EA040800B1 - METHODS OF TREATMENT OF CHOLESTATIC DISEASE - Google Patents

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к лечению холестатических заболеваний.The present invention relates to the field of medicine, in particular to the treatment of cholestatic diseases.

Уровень техникиState of the art

Аномальное и усиленное накопление внеклеточного матрикса является признаком фибротических заболеваний, в том числе фиброза печени, легких, почек и сердца. Спектр пораженных органов, прогрессирующая природа фибротического процесса, большое количество страдающих индивидуумов и отсутствие эффективного лечения являются огромной проблемой при лечении фибротических заболеваний.Abnormal and increased accumulation of extracellular matrix is a sign of fibrotic diseases, including fibrosis of the liver, lungs, kidneys and heart. The spectrum of affected organs, the progressive nature of the fibrotic process, the large number of affected individuals, and the lack of effective treatment are a huge problem in the treatment of fibrotic diseases.

В попытках предложить новые терапевтические стратегии для лечения фибротических заболеваний, авторы изобретения обнаружили, что соединение 2-[(5-нитро-1,3-тиазол-2-ил)карбамоил]фенил]этаноат (нитазоксанид или NTZ), синтетическое антипротозойное средство, также демонстрирует мощные противофиброзные свойства. Более того, оценка NTZ в модели повреждения печени продемонстрировала его способность снижать концентрацию циркулирующих желчных кислот, таким образом, отражая его потенциал к лечению как холестатических (таких как РВС и PSC), так и фибротических заболеваний.In an attempt to propose new therapeutic strategies for the treatment of fibrotic diseases, the inventors found that the compound 2-[(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)carbamoyl]phenyl]ethanoate (nitazoxanide or NTZ), a synthetic antiprotozoal agent, also demonstrates potent anti-fibrotic properties. Moreover, evaluation of NTZ in a liver injury model demonstrated its ability to reduce circulating bile acids, thus reflecting its potential for the treatment of both cholestatic (such as PBC and PSC) and fibrotic diseases.

Было показано, что NTZ, впервые описанный в 1975 году (Rossignol and Cavier, 1975), является высокоэффективным против анаэробных простейших, гельминтов и широкого спектра микробов, включая как анаэробные, так и аэробные бактерии (Rossignol and Maisonneuve, 1984; Dubreuil, Houcke et al., 1996; Megraudd, Occhialini et al., 1998; Fox and Saravolatz, 2005; Pankuch and Appelbaum, 2006; Finegold, Molitoris et al., 2009). Сначала его исследовали у человека для лечения, направленного против кишечных цестод (Rossignol and Maisonneuve, 1984), и в настоящее время он лицензирован в США (Alinia®, Romark laboratories) для лечения диареи, вызванной паразитами-простейшими Crystosporidium parvum и Giardia intestinalis. NTZ также широко продается в Латинской Америке и Индии, где он показан для лечения широкого спектра кишечных паразитарных инфекций (Hemphill, Mueller et al., 2006). Полагают, что возможным механизмом действия, посредством которого NTZ проявляет его антипаразитарную активность, является ингибирование зависимых от фермента пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы (PFOR) реакций с переносом электронов, которые необходимы для анаэробного метаболизма (Hoffman, Sisson et al., 2007). NTZ также проявляет активность против Mycobacterium tuberculosis, которые не обладают гомологом PFOR, что, таким образом, указывает на альтернативный механизм действия. Действительно, было показано, что NTZ также выступает в качестве разобщителя, нарушающего мембранный потенциал и гомеостаз рН внутри организма (de Carvalho, Darby et al., 2011).NTZ, first described in 1975 (Rossignol and Cavier, 1975), has been shown to be highly effective against anaerobic protozoa, helminths, and a wide range of microbes, including both anaerobic and aerobic bacteria (Rossignol and Maisonneuve, 1984; Dubreuil, Houcke et al. al., 1996; Megraudd, Occhialini et al., 1998; Fox and Saravolatz, 2005; Pankuch and Appelbaum, 2006; Finegold, Molitoris et al., 2009). It was first studied in humans for the treatment of intestinal cestodes (Rossignol and Maisonneuve, 1984) and is now licensed in the USA (Alinia®, Romark laboratories) for the treatment of diarrhea caused by the protozoan parasites Crystosporidium parvum and Giardia intestinalis. NTZ is also widely marketed in Latin America and India, where it is indicated for the treatment of a wide range of intestinal parasitic infections (Hemphill, Mueller et al., 2006). It is believed that a possible mechanism of action by which NTZ exerts its antiparasitic activity is the inhibition of pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (PFOR) enzyme dependent electron transfer reactions that are essential for anaerobic metabolism (Hoffman, Sisson et al., 2007). NTZ also shows activity against Mycobacterium tuberculosis, which do not have a PFOR homologue, thus suggesting an alternative mechanism of action. Indeed, NTZ has also been shown to act as an uncoupler that disrupts membrane potential and pH homeostasis within the body (de Carvalho, Darby et al., 2011).

Фармакологические эффекты NTZ не ограничиваются его антипаразитарной активностью и в последние годы в нескольких исследованиях было показано, что NTZ также может проявлять противовирусную активность (Di Santo and Ehrisman, 2014; Rossignol, 2014). NTZ препятствует репликации вирусов различными путями, включая блокаду созревания белков гемагглютинина (вирус гриппа) или VP7 (ротавирус), или активацию белка PKR, вовлеченного во врожденный иммунный ответ (для обзора, см. (Rossignol, 2014)). Было показано, что NTZ обладает выраженными противораковыми свойствами, препятствуя ключевым метаболическим и способствующим гибели сигнальным путям (Di Santo and Ehrisman, 2014).The pharmacological effects of NTZ are not limited to its antiparasitic activity and in recent years, several studies have shown that NTZ may also exhibit antiviral activity (Di Santo and Ehrisman, 2014; Rossignol, 2014). NTZ interferes with viral replication in various ways, including blockade of the maturation of hemagglutinin (influenza virus) or VP7 (rotavirus) proteins, or activation of the PKR protein involved in the innate immune response (for a review, see (Rossignol, 2014)). NTZ has been shown to have potent anti-cancer properties by interfering with key metabolic and death-promoting signaling pathways (Di Santo and Ehrisman, 2014).

В рамках настоящего изобретения с использованием фенотипического скринингового анализа для идентификации потенциальных противофиброзных средств было обнаружено, что NTZ или его активный метаболит тизоксанид (или TZ) препятствуют активации звездчатых клеток печени (HSC), которые играют ключевую роль в развитии фиброза печени. Этот эффект был абсолютно неожиданным ввиду свойств, ранее описываемых для этих молекул. Более того, было показано, что NTZ и TZ препятствуют активации стимулированных фибробластов в других органах, таких как сердце, легкое и кишечник. Противофиброзные свойства NTZ были далее подтверждены в доклинической модели заболевания печени (NASH, индуцированный диетой с CDAAc) путем демонстрации значительно сниженных уровней коллагена и фиброза в печени. В дополнение к противофиброзной активности также было показано, что NTZ снижает концентрацию циркулирующих желчных кислот в модели индуцируемого СС14 повреждения печени. Таким образом NTZ и TZ оказались соединениями, представляющими интерес для лечения холестатических заболеваний и различных типов фибротических заболеваний.Within the framework of the present invention, using a phenotypic screening assay to identify potential antifibrotic agents, NTZ or its active metabolite tizoxanide (or TZ) was found to interfere with the activation of hepatic stellate cells (HSCs), which play a key role in the development of liver fibrosis. This effect was completely unexpected in view of the properties previously described for these molecules. Moreover, NTZ and TZ have been shown to inhibit the activation of stimulated fibroblasts in other organs such as the heart, lung, and intestines. The anti-fibrotic properties of NTZ were further confirmed in a pre-clinical model of liver disease (CDAAc diet-induced NASH) by demonstrating significantly reduced levels of collagen and fibrosis in the liver. In addition to antifibrotic activity, NTZ has also been shown to reduce circulating bile acid concentrations in a model of CC14-induced liver injury. Thus, NTZ and TZ have proven to be compounds of interest in the treatment of cholestatic diseases and various types of fibrotic diseases.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение относится к применению соединения, выбранного из группы, состоящей из нитазоксанида (NTZ), тизоксанида (TZ) и тизоксанида глюкуронида (TZG), и фармацевтически приемлемой соли NTZ, TZ или TZG, для лечения холестатического нарушения.The present invention relates to the use of a compound selected from the group consisting of nitazoxanide (NTZ), tizoxanide (TZ) and tizoxanide glucuronide (TZG), and a pharmaceutically acceptable salt of NTZ, TZ or TZG, for the treatment of a cholestatic disorder.

Данное соединение может быть выбрано из группы, состоящей из NTZ и TZ, и фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ.The compound may be selected from the group consisting of NTZ and TZ and a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ.

Предпочтительно указанное соединение содержится в фармацевтической композиции.Preferably, said compound is contained in a pharmaceutical composition.

Холестатическое нарушение может быть выбрано из группы, состоящей из первичного билиарного холангита (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), внутрипеченочного холестаза при беременности, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, атрезии желчных протоков, холелитиаза, инфекционного холангита, холангита, ассоциированного с гистиоцитозом из клеток Лангерганса, синдрома Алажилля, внесиндромной недостаточности протоков, индуцируемого лекарствен- 1 040800 ными средствами холестаза и ассоциированного с полным парентеральным питанием холестаза.The cholestatic disorder may be selected from the group consisting of primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), intrahepatic cholestasis of pregnancy, progressive familial intrahepatic cholestasis, biliary atresia, cholelithiasis, infectious cholangitis, cellular histiocytosis associated cholangitis Langerhans syndrome, Alagille syndrome, extrasyndromic duct insufficiency, drug-induced cholestasis, and total parenteral nutrition-associated cholestasis.

В одном из вариантов осуществления изобретения холестатическое нарушение представляет собойIn one embodiment, the cholestatic disorder is

РВС.RVS.

Кроме того, применение согласно изобретению может осуществляться в комбинации по меньшей мере с одним терапевтически активным средством с известной противофиброзной активностью, выбранным из пирфенидона или ингибиторов рецепторных тирозинкиназ (RTKI), таких как нинтеданиб, сорафениб и другие RTKI, или блокаторов рецепторов ангиотензина II (AT1), или ингибитора CTGF, или любого противофиброзного соединения, связанного с препятствованием активируемым TGFe и BMP каскадам, включая активаторы латентного комплекса TGFe, такие как ММР2, ММР9, THBS1 или интегрины клеточной поверхности, рецепторы TGFe типа I (TGFBRI) или типа II (TGFBRII) и их лиганды, такие как TGFe, активин, ингибин, Nodal, антимюллеров гормон, GDF или BMP, вспомогательные корецепторы (также известные как рецепторы типа III), или компоненты SMAD-зависимого канонического каскада, включающего регуляторные или ингибиторные белки SMAD, или представители независимых от SMAD или неканонических каскадов, включая различные ветви передачи сигнала MAPK, TAK1, каскады передачи сигнала Rho-подобной GTP-азой, каскады фосфатидилинозитол-3 киназы/AKT, TGFeиндуцируемый процесс ЕМТ или канонические и неканонические каскады передачи сигнала Hedgehog, включающие лиганды Hh или гены-мишени, или любые представители каскадов WNT или Notch, которые подвержены влиянию передачи сигнала TGFe.In addition, the use according to the invention can be carried out in combination with at least one therapeutically active agent with known anti-fibrotic activity, selected from pirfenidone or receptor tyrosine kinase inhibitors (RTKIs) such as nintedanib, sorafenib and other RTKIs, or angiotensin II receptor blockers (AT1 ), or a CTGF inhibitor, or any anti-fibrotic compound associated with interfering with the activated TGFe and BMP cascades, including TGFe latent complex activators such as MMP2, MMP9, THBS1 or cell surface integrins, type I (TGFBRI) or type II (TGFBRII) TGFe receptors ) and their ligands such as TGFe, activin, inhibin, Nodal, anti-Mullerian hormone, GDF or BMP, accessory co-receptors (also known as type III receptors), or components of an SMAD-dependent canonical cascade involving SMAD regulatory or inhibitory proteins, or representatives independent of SMAD or non-canonical cascades, including various branches of MAPK, TAK1, Rho-like GTPase signaling cascades, phosphatidylinositol-3 kinase/AKT cascades, TGFe inducible EMT process, or canonical and non-canonical Hedgehog signaling cascades involving Hh ligands or target genes, or any of the WNT or Notch, which are affected by TGFe signaling.

В другом варианте осуществления изобретения применение согласно изобретению может осуществляться в комбинации по меньшей мере с одним терапевтически активным средством, выбранным из ингибиторов JAK/STAT, других противовоспалительных средств и/или иммунодепрессантов.In another embodiment of the invention, the use according to the invention may be carried out in combination with at least one therapeutically active agent selected from JAK/STAT inhibitors, other anti-inflammatory agents and/or immunosuppressants.

Предпочтительно указанное терапевтически активное средство выбрано из глюкокортикоидов, NSAID, циклофосфамида, нитрозомочевины, аналогов фолиевой кислоты, аналогов пуринов, аналогов пиримидинов, метотрексата, азатиоприна, меркаптопурина, циклоспорина, мириоцина, такролимуса, сиролимуса, производных микофеноловой кислоты, финголимода и других модуляторов рецепторов сфингозин-1-фосфата, моноклональных и/или поликлональных антител против таких мишеней, как провоспалительные цитокины и рецепторы провоспалительных цитокинов, Т-клеточный рецептор, интегрины.Preferably, said therapeutically active agent is selected from glucocorticoids, NSAIDs, cyclophosphamide, nitrosoureas, folic acid analogs, purine analogs, pyrimidine analogs, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, cyclosporine, myriocin, tacrolimus, sirolimus, mycophenolic acid derivatives, fingolimod, and other sphingosine receptor modulators. 1-phosphate, monoclonal and/or polyclonal antibodies against such targets as pro-inflammatory cytokines and pro-inflammatory cytokine receptors, T-cell receptor, integrins.

Далее изобретение включает способ лечения холестатического нарушения, включающий введение соединения, выбранного из группы, состоящей из нитазоксанида (NTZ), тизоксанида (TZ) и тизоксанида глюкуронида (TZG), и фармацевтически приемлемой соли NTZ, TZ или TZG в терапевтически эффективном количестве.The invention further includes a method for treating a cholestatic disorder comprising administering a compound selected from the group consisting of nitazoxanide (NTZ), tizoxanide (TZ) and tizoxanide glucuronide (TZG) and a pharmaceutically acceptable salt of NTZ, TZ or TZG in a therapeutically effective amount.

В указанном способе соединение может быть выбрано из группы, состоящей из NTZ и TZ, и фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ.In said method, the compound may be selected from the group consisting of NTZ and TZ and a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ.

Предпочтительно соединение, применяемое в указанном способе, содержится в фармацевтической композиции.Preferably, the compound used in said method is contained in a pharmaceutical composition.

Холестатическое нарушение, на лечение которого направлен данный способ, может быть выбрано из группы, состоящей из первичного билиарного холангита (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), внутрипеченочного холестаза при беременности, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, атрезии желчных протоков, холелитиаза, инфекционного холангита, холангита, ассоциированного с гистиоцитозом из клеток Лангерганса, синдрома Алажилля, внесиндромной недостаточности протоков, индуцируемого лекарственными средствами холестаза и ассоциированного с полным парентеральным питанием холестаза.The cholestatic disorder treated by this method may be selected from the group consisting of primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), intrahepatic cholestasis of pregnancy, progressive familial intrahepatic cholestasis, biliary atresia, cholelithiasis, infectious cholangitis , Langerhans cell histiocytosis-associated cholangitis, Alagille syndrome, extrasyndromic duct insufficiency, drug-induced cholestasis, and total parenteral nutrition-associated cholestasis.

В одном из вариантов осуществления данного способа холестатическое нарушение представляет собой РВС.In one embodiment of this method, the cholestatic disorder is PBC.

Согласно способу по изобретению данное соединение может быть введено в комбинации по меньшей мере с одним терапевтически активным средством с известной противофиброзной активностью, выбранным из пирфенидона или ингибиторов рецепторных тирозинкиназ (RTKI), таких как нинтеданиб, сорафениб и другие RTKI, или блокаторов рецепторов ангиотензина II (AT1), или ингибитора CTGF, или любого противофиброзного соединения, связанного с препятствованием активируемым TGFe и BMP каскадам, включая активаторы латентного комплекса TGFe, такие как ММР2, ММР9, THBS1 или интегрины клеточной поверхности, рецепторы TGFe типа I (TGFBRI) или типа II (TGFBRII) и их лиганды, такие как TGFe, активин, ингибин, Nodal, антимюллеров гормон, GDF или BMP, вспомогательные корецепторы (также известные как рецепторы типа III), или компоненты SMAD-зависимого канонического каскада, включающего регуляторные или ингибиторные белки SMAD, или представители независимых от SMAD или неканонических каскадов, включая различные ветви передачи сигнала MAPK, TAK1, каскады передачи сигнала Rho-подобной GTP-азой, каскады фосфатидилинозитол-3 киназы/AKT, TGFeиндуцируемый процесс ЕМТ или канонические и неканонические каскады передачи сигнала Hedgehog, включающие лиганды Hh или гены-мишени, или любые представители каскадов WNT или Notch, которые подвержены влиянию передачи сигнала TGFe.According to the method of the invention, the compound may be administered in combination with at least one therapeutically active agent with known antifibrotic activity, selected from pirfenidone or receptor tyrosine kinase inhibitors (RTKIs) such as nintedanib, sorafenib and other RTKIs, or angiotensin II receptor blockers ( AT1), or a CTGF inhibitor, or any antifibrotic compound associated with interfering with the activated TGFe and BMP cascades, including TGFe latent complex activators such as MMP2, MMP9, THBS1 or cell surface integrins, type I TGFe receptors (TBRI) or type IIGF ( TGFBRII) and their ligands such as TGFe, activin, inhibin, Nodal, anti-Mullerian hormone, GDF or BMP, accessory co-receptors (also known as type III receptors), or components of an SMAD-dependent canonical cascade involving SMAD regulatory or inhibitory proteins, or representatives of SMAD-independent or non-canonical cascades, including various branches MAPK, TAK1, Rho-like GTPase signaling cascades, phosphatidylinositol-3 kinase/AKT cascades, TGFe induced EMT process or canonical and non-canonical Hedgehog signaling cascades involving Hh ligands or target genes, or any of the WNT cascades or Notch, which are affected by TGFe signaling.

Предпочтительно данное соединение вводят в комбинации по меньшей мере с одним терапевтически активным средством, выбранным из ингибиторов JAK/STAT, других противовоспалительныхPreferably, the compound is administered in combination with at least one therapeutically active agent selected from JAK/STAT inhibitors, other anti-inflammatory

- 2 040800 средств и/или иммунодепрессантов.- 2 040800 agents and/or immunosuppressants.

Также терапевтически активное средство, применяемое в указанном способе, может быть выбрано из глюкокортикоидов, NSAID, циклофосфамида, нитрозомочевины, аналогов фолиевой кислоты, аналогов пуринов, аналогов пиримидинов, метотрексата, азатиоприна, меркаптопурина, циклоспорина, мириоцина, такролимуса, сиролимуса, производных микофеноловой кислоты, финголимода и других модуляторов рецепторов сфингозин-1-фосфата, моноклональных и/или поликлональных антител против таких мишеней, как провоспалительные цитокины и рецепторы провоспалительных цитокинов, Т-клеточный рецептор, интегрины.Also, the therapeutically active agent used in said method may be selected from glucocorticoids, NSAIDs, cyclophosphamide, nitrosoureas, folic acid analogs, purine analogs, pyrimidine analogs, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, cyclosporine, myriocin, tacrolimus, sirolimus, mycophenolic acid derivatives, fingolimod and other sphingosine-1-phosphate receptor modulators, monoclonal and/or polyclonal antibodies against such targets as pro-inflammatory cytokines and pro-inflammatory cytokine receptors, T-cell receptor, integrins.

Описание фигур и таблицDescription of figures and tables

Сокращенные обозначения, использованные на фигурах, в таблицах и в тексте:Abbreviations used in figures, tables and text:

α-SMA - α-гладкомышечный актин,α-SMA - α-smooth muscle actin,

BMP - морфогенетический белок костей, кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота,BMP - bone morphogenetic protein, cDNA - complementary deoxyribonucleic acid,

COL1A1 - коллаген 1 типа, α 1,COL1A1 - type 1 collagen, α 1,

CDAA - рацион с дефицитом холина, определяемым L-аминокислотами,CDAA - choline deficient diet determined by L-amino acids,

CDAAc - рацион с дефицитом холина, определяемым L-аминокислотами, дополненный холестерином,CDAAc - choline deficient diet defined by L-amino acids supplemented with cholesterol,

CHOL - холестерин,CHOL - cholesterol,

CSAA - рацион, определяемый L-аминокислотами, дополненный холином,CSAA - diet defined by L-amino acids, supplemented with choline,

CYPA - циклофилин А,CYPA - cyclophilin A,

DDC - 3,5-диэтоксикарбонил-1,4-дигидроколлидин,DDC - 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,

DMSO - диметилсульфоксид,DMSO - dimethyl sulfoxide,

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ,ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay,

ЕМТ - эпителиально-мезенхимальный переход,EMT - epithelial-mesenchymal transition,

DTT - дитиотреитол,DTT - dithiothreitol,

FBS - эмбриональная телячья сыворотка,FBS - fetal bovine serum,

FDA - управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств,FDA - Food and Drug Administration,

GDF - факторы роста и дифференцировки,GDF - growth and differentiation factors,

Hh - Hedgehog, hHSC - звездчатые клетки печени человека,Hh - Hedgehog, hHSC - human liver stellate cells,

HSC - звездчатые клетки печени,HSC - liver stellate cells,

IC₅₀ - полумаксимальная ингибиторная концентрация,IC ₅₀ - half-maximal inhibitory concentration,

InMyoFib - кишечные миофибробласты,InMyoFib - intestinal myofibroblasts,

ММР2 - матриксная металлопептидаза 2,MMP2 - matrix metallopeptidase 2,

ММР9 - матриксная металлопептидаза 9,MMP9 - matrix metallopeptidase 9,

Мкл - микролитры,µl - microliters,

NHLF - нормальные фибробласты легкого человека,NHLF - normal human lung fibroblasts,

NTZ - нитазоксанид,NTZ - nitazoxanide,

РВС - первичный билиарный холангит,PBC - primary biliary cholangitis,

PBS - фосфатно-солевой буфер,PBS - phosphate-buffered saline,

PSC - первичный склерозирующий холангит, кПЦР - количественная полимеразная цепная реакция, пМоль - пикомоль, rhFGF - рекомбинантный основный фибробластный фактор роста человека,PSC - primary sclerosing cholangitis, qPCR - quantitative polymerase chain reaction, pMol - picomole, rhFGF - recombinant basic human fibroblast growth factor,

РНК - рибонуклеиновая кислота,RNA - ribonucleic acid,

RT - обратная транскриптаза,RT - reverse transcriptase,

SmBM - назальная среда гладкомышечных клеток,SmBM - Nasal Smooth Muscle Cell Medium,

SteCGS - добавка для роста звездчатых клеток,SteCGS - stellate cell growth supplement,

SteCM - среда для звездчатых клеток,SteCM - medium for stellate cells,

ТВА - общий уровень желчных кислот,TBA - total level of bile acids,

TGFe1 - фактор роста опухоли β 1,TGFe1 - tumor growth factor β 1,

TGFBRI - рецептор TGFb типа I,TGFBRI - TGFb type I receptor,

TGFBRII - рецептор TGFb типа II,TGFBRII - TGFb type II receptor,

THBS1 - тромбоспондин 1,THBS1 - thrombospondin 1,

TMB - тетраметилбензидин,TMB - tetramethylbenzidine,

TZ - тизоксанид,TZ - tizoxanide,

TZG - тизоксанида глюкуронид,TZG - tizoxanide glucuronide,

TZ(G) - TZ или TZG.TZ(G) - TZ or TZG.

Фиг. 1. Нитазоксанид и его метаболит тизоксанид ингибируют индуцируемую TGFe1 экспрессию белка α-SMA в HSC человека.Fig. 1. Nitazoxanide and its metabolite tizoxanide inhibit TGFe1-induced α-SMA protein expression in human HSCs.

Лишенные сыворотки HSC предварительно инкубировали в течение 1 ч с NTZ (А) или TZ (В), а заSerum-deprived HSCs were pre-incubated for 1 h with NTZ (A) or TZ (B), and after

- 3 040800 тем проводили активацию профиброгенным цитокином TGFei (1 нг/мл). После инкубации в течение 48 ч экспрессию α-SMA количественно определяли посредством ELISA. Полученные величины переводили в процентное ингибирование относительно контроля с TGFe1. Данные представлены в качестве среднего значения (для трех повторений) ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством одностороннего ANOVA, а затем апостериорного критерия Бонферрони, с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0. [*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001 (сравнение против группы TGFe1 1 нг/мл)]. Аппроксимацию кривой и вычисление полумаксимальной ингибиторной концентрации (IC₅₀) проводили с использованием программного обеспечения XLFit 5.3.1.3.- 3,040,800 subjects were activated by the profibrogenic cytokine TGFei (1 ng/ml). After incubation for 48 hours, α-SMA expression was quantified by ELISA. The values obtained were converted into percentage inhibition relative to the control with TGFe1. Data are presented as mean (for three repetitions) ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test using Sigma Plot 11.0 software. [*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparison against TGFe1 1 ng/ml group)]. Curve fitting and calculation of the half-maximal inhibitory concentration (IC ₅₀ ) was performed using XLFit 5.3.1.3 software.

Фиг. 2. Нитазоксанид и его метаболит тизоксанид снижают уровень транскриптов COL1A1 в индуцированных TGFe1 HSC человека.Fig. 2. Nitazoxanide and its metabolite tizoxanide reduce the level of COL1A1 transcripts in TGFe1-induced human HSCs.

Лишенные сыворотки HSC предварительно инкубировали в течение 1 ч с NTZ (А) или TZ (В), а затем проводили активацию TGFe1 (1 нг/мл). После инкубации в течение 24 ч экспрессию COL1A1 количественно определяли посредством ОТ-кПЦР. Уровни экспрессии переводили в кратность индукции относительно контроля TGFe1. Данные представлены в качестве среднего значения (для трех повторений) ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством одностороннего ANOVA, а затем апостериорного критерия Бонферрони, с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0. [*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001 (сравнение против группы TGFe1 1 нг/мл)].Serum-deprived HSCs were pre-incubated for 1 h with NTZ (A) or TZ (B) and then activated with TGFe1 (1 ng/ml). After incubation for 24 hours, COL1A1 expression was quantified by RT-qPCR. Expression levels were converted to induction fold relative to the TGFe1 control. Data are presented as mean (for three repetitions) ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test using Sigma Plot 11.0 software. [*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparison against TGFe1 1 ng/ml group)].

Фиг. 3. NTZ (А) или TZ (В) ингибируют индуцируемую TFGe1 экспрессию белка α-SMA в HSC крысы.Fig. 3. NTZ (A) or TZ (B) inhibit TFGe1-induced α-SMA protein expression in rat HSC.

NTZ (А) или TZ (В) добавляли к лишенным сыворотки HSC крысы (rHSC) за 1 ч до активации посредством TGFe1 (3 нг/мл). После инкубации в течение 48 ч экспрессию α-SMA количественно определяли посредством ELISA. Полученные величины переводили в процентное ингибирование относительно контроля с TGFe1. Данные представлены в качестве среднего значения (для трех повторений) ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством одностороннего ANOVA, а затем апостериорного критерия Бонферрони, с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0. [*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001 (сравнение против группы TGFe1 3 нг/мл)].NTZ (A) or TZ (B) was added to serum-deprived rat HSC (rHSC) 1 h prior to activation with TGFe1 (3 ng/ml). After incubation for 48 hours, α-SMA expression was quantified by ELISA. The values obtained were converted into percentage inhibition relative to the control with TGFe1. Data are presented as mean (for three repetitions) ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test using Sigma Plot 11.0 software. [*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparison against TGFe1 3 ng/ml group)].

Фиг. 4. NTZ (А) или TZ (В) ингибируют индуцируемую TFGe1 экспрессию белка α-SMA в фибробластах легкого человека.Fig. 4. NTZ (A) or TZ (B) inhibit TFGe1-induced α-SMA protein expression in human lung fibroblasts.

NTZ (А) или TZ (В) добавляли к лишенным сыворотки фибробластам легкого (NHLF) за 1 ч до активации посредством TGFe1 (1 нг/мл). После инкубации в течение 48 ч экспрессию α-SMA количественно определяли посредством ELISA. Полученные величины переводили в процентное ингибирование относительно контроля с TGFe1. Данные представлены в качестве среднего значения (для трех повторений) ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством одностороннего ANOVA, а затем апостериорного критерия Бонферрони, с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0. [*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001 (сравнение против группы TGFe1 1 нг/мл)].NTZ (A) or TZ (B) was added to serum-deprived lung fibroblasts (NHLF) 1 h prior to activation with TGFe1 (1 ng/ml). After incubation for 48 hours, α-SMA expression was quantified by ELISA. The values obtained were converted into percentage inhibition relative to the control with TGFe1. Data are presented as mean (for three repetitions) ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test using Sigma Plot 11.0 software. [*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparison against TGFe1 1 ng/ml group)].

Фиг. 5. NTZ (А) или TZ (В) ингибируют индуцируемую TFGe1 экспрессию белка α-SMA в фибробластах сердца человека.Fig. 5. NTZ (A) or TZ (B) inhibit TFGe1-induced α-SMA protein expression in human heart fibroblasts.

NTZ (А) или TZ (В) добавляли к лишенным сыворотки фибробластам сердца (NHCF) за 1 ч до активации посредством TGFe1 (3 нг/мл). После инкубации в течение 48 ч экспрессию α-SMA количественно определяли посредством ELISA. Полученные величины переводили в процентное ингибирование относительно контроля с TGFe1. Данные представлены в качестве среднего значения (для трех повторений) ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством одностороннего ANOVA, а затем апостериорного критерия Бонферрони, с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0. [*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001 (сравнение против группы TGFe1 3 нг/мл)].NTZ (A) or TZ (B) was added to serum-deprived cardiac fibroblasts (NHCF) 1 hour prior to activation with TGFe1 (3 ng/ml). After incubation for 48 hours, α-SMA expression was quantified by ELISA. The values obtained were converted into percentage inhibition relative to the control with TGFe1. Data are presented as mean (for three repetitions) ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test using Sigma Plot 11.0 software. [*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparison against TGFe1 3 ng/ml group)].

Фиг. 6. NTZ (А) или TZ (В) ингибируют индуцируемую TFGe1 экспрессию белка α-SMA в фибробластах кишечника человека.Fig. 6. NTZ (A) or TZ (B) inhibit TFGe1-induced α-SMA protein expression in human intestinal fibroblasts.

NTZ (А) или TZ (В) добавляли к лишенным сыворотки фибробластам кишечника (InMyoFib) за 1 ч до активации посредством TGFe1 (3 нг/мл). После инкубации в течение 48 ч экспрессию α-SMA количественно определяли посредством ELISA. Полученные величины переводили в процентное ингибирование относительно контроля с TGFe1. Данные представлены в качестве среднего значения (для трех повторений) ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством одностороннего ANOVA, а затем апостериорного критерия Бонферрони, с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0. [*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001 (сравнение против группы TGFe1 3 нг/мл)].NTZ (A) or TZ (B) was added to serum-deprived intestinal fibroblasts (InMyoFib) 1 h prior to activation with TGFe1 (3 ng/ml). After incubation for 48 hours, α-SMA expression was quantified by ELISA. The values obtained were converted into percentage inhibition relative to the control with TGFe1. Data are presented as mean (for three repetitions) ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test using Sigma Plot 11.0 software. [*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001 (comparison against TGFe1 3 ng/ml group)].

Фиг. 7. Хроническое пероральное введение нитазоксанида (10 мг/кг/сутки) препятствует индуцируемому CDAA накоплению коллагена в печени мышей C57Bl/6J.Fig. 7. Chronic oral administration of nitazoxanide (10 mg/kg/day) prevents CDAA-induced collagen accumulation in the liver of C57Bl/6J mice.

Мышей C57BL/6 в возрасте 6 недель кормили контрольным рационом (CSAA), рационом CDAA+1% CHOL (CDAAc) или рационом CDAAc с дополнением 10 мг/кг/сутки NTZ в течение 12 недель. После умерщвления определяли содержание коллагена в печени. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством tкритерия Стьюдента с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0: CSAA против CDAAcC57BL/6 mice at 6 weeks of age were fed a control diet (CSAA), a CDAA+1% CHOL diet (CDAAc), or a CDAAc diet supplemented with 10 mg/kg/day NTZ for 12 weeks. After sacrifice, the content of collagen in the liver was determined. Data are presented as mean ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by Student's t test using Sigma Plot 11.0 software: CSAA vs. CDAAc

- 4 040800 (#: p<0,05; ##: p<0,01; ###: p<0,001) и CDAAc против NTZ 10 мг/кг/сутки (*: p<0,05; **: p<0,01; ***:- 4 040800 (#: p<0.05; ##: p<0.01; ###: p<0.001) and CDAAc vs. NTZ 10 mg/kg/day (*: p<0.05; ** : p<0.01;***:

p<0,001).p<0.001).

Фиг. 8. Длительное пероральное введение нитазоксанида (10 мг/кг/сутки) препятствует индуцируемому рационом с CDAAc фиброзу в печени мышей C57Bl/6J.Fig. 8. Long-term oral administration of nitazoxanide (10 mg/kg/day) interferes with CDAAc diet-induced fibrosis in the liver of C57Bl/6J mice.

Мышей C57BL/6 в возрасте 6 недель кормили контрольным рационом (CSAA), рационом CDAAc или рационом CDAAc с дополнением 10 мг/кг/сутки NTZ в течение 12 недель. После умерщвления определяли фиброз печени. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством t-критерия Стьюдента с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0: CSAA против CDAAc (#: р<0,05; ##: р<0,01; ###: р<0,001) и CDAAc против NTZ 10 мг/кг/сутки (*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001).C57BL/6 mice at 6 weeks of age were fed a control diet (CSAA), a CDAAc diet, or a CDAAc diet supplemented with 10 mg/kg/day NTZ for 12 weeks. After sacrifice, hepatic fibrosis was determined. Data are presented as mean ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by Student's t-test using Sigma Plot 11.0 software: CSAA vs. CDAAc (#: p<0.05; ##: p<0.01; ###: p<0.001) and CDAAc vs. NTZ 10 mg/kg/day (*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001).

Фиг. 9. Длительное пероральное введение нитазоксанида препятствует индуцируемым CCl₄ уровням концентрации циркулирующего ТВА.Fig. 9. Long-term oral administration of nitazoxanide interferes with CCl ₄ -induced circulating TBA levels.

Крысам массой 250-275 г внутрибрюшинно инъецировали оливковое масло (контрольная группа) или CCl₄, эмульгированный в оливковом масле (CCl₄:оливковое масло 1:2 об./об., конечная концентрация CCl₄: 2 мл/кг) два раза в неделю в течение 3 недель. Одновременно группе, в которой инъецировали оливковое масло, начинали давать контрольный рацион, в то время как в группах, в которых инъецировали CCl₄, начинали давать контрольный рацион или рацион, дополненный NTZ 10 мг/кг/сутки или 30 мг/кг/сутки. После умерщвления определяли концентрацию циркулирующего ТВА. Данные представлены в качестве среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили посредством t-критерия Стьюдента с использованием программного обеспечения Sigma Plot 11.0: оливковое масло против CCl₄ (#: р<0,05; ##: р<0,01; ###: р<0,001) и CCl₄ против NTZ (*: р<0,05; **: р<0,01; ***: р<0,001).Rats weighing 250-275 g were intraperitoneally injected with olive oil (control group) or CCl ₄ emulsified in olive oil (CCl ₄ : olive oil 1:2 v/v, final concentration of CCl ₄ : 2 ml/kg) twice a day. week for 3 weeks. Simultaneously, the olive oil injected group was started on the control diet, while the CCl ₄ injected groups were started on the control diet or the diet supplemented with NTZ 10 mg/kg/day or 30 mg/kg/day. After sacrifice, the concentration of circulating TBA was determined. Data are presented as mean ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed by Student's t-test using Sigma Plot 11.0 software: olive oil vs. CCl ₄ (#: p<0.05;##:p<0.01;###:p<0.001) and CCl ₄ vs. NTZ (*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001).

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

В экспериментальной части настоящей заявки показано, что соединения [2-[(5-нитро-1,3-тиазол-2ил)карбамоил]фенил]этаноат (нитазоксанид) и 2-гидрокси-N-(5-нитро-2-тиазолил)бензамид (тизоксанид) обладают противофиброзными свойствами в нескольких моделях фиброза. Более того, показано, что NTZ или его активный метаболит TZ обладают способностью препятствовать появлению измененных уровней циркулирующих желчных кислот в модели повреждения печени, демонстрируя способность NTZ и TZ лечить холестатические заболевания. Таким образом, настоящее изобретение относится к новым терапевтическим применениям соединения NTZ или его активного метаболита, такого как TZ или TZG.The experimental part of this application shows that the compounds [2-[(5-nitro-1,3-thiazol-2yl)carbamoyl]phenyl]ethanoate (nitazoxanide) and 2-hydroxy-N-(5-nitro-2-thiazolyl) benzamide (tizoxanide) has antifibrotic properties in several models of fibrosis. Moreover, NTZ or its active metabolite TZ has been shown to have the ability to prevent the appearance of altered levels of circulating bile acids in a liver injury model, demonstrating the ability of NTZ and TZ to treat cholestatic diseases. Thus, the present invention relates to novel therapeutic uses for an NTZ compound or its active metabolite such as TZ or TZG.

В частности, настоящее изобретение относится к соединению NTZ или TZ(G), или к фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), для применения в способе лечения холестатического или фибротического нарушения. Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей NTZ или TZ(G), или их фармацевтически приемлемую соль, для применения в способе лечения холестатического или фибротического нарушения. Более того, изобретение относится к применению NTZ или TZ(G), или их фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства, пригодного для лечения холестатического или фибротического нарушения. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей NTZ или TZ(G), или их фармацевтически приемлемую соль. Фармацевтическая композиция по изобретению пригодна для лечения холестатического или фибротического нарушения.In particular, the present invention relates to an NTZ or TZ(G) compound, or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), for use in a method of treating a cholestatic or fibrotic disorder. The invention relates to a pharmaceutical composition containing NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in a method for treating a cholestatic or fibrotic disorder. Moreover, the invention relates to the use of NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a medicament suitable for the treatment of a cholestatic or fibrotic disorder. The invention also relates to a pharmaceutical composition containing NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The pharmaceutical composition of the invention is useful in the treatment of a cholestatic or fibrotic disorder.

Хотя этиологические факторы или инициирующие события фибротических нарушений являются довольно разнообразными и их патогенез варьируется, общим признаком пораженных тканей является присутствие больших количеств активированных фибробластов, называемых миофибробластами ((Rosenbloom, Mendoza et al., 2013) ). Стимул фиброза, такой как TGFe1, может индуцировать дифференцировку фибробластов в миофибробласты (Leask and Abraham, 2004; Leask, 2007). Миофибробласты представляют собой метаболически и морфологически отличимые фибробласты, активация и пролиферация которых играет ключевую роль в развитии фибротического ответа. Более того, эти миофибробласты проявляют уникальные биологические функции, включая экспрессию белков, вовлеченных в образование внеклеточного матрикса, таких как различные формы коллагена, фибронектин и другие белки ЕСМ. Индукция экспрессии α-гладкомышечного актина (α-SMA) является общепризнанным признаком дифференцировки покоящихся фибробластов в активированные миофибробласты, и ее можно использовать в качестве физиологического показателя для оценки эффективности лекарственных средств, препятствующих фибротическому процессу.Although the etiological factors or initiating events of fibrotic disorders are quite diverse and their pathogenesis varies, a common feature of affected tissues is the presence of large numbers of activated fibroblasts called myofibroblasts ((Rosenbloom, Mendoza et al., 2013) ). A fibrosis stimulus such as TGFe1 can induce fibroblast differentiation into myofibroblasts (Leask and Abraham, 2004; Leask, 2007). Myofibroblasts are metabolically and morphologically distinct fibroblasts whose activation and proliferation play a key role in the development of a fibrotic response. Moreover, these myofibroblasts exhibit unique biological functions, including the expression of proteins involved in the formation of the extracellular matrix, such as various forms of collagen, fibronectin, and other ECM proteins. Induction of α-smooth muscle actin (α-SMA) expression is a well-recognized sign of differentiation of resting fibroblasts into activated myofibroblasts, and can be used as a physiological index to assess the effectiveness of drugs that interfere with the fibrotic process.

Факторы роста опухоли β и особенно фактор роста опухоли β 1 (TGFe1) являются общепризнанными физиологическими сигналами, которые индуцируют фенотипическую трансформацию фибробластов в профибротические миофибробласты, которые экспрессируют высокие уровни α-SMA и высокие уровни белков внеклеточного матрикса, которые затем секретируются и формируют фиброзную рубцовую ткань.Tumor growth factors β and especially tumor growth factor β 1 (TGFe1) are recognized physiological signals that induce the phenotypic transformation of fibroblasts into profibrotic myofibroblasts that express high levels of α-SMA and high levels of extracellular matrix proteins, which are then secreted and form fibrous scar tissue. .

Более того, известно, что пролиферация и активация фибробластов ответственна за продукцию нескольких компонентов соединительной ткани (например, коллагены, эластин, протеогликаны и гиалуро- 5 040800 нан), которые составляют внеклеточный матрикс (Kendall and Feghali-Bostwick, 2014).Moreover, fibroblast proliferation and activation is known to be responsible for the production of several connective tissue components (eg, collagens, elastin, proteoglycans, and hyaluronan) that make up the extracellular matrix (Kendall and Feghali-Bostwick, 2014).

Неожиданно, NTZ, а также его активный метаболит TZ, продемонстрировали противофиброзные свойства, поскольку эти соединения дозозависимым образом снижали уровень α-SMA в индуцированных TGFe звездчатых клетках печени и в первичных фибробластах из других органов. Более того, обработка NTZ или TZ также снижала экспрессию коллагена (Collal) в активированных TGFp HSC крысы, что подтверждает противофиброзные свойства обеих молекул. Противофиброзная активность NTZ или его метаболита TZ также была продемонстрирована in vivo с использованием модели индуцированного CDAAc фиброза печени, в которой было проиллюстрировано сниженное содержание коллагена печени и уменьшенная площадь фиброза. Более того, в модели индуцированного CCl₄ повреждения печени было показано, что NTZ или его активный метаболит TZ могли препятствовать индукции уровней циркулирующих желчных кислот, являющихся маркером холестатических заболеваний.Surprisingly, NTZ, as well as its active metabolite TZ, demonstrated anti-fibrotic properties, as these compounds dose-dependently reduced α-SMA levels in TGFe-induced liver stellate cells and in primary fibroblasts from other organs. Moreover, NTZ or TZ treatment also reduced collagen (Collal) expression in TGFp-activated rat HSCs, confirming the anti-fibrotic properties of both molecules. The antifibrotic activity of NTZ or its metabolite TZ has also been demonstrated in vivo using a model of CDAAc-induced liver fibrosis, in which reduced liver collagen content and reduced fibrosis area were illustrated. Moreover, in a CCl ₄ -induced liver injury model, it was shown that NTZ or its active metabolite TZ could interfere with the induction of circulating bile acid levels, a marker of cholestatic diseases.

NTZ, TZ и TZG для применения в рамках изобретения имеют следующие формулы (I), (II) и (III) соответственноNTZ, TZ and TZG for use within the scope of the invention have the following formulas (I), (II) and (III) respectively

NTZ и TZ известны вследствие их противопаразитарной и противовирусной активности, однако в документах уровня техники не описано, что NTZ, TZ и TZG обладают антихолестатическими и противофиброзными эффектами.NTZ and TZ are known for their antiparasitic and antiviral activity, however, prior art documents do not disclose that NTZ, TZ and TZG have anticholestatic and antifibrotic effects.

Авторы изобретения продемонстрировали новым и изобретательским путем, что эти соединения обладают терапевтическим эффектом при лечении холестаза или фиброза.The inventors have demonstrated in a novel and inventive way that these compounds have a therapeutic effect in the treatment of cholestasis or fibrosis.

Таким образом, изобретение относится к соединению NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), для применения в способе лечения холестатического или фибротического нарушения.Thus, the invention relates to an NTZ or TZ(G) compound, or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), for use in a method of treating a cholestatic or fibrotic disorder.

В следующем аспекте изобретение относится к NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), для применения для ингибирования пролиферации и/или активации фибробластов. Как известно в данной области, фибробласты ответственны за продукцию коллагеновых волокон и других компонентов соединительной ткани во внеклеточном матриксе.In a further aspect, the invention relates to NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), for use in inhibiting proliferation and/or activating fibroblasts. As is known in the art, fibroblasts are responsible for the production of collagen fibers and other connective tissue components in the extracellular matrix.

В соответствии с настоящим изобретением термины фиброз, фибротическое заболевание, фибротическое нарушение и их склонения обозначают патологическое состояние чрезмерного накопления фиброзной соединительной ткани в органе или ткани. Более конкретно, фиброз является патологическим процессом, который включает постоянное образование фиброзных рубцов и сверхпродукцию внеклеточного матрикса соединительной тканью в ответ на повреждение ткани. Физиологически накопление соединительной ткани может нарушать архитектуру и функцию соответствующего органа или ткани.In accordance with the present invention, the terms fibrosis, fibrotic disease, fibrotic disorder and their declensions denote a pathological condition of excessive accumulation of fibrous connective tissue in an organ or tissue. More specifically, fibrosis is a pathological process that involves the persistent formation of fibrous scars and overproduction of extracellular matrix by connective tissue in response to tissue injury. Physiologically, the accumulation of connective tissue can disrupt the architecture and function of the corresponding organ or tissue.

В соответствии с настоящим изобретением фиброз или фибротическое нарушение могут быть ассоциированы с фиброзом любого органа или ткани. Иллюстративные неограничивающие примеры фиброза конкретного органа включают фиброз печени, кишечного тракта, почки, кожи, эпидермиса, эндодермы, мышцы, сухожилия, хряща, сердца, поджелудочной железы, легкого, матки, нервной системы, яичка,In accordance with the present invention, fibrosis or fibrotic disorder may be associated with fibrosis of any organ or tissue. Illustrative non-limiting examples of fibrosis of a specific organ include fibrosis of the liver, intestinal tract, kidney, skin, epidermis, endoderm, muscle, tendon, cartilage, heart, pancreas, lung, uterus, nervous system, testis,

- 6 040800 полового члена, яичника, надпочечника, артерии, вены, толстого кишечника, кишечника (например, тонкого кишечника), желчных путей, мягких тканей (например, средостения или забрюшинного пространства), костного мозга, суставов, и желудка, в частности фиброз печени, почки, кожи, эпидермиса, эндодермы, мышцы, сухожилия, хряща, сердца, поджелудочной железы, легкого, матки, нервной системы, яичка, яичника, надпочечника, артерии, вены, толстого кишечника, кишечника (например, тонкого кишечника), желчных путей, мягких тканей (например, средостения или забрюшинного пространства), костного мозга, суставов и желудка.- 6 040800 penis, ovary, adrenal gland, artery, vein, large intestine, intestine (eg small intestine), biliary tract, soft tissues (eg mediastinum or retroperitoneum), bone marrow, joints, and stomach, in particular fibrosis liver, kidney, skin, epidermis, endoderm, muscle, tendon, cartilage, heart, pancreas, lung, uterus, nervous system, testicle, ovary, adrenal gland, artery, vein, large intestine, intestine (eg, small intestine), bile pathways, soft tissues (eg, mediastinum or retroperitoneum), bone marrow, joints, and stomach.

В соответствии с настоящим изобретением термины холестаз, или холестатическое заболевание, или холестатическое нарушение и его склонения обозначают патологическое состояние, определяемое снижением тока желчи вследствие нарушения секреции гепатоцитами или препятствования току желчи через внутрипеченочные и внепеченочные желчные протоки. Таким образом, клиническим определением холестаза является любое состояние, при котором вещества, обычно экскретируемые в желчь, задерживаются.In accordance with the present invention, the terms cholestasis, or cholestatic disease, or cholestatic disorder and its declensions denote a pathological condition defined by a decrease in bile flow due to impaired secretion by hepatocytes or obstruction of the flow of bile through the intrahepatic and extrahepatic bile ducts. Thus, the clinical definition of cholestasis is any condition in which substances normally excreted in the bile are retained.

В конкретном варианте осуществления фибротическое нарушение выбрано из группы, состоящей из фиброза печени, кишечного тракта, легкого, сердца, почки, мышцы, кожи, мягких тканей (например, средостения или забрюшинного пространства), костного мозга, кишечника и суставов (например, коленного, плечевого или других суставов).In a specific embodiment, the fibrotic disorder is selected from the group consisting of fibrosis of the liver, intestinal tract, lung, heart, kidney, muscle, skin, soft tissues (e.g., mediastinum or retroperitoneum), bone marrow, intestines, and joints (e.g., knee, shoulder or other joints).

В предпочтительном варианте осуществления фибротическое нарушение выбрано из группы, состоящей из фиброза печени, легкого, кожи, почки и кишечника.In a preferred embodiment, the fibrotic disorder is selected from the group consisting of liver, lung, skin, kidney and intestinal fibrosis.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения подвергаемое лечению фибротическое нарушение выбрано из группы, состоящей из следующего неполного перечня фибротических нарушений: неалкогольный стеатогепатит (NASH), фиброз легких, идиопатический фиброз легких, фиброз кожи, фиброз глаз, эндомиокардиальный фиброз, средостенный фиброз, миелофиброз, забрюшинный фиброз, прогрессирующий массивный фиброз (осложнение пневмокониоза шахтеров), пролиферативный фиброз, неопластический фиброз, фиброз легких после хронического воспалительного заболевания легких (COPD, астма, эмфизема, легкое курильщика, туберкулез), алкогольный или индуцируемый лекарственными средствами фиброз печени, цирроз печени, индуцируемый инфекцией фиброз печени, индуцируемый радиацией или химиотерапией фиброз, нефрогенный системный фиброз, болезнь Крона, язвенный колит, келоид, перенесенный инфаркт миокарда, склеродермия/системная склеродермия, артрофиброз, некоторые формы адгезивного капсулита, хронические фиброзирующие холангиопатии, такие как первичный склерозирующий холангит (PSC) и первичный билиарный холангит (РВС), атрезия желчных протоков, семейный внутрипеченочный холестаз 3 типа (PFIC3), периимплантационный фиброз и асбестоз.In a more preferred embodiment of the present invention, the fibrotic disorder being treated is selected from the group consisting of the following non-exhaustive list of fibrotic disorders: non-alcoholic steatohepatitis (NASH), pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, skin fibrosis, ocular fibrosis, endomyocardial fibrosis, mediastinal fibrosis, myelofibrosis, retroperitoneal fibrosis, progressive massive fibrosis (a complication of miners' pneumoconiosis), proliferative fibrosis, neoplastic fibrosis, pulmonary fibrosis after chronic inflammatory lung disease (COPD, asthma, emphysema, smoker's lung, tuberculosis), alcoholic or drug-induced liver fibrosis, liver cirrhosis, induced infection, liver fibrosis, radiation or chemotherapy-induced fibrosis, nephrogenic systemic fibrosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, keloid, previous myocardial infarction, scleroderma/systemic scleroderma, arthrofibrosis, some forms of adhesive capsulitis, chronic fibrosing cholangiopathy such as primary sclerosing cholangitis (PSC) and primary biliary cholangitis (PBC), bile duct atresia, type 3 familial intrahepatic cholestasis (PFIC3), peri-implantation fibrosis, and asbestosis.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения холестатическое заболевание выбрано из группы, состоящей из первичного билиарного холангита (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), внутрипеченочного холестаза при беременности, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, атрезии желчных протоков, холелитиаза, инфекционного холангита, холангита, ассоциированного с гистиоцитозом из клеток Лангерганса, синдрома Алажилля, внесиндромной недостаточности протоков, индуцируемого лекарственными средствами холестаза и ассоциированного с полным парентеральным питанием холестаза. В предпочтительном варианте осуществления холестатическое заболевание представляет собой РВС или PSC, в частности РВС.According to a specific embodiment of the invention, the cholestatic disease is selected from the group consisting of primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), intrahepatic cholestasis of pregnancy, progressive familial intrahepatic cholestasis, biliary atresia, cholelithiasis, infectious cholangitis, cholangitis associated with Langerhans cell histiocytosis, Alagille syndrome, extrasyndromic duct insufficiency, drug-induced cholestasis, and total parenteral nutrition-associated cholestasis. In a preferred embodiment, the cholestatic disease is PBC or PSC, in particular PBC.

Термин лечение или лечащий относится к направленному на излечение или профилактическому лечению холестатического или фибротического нарушения у индивидуума, нуждающегося в этом. Лечение вовлекает введение соединения, в частности, содержащегося в фармацевтической композиции, индивидууму, имеющему установленное нарушение, т.е. пациенту, для излечения, отсрочивания, обращения вспять или замедления прогрессирования нарушения, тем самым улучшая состояния индивидуума. Лечение также можно проводить у индивидуума, который является здоровым или имеет риск развития холестатического или фибротического нарушения, для предупреждения или отсрочивания нарушения.The term treating or treating refers to the curative or prophylactic treatment of a cholestatic or fibrotic disorder in an individual in need thereof. Treatment involves administering a compound, in particular contained in a pharmaceutical composition, to an individual having an established disorder, i. to the patient, to cure, delay, reverse or slow the progression of the disorder, thereby improving the condition of the individual. Treatment can also be given to an individual who is healthy or at risk of developing a cholestatic or fibrotic disorder to prevent or delay the disorder.

Таким образом, согласно изобретению лечение фибротического нарушения вовлекает введение NTZ или TZ(G), или их фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей их, индивидууму, имеющему установленное нарушение, для излечения, отсрочивания, обращения вспять или замедления прогрессирования нарушения, таким образом, улучшая состояние пациента, или здоровому индивидууму, в частности индивидууму, имеющему риск развития холестатического или фибротического нарушения.Thus, according to the invention, the treatment of a fibrotic disorder involves administering NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition containing them, to an individual having an established disorder to cure, delay, reverse, or slow the progression of the disorder, thereby , improving the condition of the patient, or a healthy individual, in particular an individual at risk of developing a cholestatic or fibrotic disorder.

Индивидуумом, подвергаемым лечению, является млекопитающее, предпочтительно человек. Индивидуум, подвергаемый лечению согласно изобретению, может быть выбран, исходя из нескольких критериев, ассоциированных с холестатическими или фибротическими заболеваниями, таких как предшествующее лечение лекарственными средствами, ассоциированные патологии, генотип, воздействие факторов риска, вирусный инфекция, а также исходя из обнаружения какого-либо значимого биомаркера, который можно оценивать способами визуализации и иммунологическими, биохимическими, ферментативными, химическими способами, или способами обнаружения нуклеиновых кислот.The subject being treated is a mammal, preferably a human. An individual to be treated according to the invention may be selected based on several criteria associated with cholestatic or fibrotic diseases, such as prior drug treatment, associated pathologies, genotype, exposure to risk factors, viral infection, and also based on the detection of any a significant biomarker that can be assessed by imaging and immunological, biochemical, enzymatic, chemical, or nucleic acid detection methods.

Синтез NTZ или TZ можно проводить, например, как описано Rossignol and Cavier, 1975, или лю- 7 040800 бым другим способом синтеза, известным специалисту в данной области. TZG можно синтезировать, например, любым способом синтеза, известным в данной области, таким как в Wadouachi 2011. S'agit-il de A Wadouachi, J Kovensky, Synthesis of Glycosides of Glucuronic, Galacturonic and Mannuronic Acids: AnThe synthesis of NTZ or TZ can be carried out, for example, as described by Rossignol and Cavier, 1975, or by any other synthetic method known to the person skilled in the art. TZG can be synthesized, for example, by any synthetic method known in the art, such as in Wadouachi 2011. S'agit-il de A Wadouachi, J Kovensky, Synthesis of Glycosides of Glucuronic, Galacturonic and Mannuronic Acids: An

Overview, Molecules, 2011, 16(5), 3933-3968.Overview, Molecules, 2011, 16(5), 3933-3968.

В конкретном варианте осуществления лечение холестатического или фибротического нарушения может включать введение комбинации как NTZ, так и TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ и TZ(G). Согласно варианту этого варианта осуществления как NTZ, так и TZ(G) содержатся вместе в одной композиции.In a particular embodiment, treatment of a cholestatic or fibrotic disorder may include administering a combination of both NTZ and TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ and TZ(G). According to a variant of this embodiment, both NTZ and TZ(G) are contained together in one composition.

В другом варианте этого варианта осуществления NTZ и TZ(G) предназначены для одновременного, последовательного или раздельного введения при терапии, таким образом, они могут быть включены в различные композиции. В случае последовательного введения NTZ можно вводить до введения TZ(G), или TZ(G) можно вводить до введения NTZ. По существу, изобретение также относится к набору, содержащему (i) NTZ или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическую композицию, содержащую NTZ или его фармацевтически приемлемую соль; и (ii) TZ(G) или его фармацевтически приемлемую соль или фармацевтическую композицию, содержащую TZ(G) или его фармацевтически приемлемую соль, для одновременного, последовательного или раздельного введения.In another embodiment of this embodiment, NTZ and TZ(G) are intended for simultaneous, sequential or separate administration in therapy, thus they can be included in different compositions. In the case of sequential administration, NTZ may be administered prior to TZ(G) administration, or TZ(G) may be administered prior to NTZ administration. As such, the invention also relates to a kit containing (i) NTZ or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition containing NTZ or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and (ii) TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition containing TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for simultaneous, sequential or separate administration.

NTZ или TZ(G) можно составлять в качестве фармацевтически приемлемых солей, в частности кислых или основных солей, совместимых с фармацевтическим применением. Соли NTZ и TZ(G) включают фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли, фармацевтически приемлемые основноаддитивные соли, фармацевтически приемлемые соли металлов, соли аммония и соли алкилированного аммония. Эти соли можно получать на конечной стадии очистки соединения или путем включения соли в ранее очищенное соединение.NTZ or TZ(G) can be formulated as pharmaceutically acceptable salts, in particular acidic or basic salts compatible with pharmaceutical use. NTZ and TZ(G) salts include pharmaceutically acceptable acid addition salts, pharmaceutically acceptable base addition salts, pharmaceutically acceptable metal salts, ammonium salts, and alkylated ammonium salts. These salts can be obtained in the final purification step of the compound or by incorporating the salt into a previously purified compound.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение, выбранное из NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), для применения в способе лечения холестатического или фибротического заболевания.In another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a compound selected from NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), for use in a method of treating a cholestatic or fibrotic disease.

Фармацевтическая композиция, содержащая NTZ или TZ(G), в частности, для применения в способе лечения холестатического или фибротического нарушения, также может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов или носителей (например, солевые растворы, физиологические растворы, изотонические растворы и т.д., совместимые с фармацевтическим применением и хорошо известные специалисту в данной области).A pharmaceutical composition containing NTZ or TZ(G), in particular for use in a method of treating a cholestatic or fibrotic disorder, may also contain one or more pharmaceutically acceptable excipients or carriers (for example, saline solutions, saline solutions, isotonic solutions, etc. ., compatible with pharmaceutical use and well known to the person skilled in the art).

Эти композиции, кроме того, могут содержать одно или несколько средств или носителей, выбранных из диспергирующих средств, солюбилизаторов, стабилизаторов, консервантов и т.д. Средства или носители, пригодные для этих составов (жидкие, и/или инъекционные, и/или твердые), в частности, представляют собой метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, полисорбат 80, маннит, желатин, лактозу, растительные масла, гуммиарабик, липосомы и т.д.These compositions may also contain one or more agents or carriers selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, and the like. Suitable agents or carriers for these formulations (liquid and/or injectable and/or solid) are in particular methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils, gum arabic, liposomes, etc. .d.

Эти композиции можно составлять в форме инъекционных суспензий, сиропов, гелей, масел, мазей, пилюль, таблеток, суппозиториев, порошков, желатиновых капсул, капсул, аэрозолей и т.д., наконец, посредством галеновых форм или устройств, обеспечивающих пролонгированное и/или замедленное высвобождение. Для составов этого типа предпочтительно можно использовать такие средства, как целлюлоза, карбонаты или крахмалы.These compositions can be formulated in the form of injectable suspensions, syrups, gels, oils, ointments, pills, tablets, suppositories, powders, gelatin capsules, capsules, aerosols, etc., finally, by means of galenic forms or devices providing prolonged and/or delayed release. For formulations of this type, agents such as cellulose, carbonates or starches may preferably be used.

NTZ или TZ(G) можно вводить различными путями и в различных формах. Например, соединение(я) можно вводить системным путем, перорально, парентерально, ингаляционным путем, посредством назального спрей, посредством вливания через нос, или путем инъекции, например, внутривенно, внутримышечным путем, подкожным путем, трансдермальным путем, местным путем, внутриартериальным путем и т.д.NTZ or TZ(G) may be administered in various ways and in various forms. For example, the compound(s) can be administered systemically, orally, parenterally, by inhalation, by nasal spray, by nasal infusion, or by injection, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, transdermally, topically, intra-arterially, and etc.

Безусловно, путь введения будет адаптирован к форме NTZ или TZ(G) по методикам, хорошо известным специалистам в данной области.Of course, the route of administration will be adapted to the form of NTZ or TZ(G) by techniques well known to those skilled in the art.

В конкретном варианте осуществления соединение составлено в качестве таблетки. В другом конкретном варианте осуществления соединение вводят перорально.In a particular embodiment, the compound is formulated as a tablet. In another specific embodiment, the compound is administered orally.

NTZ или TZ(G), или их фармацевтически приемлемую соль, вводят в терапевтически эффективном количестве. В контексте изобретения термин эффективное количество относится к количеству соединения, достаточному для обеспечения желаемого терапевтического эффекта.NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is administered in a therapeutically effective amount. In the context of the invention, the term effective amount refers to an amount of a compound sufficient to provide the desired therapeutic effect.

Частота и/или доза для введения могут быть адаптированы специалистом в данной области, в зависимости от пациента, патологии, формы введения и т.д. Как правило, NTZ или TZ(G) можно вводить для лечения холестатического или фибротического заболевания в дозе, составляющей от 0,01 мг/сутки до 4000 мг/сутки, как, например, от 50 до 2000 мг/сутки, такой как от 100 до 2000 мг/сутки; и, в частности, от 100 до 1000 мг/сутки. В конкретном варианте осуществления NTZ, TZ(G) или их фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе приблизительно 1000 мг/сутки (т.е. в дозе от 900 до 1100 мг/сутки), в частности в дозе 1000 мг/сутки. В конкретном варианте осуществления NTZ, TZ(G) или их фармацевтически приемлемую соль вводят перорально в дозе приблизительно 1000 мг/сутки, в частности 1000 мг/сутки, в частности в виде таблетки. Введение можно проводить каждые сутки или при необходимости даже несколько раз в сутки. В одном варианте осуществления соединение вводят по меньшей мере одинThe frequency and/or dosage for administration may be adapted by one of ordinary skill in the art, depending on the patient, pathology, form of administration, etc. Typically, NTZ or TZ(G) may be administered for the treatment of cholestatic or fibrotic disease at a dose of 0.01 mg/day to 4000 mg/day, such as 50 to 2000 mg/day, such as 100 up to 2000 mg/day; and in particular from 100 to 1000 mg/day. In a specific embodiment, NTZ, TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is administered at a dose of about 1000 mg/day (ie 900 to 1100 mg/day), in particular at a dose of 1000 mg/day. In a specific embodiment, NTZ, TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally at a dose of about 1000 mg/day, in particular 1000 mg/day, in particular in the form of a tablet. The introduction can be carried out every day or, if necessary, even several times a day. In one embodiment, the compound is administered at least one

- 8 040800 раз в сутки, например один раз в сутки, два раза в сутки или три раза в сутки. В конкретном варианте осуществления соединение вводят один раз в сутки или два раза в сутки. В частности, пероральное введение можно проводить один раз в сутки в ходе приема пищи, например во время завтрака, обеда или ужина, путем приема таблетки, содержащей соединение в дозе приблизительно 1000 мг, в частности в дозе 1000 мг. В другом варианте осуществления таблетку вводят перорально два раза в сутки, например, путем введения первой таблетки, содержащей соединение в дозе приблизительно 500 мг (т.е. в дозе от 450 до 550 мг), в частности в дозе 500 мг, во время одного приема пищи, и введения второй таблетки, содержащей соединение, в дозе приблизительно 500 мг, в частности в дозе 500 мг, во время другого приема пищи в тот же день.- 8 040800 times a day, for example once a day, twice a day or three times a day. In a particular embodiment, the compound is administered once a day or twice a day. In particular, oral administration can be carried out once a day during meals, for example during breakfast, lunch or dinner, by taking a tablet containing the compound at a dose of approximately 1000 mg, in particular at a dose of 1000 mg. In another embodiment, the tablet is administered orally twice a day, for example, by administering the first tablet containing the compound at a dose of approximately 500 mg (i.e., at a dose of 450 to 550 mg), in particular at a dose of 500 mg, during one meal, and administering a second tablet containing the compound at a dose of approximately 500 mg, in particular at a dose of 500 mg, at another meal on the same day.

В подходящем случае курс лечения NTZ, TZ(G) или их фармацевтически приемлемой солью составляет по меньшей мере 1 неделю, в частности по меньшей мере 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 24 недели или более. В частности, курс лечения NTZ, TZ(G) или их фармацевтически приемлемой солью составляет по меньшей мере 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или по меньшей мере 5 лет.Suitably, the course of treatment with NTZ, TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is at least 1 week, in particular at least 2, 3, 4, 5, b, 7, 8, 9, 10, 15, 20 or 24 weeks or more. In particular, the course of treatment with NTZ, TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is at least 1 year, 2 years, 3 years, 4 years or at least 5 years.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к лечению холестатического или фибротического заболевания, в частности фиброза печени, более конкретно фиброза печени после NASH, у пациента, нуждающегося в этом, включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), в частности введение NTZ в дозе 1000 мг/сутки, в частности, путем приема таблетки, содержащей 500 мг NTZ, два раза в сутки, в частности во время двух различных приемов пищи.In a specific embodiment, the invention relates to the treatment of a cholestatic or fibrotic disease, in particular liver fibrosis, more specifically liver fibrosis after NASH, in a patient in need thereof, comprising administering to said patient a therapeutically effective amount of NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt NTZ or TZ(G), in particular the administration of NTZ at a dose of 1000 mg/day, in particular by taking a tablet containing 500 mg of NTZ twice a day, in particular at two different meals.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к применению NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), для лечения холестатического или фибротического заболевания в комбинации по меньшей мере с одним другим терапевтически активным средством с известной противофиброзной активностью. Согласно варианту этого варианта осуществления NTZ или TZ(G) можно комбинировать с любым противофиброзным соединением, таким как пирфенидон или ингибиторы рецепторных тирозинкиназ (RTKI), такие как нинтеданиб, сорафениб и другие RTKI, или блокаторы рецепторов ангиотензина II (AT1), или ингибитор CTGF, или любое противофиброзное соединение, связанное с препятствованием активируемым TGFe и BMP каскадам, включая активаторы латентного комплекса TGFe, такие как ММР2, ММР9, THBS1 или интегрины клеточной поверхности, рецепторы TGFe типа I (TGFBRI) или типа II (TGFBRII) и их лиганды, такие как TGFe, активин, ингибин, Nodal, антимюллеров гормон, GDF или BMP, вспомогательные корецепторы (также известные как рецепторы типа III), или компоненты SMAD-зависимого канонического каскада, включающего регуляторные или ингибиторные белки SMAD, или представители независимых от SMAD или неканонических каскадов, включая различные ветви передачи сигнала MAPK, TAK1, каскады передачи сигнала Rho-подобной GTP-азой, каскады фосфатидилинозитол-3 киназы/AKT, TGFe-индуцируемый процесс ЕМТ или канонические и неканонические каскады передачи сигнала Hedgehog, включающие лиганды Hh или генымишени, или любые представители каскадов WNT или Notch, которые подвержены влиянию передачи сигнала TGFe.In a specific embodiment, the invention relates to the use of NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), for the treatment of cholestatic or fibrotic disease in combination with at least one other therapeutically active agent with known antifibrotic activity. According to a variant of this embodiment, NTZ or TZ(G) can be combined with any anti-fibrotic compound such as pirfenidone or receptor tyrosine kinase inhibitors (RTKIs) such as nintedanib, sorafenib and other RTKIs or angiotensin II receptor blockers (AT1) or a CTGF inhibitor , or any anti-fibrotic compound associated with interfering with activated TGFe and BMP cascades, including TGFe latent complex activators such as MMP2, MMP9, THBS1 or cell surface integrins, type I (TGFBRI) or type II (TGFBRII) TGFe receptors and their ligands, such as TGFe, activin, inhibin, Nodal, anti-Mullerian hormone, GDF or BMP, accessory co-receptors (also known as type III receptors), or components of an SMAD-dependent canonical cascade involving regulatory or inhibitory SMAD proteins, or representatives of SMAD-independent or non-canonical cascades including various MAPK, TAK1 signaling branches, Rho-like GTPase signaling cascades oh, phosphatidylinositol-3 kinase/AKT cascades, TGFe-induced EMT process, or canonical and non-canonical Hedgehog signaling cascades involving Hh or gene target ligands, or any of the WNT or Notch cascades that are affected by TGFe signaling.

Таким образом, изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение, выбранное из NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), в комбинации по меньшей мере с одним терапевтически активным средством с известной противофиброзной активностью, выбранным из пирфенидона или ингибиторов рецепторных тирозинкиназ (RTKI), таких как нинтеданиб, сорафениб и другие RTKI, или блокаторов рецепторов ангиотензина II (AT1), или ингибитора CTGF, или любого противофиброзного соединения, связанного с препятствованием активируемым TGFe и BMP каскадам, включая активаторы латентного комплекса TGFe, такие как ММР2, ММР9, THBS1 или интегрины клеточной поверхности, рецепторы TGFe типа I (TGFBRI) или типа II (TGFBRII) и их лиганды, такие как TGFe, активин, ингибин, Nodal, антимюллеров гормон, GDF или BMP, вспомогательные корецепторы (также известные как рецепторы типа III), или компоненты SMAD-зависимого канонического каскада, включающего регуляторные или ингибиторные белки SMAD, или представители независимых от SMAD или неканонических каскадов, включая различные ветви передачи сигнала MAPK, TAK1, каскады передачи сигнала Rho-подобной GTP-азой, каскады фосфатидилинозитол-3 киназы/AKT, TGFe-индуцируемый процесс ЕМТ или канонические и неканонические каскады передачи сигнала Hedgehog, включающие лиганды Hh или гены-мишени, или любые представители каскадов WNT или Notch, которые подвержены влиянию передачи сигнала TGFe, для применения в способе лечения фибротического нарушения.Thus, the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a compound selected from NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), in combination with at least one therapeutically active agent with known antifibrotic activity, selected from pirfenidone or receptor tyrosine kinase inhibitors (RTKIs) such as nintedanib, sorafenib, and other RTKIs, or an angiotensin II receptor (AT1) blocker, or a CTGF inhibitor, or any anti-fibrotic compound associated with interfering with the activated TGFe and BMP cascades, including TGFe latent complex activators , such as MMP2, MMP9, THBS1 or cell surface integrins, TGFe type I (TGFBRI) or type II (TGFBRII) receptors and their ligands such as TGFe, activin, inhibin, Nodal, anti-Müllerian hormone, GDF or BMP, accessory co-receptors ( also known as type III receptors), or components of an SMAD-dependent canonical cascade involving regulatory or inhibitor SMAD proteins, or members of SMAD-independent or non-canonical cascades, including various branches of MAPK, TAK1 signaling, Rho-like GTPase signaling cascades, phosphatidylinositol-3 kinase/AKT cascades, TGFe-induced EMT process, or canonical and non-canonical cascades Hedgehog signaling, including Hh ligands or target genes, or any member of the WNT or Notch cascade that is affected by TGFe signaling, for use in a method of treating a fibrotic disorder.

В другом конкретном варианте осуществления другие классы молекул, которые можно комбинировать с NTZ или TZ(G), включают ингибиторы JAK/STAT или другие противовоспалительные средства и/или иммунодепрессанты. Неполный перечень этих средств включает, но не ограничивается ими, глюкокортикоиды, NSAID, циклофосфамид, нитрозомочевину, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пуринов, аналоги пиримидинов, метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин, циклоспорин, мириоцин, такролимус, сиролимус, производные микофеноловой кислоты, финголимод и другие модуляторы рецепторов сфингозин-1-фосфата, моноклональные и/или поликлональные антитела против таких мишеней, как провос- 9 040800 палительные цитокины и рецепторы провоспалительных цитокинов, Т-клеточный рецептор, интегрины.In another specific embodiment, other classes of molecules that can be combined with NTZ or TZ(G) include JAK/STAT inhibitors or other anti-inflammatory and/or immunosuppressant agents. A non-exhaustive list of these agents includes, but is not limited to, glucocorticoids, NSAIDs, cyclophosphamide, nitrosourea, folic acid analogs, purine analogs, pyrimidine analogs, methotrexate, azathioprine, mercaptopurine, cyclosporine, myriocin, tacrolimus, sirolimus, mycophenolic acid derivatives, fingolimod, and others. sphingosine-1-phosphate receptor modulators, monoclonal and/or polyclonal antibodies against such targets as pro-inflammatory cytokines and pro-inflammatory cytokine receptors, T-cell receptor, integrins.

Другие классы молекул, которые также можно комбинировать с NTZ или TZ(G), включают молекулы, которые потенциально могут усиливать экспозицию или эффект NTZ или TZ(G).Other classes of molecules that can also be combined with NTZ or TZ(G) include those that have the potential to enhance the exposure or effect of NTZ or TZ(G).

В другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к комбинации NTZ, TZ(G) или их фармацевтически приемлемой соли по меньшей мере с одним другим терапевтически активным средством с известной противофиброзной активностью, или с ингибиторами JAK/STAT, или с другими противовоспалительными средствами и/или иммунодепрессантами. Комбинация может быть в форме одной фармацевтической композиции, содержащей различные активные ингредиенты, включая NTZ, TZ(G) или их фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте комбинация представляет собой набор, содержащий NTZ, TZ(G) или их фармацевтически приемлемую соль, и другой активный ингредиент, такой как другое противофиброзное средство, ингибитор JAK/STAT или другое противовоспалительное средство или иммунодепрессант. Указанный набор может быть предназначен для одновременного, раздельного или последовательного введения для лечения холестатического или фибротического нарушения.In another specific embodiment, the invention relates to the combination of NTZ, TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof with at least one other therapeutically active agent with known anti-fibrotic activity, or with JAK/STAT inhibitors, or with other anti-inflammatory agents and/or immunosuppressants. . The combination may be in the form of a single pharmaceutical composition containing various active ingredients including NTZ, TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In one embodiment, the combination is a kit containing NTZ, TZ(G) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and another active ingredient such as another anti-fibrotic agent, JAK/STAT inhibitor, or other anti-inflammatory agent or immunosuppressant. Said kit may be intended for simultaneous, separate or sequential administration for the treatment of a cholestatic or fibrotic disorder.

В другом варианте осуществления соединение NTZ или TZ(G), или комбинацию NTZ и TZ(G), вводят в качестве единственного активного ингредиента. Таким образом, изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение, выбранное из NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемую соль NTZ или TZ(G), или их смесь, для применения в способе лечения холестатического или фибротического нарушения, где указанное соединение(я) является единственным активным ингредиентом(ами) в композиции.In another embodiment, an NTZ or TZ(G) compound, or a combination of NTZ and TZ(G), is administered as the sole active ingredient. Thus, the invention also relates to a pharmaceutical composition containing a compound selected from NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), or a mixture thereof, for use in a method of treating a cholestatic or fibrotic disorder, wherein said compound (i) is the only active ingredient(s) in the composition.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения холестатических или фибротических заболеваний, включающим введение NTZ или TZ(G), или фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ(G), в частности, в форме фармацевтической композиции, содержащей NTZ или TZ.In a further embodiment, the present invention relates to methods for treating cholestatic or fibrotic diseases comprising administering NTZ or TZ(G), or a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ(G), particularly in the form of a pharmaceutical composition containing NTZ or TZ.

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему нитазоксанид или фармацевтически приемлемую соль нитазоксанида и тизоксанид или фармацевтически приемлемую соль тизоксанида.In another aspect, the invention relates to a kit containing nitazoxanide or a pharmaceutically acceptable salt of nitazoxanide and tizoxanide or a pharmaceutically acceptable salt of tizoxanide.

Соединения набора по изобретению вводят одновременно, по отдельности или последовательно для лечения фибротического нарушения.The compounds of the kit of the invention are administered simultaneously, singly or sequentially for the treatment of a fibrotic disorder.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения холестатических и/или фибротических заболеваний, включающему введение два раза в сутки пациенту, нуждающемуся в этом, имеющему холестатическое или фибротическое заболевание (в частности, пациенту с NASH или пациенту, имеющему фиброз печени) таблетки, содержащей 500 мг NTZ, в частности, во время приема пищи (например, во время завтрака, обеда или ужина).In another embodiment, the invention relates to a method for the treatment of cholestatic and/or fibrotic diseases, comprising administering twice daily to a patient in need thereof having a cholestatic or fibrotic disease (in particular, a patient with NASH or a patient having liver fibrosis) of a tablet containing 500 mg NTZ, particularly at mealtimes (eg, during breakfast, lunch, or dinner).

Изобретение далее описано с помощью следующих неограничивающих примеров.The invention is further described using the following non-limiting examples.

ПримерыExamples

Материалы и способы.Materials and methods.

Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO, Fluka, каталожный номер № 41640). Нитазоксанид (INTERCHIM, каталожный номер № RQ550U) и тизоксанид (INTERCHIM, каталожный номер № RP253) получали из коммерческих источников.The compounds were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, Fluka, cat. no. 41640). Nitazoxanide (INTERCHIM, cat. no. RQ550U) and tizoxanide (INTERCHIM, cat. no. RP253) were obtained from commercial sources.

Культивирование hHSC.Cultivation of hHSC.

Первичные звездчатые клетки человека (hHSC) (Innoprot) культивировали в среде STeCM (ScienCell, каталожный номер № 5301), которая была дополнена 2% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS, ScienCell, каталожный номер № 0010), 1% пенициллином/стрептомицином (ScienCell, каталожный номер № 0503) и добавкой для роста звездчатых клеток (SteCGS; ScienCell, каталожный номер № 5352). Флаконы для культивирования клеток были покрыты поли-Ь-лизином (Sigma, каталожный номер № Р4707) для лучшей адгезии.Primary human stellate cells (hHSC) (Innoprot) were cultured in STeCM medium (ScienCell, cat. no. 5301) that was supplemented with 2% fetal bovine serum (FBS, ScienCell, cat. no. 0010), 1% penicillin/streptomycin (ScienCell, 0503) and stellate cell growth supplement (SteCGS; ScienCell, catalog 5352). The cell culture flasks were coated with poly-L-lysine (Sigma, catalog number P4707) for better adhesion.

Активация hHSC посредством TGF-e1.hHSC activation by TGF-e1.

Первичные звездчатые клетки печени человека (hHSC) (Innoprot) культивировали в стандартных условиях, как описано выше. Затем клетки высевали с плотностью 7х10⁴ клеток/лунка в 24-луночные планшеты для исследований экспрессии генов и с плотностью 2x104 клеток/лунка в 96-луночные планшеты для количественного определения α-SMA посредством ELISA. На следующие сутки среду для культивирования клеток удаляли и клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190). hHSC подвергали голоданию в течение 24 ч в бессывороточной и не содержащей SteCGS среде. Для обработки NTZ или TZ лишенные сыворотки hHSC предварительно инкубировали в течение 1 ч с соединениями, а затем добавляли профиброгенный стимул TGFe1 (PeproTech, каталожный номер № 100-21, 1 нг/мл) в бессывороточной и не содержащей SteCGS среде на дополнительные 24 или 48 ч (время указано на легендах фигур). В конце обработки клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190), а затем добавляли 50 мкл лизирующего буфера (CelLyticTM, реагент МТ; Sigma #C3228). Затем планшеты инкубировали в течение 30 мин на льду с использованием встряхивателя для планшетов, а затем хранили при -20°С.Primary human liver stellate cells (hHSC) (Innoprot) were cultured under standard conditions as described above. Cells were then seeded at 7x10 ⁴ cells/well in 24-well plates for gene expression studies and at 2x10 4 cells/well in 96-well plates for quantification of α-SMA by ELISA. The following day, the cell culture medium was removed and the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190). hHSCs were fasted for 24 h in serum-free and SteCGS-free medium. For NTZ or TZ treatment, serum-deprived hHSCs were pre-incubated for 1 h with compounds and then TGFe1 profibrogenic stimulus (PeproTech, cat. no. 100-21, 1 ng/mL) was added in serum-free and SteCGS-free medium for an additional 24 or 48 h (the time is indicated on the figure legends). At the end of the treatment, the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190) and then 50 μl of lysis buffer (CelLyticTM, MT reagent; Sigma #C3228) was added. The plates were then incubated for 30 minutes on ice using a plate shaker and then stored at -20°C.

- 10 040800- 10 040800

Активация HSC крысы посредством TGFei.Rat HSC activation by TGFei.

Первичные звездчатые клетки крысы (rHSC) (Innoprot) культивировали в среде STeCM (ScienCell, каталожный номер № 5301), которая была дополнена 2% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS, ScienCell, каталожный номер № 0010), 1% пенициллином/стрептомицином (ScienCell, каталожный номер № 0503) и добавкой для роста звездчатых клеток (SteCGS; ScienCell, каталожный номер № 5352). Для экспериментов по активации посредством TGFe1, rHSC высевали с плотностью 10x103 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. На следующие сутки среду для культивирования клеток удаляли и клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190). rHSC подвергали голоданию в течение 24 ч в бессывороточной и не содержащей SteCGS среде. Для обработки NTZ или TZ лишенные сыворотки rHSC предварительно инкубировали в течение 1 ч с соединениями, а затем добавляли профиброгенный стимул TGFe1 (PeproTech, каталожный номер № 100-21, 3 нг/мл) в бессывороточной и не содержащей SteCGS среде на дополнительные 48 ч. В конце обработки клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190), а затем добавляли 50 мкл лизирующего буфера (CelLyticTM, реагент МТ; Sigma #C3228). Затем планшеты инкубировали в течение 30 мин на льду с использованием встряхивателя для планшетов, а затем хранили при -20°С.Primary rat stellate cells (rHSC) (Innoprot) were cultured in STeCM medium (ScienCell, cat. no. 5301) supplemented with 2% fetal calf serum (FBS, ScienCell, cat. no. 0010), 1% penicillin/streptomycin (ScienCell, 0503) and stellate cell growth supplement (SteCGS; ScienCell, catalog 5352). For activation experiments with TGFe1, rHSC were seeded at a density of 10x103 cells per well in 96-well plates. The following day, the cell culture medium was removed and the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190). rHSCs were fasted for 24 h in serum-free and SteCGS-free medium. For NTZ or TZ treatment, serum-deprived rHSCs were pre-incubated for 1 h with compounds and then TGFe1 profibrogenic stimulus (PeproTech, Cat #100-21, 3 ng/mL) was added in serum-free and SteCGS-free medium for an additional 48 h. At the end of the treatment, the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190) and then 50 μl of lysis buffer (CelLyticTM, MT reagent; Sigma #C3228) was added. The plates were then incubated for 30 minutes on ice using a plate shaker and then stored at -20°C.

Активация NHLF посредством TGFe1.NHLF activation by TGFe1.

Нормальные фибробласты легкого человека (NHLF) (Lonza) культивировали в базальной среде для фибробластов (FBM) (Lonza, каталожный номер № СС-3131), которая была дополнена набором FGM-2 SingleQuots™ (Lonza, каталожный номер № CC-3132). Полная среда содержит 2% эмбриональную телячью сыворотку. Для экспериментов по активации посредством TGFe1, NHLF высевали с плотностью 5x103 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. На следующие сутки среду для культивирования клеток удаляли и клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190). NHLF подвергали голоданию в течение 24 ч в бессывороточной, не содержащей инсулина и не содержащей rhFGF-B среде. Для обработки NTZ или TZ лишенные сыворотки NHLF предварительно инкубировали в течение 1 ч с соединениями, а затем добавляли профиброгенный стимул TGFe1 (PeproTech, каталожный номер № 100-21, 1 нг/мл) в бессывороточной, не содержащей инсулина и не содержащей rhFGF-B среде на дополнительные 48 ч. В конце обработки клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190), а затем добавляли 50 мкл лизирующего буфера (CelLyticTM, реагент МТ; Sigma #C3228). Затем планшеты инкубировали в течение 30 мин на льду с использованием встряхивателя для планшетов, а затем хранили при -20°С.Normal Human Lung Fibroblasts (NHLF) (Lonza) were cultured in Fibroblast Basal Medium (FBM) (Lonza, cat. no. CC-3131) supplemented with the FGM-2 SingleQuots™ kit (Lonza, cat. no. CC-3132). The complete medium contains 2% fetal calf serum. For activation experiments with TGFe1, NHLF was seeded at a density of 5x103 cells per well in 96-well plates. The following day, the cell culture medium was removed and the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190). NHLF was fasted for 24 h in serum-free, insulin-free and rhFGF-B-free medium. For NTZ or TZ treatment, serum-deprived NHLFs were pre-incubated for 1 h with compounds and then TGFe1 profibrogenic stimulus (PeproTech, Cat #100-21, 1 ng/mL) was added in serum-free, insulin-free, rhFGF-B-free medium for an additional 48 hours. At the end of the treatment, the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190) and then 50 μl of lysis buffer (CelLyticTM, MT reagent; Sigma #C3228) was added. The plates were then incubated for 30 minutes on ice using a plate shaker and then stored at -20°C.

Активация NHCF-V посредством TGFe1.NHCF-V activation by TGFe1.

Нормальные фибробласты сердца человека (желудочек) (NHCF-V) (Lonza) выделяли из нормальной ткани взрослого сердца. Клетки культивировали в базальной среде для фибробластов (FBM) (Lonza, каталожный номер № СС-3131), дополненной набором FGM™-3 BulletKit™ (Lonza, каталожный номер № СС-4525). Полная среда содержит 10% эмбриональную телячью сыворотку. Для экспериментов по активации посредством TGFe1, NHCF-V высевали с плотностью 6x103 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. На следующие сутки среду для культивирования клеток удаляли и клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190). NHCF-V подвергали голоданию в течение 24 ч в бессывороточной, не содержащей инсулина и не содержащей rhFGF-B среде. Для обработки NTZ или TZ лишенные сыворотки NHCF предварительно инкубировали в течение 1 ч с соединениями, а затем добавляли профиброгенный стимул TGFe1 (PeproTech, каталожный номер № 100-21, 3 нг/мл) в бессывороточной, не содержащей инсулина и не содержащей rhFGF-B среде на дополнительные 48 ч. В конце обработки клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190), а затем добавляли 50 мкл лизирующего буфера (CelLyticTM, реагент МТ; Sigma #C3228). Затем планшеты инкубировали в течение 30 мин на льду с использованием встряхивателя для планшетов, а затем хранили при -20°С.Normal Human Heart Fibroblasts (Ventricle) (NHCF-V) (Lonza) were isolated from normal adult heart tissue. Cells were cultured in fibroblast basal medium (FBM) (Lonza, cat. no. CC-3131) supplemented with FGM™-3 BulletKit™ (Lonza, cat. no. CC-4525). The complete medium contains 10% fetal calf serum. For activation experiments with TGFe1, NHCF-V was seeded at a density of 6x103 cells per well in 96-well plates. The following day, the cell culture medium was removed and the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190). NHCF-V was fasted for 24 hours in serum-free, insulin-free and rhFGF-B-free medium. For NTZ or TZ treatment, serum-deprived NHCFs were pre-incubated for 1 h with compounds and then TGFe1 profibrogenic stimulus (PeproTech, Cat #100-21, 3 ng/mL) was added in serum-free, insulin-free, rhFGF-B-free medium for an additional 48 hours. At the end of the treatment, the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190) and then 50 μl of lysis buffer (CelLyticTM, MT reagent; Sigma #C3228) was added. The plates were then incubated for 30 minutes on ice using a plate shaker and then stored at -20°C.

Активация InMyoFib посредством TGFe1.Activation of InMyoFib by TGFe1.

Миофибробласты кишечника человека (InMyoFib) (Lonza) культивировали в базальной среде для гладкомышечных клеток (SmBM-2TM) (Lonza, каталожный номер № СС-3181), дополненной SmGMTM2 BulletKit TM (Lonza, каталожный номер № СС-4149). Полная среда содержит 5% эмбриональную телячью сыворотка. Для экспериментов по активации посредством TGFe1, iHMyoFib высевали с плотностью 10x103 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. На следующие сутки среду для культивирования клеток удаляли и клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190). iHMyoFib подвергали голоданию в течение 24 ч в бессывороточной, не содержащей инсулина и не содержащей rhFGF-B среде. Для обработки NTZ или TZ лишенные сыворотки iHMyoFib предварительно инкубировали в течение 1 ч соединениями, а затем добавляли профиброгенный стимул TGFe1 (PeproTech, каталожный номер № 10021, 3 нг/мл) в бессывороточной, не содержащей инсулина и не содержащей rhFGF-B среде на дополнительные 48 ч. В конце обработки клетки промывали PBS (Invitrogen, каталожный номер № 14190), а затем добавляли 50 мкл лизирующего буфера (CelLyticTM, реагент МТ; Sigma #C3228). Затем планшеты инкубировали в течение 30 мин на льду с использованием встряхивателя для планшетов, а затем хранили при -20°С.Human intestinal myofibroblasts (InMyoFib) (Lonza) were cultured in basal smooth muscle cell medium (SmBM-2TM) (Lonza, cat. no. CC-3181) supplemented with SmGMTM2 BulletKit TM (Lonza, cat. no. CC-4149). The complete medium contains 5% fetal calf serum. For activation experiments with TGFe1, iHMyoFib was seeded at a density of 10x103 cells per well in 96-well plates. The following day, the cell culture medium was removed and the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190). iHMyoFib was fasted for 24 hours in serum-free, insulin-free and rhFGF-B-free medium. For NTZ or TZ treatment, serum-deprived iHMyoFib was pre-incubated for 1 h with compounds and then TGFe1 profibrogenic stimulus (PeproTech, Cat #10021, 3 ng/mL) was added in serum-free, insulin-free, rhFGF-B-free medium for additional 48 hours At the end of the treatment, the cells were washed with PBS (Invitrogen, cat. no. 14190) and then 50 μl of lysis buffer (CelLyticTM, MT reagent; Sigma #C3228) was added. The plates were then incubated for 30 minutes on ice using a plate shaker and then stored at -20°C.

ELISA для α-SMA.ELISA for α-SMA.

- 11 040800- 11 040800

Уровень α-SMA количественно определяли с использованием сэндвич-ELISA. В кратком изложении, стенки планшета для ELISA сначала покрывали антителом для улавливания (моноклональное антитело мыши против АСТА2, Abnova) при 4°С в течение ночи. После 3 промывания в PBS+0,2% Tween 20 добавляли блокирующий раствор, состоящий из PBS+0,2% BSA, на один час, а затем проводили другой цикл промывания. Клеточные лизаты переносили в лунки для связывания с антителом для улавливания на 2 ч при комнатной температуре. После процедуры промывания добавляли антитело для обнаружения (биотинилированное моноклональное антитело мыши против АСТА2, Abnova) на 2 ч при комнатной температуре, а затем проводили 3 промывания. Для обнаружения сначала наносили конъюгированный с HRP стрептавидин (R&D Systems, каталожный номер № DY998) в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания добавляли ТМВ (BD, #555214), являющийся субстратом HRP, и инкубировали в течение 7 мин при комнатной температуре в темноте. При окислении ТМВ образует растворимый в воде синий продукт реакции, который становится желтым при добавлении серной кислоты (стопраствор), что позволяет точное измерение интенсивности при 450 нм с использованием спектрофотометра.The level of α-SMA was quantified using a sandwich ELISA. Briefly, the walls of the ELISA plate were first coated with capture antibody (mouse monoclonal antibody against ACTA2, Abnova) at 4° C. overnight. After 3 washes in PBS+0.2% Tween 20, a blocking solution consisting of PBS+0.2% BSA was added for one hour, followed by another wash cycle. Cell lysates were transferred to capture antibody binding wells for 2 hours at room temperature. After the washing procedure, detection antibody (biotinylated mouse anti-ACTA2 monoclonal antibody, Abnova) was added for 2 hours at room temperature, followed by 3 washes. For detection, HRP-conjugated streptavidin (R&D Systems, cat. no. DY998) was first applied for 30 minutes at room temperature. After washing, TMB (BD, #555214), which is an HRP substrate, was added and incubated for 7 min at room temperature in the dark. On oxidation, TMB forms a water-soluble blue reaction product that turns yellow upon addition of sulfuric acid (stop solution), allowing accurate measurement of intensity at 450 nm using a spectrophotometer.

Развившаяся окраска прямо пропорциональна количеству α-SMA, присутствующего в лизате.The developed color is directly proportional to the amount of α-SMA present in the lysate.

Экспрессия генов.Expression of genes.

Тотальную РНК выделяли с использованием Nucleospin® 96 RNA (Macherey Nagel) в соответствии с инструкциями изготовителя. Тотальную РНК (500 нг для образцов in vitro) подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием M-MLV RT (обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони) (Invitrogen, каталожный номер № 28025) в 1х буфере для RT (Invitrogen), 1 мМ DTT (Invitrogen), 0,18 мМ dNTP (Promega), 200 нг pdN6 (Amersham) и 30 Е ингибитора РНК-азы (Promega).Total RNA was isolated using Nucleospin® 96 RNA (Macherey Nagel) according to the manufacturer's instructions. Total RNA (500 ng for in vitro samples) was reverse transcribed into cDNA using M-MLV RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) (Invitrogen, cat. no. 28025) in 1x RT buffer (Invitrogen), 1 mM DTT ( Invitrogen), 0.18 mM dNTP (Promega), 200 ng pdN6 (Amersham), and 30 U RNase inhibitor (Promega).

Затем проводили ПЦР с использованием системы MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System (Biorad). В кратком изложении, реакции ПЦР проводили в формате 96-WP в общем объеме 25 мкл, содержащем 1 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции, 0,5 мкл обратного и прямого праймеров (по 10 пмоль каждого) и 12,5 мкл 2х iQ SYBR Green Supermix (BioRad, 1725006CUST). Последовательности праймеров представлены в табл. 1.PCR was then performed using the MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System (Biorad). Briefly, PCR reactions were performed in 96-WP format in a total volume of 25 µl containing 1 µl reverse transcription reaction mixture, 0.5 µl reverse and forward primers (10 pmol each) and 12.5 µl 2x iQ SYBR Green Supermix (BioRad, 1725006CUST). The primer sequences are presented in table. 1.

Таблица 1Table 1

Праймеры для последовательностей человекаPrimers for Human Sequences

Название праймера Primer name Последовательность (5'->3') Sequence (5'->3') 36В4, прямой 36B4, straight CATGCTCAACATCTCCCCCTTCTCC (SEQ ID NO:1) CATGCTCAACATCTCCCCCTTCTCC (SEQ ID NO:1) 36В4, обратный 36V4, reverse GGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAG (SEQ ID NO:2) GGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAG (SEQ ID NO:2) COL1A1, прямой COL1A1, straight AGGCGAACAAGGTGACAGAG (SEQ ID NO:3) AGGCGAACAAGGTGACAGAG (SEQ ID NO:3) COL1A1, обратный COL1A1, reverse GCCAGGAGAACCAGCAGAG (SEQ ID NO:4) GCCAGGAGAACCAGCAGAG (SEQ ID NO:4)

Уровни экспрессии нормализовывали с использованием экспрессии гена 36В4 в качестве эталона в образцах человека.Expression levels were normalized using 36B4 gene expression as a reference in human samples.

Для каждого гена строили стандартные кривые путем выбора наилучших точек (по меньшей мере три точки), чтобы эффективность реакции ПЦР приближалась к 100% и коэффициент корреляции приближался к 1. Уровни экспрессии определяли с использованием уравнения для стандартной кривой как для гена домашнего хозяйства, так и для гена-мишени (учитывая эффективность конкретной ПЦР для каждого гена-мишени).For each gene, standard curves were constructed by selecting the best points (at least three points) so that the efficiency of the PCR reaction approached 100% and the correlation coefficient approached 1. Expression levels were determined using the standard curve equation for both the housekeeping gene and for the target gene (taking into account the effectiveness of a particular PCR for each target gene).

Оценка NTZ в модели хронического индуцированного рационом с CDAAc фиброза печени.Assessment of NTZ in a model of chronic diet-induced CDAAc liver fibrosis.

Противофиброзный эффект NTZ оценивали в модели индуцируемого рационом с CDAAc экспериментального фиброза печени на мышах. Мышей C57BL/6 в возрасте 6 недель кормили в течение 12 недель контрольным рационом (CSAA), рационом с CDAAc или рационом с CDAAc, дополненным NTZ, 10 мг/кг/сутки, в течение 12 недель.The antifibrotic effect of NTZ was evaluated in a CDAAc diet-induced experimental liver fibrosis mouse model. C57BL/6 mice at 6 weeks of age were fed for 12 weeks on a control diet (CSAA), CDAAc diet, or CDAAc supplemented with NTZ, 10 mg/kg/day, for 12 weeks.

Мониторинг массы тела и приема пищи проводили два раза в неделю. В последний день введения мышей умерщвляли после периода голодания, длившегося 6 ч. Печень сразу извлекали для биохимических и гистологических исследований.Body weight and food intake were monitored twice a week. On the last day of administration, mice were sacrificed after a fasting period of 6 hours. The liver was immediately removed for biochemical and histological studies.

Все процедуры на животных проводили в соответствии со стандартными протоколами и в соответствии со стандартными рекомендациями по надлежащему уходу и использованию лабораторных животных.All animal procedures were performed according to standard protocols and in accordance with standard guidelines for the proper care and use of laboratory animals.

Оценка NTZ в модели индуцированного CCl₄ повреждения печени.Assessment of NTZ in a CCl ₄ -induced liver injury model.

Противофиброзный эффект NTZ оценивали в модели индуцированного CCl₄ повреждения печени на крысах.The antifibrotic effect of NTZ was evaluated in a rat CCl ₄ -induced liver injury model.

Крыс OFA S;Dawley (исходная масса тела 250-275 г) случайным образом распределяли в соответстOFA S;Dawley rats (initial body weight 250-275 g) were randomly distributed according to

- 12 040800 вии с их массой тела в 4 группы и лечили в течение 3 недель. Крысам внутрибрюшинно инъецировали оливковое масло (контрольная группа) или CCl4, эмульгированный в оливковом масле (CCl4:оливковое масло 1:2 об./об., конечная концентрация CCl₄: 2 мл/кг) два раза в неделю. Одновременно в группе, в которой инъецировали оливковое масло, начинали контрольный рацион, в то время как в группах, в которых инъецировали CCl₄, начинали контрольный рацион или рацион, дополненный NTZ. Использовали 2 режима, включающих NTZ, для воздействия 10 или 30 мг/кг/сутки. На последние сутки лечения крыс умерщвляли после периода голодания, длившегося 6 ч. Проводили взятие образцов крови и выделение сыворотки для биохимических анализов.- 12 040800 vii with their body weight in 4 groups and treated for 3 weeks. Rats were intraperitoneally injected with olive oil (control group) or CCl4 emulsified in olive oil (CCl4: olive oil 1:2 v/v, final concentration CCl ₄ : 2 ml/kg) twice a week. Simultaneously, the olive oil injected group started the control diet, while the CCl ₄ injected groups started the control diet or NTZ supplemented diet. Used 2 modes, including NTZ, for exposure to 10 or 30 mg/kg/day. On the last day of treatment, rats were sacrificed after a fasting period of 6 hours. Blood samples were taken and serum was isolated for biochemical analyses.

Оценка NTZ в модели холестаза с DDC.NTZ score in a cholestasis model with DDC.

Мышей C57BL/6 кормят в течение 8 недель рационом, дополненным 0,1% DDC, или рационом, дополненным 0,1% DDC, включающим NTZ 100 мг/кг/сутки, или стандартным рационом для мышей (Ssniff). В последний день введения мышей умерщвляют после периода голодания, длящегося 6 ч. Проводят взятие образцов крови для биохимического анализа и печень сразу извлекают для биохимических и гистологических исследований.C57BL/6 mice are fed for 8 weeks on a diet supplemented with 0.1% DDC, or a diet supplemented with 0.1% DDC, including NTZ 100 mg/kg/day, or a standard diet for mice (Ssniff). On the last day of administration, mice are sacrificed after a fasting period of 6 hours. Blood samples are taken for biochemical analysis and the liver is immediately removed for biochemical and histological studies.

Оценка NTZ в модели хронического индуцированного CCl₄ фиброза печени.Assessment of NTZ in a chronic CCl ₄ -induced liver fibrosis model.

Мышам C57BL/6 в возрасте 9 недель дают контрольный рацион или рацион, дополненный NTZ, в течение 6 недель. Используют 2 режима, включающих NTZ, для воздействия 30 или 100 мг/кг/сутки. Одновременно и на протяжении всех 6 недель мышам вводят 3 раза в неделю CCl₄, растворенный в оливковом масле, или носитель, через пероральный зонд. Количество CCl₄ постепенно повышают от 0,875 до 2,5 мл/кг. В последний день введения мышей умерщвляют после периода голодания, длящегося 6 ч. Проводят взятие образцов крови для биохимического анализа сыворотки. Печень сазу извлекают для биохимических, гистологических исследований и исследований экспрессии.C57BL/6 mice at 9 weeks of age are fed a control diet or an NTZ supplemented diet for 6 weeks. Use 2 modes, including NTZ, for exposure to 30 or 100 mg/kg/day. Simultaneously and for the entire 6 weeks, mice are injected 3 times a week with CCl ₄ dissolved in olive oil, or vehicle, via oral gavage. The amount of CCl ₄ is gradually increased from 0.875 to 2.5 ml/kg. On the last day of administration, mice are sacrificed after a fasting period of 6 hours. Blood samples are taken for serum biochemical analysis. Sazu liver is recovered for biochemical, histological and expression studies.

Гистология.Histology.

Заливка и получение срезов тканей.Pouring and obtaining tissue sections.

Срезы печени сначала фиксировали в течение 12 ч в 4% растворе формалина. Затем фрагменты печени промывали в течение 30 мин в PBS и дегидратировали в растворах этанола (последовательные ванны с 70, 80, 95 и 100% этанолом). Фрагменты печени инкубировали в трех различных ваннах с ксилолом (Sigma-Aldrich, каталожный номер № 534056), а затем в двух ваннах с вазелиновым маслом (56°С). Затем фрагменты печени помещали в подставки, которые осторожно заполняли Histowax® до полного покрытия ткани.Liver sections were first fixed for 12 hours in 4% formalin solution. The liver fragments were then washed for 30 min in PBS and dehydrated in ethanol solutions (successive baths with 70%, 80%, 95%, and 100% ethanol). The liver fragments were incubated in three different xylene baths (Sigma-Aldrich, cat. no. 534056) and then in two vaseline oil baths (56° C.). The liver fragments were then placed in trays, which were carefully filled with Histowax® until the tissue was completely covered.

Парафиновые блоки, содержавшие фрагменты тканей, извлекали из подставок и хранили при комнатной температуре. Блоки печени нарезали на срезы толщиной 3 мкм.Paraffin blocks containing tissue fragments were removed from the stands and stored at room temperature. The liver blocks were cut into sections with a thickness of 3 μm.

Окрашивание пикросириусом красным.Stained with picrosirius red.

Срезы печени депарафинизировали, регидратировали и инкубировали в течение 15 мин в растворе Fast Green FCF 0,1% (Sigma-Aldrich, каталожный номер № F7258) перед промыванием в ванне с 0,5% уксусной кислотой (Panreac, каталожный номер № 131008,1611). Срезы печени ополаскивали водой и инкубировали в течение 30 мин в растворе 0,1% сириуса красного (Direct Red 80, Fluka, каталожный номер 43665) в насыщенном водном растворе пикриновой кислоты (Sigma-Aldrich, каталожный номер № Р6744). Наконец, срезы печени дегидратировали и заливали с использованием среды CV Mount medium (Leica, каталожный номер № 14046430011).Liver sections were deparaffinized, rehydrated, and incubated for 15 min in Fast Green FCF 0.1% (Sigma-Aldrich, cat. no. F7258) before washing in a 0.5% acetic acid bath (Panreac, cat. no. 131008,1611 ). Liver sections were rinsed with water and incubated for 30 min in a solution of 0.1% Sirius red (Direct Red 80, Fluka, cat. no. 43665) in saturated aqueous picric acid (Sigma-Aldrich, cat. no. P6744). Finally, the liver sections were dehydrated and mounted using CV Mount medium (Leica, cat. no. 14046430011).

Гистологические исследования.Histological studies.

Тип образца печени был неизвестен исследователю. Виртуальные препараты получали с использованием сканера Pannoramic 250 jn 3D Histech. С использованием программного обеспечения Quant Center (3D Histech, включающее модули Pattern Quant и Histo Quant) проводили количественное определение окрашенных коллагеном областей. В кратком изложении, Pattern Quant использовали для обнаружения соответствующей структуры ткани и для количественного определения поверхности. Затем Histo Quant использовали для обнаружения содержания окрашенного коллагена и для количественного определения общей площади и процентов согласно способу цветового порога. Площадь фиброза выражали в качестве процента коллагеновой поверхности относительно всей ткани.The type of liver sample was unknown to the investigator. Virtual preparations were obtained using a Pannoramic 250 jn 3D Histech scanner. Collagen-stained areas were quantified using the Quant Center software (3D Histech, including Pattern Quant and Histo Quant modules). Briefly, Pattern Quant was used to detect the corresponding tissue structure and to quantify the surface. Histo Quant was then used to detect the content of colored collagen and to quantify the total area and percentages according to the color threshold method. The area of fibrosis was expressed as a percentage of the collagen surface relative to the entire tissue.

Количественное определение содержания коллагена в печени.Quantitative determination of collagen content in the liver.

Содержание коллагена в печени определяли с использованием соответствующего набора QuickZyme kit (анализ общего коллагена, каталожный номер № QZB-totcol2). Анализ основан на обнаружении гидроксипролина, который является непротеиногенной аминокислотой, в основном встречающейся в тройной спирали коллагена. Таким образом, гидроксипролин в гидролизатах тканей можно использовать в качестве прямого показателя количества коллагена, присутствующего в ткани (без различения проколлагена, зрелого коллагена и продуктов деградации коллагена).Liver collagen content was determined using the appropriate QuickZyme kit (Total Collagen Assay, Cat # QZB-totcol2). The assay is based on the detection of hydroxyproline, which is a non-proteinogenic amino acid primarily found in the collagen triple helix. Thus, hydroxyproline in tissue hydrolysates can be used as a direct measure of the amount of collagen present in tissue (without distinguishing between procollagen, mature collagen, and collagen degradation products).

Перед введением гидроксипролина требуется полный гидролиз образцов тканей в 6М HCl при 95°С. Анализ приводит к образованию хромогена с максимальным поглощением при 570 нм. Результаты выражают в мг коллагена/г печени.Before the introduction of hydroxyproline requires complete hydrolysis of tissue samples in 6M HCl at 95°C. The analysis results in the formation of a chromogen with maximum absorption at 570 nm. The results are expressed as mg collagen/g liver.

Оценка NTZ в модели BDL.Estimation of NTZ in the BDL model.

Хирургическое лигирование желчных протоков проводят на крысах для индукции внепеченочного холестаза, а затем фиброза печени. После восстановления в течение 2 недель животным вводят NTZ вSurgical ligation of the bile ducts is performed in rats to induce extrahepatic cholestasis and then liver fibrosis. After 2 weeks of recovery, animals are treated with NTZ in

- 13 040800 дозе 30 или 100 мг/кг/сутки в течение одной или двух недель. В последний день введения мышей умерщвляют после периода голодания, длящегося 6 ч. Образцы крови собирают для биохимического анализа сыворотки. Печень сразу извлекают для биохимических, гистологических исследований и исследований экспрессии.- 13 040800 dose of 30 or 100 mg/kg/day for one or two weeks. On the last day of administration, mice are sacrificed after a fasting period of 6 hours. Blood samples are collected for serum biochemistry. The liver is immediately removed for biochemical, histological and expression studies.

Количественное определение концентрации общих желчных кислот в плазме.Quantitative determination of the concentration of total bile acids in plasma.

Концентрацию общих желчных кислот (ТВА) в плазме определяли с использованием соответствующего набора Randox для автоматического анализатора Daytona (Randox, каталожный номер № BI 3863). В присутствии тио-NAD, фермент 3-α гидроксистероиддегидрогеназа (3-α HSD) конвертирует желчные кислоты в 3-кетостероиды и тио-NADH. Реакция является обратимой и 3-α HSD может конвертировать 3-кетостероиды и тио-NADFH в желчные кислоты и тио-NAD. В присутствии избытка NADH эффективно происходит кругооборот фермента, и скорость образования тио-NADH определяют путем количественного определения специфического изменения поглощения при 405 нм. Результаты выражают в мкмоль/л.Plasma total bile acid (TBA) concentrations were determined using the appropriate Randox kit for the Daytona automated analyzer (Randox, catalog number BI 3863). In the presence of thio-NAD, the enzyme 3-α hydroxysteroid dehydrogenase (3-α HSD) converts bile acids to 3-ketosteroids and thio-NADH. The reaction is reversible and 3-α HSD can convert 3-ketosteroids and thio-NADFH to bile acids and thio-NAD. In the presence of excess NADH, the enzyme is efficiently cycled and the rate of thio-NADH formation is determined by quantifying the specific change in absorbance at 405 nm. The results are expressed in µmol/l.

Результаты и заключения.Results and conclusions.

Аномальное присутствие дифференцированных миофибробластов является признаком многих фибротических заболеваний. После повреждения печени покоящиеся HSC претерпевают процесс активации, характеризующийся дифференцировкой в (α-SMA)-положительные миофибробласты. В попытках найти новые противофиброзные молекулы библиотеку одобренных FDA лекарственных средств подвергали фенотипическому скринингу в модели HSC человека, активированных профиброгенным цитокином TGFe1. Уровни α-SMA, признак фибротических очагов, использовали для оценки эффективности препятствования лекарственными средствами фиброзного процесса. Скрининг привел к идентификации нитазоксанида (NTZ), который дозозависимым образом снижал уровень α-SMA в индуцированных TGFe HSC. В целом, NTZ проявлял IC₅₀ от 0,1 до 3 мкМ (фиг. 1А). Поскольку известно, что NTZ быстро гидролизуется в активный метаболит тизоксанид (TZ) (Broekhuysen, Stockis et al., 2000), этот метаболит также оценивали в отношении его противофиброзной активности в HSC. TZ продемонстрировал профиль, сходный с исходным лекарственным средством, с IC₅₀ от 0,1 до 3 мкМ (фиг. 1В). Другие маркеры стимуляции TGFe снижались обоими соединениями, включая коллаген 1А1 (COL1A1) внеклеточного матрикса (фиг. 2). Анализы токсичности подтвердили, что сниженные уровни α-SMA не были следствием токсичности или апоптоза HSC (данные не представлены).The abnormal presence of differentiated myofibroblasts is a feature of many fibrotic diseases. After liver injury, resting HSCs undergo an activation process characterized by differentiation into (α-SMA)-positive myofibroblasts. In an attempt to find new anti-fibrotic molecules, a library of FDA-approved drugs was subjected to phenotypic screening in a human HSC model activated by the profibrogenic cytokine TGFe1. Levels of α-SMA, a hallmark of fibrotic lesions, were used to assess the effectiveness of drugs in preventing the fibrotic process. The screening led to the identification of nitazoxanide (NTZ), which dose-dependently reduced the level of α-SMA in TGFe-induced HSCs. In general, NTZ exhibited an IC ₅₀ of 0.1 to 3 μM (FIG. 1A). Since NTZ is known to rapidly hydrolyze to the active metabolite thizoxanide (TZ) (Broekhuysen, Stockis et al., 2000), this metabolite was also evaluated for its anti-fibrotic activity in HSC. TZ showed a profile similar to the parent drug, with an IC ₅₀ of 0.1 to 3 μM (FIG. 1B). Other markers of TGFe stimulation were reduced by both compounds, including extracellular matrix collagen 1A1 (COL1A1) (FIG. 2). Toxicity analyzes confirmed that the reduced levels of α-SMA were not due to HSC toxicity or apoptosis (data not shown).

NTZ и TZ также снижали уровни α-SMA в активированных TGFe HSC, происходящих из крысы (фиг. 3). Кроме того, противофиброзный потенциал NTZ и TZ распространялся на фибробласты из других тканей, в то числе на нормальные фибробласты легкого человека (NHLF) (фиг. 4), нормальные фибробласты сердца человека (фиг. 5) и миофибробласты кишечника человека (InMyoFib) (фиг. 6). Во всех этих моделях фиброза NTZ и TZ продемонстрировали значительные противофиброзные эффекты в концентрации 1 мкМ.NTZ and TZ also reduced α-SMA levels in rat-derived activated TGFe HSCs (FIG. 3). In addition, the anti-fibrotic potential of NTZ and TZ extended to fibroblasts from other tissues, including normal human lung fibroblasts (NHLF) (Fig. 4), normal human heart fibroblasts (Fig. 5), and human intestinal myofibroblasts (InMyoFib) (Fig. .6). In all these models of fibrosis, NTZ and TZ showed significant anti-fibrotic effects at 1 μM.

Эффективность NTZ in vivo оценивали в модели индицируемого CDAA-холестерином экспериментального фиброза печени. Хроническое пероральное введение нитазоксанида в дозе 10 мг/кг/сутки продемонстрировало противофиброзные свойства, отражающиеся значительно более низким содержанием коллагена в печени (фиг. 7) и уменьшенной площадью фиброза печени при гистологическом исследовании (фиг. 8).The in vivo efficacy of NTZ was evaluated in a CDAA-cholesterol-induced experimental liver fibrosis model. Chronic oral administration of nitazoxanide at a dose of 10 mg/kg/day demonstrated anti-fibrotic properties, reflected by a significantly lower collagen content in the liver (Fig. 7) and a reduced area of hepatic fibrosis on histological examination (Fig. 8).

В модели in vivo индуцируемого CCl₄ повреждения печени NTZ препятствовал патологическому увеличению концентрации циркулирующего ТВА (фиг. 9), который является маркером, ассоциированным с холестазом (Chang 2013).In an in vivo model of CCl ₄ -induced liver injury, NTZ prevented the pathological increase in circulating TBA (Fig. 9), which is a marker associated with cholestasis (Chang 2013).

В заключение, заявитель открыл неожиданную противофиброзную и противохолестатическую активность противопаразитарного средства NTZ. Эти результаты демонстрируют, что NTZ и/или его активный метаболит TZ могут обеспечить терапевтическую пользу при холестатических заболеваниях и множестве типов фибротических заболеваний.In conclusion, the Applicant discovered the unexpected antifibrotic and anticholestatic activity of the antiparasitic NTZ. These results demonstrate that NTZ and/or its active metabolite TZ may provide therapeutic benefit in cholestatic diseases and many types of fibrotic diseases.

- 14 040800- 14 040800

Ссылки.Links.

Broekhuysen, J., A. Stockis, et al. (2000). Nitazoxanide: pharmacokinetics and metabolism in man. Int J Clin Pharmacol Ther 38(8): 387-394.Broekhuysen, J., A. Stockis, et al. (2000). Nitazoxanide: pharmacokinetics and metabolism in man. Int J Clin Pharmacol Ther 38(8): 387-394.

de Carvalho, L. P. S., С. M. Darby, et al. (2011). Nitazoxanide disrupts membrane potential and intrabacterial pH homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chern. Lett. 2(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 849-854.de Carvalho, L. P. S., C. M. Darby, et al. (2011). Nitazoxanide disrupts membrane potential and intrabacterial pH homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chern. Lett. 2(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 849-854.

Di Santo, N. and J. Ehrisman (2014) . A functional perspective of nitazoxanide as a potential anticancer drug. Mutat. Res., Fundam. Mol. Meeh. Mutagen. 768(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 16-21.Di Santo, N. and J. Ehrisman (2014) . A functional perspective of nitazoxanide as a potential anticancer drug. Mutat. Res., Fundam. Mol. Meeh. Mutagen. 768(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 16-21.

- 15 040800- 15 040800

Dubreuil, L., I. Houcke, et al. (1996) . In vitro evaluation of activities of nitazoxanide and tizoxanide against anaerobes and aerobic organisms. Antimicrob. Agents Chemother.Dubreuil, L., I. Houcke, et al. (1996). In vitro evaluation of activities of nitazoxanide and tizoxanide against anaerobes and aerobic organisms. Antimicrob. Agents Chemother.

40(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All40(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All

Rights Reserved.): 2266-2270.Rights Reserved.): 2266-2270.

Finegold, S. M., D. Molitoris, et al. (2009). Study of the in vitro activities of rifaximin and comparator agents against 536 anaerobic intestinal bacteria from the perspective of potential utility in pathology involving bowel flora. Antimicrob. Agents Chemother. 53(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 281-286.Finegold, S. M., D. Molitoris, et al. (2009). Study of the in vitro activities of rifaximin and comparator agents against 536 anaerobic intestinal bacteria from the perspective of potential utility in pathology involving bowel flora. Antimicrob. Agents Chemother. 53(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 281-286.

Fox, L. M. and L. D. Saravolatz (2005) . Nitazoxanide: a new thiazolide antiparasitic agent. Clin. Infect. Dis. 40(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 1173-1180.Fox, L. M. and L. D. Saravolatz (2005) . Nitazoxanide: a new thiazolide antiparasitic agent. Clin. Infect. Dis. 40(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 1173-1180.

Hemphill, A., J. Mueller, et al. (2006). Nitazoxanide, a broad-spectrum thiazolide anti-infective agent for the treatment of gastrointestinal infections. Expert Opin. Pharmacother. 7(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 953-964.Hemphill, A., J. Mueller, et al. (2006). Nitazoxanide, a broad-spectrum thiazolide anti-infective agent for the treatment of gastrointestinal infections. Expert Opin. Pharmacother. 7(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 953-964.

Hoffman, P. S., G. Sisson, et al. (2007) . Antiparasitic drug nitazoxanide inhibits the pyruvate oxidoreductases of Helicobacter pylori, selected anaerobic bacteria and parasites, and Campylobacter jejuni. Antimicrob. Agents Chemother. 51(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 868-876.Hoffman, P. S., G. Sisson, et al. (2007). Antiparasitic drug nitazoxanide inhibits the pyruvate oxidoreductases of Helicobacter pylori, selected anaerobic bacteria and parasites, and Campylobacter jejuni. Antimicrob. Agents Chemother. 51(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 868-876.

Kendall, R. T. and C. A. Feghali-Bostwick (2014) . Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Front Pharmacol 5: 123.Kendall, R. T. and C. A. Feghali-Bostwick (2014) . Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Front Pharmacol 5: 123.

Leask, A. (2007) . TGFbeta, cardiac fibroblasts, and the fibrotic response. Cardiovasc Res 74(2): 207-212.Leask, A. (2007) . TGFbeta, cardiac fibroblasts, and the fibrotic response. Cardiovasc Res 74(2): 207-212.

Leask, A. and D. J. Abraham (2004). TGF-beta signaling and the fibrotic response. FASEB J 18(7): 816-827.Leask, A. and D. J. Abraham (2004). TGF-beta signaling and the fibrotic response. FASEB J 18(7): 816-827.

Megraudd, F., A. Occhialini, et al. (1998). Nitazoxanide, a potential drug for eradication of Helicobacter pylori with no cross-resistance to metronidazole. Antimicrob. AgentsMegraudd, F., A. Occhialini, et al. (1998). Nitazoxanide, a potential drug for eradication of Helicobacter pylori with no cross-resistance to metronidazole. Antimicrob. Agents

--

Claims (7)

Chemother. 42 (Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 2836-2840.Chemother. 42 (Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 2836-2840. Pankuch, G. A. and P. C. Appelbaum (2006) . Activities of tizoxanide and nitazoxanide compared to those of five other thiazolides and three other agents against anaerobic species. IAntimicrob. Agents Chemother. 50(Copyright (C) 2015 AmericanPankuch, G. A. and P. C. Appelbaum (2006) . Activities of tizoxanide and nitazoxanide compared to those of five other thiazolides and three other agents against anaerobic species. IAntimicrob. Agents Chemother. 50(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 1112-1117.Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): 1112-1117. Rosenbloom, J., F. A. Mendoza, et al. (2013) . Strategies for anti-fibrotic therapies. Biochim Biophys Acta 1832(7): 1088-1103.Rosenbloom, J., F. A. Mendoza, et al. (2013). Strategies for anti-fibrotic therapies. Biochim Biophys Acta 1832(7): 1088-1103. Rossignol, J.-F. (2014). Nitazoxanide: A first-in-class broad-spectrum antiviral agent. Antiviral Res. 110(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS) . All Rights Reserved.) : 94-103.Rossignol, J.-F. (2014). Nitazoxanide: A first-in-class broad-spectrum antiviral agent. Antiviral Res. 110(Copyright (C) 2015 American Chemical Society (ACS) . All Rights Reserved.) : 94-103. Rossignol, J. F. and R. Cavier (1975). 2-Benzamido-5nitrothiazoles, S.P.R.L. Phavic, Belg.. 11 pp.Rossignol, J. F. and R. Cavier (1975). 2-Benzamido-5nitrothiazoles, S.P.R.L. Phavic, Belg. 11 pp. Rossignol, J. F. and H. Maisonneuve (1984). Nitazoxanide in the treatment of Taenia saginata and Hymenolepis nana infections. Am J Trop Med Hyg 33(Copyright (C) 2015 U.S.Rossignol, J. F. and H. Maisonneuve (1984). Nitazoxanide in the treatment of Taenia saginata and Hymenolepis nana infections. Am J Trop Med Hyg 33(Copyright (C) 2015 U.S. National Library of Medicine.): 511-512.National Library of Medicine.): 511-512. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Применение соединения, выбранного из группы, состоящей из нитазоксанида (NTZ), тизоксанида (TZ) и тизоксанида глюкуронида (TZG), и фармацевтически приемлемой соли NTZ, TZ или TZG, для лечения холестатического нарушения.1. Use of a compound selected from the group consisting of nitazoxanide (NTZ), tizoxanide (TZ) and tizoxanide glucuronide (TZG), and a pharmaceutically acceptable salt of NTZ, TZ or TZG, for the treatment of a cholestatic disorder. 2. Применение по п.1, где соединение выбрано из группы, состоящей из NTZ и TZ, и фармацевтически приемлемой соли NTZ или TZ.2. Use according to claim 1, wherein the compound is selected from the group consisting of NTZ and TZ and a pharmaceutically acceptable salt of NTZ or TZ. 3. Применение по п.1 или 2, где соединение содержится в фармацевтической композиции.3. Use according to claim 1 or 2, wherein the compound is contained in a pharmaceutical composition. 4. Применение по любому из пп.1-3, где холестатическое нарушение выбрано из группы, состоящей из первичного билиарного холангита (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), внутрипеченочного холестаза при беременности, прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, атрезии желчных протоков, холелитиаза, инфекционного холангита, холангита, ассоциированного с гистиоцитозом из клеток Лангерганса, синдрома Алажилля, внесиндромной недостаточности протоков, индуцируемого лекарственными средствами холестаза и ассоциированного с полным парентеральным питанием холестаза.4. Use according to any one of claims 1 to 3, wherein the cholestatic disorder is selected from the group consisting of primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), intrahepatic cholestasis of pregnancy, progressive familial intrahepatic cholestasis, bile duct atresia, cholelithiasis , infectious cholangitis, Langerhans cell histiocytosis-associated cholangitis, Alagille syndrome, extrasyndromic duct insufficiency, drug-induced cholestasis, and total parenteral nutrition-associated cholestasis. 5. Применение по п.4, где холестатическое нарушение представляет собой РВС.5. Use according to claim 4, wherein the cholestatic disorder is PBC. 6. Применение по любому из пп.1-5 в комбинации по меньшей мере с одним терапевтически активным средством с известной противофиброзной активностью, выбранным из пирфенидона или ингибиторов рецепторных тирозинкиназ (RTKI), таких как нинтеданиб, сорафениб и другие RTKI, или блокаторов рецепторов ангиотензина II (AT1), или ингибитора CTGF, или любого противофиброзного соединения, связанного с препятствованием активируемым TGFe и BMP каскадам, включая активаторы латентного комплекса TGFe, такие как ММР2, ММР9, THBS1 или интегрины клеточной поверхности, рецепторы TGFe типа I (TGFBRI) или типа II (TGFBRII) и их лиганды, такие как TGFe, активин, ингибин, Nodal, антимюллеров гормон, GDF или BMP, вспомогательные корецепторы (также известные как рецепторы типа III), или компоненты SMAD-зависимого канонического каскада, включающего регуляторные или ингибиторные белки SMAD, или представители независимых от SMAD или неканонических каскадов, включая различные ветви передачи сигнала MAPK, TAK1, каскады передачи сигнала Rho-подобной GTP-азой, каскады фосфатидилинозитол-3 киназы/AKT, TGFe-индуцируемый процесс ЕМТ или канонические и неканонические каскады передачи сигнала Hedgehog, включающие лиганды Hh или генымишени, или любые представители каскадов WNT или Notch, которые подвержены влиянию передачи сигнала TGFe.6. Use according to any one of claims 1 to 5 in combination with at least one therapeutically active agent with known antifibrotic activity selected from pirfenidone or receptor tyrosine kinase inhibitors (RTKIs) such as nintedanib, sorafenib and other RTKIs or angiotensin receptor blockers II (AT1), or a CTGF inhibitor, or any anti-fibrotic compound associated with interfering with the activated TGFe and BMP cascades, including TGFe latent complex activators such as MMP2, MMP9, THBS1 or cell surface integrins, type I TGFe receptors (TGFBRI) or type II (TGFBRII) and their ligands such as TGFe, activin, inhibin, Nodal, anti-Mullerian hormone, GDF or BMP, accessory co-receptors (also known as type III receptors), or components of an SMAD-dependent canonical cascade involving regulatory or inhibitory SMAD proteins , or representatives of SMAD-independent or non-canonical cascades, including various signal transduction branches MAPK, TAK1, cascade Rho-like GTPase signaling, phosphatidylinositol-3 kinase/AKT cascades, TGFe-induced EMT, or canonical and non-canonical Hedgehog signaling cascades involving Hh ligands or genes, or any member of the WNT or Notch cascades that are affected by signaling TGFe signal. 7. Применение по любому из пп.1-5 в комбинации по меньшей мере с одним терапевтически актив-7. Use according to any one of claims 1-5 in combination with at least one therapeutically active --