть белка, вплоть до остатка VX включительно, так что ВС-петля замещена 6, 7, 8 или 9 рандомизированными аминокислотами. Эти фрагменты были синтезированы до открытия мутаций L17A, N46V и E83I (CEN5243), но эти мутации были введены на этапах молекулярной биологии, описанных ниже. Чтобы объединить этот фрагмент с фрагментами, кодирующими рандомизированные FG-петли, были предприняты следующие шаги.
Сначала фрагмент ДНК, кодирующий промотор Тас и 5' последовательность Tencon вплоть до нуклеотида, кодирующего аминокислоту А17 (130mer-L17A, SEQ ID NO: 17), был получен с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов POP2222ext (SEQ ID NO: 18) и LS1114 (SEQ ID NO: 19). Это было сделано для включения мутации L17A в библиотеку (CEN5243). Затем фрагменты ДНК, кодирующие остатки R18-V75 Tencon включая рандомизированные ВС-петли, были амплифицированы с помощью ПЦР с использованием BC6, ВС7, ВС8 или ВС9 в качестве матриц и олигонуклеотидов LS1115 (SEQ ID NO:20) и LS1117 (SEQ ID NO: 21). Этот шаг в виде ПЦР представил сайт BsaI на 3'-конце. Эти фрагменты ДНК были впоследствии объединены с помощью перекрывающейся ПЦР с использованием олигонуклеотидов POP2222ext и LS1117 в качестве праймеров. Полученный продукт ПЦР размером 240 п.н. объединяли и очищали с помощью набора для очистки ПЦР Qiagen. Очищенную ДНК расщепляли BsaIHF и очищали в геле.
Фрагменты, кодирующие FG-петлю, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием FG7 (SEQ ID NO: 31), FG8 (SEQ ID NO:30), FG9 (SEQ ID NO: 29), FG10 (SEQ ID NO: 28), FG11 (SEQ ID NO: 27) и FG12 (SEQ ID NO: 26) в качестве матриц с олигонуклеотидами SDG10 (SEQ ID NO: 22) и SDG24 (SEQ ID NO: 23) для включения сайта рестрикции BsaI и вариаций N46V и E86I (CEN5243).
Расщепленные фрагменты ВС и фрагменты FG лигировали вместе в одну стадию с использованием тройственного лигирования. Были составлены четыре реакции лигирования в 16 возможных комбинациях, причем каждая реакция лигирования объединяла две длины ВС-петли с 2 длинами FG-петли. Каждая реакция лигирования содержала ~300 нг общего фрагмента ВС и 300 нг фрагмента FG. Эти 4 пула лигирований затем амплифицировали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов РОР2222 (SEQ ID NO: 24) и SDG28 (SEQ ID NO: 25). Затем 7,5 мкг каждого продукта реакции расщепляли с помощью Not1 и очищали с помощью колонки для очистки ПЦР Qiagen. 5,2 мкг этой ДНК лигировали с равным молярным количеством фрагмента ДНК RepA (~14 мкг), расщепленного с помощью PspOMI, и продукт амплифицировали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов РОР2222.
Пример 2. Создание библиотек Tencon, имеющих альтернативные поверхности связывания
Выбор остатков, подвергаемых рандомизации в конкретной конструкции библиотеки, определяет общую форму создаваемой поверхности взаимодействия. Рентгено-кристаллографический анализ домена FN3, содержащего каркасный белок, выбранный для связывания мальтозосвязывающего белка (МВР) из библиотеки, в которой рандомизации были подвергнуты ВС-, DE- и FG-петли, показал в значительной степени изогнутую поверхность соприкосновения, которая встраивается в активный центр МВР (Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 6632-6637, 2007). В отличие от этого, было обнаружено, что каркасный белок анкириновых повторов, который был выбран для связывания с МВР, имеет гораздо более плоскую поверхность взаимодействия и связывается с внешней поверхностью МВР, отдаленной от активного центра (Binz et al., Nat Biotechnol 22: 575-582, 2004). Эти результаты предполагают, что форма поверхности связывания каркасной молекулы каркаса (изогнутая против плоской) может определять, какие белкимишени или специфические эпитопы на этих белках-мишенях могут эффективно связываться каркасом.
Опубликованные попытки конструирования белковых каркасов, содержащих домены FN3 для связывания белка, были основаны на конструировании смежных петель для связывания мишеней, что при- 18 041577 водит к образованию изогнутых поверхностей связывания. Этот подход может ограничить число мишеней и эпитопов, доступных для таких каркасов.
Tencon и другие домены FN3 содержат две совокупности CDR-подобных петель, лежащих на противоположных сторонах молекулы, первая совокупность, образованная ВС-, DE- и FG-петлями, и вторая совокупность, образованная АВ-, CD- и EF-петлями. Две совокупности петель разделены бета-цепями, которые образуют центральную часть структуры FN3. Если изображение Tencon повернуть на 90°, можно увидеть альтернативную поверхность. Эта слегка вогнутая поверхность образована CD- и FG-петлями и двумя антипараллельными бета-цепями, бета-цепями С и F и называется здесь поверхностью C-CD-FFG. Поверхность С-CD-F-FG может использоваться в качестве образца для конструирования библиотек поверхностей взаимодействия белковых каркасов путем рандомизации подмножества остатков, которые образуют поверхность. Бета-цепи имеют повторяющуюся структуру с боковой цепью каждого второго остатка, выставленной на поверхность белка. Таким образом, библиотека может быть создана путем рандомизации некоторых или всех выставленных на поверхность остатков в бета-цепях. При выборе подходящих остатков в бета-цепях присущая стабильность каркаса Tencon должна быть нарушена минимально, обеспечивая уникальную поверхность каркаса для взаимодействия с другими белками.
Библиотека TCL14 (SEQ ID NO:7) была сконструирована в каркасе Tencon27 (SEQ ID NO:4).
Полное описание использованных для конструирования этой библиотеки способов описано в публикации заявки на патент США № US 2013/0226834.
Библиотека TCL14 (SEQ ID NO:7):
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERS
YDLTGLKPGTEYX8VX9IXioGVKGGXiiXi2SXi3PLSAIFTT;
где
Xb Х2, X3, X4, Х5, Х6, X10, Xu, X12 и X13 представляют собой A, D, E, F, G, Н, I, K, L, N, P, Q, R, S, Т, V, W,Y или М.
Две бета-цепи, образующие поверхность C-CD-F-FG в Tencon27, имеют в общей сложности 9 выставленных на поверхность остатков, которые можно было подвергнуть рандомизации; в С-цепи: S30, L32, Q34, Q36; в F-цепи: E66, Т68, S70, Y72 и V74, в то время как CD-петля имеет 6 потенциальных остатков: S38, Е39, K40, V41, G42 и Е43, а FG-петля имеет 7 потенциальных остатков: K75, G76, G77 Н78, R79, S80 и N81. Выбранные остатки были выбраны для включения в конструкцию TCL14 из-за большего теоретического размера библиотеки, если бы все 22 остатка были подвергнуты рандомизации.
Для рандомизации были выбраны тринадцать положений в Tencon: L32, Q34 и Q36 в С-цепи, S38, Е39, K40 и V41 в CD-петле, Т68, S70 и Y72 в F-цепи, Н78, R79 и N81 в FG-петле. В С- и F-цепях S30 и E66 не были подвергнуты рандомизации, поскольку они расположены сразу после CD- и FG-петель и, по-видимому, не являются частью поверхности C-CD-F-FG. Для CD-петли G42 и Е43 не были подвергнуты рандомизации, так как глицин, обеспечивающий гибкость, может быть ценным в петлевых областях, а Е43 находится на стыке поверхности. В случае FG-петли были исключены K75, G76, G77 и S80. Глицины были исключены по вышеуказанным причинам, в то время как тщательный осмотр кристаллических структур выявил, что S80 создает ключевые контакты с основой, чтобы помочь в образовании стабильной FG-петли. K75 отвернут от поверхности С-CD-F-FG и был менее привлекательным кандидатом для рандомизации. Хотя вышеупомянутые остатки не были подвергнуты рандомизации в исходной конструкции TCL14, они могли быть включены в последующие конструкции библиотек, чтобы обеспечить дополнительное разнообразие для de novo отбора или, например, для библиотеки созревания аффинности к отобранному мишень-специфическому наилучшему результату поиска в TCL14.
После получения TCL14 были созданы 3 дополнительные библиотеки Tencon с аналогичной конструкцией. Эти три библиотеки, TCL19, TCL21 и TCL23, подвергнуты рандомизации в тех же положениях, что и TCL14 (смотрите выше), однако распределение аминокислот, встречающихся в этих положениях, изменено (таблица 3). TCL19 и TCL21 были сконструированы с включением равного распределения 18 природных аминокислот в каждом положении (5,55% каждой), исключая только цистеин и метионин. TCL23 была сконструирована таким образом, что каждое рандомизированное положение приблизительно соответствует распределению аминокислот, обнаруживаемому в петлях HCDR3 функциональных антител (Birtalan et al., J Mol Biol 377: 1518-1528, 2008), как описано в табл. 2. Как и в случае библиотеки TCL21, цистеин и метионин были исключены.
Была создана еще одна дополнительная библиотека для расширения потенциальной поверхности связывания мишеней других библиотек. В этой библиотеке TCL24 рандомизации были подвергнуты 4 дополнительных положения Tencon по сравнению с библиотеками TCL14, TCL19, TCL21 и TCL23. Эти положения включают N46 и Т48 из D-цепи и S84 и 186 из G-цепи. Положения 46, 48, 84 и 86 были выбраны, в частности, поскольку боковые цепи этих остатков выставлены на поверхность из бета-цепей D и G и находятся структурно рядом с рандомизированными частями С- и F-цепей, таким образом увеличивая площадь поверхности, доступную для связывания с белками-мишенями. Распределение аминокислот, используемое в каждом положении, в случае TCL24 идентично распределению, описанному для TCL19 и TCL21 в табл. 2.
- 19 041577
Библиотека TCL24 (SEQ ID NO:8)
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSE
RSYDLTGLKPGTEYXioVXiiIXi2GVKGGXi3Xi4SXi5PLXi6AXi7FTT;
где
Xi, X2, Х3, Х4, Х5, Хб, Χίο, X11, X12 и X13 представляют собой A, D, E, F, G, Н, I, K, L, N, P, Q, R, S, Т, V или W.
Таблица 3. Частота (%) аминокислоты в каждом рандомизированном положении для
TCL21, TCL23 и TCL24
Аминокислота TCL19 TCL21 TCL23 TCL24
Ala 5,6 5,6 6, 0 5,6
Arg 5,6 5,6 6, 0 5,6
As η 5,6 5,6 3,9 5,6
Asp 5,6 5,6 7,5 5,6
Cys 0,0 0,0 0,0 0,0
Gin 5,6 5,6 1,5 5,6
Glu 5,6 5,6 2,5 5,6
Gly 5,6 5,6 15,0 5,6
His 5,6 5,6 2,3 5,6
He 5,6 5,6 2,5 5,6
Leu 5,6 5,6 5,0 5,6
Lys 5,6 5,6 1,5 5,6
Met 0,0 0,0 0,0 0,0
Phe 5,6 5,6 2,5 5,6
Pro 5,6 5,6 4,0 5,6
Ser 5,6 5,6 10,0 5,6
Thr 5,6 5,6 4,5 5,6
Trp 5,6 5,6 4,0 5,6
Tyr 5,6 5,6 17,3 5,6
Vai 5,6 5,6 4,0 5,6
Создание библиотек TCL21, TCL23 и TCL24
Библиотека TCL21 была создана с использованием технологии создания библиотеки Colibra (Isogenica) для контролирования распределения аминокислот. Фрагменты генов TCL19, TCL23 и TCL24 были получены с использованием технологии Slonomics (Morphosys) для контролирования распределения аминокислот. ПЦР использовали для амплификации каждой библиотеки после первоначального синтеза с последующим лигированием с геном для RepA, чтобы использовать его в отборах с использованием системы цис-дисплея (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-2810, 2004), как описано выше для библиотек петель.
Пример 3. Отбор доменов фибронектина типа III (FN3), которые связываются с человеческим сывороточным альбумином.
Скрининг библиотеки
Цис-дисплей использовали для отбора доменов, связывающихся с человеческим сывороточным альбумином, из библиотек TCL14, TCL19, TCL21, TCL23 и TCL24. Альбумин сыворотки человека и кролика, очищенный из сыворотки (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), биотинилировали с использованием стандартных методов и использовали для пэннинга. Для транскрипции и трансляции in vitro (ITT) 3 мкг библиотечной ДНК инкубировали с 0,1 мМ аминокислот в полном составе, 1X предварительно смешанными компонентами S30 и 15 мкл экстракта S30 (Promega) в общем объеме 50 мкл и инкубировали при 30°C. Через 1 ч добавляли 375 мкл раствора для блокирования ((0,1% казеина (Thermo Fisher, Rockford, IL)), 100 мг/мл ДНК спермы сельди (Promega, Madison, WI), 1 мг/мл гепарина (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО)) и реакционную смесь инкубировали на льду в течение 15 мин. Для отбора добавляли биотинилированный антиген в концентрациях 400 нМ (цикл 1), 200 нМ (циклы 2 и 3) и 100 нМ (циклы 4 и 5). Связанные члены библиотеки извлекали, используя магнитные шарики с нейтравидином (Thermo Fisher, Rockford, IL) (циклы 1, 3 и 5) или магнитные шарики со стрептавидином (Promega, Madison, WI) (циклы 2 и 4), и несвязанные члены библиотеки удалялись путем промывки шариков 5-14 раз 500 мкл PBST с последующими 2 промывками 500 мкл PBS. Дополнительные циклы отбора были выполнены для идентификации каркасных молекул с увеличенным сродством. Вкратце, результата отбора после цикла 5 были приготовлены, как описано выше, и подвергнуты дополнительным повторным циклам отбора со следующими изменениями: время инкубации с биотинилированным антигеном было уменьшено с 1 ч до 15 мин, а время захвата шариков было уменьшено с 20 до 15 мин, концентрация bt-HSA была уменьшена до 25 нМ (циклы 6 и 7) или 2,5 нМ (циклы 8 и 9), и дополнительную промывку в течение 1 ч осуществляли в присутствии избыточного количества небиотинилированного белка-мишени. Цель этих изменений со- 20 041577 стояла в одновременном отборе связующих с потенциально более высокой скоростью ассоциации и более медленной скоростью диссоциации, что обеспечивает существенно более низкую KD.
После пэннинга отобранные домены FN3 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов Tcon6 (SEQ ID NO:33) и Tcon5shortE86I (SEQID NO: 34), субклонировали путем отжига в pET15-LIC и трансформировали в клетки BL21-GOLD (DE3) (Agilent, Santa Clara, CA) для растворимой экспрессии в E.coli, используя стандартные методы молекулярной биологии. Отдельные клоны отбирали и выращивали до насыщения в 1 мл LB с ампициллином в планшетах с 96 глубокими лунками при 37°C. На следующий день 25 мкл переносили в 1 мл свежей среды LB-Amp в планшетах с 96 глубокими лунками и выращивали при 37°C в течение 2 ч. IPTG добавляли в конечной концентрации 1 мМ, и экспрессию белка индуцировали при 30°C в течение 16 ч. Клетки собирали центрифугированием и затем лизировали с помощью Bugbuster HT (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) с добавлением 0,2 мг/мл в конечной концентрации лизоцима куриного яичного белка (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Бактериальные лизаты осветляли центрифугированием, и супернатанты переносили в новые планшеты с 96 глубокими лунками и проверяли на связывание с белком-мишенью с помощью ELISA.
Отбор доменов FN3, которые связываются с человеческим сывороточным альбумином
Иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA) проводили на отдельных клонах из отобранных результатов пэннинга с целью идентификации связующих для человеческого сывороточного альбумина. Планшеты Maxisorp (Nunc, Rochester, NY) покрывали 5 мкг HSA, rabSA или 5 мкг/мл овальбумина в течение ночи (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), промывали Трис-буферным солевым раствором, рН 7,4 с 0,05% Tween-20 (TBST) и блокировали с использованием Starting Block T20 (Thermo Fisher, Rockford, IL). Осветленные бактериальные лизаты (описанные выше) вносили в лунки покрытых HSA, rabSA и овальбумином планшетов. Планшеты инкубировали в течение 1 ч, промывали TBST, и связанный Centyrin детектировали с помощью pAb25-HRP (Janssen R&D, Springhouse PA) и хемилюминесцентного субстрата POD (Roche, Indianapolis, IN), используя устройство для считывания планшетов Molecular Devices M5. Лучшие результаты поиска определяли как сигнал связывания человеческого сывороточного альбу мина:сигнал связывания овальбумина >10.
Клоны были дополнительно охарактеризованы в анализе ELISA, описанном выше, в отношении связывания с различными конструкциями доменов человеческого сывороточного альбумина и в отношении перекрестной реактивности с альбуминами различных видов: доменом I альбумина (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), доменом II (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), доменом III (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), доменом I-II (Albumin Biosciences, Huntsville, AL), сывороточным альбумином макакирезус (Sigma-Aldrich, St. Lousis, МО) и мышиным сывороточным альбумином (Sigma-Aldrich, St. Lousis, MO). Домены I, II и III использовались для покрытия в концентрации 1 мкг/мл, домен I-II в концентрации 2 мкг/мл, а полноразмерные альбумины резус-макака и мыши - в концентрации 3 мкг/мл вместе с человеческим сывороточным альбумином, служащим в качестве положительного контроля связывания в концентрации 3 мкг/мл. Специфичности альбуминсвязывающих доменов - отобранных доменов FN3 продемонстрирована в табл. 4. В табл. 5 представлены полноразмерные аминокислотные последователь ности отобранных доменов FN3.
Таблица 4. Специфичности альбуминсвязывающих доменов отобранных доменов FN3
ID клона
Специфичность альбуминсвязывающих доменов
ALB-E05
ALB-E07
ALB-H9
Таблица 5. Аминокислотные последовательности отобранных доменов FN3
ID клона SEQ ID NO: Последовательность
ALB- Е05 51 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFQIEYWEDDVGGEAIVLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYDVYI LGVKGGWESGPLSAIFTT
ALB- Е07 52 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFKILYEEYLVFGEAIVLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYWVAIW GVKGGQVS GT L SAIFTT
ALB- Н9 53 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFHIEYWEQSIVGEAIVLTVPGSERSY DLTGLKPGTEYRVWIYG VKGGNDSWPLSAIFTT
Экспрессия и очистка в малых масштабах идентифицированных доменов FN3, связывающихся с человеческим сывороточным альбумином
Отобранные клоны с доменами FN3 отбирали и выращивали до насыщения в 1 мл бульона Лурия (LB) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина (среде LB-Amp) в планшетах с 96 глубокими лунками при 37°C. На следующий день 25 мкл переносили в 5 мл свежей среды LB-Amp в планшетах с 24 глубокими
- 21 041577 лунками и выращивали при 37°C в течение 2 ч. IPTG добавляли в конечной концентрации 1 мМ, и экспрессию белка индуцировали при 30°C в течение 16 ч. Клетки собирали центрифугированием и лизировали с помощью Bugbuster HT (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) с добавлением 0,2 мг/мл в конечной концентрации лизоцима куриного яичного белка (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Бактериальные лизаты осветляли центрифугированием, и супернатанты переносили в новые планшеты с 96 глубокими лунками. His-меченные домены FN3 очищали с использованием 96-луночного планшета Ni-NTA Multitrap Plate в соответствии с рекомендациями производителей (GE Lifesciences, Piscataway, NJ).
Анализ с использованием гель-хроматографии
Гельпроникающую хроматографию (SEC) использовали для определения состояния агрегации доменов FN3, связывающихся с сывороточным альбумином человека. Аликвоты (10 мкл) каждого очищенного домена FN3 инъецировали в колонку Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) со скоростью потока 0,3 мл/мин в подвижной фазе PBS, рН 7,4. Элюирование из колонки контролировали по оптической плотности при 280 нм. Домены FN3, которые демонстрировали высокие уровни агрегации при проведении SEC, были исключены из дальнейшего анализа.
Пример 4. Характеристика доменов FN3, связывающихся с человеческим сывороточным альбумином
Иммунопреципитация комплексов человеческий сывороточный альбумин-домен FN3
Для оценки функциональности связующих отобранные домены FN3 были проверены на их способность к образованию комплексов с эндогенным альбумином в нормальной сыворотке. Чтобы убедиться в сохранении связывания с альбумином в случае присоединения отобранных доменов FN3 или к N-, или к С-концу другого домена FN3, были получены гены бивалентных FN3 для создания конструкций ALB18, ALB30, ALB21, ALB33, ALB34 и ALB35 (табл. 6).
Таблица 6. Бивалентные конструкции, исследованные на предмет сохранения связывания _______________________ с альбумином______________________
ID клона Домен 1 FN3 Линкер Домен 2 FN3
ALB18 ТС25 (G4S)4 (SEQ ID NO:71) ALB-E05
ALB3 0 ALB-E05 (G4S)4 (SEQ ID NO:71) Tc25
ALB21 ALB-E07 (G4S)4 (SEQ ID NO:71) Tc25
ALB33 Тс25 (G4S)4 (SEQ ID NO:71) ALB-E07
ALB34 Тс25 (G4S)4 (SEQ ID NO:71) ALB-H9
ALB35 ALB-H9 (G4S)4 (SEQ ID NO:71) Tc25
His6-меченные (SEQ ID NO: 72) на С-конце бивалентные домены FN3 (0,25-2,0 мг/мл в 1X DPBS без кальция или магния) смешивали в объемном соотношении 1:1 с нормальной сывороткой и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре для допуска связывания с эндогенным альбумином в сыворотке. Комплексы His6-меченный (SEQ ID NO: 72) домен FN3-альбумин извлекали из сыворотки с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC), используя колонки 200+ PhyTip, содержащие 5-мкл слой смолы (PureSpeed™ Protein Tip IMAC от Rainin Instrument LLC; Oakland, CA), предварительно уравновешенные с использованием буфера 50 мМ Трис, рН 7,0, содержащего 500 мМ NaCl и 10 мМ имидазол. Несвязанные сывороточные белки удаляли путем тщательного промывания смолы буфером для уравновешивания. Связанный белок элюировали с использованием 25-100 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис, рН 7,0, содержащего 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазол, рН 7,5). Элюаты анализировали с помощью электрофореза в SDS-ПААГ (SDS-PAGE) на соосаждение альбумина. Гели после SDS-PAGE окрашивали коллоидным Кумасси. Дорожки, содержащие альбуминсвязывающие домены FN3, содержали интенсивные полосы, соответствующие молекулярной массе сывороточного альбумина плюс домены FN3. Напротив, альбумин не образовывал комплексы, когда Tencon25 (SEQ ID NO: 73), домен FN3, не имеющий сродства к сывороточному альбумину, извлекали из сыворотки с помощью очистки с использованием IMAC (см. фиг. 2).
Фармакокинетика альбуминсвязывающих доменов FN3 у яванских макак
Исследования in vivo проводили с ALB18 и ALB33. Исследуемые образцы поставлялись в проводящую исследование лабораторию в концентрации 2,0 мг/мл и хранились при -70±10°C. Домены FN3 оттаивали при комнатной температуре за 24 ч до введения доз и хранили при 2-8°C. В день введения доз исследуемые образцы нагревали до комнатной температуры. Девять не подвергаемых ранее воздействию самок яванских макак весом от 2,0 до 4,0 кг на момент введения доз были разделены на 3 группы. Домены FN3 вводили с помощью внутривенной (IV) болюсной инъекции (планируемое время 1-3 мин в зависимости от общего объема дозы) в день 1 в дозе 2 мг/кг. Объем каждой введенной дозы (мл) основывался на весе тела отдельного животного, зафиксированном за 1-2 дня до введения дозы. Приблизительно 1 мл цельной крови собирали из периферического сосуда в день 1 до введения дозы, через 10 мин и через 6 и 24 ч после введения дозы. Дополнительные образцы были собраны в дни 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14 и 21 примерно в одно и то же время дня. Все образцы крови были собраны в пробирки для отделения сыворотки
- 22 041577 без антикоагулянта. Образцы крови сворачивались в течение 30 мин, и затем их центрифугировали в центрифуге с охлаждением в течение 15 мин. Приблизительно 1 мл сыворотки переносили в две пробирки Eppendorf (по 0,5 мл каждая) и хранили при -65°C до отправки спонсору.
Н9 оценивали следующим образом. Трем не подвергаемым ранее воздействию самцам яванских макак весом в диапазоне от 2,2 до 4,4 кг вводили дозу 1 мг/кг Н9 (0,5 мг/мл, приготовленного в PBS) при внутривенной болюсной инъекции 2 мл/кг. Образцы крови (приблизительно 1 мл) собирали из головной или бедренной вены в пробирки BD Vacutainer® SST™ объемом 3,5 мл (кат. № 367957) без антикоагулянта. Пробы отбирали в следующие моменты времени: перед введением дозы (t=0) и через 10 мин, 1, 6, 24, 48, 72 ч (день 4), 168 ч (день 8), 240 ч (день 11), 336 ч (день 15) и 504 ч (день 22) после введения дозы. Образцы крови в каждый момент времени свертывались в течение 30-60 мин при комнатной температуре с последующим центрифугированием в течение 15 мин при комнатной температуре. Приблизительно 0,5 мл сыворотки переносили в предварительно помеченную полипропиленовую микропробирку и сразу же помещали на сухой лед перед хранением при -70°C или ниже. Образцы сыворотки отправлялись в сухом льду.
Для определения концентрации доменов FN3, присутствующих в образцах сыворотки, стандартные кривые для альбуминсвязывающих доменов FN3 Н9, ALB18 и ALB33 были приготовлены в концентрации 300 нг/мл и последовательно разведены в 3 раза в буфере для анализа (10% контрольной сыворотке от не подвергаемым ранее воздействию яванских макак (Bioreclamation) в блокирующем буфере Super Block T20 (TBS) (Thermo Scientific)) для кривой по 11 точкам. Все исследуемые образцы сыворотки оттаивали при комнатной температуре и готовили в буфере для анализа в разведении 1:10 и дополнительно последовательно разводили, используя 5-кратные разведения в буфере для анализа. Гомогенную мастерсмесь для захвата и детектирования получали с использованием биотинилированных антител для захвата и детектирования, помеченных рутением (поликлонального антитела против домена FN3 pab139, Janssen Pharmaceuticals), приготовленных в Super Block до 0,625 мкг/мл. 40 мкл мастер-смеси и 10 мкл разведенных образцов, стандартов или контролей добавляли в 96-луночные планшеты с конъюгированными со стрептавидином частицами золота (Mesoscale Discovery). Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Планшеты промывали с использованием 300 мкл TBS-T, 0,05% Tween-20 (Sigma) и промокали досуха. 1X раствор Read Buffer T с поверхностно-активным веществом (Mesoscale Discovery) готовили в дистиллированной воде. Буфер для считывания добавляли в планшеты для анализа в количестве 150 мкл/лунку и электрохемилюминесценцию измеряли, используя считывающее устройство QuickPlex SQ 120 (Mesoscale Discovery).
Стандартные кривые были построены в GraphPad Prism путем преобразования осей X и Y в X=log(X) и Y=log(Y). Нелинейный регрессионный анализ (подбор кривой) был выполнен с использованием сигмоидальной кривой доза-ответ (изменяемого наклона); неизвестные были интерполированы за пределами стандартной кривой. Чтобы скорректировать начальное преобразование, средние интерполированные результаты были преобразованы с использованием Х=10ЛХ и Υ=10ΛΥ. Линейный участок стандартной кривой определяли на глаз. Все интерполированные концентрации были скорректированы с учетом коэффициента разведения, используемого в анализе. Конечную концентрацию определяли путем усреднения действительных результатов для всех разведений и перевода из нг/мл в нМ.
Для фармакокинетического анализа использовали расширение PKSolver для Excel (Zhang, Y. et al. (2010) Comput. Methods Programs Biomed., 99 306-314). Модельно-независимый анализ проводили для каждого животного. Период полужизни и клиренс для трех животных для каждой конструкции усредняли для определения окончательных результатов. Фармакокинетические данные для альбуминсвязывающих доменов FN3 представлены на фиг. 2 и в табл. 7. Связующие для домена 3 альбумина, Н9 и ALB18 показали сходные профили экспозиции и конечные значения периода полужизни (33-47 ч). Связующее для домена 1 альбумина ALB33 демонстрирует промежуточную экспозицию и конечное время полужизни, составляющее приблизительно 26 ч.
Таблица 7. Фармакокинетические свойства альбуминсвязывающих доменов FN3 у яванских макак, представленные в виде среднего значения +/- стандартное отклонение
- 23 041577
Информация о последовательности
SEQ ID NO:1=исходная последовательность Tencon
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT
SEQ ID NO:2=Библиотека TCL1
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGV(X) 7_12PLSAEFTT;
где
Х1, Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, Х7 представляет собой любую аминокислоту и
Х8, Х9, Х10, Хц и Х12 представляют собой любую аминокислоту или делегированы. SEQ ID NO:3=Библиотека TCL2
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSER
SYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX9X10X11X12X13SX14X15LSAEFTT;
где
X1 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X2 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X3 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X4 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X5 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X6 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X7 представляет собой Phe, Ile, Leu, Val или Tyr;
X8 представляет собой Asp, Glu или Thr;
X9 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X10 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X11 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X12 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X13 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;
X14 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val и
X15 представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val.
SEQ ID NO:4=Стабилизированный Tencon (Tencon 27)
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
SEQ ID NO:5=TCL7 (FG- и ВС-петли)
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWXiX^X^XgX^gXgFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVP
GSERS YDLTGLKPGTEYTVSIYGVX10X11X12X13X14X15X16X17X18X19SNPLSAI FTT;
где
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X10, X11, X12, X13, X14, X15 и X16 представляют собой A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y и
X7, X8, X9, X17, X18 и Х19 представляют собой A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y или делетированы.
SEQ ID NO:6=TCL9 (FG-петля)
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLT
GLKPGTEYTVSIYGV Х1Х2ХзХ4Х5ХбХ7Х8Х9 XiqXhX^SNPLSAI FTT;
где
X1, X2, X3, X4, X5, X6 и Х7 представляет собой A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W или Y и
X8, X9, X10, X11 и X12 представляет собой A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y или делетирован.
- 24 041577
SEQ ID NO:7=Библиотека TCL14
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXiIX2YX3EX4X5X6X7GEAIVLTVPGSERS
YDLTGLKPGTEYX8VX9IXioGVKGGXiiXi2SXi3PLSAIFTT;
где
X1, X2, X3, X4, X5, Хб, Χίο, X11, X12 и X13 представляют собой A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W,Y или М.
SEQ ID NO:8=Библиотека TCL24
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX1IX2YX3EX4X5X6X7GEAIX8LX9VPGSE
RSYDLTGLKPGTEYXioVXnIXisGVKGGXisXMSXisPLXieAXivFTT;
где
X1, X2, X3, X4, Х5, Х6, X10, X11, X12 и X13 представляют собой A, D, E, F, G, Н, I, K, L, N, P, Q, R, S, Т, V или W.
SEQ ID NO :9=Sloning-FOR
GTGACACGGCGGTTAGAAC
SEQ ID NO: 10=Sloning-REV
GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG
SEQ ID NO :11=POP2250
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
SEQ ID NO:12=DigLigRev
CATGATTACGСCAAGСTCAGAA SEQ ID NO:13=BC9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCG TCTGTCTTG GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTY GAC TCTTTCCTGATC CAG TAG GAG GAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACC TGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCC AAAGGC
SEQ ID NO:14=BC8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCG TCTGTCTTG GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTY GAC TCTTTCCTGATC CAG TAG GAG GAA TCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGA CCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAA GGC
SEQ ID NO:15=BC7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCG TCTGTCTTG GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTY GAC TCTTTCCTGATC CAG TAG GAG GAAT С T GAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCG GTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
- 25 041577
SEQ ID NO:16=BC6
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCG TCTGTCTTG GNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTY GAG TCTTTCCTGATC GAG TAG GAG GAAT С T GAA AAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTC TGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC
SEQ ID NO:17=13Omer-Ll7A
CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAAT CATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTA CCATGCTG
SEQ ID NO :18=POP222ext
CGG CGG TTA GAA CGC GGC ТАС AAT TAA TAG
SEQ ID NO:19=LS1114
CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTT CGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC
SEQ ID NO:20=LS1115
CCG AAG ACT CTG CCC GTC TGT CTT GG
SEQ ID NO:21=LS1117
CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA
SEQ ID NO:22=SDG10
CATGCGGTCTCTTCCGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTCCTGACCGTTCCGGGT
SEQ ID NO:23=SDG24
GGTGGTGAAGATCGCAGACAGCGGGTTAG
SEQ ID NO :24=POP2222
CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC
SEQ ID NO:25=SDG28
AAGATCAGTTGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCACCGCCGGTGGTGAAGATCGCAG
AC
SEQ ID NO:26=FG12
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCG TCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAA AAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTC T GAAAC C G G G TAC C GAATACAC CGTTTCTATCTACGGTGTT NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
- 26 041577
NNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCAC CATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID NO:27=FG11
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCG TCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAA AAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTC T GAAAC C G G G TAC C GAATACAC CGTTTCTATCTACGGTGTT NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCAT GGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID NQ:28=FG10
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCG TCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAA AAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTC T GAAAC C G G G TAC C GAATACAC CGTTTCTATCTACGGTGTT NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGC AGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID NO:29=FG9
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCG TCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAA AAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTC T GAAAC C G G G TAC C GAATACAC CGTTTCTATCTACGGTGTT NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGC GGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID NQ:30=EG8
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCG TCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAA AAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTC T GAAAC C G G G TAC C GAATACAC CGTTTCTATCTACGGTGTT NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
- 27 041577
NTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGT TCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID NO:31=FG7
GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG GATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCG TCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAA AAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTC TGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTC TAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCT AGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC
SEQ ID NO:32=ЕС-петля Tencon
KGGHRSN
SEQ ID NO:33=Tcon 6
AAGAAGGAGAACCGGTATGCTGCCGGCGCCGAAAAAC
SEQ ID NO:34=Tcon5E86Ishort
GAG CCG CCG CCA CCG GTT TAA TGG TGA TGG TGA
TGG TGA CCA CCG GTG GTG AAG АТС GCA GAC AG
SEQ ID ИО:35=С-цепь исходного Tencon
Sfliqyqe
SEQ ID NO:36=C-uenb ALB-E05 sfQiEyWe
SEQ ID NO:37=C-uenb ALB-E07 sfKiLyEe
SEQ ID NO:38=C-uenb ALB-H9 sfHiEyWe
SEQ ID NO:39=СО-петля исходного Tencon
Sekvge
SEQ ID NO:40=СО-петля ALB-E05
DDVGge
SEQ ID NO:41=СО-петля ALB-E07
YLVFge
SEQ ID NO:42=СО-петля ALB-H9
QSIVge
SEQ ID NO:43=F-uenb исходного Tencon
Eytvsiygvk
- 28 041577
SEQ ID ЫО:44=Е-цепь ALB-E05 eyDvYiLgvk
SEQ ID ЫО:45=Е-цепь ALB-E07 eyWvAiWgvk
SEQ ID NO:46=F-uenb ALB-H9 eyRvWiYgvk
SEQ ID NO:47 = ЕС-петля исходного Tencon
Gghrsnp
SEQ ID NO:48=ЕО-петля ALB-E05 ggWEsGP
SEQ ID NO:49=ЕС-петля ALB-E07 ggQVsGT
SEQ ID NO:50: FG-петля ALB-H9 ggNDsWP
SEQ ID NO :51=ALB-E05
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFQIEYWEDDVGGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYDVYILGVKGGWESGPLSAIFTT
SEQ ID NO :52=ALB-E07
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFKILYEEYLVFGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYWVAIWGVKGGQVSGTLSAIFTT
SEQ ID NO:53=ALB-H9
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFHIEYWEQSIVGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYRVWIYGVKGGNDSWPLSAIFTT
SEQ ID NO:54=(GS) 2
GSGS
SEQ ID NO:55=(GGGS)2
GGGSGGGS
SEQ ID NO:56=(GGGGS)2
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:57=(AP)2
APAP
SEQ ID NO:58=(AP)5
APAPAPAPAP
SEQ ID NO:59=(AP)ю
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
SEQ ID NO: 60= (AP) 20
- 29 041577
APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP
SEQ ID NO:61=A(EAAAK) 5AAA
AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA
SEQ ID NO:62=Альбумин сыворотки человека
KWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPF EDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAA FTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAE VENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETT LEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNR RPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVM DDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO:63=Альбумин сыворотки яванского макака
KWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDTHKSEVAHRFKDLGEEHFKGLVLVAFSQYLQQCPF EEHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPPLVRPEVDVMCTAFHDNEATFLKKYLYEVARRHPYFYAPELLFFAARYKAA FAECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGDRAFKAWAVARLSQKFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYMCENQDSISSKLKECCDKPLLEKSHCLAE VENDEMPADLPSLAADYVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVMLLLRLAKAYEAT LEKCCAAADPHECYAKVFDEFQPLVEEPQNLVKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGAKCCKLPEAKRMPCAEDYLSWLNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNR RPCFSALELDEAYVPKAFNAETFTFHADMCTLSEKEKQVKKQTALVELVKHKPKATKEQLKGVM DNFAAFVEКСCKADDKEACFAEEGPКFVAASQAALA
SEQ ID NO:64=Последовательность нуклеиновой кислоты ALB-E05
TTGCCGGCCCCGAAGAACCTGGTCGTGAGCCGTGTTACCGAGGACAGCGCGCGTCTGAG CTGGACCGCACCGGACGCGGCGTTTGATTCGTTTCAGATTGAGTATTGGGAAGATGACGTGGGT GGTGAGGCTATCGTGCTGACCGTCCCGGGTAGCGAGCGCAGCTACGATCTGACGGGTCTGAAAC CGGGTACCGAGTACGACGTGTACATTTTGGGTGTTAAAGGTGGCTGGGAGAGCGGTCCGCTGTC AGСAATСTTTACGACG
SEQ ID NO:65=Последовательность нуклеиновой кислоты ALB-E07
CTGCCGGCCCCGAAGAACCTGGTCGTGAGCCGTGTTACCGAGGACAGCGCGCGTCTGAG CTGGACCGCACCGGACGCGGCGTTTGATTCGTTTAAGATTCTGTATGAAGAATACCTGGTGTTC GGTGAGGCTATCGTGCTGACCGTCCCGGGTAGCGAGCGCAGCTACGATCTGACGGGTCTGAAAC CGGGTACCGAGTACTGGGTGGCGATTTGGGGTGTTAAAGGTGGCCAGGTGAGCGGCACCCTGAG CGCAATCTTTACGACG
SEQ ID NO:66=Последовательность нуклеиновой кислоты ALB-H9
ATGTTGCCGGCCCCGAAGAACCTGGTCGTGAGCCGTGTTACCGAGGACAGCGCGCGTCT GAGCTGGACCGCACCGGACGCGGCGTTTGATTCGTTTCACATTGAGTATTGGGAACAGAGCATC GTGGGTGAGGCTATCGTGCTGACCGTCCCGGGTAGCGAGCGCAGCTACGATCTGACGGGTCTGA AACCGGGTACCGAGTACCGCGTGTGGATTTACGGTGTTAAAGGTGGCAATGACAGCTGGCCGCT G T CAG CAAT С T T TAC GAC G
SEQ ID NO :67=Tencon25
LPAPKNLWSEVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLT GLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
SEQ ID ЕО:68=3-ий домен FN3 в тенасцине С человека
DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGN LKPDTEYEVSLISRRGDMSSNPAKETFTT
SEQ ID ΝΟ:69=Φη6κοη
LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITGYRITYTPSNGPGEPKELTVPPSSTSVTIT GLTPGVEYWSLYALKDNQESPPLVGTQTT
SEQ ID Е0:70=10-ый домен FN3 в фибронектине человека
VSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATI
SGLKPGVDYTITVYAVTGRGDS PAS SKPISINYRT

Claims (18)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенный домен фибронектина типа III (FN3), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53 или аминокислотную последовательность, имеющую 1, 2, 3 или 4 замен по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 53.
  2. 2. Выделенный домен FN3 по п.1, где период полужизни в сыворотке домена FN3 превышает по меньшей мере в 10 раз период полужизни в сыворотке белка, включающего аминокислотную последовательность Tencon25 SEQ ID NO: 67.
  3. 3. Выделенный домен FN3 по п.1, где период полужизни в сыворотке домена FN3 составляет по меньшей мере приблизительно 25 ч у яванского макака.
  4. 4. Выделенный полинуклеотид, кодирующий домен FN3 по п.1.
  5. 5. Вектор, включающий полинуклеотид по п.4.
  6. 6. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор по п.5.
  7. 7. Способ получения домена FN3, включающий культивирование выделенной клетки-хозяина по п.6 в условиях, при которых экспрессируется домен FN3, и очистку домена FN3.
  8. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая домен FN3 по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
  9. 9. Способ обнаружения присутствия человеческого сывороточного альбумина в биологическом образце, включающий получение биологического образца от субъекта, приведение биологического образца в контакт с доменом FN3 по п.1, присоединенным к метке, которая может быть детектирована, где метка, которая может быть детектирована, представляет собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента, и оценку связывания биологического образца с доменом FN3, используя известный способ обнаружения, пригодный для метки, которая может быть детектирована.
  10. 10. Выделенная биспецифичная молекула FN3, содержащая первый домен FN3 и второй домен FN3, причем первый домен FN3 включает домен FN3 по п.1, а второй домен FN3 связывается с белкоммишенью, отличным от человеческого сывороточного альбумина.
  11. 11. Выделенный домен FN3 по п.1, где домен FN3 по меньшей мере на 97, 98 или 99% идентичен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 53.
  12. 12. Выделенный домен FN3 по п.1, где домен FN3 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет 1, 2, 3 или 4 замен по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 53.
  13. 13. Выделенный домен FN3 по п.1, где домен FN3 по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53.
  14. 14. Выделенный домен FN3 по п.1, где домен FN3 по меньшей мере на 97% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53.
  15. 15. Выделенный домен FN3 по п.1, где домен FN3 по меньшей мере на 98% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53.
  16. 16. Выделенный домен FN3 по п.1, где домен FN3 по меньшей мере на 99% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53.
  17. 17. Выделенный домен FN3 по п.1, где домен FN3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.
  18. 18. Выделенный домен фибронектина типа III (FN3) по п.1, где 1, 2, 3 или 4 замены могут происходить в остатках 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 68, 70, 72, 78, 79, 81, 82 или любой их комбинации.
EA201892796 2016-06-03 2017-06-01 Связывающиеся с сывороточным альбумином домены фибронектина типа iii EA041577B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/345,190 2016-06-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA041577B1 true EA041577B1 (ru) 2022-11-09

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11833190B2 (en) Serum albumin-binding fibronectin type III domains
US9775912B2 (en) Designed repeat proteins binding to serum albumin
JP6486908B2 (ja) 肝細胞増殖因子に結合する設計アンキリン反復タンパク質
US9260496B2 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23
TW201130501A (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23
WO2014165093A2 (en) Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto
EA041577B1 (ru) Связывающиеся с сывороточным альбумином домены фибронектина типа iii
US20230039851A1 (en) Serum albumin-binding fibronectin type iii domains and uses thereof