EA041126B1 - ANTIBODIES AND POLYPEPTIDES AGAINST CD127 - Google Patents

Description

Изобретение относится к области полипептидов или антител, подходящих для терапевтического и диагностического применения, нацеленных на CD127, альфа-цепь рецептора IL7, и обеспечивает, в частности, гуманизированные моноклональные антитела против CD127, в частности CD127 человека, их терапевтическое и диагностическое применение.The invention relates to the field of polypeptides or antibodies suitable for therapeutic and diagnostic use, targeting CD127, the alpha chain of the IL7 receptor, and provides, in particular, humanized monoclonal antibodies against CD127, in particular human CD127, their therapeutic and diagnostic use.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Альфа-цепь (или субъединица) рецептора интерлейкина-7 (IL-7) обозначается как CD127 или р90 IL-7R или IL-7Ra или IL-7Ra (иногда также обозначается IL-7Ra). В конкретном аспекте изобретения антитела, в частности моноклональные антитела, предложенные в настоящем документе, направлены против альфа-цепи рецептора человеческого IL-7, экспрессируемого на клетках человека. В конкретном аспекте изобретения антитела, предложенные в настоящем документе, обладают антагонистическими свойствами для взаимодействия IL-7-IL-7R, способны проявлять цитотоксическую активность в отношении CD127-положительных клеток, но не увеличивают созревание дендритных клеток (DC), индуцированное TSLP. В частности, антитела, предложенные в настоящем документе, распознают человеческий эпитоп CD127, содержащий последовательности из сайта 2b в CD127, в частности этот эпитоп содержит человеческие последовательности CD127 домена D1 и сайта 2b CD127, в частности этот эпитоп содержит по меньшей мере одну последовательность из D1 и по меньшей мере одну последовательность из сайта 2b, предпочтительно из третьего бета-слоя сайта 2b в CD127. В дополнение или в качестве альтернативы, в конкретном аспекте изобретения, антитела, предложенные в настоящем документе, не индуцируют интернализацию CD127 и/или ингибируют индуцированную IL7 интернализацию CD127. В конкретном аспекте изобретения антитела, предложенные в настоящем документе, являются гуманизированными и содержат по меньшей мере 80% и предпочтительно по меньшей мере 84% или по меньшей мере 85% человеческих остатков. В конкретном аспекте изобретения антитела, предложенные в настоящем документе, оказывают быстрое воздействие на эффекторные Т-клетки памяти, длительное действие на эффекторные Т-клетки памяти или, предпочтительно, быстрое и длительное действие на эффекторные Т-клетки памяти. В конкретном аспекте изобретения антитела, предложенные в настоящем документе, позволяют их эффективное продуцирование. В конкретном аспекте изобретения для оценки вероятности ответа могут быть измерены уровни экспрессии CD127, IL-7 и/или TSLP, в частности, с использованием антител против CD127, предложенных в настоящем документе. В дополнение к антителам, предложенным в настоящем документе, в частности, в качестве средств для получения антител и/или для применений, подобных указанным антителам, предложены полипептиды, в частности вариабельные домены легкой цепи антитела или легкие цепи антитела, антигенсвязывающие фрагменты и молекулы-миметики таких антител и полинуклеотидов.The alpha chain (or subunit) of the interleukin-7 (IL-7) receptor is referred to as CD127 or p90 IL-7R or IL-7Ra or IL-7Ra (sometimes also referred to as IL-7Ra). In a specific aspect of the invention, the antibodies, in particular the monoclonal antibodies provided herein, are directed against the alpha chain of the human IL-7 receptor expressed on human cells. In a specific aspect of the invention, the antibodies provided herein have IL-7-IL-7R interaction antagonistic properties, are capable of exhibiting cytotoxic activity against CD127 positive cells, but do not increase TSLP-induced dendritic cell (DC) maturation. In particular, the antibodies provided herein recognize a human CD127 epitope containing sequences from site 2b in CD127, in particular this epitope contains human CD127 sequences of the D1 domain and site 2b of CD127, in particular this epitope contains at least one sequence from D1 and at least one sequence from site 2b, preferably from the third beta layer of site 2b in CD127. In addition or alternatively, in a particular aspect of the invention, the antibodies provided herein do not induce CD127 internalization and/or inhibit IL7-induced CD127 internalization. In a specific aspect of the invention, the antibodies provided herein are humanized and contain at least 80% and preferably at least 84% or at least 85% human residues. In a specific aspect of the invention, the antibodies provided herein have a rapid effect on effector memory T cells, a long-term effect on effector memory T cells, or, preferably, a fast and long-term effect on effector memory T cells. In a specific aspect of the invention, the antibodies provided herein allow their efficient production. In a specific aspect of the invention, expression levels of CD127, IL-7 and/or TSLP can be measured to assess the likelihood of a response, in particular using the anti-CD127 antibodies provided herein. In addition to the antibodies provided herein, in particular as vehicles for making antibodies and/or for applications similar to said antibodies, polypeptides are provided, in particular antibody light chain variable domains or antibody light chains, antigen-binding fragments and mimetic molecules. such antibodies and polynucleotides.

Авторы настоящего изобретения стремились получить усовершенствованные гуманизированные антитела по сравнению с антителами N13В2-h1, N13B2-h2 и N13B2-h3, раскрытыми в WO 2015/189302. Хотя известно, что некоторые остатки в каркасных последовательностях вариабельных доменов, включая остатки в зоне Вернье, канонические остатки, остатки на границе VH/VL и т.д., являются критическими в структуре антитела и не подлежат мутации для сохранения биохимической и биологической активности антитела, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые мутации в каркасной последовательности вариабельного домена легкой цепи N13B2, включая некоторые из таких критических остатков, позволяют увеличивать содержание остатков человека (выше чем N13B2-h3 и вплоть до 86,3%) и повысить продуцирование (до 4 раз выше, чем у N13B2-h3) при сохранении всех функциональных возможностей.The authors of the present invention sought to obtain improved humanized antibodies in comparison with the N13B2-h1, N13B2-h2 and N13B2-h3 antibodies disclosed in WO 2015/189302. Although it is known that certain residues in variable domain framework sequences, including residues in the Vernier zone, canonical residues, residues at the VH/VL interface, etc., are critical in the structure of an antibody and cannot be mutated to maintain the biochemical and biological activity of an antibody, The present inventors have surprisingly found that certain mutations in the N13B2 light chain variable framework sequence, including some of these critical residues, allow for an increase in human residues (higher than N13B2-h3 and up to 86.3%) and increased production (up to 4 times higher than N13B2-h3) while maintaining all functionality.

Эти мутации состоят из 16 аминокислотных замен в каркасной последовательности вариабельного домена легкой цепи N13B2 и, в частности, дополнительно в замене остатка валина в положении 48 остатком лейцина (V48L) и/или в замене остатка фенилаланина в положении 87 остатком тирозина (F87Y). Эти положения и любые положения аминокислот для цепей антител, предложенных в настоящем документе, если не указано иное, обозначены с использованием нумерации Кабат. В настоящем документе предложены усовершенствованные вариабельные домены легкой цепи антитела, состоящие из следующих последовательностей:These mutations consist of 16 amino acid substitutions in the framework sequence of the N13B2 light chain variable domain and, in particular, additionally in the replacement of the valine residue at position 48 with a leucine residue (V48L) and/or the replacement of the phenylalanine residue at position 87 with a tyrosine residue (F87Y). These positions, and any amino acid positions for the antibody chains provided herein, unless otherwise indicated, are designated using Kabat numbering. Provided herein are improved antibody light chain variable domains consisting of the following sequences:

SEQ ID NO: 9 (включая указанные 16 аминокислотных замен - указанный вариабельный домен легкой цепи антитела в дальнейшем обозначен N13B2-hVL3);SEQ ID NO: 9 (including the indicated 16 amino acid substitutions - the indicated antibody light chain variable domain is hereinafter referred to as N13B2-hVL3);

SEQ ID NO: 10 (включая указанные 16 аминокислотных замен и, кроме того, с мутацией V48L указанный вариабельный домен легкой цепи антитела в дальнейшем обозначен N13B2-hVL4);SEQ ID NO: 10 (including the indicated 16 amino acid substitutions and, furthermore, with the V48L mutation, the indicated antibody light chain variable domain is hereinafter referred to as N13B2-hVL4);

SEQ ID NO: 11 (включая указанные 16 аминокислотных замен и, кроме того, с мутацией F87Y указанный вариабельный домен легкой цепи антитела в дальнейшем обозначен N13B2-hVL5); иSEQ ID NO: 11 (including the indicated 16 amino acid substitutions and, furthermore, with the F87Y mutation, the indicated antibody light chain variable domain is hereinafter referred to as N13B2-hVL5); And

SEQ ID NO: 12 (включая указанные 16 аминокислотных замен и, кроме того, обе мутации V48L и F87Y) - указанный вариабельный домен легкой цепи антитела обозначен в дальнейшем N13B2-hVL6).SEQ ID NO: 12 (including the indicated 16 amino acid substitutions and in addition both V48L and F87Y mutations - the indicated antibody light chain variable domain is hereinafter referred to as N13B2-hVL6).

Таким образом, вариабельный домен легкой цепи антитела, обозначенный в настоящем документе N13B2-hVL3, содержит все CDR из N13B2-h3, указанные 16 аминокислотных замен и исходные остатки из N13B2 в критических положениях 48 и 87 (т.е. соответственно V и F) в человеческих каркасных последовательностях и имеет последовательность SEQ ID NO: 9. Вариабельный домен легкой цепи предпочтительного усовершенствованного антитела, предложенного в настоящем документе, обозначенныйThus, the antibody light chain variable domain, herein designated N13B2-hVL3, contains all of the CDRs from N13B2-h3, the indicated 16 amino acid substitutions, and the original residues from N13B2 at critical positions 48 and 87 (i.e., V and F, respectively) in human framework sequences and has the sequence of SEQ ID NO: 9. The light chain variable domain of the preferred improved antibody provided herein is designated

- 1 041126- 1 041126

N13B2-hVL6, включающий дополнительно обе мутации V48L и F87Y, состоит из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 12.N13B2-hVL6, additionally including both mutations V48L and F87Y, consists of the sequence shown in SEQ ID NO: 12.

Для специалиста будет неожиданным, что указанные мутации, особенно в таких положениях в каркасах вариабельного домена легкой цепи, не влияют на аффинность антитела с CD127: V48 является каноническим остатком, a F87 расположен на границе VH/VL; мутация таких остатков, как известно специалисту и описано, например, в Clark, 2014, должна влиять на аффинность и/или стабильность антитела. Используемый в настоящем документе термин канонический остаток относится к остатку в CDR или каркасе, который определяет конкретную каноническую структуру CDR, как определено Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901- 907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799 (1992). Согласно Chothia et al., критические части CDR многих антител имеют почти идентичные конформации пептидного остова, несмотря на большое разнообразие на уровне аминокислотной последовательности. Каждая каноническая структура определяет прежде всего набор торсионных углов пептидного остова для смежного сегмента аминокислотных остатков, образующих петлю. Невозможно было предвидеть, что введение раскрытых в изобретении мутаций в обоих положениях приведет к улучшению продуцирования, при этом сохраняя свойства связывания и, что весьма полезно, другие функциональные свойства этих антител.It will be surprising to one skilled in the art that these mutations, especially at these positions in the light chain variable domain frameworks, do not affect the affinity of the antibody for CD127: V48 is the canonical residue and F87 is located at the VH/VL border; mutation of such residues, as is known to the skilled person and described, for example, in Clark, 2014, should affect the affinity and/or stability of the antibody. As used herein, the term canonical residue refers to a residue in a CDR or framework that defines a particular canonical CDR structure as defined by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992). According to Chothia et al., critical portions of the CDRs of many antibodies have nearly identical peptide backbone conformations despite great diversity at the amino acid sequence level. Each canonical structure primarily determines the set of torsion angles of the peptide backbone for the adjacent segment of amino acid residues forming a loop. It could not be foreseen that the introduction of the mutations disclosed in the invention at both positions would lead to improved production, while retaining the binding properties and, very usefully, other functional properties of these antibodies.

Соответственно, в данном документе предложен полипептид, подходящий, в частности, для получения таких антител, в частности вариабельного домена легкой цепи антитела или легкой цепи антитела, состоящего из последовательности, в частности до 250 аминокислот, включающей или состоящий из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; или SEQ ID NO: 11; или SEQ ID NO: 12, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его молекулу-миметик антитела, согласно приведенному ниже определению. В конкретном аспекте изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, предложенным в данном документе, в частности к гуманизированным моноклональным антителам, специфически связывающимся с CD127, в частности с человеческим CD127, и содержат: легкую цепь антитела, содержащую, или вариабельный домен легкой цепи антитела, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; в частности SEQ ID NO: 12; и вариабельный домен тяжелой цепи антитела, содержащий три CDR, состоящие из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, в частности вариабельный домен тяжелой цепи антитела, состоящий из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 7.Accordingly, provided herein is a polypeptide particularly suitable for the preparation of such antibodies, in particular an antibody light chain variable domain or an antibody light chain consisting of a sequence, in particular up to 250 amino acids, comprising or consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; or SEQ ID NO: 11; or SEQ ID NO: 12, or an antigen-binding fragment thereof, or an antibody mimetic molecule thereof, as defined below. In a specific aspect, the invention relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof, proposed herein, in particular to humanized monoclonal antibodies that specifically bind to CD127, in particular human CD127, and contain: an antibody light chain containing, or an antibody light chain variable domain , consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; in particular SEQ ID NO: 12; and an antibody heavy chain variable domain comprising three CDRs consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, in particular an antibody heavy chain variable domain consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 7.

В предпочтительном варианте реализации изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, предложенным в данном документе, в частности к гуманизированным моноклональным антителам, которые специфически связываются с CD127, в частности с человеческим CD127, и содержат:In a preferred embodiment, the invention relates to antibodies or antigen-binding fragments provided herein, in particular to humanized monoclonal antibodies that specifically bind to CD127, in particular human CD127, and contain:

вариабельный домен легкой цепи, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, в частности SEQ ID NO: 12; и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий три CDR, состоящие из последовательностей, привеенных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, в частности вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7.a light chain variable domain consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, in particular SEQ ID NO: 12; and a heavy chain variable domain comprising three CDRs consisting of the sequences grafted in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, in particular a heavy chain variable domain consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: : 7.

В конкретном аспекте изобретения антитело, предложенное в настоящем документе, содержит легкую цепь с вариабельным доменом, как указано выше, и константный домен, состоящий из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 27 или 28, предпочтительно SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь с вариабельным доменом, как указано выше, и константным доменом, состоящим из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26.In a specific aspect of the invention, an antibody provided herein comprises a light chain with a variable domain as defined above and a constant domain consisting of a sequence selected from SEQ ID NO: 27 or 28, preferably SEQ ID NO: 27, and a heavy chain with a variable domain as above and a constant domain consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 26.

Также в настоящем документе предложен выделенный полипептид, состоящий из последовательности до 250 аминокислот, конкретно до 217, до 214, до 211, более конкретно, до 200, до 175, до 150, до 135, до 120, до 107, и еще более конкретно, до 100, до 90, до 80, до 74, до 70, до 60 аминокислот, причем указанная последовательность включает или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из:Also provided herein is an isolated polypeptide consisting of a sequence of up to 250 amino acids, specifically up to 217, up to 214, up to 211, more specifically up to 200, up to 175, up to 150, up to 135, up to 120, up to 107, and even more specifically , up to 100, up to 90, up to 80, up to 74, up to 70, up to 60 amino acids, and the specified sequence includes or consists of a sequence selected from the group consisting of:

SEQ ID NO: 9 (CDR-области из N13B2-h3 в каркасных последовательностях человека);SEQ ID NO: 9 (CDR regions from N13B2-h3 in human framework sequences);

SEQ ID NO: 10 (CDR-области из N13B2-h3 в каркасных последовательностях человека, включая мутацию V48L);SEQ ID NO: 10 (CDR regions from N13B2-h3 in human framework sequences including the V48L mutation);

SEQ ID NO: 11 (CDR-области из N13B2-h3 в каркасных последовательностях человека, включая мутацию F87Y);SEQ ID NO: 11 (CDR regions from N13B2-h3 in human framework sequences including the F87Y mutation);

SEQ ID NO: 12 (CDR-области из N13B2-h3 в каркасных последовательностях человека, включая обе мутации V48L и F87Y); и соответствующий антигенсвязывающий фрагмент, в частности указанный фрагмент, содержащий три CDR, состоящие из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, более конкретно фрагмент, содержащий по меньшей мере 74 аминокислоты, включая аминокислоты с 24 по 97 из SEQ ID NO: 12.SEQ ID NO: 12 (CDR regions from N13B2-h3 in human framework sequences, including both V48L and F87Y mutations); and an appropriate antigen-binding fragment, in particular said fragment containing three CDRs consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, more specifically a fragment containing at least 74 amino acids, including amino acids 24 to 97 of SEQ ID NO: 12.

В настоящем документе также предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, предложенные в настоящем документе, в частности антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изо- 2 041126 бретению. Такие полинуклеотиды кодируют, в частности, полипептиды, содержащие или состоящие из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9-12, а также кодируют полипептиды, содержащие или состоящие из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1-3, в частности SEQ ID NO: 7, и могут также кодировать полипептиды, содержащие или состоящие из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-28. В частности, указанные полинуклеотиды содержат или состоят из комбинации по меньшей мере двух выделенных последовательностей (молекул) нуклеиновых кислот, причем первая выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15-18; в частности SEQ ID NO: 18; указанная комбинация также содержит или состоит из второй выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 29-31, в частности SEQ ID NO: 13.Also provided herein are polynucleotides encoding the polypeptides provided herein, in particular the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the invention. Such polynucleotides encode, in particular, polypeptides containing or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9-12, and also encode polypeptides containing or consisting of sequences selected from SEQ ID NOs: 1-3, in particular SEQ ID NO: 7, and may also encode polypeptides containing or consisting of sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 26-28. In particular, said polynucleotides comprise or consist of a combination of at least two isolated nucleic acid sequences (molecules), wherein the first isolated nucleic acid molecule contains or consists of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15-18; in particular SEQ ID NO: 18; said combination also contains or consists of a second isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 29-31, in particular SEQ ID NO: 13.

В частности, полипептид по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи антитела или легкую цепь антитела, причем указанный полипептид содержит по меньшей мере 84% и более конкретно по меньшей мере 85% человеческих остатков. Указанный полипептид может представлять собой антигенсвязывающий фрагмент и/или молекулу-миметик антитела из антитела, раскрытого в данном документе.In particular, the polypeptide of the invention comprises an antibody light chain variable domain or an antibody light chain, said polypeptide comprising at least 84% and more particularly at least 85% human residues. Said polypeptide may be an antigen-binding fragment and/or an antibody mimetic molecule from an antibody disclosed herein.

В настоящем документе также представлены композиции, содержащие указанные полипептиды, в частности вариабельные домены легкой цепи антитела или легкие цепи антитела, антитела, антигенсвязывающий фрагмент или соответствующую молекулу-миметик антитела, способы получения указанных антител, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные полипептиды и антитела, и применения указанных полипептидов, антител и композиций.Also provided herein are compositions comprising said polypeptides, in particular, antibody light chain variable domains or antibody light chains, antibodies, an antigen-binding fragment or a corresponding antibody mimetic molecule, methods for producing said antibodies, nucleic acid molecules encoding said polypeptides and antibodies, and the use of said polypeptides, antibodies and compositions.

Соответственно, полипептиды, вариабельные домены легкой цепи антитела, легкие цепи антитела, антитела, антигенсвязывающие фрагменты, молекулы-миметики антитела и композиция, предложенные в настоящем документе, могут быть предназначены и/или быть подходящими для применения с целью лечения состояния, диагностированного у пациента-человека, которое возникает в результате патогенеза, связанного с лимфопоэзом, когда указанному патогенезу способствуют сигнальные пути IL-7, особенно когда увеличение созревания, точнее, активация костимулирующих молекул дендритных клеток является нежелательным.Accordingly, the polypeptides, antibody light chain variable domains, antibody light chains, antibodies, antigen-binding fragments, antibody mimetic molecules, and composition provided herein may be intended and/or suitable for use in the treatment of a condition diagnosed in a patient - human, which arises as a result of pathogenesis associated with lymphopoiesis, when said pathogenesis is promoted by IL-7 signaling pathways, especially when the increase in maturation, more precisely, the activation of co-stimulatory molecules of dendritic cells is undesirable.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Биохимия.Biochemistry.

CD127 является общим для рецептора IL-7 (IL-7R) и для рецептора TSLP (TSLPR). IL-7R состоит из гетеродимера CD127 и общей гамма-цепи (ус) рецепторов интерлейкина. Общая гамма-цепь yc иногда обозначается в настоящем документе и в литературе как CD132. IL-7R связывается интерлейкином 7. Рецептор TSLP представляет собой гетеродимер CD127 и фактора 2, подобного рецептору цитокинов (CRLF2). Рецептор TSLP связывается TSLP. В литературе TSLPR иногда используется для обозначения как цепи рецептора CRLF2, так и комплекса CD127/CRLF2. Во избежание путаницы в дальнейшем TSLPR обычно обозначает комплекс.CD127 is shared by the IL-7 receptor (IL-7R) and the TSLP receptor (TSLPR). IL-7R consists of a CD127 heterodimer and a common gamma chain (wc) of interleukin receptors. The common gamma chain yc is sometimes referred to herein and in the literature as CD132. IL-7R binds to interleukin 7. The TSLP receptor is a heterodimer of CD127 and cytokine receptor-like factor 2 (CRLF2). The TSLP receptor binds TSLP. In the literature, TSLPR is sometimes used to refer to both the CRLF2 receptor chain and the CD127/CRLF2 complex. To avoid confusion in the future, TSLPR usually denotes a complex.

CD127 (номер доступа Swiss Prot P16871) может существовать в четырех изоформах. Каноническая изоформа, также называемая Н20 (Swiss Prot P16871.1), представляет собой однопроходный трансмембранный белок и содержит 459 аминокислот состоящих, от N- до С-конца, из сигнального пептида из 20 аминокислот, внеклеточного домена из 219 аминокислот, трансмембранного домена из 25 аминокислот и внутриклеточного домена из 195 аминокислот. Другие изоформы имеют общую последовательность (или большую часть) внеклеточного домена Н20 и демонстрируют различные С-концевые последовательности. Изоформы 2 и 4 явля.тся секретируемыми (Swiss Prot P16871-4 и Р16871-3), в то время как изоформа 3 (Swiss Prot P16871-2) также является трансмембранным белком. Сообщается, что CD127 имеет последовательность SEQ ID NO: 21, а его внеклеточный домен, когда сигнальный пептид удален, имеет последовательность SEQ ID NO: 22. Если не указано иное, используемая в настоящем документе нумерация для аминокислот CD127, представляет собой нумерацию из SEQ ID NO: 22.CD127 (accession number Swiss Prot P16871) can exist in four isoforms. The canonical isoform, also referred to as H20 (Swiss Prot P16871.1), is a single-pass transmembrane protein and contains 459 amino acids consisting, N- to C-terminus, of a 20 amino acid signal peptide, a 219 amino acid extracellular domain, a 25 amino acid transmembrane domain amino acids and an intracellular domain of 195 amino acids. Other isoforms share a common sequence (or most) of the extracellular H20 domain and show different C-terminal sequences. Isoforms 2 and 4 are secreted (Swiss Prot P16871-4 and P16871-3), while isoform 3 (Swiss Prot P16871-2) is also a transmembrane protein. CD127 is reported to have the sequence of SEQ ID NO: 21 and its extracellular domain, when the signal peptide is removed, to have the sequence of SEQ ID NO: 22. Unless otherwise indicated, the numbering used herein for the amino acids of CD127 is the numbering from SEQ ID NO: 22.

CD127 представляет собой рецептор из класса гомологии цитокиновых рецепторов I (CRH I). Как хорошо известно в данной области, внеклеточный домен этих рецепторов состоит из двух доменов фибронектина 3, называемых D1 и D2. Точная кристаллографическая структура CD127 была опубликована и обсуждена, например, в McElroy et al., 2009; McElroy et al., 2012 и Walsh, 2012 и, в частности, была раскрыта в виде данных о структуре белка в базе данных белков Коллаборации по исследованию структурной биоинформатики (RCSB PDB) с номером доступа 3UP1. Обычно считается, что D1 участвует в связывании с IL-7, тогда как D2 участвует в связывании с yc-цепью (а также с IL-7). Важно, что сайт 2b домена D2 содержит три бета-слоя, включая следующие последовательности SEQ ID NO: 32 (FDLSVIYRE); SEQ ID NO: 33 (NDFWTFNTS) и SEQ ID NO: 34 (TKLTLLQR). Таким образом, сайт 2b домена D2 включен между аминокислотами 109 и 180 SEQ ID NO: 22 (см. Walsh, 2012; Verstraete, K. et al, Nature Com 2017). Сайт 2b домена D2 также может быть определен как включенный между аминокислотами 109 и 173 SEQ ID NO: 22. Сайт 2b домена D2 также может быть определен как включенный между аминокислотами 113 и 180 SEQ ID NO: 22. Сайт 2b домена 2b также может быть определен как вклюCD127 is a receptor from the cytokine receptor homology class I (CRH I). As is well known in the art, the extracellular domain of these receptors consists of two fibronectin 3 domains, referred to as D1 and D2. The precise crystallographic structure of CD127 has been published and discussed in, for example, McElroy et al., 2009; McElroy et al., 2012 and Walsh, 2012 and, in particular, has been disclosed as protein structure data in the Structural Bioinformatics Research Collaboration Protein Database (RCSB PDB) with accession number 3UP1. It is generally believed that D1 is involved in binding to IL-7, while D2 is involved in binding to the yc chain (as well as IL-7). Importantly, site 2b of the D2 domain contains three beta layers, including the following sequences SEQ ID NO: 32 (FDLSVIYRE); SEQ ID NO: 33 (NDFWTFNTS) and SEQ ID NO: 34 (TKLTLLQR). Thus, site 2b of the D2 domain is included between amino acids 109 and 180 of SEQ ID NO: 22 (see Walsh, 2012; Verstraete, K. et al, Nature Com 2017). D2 domain site 2b can also be defined as included between amino acids 109 and 173 of SEQ ID NO: 22. D2 domain site 2b can also be defined as included between amino acids 113 and 180 of SEQ ID NO: 22. Domain 2b site 2b can also be defined how to include

- 3 041126 ченный между аминокислотами 113 и 173 SEQ ID NO: 22. В частности, сайт 2b домена D2 включает, в частности, состоит, по существу, из аминокислот 109-133 SEQ ID NO: 22, в частности от 109 до 127, где первые два бета-слоя локализованы; и аминокислот с 166 по 180 SEQ ID NO: 22, где третий бета-слой локализован. Более конкретно, сайт 2b состоит в основном из аминокислот от 113 до 133, в частности от 113 до 127, SEQ ID NO: 22 и из аминокислот от 166 до 180 из SEQ ID NO: 22. В частности, сайт 2b состоит по существу из аминокислот от 109 до 133, в частности от 109 до 127, из SEQ ID NO: 22 и аминокислот от 166 до 173 из SEQ ID NO: 22. Более конкретно, сайт 2b состоит по существу из аминокислот от 113 до 133, в частности 113-127, из SEQ ID NO: 22 и аминокислот 166-173 из SEQ ID NO: 22. Сайт 2b домена D2 является критическим для взаимодействия CD127-yc, в частности, для разрешения или увеличения связывания CD127 с yc в присутствии IL-7. В частности, мутации в Р112 и L115, которые были идентифицированы у пациентов, страдающих от тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID), как полагают, дестабилизируют гидрофобное ядро домена D2, что, вероятно, приводит к их патогенным признакам.- 3 041126 between amino acids 113 and 173 of SEQ ID NO: 22. In particular, site 2b of the D2 domain includes, in particular, consists essentially of amino acids 109-133 of SEQ ID NO: 22, in particular from 109 to 127, where the first two beta layers are localized; and amino acids 166 to 180 of SEQ ID NO: 22, where the third beta layer is localized. More specifically, site 2b consists primarily of amino acids 113 to 133, in particular 113 to 127, of SEQ ID NO: 22 and of amino acids 166 to 180 of SEQ ID NO: 22. In particular, site 2b consists essentially of amino acids 109 to 133, in particular 109 to 127, of SEQ ID NO: 22 and amino acids 166 to 173 of SEQ ID NO: 22. More specifically, site 2b consists essentially of amino acids 113 to 133, in particular 113 -127, from SEQ ID NO: 22 and amino acids 166-173 from SEQ ID NO: 22. Site 2b of the D2 domain is critical for CD127-yc interaction, in particular to resolve or increase CD127 binding to yc in the presence of IL-7. In particular, mutations in P112 and L115 that have been identified in patients suffering from severe combined immunodeficiency (SCID) are believed to destabilize the hydrophobic core of the D2 domain, likely leading to their pathogenic features.

Как указано выше, сайт 2b состоит, по существу, из аминокислот 109-180 из SEQ ID NO: 22, или состоит, по существу, из аминокислот 109-173 из SEQ ID NO: 22, или состоит, по существу, из аминокислот 113-180 из SEQ ID 22 или состоит, по существу, из аминокислот 113-173 из SEQ ID NO: 22. Специалист поймет, что концы такого домена не обязательно могут быть однозначно определены с точностью до одного основания, и что сайт 2b можно понимать, как содержащий на одном или обоих концах упомянутой последовательности (ей) на 1, 2 или 3 больше или меньше аминокислот. Следовательно, при упоминании в настоящем документе сайта 2b или CD127, следует понимать, что это относится к последовательности CD127, начинающейся в положении 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 или 113 и заканчивающейся в положении 173, 174, 175 176, 177, 178, 179 или 180 или SEQ ID NO: 22; в частности, к такой последовательности, которая, как полагают или показано, составляет существенно важный сайт связывания с yc-цепью IL7-R, в частности, в присутствии IL-7. Более конкретно, когда в настоящем документе упоминается сайт 2b CD127, следует понимать, что это относится к последовательности CD127, начинающейся в положении 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 или 113 и заканчивающейся в положении 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 или 133 SEQ ID NO: 22, но также и к последовательности CD127, начинающейся в положении 162, 163, 164, 165 или 166 и заканчивающейся в положении 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 или 180 из SEQ ID NO: 22. Следует отметить, что три бета-слоя, как определено в настоящем документе, могут содержать эпитопные последовательности, специфичные для антител или антигенсвязывающих фрагментов или антигенсвязывающего миметика в соответствии с изобретением. Антитела, антигенсвязывающие фрагменты и антигенсвязывающие миметики по изобретению могут быть способны специфически связываться с SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и/или SEQ ID NO: 34. Кроме того, аминокислотная последовательность, содержащая, по меньшей мере, часть одного бета-слоя и некоторых смежных аминокислот, локализованных на одном конце любого бета-слоя, также может представлять собой последовательность эпитопа, специфичную для антитела по изобретению. В качестве примера, последовательность SEQ ID NO: 35 (TLLQRKLQPAAMYEI) содержит последние пять аминокислот третьего бета-слоя и десять дополнительных аминокислот, локализованных вне третьего бетаслоя. В качестве другого примера, SEQ ID NO: 96 (RKLQPAAM) содержит одну аминокислоту, локализованную в третьем бета-слое, и семь дополнительных аминокислот, локализованных вне третьего бетаслоя. В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик по изобретению могут специфически связываться с R173 SEQ ID NO: 22. В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик согласно изобретению могут специфически связываться по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96. В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик по изобретению могут специфически связываться по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы состоящий из SEQ ID NO: 36 (LVEVKCLNFR); SEQ ID NO: 37 (ICGALVEVKCLNFR) и SEQ ID No: 38 (LVEVKCLNFRK). В качестве альтернативы или дополнения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик по изобретению могут специфически связываться по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39 (KKFLLIG); SEQ ID NO: 40 (KKFLLIGKSNI) и SEQ ID NO: 41 (FIETKKFLLIG). SEQ ID NO: 36 - SEQ ID NO: 41 локализованы в домене D1 из CD127 и представляют собой эпитопные последовательности, распознаваемые антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или молекулой-миметиком антитела в соответствии с изобретением. В альтернативном или дополнительном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или молекула-миметик антитела согласно изобретению могут специфически связываться по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 (CLNFR) и SEQ ID NO: 43 (FIETKKF). Эти две последовательности представляют собой эпитопные последовательности, локализованные в домене D1 из CD127. В конкретном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик по изобретению могут специфически связываться по меньшей мере с одной последоваAs stated above, site 2b consists essentially of amino acids 109-180 of SEQ ID NO: 22, or consists essentially of amino acids 109-173 of SEQ ID NO: 22, or consists essentially of amino acids 113 -180 of SEQ ID 22, or consists essentially of amino acids 113-173 of SEQ ID NO: 22. One skilled in the art will appreciate that the ends of such a domain may not necessarily be uniquely defined to within one base, and that site 2b can be understood as containing at one or both ends of said sequence(s) 1, 2 or 3 more or less amino acids. Therefore, references herein to site 2b or CD127 should be understood to refer to a CD127 sequence beginning at position 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, or 113 and ending at position 173, 174, 175,176 , 177, 178, 179 or 180 or SEQ ID NO: 22; in particular to such a sequence that is believed or shown to constitute an essential binding site for the yc chain of IL7-R, in particular in the presence of IL-7. More specifically, when CD127 site 2b is referred to herein, it should be understood that this refers to a CD127 sequence starting at position 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, or 113 and ending at position 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, or 133 of SEQ ID NO: 22, but also to a CD127 sequence starting at position 162, 163, 164, 165, or 166 and ending at position 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 or 180 of SEQ ID NO: 22. It should be noted that the three beta layers as defined herein may contain epitope sequences specific for antibodies or antigen-binding fragments or an antigen-binding mimic according to the invention. The antibodies, antigen-binding fragments, and antigen-binding mimetics of the invention may be capable of specifically binding to SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, and/or SEQ ID NO: 34. In addition, an amino acid sequence containing at least a portion of one beta -layer and some adjacent amino acids located at one end of any beta layer may also be an epitope sequence specific to an antibody of the invention. As an example, the sequence of SEQ ID NO: 35 (TLLQRKLQPAAMYEI) contains the last five amino acids of the third beta layer and ten additional amino acids located outside the third beta layer. As another example, SEQ ID NO: 96 (RKLQPAAM) contains one amino acid located in the third beta layer and seven additional amino acids located outside the third beta layer. In particular, an antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimic of the invention can specifically bind to R173 of SEQ ID NO: 22. In particular, an antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic of the invention can specifically bind to at least one sequence selected from the group , consisting of SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 96. In particular, an antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic thereof of the invention can specifically bind to at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 36(LVEVKCLNFR); SEQ ID NO: 37 (ICGALVEVKCLNFR) and SEQ ID No: 38 (LVEVKCLNFRK). Alternatively or in addition, an antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimic of the invention can specifically bind to at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 39 (KKFLLIG); SEQ ID NO: 40 (KKFLLIGKSNI) and SEQ ID NO: 41 (FIETKKFLLIG). SEQ ID NO: 36 - SEQ ID NO: 41 are located in the D1 domain of CD127 and are epitope sequences recognized by an antibody or antigen-binding fragment or antibody mimetic molecule of the invention. In an alternative or additional embodiment of the invention, an antibody or an antigen-binding fragment thereof or an antibody mimetic molecule of the invention can specifically bind to at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 (CLNFR) and SEQ ID NO: 43 ( FIETKKF). These two sequences are epitope sequences located in the D1 domain of CD127. In a particular embodiment, an antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic of the invention can specifically bind to at least one sequence

- 4 041126 тельностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96, в частности, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96; и по меньшей мере одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, в частности, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43. В предпочтительном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик могут специфически связываться с SEQ ID NO: 34 и по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, в частности, с SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43. В предпочтительном варианте реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или антигенсвязывающий миметик могут специфически связываться с SEQ ID NO: 35 и по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, в частности, с SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43. В предпочтительном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик могут специфически связываться с SEQ ID NO: 96 и по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, в частности с SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43. В предпочтительном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик могут специфически связываться с обеими последовательностями SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96. В предпочтительном варианте реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или антигенсвязывающий миметик могут специфически связываться с обеими последовательностями SEQ ID NO: 42. и SEQ ID NO: 43. В конкретном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик по изобретению могут специфически распознавать по меньшей мере третий бета-слой сайта 2b домена D2 CD127. Третий бета-слой предпочтительно определяется как локализованный между аминокислотами 166 и 173 SEQ ID NO: 22, что соответствует SEQ ID NO: 34, и более конкретно, третий бета-слой соответствует SEQ ID NO: 34. В более конкретном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик в соответствии с изобретением могут специфически распознавать по меньшей мере два из бета-слоев, локализованных в сайте 2b домена D2, и более конкретно, антитело или антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик согласно изобретению могут специфически распознавать три бета-слоя, локализованных в сайте 2b домена D2, согласно определению выше. В более конкретном варианте реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или антигенсвязывающий миметик могут специфически распознавать по меньшей мере один бета-слой, локализованный в сайте 2b домена D2, в частности третий бета-слой, соответствующий SEQ ID NO: 34, и связываются по меньшей мере с одной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43. В предпочтительном варианте реализации изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или антигенсвязывающий миметик могут специфически распознавать по меньшей мере третий бета-слой, соответствующий SEQ ID NO: 34, и по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43, в частности, с SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43. В более конкретном варианте реализации изобретения антитело или антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий миметик могут специфически распознавать линейный пептид или линейный эпитоп, состоящий из аминокислот SEQ ID NO: 35. В дополнение или в качестве альтернативы, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или антигенсвязывающий миметик могут специфически распознавать конформационный пептид или конформационный эпитоп, состоящий из аминокислот с последовательностью ID № 96. В более конкретном варианте реализации антитело или антигенсвязывающее фрагмент или антигенсвязывающий миметик могут специфически распознавать линейный эпитоп или линейный пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 35 и конформационный эпитоп или конформационный пептид SEQ ID NO: 96.- 4 041126 with a value selected from the group consisting of SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96, in particular from the group consisting of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96; and at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, in particular from the group consisting of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In a preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic can specifically bind to SEQ ID NO: 34 and at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, in particular SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In a preferred embodiment of the invention, an antibody, or an antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic thereof, can specifically bind to SEQ ID NO: 35 and at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, in particular to SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In a preferred embodiment, the antibody, or an antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic thereof, can specifically bind to SEQ ID NO: 96 and at least one sequence selected from d The group consisting of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, in particular SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In a preferred embodiment of the invention, the antibody or its antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic can specifically bind to both sequences SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96. In a preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic thereof can specifically bind to both SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In a specific embodiment of the invention, an antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic of the invention can specifically recognize at least the third beta layer of site 2b of the D2 domain of CD127. The third beta layer is preferably defined as being located between amino acids 166 and 173 of SEQ ID NO: 22, corresponding to SEQ ID NO: 34, and more specifically, the third beta layer corresponds to SEQ ID NO: 34. In a more specific embodiment, the antibody or its antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic according to the invention can specifically recognize at least two of the beta layers located at site 2b of the D2 domain, and more specifically, the antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic according to the invention can specifically recognize three beta layers, located at site 2b of the D2 domain, as defined above. In a more specific embodiment, the antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic can specifically recognize at least one beta layer located at site 2b of the D2 domain, in particular the third beta layer corresponding to SEQ ID NO: 34, and bind with at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In a preferred embodiment, the antibody, or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic thereof, can specifically recognize at least a third beta layer corresponding to SEQ ID NO: 34 and at least one a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, in particular SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. In a more specific embodiment, the antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic may specifically recognize a linear peptide or linear epitope consisting of amino acids of SEQ ID NO: 35. In addition or alternatively, an antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding mimetic thereof can specifically recognize a conformational peptide or conformational epitope consisting of amino acids of sequence ID NO: 96. In a more specific embodiment, the antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding The excitatory mimetic can specifically recognize a linear epitope or linear peptide with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 and a conformational epitope or conformational peptide of SEQ ID NO: 96.

Передача сигналов IL-7R. Связывание IL-7 с IL-7R запускает активацию нескольких сигнальных путей, включая Янус-киназы (JAK)-1 и -3, трансдуктор сигнала и активатор транскрипции 5 (STAT5) и фосфатидилинозол-3-киназу (PI3-k). Сообщается, что пути STAT1 и STAT3 активированы, хотя они не являются основными путями. Активация пути STAT5 необходима для индукции антиапоптотического белка Вс1-2 и предотвращения проникновения проапоптотического белка Вах в митохондрию и, таким образом, для выживания развивающихся в тимусе предшественников Т-клеток. Активация пути PI3-k приводит к фосфорилированию и цитоплазматическому удержанию проапоптотического белка Bad.IL-7R signaling. Binding of IL-7 to IL-7R triggers the activation of several signaling pathways, including Janus kinases (JAK)-1 and -3, signal transducer and transcription activator 5 (STAT5), and phosphatidylinosole-3-kinase (PI3-k). The STAT1 and STAT3 pathways are reported to be up, although they are not the main pathways. Activation of the STAT5 pathway is necessary for the induction of the anti-apoptotic Bcl-2 protein and the prevention of entry of the pro-apoptotic Bax protein into the mitochondria and, thus, for the survival of T-cell progenitors developing in the thymus. Activation of the PI3-k pathway leads to phosphorylation and cytoplasmic retention of the pro-apoptotic Bad protein.

Передача сигналов TSLPR. Тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) представляет собой цитокин эпителиальных клеток, который активен при лимфопоэзе и, в частности, участвует в регуляции развития клеток иммунной системы, причем эта регуляция влияет, в частности, на созревание указанных клеток. TSLP человека (номер доступа Genbank AF338732) является фактором, который вызывает поляризацию дендритных клеток и способствует пролиферации и дифференцировке Т- и В-клеток. TSLP также подавляет образование клеток Treg (Lei et al., 2011).TSLPR signaling. Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) is an epithelial cell cytokine that is active in lymphopoiesis and, in particular, is involved in the regulation of the development of cells of the immune system, and this regulation affects, in particular, the maturation of these cells. Human TSLP (Genbank accession number AF338732) is a factor that induces polarization of dendritic cells and promotes T and B cell proliferation and differentiation. TSLP also suppresses the formation of Treg cells (Lei et al., 2011).

Было показано, что сигнальные пути, индуцированные TSLP, на молекулярном уровне отличаютсяTSLP-induced signaling pathways have been shown to differ at the molecular level

- 5 041126 от индуцированных IL-7 путей. В частности, хотя связывание TSLP с его рецептором также активирует Jak-1, оно не активирует Jak-3, но активирует Jak-2. Эти различия согласуются с наблюдением, что Jak-1 ассоциируется с CD127, общим для обоих рецепторов, в то время как Jak-2 ассоциируется с CRLF2 и Jak3 с ус (Rochman et al., 2010). Также сообщается об активации пути STAT5 для передачи сигналов, индуцированной TSLP (Zhong et al., 2014). Одним из основных эффектов TSLP является то, что он приводит к активации дендритных клеток, индуцируя сверхэкспрессию костимулирующих молекул, таких как CD80, тем самым стимулируя опосредованные ТН-2 воспалительные реакции (Reche et al., 2001).- 5 041126 from IL-7 induced pathways. In particular, although binding of TSLP to its receptor also activates Jak-1, it does not activate Jak-3 but does activate Jak-2. These differences are consistent with the observation that Jak-1 associates with CD127, which is common to both receptors, while Jak-2 associates with CRLF2 and Jak3 with a mustache (Rochman et al., 2010). Activation of the STAT5 pathway for TSLP-induced signaling has also been reported (Zhong et al., 2014). One of the main effects of TSLP is that it leads to the activation of dendritic cells, inducing overexpression of costimulatory molecules such as CD80, thereby stimulating TH-2 mediated inflammatory responses (Reche et al., 2001).

Клеточная биология.Cell biology.

Термин CD127-положительные клетки обозначает клетки, экспрессирующие CD127 на своей клеточной поверхности. В большинстве случаев CD127-положительные клетки экспрессируют CD127 в комплексе, образующем IL-7R (IL-7R-положительные клетки), и/или в комплексе, образующем TSLPR (TSLPR-положительные клетки). CD127 экспрессируется различными клетками, в том числе как Тклетками памяти, так и наивными Т-клетками. CD127, в частности, экспрессируется эффекторными Тклетками (Teff), в том числе покоящимися и Т-клетками памяти, и незрелыми В-клетками, но в частности не экспрессируется покоящимися природными регуляторными Т-клетками (природными Treg). CD127 необходим для стимулирования дифференцировки тимоцитов и клональной экспансии лимфоцитов.The term CD127 positive cells refers to cells expressing CD127 on their cell surface. In most cases, CD127-positive cells express CD127 in an IL-7R-forming complex (IL-7R-positive cells) and/or in a TSLPR-forming complex (TSLPR-positive cells). CD127 is expressed by a variety of cells, including both memory T cells and naive T cells. CD127 is specifically expressed by effector T cells (Teff), including resting and memory T cells and immature B cells, but is not particularly expressed by resting natural regulatory T cells (natural Tregs). CD127 is required to stimulate thymocyte differentiation and clonal expansion of lymphocytes.

Важность пути IL7-CD127 для гомеостаза наивных Т-клеток подчеркивается несколькими недавними исследованиями, показывающими, что уровни экспрессии мембраносвязанного CD127 на обычных CD4+ Т-клетках коррелируют с частотами недавних эмигрантов тимуса (RTE)-CD4+ Т-клеток у здоровых людей и ВИЧ-инфицированных пациентов, а также у пациентов с PC (Albuquerque et al., 2007) (Broux et al., 2010). CD127 также является компонентом рецептора TSLP. Было продемонстрировано, что секреция TSLP тельцами Хассалла, структурами, состоящими из эпителиальных клеток в мозговом веществе тимуса, кондиционирует CDHc+миелоидные дендритные клетки (MDC) для индукции дифференцировки тимоцитов в Treg (Watanabe et al., 2005a). Соответственно, сигналы от рецептора IL-7 необходимы для развития Treg, как показано у мышей, нокаутных по CD127 (Mazzucchelli et al., 2008). В работе Haas et al., 2011, авторы продемонстрировали снижение экспрессии CD127 на обычных Т-клетках и повышенный уровень IL-7 в плазме, а также снижение частот недавних эмигрантов тимуса-Treg и функции Treg при PC без явного генетического влияния (Haas et al., 2011).The importance of the IL7-CD127 pathway for naïve T cell homeostasis is highlighted by several recent studies showing that expression levels of membrane-bound CD127 on normal CD4+ T cells correlate with frequencies of recent thymic emigrant (RTE)-CD4+ T cells in healthy individuals and HIV-infected individuals. patients, as well as in patients with MS (Albuquerque et al., 2007) (Broux et al., 2010). CD127 is also a component of the TSLP receptor. TSLP secretion by Hassall bodies, structures composed of epithelial cells in the thymic medulla, has been shown to condition CDHc+myeloid dendritic cells (MDCs) to induce thymocyte differentiation into Treg (Watanabe et al., 2005a). Accordingly, signals from the IL-7 receptor are required for Treg development, as shown in CD127 knockout mice (Mazzucchelli et al., 2008). In Haas et al., 2011, the authors demonstrated reduced expression of CD127 on normal T cells and increased plasma IL-7 levels, as well as reduced frequencies of recent thymic Treg emigrants and Treg function in MS without clear genetic influence (Haas et al ., 2011).

Рассмотрение вопроса о том, как IL-7 регулирует миграцию своих родственных рецепторов через мембрану, имеет решающее значение для глубокого понимания роли IL-7/IL-7R в функции лимфоцитов. Предыдущие исследования показали, что стимуляция Т-клеток IL-7 приводит к поверхностной понижающей модуляции CD127 в течение 30 мин, возможно, из-за интернализации рецептора. Было показано, что в более поздние моменты времени (2-6 ч) IL-7 индуцирует транскрипционное подавление CD127. Тем не менее, фактическую динамику интернализации CD127 и регуляции механизмов переноса IL-7 еще предстоит выяснить (Henriques et al., 2010). Было также высказано предположение, что IL-7индуцированная передача сигналов зависит от интернализации CD127 и что последующая деградация рецептора зависит от активности JAK3 и опосредуется как протеасомами, так и лизосомами.Considering how IL-7 regulates the migration of its cognate receptors across the membrane is critical to a deep understanding of the role of IL-7/IL-7R in lymphocyte function. Previous studies have shown that stimulation of T cells with IL-7 results in surface down-modulation of CD127 within 30 min, possibly due to receptor internalization. It was shown that at later time points (2-6 h) IL-7 induces transcriptional repression of CD127. However, the actual dynamics of CD127 internalization and regulation of IL-7 transport mechanisms remains to be elucidated (Henriques et al., 2010). It has also been suggested that IL-7 induced signaling depends on CD127 internalization and that subsequent receptor degradation depends on JAK3 activity and is mediated by both proteasomes and lysosomes.

Патофизиология.Pathophysiology.

Дендритные клетки экспрессируют высокие уровни костимулирующих молекул после созревания, таких как CD80, что стимулирует опосредованные Т-клетками иммунные ответы. Они также продуцируют цитокин TARC (CCL17), который индуцирует хемотаксис в Т-клетках. В таковом качестве, зрелые дендритные клетки вносят вклад в физиопатологию некоторых иммуноопосредованных заболеваний, в которых проявляются ответы Т-клеток, например, при астме, ревматоидном артрите, колите, рассеянном склерозе и увеите. Зрелые дендритные клетки также играют ключевую роль в процессе отторжения клеток, тканей или аллотрансплантатов органов. Поэтому многие терапевтические стратегии направлены на предотвращение созревания дендритных клеток.Dendritic cells express high levels of costimulatory molecules after maturation, such as CD80, which stimulate T-cell mediated immune responses. They also produce the cytokine TARC (CCL17), which induces chemotaxis in T cells. As such, mature dendritic cells contribute to the physiopathology of several immune-mediated diseases in which T-cell responses occur, such as asthma, rheumatoid arthritis, colitis, multiple sclerosis, and uveitis. Mature dendritic cells also play a key role in the process of rejection of cells, tissues or organ allografts. Therefore, many therapeutic strategies are aimed at preventing the maturation of dendritic cells.

Наличие или отсутствие костимулирующих молекул на антиген-презентирующих клетках (АРС), таких как дендритные клетки, значительно влияет на качественный и количественный характер иммунного ответа. Сверхэкспрессия CD80 дендритными клетками вызывает созревание DC и увеличивает активацию Т-клеток памяти (Bour-Jordan et al., 2011). Механистически взаимодействие CD28 с CD80 занимает центральный кластер иммунологического синапса и колокализуется с вовлеченным TCR, тем самым стабилизируя иммунный синапс (Dustin and Shaw, 1999) (Grakoui et al., 1999). Взаимодействие между CD28 и CD80 фактически создает соответствующее пространственное распределение для TCR для эффективного взаимодействия с молекулами HLA (Shaw and Dustin, 1997).The presence or absence of costimulatory molecules on antigen presenting cells (APCs), such as dendritic cells, significantly affects the qualitative and quantitative nature of the immune response. Overexpression of CD80 by dendritic cells induces DC maturation and increases the activation of memory T cells (Bour-Jordan et al., 2011). Mechanistically, the interaction of CD28 with CD80 occupies the central cluster of the immunological synapse and colocalizes with the involved TCR, thereby stabilizing the immune synapse (Dustin and Shaw, 1999) (Grakoui et al., 1999). The interaction between CD28 and CD80 actually creates an appropriate spatial distribution for the TCR to interact effectively with HLA molecules (Shaw and Dustin, 1997).

Рассеянный склероз (PC) - это воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС). Появление демиелинизирутощих бляшек в ЦНС у пациентов с PC ассоциировано с воспалительным инфильтратом, в основном состоящим из макрофагов и Т-лимфоцитов. На механистическом уровне PC рассматривается как аутоиммунное заболевание. PC обычно рассматривается как заболевание, в первую очередь опосредованное CD4+ Т-клетками.Multiple sclerosis (PC) is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS). The appearance of demyelinating plaques in the CNS in patients with MS is associated with an inflammatory infiltrate, mainly consisting of macrophages and T-lymphocytes. On a mechanistic level, PC is considered to be an autoimmune disease. MS is generally regarded as a disease primarily mediated by CD4+ T cells.

Определенные субпопуляции CD4+: Th1 и совсем недавно Th17 были названы причастными к патофизиологии заболевания. В настоящее время пока трудно присвоить конкретные роли каждой под- 6 041126 группе Th1 и Th17. Кроме того, в настоящее время ингибирование переноса лейкоцитов за счет антагонизма альфа4 (а4)-интегрина подтверждено в качестве терапевтического подхода для лечения воспалительных заболеваний, таких как PC и воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), а также для лечения атеросклероза (Zhi) et al., 2014). α4β7 экспрессируется на более ограниченном наборе лейкоцитов, включая активированный макрофаг, субпопуляции лимфоцитов, NK-клетки, тучные клетки и эозинофилы.Certain subpopulations of CD4+: Th1 and more recently Th17 have been implicated in the pathophysiology of the disease. At present, it is still difficult to assign specific roles to each of the Th1 and Th17 subgroups. In addition, inhibition of leukocyte transport by alpha4(a4)-integrin antagonism has now been validated as a therapeutic approach for the treatment of inflammatory diseases such as MS and inflammatory bowel disease (IBD) as well as for the treatment of atherosclerosis (Zhi) et al. , 2014). α4β7 is expressed on a more limited set of leukocytes, including activated macrophage, lymphocyte subpopulations, NK cells, mast cells, and eosinophils.

Человеческий IL-7 индуцирует сильную экспрессию интегринов α4 и β7 in vitro на Т-лимфоцитах человека и резко увеличивает частоту Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих интегрины α4, β7 и α4/β7, которые необходимы для хоминга и удержания Т-лимфоцитов в. нелимфоидных тканях, таких как кишечник, мозг и кожа (Denucci et al., 2009; Gorfu et al., 2009). Наивные Т-клетки частично ответственны за острое отторжение трансплантированных органов и тканей. Эти клетки могут контролироваться современными иммунодепрессантами (ингибиторами кальциневрина) и моноклональными антителами, которые блокируют костимуляцию (антиадгезивные, ингибиторы CD80/86). Т-клетки памяти также ответственны за отторжение трансплантата. Т-клетки памяти накапливаются у человека благодаря приобретенной иммунной истории, в основном - прежним реакциям на вирусы. Было показано, что Т-клетки памяти могут реактивироваться алло антигенами в результате гетерологичного иммунитета, который является перекрестной реакцией нашей антивирусной защиты с аллоантигенами (Adams et al., 2003). Гетерологичный иммунитет представляет собой мощный барьер для индукции толерантности, поскольку Т-клетки памяти, в отличие от наивных Т-клеток, запрограммированы на быструю активацию, с уменьшенной потребностью в костимулирующих сигналах. Т-клетки памяти также могут быть вовлечены в хроническое отторжение. Помимо своей роли в трансплантации органов и тканей, наивные Т-клетки и Тклетки памяти также несут часть ответственности за многие аутоиммунные заболевания. Это касается язвенного колита (Shinohara et al., 2011), ревматоидного артрита, псориаза или болезни трансплантат против хозяина.Human IL-7 induces strong expression of α4 and β7 integrins in vitro on human T lymphocytes and dramatically increases the frequency of human T lymphocytes expressing α4, β7 and α4/β7 integrins, which are required for T lymphocyte homing and retention. non-lymphoid tissues such as the gut, brain, and skin (Denucci et al., 2009; Gorfu et al., 2009). Naive T cells are partly responsible for the acute rejection of transplanted organs and tissues. These cells can be controlled by modern immunosuppressants (calcineurin inhibitors) and monoclonal antibodies that block costimulation (anti-adhesives, CD80/86 inhibitors). Memory T cells are also responsible for transplant rejection. Memory T-cells accumulate in humans due to acquired immune history, mainly due to previous reactions to viruses. It has been shown that memory T cells can be reactivated by alloantigens as a result of heterologous immunity, which is a cross-reaction of our antiviral defenses with alloantigens (Adams et al., 2003). Heterologous immunity represents a powerful barrier to tolerance induction because memory T cells, unlike naïve T cells, are programmed to be rapidly activated, with a reduced need for co-stimulatory signals. Memory T cells may also be involved in chronic rejection. In addition to their role in organ and tissue transplantation, naive and memory T cells are also partly responsible for many autoimmune diseases. This applies to ulcerative colitis (Shinohara et al., 2011), rheumatoid arthritis, psoriasis, or graft versus host disease.

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), такие как язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (CD), представляют собой хронические рецидивирующие желудочно-кишечные расстройства, характеризующиеся хроническим кишечным воспалением, разрегулированными иммунными ответами на микробиоту кишечника и дисфункцию эпителиального барьера (Khor et al. at., 2011; Abraham and Cho, 2009). Уровни заболеваемости и распространенности ВЗК во всем мире растут, причем эти заболевания ассоциированы с выраженной заболеваемостью и оказывают значительное влияние на качество жизни и трудоспособность (Danese and Fiocchi, 2011; Baumgart and Sandbom, 2012). Современные общепринятые способы лечения направлены на ослабление воспаления с поэтапным использованием противовоспалительных агентов, иммунодепрессантов и биологических агентов, нацеленных на воспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа (TNFa). Ключевой особенностью ВЗК также является быстрый рекрутинг и длительная персистенция лейкоцитов в месте воспаления, чему способствует взаимодействие интегринов с родственными рецепторами, экспрессируемыми эндотелиальными клетками, приводящее к клеточной адгезии и трансмиграции (Adams and Eksteen, 2006; Agace, 2006). Инновационные способы лечения нацеливаются на эту входную дверь в кишечник с помощью молекул антиадгезии, в частности нацеливаются на кишечно-специфический путь интегринов α4β7 (Feagan et al., 2013; Sandbom et al., 2013)^7,8. Однако эти способы лечения не поддерживают ремиссию более чем у половины пациентов, и рецидивирующие вспышки возникают у высокой доли первичных ответивших. Также развиваются оппортунистические инфекции как следствие общей иммуносупрессии. Таким образом, одна из основных целей заключается в создании новых способов лечения ВЗК и выявлении маркеров, определяющих вероятность хроничности, ответа и рецидивов ВЗК.Inflammatory bowel diseases (IBD), such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD), are chronic relapsing gastrointestinal disorders characterized by chronic intestinal inflammation, deregulated immune responses to the gut microbiota, and epithelial barrier dysfunction (Khor et al. at., 2011; Abraham and Cho, 2009). Incidence and prevalence rates of IBD are increasing worldwide, and these diseases are associated with severe morbidity and have a significant impact on quality of life and work capacity (Danese and Fiocchi, 2011; Baumgart and Sandbom, 2012). Current conventional therapies are aimed at reducing inflammation with the stepwise use of anti-inflammatory agents, immunosuppressants and biological agents targeting inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor alpha (TNFa). A key feature of IBD is also the rapid recruitment and long-term persistence of leukocytes at the site of inflammation, which is facilitated by the interaction of integrins with related receptors expressed by endothelial cells, leading to cell adhesion and transmigration (Adams and Eksteen, 2006; Agace, 2006). Innovative therapies target this entry door to the gut via anti-adhesion molecules, specifically targeting the gut-specific α4β7 integrin pathway (Feagan et al., 2013; Sandbom et al., 2013) ^7,8 . However, these treatments do not maintain remission in more than half of patients, and recurrent flares occur in a high proportion of primary responders. Opportunistic infections also develop as a consequence of general immunosuppression. Thus, one of the main goals is to create new treatments for IBD and to identify markers that determine the likelihood of chronicity, response, and recurrence of IBD.

Кроме того, было показано, что некоторые злокачественные клетки также демонстрируют IL-7R. Это верно для кожной лимфомы Сезари (60% из них) или детского острого лимфобластного лейкоза, при котором примерно в 15% случаев развивается мутация с усилением функции в CD127, что делает эти опухоли частично зависимыми от IL-7 (Shochat et al, 2011).In addition, some cancer cells have also been shown to exhibit IL-7R. This is true for cutaneous Cesari's lymphoma (60% of them) or childhood acute lymphoblastic leukemia, in which about 15% of cases develop a gain-of-function mutation in CD127, making these tumors partly dependent on IL-7 (Shochat et al, 2011) .

Истощение Т-лимфоцитов было очевидным иммуносупрессивным подходом для противодействия отторжению аллотрансплантата или борьбе с аутоиммунитетом. Однако полное истощение Т-клеток может быть не благоприятным для индукции иммунологической толерантности. Про-толерогенный подход может включать в себя нацеливание на субпопуляции Т-клеток или селективно активированные Т-клетки без модификации Treg-клеток (Haudebourg et al., 2009). Таким образом, CD127 можно рассматривать как потенциально привлекательную терапевтическую мишень для моноклональных антител (Mab), нацеленных на модулирование иммунных ответов, поскольку такие моноклональные антитела могут обладать способностью истощать эффектор, но не регуляторные лимфоциты. Соответственно, было предположено, что они могут проявлять эффективность при трансплантации, аутоиммунности (Michel et al., 2008) и злокачественных новообразованиях путем антагонистического доступа IL-7 к IL-7-R и, таким образом, ограничения функции и роста Т- и В-клеток.T-lymphocyte depletion has been an obvious immunosuppressive approach to counter allograft rejection or combat autoimmunity. However, the complete depletion of T cells may not be favorable for the induction of immunological tolerance. A pro-tolerogenic approach may involve targeting subpopulations of T cells or selectively activated T cells without modifying Treg cells (Haudebourg et al., 2009). Thus, CD127 can be considered as a potentially attractive therapeutic target for monoclonal antibodies (MAbs) aimed at modulating immune responses, since such monoclonal antibodies may have the ability to deplete effector, but not regulatory lymphocytes. Accordingly, it has been suggested that they may be effective in transplantation, autoimmunity (Michel et al., 2008) and malignancy by antagonistic access of IL-7 to IL-7-R and thus limiting the function and growth of T- and B -cells.

Терапия моноклональным антителом против клеток CD127+, которая препятствует пути IL-7, могла бы достичь этой цели путем устранения/нейтрализации наивных Т-клеток и Т-клеток памяти и/или уменьшения их количества при сохранении клеток Treg или путем устранения или уменьшения количе- 7 041126 ства CD127-положительных злокачественных клеток. Однако терапия моноклональным антителом против клеток CD127+ может действовать как обоюдоострый меч, если она приводит к активации дендритных клеток. Действительно, CD127 также экспрессируется дендритными клетками в ассоциации с CRLF2, образуя рецептор TSLP. В присутствии TSLP дендритные клетки активируются и стимулируют опосредованные Т-клетками иммунные ответы. Некоторые моноклональные антитела против CD127, предположительно, путем изменения способа взаимодействия TSLP с рецептором TSLP, обладают способностью увеличивать созревание дендритных клеток, индуцированное TSLP. Как следствие, терапия моноклональным антителом против CD127, которая не будет увеличивать созревание дендритных клеток, индуцированное TSLP, будет обеспечивать терапевтическое преимущество. Это дало бы преимущество в виде блокирования IL7R без недостатка, связанного с активацией дендритных клеток в воспаленном окружении, содержащем TSLP.Anti-CD127+ monoclonal antibody therapy that interferes with the IL-7 pathway could achieve this goal by eliminating/neutralizing and/or reducing naïve and memory T cells while maintaining Treg cells, or by eliminating or reducing 041126 CD127-positive malignant cells. However, anti-CD127+ monoclonal antibody therapy can act as a double-edged sword if it results in dendritic cell activation. Indeed, CD127 is also expressed by dendritic cells in association with CRLF2 to form the TSLP receptor. In the presence of TSLP, dendritic cells are activated and stimulate T-cell mediated immune responses. Some monoclonal antibodies against CD127, presumably by changing the way TSLP interacts with the TSLP receptor, have the ability to increase TSLP-induced maturation of dendritic cells. As a consequence, anti-CD127 monoclonal antibody therapy that will not increase TSLP-induced maturation of dendritic cells will provide a therapeutic benefit. This would have the advantage of blocking IL7R without the disadvantage associated with dendritic cell activation in an inflamed environment containing TSLP.

В публикации (Racape et al., 2009) авторы проанализировали интересность альфа-рецептора IL-7 (IL7Ra) в качестве потенциальной терапевтической мишени при трансплантации. Рассмотрев экспрессию IL-7Ra на различных Т-клетках и клетках, реагирующих на IL-7, авторы определили, может ли нацеливание на Т-клетки памяти, экспрессирующие IL-7Ra, продлить выживаемость аллотрансплантата у мышей, и пришли к выводу, что нацеливание на IL-7 или IL-7Ra будет с пользой сберегать клетки Treg. Среди перспектив авторы указали, что нацеливание либо на IL-7, либо на IL-7Ra в терапевтическом лечении может иметь различные последствия для выживания клеток, экспрессирующих CD127, и может вызывать разные типы лимфопении. Вопрос об эффектах антител, которые будут направлены против IL7Ra в зависимости от того, будут ли они блокирующими или нейтрализующими, или цитотоксическими антителами, также был поставлен с концептуальной точки зрения. Авторы, тем не менее, не показали, что получили и проанализировали такие антитела, а скорее выразили необходимость дальнейших исследований, чтобы оценить актуальность этой гипотезы.In a publication (Racape et al., 2009), the authors analyzed the interest of the IL-7 receptor alpha (IL7Ra) as a potential therapeutic target in transplantation. By examining the expression of IL-7Ra on various T cells and IL-7 responsive cells, the authors determined whether targeting memory T cells expressing IL-7Ra could prolong allograft survival in mice, and concluded that targeting IL-7 or IL-7Ra will beneficially conserve Treg cells. Among the perspectives, the authors indicated that targeting either IL-7 or IL-7Ra in therapeutic treatment may have different consequences for the survival of cells expressing CD127 and may cause different types of lymphopenia. The question of the effects of antibodies that will be directed against IL7Ra, depending on whether they are blocking or neutralizing, or cytotoxic antibodies, has also been raised from a conceptual point of view. The authors, however, did not show that they obtained and analyzed such antibodies, but rather expressed the need for further research to assess the relevance of this hypothesis.

Ввиду недостатков доступных терапевтических подходов при связанных с иммунитетом заболеваниях и других заболеваниях, связанных с IL-7/IL-7Ra, таких как различные виды рака, включая некоторые виды рака молочной железы, все еще существует потребность в дополнительных лекарственных препаратах, особенно для кандидатов, активных в отношении более селективных мишеней с целью контроля, например, модулирования иммунной активации у людей.Due to the shortcomings of the available therapeutic approaches in immune-related and other IL-7/IL-7Ra-associated diseases such as various cancers, including some breast cancers, there is still a need for additional drugs, especially for candidates active against more selective targets to control, for example, modulate immune activation in humans.

В этом контексте моноклональные антитела против IL-7Ra, обладающие антагонистическими свойствами в отношении IL-7Ra, были раскрыты в WO2010/017468, и их гуманизированные версии - в WO2011/094259 с целью лечения аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз. Считается, что описанные антитела являются антагонистом для связывания IL-7 с его рецептором и активны против размножения и выживания клеток Th17 и Th1, для которых, как было сказано, требуется взаимодействие IL-7 с их рецептором CD127. Влияние этих антител на созревание иммунных клеток, и в частности дендритных клеток, не рассматривалось. Кроме того, сообщается, что эти антитела не ингибируют TSLPиндуцированную выработку TARC (стр.107 WO 2011/094259). Аналогично, анти-CD127-антитела, описанные в WO2011/104687 или в WO2013/056984, которые предполагаются для применения при лечении диабета, волчанки, ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний, не обсуждались в отношении их возможного влияния на созревание, дендритных клеток, и об их взаимодействии с TSLPиндуцированной передачей сигналов не сообщалось. Кроме того, как опубликовано Kern et al. (Kern et al., 2013; Kern et al., 2015) и как показано в настоящем документе, анти-CD127-антитела предшествующего уровня техники индуцируют интернализацию рецептора. Поскольку антагонистические антиCD127-антитела, которые также индуцируют интернализацию CD127, не способны контролировать гиперчувствительность кожного типа IV, тогда как антагонистические анти-CD127-антитела, которые не индуцируют интернализацию, способны на это, возможно, что процесс интернализации активирует сигнальный путь, смягчая антагонистический эффект антитела. Наконец, антитела предшествующего уровня техники распознают эпитоп, который не содержит никакой последовательности из сайта 2b CD127 (т.е., в частности, из аминокислот 109-180 SEQ ID NO: 22 или, в частности, из аминокислот 109-17 из SEQ ID NO: 22 или, в частности, из аминокислот 113-180 из SEQ ID NO: 22 или, в частности, из аминокислот 113-173 из SEQ ID NO: 22); и не было показано, что они нарушает связывание CD127 с yc-цепью IL7-R.In this context, anti-IL-7Ra monoclonal antibodies with IL-7Ra antagonistic properties have been disclosed in WO2010/017468 and humanized versions thereof in WO2011/094259 for the treatment of autoimmune diseases such as multiple sclerosis. The described antibodies are believed to be an antagonist for binding IL-7 to its receptor and are active against the expansion and survival of Th17 and Th1 cells, which have been said to require interaction of IL-7 with their CD127 receptor. The effect of these antibodies on the maturation of immune cells, and in particular dendritic cells, has not been considered. In addition, these antibodies are reported not to inhibit TSLP-induced TARC production (page 107 of WO 2011/094259). Similarly, anti-CD127 antibodies described in WO2011/104687 or WO2013/056984, which are proposed for use in the treatment of diabetes, lupus, rheumatoid arthritis, and other autoimmune diseases, have not been discussed with regard to their possible effect on maturation, dendritic cells, and their interaction with TSLP-induced signaling has not been reported. In addition, as published by Kern et al. (Kern et al., 2013; Kern et al., 2015) and as shown herein, prior art anti-CD127 antibodies induce receptor internalization. Because anti-CD127 antagonist antibodies that also induce CD127 internalization fail to control cutaneous type IV hypersensitivity, while anti-CD127 antagonist antibodies that do not induce internalization do, it is possible that the internalization process activates the signaling pathway, mitigating the antagonistic effect. antibodies. Finally, prior art antibodies recognize an epitope that does not contain any sequence from CD127 site 2b (i.e., in particular from amino acids 109-180 of SEQ ID NO: 22 or, in particular, from amino acids 109-17 of SEQ ID NO: 22 or in particular from amino acids 113-180 of SEQ ID NO: 22 or in particular from amino acids 113-173 of SEQ ID NO: 22); and have not been shown to interfere with CD127 binding to the yc chain of IL7-R.

Таким образом, несмотря на недавний интерес к разработке антител против CD127, усилия, были сосредоточены на ингибировании IL7-индуцированной передачи сигналов IL-7R. Вместе с тем, TSLP и TSLPR также оказались вовлеченными в ряд патологий. Было показано, что TSLP играет некую роль в заболеваниях кожи и легких (Не and Geha, 2010) и ассоциируется с различными патологиями, включая воспалительные заболевания дыхательных путей и атопический дерматит у человека и мышей (Ying et al., 2008) (Jariwala et al. 2011). Кроме того, было показано, что TSLP ассоциируется с регуляцией кишечного иммунитета и воспаления (Taylor et al., 2009). Другие патологии, включающие TSLP и TSLPR, включают В-клеточный лейкоз у детей (van Bodegom et al., 2012), аллергические заболевания легких и кожи, аутоиммунные заболевания (Roan et al., 2012) и рак, включая рак молочной железы (Olkhanud et al., 2011).Thus, despite recent interest in developing anti-CD127 antibodies, efforts have been focused on inhibiting IL7-induced IL-7R signaling. However, TSLP and TSLPR have also been implicated in a number of pathologies. TSLP has been shown to play a role in skin and lung diseases (He and Geha, 2010) and is associated with various pathologies including inflammatory airway disease and atopic dermatitis in humans and mice (Ying et al., 2008) (Jariwala et al. . 2011). In addition, TSLP has been shown to be associated with the regulation of intestinal immunity and inflammation (Taylor et al., 2009). Other pathologies involving TSLP and TSLPR include childhood B-cell leukemia (van Bodegom et al., 2012), allergic lung and skin diseases, autoimmune diseases (Roan et al., 2012), and cancer, including breast cancer (Olkhanud et al., 2011).

- 8 041126- 8 041126

Антитела, которые не проявляют эффекта увеличения созревания дендритных клеток и/или которые не вызывают интернализацию CD127 и/или которые ингибируют интернализацию, индуцированную IL7, были раскрыты в WO 2015/189302. Указанные антитела, названные N13B2 (химерное антитело), N13B2h1, N13B2-h2 и N13B2-h3 (гуманизированное N13B2) в указанной заявке и далее в настоящем документе, имеют высокую эффективность, особенно in vivo, и, в частности, как было показано, быстро воздействуют на эффекторные Т-клетки памяти, как определено далее. Однако указанные антитела гуманизированы в ограниченной степени, и их эффективность продуцирования также ограничена. Более того, не сообщалось о длительном воздействии указанных антител на эффекторные Т-клетки памяти.Antibodies that do not show the effect of increasing maturation of dendritic cells and/or that do not induce CD127 internalization and/or that inhibit IL7-induced internalization have been disclosed in WO 2015/189302. Said antibodies, referred to as N13B2 (chimeric antibody), N13B2h1, N13B2-h2 and N13B2-h3 (humanized N13B2) in this application and hereinafter, are highly effective, especially in vivo, and in particular have been shown to rapidly affect effector memory T cells, as defined below. However, these antibodies are humanized to a limited extent, and their production efficiency is also limited. Moreover, no long-term effects of these antibodies on effector memory T cells have been reported.

Изобретение относится к инструментам для конструирования новых антител, подходящих в качестве терапевтических кандидатов для введения пациентам с заболеванием, включающим сигнальные пути IL-7, или с риском такого заболевания. Согласно различным подходам, предложенным в настоящем документе, такие средства улучшают приготовление антител, предназначенных для введения людямхозяевам. Такие средства включают, в частности, гуманизированные, в частности моноклональные, антитела, которые содержат все CDR-последовательности N13B2-h3.The invention relates to tools for constructing novel antibodies suitable as therapeutic candidates for administration to patients with or at risk of a disease involving IL-7 signaling pathways. According to various approaches proposed herein, such tools improve the preparation of antibodies intended for administration to human hosts. Such agents include, in particular, humanized, in particular monoclonal, antibodies which contain all of the N13B2-h3 CDR sequences.

Такие полипептиды (или полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды) предложены, в частности, для получения антител (или их антигенсвязывающих фрагментов) и/или в виде антител (или их антигенсвязывающих фрагментов), в частности, которые специфически связываются с CD127; указанные антитела, в частности моноклональные антитела, содержат вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий три CDR-последовательности VHCDR1, приведенные в SEQ ID NO: 1, VHCDR2, приведенные в SEQ ID NO: 2, и VHCDR3, указанные в SEQ ID NO: 3. в частности, указанный вариабельный домен тяжелой цепи состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, или имеет указанную последовательность с дополнительными мутациями, в частности заменой, делецией или вставкой четырех остатков, предпочтительно трех или двух остатков и даже более предпочтительно одного остатка, предпочтительно, где указанные мутации не находятся ни в последовательностях CDR, ни в канонических положениях или положениях Вернье каркасных последовательностей.Such polypeptides (or polynucleotides encoding such polypeptides) are provided, in particular, for the production of antibodies (or antigen-binding fragments thereof) and/or as antibodies (or antigen-binding fragments thereof), in particular, which specifically bind to CD127; these antibodies, in particular monoclonal antibodies, contain a heavy chain variable domain containing three CDR sequences of VHCDR1 shown in SEQ ID NO: 1, VHCDR2 shown in SEQ ID NO: 2, and VHCDR3 shown in SEQ ID NO: 3. in particular, the specified heavy chain variable domain consists of the sequence specified in SEQ ID NO: 7, or has the specified sequence with additional mutations, in particular the substitution, deletion or insertion of four residues, preferably three or two residues, and even more preferably one residue, preferably, where said mutations are neither in the CDR sequences nor in the canonical or Vernier positions of the framework sequences.

Антитела, предложенные в настоящем документе, предпочтительно представляют собой моноклональные антитела, что означает, что композиция этих антител является гомогенной, в частности - идентичной, с точки зрения антигенсвязывающей специфичности и, соответственно, с точки зрения состава вариабельной области.The antibodies provided herein are preferably monoclonal antibodies, which means that the composition of these antibodies is homogeneous, in particular identical in terms of antigen-binding specificity and thus in terms of variable region composition.

Изобретение относится к антителам, которые имеют общие CDR с антителом N13B2-h3, но имеют отличающуюся структуру вариабельного домена легкой цепи. Авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что антитела, содержащие совпадающие CDR вариабельного домена легкой цепи N13B2-h3, т.е. CDR с SEQ ID NO: 4 и 5 и 6, но содержащие другую последовательность вариабельного домена легкой цепи, т.е. SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12; будучи в значительной степени гуманизированными, обеспечивают высокое продуцирование по сравнению с N13B2h3 (до 4 раз выше), сохраняя при этом все функциональные особенности.The invention relates to antibodies that share CDRs with the N13B2-h3 antibody but have a different light chain variable domain structure. The present inventors unexpectedly showed that antibodies containing matching CDRs of the N13B2-h3 light chain variable domain, i. CDRs of SEQ ID NOs: 4 and 5 and 6 but containing a different light chain variable domain sequence, i.e. SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12; being highly humanized, provide high production compared to N13B2h3 (up to 4 times higher), while maintaining all the functional features.

Изобретение относится к средствам, целесообразным в этом контексте, включающим, в частности, специфические моноклональные антитела против IL-7Ra. В частных вариантах реализации указанные антитела вмешиваются только отрицательно в путь TSLP. Соответственно, в предпочтительных воплощениях указанные антитела не увеличивают вызванное TSLP созревание дендритных клеток. В дополнение или в качестве альтернативы, в частных вариантах реализации, указанные антитела не индуцируют интернализацию CD127 и/или ингибируют индуцированную IL7 интернализацию CD127. В частных вариантах реализации указанные антитела объединяют эти свойства, связанные с созреванием DC и/или интернализацией, с антагонистической активностью в отношении передачи сигналов IL-7/IL-7-R. В частных вариантах реализации указанные антитела ингибируют индуцированную IL7 экспрессию интегринов α4, β7 и α4/β7 в Т-клетках, в частности in vivo. В частных вариантах реализации указанные антитела оказывают цитотоксическое действие против клеток-мишеней CD127+, которое физически уменьшают их количество (сокращение субпопуляции). В дополнение или в качестве альтернативы, в частных вариантах реализации указанные антитела включают по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 84% или более чем 84% и даже более предпочтительно по меньшей мере 85% человеческих остатков, согласно приведенному ниже определению. В дополнение или в качестве альтернативы, в частных вариантах реализации указанные антитела вырабатываются по меньшей мере так же эффективно, как N13B2-h3, предпочтительно по меньшей мере в два раза эффективнее, согласно приведенному ниже определению. В дополнение или в качестве альтернативы, в частных вариантах реализации указанные антитела оказывают быстрое и/или длительное действие на эффекторные Т-клетки памяти.The invention relates to agents useful in this context, including, in particular, specific monoclonal antibodies against IL-7Ra. In particular embodiments, said antibodies interfere only negatively with the TSLP pathway. Accordingly, in preferred embodiments, said antibodies do not increase TSLP-induced maturation of dendritic cells. In addition or alternatively, in particular embodiments, said antibodies do not induce CD127 internalization and/or inhibit IL7-induced CD127 internalization. In particular embodiments, said antibodies combine these DC maturation and/or internalization properties with IL-7/IL-7-R signaling antagonistic activity. In particular embodiments, said antibodies inhibit IL7-induced expression of α4, β7, and α4/β7 integrins in T cells, particularly in vivo. In particular embodiments, said antibodies have a cytotoxic effect against CD127+ target cells that physically reduces their number (subpopulation reduction). In addition or alternatively, in particular embodiments, said antibodies comprise at least 80%, preferably at least 84%, or more than 84%, and even more preferably at least 85% of human residues, as defined below. In addition or alternatively, in particular embodiments, said antibodies are produced at least as efficiently as N13B2-h3, preferably at least twice as efficiently, as defined below. In addition or alternatively, in particular embodiments, said antibodies have a rapid and/or long lasting effect on memory effector T cells.

В частности, антитела, предложенные в этом документе, содержат вариабельную тяжелую (VH) цепь, содержащую следующие аминокислотные последовательности:In particular, the antibodies provided herein comprise a variable heavy (VH) chain containing the following amino acid sequences:

VHCDR1 SEQ ID NO: 1; VHCDR2 SEQ ID NO: 2; VHCDR3 SEQ ID NO: 3.VHCDR1 SEQ ID NO: 1; VHCDR2 SEQ ID NO: 2; VHCDR3 SEQ ID NO: 3.

Антитела, предложенные в настоящем документе, предпочтительно содержат цепь VH, состоящую из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 7:The antibodies provided herein preferably comprise a VH chain consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 7:

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAVSGFTLSDYYMAWIRQAPGKGLEWVSTISASGLRTYYPDQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAVSGFTLSDYYMAWIRQAPGKGLEWVSTISASGLRTYYPD

- 9 041126- 9 041126

SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPLSAHYGFNYFDYWGQGTLVTVSS. Указанная вариабельная тяжелая цепь, в частности, связана с константной тяжелой цепью, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 26, с образованием полной тяжелой цепи антитела.SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPLSAHYGFNYFDYWGQGTLVTVSS. The specified variable heavy chain, in particular, is associated with a constant heavy chain, consisting of the sequence of SEQ ID NO: 26, with the formation of the full heavy chain of the antibody.

В частности, антитела, предложенные в настоящем документе, содержат цепь VL, состоящую из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, последовательности SEQ ID NO: 11 и последовательности SEQ ID NO: 12, в частности последовательность SEQ ID NO: 12:In particular, the antibodies provided herein comprise a VL chain consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12 , in particular the sequence of SEQ ID NO: 12:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYQGLAWYQQKPGKAPKLLLYSANTLHIGVPSRFSG SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYYDYPLAFGGGTKVEIK. Указанная вариабельная легкая цепь, в частности, связана с константной легкой цепью, состоящей из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28, в частности SEQ ID NO: 27, с образованием полной легкой цепи антитела.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYQGLAWYQQKPGKAPKLLLYSANTLHIGVPSRFSG SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYYDYPLAFGGGTKVEIK. Said variable light chain is specifically linked to a constant light chain consisting of a sequence selected from SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28, in particular SEQ ID NO: 27, to form a complete antibody light chain.

В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению специфически связывается с CD127, в частности с человеческим CD127, и содержит:In particular, an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the invention specifically binds to CD127, in particular human CD127, and contains:

легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен легкой цепи антитела, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; в частности SEQ ID NO: 12; а также вариабельный домен тяжелой цепи антитела, содержащий три CDR, состоящие из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, в частности вариабельный домен тяжелой цепи антитела, состоящий из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7.an antibody light chain comprising an antibody light chain variable domain consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; in particular SEQ ID NO: 12; as well as an antibody heavy chain variable domain containing three CDRs consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, in particular, an antibody heavy chain variable domain consisting of the sequence indicated in SEQ ID NO: 7.

В более конкретном варианте реализации изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с CD127, в частности с человеческим CD127, и содержит:In a more specific embodiment of the invention, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to CD127, in particular human CD127, and contains:

вариабельный домен легкой цепи антитела или легкую цепь антитела по изобретению, в частности, состоящие из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, в частности SEQ ID NO: 12; и вариабельный домен тяжелой цепи антитела, содержащий три CDR, состоящие из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, в частности вариабельный домен тяжелой цепи антитела, состоящий из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7.an antibody light chain variable domain or an antibody light chain of the invention, in particular consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, in particular SEQ ID NO: 12; and an antibody heavy chain variable domain comprising three CDRs consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, in particular an antibody heavy chain variable domain consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 7.

Связывание CD127.Binding of CD127.

В соответствии с изобретением термин связывание с белком IL-7Ra относится к взаимодействию типа антиген-антитело и охватывает свойства специфического связывания антител или их антигенсвязывающих фрагментов, причем специфическое связывание означает, что антитела или антигенсвязывающие фрагменты связываются с белком IL-7Ra, в то время как они не связываются или связываются со значительно более слабой аффинностью с другими белками (например, общей γ-цепью рецептора цитокинов). Специфическое связывание предпочтительно устанавливают и/или определяют в физиологических условиях, особенно с точки зрения рН и содержания соли в исследуемом растворе. Связывание и специфичность связывания можно анализировать в соответствии с тестами, раскрытыми в примерах, и, в частности, можно анализировать с помощью биосенсора, систем Blitz, Biacore, ELISA или вестерн-блотанализа.According to the invention, the term IL-7Ra protein binding refers to an antigen-antibody type interaction and encompasses the specific binding properties of antibodies or antigen-binding fragments thereof, where specific binding means that the antibodies or antigen-binding fragments bind to the IL-7Ra protein, while they do not bind, or bind with much weaker affinity, to other proteins (eg, the common cytokine receptor γ chain). Specific binding is preferably established and/or determined under physiological conditions, especially in terms of pH and salt content in the test solution. Binding and binding specificity can be analyzed according to the tests disclosed in the examples, and in particular can be analyzed using a biosensor, Blitz, Biacore, ELISA or Western blot systems.

В частных вариантах реализации антитела, предложенные в настоящем документе, нацелены на и связывают альфа-цепь IL-7-R, когда она образует комплекс в рецепторе TSLP (с CCRF2; номер доступа Genbank AF338733; Reche et al., 2001). В частных вариантах реализации антитела, предложенные в настоящем документе, связываются с CD127 в виде выделенного белка с константой аффинности (KD), равной или меньшей 5x10’9 М, что может быть определено биосенсорным анализом, в частности, методом Blitz. В частных вариантах реализации свойства связывания антител устанавливают или определяют с использованием антигена человеческого CD127, содержащего последовательности ep1 (SEQ ID NO: 19) и/или ер2 (SEQ ID NO: 20). В частных вариантах реализации антиген содержит фрагмент человеческого CD127, содержащий как ep1, так и ер2 (т.е. антиген содержит последовательности ep1 и ер2 и интеркалированные последовательности человеческого CD127). В частных вариантах реализации антитела, предложенные в настоящем документе, имеют по меньшей мере такую же аффинность к указанному антигену, что и антитело N13B2-h3, раскрытое в WO 2015/189302, и/или как антитело N13B2-hVL6, раскрытое в данном ID NO: 12) и/или что и антитело с VH, имеющей последовательность SEQ ID NO: 7, и VL с последовательностью SEQ ID NO: 10 или с последовательностью SEQ ID NO: 11.In particular embodiments, the antibodies provided herein target and bind the alpha chain of IL-7-R when it forms a complex at the TSLP receptor (with CCRF2; Genbank accession number AF338733; Reche et al., 2001). In particular embodiments, the antibodies provided herein bind to CD127 as an isolated protein with an affinity constant (KD) equal to or less than 5x10'9 M, which can be determined by biosensor analysis, in particular the Blitz method. In particular embodiments, antibody binding properties are determined or determined using the human CD127 antigen containing the sequences ep1 (SEQ ID NO: 19) and/or ep2 (SEQ ID NO: 20). In particular embodiments, the antigen comprises a human CD127 fragment containing both ep1 and ep2 (ie, the antigen contains ep1 and ep2 sequences and intercalated human CD127 sequences). In particular embodiments, the antibodies provided herein have at least the same affinity for said antigen as the N13B2-h3 antibody disclosed in WO 2015/189302 and/or as the N13B2-hVL6 antibody disclosed in this ID NO : 12) and/or that an antibody with a VH having the sequence of SEQ ID NO: 7 and a VL with the sequence of SEQ ID NO: 10 or with the sequence of SEQ ID NO: 11.

Способы исследования на связывание антител с их мишенью, либо полноразмерным CD127, выделенным, либо в виде TSLPR или IL7R, либо их антигеном, как указано выше, включая, в частности, метод Blitz, известны специалисту в данной области, и проиллюстрированы, в частности, на фиг. 3, в примере 3 и примере 4 в настоящем документе и на с. 14, фиг 3, 4 и 6 и в соответствующих пояснениях, а также в примерах 1, 2, 6, 7 в WO 2015/189302.Methods for assaying the binding of antibodies to their target, either full-length CD127 isolated, or as TSLPR or IL7R, or their antigen as above, including but not limited to the Blitz method, are known to those skilled in the art, and are illustrated in particular by in fig. 3, in example 3 and example 4 in this document and on p. 14, FIGS. 3, 4 and 6 and in the corresponding explanations, as well as in examples 1, 2, 6, 7 in WO 2015/189302.

Отсутствие повышенного TSLP-индуцированного созревания дендритных клеток.No increased TSLP-induced dendritic cell maturation.

Антитела, предложенные в настоящем документе, могут связывать CD127 в рецепторе TSLP (т.е. могут связывать CD127, когда он находится в комплексе с CRLF2, образуя рецептор TSLP). Следовательно, антитела, предложенные в настоящем документе, могут вмешиваться в передачу сигналов, вы- 10 041126 званную TSLP и/или рецептором TSLP. Предпочтительно антитела, предложенные в настоящем документе, не действуют синергически с TSLP для созревания иммунных клеток, в частности дендритных клеток. Другими словами, антитела по изобретению не увеличивают созревание иммунных клеток, индуцированных TSLP.The antibodies provided herein can bind CD127 at the TSLP receptor (ie, can bind CD127 when complexed with CRLF2 to form the TSLP receptor). Therefore, the antibodies provided herein may interfere with signaling induced by TSLP and/or the TSLP receptor. Preferably, the antibodies provided herein do not act synergistically with TSLP for the maturation of immune cells, in particular dendritic cells. In other words, the antibodies of the invention do not increase the maturation of immune cells induced by TSLP.

Этот эффект особенно желателен для созревания дендритных клеток. Средства для измерения такого эффекта известны специалисту и раскрыты, в частности, в WO 2015/189302 на страницах 16-17 и в примере 9 оттуда. В частности, антитела, предложенные в настоящем документе, не увеличивают экспрессию CD40 более чем на 50% по сравнению со стимуляцией только TSLP (без антитела). Предпочтительно экспрессия CD40 увеличивается не более чем на 25%, предпочтительно не более чем на 10% и еще более предпочтительно не более чем на 5%. В особенно предпочтительных вариантах реализации экспрессия CD40 в клетках, стимулированных TSLP и указанными антителами, не увеличивается или уменьшается по сравнению с клетками, стимулированными только TSLP.This effect is especially desirable for the maturation of dendritic cells. Means for measuring such an effect are known to the skilled person and are disclosed in particular in WO 2015/189302 on pages 16-17 and in example 9 therefrom. In particular, the antibodies provided herein do not increase CD40 expression by more than 50% compared to stimulation with TSLP alone (no antibody). Preferably CD40 expression is increased by no more than 25%, preferably no more than 10%, and even more preferably no more than 5%. In particularly preferred embodiments, CD40 expression in cells stimulated with TSLP and these antibodies is not increased or decreased compared to cells stimulated with TSLP alone.

Ингибирование IL7-индуцированной экспрессии интегринов α4, р7 и а4/р7.Inhibition of IL7-induced expression of α4, p7 and a4/p7 integrins.

В частных вариантах реализации антитела, предложенные в настоящем документе, ингибируют индуцированную IL7 экспрессию интегринов α4, β7 и α4/β7 in vitro. Индуцированная IL7 экспрессия интегринов α4, β7 и α4/β7 в настоящем документе обозначает либо увеличение уровня экспрессии интегринов α4 и β7, либо увеличение количества или соотношения Т-лимфоцитов, экспрессирующих α4, β7 и/или интегринов α4/β7, либо и то, и другое. Ингибирование может быть частичным, т.е. уровень экспрессии интегринов α4, P7 и а4/р7 в присутствии IL7 повышается по сравнению с базовым уровнем (т.е. уровнем без антител или IL7) в присутствии антител, но меньше, чем в отсутствие антител; или ингибирование может быть полным, т.е. уровень экспрессии интегринов α4, β7 и α4/β7 в присутствии IL7 и антитела не выше исходного уровня.In particular embodiments, the antibodies provided herein inhibit IL7-induced expression of α4, β7, and α4/β7 integrins in vitro. IL7-induced expression of α4, β7 and α4/β7 integrins, as used herein, refers to either an increase in the level of expression of α4 and β7 integrins, or an increase in the number or ratio of T lymphocytes expressing α4, β7 and/or α4/β7 integrins, or both. other. The inhibition may be partial, ie. the level of expression of α4, P7 and a4/p7 integrins in the presence of IL7 is increased compared to the baseline level (ie, the level without antibodies or IL7) in the presence of antibodies, but less than in the absence of antibodies; or the inhibition may be complete, ie. the level of expression of integrins α4, β7 and α4/β7 in the presence of IL7 and antibodies is not higher than the initial level.

В частных вариантах реализации антитела, предложенные в настоящем документе, ингибируют экспрессию интегринов α4, р7 и/или а4/р7 in vitro, т.е. уровень экспрессии интегринов α4, р7 и/или а4/р7 ниже в клетках, обработанных антителами (и с и/или без IL7), чем в необработанных клетках (т.е. без антител или IL7). Степень ингибирования может зависеть от дозы. Ингибирование экспрессии может быть более конкретно определено, исследовано и/или измерено, как изложено в WO 2015/189302 на с. 18, в частности в параграфе [58] и в примере 16.In particular embodiments, the antibodies provided herein inhibit the expression of α4, p7 and/or a4/p7 integrins in vitro, i. the level of expression of α4, p7 and/or a4/p7 integrins is lower in cells treated with antibodies (and/or without IL7) than in untreated cells (ie without antibodies or IL7). The degree of inhibition may be dose dependent. Inhibition of expression can be more specifically defined, investigated and/or measured, as set forth in WO 2015/189302 on p. 18, in particular in paragraph [58] and in example 16.

Ингибиторы интернализации CD127.CD127 internalization inhibitors.

В конкретном варианте реализации предложенные в настоящем документе антитела ингибируют индуцированную IL7 интернализацию CD127. Таким образом, при инкубации с указанными антителами присутствие IL7 не вызывает снижения экспрессии CD127 на клеточной поверхности или вызывает менее сильное снижение экспрессии CD127 на клеточной поверхности, чем клетки, инкубированные без антител. В частных вариантах реализации при инкубации с указанными антителами уровень экспрессии на клеточной поверхности CD127, когда клетки инкубируют при 37°С в течение 15 мин с 5 нг/мл IL7, составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% от уровня экспрессии на клеточной поверхности в клетках, инкубированных без IL7. В условиях in vitro экспрессию на клеточной поверхности предпочтительно измеряют по истечении ограниченного периода времени, как указано выше. Кроме того, поскольку при низкой температуре большинство процессов клеточной интернализации ингибированы, этот эффект обычно лучше всего наблюдается при физиологической температуре, в частности при 37°С. Однако также предполагается инкубировать клетки при низкой температуре, в частности при 4°С.In a specific embodiment, the antibodies provided herein inhibit IL7-induced internalization of CD127. Thus, when incubated with these antibodies, the presence of IL7 does not cause a decrease in CD127 expression on the cell surface, or causes a lesser decrease in CD127 expression on the cell surface than cells incubated without antibodies. In particular embodiments, upon incubation with said antibodies, the expression level on the cell surface of CD127 when the cells are incubated at 37°C for 15 min with 5 ng/ml IL7 is at least 80%, preferably at least 90% of the expression level. on the cell surface in cells incubated without IL7. Under in vitro conditions, expression on the cell surface is preferably measured after a limited period of time, as described above. In addition, since most cellular internalization processes are inhibited at low temperature, this effect is usually best observed at physiological temperature, in particular at 37°C. However, it is also contemplated to incubate the cells at a low temperature, in particular at 4°C.

В предпочтительном варианте реализации антитела, предложенные в настоящем документе, не вызывают интернализацию CD127. Таким образом, экспрессия клеточной поверхности CD127 в клетках, инкубированных в присутствии указанных антител, не снижается или существенно не снижается по сравнению с экспрессией клеточной поверхности в клетках, инкубированных в других идентичных условиях, но в отсутствие антитела. В частных вариантах реализации при инкубации при 37°С в течение от 30 до 45 мин в присутствии 50 нг/мл антитела уровень экспрессии CD127 на клеточной поверхности составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% от его уровня в инкубированных клетках, в отсутствие антитела. Этот эффект может наблюдаться и в отсутствие IL7 (как в обработанных антителами, так и в необработанных клетках), и в присутствии IL7, и/или в обоих случаях.In a preferred embodiment, the antibodies provided herein do not induce internalization of CD127. Thus, cell surface expression of CD127 in cells incubated in the presence of these antibodies is not reduced or significantly reduced compared to cell surface expression in cells incubated under otherwise identical conditions but in the absence of the antibody. In particular embodiments, upon incubation at 37°C for 30 to 45 minutes in the presence of 50 ng/ml of antibody, the expression level of CD127 on the cell surface is at least 80%, preferably at least 90% of its level in incubated cells, in the absence of antibodies. This effect can be observed in the absence of IL7 (both in antibody-treated and untreated cells), and in the presence of IL7, and/or both.

Два описанных выше признака, связанных с интернализацией CD127, (т.е. ингибирование интернализации, вызванной IL7 или неиндукция интернализации) могут быть дополнительно определены и/или исследованы, как изложено в WO2015/189302, в частности в параграфах [59]-[63] на страницах 19-20 и на фиг. 16 и в примере 5.The two features described above associated with CD127 internalization (i.e. inhibition of IL7-induced internalization or non-induction of internalization) can be further defined and/or investigated as set forth in WO2015/189302, in particular paragraphs [59]-[63 ] on pages 19-20 and in FIG. 16 and in example 5.

Нарушение взаимодействия CD127 - ус-цепи.Violation of the interaction of CD127 - mustache chain.

Согласно частному варианту реализации, антитела, предложенные в этом документе, могут нарушать связывание CD127 с ус-цепью IL7-R. Это означает, что в условиях (в частности, химических и физических условиях), когда CD127 и yc-цепь связаны друг с другом в отсутствие антитела и, в частности, в присутствии IL7, присутствие указанных антител значительно снижает указанную связь. В частных вариантах реализации в присутствии антитела и IL7 CD127 не связывается с ус. В частности, в присутствииIn a particular embodiment, the antibodies provided herein can interfere with the binding of CD127 to the IL7-R cinnamon chain. This means that under conditions (particularly chemical and physical conditions) where CD127 and the yc chain are linked to each other in the absence of an antibody, and in particular in the presence of IL7, the presence of said antibodies significantly reduces said linkage. In private embodiments, in the presence of the antibody and IL7, CD127 does not bind to yelp. Particularly in the presence

- 11 041126 антитела и IL-7 количество ус-цепи, обнаруженной ассоциированной с (или связанной) с CD127, составляет менее 80, предпочтительно менее 50, еще более предпочтительно менее 25 или 10% от количества, связанного в отсутствие антитела (или в присутствии другого антитела против CD-127, такого как MD707-13) в других идентичных условиях, в частности в присутствии IL7. Такая особенность антитела может быть оценена, в частности, с помощью методов совместной иммунопреципитации, хорошо известных специалисту по исседованию взаимодействия белков и проиллюстрированных, например, в WO 2015/189302 в примере 21. В частности, клетки можно инкубировать в присутствии или в отсутствие тестируемого антитела, затем солюбилизировать в условиях, обеспечивающих сохранение белковых комплексов, и полученный лизат можно подвергнуть иммунопреципитации с использованием анти-CD127, и оценить присутствие ус в CD127-содержащем иммунопреципитированном комплексе методом вестернблоттинга с использованием анти-ус-антител (и наоборот, иммунопреципитацию можно проводить с использованием анти-ус-антител, а присутствие CD127 оценить с использованием анти-CD127-антител).- 11 041126 antibodies and IL-7, the amount of cyl chain found associated with (or linked to) CD127 is less than 80, preferably less than 50, even more preferably less than 25 or 10% of the amount bound in the absence of antibody (or in the presence of another anti-CD-127 antibody such as MD707-13) under otherwise identical conditions, in particular in the presence of IL7. Such a feature of an antibody can be assessed, in particular, using co-immunoprecipitation methods well known to the expert in protein interaction research and illustrated, for example, in WO 2015/189302 in example 21. In particular, cells can be incubated in the presence or absence of the antibody to be tested. , then solubilized under conditions that preserve the protein complexes, and the resulting lysate can be subjected to immunoprecipitation using anti-CD127, and the presence of whisker in the CD127-containing immunoprecipitated complex can be assessed by western blot using anti-cotton antibodies (and vice versa, immunoprecipitation can be carried out with using anti-mc antibodies, and the presence of CD127 to assess using anti-CD127 antibodies).

Антагонист в отношении взаимодействия IL7-IL7-R.Antagonist for IL7-IL7-R interaction.

В соответствии с частным вариантом реализации макромолекула, в частности антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по изобретению дополнительно обладает антагонистическими свойствами в отношении интерлейкина 7 (IL7), тем самым антагонизируя доступ, т.е. связывание IL7 с CD127 на CD127-положительных клетках.According to a particular embodiment, the macromolecule, in particular the antibody or antigen-binding fragment thereof, according to the invention further possesses interleukin 7 (IL7) antagonistic properties, thereby antagonizing access, i.e. binding of IL7 to CD127 on CD127 positive cells.

Термин антагонистические свойства в отношении взаимодействия IL7-IL7-R означает, что антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению, которые нацелены на IL7-R-альфа, обладают эффектом предотвращения доступности рецептора IL7, экспрессируемого на клетках CD 127, особенно человеческих эффекторных Т-клетках, в частности человеческих Т-клетках памяти, для его связывающего партнера IL7, особенно человеческого IL7. В результате антагонистического связывания IL7 антитела по изобретению или их функциональные фрагменты приводят к лимфопении, предотвращая ГЬ7-зависимую тимусную генерацию Т-клеток.The term IL7-IL7-R interaction antagonistic properties means that the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the invention that target IL7-R-alpha have the effect of preventing the availability of the IL7 receptor expressed on CD127 cells, especially human effector T cells. , in particular human memory T cells, for its IL7 binding partner, especially human IL7. As a result of antagonistic binding of IL7, the antibodies of the invention or functional fragments thereof lead to lymphopenia, preventing IL7-dependent thymic generation of T cells.

Антагонистические свойства могут быть, в частности, антагонизмом в отношении передачи сигналов IL7-R, индуцируемой IL7. Антагонист передачи сигналов IL7-R, индуцированный IL7, может быть идентифицирован путем измерения ингибирования фосфорилирования STAT5, как описано в примерах. Индуцированное IL7 фосфорилирование STAT5 является маркером активации IL7-R, и ожидается, что антитело, противодействующее взаимодействию IL7-IL7-R, уменьшит индуцированное IL7 фосфорилирование STAT5.The antagonistic properties may in particular be antagonistic to IL7-R signaling induced by IL7. An IL7-R signaling antagonist induced by IL7 can be identified by measuring the inhibition of STAT5 phosphorylation as described in the examples. IL7-induced STAT5 phosphorylation is a marker for IL7-R activation, and an antibody that antagonizes the IL7-IL7-R interaction is expected to reduce IL7-induced STAT5 phosphorylation.

В частных вариантах реализации макромолекула по изобретению является антагонистом передачи сигналов IL7-R, индуцированных IL7. В конкретном варианте реализации макромолекула по изобретению ингибирует индуцированное IL7 фосфорилирование STAT5. В предпочтительных вариантах реализации ингибирование фосфорилирования STAT5 составляет более 50% при концентрациях антител до 55 нг/мл и/или ингибирование фосфорилирования STAT5 составляет более 80% при концентрациях антител до 100 нг/мл. Ингибирование фосфорилирования STAT5 можно оценивать способами, известными специалисту в данной области, и, в частности, способом, приведенным в разделе примеров, в частности, в примере 5 и/или на страницах 21, параграфы [69] и [70] и пример 3 из WO2015/189302.In particular embodiments, the macromolecule of the invention is an IL7-R signaling antagonist induced by IL7. In a specific embodiment, a macromolecule of the invention inhibits IL7-induced phosphorylation of STAT5. In preferred embodiments, the inhibition of STAT5 phosphorylation is greater than 50% at antibody concentrations up to 55 ng/ml and/or the inhibition of STAT5 phosphorylation is greater than 80% at antibody concentrations up to 100 ng/ml. Inhibition of STAT5 phosphorylation can be assessed by methods known to the person skilled in the art, and in particular by the method given in the examples section, in particular in example 5 and/or on pages 21, paragraphs [69] and [70] and example 3 of WO2015/189302.

Также желательно, чтобы макромолекула по изобретению (в частности антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или молекула-миметик антитела) ингибировала активацию и/или не активировала или не увеличивала активацию PI3-k и/или сигнальные пути ERK (внеклеточной сигнально-регулируемой киназы) и, в частности, ингибируют фосфорилирование и/или не индуцируют или не увеличивают фосфорилирование PI3-k и/или ERK 1 и/или ERK 2. В частности, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или молекулу-миметик антитела, предложенные в настоящем документе, и, в частности, такое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или молекулу-миметик антитела, которые являются антагонистом в отношении взаимодействия IL-7-IL-7R, не индуцируют активацию PI3-k и/или пути ERK (предпочтительно пути PI3-k и пути ERK), и, в частности, не индуцируют фосфорилирование PI3-k и/или ERK 1 и/или ERK 2, более конкретно, не индуцируют фосфорилирование PI3-k и ЕРК 1 и ERK 2. В частности, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или молекула-миметик антитела, предложенные в настоящем документе, и, в частности, такое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или молекуламиметик антитела, которые являются антагонистом в отношении взаимодействия IL-7-IL-7R, ингибируют активацию путей PI3-k и/или ERK и, в частности, ингибируют фосфорилирование PI3-k и/или ERK 1 и/или ERK 2, более конкретно ингибируют фосфорилирование PI3-k и ERK 1 и ERK 2. Активация путей и/или фосфорилирования указанных белков может быть исследована способами, известными специалисту, и, в частности, с помощью вестерн-блоттинга, как показано на фиг. 7 и в примере 8.It is also desirable that the macromolecule of the invention (in particular an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or an antibody mimetic molecule) inhibit the activation and/or not activate or increase the activation of PI3-k and/or ERK (extracellular signal-regulated kinase) signaling pathways and, specifically, inhibit phosphorylation and/or do not induce or increase phosphorylation of PI3-k and/or ERK 1 and/or ERK 2. In particular, an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or an antibody mimetic molecule as provided herein, and, in in particular, such an antibody, its antigen-binding fragment or antibody mimetic molecule, which is an antagonist with respect to the interaction of IL-7-IL-7R, does not induce activation of the PI3-k and/or the ERK pathway (preferably the PI3-k pathway and the ERK pathway), and, in particular, do not induce phosphorylation of PI3-k and/or ERK 1 and/or ERK 2, more specifically, do not induce phosphorylation of PI3-k and ERK 1 and ERK 2. In particular, an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or an antibody mimetic molecule as provided herein, and in particular such an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or an antibody mimetic molecule that antagonizes the IL-7-IL-7R interaction inhibits the activation of the PI3-k and/or ERK pathways, and in particular inhibit PI3-k and/or ERK 1 and/or ERK 2 phosphorylation, more specifically inhibit PI3-k and ERK 1 and ERK 2 phosphorylation. and in particular by Western blotting as shown in FIG. 7 and in example 8.

Антагонист для связывания TSLP.Antagonist for TSLP binding.

Поскольку антитела, предложенные в настоящем документе, связывают CD127 в IL7-R, они могут также связывать CD127 в TSLPR и, в частности, посредством стерического затруднения и/или конкуренции на общих сайтах связывания, они могут ингибировать связывание TSLP с TSLPR. Другими словами, антитела, предложенные в настоящем документе, могут проявлять антагонистическую активность в отношении связывания TSLP.Because the antibodies provided herein bind CD127 to IL7-R, they can also bind CD127 to TSLPR and, in particular, through steric hindrance and/or competition at common binding sites, they can inhibit TSLP binding to TSLPR. In other words, the antibodies provided herein may exhibit antagonistic activity against TSLP binding.

- 12 041126- 12 041126

Ингибитор TSLP-индуцированного продуцирования TARC.Inhibitor of TSLP-induced TARC production.

В конкретном варианте реализации антитела, предложенные в настоящем документе, ингибируют индуцированное TSLP продуцирование TARC CD127-положительными клетками. Как упомянуто выше, TSLP-стимулированные дендритные клетки продуцируют повышенные уровни TARC. Это может быть результатом их связывания с TSLPR и их потенциального действия в качестве антагонистов связывания TSLP. В конкретном варианте реализации антитела, предложенные в настоящем документе, не увеличивают созревание дендритных клеток (где созревание определяется, например, повышенной экспрессией маркера клеточной поверхности CD40 и/или CD80).In a specific embodiment, the antibodies provided herein inhibit TSLP-induced TARC production by CD127 positive cells. As mentioned above, TSLP-stimulated dendritic cells produce elevated levels of TARC. This may be a result of their binding to TSLPR and their potential action as TSLP binding antagonists. In a specific embodiment, the antibodies provided herein do not increase the maturation of dendritic cells (where maturation is determined, for example, by increased expression of the cell surface marker CD40 and/or CD80).

Уровень индуцированной TSLP выработки TARC может быть ниже в клетках, обработанных TSLP вместе с антителами против CD127, предложенными в настоящем документе, чем в клетках, обработанных одним TSLP. Другими словами, антитела, предлагаемые в настоящем документе, могут быть ингибиторами TSLP-индуцированной выработки TARC. В варианте реализации изобретения антитела, предложенные в настоящем документе, снижают уровни выработки TARC. В конкретном варианте реализации уровень выработки TARC в клетках, обработанных TSLP и антителом, предложенным в настоящем документе, снижается более чем на 10%, предпочтительно более чем на 20%, по сравнению с уровнем в клетках, обработанных одним TSLP, даже при низких концентрациях антител 1 мкг/мл. Измерение выработки TARC может быть выполнено на CD127-положительных иммунных клетках, в частности на дендритных клетках, из образца крови с использованием любого стандартного способа, известного специалисту, и проиллюстрировано, например, в WO 2015/189302 в примере 9.The level of TSLP-induced TARC production may be lower in cells treated with TSLP together with the anti-CD127 antibodies provided herein than in cells treated with TSLP alone. In other words, the antibodies provided herein may be inhibitors of TSLP-induced TARC production. In an embodiment, the antibodies provided herein reduce levels of TARC production. In a specific embodiment, the level of TARC production in cells treated with TSLP and the antibody provided herein is reduced by more than 10%, preferably by more than 20%, compared with the level in cells treated with TSLP alone, even at low antibody concentrations. 1 µg/ml. The measurement of TARC production can be performed on CD127 positive immune cells, in particular dendritic cells, from a blood sample using any standard method known to those skilled in the art and is illustrated, for example, in WO 2015/189302 in Example 9.

Цитотоксическая активность.cytotoxic activity.

В конкретном варианте реализации антитела, предложенные в настоящем документе, являются цитотоксическими в отношении клеток человека, особенно человеческих Т-клеток, экспрессирующих CD127. Клетками человека, экспрессирующими CD127 в виде цепи рецептора IL7, являющегося мишенью для указанных антител, являются в основном Т-лимфоциты и, более точно, субпопуляции эффекторных Т-лимфоцитов, включая наивные Т-клетки и Т-клетки памяти, но не являются регуляторными Тклетками (Treg), особенно - не являются покоящимися натуральными Treg. Т-клетки памяти генерируются в результате праймирования антигенов и в основном определяются их функциональными характеристиками, в том числе способностью подвергаться пролиферации при повторной активации и дифференцировке во вторичные эффекторные клетки и клетки памяти. Аналогично, целевой рецептор TSLP (как комплекс, включающий альфа-цепь IL-7-R) регулирует дифференцировку Т-хелперных лимфоцитов, Вклеток и дендритных клеток.In a specific embodiment, the antibodies provided herein are cytotoxic to human cells, especially human T cells expressing CD127. Human cells expressing CD127 as the IL7 receptor chain targeted by these antibodies are primarily T-lymphocytes and, more specifically, subsets of effector T-lymphocytes, including naïve and memory T-cells, but are not regulatory T-cells. (Treg), especially - are not resting natural Treg. Memory T cells are generated as a result of antigen priming and are mainly determined by their functional characteristics, including the ability to proliferate upon reactivation and differentiate into secondary effector and memory cells. Similarly, the target TSLP receptor (as a complex comprising the alpha chain of IL-7-R) regulates the differentiation of T-helper lymphocytes, B cells and dendritic cells.

В частности, антитела, предложенные в настоящем документе, обладающие цитотоксической активностью в отношении Т-клеток или цитотоксическими свойствами (цитотоксические антитела), вызывают истощение популяции эффекторных Т-клеток, убивая эти клетки, и соответственно уменьшают количество этих клеток при введении. И наоборот, указанные антитела не изменяют субпопуляцию регуляторных Т-клеток или не изменяют ее в значительной степени, позволяя клеткам Treg выполнять свою функцию. В этом контексте в конкретном варианте реализации после введения указанных антител соотношение регуляторных Т (Treg) к эффекторным Т (Teff) клеткам увеличивается. В частности, антитела, предложенные в настоящем документе, позволяют повысить указанное соотношение примерно на 10% или более. В частности, увеличение соотношения Treg по сравнению с Teff составляет около 20%.In particular, the antibodies provided herein having cytotoxic activity against T cells or cytotoxic properties (cytotoxic antibodies) deplete the population of effector T cells by killing these cells and consequently decrease the number of these cells when administered. Conversely, these antibodies do not alter or significantly alter the regulatory T cell subset, allowing the Treg cells to perform their function. In this context, in a specific embodiment, following the administration of said antibodies, the ratio of regulatory T (Treg) to effector T (Teff) cells is increased. In particular, the antibodies provided herein can increase this ratio by about 10% or more. In particular, the increase in the ratio Treg compared to Teff is about 20%.

В частности, цитотоксические антитела проявляют антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В качестве альтернативы, антитела, предложенные в настоящем документе, не имеют свойств ADCC. Потенциал ADCC антитела может считаться положительным, когда специфическая цитотоксичность составляет, например, выше 10%. Свойства ADCC можно оценить в анализе ADCC, таком как тест, описанный в примере 10 WO 2015/189302. Когда антитело представляет собой антитело крысы, эффекторными клетками, используемыми в анализе ADCC, предпочтительно являются клетки LAK (лимфокин-активируемый киллер) крысы. Когда антитела являются гуманизированными, анализ ADCC можно проводить, в частности, на человеческих NK-клетках.In particular, cytotoxic antibodies exhibit antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Alternatively, the antibodies provided herein do not have ADCC properties. The ADCC potential of an antibody can be considered positive when the specific cytotoxicity is, for example, above 10%. ADCC properties can be assessed in an ADCC assay such as the test described in Example 10 of WO 2015/189302. When the antibody is a rat antibody, the effector cells used in the ADCC assay are preferably rat LAK (lymphokine-activated killer) cells. When the antibodies are humanized, the ADCC assay can be performed in particular on human NK cells.

Антитела по изобретению, которые обладают как цитотоксическими, так и антагонистическими свойствами против CD127-положительных клеток, обеспечивают кумулятивный эффект этих свойств в отношении истощения эффекторных Т-клеток, особенно Т-клеток памяти, тем самым обеспечивая более сильное истощение (истощение пула CD127+ клеток) и соответствующее уменьшение количества Тклеток-мишеней.Antibodies of the invention that have both cytotoxic and antagonistic properties against CD127-positive cells provide a cumulative effect of these properties on the depletion of effector T cells, especially memory T cells, thereby providing more severe depletion (depletion of the CD127+ cell pool) and a corresponding decrease in the number of target T cells.

В приведенных выше параграфах, а также в примерах описано, как исследовать соответствующие желаемые функциональные характеристики антител, предложенных в этом документе. В следующих разделах будут подробно описаны различные структурные характеристики и возможные модификации антител. В свете этих указаний специалист в данной области сможет получить антитела, имеющие нижеприведенные структурные характеристики, а также желательные функциональные характеристики, в частности, взяв за начало антитело N13B2-hVL6, которое имеет желаемые функциональные характеристики.The above paragraphs, as well as the examples, describe how to explore the appropriate desired functional characteristics of the antibodies proposed in this document. The following sections will detail the various structural characteristics and possible modifications of antibodies. In light of these guidelines, one skilled in the art will be able to produce antibodies having the following structural characteristics as well as desired functional characteristics, in particular by starting with the N13B2-hVL6 antibody which has the desired functional characteristics.

Специалисту известно, что при введении людям, желательно, чтобы антитела представляли как можно более сильную гомологию с человеческими антителами. Степень идентичности с человеческим антителом измеряется как процент человеческих остатков в последовательности антитела, в частности, вThe skilled artisan will recognize that when administered to humans, it is desirable that the antibodies show as much homology as possible to human antibodies. The degree of identity with a human antibody is measured as the percentage of human residues in the antibody sequence, specifically in

- 13 041126 каркасе вариабельного домена легкой или тяжелой цепи антитела, т.е. процент остатков в последовательности антитела, в частности, в каркасе вариабельного домена легкой или тяжелой цепи антитела, которые идентичны в том же функциональном положении остатку в наиболее гомологичном из известных человеческих антител, в частности в каркасе наиболее гомологичного известного вариабельного домена легкой или тяжелой цепи человеческого антитела. Эта особенность как правило выражена в настоящем документе, как и в литературе, как антитело А (или каркасная последовательность его вариабельного домена) имеет хх% человеческих остатков, что означает, что антитело А (или каркасная последовательность его вариабельного домена) имеет хх% остатков, которые идентичны в том же функциональном положении остаткам наиболее гомологичного из известных антител человека (или каркасной последовательности его вариабельного домена). Такая степень идентичности может быть измерена с помощью средств, известных специалисту, и, в частности, с помощью инструмента DomainGapAlign Международной информационной системы по иммуногенетике (IMGT), как было выяснено в ходе открытого заседания группы экспертов INN ВОЗ (апрель 2015 г.). Предпочтительно, антитела, предложенные в настоящем документе, имеют более чем 80, еще более предпочтительно по меньшей мере 84, более чем 84 и даже более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичности с антителом человека, в частности, на основании определения с использованием инструмента DomainGapAlign. Указанная степень идентичности может быть определена только для вариабельного домена легкой цепи или только для легкой цепи (по сравнению с вариабельным доменом легкой цепи или легкой цепи человеческого антитела) или для легкой цепи и тяжелой цепи, взятых вместе, путем сравнения каждой цепи с наиболее гомологичной соответствующей цепью человеческого антитела и регистрации кумулятивного процента идентичности. В частности, вариабельный домен легкой цепи антитела или легкая цепь антитела по изобретению составляет по меньшей мере 80, более конкретно, 84, и еще более конкретно по меньшей мере 85% человеческих остатков. Вариабельные домены легкой цепи конкретного антитела, предложенные в данном документе, имеют соответственно 84,2% (SEQ ID NO: 9); 85,3% (SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11) и 86,3% (SEQ ID NO: 12) человеческих остатков. Предпочтительный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, предложенный в настоящем документе (SEQ ID NO: 7), имеет 90,8% человеческих остатков.- 13 041126 framework of the variable domain of the light or heavy chain of the antibody, i.e. percentage of residues in an antibody sequence, in particular in the backbone of an antibody light or heavy chain variable domain, that are identical in the same functional position to a residue in the most homologous known human antibody, in particular in the backbone of the most homologous known light or heavy chain variable domain of a human antibody . This feature is generally expressed here, as in the literature, as antibody A (or the framework sequence of its variable domain) has xx% human residues, which means that antibody A (or the framework sequence of its variable domain) has xx% residues, which are identical in the same functional position to the residues of the most homologous known human antibody (or the framework sequence of its variable domain). This degree of identity can be measured by means known to the skilled artisan, and in particular by the International Immunogenetics Information System (IMGT) DomainGapAlign tool, as was clarified during the WHO INN Expert Group Public Meeting (April 2015). Preferably, the antibodies provided herein have greater than 80, even more preferably at least 84, greater than 84, and even more preferably at least 85% identity with a human antibody, particularly as determined using the DomainGapAlign tool. The indicated degree of identity can be determined for the light chain variable domain alone, or for the light chain alone (compared to the light chain or light chain variable domain of a human antibody), or for the light chain and heavy chain taken together, by comparing each chain with the most homologous corresponding human antibody chain and recording the cumulative percent identity. In particular, the light chain variable domain of an antibody or light chain of an antibody of the invention is at least 80, more specifically 84, and even more specifically at least 85% of human residues. The light chain variable domains of a particular antibody provided herein are respectively 84.2% (SEQ ID NO: 9); 85.3% (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11) and 86.3% (SEQ ID NO: 12) human residues. The preferred heavy chain variable domain of the antibody provided herein (SEQ ID NO: 7) has 90.8% human residues.

Вариабельный домен легкой цепи антитела, предложенного в настоящем документе, может включать до 135 аминокислот, предпочтительно до 120 аминокислот и еще более предпочтительно до 110 или 107 аминокислот. Вариабельный домен легкой цепи антитела, предложенного в настоящем документе, может включать по меньшей мере 80, предпочтительно по меньшей мере 90 и даже более предпочтительно по меньшей мере 100 или 106 аминокислот. Вариабельный домен легкой цепи антитела, предложенного в настоящем документе, может содержать от 80 до 135, предпочтительно от 90 до 120 и еще более предпочтительно от 105 до 110 аминокислот. Предложенная в настоящем документе легкая цепь антитела может содержать до 250 аминокислот, предпочтительно до 230 аминокислот и еще более предпочтительно до 214 или 211 аминокислот. Предложенная в настоящем документе легкая цепь антитела может содержать по меньшей мере 150, предпочтительно по меньшей мере 190 и даже более предпочтительно по меньшей мере 200 или 210 аминокислот. Предложенная в настоящем документе легкая цепь антитела может включать от 150 до 250, предпочтительно от 190 до 230 и еще более предпочтительно от 210 до 220 аминокислот.The light chain variable domain of an antibody provided herein may be up to 135 amino acids, preferably up to 120 amino acids, and even more preferably up to 110 or 107 amino acids. The light chain variable domain of an antibody provided herein may comprise at least 80, preferably at least 90, and even more preferably at least 100 or 106 amino acids. The light chain variable domain of an antibody provided herein may comprise 80 to 135, preferably 90 to 120, and even more preferably 105 to 110 amino acids. An antibody light chain as provided herein may be up to 250 amino acids, preferably up to 230 amino acids, and even more preferably up to 214 or 211 amino acids. As provided herein, an antibody light chain may comprise at least 150, preferably at least 190, and even more preferably at least 200 or 210 amino acids. As provided herein, an antibody light chain may comprise 150 to 250, preferably 190 to 230, and even more preferably 210 to 220 amino acids.

В настоящем документе также представлены полипептиды, которые представляют собой (i) антигенсвязывающие фрагменты антител, предложенных в данном документе, в частности антигенсвязывающие фрагменты, состоящие из или содержащие фрагмент легкой цепи антитела или вариабельных областей легкой цепи антитела, предложенных в настоящем документе, вариабельный домен тяжелой цепи антитела, предложенный в настоящем документе, и/или (ii) молекулы-миметики антител, предложенные в настоящем документе.Also provided herein are polypeptides that are (i) antigen-binding fragments of antibodies provided herein, in particular antigen-binding fragments consisting of or containing an antibody light chain fragment or antibody light chain variable regions provided herein, a heavy variable domain antibody chains as provided herein; and/or (ii) antibody mimetic molecules as provided herein.

Антигенсвязывающий фрагмент представляет собой полипептид, который специфически связывается с белком CD127, согласно определению выше в соответствующем разделе (параграфы [44]-[47]), и содержит по меньшей мере три CDR из N13B2-h3 (состоящие из последовательности SEQ ID NO: 4-6), предпочтительно фрагмент вариабельных доменов легкой цепи, предложенный в настоящем документе (с SEQ ID NO: 9-12), содержащий указанные последовательности CDR. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать по меньшей мере 40, предпочтительно по меньшей мере 50 и еще более предпочтительно по меньшей мере 70 или 74 аминокислоты. Антитело-связывающий фрагмент может содержать не более 100, предпочтительно не более 90 и даже более предпочтительно не более 80 или 74 аминокислот. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать от 40 до 100, от 50 до 90 и предпочтительно от 60 до 100 и еще более предпочтительно от 50 до 70 или от 60 до 80 аминокислот. Антигенсвязывающий фрагмент, предложенный в настоящем документе, может, в частности, иметь любые подходящие функциональные признаки, раскрытые в отношении антител, предложенных в этом документе, в частности признаки, раскрытые в пунктах [47]-[62].An antigen-binding fragment is a polypeptide that specifically binds to the CD127 protein, as defined above in the relevant section (paragraphs [44]-[47]), and contains at least three CDRs from N13B2-h3 (consisting of the sequence SEQ ID NO: 4 -6), preferably the light chain variable domain fragment provided herein (with SEQ ID NOs: 9-12) containing the indicated CDR sequences. The antigen binding fragment may contain at least 40, preferably at least 50, and even more preferably at least 70 or 74 amino acids. An antibody binding fragment may contain no more than 100, preferably no more than 90, and even more preferably no more than 80 or 74 amino acids. The antigen binding fragment may contain 40 to 100, 50 to 90 and preferably 60 to 100 and even more preferably 50 to 70 or 60 to 80 amino acids. The antigen-binding fragment provided herein may in particular have any suitable functional features disclosed in relation to the antibodies provided herein, in particular the features disclosed in paragraphs [47]-[62].

Соответственно, выделенный полипептид, предложенный в настоящем документе, может состоять из последовательности до 250 аминокислот, конкретно до 217, до 214, до 211, более конкретно, до 200, до 175 до 150, до 135, до 120, до 107, еще более конкретно, до 100, до 90, до 80, до 74, до 70, до 60 амиAccordingly, an isolated polypeptide provided herein may be composed of a sequence of up to 250 amino acids, specifically up to 217, up to 214, up to 211, more specifically up to 200, up to 175 to 150, up to 135, up to 120, up to 107, even more specifically, up to 100, up to 90, up to 80, up to 74, up to 70, up to 60 am

- 14 041126 нокислот.- 14 041126 no acids.

Молекула-миметик антитела представляет собой полипептид со свойствами, подобными антителу, в частности, со сходными свойствами связывания с CD127. Миметиками антител могут быть, например, молекулы-аффитела, аффилины, аффимеры, антикалины, монотела и т.д. Молекула-миметик антитела, предложенная в настоящем документе, может, в частности, иметь любые подходящие функциональные признаки, раскрытые в отношении антител, предложенных в настоящем документе, в частности, признаки, раскрытые в пунктах [47]-[62].An antibody mimetic molecule is a polypeptide with antibody-like properties, in particular similar binding properties to CD127. Antibody mimetics can be, for example, affitel molecules, affilins, affimers, anticalins, monobodies, and the like. An antibody mimetic molecule provided herein may in particular have any suitable functional features disclosed in relation to the antibodies provided herein, in particular the features disclosed in paragraphs [47]-[62].

В частности, антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит константные домены, полученные из константных доменов человека. В частности, константный домен легкой цепи антитела происходит от константного домена легкой цепи каппа человека и/или константный домен тяжелой цепи антитела происходит от константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG4 человека, особенно от константной области тяжелой цепи IgG4 человека. Полученный из означает некоторые точечные мутации путем аминокислотных замен, таких как IgG4 (S228P) или IgGl (E333A). Эти мутации, хорошо известные специалисту в данной области, обычно модифицируют некоторые свойства родительской цепи. Например, они приводят к меньшей иммуногенности по сравнению с родительским антителом или отменяют связывание с Fcy-рецептором или устраняют димеризацию мономерного антитела или стабилизируют димеризацию, делая антитела лучше для терапевтического использования у человека. Антитело по изобретению, полученное из родительского константного домена тяжелой и легкой цепи, содержит или состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 или в SEQ ID NO: 28 или их фрагмента, соответственно. Более конкретно, константный домен легкой цепи антитела состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 27. В частности, константный домен тяжелой цепи антитела содержит или состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26, или ее фрагмента. Более конкретно, константный домен тяжелой цепи антитела состоит из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 26.In particular, the antibody of the invention is a humanized antibody that contains constant domains derived from human constant domains. In particular, an antibody light chain constant domain is derived from a human kappa light chain constant domain and/or an antibody heavy chain constant domain is derived from a human IgG1, IgG2 or IgG4 heavy chain constant region, especially a human IgG4 heavy chain constant region. Derived from means some point mutations by amino acid substitutions such as IgG4 (S228P) or IgGl (E333A). These mutations, well known to the person skilled in the art, usually modify some property of the parent strand. For example, they result in less immunogenicity than the parent antibody, or abolish Fcy receptor binding, or abolish dimerization of a monomeric antibody, or stabilize dimerization, making the antibody better for therapeutic use in humans. An antibody of the invention derived from a heavy and light chain parental constant domain contains or consists of the sequence shown in SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28, or a fragment thereof, respectively. More specifically, the antibody light chain constant domain consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 27. In particular, the antibody heavy chain constant domain comprises or consists of the sequence set forth in SEQ ID NO: 26, or a fragment thereof. More specifically, the heavy chain constant domain of an antibody consists of the sequence shown in SEQ ID NO: 26.

В настоящем документе также представлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид по изобретению, или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем документе. В частности, указанные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют вариабельный домен легкой цепи или легкую цепь антитела, предложенного в настоящем документе, в комбинации с выделенными молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими тяжелую цепь антитела, предложенными в настоящем документе, в соответствии с любым из приведенных в настоящем документе определений. В частности, в настоящем документе предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий или состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12. В частности, выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18. В частности, указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты представлена в комбинации с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь, включающую три CDR, состоящие из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, в частности, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, более конкретно, выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13. В предпочтительном варианте реализации представлена комбинация выделенных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанная комбинация включает или состоит из первой выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18; и второй выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 13. В другом предпочтительном варианте реализации представлена комбинация выделенных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанная комбинация включает или состоит из первой выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 18; и второй выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 13.Also provided herein are isolated nucleic acid molecules encoding a polypeptide of the invention, or an antibody or antigen-binding fragment thereof, provided herein. In particular, said nucleic acid molecules encode the light chain variable domain or light chain of an antibody provided herein in combination with the isolated heavy chain encoding nucleic acid molecules provided herein, in accordance with any of the definitions provided herein. . In particular, provided herein is an isolated nucleic acid molecule encoding a polypeptide comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12. In particular, the isolated nucleic acid molecule of the invention comprises or consists of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 18 In particular, said isolated nucleic acid molecule is presented in combination with an isolated nucleic acid molecule encoding a heavy chain comprising three CDRs consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, in particular encoding a heavy chain variable domain consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 7, more specifically, an isolated nucleic acid molecule consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 13. In a preferred embodiment, a combination of isolated nucleic acid molecules is provided. acids encoding an antibody or an antigen-binding fragment thereof, said combination comprising or consisting of a first isolated nucleic acid molecule containing and consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; and a second isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 13. In another preferred embodiment, a combination of isolated nucleic acid molecules encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof is provided, said combination comprising or consisting of a first isolated nucleic acid molecule, containing or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 18; and a second isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 13.

В настоящем документе также представлены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную последовательность полной легкой цепи, включающую как вариабельный, так и константный домен, т.е., в частности, полинуклеотиды, кодирующие одну из последовательностей SEQ ID NO: 9-12 и последовательность SEQ ID NO: 27 или 28, в частности полинуклеотиды, содержащие или состоящие из одной из последовательностей SEQ ID NO: 15-18, конкатенированных с SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31. Такие полинуклеотиды представлены, в частности, в комбинации с полинуклеотидом, кодирующим полипептидную последовательность полной тяжелой цепи, содержащей как вариабельный, так и константный домен, т.е., в частности, полинуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO: 7 и последовательность SEQ ID NO: 26, в частности, полинуклеотиды, содержащие или состоящие из SEQ ID NO: 13, конкатенированной с SEQ ID NO: 29.Also provided herein are polynucleotides encoding a complete light chain polypeptide sequence comprising both a variable and a constant domain, i.e., in particular, polynucleotides encoding one of the sequences of SEQ ID NO: 9-12 and the sequence of SEQ ID NO: 27 or 28, in particular polynucleotides containing or consisting of one of the sequences of SEQ ID NO: 15-18 concatenated with SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31. Such polynucleotides are presented, in particular, in combination with a polynucleotide encoding a polypeptide sequence of a complete heavy chain containing both a variable and a constant domain, i.e., in particular, polynucleotides encoding SEQ ID NO: 7 and the sequence of SEQ ID NO: 26, in particular, polynucleotides containing or consisting of SEQ ID NO: 13 concatenated with SEQ ID NO: 29.

В частности, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные в настоящем документе,In particular, the isolated nucleic acid molecules provided herein

- 15 041126 могут преимущественно содержать, помимо последовательности, кодирующей легкую цепь и, необязательно, тяжелую цепь антитела, предложенного в настоящем документе, в обратном направлении от последовательности, кодирующей указанные цепи антитела, последовательность, кодирующую сигнальный пептид, позволяя секретировать указанные цепи при экспрессии в продуцирующей клетке. Они также могут содержать одну или несколько последовательностей, кодирующих один или несколько маркерных пептидов, для обнаружения и/или облегчения очистки указанных цепей.- 15 041126 may advantageously contain, in addition to the sequence encoding the light chain and optionally the heavy chain of the antibody provided herein, upstream from the sequence encoding said antibody chains, a sequence encoding a signal peptide, allowing said chains to be secreted when expressed in producing cell. They may also contain one or more sequences encoding one or more marker peptides to detect and/or facilitate purification of said chains.

В настоящем документе также представлен вектор для клонирования и/или экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, предложенной в настоящем документе. В частности, указанный предложенный вектор представляет собой плазмиду, подходящую для клонирования и/или экспрессии в клетках млекопитающих, которая содержит регуляторные последовательности для транскрипции и экспрессии. Соответственно, в данном документе предложен вектор, содержащий полинуклеотид, описанный выше, в частности полинуклеотид, описанный в параграфах [76]-[78].This document also provides a vector for cloning and/or expression of the nucleic acid molecule proposed herein. In particular, said proposed vector is a plasmid suitable for cloning and/or expression in mammalian cells, which contains regulatory sequences for transcription and expression. Accordingly, this document provides a vector containing the polynucleotide described above, in particular the polynucleotide described in paragraphs [76]-[78].

Кроме того, в данном документе предложены клетки или клеточные линии, рекомбинированные с молекулой нуклеиновой кислоты, как указано выше, в частности вектор, особенно, клетки или клеточные линии млекопитающих или птиц, в частности, как подробно показано на фиг. 2. Например, Клетки яичника китайского хомяка, генетически модифицированные для уменьшения глобального фукозилирования. Действительно, антитела, в которых отсутствует фукозилирование ядра, демонстрируют значительно повышенную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) (von Horsten et al., 2010). Другим примером является клеточная линия ЕВ66, которая, по природе, обладает свойствами низкого фукозилирования (Olivier et al., 2010). Антитела могут также продуцироваться в клетках, временно трансфицированных молекулой нуклеиновой кислоты, как указано выше, в частности вектором, в частности клетками COS, в частности, как подробно описано в примере 2.Further provided herein are cells or cell lines recombined with a nucleic acid molecule as defined above, in particular a vector, especially mammalian or avian cells or cell lines, in particular as detailed in FIG. 2. For example, Chinese hamster ovary cells genetically modified to reduce global fucosylation. Indeed, antibodies lacking nuclear fucosylation exhibit significantly increased antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) (von Horsten et al., 2010). Another example is the EB66 cell line, which is naturally low fucosylated (Olivier et al., 2010). Antibodies can also be produced in cells transiently transfected with a nucleic acid molecule as above, in particular with a vector, in particular COS cells, in particular as detailed in Example 2.

В настоящем документе также представлены способы получения полипептида, предложенного в настоящем документе, в частности, легкой цепи антитела и/или моноклонального антитела, причем указанные способы включают стадию экспрессии указанного полипептида, легкой цепи антитела или моноклонального антитела (или легкой и, необязательно, тяжелой цепи моноклонального антитела) в клетках, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полипептид, в условиях, обеспечивающих выделение указанного полипептида и стадию выделения указанного полипептида. В частности, антитела или их фрагменты получают в клетках, которые обладают низкими свойствами фукозилирования, таких как клетки птиц ЕВ66.Also provided herein are methods for producing a polypeptide as provided herein, in particular an antibody light chain and/or a monoclonal antibody, said methods comprising the step of expressing said polypeptide, antibody light chain or monoclonal antibody (or light and optionally heavy chain monoclonal antibody) in cells containing a nucleic acid molecule encoding said polypeptide, under conditions that allow the isolation of said polypeptide and the step of isolating said polypeptide. In particular, antibodies or fragments thereof are produced in cells that have poor fucosylation properties, such as avian EB66 cells.

В настоящем документе также представлена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид (в частности, вариабельный домен легкой цепи антитела или легкую цепь антитела) и/или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или соответствующую молекулу-миметик антитела, и/или выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, согласно определению выше, и фармацевтический носитель. Указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другой активный ингредиент. Указанная композиция представлена, в частности, в составе, подходящем для системного введения или для местного применения. В частности, в настоящем документе предложены композиции, подходящие для местного применения, в частности для внутримышечной или подкожной инъекции, для инъекции с использованием устройства, такого как автоинъектор (или ручка-инъектор), для трансдермального введения, в частности с использованием трансдермального пластыря, для трансмукозального введения, в частности интраназального или ректального введения. В частности, в настоящем документе предложены композиции, подходящие для местного введения в желудочно-кишечный тракт (GI), в частности посредством перорального введения, в частности для лечения кишечного заболевания, такого как болезнь Крона или ЯК, в частности композиции, подходящие для доставки в толстую кишку. В частности, в настоящем документе предложены композиции, подходящие для системного введения, в частности для парентерального или энтерального введения, в частности для внутривенного введения или перорального введения. Как известно специалисту, энтеральное введение может быть либо местным введением в желудочно-кишечный тракт, либо системным введением. В тех случаях, когда такие фармацевтические композиции или их применения представлены в настоящем документе, следует понимать, что также могут быть представлены носитель для введения и их применения, например, когда фармацевтическая композиция для инъекций представлена явно, следует понимать, что композиция представлена сама по себе, а также в устройстве или в комбинации с устройством, позволяющим выполнять введение и/или инъекцию указанной композиции (устройство для доставки). Примеры устройств для доставки включают, среди прочего, автоинъекторы, в частности многокамерные шприцы и трансдермальные пластыри. Соответственно, в данном документе предоставляется устройство для доставки, в частности автоинжектор, насос или трансдермальный пластырь, содержащие указанную композицию, и их применения, как представлено ниже в отношении фармацевтических композиций. В настоящем документе также представлен набор, включающий фармацевтическую композицию и устройство для локальной доставки, в частности устройство для подкожной, энтеральной или пероральной доставки, в частности предварительно заполненный шприц или безыгольное устройство, содержащее указанную композицию и/или подходящее для введение указанной композиции, и его применение, как представлено ниже в отношении фармацевтических композиций. Такая фармацевтическая композиция предоставляется в любой подходящей форме для ввеAlso provided herein is a pharmaceutical composition comprising a polypeptide (in particular, an antibody light chain variable domain or an antibody light chain) and/or an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, or a corresponding antibody mimetic molecule, and/or an isolated nucleic acid molecule as defined above, and a pharmaceutical carrier. Said pharmaceutical composition may additionally contain another active ingredient. Said composition is presented, in particular, in a formulation suitable for systemic administration or for topical administration. In particular, this document provides compositions suitable for topical use, in particular for intramuscular or subcutaneous injection, for injection using a device such as an auto-injector (or injector pen), for transdermal administration, in particular using a transdermal patch, for transmucosal administration, in particular intranasal or rectal administration. In particular, this document provides compositions suitable for topical administration to the gastrointestinal (GI) tract, in particular by oral administration, in particular for the treatment of an intestinal disease such as Crohn's disease or UC, in particular compositions suitable for delivery to large intestine. In particular, this document provides compositions suitable for systemic administration, in particular for parenteral or enteral administration, in particular for intravenous administration or oral administration. As is known to the skilled person, enteral administration can be either local administration to the gastrointestinal tract or systemic administration. Where such pharmaceutical compositions or uses thereof are provided herein, it is to be understood that a carrier for administration and their use may also be provided, e.g., where a pharmaceutical composition for injection is expressly provided, it is to be understood that the composition is provided by itself. , as well as in a device or in combination with a device that allows the introduction and/or injection of the specified composition (delivery device). Examples of delivery devices include, but are not limited to, autoinjectors such as multi-chamber syringes and transdermal patches. Accordingly, provided herein is a delivery device, such as an auto-injector, a pump, or a transdermal patch, containing said composition, and their use as set out below in relation to pharmaceutical compositions. The present document also provides a kit comprising a pharmaceutical composition and a device for local delivery, in particular a device for subcutaneous, enteral or oral delivery, in particular a pre-filled syringe or a needleless device containing said composition and/or suitable for administering said composition, and its the use as set out below for pharmaceutical compositions. Such a pharmaceutical composition is provided in any suitable form for administration.

- 16 041126 дения, в том числе в виде раствора, в частности стерильного водного раствора, в виде суспензии, в виде твердого вещества, в частности лиофилизированного твердого вещества, в частности для адсорбции на (или в адсорбированном виде на) пластыре, и/или для ресуспендирования и введения в виде раствора, в виде пилюли, таблетки или другой твердой формы, подходящей для перорального введения, в частности с отсроченным или пролонгированным высвобождением, в виде наночастиц, например, композиция, содержащая наночастицы с полипептидом, адсорбированным на поверхности или внутри указанных наночастиц и т.д. Форма фармацевтической композиции и, необязательно, характер устройства для доставки могут быть подходящими для доставки активного ингредиента, предложенного в настоящем документе, системно или локально, т.е. может подходить для активного ингредиента для достижения целевых клеток, тканей, органов в активном состоянии. В частности, форма фармацевтической композиции и, необязательно, характер устройства доставки могут быть подходящими для доставки в желудочно-кишечный тракт, в частности в толстую кишку. Считается, что фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель; однако фармацевтические композиции также предоставляются без носителя для аналогичных применений и целей, когда такой носитель не требуется для фармацевтического применения, например, если продукт вводят в виде чистого лиофилизированного твердого вещества. В частности, введение осуществляют в соответствии с любыми подходящими способами, такими, как описанные в настоящем документе для кишечного высвобождения, особенно для кишечного отсроченного высвобождения.- 16 041126 denium, including in the form of a solution, in particular a sterile aqueous solution, in the form of a suspension, in the form of a solid, in particular a lyophilized solid, in particular for adsorption on (or in adsorbed form on) a patch, and / or for resuspension and administration in the form of a solution, in the form of a pill, tablet or other solid form suitable for oral administration, in particular with a delayed or prolonged release, in the form of nanoparticles, for example, a composition containing nanoparticles with a polypeptide adsorbed on the surface or within these nanoparticles, etc. The form of the pharmaceutical composition and optionally the nature of the delivery device may be suitable for delivering the active ingredient provided herein systemically or locally, i. may be suitable for the active ingredient to reach the target cells, tissues, organs in the active state. In particular, the form of the pharmaceutical composition and optionally the nature of the delivery device may be suitable for delivery to the gastrointestinal tract, in particular the colon. It is believed that the pharmaceutical composition contains a pharmaceutically acceptable carrier; however, pharmaceutical compositions are also provided without a carrier for similar uses and purposes when such a carrier is not required for the pharmaceutical use, for example, if the product is administered as a pure lyophilized solid. In particular, the introduction is carried out in accordance with any suitable methods, such as described herein for intestinal release, especially for intestinal delayed release.

В настоящем документе также представлена композиция, содержащая в качестве активного ингредиента полипептид (в частности, вариабельный домен легкой цепи антитела или легкую цепь антитела) и/или антитело (в частности, моноклональное антитело), соответствующий антигенсвязывающий фрагмент или молекулу миметик антитела, согласно определению выше, или фармацевтическая композиция, согласно определению выше, в составе, подходящем для контроля выживания или размножения CD127положительных клеток человека, в частности CD127-положительных эффекторных клеток человека, особенно выживания или размножения Т-клеток памяти CD127+, особенно Т-клеток памяти, которые одновременно являются CD127+ и CD8+, или которые одновременно являются клетками CD127+ и CD4+, при введении пациенту-человеку. В частности, указанная композиция, содержащая антитело (или другой агент, как указано выше) в качестве активного ингредиента, находится в составе, подходящем для контроля дифференцировки и/или созревания дендритных клеток при введении пациенту.Also provided herein is a composition comprising, as an active ingredient, a polypeptide (particularly an antibody light chain variable domain or an antibody light chain) and/or an antibody (particularly a monoclonal antibody), an appropriate antigen-binding fragment, or an antibody mimetic molecule as defined above. , or a pharmaceutical composition as defined above, in a formulation suitable for controlling the survival or expansion of human CD127 positive cells, in particular human CD127 positive effector cells, especially the survival or expansion of CD127+ memory T cells, especially memory T cells, which are both CD127+ and CD8+, or which are both CD127+ and CD4+ cells, when administered to a human patient. In particular, said composition containing an antibody (or other agent as defined above) as an active ingredient is in a formulation suitable for controlling the differentiation and/or maturation of dendritic cells when administered to a patient.

Авторы изобретения неожиданно показали, что однократная инъекция антитела, предложенного в настоящем документе, обеспечивает устойчивый эффект, и воспалительный ответ все еще значительно снижен у животных, которых лечили однократной инъекцией предложенных антител, вплоть до 14 месяцев и даже до 18 месяцев после указанной однократной инъекции. Введение и предпочтительно однократное введение полипептида, в частности легкой цепи антитела и, более конкретно, антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или молекулы - миметика антитела, предложенного в настоящем документе, предпочтительно оказывает быстрое и/или длительное действие на эффекторные Т-клетки памяти. Быстрый эффект наблюдается предпочтительно в течение недели и более предпочтительно в течение 48 ч и еще более предпочтительно в течение дня после введения указанного полипептида, цепи антитела или антитела. Длительный эффект наблюдается предпочтительно по меньшей мере 12 месяцев и более предпочтительно по меньшей мере 14 месяцев после самого последнего (и, предпочтительно, однократного) введения указанного полипептида, цепи антитела или антитела. Такой эффект является, в частности, обратимым (в частности, ответ Т-клеток может быть восстановлен новой вакцинацией). Такой эффект предпочтительно является специфическим в отношении антигена и/или ответа и предпочтительно не ассоциирован с измеримой лимфодеплецией (т.е. общее количество лимфоцитов у субъекта не уменьшается, согласно измерениям обычными способами). В остальном такой эффект можно определить как клональную делецию Т-клеток памяти или как обратимую антигенспецифическую делецию иммунной Т-памяти. Влияние такого введения на эффекторные Т-клетки памяти может быть оценено путем сравнения уровней секретирутощих IFN-γ клеток (измеренных, например, с помощью ELISPOT) в ответ на антиген, например, туберкулин, у вакцинированных субъектов (в частности, у павианов), которых позднее лечили полипептидом, цепью антитела или моноклональным антителом, предложенным в настоящем документе, и у необработанных вакцинированных субъектов: эффект является наблюдаемым, если измеренный уровень антигенспецифических Т-клеток значительно ниже (предпочтительно по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 40% ниже) у получивших лечение субъектов в соответствующий момент времени после лечения. Такой эффект можно также измерить, оценивая другим способом воспалительную реакцию на данный антиген, например, местную, в частности кожную, воспалительную реакцию в ответ на местно вводимый антиген. В качестве альтернативы, может быть использован анализ тетрамера МНС. Способы исследования такого эффекта известны специалисту в данной области и проиллюстрированы в настоящем документе, в частности, в примере 6.The inventors have unexpectedly shown that a single injection of the antibody provided herein provides a sustained effect and the inflammatory response is still significantly reduced in animals treated with a single injection of the proposed antibodies up to 14 months and even up to 18 months after said single injection. The introduction and preferably a single administration of a polypeptide, in particular the light chain of an antibody and, more specifically, an antibody, its antigen-binding fragment or antibody mimetic molecule, proposed herein, preferably has a rapid and/or long-term effect on memory effector T cells. A rapid effect is observed preferably within a week and more preferably within 48 hours and even more preferably within a day after administration of said polypeptide, antibody chain or antibody. A lasting effect is observed preferably at least 12 months and more preferably at least 14 months after the most recent (and preferably single) administration of said polypeptide, antibody chain or antibody. This effect is, in particular, reversible (in particular, the response of T cells can be restored by a new vaccination). Such an effect is preferably antigen and/or response specific and preferably not associated with measurable lymphodepletion (i.e., the subject's total lymphocyte count is not reduced as measured by conventional methods). Otherwise, this effect can be defined as a clonal deletion of memory T-cells or as a reversible antigen-specific deletion of immune T-memory. The effect of such administration on effector memory T cells can be assessed by comparing the levels of secreting IFN-γ cells (measured, for example, by ELISPOT) in response to an antigen, for example, tuberculin, in vaccinated subjects (in particular, baboons), which later treated with a polypeptide, antibody chain or monoclonal antibody provided herein and in untreated vaccinated subjects: an effect is observable if the level of antigen-specific T cells measured is significantly lower (preferably at least 10%, more preferably at least 40 % below) in treated subjects at the appropriate time point after treatment. Such an effect can also be measured by assessing in another way the inflammatory response to a given antigen, for example, a local, in particular skin, inflammatory response in response to a locally administered antigen. Alternatively, an MHC tetramer assay can be used. Methods for investigating such an effect are known to the person skilled in the art and are illustrated herein, in particular in Example 6.

Кроме того, авторы изобретения неожиданно показали, что антитело, предложенное в настоящем документе, может оказывать быстрое действие, в частности на активацию Т-клеток, в частности на высвобождение цитокинов Т-клетками, в частности в воспалительной ткани. Такой эффект, в частности, наблюдается в течение недели, предпочтительно в течение 48 и даже более предпочтительно в течениеIn addition, the inventors unexpectedly showed that the antibody proposed herein can have a rapid effect, in particular on the activation of T cells, in particular on the release of cytokines by T cells, in particular in inflammatory tissue. This effect, in particular, is observed within a week, preferably within 48 and even more preferably within

- 17 041126 ч после введения антитела, и, в частности, наблюдается как уменьшение выработки (или высвобождения) IFNy. Такой эффект, в частности, наблюдается локально, т.е. в месте введения антитела или в месте доставки. В частности, антитело, предложенное в настоящем документе, производит быстрый эффект, в частности быстрый локальный эффект, в частности, на высвобождение цитокинов Т-клетками, в частности, производит эффект, наблюдаемый в течение 24 ч после введения. Когда антитело вводят для локальной доставки, но не непосредственно в месте предполагаемой доставки, антитело может оказывать быстрый эффект, как описано выше, в месте доставки, в течение тех же периодов времени после доставки, а не после введения, что может подразумевать или не подразумевать задержку от момента введения, как известно специалисту.- 17 041126 hours after the administration of the antibody, and, in particular, is observed as a decrease in the production (or release) of IFNy. Such an effect, in particular, is observed locally; at the site of administration of the antibody or at the site of delivery. In particular, the antibody provided herein has a rapid effect, in particular a rapid local effect, in particular on the release of cytokines by T cells, in particular, an effect observed within 24 hours after administration. When an antibody is administered for local delivery, but not directly at the site of intended delivery, the antibody may have a rapid effect, as described above, at the site of delivery, for the same time periods after delivery, rather than after administration, which may or may not imply a delay. from the moment of introduction, as known to the specialist.

Композиция, предложенная в настоящем документе, может дополнительно содержать дополнительное соединение, обладающее терапевтическим иммуномодуляторным действием, в частности, на клетки, участвующие в аллергит или аутоиммунитете. Для иллюстрации, примерами представляющих интерес иммуномодуляторов являются другие моноклональные антитела, нацеленные на Т-клетки, такие как анти-CD3, анти-ICOS или анти-CD28-антитела, или рекомбинантные белки или антитела, нацеленные на вспомогательные А-клетки, такие как CTLA4Ig или анти-CD40-антитела.The composition provided herein may additionally contain an additional compound having a therapeutic immunomodulatory effect, in particular on cells involved in allergitis or autoimmunity. To illustrate, examples of immunomodulators of interest are other monoclonal antibodies targeting T cells, such as anti-CD3, anti-ICOS, or anti-CD28 antibodies, or recombinant proteins or antibodies targeting helper A cells, such as CTLA4Ig. or anti-CD40 antibodies.

Полипептид, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или молекула-миметик антитела, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, клетка и/или композиция, предложенные в настоящем документе, могут быть представлены в комбинированном продукте, включающем дополнительные продукты, в частности агент с терапевтическим иммуномодуляторным эффектом, как указано выше, в частности, предназначенные для одновременного, раздельного или последовательного введения. В данном документе предложен комбинированный продукт, содержащий полипептид (в частности, вариабельный домен легкой цепи антитела или легкую цепь антитела) и/или антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его молекулу-миметик, и/или выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, клетку или клеточную линию и/или фармацевтическую композицию, согласно определению выше, и необязательно дополнительно включающий: агент с терапевтическим иммуномодуляторным действием, в частности, предназначенный для введения в сочетании, например, с антителом по настоящему изобретению, в частности, когда указанное введение является либо одновременным, либо раздельным по времени, и/или когда указанное введение осуществляется тем же или другим путем; и/или устройство для введения продукта.A polypeptide, antibody, antigen-binding fragment thereof, or antibody mimetic molecule, isolated nucleic acid molecule, cell and/or composition provided herein may be provided in a combined product comprising additional products, in particular an agent with a therapeutic immunomodulatory effect, as indicated above, in particular those intended for simultaneous, separate or sequential administration. This document provides a combined product containing a polypeptide (in particular, an antibody light chain variable domain or an antibody light chain) and/or an antibody, an antigen-binding fragment thereof or a mimetic molecule thereof, and/or an isolated nucleic acid molecule, a vector, a cell, or a cellular line and/or pharmaceutical composition as defined above, and optionally further comprising: an agent with a therapeutic immunomodulatory effect, in particular intended to be administered in combination with, for example, an antibody of the present invention, in particular when said administration is either simultaneous or separate in time, and/or when said administration is by the same or different route; and/or a device for introducing the product.

Полипептид, в частности легкая цепь антитела и/или антитело, в частности моноклональное антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент, или молекула-миметик антитела и/или нуклеиновая кислота, вектор, клетка или клеточная линия и/или фармацевтическая композиция или композиция, согласно определению выше, в частности, представлены для применения у пациента-человека для лечения патологий или патологических состояний, на которые влияют иммунные ответы, особенно ответы Т-клеток памяти. Такие состояния или патологии включают состояния или патологии, вызванные отторжением трансплантата, аутоиммунные заболевания, аллергические заболевания, респираторные заболевания, хронические вирусные инфекции, хронические воспалительные заболевания, в частности хронические кишечные воспалительные заболевания, лимфому, лейкоз или другие раковые заболевания, включая заболевания, которые возникают в результате солидных опухолей, когда эти патологии ассоциированы с CD127-положительными клетками, а также с сигнальным путем IL-7, в частности, когда следует избегать увеличения созревания дендритных клеток. Соответственно, авторы изобретения показывают, что использование указанных агентов может быть рассмотрено для лечения конкретных аллергических кожных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), в частности болезни Крона (CD) или язвенного колита (ЯК), или первичного синдрома Шегрена, или системной красной волчанки, или системного склероза, или рассеянного склероза, или диабета типа I или острого лимфобластного лейкоза (например, Т-ОЛЛ) или лимфомы Ходжкина, или рака молочной железы, ассоциированного с клетками CD127+, рака почки, рака мочевого пузыря, рака легкого, рака поджелудочной железы или для лечения Т-клеточной лимфомы кожи, такой как лимфома Сезари, или для лечения острого лимфобластного лейкоза с мутацией усиления функции пути IL-7-R/TSLP или для лечения отторжения трансплантата и/или пациентов, нуждающихся в трансплантации и/или на стадии подготовки к трансплантации и/или перенесших трансплантацию. В предпочтительных вариантах реализации рассматривается лечение воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), в частности болезни Крона (CD) или язвенного колита (ЯК), или первичного синдрома Шегрена, или системной красной волчанки, или системного склероза, или рассеянного склероза, или диабета типа I. В частности, изобретение относится к полипептиду или его антителу или антигенсвязывающему фрагменту или его молекуле-миметику антитела, или к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, или к фармацевтической композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства, более конкретно для применения в профилактике или лечении отторжения трансплантата органа или ткани или заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, в частности ревматоидного артрита, системного склероза, рассеянного склероза, диабета I типа, аутоиммунного тиреоидита, системной красной волчанки, первичного синдрома Шегрена и воспалительных заболеваний, в частности воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), более конкретно, болезни Крона и язвенного колита, и энцефаломиелита, а также аллергических заболеваний и раковых заболеваний и заболеваний, связанных с трансплантацией, и респираторных заболеваний, предA polypeptide, in particular an antibody light chain and/or an antibody, in particular a monoclonal antibody and/or an antigen-binding fragment, or an antibody mimetic molecule and/or a nucleic acid, a vector, cell or cell line and/or a pharmaceutical composition or composition as defined above are in particular provided for use in a human patient for the treatment of pathologies or pathological conditions that are influenced by immune responses, especially memory T cell responses. Such conditions or pathologies include conditions or pathologies caused by transplant rejection, autoimmune diseases, allergic diseases, respiratory diseases, chronic viral infections, chronic inflammatory diseases, in particular chronic intestinal inflammatory diseases, lymphoma, leukemia, or other cancers, including diseases that occur as a result of solid tumors, when these pathologies are associated with CD127-positive cells, as well as with the IL-7 signaling pathway, in particular, when increased maturation of dendritic cells should be avoided. Accordingly, the inventors show that the use of these agents can be considered for the treatment of specific allergic skin diseases, inflammatory bowel diseases (IBD), in particular Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC), or primary Sjögren's syndrome, or systemic lupus erythematosus , or systemic sclerosis, or multiple sclerosis, or type I diabetes, or acute lymphoblastic leukemia (eg, T-ALL), or Hodgkin's lymphoma, or CD127+ cell-associated breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, lung cancer, pancreatic cancer gland or for the treatment of T-cell lymphoma of the skin, such as Sezary's lymphoma, or for the treatment of acute lymphoblastic leukemia with an enhancement-of-function mutation in the IL-7-R/TSLP pathway, or for the treatment of transplant rejection and/or patients requiring transplantation and/or stages of preparation for transplantation and/or those who underwent transplantation. In preferred embodiments, the treatment of inflammatory bowel disease (IBD) is contemplated, in particular Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) or primary Sjogren's syndrome or systemic lupus erythematosus or systemic sclerosis or multiple sclerosis or type I diabetes. In particular, the invention relates to a polypeptide, or an antibody thereof, or an antigen-binding fragment, or an antibody mimetic molecule thereof, or an isolated nucleic acid molecule, or a pharmaceutical composition of the invention for use as a medicament, more particularly for use in the prevention or treatment of transplant rejection. organ or tissue or disease selected from the group consisting of autoimmune diseases, in particular rheumatoid arthritis, systemic sclerosis, multiple sclerosis, type I diabetes, autoimmune thyroiditis, systemic lupus erythematosus, primary Sjögren's syndrome and inflammatory diseases, in particular inflammatory diseases bowel disease (IBD), more specifically, Crohn's disease and ulcerative colitis, and encephalomyelitis, as well as allergic diseases and cancers and diseases associated with transplantation, and respiratory diseases,

- 18 041126 почтительно при местном применении.- 18 041126 respectfully when applied topically.

В настоящем документе предложены применения полипептида, легкой цепи антитела или антитела, соответствующего антигенсвязывающего фрагмента или молекулы-миметика антитела при лечении патологических состояний, включающих изменение иммунного ответа у пациента-человека, приводящее к доминантному толерогенному статусу, или, напротив, отсутствию толерантности в случаях, когда необходим контроль уровня иммунного ответа, а также разрушение злокачественных CD127-положительных клеток.Provided herein are uses of a polypeptide, antibody light chain, or antibody, corresponding antigen-binding fragment, or antibody mimetic molecule in the treatment of pathological conditions involving altered immune response in a human patient resulting in a dominant tolerogenic status, or conversely, intolerance in cases when it is necessary to control the level of the immune response, as well as the destruction of malignant CD127-positive cells.

Под лечением или терапевтическим лечением подразумевается, что проведенные этапы введения приводят к улучшению клинического состояния животного или человека, нуждающегося в этом, страдающего от расстройства (расстройств), ассоциированных с путем IL-7, т.е. включающих активацию или пролиферацию CD127-положительных клеток. Такое лечение направлено на улучшение клинического состояния животного или человека-пациента путем устранения или облегчения симптомов, ассоциированных с расстройством (-ами), связанными с путем IL-7, т.е. с активацией или пролиферацией CD127положительных клеток. Предпочтительно лечение, предлагаемое в настоящем документе, позволяет восстановить здоровье. Предпочтительно, указанное лечение не имеет нежелательных отрицательных эффектов, связанных с повышенным созреванием иммунных клеток, в частности дендритных клеток.By treatment or therapeutic treatment is meant that the administration steps carried out result in an improvement in the clinical condition of the animal or human in need thereof suffering from the disorder(s) associated with the IL-7 pathway, i.e. including activation or proliferation of CD127-positive cells. Such treatment aims to improve the clinical condition of the animal or human patient by eliminating or alleviating the symptoms associated with the disorder(s) associated with the IL-7 pathway, ie. with activation or proliferation of CD127 positive cells. Preferably, the treatment provided herein is to restore health. Preferably, said treatment does not have the undesirable negative effects associated with increased maturation of immune cells, in particular dendritic cells.

В частных аспектах лечения пациентов представлены полипептид, антитело, антигенсвязывающий фрагмент, молекула-миметик антитела, полинуклеотид, клетки или клеточная линия или композиция, предназначенные и/или подходящие для применения для истощения CD127-положительных клеток при сохранении CD127-отрицательных клеток.In particular aspects of treating patients, a polypeptide, antibody, antigen-binding fragment, antibody mimetic molecule, polynucleotide, cell or cell line or composition is provided for and/or suitable for use in depleting CD127-positive cells while maintaining CD127-negative cells.

В частных аспектах лечения пациентов представлено применение полипептида, антитела, антигенсвязывающего фрагмента, молекулы-миметика антитела, полинуклеотида, клеток или клеточной линии или композиции, предназначенных и/или подходящих для применения для предотвращения дифференцировки и/или экспансии и/или созревания CD127-положительных клеток, в частности дифференцировки, экспансии или созревания, индуцируемых IL-7 и/или TSLP, при этом оказывая незначительное влияние или не оказывая прямого влияния на CD127-негативные клетки.In particular aspects of treating patients, the use of a polypeptide, antibody, antigen-binding fragment, antibody mimetic molecule, polynucleotide, cell or cell line or composition intended and/or suitable for use in preventing differentiation and/or expansion and/or maturation of CD127-positive cells is provided. , in particular differentiation, expansion or maturation induced by IL-7 and/or TSLP, while having little or no direct effect on CD127-negative cells.

В частных аспектах лечения пациентов представлено применение полипептида, антитела, антигенсвязывающего фрагмента, молекулы-миметика антитела, полинуклеотида, клеток или клеточной линии или композиции, предназначенных и/или подходящих для применения для устранения/нейтрализации наивных Т-клеток и Т-клеток памяти путем вмешательства в передачу сигналов, индуцированную IL-7, при сохранении Treg-клеток.In particular aspects of the treatment of patients, the use of a polypeptide, antibody, antigen-binding fragment, antibody mimetic molecule, polynucleotide, cell or cell line, or composition intended and/or suitable for use in the elimination/neutralization of naive and memory T cells by intervention is provided. into IL-7 induced signaling while maintaining Treg cells.

В частных аспектах лечения пациентов представлено применение полипептида, антитела, антигенсвязывающего фрагмента, молекулы-миметика антитела, полинуклеотида, линии клеток или клеток, предназначенных и/или подходящих для применения для истощения субпопуляций лимфоцитов или других популяций клеток, экспрессирующих CD127 (включая нормальные или патологические Т- и Влимфоциты, NK-клетки, дендритные клетки и другие типы клеток, включая эпителиальные клетки) в результате цитотоксического действия антител, возможно, но не исключительно, посредством ADCC (антитело-зависимая клеточная цитотоксичность) и, необязательно, посредством CDC (комплементзависимая цитотоксичность).In particular aspects of the treatment of patients, the use of a polypeptide, antibody, antigen-binding fragment, antibody mimetic molecule, polynucleotide, cell line or cell line designed and/or suitable for use in the depletion of subpopulations of lymphocytes or other cell populations expressing CD127 (including normal or pathological T - and B lymphocytes, NK cells, dendritic cells and other cell types, including epithelial cells) as a result of the cytotoxic effect of antibodies, possibly, but not exclusively, through ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) and optionally through CDC (complement-dependent cytotoxicity) .

Также в данном документе предложен полипептид, в частности, легкая цепь антитела и/или антитело, антигенсвязывающий фрагмент, молекула-миметик антитела, полинуклеотид, клетки или клеточная линия или композиция, определенные выше, для применения в качестве активного ингредиента в комбинированой или дополнительной терапевтической схеме у пациента, нуждающегося в этом. Также предусмотрено применение полипептида, в частности легкой цепи антитела и/или антитела, антигенсвязывающего фрагмента, молекулы-миметика антитела, полинуклеотида, клеток или клеточной линии или композиции, определенных выше, в качестве терапевтически активного ингредиента в комбинированой или дополнительной терапевтической схеме у пациента, нуждающегося в этом.Also provided herein is a polypeptide, in particular an antibody light chain and/or an antibody, an antigen-binding fragment, an antibody mimetic molecule, a polynucleotide, a cell or cell line, or a composition as defined above, for use as an active ingredient in a combination or complementary therapeutic regimen. in a patient in need of it. Also contemplated is the use of a polypeptide, in particular an antibody and/or antibody light chain, antigen-binding fragment, antibody mimetic molecule, polynucleotide, cell or cell line or composition as defined above, as a therapeutically active ingredient in a combination or additional therapeutic regimen in a patient in need of in that.

В вышеуказанных аспектах предполагаемое использование также применимо к нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам, клеточным линиям, композициям и фармацевтическим композициям, предложенным выше.In the above aspects, the intended use also applies to the nucleic acids, vectors, cells, cell lines, compositions and pharmaceutical compositions provided above.

Предложенные в настоящем документе средства и продукты, указанные выше, предназначены и/или являются подходящими для применения при патологиях, таких как вызванные отторжением трансплантата, аутоиммунные заболевания, аллергические заболевания, респираторные заболевания, хронические вирусные инфекциями, хронические воспалительные заболевания, в частности хроническое воспаление кишечника., лимфома, лейкоз или другие раковые заболевания, включая заболевания, возникающие в результате солидных опухолей, когда эти патологии ассоциированы с CD127-положительными клетками, а также с сигнальным путем IL-7, в частности, когда следует избегать увеличения созревания дендритных клеток. Соответственно, указанные средства и продукты в частности предназначены и/или являются подходящими для лечения определенных аллергических кожных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), в частности болезни Крона (CD) или язвенного колита (ЯК), или острого лимфобластного лейкоза (например, Т-ОЛЛ) или лимфомы Ходжкина, или рака молочной железы, ассоциированных с клетками CD127+, рак почки, рак мочевого пузыря, рака легкого, рака поджелудочнойThe agents and products provided herein as defined above are intended and/or suitable for use in pathologies such as those caused by transplant rejection, autoimmune diseases, allergic diseases, respiratory diseases, chronic viral infections, chronic inflammatory diseases, in particular chronic inflammatory bowel disease. ., lymphoma, leukemia, or other cancers, including diseases resulting from solid tumors, when these pathologies are associated with CD127-positive cells, as well as with the IL-7 signaling pathway, in particular, when increased maturation of dendritic cells should be avoided. Accordingly, said agents and products are particularly intended and/or suitable for the treatment of certain allergic skin diseases, inflammatory bowel disease (IBD), in particular Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC), or acute lymphoblastic leukemia (e.g., T -ALL) or Hodgkin's lymphoma or CD127+ cell-associated breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, lung cancer, pancreatic cancer

- 19 041126 железы или для лечения Т-клеточной кожной лимфомы, такой как лимфома Сезари, или для лечения острого лимфобластного лейкоза с мутацией усиления функции пути IL-7-R/TSLP или для лечения отторжения трансплантата и/или пациентов, нуждающихся в трансплантации и/или на стадии подготовки к трансплантации и/или перенесших трансплантацию.- 19 041126 of the gland or for the treatment of T-cell cutaneous lymphoma, such as Sezary's lymphoma, or for the treatment of acute lymphoblastic leukemia with an enhancement of function mutation in the IL-7-R/TSLP pathway, or for the treatment of transplant rejection and / or patients in need of transplantation and /or at the stage of preparation for transplantation and/or who have undergone transplantation.

В частности, в настоящем документе предложено применение полипептида, в частности, легкой цепи антитела и/или антитела, антигенсвязывающего фрагмента, молекулы-миметика антитела, нуклеиновой кислоты, клеток, клеточной линии или композиции пациенту-человеку для лечения состояний и/или патологий, вызванных отторжением трансплантата, аутоиммунных заболеваний, аллергических заболеваний, респираторных заболеваний, хронических вирусных инфекций, хронических воспалительных заболеваний, в частности хронических воспалительных заболеваний кишечника, лимфомы, лейкоза или других раковых заболеваний, включая те, которые возникают в результате солидных опухолей, когда эти патологии ассоциированы с CD127-положительными клетками, а также с сигнальным путем IL7, в частности, когда следует избегать увеличения созревания дендритных клеток. Соответственно, указанные продукты предназначены, в частности, для лечения определенных аллергических кожных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), в частности болезни Крона (БК) или язвенного колита (ЯК), или острого лимфобластного лейкоза (например, Т-ОЛЛ) или лимфомы Ходжкина или рака молочной железы, ассоциированных с клетками CD127+, рака почки, рака мочевого пузыря, рака легкого, рака поджелудочной железы или для лечения Т-клеточной кожной лимфомы, такой как лимфома Сезари, или для лечения острого лимфобластного лейкоза с мутацией усиления функции пути IL7-R/TSLP или для лечения отторжения трансплантата и/или пациентов, нуждающихся в трансплантации и/или на стадии подготовки к трансплантации и/или перенесших трансплантацию или для лечения аутоиммунного заболевания или аллергического заболевания, или для лечения лейкоза, такой как острый лимфобластный лейкоз, или для лечения лимфомы, или для лечения ракового заболевания, или для лечения хронической вирусной инфекции, или для лечения воспалительных заболеваний, в частности ВЗК, особенно БК или ЯК, или для лечения респираторных заболеваний, или для профилактики и/или лечения симптомов, связанных с трансплантацией.In particular, this document proposes the use of a polypeptide, in particular, an antibody and/or antibody light chain, antigen-binding fragment, antibody mimetic molecule, nucleic acid, cell, cell line or composition to a human patient for the treatment of conditions and/or pathologies caused by transplant rejection, autoimmune diseases, allergic diseases, respiratory diseases, chronic viral infections, chronic inflammatory diseases, in particular chronic inflammatory bowel disease, lymphoma, leukemia or other cancers, including those arising from solid tumors when these pathologies are associated with CD127-positive cells, as well as with the IL7 signaling pathway, in particular when increased dendritic cell maturation should be avoided. Accordingly, said products are intended in particular for the treatment of certain allergic skin diseases, inflammatory bowel diseases (IBD), in particular Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC), or acute lymphoblastic leukemia (e.g. T-ALL) or lymphoma Hodgkin or CD127+ cell-associated breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, lung cancer, pancreatic cancer, or for the treatment of T-cell cutaneous lymphoma such as Sezary's lymphoma, or for the treatment of acute lymphoblastic leukemia with an IL7 pathway enhancement mutation -R/TSLP or for the treatment of transplant rejection and/or patients in need of transplantation and/or in preparation for transplantation and/or undergoing transplantation or for the treatment of an autoimmune disease or an allergic disease, or for the treatment of leukemia such as acute lymphoblastic leukemia, or for the treatment of lymphoma, or for the treatment of cancer, or for the treatment of a chronic viral infection or for the treatment of inflammatory diseases, in particular IBD, especially CD or UC, or for the treatment of respiratory diseases, or for the prevention and/or treatment of symptoms associated with transplantation.

В частности, в настоящем документе предложен способ лечения, включающий введение полипептида (в частности, вариабельного домена легкой цепи антитела или легкой цепи антитела) и/или антитела, антигенсвязывающего фрагмента, молекулы-миметика антитела, или выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, клеток и/или клеточной линии или композиции и/или фармацевтической композиции, согласно определению выше, пациенту-человеку для лечения состояний и/или патологий, вызванных отторжением трансплантата, аутоиммунных заболеваний, аллергических заболеваний, респираторных заболеваний, хронических вирусных инфекций, хронических воспалительных заболеваний, в частности хронических кишечных воспалительных заболеваний, лимфомы, лейкоза или других раковых заболеваний, включая заболевания, возникающие в результате солидных опухолей, когда эти патологии ассоциированы с CD127-положительными клетками, а также с сигнальным путем IL-7, в особенно когда следует избегать увеличения созревания дендритных клеток. Соответственно, указанные способы предназначены, в частности, для лечения определенных аллергических кожных заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), в частности болезни Крона (БК) или язвенного колита (ЯК), или острого лимфобластного лейкоза (например, Т-ОЛЛ) или лимфомы Ходжкина, или рака молочной железы, ассоциированного с CD127+ клетками, рака почки, рака мочевого пузыря, рака легкого, рака поджелудочной железы, или для лечения Т-клеточной кожной лимфомы, такой как лимфома Сезари, или для лечения острого лимфобластного лейкоза с мутацией усиления функции пути IL7-R/TSLP или для лечения отторжения трансплантата и/или пациентов, нуждающихся в трансплантации и/или на стадии подготовки к трансплантации и/или перенесших трансплантацию или для лечения аутоиммунного заболевания или аллергического заболевания, или для лечения лейкоза, такой как острый лимфобластный лейкоз, или для лечения лимфомы, или для лечения ракового заболевания, или для лечения хронической вирусной инфекции, или для лечения воспалительных заболеваний, в частности ВЗК, особенно БК или ЯК, или для лечения респираторных заболеваний, или для профилактики и/или лечения симптомов, связанных с трансплантацией.In particular, provided herein is a method of treatment comprising administering a polypeptide (in particular, an antibody light chain variable domain or an antibody light chain) and/or an antibody, an antigen-binding fragment, an antibody mimetic molecule, or an isolated nucleic acid molecule, cells and/or cell line or composition and/or pharmaceutical composition, as defined above, to a human patient for the treatment of conditions and/or pathologies caused by transplant rejection, autoimmune diseases, allergic diseases, respiratory diseases, chronic viral infections, chronic inflammatory diseases, in particular chronic intestinal inflammatory diseases, lymphoma, leukemia, or other cancers, including diseases resulting from solid tumors, when these pathologies are associated with CD127-positive cells as well as IL-7 signaling, especially when increased maturation of dendritic cells should be avoided. Accordingly, these methods are intended, in particular, for the treatment of certain allergic skin diseases, inflammatory bowel diseases (IBD), in particular Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC), or acute lymphoblastic leukemia (for example, T-ALL) or lymphoma Hodgkin or CD127+ associated breast cancer, kidney cancer, bladder cancer, lung cancer, pancreatic cancer, or for the treatment of T-cell cutaneous lymphoma such as Sezari's lymphoma, or for the treatment of gain-of-function mutant acute lymphoblastic leukemia IL7-R/TSLP pathway or for the treatment of transplant rejection and/or patients in need of transplantation and/or in preparation for transplantation and/or transplant recipients or for the treatment of an autoimmune disease or allergic disease, or for the treatment of leukemia such as acute lymphoblastic leukemia, or to treat lymphoma, or to treat cancer, or to treat a chronic viral infection injection, or for the treatment of inflammatory diseases, in particular IBD, especially CD or UC, or for the treatment of respiratory diseases, or for the prevention and/or treatment of symptoms associated with transplantation.

Авторы изобретения также показали, что у пациентов с ЯК уровни IL7, CD127 и/или мРНК TSLPR позволяют прогнозировать ответ на обычное иммуносупрессивное лечение: ответившие (т.е. пациенты, у которых наблюдается выраженное снижение симптомов в ответ на лечение) имеют более низкие уровни IL-7 и CD127 и более высокие уровни TLSPR, чем не ответившие. Соответственно, в настоящем документе предложены способы оценки in vivo вероятности ответа на иммуносупрессивное лечение у пациентов, в частности у пациентов с язвенным колитом (ЯК), включающие измерение в образце, полученном от указанного пациента, уровня IL7, CD127 и/или мРНК TLSPR или белка, и позволяющие сделать вывод о том, что вероятность ответа увеличена по сравнению с контрольной группой, когда измеренный уровень IL7 и/или CD127 ниже, чем средний уровень в указанной группе, и/или когда измеренный уровень TSLPR выше, чем средний уровень в указанной группе. Методы для выполнения требуемых измерений известны специалисту в данной области и могут включать использование антитела против CD127, в частности, для измерения уровней экспрессии белка CD127. Полипептид, в частности, легкая цепь ан- 20 041126 титела и/или моноклональное антитело, предложенные выше, представлены, в частности, для применения в таких способах, и такие способы представлены, в частности, с использованием такого полипептида, легкой цепи антитела и/или моноклонального антитела.The inventors have also shown that in UC patients, IL7, CD127 and/or TSLPR mRNA levels are predictive of response to conventional immunosuppressive treatment: responders (i.e. patients who experience a marked reduction in symptoms in response to treatment) have lower levels IL-7 and CD127 and higher levels of TLSPR than non-responders. Accordingly, the present document provides methods for assessing in vivo the likelihood of response to immunosuppressive treatment in patients, in particular in patients with ulcerative colitis (UC), comprising measuring, in a sample obtained from said patient, the level of IL7, CD127 and/or TLSPR mRNA or protein , and allowing to conclude that the probability of response is increased compared with the control group, when the measured level of IL7 and/or CD127 is lower than the average level in the specified group, and/or when the measured TSLPR level is higher than the average level in the specified group . Methods for performing the required measurements are known to those skilled in the art and may include the use of an anti-CD127 antibody, in particular to measure CD127 protein expression levels. A polypeptide, in particular an antibody light chain and/or a monoclonal antibody as provided above, is provided specifically for use in such methods, and such methods are provided in particular using such a polypeptide, an antibody light chain and/or or a monoclonal antibody.

В частности, в данном документе предложен способ выбора соединения из группы, состоящей из антитела, его антигенсвязывающего фрагмента и молекулы-миметика антитела, причем этот способ включает по меньшей мере одну из следующих стадий:In particular, this document provides a method for selecting a compound from the group consisting of an antibody, an antigen-binding fragment thereof, and an antibody mimetic molecule, the method comprising at least one of the following steps:

i) исследование связывания данного соединения с CD127, в частности с человеческим CD127, в частности с последовательностью эпитопа из домена D1 и/или из сайта 2b домена D2 из CD127. Эпитопная последовательность из домена D1 и/или из сайта 2b домена D2 может быть любой из эпитопных последовательностей, описанных в данном документе, в частности, как описано в параграфах [16], в частности эпитопной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 96 и, в частности, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96. В конкретном варианте реализации изобретения исследование на связывание может включать исследование на связывание соединения с последовательностью эпитопа, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96, и исследование на связывание соединения с последовательностью эпитопа, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43. Связывающая способность соединения может быть исследована любым из способов, известных в данной области, в частности методом Blitz, известным специалисту в данной области и проиллюстрированным, в частности, на фиг. 3, в примере 3 и примере 4 в настоящем документе и в п.14, фиг. 3, 4 и 6 и в соответствующих пояснениях, а также в примерах 1, 2, 6, 7 из WO 2015/189302, и/или способом из примера 10, раскрытого в настоящем документе; и/или ii) исследование ингибирования передачи сигналов IL7-R, индуцированной IL-7, в частности фосфорилирования STAT5, в присутствии данного соединения. Ингибирование, индуцированное IL7 в присутствии данного соединения, может быть исследовано способом, раскрытым в примере 8 и/или примере 11 в настоящем документе; и/или iii) исследование активации фосфатидилинозитол-3-киназы в присутствии данного соединения. Активация фосфатидилинозитол-3-киназы в присутствии данного соединения может быть исследована в соответствии со способом, раскрытым в примере 8 и/или примере 11 в настоящем документе; и/или iv) исследование активации сигнального пути ERK в присутствии данного соединения. Активация сигнального пути ERK в присутствии данного соединения может быть исследована в соответствии со способом, раскрытым в примере 8 и/или примере 11 в настоящем документе;i) study of the binding of this compound to CD127, in particular to human CD127, in particular to an epitope sequence from the D1 domain and/or from site 2b of the D2 domain of CD127. The epitope sequence from the D1 domain and/or from site 2b of the D2 domain may be any of the epitope sequences described herein, in particular as described in paragraphs [16], in particular an epitope sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 or SEQ ID NO: 96 and in particular SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96. In a particular embodiment, a binding assay may include a assay for binding of a compound to an epitope sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, and SEQ ID NO: 96, and assay for binding of a compound to an epitope sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43. The binding capacity of a compound can be tested by any of the methods known in the art, in particular the Blitz method known to one skilled in the art and illustrated, in particular sti, in Fig. 3 in Example 3 and Example 4 herein and in claim 14, FIG. 3, 4 and 6 and in the respective explanations, as well as in examples 1, 2, 6, 7 of WO 2015/189302, and/or the method of example 10 disclosed herein; and/or ii) study of inhibition of IL7-R signaling induced by IL-7, in particular STAT5 phosphorylation, in the presence of this compound. Inhibition induced by IL7 in the presence of this compound can be investigated by the method disclosed in example 8 and/or example 11 herein; and/or iii) studying the activation of phosphatidylinositol-3-kinase in the presence of this compound. The activation of phosphatidylinositol-3-kinase in the presence of this compound can be investigated in accordance with the method disclosed in example 8 and/or example 11 herein; and/or iv) studying the activation of the ERK signaling pathway in the presence of this compound. Activation of the ERK signaling pathway in the presence of this compound can be investigated in accordance with the method disclosed in example 8 and/or example 11 herein;

v) исследование способности связывания данного соединения по меньшей мере с одним бетаслоем сайта 2b домена D2 из CD127, в частности по меньшей мере с третьим бета-слоем сайта 2b, определяемым как нуклеокислоты SEQ ID NO: 34 и/или по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96. Связывающая способность соединения может быть исследована любым из способов, известных в данной области, в частности, методом Blitz, известным специалисту и проиллюстрированным, в частности, на фиг. 3, примере 3 и примере 4 в настоящем документе и на с. 14, фиг. 3, 4 и 6 и соответствующих пояснениях, а также примерах 1, 2, 6, 7 из WO 2015/189302 и/или способом из примера 10, раскрытого в настоящем документе.v) testing the ability of the compound to bind to at least one beta layer of site 2b of the D2 domain of CD127, in particular to at least the third beta layer of site 2b defined as the nucleoacids of SEQ ID NO: 34 and/or at least one amino acid a sequence selected from the group of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96. The binding capacity of a compound can be tested by any of the methods known in the art, in particular the Blitz method known to the skilled person and illustrated in particular in FIG. 3, example 3 and example 4 in this document and on p. 14, fig. 3, 4 and 6 and the corresponding explanations, as well as examples 1, 2, 6, 7 of WO 2015/189302 and/or the method of example 10 disclosed herein.

Способ может дополнительно включать в себя любой из следующих необязательных этапов или по меньшей мере один из следующих необязательных этапов:The method may further include any of the following optional steps, or at least one of the following optional steps:

vi) исследование связывания CD127, в частности человеческого CD127, с общей ус-цепью цитокиновых рецепторов в присутствии соединения. Связывание CD127 с общей ус-цепью цитокиновых рецепторов цитокинов в присутствии соединения может быть оценено, в частности, с помощью методов совместной иммунопреципитации, хорошо известных специалисту для исследования взаимодействия белков и проиллюстрированных, например, в WO 2015/189302 в примере 21. В частности, клетки можно инкубировать в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения, затем солюбилизировать в условиях, обеспечивающих сохранение белковых комплексов, и полученный лизат может быть подвергнут иммунопреципитации против CD127, и присутствие ус в CD127-содержащем иммунопреципитированном комплексе, может быть оценено вестерн-блоттингом с использованием анти-ус-антител (и наоборот, иммунопреципитацию можно проводить с использованием анти-ус-антител, а присутствие CD127 оценивать с использованием анти-CD127-антител); и/или vii) исследование интернализации CD127, в частности человеческого CD127, и/или IL7индуцированной интернализации CD127 в присутствии соединения. Интернализация CD127, определенная в настоящем документе в параграфах [51]-[53], может быть дополнительно определена и/или исследована, как изложено в W02015/189302, в частности в параграфах [59]-[63] на страницах 19-20 и на фиг. 16 в и примере 5; и/или viii) исследование созревания дендритных клеток, индуцированных TSLP в присутствии соединения. Созревание дендритных клеток, вызванное TSLP, определено в параграфах [47] и [48] настоящего документа. Средства для измерения такого эффекта известны специалисту и раскрыты, в частности, вvi) study of the binding of CD127, in particular human CD127, to the common ac chain of cytokine receptors in the presence of the compound. Binding of CD127 to the common cyl chain of cytokine receptors in the presence of a compound can be assessed, in particular, using co-immunoprecipitation methods well known to the person skilled in the art for studying protein interactions and illustrated, for example, in WO 2015/189302 in example 21. In particular, cells can be incubated in the presence or absence of a test compound, then solubilized under conditions to preserve the protein complexes, and the resulting lysate can be immunoprecipitated against CD127, and the presence of whiskers in the CD127-containing immunoprecipitated complex can be assessed by Western blotting using anti mc antibodies (conversely, immunoprecipitation can be performed using anti-mc antibodies and the presence of CD127 assessed using anti-CD127 antibodies); and/or vii) study of internalization of CD127, in particular human CD127, and/or IL7-induced internalization of CD127 in the presence of the compound. The internalization of CD127 as defined herein in paragraphs [51]-[53] may be further defined and/or investigated as set out in W02015/189302, in particular in paragraphs [59]-[63] on pages 19-20 and in fig. 16 in and example 5; and/or viii) study of maturation of dendritic cells induced by TSLP in the presence of the compound. The maturation of dendritic cells caused by TSLP is defined in paragraphs [47] and [48] of this document. Means for measuring such an effect are known to the skilled person and are disclosed, in particular, in

- 21 041126 публикации WO 2015/189302 на страницах 16-17 и в примере 9 оттуда. В частности, средства для измерения такого эффекта включают измерение экспрессии CD40 между клетками, стимулированнвми соединением, и клетками, стимулированными только TSLP (без соединения).- 21 041126 of WO 2015/189302 on pages 16-17 and example 9 therefrom. In particular, means for measuring such an effect include measuring CD40 expression between cells stimulated with the compound and cells stimulated with TSLP alone (no compound).

В конкретном варианте реализации способа выбирают соединение, которое специфически связывается с CD127, в частности человеческим CD127, является антагонистом передачи сигналов IL7-R, индуцированной IL7, не индуцирующим активацию фосфатидилинозитол-3-киназы и/или сигнального пути ERK. В более конкретном варианте реализации способа выбирают соединение, которое специфически связывается с CD127, в частности с человеческим CD127, является антагонистом передачи сигналов IL7R, индуцированной IL7, и не индуцирующим активацию фосфатидилинозитол-3-киназы и не индуцирующим активацию сигнального пути ERK.In a specific embodiment of the method, a compound is selected that specifically binds to CD127, in particular human CD127, is an antagonist of IL7-induced IL7-R signaling that does not induce activation of phosphatidylinositol-3-kinase and/or the ERK signaling pathway. In a more specific embodiment of the method, a compound is selected that specifically binds to CD127, in particular human CD127, is an antagonist of IL7-induced IL7R signaling and does not induce phosphatidylinositol 3-kinase activation and does not induce activation of the ERK signaling pathway.

В частности, в настоящем документе предложен способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, индуцируемого против CD127, возможно, вызванного иммунизацией животного, не являющегося человеком, такого как крысы штамма LOU/C Igkla, доступного в Университете г.Лувен, Бельгия). Иммунизация может быть проведена с использованием фрагмента аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22 и, в частности, фрагмента SEQ ID NO: 22, содержащего эпитопную последовательность, определенную в настоящем документе, и, в частности, SEQ ID NO: 35 и/или SEQ ID NO: 96, в качестве иммуногена. Гибридома может быть получена путем слияния одноядерных клеток селезенки с иммуноцитомой IR983F крысы LOU. Гибридома может быть подвергнута скринингу в соответствии со способностью секретируемых моноклональных антител связываться с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96, в особенности SEQ ID NO: 35 и/или SEQ ID NO: 96. Таким образом, изобретение также охватывает иммуногенное соединение, причем указанное иммуногенное соединение представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22, в частности фрагмент, содержащий по меньшей мере одну выбранную аминокислотную последовательность, из группы SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96, в особенности SEQ № 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 96, более конкретно SEQ ID NO: 96. В конкретном варианте реализации изобретения иммуногенное соединение представляет собой линейный пептид, в частности линейный пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96, более конкретно, линейный пептид, включающий или состоящий из, предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35.In particular, the present document provides a method for producing an antibody or antigen-binding fragment of the invention induced against CD127, possibly induced by immunization of a non-human animal such as LOU/C Igkla rats available from the University of Louvain, Belgium). Immunization can be carried out using a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and, in particular, a fragment of SEQ ID NO: 22 containing the epitope sequence defined herein, and in particular SEQ ID NO: 35 and/or SEQ ID NO: 96, as an immunogen. A hybridoma can be obtained by fusing uninuclear spleen cells with an IR983F rat LOU immunocytoma. The hybridoma may be screened according to the ability of secreted monoclonal antibodies to bind to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96, especially SEQ ID NO: 35 and/ or SEQ ID NO: 96. Thus, the invention also encompasses an immunogenic compound, said immunogenic compound being a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, in particular a fragment containing at least one selected amino acid sequence from the group of SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96, especially SEQ No. 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 96, more specifically SEQ ID NO: 96. In a specific embodiment of the invention, the immunogenic compound is a linear peptide, in particular a linear peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96, more specifically, a linear peptide comprising or consisting of, preferably consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Фиг. 1 - аминокислотные последовательности антител, предложенные в настоящем документе.Fig. 1 - amino acid sequences of antibodies proposed in this document.

Панель А. Последовательность тяжелой цепи (VH). CDR выделены жирным шрифтом.Panel A. Heavy chain (VH) sequence. CDRs are in bold.

Панель В. Последовательность гуманизированных легких цепей (LH), полученных из N13B2. CDR выделены жирным шрифтом. N13B2-VL3 содержит исходные каркасные остатки N13B2-h3 в положениях 48 и 87 (подчеркнуты); N13B2-VL4-V48L и N13B2-VL5-F87Y содержат соответствующий гуманизированный каркасный остаток, a N13B2-VL6-V48L-F87Y содержат оба гуманизированных каркасных остатка.Panel B. Sequence of humanized light chains (LH) derived from N13B2. CDRs are in bold. N13B2-VL3 contains the original N13B2-h3 framework residues at positions 48 and 87 (underlined); N13B2-VL4-V48L and N13B2-VL5-F87Y contain the corresponding humanized framework residue, and N13B2-VL6-V48L-F87Y contain both humanized framework residues.

Фиг. 2 - производство антител - стабильная трансфекция.Fig. 2 - antibody production - stable transfection.

Для каждого из упомянутых антител в клетках СНО-М были выполнены три разные промышленные партии в соответствии с общепринятыми способами, с использованием коммерчески доступных бессывороточных сред, и в настоящем документе приведены титры, полученные в типичных экспериментах, измеренные с помощью анализа ELISA. Горизонтальная ось: время культивирования в днях, вертикальная ось: полученные титры антител в мкг/мл.For each of these antibodies in CHO-M cells, three different production batches were made according to conventional methods, using commercially available serum-free media, and titers obtained in representative experiments, measured by ELISA assay, are reported herein. Horizontal axis: culture time in days, vertical axis: obtained antibody titers in μg/ml.

Фиг. 3 - связывание с CD127.Fig. 3 - binding to CD127.

Связывание указанных антител с рекомбинантным CD127 анализировали методом ELISA в соответствии со способом, подробно описанным в примере 3. Горизонтальная ось: концентрация антитела в нг/мл, вертикальная ось: оптическую плотность на 450 нм в произвольных единицах.Binding of these antibodies to recombinant CD127 was analyzed by ELISA according to the method detailed in Example 3. Horizontal axis: antibody concentration in ng/ml, vertical axis: optical density at 450 nm in arbitrary units.

Фиг. 4 - ингибирование фосфорилирования STAT5.Fig. 4 - inhibition of STAT5 phosphorylation.

Ингибирование фосфорилирования STAT5 указанными антителами анализировали с помощью цитофлуорометрии в соответствии со способом, подробно описанным в примере 5. Процент клеток CD3+, окрашенных антителами pSTAT5, показан на панели А (горизонтальная ось: концентрация антител в нг/мл), а средняя интенсивность флуоресценции (в произвольных единицах) сигнала pSTAT5 для клеток CD3+ показана на панели В.Inhibition of STAT5 phosphorylation by these antibodies was analyzed by cytofluorometry according to the method detailed in Example 5. The percentage of CD3+ cells stained with pSTAT5 antibodies is shown in panel A (horizontal axis: antibody concentration in ng/mL) and the mean fluorescence intensity (in arbitrary units) of the pSTAT5 signal for CD3+ cells is shown in panel B.

Фиг. 5 - влияние на Т-клетки памяти.Fig. 5 - effect on memory T-cells.

Панель А. Ответ DTH (площадь под кривой кривых эритемы) у павиана после инъекции N13B2.Panel A. DTH response (area under the curve of erythema curves) in a baboon after N13B2 injection.

Гиперчувствительность замедленного типа в ответ на провокацию туберкулином проанализировали у вакцинированных павианов после введения N13B2 (n=7 павианов) или вспомогательного вещества (n=4 павиана) путем измерения кожной реакции в соответствии со способом, подробно описанным в примере 6. Вертикальная ось: площадь под кривой эритемы в произвольных единицах. Значения приведены для внутрикожных реакций, проводимых в заданные моменты времени, указанные в днях по горизонтальной оси, до или после введения N13B2 или вспомогательного вещества (вводимого в день 0). После БЦЖ соответствует результатам кожной реакции, выполненным после новой вакцинации БЦЖ (nd=не определено).Delayed type hypersensitivity in response to tuberculin challenge was analyzed in vaccinated baboons after administration of N13B2 (n=7 baboons) or excipient (n=4 baboons) by measuring the skin reaction according to the method detailed in Example 6. Vertical axis: area under erythema curve in arbitrary units. Values are given for intradermal reactions performed at given time points, indicated in days on the horizontal axis, before or after administration of N13B2 or excipient (administered on day 0). Post-BCG consistent with skin reaction results performed after new BCG vaccination (nd=not determined).

Контроль с использованием только вспомогательного вещества не определяли в дни 150 и 180 иExcipient-only control was not determined on days 150 and 180 and

- 22 041126 после БЦЖ (nd).- 22 041126 after BCG (nd).

Панель В. Ответ DTH (площадь под кривой кривых эритемы) у павиана после инъекции гуманизированного N13B2.Panel B. DTH response (area under the curve of erythema curves) in a baboon after injection of humanized N13B2.

Гиперчувствительность замедленного типа в ответ на заражение туберкулином анализировали у вакцинированных павианов после введения гуманизированного N13B2 (АА892ВВ, 32257, V915GQ, 33874) или буфера путем измерения кожной реакции в соответствии со способом, подробно описанным в примере 6. Вертикальная ось: площадь под кривой эритемы, в произвольных единицах. Значения приведены для внутрикожных реакций, измеряемых перед введением гуманизированного N13B2 или буфера (IDR1, первый столбик слева для каждого павиана), через 4 ч после введения гуманизированного N13B2 или буфера (IDR2, второй столбик слева), через один два и три месяца (IDR3-5, с третьего по пятый столбик слева) и через четыре месяца (IDR6, шестой столбик слева, только для V915GA) после введения гуманизированного N13B2 или буфера и после новой вакцинации БЦЖ (IDR7, последний столбик слева).Delayed type hypersensitivity in response to tuberculin challenge was analyzed in vaccinated baboons following administration of humanized N13B2 (AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) or buffer by measuring skin response according to the method detailed in Example 6. Vertical axis: area under the erythema curve, in arbitrary units. Values are for intradermal responses measured before administration of humanized N13B2 or buffer (IDR1, first bar from the left for each baboon), 4 hours after administration of humanized N13B2 or buffer (IDR2, second bar from left), one two and three months (IDR3- 5, third to fifth bars from the left) and four months (IDR6, sixth bar from the left, for V915GA only) after administration of humanized N13B2 or buffer and after a new BCG vaccination (IDR7, last bar from the left).

Панель С. Анализ IFNy ELISPOT проводили на РВМС в крови у вакцинированного БЦЖ павиана, после провокации туберкулином и введения гуманизированного N13B2.Panel C. An IFNy ELISPOT assay was performed on PBMCs in the blood of a BCG vaccinated baboon following tuberculin challenge and humanized N13B2 administration.

Частоту AG-специфических Т-клеток после заражения туберкулином анализировали у вакцинированных павианов после введения гуманизированного N13B2 (АА892ВВ, 32257, V915GQ, 33874) или с помощью анализа IFNy методом ELISPOT в соответствии со способом, подробно описанным в примере 6. Вертикальная ось: частота пятен на 100000 клеток. Значения приведены для ELISPOT без антигена (без Ag, левые столбики) или с туберкулиновым антигеном (правые столбики), выполненного до введения гуманизированного N13B2 или буфера (первый столбик слева для каждой группы столбиков), через 4 дня после введения гуманизированного N13B2 или буфера (IDR2), через один, два и три месяца (IDR3-5) и четыре месяца (IDR6, только для V915GA) после введения гуманизированного N13B2 или буфера и после новой вакцинации БЦЖ (последний столбик слева, заштрихованный).The frequency of AG-specific T cells after tuberculin challenge was analyzed in vaccinated baboons after administration of humanized N13B2 (AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) or by IFNy ELISPOT assay according to the method detailed in Example 6. Vertical axis: spot frequency per 100,000 cells. Values are for ELISPOT without antigen (without Ag, left bars) or with tuberculin antigen (right bars) performed before administration of humanized N13B2 or buffer (first bar from the left for each group of bars), 4 days after administration of humanized N13B2 or buffer (IDR2). ), one, two and three months (IDR3-5) and four months (IDR6, for V915GA only) after administration of humanized N13B2 or buffer, and after a new BCG vaccination (last bar on the left, shaded).

Фиг. 6 - экспрессия IL-7, CD127 и TSLP у пациентов с ВЗК.Fig. 6 - Expression of IL-7, CD127 and TSLP in patients with IBD.

Уровни экспрессии мРНК IL-7, CD127 (растворимая форма IL-7Ra) и TSLP (полноразмерные) измеряли в соответствии со способом, подробно описанным в примере 7, в образцах тканей от здоровых контрольных субъектов (контроль без ВЗК), здоровых и больных (воспаленных) образцах биопсии толстой кишки от пациентов с активным язвенным колитом (ЯК), которые не ответили (или перестали отвечать) на противовоспалительное лечение, и в образцах от пациентов с ЯК с неактивным заболеванием т.е., которые были вылечены или находились в стадии ремиссии во время отбора проб (ответившие). Вертикальная ось: относительные единицы флуоресценции. Точки отображают значение для каждого образца в отдельной группе, горизонтальная полоска представляет средние значения для группы, а усы ошибок представляют стандартное отклонение. * обозначает р-значение <0,05; ** - р-значение <0,01; **** - р-значение <0,0001.mRNA expression levels of IL-7, CD127 (soluble form of IL-7Ra) and TSLP (full-length) were measured according to the method detailed in Example 7 in tissue samples from healthy controls (control without IBD), healthy and sick (inflamed ) colon biopsy specimens from patients with active ulcerative colitis (UC) who did not respond (or stopped responding) to anti-inflammatory treatment, and in specimens from UC patients with inactive disease i.e. who were cured or in remission during sampling (responders). Vertical axis: relative units of fluorescence. The dots represent the value for each sample in a particular group, the horizontal bar represents the means for the group, and the error whiskers represent the standard deviation. * denotes p-value <0.05; ** - p-value <0.01; **** - p-value <0.0001.

Фиг. 7 - ингибирование сигнальных путей CD127.Fig. 7 - inhibition of signaling pathways CD127.

Влияние различных антител против CD127 человека на активацию сигнальных путей оценивали с помощью вестерн-блоттинга, как подробно описано в примере 8. На фигуре представлены репрезентативные результаты от 6 различных доноров. Без IL-7 соответствует образцу, который не был стимулирован IL-7. С соответствует контрольному образцу, стимулированному IL-7 в отсутствие антитела против CD127. Горизонтальные линии слева от блота представляют миграцию указанного маркера молекулярной массы. Стрелки справа от блота указывают миграцию тирозин-фосфорилированного STAT5, тирозина 199-фосфорилированного PI3-k p55, фосфорилированного Akt, фосфорилированного ERK 1/2 и, в качестве эталона загрузки, GAPDH.The effect of various anti-human CD127 antibodies on the activation of signaling pathways was assessed by Western blotting as detailed in Example 8. The figure shows representative results from 6 different donors. Without IL-7 matches the pattern that was not stimulated by IL-7. C corresponds to a control sample stimulated with IL-7 in the absence of anti-CD127 antibody. The horizontal lines to the left of the blot represent the migration of the indicated molecular weight marker. Arrows to the right of the blot indicate migration of tyrosine-phosphorylated STAT5, tyrosine 199-phosphorylated PI3-k p55, phosphorylated Akt, phosphorylated ERK 1/2 and, as loading reference, GAPDH.

Фиг. 8 - подавление высвобождения цитокинов Т-клеток из биоптатов ЯК.Fig. 8 - suppression of the release of T-cell cytokines from UC biopsies.

Панель А. Продуцирование IFNy образцами биопсии пациентов с ЯК, выращенными ex-vivo.Panel A. IFNy production in ex-vivo cultured biopsies from UC patients.

Панель В. Продуцирование IFNy образцами биопсии пациентов с CD, выращенными ex-vivo.Panel B. IFNy production in ex-vivo grown CD patient biopsies.

На обеих панелях образцы были получены и обработаны, как подробно описано в примере 9. Каждый символ представляет один образец от пациента, культивируемый с IgG (Ctrl Ab) или с антителом против CD127 (aIL-7Ra). Связанные символы представляют собой парные образцы от одного и того же пациента. **р<0,01 с критерием для связанных пар Уилкоксона. Продуцирование IFNy была значительно ингибирована mAb против IL7Ra. Аналогичные результаты наблюдались для образцов биопсии пациентов с CD.In both panels, samples were obtained and processed as detailed in Example 9. Each symbol represents one patient sample cultured with either IgG (Ctrl Ab) or anti-CD127 antibody (aIL-7Ra). Linked symbols are paired samples from the same patient. **p<0.01 with Wilcoxon coupled pair test. IFNy production was significantly inhibited by the anti-IL7Ra mAb. Similar results were observed for biopsy specimens from patients with CD.

Фиг. 9 - антитела против IL-7Ra человека и агонистические сигналы.Fig. 9 - antibodies against human IL-7Ra and agonist signals.

Влияние различных антител против человеческого CD127 на активацию сигнальных путей STAT5, PI3K и ERK оценивали с помощью Вестерн-блоттинга, как подробно описано в примере 11. На фиг. 9А показана одна из семи различных донорских клеток в отсутствие экзогенного рекомбинантного человека IL-7. Панель А. Среда соответствует образцу, не содержащему никаких антител против человеческого CD127. Без IL7 означает, что четыре образца не были стимулированы IL-7. Три образца предварительно обрабатывали 10 мкг/мл одного mAb против IL-7Ra (N13B2-WL6 или MD707-13-G4 или 1A11-G1).The effect of various anti-human CD127 antibodies on the activation of the STAT5, PI3K and ERK signaling pathways was assessed by Western blotting as detailed in Example 11. FIG. 9A shows one of seven different donor cells in the absence of exogenous recombinant human IL-7. Panel A. Medium corresponds to a sample containing no antibodies against human CD127. No IL7 means four samples were not stimulated with IL-7. Three samples were pretreated with 10 μg/ml of a single anti-IL-7Ra mAb (N13B2-WL6 or MD707-13-G4 or 1A11-G1).

Панель В. Количественное определение pI3K и pERK, скорректированное на экспрессию GAPDH иPanel B. pI3K and pERK quantitation corrected for GAPDH expression and

- 23 041126 нормализованное к контрольным условиям среды (n=7 различных доноров). Вертикальная ось: экспрессия, нормализованная к контролю. Точки отображают значение для каждого образца в отдельной группе, горизонтальная полоска представляет средние значения для группы, а усы ошибок представляют стандартное отклонение.- 23 041126 normalized to control environmental conditions (n=7 different donors). Vertical axis: expression normalized to control. The dots represent the value for each sample in a particular group, the horizontal bar represents the means for the group, and the error whiskers represent the standard deviation.

Фиг. 10 - влияние антител против IL7-Ra человека на активацию пути IL7.Fig. 10 - Effect of antibodies against human IL7-Ra on the activation of the IL7 pathway.

Количественное определение сигнала фосфо-STAT5 было скорректировано с учетом экспрессии GADPH и нормализовано к контрольным условиям среды. РВМС предварительно обрабатывали 10 мкг/мл одного mAb против IL7-Ra (N13B2-hVL6 или MD707-13-G4 или 1А11) и затем инкубировали в течение 10 мин при 37°С с 5 нг/мл IL7 человека. Количественные оценки сигнала фосфо-STAT5 были скорректированы на экспрессию GAPDH (n=7 различных доноров). Пунктирная линия изображает состояние среды без обработки. Точки отображают значение для каждого образца в отдельной группе, горизонтальная полоска представляет средние значения для группы, а усы ошибок представляют стандартное отклонение. * обозначает р-значение <0,05 между указанными группами.Phospho-STAT5 signal quantitation was adjusted for GADPH expression and normalized to control media conditions. PBMCs were pretreated with 10 μg/ml of a single anti-IL7-Ra mAb (N13B2-hVL6 or MD707-13-G4 or 1A11) and then incubated for 10 min at 37° C. with 5 ng/ml of human IL7. Phospho-STAT5 signal quantitations were corrected for GAPDH expression (n=7 different donors). The dotted line depicts the state of the environment without processing. The dots represent the value for each sample in a particular group, the horizontal bar represents the means for the group, and the error whiskers represent the standard deviation. * denotes p-value <0.05 between indicated groups.

Фиг. 11 - двойные mAb-агонисты/антагонисты против IL7-Ra индуцируют модификации транскрипции.Fig. 11 Anti-IL7-Ra dual mAb agonists/antagonists induce transcriptional modifications.

Анализ последовательностей РНК человеческих РВМС (n=7), инкубированных в течение 3,5 ч (1) с 5 нг/мл IL7 человека, (2) без IL7, (3,4,5) с 5 нг/мл IL7 человека и с различными анти- mAb IL7-Ra человека ((3): 10 мкг/мл N13B2-hVL6; (4): 10 мкг/мл MD707-13-Ig4; (5): 10 мкг/мл 1А11).Analysis of RNA sequences of human PBMCs (n=7) incubated for 3.5 h (1) with 5 ng/ml human IL7, (2) without IL7, (3,4,5) with 5 ng/ml human IL7 and with various anti-human IL7-Ra mAbs ((3): 10 μg/ml N13B2-hVL6; (4): 10 μg/ml MD707-13-Ig4; (5): 10 μg/ml 1A11).

Панель А. Тепловая карта экспрессии 93 наиболее дифференцированно экспрессируемых генов (уровень ложноположительных результатов (FDR) 5%, кратность изменения (FD) >2) между стимуляцией IL7 и контрольными условиями.Panel A. Expression heat map of the 93 most differentially expressed genes (false positive rate (FDR) 5%, fold change (FD) >2) between IL7 stimulation and control conditions.

Панель В. Количественная оценка медианного профиля трех индуцированных IL7 кластеров в условиях стимуляции IL7, контроля и IL7 и анти-человеческого IL7-Ra.Panel B. Quantification of the median profile of three IL7-induced clusters under IL7 stimulation, control and IL7, and anti-human IL7-Ra.

Панель С. Диаграмма Венна для анализа последовательностей РНК человеческих РВМС (n=7), инкубированных без IL-7 в течение 3,5 ч с различными mAb против IL-7Ra человека (10 мкг/мл N13B2hVL6, 10 мкг/мл. MD707-13-Ig4 № 1 или 10 мкг/мл 1А11). Диаграмма Венна для 481 дифференциально экспрессируемых генов (FDR 5%, FC>1,5), при сравнении mAb против IL-7Ra человека и контрольных условий среды. Размер круга пропорционален количеству генов для каждой категории.Panel C. Venn diagram for analysis of human PBMC RNA sequences (n=7) incubated without IL-7 for 3.5 h with various anti-human IL-7Ra mAbs (10 µg/ml N13B2hVL6, 10 µg/ml MD707- 13-Ig4 no. 1 or 10 µg/ml 1A11). Venn diagram for 481 differentially expressed genes (FDR 5%, FC>1.5), comparing anti-human IL-7Ra mAb and environmental control conditions. The size of the circle is proportional to the number of genes for each category.

ПримерыExamples

Пример 1. Гуманизация легких цепей.Example 1 Humanization of light chains.

Следующую тяжелую цепь использовали во всех описанных в настоящем документе экспериментах, если не указано иное.The following heavy chain was used in all experiments described herein unless otherwise noted.

N13B2 гуманизированная_VH, нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 13): CAGGTGCAGCTGGTCGAATCAGGGGGGGGACTGGTCAAACCCGGGGGCTCACTGCGTCTGTCN13B2 humanized_VH, nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13): CAGGTGCAGCTGGTCGAATCAGGGGGGGGACTGGTCAAACCCGGGGGCTCACTGCGTCTGTC

ATGTGCCGTCTCAGGCTTCACACTGAGCGACTACTATATGGCATGGATCCGACAGGCACCAGG CAAGGGACTGGAGTGGGTGTCTACTATTTCTGCCAGTGGCCTGAGGACCTACTATCCTGACAG TGTCAAGGGAAGGTTCACAATCTCACGGGATAACGCTAAAAATTCCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGAGCCGAAGACACCGCTGTGTACTATTGCGCTCGCCCACTGTCCGCACACTATGG CTTCAATTACTTTGATTATTGGGGGCAGGGTACCCTGGTGACAG TCTCCAGCATGTGCCGTCTCAGGCTTCACACTGAGCGACTACTATATGGCATGGATCCGACAGGCACCAGG CAAGGGACTGGAGTGGGTGTCTACTATTTCTGCCAGTGGCCTGAGGACCTACTATCCTGACAG TGTCAAGGGAAGGTTCACAATCTCACGGGATAACGCTAAAAATTCCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGAGCCGAAGACACCGCTGTGTACTATTGCGCTCGCCCACTGTCCGCACACTATGG CTTCAATTACTTTGATTATTGGGGGCAGGGTACCCTGGTGACAG TCTCCAGC

N13B2 гуманизированная VH, аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7): см. фиг. 1А.N13B2 humanized VH, amino acid sequence (SEQ ID NO: 7): see FIG. 1A.

Следующие оптимизированные нуклеотидные последовательности использовали для получения легких цепей антитела (аминокислотные последовательности которых представлены на фиг. 1В):The following optimized nucleotide sequences were used to generate antibody light chains (the amino acid sequences of which are shown in Figure 1B):

N13B2-h3 (SEQ ID NO: 14):N13B2-h3 (SEQ ID NO: 14):

GAGATCGTCATGACGCAGTCCCCCGCAACGCTCTCCGTCTCCCCGGGGGAACGCGCGACCGAGATCGTCATGACGCAGTCCCCCGCAACGCTCTCCGTCTCCCCGGGGGAACGCGCGACC

CTGTCGTGCAGGACCTCCGAGGACATCTACCAAGGCCTCGCGTGGTATCAGCAGAAGCCC GGCCAGGCCCCGCGGCTGTTGATCTACTCCGCGAACACCTTGCACATCGGCATCCCGGCG CGCTTCTCGGGGTCAGGGAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCGTCGCTCCAGAGC GAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACGACTACCCCCTGGCGTTCGGGGGC GGGACCAAGGTGGAGATCAAGCTGTCGTGTCAGGACCTCCGAGGACATCTACCAAGGCCTCGCGTGGTATCAGCAGAAGCCC GGCCAGGCCCCGCGGCTGTTGATCTACTCCGCGAACACCTTGCACATCGGCATCCCGGCG CGCTTCTCGGGGTCAGGGAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCGTCGCTCCAGAGC

N13B2hVL3 (SEQ ID No: 15):N13B2hVL3 (SEQ ID No: 15):

GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG GAAGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC GGCACCAAGGTCGAGATCAAGGACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG GAAGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC GGCACCAAGGTCGAGATCAAG

N13B2hVL4 (SEQ ID No: 16):N13B2hVL4 (SEQ ID No: 16):

GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCGGACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGTGGCGACCGCGTGTCACG ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGCGGACTACACCCTCCAGATCTCGTCCC

- 24 041126- 24 041126

GAAGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGCGAAGACTTCGCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC

GGCACCAAGGTCGAGATCAAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAG

N13B2hVL5 (SEQ ID No: 17):N13B2hVL5 (SEQ ID No: 17):

GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACGGACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGTGGCGACCGCGTGTGACG

ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG GAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC GGCACCAAGGTCGAGATCAAGATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG

N13B2hVL6 (SEQ ID No: 18):N13B2hVL6 (SEQ ID No: 18):

GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACGGACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGTGGCGACCGCGTGTGACG

ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCGATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG

GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG GAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC GGCACCAAGGTCGAGATCAAGGGCAAGGCCCCCAAACTGCCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG

Каждую последовательность VL получали путем синтеза генов, вставленных в вектор клонирования (pUC57) с 5'- и 3'-конечными BsiWI и добавлением последовательности Козака (GCCACC) перед АТС В качестве вектора экспрессии использовали плазмиду экспрессии pFuseCLIg-hk (Invivogen), содержащую константный домен CLkappa человеческого IgG1.Each VL sequence was obtained by synthesizing genes inserted into a cloning vector (pUC57) with 5'- and 3'-terminal BsiWI and adding a Kozak sequence (GCCACC) before ATC. The expression plasmid pFuseCLIg-hk (Invivogen) containing the constant CLkappa domain of human IgG1.

Каждую клонирующую плазмиду (VL-pUC57-Genscript) расщепляли рестриктазой BsiWI для экстракции вставки VL (400 п.н.). Очищенную вставку лигировали в экспрессионную плазмиду pFuseCLIg-hk, линеаризованную расщеплением BsiWI, и дефосфорилировали. Положительные клоны, имеющие фрагменты VL, вставленные в правильной ориентации перед человеческими константными доменами, амплифицировали и очищали препаратом Midiprep без эндотоксинов (Macherey-Nagel) для стадии трансфекции. Тяжелую цепь клонировали аналогичным образом с константным доменом, состоящим из SEQ ID NO: 26.Each cloning plasmid (VL-pUC57-Genscript) was digested with BsiWI to extract the VL insert (400 bp). The purified insert was ligated into the pFuseCLIg-hk expression plasmid linearized by BsiWI digestion and dephosphorylated. Positive clones having VL fragments inserted in the correct orientation before the human constant domains were amplified and purified with Midiprep without endotoxins (Macherey-Nagel) for the transfection step. The heavy chain was cloned in a similar manner with a constant domain consisting of SEQ ID NO: 26.

Пример 2. Получение гуманизированных легких цепей.Example 2 Preparation of humanized light chains.

Для исследованных гуманизированных антител против CD127 трансфекцию и отбор стабильных клонов осуществляли в соответствии с общепринятыми способами. Готовили и исследовали три супернатанта для каждого антитела, соответствующие разному соотношению трансфекции тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC): 2:1, 1:1,3 и 1:2 HC:LC. Полученные титры представлены на фиг. 2, полученной после продуцирования в клетках СНО, высеянных в количестве 300000 клеток/мл; без антибиотиков, в соответствии с общепринятыми способами: титр анализировали с помощью ELISA на иммобилизованном анти-человеческом IgG (Fc) соответствующего антитела и выявление проводили с помощью мышиных анти-человеческих каппа-mAb плюс меченные пероксидазой ослиные антимышиные антитела, с выявлением методом колориметрии на 450 нм с использованием субстрата ТМВ.For the investigated humanized antibodies against CD127 transfection and selection of stable clones was carried out in accordance with conventional methods. Three supernatants for each antibody were prepared and tested, corresponding to different transfection ratios of heavy chain (HC) and light chain (LC): 2:1, 1:1.3 and 1:2 HC:LC. The resulting titers are shown in Fig. 2 obtained after production in CHO cells seeded at 300,000 cells/ml; without antibiotics, according to conventional methods: the titer was analyzed by ELISA on immobilized anti-human IgG (Fc) of the corresponding antibody and detection was performed using mouse anti-human kappa-mAb plus peroxidase-labeled donkey anti-mouse antibodies, with detection by colorimetry at 450 nm using TMB substrate.

Продуцирование N13B2-h3 и N13B2-hVL6 также исследовали в экспериментах с транзиторной трансфекцией. За один день до трансфекции клетки COS высевали в количестве 100 000 клеток/лунку в планшет Р12 с полной средой (DMEM SVF10% (Hyclone)+PS 1%+Glu 1%) и инкубировали при 37°С, 5% СО₂. В день трансфекции клетки COS использовали при слиянии величиной от 50 до 90%. Их промывали PBS и хранили с 500 мкл в полной среде. Смешивали 0,6 мкг варианта VH + 0,4 мкг варианта VL в 200 мкл среды OptiMEM и добавляли 1 мкл реагента Plus (Invitrogen) (инкубация 15 мин при комнатной температуре). В смесь добавляли 3,5 мкл липофектамина LTX (Invitrogen) + 100 мкл и инкубировали 25 мин при комнатной температуре. Всю смесь наносили по каплям на клетки COS и инкубировали в течение 48 ч при 37%, 5% СО₂. Через 48 ч супернатанты собирали и центрифугировали (1500 об/мин, 10 мин, 4°С). Супернатанты количественно оценивали с помощью ELISA № ТН-МО-43. Количественный анализ активности выполняли с помощью ELISA TH-MO-44.The production of N13B2-h3 and N13B2-hVL6 was also investigated in transient transfection experiments. One day prior to transfection, COS cells were seeded at 100,000 cells/well in a P12 plate with complete medium (DMEM SVF10% (Hyclone)+PS 1%+Glu 1%) and incubated at 37° C., 5% CO ₂ . On the day of transfection, COS cells were used at a confluence of 50 to 90%. They were washed with PBS and stored with 500 µl in complete medium. 0.6 µg of VH variant + 0.4 µg of VL variant were mixed in 200 µl of OptiMEM medium and 1 µl of Plus reagent (Invitrogen) was added (15 min incubation at room temperature). 3.5 μl of Lipofectamine LTX (Invitrogen) + 100 μl was added to the mixture and incubated for 25 min at room temperature. The whole mixture was applied dropwise to COS cells and incubated for 48 h at 37%, 5% CO ₂ . After 48 h, the supernatants were collected and centrifuged (1500 rpm, 10 min, 4°C). Supernatants were quantified using ELISA No. TH-MO-43. Activity was quantified using ELISA TH-MO-44.

Пример 3. Связывание с CD127 - Elisa.Example 3 Binding to CD127 - Elisa.

Для сэндвич-ELISA ослиное антитело против человеческого IgG (Fc-специфическое) наносили в концентрации 1,2 мкг/мл на планшет Р96 и добавляли очищенные антитела для измерения концентрации как функции от стандартного диапазона. После инкубации и промывания добавляли мышиные антитела против человеческий легкой цепи, каппа-специфичные, (Effimune, клон NaM76-5F3) плюс меченные пероксидазой ослиные антимышиные антитела (Jackson Immunoresearch, номер 715-036-151) и проявляли обычными способами.For the sandwich ELISA, donkey anti-human IgG (Fc-specific) was applied at a concentration of 1.2 μg/ml to a P96 plate and purified antibodies were added to measure the concentration as a function of the standard range. After incubation and washing, mouse anti-human light chain antibody, kappa-specific, (Effimune, clone NaM76-5F3) plus peroxidase-labeled donkey anti-mouse antibodies (Jackson Immunoresearch, number 715-036-151) was added and developed by conventional methods.

Для анализа активности ELISA рекомбинантный hCD127 (Sino Biologicals, Пекин, Китай; номер 10975-H08H) иммобилизовали на пластике при концентрации 1 мкг/мл и добавляли разведения антиCD127-антитела для измерения связывания. После инкубации и промывки добавляли мышиные антитела против человеческий легкой цепи (каппа-специфичные) плюс меченные пероксидазой ослиные антимышиные антитела и проявляли колориметрией на 450 нм с использованием субстрата ТМВ обычными способами.For ELISA activity assay, recombinant hCD127 (Sino Biologicals, Beijing, China; number 10975-H08H) was immobilized on plastic at a concentration of 1 μg/ml, and anti-CD127 antibody dilutions were added to measure binding. After incubation and washing, mouse anti-human light chain antibodies (kappa-specific) plus peroxidase-labeled donkey anti-mouse antibodies were added and developed by colorimetry at 450 nm using TMB substrate by conventional methods.

Были получены следующие значения ED50 (концентрация, необходимая для достижения 50% максимального сигнала):The following ED50 values (the concentration required to achieve 50% of the maximum signal) were obtained:

- 25 041126- 25 041126

Таблица 1. Значение ED50 (в нг/мл) для связывания антител с CD127Table 1. ED50 value (in ng/ml) for antibody binding to CD127

ED50 (нг/мл) ED50 (ng/ml) N13B2-h3 N13B2-h3 16,8 16.8 N13B2-hVL3 N13B2-hVL3 15,1 15.1 N13B2-hVL4 N13B2-hVL4 12,6 12.6 N13B2-hVL5 N13B2-hVL5 14,8 14.8 N13B2-hVL6 N13B2-hVL6 9,5 9.5

Стабильность антител изучали с помощью инкубации антител в течение 7, 14 или 30 дней при 4, 25 и 42°С. Связывание антител с CD127 оставалось превосходным даже после 30-дневной инкубации. Значения ED50, определенные с помощью ИФА после 30 дней инкубации, приведены в табл. 2.The stability of the antibodies was studied by incubating the antibodies for 7, 14 or 30 days at 4, 25 and 42°C. Antibody binding to CD127 remained excellent even after 30 days of incubation. ED50 values determined by ELISA after 30 days of incubation are shown in Table. 2.

Таблица 2. Значение ED50 (в нг/мл) для связывания антител с CD127 после 30-дневной инкубации при указанной температуре ΙΊ)50 (iii/m.i)Table 2. ED50 value (in ng/mL) for antibody binding to CD127 after 30 days of incubation at indicated temperature ΙΊ)50 (iii/m.i)

N13B2-hVL6 d7 при 4°C N13B2-hVL6 d7 at 4°C 55.31 55.31 N13B2-hVL6 d7 при 25°C N13B2-hVL6 d7 at 25°C 47,83 47.83 N13B2-hVL6 d7 при 42°C N13B2-hVL6 d7 at 42°C 56,16 56.16 N13B2-hVL6 dl4 при 4°C N13B2-hVL6 dl4 at 4°C 62,75 62.75 N13B2-hVL6 dl4 при 25°C N13B2-hVL6 dl4 at 25°C 52,58 52.58 N13B2-hVL6 dl4 при 42°C N13B2-hVL6 dl4 at 42°C 40,62 40.62 N13B2-hVL6 d30 при 4°C N13B2-hVL6 d30 at 4°C 46,98 46.98 N13B2-hVL6 d30 при 25°C N13B2-hVL6 d30 at 25°C 40,19 40.19 N13B2-hVL6 d30 при 42°C N13B2-hVL6 d30 at 42°C 58,69 58.69

Пример 4. Связывание с CD127 - Blitz.Example 4 Binding to CD127 - Blitz.

Этот способ выполняли с помощью технологии Blitz (Forte Bio, C22-2 No 61010-1). Рекомбинантный hCD127 (Sino Biologicals, Пекин, Китай; номер 10975-Н08Н)/рекомбинантный белок (Sino Biological Cat: 11612-H08H) иммобилизовали при концентрации 50 мкг/мл с помощью фрагмента Fc в биосенсор Fc анти-IgG человека (АНС) (Forte) Bio, 18-5063) в течение 30 с. Затем добавляли анти-CD127-антитела в концентрации 20 мкг/мл (насыщающая концентрация) в течение периода ассоциации 120 с, с последующим периодом диссоциации анти-CD127-антитела в буфере кинетики в течение 120 с. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения Blitz Pro 1.2, которое вычисляло константу ассоциации (ka) и константу диссоциации (kd) и определяло постоянную аффинности KD (ka/kd). Результаты представлены в табл. 3.This method was performed using Blitz technology (Forte Bio, C22-2 No 61010-1). Recombinant hCD127 (Sino Biologicals, Beijing, China; number 10975-H08H)/recombinant protein (Sino Biological Cat: 11612-H08H) was immobilized at a concentration of 50 μg/mL with an Fc fragment into an anti-human IgG (AHC) Fc biosensor (Forte ) Bio, 18-5063) for 30 s. Anti-CD127 antibodies were then added at a concentration of 20 μg/ml (saturating concentration) for an association period of 120 s, followed by a dissociation period of the anti-CD127 antibody in kinetic buffer for 120 s. Data analysis was performed using Blitz Pro 1.2 software, which calculated the association constant (ka) and dissociation constant (kd) and determined the KD affinity constant (ka/kd). The results are presented in table. 3.

Таблица 3. Анализ аффинностиь для анти-CD127 антител на человеческом рекомбинантном белке CD127 методикой Blitz Ассоциация (ka) Диссоциация (kd ι Аффи ι и юс i ь ( KI) I ( ΜI (I/мс) (1/c)Table 3. Affinity analysis for anti-CD127 antibodies on human recombinant protein CD127 by the Blitz method

M3B2-h3 M3B2-h3 l,15xl0⁶ l,15xl0 ⁶ 2,67xl0^-3 2.67xl0 ^-3 2,33xl0⁹ 2.33xl0 ⁹ M3B2-hVL3 M3B2-hVL3 1,27 xlO^{6 1.27xlO6} 4,47xl0’^{3 4.47xl0'3} 3,51xl0⁹ 3.51xl0 ⁹ M3B2-IA 3.4 M3B2-IA 3.4 l,04xl0⁶ l,04xl0 ⁶ 2,81xl0-^{3 2.81xl0-3} 2,71xl0⁹ 2.71xl0 ⁹ M3B241VL5 M3B241VL5 Ι,ΟΙχΙΟ⁶ Ι,ΟΙχΙΟ ⁶ 2,66xl0-^{3 2.66xl0-3} 2,63xl0'⁹ 2.63xl0' ⁹ M3B2-h\ 1.6 M3B2-h\ 1.6 1,05хЮ^б 1.05 x Yu ^b 2,66xl0’³ 2.66xl0' ³ 2,53xl0⁹ 2.53xl0 ⁹

Пример 5. Ингибирование фосфорилирования STAT5.Example 5 Inhibition of STAT5 Phosphorylation.

Чтобы проверить ингибирование IL7R в функциональном анализе, антитело инкубировали с РВМС человека в течение 30 мин при 37°С, а затем стимулировали IL7 (AbD Serotec, номер РНР046) в концентрации 0,1 нг/мл в течение 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали при 4°С и промывали буфером Perm Wash перед фиксацией с помощью набора Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience, номер 554722) в течение 15 мин при 4°С. Клетки промывали и окрашивали FITC-меченным анти-CD3 (BD Bioscience, номер 557694) в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки пермеабилизировали при инкубации с Perm Buffer III (BD Bioscience, номер 558050) в течение 30 мин при 4°С. После промывания PBS BSA1% азид 0,1%, клетки окрашивали меченным А1еха-647 антителом против pStat5 (BD Bioscience, номер 612599) в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы анализировали на цитофлуорометре BD CantoII. hPBMC-CD3+ с IL7 индуцировали фосфорилирование pStat5, тогда как без IL7 фосфорилирования не наблюдалось. Результаты представлены на фиг. 4 и в таблице ниже, где приаедена ED50, т.е. концентрация указанного антитела для достижения 50% сигнала в этом анализе.To test IL7R inhibition in a functional assay, the antibody was incubated with human PBMC for 30 min at 37°C and then stimulated with IL7 (AbD Serotec, number PHP046) at 0.1 ng/mL for 15 min at 37°C. The reaction was stopped at 4°C and washed with Perm Wash buffer before fixing with Cytofix/Cytoperm kit (BD Bioscience, number 554722) for 15 min at 4°C. Cells were washed and stained with FITC-labeled anti-CD3 (BD Bioscience, number 557694) for 30 min at 4°C. The cells were then permeabilized by incubation with Perm Buffer III (BD Bioscience, number 558050) for 30 min at 4°C. After washing with PBS BSA1% azide 0.1%, cells were stained with Alexa-647 labeled anti-pStat5 antibody (BD Bioscience, number 612599) for 30 minutes at room temperature. Samples were analyzed on a BD CantoII cytofluorometer. hPBMC-CD3+ with IL7 induced pStat5 phosphorylation, while no phosphorylation was observed without IL7. The results are shown in FIG. 4 and in the table below, where ED50 is attached, i.e. the concentration of said antibody to achieve 50% signal in that assay.

- 26 041126- 26 041126

Таблица 4. Ингибирование фосфорилирования STAT5 антителами против CD127Table 4. Inhibition of STAT5 phosphorylation by anti-CD127 antibodies

Этот эксперимент подтвердил, что модификация зародышевой линии и модификация структурных остатков гуманизированной аминокислотой не изменяет биологическую активность антитела против CD127. Все исследованные варианты (N13B2-h3, N13B2-hVL3, N13B2-hVL4, N13B2-hVL5, N13B2-hVL6) могут ингибировать фосфорилирование Stat5 после стимуляции IL7 на hPBMC, подобно ранее полученным эталонным партиям N13B2. Сосредоточившись на N13B2-hVL6 (наиболее гуманизированном и наиболее оптимизированном), мы заметили, что оно способно поддерживать свою биологическую активность в ингибировании фосфорилирования Stat5 в той же степени, что и эталонное N13B2-h3. Более того, этот вариант был очень стабильным после 14 дней инкубации при 42, 25 или 4°С, не вызывал образования агрегатов и сохранял свою связывающую активность.This experiment confirmed that germline modification and modification of structural residues with a humanized amino acid did not alter the biological activity of the anti-CD127 antibody. All studied variants (N13B2-h3, N13B2-hVL3, N13B2-hVL4, N13B2-hVL5, N13B2-hVL6) can inhibit Stat5 phosphorylation after IL7 stimulation on hPBMC, similar to previously obtained N13B2 reference lots. By focusing on N13B2-hVL6 (the most humanized and most optimized), we observed that it was able to maintain its biological activity in inhibiting Stat5 phosphorylation to the same extent as the reference N13B2-h3. Moreover, this variant was very stable after 14 days of incubation at 42, 25 or 4°C, did not cause the formation of aggregates and retained its binding activity.

Пример 6. Влияние на Т-клетки памяти.Example 6. Effect on memory T-cells.

Туберкулиновая модель гиперчувствительности замедленного типа.Tuberculin model of delayed hypersensitivity.

Павианов дважды иммунизировали внутрикожно вакциной бациллы Кальмета-Герена (0,1 мл; 2-8 10⁵ КОЕ; Sanofi Pasteur MSD, Лион, Франция) в верхней части голени, за 4 и 2 недели до кожного теста гиперчувствительности замедленного типа (DTH). Внутрикожные реакции (IDR) исследовали с помощью внутрикожных инъекций 2000 или 1000 UI очищенного белкового деривата туберкулина, очищенного от белков среды (PPD; Symbiotics Corporation, Сан-Диего, Калифорния). Солевой раствор (0,1 мл) использовали в качестве отрицательного контроля. Кожные реакции в местах инъекций измеряли с использованием штангенциркуля как минимум двумя наблюдателями и считали положительными при диаметре >4 мм. Второй IDR выполняли после трехнедельного периода вымывания, и животные получали одну внутривенную инъекцию 10 мг/кг N13B2 (n=7) или 10 мг/кг (V915GA, АА892ВВ, 32257, 33874) (n=4) гуманизированной N13B2 или эквивалентного объема вспомогательного вещества (n=4). Дополнительные IDR выполняли каждый месяц после инъекции. После периода вымывания некоторых павианов (ранее получивших N13B2) снова иммунизировали дважды внутрикожно вакциной БЦЖ с последующим новым IDR. Среднее значение записывали и наносили на график для каждой временной точки. Чтобы сравнить множественные экспериментальные условия, ответы на эритему определяли количественно как площадь под кривой (AUC) с использованием для расчета программного обеспечения Graph Pad Prism (фиг. 5А и В).Baboons were immunized twice intradermally with the bacillus Calmette-Guerin vaccine (0.1 ml; 2-8 10 ⁵ CFU; Sanofi Pasteur MSD, Lyon, France) in the upper leg, 4 and 2 weeks before the delayed-type hypersensitivity (DTH) skin test. Intradermal reactions (IDRs) were tested with intradermal injections of 2000 or 1000 UI purified medium protein purified tuberculin protein derivative (PPD; Symbiotics Corporation, San Diego, CA). Saline solution (0.1 ml) was used as a negative control. Skin reactions at the injection sites were measured using calipers by at least two observers and were considered positive at >4 mm in diameter. A second IDR was performed after a three-week washout period and animals received a single intravenous injection of 10 mg/kg N13B2 (n=7) or 10 mg/kg (V915GA, AA892BB, 32257, 33874) (n=4) humanized N13B2 or equivalent volume of excipient (n=4). Additional IDRs were performed every month after injection. After a washout period, some baboons (previously treated with N13B2) were re-immunized twice intradermally with BCG vaccine followed by a new IDR. The mean value was recorded and plotted for each time point. To compare multiple experimental conditions, erythema responses were quantified as area under the curve (AUC) using Graph Pad Prism calculation software (FIGS. 5A and B).

ELISPOT.Elispot.

Ag-спепифическую частоту Т-клеток отслеживали с помощью анализа ELISPOT IFN-g (набор IFISg ELISPOT для приматов, не являющихся человеком; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) на свежевыделенных РВМС, повторно стимулированных туберкулином, в соответствии с инструкциями производителя.Ag-specific T cell frequency was monitored using an IFN-g ELISPOT assay (IFISg ELISPOT kit for non-human primates; R&D Systems, Minneapolis, Minn.) on freshly isolated tuberculin-restimulated PBMCs according to the manufacturer's instructions.

Вкратце, захватывающее антитело (R&D systems, каталожный номер SEL961) добавляли в каждую лунку фильтровальных пластин ELISPOT MultiScreen® HTS Filter Plates (Merck Millipore) и инкубировали одну ночь при 4°С. После трех промывок добавляли блокирующий буфер и планшет инкубировали 2 ч при температуре окружающей среды. РВМС павианов были недавно извлечены из крови павианов с помощью центрифугирования в градиенте фиколла (GE Healthcare Life Science, Париж, Франция). Затем эритроциты лизировали и клетки промывали перед восстановлением в соответствующей концентрации в культуральной среде (среда TexMacs, дополненная пенициллин-стрептомицином (Gibco)) с очищенным белковым дериватом туберкулина или без него. Планшет инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 1824 ч. После трех промывок буфером для промывки добавляли детектирующее антитело (R&D systems, каталожный номер SEL961) и инкубировали при 4°С в течение 24 ч. Стрептавидин-АР (R&D systems, каталожный номер SEL002) добавляли после трех промываний и инкубировали два часа при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Выполняли три промывания. Затем добавляли BCIP/NBT (R&D systems, каталожный номер SEL002) и выдерживали в темноте 30 мин. Требовалось несколько промывок буфером для промывки и одна - деионизированной водой (фиг. 5С).Briefly, a capture antibody (R&D systems, catalog number SEL961) was added to each well of ELISPOT MultiScreen® HTS Filter Plates (Merck Millipore) and incubated one night at 4°C. After three washes, blocking buffer was added and the plate was incubated for 2 hours at ambient temperature. Baboon PBMCs were recently isolated from baboon blood by ficoll gradient centrifugation (GE Healthcare Life Science, Paris, France). The erythrocytes were then lysed and the cells were washed before being reconstituted at the appropriate concentration in culture medium (TexMacs medium supplemented with penicillin-streptomycin (Gibco)) with or without purified tuberculin protein derivative. The plate was incubated at 37° C. and 5% CO ₂ for 1824 hours. After three washes with wash buffer, detection antibody (R&D systems, cat. no. SEL961) was added and incubated at 4° C. for 24 hours. Streptavidin-AP (R&D systems , catalog number SEL002) was added after three washes and incubated for two hours at ambient temperature for 2 hours. Three washes were performed. BCIP/NBT (R&D systems, catalog number SEL002) was then added and kept in the dark for 30 minutes. Several washes with wash buffer and one with deionized water were required (FIG. 5C).

Животные.Animals.

Павианы (Papio anubis; 7-14 кг) были получены из Национального научного центра Приматологии (Руссе, Франция). Животных содержали в крупном виварии блока INSERM 1064. Исследования на животных были одобрены Национальным комитетом по этике Франции.Baboons (Papio anubis; 7-14 kg) were obtained from the National Research Center for Primatology (Roussay, France). Animals were kept in a large vivarium block INSERM 1064. Animal studies were approved by the French National Committee of Ethics.

Результаты.Results.

В первом эксперименте первый тест IDR с туберкулином выполняли на павианах, вакцинированных БЦЖ, которые не получали лечения в это время (день -30). После периода вымывания длиной один меIn the first experiment, the first tuberculin IDR test was performed on BCG vaccinated baboons that were not receiving treatment at this time (day -30). After a washout period of one me

- 27 041126 сяц второй тест IDR выполняли через 4 ч и затем раз в месяц после в/в инъекции 10 мг/кг N13B2 (белые столбики). Последний тест на IDR выполняли после новой вакцинации БЦЖ (через 14 месяцев после введения антитела). Контрольные животные (черные столбики) получали аналогичный объем вспомогательного вещества, т.е. получали провокацию по тому же протоколу. Полученные результаты показали, что химерное антитело против IL7Ra вызывает очень длительную защиту (до 14 месяцев) после однократного введения. Ответ на тпровокацию восстановился только после новой вакцинации.- 27 041126 Months a second IDR test was performed 4 hours later and then once a month after an IV injection of 10 mg/kg N13B2 (white bars). The last IDR test was performed after a new BCG vaccination (14 months after antibody administration). Control animals (black bars) received the same volume of excipient, i.e. received provocation under the same protocol. The results obtained showed that the chimeric anti-IL7Ra antibody induces very long-term protection (up to 14 months) after a single administration. The response to the challenge was restored only after a new vaccination.

В другом эксперименте первый тест IDR с туберкулином выполняли на павианах, вакцинированных БЦЖ (заштрихованные столбики - например, IDR1 для V915GA). После периода вымывания длиной в один месяц тест IDR выполняли через 4 ч и затем раз в месяц после в/в инъекции 10 мг/кг гуманизированного N13B2 (сплошные столбики - например, IDR2-6 для V915GA). Последний тест на IDR выполняли после новой вакцинации БЦЖ и туберкулином (заштрихованные столбики - например, IDR7 для V915GA). Контрольные животные (черные столбики) получали аналогичный объем вспомогательного вещества, т.е. получали провокацию по тому же протоколу. Полученные результаты показали, что гуманизированное N13B2 индуцирует длительную защиту после однократного введения у 3 из 4 оцененных павианов. Животное 33874 первоначально отвечало сразу после введения антитела, но ответ восстановился самопроизвольно через месяц. РВМС в крови повторно стимулировали ex vivo туберкулином. Первый анализ ELISPOT IFNy с туберкулином или без него выполняли на павианах, вакцинированных БЦЖ (заштрихованные столбики). Второй анализ ELISPOT IFNy проводили через 4 дня после инъекции 10 мг/кг гуманизированного N13B2 (сплошные столбики). Затем новый анализ ELISPOT проводили каждый месяц при каждом новом тесте IDR туберкулином in vivo. Последний анализ ELISPOT IFNy проводили после новой вакцинации БЦЖ (заштрихованные столбики). Полученные результаты показали, что введение гуманизированного N13B2 индуцировало антигенспецифическую делецию Т-клеток памяти у животных с длительным ответом. Павиан 33874 не показал значительного сокращения туберкулинспецифических Т-клеток памяти параллельно с отсутствием долгосрочной защиты в модели DTH. После новой вакцинации БЦЖ животные с длительным ответом показали повышенную частоту антигенспецифических Т-клеток памяти, которые восстанавливаются до базального уровня (до инъекции mAb), и это ассоциировано с восстановлением ответа DTH in vivo. В целом, эти результаты продемонстрировали, что долговременная защита, индуцированная гуманизированным N13B2, ассоциирована с делецией антиген-специфических Т-клеток памяти, что объясняет долгосрочный эффект препарата.In another experiment, the first tuberculin IDR test was performed on BCG vaccinated baboons (shaded bars - eg IDR1 for V915GA). After a washout period of one month, an IDR test was performed 4 hours later and then once a month after an iv injection of 10 mg/kg humanized N13B2 (solid bars - eg IDR2-6 for V915GA). The last test for IDR was performed after a new vaccination with BCG and tuberculin (shaded bars - for example, IDR7 for V915GA). Control animals (black bars) received the same volume of excipient, i.e. received provocation under the same protocol. The results showed that humanized N13B2 induces long-term protection after a single dose in 3 out of 4 baboons evaluated. Animal 33874 initially responded immediately after administration of the antibody, but the response recovered spontaneously after one month. PBMCs in the blood were restimulated ex vivo with tuberculin. The first IFNy ELISPOT assay with or without tuberculin was performed on BCG vaccinated baboons (hatched bars). A second IFNy ELISPOT analysis was performed 4 days after injection of 10 mg/kg humanized N13B2 (solid bars). Thereafter, a new ELISPOT analysis was performed every month at each new in vivo tuberculin IDR test. The last IFNy ELISPOT analysis was performed after a new BCG vaccination (shaded bars). The results obtained showed that administration of humanized N13B2 induced an antigen-specific deletion of memory T cells in sustained response animals. Baboon 33874 did not show a significant reduction in tuberculin-specific memory T cells in parallel with the lack of long-term protection in the DTH model. After a new BCG vaccination, sustained response animals showed an increased frequency of antigen-specific memory T cells that recover to basal levels (before mAb injection), and this is associated with recovery of the DTH response in vivo. Overall, these results demonstrate that the long-term protection induced by humanized N13B2 is associated with the deletion of antigen-specific memory T cells, which explains the long-term effect of the drug.

Пример 7. Экспрессия IL-7, CD127 и TSLP у пациентов с ВЗК.Example 7 Expression of IL-7, CD127 and TSLP in patients with IBD.

Необработанные данные по экспрессии мРНК, полученные, как подробно описано в Planell et al. Gut 2013 анализировали как подробно изложено в описании на фиг. 6.Raw mRNA expression data obtained as detailed in Planell et al. Gut 2013 was analyzed as detailed in the description in FIG. 6.

Пример 8. Сигнальный путь человеческих РВМС, стимулированных анти-CD127 антителами плюс IL7.Example 8 Signaling Pathway of Human PBMCs Stimulated with Anti-CD127 Antibodies Plus IL7.

Сигнальные пути IL7 изучали с использованием лизатов РВМС человека, инкубированных 30 мин при 37°С с 10 мкг/мл растворимых антител против CD127 человека и стимулированных IL7 (AbD Serotec, номер РНР046) в концентрации 5 нг/мл в течение 10 мин при 37°С. Вестерн-блоттинг проводили в восстанавливающих условиях с 20 мкг белка клеточных лизатов в 7,5% полиакриламидных гелях и наносили блоттингом на нитроцеллюлозные мембраны (GeHealthcare). Блоты насыщали 5% BSA-трисбуферным солевым раствором (TBS) и проявляли либо с помощью антитела Phospho-Stat5, Phospho-PI3киназы р85, фосфо-Akt и фосфо-ERK1/2 (Cell Signalling Technology) при концентрации 1/1000 в 1% BSATBS (в течение ночи при 4°С) с последующим добавлением поликлонального меченного пероксидазой хрена козьего анти-кроличьего антитела, (технология Cell Signaling), при концентрации 1/2000 в течение 1 ч при комнатной температуре либо с антителом GAPDH (Santa Cruz) при концентрации 1/1000 в 1% BSA-TBS (в течение ночи при 4°С) с последующим добавлением поликлонального меченного пероксидазой хрена козьего антимышиного антитела (Jackson Immunoresearch) при концентрации 1/2000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны проявляли хемилюминесценцией с использованием системы визуализации LAS-3000 (Fujifilm). Таким образом, были проанализированы следующие античеловеческие антитела против CD127: N13B2-h3 и N13B2-hVL6 (оба антитела против сайта 1/2b, описанные в настоящем документе); MD707-13-G4 (антитело против сайта 1, раскрытое в заявке на патент WO2013/056984) и 1А11 (раскрытое в патенте GSK WO2011/094259).IL7 signaling pathways were studied using human PBMC lysates incubated for 30 min at 37°C with 10 μg/mL of soluble anti-human CD127 antibodies and stimulated with IL7 (AbD Serotec, number PHP046) at a concentration of 5 ng/mL for 10 min at 37°C. WITH. Western blotting was performed under reducing conditions with 20 μg of cell lysate protein in 7.5% polyacrylamide gels and blotted onto nitrocellulose membranes (GeHealthcare). Blots were saturated with 5% BSA-trisbuffer saline (TBS) and developed with either Phospho-Stat5 antibody, Phospho-PI3 kinase p85, phospho-Akt and phospho-ERK1/2 (Cell Signaling Technology) at 1/1000 concentration in 1% BSATBS (overnight at 4°C) followed by the addition of a polyclonal horseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit antibody, (Cell Signaling Technology), at a concentration of 1/2000 for 1 hour at room temperature, or with a GAPDH antibody (Santa Cruz) at a concentration of 1/1000 in 1% BSA-TBS (overnight at 4°C) followed by the addition of a polyclonal horseradish peroxidase labeled goat anti-mouse antibody (Jackson Immunoresearch) at a concentration of 1/2000 for 1 hour at room temperature. The membranes were developed by chemiluminescence using a LAS-3000 imaging system (Fujifilm). Thus, the following anti-human CD127 antibodies were analyzed: N13B2-h3 and N13B2-hVL6 (both anti-site 1/2b antibodies described herein); MD707-13-G4 (anti-site 1 antibody disclosed in patent application WO2013/056984) and 1A11 (disclosed in GSK patent WO2011/094259).

Пример 9. Влияние на высвобождение цитокинов Т-клетками в ткани ВЗК.Example 9 Influence on Cytokine Release by T Cells in IBD Tissue.

Биоптаты пациентов с ВЗК можно использовать в качестве модели воспаления ex-vivo, и было показано, что они спонтанно высвобождают высокие уровни провоспалительных цитокинов после 24 ч культивирования (ЯК: IFNy, 130±19 пг/мл; IL-6 4042±529 пг/мл; IL-8 25626±1640 пг/мл - CD: IFNy 180±38 пг/мл; IL-6 3653±734 пг/мл; IL-8 15540±2452 пг/мл [средние±стандартная ошибка среднего для ЯК и БК соответственно].Biopsies from patients with IBD can be used as an ex-vivo model of inflammation and have been shown to spontaneously release high levels of pro-inflammatory cytokines after 24 h in culture (UC: IFNy, 130±19 pg/mL; IL-6 4042±529 pg/mL). ml; IL-8 25626±1640 pg/ml - CD: IFNy 180±38 pg/ml; IL-6 3653±734 pg/ml; IL-8 15540±2452 pg/ml BC, respectively].

Применяли анти-CD127 mAb в концентрации 10 мкг/мл в этом анализе культуры органов с использованием хирургических образцов, взятых из воспаленной слизистой оболочки толстой кишки 20 пациентов с ВЗК (10 пациентов с болезнью Крона и 10 пациентов с язвенным колитом), и культивирование проводили при 37°С в течение 24 ч в среде с 10 мкг/мл контрольного mAb IgG или блокирующего mAbAnti-CD127 mAb was used at a concentration of 10 μg/mL in this organ culture assay using surgical specimens taken from the inflamed colonic mucosa of 20 IBD patients (10 Crohn's disease patients and 10 ulcerative colitis patients) and cultured at 37°C for 24 h in medium with 10 μg/ml control IgG mAb or blocking mAb

- 28 041126 против человеческого IL-7Ra (подробности отбора проб и условий культивирования см. ниже). Для каждого пациента отбирали парный контрольный образец и культивировали в тех же условиях, с контролем- 28 041126 against human IL-7Ra (see below for details of sampling and culture conditions). For each patient, a paired control sample was taken and cultured under the same conditions, with control

IgG вместо антитела против CD127. Концентрацию цитокинов измеряли с помощью ELISA (как подробно описано ниже) в супернатанте культивируемых ex-vivo образцов.IgG instead of anti-CD127 antibody. The concentration of cytokines was measured using ELISA (as detailed below) in the supernatant of cultured ex-vivo samples.

Выработка IFNy образцами биопсии ЯК, выращенными ex vivo, была значительно ингибирована mAb против IL7Ra. Аналогичные результаты наблюдали для некоторых образцов биопсии БК секретирующих большое количество IFNy.The production of IFNy by ex vivo grown UC biopsy specimens was significantly inhibited by the anti-IL7Ra mAb. Similar results were observed for some BC biopsy specimens secreting large amounts of IFNy.

Взятие образцов и культивирование органов ex-vivo.Sampling and ex-vivo organ culture.

В случае использования резекционной ткани слизистой оболочки, небольшие фрагменты размером с биоптат разрезали ножницами. Затем биоптаты или фрагменты размером с биоптат помещали в 300 мкл бессывороточной среды HL-1 (Lonza, Cambridge BioScience, Великобритания) с добавлением Lглутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл гентамицина. Экспланты слизистой оболочки инкубировали в течение 24 ч при 37°С и 5% СО₂. Соответствующее тестируемое антитело (N13B2) или контроль IgG, используемые в концентрации 10 мкг/мл, добавляли в среду в начале периода инкубации. Наконец, супернатант и материал для биопсии быстро замораживали и хранили при -70°С для последующего анализа.In the case of mucosal resection tissue, small biopsy-sized fragments were cut with scissors. The biopsies or biopsy-sized fragments were then placed in 300 µl of serum-free HL-1 medium (Lonza, Cambridge BioScience, UK) supplemented with L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, and 50 µg/ml gentamicin. Mucosal explants were incubated for 24 h at 37°C and 5% CO ₂ . The appropriate test antibody (N13B2) or IgG control, used at a concentration of 10 μg/ml, was added to the medium at the start of the incubation period. Finally, the supernatant and biopsy material were quickly frozen and stored at -70°C for later analysis.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Выработку цитокинов в супернатанте биоптатов измеряли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Человеческий рекомбинантный IFN-y от производителя ImmunoTools (№ 31673539, Friesoythe, Г ермания) использовали в соответствии с инструкцией производителя.The production of cytokines in the biopsy supernatant was measured by enzyme immunoassay (ELISA). Human recombinant IFN-y from the manufacturer ImmunoTools (No. 31673539, Friesoythe, Germany) was used according to the manufacturer's instructions.

Пример 10. Сравнение антител против IL7-Ra человека, связанное с их характеризацией эпитопов.Example 10 Comparison of anti-human IL7-Ra antibodies related to their epitope characterization.

Масс-спектрометрический анализ: профилирование антител с использованием пептидного микрочипа.Mass spectrometric analysis: antibody profiling using a peptide microarray.

Пептидные микрочипы PepStar™ компании Pepti Technologies содержат очищенные синтетические пептиды, полученные из антигенов или других источников, которые хемоселективно и ковалентно иммобилизованы на поверхности стекла. Оптимизированный гидрофильный линкерный фрагмент вставляют между поверхностью стекла и пептидной последовательностью, полученной из антигена, чтобы избежать ложноотрицательных результатов, вызванных стерическим затруднением. По техническим причинам все пептиды содержат С-концевой глицин. Эксперименты по профилированию образцов проводили на пептидной библиотеке, состоящей из 52 пептидов.PepStar™ peptide microarrays from Pepti Technologies contain purified synthetic peptides derived from antigens or other sources that are chemoselectively and covalently immobilized on a glass surface. An optimized hydrophilic linker fragment is inserted between the glass surface and the peptide sequence derived from the antigen to avoid false negative results due to steric hindrance. For technical reasons, all peptides contain a C-terminal glycine. Sample profiling experiments were performed on a peptide library consisting of 52 peptides.

Полный список пептидов приведен ниже.The full list of peptides is below.

Таблица 5. Список пептидов, используемых в анализах пептидных микрочиповTable 5. List of peptides used in peptide microarray assays

SE Q ID SE Q ID Последовательность Subsequence SE Q ID SE Q ID Последовательность Subsequence SE Q ID SE Q ID Последовательность Subsequence 44 44 ESGYAQNGDLEDAEL ESGYAQNGDLEDAEL 62 62 FIETKKFLLIGKSNI FIETKKFLLIGKSNI 80 80 HDVAYRQEKDENKWT HDVAYRQEKDENKWT 45 45 AQNGDLEDAELDDYS AQNGDLEDAELDDYS 63 63 KKFLLIGKSNICVKV KKFLLIGKSNICVKV 81 81 YRQEKDENKWTHVNL YRQEKDENKWTHVNL 46 46 DLEDAELDDYSFSCY DLEDAELDYSFSCY 64 64 LIGKSNICVKVGEKS LIGKSNICVKVGEKS 82 82 KDENKWTHVNLSSTK KDENKWTHVNLSSTK 47 47 AELDDYSFSCYSQLE AELDDYSFSCYSQLE 65 65 SNICVKVGEKSLTCK SNICVKVGEKSLTCK 83 83 KWTHVNLSSTKLTLL KWTHVNLSSTKLTLL 48 48 DYSFSCYSQLEVNGS DYSFSCYSQLEVNGS 66 66 VKVGEKSLTCKKIDL VKVGEKSLTCKKIDL 84 84 VNLSSTKLTLLQRKL VNLSSTKLTLLQRKL 49 49 SCYSQLEVNGSQHSL SCYSQLEVNGSQHSL 67 67 EKSLTCKKIDLTTIV EKSLTCKKIDLTTIV 85 85 STKLTLLQRKLQPAA STKLTLLQRKLQPAA 50 50 QLEVNGSQHSLTCAF QLEVNGSQHSLTCAF 68 68 TCKKIDLTTIVKPEA TCKKIDLTTIVKPEA 86 86 TLLQRKLQPAAMYEI TLLQRKLQPAAMYEI 51 51 NGSQHSLTCAFEDPD NGSQHSLTCAFEPDPD 69 69 IDLTTIVKPEAPFDL IDLTTIVKPEAPFDL 87 87 RKLQPAAMYEIKVRS RKLQPAAMYEIKVRS 52 52 HSLTCAFEDPDVNTT HSLTCAFEDPDVNTT 70 70 TIVKPEAPFDLSVIY TIVKPEAPFDLSVIY 88 88 PAAMYEIKVRSIPDH PAAMYEIKVRSIDPDH 53 53 CAFEDPDVNTTNLEF CAFEDPDVNTTNLEF 71 71 PEAPFDLSVIYREGA PEAPFDLSVIYREGA 89 89 YEIKVRSIPDHYFKG YEIKVRSIPDHYFKG 54 54 DPDVNTTNLEFEICG DPDVNTTNLEFEICG 72 72 FDLSVIYREGANDFV FDLSVIYREGANDFV 90 90 VRSIPDHYFKGFWSE VRSIPDHYFKGFWSE 55 55 NTTNLEFEICGALVE NTTNLEFEICGALVE 73 73 VIYREGANDFVVTFN VIYREGANDFVVTFN 91 91 PDHYFKGFWSEWSPS PDHYFKGFWSEWSPS 56 56 LEFEICGALVEVKCL LEFEICGALVEVKCL 74 74 EGANDFVVTFNTSHL EGANDFVVTFNTSHL 92 92 FKGFWSEWSPSYYFR FKGFWSEWSPSYYFR 57 57 ICGALVEVKCLNFRK ICGALVEVKCLNFRK 75 75 DFVVTFNTSHLQKKY DFVVTFNTSHLQKKY 93 93 WSEWSPSYYFRTPEI WSEWSPSYYFRTPEI 58 58 LVEVKCLNFRKLQEI LVEVKCLNFRKLQEI 76 76 TFNTSHLQKKYVKVL TFNTSHLQKKYVKVL 94 94 SPSYYFRTPEINNSS SPSYYFRTPEINNSS 59 59 KCLNFRKLQEIYFIE KCLNFRKLQEIYFIE 77 77 SHLQKKYVKVLMHDV SHLQKKYVKVLMHDV 95 95 YFRTPEINNSSGEMD YFRTPEINNSSGEMD 60 60 FRKLQEIYFIETKKF FRKLQEIYFIETKKF 78 78 KKYVKVLMHDVAYRQ KKYVKVLMHDVAYRQ 61 61 QEIYFIETKKFLLIG QEIYFIETKKFLLIG 79 79 KVLMHDVAYRQEKDE KVLMHDVAYRQEKDE

- 29 041126- 29 041126

В общей сложности 4 образца инкубировали на предметных стеклах с микрочипами в формате Multiwell. Для антитела N13B2-h3VL6 и другого образца (MD707-13, HAL и 1A11) применяли 6 различных концентраций (10; 2; 1; 0,1; 0,01; 0,001 мкг/мл). Серийные разведения образцов инкубировали в течение 1 ч при 30°С на многолуночном микропланшете, содержащем 21 отдельный миничип (1 миничип на каждое разведение образца). После инкубации образца добавляли вторичное антитело против IgG человека в концентрации 1 мкг/мл и оставляли реагировать в течение 1 ч. Параллельно проводили дополнительную контрольную инкубацию с применением только вторичного антитела на том же предметном стекле микрочипа для оценки ложноположительного связывания с пептидами. После промывки и сушки предметное стекло сканировали с помощью лазерного сканера высокого разрешения на 635 нм для получения профилей интенсивности флуоресценции. Полученные изображения количественно оценивали для получения среднего значения пикселей для каждого пептида. Изображения количественно оценивали для получения среднего значения пикселей для каждого пептида. Вторичное антитело против IgG человеческого, меченное Су5 в концентрации 1 мкг/мл.A total of 4 samples were incubated on microchip slides in Multiwell format. For the N13B2-h3VL6 antibody and another sample (MD707-13, HAL and 1A11), 6 different concentrations (10; 2; 1; 0.1; 0.01; 0.001 μg/ml) were used. Serial dilutions of samples were incubated for 1 hour at 30° C. on a multiwell microplate containing 21 individual minichips (1 minichip for each sample dilution). After incubation of the sample, a secondary antibody against human IgG was added at a concentration of 1 μg/ml and left to react for 1 h. In parallel, an additional control incubation was performed using only the secondary antibody on the same microchip slide to assess false positive binding to peptides. After washing and drying, the slide was scanned with a high resolution laser scanner at 635 nm to obtain fluorescence intensity profiles. The resulting images were quantified to obtain an average pixel value for each peptide. Images were quantified to obtain an average pixel value for each peptide. Secondary antibody against human IgG labeled with Cy5 at a concentration of 1 µg/ml.

Буферы и растворы. Использовали TBS-буфер, включающий 0,05% Tween20 (JPT) и буфер для анализа Т20 (Pierce, SuperBlock TBS T20, №37536). Сбор и анализ проводили с использованием пептидных микрочипов (JPT Peptide Technologies GmbH, Берлин, Германия; партия № 2668, многолуночная инкубационная камера, сканер Axon Genepix Scanner 4200AL). Микрочипы сканировали с использованием флуоресцентного сканера высокого разрешения. Параметры лазера и применяемое разрешение были идентичными, для всех выполненных измерений. Полученные изображения анализировали и количественно оценивали с использованием программного обеспечения для распознавания пятен GenePix (Molecular Devices). Для каждого пятна была извлечена средняя интенсивность сигнала (от 0 до 65535 произвольных единиц).buffers and solutions. A TBS buffer was used containing 0.05% Tween20 (JPT) and T20 assay buffer (Pierce, SuperBlock TBS T20, #37536). Harvesting and analysis were performed using peptide microarrays (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germany; batch #2668, multiwell incubation chamber, Axon Genepix Scanner 4200AL). The microarrays were scanned using a high resolution fluorescent scanner. The laser parameters and applied resolution were identical for all measurements taken. The resulting images were analyzed and quantified using GenePix spot recognition software (Molecular Devices). For each spot, the average signal intensity was extracted (from 0 to 65535 arbitrary units).

Для дальнейшей оценки данных определяли так называемые значения ММС2. ММС2 равняется среднему значению всех трех экземпляров на микрочипе, кроме случаев, когда коэффициент вариации (CV) - стандартное отклонение, деленное на среднее значение - больше 0,5. В этом случае ММС2 присваивается среднее из двух ближайших значений (МС2).For further evaluation of the data, the so-called MMC2 values were determined. MMC2 is equal to the average value of all three instances on the microarray, except when the coefficient of variation (CV) - standard deviation divided by the average value - is greater than 0.5. In this case, MMC2 is assigned the average of the two closest values (MC2).

Анализ с помощью дейтерия.Analysis using deuterium.

Используя систему HDX-2 (Waters SA/NV; Зеллик, Бельгия) рекомбинантный человеческий CD127 и 0- или 1-молярный эквивалент mAb смешивали и разбавляли в 99,9% D₂O, 10 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl, рН 6,8 до конечного содержание D2O 90% и концентрация комплекса CD127 или CD127/mAb 27,5 мкМ. Водородно-дейтериевый обмен проводили при 20,0°С в течение 30 мин. Обмен гасили путем разбавления 1:1 (об./об.) образцов 100 мМ фосфатом натрия, 4 М гуанидин-HCl, 0,4 М ТСЕР, рН 2,3, при 1,0°С, с получением конечногорН 2,5. Через 2 мин погашенные образцы загружали в устройство HDX для оперативного расщепления пепсином при 20,0°С (Энзимат ВЕН пепсин, 2,1x30 мм; 5 мкм) с последующим обессоливанием (Acquity ВЕН С18 Vanguard 2,1x5 мм; 1,7 м) и разделением обращенных фаз (Acquity ВЕН С18 1,0x100 мм; 1,7 мкМ) с использованием градиента от 5 до 40% 0,2% муравьиной кислоты в ацетонитриле (рН 2,5) в течение 10 мин при расходе 40 мкл/мин при 0,0°С. Массспектрометрический анализ выполняли на масс-спектрометре Waters Xevo G2-XS ESI-Q-TOF в режиме положительных ионов с коррекцией методом LockSpray. Использовали мягкие условия источника (температура: 90°С, капиллярное напряжение: 2,5 кВ, конус для отбора проб: 30 В, расход десольватационного газа: 800 л/ч, температура десольватации: 250°С) для минимизации обратного обмена при обеспечении надлежащей десольватации (73). Идентификации пептидов способствовала вызванная столкновением диссоциация, регистрируемая в режиме MSE с использованием PLGS 3.0.2 и UNIFI 1.8. Включение дейтерия определяли в DynamX 3.0. Изображения структуры готовили с использованием PyMOL 1.8.2.3 (Schrodinger LLC, Кембридж, Массачусетс, США) из PDB ID 3DI3 (19). Одноосновный и двухосновный фосфат натрия, хлорид натрия, гидрохлорид гуанидина, трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид (ТСЕР), 50% гидроксид натрия и муравьиную кислоту приобретали у Sigma Aldrich (Schnelldorf, Германия) с наивысшей доступной чистотой. Растворители класса LC-MS получали от Biosolve Chimie (Дьез, Франция), оксид дейтерия (99,9% D) и 20% хлорид дейтерия в оксиде дейтерия (99,96% D) получали из Cambridge Isotope Laboratories (Андовер, Массачусетс, США), 37% соляную кислоту - от VWR International (Фонтене-су-Буа, Франция) и бычий цитохром С - от Thermo Fisher Scientific (Гермеринг, Германия). Ультрацентробежные фильтры Amicon (0,5 мл; отсечка 10 кДа) получали от Merck Millipore (Мольсем, Франция).Using the HDX-2 system (Waters SA/NV; Zoellick, Belgium), recombinant human CD127 and 0 or 1 molar mAb equivalent were mixed and diluted in 99.9% D ₂ O, 10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, pH 6 ,8 to a final D2O content of 90% and a CD127 or CD127/mAb complex concentration of 27.5 µM. Hydrogen-deuterium exchange was carried out at 20.0°C for 30 min. The exchange was quenched by a 1:1 (v/v) dilution of the samples with 100 mM sodium phosphate, 4 M guanidine-HCl, 0.4 M TCEP, pH 2.3, at 1.0° C., to give final H 2.5 . After 2 min, the quenched samples were loaded into an HDX device for on-line pepsin digestion at 20.0°C (VEN Enzymat pepsin, 2.1x30 mm; 5 µm) followed by desalting (Acquity VEN C18 Vanguard 2.1x5 mm; 1.7 m) and reverse phase separation (Acquity BEN C18 1.0x100 mm; 1.7 µM) using a gradient of 5 to 40% 0.2% formic acid in acetonitrile (pH 2.5) over 10 min at a flow rate of 40 µl/min at 0.0°C. Mass spectrometric analysis was performed on a Waters Xevo G2-XS ESI-Q-TOF mass spectrometer in positive ion mode with LockSpray correction. Mild source conditions (temperature: 90°C, capillary voltage: 2.5 kV, sampling cone: 30 V, desolvation gas flow rate: 800 l/h, desolvation temperature: 250°C) were used to minimize reverse exchange while ensuring proper desolvation (73). Peptide identification was facilitated by collision-induced dissociation recorded in MSE mode using PLGS 3.0.2 and UNIFI 1.8. Deuterium incorporation was determined in DynamX 3.0. Structure images were prepared using PyMOL 1.8.2.3 (Schrodinger LLC, Cambridge, MA, USA) from PDB ID 3DI3 (19). Monobasic and dibasic sodium phosphate, sodium chloride, guanidine hydrochloride, tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), 50% sodium hydroxide and formic acid were purchased from Sigma Aldrich (Schnelldorf, Germany) in the highest purity available. LC-MS grade solvents were obtained from Biosolve Chimie (Dieuze, France), deuterium oxide (99.9% D) and 20% deuterium chloride in deuterium oxide (99.96% D) were obtained from Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA). ), 37% hydrochloric acid from VWR International (Fontenay-sous-Bois, France) and bovine cytochrome C from Thermo Fisher Scientific (Germering, Germany). Amicon ultracentrifugal filters (0.5 ml; cut-off 10 kDa) were obtained from Merck Millipore (Molsem, France).

Результаты.Results.

Характеризация эпитопов с помощью линейного пептидного массива различных mAb против IL7Ra позволила идентифицировать два типа mAb-антагонистов: (1) mAb, связывающиеся с областью (сайт-1) взаимодействия с IL-7, как ранее описано двумя другими группами исследователей (клон 1А11, описанный в WO/2011/094259, и клон HAL, описанный в WO/2011/104687) и включающие MD707-13, и (2) mAb, т.е. N13B2-h3VL6 по настоящему изобретению, связывающие как сайт-1, так и эпитоп, перекрывающий предсказанный домен (сайт-2b) гетеродимеризации между IL-7Ra и субъединицами γ-цепи (Walsh 2012).Epitope characterization with a linear peptide array of various anti-IL7Ra mAbs identified two types of mAb antagonists: (1) mAbs that bind to the IL-7 interaction site (site-1) as previously described by two other research groups (clone 1A11 described in WO/2011/094259 and the HAL clone described in WO/2011/104687) and comprising MD707-13 and (2) mAbs, i.e. N13B2-h3VL6 of the present invention binding both site-1 and an epitope spanning the predicted heterodimerization domain (site-2b) between IL-7Ra and γ-chain subunits (Walsh 2012).

- 30 041126- 30 041126

N13B2-h3VL6 и MD707-13 с высокой и сходной аффинностью (связывание с сайтом-1/2Ь с KD 2х10^-10 М и связывание с сайтом-1 с аналогичным KD 5х10^-10 М) рекомбинантно экспрессировали с изотипом Fc человеческого IgG4 (содержащим шарнирную мутацию S228P для предотвращения обмена Fab-плечо) и сравнивали с ранее описанным mAb с другим сайтом-1 с аналогичной аффинностью, клон 1А11, описанным в WO/2011/094259 (KD 6х10^-10 М) и рекомбинантно экспрессировали с изотипом Fc человеческого IgG1, которое в настоящее время разрабатывается в клинических испытаниях (клинические испытания NCT02293161). Анализ конформационного эпитопа с использованием водороднодейтериевого обмена с масс-спектрометрией (HDX-MS) подтвердил предыдущие наблюдения и продемонстрировал, что антитело по изобретению, т.е. N13B2-h3VL6 (сайт-1/2b mAb), защищено от включения дейтерия в несколько пептидов сайта-1, но также в пептид, перекрывающий сайт-2b, в то время как два других mAb (MD707-13 и 1A11) значительно предотвращают включение дейтерия только в пептиды из сайта-1 (данные не показаны).N13B2-h3VL6 and MD707-13 with high and similar affinity (binding to site-1/2b with a KD of 2x10 ^-10 M and binding to site-1 with a similar KD of 5x10 ^-10 M) were recombinantly expressed with the Fc isotype of human IgG4 (containing a hinge mutation S228P to prevent Fab-arm exchange) and compared with a previously described mAb with another site-1 with similar affinity, clone 1A11 described in WO/2011/094259 (KD 6x10 ^-10 M) and recombinantly expressed with the Fc isotype of human IgG1, which is currently being developed in clinical trials (clinical trial NCT02293161). Conformational epitope analysis using hydrogen-deuterium exchange with mass spectrometry (HDX-MS) confirmed previous observations and demonstrated that the antibody of the invention, i. N13B2-h3VL6 (site-1/2b mAb) is protected from deuterium incorporation in several site-1 peptides, but also in the site-2b spanning peptide, while two other mAbs (MD707-13 and 1A11) significantly prevent incorporation deuterium only into peptides from site-1 (data not shown).

Антитело по изобретению было единственным, которое распознало конформационный эпитоп, локализованный на сайте 1 из домена 1, и конформационный эпитоп, локализованный на сайте 2b человеческого CD127.The antibody of the invention was the only one that recognized a conformational epitope located at site 1 of domain 1 and a conformational epitope located at site 2b of human CD127.

Пример 11. Сравнение антител против IL-7Ra человека по их способности быть агонистом и/или антагонистом пути IL-7.Example 11 Comparison of anti-human IL-7Ra antibodies for their ability to be an agonist and/or antagonist of the IL-7 pathway.

Вестерн-блоттинг.Western blotting.

Свежевыделенные РВМС человека инкубировали в течение 30 мин при 37°С с 10 мкг/мл mAb против IL-7Ra человека, а затем культивировали отдельно или с 5 нг/мл рекомбинантного человеческого IL7 (AbDSerotec) в течение 10 мин при 37°С. После остановки реакций на льду готовили лизаты клеток с использованием буфера RIPA (с коктейлем ингибитора протеазы). Белки (15 мкг) растворяли в восстанавливающих условиях на 7,5%-полиакриламидных гелях и иммобилизировали на нитроцеллюлозных мембранах (GeHealthcare) с использованием стандартных способов. Блоты промывали 5% BSA-трисбуферным солевым раствором и инкубировали с Phospho-STAT 5, Phospho-PI3K p55 или Phospho-ERKспецифическими антителами в 1% BSA-TBS (в течение ночи при 4°С), а затем поликлональными антикозьими антителами кролика, меченными пероксидазой хрена (технология Cell Signaling), в течение 1 ч при комнатной температуре. В качестве альтернативы, блоты окрашивали с использованием антитела GAPDH (Santa Cruz) в 1% BSA-TBS (в течение ночи при 4°С), а затем поликлонального козьего антимышиного антитела, меченного пероксидазой хрена (Jackson Immunoresearch), в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны детектировали хемилюминесценцией с использованием системы визуализации LAS-3000 (Fujifilm).Freshly isolated human PBMCs were incubated for 30 min at 37°C with 10 μg/ml mAb against human IL-7Ra and then cultured alone or with 5 ng/ml recombinant human IL7 (AbDSerotec) for 10 min at 37°C. After stopping reactions on ice, cell lysates were prepared using RIPA buffer (with a protease inhibitor cocktail). Proteins (15 μg) were dissolved under reducing conditions on 7.5% polyacrylamide gels and immobilized on nitrocellulose membranes (GeHealthcare) using standard methods. Blots were washed with 5% BSA-Trisbuffered saline and incubated with Phospho-STAT 5, Phospho-PI3K p55, or Phospho-ERK specific antibodies in 1% BSA-TBS (overnight at 4°C) and then polyclonal rabbit anti-goat antibodies labeled horseradish peroxidase (Cell Signaling technology), for 1 hour at room temperature. Alternatively, blots were stained with GAPDH antibody (Santa Cruz) in 1% BSA-TBS (overnight at 4°C) followed by horseradish peroxidase-labeled polyclonal goat anti-mouse antibody (Jackson Immunoresearch) for 1 h at room temperature. The membranes were detected by chemiluminescence using a LAS-3000 imaging system (Fujifilm).

РНК-секвенирование.RNA sequencing.

Свежевыделенные человеческие РВМС инкубировали с 10 мкг/мл моноклональных антител против человеческого IL-7Ra (30 мин при 37°С), а затем культивировали отдельно или с 5 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-7 (AbDSerotec) в течение 3 ч при 37°С. Реакции останавливали на льду и осадок клеток ресуспендировали в буфере RLT (Qiagen), содержащем 1% Р-меркаптоэтанол, в очищенной от РНКазы/ДНКазы воде и хранили при -80°С. РНК экстрагировали с использованием набора для миниэкстракции РНК в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen). Качество и количество РНК оценивали с помощью инфракрасной спектрометрии (Nanodrop) и биоанализатора Agilent (Agilent RNA 6000 Pico Kit). Библиотеки Smart-Seq2 готовили в Broad Technology Labs и секвенировали с помощью Broad Genomics Platform в соответствии с протоколом SmartSeq2 с некоторыми изменениями. Вкратце, полную РНК очищали с использованием микросфер PHK-SPRI, мРНК polyA+ подвергали обратной транскрипции в кДНК, и амплифицированную кДНК подвергали фрагментации на основе транспозона, используя двойное индексирование для штрихкодировния каждого фрагмента каждого преобразованного транскрипта комбинацией специфических штрихкодов для каждого образца. Секвенирование проводили в формате спаренных концов 2х25 п.н. с дополнительными 8 циклами для каждого индекса. Данные разделяли по штрихкоду и выровнены с использованием Tophat версии 2.0.10 с настройками по умолчанию. Транскрипты количественно оценивали с помощью вычислительного конвейера Broad Technology Labs с использованием Cuffquant версии 2.2.1. Вкратце, данные обрабатывали с помощью CuffNorm, если 50% считываний были выровнены, и если по крайней мере 100000 пар были выровнены на каждый образец. При нормализации использовали настройки по умолчанию, включая геометрическую нормализацию, и информацию об уровне экспрессии, в виде преобразованные в log2 значений FPKM (число фрагментов на т.п.н. транскрипта на миллион картированных фрагментов), использовали для последующего анализа. Для выявления дифференциальных генов выполняли линейное моделирование с оценкой отношения среднее-дисперсия (подход limma-trend) с помощью эмпирической байесовской статистической процедуры с использованием пакета LIMMA в R. Гены с р-значением, откорректированным по Бенджамини и Хохбергу, <5% и кратностью изменения (FC)> 1,5 считались дифференциально эксперессированными. Для представления экспрессии генов выполняли анализ основных компонентов (РСА) и кластеризацию в R v3.3.2 с использованием пакетов ade4/adegraphics и pheatmap соответственно. Биологическую значимость отобранных генов оценивали с использованием пакета R clusterProfiler. Отбирали категории ген- 31 041126 ной онтологии (GO), обогащенные показателем ложного обнаружения (FDR) <5% и по меньшей мере с пятью представленными генами. Доступ к данным RNA-seq можно получить используя номер доступаFreshly isolated human PBMCs were incubated with 10 μg/ml anti-human IL-7Ra monoclonal antibodies (30 min at 37°C) and then cultured alone or with 5 ng/ml recombinant human IL-7 (AbDSerotec) for 3 h at 37°C. WITH. Reactions were stopped on ice and the cell pellet was resuspended in RLT buffer (Qiagen) containing 1% P-mercaptoethanol in RNase/DNase-purified water and stored at -80°C. RNA was extracted using a mini-RNA extraction kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen). RNA quality and quantity were assessed using infrared spectrometry (Nanodrop) and an Agilent bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Pico Kit). Smart-Seq2 libraries were prepared at Broad Technology Labs and sequenced using the Broad Genomics Platform according to the SmartSeq2 protocol with some modifications. Briefly, total RNA was purified using PHK-SPRI microspheres, polyA+ mRNA was reverse transcribed into cDNA, and amplified cDNA was subjected to transposon-based fragmentation using dual indexing to barcode each fragment of each transformed transcript with a combination of specific barcodes for each sample. Sequencing was performed in a 2x25 bp paired-end format. with an additional 8 loops for each index. Data was separated by barcode and aligned using Tophat version 2.0.10 with default settings. Transcripts were quantified using the Broad Technology Labs computational pipeline using Cuffquant version 2.2.1. Briefly, data were processed with CuffNorm if 50% of the reads were aligned and if at least 100,000 pairs were aligned per sample. Normalization used default settings, including geometric normalization, and expression level information, in the form of converted to log2 FPKM values (number of fragments per kb transcript per million mapped fragments), was used for subsequent analysis. To identify differential genes, linear modeling was performed with an estimate of the mean-variance ratio (limma-trend approach) using an empirical Bayesian statistical procedure using the LIMMA package in R. Genes with a Benjamini and Hochberg-adjusted p-value <5% and a fold change (FC) > 1.5 were considered differentially expressed. To represent gene expression, principal component analysis (PCA) and clustering in R v3.3.2 were performed using the ade4/adegraphics and pheatmap packages, respectively. The biological significance of the selected genes was assessed using the R clusterProfiler package. Gene ontology (GO) categories enriched in false positive rate (FDR) <5% and with at least five genes represented were selected. RNA-seq data can be accessed using access number

GEO GSEGEO GSE

Результаты.Results.

Сигнальные пути STAT5, PIK3 и ERK.STAT5, PIK3 and ERK signaling pathways.

Затем mAb против IL-7Ra человека (N13B2-h3VL6, MD707-13, 1А11 и HAL) сравнивали по их способности активировать или блокировать сигнальные пути STAT5, PI3K и ERK, ранее ассоциированные с передачей сигналов IL-7R (фиг. 9 и 10). Как показано ранее (см., например, фиг. 7), IL-7 индуцирует сильное фосфорилирование STAT5 на человеческих РВМС, и все исследованные mAb являются мощными ингибиторами этого фосфорилирования STAT5 (см. фиг. 7). В отличие от этого, как показано на фиг. 9 и 10, авторы изобретения обнаружили, что хотя IL-7 индуцирует вариабельное фосфорилирование PI3K и не вызывает фосфорилирования ERK, антитела предшествующего уровня техники (а именно MD707-13, 1А11 и HAL) значительно индуцируют фосфорилирование ERK и в меньшей степени сигнал PI3K даже в отсутствие экзогенного IL-7, в отличие от антитела по изобретению. Эти результаты показывают, что антитела против IL-7Ra человека предшествующего уровня техники обладают частичными свойствами агониста и поэтому рассматриваются как двойные агонистические/антагонистические mAb в отношении человеческого IL-7R. Напротив, антитело по изобретению, и в частности N13B2-h3VL6, обладает свойством только антагониста человеческого IL-7R.Anti-human IL-7Ra mAbs (N13B2-h3VL6, MD707-13, 1A11, and HAL) were then compared for their ability to activate or block the STAT5, PI3K, and ERK signaling pathways previously associated with IL-7R signaling (Figures 9 and 10) . As shown previously (see, for example, Fig. 7), IL-7 induces strong STAT5 phosphorylation on human PBMCs, and all mAbs tested are potent inhibitors of this STAT5 phosphorylation (see Fig. 7). In contrast, as shown in FIG. 9 and 10, the inventors found that although IL-7 induces variable PI3K phosphorylation and does not induce ERK phosphorylation, prior art antibodies (namely MD707-13, 1A11 and HAL) significantly induce ERK phosphorylation and to a lesser extent PI3K signal even in the absence of exogenous IL-7, in contrast to the antibody of the invention. These results indicate that prior art anti-human IL-7Ra antibodies have partial agonist properties and are therefore considered dual agonist/antagonist mAbs for human IL-7R. In contrast, the antibody of the invention, and in particular N13B2-h3VL6, has the property of being a human IL-7R antagonist only.

Авторы изобретения оценили, могут ли антитела со свойствами агониста/антагониста доставлять эффективный агонистический сигнал, способный модифицировать Т-клетки человека. Транскриптомы человеческих РВМС, инкубированные в течение 3,5 ч без экзогенного человеческого IL-7, с человеческим IL-7 и с IL-7 и антителом (MD707-13, 1A11 сайт-1 (IgG4 № 1 или IgG1 № 2 соответственно) или N13B2-hVL6 сайт-1/2b (IgG4)), проанализировали с помощью РНК-секвенирования следующего поколения (RNA-SEQ). В общей сложности 481 ген был дифференциально экспрессирован в человеческих РВМС, инкубированных с mAb против IL-7Ra человека, по сравнению с контрольными условиями, в то время как в общей сложности 334 гена были дифференциально экспрессированы только стимуляцией IL7 человека по сравнению с контрольными условиями.The inventors evaluated whether antibodies with agonist/antagonist properties could deliver an effective agonist signal capable of modifying human T cells. Human PBMC transcriptomes incubated for 3.5 h without exogenous human IL-7, with human IL-7 and with IL-7 and an antibody (MD707-13, 1A11 site-1 (IgG4 #1 or IgG1 #2, respectively) or N13B2-hVL6 site-1/2b (IgG4)), analyzed by next generation RNA sequencing (RNA-SEQ). A total of 481 genes were differentially expressed in human PBMCs incubated with anti-human IL-7Ra mAb compared to control conditions, while a total of 334 genes were differentially expressed by human IL7 stimulation alone compared to control conditions.

- 32 041126- 32 041126

Таблица 6. Список генов, достоверно (FDR 5%) и дифференциально (кратность изменения >1,5), экспрессируемых после инкубации человеческих РВМС (n=7) с mAb против IL7Ra по сравнению с нестимулированными клеткамиTable 6. List of genes, significant (FDR 5%) and differentially (fold change >1.5), expressed after incubation of human PBMCs (n=7) with anti-IL7Ra mAb compared to unstimulated cells

Ген Gene N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2 logFC / нестимул. logFC / non-stimulus. Скоррек тиров. Pзначение Tier correction. P value logFC / нестимул. logFC / non-stimulus. Скорректи ров. Pзначение Correct ditch. P value logFC / нестимул. logFC / non-stimulus. Скоррект иров. Pзначение Correction P value ACADVL ACADVL ().85 ().85 0,04ο 0.04ο 1.15 1.15 0,001 0.001 O.X^{- OX-} 0,011 0.011 AHR AHR O.XG O.XG 0,029 0.029 I.K. I.K. 0,000 0.000 1.21 1.21 0,000 0.000 AKIRIN1 AKIRIN1 0.? 0.? 0,028 0.028 (i.SS (i.SS 0,002 0.002 ().X ().X 0,006 0.006 ALDH16A1 ALDH16A1 1.23 1.23 0,021 0.021 0,001 0.001 0,003 0.003 ALDH5A1 ALDH5A1 O.2 O.2 0,044 0.044 ().93 ().93 0,002 0.002 l.o^{s los} 0,001 0.001 АРРВР2 RRRVR2 o.SI o.SI 0,001 0.001 0.9(1 0.9(1 0,000 0.000 o.Xl o.Xl 0,000 0.000 ARHGEF1 ARHGEF1 o.X? o.x? 0,001 0.001 1.05 1.05 0,000 0.000 O.XX O.XX 0,000 0.000 B3GNT2 B3GNT2 1.03 1.03 0,034 0.034 1.23 1.23 0,003 0.003 1.1^{s 1.1s} 0,005 0.005 C17orf59 C17orf59 l.o l.o. 0,039 0.039 0,001 0.001 0,004 0.004 CCDC117 CCDC117 0. 0. 0,024 0.024 o.ss o.ss 0,002 0.002 O.Xl) O.Xl) 0,005 0.005 CCNI CCNI o.3 o.3 0,004 0.004 0.9S 0.9S 0,000 0.000 ||.X ||.X 0,001 0.001 CDK17 CDK17 о os about os 0,003 0.003 1.09 1.09 0,000 0.000 0.94 0.94 0,001 0.001 COTL1 COTL1 0,000 0.000 1.S0 1.S0 0,000 0.000 lll^^ lll^^ 0,000 0.000 CYP1B1 CYP1B1 -o.(>(> -o.(>(> 0,029 0.029 -().5 -().5 0,003 0.003 -0.()9 -0.()9 0,006 0.006 DDI2 DDI2 0,011 0.011 0,000 0.000 1.24 1.24 0,002 0.002 DEF6 DEF6 1.03 1.03 0,030 0.030 0,001 0.001 1.09 1.09 0,006 0.006 DNLZ DNLZ 1.1 1.1 0,029 0.029 1.19 1.19 0,008 0.008 1.22 1.22 0,006 0.006 DUSP2 DUSP2 0,002 0.002 |g|« |g| 0,000 0.000 0,000 0.000 ENG ENG 0,004 0.004 ||m ||m 0,005 0.005 0,002 0.002 ЕХОС8 EXOC8 O.(>9 O.(>9 0,043 0.043 ().()2 ().()2 0,033 0.033 0.()3 0.()3 0,026 0.026 FAM 160В1 FAM 160B1 0.83 0.83 0,030 0.030 0,000 0.000 o.~2 o.~2 0,024 0.024 FEM IB FEM IB 0.99 0.99 0,005 0.005 1.09 1.09 0,000 0.000 O.X O.X 0,005 0.005 GCFC2 GCFC2 1.00 1.00 0,011 0.011 ().X~ ().X~ 0,011 0.011 O.X3 O.X3 0,013 0.013 GNA15 GNA15 0.99 0.99 0,011 0.011 1.14 1.14 0,001 0.001 1.2^{s 1.2s} 0,000 0.000 GOPC GOPC 0.83 0.83 0,015 0.015 0.()4 0.()4 0,029 0.029 0.()9 0.()9 0,015 0.015 GRSF1 GRSF1 ().(,5 ().(,5 0,015 0.015 ().81 ().81 0,000 0.000 ().()9 ().()9 0,002 0.002 HIPK3 HIPK3 0.0 0.0 0,025 0.025 O.9 O.9 0,002 0.002 0.()9 0.()9 0,006 0.006 HMHA1 HMHA1 o.ss o.ss 0,004 0.004 1.05 1.05 0,000 0.000 0.X9 0.X9 0,001 0.001 HSBP1L1 HSBP1L1 1.04 1.04 0,029 0.029 0.9 0.9 0,017 0.017 O.X() O.X() 0,030 0.030 JUNB JUNB 0.91 0.91 0,025 0.025 0,000 0.000 0,000 0.000 KLC2 KLC2 1.0S 1.0S 0,036 0.036 1J X 1J X 0,007 0.007 1·!^ 1 !^ 0,002 0.002 LYSMD2 LYSMD2 O.8 O.8 0,016 0.016 O.~2 O.~2 0,010 0.010 0.-() 0.-() 0,009 0.009 LYZ LYZ -0.()0 -0.()0 0,031 0.031 -O.Sb -O.Sb 0,000 0.000 -0.-() -0.-() 0,001 0.001 MS4A7 MS4A7 -0.S0 -0.S0 0,001 0.001 -0.9S -0.9S 0,000 0.000 -0.59 -0.59 0,006 0.006 MTA2 MTA2 0.X4 0.x4 0,038 0.038 1.IS 1.IS 0,001 0.001 l.lo l.lo 0,002 0.002 NCOA5 NCOA5 0.05 0.05 0,018 0.018 0.S4 0.S4 0,000 0.000 0.X9 0.X9 0,000 0.000 NSUN2 NSUN2 0.03 0.03 0,029 0.029 o.4 o.4 0,002 0.002 o.5 o.5 0,002 0.002 PITHD1 PITHD1 O.SI O.SI 0,040 0.040 1.03 1.03 0,002 0.002 o.Xl o.Xl 0,013 0.013 PLEKHF2 PLEKHF2 o.2 o.2 0,004 0.004 0.S3 0.S3 0,000 0.000 (). (). 0,001 0.001 POLRMT POLRMT 1.09 1.09 0,001 0.001 ΙΙΙΜ^ ΙΙΙΜ^ 0,000 0.000 1.()(. 1.()(. 0,000 0.000 PPP2CA PPP2CA o.5 o.5 0,025 0.025 O.X^{- OX-} 0,002 0.002 o.^s o. ^s 0,007 0.007 PREB PREB O.SS O.SS 0,018 0.018 O.S O.S. 0,014 0.014 0.92 0.92 0,004 0.004 PRKCH PRKCH o.o o.o 0,011 0.011 o.ss o.ss 0,000 0.000 o.x o.x 0,001 0.001

- 33 041126- 33 041126

N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2 PSMD3 PSMD3 1 .(11 1 .(11 0,035 0.035 1.58 1.58 0,000 0.000 1.3- 1.3- 0,001 0.001 PYGO2 PYGO2 1.()8 1.()8 0,003 0.003 0,001 0.001 ·Μ·|| ·Μ·|| 0,016 0.016 RASSF5 RASSF5 (1.()3 (1.()3 0,004 0.004 ().()- ().()- 0,000 0.000 0.()() 0.()() 0,002 0.002 RBL2 RBL2 o.l o.l 0,011 0.011 ().8^ ().8^ 0,000 0.000 0.59 0.59 0,012 0.012 RRP1 RRP1 0.69 0.69 0,019 0.019 ().(,2 ().(,2 0,013 0.013 ().8() ().8() 0,002 0.002 SMCHD1 SMCHD1 ().l ().l 0,001 0.001 1.()() 1.()() 0,000 0.000 ().85 ().85 0,000 0.000 SREBF2 SREBF2 0.83 0.83 0,009 0.009 1,13 1.13 0,000 0.000 ().98 ().98 0,000 0.000 TAF10 TAF10 0,001 0.001 0,001 0.001 0,006 0.006 TAF4B TAF4B 0,030 0.030 0,000 0.000 0,000 0.000 TMX4 TMX4 1.04 1.04 0,009 0.009 1.13 1.13 0,001 0.001 ().89 ().89 0,009 0.009 TPGS1 TPGS1 MMMiMiliM MMMiMiliM 0,008 0.008 И1И111ИМИ11 I1I111IMI11 0,000 0.000 0,011 0.011 TRAM1 TRAM1 0,71 0.71 0,001 0.001 0.-3 0.-3 0,000 0.000 0,002 0.002 TRPC4AP TRPC4AP ().98 ().98 0,005 0.005 1.21 1.21 0,000 0.000 1.()(. 1.()(. 0,001 0.001 TTC13 TTC13 0.-(, 0.-(, 0,034 0.034 0.90 0.90 0,003 0.003 ().(.8 ().(.8 0,022 0.022 UNCI 19 UNCI 19 1.02 1.02 0,036 0.036 0,001 0.001 ИИМ11Д IIM11D 0,002 0.002 USP9X USP9X 0.00 0.00 0,000 0.000 ().92 ().92 0,000 0.000 0.85 0.85 0,000 0.000 VPS4A VPS4A ().-4 ().-4 0,042 0.042 ().9^ ().9^ 0,002 0.002 О.? ABOUT.? 0,012 0.012 ZNF800 ZNF800 0.-4 0.-4 0,013 0.013 1.01 1.01 0,000 0.000 ().84 ().84 0,001 0.001 ACTN4 ACTN4 o.ss o.ss 0,005 0.005 ().(,() ().(,() 0,000 0.000 ().()5 ().()5 0,000 0.000 C15orf48 C15orf48 -().(,3 -().(,3 0,029 0.029 -0.8 -0.8 0,000 0.000 0,035 0.035 C3AR1 C3AR1 -ОД(> -OD(> 0,011 0.011 0,000 0.000 llliM llliM 0,001 0.001 CD247 CD247 0.80 0.80 0,004 0.004 (1.8 (1.8 0,000 0.000 0,50 0.50 0,038 0.038 FAM50A FAM50A 0.(,(, 0.(,(, 0,028 0.028 ().93 ().93 0,000 0.000 0,54 0.54 0,031 0.031 HCK HCK -().(,? -().(,? 0,009 0.009 -().83 -().83 0,000 0.000 -0,46 -0.46 0,030 0.030 IL6ST IL6ST 0.43 0.43 0,034 0.034 ().(,() ().(,() 0,000 0.000 0. 0. 0,000 0.000 JAKI JAKI o.l o.l 0,001 0.001 ().8() ().8() 0,000 0.000 0,58 0.58 0,002 0.002 KYNU KYNU -0.(,0 -0.(,0 0,018 0.018 -().94 -().94 0,000 0.000 -0,56 -0.56 0,007 0.007 NCF2 NCF2 -о.? -O.? 0,029 0.029 IlilllM IllillM 0,001 0.001 -0.-() -0.-() 0,001 0.001 PARP10 PARP10 0.58 0.58 0,037 0.037 O.’S O.'S 0,002 0.002 o.“3 o.“3 0,002 0.002 RAD54L2 RAD54L2 ().(,1 ().(,1 0,037 0.037 0.(,(, 0.(,(, 0,008 0.008 ().-^3 ().-^3 0,033 0.033 SMG5 SMG5 0.54 0.54 0,033 0.033 ().8() ().8() 0,000 0.000 (I.^-?( ^I.- ? 0,001 0.001 T0R3A T0R3A o.“3 o.“3 0,028 0.028 0.(,2 0.(,2 0,028 0.028 o/~ o/~ 0.040 0.040 ADM ADM -0.88 -0.88 0,005 0.005 0,000 0.000 -0,02 -0.02 0,967 0.967 CES1 CES1 М111И M111I 0,028 0.028 0,008 0.008 -0,45 -0.45 0,145 0.145 SLC31A2 SLC31A2 0,004 0.004 -0.(,0 -0.(,0 0,012 0.012 -0,17 -0.17 0,577 0.577 SMPDL3A SMPDL3A 0,009 0.009 ИИ AI 0,002 0.002 -0,56 -0.56 0,149 0.149 TREM1 TREM1 0,009 0.009 0,005 0.005 -0,28 -0.28 0,287 0.287 VNN1 VNN1 0,030 0.030 0,002 0.002 -0.35 -0.35 0,423 0.423 FLT1 FLT1 MIMI MIMI 0,028 0.028 -0.(,(, -0.(,(, 0,101 0.101 -0.80 -0.80 0,039 0.039 ABCG1 ABCG1 0,39 0.39 0,339 0.339 0.-() 0.-() 0,028 0.028 0.()2 0.()2 0,047 0.047 ANKRD30BL ANKRD30BL 0,88 0.88 0,342 0.342 иимдд yimdd 0,049 0.049 0,012 0.012 C16orf58 C16orf58 0,42 0.42 0,219 0.219 ().(,3 ().(,3 0,019 0.019 0.59 0.59 0,026 0.026 C6orfl20 C6orfl20 0,31 0.31 0,536 0.536 1.03 1.03 0,003 0.003 0.84 0.84 0,013 0.013 CA2 CA2 -0,33 -0.33 0,450 0.450 -().-() -().-() 0,033 0.033 -o.⁷3-o. ⁷ 3 0,022 0.022

- 34 041126- 34 041126

CCNL2 CCNL2 N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2 0,51 0.51 0,178 0.178 (>.5 (>.5 0,012 0.012 0.59 0.59 0,049 0.049 CD14 CD14 -0,64 -0.64 0,070 0.070 -0.98 -0.98 0,001 0.001 -().89 -().89 0,002 0.002 CDK16 CDK16 0,64 0.64 0,118 0.118 (1.9() (1.9() 0,004 0.004 ().8() ().8() 0,014 0.014 CHTF18 CHTF18 0,67 0.67 0,174 0.174 0.8“ 0.8" 0,030 0.030 1.13 1.13 0,004 0.004 CLPTM1 CLPTM1 0,74 0.74 0,111 0.111 1.(1() 1.(1() 0,005 0.005 1.()1 1.()1 0,007 0.007 CREBZF CREBZF 0,50 0.50 0,116 0.116 (>.~2 (>.~2 0,006 0.006 0.()- 0.()- 0,008 0.008 CREG1 CREG1 0,70 0.70 0,095 0.095 (1.8() (1.8() 0,013 0.013 ().99 ().99 0,004 0.004 CSF1R CSF1R -0,39 -0.39 0,263 0.263 0,010 0.010 -0 92 -0 92 0,001 0.001 DAPK3 DAPK3 0,56 0.56 0,240 0.240 (1.8(1 (1.8(1 0,038 0.038 ().9^- ().9 ^- 0,008 0.008 DDRGK1 DDRGK1 0,91 0.91 0,126 0.126 0,004 0.004 ||l^^ ||l^^ 0,002 0.002 DOHH DOHH 1,40 1.40 0,061 0.061 0,020 0.020 1.()9 1.()9 0,006 0.006 EMC8 EMC8 0,61 0.61 0,229 0.229 1.15 1.15 0,004 0.004 1.()4 1.()4 0,008 0.008 FAM115C FAM115C 0,37 0.37 0,264 0.264 (1.()1 (1.()1 0,022 0.022 0.()4 0.()4 0,013 0.013 FUCA1 FUCA1 -0,35 -0.35 0,234 0.234 -0.59 -0.59 0,011 0.011 -0.()6 -0.()6 0,004 0.004 GAPT GAPT -0,48 -0.48 0,188 0.188 -(1.()^- -(1.() ^- 0,023 0.023 -().85 -().85 0,003 0.003 GMIP GMIP 0,55 0.55 0,076 0.076 ().8 ().8 0,002 0.002 0.-0 0.-0 0,005 0.005 GMPPB GMPPB 0,82 0.82 0,073 0.073 ().92 ().92 0,016 0.016 0.95 0.95 0,010 0.010 HCG11 HCG11 0,70 0.70 0,087 0.087 1Л5 1L5 0,002 0.002 0.80 0.80 0,014 0.014 HEATR3 HEATR3 0,43 0.43 0,280 0.280 0.-4 0.-4 0,019 0.019 0.-4 0.-4 0,017 0.017 HEIH HEIH 0,97 0.97 0,056 0.056 1.()5 1.()5 0,014 0.014 0.84 0.84 0,047 0.047 HELZ2 HELZ2 0,42 0.42 0,287 0.287 (I ” (I" 0,013 0.013 0. 0. 0,010 0.010 HMG20B HMG20B 0,54 0.54 0,088 0.088 0.()1 0.()1 0,019 0.019 0.59 0.59 0,022 0.022 HNRNPAO HNRNPAO 0,58 0.58 0,165 0.165 0.-4 0.-4 0,028 0.028 ().9() ().9() 0,006 0.006 HPCAL1 HPCAL1 0,38 0.38 0,344 0.344 (1.8() (1.8() 0,005 0.005 ().()“ ().()" 0,028 0.028 ΚΙΑΑ1919 ΚΙΑΑ1919 0,63 0.63 0,116 0.116 0.81 0.81 0,013 0.013 ().()() ().()() 0,042 0.042 KLHDC2 KLHDC2 0,54 0.54 0,149 0.149 o.-| o.-| 0,019 0.019 0.()2 0.()2 0,040 0.040 LTB LTB 0,45 0.45 0,248 0.248 0.92 0.92 0,003 0.003 O.X2 O.X2 0,007 0.007 MAF1 MAF1 0,86 0.86 0,161 0.161 1.54 1.54 0,002 0.002 1.38 1.38 0,005 0.005 MAFF MAFF 0,54 0.54 0,249 0.249 0.81 0.81 0,029 0.029 1.19 1.19 0,001 0.001 ΜΑΡ3Κ11 ΜΑΡ3Κ11 0,49 0.49 0,263 0.263 0. 0. 0,030 0.030 0.-() 0.-() 0,044 0.044 MGST1 MGST1 -1,05 -1.05 0,089 0.089 -1.24 -1.24 0,015 0.015 -UK) -UK) 0,036 0.036 MIER2 MIER2 0,89 0.89 0,112 0.112 0.93 0.93 0,047 0.047 1.25 1.25 0,006 0.006 MOB2 MOB2 0,69 0.69 0,150 0.150 1.05 1.05 0,007 0.007 ().9() ().9() 0,017 0.017 PET 100 PET 100 -0,32 -0.32 0,298 0.298 -0.()1 -0.()1 0,013 0.013 -0.()1 -0.()1 0,010 0.010 PLK3 PLK3 0,20 0.20 0,700 0.700 0.-9 0.-9 0,021 0.021 0.83 0.83 0,012 0.012 POLG POLG 0,52 0.52 0,086 0.086 0.9^- 0.9 ^- 0,000 0.000 O.“9 O.“9 0,002 0.002 PSMD2 PSMD2 0,41 0.41 0,212 0.212 0.()2 0.()2 0,018 0.018 0.()1 0.()1 0,017 0.017 RABIS RABIS -0,50 -0.50 0,089 0.089 -0.-3 -0.-3 0,002 0.002 -0.()2 -0.()2 0,009 0.009 RASAL3 RASAL3 0,74 0.74 0,067 0.067 0.92 0.92 0,006 0.006 O.^_2 ^O._2 0,028 0.028 RELB RELB 0,22 0.22 0,633 0.633 ().()3 ().()3 0,046 0.046 ().()9 ().()9 0,022 0.022 RGMB RGMB 0,58 0.58 0,173 0.173 ().8() ().8() 0,020 0.020 o.4 o.4 0,028 0.028 RNF10 RNF10 0,56 0.56 0,095 0.095 0.()- 0.()- 0,016 0.016 0.()() 0.()() 0,014 0.014 RNF149 RNF149 0,60 0.60 0,077 0.077 ().()9 ().()9 0,016 0.016 0.()9 0.()9 0,012 0.012 RPL39L RPL39L -1,02 -1.02 0,125 0.125 -1.09 -1.09 0,049 0.049 111« 111" 0,008 0.008 RPUSD1 RPUSD1 0,76 0.76 0,105 0.105 0.84 0.84 0,031 0.031 1.00 1.00 0,008 0.008

- 35 041126- 35 041126

N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707- MD707- 13 IgG4 №1 13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2 SCARF 1 Scarf 1 0,39 0.39 0,408 0.408 (1. (1. O.032 O.032 1.13 1.13 0,002 0.002 SENP6 SENP6 0,44 0.44 0,204 0.204 (1.()9 (1.()9 0,012 0.012 II.2 II.2 0,007 0.007 SIPA1L3 SIPA1L3 -0,01 -0.01 0,992 0.992 (i.l (i.l 0,021 0.021 O.4 O.4 0,013 0.013 SLC25A22 SLC25A22 0,51 0.51 0,283 0.283 o.5 o.5 0,047 0.047 (1.83 (1.83 0,024 0.024 SLC38A10 SLC38A10 0,24 0.24 0,595 0.595 <!.“() <!.“() 0,014 0.014 (1.()() (1.()() 0,030 0.030 SLC43A2 SLC43A2 0,66 0.66 0,068 0.068 0.()3 0.()3 0,040 0.040 (1.99 (1.99 0,001 0.001 SPATC1L SPATC1L 0,96 0.96 0,180 0.180 1.1“ 1.1" 0,044 0.044 1.22 1.22 0,031 0.031 SPP1 SPP1 -0,53 -0.53 0,102 0.102 -o.x 5 -o.x 5 0,001 0.001 -().()2 -().()2 0,017 0.017 SRP68 SRP68 0,68 0.68 0,096 0.096 o. o. 0,024 0.024 (I.9X (I.9X 0,003 0.003 TAZ TAZ 0,95 0.95 0,092 0.092 1.23 1.23 0,008 0.008 1.22 1.22 0,007 0.007 TCIRG1 TCIRG1 0,79 0.79 0,069 0.069 1.15 1.15 0,001 0.001 1.15 1.15 0,002 0.002 TNFRSF1B TNFRSF1B 0,51 0.51 0,208 0.208 o.2 o.2 0,026 0.026 0.82 0.82 0,009 0.009 TNFRSF4 TNFRSF4 0,23 0.23 0,751 0.751 0.9 0.9 0,034 0.034 1.15 1.15 0,009 0.009 TNKS TNKS 0,66 0.66 0,052 0.052 o.8 o.8 0,006 0.006 0.()^- 0.() ^- 0,016 0.016 TSC22D2 TSC22D2 0,47 0.47 0,137 0.137 0.()5 0.()5 0,011 0.011 0.()1 0.()1 0,014 0.014 UBA5 UBA5 0,91 0.91 0,076 0.076 1.22 1.22 0,004 0.004 1,17 1.17 0,005 0.005 USP48 USP48 0,64 0.64 0,145 0.145 0.90 0.90 0,012 0.012 o.^-2o. ^- 2 0,044 0.044 VPS51 VPS51 0,50 0.50 0,145 0.145 0.82 0.82 0,003 0.003 O.() O.() 0,005 0.005 ZFAND5 ZFAND5 0,56 0.56 0,054 0.054 o.-| o.-| 0,003 0.003 0.()4 0.()4 0,007 0.007 ZNF259 ZNF259 0,47 0.47 0,242 0.242 0.85 0.85 0,007 0.007 0.()5 0.()5 0,038 0.038 ZNF496 ZNF496 0,51 0.51 0,220 0.220 0.8() 0.8() 0,008 0.008 0.83 0.83 0,009 0.009 ZNF696 ZNF696 0,80 0.80 0,061 0.061 1.09 1.09 0,002 0.002 o.” o.” 0,033 0.033 ANXA1 ANXA1 -0,43 -0.43 0,034 0.034 -0.49 -0.49 0,005 0.005 -0.()3 -0.()3 0,000 0.000 C12orf75 C12orf75 -0,45 -0.45 0,041 0.041 -0.43 -0.43 0,022 0.022 мим mime 0,001 0.001 C18orf32 C18orf32 -0,56 -0.56 0,040 0.040 -0.()1 -0.()1 0,008 0.008 -0,48 -0.48 0,036 0.036 CHMP7 CHMP7 0,50 0.50 0,028 0.028 0.()4 0.()4 0,001 0.001 0,55 0.55 0,004 0.004 DNAJC3 DNAJC3 -0,49 -0.49 0,004 0.004 -0.()2 -0.()2 0,000 0.000 -0,36 -0.36 0,013 0.013 EVI2B EVI2B -0,36 -0.36 0,046 0.046 -0.38 -0.38 0,013 0.013 -o.⁷5-o. ⁷ 5 0,000 0.000 HCST HCST -0,54 -0.54 0,034 0.034 -0.45 -0.45 0,042 0.042 0,003 0.003 HSBP1 HSBP1 -0,44 -0.44 0,009 0.009 -0.()4 -0.()4 0,000 0.000 -U,4O -U,4O 0,002 0.002 PAPOLA PAPOLA 0,57 0.57 0,018 0.018 o.2 o.2 0,000 0.000 0,55 0.55 0,006 0.006 PPBP PPBP -0,55 -0.55 0,018 0.018 -0.()5 -0.()5 0,001 0.001 -0,50 -0.50 0,010 0.010 TIMP1 TIMP1 -0,52 -0.52 0,019 0.019 -0.()5 -0.()5 0,001 0.001 -0,57 -0.57 0,002 0.002 TLR2 TLR2 -0,42 -0.42 0,044 0.044 -0.()0 -0.()0 0,001 0.001 -0,35 -0.35 0,048 0.048 UBE2D2 UBE2D2 0,49 0.49 0,040 0.040 o.4 o.4 0,000 0.000 0,49 0.49 0,013 0.013 AGTRAP AGTRAP -0,52 -0.52 0,040 0.040 -0.()() -0.()() 0,002 0.002 -0,42 -0.42 0,051 0.051 CXCL16 CXCL16 -0,55 -0.55 0,034 0.034 -0.()0 -0.()0 0,006 0.006 -0,38 -0.38 0,091 0.091 P2RX4 P2RX4 -0,48 -0.48 0,034 0.034 -(1.()0 -(1.()0 0,002 0.002 -0,06 -0.06 0,846 0.846 P2RX7 P2RX7 -072 -072 0,018 0.018 -0.54 -0.54 0,039 0.039 0,32 0.32 0,258 0.258 SLAMF7 SLAMF7 -0.44 -0.44 0,011 0.011 -0.()4 -0.()4 0,000 0.000 -0,19 -0.19 0,251 0.251 SLC2A6 SLC2A6 -0.59 -0.59 0,028 0.028 -o.5() -o.5() 0,013 0.013 -0,13 -0.13 0,648 0.648 SUGP2 SUGP2 o.(>4 o.(>4 0,005 0.005 O.5O O.5O 0,012 0.012 0,33 0.33 0,114 0.114 TNFAIP6 TNFAIP6 -0,55 -0.55 0,029 0.029 -0.90 -0.90 0,000 0.000 -0,13 -0.13 0,637 0.637 TNIP3 TNIP3 -0,55 -0.55 0,028 0.028 -0.()1 -0.()1 0,004 0.004 -0,21 -0.21 0,385 0.385

- 36 041126- 36 041126

CYBA CYBA N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2 -0,53 -0.53 0,030 0.030 -0,39 -0.39 0,065 0.065 -().(13 -().(13 0,002 0.002 EPG5 EPG5 0.59 0.59 0,034 0.034 0,39 0.39 0,112 0.112 0.5 0.5 0,013 0.013 RNF135 RNF135 -().5 -().5 0,043 0.043 -0,33 -0.33 0,209 0.209 -().(14 -().(14 0,006 0.006 ALDH1B1 ALDH1B1 -().79 -().79 0,036 0.036 -0,38 -0.38 0,294 0.294 -0,36 -0.36 0,311 0.311 CKS2 CKS2 -0.85 -0.85 0,048 0.048 -0,61 -0.61 0,109 0.109 -0,59 -0.59 0,116 0.116 ETFDH ETFDH 0,003 0.003 -0,36 -0.36 0,090 0.090 -0,40 -0.40 0,054 0.054 FPR1 FPR1 0,029 0.029 -0,62 -0.62 0,076 0.076 -0,29 -0.29 0,467 0.467 GSTT1 GSTT1 iiiiM iiiM 0,030 0.030 -0,52 -0.52 0,195 0.195 -0,46 -0.46 0,254 0.254 NFYB NFYB 0,025 0.025 -0,42 -0.42 0,075 0.075 -0,14 -0.14 0,633 0.633 PREP PREP o.2 o.2 0,030 0.030 0,48 0.48 0,102 0.102 0,48 0.48 0,092 0.092 TGFBI TGFBI -O.w -O.w 0,007 0.007 -0,27 -0.27 0,477 0.477 -0,36 -0.36 0,310 0.310 TMEM160 TMEM160 0,030 0.030 -0,30 -0.30 0,373 0.373 -0,55 -0.55 0,062 0.062 TYMP TYMP 0,040 0.040 -0,38 -0.38 0,278 0.278 -0,17 -0.17 0,687 0.687 UBE3D UBE3D -0.0(1 -0.0(1 0,046 0.046 -0,35 -0.35 0,477 0.477 -0,33 -0.33 0,497 0.497 ZNF619 ZNF619 o.o o.o 0,043 0.043 0.49 0.49 0,170 0.170 0,52 0.52 0,128 0.128 ABCA1 ABCA1 -0,43 -0.43 0,068 0.068 -().()0 -().()0 0,002 0.002 -0,39 -0.39 0,044 0.044 ACTR6 ACTR6 -0,31 -0.31 0,332 0.332 -().(15 -().(15 0,007 0.007 -0,56 -0.56 0,020 0.020 ANXA5 ANXA5 -0,40 -0.40 0,089 0.089 0,001 0.001 -0,39 -0.39 0,046 0.046 C16orf70 C16orf70 -0,21 -0.21 0,548 0.548 -().>(, -().>(, 0,021 0.021 -().(18 -().(18 0,005 0.005 CANDI CANDI 0,54 0.54 0,102 0.102 ().5(, ().5(, 0,046 0.046 ().88 ().88 0,001 0.001 CAPG CAPG -0,50 -0.50 0,076 0.076 0,001 0.001 -0.48 -0.48 0,036 0.036 CCDC66 CCDC66 -0,41 -0.41 0,204 0.204 -().55 -().55 0,037 0.037 -().() -().() 0,006 0.006 COMMD8 COMMD8 -0,33 -0.33 0,165 0.165 -l).5<) -l).5<) 0,002 0.002 -().4() -().4() 0,034 0.034 CPD CPD 0,52 0.52 0,055 0.055 0.4(1 0.4(1 0,043 0.043 0.(14 0.(14 0,004 0.004 CYB5R1 CYB5R1 -0,25 -0.25 0,327 0.327 -0.5 I -0.5 I 0,011 0.011 0,000 0.000 DUSP6 DUSP6 -0,45 -0.45 0,129 0.129 -О.Ы -O.S 0,013 0.013 -0.48 -0.48 0,049 0.049 ENY2 ENY2 -0,45 -0.45 0,067 0.067 -0,46 -0.46 0,026 0.026 -O.5O -O.5O 0,004 0.004 FCER1G FCER1G -0,45 -0.45 0,165 0.165 -(). 5 -(). 5 0,004 0.004 -0,51 -0.51 0,049 0.049 FRMD8 FRMD8 0,52 0.52 0,053 0.053 o.’2 o.'2 0,001 0.001 0,49 0.49 0,028 0.028 GSR GSR 0,43 0.43 0,086 0.086 o.l o.l 0,001 0.001 0,50 0.50 0,014 0.014 KIF1B KIF1B 0,45 0.45 0,092 0.092 O.5O O.5O 0,007 0.007 0,57 0.57 0,008 0.008 MEF2D MEF2D 0,53 0.53 0,103 0.103 0.(10 0.(10 0,028 0.028 0,57 0.57 0,035 0.035 MPZL1 MPZL1 0,38 0.38 0,220 0.220 ().58 ().58 0,020 0.020 ().5 ().5 0,002 0.002 MRPS6 MRPS6 -0,43 -0.43 0,075 0.075 -().55 -().55 0,006 0.006 -0.88 -0.88 0,000 0.000 NDUFA5 NDUFA5 -0,25 -0.25 0,247 0.247 -().(10 -().(10 0,000 0.000 -0.3(1 -0.3(1 0,037 0.037 NDUFB7 NDUFB7 -0,37 -0.37 0,213 0.213 -0,49 -0.49 0,043 0.043 -0.(12 -0.(12 0,007 0.007 NUP153 NUP153 0,34 0.34 0,228 0.228 0,57 0.57 0,009 0.009 0.(12 0.(12 0,005 0.005 S100A4 S100A4 -0,41 -0.41 0,120 0.120 -0,54 -0.54 0,014 0.014 -0.82 -0.82 0,000 0.000 S100A8 S100A8 -0,38 -0.38 0,266 0.266 -0,56 -0.56 0,043 0.043 0,004 0.004 SERPINA1 SERPINA1 -0,46 -0.46 0,067 0.067 -0.(10 -0.(10 0,001 0.001 -0.4 -0.4 0,021 0.021 SLC17A5 SLC17A5 -0,33 -0.33 0,173 0.173 -0.51 -0.51 0,010 0.010 0,000 0.000 SLC7A7 SLC7A7 -0,47 -0.47 0,076 0.076 -0.(18 -0.(18 0,002 0.002 -0.52 -0.52 0,016 0.016 SNRK-AS1 SNRK-AS1 0,59 0.59 0,079 0.079 0.5 0.5 0,042 0.042 ().50 ().50 0,031 0.031 STAT5A STAT5A 0,34 0.34 0,166 0.166 0.(1(1 0.(1(1 0,001 0.001 O.4O O.4O 0,012 0.012 TBXAS1 TBXAS1 -0,27 -0.27 0,390 0.390 -0,40 -0.40 0,043 0.043 -0.(14 -0.(14 0,007 0.007

- 37 041126- 37 041126

N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2

TFPI2 TFPI2 -0,52 -0.52 0,079 0.079 -0.65 -0.65 0,008 0.008 -0,49 -0.49 0,042 0.042 TMEM184B TMEM184B 0,22 0.22 0,545 0.545 0.63 0.63 0,013 0.013 0,55 0.55 0,027 0.027 TYROBP TYROBP -0,35 -0.35 0,212 0.212 -0.56 -0.56 0,012 0.012 -0.84 -0.84 0,000 0.000 USMG5 USMG5 -0,39 -0.39 0,120 0.120 -O.4O -O.4O 0,018 0.018 -().68 -().68 0,001 0.001 USP19 USP19 0,48 0.48 0,145 0.145 O.6 O.6 0,005 0.005 0.54 0.54 0,044 0.044 USP38 USP38 0,44 0.44 0,105 0.105 0.40 0.40 0,029 0.029 0.61 0.61 0,006 0.006 XYLT2 XYLT2 0,27 0.27 0,329 0.329 O.(>O O.(>O 0,005 0.005 0,57 0.57 0,006 0.006 ACTR5 ACTR5 0,56 0.56 0,137 0.137 O.-4 O.-4 0,018 0.018 0,53 0.53 0,093 0.093 ADAMDEC1 ADAMDEC1 -0,88 -0.88 0,095 0.095 -1.24 -1.24 0,004 0.004 -0,63 -0.63 0,176 0.176 ARHGAP18 ARHGAP18 -0,55 -0.55 0,094 0.094 -0.()3 -0.()3 0,021 0.021 -0,51 -0.51 0,060 0.060 AUH AUH 1,01 1.01 0,101 0.101 1.14 1.14 0,026 0.026 0,67 0.67 0,223 0.223 BAG2 BAG2 0,29 0.29 0,548 0.548 o.o o.o 0,042 0.042 0,42 0.42 0,254 0.254 BAIAP2 BAIAP2 -0,44 -0.44 0,367 0.367 -0.82 -0.82 0,031 0.031 -0,32 -0.32 0,474 0.474 BLOC 1 S3 BLOC 1 S3 -0,54 -0.54 0,180 0.180 0,029 0.029 -0,37 -0.37 0,290 0.290 C16orf54 C16orf54 0,44 0.44 0,128 0.128 0.(12 0.(12 0,008 0.008 0,20 0.20 0,477 0.477 Clorf216 Clorf216 0,25 0.25 0,669 0.669 0.82 0.82 0,042 0.042 0,55 0.55 0,193 0.193 C2orf49 C2orf49 -0,47 -0.47 0,455 0.455 -0.9’ -0.9' 0,040 0.040 -0,44 -0.44 0,407 0.407 C3orf58 C3orf58 0,46 0.46 0,182 0.182 0.()0 0.()0 0,032 0.032 0,43 0.43 0,144 0.144 CAMKID CAMKID 0,47 0.47 0,228 0.228 0.()4 0.()4 0,040 0.040 0,48 0.48 0,136 0.136 CCL2 CCL2 -0,33 -0.33 0,522 0.522 -0.8() -0.8() 0,019 0.019 0,52 0.52 0,186 0.186 CCL7 CCL7 -0,48 -0.48 0,282 0.282 -().0() -().0() 0,010 0.010 0,36 0.36 0,355 0.355 CCRL2 CCRL2 -0,42 -0.42 0,263 0.263 -0.-() -0.-() 0,011 0.011 0,09 0.09 0,848 0.848 CD33 CD33 -1,08 -1.08 0,261 0.261 0,039 0.039 -1,28 -1.28 0,103 0.103 CD6 CD6 0,12 0.12 0,833 0.833 0.6“ 0.6" 0,042 0.042 0,51 0.51 0,134 0.134 CD68 CD68 -0,35 -0.35 0,184 0.184 -0.()() -0.()() 0,002 0.002 -0,36 -0.36 0,093 0.093 CDC42EP2 CDC42EP2 -0,30 -0.30 0,490 0.490 -0.()() -0.()() 0,037 0.037 0,08 0.08 0,864 0.864 CLEC4E CLEC4E -0,61 -0.61 0,086 0.086 -0.04 -0.04 0,001 0.001 -0,53 -0.53 0,069 0.069 CLEC7A CLEC7A -0,35 -0.35 0,521 0.521 -0.83 -0.83 0,034 0.034 -0,51 -0.51 0,223 0.223 CPNE8 CPNE8 -0,52 -0.52 0,422 0.422 0,036 0.036 -0,32 -0.32 0,601 0.601 CSF3 CSF3 0,03 0.03 0,959 0.959 -o.(>3 -o.(>3 0,030 0.030 0,30 0.30 0,353 0.353 CTSF CTSF 0,32 0.32 0,628 0.628 1.25 1.25 0,006 0.006 0,88 0.88 0,051 0.051 DAB2 DAB2 -0,62 -0.62 0,089 0.089 -().(>- -().(>- 0,029 0.029 -0,49 -0.49 0,119 0.119 DFNA5 DFNA5 -0,63 -0.63 0,080 0.080 -0.80 -0.80 0,002 0.002 -0,33 -0.33 0,311 0.311 ECI1 ECI1 0,62 0.62 0,167 0.167 0.-8 0.-8 0,031 0.031 0,45 0.45 0,249 0.249 ELAVL1 ELAVL1 0,56 0.56 0,120 0.120 ().-4 ().-4 0,013 0.013 0,51 0.51 0,091 0.091 ERO IL ERO IL -0,52 -0.52 0,086 0.086 -0.85 -0.85 0,001 0.001 -0,31 -0.31 0,252 0.252 EXOSC4 EXOSC4 -0,51 -0.51 0,130 0.130 -0.()0 -0.()0 0,013 0.013 -0,23 -0.23 0,491 0.491 FAM 105 A FAM 105 A 0,50 0.50 0,080 0.080 O.6 O.6 0,001 0.001 0,44 0.44 0,064 0.064 FAM83G FAM83G 0,39 0.39 0,431 0.431 0.82 0.82 0,029 0.029 0,71 0.71 0,055 0.055 FCAR FCAR -0,32 -0.32 0,280 0.280 -0.71 -0.71 0,002 0.002 -0,31 -0.31 0,211 0.211 FGR FGR -0,41 -0.41 0,067 0.067 -0.67 -0.67 0,000 0.000 -0,27 -0.27 0,169 0.169 FHL3 FHL3 0,57 0.57 0,180 0.180 o.2 o.2 0,035 0.035 0,24 0.24 0,572 0.572 FKBP8 FKBP8 0,39 0.39 0,166 0.166 0.()8 0.()8 0,002 0.002 0,28 0.28 0,250 0.250 FLU FLU 0,63 0.63 0,053 0.053 1.03 1.03 0,000 0.000 0,51 0.51 0,065 0.065 FPR2 FPR2 -0,36 -0.36 0,529 0.529 -0.88 -0.88 0,032 0.032 0,11 0.11 0,867 0.867

- 38 041126- 38 041126

N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 lAHIgGl№2 lAHIgGl#2

G0S2 G0S2 -0,40 -0.40 0,231 0.231 -().65 -().65 0,015 0.015 0,02 0.02 0,973 0.973 GEMIN2 GEMIN2 -0,13 -0.13 0,855 0.855 0,041 0.041 -0,38 -0.38 0,420 0.420 GGH GGH -0,45 -0.45 0,302 0.302 0,034 0.034 -0,59 -0.59 0,091 0.091 GIMAP1 GIMAP1 0,39 0.39 0,256 0.256 0.(.0 0.(.0 0,012 0.012 0,47 0.47 0,097 0.097 GIMAP1- GIMAP1- GIMAP5 GIMAP5 1,89 1.89 0,075 0.075 ·||Ι· ·||Ι· 0,047 0.047 0,95 0.95 0,331 0.331 GNG10 GNG10 -0,30 -0.30 0,280 0.280 0,005 0.005 -0,10 -0.10 0,752 0.752 GPR137B GPR137B -0,51 -0.51 0,376 0.376 -0.00 -0.00 0,044 0.044 -0,31 -0.31 0,566 0.566 GPR35 GPR35 -0,41 -0.41 0,322 0.322 0,031 0.031 -0,12 -0.12 0,791 0.791 GPR84 GPR84 -0,38 -0.38 0,154 0.154 -0.()8 -0.()8 0,002 0.002 0,05 0.05 0,891 0.891 GTF2I GTF2I 0,85 0.85 0,101 0.101 0,009 0.009 0,75 0.75 0,082 0.082 GZMM GZMM 0,55 0.55 0,215 0.215 o. o. 0,029 0.029 0,31 0.31 0,448 0.448 HBEGF HBEGF -0,57 -0.57 0,080 0.080 0,004 0.004 0,02 0.02 0,970 0.970 HECTD3 HECTD3 0,61 0.61 0,107 0.107 0.()() 0.()() 0,038 0.038 0,38 0.38 0,267 0.267 HLCS HLCS 0,46 0.46 0,310 0.310 o.xo o.xo 0,024 0.024 0,59 0.59 0,105 0.105 IFF01 IFF01 0,50 0.50 0,145 0.145 0.()1 0.()1 0,032 0.032 0,23 0.23 0,487 0.487 IGSF6 IGSF6 -0,65 -0.65 0,058 0.058 -0.85 -0.85 0,003 0.003 -0,23 -0.23 0,502 0.502 IL19 IL19 -0,62 -0.62 0,543 0.543 0,033 0.033 -0,56 -0.56 0,516 0.516 IL1R2 IL1R2 -0,38 -0.38 0,627 0.627 0,025 0.025 -0,63 -0.63 0,285 0.285 IL24 IL24 -0,86 -0.86 0,053 0.053 0,013 0.013 -0,51 -0.51 0,201 0.201 IL6 IL6 -0,43 -0.43 0,196 0.196 -().68 -().68 0,012 0.012 0,14 0.14 0,701 0.701 ILF3-AS1 ILF3-AS1 -0,50 -0.50 0,263 0.263 0,035 0.035 -0,26 -0.26 0,542 0.542 ISY1-RAB43 ISY1-RAB43 0,18 0.18 0,841 0.841 0,033 0.033 0,24 0.24 0,717 0.717 JTB JTB 0,24 0.24 0,621 0.621 o.“3 o.“3 0,030 0.030 0,33 0.33 0,372 0.372 KCNA3 KCNA3 0,08 0.08 0,879 0.879 0.85 0.85 0,005 0.005 0,37 0.37 0,264 0.264 KMO KMO -0,50 -0.50 0,122 0.122 0,006 0.006 -0,38 -0.38 0,183 0.183 LACC1 LACC1 -0,40 -0.40 0,071 0.071 -0.()5 -0.()5 0,000 0.000 -0,27 -0.27 0,171 0.171 LILRB3 LILRB3 -0,31 -0.31 0,410 0.410 0,017 0.017 0,12 0.12 0,763 0.763 MET MET -0,36 -0.36 0,419 0.419 0,049 0.049 -0,06 -0.06 0,916 0.916 MMP1 MMP1 -0,29 -0.29 0,342 0.342 11||Ж 11||F 0,001 0.001 -0,29 -0.29 0,245 0.245 MMP19 MMP19 -0,34 -0.34 0,254 0.254 0,013 0.013 -0,32 -0.32 0,204 0.204 MTERFD1 MTERFD1 -0,02 -0.02 0,982 0.982 0,048 0.048 -0,38 -0.38 0,249 0.249 NCF1 NCF1 -0,48 -0.48 0,214 0.214 -0.85 -0.85 0,006 0.006 -0,39 -0.39 0,241 0.241 NCF1C NCF1C -0,56 -0.56 0,254 0.254 0,005 0.005 -0,53 -0.53 0,198 0.198 NENF NENF 0,90 0.90 0,068 0.068 0.6 0.6 0,018 0.018 0,51 0.51 0,247 0.247 OCEL1 OCEL1 0,70 0.70 0,198 0.198 I.O4 I.O4 0,018 0.018 0,57 0.57 0,232 0.232 PEX26 PEX26 0,54 0.54 0,179 0.179 0.83 0.83 0,010 0.010 0,47 0.47 0,166 0.166 PGAM5 PGAM5 0,47 0.47 0,256 0.256 0.82 0.82 0,013 0.013 0,63 0.63 0,055 0.055 PHF1 PHF1 0,08 0.08 0,883 0.883 0.()5 0.()5 0,043 0.043 0,38 0.38 0,270 0.270 PIGP PIGP -0,03 -0.03 0,970 0.970 -0.()8 -0.()8 0,046 0.046 -0,24 -0.24 0,557 0.557 PILRA PILRA -0,49 -0.49 0,095 0.095 0,002 0.002 -0,45 -0.45 0,063 0.063 PKIA PCIA 0,57 0.57 0,256 0.256 0.8() 0.8() 0,034 0.034 0,54 0.54 0,211 0.211 PLA2G7 PLA2G7 -0,53 -0.53 0,058 0.058 0,002 0.002 -0,33 -0.33 0,187 0.187 PLAUR PLAUR -0,32 -0.32 0,229 0.229 -0.()8 -0.()8 0,001 0.001 -0,21 -0.21 0,363 0.363 PMP22 PMP22 -0,72 -0.72 0,132 0.132 0,005 0.005 -0,45 -0.45 0,290 0.290

- 39 041126- 39 041126

N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2

PTAFR PTAFR -0,58 -0.58 0,099 0.099 -().73 -().73 0,012 0.012 0,08 0.08 0,867 0.867 QPCT QPCT -0,57 -0.57 0,108 0.108 -0.81 -0.81 0,005 0.005 -0,53 -0.53 0,072 0.072 RAB2A RAB2A 0,45 0.45 0,198 0.198 0.()(1 0.()(1 0,033 0.033 0,53 0.53 0,059 0.059 RAC1 RAC1 0,90 0.90 0,065 0.065 1.13 1.13 0,005 0.005 0,76 0.76 0,063 0.063 RALY RALY 0,39 0.39 0,234 0.234 0.()0 0.()0 0,023 0.023 0,44 0.44 0,107 0.107 RANBP10 RANBP10 0,14 0.14 0,738 0.738 0.50 0.50 0,026 0.026 0,31 0.31 0,293 0.293 RASA3 RASA3 0,38 0.38 0,120 0.120 0.()() 0.()() 0,001 0.001 0,34 0.34 0,102 0.102 RAVERI RAVERI 0,43 0.43 0,182 0.182 o.()2 o.()2 0,017 0.017 0,50 0.50 0,053 0.053 RCN2 RCN2 0,48 0.48 0,231 0.231 o.(> o.(> 0,017 0.017 0,41 0.41 0,234 0.234 RETSAT RETSAT 0,48 0.48 0,231 0.231 0.()5 0.()5 0,047 0.047 0,59 0.59 0,065 0.065 RSPH3 RSPH3 -0,13 -0.13 0,841 0.841 -0.05 -0.05 0,008 0.008 -0,29 -0.29 0,497 0.497 SEMA4A SEMA4A -0,53 -0.53 0,057 0.057 -0.()0 -0.()0 0,003 0.003 -0,04 -0.04 0,911 0.911 SEPHS2 SEPHS2 0,43 0.43 0,503 0.503 l.oo l.oo 0,030 0.030 0,87 0.87 0,055 0.055 SLAMF8 SLAMF8 -0,27 -0.27 0,544 0.544 -0.()4 -0.()4 0,040 0.040 0,53 0.53 0,087 0.087 SNAPCI SNAPCI -0,34 -0.34 0,325 0.325 -0.()4 -0.()4 0,016 0.016 -0,30 -0.30 0,300 0.300 SUSD3 SUSD3 0,53 0.53 0,101 0.101 0.50 0.50 0,027 0.027 0,41 0.41 0,136 0.136 TAFIA TAFIA -0,23 -0.23 0,588 0.588 -0.()0 -0.()0 0,043 0.043 -0,03 -0.03 0,954 0.954 TBC1D17 TBC1D17 0,37 0.37 0,330 0.330 0.()5 0.()5 0,029 0.029 0,38 0.38 0,227 0.227 TBC1D22A TBC1D22A 0,38 0.38 0,254 0.254 o.()2 o.()2 0,020 0.020 0,23 0.23 0,469 0.469 TBC1D25 TBC1D25 0,37 0.37 0,298 0.298 o.l o.l 0,010 0.010 0,44 0.44 0,120 0.120 TBL2 TBL2 0,31 0.31 0,450 0.450 0.()8 0.()8 0,026 0.026 0,23 0.23 0,542 0.542 TFE3 TFE3 0,23 0.23 0,552 0.552 0.(,1 0.(,1 0,027 0.027 0,41 0.41 0,159 0.159 THBS1 THBS1 -0,37 -0.37 0,256 0.256 -0.()4 -0.()4 0,012 0.012 -0,49 -0.49 0,053 0.053 TLR8 TLR8 -0,74 -0.74 0,089 0.089 -0.88 -0.88 0,015 0.015 -0,03 -0.03 0,963 0.963 TMEM176B TMEM176B -0,94 -0.94 0,068 0.068 0,016 0.016 -0,82 -0.82 0,055 0.055 TPRKB TPRKB -0,46 -0.46 0,212 0.212 -0.88 -0.88 0,003 0.003 -0,48 -0.48 0,120 0.120 UBE3A UBE3A 0,06 0.06 0,924 0.924 0.(.5 0.(.5 0,042 0.042 0,54 0.54 0,096 0.096 USP21 USP21 0,37 0.37 0,272 0.272 o.~5 o.~5 0,004 0.004 0,27 0.27 0,363 0.363 VAMP4 VAMP4 -0,31 -0.31 0,375 0.375 -().()1 -().()1 0,024 0.024 -0,40 -0.40 0,163 0.163 VNN2 VNN2 -0,47 -0.47 0,086 0.086 -0.()0 -0.()0 0,008 0.008 -0,41 -0.41 0,074 0.074 WBP5 WBP5 -0,97 -0.97 0,205 0.205 IB IB 0,020 0.020 -0,70 -0.70 0,298 0.298 XPOT XPOT 0,78 0.78 0,061 0.061 O.8 O.8 0,026 0.026 0,57 0.57 0,108 0.108 ZDHHC3 ZDHHC3 0,56 0.56 0,095 0.095 o.”3 o.”3 0,008 0.008 0,30 0.30 0,328 0.328 ZER1 ZER1 0,58 0.58 0,161 0.161 O.~8 O.~8 0,019 0.019 0,36 0.36 0,333 0.333 ZNF589 ZNF589 0,27 0.27 0,504 0.504 o.3 o.3 0,012 0.012 0,25 0.25 0,474 0.474 ZNF71 ZNF71 0,55 0.55 0,101 0.101 0.()5 0.()5 0,020 0.020 0,23 0.23 0,487 0.487 ZNF792 ZNF792 0,70 0.70 0,108 0.108 0.05 0.05 0,008 0.008 0.67 0.67 0,063 0.063 ABHD14A ABHD14A -0,24 -0.24 0,527 0.527 (Hill (Hill 1,000 1,000 -(1.()2 -(1.()2 0,018 0.018 ACSL1 ACSL1 0,07 0.07 0,872 0.872 -0,08 -0.08 0,823 0.823 (1.()2 (1.()2 0,014 0.014 AGO2 AGO2 0,21 0.21 0,547 0.547 0,31 0.31 0,259 0.259 (l.-| (l.-| 0,003 0.003 APOBEC3D APOBEC3D 0,20 0.20 0,673 0.673 0,12 0.12 0,801 0.801 0.()8 0.()8 0,034 0.034 ARHGAP31 ARHGAP31 0,22 0.22 0,582 0.582 0,28 0.28 0,364 0.364 (1.()(1 (1.()(1 0,026 0.026 ATF3 ATF3 0,18 0.18 0,771 0.771 0,04 0.04 0,949 0.949 (1.89 (1.89 0,017 0.017 B3GNT5 B3GNT5 0,11 0.11 0,855 0.855 -0,01 -0.01 0,985 0.985 (1.81 (1.81 0,013 0.013 BACH2 BACH2 0,26 0.26 0,352 0.352 0,25 0.25 0,296 0.296 ().l ().l 0,001 0.001

- 40 041126- 40 041126

C19orf43 C19orf43 N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2 -0,57 -0.57 0,055 0.055 -0,30 -0.30 0,285 0.285 -0.59 -0.59 0,014 0.014 C9orf69 C9orf69 0,34 0.34 0,319 0.319 0,40 0.40 0,153 0.153 0.(,4 0.(,4 0,012 0.012 CCL4 CCL4 -0,15 -0.15 0,757 0.757 -0,39 -0.39 0,248 0.248 0.94 0.94 0,002 0.002 CCL8 CCL8 -0,28 -0.28 0,813 0.813 -0,94 -0.94 0,214 0.214 0,003 0.003 CCR2 CCR2 -0,56 -0.56 0,174 0.174 -0,32 -0.32 0,412 0.412 -l.oo -l.oo 0,002 0.002 CD 160 CD 160 -0,64 -0.64 0,288 0.288 -0,74 -0.74 0,143 0.143 0,000 0.000 CD274 CD274 -0,28 -0.28 0,494 0.494 -0,36 -0.36 0,285 0.285 O.8 O.8 0,008 0.008 CD36 CD36 -0,77 -0.77 0,172 0.172 -0,72 -0.72 0,129 0.129 0,005 0.005 CD52 CD52 -0,08 -0.08 0,769 0.769 -0,25 -0.25 0,155 0.155 -0.(,1 -0.(,1 0,000 0.000 CD69 CD69 0,02 0.02 0,974 0.974 -0,08 -0.08 0,770 0.770 0.82 0.82 0,000 0.000 CD72 CD72 -0,30 -0.30 0,499 0.499 -0,29 -0.29 0,431 0.431 (1.(,5 (1.(,5 0,038 0.038 CHKA CHKA -0,41 -0.41 0,410 0.410 -0,56 -0.56 0,156 0.156 -(!.(, -(!.(, 0,039 0.039 CLIC3 CLIC3 0,05 0.05 0,939 0.939 -0,05 -0.05 0,913 0.913 0,041 0.041 COMMD3- COMMD3- 0,34 0.34 0,655 0.655 0,21 0.21 0,771 0.771 ||||^^ ||||^^ 0,005 0.005 BMI1 BMI1 COX17 COX17 -0,21 -0.21 0,616 0.616 -0,45 -0.45 0,133 0.133 mJ» mj" 0,015 0.015 CRTAM CRTAM -0,39 -0.39 0,388 0.388 -0,39 -0.39 0,310 0.310 1.05 1.05 0,002 0.002 CSF2 CSF2 0,11 0.11 0,939 0.939 0,79 0.79 0,337 0.337 0,024 0.024 CSF2RB CSF2RB 0,04 0.04 0,930 0.930 0,01 0.01 0,989 0.989 o.3 o.3 0,004 0.004 CX3CR1 CX3CR1 -0,19 -0.19 0,662 0.662 -0,24 -0.24 0,493 0.493 -0.(,4 -0.(,4 0,023 0.023 CXCL10 CXCL10 -0,55 -0.55 0,511 0.511 -0,36 -0.36 0,648 0.648 0,007 0.007 CXCL9 CXCL9 -0,32 -0.32 0,687 0.687 -0,05 -0.05 0,956 0.956 0,002 0.002 DUSP1 DUSP1 0,85 0.85 0,133 0.133 0,82 0.82 0,088 0.088 0.93 0.93 0,043 0.043 DVL2 DVL2 0,54 0.54 0,143 0.143 0,58 0.58 0,058 0.058 0.(,1 0.(,1 0,040 0.040 EGR2 EGR2 -0,67 -0.67 0,094 0.094 -0,45 -0.45 0,210 0.210 0.85 0.85 0,008 0.008 EIF4EBP1 EIF4EBP1 -0,46 -0.46 0,260 0.260 -0,15 -0.15 0,737 0.737 -0.81 -0.81 0,010 0.010 EPSTI1 EPSTI1 0,09 0.09 0,874 0.874 0,16 0.16 0,728 0.728 o.5 o.5 0,021 0.021 FAM91A1 FAM91A1 0,35 0.35 0,338 0.338 0,50 0.50 0,083 0.083 0.59 0.59 0,034 0.034 FASLG FASLG 0,05 0.05 0,933 0.933 0,06 0.06 0,881 0.881 ().(> ().(> 0,007 0.007 FBXO30 FBXO30 0,27 0.27 0,586 0.586 0,63 0.63 0,077 0.077 o.(, o.(, 0,024 0.024 FGFBP2 FGFBP2 -0,16 -0.16 0,647 0.647 -0,23 -0.23 0,384 0.384 0,001 0.001 FUS FUS 0,30 0.30 0,429 0.429 0,37 0.37 0,238 0.238 0.(,1 0.(,1 0,029 0.029 GBP1 GBP1 -0,22 -0.22 0,716 0.716 -0,34 -0.34 0,475 0.475 l.o l.o. 0,005 0.005 GBP1P1 GBP1P1 -0,19 -0.19 0,820 0.820 -0,02 -0.02 0,979 0.979 l.l 1 l.l 1 0,019 0.019 GBP2 GBP2 0,04 0.04 0,924 0.924 0,02 0.02 0,956 0.956 0.(,1 0.(,1 0,004 0.004 GBP4 GBP4 0,00 0.00 0,997 0.997 0,08 0.08 0,823 0.823 o.4 o.4 0,002 0.002 GBP5 GBP5 0,00 0.00 1,000 1,000 0,06 0.06 0,921 0.921 1.14 1.14 0,002 0.002 GCHFR GCHFR -0,03 -0.03 0,952 0.952 -0,16 -0.16 0,574 0.574 -0.(,4 -0.(,4 0,004 0.004 GIMAP8 GIMAP8 0,37 0.37 0,298 0.298 0,49 0.49 0,092 0.092 0.59 0.59 0,035 0.035 GZMA GZMA -0,28 -0.28 0,298 0.298 -0,29 -0.29 0,194 0.194 -0.(,1 -0.(,1 0,003 0.003 GZMB GZMB 0,05 0.05 0,916 0.916 -0,08 -0.08 0,829 0.829 o.l o.l 0,002 0.002 GZMH GZMH -0,23 -0.23 0,512 0.512 -0,36 -0.36 0,181 0.181 -0.(,8 -0.(,8 0,005 0.005 HAVCR2 HAVCR2 0,07 0.07 0,858 0.858 -0,19 -0.19 0,435 0.435 0.(,(, 0.(,(, 0,001 0.001 HIST1H2BK HIST1H2BK -0,29 -0.29 0,391 0.391 -0,47 -0.47 0,076 0.076 0,005 0.005 HIVEP1 HIVEP1 0,36 0.36 0,213 0.213 0,09 0.09 0,783 0.783 0.(,5 0.(,5 0,005 0.005

- 41 041126- 41 041126

HSPBPl HSPBPl N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4 №1 MD707-13 IgG4 #1 1A11 IgGl №2 1A11 IgGl #2 0,53 0.53 0,153 0.153 0,49 0.49 0,120 0.120 ().^-8(). ^- 8 0,007 0.007 HSPH1 HSPH1 0,40 0.40 0,414 0.414 0,71 0.71 0,056 0.056 <>.2 <>.2 0,046 0.046 IFNG IFNG 0,32 0.32 0,706 0.706 -0,32 -0.32 0,654 0.654 1.21 1.21 0,024 0.024 IGF2R IGF2R 0,15 0.15 0,664 0.664 0,37 0.37 0,119 0.119 (),(.(. (),(.(. 0,003 0.003 IKZF2 IKZF2 0,20 0.20 0,664 0.664 0,42 0.42 0,212 0.212 0,049 0.049 IL21R-AS1 IL21R-AS1 0,16 0.16 0,635 0.635 0,34 0.34 0,172 0.172 (1.(. 1 (eleven 0,007 0.007 INADL INADL 0,56 0.56 0,070 0.070 0,45 0.45 0,088 0.088 (1.59 (1.59 0,018 0.018 INHBA INHBA -0,08 -0.08 0,885 0.885 -0,24 -0.24 0,549 0.549 (1.89 (1.89 0,005 0.005 INIP INIP -0,50 -0.50 0,067 0.067 -0,38 -0.38 0,111 0.111 -0.59 -0.59 0,008 0.008 INTS3 INTS3 0,55 0.55 0,092 0.092 0,49 0.49 0,079 0.079 ().(> ().(> 0,010 0.010 IRF1 IRF1 0,01 0.01 0,996 0.996 0,13 0.13 0,727 0.727 (1.(,8 (1.(,8 0,013 0.013 IRF4 IRF4 0,36 0.36 0,256 0.256 0,41 0.41 0,113 0.113 1.03 1.03 0,000 0.000 IRF8 IRF8 -0,09 -0.09 0,790 0.790 0,01 0.01 0,982 0.982 o.l o.l 0,000 0.000 IRG1 IRG1 -0,36 -0.36 0,567 0.567 -0,45 -0.45 0,380 0.380 1.41 1.41 0,002 0.002 ISOC2 ISOC2 0,30 0.30 0,564 0.564 0,07 0.07 0,898 0.898 o.4 o.4 0,036 0.036 JAK2 JAK2 0,63 0.63 0,087 0.087 0,53 0.53 0,091 0.091 0.9X 0.9X 0,001 0.001 JUN JUN 0,06 0.06 0,880 0.880 0,23 0.23 0,400 0.400 ().(. ().(. 0,002 0.002 KCNK6 KCNK6 0,37 0.37 0,503 0.503 0,60 0.60 0,144 0.144 0.80 0.80 0,040 0.040 KDM6B KDM6B -0,05 -0.05 0,911 0.911 0,19 0.19 0,527 0.527 0,(.(. 0,(.(. 0,006 0.006 KHK KHK -0,81 -0.81 0,070 0.070 -0,17 -0.17 0,733 0.733 -O.^-3-O. ^- 3 0,047 0.047 KIR2DL4 KIR2DL4 -0,26 -0.26 0,656 0.656 -0,39 -0.39 0,402 0.402 1.02 1.02 0,008 0.008 KLRB1 KLRB1 -0,13 -0.13 0,622 0.622 -0,26 -0.26 0,178 0.178 -0.82 -0.82 0,000 0.000 LGALS1 LGALS1 -0,42 -0.42 0,178 0.178 -0,49 -0.49 0,052 0.052 -().(.9 -().(.9 0,005 0.005 LIMK2 LIMK2 -0,08 -0.08 0,879 0.879 -0,01 -0.01 0,976 0.976 (I.9 (I.9 0,006 0.006 LMNB1 LMNB1 0,13 0.13 0,793 0.793 0,30 0.30 0,418 0.418 o.~2 o.~2 0,018 0.018 LOC729013 LOC729013 -0,42 -0.42 0,503 0.503 -0,39 -0.39 0,469 0.469 -0.93 -0.93 0,035 0.035 LRCH4 LRCH4 0,72 0.72 0,170 0.170 0,74 0.74 0,087 0.087 0.X9 0.X9 0,033 0.033 LST1 LST1 -0,45 -0.45 0,432 0.432 -0,83 -0.83 0,055 0.055 -1.03 -1.03 0,013 0.013 MAP3K13 MAP3K13 -0,09 -0.09 0,837 0.837 -0,38 -0.38 0,125 0.125 -0.64 -0.64 0,006 0.006 MB21D1 MB21D1 0,00 0.00 1,000 1,000 0,15 0.15 0,701 0.701 (),(. (),(. 0,009 0.009 MFGE8 MFGE8 0,08 0.08 0,941 0.941 0,21 0.21 0,792 0.792 |||||O |||||O 0,034 0.034 MPPE1 MPPE1 -0,31 -0.31 0,477 0.477 -0,43 -0.43 0,220 0.220 0,013 0.013 NAB2 NAB2 0,25 0.25 0,731 0.731 0,55 0.55 0,278 0.278 1.23 1.23 0,006 0.006 NDUFAF6 NDUFAF6 -0,27 -0.27 0,557 0.557 -0,54 -0.54 0,115 0.115 -().(,5 -().(,5 0,044 0.044 NFKBIB NFKBIB 0,08 0.08 0,881 0.881 0,21 0.21 0,576 0.576 0.(,0 0.(,0 0,043 0.043 NOP 14 NOP 14 0,14 0.14 0,821 0.821 0,55 0.55 0,164 0.164 0.80 0.80 0,028 0.028 NR4A1 NR4A1 0,12 0.12 0,777 0.777 0,06 0.06 0,871 0.871 0.95 0.95 0,000 0.000 NR4A2 NR4A2 -0,09 -0.09 0,841 0.841 -0,25 -0.25 0,373 0.373 o.5 o.5 0,002 0.002 OSBPL5 OSBPL5 -0,55 -0.55 0,152 0.152 -0,21 -0.21 0,581 0.581 -0.(,2 -0.(,2 0,046 0.046 PAGR1 PAGR1 0,48 0.48 0,159 0.159 0,54 0.54 0,051 0.051 0.(,4 0.(,4 0,016 0.016 PIM3 PIM3 0,05 0.05 0,930 0.930 0,42 0.42 0,181 0.181 0.59 0.59 0,040 0.040 PLEK PLEK -0,08 -0.08 0,853 0.853 -0,17 -0.17 0,579 0.579 0.82 0.82 0,001 0.001 PML PML 0,51 0.51 0,168 0.168 0,56 0.56 0,067 0.067 0.(,2 0.(,2 0,036 0.036 PPP1R15B PPP1R15B 0,27 0.27 0,302 0.302 0,32 0.32 0,143 0.143 0.(,0 0.(,0 0,003 0.003 PTGES2 PTGES2 -0,39 -0.39 0,545 0.545 -0,64 -0.64 0,189 0.189 -l.oo -l.oo 0,026 0.026

- 42 041126- 42 041126

PTGS2 PTGS2 N13B2-h3VL6 N13B2-h3VL6 MD707-13 IgG4№l MD707-13 IgG4#l 1А11 IgGl №2 1A11 IgGl №2 0,12 0.12 0,854 0.854 -0,02 -0.02 0,971 0.971 ιι.^-9ιι. ^- 9 0,022 0.022 PYCARD PYCARD -0,16 -0.16 0,703 0.703 -0,21 -0.21 0,550 0.550 -(1.(,(1 -(1.(,(1 0,032 0.032 RAB20 RAB20 -0,28 -0.28 0,509 0.509 -0,34 -0.34 0,324 0.324 И|ИМ I|IM 0,045 0.045 RGS16 RGS16 -0,16 -0.16 0,809 0.809 -0,07 -0.07 0,901 0.901 1.( 19 1.( 19 0,004 0.004 RNF19A RNF19A 0,22 0.22 0,457 0.457 0,26 0.26 0,282 0.282 (1.()^- (1.() ^- 0,002 0.002 RPL21 RPL21 -0,54 -0.54 0,132 0.132 -0,10 -0.10 0,809 0.809 -0.84 -0.84 0,004 0.004 RPL34 RPL34 -0,07 -0.07 0,837 0.837 -0,10 -0.10 0,709 0.709 Illi· Illy 0,003 0.003 RPS29 RPS29 -0,02 -0.02 0,975 0.975 -0,06 -0.06 0,878 0.878 -().()(1 -().()(1 0,024 0.024 SBNO2 SBNO2 0,14 0.14 0,758 0.758 0,23 0.23 0,515 0.515 0/9 0/9 0,044 0.044 SERPINE2 SERPINE2 -0,19 -0.19 0,655 0.655 0,02 0.02 0,957 0.957 0.()3 0.()3 0,026 0.026 SH2D1B SH2D1B -0,11 -0.11 0,749 0.749 -0,09 -0.09 0,742 0.742 0.94 0.94 0,000 0.000 SH3BGRL3 SH3BGRL3 -0,28 -0.28 0,207 0.207 -0,26 -0.26 0,180 0.180 -0.()() -0.()() 0,000 0.000 SLC25A20 SLC25A20 -0,14 -0.14 0,731 0.731 -0,33 -0.33 0,257 0.257 ми— mi— 0,024 0.024 SLC7A5 SLC7A5 0,33 0.33 0,355 0.355 0,21 0.21 0,530 0.530 0.()0 0.()0 0,024 0.024 SLMO2-ATP5E SLMO2-ATP5E -0,30 -0.30 0,893 0.893 -0,82 -0.82 0,594 0.594 0,042 0.042 SMG6 SMG6 0,30 0.30 0,410 0.410 0,45 0.45 0,121 0.121 (1.()2 (1.()2 0,021 0.021 SMIM11 SMIM11 -0,40 -0.40 0,417 0.417 -0,43 -0.43 0,299 0.299 -о.^-4-O. ^- 4 0,045 0.045 SMIM14 SMIM14 -0,32 -0.32 0,165 0.165 -0,36 -0.36 0,057 0.057 -().()8 -().()8 0,000 0.000 SNHG8 SNHG8 -0,25 -0.25 0,666 0.666 -0,37 -0.37 0,400 0.400 -0.80 -0.80 0,034 0.034 SPRY2 SPRY2 -0,16 -0.16 0,880 0.880 -0,46 -0.46 0,531 0.531 0,018 0.018 SRC SRC 0,25 0.25 0,549 0.549 0,32 0.32 0,341 0.341 0.59 0.59 0,042 0.042 SREBF1 SREBF1 0,41 0.41 0,509 0.509 0,58 0.58 0,233 0.233 (1.93 (1.93 0,034 0.034 STARD4 STARD4 0,21 0.21 0,583 0.583 0,33 0.33 0,268 0.268 0.83 0.83 0,002 0.002 STAT1 STAT1 0,20 0.20 0,582 0.582 0,23 0.23 0,428 0.428 0.()4 0.()4 0,008 0.008 SUMF1 SUMF1 -0,17 -0.17 0,683 0.683 -0,37 -0.37 0,222 0.222 -0.()4 -0.()4 0,017 0.017 TAGAP TAGAP 0,03 0.03 0,937 0.937 0,08 0.08 0,793 0.793 1.0() 1.0() 0,000 0.000 TESK1 TESK1 -0,06 -0.06 0,921 0.921 0,18 0.18 0,645 0.645 о.()3 o.()3 0,038 0.038 ТМЕМ165 TMEM165 0,42 0.42 0,303 0.303 0,57 0.57 0,083 0.083 О.(А O.(A 0,038 0.038 TNF TNF -0,33 -0.33 0,261 0.261 -0,32 -0.32 0,206 0.206 о.()1 o.()1 0,007 0.007 TNFRSF10A TNFRSF10A 0,34 0.34 0,619 0.619 0,63 0.63 0,215 0.215 0.93 0.93 0,044 0.044 TNFRSF9 TNFRSF9 0,02 0.02 0,976 0.976 -0,09 -0.09 0,807 0.807 1.08 1.08 0,000 0.000 TP53I13 TP53I13 0,53 0.53 0,210 0.210 0,62 0.62 0,073 0.073 0.84 0.84 0,010 0.010 TYSND1 TYSND1 -0,24 -0.24 0,590 0.590 -0,10 -0.10 0,818 0.818 -О.Л1 -O.L1 0,018 0.018 UBE2D1 UBE2D1 0,63 0.63 0,111 0.111 0,62 0.62 0,066 0.066 о.9| o.9| 0,005 0.005 XCL1 XCL1 -0,07 -0.07 0,941 0.941 0,02 0.02 0,979 0.979 —1Ш1— —1SH1— 0,000 0.000 XCL2 XCL2 -0,25 -0.25 0,805 0.805 0,77 0.77 0,257 0.257 0,000 0.000 ZNF326 ZNF326 -0,37 -0.37 0,344 0.344 -0,53 -0.53 0,088 0.088 -0.()(1 -0.()(1 0,044 0.044

Анализ диаграммы Венна (фиг. 11С) выявил 61 общий дифференциально экспрессируемый ген с тремя mAb без какого-либо особого обогащения генной онтологии по данным GoMiner. Несмотря на 61 общий ген, антитело по изобретению индуцирует только 31 значительную модификацию гена без обогащения генной онтологии. Напротив, два антитела предшествующего уровня техники индуцируют важную транскрипционную модификацию транскриптома РВМС человека с 245 дифференциально экспрессированными генами, индуцированными mAb IgG4 № 1 сайта-1, и 237 дифференциально экспрессированными генами, индуцированными mAb IgG1 № 2 сайта-1. 78 дифференциально экспрессируемых генов были общими для этих двух mAb сайта-1, но эти гены не экспрессируются дифференциально, когда РВМС стимулированы антителом N13B2-hVL6. Анализ основных компонентов (РСА) сигнатуры IL-7 показывает, что дифференциально экспрессируемые гены, индуцированные антителами предшествующего уровня техники, сильно отличаются от дифференциально экспрессируемых генов, индуцированных IL-7. Обогащение генной онтологии GoMiner показывает, что оба антитела предшествующего уровня техники модифицируют биологические функции РВМС, такие как активация, пролиферация, миграция, хемотаксис лейкоцитов, секреция цитокинов и воспалительные реакции, ассоциированные с путем MAPK/ERK.Venn diagram analysis (FIG. 11C) revealed 61 common differentially expressed genes with three mAbs without any specific enrichment of the gene ontology according to GoMiner. Despite 61 common genes, the antibody of the invention induces only 31 significant gene modifications without gene ontology enrichment. In contrast, two prior art antibodies induce an important transcriptional modification of the human PBMC transcriptome with 245 differentially expressed genes induced by IgG4 mAb #1 site-1 and 237 differentially expressed genes induced by IgG1 mAb #2 site-1. 78 differentially expressed genes were shared between the two site-1 mAbs, but these genes are not differentially expressed when PBMCs are stimulated with the N13B2-hVL6 antibody. Principal component analysis (PCA) of the IL-7 signature shows that the differentially expressed genes induced by prior art antibodies are very different from the differentially expressed genes induced by IL-7. Enrichment of the GoMiner gene ontology shows that both prior art antibodies modify the biological functions of PBMCs such as activation, proliferation, migration, leukocyte chemotaxis, cytokine secretion, and inflammatory responses associated with the MAPK/ERK pathway.

Среди 334 генов, дифференциально экспрессируемых с IL7 по сравнению с контрольным условием, 93 гена были дифференциально экспрессированы с высоким кратным изменением (>2) и были разделены на 3 отдельных кластера с помощью анализа с использованием тепловой карты (фиг. 11А). Первый кластер генов с пониженной регуляцией, оцениваемый по обогащению онтологии генов, в основном был вовлечен в дифференцировку и апоптоз лейкоцитов, второй кластер генов с высоким уровнем регуляции ассоциирован с адгезией, дифференцировкой и активацией лейкоцитов, а третий кластер генов с повышенным уровнем регуляции имел смешанную онтологию генов. Интересно, что все исследованные mAb (как сайт-1, так и сайт-1/2b) демонстрировали сходные эффекты, предотвращая модификацию кластера-1 и кластера-2, но без воздействия на кластер-3 (фиг. 11В).Among the 334 genes differentially expressed with IL7 compared to control, 93 genes were differentially expressed with high fold change (>2) and were separated into 3 separate clusters by heat map analysis (FIG. 11A). The first downregulated gene cluster, as assessed by gene ontology enrichment, was mainly involved in leukocyte differentiation and apoptosis, the second highly regulated gene cluster is associated with leukocyte adhesion, differentiation and activation, and the third upregulated gene cluster had a mixed ontology. genes. Interestingly, all mAbs tested (both site-1 and site-1/2b) showed similar effects, preventing modification of cluster-1 and cluster-2, but no effect on cluster-3 (FIG. 11B).

В целом, транскрипционный анализ подтвердил, что несмотря на то, что mAb против человеческого IL-7Ra сайта-1/2-b обладали сходными антагонистическими свойствами, два mAb сайта-1, ранее описанные в данной области техники, индуцируют значительные транскрипционные модификации человече- 43 041126 ских РВМС, совместимые с активацией Т-клеток и воспалительными реакциями, индуцированными путем MAPK/ERK.Overall, transcriptional analysis confirmed that while site-1/2-b anti-human IL-7Ra mAbs had similar antagonistic properties, the two site-1 mAbs previously described in the art induce significant human transcriptional modifications. 43 041126 PBMCs compatible with T cell activation and inflammatory responses induced by MAPK/ERK.

MAb сайта-1/2b против IL-7Ra человека по изобретению, т.е. N13B2-hVL6, индуцировало меньшую транскрипционную модификацию человеческих РВМС по сравнению с двумя mAb сайта-1, ранее описанными в уровне техники. Отсутствие специфических и только антагонистческих mAb против IL-7Ra для более крупных биологических видов не позволило проверить этот эффект у приматов или людей. Авторы изобретения обнаружили, что антагонистические/антагонистические свойства mAb против IL7Ra зависят от специфического целевого эпитопа, поскольку антитела существующего уровня техники, связывающие домен взаимодействия IL-7 сайта-1, по-видимому, обладают как антагонистическими, так и антагонистическими свойствами, тогда как антитело по изобретению, связывающее домен димеризации IL-7Ra/yc (сайт 2b), проявляет строгую антагонистическую активность. Авторы изобретения предполагают, что антитело по изобретению может нарушать димеризацию IL-7Ra/yc, необходимую для интернализации и передачи сигнала рецептора. Только антагонистические антитела против IL-7R предотвращали долговременное воспаление кожи у приматов, опосредованное Т-клетками памяти, даже после хронической антигенной стимуляции, не индуцируя лимфопении или поликлональных Т-клеточных функциональных или метаболических нарушений.Anti-human IL-7Ra site-1/2b MAb of the invention, i. N13B2-hVL6 induced less transcriptional modification of human PBMCs compared to the two site-1 mAbs previously described in the art. The lack of specific and only antagonistic anti-IL-7Ra mAbs for larger species has prevented this effect from being tested in primates or humans. The inventors have found that the antagonistic/antagonistic properties of the anti-IL7Ra mAb depend on the specific target epitope, since prior art antibodies binding the IL-7 interaction domain of site-1 appear to have both antagonistic and antagonistic properties, whereas the antibody according to the invention, which binds the IL-7Ra/yc dimerization domain (site 2b), exhibits strong antagonistic activity. The inventors suggest that the antibody of the invention may interfere with IL-7Ra/yc dimerization required for receptor internalization and signaling. Only antagonistic antibodies against IL-7R prevented long-term memory T-cell mediated skin inflammation in primates, even after chronic antigen challenge, without inducing lymphopenia or polyclonal T-cell functional or metabolic disorders.

Было показано, что IL-7 индуцирует пролиферативные и антиапоптотические сигналы посредством передачи сигналов IL-7R, главным образом, путем активации пути JAK/STAT. Также считается, что передача сигналов IL-7R включает путь PI3K/AKT, но это наблюдалось в трансформированных иммортализованных клеточных линиях или первичных тимоцитах, и эти сигналы не были обнаружены в периферических наивных или человеческих Т-лимфоцитах памяти (Watanabe, J. Ехр. Med., 1998). В нескольких сообщениях также было высказано предположение, что передача сигналов IL-7R может усиливать фосфорилирование ERK либо в Т-лимфоцитах, либо в субпопуляциях про-В-клеток (Deshpande P. I. Immunol, 2013; Fleming HE и Paige CJ, Immunity, 2001). Роль этих путей в передаче сигналов IL-7R в зрелых и человеческих Т-клетках менее ясна. Используя первичные свежевыделенные человеческие РВМС (в основном состоящие из Т и В-лимфоцитов, моноцитов и NK-клеток) от здоровых добровольцев, стимулированные высокой концентрацией рекомбинантного человеческого IL-7 (5000 пг/мл, в то время как концентрация в сыворотке составляет ~5 пг/мл в лимфопенических условиях, Wong HL, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008), авторы изобретения подтвердили, что IL-7 индуцировал воспроизводимое фосфорилирование STAT5. Активация сигнала PI3K была более вариабельной, и авторы изобретения не наблюдали фосфорилирования ERK. Хотя все mAb против IL7Ra, использованные в этом исследовании, были сильными ингибиторами IL-7-индуцированного pSTAT5 и проявляли сходные свойства транскрипционных антагонистов, мы обнаружили, что два mAb сайта-1 уровня техники индуцировали агонистические сигналы PI3K/ERK и важные транскрипционные модификации, ассоциированные с активацией Тклеток и воспалительными реакциями, индуцированными путем MAPK/ERK. Эти противоположные свойства двойного агониста/антагониста некоторых mAb не являются уникальными, поскольку другие мишени, такие как IL-4, IL-6R, IL-15, CD28, CD38, CD40 или HER2, продемонстрировали сходные виды активности после эндоцитоза/интернализации рецепторов.IL-7 has been shown to induce proliferative and anti-apoptotic signals through IL-7R signaling, primarily through activation of the JAK/STAT pathway. IL-7R signaling is also thought to involve the PI3K/AKT pathway, but this has been observed in transformed immortalized cell lines or primary thymocytes and these signals have not been detected in peripheral naive or human memory T lymphocytes (Watanabe, J. Exp. Med ., 1998). Several reports have also suggested that IL-7R signaling may enhance ERK phosphorylation in either T lymphocytes or pro-B cell subpopulations (Deshpande P. I. Immunol, 2013; Fleming HE and Paige CJ, Immunity, 2001). The role of these pathways in IL-7R signaling in mature and human T cells is less clear. Using primary freshly isolated human PBMCs (mainly composed of T and B lymphocytes, monocytes and NK cells) from healthy volunteers, stimulated with a high concentration of recombinant human IL-7 (5000 pg/ml, while the serum concentration is ~5 pg/ml in lymphopenic conditions, Wong HL, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008), the inventors confirmed that IL-7 induced reproducible STAT5 phosphorylation. The activation of the PI3K signal was more variable and the inventors did not observe ERK phosphorylation. Although all of the anti-IL7Ra mAbs used in this study were potent inhibitors of IL-7-induced pSTAT5 and exhibited similar transcriptional antagonist properties, we found that two prior art site-1 mAbs induced PI3K/ERK agonist signals and important transcriptional modifications associated with with T cell activation and inflammatory responses induced by MAPK/ERK. These opposite dual agonist/antagonist properties of some mAbs are not unique as other targets such as IL-4, IL-6R, IL-15, CD28, CD38, CD40 or HER2 have shown similar activities following receptor endocytosis/internalization.

Также исследователи недавно подтвердили гетеродимеризацию этого сайта 2b с TSLPR и продемонстрировали ее готовность к передаче сигналов рецептора, как уже предсказывалось для IL-7Ra и γцепи (Verstraete K., Nature Communications, 2017). Интересно, что предсказанный сайт гетеродимеризации между IL-7Rα/γ-цепью и IL-7Ra/TSLPR перекрывается, что указывает на общий механизм передачи сигналов, опосредованный гетеродимеризацией, между обоими рецепторами.Also, researchers recently confirmed the heterodimerization of this site 2b with TSLPR and demonstrated its readiness for receptor signaling, as already predicted for IL-7Ra and the γ chain (Verstraete K., Nature Communications, 2017). Interestingly, the predicted heterodimerization site between IL-7Rα/γ chain and IL-7Ra/TSLPR overlaps, indicating a common heterodimerization-mediated signaling mechanism between both receptors.

Мы обнаружили, что анализ ингибирования pSTAT5 in vitro не позволяет предсказать эффективность анти-IL-7R-антител in vivo. В предыдущем сообщении другое анти-IL7Rα-mAb предотвращало in vitro и ex vivo IL-7-индуцированный pSTAT5 у приматов, но не защищало от воспаления головного мозга на экспериментальной модели мартышек с аутоиммунным энцефалитом (ЕАЕ) (Dunham J., J. Neuroimmune.Pharmacol, 2016).We found that the in vitro pSTAT5 inhibition assay does not predict the efficacy of anti-IL-7R antibodies in vivo. In a previous report, another anti-IL7Rα mAb prevented in vitro and ex vivo IL-7-induced pSTAT5 in primates but did not protect against brain inflammation in an experimental monkey model with autoimmune encephalitis (EAE) (Dunham J., J. Neuroimmune. Pharmacol, 2016).

IL-7 уже хорошо описан в плане поддержания пула периферических наивных Т-лимфоцитов и Тлимфоцитов памяти у мышей. Однако у приматов важность IL-7 в поддержании периферического Тклеточного гомеостаза может быть менее очевидной, и/или дублирующие механизмы могут объяснить эту разницу между биологическими видами.IL-7 has already been well described in terms of maintaining a pool of peripheral naive T-lymphocytes and memory T-lymphocytes in mice. However, in primates, the importance of IL-7 in maintaining peripheral T-cell homeostasis may be less clear, and/or overlapping mechanisms may explain this difference between species.

Эти данные показали, что антагонистические свойства mAb против IL-7Ra и эффективность in vivo связаны не только с предотвращением связывания IL-7 и ингибирования pSTAT5. Эти данные показали, что антитело по изобретению, также нацеленное на сайт гетеродимеризации рецептора (сайт 2b), является только антагонистическим и обеспечивает более высокую эффективность ингибирующих Тклеточных ответов in vivo.These data indicated that the anti-IL-7Ra mAb antagonistic properties and in vivo efficacy are not only related to preventing IL-7 binding and pSTAT5 inhibition. These data showed that the antibody of the invention, also targeting the site of receptor heterodimerization (site 2b), is only antagonistic and provides a higher efficiency of inhibitory T cell responses in vivo.

Нацеливание на IL7R антител с только антагонистическими свойствами потенциально способно регулировать выживание и накопление антиген-специфических Т-клеток памяти и, следовательно, может способствовать предотвращению долгосрочного рецидива при аутоиммунных и воспалительных заболеваниях.Targeting IL7R antibodies with only antagonistic properties has the potential to regulate the survival and accumulation of antigen-specific memory T cells and therefore may contribute to the prevention of long-term relapse in autoimmune and inflammatory diseases.

- 44 041126- 44 041126

СсылкиLinks

Abraham, С. & Cho, J. H. Inflammatory Bowel Disease. New England Journal of Medicine 361, 2066-2078 (2009).Abraham, C. & Cho, J. H. Inflammatory Bowel Disease. New England Journal of Medicine 361, 2066-2078 (2009).

Adams, D. H. & Eksteen, B. Aberrant homing of mucosal T cells and extra-intestinal manifestations of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 6, 244-251 (2006).Adams, D. H. & Eksteen, B. Aberrant homing of mucosal T cells and extra-intestinal manifestations of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 6, 244-251 (2006).

Agace, W. W. Tissue-tropic effector T cells: generation and targeting opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 682-692 (2006).Agace, W. W. Tissue-tropic effector T cells: generation and targeting opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 682-692 (2006).

Albuquerque AS, Cortesao CS, Foxall RB, Soares RS, Victorino RM, Sousa AE. Rate of increase in circulating IL-7 and loss of IL-7Ralpha expression differ in HIV-1 and HIV-2 infections: two lymphopenic diseases with similar hyperimmune activation but distinct outcomes. J Immunol. 2007 Mar 1; 178(5):3252-9. PubMedPMID: 17312174.Albuquerque AS, Cortesao CS, Foxall RB, Soares RS, Victorino RM, Sousa AE. Rate of increase in circulating IL-7 and loss of IL-7Ralpha expression differ in HIV-1 and HIV-2 infections: two lymphopenic diseases with similar hyperimmune activation but distinct outcomes. J Immunol. 2007 Mar 1; 178(5):3252-9. PubMedPMID: 17312174.

Baumgart, D. C. & Sandbom, W. J. Crohn’s disease. Lancet 380, 1590-1605 (2012).Baumgart, D. C. & Sandbom, W. J. Crohn's disease. Lancet 380, 1590-1605 (2012).

Broux, B., Hellings, N., Venken, K., Rummens, J.-L., Hensen, K., Van Wijmeersch, B., and Stinissen, P. (2010). Haplotype 4 of the multiple sclerosis-associated interleukin-7 receptor alpha gene influences the frequency of recent thymic emigrants. Genes Immun. 11, 326-333.Broux, B., Hellings, N., Venken, K., Rummens, J.-L., Hensen, K., Van Wijmeersch, B., and Stinissen, P. (2010). Haplotype 4 of the multiple sclerosis-associated interleukin-7 receptor alpha gene influences the frequency of recent thymic emigrants. Genes Immun. 11, 326-333.

Chothia, C., and Lesk, A.M. (1987). Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917.Chothia, C., and Lesk, A.M. (1987). Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917.

Chothia C, Lesk AM, Gherardi E, Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. J Mol Biol. 1992 Oct 5;227(3):799-817.Chothia C, Lesk AM, Gherardi E, Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. J Mol Biol. 1992 Oct 5;227(3):799-817.

Clark LA, Demarest SJ, Eldredge J, Jarpe MB, Li Y, Simon K, van Vlijmen HW. Influence of canonical structure determining residues on antibody affinity and stability. J Struct Biol. 2014 Feb; 185(2):223-7. doi: 10.1016/j.jsb.2013.08.009. PubMedPMID: 23994046Clark LA, Demarest SJ, Eldredge J, Jarpe MB, Li Y, Simon K, van Vlijmen HW. Influence of canonical structure determining residues on antibody affinity and stability. J Struct Biol. February 2014; 185(2):223-7. doi: 10.1016/j.jsb.2013.08.009. PubMedPMID: 23994046

Danese, S. & Fiocchi, C. Ulcerative colitis. N. Engl. J. Med. 365, 1713-1725 (2011).Danese, S. & Fiocchi, C. Ulcerative colitis. N. Engl. J. Med. 365, 1713-1725 (2011).

Denucci, C.C., Mitchell, J.S., and Shimizu, Y. (2009). Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Crit. Rev. Immunol. 29, 87-109.Denucci, C.C., Mitchell, J.S., and Shimizu, Y. (2009). Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Crit. Rev. Immunol. 29, 87-109.

Feagan, B. G. et al. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Ulcerative Colitis. New England Journal of Medicine 369, 699710 (2013).Feagan, B. G. et al. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Ulcerative Colitis. New England Journal of Medicine 369, 699710 (2013).

Deshpande, P., Cavanagh, M.M., Le Saux, S., Singh, K., Weyand, C.M., and Goronzy, J.J. (2013). IL-7- and IL-15-mediated TCR sensitization enables T cell responses to self-antigens. J. Immunol. Baltim. Md 1950 190, 1416-1423.Deshpande, P., Cavanagh, M.M., Le Saux, S., Singh, K., Weyand, C.M., and Goronzy, J.J. (2013). IL-7- and IL-15-mediated TCR sensitization enables T cell responses to self-antigens. J. Immunol. Baltim. Md 1950 190, 1416-1423.

Dunham, J., Lee, L.-F., Driel, N. van, Laman, J.D., Ni, I., Zhai, W., Tu, G.-H., Lin, J.C., Bauer, J., Hart, B.A. ‘t, et al. (2016). Blockade of CD127 Exerts a Dichotomous Clinical Effect in Marmoset Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 11, 73-83.Dunham, J., Lee, L.-F., Driel, N. van, Laman, J.D., Ni, I., Zhai, W., Tu, G.-H., Lin, J.C., Bauer, J., Hart, B.A. ‘t, et al. (2016). Blockade of CD127 Exerts a Dichotomous Clinical Effect in Marmoset Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 11, 73-83.

Fleming, H.E., and Paige, C.J. (2001). Pre-В Cell Receptor Signaling Mediates Selective Response to IL-7 at the Pro-В to Pre- В Cell Transition via an ERK/MAP Kinase-Dependent Pathway. Immunity 15, 521-531.Fleming, H.E., and Paige, C.J. (2001). Pre-B Cell Receptor Signaling Mediates Selective Response to IL-7 at the Pro-B to Pre-B Cell Transition via an ERK/MAP Kinase-Dependent Pathway. Immunity 15, 521-531.

Gorfu, G., Rivera-Nieves, J., and Ley, K. (2009). Role of beta7 integrins in intestinal lymphocyte homing and retention. Curr. Mol. Med. 9, 836-850.Gorfu, G., Rivera-Nieves, J., and Ley, K. (2009). Role of beta7 integrins in intestinal lymphocyte homing and retention. Curr. Mol. Med. 9, 836-850.

Haas, J., Korporal, M., Schwarz, A., Balint, B., and Wildemann, B. (2011). The interleukin-7 receptor a chain contributes to altered homeostasis of regulatory T cells in multiple sclerosis. Eur. J. Immunol. 41, 845-853.Haas, J., Korporal, M., Schwarz, A., Balint, B., and Wildemann, B. (2011). The interleukin-7 receptor a chain contributes to altered homeostasis of regulatory T cells in multiple sclerosis. Eur. J. Immunol. 41, 845-853.

Haudebourg, T., Poirier, N., and Vanhove, B. (2009). Depleting T-cell subpopulations in organ transplantation. Transpl. Int. Off. J. Eur. Soc. Organ Transplant. 22, 509-518.Haudebourg, T., Poirier, N., and Vanhove, B. (2009). Depleting T-cell subpopulations in organ transplantation. Transpl. Int. off. J. Eur. soc. Organ Transplant. 22, 509-518.

He, R., and Geha, R.S. (2010). Thymic stromal lymphopoietin. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1183, 13-24.He, R., and Geha, R.S. (2010). Thymic stromal lymphopoietin. Ann. N. Y. Acad. sci. 1183, 13-24.

Henriques, C.M., Rino, J., Nibbs, R.J., Graham, G.J., and Barata, J.T. (2010). IL-7 induces rapid clathrin-mediated internalization and JAK3-dependent degradation of IL-7Ralpha in T cells. Blood 115, 3269-3277.Henriques, C.M., Rino, J., Nibbs, R.J., Graham, G.J., and Barata, J.T. (2010). IL-7 induces rapid clathrin-mediated internalization and JAK3-dependent degradation of IL-7Ralpha in T cells. Blood 115, 3269-3277.

Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. and Gottesman, K.S. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE publishing, 1992).Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. and Gottesman, K.S. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE publishing, 1992).

Kern, B., Kraynov, E., Lee, L.-F., Ray, R. (2013). Receptor occupancy and internalization of an anti-IL-7 receptor antibody. Cytokine 63, 276-277.Kern, B., Kraynov, E., Lee, L.-F., Ray, R. (2013). Receptor occupancy and internalization of an anti-IL-7 receptor antibody. Cytokine 63, 276-277.

Kern B, Li W, Bono C, Lee LF, Kraynov E. Receptor occupancy and blocking of STAT5 signaling by an anti-IL-7 receptor a antibody in cynomolgus monkeys. Cytometry В Clin Cytom. 2016 Mar;90(2):191-8.Kern B, Li W, Bono C, Lee LF, Kraynov E. Receptor occupancy and blocking of STAT5 signaling by an anti-IL-7 receptor a antibody in cynomolgus monkeys. Cytometry In Clin Cytom. 2016 Mar;90(2):191-8.

Khor, B., Gardet, A. & Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature 474, 307-317 (2011).Khor, B., Gardet, A. & Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature 474, 307-317 (2011).

Lei, L., Zhang, Y., Yao, W., Kaplan, M.H., and Zhou, B. (2011). Thymic Stromal Lymphopoietin Interferes with Airway Tolerance by Suppressing the Generation of Antigen-Specific Regulatory T Cells. J. Immunol. 186, 2254-2261.Lei, L., Zhang, Y., Yao, W., Kaplan, M.H., and Zhou, B. (2011). Thymic Stromal Lymphopoietin Interferes with Airway Tolerance by Suppressing the Generation of Antigen-Specific Regulatory T Cells. J. Immunol. 186, 2254-2261.

Mazzucchelli, R., Hixon, J.A., Spolski, R., Chen, X., Li, W.Q., Hall, V.L., Willette-Brown, J., Hurwitz, A.A., Leonard, W.J., and Durum, S.K. (2008). Development of regulatory T cells requires IL-7Ralpha stimulation by IL-7 or TSLP. Blood 112, 3283-3292.Mazzucchelli, R., Hixon, J.A., Spolski, R., Chen, X., Li, W.Q., Hall, V.L., Willette-Brown, J., Hurwitz, A.A., Leonard, W.J., and Durum, S.K. (2008). Development of regulatory T cells requires IL-7Ralpha stimulation by IL-7 or TSLP. Blood 112, 3283-3292.

McElroy CA, Dohm JA, Walsh ST. Structural and biophysical studies of the human IL-7/IL-7Ralpha complex. Structure. 2009 Jan 14; 17(1):54-65. doi: 10.1016/j.str.2008.10.019.McElroy CA, Dohm JA, Walsh ST. Structural and biophysical studies of the human IL-7/IL-7Ralpha complex. structure. 2009 Jan 14; 17(1):54-65. doi: 10.1016/j.str.2008.10.019.

McElroy CA, Holland PJ, Zhao P, Lim JM, Wells L, Eisenstein E, Walsh ST. Structural reorganization of the interleukin-7 signaling complex. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Feb 14;109(7):2503-8. doi: 10.1073/pnas. 1116582109McElroy CA, Holland PJ, Zhao P, Lim JM, Wells L, Eisenstein E, Walsh ST. Structural reorganization of the interleukin-7 signaling complex. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Feb 14;109(7):2503-8. doi: 10.1073/pnas. 1116582109

Michel, L., Berthelot, L., Pettre, S., Wiertlewski, S., Lefrere, F., Braudeau, C., Brouard, S., Soulillou, J.-P., and Laplaud, D.- A. (2008). Patients with relapsing-remitting multiple sclerosis have normal Treg function when cells expressing IL-7 receptor alpha-chain are excluded from the analysis. J. Clin. Invest. 118, 3411-3419.Michel, L., Berthelot, L., Pettre, S., Wiertlewski, S., Lefrere, F., Braudeau, C., Brouard, S., Soulillou, J.-P., and Laplaud, D.-A (2008). Patients with relapsing-remitting multiple sclerosis have normal Treg function when cells expressing IL-7 receptor alpha-chain are excluded from the analysis. J.Clin. Invest. 118, 3411-3419.

Planell N, Lozano JJ, Mora-Buch R, Masamunt MC, Jimeno M, Ordas I, Esteller M, Ricart E, Pique JM, Panes J, Salas A. Transcriptional analysis of the intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis in remission reveals lasting epithelial cell alterations. Gut. 2013 Jul;62(7):967-76. doi: 10.1136/gutjnl-2012-303333Planell N, Lozano JJ, Mora-Buch R, Masamunt MC, Jimeno M, Ordas I, Esteller M, Ricart E, Pique JM, Panes J, Salas A. Transcriptional analysis of the intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis in remission reveals lasting epithelial cell alterations. gut. 2013 Jul;62(7):967-76. doi:10.1136/gutjnl-2012-303333

Racape, M., Vanhove, B., Soulillou, J.-P., and Brouard, S. (2009). Interleukin 7 receptor alpha as a potential therapeutic target in transplantation. Arch Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 57, 253-261.Racape, M., Vanhove, B., Soulillou, J.-P., and Brouard, S. (2009). Interleukin 7 receptor alpha as a potential therapeutic target in transplantation. Arch Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 57, 253-261.

Reche PA, Soumelis V, Gorman DM, Clifford T, Liu Mr, Travis M, Zurawski SM, Johnston J, Liu YJ, Spits H, de Waal Maleiyt R, KasteleinRA, Bazan JF. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 2001 Jul l;167(l):336-43Reche PA, Soumelis V, Gorman DM, Clifford T, Liu Mr, Travis M, Zurawski SM, Johnston J, Liu YJ, Spits H, de Waal Maleiyt R, KasteleinRA, Bazan JF. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 2001 Jull;167(l):336-43

Roan, F., Bell, B.D., Stoklasek, T.A., Kitajima, M., Han, H., and Ziegler, S.F. (2012). The multiple facets of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) during allergic inflammation and beyond. J. Leukoc. Biol. 91, 877-886.Roan, F., Bell, B.D., Stoklasek, T.A., Kitajima, M., Han, H., and Ziegler, S.F. (2012). The multiple facets of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) during allergic inflammation and beyond. J. Leukoc. Biol. 91, 877-886.

Rochman, Y., Kashyap, M., Robinson, G.W., Sakamoto, K., Gomez-Rodriguez, J., Wagner, K.-U., and Leonard, W.J. (2010). Thymic stromal lymphopoietin-mediated STAT5 phosphorylation via kinases JAKI and JAK2 reveals a key difference from IL-7-induced signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 19455-19460.Rochman, Y., Kashyap, M., Robinson, G.W., Sakamoto, K., Gomez-Rodriguez, J., Wagner, K.-U., and Leonard, W.J. (2010). Thymic stromal lymphopoietin-mediated STAT5 phosphorylation via kinases JAKI and JAK2 reveals a key difference from IL-7-induced signaling. Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 107, 19455-19460.

Sandbom, W. J. et al. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Crohn’s Disease. New England Journal of Medicine 369, 711-721 (2013).Sandbom, W. J. et al. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Crohn's Disease. New England Journal of Medicine 369, 711-721 (2013).

--

Claims (11)

Shochat C, Tai N, Bandapalli OR, Palmi C, Ganmore I, te Kronnie G, Cario G, Cazzaniga G, Kulozik AE, Stanulla M, Schrappe M, Biondi A, Basso G, Bercovich D, Muckenthaler MU, Izraeli S. Gain-of-function mutations in interleukin-7 receptor-a (IL7R) in childhood acute lymphoblastic leukemias. J Exp Med. 2011 May 9;208(5):901-8. doi: 10.1084/jem.20110580. Erratum in: J Exp Med. 2011 May 9;208(5):preceding901. JExpMed. 2011 Jun 6;208(6): 1333Shochat C, Tai N, Bandapalli OR, Palmi C, Ganmore I, te Kronnie G, Cario G, Cazzaniga G, Kulozik AE, Stanulla M, Schrappe M, Biondi A, Basso G, Bercovich D, Muckenthaler MU, Izraeli S. Gain -of-function mutations in interleukin-7 receptor-a (IL7R) in childhood acute lymphoblastic leukemias. J Exp Med. 2011 May 9;208(5):901-8. doi: 10.1084/jem.20110580. Erratum in: J Exp Med. 2011 May 9;208(5):preceding901. jexpmed. 2011 Jun 6;208(6): 1333 Taylor, B.C., Zaph, C., Troy, A.E., Du, Y., Guild, K.J., Comeau, M.R., and Artis, D. (2009). TSLP regulates intestinal immunity and inflammation in mouse models of helminth infection and colitis. J. Exp. Med. 206, 655-667.Taylor, B.C., Zaph, C., Troy, A.E., Du, Y., Guild, K.J., Comeau, M.R., and Artis, D. (2009). TSLP regulates intestinal immunity and inflammation in mouse models of helminth infection and colitis. J. Exp. Med. 206, 655-667. Van Bodegom, D., Zhong, J., Kopp, N., Dutta, C., Kim, M.-S., Bird, L., Weigert, 0., Tyner, J., Pandey, A., Yoda, A., et al. (2012). Differences in signaling through the В-cell leukemia oncoprotein CRLF2 in response to TSLP and through mutant JAK2. Blood 120, 28532863.Van Bodegom, D., Zhong, J., Kopp, N., Dutta, C., Kim, M.-S., Bird, L., Weigert, 0., Tyner, J., Pandey, A., Yoda , A., et al. (2012). Differences in signaling through the B-cell leukemia oncoprotein CRLF2 in response to TSLP and through mutant JAK2. Blood 120, 28532863. Verstraete, K., Peelman, F., Braun, H., Lopez, J., Van Rompaey, D., Dansercoer, A., Vandenberghe, I., Pauwels, K., Tavernier, J., Lambrecht, B.N., et al. (2017). Structure and antagonism of the receptor complex mediated by human TSLP in allergy and asthma. Nat. Commun. 8.Verstraete, K., Peelman, F., Braun, H., Lopez, J., Van Rompaey, D., Dansercoer, A., Vandenberghe, I., Pauwels, K., Tavernier, J., Lambrecht, B.N., et al. (2017). Structure and antagonism of the receptor complex mediated by human TSLP in allergy and asthma. Nat. commun. 8. Walsh ST. Structural insights into the common у-chain family of cytokines and receptors from the interleukin-7 pathway. Immunol Rev.Walsh ST. Structural insights into the common γ-chain family of cytokines and receptors from the interleukin-7 pathway. Immunol Rev. 2012 Nov;250(l):303-162012 Nov;250(l):303-16 Watanabe, M., Ueno, Y., Yajima, T., Okamoto, S., Hayashi, T., Yamazaki, M., Iwao, Y., Ishii, H., Habu, S., Uehira, M., et al. (1998).Watanabe, M., Ueno, Y., Yajima, T., Okamoto, S., Hayashi, T., Yamazaki, M., Iwao, Y., Ishii, H., Habu, S., Uehira, M., et al. (1998). Interleukin 7 transgenic mice develop chronic colitis with decreased interleukin 7 protein accumulation in the colonic mucosa. J. Exp. Med.Interleukin 7 transgenic mice develop chronic colitis with decreased interleukin 7 protein accumulations in the colonic mucosa. J. Exp. Med. 187, 389-402.187, 389-402. Watanabe, N., Wang, Y.-H., Lee, H.K., Ito, T., Wang, Y.-H., Cao, W., and Liu, Y.-J. (2005a). Hassall’s corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+ regulatory T cells in human thymus. Nature 436, 1181-1185.Watanabe, N., Wang, Y.-H., Lee, H.K., Ito, T., Wang, Y.-H., Cao, W., and Liu, Y.-J. (2005a). Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+ regulatory T cells in human thymus. Nature 436, 1181-1185. Wong, H.-L., Pfeiffer, R.M., Fears, T.R., Vermeulen, R., Ji, S., and Rabkin, C.S. (2008). ReproducibilityWong, H.-L., Pfeiffer, R.M., Fears, T.R., Vermeulen, R., Ji, S., and Rabkin, C.S. (2008). reproduction Ying, S., O’Connor, B., Ratoff, J., Meng, Q., Fang, C., Cousins, D., Zhang, G., Gu, S., Gao, Z., Shamji, B., et al. (2008). Expression and cellular provenance of thymic stromal lymphopoietin and chemokines in patients with severe asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J. Immunol. Baltim. Md 1950 181, 2790-2798.Ying, S., O'Connor, B., Ratoff, J., Meng, Q., Fang, C., Cousins, D., Zhang, G., Gu, S., Gao, Z., Shamji, B ., et al. (2008). Expression and cellular provenance of thymic stromal lymphopoietin and chemokines in patients with severe asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J. Immunol. Baltim. Md 1950 181, 2790-2798. Zhi, K., Li, M., Zhang, X., Gao, Z., Bai, J., Wu, Y., Zhou, S., Li, M., and Qu, L. (2014). α4β7 Integrin (LPAM-1) is upregulated at atherosclerotic lesions and is involved in atherosclerosis progression. Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 33, 1876-1887Zhi, K., Li, M., Zhang, X., Gao, Z., Bai, J., Wu, Y., Zhou, S., Li, M., and Qu, L. (2014). α4β7 Integrin (LPAM-1) is upregulated at atherosclerotic lesions and is involved in atherosclerosis progression. cell. physiol. Biochem. Int. J. Exp. cell. physiol. Biochem. Pharmacol. 33, 1876-1887 Zhong, J., Sharma, J., Raju, R., Palapetta, S.M., Prasad, T.S.K., Huang, Т.-C., Yoda, A., Tyner, J.W., vanBodegom, D., Weinstock, D.M., et al. (2014). TSLP signaling pathway map: a platform for analysis of TSLP-mediated signaling. Database J. Biol. Databases Curation 2014, bau007.Zhong, J., Sharma, J., Raju, R., Palapetta, S.M., Prasad, T.S.K., Huang, T.-C., Yoda, A., Tyner, J.W., vanBodegom, D., Weinstock, D.M., et al. (2014). TSLP signaling pathway map: a platform for analysis of TSLP-mediated signaling. Database J. Biol. Databases Curation 2014, bau007. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с CD127, содержащие:1. An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD127, containing: легкую цепь антитела, содержащую последовательность, или вариабельный домен легкой цепи антитела, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; и вариабельный домен тяжелой цепи антитела, состоящий из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 7.an antibody light chain containing a sequence, or an antibody light chain variable domain, consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; and an antibody heavy chain variable domain consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 7. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, в частности, где константный домен легкой цепи антитела происходит от константного домена легкой цепи каппа человека, в частности, где константный домен легкой цепи состоит из последовательности SEQ ID NO: 27 или 28, и где константный домен тяжелой цепи антитела происходит от константного домена тяжелой цепи lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4 человека, в частности от константного домена тяжелой цепи lgG4 человека, в частности, где константный домен тяжелой цепи антитела состоит из последовательности c SEQ ID NO: 26.2. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein said antibody is a humanized monoclonal antibody, in particular, where the light chain constant domain of the antibody is derived from a human kappa light chain constant domain, in particular, where the light chain constant domain consists of the sequence SEQ ID NO: 27 or 28, and wherein the antibody heavy chain constant domain is derived from a human lgG1, lgG2, lgG3 or lgG4 heavy chain constant domain, in particular from a human lgG4 heavy chain constant domain, in particular wherein the antibody heavy chain constant domain consists from sequence c SEQ ID NO: 26. 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где легкая цепь антитела содержит или вариабельный домен легкой цепи антитела состоит из SEQ ID NO: 12.3. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, wherein the antibody light chain comprises or the antibody light chain variable domain consists of SEQ ID NO: 12. 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, которое является антагонистом передачи сигналов IL-7R, индуцированной IL-7, и которое не индуцирует активацию фосфатидилинозитол-3-киназы и/или сигнального пути ERK.4. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, which is an antagonist of IL-7R signaling induced by IL-7 and which does not induce activation of phosphatidylinositol 3-kinase and/or ERK signaling pathway. 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, которое распознает эпитоп, содержащий последовательность, взятую из сайта 2b из CD127, и/или нарушает связывание CD127 с общей цепью yc цитокиновых рецепторов, в частности, которое распознает по меньшей мере третий бета-слой сайта 2b CD127.5. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 4, which recognizes an epitope containing a sequence taken from site 2b of CD127 and/or disrupts the binding of CD127 to the common chain yc of cytokine receptors, in particular, which recognizes at least at least the third beta layer of site 2b of CD127. 6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, которое не индуцирует интернализацию CD127 и/или ингибирует индуцированную IL7 интернализацию CD127.6. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 5, which does not induce CD127 internalization and/or inhibits IL7-induced CD127 internalization. 7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, которое не увеличивает созревание дендритных клеток, индуцированное TSLP.7. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 6, which does not increase the maturation of dendritic cells induced by TSLP. 8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, которое оказывает длительный эффект и/или быстрый эффект, в частности, которое оказывает быстрый локальный эффект.8. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 7, which has a long-term effect and/or a rapid effect, in particular, which has a rapid local effect. 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8, которое специфически связывается CD127 человека с константой аффинности KD ниже 5х10^-9 М, что может быть определено биосенсорным анализом.9. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8, which specifically binds human CD127 with a KD affinity constant below 5x10 ^-9 M, which can be determined by biosensor analysis. 10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, которое специфически связывается с CD127 человека.10. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 9, which specifically binds to human CD127. 11. Комбинация для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из11. Combination to produce an antibody or antigen-binding fragment according to any one of --