EA041061B1 - METHODS FOR IDENTIFYING CANCER AS LIKELY ANTI-FOLR1 REACTIVE IMMUNOCONJUGATE - Google Patents

Description

Область техникиTechnical field

Область техники в целом относится к повышению эффективности лечения рака, развитие которого характеризуется избыточной экспрессией человеческого рецептора фолата 1 (FOLR1). В частности, изобретение относится к способу повышения эффективности лечения пациентов, склонных к развитию у них рака или с поставленным диагнозом рак, у которых опухолевые клетки избыточно экспрессируют FOLR1, что определяется с помощью анализа экспрессии генов посредством антагониста FOLR1, например иммуноконъюгата FOLR1.The field of technology generally relates to improving the effectiveness of the treatment of cancer, the development of which is characterized by overexpression of the human folate receptor 1 (FOLR1). In particular, the invention relates to a method for improving the treatment of patients who are prone to developing cancer or diagnosed with cancer, in which tumor cells overexpress FOLR1, as determined by analyzing gene expression with a FOLR1 antagonist, for example, a FOLR1 immunoconjugate.

Уровень техникиState of the art

Рак является одной из ведущих причин смерти в развитых странах мира. Более, чем миллиону людей ставится диагноз рак, являющийся причиной 500000 смертей в год в одних только Соединенных Штатах Америки. Считается, что более, чем у 1 из 3 человек в течение жизни разовьется одна из форм рака. Существует более 200 различных типов рака, на четыре из которых - рак молочной железы, легких, толстой кишки и предстательной железы - приходится более половины всех вновь зарегистрированных случаев заболевания (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26).Cancer is one of the leading causes of death in the developed world. More than a million people are diagnosed with cancer, which causes 500,000 deaths a year in the United States of America alone. It is estimated that more than 1 in 3 people will develop some form of cancer during their lifetime. There are more than 200 different types of cancer, four of which—breast, lung, colon, and prostate cancer—account for more than half of all newly reported cases (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26 ).

Рецептор фолиевой кислоты 1 (FOLR1), также известный как рецептор фолиевой кислоты альфа или фолат-связывающий белок, представляет собой N-гликозилированный белок, экспрессируемый на плазматической клеточной мембране. FOLR1 обладает высокой степенью сродства к фолиевой кислоте и несколько более низкой - к производным фолиевой кислоты. FOLR1 опосредует доставку внутрь клетки активной формы фолиевой кислоты, 5-метилтетрагидрофолата.Folic acid receptor 1 (FOLR1), also known as folic acid receptor alpha or folate-binding protein, is an N-glycosylated protein expressed at the plasma cell membrane. FOLR1 has a high affinity for folic acid and a slightly lower affinity for folic acid derivatives. FOLR1 mediates intracellular delivery of the active form of folic acid, 5-methyltetrahydrofolate.

Избыточная экспрессия FOLR1 наблюдается в большинстве случаев рака яичников, а также во многих случаях рака матки, рака эндометрия, поджелудочной железы, почек, легких и молочной железы, в то время как экспрессия FOLR1 в здоровых тканях ограничивается апикальной мембраной эпителиальных клеток в проксимальных почечных канальцах, альвеолярных пневмоцитах легкого, мочевом пузыре, яичках, хороидном сплетении и щитовидной железе (Weitman SD et al, Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Antony AC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996); Kalli KR, et al. Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). Такой паттерн экспрессии FOLR1 делает его желательной мишенью для FOLR1-направленной антираковой терапии.FOLR1 is overexpressed in most ovarian cancers, as well as in many uterine, endometrial, pancreatic, kidney, lung, and breast cancers, while FOLR1 expression in healthy tissues is limited to the apical membrane of epithelial cells in the proximal renal tubules. alveolar pneumocytes of the lung, bladder, testes, choroid plexus, and thyroid gland (Weitman SD et al, Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Antony AC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996); Kalli KR, et al Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). This expression pattern of FOLR1 makes it a desirable target for FOLR1-targeted anticancer therapy.

Из-за обычно бессимптомного развития рака яичников вплоть до поздней стадии, зачастую он поздно диагностируется и имеет плохой прогноз при лечении посредством доступных в настоящее время процедур, как правило, с помощью химиотерапевтических препаратов после хирургической циторедукции (von Gruenigen V et al, Cancer 112: 2221-2227 (2008); Ayhan A et al., Am J Obstet Gynecol 196: 81 e8186 (2007); Harry VN et al, Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). Таким образом, существует четкая нереализованная медицинская потребность в более эффективных терапевтических средствах для лечения рака яичников.Due to the usually asymptomatic development of ovarian cancer up to an advanced stage, it is often diagnosed late and has a poor prognosis when treated with currently available procedures, usually with chemotherapy drugs after surgical debulking (von Gruenigen V et al, Cancer 112: 2221-2227 (2008); Ayhan A et al., Am J Obstet Gynecol 196: 81 e8186 (2007); Harry VN et al, Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). Thus, there is a clear unmet medical need for more effective therapeutic agents for the treatment of ovarian cancer.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение основано на открытии динамического диапазона экспрессии FOLR1 в опухолевой ткани и увеличения чувствительности опухоли с повышенным уровнем экспрессии FOLR1 к терапии анти-FOLR1 антителами или анти-FOLR1 иммуноконъюгатами. Настоящее изобретение позволяет успешно производить лечение пациентов, имеющих большую вероятность ответа на терапию, состоящую во введении терапевтических агентов, то есть анти-FOLRl антител или анти-FOLRl иммуноконъюгатов пациентам, у которых определяется повышенный уровень экспрессии FOLR1.The present invention is based on discovering the dynamic range of FOLR1 expression in tumor tissue and increasing the sensitivity of a FOLR1 overexpressing tumor to therapy with anti-FOLR1 antibodies or anti-FOLR1 immunoconjugates. The present invention makes it possible to successfully treat patients who are more likely to respond to therapy consisting in the administration of therapeutic agents, ie anti-FOLR1 antibodies or anti-FOLR1 immunoconjugates, to patients who have an increased level of FOLR1 expression.

Настоящее изобретение представляет способ идентификации субъекта, предрасположенного к положительной реакции на таргетную против рецептора фолата 1 (FOLR1-таргетную) антираковую терапию, причем способ включает обнаружение экспрессии FOLR1 в образце ткани субъекта.The present invention provides a method for identifying a subject predisposed to responding positively to an anti-folate receptor 1 (FOLR1-targeted) anticancer therapy, the method comprising detecting FOLR1 expression in a tissue sample of the subject.

В одном воплощении изобретения степень и равномерность экспрессии FOLR1 определяется с помощью способов иммуногистохимического (ИГХ) анализа, проточной цитометрии или гибридизации нуклеиновых кислот. В другом варианте уровень экспрессии FOLR1 определяется с помощью иммуногистохимического анализа.In one embodiment of the invention, the extent and uniformity of FOLR1 expression is determined using immunohistochemical (IHC) analysis, flow cytometry, or nucleic acid hybridization methods. In another embodiment, the expression level of FOLR1 is determined using immunohistochemical analysis.

Неограничивающие примеры ИГХ включают способы ИГХ, в которых различаются различные уровни FOLR1 и калиброванные ИГХ способы, как описано в данном документе. Экспрессия FOLR1 может быть оценена посредством соответствующих систем, в том числе, но не ограничиваясь ими, посредством способов оценки, описанных в данном документе. Например, экспресия FOLR1 может быть оценена посредством калиброванного ИГХ способа, который включает в себя диапазон интенсивности окрашивания 0, 1, 2, 3 и 3+, где 0 означает самую низкую интенсивность окрашивания и 3+ - самую высокую интенсивность. В соответствии с другим или дополнительным вариантом, экспрессия FOLR1 может быть оценена посредством калиброванного ИГХ способа, в котором исследуется однородность окрашивания, колеблющаяся от фокальной (<25% окрашенных клеток) до неоднородной (25-75% окрашенных клеток) и однородной (>75% окрашенных клеток), где фокальное окрашивание является наименее равномерным, а однородное - наиболее равномерным.Non-limiting examples of IHC include IHC methods that differentiate between different levels of FOLR1 and calibrated IHC methods as described herein. Expression of FOLR1 can be assessed by appropriate systems, including, but not limited to, the assessment methods described herein. For example, FOLR1 expression can be assessed by a calibrated IHC method that includes a staining intensity range of 0, 1, 2, 3, and 3+, where 0 is the lowest staining intensity and 3+ is the highest staining intensity. Alternatively, or additionally, FOLR1 expression can be assessed by a calibrated IHC method that examines stain uniformity ranging from focal (<25% stained cells) to heterogeneous (25-75% stained cells) to uniform (>75% stained cells), where focal staining is the least uniform, and homogeneous staining is the most uniform.

В еще одном варианте воплощения экспрессия FOLR1 в образце (например, образце опухолевой ткани) измеряется и сравнивается с одним или более референсными образцами и производится специфическая оценка соответствия степени и равномерности экспресии FOLR1 в образце опухолевой тканиIn yet another embodiment, the expression of FOLR1 in a sample (e.g., a tumor tissue sample) is measured and compared to one or more reference samples, and a specific assessment is made to match the degree and uniformity of FOLR1 expression in the tumor tissue sample.

- 1 041061 субъекта, ксенотрансплантата опухоли или клеточной линии по сравнению с одним или более референсными образцами. В различных примерах экспрессия FOLR1 при однородном окрашивании образца ткани или клеточного образца с уровнями интенсивности окрашивания FOLR1, равными 1, 2, 3 или 3+, считается увеличенной; экспрессия FOLR1 также считается увеличенной при интенсивности FOLR1 окрашивания образца ткани или клеточного образца с уровнем 3 при неоднородном или фокальном характере окрашивания. В другом варианте воплощения экспрессия FOLR1 в образце измеряется и сравнивается с одним или более референсными образцами для определения сопоставимого уровня окрашивания. В одном варианте воплощения используется референсный образец с предварительной ИГХ оценкой и/или предварительно установленным количеством антигена на клетку или числом САК (связанных антител на клетку), таким образом, количество антигена или САК для образца ткани может быть определено путем сравнения.- 1,041,061 subjects, tumor xenografts or cell lines compared to one or more reference samples. In various examples, expression of FOLR1 when uniformly stained in a tissue sample or cell sample with FOLR1 staining intensity levels of 1, 2, 3, or 3+ is considered to be increased; FOLR1 expression is also considered to be increased when the intensity of FOLR1 staining of a tissue sample or a cell sample with a level of 3 with a heterogeneous or focal pattern of staining. In another embodiment, FOLR1 expression in a sample is measured and compared to one or more reference samples to determine a comparable level of staining. In one embodiment, a reference sample is used with a pre-IHC assessment and/or a predetermined amount of antigen per cell or number of CAA (bound antibodies per cell), so that the amount of antigen or CAA for a tissue sample can be determined by comparison.

В одном варианте воплощения экспрессия FOLR1 в образце (например, образце опухолевой ткани) измеряется и сравнивается с одним или более контрольными образцами и производится специфическая оценка соответствия степени и равномерности экспрессии FOLR1 в образце опухолевой ткани субъекта, ксенотрансплантата опухоли или клеточной линии по сравнению с одним или более контрольными образцами. В одном варианте воплощения экспрессия FOLR1 в образце сравнивается с образцом для отрицательного контроля, который демонстрирует отсутствие или низкий уровень экспрессии FOLR1. В другом варианте воплощения экспрессия FOLR1 в образце сравнивается с образцом для положительного контроля, обладающего повышенной экспрессией FOLR1 (уровень 1, 2, 3 или 3+). В некоторых вариантах воплощения контрольные образцы включают, но не ограничиваются ими, клеточные образцы Namalwa, SW2, SW620, T47D, IGrOv-1, 300,19 FR1, HeLa или KB. В конкретных вариантах воплощения контрольные образцы включают в себя клетки или клеточные конгломераты из клеток, трансфицированных рецепторами фолиевой кислоты (например, 300.19 FR1).In one embodiment, FOLR1 expression in a sample (e.g., a tumor tissue sample) is measured and compared to one or more controls and a specific assessment is made to match the extent and uniformity of FOLR1 expression in a subject's tumor tissue sample, tumor xenograft, or cell line, compared to one or more more control samples. In one embodiment, FOLR1 expression in a sample is compared to a negative control sample that shows no or low FOLR1 expression. In another embodiment, FOLR1 expression in a sample is compared to a positive control sample having increased FOLR1 expression (level 1, 2, 3, or 3+). In some embodiments, controls include, but are not limited to, Namalwa, SW2, SW620, T47D, IGrOv-1, 300.19 FR1, HeLa, or KB cell samples. In specific embodiments, controls comprise cells or cell conglomerates from cells transfected with folic acid receptors (eg, 300.19 FR1).

В одном варианте воплощения FOLR1-таргетным антираковым терапевтическим веществом является FOLR1 иммуноконъюгат. В одном варианте воплощения иммуноконъюгат включает анти-FOLR1 антитело, линкер и цитотоксин.In one embodiment, the FOLR1-targeted anti-cancer therapeutic agent is a FOLR1 immunoconjugate. In one embodiment, the immunoconjugate comprises an anti-FOLR1 antibody, a linker, and a cytotoxin.

В другом варианте воплощения анти-FOLR1 антитело представляет собой huMOV19. В другом варианте воплощения линкер выбирается из группы, состоящей из расщепляемого линкера, нерасщепляемого линкера, гидрофильного линкера и линкера на основе дикарбоновой кислоты. В другом варианте воплощения линкер выбран из группы, включающей: N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP) или N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфопентаноат (сульфо-SPP), N- сукцинимидил 4-(2пиридилдитио)бутаноат (SPDB) или N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноат (сульфоSPDB), N-сукцинимидил 4-(малеимидометил) циклогексанкарбоксилат (SMCC), N-сульфосукцинимидил 4-(малеимидометил) циклогексанкарбоксилат (сульфо-SMCC), N-сукцинимидил-4-(иодоацетил)аминобензоат (SIAB) и N-сукцинимидил-[(N-малеимидопропионамидо)тетраэтиленгликольный] эстер (NHS-PEG4-малеимид). В другом варианте воплощения линкер представляет собой N-сукцинимидил 4(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB). В другом варианте осуществления изобретения цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, аналога майтанзиноида, бензодиазепина, таксоида, СС-1065, аналога СС-1065, дуокармицина, аналога дуокармицина, калихеамицина, доластатина, аналога доластатина, ауристатина, производного томаймицина и производного лептомицина или этих агентов в форме пролекарства. В другом варианте воплощения цитотоксическое средство представляет собой майтанзиноид. В другом варианте воплощения цитотоксическим агентом является N(2')деацетил-М-(2')-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансин или N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-4-метил-1оксопентил)-майтансин. В другом варианте воплощения цитотоксический агент представляет собой N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-4-метил-l-оксопентил)-майтансин (DM4). В еще одном варианте воплощения иммуноконъюгат включает антитело HUMOV19, сульфо-SPDB и DM4 (IMGN853).In another embodiment, the anti-FOLR1 antibody is huMOV19. In another embodiment, the linker is selected from the group consisting of a cleavable linker, a non-cleavable linker, a hydrophilic linker, and a dicarboxylic acid linker. In another embodiment, the linker is selected from the group consisting of: N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate (SPP) or N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-2-sulfopentanoate (sulfo-SPP), N-succinimidyl 4 -(2pyridyldithio)butanoate (SPDB) or N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-2-sulfobutanoate (sulfoSPDB), N-succinimidyl 4-(maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N-sulfosuccinimidyl 4-(maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate ( sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4-(iodoacetyl)aminobenzoate (SIAB) and N-succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)tetraethylene glycol]ester (NHS-PEG4-maleimide). In another embodiment, the linker is N-succinimidyl 4(2-pyridyldithio)-2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB). In another embodiment, the cytotoxic agent is selected from the group consisting of maytansinoid, maytansinoid analog, benzodiazepine, taxoid, CC-1065, CC-1065 analog, duocarmycin, duocarmycin analog, calicheamicin, dolastatin, dolastatin analog, auristatin, tomaimycin derivative, and leptomycin derivative. or these agents in the form of a prodrug. In another embodiment, the cytotoxic agent is a maytansinoid. In another embodiment, the cytotoxic agent is N(2')deacetyl-M-(2')-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine or N(2')-deacetyl-N2-(4-mercapto-4- methyl-1oxopentyl)-maytansine. In another embodiment, the cytotoxic agent is N(2')-deacetyl-N2-(4-mercapto-4-methyl-l-oxopentyl)-maytansine (DM4). In yet another embodiment, the immunoconjugate comprises the HUMOV19 antibody, sulfo-SPDB and DM4 (IMGN853).

Изобретение также относится к способу идентификации рака, как с вероятностью реагирующего на анти-FOLR1 антитело или анти-FOLR1 иммуноконъюгат, который включает: (а) приведение биологического образца, содержащего клетки указанного рака, в контакт с агентом, связывающим FOLR1 белок на поверхности клетки; (б) определение связывания указанного агента, который связывается с FOLR1 белком на клеточной поверхности биологического образца, указанного на стадии (а) с использованием способа обнаружения, различающего интенсивность и однородность окрашивания; и (в) оценку связывания, указанного на стадии (б), причем оценка интенсивности окрашивания FOLR1, составляющая 2 или более в по меньшей мере 25% клеток в образце опухоли от субъекта с использованием способа обнаружения, идентифицирует указанный рак как вероятно реагирующий на анти-FOLR1 антитело или анти-FOLR1 иммуноконъюгат. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак яичников или рак легких.The invention also relates to a method for identifying a cancer as likely to be responsive to an anti-FOLR1 antibody or an anti-FOLR1 immunoconjugate, which includes: (a) bringing a biological sample containing said cancer cells into contact with an agent that binds the FOLR1 protein on the cell surface; (b) determining the binding of said agent that binds to the FOLR1 protein on the cell surface of the biological sample of step (a) using a detection method that distinguishes staining intensity and uniformity; and (c) assessing the binding indicated in step (b), wherein an assessment of FOLR1 staining intensity of 2 or more in at least 25% of the cells in a tumor sample from the subject using the detection method identifies said cancer as likely to respond to anti- FOLR1 antibody or anti-FOLR1 immunoconjugate. In some embodiments, the cancer is ovarian cancer or lung cancer.

Изобретение также относится к способу идентификации опухоли, чувствительной к терапии антиFOLR1 антителами или анти-FOLR1 иммуноконъюгатами, причем указанный способ включает: (а) измерение уровня экспрессии FOLR1 в образце опухолевой ткани, полученной из указанной опухоли, где указанное измерение включает использование способа обнаружения, различающего интенсивность или равномерность окрашивания в образце опухолевой ткани, экспрессирующей FOLR1 по сравнению с интенсивностью или равномерностью окрашивания одного или нескольких референсных образцов; (б) опThe invention also relates to a method for identifying a tumor sensitive to therapy with antiFOLR1 antibodies or anti-FOLR1 immunoconjugates, said method comprising: (a) measuring the expression level of FOLR1 in a tumor tissue sample obtained from said tumor, said measurement comprising using a detection method that distinguishes the intensity or uniformity of staining in a tumor tissue sample expressing FOLR1 compared to the intensity or uniformity of staining of one or more reference samples; (b) op

- 2 041061 ределение степени интенсивности окрашивания FOLR1 для указанного образца опухолевой ткани; и (в) сравнение интенсивности окрашивания FOLR1, определенной на этапе (б) с относительным значением, которое определяется путем измерения экспрессии белка FOLR1 в, по меньшей мере, одном контрольном образце, где указанный контрольный образец представляет собой ткань, клетки или клеточный конгломерат, который не чувствителен к терапии анти-FOLR1 антителами или анти-FOLR1 иммуноконъюгатами, и в котором интенсивность окрашивания FOLR1 указанного образца определена на этапе (б), и является более высокой, чем указанное относительное значение, идентифицирует данную опухоль как чувствительную к терапии анти-FOLR1 антителами или анти-FOLR1 иммуноконъюгатами. В некоторых вариантах воплощения обнаружение производится вручную или с помощью автоматизированной системы. В одном варианте воплощения способом обнаружения является ИГХ. В другом варианте воплощения используется откалиброванный способ ИГХ, при котором возможно различать различные уровни экспрессии FOLR1.- 2 041061 determination of the degree of intensity of staining FOLR1 for the specified sample of tumor tissue; and (c) comparing the intensity of FOLR1 staining determined in step (b) with a relative value, which is determined by measuring the expression of the FOLR1 protein in at least one control sample, where the specified control sample is a tissue, cells or cell conglomerate, which is not sensitive to anti-FOLR1 antibody therapy or anti-FOLR1 immunoconjugate therapy, and in which the FOLR1 staining intensity of the specified sample is determined in step (b), and is higher than the specified relative value, identifies this tumor as sensitive to anti-FOLR1 antibody therapy or anti-FOLR1 immunoconjugates. In some embodiments, detection is performed manually or by an automated system. In one embodiment, the detection method is IHC. In another embodiment, a calibrated IHC method is used in which it is possible to distinguish between different levels of FOLR1 expression.

Изобретение также относится к способу выявления экспрессии FOLR1 на клеточной поверхности раковых клеток образца опухолевой ткани индивидуума, где указанный способ включает: (а) получение образца опухолевой ткани, где образец клеток указанного рака зафиксирован в формалине и залит парафином; (б) контактирование указанного образца с антителом, которое специфически связывается связывает FOLR1 белок на поверхности клетки; (в) измерение степени связывания указанного в (б) антитела с указанным FOLR1 белком на поверхности клетки в указанном образце опухолевой ткани с помощью способа обнаружения, который может различать интенсивность или равномерность окрашивания при экспрессии FOLR1 в опухолевом образце по сравнению с интенсивностью или равномерностью окрашивания одного или нескольких референсных образцов; и (г) назначение уровня экспрессии FOLR1 указанному FOLR1 после сравнения уровня интенсивности или равномерности окрашивания клеточной поверхности FOLR1 в указанном образце опухолевой ткани с одним или более референсными образцами.The invention also relates to a method for detecting the expression of FOLR1 on the cell surface of cancer cells of a sample of tumor tissue of an individual, where this method includes: (a) obtaining a sample of tumor tissue, where the sample of said cancer cells is fixed in formalin and embedded in paraffin; (b) contacting said sample with an antibody that specifically binds to the FOLR1 protein on the cell surface; (c) measuring the degree of binding of an antibody in (b) to said FOLR1 protein on a cell surface in said tumor tissue sample using a detection method that can distinguish between the intensity or uniformity of staining when FOLR1 is expressed in the tumor sample compared to the intensity or uniformity of staining alone or several reference samples; and (d) assigning an expression level of FOLR1 to said FOLR1 after comparing the level of intensity or uniformity of FOLR1 cell surface staining in said tumor tissue sample to one or more reference samples.

Изобретение также относится к способу идентификации субъекта, страдающего от рака легких или рака яичников, способного ответить на режим терапии низкими дозами анти-FOLR1 антител или антиFOLR1 иммуноконъюгата, включающий: (а) контактирование биологического образца, включающего в себя клетки указанного рака яичников или легких с агентом, который связывается с FOLR1 белком на клеточной поверхности; (б) определение степени связывания указанного агента для указанного в (а) биологического образца; (в) назначения уровня связывания, указанного на стадии (б), при котором указанный уровень присваивается на основании сравнения с одним или несколькими референсными образцами; и (г) сравнение указанного на стадии (в) уровня с уровнем референсного образца ткани или клеток, при котором оценка для упомянутого уровня FOLR1 при раке яичников или легких больше оценки для нормального или пониженного уровня экспрессии FOLR1 референсного образца или оценка для упомянутого уровня FOLR1 при раке яичников или легких равняется или больше оценки для высокого уровня экспрессии FOLR1 референсного образца, что идентифицирует указанный рак яичников или легких, как способный ответить на низкие дозы анти-FOLR1 антител или анти-FOLR1 иммуноконъюгата. В некоторых вариантах воплощения способ дополнительно включает введение терапевтически эффективного количества гуманизированного анти-FOLR1 антитела или анти-FOLR1 иммуноконъюгата указанному субъекту.The invention also relates to a method for identifying a subject suffering from lung cancer or ovarian cancer capable of responding to a low dose anti-FOLR1 antibody or antiFOLR1 immunoconjugate therapy regimen comprising: (a) contacting a biological sample comprising cells of said ovarian or lung cancer with an agent that binds to the FOLR1 protein on the cell surface; (b) determining the degree of binding of the specified agent for specified in (a) biological sample; (c) assigning a binding level indicated in step (b), wherein said level is assigned based on comparison with one or more reference samples; and (d) comparing the level indicated in step (c) with that of a reference tissue or cell sample such that the score for said FOLR1 level in ovarian or lung cancer is greater than the score for normal or reduced FOLR1 expression in the reference sample, or the score for said FOLR1 level in ovarian or lung cancer is equal to or greater than the high FOLR1 expression score of the reference sample, which identifies said ovarian or lung cancer as capable of responding to low doses of anti-FOLR1 antibodies or anti-FOLR1 immunoconjugate. In some embodiments, the method further comprises administering a therapeutically effective amount of a humanized anti-FOLR1 antibody or anti-FOLR1 immunoconjugate to said subject.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Фиг. 1. Ручной способ окрашивания. Обнаружение экспрессии FOLR1 с помощью anti-FOLR1 антител в трансфицированных клетках. Клетки серии 300.19 были трансфицированы полинуклеотидом, кодирующим человеческий FOLR1. Экспрессия белка FOLR1 обнаруживалась с применением мышиного антитела BN3.2. Smith AE et al, Hybridoma (Larchmt). 2007 Oct;26(5):281-8.Fig. 1. Manual staining method. Detection of FOLR1 expression with anti-FOLR1 antibodies in transfected cells. 300.19 series cells were transfected with a polynucleotide encoding human FOLR1. Expression of the FOLR1 protein was detected using the mouse BN3.2 antibody. Smith AE et al, Hybridoma (Larchmt). 2007 Oct;26(5):281-8.

Фиг. 2. Ручной способ окрашивания. Используя anti-FOLR1 антитела можно выделить различные уровни экспрессии FOLR1. Антитело BN3.2 использовалось для обнаружения экспрессии FOLR1 в различных клетках ксенотрансплантата. Предел обнаружения для антитела BN3.2 составляет приблизительно 4000 антител, связанных с клеткой (САК).Fig. 2. Manual staining method. Using anti-FOLR1 antibodies, different levels of FOLR1 expression can be isolated. The BN3.2 antibody was used to detect FOLR1 expression in various xenograft cells. The detection limit for the BN3.2 antibody is approximately 4000 cell-associated antibodies (CAAs).

Фиг. 3. Ручной способ окрашивания. Используя anti-FOLR1 антитела можно выделить различные уровни экспрессии FOLR1 в образцах тканей. BN3.2 использовалось для обнаружения экспрессии FOLR1 в опухолях яичников (А) и опухолях не мелкоклеточного рака легких (В).Fig. 3. Manual staining method. Using anti-FOLR1 antibodies, different levels of FOLR1 expression in tissue samples can be isolated. BN3.2 has been used to detect FOLR1 expression in ovarian (A) and non-small cell lung cancer (B) tumors.

Фиг. 4. Ручной способ окрашивания. Равномерная экспрессия FOLR1 в опухолях НМРЛ и рака яичников. Экспрессия FOLR1 была высокой во многих образцах карциномы яичников, а также аденокарциномы легких и бронхиолоальвеолярной карциномы. Большинство образцов карциномы яичников показали самые высокие уровни интенсивности окрашивания серозных или эндометриоидных клеток. При исследовании НМРЛ самые высокие значения САК были обнаружены в образцах бронхиолоальвеолярной карциномы и папиллярной аденокарциномы.Fig. 4. Manual staining method. Uniform expression of FOLR1 in NSCLC and ovarian cancer tumors. FOLR1 expression was high in many ovarian carcinoma samples, as well as lung adenocarcinoma and bronchioloalveolar carcinoma. The majority of ovarian carcinoma specimens showed the highest levels of serous or endometrioid staining. In the study of NSCLC, the highest SAH values were found in samples of bronchioloalveolar carcinoma and papillary adenocarcinoma.

Фиг. 5. Ручной способ окрашивания. Экспрессия FOLR1, как правило, ограничивается мембраной клеток НМРЛ. Микроскопическое исследование с высоким разрешением показало, что окрашивание FOLR1 опухоли НМРЛ было ограничено преимущественно клеточными мембранами.Fig. 5. Manual staining method. FOLR1 expression is typically membrane-limited in NSCLC cells. High-resolution microscopic examination showed that FOLR1 staining of the NSCLC tumor was limited predominantly to cell membranes.

Фиг. 6. Ручной способ окрашивания. Экспрессия FOLR1, как правило, ограничивается мембраной клеток рака яичников. Микроскопическое исследование с высоким разрешением показало, что окрашиFig. 6. Manual staining method. FOLR1 expression is typically membrane-limited in ovarian cancer cells. High resolution microscopic examination showed that

- 3 041061 вание FOLR1 опухоли рака яичников было ограничено преимущественно клеточными мембранами.- 3 041061 FOLR1 ovarian cancer tumor activity was limited predominantly to cell membranes.

Фиг. 7. In vivo эффективность huMov19-таргетных конъюгатов в KB модели ксенотрансплантата. FOLR1-таргетированный расщепляемый конъюгат huMov19-SPDB-DM4 (В) по сравнению с He-FOLR1таргетированным huC242-SPDB-DM4 (D), и нерасщепляемым конъюгатом huMov19-PEG4-Mal-DM4 (С) по сравнению с нетаргетированным huC242-PEG4Mal-DM4 (E) были протестированы посредством установленной модели ксенотрансплантата KB клеток, подкожно имплантированных мышам с ТКИН (тяжёлой комбинированной иммунной недостаточностью). Таргетирование huMov19 по FOLR1 привело к значительному снижению среднего объема опухоли.Fig. 7. In vivo efficacy of huMov19-targeted conjugates in a KB xenograft model. FOLR1-targeted cleavable huMov19-SPDB-DM4 conjugate (B) versus He-FOLR1-targeted huC242-SPDB-DM4 (D), and non-cleavable huMov19-PEG4-Mal-DM4 conjugate (C) versus non-targeted huC242-PEG4Mal-DM4 (E) were tested in an established xenograft model of KB cells subcutaneously implanted in mice with SCID (severe combined immunodeficiency). FOLR1 targeting of huMov19 resulted in a significant reduction in mean tumor volume.

Фиг. 8. Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 терапии OVCAR-3 ксенотрансплантата карциномы яичников человека. Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ.Fig. 8. Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 therapy in OVCAR-3 human ovarian carcinoma xenograft. Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS.

Фиг. 9. Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 терапии IGROV-1 ксенотрансплантата карциномы яичников человека. Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ.Fig. 9. Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 therapy for IGROV-1 human ovarian carcinoma xenograft. Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS.

Фиг. 10. Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 терапии OV-90 ксенотрансплантата карциномы яичников человека. Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ.Fig. 10. Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 therapy in human ovarian carcinoma xenograft xenograft OV-90. Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS.

Фиг. 11. Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 терапии SKOV-3 ксенотрансплантата карциномы яичников человека. Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ.Fig. 11. Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 therapy for SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS.

Фиг. 12. Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 терапии KB ксенотрансплантата аденокарциномы шейки матки человека. Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,0, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ.Fig. 12. Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 therapy of KB xenograft of human cervical adenocarcinoma. Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.0, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS.

Фиг. 13. Автоматизированные способы окрашивания: типичные фотографии и гистограммы, показывающие экспрессию FOLR1 в клеточных линиях, определенную с помощью ИГХ и проточной цитометрии. Клетки линий SW620, T47D, Igrov-1, 300.19/FR1, HeLa и KB оценивались по интенсивности и равномерности окрашивания FOLR1. Степень и равномерность окрашивания клеток SW630 и IGROV-1 были оценены, как 1-3 неоднородная, T47D как 1-2 неоднородная, HeLa как 2-3 неоднородная, в то время как 300.19/FR1 и KB были оценены, как 3 однородная.Fig. 13. Automated staining methods: typical photographs and histograms showing FOLR1 expression in cell lines, determined by IHC and flow cytometry. SW620, T47D, Igrov-1, 300.19/FR1, HeLa, and KB cell lines were assessed by the intensity and uniformity of FOLR1 staining. The extent and uniformity of staining of SW630 and IGROV-1 cells were scored as 1-3 heterogeneous, T47D as 1-2 heterogeneous, HeLa as 2-3 heterogeneous, while 300.19/FR1 and KB were scored as 3 homogeneous.

Фиг. 14. Автоматизированные способы окрашивания: типичное окрашивание FOLR1 серозного рака яичников. Образцы показали степень и равномерность окрашивания такие, как 3 однородная, 2-3 однородная, 2 однородная и 2 неоднородная, установленные с помощью ИГХ на срезах ткани серозного рака яичников.Fig. 14. Automated staining methods: typical FOLR1 staining of serous ovarian cancer. The samples showed the degree and uniformity of staining, such as 3 homogeneous, 2-3 homogeneous, 2 homogeneous and 2 heterogeneous, established by IHC on tissue sections of serous ovarian cancer.

Фиг. 15. Автоматизированные способы окрашивания: типичное окрашивание FOLR1 эндометриоидного рака яичников. Образцы показали степень и равномерность окрашивания такие, как 3 однородная, 2-3 однородная, 3 фокальная и 1-2 неоднородная, установленные с помощью ИГХ на срезах ткани эндометриоидного рака.Fig. 15. Automated staining methods: typical FOLR1 staining of endometrioid ovarian cancer. The samples showed the degree and uniformity of staining, such as 3 homogeneous, 2-3 homogeneous, 3 focal and 1-2 heterogeneous, established by IHC on endometrioid cancer tissue sections.

Фиг. 16. Автоматизированные способы окрашивания: типичное окрашивание FOLR1 НМРЛ подтипа аденокарциномы (за исключением бронхиолоальвеолярной карциномы). Образцы показали степень и равномерность окрашивания, такие как 3 однородная, 2-3 однородная, 2 неоднородная, 2 однородная и 12 неоднородная, установленные с помощью ИГХ на срезах ткани немелкоклеточного рака легкого, подтипа аденокарциномы.Fig. 16. Automated staining methods: typical FOLR1 staining of NSCLC adenocarcinoma subtype (excluding bronchioloalveolar carcinoma). The samples showed the degree and uniformity of staining, such as 3 homogeneous, 2-3 homogeneous, 2 heterogeneous, 2 homogeneous and 12 heterogeneous, established by IHC on tissue sections of non-small cell lung cancer, a subtype of adenocarcinoma.

Фиг. 17. Автоматизированные способы окрашивания: типичное окрашивание FOLR1 аденокарциномы эндометрия. Образцы показали степень и равномерность окрашивания такие, как 3 неоднородная, 2 неоднородная и 1 неоднородная, установленные с помощью ИГХ на срезах ткани аденокарциномы эндометрия.Fig. 17. Automated staining methods: typical FOLR1 staining of endometrial adenocarcinoma. The samples showed the degree and uniformity of staining, such as 3 inhomogeneous, 2 inhomogeneous and 1 inhomogeneous, established by IHC on tissue sections of endometrial adenocarcinoma.

Фиг. 18. Автоматизированные способы окрашивания: типичное окрашивание FOLR1 почечноклеточной карциномы. Образцы показали степень и равномерность окрашивания такие, как 2 однородная, 2 неоднородная и 1 неоднородная, установленные с помощью ИГХ на срезах ткани почечноклеточного рака.Fig. 18. Automated staining methods: typical FOLR1 staining of renal cell carcinoma. The samples showed the degree and uniformity of staining, such as 2 homogeneous, 2 heterogeneous and 1 heterogeneous, established by IHC on sections of renal cell carcinoma tissue.

Фиг. 19. Цитотоксическая in vitro активность IMGN853. Пять FOLR1-положительных клеточных линий (KB, IGROV-1, JEG-3, SKOV-3 и OVCAR-3) и две FOLR1-отрицательные клеточные линии (Namalwa и SW2) анализировались на их чувствительность к цитотоксическим эффектам IMGN853. Клетки подвергали воздействию IMGN853 (сплошная линия) или IMGN853 плюс 0,5 мкМ неконъюгированного huMov19 (M9346A) (пунктирная линия) в течение 5 дней, а выживаемость клеток была определена с помощью анализа на основе WST-8. Показаны репрезентативные данные. Процент выживших клеток наносили на график по сравнению с десятичным логарифмом концентрации IMGN853.Fig. 19. In vitro cytotoxic activity of IMGN853. Five FOLR1 positive cell lines (KB, IGROV-1, JEG-3, SKOV-3 and OVCAR-3) and two FOLR1 negative cell lines (Namalwa and SW2) were analyzed for their sensitivity to the cytotoxic effects of IMGN853. Cells were exposed to IMGN853 (solid line) or IMGN853 plus 0.5 μM unconjugated huMov19 (M9346A) (dashed line) for 5 days, and cell survival was determined using a WST-8 based assay. Representative data shown. The percentage of surviving cells was plotted against the tenth logarithm of the IMGN853 concentration.

- 4 041061- 4 041061

Фиг. 20. Чувствительность FOLRl-положительных клеточных линий к IMGN853 против уровня экспрессии FOLR1. Эффективность и специфичность IMGN853 была проанализирована на FOLR1положительных клеточных линиях с широким спектром экспрессии FOLR1. Клеточные линии, инкубированые с IMGN853 и KB, Igrov-1 и Jeg-3 показали специфическую чувствительность к IMGN853, тогда как неконъюгированные huMov19 (M9346A) показали снижение активности конъюгата. Skov-3 и Ovcar-3 не были чувствительны к IMGN853 и неконъюгированные huMov19 (M9346A) не изменили активность конъюгата.Fig. 20. Sensitivity of FOLRl-positive cell lines to IMGN853 against the level of FOLR1 expression. The efficacy and specificity of IMGN853 was analyzed in FOLR1 positive cell lines with a wide spectrum of FOLR1 expression. Cell lines incubated with IMGN853 and KB, Igrov-1 and Jeg-3 showed specific sensitivity to IMGN853, while unconjugated huMov19 (M9346A) showed a decrease in conjugate activity. Skov-3 and Ovcar-3 were not sensitive to IMGN853 and unconjugated huMov19 (M9346A) did not change the activity of the conjugate.

Фиг. 21. Автоматизированные способы окрашивания: модели эффективности ксенотрансплантата карциномы яичников, окрашенные для FOLR1. Образцы показали степень и равномерность окрашивания такие, как 1-3 неоднородная (Ovcar 3), 1-3 однородная (Igrov 1), 1-2 неоднородная (Ov 90) и отрицательный результат (SKOV 3), установленные с помощью ИГХ на срезах ткани ксенотрансплантатов рака яичников.Fig. 21. Automated staining methods: ovarian carcinoma xenograft performance models stained for FOLR1. Samples showed the degree and uniformity of staining such as 1-3 heterogeneous (Ovcar 3), 1-3 homogeneous (Igrov 1), 1-2 heterogeneous (Ov 90) and negative (SKOV 3) as determined by IHC on tissue sections ovarian cancer xenografts.

Фиг. 22. Автоматизированные способы окрашивания: мышиные модели ксенотрансплантатов. Показаны образцы окрашивания для FOLR1 ксенотрансплантатов клеточных линий НМРЛ (А), карциномы эндометрия (В) и карциномы шейки матки (С). Образцы НМРЛ показали степень и равномерность окрашивания такие, как 2-3 однородная или 2 однородная, карциномы эндометрия 2 неоднородная/3 фокальная, рака шейки матки 3 однородная.Fig. 22. Automated staining methods: mouse models of xenografts. Staining patterns for FOLR1 xenografts from NSCLC cell lines (A), endometrial carcinoma (B), and cervical carcinoma (C) are shown. NSCLC samples showed the degree and uniformity of staining such as 2-3 homogeneous or 2 homogeneous, endometrial carcinoma 2 heterogeneous/3 focal, cervical cancer 3 homogeneous.

Фиг. 23. Руководство по автоматизированному окрашиванию контрольных образцов тканей. Окрашенные образцы, используемые для отрицательного (пищевод 0) и положительного контроля (слюнная железа 1-2 неоднородная, легкие 2 однородная, поджелудочная железа 3 однородная), показаны подготовленными для автоматизированной ИГХ.Fig. 23. Guidelines for automated staining of control tissue samples. Stained specimens used for negative (esophagus 0) and positive controls (salivary gland 1-2 heterogeneous, lung 2 homogeneous, pancreas 3 homogeneous) are shown prepared for automated IHC.

Фиг. 24. Руководство по автоматизированному окрашиванию опухолевых тканей. Типичные образцы окрашивания уровня 3, уровня 2 и уровня 1 показаны на контрольной ткани подготовленными для автоматизированной ИГХ.Fig. 24. Guidelines for automated staining of tumor tissues. Representative level 3, level 2 and level 1 stains are shown on control tissue prepared for automated IHC.

Фиг. 25. Руководство по автоматизированному окрашиванию опухолевых тканей. Типичные образцы окрашивания уровня 3, уровня 2 и уровня 1/отрицательного показаны на контрольной ткани подготовленными для автоматизированной ИГХ.Fig. 25. Guidelines for automated staining of tumor tissues. Representative level 3, level 2 and level 1/negative stains are shown on control tissue prepared for automated IHC.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности или вероятности ответа на лечение рака, характеризующегося избыточной экспрессией FOLR1. Настоящее изобретение основано на открытии существования динамического диапазона экспресии FOLR1 в опухолевой ткани и увеличения чувствительности опухоли с повышенным уровнем экспрессии FOLR1 к терапии анти-FOLR1 антителами или анти-FOLR1 иммуноконъюгатами. Нами также было обнаружены различия между автоматизированными и ручными способами анализа чувствительности и обнаружения динамических диапазонов. Дополнительно предусмотрены наборы, включающие один или более реагентов, используемых для практического воплощения способов по изобретению.The present invention relates to methods for improving the efficacy or likelihood of response to the treatment of cancer characterized by overexpression of FOLR1. The present invention is based on the discovery that there is a dynamic range of FOLR1 expression in tumor tissue and an increase in the sensitivity of a FOLR1 overexpressing tumor to therapy with anti-FOLR1 antibodies or anti-FOLR1 immunoconjugates. We also found differences between automated and manual sensitivity analysis and dynamic range detection. Additionally, kits are provided that include one or more reagents used to practice the methods of the invention.

I. ОпределенияI. Definitions

Для облегчения понимания сути настоящего изобретения, ниже определяется ряд терминов и выражений.To facilitate understanding of the essence of the present invention, a number of terms and expressions are defined below.

Термин рецептор фолиевой кислоты 1 человека или FOLR1, используемый в данном документе, относится к любому нативному человеческому FOLR1, если не указано иное. Термин FOLR1 относится к полноразмерным необработанным FOLR1, а также к любой форме FOLR1, полученной в результате процессинга внутри клетки. Термин также включает естественно встречающиеся варианты FOLR1, например сплайс-варианты, аллельные варианты и изоформы. Полипептиды FOLR1, описанные в данном документе, могут быть выделены из различных источников, например из человеческих тканей различных типов, или из другого источника, или получены с помощью рекомбинантных или синтетических способов. Примеры последовательностей FOLR1 включают, но не ограничиваются номерами NCBI P15328, NP_001092242.1, AAX29268.1, AAX37119.1,NP_057937.1 и NP_057936.1, и указаны в SEQ ID №: 1 и 2.The term human folic acid receptor 1 or FOLR1, as used herein, refers to any native human FOLR1 unless otherwise indicated. The term FOLR1 refers to full-length, unprocessed FOLR1, as well as any form of FOLR1 resulting from intracellular processing. The term also includes naturally occurring variants of FOLR1, such as splice variants, allelic variants, and isoforms. The FOLR1 polypeptides described herein may be isolated from various sources, such as from various types of human tissues or from another source, or obtained using recombinant or synthetic methods. Exemplary FOLR1 sequences include, but are not limited to, NCBI numbers P15328, NP_001092242.1, AAX29268.1, AAX37119.1, NP_057937.1 and NP_057936.1, and are listed in SEQ ID nos: 1 and 2.

Термин повышенная экспрессия FOLR1 относится к образцу, показывающему повышенные уровни экспрессии FOLR1. В одном примере экспрессия FOLR1 измеряется с помощью ИГХ и дается оценка интенсивности окрашивания или оценка равномерности окрашивания образца по сравнению с контрольной группой (например, откалиброванных образцов), путем использования определенных значений (например, тестовому образцу присваивается значение интенсивности 3, если интенсивность сравнима с уровнем 3 калиброванного образца или тестовому образцу присваивается значение интенсивности 2, если интенсивность сравнима с уровнем 2 калиброванного образца). Например, показатель 1, 2, 3 и 3+ или выше, определенный с помощью иммуногистохимии показывает повышенную экспрессию FOLR1. Равномерность окрашивания, которая может быть неоднородной или однородной, также свидетельствует о повышенной экспрессии FOLR1. Интенсивность окрашивания и оценки однородности окрашивания могут быть использованы отдельно или в комбинации (например, 2 однородная, 2 неоднородная, 3 однородная, 3 неоднородная и т.п.). В другом примере повышение экспрессии FOLR1 может быть определено путем обнаружения его увеличения по меньшей мере в 2 раза, или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз по сравнению с контрольными значениями (например, уровень экспрессии в тканиThe term overexpression of FOLR1 refers to a pattern showing elevated levels of FOLR1 expression. In one example, FOLR1 expression is measured by IHC and a staining intensity score or a sample uniformity of staining compared to a control group (e.g., calibrated samples) is given by using specific values (e.g., a test sample is assigned an intensity value of 3 if the intensity is comparable to the level 3 of the calibrated sample or the test sample is assigned an intensity value of 2 if the intensity is comparable to level 2 of the calibrated sample). For example, a score of 1, 2, 3 and 3+ or higher as determined by immunohistochemistry indicates increased expression of FOLR1. Evenness of staining, which may be heterogeneous or uniform, is also indicative of overexpression of FOLR1. Staining intensity and staining uniformity scores can be used alone or in combination (eg, 2 uniform, 2 heterogeneous, 3 uniform, 3 heterogeneous, etc.). In another example, an increase in FOLR1 expression can be determined by detecting an increase of at least 2-fold, or at least 3-fold, or at least 5-fold over control values (e.g., tissue expression level

- 5 041061 или клетке у субъекта без рака или имеющего рак, не вызывающий повышение значений FOLR1).- 5 041061 or a cell in a subject without cancer or having cancer that does not cause an increase in FOLR1 values).

Термин референсный образец может быть использован для корреляции и сравнения результатов, полученных от тестируемого образца при помощи способов, описанных в изобретении. Референсными образцами могут быть клетки (например, клеточные линии, конгломераты клеток) или ткани. Уровни FOLR1 в референсном образце могут показывать абсолютные или относительные значения, находиться внутри диапазона значений, принимать минимальное и/или максимальное значение, среднее значение и/или медианное значение FOLR1. Способы диагностики по изобретению включают сравнение уровней экспрессии FOLR1 в тестируемом образце с референтными значениями. В некоторых вариантах воплощения референтное значение соответствует уровню экспрессии FOLR1 в референсном образце. Референтное значение может быть заранее заданным значением, а также может быть определено из референсных образцов (например, контрольных биологических образцов), исследуемых параллельно с тестовыми образцами. Референтное значение может быть одним пороговым значением, например, медианным или средним, или диапазоном значений, таким, как доверительный интервал. Референтные значения могут быть установлены для различных подгрупп лиц, таких, как лица, предрасположенные к раку, лица, имеющие рак на ранних или поздних стадиях, лица мужского и/или женского пола либо лица во время прохождения антираковой терапии. Примеры нормальных референсных образцов или значений, и положительных референсных образцов или значений, описаны в данном документе.The term reference sample can be used to correlate and compare the results obtained from a test sample using the methods described in the invention. Reference samples can be cells (eg, cell lines, cell conglomerates) or tissues. FOLR1 levels in a reference sample can show absolute or relative values, be within a range of values, have a minimum and/or maximum value, an average value and/or a median value of FOLR1. The diagnostic methods of the invention include comparing FOLR1 expression levels in a test sample with reference values. In some embodiments, the reference value corresponds to the level of FOLR1 expression in the reference sample. The reference value may be a predetermined value, and may also be determined from reference samples (eg, control biological samples) tested in parallel with test samples. The reference value can be a single threshold value, such as the median or mean, or a range of values, such as a confidence interval. Reference values may be established for various subgroups of individuals, such as individuals at risk for cancer, individuals with early or advanced cancer, males and/or females, or individuals undergoing anti-cancer therapy. Examples of normal reference samples or values, and positive reference samples or values, are described in this document.

В некоторых вариантах воплощения референсный образец представляет собой образец здоровой ткани, в частности, соответствующей ткани, которая не поражена раковой опухолью. Этот тип референсных образцов называются образцами для отрицательного контроля. В других вариантах воплощения референсный образец представляет собой образец из опухолевой ткани, которая экспрессирует FOLR1. Этот тип референсных образцов называются образцами для положительного контроля. Образцы для положительного контроля также могут быть использованы в качестве индикатора сравнения для проверки однородности (неоднородная против однородной) и/или степени (1, 2, 3, 3+) интенсивности окрашивания, которая коррелирует с уровнем экспрессии FOLR1. Образцы для сравнительного положительного контроля также называют калиброванными референсными образцами, которые используются для определения динамического диапазона интенсивности или однородности окрашивания. Как показано в примерах 1-9, референсные образцы, не экспрессирующие FOLR1 включают в себя человеческие ткани пищевода; образцы с низким уровнем экспрессии FOLR1 включают ткани слюнной железы (в частности, промежуточных протоков) и легких (в частности дыхательного эпителия), образцы тканей с высоким уровнем экспрессии FOLR1 включают ткани поджелудочной железы (в частности, клетки протоков). Клеточные линии с низкой экспрессией включают, но не ограничиваются OVCAR3 и T47D, умеренной экспрессией включают, но не ограничиваются ими, SW620, IGROV-1, JEG3 и высокой экспрессией включают, но не ограничиваются ими, KB и IGROV1. Особенно желательными образцами для положительного контроля высокой экспрессии FOLR1 являются линии клеток, постоянно или временно трансфицированных фолатным рецептором 1 (например, 300.19/FR1). Соответствующие положительные и отрицательные контрольные уровни FOLR1 для конкретного вида рака могут быть определены путем измерения уровней FOLR1 у одного или нескольких соответствующих субъектов, и такие контрольные уровни могут быть привязаны к конкретным популяциям пациентов (например, контрольный уровень может соответствовать возрастной группе, так что сравнение может быть сделано между уровнями FOLR1 образцов, полученных от субъектов определенного возраста, и контрольными уровнями для конкретного типа заболевания, фенотипа или отсутствия таковых в определенной возрастной группе. Такие контрольные уровни могут быть привязаны к конкретным способам, используемым для измерения уровня FOLR1 в биологических образцах (например, иммунологическим и др. анализам), уровни FOLR1 может отличаться из-за специфической методики, на которой эти измерения базируются.In some embodiments, the reference sample is a sample of healthy tissue, in particular corresponding tissue that is not affected by a cancerous tumor. This type of reference sample is called a negative control sample. In other embodiments, the reference sample is a sample from tumor tissue that expresses FOLR1. This type of reference sample is called a positive control sample. Positive control samples can also be used as a comparison indicator to test for uniformity (heterogeneous vs. uniform) and/or degree (1, 2, 3, 3+) of staining intensity that correlates with the level of FOLR1 expression. Comparative positive control samples are also referred to as calibrated reference samples and are used to determine the dynamic range of intensity or color uniformity. As shown in examples 1-9, reference samples not expressing FOLR1 include human tissues of the esophagus; samples with low FOLR1 expression include tissues of the salivary gland (particularly the intermediate ducts) and lungs (particularly the respiratory epithelium), tissue samples with a high level of FOLR1 expression include pancreatic tissues (particularly ductal cells). Low expression cell lines include but are not limited to OVCAR3 and T47D, moderate expression include but are not limited to SW620, IGROV-1, JEG3 and high expression include but are not limited to KB and IGROV1. Particularly desirable samples for positive control of high FOLR1 expression are cell lines permanently or transiently transfected with folate receptor 1 (eg, 300.19/FR1). Appropriate positive and negative FOLR1 control levels for a particular cancer can be determined by measuring FOLR1 levels in one or more relevant subjects, and such control levels can be tied to specific patient populations (e.g., the control level can be age group-specific so that comparison can be made). be made between FOLR1 levels in samples obtained from subjects of a certain age and control levels for a particular disease type, phenotype, or absence in a particular age group.Such control levels can be tied to specific methods used to measure the level of FOLR1 in biological samples (for example , immunological, and other assays), FOLR1 levels may differ due to the specific methodology on which these measurements are based.

Термин первичное антитело относится к антителу, которое специфически связывается с антигеном белка-мишени в образце ткани. Первичное антитело, как правило, является первым антителом, используемым в процедуре иммуногистохимического (ИГХ) анализа. В одном варианте воплощения первичным антителом является единственное антитело, используемое в процедуре ИГХ. Термин вторичное антитело относится к антителу, которое специфически связывается с первичным антителом, образуя мостик между первичным антителом и последующим реагентом, если таковые имеются. Первичное антитело, как правило, является вторым антителом, используемым в процедуре иммуногистохимического анализа.The term primary antibody refers to an antibody that specifically binds to an antigen of a target protein in a tissue sample. The primary antibody is typically the first antibody used in an immunohistochemical (IHC) assay procedure. In one embodiment, the primary antibody is the only antibody used in the IHC procedure. The term secondary antibody refers to an antibody that specifically binds to a primary antibody, forming a bridge between the primary antibody and the subsequent reagent, if any. The primary antibody is usually the second antibody used in the immunohistochemical analysis procedure.

Образец или биологический образец по настоящему изобретению имеет биологическое происхождение в конкретных вариантах воплощения, полученный из эукариотических организмов. В предпочтительных вариантах воплощения образец представляет собой образец ткани человека, но в практике настоящего изобретения также могут быть использованы образцы ткани животного. Неограничивающие источники образцов для использования в настоящем изобретении включают, например, плотные ткани, аспираты, полученные при биопсии, асцитическую жидкость, жидкостные экстракты, кровь, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфоидную жидкость, внешние участки кожи, дыхательного, кишечного и мочеполового трактов, слезы, слюну, молоко, опухоли, органы, клеточные культуры и/или компоненты клеточной культуры.The sample or biological sample of the present invention is of biological origin, in specific embodiments, derived from eukaryotic organisms. In preferred embodiments, the sample is a human tissue sample, but animal tissue samples may also be used in the practice of the present invention. Non-limiting sample sources for use in the present invention include, for example, solid tissue, biopsy aspirates, ascitic fluid, fluid extracts, blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, lymphoid fluid, external skin, respiratory, intestinal, and genitourinary tracts, tears, saliva, milk, tumors, organs, cell cultures and/or cell culture components.

- 6 041061- 6 041061

Настоящее изобретение особенно эффективно для образцов раковой ткани, которые обычно включают образцы плотных тканей, или различных жидкостей организма, таких как асцитическая жидкость, где количество доступных материалов является небольшим. Данный способ может быть использован для изучения аспектов экспрессии FOLR1 или состояния образца, в том числе, но не ограничиваясь этим, сравнения различных типов клеток или тканей, сравнения различных стадий развития и обнаружения или определения присутствия и/или типа заболевания или аномалии.The present invention is particularly effective for cancer tissue samples, which typically include solid tissue samples, or various body fluids such as ascitic fluid, where the amount of materials available is small. This method can be used to study aspects of FOLR1 expression or condition of a sample, including, but not limited to, comparing different cell or tissue types, comparing different developmental stages, and detecting or determining the presence and/or type of a disease or anomaly.

Для целей данного изобретения, понятие срез образца ткани относится к единичной части или определенному количеству образца ткани, например, тонкому слою ткани или клеток, вырезанных из образца ткани. Следует понимать, что несколько срезов тканевых образцов могут быть получены и подвержены анализу в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых случаях выбранная часть или срез ткани состоит из однородной популяции клеток. В других случаях выбранная часть включает участок ткани, например, в качестве неограничивающего примера просвет. Выбранная часть может состоять из, например, одной клетки или двух клеток, или может представлять много тысяч клеток. В большинстве случаев процесс сбора клеток является важным, и в то время как изобретение описано для использования с целью детекции клеточных компонентов, способ также может быть использован для обнаружения не-клеточных компонентов организма (например, в качестве неограничивающего примера растворимых в крови компонентов).For the purposes of this invention, a section of a tissue sample refers to a single portion or quantity of a tissue sample, such as a thin layer of tissue or cells cut from a tissue sample. It should be understood that multiple sections of tissue samples can be obtained and analyzed in accordance with the present invention. In some cases, a selected portion or section of tissue consists of a homogeneous population of cells. In other cases, the selected portion includes an area of tissue, for example, as a non-limiting example, a lumen. The selected portion may consist of, for example, one cell or two cells, or may represent many thousands of cells. In most cases, the process of collecting cells is important, and while the invention is described for use in the detection of cellular components, the method can also be used to detect non-cellular components of the body (for example, as a non-limiting example of blood-soluble components).

Под коррелированием или корреляцией подразумевается сравнение, в любом случае, производительности и/или результатов первого анализа с производительностью и/или результатами второго анализа. Например, можно использовать результаты первого анализа при проведении второго анализа и/или можно использовать результаты первого анализа, чтобы определить, стоит ли проводить второй анализ и/или можно сравнивать результаты первого анализа с результатами второго анализа. В одном варианте воплощения повышенная экспрессия FOLR1 коррелирует с увеличением вероятности эффективности FOLR1-таргетированной противораковой терапии.By correlation or correlation is meant a comparison, in any case, of the performance and/or results of the first analysis with the performance and/or results of the second analysis. For example, you can use the results of the first analysis when conducting a second analysis and/or you can use the results of the first analysis to determine whether to conduct a second analysis and/or you can compare the results of the first analysis with the results of the second analysis. In one embodiment, increased expression of FOLR1 correlates with an increase in the likelihood of efficacy of FOLR1-targeted cancer therapy.

Термин антитело означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеуказанного через, по меньшей мере, один сайт распознавания антигена внутри вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в данном документе термин антитело включает в себя интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты), одноцепочечные Fv (ScFv) мутанты, мультиспецифические антитела, такие как биспецифические антитела, полученные из, по меньшей мере, двух интактных антител, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, составные белки, включающие часть антитела, определяющую антиген и любые другие модифицированные молекулы иммуноглобулина, включающие сайт распознавания антигена при условии, что антитела обладают ожидаемой биологической активностью. Антитело может принадлежать любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), базирующихся на идентичности их тяжелых цепей константных доменов, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов обладают различными и хорошо известными структурными субъединицами и трехмерными конфигурациями. Антитела могут быть открытыми или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и тому подобные.The term antibody means an immunoglobulin molecule that recognizes and specifically binds to a target such as a protein, polypeptide, peptide, carbohydrate, polynucleotide, lipid, or combinations of the foregoing, via at least one antigen recognition site within the variable region of the immunoglobulin molecule. As used herein, the term antibody includes intact polyclonal antibodies, intact monoclonal antibodies, antibody fragments (e.g., Fab, Fab', F(ab')2 and Fv fragments), single chain Fv (ScFv) mutants, multispecific antibodies such as bispecific antibodies derived from at least two intact antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, composite proteins comprising an antigen-defining portion of an antibody, and any other modified immunoglobulin molecule comprising an antigen recognition site, provided that the antibodies have expected biological activity. An antibody may belong to any of the five major immunoglobulin classes: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, or subclasses (isotypes) thereof (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) based on the identity of their constant domain heavy chains , called alpha, delta, epsilon, gamma, and mu, respectively. Different classes of immunoglobulins have different and well-known structural subunits and three-dimensional configurations. Antibodies may be open or conjugated to other molecules such as toxins, radioisotopes, and the like.

Блокирующее антитело или антитело-антагонист представляет собой антитело, которое ингибирует или уменьшает биологическую активность антигена, с которым оно связывается, например, FOLR1. В определенном варианте воплощения блокирующие антитела или антитела-антагонисты в значительной степени или полностью ингибируют биологическую активность антигена. Ожидаемая биологическая активность снижается на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%.A blocking or antagonist antibody is an antibody that inhibits or reduces the biological activity of the antigen to which it binds, eg FOLR1. In a certain embodiment, the blocking or antagonist antibodies substantially or completely inhibit the biological activity of the antigen. The expected biological activity is reduced by 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% or even 100%.

Термин анти-FOLR1 антитело или антитело, которое связывается FOLR1 относится к антителу, которое способно связывать FOLR1 с достаточной аффинностью. Данное антитело является эффективным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для прицельного воздействия на FOLR1. Степень связывания анти-FOLR1 антитела с неродственным, не FOLR1 белком составляет менее, чем приблизительно 10% от степени связывания антитела с FOLR1, например, измеренной с помощью радиоиммуноанализа (РИА). В некоторых вариантах воплощения антитело, которое связывается с FOLR1 имеет константу диссоциации (Kd) <1 мкМ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ или <0,1 нМ. Примеры анти-FOLRI антител известны в данной области и описаны в патенте США № 2012/0009181, включенном в данный документ посредством ссылки.The term anti-FOLR1 antibody or antibody that binds FOLR1 refers to an antibody that is capable of binding FOLR1 with sufficient affinity. This antibody is effective as a diagnostic and/or therapeutic agent for targeting FOLR1. The degree of binding of an anti-FOLR1 antibody to an unrelated, non-FOLR1 protein is less than about 10% of the degree of binding of the antibody to FOLR1, eg as measured by radioimmunoassay (RIA). In some embodiments, an antibody that binds to FOLR1 has a dissociation constant (Kd) of <1 μM, <100 nM, <10 nM, <1 nM, or <0.1 nM. Examples of anti-FOLRI antibodies are known in the art and are described in US Pat. No. 2012/0009181, incorporated herein by reference.

Термин фрагмент антитела обозначает часть интактного антитела и относится к антиген определяющим вариабельным регионам интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают, но не ограничиваются ими, Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты, линейные антитела, одноцепочечные антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.The term antibody fragment denotes a portion of an intact antibody and refers to the antigen defining variable regions of an intact antibody. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab')2 and Fv fragments, linear antibodies, single chain antibodies, and multispecific antibodies formed from antibody fragments.

Моноклональное антитело относится к однородной популяции антител, участвующих в высокоспецифическом распознавании и связывании с одной антигенной детерминантой или эпитопом. Этим они отличаются от поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направA monoclonal antibody refers to a homogeneous population of antibodies involved in highly specific recognition and binding to a single antigenic determinant or epitope. In this they differ from polyclonal antibodies, which usually include various antibodies aimed at

- 7 041061 ленные против различных антигенных детерминант. Термин моноклональное антитело включает интактные и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (ScFv), мутанты, составные белки, включающие части антител и любые другие модифицированные молекулы иммуноглобулина, включающие сайт распознавания антигена. Кроме того, понятие моноклональное антитело относится к антителам, полученным любым количеством способов, включая, но не ограничиваясь ими, использование гибридом, селекции фагов, рекомбинантной экспрессии и трансгенных животных.- 7 041061 against various antigenic determinants. The term monoclonal antibody includes intact and full-length monoclonal antibodies, as well as antibody fragments (e.g., Fab, Fab', F(ab')2, Fv), single chain (ScFv), mutants, compound proteins, including parts of antibodies, and any other modified molecules. immunoglobulin, including the antigen recognition site. In addition, the term monoclonal antibody refers to antibodies obtained by any number of methods, including, but not limited to, the use of hybridomas, phage selection, recombinant expression, and transgenic animals.

Термины эпитоп или антигенная детерминанта используются взаимозаменяемо и относятся к той части антигена, который может распознаваться и специфически связывается с конкретным антителом. Если антиген представляет собой полипептид, эпитопы могут быть сформированы из смежных и несмежных аминокислот сопоставлением при третичном складывании белка. Эпитопы, формируемые из смежных аминокислот, как правило, сохраняются при денатурации белка, тогда как эпитопы, образованные третичным складыванием обычно при денатурации белка теряются. Эпитоп обычно включает в себя по меньшей мере три, а чаще, по меньшей мере, 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.The terms epitope or antigenic determinant are used interchangeably and refer to that portion of an antigen that can be recognized and specifically binds to a particular antibody. If the antigen is a polypeptide, epitopes can be formed from contiguous and non-contiguous amino acids by matching in tertiary folding of the protein. Epitopes formed from contiguous amino acids are usually retained upon protein denaturation, while epitopes formed by tertiary folding are usually lost upon protein denaturation. An epitope usually includes at least three, and more often at least 5 or 8-10 amino acids in a unique spatial conformation.

Аффинность связывания обычно относится к интенсивности суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, при использовании в данном документе, понятие аффинность связывания относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X относительно своего партнера Y обычно может быть представлена с помощью константы диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена общими способами, известными в данной области техники, включая описанные в данном документе. Низкоаффинные антитела обычно связываются с антигеном медленно и, как правило, легко диссоциируют, тогда как антитела с высокой аффиностью обычно связываются с антигеном быстрее и, как правило, остаются связанными дольше. Различные способы измерения аффинности связывания хорошо известны в данной области техники, любой из них может быть использован для целей настоящего изобретения. Конкретные демонстративние варианты воплощения описаны далее.Binding affinity generally refers to the intensity of the sum of non-covalent interactions between one binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Unless otherwise indicated, as used herein, the term binding affinity refers to intrinsic binding affinity, which reflects a 1:1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). The affinity of a molecule X for its partner Y can usually be represented by the dissociation constant (Kd). Affinity can be measured by general methods known in the art, including those described herein. Low affinity antibodies generally bind antigen slowly and tend to dissociate easily, while high affinity antibodies generally bind antigen faster and tend to remain bound longer. Various methods for measuring binding affinity are well known in the art, any of which can be used for the purposes of the present invention. Specific exemplary embodiments are described below.

Или лучше при использовании в данном документе относится к обозначению аффинности связывания и относится к сильной связи между молекулой и ее партнером по связыванию. Или лучше при использовании в данном описании относится к сильной связи, представленной меньшим численным значением Kd. Например, в случае, когда антитело обладает сродством к антигену 0,6 нМ или лучше, сродство антитела к антигену составляет <0,6 нМ, т.е. 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ и т.д., или любое значение менее 0,6 нМ.Or better when used herein refers to the designation of binding affinity and refers to a strong bond between a molecule and its binding partner. Or, better when used herein, refers to a strong bond represented by a smaller Kd numerical value. For example, in the case where the antibody has an affinity for the antigen of 0.6 nM or better, the affinity of the antibody for the antigen is <0.6 nM, i. 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM, etc., or any value less than 0.6 nM.

Фраза по существу аналогичный или по существу такой же, при использовании в данном документе, обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (обычно одно связано с антителом по изобретению, другое связано с референсным антителом/антителом для сравнения), так что специалист в данной области техники должен учитывать разницу между двумя значениями, которая может быть малой или вообще не нести биологической и/или статистической значимости в контексте измерения указанных значений биологических характеристик (например, значения Kd). Разница между двумя указанными значениями составляет менее, чем приблизительно 50%, менее, чем приблизительно 40%, менее, чем приблизительно 30%, менее, чем приблизительно 20% или менее чем приблизительно 10% в зависимости от значения для референсного антитела/антитела для сравнения.The phrase substantially similar or substantially the same, as used herein, denotes a sufficiently high degree of similarity between two numerical values (usually one associated with an antibody of the invention, the other associated with a reference antibody/antibody for comparison) such that a person skilled in the art The technical field must take into account the difference between the two values, which may be of little or no biological and/or statistical significance in the context of measuring said biological characteristic values (eg, Kd values). The difference between these two values is less than about 50%, less than about 40%, less than about 30%, less than about 20%, or less than about 10%, depending on the value for the reference antibody/comparison antibody .

Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетки или композиции, которые являются выделенными, представляют собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетки или композиции, находящиеся в форме, которая не встречается в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают те, которые были очищены до такой степени, что далее они существуют в другой форме по сравнению с той, в которой они встречаются в природе. В некоторых вариантах воплощения выделенные антитело, полинуклеотид, вектор, клетки или композиции являются, по существу, чистыми.The polypeptide, antibody, polynucleotide, vector, cells, or compositions that are isolated are the polypeptide, antibody, polynucleotide, vector, cells, or compositions in a form that does not occur naturally. Isolated polypeptides, antibodies, polynucleotides, vectors, cells, or compositions include those that have been purified to the extent that they then exist in a different form from that in which they occur naturally. In some embodiments, the isolated antibody, polynucleotide, vector, cells, or compositions are substantially pure.

Используемый в данном документе термин по существу чистый относится к материалу, который по меньшей мере чистый на 50% (то есть без загрязнений), по меньшей мере чистый на 90%, по меньшей мере чистый на 95%, по меньшей мере чистый на 98% или по меньшей мере чистый на 99%.As used herein, the term substantially pure refers to material that is at least 50% pure (i.e., free of contaminants), at least 90% pure, at least 95% pure, at least 98% pure. or at least 99% pure.

Термин иммуноконъюгат или конъюгат, используемый в данном документе, относится к соединению или его производному, которое связано с агентом, связующимся с клеткой (например, антиFOLR1 антителу или его фрагменту) и определяется общей формулой C-L-A, где С = цитотоксин, L = линкер, и А = связующийся с клеткой агент или анти-FOLR1 антитело или фрагмент антитела. Иммуноконъюгаты также могут быть определены общей формулой в обратном порядке: A-L-C.The term immunoconjugate or conjugate as used herein refers to a compound or derivative thereof that is linked to a cell-binding agent (e.g., an antiFOLR1 antibody or fragment thereof) and is defined by the general formula C-L-A where C=cytotoxin, L=linker, and A = cell-binding agent or anti-FOLR1 antibody or antibody fragment. Immunoconjugates can also be defined by the general formula in reverse order: A-L-C.

Линкер означает любую химическую группу, которая способна связывать соединение, как правило, лекарственное средство, такое как майтанзиноид, с агентом, связывающимся с клеткой, таким как анти-FOLR1 антитело или его фрагмент, стабильным ковалентным способом. Линкеры могут быть чувствительными или быть практически устойчивыми к кислотно-индуцированному расщеплению, расщеплению, индуцированному светом, расщеплению, индуцированному пептидазой, расщеплению, индуциA linker means any chemical group that is capable of linking a compound, typically a drug, such as a maytansinoid, to a cell-binding agent, such as an anti-FOLR1 antibody or fragment thereof, in a stable covalent manner. Linkers can be sensitive or substantially resistant to acid-induced cleavage, light-induced cleavage, peptidase-induced cleavage, cleavage, induction

- 8 041061 рованному эстеразой и расщеплению дисульфидной связи, в условиях, при которых соединение или антитело остается активным. Подходящие линкеры хорошо известны в данной области техники и включают, например, дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотно-лабильные группы, фотолабильные группы, пептидазо-лабильные группы и эстеразо-лабильные группы. Линкеры также включают заряженные линкеры и их гидрофильные формы, известные в данной области техники, как описано выше.- 8 041061 esterase and disulfide bond cleavage, under conditions under which the compound or antibody remains active. Suitable linkers are well known in the art and include, for example, disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, photolabile groups, peptidase labile groups, and esterase labile groups. Linkers also include charged linkers and their hydrophilic forms known in the art, as described above.

Термины рак и раковый относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, в котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких, плоскоклеточный рак легкого, рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рака молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи.The terms cancer and cancerous refer to or describe a physiological condition in mammals in which a population of cells is characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, squamous cell lung cancer, abdominal cancer, hepatocellular cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer , liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver carcinoma, and various types of head and neck cancer.

Термины опухоль и новообразование относятся к любой массе ткани, которая в результате чрезмерного клеточного роста или пролиферации может быть как доброкачественной (нераковой), так и злокачественной (раковой), включая предраковые поражения тканей.The terms tumor and neoplasm refer to any mass of tissue that, as a result of excessive cell growth or proliferation, can be either benign (noncancerous) or malignant (cancerous), including precancerous tissue lesions.

Термины раковая клетка, клетка опухоли и их грамматические эквиваленты относятся к общей популяции клеток, полученных из опухоли или предраковых поражений, в том числе и неонкогенных клеток, которые составляют большую часть популяции опухолевых клеток, и онкогенных стволовых клеток (раковых стволовых клеток). Термин клетка опухоли, при использовании в данном документе, будет изменен на термин неонкогенный, когда речь идет лишь об опухолевых клетках, не способных к обновлению и дифференцированию, чтобы отличить эти опухолевые клетки от раковых стволовых клеток.The terms cancer cell, tumor cell and their grammatical equivalents refer to the general population of cells derived from a tumor or precancerous lesions, including both non-oncogenic cells, which make up the majority of the tumor cell population, and oncogenic stem cells (cancer stem cells). The term tumor cell, as used herein, will be changed to non-oncogenic when referring only to tumor cells that are not capable of renewal and differentiation to distinguish these tumor cells from cancer stem cells.

Термин субъект относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь ими, людей, приматов, кроме человека, грызунов и т.п., которое должно получить конкретное лечение. Как правило, термин субъект и пациент используются в данном документе взаимозаменяемо по отношению к субъекту-человеку.The term subject refers to any animal (eg, mammal), including, but not limited to, humans, non-human primates, rodents, and the like, that is to receive a particular treatment. Generally, the terms subject and patient are used interchangeably herein with respect to a human subject.

Назначение в сочетании с одного или более дополнительных терапевтических агентов включает в себя одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке.Administration in combination with one or more additional therapeutic agents includes simultaneous (joint) and sequential administration in any order.

Термин фармацевтическая композиция относится к препарату, который находится в форме, обеспечивающей биологическую активность действующего вещества для обеспечения его эффективности, и которая не включает дополнительных компонентов, являющихся неприемлемо токсичными для субъекта, которому должна быть введена композиция. Такая композиция может быть стерильной.The term pharmaceutical composition refers to a preparation that is in a form that provides the biological activity of the active substance to ensure its effectiveness, and which does not include additional components that are unacceptably toxic to the subject to whom the composition is to be administered. Such a composition may be sterile.

Эффективное количество антитела, как описано в данном документе, означает количество, достаточное для осуществления специфически заявленного предназначения. Эффективное количество может быть определено эмпирически и рутинным способом относительно заявленного предназначения.An effective amount of an antibody, as described herein, means an amount sufficient to carry out the specifically stated purpose. An effective amount can be determined empirically and in a routine manner with respect to the intended use.

Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству антитела или другого лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства у субъекта или млекопитающего. В случае рака, терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить число раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлить до некоторой степени и, в определенном варианте воплощения, остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлить до некоторой степени и, в определенном варианте воплощения, остановить) развитие метастазов опухоли; ингибировать, в некоторой степени, рост опухоли и/или облегчить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком. См. далее определение понятия лечение. В зависимости от способности препарата соответствующим образом предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, он может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. В некоторых вариантах воплощения определение повышенных уровнейThe term therapeutically effective amount refers to the amount of an antibody or other drug for the treatment of a disease or disorder in a subject or mammal. In the case of cancer, a therapeutically effective amount of the drug may reduce the number of cancer cells; reduce the size of the tumor; inhibit (ie, slow down to some extent and, in a certain embodiment, stop) the infiltration of cancer cells into peripheral organs; inhibit (ie, slow to some extent and, in a certain embodiment, stop) the development of tumor metastases; inhibit, to some extent, tumor growth; and/or alleviate, to some extent, one or more of the symptoms associated with the cancer. See below for a definition of treatment. Depending on the ability of the drug to appropriately prevent the growth and/or kill existing cancer cells, it may be cytostatic and/or cytotoxic. In some embodiments, the determination of elevated levels

FOLR1 дает возможность назначать пониженную дозу FOLR1-таргетной терапии для достижения такого же терапевтического эффекта, какой был бы при назначении более высоких доз. Количество, эффективное для профилактики относится к эффективному количеству, в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, но не обязательно, исходя из того, что профилактическая доза используется до начала заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.FOLR1 makes it possible to prescribe a lower dose of FOLR1-targeted therapy to achieve the same therapeutic effect as would be the case with higher doses. An amount effective for prophylaxis refers to an effective amount, in doses and for periods of time necessary to achieve the desired prophylactic result. Usually, but not necessarily, assuming that the prophylactic dose is used before the onset of the disease or at an early stage, the prophylactically effective amount will be less than the therapeutically effective amount.

Термин благоприятно реагировать обычно относится к вызыванию у субъекта благоприятного состояния. Что касается лечения рака, термин относится к обеспечению у субъекта терапевтического эффекта. Положительный терапевтический эффект при лечении рака может быть измерен несколькими способами (см. W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)). Для оценки терапевтической эффективности антираковой терапии могут быть использованы, например, оценка ингибирования роста опухоли, экспрессии молекулярных маркеров, экспрессии сывороточных маркеров и молекулярные способы визуализации. В отношении ингибирования роста опухоли, согласно стандартам NCI, значение соотношения Т/СThe term respond favorably generally refers to inducing a favorable state in the subject. With regard to the treatment of cancer, the term refers to providing a therapeutic effect in a subject. A positive therapeutic effect in the treatment of cancer can be measured in several ways (see W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)). To assess the therapeutic efficacy of anti-cancer therapy, for example, assessment of tumor growth inhibition, expression of molecular markers, expression of serum markers, and molecular imaging techniques can be used. With regard to tumor growth inhibition, according to NCI standards, the value of the T/C ratio

- 9 041061 <42% является минимальным уровнем противоопухолевой активности. Т/С <10% считается высоким уровнем противоопухолевой активности, при том, что формула определения Т/С выглядит, как: Т/С (%) = Медиана объема опухоли, подвергаемой терапии/Медиана объема опухоли, используемой для контроля х100.- 9 041061 <42% is the minimum level of antitumor activity. A T/C <10% is considered to have a high level of antitumor activity, with the formula for determining T/C being: T/C (%) = Median tumor volume treated/Median tumor volume used for control x100.

Термин метка, используемый в данном документе, относится к детектируемому соединению или композиции, конъюгированному с антителом непосредственно или опосредованно, таким образом, что образуется меченое антитело. Метка может обнаруживаться сама по себе (например, радиоизотопные или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическое изменение субстрата соединения или композиции, которое затем может быть обнаружено.The term label as used herein refers to a detectable compound or composition conjugated directly or indirectly to an antibody such that a labeled antibody is formed. The label may itself be detectable (eg, radioisotope or fluorescent labels) or, in the case of an enzymatic label, may catalyze a chemical change in the substrate of the compound or composition, which can then be detected.

Химиотерапевтическое средство представляет собой химическое соединение, используемое для лечения рака, независимо от его механизма действия. Классы химиотерапевтических средств включают, но не ограничиваются ими: алкилирующие агенты, антиметаболиты, растительные алкалоиды, блокирующие митотическое веретено, цитотоксические/противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, антитела, фотосенсибилизаторы и ингибиторы киназ. Химиотерапевтические средства включают соединения, используемые для таргетной терапии и традиционной химиотерапии.A chemotherapeutic agent is a chemical compound used to treat cancer, regardless of its mechanism of action. Classes of chemotherapeutic agents include, but are not limited to: alkylating agents, antimetabolites, plant alkaloids that block the mitotic spindle, cytotoxic/antineoplastic antibiotics, topoisomerase inhibitors, antibodies, photosensitizers, and kinase inhibitors. Chemotherapeutic agents include compounds used for targeted therapy and conventional chemotherapy.

Такие термины как терапия или лечение или лечить или облегчение состояния или облегчить состояние относятся к 1) терапевтическим мерам, позволяющим вылечить, замедлить развитие, уменьшить симптомы и/или остановить прогрессирование диагностированного патологического состояния или расстройства и 2) профилактическим или превентивным мерам, которые предотвращают и/или замедляют развитие возможного патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет расстройство; тех, кто склонны к расстройству и тех, у кого расстройства должны быть предотвращены. В некоторых вариантах воплощения субъект считается успешно вылеченным от рака в соответствии со способами по настоящему изобретению, если он демонстрирует одно или более из следующего: уменьшение кахексии, увеличение продолжительности жизни, удлинение времени до прогрессирования опухоли, снижение опухолевой массы, снижение опухолевой массы и/или продление отрезка времени до возникновения метастазов опухоли и времени до возникновения рецидива опухоли, ответ опухоли на лечение, полный ответ, частичный ответ, стабилизацию заболевания, устранение прогрессирования заболевания, выживаемость без прогрессирования заболевания (ВБП), общую выживаемость (ОВ); каждый из параметров оценен согласно стандартам, установленным Национальным институтом рака и Администрацией США по пищевым продуктам и лекарственным веществам для утверждения новых лекарств. См. Johnson et al, (2003) J. Clin. Oncol. 21(7): 14041411.Terms such as therapy or cure or treat or alleviate a condition or alleviate a condition refer to 1) therapeutic measures to cure, retard, reduce symptoms and/or stop the progression of a diagnosed condition or disorder and 2) prophylactic or preventive measures that prevent and /or slow down the development of a possible pathological condition or disorder. Thus, those in need of treatment include those who already have the disorder; those who are prone to the disorder and those whose disorders need to be prevented. In some embodiments, a subject is considered to have been successfully treated for cancer according to the methods of the present invention if they exhibit one or more of the following: reduction in cachexia, increase in survival, prolongation of time to tumor progression, reduction in tumor burden, reduction in tumor burden, and/or extension of time to tumor metastases and time to tumor recurrence, tumor response to treatment, complete response, partial response, disease stabilization, elimination of disease progression, progression-free survival (PFS), overall survival (OS); each of the parameters is evaluated according to the standards set by the National Cancer Institute and the US Food and Drug Administration for the approval of new drugs. See Johnson et al, (2003) J. Clin. oncol. 21(7): 14041411.

Выживаемость без прогрессирования (ВБП), также называемая временем до прогрессирования опухоли (ВДП) указывает продолжительность времени в течение лечения и после него, пока опухоль не растет. Выживаемость без прогрессирования заболевания включает в себя отрезок времени, за который пациенты испытывали полный или частичный ответ на лечение, а также отрезок времени, за который пациенты испытывали стабилизацию заболевания.Progression-free survival (PFS), also called time to tumor progression (TTP), indicates the length of time during and after treatment that the tumor does not grow. Progression-free survival includes the length of time patients experienced a complete or partial response to treatment, as well as the length of time patients experienced disease stabilization.

Период ремиссии (ПР) относится к отрезку времени в течение лечения и после него, на протяжении которого пациент не испытывает признаков заболевания.The period of remission (PR) refers to the length of time during and after treatment during which the patient does not experience signs of disease.

Общая выживаемость (ОВ) относится к продлению ожидаемой продолжительности жизни по сравнению с лицами или пациентами, не подвергнутыми какому-либо воздействию или лечению.Overall survival (OS) refers to the prolongation of life expectancy compared to individuals or patients not exposed to any intervention or treatment.

При использовании в настоящем описании изобретения и формуле изобретения формы единственного числа включают множественные формы, если из контекста явно не следует другое.When used in the present specification and claims, singular forms include plural forms unless the context clearly dictates otherwise.

Следует понимать, что описанный в настоящем варианте воплощения термин включающий, в аналогичных вариантах воплощения описывается в терминах состоящий из и/или по существу состоящий из.It should be understood that as described in the present embodiment, the term including, in similar embodiments, the embodiment is described in terms of consisting of and/or essentially consisting of.

Термин и/или, при использовании в фразе, такой как А и/или Б в данном описании, включают в себя А и Б, А или Б, А и Б. Аналогично, термин и/или, используемый в фразе типа А, Б и/или В предназначен для охвата каждого из следующих вариантов: А, Б и В; А, Б или В; А или В; А или Б; Б или В; А и В; А и Б, Б и В; А (отдельно), Б (отдельно) и В (отдельно).The term and/or, when used in a phrase such as A and/or B in this specification, includes A and B, A or B, A and B. Similarly, the term and/or used in a phrase like A, B and/or C is intended to cover each of the following: A, B, and C; A, B or C; A or B; A or B; B or C; A and B; A and B, B and C; A (separately), B (separately) and C (separately).

II. Биологические образцыII. biological samples

Биологические образцы часто фиксируют с помощью фиксатора. Для этой цели обычно используются альдегидные фиксаторы, такие как формалин (формальдегид) и глютаральдегид. Образцы тканей фиксируются посредством других способов фиксации, таких как погружение в спирт (Battifora и Kopinski, J. Histochem. Cytochem. (1986) 34:1095). Используемые образцы также могут быть залиты парафином. В одном варианте воплощения образцы ткани фиксируются в формалине и заливаются парафином (ФФЗП). В другом варианте воплощения блок ФФЗП окрашивается гематоксилином и эозином до выбора одной или более его частей для проведения анализа с целью выбора конкретной зоны (зон) образца ФФЗП. Способы подготовки блоков тканей из этих частей образцов использовались в предыдущих ИГХ исследованиях различных факторов прогноза и/или хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Abbondanzo et al., Am J Clin Pathol. 1990 May;93(5):698-702; Allred et al., Arch Surg. 1990 Jan; 125(1): 107-13).Biological samples are often fixed with a fixative. Aldehydic fixatives such as formalin (formaldehyde) and glutaraldehyde are commonly used for this purpose. Tissue samples are fixed by other fixation methods such as alcohol immersion (Battifora and Kopinski, J. Histochem. Cytochem. (1986) 34:1095). Samples used can also be embedded in paraffin. In one embodiment, tissue samples are fixed in formalin and embedded in paraffin (FFZP). In another embodiment, the FFZP block is stained with hematoxylin and eosin before selecting one or more of its parts for analysis in order to select a specific zone (zones) of the FFZP sample. Methods for preparing tissue blocks from these portions of samples have been used in previous IHC studies of various prognostic factors and/or are well known to those skilled in the art (see, for example, Abbondanzo et al., Am J Clin Pathol. 1990 May;93(5): 698-702; Allred et al., Arch Surg. 1990 Jan; 125(1): 107-13).

- 10 041061- 10 041061

Вкратце, все интактные органы или ткани могут быть разрезаны на достаточно мелкие образцы и выдержаны в различных фиксаторах (например, формалин, спирт и т.д.) в течение различных периодов времени, пока ткань не зафиксируется. Могут быть получены образцы практически любой интактной ткани, хирургически удаленной из организма. Образцы можно разрезать на относительно небольшие фрагменты, которые помещаются в оборудование, обычно используемое в гистопатологических лабораториях. Размер фрагментов образца обычно составляет от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров.Briefly, all intact organs or tissues can be cut into sufficiently small samples and kept in various fixatives (eg formalin, alcohol, etc.) for various periods of time until the tissue is fixed. Samples of almost any intact tissue surgically removed from the body can be obtained. Specimens can be cut into relatively small pieces that fit into equipment commonly used in histopathology laboratories. Sample fragments typically range in size from a few millimeters to several centimeters.

III. Конъюгаты детекторных антителIII. Detector antibody conjugates

Настоящее изобретение также относится к антителам против FOLR1, обычно моноклонального типа, которые связаны с, по меньшей мере, одним агентом с образованием конъюгата детекторного антитела. В целях повышения эффективности использования молекул антител в качестве диагностических их связывают обычной или ковалентной связью или образуют комплекс с, по меньшей мере, одной целевой молекулой или фрагментом. Такая молекула или фрагмент может являться, не ограничиваясь этим, по меньшей мере, одной репортерной группой. Репортерная группа определяется как любой фрагмент, который может быть обнаружен с помощью анализа. Неограничивающие примеры репортерных групп, конъюгированных с антителами включают ферменты, радиоактивные метки, гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцирующие молекулы, хемилюминесцентные молекулы, хромофоры, люминесцентные молекулы, молекулы, проявляющие фотоаффинность, окрашенные частицы и/или лиганды, такие как биотин.The present invention also relates to anti-FOLR1 antibodies, usually of the monoclonal type, which are coupled to at least one agent to form a detector antibody conjugate. In order to increase the effectiveness of the use of antibody molecules as diagnostics, they are bound by a conventional or covalent bond or form a complex with at least one target molecule or fragment. Such a molecule or fragment may be, but is not limited to, at least one reporter group. A reporter group is defined as any fragment that can be detected by analysis. Non-limiting examples of antibody-conjugated reporter groups include enzymes, radioactive labels, haptens, fluorescent labels, phosphorescent molecules, chemiluminescent molecules, chromophores, luminescent molecules, molecules exhibiting photoaffinity, colored particles, and/or ligands such as biotin.

Любой клеточно-связывающий агент (например, антитело или полипептид) с достаточной селективностью, специфичностью или аффинностью может быть использован в качестве основы для детектирования FOLR1 полипептида. Такие свойства агента могут быть оценены посредством общепринятых иммунологических скрининговых способов, известным специалистам в данной области техники. Сайты для связывания с биологически активными молекулами в молекуле антитела, в дополнение к каноническим антигенсвязывающим сайтам, включают сайты, которые могут связываться с антигеном, находящиеся в области вариабельного домена. Кроме того, вариабельный домен вовлечен в процесс самосвязывания антитела (Kang et al., 1988) и включает эпитопы (идиотопы), распознаваемые антиантителами (Kohler et al., 1989).Any cell binding agent (eg, antibody or polypeptide) with sufficient selectivity, specificity, or affinity can be used as a basis for detecting a FOLR1 polypeptide. Such agent properties can be assessed by conventional immunological screening methods known to those skilled in the art. Sites for binding to biologically active molecules in the antibody molecule, in addition to the canonical antigen-binding sites, include sites that can bind to an antigen located in the region of the variable domain. In addition, the variable domain is involved in the process of self-binding antibodies (Kang et al., 1988) and includes epitopes (idiotopes) recognized by anti-antibodies (Kohler et al., 1989).

Некоторые примеры конъюгатов, полученных при связывании с белками (например, антитела), включают конъюгаты, в которых агент, связывающий белок (например, антитело) связан с детектируемой меткой. Детектируемые метки являются соединениями и/или элементами, которые могут быть обнаружены благодаря их особым функциональным свойствам и/или химическим характеристикам, использование которых позволяет антителу, к которому они присоединены, быть обнаруженным и/или, при необходимости, количественно оцененным.Some examples of protein-coupled conjugates (eg, antibodies) include conjugates in which a protein-binding agent (eg, antibody) is linked to a detectable label. Detectable labels are compounds and/or elements that can be detected due to their specific functional properties and/or chemical characteristics, the use of which allows the antibody to which they are attached to be detected and/or, if necessary, quantified.

В данной области техники известно большое количество соответствующих визуализирующих агентов, как известны и способы их крепления к антителам (см., например, патенты США № № 5021236;. 4938948 и 4472509, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки). Например, в качестве визуализирующих фрагментов, могут быть использованы парамагнитные ионы; радиоактивные изотопы; флюорохромы; обнаруживаемые с помощью ЯМР вещества и/или вещества для визуализации с помощью рентгеновского излучения.A large number of suitable imaging agents are known in the art, as are methods for attaching them to antibodies (see, for example, US Pat. Nos. 5,021,236; For example, paramagnetic ions can be used as imaging fragments; radioactive isotopes; fluorochromes; NMR detectable substances and/or X-ray visualization substances.

Примеры флуоресцентных меток, предполагаемых для использования их как конъюгатов для связывания с белками (например, антителами), включают Alexa 350, Alexa 430, Alexa 488, АМСА, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Dylight 488, флуоресцеинизотиоцианат, зеленый флуоресцентный белок (GFP), HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, фикоэритрин, REG, родамин зеленый, родамин красный, тетраметилродамин (TMR), Renographin, ROX, TAMRA, TET, тетраметилродамин, Texas Red и производные этих меток (например, галогенированные аналоги, модифицированные изотиоцианатом или другим конъюгирующим линкером и т.д.). Примером радиоактивной метки является тритий.Examples of fluorescent labels contemplated for use as conjugates for binding to proteins (eg, antibodies) include Alexa 350, Alexa 430, Alexa 488, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Dylight 488, fluorescein isothiocyanate, green fluorescent protein (GFP), HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, Phycoerythrin, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Tetramethylrhodamine (TMR), Renographin, ROX, TAMRA, TET, Tetramethylrhodamine, Texas Red, and derivatives of these labels (e.g., halogenated analogues modified with isothiocyanate or other conjugating linker, etc. ). An example of a radioactive label is tritium.

Детектируемые конъюгаты, связывающиеся с белками (например, антитела), рассматриваемые в настоящем изобретении, включают предназначенные для использования in vitro, где антитело связано с вторично связанным лигандом и/или ферментом (ферментная метка), которые будут окрашивать продукт при контакте с хромогенным субстратом. Примеры подходящих ферментов включают уреазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу (хрена) и/или оксидазу глюкозы. Предпочтительными лигандами вторичного связывания являются соединения биотина и/или авидина и стрептавидина. Использование таких меток хорошо известно специалистам в данной области техники и описано, например, в патентах США №№ 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241, каждый из которых включен в данный документ в виде ссылки.Detectable protein-binding conjugates (e.g., antibodies) contemplated by the present invention include those intended for in vitro use, where the antibody is coupled to a secondarily bound ligand and/or enzyme (enzyme label) that will color the product upon contact with a chromogenic substrate. Examples of suitable enzymes include urease, alkaline phosphatase, peroxidase (horseradish) and/or glucose oxidase. Preferred secondary binding ligands are biotin and/or avidin and streptavidin compounds. The use of such labels is well known to those skilled in the art and is described, for example, in US Pat.

Молекулы, включающие азидогруппы, также могут быть использованы с образованием ковалентных связей с белками через реактивные нитреновые интермедиаты, которые генерируются ультрафиолетовым светом низкой интенсивности (Potter & Haley, 1983). В частности, 2- и 8-азидовые аналоги пуриновых нуклеотидов были использованы как сайт-ориентированные фотозонды для идентификации нукMolecules containing azido groups can also be used to form covalent bonds with proteins via reactive nitrene intermediates that are generated by low intensity ultraviolet light (Potter & Haley, 1983). In particular, 2- and 8-azide analogs of purine nucleotides have been used as site-directed photoprobes for the identification of nuclei.

- 11 041061 леотидных связывающих белков в сырых клеточных экстрактах (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- и 8-азидонуклеотиды также использовались для отображения нуклеотидных связывающих доменов очищенных белков (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989 и Dholakia et al., 1989) и могут быть использованы в качестве агентов связывания антител.- 11,041,061 leotide binding proteins in crude cell extracts (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- and 8-azidonucleotides have also been used to display the nucleotide binding domains of purified proteins (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989 and Dholakia et al., 1989) and can be used as antibody binding agents.

В данной области техники известны несколько способов присоединения или конъюгации антитела к его конъюгированному фрагменту. Некоторые из способов присоединения включают использование комплексов хелатов металлов посредством, например, органического хелатирующего агента, такого как ангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA); этилентриаминтетрауксусная кислота, Nхлор-р-толуолсульфонамид и/или тетрахлор-3а-6а-дифенилгликолурил-3, прикрепленного к антителу (патент США №№ 4472509 и 4938948, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки). Моноклональные антитела также могут быть подвергнуты взаимодействию с ферментом в присутствии связывающего агента, такого как глутаральдегид или периодат. Белок-связывающие конъюгаты (например, связывающие белок с антителом) с маркерами флуоресцеина готовят в присутствии этих сшивающих агентов или путем взаимодействия с изоцианатом. В патенте США № 4938948, визуализация опухолей молочной железы, например, достигается путем использования моноклональных антител, когда обнаруживаемые визуализационные фрагменты связаны с антителом посредством линкеров, таких как метил-р-гидроксибензимидат или N-сукцинимидил-3-(4-гидроксифенил)-пропионат. В других вариантах воплощения рассматривается дериватизация иммуноглобулинов путем избирательного введения сульфгидрильных групп в Fc регион иммуноглобулина посредством условий реакции, не изменяющих сайт антитела. Конъюгаты антител, полученные по описанной методике, демонстрируют улучшенную долговечность, специфичность и чувствительность (патент США № 5196066, включен в данный документ в виде ссылки). Сайт-специфическое крепление эффекторной или репортерной молекулы, при котором репортерная или эффекторная молекула конъюгирована с углеводным остатком в Fc регионе, также описано в литературе (O'Shannessy et al., 1987). В других вариантах воплощения изобретения иммуноглобулины помечены радиоактивными метками посредством нуклидов, таких как тритий. В дополнительных вариантах воплощения используются наночастицы золота (например, размером от приблизительно 0,5 нм до 40 нм) и/или квантовые точки (Hayward, Calif.).Several methods are known in the art for attaching or conjugating an antibody to its conjugated fragment. Some of the attachment methods include the use of metal chelate complexes via, for example, an organic chelating agent such as diethylenetriaminepentaacetic acid anhydride (DTPA); ethylenetriaminetetraacetic acid, Nchloro-p-toluenesulfonamide and/or tetrachloro-3a-6a-diphenylglycoluryl-3 attached to an antibody (US Pat. Nos. 4,472,509 and 4,938,948, each of which is incorporated herein by reference). Monoclonal antibodies can also be reacted with an enzyme in the presence of a binding agent such as glutaraldehyde or periodate. Protein-binding conjugates (eg, protein-antibody binding) with fluorescein markers are prepared in the presence of these crosslinkers or by reaction with an isocyanate. In US Pat. No. 4,938,948, imaging of breast tumors is, for example, achieved using monoclonal antibodies, where the detectable imaging fragments are linked to the antibody via linkers such as methyl p-hydroxybenzimidate or N-succinimidyl-3-(4-hydroxyphenyl)-propionate . In other embodiments, derivatization of immunoglobulins is contemplated by selectively introducing sulfhydryl groups into the Fc region of an immunoglobulin through reaction conditions that do not alter the antibody site. Antibody conjugates prepared according to the described procedure show improved durability, specificity, and sensitivity (US Pat. No. 5,196,066, incorporated herein by reference). Site-specific attachment of an effector or reporter molecule, in which the reporter or effector molecule is conjugated to a carbohydrate moiety in the Fc region, has also been described in the literature (O'Shannessy et al., 1987). In other embodiments, the immunoglobulins are radioactively labeled with nuclides such as tritium. In further embodiments, gold nanoparticles (eg, about 0.5 nm to 40 nm in size) and/or quantum dots (Hayward, Calif.) are used.

IV. Ферменты и субстраты (Chromagens)IV. Enzymes and Substrates (Chromagens)

Для обнаружения FOLR1 предполагается использование субстратов и индикаторов, таких как используемые в качестве примера в приводимых ниже вариантах воплощения. Пероксидаза хрена (HRP) является ферментом, который сначала образует комплекс с перекисью водорода, а затем приводит к его разложению, в результате чего выделяется вода и атомарный кислород. Как и со многими другими ферментами, HRP и HRP-подобная активности могут быть ингибированы избытком субстрата. Комплекс, образованный между HRP и избыточным количеством перекиси водорода каталитически неактивен и в отсутствии донора электронов (например хромогенного вещества) обратимо ингибирует. Это значит, что избыток перекиси водорода и отсутствие донора электронов приводит к гашению эндогенной активности HRP.For the detection of FOLR1, the use of substrates and indicators such as those used as an example in the following embodiments is contemplated. Horseradish peroxidase (HRP) is an enzyme that first forms a complex with hydrogen peroxide and then causes it to decompose, releasing water and atomic oxygen. As with many other enzymes, HRP and HRP-like activities can be inhibited by excess substrate. The complex formed between HRP and excess hydrogen peroxide is catalytically inactive and, in the absence of an electron donor (eg, a chromogenic substance), reversibly inhibits. This means that an excess of hydrogen peroxide and the absence of an electron donor leads to the quenching of endogenous HRP activity.

В аналитических системах HRP также может быть использована для преобразования определенного субстрата в его активированный хромоген, что приводит к изменению цвета. Фермент HRP может быть конъюгирован с антителом, белком, пептидом, полимером или другой молекулой посредством ряда способов. Такие способы известны специалистам в данной области техники. Добавление глутаральдегида в раствор, включающий смесь HRP и антител приведет к тому, что молекулы антитела будут больше конъюгированы друг с другом, чем с ферментом. В двухэтапной процедуре HRP в первую очередь реагирует с бифункциональными реагентами. На втором этапе с антителом смешивают только активированную HRP, что приводит к гораздо более эффективному мечению без полимеризации. HRP также конъюгирует со (стрепт)авидином посредством двухэтапной глутаральдегидной процедуры. Эта форма используется в процедурах, где субстратом, являються, например, LAB и LSAB. Конъюгация с биотином также состоит из двух этапов, так как биотин сначала должен быть получен в виде его производных -биотинилN-гидроксисукцинимидового эстера или биотингидразида, прежде чем он может быть подвергнут взаимодействию с эпсилонаминовыми группами фермента HRP. 3,3'-диаминобензидин (DAB) является субстратом для ферментов, таких как HRP, которые производят конечный продукт коричневого цвета, практически нерастворимый в этаноле и других органических растворителях. Окисление DAB также приводит к полимеризации, что приводит к способности его реагирования с тетраоксидом осмия и, таким образом, увеличению интенсивности окрашивания и электронной плотности. Из нескольких металлов и способов, используемых для повышения оптической плотности полимеризованного DAB наиболее эффективным, по-видимому, является использование хлорида золота в сочетании с сульфидом серебра.In analytical systems, HRP can also be used to convert a specific substrate to its activated chromogen, resulting in a color change. The HRP enzyme can be conjugated to an antibody, protein, peptide, polymer, or other molecule in a number of ways. Such methods are known to those skilled in the art. Adding glutaraldehyde to a solution containing a mixture of HRP and antibodies will cause the antibody molecules to be more conjugated to each other than to the enzyme. In a two-step procedure, HRP reacts first with bifunctional reagents. In the second step, only activated HRP is mixed with the antibody, resulting in much more efficient labeling without polymerization. HRP is also conjugated to (strept)avidin via a two step glutaraldehyde procedure. This form is used in procedures where the substrate is, for example, LAB and LSAB. Conjugation to biotin also consists of two steps, as biotin must first be prepared as its α-biotinyl N-hydroxysuccinimide ester or biotin hydrazide derivatives before it can be reacted with the epsilonamine groups of the HRP enzyme. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is a substrate for enzymes such as HRP, which produce a brown end product that is practically insoluble in ethanol and other organic solvents. Oxidation of DAB also results in polymerization, which results in its ability to react with osmium tetroxide and thus increase color intensity and electron density. Of the several metals and methods used to increase the absorbance of polymerized DAB, the most effective appears to be the use of gold chloride in combination with silver sulfide.

3-Амино-9-этилкарбазол (АЕС) является субстратом для ферментов, таких как HRP. Во время окисления он образует конечный продукт розово-красного цвета, растворимый в этаноле. Таким образом, образцы, обработанные АЕС не должны погружаться в спирт или спиртовые растворы (например, гематоксилин Харриса). Вместо этого должны использоваться водные контрастирующие и заливочные среды. АЕС, к сожалению, склонен к дальнейшему окислению, и при воздействии яркого света его интенсивность будет уменьшаться. Поэтому его рекомендуется хранить в темном месте.3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) is a substrate for enzymes such as HRP. During oxidation, it forms a pink-red end product, soluble in ethanol. Therefore, samples treated with AEC should not be immersed in alcohol or alcohol solutions (eg, Harris' hematoxylin). Instead, aqueous contrast and embedding media should be used. AEC is unfortunately prone to further oxidation and will decrease in intensity when exposed to bright light. Therefore, it is recommended to store it in a dark place.

4-Хлор-1-нафтол (CN) является субстратом для ферментов, таких как HRP и выпадает в осадок в4-Chloro-1-naphthol (CN) is a substrate for enzymes such as HRP and precipitates in

- 12 041061 виде конечного продукта синего цвета. Поскольку CN растворим в этаноле и других органических растворителях, образец не должен дегидратироваться, подвергаться контрастирующему окрашиванию с помощью этанола или заклеиванию покровными стёклами в заливочных средах, включающих органические растворители. В отличие от DAB, CN имеет тенденцию диффундировать от места осаждения. pФенилендиамина дигидрохлорид/пирокатехин (реактив Ханкера-Яте) является субстратом донора электронов для ферментов, таких как HRP и дает продукт реакции сине-черного цвета, нерастворимый в спирте и других органических растворителях. Как и полимеризованный DAB, данный продукт реакции может быть зафиксирован в растворе осмиевой кислоты. Различные результаты были достигнуты при использовании реактива Ханкера-Яте в иммунопероксидазных способах.- 12 041061 as a blue end product. Because CN is soluble in ethanol and other organic solvents, the specimen should not be dehydrated, counterstained with ethanol, or covered with coverslips in embedding media containing organic solvents. Unlike DAB, CN tends to diffuse away from the site of deposition. pPhenylenediamine dihydrochloride/pyrocatechol (Hanker-Yate reagent) is an electron donor substrate for enzymes such as HRP and produces a blue-black reaction product that is insoluble in alcohol and other organic solvents. Like polymerized DAB, this reaction product can be fixed in an osmic acid solution. Various results have been achieved using the Hunker-Yate reagent in immunoperoxidase methods.

Щелочная фосфатаза кишечника теленка (АР) (молекулярная масса 100 кДа) представляет собой фермент, который удаляет (путем гидролиза) и переносит фосфатные группы органических сложных эфиров путем разрыва связи Р-0; при этом кратковременно формируется промежуточная связь ферментсубстрат. Основными металлическими активирующими добавками для АР являются Mg++, Mn++ и Са++.Calf intestinal alkaline phosphatase (AP) (molecular weight 100 kDa) is an enzyme that removes (by hydrolysis) and transfers the phosphate groups of organic esters by cleavage of the P-0 bond; in this case, an intermediate enzyme-substrate bond is formed for a short time. The main metal activating additives for AR are Mg++, Mn++ and Ca++.

АР никогда широко не использовалась в иммуногистохимии до публикации процедуры посредством немеченной щелочной фосфатазы-антищелочной фосфатазы (АРААР). Растворимые иммунные комплексы, используемые в этой процедуре, имеют молекулярную массу приблизительно 560 кДа. Основным преимуществом АРААР процедуры по сравнению с РАР способом является отсутствие помех, связанных с активностью эндогенной пероксидазы. Из-за возможного отвлечения эндогенной активности пероксидазы на РАР окрашивание, техника АРААР рекомендуется для использования на мазках крови и костного мозга. Эндогенная активность щелочной фосфатазы, полученной из тканей костей, почек, печени и некоторых лейкоцитов может быть подавлена добавлением 1 мМ левамизола в раствор субстрата, хотя было установлено, что более эффективным является добавление 5 мМ. Кишечная щелочная фосфатаза должным образом не подавляется левамизолом.AP was never widely used in immunohistochemistry until the publication of the procedure by unlabeled alkaline phosphatase-antialkaline phosphatase (APAAP). The soluble immune complexes used in this procedure have a molecular weight of approximately 560 kDa. The main advantage of the APAAP procedure compared to the PAP method is the absence of interference associated with endogenous peroxidase activity. Because of the possible diversion of endogenous peroxidase activity to PAP staining, the APAAP technique is recommended for use on blood and bone marrow smears. Endogenous activity of alkaline phosphatase derived from bone, kidney, liver, and some leukocytes can be inhibited by adding 1 mM levamisole to the substrate solution, although 5 mM has been found to be more effective. Intestinal alkaline phosphatase is not adequately suppressed by levamisole.

В иммуногистохимическом способе окрашивания посредством щелочной фосфатазы, фермент гидролизует нафтоловые фосфатные эфиры (субстрат) до фенольных соединений и фосфатов. Фенолы контактируют с бесцветными солями диазония (хромоген) с получением нерастворимых цветных азокрасителей. Были успешно использованы несколько различных комбинаций субстратов и хромогенов.In the alkaline phosphatase immunohistochemical staining method, the enzyme hydrolyzes naphthol phosphate esters (substrate) to phenolic compounds and phosphates. Phenols are contacted with colorless diazonium salts (chromogen) to produce insoluble colored azo dyes. Several different combinations of substrates and chromogens have been successfully used.

Нафтол AS-MX-фосфат может быть использован в его кислотной форме или в виде натриевой соли. Хромогены Fast Red TR и Fast Blue BB производят ярко-красный или синий конечный продукт, соответственно. Оба растворимы в спиртовых и других органических растворителях, так что для их заливки должны использоваться среды на водной основе. Для окрашивания клеток мазков предпочтительным является Fast Red TR.Naphthol AS-MX-phosphate can be used in its acid form or as its sodium salt. Chromogens Fast Red TR and Fast Blue BB produce a bright red or blue end product, respectively. Both are soluble in alcohol and other organic solvents, so water-based media must be used for potting. For smear cell staining, Fast Red TR is preferred.

Дополнительные примеры субстратов включают нафтол AS-BI фосфат, нафтол AS-TR фосфат и 5бром-4-хлор-3-индоксил фосфат (BCIP). Другие возможные хромогены включают Fast Red LB, Fast Garnet GBC, Nitro Blue тетразол (NBT) иодонитротетразол Violet (INT) и производные структуры.Additional examples of substrates include naphthol AS-BI phosphate, naphthol AS-TR phosphate, and 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP). Other possible chromogens include Fast Red LB, Fast Garnet GBC, Nitro Blue tetrazole (NBT) iodonitrotetrazole Violet (INT) and derivative structures.

V. Иммунологические способыV. Immunological methods

В других вариантах воплощения настоящее изобретение относится к иммунологическим способам связывания, очистки, количественного удаления и/или иного обнаружения биологических компонентов, таких как лиганды, рассмотренным в настоящем изобретении. Антитела, полученные в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для обнаружения лигандов дикого типа и/или мутантов белков, полипептидов и/или пептидов. Как описано в настоящей публикации, предполагается использование лигандов дикого типа и/или мутантов специфических антител. Некоторые способы иммунодетекции включают проточную цитометрию, иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммуноанализ (РИА), иммунорадиометрический анализ, флуороиммуноанализ, хемилюминесцентный анализ, биолюминесцентный анализ и вестерн-блоттинг, здесь упомянуты некоторые из них. Этапы различных полезных иммунологических способов были описаны в научной литературе, такой как, например, Doolittle M H and Ben-Zeev О, Methods Mol Biol. 1999;109:215-37; Gulbis В и Galand P, Hum Pathol. 1993 Dec;24(12): 1271-85; и De Jager R et al., Semin Nucl Med. 1993 Apr;23(2): 165-79, каждый из которых включен в данный документ в виде ссылки.In other embodiments, the present invention relates to immunological methods for binding, purifying, quantitatively removing and/or otherwise detecting biological components, such as ligands, as contemplated in the present invention. Antibodies obtained in accordance with the present invention can be used to detect wild-type ligands and/or mutants of proteins, polypeptides and/or peptides. As described in this publication, the use of wild-type ligands and/or mutants of specific antibodies is contemplated. Some immunodetection methods include flow cytometry, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunoradiometric assay, fluoroimmunoassay, chemiluminescence assay, bioluminescence assay, and Western blotting, to name but a few. The steps of various useful immunological methods have been described in the scientific literature such as, for example, Doolittle M H and Ben-Zeev O, Methods Mol Biol. 1999;109:215-37; Gulbis B and Galand P, Hum Pathol. 1993 Dec;24(12): 1271-85; and De Jager R et al., Semin Nucl Med. 1993 Apr;23(2): 165-79, each of which is incorporated herein by reference.

В общем, способы иммунного связывания включают в себя получение образца, предположительно включающего лиганд белка, полипептида и/или пептида и контактирование образца с первым лигандсвязывающим пептидом (например, анти-лигандным антителом), в соответствии с настоящим изобретением, в зависимости от обстоятельств, в условиях, способствующих формированию иммунных комплексов.In general, immunobinding methods include obtaining a sample putatively containing a protein, polypeptide and/or peptide ligand and contacting the sample with a first ligand-binding peptide (e.g., an anti-ligand antibody) according to the present invention, as the case may be, in conditions conducive to the formation of immune complexes.

С точки зрения выявления антигена, анализируемым биологическим образцом может быть любой образец, который может включать лиганд дикого типа или мутантный лиганд белково-специфического антигена, например, срез ткани или образца, гомогенизированный экстракт ткани, аспират биопсии, клетку, выделенную и/или очищенную форму любой из вышеуказанных композиций дикого типа или мутантов, включающих FOLR1, или даже любую биологическую жидкость, которая находится в соприкосновении с тканью, в том числе кровь и/или сыворотку, хотя предпочтительными являются образцы или экстракты тканей.In terms of antigen detection, the biological sample analyzed can be any sample that can include a wild-type ligand or a mutant ligand of a protein-specific antigen, for example, a tissue or sample section, a homogenized tissue extract, a biopsy aspirate, a cell, an isolated and/or purified form any of the above wild-type or mutant compositions comprising FOLR1, or even any biological fluid that is in contact with tissue, including blood and/or serum, although tissue samples or extracts are preferred.

Контактирование выбранного биологического образца с антителом при соответствующих условияхContacting a selected biological sample with an antibody under appropriate conditions

- 13 041061 и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (первичных иммунных комплексов), как правило, состоит в простом добавлении композиции антител к образцу и выдерживанию смеси в течение достаточно долгого времени для того, чтобы антитела сформировали с ними иммунные комплексы, т. е. связались с любыми лигандами белка, включающего антигены. По истечении этого времени композиции образец-антитело, такие как срез ткани, ИФА планшет, устройство для дотблоттинга или вестерн-блоттинга, как правило, промывают, чтобы удалить любые виды неспецифически связанных антител, оставляя для обнаружения только антитела, специфически связанные с первичными иммунными комплексами.- 13 041061 and for a period of time sufficient for the formation of immune complexes (primary immune complexes), as a rule, consists in simply adding the antibody composition to the sample and keeping the mixture for a long enough time for the antibodies to form immune complexes with them, i.e., bound to any ligands of the protein containing the antigens. After this time, sample-antibody compositions such as tissue section, ELISA plate, dot blot or Western blot device are typically washed to remove any non-specifically bound antibodies, leaving only antibodies specifically bound to primary immune complexes to be detected. .

В целом, способы обнаружения образованных иммунокомплексов хорошо известны в данной области техники и могут выполняться с применением многочисленных подходов. Эти способы обычно основаны на обнаружении маркера или метки, такой как любая из радиоактивных, флуоресцентных, биологических и ферментативных меток. Использование таких меток описано, например, в патентах США №№ 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241, каждый из которых включен в данный документ в виде ссылки. Конечно, как известно в данной области техники, можно найти дополнительные преимущества за счет использования вторичного связывания лиганда, такие как расположение связывания лигандов с вторичными антителами и/или биотином/авидином.In general, methods for detecting formed immunocomplexes are well known in the art and can be performed using numerous approaches. These methods are typically based on the detection of a marker or label, such as any of the radioactive, fluorescent, biological, and enzymatic labels. The use of such labels is described, for example, in US Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; Of course, as is known in the art, additional advantages can be found through the use of secondary ligand binding, such as the location of ligand binding to secondary antibodies and/or biotin/avidin.

Антитела к антилиганду, используемые для обнаружения, сами могут быть связаны с детектируемой меткой, которую затем можно было бы просто обнаружить, таким образом позволяя определить количество первичных иммунных комплексов в композиции. В альтернативном варианте первое антитело, которое связывается с первичным иммунным комплексом может быть обнаружено с помощью второго связывающего агента, который обладает связывающей способностью к антителу. В этих случаях второй связывающий агент может быть связан с детектируемой меткой. Второй связывающий агент сам часто является антителом, которое, таким образом, может называется вторичным антителом или полимерной системой обнаружения. Первичные иммунные комплексы контактируют с меченным вторичным связующим агентом или системой обнаружения антитело/полимер при соответствующих условиях и в течение периода времени, достаточного для образования вторичных иммунных комплексов. Затем вторичные иммунные комплексы обычно подвергают промывке для удаления неспецифически связанных меченных вторичных антител или лигандов, а затем производят детекцию оставшихся на вторичных иммунных комплексах меток.The anti-ligand antibodies used for detection can themselves be linked to a detectable label, which can then be simply detected, thus allowing the amount of primary immune complexes in the composition to be quantified. Alternatively, the first antibody that binds to the primary immune complex can be detected by a second binding agent that has binding ability to the antibody. In these cases, the second binding agent may be associated with a detectable label. The second binding agent is often itself an antibody, which may thus be referred to as a secondary antibody or polymeric detection system. Primary immune complexes are contacted with a labeled secondary binding agent or antibody/polymer detection system under appropriate conditions and for a period of time sufficient to form secondary immune complexes. The secondary immune complexes are then usually washed to remove non-specifically bound labeled secondary antibodies or ligands, and then the remaining labels on the secondary immune complexes are detected.

Другие способы включают в себя обнаружение первичных иммунных комплексов в два этапа. Второй связывающий агент, такой как антитело, обладающее связывающей способностью к антителам, как описано выше, используется для образования вторичных иммунных комплексов. После промывки, вторичные иммунные комплексы контактируют с третьим связывающим агентом или антителом, обладающим связывающей способностью со вторым антителом, при таких же соответствующих условиях и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (третичных иммунных комплексов). Третий лиганд или антитело связано с детектируемой меткой, что позволяет производить обнаружение третичных иммунных комплексов таким же образом. При необходимости данная система может обеспечить амплификацию сигнала.Other methods include detection of primary immune complexes in two steps. A second binding agent, such as an antibody having antibody binding capacity as described above, is used to form secondary immune complexes. After washing, the secondary immune complexes are contacted with a third binding agent or antibody having a binding capacity to the second antibody under the same appropriate conditions and for a period of time sufficient to form immune complexes (tertiary immune complexes). The third ligand or antibody is associated with a detectable label, which allows the detection of tertiary immune complexes in the same way. If necessary, this system can provide signal amplification.

В другом варианте воплощения для обнаружения целевого антигена(ов) используются биотинилированные моноклональные или поликлональные антитела, и затем антитело на втором этапе используется для обнаружения биотина, прикрепленного к биотиновым комплексам. При использовании данного способа тестируемый образец сначала инкубируют в растворе, включающем антитела для первого этапа. Если присутствует антиген-мишень, некоторые из антител связывается с ним, чтобы сформировать биотинилированный комплекс антитело/антиген. Затем комплекс антитело/антиген амплифицируется путем инкубации в последовательных растворах стрептавидина (или авидина), биотинилированных ДНК и/или комплементарных биотинилированных ДНК, с добавлением на каждом этапе дополнительных биотиновых сайтов к комплексу антитело/антиген. Этапы амплификации повторяются, пока не будет достигнут соответствующий уровень амплификации, после чего образец инкубируют в растворе, включающем антитела против биотина для второго этапа. Это антитело второго этапа помечено, например, ферментом, который может быть использован для обнаружения присутствия комплекса антитело/антиген с помощью гистоэнзимологии посредством хромогенного субстрата. При соответствующей амплификации конъюгат связывания белков (например, с антителами) может производиться до макроскопической видимости.In another embodiment, biotinylated monoclonal or polyclonal antibodies are used to detect the target antigen(s) and the antibody is then used in a second step to detect biotin attached to the biotin complexes. When using this method, the test sample is first incubated in a solution containing antibodies for the first stage. If a target antigen is present, some of the antibodies bind to it to form a biotinylated antibody/antigen complex. The antibody/antigen complex is then amplified by incubation in successive solutions of streptavidin (or avidin), biotinylated DNA and/or complementary biotinylated DNA, with additional biotin sites added at each step to the antibody/antigen complex. The amplification steps are repeated until the appropriate level of amplification is reached, after which the sample is incubated in a solution containing anti-biotin antibodies for the second step. This second step antibody is labeled with, for example, an enzyme that can be used to detect the presence of an antibody/antigen complex by histoenzymology via a chromogenic substrate. With appropriate amplification, a protein binding conjugate (eg, with antibodies) can be produced to macroscopic visibility.

Другой известный способ иммунодетекции использует преимущества методологии иммуно-ПЦР (полимеразной цепной реакции). Способ ПЦР использует комплекс ДНК/биотин/стрептавидин/антитело, промываемый буфером с низким рН или высоким содержанием соли, что приводит к высвобождению антител. Затем результирующий промывочный раствор используют для проведения ПЦР-реакции с подходящими праймерами под соответствующим контролем. В конкретных вариантах воплощения огромные возможности амплификации и специфичности ПЦР могут быть использованы для обнаружения одной молекулы антигена. Такое обнаружение может происходить в режиме реального времени. Например, рассматривается использование количественной ПЦР реального времени.Another known immunodetection method takes advantage of the immuno-PCR (polymerase chain reaction) methodology. The PCR method uses a DNA/biotin/streptavidin/antibody complex washed with a low pH or high salt buffer, which results in the release of antibodies. The resulting wash solution is then used to carry out the PCR reaction with the appropriate primers under appropriate control. In specific embodiments, the tremendous amplification and specificity of PCR can be used to detect a single antigen molecule. Such detection can occur in real time. For example, the use of quantitative real-time PCR is considered.

При клинической диагностике и/или мониторинге больных с различными формами заболевания, обнаружение FOLR1 мутанта и/или изменений уровней FOLR1 по сравнению с уровнями в соответстIn clinical diagnosis and/or monitoring of patients with various forms of the disease, the detection of a FOLR1 mutant and/or changes in FOLR1 levels compared to levels corresponding to

- 14 041061 вующей биологической пробе нормального субъекта указывает на пациента с болезнью. Однако, как известно специалистам в данной области техники, клинический диагноз не обязательно может быть сделан на основе только данного способа. Специалистам в данной области техники хорошо знакомы существенные различиями в типах и/или количестве биомаркеров, которые используются для положительной идентификации и/или низкий уровень и/или изменения фонового уровня биомаркеров. Действительно, фоновые уровни экспрессии часто используются, чтобы сформировать уровень отсечения, превышение которого считается как значимое и/или положительное значение.- 14 041061 a biological sample from a normal subject indicates a patient with a disease. However, as is known to those skilled in the art, a clinical diagnosis may not necessarily be made based on this method alone. Those skilled in the art are well aware of the significant differences in the types and/or amount of biomarkers that are used for positive identification and/or low levels and/or changes in the background level of biomarkers. Indeed, background expression levels are often used to form a cut-off level above which is considered a significant and/or positive value.

В одном варианте воплощения обнаружение с помощью иммунологических способов (иммуногистохимии) FOLR1 оценивается по интенсивности и равномерности (процент окрашенных клеток - только мембраны). Сравнительная шкала интенсивности экспрессии FOLR1 устанавливается как 0 - отрицательная интенсивность, 0-1 - очень слабая, 1 - слабая, 1-2 - от слабой до умеренной, 2 - умеренная, 2-3 - от умеренной до сильной, 3 - сильная. Количественно, оценка 0 указывает на то, что окрашивание мембран опухолевых клеток не наблюдается. Оценка 1 указывает на слабое / едва заметное окрашивание мембран опухолевых клеток. Для оценки 2 в опухолевых клетках наблюдается умеренное окрашивание мембран. Наконец, оценка 3 или 3+ указывает на степень окрашивания мембран опухолевых клеток от умеренной до сильной. Образцы с оценкой экспрессии FOLR1 0 или 1 могут быть охарактеризованы, как образцы без гиперэкспрессии FOLR1, тогда как образцы с 2 или 3 баллами могут быть охарактеризованы, как образцы с гиперэкспрессией FOLR1. Образцы с гиперэкспрессией FOLR1 также могут быть классифицированы с помощью иммуногистохимической оценки, соответствующей числу копий молекулы FOLR1, экспрессированных клеткой и биохимически определенных: 0 = 0-10000 копий/клетку, 1 = по меньшей мере, около 200000 копий/клетку, 2 = по меньшей мере, около 500000 копий/клетку и 3 = по меньшей мере, около 2000000 копий/клетку. Сравнительные веса для FOLR1 процентов однородности окрашивания мембраны клетки коррелирует следующим образом: 0-отрицательная, фокальная (очаговая) - <25%, неоднородная (гетеро) - 25-75%, однородная (гомо) ->75%.In one embodiment, detection by immunological methods (immunohistochemistry) of FOLR1 is assessed by intensity and uniformity (percentage of stained cells - membranes only). The comparative scale of FOLR1 expression intensity is set as 0 - negative intensity, 0-1 - very weak, 1 - weak, 1-2 - weak to moderate, 2 - moderate, 2-3 - moderate to strong, 3 - strong. Quantitatively, a score of 0 indicates that no staining of tumor cell membranes is observed. A score of 1 indicates weak/slight staining of the tumor cell membranes. For score 2, moderate membrane staining is observed in tumor cells. Finally, a score of 3 or 3+ indicates moderate to strong staining of the tumor cell membranes. Samples with a FOLR1 expression score of 0 or 1 can be characterized as samples without FOLR1 overexpression, while samples with a score of 2 or 3 can be characterized as samples with FOLR1 overexpression. Samples overexpressing FOLR1 can also be classified by immunohistochemical score corresponding to the number of copies of the FOLR1 molecule expressed by the cell and biochemically determined: 0 = 0-10,000 copies/cell, 1 = at least about 200,000 copies/cell, 2 = at least at least about 500,000 copies/cell; and 3 = at least about 2,000,000 copies/cell. Comparative weights for FOLR1 percent homogeneity of cell membrane staining correlate as follows: 0-negative, focal (focal) - <25%, heterogeneous (hetero) - 25-75%, homogeneous (homo) -> 75%.

VI. Гибридизация нуклеиновых кислотVI. Hybridization of nucleic acids

In situ гибридизацию обычно проводят на клетках или срезах ткани, закрепленных на стеклах. In situ гибридизация может быть выполнена по нескольким стандартным методикам (см., например, Leitch et al. In situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v. 27 (1994)). В одной in situ процедуре флуоресцентные красители (такие как флуоресцеин изотиоцианат (FITC), который флуоресцирует зеленым свечением при возбуждении аргоновым ионным лазером) используются для обозначения зонда в виде последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеотидной последовательности-мишени в клетке. Каждая клетка, включающая нуклеотидную последовательность-мишень связывается меченным зондом, производящим флуоресцентный сигнал при воздействии на клетки источника света с длиной волны, подходящей для возбуждения специфических флуорохромов, используемых в зонде.In situ hybridization is usually carried out on cells or tissue sections mounted on slides. In situ hybridization can be performed according to several standard techniques (see, for example, Leitch et al. In situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v. 27 (1994)). In one in situ procedure, fluorescent dyes (such as fluorescein isothiocyanate (FITC), which fluoresces green when excited by an argon ion laser) are used to designate the probe as a nucleic acid sequence complementary to the target nucleotide sequence in the cell. Each cell containing the target nucleotide sequence is bound by a labeled probe that produces a fluorescent signal when the cells are exposed to a light source at a wavelength suitable to excite the specific fluorochromes used in the probe.

Могут быть использованы различные степени гибридизации. С повышением жесткости условий гибридизации повышается требуемая степень комплементарности между зондом и мишенью для формирования и поддержания стабильной дуплексной связи. Жесткость условий увеличивается при повышении температуры, снижении концентрации соли или увеличении концентрации формамида. Добавление сульфата декстрана или повышение его концентрации также может увеличить эффективную концентрацию меченного зонда, что увеличит скорость гибридизации и интенсивность конечного сигнала. После гибридизации стекла промывают в растворе, обычно включающем реагенты, сходные с применяемыми в растворе для гибридизации со временем промывки от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от требуемой жесткости. Более длительные или более строгие промывки обычно снижают неспецифические фоновые влияния, но при этом существует риск снижения общей чувствительности.Various degrees of hybridization may be used. With an increase in the stringency of the hybridization conditions, the required degree of complementarity between the probe and the target for the formation and maintenance of a stable duplex bond increases. The severity of conditions increases with increasing temperature, decreasing salt concentration or increasing the concentration of formamide. Adding dextran sulfate or increasing its concentration can also increase the effective concentration of the labeled probe, which will increase the rate of hybridization and the intensity of the final signal. After hybridization, the slides are washed in a solution typically containing reagents similar to those used in the hybridization solution with wash times ranging from several minutes to several hours, depending on the desired stringency. Longer or more stringent washes usually reduce non-specific background effects, but there is a risk of overall sensitivity being reduced.

Зонды, используемые в анализе гибридизации нуклеиновых кислот могут быть РНК или ДНК олигонуклеотидами или полинуклеотидами и могут включать не только природные нуклеотиды, но и их аналоги, такие как, например, дигоксигенин дЦТФ, биотин дЦТФ 7-азагуанозин, азидотимидин, инозин или уридин. Другие пригодные зонды включают, например, пептидные зонды и их аналоги, разветвленные ДНК-зонды, пептидометики, пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и/или антитела.The probes used in the nucleic acid hybridization assay may be RNA or DNA oligonucleotides or polynucleotides and may include not only natural nucleotides but also their analogs such as, for example, digoxigenin dCTP, biotin dCTP 7-azaguanosine, azidothymidine, inosine or uridine. Other suitable probes include, for example, peptide probes and analogs thereof, branched DNA probes, peptidometics, peptide nucleic acids (PNA) and/or antibodies.

Зонды должны обладать достаточной комплементарностью с целевой последовательностью нуклеиновых кислот, представляющей интерес, чтобы обеспечить стабильное и специфическое связывание между целевой последовательностью нуклеиновых кислот и зондом. Степень гомологии, необходимая для стабильной гибридизации, зависит от жесткости среды гибридизации и/или промывочной среды. В настоящем изобретении предпочтительным является использование полностью гомологичных зондов, но специалистам в данной области техники будет понятно, что зонды, показывающие меньшую, но достаточную гомологию также могут быть использованы в настоящем изобретении (см., например, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, Т., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)).Probes must have sufficient complementarity with the target nucleic acid sequence of interest to ensure stable and specific binding between the target nucleic acid sequence and the probe. The degree of homology required for stable hybridization depends on the stringency of the hybridization medium and/or wash medium. In the present invention, the use of fully homologous probes is preferred, but those skilled in the art will appreciate that probes showing less but sufficient homology may also be used in the present invention (see, for example, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)).

Зонды также могут быть образованы и выбраны несколькими способами, включая, но не ограничиваясь этим, отображение с помощью гибридизации in situ, панели гибридных соматических клеток или спот-блоттинг отсортированных хромосом; анализ хромосомальных связей; или клонирование и выделение из отсортированных хромосомных библиотек клеточных линий человека или гибридов соматическихProbes can also be generated and selected in a number of ways, including, but not limited to, display by in situ hybridization, hybrid somatic cell panels, or spot blotting of sorted chromosomes; analysis of chromosomal links; or cloning and isolation from sorted chromosomal libraries of human cell lines or somatic hybrids

- 15 041061 клеток с человеческими хромосомами, радиационных гибридов соматических клеток, микродиссекций хромосомных регионов или искусственных хромосом дрожжей (YACs) определяемых с помощью ПЦР с праймерами, специфичными к уникальным локусам хромосом или другого подходящего средства, такого как соседние YAC-клоны. Зонды могут представлять собой геномную ДНК, кДНК или РНК, клонированную в плазмиды, фаги, космиды, YAC, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), вирусные или любые другие подходящие векторы. Зонды могут быть клонированы или синтезированы химическим путем обычными способами. В случае клонирования, выделенные в качестве зонда фрагменты нуклеиновой кислоты обычно встраиваются в вектор, такой как лямбда фаг, pBR322, M13, или векторы, включающие SP6 или Т7 промотор и клонированные в виде библиотеки в бактерии-хозяине. [См., например, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, Т., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)].- 15,041,061 cells with human chromosomes, somatic cell radiation hybrids, microdissections of chromosomal regions, or yeast artificial chromosomes (YACs) as determined by PCR with primers specific to unique chromosome loci or other suitable means such as adjacent YAC clones. The probes can be genomic DNA, cDNA or RNA cloned into plasmids, phages, cosmids, YACs, bacterial artificial chromosomes (BACs), viral or any other suitable vectors. Probes can be cloned or chemically synthesized by conventional means. In the case of cloning, probe-isolated nucleic acid fragments are typically inserted into a vector such as lambda phage, pBR322, M13, or vectors comprising the SP6 or T7 promoter and cloned as a library in a host bacterium. [See, for example, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)].

Зонды предпочтительно помечать, например, с помощью флуорофоров. Примеры флуорофоров, включают, но не ограничиваются ими, хелаты редкоземельных металлов (хелаты европия), Texas Red, родамин, флуоресцеин, дансил, лиссамин, умбеллиферон, фикоэритрин, фикоцианин или доступные на рынке флуорофоры, такие, как SPECTRUM ORANGE™ и SPECTRUM GREEN™ и/или производные любого одного или более из вышеперечисленных. Несколько зондов, используемых для анализа могут быть помечены более чем одним различимым флуоресцентным или пигментным цветом. Эти различия цвета обеспечивают средства для идентификации позиций гибридизации специфических зондов. Кроме того, зонды, которые не разделены пространственно, можно идентифицировать по различным цветам свечения или пигментам в результате смешения двух других цветов (например, светло-красный+зеленый =желтый) пигмент (например, синий+желтый=зеленый) или с помощью набора фильтров, который пропускают свет только одного цветового оттенка.The probes are preferably labeled, for example, with fluorophores. Examples of fluorophores include, but are not limited to, rare earth metal chelates (europium chelates), Texas Red, rhodamine, fluorescein, dansyl, lyssamine, umbelliferone, phycoerythrin, phycocyanin, or commercially available fluorophores such as SPECTRUM ORANGE™ and SPECTRUM GREEN™ and/or derivatives of any one or more of the above. Multiple probes used for analysis may be labeled with more than one distinguishable fluorescent or pigment color. These color differences provide a means to identify hybridization positions of specific probes. In addition, probes that are not spatially separated can be identified by different luminous colors or pigments by mixing two other colors (e.g. light red+green=yellow) pigment (e.g. blue+yellow=green) or by using a set of filters , which transmit light of only one color shade.

Зонды можно помечать прямо или косвенно с помощью флуорофора посредством обычной методологии, известной специалистам в данной области техники.Probes can be labeled directly or indirectly with a fluorophore using conventional methodology known to those skilled in the art.

VII. Наборы и композиции для обнаруженияVII. Sets and compositions for detection

Кроме того, в изобретении предусмотрены наборы для использования в практике настоящего изобретения, как описано в данном документе. Такие наборы могут включать контейнеры, каждый из которых включает один или более различных реагентов (обычно в концентрированной форме), используемых в способах, в том числе, например, один или несколько связывающих агентов (антитела), которые уже прикреплены к маркеру или, необязательно, реагенты для соединения связывающего агента с антителом или молекулой нуклеиновой кислоты (также, как и сам маркер); буферные растворы соответствующих нуклеотидных трифосфатов (например, дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дУТФ, АТФ, СТР, GTP и UTP), обратную транскриптазу, ДНК-полимеразу, РНК-полимеразу, один или более специфический к последовательностям или вырожденный праймер, используемый при детекции молекул нуклеиновых кислот путем амплификации; и/или реагенты и оборудование для выделения (опционально, путем микродиссекции) для поддержки практического осуществления изобретения. Также в набор обычно бывают включены описание метки или индикатора, набор инструкций для использования компонентов набора в способе обнаружения лиганд по настоящему изобретению, где инструкции могут быть размещены на вкладыше и/или упаковке набора или его компонентов.In addition, the invention provides kits for use in the practice of the present invention, as described in this document. Such kits may include containers, each containing one or more different reagents (usually in concentrated form) used in the methods, including, for example, one or more binding agents (antibodies) that are already attached to the marker or, optionally, reagents for connecting the binding agent to the antibody or nucleic acid molecule (as well as the marker itself); appropriate nucleotide triphosphate buffers (e.g., dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, ATP, CTP, GTP, and UTP), reverse transcriptase, DNA polymerase, RNA polymerase, one or more sequence-specific or degenerate primers used in detection of nucleic acid molecules by amplification; and/or reagents and isolation equipment (optionally by microdissection) to support the practice of the invention. Also included in the kit is usually a description of the label or indicator, a set of instructions for using the kit components in the ligand detection method of the present invention, where the instructions may be placed on the insert and/or packaging of the kit or its components.

В других вариантах воплощения настоящее изобретение относится к наборам для иммунодетекции для использования с иммунологическими способами, описанными выше. В качестве антител для обнаружения белков дикого типа и/или мутантных белков, полипептидов и/или пептидов, как правило, используются антитела, предпочтительно включенные в комплект. Иммунологические наборы, таким образом, содержат в соответствующих контейнерах первое антитело, которое связывается с белком дикого типа и/или мутантным белком, полипептидом и/или пептидом и/или, необязательно, иммунологический реагент, и/или кроме того, необязательно, белок дикого типа и/или мутантный белок, полипептид и/или пептид.In other embodiments, the present invention provides immunodetection kits for use with the immunological methods described above. As antibodies for the detection of wild-type and/or mutant proteins, polypeptides and/or peptides, as a rule, antibodies are used, preferably included in the kit. Immunological kits thus contain, in appropriate containers, a first antibody that binds to a wild-type protein and/or a mutant protein, a polypeptide and/or a peptide and/or optionally an immunological reagent, and/or additionally, optionally, a wild-type protein and/or mutant protein, polypeptide and/or peptide.

Реагенты, входящие в состав иммунологического набора могут принимать любую форму, в том числе детектируемых меток, которые объединены и/или связаны с данным антителом. Рассматриваются также детектируемые метки, которые объединены и/или присоединены к вторичному связанному лиганду. Примерами вторичных лигандов являются вторичные антитела или полимеры, имеющие сродство к первому антителу.The reagents included in the immunological kit can take any form, including detectable labels that are combined and/or associated with this antibody. Also considered are detectable labels that are combined and/or attached to a secondary bound ligand. Examples of secondary ligands are secondary antibodies or polymers having an affinity for the first antibody.

Другие подходящие иммунологические реагенты для использования в настоящем наборы включают двухкомпонентные реагенты, которые включают вторичное антитело, обладающее связывающей способностью к первому антителу, вместе с третьим антителом или полимером, обладающим связывающей способностью к второму антителу. Третье антитело связано с детектируемой меткой. Как отмечалось выше, в данной области техники известен ряд типичных меток и/или все они могут быть соответствующим образом использованы в настоящем изобретении.Other suitable immunological reagents for use in the present kits include two-component reagents that include a secondary antibody that binds to the first antibody together with a third antibody or polymer that binds to the second antibody. The third antibody is associated with a detectable label. As noted above, a number of typical labels are known in the art and/or all of them can be appropriately used in the present invention.

Наборы могут также содержать соответствующие аликвотированные композиции белков дикого типа и/или мутантных белков, полипептиды и/или помеченные и/или непомеченные полипептиды, которые могут быть использованы для получения стандартной кривой для анализа обнаружения. Наборы могут содержать конъюгаты с антитело- или полимерными метками, либо в полностью конъюгированнойThe kits may also contain appropriate aliquoted compositions of wild-type and/or mutant proteins, polypeptides, and/or labeled and/or unlabeled polypeptides, which can be used to generate a standard curve for detection analysis. Kits may contain antibody- or polymer-labeled conjugates, or fully conjugated

- 16 041061 форме, в виде промежуточных соединений и/или в виде отдельных фрагментов для конъюгирования пользователем набора. Компоненты наборов могут быть помещены в водную среду и/или находиться в лиофилизированной форме.- 16 041061 form, in the form of intermediate compounds and / or in the form of separate fragments for conjugation by the user of the kit. The components of the kits may be placed in an aqueous medium and/or be in lyophilized form.

Контейнер, содержащий комплект обычно включает, по меньшей мере, один флакон, пробирки, колбы, сосуды, шприцы и/или другие емкости, в которые могут быть помещены антитела, и/или предпочтительно, соответствующим образом разделенные на аликвоты. Наборы по настоящему изобретению также обычно включают в себя емкость, содержащую антитела, антигены и/или любые другие контейнеры с реагентами в плотно закрытой упаковке для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать приспособление для инъекций и/или пластиковые контейнеры выдувного формования, в которых сохраняются требуемые флаконы.The container containing the kit typically includes at least one vial, tubes, flasks, vials, syringes, and/or other containers into which the antibodies can be placed, and/or preferably suitably aliquoted. The kits of the present invention also typically include a container containing antibodies, antigens, and/or any other reagent containers in a tightly closed package for commercial sale. Such containers may include an injection device and/or blow molded plastic containers in which the required vials are stored.

Наборы могут также включать один или более терапевтических агентов для лечения рака, таких как FOLR1 иммуноконъюгат и/или химиотерапевтическое средство.The kits may also include one or more cancer therapeutic agents such as a FOLR1 immunoconjugate and/or a chemotherapeutic agent.

Набор может дополнительно включать реагент для обнаружения FOLR1, используемый для измерения уровня экспрессии FOLR1 у субъекта, куда входит реагент для обнаружения FOLR1 и инструкция по применению. В одном варианте воплощения реагент для обнаружения FOLR1 включает FOLR1 связывающий пептид, белок или молекулярный зонд (например, нуклеиновую кислоту). В другом варианте воплощения реагент для обнаружения FOLR1 представляет собой анти-FOLR1 антитело. В другом варианте воплощения набор дополнительно включает вторичное антитело, которое связывается с антиFOLR1 антителом. В одном варианте воплощения используются специфические FOLR1 антитела в концентрации от 0,5 до 7,5 мкг/мл, предпочтительно от 0,9 до 3,8±0,5 мкг/мл. В другом варианте воплощения используются антитела в концентрации 1,0±0,5 мкг/мл, 1,5±0,5 мкг/мл, 1,9±0,5 мкг/мл, 2,5±0,5 мкг/мл, 3,0±0,5 мкг/мл, 3,5±0,5 мкг/мл, 3,8±0,5 мкг/мл или до 4,2 мкг/мл. В другом варианте воплощения антитело используется в концентрированном растворе с инструкциями для разведения для достижения конечной концентрации от 0,9 до 3,8±0,5 мкг/мл. В другом варианте воплощения изобретения набор дополнительно включает реагент для обнаружения, который выбран из группы, состоящей из фермента, флуорофора, радиоактивной метки и люминофора. В другом варианте воплощения реагент для обнаружения выбран из группы, состоящей из биотина, дигоксигенина, флуоресцеина, трития и родамина.The kit may further include a FOLR1 detection reagent used to measure the expression level of FOLR1 in a subject, which includes a FOLR1 detection reagent and instructions for use. In one embodiment, the FOLR1 detection reagent comprises a FOLR1 binding peptide, protein, or molecular probe (eg, nucleic acid). In another embodiment, the FOLR1 detection reagent is an anti-FOLR1 antibody. In another embodiment, the kit further includes a secondary antibody that binds to an antiFOLR1 antibody. In one embodiment, specific FOLR1 antibodies are used at a concentration of 0.5 to 7.5 µg/ml, preferably 0.9 to 3.8 ± 0.5 µg/ml. In another embodiment, antibodies are used at a concentration of 1.0 ± 0.5 μg / ml, 1.5 ± 0.5 μg / ml, 1.9 ± 0.5 μg / ml, 2.5 ± 0.5 μg / ml, 3.0±0.5 µg/ml, 3.5±0.5 µg/ml, 3.8±0.5 µg/ml or up to 4.2 µg/ml. In another embodiment, the antibody is used in a stock solution with dilution instructions to achieve a final concentration of 0.9 to 3.8±0.5 µg/mL. In another embodiment, the kit further includes a detection reagent that is selected from the group consisting of an enzyme, a fluorophore, a radioactive label, and a phosphor. In another embodiment, the detection reagent is selected from the group consisting of biotin, digoxigenin, fluorescein, tritium, and rhodamine.

Набор также может включать инструкции для обнаружения и оценки экспрессии FOLR1. Набор также может включать в себя контрольные или референсные образцы. Неограничивающие примеры контрольных или референсных образцов включают в себя конгломераты клеток или клеточных линий тканевой культуры, полученные из образцов нормальной ткани (нормальный контроль) или ткани опухоли (положительный контроль). Примеры клеточных линий включают KB, NCI-H2110, Igrov-1, Ishikawa, Jeg3, Skov-3, Hela, T47D, Caco2, Sw620, OAW28, HCC827, Ovcar-8 и Ovcar-3, Ov-90, другие линии опухолевых клеток с известной экспрессией FOLR1, и клеточные линии, которые постоянно или временно трансфицированы вектором экспрессии, экспрессирующим FOLR1. Дополнительные примеры тканей для положительного контроля приведены в примерах 9-11. Набор может также содержать руководство по окрашиванию, где визуально изображены положительные и нормальные референсные образцы интенсивности и однородности окрашивания. Такие руководства по окрашиванию могут содержать референсные образцы нормального легкого, поджелудочной железы и/или слюнной железы и окрашенные опухолевые ткани с унифицированными оценками (например, ткани опухоли яичников, легких, почек и эндометрия, как описано в примерах и показано на фиг. 23-25).The kit may also include instructions for detecting and assessing FOLR1 expression. The kit may also include control or reference samples. Non-limiting examples of control or reference samples include conglomerates of cells or tissue culture cell lines derived from samples of normal tissue (normal control) or tumor tissue (positive control). Example cell lines include KB, NCI-H2110, Igrov-1, Ishikawa, Jeg3, Skov-3, Hela, T47D, Caco2, Sw620, OAW28, HCC827, Ovcar-8 and Ovcar-3, Ov-90, other tumor cell lines known to express FOLR1, and cell lines that are permanently or transiently transfected with an expression vector expressing FOLR1. Additional examples of positive control tissues are provided in Examples 9-11. The kit may also contain a staining guide that visually depicts positive and normal reference samples for stain intensity and uniformity. Such staining guides may contain normal lung, pancreas, and/or salivary gland reference samples and stained tumor tissues with unified scores (e.g., ovarian, lung, kidney, and endometrial tumor tissues as described in the examples and shown in Figures 23-25 ).

VIII. FOLR1 связующие агентыVIII. FOLR1 coupling agents

Любые антитела, связывающие FOLR1 могут быть использованы для способов обнаружения в настоящем изобретении. Примеры терапевтически эффективных анти-FOLR1 антител можно найти в заявке на патент США № 2012/0009181, включенной в данный документ посредством ссылки. Полноразмерная аминокислотная (аа) и нуклеотидная (nt) последовательности для FOLR1 известны в этой области техники и представлены в данном документе в виде SEQ ID №№ 1 и 2 соответственно. Особенно эффективным антителом для обнаружения FOLR1 является мышиное моноклональное антитело антиhuFOLR1, клон BN3.2 (Leica # NCL-L-FRalpha). Примером терапевтически эффективного анти-FOLR1 антитела является huMov19 (M9346A). Полипептидные последовательности SEQ ID №№: 3-5 включают вариабельный домен тяжелой цепи huMov19 (M9346A), вариабельный домен легкой цепи версии 1.00 и вариабельный домен легкой цепи, версия 1.60 для huMov19 соответственно. В некоторых вариантах воплощения huMov19 (M9346A) антитела, кодируемые плазмидами, депонированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС), расположенной по адресу: 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 от 7 апреля 2010 г. в соответствии с условиями Будапештского договора, и имеют АТСС депозитные номера РТА-10772 и РТА-10773 или 10774. Примеры FOLR1 иммуноконъюгатов, используемых в терапевтических способах по изобретению приведены ниже.Any antibodies that bind FOLR1 can be used for the detection methods of the present invention. Examples of therapeutically effective anti-FOLR1 antibodies can be found in US Patent Application No. 2012/0009181, incorporated herein by reference. The full length amino acid (aa) and nucleotide (nt) sequences for FOLR1 are known in the art and are presented herein as SEQ ID Nos. 1 and 2, respectively. A particularly effective antibody for detecting FOLR1 is the mouse antihuFOLR1 monoclonal antibody, clone BN3.2 (Leica # NCL-L-FRalpha). An example of a therapeutically effective anti-FOLR1 antibody is huMov19 (M9346A). The polypeptide sequences of SEQ ID NOs: 3-5 comprise huMov19 heavy chain variable domain (M9346A), light chain variable domain version 1.00, and light chain variable domain version 1.60 for huMov19, respectively. In some embodiments, huMov19 (M9346A) plasmid-encoded antibodies are deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) located at 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 on April 7, 2010 under the terms of the Budapest Treaty, and have ATCC deposit numbers PTA-10772 and PTA-10773 or 10774. Examples of FOLR1 immunoconjugates used in the therapeutic methods of the invention are given below.

IX. FOLR1 иммуноконъюгатыIX. FOLR1 immunoconjugates

Настоящее изобретение также относится к способам повышения эффективности конъюгатов (также упоминаемых в данном документе как иммуноконъюгаты), включающих анти-FOLR1 антитела, фрагменты антител, функциональные эквиваленты, улучшенные антитела и их аспекты, как описано в данномThe present invention also relates to methods for improving the effectiveness of conjugates (also referred to herein as immunoconjugates), including anti-FOLR1 antibodies, antibody fragments, functional equivalents, improved antibodies, and aspects thereof, as described herein.

- 17 041061 документе, связанные или конъюгированные с цитотоксином (лекарством) или пролекарством. Примеры иммуноконъюгатов FOLR1 можно найти в заявке на патент США № 2012/0009181, включенной в данный документ посредством ссылки. В частности, эффективные терапевтические иммуноконъюгаты, согласно изобретению, включают антитело huMov19, описанное выше.- 17 041061 document associated or conjugated with a cytotoxin (drug) or prodrug. Examples of FOLR1 immunoconjugates can be found in US Patent Application No. 2012/0009181, incorporated herein by reference. In particular, effective therapeutic immunoconjugates according to the invention include the huMov19 antibody described above.

Подходящие лекарства или пролекарства хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения лекарства или пролекарства являются цитотоксическими агентами. Цитотоксический агент, используемый в составе цитотоксического конъюгата по настоящему изобретению может быть любым соединением, которое приводит к гибели клетки, или индуцирует гибель клеток, или каким-либо образом уменьшает жизнеспособность клеток и включает, например, майтанзиноиды и их аналоги, бензодиазепины, таксоиды, СС-1065 и аналоги СС-1065, дуокармицины и их аналоги, энедийны, например калихеамицины, доластатин и его аналоги, включая ауристатины, производные томаймицина, производные лептомицина, метотрексат, цисплатин, карбоплатин, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мельфалан, митомицин С, хлорамбуцил и морфолинодоксорубицин. В некоторых вариантах воплощения цитостатические агенты представляют собой майтанзиноиды и аналоги майтанзиноидов.Suitable drugs or prodrugs are well known to those skilled in the art. In some embodiments, the drugs or prodrugs are cytotoxic agents. The cytotoxic agent used in the composition of the cytotoxic conjugate of the present invention may be any compound that causes cell death, or induces cell death, or in any way reduces cell viability, and includes, for example, maytansinoids and their analogs, benzodiazepines, taxoids, CC -1065 and CC-1065 analogs, duocarmycins and analogs thereof, enediines, e.g. calicheamicins, dolastatin and its analogs, including auristatins, tomaimycin derivatives, leptomycin derivatives, methotrexate, cisplatin, carboplatin, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinblastine, melphalan, mitomycin C , chlorambucil and morpholinodoxorubicin. In some embodiments, the cytostatic agents are maytansinoids and maytansinoid analogs.

Лекарственное средство или пролекарство может быть связано, например, с анти-FOLR1 антителом, таким как huMov19 или его фрагмент посредством дисульфидной связи. Линкерная молекула или сшивающий агент включает реакционноспособную группу химических веществ, которые могут реагировать с анти-FOLR1 антителом или его фрагментом. В некоторых вариантах воплощения реакционноспособными группами химических веществ, способных реагировать с клеточно-связывающим агентом являются N-сукцинимидиловые эстеры и N-сульфосукцинимидиловые эстеры. Кроме того, линкерная молекула включает реакционноспособную группу химических веществ, в некоторых вариантах воплощения дитиопиридильную группу, которая может реагировать с лекарственным средством с образованием дисульфидной связи. В определенных вариантах воплощения линкерные молекулы включают, например, N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см., например, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB) (см., например, патент США № 4563304), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио) 2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB) (см. публикацию США № 20090274713), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио) пентаноат (SPP) (см., например, регистрационный номер CAS 341498-08-6), 2-иминотиолан или ангидрид ацетилянтарной кислоты.The drug or prodrug may be linked, for example, to an anti-FOLR1 antibody such as huMov19 or a fragment thereof via a disulfide bond. The linker molecule or crosslinker includes a reactive group of chemicals that can react with an anti-FOLR1 antibody or fragment thereof. In some embodiments, the reactive chemical groups capable of reacting with the cell-binding agent are N-succinimidyl esters and N-sulfosuccinimidyl esters. In addition, the linker molecule includes a reactive group of chemicals, in some embodiments, a dithiopyridyl group, which can react with a drug to form a disulfide bond. In certain embodiments, the linker molecules include, for example, N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP) (see, for example, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butanoate (SPDB) (see e.g. US Pat. 20090274713), N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate (SPP) (see, for example, CAS registration number 341498-08-6), 2-iminothiolane, or acetysuccinic anhydride.

Также могут быть получены конъюгаты антитело-майтанзиноид с нерасщепляющимися связями. Такие сшивающие агенты описаны в данной области техники (см. ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook и заявку на патент США № 2005/0169933), и включают, но не ограничиваются ими, N-сукцинимидил 4-(малеимидометил) циклогексанкарбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил-4-(Nмалеимидометил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который является длинноцепочечным аналогом SMCC (LC-SMCC), κ-малеимидоундекановой кислоты N-сукцинимидиловый эстер (KMUA), βмалеимидопропионовой кислоты N-сукцинимидиловый эстер (BMPS), γ-малеимидомасляной кислоты Nсукцинимидиловый эстер (GMBS), ε-малеимидокапроновой кислоты N-гидроксисукцинимидовый эстер (EMCS), m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидовый эстер (MBS), N-(α-малеимидоацетокси)сукцинимидовый эстер (AMAS), сукцинимидил-6-в-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH), Nсукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)-бутират (SMPB) и N-(р-малеимидофенил)изоцианат (PMPI), Nсукцинимидил-4-(иодоацетил)-аминобензоат (SIAB), N-сукцинимидилйодацетат (SIA), Nсукцинимидилбромацетат (SBA) и N-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP). В некоторых вариантах воплощения антитело модифицируют с помощью сшивающих реагентов, таких как сукцинимидил 4-(Н-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сульфо-SMCC, малеимидобензоил-Nгидроксисукцинимида (MBS), сульфо-MBS или сукцинимидилйодацетат, как описано в литературе, внедряя от 1 до 10 реакционноспособных групп (Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); and Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)).Non-cleavable antibody-maytansinoid conjugates can also be prepared. Such crosslinking agents are described in the art (see ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook and US Patent Application No. 2005/0169933), and include, but are not limited to, N-succinimidyl 4-(maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N- succinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate), which is a long chain analogue of SMCC (LC-SMCC), κ-maleimidoundecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), βmaleimidopropionic acid N-succinimidyl ester ( BMPS), γ-maleimidobutyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ε-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), N-(α-maleimidoacetoxy)succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6-β-maleimidopropionamido)hexanoate (SMPH), N-succinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)-butyrate (SMPB) and N-(p-maleimidophenyl)isocyanate (PMPI), N-succinimidyl-4-(iodoacetyl)-aminobenzoate (SIAB ), N-succinimidyl iodoacetate (SIA), N-succinimide lbromoacetate (SBA); and N-succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate (SBAP). In some embodiments, the antibody is modified with cross-linking reagents such as succinimidyl 4-(H-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), sulfo-SMCC, maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide (MBS), sulfo-MBS, or succinimidyl iodoacetate as described. in the literature, introducing 1 to 10 reactive groups (Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); and Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)).

Настоящее изобретение включает аспекты, в которых от приблизительно 2 до приблизительно 8 молекул лекарства (лекарственная нагрузка), например, майтансиноида, связаны с анти-FOLR1 антителом или его фрагментом. Противоопухолевый эффект такого конъюгата является гораздо более эффективным по сравнению с лекарственной нагрузкой большим или меньшим числом препаратов, связанных с тем же клеточносвязывающим агентом. Понятие лекарственная нагрузка, при использовании в данном документе, относится к числу молекул лекарства (например, майтансиноида), которые могут быть прикреплены к клеточносвязывающему агенту (например, анти-FOLR1 антителу или его фрагменту). В одном аспекте количество молекул лекарства, которые могут быть прикреплены к клеточносвязывающему агенту может составлять в среднем от приблизительно 2 до приблизительно 8 (например, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1). В некоторых вариантах воплощения лекарством является N² -деацетилN²-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансин (DM1) или N²-деацетил-N²-(4-меркапто-4-метил-1оксопентил) майтансин (DM4). Таким образом, в определенном варианте воплощения антитело huMov19The present invention includes aspects in which from about 2 to about 8 drug molecules (drug load), such as a maytansinoid, are linked to an anti-FOLR1 antibody or fragment thereof. The antitumor effect of such a conjugate is much more effective than the drug load of more or less drugs associated with the same cell-binding agent. The term drug load, as used herein, refers to the number of drug molecules (eg, maytansinoid) that can be attached to a cell-binding agent (eg, anti-FOLR1 antibody or fragment thereof). In one aspect, the number of drug molecules that can be attached to a cell binding agent may average from about 2 to about 8 (e.g., 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 , 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3 .7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 , 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6 .2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 , 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1). In some embodiments, the drug is N ² -deacetylN ² -(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine (DM1) or N ² -deacetyl-N ² -(4-mercapto-4-methyl-1oxopentyl) maytansine (DM4) . Thus, in a certain embodiment, the huMov19 antibody

- 18 041061 конъюгировано с DM1 или DM4. В другом варианте воплощения антитело FR-1-21 конъюгировано с DM1 или DM4. В другом варианте воплощения антитело FR-1-48 конъюгировано с DM1 или DM4. В другом варианте воплощения антитело FR-1-49 конъюгировано с DM1 или DM4. В другом варианте воплощения антитело FR-1-57 конъюгировано с DM1 или DM4. В другом варианте воплощения антитело FR-1-65 конъюгировано с DM1 или DM4.- 18 041061 conjugated to DM1 or DM4. In another embodiment, the FR-1-21 antibody is conjugated to DM1 or DM4. In another embodiment, the FR-1-48 antibody is conjugated to DM1 or DM4. In another embodiment, the FR-1-49 antibody is conjugated to DM1 or DM4. In another embodiment, the FR-1-57 antibody is conjugated to DM1 or DM4. In another embodiment, the FR-1-65 antibody is conjugated to DM1 or DM4.

X. Корреляция между экспрессией FOLR1 и терапевтической эффективностьюX. Correlation between FOLR1 expression and therapeutic efficacy

В некоторых вариантах воплощения изобретение относится к способу идентификации субъектов с повышенной вероятностью ответа на FOLR1-таргетную противораковую терапию. Настоящее изобретение частично основано на открытии, состоящем в том, что повышенные уровни экспрессии FOLR1 коррелирует с эффективностью FOLR-1-таргетной противораковой терапии.In some embodiments, the invention relates to a method for identifying subjects with an increased likelihood of responding to FOLR1-targeted cancer therapy. The present invention is based in part on the discovery that elevated levels of FOLR1 expression correlate with the efficacy of FOLR-1 targeted cancer therapy.

Оценка образцов тканей, полученных от пациентов и корреляция эффективности при использовании in vivo моделей ксенотрансплантатов, демонстрирует эффективность анализа экспрессии для выбора субъектов с повышенной вероятностью ответа на лечение. ИГХ обеспечивает оценку экспрессии FOLR1 на опухолевых клетках: от 0 (экспрессия отсутствует) до 3+ (очень высокие уровни экспрессии). Данные исследований in vivo посредством моделей ксенотрансплантатов показывают, что образцы тканей с оценкой 1, 2, 3 или 3+ для экспрессии FOLR1, предпочтительно с оценкой 2, 3 или 3+, имеют повышенную вероятность реакции на FOLR-1-таргетную противораковую терапию клинически значимыми дозами FOLR1 иммуноконъюгатов (например, доза иммуноконъюгата FOLR1 5 мг/кг для ксенотрансплантата составит приблизительно 185 мг/м² для пациентов). Таким образом, выявление лиц с повышенной оценкой FOLR1 поможет определить пациентов, могущих реагировать на клинически значимые дозы. Как описано более подробно ниже, восприимчивость FOLR1 терапии коррелирует с оценкой FOLR1, равной 2 или выше, особенно с оценкой 3. Кроме того, более равномерные уровни экспрессии FOLR1 обеспечивают лучшую корреляцию с терапевтическим эффектом. Таким образом, гомогенность (однородность) окрашивания является предпочтительной, но комбинации повышенной интенсивности с неоднородностью окрашивания также свидетельствуют о повышенной экспрессии FOLR1. Например, оценка более 2 с неоднородным окрашиванием является критерием отбора пациента для лечения посредством FOLR1 терапевтического агента.Evaluation of patient-derived tissue samples and correlation of efficacy using in vivo xenograft models demonstrates the efficacy of expression analysis in selecting subjects with an increased likelihood of response to treatment. IHC provides a score for FOLR1 expression on tumor cells ranging from 0 (no expression) to 3+ (very high levels of expression). Data from in vivo studies using xenograft models indicate that tissue samples scoring 1, 2, 3, or 3+ for FOLR1 expression, preferably scoring 2, 3, or 3+, have an increased likelihood of responding to FOLR-1-targeted cancer therapy with clinically significant doses of FOLR1 immunoconjugates (eg, a dose of 5 mg/kg FOLR1 immunoconjugate for a xenograft would be approximately 185 mg/m ² for patients). Thus, identifying individuals with elevated FOLR1 scores will help identify patients who may respond to clinically relevant doses. As described in more detail below, responsiveness to FOLR1 therapy correlates with a FOLR1 score of 2 or higher, especially a score of 3. In addition, more uniform levels of FOLR1 expression provide a better correlation with therapeutic effect. Thus, homogeneity (uniformity) of staining is preferred, but combinations of increased intensity with staining heterogeneity are also indicative of increased FOLR1 expression. For example, a score greater than 2 with non-uniform staining is a criterion for selecting a patient for treatment with a FOLR1 therapeutic agent.

Анализ экспрессии FOLR1 также идентифицирует пациентов, у которых сниженные дозы FOLR1таргетной противораковой терапии (терапия низкой дозой) может быть эффективными для получения противоопухолевого ответа. Как было оценено на практике, соединения обычно вводят в наименьшей дозе, которая достаточна для достижения желаемого терапевтического эффекта. Это особенно важно для терапии, вызывающей клинические и часто нежелательные побочные эффекты. Способность распознавать пациентов с повышенным уровнем экспрессии FOLR1 позволяет минимизировать дозы FOLR-1таргетной терапии, таким образом уменьшая возможные побочные эффекты при сохранении терапевтической эффективности.Analysis of FOLR1 expression also identifies patients in whom reduced doses of FOLR1 targeted cancer therapy (low dose therapy) may be effective in obtaining an antitumor response. As has been appreciated in practice, the compounds are usually administered at the lowest dose that is sufficient to achieve the desired therapeutic effect. This is especially important for therapies that cause clinical and often undesirable side effects. The ability to recognize patients with elevated levels of FOLR1 expression allows minimizing doses of FOLR-1 targeted therapy, thus reducing possible side effects while maintaining therapeutic efficacy.

Как показано в данном документе, оценка экспрессии FOLR1 2 или более с неоднородным окрашиванием, коррелируют с повышенной чувствительность к анти-FOLR1 иммуноконъюгатам. В некоторых вариантах воплощения наблюдается увеличение реактивности кахексии, увеличение продолжительности жизни, удлинение времени до прогрессирования, уменьшение массы опухоли, снижение опухолевой массы и/или продление времени до метастазирования опухоли, времени до возникновения рецидива опухоли, ответ опухоли на лечение, полный ответ, частичный ответ, стабилизация заболевания, прогрессирование заболевания, увеличение выживаемости без прогрессирования (ВБП) или общей выживаемости (ОВ). В некоторых вариантах воплощения экспрессия FOLR1 2 или более с неоднородным окрашиванием, коррелируют с увеличением ВБП, ВПЗ или ОВ.As shown herein, FOLR1 expression scores of 2 or more with heterogeneous staining correlate with increased sensitivity to anti-FOLR1 immunoconjugates. In some embodiments, there is an increase in cachexia reactivity, an increase in survival, an increase in time to progression, a decrease in tumor mass, a decrease in tumor mass, and/or an increase in time to tumor metastasis, time to tumor recurrence, tumor response to treatment, complete response, partial response. , disease stabilization, disease progression, progression-free survival (PFS) or overall survival (OS). In some embodiments, expression of FOLR1 2 or more with heterogeneous staining correlates with an increase in PFS, VSW, or OS.

Наборы для использования в способах обнаружения и корреляции с референсными/контрольными образцами могут включать контрольные (для положительного и/или отрицательного контроля) или референсные образцы. Образцы для положительного контроля или положительные референсные образцы могут быть получены из клеточных линий культуры тканей, образцов нормальных тканей или опухолевых тканей. Положительные и отрицательные референсные образцы могут быть получены из клеточных линий, включая SW620, T47D, IGROV-1, HeLa, KB, JEG-3, других опухолевых клеточных линий и клеточных линий постоянно или временно трансфицированных вектором экспрессии, кодирующим FOLR1. Образцы нормальной или опухолевой ткани и клеточные линии культуры тканей также могут быть использованы в качестве референсных образцов для отрицательного контроля. Для информации о дополнительных образцах, см. примеры 9-11 и фиг. 23-25.Kits for use in detection methods and correlation with reference/control samples may include control (for positive and/or negative control) or reference samples. Positive control samples or positive reference samples can be obtained from tissue culture cell lines, normal tissue samples, or tumor tissue samples. Positive and negative reference samples can be obtained from cell lines including SW620, T47D, IGROV-1, HeLa, KB, JEG-3, other tumor cell lines, and cell lines permanently or transiently transfected with an expression vector encoding FOLR1. Normal or tumor tissue samples and tissue culture cell lines can also be used as negative control reference samples. For additional samples, see Examples 9-11 and FIGS. 23-25.

XI. Фармацевтические композиции и терапевтические способыXI. Pharmaceutical Compositions and Therapeutic Methods

FOLR1-связывающие агенты (включая антитела, иммуноконъюгаты и полипептиды) пригодны для использования в различных областях применения, включая, но не ограничиваясь этим, терапевтические способы лечения, например, при лечении рака. В некоторых вариантах воплощения агенты используются для ингибирования роста опухоли, индуцирования дифференциации, уменьшения объема опухоли и/или снижения онкогенности опухоли. Способы применения могут быть in vitro, ex vivo или in vivo. В некоторых вариантах воплощения FOLR1-связывающий агент, или антитело, или иммуноконъюгат или полипептид представляет собой антагонист человеческого FOLR1, с которым он связывается.FOLR1 binding agents (including antibodies, immunoconjugates, and polypeptides) are suitable for use in a variety of applications, including, but not limited to, therapeutic therapies, such as in the treatment of cancer. In some embodiments, agents are used to inhibit tumor growth, induce differentiation, reduce tumor volume, and/or reduce tumor tumorigenicity. Methods of application may be in vitro, ex vivo or in vivo. In some embodiments, the FOLR1 binding agent or antibody or immunoconjugate or polypeptide is a human FOLR1 antagonist to which it binds.

- 19 041061- 19 041061

В некоторых вариантах воплощения заболевание, лечение которого производится с помощью FOLRl-связывающего агента или антагониста (например, huMov19 антитела или иммуноконъюгата) представляет собой рак. В некоторых вариантах воплощения рак характеризуется опухолью, экспрессирующей рецептор фолата 1, с которым связывается FOLR1-связывающий агент (например, антитело).In some embodiments, the disease being treated with the FOLR1 binding agent or antagonist (eg, huMov19 antibody or immunoconjugate) is cancer. In some embodiments, the cancer is characterized by a tumor expressing the folate receptor 1 to which a FOLR1 binding agent (eg, antibody) binds.

Настоящее изобретение относится к способам лечения рака, включающим введение терапевтически эффективного количества FOLR1-связывающего агента субъекту (например, пациенту, нуждающемуся в лечении). В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак яичников, рак печени, рак молочной железы, рак мозга, рак почки, рак предстательной железы, рак желудочно-кишечного тракта, меланому, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, глиобластому и рак головы и шеи. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак яичников. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак легких. В некоторых вариантах воплощения субъектом является человек.The present invention relates to methods of treating cancer comprising administering a therapeutically effective amount of a FOLR1 binding agent to a subject (eg, a patient in need of treatment). In some embodiments, the cancer is colon cancer, pancreatic cancer, lung cancer, ovarian cancer, liver cancer, breast cancer, brain cancer, kidney cancer, prostate cancer, gastrointestinal cancer, melanoma, cervical cancer, bladder cancer, glioblastoma, and head and neck cancer. In some embodiments, the cancer is ovarian cancer. In some embodiments, the cancer is lung cancer. In some embodiments, the subject is a human.

Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования роста опухоли посредством антител или других агентов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах воплощения способ ингибирования роста опухоли включает контактирование клетки с FOLR1-связывающим агентом (например, антителом) in vitro. Например, иммортализованную линию клеток или линию клеток рака, экспрессирующих FOLR1 культивируют в среде, в которую добавлены антитела или другие агенты для ингибирования роста опухоли. В некоторых вариантах воплощения опухолевые клетки выделяют из образца ткани пациента, такого как, например, биоптат ткани, плевральный выпот или проба крови и культивируют в среде, в которую добавлен FOLR1-связывающий агент для ингибирования роста опухоли.The present invention also relates to methods for inhibiting tumor growth by antibodies or other agents described herein. In some embodiments, a method for inhibiting tumor growth comprises contacting a cell with a FOLR1 binding agent (eg, antibody) in vitro. For example, an immortalized cell line or a cancer cell line expressing FOLR1 is cultured in a medium supplemented with antibodies or other agents to inhibit tumor growth. In some embodiments, tumor cells are isolated from a tissue sample of a patient, such as, for example, a tissue biopsy, pleural effusion, or blood sample, and cultured in a medium supplemented with a FOLR1 binding agent to inhibit tumor growth.

В некоторых вариантах воплощения способ ингибирования роста опухоли включает контактирование опухоли или опухолевых клеток с FOLR1-связывающим агентом (например, антителом) in vivo. В некоторых вариантах воплощения контактирование опухоли или опухолевых клеток с FOLR1связывающим агентом осуществляется на животной модели. Например, FOLR1-связывающие агенты могут быть введены ксенотрансплантатам, экспрессирующим один или более FOLR1, которые были выращены в организмах иммунологически скомпрометированных мышей (например NOD/SCID мышей) для ингибирования роста опухоли. В некоторых вариантах воплощения FOLR1-связывающий агент вводят одновременно или вскоре после введения онкогенных клеток в организм животного, чтобы предотвратить рост опухоли. В некоторых вариантах воплощения FOLR1-связывающий агент вводят в качестве терапевтического после роста онкогенных клеток до заданного размера.In some embodiments, a method for inhibiting tumor growth comprises contacting the tumor or tumor cells with a FOLR1 binding agent (eg, antibody) in vivo. In some embodiments, contacting a tumor or tumor cells with a FOLR1 binding agent is performed in an animal model. For example, FOLR1 binding agents can be administered to xenografts expressing one or more FOLR1 that have been grown in immunocompromised mice (eg NOD/SCID mice) to inhibit tumor growth. In some embodiments, the FOLR1 binding agent is administered at the same time or shortly after the oncogenic cells are introduced into the animal to prevent tumor growth. In some embodiments, the FOLR1 binding agent is administered as a therapeutic agent after the oncogenic cells have grown to a predetermined size.

В некоторых вариантах воплощения способ ингибирования роста опухоли включает введение субъекту терапевтически эффективного количества FOLR1-связывающего агента. В некоторых вариантах воплощения субъектом является человек. В некоторых вариантах воплощения субъект имеет опухоль или опухоль была удалена.In some embodiments, a method for inhibiting tumor growth comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of a FOLR1 binding agent. In some embodiments, the subject is a human. In some embodiments, the subject has a tumor or the tumor has been removed.

В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль мозга, опухоль толстой кишки, опухоль поджелудочной железы, опухоль легкого, опухоль яичников, опухоль печени, опухоль молочной железы, опухоль почки, опухоль предстательной железы, опухоль желудочно-кишечного тракта, меланому, опухоль шейки матки, опухоль мочевого пузыря, глиобластому, опухоль головы и шеи. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль яичников.In some embodiments, the tumor is a brain tumor, colon tumor, pancreatic tumor, lung tumor, ovarian tumor, liver tumor, breast tumor, kidney tumor, prostate tumor, gastrointestinal tumor, melanoma, cervical tumor, bladder tumor, glioblastoma, head and neck tumor. In some embodiments, the tumor is an ovarian tumor.

В некоторых вариантах воплощения изобретение относится к способам ингибирования роста опухоли посредством низких доз FOLR1-связывающего агента. Термин низкая доза, используемый в данном документе, относится к терапевтически эффективной дозе FOLR1-связывающего агента, которая меньше, чем обычная или стандартная доза, необходимая для получения терапевтического эффекта.In some embodiments, the invention relates to methods for inhibiting tumor growth with low doses of a FOLR1 binding agent. The term low dose as used herein refers to a therapeutically effective dose of a FOLR1 binding agent that is less than the usual or standard dose required to obtain a therapeutic effect.

Таким образом, в некоторых вариантах воплощения изобретение относится к способам лечения рака посредством huMov19 антител и иммуноконъюгатов. В некоторых вариантах воплощения иммуноконъюгатами huMov19 является huMov19-SPDB-DM4; huMov19-sulfo-SPP-DM1; huMov19-SPP-DM1, или huMov19-PEG4-Mal-DM4. В определенном варианте воплощения иммуноконъюгатом huMov19 является huMov19-SPDB-DM4, который также называют IMGN853.Thus, in some embodiments, the invention relates to methods for treating cancer with huMov19 antibodies and immunoconjugates. In some embodiments, the huMov19 immunoconjugates are huMov19-SPDB-DM4; huMov19-sulfo-SPP-DM1; huMov19-SPP-DM1 or huMov19-PEG4-Mal-DM4. In a specific embodiment, the huMov19 immunoconjugate is huMov19-SPDB-DM4, also referred to as IMGN853.

В некоторых вариантах воплощения композиции создаются для хранения и использования путем объединения очищенного антитела или агента по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым носителем (например, носителем, наполнителем) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилили пропилпарабен; катехол; резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (например, содержащие менее чем приблизительно 10 аминокислотных остатков), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие проIn some embodiments, compositions are formulated for storage and use by combining a purified antibody or agent of the present invention with a pharmaceutically acceptable carrier (eg, carrier, excipient) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). Suitable pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, non-toxic buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; salts such as sodium chloride, antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (eg octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol); low molecular weight polypeptides (eg, containing less than about 10 amino acid residues), proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; carbohydrates such as monosaccharides, disaccharides, glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming pro

- 20 041061 тивоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-протеиновые комплексы) и неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (ПЭГ).- 20 041061 tivoions, such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes); and non-ionic surfactants such as TWEEN or polyethylene glycol (PEG).

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены любым числом способов для местной или системной терапии. Способы введения могут быть местными (например, на слизистые оболочки, включая вагинальное и ректальное введение), используя трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки, легочными (например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера; интратрахеальным, интраназальным, трансдермальным и эпидермальным способом), пероральными или парентеральными, включая внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекции или инфузии, или внутричерепными (например, интратекальное или внутрижелудочковое введение).The pharmaceutical compositions of the present invention may be administered by any number of routes for topical or systemic therapy. Routes of administration may be topical (eg, mucosal, including vaginal and rectal administration), using transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids, and powders, pulmonary (eg, by inhalation or insufflation of powders). or aerosols, including by nebulizer; intratracheal, intranasal, transdermal and epidermal route), oral or parenteral, including intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injections or infusions, or intracranial (for example, intrathecal or intraventricular administration).

Антитело или иммуноконъюгат согласно изобретению могут быть объединены в комбинированную фармацевтическую композицию или в режиме дозирования в качестве комбинированной терапии, со вторым соединением, обладающим противораковыми свойствами. Второе соединение комбинированной фармацевтической композиции или режима дозирования предпочтительно имеет дополнительное влияние на нагруженное лекарственным средством антитело (ADC) комбинации так, что они не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Также используются фармацевтические композиции, включающие FOLR1-связывающий агент и вторым противораковое средство.The antibody or immunoconjugate of the invention may be combined in a combined pharmaceutical composition or dosage regimen as a combination therapy with a second compound having anti-cancer properties. The second compound of the combination pharmaceutical composition or dosage regimen preferably has an additional effect on the drug-loaded antibody (ADC) of the combination such that they do not adversely affect each other. Also used are pharmaceutical compositions comprising a FOLR1 binding agent and a second anti-cancer agent.

Для лечения заболевания подходящая доза антитела или агента по настоящему изобретению зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, тяжести и течения заболевания, чувствительности заболевания к лечению, терапевтических или профилактических целей введения антитела или агента, предыдущей терапии, анамнеза пациента и т.д. на усмотрение лечащего врача. Антитело или агент можно вводить однократно или в серии процедур продолжительностью от нескольких дней до нескольких месяцев, или пока не проявится терапевтический эффект или уменьшится болезненное состояние (например, уменьшится размер опухоли). Оптимальная схема введения может быть рассчитана, исходя из измерения накопления лекарственного средства в организме пациента и будет зависеть от относительной эффективности антитела или агента. Лечащий врач может легко определить оптимальные дозировки, методологию дозирования и частоту введения. В некоторых вариантах воплощения доза составляет от 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела, и может вводиться один или несколько раз ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно. В некоторых вариантах воплощения антитело или другой FOLR1-связывающий агент вводится один раз каждые две недели или один раз каждые три недели. В некоторых вариантах воплощения дозировка антитела или другого FOLR1-связывающего агента составляет от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 20 мг на кг веса тела. Лечащий врач может оценить частоту введения для дозирования на основании измеренного времени удержания и концентрации препарата в жидкостях или тканях тела.For the treatment of a disease, the appropriate dose of an antibody or agent of the present invention depends on the type of disease being treated, the severity and course of the disease, the susceptibility of the disease to treatment, the therapeutic or prophylactic goals for administering the antibody or agent, previous therapy, patient history, and so on. at the discretion of the attending physician. The antibody or agent can be administered in a single dose or in a series of treatments lasting from several days to several months, or until a therapeutic effect is manifested or the disease state is reduced (eg, tumor size is reduced). The optimal administration schedule can be calculated based on the measurement of drug accumulation in the patient's body and will depend on the relative potency of the antibody or agent. The attending physician can easily determine the optimal dosages, dosing methodology and frequency of administration. In some embodiments, the dose is from 0.01 μg to 100 mg per kg of body weight, and may be administered one or more times daily, weekly, monthly, or yearly. In some embodiments, the antibody or other FOLR1 binding agent is administered once every two weeks or once every three weeks. In some embodiments, the dosage of the antibody or other FOLR1 binding agent is from about 0.1 mg to about 20 mg per kg of body weight. The attending physician can estimate the frequency of administration for dosing based on the measured retention time and concentration of the drug in body fluids or tissues.

Комбинированная терапия может обеспечить синергизм и показать синергетический эффект, то есть эффект, состоящий в том, что использование вместе активных ингредиентов дает эффект больший, чем сумма эффектов при использовании соединений по отдельности. Синергетический эффект может быть достигнут, когда активные ингредиенты являются: (1) совместно составленными и введенными одновременно в комбинированной лекарственной форме одной дозой, (2) введенными поочередно или одновременно в виде отдельных композиций, или (3) в другом режиме. При поочередном введении в чередующейся терапии синергетический эффект может быть достигнут при последовательном введении соединений, например, путем инъекций в различных отдельных шприцах. В общем, при поочередной терапии эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят по очереди, то есть последовательно, тогда как при комбинированной терапии эффективные дозы двух или более активных ингредиентов вводят вместе.Combination therapy can provide synergy and show a synergistic effect, that is, the effect that the use of active ingredients together produces an effect greater than the sum of the effects when using the compounds separately. A synergistic effect can be achieved when the active ingredients are: (1) co-formulated and administered simultaneously in a combined dosage form in a single dose, (2) administered alternately or simultaneously as separate compositions, or (3) in another regimen. When administered alternately in alternating therapy, a synergistic effect can be achieved by sequential administration of the compounds, for example by injection in different separate syringes. In general, in alternate therapy, an effective dose of each active ingredient is administered in turn, i.e. sequentially, while in combination therapy, effective doses of two or more active ingredients are administered together.

Варианты воплощения настоящего изобретения могут быть дополнительно определены с помощью ссылки на следующие не ограничивающие примеры, которые подробно описывают получение некоторых антител по настоящему изобретению и способы использования антител по настоящему изобретению. Специалистам в данной области техники будет очевидно то, что многие модификации как материалов, так и способов могут быть осуществлены без отклонения от области применения настоящего изобретения.Embodiments of the present invention may be further defined by reference to the following non-limiting examples, which describe in detail the production of certain antibodies of the present invention and methods of using the antibodies of the present invention. Those skilled in the art will appreciate that many modifications to both materials and methods can be made without departing from the scope of the present invention.

ПримерыExamples

Следует помнить, что примеры и варианты воплощения описаны в данном документе только в демонстративных целях и что различные модификации или изменения с их учетом будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и объем настоящего приложения.It should be remembered that the examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only and that various modifications or changes to them will be suggested to those skilled in the art and should be included within the spirit and scope of this application.

Высокие уровни экспрессии рецептора фолата 1 (FOLR1) наблюдаются в опухолях яичников, уровни экспрессии от высоких до умеренных - в опухолях мозга, молочной железы, мочевого пузыря, эндометрия, легкого, поджелудочной железы и карциномы почек. С другой стороны, в нормальных тканях, к которым относятся ткани почек, легких, хороидного сплетения, поджелудочной железы, молочной железы, щитовидной железы, яичников, предстательной железы и легких, экспрессия FOLR1 ограничена.High levels of folate receptor 1 (FOLR1) expression are observed in ovarian tumors, high to moderate expression levels in tumors of the brain, breast, bladder, endometrium, lung, pancreas and renal carcinoma. On the other hand, in normal tissues such as kidney, lung, choroid plexus, pancreas, breast, thyroid, ovary, prostate, and lung, FOLR1 expression is limited.

В способах количественной оценки FOLR1 используются гомогенаты свежезамороженной ткани. ВMethods for quantifying FOLR1 use fresh frozen tissue homogenates. IN

- 21 041061 гомогенатах полного объема ткани невозможно отличить цитоплазматическую экспрессию от мембранассоциированной экспрессии, поэтому свежезамороженные образцы не поддаются исследованию в клинических условиях. Тем не менее, образцы, фиксированные в формалине и залитые парафином (ФФЗП) по желанию пациента могут быть сохранены в клинике для дальнейших исследований.- 21 041061 whole tissue homogenates, it is impossible to distinguish cytoplasmic expression from membrane-associated expression, therefore, fresh frozen samples are not amenable to clinical examination. However, formalin-fixed and paraffin-embedded (FFZP) specimens may be retained at the clinic for further study if desired by the patient.

Пример 1.Example 1

Иммуногистохимическое окрашивание FOLR1 клеточных образцов - ручные способы окрашивания. Фиксированные формалином и залитые парафином конгломераты клеток и тканей использовались в качестве образцов со следующими окрашивающими реагентами и при следующих условиях.Immunohistochemical staining of FOLR1 cell samples - manual staining methods. Formalin-fixed and paraffin-embedded cell and tissue conglomerates were used as samples with the following staining reagents and under the following conditions.

ИГХ Антитела Условия анализа ФФЗПIHC Antibodies Assay conditions FFZP

Исследуемый препарат: Investigational drug: Этапы Stages Состояния states моноклональные мышиные антитела huFOLRl клон BN3.2 (Leica # NCL-LFRalpha) ImmunoGen: Прокариотический рекомбинантный белок отвечает 189 аминокислотам внешней области альфамолекулы рецептора фолата. monoclonal mouse antibody huFOLRl clone BN3.2 (Leica # NCL-LFRalpha) ImmunoGen: Prokaryotic recombinant protein responds to 189 amino acids of the outer region of the folate receptor alpha molecule. Поиски антигена The search for an antigen Borg (Biocare) pH 9,0 Borg (Biocare) pH 9.0 Этапы блокирования Stages of blocking Авидин/Б иотин; пероксид Avidin/B iotin; peroxide Тестовый или контрольный препарат Test or control drug 2,0 мкг/мл 2.0 µg/ml Растворитель Solvent ФСБ содержащий 2% сыворотку лошади PBS containing 2% horse serum Контрольный препарат: Control drug: mulgGI (Coulter) клон, Cat# 6602872 mulgGI (Coulter) clone, Cat# 6602872 Вторичное антитело secondary antibody Вторичное антитело secondary antibody 10 мкг/мл 10 µg/ml Биотинилированное лошадиное антимышиное (Vector, Cat# РК-6100) Biotinylated equine anti-mouse (Vector, Cat# PK-6100) Система обнаружения* Detection system* Комплекс авидинбиотин-пероксидаза; ABC (Vector Labs) Avidinbiotin-peroxidase complex; ABC (Vector Labs) Хромаген Chromagen ДАБ (Dako) DAB (Dako) Время проявления ДАБ Development time DAB > 5 мин > 5 min

Зафиксированные в формалине и залитые парафином (ФФЗП) биоптаты опухоли яичников пациента и ксенотрансплантатную опухоль яичников окрашивали мышиными анти-FOLR1 антителами клона BN3.2, (Leica, Cat # NCL-L-FRalpha), в качестве контроля использовали mulgG1 пр-ва Coulter. После демаскирования антигена буфером с рН 9,5, стекла блокировали 2% лошадиной сывороткой в сочетании с авидином. Стекла промывали ФСБ и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин с антиFOLR1 или контрольным mulgGI антителом, а затем 30 мин с биотинилированным анти-мышиным IgG и 40 мин с комплексом авидин-биотин-пероксидаза для обнаружения связанного вторичного антитела. Инкубация в течение 5 мин с ДАБ (3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид) привела к появлению цветового сигнала. Стекла подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином.Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFZP) patient ovarian tumor biopsies and xenograft ovarian tumors were stained with mouse anti-FOLR1 antibodies of clone BN3.2, (Leica, Cat # NCL-L-FRalpha), Coulter's mulgG1 was used as control. After antigen demasking with pH 9.5 buffer, slides were blocked with 2% horse serum plus avidin. Slides were washed with PBS and incubated at room temperature for 60 min with antiFOLR1 or control mulgGI antibody, followed by 30 min with biotinylated anti-mouse IgG and 40 min with avidin-biotin-peroxidase complex to detect bound secondary antibody. Incubation for 5 minutes with DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride) resulted in a color signal. The slides were counterstained with hematoxylin.

Интенсивность и картина распределения окрашивания FOLR1 были оценены по сравнению с контрольными окрашиванием IgG (неспецифическим). Интенсивность оценивали по шкале от 0 до 3 (0 = нет окрашивания, 1 = слабое, 2 = умеренное и 3 = сильное), а распределение было оценено как фокальное (<25% окрашенных клеток), неоднородное (25-75% окрашенных клеток) и однородное (>75% окрашенных клеток).The intensity and distribution pattern of FOLR1 staining were assessed in comparison to control IgG staining (non-specific). Intensity was rated on a scale of 0 to 3 (0=no staining, 1=weak, 2=moderate, and 3=strong) and distribution was rated as focal (<25% stained cells), heterogeneous (25-75% stained cells) and homogeneous (>75% stained cells).

ФФЗП образцы были получены из микромассивов опухоли, а блоки человеческих тканей - из семи различных опухолей, как описано ниже.FFZP samples were obtained from tumor microarrays and human tissue blocks from seven different tumors, as described below.

- 22 041061- 22 041061

ФФЗП тестовые образцыFFZP test samples

Микромассивы опухоли человека (ТМА) Human tumor microarrays (TMA) Описание Description Коммерческий источник commercial source Смешанной опухоли mixed tumor 96 образцов 33 типов рака 96 samples from 33 types of cancer Biomax Cat# МС961 Biomax Cat# MC961 Опухоли яичников Tumors of the ovaries 64 образцов 64 samples Biochain Cat# T8235725 Biochain Cat# T8235725 НМРЛ NSCLC 80 образцов 80 samples Biomax Cat# LC806 Biomax Cat# LC806 Колоректального рака colorectal cancer 85 дубликатов образцов 85 duplicate samples Biomax Cat# BC000110 Biomax Cat# BC000110 Блоки человеческих тканей Blocks of human tissues Количество Quantity Коммерческий источник commercial source Опухоли молочной железы Tumors of the mammary glands 4 4 CHTN CHTN Колоректального рака colorectal cancer 4 4 Опухоли яичников Tumors of the ovaries 4 4 НМРЛ NSCLC 8 8 Опухоли поджелудочной железы Tumors of the pancreas 1 1 Опухоли почки Tumors of the kidney 8 8 ПРГШ PRGS 14 14

FOLR1 исследуемый препарат и мышиный анти-FOLRl клон BN3.2 были испытаны для определения специфичности связывания с антигеном huFOLR1. Используя описанные способы ИГХ окрашивания, ФФЗП срезы 300-19 и 300-19 трансфицированные huFOLR1 (300-10/FOLR1) и конгломераты клеток окрашивали и оценивали на FOLR1. Для определения FOLR1 клетки исследуемого препарата специально окрашивались 300.19/FOLR1+ и не показали окрашивания в клетках 300-19 (3-однородное и отрицательное окрашивание, соответственно). Эти результаты показывают, что клон BN3.2 ориентирован исключительно на huFOLR1 антиген. (фиг. 1).The FOLR1 study drug and the mouse anti-FOLR1 clone BN3.2 were tested to determine the specificity of binding to the huFOLR1 antigen. Using the described IHC staining methods, FFZP sections 300-19 and 300-19 transfected with huFOLR1 (300-10/FOLR1) and cell conglomerates were stained and evaluated for FOLR1. For FOLR1 detection, test preparation cells were specifically stained with 300.19/FOLR1+ and showed no staining in 300-19 cells (3-staining and negative staining, respectively). These results indicate that the BN3.2 clone is exclusively targeted to the huFOLR1 antigen. (Fig. 1).

BN3.2 антитела также использовались для обнаружения экспресии FOLR1 в образцах тканей. Иммунореактивность каждого тестового и контрольного образца тканей и клеточных конгломератов определял патологоанатом-консультант, д-р David Dorfman. Клеточные конгломераты для контроля были оценены сначала, затем оценивались образцы тканей. Для каждой ткани сообщались оценка и описание интенсивности и однородности окрашивания. Оценка интенсивности окрашивания и величина однородности описаны ниже. Конечный балл для каждого образца ткани вычислялся, как оценка тестового образца минус оценка соответствующего контрольного образца.BN3.2 antibodies have also been used to detect FOLR1 expression in tissue samples. The immunoreactivity of each test and control sample of tissue and cell conglomerates was determined by consultant pathologist, Dr. David Dorfman. Cell conglomerates for control were evaluated first, then tissue samples were evaluated. For each tissue, an assessment and description of the intensity and uniformity of staining was reported. Staining intensity evaluation and uniformity value are described below. The final score for each tissue sample was calculated as the score of the test sample minus the score of the corresponding control sample.

Уровень САК для каждого образца оценивали путем сравнения оценки окрашивания с калиброванным образцом конгломерата клеток.The CAH level for each sample was assessed by comparing the staining score with a calibrated cell conglomerate sample.

Интенсивность (количество окрашивающего средства) Intensity (amount of coloring agent) Однородность (количество окрашенных клеток) Uniformity (number of stained cells) 0 0 Негативная Negative 1 1 Слабая Weak 0 0 Негативная Negative 2 2 У меренная moderate Фокальная Focal <25% <25% 3 3 Сильная strong Неоднородная (гетерогенная) Heterogeneous (heterogeneous) 25-75% 25-75% 3 + 3+ Очень сильная Very strong Однородная (гомогенная) Homogeneous (homogeneous) > 75% > 75%

Значения показателя связанных антител на клетку (САК) были определены для FOLRI-позитивных опухолевых клеточных линий (KB, IGROV1, JEG3 и OVCAR3) посредством анти-FOLR1-фикоэритрина, BD Quantibrite Beads и проточной цитометрии и показали разные значения САК (фиг. 2). Условия окрашивание были оптимизированы для FOLR1 так, чтобы конгломераты клеток, полученные из FOLR1позитивных опухолевых клеточных линий показали различные уровни интенсивности ИГХ окрашивания. Конгломерат клеток KB показал очень высокую степень однородности окрашивания с высокой инBound antibody per cell (BAC) values were determined for FOLRI-positive tumor cell lines (KB, IGROV1, JEG3, and OVCAR3) by anti-FOLR1 phycoerythrin, BD Quantibrite Beads, and flow cytometry and showed different BAC values (Fig. 2) . Staining conditions were optimized for FOLR1 so that cell conglomerates derived from FOLR1 positive tumor cell lines showed different levels of IHC staining intensity. The KB cell conglomerate showed a very high degree of staining uniformity with high intensity.

- 23 041061 тенсивностью (3+), конгломерат клеток IGROV1 показал высокую степень окрашивания (3), конгломерат клеток JEG3 показал умеренную степень (2-3) неоднородного окрашивания, а конгломерат клеток OVCAR3 показал низкую степень интенсивности (1-2) неоднородного окрашивания. Тенденции интенсивности окрашивания FOLR1, наблюдаемые на конгломератах клеток соответствуют приведенным значениям САК, где KB клетки показали высокое значение САК 1700000, IGROV-1 клетки показали следующее по величине значение САК 260000, JEG-3 имели более низкое значение САК 41000, a OVCAR3 клетки показали самое низкое значение САК 4000. Результаты окрашивания и соответствующие значения САК перечислены в таблице ниже.- 23 041061 intensity (3+), the conglomerate of IGROV1 cells showed a high degree of staining (3), the conglomerate of JEG3 cells showed a moderate degree (2-3) of heterogeneous staining, and the conglomerate of OVCAR3 cells showed a low degree of intensity (1-2) of heterogeneous staining. Trends in FOLR1 staining intensity observed on cell conglomerates are consistent with the reported BAH values, where KB cells showed the highest BAH of 1700000, IGROV-1 cells showed the next highest BAH of 260000, JEG-3 had a lower BAH of 41000, and OVCAR3 cells showed the highest low BAC value of 4000. Staining results and corresponding BAC values are listed in the table below.

Значения САК и соответствующие результаты окрашивания huFOLR1 клеточных линий и соответствующих клеточных конгломератовCAH values and corresponding huFOLR1 staining results of cell lines and corresponding cell conglomerates

Клеточная линия cell line FOLR1 FOLR1 САК SAK Оценка Grade КВ HF 1700000 1700000 3+ однородная 3+ homogeneous IGROV1 IGROV1 260000 260000 3 однородная 3 homogeneous JEG3 JEG3 41000 41000 2-3 неоднородная 2-3 heterogeneous OVCAR3 OVCAR3 4000 4000 1-2 неоднородная 1-2 heterogeneous

Дополнительные клеточные линии, в том числе Capan-1, Jar, Нес-1-А, Нес-1-В, Ishikawa, NCIH292, BT474EEI, РА-1, OV-90, CaOv-4, CaOv-3, A2780, Ovcar-5, Ovcar-4, HCT-15, 786-O, NCI H838, NCI H 522, NCI H2110, NCI H1734, NCI H228 и FU.OV-3 были испытаны и признаны FOLR1 позитивными, но их уровни экспрессии FOLR1 и чувствительности к анти-FOLR1 иммуноконъюгату сильно отличаются. Для справочных целей предпочтительными являются клеточные линии, обладающие стабильной экспрессией FOLR1 и чувствительностью к анти-FOLR! иммуноконъюгатам.Additional cell lines, including Capan-1, Jar, Hec-1-A, Hec-1-B, Ishikawa, NCIH292, BT474EEI, RA-1, OV-90, CaOv-4, CaOv-3, A2780, Ovcar -5, Ovcar-4, HCT-15, 786-O, NCI H838, NCI H 522, NCI H2110, NCI H1734, NCI H228, and FU.OV-3 have been tested and found to be FOLR1 positive, but their FOLR1 expression levels and sensitivity to the anti-FOLR1 immunoconjugate are very different. For reference purposes, cell lines with stable FOLR1 expression and anti-FOLR sensitivity are preferred! immunoconjugates.

Особенно важным является то, что способом ИГХ удалось обнаружить стабильную экспрессию FOLR1 образцов ткани рака яичников и немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Как показано на фиг. 3, экспрессия FOLR1 может быть достоверно обнаружена в образцах карциномы яичников и НМРЛ с оценкой от 2 неоднородной до 3 однородной. Значения САК для этих образцов находятся в диапазоне от приблизительно 41 000 для образцов с оценкой 2 неоднородной, до более чем 260 000 для образцов с оценкой 3 однородной. Как показано на фиг. 4, высокая интенсивность и однородность окрашивания наблюдалась также для рака яичников, аденокарциномы легких и бронхиолоальвеолярной карциномы. Кроме того, было дополнительно установлено, что экспрессия FOLR1 в образцах тканей НМРЛ (фиг. 5) и рака яичников (фиг. 6) преимущественно локализована на мембранах. Экспрессия была обнаружена на нескольких образцах одной, а также различных образцах опухоли. Интересно, что ни один из образцов опухоли толстой кишки, молочной железы или мелкоклеточного рака легких не показал оценки выше 2 неоднородной.Of particular importance, the IHC method was able to detect stable expression of FOLR1 in ovarian cancer and non-small cell lung cancer (NSCLC) tissue samples. As shown in FIG. 3, FOLR1 expression can be reliably detected in ovarian carcinoma and NSCLC samples with a score of 2 heterogeneous to 3 homogeneous. The SAH values for these samples range from approximately 41,000 for samples with a score of 2 heterogeneous to over 260,000 for samples with a score of 3 homogeneous. As shown in FIG. 4, high intensity and uniformity of staining was also observed for ovarian cancer, lung adenocarcinoma, and bronchioloalveolar carcinoma. Furthermore, FOLR1 expression in NSCLC (FIG. 5) and ovarian cancer (FIG. 6) tissue samples was further found to be preferentially localized to membranes. Expression was found in several samples of the same as well as different tumor samples. Interestingly, none of the colon, breast, or small cell lung tumor samples showed scores greater than 2 inhomogeneous.

Пример 2.Example 2

In vivo эффективность huMov19-PEG4Mal-DM4 и huMov19-SPDB-DM4 конъюгатов по сравнению с аналогичными нетаргетными конъюгатами в модели ксенотрансплантата KB.In vivo performance of huMov19-PEG4Mal-DM4 and huMov19-SPDB-DM4 conjugates compared to similar non-targeted conjugates in the KB xenograft model.

FOLR1-таргетный расщеплямый конъюгат huMov19-SPDB-DM4 в сравнении с не таргентным huC242-SPDB-DM4, нерасщеплямый конъюгат huMov19-PEG4-Mal-DM4 в сравнении с не таргентным huC242-PEG4Mal-DM4 были протестированы посредством установленной модели ксенотрансплантата KB клеток (очень высокая экспрессия FOLR1, 3+ однородная при ИГХ с ручным окрашиванием), имплантированного подкожно ТКИН-мышам. Мыши были случайным образом распределены по весу тела в группы терапии и подвергались воздействию либо один раз (SPDB конъюгатами) на 3 день после инокуляции клеток, либо три раза в неделю в дни 3, 10 и 17 после инокуляции клеток 5 и 10 мг конъюгата / кг массы тела, соответственно. Средний объем опухоли в различных группах терапии приведен на фиг. 7. Терапия посредством huMov19-SPDB-DM4 или huMov19-PEG4Mal-DM4 привела к снижению среднего объема опухоли по сравнению с контрольной группой, в которой использовался ФСБ, в то время как лечение посредством любого из соответствующих не таргетных конъюгатов не показало заметного эффекта.FOLR1-targeted cleavage conjugate huMov19-SPDB-DM4 versus non-targeted huC242-SPDB-DM4, non-cleaved huMov19-PEG4-Mal-DM4 conjugate versus non-targeted huC242-PEG4Mal-DM4 were tested using an established KB cell xenograft model (very high expression of FOLR1, 3+ homogeneous on IHC with manual staining) implanted subcutaneously in SCID mice. Mice were randomized by body weight into treatment groups and exposed either once (SPDB conjugates) on day 3 after cell inoculation or three times a week on days 3, 10 and 17 after cell inoculation with 5 and 10 mg conjugate/kg body weight, respectively. The mean tumor volume in different treatment groups is shown in FIG. 7. Therapy with huMov19-SPDB-DM4 or huMov19-PEG4Mal-DM4 resulted in a reduction in mean tumor volume compared to the PBS control group, while treatment with any of the respective non-targeted conjugates showed no significant effect.

Пример 3.Example 3

Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 при воздействии на OVCAR-3 ксенотрансплантат карциномы яичников человека.Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 on OVCAR-3 human ovarian carcinoma xenograft.

Противоопухолевый эффект IMGN853 оценивали на стандартной модели подкожного ксенотрансплантата карциномы яичника. ТКИН-мышам инокулировали клетки карциномы яичника OVCAR-3 (1x107 клеток/животное), которые вводились подкожно в правый бок животного. Когда объем опухолей достиг приблизительно 100 мм3 (21 день после инокуляции опухолевых клеток), мышей случайным образом делили на четыре группы (по 6 животных в группе). Мышей обрабатывали с помощью однократThe antitumor effect of IMGN853 was evaluated in a standard subcutaneous ovarian carcinoma xenograft model. SCID mice were inoculated with OVCAR-3 ovarian carcinoma cells (1x107 cells/animal) which were injected subcutaneously into the right flank of the animal. When the volume of tumors reached approximately 100 mm3 (21 days after inoculation of tumor cells), mice were randomly divided into four groups (6 animals per group). Mice were treated with a single

- 24 041061 ной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ. Рост опухоли контролировали путем измерения ее размера два раза в неделю. Размер опухоли рассчитывали по формуле: длина х ширина х высота х 1/₂.- 24 041061 intravenous injection of IMGN853 at a dose of 1.2, 2.5 or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS. Tumor growth was monitored by measuring its size twice a week. Tumor size was calculated using the formula: length x width x height x _1/2 .

Препарат IMGN853 проявил высокую активность в отношении OVCAR-3 опухолей (ИГХ оценка 3, однородная, при использовании ручных ИГХ способов) с точки зрения ингибирования роста опухоли (Т/С=0%), при уровнях дозы 2,5 и 5,0 мг/кг (фиг. 8). У 6/6 мышей, получавших IMGN853 в дозе 5,0 мг/кг была достигнута полная регрессия (ПР) опухоли. У мышей, получавших IMGN853 в дозе 2,5 мг/кг была достигнута частичная регрессия (ЧР) опухоли в 6/6, и ПР - в 4/6. Препарат IMGN853 показал активность в дозе 1,2 мг/кг, с Т/С равном 18% при ЧР 2/6 и ПР 1/6. В соответствии со стандартами Национального института рака (NCI) значение Т/С в диапазоне от 10% до 42% считается активным, значение Т/С менее 10% считается чрезвычайно активными.IMGN853 was highly active against OVCAR-3 tumors (IHC score 3, uniform using manual IHC methods) in terms of tumor growth inhibition (T/C=0%) at dose levels of 2.5 and 5.0 mg /kg (Fig. 8). In 6/6 mice treated with IMGN853 at a dose of 5.0 mg/kg, complete regression (CR) of the tumor was achieved. Mice treated with IMGN853 at 2.5 mg/kg achieved partial tumor regression (PR) in 6/6 and PR in 4/6. IMGN853 was active at 1.2 mg/kg, with a T/C of 18% at FR 2/6 and CR 1/6. According to the National Cancer Institute (NCI) standards, a T/C value in the range of 10% to 42% is considered active; a T/C value of less than 10% is considered extremely active.

Пример 4.Example 4

Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 при воздействии на IGROV-1 ксенотрансплантат карциномы яичников человека.Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 on IGROV-1 human ovarian carcinoma xenograft.

Противоопухолевый эффект IMGN853 оценивали на стандартной модели подкожного ксенотрансплантата карциномы яичника. ТКИН-мышам инокулировали клетки карциномы яичника IGROV-1 (1x107 клеток/животное), которые вводились подкожно в правый бок животного. Когда объем опухолей достиг приблизительно 100 мм3 (7 день после инокуляции опухолевых клеток), мышей случайным образом делили на четыре группы (по 6 животных в группе). Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ. Рост опухоли контролировали путем измерения ее размера два раза в неделю. Размер опухоли рассчитывали по формуле: длина х ширина х высота х 1/₂.The antitumor effect of IMGN853 was evaluated in a standard subcutaneous ovarian carcinoma xenograft model. SCID mice were inoculated with IGROV-1 ovarian carcinoma cells (1x107 cells/animal) which were injected subcutaneously into the right flank of the animal. When the tumor volume reached approximately 100 mm3 (day 7 after tumor cell inoculation), mice were randomly divided into four groups (6 animals per group). Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS. Tumor growth was monitored by measuring its size twice a week. Tumor size was calculated using the formula: length x width x height x _1/2 .

Препарат IMGN853 проявил высокую активность в отношении IGROV-1 опухолей (ИГХ оценка 3, однородная, при использовании ручных ИГХ способов) при дозах 2,5 и 5,0 мг/кг, результирующее соотношение Т/С равно 5% для обеих доз (фиг. 9). У 5/6 и 6/6 мышей наблюдалась частичная регрессия опухоли при дозах 2,5 и 5,0 мг/кг, соответственно. В дозе 1,2 мг/кг (Т/С=47%) препарат IMGN853 активности не проявил.IMGN853 was highly active against IGROV-1 tumors (IHC score 3, homogeneous using manual IHC methods) at 2.5 and 5.0 mg/kg, resulting in a T/C ratio of 5% for both doses (Fig. . 9). 5/6 and 6/6 mice showed partial tumor regression at doses of 2.5 and 5.0 mg/kg, respectively. At a dose of 1.2 mg/kg (T/C=47%), IMGN853 showed no activity.

Пример 5.Example 5

Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 при воздействии на OV-90 ксенотрансплантат карциномы яичников человека.Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 on OV-90 human ovarian carcinoma xenograft.

Противоопухолевый эффект IMGN853 оценивали на стандартной модели подкожного ксенотрансплантата карциномы яичника. ТКИН-мышам инокулировали OV-90 клетки карциномы яичника (1x107 клеток/животное), которые вводились подкожно в правый бок животного. Когда объем опухолей достиг приблизительно 100 мм3 (13 день после инокуляции опухолевых клеток), мышей случайным образом делили на четыре группы (по 6 животных в группе). Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ. В контрольной группе, получавшей ФСБ, внутривенные инъекции проводились по такому же графику. Рост опухоли контролировали путем измерения ее размера в два раза в неделю. Размер опухоли рассчитывали по формуле: длина х ширина х высота х 1/₂.The antitumor effect of IMGN853 was evaluated in a standard subcutaneous ovarian carcinoma xenograft model. SCID mice were inoculated with OV-90 ovarian carcinoma cells (1x107 cells/animal) which were injected subcutaneously into the right flank of the animal. When the volume of tumors reached approximately 100 mm3 (13 days after inoculation of tumor cells), mice were randomly divided into four groups (6 animals per group). Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS. In the control group receiving PBS, intravenous injections were carried out according to the same schedule. Tumor growth was monitored by measuring its size twice a week. Tumor size was calculated using the formula: length x width x height x _1/2 .

Препарат IMGN853 проявил активность в отношении OV-90 опухолей (ИГХ оценка 3, однороднаянеоднородная при использовании ручных ИГХ способов) при дозах 2,5 и 5,0 мг/кг, результирующее соотношение Т/С равно 36 и 18%, соответственно (фиг. 10). У двух животных наблюдался частичный регресс опухоли в группе 5,0 мг/кг, никакого другого регресса опухоли в любой из групп не наблюдалось. В дозе 1,2 мг/кг (Т/С=77%) препарат IMGN853 активности не проявил.IMGN853 was active against OV-90 tumors (IHC score 3, homogeneous inhomogeneous using manual IHC methods) at doses of 2.5 and 5.0 mg/kg, resulting in a T/C ratio of 36 and 18%, respectively (Fig. 10). Two animals showed partial tumor regression in the 5.0 mg/kg group, no other tumor regression was observed in either group. At a dose of 1.2 mg/kg (T/C=77%), IMGN853 showed no activity.

Пример 6.Example 6

Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 при воздействии на SKOV-3 ксенотрансплантат карциномы яичников человека.Dose-dependent antitumor activity of IMGN853 on SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.

Противоопухолевый эффект IMGN853 оценивали на стандартной модели подкожного ксенотрансплантата карциномы яичника. ТКИН-мышам инокулировали клетки карциномы яичника SKOV-3 (1x10⁷ клеток/животное), которые вводились подкожно в правый бок животного. Когда объем опухолей достиг приблизительно 100 мм3 (26 день после инокуляции опухолевых клеток), мышей случайным образом делили на четыре группы (по 6 животных в группе). Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ. Рост опухоли контролировали путем измерения ее размера два раза в неделю. Размер опухоли рассчитывали по формуле: длина х ширина х высота х 1/₂.The antitumor effect of IMGN853 was evaluated in a standard subcutaneous ovarian carcinoma xenograft model. SCID mice were inoculated with SKOV-3 ovarian carcinoma cells (1x10 ⁷ cells/animal) which were injected subcutaneously into the right flank of the animal. When the tumor volume reached approximately 100 mm3 (day 26 after tumor cell inoculation), mice were randomly divided into four groups (6 animals per group). Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS. Tumor growth was monitored by measuring its size twice a week. Tumor size was calculated using the formula: length x width x height x _1/2 .

Препарат IMGN853 не проявил активность в отношении SKOV-3 опухоли (1ИГХ оценка 3, фокальная при использовании ручных ИГХ способов) во всех дозах, с ростом IMGN853 обработанных опухолей параллельно контрольной группе, обработанной ФСБ (фиг. 11). Анализ данных не проводился, а само исследование было досрочно прекращено в связи с отсутствием активности IMGN853 в этой модели.The IMGN853 preparation showed no activity against the SKOV-3 tumor (1IHC score 3, focal using manual IHC methods) at all doses, with the growth of IMGN853 treated tumors parallel to the PBS treated control group (FIG. 11). Data analysis was not performed, and the study itself was terminated early due to the lack of IMGN853 activity in this model.

Пример 7.Example 7

Дозозависимая противоопухолевая активность IMGN853 при воздействии на KB ксенотрансплантатDose-dependent antitumor activity of IMGN853 when exposed to KB xenograft

- 25 041061 человеческой аденокарциномы шейки матки.- 25 041061 human adenocarcinoma of the cervix.

Противоопухолевый эффект IMGN853 оценивали на стандартной модели подкожного ксенотрансплантата аденокарциномы шейки матки. ТКИН-мышам инокулировали клетки аденокарциномы шейки матки KB (1 х 10⁷ клеток/животное), которые вводились подкожно в правый бок животного. Когда объем опухолей достиг приблизительно 100 мм3 (7 день после инокуляции опухолевых клеток), мышей случайным образом делили на четыре группы (по 6 животных в группе). Мышей обрабатывали с помощью однократной внутривенной инъекции IMGN853 дозой 1,2, 2,5 или 5,0 мг/кг. Животные контрольной группы получали однократную внутривенную инъекцию ФСБ. Рост опухоли контролировали путем измерения ее размера в два раза в неделю. Размер опухоли рассчитывали по формуле: длина х ширина х высота х 1/₂.The antitumor effect of IMGN853 was evaluated in a standard subcutaneous xenograft model of cervical adenocarcinoma. SCID mice were inoculated with KB cervical adenocarcinoma cells (1 x 10 ⁷ cells/animal) which were injected subcutaneously into the right flank of the animal. When the tumor volume reached approximately 100 mm3 (day 7 after tumor cell inoculation), mice were randomly divided into four groups (6 animals per group). Mice were treated with a single intravenous injection of IMGN853 at 1.2, 2.5, or 5.0 mg/kg. Animals of the control group received a single intravenous injection of PBS. Tumor growth was monitored by measuring its size twice a week. Tumor size was calculated using the formula: length x width x height x _1/2 .

Препарат IMGN853 проявил высокую активность в отношении опухоли KB с точки зрения торможения роста опухоли (Т/С = 0%) в дозах 2,5 и 5,0 мг/кг (фиг. 12). У шести из шести мышей в группе 5,0 мг/кг и пяти из шести мышей в группе 2,5 мг/кг наблюдалась ПР с полным исчезновением опухоли к концу исследования (день 120). Доза 1,0 мг/кг показала активность, результирующее соотношение Т/С составило 37%, однако ни частичной, ни полной регрессии при ней не наблюдалось.The IMGN853 preparation showed high activity against the KB tumor in terms of tumor growth inhibition (T/C = 0%) at doses of 2.5 and 5.0 mg/kg (Fig. 12). Six out of six mice in the 5.0 mg/kg group and five out of six mice in the 2.5 mg/kg group experienced CR with complete tumor resolution by the end of the study (day 120). The 1.0 mg/kg dose showed activity, resulting in a T/C ratio of 37%, but neither partial nor complete regression was observed.

Пример 8.Example 8

Иммуногистохимическое окрашивание FOLR1 клеточных образцов, фиксированных в формалине и залитых парафином (ФФЗП) - автоматизированные способы окрашивания.Immunohistochemical staining of FOLR1 cell samples fixed in formalin and embedded in paraffin (FFZP) - automated staining methods.

При анализе ИГХ окрашивания используются IVD реагенты класса I, в том числе антитела Novocastra FOLR1 (Novocastra/Leica Cat # NCI-L-FRalpha, клон BN3.2) в качестве исследуемого препарата и автоматизированное устройство для окрашивания Leica Bond RX. Связанный испытываемый или контрольный образец выявлялся путем инкубации с системой детектирования Leica Bond Refine, которая включает использование первичного реагента (кроличий антимышиный IgG), а затем реагента полимера (козий анти-кроличий полимер) и 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорида (ДАБ) хромогена. ФФЗП образцы окрашивали с указанной концентрацией первичного антитела (полученный разбавлением в Leica разбавителе FOLR1), как показано ниже.IHC staining assay uses Class I IVD reagents, including Novocastra FOLR1 antibody (Novocastra/Leica Cat #NCI-L-FRalpha, clone BN3.2) as test preparation and Leica Bond RX automated stainer. Bound test or control sample was detected by incubation with the Leica Bond Refine detection system, which involves the use of a primary reagent (rabbit anti-mouse IgG) followed by a polymer reagent (goat anti-rabbit polymer) and 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) chromogen. FFZP samples were stained with the indicated concentration of the primary antibody (prepared by dilution in Leica FOLR1 diluent) as shown below.

Антитела для ИГХAntibodies for IHC

Альфа-рецепторы фолиевой кислоты (Novocastra/Leica Исследуемый препаратFolic acid receptor alpha (Novocastra/Leica Investigational drug

Cat # NCI-L-FRalpha, Lot 159506), мышиные, клонCat # NCI-L-FRalpha, Lot 159506), murine, clone

BN3.2, жидкий концентрат: 75 мкг/млBN3.2 liquid concentrate: 75 µg/mL

IgGl (Beckman Coulter Cat # 6602872, Lots2S7SPS04-23 Контрольный препарат и 2S7SPS04-26.) концентрация исходного раствора: 1 мг/мл, мышиные, клон 2T8-2F5IgGl (Beckman Coulter Cat # 6602872, Lots2S7SPS04-23 Control and 2S7SPS04-26.) stock concentration: 1 mg/mL, mouse, clone 2T8-2F5

- 26 041061- 26 041061

Способ анализа ФФЗП посредством Leica Bond RXFFZP Analysis Method with Leica Bond RX

Этап Stage Действие Action Время Time Термическая обработка Heat treatment Температура: 60°С Temperature: 60°C 30 минут 30 minutes Депарафинизирование Dewaxing С помощью раствора Bond Dewax With Bond Dewax Fixed fixed 100% этанол 100% ethanol Fixed fixed Демаскирование антигена Antigen unmasking Bond ER2 Bond ER2 20 минут 20 minutes Блок эндогенной пероксидазы Block of endogenous peroxidase Пероксид (Компонент набора для очистки) Peroxide (Part of cleaning kit) 5 минут 5 minutes Исследуемый препарат: Investigational drug: FOLR1 при 1,9 мкг/мл в разбавителе Leica FOLR1 at 1.9 µg/ml in Leica diluent 15 минут 15 minutes Обнаружение Detection Пост-первичный реагент (Набор для очистки) Post Primary Reagent (Purification Kit) 8 минут 8 minutes Полимер (Набор для очистки) Polymer (Cleaning Kit) 8 минут 8 minutes Смесь ДАБ (Набор для очистки) DAB Blend (Cleaning Kit) 10 минут 10 minutes Контрастирующее окрашивание Contrasting staining Гематоксилин (Набор для очистки) Hematoxylin (Cleaning Kit) 5 минут 5 minutes

Все окрашенные образцы исследовались и оценивались. Сначала исследовались контрольные образцы, затем тестовые образцы (срезы целиком и отдельные центральные фрагменты тканевых блоков). Для каждой исследуемой опухолевой ткани или конгломерата клеток производилось описание интенсивности окрашивания и соответствующих пропорций окрашенных клеток опухоли. Окрашивание, ассоциированное с мембранами, записывалось для каждого образца. В случае, если от одного пациента были получены дублирующие оценки, в анализ был включен только наивысший балл. Если при оценке регистрировалось окрашивание только цитоплазмы, окончательная оценка равнялась нулю (0). Интенсивность и однородность каждого образца подавались, как описано в таблице ниже. Интенсивность и картина распределения окрашивания были оценены по сравнению с контрольными окрашиванием IgG (неспецифическим). Интенсивность оценивали по шкале от 0 до 3 (0 = нет окрашивания, 1 = слабое, 2 = умеренное и 3 = сильное) а распределение было оценено как фокальное (<25% окрашенных клеток), неоднородное (25-75% окрашенных клеток) и однородное (>75% окрашенных клеток). В нормальной ткани при расчете интенсивности и пропорции рассматривались только определенные подструктуры.All stained samples were examined and evaluated. First, control samples were studied, then test samples (sections as a whole and separate central fragments of tissue blocks). For each studied tumor tissue or conglomerate of cells, a description of the intensity of staining and the corresponding proportions of stained tumor cells was made. Membrane-associated staining was recorded for each sample. In the event that duplicate scores were obtained from one patient, only the highest score was included in the analysis. If only cytoplasmic staining was detected during the evaluation, the final score was zero (0). The intensity and homogeneity of each sample was reported as described in the table below. The intensity and distribution pattern of the staining was assessed in comparison to control IgG staining (non-specific). Intensity was scored on a scale of 0 to 3 (0=no staining, 1=weak, 2=moderate, and 3=strong) and distribution was rated as focal (<25% stained cells), heterogeneous (25-75% stained cells), and homogeneous (>75% stained cells). In normal tissue, only certain substructures were considered when calculating intensity and proportion.

- 27 041061- 27 041061

ИГХ система оценки, состоящая из весов интенсивности и равномерностиIHC scoring system consisting of intensity and uniformity weights

Интенсивность (количество окрашивающего средства) Intensity (amount of coloring agent) Наблюдаемая интенсивность Observed intensity Категория интенсивности Category of intensity Оценка интенсивности Intensity score 0 0 Негативная Negative 0 0 0-1 0-1 Очень слабая Very weak 1 1 1 1 Слабая Weak 1-2 1-2 Слабая до умеренной Weak to moderate 2 2 2 2 Умеренная Moderate 2-3 2-3 Умеренная до сильной Moderate to strong 3 3 3 3 Сильная strong Однородность (процент только окрашенных мембран клеток) Uniformity (percentage of cell membranes only stained) 0 0 Негативная Negative Фокальная Focal <25% <25% Неоднородная (гетерогенная) Heterogeneous (heterogeneous) 25-75% 25-75% Однородная (гомогенная) Homogeneous (homogeneous) > 75% > 75%

ФФЗП образцы были получены из микромассивов опухоли, а также блоки человеческих тканей из семи различных опухолей, как описано ниже.FFZP samples were obtained from tumor microarrays, as well as human tissue blocks from seven different tumors, as described below.

- 28 041061- 28 041061

ФФЗП тестовые образцы: фрагменты тканевых блоковFFZP test samples: fragments of tissue blocks

Анатомическая область Anatomical region Поставщик Provider № в каталоге catalog no. Код Code Количество образцов на одного пациента Number of samples per patient Общее количество пациентов Total number of patients Почка Bud Pantomics pantomics Kiel501 Kiel501 PT- ARR- KID- 122711- 1 PT- ARR- KID- 122711- 1 2 2 69 69 Легкое Lung Pantomics pantomics LUC 1501 LUC 1501 PT- ARR- LNG- 122711- 1 PT- ARR- LNG- 122711- 1 2 2 70 70 Легкое Lung Tristar Tristar 69571059/TA1249 69571059/TA1249 PT- ARR- OVA- 122711- 1 PT- ARR- OVA- 122711- 1 1 1 110 110 Яичник Ovary Biochain biochain T8235725-5 T8235725-5 PT- ARR- OVA- 122111- 1 PT- ARR- OVA- 122111- 1 1 1 62 62 Яичник Ovary Pantomics pantomics OVC1501 OVC1501 PT- ARR- OVA- 122711- 1 PT- ARR- OVA- 122711- 1 2 2 70 70 Яичник Ovary Tristar Tristar 69571091/TA1322 69571091/TA1322 PT- ARR- OVA- 010912- PT- ARR- OVA- 010912- 2 2 96 96

1 1 Матка (Эндометрий) Uterus (Endometrium) Pantomics pantomics EMC 1501 EMC 1501 РТ- ARR- ЕМЕ- 122711- 1 RT- ARR- EME- 122711- 1 2 2 70 70 Различные органы Various bodies Pantomics pantomics MTU481 MTU481 РТ- ARR- 122711- 1 RT- ARR- 122711- 1 1 1 48 48

- 29 041061- 29 041061

ФФЗП тестовые образцы: срезы целикомFFZP test specimens: whole sections

Орган Organ Код Code Источник Source Диагноз (из документации источника) Diagnosis (from source documentation) Яичник Ovary 1 1 Неизвестный Unknown аденокарцинома эндометрия endometrial adenocarcinoma 2 2 Proteogenex Proteogenex аденокарцинома эндометрия endometrial adenocarcinoma 3 3 CHTN CHTN аденокарцинома смешанного типа со свойствами аденокарциномы эндометрия, серозной и светлоклеточной adenocarcinoma of mixed type with properties of endometrial adenocarcinoma, serous and clear cell 4 4 CHTN CHTN аденокарцинома высокой степени дифференцировки смешанного типа с областями папиллярных, серозных, эндометриоидных и светлых клеток mixed type high-grade adenocarcinoma with areas of papillary, serous, endometrioid, and clear cells 5 5 CHTN CHTN серозная аденокарцинома папиллярного типа papillary serous adenocarcinoma type 6 6 Proteogenex Proteogenex серозная аденокарцинома serous adenocarcinoma 7 7 Proteogenex Proteogenex серозная аденокарцинома папиллярного типа papillary serous adenocarcinoma type 8 8 Proteogenex Proteogenex серозная аденокарцинома папиллярного типа papillary serous adenocarcinoma 9 9 CHTN CHTN серозная аденокарцинома папиллярного типа papillary serous adenocarcinoma type 10 10 Proteogenex Proteogenex серозная аденокарцинома папиллярного типа papillary serous adenocarcinoma type Легкое Lung 1 1 CHTN CHTN слабо дифференцированная аденокарцинома poorly differentiated adenocarcinoma 2 2 CHTN CHTN ацинарная аденокарцинома, хорошо дифференцированная, со свойствами бронхиолоальвеолярной acinar adenocarcinoma, well differentiated, with bronchial-alveolar properties 3 3 CHTN CHTN аденокарцинома с муцинозными свойствами adenocarcinoma with mucinous properties 4 4 CHTN CHTN аденокарцинома adenocarcinoma 5 5 CHTN CHTN аденокарцинома adenocarcinoma 6 6 CHTN CHTN аденокарциномы (бронхиолоальвеолярная) карцинома adenocarcinoma (bronchioloalveolar) carcinoma 7 7 CHTN CHTN аденокарцинома adenocarcinoma

8 8 CHTN CHTN аденокарцинома, умеренно дифференцированная, со свойствами светлоклеточной adenocarcinoma, moderately differentiated, with clear cell properties 9 9 CHTN CHTN аденокарцинома adenocarcinoma 10 10 CHTN CHTN плоскоклеточный рак squamous cell carcinoma

Клетки (опухолевые клетки или трансфицированные клетки) были зафиксированы формалином и залиты парафином (ФФЗП). При определении с помощью проточной цитометрии, ФФЗП клеточные конгломераты образцов показали различные диапазоны экспрессии FOLR1. В этом исследовании также были использованы нормальные человеческие ткани для положительного и отрицательного контроля и дляCells (tumor cells or transfected cells) were fixed with formalin and embedded in paraffin (FFZP). When determined by flow cytometry, FFZP cell conglomerates of the samples showed different ranges of FOLR1 expression. In this study, normal human tissues were also used as positive and negative controls and for

- 30 041061 анализа специфичности. Конгломераты клеток показали различные уровни FOLR1, соответствующие оценки приведены ниже. В конгломератах клеток наблюдалась слабая корреляция между оценками окрашивания и соответствующими уровнями экспрессии FOLR1 (связанных антител на клетку, САК, определяется с помощью калиброванной проточной цитометрии). Например оценка 1-3 неоднородная была дана для SW620 и IGROV-1, показавших значения САК 40098 и 565481, соответственно. Кроме того, клетки Hela показали значение САК 1,5 млн при оценке 2-3 неоднородная, в то время как 300.19/FR1 показали значение САК 830003 при высокой оценке - 3 однородная.- 30 041061 specificity analysis. Cell conglomerates showed different levels of FOLR1, the corresponding scores are given below. In cell conglomerates, a weak correlation was observed between staining scores and corresponding levels of FOLR1 expression (bound antibodies per cell, BAA, determined by calibrated flow cytometry). For example, a score of 1-3 non-uniform was given for SW620 and IGROV-1, showing SAH values of 40098 and 565481, respectively. In addition, Hela cells showed a BAH value of 1.5 million with a score of 2-3 heterogeneous, while 300.19/FR1 showed a BAH value of 830003 with a high score of 3 homogeneous.

Окончательные оценки для клеточных конгломератов при концентрации исследуемого препарата 1,9 мкг/млFinal scores for cell conglomerates at 1.9 µg/mL study drug concentration

Клеточная линия cell line Значение САК SAH value Оценка окрашивания Staining score SW620 SW620 40098 40098 1-3 неоднородная 1-3 heterogeneous T47D T47D 97576 97576 1-2 неоднородная 1-2 heterogeneous IGROV-1 IGROV-1 565481 565481 1-3 неоднородная 1-3 heterogeneous 300,19 / FR1 300.19/FR1 830003 830003 3 однородная 3 homogeneous HELA HELA 1500587 1500587 2-3 неоднородная 2-3 heterogeneous КВ HF 4000000 4000000 3 однородная 3 homogeneous

^аПолученное значение САК представляет собой среднее значение связанных антител на клетку в популяции клеток и определяется следующим образом: используется концентрация 1,0х 10^-8 М анти-FOLR1-PE (1:1) для определения значений САК соответствующей линии клеток посредством способов проточной цитометрии и Quantibrite™ Beads (BD Biosciences). ^a The calculated BAC value is the average value of bound antibodies per cell in the cell population and is determined as follows: a concentration of 1.0 x 10 ^-8 M anti-FOLR1-PE (1:1) is used to determine the BAC values of the respective cell line by flow cytometry methods and Quantibrite™ Beads (BD Biosciences).

Гистограммы проточной цитометрии показывают распределение клеток по сравнению с числом анти-FOLRI связей на клетку (уровень экспрессии FOLR1). И гистограммы, и соответствующие результаты ИГХ окрашивания показывают, что каждая из этих клеточных линий включает гетерогенную популяцию клеток, обладающих широким диапазоном экспрессии FOLR1. Исключением является клеточная линия 300.19/FR1, показавшая и равномерную гистограмму проточной цитометрии, и оценки ИГХ окрашивания. Эти данные свидетельствуют о том, что клеточные линии, экспрессирующие FOLR1 более равномерно, показывают более точную корреляцию между значениями САК и соответствующими оценками окрашивания. Хотя анализ показал положительное окрашивание всех FOLRI-позитивных контрольных конгломератов клеток, существует лишь слабая корреляция между оценкой окрашивания и соответствующими уровнями экспрессии FOLR1 большинства этих конгломератов клеток. Таким образом, клеточные конгломераты этой группы не могут быть идентифицированы как контрольные образцы с высокой, средней и низкой экспрессией. Типичные фотоизображения и гистограммы, показывающие экспрессию FOLR1 в клеточных линиях, определенную с помощью ИГХ и проточной цитометрии приведены на фиг. 13.Flow cytometry histograms show cell distribution versus the number of anti-FOLRI bonds per cell (FOLR1 expression level). Both the histograms and the corresponding IHC staining results show that each of these cell lines includes a heterogeneous population of cells with a wide range of FOLR1 expression. An exception is the 300.19/FR1 cell line, which showed both a uniform flow cytometry histogram and IHC staining scores. These data suggest that cell lines expressing FOLR1 more uniformly show a more accurate correlation between SAH values and corresponding staining scores. Although the assay showed positive staining for all FOLRI-positive control cell clumps, there was only a weak correlation between staining score and corresponding FOLR1 expression levels for most of these cell clumps. Thus, cell conglomerates of this group cannot be identified as controls with high, medium, and low expression. Representative photographic images and histograms showing FOLR1 expression in cell lines as determined by IHC and flow cytometry are shown in FIG. 13.

Для определения условий анализа был испытан диапазон разбавлений тестируемого и контрольного препарата с тем, чтобы выбрать разбавления, соответствующие требуемому уровню чувствительности. Эксперименты проводили на панели ФФЗП образцов, включая FOLR1-позитивные конгломераты клеток и фрагменты тканевых блоков, и ТМА, состоящие из FOLR1 положительных и отрицательных нормальных тканей (надпочечников (коры/мозгового вещества), молочной железы (протоков и долек/соединительной ткани), фаллопиевых труб (поверхностного эпителия/мышечной стенки), почек (канальцев/клубочков), легких (пневмоцитов I/II типа/межальвеолярной соединительной ткани), поджелудочной железы (каналов/островков Лангерганса), слюнных желез (каналов/стромы), кожи (потовых желез/эпидермиса), желудка (поверхностного эпителия/подслизистой)), и целых срезов опухолевых тканей (10 образцов опухолей яичников и 10 образцов опухолей легких). Каждый образец окрашивали с помощью серийных разбавлений концентрации тестируемого препарата (0,25, 0,5, 0,9, 1,9, 3,8 и 7,5 мкг/мл) или концентрации контрольного препарата 1,9 мкг/мл и 3,8 мкг/мл. Относительные интенсивности окрашивания для каждого разбавления сравнивались для каждого образца для определения оптимальной степени разбавления. Критерием для оптимальной степени разбавления было разбавление, которое 1) не вызывало окрашивания фона в окрашенных образцах с изотипическим контролем 2) не вызывало окрашивания ткани образца для отрицательного контроля, окрашенного тестовым препаратом и 3) показывало различие между разными уровнями ассоциированной с мембранами экспрессии FOLR1 среди образцов, представляющих интерес (ФФЗП ткани опухоли яичников, опухоли эндометрия, НМРЛ и опухоли почки). Из пяти разбавлений тестируемого препарата концентрация 1,9 мкг/мл показала лучший динамический диапазон результатов окрашивания посредством автоматизированных протоколов Leica Bond RX (Протоколы термической обработки и депарафинизирования, протокол HIER посредством ER2 в течение 20 минут и протокол ИГХ окрашивания F с дополнительной промывкой).To determine the assay conditions, a range of test and control dilutions were tested in order to select the dilutions corresponding to the required level of sensitivity. Experiments were performed on a panel of FFZP samples, including FOLR1-positive cell conglomerates and fragments of tissue blocks, and TMAs consisting of FOLR1 positive and negative normal tissues (adrenals (cortex/medulla), breast (ducts and lobules/connective tissue), fallopian tubes (surface epithelium/muscular wall), kidneys (tubules/glomeruli), lungs (type I/II pneumocytes/interalveolar connective tissue), pancreas (canals/islets of Langerhans), salivary glands (canals/stromas), skin (sweat glands /epidermis), stomach (surface epithelium/submucosal)), and whole sections of tumor tissue (10 ovarian tumors and 10 lung tumors). Each sample was stained with serial dilutions of test drug concentration (0.25, 0.5, 0.9, 1.9, 3.8, and 7.5 µg/mL) or control drug concentration of 1.9 µg/mL and 3 .8 µg/ml. The relative staining intensities for each dilution were compared for each sample to determine the optimal dilution. The criterion for optimal dilution was a dilution that 1) did not cause background staining in the stained isotype control samples, 2) did not stain the tissue of the negative control sample stained with the test preparation, and 3) showed a difference between different levels of membrane-associated FOLR1 expression among the samples of interest (FFZP tissue ovarian tumors, endometrial tumors, NSCLC and kidney tumors). Of the five dilutions of the test preparation, the concentration of 1.9 µg/ml showed the best dynamic range of staining results using Leica Bond RX automated protocols (Heat and dewaxing protocols, HIER protocol with ER2 for 20 minutes, and IHC staining F protocol with additional wash).

Пример 9.Example 9

Идентификация и характеристика контрольных образцов, характеризующих динамический диапаIdentification and characterization of control samples characterizing the dynamic range

- 31 041061 зон анализа автоматизированных способов окрашивания Контроль качества: нормальные человеческие ткани слюнной железы, легких и поджелудочной железы были определены, как ткани для положительного контроля, используемые в каждом анализе, чтобы убедиться, что процедура окрашивания выполняется, как ожидалось. Нормальные ткани пищевода человека были идентифицированы в качестве отрицательного контроля. Эти контрольные образцы были охарактеризованы следующим образом: для того, чтобы обеспечить контроль, который охватывает динамический диапазон анализа, матричный мультитканевый блок (ММБ), состоящий из нескольких FOLR1 положительных и отрицательных образцов нормальной ткани должен обладать динамическим диапазоном анализа, использованного в качестве анализа проверки контроля во время фаз оптимизации и валидации. Четыре типа нормальных тканей с определенными структурами в этом ММБ были определены как соответствующие виды контроля для анализа следующим образом: дыхательный эпителий нормального человеческого легкого (оценка 2, однородная); протоки нормальной поджелудочной железы человека (оценка 3, однородная, апикальное окрашивание); промежуточные протоки нормальной человеческой слюнной железы (оценка 1-2 неоднородная) и нормальная ткань человеческого пищевода (оценка 0). Всего было проведено более 4 анализов, соответствующие контрольные анализы этого ММБ дали идентичные результаты. Эти результаты показывают, что выбранный контрольный образец дает устойчивые результаты и охватывает динамический диапазон анализа.- 31 041061 analysis zones of automated staining methods Quality control: normal human salivary gland, lung and pancreas tissues were identified as positive controls used in each assay to ensure that the staining procedure performed as expected. Normal tissues of the human esophagus were identified as a negative control. These controls were characterized as follows: in order to provide a control that spans the dynamic range of the assay, a matrix multitissue block (MTB) consisting of multiple FOLR1 positive and negative normal tissue samples must have the dynamic range of the assay used as the control validation assay. during the optimization and validation phases. Four types of normal tissues with defined structures in this MMB were identified as relevant controls for analysis as follows: respiratory epithelium of a normal human lung (score 2, uniform); normal human pancreatic ducts (score 3, uniform, apical staining); intermediate ducts of normal human salivary gland (score 1-2 heterogeneous) and normal tissue of the human esophagus (score 0). In total, more than 4 analyzes were carried out, the corresponding control analyzes of this MMB gave identical results. These results show that the selected control sample gives consistent results and covers the dynamic range of the assay.

Структуры в нормальных тканях, определенные в качестве контроля, охватывающего динамический диапазон анализаStructures in normal tissues defined as a control spanning the dynamic range of the assay

Нормальный орган normal organ Суб-структура Sub-structure Оценка окрашивания (контрольный препарат) Staining assessment (control preparation) Оценка окрашивания (тестируемый препарат) Staining assessment (test preparation) Пищевод Esophagus Все структуры All structures 0(отрицательная) 0(negative) 0(отрицательная) 0(negative) Слюнная железа Salivary gland Промежуточные протоки Intermediate ducts 0 (отрицательная) 0 (negative) 1-2 неоднородная 1-2 heterogeneous Легкое Lung Дыхательный эпителий Respiratory epithelium 0(отрицательная) 0(negative) 2 однородная 2 homogeneous Поджелудочная железа pancreas gland Протоки ducts 0(отрицательная) 0(negative) 3 однородная, апикальное окраш. 3 uniform, apical stain.

Апикальное окрашивание определяется как поляризованное неоднородное окрашивание мембраны. Пример 10.Apical staining is defined as polarized inhomogeneous staining of the membrane. Example 10

Анализ эффективности автоматизированного способа окрашивания.Analysis of the effectiveness of the automated staining method.

Использование данного анализа позволяет специфически обнаружить воспроизводимость FOLR1 и с соответствующей чувствительностью дифференцировать различные уровни и единообразие ассоциированной с мембранами экспресии FOLR1 (оптимальный динамический диапазон) ФФЗП тканей опухоли яичников, эндометрия, НМРЛ и почек. Таким образом, критериями эффективности считаются специфичность, воспроизводимость и чувствительность.The use of this assay makes it possible to specifically detect the reproducibility of FOLR1 and, with appropriate sensitivity, to differentiate the different levels and uniformity of membrane-associated FOLR1 expression (optimal dynamic range) of FFZP in ovarian, endometrial, NSCLC, and kidney tumor tissues. Thus, specificity, reproducibility and sensitivity are considered to be performance criteria.

Специфичность и чувствительность анализа оценивали путем сравнения окрашивания нормальных тканей с изучением результатов анализа, сообщавшихся ранее. Результаты окрашивания в этом исследовании были сопоставлены с соответствующими результатами окрашивания Scorer et al 2010 (A Full Immunohistochemical Evaluation of a Novel Monoclonal Antibody to Folate Receptor - alpha. The Novocastra Journal of Histopathology, REAGENTS: 2010(3):8-12, describing the same antibody clone BN3.2) с ФФЗП нормальной ткани и из исследования кросс-реактивности тканей (КРТ) посредством IMGN853 (huMov19 (M9346A) антител) на свежезамороженной нормальной ткани (ImmunoGen Report IMH28-003). Сравнение результатов окрашивания для каждого способа свидетельствует, что три анализа показали в целом аналогичные нормальные профили окрашивания тканей с различной относительной чувствительностью. Анализ Scorer оказался наименее чувствительным, анализ из исследования (IMH28-011) обладал промежуточной чувствительностью, способ исследования КРТ являлся наиболее чувствительным. Некоторые структуры показали положительное окрашивание только при использовании двух более чувствительных способов (анализа из исследования и КРТ анализа). Не было ни одного примера положительного окрашивания в наименее чувствительном анализе Scorer, который также не был положительным в анализе из исследования и при использовании способа КРТ. Данные результаты показывают, что специфичность и чувствительность анализа из исследования является подходящей для оценки FOLR1 экспрессии в нормальных тканях.The specificity and sensitivity of the assay was assessed by comparing the staining of normal tissues with an examination of the assay results reported previously. Staining results in this study were compared with corresponding staining results Scorer et al 2010 (A Full Immunohistochemical Evaluation of a Novel Monoclonal Antibody to Folate Receptor - alpha. The Novocastra Journal of Histopathology, REAGENTS: 2010(3):8-12, describing the same antibody clone BN3.2) from normal tissue FFZP and from a tissue cross-reactivity (CRT) study with IMGN853 (huMov19 (M9346A) antibodies) on fresh frozen normal tissue (ImmunoGen Report IMH28-003). Comparison of the staining results for each method indicates that the three analyzes showed generally similar normal tissue staining profiles with different relative sensitivities. The Scorer assay was the least sensitive, the assay from the study (IMH28-011) had intermediate sensitivity, and the CRT assay was the most sensitive. Some structures showed positive staining only when using two more sensitive methods (analysis from the study and CRT analysis). There was not a single example of positive staining in the least sensitive Scorer assay, which was also not positive in the assay from the study and using the CRT method. These results indicate that the specificity and sensitivity of the assay from the study is appropriate for assessing FOLR1 expression in normal tissues.

Специфичность и чувствительность анализа из исследования дополнительно характеризуется окThe specificity and sensitivity of the assay from the study is further characterized by approx.

- 32 041061 рашиванием и оценкой панели опухолевых ММБ, состоящей из клеток рака яичников, эндометрия, НМРЛ и рака почки (набор образцов предназначен для клинического использования анализа). Положительное окрашивание последовательно локализовалось в опухолевой ткани с прилегающими компонентами нормальной ткани, включая строму, сосуды, лимфоциты и нормальные ткани органа. Окрашивание было отрицательным или положительным, как и ожидалось. Для каждого подтипа карциномы яичника или НМРЛ распределение оценок окрашивания между ММБ различных производителей показало аналогичное распределение оценок, наводящее на мысль, что данный способ не чувствителен к различным условиям фиксации и обработки. Поскольку модели распределения среди ММБ были подобны, данные из различных блоков были объединены и оценки были классифицированы. Итоговые оценки для подтипов опухоли, включающие 20 или более образцов на подтип перечислены в следующих таблицах. Как показано в этих таблицах, динамический диапазон оценок отмечается для каждого типа опухоли и указывает, что этот анализ демонстрирует соответствующую чувствительность к различению разных уровней и различных видов однородности окрашивания экспрессии FOLR1, ассоциированной с мембранами в тканях опухоли яичников, эндометрия, НМРЛ и почек. Типичные фотоизображения серозной карциномы яичников, эндометриоидной карциномы яичников, НМРЛ, рака эндометрия и почечноклеточной карциномы показаны на фиг. 14-18. Дополнительные фотографии, пригодные, например, для руководства по окрашиванию или диагностического набора, показаны на фиг. 23-25. Данные исследования показывают, что анализ является специфичным и обладает соответствующей чувствительностью для использования в качестве диагностического реагента или его дополнения.- 32 041061 expansion and evaluation of a panel of tumor MMBs consisting of ovarian, endometrial, NSCLC, and kidney cancer cells (sample set intended for clinical use of the assay). Positive staining was consistently localized in tumor tissue with adjacent normal tissue components, including stroma, vessels, lymphocytes, and normal tissues of the organ. Staining was negative or positive as expected. For each subtype of ovarian carcinoma or NSCLC, the distribution of stain scores between MMBs from different manufacturers showed a similar distribution of scores, suggesting that the method is not sensitive to different fixation and processing conditions. Because the distribution patterns among MMBs were similar, data from different blocks were pooled and scores were classified. Summary scores for tumor subtypes, including 20 or more specimens per subtype, are listed in the following tables. As shown in these tables, the dynamic range of scores is noted for each tumor type and indicates that this assay demonstrates appropriate sensitivity to distinguish between different levels and different patterns of stain uniformity in membrane-associated FOLR1 expression in ovarian, endometrial, NSCLC, and renal tumor tissues. Representative photographic images of serous ovarian carcinoma, endometrioid ovarian carcinoma, NSCLC, endometrial cancer, and renal cell carcinoma are shown in FIG. 14-18. Additional photographs suitable for example for a staining guide or diagnostic kit are shown in FIG. 23-25. These studies show that the assay is specific and has appropriate sensitivity for use as a diagnostic reagent or as an adjunct.

Итоговые оценки окрашивания преобладающих подтипов опухолей яичниковSummary Staining Estimates of Predominant Subtypes of Ovarian Tumors

Подтип Subtype Номер образца (%) Sample number (%) Всего Total >3 неодн. 1) >3 more than one 1) >2 неодн. 1) >2 more than one 1) > 1 неодн. 1) > 1 more than one 1) 1-3 фокальн. 1-3 focal Любой положит. Anyone put. Отриц. Negative Эндометриоидный endometrioid 35 35 15 15 18 18 20 20 6 6 26 26 9 9 (100) (100) (43) (43) (51) (51) (57) (57) (17) (17) (74) (74) (26) (26) Муцинозный mucinous 29 29 2 2 4 4 5 5 0 0 5 5 24 24 (ЮО) (YuO) (Ό (Ό (14) (14) (17) (17) (0) (0) (17) (17) (83) (83) Серозный Serous 129 129 44 44 92 92 92 92 8 8 100 100 29 29 (ЮО) (YuO) (34) (34) (71) (71) (71) (71) (6) (6) (78) (78) (22) (22)

i) Фокальный характер окрашивания был исключенi) Focal staining has been excluded

Итоговые оценки окрашивания опухоли НМРЛSummary scores of NSCLC tumor staining

Тип Type Подтип Subtype Номер образца (%) Sample number (%) Всег о Total >3 неодн. 1) >3 more than one 1) >2 неодн 1) >2 not one 1) >1 неодн 1) >1 not one 1) 1-3 фокаль н. 1-3 focal n. Любой положи Any put Отри ц. Reject c. Аденокарцинома Adenocarcinoma Все ^в All ⁱⁿ 67 67 17 17 39 39 42 42 5 5 47 47 20 20 (ЮО) (YuO) (25) (25) (58) (58) (63) (63) (7) (7) 70 70 30 thirty Брон- хиоло- альвео- лярная Bron- hyolo- alveo- polar 7 7 2 2 5 5 5 5 0 0 5 5 2 2 (100) (100) (29) (29) (71) (71) (71) (71) (0) (0) (71) (71) (29) (29) Плоскокле- точный рак flat glue precise cancer Все All 74 74 1 1 4 4 6 6 6 6 12 12 62 62 (100) (100) (1) (1) (5) (5) (8) (8) (8) (8) (16) (16) (84) (84)

^Фокальный характер окрашивания был исключен^Focal staining was excluded

Включены все образцы аденокарциномы, за исключением указанного типа образцов бронхиолоальвеолярной карциномы.All adenocarcinoma specimens are included except for the indicated type of bronchioloalveolar carcinoma specimens.

- 33 041061- 33 041061

Итоговые оценки окрашивания для аденокарциномы эндометрия и светлоклеточного рака почкиSummary Staining Scores for Endometrial Adenocarcinoma and Clear Cell Renal Carcinoma

Тип / подтип опухоли Type / subtype of tumor Количество образцов (%) Number of Samples (%) Всего Total >3 неодн. 1) >3 more than one 1) >2 неодн. 1) >2 more than one 1) > 1 неодн. 1) > 1 more than one 1) 1-3 фокальн. 1-3 focal Любой положит. Anyone put. Отриц. Negative Эндометрий / аденокарциномы Endometrium / adenocarcinomas 58 58 5 5 23 23 30 thirty 10 10 40 40 18 18 (ЮО) (YuO) (9) (9) (40) (40) (52) (52) (17) (17) (69) (69) (31) (31) Почки/ Светлоклеточный рак Kidneys/ clear cell cancer 34 34 0 0 9 9 23 23 6 6 29 29 5 5 (ЮО) (YuO) (0) (0) (26) (26) (68) (68) (18) (18) (85) (85) (15) (15)

Фокальный характер окрашивания был исключен.Focal staining was excluded.

Точность анализа исследования изучали путем выполнения теста внутренней и внешней воспроизводимости анализа посредством трех ФФЗП образцов опухоли ткани яичников, НМРЛ или рака почки, где каждый образец показывал высокую, среднюю или низкую оценки. Для оценки внутренней воспроизводимости девять стекол, каждое из которых содержало срез опухоли легкого, яичника и почки были помещены в девять случайных мест на Leica Bond RX. Для оценки внешней воспроизводимости три стекла, содержащих срезы одного и того же образца окрашивали в три различных дня. Все стекла после проведения экспериментов внутренней и внешней воспроизводимости были оценены и показали эквивалентные оценки окрашивания для каждого соответствующего образца: опухоль легких (высокая: 3 однородная), опухоль яичников (средняя: 2 неоднородная) и опухоль почки (низкая: 1-2 неоднородная). Полученные данные демонстрируют воспроизводимость для разных типов тканей с низким, средним и высоким уровнем экспрессии.The accuracy of the study analysis was studied by performing an internal and external reproducibility test of the analysis on three FFZP samples of ovarian tumor tissue, NSCLC, or kidney cancer, where each sample showed a high, medium, or low score. To assess internal reproducibility, nine slides, each containing a section of a lung, ovary, and kidney tumor, were placed at nine random locations on a Leica Bond RX. To assess external reproducibility, three slides containing sections of the same sample were stained on three different days. All slides from internal and external reproducibility experiments were evaluated and showed equivalent staining scores for each respective sample: lung tumor (high: 3 uniform), ovarian tumor (medium: 2 heterogeneous), and kidney tumor (low: 1-2 heterogeneous). The obtained data demonstrate reproducibility for different types of tissues with low, medium and high levels of expression.

Пример 11.Example 11.

Экспрессия FOLR1 с ИГХ оценкой >2 гетерогенная является критерием отбора пациентов для лечения с применением IMGN853.Expression of FOLR1 with an IHC score of >2 heterogeneous is a criterion for selecting patients for treatment with IMGN853.

Уровни экспрессии FOLR1 опухолевых клеточных линий были определены посредством конъюгата антитело-РЕ (FR1-24-PE) и системы QuantiBRITE. Три клеточных линии карциномы яичников (IGROV1, Skov-3 и Ovcar-3), линия клеток хориокарциномы Jeg-3 и клеточная линия карциномы шейки матки KB были включены в исследование. Для того чтобы получить заслуживающие доверия значения САК, эксперименты по связыванию с конъюгатом антитело-РЕ следует проводить при насыщающей концентрации (концентрации, при которой все доступные сайты связывания заняты конъюгатом). Для определения такой концентрации для конъюгатов FR1-24-PE мы провели эксперименты по связыванию на панели FOLRl-позитивных клеточных линий с различными уровнями экспрессии FOLR1. Клетки инкубировали с FR1-24-PE конъюгатом в широком диапазоне концентраций в течение двух часов на льду, промывали ФАС-буфером (ФСБ с 1% БСА), фиксировали 1% формальдегидом в ФСБ и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur. При концентрации 1 х10^-8 М конъюгат насыщает сайты связывания на клеточной поверхности всех протестированных линий клеток Igrov-1, Jeg-3, Skov-3, Ovcar-3 и KB. В последующих экспериментах на связывание FR1-24-PE и определение САК, конъюгаты использовались в концентрации 1 х 10^-8 М. Каждый образец поддавался троекратному анализу, на каждой клеточной линии выполнялось несколько независимых экспериментов. Самые высокие значения экспрессии были обнаружены на клетках KB со значением САК приблизительно 4000000±3000000, затем шли клеточные линии IGROV-1 и Jeg-3 со значениями САК 4000000±85000 и 150000±75000, соответственно. Две клеточных линии, Skov-3 и Ovcar-3 показали низкий уровень экспрессии FOLR1, 20000±10000 и 7000±4000 САК соответственно. Значительные изменения значений САК от эксперимента к эксперименту наблюдали для клеточной линии Jeg-3, где значения САК варьировали от 40000 до 300000. Эта вариабельность скорее всего отражает некоторые биологические свойства клеточной линии, а не вариабельность анализа, так как значения САК, полученные для других проанализированных клеточных линий были гораздо менее вариабельны (см. табл. ниже).The expression levels of FOLR1 tumor cell lines were determined using the antibody-PE conjugate (FR1-24-PE) and the QuantiBRITE system. Three ovarian carcinoma cell lines (IGROV1, Skov-3, and Ovcar-3), the Jeg-3 choriocarcinoma cell line, and the KB cervical carcinoma cell line were included in the study. In order to obtain reliable CAA values, antibody-PE conjugate binding experiments should be performed at saturation concentration (the concentration at which all available binding sites are occupied by the conjugate). To determine this concentration for FR1-24-PE conjugates, we performed panel binding experiments on FOLR1-positive cell lines with different levels of FOLR1 expression. Cells were incubated with FR1-24-PE conjugate in a wide range of concentrations for two hours on ice, washed with FAS buffer (PBS with 1% BSA), fixed with 1% formaldehyde in PBS, and analyzed on a FACSCalibur flow cytometer. At a concentration of 1 x 10 ^-8 M, the conjugate saturates binding sites on the cell surface of all tested cell lines Igrov-1, Jeg-3, Skov-3, Ovcar-3 and KB. In subsequent experiments on FR1-24-PE binding and CAH determination, the conjugates were used at a concentration of 1 x 10 ^-8 M. Each sample was analyzed in triplicate, and several independent experiments were performed on each cell line. The highest expression values were found on KB cells with a CAH value of approximately 4,000,000 ± 3,000,000, followed by the IGROV-1 and Jeg-3 cell lines with CAH values of 4,000,000 ± 85,000 and 150,000 ± 75,000, respectively. Two cell lines, Skov-3 and Ovcar-3 showed a low level of FOLR1 expression, 20000±10000 and 7000±4000 CAA, respectively. Significant changes in BAH values from experiment to experiment were observed for the Jeg-3 cell line, where BAH values varied from 40,000 to 300,000. cell lines were much less variable (see table below).

- 34 041061- 34 041061

Клеточная линия cell line САК (Среднее ± SD, η)'! SAK (Mean ± SD, η)'! Изменения от эксперимента к эксперименту Changes from experiment to experiment Самый высокий зарегистрированный уровень САК The highest recorded level of SAH Самый низкий зарегистрированный уровень САК The lowest recorded level of SAH КВ HF 4000000 ± 300000, 4 4000000 ± 300000, 4 4500000 4500000 3800000 3800000 IGROV-1 IGROV-1 400 000 ± 85 000, 5 400,000 ± 85,000.5 480000 480000 280000 280000 Jeg-3 Jeg-3 150 000 ±75 000, 14 150,000 ±75,000, 14 260000 260000 40000 40000 Skov-3 Skov-3 20 000 ± 10 000 20,000±10,000 28000 28000 10000 10000 Ovcar-3 Ovcar-3 7000 ± 4000 7000±4000 10000 10000 4000 4000

i)SD - стандартное отклонение, n - количество независимых экспериментовi) SD - standard deviation, n - number of independent experiments

Значения САК были определены с помощью анализа на основе ФАС с FR1-24 РЕ-меченными антителами и системы QuantiBRITE. Среднее значение ± стандартное отклонение (SD) было рассчитано для независимых экспериментов.SAH values were determined using a FAS-based assay with FR1-24 PE labeled antibodies and the QuantiBRITE system. The mean ± standard deviation (SD) was calculated for independent experiments.

Активность и специфичность IMGN853 были проанализированы с FOLRI-позитивными клеточными линиями с широким спектром экспрессии FOLR1 (значения САК клеточных линий указаны выше). Кроме того, в эксперименты были включены FOLR1-негативные клеточные линии Namalwa и SW2. IMGN853 показал высокую цитотоксичность против клеток KB с повышенной экспрессией FOLR1 (4000000±300000 САК), Igrov-1 (400000±85000 САК) и Jeg-3 (150000±75000 САК), при этом значения ИК₅₀ составляли 0,10±0,01 нМ, 0,50±0,07 нМ и 1,00±0,05 нМ, соответственно. Активность лизиса клеток в отношении всех трех клеточных линий зависила от FOLR1, так как избыток немодифицированного huMov19 (M9346A) антитела (0,5 мкМ) заметно уменьшал активность конъюгата для типичных неспецифических уровней (от 10 до 20 раз). IMGN853 показал только незначительную активность в отношении слабоэкспрессирующих FOLR1 клеток Skov-3 и Ovcar-3 (20000±10000 и 7000±4000 САК соответственно), а также против FOLR1-негативных клеток Namalwa и SW2, при значениях ИК₅₀, превышающих 2 нМ. Цитотоксическая активность IMGN853 против этих клеточных линий была низкой и не FOLR1зависимой, блокирование huMov19 (M9346A) не затрагивало ее. См. фиг. 19 и 20.The activity and specificity of IMGN853 were analyzed with FOLRI-positive cell lines with a wide spectrum of FOLR1 expression (CAH values of cell lines are indicated above). In addition, FOLR1-negative Namalwa and SW2 cell lines were included in the experiments. IMGN853 showed high cytotoxicity against KB cells overexpressing FOLR1 (4000000±300000 SAH), Igrov-1 (400000±85000 SAH) and Jeg-3 (150000±75000 SAH), while IC ₅₀ values were 0.10±0, 01 nM, 0.50±0.07 nM, and 1.00±0.05 nM, respectively. Cell lysis activity against all three cell lines was FOLR1 dependent, as an excess of unmodified huMov19 (M9346A) antibody (0.5 μM) markedly reduced conjugate activity for typical non-specific levels (10 to 20-fold). IMGN853 showed only negligible activity against weakly FOLR1-expressing Skov-3 and Ovcar-3 cells (20,000 ± 10,000 and 7,000 ± 4,000 SAH, respectively), as well as against FOLR1-negative Namalwa and SW2 cells, with IC ₅₀ values greater than 2 nM. The cytotoxic activity of IMGN853 against these cell lines was low and not FOLR1 dependent, blocking huMov19 (M9346A) did not affect it. See fig. 19 and 20.

ФФЗП образцы, полученные из мышиных моделей ксенотрансплантата опухоли оценивались на FOLR1 положительность, используя оптимизированные и утвержденные способы анализа, описанного выше. Окрашивание не было замечено в опухолевых клетках любого образца ксенотрансплантата, окрашиваемого контрольным препаратом. ФФЗП ткани ксенотрансплантата мыши, полученные из следующих клеточных линий показали такие модели окрашивания: Igrov-1, KB и NCI-H2110 показали однородную модель окрашивание 3-го уровня интенсивности; Ishikawa и Ovcar 3 показали неоднородную модель окрашивание 3-го уровня интенсивностии; LXFA737 показал однородную модель окрашивания с уровнем интенсивности 2; OV-90 показал неоднородную модель с уровнем интенсивности 2, SKOV3 показал отрицательное значение. Типичные фотоизображения ксенотрансплантатов опухоли приведены на фиг. 21 и 22.FFZP samples derived from mouse tumor xenograft models were evaluated for FOLR1 positivity using the optimized and validated assay methods described above. Staining was not seen in the tumor cells of any xenograft sample stained with the control preparation. FFZP of mouse xenograft tissue derived from the following cell lines showed the following staining patterns: Igrov-1, KB and NCI-H2110 showed a uniform intensity level 3 staining pattern; Ishikawa and Ovcar 3 showed a heterogeneous staining pattern at the 3rd intensity level; LXFA737 showed a uniform staining pattern with intensity level 2; OV-90 showed a heterogeneous pattern with intensity level 2, SKOV3 showed a negative value. Representative photographic images of tumor xenografts are shown in FIG. 21 and 22.

- 35 041061- 35 041061

Родительская клеточная линия или фрагмент опухоли Parental cell line or tumor fragment Тип заболевания Type of disease Окончательная оценка Final Score Категория окрашивания Coloring category IGROV-1 IGROV-1 Рак яичников ovarian cancer 1-3 однородная 1-3 uniform 3 однородная 3 homogeneous 1-3 однородная 1-3 uniform 1-3 однородная 1-3 uniform Ishikawa Ishikawa Рак эндометрия Cancer endometrium 2-3 неоднородная 2-3 heterogeneous 3 неоднородная 3 heterogeneous 1-2 неоднородная/ 3 Фокальная 1-2 heterogeneous / 3 Focal 2 неоднородная / 3 Фокальная 2 heterogeneous / 3 Focal 2 неоднородная / 3 Фокальная 2 heterogeneous / 3 Focal КВ HF Рак шейки матки cervical cancer uterus 3 однородная 3 homogeneous 3 однородная 3 homogeneous 3 однородная 3 homogeneous LXFA737 LXFA737 НМРЛ NSCLC 2 однородная 2 homogeneous 2 однородная 2 homogeneous 2 однородная 2 homogeneous NCI-H2110 NCI-H2110 НМРЛ NSCLC 2-3 однородная 2-3 uniform 3 однородная 3 homogeneous 2 однородная 2 homogeneous OV-90 OV-90 Рак яичников ovarian cancer 1-2 неоднородная 1-2 heterogeneous 2 неоднородная 2 heterogeneous отрицательная³ negative ³ OVCAR3 OVCAR3 Рак яичников ovarian cancer 1-3 неоднородная 1-3 heterogeneous 3 неоднородная 3 heterogeneous 1-3 неоднородная 1-3 heterogeneous SKOV-3 SKOV-3 Рак яичников ovarian cancer Отриц. Negative Отриц. Negative Отриц. Negative

Порог окрашивания (>2 неоднородная) требует минимального уровня экспрессии (интенсивность окрашивания) и минимального распределения окрашивания (процент опухолевых клеток, экспрессирующих FOLR1). Доклинические данные предоставляют обоснование для этого порога у карциномы яичников. Образцы опухоли мышиного ксенотрансплантата с баллами ИГХ >2 неоднородная показали чувствительность к IMGN 853 в условиях in vivo. ФФЗП образцы, полученные из мышиных моделей ксенотрансплантата опухоли оценивались на FOLR1 положительность, используя оптимизированные и утвержденные способы анализа, описанного выше. Две модели ксенотрансплантата карциномы яичников OVCAR-3 и IGROV-1 показали неоднородное или однородное окрашивания 3-го уровня интенсивности. Модель ксенотрансплантата, полученная из клеток карциномы яичников OV-90 показала неоднородное окрашивание с оценкой уровня интенсивности 2; модель карциномы яичников Skov-З оказалась FOLR1отрицательной. Высокая активность EVIGN853 была проявлена на двух моделях яичников с уровнем 3 FOLR1 интенсивности, активность OV-90 модели составила 2 уровень FOLR1 интенсивности. Skov-3 модель не показывала никакой активности. Модели ксенотрансплантата оценивали также для других заболеваний, включая легкие, эндометрию и опухоли шейки матки, и, хотя была обнаружена корреляцияA staining threshold (>2 inhomogeneous) requires a minimum level of expression (staining intensity) and a minimum distribution of staining (percentage of tumor cells expressing FOLR1). Preclinical data provide a rationale for this threshold in ovarian carcinoma. Mouse xenograft tumor samples with IHC scores >2 heterogeneous showed sensitivity to IMGN 853 in vivo. FFZP samples derived from mouse tumor xenograft models were evaluated for FOLR1 positivity using the optimized and validated assay methods described above. The two ovarian carcinoma xenograft models OVCAR-3 and IGROV-1 showed heterogeneous or uniform staining at level 3 intensity. A xenograft model derived from OV-90 ovarian carcinoma cells showed heterogeneous staining with an intensity level score of 2; the Skov-3 ovarian carcinoma model was FOLR1-negative. High activity of EVIGN853 was shown in two ovarian models with FOLR1 intensity level 3, the activity of OV-90 model was FOLR1 intensity level 2. The Skov-3 model did not show any activity. Xenograft models have also been evaluated for other diseases, including lung, endometrial, and cervical tumors, and although a correlation has been found

-36041061 между активностью и FOLR1 оценкой окрашивания, должны быть проверены дополнительные образцы.-36041061 between activity and FOLR1 staining score, additional samples should be tested.

Чувствительность модели ксенотрансплантата опухолей яичников к EVIGN853 против уровня экспрессии FOLR1.Sensitivity of the ovarian tumor xenograft model to EVIGN853 against the level of FOLR1 expression.

Ксенотрансплантат Xenograft Активность in vivo (5 мг/кг IMGN853, разовая доза) In vivo activity (5 mg/kg IMGN853, single dose) Оценка интенсивности, тип распределения Intensity estimation, type of distribution OVCAR3 OVCAR3 Высокая активность high activity 3 неоднородная 3 heterogeneous IGROV-1 IGROV-1 Высокая активность high activity 3 однородная 3 homogeneous OV-90 OV-90 Активность Activity 2 неоднородная 2 heterogeneous SKOV-3 SKOV-3 Неактивный Inactive Негативный результат Negative result

Чувствительность модели ксенотрансплантата опухолей к IMGN853 против уровня экспрессии FOLR1Sensitivity of tumor xenograft model to IMGN853 versus FOLR1 expression level

Ксенотрансплантат xenograft Тип опухоли Type of tumor Активность in vivo (5 мг/кг IMGN853, разовая доза) In vivo activity (5 mg/kg IMGN853, single dose) Оценка интенсивности, тип распределения Intensity estimation, type of distribution NCI-H2110 NCI-H2110 НМРЛ NSCLC Высокая активность high activity 3 однородная 3 homogeneous Ishikawa Ishikawa Эндометрия endometrium Препарат неактивный The drug is inactive 2 однородная 2 homogeneous КВ HF Шейки матки Cervix Высокая активность high activity 3 однородная 3 homogeneous

Все публикации, патенты, патентные заявки, интернет-сайты и инвентарные номера/базы данных последовательностей (включая полинуклеотидные и полипептидные последовательности), приведенные в данном документе, включены путем ссылки во всей их полноте для всех целей и в такой же степени, как если бы о каждой отдельной публикации, патенте, патентной заявке, интернет-сайте или инвентарном номере/последовательности базы данных было специально и отдельно указано, что они применяются в качестве ссылки.All publications, patents, patent applications, internet sites and sequence numbers/databases (including polynucleotide and polypeptide sequences) cited herein are incorporated by reference in their entirety for all purposes and to the same extent as if each individual publication, patent, patent application, internet site or database accession/sequence has been expressly and separately identified as being used by reference.

--

Claims (22)

Последовательности.Sequences. SEQ ГО NO: 1 - человеческий рецептор фолиевой кислоты 1SEQ GO NO: 1 - human folic acid receptor 1 MAQRMTTQLLLLLVWVAWGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQ CRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNL GPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNK CAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVA RFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLSMAQRMTTQLLLLLVWVAWGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQ CRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNL GPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNK CAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVA RFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS SEQ ГО NO: 2 - человеческий рецептор фолиевой кислоты 1, последовательность нуклеиновой кислоты atggctcagcggatgacaacacagctgctgctccttctagtgtgggtggctgtagtaggggaggctcagacaaggattgcatgggccagg actgagcttctcaatgtctgcatgaacgccaagcaccacaaggaaaagccaggccccgaggacaagttgcatgagcagtgtcgaccctgg aggaagaatgcctgctgttctaccaacaccagccaggaagcccataaggatgtttcctacctatatagattcaactggaaccactgtggaga gatggcacctgcctgcaaacggcatttcatccaggacacctgcctctacgagtgctcccccaacttggggccctggatccagcaggtggat cagagctggcgcaaagagcgggtactgaacgtgcccctgtgcaaagaggactgtgagcaatggtgggaagattgtcgcacctcctacac ctgcaagagcaactggcacaagggctggaactggacttcagggtttaacaagtgcgcagtgggagctgcctgccaacctttccatttctact tccccacacccactgttctgtgcaatgaaatctggactcactcctacaaggtcagcaactacagccgagggagtggccgctgcatccagat gtggttcgacccagcccagggcaaccccaatgaggaggtggcgaggttctatgctgcagccatgagtggggctgggccctgggcagcct ggcctttcctgcttagcctggccctaatgctgctgtggctgctcagcSEQ ГО NO: 2 - человеческий рецептор фолиевой кислоты 1, последовательность нуклеиновой кислоты atggctcagcggatgacaacacagctgctgctccttctagtgtgggtggctgtagtaggggaggctcagacaaggattgcatgggccagg actgagcttctcaatgtctgcatgaacgccaagcaccacaaggaaaagccaggccccgaggacaagttgcatgagcagtgtcgaccctgg aggaagaatgcctgctgttctaccaacaccagccaggaagcccataaggatgtttcctacctatatagattcaactggaaccactgtggaga gatggcacctgcctgcaaacggcatttcatccaggacacctgcctctacgagtgctcccccaacttggggccctggatccagcaggtggat cagagctggcgcaaagagcgggtactgaacgtgcccctgtgcaaagaggactgtgagcaatggtgggaagattgtcgcacctcctacac ctgcaagagcaactggcacaagggctggaactggacttcagggtttaacaagtgcgcagtgggagctgcctgccaacctttccatttctact tccccacacccactgttctgtgcaatgaaatctggactcactcctacaaggtcagcaactacagccgagggagtggccgctgcatccagat gtggttcgacccagcccagggcaaccccaatgaggaggtggcgaggttctatgctgcagccatgagtggggctgggccctgggcagcct ggcctttcctgcttagcctggccctaatgctgctgtggctgctcagc SEQ ID NO :3 - huMovl9 vHCSEQ ID NO :3 - huMovl9 vHC QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDT FYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVT vssQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDT FYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVT vss SEQ ID NO: 4 - huMovl9 vLCvl.00SEQ ID NO: 4 - huMovl9 vLCvl.00 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRDIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR SEQ ID NO: 5 - huMovl9 vLCvl.60SEQ ID NO: 5 - huMovl9 vLCvl.60 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRDIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Способ идентификации рака как с вероятностью реагирующего на анти-FOLR1 иммуноконъюгат, включающий:1. A method for identifying cancer as likely to respond to an anti-FOLR1 immunoconjugate, comprising: (а) приведение биологического образца, содержащего клетки указанного рака, в контакт с антителом для обнаружения или его антигенсвязывающим фрагментом, которое специфически связывается с FOLR1;(a) bringing a biological sample containing said cancer cells into contact with a detection antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FOLR1; (б) определение связывания антитела для обнаружения или его антигенсвязывающего фрагмента с биологическим образцом стадии (а) с использованием способа обнаружения, различающего интенсивность и однородность окрашивания; и (в) оценку связывания, указанного на стадии (б), причем оценка интенсивности окрашивания FOLR1, составляющая 2 или более в по меньшей мере 25% клеток в образце опухоли от субъекта с использованием способа обнаружения, идентифицирует (b) determining the binding of the detection antibody or antigen-binding fragment thereof to the biological sample of step (a) using a detection method that distinguishes between intensity and uniformity of staining; and (c) assessing the binding indicated in step (b), wherein an assessment of FOLR1 staining intensity of 2 or more in at least 25% of cells in a tumor sample from a subject using the detection method identifies - 38 041061 указанный рак как с вероятностью реагирующий на анти-FOLRl иммуноконъюгат.- 38 041061 indicated cancer as likely to respond to anti-FOLR1 immunoconjugate. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный анти-FOLR1 иммуноконъюгат определяется формулой (A)-(L)-(C), где:2. The method according to claim 1, characterized in that said anti-FOLR1 immunoconjugate is defined by formula (A)-(L)-(C), where: (А) включает терапевтическое анти-FOLR1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR1 тяжелой цепи, содержащий GYFMN (SEQ ID NO: 6); CDR2 тяжелой цепи, содержащий RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); и CDR3 тяжелой цепи, содержащий YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) и CDR1 легкой цепи, содержащий KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); CDR2 легкой цепи, содержащий RASNLEA (SEQ ID NO: 10); и CDR3 легкой цепи, содержащий QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11), (L) включает линкер, (С) включает цитотоксический агент, и при этом (L) связывает (А) с (С).(A) comprises a therapeutic anti-FOLR1 antibody, or an antigen-binding fragment thereof, containing a heavy chain CDR1 containing GYFMN (SEQ ID NO: 6); a heavy chain CDR2 containing RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); and a heavy chain CDR3 containing YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) and a light chain CDR1 containing KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); Light chain CDR2 containing RASNLEA (SEQ ID NO: 10); and a light chain CDR3 containing QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11), (L) includes a linker, (C) includes a cytotoxic agent, and wherein (L) links (A) to (C). 3. Способ идентификации опухоли как чувствительной к терапии анти-FOLR1 иммуноконъюгатом, включающий:3. A method for identifying a tumor as susceptible to anti-FOLR1 immunoconjugate therapy, comprising: (а) измерение уровня экспрессии FOLR1 в образце опухолевой ткани, полученном из указанной опухоли, с использованием антитела для обнаружения или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфически связывается с FOLR1, где указанное измерение включает использование способа обнаружения, различающего интенсивность окрашивания в образце рака, экспрессирующего FOLR1, по сравнению с интенсивностью окрашивания одного или более референсных образцов;(a) measuring the expression level of FOLR1 in a tumor tissue sample obtained from said tumor using a detection antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FOLR1, wherein said measurement comprises using a detection method discriminating staining intensity in a cancer sample expressing FOLR1 , compared with the staining intensity of one or more reference samples; (б) определение оценки интенсивности окрашивания FOLR1 для указанного образца опухолевой ткани; и (в) сравнение оценки интенсивности окрашивания FOLR1, определенной на этапе (б) с референсным значением, которое определяется путем измерения экспрессии белка FOLR1 в по меньшей мере одном референсном образце, где указанный по меньшей мере один референсный образец представляет собой образец ткани, клетки или клеточного конгломерата, не чувствительный к терапии анти-FOLR1 иммуноконъюгатом, причем оценка интенсивности окрашивания FOLR1 указанного образца опухолевой ткани, определенная на этапе (б) и являющаяся более высокой, чем указанное референсное значение, идентифицирует данную опухоль как чувствительную к терапии анти-FOLR1 иммуноконъюгатом, причем указанный анти-FOLR1 иммуноконъюгат определяется формулой (A)-(L)-(C), где:(b) determining a FOLR1 staining intensity score for said tumor tissue sample; and (c) comparing the FOLR1 staining intensity score determined in step (b) with a reference value determined by measuring FOLR1 protein expression in at least one reference sample, wherein said at least one reference sample is a tissue, cell, or a cell conglomerate that is not sensitive to anti-FOLR1 immunoconjugate therapy, wherein the FOLR1 staining intensity of said tumor tissue sample, determined in step (b) and being higher than the specified reference value, identifies the tumor as sensitive to anti-FOLR1 immunoconjugate therapy, wherein said anti-FOLR1 immunoconjugate is defined by formula (A)-(L)-(C) where: (А) включает терапевтическое анти-FOLR1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR1 тяжелой цепи, содержащий GYFMN (SEQ ID NO: 6); CDR2 тяжелой цепи, содержащий RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); и CDR3 тяжелой цепи, содержащий YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) и CDR1 легкой цепи, содержащий KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); CDR2 легкой цепи, содержащий RASNLEA (SEQ ID NO: 10); и CDR3 легкой цепи, содержащий QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11), (L) включает линкер, (С) включает цитотоксический агент, и при этом (L) связывает (А) с (С).(A) comprises a therapeutic anti-FOLR1 antibody, or an antigen-binding fragment thereof, containing a heavy chain CDR1 containing GYFMN (SEQ ID NO: 6); a heavy chain CDR2 containing RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); and a heavy chain CDR3 containing YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) and a light chain CDR1 containing KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); Light chain CDR2 containing RASNLEA (SEQ ID NO: 10); and a light chain CDR3 containing QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11), (L) includes a linker, (C) includes a cytotoxic agent, and wherein (L) links (A) to (C). 4. Способ идентификации рака яичников как с вероятностью реагирующего на анти-FOLR1 иммуноконъюгат, включающий:4. A method for identifying ovarian cancer as likely to respond to an anti-FOLR1 immunoconjugate, comprising: (а) приведение биологического образца, содержащего клетки указанного рака, в контакт с антителом для обнаружения или его антигенсвязывающим фрагментом, которое специфически связывается с FOLR1; и (б) определение связывания антитела для обнаружения или его антигенсвязывающего фрагмента с биологическим образцом стадии (а) с использованием иммуногистохимического (ИГХ) способа обнаружения, различающего интенсивность и однородность окрашивания FOLR1;(a) bringing a biological sample containing said cancer cells into contact with a detection antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FOLR1; and (b) determining the binding of the detection antibody, or antigen-binding fragment thereof, to the biological sample of step (a) using an immunohistochemical (IHC) detection method distinguishing the intensity and uniformity of FOLR1 staining; причем оценка интенсивности окрашивания FOLR1, составляющая 2 или более в более чем 75% клеток биологического образца, идентифицирует указанный рак яичников как вероятно чувствительный к анти-FOLR1 иммуноконъюгату;wherein a FOLR1 staining intensity score of 2 or more in more than 75% of cells in a biological sample identifies said ovarian cancer as likely susceptible to an anti-FOLR1 immunoconjugate; причем указанный анти-FOLR1 иммуноконъюгат определяется формулой (A)-(L)-(C), где:wherein said anti-FOLR1 immunoconjugate is defined by formula (A)-(L)-(C) where: (А) включает терапевтическое анти-FOLR1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR1 тяжелой цепи, содержащий GYFMN (SEQ ID NO: 6); CDR2 тяжелой цепи, содержащий RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); и CDR3 тяжелой цепи, содержащий YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) и CDR1 легкой цепи, содержащий KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); CDR2 легкой цепи, содержащий RASNLEA (SEQ ID NO: 10); и CDR3 легкой цепи, содержащий QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11), (L) включает линкер, (С) включает цитотоксический агент, и при этом (L) связывает (А) с (С).(A) comprises a therapeutic anti-FOLR1 antibody, or an antigen-binding fragment thereof, containing a heavy chain CDR1 containing GYFMN (SEQ ID NO: 6); a heavy chain CDR2 containing RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); and a heavy chain CDR3 containing YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) and a light chain CDR1 containing KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); Light chain CDR2 containing RASNLEA (SEQ ID NO: 10); and a light chain CDR3 containing QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11), (L) includes a linker, (C) includes a cytotoxic agent, and wherein (L) links (A) to (C). 5. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что линкер выбран из группы, состоящей из: нерасщепляемого линкера, гидрофильного линкера и линкера на основе дикарбоновых кислот.5. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that the linker is selected from the group consisting of: a non-cleavable linker, a hydrophilic linker and a dicarboxylic acid linker. 6. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что линкер представляет собой расщепляемый линкер.6. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that the linker is a cleavable linker. 7. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что линкер выбран из группы, состоящей из: N7. The method according to any one of claims 2-4, characterized in that the linker is selected from the group consisting of: N - 39 041061 сукцинимидил 4-(малеимидометил) циклогексанкарбоксилата (SMCC), N-сульфосукцинимидил 4(малеимидометил) циклогексанкарбоксилата (сульфо-SMCC), N-сукцинимидил-4-(иодоацетил)аминобензоата (SIAB); N-сукцинимидил-[(N-малеимидопропионамидо)-тетраэтиленгликоль] эфира (NHS-PEG4-малеимид); N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноата (SPP); N-сукцинимидил 4-(2пиридилдитио)-2-сульфопентаноата (сульфо-SPP), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноата (SPDB); и N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноата (сульфо-SPDB).- 39 041061 succinimidyl 4-(maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC), N-sulfosuccinimidyl 4(maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate (sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4-(iodoacetyl)aminobenzoate (SIAB); N-succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-tetraethylene glycol] ether (NHS-PEG4-maleimide); N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate (SPP); N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-2-sulfopentanoate (sulfo-SPP), N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butanoate (SPDB); and N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB). 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что расщепляемый линкер представляет собой Nсукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB).8. The method of claim 6 wherein the cleavable linker is Nsuccinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB). 9. Способ по любому из пп.2-7, отличающийся тем, что цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из: майтансиноида, аналога майтансиноида, бензодиазепина, таксоида, СС-1065, аналога СС1065, дуокармицина, аналога дуокармицина, калихеамицина, доластатина, аналога доластатина, ауристатина, производного томаймицина и производного лептомицина, или пролекарства указанного цитотоксического агента.9. The method according to any one of claims 2 to 7, characterized in that the cytotoxic agent is selected from the group consisting of: maytansinoid, maytansinoid analog, benzodiazepine, taxoid, CC-1065, CC1065 analog, duocarmycin, duocarmycin analog, calicheamicin, dolastatin, a dolastatin analog, auristatin, a tomaimycin derivative and a leptomycin derivative, or a prodrug of said cytotoxic agent. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный цитотоксический агент представляет собой майтансиноид.10. The method of claim 9, wherein said cytotoxic agent is a maytansinoid. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный цитотоксический агент представляет собой N(2')-деацетил-N-(2')-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансин (DM1) или N(2')-деацетил-N(2')-(4меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин (DM4).11. The method according to claim 10, characterized in that said cytotoxic agent is N(2')-deacetyl-N-(2')-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine (DM1) or N(2 ')-deacetyl-N(2')-(4-mercapto-4-methyl-1-oxopentyl)-maytansine (DM4). 12. Способ по любому из пп.2-11, отличающийся тем, что терапевтическое анти-FOLR1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 4 или 5.12. The method according to any one of claims 2-11, characterized in that the therapeutic anti-FOLR1 antibody or antigen-binding fragment contains a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 4 or 5. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что терапевтическое анти-FOLR1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность тяжелой цепи, кодируемой плазмидой, депонированной в АТСС как РТА-10772, и (ii) легкую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность легкой цепи, кодируемой плазмидой, депонированной в АТСС как РТА-10773 или РТА-10774.13. The method of claim 12, wherein the therapeutic anti-FOLR1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprises (i) a heavy chain containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the heavy chain encoded by the plasmid deposited with ATCC as PTA- 10772, and (ii) a light chain containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the light chain encoded by the plasmid deposited with ATCC as PTA-10773 or PTA-10774. 14. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что терапевтическое анти-FOLRI антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 4 или 5, причем линкер представляет собой N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноата (сульфо-SPDB), и при этом цитотоксический агент представляет собой N(2')-деацетил-N(2')-(4-меркапто-4-метил-1оксопентил)-майтансин (DM4).14. The method according to any one of claims 2-4, characterized in that the therapeutic anti-FOLRI antibody or antigen-binding fragment contains a heavy chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain with the sequence of SEQ ID NO: 4 or 5 wherein the linker is N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB) and the cytotoxic agent is N(2')-deacetyl-N(2')-(4- mercapto-4-methyl-1oxopentyl)-maytansine (DM4). 15. Способ по любому из пп.2-4, отличающийся тем, что терапевтическое анти-FOLRI антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность тяжелой цепи, кодируемой плазмидой, депонированной в АТСС как РТА-10772, и (ii) легкую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность легкой цепи, кодируемой плазмидой, депонированной в АТСС как РТА-10774, причем линкер представляет собой N-сукцинимидил 4-(2пиридилдитио)-2-сульфобутаноата (сульфо-SPDB), и при этом цитотоксический агент представляет собой N(2')-деацетил-N(2')-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин (DM4).15. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized in that the therapeutic anti-FOLRI antibody or antigen-binding fragment contains (i) a heavy chain containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the heavy chain encoded by the plasmid deposited in ATCC as PTA-10772, and (ii) a light chain containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the light chain encoded by the plasmid deposited in ATCC as PTA-10774, wherein the linker is N-succinimidyl 4-(2pyridyldithio)- 2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB), and wherein the cytotoxic agent is N(2')-deacetyl-N(2')-(4-mercapto-4-methyl-1-oxopentyl)-maytansine (DM4). 16. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что антитело для обнаружения или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий GYFMN (SEQ ID NO: 6); CDR2 тяжелой цепи, содержащий RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); и CDR3 тяжелой цепи, содержащий YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) и CDR1 легкой цепи, содержащий KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); CDR2 легкой цепи, содержащий RASNLEA (SEQ ID NO: 10); и CDR3 легкой цепи, содержащий QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11).16. The method according to any one of paragraphs.1-15, characterized in that the detection antibody or its antigennegative fragment contains a heavy chain CDR1 containing GYFMN (SEQ ID NO: 6); A heavy chain CDR2 containing RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7); and a heavy chain CDR3 containing YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 8) and a light chain CDR1 containing KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 9); Light chain CDR2 containing RASNLEA (SEQ ID NO: 10); and a light chain CDR3 containing QQSREYPYT (SEQ ID NO: 11). 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что антитело для обнаружения или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 4 или 5.17. The method of claim 16, wherein the detection antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable domain of SEQ ID NO: 4 or 5. 18. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что антитело для обнаружения или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой BN3.2.18. The method according to any one of claims 1 to 15, wherein the detection antibody or antigen-binding fragment thereof is BN3.2. 19. Способ по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что антитело для обнаружения или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит реагент для обнаружения, выбранный из группы, состоящей из: фермента, флуорофора, радиоактивной метки и люминофора.19. The method according to any one of claims 1 to 18, characterized in that the detection antibody or antigen-binding fragment further comprises a detection reagent selected from the group consisting of: an enzyme, a fluorophore, a radioactive label, and a phosphor. 20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что указанный способ обнаружения выполняется с помощью автоматизированной системы.20. A method according to any one of claims 1 to 19, characterized in that said detection method is performed by an automated system. 21. Способ по любому из пп.1-3 и 5-20, отличающийся тем, что указанный способ обнаружения является иммуногистохимическим (ИГХ).21. The method according to any one of claims 1-3 and 5-20, characterized in that said detection method is immunohistochemical (IHC). 22. Способ по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что оценка интенсивности окрашивания FOLR1, составляющая 2 или более в более чем 75% клеток биологического образца, идентифицирует указанный рак как с вероятностью реагирующий на анти-FOLR1 иммуноконъюгат, идентифицирует опу22. The method according to any one of claims 1 to 21, characterized in that the assessment of the intensity of FOLR1 staining, which is 2 or more in more than 75% of the cells of the biological sample, identifies said cancer as likely to be responsive to the anti-FOLR1 immunoconjugate, identifies the tumor --