EA041483B1

EA041483B1 - LAG-3 BINDING MOLECULES AND METHODS FOR THEIR APPLICATION

Info

Publication number: EA041483B1
Application number: EA201792657
Authority: EA
Inventors: Мотт-Мохс Росс Ла; Калпана ШАН; Дуглас Х. Смит; Лесиль С. Джонсон; Пол А. Мур; Эцио Бонвини; Скотт КОЕНИГ
Original assignee: Макродженикс, Инк.
Priority date: 2015-06-08
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2022-10-28

Description

Ссылки на родственные заявкиLinks to related applications

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с заявками на выдачу патента США № 62/255094 (поданной 13 ноября 2015 г.; на рассмотрении) и № 62/172277 (поданной 8 июня 2015 г.; на рассмотрении), каждая из этих заявок включена в настоящий документ при помощи ссылки в полном их объеме.This application claims priority under U.S. Patent Applications No. 62/255094 (filed November 13, 2015; pending) and U.S. Patent Applications No. 62/172277 (filed June 8, 2015; pending), each of these applications is included herein by reference in their entirety.

Ссылка на перечень последовательностейLink to sequence listing

Настоящая заявка включает один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. 1.821 и далее, которые раскрыты на машиночитаемом носителе (название файла: 1301_0121PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, создан 18 мая 2016 г. и имеет размер 105774 байта), при этом данный файл включен в настоящий документ с помощью ссылки в полном его объеме.This application includes one or more sequence listings in accordance with 37 C.F.R. 1.821 ff, which are disclosed on a machine-readable medium (file name: 1301_0121PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, created on May 18, 2016, and has a size of 105774 bytes), and this file is incorporated into this document by reference in its entirety.

Область техники, к которой относится настоящее изобретениеThe field of technology to which the present invention relates

Настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулы, которые содержат связывающий LAG-3 домен выбранных антител к LAG-3: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6, которые способны связываться как с LAG-3 яванского макака, так и с LAG-3 человека. Настоящее изобретение, в частности, относится к связывающим LAG-3 молекулам, которые являются гуманизированными или химерными версиями таких антител или которые содержат связывающие LAG-3 фрагменты таких антител к LAG-3 (особенно к иммуноконъюгатам, диателам, BiTE, биспецифическим антителам и т.д.). Настоящее изобретение, в частности, относится к таким связывающим LAG-3 молекулам, которые дополнительно способны связываться с эпитопом молекулы, участвующей в регуляции иммунной контрольной точки, которая присутствует на поверхности иммунной клетки. Настоящее изобретение также относится к способам применения таких связывающих LAG-3 молекул для детекции LAG-3 или для стимуляции иммунного ответа. Настоящее изобретение также относится к способам комбинированной терапии, при которых связывающую LAG молекулу, которая содержит один или несколько связывающих LAG-3 доменов таких выбранных антител к LAG-3, вводят в комбинации с одной или несколькими дополнительными молекулами, которые эффективны в стимуляции иммунного ответа, тем самым дополнительно усиливая, стимулируя или повышая такой иммунный ответ у субъекта.The present invention relates to LAG-3 binding molecules which contain the LAG-3 binding domain of selected anti-LAG-3 antibodies: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6 that are capable of binding to both cynomolgus monkey LAG-3 and human LAG-3. The present invention specifically relates to LAG-3 binding molecules that are humanized or chimeric versions of such antibodies or that contain LAG-3 binding fragments of such anti-LAG-3 antibodies (especially immunoconjugates, diabodies, BiTEs, bispecific antibodies, etc.). d.). The present invention specifically relates to such LAG-3 binding molecules that are further capable of binding to an epitope of a molecule involved in the regulation of an immune checkpoint that is present on the surface of an immune cell. The present invention also relates to methods for using such LAG-3 binding molecules to detect LAG-3 or to stimulate an immune response. The present invention also relates to combination therapy methods in which a LAG binding molecule that contains one or more LAG-3 binding domains of such selected anti-LAG-3 antibodies is administered in combination with one or more additional molecules that are effective in stimulating an immune response, thereby further enhancing, stimulating or enhancing such an immune response in the subject.

Уровень техникиState of the art

I. Клеточные иммунные ответыI. Cellular immune responses

Иммунная система людей и других млекопитающих отвечает за обеспечение защиты от инфекции и заболевания. Такая защита обеспечивается как гуморальным иммунным ответом, так и клеточным иммунным ответом. Гуморальный ответ приводит в результате к выработке антител и других биомолекул, которые способны распознавать и нейтрализовать инородные мишени (антигены). Для сравнения, при клеточном иммунном ответе происходит активация макрофагов, натуральных киллеров (NK) и антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов Т-клетками и высвобождение различных цитокинов в ответ на распознание антигена (Dong, С. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules Immunolog. Res. 28(1):39-48).The immune system of humans and other mammals is responsible for providing protection against infection and disease. Such protection is provided by both the humoral immune response and the cellular immune response. The humoral response results in the production of antibodies and other biomolecules that are able to recognize and neutralize foreign targets (antigens). In comparison, in a cellular immune response, macrophages, natural killer (NK), and antigen-specific cytotoxic T lymphocytes are activated by T cells and release various cytokines in response to antigen recognition (Dong, C. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules Immunolog Res 28(1):39-48).

Способность Т-клеток оптимально опосредовать иммунный ответ на антиген нуждается в двух различных сигнальных взаимодействиях (Viglietta, V. et al. (2007) Modulating Co-Stimulation Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy Adv. Immunol. 90:297-339). Во-первых, антиген, который дислоцируется на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC), должен быть презентирован антиген-специфической наивной CD4+ Т-клетке. Такое презентирование доставляет сигнал с помощью Т-клеточного рецептора (TCR), который заставляет Т-клетку инициировать иммунный ответ, который будет специфическим к презентируемому антигену. Во-вторых, серия костимулирующих и коингибирующих сигналов, опосредуемых взаимодействиями между APC и различными молекулами на поверхности Т-клеток, запускает сначала активацию и пролиферацию Тклеток и в конечном итоге их ингибирование. Таким образом, первый сигнал придает специфичность иммунному ответу, в то время как второй сигнал служит для определения природы, величины и продолжительности ответа.The ability of T cells to optimally mediate an immune response to an antigen requires two distinct signaling interactions (Viglietta, V. et al. (2007) Modulating Co-Stimulation Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy Adv. Immunol. 90:297-339). First, the antigen that is deployed on the surface of antigen-presenting cells (APCs) must be presented to an antigen-specific naive CD4+ T cell. This presentation delivers a signal via the T cell receptor (TCR) that causes the T cell to initiate an immune response that is specific to the antigen being presented. Second, a series of co-stimulatory and co-inhibitory signals, mediated by interactions between APCs and various molecules on the surface of T cells, triggers first T cell activation and proliferation and ultimately their inhibition. Thus, the first signal gives specificity to the immune response, while the second signal serves to determine the nature, magnitude and duration of the response.

Иммунная система жестко контролируется костимулирующими и коингибирующими лигандами и рецепторами. Такие молекулы обеспечивают второй сигнал для активации Т-клеток и обеспечивают сбалансированную сеть положительных и отрицательных сигналов для максимизации иммунных ответов к инфекции, при этом ограничивая иммунитет к своим клеткам (Wang, L. et al. (2011) VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, В. et al. (2008) The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections, Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). Ингибирующие пути, важные для сохранения аутотолерантности и модулирования продолжительности и величины иммунных ответов, совместно называют иммунными контрольными точками. Особое значение имеет связывание лигандов В7.1 (CD80) и В7.2 (CD86) антиген-презентирующих клеток с рецепторами CD28 и CTLA-4 у CD4+ T-лимфоцита (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev.The immune system is tightly controlled by costimulatory and coinhibitory ligands and receptors. Such molecules provide a second signal for T cell activation and provide a balanced network of positive and negative signals to maximize immune responses to infection while limiting immunity to their own cells (Wang, L. et al. (2011) VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16 Lepenies, B. et al. (2008) The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections, Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). Inhibitory pathways important for maintaining self-tolerance and modulating the duration and magnitude of immune responses are collectively referred to as immune checkpoints. Of particular importance is the binding of the B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) ligands of antigen presenting cells to the CD28 and CTLA-4 receptors on the CD4+ T lymphocyte (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P. S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev.

- 1 041483- 1 041483

229:307-321). Связывание В7.1 или В7.2 с CD28 стимулирует активацию Т-клеток; связывание В7.1 или В7.2 с CTLA-4 ингибирует такую активацию (Dong, С. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28 конститутивно экспрессируется на поверхности Тклеток (Gross, J., et al. (1992) Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse, J. Immunol. 149:380-388), в то время как экспрессия CTLA-4 быстро возрастает после активации Т-клеток (Linsley, P. et al. (1996) Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement, Immunity 4:535-543). Поскольку CTLA-4 является более высокоаффинным рецептором (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126), связывание сначала инициирует пролиферацию Т-клеток (посредством CD28), а затем ингибирует ее (посредством начинающейся экспрессии CTLA-4), тем самым ослабляя эффект, если в пролиферации более нет необходимости.229:307-321). Binding of B7.1 or B7.2 to CD28 stimulates T cell activation; binding of B7.1 or B7.2 to CTLA-4 inhibits such activation (Dong, C. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R. J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548 ). CD28 is constitutively expressed on the surface of T cells (Gross, J., et al. (1992) Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse, J. Immunol. 149:380-388), while CTLA-4 expression is rapidly increases after T cell activation (Linsley, P. et al. (1996) Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement, Immunity 4:535-543). Because CTLA-4 is a higher affinity receptor (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126), binding first initiates T cell proliferation (via CD28) and then inhibits it (through incipient expression of CTLA-4), thereby weakening the effect if proliferation is no longer needed.

Дополнительные исследования в лигандах рецептора CD28 привели к выявлению и описанию характеристик ряда родственных молекул В7 (суперсемейство В7) (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) The В7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells, Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance, Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366372; Wang, S. et al. (2004) Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses, Microbes Infect. 6:759-766). В настоящее время существует несколько известных членов семейства: В7.1 (CD80), В7.2 (CD86), индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), лиганд программируемой смерти 1 (PD-L1; В7-Н1), лиганд программируемой смерти 2 (PD-L2; B7-DC), В7-НЗ, В7-н4 и В7-Н6 (Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, Immunogenetics 64(8):571-90).Additional research on CD28 receptor ligands has led to the identification and characterization of a number of related B7 molecules (the B7 superfamily) (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke Korman, A. J. et al (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy , Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D. B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al (2008) The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance, Curr Opin Organ Transplant 13:366372 Wang, S et al (2004) Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Ne negative Regulation Of T Lymphocyte Responses, Microbes Infect. 6:759-766). There are currently several known members of the family: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), inducible costimulatory ligand (ICOS-L), programmed death ligand 1 (PD-L1; B7-H1), programmed death ligand 2 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 and B7-H6 (Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al.(2012) Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, Immunogenetics 64(8):571- 90).

II. Ген активации лимфоцитов 3 (LAG-3)II. Lymphocyte activation gene 3 (LAG-3)

Ген активации лимфоцитов 3 кодирует белок рецептора клеточной поверхности, который называют LAG-3 или CD223 (Triebel, F. et al. (1990) LAG-3, A Novel Lymphocyte Activation Gene Closely Related To CD4, J. Exp. Med. 171 (5): 1393-1405). LAG-3 экспрессируется у активированных CD4⁺ и CD8⁺ Тклеток и NK-клеток и конститутивно экспрессируются у плазмоцитоидных дендритных клеток. LAG-3 не экспрессируется у В клеток, моноцитов или клеток любого другого протестированного типа (Workman, CJ. et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 18851891).Lymphocyte activation gene 3 encodes a cell surface receptor protein termed LAG-3 or CD223 (Triebel, F. et al. (1990) LAG-3, A Novel Lymphocyte Activation Gene Closely Related To CD4, J. Exp. Med. 171 ( 5): 1393-1405). LAG-3 is expressed in activated CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T cells and NK cells and is constitutively expressed in plasmacytoid dendritic cells. LAG-3 is not expressed in B cells, monocytes, or any other cell type tested (Workman, CJ. et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 18851891).

Было обнаружено, что LAG-3 является близкородственным Т-клеточному корецептору CD4 (Triebel, F. et al. (1990) LAG-3, A Novel Lymphocyte Activation Gene Closely Related To CD4, J. Exp. Med. 171(5): 1393-1405; Grosso, J.F. et al. (2009) Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells, J. Immunol. 182(11):6659-6669; Huang, C.T. et al. (2004) Role Of LAG-3 In Regulatory T-Cells, Immunity 21:503-513; Workman, C.J. et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 1885-1891). Как и CD4, LAG-3 также связывается с молекулами МНС II класса, но делает это со значительно более высокой аффинностью (Workman, C.J. et al. (2002) Phenotypic Analysis Of The Murine CD4-Related Glycoprotein, Cd223 (LAG-3), Eur. J. Immunol. 32:2255-2263; Huard, B. et al. (1995) CD4/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Analyzed With CD4-And Lymphocyte Activation Gene-3 (LAG-3)-Ig Fusion Proteins, Eur. J. Immunol. 25:2718-2721; Huard, B. et al. (1994) Cellular Expression And Tissue Distribution Of The Human LAG-3Encoded Protein, AnMHC Class II Ligand, Immunogenetics 39:213-217).LAG-3 has been found to be closely related to the T-cell co-receptor CD4 (Triebel, F. et al. (1990) LAG-3, A Novel Lymphocyte Activation Gene Closely Related To CD4, J. Exp. Med. 171(5): 1393-1405 Grosso, J. F. et al (2009) Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells, J. Immunol 182(11):6659-6669 Huang, C. T. et al (2004) Role Of LAG-3 In Regulatory T-Cells, Immunity 21:503-513 Workman, C. J. et al (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol 182(4): 1885-1891). Like CD4, LAG-3 also binds to MHC class II molecules, but does so with significantly higher affinity (Workman, C.J. et al. (2002) Phenotypic Analysis Of The Murine CD4-Related Glycoprotein, Cd223 (LAG-3), Eur J. Immunol 32:2255-2263 Huard, B. et al (1995) CD4/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Analyzed With CD4-And Lymphocyte Activation Gene-3 (LAG-3)-Ig Fusion Proteins, Eur J. Immunol 25:2718-2721 Huard, B. et al (1994) Cellular Expression And Tissue Distribution Of The Human LAG-3Encoded Protein, AnMHC Class II Ligand, Immunogenetics 39:213-217).

Исследования показали, что LAG-3 играет важную роль в отрицательной регуляции Т-клеточной пролиферации, функции и гомеостазе (Workman C.J. et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 1885-1891; Workman C.J. et al. (2002) Cutting Edge: Molecular Analysis Of The Negative Regulatory Function Of Lymphocyte Activation Gene-3, J. Immunol. 169:5392-5395; Workman, C.J. et al. (2003) The CD4-Related Molecule, LAG-3 (CD223), Regulates The Expansion Of Activated T-Cells, Eur. J. Immunol. 33:970-979; Workman, C.J. (2005) Negative Regulation Of T-Cell Homeostasis By Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223), J. Immunol. 174:688-695; Hannier, S. et al. (1998) CD3/TCR Complex-Associated Lymphocyte Activation Gene-3 Molecules Inhibit CD3/TCR Signaling, J. Immunol. 161:4058-4065; Huard, B. et al. (1994) Lymphocyte-Activation Gene 3/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Modulates The Antigenic Response Of CD4⁺ T Lymphocytes, Eur. J. Immunol. 24:32163221).Studies have shown that LAG-3 plays an important role in the downregulation of T cell proliferation, function and homeostasis (Workman CJ et al. (2009) LAG-3 Regulates Plasmacytoid Dendritic Cell Homeostasis, J. Immunol. 182(4): 1885- 1891 Workman CJ et al (2002) Cutting Edge: Molecular Analysis Of The Negative Regulatory Function Of Lymphocyte Activation Gene-3, J Immunol 169:5392-5395 Workman CJ et al (2003) The CD4-Related Molecule, LAG-3 (CD223), Regulates The Expansion Of Activated T-Cells, Eur J Immunol 33:970-979 Workman, CJ (2005) Negative Regulation Of T-Cell Homeostasis By Lymphocyte Activation Gene-3 ( CD223, J. Immunol. 174:688-695 Hannier, S. et al. (1998) CD3/TCR Complex-Associated Lymphocyte Activation Gene-3 Molecules Inhibit CD3/TCR Signaling, J. Immunol. 161:4058-4065 Huard, B. et al (1994) Lymphocyte-Activation Gene 3/Major Histocompatibility Complex Class II Interaction Modulates The Antigenic Response Of CD4 ⁺ T Lymphocytes, Eur J. Immunol 24:32163221 ).

Исследования показали, что ингибирование функции LAG-3 посредством блокады антителами мо- 2 041483 жет обращать LAG-3-опосредованное ингибирование иммунной системы и частично восстанавливать эффекторную функцию (Grosso, J.F. et al. (2009) Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells, J. Immunol. 182(11):6659-6669; Grosso, J.F. et al. (2007) LAG-3 Regulates CD8⁺ T-Cell Accumulation And Effector Function During Self And Tumor Tolerance, J. Clin. Invest. 117:3383-3392). Было обнаружено, что LAG-3 отрицательно регулирует размножение Тклеток посредством ингибирования TCR-индуцируемых кальциевых потоков и контролирует размер пула Т-клеток памяти (Matsuzaki, J. et al. (2010) Tumor-Infiltrating NY-ESO-1-Specific CD8⁺ T-Cells Are Negatively Regulated By LAGS and PD-1 In Human Ovarian Cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107(17):7875-7880; Workman C.J., et al. (2004) Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223) Regulates The Size Of The Expanding T-Cell Population Following Antigen Activation in vivo, J. Immunol. 172:5450-5455).Studies have shown that inhibition of LAG-3 function via antibody blockade can reverse LAG-3-mediated inhibition of the immune system and partially restore effector function (Grosso, JF et al. (2009) Functionally Distinct LAG-3 and PD-1 Subsets on Activated and Chronically Stimulated CD8 T-Cells, J Immunol 182(11):6659-6669 Grosso, JF et al (2007) LAG-3 Regulates CD8 ⁺ T-Cell Accumulation And Effector Function During Self And Tumor Tolerance, J. Clin. Invest. 117:3383-3392). LAG-3 has been found to negatively regulate T cell proliferation through inhibition of TCR-induced calcium fluxes and to control the size of the memory T cell pool (Matsuzaki, J. et al. (2010) Tumor-Infiltrating NY-ESO-1-Specific CD8 ⁺ T Cells Are Negatively Regulated By LAGS and PD-1 In Human Ovarian Cancer, Proc Natl Acad Sci (USA) 107(17):7875-7880 Workman CJ, et al (2004) Lymphocyte Activation Gene-3 (CD223) Regulates The Size Of The Expanding T-Cell Population Following Antigen Activation in vivo, J Immunol 172:5450-5455).

Тем не менее, несмотря на все такие предыдущие достижения, сохраняется потребность в усовершенствованных композициях, способных сильнее заставлять иммунную систему организма атаковать клетки злокачественной опухоли или инфицированные патогеном клетки, особенно в более низких терапевтических концентрациях. Даже несмотря на то, что адаптивная иммунная система может быть сильным защитным механизмом от злокачественной опухоли и заболевания, она зачастую подавляется иммуносупрессорными механизмами в опухолевом микроокружении, таком как экспрессия LAG-3. Кроме того, коингибирующие молекулы, экспрессируемые опухолевыми клетками, иммунными клетками и стромальными клетками в опухолевой среде, могут доминантно ослаблять Т-клеточные ответы на клетки злокачественной опухоли. Таким образом, сохраняется потребность в высокоактивных связывающих LAG-3 молекулах. Так, в частности, существует потребность в связывающих LAG-3 молекулах, которые имеют требуемый профиль кинетики связывания, связывают различные эпитопы LAG-3 и/или характеризуются активностью в отношении отдельного агента, что может повысить терапевтическое значение для пациентов, страдающих от злокачественной опухоли или других заболеваний или состояний. Настоящее изобретение относится к решению этих и других задач.However, despite all such previous advances, there remains a need for improved compositions capable of more strongly causing the body's immune system to attack cancer cells or pathogen-infected cells, especially at lower therapeutic concentrations. Even though the adaptive immune system can be a strong defense mechanism against cancer and disease, it is often suppressed by immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment, such as LAG-3 expression. In addition, co-inhibitory molecules expressed by tumor cells, immune cells, and stromal cells in the tumor environment can dominantly attenuate T cell responses to cancer cells. Thus, there remains a need for highly active LAG-3 binding molecules. Thus, in particular, there is a need for LAG-3 binding molecules that have the desired binding kinetic profile, bind various LAG-3 epitopes, and/or have activity against a single agent, which can increase therapeutic value for patients suffering from cancer or other diseases or conditions. The present invention addresses these and other problems.

Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief summary of the present invention

Если подробно, настоящее изобретение относится к связывающей LAG-3 молекуле, которая способна связываться как с LAG-3 человека, так и с LAG-3 яванского макака, причем указанная молекула содержит три домена CDR тяжелой цепи: CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3, и три домена CDR легкой цепи: CDRL1, CDRL2 и CDRL3, причем:In more detail, the present invention provides a LAG-3 binding molecule that is capable of binding to both human LAG-3 and cynomolgus monkey LAG-3, said molecule containing three heavy chain CDR domains: CDR _H 1 , CDR _H 2 and CDR _H 3, and three light chain CDR domains: CDRL1, CDRL2 and CDRL3, moreover:

(A) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 или (B) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из hLAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из hLAG-3 mAb 1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15; или (C) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 2 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 2 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 и(A) (1) CDRH1 domain, CDRH2 domain and CDRH3 domain are heavy chain CDRs from LAG-3 mAb 1 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 and ( 2) CDRL1 domain, CDRL2 domain and CDRL3 domain are light chain CDRs from LAG-3 mAb 1 and respectively have the amino acid sequences: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 or (B) (1 ) CDR _H 1 domain, CDR _H 2 domain and CDR _H 3 domain are heavy chain CDRs from hLAG-3 mAb 1 and respectively have the amino acid sequences: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 and (2) CDRL1 domain, CDRL2 domain and CDRL3 domain are light chain CDRs from hLAG-3 mAb 1 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15; or (C) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are heavy chain CDRs from LAG-3 mAb 2 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, and SEQ ID NO: 33; and (2) CDRL1 domain, CDRL2 domain and CDRL3 domain are light chain CDRs from LAG-3 mAb 2 and respectively have the amino acid sequences: SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 and

- 3 041483- 3 041483

SEQ ID NO: 38; или (D) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 3 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 3 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48; или (E) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 4 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 4 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58; или (F) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 5 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 5 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68; или (G) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 mAb 6 VH1 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из LAG-3 mAb 6 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78; или (H) (1) домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 представляют собой CDR тяжелой цепи из LAG-3 hAb 6 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой CDR легкой цепи из hLAG-3 hAb 6 и соответственно имеют аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.SEQ ID NO: 38; or (D) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are heavy chain CDRs from LAG-3 mAb 3 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, and SEQ ID NO: 43; and (2) CDRL1 domain, CDRL2 domain and CDRL3 domain are light chain CDRs from LAG-3 mAb 3 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48; or (E) (1) CDR _H 1 domain, CDR _H 2 domain and CDR _H 3 domain are heavy chain CDRs from LAG-3 mAb 4 and respectively have the amino acid sequences of: SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53; and (2) CDRL1 domain, CDRL2 domain and CDRL3 domain are light chain CDRs from LAG-3 mAb 4 and respectively have the amino acid sequences: SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 58; or (F) (1) CDRH1 domain, CDRH2 domain and CDRH3 domain are heavy chain CDRs from LAG-3 mAb 5 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 63; and (2) CDRL1 domain, CDRL2 domain and CDRL3 domain are light chain CDRs from LAG-3 mAb 5 and respectively have the amino acid sequences: SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 68; or (G) (1) CDR _H 1 domain, CDR _H 2 domain and CDR _H 3 domain are heavy chain CDRs from LAG-3 mAb 6 VH1 and respectively have the amino acid sequences: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO: 73; and (2) CDRL1 domain, CDRL2 domain and CDRL3 domain are light chain CDRs from LAG-3 mAb 6 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78; or (H) (1) CDR _H 1 domain, CDR _H 2 domain and CDR _H 3 domain are heavy chain CDRs from LAG-3 hAb 6 and respectively have the amino acid sequences: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO: 73; and (2) the CDRL1 domain, CDRL2 domain, and CDRL3 domain are light chain CDRs from hLAG-3 hAb 6 and respectively have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 78.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49 или SEQ ID NO: 59.The present invention further relates to embodiments of such LAG-3 binding molecules wherein the heavy chain variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, or SEQ ID NO: 59.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54 или SEQ ID NO: 64.The present invention further provides embodiments of such LAG-3 binding molecules wherein the light chain variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, or SEQ ID NO :64.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 79 или SEQ ID NO: 80.The present invention further relates to embodiments of such LAG-3 binding molecules wherein the heavy chain variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 79, or SEQ ID NO: 80.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где вариабельный домен легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 85.The present invention further relates to embodiments of such LAG-3 binding molecules, wherein the light chain variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 83 or SEQ ID NO: 85.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления всех таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула представляет собой антитело и особенно где молекула представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.The present invention further relates to embodiments of all such LAG-3 binding molecules wherein the molecule is an antibody, and especially where the molecule is a chimeric antibody or a humanized antibody.

Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления, где связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическую связывающую молекулу, способную одновременно связываться с LAG-3 человека и со вторым эпитопом, и, в частности, относится к варианту осуществления, где второй эпитоп представляет собой эпитоп молекулы, участвующей в регуляцию иммунной контрольной точки, присутствующей на поверхности иммунной клетки (особенно где второй эпитоп представляет собой эпитоп В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA, и, наиболее конкретно, где второй эпитоп представляет собой эпитоп CD137, ОХ40, PD-1, TIGIT или TIM-3).The present invention further relates to an embodiment wherein the LAG-3 binding molecule is a bispecific binding molecule capable of simultaneously binding to human LAG-3 and a second epitope, and particularly relates to an embodiment wherein the second epitope is an epitope of the molecule involved in the regulation of an immune checkpoint present on the surface of an immune cell (especially where the second epitope is a B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226 epitope , CTLA-4, galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1 , PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3, or VISTA, and most specifically, where the second epitope is a CD137, OX40, PD-1, TIGIT, or TIM-3 epitope).

Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула представляет собой диатело и особенно где диатело представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит два или три, или четыре, или пять или более пяти полипептидных цепей. Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул антител, где молекула представляет собой трехвалентную связывающую молекулу, причем трехвалентная связывающая молекула представляет собой ковалентно связанныйThe present invention further relates to an embodiment of such LAG-3 binding molecules wherein the molecule is a diabody and especially where the diabody is a covalently linked complex that contains two or three or four or five or more than five polypeptide chains. The present invention further relates to an embodiment of such LAG-3 binding antibody molecules, wherein the molecule is a trivalent binding molecule, wherein the trivalent binding molecule is a covalently bound

- 4 041483 комплекс, который содержит три, четыре, пять или более полипептидных цепей. Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула включает Fc-участок. Настоящее изобретение дополнительно относится к варианту осуществления таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула содержит альбумин-связывающий домен и особенно деиммунизированный альбумин-связывающий домен.- 4 041483 a complex that contains three, four, five or more polypeptide chains. The present invention further relates to an embodiment of such LAG-3 binding molecules, wherein the molecule comprises an Fc region. The present invention further relates to an embodiment of such LAG-3 binding molecules, wherein the molecule contains an albumin binding domain and especially a deimmunized albumin binding domain.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления всех таких связывающих LAG-3 молекул, где молекула включает Fc-участок (кристаллизующийся фрагмент), и где Fcучасток представляет собой вариантный Fc-участок, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность вариантного Fc-участка в отношении FcyR и/или увеличивают период полужизни в сыворотке, и, более конкретнее, где модификации содержат по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из:The present invention further relates to embodiments of all such LAG-3 binding molecules, wherein the molecule comprises an Fc region (crystallizable fragment), and wherein the Fc region is a variant Fc region that contains one or more amino acid modifications that reduce the affinity of the variant Fc region. an FcyR site and/or increase serum half-life, and more specifically, wherein the modifications comprise at least one amino acid substitution selected from the group consisting of:

(1) L234A;(1) L234A;

(2) L235A;(2) L235A;

(3) L234A и L235A;(3) L234A and L235A;

(4) M252Y, M252Y и S254T;(4) M252Y, M252Y and S254T;

(5) M252Y и Т256Е;(5) M252Y and T256E;

(6) M252Y, S254T и Т256Е или (7) К288В и H435K;(6) M252Y, S254T and T256E or (7) K288B and H435K;

причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.moreover, the specified numbering corresponds to the EU numbering system according to Kabat.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления, где любые описанные выше связывающие LAG-3 молекулы применяются для стимуляции Т-клеточного иммунного ответа. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления, где любая из описанных выше связывающих LAG-3 молекул применяется при лечении заболевания или состояния, ассоциированного с подавленной иммунной системой, особенно злокачественной опухоли или инфекции.The present invention further relates to embodiments wherein any of the LAG-3 binding molecules described above are used to stimulate a T cell immune response. The present invention further relates to embodiments wherein any of the LAG-3 binding molecules described above is used in the treatment of a disease or condition associated with a suppressed immune system, especially cancer or infection.

Настоящее изобретение, в частности, относится к такому применению при лечении, или диагностике, или прогнозировании развития злокачественной опухоли, причем злокачественная опухоль характеризуется присутствием клетки злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечника, ассоциированной со СПИДом злокачественной опухоли, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли костей, злокачественной опухоли головного и спинного мозга, метатастатической опухоли головного мозга, злокачественной опухоли молочной железы, опухолей каротидного тельца, цервикальной злокачественной опухоли, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светло-клеточной карциномы, злокачественной опухоли толстой кишки, колоректальной злокачественной опухоли, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной слизеподобной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, злокачественной опухоли желчного пузыря или желчевыводящих путей, злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, злокачественной опухоли головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, опухоли островков поджелудочной железы, саркомы Капоши, злокачественной опухоли почки, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, злокачественной опухоли печени, лимфомы, злокачественной опухоли легкого, гранулобластомы, меланомы, менингиомы, множественных эндокринных неоплазий, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидных желез, детской злокачественной опухоли, опухоли оболочки периферического нерва, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, злокачественной опухоли предстательной железы, увеальной меланомы заднего отдела глаза, редкого нарушения со стороны кроветворной системы, почечной метастатической злокачественной опухоли, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, злокачественной опухоли кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли желудка, синовиальной саркомы, злокачественной опухоли яичка, тимуснои карциномы, тимомы, метастатической злокачественной опухоли щитовидной железы и злокачественной опухоли матки.The present invention particularly relates to such use in the treatment or diagnosis or prognosis of cancer, wherein the cancer is characterized by the presence of a cancer cell selected from the group consisting of: adrenal tumor, AIDS-associated cancer, alveolar sarcoma soft tissue, astrocytic tumor, bladder cancer, bone cancer, brain and spinal cord cancer, metastatic brain tumor, breast cancer, carotid body tumors, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobic renal cell carcinoma, clear cell carcinoma, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous benign fibrous histiocytoma, desmoplastic small round cell tumor, ependymoma, Ewing tumor, extraskeletal mucoid chondrosarcoma, bone fibrogenesis imperfecta, fibrous bone dysplasia, gallbladder or biliary tract cancer, gastrointestinal cancer, gestational trophoblastic disease, embryonic cell tumor, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic islet tumor, sarcoma Kaposi, kidney cancer, leukemia, lipoma/benign lipomatous tumor, liposarcoma/lipomatous tumor, liver cancer, lymphoma, lung cancer, granuloblastoma, melanoma, meningioma, multiple endocrine neoplasias, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblastoma, neuroendocrine tumors , malignant tumor of the ovary, malignant tumor of the pancreas, papillary thyroid carcinoma, tumor of the parathyroid glands, childhood malignant tumor, peripheral membrane tumor nerve, pheochromocytoma, pituitary tumor, prostate cancer, uveal melanoma of the posterior eye, rare hematopoietic disorder, renal metastatic malignancy, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell malignancy, gastric cancer, synovial sarcoma, testicular cancer, thymic carcinoma, thymoma, metastatic thyroid cancer, and uterine cancer.

Настоящее изобретение, в частности, относится к такому применению при лечении, или диагностике, или прогнозировании развития злокачественной опухоли, причем злокачественная опухоль представляет собой колоректальную злокачественную опухоль, гепатоклеточную карциному, глиому, злокачественную опухоль почки, злокачественную опухоль молочной железы, множественную миелому, злокачественную опухоль мочевого пузыря, нейробластому; саркому, неходжкинскую лимфому, немелкоклеточную злокачественную опухоль легкого, злокачественную опухоль яичника, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль прямой кишки, острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), острый В-лимфобластный лейкоз (B-ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз (HCL), новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), неходжкинские лимфомы (NHL), включая мантийноклеточнуюThe present invention particularly relates to such use in treating or diagnosing or predicting the development of a cancer, wherein the cancer is colorectal cancer, hepatocellular carcinoma, glioma, kidney cancer, breast cancer, multiple myeloma, cancer bladder, neuroblastoma; sarcoma, non-Hodgkin's lymphoma, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, rectal cancer, acute myeloid leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia (CML), acute B-lymphoblastic leukemia (B-ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), hairy cell leukemia (HCL), blast plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN), non-Hodgkin's lymphomas (NHL), including mantle cell

- 5 041483 лимфому (MCL) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), ходжкинскую лимфому, системный мастоцитоз или лимфому Беркитта.- 5 041483 lymphoma (MCL) and small cell lymphocytic lymphoma (SLL), Hodgkin's lymphoma, systemic mastocytosis or Burkitt's lymphoma.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления, в которых любая из вышеописанных связывающих LAG-3 молекул помечена детектируемой меткой и применяется в детекции LAG-3.The present invention further relates to embodiments in which any of the above-described LAG-3 binding molecules are labeled with a detectable label and used in LAG-3 detection.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

На фиг. 1 представлено схематическое изображение типичного ковалентно связанного диатела с двумя эпитопсвязывающими сайтами, состоящей из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет способствующий образованию гетеродимера домен с Е-спиралью или K-спиралью. Цистеиновый остаток может присутствовать в линкере и/или в способствующем образованию гетеродимера домене, как показано на фиг. 3В. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.In FIG. 1 is a schematic representation of a typical covalently linked diabody with two epitope binding sites, consisting of two polypeptide chains, each having an E-helix or K-helix heterodimer promoting domain. The cysteine residue may be present in the linker and/or in the heterodimer-promoting domain, as shown in FIG. 3B. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown with the same shading or shading.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение типичной ковалентно связанной молекулы диатела с двумя эпитопсвязывающими сайтами, состоящей из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет домен СН2 и СН3, так чтобы ассоциированные цепи образовывали весь Fc-участок или его часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.In FIG. 2 is a schematic representation of a typical covalently linked diabody molecule with two epitope binding sites, consisting of two polypeptide chains, each having a CH2 and CH3 domain, such that the associated chains form all or part of an Fc region. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown with the same shading or shading.

На фиг. 3А-3С представлены схематически изображения, на которых показаны типичные четырехвалентные диатела с четырьмя эпитопсвязывающими сайтами, состоящие из двух пар полипептидных цепей (т.е. всего четырех полипептидных цепей). Один полипептид каждой пары обладает доменом СН2 и СН3, так чтобы связанные цепи образовывали весь Fc-участок или его часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой. Две пары полипептидных цепей могут быть одинаковыми. В соответствии с такими вариантами осуществления, если домены VL и VH распознают различные эпитопы (как показано на фиг. 3А-3С), полученная в результате молекула обладает четырьмя эпитоп-связывающими сайтами и является биспецифической и двухвалентной по отношению к каждому связываемому эпитопу. В соответствии с такими вариантами осуществления, если домены VL и VH распознают один и тот же эпитоп (например, на обеих цепях задействованы одинаковые CDR домена VL и одинаковые CDR домена VH), полученная в результате молекула обладает четырьмя эпитопсвязывающими сайтами и является моноспецифической и четырехвалентной по отношению к одному эпитопу. Альтернативно, две пары полипептидов могут различаться. В соответствии с такими вариантами осуществления, если домены VL и VH каждой пары полипептидов распознают различные эпитопы (как показано на фиг. 3С), полученная в результате молекула обладает четырьмя эпитопсвязывающими сайтами и является тетраспецифической и одновалентной по отношению к каждому связываемому эпитопу. На фиг. 3А показано Fc-диатело, которое содержит пептидный способствующий образованию гетеродимера домен, содержащий цистеиновый остаток. На фиг. 3В показано содержащее Fc-участок диатело, которое содержит Fc-участок и способствующие образованию гетеродимера домены с Е-спиралью и K-спиралью, содержащие цистеиновый остаток и линкер (с необязательным цистеиновым остатком). На фиг. 3С показано содержащее Fc-участок диатело, которое содержит домены СН1 и CL антитела.In FIG. 3A-3C are schematic representations showing exemplary tetravalent diabodies with four epitope-binding sites, consisting of two pairs of polypeptide chains (ie, four polypeptide chains in total). One polypeptide of each pair has a CH2 and CH3 domain such that the linked strands form all or part of the Fc region. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown with the same shading or shading. The two pairs of polypeptide chains may be the same. According to such embodiments, if the VL and VH domains recognize different epitopes (as shown in Figures 3A-3C), the resulting molecule has four epitope binding sites and is bispecific and bivalent for each epitope that binds. According to such embodiments, if the VL and VH domains recognize the same epitope (e.g., the same VL domain CDRs and the same VH domain CDRs are involved on both strands), the resulting molecule has four epitope-binding sites and is monospecific and tetravalent in relative to one epitope. Alternatively, the two pairs of polypeptides may be different. According to such embodiments, if the VL and VH domains of each polypeptide pair recognize different epitopes (as shown in Figure 3C), the resulting molecule has four epitope-binding sites and is tetraspecific and univalent for each epitope that binds. In FIG. 3A shows an Fc diabody that contains a peptide heterodimer-promoting domain containing a cysteine residue. In FIG. 3B shows an Fc region-containing diabody that contains an Fc region and E-helix and K-helix heterodimer promoting domains containing a cysteine residue and a linker (with an optional cysteine residue). In FIG. 3C shows an Fc region-containing diabody that contains the CH1 and CL domains of an antibody.

На фиг. 4А и 4В представлены схематические изображения типичной ковалентно связанной молекулы диатела, имеющей два эпитоп-связывающих сайта, состоящих из трех полипептидных цепей. Две полипептидные цепи имеют домен СН2 и СН3, так чтобы связанные цепи образовывали весь Fc-участок или его часть. Полипептидные цепи, содержащие домен VL и VH, дополнительно содержат способствующий образованию гетеродимера домен. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.In FIG. 4A and 4B are schematic representations of a typical covalently linked diabody molecule having two epitope binding sites consisting of three polypeptide chains. The two polypeptide chains have a CH2 and a CH3 domain so that the linked chains form all or part of the Fc region. Polypeptide chains containing a VL and VH domain additionally contain a heterodimer-promoting domain. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown with the same shading or shading.

На фиг. 5 представлены схематические изображения типичной ковалентно связанной молекулы диатела, имеющей четыре эпитопсвязывающих сайта, состоящих из пяти полипептидных цепей. Две полипептидные цепи имеют домен СН2 и СН3, так чтобы связанные цепи образовывали Fc-участок, который представляет собой весь Fc-участок или его часть. Полипептидные цепи, содержащие соединенные домены VL и VH, дополнительно содержат способствующий образованию гетеродимера домен. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.In FIG. 5 is a schematic representation of a typical covalently linked diabody molecule having four epitope binding sites consisting of five polypeptide chains. The two polypeptide chains have a CH2 and a CH3 domain such that the linked chains form an Fc region, which is all or part of the Fc region. Polypeptide chains containing linked VL and VH domains further comprise a heterodimer-forming domain. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown with the same shading or shading.

На фиг. 6A-6F представлены схематические изображения типичных Fc-участков, содержащих трехвалентные связывающие молекулы, имеющие три эпитопсвязывающих сайта. На фиг. 6А и 6В соответственно схематично проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена по типу диател и связывающий домен по типу Fab, имеющих различные ориентации доменов, в которых связывающие домены по типу диатела являются N-концевыми или Сконцевыми к Fc-участку. Молекулы на фиг. 6А и 6В содержат четыре цепи. На фиг. 6С и 6D соответственно схематично проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два N-концевых к Fc-участку связывающих домена по типу диатела и связывающий домен Fab-типа, в котором легкая цепь и тяжелая цепь соединены с помощью полипептидного линкерного спейсера, или связывающий домен scFv-типа. Для трехвалентных связывающих молекул на фиг. 6Е и 6F соответственно схематически проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два СIn FIG. 6A-6F are schematic representations of exemplary Fc regions containing trivalent binding molecules having three epitope binding sites. In FIG. 6A and 6B respectively schematically illustrate the domains of trivalent binding molecules containing two diabody binding domains and a Fab binding domain having various domain orientations in which the diabody binding domains are N-terminal or C-terminal to the Fc region. The molecules in Fig. 6A and 6B contain four chains. In FIG. 6C and 6D, respectively, schematically illustrate the domains of trivalent binding molecules containing two N-terminal diabody-type Fc binding domains and a Fab-type binding domain in which the light chain and heavy chain are joined by a polypeptide linker spacer, or the scFv binding domain. -type. For the trivalent binding molecules in FIG. 6E and 6F, respectively, schematically illustrate the domains of trivalent binding molecules containing two C

- 6 041483 концевых к Fc-участку связывающих домена по типу диатела и присоединенный связывающий домен Fab-типа или связывающий домен scFv-типа, в которых находятся связывающие домены по типу диатела. Трехвалентные связывающие молекулы на фиг. 6C-6F содержат три цепи. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны одинаковой штриховкой или заливкой.- 6 041483 Fc-terminal diabody-type binding domains and an attached Fab-type binding domain or scFv-type binding domain in which diabody-type binding domains are located. The trivalent binding molecules in FIG. 6C-6F contain three chains. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown with the same shading or shading.

На фиг. 7А-7С показаны характеристики связывания LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 с LAG-3 яванского макака. Кривые связывания Biacore для hLAG-3 mAb 6 (1.1) (фиг. 7А), hLAG-3 mAb 1 (1.4) (фиг. 7В) и LAG-3 mAb А (фиг. 7С), демонстрирующие, что hLAG-3 mAb 6 (1.1) характеризуется лучшим связыванием с LAG-3 яванского макака (RU - единицы ответа).In FIG. 7A-7C show the binding characteristics of LAG-3 mAb 1 and LAG-3 mAb 6 to cynomolgus monkey LAG-3. Biacore binding curves for hLAG-3 mAb 6 (1.1) (FIG. 7A), hLAG-3 mAb 1 (1.4) (FIG. 7B), and LAG-3 mAb A (FIG. 7C), demonstrating that hLAG-3 mAb 6 (1.1) is characterized by better binding to cynomolgus monkey LAG-3 (RU - response units).

На фиг. 8A-8D показано, что LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 связывают эпитоп, отличный от того, который связывается эталонным антителом LAG 3 mAb А. Профили связывания меченых LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-3 mAb А в отсутствие конкурентного антитела (фиг. 8А), в присутствии избыточного LAG-3 mAb 1 (фиг. 8В), избыточного LAG-3 mAb 6 (фиг. 8С) или LAG-3 mAb А (фиг. 8D) (RU единицы ответа).In FIG. 8A-8D show that LAG-3 mAb 1 and LAG-3 mAb 6 bind a different epitope than that bound by reference LAG 3 mAb A. Binding profiles of labeled LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 and LAG- 3 mAb A in the absence of competitive antibody (FIG. 8A), in the presence of excess LAG-3 mAb 1 (FIG. 8B), excess LAG-3 mAb 6 (FIG. 8C), or LAG-3 mAb A (FIG. 8D) ( RU response units).

На фиг. 9А-9В показано, что выделенные антитела ингибируют связывание растворимого LAG-3 человека (shLAG-3) с МНС II класса, по результатам определения в анализе ИФА. На фиг. 9А показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 и LAG-3 mAb 5. На фиг. 9В показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb А, гуманизированного hLAG-3 1 (1.4) и hLAG-3 6 (1.1) (RLU - относительные единицы люминесценции).In FIG. 9A-9B show that the isolated antibodies inhibit the binding of soluble human LAG-3 (shLAG-3) to MHC class II as determined by ELISA. In FIG. 9A shows inhibition curves for LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, and LAG-3 mAb 5. FIG. 9B shows inhibition curves for LAG-3 mAb A, humanized hLAG-3 1 (1.4) and hLAG-3 6 (1.1) (RLU = Relative Luminescence Units).

На фиг. 10А-10С показано, что выделенные антитела ингибируют связывание shLAG-3 с поверхностью клеток Дауди, экспрессирующих МНС II класса. На фиг. 10А показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и эталонного антитела LAG-3 mAb А. На фиг. 10В показаны кривые ингибирования для LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-3 mAb А. На фиг. 10С показаны кривые ингибирования LAG-3 mAb 1 и гуманизированного hLAG-3 1 (1.4), hLAG3 1 (1.2), hLAG-3 1 (2.2), hLAG-3 1 (1.1). Каждая цифра представляет собой отдельный эксперимент; MFI - средняя интенсивность флуоресценции.In FIG. 10A-10C show that isolated antibodies inhibit shLAG-3 binding to the surface of Daudi cells expressing MHC class II. In FIG. 10A shows inhibition curves for LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, and reference antibody LAG-3 mAb A. FIG. 10B shows inhibition curves for LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6, and LAG-3 mAb A. FIG. 10C shows inhibition curves of LAG-3 mAb 1 and humanized hLAG-3 1 (1.4), hLAG3 1 (1.2), hLAG-3 1 (2.2), hLAG-3 1 (1.1). Each figure represents a separate experiment; MFI - average fluorescence intensity.

На фиг. 11А-11С показано, что экспрессия LAG-3 повышается в простимулированных CD4+ Тклетках. Проточный цитометрический анализ экспрессии LAG-3 на непростимулированных CD4+ Тклетках (фиг. 11А) и простимулированных CD3/CD28 гранулами CD4+ Т-клетках от двух различных доноров (фиг. 11В и 11С) соответственно на 11-е и 14-е сутки. Все клетки были совместно окрашены антителом к CD4.In FIG. 11A-11C show that LAG-3 expression is upregulated in stimulated CD4+ T cells. Flow cytometric analysis of LAG-3 expression on unstimulated CD4+ T cells (FIG. 11A) and CD3/CD28 bead stimulated CD4+ T cells from two different donors (FIGS. 11B and 11C) on days 11 and 14, respectively. All cells were costained with anti-CD4 antibody.

На фиг. 12 (секции A-F) показано, что выделенные антитела к LAG-3 связываются с простимулированными, но не с непростимулированными Т-клетками. Проточный цитометрический анализ простимулированных CD3/CD28 CD4+ Т-клеток (секции А-С) и непростимулированных CD4+ Т-клеток (секции DF), помеченных с помощью LAG-3 mAb 1 (секции А и D), LAG-3 mAb 2 (секции В и Е) или LAG-3 mAb 3 (секции С и F). Все клетки были совместно окрашены антителом к CD4.In FIG. 12 (panels A-F) shows that isolated anti-LAG-3 antibodies bind to stimulated but not unstimulated T cells. Flow cytometric analysis of stimulated CD3/CD28 CD4+ T cells (sections A-C) and unstimulated CD4+ T cells (sections DF) labeled with LAG-3 mAb 1 (sections A and D), LAG-3 mAb 2 (sections B and E) or LAG-3 mAb 3 (sections C and F). All cells were costained with anti-CD4 antibody.

На фиг. 13 (секции A-D) показано, что выделенные антитела к LAG-3 связываются с простимулированными, но не с непростимулированными Т-клетками.In FIG. 13 (panels A-D) shows that isolated anti-LAG-3 antibodies bind to stimulated but not unstimulated T cells.

Проточный цитометрический анализ простимулированных CD3/CD28 CD4+ Т-клеток (секции А-В) и непростимулированных CD4+ Т-клеток (секции C-D), помеченных с помощью LAG-3 mAb 4 (секции А и С) или LAG-3 mAb 5 (секции В и D). Все клетки были совместно окрашены антителом к CD4.Flow cytometric analysis of stimulated CD3/CD28 CD4+ T cells (sections A-B) and unstimulated CD4+ T cells (sections C-D) labeled with LAG-3 mAb 4 (sections A and C) or LAG-3 mAb 5 (sections B and D). All cells were costained with anti-CD4 antibody.

На фиг. 14 (секции A-D) показано, что экспрессия LAG-3 и PD-1 повышается на мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС), простимулированных энтеротоксином типа В (SEB) Staphylococcus aureus, которые были получены от типичного донора D:34765. Проточный цитометрический анализ SEB-простимулированных РВМС от типичного донора спустя 48 ч после первичной стимуляции (секции А-В), помеченных антителами к LAG-3/к CD3 (секция А) или антителами к PD-1/к CD3 (секция В), и на пятые сутки после SEB-стимуляции (секции C-D) клетки, обработанных только SEB (секция С) или изотипическим контрольным антителом (секция D) во время вторичной стимуляции, помеченные антителами к LAG-3/к PD-1.In FIG. 14 (panels A-D) shows that LAG-3 and PD-1 expression is upregulated on Staphylococcus aureus enterotoxin type B (SEB) stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), which were obtained from typical donor D:34765. Flow cytometric analysis of SEB-stimulated PBMCs from a typical donor 48 hours after primary stimulation (sections A-B) labeled with anti-LAG-3/anti-CD3 antibodies (section A) or anti-PD-1/anti-CD3 antibodies (section B), and on the fifth day after SEB stimulation (sections C-D), cells treated with only SEB (section C) or isotype control antibody (section D) during secondary stimulation, labeled with anti-LAG-3/anti-PD-1 antibodies.

На фиг. 15 (секции A-D) показано, что экспрессия LAG-3 и PD-1 повышается на SEBпростимулированных РВМС от другого типичного донора D:53724. Проточный цитометрический анализ SEB-простимулированных РВМС от типичного донора через 48 ч после первичной стимуляции (секции А-В), помеченных антителами к LAG-3/к CD3 (секция А) или антителами к PD-1/к CD3 (секция В), и на пятые сутки после SEB-стимуляции (секции C-D) клетки, обработанные только SEB (секция С) или изотипическим контрольным антителом (секция D), помеченные антителами к LAG-3/к PD-1.In FIG. 15 (panels A-D) shows that LAG-3 and PD-1 expression is upregulated on SEB-stimulated PBMCs from another exemplary donor, D:53724. Flow cytometric analysis of SEB-stimulated PBMCs from a typical donor 48 hours after primary stimulation (sections A-B) labeled with anti-LAG-3/anti-CD3 antibodies (section A) or anti-PD-1/anti-CD3 antibodies (section B), and on the fifth day after SEB stimulation (sections C-D), cells treated with only SEB (section C) or isotype control antibody (section D) labeled with anti-LAG-3/anti-PD-1 antibodies.

На фиг. 16А-16В показано, что LAG-3 mAb 1 способно стимулировать выработку цитокинов до уровней, сравнимых с обработкой антителами к PD-1. Профили секреции IFNy (фиг. 16А) и TNFa (фиг. 16В) у SEB-простимулированных РВМС, обработанных антителами к LAG-3 или к PD-1.In FIG. 16A-16B show that LAG-3 mAb 1 is able to stimulate cytokine production to levels comparable to anti-PD-1 antibody treatment. Secretion profiles of IFNy (FIG. 16A) and TNFa (FIG. 16B) in SEB-stimulated PBMCs treated with anti-LAG-3 or anti-PD-1 antibodies.

На фиг. 17 показано, что LAG-3 mAb 1 способно стимулировать выработку цитокинов до уровней, сравнимых с обработкой антителами к PD-1, и что обработка посредством LAG-3 mAb 1 в комбинации с антителами к PD-1 обеспечивала наибольшее усиление высвобождения цитокинов. Профили секреции IFNy из SEB-простимулированных РВМС, обработанных антителами к LAG-3 и к PD-1 в отдельности и вIn FIG. 17 shows that LAG-3 mAb 1 was able to stimulate cytokine production to levels comparable to anti-PD-1 antibody treatment, and that treatment with LAG-3 mAb 1 in combination with anti-PD-1 antibodies provided the greatest enhancement in cytokine release. IFNy secretion profiles from SEB-stimulated PBMCs treated with anti-LAG-3 and anti-PD-1 antibodies alone and in

- 7 041483 комбинации.- 7 041483 combinations.

На фиг. 18А-18В показано связывание антител к LAG-3: hLAG-3 mAb 6 (1.1) и LAG-3 mAb А, с эндогенным LAG-3, экспрессируемым SEB-простимулированными PBMC яванского макака от двух доноров (фиг. 18А и 18В). Антитело к PD-1, PD-1 mAb А, было включено в качестве положительного контроля для SEB-стимуляции.In FIG. 18A-18B show the binding of anti-LAG-3 antibodies, hLAG-3 mAb 6 (1.1) and LAG-3 mAb A, to endogenous LAG-3 expressed by SEB-stimulated cynomolgus monkey PBMCs from two donors (FIGS. 18A and 18B). An anti-PD-1 antibody, PD-1 mAb A, was included as a positive control for SEB stimulation.

Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed disclosure of the present invention

I. Антитела и их связывающие доменыI. Antibodies and their binding domains

Антитела по настоящему изобретению представляют собой молекулы иммуноглобулина, способные иммуноспецифически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., с помощью по меньшей мере одного эпитопраспознающего сайта, расположенного в вариабельном домене молекулы иммуноглобулина.The antibodies of the present invention are immunoglobulin molecules capable of immunospecifically binding to a target such as a carbohydrate, polynucleotide, lipid, polypeptide, etc., via at least one epitope recognition site located in the variable domain of the immunoglobulin molecule.

Применяемый в контексте настоящего документа термин антитело обозначает молекулу иммуноглобулина, способную иммуноспецифически связываться с полипептидом или белком или небелковой молекулой в связи с наличием на такой молекуле конкретного домена, или фрагмента, или конформации (эпитопа). Эпитоп-содержащая молекула может обладать иммуногенной активностью, такой, что вызывает ответ с выработкой антител у животного; такие молекулы называют антигенам). Эпитопсодержащие молекулы не обязательно являются иммуногенными.As used herein, the term antibody refers to an immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to a polypeptide or protein or non-protein molecule due to the presence on such molecule of a specific domain, or fragment, or conformation (epitope). An epitope-containing molecule may have immunogenic activity, such as to elicit an antibody response in an animal; such molecules are called antigens). Epitope-containing molecules are not necessarily immunogenic.

Связывающие домены по настоящему изобретению связываются с эпитопами иммуноспецифическим образом. В контексте настоящего документа говорят, что антитело, диатело или другая эпитопсвязывающая молекула иммуноспецифически связывается (или характеризуется специфическим связыванием) с участком другой молекулы (т.е. эпитопом), если она вступает в реакцию или ассоциируется чаще, быстрее, дольше и/или с большей аффинностью с таким эпитопом, относительно альтернативных эпитопов. Например, антитело, которое специфически связывается с эпитопом LAG-3, является антителом, которое связывает такой эпитоп LAG-3 с большей аффинностью, авидностью, легче и/или дольше, чем оно связывается с другими эпитопами LAG-3 или с отличным от LAG-3 эпитопом. Также при прочтении этого определения будет понятно, что, например, антитело (или фрагмент, или эпитоп), которое иммуноспецифически связывается с первой мишенью, может специфически или предпочтительно связываться или не связываться со второй мишенью. Таким образом, иммуноспецифическое связывание не обязательно указывает (хотя и может включать) на исключительное связывание. Как правило, но не обязательно, отсылка к связыванию означает специфическое связывание. Говорят, что две молекулы способны связываться друг с другом физиоспецифическим образом, если такое связывание характеризуется специфичностью, с которой рецепторы связываются с их соответствующими лигандами. Способность антитела иммуноспецифически связываться с эпитопом может быть определена, например, с помощью иммуноанализа.The binding domains of the present invention bind to epitopes in an immunospecific manner. In the context of this document, an antibody, diabody, or other epitope-binding molecule is said to immunospecifically bind (or exhibit specific binding) to a portion of another molecule (i.e., an epitope) if it reacts or associates more frequently, faster, longer, and/or with greater affinity for such an epitope relative to alternative epitopes. For example, an antibody that specifically binds to a LAG-3 epitope is an antibody that binds that LAG-3 epitope with greater affinity, avidity, more readily, and/or longer than it binds to other LAG-3 epitopes or to non-LAG-3 epitopes. 3 epitopes. It will also be appreciated from reading this definition that, for example, an antibody (or fragment or epitope) that immunospecifically binds to a first target may or may not specifically or preferentially bind to a second target. Thus, immunospecific binding does not necessarily indicate (although it may include) exclusive binding. Typically, but not necessarily, a reference to a binding means a specific binding. Two molecules are said to be capable of binding to each other in a physiospecific manner if such binding is characterized by the specificity with which the receptors bind to their respective ligands. The ability of an antibody to immunospecifically bind to an epitope can be determined, for example, using an immunoassay.

Естественные антитела (такие как антитела IgG) состоят из двух легких цепей в комплексе с двумя тяжелыми цепями. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен (VH), три константных домена (CH1, CH2 и СН3) и шарнирный домен (Н), расположенный между доменами СН1 и СН2. Таким образом, основной структурной единицей естественных иммуноглобулинов (например, IgG) является тетрамер, имеющий две легкие цепи и две тяжелые цепи, обычно экспрессируемые в виде гликопротеина с массой приблизительно 150000 Да. Аминоконцевая (N-концевая) часть каждой цепи включает в себя вариабельный домен, содержащий приблизительно 100-110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевая (С-концевая) часть каждой цепи определяет константный участок, причем легкие цепи имеют один константный домен, а тяжелые цепи обычно имеют три константных домена и шарнирный домен. Таким образом, структура легких цепей молекулы IgG представляет собой n-VL-CL-c, а структура тяжелых цепей IgG представляет собой n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (где п и сNatural antibodies (such as IgG antibodies) consist of two light chains complexed with two heavy chains. Each light chain contains a variable domain (VL) and a constant domain (CL). Each heavy chain contains a variable domain (VH), three constant domains (CH1, CH2 and CH3) and a hinge domain (H) located between the CH1 and CH2 domains. Thus, the basic structural unit of natural immunoglobulins (eg, IgG) is a tetramer having two light chains and two heavy chains, usually expressed as a glycoprotein with a mass of approximately 150,000 Da. The amino-terminal (N-terminal) portion of each chain includes a variable domain containing approximately 100-110 or more amino acids, primarily responsible for antigen recognition. The carboxy-terminal (C-terminal) portion of each chain defines a constant region, with light chains having one constant domain and heavy chains typically having three constant domains and a hinge domain. Thus, the structure of the light chains of the IgG molecule is n-VL-CL-c, and the structure of the heavy chains of IgG is n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (where n and c

- 8 041483 представляют собой соответственно N-конец и С-конец полипептида). Способность антитела связывать эпитоп антигена зависит от наличия и аминокислотной последовательности доменов VL и VH антитела. В результате взаимодействия легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела и, в частности, взаимодействия его доменов VL и VH образуется один из двух эпитоп-связывающих сайтов естественного антитела. Естественные антитела способны связываться только с одним видом эпитопа (т.е. они являются моноспецифическими), при этом они могут связывать несколько копий такого вида (т.е. характеризуются бивалентностью или мультивалентностью). Вариабельные домены молекулы IgG состоят из определяющих комплементарность участков (CDR), которые содержат остатки, вступающие в контакт с эпитопом, и не относящиеся к CDR сегменты, называемые каркасными сегментами (FR), которые обычно поддерживают структуру и определяют позиционирование петель CDR с тем, чтобы сделать такой контакт возможным (хотя некоторые каркасные остатки также могут вступать в контакт с антигеном). Таким образом, домены VL и VH имеют структуру n-FR1-CDRL-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C. Полипептиды, которые представляют собой (или могут выступать в их роли) первый, второй и третий CDR легкой цепи антитела, в настоящем документе соответственно обозначены доменом CDRL1, доменом CDRL2 и доменом CDRL3. Аналогичным образом, полипептиды, которые представляют собой (или могут выступать в их роли) первый, второй и третий CDR тяжелой цепи антитела, в настоящем документе соответственно обозначены доменом CDR_H1, доменом CDR_H2 и доменом CDR_H3. Таким образом, термины домен CDRL1, домен CDRL2, домен CDRL3, домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 относятся к полипептидам, которые при включении в белок приводит к тому, что белок становится способным связываться со специфическим эпитопом независимо от того, является ли белок антителом, имеющим легкую и тяжелую цепи, или диателом, или одноцепочечной связывающей молекулой (например, scFv, BiTe и т. д.) или является другим типом белка. Следовательно, применяемый в контексте настоящего документа термин эпитопсвязывающий домен обозначает такую часть эпитопсвязывающей молекулы, которая отвечает за способность такой молекулы иммуноспецифически связывать эпитоп. Эпитопсвязывающий фрагмент может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 доменов CDR такого антитела и, хотя он и способен иммуноспецифически связываться с таким эпитопом, может характеризоваться иммуноспецифичностью, аффинностью или селективностью в отношении такого эпитопа, которые отличаются от таковых, у такого антитела. Предпочтительно тем не менее, эпитопсвязывающий фрагмент будет содержать все 6 доменов CDR такого антитела. Эпитопсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой отдельную полипептидную цепь (например, scFv) или может содержать две или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет аминоконец и карбоксиконец (например, диатело, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент и т.д.).- 8 041483 represent the N-terminus and C-terminus of the polypeptide, respectively). The ability of an antibody to bind an antigen epitope depends on the presence and amino acid sequence of the VL and VH domains of the antibody. As a result of the interaction of the light chain of the antibody and the heavy chain of the antibody, and in particular the interaction of its VL and VH domains, one of the two epitope-binding sites of a natural antibody is formed. Natural antibodies can only bind to one type of epitope (i.e., they are monospecific), while they can bind multiple copies of this type (i.e., they are bivalent or multivalent). The variable domains of the IgG molecule are composed of complementarity determining regions (CDRs), which contain residues that come into contact with the epitope, and non-CDR segments called framework segments (FRs), which typically maintain the structure and determine the positioning of the CDR loops so that make such contact possible (although some framework residues may also come into contact with the antigen). Thus, the VL and VH domains have the structure n-FR1-CDRL-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C. The polypeptides that are (or may be) the first, second, and third CDRs of the light chain of an antibody are referred to herein as CDRL1 domain, CDRL2 domain, and CDRL3 domain, respectively. Similarly, polypeptides that are (or may act as) the first, second, and third CDRs of an antibody heavy chain are referred to herein as the CDR _H 1 domain, the CDR _H 2 domain, and the CDR _H 3 domain, respectively. Thus, the terms CDRL1 domain, CDRL2 domain, CDRL3 domain, CDRH1 domain, CDRH2 domain, and CDRH3 domain refer to polypeptides which, when incorporated into a protein, result in the protein being able to bind to a specific epitope, whether or not the protein is an antibody having a light and a heavy chain, or a diabody, or a single-stranded binding molecule (eg, scFv, BiTe, etc.), or is another type of protein. Therefore, as used herein, the term epitope-binding domain refers to that portion of an epitope-binding molecule that is responsible for the ability of that molecule to immunospecifically bind an epitope. An epitope-binding fragment may contain 1, 2, 3, 4, 5, or all 6 CDRs of such an antibody and, although capable of immunospecific binding to such an epitope, may have an immunospecificity, affinity, or selectivity for that epitope that differs from that of such an antibody. Preferably, however, the epitope-binding fragment will contain all 6 CDRs of such an antibody. The epitope-binding fragment of an antibody may be a single polypeptide chain (e.g., scFv) or may contain two or more polypeptide chains, each having an amino-terminus and a carboxy-terminus (e.g., diatelo, Fab fragment, F(ab') ₂ fragment, etc.). d.).

Применяемый в контексте настоящего документа термин антитело охватывает моноклональные антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, поликлональные антитела, камелизированные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, иммунологически активные фрагменты антитела (например, фрагменты антитела, способные связываться с эпитопом, например, Fab-фрагменты, Fab'фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, Fv-фрагменты, фрагменты, содержащие домен V_L и/или VH, или которые содержат 1, 2 или 3 определяющих комплементарность участков (CDR) такого домена VL (т. е. CDRL1, CDR_L2 и/или CDR_L3) или домена VH (т. е. CDR_H1, CDR_H2 и/или CDR_H3)), которые специфически связывают антиген и т.д., бифункциональные или мультифункциональные антитела, связанные дисульфидным мостиком биспецифические Fvs (sdFv), интраантитела и диатела и эпитопсвязывающие фрагменты любых из перечисленных выше. Так, в частности, термин антитело подразумевают как охватывающий молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулина, т. е. молекул, которые содержат эпитоп-связывающий сайт. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA1 и IgA₂) или подкласса (см., например, патентные публикации США №№ 20040185045, 20050037000, 20050064514, 20050215767, 20070004909, 20070036799, 20070077246 и 20070244303). Последние несколько десятилетий наблюдается оживление интереса в терапевтическом потенциале антител, а антитела становятся одним из лидирующих классов получаемых биотехнологическими методами лекарственных средств (Chan, C.E. et al. (2009) The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases, Singapore Med. J. 50(7):663-666). Более 200 лекарственных средств на основе антител были одобрены для применения или находятся на стадии разработки.As used herein, the term antibody includes monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, synthetic antibodies, chimeric antibodies, polyclonal antibodies, camelized antibodies, single chain Fvs (scFv), single chain antibodies, immunologically active antibody fragments (e.g., antibody fragments). capable of binding to an epitope, for example, Fab fragments, Fab'fragments, F(ab') ₂ fragments, Fv fragments, fragments containing a V _L and/or VH domain, or which contain 1, 2 or 3 complementarity determining regions (CDRs) of such a VL domain (i.e. CDRL1, CDR _L 2 and/or CDR _L 3) or a VH domain (i.e. CDR _H 1, CDR _H 2 and/or CDR _H 3)) that specifically bind antigen, etc., bifunctional or multifunctional antibodies, disulfide-linked bispecific Fvs (sdFv), intra-antibodies and diabodies, and epitope-binding fragments of any of the above. Thus, in particular, the term antibody is meant to encompass immunoglobulin molecules and immunologically active fragments of immunoglobulin molecules, ie, molecules that contain an epitope-binding site. Immunoglobulin molecules can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (eg, IgG1, IgG ₂ , IgG ₃ , IgG ₄ , IgA1 and IgA ₂ ) or subclass (see, for example, U.S. Patent Publication Nos. 20040185045, 20050037000, 20050064514, 20050215767, 20070004909, 20070036799, 20070077246 and 20070244303). The last few decades have seen a revival of interest in the therapeutic potential of antibodies, with antibodies becoming one of the leading classes of biotechnologically produced drugs (Chan, CE et al. (2009) The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases, Singapore Med. J. 50 (7):663-666). More than 200 antibody-based drugs have been approved or are under development.

К антителам к LAG-3 по настоящему изобретению относятся гуманизированные, химерные или канинизированные варианты антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6.Anti-LAG-3 antibodies of the present invention include humanized, chimeric, or caninized variants of LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, or LAG-3 mAb 6.

Термин химерное антитело обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична антителу от одного вида (например, мыши) или класса или подкласса антитела, в то время как оставшаяся часть идентична или гомологична антителу другого вида (например, человека) или класса или подкласса антитела, при условии, что они характеризуются необходимой биологической активностью. К представляющим интерес химерным антителам по настоящему описанию относятся примитизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от отличного от человека примата (например, мартышковых, человекообразThe term chimeric antibody refers to an antibody in which a portion of the heavy and/or light chain is identical or homologous to an antibody from one species (e.g. mouse) or class or subclass of antibody, while the remainder is identical or homologous to an antibody of another species (e.g. human) or class or subclass of an antibody, provided that they are characterized by the desired biological activity. Chimeric antibodies of interest herein include primitive antibodies comprising variable domain antigen-binding sequences derived from a non-human primate (e.g., marmoset, hominin).

- 9 041483 ных обезьян и т.д.), и последовательности константного участка человека.- 9 041483 monkeys, etc.), and human constant region sequences.

Применяемый в контексте настоящего описания термин моноклональное антитело обозначает антитело популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в состав популяции, являются идентичными, за исключением возможных антител, обладающих встречающимися в природе мутациями, которые могут присутствовать в незначительном количестве, а применяемый в контексте настоящего документа термин поликлональное антитело обозначает антитело, полученное из популяции гетерогенных антител. Термин моноклональное указывает на характерных признак антитела как являющегося популяцией практически однородных антител, и его не следует истолковывать как обозначающее получение антитела каким-либо конкретным способом (например, с помощью гибридомы, фагового отбора, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает целые иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше под определением антитела. Способы получения моноклональных антител известны из уровня техники. Одним способом, который можно использовать, является способ Kohler, G. et al. (1975) Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity, Nature 256:495-497, или его модификация. Как правило, моноклональные антитела разрабатывают на мышах, крысах или кроликах. Антитела получают путем иммунизации животного иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые содержат необходимый эпитоп. Иммуноген может представлять собой без ограничения первичные клетки, культивируемые клеточные линии, злокачественные опухолевые клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или ткань.Used in the context of the present description, the term monoclonal antibody refers to the antibody of a population of substantially homogeneous antibodies, ie. individual antibodies within a population are identical except for possible antibodies that have naturally occurring mutations that may be present in small numbers, and as used herein, the term polyclonal antibody refers to an antibody derived from a population of heterogeneous antibodies. The term monoclonal refers to the characteristic of an antibody as being a population of substantially homogeneous antibodies, and should not be construed as meaning the production of an antibody by any particular method (eg, hybridoma, phage selection, recombinant expression, transgenic animals, etc.). The term includes whole immunoglobulins as well as fragments, etc., as described above under the definition of an antibody. Methods for producing monoclonal antibodies are known in the art. One method that can be used is that of Kohler, G. et al. (1975) Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity, Nature 256:495-497, or a modification thereof. Typically, monoclonal antibodies are developed in mice, rats, or rabbits. Antibodies are produced by immunizing an animal with an immunogenic amount of cells, cell extracts, or protein preparations that contain the desired epitope. An immunogen can be, without limitation, primary cells, cultured cell lines, cancer cells, proteins, peptides, nucleic acids, or tissue.

Применяемые для иммунизации клетки можно культивировать в течение некоторого периода времени (например, по меньшей мере 24 ч) перед их применением в качестве иммуногена. Клетки можно применять в качестве иммуногенов сами по себе или в комбинации с неденатурирующим адъювантом, таким как Ribi (см., например, Jennings, V.M. (1995) Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production, ILAR J. 37(3): 119-125). Обычно клетки следует поддерживать интактными и предпочтительно жизнеспособными при применении в качестве иммуногенов. Интактные клетки могут обеспечивать для иммунизированных животных лучшую детекцию антигенов, чем разрушенные клетки. Применение денатурирующих или агрессивных адъювантов, например, адъюванта Фрейнда, может разрушить клетки и, следовательно, не рекомендуется. Иммуноген можно вводить многократно с периодическими интервалами, такими как два раза в неделю или раз в неделю, или можно вводить таким образом, чтобы сохранялась его жизнеспособность у животного (например, в рекомбинантной ткани). Альтернативно, существующие моноклональные антитела и любые другие эквивалентные антитела, которые являются иммуноспецифическими для необходимого патогенного эпитопа, можно секвенировать и получить рекомбинантно любыми способами, известными из уровня техники. В соответствии с одним вариантом осуществления такое антитело секвенируют, а полинуклеотидную последовательность затем клонируют в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующую представляющее интерес антитело, можно сохранять в векторе в клетке-хозяине, а затем клетку-хозяина можно размножить и заморозить для последующего применения. Полинуклеотидную последовательность таких антител можно применять для генетической манипуляции с целью создания моноспецифических или мультиспецифических (например, биспецифических, триспецифических и тетраспецифических) молекул по настоящему изобретению, а также антитела с оптимизированной аффинностью, химерного антитела, гуманизированного антитела и/или канинизированного антитела для улучшения аффинности или других характеристик антитела.The cells used for immunization can be cultured for a period of time (eg, at least 24 hours) before they are used as an immunogen. The cells can be used as immunogens alone or in combination with a non-denaturing adjuvant such as Ribi (see, for example, Jennings, V.M. (1995) Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production, ILAR J. 37(3): 119- 125). In general, cells should be kept intact and preferably viable when used as immunogens. Intact cells may provide better antigen detection for immunized animals than destroyed cells. The use of denaturing or aggressive adjuvants, such as Freund's adjuvant, can destroy cells and is therefore not recommended. The immunogen may be administered multiple times at periodic intervals, such as twice a week or once a week, or may be administered in such a manner that it is viable in the animal (eg, in recombinant tissue). Alternatively, existing monoclonal antibodies and any other equivalent antibodies that are immunospecific for the desired pathogenic epitope can be sequenced and produced recombinantly by any means known in the art. In accordance with one embodiment, such an antibody is sequenced and the polynucleotide sequence is then cloned into a vector for expression or propagation. The sequence encoding the antibody of interest can be stored in a vector in a host cell, and then the host cell can be expanded and frozen for later use. The polynucleotide sequence of such antibodies can be used for genetic manipulation to create monospecific or multispecific (e.g., bispecific, trispecific, and tetraspecific) molecules of the present invention, as well as an affinity-optimized antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, and/or a caninized antibody to improve affinity, or other characteristics of the antibody.

Термин scFv относится к одноцепочечным фрагментам вариабельных доменов. Молекулы scFv получают путем связывания вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи с помощью короткого соединяющего пептида. В работе Bird et al. (1988) (Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426) описан пример соединяющих пептидов, которые соединяют мостиком примерно 3,5 нм между карбоксильным концом одного вариабельного домена и аминоконцом другого вариабельного домена. Были разработаны и применяются линкеры с другими последовательностями (Bird et al. (1988) Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426). В свою очередь, линкеры можно модифицировать для дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно получить либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетического получения scFv можно применять автоматизированный синтезатор. Для рекомбинантного получения scFv подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, который кодирует scFv, можно ввести в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как дрожжевые клетки, клетки растения, насекомого или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, можно получить обычными манипуляциями, такими как лигирование полинуклеотидов. Полученный в результате scFv можно выделить с помощью стандартных методик очистки белка, известных из уровня техники.The term scFv refers to single chain fragments of variable domains. The scFv molecules are generated by linking the light and/or heavy chain variable domain with a short bridging peptide. Bird et al. (1988) (Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426) describes an example of bridging peptides that bridge about 3.5 nm between the carboxyl terminus of one variable domain and the amino terminus of another variable domain. Linkers with other sequences have been developed and are being used (Bird et al. (1988) Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426). In turn, linkers can be modified for additional functions such as drug attachment or attachment to solid supports. Single chain variants can be produced either recombinantly or synthetically. An automated synthesizer can be used to synthesize scFv. For recombinant scFv production, a suitable plasmid containing a polynucleotide that encodes an scFv can be introduced into a suitable host cell, either eukaryotic, such as yeast, plant, insect, or mammalian cells, or prokaryotic, such as E. coli. Polynucleotides encoding the scFv of interest can be obtained by conventional manipulations such as polynucleotide ligation. The resulting scFv can be isolated using standard protein purification techniques known in the art.

Настоящее изобретение, в частности, относится к гуманизированным вариантам антител к LAG-3 по настоящему изобретению и к мультиспецифическим связывающим молекулам, содержащим их. Термин гуманизированное антитело обозначает химерную молекулу, обычно полученную с помощью рекомбинантных методик, имеющую эпитопсвязывающий сайт иммуноглобулина от не относящихся к чеThe present invention particularly relates to the humanized variants of the anti-LAG-3 antibodies of the present invention and to multispecific binding molecules containing them. The term humanized antibody refers to a chimeric molecule, usually produced by recombinant techniques, having a non-human immunoglobulin epitope-binding site.

- 10 041483 ловеку вида и остальную иммуноглобулиновую структуру молекулы, которая основана на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Эпитопсвязывающий сайт может содержать либо полные вариабельные домены, слитые на константных доменах, либо только CDR, привитые на соответствующие каркасные участки в вариабельных доменах. Эпитоп-связывающие сайты могут быть дикого типа или модифицированы одной или несколькими аминокислотными заменами. Это устраняет константный участок в качестве иммуногена у людей, но возможность иммунного ответа на чужеродный вариабельный участок сохраняется (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). В другом подходе основное внимание уделяется не только обеспечению наличия константных участков человеческого происхождения, но и модификации вариабельных участков, а также изменению их формы на как можно более близкую к человеческой форме. Известно, что вариабельные участки как тяжелых, так и легких цепей содержат три CDR, которые варьируют в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют связывающую способность, фланкированные четырьмя каркасными участками (FR), которые относительно консервативны у заданного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении отличных от человеческих антител к конкретному антигену вариабельные участки можно переформировать или гуманизировать путем прививки CDR, полученных из отличного от человеческого антитела, на FR, присутствующие в подлежащем модификации человеческом антителе. Применение такого подхода к различным антителам рассмотрено в работе Sato, K. et al. (1993) Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth, Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; Kettleborough, С. A. et al. (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-p 185her 2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. et al. (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, J. Immunol. 148:1149-1154. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). В соответствии с другими вариантами осуществления гуманизированные антитела имеют один или несколько CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), которые изменены по их аминокислотной последовательности(ям) относительно исходного антитела, которые также называют одним или несколькими CDR, которые являются производными от одного или нескольких CDR из исходного антитела (т.е. являются производными от таких CDR, которые получены благодаря сведениям об аминокислотных последовательностях таких CDR и т.д.). Полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен антитела, можно применять для создания таких производных и улучшения аффинности или других характеристик таких антител. Общий принцип гуманизации антитела предусматривает сохранение основной последовательности эпитопсвязывающей части антитела при замене оставшейся нечеловеческой части антитела на последовательности человеческого антитела. Существует четыре общих стадии гуманизации моноклонального антитела. Эти стадии следующие:- 10 041483 species and the rest of the immunoglobulin structure of the molecule, which is based on the structure and/or sequence of human immunoglobulin. The epitope-binding site may either contain complete variable domains fused on the constant domains, or only CDRs grafted onto the appropriate framework regions in the variable domains. Epitope binding sites may be wild-type or modified with one or more amino acid substitutions. This eliminates the constant region as an immunogen in humans, but the possibility of an immune response to the foreign variable region remains (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 86:4220-4224). In another approach, the focus is not only on ensuring that there are constant regions of human origin, but also on modifying the variable regions, as well as changing their shape to as close as possible to the human form. The variable regions of both the heavy and light chains are known to contain three CDRs that vary depending on the antigens in question and determine binding capacity, flanked by four framework regions (FRs) that are relatively conserved across a given species and that presumably provide a scaffold for the CDRs. When obtaining non-human antibodies to a particular antigen, the variable regions can be rearranged or humanized by grafting CDRs derived from a non-human antibody onto FRs present in the human antibody to be modified. The application of this approach to various antibodies is reviewed by Sato, K. et al. (1993) Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth, Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-p 185her 2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, J. Immunol. 148:1149-1154. In some embodiments, humanized antibodies retain all CDR sequences (eg, a humanized mouse antibody that contains all six CDRs from mouse antibodies). In accordance with other embodiments, humanized antibodies have one or more CDRs (one, two, three, four, five, or six) that are altered in their amino acid sequence(s) from the parent antibody, also referred to as one or more CDRs that are derived from one or more CDRs from the parent antibody (ie, derived from such CDRs derived from knowledge of the amino acid sequences of such CDRs, etc.). A polynucleotide sequence that encodes the variable domain of an antibody can be used to create such derivatives and improve the affinity or other characteristics of such antibodies. The general principle of humanizing an antibody is to retain the core sequence of the epitope-binding portion of the antibody while replacing the remaining non-human portion of the antibody with human antibody sequences. There are four general steps in the humanization of a monoclonal antibody. These stages are:

(1) определение нуклеотидной и прогнозируемой аминокислотной последовательности вариабельных доменов легких и тяжелых цепей исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела или канинизированного антитела, т. е. принятие решения о том, какой каркасный участок антитела применять в процессе гуманизации или канинизации, (3) фактические методологии/методики гуманизации или канинизации и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США №№ 4816567, 5807715, 5866692 и 6331415.(1) determining the nucleotide and predicted amino acid sequence of the variable domains of the light and heavy chains of the parent antibody, (2) constructing a humanized antibody or caninized antibody, i.e. deciding which antibody framework region to use in the humanization or caninization process, (3 ) actual methodologies/techniques for humanization or caninization; and (4) transfection and expression of the humanized antibody. See, for example, US Pat. Nos. 4,816,567, 5,807,715, 5,866,692 and 6,331,415

Эпитопсвязывающий сайт молекул по настоящему изобретению может содержать полный вариабельный домен, слитый с константным доменом, или только определяющие комплементарность участки (CDR) такого вариабельного участка, привитые к соответствующим каркасным участкам. Эпитопсвязывающие сайты могут быть дикого типа или модифицированы одной или несколькими аминокислотными заменами. Это устраняет константный участок в качестве иммуногена у людей, но возможность иммунного ответа на чужеродный вариабельный домен сохраняется (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). В другом подходе основное внимание уделяется не только обеспечению наличия константных участков человеческого происхождения, но и модификации вариабельных доменов, а также изменению их формы на как можно более близкую к человеческой форме. Известно, что вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей содержат три определяющий комплементарность учаThe epitope-binding site of the molecules of the present invention may comprise the entire variable domain fused to the constant domain, or only the complementarity determining regions (CDRs) of such a variable region grafted onto the appropriate framework regions. Epitope binding sites may be wild-type or modified with one or more amino acid substitutions. This eliminates the constant region as an immunogen in humans, but the possibility of an immune response to the foreign variable domain remains (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 86:4220-4224). In another approach, the focus is not only on providing constant regions of human origin, but also modifying the variable domains, as well as changing their shape to as close as possible to the human form. It is known that the variable domains of both heavy and light chains contain three complementarity-determining patterns.

- 11 041483 стка (CDR), которые варьируют в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют связывающую способность, фланкированные четырьмя каркасными участками (FR), которые относительно консервативны у заданного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении отличных от человеческих антител к конкретному антигену вариабельные домены можно переформировать или гуманизировать путем прививки CDR, полученных из отличного от человеческого антитела, на FR, присутствующие в подлежащем модификации человеческом антителе. Применение такого подхода к различным антителам рассмотрено в работе Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; Kettleborough, С. A. et al (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-p 185her 2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. etal (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, J. Immunol. 148:1149-1154. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). В соответствии с другими вариантами осуществления гуманизированные антитела имеют один или несколько CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), которые различаются по последовательности относительно исходного антитела.- 11 041483 lines (CDRs), which vary depending on the antigens in question and determine the binding capacity, flanked by four framework regions (FRs) that are relatively conserved in a given species and which presumably provide a framework for the CDRs. When generating non-human antibodies to a particular antigen, the variable domains can be rearranged or humanized by grafting CDRs derived from a non-human antibody onto FRs present in the human antibody to be modified. The application of this approach to various antibodies is reviewed by Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation, Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity, Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-p 185her 2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. etal (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen, J. Immunol. 148:1149-1154. In some embodiments, humanized antibodies retain all CDR sequences (eg, a humanized mouse antibody that contains all six CDRs from mouse antibodies). In accordance with other embodiments, humanized antibodies have one or more CDRs (one, two, three, four, five, or six) that differ in sequence from the parent antibody.

Был описан ряд гуманизированных молекул антител, содержащих эпитопсвязывающий сайт, полученный из отличного от человеческого иммуноглобулина, включая химерные антитела, имеющие вариабельный домен грызуна или модифицированный вариабельный домен грызуна и ассоциированный с ним определяющие комплементарность участки (CDR), слитые с константными доменами человека (см., например, Winter et al. (1991) Man-made Antibodies, Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1 A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen, J. Immunol. 138:4534-4538, и Brown et al. (1987) Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody, Cancer Res. 47:3577-3583). В других источниках описаны CDR грызунов, привитые в поддерживающий каркасный участок (FR) человека перед слиянием с соответствующим константный доменом человеческого антитела (см., например, Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; и Jones et al. (1986) Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse, Nature 321:522-525). В другом источнике описаны CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно венированными каркасными участками грызунов. См., например, публикацию европейского патента № 519596. Такие гуманизированные молекулы сконструированы для минимизации нежелательного иммунологического ответа на молекулы антител грызунов к антителу человека, что ограничивает продолжительность и эффективность терапевтических применений таких фрагментов у принимающих такой препарат людей. Другие способы гуманизации антител, которые также можно использовать, раскрыты в работе Daugherty et al. (1991) Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, и в патентах США №№ 6180377,6054297, 5997867 и 5866692.A number of humanized antibody molecules have been described containing an epitope-binding site derived from a non-human immunoglobulin, including chimeric antibodies having a rodent variable domain or a modified rodent variable domain and its associated complementarity determining regions (CDRs) fused to human constant domains (see eg Winter et al (1991) Man-made Antibodies, Nature 349:293-299 Lobuglio et al (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc Natl Acad Sci (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al.(1987) Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1 A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen, J. Immunol.138: 4534-4538, and Brown et al (1987) Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody, Cancer Res 47:3577-3583). Other references describe rodent CDRs grafted into a human framework support region (FR) prior to fusion with the corresponding human antibody constant domain (see, for example, Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323 -327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse, Nature 321:522-525). Another reference describes rodent CDRs maintained by recombinantly venated rodent scaffolds. See, for example, European Patent Publication No. 519596. Such humanized molecules are designed to minimize undesirable immunological response to rodent anti-human antibody molecules, which limits the duration and effectiveness of therapeutic applications of such fragments in humans receiving such a drug. Other methods for humanizing antibodies that can also be used are disclosed in Daugherty et al. (1991) Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, and US Pat. Nos. 6,180,377, 6,054,297, 5,997,867, and 5,866,692.

II. Рецепторы Fcy (FcyR)II. Fcy receptors (FcyR)

Домены СН2 и СН3 двух тяжелых цепей взаимодействуют с образованием Fc-участка, который является доменом, который распознается клеточными рецепторами Fc, в том числе без ограничения гаммарецепторами Fc (FcyR). Применяемый в контексте настоящего документа термин Fc-участок применяют для обозначения С-концевого участка тяжелой цепи IgG. Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG1 человека представляет собой (SEQ ID NO: 1):The CH2 and CH3 domains of the two heavy chains interact to form an Fc region, which is a domain that is recognized by cellular Fc receptors, including but not limited to Fc gamma receptors (FcyR). As used herein, the term Fc region is used to refer to the C-terminal region of an IgG heavy chain. The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of exemplary human IgG1 is (SEQ ID NO: 1):

- 12 041483- 12 041483

231 240 231 240 250 250 260 260 270 270 280 280 APELLGGPSV APELLGGPSV FLFPPKPKDT FLFPPKPKDT LMISRTPEVT LMISRTPEVT CVVVDVSHED CVVVDVSHED PEVKFNWYVD PEVKFNWYVD 290 290 300 300 310 310 320 320 330 330 GVEVHNAKTK GVEVHNAKTK PREEQYNSTY PREQYNSTY RVVSVLTVLH RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK QDWLNGKEYK CKVSNKALPA CKVSNKALPA 340 340 350 350 360 360 370 370 380 380 PIEKTISKAK PIEKTISKAK GQPREPQVYT GQPREPQVYT LPPSREEMTK LPPSREEMTK NQVSLTCLVK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE GFYPSDIAVE 390 390 400 400 410 410 420 420 430 430 WESNGQPENN WESNGQPENN YKTTPPVLDS YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE NVFSCSVMHE 440 440 447 447 ALHNHYTQKS ALHNHYTQKS LSLSPGX LSLSPGX

которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.which is numbered according to the Kabat EU numbering system, where X is lysine (K) or absent.

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG2 человека представляет собой (SEQ ID NO: 2):The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of exemplary human IgG2 is (SEQ ID NO: 2):

231 240 231 240 250 250 260 260 270 270 280 280 APPVA-GPSV APPVA-GPSV FLFPPKPKDT FLFPPKPKDT LMISRTPEVT LMISRTPEVT CVVVDVSHED CVVVDVSHED PEVQFNWYVD PEVQFNWYVD 290 290 300 300 310 310 320 320 330 330 GVEVHNAKTK GVEVHNAKTK PREEQFNSTF PREEQFNSTF RVVSVLTVVH RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA CKVSNKGLPA 340 340 350 350 360 360 370 370 380 380 PIEKTISKTK PIEKTISKTK GQPREPQVYT GQPREPQVYT LPPSREEMTK LPPSREEMTK NQVSLTCLVK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE GFYPSDISVE 390 390 400 400 410 410 420 420 430 430 WESNGQPENN WESNGQPENN YKTTPPMLDS YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE NVFSCSVMHE

440 447440 447

ALHNHYTQKS LSLSPGX которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.ALHNHYTQKS LSLSPGX which is numbered according to the Kabat EU numbering system, where X is lysine (K) or absent.

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG3 человека представ-The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of exemplary human IgG3 is

ляет собой (SEQ ID NO: 3): is (SEQ ID NO: 3): 231 240 231 240 250 250 260 260 270 270 280 280 APELLGGPSV APELLGGPSV FLFPPKPKDT FLFPPKPKDT LMISRTPEVT LMISRTPEVT CVVVDVSHED CVVVDVSHED PEVQFKWYVD PEVQFKWYVD 290 290 300 300 310 310 320 320 330 330 GVEVHNAKTK GVEVHNAKTK PREEQYNSTF PREQYNSTF RVVSVLTVLH RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK QDWLNGKEYK CKVSNKALPA CKVSNKALPA 340 340 350 350 360 360 370 370 380 380 PIEKTISKTK PIEKTISKTK GQPREPQVYT GQPREPQVYT LPPSREEMTK LPPSREEMTK NQVSLTCLVK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE GFYPSDIAVE 390 390 400 400 410 410 420 420 430 430 WESSGQPENN WESSGQPENN YNTTPPMLDS YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE NIFSCSVMHE 440 440 447 447 ALHNRFTQKS ALHNRFTQKS LSLSPGX LSLSPGX

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG4 человека представ-The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of exemplary human IgG4 is

ляет собой (SEQ ID NO: 4): is (SEQ ID NO: 4): 231 240 231 240 250 250 260 260 270 270 280 280 APEFLGGPSV APEFLGGPSV FLFPPKPKDT FLFPPKPKDT LMISRTPEVT LMISRTPEVT CVVVDVSQED CVVVDVSQED PEVQFNWYVD PEVQFNWYVD 290 290 300 300 310 310 320 320 330 330 GVEVHNAKTK GVEVHNAKTK PREEQFNSTY PREQFNSTY RVVSVLTVLH RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS CKVSNKGLPS 340 340 350 350 360 360 370 370 380 380 SIEKTISKAK SIEKTISKAK GQPREPQVYT GQPREPQVYT LPPSQEEMTK LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE GFYPSDIAVE 390 390 400 400 410 410 420 420 430 430 WESNGQPENN WESNGQPENN YKTTPPVLDS YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE NVFSCSVMHE 440 440 447 447 ALHNHYTQKS ALHNHYTQKS LSLSLGX LSLSLGX

По всему настоящему описанию нумерация остатков в константном участке тяжелой цепи IgG соответствует EU системе нумерации по Kabat et al., SEQUENCES OF Proteins of Immunological Interest, 5^thEd. Public Health Service, NH1, MD (1991) (Kabat), явным образом включенной в настоящий документ посредством ссылок. EU система нумерации по Kabat относится к нумерации EU антитела IgG1 человека. Аминокислоты из вариабельных доменов зрелых тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов обозначены по положению аминокислоты в цепи, a CDR указан согласно определению по Kabat (будет понятно, что CDRH1, согласно определению по Chothia, С. & Lesk, A. M. ((1987) Canonical structures for theThroughout this specification, the numbering of residues in the IgG heavy chain constant region follows the EU numbering system of Kabat et al., SEQUENCES OF Proteins of Immunological Interest, 5 ^th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (Kabat), expressly incorporated herein by reference. The Kabat EU numbering system refers to the EU numbering of a human IgG1 antibody. Amino acids from the variable domains of mature immunoglobulin heavy and light chains are designated by the position of the amino acid in the chain, and the CDR is indicated as defined by Kabat (it will be understood that CDRH1, as defined by Chothia, C. & Lesk, AM ((1987) Canonical structures for the

- 13 041483 hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917) начинается на пять остатков раньше). Kabat описал многочисленные аминокислотные последовательности для антител, определил аминокислотную консенсусную последовательность для каждой подгруппы и присвоил каждой аминокислоте номер остатка. Схема нумерации по Kabat можно расширить на антитела, не включенные в его сборник, путем выравнивания рассматриваемого антитела с одной из консенсусных последовательностей по Kabat с учетом консервативных аминокислот. Этот способ присвоения номеров остатков стал стандартным в настоящей области техники и позволяет легко выявить аминокислоты в эквивалентных положениях у разных антител, в том числе у химерных или гуманизированных вариантов. Например, аминокислота в положении 50 легкой цепи антитела человека занимает эквивалентное положение аминокислоте в положении 50 легкой цепи антитела мыши.- 13 041483 hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917) begins five residues earlier). Kabat described numerous amino acid sequences for antibodies, determined an amino acid consensus sequence for each subgroup, and assigned a residue number to each amino acid. The Kabat numbering scheme can be extended to antibodies not included in its collection by aligning the antibody in question with one of the Kabat consensus sequences, taking into account conservative amino acids. This method of assigning residue numbers has become standard in the art and makes it easy to identify amino acids at equivalent positions in different antibodies, including chimeric or humanized variants. For example, the amino acid at position 50 of the light chain of a human antibody occupies an equivalent position to the amino acid at position 50 of the light chain of a mouse antibody.

По ряде различных положений в пределах константных участках антитела наблюдались полиморфизмы (например, по положениям Fc, в том числе без ограничения положениям 270, 272, 312, 315, 356 и 358, пронумерованным согласно EU системе нумерации по Kabat), и, следовательно, могут иметь место небольшие различия между представленной последовательностью и последовательностями, известными из уровня техники. Были хорошо охарактеризованы полиморфные формы иммуноглобулинов человека. В настоящее время известны 18 Gm аллотипов: G1m (1, 2, 3, 17) или G1m (a, X, f, z), G2m (23) или G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (b1, с3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation, Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). В частности, предполагается, что антитела по настоящему изобретению могут включать любой аллотип, изоаллотип или гаплотип любого гена иммуноглобулина и не ограничены аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом последовательностей, представленных в настоящем документе. Кроме того, в некоторых системах экспрессии Сконцевой аминокислотный остаток (выделен жирным выше) домена СН3 может быть удален посттрансляционно. Соответственно, С-концевой остаток домена СН3 является необязательным аминокислотным остатком в связывающих LAG-3 молекулах по настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам без С-концевого остатка домена СН3. Также, в частности, настоящее изобретение относится к таким конструкциям, которые содержат С-концевой остаток лизина домена СН3.Polymorphisms have been observed at a number of different positions within the antibody constant regions (e.g., at Fc positions, including but not limited to positions 270, 272, 312, 315, 356, and 358, numbered according to Kabat's EU numbering system), and therefore may there are small differences between the presented sequence and the sequences known from the prior art. The polymorphic forms of human immunoglobulins have been well characterized. Currently, 18 Gm allotypes are known: G1m (1, 2, 3, 17) or G1m (a, X, f, z), G2m (23) or G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) or G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation, Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199- 211). In particular, it is contemplated that the antibodies of the present invention may include any allotype, isoallotype, or haplotype of any immunoglobulin gene, and are not limited to the allotype, isoallotype, or haplotype of the sequences provided herein. In addition, in some expression systems, the C-terminal amino acid residue (in bold above) of the CH3 domain may be deleted post-translationally. Accordingly, the C-terminal residue of the CH3 domain is an optional amino acid residue in the LAG-3 binding molecules of the present invention. In particular, the present invention relates to LAG-3 binding molecules without a C-terminal residue of the CH3 domain. Also, in particular, the present invention relates to such constructs that contain a C-terminal lysine residue of the CH3 domain.

Активирующие и ингибирующие сигналы трансдуцируются при лигировании Fc-участка с клеточным рецептором Fc (FcyR). Способность такого лигирования приводить к диаметрально противоположным функциям проистекает изструктурных различий среди различных изоформ рецепторов. Различные ответы обуславливают два различных домена в цитоплазматических сигнальных доменах рецептора, называемые иммунорецепторными тирозиновыми активирующими мотивами (ITAM) и иммунорецепторными тирозиновыми ингибирующими мотивами (ITIMS). Привлечение различных цитоплазматических ферментов в такие структуры обуславливает результат FcγR-опосредованных клеточных ответов. К ITAM-содержащим комплексам FcyR относятся FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, тогда как к ITIM-содержащим комплексам относится только FcyRIIB. Человеческие нейтрофилы экспрессируют ген FcyRIIA. Группировка FcyRIIA посредством иммунных комплексов или сшивания со специфическими антителами способствует агрегации ITAM с рецептор-ассоциированными киназами, которые облегчают фосфорилирование ITAM. Фосфорилирование ITAM выполняет роль сайта докинга для Syk-киназы, активация которой приводит в результате к активации последующих субстратов (например, PI3K). Клеточная активация приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов. Ген FcyRIIB экспрессируется на Влимфоцитах; его внеклеточный домен на 96% идентичен FcyRIIA и связывает комплексы IgG неразличимым образом. Наличие ITIM в цитоплазматическом домене FcyRIIB определяет этот ингибирующий подкласс FcyR.Activating and inhibitory signals are transduced when the Fc region is ligated to the Fc cellular receptor (FcyR). The ability of such ligation to lead to diametrically opposed functions stems from structural differences among the various receptor isoforms. The different responses give rise to two distinct domains in the receptor's cytoplasmic signaling domains, termed immunoreceptor tyrosine activating motifs (ITAM) and immunoreceptor tyrosine inhibitory motifs (ITIMS). The recruitment of various cytoplasmic enzymes into such structures results in FcγR-mediated cellular responses. ITAM-containing FcyR complexes include FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, while ITIM-containing complexes include only FcyRIIB. Human neutrophils express the FcyRIIA gene. Grouping FcyRIIA via immune complexes or cross-linking with specific antibodies promotes ITAM aggregation with receptor-associated kinases that facilitate ITAM phosphorylation. Phosphorylation of ITAM acts as a docking site for Syk kinase, the activation of which results in the activation of subsequent substrates (eg, PI3K). Cellular activation leads to the release of pro-inflammatory mediators. The FcyRIIB gene is expressed on B lymphocytes; its extracellular domain is 96% identical to FcyRIIA and binds IgG complexes in an indistinguishable manner. The presence of ITIM in the cytoplasmic domain of FcyRIIB defines this inhibitory subclass of FcyR.

Недавно была установлена молекулярная основа такого ингибирования. При совместном лигировании с активирующим FcyR, ITIM в FcyRIIB становится фосфорилированным и притягивает домен SH2 инозитолполифосфат-5'-фосфатазы (SHIP), который гидролизирует фосфоинозитоловые мессенджеры, высвобождаемые в результате активации ITAM-содержащей FcyR-зависимой тирозинкиназы, в результате предотвращается приток внутриклеточного Ca++. Таким образом, перекрестное сшивание FcyRIIB ослабляет активирующий ответ на лигирование FcyR и ингибирует клеточную ответную реакцию. Следовательно, активация В-клеток, пролиферация В-клеток и секреция антител прекращаются.The molecular basis for this inhibition has recently been established. When co-ligated with an activating FcyR, ITIM in FcyRIIB becomes phosphorylated and attracts the SH2 domain of inositol polyphosphate 5'-phosphatase (SHIP), which hydrolyzes phosphoinositol messengers released by activation of the ITAM-containing FcyR-dependent tyrosine kinase, thereby preventing intracellular Ca++ influx. Thus, FcyRIIB cross-linking attenuates the activating response to FcyR ligation and inhibits the cellular response. Consequently, B cell activation, B cell proliferation, and antibody secretion cease.

III. Биспецифические антитела, мультиспецифические диатела и диатела DART®III. Bispecific antibodies, multispecific diabodies and DART® diabodies

Функциональность антител может быть повышена путем создания мультиспецифических молекул на основе антител, которые могут одновременно связывать два отдельных и разных антигена (или различные эпитопы одного и того же антигена), и/или путем создания молекулы на основе антител, имеющей более высокую валентность (т. е. более двух сайтов связывания) для одного эпитопа и/или антигена.Antibody functionality can be enhanced by designing multispecific antibody molecules that can simultaneously bind two separate and different antigens (or different epitopes of the same antigen) and/or by designing an antibody molecule that has a higher valency (i.e. e. more than two binding sites) for one epitope and/or antigen.

Для получения молекул, обладающих большими функциональными возможностями, чем природные антитела, был разработан широкий спектр форматов рекомбинантных биспецифических антител (см., например, PCT публикации WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), большинство из которых предусматривают приTo obtain molecules with greater functionality than natural antibodies, a wide range of recombinant bispecific antibody formats have been developed (see, for example, PCT publications WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), most of which provide for

- 14 041483 менение линкерных пептидов либо для слияния дополнительного эпитоп-связывающего фрагмента (например, scFv, VL, VH и т.д.) с остовом антитела или в остове антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), либо для слияния множества эпитопсвязывающих фрагментов (например, двух Fab-фрагментов или scFvs). Альтернативные форматы предусматривают применение линкерных пептидов для слияния эпитопсвязывающего фрагмента (например, scFv, VL, VH и т.д.) с доменом димеризации, таким как домен СН2СН3, или альтернативными полипептидами (WO 2005/070966, WO 2006/W7786A WO 2006/107617А, WO 2007/046893). Как правило, такие подходы предусматривают компромиссы и баланс преимуществ и недостатков. Например, в PCT публикациях wO 2013/174873, WO 2011/133886 и WO 2010/136172 раскрыто, что применение линкеров может вызывать проблемы в терапевтических планах, и предложено триспецифическое антитело, в котором домены CL и СН1 переключены из их соответствующих природных положений, а домены VL и VH сделаны разнообразными (WO 2008/027236, WO 2010/108127) для обеспечения им возможности связываться с более чем одним антигеном. Таким образом, в раскрытых в этих документах молекулах специфичность связывания принесена в жертву способности связывать дополнительные виды антигенов. В PCT публикациях WO 2013/163427 и WO 2013/119903 раскрыта модификация домена СН2 для включения аддукта слитого белка, содержащего связывающий домен. В документе отмечается, что домен СН2, вероятно, играет лишь минимальную роль в опосредовании эффекторной функции. В PCT публикациях WO 2010/028797, WO 2010028796 и WO 2010/028795 раскрыты рекомбинантные антитела, Fc-участки которых были заменены дополнительными доменами VL и VH с образованием трехвалентных связывающих молекул. В PCT публикациях WO 2003/025018 и WO2003012069 раскрыты рекомбинантные диатела, отдельные цепи которых содержат домены scFv. В PCT публикации WO 2013/006544 раскрыты многовалентные молекулы Fab, которые синтезируются в виде единой полипептидной цепи, а затем подвергаются протеолизу с образованием на выходе гетеродимерных структур. Таким образом, у раскрытых в этих документах молекул полную или частичную способность опосредовать эффекторную функцию принесена в жертву способности связывать дополнительные виды антигенов. В PCT публикациях WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 и WO 1991/003493 раскрыто добавление дополнительных связывающих доменов или функциональных групп к антителу или части антитела (например, добавление диатела к легкой цепи антитела, или добавление дополнительных доменов VL и VH к легким и тяжелым цепям антитела, или добавление гетерологичного слитого белка, или связывание нескольких доменов Fab друг с другом в цепь). Таким образом, у раскрытых в этих документах молекул нативная структура антитела принесена в жертву способности связывать дополнительные виды антигенов.- 14 041483 changing linker peptides either to fuse an additional epitope-binding fragment (e.g. scFv, VL, VH, etc.) to the backbone of the antibody or in the backbone of the antibody (IgA, IgD, IgE, IgG or IgM), or to merge a plurality of epitope-binding fragments (eg, two Fab fragments or scFvs). Alternative formats involve the use of linker peptides to fuse an epitope-binding moiety (e.g. scFv, VL, VH, etc.) to a dimerization domain such as a CH2CH3 domain or alternative polypeptides (WO 2005/070966, WO 2006/W7786A WO 2006/107617A WO 2007/046893). As a rule, such approaches involve trade-offs and a balance of advantages and disadvantages. For example, PCT publications wO 2013/174873, WO 2011/133886 and WO 2010/136172 disclose that the use of linkers can cause problems in therapeutic plans and propose a trispecific antibody in which the CL and CH1 domains are switched from their respective natural positions, and the VL and VH domains are diversified (WO 2008/027236, WO 2010/108127) to enable them to bind to more than one antigen. Thus, in the molecules disclosed in these documents, binding specificity is sacrificed for the ability to bind additional types of antigens. PCT publications WO 2013/163427 and WO 2013/119903 disclose the modification of the CH2 domain to include a fusion protein adduct containing a binding domain. The document notes that the CH2 domain probably plays only a minimal role in mediating effector function. PCT publications WO 2010/028797, WO 2010028796 and WO 2010/028795 disclose recombinant antibodies whose Fc regions have been replaced with additional VL and VH domains to form trivalent binding molecules. PCT publications WO 2003/025018 and WO2003012069 disclose recombinant diabodies, individual strands of which contain scFv domains. PCT publication WO 2013/006544 discloses multivalent Fab molecules that are synthesized as a single polypeptide chain and then proteolyzed to form heterodimeric structures at the output. Thus, in the molecules disclosed in these documents, full or partial ability to mediate an effector function is sacrificed for the ability to bind additional types of antigens. In PCT Publications WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 2007/075270, WO 2007/075270 /022583 and WO 1991/003493 disclose the addition of additional binding domains or functional groups to an antibody or antibody portion (for example, adding a diabody to an antibody light chain, or adding additional VL and VH domains to the light and heavy chains of an antibody, or adding a heterologous fusion protein, or linking several Fab domains to each other in a chain). Thus, in the molecules disclosed in these documents, the native structure of the antibody is sacrificed for the ability to bind additional types of antigens.

Кроме того, в уровне техники отмечалась возможность получения диател, которые отличаются от таких природных антител способностью связывать два или более различных видов эпитопов (т. е. характеризуются биспецифичностью или мультиспецифичностью в дополнение к двухвалентности или многовалентности) (см., например, Holliger et al. (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); uS 2004/0220388/WO 02/02781 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) Covalent Disulfide-LinkedAnti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange, Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P. A. et al. (2009) Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy, Cancer Res. 69(12):4941-4944).In addition, the prior art has noted the possibility of obtaining diabodies that differ from such natural antibodies by the ability to bind two or more different types of epitopes (i.e., are characterized by bispecificity or multispecificity in addition to bivalentity or multivalence) (see, for example, Holliger et al (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc Natl Acad Sci (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388/WO 02 /02781 (Mertens et al.) Alt et al (1999) FEBS Lett 454(1-2):90-94 Lu, D. et al (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) Covalent Disulfide-LinkedAnti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Protein Eng . Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange, Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P. A. et al. (2009) Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy, Cancer Res. 69(12):4941-4944).

Конструкция диатела основана на производном антитела, известном как одноцепочечный фрагмент вариабельного домена (scFv). Такие молекулы получают путем связывания вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепи с помощью короткого соединяющего пептида. В свою очередь, линкеры можно модифицировать для дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно получить либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетического получения scFv можно применять автоматизированный синтезатор. Для рекомбинантного получения scFv подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, который кодирует scFv, можно ввести в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как дрожжевые клетки, клетки растения, насекомого или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, можно получить обычными манипуляциями, такими как лигирование полинуклеотидов. Полученный в результате scFv можно выделить с помощью стандартных методик очистки белка, известных из уровня техники.The design of the diabody is based on an antibody derivative known as a single chain variable domain fragment (scFv). Such molecules are produced by linking the light and/or heavy chain variable domains with a short bridging peptide. In turn, linkers can be modified for additional functions such as drug attachment or attachment to solid supports. Single chain variants can be produced either recombinantly or synthetically. An automated synthesizer can be used to synthesize scFv. For recombinant scFv production, a suitable plasmid containing a polynucleotide that encodes an scFv can be introduced into a suitable host cell, either eukaryotic, such as yeast, plant, insect, or mammalian cells, or prokaryotic, such as E. coli. Polynucleotides encoding the scFv of interest can be obtained by conventional manipulations such as polynucleotide ligation. The resulting scFv can be isolated using standard protein purification techniques known in the art.

Создание немоноспецифических диател дает значительное преимущество перед антителами, включая без ограничения способность совместно лигировать и совместно локализовать клетки, которые эксThe generation of non-monospecific diabodies offers significant advantages over antibodies, including, but not limited to, the ability to co-ligate and co-localize cells that are

- 15 041483 прессируют различные эпитопы. Таким образом, биспецифические диатела имеют широкий спектр применений, в том числе в терапии и иммунодиагностике. Биспецифичность обеспечивает большую гибкость в конструировании и разработке диатела для различных задач, в обеспечении повышенной авидности к мультимерным антигенам, в перекрестном сшивании различных антигенов и в направленном нацеливании на конкретные типы клеток, исходя из наличие обоих целевых антигенов. Благодаря их повышенной валентности, низким скоростям диссоциации и быстрому выведению из кровотока (для диател небольших размеров, на уровне или ниже ~50 кДа), для известных из уровня техник молекул диател также было продемонстрировано особое применение в области визуализации опухоли (Fitzgerald et al. (1997) Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichiapastoris, Protein Eng. 10:1221).- 15 041483 press various epitopes. Thus, bispecific diabodies have a wide range of applications, including therapy and immunodiagnostics. The bispecificity allows greater flexibility in the design and development of the diabody for different purposes, in providing increased avidity for multimeric antigens, in cross-linking different antigens, and in targeting specific cell types based on the presence of both target antigens. Due to their increased valency, low dissociation rates, and rapid clearance from the circulation (for small diabodies, at or below ~50 kDa), prior art diabody molecules have also shown particular utility in tumor imaging (Fitzgerald et al. ( 1997) Improved Tumor Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichiapastoris, Protein Eng. 10:1221).

Биспецифичность диател привела к их применению для совместного лигирования различных клеток, например, перекрестного сшивания цитотоксических Т-клеток с опухолевыми клетками (Staerz et al. (1985) Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By TCells, Nature 314:628-631, и Holliger et al. (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). Альтернативно, или дополнительно, биспецифические диатела можно применять для совместного лигирования рецепторов на поверхности различных клеток или на одной клетке. Совместное лигирование различных клеток и/или рецепторов полезно для модулирования эффекторных функций и/или передачи сигналов у иммунной клетки. Мультиспецифические молекулы (например, биспецифические диатела), содержащие эпитоп-связывающие сайты, могут быть направлены на поверхностную детерминанту любой иммунной клетки, такую как В7-Н3 (CD276), В7-Н4 (VTCN1), BTLA (CD272), CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70 (CD27L), CD80 (В7-1), CD86 (В7-2), CD94 (KLRD1), CD137 (4-1ВВ), CD137L (4-1BBL), CD226, CTLA-4 (CD152), галектин-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS (CD278), ICOSL (CD275), рецептор активации киллеров (KIR), LAG-3 (CD223), LIGHT (TNFSF14, CD258), МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40 (CD134), OX40L (CD134L), PD1H, PD-1 (CD279), PD-L1 (B7-H1, CD274), PD-L2 (B7-CD, CD273), PVR (NECL5, CD155), SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 (HAVCR2) и/или VISTA (PD-1H), которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, натуральных киллерах (NK), антигенпрезентирующих клетках или других мононуклеарных клетках. Так, в частности, эпитопсвязывающие сайты, направленные на рецептор клеточной поверхности, который участвует в регуляции иммунной контрольной точки (или ее лиганда), полезны для создания биспецифических или мультиспецифических связывающих молекул, которые антагонизируют или блокируют передачу ингибирующего сигнала молекулами иммунной контрольной точки и тем самым стимулируют, повышают или усиливают иммунные ответы у субъекта. К молекулам, участвующим в регуляции иммунных контрольных точек, относятся без ограничения В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектин-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 и/или VISTA.The bispecificity of diabodies has led to their use for co-ligation of various cells, such as crosslinking cytotoxic T cells with tumor cells (Staerz et al. (1985) Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By TCells, Nature 314:628-631, and Holliger et al (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, Protein Eng 9:299-305 Marvin et al (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). Alternatively, or additionally, bispecific diabodies can be used to co-ligate receptors on the surface of different cells or on the same cell. Co-ligation of different cells and/or receptors is useful for modulating effector functions and/or signaling in an immune cell. Multispecific molecules (e.g., bispecific diabodies) containing epitope binding sites can target any immune cell surface determinant such as B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA (CD272), CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70 (CD27L), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD94 (KLRD1), CD137 (4-1BB), CD137L (4-1BBL ), CD226, CTLA-4 (CD152), galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS (CD278), ICOSL (CD275), killer activation receptor (KIR), LAG-3 (CD223), LIGHT (TNFSF14, CD258 ), MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40 (CD134), OX40L (CD134L), PD1H, PD-1 (CD279), PD-L1 (B7-H1, CD274), PD-L2 (B7-CD, CD273), PVR (NECL5, CD155), SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 (HAVCR2), and/or VISTA (PD-1H) that are expressed on T-lymphocytes, natural killer (NK), antigen-presenting cells, or other mononuclear cells. Thus, in particular, epitope-binding sites directed to a cell surface receptor that is involved in the regulation of the immune checkpoint (or its ligand) are useful for designing bispecific or multispecific binding molecules that antagonize or block inhibitory signal transmission by immune checkpoint molecules and thereby stimulate, increase or enhance immune responses in the subject. Molecules involved in the regulation of immune checkpoints include, but are not limited to, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, Galectin-9 , GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa , TCR, TIGIT, TIM-3 and/or VISTA.

Тем не менее, вышеупомянутые преимущества обходятся высокой ценой. Для образование таких немоноспецифических диател необходима успешная сборка двух или более разных и различных полипептидов (т.е. для такого образования необходимо, чтобы диатела образовывались посредством гетеродимеризации полипептидных цепей различных видов). Этот факт сильно отличает их от моноспецифических диател, которые образуются посредством гомодимеризации идентичных полипептидных цепей. Поскольку должны быть представлены по меньшей мере два разнородных полипептида (т. е. полипептиды двух видов) для образования немоноспецифического диатела, а также поскольку гомодимеризация таких полипептидов приводит к получению неактивных молекул (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583588), получение таких полипептидов необходимо осуществлять таким образом, чтобы предотвратить ковалентное связывание между полипептидами одного вида (т.е. предотвратить гомодимеризацию) (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588). Таким образом, в уровне техники было раскрыто нековалентное связывание таких полипептидов (см., например, Olafsen et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Lu D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity , J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).However, the aforementioned benefits come at a high price. The formation of such non-monospecific diabodies requires the successful assembly of two or more different and distinct polypeptides (ie, such formation requires that diabodies are formed by heterodimerization of polypeptide chains of different species). This fact greatly distinguishes them from monospecific diabodies, which are formed by homodimerization of identical polypeptide chains. Because at least two heterogeneous polypeptides (i.e., two kinds of polypeptides) must be present to form a non-monospecific diabody, and because homodimerization of such polypeptides results in inactive molecules (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583588), the production of such polypeptides must be done in such a way as to prevent covalent binding between polypeptides of the same species (i.e., prevent homodimerization) (Takemura, S et al (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588). Thus, the non-covalent binding of such polypeptides has been disclosed in the art (see, e.g., Olafsen et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, Lu D. et al (2005) A Fully Human Recombinant IgG- Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol Chem 280(20): 19665-19672).

Тем не менее, из уровня техники известно, что биспецифические диатела, состоящие из нековалентно связанных полипептидов, являются нестабильными и легко диссоциируют на нефункциональные мономеры (см., например, Lu, D. et al. (2005) А Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced AntiHowever, it is known in the art that bispecific diabodies composed of non-covalently linked polypeptides are unstable and readily dissociate into non-functional monomers (see, e.g., Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Anti

- 16 041483 tumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).- 16 041483 tumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).

Ввиду этой проблемы, в области техники удалось разработать стабильные, ковалентно связанные гетеродимерные немоноспецифические диатела, называемые диателами DART® (Dual Affinity ReTargeting Reagents - целенаправленные реагенты с двойной аффинностью); см., например, патентные публикации США №№ 2013-0295121, 2010-0174053 и 2009-0060910; публикации европейских патентов №№ EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 и PCT публикации WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538, WO 2008/157379, WO 2006/113665 и Sloan, D.D. et al. (2015) Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells, PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.l005233; A1 Hussaini, M. et al. (2015) Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform, Blood 127(1): 122-131; Chichili, G.R. et al. (2015) A CD3xCDI23 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates, Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold, Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion, J. Mol. Biol. 399(3):436-449; Marvin, J.S. et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Olafsen, T. et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Holliger, P. et al. (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448. Такие диатела содержат два или более ковалентно связанных в комплекс полипептида и предусматривают включение способами инженерии одного или нескольких цистеиновых остатков в каждом из используемых видов полипептида, которые обеспечивают образование дисульфидных связей и тем самым ковалентно связывают две полипептидные цепи. Например, было показано, что добавление цистеинового остатка к С-концу таких конструкций позволяет образовать дисульфидную связь между полипептидными цепями, стабилизируя полученный в результате гетеродимер без вмешательства в характеристики связывания двухвалентной молекулы. Каждый из двух полипептидов простейшего биспецифического диатела DART® содержит три домена. Первый полипептид содержит (в направлении от N-конца к Сконцу):In view of this problem, the art has been able to develop stable, covalently linked heterodimeric non-monospecific diabodies, called DART® (Dual Affinity ReTargeting Reagents) diabodies; see, for example, US Patent Publication Nos. 2013-0295121, 2010-0174053 and 2009-0060910; European Patent Publications Nos. EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 and PCT Publications WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538, WO 2008/157379, WO 2006/113665 and D.D. et al. (2015) Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells, PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.l005233; A1 Hussaini, M. et al. (2015) Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform, Blood 127(1): 122-131; Chichili, G.R. et al. (2015) A CD3xCDI23 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates, Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold, Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion, J. Mol. Biol. 399(3):436-449; Marvin, J.S. et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. sin. 26:649-658; Olafsen, T. et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Holliger, P. et al. (1993) 'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 90:6444-6448. Such diabodies contain two or more covalently complexed polypeptides and involve the incorporation of one or more cysteine residues in each of the polypeptide species used, by means of engineering, which provide for the formation of disulfide bonds and thereby covalently link the two polypeptide chains. For example, the addition of a cysteine residue to the C-terminus of such constructs has been shown to allow the formation of a disulfide bond between polypeptide chains, stabilizing the resulting heterodimer without interfering with the binding characteristics of the divalent molecule. Each of the two polypeptides of the simplest bispecific DART® diabody contains three domains. The first polypeptide contains (in the direction from the N-terminus to the C-terminus):

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), и (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеин-содержащий домен) и способствующий образованию гетеродимера домен, который способствует гетеродимеризации со вторым полипептидом диатела и ковалентно связывает первый и второй полипептид диатела друг с другом.(i) a first domain that contains the immunoglobulin light chain variable domain binding site of the first immunoglobulin (VL1), (ii) a second domain that contains the immunoglobulin heavy chain variable domain binding site of the second immunoglobulin (VH2), and (iii) a third domain that contains the cysteine a residue (or cysteine-containing domain) and a heterodimer-promoting domain that promotes heterodimerization with the second diabody polypeptide and covalently links the first and second diabody polypeptide to each other.

Второй полипептид содержит (в направлении от N-конца к С-концу):The second polypeptide contains (in the direction from the N-terminus to the C-terminus):

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеинсодержащий домен) и комплементарный способствующий образованию гетеродимера домен, который образует комплекс со способствующим образованию гетеродимера доменом первой полипептидной цепи для того, чтобы способствовать гетеродимеризации с первой полипептидной цепью.(i) a first domain that contains a second immunoglobulin light chain variable domain binding site (VL2), (ii) a second domain that contains a first immunoglobulin heavy chain variable domain binding site (VH1), and (iii) a third domain that contains a cysteine a residue (or cysteine-containing domain); and a complementary heterodimer-promoting domain that forms a complex with the heterodimer-promoting domain of the first polypeptide chain to promote heterodimerization with the first polypeptide chain.

Цистеиновый остаток (или цистеин-содержащий домен) третьего домена второй полипептидной цепи способствует образованию ковалентной связи второй полипептидной цепи с первой полипептидной цепью диатела. Такие молекулы являются стабильными, высокоактивными и обладают способностью одновременно связывать два или более антигенов. В соответствии с одним вариантом осуществления третьи домены каждого из первого и второго полипептидов содержат цистеиновый остаток, который предназначен для связывания полипептидов друг с другом посредством дисульфидной связи. На фиг. 1 представлено схематическое изображение такого диатела, в котором используются способствующие образованию гетеродимера домены с E-спиралью/K-спиралью и цистеинсодержащий линкер для ковалентного связывания. На фиг. 2 и 3А-3С показано, что один или оба полипептида могут дополнительно обладать последовательностью домена СН2-СН3, так чтобы комплексообразование между двумя полипептидами диатела формировало Fc-участок, который способен связываться с рецептором Fc у клеток (таких как В-лимфоциты, дендритные клетки, натуральные киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки). Как более подробно представлено ниже, домены СН2 и/или СН3 таких полипептидных цепей не обязательно должны быть идентичными по последовательности, и преимущественThe cysteine residue (or cysteine-containing domain) of the third domain of the second polypeptide chain promotes the formation of a covalent bond of the second polypeptide chain with the first polypeptide chain of the diabody. Such molecules are stable, highly active and have the ability to simultaneously bind two or more antigens. In accordance with one embodiment, the third domains of each of the first and second polypeptides contain a cysteine residue that is designed to link the polypeptides to each other via a disulfide bond. In FIG. 1 is a schematic representation of such a diabody utilizing E-helix/K-helix heterodimer promoting domains and a cysteine-containing linker for covalent bonding. In FIG. 2 and 3A-3C show that one or both of the polypeptides may additionally have a CH2-CH3 domain sequence such that complexation between the two diabody polypeptides forms an Fc region that is capable of binding to the Fc receptor in cells (such as B lymphocytes, dendritic cells , natural killers, macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils and mast cells). As presented in more detail below, the CH2 and/or CH3 domains of such polypeptide chains need not be identical in sequence, and advantageously

- 17 041483 но они модифицированы таким образом, чтобы это содействовало комплексообразованию между двумя полипептидными цепями.- 17 041483 but they are modified in such a way that it promotes complexation between two polypeptide chains.

Было описано множество вариантов таких молекул (см., например, патентные публикации США №№ 2015/0175697, 2014/0255407, 2014/0099318, 2013/0295121, 2010/0174053 и 2009/0060910; публикации европейских патентов №№ EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 и PCT публикации WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). Такие содержащие Fc-участок диатела DART® могут содержать две пары полипептидных цепей. Первая полипептидная цепь содержит (в направлении от Nконца к С-концу):Many variants of such molecules have been described (see, for example, US Patent Publications Nos. 2015/0175697, 2014/0255407, 2014/0099318, 2013/0295121, 2010/0174053 and 2009/0060910; European Patent Publications Nos. EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 and PCT publications WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). Such Fc-containing DART® diabodies may contain two pairs of polypeptide chains. The first polypeptide chain contains (in the direction from the N-terminus to the C-terminus):

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеинсодержащий домен) и способствует гетеродимеризации со вторым полипептидом диатела и ковалентно связывает первый и второй полипептид диатела друг с другом, и (iv) домен СН2-СН3.(i) a first domain that contains the immunoglobulin light chain variable domain binding site of the first immunoglobulin (VL1), (ii) a second domain that contains the immunoglobulin heavy chain variable domain binding site of the second immunoglobulin (VH2), (iii) a third domain that contains a cysteine residue (or cysteine-containing domain) and promotes heterodimerization with the second diabody polypeptide and covalently links the first and second diabody polypeptide to each other, and (iv) a CH2-CH3 domain.

(i) первый домен, который содержит участок связывания вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) второй домен, который содержит участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) третий домен, который содержит цистеиновый остаток (или цистеин-содержащий домен) и способствующий образованию гетеродимера домен, который способствует гетеродимеризации с первой полипептидной цепью.(i) a first domain that contains a second immunoglobulin light chain variable domain binding site (VL2), (ii) a second domain that contains a first immunoglobulin heavy chain variable domain binding site (VH1), and (iii) a third domain that contains a cysteine a residue (or cysteine-containing domain) and a heterodimer-promoting domain that promotes heterodimerization with the first polypeptide chain.

В этом случае два первых полипептида образуют комплекс друг с другом с образованием Fcучастка. На фиг. 3А-3С представлены схематические изображения трех вариантов таких диател с использованием различных способствующих образованию гетеродимера доменов.In this case, the first two polypeptides are complexed with each other to form an Fc region. In FIG. 3A-3C are schematic representations of three embodiments of such diabodies using different heterodimer-promoting domains.

Другие содержащие Fc-участок диатела DART® могут содержать три полипептидные цепи. Первый полипептид таких диател DART® содержит три домена:Others containing the Fc region of the diabody DART® may contain three polypeptide chains. The first polypeptide of such DART® diabodies contains three domains:

(i) VL1-содержащий домен, (ii) VL2-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.(i) a VL1 containing domain, (ii) a VL2 containing domain, and (iii) a domain containing a CH2-CH3 sequence.

Второй полипептид таких диател DART® содержит:The second polypeptide of such DART® diabodies contains:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентному связыванию первой полипептидной цепи диатела. Третий полипептид таких диател DART® содержит последовательность СН2-СН3.(i) a VL2 containing domain, (ii) a VH1 containing domain, and (iii) a domain that promotes heterodimerization and covalent binding of the first diabody polypeptide chain. The third polypeptide of such diabodies DART® contains the sequence CH2-CH3.

Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких диател DART® ассоциируются друг с другом с образованием сайт связывания VL1/VH1, который способен связываться с эпитопом, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Такие более сложные молекулы DART® также имеют цистеин-содержащие домены, функция которых заключается в образовании ковалентно связанного комплекса. Таким образом, первый и второй полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков в их соответствующих третьих доменах. Следует отметить, что первая и третья полипептидные цепи объединяются в комплекс друг с другом с образованием Fc-участка, который стабилизирован дисульфидной связью. На фиг. 4А-4В представлены схематические изображения таких диател, содержащих три полипептидные цепи.Thus, the first and second polypeptide chains of such DART® diabodies associate with each other to form a VL1/VH1 binding site that is capable of binding to an epitope as well as a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to a second epitope. These more complex DART® molecules also have cysteine-containing domains whose function is to form a covalently bonded complex. Thus, the first and second polypeptides are linked to each other via a disulfide bond involving cysteine residues in their respective third domains. It should be noted that the first and third polypeptide chains are complexed with each other to form an Fc region that is stabilized by a disulfide bond. In FIG. 4A-4B are schematic representations of such diabodies containing three polypeptide chains.

Еще одни содержащие Fc-участки диатела DART® могут содержать пять полипептидных цепей, которые могут содержать участки связывания из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей от трех или менее различных иммуноглобулинов (называемые VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3). Например, первая полипептидная цепь таких диател может содержать:Still other Fc regions of the DART® diabody may contain five polypeptide chains, which may contain binding sites from light and heavy chain variable domains from three or less different immunoglobulins (referred to as VL1/VH1, VL2/VH2 and VL3/VH3). For example, the first polypeptide chain of such diabodies may contain:

(i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.(i) a VH1 containing domain, (ii) a CH1 containing domain, and (iii) a domain containing a CH2-CH3 sequence.

Вторая и пятая полипептидные цепи таких диател могут содержать:The second and fifth polypeptide chains of such diabodies may contain:

(i) VL1-содержащий домен и (ii) CL-содержащий домен.(i) a VL1 containing domain; and (ii) a CL containing domain.

Третья полипептидная цепь таких диател может содержать:The third polypeptide chain of such diabodies may contain:

(i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен, (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, (iv) VL2-содержащий домен, (v) VH3-содержащий домен и(i) a VH1 containing domain, (ii) a CH1 containing domain, (iii) a domain containing a CH2-CH3 sequence, (iv) a VL2 containing domain, (v) a VH3 containing domain, and

- 18 041483 (vi) способствующий образованию гетеродимера домен, где способствующие образованию гетеродимера домены способствуют димеризации третьей цепи с четвертой цепью.- 18 041483 (vi) a heterodimer-promoting domain, wherein the heterodimer-promoting domains promote dimerization of the third strand with the fourth strand.

Четвертый полипептид таких диател может включать:The fourth polypeptide of such diabodies may include:

(i) VL3-содержащий домен, (ii) VH2-содержащий домен и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентному связыванию третьей полипептидной цепи диатела.(i) a VL3 containing domain, (ii) a VH2 containing domain, and (iii) a domain that promotes heterodimerization and covalent binding of the third diabody polypeptide chain.

В этом случае первый и третий полипептиды образуют комплекс друг с другом с образованием Fcучастка. Такие более сложные молекулы DART® также имеют цистеин-содержащие домены, функция которых заключается в образовании ковалентно связанного комплекса, так чтобы каждая полипептидная цепь была связана по меньшей мере с одной присоединяемой полипептидной цепью посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков. Предпочтительно такие домены расположены в порядке от N-конца к С-концу. На фиг. 5 представлены схематические изображения таких диател, содержащих пять полипептидных цепей.In this case, the first and third polypeptides are complexed with each other to form an Fc region. These more complex DART® molecules also have cysteine-containing domains, the function of which is to form a covalently linked complex such that each polypeptide chain is linked to at least one attached polypeptide chain via a disulfide bond involving cysteine residues. Preferably, such domains are arranged in N-terminal to C-terminal order. In FIG. 5 is a schematic representation of such diabodies containing five polypeptide chains.

Из уровня техники известны альтернативные конструкции для задач, где требуется четырехвалентная молекула, но не требуется Fc, включая без ограничения четырехвалентные тандемные антитела, также называемые TandAb (см., например, патентные публикации США №№ 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 2013-0189263; публикации европейских патентов №№ EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 и EP 1293514; PCT публикации WO 1999/057150, WO 2003/025018 и WO 2013/013700), которые образованы в результате гомодимеризации двух идентичных цепей, каждая из которых обладает доменом VH1, VL2, VH2 и VL2.Alternative constructs are known in the art for applications where a tetravalent molecule is required but no Fc is required, including, without limitation, tetravalent tandem antibodies, also referred to as TandAbs (see, for example, US Patent Publications Nos. 2005-0079170, 2007-0031436, 2010- 0099853, 2011-020667 2013-0189263; European Patent Publication Nos. EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 and EP 1293514; PCT Publication WO 1999/057150, WO 2003/025018 and WO 2013/0), which are formed by homodimerization) identical chains, each having a VH1, VL2, VH2 and VL2 domain.

Недавно были описаны трехвалентные структуры, включающие два связывающих домена по типу диатела и один домен отличного от диатела типа и Fc-участок (см., например, PCT заявку PCT/US15/33076 под названием Триспецифические связывающие молекулы и способы их применения (Tri-Specific Binding Molecules и Methods of Use Thereof), поданную 29 мая 2015 г.; и PCT/US 15/33081 под названием Триспецифические связывающие молекулы, которые специфически связываются со множеством антигенов злокачественных опухолей, и способы их применения (Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof), поданную 29 мая 2015 г.). Такие трехвалентные молекулы можно использовать для создания моноспецифических, биспецифических или триспецифических молекул. На фиг. 6A-6F представлены схематические изображения таких трехвалентных молекул, содержащих 3 или 4 полипептидные цепи.Recently, trivalent structures have been described that include two diabody-type binding domains and one non-diabody-type domain and an Fc region (see, for example, PCT application PCT/US15/33076 titled Tri-Specific Binding Molecules and Methods for Using Them). Binding Molecules and Methods of Use Thereof, filed May 29, 2015; and PCT/US 15/33081 titled Tri-Specific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Use Thereof, filed May 29, 2015). Such trivalent molecules can be used to create monospecific, bispecific or trispecific molecules. In FIG. 6A-6F are schematic representations of such trivalent molecules containing 3 or 4 polypeptide chains.

IV. Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретениюIV. LAG-3 binding molecules of the present invention

К предпочтительным связывающим LAG-3 молекулам по настоящему изобретению относятся антитела, диатела, BiTE и т.д., и они способны связываться со сплошной или дискретной (например, конформационной) частью (эпитопом) LAG-3 человека. Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению будут предпочтительно также характеризоваться способностью связываться с молекулами LAG-3 одного или нескольких отличных от человека видов, в частности, приматов (и особенно таких приматов, как яванский макак). Типичный полипептид LAG-3 человека (последовательность в NCBI NP_002277.4, включая сигнальную последовательность из 22 аминокислотных остатков (показанную подчеркнуто) и зрелый белок из 503 аминокислотных остатков) имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 5):Preferred LAG-3 binding molecules of the present invention include antibodies, diabodies, BiTE, etc., and are capable of binding to a continuous or discrete (eg, conformational) portion (epitope) of human LAG-3. The LAG-3 binding molecules of the present invention will preferably also be characterized by the ability to bind to LAG-3 molecules of one or more non-human species, in particular primates (and especially primates such as cynomolgus monkeys). A typical human LAG-3 polypeptide (the sequence in NCBI NP_002277.4, including the 22 amino acid signal sequence (shown underlined) and the 503 amino acid mature protein) has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5):

MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP WWAQEGAPA QLPCSPTIPLMWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP WWAQEGAPA QLPCSPTIPL

QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYTQDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APPHPAAPS SWGPRPRRYT

VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAAVLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA

VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASVVHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV

HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFNHWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN

VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTPVSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP

PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAIPGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI

ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEAITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA

QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHLQEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL

LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIELLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE

ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQLELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению характеризуются любым (одним или несколькими) из следующих критериев:In some embodiments, the LAG-3 binding molecules of the present invention are characterized by any (one or more) of the following criteria:

(1) специфически связывает LAG-3 человека в качестве эндогенно экспрессируемого на поверхности простимулированных Т-клеток человека;(1) specifically binds human LAG-3 as endogenously expressed on the surface of stimulated human T cells;

(2) специфически связывает LAG-3 человека с равновесной константой связывания (KD) 40 нМ или менее;(2) specifically binds human LAG-3 with a steady state binding constant (KD) of 40 nM or less;

(3) специфически связывает LAG-3 человека с равновесной константой связывания (K_D) 0,5 нМ или(3) specifically binds human LAG-3 with an equilibrium binding constant (K _D ) of 0.5 nM, or

- 19 041483 менее;- 19 041483 less;

(4) специфически связывает LAG-3 отличного от человека примата (например, LAG-3 яванского макака);(4) specifically binds non-human primate LAG-3 (eg, cynomolgus monkey LAG-3);

(5) специфически связывает LAG-3 отличного от человека примата с равновесной константой связывания (K_D) 50 нМ или менее;(5) specifically binds non-human primate LAG-3 with an equilibrium binding constant (K _D ) of 50 nM or less;

(6) специфически связывает LAG-3 отличного от человека примата с равновесной константой связывания (K_D) 5 нМ или менее;(6) specifically binds non-human primate LAG-3 with an equilibrium binding constant (K _D ) of 5 nM or less;

(7) ингибирует (т.е. блокирует или препятствует ему) связывание LAG-3 с МНС II класса;(7) inhibits (ie, blocks or interferes with) LAG-3 binding to MHC class II;

(8) стимулирует иммунный ответ;(8) stimulates the immune response;

(9) стимулирует антигенспецифический Т-клеточный ответ в качестве отдельного средства;(9) stimulates an antigen-specific T-cell response as a separate agent;

(10) проявляет синергизм с антителом к PD-1, стимулируя антигенспецифический Т-клеточный ответ;(10) synergizes with an anti-PD-1 antibody to stimulate an antigen-specific T cell response;

(11) связывает такой же эпитоп LAG-3, что и антитело к LAG-3: LAG-3 mAb 1 или LAG-3 mAb 6, и/или (12) не конкурирует с антителом к LAG-3 257F (BMS 986016, Medarex/BMS) за связывание с LAG-3 (например, по результатам измерений с помощью анализа Biacore).(11) binds the same LAG-3 epitope as an anti-LAG-3 antibody: LAG-3 mAb 1 or LAG-3 mAb 6, and/or (12) does not compete with an anti-LAG-3 antibody 257F (BMS 986016, Medarex/BMS) for binding to LAG-3 (eg as measured by Biacore assay).

Применяемый в контексте настоящего документа термин антигенспецифический Т-клеточный ответ относится к ответам, производимым Т-клетками, которые являются результатом стимуляции Тклетки антигеном, в отношении которого Т-клетка является специфической. К неограничивающим примерам ответов, производимых Т-клеткой при антигенспецифической стимуляции, относятся пролиферация и выработка цитокинов (например, выработку TNF-α, IFN-γ). Способность молекулы стимулировать антигенспецифический Т-клеточный ответ можно определить, например, с помощью описанного в настоящем документе анализа PBMC, простимулированных антигеном энтеротоксина типа В (SEB) Staphylococcus aureus.As used herein, the term antigen-specific T cell response refers to responses produced by T cells that result from stimulation of a T cell with an antigen for which the T cell is specific. Non-limiting examples of responses produced by a T cell upon antigen-specific stimulation include proliferation and cytokine production (eg, TNF-α, IFN-γ production). The ability of a molecule to stimulate an antigen-specific T cell response can be determined, for example, using the Staphylococcus aureus enterotoxin type B antigen (SEB) stimulated PBMC assay described herein.

Предпочтительные связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению имеют домены VH и/или VL мышиных моноклональных антител к LAG-3: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 6, и более предпочтительно имеют 1, 2 или все 3 CDR_H из домена VH и/или 1, 2 или все 3 CDRL из домена VL таких моноклональных антител к LAG-3. К таким предпочтительным связывающим LAG-3 молекулам относятся биспецифические (или мультиспецифические) антитела, химерные или гуманизированные антитела, BiTe, диатела и т. д. и такие связывающие молекулы, которые имеют вариантные Fc-участки.Preferred LAG-3 binding molecules of the present invention have the VH and/or VL domains of mouse anti-LAG-3 monoclonal antibodies: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 3 mAb 5 and/or LAG-3 mAb 6, and more preferably have 1, 2 or all 3 _H CDRs from the VH domain and/or 1, 2 or all 3 CDRLs from the VL domain of such anti-LAG-3 monoclonal antibodies. Such preferred LAG-3 binding molecules include bispecific (or multispecific) antibodies, chimeric or humanized antibodies, BiTe, diabodies, etc., and those binding molecules that have variant Fc regions.

Настоящее изобретение, в частности, относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим связывающий LAG-3 домен, который имеет:The present invention specifically relates to LAG-3 binding molecules containing a LAG-3 binding domain that has:

(A) (1) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1 или VL4 hLAG-3 mAb 1;(A) (1) three CDRHs from the VH domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 1 or VL4 hLAG-3 mAb 1;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;(2) three CDRLs from the VL domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 1;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;(3) three CDRHs from the VH domain of anti-LAG-3, LAG-3 mAb 1 and three CDRLs from the VL domain of anti-LAG-3, LAG-3 mAb 1;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;(4) VH domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 1;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;(5) VL domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 1;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1;(6) VH and VL domains of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 1;

(B) (1) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;(B) (1) three CDRHs from the VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 2;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;(2) three CDRLs from the VL domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 2;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;(3) three CDRHs from the VH domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 2 and three CDRLs from the VL domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;(4) VH domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 2;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;(5) VL domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 2;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 2;(6) VH and VL domains of antibodies to LAG-3, LAG-3 mAb 2;

(c) (1) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;(c) (1) three _H CDRs from the VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 3;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;(2) three CDRLs from the VL domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 3;

(3) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;(3) three _H CDRs from the VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 3 and three CDRLs from the VL domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 3;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;(4) VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 3;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;(5) VL domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 3;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 3;(6) VH and VL domains of antibodies to LAG-3, LAG-3 mAb 3;

(D) (1) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;(D) (1) three _H CDRs from the VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 4;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;(2) three CDRLs from the VL domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 4;

(3) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;(3) three _H CDRs from the VH domain of an anti-LAG-3, LAG-3 mAb 4 and three CDRLs from the VL domain of an anti-LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;(4) VH domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 4;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;(5) VL domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 4;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 4;(6) VH and VL domains of antibodies to LAG-3, LAG-3 mAb 4;

(E) (1) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;(E) (1) three _H CDRs from the VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 5;

- 20 041483 (2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;- 20 041483 (2) three CDRLs from the VL domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;(3) three CDRHs from the VH domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 5 and three CDRLs from the VL domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;(4) VH domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 5;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;(5) VL domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 5;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 5;(6) VH and VL domains of antibodies to LAG-3, LAG-3 mAb 5;

(F) (1) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;(F) (1) three CDRHs from the VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 6;

(2) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;(2) three CDRLs from the VL domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 6;

(3) три CDRH из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6 и три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;(3) three CDRHs from the VH domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 6 and three CDRLs from the VL domain of an antibody to LAG-3, LAG-3 mAb 6;

(4) домен VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;(4) VH domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 6;

(5) домен VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6;(5) VL domain of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 6;

(6) домены VH и VL антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 6, (G) (1) три CDRL из домена VL антитела к LAG-3, VL4 hLAG-3 mAb 1;(6) VH and VL domains of anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 6, (G) (1) three CDRLs from the VL domain of anti-LAG-3 antibody, VL4 hLAG-3 mAb 1;

(2) три CDR_H из домена VH антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1 и три CDR из домена VL антитела к LAG-3, VL4 hLAG-3 mAb 1; или который связывается или конкурирует за связывание с эпитопом, который иммуноспецифически связывает LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6.(2) three _H CDRs from the VH domain of an anti-LAG-3 antibody, LAG-3 mAb 1 and three CDRs from the VL domain of an anti-LAG-3 antibody, VL4 hLAG-3 mAb 1; or which binds or competes for binding to an epitope that immunospecifically binds LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, or LAG-3 mAb 6.

А. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 1A. Antibody to LAG, LAG-3 mAb 1

1. Мышиное антитело к антителу человека LAG-3 mAb 11. Mouse Anti-Human LAG-3 mAb 1

Аминокислотная последовательность домена VH LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 6) показана ниже (остатки CDRH показаны подчеркнутыми).The amino acid sequence of the VH domain of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 6) is shown below (CDRH residues are shown underlined).

QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMNWVKQA PGKVLKWMGWQIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMNWVKQA PGKVLKWMGW

INTYTGESTY ADDFEGRFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCARESINTYTGESTY ADDFEGRFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCARES

LYDYYSMDYW GQGTSVTVSSLYDYYSMDYW GQGTSVTVSS

CDRhI из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:8): NYGMNCDRhI from LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:8): NYGMN

CDR_H2 из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:9): WINTYTGESTYADDFEGCDR _H 2 from LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:9): WINTYTGESTYADDFEG

CDR_H3 из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 10): ESLYDYYSMDYCDR _H 3 from LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 10): ESLYDYYSMDY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 7 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggta taccttcaga aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg ttttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gtcaacatat gctgatgact tcgagggacg gtttgccttc tctttgggaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acatcctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagaatcc ctctatgatt actattctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctcaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 7 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggta taccttcaga aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg ttttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gtcaacatat gctgatgact tcgagggacg gtttgccttc tctttgggaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acatcctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagaatcc ctctatgatt actattctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 11) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 11) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DWVTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE RLIYLVSELD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKLE IKDWVTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE RLIYLVSELD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKLE IK

CDRlI of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:13): KSSQSLLHSDGKTYLNCDRlI of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:13): KSSQSLLHSDGKTYLN

CDR_l2 of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:14): LVSELDSCDR _l 2 of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:14): LVSELDS

CDR_L3 of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:15): WQGTHFPYTCDR _L 3 of LAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO:15): WQGTHFPYT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 12 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatgttgtgg tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccagag cgcctaatct atctggtgtc tgaactggac tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 12 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatgttgtgg tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccagag cgcctaatct atctggtgtc tgaactggac tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa

2. Гуманизация антитела к LAG-3 LAG-3 mAb 1 для образования hLAG-3 mAb 12. Humanization of anti-LAG-3 antibody LAG-3 mAb 1 to form hLAG-3 mAb 1

Вышеописанное мышиное антитело к LAG-3, LAG-3mAb 1, было гуманизировано для демонстрации возможности гуманизации антитела к LAG-3 с целью уменьшения его антигенности при введении принимающему такой препарат человеку. Гуманизация давала на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VH-2 hLAG-3 mAb 1, и четыреThe mouse anti-LAG-3 antibody described above, LAG-3mAb 1, has been humanized to demonstrate that an anti-LAG-3 antibody can be humanized to reduce its antigenicity when administered to a human host. Humanization yielded two humanized VH domains, herein referred to as VL-1 hLAG-3 mAb 1 and VH-2 hLAG-3 mAb 1, and four

- 21 041483 гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1, VL-2 hLAG-3 mAb 1, VL-3 hLAG-3 mAb 1 и VL-4 hLAG-3 mAb 1. Любой из гуманизированных доменов VL может формировать пару с гуманизированными доменами VH. Соответственно любое антитело, содержащее один из гуманизированных доменов VL, соединенный в паре с гуманизированным доменом VH, в общем называют hLAG-3 mAb 1, а конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL называют с указанием конкретных доменов VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VL-2 hLAG-3 mAb 1, в частности, называют hLAG-3 mAb 1 (1.2).- 21 041483 humanized VL domains, referred to herein as VL-1 hLAG-3 mAb 1, VL-2 hLAG-3 mAb 1, VL-3 hLAG-3 mAb 1 and VL-4 hLAG-3 mAb 1. Any of humanized VL domains can pair with humanized VH domains. Accordingly, any antibody containing one of the humanized VL domains paired with a humanized VH domain is collectively referred to as hLAG-3 mAb 1, and specific combinations of humanized VH/VL domains are referred to by indicating the specific VH/VL domains, for example, a humanized antibody, containing VL-1 hLAG-3 mAb 1 and VL-2 hLAG-3 mAb 1, in particular, called hLAG-3 mAb 1 (1.2).

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VL-1 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 16) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the VL-1 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 16) is shown below (CDR _H residues are shown underlined):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSSQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 17 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt attattgtgc ccgcgagagt ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac agtgagttccИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 17 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR _H , показаны подчеркнутыми): caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt attattgtgc ccgcgaggact ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac agtgagttcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VH-2 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 18) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the VH-2 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 18) is shown below (CDRH residues are shown underlined):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSSQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VH-2 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 19 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt atttctgtgc ccgcgagagt ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac agtgagttccИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VH-2 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 19 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): caggtgcaac tggttcaatc cggcgccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtgaaagtg tcctgtaagg catctgggta tacgttcaca aattatggta tgaactgggt gcgacaggca ccagggcagg gactggaatg gatggggtgg atcaatactt atacaggcga gagtacttat gctgacgatt tcgagggcag atttgtcttc tccatggaca ccagcgctag taccgcttat ctccagatta gttctctcaa ggcggaggac acagctgttt atttctgtgc ccgcgagagt ttgtatgact actatagcat ggattactgg ggacaaggta caaccgtgac agtgagttcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-1 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 20) (остатки CDR_L показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from VL-1 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 20) is shown below (CDR _L residues are shown underlined):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQSPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQSPE

RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 21 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca aagtccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 21 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca aagtccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-2 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 22) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the VL-2 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 22) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-2 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 23 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми):An exemplary polynucleotide that encodes for VL-2 hLAG-3 mAb 1 is SEQ ID NO: 23 (nucleotides encoding CDRL residues are shown underlined):

- 22 041483 gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactqq cttctgcaga qaccaqqcca aagtccaqag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggqa ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aqqccgaqqa cgtcggggtt tactactqtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttq gcggaggcac aaaagtggag attaaa- 22 041483 gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactqq cttctgcaga qaccaqqcca aagtccaqag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggqa ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aqqccgaqqa cgtcggggtt tactactqtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttq gcggaggcac aaaagtggag attaaa

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-3 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 24) (остатки CDR_L показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from VL-3 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 24) is shown below (CDR _L residues are shown underlined):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQPPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQPPE

RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFPRLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP

YTFGGGTKVE IKYTFGGGTKVE IK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-3 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 25 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactqg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-3 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 25 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg gaaagaccta tttgaactqg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-4 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 26) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the VL-4 hLAG-3 mAb 1 (SEQ ID NO: 26) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE

YTFGGGTKVE IKYTFGGGTKVE IK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-4 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 27 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg caaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-4 hLAG-3 mAb 1, представляет собой SEQ ID NO: 27 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gatatcgtta tgactcagac accactgtca ctgagtgtga ccccaggtca gcccgctagt atttcctgta aatcatccca gtccctcctg catagcgatg caaagaccta tttgaactgg cttctgcaga aaccaggcca accgccagag agattgatct acctcgtttc agaactcgac agtggagtgc ccgatcgctt ctcagggtcc ggctctggga ctgattttac tctcaagatc tcaagagtgg aggccgagga cgtcggggtt tactactgtt ggcagggtac ccacttccct tatacatttg gcggaggcac aaaagtggag attaaa

CDRL1 из домена VL, VL-4 hLAG-3 mAb 1, содержит аминокислотную замену глицина на аланин и имеет аминокислотную последовательность: KSSQSLLHSDAKTYLN (SEQ ID NO: 28), замененный аланин показан подчеркнутым). Предполагается, что аналогичная замена может быть включена в любой из описанных выше доменов CDRL1 LAG-3 mAb 1.CDRL1 from the VL domain, VL-4 hLAG-3 mAb 1, contains an amino acid substitution of glycine for alanine and has the amino acid sequence: KSSQSLLHSDAKTYLN (SEQ ID NO: 28, the alanine substitution is shown underlined). It is contemplated that a similar substitution could be included in any of the CDRL1 LAG-3 mAb 1 domains described above.

В. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 2B. Anti-LAG antibody, LAG-3 mAb 2

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO: 29) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO: 29) is shown below (CDR _H residues are shown underlined):

EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DYNIHWLRQS HGESLEWIGYEVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DYNIHWLRQS HGESLEWIGY

IYPYSGDIGY NQKFKNRATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWHIYPYSGDIGY NQKFKNRATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWH

RNYFGPWFAY WGQGTPVTVS ARNYFGPWFAY WGQGTPVTVS A

CDR_H1 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:31): DYNIHCDR _H 1 from LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:31): DYNIH

CDR_H2 VH из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:32): YIYPYSGDIGYNQKFKNCDR _H 2 VH from LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:32): YIYPYSGDIGYNQKFKN

CDR_H3 VH из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:33): WHRNYFGPWFAYCDR _H 3 VH from LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:33): WHRNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 2, представляет собой SEQ ID NO: 30 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaaqatt tcctgcaaga cttctggata cacatttact gactacaaca tacactqqtt gaggcagagc catggagaga gccttgagtg qattqqatat atttatcctt acagtggtga tattggatac aaccagaagt tcaagaacag ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc gcagcctgac atctgaagac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactccggt cactgtctct gcaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 2, представляет собой SEQ ID NO: 30 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR _H , показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaaqatt tcctgcaaga cttctggata cacatttact gactacaaca tacactqqtt gaggcagagc catggagaga gccttgagtg qattqqatat atttatcctt acagtggtga tattggatac aaccagaagt tcaagaacag ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc gcagcctgac atctgaagac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactccggt cactgtctct gca

- 23 041483- 23 041483

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO: 34) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO: 34) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKLDIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKL

LIYWSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL TFGAGTKLEL КLIYWSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL TFGAGTKLEL K

CDR_l1 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:36): KASQSVDYDGESYMNCDR _l 1 from LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:36): KASQSVDYDGESYMN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:37): WSNLESCDR _l 2 from LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:37): WSNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:38): QQSSEDPLTCDR _l 3 from LAG-3 mAb 2 (SEQ ID NO:38): QQSSEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 2, представляет собой SEQ ID NO: 35 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg Iaaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatg ttgtatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 2, представляет собой SEQ ID NO: 35 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg Iaaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatg ttgtatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggcag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

С. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 3C. Antibody to LAG, LAG-3 mAb 3

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO: 39) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO: 39) is shown below (CDR _H residues are shown underlined):

EVRLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVRQS HGQSLEWIGYEVRLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVRQS HGQSLEWIGY

IYPYNGDTGY NQKFKTKATL TVDNSSNTAY MELRSLASED SAVYYCTRWS RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS AIYPYNGDTGY NQKFKTKATL TVDNSSNTAY MELRSLASED SAVYYCTRWS RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A

CDRhI из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:41): DYNIHCDRhI from LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:41): DYNIH

CDR_H2 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:42): YIYPYNGDTGYNQKFKTCDR _H 2 from LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:42): YIYPYNGDTGYNQKFKT

CDR_H3 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:43): WSRNYFGPWFAYCDR _H 3 from LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:43): WSRNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 3, представляет собой SEQ ID NO: 40 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccggc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca ttcactgggt gaggcagagc catggacaga gccttgagtg gattggatat atttatcctt ataatggtga tactggctac aaccagaagt tcaagaccaa ggccacattg actgtagaca attcctccaa cacagcctac atggaactcc gcagcctggc atctgaagac tctgcagtct attactgtac aagatggagc aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 3, представляет собой SEQ ID NO: 40 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccggc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca ttcactgggt gaggcagagc catggacaga gccttgagtg gattggatat atttatcctt ataatggtga tactggctac aaccagaagt tcaagaccaa ggccacattg actgtagaca attcctccaa cacagcctac atggaactcc gcagcctggc atctgaagac tctgcagtct attactgtac aagatggagc aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO: 44) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO: 44) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIVLTQSPTS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL TFGAGTKLEL КDIVLTQSPTS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSSEDPL TFGAGTKLEL K

CDRlI из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:46): KASQSVDYDGDSYMNCDRlI from LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:46): KASQSVDYDGDSYMN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:47): AASNLESCDR _l 2 from LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:47): AASNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:48): QQSSEDPLTCDR _l 3 from LAG-3 mAb 3 (SEQ ID NO:48): QQSSEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 3, представляет собой SEQ ID NO: 45 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtat caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 3, представляет собой SEQ ID NO: 45 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccaacttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtat caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggcag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

D. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 4D. Anti-LAG antibody, LAG-3 mAb 4

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO: 49) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO: 49) is shown below (CDRH residues are shown underlined):

- 24 041483- 24 041483

EVQLHQSGPE LVKPGASVKI SCKTSGYTFT DYNIHWVKQS HGKSLEWIGY IYPYNGDAGY NQNFKTKATL TVDNSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARWN MNYFGPWFAY WGQGTLVTVS AA

CDRhI из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:51): DYNIHCDRhI from LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:51): DYNIH

CDR_H2 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:52): YIYPYNGDAGYNQNFKTCDR _H 2 from LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:52): YIYPYNGDAGYNQNFKT

CDR_H3 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:53): WNMNYFGPWFAYCDR _H 3 from LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:53): WNMNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-4 mAb 4, представляет собой SEQ ID NO: 50 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcaccagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata tcctgcaaga cttctggata cactttcact gactacaaca tacactgggt gaagcagagc catggaaaga gccttgagtg gattggatat atttatcctt acaatggtga tgctggctac aaccagaact tcaagaccaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatggaac atgaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcgИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-4 mAb 4, представляет собой SEQ ID NO: 50 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR _H , показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcaccagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata tcctgcaaga cttctggata cactttcact gactacaaca tacactgggt gaagcagagc catggaaaga gccttgagtg gattggatat atttatcctt acaatggtga tgctggctac aaccagaact tcaagaccaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatggaac atgaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcg

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO: 54) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO: 54) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGVTYINWY QQKPGQPPKL LIFAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSNEDPL TFGAGTKLEL КDIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGVTYINWY QQKPGQPPKL LIFAASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQQSNEDPL TFGAGTKLEL K

CDRlI из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:56): KASQSVDYDGVTYINCDRlI from LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:56): KASQSVDYDGVTYIN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:7570): AASNLESCDR _l 2 from LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:7570): AASNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:58): QQSNEDPLTCDR _l 3 from LAG-3 mAb 4 (SEQ ID NO:58): QQSNEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 4, представляет собой SEQ ID NO: 55 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg ttacttatat caactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctttg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 4, представляет собой SEQ ID NO: 55 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg ttacttatat caactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctttg ctgcatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggcag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

Е. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 5E. Antibody to LAG, LAG-3 mAb 5

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO: 59) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO: 59) is shown below (CDRH residues are shown underlined):

EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVKQS PGKSLEWIGY IYPYSGDFGY NQKFKSKATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWH RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS AEVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYNIHWVKQS PGKSLEWIGY IYPYSGDFGY NQKFKSKATL TVDNSSSTAY MDLRSLTSED SAVFYCARWH RNYFGPWFAY WGQGTLVTVS A

CDR_H1 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:61): DYNIHCDR _H 1 from LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:61): DYNIH

CDR_H2 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:62): YIYPYSGDFGYNQKFKSCDR _H 2 from LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:62): YIYPYSGDFGYNQKFKS

CDR_H3 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:63): WHRNYFGPWFAYCDR _H 3 from LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:63): WHRNYFGPWFAY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 5, представляет собой SEQ ID NO: 60 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagatt tcctgcaaag cttctggata cacatttact gactacaaca tacactgggt gaagcagagc cctggaaaga gccttgaatg gattggatat atttatcctt acagtggtga ttttggatac aaccagaagt tcaagagcaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 5, представляет собой SEQ ID NO: 60 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc ttcagcagtc aggacctgag ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagatt tcctgcaaag cttctggata cacatttact gactacaaca tacactgggt gaagcagagc cctggaaaga gccttgaatg gattggatat atttatcctt acagtggtga ttttggatac aaccagaagt tcaagagcaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac atggatctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct tttactgtgc aagatggcac aggaactact ttggcccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO: 64) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKLThe amino acid sequence of the VL domain from LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO: 64) is shown below (CDRL residues are shown underlined): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGESYMNWY QQKPGQPPKL

- 25 041483- 25 041483

CDRlI из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:66): KASQSVDYDGESYMNCDRlI from LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:66): KASQSVDYDGESYMN

CDR_l2 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:67): WSNLESCDR _l 2 from LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:67): WSNLES

CDR_l3 из LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:68): QQSSEDPLTCDR _l 3 from LAG-3 mAb 5 (SEQ ID NO:68): QQSSEDPLT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 5, представляет собой SEQ ID NO: 65 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_L, показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg Iaaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatg ttgtttccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 5, представляет собой SEQ ID NO: 65 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR _L , показаны подчеркнутыми): gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg Iaaagttatat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatttatg ttgtttccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtagtga ggatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa

F. Антитело к LAG, LAG-3 mAb 6F. Anti-LAG antibody, LAG-3 mAb 6

1. Мышиное антитело к антителу человека LAG-3 mAb 61. Mouse Anti-Human LAG-3 mAb 6

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 69) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 69) is shown below (CDR _H residues are shown underlined):

EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMDWVKQS HGESLEWIGD INPDNGVTIY NQKFEGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSSEVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMDWVKQS HGESLEWIGD INPDNGVTIY NQKFEGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS

CDR_H1 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:71): DYNMDCDR _H 1 from LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:71): DYNMD

CDR_H2 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:72): DINPDNGVTIYNQKFEGCDR _H 2 from LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:72): DINPDNGVTIYNQKFEG

CDR_H3 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:72): EADYFYFDYCDR _H 3 from LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:72): EADYFYFDY

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 70 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR_H, показаны подчеркнутыми): gaggtcctgc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc catggagaga gccttgagtg gattggagat attaatcctg acaatggtgt tactatctac aa^cagaagt ttgagggcaa ggccacactg actgtagaca agtcctccag tacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaqagaggcg gattacttct actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcaИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VH из LAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 70 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDR _H , показаны подчеркнутыми): gaggtcctgc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc catggagaga gccttgagtg gattggagat attaatcctg acaatggtgt tactatctac aa^cagaagt ttgagggcaa ggccacactg actgtagaca agtcctccag tacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaqagaggcg gattacttct actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 74) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 74) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITCKASQDVS SWAWYQQKP GQSPKLLIFS ASYRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKDIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITCKASQDVS SWAWYQQKP GQSPKLLIFS ASYRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK

CDRlI из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:76): KASQDVSSWACDRlI from LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:76): KASQDVSSWA

CDR_l2 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:77): SASYRYTCDR _l 2 from LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:77): SASYRYT

CDR_l3 из LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:78): QQHYSTPWTCDR _l 3 from LAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO:78): QQHYSTPWT

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 75 (нуклеотиды, кодирующие CDR, показаны подчеркнутыми): gacattgtga tgacccagtc tcacagattc atgtccacat cagttggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt tctgttgtag cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaattact gattttttcg gcatcctacc ggtacactqg agtccctgat cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gcagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa aИллюстративный полинуклеотид, который кодирует домен VL из LAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 75 (нуклеотиды, кодирующие CDR, показаны подчеркнутыми): gacattgtga tgacccagtc tcacagattc atgtccacat cagttggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt tctgttgtag cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaattact gattttttcg gcatcctacc ggtacactqg agtccctgat cgcttcactg a

2. Гуманизация антитела к LAG-3 LAG-3 mAb 6 для образования hLAG-3 mAb 62. Humanization of Anti-LAG-3 Antibody LAG-3 mAb 6 to Generate hLAG-3 mAb 6

Вышеописанное мышиное антитело к LAG-3, LAG-3mAb 6, было гуманизировано для демонстрации возможности гуманизации антитела к LAG-3 с целью уменьшения его антигенности при введении принимающему такой препарат человеку. Гуманизация дала на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VH-2 hLAG-3 mAb 6, и два гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VL-2 hLAG-3 mAb 6. Любой из гуманизированных доменов VL может формировать пару с любым из гуманизированных доменов VH. Соответственно любое антитело, содержащее один из гуманизированных доThe mouse anti-LAG-3 antibody described above, LAG-3mAb 6, was humanized to demonstrate the ability to humanize an anti-LAG-3 antibody to reduce its antigenicity when administered to a human host. Humanization yielded two humanized VH domains, herein referred to as VL-1 hLAG-3 mAb 6 and VH-2 hLAG-3 mAb 6, and two humanized VL domains, herein referred to as VL-1 hLAG-3 mAb 6 and VL-2 hLAG-3 mAb 6. Any of the humanized VL domains can pair with any of the humanized VH domains. Accordingly, any antibody containing one of the humanized to

- 26 041483 менов VL, соединенный в паре с гуманизированным доменом VH, в общем называют hLAG-3 mAb 6, а конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL называют с указанием конкретных доменов VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VL-2 hLAG-3 mAb 6, в частности, называют hLAG-3 mAb 6 (1.2).- 26 041483 A VL name paired with a humanized VH domain is collectively referred to as hLAG-3 mAb 6 and specific combinations of humanized VH/VL domains are referred to by specific VH/VL domains, e.g., a humanized antibody containing the VL-1 hLAG -3 mAb 6 and VL-2 hLAG-3 mAb 6 are specifically referred to as hLAG-3 mAb 6 (1.2).

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VL-1 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 79) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the VL-1 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 79) is shown below (CDRH residues are shown underlined):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMDWVRQA PGQGLEWMGDQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMDWVRQA PGQGLEWMGD

INPDNGVTIY NQKFEGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSSINPDNGVTIY NQKFEGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 80 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): caggtccagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcaag cgtgaaggtg tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt ccgacaggcc ccaggacagg gcctggaatg gatgggcgac atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaaat tcgagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac atggaactgc ggtccctgcg gagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctccИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 80 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): caggtccagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcaag cgtgaaggtg tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt ccgacaggcc ccaggacagg gcctggaatg gatgggcgac atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaaat tcgagggcag agtgaccatg accaccgaca ccagcaccag caccgcctac atggaactgc ggtccctgcg gagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH из VH-2 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 81) (остатки CDR_H показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain from the VH-2 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 81) is shown below (CDR _H residues are shown underlined):

EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMDWVRQA PGKGLEWVSDEVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMDWVRQA PGKGLEWVSD

INPDNGVTIY NQKFEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSSINPDNGVTIY NQKFEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VH-2 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 82 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc gactacaaca tggactgggt ccgacaggcc cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgac atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaagt tcgagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctccИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VH-2 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 82 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, показаны подчеркнутыми): gaggtccagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtcaagc ctggcggcag cctgagactg agctgcgctg ccagcggctt caccttcagc gactacaaca tggactgggt ccgacaggcc cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccgac atcaaccccg acaacggcgt gaccatctac aaccagaagt tcgagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggcc gactacttct acttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgtc ctcc

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-1 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 83) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the VL-1 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 83) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYSDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGGASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG

GTKLEIKGTKLEIK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 84 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccagc agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa gИллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-1 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 84 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми): gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccagc agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa g

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL из VL-2 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 85) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain from the VL-2 hLAG-3 mAb 6 (SEQ ID NO: 85) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKDIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK

Иллюстративный полинуклеотид, который кодирует VL-2 hLAG-3 mAb 6, представляет собой SEQ ID NO: 86 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, показаны подчеркнутыми):An exemplary polynucleotide that encodes for VL-2 hLAG-3 mAb 6 is SEQ ID NO: 86 (nucleotides encoding CDRL residues are shown underlined):

- 27 041483 gacatcgtga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccgat agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc gaggacatcg ccgtttacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa g- 27 041483 gacatcgtga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggccagcca ggatgtgtcc agcgtggtgg cctggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccgat agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc gaggacatcg ccgtttacta ctgccagcag cactacagca ccccctggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa g

CDRL1 из домена VL, VL-1 и VL-2 hLAG-3 mAb 2, содержит аминокислотную замену лизина на аргинин и имеет аминокислотную последовательность rasqdvsswa (SEQ ID NO: 87), замененный аргинин показан подчеркнутым). Предполагается, что аналогичная замена может быть включена в любую из описанных выше областей LAG-3 mAb 6 CDRL1.CDRL1 from the VL domain, VL-1 and VL-2 of hLAG-3 mAb 2, contains the amino acid substitution of lysine for arginine and has the amino acid sequence rasqdvsswa (SEQ ID NO: 87, the substitution arginine is shown underlined). It is contemplated that a similar substitution could be included in any of the LAG-3 mAb 6 CDRL1 regions described above.

Предусмотрены незначительные изменения в аминокислотной последовательности представленных в настоящем документе доменов VH и/или VL. Например, С-концевой аминокислотный остаток любого из описанных в настоящем документе доменов VH и/или VL может быть заменен для облегчения субклонирования.Minor changes in the amino acid sequence of the VH and/or VL domains presented herein are contemplated. For example, the C-terminal amino acid residue of any of the VH and/or VL domains described herein may be substituted to facilitate subcloning.

V. Антитела к LAG-3, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 6, и их производные, имеющие сконструированный Fc-участокV. Antibodies to LAG-3, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 and/or LAG-3 mAb 6, and their derivatives, having an engineered Fc region

В традиционной иммунной функции взаимодействие комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы приводит в результате к широкому спектру ответов, начиная от эффекторных функций, таких как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, до иммуномодулирующих сигналов, таких как регуляция пролиферации лимфоцитов и секреции антител. Все эти взаимодействия инициируются при связывании Fc-участка антител или иммунных комплексов со специализированными рецепторами клеточной поверхности на гематопоэтических клетках. Разнообразие клеточных ответов, запускаемых антителами и иммунными комплексами, обусловлено структурной гетерогенностью трех рецепторов Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) и FcyRIII (CD16) являются активирующими (т.е. усиливающими иммунную систему) рецепторами; FcyRIIB (CD32B) является ингибирующим (т.е. ослабляющим иммунную систему) рецептором. Кроме того, взаимодействие с неонатальным рецептором Fc (FcRn) опосредует рециркуляцию молекул IgG из эндосомы на клеточную поверхность и высвобождение в кровь. Выше представлена аминокислотная последовательность иллюстративного IgG1 (SEQ ID NO: 1), IgG2 (SEQ ID NO: 2), IgG3 (SEQ ID NO: 3) и IgG4 (SEQ ID NO: 4)In traditional immune function, the interaction of antibody-antigen complexes with cells of the immune system results in a wide range of responses ranging from effector functions such as antibody-dependent cytotoxicity, mast cell degranulation and phagocytosis to immunomodulatory signals such as regulation of lymphocyte proliferation and antibody secretion. All of these interactions are initiated by binding of the Fc region of antibodies or immune complexes to specialized cell surface receptors on hematopoietic cells. The diversity of cellular responses triggered by antibodies and immune complexes is due to the structural heterogeneity of three Fc receptors: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), and FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A), and FcyRIII (CD16) are activating (i.e., boosting the immune system) receptors; FcyRIIB (CD32B) is an inhibitory (ie, weakening of the immune system) receptor. In addition, interaction with the neonatal Fc receptor (FcRn) mediates the recycling of IgG molecules from the endosome to the cell surface and release into the blood. Above is the amino acid sequence of exemplary IgG1 (SEQ ID NO: 1), IgG2 (SEQ ID NO: 2), IgG3 (SEQ ID NO: 3), and IgG4 (SEQ ID NO: 4)

Модификация Fc-участка обычно приводит к изменению фенотипа, например, изменению периода полужизни в сыворотке, изменению стабильности, изменению восприимчивости к клеточным ферментам или изменению эффекторной функции. Может быть необходима модификация антитела или другой связывающей молекулы по настоящему изобретению в отношении эффекторной функции, например, с тем чтобы повысить эффективность такой молекулы при лечении злокачественной опухоли. В некоторых случаях необходимо уменьшение или исключение эффекторной функции, например, в случае антител, механизм действия которых предусматривает блокировку или антагонизм, но не уничтожение клеток, несущих целевой антиген. Повышенная эффекторная функция, как правило, необходима в отношении нежелательных клеток, таких как опухолевые и чужеродные клетки, где FcyR экспрессируются на низких уровнях, например опухолеспецифические В-клетки с низкими уровнями FcyRIIB (например, при неходжкинской лимфоме, CLL и лимфоме Беркитта). В соответствии с указанными вариантами осуществления молекулы по настоящему изобретению, которым придали или изменили эффекторную функциональную активность, полезны для лечения и/или предупреждения заболевания, нарушения или инфекции, при которых необходима повышенная эффективность эффекторной функциональной активности.Modification of the Fc region typically results in a change in phenotype, such as a change in serum half-life, a change in stability, a change in susceptibility to cellular enzymes, or a change in effector function. It may be necessary to modify the antibody or other binding molecule of the present invention with respect to effector function, for example, in order to increase the effectiveness of such a molecule in the treatment of cancer. In some cases, it is necessary to reduce or eliminate the effector function, for example, in the case of antibodies, the mechanism of action of which is to block or antagonize, but not kill, cells bearing the target antigen. Increased effector function is generally required for unwanted cells such as tumor and foreign cells where FcyRs are expressed at low levels, such as tumor-specific B cells with low levels of FcyRIIB (eg, in non-Hodgkin's lymphoma, CLL and Burkitt's lymphoma). In accordance with these embodiments, the molecules of the present invention, which have been given or changed effector functional activity, are useful for the treatment and/or prevention of a disease, disorder or infection in which an increased effectiveness of effector functional activity is needed.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок, который имеет одну или несколько модификаций (например, замены, делеции или вставки) относительно последовательности аминокислот Fc-участка дикого типа (например, SEQ ID NO: 1), которые уменьшают аффинность и авидность Fc-участка и, следовательно, молекулы по настоящему изобретению к одному или нескольким рецепторам FcyR. В соответствии с другими вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок, который имеет одну или несколько модификаций относительно аминокислот Fc-участка дикого типа, которые увеличивают аффинность и авидность Fc-участка и, следовательно, молекулы по настоящему изобретению к одному или нескольким рецепторам FcyR. В соответствии с другими вариантами осуществления, молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или опосредует повышенную активность, а именно антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), и/или повышенное связывание с FcyRIIA относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с альтернативными вариантами осуществления молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или опосредует пониженную ADCC-активность (или другую эффекторную функцию) и/или повышенное связывание сIn some embodiments, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise an Fc region that has one or more modifications (e.g., substitutions, deletions, or insertions) relative to the amino acid sequence of the wild-type Fc region (e.g., SEQ ID NO: 1), which reduce the affinity and avidity of the Fc region, and hence the molecule of the present invention, for one or more FcyR receptors. In accordance with other embodiments, the molecules of the present invention comprise an Fc region that has one or more modifications relative to the amino acids of the wild-type Fc region that increase the affinity and avidity of the Fc region, and therefore the molecules of the present invention, for one or more FcyR receptors. In other embodiments, the molecules contain a variant Fc region, said variant conferring or mediating increased activity, namely antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), and/or increased binding to FcyRIIA relative to a molecule lacking an Fc region or containing an Fc -land of the wild type. In alternative embodiments, the molecules contain a variant Fc region, said variant conferring or mediating reduced ADCC activity (or other effector function) and/or increased binding to

- 28 041483- 28 041483

FcyRIIB относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим вариантный Fc-участок, причем у такого вариантного Fc-участка не наблюдают поддающегося детекции связывания с любым FcyR относительно сравниваемой молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим вариантный Fc-участок, причем такой вариантный Fc-участок связывает лишь один FcyR, предпочтительно один из FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIIIA. Любую такую повышенную аффинность и/или авидность предпочтительно оценивают путем измерения in vitro степени поддающегося детекции связывания с FcyR или FcyR-связанной активности в клетках, которые экспрессируют низкие уровни FcyR, если активность связывания исходной молекулы (без модифицированного Fc-участка) нельзя детектировать в клетках, или в клетках, которые экспрессируют целевые антигены отличного от FcyR рецептора с плотностью от 30000 до 20000 молекул/клетка, с плотностью от 20000 до 10000 молекул/клетка, с плотностью от 10000 до 5000 молекул/клетка, с плотностью от 5000 до 1000 молекул/клетка, с плотностью от 1000 до 200 молекул/клетка или с плотностью 200 молекул/клетка или менее (но по меньшей мере 10, 50, 100 или 150 молекул/клетка).FcyRIIB relative to a molecule that does not contain an Fc region or contains a wild type Fc region. In some embodiments, the present invention relates to LAG-3 binding molecules containing a variant Fc region, wherein such variant Fc region does not show detectable binding to any FcyR relative to a comparison molecule containing the wild-type Fc region. In accordance with other embodiments, the present invention relates to LAG-3 binding molecules containing a variant Fc region, and such a variant Fc region binds only one FcyR, preferably one of FcyRIIA, FcyRIIB or FcyRIIIA. Any such increased affinity and/or avidity is preferably assessed by in vitro measurement of the degree of detectable FcyR binding or FcyR-related activity in cells that express low levels of FcyR if the binding activity of the parent molecule (without the modified Fc region) cannot be detected in the cells. , or in cells that express target non-FcyR receptor antigens at a density of 30,000 to 20,000 molecules/cell, at a density of 20,000 to 10,000 molecules/cell, at a density of 10,000 to 5,000 molecules/cell, at a density of 5,000 to 1,000 molecules /cell, with a density of 1000 to 200 molecules/cell, or with a density of 200 molecules/cell or less (but at least 10, 50, 100 or 150 molecules/cell).

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению могут содержать вариантный Fcучасток, имеющий измененные аффинности в отношении активирующего и/или ингибирующего рецептора Fcy. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула содержит вариантный Fc-участок, который обладает повышенной аффинностью в отношении FcyRIIB и пониженной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fcучастком дикого типа. В соответствии с другим вариантом осуществления, связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит вариантный Fc-участок, который обладает пониженной аффинностью в отношении FcyRIIB и повышенной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fcучасток, который обладает пониженной аффинностью в отношении FcyRIIB и пониженной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который обладает неизмененной аффинность в отношении FcyRIIB и пониженной (или повышенной) аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа.The LAG-3 binding molecules of the present invention may contain a variant Fc region having altered affinities for an activating and/or inhibitory Fcy receptor. In one embodiment, the LAG-3 binding molecule contains a variant Fc region that has increased affinity for FcyRIIB and reduced affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA relative to a wild-type Fc region comparison molecule. According to another embodiment, the LAG-3 binding molecule of the present invention comprises a variant Fc region that has reduced affinity for FcyRIIB and increased affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA relative to a comparable molecule with a wild-type Fc region. In yet another embodiment, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region that has reduced affinity for FcyRIIB and reduced affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA relative to the comparison molecule with the wild-type Fc region. In yet another embodiment, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region that has unchanged affinity for FcyRIIB and reduced (or increased) affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA relative to the comparison molecule with the wild-type Fc region. type.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, обладающий измененной аффинностью в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA с тем, чтобы иммуноглобулин имел усиленную эффекторную функцию. К неограничивающим примерам эффекторных клеточных функций относятся антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность, антителозависимый фагоцитоз, фагоцитоз, опсонизация, опсонофагоцитоз, клеточное связывание, розеткообразование, связывание с C1q и комплементзависимая клеточноопосредованная цитотоксичность.In some embodiments, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region having altered affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA such that the immunoglobulin has enhanced effector function. Non-limiting examples of effector cellular functions include antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, antibody-dependent phagocytosis, phagocytosis, opsonization, opsonophagocytosis, cell binding, rosette formation, C1q binding, and complement-dependent cell-mediated cytotoxicity.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, изменение аффинности или эффекторной функции является по меньшей мере 2-кратным, предпочтительно по меньшей мере 4-кратным, по меньшей мере 5-кратным, по меньшей мере 6-кратным, по меньшей мере 7-кратным, по меньшей мере 8кратным, по меньшей мере 9-кратным, по меньшей мере 10-кратным, по меньшей мере 50-кратным или по меньшей мере 100-кратным относительно сравниваемой молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения, вариантный Fcучасток иммуноспецифически связывает один или несколько FcR с аффинностью, которая по меньшей мере на 65%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 125%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 175%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 225% или по меньшей мере на 250% больше, чем у молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. Такие измерения можно осуществлять с помощью in vivo или in vitro анализа, и в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, in vitro анализами, такими как анализы ИФА или на основе поверхностного плазмонного резонанса.According to a preferred embodiment, the change in affinity or effector function is at least 2-fold, preferably at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, at least 10-fold, at least 50-fold, or at least 100-fold relative to the comparison molecule containing the wild-type Fc region. In accordance with other embodiments of the present invention, the variant Fc region immunospecifically binds one or more FcRs with an affinity that is at least 65%, preferably at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 100%, at least 125%, at least 150%, at least 175%, at least 200%, at least 225%, or at least 250% more than a molecule containing a wild-type Fc region. Such measurements can be made using in vivo or in vitro assays, and according to a preferred embodiment, in vitro assays such as ELISA or surface plasmon resonance assays.

В соответствии с различными вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант оказывает агонистическое действие по меньшей мере на одну активность рецептора FcyR или антагонистическое действие по меньшей мере на одну активность рецептора FcyR. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления молекулы содержат вариант, который оказывает антагонистическое действие на одну или несколько активностей FcyRIIB, например, опосредуемой В-клеточным рецептором передачу сигнала, активацию В-клеток, пролиферацию В-клеток, выработку антител, приток внутриклеточного кальция у В-клеток, прогрессирование клеточного цикла, FcyRIIB-опосредуемое ингибирование передачи сигналаIn various embodiments, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region, wherein said variant agonistically affects at least one FcyR receptor activity or antagonizes at least one FcyR receptor activity. According to a preferred embodiment, the molecules comprise a variant that antagonizes one or more FcyRIIB activities, e.g., B cell receptor-mediated signaling, B cell activation, B cell proliferation, antibody production, intracellular calcium influx at B- cells, cell cycle progression, FcyRIIB-mediated inhibition of signal transduction

- 29 041483- 29 041483

FcεRI, фосфорилирование FcyRIIB, SHIP-рекрутинг, SHIP-фосфорилирование и ассоциацию с Shc, или активность одной или нескольких последующих молекул (например, МАР-киназы, JNK, р38 или Akt) в пути сигнальной транедукции с участием FcyRIIB. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариант, который оказывает агонистическое действие на одну или несколько активностей FcεRI, например активацию тучных клеток, мобилизацию кальция, дегрануляцию, выработку цитокинов или высвобождение серотонина.FcεRI, FcyRIIB phosphorylation, SHIP recruitment, SHIP phosphorylation, and association with Shc, or the activity of one or more downstream molecules (eg, MAP kinase, JNK, p38, or Akt) in the FcyRIIB signal transduction pathway. In another embodiment, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant that agonizes one or more FcεRI activities, such as mast cell activation, calcium mobilization, degranulation, cytokine production, or serotonin release.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы содержат Fc-участок, содержащий участки от двух или более изотипов IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). В контексте настоящего документа говорят, что Fc-участок относится к определенному изотипу IgG, если его аминокислотная последовательность является наиболее гомологичной такому изотипу относительно других изотипов IgG. Различные изотипы IgG характеризуются различными физическими и функциональными свойствами, включая период полужизни в сыворотке, связывание комплемента, аффинности связывания FcyR и активности эффекторных функций (например, ADCC, CDC и т.д.), из-за различий в аминокислотных последовательностях их шарнира и/или Fc-участков, например, как описано у Flesch и Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; или Brhggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361. Такой тип вариантного Fc-участка можно использовать отдельно или в комбинации с аминокислотной модификацией для воздействия на Fc-опосредованную эффекторную функцию и/или активность связывания. В комбинации аминокислотная модификация и шарнир/Fc-участоk IgG могут проявлять сходную функциональность (например, повышенную аффинность в отношении FcyRIIA) и могут действовать аддитивно или, что более предпочтительно синергически, модифицируя эффекторную функциональность молекулы по настоящему изобретению относительно молекулы по настоящему изобретению, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления аминокислотная модификация и Fc-участок IgG могут проявлять противоположную функциональность (например, соответственно повышенную и пониженную аффинность в отношении FcyRIIA) и могут действовать, селективно ослабляя или уменьшая специфическую функциональность молекуле по настоящему изобретению относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа того же изотипа.In some embodiments, the molecules comprise an Fc region containing regions from two or more IgG isotypes (eg, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4). In the context of this document, an Fc region is said to belong to a particular IgG isotype if its amino acid sequence is most homologous to that isotype relative to other IgG isotypes. Different IgG isotypes have different physical and functional properties, including serum half-life, complement fixation, FcyR binding affinities, and activity of effector functions (e.g., ADCC, CDC, etc.), due to differences in the amino acid sequences of their hinge and/or or Fc regions, for example, as described in Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; or Brhggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361. This type of variant Fc region can be used alone or in combination with an amino acid modification to affect Fc-mediated effector function and/or binding activity. In combination, the amino acid modification and the hinge/Fc region of IgG may exhibit similar functionality (e.g., increased affinity for FcyRIIA) and may act additively, or more preferably synergistically, to modify the effector functionality of a molecule of the present invention relative to an Fc-containing molecule of the present invention. -land of the wild type. In other embodiments, the amino acid modification and the IgG Fc region may exhibit opposite functionality (e.g., increased and decreased affinity for FcyRIIA respectively) and may act to selectively attenuate or reduce the specific functionality of a molecule of the present invention relative to a molecule that does not contain an Fc- plot or containing a wild type Fc region of the same isotype.

В соответствии с предпочтительным конкретным вариантом осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-участка дикого типа, так чтобы указанная молекула имела измененную аффинность в отношении FcR, при условии, что указанный вариантный Fc-участок не имеет замены в положениях, которые непосредственно контактируют с FcyR, по результатам кристаллографического и структурного анализа взаимодействий Fc-FcR, таких как описанные у Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73. Примерами положений в Fcучастке, которые непосредственно контактируют с FcyR, являются аминокислотные остатки 234-239 (шарнирный участок), аминокислотные остатки 265-269 (петля В/С), аминокислотные остатки 297-299 (петля С7Е) и аминокислотные остатки 327-332 (петля F/G). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы по настоящему изобретению содержат вариантные Fc-участки, которые содержат модификацию по меньшей мере одного остатка, которая не создает непосредственного контакта с FcyR, по результатам кристаллографического и структурного анализа, например, не находится в сайте связывания Fc-FcyR.In accordance with a preferred specific embodiment, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region, wherein said variant Fc region contains at least one amino acid modification relative to the wild-type Fc region such that said molecule has an altered affinity for FcR, provided that said variant Fc region has no substitution at positions that directly contact the FcR, based on crystallographic and structural analysis of Fc-FcR interactions such as those described by Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73. Examples of positions in the Fc region that directly contact FcyR are amino acid residues 234-239 (hinge region), amino acid residues 265-269 (B/C loop), amino acid residues 297-299 (C7E loop), and amino acid residues 327-332 ( loop F/G). In accordance with some embodiments, the molecules of the present invention contain variant Fc regions that contain a modification of at least one residue that does not create direct contact with FcyR, as determined by crystallographic and structural analysis, for example, is not located in the Fc-FcyR binding site .

Вариантные Fc-участки хорошо известны из уровня техники, и в соответствии с настоящим изобретением, можно применять любой известный вариантный Fc-участок для придания или модификации эффекторной функции, проявляемой молекулой по настоящему изобретению, содержащей Fc-участок (или его часть), согласно результатам функционального анализа, например, в NK-зависимом или макрофагзависимом анализе. Например, варианты Fc-участка, выявленные как изменяющие эффекторную функцию, раскрыты в PCT публикациях WO 04/063351, WO 06/088494, WO 07/024249, WO 06/113665, WO 07/021841, WO 07/106707 и WO 2008/140603, и в настоящих молекулах можно применять любой подходящий раскрытый в них вариант.Variant Fc regions are well known in the art, and in accordance with the present invention, any known variant Fc region can be used to confer or modify the effector function exhibited by a molecule of the present invention containing an Fc region (or part thereof), according to the results functional analysis, for example, in NK-dependent or macrophage-dependent analysis. For example, Fc region variants identified as altering effector function are disclosed in PCT Publications WO 04/063351, WO 06/088494, WO 07/024249, WO 06/113665, WO 07/021841, WO 07/106707 and WO 2008/ 140603, and any suitable embodiment disclosed therein can be used in the present molecules.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, имеющий одну или несколько аминокислотных модификаций в одном или нескольких участках, при этом модификация(ии) изменяет (относительно Fc-участка дикого типа) соотношение аффинностей вариантного Fc-участка к активирующему FcyR (такому как FcyRIIA или FcyRIIIA) относительно ингибирующего FcyR (такого как FcyRIIB):In some embodiments, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region having one or more amino acid modifications at one or more regions, wherein the modification(s) alters (relative to the wild-type Fc region) the affinity ratio of the variant Fc region to an activating FcyR (such as FcyRIIA or FcyRIIIA) relative to an inhibitory FcyR (such as FcyRIIB):

Изменение у дикого типа к вариантному аффинности к ГсуКлктивирующийChange in wild-type to variant affinity for GsCl-activating

Соотношение аффинностей= ___________________________________________________Affinity ratio = _________________________________________________

Изменение у дикого типа к вариантному аффиности к ГсуДингибирующийChange in wild-type to variant affinity for GsuDinginhibitory

Особенно предпочтительными являются связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, которые имеют вариантный Fc-участок (относительно Fc-участка дикого типа), при этом такой вариантный Fc-участок имеет соотношение аффинностей, превышающее 1. Такие молекулы особенно поParticularly preferred are the LAG-3 binding molecules of the present invention which have a variant Fc region (relative to the wild-type Fc region), such variant Fc region having an affinity ratio greater than 1. Such molecules are particularly preferred.

- 30 041483 лезны при осуществлении терапевтического или профилактического лечения заболевания, нарушения или инфекции или ослаблении их симптома, когда необходима повышенная эффективность эффекторной клеточной функции (например, ADCC), опосредованной FcyR, например, в случае злокачественной опухоли или инфекционного заболевания. Для сравнения, вариантный Fc-участок, имеющий соотношение аффинностей менее 1, опосредует пониженную эффективность эффекторной клеточной функции. В табл. 1 приведены иллюстративные одиночные, двойные, тройные, четверные и пятикратные мутации по значениям их соотношения аффинностей, которые либо превышают 1, либо нет.- 30 041483 useful in the implementation of therapeutic or prophylactic treatment of a disease, disorder or infection, or attenuation of their symptoms, when you want to increase the effectiveness of effector cellular function (for example, ADCC) mediated by FcyR, for example, in the case of a malignant tumor or infectious disease. In comparison, a variant Fc region having an affinity ratio of less than 1 mediates a reduced efficiency of effector cellular function. In table. 1 shows exemplary single, double, triple, quadruple, and five-fold mutations by their affinity ratio values that are either greater than 1 or not.

- 31 041483- 31 041483

Таблица 1. Иллюстративные одиночные или множественные мутации, приведенные с помощью __________________соотношения аффинностей_____________Table 1. Illustrative single or multiple mutations given by __________________ affinity ratios______

Одино чная Single Двойная Double Тройная Triple Четверная quadruple Пятерная quintuple Соотношение аффинностей >1 Affinity ratio >1 F243L D270E R292G R292P F243L D270E R292G R292P F243L и R292P F243L и Y300L F243L и P396L D270E и P396L R292P и Y300L R292P и V305I R292P и P396L Y300L и P396L P396L и Q419H F243L and R292P F243L and Y300L F243L and P396L D270E and P396L R292P and Y300L R292P and V305I R292P and P396L Y300L and P396L P396L and Q419H F243L, P247L и N421K F243L, R292P и Y300L F243L, R292P и V305I F243L, R292P и P396L F243L, Y300L и P396L P247L, D270E и N421K R255L, D270E и P396L D270E, G316D и R416G D270E, К392Т и P396L D270E, P396L и Q419H V284M, R292L и K370N R292P, Y300L и P396L F243L, P247L and N421K F243L, R292P and Y300L F243L, R292P and V305I F243L, R292P and P396L F243L, Y300L and P396L P247L, D270E and N421K R255L, D270E and P396L D270E, G316D and R416G D270E, K392T and P396L D270E, P396L and Q419H V284M, R292L and K370N R292P, Y300L and P396L L234F, F243L, R292P и Y300L L235I, F243L, R292P и Y300L L235Q, F243L, R292P и Y300L F243L, P247L, D270EhN421K F243L, R255L, D270E и P396L F243L, D270E, G316DhR416G F243L, D270E, К392Т и P396L F243L, D270E, P396LhQ419H F243L, R292P, Y300L, и P396L F243L, R292P, V305I и P396L P247L, D270E, Y300LhN421K R255L, D270E, R292GhP396L R255L, D270E, Y300LhP396L L234F, F243L, R292P and Y300L L235I, F243L, R292P and Y300L L235Q, F243L, R292P and Y300L F243L, P247L, D270EhN421K F243L, R255L, D270E and P396L F243L, D270E, G316DhR416G F243L, D270E, K392T and P396L F243L, D270E, P396LhQ419H F243L, R292P, Y300L, and P396L F243L, R292P, V305I and P396L P247L, D270E, Y300LhN421K R255L, D270E, R292GhP396L R255L, D270E, Y300LhP396L L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L L235P, F243L, R292P, Y300L и P396L F243L, R292P, V305I, Y300L и P396L L235V, F243L, R292P, Y300L and P396L L235P, F243L, R292P, Y300L and P396L F243L, R292P, V305I, Y300L and P396L D270E, G316D, P396LhR416G D270E, G316D, P396LhR416G Соотношение аффинностей <1 Affinity ratio <1 Y300L Y300L F243L и P396L F243L and P396L F243L, R292P и V305I F243L, R292P and V305I P396L P396L P247L и N421K P247L and N421K R255L и P396L R255L and P396L R292P и V3O5I R292P and V3O5I К392Т и P396L K392T and P396L P396L и Q419H P396L and Q419H

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 или 330 и предпочтительно на один или несколько из следующих остатков: А240, I240, L241, L243, Н244, N298, I328 или V330. В соответствии с другим конкретным вариантомIn a particular embodiment, in variant Fc regions, any amino acid modifications (e.g., substitutions) occur at any of positions 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328, or 330, and preferably to one or more of the following residues: A240, I240, L241, L243, H244, N298, I328 or V330. According to another specific option

- 32 041483 осуществления в вариантных Fc-участках любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439 и предпочтительно на один или несколько из следующих остатков: Н280, Q280, Y280, G290, S290, Т290, Y290, N294, K295, Р296, D298, N298, Р298, V298, I300 или L300.- 32 041483 implementation in variant Fc regions, any amino acid modifications (for example, substitutions) occur at any of positions 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 or 439 and preferably one or more of the following residues : H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 or L300.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyR с измененной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Предпочтительно вариантный Fc-участок имеет любой из следующих остатков: А256, N268, Q272, D286, Q286, S286, А290, S290, А298, М301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, Т339, А333, А334, Е334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 или А430.In accordance with a preferred embodiment, in variant Fc regions that bind FcyR with altered affinity, any amino acid modifications (e.g., substitutions) occur at any of positions 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, or 439. Preferably, the variant Fc region has any of the following residues: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333 , A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 or A430.

В соответствии с другим вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyR (посредством его Fc-участка) с уменьшенной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 или 439.According to another embodiment, in variant Fc regions that bind FcyR (via its Fc region) with reduced affinity, any amino acid modifications (e.g., substitutions) occur at any of positions 252, 254, 265, 268, 269, 270 , 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414 , 416, 419, 434, 435, 437, 438 or 439.

В соответствии с другим вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyR (посредством его Fc-участка) с увеличенной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 или 430. В соответствии с другим вариантом осуществления в вариантных Fc-участках, которые связывают FcyRIIA с увеличенной аффинностью, находятся любые из следующих остатков: А255, А256, А258, А267, А268, N268, А272, q272, А276, А280, А283, А285, А286, D286, Q286, S286, А290, S290, М301, Е320, М320, Q320, R320, Е322, А326, D326, Е326, S326, K330, А331, Q335, А337 или А430.According to another embodiment, in variant Fc regions that bind FcyR (through its Fc region) with increased affinity, any amino acid modifications (e.g., substitutions) occur at any of positions 280, 283, 285, 286, 290, 294 , 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, or 430. According to another embodiment, in variant Fc regions that bind FcyRIIA with increased affinity, any of the following residues are found: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 or A430.

Предпочтительные варианты включают одну или несколько модификаций в любых положениях: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 или 332.Preferred options include one or more modifications in any position: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271 , 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 or 332.

Особенно предпочтительные варианты включают одну или несколько модификаций, выбранных из групп A-AI:Particularly preferred options include one or more modifications selected from groups A-AI:

- 33 041483- 33 041483

А A 228Е, 228К, 228Y или 228G; 228E, 228K, 228Y or 228G; В IN 230А, 23 0Е, 23 0Y или 23 0G; 230A, 23 0E, 23 0Y or 23 0G; С WITH 231Е, 231К, 231Y, 231Р или 231G; 231E, 231K, 231Y, 231P or 231G; D D 232Е, 232К, 232Y, 232G; 232E, 232K, 232Y, 232G; Е E 233D; 233D; F F 2341 или 234F; 2341 or 234F; G G 235D, 235Q, 23 5Р, 2351 или 235V; 235D, 235Q, 235P, 2351 or 235V; Н H 239D, 239Е, 239N или 239Q; 239D, 239E, 239N or 239Q; I I 240А, 2401, 240М или 240Т; 240A, 2401, 240M or 240T; J J 243R, 243, 243Y, 243L, 243Q, 243W, 243Н или 2431; 243R, 243, 243Y, 243L, 243Q, 243W, 243H or 2431; К TO 244Н; 244H; L L 245А; 245A; М M 247G, 247V или 247L; 247G, 247V or 247L; N N 262А, 262Е, 2621, 262Т, 262Е или 262F; 262A, 262E, 2621, 262T, 262E or 262F; О ABOUT 263А, 2631, 263М или 263Т; 263A, 2631, 263M or 263T; Р R 264F, 264Е, 264R, 2641, 264А, 264Т или 264W; 264F, 264E, 264R, 2641, 264A, 264T or 264W; Q Q 265F, 265Y, 265Н, 2651, 265L, 265Т, 265V, 265N или 265Q; 265F, 265Y, 265H, 2651, 265L, 265T, 265V, 265N or 265Q; R R 266А, 2661, 266М или 266Т; 266A, 2661, 266M or 266T; S S 271D, 271Е, 271N, 271Q, 271К, 271R, 271S, 271Т, 271Н, 271А, 271V, 271L, 2711, 271F, 271М, 271Y, 271W или 271G; 271D, 271E, 271N, 271Q, 271K, 271R, 271S, 271T, 271H, 271A, 271V, 271L, 2711, 271F, 271M, 271Y, 271W or 271G; т T 2731; 2731; и And 275L или 275W; 275L or 275W; V V 281D, 281К, 281Y или 281Р; 281D, 281K, 281Y or 281P; W W 284Е, 284N, 284Т, 284L, 284Y или284М; 284E, 284N, 284T, 284L, 284Y or 284M; X X 291D, 291Е, 291Q, 29IT, 291Н, 2911 или 291G; 291D, 291E, 291Q, 29IT, 291H, 2911 or 291G; Y Y 299А, 299D, 299Е, 299F, 299G, 299Н, 2991, 299К, 299L, 299М, 299N, 299Р, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W или 299Y; 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 2991, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W or 299Y; Z Z 3021; 3021; АА AA 304D, 304N, 304Т, 304Н или 304L 304D, 304N, 304T, 304H or 304L АВ AB 3051; 3051; АС AC 313F; 313F; AD AD 3231; 3231; АЕ AE 325А, 325D, 325Е, 325G, 325Н, 3251, 325L, 325К, 325R, 325S, 325F, 325М, 325Т, 325V, 325Y, 325W или 325Р; 325A, 325D, 325E, 325G, 325H, 3251, 325L, 325K, 325R, 325S, 325F, 325M, 325T, 325V, 325Y, 325W or 325P; AF AF 328D, 328Q, 328К, 328R, 328S, 328Т, 328V, 3281, 328Y, 328W, 328Р, 328G, 328А, 328Е, 328F, 328Н, 328М или 328N; 328D, 328Q, 328K, 328R, 328S, 328T, 328V, 3281, 328Y, 328W, 328P, 328G, 328A, 328E, 328F, 328H, 328M or 328N; AG AG 330L, 330Y, 3301 или 330V; 330L, 330Y, 3301 or 330V; АН AN 332А, 332D, 332Е, 332Н, 332N, 332Q, 332Т, 332К, 332R, 332S, 332V, 332L, 332F, 332М, 332W, 332Р, 332G или 332Y; и 332A, 332D, 332E, 332H, 332N, 332Q, 332T, 332K, 332R, 332S, 332V, 332L, 332F, 332M, 332W, 332P, 332G or 332Y; And AI AI 336Е, 336К или 336Y 336E, 336K or 336Y

Еще более особенные варианты включают одну или несколько модификаций, выбранных из групп 1-105:Even more specific options include one or more modifications selected from groups 1-105:

- 34 041483- 34 041483

Группа Group Вариант Option Группа Group Вариант Option 1 1 A330L/I332E A330L/I332E 54 54 S239D / D265L / N297D / I332E S239D / D265L / N297D / I332E 2 2 D265F/N297E/I332E D265F/N297E/I332E 55 55 S239D / D265T / N297D / I332E S239D / D265T / N297D / I332E 3 3 D265Y/N297D/I332E D265Y/N297D/I332E 56 56 S239D / D265V / N297D / I332E S239D / D265V / N297D / I332E 4 4 D265Y / N297D / T299L / I332E D265Y / N297D / T299L / I332E 57 57 S239D / D265Y / N297D / I332E S239D / D265Y / N297D / I332E 5 5 F241E / F243Q / V262T / V264F F241E / F243Q / V262T / V264F 58 58 S239D /133 2D S239D /133 2D 6 6 F241E / F243Q / V262T / V264E / I332E F241E / F243Q / V262T / V264E / I332E 59 59 S239D / I332E S239D / I332E 7 7 F241E / F243R / V262E / V264R F241E / F243R / V262E / V264R 60 60 S239D/I332E/A330I S239D/I332E/A330I 8 8 F241E / F243R / V262E / V264R / I332E F241E / F243R / V262E / V264R / I332E 61 61 S239D / I332N S239D / I332N 9 9 F241E / F243Y / V262T / V264R F241E / F243Y / V262T / V264R 62 62 S239D / I332Q S239D / I332Q 10 10 F241E / F243Y / V262T / V264R / I332E F241E / F243Y / V262T / V264R / I332E 63 63 S239D/N297D/I332E S239D/N297D/I332E И AND F241L / F243L / V262I / V264I F241L / F243L / V262I / V264I 64 64 S239D / N297D / I332E / A330Y S239D / N297D / I332E / A330Y 12 12 F241L/V262I F241L/V262I 65 65 S239D / N297D / I332E / A330Y / F241S / F243H / V262T / V264T S239D / N297D / I332E / A330Y / F241S / F243H / V262T / V264T 13 13 F241R / F243Q / V262T / V264R F241R / F243Q / V262T / V264R 66 66 S239D / N297D / I332E / К326Е S239D / N297D / I332E / K326E 14 14 F241R / F243Q / V262T / V264R / I332E F241R / F243Q / V262T / V264R / I332E 67 67 S239D /N297D / I332E / L235D S239D /N297D / I332E / L235D 15 15 F241W / F243W / V262A / V264A F241W / F243W / V262A / V264A 68 68 S239D/S298A/I332E S239D/S298A/I332E

- 35 041483- 35 041483

16 16 F241Y / F243Y / V262T / V264T F241Y / F243Y / V262T / V264T 69 69 S239D / V264I / A330L / I332E S239D / V264I / A330L / I332E 17 17 F241Y / F243Y / V262T / V264T /N297D/I332E F241Y / F243Y / V262T / V264T /N297D/I332E 70 70 S239D / V264I / I332E S239D / V264I / I332E 18 18 F243L / V262I / V264W F243L / V262I / V264W 71 71 S239D / V264I / S298A / I332E S239D / V264I / S298A / I332E 19 19 P243L / V264I P243L / V264I 72 72 S239E/D265N S239E/D265N 20 20 L328D / I332E L328D / I332E 73 73 S239E/D265Q S239E/D265Q 21 21 L328E/I332E L328E/I332E 74 74 S239E/I332D S239E/I332D 22 22 L328H/I332E L328H/I332E 75 75 S239E/I332E S239E/I332E 23 23 L328I/I332E L328I/I332E 76 76 S239E/I332N S239E/I332N 24 24 L328M/I332E L328M/I332E 77 77 S239E/I332Q S239E/I332Q 25 25 L328N/I332E L328N/I332E 78 78 S239E/N297D/I332E S239E/N297D/I332E 26 26 L328Q / I332E L328Q / I332E 79 79 S239E / V264I / A330Y / 1332 Е S239E / V264I / A330Y / 1332 E 27 27 L328T / I332E L328T/I332E 80 80 S239E / V264I / 1332 Е S239E / V264I / 1332 E 28 28 L328V/I332E L328V/I332E 81 81 S239E / V264I / S298A / A330Y / I332E S239E / V264I / S298A / A330Y / I332E 29 29 N297D/A330Y/I332E N297D/A330Y/I332E 82 82 S239N/A330L/I332E S239N/A330L/I332E 30 thirty N297D / I332E N297D / I332E 83 83 S239N/A330Y/I332E S239N/A330Y/I332E 31 31 N297D / I332E / S239D / A330L N297D / I332E / S239D / A330L 84 84 S239N/I332D S239N/I332D 32 32 N297D / S298A / A330Y / I 332Е N297D / S298A / A330Y / I 332E 85 85 S239N/I332E S239N/I332E 33 33 N297D/T299L/I332E N297D/T299L/I332E 86 86 S239N/I332N S239N/I332N 34 34 N297D / T299F / I332E / N297D / T299H/I332E N297D / T299F / I332E / N297D / T299H/I332E 87 87 S239N/I332Q S239N/I332Q 35 35 N297D / T299I / I332E N297D / T299I / I332E 88 88 S239N1S298A / I332E S239N1S298A / I332E 36 36 N297D/T299L/I332E N297D/T299L/I332E 89 89 S239Q/I332D S239Q/I332D 37 37 N297D/T299V/I332E N297D/T299V/I332E 90 90 S239Q/I332E S239Q/I332E 38 38 N297E/I332E N297E/I332E 91 91 S239Q/I332N S239Q/I332N 39 39 N297S / I332E N297S / I332E 92 92 S239Q/I332Q S239Q/I332Q 40 40 P230A/E233D/I332E P230A/E233D/I332E 93 93 S239Q / V264I / I332E S239Q / V264I / I332E 41 41 Р244Н/Р245A /P247V Р244Н/Р245A /P247V 94 94 S298A/I332E S298A/I332E 42 42 S239D/A330L/I332E S239D/A330L/I332E 95 95 V264E/N297D/I332E V264E/N297D/I332E 43 43 S239D/A330Y/I332E S239D/A330Y/I332E 96 96 V264I / A330L / I332E V264I / A330L / I332E 44 44 S239D / A33OY / I332E / К326Е S239D / A33OY / I332E / K326E 97 97 V264I / A330Y / I332E V264I / A330Y / I332E 45 45 S239D / A33OY / I332E / К326Т S239D / A33OY / I332E / K326T 98 98 V264I/I332E V264I/I332E 46 46 S239D / A330Y / I332E / L234I S239D / A330Y / I332E / L234I 99 99 V264I / S298A / I332E V264I / S298A / I332E 47 47 S239D / A330Y / I332E / L235D S239D / A330Y / I332E / L235D 100 100 Y296D/N297D/I332E Y296D/N297D/I332E 48 48 S239D / A330Y / I332E / V240I S239D / A330Y / I332E / V240I 101 101 Y296E/N297D/I332E Y296E/N297D/I332E 49 49 S239D / A330Y / I332E / V264T S239D / A330Y / I332E / V264T 102 102 Y296H/N297D/I332E Y296H/N297D/I332E 50 50 S239D / A330Y / I332E / V266I S239D / A330Y / I332E / V266I 103 103 Y296N/N297D/I332E Y296N/N297D/I332E 51 51 S239D / D265F / N297D / I332E S239D / D265F / N297D / I332E 104 104 Y296Q/N297I/I332E Y296Q/N297I/I332E 52 52 S239D / D265H / N297D / I332E S239D / D265H / N297D / I332E 105 105 Y296T/N297D/I332E Y296T/N297D/I332E 53 53 S239D / D265I / N297D / I332E S239D / D265I / N297D / I332E

В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению будет содержать вариантный Fc-участок, имеющий по меньшей мере одну модификацию вIn accordance with one embodiment, the LAG-3 binding molecule of the present invention will contain a variant Fc region having at least one modification in

Fc-участке. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.Fc plot. In some embodiments, the variant Fc region contains at least one substitution selected from the group consisting of L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I, and P396L, which numbering follows the Kabat EU numbering system.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, вариантный Fc-участок содержит:According to a particular embodiment, the variant Fc region contains:

(A) по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L;(A) at least one substitution selected from the group consisting of F243L, R292P, Y300L, V305I and P396L;

(B) по меньшей мере две замены, выбранные из группы, состоящей из:(B) at least two replacements selected from the group consisting of:

(1) F243L и P396L;(1) F243L and P396L;

(2) F243L и R292P; и (3) R292P и V305I;(2) F243L and R292P; and (3) R292P and V305I;

(C) по меньшей мере три замены, выбранные из группы, состоящей из:(C) at least three replacements selected from the group consisting of:

- 36 041483 (1) F243L, R292P и Y300L;- 36 041483 (1) F243L, R292P and Y300L;

(2) F243L, R292P и V305I;(2) F243L, R292P and V305I;

(3) F243L, R292P и P396L; и (4) R292P, V305I и P396L;(3) F243L, R292P and P396L; and (4) R292P, V305I and P396L;

(D) по меньшей мере четыре замены, выбранные из группы, состоящей из:(D) at least four substitutions selected from the group consisting of:

(1) F243L, R292P, Y300L и P396L; и (2) F243L, R292P, V305I и P396L или (E) по меньшей мере пять замен, выбранных из группы, состоящей из:(1) F243L, R292P, Y300L and P396L; and (2) F243L, R292P, V305I and P396L or (E) at least five substitutions selected from the group consisting of:

(1) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L; и (2) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L.(1) F243L, R292P, Y300L, V305I and P396L; and (2) L235V, F243L, R292P, Y300L and P396L.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления вариантный Fc-участок содержит замены из:According to another specific embodiment, the variant Fc region contains substitutions from:

(A) F243L, R292P и Y300L;(A) F243L, R292P and Y300L;

(b) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L; или (C) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L.(b) L235V, F243L, R292P, Y300L and P396L; or (C) F243L, R292P, Y300L, V305I and P396L.

В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит вариантный Fc-участок, который характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению будет содержать вариантный Fc-участок, который характеризуется уменьшенным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyR (например, FcyRIIIA) и уменьшенной (или практически отсутствующей) ADCC-эффекторной функцией. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L234A, L235A, D265A, N297Q и N297G. В соответствии с конкретным вариантом осуществления вариантный Fc-участок содержит замену из L234A, L235A, L234A и L235A, D265A, N297Q или N297G.In one embodiment, the LAG-3 binding molecule of the present invention comprises a variant Fc region that has reduced (or substantially absent) binding to FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a), or FcyRIIIB (CD16b) (relative to the binding that characterizes the Fc region of wild-type IgG1 (SEQ ID NO: 1)). In one embodiment, the LAG-3 binding molecule of the present invention will comprise a variant Fc region that is characterized by reduced (or substantially absent) FcyR (e.g., FcyRIIIA) binding and reduced (or substantially absent) ADCC effector function. In accordance with some embodiments, the variant Fc region contains at least one substitution selected from the group consisting of L234A, L235A, D265A, N297Q, and N297G. In accordance with a specific embodiment, the variant Fc region contains a substitution of L234A, L235A, L234A and L235A, D265A, N297Q or N297G.

В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит Fc-участок, который изначально характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIIIA (CD16а) и/или уменьшенной эффекторной функцией (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). В соответствии с конкретным вариантом осуществления связывающая LAG-3 молекула по настоящему изобретению содержит Fc-участок IgG2 (SEQ ID NO: 2) или Fc-участок IgG4 (SEQ ID NO: 4). При использовании Fcучастка IgG4 настоящее изобретение также относится к внесению стабилизирующей мутации, такой как замена S228P в шарнирном участке IgG4 (см., например, ^SE$^{ID NO:117:} eskygppcppcp, (Lu et al. (2008) The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultmcentrifugation, J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969) для уменьшения случаев обмена цепями. В Fc-участок IgG4 могут быть введены и другие стабилизирующие мутации, известные из уровня техник (Peters, P et al. (2012) Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability, J. Biol. Chem., 287:24525-24533; патентная PCT публикация WO 2008/145142).According to another embodiment, the LAG-3 binding molecule of the present invention contains an Fc region that initially has reduced (or substantially absent) binding to FcyRIIIA (CD16a) and/or reduced effector function (relative to the binding that characterizes the Fc region of IgG1 wild-type (SEQ ID NO: 1)). According to a specific embodiment, the LAG-3 binding molecule of the present invention comprises an IgG2 Fc region (SEQ ID NO: 2) or an IgG4 Fc region (SEQ ID NO: 4). When using the Fc region of IgG4, the present invention also relates to the introduction of a stabilizing mutation, such as an S228P substitution in the hinge region of IgG4 (see, for example, ^SE $ ^{ID NO:117:} eskygppcppcp, (Lu et al. (2008) The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultmcentrifugation, J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969) Other stabilizing mutations known in the art can be introduced into the Fc region of IgG4 (Peters, P et al (2012) Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability, J. Biol. Chem., 287:24525-24533; PCT Patent Publication WO 2008/145142).

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретение относится к применению любого известного из уровня техники варианта Fc, такого как раскрытые в работе Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models, Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, Biochem. Soc. Trans. 30:48790; Idusogie, E.E. et al. (2001) Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement, J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R, J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc, J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4, J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies, Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities, Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions, Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains, J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:1198084; Jefferis, R. et al. (1995) Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation, Immunol. Lett. 44:111-17; Lund J. et al. (1995) Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can ModuIn accordance with other embodiments, the present invention relates to the use of any Fc variant known in the art, such as those disclosed in Jefferis, B.J. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models, Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, Biochem. soc. Trans. 30:48790; Idusogie, E.E. et al. (2001) Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement, J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R, J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc, J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4, J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies, Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities, Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions, Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains, J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H, Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 92:1198084; Jefferis, R. et al. (1995) Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation, Immunol. Lett. 44:111-17; Lund J. et al. (1995) Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modu

- 37 041483 late Recognition By Fc Gamma Receptors, FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) A Non-Activating Humanized, Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) Multiple Binding Sites On The Ch2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11, Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG, J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG, Nature 332:563-564; патенты США №№ 5624821, 5885573, 6194551, 7276586 и 7317091; и PCT публикации WO 00/42072 и WO 99/58572.- 37 041483 late Recognition By Fc Gamma Receptors, FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) A Non-Activating Humanized, Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) Multiple Binding Sites On The Ch2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11, Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG, J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG, Nature 332:563-564; US patents Nos. 5624821, 5885573, 6194551, 7276586 and 7317091; and PCT publications WO 00/42072 and WO 99/58572.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы по настоящему изобретению дополнительно содержат один или несколько сайтов гликозилирования, так чтобы один или несколько углеводных фрагментов были ковалентно присоединены к молекуле. Предпочтительно молекулы по настоящему изобретению с одним или несколькими сайтами гликозилирования и/или одной или несколькими модификациями в Fc-участке придают или имеют повышенную антителоопосредованную эффекторную функцию, например, повышенную ADCC-активность по сравнению с немодифицированным антителом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к молекулам, содержащим одну или несколько модификаций аминокислот, которые известны как непосредственно или опосредовано взаимодействующие с углеводным фрагментом Fcучастка, включая без ограничения аминокислоты в положениях 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 или 301. Аминокислоты, которые непосредственно или опосредовано взаимодействуют с углеводным фрагментом Fc-участка, известны из уровня техники, см., например, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.According to some embodiments, the molecules of the present invention further comprise one or more glycosylation sites such that one or more carbohydrate moieties are covalently attached to the molecule. Preferably, molecules of the present invention with one or more glycosylation sites and/or one or more modifications in the Fc region confer or have an increased antibody-mediated effector function, eg, increased ADCC activity compared to an unmodified antibody. In accordance with some embodiments, the present invention further relates to molecules containing one or more amino acid modifications that are known to directly or indirectly interact with the carbohydrate fragment of the F c region, including, without limitation, amino acids at positions 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299, or 301. Amino acids that interact directly or indirectly with the carbohydrate moiety of the Fc region are known in the art, see e.g. Jefferis et al., 1995 Immunology Letters , 44: 111-7, which is incorporated herein by reference in its entirety.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к молекулам, которые были модифицированы внесением одного или нескольких сайтов гликозилирования в один или несколько сайтов молекул, предпочтительно без изменения функциональности молекул, например, активности связывания с целевым антигеном или FcyR. Сайты гликозилирования могут быть внесены в вариабельный и/или константный участок молекул по настоящему изобретению. Применяемые в контексте настоящего документа сайты гликозилирования включают любую специфическую аминокислотную последовательность в антителе, к которой будет специфически или ковалентно присоединен олигосахарид (т. е. углеводы, содержащие два или более соединенных вместе простых Сахаров). Боковые олигосахаридные цепи обычно связаны с остовом антитела посредством либо N-, либо O-связей. Nсвязанное гликозилирование относится к присоединению олигосахаридного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка.In accordance with another embodiment, the present invention relates to molecules that have been modified by introducing one or more glycosylation sites at one or more sites of the molecules, preferably without changing the functionality of the molecules, for example, the activity of binding to the target antigen or FcyR. Glycosylation sites can be introduced into the variable and/or constant region of the molecules of the present invention. As used herein, glycosylation sites include any specific amino acid sequence in an antibody to which an oligosaccharide (ie, carbohydrates containing two or more simple sugars linked together) will be specifically or covalently attached. Side oligosaccharide chains are usually linked to the antibody backbone via either N- or O-bonds. N-linked glycosylation refers to the attachment of an oligosaccharide moiety to the side chain of an aspartic residue.

О-связанное гликозилирование относится к присоединению олигсахаридного фрагмента к гидроксиаминокислоте, например, серину, треонину. Молекулы по настоящему изобретению могут содержать один или несколько сайтов гликозилирования, включая сайты N-связанного и O-связанного гликозилирования. В соответствии с настоящим изобретением, можно применять любой известный из уровня техники сайт гликозилирования для N-связанного или O-связанного гликозилирования. Иллюстративным сайтом N-связанного гликозилирования, который является пригодным в соответствии со способами по настоящему изобретению, является аминокислотная последовательность: Asn-X-Thr/Ser, где X может быть любой аминокислотой, a Thr/Ser обозначает треонин или серин. Такой сайт или сайты можно внести в молекулу по настоящему изобретению с помощью способов, хорошо известных в области техники, к которой относится настоящее изобретение (см., например, In VITRO MUTAGENESIS, Recombinant DNA: A Short COURSE, J. D. Watson, et al., W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме. Иллюстративный способ внесения сайта гликозилирования в молекулу по настоящему изобретению может предусматривать модификацию или мутацию аминокислотной последовательности молекулы так, чтобы получить необходимую последовательность Asn-X-Thr/Ser.O-linked glycosylation refers to the attachment of an oligsaccharide moiety to a hydroxy amino acid, eg serine, threonine. The molecules of the present invention may contain one or more glycosylation sites, including N-linked and O-linked glycosylation sites. In accordance with the present invention, any glycosylation site known in the art for N-linked or O-linked glycosylation can be used. An exemplary N-linked glycosylation site that is useful in accordance with the methods of the present invention is the amino acid sequence: Asn-X-Thr/Ser where X can be any amino acid and Thr/Ser is threonine or serine. Such a site or sites can be introduced into the molecule of the present invention using methods well known in the art to which the present invention relates (see, for example, In VITRO MUTAGENESIS, Recombinant DNA: A Short COURSE, J. D. Watson, et al., W. H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116, which is incorporated herein by reference in its entirety. to get the required sequence Asn-X-Thr/Ser.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к способам модификации углеводного содержимого молекулы по настоящему изобретению путем добавления или удаления сайта гликозилирования. Способы модификации углеводного содержимого антител (и молекул, содержащих домены антитела, например, Fc-участок) хорошо известны из уровня техники и охватываются настоящим изобретением, см., например, патент США № 6218149, EP 0359096 В1; публикацию US 2002/0028486, WO 03/035835; публикацию США № 2003/0115614; патент США № 6218149; патент США № 6472511; все из которых включены в настоящий документ в полном их объеме. В соответствии с другими вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к способам модификации углеводного содержимого молекулы по настоящему изобретению путем удаления одного или нескольких эндогенных углеводных фрагментов молекулы. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к сдвигу сайта гликозилирования Fc-участка антитела путем модификации положений, прилегающих к 297. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к модификации положения 296 так, чтобы гликозилировалось положение 296, а не положение 297.According to some embodiments, the present invention relates to methods for modifying the carbohydrate content of a molecule of the present invention by adding or removing a glycosylation site. Methods for modifying the carbohydrate content of antibodies (and molecules containing antibody domains, such as the Fc region) are well known in the art and are covered by the present invention, see, for example, US patent No. 6218149, EP 0359096 B1; publication US 2002/0028486, WO 03/035835; US Publication No. 2003/0115614; US patent No. 6218149; US patent No. 6472511; all of which are incorporated herein in their entirety. In accordance with other embodiments, the present invention relates to methods for modifying the carbohydrate content of a molecule of the present invention by removing one or more endogenous carbohydrate fragments of the molecule. In a specific embodiment, the present invention relates to shifting the glycosylation site of an Fc region of an antibody by modifying positions adjacent to 297. In a specific embodiment, the present invention relates to modifying position 296 so that position 296 is glycosylated rather than position 297.

- 38 041483- 38 041483

Эффекторную функцию также можно модифицировать с помощью таких методик, как введение одного или нескольких цистеиновых остатков в Fc-участок, тем самым обеспечивая возможность образования межцепочечной дисульфидной связи в этом участке, в результате чего образуется гомодимерное антитело, которое может характеризоваться улучшенной способностью к интернализации и/или повышенным комплементзависимым цитолизом клеток и ADCC (Caron, Р.С. et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity, J. Immunol. 148(9):2918-2922. Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также можно получить с помощью гетеробифункциональных сшивающих линкеров, как описано в работе Wolff, E.A. et al. (1993) Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice, Cancer Research 53:25602565. Альтернативно, может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные Fc-участки и, таким образом, может иметь повышенные комплементзависимые литические и ADCC-характеристики (Stevenson, G.T. et al. (1989) A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).The effector function can also be modified by techniques such as introducing one or more cysteine residues into the Fc region, thereby allowing the formation of an interchain disulfide bond in that region, resulting in a homodimeric antibody that may have improved internalization and/or or increased complement dependent cell cytolysis and ADCC (Caron, PC et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity, J. Immunol 148(9):2918-2922 Homodimeric antibodies with enhanced antitumor activity can also be generated using heterobifunctional cross-linking linkers as described by Wolff, E. A. et al.( 1993) Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice, Cancer Research 53:25602565. An antibody has been developed that has dual Fc regions and thus may have increased complement-dependent lytic and ADCC characteristics (Stevenson, G.T. et al. (1989) A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

Период полужизни в сыворотке молекул по настоящему изобретению, содержащих Fc-участки, может быть увеличен путем увеличения аффинности связывания Fc-участка с FcRn. Применяемый в контексте настоящего документа термин период полужизни означает фармакокинетическое свойство молекулы, которое представляет собой меру среднего времени жизни молекул после их введения. Период полужизни может быть выражен как время, необходимое для устранения пятидесяти процентов (50%) известного количества молекулы из организма субъекта (например, пациента-человека или другого млекопитающего) или его конкретной части, например, которое измерено в сыворотке, т. е. период полужизни в кровотоке, или в других тканях. Как правило, увеличение периода полужизни приводит в результате к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке для вводимой молекулы.The serum half-life of molecules of the present invention containing Fc regions can be increased by increasing the binding affinity of the Fc region to FcRn. Used in the context of this document, the term half-life means the pharmacokinetic property of the molecule, which is a measure of the average life of the molecules after their introduction. The half-life can be expressed as the time required to eliminate fifty percent (50%) of a known amount of a molecule from the body of a subject (e.g., a human patient or other mammal) or a specific portion of it, such as that measured in serum, i.e. half-life in the bloodstream, or in other tissues. Typically, an increase in half-life results in an increase in the mean retention time (MRT) in the circulation for the administered molecule.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-участка дикого типа и которые характеризуются увеличенным периодом полужизни (относительно Fc-участка дикого типа).In some embodiments, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region that contains at least one amino acid modification relative to the wild-type Fc region and which has an increased half-life (relative to the wild-type Fc region).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который содержит увеличивающую периодом полужизни аминокислотную замену по одному или нескольким положениям, выбранным из группы, состоящей из 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 и 436, которые пронумерованы согласно EU системе нумерации по Kabat. Многочисленные конкретные мутации, способные увеличивать период полужизни содержащей Fc-участок молекулы, известны из уровня техники и включают, например, M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации. Например, см. мутации, описанные в патентах США №№ 6277375, 7083784, 7217797, 8088376, публикациях США №№ 2002/0147311, 2007/0148164 и международных публикациях WO 98/23289, WO 2009/058492 и WO 2010/033279, которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном их объеме. Содержащие Fc-участок молекулы с увеличенным периодом полужизни также включают молекулы с заменами по двум или более остаткам Fc-участка 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 и 436. В частности, две или более замен выбраны из: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, Н435К и Y436I.In some embodiments, the LAG-3 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region that contains a half-life increasing amino acid substitution at one or more positions selected from the group consisting of 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 and 436, which are numbered according to the Kabat EU numbering system. Numerous specific mutations capable of increasing the half-life of an Fc-containing molecule are known in the art and include, for example, M252Y, S254T, T256E, and combinations thereof. For example, see the mutations described in US Patent Nos. 6277375, 7083784, 7217797, 8088376, US Publications Nos. incorporated herein by reference in their entirety. Fc region-containing molecules with extended half-life also include molecules with substitutions at two or more Fc region residues 435 and 436. In particular, two or more substitutions are selected from: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K, and Y436I.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, вариантный Fc-участок содержит замены из:According to a particular embodiment, the variant Fc region contains substitutions from:

(A) 252Y, 254Т и 256Е;(A) 252Y, 254T and 256E;

(b) M252Y и S254T;(b) M252Y and S254T;

(C) M252Y и Т256Е;(C) M252Y and T256E;

(D) 250Q и 428L;(D) 250Q and 428L;

(E) T307Q и N434A;(E) T307Q and N434A;

(F) A378V и N434A;(F) A378V and N434A;

(G) N434A и Y436I;(G) N434A and Y436I;

(Н) V3O8P и N434A; или (I) K288D и Н435К.(H) V3O8P and N434A; or (I) K288D and H435K.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантным Fc-участкам, содержащим:The present invention further relates to variant Fc regions containing:

(A) одну или несколько мутаций, которые изменяют эффекторную функцию и/или FcyR; и (B) одну или несколько мутаций, которые продлевают период полужизни в сыворотке.(A) one or more mutations that alter effector function and/or FcyR; and (B) one or more mutations that prolong the serum half-life.

VI. Биспецифические связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретениюVI. Bispecific LAG-3 Binding Molecules of the Invention

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим связывающим молекулам, которые способны связываться с первым эпитопом и вторым эпитопом, причем первый эпитоп представляет собой эпитоп LAG-3 человека, а второй эпитоп представляет собой такой же или отличный эпитоп LAG-3 или представляет собой эпитоп другой молекулы, которая присутствует на поверхности иммунной клетки (такой как Т-лимфоцит) и участвует в регуляции иммунной контрольной точки. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления второй эпитоп предпочтительно не представляет собой эпитоп LAG-3. В соответствии с одним вариантом осуществления второй эпитопOne embodiment of the present invention relates to bispecific binding molecules that are capable of binding to a first epitope and a second epitope, wherein the first epitope is a human LAG-3 epitope and the second epitope is the same or a different LAG-3 epitope or is an epitope of a different a molecule that is present on the surface of an immune cell (such as a T-lymphocyte) and is involved in the regulation of the immune checkpoint. In some embodiments, the second epitope is preferably not a LAG-3 epitope. According to one embodiment, the second epitope

- 39 041483 представляет собой эпитоп В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, МНС I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA. В соответствии с конкретным вариантом осуществления второй эпитоп представляет собой CD137, PD-1, OX40, TIGIT или TIM-3. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такие биспецифические молекулы содержат более двух эпитоп-связывающих сайтов. Такие биспецифические молекулы могут, например, связывать два или более различных эпитопов LAG-3 и по меньшей мере один эпитоп молекулы, которая не является LAG-3.- 39 041483 is an epitope of B7-H3, B7-H4, BTLA, CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA- 4, galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD- L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3, or VISTA. In accordance with a specific embodiment, the second epitope is CD137, PD-1, OX40, TIGIT, or TIM-3. In accordance with some embodiments, such bispecific molecules contain more than two epitope binding sites. Such bispecific molecules may, for example, bind two or more different epitopes of LAG-3 and at least one epitope of a molecule that is not LAG-3.

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, способным одновременно связываться с LAG-3 и вторым эпитопом (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA4, ICOS, KIR, МНС I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления биспецифическое антитело, способное одновременно связываться с PD-1 и вторым эпитопом, получают с помощью любого из способов, описанных в PCT публикациях WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 2006/107617, WO 2007/046893, WO 2007/146968, WO 2008/003103, WO 2008/003116, WO 2008/027236, WO 2008/024188, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2010/028797, WO2010028796, WO 2010/028795, WO 2010/108127, WO 2010/136172, WO 2011/086091, WO 2011/133886, WO 2012/009544, WO 2013/003652, WO 2013/070565, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873 и WO 2014/022540, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.The present invention relates to bispecific antibodies capable of simultaneously binding to LAG-3 and a second epitope (for example, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA4, ICOS, KIR, MHC class I or II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). In some embodiments, a bispecific antibody capable of simultaneously binding to PD-1 and a second epitope is obtained using any of the methods described in PCT Publications WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/024715, Wo 2007/075270, Wo 2006/107617, Wo 2007/046893, WO 2007/146968, Wo 2008/003103, Wo 2008/003116, Wo 2008/027236, Wo 2008/024188, Wo 2009/132876, Wo 2009/018386, Wo 2009/018386, Wo 2010/028797, Wo2010028796, Wo 2010/028795, Wo 2010/108127, Wo 2010/136172, Wo 2011/086091, Wo 2011/133886, Wo 2012/009544, Wo 2013/003652, Wo 2013/070565, Wo 2012/Wo 2012/Wo 2012/Wo 2012/Wo 2012/Wo 2012/Wo 2012 162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873 and WO 2014/022540, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

1. Биспецифические диатела, не имеющие Fc-участков1. Bispecific diabodies lacking Fc regions

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим одновалентным диателам, которые содержат первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, и наиболее предпочтительно состоят из них, последовательности которых позволяют полипептидным цепям ковалентно связываться друг с другом с образованием ковалентно связанного диатела, которое способно одновременно связываться с первым эпитопом (эпитопом 1) и вторым эпитопом (эпитопом 2), причем такие эпитопы не идентичны друг другу. Таким образом, такие биспецифические диатела содержат домены VL1/VH1, которые способны связываться с первым эпитопом (VL_{эnuтоn 1}/VH_эпитоп 1), и домены VL2/VH2, которые способны связываться со вторым эпитопом (VL_{эnuтоn 2}/VHJ_{пиmоп 2}). Обозначения VL1 и VH1 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают первый эпитоп такого биспецифического диатела. Аналогичным образом, обозначения VL2 и VH2 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают второй эпитоп такого биспецифического диатела. В соответствии с одним вариантом осуществления, эпитоп 1 таких молекул диатела является эпитопом LAG-3, а эпитоп 2 таких молекул диатела не является эпитопом LAG-3 (например, он представляет собой эпитоп из В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, MHCI или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Домен VL первой полипептидной цепи таких связующих LAG-2 диател взаимодействует с доменом VH второй полипептидной цепи с образованием первого функционального эпитопсвязывающего сайта, который специфичен к первому антигену (т.е. либо LAG-3, либо антигену, который содержит второй эпитоп). Аналогичным образом, домен VL второй полипептидной цепи взаимодействует с доменом VH первой полипептидной цепи с образованием второго функционального эпитопсвязывающего сайта, который специфичен ко второму антигену (т.е. либо антигену, который содержит второй эпитоп, либо LAG-3). Таким образом, выбор доменов VL и VH первой и второй полипептидных цепей скоординирован таким образом, чтобы две полипептидные цепи диатела в совокупности содержали домены VL и VH, способные связываться как с эпитопом LAG-3, так и со вторым эпитопом (т. е. они в совокупности содержат домены VL_lag.₃/VH_lag.₃ и УЬ_эпитоп 2/VH_{эпитоп 2}). He имеет значения, обозначена ли конкретная пара связывающих доменов (т.е. VL_{эпиmоп 1}/VH_эпитоп 1 или VL_эпитоп 2^_{Нэпитоп 2}), эпитоп антигена с эпитопом 1 или эпитоп антигена с эпитопом 2), как первый относительно второго эпитоп диатела; такие обозначения имеют отношение только к наличию и ориентации доменов полипептидных цепей связывающих молекул по настоящему изобретению.One embodiment of the present invention relates to bispecific monovalent diabodies that comprise, and most preferably consist of, a first polypeptide chain and a second polypeptide chain, the sequences of which allow the polypeptide chains to covalently bind to each other to form a covalently linked diabody that is capable of simultaneously binding to the first epitope (epitope 1) and a second epitope (epitope 2), and such epitopes are not identical to each other. Thus, such bispecific diabodies contain VL1/VH1 domains that are able to bind to the first epitope (VL _{enuton 1} /VH _epitope 1) and VL2/VH2 domains that are able to bind to the second epitope (VL _{enuton 2} /VHJ _{epitope 2} ). The designations VL1 and VH1 denote, respectively, the light chain variable domain and the heavy chain variable domain that bind the first epitope of such a bispecific diabody. Similarly, the designations VL2 and VH2 denote, respectively, a light chain variable domain and a heavy chain variable domain that bind the second epitope of such a bispecific diabody. In one embodiment, epitope 1 of such diabody molecules is a LAG-3 epitope and epitope 2 of such diabody molecules is not a LAG-3 epitope (e.g., it is an epitope from B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, MHCI or Class II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). The VL domain of the first polypeptide chain of such LAG-2 diabody binders interacts with the VH domain of the second polypeptide chain to form a first functional epitope binding site that is specific for the first antigen (i.e. either LAG-3 or an antigen that contains a second epitope). Similarly, the VL domain of the second polypeptide chain interacts with the VH domain of the first polypeptide chain to form a second functional epitope-binding site that is specific for a second antigen (i.e., either an antigen that contains a second epitope or LAG-3). Thus, the choice of VL and VH domains of the first and second polypeptide chains is coordinated so that the two diabody polypeptide chains together contain VL and VH domains capable of binding to both the LAG-3 epitope and the second epitope (i.e., they together contain _the VL _lag.3 /VH _lag.3 and VL _epitope 2/ _VH _{epitope 2} domains). It does not matter whether a particular pair of binding domains (i.e., VL _{epitope 1} /VH _epitope 1 or VL _epitope 2^ _{Nepitope 2} ), an antigen epitope with epitope 1, or an antigen epitope with epitope 2, is designated as first relative to the second diabody epitope ; such designations refer only to the presence and orientation of the domains of the polypeptide chains of the binding molecules of the present invention.

Первая полипептидная цепь по варианту осуществления таких биспецифических одновалентных диател содержит, в направлении от N-конца до С-конца, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться либо с первым эпитопом, либо с доменом VL моноклонального антитела, способного связываться со вторым эпитопом (т.е. либо VL_lag.₃, либо VL_{эnитоn 2}), первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться либо со вторым эпитопом (если такая первая полипептидная цепь содержит VL_lag.₃), либо с доменом VH моноклонального антитела, способного связываться с первым эпитопом (если такая первая полипептидная цепь содержит VL_{эnитоn 2}), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий цистеиновый остаток способствующего образованию гетеродимера домена, и С-конец (фиг. 1).The first polypeptide chain in an embodiment of such bispecific monovalent diabodies contains, N-terminus to C-terminus, the N-terminus, the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding either to the first epitope or the VL domain of the monoclonal antibody capable of binding to the second epitope (i.e. either VL _lag . ₃ or VL _{enton 2} ), first intermediate spacer peptide (linker 1), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to either the second epitope (if such first polypeptide chain contains VL _lag . ₃ ) , or with a VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to a first epitope (if such first polypeptide chain contains a VL _{enton 2} ), a second intermediate spacer peptide (linker 2), optionally containing a cysteine residue of a heterodimer-promoting domain, and a C-terminus (Fig. 1).

Вторая полипептидная цепь по варианту осуществления биспецифических одновалентных диател содержит в направлении от N-конца до С-конца N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 или доменом VL моноклонального антитела, способного связываться со вторым эпитопом (т. е. либо VL_lag.₃, либо VL_{эnитоn 2}, и являющийся доменом VL, который не выбран дляThe second polypeptide chain of an embodiment of the bispecific monovalent diabodies comprises, in the N-terminus to C-terminus direction, the N-terminus, the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3, or the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to a second epitope (i.e. either VL _lag _.3 or VL _{eniton 2} and being a VL domain that is not selected for

- 40 041483 включения в первую полипептидную цепь антитела), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться либо со вторым эпитопом (если такая вторая полипептидная цепь содержит VLLAG-3), либо с доменом VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (если такая вторая полипептидная цепь содержит VL_эпuтоп 2), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий цистеиновый остаток способствующего образованию гетеродимера домена, и С-конец (фиг. 1).- 40 041483 inclusions in the first polypeptide chain of the antibody), an intermediate linker peptide (linker 1), the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding either to a second epitope (if such a second polypeptide chain contains VLLAG-3), or to the VH domain of a monoclonal antibody capable of bind to LAG-3 (if such second polypeptide chain contains VL _epitope 2), a second intermediate spacer peptide (linker 2), optionally containing a cysteine residue of a heterodimer-promoting domain, and a C-terminus (FIG. 1).

Наиболее предпочтительно, длину промежуточного линкерного пептида (например, линкера 1), который разделяет такие домены VL и VH) выбирают такую, чтобы практически или полностью предупредить связывание доменов VL и VH полипептидной цепи друг с другом. Таким образом, домены VL и VH первой полипептидной цепи практически или полностью не способны связываться друг с другом. Аналогично, домены VL и VH второй полипептидной цепи практически или полностью не способны связываться друг с другом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) имеет последовательность (^SEQ ^ID NO:88): GGGSGGGG.Most preferably, the length of the intermediate linker peptide (eg, linker 1) that separates such VL and VH domains) is chosen to substantially or completely prevent the VL and VH domains of the polypeptide chain from linking to each other. Thus, the VL and VH domains of the first polypeptide chain are practically or completely unable to communicate with each other. Similarly, the VL and VH domains of the second polypeptide chain are almost or completely unable to communicate with each other. A preferred intermediate spacer peptide (linker 1) has the sequence ( ^SE Q ^ID NO:88): GGGSGGGG.

Длину и состав второго промежуточного линкерного пептида (линкер 2) выбирают на основе выбора способствующих образованию гетеродимера доменов. Обычно второй промежуточный линкерный пептид (линкер 2) будет содержать 3-20 аминокислотных остатков. Так, в частности, если способствующие образованию гетеродимера домены не содержат цистеиновый остаток, то используют цистеинсодержащий второй промежуточный линкерный пептид (линкер 2). Цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2) будет содержать 1, 2, 3 или более 3 цистеиновых остатков. Предпочтительный цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) имеет последовательность (SEQ ID NO:89): GGCGGGThe length and composition of the second intermediate linker peptide (linker 2) is chosen based on the selection of heterodimer-promoting domains. Typically, the second intermediate linker peptide (linker 2) will contain 3-20 amino acid residues. Thus, in particular, if the heterodimer-promoting domains do not contain a cysteine residue, then a cysteine-containing second intermediate linker peptide (linker 2) is used. The cysteine-containing second intermediate spacer peptide (linker 2) will contain 1, 2, 3 or more than 3 cysteine residues. A preferred cysteine-containing spacer peptide (linker 2) has the sequence (SEQ ID NO:89): GGCGGG

Альтернативно, линкер 2 не содержит цистеин (например,Alternatively, linker 2 does not contain cysteine (for example,

GGG, GGGS (SEQ ID NO:90),GGG, GGGS (SEQ ID NO:90),

LGGGSG (SEQ ID NO:91), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:92), ASTKG (SEQ ID NO:93), LEPKSS (SEQ ID NO:94), APSSS (SEQ ID NO:95) и т.д.), и тогда, как описано ниже, применяют цистеинсодержащий, способствующий образованию гетеродимера домен. Необязательно, применяют как цистеинсодержащий линкер 2, так и цистеинсодержащий способствующий образованию гетеродимера домен.LGGGSG (SEQ ID NO:91), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:92), ASTKG (SEQ ID NO:93), LEPKSS (SEQ ID NO:94), APSSS (SEQ ID NO:95), etc.) and then, as described below, a cysteine-containing heterodimer-promoting domain is used. Optionally, both a cysteine-containing linker 2 and a cysteine-containing heterodimer-promoting domain are used.

Способствующие образованию гетеродимера домены могут представлять собой GVEPKSC (SEQ ID NO:96), или VEPKSC (SEQ ID NO:97), или AEPKSC (SEQ ID_NO:98) на одной полипептидной цепи и GFNRGEC (SEQ ID NO:99) или FNRGEC (SEQ IDNO:100) на другой полипептидной цепи (US 2007/0004909).The heterodimer promoting domains can be GVEPKSC (SEQ ID NO:96) or VEPKSC (SEQ ID NO:97) or AEPKSC (SEQ _ID NO:98) on the same polypeptide chain and GFNRGEC (SEQ ID NO:99) or FNRGEC (SEQ IDNO:100) on another polypeptide chain (US 2007/0004909).

Более предпочтительно тем не менее способствующие образованию гетеродимера домены таких диател образуются из одного, двух, трех или четырех тандемно повторяемых спиральных доменов с противоположным зарядом, которые содержат последовательность по меньшей мере из шести, по меньшей мере из семи или по меньшей мере из восьми аминокислотных остатков, так чтобы способствующий образованию гетеродимера домен обладал полным зарядом (Apostolovic, В. et al. (2008) pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil, Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt K.M. et al. (2001) Helixstabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain, J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt K.M. et al. (2002) Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils, Structure 10:1235-1248; Boucher, С. et al. (2010) Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions, Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P. J. et al. (2004) Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy, J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding, Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag, Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures, Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions, Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity, J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) The d'-d-d' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'-a-a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif’, J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface, J. Molec. Biol. 366:12321242; Tripet, B. et al. (2002) Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin С and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance, J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies, Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism, J. Gene Med. 10:355-367).More preferably, however, the heterodimer-promoting domains of such diabodies are formed from one, two, three, or four tandemly repeated helical domains of opposite charge, which contain a sequence of at least six, at least seven, or at least eight amino acid residues. so that the heterodimer-promoting domain has a full charge (Apostolovic, B. et al. (2008) pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil, Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt K. M. et al. (2001) Helixstabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain, J. Molec Biol 312:221-228 Arndt K. M. et al (2002) Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils, Structure 10:1235-1248 Boucher, C. et al (2010) Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions, Analytical Biochemistry 399:138-140 Cachi a, P. J. et al. (2004) Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy, J. Mol. Recognize. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding, Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag, Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures, Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions, Curr. Opin. struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity, J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) The d'-d-d' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'-a-a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif', J. Amer. Chem. soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface, J. Molec. Biol. 366:12321242; Tripet, B. et al. (2002) Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance, J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies, Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism, J. Gene Med. 10:355-367).

- 41 041483- 41 041483

Такие повторяющиеся спиральные домены могут быть точными повторами или могут иметь замены. Например, спиральный домен способствующего образованию гетеродимера домена первой полипептидной цепи может содержать последовательность из восьми аминокислотных остатков, выбранных для придания отрицательного заряда такому способствующему образованию гетеродимера домену, а спиральный домен способствующего образованию гетеродимера домена второй полипептидной цепи может содержать последовательность из восьми аминокислотных остатков, выбранных для придания положительного заряда такому способствующему образованию гетеродимера домену. Не имеет значения, какая спираль предусмотрена для первой или второй полипептидных цепей при условии, что, если в обеих полипептидных цепях представлены такие способствующие образованию гетеродимеров домены, то для другой полипептидной цепи используется спираль с противоположным зарядом. Положительно заряженная аминокислота может представлять собой лизин, аргинин, гистидин и т.д., и/или отрицательно заряженная аминокислота может представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и т.д. Положительно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой лизин, и/или отрицательно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой глутаминовую кислоту. Можно использовать только один способствующий образованию гетеродимера домен (поскольку такой домен будет ингибировать гомодимеризацию и тем самым способствовать гетеродимеризации), тем не менее, предпочтительно, чтобы способствующие образованию гетеродимера домены содержали как первая, так и вторая полипептидные цепи диател по настоящему изобретению.Such repeating helical domains may be exact repeats or may have substitutions. For example, the helical domain of the heterodimer-promoting domain of the first polypeptide chain may comprise a sequence of eight amino acid residues selected to confer a negative charge on such a heterodimer-promoting domain, and the helical domain of the heterodimer-promoting domain of the second polypeptide chain may comprise a sequence of eight amino acid residues selected for imparting a positive charge to such a heterodimer-promoting domain. It does not matter which helix is provided for the first or second polypeptide chains, provided that if such heterodimer-promoting domains are present in both polypeptide chains, the helix with the opposite charge is used for the other polypeptide chain. The positively charged amino acid may be lysine, arginine, histidine, etc., and/or the negatively charged amino acid may be glutamic acid, aspartic acid, etc. The positively charged amino acid is preferably lysine and/or the negatively charged amino acid is preferably glutamic acid. Only one heterodimer-promoting domain can be used (because such a domain will inhibit homodimerization and thereby promote heterodimerization), however, it is preferred that the heterodimer-producing domains contain both the first and second polypeptide chains of the diabodies of the present invention.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, один из способствующих образованию гетеродимера доменов будет содержат четыре тандемных спиральных домена с E-спиралями (SEQ ID NO: 101: evaalek-evaalek-ev7\alek-evaalek), глутаматные остатки которых образуют будут формировать отрицательный заряд при pH 7, в то время как другой из способствующих образованию гетеродимера доменов будет содержать четыре тандемных спиральных домена с K-спиралями (SEQ ID NO: 102: kvaalke-kvaalke-kvaalke-kvaalke), лизиновые остатки которых будут образовывать положительный заряд при pH 7. Наличие таких заряженных доменов способствует ассоциации между первым и вторым полипептидами и, следовательно, способствует образованию гетеродимера. Особенно предпочтительным является способствующий образованию гетеродимера домен, в котором один из четырех тандемных спиральных доменов с Е-спиралью с SEQ ID NO: 101 был модифицирован с включением цистеинового остатка: (SEQ ID NO: 103).According to a preferred embodiment, one of the heterodimer-promoting domains will contain four tandem helical domains with E-helices (SEQ ID NO: 101: evaalek-evaalek-ev7\alek-evaalek) whose glutamate residues form will form a negative charge when pH 7, while the other of the heterodimer-promoting domains will contain four tandem helical domains with K-helices (SEQ ID NO: 102: kvaalke-kvaalke-kvaalke-kvaalke), whose lysine residues will form a positive charge at pH 7. The presence of such charged domains promotes association between the first and second polypeptides and hence promotes heterodimer formation. Particularly preferred is a heterodimer promoting domain in which one of the four E-helix tandem helix domains of SEQ ID NO: 101 has been modified to include a cysteine residue: (SEQ ID NO: 103).

Аналогично, особенно предпочтительным является способствующий образованию гетеродимера домен, в котором один из четырех тандемных спиральных доменов с K-спиралью с SEQ ID NO: 102 был модифицирован с включением цистеинового остатка: ^^cke-kvaalke-kvaalke-kvaalke (SEQ id NO:104).Likewise, particularly preferred is a heterodimer-promoting domain in which one of the four K-helix tandem helical domains of SEQ ID NO: 102 has been modified to include a cysteine residue: ).

В WO 2012/018687 раскрыто, что для улучшения фармакокинетических свойств in vivo диател диатело можно модифицировать с включением полипептидной части связывающегося в сыворотке белка на одном или нескольких концах диатела. Наиболее предпочтительно такая полипептидная часть связывающегося в сыворотке белка будет встроена в С-конец диатела. Альбумин является самым распространенным белком в плазме и имеет период полужизни у людей, составляющий 19 дней. Альбумин имеет несколько сайтов связывания малых молекул, которые позволяют ему нековалентно связываться с другими белками и тем самым продлевать их период полужизни в сыворотке. Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G из штамма G148 Streptococcus состоит из 46 аминокислотных остатков, образующих стабильный трехспиральный пучок, и имеет широкую альбуминсвязывающую специфичность (Johansson, M.U. et al. (2002) Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules, J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120. Таким образом, особо предпочтительная полипептидная часть связывающегося в сыворотке белка для улучшения фармакокинетических свойств in vivo диатела представляет собой альбуминсвязывающий домен (ABD) из стрептококкового белка G и более предпочтительно альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G из штамма G148 Streptococcus (SEQ ID NO: 105): LAEAKVLANR eldkygvsdy yknlidnaks aegvkalide ilaalp.WO 2012/018687 discloses that to improve the in vivo pharmacokinetic properties of the diabody, the diabody can be modified to include the polypeptide portion of the serum-binding protein at one or more ends of the diabody. Most preferably, such a polypeptide portion of the serum-binding protein will be inserted into the C-terminus of the diabody. Albumin is the most abundant protein in plasma and has a half-life of 19 days in humans. Albumin has several small molecule binding sites that allow it to non-covalently bind to other proteins and thereby extend their serum half-life. Albumin-binding domain 3 (ABD3) of G protein from G148 Streptococcus strain consists of 46 amino acid residues forming a stable three-stranded bundle and has broad albumin-binding specificity (Johansson, M.U. et al. (2002) Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin- Binding Modules, J. Biol Chem 277(10):8114-8120 Thus, a particularly preferred polypeptide moiety of the serum-binding protein for improving the in vivo pharmacokinetic properties of the diabody is the albumin-binding domain (ABD) from streptococcal protein G and more preferably albumin binding domain 3 (ABD3) of protein G from Streptococcus strain G148 (SEQ ID NO: 105): LAEAKVLANR eldkygvsdy yknlidnaks aegvkalide ilaalp.

Как раскрыто в WO 2012/162068 (включенной в настоящий документ посредством ссылки), деиммунизированные варианты SEQ ID NO: 105 обладают способностью ослаблять или исключать связывание с МНС II класса. Исходя из результатов комбинационной мутации, следующие комбинации замен считают предпочтительными заменами для образования такого деиммунизированного ABD: 66D/70S +71А; 66S/70S +71А; 66S/70S +79А; 64А/65А/71А; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64А/65А/71А+66Е; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64А/65А/79А+66Е. Вариантные ABD, имеющие модификации L64A, I65A и D79A или модификации N66S, T70S и D79A. Вариантный деиммунизированный ABD, имеющий аминокислотную последовательность:As disclosed in WO 2012/162068 (incorporated herein by reference), deimmunized variants of SEQ ID NO: 105 have the ability to reduce or eliminate binding to MHC class II. Based on the combination mutation results, the following combinations of substitutions are considered preferred substitutions for the formation of such a deimmunized ABD: 66D/70S +71A; 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. Variant ABDs with modifications L64A, I65A and D79A or modifications N66S, T70S and D79A. A variant deimmunized ABD having the amino acid sequence:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP (SEQLAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP (SEQ

ID NO: 106), или аминокислотную последовательность:ID NO: 106), or amino acid sequence:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA₆₄A₆5NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP (SEQLAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA ₆₄ A ₆ 5NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ

ID NO: 107), или аминокислотную последовательность:ID NO: 107), or amino acid sequence:

- 42 041483- 42 041483

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLISeeNAKSvo VEGVKALIA79E ILAALP (SEQLAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLISeeNAKSvo VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ

ID NO: 108), особенно предпочтительны, поскольку такие деиммунизированные ABD характеризуются связыванием практически равным дикому типу, при этом обеспечивая ослабленное связывание с МНС II класса. Таким образом, первая полипептидная цепь такого диатела, имеющего ABD, содержит третий линкер (линкер 3), предпочтительно расположенный на С-конце относительно домена с Е-спиралью (или Kспиралью) такой полипептидной цепи с тем, чтобы находиться между доменом с Е-спиралью (или Kспиралью) и ABD (который предпочтительно является деиммунизированным ABD). Предпочтительной последовательностью для такого линкера 3 является SEQ ID NO:90: GGGS.ID NO: 108) are particularly preferred because such deimmunized ABDs exhibit nearly wild-type binding while providing reduced binding to MHC class II. Thus, the first polypeptide chain of such a diabody having an ABD contains a third linker (linker 3), preferably located at the C-terminus relative to the E-helix (or K-helix) domain of such a polypeptide chain, so as to be between the E-helix domain (or K-coil) and ABD (which is preferably deimmunized ABD). The preferred sequence for such linker 3 is SEQ ID NO:90: GGGS.

2. Биспецифические содержащие Fc-участок диатела2. Bispecific containing the Fc region of the diabody

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим диателам, содержащим Fc-участок, способный одновременно связываться с LAG-3 и вторым эпитопом (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, МНС I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Добавление домена СН2-СН3 IgG в одну или обе из полипептидных цепей диатела, так чтобы образование комплекса между цепями диатела приводило в результате к образованию Fc-участка, увеличивает биологический период полужизни и/или изменяет валентность диатела. Включение домена СН2-СН3 IgG в оба полипептида диатела будет обеспечивать образование двухцепочечного биспецифического диатела, содержащего Fc-участок (фиг. 2).One embodiment of the present invention relates to bispecific diabodies containing an Fc region capable of simultaneously binding to LAG-3 and a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, MHC class I or II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). Addition of an IgG CH2-CH3 domain to one or both of the diabody polypeptide chains such that complex formation between the diabody chains results in an Fc region increases the biological half-life and/or alters the diabody's valency. The incorporation of an IgG CH2-CH3 domain into both diabody polypeptides will generate a double-chain, bispecific diabody containing an Fc region (FIG. 2).

Альтернативно, включение домена СН2-СН3 IgG только в один полипептид диатела обеспечивать образование более сложного четырехцепочечного биспецифического диатела, содержащего Fc-участок (фиг. 3А-3С). На фиг. 3С показано типичное четырехцепочечное диатело, имеющее константный домен легкой цепи (CL) и константный домен тяжелой цепи СН1, тем не менее, в качестве альтернативы можно использовать фрагменты таких доменов, а также другие полипептиды (см., например, фиг. ЗА и 3В, патентные публикации США №№ 2013-0295121, 2010-0174053 и 2009-0060910; публикации европейских патентов EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 и PCT публикации WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). Таким образом, например, вместо домена СН1 можно использовать пептид с аминокислотной последовательностью GVEPKSC (SEQ ID NO:96) VEPKSC (SEQ ID NO:97) или VEPKSC (SEQ ID NO:98), полученный из шарнирного домена IgG человека, а вместо домена CL можно использовать 6 С-концевых аминокислот легкой каппа-цепи человека, GFNRGEC (SEQ ID NO:99) или FNRGEC (SEQ ID NO: 100).Alternatively, incorporation of the IgG CH2-CH3 domain into only one diabody polypeptide allows for the formation of a more complex four-chain bispecific diabody containing an Fc region (FIGS. 3A-3C). In FIG. 3C shows an exemplary four-chain diabody having a light chain constant domain (CL) and a heavy chain constant domain CH1, however, fragments of such domains as well as other polypeptides can be used as an alternative (see, for example, FIGS. 3A and 3B, US Patent Publications Nos. 2013-0295121, 2010-0174053 and 2009-0060910, European Patent Publications EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221 and PCT Publications WO 2012/162068, WO 2012/01807). Thus, for example, instead of the CH1 domain, a peptide with the amino acid sequence GVEPKSC (SEQ ID NO:96) VEPKSC (SEQ ID NO:97) or VEPKSC (SEQ ID NO:98) derived from the human IgG hinge domain can be used, and instead of the domain CL can use the 6 C-terminal amino acids of the human kappa light chain, GFNRGEC (SEQ ID NO: 99) or FNRGEC (SEQ ID NO: 100).

Типичное четырехцепочечное диатело, содержащее пептид, показано на фиг. 3А. В качестве альтернативы или в дополнение, можно использовать пептид, содержащий тандемные спиральные домены с противоположным зарядом, такие как спиральные домены с Е-спиралью (SEQ ID NO: 101: ЕVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK или SEQ IDAn exemplary four chain diabody containing the peptide is shown in FIG. 3A. Alternatively or in addition, a peptide containing tandem helical domains of opposite charge, such as E-helix helical domains (SEQ ID NO: 101: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK or SEQ ID

NO: 103: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK);NO: 103: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK);

и домены с K-спиральюand K-helix domains

ID NO:102: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE или SEQ ID NO:104: KVAACKE(SEQ KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE).ID NO:102: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE or SEQ ID NO:104: KVAACKE(SEQ KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE).

Типичное четырехцепочечное диатело, содержащее домен, который содержит спираль, показан на фиг. 3В.An exemplary four-stranded diabody containing a domain that contains a helix is shown in FIG. 3B.

Содержащие Fc-участок молекулы диател по настоящему изобретению обычно включают дополнительный промежуточные линкерные пептиды (линкеры). Как правило, дополнительные линкеры будут содержать 3-20 аминокислотных остатков. Дополнительные или альтернативные линкеры, которые можно использовать в содержащих Fc-участок молекулах диател по настоящему изобретению, включаютThe Fc region-containing diabody molecules of the present invention typically include additional intermediate linker peptides (linkers). Typically, additional linkers will contain 3-20 amino acid residues. Additional or alternative linkers that can be used in the Fc region containing diabody molecules of the present invention include

GGGS (SEQ ID NO:90), LGGGSG (SEQ ID NO:91), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:92), ASTKG (SEQ ID NO:93), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:109), LEPKSS (SEQ ID NO:94), APSSS (SEQ ID NO:95) и APSSSPME (SEQ ID NO:110), LEPKSADKTHTCPPC (SEQ IDNO:111), GGC и GGG.GGGS (SEQ ID NO:90), LGGGSG (SEQ ID NO:91), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:92), ASTKG (SEQ ID NO:93), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:109), LEPKSS (SEQ ID NO:109 :94), APSSS (SEQ ID NO:95) and APSSSPME (SEQ ID NO:110), LEPKSADKTHTCPPC (SEQ IDNO:111), GGC and GGG.

Для облегчения клонирования можно применять SEQ ID NO: 94 вместо GGG или ggc.To facilitate cloning, SEQ ID NO: 94 can be used instead of GGG or ggc.

Кроме того, после аминокислотной последовательности GGG или SEQ ID NO: 94 может сразу же следовать SEQ ID NO: 109 для образования альтернативных линкеров:In addition, the amino acid sequence GGG or SEQ ID NO: 94 may be immediately followed by SEQ ID NO: 109 to form alternative linkers:

GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 112); и LEPKSSDKTHTCPPCP; (SEQ ID NO:113).GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 112); and LEPKSSDKTHTCPPCP; (SEQ ID NO:113).

Содержащая Fc-участок молекула диатела по настоящему изобретению может включать шарнирный участок IgG в дополнение к линкеру или вместо него. Иллюстративные шарнирные участки включают вариант шарнира EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:114) из IgG1, ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:115) из IgG2, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:116) из IgG4 и eskygppcppcp (SEQ id NO:117) из IgG4, содержащий стабилизирующую замену для уменьшения обмена цепями.The Fc region-containing diabody molecule of the present invention may include an IgG hinge region in addition to or instead of a linker. Exemplary hinge regions include the hinge variant EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:114) from IgG1, ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:115) from IgG2, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:116) from IgG4, and eskygppcppcp (SEQ ID NO:117) from IgG4, containing a stabilizing substitution to reduce chain exchange.

Как приведено на фиг. 3А-3С, диатела по настоящему изобретению могут содержать четыре различных цепи. Первая и третья полипептидные цепи такого диатела содержат три домена:As shown in FIG. 3A-3C, the diabodies of the present invention may contain four different chains. The first and third polypeptide chains of such a diabody contain three domains:

(i) VL1-содержащий домен,(i) a VL1 containing domain,

- 43 041483 (ii) VL2-содержащий домен, (iii) способствующий образованию гетеродимера домен и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.- 43 041483 (ii) a VL2-containing domain, (iii) a heterodimer-forming domain, and (iv) a domain containing a CH2-CH3 sequence.

Вторая и четвертая полипептидные цепи содержат:The second and fourth polypeptide chains contain:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) способствующий образованию гетеродимера домен, причем способствующие образованию гетеродимера домены способствуют димеризацию первой/третьей полипептидных цепей со второй/четвертой полипептидными цепями.(i) a VL2 containing domain, (ii) a VH1 containing domain, and (iii) a heterodimer promoting domain, wherein the heterodimer promoting domains promote dimerization of the first/third polypeptide chains with the second/fourth polypeptide chains.

Домены VL и/или VH третьей и четвертой полипептидных цепей и домены VL и/или VH первой и второй полипептидных цепей могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения четырехвалентного связывания, которое является либо моноспецифическим, либо биспецифическим, либо тетраспецифическим. Обозначения VL3 и VH3 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают третий эпитоп такого диатела (эпитоп 3). Аналогичным образом, обозначения VL4 и VH4 обозначают соответственно вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают четвертый эпитоп такого диатела (эпитоп 4). Общая структура полипептидных цепей типичных содержащих Fc-участок четырехцепочечных диател по настоящему изобретению представлена в табл. 2.The VL and/or VH domains of the third and fourth polypeptide chains and the VL and/or VH domains of the first and second polypeptide chains may be the same or different to provide tetravalent binding that is either monospecific, bispecific, or tetraspecific. The designations VL3 and VH3 denote the light chain variable domain and the heavy chain variable domain, respectively, which bind the third epitope of such a diabody (epitope 3). Similarly, the designations VL4 and VH4 refer to the light chain variable domain and the heavy chain variable domain, respectively, which bind the fourth epitope of such a diabody (epitope 4). The general structure of the polypeptide chains of exemplary Fc region-containing four chain diabodies of the present invention is shown in Table 1. 2.

Таблица 2table 2

Биспецифическое Bispecific 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООНNH ₂ -VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -СООНNH ₂ -VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH Тетраспецифическое tetraspecific 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -COOHNH ₂ -VL 1 - VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH 3-я цепь 3rd chain NH₂-VL3 - VH4-HPD-CH2-CH3 -COOHNH ₂ -VL3 - VH4-HPD-CH2-CH3 -COOH 4-я цепь 4th chain NH₂-VL4-VH3-HPD-COOH _NH2 -VL4-VH3-HPD-COOH

HPD=способствующий образованию гетеродимера доменHPD = heterodimer-promoting domain

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, диатела по настоящему изобретению являются биспецифическими, четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами), Fc-содержащими диателами (фиг. 3А-3С), которые состоят из четырех полных полипептидных цепей. Биспецифические, четырехвалентные, Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат два эпитоп-связывающих сайта, иммуноспецифических к LAG-3 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом LAG-3 или с различными эпитопами LAG-3), и два эпитопсвязывающих сайта, специфичных ко второму эпитопу (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, MHC I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).In accordance with a particular embodiment, the diabodies of the present invention are bispecific, tetravalent (ie, have four epitope-binding sites), Fc-containing diabodies (FIGS. 3A-3C) that are composed of four complete polypeptide chains. The bispecific, tetravalent, Fc-containing diabodies of the present invention contain two LAG-3 immunospecific epitope-binding sites (which may be able to bind to the same LAG-3 epitope or to different LAG-3 epitopes) and two epitope-binding sites. site specific for the second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, MHC class I or II, OX40, PD-1, PD-L1 , TCR, TIM-3, etc.).

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления биспецифические содержащие Fcучасток диатела могут содержать три полипептидные цепи. Первый полипептид такого диатела содержит три домена:According to a further embodiment, the bispecific Fc-containing diabody region may comprise three polypeptide chains. The first polypeptide of such a diabody contains three domains:

Второй полипептид таких диател содержит:The second polypeptide of such diabodies contains:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и ковалентному связыванию первой полипептидной цепи диатела.(i) a VL2 containing domain, (ii) a VH1 containing domain, and (iii) a domain that promotes heterodimerization and covalent binding of the first diabody polypeptide chain.

Третий полипептид таких диател содержит последовательность СН2-СН3. Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких диател объединяются вместе с образованием сайта связывания VL1/VH1, который способен связываться с первым эпитопом, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Первый и второй полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков в их соответствующих третьих доменах. Следует отметить, что первая и третья полипептидные цепи объединяются в комплекс друг с другом с образованием Fc-участка, который стабилизирован дисульфидной связью. Такие диатела имеют повышенную активность. На фиг 4А и 4В показаны структуры таких диател. Такие содержащие Fcучасток биспецифические диатела могут иметь любую из двух ориентации (табл. 3):The third polypeptide of such diabodies contains the sequence CH2-CH3. Thus, the first and second polypeptide chains of such diabodies come together to form a VL1/VH1 binding site that is capable of binding to the first epitope, as well as a VL2/VH2 binding site that is able to bind to the second epitope. The first and second polypeptides are linked to each other via a disulfide bond involving cysteine residues in their respective third domains. It should be noted that the first and third polypeptide chains are complexed with each other to form an Fc region that is stabilized by a disulfide bond. Such diabodies have increased activity. Figures 4A and 4B show the structures of such diabodies. Such Fc-containing bispecific diabodies can have either of two orientations (Table 3):

- 44 041483- 44 041483

Таблица 3Table 3

Первая ориентация First orientation 3-я цепь 3rd chain NH₂-CH2-CH3-COOH _NH2 -CH2-CH3-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -СООНNH ₂ -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH Вторая ориентация Second orientation 3-я цепь 3rd chain NH₂-CH2-CH3-COOH _NH2 -CH2-CH3-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-CH2-CH3 -VL1-VH2-HPD-COOHNH ₂ -CH2-CH3 -VL1-VH2-HPD-COOH 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, диатела по настоящему изобретению являются биспецифическими, двухвалентными (т.е. имеют два эпитопсвязывающих сайта), Fcсодержащими диателами (фиг. 4А-4В), которые состоят из трех полных полипептидных цепей. Биспецифические, двухвалентные Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифический к LAG-3 и один эпитоп-вязывающий сайт, специфичный ко второму эпитопу (например, B7-H3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).In accordance with a particular embodiment, the diabodies of the present invention are bispecific, bivalent (ie, have two epitope binding sites), Fc-containing diabodies (FIGS. 4A-4B) that consist of three complete polypeptide chains. The bispecific, divalent Fc-containing diabodies of the present invention contain one epitope-binding site immunospecific for LAG-3 and one epitope-binding site specific for a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).

В соответствии со следующим вариантом осуществления биспецифические содержащие Fc-участок диатела могут содержать все пять полипептидных цепей. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, две из указанных пяти полипептидных цепей имеют одинаковую аминокислотную последовательность. Первая полипептидная цепь таких диател включает:According to a further embodiment, bispecific Fc region-containing diabodies may contain all five polypeptide chains. In accordance with a specific embodiment, two of these five polypeptide chains have the same amino acid sequence. The first polypeptide chain of such diabodies includes:

(i) VH1-содержaщий домен, (ii) СН1-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.(i) a VH1 containing domain, (ii) a CH1 containing domain, and (iii) a domain containing a CH2-CH3 sequence.

Первая полипептидная цепь может представлять собой тяжелую цепь антитела, которая содержит VH1 и константный участок тяжелой цепи. Вторая и пятая полипептидные цепи таких диател содержат:The first polypeptide chain may be an antibody heavy chain that contains VH1 and a heavy chain constant region. The second and fifth polypeptide chains of such diabodies contain:

Вторая и/или пятая полипептидные цепи таких диател могут представлять собой легкие цепи антитела, которое содержат VL1, комплементарный VH1 первой/третьей полипептидной цепи. Первую, вторую и/или пятую полипептидные цепи можно выделить из естественных антител. Альтернативно, их можно сконструировать рекомбинантными способами. Третья полипептидная цепь таких диател содержит:The second and/or fifth polypeptide chains of such diabodies can be antibody light chains that contain VL1 complementary to VH1 of the first/third polypeptide chain. The first, second and/or fifth polypeptide chains can be isolated from natural antibodies. Alternatively, they can be constructed by recombinant methods. The third polypeptide chain of such diabodies contains:

(i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен, (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, (iv) VL2-содержaщий домен, (v) VH3-содержащий домен и (vi) способствующий образованию гетеродимера домен, где способствующие образованию гетеродимера домены способствуют димеризации третьей цепи с четвертой цепью.(i) a VH1-containing domain, (ii) a CH1-containing domain, (iii) a domain containing a CH2-CH3 sequence, (iv) a VL2-containing domain, (v) a VH3-containing domain, and (vi) a heterodimer-promoting domain where heterodimer-promoting domains promote dimerization of the third strand with the fourth strand.

Четвертый полипептид таких диател содержит:The fourth polypeptide of such diabodies contains:

Таким образом, первая и вторая, а также третья и пятая полипептидные цепи таких диател объединятся вместе с образованием двух связывающих сайтов VL1/VH1, способных связывать первый эпитоп. Третья и четвертая полипептидные цепи таких диател объединяются вместе с образованием сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом, а также сайта связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом. Первый и третий полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи с участием цистеиновых остатков в их соответствующих константных участках. Следует отметить, что первая и третья полипептидные цепи объединяются в комплекс друг с другом с образованием Fc-участка. Такие диатела имеют повышенную активность. На фиг. 5 показана структура таких диател. Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения связывания, которое является моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим. Тем не менее, как представлено в настоящем документе, такие домены предпочтительно выбраны так, чтобы связывать LAG-3 и второй эпитоп (или второй и третий эпитоп (например, B7-H3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Второй и третий эпитопы могут быть различными эпитопами одной и той же молекулы антигена или могут быть эпитопами различных молекул антигена. ТакиеThus, the first and second, as well as the third and fifth, polypeptide chains of such diabodies will join together to form two VL1/VH1 binding sites capable of binding the first epitope. The third and fourth polypeptide chains of these diabodies combine to form a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to a second epitope, as well as a VL3/VH3 binding site that is able to bind to a third epitope. The first and third polypeptides are linked to each other via a disulfide bond involving cysteine residues in their respective constant regions. It should be noted that the first and third polypeptide chains are complexed with each other to form an Fc region. Such diabodies have increased activity. In FIG. 5 shows the structure of such diabodies. It should be understood that the VL1/VH1, VL2/VH2, and VL3/VH3 domains may be the same or different to provide binding that is monospecific, bispecific, or trispecific. However, as presented herein, such domains are preferably chosen to bind LAG-3 and the second epitope (or second and third epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137 , CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.) The second and third epitopes may be different epitopes of the same antigen molecule or may be epitopes of different antigen molecules.

- 45 041483 аспекты настоящего изобретения более подробно рассмотрены ниже.- 45 041483 aspects of the present invention are discussed in more detail below.

Таким образом, домены VL и VH полипептидных цепей выбраны таким образом, чтобы образовывались сайты связывания VL/VH, специфичные к требуемым эпитопам. Сайты связывания VL/VH, образованные в результате связывания полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения четырехвалентного связывания, которое является моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или тетрапецифическим. В частности, домены VL и VH могут быть выбраны таким образом, чтобы биспецифическое диатело могло содержать два сайта связывания к первому эпитопу и два сайта связывания ко второму эпитопу, или три сайта связывания к первому эпитопу и один сайт связывания ко второму эпитопу, или два сайта связывания к первому эпитопу, один сайт связывания ко второму эпитопу и один сайт связывания к третьему эпитопу (как показано на фиг. 5). Общая структура полипептидных цепей типичных содержащих Fc-участок пятицепочечных диател по настоящему изобретению представлена в табл. 4.Thus, the VL and VH domains of the polypeptide chains are chosen such that VL/VH binding sites specific to the desired epitopes are formed. The VL/VH binding sites resulting from the binding of polypeptide chains may be the same or different to provide tetravalent binding that is monospecific, bispecific, trispecific, or tetraspecific. In particular, the VL and VH domains can be chosen such that the bispecific diabody can contain two binding sites to the first epitope and two binding sites to the second epitope, or three binding sites to the first epitope and one binding site to the second epitope, or two sites binding to the first epitope, one binding site to the second epitope and one binding site to the third epitope (as shown in Fig. 5). The general structure of the polypeptide chains of a typical Fc-containing five-chain diabodies of the present invention is presented in table. 4.

______________________________________________________ Таблица 4______________________________________________________ Table 4

Биспецифическое (2x2) Bispecific (2x2) 2-я цепь 2nd chain NH2-VLI-CL-COOH NH2-VLI-CL-COOH 1-я цепь 1st chain NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH 3-я цепь 3rd chain NH2-VHI-CHI-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH NH2-VHI-CHI-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH 5-я цепь 5th chain NH2-VLI-CL-COOH NH2-VLI-CL-COOH 4-я цепь 4th chain NH2-VL2-VH2-HPD-COOH NH2-VL2-VH2-HPD-COOH Биспецифическое (3x1) Bispecific (3x1) 2-я цепь 2nd chain NH2-VLI-CL-COOH NH2-VLI-CL-COOH 1-я цепь 1st chain NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH 3-я цепь 3rd chain NH₂-VH1 -CHI -СН2-СНЗ -VL 1-VH2-HPD-COOHNH ₂ -VH1 -CHI -CH2-CH3 -VL 1-VH2-HPD-COOH 5-я цепь 5th chain NH2-VLI-CL-COOH NH2-VLI-CL-COOH 4-я цепь 4th chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH Триспецифическое (2x1x1) Trispecific (2x1x1) 2-я цепь 2nd chain NH2-VLI-CL-COOH NH2-VLI-CL-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-VH1-CH1-CH2-CH3-COOHNH ₂ -VH1-CH1-CH2-CH3-COOH 3-я цепь 3rd chain NH2-VHI-СН1-СН2-СНЗ -VL2-VH3 -HPD-COOH NH2-VHI-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD-COOH 5-я цепь 5th chain NH2-VLI-CL-COOH NH2-VLI-CL-COOH 4-я цепь 4th chain NH₂-VL3 - VH2-HPD-COOHNH2 _- VL3-VH2-HPD-COOH

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, диатела по настоящему изобретению являются биспецифическими четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами) Fc-содержащими диателами, которые состоят из пяти полных полипептидных цепей, имеющих два сайта связывания к первому эпитопу и два сайта связывания ко второму эпитопу. В соответствии с одним вариантом осуществления, биспецифические четырехвалентные Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифических к LAG-3 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом LAG-3 или с различными эпитопами LAG-3), и два эпитопсвязывающих сайта, специфичных ко второму эпитопу (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). В соответствии с другим вариантом осуществления биспецифические четырехвалентные Fcсодержащие диатела по настоящему изобретению содержат три эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифических к LAG-3 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом LAG-3 или с различными эпитопами LAG-3), и один эпитопсвязывающий сайт, специфичный ко второму эпитопу (например, В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). В соответствии с другим вариантом осуществления биспецифические четырехвалентные Fc-содержащие диатела по настоящему изобретению содержат один эпитопсвязывающий сайт, иммуноспецифический к LAG-3, и три эпитоп-связывающих сайта, специфичных ко второму эпитопу (например, В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).In accordance with a specific embodiment, the diabodies of the present invention are bispecific tetravalent (i.e., have four epitope-binding sites) Fc-containing diabodies that consist of five complete polypeptide chains having two binding sites to the first epitope and two binding sites to the second epitope. In accordance with one embodiment, the bispecific tetravalent Fc-containing diabodies of the present invention contain two LAG-3 immunospecific epitope-binding sites (which may be capable of binding to the same LAG-3 epitope or to different LAG-3 epitopes), and two epitope-binding sites specific for a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD -L1, TCR, TIM-3, etc.). According to another embodiment, the bispecific tetravalent Fc-containing diabodies of the present invention comprise three LAG-3 immunospecific epitope-binding sites (which may be capable of binding to the same LAG-3 epitope or to different LAG-3 epitopes) and one epitope-binding site site specific to the second epitope (e.g. B7-I3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). In accordance with another embodiment, the bispecific tetravalent Fc-containing diabodies of the present invention contain one epitope-binding site immunospecific for LAG-3 and three epitope-binding sites specific for a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).

3. Биспецифические трехвалентные содержащие Fc-участки связывающие молекулы3. Bispecific trivalent Fc-containing binding molecules

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим трехвалентным содержащим Fc-участок связывающим молекулам и способным одновременно связываться с первым эпитопом, вторым эпитопом и третьим эпитопом, причем по меньшей мере один из таких эпитопов не идентичен другому из таких эпитопов. Таким образом, такие биспецифические диатела содержат домены VLr7VHr’, которые способны связываться с первым эпитопом, домены ’’VL2/VH2, которые способны связываться со вторым эпитопом, и домены VL37VH3, которые способны связываться с третьим эпитопом. В соответствии с одним вариантом осуществления, один или два из таких эпитопов являются эпитопом LAG-3, а другой (или другие) из таких эпитопов не является эпитопом LAG-3 (например, эпитопом В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, МНС I или II класса, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Такие биспецифические трехвалентные связывающие молекулы содержат три эпитопсвязывающих сайта, два из которых являются связывающими домеAnother embodiment of the present invention relates to bispecific trivalent Fc-region containing binding molecules and capable of simultaneously binding to a first epitope, a second epitope and a third epitope, at least one of such epitopes is not identical to another of such epitopes. Thus, such bispecific diabodies contain VLr7VHr' domains that are able to bind to the first epitope, ''VL2/VH2 domains that are able to bind to the second epitope, and VL37VH3 domains that are able to bind to the third epitope. In one embodiment, one or two of such epitopes is a LAG-3 epitope and the other (or others) of such epitopes is not a LAG-3 epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). Such bispecific trivalent binding molecules contain three epitope-binding sites, two of which are binding at home.

- 46 041483 нами по типу диатела, которые обеспечивают сайт связывания А и сайт связывания В, и один из которых является связывающим доменом, не относящимся по типу диатела, который обеспечивает сайт связывания С (см., например, фиг. 6A-6F, и PCT заявки №: PCT/US 15/33081 и PCT/US 15/33076).- 46 041483 by us on the diabody type, which provide the binding site A and the binding site B, and one of which is a non-diabody binding domain that provides the binding site C (see, for example, Fig. 6A-6F, and PCT Application Nos: PCT/US 15/33081 and PCT/US 15/33076).

Как правило, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению будут содержать четыре различных полипептидных цепи (см. фиг. 6А-6В), тем не менее, молекулы могут содержать меньшее или большее количество полипептидных цепей, например, в результате слияния таких полипептидных цепей друг с другом (например, посредством пептидной связи), или в результате разделения таких полипептидных цепей с образованием дополнительных полипептидных цепей, или в результате связывания меньшего количества или дополнительных полипептидных цепей посредством дисульфидных связей. На фиг. 6B-6F приведена иллюстрация этого аспекта настоящего изобретения, на которой схематически изображены такие молекулы с тремя полипептидными цепями. Как представлено на фиг. 6A-6F, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут иметь альтернативные ориентации, в которых связывающие домены по типу диатела являются N-концевыми (фиг. 6А, 6С и 6D) или С-концевыми (фиг. 6В, 6Е и 6F) по отношению к Fc-участку.Typically, the trivalent binding molecules of the present invention will contain four different polypeptide chains (see FIGS. 6A-6B), however, the molecules may contain fewer or more polypeptide chains, for example, as a result of the fusion of such polypeptide chains with each other. (eg, via a peptide bond), or by separating such polypeptide chains to form additional polypeptide chains, or by linking fewer or additional polypeptide chains via disulfide bonds. In FIG. 6B-6F is an illustration of this aspect of the present invention, which schematically depicts such molecules with three polypeptide chains. As shown in FIG. 6A-6F, the trivalent binding molecules of the present invention may have alternative orientations in which the diabody binding domains are N-terminal (FIGS. 6A, 6C and 6D) or C-terminal (FIGS. 6B, 6E and 6F) with respect to to the Fc region.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, первая полипептидная цепь таких трехвалентных связывающих молекул по настоящему изобретению содержит:In accordance with some embodiments, the first polypeptide chain of such trivalent binding molecules of the present invention contains:

(i) VL1-содержащий домен, (ii) VL2-содержащий домен, (iii) способствующий образованию гетеродимера домен и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.(i) a VL1-containing domain, (ii) a VL2-containing domain, (iii) a heterodimer-forming domain, and (iv) a domain containing a CH2-CH3 sequence.

Домены VL1 и VL2 расположены на N-конце или С-конце относительно СН2-СН3-содержащего домена, как представлено в табл. 5 (фиг. 6А и 6В). Вторая полипептидная цепь таких вариантов осуществления содержит:Domains VL1 and VL2 are located at the N-terminus or C-terminus relative to CH2-CH3-containing domain, as shown in table. 5 (FIGS. 6A and 6B). The second polypeptide chain of such embodiments comprises:

(i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) способствующий образованию гетеродимера домен.(i) a VL2-containing domain, (ii) a VH1-containing domain, and (iii) a heterodimer-promoting domain.

Третья полипептидная цепь по таким вариантам осуществления содержит:The third polypeptide chain of such embodiments comprises:

(i) VH3-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3.(i) a VH3 containing domain, (ii) a CH1 containing domain, and (iii) a domain containing a CH2-CH3 sequence.

Третья полипептидная цепь может представлять собой тяжелую цепь антитела, которая содержит VH3 и константный участок тяжелой цепи. Четвертый полипептид по таким вариантам осуществления содержит:The third polypeptide chain may be an antibody heavy chain that contains VH3 and a heavy chain constant region. The fourth polypeptide of such embodiments comprises:

(i) VL3-содержащий домен и (ii) CL-содержащий домен.(i) a VL3 containing domain; and (ii) a CL containing domain.

Четвертая полипептидная цепь может представлять собой легкую цепь антитела, которая содержит VL3, комплементарный VH3 третьей полипептидной цепи. Третью или четвертую полипептидные цепи можно выделить из естественных антител. Альтернативно их можно сконструировать рекомбинантными, синтетическими или другими способами.The fourth polypeptide chain may be an antibody light chain that contains a VL3 complementary to the VH3 of the third polypeptide chain. The third or fourth polypeptide chains can be isolated from natural antibodies. Alternatively, they can be engineered by recombinant, synthetic, or other means.

Вариабельные домены легкой цепи из первой и второй полипептидных цепей отделены от вариабельных доменов тяжелой цепи из таких полипептидных цепей промежуточным спейсерным линкером, который имеет слишком короткую длину, чтобы позволить их доменам VL1/VH2 (или их VL2/VH1) связаться вместе с образованием эпитоп-связывающего сайта, способного связываться с первым или вторым эпитопом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) для такой цели имеет последовательность (SEQ ID NO: 14): GGGSGGGG.The light chain variable domains from the first and second polypeptide chains are separated from the heavy chain variable domains from such polypeptide chains by an intermediate spacer linker that is too short in length to allow their VL1/VH2 domains (or their VL2/VH1) to be linked together to form an epitope. a binding site capable of binding to the first or second epitope. A preferred intermediate spacer peptide (linker 1) for this purpose has the sequence (SEQ ID NO: 14): GGGSGGGG.

Другие домены трехвалентных связывающих молекул могут быть разделены одним или несколькими промежуточными спейсерными пептидами, необязательно содержащими цистеиновый остаток.Other trivalent binding molecule domains may be separated by one or more intermediate spacer peptides, optionally containing a cysteine residue.

Иллюстративные линкеры, пригодные для создания трехвалентных связывающих молекул, приведены в настоящем описании, а также представлены в PCT заявках PCT/US 15/33081 и PCT/US 15/33076. Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких трехвалентных связывающих молекул объединяются вместе с образованием сайта связывания VL1/VH1, который способен связывать первый эпитоп, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Третья и четвертая полипептидные цепи таких трехвалентных связывающих молекул объединяются вместе с образованием сайта связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом.Exemplary linkers suitable for the creation of trivalent binding molecules are described herein and also in PCT applications PCT/US 15/33081 and PCT/US 15/33076. Thus, the first and second polypeptide chains of such trivalent binding molecules are combined together to form a VL1/VH1 binding site that is capable of binding a first epitope, as well as a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to a second epitope. The third and fourth polypeptide chains of these trivalent binding molecules join together to form a VL3/VH3 binding site that is capable of binding to a third epitope.

Как описано далее, трехвалентные связывающие молекулы по настоящему изобретению могут содержать три полипептида. Трехвалентные связывающие молекулы, содержащие три полипептидные цепи, могут быть получены путем связывания доменов четвертого полипептида, N-концевого по отношению к VH3-содержащему домену третьего полипептида. Альтернативно, используют третью полипептидную цепь трехвалентной связывающей молекулы по настоящему изобретению, содержащую следующие три домена:As described below, trivalent binding molecules of the present invention may contain three polypeptides. Trivalent binding molecules containing three polypeptide chains can be obtained by linking the domains of the fourth polypeptide, N-terminal in relation to the VH3-containing domain of the third polypeptide. Alternatively, a third polypeptide chain of the trivalent binding molecule of the present invention is used, containing the following three domains:

(i) VL3-содержащий домен, (ii) VH3-содержащий домен и(i) a VL3 containing domain, (ii) a VH3 containing domain, and

- 47 041483 (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, причем VL3 и VH3 отделены друг от друга промежуточным спейсерным пептидом, который имеет достаточную длину (по меньшей мере 9 или более аминокислотных остатков), чтобы позволить объединение таких доменов с образованием эпитопсвязывающего сайта.- 47 041483 (iii) a domain containing the sequence CH2-CH3, wherein VL3 and VH3 are separated from each other by an intermediate spacer peptide that is of sufficient length (at least 9 or more amino acid residues) to allow such domains to combine to form an epitope-binding site .

Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 таких молекул диател могут быть одинаковыми или различаться для обеспечения связывания, которое является моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим. Тем не менее, как указано в настоящем документе, такие домены предпочтительно выбраны так, чтобы связывать LAG-3 и второй эпитоп (или второй и третий эпитоп) (предпочтительно, такие эпитопы представляли собой эпитопы В7-НЗ, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т. д.).It should be understood that the VL1/VH1, VL2/VH2, and VL3/VH3 domains of such diabody molecules may be the same or different to provide binding that is monospecific, bispecific, or trispecific. However, as indicated herein, such domains are preferably chosen to bind LAG-3 and the second epitope (or second and third epitope) (preferably, such epitopes were epitopes B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40 , CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).

В частности, домены VL и VH могут быть выбраны таким образом, чтобы трехвалентная связывающая молекула содержала два сайта связывания к первому эпитопу и один сайт связывания ко второму эпитопу, или один сайт связывания к первому эпитопу и два сайта связывания ко второму эпитопу, или один сайт связывания к первому эпитопу, один сайт связывания ко второму эпитопу и один сайт связывания к третьему эпитопу. Общая структура полипептидных цепей типичных трехвалентных связывающих молекул по настоящему изобретению представлена на фиг. 6A-6F и в табл. 5:In particular, the VL and VH domains can be chosen such that the trivalent binding molecule contains two binding sites to the first epitope and one binding site to the second epitope, or one binding site to the first epitope and two binding sites to the second epitope, or one site binding to the first epitope, one binding site to the second epitope and one binding site to the third epitope. The general structure of the polypeptide chains of exemplary trivalent binding molecules of the present invention is shown in FIG. 6A-6F and in table. 5:

Таблица 5Table 5

1-я ориентация четырех цепей 1st orientation of four chains 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -СООНNH ₂ -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH 3-я цепь 3rd chain NH₂-VH3 -CH 1-СН2-СНЗ -СООНNH ₂ -VH3 -CH 1-CH2-CH3 -COOH 4-я цепь 4th chain NH₂-VL3-CL-COOH _NH2 -VL3-CL-COOH 2-я ориентация четырех цепей 2nd orientation of four strands 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD СООНNH ₂ -CH2-CH3-VL1-VH2-HPD COOH 3-я цепь 3rd chain NH₂-VH3 -CH 1-СН2-СНЗ -СООНNH ₂ -VH3 -CH 1-CH2-CH3 -COOH 4-я цепь 4th chain NH₂-VL3-CL-COOH _NH2 -VL3-CL-COOH 1-я ориентация трех цепей 1st orientation of three chains 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -СООНNH ₂ -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3 -COOH 3-я цепь 3rd chain NH₂-VL3 -VH3-HPD-CH2-CH3 -СООНNH ₂ -VL3 -VH3-HPD-CH2-CH3 -COOH 2-я ориентация трех цепей 2nd orientation of three strands 2-я цепь 2nd chain NH₂-VL2-VH1-HPD-COOH _NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH 1-я цепь 1st chain NH₂-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD СООНNH ₂ -CH2-CH3-VL1-VH2-HPD COOH 3-я цепь 3rd chain NH₂-VL3 -VH3-HPD-CH2-CH3 -СООНNH ₂ -VL3 -VH3-HPD-CH2-CH3 -COOH

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим трехвалентным связывающим молекулам, которые содержат два эпитопсвязывающих сайта к LAG-3 и один эпитопсвязывающий сайт ко второму эпитопу, присутствующему на молекуле, отличной от LAG-3 (например, В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Два эпитопсвязывающих сайта к LAG-3 могут связывать один и тот же эпитоп или различные эпитопы. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к биспецифическим трехвалентным связывающим молекулам, которые содержат один эпитопсвязывающий сайт к LAG-3 и два эпитопсвязывающих сайта, которые связывают второй антиген, присутствующий на молекуле, отличной от LAG-3 (например, В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, МНС I или II класса, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Два эпитопсвязывающих сайта ко второму антигену могут связывать один и тот же эпитоп или различные эпитопы антигена (например, одинаковые или различные эпитопы LAG-3).One embodiment of the present invention relates to bispecific trivalent binding molecules that contain two epitope-binding sites to LAG-3 and one epitope-binding site to a second epitope present on a molecule other than LAG-3 (e.g., B7-I3, B7-H4, BTLA , CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). Two epitope-binding sites to LAG-3 can bind the same epitope or different epitopes. Another embodiment of the present invention relates to bispecific trivalent binding molecules that contain one epitope-binding site to LAG-3 and two epitope-binding sites that bind a second antigen present on a molecule other than LAG-3 (e.g., B7-I3, B7-H4 , BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). The two epitope-binding sites to the second antigen may bind the same epitope or different epitopes of the antigen (eg, the same or different epitopes of LAG-3).

Как показано выше, такие биспецифические трехвалентные связывающие молекулы могут содержать три или четыре полипептидных цепи.As shown above, such bispecific trivalent binding molecules may contain three or four polypeptide chains.

VII. Константные домены и Fc-участкиVII. Constant domains and Fc regions

В настоящем документе представлены константные домены антитела, пригодные для создания связывающих LAG-3 молекул (например, антител, диател, трехвалентных связывающих молекул и т.д.) по настоящему изобретению.Provided herein are antibody constant domains useful for constructing the LAG-3 binding molecules (eg, antibodies, diabodies, trivalent binding molecules, etc.) of the present invention.

Предпочтительным доменом CL является каппа-домен CL IgG человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного каппа-домена CL человека является (SEQ ID NO: 118):A preferred CL domain is the kappa domain of human IgG CL. The amino acid sequence of an exemplary human CL kappa domain is (SEQ ID NO: 118):

RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSGRTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG

NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGECNSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC

Альтернативно, иллюстративным доменом CL является лямбда-домен CL IgG человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного каппа-домена CL человека является (SEQ ID NO: 119):Alternatively, an exemplary CL domain is the lambda domain of human IgG CL. The amino acid sequence of an exemplary human CL kappa domain is (SEQ ID NO: 119):

- 48 041483- 48 041483

QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECSQPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS

Как представлено в настоящем документе, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению могут содержать Fc-участок. Fc-участок таких молекул по настоящему изобретению может относиться к любому изотипу (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению могут дополнительно содержать домен СН1 и/или шарнирный участок. При наличии, домен СН1 и/или шарнирный участок могут относиться к любому изотипу (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и предпочтительно относятся к тому же изотипу, что и требуемый Fc-участок.As presented herein, the LAG-3 binding molecules of the present invention may contain an Fc region. The Fc region of such molecules of the present invention may be of any isotype (eg IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4). The LAG-3 binding molecules of the present invention may further comprise a CH1 domain and/or a hinge region. If present, the CH1 domain and/or hinge region may be of any isotype (eg, IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4), and are preferably of the same isotype as the desired Fc region.

Иллюстративным доменом СН1 является домен СН IgG1. Аминокислотной последовательностью иллюстративного домена CH1 IgG1 человека является (SEQ ID NO: 120):An exemplary CH1 domain is an IgG1 CH domain. The amino acid sequence of an exemplary human IgG1 CH1 domain is (SEQ ID NO: 120):

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVHTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV

Иллюстративным доменом CH1 является домен СН IgG2. Аминокислотной последовательностью иллюстративного домена CH1 IgG2 человека является (SEQ ID NO: 121):An exemplary CH1 domain is the CH domain of IgG2. The amino acid sequence of an exemplary human IgG2 CH1 domain is (SEQ ID NO: 121):

I ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVI ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVHTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV

Иллюстративным доменом СН1 является домен CH1 IgG4. Аминокислотной последовательностью иллюстративного домена CH1 IgG4 человека является (SEQ ID NO: 122):An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of IgG4. The amino acid sequence of an exemplary human IgG4 CH1 domain is (SEQ ID NO: 122):

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVHTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV

Одним иллюстративным шарнирным участком является шарнирный участок IgG1 человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного шарнирного участка IgG1 человека является (SEQ ID NO:114): EPKSCDKTHTCPPCP .One exemplary hinge region is the human IgG1 hinge region. The amino acid sequence of an exemplary human IgG1 hinge is (SEQ ID NO:114): EPKSCDKTHTCPPCP.

Другой иллюстративный шарнирный участок представляет собой шарнирный участок IgG2 человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного шарнирного участка IgG2 человека является (SEQ ID NO:115): ERKCCVECPPCP .Another exemplary hinge region is the human IgG2 hinge region. The amino acid sequence of an exemplary human IgG2 hinge is (SEQ ID NO:115): ERKCCVECPPCP.

Другой иллюстративный шарнирный участок представляет собой шарнирный участок IgG4 человека. Аминокислотной последовательностью иллюстративного шарнирного участка IgG4 человека является (SEQ ID NO:116): ESKYGPPCPSCP.Another illustrative hinge region is the human IgG4 hinge region. The amino acid sequence of an exemplary human IgG4 hinge is (SEQ ID NO:116): ESKYGPPCPSCP.

Как описано в настоящем документе, шарнирный участок IgG4 может содержать стабилизирующую мутацию, такую как замена S228P. Аминокислотной последовательностью иллюстративного стабилизированного шарнирного участка IgG4 является (^SEQ ^ID NO:117): eskygppcppcp .As described herein, the IgG4 hinge region may contain a stabilizing mutation, such as the S228P substitution. The amino acid sequence of an exemplary stabilized IgG4 hinge is ( ^SE Q ^ID NO:117): eskygppcppcp.

Fc-участок содержащих Fc-участок молекул (например, антител, диател и трехвалентных молекул) по настоящему изобретению может представлять собой либо полный Fc-участок (например, полный Fcучасток IgG), либо только фрагмент Fc-участка. Необязательно, Fc-участок содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению не имеет С-концевой лизиновый аминокислотный остаток. Так, в частности, Fc-участок содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению может быть сконструированным вариантным Fc-участком. Несмотря на то, что Fc-участок биспецифических содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению может обладать способностью связываться с одним или несколькими рецепторами Fc (например, FcyR(s)), более предпочтительно такой вариантный Fc-участок будет иметь измененное связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16а) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок дикого типа) или будут иметь существенно уменьшенную или отсутствующую способность связываться с ингибирующим(-и) рецептором(-ами). Таким образом, Fc-участок содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению может включать несколько или все домены СН2 и/или несколько или все домены СН3 полного Fc-участка, или может содержать последовательность вариантного СН2 и/или вариантного СН3 (который может включать, например, одну или несколько вставок и/или одну или несколько делеций по отношению к доменам СН2 или СН3 полного Fc-участка). Такие Fc-участки могут содержать не относящиеся к Fc полипептидные части, или могут содержать части неприродных полных Fc-участков, или могут содержать не встречающиеся в природе ориентации доменов СН2 и/или СН3 (такие как, например, два домена СН2, или два домена СН3, или в направлении от N-конца до С-конца, домен СН3 связанный с доменом СН2 и т.д.).The Fc region of the Fc region-containing molecules (eg, antibodies, diabodies, and trivalent molecules) of the present invention may be either the entire Fc region (eg, the complete Fc region of IgG) or only a fragment of the Fc region. Optionally, the Fc region of the Fc region containing molecules of the present invention does not have a C-terminal lysine amino acid residue. Thus, in particular, the Fc region of the Fc region-containing molecules of the present invention may be an engineered variant Fc region. While the Fc region of the bispecific Fc region-containing molecules of the present invention may have the ability to bind to one or more Fc receptors (e.g., FcyR(s)), more preferably such a variant Fc region will have altered binding to FcyRIA ( CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) or FcyRIIIB (CD16b) (relative to the binding that characterizes the wild-type Fc region) or will have a significantly reduced or no ability to bind to the inhibitory receptor(s) (s). Thus, the Fc region of the Fc region-containing molecules of the present invention may include some or all of the CH2 domains and/or some or all of the CH3 domains of the entire Fc region, or may contain the sequence of a variant CH2 and/or a variant CH3 (which may include, for example, one or more insertions and/or one or more deletions to the CH2 or CH3 domains of the complete Fc region). Such Fc regions may contain non-Fc polypeptide portions, or may contain portions of non-naturally complete Fc regions, or may contain unnatural orientations of CH2 and/or CH3 domains (such as, for example, two CH2 domains, or two CH3, or N-terminus to C-terminus, CH3 domain linked to CH2 domain, etc.).

Из уровня техники известны модификации Fc-участка, которые были определены как изменяющие эффекторную функцию, в том числе модификации, которые увеличивают связывание с активирующими рецепторами (например, FcyRIIA (CD16A) и уменьшают связывание с ингибирующими рецепторами (например, FcyRIIB (CD32B) (см., например, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors, Cancer Res. 57(18):8882-8890). Иллюстративные варианты Fc-участков IgG1 человека с уменьшенным связыванием с CD32B и/или увеличенным связыванием сModifications to the Fc region are known in the art that have been identified as altering effector function, including modifications that increase binding to activating receptors (e.g., FcyRIIA (CD16A) and decrease binding to inhibitory receptors (e.g., FcyRIIB (CD32B) (see ., for example, Stavenhagen, J. B. et al.(2007) Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors, Cancer Res. 57(18):8882 -8890) Exemplary variants of human IgG1 Fc regions with reduced binding to CD32B and/or increased binding to

- 49 041483- 49 041483

CD16A содержат замены F243L, R292P, Y300L, V305I или P296L. Такие аминокислотные замены могут присутствовать в Fc-участке IgG1 человека в любой комбинации или подкомбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления вариант Fc-участка IgG1 человека содержит замену F243L, R292P и Y300L. В соответствии с другим вариантом осуществления, вариант Fc-участка IgG1 человека содержит замены F243L, R292P, Y300L, V305I и P296L.CD16A contain F243L, R292P, Y300L, V305I, or P296L replacements. Such amino acid substitutions may be present in the Fc region of human IgG1 in any combination or subcombination. In accordance with one embodiment, the Fc region variant of human IgG1 contains the substitution F243L, R292P and Y300L. According to another embodiment, the human IgG1 Fc region variant contains substitutions F243L, R292P, Y300L, V305I, and P296L.

Так, в частности, предпочтительно, чтобы домены СН2-СН3 полипептидных цепей содержащих Fcучасток молекул по настоящему изобретению характеризовались сниженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). Выше описаны вариантные Fc-участки и мутантные формы, способные опосредовать такое измененное связывание. В соответствии с конкретным вариантом осуществления содержащие Fcучасток молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок IgG, который характеризуется уменьшенной ADCC-эффекторной функцией. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления домен СН2-СН3 первой и/или третьей полипептидных цепей таких молекул включают любую 1, 2 или 3 замены: L234A, L235A, N297Q и N297G. В соответствии с другим вариантом осуществления вариант Fc-участка IgG человека содержит замену N297Q, замену N297G, замены L234A и L235A замены или замену D265A, поскольку эти мутации устраняют связывание FcR. В соответствии с альтернативным вариантом используют домен СН2-СН3, который изначально характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIIIA (CD16а) и/или уменьшенной эффекторной функцией (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, содержащие Fc-участок молекулы по настоящему изобретению содержат Fc-участок IgG2 (SEQ ID NO: 2) или Fc-участок IgG4 (SEQ ID NO: 4). В случае использования Fc-участка IgG4 настоящее изобретение также относится к внесению стабилизирующей мутации, такой как описанная выше замена S228P в шарнирном участке (см., например, SEQ ID NO: 117). Поскольку замены N297G, N297Q, L234A, L235A и D265A устраняют эффекторную функцию, в тех обстоятельствах, когда необходима эффекторная функция, эти замены предпочтительно не будут ис пользоваться.Thus, in particular, it is preferable that the CH2-CH3 domains of the polypeptide chains containing the Fc region of the molecules of the present invention are characterized by reduced (or practically absent) binding to FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) or FcyRIIIB (CD16b) (relative to the binding that characterizes the wild-type IgG1 Fc region (SEQ ID NO: 1)). Described above are variant Fc regions and mutants capable of mediating such altered binding. In accordance with a specific embodiment, the Fc region-containing molecules of the present invention contain an IgG Fc region that has reduced ADCC effector function. According to a preferred embodiment, the CH2-CH3 domain of the first and/or third polypeptide chains of such molecules includes any 1, 2 or 3 substitutions: L234A, L235A, N297Q and N297G. In another embodiment, the human IgG Fc region variant contains an N297Q substitution, an N297G substitution, an L234A and L235A substitution, or a D265A substitution because these mutations abolish FcR binding. Alternatively, a CH2-CH3 domain is used that initially has reduced (or virtually no) binding to FcyRIIIA (CD16a) and/or reduced effector function (relative to the binding that characterizes the wild-type IgG1 Fc region (SEQ ID NO: 1 )). According to a specific embodiment, the Fc region-containing molecules of the present invention comprise an IgG2 Fc region (SEQ ID NO: 2) or an IgG4 Fc region (SEQ ID NO: 4). In the case of using the Fc region of IgG4, the present invention also relates to the introduction of a stabilizing mutation, such as the S228P substitution described above in the hinge region (see, for example, SEQ ID NO: 117). Since the N297G, N297Q, L234A, L235A, and D265A substitutions eliminate effector function, in circumstances where effector function is desired, these substitutions will preferably not be used.

Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению будет иметь замены L234A/L235A (SEQ ID NO: 123):The preferred IgG1 sequence for the CH2 and CH3 domains of the LAG-3 binding molecules of the present invention would be L234A/L235A (SEQ ID NO: 123):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

Так, в частности, предпочтительно, чтобы Fc-участки полипептидных цепей содержащих Fcучасток молекул по настоящему изобретению характеризовались повышенным период полужизни в сыворотке (относительно периода полужизни, которым характеризуется соответствующий Fc дикого типа). Выше описаны вариантные Fc-участки и мутантные формы, характеризующиеся продолжительным периодом полужизни в сыворотке. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, домен СН2-СН3 первой и/или третьей полипептидных цепей таких содержащих Fc-участок молекул включают любую 1, 2 или 3 замены: M252Y, S254T и Т256Е. Настоящее изобретение дополнительно относится к содержащим Fc-участок молекулам по настоящему изобретению, содержащим вариантные Fc-участки, содержащие:Thus, in particular, it is preferred that the Fc regions of the polypeptide chains containing the Fc region of the molecules of the present invention have an increased serum half-life (relative to the half-life that characterizes the corresponding wild-type Fc). Described above are variant Fc regions and mutants characterized by a long serum half-life. According to a preferred embodiment, the CH2-CH3 domain of the first and/or third polypeptide chains of such Fc region containing molecules comprise any 1, 2 or 3 substitutions: M252Y, S254T and T256E. The present invention further relates to Fc region-containing molecules of the present invention containing variant Fc regions comprising:

Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению будут содержать замены L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 124):The preferred IgG1 sequence for the CH2 and CH3 domains of the Fc region containing molecules of the present invention will comprise the substitutions L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 124):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPAGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEWESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.ALHNHYTQKS LSLSPGX where X is lysine (K) or absent.

Предпочтительная последовательность IgG4 для доменов СН2 и СН3 содержащих Fc-участок молекул по настоящему изобретению будут содержать замены M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 125):The preferred IgG4 sequence for the CH2 and CH3 domains of the Fc region containing molecules of the present invention would contain the substitutions M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 125):

- 50 041483- 50 041483

APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

Для диател и трехвалентных связывающих молекул (первая и третья полипептидные цепи которых не идентичны) желательно уменьшить или предупредить гомодимеризацию между доменами СН2-СН3 двух первых полипептидных цепей или между доменами СН2-СН3 двух третьих полипептидных цепей. Домены СН2 и/или СН3 таких полипептидных цепей не обязательно должны быть идентичными по последовательности, и преимущественно они модифицированы таким образом, чтобы это содействовало комплексообразованию между двумя полипептидными цепями. Например, аминокислотная замена (предпочтительно замена на аминокислоту, содержащую объемную боковую группу, образующую выступ, например, триптофан), может быть введена в домен СН2 или СН3 с тем, чтобы стерическое влияние препятствовало взаимодействию с аналогично мутированным доменом и принуждало мутированный домен образовывать пару с доменом, в который методом инженерии была встроена комплементарная или согласующаяся мутация, т.е. впадина (например, замена на глицин). Такие наборы мутаций могут быть встроены способами инженерии в любую пару полипептидов, содержащих домены СН2-СН3, которые образуют Fc-участок. Способы белковой инженерии для облегчения гетеродимеризации относитель но гомодимеризации хорошо известны их уровня техники, в частности, в отношении инженерии иммуноглобулиноподобных молекул, и охватываются настоящим документом (см., например, Ridgway et al. (1996) 'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, J. Mol. Biol. 270: 26-35, и Xie et al. (2005) A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, J. Immunol. Methods 296:95-101; каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме). Предпочтительно, выступ встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 первой полипептидной цепи, а впадину встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 третьей полипептидной цепи диател, содержащих три полипептидные цепи. Таким образом, выступ будет способствовать предупреждению гомодимеризации первой полипептидной цепи через ее домены СН2 и/или СН3. Поскольку третья полипептидная цепь предпочтительно содержит замену впадина, она будет гетеродимеризироваться с первой полипептидной цепью, а также гомодимеризироваться сама по себе. Эта стратегия может быть использована для диател и трехвалентных связывающих молекул, содержащих три, четыре или пять цепей, как подробно описано выше, где выступ встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 первой полипептидной цепи, а впадину встраивают способами инженерии в домены СН2-СН3 третьей полипептидной цепи.For diabodies and trivalent binding molecules (whose first and third polypeptide chains are not identical), it is desirable to reduce or prevent homodimerization between the CH2-CH3 domains of the first two polypeptide chains or between the CH2-CH3 domains of the two third polypeptide chains. The CH2 and/or CH3 domains of such polypeptide chains do not have to be identical in sequence, and are advantageously modified in such a way as to promote complexation between the two polypeptide chains. For example, an amino acid substitution (preferably a substitution with an amino acid containing a bulky side group that forms a ledge, such as tryptophan) can be introduced into the CH2 or CH3 domain so that steric influence prevents interaction with a similarly mutated domain and forces the mutated domain to pair with a domain into which a complementary or concordant mutation has been engineered, i.e. depression (for example, replacement with glycine). Such sets of mutations can be engineered into any pair of polypeptides containing CH2-CH3 domains that form an Fc region. Protein engineering techniques for facilitating heterodimerization with respect to homodimerization are well known in the art, in particular with respect to engineering of immunoglobulin-like molecules, and are covered by this document (see, for example, Ridgway et al. (1996) 'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al.(1997) Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, J. Mol. Biol.270:26- 35, and Xie et al (2005) A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, J Immunol Methods 296:95-101, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. volume). Preferably, the ridge is engineered into the CH2-CH3 domains of the first polypeptide chain and the trough is engineered into the CH2-CH3 domains of the third polypeptide chain of diabodies containing three polypeptide chains. Thus, the protrusion will help prevent homodimerization of the first polypeptide chain through its CH2 and/or CH3 domains. Because the third polypeptide chain preferably contains a trough substitution, it will heterodimerize with the first polypeptide chain as well as homodimerize on its own. This strategy can be used for diabodies and trivalent binding molecules containing three, four or five chains, as detailed above, where the ridge is engineered into the CH2-CH3 domains of the first polypeptide chain and the trough is engineered into the CH2-CH3 domains of the third polypeptide chain.

Предпочтительный выступ создают путем модификации Fc-участка IgG с включением модификации T366W. Предпочтительную впадину создают путем модификации Fc-участка IgG с включением модификации T366S, L368A и Y407V. Для облегчения очистки гомодимера несущей впадину третьей полипептидной цепи из конечной биспецифической гетеродимерной содержащей Fc-участок молекулы сайт связывания белка А доменов СН2 и СН3 третьей полипептидной цепи предпочтительно мутируют путем замены аминокислоты в положении 435 (H435R). Таким образом, гомодимер несущей впадину третьей полипептидной цепи не будет связываться с белком А, тогда как биспецифический гетеродимер будет сохранять свою способность связывать белок А посредством сайта связывания белка А на первой полипептидной цепи. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, несущая впадину третья полипептидная цепь может включать аминокислотные замены в положениях 434 и 435 (N434A/N435K).The preferred overhang is created by modifying the IgG Fc region to include the T366W modification. The preferred pit is created by modifying the IgG Fc region to include T366S, L368A and Y407V modifications. To facilitate purification of the homodimer of the hollow third polypeptide chain from the final bispecific heterodimeric Fc region containing molecule, the protein A binding site of the CH2 and CH3 domains of the third polypeptide chain is preferably mutated by changing the amino acid at position 435 (H435R). Thus, the homodimer of the cavity-bearing third polypeptide chain will not bind protein A, while the bispecific heterodimer will retain its ability to bind protein A via the protein A binding site on the first polypeptide chain. According to an alternative embodiment, the recess-bearing third polypeptide chain may include amino acid substitutions at positions 434 and 435 (N434A/N435K).

Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 первой полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы по настоящему изобретению будет иметь несущую выступ последовательность (SEQ ID NO: 126):The preferred IgG1 amino acid sequence for the CH2 and CH3 domains of the first polypeptide chain containing the Fc region of the molecule of the present invention would have the overhang sequence (SEQ ID NO: 126):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVDAPEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE

Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 второй полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы по настоящему изобретению, имеющей две полипептидные цепи (или третьей полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы, имеющей три, четыре, или пять полипептидных цепей), будет иметь несущую впадину последовательность (SEQ ID NO: 127):The preferred IgG1 amino acid sequence for the CH2 and CH3 domains of a second polypeptide chain of an Fc-containing molecule of the present invention having two polypeptide chains (or a third polypeptide chain of an Fc-containing molecule having three, four, or five polypeptide chains) will have a carrier trough sequence (SEQ ID NO: 127):

- 51 041483- 51 041483

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX where X is lysine (K) or absent.

Как можно видеть, домены СН2-СН3 с SEQ ID NO: 126 и SEQ ID NO: 127 включают замену в положении 234 на аланин и 235 на аланин и таким образом образуют Fc-участок, которых характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок дикого типа (SEQ ID NO: 1). Настоящее изобретение также относится к таким доменам СН2-СН3, которые содержат аланиновые остатки в положениях 234 и/или 235 и/или альтернативные и/или дополнительные замены, которые модифицируют эффекторную функцию и/или связывающую с FyR активность у Fc-участка. Настоящее изобретение также относится к таким доменам СН2-СН3, кото рые дополнительно содержат одну или несколько аминокислотных замен, удлиняющих период полужиз ни. В частности, настоящее изобретение относится к таким несущим впадину и таким несущим выступ доменам СН2-СН3, которые дополнительно содержат M252Y/S254T/T256E.As can be seen, the CH2-CH3 domains of SEQ ID NO: 126 and SEQ ID NO: 127 include a substitution at position 234 to alanine and 235 to alanine, and thus form an Fc region that is characterized by reduced (or virtually absent) binding to FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) or FcyRIIIB (CD16b) (relative to the binding that characterizes the wild-type Fc region (SEQ ID NO: 1). The present invention also relates to such CH2 domains -CH3 which contain alanine residues at positions 234 and/or 235 and/or alternative and/or additional substitutions which modify the effector function and/or FyR binding activity at the Fc region The present invention also relates to such CH2-CH3 domains which additionally contain one or more amino acid substitutions that extend the half-life.In particular, the present invention relates to those trough-bearing and those chimney-bearing CH2-CH3 domains that additionally contain M252Y/S25 4T/T256E.

Предпочтительно, чтобы первая полипептидная цепь имела несущую выступ последовательность СН2-СН3, такую как последовательность SEQ ID NO: 126. Тем не менее, как будет понятно, в первой полипептидной цепи может быть использован несущий впадину домен СН2-СН3 (например, SEQ ID NO: 127), и в этом случае несущий выступ домен СН2-СН3 (например, SEQ ID NO: 126) будет использован во второй полипептидной цепи содержащей Fc-участок молекулы по настоящему изобретению, имеющей две полипептидные цепи (или в третьей полипептидной цепи содержащей Fc-участок молеку лы, имеющей три, четыре или пять полипептидных цепей).Preferably, the first polypeptide chain has a CH2-CH3 overhang-bearing sequence, such as the sequence of SEQ ID NO: 126. However, as will be appreciated, a CH2-CH3 trough-bearing domain can be used in the first polypeptide chain (e.g., SEQ ID NO : 127), in which case a CH2-CH3 overhang domain (e.g., SEQ ID NO: 126) would be used in the second polypeptide chain containing the Fc region of the molecule of the present invention having two polypeptide chains (or in the third polypeptide chain containing the Fc -a section of a molecule with three, four or five polypeptide chains).

Как подробно описано выше, настоящее изобретение относится к содержащим Fc-участок молеку лам (например, антителам и содержащим Fc-участок диателам), имеющим домены СН2 и СН3 дикого типа или имеющим домены СН2 и СН3, содержащие описанные выше комбинации замен. Иллюстративной аминокислотной последовательностью домена СН2-СН3 IgG1, охватывающей такие изменения, яв ляется (SEQ ID NO: 128):As detailed above, the present invention relates to Fc-containing molecules (e.g., antibodies and Fc-containing diabodies) having wild-type CH2 and CH3 domains or having CH2 and CH3 domains containing the combinations of substitutions described above. An exemplary IgG1 CH2-CH3 domain amino acid sequence encompassing such changes is (SEQ ID NO: 128):

APEX1X2GGPSV FLFPPKPKDT LX3IX4RX5PEVT CVWDVSHEDAPEX1X2GGPSV FLFPPKPKDT LX3IX4RX5PEVT CVWDVSHED

PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLHPEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH

QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYTQDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT

LPPSREEMTK NQVSLX₆CX₇VK GFYPSDIAVE WESNGQPENNLPPSREEMTK NQVSLX ₆ CX ₇ VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN

YKTTPPVLDS DGSFFLXsSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEYKTTPPVLDS DGSFFLXsSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHX9X10YTQKS LSLSPGXn где:ALHX9X10YTQKS LSLSPGXn where:

(a) как X1, так и X₂ представляют собой L (дикий тип) или представляют собой А (пониженное связывание с FcyR);(a) both X1 and X ₂ are L (wild type) or are A (reduced binding to FcyR);

(b) Х₃, Х₄ и X₆ соответственно представляют собой М, S и Т (дикий тип) или представляют собой Y, Т и Е (удлиненный период полужизни), (с) Х₆, Х₇ и Х₈ соответственно представляют собой Т, L и Y (дикий тип) или представляют собой W, L и Y (выступ) или S, А и V (впадина);(b) X ₃ , X ₄ and X ₆ respectively are M, S and T (wild type) or are Y, T and E (extended half-life), (c) X ₆ , X ₇ and X ₈ respectively are are T, L and Y (wild type) or are W, L and Y (ledge) or S, A and V (trough);

(d) X9 и Х₁₀ соответственно представляют собой N и Н (дикий тип) или представляют собой N и R (без связывания белка А) или А и K (без связывания белка А) и (e) Х11 представляет собой K или отсутствует.(d) X9 and X ₁₀ respectively are N and H (wild type) or are N and R (no protein A binding) or A and K (no protein A binding) and (e) X11 is K or absent.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретение относится к связывающим LAG-3 молекулам, содержащим домены СН2 и/или СН3, которые были изменены способами инженерии для облегчения гетеродимеризации относительно гомодимеризации с помощью известных из уровня техники мутаций, таких как раскрытые в PCT публикациях WO 2007/110205, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/06867, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном их объеме.According to other embodiments, the present invention relates to LAG-3 binding molecules containing CH2 and/or CH3 domains that have been engineered to facilitate heterodimerization relative to homodimerization by mutations known in the art, such as those disclosed in PCT publications WO 2007 /110205, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/06867, all of which are incorporated herein by reference in their entirety.

VIII. Эталонные антителаVIII. Reference antibodies

А. Эталонное антитело к LAG-3A. Anti-LAG-3 Reference Antibody

Для оценки и характеристики новых связывающих LAG-3 молекул антител по настоящему изобретению использовали следующее эталонное антитело: 25F7 (BMS-986016, Medarex/BMS, обозначенное в настоящем документе как LAG-3 mAb A).The following reference antibody was used to evaluate and characterize the novel LAG-3 binding antibody molecules of the present invention: 25F7 (BMS-986016, Medarex/BMS, herein referred to as LAG-3 mAb A).

1. 25F7 (LAG-3 mAb A)1. 25F7 (LAG-3 mAb A)

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VH у 25F7 (LAG-3 mAb A) (SEQ ID NO: 129) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VH domain of 25F7 (LAG-3 mAb A) (SEQ ID NO: 129) is shown below (CDRH residues are shown underlined):

- 52 041483- 52 041483

QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS DYEYNWFDPW GQGTLVTVSSQVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS

Ниже показана аминокислотная последовательность домена VL у 25F7 (LAG-3 mAb A) (SEQ ID NO: 130) (остатки CDRL показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the VL domain of 25F7 (LAG-3 mAb A) (SEQ ID NO: 130) is shown below (CDRL residues are shown underlined):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIKEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIK

В. Эталонные антитела к PD-1B. Reference antibodies to PD-1

Для оценки и характеристики активности новых связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению в комбинации с антителом к PD-1 можно применять эталонное антитело. Известны антитела, которые являются иммуноспецифическими к PD-1 (см., например, патенты Соединенных Штатов №№ 8008449, 8552154; патентные PCT публикации WO 2012/135408, WO 2012/145549 и WO 2013/014668), и в их число входят: ниволумаб (также известный как 5С4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106, и представленный на рынке как OPDIVO® от Bristol-Myers Squibb), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 1, пембролизумаб (ранее известный как ламбролизумаб, также известный как МК-3475, SCH-900475, и представленный на рынке как KEYTRUDA® от Merck), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 2; ЕН12.2Н7 (Dana Farber), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 3; пидилизумаб (также известный как СТ-011, CureTech), обозначенный в настоящем документе как PD-1 mAb 4.A reference antibody can be used in combination with an anti-PD-1 antibody to evaluate and characterize the activity of the novel LAG-3 binding molecules of the present invention. Antibodies are known that are immunospecific for PD-1 (see, for example, United States Patent Nos. 8008449, 8552154; Patent PCT Publications WO 2012/135408, WO 2012/145549 and WO 2013/014668) and include: nivolumab (also known as 5C4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106, and marketed as OPDIVO® by Bristol-Myers Squibb), referred to herein as PD-1 mAb 1, pembrolizumab (formerly known as lambrolizumab , also known as MK-3475, SCH-900475, and marketed as KEYTRUDA® by Merck), referred to herein as PD-1 mAb 2; EH12.2H7 (Dana Farber), referred to herein as PD-1 mAb 3; pidilizumab (also known as CT-011, CureTech), referred to in this document as PD-1 mAb 4.

1. Ниволумаб (PD-1 mAb 1)1. Nivolumab (PD-1 mAb 1)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 1 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 131) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the heavy chain variable domain of PD-1 mAb 1 has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 131) (CDRH residues are shown underlined):

QVQLVESGGG WQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND DYWGQGTLVT VSSQVQLVESGGG WQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND DYWGQGTLVT VSS

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 1 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 132) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the light chain variable domain of PD-1 mAb 1 has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 132) (CDRH residues are shown underlined):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT L5CRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYDEIVLTQSPAT LSLSPGERAT L5CRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIK

2. Пембролизумаб (PD-1 mAb 2)2. Pembrolizumab (PD-1 mAb 2)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 2 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 133) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSSThe amino acid sequence of the heavy chain variable domain of PD-1 mAb 2 has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 133) (CDRH residues are shown underlined):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 2 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 134) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEIKThe amino acid sequence of the light chain variable domain of PD-1 mAb 2 has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 134) (CDRH residues shown underlined):

3. ЕН12.2Н7 (PD-1 mAb 3)3. EN12.2H7 (PD-1 mAb 3)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 3 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 135) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIHWVKQR PGQGLEWIGY IYPSTGFTEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARWR DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSSThe amino acid sequence of the heavy chain variable domain of PD-1 mAb 3 has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 135) (CDRH residues shown underlined):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 3 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 136) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISCRASQSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL LIKFGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQHSWEIPY TFGGGTKLEI КThe amino acid sequence of the light chain variable domain of PD-1 mAb 3 has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 136) (CDRH residues shown underlined):

4. Пидилизумаб (PD-1 mAb 4)4. Pidilizumab (PD-1 mAb 4)

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 4 имеет амиThe amino acid sequence of the heavy chain variable domain of PD-1 mAb 4 has ami

- 53 041483 нокислотную последовательность (SEQ ID NO: 137) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми): QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW- 53 041483 no acid sequence (SEQ ID NO: 137) (CDRH residues shown underlined): QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW

INTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG YDALDYWGQG TLVTVSSINTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG YDALDYWGQG TLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 4 имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 138) (остатки CDRH показаны подчеркнутыми):The amino acid sequence of the light chain variable domain of PD-1 mAb 4 has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 138) (CDRH residues are shown underlined):

EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG TKLEIKEIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG TKLEIK

IX. Способы полученияIX. How to get

Антитело к полипептиду LAG-3 и другие LAG-3-агонисты, антагонисты и модуляторы можно создавать из полинуклеотидов и/или последовательностей антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 с помощью известных из уровня техники способов, например, синтетически или рекомбинантно. Один из способов получения таких пептидных агонистов, антагонистов и модуляторов предусматривает химический синтез полипептида с последующей обработкой в окисляющих условиях, подходящих для получения нативной конформации, т. е. правильных соединений посредством дисульфидных связей. Это может быть выполнено с помощью методик, хорошо известных специалистам в настоящей области техники (см., например, Kelley, R. F. et al. (1990) In: GENETIC Engineering Principles and Methods, Setlow J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; также см. патенты США №№ 4105603, 3972859, 3842067 и № 3862925).Anti-LAG-3 polypeptide antibody and other LAG-3 agonists, antagonists and modulators can be generated from polynucleotides and/or antibody sequences LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6 using methods known from the prior art, for example, synthetically or recombinantly. One way to obtain such peptide agonists, antagonists and modulators involves the chemical synthesis of the polypeptide, followed by processing under oxidizing conditions suitable for obtaining a native conformation, ie, correct connections through disulfide bonds. This can be done using techniques well known to those skilled in the art (see, for example, Kelley, R. F. et al. (1990) In: GENETIC Engineering Principles and Methods, Setlow J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19, Stewart, J. M et al (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, also see US Pat.

Полипептиды по настоящему изобретению можно легко получить с помощью твердофазного пептидного синтеза (Merrifield, В. (1986) Solid Phase Synthesis, Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century, Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).The polypeptides of the present invention can be readily prepared by solid-phase peptide synthesis (Merrifield, B. (1986) Solid Phase Synthesis, Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century, Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

В соответствии с другой альтернативой, полностью человеческие антитела, имеющие один или несколько CDR из LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6, или которые конкурируют с LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 за связывание с LAG-3 человека или его растворимой формой, можно получить с помощью коммерчески доступных мышей, которые были изменены способами инженерии так, чтобы они экспрессировали конкретные белки иммуноглобулина человека. Для получения гуманизированных или человеческих антител также можно применять трансгенных животных, которые предназначены для выработки более желательных (например, полностью человеческих антител) или более робастного иммунного ответа. Примерами такой методики являются XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Фримонт, Калифорния) и HuMAb-MOUSE® и ТС MOUSE™ (оба от Medarex, Inc., Принстон, Нью-Джерси).According to another alternative, fully human antibodies having one or more CDRs of LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, or LAG-3 mAb 6, or which compete with LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, or LAG-3 mAb 6 for binding to or from human LAG-3 soluble form can be obtained using commercially available mice that have been engineered to express specific human immunoglobulin proteins. Transgenic animals that are designed to produce a more desirable (eg, fully human antibody) or more robust immune response can also be used to generate humanized or human antibodies. Examples of such a technique are XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) and HuMAb-MOUSE® and TC MOUSE™ (both from Medarex, Inc., Princeton, NJ).

В альтернативном варианте антитела могут быть получены рекомбинантно и экспрессированы с помощью любого известного из уровня техники способа. Антитела могут быть получены рекомбинантно путем сначала выделения антител, полученных из животных-хозяев, получения последовательности генов и применения последовательности генов для рекомбинантной экспрессии антитела в клеткаххозяевах (например, клетках СНО). Другим способом, который может быть использован, является экспрессия последовательности антител в растениях (например, табаке) или в трансгенном молоке. Были раскрыты подходящие способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке (см., например, Peeters et al. (2001) Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) Human Antibodies From Transgenic Mice, Int. Rev. Immunol 13:65-93; и Pollock et al. (1999) Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies, J. Immunol Methods 231:147-157). Из уровня техники известны подходящие способы получения производных антител, например, гуманизированных, одноцепочечных и т. д. В другом альтернативном варианте антитела можно получить рекомбинантно с помощью технологии фагового дисплея (см., например, патенты США №№ 5565332, 5580717, 5733743, 6265150 и Winter, G. et al. (1994) Making Antibodies By Phage Display Technology, Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).Alternatively, antibodies can be produced recombinantly and expressed using any method known in the art. Antibodies can be produced recombinantly by first isolating antibodies derived from host animals, obtaining the gene sequence, and using the gene sequence to recombinantly express the antibody in host cells (eg, CHO cells). Another method that can be used is the expression of the antibody sequence in plants (eg tobacco) or in transgenic milk. Suitable methods for recombinant expression of antibodies in plants or milk have been disclosed (see, for example, Peeters et al. (2001) Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) Human Antibodies From Transgenic Mice, Int. Rev. Immunol 13:65-93 and Pollock et al. (1999) Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies, J. Immunol Methods 231:147-157). Suitable methods for producing derivatives of antibodies, e.g., humanized, single chain, etc. are known in the art. In another alternative, antibodies can be obtained recombinantly using phage display technology (see, for example, US patents Nos. and Winter, G. et al (1994) Making Antibodies By Phage Display Technology, Annu Rev Immunol 12.433-455).

Представляющие интерес антитела или белок могут быть подвергнуты секвенированию с расщеплением по Эдману, которое хорошо известно специалистам в настоящей области техники. Информацию о пептидах, полученную по результатам масс-спектрометрии или расщепления по Эдману, можно применять для разработки зондов или праймеров, которые применяют для клонирования представляющего интерес белка.The antibody or protein of interest can be subjected to Edman digestion sequencing, which is well known to those skilled in the art. Peptide information derived from mass spectrometry or Edman digestion can be used to design probes or primers that are used to clone the protein of interest.

Альтернативным способом клонирования представляющего интерес белка является пэннинг с помощью очищенного LAG-3 или его частей для клеток, экспрессирующих представляющее интерес антитело или белок, которое имеет один или несколько CDR LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3,An alternative method for cloning a protein of interest is panning with purified LAG-3 or portions thereof to cells expressing the antibody or protein of interest that has one or more CDRs of LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3 ,

- 54 041483- 54 041483

LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, или LAG-3 mAb 6 или которое конкурирует с LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 за связывание с LAG-3 человека. Процедуру пэннинга можно проводить путем получения библиотеки кДНК из тканей или клеток, которые экспрессируют LAG-3, сверхэкспрессии кДНК в клетках второго типа и скрининга трансфицированных клеток второго типа в отношении специфического связывания с LAG-3 в присутствии или отсутствии LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6. Подробное описание способов, применяемых при клонировании генов млекопитающих, кодирующих белки клеточной поверхности, с помощью пэннинга, можно найти в уровне техники (см., например, Aruffo, A. et al. (1987) Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577, и Stephan, J. et al. (1999) Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, Endocrinol. 140:5841-5854).LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, or LAG-3 mAb 6 or which competes with LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6 for binding to human LAG-3. The panning procedure can be performed by obtaining a cDNA library from tissues or cells that express LAG-3, overexpressing the cDNA in type 2 cells, and screening transfected type 2 cells for specific binding to LAG-3 in the presence or absence of LAG-3 mAb 1, LAG -3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, or LAG-3 mAb 6. A detailed description of methods used in cloning mammalian genes encoding cell surface proteins using panning can be found in the prior art (see, for example, Aruffo, A. et al. (1987) Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573- 8577, and Stephan, J. et al (1999) Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, Endocrinol 140:5841-5854).

Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клеткухозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ, бомбардировку микрочастицами, липофекцию и инфекцию (например, где вектор является инфекционным агентом, таким как вирус коровьей оспы). Выбор вводящихся векторов или полинуклеотидов зачастую будет зависеть от особенностей клетки-хозяина.The vectors containing the polynucleotides of interest may be introduced into the host cell by any of a number of suitable methods, including electroporation, transfection using calcium chloride, rubidium chloride, calcium phosphate, DEAE-dextran, or other substances, microparticle bombardment, lipofection, and infection (e.g., where the vector is an infectious agent such as vaccinia virus). The choice of vectors or polynucleotides to be administered will often depend on the characteristics of the host cell.

Для выделения генов, кодирующих представляющее интерес антитело, полипептид или белок, можно применять любую клетку-хозяина, способную к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК. Неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают без ограничения клетки COS, HeLa и СНО. Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне приблизительно в 5 раз превышающем, более предпочтительно в 10 раз превышающем, еще более предпочтительно в 20 раз превышающем уровень соответствующего представляющего интерес эндогенного антитела или белка, при наличии, у клетки-хозяина. Скрининг клеток-хозяев в отношении специфического связывания с LAG-3 осуществляют иммуноанализом или FACS. Можно выявить клетку, сверхэкспрессирующую представляющее интерес антитело или белок.Any host cell capable of overexpressing heterologous DNA can be used to isolate genes encoding an antibody, polypeptide, or protein of interest. Non-limiting examples of suitable mammalian host cells include, but are not limited to, COS, HeLa, and CHO cells. Preferably, the host cells express cDNA at about 5 times, more preferably 10 times, even more preferably 20 times the level of the respective endogenous antibody or protein of interest, if present, in the host cell. Host cells are screened for specific binding to LAG-3 by immunoassay or FACS. A cell can be identified that overexpresses the antibody or protein of interest.

Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность антител по настоящему изобретению. Полипептиды по настоящему изобретению можно получить с помощью процедур, известных из уровня техники. Полипептиды можно получить с помощью протеолитического или другого расщепления антител, с помощью рекомбинантных способов (т. е. отдельными или слитыми полипептидами), как описано выше, или с помощью химического синтеза. Полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды размером приблизительно до 50 аминокислот, обычно получают с помощью химического синтеза. Способы химического синтеза известны из уровня техники и являются коммерчески доступными. Например, антитело к полипептиду LAG-3 можно получить с помощью автоматического синтезатора полипептидов, использующего твердофазный способ.The present invention relates to polypeptides containing the amino acid sequence of the antibodies of the present invention. The polypeptides of the present invention can be obtained using procedures known in the art. Polypeptides can be produced by proteolytic or other cleavage of antibodies, by recombinant methods (ie, single or fused polypeptides) as described above, or by chemical synthesis. Antibody polypeptides, especially shorter polypeptides of up to about 50 amino acids, are usually prepared by chemical synthesis. Methods for chemical synthesis are known in the art and are commercially available. For example, an antibody to a LAG-3 polypeptide can be made using an automatic polypeptide synthesizer using a solid phase method.

Настоящее изобретение относится к вариантам антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 и их полипептидным фрагментам, которые связываются с LAG-3, включая функционально эквивалентные антитела и слитые полипептиды, которые не оказывают значительного влияния на свойства таких молекул, а также варианты, которые обладают увеличенной или пониженной активностью. Модификация полипептидов является обычной практикой в настоящей области техники и не нуждается в подробном описании в настоящем документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или несколькими делециями или добавлениями аминокислот, которые не оказывают значительного пагубного влияния на функциональную активность, или с применением химических аналогов. К аминокислотным остаткам, которые могут быть консервативно заменены друг другом, относятся без ограничения глицин/аланин, серин/треонин, валин/изолейцин/лейцин, аспарагин/глутамин, аспарагиновая кислота/глутаминовая кислота, лизин/аргинин и фенилаланин/тирозин. К таким полипептидам также относятся гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Предпочтительно аминокислотные замены будут консервативными, т. е. внесенная в результате замены аминокислота будет обладать такими же химическими свойствами, что и исходная аминокислота. Такие консервативные замены известны из уровня техники, и их примеры были приведены выше. Аминокислотные модификации могут варьировать от изменения или модификации одной или нескольких аминокислот до полной реорганизации участка, такого как вариабельный домен. Изменения в вариабельном домене могут изменять аффинность и/или специфичность связывания. Другие способы модификации предусматривают применение известных в настоящей области методик связывания, включая без ограничения ферментативные средства, окислительное замещение и хелатирование. Модификации можно применять, например, для прикрепления меток для иммуноанализа, такого как прикрепление радиоактивных фрагментов для радиоиммунологического анализа. Модифицированные полипептиды получают с помощью общепринятых в настоящей области техники процедур, и их можно подвергнуть скринингу с помощью известных в настоящей области техники стандартных ана- 55 041483 лизов.The present invention relates to antibody variants LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6 and their polypeptide fragments that bind to LAG -3, including functionally equivalent antibodies and fusion polypeptides that do not significantly affect the properties of such molecules, as well as variants that have increased or decreased activity. Modification of polypeptides is a common practice in the present technical field and does not need to be described in detail in this document. Examples of modified polypeptides include those with conservative amino acid residue substitutions, one or more amino acid deletions or additions that do not significantly detrimental to functional activity, or using chemical analogs. Amino acid residues that may be conservatively substituted with each other include, but are not limited to, glycine/alanine, serine/threonine, valine/isoleucine/leucine, asparagine/glutamine, aspartic acid/glutamic acid, lysine/arginine, and phenylalanine/tyrosine. Such polypeptides also include glycosylated and non-glycosylated polypeptides, as well as polypeptides with other post-translational modifications such as, for example, glycosylation with various sugars, acetylation and phosphorylation. Preferably, the amino acid substitutions will be conservative, i.e. the amino acid introduced as a result of the substitution will have the same chemical properties as the original amino acid. Such conservative substitutions are known in the art and have been exemplified above. Amino acid modifications can range from a change or modification of one or more amino acids to a complete reorganization of a site, such as a variable domain. Changes in the variable domain can change the affinity and/or specificity of the binding. Other modification methods involve the use of coupling techniques known in the art, including, without limitation, enzymatic agents, oxidative displacement, and chelation. Modifications can be used, for example, to attach labels for immunoassay, such as attaching radioactive fragments for radioimmunoassay. Modified polypeptides are obtained using procedures generally accepted in the art and can be screened using standard assays known in the art.

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим один или несколько полипептидов или антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6 по настоящему изобретению. В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к слитому полипептиду, который содержит легкую цепь, тяжелую цепь или как легкую, так и тяжелую цепь. В соответствии с другим вариантом осуществления, слитый полипептид содержит гетерологичный константный участок иммуноглобулина. В соответствии с другим вариантом осуществления, слитый полипептид содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи антитела, полученного из общедоступной депонированной гибридомы. В контексте настоящего изобретения слитый белок антитела содержит один или несколько полипептидных доменов, которые специфически связываются с LAG-3, и другую аминокислотную последовательность, к которой он не присоединен в нативной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другого участка.The present invention relates to fusion proteins containing one or more polypeptides or antibodies LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6 the present invention. According to one embodiment, the present invention relates to a fusion polypeptide that contains a light chain, a heavy chain, or both a light chain and a heavy chain. According to another embodiment, the fusion polypeptide comprises a heterologous immunoglobulin constant region. In accordance with another embodiment, the fusion polypeptide comprises a light chain variable domain and a heavy chain variable domain of an antibody derived from a publicly available deposited hybridoma. In the context of the present invention, an antibody fusion protein contains one or more polypeptide domains that specifically bind to LAG-3 and another amino acid sequence to which it is not attached in the native molecule, such as a heterologous sequence or a homologous sequence from another site.

X. Применения связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретениюX. Uses of the LAG-3 Binding Molecules of the Invention

Настоящее изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению (например, антитела к LAG-3, биспецифические антитела к LAG-3 и т.д.), полипептиды, полученные из таких молекул, полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие такие молекулы или полипептиды, и другие средства, которые описаны в настоящем документе.The present invention relates to compositions, including pharmaceutical compositions, containing LAG-3 binding molecules of the present invention (e.g., antibodies to LAG-3, bispecific antibodies to LAG-3, etc.), polypeptides derived from such molecules, polynucleotides, containing sequences encoding such molecules or polypeptides, and other agents as described herein.

Как рассмотрено выше, LAG-3 играет важную роль в отрицательной регуляции пролиферации, функции и гомеостаза Т-клеток. Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению обладают способностью ингибировать функцию LAG-3 и таким образом обращать опосредованное LAG-3 ингибирование иммунной системы. Таким образом, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и LAG-3 mAb 6, их гуманизированные производные и молекулы, содержащие их связывающие LAG-3 фрагменты (например, биспецифические диатела и т.д.) или которые конкурируют за связывание с такими антителами, можно применять для блокировки опосредованного LAG-3 ингибирования иммунной системы и тем самым для того, чтобы способствовать активации иммунной системы.As discussed above, LAG-3 plays an important role in the down regulation of T cell proliferation, function, and homeostasis. The LAG-3 binding molecules of the present invention have the ability to inhibit LAG-3 function and thus reverse LAG-3 mediated inhibition of the immune system. Thus, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 and LAG-3 mAb 6, their humanized derivatives, and molecules containing their binding LAG- 3 fragments (eg, bispecific diabodies, etc.) or which compete for binding to such antibodies can be used to block LAG-3 mediated inhibition of the immune system and thereby promote immune system activation.

Биспецифические связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, которые связываются с LAG-3 и другой молекулой, участвующей в регуляции иммунной контрольной точки, присутствующей на поверхности клетки (например, PD-1), усиливают иммунную систему путем блокировки опосредованного LAG-3 ингибирования иммунной системы и таких молекул иммунной контрольной точки. Таким образом, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению пригодны для усиления иммунного ответа (например, Т-клеточного иммунного ответа) у субъекта. В частности, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно применять для лечения любого заболевания или состояния, ассоциированного с нежелательно подавленной иммунной системой, в том числе злокачественной опухоли и заболеваний, которые ассоциированы с присутствием патогена (например, бактериальной, грибковой, вирусной инфекции или инфекции простейшими).The bispecific LAG-3 binding molecules of the present invention, which bind to LAG-3 and another molecule involved in the regulation of an immune checkpoint present on the cell surface (e.g., PD-1), enhance the immune system by blocking LAG-3 mediated immune inhibition. system and such immune checkpoint molecules. Thus, the LAG-3 binding molecules of the present invention are useful in enhancing an immune response (eg, T-cell immune response) in a subject. In particular, the LAG-3 binding molecules of the present invention can be used to treat any disease or condition associated with an undesirably suppressed immune system, including cancer and diseases that are associated with the presence of a pathogen (e.g., bacterial, fungal, viral infection, or protozoan infections).

Злокачественные опухоли, которые можно лечить с помощью связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, включают виды злокачественных опухолей, характеризуемых присутствием клетки злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечника, ассоциированной со СПИДом злокачественной опухоли, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли костей, злокачественной опухоли головного и спинного мозга, метатастатической опухоли головного мозга, злокачественной опухоли молочной железы, опухолей каротидного тельца, цервикальной злокачественной опухоли, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светло-клеточной карциномы, злокачественной опухоли толстой кишки, колоректальной злокачественной опухоли, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной слизеподобной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, злокачественной опухоли желчного пузыря или желчевыводящих путей, злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, злокачественной опухоли головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, опухоли островков поджелудочной железы, саркомы Капоши, злокачественной опухоли почки, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, злокачественной опухоли печени, лимфомы, злокачественной опухоли легкого, гранулобластомы, меланомы, менингиомы, множественных эндокринных неоплазий, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидных желез, детской злокачественной опухоли, опухоли оболочки периферического нерва, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, злокачественной опухоли предстательной железы, увеальной меланомы заднего отдела глаза, редкого нарушения со стороны кроветворной системы, почечной метастатической злокачественной опухоли, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, злокачественной опухоли кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной злокачественной опухоли, злокачестCancers that can be treated with the LAG-3 binding molecules of the present invention include types of cancers characterized by the presence of a cancer cell selected from the group consisting of: adrenal tumor, AIDS-associated cancer, soft tissue alveolar sarcoma, astrocytic tumor, bladder cancer, bone cancer, brain and spinal cord cancer, metatastatic brain tumor, breast cancer, carotid body tumors, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobe renal cell carcinoma, clear cell carcinoma carcinoma, malignant tumor of the colon, colorectal malignancy, cutaneous benign fibrous histiocytoma, desmoplastic small round cell tumor, ependymoma, Ewing tumor, extraskeletal mucoid chondrosarcoma, not perfect bone fibrogenesis, fibrous bone dysplasia, malignant tumor of the gallbladder or biliary tract, malignant tumor of the gastrointestinal tract, gestational trophoblastic disease, embryonic cell tumor, malignant tumor of the head and neck, hepatocellular carcinoma, tumor of the pancreatic islets, Kaposi's sarcoma, malignant kidney tumor, leukemia, lipoma/benign lipomatous tumor, liposarcoma/malignant lipomatous tumor, malignant liver tumor, lymphoma, malignant lung tumor, granuloblastoma, melanoma, meningioma, multiple endocrine neoplasias, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblastoma, neuroendocrine tumors, malignant tumor ovarian cancer, pancreatic cancer, papillary thyroid carcinoma, parathyroid tumor, pediatric cancer, peripheral nerve sheath tumor, pheochromocytoma, tumor pituitary gland, prostate cancer, posterior uveal melanoma, rare hematopoietic disorder, renal metastatic malignancy, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell malignancy, malignancy

- 56 041483 венной опухоли желудка, синовиальной саркомы, злокачественной опухоли яичка, тимусной карциномы, тимомы, метастатической злокачественной опухоли щитовидной железы и злокачественной опухоли матки.- 56 041483 gastric vein tumor, synovial sarcoma, testicular cancer, thymic carcinoma, thymoma, metastatic thyroid cancer and uterine cancer.

В частности, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно применять для лечения колоректальной злокачественной опухоли, гепатоклеточной карциномы, глиомы, злокачественной опухоли почки, злокачественной опухоли молочной железы, множественной миеломы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, нейробластомы; саркомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточной злокачественной опухоли легкого, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы и злокачественной опухоли прямой кишки.In particular, the LAG-3 binding molecules of the present invention can be used to treat colorectal cancer, hepatocellular carcinoma, glioma, kidney cancer, breast cancer, multiple myeloma, bladder cancer, neuroblastoma; sarcoma, non-Hodgkin's lymphoma, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, and rectal cancer.

К ассоциированным с патогеном заболеваниям, которые можно лечить с помощью связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, относятся хронические вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные инфекции. К хроническим инфекциям, которые можно лечить с помощью связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, относятся вирус Эпштейна - Барра, вирус гепатита A (HAV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирусы герпеса (например, HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус везикулярного стоматита (VSV),Pathogen-associated diseases that can be treated with the LAG-3 binding molecules of the present invention include chronic viral, bacterial, fungal, and parasitic infections. Chronic infections that can be treated with the LAG-3 binding molecules of the present invention include Epstein-Barr virus, hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), herpes viruses (for example, HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), human immunodeficiency virus (HIV), vesicular stomatitis virus (VSV),

Bacilli, Citrobacter, Cholera, Diphtheria, Enterobacter,Bacilli, Citrobacter, Cholera, Diphtheria, Enterobacter,

Gonococci, Helicobacter pylori, Klebsiella, Legionella, Meningococci, микобактерия, Pseudomonas, Pneumonococci, рикетсия, Salmonella, Serratia, Staphylococci, Streptococci, Tetanus, Aspergillus (A. fumigatus, A. niger и m. d\ Blastomyces dermatitidis, Candida (C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. Tropicalis и т. д.), Cryptococcus neoformans, род Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Leptospirosis, Borrelia burgdorferi, гельминтовый паразит (анкилостоматиды, ленточные черви, трематоды, плоские черви (например, Schistosomia), Giardia lambia, trichinella, Dientamoeba Fragilis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi и Leishmania donovani.Gonococci, Helicobacter pylori, Klebsiella, Legionella, Meningococci, Mycobacterium, Pseudomonas, Pneumonococci, Rickettsia, Salmonella, Serratia, Staphylococci, Streptococci, Tetanus, Aspergillus (A. fumigatus, A. niger and m. d\ Blastomyces dermatitidis, Candida (C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. Tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Leptospirosis, Borrelia burgdorferi, helminth parasite (hookworms, tapeworms, flukes, flatworms (e.g. Schistosomia), Giardia lambia, trichinella, Dientamoeba Fragilis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi and Leishmania donovani.

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с иммуногенным средством, таким как противоопухолевая вакцина. Такие вакцины могут содержать очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и молекулы углеводов), аутологичные или аллогенные опухолевые клетки. Был описан ряд стратегий опухолевой вакцины (см., например, Palena, С, et al. (2006) Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies, Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I, et al. (2011) Cancer immunotherapy comes of age, Nature 480, 480-489; Zhang, X. M. et al. (2008) The Anti-Tumor Immune Response Induced By A Combination of MAGE-3/MAGE-n-Derived Peptides, Oncol. Rep. 20, 245-252; Disis, M. L. et al. (2002) Generation of T-cell Immunity to the HER-2/neu Protein After Active Immunization with HER-2/neu Peptide-Based Vaccines, J. Clin. Oncol. 20:2624-2632; Vermeij, R. et al. (2012) Potentiation of a p53-SLP Vaccine By Cyclophosphamide In Ovarian Cancer: A Single-Arm Phase II Study, Int. J. Cancer 131 :E670-E680). Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с режимами химиотерапевтического лечения. В этих случаях может быть возможность уменьшить дозу вводимого химиотерапевтического реагента (Mokyr. M.B. et al. (1998) Realization Of The Therapeutic Potential Of CTLA-4 Blockade In Low-Dose Chemotherapy-Treated TumorBearing Mice, Cancer Research 58: 5301-5304).The LAG-3 binding molecules of the present invention can be combined with an immunogenic agent such as a cancer vaccine. Such vaccines may contain purified tumor antigens (including recombinant proteins, peptides and carbohydrate molecules), autologous or allogeneic tumor cells. A number of tumor vaccine strategies have been described (see, for example, Palena, C, et al. (2006) Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies, Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I, et al. ( 2011) Cancer immunotherapy comes of age, Nature 480, 480-489 Zhang, X. M. et al (2008) The Anti-Tumor Immune Response Induced By A Combination of MAGE-3/MAGE-n-Derived Peptides, Oncol. Rep. 20, 245-252 Disis, M. L. et al. (2002) Generation of T-cell Immunity to the HER-2/neu Protein After Active Immunization with HER-2/neu Peptide-Based Vaccines, J. Clin. Oncol. 20 :2624-2632 Vermeij, R. et al.(2012) Potentiation of a p53-SLP Vaccine By Cyclophosphamide In Ovarian Cancer: A Single-Arm Phase II Study, Int. J. Cancer 131 :E670-E680). The LAG-3 binding molecules of the present invention can be combined with chemotherapy treatment regimens. In these cases, it may be possible to reduce the dose of chemotherapy agent administered (Mokyr. M.B. et al. (1998) Realization Of The Therapeutic Potential Of CTLA-4 Blockade In Low-Dose Chemotherapy-Treated TumorBearing Mice, Cancer Research 58: 5301-5304).

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с другими иммуностимулирующими молекулами, такими как антитела, которые активируют иммунную ответную реакцию у хозяина для обеспечения повышенных уровни активации Т-клеток. В частности, было продемонстрировано, что антитела к PD-1, антитела к PD-L1 и/или антитела к CTLA-4 активируют иммунную систему (см., например, del Rio, M-L. et al. (2005) Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation, Eur. J. Immunol 35:3545-3560; Barber, D. L. et al. (2006) Restoring Function In Exhausted CD8 T Cells During Chronic Viral Infection, Nature 439, 682-687; Iwai, Y. et al. (2002) Involvement of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy by PD-L1 blockade, Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293-12297; Leach, D. R., et al. (1996) Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade, Science 271, 1734-1736). К дополнительным иммуностимулирующим молекулам, которые можно комбинировать со связывающими LAG-3 молекулами по настоящему изобретению, относятся антитела к молекулам на поверхности дендритных клеток, которые активируют функцию дендритных клеток (DC) и презентирование антигена, антитела к CD40, способные замещать Т-клеточную хелперную активность и активацию антител на костимулирующие молекулы Т-клеток, такие как PD-L1, CTLA-4, OX-40 4-1BB и ICOS (см., например, Ito et al. (2000) Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4 Antibodies, Immunobiology 201:52740; патент США № 5811097; Weinberg et al. (2000) Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity, Immunol 164:2160-2169; Melero et al. (1997) Monoclonal Antibodies Against The 4The LAG-3 binding molecules of the present invention can be combined with other immunostimulatory molecules, such as antibodies, which activate an immune response in the host to provide increased levels of T cell activation. In particular, anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, and/or anti-CTLA-4 antibodies have been shown to activate the immune system (see, e.g., del Rio, M-L. et al. (2005) Antibody-Mediated Signaling Through PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation, Eur J Immunol 35:3545-3560 Barber, D L et al (2006) Restoring Function In Exhausted CD8 T Cells During Chronic Viral Infection, Nature 439, 682 -687;Iwai, Y. et al.(2002) Involvement of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy by PD-L1 blockade, Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293-12297 Leach, D. R., et al (1996) Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade, Science 271, 1734-1736). Additional immunostimulatory molecules that can be combined with the LAG-3 binding molecules of the present invention include antibodies to molecules on the surface of dendritic cells that activate dendritic cell (DC) function and antigen presentation, anti-CD40 antibodies that can replace T-cell helper activity and activation of antibodies to costimulatory T cell molecules such as PD-L1, CTLA-4, OX-40 4-1BB and ICOS (see, for example, Ito et al. (2000) Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4 Antibodies, Immunobiology 201:52740 Weinberg et al.(2000) Engagement of the OX-40 Receptor In Vivo Enhances Antitumor Immunity, Immunol 164:2160-2169 Melero et al (1997) Monoclonal Antibodies Against The 4

- 57 041483- 57 041483

1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors, Nature Medicine 3: 682-685; Hutloff et al. (1999) ICOS is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related to CD28, Nature 397: 263-266 и Moran, A.E. et al. (2013) The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy, Curr Opin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004), и/или стимулирующие химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие антиген-связывающий домен, направленный к антигену заболевания, слитый с одним или несколькими внутриклеточными сигнальными доменами из различных рецепторов костимулирующего белка (например, CD28, 4-1ВВ, ICOS, OX40 и т.д.), которые предназначены для стимуляции Т-клеток при связывании антигена (см., например, Tettamanti S. et al. (2013) Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD12SSpecific Chimeric Antigen Receptor, Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells, Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia, Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo, Leukemia 28(8): 1596-1605).1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors, Nature Medicine 3: 682-685; Hutloff et al. (1999) ICOS is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related to CD28, Nature 397: 263-266 and Moran, A.E. et al. (2013) The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy, Curr Opin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004), and/or stimulatory chimeric antigen receptors (CARs) containing an antigen-binding domain directed to a disease antigen fused to one or more intracellular signaling domains from various costimulatory receptors. protein (e.g. CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, etc.) that are designed to stimulate T cells upon antigen binding (see e.g. Tettamanti S. et al. (2013) Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD12SSpecific Chimeric Antigen Receptor, Br J Haematol 161:389-401 Gill S et al (2014) Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells, Blood 123(15): 2343-2354;Mardiros, A. et al.(2013) T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukem ia, Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo, Leukemia 28(8): 1596-1605).

Связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно комбинировать с ингибирующими химерными антигенными рецепторами (iCAR) для отведения целенаправленных иммунотерапевтических ответов. Антиген-связывающий домен iCAR, направленный к антигену заболевания, слит с одним или несколькими внутриклеточными сигнальными доменами из различных ингибирующих рецепторов белка (например, CTLA-4, PD-1 и т. д.), которые предназначены для ограничения Т-клеточных ответов при связывании антигена (см., например, Fedorov V.D. (2013) PD-1-and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses, Sci Tranl Med. 5(215):215ral72).The LAG-3 binding molecules of the present invention can be combined with inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) to elicit targeted immunotherapeutic responses. The iCAR antigen-binding domain directed to the disease antigen is fused to one or more intracellular signaling domains from various inhibitory protein receptors (eg, CTLA-4, PD-1, etc.) that are designed to limit T cell responses when antigen binding (see, for example, Fedorov V.D. (2013) PD-1-and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses, Sci Tranl Med. 5(215):215ral72).

В частности, антитело к LAG-3 по настоящему изобретению применяют в комбинации с антителом к CD137, антителом к ОХ40, антителом к PD-1, антителом к PD-L1, антителом к TIGIT, антителом к TIM-3 и/или вакциной против злокачественных опухолей.In particular, an anti-LAG-3 antibody of the present invention is used in combination with an anti-CD137 antibody, an anti-OX40 antibody, an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-TIGIT antibody, an anti-TIM-3 antibody, and/or a cancer vaccine. tumors.

Помимо их полезности в терапии связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно пометить детектируемой меткой и применять в детекции LAG-3 в образцах или в визуализации LAG-3 на клетках.In addition to their utility in therapy, the LAG-3 binding molecules of the present invention can be labeled with a detectable label and used in the detection of LAG-3 in samples or in the imaging of LAG-3 on cells.

XI. Фармацевтические композицииXI. Pharmaceutical compositions

К композициям по настоящему изобретению относятся бестарные лекарственные композиции, пригодные для изготовления фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиций), и фармацевтические композиции (т.е. композиции, которые пригодны для введения субъекту или пациенту), которые можно применять при получении стандартных лекарственных форм. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению или комбинацию таких средств и фармацевтически приемлемого носителя. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению содержат профилактически или терапевтически эффективное количество связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение, в частности, относится к таким фармацевтическим композициям, в которых связывающая LAG-3 молекула представляет собой антитело LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; гуманизированное антитело LAG-3 mAb 1; LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; связывающий LAG-3 фрагмент любого такого антитела; или в которых связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическое диатело к LAG-3 (например, LAG-3xPD-1 биспецифическое диатело). Особенно охватываются такие молекулы, которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 1; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 2; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 3, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 4, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 5, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 6.The compositions of the present invention include bulk drug compositions suitable for the manufacture of pharmaceutical compositions (e.g., crude or non-sterile compositions) and pharmaceutical compositions (i.e., compositions that are suitable for administration to a subject or patient) that can be used in the preparation of standard medicinal products. forms. Such compositions contain a prophylactically or therapeutically effective amount of the LAG-3 binding molecules of the present invention, or a combination of such agents and a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, the compositions of the present invention comprise a prophylactically or therapeutically effective amount of the LAG-3 binding molecules of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention particularly relates to such pharmaceutical compositions wherein the LAG-3 binding molecule is an antibody LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6; humanized antibody LAG-3 mAb 1; LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6; a LAG-3 binding fragment of any such antibody; or wherein the LAG-3 binding molecule is a LAG-3 bispecific diabody (eg, LAG-3xPD-1 diabody bispecific). Especially covered are those molecules that contain 3 CDRL and 3 CDRH from LAG-3 mAb 1; or which contain 3 CDRL and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 2; or which contain 3 CDRLs and 3 CDRHs from LAG-3 mAb 3, or which contain 3 CDRLs and 3 CDRHs from LAG-3 mAb 4, or which contain 3 CDRLs and 3 CDRHs from LAG-3 mAb 5, or which contain 3 CDRLs and 3 CDRHs from LAG-3 mAb 6.

Настоящее изобретение также относится к таким фармацевтическим композициям, которые дополнительно включают второе терапевтическое антитело (например, опухолеспецифическое моноклональное антитело), которое является биспецифическим к конкретному антигену злокачественной опухоли, и фармацевтически приемлемый носитель.The present invention also relates to such pharmaceutical compositions which further comprise a second therapeutic antibody (eg, a tumor-specific monoclonal antibody) that is bispecific for a particular cancer antigen, and a pharmaceutically acceptable carrier.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регуляторным органом федерального правительства или правительства штата или указанный в перечне в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных, а конкретнее, на людях. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), вспомогательному средству или среде, с которыми вводят терапевтическое средство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является предпочтительным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. СоIn a specific embodiment, the term pharmaceutically acceptable means approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the USP or other generally accepted pharmacopoeia for use in animals, and more specifically, in humans. The term carrier refers to the diluent, adjuvant (e.g., Freund's adjuvant (complete and incomplete), adjuvant, or vehicle with which the therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids such as water and oils, including petroleum, animal oils). , vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc. Water is the preferred carrier for intravenous administration of the pharmaceutical composition.

- 58 041483 левые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов. В число подходящих фармацевтических вспомогательных средств входят крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и др. При необходимости, композиция может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих средств или средств для буферизации pH. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным высвобождением и др.- 58 041483 left solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid carriers, especially for injection solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerin, propylene, glycol, water, ethanol, etc. If necessary, the composition may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents or pH buffering agents. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations, and the like.

Как правило, ингредиенты композиций по настоящему изобретению поставляют либо раздельно, либо в смешанном друг с другом состоянии в единичной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытой емкости, такой как ампула или саше, с указанием количества активного средства. Если композицию необходимо вводить путем инфузии, она может быть дозирована при помощи инфузионного флакона, содержащего стерильную фармацевтическую воду или солевой раствор. Если композицию вводят путем инъекции, может быть предоставлена ампула стерильной воды для инъекций или солевого раствора, с тем чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.As a rule, the ingredients of the compositions of the present invention are supplied either separately or mixed with each other in a unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or anhydrous concentrate in a sealed container, such as an ampoule or sachet, indicating the amount of active agent . If the composition is to be administered by infusion, it may be dosed using an infusion bottle containing sterile pharmaceutical water or saline. If the composition is to be administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline may be provided so that the ingredients can be mixed prior to administration.

Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают без ограничения соли, образованные анионами, такими как анионы, происходящие из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные катионами, такими как катионы, происходящие из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.The compositions of the present invention may be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include, without limitation, salts formed with anions such as anions derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and salts formed with cations such as cations derived from sodium, potassium, hydroxides, ammonium, calcium, iron, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, которые содержат одну или несколько емкостей, заполненных связывающей LAG-3 молекулой по настоящему изобретению (и более предпочтительно антителом LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; гуманизированным антителом LAG-3 mAb 1; LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6; связывающим LAG-3 фрагментом любого такого антитела; или в которых связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическое диатело к LAG-3 (например, LAG-3xPD-1 биспецифическое диатело)). Особенно охватываются такие молекулы, которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 1; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 2; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 3, или которые содержат 3 CDRL и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 4, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 5, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 6, отдельно или с таким фармацевтически приемлемым носителем. Кроме того, в фармацевтическую упаковку или набор также могут быть включены один или несколько других профилактических или терапевтических средств, пригодных для лечения заболевания. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему одну или несколько емкостей, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по настоящему изобретению. С такой емкостью(емкостями) необязательно может быть ассоциировано информационное уведомление в форме, предписанной правительственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, при этом в информационном уведомлении отражено одобрение таким органом производства, применения или продажи для приема человеком.The present invention also relates to a pharmaceutical package or kit that contains one or more containers filled with a LAG-3 binding molecule of the present invention (and more preferably LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG -3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6, humanized antibody LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG -3 mAb 6; a LAG-3 binding fragment of any such antibody; or wherein the LAG-3 binding molecule is a LAG-3 bispecific diabody (eg, LAG-3xPD-1 diabody bispecific)). Especially covered are those molecules that contain 3 CDRL and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 1; or which contain 3 CDRL and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 2; or which contain 3 CDRL and 3 CDRH from LAG-3 mAb 3, or which contain 3 CDRL and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 4, or which contain 3 CDR _L and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 5, or which contain 3 CDR _L and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 6, alone or with such a pharmaceutically acceptable carrier. In addition, one or more other prophylactic or therapeutic agents useful in the treatment of the disease may also be included in the pharmaceutical package or kit. The present invention also relates to a pharmaceutical package or kit containing one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical compositions of the present invention. Such container(s) may optionally be associated with an information notice in the form prescribed by a governmental authority regulating the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products, the information notice reflecting such authority's approval of manufacture, use, or sale for human consumption.

Настоящее изобретение относится к наборам, которые можно применять в описанных выше способах. Набор может содержат любую из связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению. Набор может дополнительно содержать одно или несколько других профилактических и/или терапевтических средств, пригодных для лечения злокачественной опухоли, в одной или нескольких емкостях; и/или набор может дополнительно содержать одно или несколько цитотоксических антител, которые связывают один или несколько антигенов злокачественной опухоли, ассоциированных со злокачественной опухолью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, другое профилактическое или терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. В соответствии с другими вариантами осуществления, профилактическое или терапевтическое средство представляет собой биологическое или гормональное терапевтическое средство.The present invention relates to kits that can be used in the methods described above. The kit may contain any of the LAG-3 binding molecules of the present invention. The kit may further comprise one or more other prophylactic and/or therapeutic agents useful in the treatment of cancer, in one or more containers; and/or the kit may further comprise one or more cytotoxic antibodies that bind one or more cancer antigens associated with the cancer. In accordance with some embodiments, the other prophylactic or therapeutic agent is a chemotherapeutic agent. According to other embodiments, the prophylactic or therapeutic agent is a biological or hormonal therapeutic agent.

XII. Способы введенияXII. Methods of administration

Композиции по настоящему изобретению могут быть предусмотрены для лечения, профилактики и облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, нарушением или инфекцией, путем введения субъекту эффективного количества слитого белка или конъюгированной молекулы по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей слитый белок или конъюгированную молекулу по настоящему изобретению. В соответствии с предпочтительным аспектом, такие композиции являются практически чистыми (т.е. практически не содержат веществ, которые ограничивают ее действие или вызывают нежелательные побочные эффекты). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, субъектом является животное, предпочтительно млекопитающее, такое как отличное от примата млекопитающее (например, бычьи, лошадиные, кошачьи, псовые, грызуны и т.д.) или примат (например, обезьяна, такая как яванский макак, человек и т.д.). В соответствии с предCompositions of the present invention may be provided for the treatment, prevention, and alleviation of one or more symptoms associated with a disease, disorder, or infection by administering to a subject an effective amount of a fusion protein or conjugate molecule of the present invention or a pharmaceutical composition comprising a fusion protein or conjugate molecule of the present invention. the present invention. In a preferred aspect, such compositions are substantially pure (ie, substantially free of substances that limit its action or cause undesirable side effects). According to a specific embodiment, the subject is an animal, preferably a mammal, such as a non-primate mammal (e.g., bovine, equine, feline, canine, rodents, etc.) or a primate (e.g., a monkey such as a cynomolgus macaque, person, etc.). In accordance with pre

- 59 041483 почтительным вариантом осуществления, субъектом является человек.- 59 041483 respectful embodiment, the subject is a human.

Известны различные системы доставки, и их можно применять для введения композиций по настоящему изобретению, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантных клетках, способных экспрессировать антитело или слитый белок, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987) Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т. д.Various delivery systems are known and can be used to administer the compositions of the present invention, for example, encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing an antibody or fusion protein, receptor-mediated endocytosis (see, for example, Wu et al. ( 1987) Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construction of a nucleic acid as part of a retroviral or other vector, etc.

Способы введения молекулы по настоящему изобретению предусматривают без ограничения парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и чрезслизистое (например, интраназальные и пероральные пути). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным путем, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством абсорбции через эпителиальные или слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или локальным. Кроме того, также можно использовать легочное введение, например, с применением ингалятора или небулайзера и состава с аэрозолирующим средством. См., например, патенты США №№ 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078 и PCT публикации WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.The routes of administration of the molecule of the present invention include, without limitation, parenteral administration (eg, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous), epidural, and transmucosal (eg, intranasal and oral routes). In accordance with a specific embodiment, the LAG-3 binding molecules of the present invention are administered intramuscularly, intravenously or subcutaneously. The compositions can be administered by any convenient route, for example, by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucosal surfaces (eg, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.), and can be administered together with other biologically active means. The introduction can be systemic or local. In addition, pulmonary administration may also be used, for example using an inhaler or nebulizer and an aerosol formulation. See, for example, US Pat. 66903, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Настоящее изобретение также относится к тому, что связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению упакованы в герметично закрытую емкость, такую как ампула или саше, на которой указано количество молекулы. В соответствии с одним вариантом осуществления, такие молекулы поставляют в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытой емкости, и их можно ресуспендировать, например, водой или солевым раствором до соответствующей концентрации для введения субъекту. Предпочтительно, связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытой емкости.The present invention also relates that the LAG-3 binding molecules of the present invention are packaged in a hermetically sealed container, such as an ampoule or sachet, on which the number of the molecule is indicated. According to one embodiment, such molecules are supplied as a dry, sterilized, lyophilized powder or anhydrous concentrate in a sealed container and can be resuspended, for example, with water or saline, to an appropriate concentration for administration to a subject. Preferably, the LAG-3 binding molecules of the present invention are supplied as a dry sterile lyophilized powder in a sealed container.

Лиофилизированные связывающие LAG-3 молекулы по настоящему изобретению следует хранить при температуре от 2 до 8°С в их исходной емкости, и молекулы следует вводить в пределах 12 ч, предпочтительно в пределах 6 ч, в пределах 5 ч, в пределах 3 ч или в пределах 1 ч после ресуспендирования. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления такие молекулы поставляют в жидкой форме в герметично закрытой емкости с указанием количества и концентрации молекулы, слитого белка или конъюгированной молекулы. Предпочтительно, такие связывающие LAG-3 молекулы, если они представлены в жидкой форме, поставляют в герметично закрытой емкости.The lyophilized LAG-3 binding molecules of the present invention should be stored at 2 to 8°C in their original container, and the molecules should be administered within 12 hours, preferably within 6 hours, within 5 hours, within 3 hours, or within within 1 hour after resuspension. In an alternative embodiment, such molecules are supplied in liquid form in a sealed container, indicating the amount and concentration of the molecule, fusion protein, or conjugated molecule. Preferably, such LAG-3 binding molecules, if provided in liquid form, are supplied in a sealed container.

Количество композиции по настоящему изобретению, которая будет эффективной при лечении, предупреждении или облегчении одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением, можно определить с помощью стандартных клинических методик. Точная доза, которая будет использована в составе, также будет зависеть от пути введения и от тяжести состояния и должна определяться на усмотрение практикующего клинициста и с учетом обстоятельств для каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимостей доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на модельных животных.The amount of a composition of the present invention that will be effective in treating, preventing, or alleviating one or more of the symptoms associated with a disorder can be determined using standard clinical procedures. The precise dosage to be used in the formulation will also depend on the route of administration and the severity of the condition and should be at the discretion of the practicing clinician and taking into account the circumstances of each patient. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves obtained from in vitro test systems or animal models.

В контексте настоящего документа эффективное количество фармацевтической композиции в соответствии с одним вариантом осуществления представляет собой количество, достаточное для достижения полезных или необходимых результатов, включая без ограничения клинические результаты, такие как уменьшение симптомов, вызванных заболеванием, ослабление симптома инфекции (например, вирусной нагрузки, лихорадки, боли, сепсиса и т.д.) или симптома злокачественной опухоли (например, пролиферации клеток злокачественной опухоли, наличие опухоли, метастаз опухоли и т.д.), тем самым повышая качество жизни страдающих заболеванием, уменьшая дозу других лекарственных препаратов, необходимых для лечения заболевания, усиливая эффект другого лекарственного препарата, например, путем нацеливания и/или интернализации, задерживая прогрессирование заболевания и/или продлевая дожитие индивидуумов.As used herein, an effective amount of a pharmaceutical composition according to one embodiment is an amount sufficient to achieve beneficial or desired results, including, without limitation, clinical results such as reduction in symptoms caused by a disease, reduction in a symptom of an infection (e.g., viral load, fever, , pain, sepsis, etc.) or a symptom of a malignant tumor (for example, proliferation of malignant tumor cells, the presence of a tumor, tumor metastasis, etc.), thereby improving the quality of life of those suffering from the disease, reducing the dose of other drugs needed for treating a disease by enhancing the effect of another drug, for example by targeting and/or internalizing, delaying the progression of the disease and/or prolonging the survival of individuals.

Эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений. В контексте настоящего изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для уменьшения пролиферации (или эффекта) вирусного присутствия и для уменьшения и/или замедления развития вирусного заболевания, либо непосредственно, либо опосредованно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть или не быть достигнуто в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, эффективное количество можно рассматривать в контексте введения одного или нескольких химиотерапевтических средств, и одно средство можно рассматривать как такое, которое дают в эффективном количестве, если в сочетании с одним или несколькими другимиAn effective amount may be administered in one or more administrations. In the context of the present invention, an effective amount of a drug, compound or pharmaceutical composition is an amount sufficient to reduce the proliferation (or effect) of the viral presence and to reduce and/or slow the progression of the viral disease, either directly or indirectly. According to some embodiments, an effective amount of a drug, compound, or pharmaceutical composition may or may not be achieved in combination with another drug, compound, or pharmaceutical composition. Thus, an effective amount may be considered in the context of administering one or more chemotherapeutic agents, and one agent may be considered to be given in an effective amount when combined with one or more other

- 60 041483 средствами может быть достигнут или достигается необходимый результат. Несмотря на то, что индивидуальные потребности различаются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого компонента входит в компетенцию специалистов в настоящей области техники.- 60 041483 means can be achieved or achieved the desired result. While individual needs vary, it is within the skill of the art to determine the optimal ranges for effective amounts of each component.

Для связывающих LAG-3 молекул, охватываемых настоящим изобретением (например, антител, диател и т.д.), дозировку, вводимую пациенту, предпочтительно определяют, исходя из массы тела (кг) субъекта, принимающего такую молекулу. Для связывающих LAG молекул, охватываемых настоящим изобретением, дозировка, вводимая пациенту, обычно составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,05 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,1 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,2 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,5 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 2 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 3 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 20 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 30 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 100 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 250 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 750 мкг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 1,5 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг массы тела или по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 30 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 75 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 125 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 150 мг/кг или более массы тела. Рассчитанную дозу будут вводить, исходя из массы тела пациента на исходном уровне лечения. Значительное (>10%) изменение массы тела от исходного уровня или массы при установившемся плато должно приводить к перерасчету дозы.For LAG-3 binding molecules encompassed by the present invention (eg, antibodies, diabodies, etc.), the dosage administered to a patient is preferably determined based on the body weight (kg) of the subject receiving such a molecule. For LAG binding molecules encompassed by the present invention, the dosage administered to a patient is typically at least about 0.01 µg/kg body weight, at least about 0.05 µg/kg body weight, at least about 0.1 µg /kg body weight, at least about 0.2 µg/kg body weight, at least about 0.5 µg/kg body weight, at least about 1 µg/kg body weight, at least about 2 µg/kg body weight, at least about 3 µg/kg body weight, at least about 5 µg/kg body weight, at least about 10 µg/kg body weight, at least about 20 µg/kg body weight, at least about 30 µg/kg body weight, at least about 50 µg/kg body weight, at least about 100 µg/kg body weight, at least about 250 µg/kg body weight, at least about 750 µg/kg body weight body, at least about 1 .5 mg/kg body weight, at least about 3 mg/kg body weight, at least about 5 mg/kg body weight, or at least about 10 mg/kg, at least about 30 mg/kg, at least at least about 50 mg/kg, at least about 75 mg/kg, at least about 100 mg/kg, at least about 125 mg/kg, at least about 150 mg/kg or more of body weight. The calculated dose will be administered based on the patient's body weight at baseline treatment. A significant (>10%) change in body weight from baseline or weight at a steady plateau should lead to dose recalculation.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вводимая пациенту дозировка связывающих LAG-3 биспецифических молекул (например, диател и трехвалентных связывающих молекул), охватываемых настоящим изобретением, обычно составляет по меньшей мере от приблизительно 0,3 нг/кг в сутки до приблизительно 0,9 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 1 нг/кг в сутки до приблизительно 3 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 3 нг/кг в сутки до приблизительно 9 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 10 нг/кг в сутки до приблизительно 30 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 30 нг/кг в сутки до приблизительно 90 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 100 нг/кг в сутки до приблизительно 300 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 200 нг/кг в сутки до приблизительно 600 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 300 нг/кг в сутки до приблизительно 900 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 400 нг/кг в сутки до приблизительно 800 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 500 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 600 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 700 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 800 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки, по меньшей мере от приблизительно 900 нг/кг в сутки до приблизительно 1000 нг/кг в сутки или составляет по меньшей мере приблизительно 1000 нг/кг в сутки. Рассчитанную дозу будут вводить, исходя из массы тела пациента на исходном уровне лечения. Значительное (>10%) изменение массы тела от исходного уровня или массы при установившемся плато должно приводить к перерасчету дозы.In accordance with some embodiments, the dosage of LAG-3 binding bispecific molecules (e.g., diabodies and trivalent binding molecules) encompassed by the present invention administered to a patient is typically at least about 0.3 ng/kg per day to about 0.9 ng /kg per day, at least from about 1 ng/kg per day to about 3 ng/kg per day, at least from about 3 ng/kg per day to about 9 ng/kg per day, at least from about 10 ng/kg per day to about 30 ng/kg per day, at least about 30 ng/kg per day to about 90 ng/kg per day, at least about 100 ng/kg per day to about 300 ng /kg per day, at least from about 200 ng/kg per day to about 600 ng/kg per day, at least from about 300 ng/kg per day to about 900 ng/kg per day, at least from about 400 ng/kg per day up to approx. but 800 ng/kg per day, at least about 500 ng/kg per day to about 1000 ng/kg per day, at least about 600 ng/kg per day to about 1000 ng/kg per day, at least from about 700 ng/kg per day to about 1000 ng/kg per day, from at least about 800 ng/kg per day to about 1000 ng/kg per day, from at least about 900 ng/kg per day to about 1000 ng/kg per day, or at least about 1000 ng/kg per day. The calculated dose will be administered based on the patient's body weight at baseline treatment. A significant (>10%) change in body weight from baseline or weight at a steady plateau should lead to dose recalculation.

В соответствии с другим вариантом осуществления введение пациенту осуществляют согласно режиму лечения, предусматривающему одну или несколько доз такого профилактически или терапевтически эффективного количества связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, причем введение согласно режиму лечения осуществляют на протяжении 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления режим лечения предусматривает периодическое введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению (например, введение дозы на 1-е, на 2-е, на 3-и и на 4-е сутки заданной недели) и не введение доз профилактически или терапевтически эффективного количества связывающей LAG-3 молекулы (и, в частности, антитела LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, LAG-3 mAb 6, гуманизированного антитела LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 или LAG-3 mAb 6, связывающего LAG-3 фрагмента любого такого антитела или в котором связывающая LAG-3 молекула представляет собой биспецифическое LAG-3 диатело (например, LAG-3xPD-1 биспецифическое Fc-диатело)). Особенно охватывается введение (на 5-е, на 6-е и на 7-е сутки той же недели) молекул, которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 1; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 2; или которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из LAG-3 mAb 3, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 4, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 5, или которые содержат 3 CDR_L и 3 CDR_H из LAG-3 mAb 6. Обычно имеет место 1, 2, 3, 4, 5 или более курсов лечения. Каждый курс может иметь такой же режим или другой режим лечения.In another embodiment, administration to a patient is according to a treatment regimen comprising one or more doses of such a prophylactically or therapeutically effective amount of a LAG-3 binding molecule of the present invention, wherein administration according to the treatment regimen is for 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days. In some embodiments, the treatment regimen comprises intermittent dosing of a prophylactically or therapeutically effective amount of the LAG-3 binding molecules of the present invention (e.g., dosing on Day 1, Day 2, Day 3, and Day 4). given week) and not administering doses of a prophylactically or therapeutically effective amount of a LAG-3 binding molecule (and in particular antibodies LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 3 mAb 5, LAG-3 mAb 6, humanized LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 or LAG-3 mAb 6 binding LAG -3 fragments of any such antibody, or wherein the LAG-3 binding molecule is a LAG-3 bispecific diabody (eg, LAG-3xPD-1 Fc diabody bispecific)). Particularly covered is the introduction (on the 5th, 6th and 7th day of the same week) of molecules that contain 3 CDRL and 3 CDRH from LAG-3 mAb 1; or which contain 3 CDRLs and 3 CDRHs from LAG-3 mAb 2; or which contain 3 CDRL and 3 CDRH from LAG-3 mAb 3, or which contain 3 CDR _L and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 4, or which contain 3 CDR _L and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 5, or which contain 3 CDR _L and 3 CDR _H from LAG-3 mAb 6. Usually there are 1, 2, 3, 4, 5 or more treatments. Each course may have the same regimen or a different treatment regimen.

В соответствии с другим вариантом осуществления, вводимую дозу повышают на протяжении первой четверти, первой половины или первых двух третей или трех четвертей режима(ов) (например, наAccording to another embodiment, the dose to be administered is increased during the first quarter, first half, or first two-thirds or three-quarters of the regimen(s) (e.g., by

- 61 041483 протяжении первого, второго или третьего режима лечения из 4 курсов) до тех пор, пока достигают суточного профилактически или терапевтически эффективного количества связывающей LAG-3 молекулы. В табл. 6 приведены 5 примеров различных режимов приема доз, описанных выше для типичного курса лечения диателом.- 61 041483 during the first, second or third treatment regimen of 4 courses) until a daily prophylactically or therapeutically effective amount of the LAG-3 binding molecule is reached. In table. 6 shows 5 examples of the various dosage regimens described above for a typical course of treatment with diatel.

Таблица 6Table 6

Режим Mode Сутки Day Дозировка диатела (иг диатела на кг массы субъекта в сутки) Diatel dosage (number of diabody per kg of subject's weight per day) 1 1 1,2,3,4 1,2,3,4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 5, 6, 7 5, 6, 7 нет No нет No нет No нет No нет No 2 2 1,2,3,4 1,2,3,4 300 300 500 500 700 700 900 900 1000 1000 5, 6, 7 5, 6, 7 нет No нет No нет No нет No нет No 3 3 1,2,3,4 1,2,3,4 300 300 500 500 700 700 900 900 1000 1000 5, 6, 7 5, 6, 7 нет No нет No нет No нет No нет No 4 4 1,2,3,4 1,2,3,4 300 300 500 500 700 700 900 900 1000 1000 5, 6, 7 5, 6, 7 нет No нет No нет No нет No нет No

Дозировку и частоту введения связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению можно уменьшить или изменить путем усиления поглощения и проникновения в ткань молекулы посредством таких модификаций, как, например, липидизация.The dosage and frequency of administration of the LAG-3 binding molecule of the present invention can be reduced or altered by enhancing uptake and tissue penetration of the molecule through modifications such as, for example, lipidation.

Дозировку связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению, вводимую пациенту, можно рассчитать для применения в качестве монотерапии.The dosage of the LAG-3 binding molecule of the present invention administered to a patient can be calculated for use as monotherapy.

Альтернативно, молекулу можно применять в комбинации с другими терапевтическими композициями, и вводимая пациенту дозировка будет ниже, чем при применении указанных молекул в качестве монотерапии.Alternatively, the molecule can be used in combination with other therapeutic compositions, and the dosage administered to the patient will be lower than when using these molecules as monotherapy.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить локально в нуждающуюся в лечении область; это можно осуществить, например, путем без ограничения локальной инфузии, путем инъекции или посредством имплантата, причем указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или желатинообразный материал, включая мембраны, такие как мембраны Sikalastic, или волокна. Предпочтительно, при введении молекулы по настоящему изобретению следует проявлять осторожность в случае применения материалов, в которые молекула не абсорбируется.Pharmaceutical compositions of the present invention can be administered locally to the area in need of treatment; this can be done, for example, by, but not limited to, local infusion, by injection, or by means of an implant, said implant being a porous, non-porous or gelatinous material, including membranes such as Sikalastic membranes or fibers. Preferably, when introducing a molecule of the present invention, care should be taken in the case of materials in which the molecule is not absorbed.

Композиции по настоящему изобретению можно доставлять в везикуле, в частности, в липосоме (см. Langer (1990) New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327).Compositions of the present invention can be delivered in a vesicle, in particular in a liposome (see Langer (1990) New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327).

Композиции по настоящему изобретению можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением или с замедленным высвобождением. Для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одну или несколько из связывающих LAG-3 молекул по настоящему изобретению, можно применять любую известную специалисту в настоящей области техники методику. См., например, патент США № 4526938; PCT публикацию WO 91/05548; PCT публикацию WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of LongCirculating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 и Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме. В соответствии с одним вариантом осуществления можно применять помпу в системе с контролируемым высвобождением (см. Langer, ранее; Sefton, (1987) Implantable Pumps, CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, Surgery 88:507-516; и Saudek et al. (1989) A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, N. Engl. J. Med. 321:574-579). В соответствии с другим вариантом осуществления для достижения контролируемого высвобождения молекул можно применять полимерные материалы (см., например, Medical Applications OF Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate, Science 228:190-192; During et al. (1989) Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization, Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits, J. Neurosurg. 7(1): 105-112); патент США № 5679377, патент США № 5916597, патент США № 5912015, патент США № 5989463, патент США № 5128326, PCT публикаCompositions of the present invention can be delivered in a controlled release or sustained release system. Any technique known to those skilled in the art may be used to prepare sustained release formulations containing one or more of the LAG-3 binding molecules of the present invention. See, for example, US patent No. 4526938; PCT Publication WO 91/05548; PCT publication WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of LongCirculating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. control. Rel. Bioact. mater. 24:853-854 and Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. mater. 24:759-760, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. According to one embodiment, the pump may be used in a controlled release system (see Langer, formerly; Sefton, (1987) Implantable Pumps, CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980 ) Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, Surgery 88:507-516; N. Engl. J. Med. 321:574-579). According to another embodiment, polymeric materials can be used to achieve controlled release of molecules (see, for example, Medical Applications OF Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984) Levy et al.(1985) Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate, Science 228:190-192 Howard et al (1989) Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization, Ann Neurol 25:351-356 Howard et al (1989) Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits , J. Neurosurg 7(1): 105-112); US Patent No. 5679377, US Patent No. 5916597, US Patent No. 5912015, US Patent No. 5989463, US Patent No. 5128326, PCT Public

- 62 041483 цию WO 99/15154 и PCT публикацию WO 99/20253). В число примеров полимеров, применяемых в составах с замедленным высвобождением, входят без ограничения поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), сополимеры этилена и винилацетата, поли(метакриловая кислота), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поливиниловый спирт, полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимеры лактида и гликолида (PLGA) и сложные полиортоэфиры. Систему с контролируемым высвобождением можно разместить вблизи терапевтической мишени (например, легких), таким образом будет необходима лишь часть системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, ранее, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Полимерные композиции, пригодные в качестве имплантатов с контролируемым высвобождением, можно применять в соответствии с Dunn et al. (см. U. S. 5945155). Этот конкретный способ основан на терапевтическом эффекте контролируемого in situ высвобождения биоактивного материала из полимерной системы. Имплантация обычно может происходить в любом месте организма пациента, нуждающегося в терапевтическом лечении. Можно применять неполимерную систему непрерывной доставки, при этом в качестве системы доставки лекарственного средства в организме субъекта применяют неполимерный имплантат. При имплантации в организм органический растворитель имплантата будет разрушаться, диспергироваться или вымываться из композиции в окружающую тканевую жидкость, а неполимерный материал будет постепенно коагулировать или осаждаться с образованием твердой микропористой матрицы (см. US 5888533).- 62 041483 WO 99/15154 and PCT publication WO 99/20253). Examples of polymers useful in sustained release formulations include, but are not limited to, poly(2-hydroxyethyl methacrylate), poly(methyl methacrylate), poly(acrylic acid), ethylene-vinyl acetate copolymers, poly(methacrylic acid), polyglycolides (PLG), polyanhydrides , poly(N-vinylpyrrolidone), polyvinyl alcohol, polyacrylamide, poly(ethylene glycol), polylactides (PLA), lactide-glycolide copolymers (PLGA), and polyorthoesters. The controlled release system can be placed close to the therapeutic target (e.g., the lungs) so that only a fraction of the systemic dose is needed (see, for example, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, formerly, vol. 2, pp. 115-138 ( 1984)). Polymer compositions suitable as controlled release implants can be used according to Dunn et al. (see U.S. 5945155). This particular method is based on the therapeutic effect of controlled in situ release of the bioactive material from the polymer system. Implantation can usually occur anywhere in the body of a patient in need of therapeutic treatment. A non-polymeric continuous delivery system can be used, wherein a non-polymeric implant is used as the drug delivery system in the subject's body. Upon implantation into the body, the organic solvent of the implant will break down, disperse, or leach out of the composition into the surrounding tissue fluid, and the non-polymeric material will gradually coagulate or precipitate to form a solid microporous matrix (see US 5,888,533).

Системы с контролируемым высвобождением рассмотрены в обзоре Langer (1990, New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533). Для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одно или несколько терапевтических средств по настоящему изобретению, можно применять любую известную специалисту в настоящей области техники методику. См., например, патент США № 4526938; международные публикации WO 91/05548 и WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.Controlled release systems are reviewed by Langer (1990, New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533). Any technique known to those skilled in the art may be used to prepare sustained release formulations containing one or more of the therapeutic agents of the present invention. See, for example, US patent No. 4526938; international publications WO 91/05548 and WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. control. Rel. Bioact. mater. 24:853-854; and Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. mater. 24:759-760, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Если композиция по настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую связывающую LAG-3 молекулу по настоящему изобретению, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для стимуляции экспрессии кодируемой ею связывающей LAG-3 молекулы путем конструирования ее как части соответствующего вектора экспрессии нуклеиновой кислоты и введения его таким образом, чтобы он стал внутриклеточным, например, с помощью ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или путем прямой инъекции, или с помощью бомбардировки микрочастицами (например, генной пушки; Biolistic, Dupont), или покрытия липидами или рецепторами клеточной поверхности или трансфицирующими средствами, или путем введения его в соединении с гомеобоскоподобным пептидом, о котором известно, что он попадает внутрь ядра (см., например, Joliot et al. (1991) Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868) и т. д. В альтернативном варианте нуклеиновую кислоту можно ввести внутриклеточно и встроить в ДНК клетки-хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации.Where the composition of the present invention is a nucleic acid encoding a LAG-3 binding molecule of the present invention, the nucleic acid may be administered in vivo to stimulate expression of the LAG-3 binding molecule it encodes by constructing it as part of an appropriate nucleic acid expression vector and administering it in such a manner in a manner to become intracellular, e.g. by a retroviral vector (see US Pat. No. 4,980,286), or by direct injection, or by microparticle bombardment (e.g., gene gun; Biolistic, Dupont), or coating with lipids or cell surface receptors or by transfecting agents, or by administering it in conjunction with a homeobox-like peptide known to enter the interior of the nucleus (see, for example, Joliot et al. (1991) Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 88:1864-1868), etc. Alternatively, the nucleic acid can be introduced intracellularly and inserted into the DNA of the host cell for expression by homologous recombination.

Лечение субъекта терапевтически или профилактически эффективным количеством связывающей LAG-3 молекулы по настоящему изобретению может предусматривать однократное лечение или предпочтительно может предусматривать серию лечений. В предпочтительном примере субъекта лечат таким диателом один раз в неделю в течение приблизительно 1-10 недель, предпочтительно 2-8 недель, более предпочтительно приблизительно 3-7 недель и еще более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или 6 недель. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить раз в сутки, два раза в сутки или три раза в сутки. В альтернативном варианте фармацевтические композиции можно вводить раз в неделю, два раза в неделю, раз в две недели, раз в месяц, раз в шесть недель, раз в два месяца, два раза в год или раз в год. Также будет понятно, что эффективная дозировка применяемых для лечения молекул может увеличиваться или уменьшаться в ходе курса конкретного лечения.Treatment of a subject with a therapeutically or prophylactically effective amount of the LAG-3 binding molecule of the present invention may include a single treatment, or preferably may include a series of treatments. In a preferred example, the subject is treated with such a diabody once a week for about 1-10 weeks, preferably 2-8 weeks, more preferably about 3-7 weeks, and even more preferably for about 4, 5 or 6 weeks. The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered once a day, twice a day or three times a day. Alternatively, the pharmaceutical compositions may be administered once a week, twice a week, every other week, once a month, once every six weeks, once every two months, twice a year or once a year. It will also be understood that the effective dosage of molecules used for treatment may increase or decrease during the course of a particular treatment.

ПримерыExamples

Теперь, после описания в общих чертах настоящего изобретения, то же самое будет более понятным при обращении к приведенным далее примерам, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не указано иное. Специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что на практике могут быть реализованы многие модификации как в отношении материалов, так и в отношении способов без отступления от объема настоящего раскрытия.Now, after describing in general terms the present invention, the same will be more clear when referring to the following examples, which are presented by way of illustration and are not intended to limit the present invention, unless otherwise indicated. It will be apparent to those skilled in the art that many modifications to both materials and methods can be practiced without departing from the scope of this disclosure.

Пример 1.Example 1

Характеристика моноклональных антител к LAG-3: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и LAG-3 mAb 6Characterization of monoclonal antibodies to LAG-3: LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 and LAG-3 mAb 6

- 63 041483- 63 041483

Шесть мышиных моноклональных антител выделяли как способные иммуноспецифически связываться с LAG-3 как человека, так и яванского макака, и давали им обозначения LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и LAG-3 mAb 6. Было обнаружено, что CDR этих антител отличаются, и они приведены выше. LAG-3 mAb 1 подвергали гуманизации, что давало на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VH-2 hLAG-3 mAb 1, и четыре гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 1, VL-2 hLAG-3 mAb 1, VL-3 hLAG-3 mAb 1 и VL-4 hLAG-3 mAb 1 LAG-3 mAb 6 также гуманизировали, что давало на выходе два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VH-2 hLAG-3 mAb 6, и два гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL-1 hLAG-3 mAb 6 и VL-2 hLAG3 mAb 6. Как указано выше, гуманизированные вариабельные домены тяжелых и легких цепей указанного антитела можно применять в любой комбинации, а конкретные комбинации гуманизированных вариабельных доменов указаны при помощи ссылки на конкретные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VL-1 hLAG-3 mAb 1 и VL-2 hLAG-3 mAb 1, в частности, указано как hLAG-3 mAb 1(1.2).Six mouse monoclonal antibodies were isolated as being able to immunospecifically bind to both human and cynomolgus monkey LAG-3 and were designated LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG -3 mAb 5 and LAG-3 mAb 6. The CDRs of these antibodies were found to be different and are shown above. LAG-3 mAb 1 was humanized resulting in two humanized VH domains, referred to herein as VL-1 hLAG-3 mAb 1 and VH-2 hLAG-3 mAb 1, and four humanized VL domains, referred to herein as VL-1 hLAG-3 mAb 1, VL-2 hLAG-3 mAb 1, VL-3 hLAG-3 mAb 1 and VL-4 hLAG-3 mAb 1 LAG-3 mAb 6 were also humanized, resulting in two humanized VH domain, referred to herein as VL-1 hLAG-3 mAb 6 and VH-2 hLAG-3 mAb 6, and two humanized VL domains, referred to herein as VL-1 hLAG-3 mAb 6 and VL-2 hLAG3 mAb 6. As indicated above, the humanized variable domains of the heavy and light chains of the specified antibody can be used in any combination, and specific combinations of humanized variable domains are indicated by reference to specific VH/VL domains, for example, a humanized antibody containing VL-1 hLAG- 3 mAb 1 and VL-2 hLAG-3 mAb 1, specifically listed as hLAG-3 mAb 1(1.2).

Полноразмерные гуманизированные mAb были сконструированы следующим образом: С-конец гуманизированного домена VL сливали с N-концом каппа-участка легкой цепи человека с получением легкой цепи, и каждую легкую цепь спаривали с тяжелой цепью, содержащей гуманизированный домен VH того же антитела, слитый с N-концом либо константного участка IgG1 человека, содержащего замены L234A/L235A (АА), либо константного участка IgG4 человека, содержащего замену S228P.Full-length humanized mAbs were constructed as follows: The C-terminus of a humanized VL domain was fused to the N-terminus of a human light chain kappa region to form a light chain, and each light chain was paired with a heavy chain containing the humanized VH domain of the same antibody fused to N the end of either a human IgG1 constant region containing the L234A/L235A (AA) substitutions, or a human IgG4 constant region containing the S228P substitution.

Аминокислотная последовательность иллюстративного константного участка IgG1 человека, содержащего замены L234A/L235A (АА) (SEQ ID NO: 139):Amino acid sequence of an exemplary human IgG1 constant region containing L234A/L235A (AA) substitutions (SEQ ID NO: 139):

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

В SEQ ID NO: 139 аминокислотные остатки 1-98 соответствуют домену CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 120), аминокислотные остатки 99-113 соответствуют шарнирному участку IgG1 (SEQ ID NO: 114), а аминокислотные остатки 114-329 соответствуют домену СН2-СН3 IgG1, содержащему замены L234A/L235A (подчеркнутые) (SEQ ID NO: 123).In SEQ ID NO: 139, amino acid residues 1-98 correspond to the IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 120), amino acid residues 99-113 correspond to the IgG1 hinge region (SEQ ID NO: 114), and amino acid residues 114-329 correspond to the CH2- CH3 IgG1 containing substitutions L234A/L235A (underlined) (SEQ ID NO: 123).

Аминокислотная последовательность иллюстративного константного участка IgG4 человека, содержащего замену S228P (SEQ ID NO: 140):Amino acid sequence of an exemplary human IgG4 constant region containing substitution S228P (SEQ ID NO: 140):

ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.

В SEQ ID NO: 140 аминокислотные остатки 1-98 соответствуют домену CH1 IgG4 (SEQ ID NO: 122), аминокислотные остатки 99-110 соответствуют стабилизированному шарнирному участку IgG4, содержащему замены S228P (подчеркнутые) (SEQ ID NO: 117), а аминокислотные остатки 111-326 соответствуют домену СН2-СН3 IgG4 (SEQ ID NO: 4).In SEQ ID NO: 140, amino acid residues 1-98 correspond to the CH1 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 122), amino acid residues 99-110 correspond to a stabilized IgG4 hinge containing substitutions S228P (underlined) (SEQ ID NO: 117), and amino acid residues 111-326 correspond to the CH2-CH3 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 4).

Кинетику связывания антител LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, LAG-3 mAb 6, нескольких гуманизированных и эталонного антитела LAG-3 mAb А исследовали с использованием анализа Biacore. Антитела к LAG-3 захватывали и инкубировали с His-меченным растворимым LAG-3 человека (shLAG-3-His), а кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. Расчетные k_a, kd и K_D представлены в табл. 7.The binding kinetics of antibodies LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, LAG-3 mAb 6, several humanized and reference antibodies LAG-3 mAb A was studied using Biacore analysis. Anti-LAG-3 antibodies were captured and incubated with His-labeled soluble human LAG-3 (shLAG-3-His) and binding kinetics were determined using a Biacore assay. Calculated k _a , kd and K _D are presented in table. 7.

- 64 041483- 64 041483

Таблица 7Table 7

Антитело к LAG-3 Antibody to LAG-3 ka (xio⁵)ka (xio ⁵ ) kd (xlO⁴)kd (xlO ⁴ ) KD (hM) KD(hM) LAG-3 mAb А LAG-3 mAb A 8,7 8.7 5,4 5.4 0,6 0.6 LAG-3 mAb 1^а LAG-3 mAb 1 ^a 20 20 0,26 0.26 0,013 0.013 LAG-3 mAb 1^ь LAG-3 mAb 1 ^b 31 31 0,27 0.27 0,01 0.01 LAG-3 mAb 2^а LAG-3 mAb 2 ^a 11 eleven 21 21 1,9 1.9 LAG-3 mAb 3 ^а LAG-3 mAb 3 ^a 7,7 7.7 34 34 4,4 4.4 LAG-3 mAb 4^а LAG-3 mAb 4 ^a 12 12 9,3 9.3 0,8 0.8 LAG-3 mAb 5^а LAG-3 mAb 5 ^a 14 14 13 13 0,9 0.9 LAG-3 mAb 6^а LAG-3 mAb 6 ^a 42 42 0,84 0.84 0,02 0.02 hLAG-3 mAb 1 (l,2)^d’^e hLAG-3 mAb 1 (l,2) ^d ' ^e 23 23 0,13 0.13 0,01 0.01 hLAG-3 mAb 1 (2,2)^d’^e hLAG-3 mAb 1 (2.2) ^d' ^e 8,2 8.2 2,6 2.6 0,3 0.3 hLAG-3 mAb 1 (l,l)^{d e} hLAG-3 mAb 1 (l,l) ^de 17 17 0,74 0.74 0,04 0.04 hLAG-3 mAb 1 (1,4)«^e hLAG-3 mAb 1 (1.4) ^e 16 16 0,59 0.59 0,04 0.04 hLAG-3 mAb 1 (l,4)^c’^f hLAG-3 mAb 1 (l.4) ^c ' ^f 17 17 0,86 0.86 0,05 0.05

а=захвачено на иммобилизованном Fab2 козы к мышиному Fca=captured on immobilized goat Fab2 to mouse Fc

Ь=захвачено на иммобилизованном белке G с=захвачено на иммобилизованном Fab2 козы к человеческому Fc d=захвачено на иммобилизованном белке А e=человеческий IgG1 (AA) f=IgG4 (S228P)b=captured on immobilized G protein c=captured on immobilized goat Fab2 to human Fc d=captured on immobilized protein A e=human IgG1 (AA) f=IgG4 (S228P)

В дополнительных исследованиях исследовали кинетику связывания гуманизированных антител hLAG-3 mAb 1 (1.4) и hLAG-3 mAb 6 (1.1) и эталонного антитела LAG-3 mAb А к LAG-3 как человека, так и яванского макака с помощью анализа Biacore. В этих исследованиях растворимый слитый белок с растворимым LAG-3 (внеклеточным доменом LAG-3 человека или яванского макака, слитым с IgG2a мыши) захватывали на поверхности с Fab2 козы к Fc мыши и инкубировали с антителом к LAG-3, а кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. Кривые связывания для LAG-3 mAb A, hLAG-3 mAb 1 (1.4) и hLAG-3 mAb 6 (1.1), связывающихся с LAG-3 яванского макака, показаны соответственно на фиг. 7А-7С, а расчетные k_a, kd и KD представлены в табл. 8. В отдельном исследовании изучали связывание биспецифического содержащего Fc-участок диатела, включающего hLAG-3 mAb 6 (1.1) к LAG-3 как человека, так и яванского макака, с помощью анализа Biacore. В этом исследовании содержащее hLAG-3 mAb 6 (1.1) диатело захватывали на поверхности с Fab₂ козы к Fc человека и инкубировали со слитым белком с растворимым LAG-3 (внеклеточным доменом LAG-3 яванского макака или человека, слитым с His-меткой), а кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. Расчетные k_a, kd и KD представлены в табл. 8.In additional studies, the binding kinetics of the humanized antibodies hLAG-3 mAb 1 (1.4) and hLAG-3 mAb 6 (1.1) and the reference antibody LAG-3 mAb A to both human and cynomolgus monkey LAG-3 were investigated using the Biacore assay. In these studies, a soluble fusion protein with soluble LAG-3 (human or cynomolgus monkey LAG-3 extracellular domain fused to mouse IgG2a) was surface-captured with goat anti-mouse Fc Fab2 and incubated with anti-LAG-3 antibody and binding kinetics determined with using Biacore analysis. Binding curves for LAG-3 mAb A, hLAG-3 mAb 1 (1.4) and hLAG-3 mAb 6 (1.1) binding to cynomolgus monkey LAG-3 are shown respectively in FIG. 7A-7C, and the calculated k _a , kd and KD are presented in table. 8. In a separate study, the binding of a bispecific Fc region-containing diabody comprising hLAG-3 mAb 6 (1.1) to both human and cynomolgus monkey LAG-3 was studied using a Biacore assay. In this study, an hLAG-3 mAb 6 (1.1) containing diabody was surface-captured with goat Fab ₂ to human Fc and incubated with a fusion protein with soluble LAG-3 (cynomolgus or human LAG-3 extracellular domain fused with His-tag) and binding kinetics were determined by Biacore analysis. Calculated k _a , kd and KD are presented in Table. 8.

Таблица 8Table 8

Антитело к LAG-3 Antibody to LAG-3 Человека Human Яванского макака Javanese macaque ka (xlO⁴)ka (xlO ⁴ ) kd (xlO'⁵)kd (xlO' ⁵ ) KD (nM) KD (nM) ka (xlO⁴)ka (xlO ⁴ ) kd (xlO'⁵)kd (xlO' ⁵ ) KD (nM) KD (nM) LAG-3 mAb A LAG-3 mAb A 6,2 6.2 1,0 1.0 0,16 0.16 2,4 2.4 1100 1100 458 458 hLAG-3 mAb 1 (l,4)^a hLAG-3 mAb 1 (l.4) ^a 3,4 3.4 <1,0 <1.0 <0,29 <0.29 1,9 1.9 <1,0 <1.0 <0,53 <0.53 hLAG-3 mAb 6 (l,l)^a hLAG-3 mAb 6 (l,l) ^a 9,9 9.9 <1,0 <1.0 <0,1 <0.1 8,2 8.2 30 thirty 3,7 3.7 hLAG-3 mAb 6 (l,l)^b hLAG-3 mAb 6 (l,l) ^b 480 480 16 16 0,033 0.033 59 59 78 78 0,13 0.13

а=иммобилизованный слитый белок из IgG2a мыши и LAG-3 яванского макака или человека b=иммобилизованное содержащее Fc-участок антитело, включающее эпитопсвязывающий домен hLAG-3 mAb 6 (1.1)a=immobilized fusion protein from mouse IgG2a and cynomolgus or human LAG-3 b=immobilized Fc-region-containing antibody comprising the epitope-binding domain of hLAG-3 mAb 6 (1.1)

Из результатов было видно, что LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 характеризовались лучшей кинетикой связывания, чем эталонное антитело LAG-3 mAb А. Кроме того, гуманизированное LAG-3 mAb 6 характеризовалось лучшей кинетикой перекрестного связывания с LAG-3 яванского макака.It was seen from the results that LAG-3 mAb 1 and LAG-3 mAb 6 had better binding kinetics than the reference antibody LAG-3 mAb A. In addition, the humanized LAG-3 mAb 6 had better cross-binding kinetics to Javanese LAG-3 toque.

Специфичность к эпитопу у LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и эталонного антитела LAG-3 mAb А исследовали с помощью анализа Biacore. Для определения, связывались ли антитела с различными эпитопами LAG-3, shLAG-3-His захватывали антителом мыши к пента-His, иммобилизованным на чипедатчике СМ5 в соответствии с процедурой, рекомендованной изготовителем. Вкратце, карбоксильные группы на поверхности чип-датчика активировали путем инъекции раствора, содержащего 0,2 М N-этилN-(3-диэтиламинопропил)карбодимид и 0,05 М N-гидроксисукцинимид. Антитело к пента-His вводили инъекцией на активированную поверхность с СМ5 в 10 мМ ацетате натрия, pH 5,0, со скоростью потокаThe epitope specificity of LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 and reference antibody LAG-3 mAb A was examined by Biacore analysis. To determine if the antibodies bound to various LAG-3 epitopes, shLAG-3-His was captured with a mouse anti-penta-His antibody immobilized on a CM5 transducer chip according to the manufacturer's recommended procedure. Briefly, the carboxyl groups on the surface of the sensor chip were activated by injecting a solution containing 0.2M N-ethylN-(3-diethylaminopropyl)carbodimide and 0.05M N-hydroxysuccinimide. Anti-Penta-His antibody was injected onto the activated surface with CM5 in 10 mM sodium acetate, pH 5.0, at a flow rate of

- 65 041483 мкл/мин с последующим введением 1 М этаноламина для дезактивации оставшихся аминогрупп. Эксперименты по связыванию проводили в HBS-EP буфере, который содержал 10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества Р20. Каждое антитело (LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-2 mAb А) предварительно вводили инъекцией на захваченный hLAG3-His в течение 180 с при скорости потока 5 мкл/мин в концентрации 1 мкМ с последующим подвижным буфером и инъекцией конкурентного антитела в тех же условиях. Получаемый в результате связывания ответ конкурентного антитела сравнивали с его получаемым в результате связывания ответом на hLAG3-His, предварительно введенным инъекцией с буфером для выявления антител, конкурирующих за один и тот же эпитоп. Регенерацию поверхности с иммобилизованным антителом к пента-His проводили путем импульсной инъекции 10 мМ глицина с pH 1,5. Нормативные кривые получали путем инъекции аналитов на обработанную поверхность без иммобилизованного белка. Кривые связывания строили при помощи программного обеспечения BIAevaluation v4.1 из данных сенсограммы в режиме реального времени.- 65 041483 µl/min followed by the introduction of 1 M ethanolamine to deactivate the remaining amino groups. Binding experiments were performed in HBS-EP buffer which contained 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.005% P20 surfactant. Each antibody (LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6, and LAG-2 mAb A) was pre-injected into captured hLAG3-His for 180 s at a flow rate of 5 μl/min at a concentration of 1 μM followed by running buffer and injection competitive antibody under the same conditions. The resulting binding response of a competitive antibody was compared with its resulting binding response to hLAG3-His previously injected with buffer to detect antibodies competing for the same epitope. Regeneration of the surface with immobilized anti-Penta-His antibody was performed by pulsed injection of 10 mM glycine at pH 1.5. Normative curves were obtained by injecting analytes onto the treated surface without immobilized protein. Binding curves were built using BIAevaluation v4.1 software from real-time sensogram data.

Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 8A-8D. Из результатов этого эксперимента видно, что биотинилированное антитело LAG3 mAb А было способно связываться с shLAG-3-His даже в присутствии избыточных количеств небиотинилированных антител LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6. В отличие от этого LAG-3 mAb 1 блокировало связывание LAG-3 mAb 6. Таким образом, из результатов видно, что LAG-3 mAb 1 и LAG-3 mAb 6 могли связываться с одним и тем же или перекрывающимися эпитопами LAG-3 и конкурировать друг с другом за связывание с LAG-3. Было обнаружено, что как LAG-3 mAb 1, так и LAG-3 mAb 6 связывались с эпитопом, который отличался от эпитопа, связываемого антителом LAG-3 mAb A.The results of this experiment are shown in Fig. 8A-8D. It can be seen from the results of this experiment that the biotinylated LAG3 mAb A was able to bind to shLAG-3-His even in the presence of excessive amounts of non-biotinylated LAG-3 mAb 1 and LAG-3 mAb 6. In contrast, LAG-3 mAb 1 blocked binding of LAG-3 mAb 6. Thus, the results show that LAG-3 mAb 1 and LAG-3 mAb 6 could bind to the same or overlapping LAG-3 epitopes and compete with each other for binding to LAG-3 . Both LAG-3 mAb 1 and LAG-3 mAb 6 were found to bind to an epitope that was different from that bound by LAG-3 mAb A.

Для дополнительной характеристики антител к LAG3 в двух разных анализах оценивали их способность блокировать связывание между LAG-3 и МНС II класса. В одном анализе исследовали способность антител блокировать связывание слитого белка из Fc и растворимого LAG3 человека с МНС II класса, иммобилизованным на поверхности. Для этого анализа каждый из LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 и LAG-3 mAb 5 (в количестве 0-67 нМ, 2-кратные серийные разведения) смешивали со слитым белком из Fc и растворимого LAG-3 человека (в концентрации 5 мкг/мл) и отдельно инкубировали с иммобилизованным МНС II класса (1 мкг/мл). Количество LAG-3, связывающегося с иммобилизованным МНС II класса, оценивали с помощью коньюгированного с гамма-HRP вторичного антитела козы к Fc человека. В дополнительных экспериментах LAG-3 mAb А и гуманизированные антитела hLAG-3 mAb 1 (1.4) и hLAG-3 mAb 6 (1.1) (в количестве 0,0096-7,0 нМ, трехкратные серийные разведения) смешивали со слитым белком с растворимым LAG-3 человека (0,2 мкг/мл) и анализировали на связывание с иммобилизованным МНС II класса, как описано выше. Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 9А и фиг 9В.To further characterize anti-LAG3 antibodies, their ability to block binding between LAG-3 and MHC class II was evaluated in two different assays. One assay examined the ability of antibodies to block binding of a fusion protein from Fc and soluble human LAG3 to MHC class II immobilized on a surface. For this assay, each of LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 and LAG-3 mAb 5 (at 0-67 nM, 2-fold serial dilutions) was mixed with fusion protein from Fc and soluble human LAG-3 (at a concentration of 5 μg/ml) and separately incubated with immobilized class II MHC (1 μg/ml). The amount of LAG-3 binding to the immobilized MHC class II was assessed with a goat gamma-HRP conjugated anti-human Fc secondary antibody. In additional experiments, LAG-3 mAb A and humanized antibodies hLAG-3 mAb 1 (1.4) and hLAG-3 mAb 6 (1.1) (in the amount of 0.0096-7.0 nM, three-fold serial dilutions) were mixed with a fusion protein with soluble Human LAG-3 (0.2 μg/ml) and analyzed for binding to immobilized class II MHC as described above. The results of these experiments are shown in Fig. 9A and FIG. 9B.

В другом анализе исследовали способность антител к LAG-3 по настоящему изобретению блокировать связывание слитого белка из Fc и растворимого LAG3 человека (shLAG-3-Fc) с нативным МНС II класса на клеточной поверхности. Для этого анализа каждое из LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5 и эталонного антитела LAG-3 mAb А (в концентрации 0,1-26,7 нг/мл, 2кратные серийные разведения) смешивали с биотинилированным слитым белком из Fc и растворимого LAG-3 человека (в концентрации 0,5 мкг/мл) и отдельно инкубировали с положительными по МНС II класса клетками Дауди. Количество LAG-3, связывающегося с поверхностью клеток Дауди, определяли с помощью конъюгированного с РЕ вторичного антитела к стрептавидину посредством FACS-анализа. В дополнительных отдельных экспериментах LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 и LAG-3 mAb А; или LAG-3 mAb 1 и гуманизированные антитела hLAG-3 mAb 1 (1.4), hLAG-3 mAb 1 (1.2), hLAG-3 mAb 1 (2.2) и hLAG-3 mAb 1 (1.1) анализировали, как описано выше. Результаты этих экспериментов показаны соответственно на фиг. 10А-10С.In another assay, the ability of the anti-LAG-3 antibodies of the present invention to block the binding of a fusion protein from Fc and soluble human LAG3 (shLAG-3-Fc) to native MHC class II on the cell surface was examined. For this assay, each of LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 2, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 5, and LAG-3 mAb A reference antibody (at a concentration of 0.1-26 .7 ng/mL, 2-fold serial dilutions) were mixed with biotinylated fusion protein from Fc and soluble human LAG-3 (at a concentration of 0.5 μg/mL) and separately incubated with MHC class II positive Daudi cells. The amount of LAG-3 binding to the surface of Daudi cells was determined with a PE-conjugated anti-streptavidin secondary antibody by FACS analysis. In additional separate experiments LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 6 and LAG-3 mAb A; or LAG-3 mAb 1 and humanized antibodies hLAG-3 mAb 1 (1.4), hLAG-3 mAb 1 (1.2), hLAG-3 mAb 1 (2.2) and hLAG-3 mAb 1 (1.1) were analyzed as described above. The results of these experiments are shown respectively in FIG. 10A-10C.

Из результатов этих анализов ингибирования (фиг. 9А-9В и фиг. 10А-10С) видно, что все протестированные антитела к LAG-3 блокировали связывание слитого белка shLAG-3-Fc с МНС II класса.From the results of these inhibition assays (FIGS. 9A-9B and FIGS. 10A-10C), all anti-LAG-3 antibodies tested blocked binding of the shLAG-3-Fc fusion protein to MHC class II.

Пример 2. Методология проточной цитометрииExample 2 Flow Cytometry Methodology

В экспериментах по определению уровней экспрессии ингибиторов контрольных точек: PD-1 и LAG-3 на клетках в описанных ниже экспериментах использовали следующие соответствующим образом меченые флуоресцентной меткой коммерческие антитела: конъюгированное с фикоэритринцианином 7 (РЕ-Су7) антитело к CD4 [клон SK3] или конъюгированное с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) антитело к CD4 [клон RPA-T4], коньюгированное с фикоэритрином (РЕ) антитело к LAG-3 [клон 3DS223H], коньюгированное с фикоэритрином (РЕ) антитело к PD-1 [клон ЕН12.2Н7] или коньюгированное с аллофикоцианином (APC) антитело (eBiosciences или BioLegend)) и соответствующие изотипические контроли. Все антитела применяли в рекомендованных производителем концентрациях. Окрашивание клеток проводили в буфере для FACS (10% FCS в PBS) на льду в течение 30 мин в темноте для добавления первичных антител. После двух промывок клетки либо окрашивали соответствующим вторичным реагентом на льду в течение 30 мин в темноте, либо сразу анализировали на проточном цитометре. Для исключения мертвых клеток все образцы окрашивали красителем жизнеспособных клеток: 7аминоактиномицин D (7-AAD) (BD Biosceinces или BioLegend) или дигидрохлорид 4',6-диамидино-2фенилиндола (DAPI) (Life Technologies). Все образцы анализировали на проточном цитометре либоIn experiments to determine expression levels of checkpoint inhibitors: PD-1 and LAG-3 on cells in the experiments described below, the following appropriately fluorescently labeled commercial antibodies were used: phycoerythrincyanin 7-conjugated (PE-Cy7) anti-CD4 antibody [clone SK3] or fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated anti-CD4 antibody [clone RPA-T4], phycoerythrin (PE) conjugated anti-LAG-3 antibody [clone 3DS223H], phycoerythrin (PE) conjugated anti-PD-1 antibody [clone EH12.2H7 ] or allophycocyanin (APC) conjugated antibody (eBiosciences or BioLegend)) and appropriate isotype controls. All antibodies were used at concentrations recommended by the manufacturer. Cells were stained in FACS buffer (10% FCS in PBS) on ice for 30 min in the dark to add primary antibodies. After two washes, cells were either stained with the appropriate secondary reagent on ice for 30 min in the dark or analyzed immediately on a flow cytometer. To exclude dead cells, all samples were stained with viable cell dye: 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (BD Biosceinces or BioLegend) or 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) (Life Technologies). All samples were analyzed on a flow cytometer or

- 66 041483- 66 041483

FACS Calibur, либо Fortessa (BD Biosciences) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar, Ашленд, Орегон).FACS Calibur or Fortessa (BD Biosciences) and analyzed using FlowJo software (TreeStar, Ashland, OR).

Пример 3. Экспрессия LAG-3 и связывание антител с простимулированными Т-клеткамиExample 3 Expression of LAG-3 and Binding of Antibodies to Stimulated T Cells

Изучали экспрессию LAG-3 и способность выделенных антител к LAG-3 специфически связывать LAG-3 на поверхности простимулированных CD3/CD28 Т-клеток. Т-клетки получали из мононуклеаров периферической крови (PBMC), вкратце, PBMC очищали с помощью способа центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), в соответствии с инструкциями производителя, из цельной крови, полученной согласно информированному согласию от здоровых доноров (Biological Specialty Corporation), а затем Т-клетки очищали с помощью набора Dynabeads® Untouched Human T Cells Kit (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Для стимуляции выделенные Тклетки культивировали в течение 10-14 суток в присутствии рекомбинантного IL-2 человека [30 ед./мл] (Peprotech) и активирующих гранул для Т-клеток человека Dynabeads® (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Экспрессию LAG-3 на свежевыделенных непростимулированных CD4+ Т-клетках и простимулированных CD4+ Т-клетках (взятых из культуры на 11-е или 14-е сутки) исследовали с помощью проточной цитометрии, как описано выше, с использованием конъюгированных с FITC антител к CD4 и конъюгированных с РЕ антител к LAG-3.LAG-3 expression and the ability of isolated anti-LAG-3 antibodies to specifically bind LAG-3 on the surface of stimulated CD3/CD28 T cells were studied. T cells were obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), briefly, PBMCs were purified using the Ficoll-Paque Plus Density Gradient Centrifugation Method (GE Healthcare), according to the manufacturer's instructions, from consented whole blood obtained from healthy donors ( Biological Specialty Corporation), and then T cells were purified using the Dynabeads® Untouched Human T Cells Kit (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. For stimulation, the isolated T cells were cultured for 10-14 days in the presence of recombinant human IL-2 [30 U/mL] (Peprotech) and Dynabeads® human T cell activating beads (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. LAG-3 expression on freshly isolated unstimulated CD4+ T cells and stimulated CD4+ T cells (taken from culture on days 11 or 14) was examined by flow cytometry as described above using FITC-conjugated anti-CD4 and PE-conjugated anti-LAG-3 antibodies.

Результаты этих исследований показаны на фиг. 11А-11С. Экспрессию LAG-3 не наблюдали на непростимулированных CD4+ Т-клетках (фиг. 11А). Однако у CD3/CD8-простимулированных CD4+ Тклеток от двух различных доноров (D:58468 и D:43530) наблюдали резкое увеличение экспрессии LAG-3 (фиг. 11В и 11С).The results of these studies are shown in FIG. 11A-11C. LAG-3 expression was not observed on unstimulated CD4+ T cells (FIG. 11A). However, CD3/CD8 stimulated CD4+ T cells from two different donors (D:58468 and D:43530) showed a dramatic increase in LAG-3 expression (FIGS. 11B and 11C).

Исследовали способность LAG-3 mAb 1 (фиг. 12, секции А и D), LAG-3 mAb 2 (фиг. 12, секции В и Е), LAG-3 mAb 3 (фиг. 12, секции С и F), LAG- 3 mAb 4 (фиг. 13, секции А и С) и LAG-3 mAb 5 (фиг. 13, секции В и D) специфически связываться с простимулированными CD4+ Т-клетками. Простимулированные Т-клетки (полученные, как описано выше, от донора D:58468), взятые из культуры на 14-е сутки, и свежие непростимулированные клетки (полученные, как описано выше, от донора D:43530) подвергали проточной цитометрии с применением выделенных антител к LAG-3 и последующего соответствующим образом меченного флуоресцентной меткой вторичного реагента (конъюгированного с PC антитела к IgG мыши (H+L) (Jackson ImmunoResearch Labs)) и конъюгированного с FITC антитела к CD4. Как показано на фиг. 12, секциях A-F, и фиг. 13, секциях AD, каждое из исследованных антител к LAG-3 связывалось только с простимулированными, но не с непростимулированными CD4+Т-клетками.The ability of LAG-3 mAb 1 (Fig. 12, sections A and D), LAG-3 mAb 2 (Fig. 12, sections B and E), LAG-3 mAb 3 (Fig. 12, sections C and F), LAG-3 mAb 4 (FIG. 13, sections A and C) and LAG-3 mAb 5 (FIG. 13, sections B and D) bind specifically to stimulated CD4+ T cells. Stimulated T cells (obtained as described above from donor D:58468), taken from the culture on the 14th day, and fresh unstimulated cells (obtained as described above from donor D:43530) were subjected to flow cytometry using isolated anti-LAG-3 antibody followed by an appropriately fluorescently labeled secondary reagent (PC-conjugated anti-mouse IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Labs)) and FITC-conjugated anti-CD4 antibody. As shown in FIG. 12, sections A-F, and FIG. 13, sections AD, each of the tested anti-LAG-3 antibodies only bound stimulated but not unstimulated CD4+ T cells.

Из результатов этих исследований видно, что уровень LAG-3 повышался на простимулированных Т-клетках, и что антитела к LAG-3 по настоящему изобретению специфически связывали только простимулированные Т-клетки.It can be seen from the results of these studies that LAG-3 levels were elevated on stimulated T cells and that the anti-LAG-3 antibodies of the present invention specifically bound only stimulated T cells.

Пример 4. Функциональная активность антител к LAGExample 4 Functional Activity of Anti-LAG Antibodies

Энтеротоксин типа В (SEB) Staphylococcus aureus представляет собой суперантиген микроорганизма, способный активировать большую часть Т-клеток (5-30%). SEB связывается с МНС II вне щелевидной детерминанты пептида и, следовательно, зависит от МНС II, но является нерестректированным и TCR-опосредованным. SEB-стимуляция Т-клеток приводила к пролиферации олигоклональных Т-клеток и продуцированию цитокинов (хотя можно было наблюдать вариабельность среди доноров). Исследовали экспрессию антител к LAG-3 и антител к PD-1 в отдельности и в комбинации на РМВС, простимулированных посредством SEB.Enterotoxin type B (SEB) Staphylococcus aureus is a microorganism superantigen that can activate most T cells (5-30%). SEB binds to MHC II outside the cleft peptide determinant and therefore is MHC II dependent, but is unrestricted and TCR-mediated. SEB stimulation of T cells resulted in oligoclonal T cell proliferation and cytokine production (although variability among donors could be observed). Investigated the expression of antibodies to LAG-3 and antibodies to PD-1 alone and in combination on PBMC stimulated by SEB.

PBMC, очищенные, как описано выше, культивировали в RPMI-среде+10% инактивированного теплом FBS+1% пенициллина/стрептомицина в объемных колбах Т-25 в течение 2-3 суток в отдельности или с SEB (Sigma-Aldrich) в концентрации 0,1 нг/мл (первичная стимуляция). В конце первого раунда SEB-стимуляции PBMC дважды промывали PBS и сразу же высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей в концентрации 1-5x105 клеток/лунка в только среду, в среду с SEB в концентрации 0,1 нг/мл (вторичная стимуляция) и без антитела или в среду с SEB и с контрольным антителом IgG и культивировали в течение дополнительных 2-3 суток. Через 48 ч после первичной объемной SEBстимуляции клетки изучали в отношении экспрессии PD-1 и LAG-3 с помощью проточной цитометрии с применением конъюгированных с РЕ антител к LAG-3 и конъюгированных с FITC антител к CD3; или конъюгированных с APC антител к PD-1 и конъюгированных с FITC антител к CD3. На 5-е сутки после вторичного культивирования в 96-луночном планшете с SEB-стимуляцией лунки, обработанные раствором без антитела или с контрольным антителом, изучали с помощью проточной цитометрии в отношении экспрессии PD-1 и LAG-3 с применением конъюгированного с РЕ антитела к LAG-3 и конъюгированного с APC антитела к PD-1.PBMC purified as described above were cultured in RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin in T-25 volume flasks for 2-3 days alone or with SEB (Sigma-Aldrich) at a concentration of 0 .1 ng/ml (primary stimulation). At the end of the first round of SEB stimulation, PBMCs were washed twice with PBS and immediately plated in 96-well tissue culture plates at 1-5x105 cells/well in medium alone, in medium with SEB at 0.1 ng/mL (secondary stimulation). ) and without antibody or in medium with SEB and control IgG antibody and cultured for an additional 2-3 days. 48 hours after initial SEB volume stimulation, cells were examined for PD-1 and LAG-3 expression by flow cytometry using PE-conjugated anti-LAG-3 antibodies and FITC-conjugated anti-CD3 antibodies; or APC-conjugated anti-PD-1 antibodies and FITC-conjugated anti-CD3 antibodies. On the 5th day after secondary culture in a 96-well plate with SEB stimulation, wells treated with a solution without antibody or with a control antibody were studied by flow cytometry for the expression of PD-1 and LAG-3 using a PE-conjugated antibody to LAG-3 and APC-conjugated anti-PD-1 antibody.

Результаты проточной цитометрии от двух типичных доноров (D:34765 и D:53724) показаны на фиг. 14, секции A-D (D:34765) и фиг. 15, секции A-D (D:53724). Из этих результатов видно, что уровень LAG-3 и PD-1 повышался в течение 48 ч после SEB-стимуляции с дальнейшим усилением, наблюдаемым на 5-е сутки после культивирования с SEB-стимуляцией. В этих исследованиях у донора 1 после SEBстимуляции было больше LAG-3/PD-1 двойных положительных клеток. Добавление контрольного антитела после SEB-стимуляции не изменяло экспрессию LAG-3 или PD-1 (ср. фиг. 14, секции С и D и фиг.Flow cytometry results from two representative donors (D:34765 and D:53724) are shown in FIG. 14, sections A-D (D:34765) and FIG. 15, sections A-D (D:53724). From these results it can be seen that the level of LAG-3 and PD-1 increased within 48 hours after SEB stimulation with a further increase observed on the 5th day after cultivation with SEB stimulation. In these studies, donor 1 had more LAG-3/PD-1 double positive cells after SEB stimulation. Addition of a control antibody after SEB stimulation did not alter LAG-3 or PD-1 expression (cf. FIG. 14, sections C and D and FIG.

--

Claims

(1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.(1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain, respectively, contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 73, and (2) the CDRL1 domain, CDRL2 domain, and CDRL3 domain, respectively, contain the amino acid sequences: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78.

(1) M252Y и S254T;(1) M252Y and S254T;

(1) L234A, L235A или (2) L234A и L235A, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.(1) L234A, L235A, or (2) L234A and L235A, where the numbering shown is in accordance with Kabat's EU numbering system.

(1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.(1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain, respectively, contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 73, and (2) the CDR _l 1 domain, the CDR _L 2 domain, and the CDR _L domain 3 respectively contain the amino acid sequences: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78.

1. Связывающая LAG-3 молекула, которая способна связываться как с LAG-3 человека, так и с LAG-3 яванского макака, причем указанная связывающая LAG-3 молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит домен CDRH1, домен CDRH2 и домен 1. A LAG-3 binding molecule that is capable of binding to both human LAG-3 and cynomolgus monkey LAG-3, wherein said LAG-3 binding molecule comprises a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein said heavy chain variable domain chain contains a CDRH1 domain, a CDRH2 domain, and a

- 68 041483- 68 041483

CDRH3 и указанный вариабельный домен легкой цепи содержит домен CDR_L1, домен CDR_L2 и домен CDR_l3, причем:CDRH3 and the specified variable domain of the light chain contains a CDR _L 1 domain, a CDR _L 2 domain and a CDR _l 3 domain, and:

(A) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78; или (B) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.(A) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain, respectively, contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 73, and (2) the CDR _l 1 domain, the CDR _L 2 domain, and domain CDR _L 3 respectively contain the amino acid sequences: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78; or (B) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 73; and (2) the CDR _l 1 domain, the CDR _L 2 domain, and the CDR _L 3 domain, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 78.

(2) M252Y и Т256Е;(2) M252Y and T256E;

2. Связывающая LAG-3 молекула по п.1, причем:2. The LAG-3 binding molecule according to claim 1, wherein:

(3) M252Y, S254T и Т256Е или (4) K288D и Н435К, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat.(3) M252Y, S254T and T256E, or (4) K288D and H435K, with the numbering being in accordance with Kabat's EU numbering system.

3. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.1, 2, причем указанная молекула представляет собой антитело.3. A LAG-3 binding molecule according to any one of claims 1, 2, said molecule being an antibody.

4. Связывающая LAG-3 молекула по п.3, причем указанная молекула представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.4. A LAG-3 binding molecule according to claim 3, wherein said molecule is a chimeric antibody or a humanized antibody.

5. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.1-4, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 или SEQ ID NO: 81.5. A LAG-3 binding molecule according to any one of claims 1 to 4, wherein said molecule comprises a heavy chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 or SEQ ID NO: 81.

6. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.1-5, причем указанная молекула содержит вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83 или SEQ ID NO: 85.6. A LAG-3 binding molecule according to any one of claims 1 to 5, said molecule comprising a light chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83 or SEQ ID NO: 85.

7. Связывающая LAG-3 молекула по любому из пп.5 или 6, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.7. A LAG-3 binding molecule according to any one of claims 5 or 6, wherein said molecule comprises a heavy chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and a light chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83.

8. Биспецифическая связывающая молекула, способная одновременно связываться с LAG-3 человека и со вторым эпитопом, причем второй эпитоп представляет собой эпитоп молекулы, участвующей в регуляции иммунной контрольной точки, присутствующей на поверхности иммунной клетки, причем указанная биспецифическая связывающая молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, причем указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 и указанный вариабельный домен легкой цепи содержит домен CDR_l1, домен CDR_l2 и домен CDR_l3, причем:8. A bispecific binding molecule capable of simultaneously binding to human LAG-3 and a second epitope, wherein the second epitope is an epitope of an immune checkpoint regulatory molecule present on the surface of an immune cell, said bispecific binding molecule comprising a heavy chain variable domain and a light chain variable domain, wherein said heavy chain variable domain comprises a CDRH1 domain, a CDRH2 domain, and a CDRH3 domain, and said light chain variable domain comprises a CDR _l 1 domain, a CDR _l 2 domain, and a CDR _l 3 domain, wherein:

(A ) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78; или (B ) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и (2 ) домен CDR_l1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3 соответственно содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.(A) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain, respectively, contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 73, and (2) the CDR _l 1 domain, the CDR _L 2 domain, and domain CDR _L 3 respectively contain the amino acid sequences: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78; or (B) (1) CDRH1 domain, CDRH2 domain and CDRH3 domain, respectively, contain the amino acid sequences: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO: 73 and (2) CDR _l 1 domain, CDR _L 2 domain and the CDR _L 3 domain, respectively, contain the amino acid sequences: SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78.

9. Биспецифическая связывающая молекула по п.8, причем:9. A bispecific binding molecule according to claim 8, wherein:

10. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.8, 9, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.10. A bispecific binding molecule according to any one of claims 8, 9, wherein said molecule comprises a heavy chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and a light chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83.

11. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.8-10, причем указанный второй эпитоп представляет собой эпитоп В7-И3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC I или II класса, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA.11. The bispecific binding molecule according to any one of claims 8-10, wherein said second epitope is B7-I3, B7-H4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226 epitope , CTLA-4, Galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC Class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1 , PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 or VISTA.

12. Биспецифическая связывающая молекула по п.11, причем указанный второй эпитоп представляет собой эпитоп PD-1.12. The bispecific binding molecule of claim 11, wherein said second epitope is a PD-1 epitope.

13. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.8-12, причем указанная молекула представляет собой:13. The bispecific binding molecule according to any one of claims 8 to 12, wherein said molecule is:

(a) диатело, причем указанное диатело представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит две, или три, или четыре различных полипептидных цепи; или(a) a diabody, said diabody being a covalently linked complex that contains two, or three, or four different polypeptide chains; or

- 69 041483 (b) трехвалентную связывающую молекулу, причем указанная трехвалентная связывающая молекула представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит три, четыре или пять полипептидных цепей.- 69 041483 (b) a trivalent binding molecule, wherein said trivalent binding molecule is a covalently linked complex that contains three, four or five polypeptide chains.

14. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.1-13, причем указанная молекула содержит Fc-участок.14. A bispecific binding molecule according to any one of claims 1 to 13, said molecule containing an Fc region.

15. Биспецифическая связывающая молекула по п.14, причем указанный Fc-участок представляет собой вариантный Fc-участок, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность указанного вариантного Fc-участка в отношении FcyR, причем указанные модификации, которые уменьшают аффинность вариантного Fc-участка в отношении FcyR, содержат замены:15. The bispecific binding molecule of claim 14, wherein said Fc region is a variant Fc region that contains one or more amino acid modifications that reduce the affinity of said variant Fc region for FcyR, said modifications that reduce the affinity of the variant Fc-section in relation to FcyR, contain substitutions:

15, секции С и D).15, sections C and D).

Повышение уровня иммунных белков контрольных точек LAG-3 и PD-1 после SEB-стимуляции PBMC ограничивало высвобождение цитокинов при повторной стимуляции. Изучали способность LAG3 mAb 1, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 6, моноклонального антитела к PD-1, обозначенного как PD-1 mAb 5, и эталонных антител PD-1 mAb 1 (включая Fc-вариант 235А/235А (АА)), PD-1 mAb 2, LAG-3 mAb А и коммерческого антитела к LAG3 17В4 (№ LS-C18692, LS Bio, обозначенного как LAG3 mAb В) усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольных точек.An increase in the level of immune checkpoint proteins LAG-3 and PD-1 after SEB-stimulation with PBMC limited the release of cytokines upon repeated stimulation. The ability of LAG3 mAb 1, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4, LAG-3 mAb 6, anti-PD-1 monoclonal antibody designated PD-1 mAb 5, and reference antibodies PD-1 mAb 1 (including Fc -variant 235A/235A (AA)), PD-1 mAb 2, LAG-3 mAb A, and commercial anti-LAG3 antibody 17B4 (No. LS-C18692, LS Bio, designated LAG3 mAb B) enhance cytokine release by inhibition of checkpoints.

PBMC стимулировали посредством SEB, как описано выше, за исключением вторичных стимуляций. Клетки высевали без антител, с изотипическим контрольным антителом или с антителами к LAG-3 и антителами к PD-1 в отдельности или в комбинации. В конце второй стимуляции надосадочные жидкости собирали для измерения секреции цитокинов с применением наборов для ИФА DuoSet на образцах от человека в отношении IFNy, TNFa, IL-10 и IL-4 (R&D Systems) в соответствии с инструкциями производителя. На фиг. 16А-16В показаны профили секреции IFNy (фиг. 16А) и TNFa (фиг. 16В) у PBMC, простимулированных посредством SEB, от типичного донора (D:38166), обработанного раствором без антител или с одним из следующих антител: изотипическим контролем, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, LAG-3 mAb A, LAG-3 mAb B, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 или LAG-3 mAb 6. Для этого исследования использовали антитела в концентрации 0,009, 0,039, 0,156, 0,625, 2,5, 10 и 40 мкг/мл. На фиг. 17 показаны профили секреции IFNy у PBMC, простимулированных посредством SEB, от другого типичного донора (D:58108), обработанного следующим: раствором без антитела, изотипическим контрольным антителом; PD-1 mAb 2 и/или LAG-3 mAb A; PD-1 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 1 или PD-1 mAb 5 и/или LAG-3 mAb 3. Для этого исследования применяли антитела в концентрации 10 мкг/мл.PBMCs were stimulated with SEB as described above except for secondary stimulations. Cells were seeded without antibodies, with an isotype control antibody, or with antibodies to LAG-3 and antibodies to PD-1 alone or in combination. At the end of the second challenge, supernatants were collected for cytokine secretion measurements using DuoSet ELISA kits on human samples for IFNy, TNFa, IL-10 and IL-4 (R&D Systems) according to the manufacturer's instructions. In FIG. 16A-16B show the secretion profiles of IFNy (FIG. 16A) and TNFa (FIG. 16B) in PBMC stimulated with SEB from a typical donor (D:38166) treated with a solution without antibodies or with one of the following antibodies: isotype control, PD -1 mAb 1, PD-1 mAb 2, LAG-3 mAb A, LAG-3 mAb B, LAG-3 mAb 1, LAG-3 mAb 3, LAG-3 mAb 4 or LAG-3 mAb 6. For this study antibodies were used at concentrations of 0.009, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10 and 40 µg/ml. In FIG. 17 shows IFNy secretion profiles in SEB-stimulated PBMC from another exemplary donor (D:58108) treated with the following: antibody-free solution, isotype control antibody; PD-1 mAb 2 and/or LAG-3 mAb A; PD-1 mAb 5 and/or LAG-3 mAb 1 or PD-1 mAb 5 and/or LAG-3 mAb 3. Antibodies were used for this study at a concentration of 10 μg/ml.

Из результатов этих исследований видно, что антитела к PD-1 значительно усиливали функцию иммунной системы, о чем свидетельствовала увеличенная выработка IFNy (фиг. 16А и 17) и TNFa (фиг. 16В) у PBMC, простимулированных посредством SEB, при повторной стимуляции. К удивлению также наблюдали, что LAG-3 mAb 1 также увеличивало выработку цитокинов у нескольких доноров до уровней, сравнимых с антителами к PD-1, в то время как эталонные mAb к LAG-3, LAG-3 mAb A и LAG-3 mAb В и несколько выделенных антител (LAG-3 mAb 3, LAG-4 и LAG-6) обеспечивали лишь небольшое усиление высвобождения цитокинов. Кроме того, комбинация антител к LAG-3 с антителом к PD-1 приводила к дополнительному усилению высвобождения цитокинов (фиг. 17) из PBMC, простимулированных посредством SEB, при повторной стимуляции. LAG-3 mAb 1 обеспечивало наибольшее усиление высвобождения цитокинов в сочетании с антителом к PD-1 по сравнению с LAG-3 mAb 3 и эталонным антителом LAG-3 mAb A.It can be seen from the results of these studies that anti-PD-1 antibodies significantly enhanced immune system function, as evidenced by increased production of IFNy (FIGS. 16A and 17) and TNFa (FIGS. 16B) in SEB-stimulated PBMC upon re-stimulation. Surprisingly, it was also observed that LAG-3 mAb 1 also increased cytokine production in several donors to levels comparable to anti-PD-1 antibodies, while the reference anti-LAG-3 mAbs, LAG-3 mAb A and LAG-3 mAb B and several isolated antibodies (LAG-3 mAb 3, LAG-4 and LAG-6) provided only a slight increase in cytokine release. In addition, the combination of anti-LAG-3 antibody with anti-PD-1 antibody resulted in an additional increase in cytokine release (FIG. 17) from SEB-stimulated PBMC upon re-stimulation. LAG-3 mAb 1 provided the greatest enhancement in cytokine release when combined with anti-PD-1 antibody compared to LAG-3 mAb 3 and reference LAG-3 mAb A.

Пример 5. Связывание с эндогенным LAG-3 яванского макакаExample 5 Binding to endogenous cynomolgus macaque LAG-3

С помощью FACS изучали способность гуманизированного антитела hLAG-3 mAb 6 (1.1) и эталонного антитела LAG-3 mAb А связывать эндогенный LAG-3, экспрессированный на PBMC яванского макака. Для этого исследования PBMC выделяли из цельной крови яванского макака-донора и культивировали отдельно или с SEB-стимуляцией (500 нг/мл), как фактически описано выше. Через 66 ч после SEBстимуляции клетки (непростимулированные и простимулированные) окрашивали антителами hLAG-3 mAb 6 (1.1), LAG-3 mAb А или PD-1 mAb 1 (10-кратные серийные разведения). Антитела детектировали с помощью меченного APC вторичного антитела козы к Fc человека. Связывание отображено в виде графика на фиг. 18А-18В для двух яванских макаков-доноров.Using FACS, we studied the ability of the humanized antibody hLAG-3 mAb 6 (1.1) and the reference antibody LAG-3 mAb A to bind endogenous LAG-3 expressed on cynomolgus monkey PBMC. For this study, PBMCs were isolated from donor cynomolgus monkey whole blood and cultured alone or with SEB stimulation (500 ng/mL) as actually described above. 66 h after SEB stimulation, cells (unstimulated and stimulated) were stained with antibodies hLAG-3 mAb 6 (1.1), LAG-3 mAb A or PD-1 mAb 1 (10-fold serial dilutions). Antibodies were detected with an APC labeled goat anti-human Fc secondary antibody. The binding is plotted in FIG. 18A-18B for two donor cynomolgus monkeys.

Стимуляцию SEB подтверждали по усиленной экспрессии PD-1, которая была детектирована с помощью антитела к PD-1, PD-1 mAb 1. Из результатов этих исследований было видно, что hLAG-3 mAb 6 (1.1) связывалось с эндогенным LAG-3, экспрессируемым на поверхности простимулированных PBMC яванского макака.Stimulation of SEB was confirmed by increased expression of PD-1, which was detected using an antibody to PD-1, PD-1 mAb 1. From the results of these studies, it was seen that hLAG-3 mAb 6 (1.1) associated with endogenous LAG-3, expressed on the surface of stimulated cynomolgus monkey PBMCs.

Все упомянутые в настоящем описании публикации и патенты включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная посредством ссылки в полном ее объеме. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, будет понятно, что его можно подвергнуть дополнительным модификациям, и настоящая заявка подразумевается как охватывающая любые варианты, применения или адаптации настоящего изобретения, согласно, в целом, принципам настоящего изобретения, и включающая такие отклонения от настоящего раскрытия, которые входят в общеизвестную или общепринятую практику в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и которые могут быть применимы к основным признакам, изложенным выше в настоящем документе.All publications and patents mentioned herein are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication or patent application were specifically and separately indicated as being incorporated by reference in its entirety. Although the present invention has been described in connection with specific embodiments, it will be understood that it may be subject to further modifications, and the present application is intended to cover any variations, applications, or adaptations of the present invention, in accordance, in general, with the principles of the present invention. , and includes such deviations from the present disclosure, which are well known or generally accepted practice in the field of technology to which the present invention pertains, and which may be applicable to the main features set forth above in this document.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

16. Биспецифическая связывающая молекула по любому из пп.14, 15, причем указанный Fc-участок представляет собой вариантный Fc-участок, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, которые увеличивают период полужизни в сыворотке указанного вариантного Fc-участка, причем указанные модификации, которые увеличивают период полужизни в сыворотке вариантного Fcучастка содержат замены:16. A bispecific binding molecule according to any one of claims 14, 15, wherein said Fc region is a variant Fc region that contains one or more amino acid modifications that increase the serum half-life of said variant Fc region, wherein said modifications, which increase the serum half-life of the variant Fc region contain substitutions:

17. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую LAG-3 молекулу по любому из пп.17 и фармацевтически приемлемый носитель или биспецифическую связывающую молекулу по любому из пп.8-16 и фармацевтически приемлемый носитель.17. A pharmaceutical composition comprising a LAG-3 binding molecule according to any one of claims 17 and a pharmaceutically acceptable carrier or a bespecifically binding molecule according to any one of claims 8 to 16 and a pharmaceutically acceptable carrier.

18. Применение биспецифической связывающей молекулы по п.8 для стимуляции Т-клеточного иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта.18. The use of a bispecific binding molecule according to claim 8 to stimulate a T-cell immune response in a subject in need thereof.

19. Применение биспецифической связывающей молекулы по п.8 при лечении злокачественной опухоли или инфекции у субъекта, имеющего подавленную иммунную систему.19. The use of a bespecifically binding molecule according to claim 8 in the treatment of cancer or infection in a subject having a suppressed immune system.

20. Применение биспецифичекой связывающей молекулы по любому из пп.18, 19, причем:20. The use of a bispecific binding molecule according to any one of claims 18, 19, wherein:

21. Применение биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.18-20, причем указанная молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.21. The use of a bispecific binding molecule according to any one of claims 18-20, wherein said molecule comprises a heavy chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79 and a light chain variable domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83.

22. Применение по любому из пп.19-21, для лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, состоящей из опухоли надпочечника, ассоциированной со СПИДом злокачественной опухоли, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли костей, злокачественной опухоли головного и спинного мозга, метатастатической опухоли головного мозга, злокачественной опухоли молочной железы, опухолей каротидного тельца, цервикальной злокачественной опухоли, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светло-клеточной карциномы, злокачественной опухоли толстой кишки, колоректальной злокачественной опухоли, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, внескелетной слизеподобной хондросаркомы, злокачественной опухоли желчного пузыря или желчевыводящих путей, злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, злокачественной опухоли головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, опухоли островков поджелудочной железы, саркомы Капоши, злокачественной опухоли почки, лейкоза, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, злокачественной опухоли печени, лимфомы, злокачественной опухоли легкого, гранулобластомы, меланомы, менингиомы, множественных эндокринных неоплазий, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидных желез, детской злокачественной опухоли, опухоли оболочки периферического нерва, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, злокачественной опухоли предстательной железы, увеальной меланомы заднего отдела глаза, почечной метастатической злокачественной опухоли, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, злокачественной опухоли кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли желудка, синовиальной саркомы, злокачественной опухоли яичка, 22. The use according to any one of claims 19 to 21 for the treatment of a cancer selected from the group consisting of an adrenal tumor, an AIDS-associated cancer, an alveolar soft tissue sarcoma, an astrocytic tumor, a bladder cancer, a bone cancer, a cancer brain and spinal cord tumors, metastatic brain tumor, breast cancer, carotid body tumors, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobe renal cell carcinoma, clear cell carcinoma, colon cancer, colorectal cancer, desmoplastic small round cell tumors, ependymomas, Ewing tumors, extraskeletal mucoid chondrosarcoma, malignant tumor of the gallbladder or biliary tract, malignant tumor of the gastrointestinal tract, gestational trophoblastic disease, embryonic cell tumor, malignancy head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic islet tumor, Kaposi's sarcoma, kidney cancer, leukemia, liposarcoma/lipomatous cancer, liver cancer, lymphoma, lung cancer, granuloblastoma, melanoma, meningioma, multiple endocrine neoplasias, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblastoma, neuroendocrine tumors, ovarian cancer, pancreatic cancer, papillary thyroid carcinoma, parathyroid tumor, childhood malignancy, peripheral nerve sheath tumor, pheochromocytoma, pituitary tumor, prostate cancer, uveal melanoma posterior of the eye, renal metastatic malignancy, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, malignant skin tumor, soft tissue sarcoma, squamous cell malignancy, malignant gastric tumor, synovial sarcoma, testicular cancer,

--