EA041342B1 - APPLICATION OF A BENZODIAZEPINE-BASED PRODUCT WITH ACTIVITY FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE - Google Patents
APPLICATION OF A BENZODIAZEPINE-BASED PRODUCT WITH ACTIVITY FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE Download PDFInfo
- Publication number
- EA041342B1 EA041342B1 EA201892461 EA041342B1 EA 041342 B1 EA041342 B1 EA 041342B1 EA 201892461 EA201892461 EA 201892461 EA 041342 B1 EA041342 B1 EA 041342B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- disease
- pain
- parkinson
- treatment
- alzheimer
- Prior art date
Links
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к применению продукта на основе бензодиазепина с активностью для профилактики и лечения болезни Паркинсона.The present invention relates to the use of a benzodiazepine product with activity for the prevention and treatment of Parkinson's disease.
Нейродегенерация является важной проблемой, которая является общей для многих заболеваний нервной системы, таких как деменции, болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PO) и невропатическая боль (NP). Эти заболевания являются угнетающими, лечить их дорого, а существующие способы лечения не являются адекватными. К актуальности этой проблемы можно добавить того факт, что частота возникновения этих заболеваний, связанных со старением, быстро растет ввиду происходящих демографических изменений.Neurodegeneration is an important problem that is common to many diseases of the nervous system such as dementias, Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PO) and neuropathic pain (NP). These diseases are depressing, expensive to treat, and existing treatments are not adequate. Adding to the urgency of this problem is the fact that the incidence of these diseases associated with aging is rapidly increasing due to ongoing demographic changes.
Прогрессирующее старение населения в мире сопровождается нежелательными последствиями, связанными с увеличением количества нейродегенеративных заболеваний и старческих деменции. По оценкам, во всем мире живет 46,8 млн людей с деменцией. По оценкам, что это количество будет увеличиваться практически вдвое каждые 20 лет; до 74,7 млн в 2030 г. и 131,5 млн к 2050 г. Деменция также имеет огромное влияние на экономику.The progressive aging of the world's population is accompanied by undesirable consequences associated with an increase in the number of neurodegenerative diseases and senile dementia. An estimated 46.8 million people live with dementia worldwide. It is estimated that this number will almost double every 20 years; to 74.7 million in 2030 and 131.5 million by 2050. Dementia also has a huge impact on the economy.
На сегодняшний день оцениваемые затраты в мире в отношении деменции составляют 818 миллиардов долларов и к 2018 г. станет заболеванием с затратами в триллион долларов, с очень большим влиянием на качество жизни как пациентов, так и членов их семей и опекунов (Alzheimer's Disease International. World Alzheimer Report 2015. London: Alzheimer's Disease International; 2015).Today, the estimated global cost of dementia is $818 billion and by 2018 will be a trillion dollar cost disease with a very large impact on the quality of life of both patients and their families and caregivers (Alzheimer's Disease International. World Alzheimer Report 2015. London: Alzheimer's Disease International, 2015.
Из всего этого следует, что AD является наиболее широко распространенной, причем приблизительно 35 млн людей страдают от заболевания, и оценивается, что ее частота значительно возрастет в следующие три десятилетия, наравне со средним возрастом населения (Reitz, C.; Brayne, C.; Mayeux, R. Epidemiology of Alzheimer's disease. Nat. Rev. Neurol., 2011, 7, 137-152) (Reitz, C.; Mayeux, R. Alzheimer's disease: Epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem. Pharmacol., 2014, 88, 640-651).From all this it follows that AD is the most widespread, with approximately 35 million people suffering from the disease, and it is estimated that its frequency will increase significantly in the next three decades, on par with the average age of the population (Reitz, C.; Brayne, C.; Reitz, C.; Mayeux, R. Alzheimer's disease: Epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem. Pharmacol ., 2014, 88, 640-651).
AD является нейродегенеративным расстройством головного мозга, которое приводит к потере памяти и потере когнитивных функций, прогрессирует медленно, часто сопровождается изменениями поведения, такими как агрессия и депрессия (Querfurth, H.W.; LaFerla, F.M.Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med., 2010, 362, 329-344). На ее последней стадии пациенты прикованы к постели, страдают недержанием мочи и зависят от ухода, который является очень дорогостоящим для семей. В среднем, летальный исход происходит через 9 лет после установления диагноза (Citron M. (2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5(9): 677-85).AD is a neurodegenerative disorder of the brain that results in memory and cognitive loss, progresses slowly, often accompanied by behavioral changes such as aggression and depression (Querfurth, H.W.; LaFerla, F.M. Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med., 2010, 362, 329-344). In its last stage, patients are bedridden, incontinent, and dependent on care that is very costly for families. On average, death occurs 9 years after diagnosis (Citron M. (2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5(9): 677-85).
Большое число людей, страдающих от этого заболевания, требующих круглосуточного ухода и других услуг, будут сильно влиять на медицинские, материальные и человеческие ресурсы (Suh Y.H. and Checler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525). Таким образом, это является растущей проблемой в медицине.A large number of people suffering from this disease, requiring round-the-clock care and other services, will greatly affect medical, material and human resources (Suh Y.H. and Checler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease Pharmacol Rev. 54(3): 469-525). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525). Thus, this is a growing problem in medicine.
AD представляет собой прототипическую кортикальную деменцию, характеризующуюся потерей памяти совместно с дисфазией (нарушением речи, при котором происходит нарушение речепроизводства и понимания речи), диспраксией (нарушением координации и неспособностью выполнять определенные движения и жесты в отсутствие моторных нарушений) и агнозией (неспособностью распознавать объекты, людей, звуки, формы или запахи), относящимися к вовлечению кортикальных ассоциативных зон (Crook R.et al. (1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4(4): 452-5) (Houlden H., Baker M., et al. (2000). Variant Alzheimer's disease with spastic 5 paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to exceptionally high amyloid-beta concentrations. Ann Neurol. 48(5): 806-8) (Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997). Two novel presenilin-1 mutations in early-onset Alzheimer's disease pedigrees and preliminary evidence for association of presenilin-1 mutations with a novel phenotype. Neuroreport. 8(6): 1537-42) (Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92).AD is a prototypical cortical dementia characterized by memory loss along with dysphasia (a speech disorder in which speech production and understanding are impaired), dyspraxia (impaired coordination and inability to perform certain movements and gestures in the absence of motor impairment), and agnosia (inability to recognize objects that people, sounds, shapes or smells) related to the involvement of cortical association areas (Crook R. et al. (1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4(4): 452-5) (Houlden H., Baker M., et al. (2000). Variant Alzheimer's disease with spastic 5 paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to exceptionally high amyloid- beta concentrations. Ann Neurol. 48(5): 806-8) (Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997). Two novel presenilin-1 mutations in early-onset Alzheimer's disease pedigrees and preliminary e vision for association of presenilin-1 mutations with a novel phenotype. neuroreport. 8(6): 1537-42) (Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92).
Хотя заболевание является многофакториальным и гетерогенным, оно имеет несколько общих характеристик, таких как обширные потери холинергических нейронов, накопление нейрофибриллярных клубков и бета-амилоидных агрегатов (Huang, Y.; Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Gel/, 2012,148, 1204-1222).Although the disease is multifactorial and heterogeneous, it shares several common characteristics such as extensive loss of cholinergic neurons, accumulation of neurofibrillary tangles and beta-amyloid aggregates (Huang, Y.; Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Gel/, 2012,148 , 1204-1222).
Химическая патология AD демонстрирует большую схожесть с болезнью Паркинсона (PD): окислительный стресс, сниженная активность митохондриального комплекса I, повышенное свободнорадикальное окисление липидов. Эти схожести также включают прогрессирующую природу заболевания, пролиферацию реакционноспособной микроглии вокруг отмирающих нейронов, окислительный стресс и воспалительные процессы.The chemical pathology of AD shows a strong similarity to Parkinson's disease (PD): oxidative stress, reduced mitochondrial complex I activity, increased free radical lipid oxidation. These similarities also include the progressive nature of the disease, the proliferation of reactive microglia around dying neurons, oxidative stress, and inflammation.
Несмотря на большие капиталовложения в фармацевтической промышленности, существует только несколько, а фактически нет никаких эффективных способов лечения AD.Despite large investments in the pharmaceutical industry, there are few, and in fact no, effective treatments for AD.
Сегодня следуют различным стратегиям для получения новых лекарственных средств для лечения заболевания, при условии, что наблюдали, что одобренные на сегодняшний день лекарственные средстваVarious strategies are being followed today to develop new drugs for the treatment of a disease, provided that it has been observed that currently approved drugs
- 1 041342 обеспечивают немного преимуществ для пациентов. Эти лекарственные средства временно задерживают (в лучшем случае на год) некоторые симптомы заболевания, но они не предотвращают его развитие.- 1 041342 provide few benefits for patients. These drugs temporarily delay (at best for a year) some of the symptoms of the disease, but they do not prevent its development.
Даже хотя изначально AD связывали только с холинергическим дефицитом, было показано, что другие нейромедиаторы, такие как допамин, норадреналин, серотонин и глютамат, сокращаются или не регулируются при AD. На данный момент нейромедиаторы, наиболее изученные в патогенезе AD, являются холинергическими и глутаматергическими (Palmer, AM; Gershon, S. Is the neuronal basis of Alzheimer's disease cholinergic or glutamatergic? FASEB J 1990, 4, 2745-52).Even though AD was initially associated only with cholinergic deficiency, other neurotransmitters such as dopamine, norepinephrine, serotonin, and glutamate have been shown to be reduced or unregulated in AD. Currently, the neurotransmitters most studied in the pathogenesis of AD are cholinergic and glutamatergic (Palmer, AM; Gershon, S. Is the neuronal basis of Alzheimer's disease cholinergic or glutamatergic? FASEB J 1990, 4, 2745-52).
Существующие варианты терапии AD основаны на ингибировании ацетилхолинэстеразы при помощи таких лекарственных средств, как донепезил, галантамин или ривастигмин, или на способности мемантина противодействовать глутаматному рецептору, NMDA (N-метил-D-аспартат). Ввиду низкой доли успешных попыток при помощи этих лекарственных средств, были открыты новые линии исследования. (Bartus, RT, Dean, RL 3rd; Beer, B; Lippa, AS The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science 1982, 217, 408-14) (Terry, A.V. Jr.; Buccafusco, J.J. The cholinergic hypothesis of age and Alzheimer's disease-related cognitive deficits: recent challenges and their implications for novel drug development. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 821-827) (van Marum, R. J. Current and future therapy in Alzheimer's disease. Fundam. Clin. Pharmacol., 2008, 22, 265-274).Existing AD therapy options are based on acetylcholinesterase inhibition with drugs such as donepezil, galantamine, or rivastigmine, or on the ability of memantine to antagonize the glutamate receptor, NMDA (N-methyl-D-aspartate). Due to the low success rate with these drugs, new research lines have been opened. (Bartus, RT, Dean, RL 3rd; Beer, B; Lippa, AS The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science 1982, 217, 408-14) (Terry, A.V. Jr.; Buccafusco, J.J. The cholinergic hypothesis of age and Alzheimer's disease-related cognitive deficits: recent challenges and their implications for novel drug development. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 306, 821-827) (van Marum, R. J. Current and future therapy in Alzheimer's disease. Fundam. Clin Pharmacol., 2008, 22, 265-274).
Согласно холинергической гипотезе AD, потеря холинергических функций в центральной нервной системе (ЦНС) делает значительный вклад в нарушение когнитивного процесса, связанного с AD (Bartus, R.; Dean, R.; Beer, B.; Lippa, A. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science, 1982, 217, 408-414). Кроме того, даже хотя взаимосвязь между холинергическим истощением, амилоидогенезом и фосфорилированием тау-белка является сложной, кажется, что холинергическое снижение может повышать продукцию B-амилоида, и это может вызывать фосфорилирование тау-белка. С другой стороны, глутаматергическая гипотеза AD показывает, что эксайтотоксичные механизмы, связанные с глютаматом, включают рецептор NMDA, приводящий к дегенерации и некрозу клеток (Bleich S, Romer K, Wiltfang J, Komhuber J. Glutamate and the glutamate receptor system: a target for drug action. Int J Geriatr Psychiatry 2003, 18,833-40). Синаптическое возбуждение посредством рецепторов NMDA важно для функций запоминания и памяти, но избыток глютамата может вызывать эксайтотоксичность и нейродегенерацию (Michaels RL, Rothman SM глютамат neurotoxicity in vitro: antagonist pharmacology and intracellular calcium concentrations. J Neurosci 1990 1 O, 283-92).According to the cholinergic hypothesis of AD, the loss of cholinergic functions in the central nervous system (CNS) makes a significant contribution to the impairment of the cognitive process associated with AD (Bartus, R.; Dean, R.; Beer, B.; Lippa, A. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction Science 1982, 217, 408-414). Furthermore, even though the relationship between cholinergic depletion, amyloidogenesis, and tau phosphorylation is complex, it appears that cholinergic decline may increase B-amyloid production and this may cause tau phosphorylation. On the other hand, the glutamatergic AD hypothesis shows that excitotoxic mechanisms associated with glutamate involve the NMDA receptor leading to cell degeneration and necrosis (Bleich S, Romer K, Wiltfang J, Komhuber J. Glutamate and the glutamate receptor system: a target for drug action Int J Geriatr Psychiatry 2003, 18,833-40). Synaptic excitation via NMDA receptors is important for learning and memory functions, but excess glutamate can cause excitotoxicity and neurodegeneration (Michaels RL, Rothman SM glutamate neurotoxicity in vitro: antagonist pharmacology and intracellular calcium concentrations. J Neurosci 1990 1 O, 283-92).
При этом сценарии стратегии лечения должны препятствовать обеим системам при помощи комбинации ингибитора фермента AChe, способного улучшать холинергический тонус, с антагонистом рецептора NMDA, способным сопротивляться индуцированной глютаматом нейродегенерации. Тем не менее, эта комбинация терапий имеет несколько недостатков. Помимо противостояния введению отдельных лекарственных средств, создается дополнительная проблема для пациентов старшего возраста, страдающих от AD, и для людей, которые ухаживают за ними, заключающаяся в том, что различные фармакокинетики соответствующих лекарственных средств могут иметь различную фармакодинамику. На практике, больницы не будут приветствовать комбинированную терапию двумя различными кривыми ADME (введение, распределение, метаболизм и выделение).In this scenario, treatment strategies would interfere with both systems with a combination of an inhibitor of the AChe enzyme capable of improving cholinergic tone with an NMDA receptor antagonist capable of resisting glutamate-induced neurodegeneration. However, this combination of therapies has several disadvantages. In addition to resisting the administration of individual drugs, an additional problem for older patients suffering from AD and for their caregivers is that different pharmacokinetics of the respective drugs may have different pharmacodynamics. In practice, hospitals will not welcome combination therapy with two different ADME curves (introduction, distribution, metabolism and excretion).
Альтернативный и новый подход к комбинации двух медикаментов заключается в двух лекарственных средствах, которые могут воздействовать на множество фармакологических мишеней, так называемых многоцелевых лекарственных средствах (MTD).An alternative and new approach to the combination of two drugs is two drugs that can act on multiple pharmacological targets, the so-called multipurpose drugs (MTD).
Стратегия воздействия на два или более белков одновременно простым соединением может обеспечивать превосходные терапевтические эффекты (Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerative diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72) (Zimmerman GR, Lehar J, Keith CT. Multi-target therapeutics; when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discov Today 2007, 12, 34-42) (Morphy R, Ranlovic, Z. Fragments, network biology and designing multiple ligands. Drug Discov Today 2007, 12, 156-60). Это можно объяснить рядом потенциальных выгод, обеспечиваемых использованием MTD относительно коктейлей или многокомпонентных медикаментов. Преимущества MTD относительно коктейлей можно подытожить следующим образом: 1) снижение изменчивости клинического развития, при условии, что прогнозирование фармакокинетики простого соединения намного проще, чем для коктейля, преодолевая проблему различных биодоступностей, фармакокинетики и метаболизма; 2) безопасность фармакодинамики; 3) повышенная эффективность ввиду синергического эффекта ингибирования множества терапевтических мишеней, и 4) повышенная безопасность при снижении вторичных эффектов потребления коктейлей лекарственных средств (снижение рисков ввиду взаимодействий лекарственное средство-лекарственное средство); это особенно характерно для метаболизма лекарственных средств, где конкуренция различных лекарственных средств для такого же метаболического фермента влияет на их токсичность.The strategy of targeting two or more proteins simultaneously with a single compound can provide excellent therapeutic effects (Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-target-directed ligands to combat neurodegenerative diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72) (Zimmerman GR, Lehar J, Keith CT. Multi-target therapeutics; when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discov Today 2007, 12, 34-42) (Morphy R, Ranlovic, Z. Fragments, network biology and designing multiple ligands Drug Discov Today 2007, 12, 156-60). This can be explained by a number of potential benefits provided by the use of MTD over cocktails or multidrugs. The advantages of MTD over cocktails can be summarized as follows: 1) reduced variability in clinical development, given that predicting the pharmacokinetics of a single compound is much easier than for a cocktail, overcoming the problem of different bioavailability, pharmacokinetics and metabolism; 2) pharmacodynamic safety; 3) increased efficacy due to the synergistic effect of inhibition of multiple therapeutic targets, and 4) increased safety while reducing the secondary effects of the consumption of drug cocktails (reduced risks due to drug-drug interactions); this is especially true in drug metabolism, where competition between different drugs for the same metabolic enzyme affects their toxicity.
Другим важным преимуществом является упрощенный терапевтический режим с улучшенными возможностями комплаенса, и это особенно важно для пациентов с болезнью Альцгеймера старшего возраста и их опекунов (Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13). В этом отношении важным аспектом является то, что пациенты с болезнью Альцгеймера подвержены широкому диапазону медицинских со- 2 041342 стояний (сопутствующим заболеваниям), которые включают гипертонию, сосудистые заболевания и диабет, которые часто могут быть сопутствующими. Таким образом, проблемы, связанные с использованием нескольких фармацевтических средств для населения старческого возраста, были признаны критическими в последние годы. Эти проблемы главным образом заключаются во взаимодействии лекарственных средств, что происходит чаще у этой части населения ввиду сосуществования хронических заболеваний и отказов органов. Нельзя предположить, что два лекарственных средства, которые сами по себе являются безопасными, будут также безопасны при объединении, особенно у населения преклонного возраста. Кроме того, ряд лекарственных средств, вводимых одновременно, должен быть снижен настолько, насколько это возможно, поскольку пожилой возраст является непредсказуемым фактором риска для любого лечения лекарственными средствами (Turnheim, K. When drug therapy gets old: pharmacokinetics and pharmacodynamics in the elderly. Exp. Geront. 2006, 38, 843-853). Поскольку MTD являются особенно предпочтительными относительно комплексных терапий в отношении сложности взаимодействий между многофункциональными лекарственными средствами, сопутствующими заболеваниями, измененными чувствительностями к фармакодинамике и изменениями фармококинетики у людей пожилого возраста. Клиническое использование MTD может также упростить терапевтический режим (Youdim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer's and Parkinsons diseases J. Neural Transm 112, 519-537). Комплаенс с предписанными режимами приема лекарств важен для эффективного лечения. Некомплаенс представляет общую проблему, но это проблема для пациентов с болезнью Альцгеймера и их опекунов (Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13). Следовательно, упрощенный режим лечения лекарственными средствами, действующими на множество мишеней, будет повышать следование лечению. Все указанные выше преимущества недоступны для коктейлей лекарственных средств.Another important benefit is a simplified therapeutic regimen with improved compliance capabilities, and this is especially important for older patients with Alzheimer's disease and their caregivers (Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13). In this regard, an important aspect is that patients with Alzheimer's disease are subject to a wide range of medical conditions (comorbidities), which include hypertension, vascular disease, and diabetes, which can often be comorbid. Thus, the problems associated with the use of several pharmaceuticals in the elderly population have been recognized as critical in recent years. These problems are mainly drug interactions, which occur more often in this population due to the coexistence of chronic diseases and organ failure. It cannot be assumed that two drugs that are safe on their own will also be safe when combined, especially in the elderly population. In addition, the number of drugs administered at the same time should be reduced as much as possible, since old age is an unpredictable risk factor for any drug treatment (Turnheim, K. When drug therapy gets old: pharmacokinetics and pharmacodynamics in the elderly. Exp Geront 2006, 38, 843-853). Because MTDs are particularly preferred over combination therapies for the complexity of interactions between multifunctional drugs, comorbidities, altered pharmacodynamic sensitivities, and altered pharmacokinetics in the elderly. The clinical use of MTD may also simplify the therapeutic regimen (Youdim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multi-functional drugs in the treatment of Alzheimer's and Parkinsons diseases J. Neural Transm 112, 519-537). Compliance with prescribed medication regimens is important for effective treatment. Non-compliance is a general problem, but it is a problem for Alzheimer's patients and their caregivers (Small, G, Dubois B A review of compliance to treatment in Alzheimer's disease: potential benefits of a transdermal patch. Curr Med Res Opin 2007, 23, 2705-13 ). Therefore, a simplified treatment regimen with multi-target drugs will increase treatment adherence. All of the above benefits are not available for drug cocktails.
Стратегия лиганда 1 для множества мишеней является новым подходом для разработки новых кандидатов для лечения сложных неврологических заболеваний, особенно ввиду того факта, что основные процессы, вовлеченные в нейродегенеративные заболевания, по своей природе являются многофакторными (Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M, Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-targetdirected ligands to combat neurodegenerative diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72). Такая стратегия основана на концепции, что одно единственное соединение может действовать на множество мишеней, способствующих нейродегенеративному процессу, предполагаемому при болезни Альцгеймера и при других нейродегенеративных заболеваниях, и что таким образом будет предотвращать нежелательное замещение между взаимодействующими патогенными путями. Но MTD могут представлять альтернативную практику для использования комбинаций лекарственных средств. Поскольку основная масса нейродегенеративных механизмов одинакова для многих нервных заболеваний, эти MTD также могут быть использованы в качестве лекарственного средства для лечения других заболеваний.The multi-target ligand 1 strategy is a novel approach to develop new candidates for the treatment of complex neurological diseases, especially in view of the fact that the underlying processes involved in neurodegenerative diseases are multifactorial in nature (Cavalli A, Bolognesi ML, Minarini A, Rosini M , Tumiatti V, Recanatini M, Melchiorre C. Multi-targetdirected ligands to combat neurodegenerative diseases J Med Chem 2008, 51, 347-72). Such a strategy is based on the concept that a single compound can act on multiple targets that promote the neurodegenerative process putative in Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases, and that thus will prevent undesirable displacement between interacting pathogenic pathways. But MTDs may represent an alternative practice for the use of drug combinations. Since the bulk of the neurodegenerative mechanisms are the same for many neurological diseases, these MTDs can also be used as a drug to treat other diseases.
Глобальное бремя ишемического инсульта почти в 4 раза превышает геморрагический инсульт. Существующие доказательства подтверждают, что у 25-30% переживших ишемический инсульт сразу же или через некоторое время развиваются сосудистые нарушения когнитивных функций или сосудистая деменция. Деменция после инсульта может включать все типы когнитивных расстройств. Поскольку риск летального исхода после инсультов снизился, число переживших инсульт, имеющих нарушения работы мозга и нарушение когнитивных функций, повысилось (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://cix.doi.Org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015).The global burden of ischemic stroke is almost 4 times that of hemorrhagic stroke. Existing evidence suggests that 25-30% of ischemic stroke survivors develop vascular cognitive impairment or vascular dementia either immediately or over time. Post-stroke dementia can include all types of cognitive impairment. As the risk of death after stroke has decreased, the number of stroke survivors with brain and cognitive impairment has increased (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http: //cix.doi.Org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015).
Деменция после инсульта рассматривается как нозологическая форма, определяющая все типы деменции, возникающие после инсульта, помимо того, включает ли это сосудистые, нейродегенеративные или комбинацию двух процессов. Это включает комплексную этиологию с различными комбинациями заболеваний больших и малых сосудов, а также нейродегенеративные патологии (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.org/ 10.1016/j .bbadis.2016.01.015).Post-stroke dementia is considered as a nosological entity that defines all types of dementia that occur after a stroke, whether it includes vascular, neurodegenerative, or a combination of the two. This includes complex etiology with various combinations of diseases of large and small vessels, as well as neurodegenerative pathologies (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi .org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015).
Из знаний, которые имеются относительно каскада ишемических повреждений, мы знаем, что оно состоит из ряда сложных событий, которые являются очень гетерогенными (R. Brouns, P.P. De Deyn, The complexity of neurobiological processes in acute ischemic stroke, Clin. Neurol. Neurosurg. 111 (2009) 483495), развивающиеся за минуты-дни и недели после исходного явления недостаточной перфузии. Основные явления включают недостаток энергии ввиду прерванного кровотока, эксайтотоксичность, перегрузка кальцием, окислительный стресс, дисфункция гематоэнцефалического барьера, капиллярные повреждения, гемостатическая активация, повреждения, связанные с воспалительной и иммунной реакцией и некроз клеток на уровне нейронов, глии и эндотелиальных клеток.From the knowledge that is available regarding the ischemic injury cascade, we know that it consists of a number of complex events that are very heterogeneous (R. Brouns, P.P. De Deyn, The complexity of neurobiological processes in acute ischemic stroke, Clin. Neurol. Neurosurg. 111 (2009) 483495), developing within minutes, days and weeks after the initial phenomenon of insufficient perfusion. Key events include lack of energy due to interrupted blood flow, excitotoxicity, calcium overload, oxidative stress, blood-brain barrier dysfunction, capillary damage, hemostatic activation, damage associated with inflammatory and immune responses, and cell necrosis at the level of neurons, glia, and endothelial cells.
Капиллярные повреждения и разрушение гематоэнцефалического барьера, которые могут происходить через много дней, приводят к вазогенному отеку и может также вызывать кровоизлияния. В то же время, ткани могут подвергаться сложному диапазону заживляющих и ремоделирующих реакций, что включает ангиогенез для ограничения повреждения и снижения последствий. Эти явления отброшены в стареющем головном мозге, так что паренхима необратимо повреждается, при этом содействуя нарушению когнитивного процесса (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia,Capillary damage and disruption of the blood-brain barrier, which can occur many days later, leads to vasogenic edema and can also cause hemorrhages. At the same time, tissues can undergo a complex range of healing and remodeling responses, which include angiogenesis to limit damage and reduce consequences. These phenomena are discarded in the aging brain so that the parenchyma is irreversibly damaged while contributing to cognitive impairment (R.N. Kalaria, et al., Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia,
- 3 041342- 3 041342
Biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.Org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015).biochim. Biophys. Acta (2016), http://dx.doi.Org/10.1016/j.bbadis.2016.01.015).
Экспериментальные исследования показали, что смерть клеток после ишемического нарушения сильно связана с некрозом. Тем не менее, недавние разработки показали, что смерть нервных клеток в значительной степени происходит ввиду апоптоза, а также смешанных механизмов (R.N. Kalaria, et al.,Experimental studies have shown that cell death after ischemic injury is strongly associated with necrosis. However, recent developments have shown that nerve cell death is largely due to apoptosis as well as mixed mechanisms (R.N. Kalaria, et al.,
Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016).Stroke injury, cognitive impairment and vascular dementia, Biochim. Biophys. Acta (2016).
Нейровоспаление и иммунодепрессия также связаны с инсультом, старением и инфекцией. Вероятно, это имеет разрушительное действие на когнитивную функцию после инсультов (B.W. McColl, S.M. Allan, N.J. Rothwell, Systemic inflammation and stroke: aetiology, pathology and targets for therapy, Biochem. Soc. Trans. 35 (2007) 1163-1165) (C. Meisel, A. Meisel, Suppressing immunosuppression after stroke, N. Engl. J. Med. 365 (2011) 2134-2136) (W. Swardfager, O.A. Winer, N. Herrmann, S. Winer, K.L. Lanctot, Interleukin17 in post-stroke neurodegeneration, Neurosci. Biobehav. Rev. 37 (2013) 436-447).Neuroinflammation and immunosuppression are also associated with stroke, aging, and infection. This is likely to have a devastating effect on cognitive function after strokes (B.W. McColl, S.M. Allan, N.J. Rothwell, Systemic inflammation and stroke: aetiology, pathology and targets for therapy, Biochem. Soc. Trans. 35 (2007) 1163-1165) (C Meisel, A. Meisel, Suppressing immunosuppression after stroke, N. Engl. J. Med. 365 (2011) 2134-2136) -stroke neurodegeneration, Neurosci Biobehav Rev 37 (2013) 436-447).
Болезнь Паркинсона (PO) представляет собой нейродегенеративное заболевание с симптомами нарушения движения, медленными движениями, оцепенелостью, треморами в состоянии покоя и изменениями равновесия. По мере развития болезни у многих пациентов развиваются не связанные с движением симптомы, включая тревогу, депрессию, запор и деменцию.Parkinson's disease (PO) is a neurodegenerative disease with symptoms of movement disorder, slow movements, stiffness, tremors at rest, and balance changes. As the disease progresses, many patients develop non-movement related symptoms, including anxiety, depression, constipation, and dementia.
Эти характеристики связаны с сильным снижением содержания допамина в полосатом теле и потере дофаминергических нейронов в компактной части черного вещества (Gauthier, 1982).These characteristics are associated with a severe decrease in striatal dopamine and a loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra compactus (Gauthier, 1982).
Клинические признаки PO возникают после того, как некроз дофаминергических нейронов превышает пороговый уровень 70-80% и потеря нервных окончаний в полосатом теле превышает 50-60% (Agid, 1991).Clinical signs of PO occur after dopaminergic neuron necrosis exceeds a threshold level of 70-80% and striatal nerve loss exceeds 50-60% (Agid, 1991).
Исследования относительно механизмов развития PO показали, что потеря дофаминергических нейронов в компактной части черного вещества связана с дефицитом митохондриального комплекса 1 (Jenner 1998).Research on the mechanisms of PO development has shown that the loss of dopaminergic neurons in the compact substantia nigra is associated with a deficiency in mitochondrial complex 1 (Jenner 1998).
Несмотря на то, что существуют лекарственные средства, которые облегчают симптомы болезни Паркинсона, постоянное использование этих лекарственных средств неэффективно для предотвращения прогрессирования PO и было связано с ослабляющими вторичными эффектами. Таким образом, особый интерес представляет разработка нейропротекторных терапий, которые отсрочивают или даже останавливают развитие дегенеративных процессов.Although there are drugs that relieve the symptoms of Parkinson's disease, chronic use of these drugs is not effective in preventing the progression of PO and has been associated with debilitating secondary effects. Thus, of particular interest is the development of neuroprotective therapies that delay or even stop the development of degenerative processes.
К сожалению, разработка нейропротекторных терапий была приостановлена ввиду ограниченных знаний патогенеза дегенеративных неврологических заболеваний, таких как PO. Этиология и патогенез, ответственные за нервные нарушения при болезни Паркинсона, до сих пор неизвестны. Некоторые доказательства подтверждают теорию активации микроглии, а воспалительные процессы включены в каскад событий, которые приводят к прогрессивной дегенерации нейронов (Kreutzgber, GW, 1996 Trends Neurosci, 19:312-318). Активированная микроглия находится вблизи нейронов при дегенерации в черном веществе пациентов с болезнью Паркинсона (McGeer, PL et al, 1988, Neurology, 38:1285-1291).Unfortunately, the development of neuroprotective therapies has been halted due to limited knowledge of the pathogenesis of degenerative neurological diseases such as PO. The etiology and pathogenesis responsible for the nervous disorders in Parkinson's disease are still unknown. Some evidence supports the theory of microglial activation and inflammatory processes are included in the cascade of events that lead to progressive neuronal degeneration (Kreutzgber, GW, 1996 Trends Neurosci, 19:312-318). Activated microglia are found near neurons during degeneration in the substantia nigra of patients with Parkinson's disease (McGeer, PL et al, 1988, Neurology, 38:1285-1291).
Ход классического лечения PO заключается в введении агонистов допамина, таких как леводопа (LOOPA) и карбидопа. В общем, назначают другие лекарственные средства с выраженной целью или замены допамина или ингибирования его разложения, такие как ингибиторы катехол-0-метилтрансферазы и амантадина (N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1, 2009).The course of classical treatment for PO is the administration of dopamine agonists such as levodopa (LOOPA) and carbidopa. In general, other drugs are prescribed with the express purpose of either replacing dopamine or inhibiting its degradation, such as inhibitors of catechol-O-methyltransferase and amantadine (N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1, 2009).
Хотя такие лекарственные средства, как правило, снимают симптомы у пациента, они не всегда эффективны и/или допустимы в течение времени, причем дискинезия является вторичным эффектом (A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). Другим осложнением является тот факт, что ежедневное лечение может быть обременительным и уменьшает соблюдение приема препарата пациентом. Таким образом, на сегодняшний день упор делают на новые системы введения лекарственных средств, которые могут обеспечивать непрерывную инфузию агонистов допамина путем помещения мининасосов (например, энтеральных, подкожных) и для введения через кожу посредством накожных пластырей (A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). Даже с развитием таких лекарственных средств и их систем введения, некоторые пациенты с болезнью Паркинсона тем не менее все еще не получают достаточного ослабления симптомов (N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1, 2009).Although such drugs generally relieve the patient's symptoms, they are not always effective and/or tolerated over time, with dyskinesia being a secondary effect (A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). Another complication is the fact that daily treatment can be burdensome and reduce patient compliance. Thus, the current focus is on new drug delivery systems that can provide continuous infusion of dopamine agonists by placing minipumps (eg, enteral, subcutaneous) and for transdermal administration via dermal patches (A. H. Schapira et al., European Journal of Neurology 16, 1090 (2009)). Even with the development of such drugs and their administration systems, some patients with Parkinson's disease still do not receive sufficient symptom relief (N. L. Diaz, C. H. Waters, Expert Rev Neurother 9, 1781 (Dec 1, 2009).
Экспериментальные модели митохондриальных заболеваний обычно включают ингибирование ферментов, вовлеченных в электрон-транспортную цепь (1). Также было отмечено, что множество нейродегенеративных заболеваний связаны с митохондриальной дисфункцией (2-5). Дефекты 1,11 и IV комплексов в дыхательной цепи митохондрий были обнаружены при болезнях Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона и Лу Герига (6-9).Experimental models of mitochondrial diseases typically involve inhibition of enzymes involved in the electron transport chain (1). It has also been noted that many neurodegenerative diseases are associated with mitochondrial dysfunction (2-5). Defects in the 1,11 and IV complexes in the mitochondrial respiratory chain have been found in Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's and Lou Gehrig's diseases (6-9).
Некоторые доказательства подразумевают, что болезнь Паркинсона представляет собой заболевание, которое включает свободные радикалы и митохондриальную дисфункцию, что приводит к отказу энергетической продуктивности (10-11). Повышенное окислительное повреждение, нехватка допамина, нитрирование белков, накопление железа, добавление белков и апоптоз являются характерными для болезни Паркинсона (12-14).Some evidence suggests that Parkinson's disease is a disease that involves free radicals and mitochondrial dysfunction, resulting in the failure of energy productivity (10-11). Increased oxidative damage, lack of dopamine, protein nitration, iron accumulation, protein addition, and apoptosis are characteristic of Parkinson's disease (12–14).
Множество эпидемиологических исследований показали, что широко распространена хроническая боль, серьезно влияя на здоровье людей, здравоохранение и социальные услуги (Torrance N, Smith BH.Many epidemiological studies have shown that chronic pain is widespread, seriously affecting people's health, healthcare and social services (Torrance N, Smith BH.
- 4 041342- 4 041342
Bennett MI, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289) (Treede RD, Jensen TS, Campbell JN, Cruccu G, Dostrovsky JO, Griffin JW, Hansson P, Hughes R, Nurmikko T, Serra J. Redefinition of neuropathic pain and a grading system for clinical use: consensus statement on clinical and research diagnostic criteria. Neurology 2008; 70:16301635). В частности, было оценено, что хроническая боль с невропатическим содержанием влияет приблизительно на 7-8% всего населения, а терапии, доступные для их лечения, все еще неудовлетворительны (Torrance N, Smith BH. Bennett MI, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289) (van Hecke O, Austin SK, Khan RA, Smith BH, Torrance N. Neuropathic pain in the general population: a systematic review of epidemiological studies. Pain 2014; 155:654-62) (Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review. Pain 2012; 153:359-365). NP рассматривается как симптом нейродегенерации, следовательно, логично рассмотреть нейропротективное действие как стратегию предотвращения его начала, борьбы с прогрессированием и даже возврата нервных повреждений, приводящих к этим симптомам хронической боли (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662). Нейропротективное действие включает способы, которые поддерживают выживаемость нейронов или их работу в контексте патологического стресса (травматических, токсических, ишемических или метаболических событий). Таким образом, на сегодняшний день лечение большинства невропатий периферической и центральной NP (болезненная диабетическая невропатия, дистальная полинейропатия, сенсорная дистальная, обусловленная ВИЧ, и антиретровирусная терапии, периферические нейропатия, вызванные химиотерапией, постгерпетическая невралгия, боль MS и боль после инсульта и т.д.) направлены на эту область (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (Flatters SJL, Bennett GJ. Studies of peripheral sensory nerves in paclitaxel-induced painful peripheral neuropathy: Evidence for mitochondrial dysfunction. Pain 2006; 122: 245-257) (Jaggi AS, Singh N. Mechanisms in cancer-chemotherapeutic drugsinduced peripheral neuropathy. Toxicology 2012; 291 :l-9). Особое внимание уделяется глутаматергической дисфункции, нитро-окислительному стрессу, митохондриальной дисфункции, апоптозу, трофическим факторам, нейровоспалению и изменениям в неповрежденных волокнах, вызванным нейродегенерацией (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (DeLeo JA, Sorkin LS, Watkins LR, editors. Immune and glial regulation of pain. Seattle: IASP Press; 2007) (Park ES, Gao X, Chung JM, Chung K. Levels of mitochondrial reactive oxygen species increase in rat neuropathic spinal dorsal horn neurons. Neuroscience Letters 2006; 391:108-111). Биологами было высказано предложение о разработке новых методов лечения боли, основанных на участии электронной транспортной цепи при невропатиях, зависящих от АТФ (Joseph EK, Levine JD. Mitochondrial electron transport in models of neuropathic and inflammatory pain. Pain 2006; 121:105-114) (Joseph EK, Levine JD. Multiple PKCεdependent mechanisms mediating mechanical hyperalgesia. Pain 201 O; 150:17-21). Также была отмечена митохондриальная зависимость фактора роста нервов (NGF) при индуцировании механической гипералгезии (Chu C, Levine E, Gear RW, Bogen O, Levine JD. Mitochondrial dependence of nerve growth factor-induced mechanical hyperalgesia. Pain 2011; 152:1832-1837).Bennett MI, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289) (Treede RD, Jensen TS, Campbell JN, Cruccu G, Dostrovsky JO, Griffin JW, Hansson P, Hughes R, Nurmikko T, Serra J. Redefinition of neuropathic pain and a grading system for clinical use: consensus statement on clinical and research diagnostic criteria, Neurology 2008; 70:16301635). In particular, it has been estimated that chronic pain with neuropathic content affects approximately 7-8% of the general population, and therapies available for their treatment are still unsatisfactory (Torrance N, Smith BH. Bennett MI, Lee AJ. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain 2006; 7:281-289) (van Hecke O, Austin SK, Khan RA, Smith BH, Torrance N. Neuropathic pain in the general population: a systematic review of epidemiological studies. Pain 2014; 155:654-62) (Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review. Pain 2012; 153 :359-365). NP is seen as a symptom of neurodegeneration, therefore, it is logical to consider neuroprotective action as a strategy to prevent its onset, fight progression, and even return the nerve damage leading to these symptoms of chronic pain (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain Neurotherapeutics 2009;6:648-662). Neuroprotective action includes methods that support the survival of neurons or their work in the context of pathological stress (traumatic, toxic, ischemic or metabolic events). Thus, to date, the treatment of most peripheral and central NP neuropathies (painful diabetic neuropathy, distal polyneuropathy, distal sensory, HIV-related and antiretroviral therapy, chemotherapy-induced peripheral neuropathy, postherpetic neuralgia, MS pain and post-stroke pain, etc. .) are directed to this area (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (Flatters SJL, Bennett GJ. Studies of peripheral sensory nerves in paclitaxel- induced painful peripheral neuropathy: Evidence for mitochondrial dysfunction Pain 2006; 122: 245-257) (Jaggi AS, Singh N. Mechanisms in cancer-chemotherapeutic drugs induced peripheral neuropathy. Toxicology 2012; 291 :l-9). Particular attention is paid to glutamatergic dysfunction, nitro-oxidative stress, mitochondrial dysfunction, apoptosis, trophic factors, neuroinflammation, and changes in intact fibers caused by neurodegeneration (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009 ; 6:648-662) (DeLeo JA, Sorkin LS, Watkins LR, editors. Immune and glial regulation of pain. Seattle: IASP Press; 2007) (Park ES, Gao X, Chung JM, Chung K. Levels of mitochondrial reactive oxygen species increase in rat neuropathic spinal dorsal horn neurons Neuroscience Letters 2006;391:108-111). Biologists have proposed the development of new methods of pain treatment based on the participation of the electron transport chain in ATP-dependent neuropathies (Joseph EK, Levine JD. Mitochondrial electron transport in models of neuropathic and inflammatory pain. Pain 2006; 121:105-114) (Joseph EK, Levine JD. Multiple PKCεdependent mechanisms mediating mechanical hyperalgesia. Pain 201 O; 150:17-21). Mitochondrial dependence of nerve growth factor-induced mechanical hyperalgesia has also been noted in Chu C, Levine E, Gear RW, Bogen O, Levine JD. ).
Согласно этим идеям, множество иммунных медиаторов, вовлеченных в процесс валлеровского перерождения (WD), которое происходит тогда, когда непрерывность нервного волокна нарушается, были предложены в качестве новых мишеней для лечения NP лекарственными средствами (Debovy P. Wallerian degeneration and peripheral nerve conditions for both axonal regeneration and neuropathic pain induction. Annals of Anatomy 2011; 193: 267-275) (Lingor P, Koch JC, Tanges L, Bahr M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res 2012; 349:289-311). Роль, выполняемая нейроиммунной активацией, микроглиа-нейронной сигнализацией и окислительным стрессом, также была признана в усилении передачи после повреждений нервов (Berger JV, Knaepen L, Janssen SPM, Jaken RJP, Marcus MAE, Joosten EAJ, Deumens R. Cellular and molecular insights into neuropathy-induced pain hypersensitivity for mechanismbased treatment approaches. Brain Research Reviews 2011; 67: 282-310) (De Leo J.A, Tawfik VL, La CroixFralish ML. The tetrapartite synapse: Path to CNS sensitization and chronic pain. Pain 2006;122:17-21) (Austin PJ, Moalem-Taylor G. The neuro-immune balance in neuropathic pain: Involvement of inflammatory immune cells, immune-like glial cells and cytokines Journal of Neuroimmunology 201 O; 229:26-50) (Salvemini D, Little JW, Doyle T, Neumann WL. Roles of reactive oxygen and nitrogen species in pain. Free Radical Biology &Medicine 2011; 51:951-966).According to these ideas, many immune mediators involved in the process of Wallerian degeneration (WD), which occurs when the continuity of the nerve fiber is broken, have been proposed as new targets for the treatment of NP drugs (Debovy P. Wallerian degeneration and peripheral nerve conditions for both axonal regeneration and neuropathic pain induction Annals of Anatomy 2011; 193: 267-275) 311). The role played by neuroimmune activation, microglianeural signaling, and oxidative stress has also been recognized in increased transmission after nerve injury (Berger JV, Knaepen L, Janssen SPM, Jaken RJP, Marcus MAE, Joosten EAJ, Deumens R. Cellular and molecular insights into neuropathy-induced pain hypersensitivity for mechanismbased treatment approaches. Brain Research Reviews 2011; 67: 282-310) 17-21) (Austin PJ, Moalem-Taylor G. The neuro-immune balance in neuropathic pain: Involvement of inflammatory immune cells, immune-like glial cells and cytokines Journal of Neuroimmunology 201 O; 229:26-50) (Salvemini D , Little JW, Doyle T, Neumann WL, Roles of reactive oxygen and nitrogen species in pain, Free Radical Biology &Medicine 2011;51:951-966).
Следовательно, новые стратегии, направленные на нейропротективное действие и, в частности, нейровоспаление для лечения NP, на сегодня находятся на этапе научных исследований и разработки (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009; 6:648-662) (Stavniichuk R, Drel VR, Shevalye H, Maksimchyk Y, Kuchmerovska TM, Nadler JL, Obrosova IG. Baicalein alleviates diabetic peripheral neuropathy through inhibition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK activation. Experimental Neurology 2011; 203:106-113).Therefore, new strategies aimed at neuroprotective action and, in particular, neuroinflammation for the treatment of NP are currently at the stage of research and development (Bordet T and Pruss RM. Targeting neuroprotection as an alternative approach to preventing and treating neuropathic pain. Neurotherapeutics 2009 ; 6:648-662) (Stavniichuk R, Drel VR, Shevalye H, Maksimchyk Y, Kuchmerovska TM, Nadler JL, Obrosova IG. Baicalein alleviates diabetic peripheral neuropathy through inhibition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK activation. Experimental Neurology 2011; 203:106-113).
Старение и неврологические и психиатрические расстройства вызывают повреждение и смерть нейронов. Среди частых и соответствующих изменений нервной системы мы включили, помимо проче- 5 041342 го, дегенерацию нейронов, ишемию, воспаление, иммунные реакции, травму и рак. В результате них, нейроны могут погибать за минуты или часы, или они могут выдерживать исходное повреждение в поврежденном состоянии, активируя нейродегенерацию и, наконец, также приводя к смерти клеток.Aging and neurological and psychiatric disorders cause neuronal damage and death. Among the frequent and relevant changes in the nervous system, we have included, among others, neuronal degeneration, ischemia, inflammation, immune responses, trauma, and cancer. As a result, neurons may die within minutes or hours, or they may sustain the initial injury in a damaged state, activating neurodegeneration and finally also leading to cell death.
Нейродегенерация при болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваниях, по всей видимости, является многофакторной, так что большой диапазон токсичных реакций, включая воспаление, глутаматергическую нейротоксичность, увеличение содержания железа и оксида азота, истощение эндогенных антиоксидантов, сниженная экспрессия трофических факторов, дисфункция убиквитин-протеасомной системы и экспрессия проапоптотических белков, приводят к некрозу нейронов.Neurodegeneration in Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and other neurodegenerative diseases appears to be multifactorial, such that a wide range of toxic responses, including inflammation, glutamatergic neurotoxicity, increased iron and nitric oxide, endogenous antioxidant depletion, decreased expression of trophic factors, ubiquitin dysfunction -proteasome system and expression of proapoptotic proteins lead to neuronal necrosis.
Учитывая важность нервной системы для создания основных двигательных навыков и чувствительности, существует интерес к поиску терапевтического средства для защиты нервной системы.Given the importance of the nervous system in building basic motor skills and sensation, there is interest in finding a therapeutic agent to protect the nervous system.
Нейропротективное действие направлено на сохранение, восстановление, лечение или регенерацию нервной системы, ее клеток, структуры и функции (Vajda et al 2002, J Clin Neurosci 9:4-8). Одной из целей нейропротективного действия является предотвращение или минимизация влияния первоначального поражения нервной системы или предотвращение или минимизация последствий эндогенных или экзогенных вредных процессов, которые вызывают повреждение аксонов, нейронов, синапсисов и дендритов.Neuroprotective action is aimed at maintaining, restoring, treating or regenerating the nervous system, its cells, structure and function (Vajda et al 2002, J Clin Neurosci 9:4-8). One of the goals of neuroprotective action is to prevent or minimize the impact of the initial damage to the nervous system or to prevent or minimize the consequences of endogenous or exogenous harmful processes that cause damage to axons, neurons, synapses and dendrites.
Нейропротективное действие представляет собой механизм и стратегию, используемые для защиты от повреждения нейронов или дегенерации ЦНС в результате хронического нейродегенеративного заболевания (болезнь Альцгеймера, Паркинсона). Целью нейропротективного действия является ограничение дисфункции/смерти после травмы ЦНС и попытка сохранить максимально возможную целостность для клеточных взаимодействий в головном мозге, что приводит к нетронутой нейронной функции.Neuroprotective action is a mechanism and strategy used to protect against neuronal damage or degeneration of the CNS as a result of a chronic neurodegenerative disease (Alzheimer's disease, Parkinson's disease). The goal of neuroprotective action is to limit dysfunction/death after CNS injury and attempt to preserve the greatest possible integrity for cellular interactions in the brain, resulting in intact neuronal function.
Концепция нейропротективного действия была применена к хроническим заболеваниям головного мозга, а также к острым неврологическим состояниям, учитывая, что некоторые из основных механизмов, поражающих ЦНС, подобны этим состояниям. Нейродегенеративные расстройства включают AD, PO, болезнь Гентингтона и боковой амиотрофический склероз. Нейропротективное действие рассматривалась как механизм действия лекарственного средства, используемый для лечения этих состояний.The concept of neuroprotective action has been applied to chronic brain diseases as well as acute neurological conditions, given that some of the underlying mechanisms that affect the CNS are similar to these conditions. Neurodegenerative disorders include AD, PO, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis. Neuroprotective action has been considered as the mechanism of drug action used to treat these conditions.
Существует широкий спектр нейропротекторных продуктов, доступных или исследуемых, и некоторые продукты могут потенциально использоваться для более чем одного заболевания, учитывая, что многие механизмы повреждения нейронных тканей подобны. Продукты с нейропротекторными эффектами сгруппированы в следующие категории: похитители свободных радикалов, антиэкситокситоксичные агенты, ингибиторы апоптоза (запрограммированная гибель клеток), противовоспалительные агенты, нейротрофические факторы, хелатные ионы металлов, модуляторы ионных каналов и генная терапия.There is a wide range of neuroprotective products available or under investigation, and some products have the potential to be used for more than one disease, given that many of the mechanisms of damage to neural tissues are similar. Products with neuroprotective effects are grouped into the following categories: free radical scavengers, anti-excitotoxic agents, inhibitors of apoptosis (programmed cell death), anti-inflammatory agents, neurotrophic factors, chelating metal ions, ion channel modulators, and gene therapy.
Было продемонстрировано, что свободные радикалы кислорода связаны с денатурализацией белков, инактивацией ферментов и повреждением ДНК, что приводит к перокислению липидов клеточных мембран и, наконец, гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях.Oxygen free radicals have been demonstrated to be associated with protein denaturalization, enzyme inactivation, and DNA damage, leading to lipid peroxidation of cell membranes and, finally, cell death in neurodegenerative diseases.
Исследования, проведенные как на моделях животных, так и на человеческих моделях, показывают, что потеря равновесия среди частиц-окислителей, генерируемых метаболизмом в мозге и антиоксидантными защитными механизмами, вызывает так называемый окислительный стресс, когда указанные системы защиты снижают свою эффективность и нарушаются. Этот окислительный стресс увеличивается с возрастом и обнаружен среди основных причин патогенеза AD (Neurobiol. Aging 2007, 28, 1009-1014), возможно связанных с нейронными митохондриальными дисфункциями.Studies in both animal and human models show that the imbalance among oxidant particles generated by brain metabolism and antioxidant defense mechanisms causes what is known as oxidative stress, when these defense systems become less effective and disrupted. This oxidative stress increases with age and has been found to be among the main causes of the pathogenesis of AD (Neurobiol. Aging 2007, 28, 1009-1014), possibly related to neuronal mitochondrial dysfunctions.
Мы также знаем, что продукты с антиоксидантными свойствами способны предотвращать апоптоз, индуцированный амилоидным пептидом, а также изменения гомеостаза Ca2 в культурах кортикальных нейронов (Lite Sci. 2000, 66, 1879-1892). 66, 1879-1892). Следовательно, существует большая потребность в ингибиторах ацетилхолинэстеразы (AChE) или бутирилхолинэстеразы (BuChE) и с нейропротекторной способностью от токсических повреждений, таких как оксигенированные свободные радикалы, причем указанные соединения будут иметь большое медицинское значение при лечении нейродегенеративных заболеваний, таких как AD, PO или Гентингтона.We also know that foods with antioxidant properties are able to prevent amyloid peptide-induced apoptosis as well as changes in Ca2 homeostasis in cortical neuron cultures (Lite Sci. 2000, 66, 1879-1892). 66, 1879-1892). Therefore, there is a great need for inhibitors of acetylcholinesterase (AChE) or butyrylcholinesterase (BuChE) and with neuroprotective ability against toxic damage such as oxygenated free radicals, these compounds will be of great medical importance in the treatment of neurodegenerative diseases such as AD, PO or Huntington's disease. .
Говоря в общем, стратегии лечения часто основаны на модуляции одного фактора предлагаемого поражения. Хотя мы можем наблюдать, что указанные виды лечение являются выгодными в очень ограниченных животных моделях, менее вероятно, что они продемонстрировали бы свою эффективность при более сложных человеческих расстройствах с более высокой степенью тяжести поражения в генетически разнообразной популяции (Faden and Stoica, 2007. Arch Neurol 64: 794-800). В значительной степени, учитывая предполагаемые механизмы гибели нейронов, такие как окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, добавленные белки, апоптоз и воспаление (oudim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multifunctional drugs in the treatment of Alzheimer's and Parkinsons diseases J. Neural Transm 112, 519-537), они настолько сложны, насколько они различны, нам были бы необходимы отдельные соединения, которые имеют многоцелевые эффекты на множественные механизмы поражений.Generally speaking, treatment strategies are often based on the modulation of one factor of the proposed lesion. Although we can observe that these treatments are beneficial in very limited animal models, they are less likely to be effective in more complex human disorders with higher severity in a genetically diverse population (Faden and Stoica, 2007. Arch Neurol 64: 794-800). To a large extent, given the putative mechanisms of neuronal death such as oxidative stress, mitochondrial dysfunction, added proteins, apoptosis, and inflammation (oudim, M.B., and Buccafusco, JJ (2005) CNS Targets for multifunctional drugs in the treatment of Alzheimer's and Parkinsons diseases J . Neural Transm 112, 519-537), they are as complex as they are different, we would need separate compounds that have multiple effects on multiple lesion mechanisms.
Соединение (3 -этоксикарбонил-2-метил-4-(2-нитрофенил)-4,11 -дигидро-1 Н-пиридо[2,3-Ь] [ 1,25]бензодиацепин) (JM-20), которое описано в документе патента республики Куба CU 23879 по его химической структуре, может оказывать влияние на сердечно-сосудистые, цереброваскулярные и другие заболевания, связанные с центральной нервной системой.The compound (3-ethoxycarbonyl-2-methyl-4-(2-nitrophenyl)-4,11-dihydro-1 H-pyrido[2,3-b][1,25]benzodiacepine) (JM-20), which is described in the patent document of the Republic of Cuba CU 23879 on its chemical structure, may have an effect on cardiovascular, cerebrovascular and other diseases associated with the central nervous system.
- 6 041342- 6 041342
Неожиданно исследователями было обнаружено, что соединение JM-20 оказывает выраженное терапевтическое действие на ЦНС предпочтительно для лечения таких заболеваний, как различные типы деменции, болезнь Паркинсона и боль.Unexpectedly, researchers have found that the compound JM-20 has a pronounced therapeutic effect on the CNS, preferably for the treatment of diseases such as various types of dementia, Parkinson's disease and pain.
Таким образом, сущность данного изобретения основана на использовании JM-20 и его химических продуктов, которые предпочтительно используются при лечении таких заболеваний, как различные типы деменции, болезнь Паркинсона и боль.Thus, the essence of this invention is based on the use of JM-20 and its chemical products, which are preferably used in the treatment of diseases such as various types of dementia, Parkinson's disease and pain.
JM-20 является продуктом бензодиацепина, и широко сообщалось, что бензодиацепины индуцируют деменции (Huber-Geismann, F, 1994) (Rosenberg, P. B., 2015). (Shash, D., T. Kurth, et al. 2015) (Zhong, G., Y. Wang, et al. 2015)), однако JM-20 неожиданно улучшает состояние при различных типах деменции.JM-20 is a benzodiazepine product and benzodiazepines have been widely reported to induce dementias (Huber-Geismann, F, 1994) (Rosenberg, P. B., 2015). (Shash, D., T. Kurth, et al. 2015) (Zhong, G., Y. Wang, et al. 2015)), however, JM-20 surprisingly improves the condition in various types of dementia.
Несмотря на то, что потенциальная полезность JM-20 отмечена в литературе, его потенциал в качестве терапевтического лекарственного средства при нейродегенеративных заболеваниях, таких как деменции, болезнь Паркинсона и невропатическая боль, не установлен.Although the potential utility of JM-20 has been noted in the literature, its potential as a therapeutic drug in neurodegenerative diseases such as dementias, Parkinson's disease and neuropathic pain has not been established.
В качестве дополнительного аспекта настоящего изобретения, соединение общей формулы III (JM20), его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, физиологически протестированные пролекарства могут быть введены в смеси по меньшей мере с одним средствомсредой, разбавителем и/или носителем, химически инертным, нетоксичным, здесь и далее признаваемым вспомогательными веществами, включенными в предлагаемые композиции лекарственных средств.As an additional aspect of the present invention, the compound of general formula III (JM20), its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, physiologically tested prodrugs can be administered in admixture with at least one medium, diluent and/or carrier, chemically inert, non-toxic, hereinafter recognized as excipients included in the proposed compositions of medicinal products.
Композиции лекарственных средств обеспечиваются для любой жидкой, твердой или полутвердой композиции, они могут быть введены перорально, букофарингеально, сублингвально, парентерально, например: внутримышечно, внутривенно, внутрикожно или подкожно, местно, трансдермально, трахеально, бронхиально, назально, пульмонально, ректально или другими подходящими путями введения.Drug compositions are provided for any liquid, solid or semi-solid composition, they can be administered orally, bucopharyngeally, sublingually, parenterally, for example: intramuscularly, intravenously, intradermally or subcutaneously, topically, transdermally, tracheally, bronchially, nasally, pulmonary, rectally or other suitable routes of administration.
Описанные композиции лекарственных средств будут содержать подходящие вспомогательные вещества для каждого состава. Составы получают обычно при помощи способов, существующих в данной области техники. Вспомогательные вещества выбирают по их выбранной форме лекарственного средства согласно пути, которым их будут вводить.The drug compositions described will contain suitable excipients for each formulation. The compositions are usually obtained using methods existing in the art. The excipients are selected for their chosen drug form according to the route by which they will be administered.
Соединение общей формулы III (JM-20), его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, пролекарства для его введения людям могут содержаться в фармацевтически приемлемых формах дозировок, среди которых, помимо прочего, находятся эти формы выпуска: таблетки (включая подъязычные, с покрытием и разжевываемые), твердые и мягкие капсулы (включая микрокапсулы, наночастицы и пеллеты), растворы (пероральные капли, сиропы), парентеральные растворы, трансдермальные пластыри, импланты и другие системы ретард, мази (кремы и гели), назальные спреи, мукоадгезивы, суппозитории, суспензии, порошки, которые необходимо разводить или добавлять в пищу, помимо прочих форм дозировок, включенных в настоящее изобретение.The compound of general formula III (JM-20), its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, prodrugs for its administration to humans may be contained in pharmaceutically acceptable dosage forms, among which, among others, are these forms of release: tablets ( including sublingual, coated and chewable), hard and soft capsules (including microcapsules, nanoparticles and pellets), solutions (oral drops, syrups), parenteral solutions, transdermal patches, implants and other retard systems, ointments (creams and gels), nasal sprays, mucoadhesives, suppositories, suspensions, powders to be diluted or added to food, among other dosage forms included in the present invention.
Используя известные технологические процессы уровня техники, JM-20, его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, пролекарства, можно составлять в лекарственные формы, приспособленные к их введению, смешивать их с вспомогательными веществами, такими как вспомогательные жидкие, твердые или полутвердые вещества, состоящие из органических и неорганических веществ, природного или синтетического происхождения. Некоторые из них включают: твердые наполнители, разбавители, агглютинирующие вещества, растворители, эмульсии, смазывающие средства, дезинтегрирующие средства, способствующие скольжению средства, ароматизаторы, красители, пигменты, полимеры, подсластители, пластификаторы, усилители поглощения, усилители проникания, поверхностно-активные вещества, вспомогательные поверхностно-активные вещества, специальные масла и/или буферные системы, которые придают активным соединениям или их физиологически приемлемым солям физическую, химическую и/или биологическую стабильность.Using known technological processes of the prior art, JM-20, its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, prodrugs, can be formulated into dosage forms adapted to their administration, mixed with excipients, such as auxiliary liquid, solid or semi-solid substances consisting of organic and inorganic substances, of natural or synthetic origin. Some of these include: solid fillers, diluents, agglutinants, solvents, emulsions, lubricants, disintegrants, glidants, fragrances, dyes, pigments, polymers, sweeteners, plasticizers, absorption enhancers, penetration enhancers, surfactants, auxiliary surfactants, special oils and/or buffer systems which impart physical, chemical and/or biological stability to the active compounds or their physiologically acceptable salts.
Некоторые вспомогательные вещества, используемые в составе лекарственных форм, содержащих соединение общей формулы III или его продукты, без ограничения использованием других вспомогательных веществ, представляют собой: крахмалы, лактазу, целлюлозу и ее продукты, сахарозу, сорбит, маннит и другие сахара, тальк, коллоидный диоксид кремния, карбонаты, оксиды магния, фосфаты кальция, диоксид титана, поливинилпирролидон, повидон, желатин, белки молока, цитраты, тартраты, альгинаты, декстран, этилцеллюлозу, циклодекстрины, эластомеры кремния, полисорбаты, амилопектин, парабены, животные и растительные масла, пропиленгликоль, стерилизованную воду, одно- или многоатомные спирты, такие как глицерин, стеарат магния, стеарат кальция, натрия стеарилфумарат, лаурилсульфат натрия, глицерин и воски полиэтиленгликоля, помимо прочего.Some excipients used in dosage forms containing a compound of general formula III or its products, without limitation to the use of other excipients, are: starches, lactase, cellulose and its products, sucrose, sorbitol, mannitol and other sugars, talc, colloidal silicon dioxide, carbonates, magnesium oxides, calcium phosphates, titanium dioxide, polyvinylpyrrolidone, povidone, gelatin, milk proteins, citrates, tartrates, alginates, dextran, ethylcellulose, cyclodextrins, silicon elastomers, polysorbates, amylopectin, parabens, animal and vegetable oils, propylene glycol , sterilized water, mono- or polyhydric alcohols such as glycerin, magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, sodium lauryl sulfate, glycerin, and polyethylene glycol waxes, among others.
Твердые пероральные лекарственные формы, такие как таблетки, микрогранулы, наночастицы, пеллеты, порошки, которые необходимо разводить, или капсулы, содержащие соединение общей формулы III или его соли, энантиомерные формы и продукты окисления-восстановления согласно данному изобретения, могут быть использованы для немедленного или модифицированного высвобождения.Solid oral dosage forms such as tablets, microbeads, nanoparticles, pellets, powders to be diluted or capsules containing a compound of general formula III or its salts, enantiomeric forms and redox products according to this invention can be used for immediate or modified release.
Выбранная форма лекарственного средства, согласно настоящему изобретению, представляет собой таблетки, содержащие, в качестве своего активного фармацевтического ингредиента, соединение общей формулы III или его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, пролекарства, получение смеси с микрокристаллической целлюлозой, кукурузным крахмалом, кросповидоном, добавление растворенного поливинилпирролидона и лаурилсульфата натрия с получением гранулята,The selected form of the drug, according to the present invention, is a tablet containing, as its active pharmaceutical ingredient, a compound of general formula III or its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, prodrugs, obtaining a mixture with microcrystalline cellulose, corn starch, crospovidone, adding dissolved polyvinylpyrrolidone and sodium lauryl sulfate to obtain a granulate,
- 7 041342 который сушат в полном процессе в псевдоожиженном слое и смешивают со стеаратом магния и тальком, затем таблетки получают при помощи системы вращающихся штампов для их изготовления, наконец на таблетки наносят покрытие из гидроксипропилцеллюлозы, полиэтиленгликоля 4000, диоксида титана и окрашивающей суспензии.- 7 041342 which is dried in a complete process in a fluidized bed and mixed with magnesium stearate and talc, then tablets are obtained using a system of rotary dies for their manufacture, finally the tablets are coated with hydroxypropyl cellulose, polyethylene glycol 4000, titanium dioxide and a coloring suspension.
Путем нанесения покрытия на таблетки мы достигаем привлекательный конечный вид и избегаем неприятного вкуса; это достигается маскирующим вкус средством, таким как сополимер метакриловой кислоты, этилцеллюлоза, метилгидроксипропилцеллюлоза или другие полимеры. Таблетки могут быть получены как методом влажной грануляции, показанным выше, так и методом прямого прессования при помощи вспомогательных веществ для прямого прессования и снижения количества стадий на фазе получения таблеток, при условии, что работают с низкими дозами.By coating the tablets, we achieve an attractive final appearance and avoid unpleasant taste; this is achieved by a taste masking agent such as methacrylic acid copolymer, ethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, or other polymers. Tablets can be prepared either by the wet granulation method shown above or by direct compression using direct compression auxiliaries and reducing the number of steps in the tableting phase, provided that low doses are used.
Таблетки могут быть с модифицированным высвобождением, и они могут содержать соединение общей формулы III или его продукты в микрогранулах, наночастицах или матричных системах, используя вспомогательные вещества, такие как полиэтиленоксид, гидроксипропилцеллюлоза 2910, стеарат магния, хлорид натрия, красный оксид железа, ацетат целлюлозы, полиэтиленгликоль 3350 и опадрай.Tablets may be modified release and may contain a compound of general formula III or its products in microgranules, nanoparticles or matrix systems using excipients such as polyethylene oxide, hydroxypropyl cellulose 2910, magnesium stearate, sodium chloride, iron oxide red, cellulose acetate, polyethylene glycol 3350 and opadry.
Согласно настоящему изобретению, композиции лекарственного средства могут содержать фармацевтически приемлемые полимеры, проницаемые, биоразлагаемые и нерастворимые в воде, для регулирования его профиля высвобождения, при этом получая модифицированное высвобождение (немедленное, отсроченное или регулируемое) лекарственных форм. Эти полимеры могут быть использованы для покрытия таблеток, микрогранул, капсул при получении наночастиц, в качестве матриц высвобождения в пеллетах, таблетках, гранулах или смесях с другими вспомогательными веществами, включенными в любую другую лекарственную форму, указанную в настоящем изобретении.According to the present invention, drug compositions may contain pharmaceutically acceptable polymers that are permeable, biodegradable and water-insoluble to control its release profile while providing modified release (immediate, delayed or controlled) dosage forms. These polymers can be used to coat tablets, microbeads, capsules in the preparation of nanoparticles, as release matrices in pellets, tablets, granules or mixtures with other excipients included in any other dosage form specified in the present invention.
Для перорального введения другие подходящие фармацевтические композиции представляют собой твердые капсулы, мягкие капсулы и фармацевтические порошки, соединение общей формулы III или его соли, энантиомерные формы и продукты его физиологически приемлемых окисления-восстановления можно дозировать в виде твердых желатиновых или целлюлозных капсул, например, содержащих внутри смесь активного фармацевтического ингредиента с обычно используемыми вспомогательными веществами в твердой форме, такими как описанные для таблеток; указанную смесь можно получать сухим путем, влажной грануляцией, экструзией, таблетированием, в виде микрокапсул или микротаблеток. Для доз в мягких желатиновых капсулах м используем обычные способы изготовления, и они могут включать смешивание соединения общей формулы III или его солей, гидратов, кристаллических форм, энантиомеров, изомеров, метаболитов, пролекарств с растительными маслами, жиром или другими подобными средами, подходящими для их образования.For oral administration, other suitable pharmaceutical compositions are hard capsules, soft capsules and pharmaceutical powders, the compound of general formula III or its salts, enantiomeric forms and its physiologically acceptable redox products can be dosed in the form of hard gelatin or cellulose capsules, for example, containing a mixture of the active pharmaceutical ingredient with commonly used excipients in solid form, such as those described for tablets; said mixture can be obtained by dry, wet granulation, extrusion, tabletting, microcapsules or microtablets. For doses in soft gelatin capsules, conventional methods of manufacture are used and may involve mixing the compound of general formula III, or its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, prodrugs, with vegetable oils, fat, or other similar media suitable for their application. education.
В случае фармацевтических порошков, они могут быть получены простым смешиванием соединения общей формулы III (JM-20) или его солей, энантиомерных форм и продуктов его физиологически приемлемых пролекарств с наполнителями, суспендирующими средствами, подсластителями, ароматизаторами и консервантами. Хотя в настоящем изобретении также используется метод сушки атомизацией при температуре на входе 100-150°C и температурах на выходе 50-90°C при получении порошков, используются вспомогательные вещества, такие как декстран, полиэтиленгликоль 4000 и лаурилсульфат натрия, помимо прочего, для улучшения растворимости активного фармацевтического ингредиента для его надлежащего введения в организм в растворах, или добавления его в пищу, такую как соки.In the case of pharmaceutical powders, they can be prepared by simply mixing a compound of general formula III (JM-20) or its salts, enantiomeric forms and products of its physiologically acceptable prodrugs with excipients, suspending agents, sweeteners, flavors and preservatives. Although the present invention also uses an atomization drying method at an inlet temperature of 100-150°C and an outlet temperature of 50-90°C to produce powders, auxiliary substances such as dextran, polyethylene glycol 4000 and sodium lauryl sulfate, among other things, are used to improve the solubility of the active pharmaceutical ingredient for its proper introduction into the body in solutions, or adding it to foods such as juices.
Для ректального введения соединение общей формулы III (JM-20) или его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, физиологически приемлемые пролекарства можно дозировать в виде суппозиториев, пен или ректальных растворов для микроклизм, которые могут содержать смесь активных соединений с основой из нейтрального твердого жира (Witespol 45) или некоторых других подобных сред, подходящих для их составления; сорбитан моноолеат, полисорбат 20, воскэмульгатор, ангидратный коллоидный силикон, мета-бисульфит натрия, эдатат динатрия, метилпарагидроксилбензоат, фосфаты натрия, макрогол 300, глицерин, воду, пропан, изобутен и н-бутан.For rectal administration, a compound of general formula III (JM-20) or its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, physiologically acceptable prodrugs can be dosed as suppositories, foams or rectal microclyster solutions, which can contain a mixture of active compounds with base of neutral solid fat (Witespol 45) or some other similar media suitable for their preparation; sorbitan monooleate, polysorbate 20, wax emulsifier, colloidal silicone anhydrate, sodium meta-bisulfite, disodium edatate, methyl parahydroxyl benzoate, sodium phosphates, macrogol 300, glycerin, water, propane, isobutene and n-butane.
Для жидкого перорального введения соединение общей формулы III (JM-20) или его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, физиологически приемлемые пролекарства можно составлять как сиропы, эликсиры, концентрированные капли или суспензии с фармацевтически приемлемой средой, такой как смесь этанола, глицерина, пропиленгликоля и/или полиэтиленгликоля, помимо прочего, карбоксиметилцеллюлоза или другие загустители; он может содержать краситель, ароматизатор, подсластитель (сукралозу, аспартам, цикламат, стевию) и консервант (парабены, бензоаты). Эти жидкие дозировки можно получать на основе разбавления порошкообразных фармацевтических композиций подходящим разбавителем перед использованием.For liquid oral administration, a compound of general formula III (JM-20) or its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, physiologically acceptable prodrugs can be formulated as syrups, elixirs, concentrated drops or suspensions with a pharmaceutically acceptable vehicle such as a mixture ethanol, glycerin, propylene glycol and/or polyethylene glycol, among other things, carboxymethyl cellulose or other thickeners; it may contain color, flavor, sweetener (sucralose, aspartame, cyclamate, stevia) and preservative (parabens, benzoates). These liquid dosages can be obtained by diluting powdered pharmaceutical compositions with a suitable diluent prior to use.
Для парентерального введения соединение общей формулы III (JM-20) или его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, физиологически приемлемые пролекарства можно составлять в виде растворов для инъекции. Эти растворы могут содержать стабилизирующие, консервирующие и/или буферные ингредиенты.For parenteral administration, the compound of general formula III (JM-20) or its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, physiologically acceptable prodrugs can be formulated as injectable solutions. These solutions may contain stabilizing, preservative and/or buffering ingredients.
Для подкожного введения соединение общей формулы III (JM 20) или его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, физиологически приемлемые пролекарства можно дозировать в виде имплантов при помощи вспомогательных веществ, таких как эластомеры кремния иFor subcutaneous administration, a compound of general formula III (JM 20) or its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, physiologically acceptable prodrugs can be dosed in the form of implants using excipients such as silicon elastomers and
- 8 041342 ангидратный коллоидный силикон, хотя для составления пелетты могут быть использованы другие фармацевтические полимеры.- 8 041342 anhydrate colloidal silicone, although other pharmaceutical polymers can be used to formulate the pellet.
Для трансдермального введения соединение общей формулы III (JM 20) или его соли, гидраты, кристаллические формы, энантиомеры, изомеры, метаболиты, физиологически приемлемые пролекарства можно составлять в виде пластырей; в этом случае активный фармацевтический ингредиент содержится в подложке из акрилового полимера, этанол, легкий жидкий парафин, изопропилпальмитат, полиэтилентерефталат, этиленвинилацетат раствор и слоя силикона внутри отрывного слоя (с номинальной скоростью высвобождения 15 мг/день, на площади поверхности 12,75 см2).For transdermal administration, the compound of general formula III (JM 20) or its salts, hydrates, crystalline forms, enantiomers, isomers, metabolites, physiologically acceptable prodrugs can be formulated as patches; in this case, the active pharmaceutical ingredient is contained in a support of acrylic polymer, ethanol, light liquid paraffin, isopropyl palmitate, polyethylene terephthalate, ethylene vinyl acetate solution and a layer of silicone inside the peel layer (at a nominal release rate of 15 mg/day, on a surface area of 12.75 cm 2 ) .
Примеры реализацииImplementation examples
Получение соединения IIIPreparation of Compound III
Соединение IIa или IIb, полученное ранее, подвергают реакции с ортофенилендиамином в абсолютном этаноле с получением соединения III (JM-20), которое может быть получено с образованием различных солей, в зависимости от условий и используемых реагентов.Compound IIa or IIb prepared earlier is reacted with o-phenylenediamine in absolute ethanol to give compound III (JM-20), which can be prepared to form various salts, depending on the conditions and reagents used.
Получение соединения III из IIa.Obtaining compound III from IIa.
Для получения соединения III (JM-20) мы начали с этанольного раствора соединения На и добавили эквимолярные количества ортофенилендиамина, в абсолютный этанол в качестве растворителя, с перемешиванием. Эквимолярные количества или большие (1-2 эквивалента) триэтиламина (фиг. 2, способ A) добавляли в реакционную смесь, поддерживали перемешивание или добавляли достаточные количества (1-1,5 эквивалента) гидроксида натрия путем контролируемого капанья и с непрерывным перемешиванием реакционной смеси (фиг. 2, способ B).To prepare compound III (JM-20), we started with an ethanolic solution of compound Ha and added equimolar amounts of orthophenylenediamine, in absolute ethanol as solvent, with stirring. Equimolar amounts or greater (1-2 equivalents) of triethylamine (FIG. 2, method A) were added to the reaction mixture, stirring was maintained, or sufficient amounts (1-1.5 equivalents) of sodium hydroxide were added by controlled dripping and with continuous stirring of the reaction mixture ( Fig. 2, method B).
Получение соединения III из IIb.Obtaining compound III from IIb.
Для получения соединения III (JM-20), мы начали с соединения IIb в этанольном растворе и добавили эквимолярные количества ортофенилендиамина, в абсолютный этанол в качестве растворителя, при перемешивании. Эквимолярные количества или большие (1-2 эквивалента) триэтиламина (фиг. 3, способ A) добавляли в реакционную смесь, поддерживали перемешивание или добавляли достаточные количества (1 - 1,5 эквивалента) гидроксида натрия путем контролируемого капанья и с непрерывным перемешиванием реакционной смеси (фиг. 3, способ B).To prepare compound III (JM-20), we started with compound IIb in ethanol solution and added equimolar amounts of orthophenylenediamine, in absolute ethanol as solvent, with stirring. Equimolar amounts or greater (1-2 equivalents) of triethylamine (FIG. 3, method A) were added to the reaction mixture, stirring was maintained, or sufficient amounts (1-1.5 equivalents) of sodium hydroxide were added by controlled dripping and with continuous stirring of the reaction mixture ( Fig. 3, method B).
Структура изомера соединения JM20 показана на чертеже.The structure of the JM20 compound isomer is shown in the drawing.
Получение соединения III в виде галогенгидратных солейObtaining compound III in the form of halide salts
Соответствующие гидрохлоридные или гидробромидные соли III (галогенгидраты JM-20) получали из IIa или IIb, соответственно, с или без использования катализатора. Когда соответствующую водородную кислоту добавляли в подходящих каталитических количествах (5-25 мол.%), происходил каталитический процесс, который снижал время реакции и несколько снижал выход реакции (фиг. 4).The corresponding hydrochloride or hydrobromide salts III (JM-20 halohydrates) were prepared from IIa or IIb, respectively, with or without the use of a catalyst. When the appropriate hydrogen acid was added in suitable catalytic amounts (5-25 mole %), a catalytic process occurred which reduced the reaction time and slightly reduced the reaction yield (FIG. 4).
Гидрохлорид JM20 (IIIa) получали надлежащим образом из IIa, и когда подходящие количества HCl добавляли, происходила каталитическая реакция. Соединение JM-20 также может быть получено в виде гидробромида (IIIb) из IIb (фиг. 4), причем характеристики бромида являются лучшей целевой группой, чем хлорид, реакция внутримолекулярного нуклеофильного замещения облегчается, давая быструю и эффективную реакцию с получением JM-20 в виде гидробромида.JM20 hydrochloride (IIIa) was properly prepared from IIa, and when appropriate amounts of HCl were added, a catalytic reaction occurred. Compound JM-20 can also be prepared as hydrobromide (IIIb) from IIb (Fig. 4), with bromide characteristics being a better target group than chloride, the intramolecular nucleophilic substitution reaction is facilitated giving a fast and efficient reaction to give JM-20 in form of hydrobromide.
Получение соединения III в виде фумаратной солиPreparation of compound III as fumarate salt
Фумаратную соль JM-20 (IIIc) получают из гидрохлорида или гидробромида III при добавлении фумарата мононатрия в раствор IIIa или IIIb, с перемешиванием магнитной мешалкой 2-5 часов (фиг. 5) и его последующим осаждением при добавлении этанола в подходящих количествах.JM-20 fumarate salt (IIIc) is prepared from hydrochloride or hydrobromide III by adding monosodium fumarate to a solution of IIIa or IIIb, stirring with a magnetic stirrer for 2-5 hours (Fig. 5) and then precipitating with the addition of ethanol in suitable amounts.
Осадок, соответствующий фумарату IIIc, подходящим образом фильтруют и промывают, очищают и затем помещают в сушилку с регулируемой температурой под пониженным давлением.The precipitate corresponding to the fumarate IIIc is suitably filtered and washed, purified and then placed in a temperature controlled dryer under reduced pressure.
Получение соединения III в виде фосфатной солиPreparation of Compound III as Phosphate Salt
Фосфатную соль JM-20 (IIId) можно получить способом, подобным тому, что описан выше, из IIa или IIb путем добавления эквимолярных количеств фосфорной кислоты в начале реакции или путем добавления фосфорной кислоты в IIIa или IIIb в этанольном растворе с перемешиванием (фиг. 6).JM-20 phosphate salt (IIId) can be prepared in a manner similar to that described above from IIa or IIb by adding equimolar amounts of phosphoric acid at the start of the reaction, or by adding phosphoric acid to IIIa or IIIb in an ethanolic solution with stirring (Fig. 6 ).
Получение соединения III в виде сульфатной солиPreparation of Compound III as Sulfate Salt
Сульфат JM-20 (IIIf) можно получить из IIa или IIb или на основе галогенгидратов IIIa или IIIb, как показано на фиг. 7.JM-20 sulfate (IIIf) can be prepared from IIa or IIb or based on halohydrates IIIa or IIIb as shown in FIG. 7.
- 9 041342- 9 041342
Получение состава в виде таблеткиGetting the composition in the form of a tablet
Каждая 120,00 мг таблетка содержит следующее:______________Each 120.00 mg tablet contains the following:______________
*Испаряется в процессе сушки*Evaporates during drying
Краткое описание технологического процесса.Brief description of the technological process.
1. Просеять активный компонент, кукурузный крахмал и лактазу через сито 20 меш.1. Sift the active ingredient, corn starch and lactase through a 20 mesh sieve.
2. Взвесить все компоненты состава согласно количествам, установленным в формуле.2. Weigh all the components of the composition according to the quantities specified in the formula.
3. Для раствора агглютинина вылить смесь воды и этилового спирта класса C в металлический контейнер с паровой рубашкой, добавить поливинилпирролидон и встряхивать до полного растворения.3. For the agglutinin solution, pour the mixture of water and class C ethyl alcohol into a steam jacketed metal container, add polyvinylpyrrolidone and shake until completely dissolved.
4. Загрузить в смеситель активный компонент, кукурузный крахмал и лактазу (компоненты внутренней фазы). Смешивать в течение 15 мин.4. Load the mixer with the active ingredient, cornstarch and lactase (internal phase components). Mix for 15 min.
5. Добавить медленно раствор агглютинина при помощи перистальтического насоса, доводя до необходимой степени влажности при помощи воды и этилового спирта класса C (1:1) при необходимости. Размельчить в мельнице на низкой скорости.5. Slowly add the agglutinin solution using a peristaltic pump, adjusting to the required degree of moisture with water and grade C ethyl alcohol (1:1) if necessary. Grind in a mill at low speed.
6. Высушить гранулят в псевдоожиженном слое. Через 10 мин отобрать типичный образец гранулята, дегранулироать и протестировать на его остаточную влажность; указанная влажность должна составлять от 0,8 до 1,2%.6. Dry the granulate in a fluidized bed. After 10 minutes, take a typical sample of the granulate, degranulate and test for its residual moisture; the specified humidity should be between 0.8 and 1.2%.
7. Смешать сухой гранулят со смазывающими веществами в течение 10 мин.7. Mix dry granulate with lubricants for 10 minutes.
8. В высокоскоростной центрифуге спрессовать смесь при помощи плоского, скошенного и бороздчатого штампа с диаметром 6,4 мм (1/4 PBR) с получением таблеток со следующими параметрами:8. In a high-speed centrifuge, compress the mixture using a flat, beveled, and grooved die with a diameter of 6.4 mm (1/4 PBR) to obtain tablets with the following parameters:
масса: 120,0 мг ± 10%;mass: 120.0 mg ± 10%;
высота: 2,6 ± 0,10 мм;height: 2.6 ± 0.10 mm;
твердость: 4,0 ± 1 кг-с;hardness: 4.0 ± 1 kg-s;
хрупкость: менее 1%.brittleness: less than 1%.
- 10 041342- 10 041342
Получение состава для пероральных капельGetting the composition for oral drops
Каждый мл (20 капель) содержит следующее:____________________Each ml (20 drops) contains the following:____________________
Краткое описание технологического процесса.Brief description of the technological process.
1. Измерить pH и проводимость очищенной воды в момент изготовления продукта.1. Measure the pH and conductivity of purified water at the time of product manufacture.
2. Вылить пропиленгликоль в реактор.2. Pour the propylene glycol into the reactor.
3. Растворить сахарин натрия в очищенной воде во вспомогательном резервуаре из нержавеющей стали с соответствующей емкостью.3. Dissolve sodium saccharin in purified water in a stainless steel auxiliary tank with an appropriate capacity.
4. Включить Kollidon 25, всыпая его понемногу, перемешивая в течение по меньшей мере 30 мин, пока он полностью не исчезнет.4. Turn on Kollidon 25 by adding it little by little, stirring for at least 30 minutes, until it is completely gone.
5. Перемешивать и подавать тепло к препарату, поддерживая температуру на уровне 40-50°C в течение 30 мин.5. Stir and apply heat to the preparation, maintaining the temperature at 40-50°C for 30 minutes.
6. Включить активный компонент в результат первого этапа небольшими порциями, поддерживая постоянное перемешивание в течение 30 мин.6. Include the active ingredient in the result of the first stage in small portions, maintaining constant stirring for 30 minutes.
7. Отвести тепло и подождать пока препарат не достигнет комнатной температуры: 30±2°C.7. Remove heat and wait until the preparation reaches room temperature: 30±2°C.
8. Растворить метилпарабен и пропиленгликоль в этиловом спирте класса С в вспомогательном стакане или резервуаре из нержавеющей стали с подходящей емкостью, постоянно перемешивая, пока он полностью не растворится.8. Dissolve the methyl paraben and propylene glycol in grade C ethanol in an auxiliary beaker or stainless steel container with a suitable capacity, stirring constantly until it is completely dissolved.
9. В результаты предыдущего этапа добавить растворимый жидкий клубничный ароматизатор и перемешивать до полной однородности.9. Add soluble liquid strawberry flavor to the results of the previous step and mix until completely homogeneous.
10. Включить результаты предыдущего этапа медленно в реакторную емкость, постоянно и сильно ее перемешивая.10. Incorporate the results of the previous step slowly into the reactor vessel, stirring it constantly and vigorously.
11. Растворить лимонную кислоту и дегидратированный цитрат натрия в стакане или резервуаре из нержавеющей стали, с подходящей емкостью, перемешивая его после каждого добавления до полного растворения.11. Dissolve the citric acid and dehydrated sodium citrate in a beaker or stainless steel container, with a suitable capacity, stirring after each addition until completely dissolved.
12. Медленно внести результаты предыдущего этапа в реакторную емкость, постоянно и сильно ее перемешивая.12. Slowly introduce the results of the previous step into the reactor vessel, stirring constantly and vigorously.
13. Растворить понсо S, кислотный красный в очищенной воде в стакане или резервуаре из нержавеющей стали с подходящей емкостью, перемешивания до полного растворения и введение препарата.13. Dissolve Ponceau S, acid red in purified water in a glass or stainless steel container with a suitable capacity, stirring until completely dissolved and injecting the drug.
14. Снять предварительно приготовленный объем с водой. Перемешать до однородности.14. Remove the previously prepared volume with water. Mix until smooth.
15. Протестировать, что pH поддерживается на уровне 4,0-6,0.15. Test that the pH is maintained at 4.0-6.0.
16. Провести окончательное фильтрование; протестировать органолептические характеристики.16. Carry out final filtration; test organoleptic characteristics.
- 11 041342- 11 041342
17. Поместить в бутыль окончательный препарат в бутылки из желтого стекла х 15 мл, с 15,0 ± 1,0 мл раствора, надлежащим образом закрыть крышкой, используя крышки с уменьшителями капель для маслянистых продуктов.17. Place the final formulation in amber glass bottles x 15 ml, with 15.0 ± 1.0 ml of solution into the bottle, cap properly using caps with drop reducers for oily products.
Получение инъекционного составаGetting the injection composition
Каждая колба (2 мл) JM-20 содержит следующее:__________________________________Each vial (2 ml) of JM-20 contains the following: __________________________________
1. Проверить, что реактор полностью сухой после стерилизации; если нет, промыть его дегидратированным спиртом.1. Check that the reactor is completely dry after sterilization; if not, rinse it with dehydrated alcohol.
2. Приготовить раствор 1 н соляной кислоты для регулирования pH.2. Prepare a solution of 1 N hydrochloric acid to adjust the pH.
3. Добавить одну часть Cremofor ELP и дегидратированного спирта в реактор. Смешать при 420 об/мин.3. Add one part of Cremofor ELP and dehydrated alcohol to the reactor. Mix at 420 rpm.
4. Взвесить активный компонент и добавить порции дегидратированного спирта в химический стакан, содержащий его; диспергировать его стеклянной мешалкой и добавит в реактор; повторять эту операцию пока все активные компоненты не будут сметены и весь дегидратированный спирт не будет использован.4. Weigh the active ingredient and add portions of the dehydrated alcohol to the beaker containing it; disperse it with a glass stirrer and add to the reactor; repeat this operation until all active ingredients have been swept away and all dehydrated alcohol has been used up.
5. Поддерживать перемешивание в реакторе в течение 60 мин при 420 об/мин, пока активный компонент полностью не растворится.5. Maintain stirring in the reactor for 60 minutes at 420 rpm until the active component is completely dissolved.
6. Добавить остальной Cremofor ELP, сметая остаток дегидратированным спиртом, перемешивая его в течение 10 мин при 420 об/мин.6. Add the rest of Cremofor ELP, sweeping the residue with dehydrated alcohol, stirring it for 10 minutes at 420 rpm.
7. Определить pH раствора и довести его 1 н соляной кислотой до 5.0-6.0.7. Determine the pH of the solution and bring it with 1 N hydrochloric acid to 5.0-6.0.
8. Добавить объем раствора добавлением дегидратированного спирта. Перемешивать в течение 5 мин при 420 об/мин.8. Add volume of solution by adding dehydrated alcohol. Stir for 5 min at 420 rpm.
9. Взять 10 мл раствора и направить его в лабораторию для контроля процесса (оценки и pH).9. Take 10 ml of the solution and send it to the laboratory for process control (assessments and pH).
10. Проверить правильность установки систем наполнения и азотирования.10. Check the correct installation of the filling and nitriding systems.
11. Провести проверку целостности на фильтре Sartobran P MidiCaps, пористостью (0,45+0,2 мкм) с дегидратированным спиртом.11. Carry out an integrity test on a Sartobran P MidiCaps filter, porosity (0.45+0.2 µm) with dehydrated alcohol.
12. После окончания контроля процесса, поднять давление реактора азотом (0,7-1,0 бар) для выталкивания раствора через картридж фильтра Sartobran P пористостью 0,45+0,2 мкм. Заполнить и запаять колбы, получая дозы 2,2 мл раствора.12. After completing the process control, pressurize the reactor with nitrogen (0.7-1.0 bar) to push the solution through the Sartobran P filter cartridge with a porosity of 0.45+0.2 µm. Fill and seal the flasks, receiving doses of 2.2 ml of the solution.
Исследования памяти на моделях деменцииMemory studies in models of dementia
РеагентыReagents
Все реагенты закупали в Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). JM-20 вводили в достаточных количествах для исследований, предлагаемых лабораторией органического синтеза на факультете химии Г аванского университета.All reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). JM-20 was administered in sufficient quantities for the studies offered by the Laboratory of Organic Synthesis in the Department of Chemistry, University of Havana.
Для различных исследований JM-20 суспендировали в карбоксиметилцеллюлозе (CMC) 0,05% и вводили перорально. Бромид скополамина растворяли в 0,9% солевом растворе и вводили внутрибрюшинно (1 мг/кг, 4 мл/кг веса). Хлорид алюминия растворяли в обычной питьевой воде для экспериментальных субъектов и вводили перорально в 500 мг/кг на дозу, постоянно в течение одного месяца, и в то же время проводили поведенческие исследования. Бета-амилоидные пептиды (25-35) олигомеризовали и делали растворимыми согласно нормам изготовителя и вводили интрацеребровентрикулярными средствами при 100 пмоль в 5 мкл, в правое полушарие головного мозга.For various studies, JM-20 was suspended in carboxymethyl cellulose (CMC) 0.05% and administered orally. Scopolamine bromide was dissolved in 0.9% saline and administered intraperitoneally (1 mg/kg, 4 ml/kg body weight). Aluminum chloride was dissolved in normal drinking water for experimental subjects and administered orally at 500 mg/kg per dose, continuously for one month, and at the same time behavioral studies were performed. Beta-amyloid peptides (25-35) were oligomerized and made soluble according to the manufacturer's guidelines and administered by intracerebroventricular means at 100 pmol in 5 μl, to the right hemisphere of the brain.
Экспериментальные животные. Этические соображенияexperimental animals. Ethical Considerations
In vivo эксперименты, соответствующие модели скополамина и алюминия, использовали крыс линии Wistar (самцов, 230-260 г), в то время как in vivo эксперимерты, соответствующие модели бетаамилоида, использовали мышей линии OF-1 (самцов, 25-30 г). Все животные поступали из Национального центра разведения животных для лабораторных исследований (CENPALAB, Маябеке, Куба) и после их получения их подвергали адаптации к лабораторным условиям в течение 7 дней. Их выдерживали приIn vivo experiments corresponding to the scopolamine and aluminum model used Wistar rats (male, 230-260 g), while in vivo experiments corresponding to the beta-amyloid model used OF-1 mice (male, 25-30 g). All animals came from the National Center for Breeding Animals for Laboratory Research (CENPALAB, Mayabeque, Cuba) and after receiving them were subjected to adaptation to laboratory conditions for 7 days. They were kept at
- 12 041342 чередующихся циклах 12 ч света и тьмы, при регулируемой температуре (22±2°C), 45-55% относительной влажности, и им давали воду и пищу свободно по требованию. Все поведенческие исследования проводили от 09:00 до 17:00 при регулируемых условиях уровней света и шума. Все процедуры с животными, записанные в этом исследовании, проводили согласно критериям, одобренным международным комитетом по обращению с лабораторными животными и согласно национальным нормам, установленным для экспериментов с животными.- 12 041342 alternating cycles of 12 hours of light and dark, at a controlled temperature (22±2°C), 45-55% relative humidity, and they were given water and food freely on demand. All behavioral studies were performed from 09:00 to 17:00 under controlled conditions of light and noise levels. All animal procedures recorded in this study were performed according to criteria approved by the International Committee for the Treatment of Laboratory Animals and according to national guidelines for animal experiments.
Схема экспериментаExperiment scheme
Протокол 1. Оценка влияния JM-20 на потерю памяти, вызванную скополамином.Protocol 1. Evaluation of the effect of JM-20 on scopolamine-induced memory loss.
Нами было оценено протекторное действие трех доз JM-20 (2, 4 и 8 мг/кг) на процессы приобретения и закрепления краткосрочной и долгосрочной памяти, на которую влияли острое внутрибрюшинное введение скополамина. Для этой цели JM-20 вводили перед воздействием или процесс приобретения и закрепления памяти, как краткосрочной, так и долгосрочной памяти, в четырех независимых тестах.We evaluated the protective effect of three doses of JM-20 (2, 4 and 8 mg/kg) on the acquisition and consolidation of short-term and long-term memory, which was affected by acute intraperitoneal administration of scopolamine. For this purpose, JM-20 was administered pre-exposure or memory acquisition and retention, both short-term and long-term memory, in four independent tests.
В каждом тесте образовывали 6 экспериментальных групп субъектов, выбранных произвольно (n=10, на группу): здоровая контрольная группа (CMC и солевой раствор); JM-20 группа без повреждения (JM-20 8 мг/кг); группа скополамина (CMC и скополамин 1 мг/кг); группы JM-20-скополамин (JM-20 2 мг/кг и скополамин 1 мг/кг), (JM-20 4 мг/кг и скополамин 1 мг/кг) и (JM-20 8 мг/кг и скополамин 1 мг/кг).In each test formed 6 experimental groups of subjects selected at random (n=10, per group): healthy control group (CMC and saline); JM-20 group without damage (JM-20 8 mg/kg); the scopolamine group (CMC and scopolamine 1 mg/kg); groups JM-20-scopolamine (JM-20 2 mg/kg and scopolamine 1 mg/kg), (JM-20 4 mg/kg and scopolamine 1 mg/kg) and (JM-20 8 mg/kg and scopolamine 1 mg /kg).
Влияние на память оценивали тестом распознавания новых объектов и тестом с принудительным чередованием с лабиринтом, используя схемы эксперимента, подходящие для независимого исследования процесса приобретения и закрепления краткосрочной и долгосрочной памяти.The effect on memory was assessed by the novel object recognition test and the forced alternation maze test using experimental designs suitable for independent investigation of the acquisition and retention of short-term and long-term memory.
В конце поведенческих исследований нами были проведены различные in vivo исследования мозговой ткани. Нами было изучено влияние JM-20 на различные маркеры окислительного стресса, митохондриальную функцию, уровни активности фермента ацетилхолинэстеразы AchE и гистологические параметры нейронной и аксонной жизнеспособности в областях мозга, сильно вовлеченных в процессы запоминания и обучения.At the end of the behavioral studies, we performed various in vivo studies of brain tissue. We studied the effect of JM-20 on various markers of oxidative stress, mitochondrial function, levels of AchE acetylcholinesterase enzyme activity, and histological parameters of neuronal and axonal viability in brain regions strongly involved in memory and learning processes.
Протокол 2. Оценка влияния JM-20 на потерю памяти, вызванную хлоридом алюминия.Protocol 2. Evaluation of the effect of JM-20 on memory loss caused by aluminum chloride.
Нами было оценено протекторное действие двух доз JM-20 (2 и 8 мг/кг) на различные типы памяти, на которую влияли острым внутрибрюшинным введением скополамина. Для этой цели JM-20 вводили с 15 дня после начала введения хлорида алюминия (500 мг/кг) до конца поведенческих исследований. Нами было оценено влияние JM-20 и хлорида алюминия на три типа памяти: пространственную память по тесту водного лабиринта Морриса и тесту в T-образном лабиринте; распознавание нового путем теста распознавания новых объектов; и эмоционально-ассоциативную память путем теста на пассивное избегание.We evaluated the protective effect of two doses of JM-20 (2 and 8 mg/kg) on various types of memory, which was affected by acute intraperitoneal administration of scopolamine. For this purpose, JM-20 was administered from day 15 after the start of aluminum chloride administration (500 mg/kg) until the end of the behavioral studies. We evaluated the effect of JM-20 and aluminum chloride on three types of memory: spatial memory in the Morris water maze test and the T-maze test; recognition of the new by the test of recognition of new objects; and emotional-associative memory through a passive avoidance test.
Было сформировано 5 экспериментальных групп из произвольно выбранных субъектов (n=10, на группу): здоровая контрольная группа (CMC и вода); группа JM-20- без повреждения (JM-20 8 мг/кг и вода); группа алюминия (CMC и хлорид алюминия 500 мг/кг); группы JM-20-алюминий (JM-20 2 мг/кг и алюминий 500 мг/кг) и (JM-20 8мг/кг и алюминий 500 мг/кг).5 experimental groups were formed from randomly selected subjects (n=10, per group): healthy control group (CMC and water); group JM-20- no damage (JM-20 8 mg/kg and water); aluminum group (CMC and aluminum chloride 500 mg/kg); groups JM-20-aluminum (JM-20 2 mg/kg and aluminum 500 mg/kg) and (JM-20 8 mg/kg and aluminum 500 mg/kg).
В конце поведенческих исследований нами были проведены различные in vivo исследования мозговой ткани. Нами было изучено влияние JM-20 на различные маркеры окислительного стресса, митохондриальную функцию и уровни активности фермента ацетилхолинэстеразы AchE.At the end of the behavioral studies, we performed various in vivo studies of brain tissue. We studied the effect of JM-20 on various markers of oxidative stress, mitochondrial function, and activity levels of the AchE acetylcholinesterase enzyme.
Протокол 3. Оценка влияния JM-20 на повреждение, вызванное олигомерами пептида бетаамилоида 25-35Protocol 3. Evaluation of the effect of JM-20 on damage caused by beta-amyloid 25-35 peptide oligomers
Изначально нами было оценено влияние JM-20 на жизнеспособность клеток линии клеток PC12, подвергнутых действию 1 мкМ концентрации олигомеров пептида бета-амилоида 25-35. В этом in vitro тесте оценивали влияние 3 концентраций JM-20 (3,125, 6,25 и 12,5 мкМ), растворенного в диметилсульфоксиде (DMSO). Сформировали 6 экспериментальных групп: группа необработанного контроля (NT); группа среды (DMSO); группа бета-амилоида (AP 1 мкМ); группы JM-20-бета-амилоида (JM-20 3,125+AP 1 мкМ), (JM-20 6,25+Ap 1 мкМ) и (JM-20 12,5+AP 1 мкМ).Initially, we evaluated the effect of JM-20 on the viability of PC12 cells exposed to 1 μM concentration of beta-amyloid peptide 25-35 oligomers. This in vitro test evaluated the effect of 3 concentrations of JM-20 (3.125, 6.25 and 12.5 μM) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO). Formed 6 experimental groups: the group of untreated control (NT); environment group (DMSO); amyloid beta group (AP 1 μM); JM-20-beta-amyloid groups (JM-20 3.125+AP 1 µM), (JM-20 6.25+Ap 1 µM) and (JM-20 12.5+AP 1 µM).
Затем проводили in vivo исследования на мышах линии OF-1. Нами было оценено влияние JM-20 на потерю памяти, вызванную олигомерами бета-амилоида, вводимого через 7 дней после интрацеребровентрикулярного введения AP (100 пмль) в течение 10 дней, перорально в 10 и 30 мг/кг дозах. Нами было сформировано 5 экспериментальных групп: группа здорового контроля (холостой); группа JM-20 без повреждения (холостой+JM-20 30 мг/кг); группа бета-амилоида (AP 100 пмоль+CMC); группы JM-20бета-амилоида (JM-20 1 O мг/кг+AP 100 пмоль) и (JM-20 30 мг/кг+AP 100 пмоль).Then, in vivo studies were carried out on mice of the OF-1 line. We evaluated the effect of JM-20 on memory loss caused by beta-amyloid oligomers administered 7 days after intracerebroventricular administration of AP (100 pml) for 10 days, orally at 10 and 30 mg/kg doses. We formed 5 experimental groups: healthy control group (blank); group JM-20 without damage (blank + JM-20 30 mg/kg); amyloid beta group (AP 100 pmol+CMC); groups JM-20 beta-amyloid (JM-20 1 O mg/kg+AP 100 pmol) and (JM-20 30 mg/kg+AP 100 pmol).
Поведенческие исследования Y-лабиринт. Спонтанное чередованиеBehavioral research Y-maze. Spontaneous alternation
Влияние JM-20 на пространственную память оценивали при помощи теста в Y-образном лабиринте с принудительным чередованием (20). Лабиринт строили из пластмассы с тремя рукавами (55x20x20 см) под углом 120° на центральной платформе.The effect of JM-20 on spatial memory was assessed using a forced alternation Y-maze test (20). The labyrinth was built of plastic with three arms (55x20x20 cm) at an angle of 120° on a central platform.
Тест проводили в две сессии. На первом этапе обучения мы проводили тренировочную фазу, в ходе которой каждую крысу помещали на центральную платформу и позволяли свободно исследовать рукава (A и C) лабиринта в течение 10 мин, в то время как третий рукав (B) был закрыт. Входы в каждый рукав считались входами в четыре концевые точки внутри любого рукава. Последовательность входов в рукаваThe test was carried out in two sessions. In the first stage of training, we conducted a training phase during which each rat was placed on the central platform and allowed to freely explore the arms (A and C) of the maze for 10 min, while the third arm (B) was closed. The entrances to each arm were considered to be the entrances to the four endpoints within any arm. Sleeve Entry Sequence
- 13 041342 в течение 10 мин записывалась на видео для более позднего анализа. Этап оценки заключался в том, чтобы позволить крысам свободно исследовать рукава Y-лабиринта в течение 5 мин, включая тот, который был ранее закрыт. Последовательность входов в рукава записывали в течение 5 мин для последующего анализа. Этот тест оценивал число входов в новый рукав (B), где процент входов в этот рукав был прямо пропорциональным лучшей памяти у исследуемых животных. Процент правильных входов в рукав B рассчитывали на основе пропорции чередований, проводимых из всех возможных чередований, как показано в следующем уравнении: % правильных входов = (число входов в B)/(общее число входов в три рукава)х100. После каждого теста лабиринт очищали 40% раствором этанола для снижения существования обонятельных меток.- 13 041342 was videotaped for 10 minutes for later analysis. The evaluation step was to allow the rats to freely explore the arms of the Y-maze for 5 min, including the one that was previously closed. The sequence of entries into the sleeves was recorded for 5 min for subsequent analysis. This test assessed the number of entries in the new arm (B), where the percentage of entries in this arm was directly proportional to the best memory in the studied animals. The percentage of correct entries in arm B was calculated based on the proportion of alternations drawn from all possible alternations, as shown in the following equation: % correct entries = (number of entries in B)/(total number of entries in three arms)x100. After each test, the maze was cleaned with a 40% ethanol solution to reduce the existence of olfactory marks.
Распознавание объектаObject recognition
Влияние JM-20 на память при распознавании новых объектов оценивали тестом на распознавание объекта. Этот тест проводили на открытом поле 2 последовательных дня. В первый день животные приспосабливались к полю, им позволяли исследовать бокс в течение 3 мин, в двух секциях. Во второй день тренировку проводили с оценкой обучения на 2 этапах по 5 мин каждый, затем рассматривались как тренировка (E) и фаза тестирования (P) соответственно. Во время стадии E крысам были представлены 2 идентичных объекта, называемых знакомыми (F) объектами. Через 30 мин началась стадия P, и крыс подвергали воздействию знакомого объекта F и нового объекта (N). Тесты записывали для анализа исследования объектов, определяемых временем исследования, проведенного каждым животным для каждого объекта. Скорости распознавания между объектами F и N вычислялись как ID=(N-F)/(N+F).The effect of JM-20 on memory in novel object recognition was assessed by an object recognition test. This test was performed in an open field for 2 consecutive days. On the first day, the animals adapted to the field, they were allowed to explore the box for 3 min, in two sections. On the second day, training was performed with learning evaluation in 2 stages of 5 min each, then considered as training (E) and testing phase (P), respectively. During stage E, rats were presented with 2 identical objects, referred to as familiar (F) objects. After 30 minutes, the P stage began and the rats were exposed to the familiar object F and the new object (N). The tests were recorded for the analysis of the study of objects, determined by the time of the study conducted by each animal for each object. The recognition rates between objects F and N were calculated as ID=(N-F)/(N+F).
Водный лабиринт МоррисаMorris water maze
Тест в водном лабиринте Морриса проводили, как описано в Vorhees у Williams (21) с несколькими модификациями, в круглом резервуаре (1,52 м в диаметре, 0,60 м в глубину). Проводили 5 дней обучения, по 4 секции в день и на 6-й день оценивали обучение. Животные должны были научиться находить погруженную платформу, закрепленную в неизменном положении, во всех секциях тренировки. Несколько внешних ключей помещали и сохраняли в фиксированном положении во время всего эксперимента. На каждой тренировочной сессии животных помещали в воду, мордой к стенке резервуара, на одном из 4 мест выхода, пока они не находили платформу в течение максимального времени 1 мин. В день оценки платформу удаляли. Нами количественно была определена задержка побега (время, потраченное животным на нахождение платформы) в учебных испытаниях, время, в течение которого животное оставалось в квадранте платформы во время теста для оценки обучения и расстояния до тех пор, пока не было найдено место платформы.The Morris water maze test was performed as described by Vorhees in Williams (21) with several modifications, in a circular tank (1.52 m in diameter, 0.60 m in depth). We spent 5 days of training, 4 sections per day, and on the 6th day training was evaluated. Animals had to learn to find a submerged platform, fixed in a fixed position, in all sections of the training. Several external keys were placed and kept in a fixed position during the entire experiment. At each training session, the animals were placed in the water, face to the tank wall, at one of the 4 exit sites until they found the platform for a maximum time of 1 min. On the day of evaluation, the platform was removed. We quantified the escape delay (time taken by the animal to find the platform) in the training trials, the time the animal remained in the platform quadrant during the learning test, and the distance until the platform site was found.
Пассивное избеганиеPassive Avoidance
Тест на пассивное избегание проводился на основе методологии, описанной Kohara и сотрудниками (22), с некоторыми изменениями. Мы использовали оборудование для пассивного уклонения (UGO Basile), состоящее из 2 камер, которые были освещены (30x30x30 см) и находились в темноте (10x20x12 см), соединенные дверью доступа в виде гильотины. Темная камера была оборудована электрической цепью.The passive avoidance test was performed based on the methodology described by Kohara et al (22), with some modifications. We used passive evasion equipment (UGO Basile) consisting of 2 chambers that were lit (30x30x30cm) and dark (10x20x12cm) connected by a guillotine access door. The dark chamber was equipped with an electrical circuit.
Тест проводился в 2 этапа в течение 2 последовательных дней. В первый день каждую крысу помещали в освещенную камеру на 10 с, затем дверь между камерами открывали и крысе позволяли свободно перемещаться в течение максимального времени 90 с. Как только крыса вошла в темную камеру, дверца доступа была закрыта, и крыса получила электрический заряд 1 мА в течение 5 с.The test was conducted in 2 stages for 2 consecutive days. On the first day, each rat was placed in a lighted chamber for 10 s, then the door between the chambers was opened and the rat was allowed to move freely for a maximum time of 90 s. Once the rat entered the dark chamber, the access door was closed and the rat received an electrical charge of 1 mA for 5 s.
Во второй день латентность входа в темную камеру измерялась в течение максимального времени 300 с.On the second day, the dark chamber entry latency was measured for a maximum time of 300 s.
Изучение митохондриальной функции. Выделение церебральных митохондрийStudy of mitochondrial function. Isolation of cerebral mitochondria
Митохондрии выделяли дифференциальной центрифугой. Животных умерщвляли обезглавливанием и их мозг немедленно удаляли, нарезали в 50 мл изолирующего буфера, содержащего сахарозу 75 ммоль/л, EGTA 1 ммоль/л, маннит 225 ммоль/л, BSA 0,1% и HEPES-KOH 10 ммоль/л, pH 7,2, 4°C и гомогенизировали в Potter-Elvehjen. Полученную таким образом суспензию центрифугировали при 2000 g в течение 3 мин и плавающее вещество центрифугировали при 12000 g в течение 8 мин. Осадок повторно суспендировали в 10 мл изолирующего буфера, также содержащего 20 мкл дигитонина при 10%, и его центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин. Митохондриальный осадок суспендировали в изолирующем буфере без EGTA и его центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин, плавающее вещество удаляли и его осторожно промывали изолирующим буфером без EGTA. Метод микроуровня использовался для определения концентрации белков с использованием альбуминов бычьей сыворотки в стандартной схеме (Mirandola et al., 2010).Mitochondria were isolated with a differential centrifuge. Animals were sacrificed by decapitation and their brains were immediately removed, cut into 50 ml isolation buffer containing sucrose 75 mmol/l, EGTA 1 mmol/l, mannitol 225 mmol/l, BSA 0.1% and HEPES-KOH 10 mmol/l, pH 7.2, 4°C and homogenized in Potter-Elvehjen. The suspension thus obtained was centrifuged at 2000 g for 3 minutes and the floating substance was centrifuged at 12000 g for 8 minutes. The pellet was resuspended in 10 ml of isolation buffer, also containing 20 µl of digitonin at 10%, and centrifuged at 12,000 g for 10 minutes. The mitochondrial pellet was suspended in isolation buffer without EGTA and centrifuged at 12,000 g for 10 min, the floating material was removed and washed gently with isolation buffer without EGTA. The microlevel method was used to determine the concentration of proteins using bovine serum albumin in a standard scheme (Mirandola et al., 2010).
Митохондрии инкубировали в среде KCl 130 ммоль/л, MgCl2 1 ммоль/л и HEPES-KOH, фосфат 2 ммоль/л, pH 7,4. Митохондрии (1 мг белка/мл) активировали 5 ммоль/л ротенона и 2,5 мкмоль/л сукцината калия.Mitochondria were incubated in KCl 130 mmol/l, MgCl 2 1 mmol/l and HEPES-KOH, phosphate 2 mmol/l, pH 7.4. Mitochondria (1 mg protein/ml) were activated with 5 mmol/l rotenone and 2.5 µmol/l potassium succinate.
Митохондриальный мембранный потенциалMitochondrial membrane potential
Потенциал митохондриалы-юй мембраны определяли с использованием флуоресцентного спектрофотометра POLARstar Omega (Германия) и использовали флуоресцентный маркер сафранина O (10 мкМ) в флуоресцентном спектрофотометре POLARstar Omega (Германия) при 495/586 нм (возбуждеThe mitochondrial membrane potential was determined using a POLARstar Omega fluorescent spectrophotometer (Germany) and the safranin O fluorescent marker (10 µM) was used in a POLARstar Omega fluorescent spectrophotometer (Germany) at 495/586 nm (excitation
- 14 041342 ние/эмиссия).- 14 041342 ni / issue).
Набухание митохондрийSwelling of mitochondria
Набухание митохондрий контролировалась уменьшением видимого поглощения при 540 нм суспензии митохондрий, инкубированных в стандартной среде, в присутствии Ca2+200 мкмоль/л и с использованием флуоресцентного спектрофотометра POLARstar Omega (Германия).Mitochondrial swelling was controlled by a decrease in apparent absorption at 540 nm of a suspension of mitochondria incubated in a standard medium in the presence of Ca2+200 µmol/L and using a POLARstar Omega fluorescent spectrophotometer (Germany).
Получение реактивных частиц кислородаProduction of reactive oxygen species
Реактивные частицы кислорода (ROS) определяли с помощью спектрофлуорометрии с использованием Amplex red (Molecular Probes, Орегон, Юджин) в качестве флуоресцентного маркера и 1 мкл/мл пероксидазы хрена при 563/587 нм (возбуждение/эмиссия).Reactive oxygen species (ROS) was determined by spectrofluorometry using Amplex red (Molecular Probes, Oregon, Eugene) as a fluorescent marker and 1 μl/ml horseradish peroxidase at 563/587 nm (excitation/emission).
Подготовка мозговой ткани для тестов на фермент и окислительно-восстановительное состояниеPreparing Brain Tissue for Enzyme and Redox Tests
Крыс умерщвляли обезглавливанием; их головной мозг удаляли и быстро разрезали, чтобы отделить 2 области, гиппокамп и префронтальную кору головного мозга обоих полушарий (23). Эти области гомогенизировали в буферном растворе фосфата натрия (0,1 мМ, pH 7,4: NaCl 0,13 М, KCl 0,0027 М, KH2PO4 136,04 М, Na2HPO4 0,0016 М) в пропорции 1:10 (p:v) и их центрифугировали при 6000 g в течение 20 мин в центрифуге Эппендорфа (Германия, 5424R). Соотношения гомогената мозговых структур сохраняли при -80°C до тех пор, пока их не использованы. Их концентрацию белка определяли методом Лоури (24) в POLARstar Omega (Германия), используя эталон из альбумина бычьей сыворотки.Rats were sacrificed by decapitation; their brains were removed and quickly dissected to separate 2 areas, the hippocampus and the prefrontal cortex of both hemispheres (23). These areas were homogenized in sodium phosphate buffer (0.1 mM, pH 7.4: NaCl 0.13 M, KCl 0.0027 M, KH2PO4 136.04 M, Na 2 HPO 4 0.0016 M) in a ratio of 1: 10 (p:v) and centrifuged at 6000 g for 20 min in an Eppendorf centrifuge (Germany, 5424R). The brain homogenate ratios were kept at -80° C. until they were used up. Their protein concentration was determined by the Lowry method (24) at POLARstar Omega (Germany) using a standard of bovine serum albumin.
Активность ацетилхолинэстеразы (AChE)Acetylcholinesterase (AChE) activity
Активность фермента AChE, присутствующего в гомогенате экстрагированного гиппокампа и префронтальных коры, измеряли спектрофотометрически с использованием метода, описанного Ellman (25) с небольшими изменениями (26). Испытание проводилось на 96-луночном планшете с конечным объемом 200 мкл. Реакционная среда содержала 140 мкл реагента Эллмана, 50 мкл гомогената и 10 мкл 20 мМ раствора йодата ацетилтиокола (AcSCh), и ее инкубировали в течение 1 мин при 37°C. Поглощение считывали при 405 нм в течение 20 мин с интервалом в 1 мин в спектрофотометре POLARstar Omega (Германия). Ферментативную активность рассчитывали и выражали в виде мкмоль гидролизованного (AcSCh) в течение 1 мин на мг белка.The activity of the AChE enzyme present in the extracted hippocampal and prefrontal cortex homogenate was measured spectrophotometrically using the method described by Ellman (25) with minor modifications (26). The test was carried out on a 96-well plate with a final volume of 200 μl. The reaction medium contained 140 μl of Ellman's reagent, 50 μl of homogenate and 10 μl of 20 mM acetylthiocol iodate (AcSCh) solution and was incubated for 1 min at 37°C. Absorbance was read at 405 nm for 20 min with an interval of 1 min in a POLARstar Omega spectrophotometer (Germany). Enzymatic activity was calculated and expressed as µmol hydrolyzed (AcSCh) for 1 min per mg of protein.
Изучение параметров окислительно-восстановительного состояния и окислительного поврежденияStudying the parameters of the redox state and oxidative damage
Активность супероксиддизмутазы (SOD).Superoxide dismutase (SOD) activity.
Активность фермента SOD определяли с использованием метода окисления пирогаллола (27). Смесь реагентов состояла из раствора 2,8 мл Tris 0,2 М - HCl 0,2 М (pH 8,2), 0,05 мл ЭДТА 60 мМ, 0,1 мл гомогената и 0,05 мл раствора пирогаллола 7,37 мМ. Поглощение считывали при 420 нм в течение 1 мин в спектрофотометре POLARstar Omega (Германия). Результаты были выражены как единицы активности фермента на мг белка, учитывая 1 единицу активности фермента как количество фермента, катализирующего превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин.SOD enzyme activity was determined using the pyrogallol oxidation method (27). The reagent mixture consisted of a solution of 2.8 ml Tris 0.2 M - HCl 0.2 M (pH 8.2), 0.05 ml EDTA 60 mM, 0.1 ml homogenate and 0.05 ml solution of pyrogallol 7.37 mm. Absorbance was read at 420 nm for 1 min using a POLARstar Omega spectrophotometer (Germany). The results were expressed as units of enzyme activity per mg of protein, considering 1 unit of enzyme activity as the amount of enzyme catalyzing the conversion of 1 µmol of substrate per 1 minute.
Активность каталазы (CAT).Catalase activity (CAT).
Активность CAT-ферментов определяли на основе разложения перекиси водорода (H2O2) (28). Смесь реагентов состояла из 0,9 мл фосфатного буфера (pH 7,0), 0,1 мл гомогената мозговой ткани и 0,5 мл H2O2 (50 мМ). Поглощение считывали при 240 нм, на 10 и 70 с, в флуоресцентном спектрофотометре POLARstar Omega (Германия). Результаты выражали в мкмоль H2O2, разложившегося за минуту на мг белка.The activity of CAT enzymes was determined based on the decomposition of hydrogen peroxide (H2O2) (28). The reagent mixture consisted of 0.9 ml of phosphate buffer (pH 7.0), 0.1 ml of brain tissue homogenate and 0.5 ml of H 2 O 2 (50 mm). The absorbance was read at 240 nm, for 10 and 70 s, in a POLARstar Omega fluorescent spectrophotometer (Germany). The results were expressed in µmol H 2 O 2 decomposed per minute per mg of protein.
Сниженные уровни глутатиона (GSH).Decreased levels of glutathione (GSH).
Уровни GSH устанавливали, следуя методике, описанной Ellman (29), с некоторыми изменениями.GSH levels were set following the procedure described by Ellman (29), with some modifications.
В лоток добавляли 0,375 мл фосфатного буфера (50 мМ, pH 8,0), 0,1 мл гомогената и 0,025 мл раствора 5,5'-дитио-бис-нитробензойной кислоты (OTNB)/αцетона (0,6 мМ). Поглощение считывали при 412 нм в спектрофотометре POLARstar Omega (Германия). Результаты рассчитывали при помощи коэффициента молярной экстинкции полученного хромофора (1,36x104 (моль/л)’1см’1. Результаты выражали как нмоль GSH на мг белка.0.375 ml of phosphate buffer (50 mM, pH 8.0), 0.1 ml of homogenate and 0.025 ml of 5,5'-dithio-bis-nitrobenzoic acid (OTNB)/αcetone (0.6 mM) solution were added to the tray. Absorbance was read at 412 nm using a POLARstar Omega spectrophotometer (Germany). The results were calculated using the molar extinction coefficient of the obtained chromophore (1.36x104 (mol/l)' 1 cm' 1 . The results were expressed as nmol GSH per mg of protein.
Уровни перокисления липидов.Levels of lipid peroxidation.
Уровни перокисления липидов определяли обнаружением малонового диальдегида (MOA), образованного по реакции с тиобарбитуровой кислотой (30). Реагентную среду формировали с помощью 350 мкл смеси трихлоруксусной кислоты: тиобарбитуровой мочевой кислоты: хлоргидрической кислоты, 100 мкл гомогената мозговой ткани и 50 мкл дитербутилгидрокситолуола (BHT). Смесь гомогенизировали в вибросмесителе TALBOYS (США) и помещали в течение 5 мин на водяную баню с термостатом Grant OLS200 (США) при 100°C. Затем его центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге Eppendorf (Германия, 5424R). MOA, образованный как продукт перекисного окисления липидов в мозговой ткани, реагирует с тиобарбитуровой мочевой кислотой и дает окрашенное соединение, которое было определено спектрофотометрией при 535 нм на флуоресцентном спектрофотометре POLARstar Omega (Германия). Концентрацию MOA рассчитывали, принимая во внимание коэффициент молярной экстинкции полученного окрашенного соединения (1,56x105 М-1 см-1) и в зависимости от следующегоLipid peroxidation levels were determined by detection of malondialdehyde (MOA) formed by reaction with thiobarbituric acid (30). The reagent medium was formed with 350 µl of a mixture of trichloroacetic acid:thiobarbituric acid:chlorhydric acid, 100 µl of brain tissue homogenate and 50 µl of diterbutylhydroxytoluene (BHT). The mixture was homogenized in a TALBOYS vibrating mixer (USA) and placed for 5 min in a water bath with a Grant OLS200 thermostat (USA) at 100°C. Then it was centrifuged at 3000 rpm for 10 min in an Eppendorf centrifuge (Germany, 5424R). MOA, formed as a product of lipid peroxidation in the brain tissue, reacts with thiobarbituric uric acid and gives a colored compound, which was determined by spectrophotometry at 535 nm on a POLARstar Omega fluorescent spectrophotometer (Germany). The MOA concentration was calculated taking into account the molar extinction coefficient of the obtained colored compound (1.56x105 M -1 cm -1 ) and depending on the following
- 15 041342 уравнения:- 15 041342 equations:
C=DOx 104 нМC=DOx 10 4 nM
1,56, где C представят собой концентрацию MOA, которую надо определить, a D.O. представляет собой обнаруженное поглощение. Результаты выражали как наномоли MOA на мг белка.1.56 where C is the concentration of MOA to be determined and D.O. represents the detected absorption. The results are expressed as nanomoles MOA per mg of protein.
Гистологическое исследование.Histological examination.
Гистологическая оценка поражений, вызванных острым внутрибрюшинным введением скополамина, проводилась на участках гиппокампа и префронтальной коры головного мозга. Нами был использован Paxinos and Watson Atlas (31) с анатомическим описанием головного мозга крысы, чтобы идентифицировать каждую область головного мозга, и они были обработаны растворами гематоксилина и эозина (HE) в отделах коры толщиной 4 мкм, всегда занимая первые три разреза каждой области. Оба полушария наблюдали в оптическом микроскопе Leica (Microsystems, Германия). Повреждение нейронов оценивали в зонах CA1, CA2, CA3 и зубчатой извилине гиппокампа, и атрофия, ядерный пикноз, темная окраска цитоплазмы или отсутствие нейронов считались маркерами дегенерации. Кроме того, мы рассчитали повреждение аксонов, в частности, исходя из появления частично или полностью демиелинизированных аксонов, атрофии аксона, и выражали его в процентах от общего количества аксонов, присутствующих в каждом микроскопическом препарате или в каждой исследуемой области. Проводя анализ гистологического повреждения на уровне префронтальной коры, мы подсчитали среднее число нейронов и аксонов, пораженных в трех фиксированных областях каждого полушария головного мозга, и выражали его как процент поврежденных нейронов/аксонов по сравнению с общим количеством в каждой области.Histological evaluation of lesions induced by acute intraperitoneal injection of scopolamine was performed in the hippocampus and prefrontal cortex. We used Paxinos and Watson Atlas (31) with an anatomical description of the rat brain to identify each area of the brain, and they were treated with hematoxylin and eosin (HE) solutions in sections of the cortex 4 µm thick, always occupying the first three sections of each area. Both hemispheres were observed with a Leica optical microscope (Microsystems, Germany). Neuronal damage was assessed in zones CA1, CA2, CA3 and the dentate gyrus of the hippocampus, and atrophy, nuclear pycnosis, dark cytoplasmic staining, or absence of neurons were considered markers of degeneration. In addition, we calculated damage to axons, in particular, based on the appearance of partially or completely demyelinated axons, axon atrophy, and expressed it as a percentage of the total number of axons present in each microscopic preparation or in each study area. When analyzing histological damage at the level of the prefrontal cortex, we calculated the average number of neurons and axons affected in three fixed areas of each cerebral hemisphere and expressed it as the percentage of neurons/axons damaged compared to the total number in each area.
Статистический анализ.Statistical analysis.
Для статистической обработки и анализа полученных результатов мы использовали программу GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., США). Данные были выражены как среднее±EEM (стандартная средняя ошибка), и мы проверили его нормальность и гомоскедастичность. Проводился однофакторный вариационный анализ (ANOVA), а затем тест Таки для множественных сравнений для сравнения между различными экспериментальными группами. Значение p<0,05 считалось статистически значимым.For statistical processing and analysis of the obtained results, we used the GraphPad Prism 5.0 program (GraphPad Software Inc., USA). Data were expressed as mean±EEM (standard mean error) and we tested for normality and homoscedasticity. One-way analysis of variance (ANOVA) was performed, followed by Taki's test for multiple comparisons to compare between different experimental groups. A p<0.05 value was considered statistically significant.
Результаты показаны на фиг. 8-13.The results are shown in FIG. 8-13.
Сосудистая деменцияVascular dementia
В качестве модели сосудистой деменции животные (самцы швейцарских мышей-альбиносов) были подвергнуты преходящей окклюзии общих сонных артерий в течение 20 мин, а нарушение когнитивных функций было оценено с помощью теста в водном лабиринте Морриса.As a model of vascular dementia, animals (male Swiss albino mice) were subjected to transient occlusion of the common carotid arteries for 20 min, and cognitive impairment was assessed using the Morris water maze test.
Результаты показаны на фиг. 14.The results are shown in FIG. 14.
Односторонние повреждения компактной части черного вещества при помощи инъекции 6гидроксидопамина.Unilateral damage to the compact part of the substantia nigra by injection of 6hydroxydopamine.
Материалы и способы Экспериментальные животныеMaterials and methods Experimental animals
Использовали взрослых самцов крыс линии Wistar, весом от 200 до 250 граммов в начале эксперимента, поступающих из Национального центра разведения животных для лабораторных исследований (CENPALAB), Гавана, Куба. Животных содержали в Центре исследований и разработки лекарственных средств (CIDEM) в пластиковых просвечивающих ящиках при средней температуре 23°С (22±2°С), с питанием и водоснабжением по желанию и 12-часовыми периодами света и темноты.Used adult male Wistar rats, weighing 200 to 250 grams at the beginning of the experiment, coming from the National Center for Animal Breeding for Laboratory Research (CENPALAB), Havana, Cuba. Animals were housed at the Center for Research and Development of Medicines (CIDEM) in plastic translucent boxes at an average temperature of 23°C (22±2°C), with ad libitum food and water, and 12 hour periods of light and dark.
Этические соображенияEthical Considerations
В этом исследовании соблюдались нормы, установленные в кодексе этики для экспериментов с животными. Мы гарантировали генетическую достоверность животных, приобретая животных в признанных центрах разведения. Эта процедура позволяет избежать использования генетически измененных животных. С биологической точки зрения важность генетического качества исследований заключается в том, что результаты эксперимента могут быть воспроизведены в любом другом месте, где они могут быть повторены, и с этической точки зрения он обеспечивает наименьшее количество животных, которые необходимо использовать.This study complied with the standards set out in the code of ethics for animal experiments. We have guaranteed the genetic integrity of the animals by acquiring animals from recognized breeding centers. This procedure avoids the use of genetically modified animals. From a biological point of view, the importance of the genetic quality of research lies in the fact that the results of the experiment can be reproduced in any other place where they can be repeated, and from an ethical point of view, it ensures the smallest number of animals that need to be used.
Во время исследования животные содержались в лучших условиях проживания. Их выдерживали при температуре 23°С, тем самым, в диапазоне обязательств, установленном для тропических зон (22±2°С). Контроль температуры имеет важное значение, если учесть, что высокие температуры вызывают стресс у животных, а температура более 38°С может привести к их смерти. Периоды света и темноты, которым они подвергались, длились 12 ч, поскольку фотопериодичность непосредственно и/или косвенно регулирует циркадные, биохимические и гормональные ритмы.During the study, the animals were kept in the best living conditions. They were kept at a temperature of 23°C, thus, in the range of obligations established for tropical zones (22±2°C). Temperature control is important given that high temperatures are stressful for animals and temperatures above 38°C can lead to death. The periods of light and darkness to which they were exposed lasted 12 h, since photoperiodicity directly and/or indirectly regulates circadian, biochemical and hormonal rhythms.
Введение соединения.Connection introduction.
JM-20 вводили в 3 различных дозах: 10, 20 и 40 мг/кг, через 24 ч после индуцирования повреждения и ежедневно в течение 7 дней. Соединение получали в карбоксиметилцеллюлозе (CMC) при 0,05%, внутрижелудочно канюлей. Было 5 экспериментальных групп: группа I (среда/солевой раствор с аскорбиновой кислотой, n=6), группа II (животные, на которых действовали 6-OHDA, n=8), группа III (животные,JM-20 was administered at 3 different doses: 10, 20 and 40 mg/kg, 24 hours after injury induction and daily for 7 days. The compound was prepared in carboxymethyl cellulose (CMC) at 0.05%, intragastrically by cannula. There were 5 experimental groups: group I (media/saline with ascorbic acid, n=6), group II (animals treated with 6-OHDA, n=8), group III (animals treated with 6-OHDA, n=8),
- 16 041342 на которых действовали 6-OHDA и которых совместно лечили 10 мг/кг JM-20, n=8), группа IV (животные, на которых действовали 6-OHDA и которых совместно лечили 20 мг/кг JM-20, n=8) и группа V (животные, на которых действовали 6-OHDA которых совместно лечили 40 мг/кг JM-20 n=8). Все поведенческие испытания проводили на 7 день.- 16 041342 treated with 6-OHDA and co-treated with 10 mg/kg JM-20, n=8), group IV (animals treated with 6-OHDA and co-treated with 20 mg/kg JM-20, n =8) and group V (6-OHDA treated animals co-treated with 40mg/kg JM-20 n=8). All behavioral tests were performed on day 7.
Обработка данных.Data processing.
Статистические анализы проводили при помощи пакета GraphPadPrism Version.5.01.2007. Результаты показали, что средняя±SEM процента жизнеспособности по сравнению с клетками необработанного контроля. Во всех случаях вариационный анализ проводили (OneWay ANOVA) с последующим тестом Даннета (GraphPadPrism 5) для определения значимой разницы с уровнем значимости p<0,05 (*), p<0,01 (**) и p<0,001 (***) относительно контроля, используемого в эксперименте. Чтобы сравнить все значения, полученные в эксперименте, с различными контролями и друг относительно друга, мы провели тест Таки (GraphPadPrism 5) с уровнем значимости p <0,05 (*), p <0,01 (**) и p <0,001 (***).Statistical analyzes were performed using the GraphPadPrism Version.5.01.2007 package. The results showed that the mean±SEM percent viability compared to untreated control cells. In all cases, analysis of variance was performed (OneWay ANOVA) followed by Dunnett's test (GraphPadPrism 5) to determine significant difference with significance levels p<0.05 (*), p<0.01 (**) and p<0.001 (** *) relative to the control used in the experiment. To compare all experimental values with different controls and with respect to each other, we performed Takay's test (GraphPadPrism 5) with p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), and p < 0.001 significance levels. (***).
Методы поражения в экспериментальных моделях, предназначенных для крысMethods of defeat in experimental models designed for rats
Односторонние повреждения черной субстанции при помощи инъекции 6-гидроксидопамина у крыс.Unilateral damage to the substantia nigra by 6-hydroxydopamine injection in rats.
Для целей односторонней дофаминергической денервации полосатого тела (правого полушария) крыс анестезировали хлоралгидратом (0,4 г/кг веса, внутрибрюшинно, Merck (Дармштадт, Германия)) и помещали в рамку, предназначенную для стереотаксической хирургии (Stoelting Instruments, США), где им вводили в правую черную субстанцию физиологический раствор нейротоксина 6-OHDA-HBr (8 мкг/3 мкл, также содержащим 0,2 мг/мл аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта) (Pav0n Fuentes, Nancy (2007) Efecto de la inactivacion de los receptores dopaminergicos D2 у de la manipulacion del nύcleo subtalamico sobre la conducta motora en modelos de hemiparkinsonismo en roedores. Doctor en Ciencias de una Especialidad, Universidad de Ciencias Medicas de La Habana). Координаты были рассчитаны с учетом Брегмы как точки отсчета в соответствии с Paxinos and Watson Atlas (Paxinos,G. and Watson,C., The rat brain in stereotaxic coordenates.2nd the Academic Press. New York, 1986), на который ссылаются в таблице.For the purpose of unilateral dopaminergic denervation of the striatum (right hemisphere), rats were anesthetized with chloral hydrate (0.4 g/kg of body weight, ip, Merck (Darmstadt, Germany)) and placed in a frame designed for stereotaxic surgery (Stoelting Instruments, USA), where they the right substantia nigra was injected with a physiological solution of the neurotoxin 6-OHDA-HBr (8 µg/3 µl, also containing 0.2 mg/ml ascorbic acid as an antioxidant) (Pav0n Fuentes, Nancy (2007) Efecto de la inactivacion de los receptores dopaminergicos D2 y de la manipulacion del nύcleo subtalamico sobre la conducta motora en modelos de hemiparkinsonismo en roedores Doctor en Ciencias de una Especialidad, Universidad de Ciencias Medicas de La Habana). The coordinates were calculated with Bregma as the reference point according to the Paxinos and Watson Atlas (Paxinos, G. and Watson, C., The rat brain in stereotaxic coordenates. 2nd the Academic Press. New York, 1986), referenced in the table .
Стереотаксические координаты, выраженные в мм относительно Брегмы ____(за исключением DV ссылаясь на твердую мозговую оболочку/поверхность)Stereotaxic coordinates expressed in mm relative to Bregma ____ (excluding DV referring to the dura/surface)
Когда уместно нейротоксин медленно вводили при скорости потока 1 мкл/мин с помощью шприца Манилтона (3 мкл), оставаясь на месте в течение 5 мин. после завершения инъекции.When appropriate, the neurotoxin was slowly injected at a flow rate of 1 µl/min using a Manilton syringe (3 µl), remaining in place for 5 min. after completion of the injection.
IV. Поведенческие тесты.IV. behavioral tests.
A. Проверка передних конечностей на асимметричность.A. Checking the forelimbs for asymmetry.
В этом тесте крыс помещали внутри прозрачного акрилового цилиндра диаметром 20 см и высотой 30 см, что не позволяло животному достичь края. Цилиндрическая форма способствует врожденному поведению вертикального исследования стены их задними конечностями, когда крысы были помещены в место, которое они не знали. (Chan, H., Paur, H., Vernon, A.C., Zabarsky,V., Datla, K.P.,Croucher, M.J.,Dexter, D.T., 2010. Neuroprotection and functional recovery associated with decreased microglial activation following selective activation of mGluR2/3 receptors in a rodent model of Parkinson's disease. ParkinsonsDis.pii, 190450). После размещения животного количество прикосновений, сделанных животным обеими передними лапами, справа или слева, определяется количественно до 20 прикосновений животного к стене резервуара.In this test, rats were placed inside a transparent acrylic cylinder 20 cm in diameter and 30 cm high, which did not allow the animal to reach the edge. The cylindrical shape contributes to the inherent behavior of vertical wall exploration with their hind limbs when the rats were placed in a place they did not know. (Chan, H., Paur, H., Vernon, A.C., Zabarsky, V., Datla, K.P., Croucher, M.J., Dexter, D.T., 2010. Neuroprotection and functional recovery associated with decreased microglial activation following selective activation of mGluR2/3 receptors in a rodent model of Parkinson's disease ParkinsonsDis.pii, 190450). After placing the animal, the number of touches made by the animal with both front paws, right or left, is quantified up to 20 touches of the animal against the tank wall.
Животные, пораженные 6-OHDA с одной стороны, склонны использовать лапу, которая в меньшей степени подвержена поражению, в нашем случае - левая лапа. Процент асимметрии, представленной каждым животным, определяется количественно следующей формулой (Roof RL, Schielke GP, Ren X, Hall ED (2001) A comparison of long-term functional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats. Stroke 32: 2648-2657).Animals affected by 6-OHDA on one side tend to use the less affected paw, in our case the left paw. The percentage of asymmetry presented by each animal is quantified by the following formula (Roof RL, Schielke GP, Ren X, Hall ED (2001) A comparison of long-term functional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats. Stroke 32: 2648-2657 ).
(% ипсилатеральных прикосновений) - (% прикосновений с другой стороны) = (% асимметрии)(% ipsilateral touches) - (% touches on the other side) = (% asymmetry)
Исследовательская активность.Research activity.
Для оценки вертикальной исследовательской активности животных мы использовали тест на исследовательскую активность; животное помещали в прозрачную клетку из плексигласа, 41x41x33 (h) см,To assess the vertical exploratory activity of animals, we used the exploratory activity test; the animal was placed in a transparent plexiglass cage, 41x41x33 (h) cm,
- 17 041342 (UGO BASILE, каталог MultipleActivityCage №47420. Вывод данных управляется 52050-04 пакетом программного обеспечения для сбора данных (на базе Windows®). Клетка поддерживается на прочном основании из черного плексигласа, который имеет 4 вертикальных стальных стержня со стальными канавками, так что горизонтальные/вертикальные системы обнаружения правильно прикреплены. Датчики представляют собой системы ИК-излучения, способные регистрировать движения животных по формам или, скорее, вертикальные исследования. Данные контролируются на компьютере. Животные помещаются в центр коробки, чтобы они могли исследовать ее. Коробка помещается в комнату, изолированную от исследователя и шума окружающей среды и с низким освещением, на 5 мин. Исследователь принимает количество раз, когда животное вертикально исследует стенки коробки, когда световые лучи датчика в коробке, прерываются (Cools, A. R., R. Brachten, D. Heeren, A. Willemen, and B. Ellenbroek, 1990. Search after neurobiological profile of individual-specific features of Wistar rats. Brain Res. Bull. 24: 49-69). Результаты показаны на фиг. 15.- 17 041342 (UGO BASILE, MultipleActivityCage catalog #47420. Data output is controlled by the 52050-04 Data Acquisition Software Package (Windows® based). The cage is supported on a solid black plexiglass base that has 4 vertical steel bars with steel grooves, so that the horizontal/vertical detection systems are correctly attached.The sensors are IR systems capable of registering the movements of animals in forms or rather vertical examinations.The data is controlled by a computer.Animals are placed in the center of the box so that they can examine it.The box is placed in a room isolated from the researcher and environmental noise and with low lighting for 5 minutes The researcher takes the number of times the animal vertically explores the walls of the box when the light beams of the sensor in the box are interrupted (Cools, A. R., R. Brachten, D. Heeren, A. Willemen, and B. Ellenbroek, 1990. Search after neurobiological pr ofile of individual-specific features of Wistar rats. Brain Res. Bull. 24:49-69). The results are shown in FIG. 15.
Тоническая боль.Tonic pain.
Мы изучали влияние JM-20 (10, 20, 40 мг/кг, перорально) на поведение относительно боли в модели тонической боли (тест с 5% формалина) у крыс. (Dubuisson D, Dennis SG. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine and brain-stem stimulation in rats and cats. Pain 1977;4:161-174).We studied the effect of JM-20 (10, 20, 40 mg/kg, po) on pain behavior in a tonic pain model (5% formalin test) in rats. (Dubuisson D, Dennis SG. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine and brain-stem stimulation in rats and cats. Pain 1977;4:161-174).
Результаты показаны на фиг. 16A, B и 17.The results are shown in FIG. 16A, B and 17.
Невропатическая боль.neuropathic pain.
Мы исследовали эффект JM-20 на модели постоянного стеноза седалищного нерва (CCI), модели NP (Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review. Pain 2012; 153:359-365)We investigated the effect of JM-20 in a permanent sciatic nerve stenosis (CCI), NP model (Bennett MI, Rayment C, Hjermstad M, Aass N, Caraceni A, Kaasa S. Prevalence and aetiology of neuropathic pain in cancer patients: A systematic review Pain 2012;153:359-365)
Результаты показаны на фиг. 18-22.The results are shown in FIG. 18-22.
Вызванный каррагинаном перитонит.Carrageenan-induced peritonitis.
Впоследствии мы разработали различные эксперименты в модели индуцированного CA перитонита у грызунов, чтобы исследовать возможную противовоспалительную активность JM-20 в этих условиях.Subsequently, we designed various experiments in a rodent model of CA-induced peritonitis to investigate the possible anti-inflammatory activity of JM-20 under these conditions.
Результаты показаны на фиг. 23A-E.The results are shown in FIG. 23A-E.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CU2016-0058 | 2016-05-04 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA041342B1 true EA041342B1 (en) | 2022-10-12 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ebrahimi-Fakhari et al. | Protein degradation pathways in Parkinson’s disease: curse or blessing | |
US10004744B2 (en) | Therapeutic approaches for treating Parkinson's disease | |
WO2013120040A1 (en) | Targeted pathway inhibition to improve muscle structure, function and activity in muscular dystrophy | |
CN106456583B (en) | Combinations of baclofen, acamprosate and medium chain triglycerides for the treatment of neurological disorders | |
Ju et al. | Glaucomatous optic neuropathy: Mitochondrial dynamics, dysfunction and protection in retinal ganglion cells | |
JP2019526571A (en) | Dementia treatment | |
Kazim et al. | Early neurotrophic pharmacotherapy rescues developmental delay and Alzheimer’s-like memory deficits in the Ts65Dn mouse model of Down syndrome | |
US10722491B2 (en) | Phenol compound and combination of same with a benzodiazepine fused to 1,4-dihydropyridine for treating diseases of the central nervous and vascular systems | |
AU2017259748B2 (en) | Benzodiazepine derivative with activity on the central nervous and vascular systems | |
JP5317055B2 (en) | Drugs for delaying the onset or progression of movement disorders due to rare sugar amyotrophic lateral sclerosis | |
EA041342B1 (en) | APPLICATION OF A BENZODIAZEPINE-BASED PRODUCT WITH ACTIVITY FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE | |
CN106456606A (en) | Use of indolyl and idolinyl hydroxamates for treating neurodegenerative disorders or cognitive deficits | |
US20230023770A1 (en) | Preparation of Drug for Treating Alzheimer's Disease (AD) | |
EP4247373A1 (en) | Use of pridopidine and analogs for treating rett syndrome | |
EA046099B1 (en) | USE OF A BENZODIAZEPINE-BASED PRODUCT WITH ACTIVITY FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF DEMENTIA | |
CN108601772A (en) | Tacrolimus for treating TDP-43 protein sickness | |
US20150335629A1 (en) | Methods Of Treating Fragile X Syndrome And Related Disorders | |
Rosa | Targeting autophagy as a therapeutic strategy for spinocerebellar ataxia type 2 | |
Emili | Treatment with β-2 adrenergic receptor agonists: a tool for improving brain developmental alterations in Down syndrome? | |
EA044367B1 (en) | BENZODIAZEPINE-BASED PRODUCT WITH ACTIVITY ON NEUROPATHIC PAIN | |
Yaari et al. | Cognitive enhancers and treatments for Alzheimer's disease | |
KR20220107430A (en) | Composition for preventing or treating parkinson's disease comprising evernic acid | |
CN117957003A (en) | Methods of treating neurodegenerative diseases | |
Brito | Pharmacological modulation of mutant ataxin-3 translation and it potential therapeutic effect in Machado Joseph disease | |
Tayebati et al. | Influence of treatment with CDP-choline or choline alphoscerate on brain dopamine and acetylcholine transporters |