EA040723B1

EA040723B1 - NEW COMPOUNDS AS PEPTIDE TRIPLE AGONISTS OF GLP-1/GLUCAGON/GIP RECEPTORS

Info

Publication number: EA040723B1
Application number: EA201991345
Authority: EA
Inventors: Мартин Боссарт; Андреас ЭФЕРС; Торстен ХААК; Дитер КАДЕРАЙТ; Катрин ЛОРЕНЦ; Михаэль ВАГНЕР; Стефания Пфайффер-Марек; Мартин Лоренц
Original assignee: Санофи
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2022-07-21

Description

Область техники изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к новым соединениям, которые являются тройными агонистами рецепторов GLP-1/глюкагона/GIP, и их медицинскому применению, например, при лечении нарушений при метаболическом синдроме, в том числе диабета и ожирения, а также для снижения избыточного потребления пищи. Соединения по настоящему изобретению структурно происходят от эксендина-4 и проявляют высокую растворимость и стабильность в кислых условиях в присутствии противомикробных консервантов, таких как м-крезол или фенол, что делает их особенно подходящими для комбинаций с другими противодиабетическими соединениями.The present invention relates to novel compounds that are GLP-1/glucagon/GIP receptor triple agonists and their medical use, for example, in the treatment of metabolic syndrome disorders, including diabetes and obesity, and to reduce excess food intake. The compounds of the present invention are structurally derived from exendin-4 and exhibit high solubility and stability under acidic conditions in the presence of antimicrobial preservatives such as m-cresol or phenol, making them particularly suitable for combinations with other antidiabetic compounds.

Уровень техники изобретенияState of the art invention

В работах Bhat et al. (Diabetologia, 2013, 56, 1417-1424), Bhat et al. (Biochem. Pharmacol. 2013, 85, 1655-62), Gault et al. (J. Biol. Chem. 2013, 288, 35581-91), а также Finan et al. (Nat. Med. 2015, 21, 27-36) описаны тройные агонисты рецепторов глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), глюкагона и глюкозозависимого инсулинотропного полипептида (GIP), например, разработанные путем объединения действий GLP-1, глюкагона и GIP в одной молекуле, что приводит к получению терапевтического действующего вещества с противодиабетическим действием и выраженным эффектом снижения веса, превосходящими таковые у чистых агонистов GLP-1, благодаря, среди прочего, повышению чувства насыщения и расхода энергии, опосредованному рецептором глюкагона, а также повышению секреции инсулина, опосредованному рецептором GIP.In the works of Bhat et al. (Diabetologia, 2013, 56, 1417-1424), Bhat et al. (Biochem. Pharmacol. 2013, 85, 1655-62), Gault et al. (J. Biol. Chem. 2013, 288, 35581-91), as well as Finan et al. (Nat. Med. 2015, 21, 27-36) describes triple agonists of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), glucagon and glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) receptors, for example, developed by combining the actions of GLP-1, glucagon and GIP into one molecule, resulting in a therapeutic active substance with antidiabetic activity and a pronounced weight loss effect superior to those of pure GLP-1 agonists, due, among other things, to an increase in satiety and energy expenditure mediated by the glucagon receptor, as well as an increase in insulin secretion, mediated by the GIP receptor.

Аминокислотная последовательность GLP-1(7-36)-амида показана под SEQ ID NO: 1:The amino acid sequence of GLP-1(7-36)-amide is shown under SEQ ID NO: 1:

haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-nh₂ haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-nh ₂

Лираглутид представляет собой представленный на рынке химически модифицированный аналог GLP-1, в котором среди прочих модификаций жирная кислота связана с лизином в положении 20, что приводит к продолжительной длительности действия (Drucker et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2010, 9, 267-268; Buse et al., Lancet 2009, 374, 39-47).Liraglutide is a commercially available chemically modified GLP-1 analogue in which, among other modifications, a fatty acid is linked to a lysine at position 20 resulting in a prolonged duration of action (Drucker et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2010, 9, 267-268; Buse et al., Lancet 2009, 374, 39-47).

Аминокислотная последовательность лираглутида показана под SEQ ID NO: 2:The amino acid sequence of liraglutide is shown under SEQ ID NO: 2:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK ( (S) -4-карбокси-4- гексадеканоиламинобутирил) EFIAWLVRGRG-OH.HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK ((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyryl) EFIAWLVRGRG-OH.

Глюкагон представляет собой пептид из 29 аминокислот, который высвобождается в кровоток при низком уровне циркулирующей в крови глюкозы.Glucagon is a 29 amino acid peptide that is released into the bloodstream when circulating glucose levels are low.

Аминокислотная последовательность глюкагона показана под SEQ ID NO 3:The amino acid sequence of glucagon is shown under SEQ ID NO 3:

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OHHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH

При гипогликемии, когда уровни глюкозы в крови опускаются ниже нормальных, глюкагон посылает печени сигнал о необходимости расщепления гликогена и высвобождения глюкозы, в результате чего уровни глюкозы в крови повышаются, достигая нормального уровня. Последние публикации свидетельствуют о том, что глюкагон дополнительно оказывает благоприятные эффекты на снижение массы жира в организме, снижение потребления пищи и увеличение расхода энергии (Heppner et al., Physiology & Behavior, 2010, 100, 545-548).In hypoglycemia, when blood glucose levels drop below normal, glucagon sends a signal to the liver to break down glycogen and release glucose, causing blood glucose levels to rise to normal levels. Recent publications indicate that glucagon additionally has beneficial effects in reducing body fat mass, reducing food intake and increasing energy expenditure (Heppner et al., Physiology & Behavior, 2010, 100, 545-548).

GIP (глюкозозависимый инсулинотропный полипептид) представляет собой пептид из 42 аминокислот, который выделяется K-клетками кишечника после потребления пищи. GIP и GLP-1 представляют собой два гормона, продуцируемые энтероэндокринными клетками кишечника, отвечающих за инкретиновый эффект, на долю которого приходится свыше 70% инсулиновой реакции на пероральную глюкозную нагрузку (Baggio et al. Gastroenterology, 2007, 132, 2131-2157).GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) is a 42 amino acid peptide that is secreted by intestinal K cells after food is consumed. GIP and GLP-1 are two hormones produced by intestinal enteroendocrine cells responsible for the incretin effect, which accounts for over 70% of the insulin response to an oral glucose load (Baggio et al. Gastroenterology, 2007, 132, 2131-2157).

Аминокислотная последовательность GIP показана под SEQ ID NO: 5:The amino acid sequence of GIP is shown under SEQ ID NO: 5:

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OHYAETGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OH

Пептиды, в основе которых лежит структура GLP-1 или глюкагона, и которые связывают и активируют рецепторы GLP-1, глюкагона и GIP, были описаны в заявках на патенты WO 2010/011439,Peptides based on the GLP-1 or glucagon structure and which bind and activate the GLP-1, glucagon and GIP receptors have been described in patent applications WO 2010/011439,

WO 2010/148089, WO 2012/088116, WO 2013/192129, WO 2013/192130, WO 2014/049610 иWO 2010/148089, WO 2012/088116, WO 2013/192129, WO 2013/192130, WO 2014/049610 and

WO 2015/067716. Дополнительные триспецифические агонисты на основе эксендина-4 были описаны в WO 2014/096145, WO 2015/086731, WO 2015/086732, WO 2015/086733, WO 2015/155141 иWO 2015/067716. Additional exendin-4 trispecific agonists have been described in WO 2014/096145, WO 2015/086731, WO 2015/086732, WO 2015/086733, WO 2015/155141 and

PCT/EP2016/063332. Было показано, что соединения, описанные в них, приводят к улучшенному гликемическому контролю, возможному сохранению островковых клеток и бета-клеток и интенсивному снижению веса тела.PCT/EP2016/063332. The compounds described therein have been shown to lead to improved glycemic control, eventual preservation of islet cells and beta cells, and massive weight loss.

Пептиды, которые связывают и активируют как рецептор GIP, так и рецептор GLP-1, сконструированные в виде аналогов эксендина-4 и замещенные боковой цепью жирной кислоты, описаны в заявках на патенты WO 2014/096145 A1, WO 2014/096150 A1, WO 2014/096149 A1 и WO 2014/096148 A1.Peptides that bind and activate both the GIP receptor and the GLP-1 receptor, designed as exendin-4 analogs and substituted with a fatty acid side chain, are described in patent applications WO 2014/096145 A1, WO 2014/096150 A1, WO 2014 /096149 A1 and WO 2014/096148 A1.

Эксендин-4 представляет собой пептид из 39 аминокислот, который продуцируется слюнными железами аризонского ядозуба (Heloderma suspectum). Эксендин-4 является активатором рецептора GLP-1, в то же время он демонстрирует низкий уровень активации рецептора GIP и не активирует рецептор глюкагона (см. табл. 1).Exendin-4 is a 39 amino acid peptide produced by the salivary glands of the Arizona gila-tooth (Heloderma suspectum). Exendin-4 is an activator of the GLP-1 receptor; at the same time, it exhibits a low level of GIP receptor activation and does not activate the glucagon receptor (see Table 1).

- 1 040723- 1 040723

Таблица 1Table 1

Эффективность эксендина-4 в отношении рецепторов GLP-1, GIP и глюкагона человека (указана в пМ) при увеличении концентраций и измерении образующегося cAMP, как описано в разделе СпособыEfficacy of exendin-4 at GLP-1, GIP, and human glucagon receptors (indicated in pM) at increasing concentrations and measuring cAMP generated, as described in Methods

SEQ ID NO: SEQ ID NO: Пептид Peptide ЕС50 для hGLP- 1 R [пМ] EC50 for hGLP- 1 R [pM] ЕС50 для hGIP R [пМ] EU50 for hGIP R [pM] ЕС50 для hGlucagon R [пМ] EC50 for hGlucagon R [pM] 4 4 Эксендин -4 Exendin -4 0,4 0.4 12500,0 12500.0 >10000000 >10000000

Аминокислотная последовательность эксендина-4 представлена под SEQ ID NO: 4:The amino acid sequence of exendin-4 is shown under SEQ ID NO: 4:

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2

Эксендин-4 обладает многими общими глюкорегуляторными действиями, которые наблюдаются у GLP-1. Клинические и доклинические исследования показали, что эксендин-4 обладает несколькими благоприятными противодиабетическими свойствами, в том числе глюкозозависимым усилением синтеза и секреции инсулина, глюкозозависимым подавлением секреции глюкагона, замедлением опорожнения желудка, снижением потребления пищи и веса тела, а также повышением массы бета-клеток и маркеров функции бета-клеток.Exendin-4 has many of the general glucoregulatory actions seen in GLP-1. Clinical and preclinical studies have shown that exendin-4 has several beneficial antidiabetic properties, including glucose-dependent enhancement of insulin synthesis and secretion, glucose-dependent suppression of glucagon secretion, slowing gastric emptying, reduced food intake and body weight, and increased beta-cell mass and beta cell function markers.

Данные эффекты могут быть благоприятными не только для больных диабетом, но также для пациентов, страдающих ожирением. Пациенты с ожирением имеют более высокий риск развития диабета, гипертензии, гиперлипидемии, заболеваний сердечно-сосудистой системы и опорно-двигательного аппарата.These effects may be beneficial not only for diabetic patients, but also for obese patients. Obese patients have a higher risk of developing diabetes, hypertension, hyperlipidemia, cardiovascular and musculoskeletal disorders.

По сравнению с GLP-1 эксендин-4 является устойчивым к расщеплению дипептидилпептидазой-4 (DPP4), что приводит к более длительному периоду полужизни и продолжительности активности in vivo (Eng. J., Diabetes, 1996, 45 (Suppl 2):152A (abstract 554)).Compared to GLP-1, exendin-4 is resistant to dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) cleavage, resulting in a longer half-life and duration of activity in vivo (Eng. J., Diabetes, 1996, 45 (Suppl 2):152A ( abstract 554)).

Также было показано, что эксендин-4 является в значительной степени более стабильным в отношении расщепления нейтральной эндопептидазой (NEP) по сравнению с GLP-1, глюкагоном или оксинтомодулином (Druce et al., Endocrinology, 2009, 150(4), 1712-1722). Вместе с тем эксендин-4 является химически неустойчивым вследствие окисления метионина в положении 14 (Hargrove et al., Regul. Pept., 2007, 141, 113-119), а также дезамидирования и изомеризации аспарагина в положении 28 (WO 2004/035623).Exendin-4 has also been shown to be significantly more stable to neutral endopeptidase (NEP) cleavage compared to GLP-1, glucagon, or oxyntomodulin (Druce et al., Endocrinology, 2009, 150(4), 1712-1722 ). However, exendin-4 is chemically unstable due to the oxidation of methionine at position 14 (Hargrove et al., Regul. Pept., 2007, 141, 113-119), as well as the deamidation and isomerization of asparagine at position 28 (WO 2004/035623) .

Bloom et al. (WO 2006/134340) раскрывают, что пептиды, которые связываются и активируют как рецептор глюкагона, так и рецептор GLP-1, можно создавать в виде гибридных молекул из глюкагона и эксендина-4, где N-концевая часть (например, остатки 1-14 или 1-24) происходит из глюкагона и C-концевая часть (например, остатки 15-39 или 25-39) происходит из эксендина-4. Такие пептиды содержат аминокислотный мотив YSKY глюкагона в положении 10-13. Krstenansky et al. (Biochemistry, 1986, 25, 3833-3839) показали важность этих остатков 10-13 из глюкагона для взаимодействий с его рецептором и активации аденилатциклазы.Bloom et al. (WO 2006/134340) disclose that peptides that bind to and activate both the glucagon receptor and the GLP-1 receptor can be designed as hybrid molecules from glucagon and exendin-4, where the N-terminus (for example, residues 1- 14 or 1-24) is derived from glucagon and the C-terminal portion (eg, residues 15-39 or 25-39) is derived from exendin-4. Such peptides contain the glucagon YSKY amino acid motif at position 10-13. Krstenansky et al. (Biochemistry, 1986, 25, 3833-3839) showed the importance of these residues 10-13 of glucagon for interactions with its receptor and activation of adenylate cyclase.

По сравнению с GLP-1, глюкагоном и оксинтомодулином эксендин-4 характеризуется благоприятными физико-химическими свойствами, такими как растворимость и стабильность в растворе и при физиологических условиях (в том числе стабильность в отношении разрушения при воздействии ферментами, такими как DPP4 или NEP), результатом чего является более длительная продолжительность активности in vivo.Compared to GLP-1, glucagon and oxyntomodulin, exendin-4 has favorable physicochemical properties such as solubility and stability in solution and under physiological conditions (including stability against degradation by enzymes such as DPP4 or NEP), resulting in a longer duration of activity in vivo.

Тем не менее также было показано, что эксендин-4 является химически неустойчивым вследствие окисления метионина в положении 14, а также дезамидирования и изомеризации аспарагина в положении 28. Стабильность можно дополнительно улучшать с помощью замены метионина в положении 14 и исключения последовательностей, которые, как известно, склонны к разрушению посредством образования аспартимида, в частности, Asp-Gly или Asn-Gly в положениях 28 и 29.However, exendin-4 has also been shown to be chemically unstable due to oxidation of methionine at position 14 and deamidation and isomerization of asparagine at position 28. Stability can be further improved by substitution of methionine at position 14 and elimination of sequences known to , are prone to degradation through the formation of aspartimide, in particular Asp-Gly or Asn-Gly at positions 28 and 29.

Описание изобретенияDescription of the invention

У соединений по настоящему изобретению несколько из лежащих в их основе остатков отличаются от остатков глюкагона и пептидов, описанных в WO 2006/134340. В частности, остатки Tyr10 и Tyr13, которые, как известно, способствуют фибриллированию глюкагона (J.S. Pedersen et al., Biochemistry, 2006, 45, 14503-14512), заменены на Leu. Эта замена, особенно в комбинации с изолейцином в положении 23 и глутаматом в положении 24, приводит к образованию производных эксендина-4 с потенциально улучшенными биофизическими свойствами, такими как растворимость или способность к агрегации в растворе. Замена ароматической аминокислоты на алифатическую аминокислоту в положении 13 аналога эксендина-4 приводит к образованию пептидов с высокой активностью в отношении как рецептора глюкагона, так и рецептора GIP с сохранением их активности в отношении рецептора GLP-1.In the compounds of the present invention, several of their underlying residues differ from those of the glucagon and peptides described in WO 2006/134340. In particular, Tyr10 and Tyr13 residues, which are known to promote glucagon fibrillation (J.S. Pedersen et al., Biochemistry, 2006, 45, 14503-14512), are changed to Leu. This substitution, especially in combination with isoleucine at position 23 and glutamate at position 24, results in exendin-4 derivatives with potentially improved biophysical properties such as solubility or aggregation in solution. The replacement of an aromatic amino acid with an aliphatic amino acid at position 13 of the exendin-4 analog results in peptides with high activity at both the glucagon receptor and the GIP receptor, while maintaining their activity at the GLP-1 receptor.

Нативный эксендин-4 представляет собой чистый агонист рецептора GLP-1, который не проявляет активности в отношении рецептора глюкагона и характеризуется низкой активностью в отношении рецептора GIP. В основе соединений по настоящему изобретению лежит структура нативного эксендина-4,Native exendin-4 is a pure GLP-1 receptor agonist with no activity at the glucagon receptor and low activity at the GIP receptor. The compounds of the present invention are based on the structure of native exendin-4,

- 2 040723 но они отличаются по 14 или более положениям по сравнению с SEQ ID NO: 4, причем данные отличия обусловливают усиление агонистической активности в отношении рецептора глюкагона и рецептора GIP. Среди прочих замен метионин в положении 14 заменен аминокислотой, несущей группу -NH2 в боковой цепи, которая дополнительно замещена липофильным остатком (например, жирной кислотой в сочетании с линкером). Дополнительная замена аминокислот эксендина-4 в положениях 13, 19, 20, 32, 34, 35 и 39 - на Leu в положении 13, на Gln в положении 19, на аминокислоту Aib или Lys в положении 20, на Aib в положении 34, на Pro в положении 32 и на Lys в положениях 35 и 39 - приводит к высокой активности в отношении рецептора глюкагона, а также рецептора GIP с сохранением высокой активности в отношении рецептора GLP-1. Данные пептиды также проявляют высокую химическую стабильность, растворимость и физическую стабильность при кислых значениях pH, таких как pH 4,5.- 2 040723 but they differ in 14 or more positions compared to SEQ ID NO: 4, and these differences cause an increase in agonistic activity against the glucagon receptor and the GIP receptor. Among other substitutions, the methionine at position 14 is replaced by an amino acid bearing an -NH2 group in the side chain, which is further substituted with a lipophilic residue (eg, a fatty acid in combination with a linker). Additional substitution of exendin-4 amino acids at positions 13, 19, 20, 32, 34, 35 and 39 - with Leu at position 13, with Gln at position 19, with Aib or Lys amino acid at position 20, with Aib at position 34, with Pro at position 32 and on Lys at positions 35 and 39 results in high activity for the glucagon receptor as well as the GIP receptor, while maintaining high activity for the GLP-1 receptor. These peptides also exhibit high chemical stability, solubility and physical stability at acidic pH values such as pH 4.5.

Соединения по настоящему изобретению характеризуются формулой I:The compounds of the present invention are characterized by the formula I:

H₂N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X20-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-X29-GlyXSl-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R¹ I, где X14 представляет собой аминокислотный остаток с функционализированной группой -NH2 боковой цепи, выбранный из группы, состоящей из Lys, Orn, Dab или Dap, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью -Z-C(O)-R⁵, где Z представляет собой линкер во всех стереоизомерных формах и R⁵ представляет собой фрагмент, содержащий не более 50 атомов углерода и гетероатомы, выбранные из N и O;H ₂ N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X20-Glu-Phe-Ile-Glu- Trp-Leu-Lys-Ala-X29-GlyXSl-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R ¹ I, where X14 is an amino acid residue with a functionalized -NH2 side chain group selected from the group, consisting of Lys, Orn, Dab or Dap, where the -NH2 group of the side chain is functionalized with -ZC(O)-R ⁵ where Z is a linker in all stereoisomeric forms and R ⁵ is a fragment containing not more than 50 carbon atoms and heteroatoms selected from N and O;

X20 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из Aib и Lys;X20 is an amino acid residue selected from Aib and Lys;

X29 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из D-Ala и Gly;X29 is an amino acid residue selected from D-Ala and Gly;

X31 представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из His и Pro;X31 is an amino acid residue selected from His and Pro;

R¹ представляет собой NH2 или OH, или их соль или сольват.R ¹ is NH2 or OH, or a salt or solvate thereof.

Соединения по настоящему изобретению являются агонистами рецепторов GLP-1, глюкагона и GIP, как определено путем наблюдения того, что они способны стимулировать образование внутриклеточного cAMP в анализируемой системе, описанной в разделе Способы.The compounds of the present invention are GLP-1, glucagon, and GIP receptor agonists, as determined by observing that they are capable of stimulating the formation of intracellular cAMP in the assay system described in the Methods section.

Согласно другому варианту осуществления соединения по настоящему изобретению, в частности, с лизином в положении 14, который дополнительно замещен липофильным остатком, проявляют относительную активность, составляющую по меньшей мере 0,1% (т.е. EC₅₀<₇₀₀ пМ), более предпочтительно 1% (т.е. EC₅₀<₇₀ пМ), более предпочтительно 3,5% (т.е. EC₅₀<₂₀ пМ) и еще более предпочтительно 7% (т.е. EC₅₀<₁₀ пМ) по сравнению с относительной активностью GLP-1(7-36)-амида в отношении рецептора GLP-1. Кроме того, соединения по настоящему изобретению проявляют относительную активность, составляющую по меньшей мере 0,1% (т.е. EC₅₀<₅₀₀ пМ), более предпочтительно 0,5% (т.е. EC₅₀<₁₀₀ пМ), более предпочтительно 1% (т.е. EC<50 пМ) и еще более предпочтительно 5% (т.е. EC₅₀<₁₀ пМ) по сравнению с относительной активностью природного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. Кроме того, соединения по настоящему изобретению проявляют относительную активность, составляющую по меньшей мере 0,1% (т.е. EC₅₀<₄₀₀ пМ), более предпочтительно 0,4% (т.е. EC₅₀<_{100 пМ}), более предпочтительно 1% (т.е. EC<40 пМ) и еще более предпочтительно 4% (т.е. EC₅₀<₁₀ пМ) по сравнению с относительной активностью природного GIP в отношении рецептора GIP.According to another embodiment, the compounds of the present invention, in particular those with a lysine at position 14 which is further substituted with a lipophilic residue, exhibit a relative activity of at least 0.1% (i.e. EC ₅₀ < ₇₀₀ pM), more preferably 1% (i.e. EC ₅₀ < ₇₀ pM), more preferably 3.5% (i.e. EC ₅₀ < ₂₀ pM) and even more preferably 7% (i.e. EC ₅₀ < ₁₀ pM) vs. with the relative activity of GLP-1(7-36)-amide against the GLP-1 receptor. In addition, the compounds of the present invention exhibit a relative activity of at least 0.1% (i.e. EC ₅₀ < ₅₀₀ pM), more preferably 0.5% (i.e. EC ₅₀ < ₁₀₀ pM), more preferably 1% (ie EC<50 pM) and even more preferably 5% (ie EC ₅₀ < ₁₀ pM) compared to the relative activity of native glucagon for the glucagon receptor. In addition, the compounds of the present invention exhibit a relative activity of at least 0.1% (i.e. EC ₅₀ < ₄₀₀ pM), more preferably 0.4% (i.e. EC ₅₀ < _{100 pM} ), more preferably 1% (ie EC<40 pM) and even more preferably 4% (ie EC ₅₀ < ₁₀ pM) compared to the relative activity of native GIP for the GIP receptor.

Термин активность, используемый в данном документе, предпочтительно относится к способности соединения активировать рецептор GLP-1 человека, рецептор глюкагона человека и рецептор GIP человека. Более предпочтительно термин активность, используемый в данном документе, относится к способности соединения стимулировать образование внутриклеточного cAMP. Термин относительная активность, используемый в данном документе, понимают как относящийся к способности соединения активировать рецептор в определенном соотношении по сравнению с другим агонистом рецептора или по сравнению с другим рецептором. Активацию рецепторов агонистами (например, путем измерения уровня cAMP) определяют, как описано в данном документе, например, как описано в разделе Примеры.The term activity as used herein preferably refers to the ability of a compound to activate the human GLP-1 receptor, the human glucagon receptor, and the human GIP receptor. More preferably, the term activity as used herein refers to the ability of a compound to stimulate the formation of intracellular cAMP. The term relative potency, as used herein, is understood to refer to the ability of a compound to activate a receptor in a specific ratio compared to another receptor agonist or compared to another receptor. Receptor activation by agonists (eg, by measuring cAMP levels) is determined as described herein, eg, as described in the Examples section.

Соединения по настоящему изобретению предпочтительно характеризуются EC₅₀ для рецептора hGLP-1, составляющей 450 пМ или меньше, предпочтительно 200 пМ или меньше, более предпочтительно 100 пМ или меньше, более предпочтительно 50 пМ или меньше, более предпочтительно 25 пМ или меньше, более предпочтительно 10 пМ или меньше, более предпочтительно 8 пМ или меньше и более предпочтительно 5 пМ или меньше, и EC₅₀ для рецептора hGlucagon, составляющей 450 пМ или меньше, предпочтительно 200 пМ или меньше, более предпочтительно 100 пМ или меньше, более предпочтительно 50 пМ или меньше, более предпочтительно 25 пМ или меньше, более предпочтительно 10 пМ или меньше, более предпочтительно 8 пМ или меньше и более предпочтительно 5 пМ или меньше, и EC₅₀ для рецептора hGIP, составляющей 450 пМ или меньше, предпочтительно 200 пМ или меньше, более предпочтительно 100 пМ или меньше, более предпочтительно 50 пМ или меньше, более предпочтительно 25 пМ или меньше, более предпочтительно 10 пМ или меньше, болееThe compounds of the present invention preferably have an EC ₅₀ for the hGLP-1 receptor of 450 pM or less, preferably 200 pM or less, more preferably 100 pM or less, more preferably 50 pM or less, more preferably 25 pM or less, more preferably 10 pM or less, more preferably 8 pM or less, and more preferably 5 pM or less, and an EC ₅₀ for the hGlucagon receptor of 450 pM or less, preferably 200 pM or less, more preferably 100 pM or less, more preferably 50 pM or less , more preferably 25 pM or less, more preferably 10 pM or less, more preferably 8 pM or less, and more preferably 5 pM or less, and an EC ₅₀ for the hGIP receptor of 450 pM or less, preferably 200 pM or less, more preferably 100 pM or less, more preferably 50 pM or less, more preferably 25 pM or less, more preferably 10 pM or less, more

- 3 040723 предпочтительно 8 пМ или меньше и более предпочтительно 5 пМ или меньше. EC₅₀ для рецептора hGLP-1, рецептора hGlucagon и рецептора hGIP можно определить, как описано в данном документе в разделе Способы и как применяли для получения результатов, описанных в разделе Примеры.- 3 040723 preferably 8 pM or less and more preferably 5 pM or less. The EC ₅₀ for hGLP-1 receptor, hGlucagon receptor and hGIP receptor can be determined as described herein in the Methods section and as used to obtain the results described in the Examples section.

Соединения формулы I, в частности соединения с лизином в положении 14, который дополнительно замещен липофильным остатком, демонстрируют повышенную активацию рецептора глюкагона по сравнению с производными, содержащими исходный метионин (от эксендина-4) или лейцин в положении 14 (см. также WO 2014/056872). Кроме того, окисление (in vitro или in vivo) метионина более не является возможным.Compounds of formula I, in particular compounds with a lysine at position 14 which is further substituted with a lipophilic residue, show increased activation of the glucagon receptor compared to derivatives containing the parent methionine (from exendin-4) or leucine at position 14 (see also WO 2014/ 056872). In addition, oxidation (in vitro or in vivo) of methionine is no longer possible.

Соединения формулы I демонстрируют высокую активность не только в отношении рецептора глюкагона, но также в отношении рецептора GIP. Дополнительная высокая активность в отношении рецептора GIP предназначена для повышения эффективности в отношении контроля уровня глюкозы в крови по сравнению с чистым агонизмом в отношении рецептора GLP-1 и для снижения вероятности связанных с GLP-1 побочных эффектов, таких как расстройство желудочно-кишечного тракта, поскольку вклад части GLP-1 может быть уменьшен. Дополнительная активность в отношении GIPR также предназначена для уравновешивания потенциального повышения уровня глюкозы при активации рецептора глюкагона, что, таким образом, обеспечивает возможность проявления более высокой активности рецептора глюкагона, как наблюдается у соединений формулы I (Finan et al. Nat. Med. 2015, 21, 27-36).The compounds of formula I show high activity not only for the glucagon receptor but also for the GIP receptor. The additional high potency at the GIP receptor is intended to improve blood glucose control efficacy over pure GLP-1 receptor agonism and to reduce the likelihood of GLP-1 related side effects such as gastrointestinal distress, since the contribution of the GLP-1 portion may be reduced. The additional GIPR activity is also intended to counterbalance the potential increase in glucose upon glucagon receptor activation, thus allowing for higher glucagon receptor activity as observed in compounds of formula I (Finan et al. Nat. Med. 2015, 21 , 27-36).

В одном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению характеризуются высокой растворимостью при кислых и/или физиологических значениях pH в присутствии противомикробного консерванта, такого как фенол или м-крезол, например, при степени кислотности в диапазоне pH 4-5, в частности pH 4,5, и/или более физиологическом диапазоне pH 6-8, в частности при pH 7,4 при 25 или 40°C, в другом варианте осуществления по меньшей мере 1 мг/мл и в конкретном варианте осуществления по меньшей мере 5 мг/мл.In one embodiment, the compounds of the present invention are characterized by high solubility at acidic and/or physiological pH in the presence of an antimicrobial preservative such as phenol or m-cresol, for example, at an acidity in the pH range of 4-5, in particular pH 4.5 , and/or more than the physiological pH range of 6-8, in particular at pH 7.4 at 25 or 40°C, in another embodiment at least 1 mg/ml and in a particular embodiment at least 5 mg/ml.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению предпочтительно характеризуются высокой стабильностью при хранении в растворе в присутствии противомикробного консерванта, такого как фенол или м-крезол. Предпочтительными условиями анализа для определения стабильности является хранение в течение 28 дней при 25 или 40°C в растворе при степени кислотности в диапазоне pH 4-5, в частности pH 4,5. Стабильность пептидов определяют с помощью хроматографических анализов, описанных в разделе Способы. Предпочтительно через 28 дней при 40°C в растворе при pH 4,5 потеря чистоты составляет не более 20%, более предпочтительно не более 15% и еще более предпочтительно не более 12%.In addition, the compounds of the present invention preferably have high storage stability in solution in the presence of an antimicrobial preservative such as phenol or m-cresol. The preferred assay conditions for determining stability are storage for 28 days at 25 or 40° C. in solution at an acidity in the pH range of 4-5, in particular pH 4.5. The stability of the peptides is determined using the chromatographic assays described in the Methods section. Preferably after 28 days at 40° C. in a solution at pH 4.5, the loss in purity is no more than 20%, more preferably no more than 15% and even more preferably no more than 12%.

В одном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению характеризуются гидродинамическим радиусом R_h, составляющим 5 нм или меньше, при значениях концентрации >1 мг/мл в присутствии противомикробного консерванта, такого как фенол или м-крезол, например, при степени кислотности в диапазоне pH 4-5 при 25°C, в частности pH 4,5 при 25°C, что анализировали с помощью динамического рассеяния света, как описано в разделе Способы.In one embodiment, the compounds of the present invention have a hydrodynamic radius R _h of 5 nm or less at concentrations >1 mg/mL in the presence of an antimicrobial preservative such as phenol or m-cresol, for example, at an acidity in the pH range of 4 -5 at 25°C, in particular pH 4.5 at 25°C, which was analyzed using dynamic light scattering, as described in the Methods section.

В одном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению не демонстрируют увеличения интенсивности флуоресценции с применением тиофлавина T в качестве флуоресцентного зонда при значениях концентрации 3 мг/мл в присутствии противомикробного консерванта, такого как фенол или м-крезол, например, при степени кислотности в диапазоне pH 4-5, в частности pH 4,5 при 37°C, в течение 5 ч, более предпочтительно в течение 10 ч, более предпочтительно в течение 20 ч, более предпочтительно в течение 30 ч, более предпочтительно в течение 40 ч и еще более предпочтительно в течение 45 ч, что анализировали с помощью анализа с применением ThT, как описано в разделе Способы.In one embodiment, the compounds of the present invention do not show an increase in fluorescence intensity using thioflavin T as a fluorescent probe at concentrations of 3 mg/ml in the presence of an antimicrobial preservative such as phenol or m-cresol, for example, at an acidity in the pH range of 4 -5, in particular pH 4.5 at 37°C, for 5 hours, more preferably within 10 hours, more preferably within 20 hours, more preferably within 30 hours, more preferably within 40 hours and even more preferably within 45 h, which was analyzed using the analysis using ThT, as described in the Methods section.

В одном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению более устойчивые к расщеплению нейтральной эндопептидазой (NEP) и дипептидилпептидазой-4 (DPP4), что приводит к более длительным периоду полужизни и продолжительности действия in vivo по сравнению с нативными GLP-1 и глюкагоном.In one embodiment, the compounds of the present invention are more resistant to neutral endopeptidase (NEP) and dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) cleavage, resulting in a longer in vivo half-life and duration of action compared to native GLP-1 and glucagon.

В одном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению содержат пептидный фрагмент, который представляет собой линейную последовательность из 39 аминокарбоновых кислот, в частности α-аминокарбоновых кислот, связанных пептидными, т.е. карбоксамидными связями.In one embodiment, the compounds of the present invention comprise a peptide fragment that is a linear sequence of 39 aminocarboxylic acids, in particular α-aminocarboxylic acids linked by peptides, i. carboxamide bonds.

В одном варианте осуществления R¹ представляет собой NH₂.In one embodiment, R ¹ is NH ₂ .

Конкретные предпочтительные примеры групп -Z-C(O)-R⁵, которые перечислены в табл. 2, выбраны из:Specific preferred examples of groups-ZC(O)-R ⁵ that are listed in table. 2, selected from:

(S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирила, (4S)-карбокси[2-(2-{2-[(4R)-5-карбокси-4-гексадеканоиламинопентаноиламино]этокси}этокси)ацетиламино]бутирила, (4S)-карбокси[2-(2-{2-[(4R)-5-карбокси-4-гексадеканоиламинопентаноиламино]этокси}этокси)ацетиламино]бутирила, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]- 4 040723 этокси}этокси)ацетила, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила,(S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl , (4S)-carboxy[2-(2-{2-[(4R)-5-carboxy-4-hexadecanoylaminopentanoylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino]butyryl, (4S)-carboxy[2-(2-{2- [(4R)-5-carboxy-4-hexadecanoylaminopentanoylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino]butyryl, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy }ethoxy)acetylamino]- 4 040723 ethoxy}ethoxy)acetyl, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino]ethoxy} ethoxy)acetyl,

[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-октадеканоиламиноэтокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетиламино} этокси)этокси] ацетил-.[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-octadecanoylaminoethoxy)ethoxy]acetylamino}ethoxy)ethoxy]acetylamino}ethoxy)ethoxy]acetyl-.

Кроме того, предпочтительными являются стереоизомеры, в частности энантиомеры данных групп, либо S-, либо R-энантиомеры. Термин R в табл. 2 предназначен для обозначения места присоединения -Z-C(O)-R⁵ в пептидном остове, например эпсилон-аминогруппы Lys.In addition, stereoisomers are preferred, in particular the enantiomers of these groups, either S- or R-enantiomers. The term R in the table. 2 is intended to indicate the point of attachment of -ZC(O)-R ⁵ in the peptide backbone, for example the epsilon-amino group of Lys.

Таблица 2table 2

Структура/название согласно IUPAC Structure/name according to IUPAC названи е names e О II н А /х. / R ^{V V} Ж о НО О (S)-4-Карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-O II n A /x. / R ^VV F o HO O (S)-4-Carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl- gGlu- Stea gGlu- Stea О II ^н A /А / R γ γ о НО О (S)-4-Карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил-O II ⁿ A /A / R γ γ o HO O (S)-4-Carboxy-4-hexadecanoylaminobutyryl- gGlu- Palm gGlu- Palm НО. χθ О II н R. X Y X Af II н ξ II ο о но о (S)-4-Карбокси-4-((S)-4-карбокси-4- гексадеканоиламинобутириламино)-бутирил- BUT. χθ O II n R. X Y X Af II n ξ II ο o but oh (S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4- hexadecanoylaminobutyrylamino)-butyryl- gGlugGluPalm gGlugGluPalm но. .о Ύ о 9 1 II н N X О N > П н Ξ н н о^он < [[(4S)-4-Карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2(гексадеканоиламино)этокси]этокси]ацетил]амино]бутирил But. .o Ύ o 9 1 II n N X O N > P n Ξ n n o^on < [[(4S)-4-Carboxy-4-[[(4S)-4-carboxy-4-[[2-[2-[2(hexadecanoylamino)ethoxy]ethoxy]acetyl]amino]butyryl gGlu- gGluAEEAc- Palm gGlu- gGluAEEAc- Palm

- 5 040723- 5 040723

Дополнительный вариант осуществления относится к соединениям формулы I, гдеAn additional embodiment relates to compounds of formula I, where

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована группой -Z-C(O)R⁵, гдеX14 is Lys, where the -NH2 side chain group is functionalized with a -ZC(O)R ⁵ group, where

Z представляет собой группу, выбранную из gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA-, gGlu-gGlu-AEEAc, AEEAc-AEEAc-gGlu и AEEAc-AEEAc-AEEAc; иZ is a group selected from gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA-, gGlu-gGlu-AEEAc, AEEAc-AEEAc-gGlu and AEEAc-AEEAc-AEEAc; And

R⁵ представляет собой группу, выбранную из пентадеканила или гептадеканила.R ⁵ is a group selected from pentadecanyl or heptadecanyl.

X14 представляет собой Lys, где группа -NH₂ боковой цепи функционализирована группой -Z-C(O)R⁵, гдеX14 is Lys, where the -NH ₂ side chain group is functionalized with a -ZC(O)R ⁵ group, where

Z представляет собой группу, выбранную из gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA- и gGlu-gGlu-AEEAc; иZ is a group selected from gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-AEEAc-gAAA- and gGlu-gGlu-AEEAc; And

X14 представляет собой Lys, где группа -NH₂ боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]- 6 040723 этокси}этокси)ацетила,X14 is Lys where the side chain -NH ₂ group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4 -((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino ]ethoxy}ethoxy)acetyl, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino]-6 040723 ethoxy}ethoxy)acetyl,

[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-октадеканоиламиноэтокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетиламино} этокси)этокси] ацетил-;[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-octadecanoylaminoethoxy)ethoxy]acetylamino}ethoxy)ethoxy]acetylamino}ethoxy)ethoxy]acetyl-;

R¹ представляет собой NH₂, или их соли или сольвату.R ¹ is NH ₂ or a salt or solvate thereof.

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила;X14 is Lys where the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4- ((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino] ethoxy}ethoxy)acetyl, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino]ethoxy}ethoxy)acetyl;

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-;X14 is Lys wherein the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-;

X20 представляет собой Lys или Aib;X20 is Lys or Aib;

R¹ представляет собой NH2, или их соли или сольвату.R ¹ is NH2, or a salt or solvate thereof.

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-,X14 is Lys where the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (S)-4-carboxy-4- octadecanoylaminobutyryl-,

X20 представляет собой Lys,X20 is Lys,

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-;X14 is Lys where the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (S)-4-carboxy-4- octadecanoylaminobutyryl-;

X20 представляет собой Lys;X20 is Lys;

X31 представляет собой His;X31 is His;

X20 представляет собой Lys;X20 is Lys;

X29 представляет собой Gly;X29 is Gly;

X14 представляет собой Lys, где группа -NH₂ боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-;X14 is Lys where the side chain -NH ₂ group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (S)-4-carboxy-4 -octadecanoylaminobutyryl-;

X20 представляет собой Aib;X20 is Aib;

X14 представляет собой Lys, где группа -NH₂ боковой цепи функционализирована с помощьюX14 is Lys, where the side chain -NH ₂ group is functionalized with

- 7 040723 (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-,- 7 040723 (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl-,

X20 представляет собой Aib;X20 is Aib;

X31 представляет собой Pro;X31 is Pro;

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-,X14 is Lys where the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-,

X20 представляет собой Aib;X20 is Aib;

X29 представляет собой D-Ala;X29 is D-Ala;

Конкретными примерами соединений формулы I являются соединения под SEQ ID NO: 6-27, а также их соли или сольваты.Specific examples of compounds of formula I are compounds according to SEQ ID NO: 6-27, as well as their salts or solvates.

Конкретными примерами соединений формулы I являются соединения под SEQ ID NO: 6, 9 и 11, а также их соли или сольваты.Specific examples of compounds of formula I are compounds according to SEQ ID NO: 6, 9 and 11, as well as their salts or solvates.

Конкретным примером соединений формулы I являются соединения под SEQ ID NO: 6, а также их соли или сольваты.A specific example of compounds of formula I are compounds under SEQ ID NO: 6, as well as their salts or solvates.

Конкретным примером соединений формулы I являются соединения под SEQ ID NO: 9, а также их соли или сольваты.A specific example of compounds of formula I are compounds under SEQ ID NO: 9, as well as their salts or solvates.

Конкретным примером соединений формулы I являются соединения под SEQ ID NO: 11, а также их соли или сольваты.A specific example of compounds of formula I are compounds according to SEQ ID NO: 11, as well as their salts or solvates.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению в смеси с носителем. В предпочтительных вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтически приемлемую композицию, а носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель. Соединения по настоящему изобретению могут быть в форме соли, например фармацевтически приемлемой соли, или сольвата, например гидрата. В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для применения в способе медицинского лечения, в частности в медицине человека.In an additional aspect, the present invention relates to a composition containing the compound of the present invention in admixture with a carrier. In preferred embodiments, the composition is a pharmaceutically acceptable composition and the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier. The compounds of the present invention may be in the form of a salt, eg a pharmaceutically acceptable salt, or a solvate, eg a hydrate. In another additional aspect, the present invention relates to a composition for use in a method of medical treatment, in particular in human medicine.

Соединения формулы I являются подходящими для лечения человека без дополнительного терапевтически эффективного средства. В других вариантах осуществления, тем не менее, соединения можно применять вместе по меньшей мере с одним дополнительным терапевтически активным средством, как описано в разделе Комбинированная терапия.The compounds of formula I are suitable for human treatment without additional therapeutically effective agent. In other embodiments, however, the compounds can be used together with at least one additional therapeutically active agent, as described in the Combination Therapy section.

Соединения формулы I являются особенно подходящими для лечения или предупреждения заболеваний или нарушений, вызванных, связанных с и/или сопровождающихся нарушениями метаболизма углеводов и/или липидов, например, для лечения или предупреждения гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа, ожирения и метаболического синдрома. Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут подходить для лечения или предупреждения дегенеративных заболеваний, в частности нейродегенеративных заболеваний.The compounds of formula I are particularly suitable for the treatment or prevention of diseases or disorders caused by, associated with and/or accompanied by disorders of carbohydrate and/or lipid metabolism, for example for the treatment or prevention of hyperglycemia, type 2 diabetes, impaired glucose tolerance, type 1 diabetes , obesity and metabolic syndrome. In addition, the compounds of the present invention may be suitable for the treatment or prevention of degenerative diseases, in particular neurodegenerative diseases.

Описанные соединения нашли свое применение, среди прочего, в предупреждении прибавления веса тела или в снижении веса тела. Термин предупреждение означает ингибирование или уменьшение по сравнению с отсутствием лечения и необязательно означает полное прекращение нарушения.The described compounds have found their use, inter alia, in the prevention of weight gain or in the reduction of body weight. The term prevention means inhibition or reduction compared to no treatment, and does not necessarily mean complete cessation of the disorder.

Соединения по настоящему изобретению могут вызывать снижение потребления пищи и/или увеличение расхода энергии, что приводит к наблюдаемому эффекту в отношении веса тела.The compounds of the present invention can cause a reduction in food intake and/or an increase in energy expenditure, resulting in an observable effect on body weight.

Вне зависимости от их эффекта в отношении веса тела соединения по настоящему изобретению могут оказывать благоприятный эффект в отношении уровней холестерина в циркулирующей крови, будучи способными улучшать уровни содержания липидов, в частности уровни LDL, а также HDL (например, увеличивая соотношение HDL/LDL).Regardless of their effect on body weight, the compounds of the present invention may have a beneficial effect on circulating cholesterol levels by being able to improve lipid levels, in particular LDL levels, as well as HDL (eg, by increasing the HDL/LDL ratio).

Таким образом, соединения по настоящему изобретению можно применять для непосредственной или опосредованной терапии любого состояния, вызванного или характеризующегося избыточным весом тела, такой как лечение и/или предупреждение ожирения, ожирения, препятствующего нормальному функционированию организма, воспаления, связанного с ожирением, заболевания желчного пузыря, связанного с ожирением, приступа апноэ во сне, вызванного ожирением. Их можно использовать также для лечения и предупреждения метаболического синдрома, диабета, гипертензии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, артериосклероза, ишемической болезни сердца или инсульта. Их эффекты при данных состояниях могут являться результатом их эффекта в отношении веса тела или быть связанными с ним или могут быть независимыми от него.Thus, the compounds of the present invention can be used in the direct or indirect therapy of any condition caused or characterized by overweight, such as the treatment and/or prevention of obesity, obstructive obesity, obesity-related inflammation, gallbladder disease, obesity-related sleep apnea. They can also be used to treat and prevent metabolic syndrome, diabetes, hypertension, atherogenic dyslipidemia, atherosclerosis, arteriosclerosis, coronary heart disease or stroke. Their effects under these conditions may result from or be related to or independent of their effect on body weight.

Варианты медицинского применения включают задержку или предупреждение прогрессирования заболевания при диабете 2 типа, лечение метаболического синдрома, лечение ожирения или предупреж- 8 040723 дение избыточного веса, снижения потребления пищи, увеличение расхода энергии, снижение веса тела, задержку прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе (IGT) в диабет 2 типа; задержку прогрессирования диабета 2 типа в инсулинозависимый диабет.Medical applications include delaying or preventing disease progression in type 2 diabetes, treating metabolic syndrome, treating obesity or preventing overweight, reducing food intake, increasing energy expenditure, reducing body weight, delaying the progression of impaired glucose tolerance (IGT) in type 2 diabetes; delaying the progression of type 2 diabetes to insulin-dependent diabetes.

ОпределенияDefinitions

Аминокислотные последовательности по настоящему изобретению содержат обычные однобуквенные и трехбуквенные коды для встречающихся в природе аминокислот, а также общепринятые трехбуквенные коды для других аминокислот, таких как Aib (α-аминоизомасляная кислота).The amino acid sequences of the present invention contain conventional one-letter and three-letter codes for naturally occurring amino acids, as well as conventional three-letter codes for other amino acids such as Aib (α-aminoisobutyric acid).

Термин нативный эксендин-4 относится к нативному эксендину-4, имеющему последовательностьThe term native exendin-4 refers to native exendin-4 having the sequence

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂ (SEQ ID NO: 4)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH ₂ (SEQ ID NO: 4)

Настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, определенным формулой I.The present invention relates to peptide compounds defined by formula I.

Пептидные соединения по настоящему изобретению содержат линейный остов из аминокарбоновых кислот, связанных пептидными, т.е. карбоксамидными, связями. Предпочтительно аминокарбоновые кислоты представляют собой α-аминокарбоновые кислоты и более предпочтительно L-а-аминокарбоновые кислоты, если не указано иное. Такие пептидные соединения предпочтительно содержат каркасную последовательность из 39 аминокарбоновых кислот.The peptide compounds of the present invention contain a linear backbone of aminocarboxylic acids linked by peptides, i.e. carboxamide bonds. Preferably the amino carboxylic acids are α-amino carboxylic acids and more preferably L-a-amino carboxylic acids, unless otherwise indicated. Such peptide compounds preferably contain a backbone sequence of 39 aminocarboxylic acids.

Аминокислоты в пептидном фрагменте (формула I) можно рассматривать как последовательно пронумерованные от 1 до 39 в общепринятом направлении от N-конца к C-концу. Ссылка на ''положение в пептидном фрагменте I должна быть составлена таким образом, как необходимо ссылаться на положения в нативном эксендине-4 и других молекулах, например в эксендине-4 His находится в положении 1, Gly находится в положении 2, ..., Met находится в положении 14, ... и Ser находится в положении 39.The amino acids in the peptide fragment (formula I) can be considered as sequentially numbered from 1 to 39 in the conventional direction from the N-terminus to the C-terminus. The reference to the '' position in the peptide fragment I should be made in such a way as it is necessary to refer to the positions in native exendin-4 and other molecules, for example, in exendin-4 His is at position 1, Gly is at position 2, ..., Met is in position 14, ... and Ser is in position 39.

Аминокислотный остаток с группой -NH₂ боковой цепи, например Lys, Orn, Dab или Dap, функционализирует в том отношении, что по меньшей мере один атом H группы -NH2 боковой цепи заменяют на -Z-C(O)-R⁵, где R⁵ содержит липофильный фрагмент, например ациклическую линейную или разветвленную (C8-C30)насыщенную или ненасыщенную углеводородную группу, которая является незамещенной или замещенной, например, галогеном (F, Cl, Br, J), -OH и/или CO2H, a Z содержит линкер во всех стереоизомерных формах, например линкер, содержащий одну или несколько, например от 1 до 5, предпочтительно 1, 2 или 3, аминокислотных линкерных групп, выбранных из группы гамма-глутамата (gGlu), gAAA и AEEAc. Предпочтительные группы R⁵ содержат липофильный фрагмент, например ациклическую линейную или разветвленную (C12-C₂o)насыщенную или ненасыщенную углеводородную группу, например пентадеканил, гексадеканил или гептадеканил, которая является незамещенной или замещенной CO2H, более предпочтительно пентадеканил или гептадеканил. В одном варианте осуществления аминокислотные линкерные группы выбраны из gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-gGlu-AEEAc, gGlu-AEEAc-gAAA, AEEAc-AEEAc-gGlu и AEEAc-AEEAc-AEEAc. В другом варианте осуществления аминокислотная линкерная группа представляет собой gGlu. В другом варианте осуществления аминокислотная линкерная группа представляет собой gGlu-gGlu. В другом варианте осуществления аминокислотная линкерная группа представляет собой gGlu-gGlu-AEEAc. В другом варианте осуществления аминокислотная линкерная группа представляет собой gGlu-AEEAc-gAAA. В другом варианте осуществления аминокислотная линкерная группа представляет собой AEEAc-AEEAc-gGlu. В другом варианте осуществления аминокислотная линкерная группа представляет собой AEEAc-AEEAc-AEEAc.An amino acid residue with a side chain -NH ₂ group, such as Lys, Orn, Dab or Dap, is functionalized in that at least one H atom of the side chain -NH2 group is replaced with -ZC(O)-R ⁵ where R ⁵ contains a lipophilic moiety, e.g. an acyclic linear or branched (C8-C30) saturated or unsaturated hydrocarbon group, which is unsubstituted or substituted, e.g. halogen (F, Cl, Br, J), -OH and/or CO2H, and Z contains a linker in all stereoisomeric forms, for example a linker containing one or more, for example from 1 to 5, preferably 1, 2 or 3, amino acid linker groups selected from the group of gamma-glutamate (gGlu), gAAA and AEEAc. Preferred R ⁵ groups contain a lipophilic moiety, for example an acyclic linear or branched (C12-C ₂ o) saturated or unsaturated hydrocarbon group, for example pentadecanyl, hexadecanyl or heptadecanyl, which is unsubstituted or substituted with CO2H, more preferably pentadecanyl or heptadecanyl. In one embodiment, the amino acid linker groups are selected from gGlu, gGlu-gGlu, gGlu-gGlu-AEEAc, gGlu-AEEAc-gAAA, AEEAc-AEEAc-gGlu, and AEEAc-AEEAc-AEEAc. In another embodiment, the amino acid linker group is gGlu. In another embodiment, the amino acid linker group is gGlu-gGlu. In another embodiment, the amino acid linker group is gGlu-gGlu-AEEAc. In another embodiment, the amino acid linker group is gGlu-AEEAc-gAAA. In another embodiment, the amino acid linker group is AEEAc-AEEAc-gGlu. In another embodiment, the amino acid linker group is AEEAc-AEEAc-AEEAc.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению, описанное в данном документе, или его соль или сольват в смеси с носителем.In a further aspect, the present invention relates to a composition comprising a compound of the present invention as described herein, or a salt or solvate thereof, in admixture with a carrier.

Настоящее изобретение также относится к применению соединения по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата, в частности для лечения состояния, описанного в данном описании.The present invention also relates to the use of the compounds of the present invention for use as a drug, in particular for the treatment of the condition described in this description.

Настоящее изобретение также относится к композиции, где композиция представляет собой фармацевтически приемлемую композицию и носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель.The present invention also relates to a composition wherein the composition is a pharmaceutically acceptable composition and the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.

Синтез пептидов.Synthesis of peptides.

Специалисту в данной области техники известен ряд различных способов получения пептидов. Такие способы включают без ограничения синтетические подходы и экспрессию рекомбинантных генов. Таким образом, одним способом получения пептидов является синтез в растворе либо на твердой подложке и последующие выделение и очистка. Другим способом получения пептидов является экспрессия генов в клетке-хозяине, в которую была введена последовательность ДНК, кодирующая пептид. В качестве альтернативы экспрессии генов можно достичь без использования клеточной системы. Описанные выше способы можно также комбинировать любым способом.A person skilled in the art is aware of a number of different methods for preparing peptides. Such methods include, without limitation, synthetic approaches and expression of recombinant genes. Thus, one way to obtain peptides is the synthesis in solution or on a solid support and subsequent isolation and purification. Another way to obtain peptides is by gene expression in a host cell into which the DNA sequence encoding the peptide has been introduced. Alternatively, gene expression can be achieved without the use of a cell system. The methods described above can also be combined in any way.

Предпочтительным способом получения соединений по настоящему изобретению является твердофазный синтез на подходящей смоле. Твердофазный синтез пептидов является хорошо отработанной методикой (см., например, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford,A preferred method for preparing the compounds of the present invention is solid phase synthesis on a suitable resin. Solid phase peptide synthesis is a well established technique (see e.g. Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford,

- 9 040723- 9 040723

Ill., 1984; E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach, Oxford-IRL Press, New York, 1989). Твердофазный синтез инициируют посредством присоединения защищенной с N-конца аминокислоты с помощью ее карбоксиконца к инертной твердой подложке, несущей расщепляемый линкер. Данная твердая подложка может представлять собой любой полимер, который обеспечивает соединение с первой аминокислотой, например тритильную смолу, хлортритильную смолу, смолу Ванга или смолу Ринка, при этом связывание карбоксильной группы (или карбоксамидной для смолы Ринка) со смолой является чувствительным к кислоте (при применении стратегии Fmoc). Полимерная подложка должна быть стабильной в условиях, используемых для снятия защиты с α-аминогруппы в ходе синтеза пептидов.Ill., 1984; E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach, Oxford-IRL Press, New York, 1989). Solid phase synthesis is initiated by attaching the N-terminally protected amino acid via its carboxy terminus to an inert solid support bearing a cleavable linker. This solid support can be any polymer that provides a bond to the first amino acid, such as trityl resin, chlorotrityl resin, Wang resin or Rink resin, wherein the bonding of the carboxyl group (or carboxamide for Rink resin) to the resin is acid sensitive (when used Fmoc strategies). The polymeric support must be stable under the conditions used to deprotect the α-amino group during peptide synthesis.

После связывания защищенной с N-конца первой аминокислоты с твердой подложкой защитную группу для α-аминогруппы этой аминокислоты удаляют. Затем остальные защищенные аминокислоты связывают одну за другой или с заранее преобразованным дипептидом, трипептидом или тетрапептидом в порядке, представленном пептидной последовательностью, с помощью соответствующих реагентов, связывающих амиды, например BOP, HBTU, HATU или DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид)/HOBt (1-гидроксибензотриазол), где BOP, HBTU и HATU применяют с основаниями третичных аминов. В качестве альтернативы освобожденный N-конец можно функционализировать группами, отличными от аминокислот, например карбоновыми кислотами и т.д.After binding the N-terminally protected first amino acid to the solid support, the protecting group for the α-amino group of that amino acid is removed. The remaining protected amino acids are then linked one by one or to a pre-transformed dipeptide, tripeptide or tetrapeptide in the order represented by the peptide sequence using appropriate amide binding reagents, e.g. BOP, HBTU, HATU or DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide)/HOBt (1-hydroxybenzotriazole), where BOP, HBTU and HATU are used with tertiary amine bases. Alternatively, the freed N-terminus can be functionalized with groups other than amino acids, such as carboxylic acids, etc.

Как правило, реакционноспособные группы боковых цепей аминокислот защищают подходящими блокирующими группами. Данные защитные группы удаляют после завершения сборки требуемых пептидов. Их удаляют одновременно с отщеплением требуемого продукта от смолы при тех же условиях. Защитные группы и процедуры для введения защитных групп можно найти в Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd ed., Greene, T.W. and Wuts, P.G.M., Wiley & Sons (New York, 1999).As a rule, the reactive groups of the amino acid side chains are protected with suitable blocking groups. These protecting groups are removed after the assembly of the desired peptides is completed. They are removed simultaneously with the removal of the desired product from the resin under the same conditions. Protective groups and procedures for introducing protecting groups can be found in Protective Groups in Organic Synthesis, ^3rd ed., Greene, TW and Wuts, PGM, Wiley & Sons (New York, 1999).

В некоторых случаях может быть желательным иметь защитные группы боковых цепей, которые можно селективно удалять, в то время как другие защитные группы боковых цепей остаются нетронутыми. В таком случае освобожденную функциональную группу можно селективно функционализировать. Например, лизин можно защищать с помощью защитной группы ivDde ([1-(4,4-диметил-2,6диоксоциклогекс-1-илиден)-3-метилбутил) (S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603), которая является лабильной в отношении высоконуклеофильного основания, например 4% гидразина в DMF (диметилформамид). Таким образом, если N-концевая аминогруппа и все функциональные группы боковой цепи защищены кислото-неустойчивыми защитными группами, то группу ivDde можно селективно удалять с применением 4% гидразина в DMF, а затем соответствующую свободную аминогруппу можно дополнительно модифицировать, например, с помощью ацилирования. В качестве альтернативы лизин можно присоединять к защищенной аминокислоте, а затем снимать защиту с аминогруппы данной аминокислоты с получением в результате другой свободной аминогруппы, которую можно ацилировать или прикреплять к дополнительным аминокислотам. В качестве альтернативы боковую цепь (описанную в табл. 2) можно вводить вместе с лизином в ходе синтеза пептидов с применением предварительно функционализированной структурной единицы, например, (2S)-6-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[[(4S)-5-третбутокси-4-(гексадеканоиламино)-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-2-(9H-флуорен-9илметоксикарбониламино)гексановой кислоты, в качестве партнера сочетания.In some cases it may be desirable to have side chain protecting groups that can be selectively removed while other side chain protecting groups remain intact. In such a case, the liberated functional group can be selectively functionalized. For example, lysine can be protected with the ivDde protecting group ([1-(4,4-dimethyl-2,6dioxocyclohex-1-ylidene)-3-methylbutyl) (S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603) that is labile to a highly nucleophilic base, such as 4% hydrazine in DMF (dimethylformamide). Thus, if the N-terminal amino group and all side chain functional groups are protected by acid-labile protecting groups, then the ivDde group can be selectively removed using 4% hydrazine in DMF, and then the corresponding free amino group can be further modified, for example, by acylation. Alternatively, lysine can be attached to a protected amino acid and then deprotected from the amino group of that amino acid, resulting in another free amino group that can be acylated or attached to additional amino acids. Alternatively, the side chain (described in Table 2) can be introduced along with lysine during peptide synthesis using a pre-functionalized building block such as (2S)-6-[[(4S)-5-tert-butoxy-4- [[(4S)-5-tert-butoxy-4-(hexadecanoylamino)-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-2-(9H-fluoren-9ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid as a coupling partner.

В конечном итоге пептид отщепляют от смолы. Этого можно достичь с помощью использования смеси Кинга (D.S. King, C.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266). Затем исходный материал можно очищать с помощью хроматографии, например препаративной RP-HPLC, при необходимости.Ultimately, the peptide is cleaved from the resin. This can be achieved using King's mixture (D.S. King, C.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266). The starting material can then be purified by chromatography, such as preparative RP-HPLC, if necessary.

Эффективность.Efficiency.

Используемые в данном документе термины эффективность или эффективность in vitro представляют собой показатель способности соединения активировать рецепторы GLP-1, глюкагона или GIP в исследовании на клетках. Численно это выражается как значение EC₅₀, которое представляет собой эффективную концентрацию соединения, индуцирующую полумаксимальное повышение ответа (например, образование внутриклеточного cAMP) в эксперименте зависимости доза-ответ.As used herein, the terms potency or potency in vitro is a measure of the ability of a compound to activate GLP-1, glucagon, or GIP receptors in a cell assay. This is expressed numerically as an EC ₅₀ value, which is the effective compound concentration that induces a half-maximal increase in response (eg, intracellular cAMP formation) in a dose-response experiment.

Терапевтические применения.Therapeutic applications.

Метаболический синдром представляет собой комбинацию болезней, которые, возникая вместе, увеличивают риск развития диабета 2 типа, а также атеросклеротических сосудистых заболеваний, например сердечно-сосудистых заболеваний и инсульта. Определяющие медицинские параметры метаболического синдрома включают сахарный диабет, нарушение толерантности к глюкозе, повышенный уровень глюкозы в крови натощак, инсулинорезистентность, секрецию альбумина с мочой, центральное ожирение, гипертензию, повышенный уровень триглицеридов, повышенный уровень холестерина LDL и сниженный уровень холестерина HDL.Metabolic syndrome is a combination of diseases that, when combined, increase the risk of developing type 2 diabetes, as well as atherosclerotic vascular diseases, such as cardiovascular disease and stroke. Defining medical parameters of the metabolic syndrome include diabetes mellitus, impaired glucose tolerance, elevated fasting blood glucose, insulin resistance, urinary albumin secretion, central obesity, hypertension, elevated triglycerides, elevated LDL cholesterol, and reduced HDL cholesterol.

Ожирение является нарушением, при котором избыток жира в организме накопился до такой степени, при которой он может оказывать неблагоприятный эффект на здоровье и продолжительность жизни, и в связи с увеличением распространенности ожирения у взрослых и детей оно стало одной из ведущих предупреждаемых причин смерти в современном мире. Оно увеличивает вероятность различных другихObesity is a disorder in which excess body fat has accumulated to the point where it can have an adverse effect on health and life expectancy, and due to the increasing prevalence of obesity in adults and children, it has become one of the leading preventable causes of death in the world today. . It increases the likelihood of various other

- 10 040723 заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, диабета 2 типа, обструктивного апноэ во сне, некоторых видов рака и остеоартрита, и чаще всего вызвано комбинацией избыточного потребления пищи, сниженного расхода энергии, а также генетической предрасположенностью.- 10 040723 diseases, including cardiovascular disease, type 2 diabetes, obstructive sleep apnea, certain cancers and osteoarthritis, and is most often caused by a combination of excess food intake, reduced energy expenditure, and genetic predisposition.

Сахарный диабет, часто называемый просто диабетом, представляет собой группу метаболических заболеваний, при которых индивидуум имеет высокие уровни сахара в крови, либо потому, что организм не вырабатывает достаточного количества инсулина, либо потому, что клетки не реагируют на вырабатываемый инсулин. Наиболее распространенными типами диабета являются (1) диабет 1 типа, при котором организм не в состоянии вырабатывать инсулин; (2) диабет 2 типа (T2DM), при котором организм не в состоянии использовать инсулин надлежащим образом в сочетании с увеличением дефицита инсулина с течением времени; и (3) гестационный диабет, при котором у женщины развивается диабет вследствие беременности. Все формы диабета увеличивают риск долговременных осложнений, которые, как правило, развиваются по прошествии многих лет. Основой большинства таких долговременных осложнений является повреждение кровеносных сосудов, и их можно разделить на две категории: макрососудистое заболевание, возникающее в результате атеросклероза крупных кровеносных сосудов, и микрососудистое заболевание, возникающее в результате повреждения мелких кровеносных сосудов. Примерами макрососудистых заболеваний являются ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, инсульт и заболевание периферических сосудов. Примерами микрососудистых заболеваний являются диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, а также диабетическая нейропатия.Diabetes mellitus, often referred to simply as diabetes, is a group of metabolic diseases in which an individual has high blood sugar levels, either because the body does not produce enough insulin or because the cells do not respond to the insulin that is produced. The most common types of diabetes are (1) type 1 diabetes, in which the body is unable to produce insulin; (2) type 2 diabetes (T2DM), in which the body is unable to use insulin properly, coupled with an increase in insulin deficiency over time; and (3) gestational diabetes, in which a woman develops diabetes as a result of pregnancy. All forms of diabetes increase the risk of long-term complications, which usually develop over many years. The basis of most of these long-term complications is damage to blood vessels, and they can be divided into two categories: macrovascular disease resulting from atherosclerosis of large blood vessels, and microvascular disease resulting from damage to small blood vessels. Examples of macrovascular diseases are coronary heart disease, myocardial infarction, stroke, and peripheral vascular disease. Examples of microvascular diseases are diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, and diabetic neuropathy.

Рецепторы для GLP-1 и GIP, а также для глюкагона являются представителями семейства 7-спиральных трансмембранных, гетеротримерных, связанных с G-белком рецепторов. Они структурно связаны друг с другом и имеют не только значительный уровень идентичности последовательности, но и обладают аналогичными механизмами распознавания лиганда и внутриклеточными сигнальными путями.The receptors for GLP-1 and GIP, as well as for glucagon, are members of a family of 7-helical transmembrane, heterotrimeric, G protein-coupled receptors. They are structurally related to each other and not only share a significant level of sequence identity, but also share similar ligand recognition mechanisms and intracellular signaling pathways.

Аналогичным образом пептиды GLP-1, GIP и глюкагон имеют участки высокой идентичности/подобия последовательности. GLP-1 и глюкагон получают из общего предшественника, препроглюкагона, который дифференцированно процессируется тканеспецифичным образом с получением, например, GLP-1 в эндокринных клетках кишечника и глюкагона в альфа-клетках панкреатических островков. GIP является производным более крупного предшественника-прогормона про-GIP и синтезируется и выделяется K-клетками, расположенными в тонком кишечнике.Similarly, GLP-1, GIP, and glucagon peptides have regions of high sequence identity/similarity. GLP-1 and glucagon are derived from a common precursor, preproglucagon, which is differentially processed in a tissue-specific manner to produce, for example, GLP-1 in intestinal endocrine cells and glucagon in pancreatic islet alpha cells. GIP is a derivative of the larger prohormone precursor pro-GIP and is synthesized and secreted by K cells located in the small intestine.

Пептидные инкретиновые гормоны GLP-1 и GIP секретируются эндокринными клетками кишечника в ответ на пищу и отвечают за не более 70% включительно секреции инсулина, стимулированной приемом пищи. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что секреция GLP-1 снижена у субъектов с нарушением толерантности к глюкозе или диабетом 2 типа, тогда как чувствительность к GLP-1 у таких пациентов все еще сохранена. Таким образом, целенаправленное воздействие на рецептор GLP-1 подходящими агонистами предлагает перспективный подход для лечения метаболических нарушений, в том числе диабета. Рецептор для GLP-1 является широко распространенным, и его выявляют главным образом в панкреатических островках, головном мозге, сердце, почках и желудочно-кишечном тракте. В поджелудочной железе GLP-1 действует строго глюкозозависимым образом, увеличивая секрецию инсулина из бета-клеток. Такая зависимость от глюкозы показывает малую вероятность того, что активация рецепторов GLP-1 вызовет гипогликемию. Кроме того, рецептор для GIP широко экспрессируется в периферических тканях, в том числе в панкреатических островках, жировой ткани, желудке, тонком кишечнике, сердце, костях, легких, почках, семенниках, коре надпочечников, гипофизе, эндотелиальных клетках, трахее, селезенке, вилочковой железе, щитовидной железе и головном мозге. В соответствии с его биологической функцией в виде инкретинового гормона, панкреатические β-клетки у людей экспрессируют наивысшие уровни рецептора для GIP.The peptide incretin hormones GLP-1 and GIP are secreted by intestinal endocrine cells in response to food and are responsible for no more than 70% inclusive of food-stimulated insulin secretion. Evidence suggests that GLP-1 secretion is reduced in subjects with impaired glucose tolerance or type 2 diabetes, while GLP-1 sensitivity in such patients is still preserved. Thus, targeting the GLP-1 receptor with suitable agonists offers a promising approach for the treatment of metabolic disorders, including diabetes. The receptor for GLP-1 is widespread and is found mainly in the pancreatic islets, brain, heart, kidney and gastrointestinal tract. In the pancreas, GLP-1 acts in a strictly glucose-dependent manner to increase insulin secretion from beta cells. This dependence on glucose shows a low probability that the activation of GLP-1 receptors will cause hypoglycemia. In addition, the receptor for GIP is widely expressed in peripheral tissues, including pancreatic islets, adipose tissue, stomach, small intestine, heart, bones, lungs, kidneys, testes, adrenal cortex, pituitary gland, endothelial cells, trachea, spleen, thymus gland, thyroid and brain. Consistent with its biological function as an incretin hormone, pancreatic β-cells in humans express the highest levels of the receptor for GIP.

Существует несколько клинических доказательств того, что опосредованная рецептором GIP передача сигнала может быть нарушена у пациентов с T2DM, однако показано, что нарушение активности GIP является обратимым и может восстанавливаться с улучшением диабетического статуса. Необходимо отметить, что стимуляция секреции инсулина обоими инкретиновыми гормонами, GIP и GLP-1, является строго глюкозозависимой, обеспечивая механизм абсолютной надежности, ассоциированный с низким риском возникновения гипогликемии.There is some clinical evidence that GIP receptor-mediated signaling may be impaired in T2DM patients, however, the impairment of GIP activity has been shown to be reversible and may be reversed with improvement in diabetic status. It should be noted that the stimulation of insulin secretion by both incretin hormones, GIP and GLP-1, is strictly glucose-dependent, providing an absolute reliability mechanism associated with a low risk of hypoglycemia.

Было показано, что на уровне бета-клеток GLP-1 и GIP стимулируют чувствительность к глюкозе, неогенез, пролиферацию, транскрипцию проинсулина и гипертрофию, а также антиапоптотические свойства. Можно ожидать, что пептид с агонистической активностью как в отношении рецептора GLP-1, так и рецептора GIP будет иметь дополнительную или синергическую противодиабетическую эффективность. Другие значимые эффекты GLP-1 вне поджелудочной железы включают замедленное опорожнение желудка, повышенное чувство насыщения, снижение потребления пищи, уменьшение веса тела, а также нейропротективные и кардиопротективные эффекты. У пациентов с диабетом 2 типа такие экстрапанкреатические эффекты могут быть особенно важны, учитывая высокие уровни сопутствующих патологий, таких как ожирение и сердечно-сосудистое заболевание. Дополнительное действие GIP в периферических тканях за пределами поджелудочной железы включает повышенное образование костной ткани и сниженную резорбцию костной ткани, а также нейропротективные эффекты, которые могут быть по- 11 040723 лезны для лечения остеопороза и когнитивных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера.At the beta cell level, GLP-1 and GIP have been shown to stimulate glucose sensitivity, neogenesis, proliferation, proinsulin transcription and hypertrophy, as well as anti-apoptotic properties. A peptide with agonist activity at both the GLP-1 receptor and the GIP receptor would be expected to have additional or synergistic antidiabetic efficacy. Other significant effects of GLP-1 outside the pancreas include delayed gastric emptying, increased satiety, reduced food intake, reduced body weight, and neuroprotective and cardioprotective effects. In patients with type 2 diabetes, such extrapancreatic effects may be particularly important given the high levels of comorbidities such as obesity and cardiovascular disease. Additional effects of GIP in peripheral tissues outside the pancreas include increased bone formation and reduced bone resorption, as well as neuroprotective effects, which may be useful in the treatment of osteoporosis and cognitive impairment such as Alzheimer's disease.

Глюкагон представляет собой пептидный гормон из 29 аминокислот, который продуцируется панкреатическими альфа-клетками и выделяется в кровоток при низком уровне циркулирующей в крови глюкозы. Важной физиологической ролью глюкагона является стимуляция образования глюкозы в печени, что представляет собой процесс, обеспечивающий основной антагонистический механизм для инсулина в поддержании гомеостаза глюкозы in vivo.Glucagon is a 29 amino acid peptide hormone produced by pancreatic alpha cells and released into the bloodstream when circulating glucose levels are low. An important physiological role of glucagon is to stimulate the production of glucose in the liver, which is the process that provides the main antagonistic mechanism for insulin in maintaining glucose homeostasis in vivo.

Однако рецепторы глюкагона также экспрессируются во внепеченочных тканях, таких как почки, сердце, адипоциты, лимфобласты, головной мозг, сетчатка, надпочечники и желудочно-кишечный тракт, что указывает на более широкую физиологическую роль помимо гомеостаза глюкозы. Соответственно недавние исследования показали, что глюкагон характеризуется терапевтически положительными эффектами в отношении регуляции расхода энергии, в том числе стимуляции расхода энергии и термогенеза, сопровождающихся уменьшением потребления пищи и снижением веса тела. В целом, стимуляция рецепторов глюкагона может быть пригодной при лечении ожирения и метаболического синдрома.However, glucagon receptors are also expressed in extrahepatic tissues such as the kidneys, heart, adipocytes, lymphoblasts, brain, retina, adrenal glands, and gastrointestinal tract, suggesting a wider physiological role beyond glucose homeostasis. Accordingly, recent studies have shown that glucagon has therapeutically beneficial effects on the regulation of energy expenditure, including stimulation of energy expenditure and thermogenesis, accompanied by a reduction in food intake and a decrease in body weight. In general, stimulation of glucagon receptors may be useful in the treatment of obesity and metabolic syndrome.

Оксинтомодулин представляет собой пептидный гормон, состоящий из глюкагона с восемью аминокислотами, содержащими C-концевое удлинение. Подобно GLP-1 и глюкагону, он преобразован в препроглюкагон и расщепляется и секретируется тканеспецифичным образом эндокринными клетками тонкого кишечника. Известно, что оксинтомодулин стимулирует рецепторы как для GLP-1, так и для глюкагона и, таким образом, является прототипом двойного агониста (см. Pocai, Molecular Metabolism, 2013; 3:241-51).Oxyntomodulin is a peptide hormone composed of glucagon with eight amino acids containing a C-terminal extension. Like GLP-1 and glucagon, it is converted to preproglucagon and is cleaved and secreted in a tissue-specific manner by the endocrine cells of the small intestine. Oxyntomodulin is known to stimulate receptors for both GLP-1 and glucagon and thus is a prototypical dual agonist (see Pocai, Molecular Metabolism, 2013; 3:241-51).

Поскольку GLP-1 и GIP известны своими противодиабетическими эффектами, как GLP-1, так и глюкагон известны своими эффектами, подавляющими потребление пищи, а глюкагон также является медиатором дополнительного расхода энергии, можно предположить, что объединение активностей трех гормонов в одной молекуле может дать мощный лекарственный препарат для лечения метаболического синдрома и, в частности, таких его составляющих, как сахарный диабет и ожирение.Since GLP-1 and GIP are known for their anti-diabetic effects, since both GLP-1 and glucagon are known for their food intake-suppressing effects, and since glucagon is also a mediator of extra energy expenditure, it can be hypothesized that combining the activities of the three hormones in one molecule could produce a powerful a medicinal product for the treatment of metabolic syndrome and, in particular, its components such as diabetes mellitus and obesity.

Исходя из этого, соединения по настоящему изобретению можно использовать для лечения нарушения переносимости глюкозы, инсулинорезистентности, преддиабета, повышенного уровня глюкозы в крови натощак (гипергликемии), диабета 2 типа, гипертензии, дислипидемии, артериосклероза, ишемической болезни сердца, заболевания периферических артерий, инсульта или любой комбинации компонентов этих отдельных заболеваний.On this basis, the compounds of the present invention can be used to treat impaired glucose tolerance, insulin resistance, prediabetes, elevated fasting blood glucose (hyperglycemia), type 2 diabetes, hypertension, dyslipidemia, arteriosclerosis, coronary heart disease, peripheral arterial disease, stroke, or any combination of the components of these individual diseases.

Кроме того, их можно использовать для контроля аппетита, питания и потребления калорий, увеличения расхода энергии, предупреждения прибавления веса тела, стимуляции снижения веса тела, снижения избыточного веса тела и в целом для лечения ожирения, в том числе ожирения, препятствующего нормальному функционированию организма.In addition, they can be used to control appetite, nutrition and calorie intake, increase energy expenditure, prevent weight gain, promote weight loss, reduce excess body weight, and generally treat obesity, including obesity that interferes with the normal functioning of the body.

Соединения по настоящему изобретению являются агонистами рецепторов GLP-1, GIP и глюкагона (например, тройными агонистами) и могут обеспечивать терапевтическое преимущество при решении клинической проблемы, связанной с метаболическим синдромом, с помощью одновременного лечения диабета и ожирения.The compounds of the present invention are GLP-1, GIP and glucagon receptor agonists (eg, triple agonists) and may provide a therapeutic benefit in the clinical problem of metabolic syndrome by concomitantly treating diabetes and obesity.

Дополнительные патологические состояния и состояния здоровья, которые можно лечить соединениями по настоящему изобретению, представляют собой связанное с ожирением воспаление, связанное с ожирением заболевание желчного пузыря и приступ апноэ во сне, вызванный ожирением.Additional pathological conditions and health conditions that can be treated with the compounds of the present invention are obesity-associated inflammation, obesity-associated gallbladder disease, and obesity-induced sleep apnea.

Несмотря на то что все данные состояния могут быть непосредственно или опосредованно связаны с ожирением, эффекты соединений по настоящему изобретению могут быть опосредованы в целом или частично эффектом на вес тела или не зависеть от него.Although all of these conditions may be directly or indirectly associated with obesity, the effects of the compounds of the present invention may be mediated in whole or in part by the effect on body weight or independent of it.

Кроме того, подлежащие лечению заболевания могут представлять собой нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона, или другие дегенеративные заболевания, описанные выше.Furthermore, the diseases to be treated may be neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease or other degenerative diseases as described above.

В одном варианте осуществления соединения являются пригодными при лечении или предупреждении гипергликемии, диабета 2 типа и/или ожирения.In one embodiment, the compounds are useful in the treatment or prevention of hyperglycemia, type 2 diabetes and/or obesity.

Соединения по настоящему изобретению могут обладать способностью замедлять прохождение содержимого через кишечник, увеличивать содержимое желудка и/или снижать потребление пищи пациентом. Данные виды активности соединений по настоящему изобретению можно оценивать на животных моделях, известных специалисту в данной области техники и описанных в данном документе в разделе Способы.The compounds of the present invention may have the ability to slow the passage of contents through the intestines, increase the contents of the stomach and/or reduce the food intake of the patient. These activities of the compounds of the present invention can be evaluated in animal models known to the person skilled in the art and described in this document in the Methods section.

Соединения по настоящему изобретению обладают способностью снижать уровень глюкозы в крови и/или снижать уровни HbA1c у пациента. Данные виды активности соединений по настоящему изобретению можно оценивать на животных моделях, известных специалисту в данной области техники, а также описанных в данном документе в разделах Способы и Примеры.The compounds of the present invention have the ability to lower blood glucose and/or lower HbA1c levels in a patient. These activities of the compounds of the present invention can be evaluated in animal models known to the person skilled in the art, as well as described in this document in the sections Methods and Examples.

Соединения по настоящему изобретению также могут обладать способностью снижать вес тела пациента. Данные виды активности соединений по настоящему изобретению можно оценивать на животных моделях, известных специалисту в данной области техники, а также описанных в данном документе в разделах Способы и Примеры.The compounds of the present invention may also have the ability to reduce the body weight of the patient. These activities of the compounds of the present invention can be evaluated in animal models known to the person skilled in the art, as well as described in this document in the sections Methods and Examples.

Соединения по настоящему изобретению могут быть пригодными при лечении или предупрежде- 12 040723 нии гепатостеатоза, предпочтительно неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) и неалкогольного стеатогепатита (NASH).The compounds of the present invention may be useful in the treatment or prevention of hepatosteatosis, preferably non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

Фармацевтические композиции.pharmaceutical compositions.

Термин фармацевтическая композиция означает смесь, содержащую ингредиенты, которые совместимы при смешивании и которые можно вводить. Фармацевтическая композиция может содержать одно или несколько лекарственных средств для медицинского применения. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать носители, буферы, подкисляющие средства, подщелачивающие средства, растворители, вспомогательные средства, средства, регулирующие тоничность, смягчающие средства, средства, увеличивающие объем, консерванты, физические и химические стабилизаторы, например поверхностно-активные вещества, антиоксиданты и другие компоненты, независимо от того, считаются ли они активными или неактивными ингредиентами. Руководство для специалиста по составлению фармацевтических композиций можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20^th ed.) ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippencott Williams & Wilkins и в R.C. Rowe et al. (Ed), Handbook of Pharmaceutical Excipients, PhP, обновленная редакция в мае 2013 г.The term pharmaceutical composition means a mixture containing ingredients that are compatible when mixed and that can be administered. The pharmaceutical composition may contain one or more drugs for medical use. In addition, the pharmaceutical composition may contain carriers, buffers, acidifying agents, alkalizing agents, solvents, auxiliaries, tonicity agents, emollients, bulking agents, preservatives, physical and chemical stabilizers, such as surfactants, antioxidants, and other components, regardless of whether they are considered active or inactive ingredients. Guidance for the pharmaceutical formulation specialist can be found, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, ( ^20th ed.) ed. AR Gennaro, 2000, Lippencott Williams & Wilkins and in RC Rowe et al. (Ed), Handbook of Pharmaceutical Excipients, PhP, updated May 2013.

Пептидные производные эксендина-4 по настоящему изобретению или их соли вводят в сочетании с приемлемым фармацевтическим носителем, разбавителем или наполнителем в качестве части фармацевтической композиции.The exendin-4 peptide derivatives of the present invention, or salts thereof, are administered in combination with an acceptable pharmaceutical carrier, diluent or excipient as part of a pharmaceutical composition.

Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой носитель, который является физиологически приемлемым (например, имеет физиологически приемлемое значение pH), сохраняя при этом терапевтические свойства вещества, с которым его вводят. Стандартные приемлемые фармацевтические носители и их составы известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20^th ed.) ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippencott Williams & Wilkins и в R.C. Rowe et al. (Ed), Handbook of Pharmaceutical excipients, PhP, обновленная редакция в мае 2013 г. Одним иллюстративным фармацевтически приемлемым носителем является физиологический солевой раствор.A pharmaceutically acceptable carrier is a carrier that is physiologically acceptable (eg, has a physiologically acceptable pH) while retaining the therapeutic properties of the substance with which it is administered. Standard acceptable pharmaceutical carriers and formulations thereof are known to those skilled in the art and are described, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, ( ^20th ed.) ed. AR Gennaro, 2000, Lippencott Williams & Wilkins and in RC Rowe et al. (Ed), Handbook of Pharmaceutical excipients, PhP, updated May 2013. One exemplary pharmaceutically acceptable carrier is physiological saline.

В одном варианте осуществления носители выбраны из группы буферов (например, цитрат/лимонная кислота, ацетат/уксусная кислота), подкисляющих средств (например, хлористоводородная кислота), подщелачивающих средств (например, гидроксид натрия), консервантов (например, фенол, мкрезол), вспомогательных растворителей (например, полиэтиленгликоль 400), средств, регулирующих тоничность (например, маннит, глицерин), стабилизаторов (например, поверхностно-активное вещество, антиоксиданты, аминокислоты).In one embodiment, carriers are selected from the group of buffers (eg citrate/citric acid, acetate/acetic acid), acidifying agents (eg hydrochloric acid), alkalizing agents (eg sodium hydroxide), preservatives (eg phenol, mcresol), co-solvents (eg polyethylene glycol 400), tonicity agents (eg mannitol, glycerin), stabilizers (eg surfactant, antioxidants, amino acids).

Используемые концентрации находятся в диапазоне, который является физиологически приемлемым.The concentrations used are in a range that is physiologically acceptable.

Приемлемые фармацевтические носители или разбавители включают такие, которые используют в составах, подходящих для перорального, ректального, назального или парентерального (в том числе подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрикожного и чрескожного) введения. Соединения по настоящему изобретению, как правило, вводят парентерально.Acceptable pharmaceutical carriers or diluents include those used in formulations suitable for oral, rectal, nasal, or parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, and transdermal) administration. The compounds of the present invention are generally administered parenterally.

Термин фармацевтически приемлемая соль означает соли соединений по настоящему изобретению, которые являются безопасными и эффективными для применения у млекопитающих.The term pharmaceutically acceptable salt means salts of the compounds of the present invention that are safe and effective for use in mammals.

Термин сольват означает комплексы соединений по настоящему изобретению или их солей с молекулами растворителя, например молекулами органического растворителя и/или воды.The term solvate means complexes of the compounds of the present invention or their salts with solvent molecules, for example organic solvent molecules and/or water.

В фармацевтической композиции производное эксендина-4 может быть в мономерной или олигомерной форме.In the pharmaceutical composition, the exendin-4 derivative may be in monomeric or oligomeric form.

Термин терапевтически эффективное количество соединения относится к нетоксичному, однако достаточному для обеспечения требуемого эффекта количеству соединения. Количество соединения формулы I, необходимое для достижения требуемого биологического эффекта, зависит от ряда факторов, например, конкретного выбранного соединения, предполагаемого применения, режима введения и клинического состояния у пациента. Соответствующее эффективное количество в каждом отдельном случае может быть определено специалистом в данной области техники путем проведения стандартных экспериментов. Например, терапевтически эффективное количество соединения формулы I составляет приблизительно 0,01-50 мг/доза, предпочтительно 0,02-1 мг/доза.The term "therapeutically effective amount of a compound" refers to a non-toxic but sufficient amount of the compound to provide the desired effect. The amount of a compound of formula I required to achieve the desired biological effect depends on a number of factors, for example, the particular compound chosen, the intended use, the mode of administration, and the clinical condition of the patient. The appropriate effective amount in each individual case can be determined by one of ordinary skill in the art by routine experimentation. For example, a therapeutically effective amount of a compound of formula I is about 0.01-50 mg/dose, preferably 0.02-1 mg/dose.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению являются такими, которые подходят для парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного или внутривенного), ректального, местного и перорального (например, подъязычного) введения, хотя наиболее подходящий способ введения в каждом отдельном случае зависит от природы и тяжести состояния, подлежащего лечению, а также от природы соединения формулы I, используемого в каждом случае. В одном варианте осуществления применение является парентеральным, например подкожным.Pharmaceutical compositions of the present invention are those suitable for parenteral (eg subcutaneous, intramuscular, intradermal or intravenous), rectal, topical and oral (eg sublingual) administration, although the most appropriate route of administration in each individual case depends on the nature and severity the condition to be treated, as well as the nature of the compound of formula I used in each case. In one embodiment, administration is parenteral, eg subcutaneous.

В случае парентерального применения благоприятным может являться, чтобы соответствующие составы содержали по меньшей мере один противомикробный консервант для подавления роста микроорганизмов и бактерий между введениями. Предпочтительными консервантами являются бензиловый спирт или фенольные соединения, такие как фенол или м-крезол. Было описано, что эти ингредиенты могут индуцировать агрегацию пептидов и белков, что приводит к более низкой растворимости и ста- 13 040723 бильности в составе (см. R.L. Bis et al., Int. J. Pharm. 472, 356-361, 2014; T.J. Kamerzell, Adv. Drug Deliv.In the case of parenteral administration, it may be advantageous for the respective formulations to contain at least one antimicrobial preservative to inhibit the growth of microorganisms and bacteria between administrations. Preferred preservatives are benzyl alcohol or phenolic compounds such as phenol or m-cresol. It has been described that these ingredients can induce aggregation of peptides and proteins resulting in lower solubility and stability in the formulation (see R.L. Bis et al., Int. J. Pharm. 472, 356-361, 2014; T. J. Kamerzell, Adv. Drug Deliv.

Rev., 63, 1118-1159, 2011).Rev., 63, 1118-1159, 2011).

Подходящие фармацевтические композиции могут быть в форме отдельных единиц, например капсул, таблеток и порошков, во флаконах или ампулах, каждое из которых содержит определенное количество соединения; в форме порошков или гранул; в форме раствора или суспензии в водной или неводной жидкости или в форме эмульсии типа масло в воде или вода в масле. Она может быть представлена разовой или многократной дозой в инъекционной форме, например в виде шприц-ручки. Как уже было упомянуто, композиции можно получать любым подходящим фармацевтическим способом, который включает стадию, на которой активный ингредиент и носитель (который может состоять из одного или нескольких дополнительных ингредиентов) приводят в контакт.Suitable pharmaceutical compositions may be in the form of individual units, such as capsules, tablets and powders, in vials or ampoules, each containing a certain amount of the compound; in the form of powders or granules; in the form of a solution or suspension in an aqueous or non-aqueous liquid, or in the form of an oil-in-water or water-in-oil emulsion. It may be presented as a single or multiple dose in injectable form, for example in the form of a syringe pen. As already mentioned, the compositions can be obtained by any suitable pharmaceutical method, which includes the stage at which the active ingredient and the carrier (which may consist of one or more additional ingredients) are brought into contact.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть предоставлена вместе с устройством для применения, например, вместе со шприцем, шприц-ручкой или автоинжектором. Такие устройства могут быть предоставлены отдельно от фармацевтической композиции или предварительно заполненными фармацевтической композицией.In certain embodiments, the pharmaceutical composition may be provided with a device for use, such as a syringe, pen, or auto-injector. Such devices may be provided separately from the pharmaceutical composition or pre-filled with the pharmaceutical composition.

Единица введения, упаковка, устройство по типу ручки и введение.Injection unit, packaging, pen type device and infusion.

Соединение(я) по настоящему изобретению можно получать для применения в подходящих фармацевтических композициях. Подходящие фармацевтические композиции могут находиться в виде одной или нескольких единиц введения.The compound(s) of the present invention can be prepared for use in suitable pharmaceutical compositions. Suitable pharmaceutical compositions may be in the form of one or more administration units.

Композиции можно получать посредством любого подходящего фармацевтического способа, который включает стадию, на которой соединение(я) по настоящему изобретению и носитель (который может состоять из одного или нескольких дополнительных ингредиентов) приводят в контакт.Compositions can be obtained by any suitable pharmaceutical method, which includes the stage at which the compound(s) of the present invention and the carrier (which may consist of one or more additional ingredients) are brought into contact.

Единицы введения могут представлять собой, например, капсулы, таблетки, драже, гранулы, саше, капли, растворы, суспензии, лиофилизаты и порошки, все из которых содержат определенное количество соединения(й) по настоящему изобретению.Administration units may be, for example, capsules, tablets, dragees, granules, sachets, drops, solutions, suspensions, lyophilisates and powders, all of which contain a certain amount of the compound(s) of the present invention.

Каждую из вышеуказанных единиц введения соединения(й) по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению (единицы введения) можно поставлять в упаковке для легкой транспортировки и хранения. Единицы введения упаковывают в стандартные упаковки, содержащие разовые или многократные дозы, при этом их вид, материал и форма зависят от типа полученных единиц.Each of the above administration units of the compound(s) of the present invention or the pharmaceutical composition of the present invention (administration units) can be supplied in a package for easy transportation and storage. Administration units are packaged in standard packages containing single or multiple doses, while their appearance, material and form depend on the type of units received.

Например, таблетки и другие формы твердых единиц введения можно упаковывать в виде единиц с разовой дозой, и упакованные единицы с разовой дозой можно упаковывать в контейнеры, представляющие собой групповую тару.For example, tablets and other forms of solid administration units may be packaged as single dose units, and packaged single dose units may be packaged in containers that form a group container.

Жидкие составы можно упаковывать в виде единиц с разовой дозой, таких как, например, флаконы, картриджи, шприцы/предварительно заполненные шприцы, инфузионные пакеты, мягкие пластиковые пакеты, инфузионные бутылки, бутылки, изготовленные по технологии выдувание-наполнениезапаивание или инфузионные трубки, или в инъекционной форме с разовой или многократной дозами, например, в виде устройства по типу ручки, насоса или шприца, и при этом упакованные единицы с разовой дозой можно упаковывать в контейнеры, представляющие собой групповую тару. Упаковка с разовой дозой может содержать только одну или множество единиц введения. Упаковку можно изготавливать, например, из бумаги, картона, упаковочного картона, пластика, металла, комбинаций или слоистых материалов на основе одного или нескольких из бумаги, разновидностей пластика и металла или стекла. Иллюстративные варианты осуществления представляют собой блистерные упаковки, содержащие, например, таблетки или капсулы, которые, в свою очередь, можно поставлять внутри картонной коробки, саше из многослойного материала с алюминиевым защитным покрытием, содержащие, например, порошок, стеклянные или пластиковые бутылки, содержащие, например, таблетки или раствор, или флаконы, картриджи, шприцы, инфузионные пакеты, инфузионные бутылки, инфузионные трубки или ампулы, содержащие раствор или суспензию.Liquid formulations may be packaged as single dose units such as, for example, vials, cartridges, syringes/pre-filled syringes, infusion bags, soft plastic bags, infusion bottles, blow-fill-seal bottles or infusion tubing, or in injectable form with a single or multiple doses, for example, in the form of a device like a pen, pump or syringe, and at the same time packaged units with a single dose can be packaged in containers that are group containers. A single dose package may contain only one or multiple administration units. The packaging can be made, for example, from paper, paperboard, packaging board, plastic, metal, combinations or laminates based on one or more of paper, plastic varieties and metal or glass. Exemplary embodiments are blister packs containing, for example, tablets or capsules, which in turn can be supplied inside a carton, laminated sachets containing, for example, powder, glass or plastic bottles containing, for example, tablets or solution, or vials, cartridges, syringes, infusion bags, infusion bottles, infusion tubes or ampoules containing a solution or suspension.

В определенных вариантах осуществления единицы введения можно поставлять вместе с устройством для применения, например, вместе со шприцем, шприцем-ручкой или автоинжектором. Такие устройства могут быть предоставлены отдельно от фармацевтической композиции или предварительно заполненными фармацевтической композицией.In certain embodiments, administration units may be supplied with a device for use, such as a syringe, pen, or auto-injector. Such devices may be provided separately from the pharmaceutical composition or pre-filled with the pharmaceutical composition.

Устройство для инъекции по типу ручки, часто коротко называемое шприцем-ручкой, представляет собой, как правило, устройство для инъекции, характеризующееся продолговатой формой, которая напоминает авторучку для письма. Хотя такие ручки обычно характеризуются трубчатым поперечным сечением, они легко могут характеризоваться различным поперечным сечением, таким как треугольное, прямоугольное или квадратное или любой вариацией, основанной на таких геометрических формах. В целом, устройства для инъекции по типу ручки содержат три первичных элемента: картриджную часть, которая предусматривает картридж, часто содержащийся внутри корпуса или держателя; узел для иглы, присоединенный к одному концу картриджной части; и участок дозирования, присоединенный к другому концу картриджной части. Картридж, также часто называемый ампулой, как правило, предусматривает резервуар, который заполнен лекарственным препаратом, съемную резиновую пробку или заглушку, расположенную на одном конце резервуара картриджа, и верхнюю часть, имеющую прокалываемое ре- 14 040723 зиновое уплотнение, расположенное в другом, часто суженном конце. Обжимную кольцевую металлическую ленту, как правило, применяют для закрепления резинового уплотнения на месте. В то время как корпус картриджа обычно можно изготавливать из пластика, резервуары картриджа традиционно изготавливают из стекла.A pen-type injection device, often referred to as a pen for short, is generally an injection device characterized by an elongated shape that resembles a fountain pen. Although such handles are usually characterized by a tubular cross section, they can easily be characterized by various cross sections, such as triangular, rectangular or square, or any variation based on such geometries. In general, pen-style injection devices comprise three primary elements: a cartridge portion, which provides for a cartridge, often contained within a housing or holder; a needle assembly attached to one end of the cartridge portion; and a dispensing portion connected to the other end of the cartridge portion. A cartridge, also often referred to as an ampoule, typically includes a reservoir that is filled with drug, a removable rubber stopper or plug located at one end of the cartridge reservoir, and a top having a pierceable rubber seal located at the other, often tapered end. A crimp ring metal band is typically used to hold the rubber seal in place. While the cartridge body can usually be made from plastic, cartridge reservoirs have traditionally been made from glass.

Комбинированная терапия.Combined therapy.

Соединения по настоящему изобретению, тройные агонисты рецепторов GLP-1, GIP и глюкагона, можно комбинировать со многими другими фармакологически активными соединениями, такими как все лекарственные средства, упомянутые в Rote Liste 2016, например, со всеми средствами, снижающими вес тела или подавляющими аппетит, упомянутыми в Rote Liste 2016, главе 1, со всеми гиполипидемическими средствами, упомянутыми в Rote Liste 2016, главе 58, со всеми антигипертензивными и нефропротективными средствами, упомянутыми в Rote Liste 2016, или со всеми диуретиками, упомянутыми в Rote Liste 2016, главе 36.The compounds of the present invention, GLP-1, GIP and glucagon triple agonists, can be combined with many other pharmacologically active compounds, such as all drugs mentioned in the Rote Liste 2016, for example, with all drugs that reduce body weight or suppress appetite, listed in Rote Liste 2016 Chapter 1, with all lipid-lowering agents listed in Rote Liste 2016 Chapter 58, with all antihypertensive and nephroprotective agents listed in Rote Liste 2016, or with all diuretics listed in Rote Liste 2016 Chapter 36.

Комбинации активных ингредиентов можно использовать, в частности, для синергического улучшения активности. Их можно применять либо путем раздельного введения активных ингредиентов пациенту, либо в форме комбинированных продуктов, где в одном фармацевтическом препарате присутствует множество активных ингредиентов. Если активные ингредиенты вводят путем раздельного введения активных ингредиентов, то это можно выполнять одновременно или последовательно.Combinations of active ingredients can be used, in particular, to improve activity synergistically. They can be used either by separately administering the active ingredients to a patient or in the form of combination products where multiple active ingredients are present in a single pharmaceutical formulation. If the active ingredients are administered by separate administration of the active ingredients, this may be done simultaneously or sequentially.

Другие активные вещества, которые являются подходящими для таких комбинаций, включают, в частности, те, которые, например, усиливают терапевтический эффект одного или нескольких активных веществ в отношении одного из упомянутых показаний к применению и/или которые позволяют уменьшать дозировку одного или нескольких активных веществ.Other active substances which are suitable for such combinations include in particular those which, for example, enhance the therapeutic effect of one or more active substances in relation to one of the indicated indications for use and/or which allow the dosage of one or more active substances to be reduced .

Терапевтические средства, которые являются подходящими для комбинаций, включают, например, противодиабетические средства, такие как:Therapeutic agents that are suitable for combinations include, for example, anti-diabetic agents such as:

инсулин и производные инсулина, например гларгин/Lantus®, 270-330 ед./мл инсулина гларгина (EP 2387989 A), з0о ед./мл инсулина гларгина (EP 2387989 A), глулизин/Apidra®, детемир/Levemir®, лизпро/Humalog®/Liprolog®, деглюдек/деглюдек плюс, аспарт, базальный инсулин и аналоги (например, LY-2605541, LY2963016, NN1436), пэгилированный инсулин лизпро, Humulin®, линжета, SuliXen®, NN1045, инсулин плюс симлин, PE0139, инсулины быстрого действия и короткого действия (например, линжета, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) с гидрогелем, пероральные, ингаляционные, трансдермальные и сублингвальные инсулины (например, Exubera®, Nasulin®, афрезза, трегопил, TPM 02, капсулин, Oral-lyn®, пероральный инсулин Cobalamin®, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, пероральный инсулин Oshadi).insulin and insulin derivatives, e.g. glargine/Lantus®, 270-330 U/ml insulin glargine (EP 2387989 A), 30 U/ml insulin glargine (EP 2387989 A), glulisine/Apidra®, detemir/Levemir®, lispro /Humalog®/Liprolog®, degludec/degludec plus, aspart, basal insulin and analogs (eg, LY-2605541, LY2963016, NN1436), pegylated insulin lispro, Humulin®, linget, SuliXen®, NN1045, insulin plus symlin, PE0139, fast-acting and short-acting insulins (eg, linget, PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002) with hydrogel, oral, inhaled, transdermal, and sublingual insulins (eg, Exubera®, Nasulin®, afrezza, tregopil, TPM 02, capsulin, Oral-lyn®, Cobalamin® oral insulin, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, Oshadi oral insulin).

Также дополнительно включены такие производные инсулина, которые связаны с альбумином или другим белком с помощью бифункционального линкера.Also included are those insulin derivatives that are linked to albumin or other protein via a bifunctional linker.

GLP-1, аналоги GLP-1 и агонисты рецептора GLP-1, например ликсисенатид/AVE0010/ZP10/ликсумия, эксенатид/эксендин-4/баетта/бидуреон/ITCA 650/AC-2993, лираглутид/виктоза, семаглутид, таспоглутид, синкриа/албиглутид, дулаглутид, рекомбинантный эксендин-4, CJC-1134-PC, PB-1023, TTP-054, эфпегленатид/HM-11260C, CM-3, GLP-1 Eligen, ORMD-0901, NN-9924, NN-9926, NN-9927, нодексен, Viador-GLP-1, CVX-096, ZYOG-1, ZYD-1, GSK-2374697, DA-3091, MAR-701, MAR709, ZP-2929, ZP-3022, ZP-DI-70, TT-401, MK-8521, MEDI0382, BHM-034, HM12525A, MOD-6030, CAM-2036, DA-15864, ARI-2651, ARI-2255, LY3298176, NN1177, эксенатид-XTEN и глюкагон-XTEN, NN9030.GLP-1, GLP-1 analogs and GLP-1 receptor agonists, eg lixisenatide/AVE0010/ZP10/lyxumia, exenatide/exendin-4/byetta/bidureon/ITCA 650/AC-2993, liraglutide/victose, semaglutide, taspoglutide, syncria /albiglutide, dulaglutide, recombinant exendin-4, CJC-1134-PC, PB-1023, TTP-054, efpeglenatide/HM-11260C, CM-3, GLP-1 Eligen, ORMD-0901, NN-9924, NN-9926 , NN-9927, nodexen, Viador-GLP-1, CVX-096, ZYOG-1, ZYD-1, GSK-2374697, DA-3091, MAR-701, MAR709, ZP-2929, ZP-3022, ZP-DI -70, TT-401, MK-8521, MEDI0382, BHM-034, HM12525A, MOD-6030, CAM-2036, DA-15864, ARI-2651, ARI-2255, LY3298176, NN1177, exenatide-XTEN and glucagon-XTEN , NN9030.

Ингибиторы DPP-4, например алоглиптин/несина, тражента/линаглиптин/BI1356/ондеро/тражента/траджента/трайента/традзента, саксаглиптин/онглиза, ситаглиптин/янувия/кселевия/тесаве/янумет/вельметиа, галвус/вилдаглиптин, анаглиптин, гемиглиптин, тенелиглиптин, мелоглиптин, трелаглиптин, DA-1229, омариглиптин/MK-3102, KM-223, эвоглиптин, ARI-2243, PBL-1427, пиноксацин.DPP-4 inhibitors, eg alogliptin/nesina, trajent/linagliptin/BI1356/ondero/trajent/trajent/trient/trazent, saxagliptin/ongliza, sitagliptin/januvia/xelevia/tesave/janumet/velmetia, galvus/vildagliptin, anagliptin, gemigliptin, teneligliptin, melogliptin, trelagliptin, DA-1229, omarigliptin/MK-3102, KM-223, evogliptin, ARI-2243, PBL-1427, pinoxacin.

Ингибиторы SGLT2, например инвокана/канаглифозин, форксига/дапаглифлозин, ремоглифозин, серглифлозин, эмпаглифлозин, ипраглифлозин, тофоглифлозин, лузеоглифлозин, сотаглифлозин (LX-4211), эртуглифлозин/PF-04971729, rO-4998452, бексаглифлозин (EGT-0001442), KGA-3235/DSP3235, LIK066, SBM-TFC-039, хенаглифлозин (SHR3824), янаглифлозин, тианаглифлозин, AST1935, JRP493, HEC-44616.SGLT2 inhibitors, eg invokana/canaglifozin, forxiga/dapagliflozin, remoglifozin, sergliflozin, empagliflozin, ipragliflozin, tofogliflozin, luseogliflozin, sotagliflozin (LX-4211), ertugliflozin/PF-04971729, rO-4998452, bexagliflozin (EGT-2000) 3235/DSP3235, LIK066, SBM-TFC-039, henagliflozin (SHR3824), yanagliflozin, thianagliflozin, AST1935, JRP493, HEC-44616.

Бигуаниды (например, метформин, буформин, фенформин), тиазолидиндионы (например, пиоглитазон, ривоглитазон, розиглитазон, троглитазон), двойные агонисты PPAR (например, алеглитазар, мураглитазар, тезаглитазар), сульфонилмочевины (например, толбутамид, глибенкламид, глимепирид/амарил, глипизид), меглитиниды (например, натеглинид, репаглинид, митиглинид), ингибиторы альфа-глюкозидазы (например, акарбоза, миглитол, воглибоза), амилин и аналоги амилина (например, прамлинтид, симлин).Biguanides (eg, metformin, buformin, phenformin), thiazolidinediones (eg, pioglitazone, rivoglitazone, rosiglitazone, troglitazone), dual PPAR agonists (eg, aleglitazar, muraglitazar, tezaglitazar), sulfonylureas (eg, tolbutamide, glibenclamide, glimepiride/amaril, glipizide ), meglitinides (eg, nateglinide, repaglinide, mitiglinide), alpha-glucosidase inhibitors (eg, acarbose, miglitol, voglibose), amylin, and amylin analogs (eg, pramlintide, simlin).

- 15 040723- 15 040723

Агонисты GPR119 (например, GSK-263A, PSN-821, MBX-2982, APD-597, ZYG-19, DS-8500), агонисты GPR40 (например, фазиглифам/ТАК-875, TUG-424, P-1736, JTT-851, GW9508).GPR119 agonists (eg, GSK-263A, PSN-821, MBX-2982, APD-597, ZYG-19, DS-8500), GPR40 agonists (eg, faziglypham/TAK-875, TUG-424, P-1736, JTT -851, GW9508).

Другими подходящими партнерами для комбинаций являются:Other suitable partners for combinations are:

циклосет, ингибиторы 11-бета-HSD (например, LY2523199, BMS770767, RG-4929, BMS816336,cycloset, 11beta-HSD inhibitors (e.g. LY2523199, BMS770767, RG-4929, BMS816336,

AZD-8329, HSD-016, BI-135585), активаторы глюкокиназы (например, TTP-399, AMG-151, TAK-329, GKM-001), ингибиторы DGAT (например, LCQ-908), ингибиторы протеин-тирозинфосфатазы 1 (например, тродусквемин), ингибиторы глюкозо-6-фосфатазы, ингибиторы фруктозо-1,6-бис-фосфатазы, ингибиторы гликогенфосфорилазы, ингибиторы фосфоенолпируваткарбоксикиназы, ингибиторы киназы гликогенсинтазы, ингибиторы пируватдегидрокиназы, антагонисты альфа-2-рецепторов, антагонисты CCR-2, ингибиторы SGLT-1 (например, LX-2761).AZD-8329, HSD-016, BI-135585), glucokinase activators (eg, TTP-399, AMG-151, TAK-329, GKM-001), DGAT inhibitors (eg, LCQ-908), protein tyrosine phosphatase 1 inhibitors (eg, troduskvemin), glucose-6-phosphatase inhibitors, fructose-1,6-bis-phosphatase inhibitors, glycogen phosphorylase inhibitors, phosphoenolpyruvate carboxykinase inhibitors, glycogen synthase kinase inhibitors, pyruvate dehydrokinase inhibitors, alpha-2 receptor antagonists, CCR-2 antagonists, inhibitors SGLT-1 (for example, LX-2761).

В качестве партнеров для комбинаций подходящими являются также одно или несколько гиполипидемических средств, таких как, например:Also suitable as combination partners are one or more lipid-lowering agents, such as, for example:

ингибиторы HMG-CoA-редуктазы (например, симвастатин, аторвастатин), фибраты (например, бензафибрат, фенофибрат), никотиновая кислота и ее производные (например, ниацин), агонисты или модуляторы PPAR-(альфа, гамма или альфа/гамма) (например, алеглитазар), агонисты PPAR-дельта, ингибиторы ACAT (например, авасимиб), ингибиторы абсорбции холестерина (например, эзетимиб), вещества, связывающие желчные кислоты (например, холестирамин), ингибиторы транспорта желчных кислот в подвздошной кишке, ингибиторы MTP или модуляторы PCSK9.HMG-CoA reductase inhibitors (eg, simvastatin, atorvastatin), fibrates (eg, benzafibrate, fenofibrate), nicotinic acid and its derivatives (eg, niacin), PPAR-(alpha, gamma, or alpha/gamma) agonists or modulators (eg , aleglitazar), PPAR delta agonists, ACAT inhibitors (eg, avasimibe), cholesterol absorption inhibitors (eg, ezetimibe), bile acid binders (eg, cholestyramine), ileal bile acid transport inhibitors, MTP inhibitors, or PCSK9 modulators .

Соединения, повышающие уровень HDL, такие как: ингибиторы CETP (например, торцетрапиб, анацетрапид, дальцетрапид, эвацетрапид, JTT-302, DRL-17822, TA-8995) или регуляторы ABC1.Compounds that increase HDL levels, such as: CETP inhibitors (eg, torcetrapib, anacetrapid, dalcetrapid, evacetrapid, JTT-302, DRL-17822, TA-8995) or ABC1 regulators.

Другие подходящие партнеры для комбинаций представляют собой одно или несколько активных веществ для лечения ожирения, таких как, например, сибутрамин, тезофензин, орлистат, антагонисты каннабиноидного рецептора 1 типа, антагонисты рецептора MCH-1, агонисты рецептора MC4, антагонисты NPY5 или NPY2 (например, велнеперит), бета-3-агонисты, лептин или лептиномиметики, агонисты рецептора 5HT2c (например, лоркасерин) или комбинации бупропион/налтрексон, бупропион/зонисамид, бупропион/фентермин или прамлинтид/метрелептин.Other suitable combination partners are one or more active substances for the treatment of obesity, such as, for example, sibutramine, tesofensine, orlistat, cannabinoid type 1 receptor antagonists, MCH-1 receptor antagonists, MC4 receptor agonists, NPY5 or NPY2 antagonists (for example, wellneperit), beta-3-agonists, leptin or leptin mimetics, 5HT2c receptor agonists (eg, lorcaserin), or combinations of bupropion/naltrexone, bupropion/zonisamide, bupropion/phentermine, or pramlintide/metreleptin.

Другие подходящие партнеры для комбинаций представляют собой приведенные ниже.Other suitable combination partners are as follows.

Дополнительные желудочно-кишечные пептиды, такие как пептид YY 3-36 (PYY3-36) или его аналоги, панкреатический полипептид (PP) или его аналоги.Additional gastrointestinal peptides such as YY 3-36 peptide (PYY3-36) or analogues thereof, pancreatic polypeptide (PP) or analogues thereof.

Агонисты или антагонисты рецептора глюкагона, агонисты или антагонисты рецептора GIP, антагонисты или обратные агонисты грелина, ксенин и его аналоги.Glucagon receptor agonists or antagonists, GIP receptor agonists or antagonists, ghrelin antagonists or inverse agonists, xenin and its analogues.

Кроме того, комбинации с лекарственными средствами для воздействия на высокое кровяное давление, хроническую сердечную недостаточность или атеросклероз, такие как, например, антагонисты рецепторов ангиотензина II (например, телмисартан, кандесартан, валсартан, лозартан, эпросартан, ирбесартан, олмесартан, тазосартан, азилсартан), ингибиторы ACE, ингибиторы ECE, диуретики, бетаблокаторы, антагонисты кальция, средства против гипертензии центрального действия, антагонисты альфа-2-адренергического рецептора, ингибиторы нейтральной эндопептидазы, ингибиторы агрегации тромбоцитов и другие или их комбинации, также являются подходящими.In addition, combinations with drugs to treat high blood pressure, chronic heart failure, or atherosclerosis, such as, for example, angiotensin II receptor antagonists (eg, telmisartan, candesartan, valsartan, losartan, eprosartan, irbesartan, olmesartan, tazosartan, azilsartan) , ACE inhibitors, ECE inhibitors, diuretics, beta-blockers, calcium antagonists, centrally acting antihypertensives, alpha-2 adrenergic receptor antagonists, neutral endopeptidase inhibitors, inhibitors of platelet aggregation, and others, or combinations thereof, are also suitable.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения согласно настоящему изобретению или его физиологически приемлемой соли в комбинации по меньшей мере с одним из активных веществ, описанных выше, в качестве партнера для комбинации для получения лекарственного препарата, который является подходящим для лечения или предупреждения заболеваний или состояний, на которые можно оказывать влияние путем связывания с рецепторами для GLP-1 и глюкагона и путем модуляции их активности. Оно предпочтительно представляет собой заболевание в контексте метаболического синдрома, в частности, одно из заболеваний или состояний, перечисленных выше, наиболее предпочтительно диабет или ожирение или их осложнения.In another aspect, the present invention relates to the use of a compound of the present invention, or a physiologically acceptable salt thereof, in combination with at least one of the active substances described above, as a combination partner for the preparation of a medicament that is suitable for the treatment or prevention of diseases or conditions that can be influenced by binding to receptors for GLP-1 and glucagon and by modulating their activity. It is preferably a disease in the context of the metabolic syndrome, in particular one of the diseases or conditions listed above, most preferably diabetes or obesity or complications thereof.

Применение соединений согласно настоящему изобретению или их физиологически приемлемой соли в комбинации с одним или несколькими активными веществами может происходить одновременно, по отдельности или последовательно.The use of the compounds according to the present invention or their physiologically acceptable salt in combination with one or more active substances can occur simultaneously, separately or sequentially.

Применение соединения согласно настоящему изобретению или его физиологически приемлемой соли в комбинации с другим активным веществом может происходить одновременно или со сдвигом воThe use of a compound of the present invention, or a physiologically acceptable salt thereof, in combination with another active substance may occur simultaneously or with a shift in

- 16 040723 времени, но, в частности, в течение короткого промежутка времени. Если их вводят одновременно, то два активных вещества дают пациенту вместе; если их применяют со сдвигом во времени, то два активных вещества дают пациенту в течение периода, меньшего или равного 12 ч, но, в частности, меньшего или равного 6 ч.- 16 040723 time, but in particular for a short period of time. If they are administered simultaneously, then the two active substances are given to the patient together; if they are used with a time shift, the two active substances are given to the patient for a period less than or equal to 12 hours, but in particular less than or equal to 6 hours.

Следовательно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к лекарственному препарату, который содержит соединение согласно настоящему изобретению или физиологически приемлемую соль такого соединения и по меньшей мере одно из активных веществ, описанных выше в качестве партнеров для комбинации, необязательно вместе с одним или несколькими инертными носителями и/или разбави телями.Therefore, in another aspect, the present invention provides a medicament which comprises a compound of the present invention, or a physiologically acceptable salt of such a compound, and at least one of the active substances described above as combination partners, optionally together with one or more inert carriers, and /or diluents.

Соединение согласно настоящему изобретению или его физиологически приемлемая соль или сольват и дополнительное активное вещество, подлежащее объединению с ними, могут оба присутствовать вместе в одном составе, например в таблетке или капсуле, или отдельно в двух одинаковых или разных составах, например в форме так называемых составных наборов.The compound of the present invention, or a physiologically acceptable salt or solvate thereof, and the additional active substance to be combined with them, may both be present together in one formulation, for example in a tablet or capsule, or separately in two identical or different formulations, for example in the form of so-called compound sets.

Описание графических материаловDescription of graphic materials

Фиг. 1. Сравнение кривых, построенных по динамической модели Дебая, для составов на основе пептидов, демонстрирующих обратимую самоассоциацию (притягательные взаимодействия) и отталкивающие взаимодействия согласно вириальному коэффициенту.Fig. 1. Comparison of dynamic Debye curves for peptide-based formulations showing reversible self-association (attractive interactions) and repulsive interactions according to the virial coefficient.

Фиг. 2. SEQ ID NO: 6, профиль уровней глюкозы в крови после первой обработки у мышей с DIO, получавших корм.Fig. 2. SEQ ID NO: 6, profile of blood glucose levels after first treatment in chow fed DIO mice.

Фиг. 3. SEQ ID NOFig. 3. SEQID NO

Фиг. 4. SEQ ID NOFig. 4. SEQID NO

Фиг. 5. SEQ ID NOFig. 5. SEQID NO

Фиг. 6. SEQ ID NOFig. 6. SEQID NO

Фиг. 7. SEQ ID NOFig. 7. SEQID NO

6, масса тела мышей с DIO.6, body weight of mice with DIO.

6, изменение массы тела у мышей с DIO.6, change in body weight in mice with DIO.

6, изменение общей массы жира в организме у мышей с DIO.6, Change in total body fat mass in DIO mice.

6, оценка потребления корма мышами с DIO.6, Evaluation of food intake in DIO mice.

6, масса печени у мышей с DIO перед умерщвлением.6, Liver mass in DIO mice before sacrifice.

Фиг. 8. SEQ ID NO: 6, уровень триглицеридов в плазме крови у мышей с DIO, получавших корм, перед умерщвлением.Fig. 8. SEQ ID NO: 6, Plasma triglyceride levels in chow-fed DIO mice before sacrifice.

Фиг. 9. SEQ ID NO: 6, уровень LDL в плазме крови у мышей с DIO, получавших корм.Fig. 9. SEQ ID NO: 6, Plasma LDL level in fed DIO mice.

Фиг. 10. SEQ ID NO: 11, профиль уровней глюкозы в крови после первой обработки у мышей с DIO, получавших корм.Fig. 10. SEQ ID NO: 11, profile of blood glucose levels after first treatment in chow fed DIO mice.

Фиг. 11. SEQ ID NO: 11, масса тела мышей с DIO.Fig. 11. SEQ ID NO: 11, body weight of mice with DIO.

Фиг. 12. SEQ ID NO: 11, изменение общей массы тела у мышей с DIO.Fig. 12. SEQ ID NO: 11, change in total body weight in mice with DIO.

Фиг. 13. SEQ ID NO: 11, изменение общей массы жира в организме у мышей с DIO.Fig. 13. SEQ ID NO: 11, change in total body fat mass in DIO mice.

Фиг. 14. SEQ ID NO: 11, оценка потребления корма мышами с DIO.Fig. 14. SEQ ID NO: 11, Evaluation of food intake in DIO mice.

Фиг. 15. SEQ ID NO: 11, масса печени у мышей с DIO перед умерщвлением.Fig. 15. SEQ ID NO: 11, Liver mass of DIO mice before sacrifice.

Фиг. 16. SEQ ID NO: 11, уровень триглицеридов в плазме крови у мышей с DIO, получавших корм, перед умерщвлением.Fig. 16. SEQ ID NO: 11, Plasma triglyceride levels in chow-fed DIO mice before sacrifice.

Фиг. 17. SEQ ID NO: 11, уровень LDL в плазме крови у мышей с DIO, получавших корм.Fig. 17. SEQ ID NO: 11, Plasma LDL levels in fed DIO mice.

Фиг. 18. SEQ ID NO: 11, уровень инсулина в плазме крови у мышей с DIO, получавших корм, перед умерщвлением.Fig. 18. SEQ ID NO: 11, Plasma insulin levels in chow-fed DIO mice before sacrifice.

Фиг. 19. SEQ ID NO: 11, уровень глюкозы в плазме крови у мышей с DIO, получавших корм, перед умерщвлением.Fig. 19. SEQ ID NO: 11, Plasma glucose levels in fed DIO mice before sacrifice.

Фиг. 20. SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, профиль уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 20. SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, profile of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 21. SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, площадь под кривой зависимости уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 21. SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, area under the curve of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 22. SEQ ID NO: 7, профиль уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 22. SEQ ID NO: 7, profile of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 23. SEQ ID NO: 7, площадь под кривой зависимости уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 23. SEQ ID NO: 7, area under the curve of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 24. SEQ ID NO: 11, профиль уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 24. SEQ ID NO: 11, profile of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 25. SEQ ID NO: 11, площадь под кривой зависимости уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 25. SEQ ID NO: 11, area under the curve of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 26. SEQ ID NO: 11, концентрация триацилглицерина в сыворотке крови у мышей db/db, получавших корм, перед умерщвлением.Fig. 26. SEQ ID NO: 11, serum triacylglycerol concentration in chow-fed db/db mice before sacrifice.

Фиг. 27. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 26, профиль уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 27. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 26, profile of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 28. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 26, площадь под кривой зависимости уровней глюкозы в крови у мышей db/db, получавших корм.Fig. 28. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 26, area under the curve of blood glucose levels in fed db/db mice.

Фиг. 29. Данные наблюдения потребления пищи и веса тела (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6, лираглутид).Fig. 29. Food intake and body weight data (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6, liraglutide).

Фиг. 30. Данные площади аортальной бляшки (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6, лираглутид).Fig. 30. Aortic plaque area data (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6, liraglutide).

Фиг. 31. Данные уровня общего холестерина и LDL-холестерина в сыворотке крови (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6, лираглутид).Fig. 31. Serum total cholesterol and LDL-cholesterol data (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 6, liraglutide).

- 17 040723- 17 040723

СпособыWays

Использовали следующие сокращения:The following abbreviations have been used:

AA - аминокислота;AA - amino acid;

AEEAc - (2-(2-аминоэтокси)этокси)ацетил;AEEAc - (2-(2-aminoethoxy)ethoxy)acetyl;

Aib - альфа-аминоизомасляная кислота;Aib - alpha-aminoisobutyric acid;

cAMP - циклический аденозинмонофосфат;cAMP - cyclic adenosine monophosphate;

Boc - трет-бутилоксикарбонил;Boc - tert-butyloxycarbonyl;

BOP - гексафторофосфат (бензотриазол-1-илокси)-трис-(диметиламино)фосфония;BOP - (benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate;

BSA - бычий сывороточный альбумин;BSA - bovine serum albumin;

tBu - третичный бутил;tBu - tertiary butyl;

dAla - D-аланин;dAla - D-alanine;

DCM - дихлорметан;DCM - dichloromethane;

Dde - 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)этил;Dde - 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl;

ivDde - 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил;ivDde - 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl;

DIC - N,N'-диизопропилкарбодиимид;DIC - N,N'-diisopropylcarbodiimide;

DIPEA - N,N-диизопропилэтиламин;DIPEA - N,N-diisopropylethylamine;

DMEM - среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко;DMEM - medium Needle, modified according to the method of Dulbecco;

DMF - диметилформамид;DMF - dimethylformamide;

DMS - диметилсульфид;DMS - dimethyl sulfide;

EDT - этандитиол;EDT - ethanedithiol;

FA - муравьиная кислота;FA - formic acid;

FBS - фетальная бычья сыворотка;FBS - fetal bovine serum;

Fmoc - флуоренилметилоксикарбонил;Fmoc - fluorenylmethyloxycarbonyl;

gAAA - гамма-аминоадипиновая кислота;gAAA - gamma-aminoadipic acid;

gGlu - гамма-глутамат (yE);gGlu - gamma-glutamate (yE);

HATU - гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония;HATU - O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate;

HBSS - сбалансированный солевой раствор Хэнкса;HBSS - Hanks Balanced Salt Solution;

HBTU - гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония;HBTU - 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate;

HEPES - 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота;HEPES - 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;

HOBt - 1-гидроксибензотриазол;HOBt - 1-hydroxybenzotriazole;

HOSu - N-гидроксисукцинимид;HOSu - N-hydroxysuccinimide;

HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография;HPLC - high performance liquid chromatography;

HTRF - гомогенная флуоресценция с разделением во времени;HTRF - time-separated homogeneous fluorescence;

IBMX - 3-изобутил-1-метилксантин;IBMX - 3-isobutyl-1-methylxanthine;

LC/MS - жидкостная хроматография/масс-спектрометрия;LC/MS - liquid chromatography/mass spectrometry;

Mmt - монометокситритил;Mmt - monomethoxytrityl;

Palm - пальмитоил;Palm - palmitoyl;

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор;PBS - phosphate buffered saline;

PEG - полиэтиленгликоль;PEG - polyethylene glycol;

PK - фармакокинетический;PK - pharmacokinetic;

RP-HPLC - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография;RP-HPLC - reverse phase high performance liquid chromatography;

Stea - стеарил;Stea - stearyl;

TFA - трифторуксусная кислота;TFA - trifluoroacetic acid;

Trt - тритил;Trt - trityl;

UV - ультрафиолет.UV - ultraviolet.

Общий синтез пептидных соединений.General synthesis of peptide compounds.

Материалы.Materials.

Различные амидные смолы Ринка (4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетамидонорлейциламинометильная смола, Merck Biosciences; 4-[(2,4-диметоксифенил) (Fmoc-амино)метил]феноксиацетамидометильная смола, Agilent Technologies) использовали для синтеза пептидных амидов с загрузками в диапазоне 0,2-0,7 ммоль/г.Various Rink amide resins (4-(2',4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidonorleucylaminomethyl resin, Merck Biosciences; 4-[(2,4-dimethoxyphenyl)(Fmoc-amino)methyl]phenoxyacetamidomethyl resin, Agilent Technologies) have been used for the synthesis of peptide amides with loadings in the range of 0.2-0.7 mmol/g.

Защищенные Fmoc природные аминокислоты приобрели у Protein Technologies Inc., Senn Chemicals, Merck Biosciences, Novabiochem, Iris Biotech, Bachem, Chem-Impex International или MATRIX Innovation.Fmoc-protected natural amino acids were purchased from Protein Technologies Inc., Senn Chemicals, Merck Biosciences, Novabiochem, Iris Biotech, Bachem, Chem-Impex International, or MATRIX Innovation.

В ходе синтеза использовали следующие стандартные аминокислоты:The following standard amino acids were used during the synthesis:

Fmoc-L-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Asn(Trt)-OH,Fmoc-L-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Asn(Trt)-OH,

Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Gln(Trt)-OH,Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Gln(Trt)-OH,

Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH,Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH,

Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,

Fmoc-L-Met-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Pro-OH,Fmoc-L-Met-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Pro-OH,

Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH,Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH,

Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-L-Val-OH.Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-L-Val-OH.

Кроме того, следующие конкретные аминокислоты приобретали у тех же поставщиков, которыеIn addition, the following specific amino acids were purchased from the same vendors as

- 18 040723 указаны выше: Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,- 18 040723 above: Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,

Fmoc-D-Ala-OH, Boc-L-His(Boc)-OH (доступна в виде сольвата с толуолом) и Boc-L-His(Trt)-OH.Fmoc-D-Ala-OH, Boc-L-His(Boc)-OH (available as toluene solvate), and Boc-L-His(Trt)-OH.

Кроме того, можно применять структурные единицы, представляющие собой (2S)-6-[[(4S)-5-третбутокси-4-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-(гексадеканоиламино)-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-2-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)гексановую кислоту и Boc-L-His(Trt)-Aib-OH. Обе структурные единицы синтезировали отдельно.In addition, structural units that are (2S)-6-[[(4S)-5-tert-butoxy-4-[[(4S)-5-tert-butoxy-4-(hexadecanoylamino)-5-oxopentanoyl] can be used amino]-5-oxopentanoyl]amino]-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid; and Boc-L-His(Trt)-Aib-OH. Both structural units were synthesized separately.

Способы твердофазного синтеза пептидов проводили, например, на синтезаторе пептидов Prelude (Protein Technologies Inc.) или аналогичном автоматическом синтезаторе с применением стандартной Fmoc-химии и активации HBTU/DIPEA. В качестве растворителя применяли DMF. Снятие защиты: 20% пиперидин/DMF в течение 2x2,5 мин. Промывания: 7х DMF. Присоединение 2:5:10 200 мМ AA/500 мМ HBTU/2M DIPEA в DMF 2х в течение 20 мин. Промывания: 5х DMF.Solid phase peptide synthesis methods were performed, for example, on a Prelude peptide synthesizer (Protein Technologies Inc.) or similar automated synthesizer using standard Fmoc chemistry and HBTU/DIPEA activation. DMF was used as a solvent. Deprotection: 20% piperidine/DMF for 2x2.5 min. Washes: 7x DMF. Attachment 2:5:10 200 mM AA/500 mM HBTU/2M DIPEA in DMF 2x for 20 min. Washes: 5x DMF.

В случаях, когда модифицировали боковую цепь Lys, в соответствующем положении использовали Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH или Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH. После завершения синтеза группу ivDde удаляли в соответствии с модифицированной процедурой из литературных источников (S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 1603) с использованием 4% гидрата гидразина в DMF. Группу Mmt удаляли посредством повторной обработки с помощью AcOH/TFE/DCM (1/2/7) в течение 15 мин при к.т., затем смолу повторно промывали с помощью DCM, 5% DIPEA в DCM и 5% DIPEA в DCM/DMF.In cases where the Lys side chain was modified, Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH or Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH was used at the appropriate position. After completion of the synthesis, the ivDde group was removed according to a modified procedure from the literature (S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 1603) using 4% hydrazine hydrate in DMF. The Mmt group was removed by re-treatment with AcOH/TFE/DCM (1/2/7) for 15 min at rt, then the resin was re-washed with DCM, 5% DIPEA in DCM and 5% DIPEA in DCM/ DMF.

Последующие реакции ацилирования проводили путем обработки смолы с использованием сложных N-гидроксисукцинимидных эфиров требуемой кислоты или с использованием связывающих реагентов, таких как HBTU/DIPEA или HOBt/DIC.Subsequent acylation reactions were carried out by treating the resin with N-hydroxysuccinimide esters of the desired acid or using coupling agents such as HBTU/DIPEA or HOBt/DIC.

Все пептиды, которые были синтезированы, отщепляли от смолы с использованием смеси Кинга для расщепления, состоящей из 82,5% TFA, 5% фенола, 5% воды, 5% тиоанизола, 2,5% EDT. Затем неочищенные пептиды осаждали в диэтиловом или диизопропиловом эфире, центрифугировали и лиофилизировали. Пептиды анализировали с помощью аналитической HPLC и проверяли с помощью массспектрометрии ESI. Неочищенные пептиды очищали с помощью стандартной процедуры очистки с помощью препаративной RP-HPLC.All peptides that were synthesized were cleaved from the resin using King's cleavage mixture consisting of 82.5% TFA, 5% phenol, 5% water, 5% thioanisole, 2.5% EDT. The crude peptides were then precipitated in diethyl or diisopropyl ether, centrifuged and lyophilized. Peptides were analyzed by analytical HPLC and verified by ESI mass spectrometry. The crude peptides were purified using a standard purification procedure using preparative RP-HPLC.

В качестве альтернативы пептиды синтезировали с использованием процедуры синтеза вручную: 0,3 г высушенной амидной смолы Ринка МВНА (0,66 ммоль/г) помещали в полиэтиленовый сосуд, оснащенный полипропиленовым фильтром. Обеспечивали набухание смолы в DCM (15 мл) в течение 1 ч и в DMF (15 мл) в течение 1 ч. Снятие защитной Fmoc-группы на смоле осуществляли путем ее обработки дважды с использованием 20% (об./об.) раствора пиперидин/DMF в течение 5 и 15 мин. Смолу промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым). Тест Кайзера (количественный способ) использовали для подтверждения удаления Fmoc с твердой подложки. C-концевую аминокислоту, защищенную Fmoc (5-экв. избыток, соответствующий нагрузке смолы), в сухом DMF добавляли к смоле с удаленной защитной группой и инициировали присоединение следующей защищенной Fmoc аминокислоты с 5-эквивалентным избытком DIC и HOBT в DMF. Концентрация каждого реагента в реакционной смеси составляла примерно 0,4 М. Смесь перемешивали на роторе при комнатной температуре в течение 2 ч. Смолу фильтровали и промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым). Тест Кайзера на аликвоте смолы с пептидом после завершения присоединения был отрицательным (окрашивание смолы отсутствовало). После присоединения первой аминокислоты не вступившую в реакцию аминогруппу, при наличии такой, в смоле блокировали с использованием смеси уксусный ангидрид/пиридин/DCM (1:8:8) в течение 20 мин, чтобы избежать какого-либо удаления в последовательности. После блокирования смолу промывали DCM/DMF/DCM/DMF (6/6/6/6 раз каждым). Защитную Fmoc-группу на C-концевой аминокислоте, присоединенной к пептидильной смоле, удаляли путем ее обработки дважды с использованием 20% (об./об.) раствора пиперидин/DMF в течение 5 и 15 мин. Смолу промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым). Тест Кайзера на аликвоте смолы с пептидом после завершения снятия Fmoc-защиты был положительным.Alternatively, peptides were synthesized using a manual synthesis procedure: 0.3 g of dried Rink MBHA amide resin (0.66 mmol/g) was placed in a polyethylene vessel equipped with a polypropylene filter. The resin was allowed to swell in DCM (15 ml) for 1 hour and in DMF (15 ml) for 1 hour. /DMF for 5 and 15 min. The resin was washed with DMF/DCM/DMF (6:6:6 times each). The Kaiser test (quantitative method) was used to confirm the removal of Fmoc from the solid support. The C-terminal Fmoc protected amino acid (5 equivalent excess corresponding to resin load) in dry DMF was added to the deprotected resin and the addition of the next Fmoc protected amino acid was initiated with a 5 equivalent excess of DIC and HOBT in DMF. The concentration of each reactant in the reaction mixture was about 0.4 M. The mixture was stirred on a rotor at room temperature for 2 hours. The resin was filtered and washed with DMF/DCM/DMF (6:6:6 times each). The Kaiser test on an aliquot of resin with peptide after coupling was negative (no resin coloration). After attachment of the first amino acid, the unreacted amino group, if any, in the resin was blocked using acetic anhydride/pyridine/DCM (1:8:8) for 20 minutes to avoid any removal in the sequence. After blocking, the resin was washed with DCM/DMF/DCM/DMF (6/6/6/6 times each). The Fmoc protecting group on the C-terminal amino acid attached to the peptidyl resin was removed by treating it twice with a 20% (v/v) piperidine/DMF solution for 5 and 15 minutes. The resin was washed with DMF/DCM/DMF (6:6:6 times each). The Kaiser test on an aliquot of peptide resin after Fmoc deprotection was completed was positive.

Остальные аминокислоты в целевой последовательности на амидной смоле Ринка MBHA последовательно присоединяли с применением способа Fmoc AA/DIC/HOBt с использованием 5-эквивалентного избытка, соответствующего нагрузке смолы, в DMF. Концентрация каждого реагента в реакционной смеси составляла примерно 0,4 М. Смесь перемешивали на роторе при комнатной температуре в течение 2 ч. Смолу фильтровали и промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым). После каждой стадии присоединения и стадии снятия Fmoc-защиты проводили тест Кайзера для подтверждения завершенности реакции.The remaining amino acids in the target sequence on Rink's MBHA amide resin were sequentially coupled using the Fmoc AA/DIC/HOBt method using a 5 equivalent resin loading excess in DMF. The concentration of each reactant in the reaction mixture was about 0.4 M. The mixture was stirred on a rotor at room temperature for 2 hours. The resin was filtered and washed with DMF/DCM/DMF (6:6:6 times each). After each coupling step and Fmoc deprotection step, a Kaiser test was performed to confirm the reaction was complete.

После завершения образования линейной последовательности с ε-аминогруппы лизина, использованной в качестве точки ветвления или точки модификации, удаляли защиту с помощью 2,5% гидрата гидразина в DMF в течение 15 мин х 2 и промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым). γ-Карбоксильный конец глутаминовой кислоты присоединяли к ε-аминогруппе Lys с применением Fmoc-Glu(OH)-OtBu в способе DIC/HOBt (5-эквивалентный избыток относительно нагрузки смолы) в DMF. Смесь перемешивали на роторе при комнатной температуре в течение 2 ч. Смолу фильтровали и промывали DMF/DCM/DMF (6x30 мл каждого). Снятие защитной Fmoc-группы на глутаминовой кисло- 19 040723 те осуществляли путем ее двукратной обработки с использованием 20% (об./об.) раствора пиперидин/DMF в течение 5 и 15 мин. (25 мл каждого). Смолу промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым). Тест Кайзера на аликвоте смолы с пептидом после завершения снятия Fmoc-защиты был положительным.After completion of linear sequencing from the ε-amino group of lysine used as branch point or modification point, deprotect with 2.5% hydrazine hydrate in DMF for 15 min x 2 and wash with DMF/DCM/DMF (6:6: 6 times each). The γ-carboxylic end of glutamic acid was attached to the ε-amino group of Lys using Fmoc-Glu(OH)-OtBu in the DIC/HOBt method (5 equivalent excess relative to resin loading) in DMF. The mixture was stirred on a rotor at room temperature for 2 hours. The resin was filtered and washed with DMF/DCM/DMF (6x30 ml each). Deprotection of the Fmoc group on glutamic acid was carried out by treating it twice with a 20% (v/v) piperidine/DMF solution for 5 and 15 minutes. (25 ml each). The resin was washed with DMF/DCM/DMF (6:6:6 times each). The Kaiser test on an aliquot of peptide resin after Fmoc deprotection was completed was positive.

Если ответвление боковой цепи также содержит еще одну γ-глутаминовую кислоту, вторую FmocGlu(OH)-OtBu используют для присоединения к свободной аминогруппе γ-глутаминовой кислоты по способу DIC/HOBt (5-эквивалентный избыток относительно нагрузки смолы) в DMF. Смесь перемешивали на роторе при комнатной температуре в течение 2 ч. Смолу фильтровали и промывали DMF/DCM/DMF (6x30 мл каждого). Снятие защитной Fmoc-группы на γ-глутаминовой кислоте осуществляли путем ее двухкратной обработки с использованием 20% (об./об.) раствора пиперидин/DMF в течение 5 и 15 мин. (25 мл). Смолу промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым). Тест Кайзера на аликвоте смолы с пептидом после завершения снятия Fmoc-защиты был положительным.If the side chain branch also contains another γ-glutamic acid, a second FmocGlu(OH)-OtBu is used to attach to the free amino group of γ-glutamic acid by the DIC/HOBt method (5 equivalent excess relative to resin load) in DMF. The mixture was stirred on a rotor at room temperature for 2 hours. The resin was filtered and washed with DMF/DCM/DMF (6x30 ml each). Deprotection of the Fmoc group on γ-glutamic acid was performed by treating it twice with a 20% (v/v) piperidine/DMF solution for 5 and 15 minutes. (25 ml). The resin was washed with DMF/DCM/DMF (6:6:6 times each). The Kaiser test on an aliquot of peptide resin after Fmoc deprotection was completed was positive.

Присоединение пальмитиновой кислоты и стеариновой кислоты к боковым цепям глутаминовой кислоты.Attachment of palmitic acid and stearic acid to the side chains of glutamic acid.

К свободной аминогруппе γ-глутаминовой кислоты добавляли пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту (5 экв.), растворенную в DMF, и присоединение инициировали путем добавления DIC (5 экв.) и HOBt (5 экв.) в DMF. Смолу промывали DMF/DCM/DMF (6:6:6 раз каждым).Palmitic acid or stearic acid (5 eq.) dissolved in DMF was added to the free amino group of γ-glutamic acid, and the addition was initiated by adding DIC (5 eq.) and HOBt (5 eq.) in DMF. The resin was washed with DMF/DCM/DMF (6:6:6 times each).

Окончательное отщепление пептида от смолы.Final cleavage of the peptide from the resin.

Пептидильную смолу, синтезированную в ходе синтеза вручную, промывали DCM (6x10 мл), MeOH (6x10 мл) и простым эфиром (6x10 мл) и сушили в вакуумных сушильных шкафах в течение ночи. Отщепления пептида от твердой подложки достигали путем обработки смолы с пептидом смесью реагентов (80,0% TFA/5% тиоанизол/5% фенол/2,5% EDT, 2,5% DMS и 5% DCM) при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь для отщепления собирали путем фильтрации и смолу промывали TFA (2 мл) и DCM (2x5 мл). Избыток TFA и DCM концентрировали до небольшого объема в атмосфере азота и небольшое количество DCM (5-10 мл) добавляли к остатку и выпаривали в атмосфере азота. Процесс повторяли 3-4 раза, чтобы удалить большую часть летучих примесей. Остаток охлаждали до 0°C и добавляли безводный эфир для осаждения пептида. Осажденный пептид центрифугировали, надосадочную жидкость с эфиром удаляли и свежий эфир добавляли к пептиду и повторно центрифугировали. Неочищенный образец очищали с помощью препаративной HPLC и лиофилизировали. Идентичность пептида подтверждали с помощью LCMS.The peptidyl resin synthesized during manual synthesis was washed with DCM (6x10 ml), MeOH (6x10 ml) and ether (6x10 ml) and dried in vacuum ovens overnight. Cleavage of the peptide from the solid support was achieved by treating the peptide resin with a mixture of reagents (80.0% TFA/5% thioanisole/5% phenol/2.5% EDT, 2.5% DMS and 5% DCM) at room temperature for 3 h. The mixture for cleavage was collected by filtration and the resin was washed with TFA (2 ml) and DCM (2x5 ml). Excess TFA and DCM were concentrated to a small volume under nitrogen and a small amount of DCM (5-10 ml) was added to the residue and evaporated under nitrogen. The process was repeated 3-4 times to remove most of the volatile impurities. The residue was cooled to 0°C and anhydrous ether was added to precipitate the peptide. The precipitated peptide was centrifuged, the ether supernatant was removed and fresh ester was added to the peptide and centrifuged again. The crude sample was purified by preparative HPLC and lyophilized. Peptide identity was confirmed by LCMS.

Кроме того, используют другой путь введения боковой цепи лизина с применением предварительно функционализированной структурной единицы, в которой боковая цепь уже прикреплена к лизину (например, (2S)-6-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-(гексадеканоиламино)-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-2-(9H-флуорен-9-илметоксикарбониламино)гексановой кислоты) в качестве партнера сочетания в синтезе пептида. 0,67 ммоль смолы с пептидом, несущей аминогруппу, промывают с помощью 20 мл диметилформамида. 2,93 г (2S)-6-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[[(4S)-5-третбутокси-4-(гексадеканоиламино)-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-2-(9H-флуорен-9илметоксикарбониламино)гексановой кислоты растворяют в 20 мл диметилформамида вместе с 310 мг гидрата гидроксибензотриазола и 0,32 мл диизопропилкарбодиимида. После перемешивания в течение 5 мин раствор добавляют к смоле. Смолу перемешивают в течение 20 ч и затем промывают 3 раза, при этом каждый раз с помощью 20 мл диметилформамида. Отбирают небольшой образец смолы и подвергают тесту Кайзера и тесту с хлоранилом (E. Kaiser, R.L. Colescott, C.D. Bossinger, P.I. Cook, Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598; Chloranil-Test: T. Vojkovsky, Peptide Research 1995, 8, 236-237). Данная процедура позволяет избежать необходимости стадии селективного снятия защиты, а также селективного присоединения структурных единиц боковой цепи на промежуточное соединение одной из поздних стадий синтеза.In addition, another route for introducing the lysine side chain is used, using a pre-functionalized structural unit in which the side chain is already attached to lysine (for example, (2S)-6-[[(4S)-5-tert-butoxy-4-[[ (4S)-5-tert-Butoxy-4-(hexadecanoylamino)-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid) as a coupling partner in the synthesis peptide. 0.67 mmol of resin with an amino group-bearing peptide is washed with 20 ml of dimethylformamide. 2.93 g (2S)-6-[[(4S)-5-tert-butoxy-4-[[(4S)-5-tert-butoxy-4-(hexadecanoylamino)-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl ]amino]-2-(9H-fluoren-9ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid is dissolved in 20 ml of dimethylformamide together with 310 mg of hydroxybenzotriazole hydrate and 0.32 ml of diisopropylcarbodiimide. After stirring for 5 minutes, the solution is added to the resin. The resin is stirred for 20 hours and then washed 3 times, each time with 20 ml of dimethylformamide. A small resin sample is taken and subjected to the Kaiser test and the chloranil test (E. Kaiser, R. L. Colescott, C. D. Bossinger, P. I. Cook, Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598; Chloranil-Test: T. Vojkovsky, Peptide Research 1995, 8, 236-237). This procedure avoids the need for a selective deprotection step, as well as the selective addition of side chain structural units to an intermediate in one of the later stages of the synthesis.

Аналитическая HPLC/UPLC.Analytical HPLC/UPLC.

Способ A:Method A:

обнаружение при 210-225 нм;detection at 210-225 nm;

колонка: Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1,7 мкм (150x2,1 мм) при 50°C;column: Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1.7 µm (150x2.1 mm) at 50°C;

растворитель: H₂O+0,05% TFA: ACN+0,035% TFA (расход 0,5 мл/мин);solvent: H ₂ O+0.05% TFA: ACN+0.035% TFA (0.5 ml/min flow rate);

градиент: от 80:20 (0 мин) до 80:20 (3 мин), до 25:75 (23 мин), до 2:98 (23,5 мин), до 2:98 (30,5 мин), до 80:2ο (31 мин), до 80:20 (37 мин);gradient: 80:20 (0 min) to 80:20 (3 min), to 25:75 (23 min), to 2:98 (23.5 min), to 2:98 (30.5 min), to 80:2ο (31 min), to 80:20 (37 min);

необязательно с масс-анализатором: LCT Premier, режим электрораспыления положительно заряженных ионов.optional with mass analyzer: LCT Premier, positive ion electrospray mode.

Способ B:Method B:

обнаружение при 214 нм;detection at 214 nm;

градиент: от 80:20 (0 мин) до 80:20 (3 мин), до 25:75 (23 мин), до 2:98 (23,5 мин), до 2:98 (30,5 мин), до 80:20 (31 мин), до 80:20 (37 мин);gradient: 80:20 (0 min) to 80:20 (3 min), to 25:75 (23 min), to 2:98 (23.5 min), to 2:98 (30.5 min), to 80:20 (31 min), to 80:20 (37 min);

- 20 040723 необязательно с масс-анализатором: Agilent 6230 Accurate-Mass TOF, источник ESI Dual Agilent Jet- 20 040723 optional with mass analyzer: Agilent 6230 Accurate-Mass TOF, ESI Dual Agilent Jet source

Stream.Stream.

Способ C:Method C:

обнаружение при 214 нм;detection at 214 nm;

колонка: Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1,7 мкм (150x2,1 мм) при 50°C; растворитель: H₂O+0,1% TFA: ACN+0,1% FA (расход 0,5 мл/мин);column: Waters ACQUITY UPLC® CSH™ C18 1.7 µm (150x2.1 mm) at 50°C; solvent: H ₂ O+0.1% TFA: ACN+0.1% FA (flow rate 0.5 ml/min);

градиент: от 80:20 (0 мин) до 80:20 (3 мин), до 25:75 (23 мин), до 2:98 (23,5 мин), до 2:98 (30,5 мин), до 80:20 (31 мин), до 80:20 (38 мин);gradient: 80:20 (0 min) to 80:20 (3 min), to 25:75 (23 min), to 2:98 (23.5 min), to 2:98 (30.5 min), up to 80:20 (31 min), up to 80:20 (38 min);

необязательно с масс-анализатором: Agilent 6230 Accurate-Mass TOF, источник ESI Agilent Jet Stream.optional with mass analyzer: Agilent 6230 Accurate-Mass TOF, Agilent Jet Stream ESI source.

Способ D:Method D:

обнаружение при 220 нм;detection at 220 nm;

колонка: Waters ACQUITY ВЕН C18 (2,1x100 мм, 1,7 мкм), темп.: 40°C;column: Waters ACQUITY VEN C18 (2.1x100 mm, 1.7 µm), temp.: 40°C;

Aries XB C18 для пептидов (4,6x250 мм, 3,6 мкм), темп.: 40°C;Aries XB C18 for peptides (4.6x250 mm, 3.6 µm), temp.: 40°C;

растворитель: H₂O+0,1% муравьиная кислота (буфер A): ACN+0,1% муравьиная кислота (расход 1 мл/мин) (буфер B);solvent: H ₂ O+0.1% formic acid (buffer A): ACN+0.1% formic acid (flow rate 1 ml/min) (buffer B);

градиент: уравновешивание колонки с помощью 2% буфера B, а элюирование с помощью градиента от 2% до 70% буфера B в течение 15 мин.gradient: equilibrate the column with 2% buffer B and elute with a gradient from 2% to 70% buffer B over 15 min.

Способ E: обнаружение при 215 нм;Method E: detection at 215 nm;

градиент: от 80:20 (0 мин) до 80:20 (3 мин), до 25:75 (23 мин), до 5:95 (23,5 мин), до 5:95 (25,5 мин), до 80:20 (26 мин), до 80:20 (30 мин).gradient: 80:20 (0 min) to 80:20 (3 min), to 25:75 (23 min), to 5:95 (23.5 min), to 5:95 (25.5 min), until 80:20 (26 min), until 80:20 (30 min).

Общая процедура очистки с помощью препаративной HPLC.General purification procedure by preparative HPLC.

Неочищенные пептиды очищали либо на системе Akta Purifier, на системе полупрепаративной HPLC Jasco или на системе HPLC Agilent 1100. Препаративные колонки RP-C18-HPLC различных размеров и с различными скоростями потока использовали в зависимости от количества неочищенного пептида, подлежащего очистке. В качестве элюентов использовали ацетонитрил + 0,1% TFA (B) и воду + 0,1% TFA (A). Фракции, содержащие продукт, собирали и лиофилизировали с получением очищенного продукта, как правило, в виде соли TFA.Crude peptides were purified on either an Akta Purifier system, a Jasco semi-prep HPLC system, or an Agilent 1100 HPLC system. Preparative RP-C18-HPLC columns of various sizes and flow rates were used depending on the amount of crude peptide to be purified. Acetonitrile + 0.1% TFA (B) and water + 0.1% TFA (A) were used as eluents. Fractions containing the product were collected and lyophilized to obtain a purified product, usually in the form of a TFA salt.

Оценка растворимости производных эксендина-4.Evaluation of the solubility of exendin-4 derivatives.

Перед измерением растворимости партии пептида ее чистоту определяли посредством UPLC/MS.Prior to measuring the solubility of a batch of peptide, its purity was determined by UPLC/MS.

Для тестирования растворимости целевая концентрация чистого соединения составляла 10 мг/мл. Таким образом, растворы из твердых образцов получали в буферной системе с концентрацией соединения, составляющей 10 мг/мл, на основании предварительно определенного % чистоты.For solubility testing, the target concentration of the pure compound was 10 mg/mL. Thus, solid sample solutions were prepared in a buffer system at a compound concentration of 10 mg/mL based on a predetermined % purity.

Буферная система (A) для оценки растворимости: ацетатный буфер, pH 4,5, 100 мМ тригидрата ацетата натрия, 2,7 мг/мл м-крезола.Buffer system (A) for solubility evaluation: acetate buffer, pH 4.5, 100 mM sodium acetate trihydrate, 2.7 mg/ml m-cresol.

Буферная система (B) для оценки растворимости: фосфатный буфер, pH 7,4, 100 мМ гидрофосфата натрия, 2,7 мг/мл м-крезола.Buffer system (B) for solubility evaluation: phosphate buffer, pH 7.4, 100 mM sodium hydrogen phosphate, 2.7 mg/ml m-cresol.

Буферная система (C) для оценки растворимости: цитратный буфер, pH 6,0, 100 мМ лимонная кислота, 2,7 мг/мл м-крезола.Buffer system (C) for solubility evaluation: citrate buffer, pH 6.0, 100 mM citric acid, 2.7 mg/ml m-cresol.

UPLC-UV проводили после 1 ч легкого перемешивания с надосадочной жидкостью, которую получали центрифугированием при 2500 RCF (относительное центробежное ускорение) в течение 15 мин.UPLC-UV was performed after 1 hour of gentle mixing with the supernatant, which was obtained by centrifugation at 2500 RCF (relative centrifugal acceleration) for 15 minutes.

Растворимость определяли путем сравнения площади UV-пика забуференного образца, разведенного 1:10, который вводили в объеме 2 мкл, со стандартной кривой эталонного пептида с известной концентрацией. Различные коэффициенты экстинкции УФ-излучения для образца и эталонного пептида рассчитывали на основании различных аминокислотных последовательностей и учитывали их при расчете концентрации.Solubility was determined by comparing the UV peak area of the buffered sample, diluted 1:10, which was injected in a volume of 2 μl, with a standard curve of a reference peptide of known concentration. Different UV extinction coefficients for sample and reference peptide were calculated based on different amino acid sequences and taken into account when calculating the concentration.

Оценка химической стабильности производных эксендина-4.Evaluation of the chemical stability of exendin-4 derivatives.

Перед измерением химической стабильности партии пептида ее чистоту определяли посредством UPLC/MS. Для тестирования стабильности целевая концентрация чистого соединения составляла 1 мг/мл. Таким образом, растворы из твердых образцов получали в буферной системе с концентрацией соединения, составляющей 1 мг/мл, на основании предварительно определенного % чистоты.Before measuring the chemical stability of a batch of peptide, its purity was determined by UPLC/MS. For stability testing, the target concentration of the pure compound was 1 mg/mL. Thus, solid sample solutions were prepared in a buffer system at a compound concentration of 1 mg/mL based on a predetermined % purity.

Буферная система (A) для оценки химической стабильности: 25 мМ ацетатный буфер, pH 4,5, 3 мг/мл L-метионина, 2,7 мг/мл м-крезола, 18 мг/мл 85% глицерина.Buffer system (A) for evaluating chemical stability: 25 mM acetate buffer, pH 4.5, 3 mg/ml L-methionine, 2.7 mg/ml m-cresol, 18 mg/ml 85% glycerol.

Буферная система B) для оценки химической стабильности: 25 мМ фосфатный буфер, pH 6,0, 3 мг/мл L-метионина, 2,7 мг/мл м-крезола, 18 мг/мл 85% глицерина.Buffer system B) for evaluation of chemical stability: 25 mM phosphate buffer, pH 6.0, 3 mg/ml L-methionine, 2.7 mg/ml m-cresol, 18 mg/ml 85% glycerol.

Растворы с пептидами фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкМ и разделяли на аликвоты в асептических условиях. В начальный момент времени UPLC-UV проводили с введением 2 мкл неразбавленного образца.Solutions with peptides were filtered through a filter with a pore size of 0.22 μm and divided into aliquots under aseptic conditions. At the initial time point, UPLC-UV was performed with the introduction of 2 μl of undiluted sample.

Для тестирования химической стабильности аликвоты хранили в течение 28 дней при 5 и 40°C. По- 21 040723 сле данного промежутка времени образцы центрифугировали в течение 15 мин при 2500 RCF. Затем мкл неразбавленной надосадочной жидкости анализировали посредством UPLC-UV.For chemical stability testing, aliquots were stored for 28 days at 5 and 40°C. After this time period, the samples were centrifuged for 15 minutes at 2500 RCF. The undiluted supernatant was then analyzed by UPLC-UV.

Химическую стабильность оценивали по относительной потере чистоты, рассчитанной с помощью уравнения:Chemical stability was evaluated from the relative loss of purity calculated using the equation:

[(чистота в исходный момент времени) - (чистота после 28 дней при X°C)]/(чистота в исходный момент времени)] х 100%,[(purity at baseline) - (purity after 28 days at X°C)]/(purity at baseline)] x 100%,

X=5 или 40°C.X=5 or 40°C.

Чистоту рассчитывали как [(площадь пика пептида)/(общая площадь пика)] х 100%.Purity was calculated as [(peptide peak area)/(total peak area)] x 100%.

Динамическое рассеяние света (DLS) для оценки физической стабильности.Dynamic Light Scattering (DLS) to assess physical stability.

Монохроматический и когерентный световой пучок (лазер) применяют для облучения жидкого образца. С помощью динамического рассеяния света (DLS) измеряют свет, рассеянный частицами (1 нм <радиус <1 мкм), которые совершают броуновское движение. Данное движение вызвано столкновениями между частицами и молекулами растворителя, которые сами двигаются за счет своей тепловой энергии. Диффузионное движение частиц приводит к флуктуациям рассеянного света во времени [Pecora, R. Dynamic Light Scattering: Applications of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press, 1985].A monochromatic and coherent light beam (laser) is used to irradiate a liquid sample. Dynamic Light Scattering (DLS) measures the light scattered by particles (1 nm<radius<1 μm) that are in Brownian motion. This movement is caused by collisions between particles and molecules of the solvent, which themselves move due to their thermal energy. Diffusion motion of particles leads to scattered light fluctuations in time [Pecora, R. Dynamic Light Scattering: Applications of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press, 1985].

Флуктуации интенсивности рассеянного света регистрируют и преобразуют в автокорреляционную функцию. Путем подгонки автокорреляционной кривой к экспоненциальной функции можно получить коэффициент диффузии D частиц в растворе. Коэффициент диффузии затем используют для расчета гидродинамического радиуса R_h (или эффективного радиуса Стокса) с помощью уравнения СтоксаЭйнштейна, принимая, что частицы имеют сферическую форму. Данный расчет определен в ISO 13321 и ISO 22412 [международный стандарт ISO13321 Methods for Determination of Particle Size Distribution Part 8: Photon Correlation Spectroscopy, International Organisation for Standardisation (ISO) 1996; международный стандарт ISO22412 Particle Size Analysis -Dynamic Light Scattering, International Organisation for Standardisation (ISO) 2008].Fluctuations in scattered light intensity are recorded and converted into an autocorrelation function. By fitting the autocorrelation curve to an exponential function, the diffusion coefficient D of particles in solution can be obtained. The diffusion coefficient is then used to calculate the hydrodynamic radius R _h (or effective Stokes radius) using the Stokes-Einstein equation, assuming that the particles are spherical. This calculation is defined in ISO 13321 and ISO 22412 [international standard ISO13321 Methods for Determination of Particle Size Distribution Part 8: Photon Correlation Spectroscopy, International Organization for Standardization (ISO) 1996; international standard ISO22412 Particle Size Analysis -Dynamic Light Scattering, International Organization for Standardization (ISO) 2008].

В случае полидисперсных образцов автокорреляционная функция представляет собой сумму экспоненциальных распадов, соответствующих каждой молекуле. Временные флуктуации рассеянного света можно затем использовать для определения профиля распределения фракции или семейства частиц по размерам. Результат первого порядка представляет собой распределение интенсивности рассеянного света в зависимости от размера частиц. Естественное взвешивание распределения интенсивности осуществляют в соответствии с интенсивностью рассеяния каждой фракцией или семейством частиц. Для биологических материалов или полимеров интенсивность рассеяния частицей пропорциональна квадрату молекулярной массы. Таким образом, небольшое количество агрегатов/агломератов или присутствие или более крупные виды частиц могут играть решающую роль в распределении интенсивности. Тем не менее данное распределение можно использовать в качестве чувствительного индикатора присутствия крупного материала в образце. Распределение интенсивности можно преобразовать в объемное или массовое распределение частиц по размерам с применением теории Ми при определенных допущениях. В отличие от распределения интенсивности, массовое распределение наиболее оптимально использовать для сравнительных целей, и его не следует считать как абсолютное (вследствие лежащих в его основе допущений).In the case of polydisperse samples, the autocorrelation function is the sum of the exponential decays corresponding to each molecule. The temporal fluctuations of the scattered light can then be used to determine the size distribution profile of a fraction or family of particles. The first order result is the scattered light intensity distribution as a function of particle size. Natural weighting of the intensity distribution is carried out in accordance with the scattering intensity of each fraction or family of particles. For biological materials or polymers, the intensity of particle scattering is proportional to the square of the molecular weight. Thus, a small number of aggregates/agglomerates or the presence or larger species of particles can play a decisive role in the intensity distribution. However, this distribution can be used as a sensitive indicator of the presence of large material in the sample. The intensity distribution can be converted to a volumetric or mass particle size distribution using Mie theory under certain assumptions. Unlike the intensity distribution, the mass distribution is best used for comparative purposes and should not be taken as absolute (due to the underlying assumptions).

С помощью методики DLS получают распределения с присущим расширением пика. Коэффициент полидисперсности %Pd является показателем ширины распределения частиц по размерам, и его рассчитывают с помощью стандартных способов, описанных в ISO13321 и ISO22412 [международный стандарт ISO13321 Methods for Determination of Particle Size Distribution Part 8: Photon Correlation Spectroscopy, International Organisation for Standardisation (ISO) 1996; международный стандарт ISO22412 Particle Size Analysis - Dynamic Light Scattering, International Organisation for Standardisation (ISO) 2008].Using the DLS technique, distributions with inherent peak extension are obtained. The polydispersity coefficient %Pd is a measure of the width of the particle size distribution and is calculated using the standard methods described in ISO13321 and ISO22412 1996; international standard ISO22412 Particle Size Analysis - Dynamic Light Scattering, International Organization for Standardization (ISO) 2008].

DLS параметр взаимодействия (k_D).DLS interaction parameter (k _D ).

DLS параметр взаимодействия (k_D) является показателем, описывающим взаимодействия между частицами, где частицы представляют собой свернутые белки или пептиды [Sandeep Yadav et al. (2009), J. Pharm. Sci., Vol. 99(3), p. 1152-1168; Brian D. Connolly et al. (2012), Biophysical Journal, Volume 103, p. 69-78].The DLS interaction parameter (k _D ) is a measure describing interactions between particles, where the particles are folded proteins or peptides [Sandeep Yadav et al. (2009), J. Pharm. Sc., Vol. 99(3), p. 1152-1168; Brian D. Connolly et al. (2012), Biophysical Journal, Volume 103, p. 69-78].

Параметр k_D получают из концентрационной зависимости коэффициента диффузии D, которая определяется разложением по степеням концентрации с:The parameter k _D is obtained from the concentration dependence of the diffusion coefficient D, which is determined by expansion in powers of concentration c:

D(c) = D_o (l + k_Dc+k_iDc²+k_jDc³ + ...)D(c) = D _o (l + k _D c+k _iD c ² +k _jD c ³ + ...)

Пренебрегая членами высшего порядка, т.е. k_iD=kj_D = ... = 0, данные можно аппроксимировать линейной функцией, и исходя из наклона кривой D=D₀ (1+k_D c) и D₀ получают k_D. D₀ представляет собой коэффициент диффузии при нулевой концентрации. Параметр k_D можно применять для описания взаимодействия молекул белков, или пептидов, или олигомеров между собой и с окружающей их средой в растворе, и он теоретически связан с вириальным коэффициентом B₂₂, как, например, описано Harding и Johnson, где M представляет собой молярную массу, k_s представляет собой зависящий от концентрации коэффициент скорости осаждения первого порядка и u представляет собой парциальный удельный объем [Harding S.E., Johnson P. (1985), Biochem J., 231, p. 543-547].Neglecting higher-order terms, i.e. k _iD =kj _D = ... = 0, the data can be approximated by a linear function, and based on the slope of the curve D=D ₀ (1+k _D c) and D ₀ get k _D . D ₀ is the diffusion coefficient at zero concentration. The parameter k _D can be used to describe the interaction of protein molecules or peptides or oligomers with each other and with their environment in solution, and is theoretically related to the virial coefficient B ₂₂ , as described by Harding and Johnson, where M is the molar mass, k _s is a concentration dependent first order sedimentation rate coefficient and u is a partial specific volume [Harding SE, Johnson P. (1985), Biochem J., 231, p. 543-547].

- 22 040723 k_D=2B₂₂M - k_s - и.- 22 040723 k _D =2B ₂₂ M - k _s - and.

Положительные значения B₂₂ указывают на образцы, для которых предпочтительна сольватация, а не самоассоциация, тогда как отрицательные значения B22 указывают на образцы, для которых предпочтительна самоассоциация. С прагматической точки зрения k_D аналогичен по своему значению В₂₂ и предоставляет информацию о результирующей силе взаимодействия между молекулами. Высокие значения указывают на сильные результирующие отталкивающие взаимодействия, тогда как низкие значения указывают на результирующие силы притяжения. Таким образом, k_D можно применять для относительного качественного сравнения (см. фиг. 1).Positive B ₂₂ values indicate samples that prefer solvation over self-association, while negative B22 values indicate samples that prefer self-association. From a pragmatic point of view, k _D is similar in meaning to B ₂₂ and provides information about the resulting strength of the interaction between molecules. High values indicate strong net repulsive interactions, while low values indicate net attractive forces. Thus, k _D can be used for relative qualitative comparison (see Fig. 1).

Для каждого раствора с пептидом гидродинамический радиус R_h и константу диффузии D (связанные с помощью уравнения Стокса-Эйнштейна) определяли как средние значения из трех повторностей. Оба параметра определяли при различных концентрациях пептида (например, R_h1 и Dp 1 мг/мл и R_h5 и D5: 5 мг/мл) в одной и той же буферной системе. Разница таких параметров между низкой и высокой концентрациями пептида является заменой для DLS параметра взаимодействия k_D. R_h5<R_h1 или D5>D1 соответствуют k_D>0 и, следовательно, отталкивающим взаимодействиям между частицами, которые приводят к улучшенной физической (или коллоидной) стабильности.For each solution with the peptide, the hydrodynamic radius R _h and the diffusion constant D (related using the Stokes-Einstein equation) were determined as the average values of triplicate. Both parameters were determined at different concentrations of the peptide (eg, R _h1 and Dp 1 mg/ml and R _h5 and D5: 5 mg/ml) in the same buffer system. The difference of such parameters between low and high concentrations of the peptide is a substitute for the DLS interaction parameter k _D . R _h5 <R _h1 or D5>D1 correspond to k _D >0 and hence repulsive interactions between particles which lead to improved physical (or colloidal) stability.

Буферная система (A) для оценки DLS: 25 мМ ацетатный буфер, pH 4,5, 3 мг/мл L-метионина, 2,7 мг/мл м-крезола, 18 мг/мл 85% глицерина.Buffer system (A) for DLS evaluation: 25 mM acetate buffer, pH 4.5, 3 mg/ml L-methionine, 2.7 mg/ml m-cresol, 18 mg/ml 85% glycerol.

Буферная система (B) для оценки DLS: 25 мМ фосфатный буфер, pH 6,0, 3 мг/мл L-метионина, 2,7 мг/мл м-крезола, 18 мг/мл 85% глицерина.Buffer system (B) for DLS evaluation: 25 mM phosphate buffer, pH 6.0, 3 mg/ml L-methionine, 2.7 mg/ml m-cresol, 18 mg/ml 85% glycerol.

Способ A для оценки DLS.Method A to evaluate DLS.

Измерения DLS проводили на приборе W130i (Avid Nano Ltd, Хай-Вайкомб, Великобритания) и с применением малообъемной одноразовой кюветы (UVette, Eppendorf AG, Гамбург, Германия). Данные обрабатывали с помощью i-Size 3.0, поставляемого Avid Nano. Параметры распределения частиц по размерам определяли с помощью способов наименьших квадратов с ограничениями отрицательных значений (NNLS) с применением алгоритмов DynaLS. Измерения проводили при 25°C с лазерным источником света с длиной волны 660 нм и под углом 90°.DLS measurements were performed on a W130i instrument (Avid Nano Ltd, High Wycombe, UK) and using a low volume disposable cuvette (UVette, Eppendorf AG, Hamburg, Germany). Data was processed with i-Size 3.0 supplied by Avid Nano. Particle size distribution parameters were determined using negative-limited least-squares (NNLS) methods using DynaLS algorithms. The measurements were carried out at 25°C with a laser light source with a wavelength of 660 nm and at an angle of 90°.

Способ B для оценки DLS.Method B to evaluate DLS.

Измерения DLS проводили на Nanosizer ZS (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) и с применением одноразовых UV-кювет (Brand, макро, 2,5 мл и Brand, полумикро, 1,5 мл, Brand GmbH+Co KG, Вертгейм, Германия). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Malvern Zetasizer версии 7.10 или 7.01. Параметры распределения частиц по размерам определяли с помощью способов наименьших квадратов с ограничениями отрицательных значений (NNLS). Измерения проводили при 25°C с лазерным источником света с длиной волны 633 нм в режиме NIBS (неинвазивного обратного рассеяния) под углом 173°.DLS measurements were performed on a Nanosizer ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) and using disposable UV cells (Brand, macro, 2.5 ml and Brand, semi-micro, 1.5 ml, Brand GmbH+Co KG, Wertheim, Germany) . Data were processed using Malvern Zetasizer software version 7.10 or 7.01. Particle size distribution parameters were determined using negative-limited least-squares (NNLS) methods. Measurements were taken at 25° C. with a 633 nm laser light source in NIBS (Non-Invasive Back Scattering) mode at an angle of 173°.

Способ C для оценки DLS.Method C to evaluate DLS.

Измерения DLS проводили на планшет-ридере DynaPro II (Wyatt Technology, Санта-Барбара, Калифорния, США) и с применением одного из следующих черных малообъемных и необработанных планшетов: полистирольного 384-луночного аналитического планшета с прозрачным дном (Corning, НьюЙорк, США), полистирольного 96-луночного аналитического планшета с прозрачным дном (Corning, Нью-Йорк, США), 384-луночного аналитического планшета из циклоолефинового полимера (COP) с прозрачным дном (Aurora, Монтана, США) или полистирольного 384-луночного аналитического планшета с прозрачным дном (Greiner Bio-One, Германия). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Dynamics, поставляемого Wyatt Technology. Параметры распределения частиц по размерам определяли с помощью способов наименьших квадратов с ограничениями отрицательных значений (NNLS) с применением алгоритмов DynaLS. Измерения проводили при 25°C с лазерным источником света с длиной волны 830 нм под углом 158°.DLS measurements were performed on a DynaPro II plate reader (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) and using one of the following black low-volume and untreated plates: clear bottom polystyrene 384-well assay plate (Corning, NY, USA), clear-bottom polystyrene 96-well assay plate (Corning, New York, USA), cycloolefin polymer (COP) 384-well clear-bottom assay plate (Aurora, Montana, USA), or clear-bottom polystyrene 384-well assay plate (Greiner Bio-One, Germany). Data was processed using Dynamics software supplied by Wyatt Technology. Particle size distribution parameters were determined using negative-limited least-squares (NNLS) methods using DynaLS algorithms. The measurements were carried out at 25°C with a laser light source with a wavelength of 830 nm at an angle of 158°.

Анализ с применением ThT для оценки физической стабильности.Analysis using ThT to assess physical stability.

Низкая физическая стабильность раствора с пептидом может приводить к образованию амилоидных фибрилл, которые наблюдаются в образце в виде высокоупорядоченных нитевидных макромолекулярных структур, что в конечном итоге может приводить к образованию геля. Тиофлавин T (ThT) широко применяют для визуализации и количественной оценки присутствия агрегатов неправильно свернутых белков. [Biancalana et al. (2010), Biochimica et Biophysica Acta. 1804(7):1405-1412.]. При его связывании с фибриллами, такими как фибриллы в амилоидных агрегатах, краситель проявляет характерный признак флуоресценции [Naiki et al. (1989), Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999), Methods. Enzymol. 309, 274-284]. Промежуток времени образования фибрилл часто соответствует характерной форме сигмоидальной кривой и может быть разделен на три области: лаг-фазу, фазу быстрого роста и фазу плато.The low physical stability of the solution with the peptide can lead to the formation of amyloid fibrils, which are observed in the sample in the form of highly ordered filamentous macromolecular structures, which can eventually lead to the formation of a gel. Thioflavin T (ThT) is widely used to visualize and quantify the presence of misfolded protein aggregates. [Biancalana et al. (2010), Biochimica et Biophysica Acta. 1804(7):1405-1412]. When bound to fibrils, such as fibrils in amyloid aggregates, the dye exhibits a characteristic fluorescence signature [Naiki et al. (1989), Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999), Methods. Enzymol. 309, 274-284]. The time span of fibril formation often follows the characteristic shape of a sigmoid curve and can be divided into three regions: a lag phase, a fast growth phase, and a plateau phase.

Типичный процесс образований фибрилл начинается с лаг-фазы, при которой количество частично свернутого пептида, превращенного в фибриллы, является недостаточно значительным для его выявления. Лаг-период соответствует периоду времени, в ходе которого наращивается критическая масса ядра. За этим следует фаза резкого удлинения, и при этом быстро повышается концентрация фибрилл.A typical fibril formation process begins with a lag phase in which the amount of partially folded peptide converted into fibrils is not significant enough to detect it. The lag period corresponds to the period of time during which the critical mass of the nucleus builds up. This is followed by a phase of sharp elongation, and the concentration of fibrils rapidly increases.

Исследования проводили для определения тенденций фибриллообразования в стрессовых условиях, обеспечиваемых встряхиванием при 37°C в Fluoroskan Ascent FL.Studies were performed to determine fibrillation trends under stress conditions provided by shaking at 37° C. in Fluoroskan Ascent FL.

- 23 040723- 23 040723

Для тестов в Fluoroskan Ascent FL 200 мкл образца помещали в 96-луночный титрационный микропланшет из PS с плоским дном, Greiner Fluotrac № 655076. Планшеты запечатывали клейкой лентой (Quiagen). Образцы подвергали стрессу с помощью непрерывных циклов встряхивания при 960 об./мин в течение 10 с и периода отдыха при 37°C в течение 50 с. Кинетику отслеживали путем измерения интенсивности флуоресценции каждые 20 мин.For tests in Fluoroskan Ascent FL, 200 µl of sample was placed in a 96-well PS flat bottom microtiter plate, Greiner Fluotrac #655076. The plates were sealed with adhesive tape (Quiagen). The samples were stressed with continuous cycles of shaking at 960 rpm for 10 s and a rest period at 37°C for 50 s. The kinetics was monitored by measuring the fluorescence intensity every 20 min.

Пептиды разбавляли в буферной системе до конечной концентрации 3 мг/мл. К 2 мл раствора с пептидом добавляли 20 мкл 10,1 мМ раствора ThT в H₂O с получением конечной концентрации 100 мкМ ThT. Каждый образец тестировали в восьми повторностях.The peptides were diluted in a buffer system to a final concentration of 3 mg/ml. To 2 ml of the peptide solution was added 20 μl of 10.1 mM ThT solution in H ₂ O to obtain a final concentration of 100 μM ThT. Each sample was tested in eight replicates.

Буферная система A) для анализа с применением Tht: 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,5, содержащий м-крезол (100 мМ тригидрата ацетата натрия, регулирование значения pH с применением 2н. CH3COOH, 2,7 мг/мл м-крезола)Buffer system A) for analysis using Tht: 100 mM acetate buffer, pH 4.5, containing m-cresol (100 mM sodium acetate trihydrate, pH adjustment using 2N CH3COOH, 2.7 mg/ml m-cresol)

Буферная система (B) для анализа с применением Tht: 100 мМ цитратный буфер, pH 6,0.Buffer system (B) for analysis using Tht: 100 mm citrate buffer, pH 6.0.

Клеточные анализы in vitro для оценки эффективности в отношении рецепторов GLP-1, глюкагона и GIP.Cellular in vitro assays to assess efficacy against GLP-1 receptors, glucagon and GIP.

Агонизм соединений в отношении рецепторов определяли с помощью функциональных анализов измерения ответа cAMP клеточных линий HEK-293, стабильно экспрессирующих рецепторы GLP-1, GIP или глюкагона человека.Receptor agonism of the compounds was determined using functional cAMP response assays of HEK-293 cell lines stably expressing GLP-1, GIP, or human glucagon receptors.

Содержание cAMP в клетках определяли с использованием набора от Cisbio Corp. (№ по кат. 62AM4PEJ) на основе HTRF (гомогенная флуоресценция с разделением во времени). В целях подготовки клетки распределяли по культуральным флаконам T175 и выращивали в течение ночи практически до конфлюентности в среде (DMEM/10% FBS). Среду затем удаляли и клетки промывали PBS, не содержащим кальция и магния, с последующей обработкой протеиназой совместно с аккутазой (Sigma-Aldrich, № по кат. A6964). Отделенные клетки промывали и ресуспендировали в буфере для анализа (1х HBSS; 20 мМ HEPES, 0,1% BSA, 2 мМ IBMX) и определяли плотность клеток. Затем их разводили до 400000 клеток/мл и вносили аликвоты по 25 мкл в лунки 96-луночных планшетов. Для проведения измерения в лунки добавляли 25 мкл тестируемого соединения в буфере для анализа с последующей инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления реагентов HTRF, разведенных в лизирующем буфере (компоненты набора), планшеты инкубировали в течение 1 ч с последующим измерением соотношения интенсивности флуоресценции при 665/616 нм. Эффективность агонистов in vitro количественно оценивали путем определения концентраций, которые вызывали 50% активацию максимального ответа (EC₅₀).The content of cAMP in cells was determined using a kit from Cisbio Corp. (Cat. No. 62AM4PEJ) based on HTRF (Time Separation Homogeneous Fluorescence). For preparation, cells were dispensed into T175 culture flasks and grown overnight to near confluence in medium (DMEM/10% FBS). The medium was then removed and the cells were washed with calcium- and magnesium-free PBS, followed by proteinase plus accutase (Sigma-Aldrich, Cat # A6964). The detached cells were washed and resuspended in assay buffer (1x HBSS; 20 mM HEPES, 0.1% BSA, 2 mM IBMX) and cell density determined. They were then diluted to 400,000 cells/ml and 25 μl aliquots were added to the wells of 96-well plates. For measurement, 25 μl of test compound in assay buffer was added to the wells, followed by incubation for 30 minutes at room temperature. After adding the HTRF reagents diluted in lysis buffer (kit components), the plates were incubated for 1 hour, followed by measurement of the fluorescence intensity ratio at 665/616 nm. The in vitro efficacy of agonists was quantified by determining the concentrations that caused 50% activation of the maximum response (EC ₅₀ ).

Способ биоаналитического скрининга для количественного определения производных эксендина-4 у мышей и свиней.Bioanalytical screening method for quantitative determination of exendin-4 derivatives in mice and pigs.

Мышам вводили дозу 1 мг/кг подкожно (s.c.). Мышей умерщвляли и образцы крови собирали через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 24 ч после применения. Образцы плазмы анализировали после осаждения белка посредством жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS). Параметры PK и период полужизни рассчитывали с использованием WinonLin версии 5.2.1 (некомпартментная модель).Mice were dosed at 1 mg/kg subcutaneously (s.c.). Mice were sacrificed and blood samples were collected at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 and 24 hours after application. Plasma samples were analyzed after protein precipitation by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS). PK parameters and half-life were calculated using WinonLin version 5.2.1 (non-compartmental model).

Самкам карликовых свиней Gottinger вводили дозу 0,05, 0,075 или 0,1 мг/кг подкожно (s.c.). Образцы крови собирали через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 56 и 72 ч после применения. Образцы плазмы анализировали после осаждения белка посредством жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS). Параметры PK и период полужизни рассчитывали с использованием WinonLin версии 5.2.1 (некомпартментная модель).Female Gottinger minipigs were dosed at 0.05, 0.075, or 0.1 mg/kg subcutaneously (s.c.). Blood samples were collected at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48, 56 and 72 hours after application. Plasma samples were analyzed after protein precipitation by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS). PK parameters and half-life were calculated using WinonLin version 5.2.1 (non-compartmental model).

Кратковременные и длительные эффекты в отношении уровня глюкозы в крови, массы тела, общего содержания жира в организме и потребления корма после подкожной обработки у самок мышей C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO).Short-term and long-term effects on blood glucose, body weight, total body fat, and food intake after subcutaneous treatment in dietary obese (DIO) female C57BL/6 mice.

Самок мышей C57BL/6NHsd заказывали в Envigo RMS Inc. с соблюдением условий группового содержания, доставляли в условиях группового содержания и оставляли в условиях группового содержания с доставленными соседями по клетке в клетках типа коробки для обуви с подстилкой из древесной стружки до дня 38 фазы, предшествующей введению дозы. На момент начала исследования возраст мышей составлял 25-26 недель.Female C57BL/6NHsd mice were ordered from Envigo RMS Inc. grouped, brought in grouped and left grouped with delivered cage mates in shoe box type cages with wood chip bedding until day 38 of the pre-dose phase. The mice were 25-26 weeks old at the start of the study.

Мышей содержали в условиях вивария, которые включали цикл свет/темнота 12 ч (фаза света 04:00 до полудня - 4:00 после полудня), комнатную температуру от 23 до 26°C и относительную влажность от 30 до 70%. Все животные имели свободный доступ к воде и рациону с высоким содержанием жира (TD97366) в течение 16 недель перед фармакологическим вмешательством (фаза введения дозы). Корм заменяли на свежий корм один раз в неделю до последнего раза в день 38 фазы, предшествующей введению дозы. В ходе последующей фазы введения дозы примерно 50% оставшегося корма удаляли, заменяли свежим кормом и гранулы равномерно перемешивали один раз в неделю.The mice were maintained under vivarium conditions that included a 12 h light/dark cycle (light phase 04:00 am - 4:00 pm), room temperature 23 to 26° C., and relative humidity 30 to 70%. All animals had ad libitum access to water and a high fat diet (TD97366) for 16 weeks prior to pharmacological intervention (dose phase). Food was changed to fresh food once a week until the last meal on day 38 of the pre-dose phase. During the subsequent dosing phase, approximately 50% of the remaining food was removed, replaced with fresh food, and the pellets were evenly mixed once a week.

В день 38 перед введением дозы мышей с DIO, страдающих ожирением, распределяли в группы обработки (n=8) с обеспечением соответствия средних показателей массы тела среди всех групп DIO. Сопоставимую по возрасту группу с неограниченным доступом к поддерживающему рациону для грызунов (Teklad Global Diets Rodent 2014, в виде гранул) включали в исследование в качестве контрольной группы, получающей обедненный рацион. В ходе фазы, предшествующей введению дозы, со дня 32 по 38On pre-dose day 38, obese DIO mice were assigned to treatment groups (n=8) to match the mean body weights of all DIO groups. An age-matched group with unlimited access to a rodent maintenance diet (Teklad Global Diets Rodent 2014, pelleted) was included in the study as a lean control group. During the pre-dose phase from days 32 to 38

- 24 040723 всех исследуемых животных обрабатывали средой-носителем (фосфатно-солевой буферный раствор,- 24 040723 all test animals were treated with a carrier medium (phosphate-buffered saline solution,

PBS, Gibco, без CaCl₂ и MgCl₂) один раз в день (s.c, примерно 0,2 мл/мышь).PBS, Gibco, without CaCl ₂ and MgCl ₂ ) once a day (sc, about 0.2 ml/mouse).

В день 37 фазы, предшествующей введению дозы, тестируемый образец разбавляли с помощью PBS до концентрации 100 мкг/мл и аликвоты данного исходного раствора хранили примерно при <-60°C. Аликвоты исходного раствора размораживали для еженедельного применения и после этого хранили в холодильнике примерно при 4°C. Раствор тестируемого образца для введения посредством инъекции получали в свежем виде один раз в каждый день введения дозы путем разбавления исходного раствора с помощью PBS до достижения требуемой концентрации.On day 37 of the pre-dose phase, the test sample was diluted with PBS to a concentration of 100 μg/ml and aliquots of this stock solution were stored at approximately <-60°C. Aliquots of the stock solution were thawed for weekly use and then stored in a refrigerator at about 4°C. A solution of the test sample for administration by injection was prepared fresh once on each day of dosing by diluting the stock solution with PBS until the desired concentration was reached.

Мышей обрабатывали дважды в день с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо тестируемого образца в течение 28 дней. Введение дозы в утреннее время начинали и завершали с 06:00 до 07:30 до полудня, а введение дозы в послеполуденное время осуществляли с 2:00 до 3:30 после полудня. В день 28 фазы введения дозы вводили только утреннюю дозу. Применяемый объем составлял 5 мл/кг, и дозу регулировали согласно последнему показателю массы тела, зарегистрированному для каждого индивидуума.Mice were treated twice a day with s.c. injections of either PBS carrier medium or test sample for 28 days. Dosing in the morning was started and ended from 06:00 to 07:30 a.m., and dosing in the afternoon was from 2:00 to 3:30 p.m. On day 28 of the dosing phase, only the morning dose was administered. The volume applied was 5 ml/kg and the dose was adjusted according to the last body weight recorded for each individual.

1) Кратковременный эффект в отношении профилей уровней глюкозы в крови у самок мышей с DIO, которых не воздерживали от приема пищи.1) Short-term effect on blood glucose profiles in female DIO mice that were not fasted.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В день 1 фазы введения дозы у неанестезированных животных собирали примерно 5 мкл крови путем отрезания кончика хвоста в момент времени 0 перед s.c. введением первой дозы среды-носителя PBS или тестируемого образца и через 1, 2, 3, 4, 6 и 24 ч после введения дозы. Забор крови в течение 24 ч проводили перед введением дозы в день 2. Послеполуденную дозу вводили в период между сбором образцов крови в моменты времени через 6-24 ч. Измерения уровней глюкозы проводили в цельной крови и в двух или трех повторностях с применением глюкометров Aviva.Animals had unlimited access to water and food during the experiment. On day 1 of the dosing phase, approximately 5 μl of blood was collected from unanaesthetized animals by cutting off the tip of the tail at time 0 before s.c. administration of the first dose of PBS vehicle medium or test sample and 1, 2, 3, 4, 6, and 24 hours post-dose. Blood sampling within 24 hours was performed before dosing on day 2. An afternoon dose was administered between blood sampling at time points 6-24 hours later. Glucose measurements were made in whole blood and in duplicate or triplicate using Aviva glucometers.

2) Длительный эффект в отношении массы тела у самок мышей с DIO, которых не воздерживали от приема пищи.2) Long-term effect on body weight in female DIO mice that were not fasted.

Массу тела измеряли ежедневно в примерно 06:00-07:30 до полудня со дня 32 по 38 фазы, предшествующей введению дозы, и на протяжении 28 дней фазы введения дозы. В ходе фазы введения дозы мышей обрабатывали дважды в день с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо тестируемого образца.Body weight was measured daily at about 06:00-07:30 am from day 32 to 38 of the pre-dose phase and for 28 days of the dosing phase. During the dosing phase, mice were treated twice daily with s.c. injection of either the PBS carrier medium or the test sample.

3) Длительный эффект в отношении общей массы жира в организме у самок мышей с DIO, которых не воздерживали от приема пищи.3) Long-term effect on total body fat mass in DIO female mice that were not fasted.

Для определения общей массы жира в организме в день 37 перед введением дозы и в день 26 фазы введения дозы проводили измерения с помощью количественного ядерного магнитного резонанса (QNMR). В ходе фазы введения дозы мышей обрабатывали дважды в день с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо тестируемого образца.Quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR) measurements were taken to determine total body fat mass on day 37 pre-dose and day 26 of the dosing phase. During the dosing phase, mice were treated twice daily with s.c. injection of either the PBS carrier medium or the test sample.

4) Эффект в отношении потребления корма у самок мышей с DIO.4) Effect on food intake in DIO female mice.

Потребление корма оценивали на основании ежедневного измерения веса контейнера с кормом в каждой клетке в период 06:00-07:30 до полудня. В каждой клетке содержали по четыре мыши и потребление корма рассчитывали на протяжении 28 дней фазы введения дозы. В ходе фазы введения дозы мышей обрабатывали дважды в день с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо тестируемого образца.Feed intake was assessed based on daily measurement of the weight of the food container in each cage during the period 06:00-07:30 am. Four mice were housed in each cage and food intake was calculated over the 28 days of the dosing phase. During the dosing phase, mice were treated twice daily with s.c. injection of either the PBS carrier medium or the test sample.

5) Параметры плазмы крови у самок мышей с DIO, которых не воздерживали от приема пищи, перед умерщвлением.5) Blood plasma parameters of female DIO mice that were not fasted before sacrifice.

В день 28 перед определением любых других прижизненных показателей собирали кровь для определения концентраций инсулина в плазме крови. Затем вводили утреннюю дозу и через 4 ч после введения дозы проводили некропсию. Для данной цели животных анестезировали изофлураном и кровь собирали путем кровопускания с орбитального синуса.On day 28, before determining any other intravital parameters, blood was collected to determine plasma insulin concentrations. The morning dose was then administered and necropsy was performed 4 hours post-dose. For this purpose, animals were anesthetized with isoflurane and blood was collected by bloodletting from the orbital sinus.

6) Масса печени у самок мышей с DIO, которых не воздерживали от приема пищи, перед умерщвлением.6) Liver weight of female DIO mice not fasted before sacrifice.

В день 28 и через 4 ч после введения утренней дозы у мышей собирали кровь под изофлурановой анестезией, как описано выше. Затем мышей умерщвляли и образцы печени собирали и взвешивали.On day 28 and 4 hours after the morning dose, mice were bled under isoflurane anesthesia as described above. Mice were then sacrificed and liver samples were collected and weighed.

7) Количественное определение липидов печени.7) Quantitative determination of liver lipids.

Аликвоты с печенью инкубировали с дихлорметаном:метанолом (2:1). Липофильные и липофобные фазы разделяли с помощью добавления dH₂O и последующего центрифугирования. Собирали нижнюю липофильную фазу и процедуру повторяли с оставшимися липофобным слоем и тканью печени. Затем липофильные фазы объединяли и выпаривали растворитель. Затем образцы инкубировали с 2-пропанолом при 60°C и непрерывном встряхивании. Концентрации общего холестерина, триацилглицерина и фосфолипида количественно определяли ферментативным путем с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя.Liver aliquots were incubated with dichloromethane:methanol (2:1). Lipophilic and lipophobic phases were separated by adding dH ₂ O and subsequent centrifugation. The lower lipophilic phase was collected and the procedure was repeated with the remaining lipophobic layer and liver tissue. Then the lipophilic phases were combined and the solvent was evaporated. Then the samples were incubated with 2-propanol at 60°C and continuous shaking. The concentrations of total cholesterol, triacylglycerol and phospholipid were quantified enzymatically using a commercial kit according to the manufacturer's instructions.

8) Статистические анализы.8) Statistical analyses.

Статистические анализы проводили с помощью Sigmaplot 12.5. Двусторонние T-критерии применяли для сравнения группы мышей с DIO, обработанных средой-носителем (в целом n=8), с группой мы- 25 040723 шей с DIO, обработанных тестируемым образцом (в целом n=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо различными. Данные для группы, получавшей обедненный рацион - среду-носитель приведены на фигурах, но их применяли в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения.Statistical analyzes were performed using Sigmaplot 12.5. Two-tailed T-tests were used to compare a group of DIO mice treated with vehicle (overall n=8) with a group of DIO mice treated with test sample (overall n=8). If the difference in the mean values of the two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. Data for the lean diet-carrier group are shown in the figures, but were used as a reference data set for the non-obese state.

Кратковременные эффекты в отношении концентраций глюкозы в крови после подкожной обработки у самок мышей db/db с диабетом, которых не воздерживали от приема пищи.Short-term effects on blood glucose concentrations after subcutaneous treatment in non-fasted female diabetic db/db mice.

Здоровых самок мышей, получавших обедненный рацион BKS.Cg-(истощенные)/OlaHsd и склонных к диабету BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd с ожирением, заказывали в Envigo RMS Inc. с соблюдением условий группового содержания, доставляли в условиях группового содержания и оставляли в условиях группового содержания в клетках типа коробки для обуви с подстилкой из древесной стружки до дня 15 фазы, предшествующей введению дозы. На момент начала исследования возраст мышей составлял примерно 12 недель.Healthy female mice fed a lean BKS.Cg-(depleted)/OlaHsd diet and diabetic BKS.Cg-+Lepr ^db /+Lepr ^db /OlaHsd obese mice were ordered from Envigo RMS Inc. under group conditions, delivered under group conditions and left in group conditions in shoe box type cages with wood chip bedding until day 15 of the pre-dose phase. At the start of the study, the mice were approximately 12 weeks old.

Мышей содержали в условиях вивария, включающих цикл свет/темнота 12 ч (фаза света 04:00 до полудня - 4:00 после полудня), комнатную температуру от 23 до 26°C и относительную влажность от 30 до 70%. Все животные имели свободный доступ к воде и рациону Purina Fomulab 5008.The mice were maintained under vivarium conditions including a 12 h light/dark cycle (light phase 04:00 am - 4:00 pm), room temperature 23 to 26° C., and relative humidity 30 to 70%. All animals had free access to water and Purina Fomula 5008 diet.

В день 9 перед введением дозы осуществляли измерения уровня глюкозы в крови и массы тела (в период от примерно 08:00 до 10:00 до полудня), а также уровня HbA1c. В день 15 фазы, предшествующей введению дозы, животных распределяли в группы обработки (n=8) и в новые клетки с обеспечением соответствия средних показателей HbA1c и массы тела среди всех групп db/db. Сопоставимую по возрасту группу, получавшую обедненный рацион, включали в исследование в качестве здорового эталона с обедненным рационом.On pre-dose day 9, blood glucose and body weight measurements (between about 08:00 and 10:00 a.m.) and HbA1c were measured. On day 15 of the pre-dose phase, animals were assigned to treatment groups (n=8) and new cages to ensure that the mean HbA1c and body weights were consistent across all db/db groups. An age-matched lean diet group was included in the study as a lean healthy reference.

Перед днем 1 фазы введения дозы тестируемый образец разбавляли фосфатно-солевым буферным раствором (PBS, Gibco, без CaCl₂ и MgCl₂) до концентрации 1 мг/мл и аликвоты данного исходного раствора хранили примерно при <-60°C. В день 1 фазы введения дозы аликвоты исходного раствора размораживали и раствор тестируемого образца для введения посредством инъекции получали в свежем виде путем его разбавления с помощью PBS до достижения требуемой концентрации.Before day 1 of the dosing phase, the test sample was diluted with phosphate buffered saline (PBS, Gibco, without CaCl ₂ and MgCl ₂ ) to a concentration of 1 mg/ml and aliquots of this stock solution were stored at approximately <-60°C. On day 1 of the dosing phase, aliquots of the stock solution were thawed and a test sample solution for injection was made fresh by diluting it with PBS to the desired concentration.

В день 1 фазы введения дозы мышей db/db один раз обрабатывали с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо 30 мкг/кг тестируемого образца. Эталонную группу с обедненным рационом обрабатывали один раз с помощью s.c. инъекции среды-носителя PBS. Введение дозы начинали и завершали с 08:00 до 10:00 до полудня. Применяемый объем составлял 5 мл/кг, и дозу регулировали согласно последнему показателю массы тела, зарегистрированному для каждого индивидуума.On day 1 of the dosing phase, db/db mice were treated once with s.c. injections of either PBS vehicle media or 30 µg/kg of test sample. The lean reference group was treated once with s.c. injection of PBS carrier medium. Dosing was started and ended between 08:00 and 10:00 am. The volume applied was 5 ml/kg and the dose was adjusted according to the last body weight recorded for each individual.

1) Кратковременный эффект в отношении профилей уровней глюкозы в крови у животных, которых не воздерживали от приема пищи.1) Short-term effect on blood glucose profiles in non-fasted animals.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В день 1 фазы введения дозы примерно 5 мкл крови собирали путем отрезания кончика хвоста за 30 мин и в момент времени 0 перед определением любых других прижизненных показателей. В момент времени 0 мыши получали s.c. дозу среды-носителя PBS либо 30 мкг/кг тестируемого образца. Дополнительные образцы крови собирали через 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения дозы. Измерения уровней глюкозы проводили в цельной крови с применением глюкометров AlphaTRAK. Если значения концентрации глюкозы согласно двум измерениям отличались на более чем 20 мг/дл, то регистрировали третье значение. Площадь под кривой зависимости (AUC) уровней глюкозы в крови рассчитывали с помощью способа трапеций и для периода, составляющего 24 ч после введения дозы.Animals had unlimited access to water and food during the experiment. On day 1 of the dosing phase, approximately 5 μl of blood was collected by tail-tip 30 minutes and at time 0 before any other vital signs were determined. At time 0, mice received s.c. dose of PBS carrier medium or 30 µg/kg of test sample. Additional blood samples were collected at 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8 and 24 hours post-dose. Glucose measurements were made in whole blood using AlphaTRAK glucometers. If the glucose concentration values according to the two measurements differed by more than 20 mg/dL, then a third value was recorded. The area under the curve (AUC) of blood glucose levels was calculated using the trapezoid method and for a period of 24 hours post-dose.

2) Статистические анализы.2) Statistical analyses.

На фигурах данные приведены в виде средних значений±SEM. Статистические анализы проводили с помощью Sigmaplot 12.5. Однофакторный дисперсионный анализ и множественные сравнения (способ Даннетта) проводили со сравнением группы мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных средойносителем (n=8), с каждой из мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных тестируемым образцом (n=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо различными. Данные для группы без диабета, получавшей обедненный рацион - среду-носитель, приведены на фигурах, при этом они служат в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения, без диабета.In the figures, data are shown as means±SEM. Statistical analyzes were performed using Sigmaplot 12.5. One-way analysis of variance and multiple comparisons (Dunnett's method) were performed comparing a group of vehicle-treated diabetic, obese db/db mice (n=8) with each of the test sample-treated db/db diabetic, obese mice (n=8 ). If the difference in the mean values of the two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. Data for the non-diabetic group fed the lean carrier medium diet are shown in the figures, serving as a reference data set for the non-obese, non-diabetic condition.

ПримерыExamples

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано представленными ниже примерами.The present invention is further illustrated by the examples below.

Пример 1.Example 1

Синтез SEQ ID NO: 6.Synthesis of SEQ ID NO: 6.

Твердофазный синтез, описанный в разделе Способы, проводили на амидной смоле Ринка Novabiochem (4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетамидонорлейциламинометильная смола), 100-200 меш, загрузка 0,43 ммоль/г. Применяли стратегию Fmoc-синтеза с активацией HBTU/DIPEA. В протоколе твердофазного синтеза в положении 14 применяли Fmoc-Lys(Mmt)-OH, а в положении 1 применяли Boc-His(Trt)-OH. Группу Mmt отщепляли от пептида на смоле, как описано в разделе Способы. Затем Palm-gGlu-gGlu-OSu связывали с освобожденной аминогруппой с применени- 26 040723 ем DIPEA в качестве основания. Пептид отщепляли от смолы с использованием смеси Кинга (D.S. King,The solid phase synthesis described in the Methods section was carried out on Rink's amide resin Novabiochem (4-(2',4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidonorleucylaminomethyl resin), 100-200 mesh, loading 0.43 mmol/g. The Fmoc synthesis strategy with HBTU/DIPEA activation was used. In the solid phase synthesis protocol, Fmoc-Lys(Mmt)-OH was used at position 14 and Boc-His(Trt)-OH was used at position 1. The Mmt group was cleaved from the peptide on the resin as described in the Methods section. Palm-gGlu-gGlu-OSu was then coupled to the free amino group using DIPEA as the base. The peptide was cleaved from the resin using King's mixture (D.S. King,

C.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266). Неочищенный продукт очищали посредством препаративной HPLC на колонке Waters (RP18 XSelectCSH-5 мкм, 50x150 мм) с применением градиента ацетонитрил/вода (оба буфера с 0,1% TFA). Очищенный пептид анализировали с помощьюC.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266). The crude product was purified by preparative HPLC on a Waters column (RP18 XSelectCSH-5 µm, 50x150 mm) using an acetonitrile/water gradient (both buffers with 0.1% TFA). The purified peptide was analyzed using

LCMS (способ B).LCMS (method B).

Деконволюция сигналов массы, обнаруженных под пиком со временем удерживания 8,737 мин, обеспечила выявление массы пептида 4932,68, которая соответствовала ожидаемому значению 4932,67.Deconvolution of the mass signals found below the peak with a retention time of 8.737 minutes revealed the peptide mass of 4932.68, which was in line with the expected value of 4932.67.

Пример 2.Example 2

Синтез SEQ ID NO: 11.Synthesis of SEQ ID NO: 11.

Твердофазный синтез, описанный в разделе Способы, проводили на амидной смоле Ринка Novabiochem (4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетамидонорлейциламинометильнαя смола), 100-200 меш, загрузка 0,43 ммоль/г. Применяли стратегию Fmoc-синтеза с активацией HBTU/DIPEA. В протоколе твердофазного синтеза в положении 14 применяли Fmoc-Lys(Mmt)-OH, а в положении 1 применяли Boc-His(Trt)-OH. Группу Mmt отщепляли от пептида на смоле, как описано в разделе Способы. Затем Palm-gGlu-gGlu-OSu связывали с освобожденной аминогруппой с применением DIPEA в качестве основания. Пептид отщепляли от смолы с использованием смеси Кинга (D.S. King, C.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266). Неочищенный продукт очищали посредством препаративной HPLC на колонке Waters (Sunfire Prep C18 ODB, 5 мкм, 30x250 мм) с применением градиента ацетонитрил/вода (оба буфера с 0,1% TFA). Очищенный пептид анализировали с помощью LCMS (способ B).The solid phase synthesis described in the Methods section was carried out on Rink's Novabiochem amide resin (4-(2',4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidonorleucylaminomethylα resin), 100-200 mesh, loading 0.43 mmol/g. The Fmoc synthesis strategy with HBTU/DIPEA activation was used. In the solid phase synthesis protocol, Fmoc-Lys(Mmt)-OH was used at position 14 and Boc-His(Trt)-OH was used at position 1. The Mmt group was cleaved from the peptide on the resin as described in the Methods section. Palm-gGlu-gGlu-OSu was then coupled to the free amino group using DIPEA as the base. The peptide was cleaved from the resin using King's mixture (D.S. King, C.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266). The crude product was purified by preparative HPLC on a Waters column (Sunfire Prep C18 ODB, 5 µm, 30x250 mm) using an acetonitrile/water gradient (both buffers with 0.1% TFA). The purified peptide was analyzed by LCMS (method B).

Деконволюция сигналов массы, обнаруженных под пиком со временем удерживания 9,995 мин., обеспечила выявление массы пептида 4863,67, которая соответствовала ожидаемому значению 4863,63.Deconvolution of the mass signals found below the peak with a retention time of 9.995 minutes revealed a peptide mass of 4863.67 which was in line with the expected value of 4863.63.

Пример 3.Example 3

Синтез SEQ ID NO: 20.Synthesis SEQ ID NO: 20.

Твердофазный синтез, описанный в разделе Способы, проводили на амидной смоле Ринка Novabiochem (4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)феноксиацетамидонорлейциламинометильнαя смола), 100-200 меш, загрузка 0,43 ммоль/г. Применяли стратегию Fmoc-синтеза с активацией HBTU/DIPEA. В протоколе твердофазного синтеза в положении 14 применяли Fmoc-Lys(Mmt)-OH, а в положении 1 применяли Boc-His(Trt)-OH. Группу Mmt отщепляли от пептида на смоле, как описано в разделе Способы. Затем Palm-gGlu(OSu)-OtBu (CAS 204521-63-1) связывали с освобожденной аминогруппой с применением DIPEA в качестве основания. Пептид отщепляли от смолы с использованием смеси Кинга (D.S. King, C.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266). Неочищенный продукт очищали посредством препаративной HPLC на колонке Waters (Sunfire Prep C18 ODB, 5 мкм, 30x250 мм) с применением градиента ацетонитрил/вода (оба буфера с 0,1% TFA). Очищенный пептид анализировали с помощью LCMS (способ B).The solid phase synthesis described in the Methods section was carried out on Rink's Novabiochem amide resin (4-(2',4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidonorleucylaminomethylα resin), 100-200 mesh, loading 0.43 mmol/g. The Fmoc synthesis strategy with HBTU/DIPEA activation was used. In the solid phase synthesis protocol, Fmoc-Lys(Mmt)-OH was used at position 14 and Boc-His(Trt)-OH was used at position 1. The Mmt group was cleaved from the peptide on the resin as described in the Methods section. Palm-gGlu(OSu)-OtBu (CAS 204521-63-1) was then coupled to the free amino group using DIPEA as base. The peptide was cleaved from the resin using King's mixture (D.S. King, C.G. Fields, G.B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 1990, 36, 255-266). The crude product was purified by preparative HPLC on a Waters column (Sunfire Prep C18 ODB, 5 µm, 30x250 mm) using an acetonitrile/water gradient (both buffers with 0.1% TFA). The purified peptide was analyzed by LCMS (method B).

Деконволюция сигналов массы, обнаруженных под пиком со временем удерживания 8,837 мин., обеспечила выявление массы пептида 4763,670, которая соответствовала ожидаемому значению 4763,617.Deconvolution of the mass signals found below the peak with a retention time of 8.837 minutes revealed a peptide mass of 4763.670, which was in line with the expected value of 4763.617.

Аналогичным образом синтезировали и определяли характеристики других пептидов, приведенных в табл. 3.Similarly synthesized and determined the characteristics of other peptides shown in table. 3.

- 27 040723- 27 040723

Таблица 3Table 3

Перечень синтезированных пептидов и сравнение расчетной молекулярной массы против установленной_______List of synthesized peptides and comparison of the calculated molecular weight against the established _______

SEQ ID NO SEQ ID NO Расч. масса Calc. weight Установленная масса Installed weight Моноизотопная или средняя масса Monoisotopic or average weight Время удерживания (мин.) Retention time (min.) 6 6 4932,7 4932.7 4932,7 4932.7 моноизотопная monoisotopic 8,737 8.737 7 7 4946, 7 4946.7 4946, 7 4946.7 моноизотопная monoisotopic 8, 699 8,699 8 8 4892,7 4892.7 4892,7 4892.7 моноизотопная monoisotopic 9, 376 9, 376 9 9 4906,7 4906.7 4906,7 4906.7 моноизотопная monoisotopic 9, 505 9,505 10 10 4849,6 4849.6 4849,7 4849.7 моноизотопная monoisotopic 9,758 9.758 11 eleven 4863,6 4863.6 4863,7 4863.7 моноизотопная monoisotopic 9, 995 9,995 12 12 4889,6 4889.6 4889,7 4889.7 моноизотопная monoisotopic 8,971 8.971 13 13 4903,6 4903.6 4903,6 4903.6 моноизотопная monoisotopic 9,184 9.184 14 14 5077,7 5077.7 5077,8 5077.8 моноизотопная monoisotopic 8,599 8.599 15 15 5091,8 5091.8 5091,8 5091.8 моноизотопная monoisotopic 8,839 8.839 16 16 4734,6 4734.6 4734,7 4734.7 моноизотопная monoisotopic 9, 589 9,589 17 17 4762,6 4762.6 4762,7 4762.7 моноизотопная monoisotopic 10,278 10.278 18 18 4720,6 4720.6 4720,6 4720.6 моноизотопная monoisotopic 9, 992 9,992 19 19 4748,6 4748.6 4748,3 4748.3 моноизотопная monoisotopic 10,822 10.822 20 20 4763,6 4763.6 4763,7 4763.7 моноизотопная monoisotopic 8,837 8.837 21 21 4791,6 4791.6 4791,7 4791.7 моноизотопная monoisotopic 9, 674 9,674 22 22 5094,8 5094.8 5094,8 5094.8 средняя average н. о. n. O. 23 23 5108,9 5108.9 5107,2 5107.2 средняя average н. о. n. O. 24 24 5025,8 5025.8 5025,7 5025.7 средняя average 9, 510 9,510 25 25 5011,7 5011.7 5011,6 5011.6 средняя average 9,385 9.385 26 26 5011,7 5011.7 5011,4 5011.4 средняя average 9,414 9.414 27 27 4997,7 4997.7 4997,6 4997.6 средняя average 9,280 9.280

Пример 4. Стабильность.Example 4. Stability.

Образцы пептидов получали в буферной системе A для оценки химической стабильности и стабильность оценивали, как описано в разделе Способы. Результаты представлены в табл. 4.Peptide samples were prepared in Buffer System A to assess chemical stability and stability was assessed as described in the Methods section. The results are presented in table. 4.

Таблица 4Table 4

СтабильностьStability

Пример 5. Растворимость.Example 5 Solubility

Образцы пептидов получали в буферной системе A для оценки растворимости и растворимость оценивали, как описано в разделе Способы. Результаты представлены в табл. 5.Peptide samples were prepared in solubility buffer system A and solubility was evaluated as described in the Methods section. The results are presented in table. 5.

Таблица 5Table 5

РастворимостьSolubility

- 28 040723- 28 040723

Пример 6. Стабильность, оцениваемая с помощью DLS параметра взаимодействия.Example 6 Stability Assessed Using the DLS Interaction Parameter.

Гидродинамический радиус R_h образцов пептидов определяли при различных концентрациях пептида (1 мг/мл и 5 мг/мл) в буферной системе A для оценки DLS с применением способа C для оценки DLS, как описано в разделе Способы, в качестве замены DLS параметра взаимодействия k_D. Результаты представлены в табл. 6.The hydrodynamic radius R _h of the peptide samples was determined at different peptide concentrations (1 mg/mL and 5 mg/mL) in DLS evaluation buffer system A using DLS evaluation method C as described in Methods, as a replacement for the DLS interaction parameter k _D. The results are presented in table. 6.

Таблица 6Table 6

Гидродинамический радиус R_h при концентрациях пептида 1 и 5 мг/мл.Hydrodynamic radius R _h at peptide concentrations of 1 and 5 mg/ml.

Снижение R_h при более высокой концентрации пептида указывает на более высокую физическую стабильность из-за отталкивающих _____________взаимодействий между частицами______________A decrease in R _h at a higher peptide concentration indicates higher physical stability due to repulsive _____________ interactions between particles ______________

SEQ. ID SEQ. ID R_hl [нм] с=1 мг/млR _hl [nm] c=1 mg/ml R_h5 [нм] с=5 мг/млR _h5 [nm] c=5 mg/ml Дельта R_h [нм] = R_h5 ^_ RhiDelta R _h [nm] = R _h5 ^_ Rhi 6 6 2,5 2.5 1,7 1.7 -0, 9 -0.9 8 8 3, 0 thirty 2, 6 2, 6 -0,4 -0.4 9 9 2,8 2.8 2, 6 2, 6 -0,2 -0.2 12 12 2,9 2.9 2, 6 2, 6 -0,3 -0.3 13 13 2,8 2.8 2,5 2.5 -0,3 -0.3 14 14 3, 0 thirty 2,9 2.9 -о, 1 -o, 1 15 15 3, 0 thirty 2, 6 2, 6 -0,4 -0.4

Пример 7. Стабильность оценивали в анализе с применением ThT.Example 7 Stability was assessed in a ThT assay.

Лаг-период в часах в анализе образцов пептидов с применением тиофлавина T (ThT) определяли в буферной системе A для анализа с применением ThT, как описано в разделе Способы. Результаты представлены в табл. 7.The lag period in hours in the Thioflavin T (ThT) assay of peptide samples was determined in ThT Assay Buffer System A as described in the Methods section. The results are presented in table. 7.

- 29 040723- 29 040723

Таблица 7Table 7

Лаг-период в часах в анализе с применением тиофлавина T (ThT)Lag period in hours in the analysis using thioflavin T (ThT)

SEQ ID NO SEQID NO Увеличение FI при pH 4,5 Increase in FI at pH 4.5 Лаг-период перед увеличением [ч.] Lag period before increase [h] 6 6 Отсутствует Absent >45 >45 7 7 Отсутствует Absent >45 >45 8 8 Отсутствует Absent >45 >45 9 9 Отсутствует Absent >45 >45 10 10 Отсутствует Absent >45 >45 11 eleven Отсутствует Absent >45 >45 12 12 Отсутствует Absent >45 >45 13 13 Отсутствует Absent >45 >45 14 14 Отсутствует Absent >45 >45 15 15 Отсутствует Absent >45 >45 16 16 Отсутствует Absent >45 >45 17 17 Отсутствует Absent >45 >45 18 18 Отсутствует Absent >45 >45 19 19 Отсутствует Absent >45 >45 20 20 Отсутствует Absent >45 >45 21 21 Отсутствует Absent >45 >45 22 22 Отсутствует Absent >45 >45 23 23 Отсутствует Absent >45 >45

Пример 8. Данные in vitro в отношении рецептора GLP-1, глюкагона и GIP.Example 8 In vitro data on GLP-1 receptor, glucagon and GIP.

Эффективность пептидных соединений в отношении рецепторов GLP-1, глюкагона и GIP определяли посредством воздействия на клетки, экспрессирующие рецептор глюкагона человека (hGlucagon-R), рецептор GIP человека (hGIP-R) и рецептор GLP-1 человека (hGLP-1 R), перечисленными соединениями при возрастающей концентрации и измерения образовавшегося cAMP, как описано в разделе Способы.The potency of the peptide compounds for GLP-1, glucagon, and GIP receptors was determined by targeting cells expressing the human glucagon receptor (hGlucagon-R), the human GIP receptor (hGIP-R) and the human GLP-1 receptor (hGLP-1 R), listed compounds at increasing concentration and measuring the cAMP formed as described in the Methods section.

Результаты представлены в табл. 8.The results are presented in table. 8.

- 30 040723- 30 040723

Таблица 8Table 8

Значения EC5₀ производных эксендина-4 в отношении рецепторов GLP-1, глюкагона и GIP человека (указано в пМ) _EC50 values of exendin-4 derivatives for human GLP-1, glucagon, and GIP receptors (indicated in pM)

SEQ ID NO SEQID NO ЕС50 для hGLP-lR EC50 for hGLP-lR ЕС50 для hGlucagon R EC50 for hGlucagon R ЕС50 hGIP R EU50 hGIP R 6 6 1,4 1.4 2,3 2.3 2,1 2.1 7 7 1,7 1.7 3,2 3.2 2, 6 2, 6 8 8 1,3 1.3 2,0 2.0 1,6 1.6 9 9 1,6 1.6 2,9 2.9 2,6 2.6 10 10 2,3 2.3 1,6 1.6 1,1 1.1 11 eleven 2,9 2.9 2,1 2.1 1,5 1.5 12 12 1,8 1.8 2,0 2.0 1,9 1.9 13 13 2,8 2.8 2,1 2.1 2,7 2.7 14 14 0,9 0.9 3,4 3.4 1,2 1.2 15 15 1,1 1.1 4,5 4.5 Ι,θ Ι,θ 16 16 7,1 7.1 4,3 4.3 3,7 3.7 17 17 6,4 6.4 5,3 5.3 7,3 7.3 18 18 5,3 5.3 2,8 2.8 2,0 2.0 19 19 6,1 6.1 3,1 3.1 4,0 4.0 20 20 4,8 4.8 4,2 4.2 1,9 1.9 21 21 3,4 3.4 1,9 1.9 2,6 2.6 22 22 ι,ο ι, ο 5,9 5.9 1,1 1.1 23 23 1,4 1.4 6,8 6.8 1,5 1.5 24 24 0,8 0.8 1,1 1.1 0,8 0.8 25 25 0,7 0.7 0,7 0.7 0,8 0.8 26 26 0,7 0.7 1,2 1.2 0,7 0.7 27 27 0,5 0.5 0,5 0.5 0,6 0.6

Пример 9. Сравнительное тестирование.Example 9 Benchmarking.

В отношении отбора производных эксендина-4, содержащих (среди прочего) His в положении 1, Leu в положении 13, Glu в положении 15, Gln в положении 19, аминокислоту Aib в положении 34, Pro в положении 32 и Lys в положениях 35 и 39, проводили тестирование со сравнением с соответствующими соединениями, содержащими в данных положениях аминокислотные остатки нативного эксендина-4 или другие аминокислоты. Сравниваемые пары соединений и соответствующие значения EC₅₀ для рецепторов GLP-1, глюкагона и GIP человека (указаны в пМ) приведены в табл. 9. Как показано, производные эксендина-4 по настоящему изобретению проявляют улучшенную активность в отношении рецептора GIP по сравнению с соответствующими производными, содержащими аминокислоты нативного эксендина-4 или другие аминокислоты, сохраняя свою активность в отношении рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона.Regarding the selection of exendin-4 derivatives containing (among others) His at position 1, Leu at position 13, Glu at position 15, Gln at position 19, the amino acid Aib at position 34, Pro at position 32, and Lys at positions 35 and 39 were tested against corresponding compounds containing native exendin-4 amino acid residues or other amino acids at these positions. Comparable pairs of compounds and corresponding EC ₅₀ values for human GLP-1, glucagon, and GIP receptors (indicated in pM) are shown in Table 1. 9. As shown, the exendin-4 derivatives of the present invention exhibit improved activity at the GIP receptor compared to the corresponding derivatives containing native exendin-4 amino acids or other amino acids, while retaining their activity at the GLP-1 receptor and the glucagon receptor.

- 31 040723- 31 040723

Таблица 9 Сравнение производных эксендина-4, содержащих His в положении 1, Leu в положении 13, Glu в положении 15, Gln в положении 19, аминокислоту Aib в положении 34, Pro в положении 32 и Lys в положениях 35 и 39, с производными эксендина-4, содержащими в данных положениях аминокислотные остатки нативного эксендина-4 (Lys27, Ser32, Gly34, Ala35, Ser39) или другие аминокислоты. Значения EC₅₀ для рецепторов GLP-1, глюкагона и GIP указаны в пМTable 9 Comparison of exendin-4 derivatives containing His at position 1, Leu at position 13, Glu at position 15, Gln at position 19, Aib at position 34, Pro at position 32, and Lys at positions 35 and 39 with exendin derivatives -4, containing in these positions the amino acid residues of native exendin-4 (Lys27, Ser32, Gly34, Ala35, Ser39) or other amino acids. EC ₅₀ values for GLP-1, glucagon and GIP receptors are in pM

SEQ ID NO SEQ ID NO ЕС50 для hGLP-lR EC50 for hGLP-lR ЕС50 для hGlucagon-R EU50 for hGlucagon-R ЕС50 для hGIP-1 EU50 for hGIP-1 Отличия остатков Residual Differences 28 28 2,5 2.5 1,9 1.9 39, 7 39.7 Gln3, Glnl3, Aspl5, А1а19, Ser32, Gly34, Ala35, Ser39 Gln3, Glnl3, Aspl5, A1a19, Ser32, Gly34, Ala35, Ser39 21 21 3,4 3.4 1,9 1.9 2, 6 2, 6 His3, Leul3, Glul5, Glnl9, Pro32, Aib34, Lys35, Lys39 His3, Leul3, Glul5, Glnl9, Pro32, AIb34, Lys35, Lys39 29 29 15, 1 15, 1 1,2 1.2 23, 0 23.0 Tyrl, Gln3, Glnl3, Aspl5, Alal9, Ser28, Ser32, Gly34, Ala35, Ser39 Tyrl, Gln3, Glnl3, Aspl5, Alal9, Ser28, Ser32, Gly34, Ala35, Ser39 21 21 3,4 3.4 1,9 1.9 2, 6 2, 6 Hisl, His3, Leul3, Glul5, Glnl9, Ala28, Pro32, Aib34, Hisl, His3, Leul3, Glul5, Glnl9, Ala28, Pro32, AIb34, Lys35, Lys39 Lys35, Lys39

Пример 10. Кратковременные и длительные эффекты SEQ ID NO: 6 в отношении уровня глюкозы в крови, массы тела, общего содержания жира в организме, потребления корма, веса печени перед умерщвлением и параметров плазмы крови перед умерщвлением после подкожной обработки у самок мышей C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO), получавших корм.Example 10 Short-term and long-term effects of SEQ ID NO: 6 on blood glucose, body weight, total body fat, food intake, pre-kill liver weight, and pre-kill plasma parameters after subcutaneous treatment in C57BL/6 female mice with alimentary obesity (DIO) fed.

Животные, план исследования (фаза, предшествующая введению дозы, фаза введения дозы), фармакологическое вмешательство.Animals, study design (pre-dose phase, dosing phase), pharmacological intervention.

1) Профиль уровней глюкозы в крови у животных, получавших корм в утреннее время.1) Profile of blood glucose levels in animals fed in the morning.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. Концентрации глюкозы в крови определяли в день 1 фазы введения дозы в момент времени 0 перед первой s.c. инъекцией среды-носителя PBS или 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6, а затем через 1, 2, 3, 4, 6 и 24 ч после введения дозы. Послеполуденную дозу вводили в период между сбором образцов крови в моменты времени через 6-24 ч.Animals had unlimited access to water and food during the experiment. Blood glucose concentrations were determined on day 1 of the dosing phase at time 0 before the first s.c. injection of PBS carrier medium or 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6, followed by 1, 2, 3, 4, 6 and 24 hours post-dose. The afternoon dose was administered between blood sample collections at time points 6-24 hours later.

У животных, обработанных с помощью SEQ ID NO: 6, наблюдали выраженное снижение концентраций глюкозы в крови в течение 24 ч. В отличие от этого, у контрольных мышей с DIO такого изменения концентраций глюкозы в крови не наблюдали (фиг. 2).In animals treated with SEQ ID NO: 6, a marked decrease in blood glucose concentrations was observed within 24 hours. In contrast, no such change in blood glucose concentrations was observed in DIO control mice (FIG. 2).

2) Масса тела.2) Body weight.

Длительная обработка дважды в день животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6 вызывала стабильное снижение массы тела в течение 28 дней фазы обработки по сравнению с группой с DIO с обработкой средой-носителем (фиг. 3). Длительная обработка дважды в день с помощью SEQ ID NO: 6 приводила к статистически значимому более выраженному снижению массы тела в течение 28 дней фазы введения дозы по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем (фиг. 4, табл. 10).Long-term twice-daily treatment of DIO animals with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6 caused a stable weight loss over the 28 days of the treatment phase compared to the vehicle treated DIO group (FIG. 3). Long-term twice-daily treatment with SEQ ID NO: 6 resulted in a statistically significant greater reduction in body weight during the 28 days of the dosing phase compared to vehicle-treated DIO animals (FIG. 4, Table 10).

3) Общая масса жира в организме.3) The total mass of fat in the body.

Измерения общей массы жира в организме проводили в день 37 перед введением дозы и в день 26 фазы введения дозы.Measurements of total body fat mass were taken on day 37 before dosing and on day 26 of the dosing phase.

Параллельно с выраженной потерей массы тела длительная обработка дважды в день животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6 приводила к статистически значимому более выраженному снижению общей массы жира в организме в течение 28 дней фазы введения дозы по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем (фиг. 5, табл. 10).In parallel with marked body weight loss, long-term twice-daily treatment of DIO animals with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6 resulted in a statistically significant greater reduction in total body fat mass over the 28 days of the dosing phase compared to DIO animals. treated with the carrier medium (Fig. 5, Table 10).

4) Потребление корма.4) Feed intake.

В каждой клетке содержали по четыре мыши и потребление корма оценивали на протяжении 28 дней фазы введения дозы.Four mice were housed in each cage and food intake was assessed over the 28 days of the dosing phase.

- 32 040723- 32 040723

После начала введения доз длительная обработка дважды в день с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6 обеспечивала снижение уровня потребления корма, однако мыши привыкали к фармакологическим эффектам в течение примерно десяти дней. После этого оцениваемое потребление корма было сопоставимым между группами с DIO с обработкой SEQ ID NO: 6 и с обработкой средой-носителем (фиг. 6).After the start of dosing, long-term treatment twice a day with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6 provided a reduction in food intake, however, the mice accustomed to the pharmacological effects within about ten days. Thereafter, estimated food intake was comparable between SEQ ID NO: 6 treated DIO and vehicle treated groups (FIG. 6).

5) Масса печени перед умерщвлением.5) Liver mass before sacrifice.

В день 28 мышей подвергали эвтаназии через 4 ч после введения утренней дозы и собирали образцы печени.On day 28, mice were euthanized 4 hours after the morning dose and liver samples were collected.

Длительная обработка дважды в день животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6 приводила к статистически значимому снижению массы печени в день 28 фазы введения дозы по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем (фиг. 7, табл. 10).Long-term twice-daily treatment of DIO animals with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6 resulted in a statistically significant decrease in liver weight on day 28 of the dosing phase compared to DIO animals treated with vehicle medium (Fig. 7, Table 1). 10).

6) Уровни триглицеридов и LDL в плазме крови перед умерщвлением.6) Plasma triglyceride and LDL levels before sacrifice.

В день 28 и через 4 ч после введения утренней дозы у анестезированных мышей, которых не воздерживали от приема пищи, собирали кровь путем кровопускания с орбитального синуса. Длительная обработка дважды в день животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6 приводила к статистически значимому снижению концентраций триглицеридов в плазме крови при отсутствии воздерживания от приема пищи (фиг. 8, табл. 10) и LDL в плазме крови (фиг. 9, табл. 10) по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем.On day 28 and 4 hours after the morning dose, anesthetized, non-fasted mice were bled from the orbital sinus by bloodletting. Long-term twice daily treatment of DIO animals with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6 resulted in a statistically significant decrease in plasma triglyceride concentrations in the absence of fasting (Figure 8, Table 10) and plasma LDL ( Fig. 9, Table 10) compared to DIO animals treated with vehicle.

7) Статистические анализы.7) Statistical analyses.

На фигурах данные приведены в виде средних значений ± SEM.In the figures, data are shown as means ± SEM.

Статистические анализы проводили с помощью Sigmaplot 12.5. Двусторонние T-критерии применяли для сравнения группы мышей с DIO, обработанных средой-носителем (п=8), с группой мышей с DIO, обработанных тестируемым образцом (п=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо различными. Данные для группы, получавшей обедненный рацион - среду-носитель, приведены на фигурах, при этом они служат в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения.Statistical analyzes were performed using Sigmaplot 12.5. Two-tailed T-tests were used to compare a group of DIO mice treated with vehicle medium (n=8) with a group of DIO mice treated with test sample (n=8). If the difference in the mean values of the two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. The data for the lean carrier medium group are shown in the figures, serving as a reference data set for the non-obese state.

Таблица 10Table 10

Эффекты, полученные в результате 28 дней подкожной обработки с помощью SEQ ID NO: 6, у самок мышей C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO), получавших корм.Effects obtained from 28 days of subcutaneous treatment with SEQ ID NO: 6 in dietary obese (DIO) female C57BL/6 mice fed food.

Данные представляют собой средние значения ± SEM. п=8/группаData are means ± SEM. n=8/group

Параметр Parameter DIO-среда-носитель PBS два раза в день DIO-medium-carrier PBS twice a day DIO-SEQ ID NO: 6 30 мкг/кг два раза в день DIO-SEQ ID NO: 6 30 mcg/kg twice a day Изменение массы тела (г) Change in body weight (g) +3,76 ± 0,40 +3.76±0.40 -5,51 ± 0,64 Р<0,00001 -5.51±0.64 P<0.00001 Изменение общей массы жира в организме (г) Change in total body fat mass (g) +2,89 ± 0,27 +2.89±0.27 - 4,68 ± 0, 67 Р<0,00001 - 4.68 ± 0.67 P<0.00001 Масса печени перед умерщвлением (г) The mass of the liver before killing (g) 2,13 ± 0,08 2.13±0.08 1,10 ± 0,04 Р<0,00001 1.10±0.04 P<0.00001 Уровень триглицеридов в плазме крови перед умерщвлением (ммоль/л) Plasma triglycerides before sacrifice (mmol/L) 0, 64 ± 0, 08 0.64±0.08 0,28 ± 0,04 Р<0,001 0.28 ± 0.04 P<0.001 Уровень LDL в плазме крови перед умерщвлением (ммоль/л) Plasma LDL level before sacrifice (mmol/l) 1,28 ± 0,06 1.28 ± 0.06 0,70 ± 0, 06 Р<0,00001 0.70±0.06 P<0.00001

Пример 11. Кратковременные и длительные эффекты SEQ ID NO: 11 в отношении уровня глюкозы в крови, массы тела, общего содержания жира в организме, потребления корма, веса печени перед умерщвлением и параметров плазмы крови перед умерщвлением после подкожной обработки у самок мышей C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO), получавших корм.Example 11 Short-term and long-term effects of SEQ ID NO: 11 on blood glucose, body weight, total body fat, food intake, pre-kill liver weight, and pre-kill plasma parameters after subcutaneous treatment in C57BL/6 female mice with alimentary obesity (DIO) fed.

Мышей обрабатывали дважды в день с помощью s.с. инъекции либо среды-носителя PBS, либо 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 в течение 28 дней, за исключением дня 1 и дня 28, в которые мыши получали разовую дозу. Введение дозы в утреннее время начинали и завершали с 06:00 до 07:30 до полудня, а введение дозы в послеполуденное время осуществляли с 2:00 до 3:30 после полудня. В день 1 и день 28 фазы введения дозы вводили только утреннюю дозу. Применяемый объем составлял 5 мл/кг, и дозу регулировали согласно последнему показателю массы тела, зарегистрированному для каждого индивидуума.Mice were treated twice daily with s.c. injections of either PBS vehicle medium or 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 for 28 days, except for day 1 and day 28, on which mice received a single dose. Dosing in the morning was started and ended from 06:00 to 07:30 a.m., and dosing in the afternoon was from 2:00 to 3:30 p.m. On day 1 and day 28 of the dosing phase, only the morning dose was administered. The volume applied was 5 ml/kg and the dose was adjusted according to the last body weight recorded for each individual.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В день 1 фазы введения дозы у неанестезированных животных собирали примерно 5 мкл крови путем отрезания кончикаAnimals had unlimited access to water and food during the experiment. On day 1 of the dosing phase, approximately 5 μl of blood was collected from unanaesthetized animals by cutting the tip

- 33 040723 хвоста в момент времени 0 перед s.c. введением первой дозы среды-носителя PBS или 30 мкг/кг- 33 040723 tails at time 0 before s.c. administration of the first dose of PBS carrier medium or 30 µg/kg

SEQ ID NO: 11 и через 1, 2, 3, 4, 6 и 24 ч после введения дозы. Забор крови в течение 24 ч проводили перед введением дозы в день 2. Измерения уровней глюкозы проводили в цельной крови и в двух или трех повторностях с применением глюкометров Aviva.SEQ ID NO: 11 and 1, 2, 3, 4, 6 and 24 hours post-dose. Blood sampling within 24 hours was performed prior to dosing on day 2. Glucose measurements were made in whole blood and in duplicate or triplicate using Aviva glucometers.

У животных, обработанных с помощью SEQ ID NO: 11, наблюдали выраженное снижение концентраций глюкозы в крови, которое сохранялось в течение 24 ч. В отличие от этого, у контрольных мышей с DIO такого изменения концентраций глюкозы в крови не наблюдали (фиг. 10).In animals treated with SEQ ID NO: 11, a marked decrease in blood glucose concentrations was observed, which was maintained for 24 hours. In contrast, no such change in blood glucose concentrations was observed in DIO control mice (Fig. 10) .

2) Масса тела.2) Body weight.

Массу тела измеряли ежедневно примерно в 06:00-07:30 до полудня со дня 32 по 38 фазы, предшествующей введению дозы, и на протяжении 28 дней фазы введения дозы. В ходе фазы введения дозы, за исключением дня 1 и 28, животных обрабатывали дважды в день с помощью s.c. инъекции либо средыносителя PBS, либо 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11. Длительная обработка животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 вызывала стабильное снижение массы тела в течение 28 дней фазы обработки по сравнению с группой с DIO с обработкой средой-носителем (фиг. 11). Длительная обработка дважды в день с помощью SEQ ID NO: 11 приводила к статистически значимому более выраженному снижению массы тела в течение 28 дней фазы введения дозы по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем (двусторонний T-критерий, P<0,001, фиг. 12, табл. 11).Body weight was measured daily at approximately 06:00-07:30 am from day 32 to 38 of the pre-dose phase and for 28 days of the dosing phase. During the dosing phase, except for days 1 and 28, animals were treated twice daily with s.c. injections of either PBS vehicle or 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11. Long-term treatment of animals with DIO with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 caused a stable decrease in body weight over the 28 days of the treatment phase compared to the DIO group with treatment with a carrier medium (FIG. 11). Long-term twice-daily treatment with SEQ ID NO: 11 resulted in a statistically significant greater reduction in body weight over the 28 days of the dosing phase compared to vehicle-treated DIO animals (two-tailed T-test, P<0.001, FIG. 12, Table 11).

Для определения общей массы жира в организме в день 37 перед введением дозы и в день 26 фазы введения дозы проводили измерения с помощью количественного ядерного магнитного резонанса (QNMR). В ходе фазы введения дозы мышей обрабатывали дважды в день с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо 30 мкг/кг SEQ ID NO 11.Quantitative nuclear magnetic resonance (QNMR) measurements were taken to determine total body fat mass on day 37 pre-dose and day 26 of the dosing phase. During the dosing phase, mice were treated twice daily with s.c. injections of either PBS carrier medium or 30 μg/kg of SEQ ID NO 11.

Параллельно с выраженной потерей массы тела длительная обработка дважды в день животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 приводила к статистически значимому более выраженному снижению общей массы жира в организме в течение 28 дней фазы введения дозы по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем (двусторонний T-критерий, P<0,001, фиг. 13, табл. 11).In parallel with marked weight loss, long-term twice daily treatment of DIO animals with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 resulted in a statistically significant greater reduction in total body fat mass over the 28 days of the dosing phase compared to DIO animals. treated with vehicle (two tailed T-test, P<0.001, Figure 13, Table 11).

4) Потребление корма.4) Feed intake.

Потребление корма оценивали на основании ежедневного измерения веса контейнера с кормом в период 06:00-07:30 до полудня. В каждой клетке содержали по четыре мыши и потребление корма определяли на протяжении 28 дней фазы введения дозы. В ходе фазы введения дозы мышей обрабатывали дважды в день с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо 30 мкг/кг SEQ ID NO 11.Feed intake was assessed based on daily measurement of the weight of the food container during the period 06:00-07:30 am. Four mice were housed in each cage and food intake was determined over the 28 days of the dosing phase. During the dosing phase, mice were treated twice daily with s.c. injections of either PBS carrier medium or 30 μg/kg of SEQ ID NO 11.

После начала введения доз обработка с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 обеспечивала снижение уровня потребления корма, однако мыши привыкали к фармакологическим эффектам в течение примерно 15 дней. После дня 15 фазы введения дозы оцениваемое потребление корма было сопоставимым среди мышей с DIO, обработанных с помощью SEQ ID NO: 11 и средой-носителем (фиг. 14).Upon initiation of dosing, treatment with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 provided a reduction in food intake, however, the mice accustomed to the pharmacological effects within about 15 days. After day 15 of the dosing phase, estimated food intake was comparable among DIO mice treated with SEQ ID NO: 11 and vehicle medium (FIG. 14).

В день 28 собирали кровь, затем вводили утреннюю дозу и через 4 ч после введения дозы проводили некропсию. Для данной цели животных подвергали эвтаназии с помощью изофлурановой анестезии, кровь собирали путем кровопускания с орбитального синуса с последующими смещением шейных позвонков, декапитацией, двусторонней торакотомией, обескровливанием или удалением жизненно важных органов для гарантии наступления смерти после последнего сбора крови. Затем собирали образец печени и регистрировали массу печени.On day 28, blood was collected, then the morning dose was administered, and necropsy was performed 4 hours post-dose. For this purpose, animals were euthanized with isoflurane anesthesia, blood was collected by orbital sinus bleeding followed by cervical dislocation, decapitation, bilateral thoracotomy, exsanguination, or removal of vital organs to ensure death after the last blood collection. A liver sample was then collected and the weight of the liver was recorded.

Длительная обработка дважды в день животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 приводила к статистически значимому снижению массы печени в день 28 фазы введения дозы по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем (двусторонний T-критерий, P<0,001, фиг. 15, табл. 11).Long-term twice-daily treatment of DIO animals with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 resulted in a statistically significant decrease in liver weight on day 28 of the dosing phase compared to vehicle-treated DIO animals (two-tailed T-test, P <0.001, Fig. 15, Table 11).

6) Уровни триглицеридов, LDL, инсулина и глюкозы в плазме крови перед умерщвлением.6) Plasma levels of triglycerides, LDL, insulin and glucose before sacrifice.

В день 28 собирали кровь, затем вводили утреннюю дозу и через 4 ч после введения дозы проводили некропсию. Для данной цели животных, которых не воздерживали от приема пищи, подвергали эвтаназии с помощью изофлурановой анестезии и кровь собирали путем кровопускания с орбитального синуса для измерения параметров плазмы крови.On day 28, blood was collected, then the morning dose was administered, and necropsy was performed 4 hours post-dose. For this purpose, animals that were not fasted were euthanized with isoflurane anesthesia and blood was collected by bloodletting from the orbital sinus to measure blood plasma parameters.

Через 4 ч после введения последней дозы в день 28 фазы введения дозы по сравнению с животными с DIO, обработанными средой-носителем, длительная обработка животных с DIO с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 приводила к статистически значимому снижению концентраций триглицеридов (двусторонний T-критерий, P<0,05, фиг. 16, табл. 11), LDL (двусторонний T-критерий, P<0,0001, фиг. 17, табл. 11), инсулина (двусторонний T-критерий, P=0,001, фиг. 18, табл. 11) и глюкозы в плазме крови при отсутствии воздерживания от приема пищи (двусторонний T-критерий, P<0,00001, фиг. 19, табл. 11).4 hours after the last dose on day 28 of the dosing phase, compared to DIO animals treated with vehicle medium, prolonged treatment of DIO animals with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 resulted in a statistically significant decrease in triglyceride concentrations (two-tailed T-test, P<0.05, Fig. 16, Table 11), LDL (two-tailed T-test, P<0.0001, Fig. 17, Table 11), insulin (two-tailed T-test, P= 0.001, Fig. 18, Table 11) and plasma glucose in the absence of fasting (two-tailed T-test, P<0.00001, Fig. 19, Table 11).

7) Статистические анализы.7) Statistical analyses.

На фигурах данные приведены в виде средних значений ± SEM. Статистические анализы проводили с помощью Sigmaplot 12.5. Двусторонние T-критерии применяли для сравнения группы мышей с DIO, обработанных средой-носителем (n=8), с группой мышей с DIO, обработанных соединением (n=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо раз- 34 040723 личными. Данные для группы, получавшей обедненный рацион - среду-носитель, приведены на фигурах, но при этом они служили в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения.In the figures, data are shown as means ± SEM. Statistical analyzes were performed using Sigmaplot 12.5. Two-tailed T-tests were used to compare a group of vehicle-treated DIO mice (n=8) with a compound-treated group of DIO mice (n=8). If the difference in the mean values for two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. The data for the lean carrier medium group are shown in the figures, but served as a reference data set for the non-obese state.

Таблица 11Table 11

Эффекты, полученные в результате введения разовой дозы SEQ ID NO: 11, у самок мышей C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO), получавших корм. Данные представляютEffects obtained from administration of a single dose of SEQ ID NO: 11 in dietary obese (DIO) female C57BL/6 mice fed food. The data represent

собой средние значения ± SEM. n= are means ± SEM. n= =8/г =8/g руппа group DIO-среда- DIO-environment- DIO-SEQ ID DIO SEQ ID NO: NO: Пример Example носитель carrier 11 eleven Доза Dose PBS два PBS two раза times в V 30 мкг/кг 30 mcg/kg два two день day раза в день times a day Изменение Change массы тела (г) body weight (g) +4,49 ± +4.49 ± 0,40 0.40 - 7,74 ± Р<0,00001 - 7.74 ± P<0.00001 0,56 0.56 Изменение организме Change body общей массы жира в (г) total fat mass in (g) +3,03 ± +3.03 ± 0,28 0.28 -6,84 ± Р<0,00001 -6.84± P<0.00001 0,46 0.46 Масса печени перед умерщвлением (г) The mass of the liver before killing (g) +2,39 ± +2.39 ± 0,21 0.21 + 1,07 ± 0,04 Р<0,0001 + 1.07 ± 0.04 P<0.0001 Уровень триглицеридов в плазме крови перед умерщвлением (ммоль/л) Plasma triglycerides before sacrifice (mmol/l) +0,70 ± +0.70± 0, 15 0.15 + 0,34 ± 0,06 Р<0,05 + 0.34 ± 0.06 P<0.05 Уровень LDL в плазме крови перед умерщвлением (ммоль/л) Plasma LDL level before sacrifice (mmol/l) +1,58 ± +1.58± 0, 12 0.12 + 0,84 ± Р<0,0001 +0.84± P<0.0001 0, 05 0.05 Уровень инсулина в плазме крови перед умерщвлением (мкг/л) Plasma insulin levels before sacrifice (mcg/L) +129,35 +129.35 ± 21, ± 21, 81 81 +39,59 + Р=0,001 +39.59 + P=0.001 4,74 4.74 Уровень глюкозы в плазме крови перед умерщвлением (ммоль/л) Plasma glucose level before sacrifice (mmol/l) +7,21 ± +7.21± 0,26 0.26 + 4,91 ± Р=0,00001 +4.91± P=0.00001 0, 08 0.08

Пример 12. Кратковременные эффекты SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 в отношении уровня глюкозы в крови после подкожной обработки у самок мышей db/db с диабетом, получавших кормExample 12 Short Term Effects of SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 on Blood Glucose After Subcutaneous Treatment in Feeded Diabetic Female db/db Mice

Здоровых самок мышей, получавших обедненный рацион BKS.Cg-(истощенные)/OlaHsd и склонных к диабету BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd с ожирением, заказывали в Envigo RMS Inc. с соблюдением условий группового содержания, доставляли в условиях группового содержания и оставляли в условиях группового содержания в одноразовых клетках типа коробки для обуви с подстилкой из древесной стружки до дня 15 фазы, предшествующей введению дозы. На момент начала исследования возраст мышей составлял примерно 12 недель.Healthy female mice fed a lean BKS.Cg-(depleted)/OlaHsd diet and diabetic BKS.Cg-+Lepr ^db /+Lepr ^db /OlaHsd obese mice were ordered from Envigo RMS Inc. under group conditions, delivered under group conditions and left in group conditions in disposable shoebox-type cages with wood chip bedding until day 15 of the pre-dose phase. At the start of the study, the mice were approximately 12 weeks old.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В день 1 фазы вве- 35 040723 дения дозы примерно 5 мкл крови собирали путем отрезания кончика хвоста за 30 мин и в момент времени 0 перед определением любых других прижизненных показателей. В момент времени 0 мыши получали s.c. дозу среды-носителя PBS либо 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9. Дополнительные образцы крови собирали через 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения дозы. Измерения уровней глюкозы проводили в цельной крови с применением глюкометров AlphaTRAK. Если значения концентрации глюкозы согласно двум измерениям отличались на более чем 20 мг/дл, то регистрировали третье значение. Площадь под кривой зависимости (AUC) уровней глюкозы в крови рассчитывали с помощью способа трапеций и для периода, составляющего 24 ч после введения дозы.Animals had unlimited access to water and food during the experiment. On day 1 of the dosing phase, approximately 5 µl of blood was collected by cutting off the tip of the tail at 30 minutes and at time 0 before any other vital signs were determined. At time 0, mice received s.c. PBS carrier medium dose of either 30 μg/kg SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9. Additional blood samples were collected at 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3 , 4, 6, 8 and 24 hours after dosing. Glucose measurements were made in whole blood using AlphaTRAK glucometers. If the glucose concentration values according to the two measurements differed by more than 20 mg/dL, then a third value was recorded. The area under the curve (AUC) of blood glucose levels was calculated using the trapezoid method and for a period of 24 hours post-dose.

Однократная обработка мышей db/db с диабетом, которых не воздерживали от приема пищи, с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 в течение 6 ч обеспечивала нормализацию гипергликемии до концентраций глюкозы в крови при отсутствии воздерживания от приема пищи, наблюдаемых у эталонных мышей без ожирения, получавших обедненный рацион. Средние значения концентрации глюкозы в крови через 24 ч после введения дозы у всех обработанных животных соответствовали исходному уровню или приближались к нему (фиг. 20). Однократная обработка мышей db/db с диабетом с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 приводила к статистически значимому снижению AUC уровней глюкозы в крови по сравнению с группой с диабетом - среданоситель (однофакторный ANOVA, способ Даннета, P<0,001 все группы обработки по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель, фиг. 21, табл. 12).A single treatment of non-fasted diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9 for 6 hours normalized hyperglycemia to glucose concentrations in blood in the absence of food abstinence observed in non-obese reference mice fed a lean diet. Mean blood glucose concentrations 24 hours post-dose in all treated animals were at or near baseline (FIG. 20). Single treatment of diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9 resulted in a statistically significant decrease in blood glucose AUC levels compared to the vehicle-diabetic group ( one-way ANOVA, Dunnett's method, P<0.001 all treatment groups vs. diabetes group - vehicle, Figure 21, Table 12).

2) Статистические анализы.2) Statistical analyses.

На фигурах данные приведены в виде средних значений ± SEM. Статистические анализы проводили с помощью Sigmaplot 12.5. Однофакторный дисперсионный анализ и множественные сравнения (способ Даннетта) проводили со сравнением группы мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных средойносителем (n=8), с каждой из мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных соединением (n=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо различными. Данные для группы без диабета, получавшей обедненный рацион - среду-носитель, приведены на фигурах, при этом они служат в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения, без диабета.In the figures, data are shown as means ± SEM. Statistical analyzes were performed using Sigmaplot 12.5. One-way analysis of variance and multiple comparisons (Dunnett's method) were performed comparing a group of vehicle-treated diabetic, obese db/db mice (n=8) to each of compound-treated diabetic, obese db/db mice (n=8) . If the difference in the mean values of the two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. Data for the non-diabetic group fed the lean carrier medium diet are shown in the figures, serving as a reference data set for the non-obese, non-diabetic condition.

Таблица 12Table 12

Эффекты, полученные в результате подкожной обработки с помощью SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 у самок мышей db/db с диабетом, получавших корм. Данные представляют собой средние значения ± SEM. n=8/группаEffects obtained from subcutaneous treatment with SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 in female fed diabetic db/db mice. Data are means ± SEM. n=8/group

Пример Доза Example Dose Db/dbсреданоситель PBS Db/dbenvironment PBS db/db-SEQ ID NO: 6 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 6 30 mcg/kg once db/db-SEQ ID NO: 8 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 8 30 mcg/kg once db/db-SEQ ID NO: 9 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 9 30 mcg/kg once AUC уровней глюкозы в крови (ммоль/л в течение 24 часов) AUC of blood glucose levels (mmol/L over 24 hours) 646, 38 ±45,04 646, 38 ±45.04 376, 58 ± 23,20 Р<0,001 376.58± 23.20 P<0.001 406,72±34, 41 Р<0,001 406.72±34, 41 P<0.001 422,08±37,43 Р<0,001 422.08±37.43 P<0.001

Пример 13. Кратковременные эффекты SEQ ID NO: 7 в отношении уровня глюкозы в крови после подкожной обработки у самок мышей db/db с диабетом, получавших корм.Example 13 Short-term effects of SEQ ID NO: 7 on blood glucose after subcutaneous treatment in fed female diabetic db/db mice.

В день 9 перед введением дозы осуществляли измерения уровня глюкозы в крови и массы тела (в период от примерно 08:00 до 10:00 до полудня), а также уровня НЬА1с. В день 15 фазы, предшествующей введению дозы, животных распределяли в группы обработки (n=8) и в новые клетки с обеспечением соответствия средних показателей HbA1c и массы тела среди всех групп db/db. Сопоставимую по возрасту группу, получавшую обедненный рацион, включали в исследование в качестве здорового эталона с обедненным рационом.On pre-dose day 9, blood glucose and body weight measurements (between about 08:00 and 10:00 a.m.) and HbA1c were measured. On day 15 of the pre-dose phase, animals were assigned to treatment groups (n=8) and new cages to ensure that the mean HbA1c and body weights were consistent across all db/db groups. An age-matched lean diet group was included in the study as a lean healthy reference.

- 36 040723- 36 040723

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В день 1 фазы введения дозы примерно 5 мкл крови собирали путем отрезания кончика хвоста за 30 мин и в момент времени 0 перед определением любых других прижизненных показателей. В момент времени 0 мыши получали s.c. дозу среды-носителя PBS либо 30 мкг/кг SEQ ID NO: 7. Дополнительные образцы крови собирали через 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения дозы. Измерения уровней глюкозы проводили в цельной крови с применением глюкометров AlphaTRAK. Если значения концентрации глюкозы согласно двум измерениям отличались на более чем 20 мг/дл, то регистрировали третье значение. Площадь под кривой зависимости (AUC) уровней глюкозы в крови рассчитывали с помощью способа трапеций и для периода, составляющего 24 ч после введения дозы.Animals had unlimited access to water and food during the experiment. On day 1 of the dosing phase, approximately 5 μl of blood was collected by tail-tip 30 minutes and at time 0 before any other vital signs were determined. At time 0, mice received s.c. carrier medium dose of PBS or 30 μg/kg SEQ ID NO: 7. Additional blood samples were collected at 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8 and 24 hours post-dose . Glucose measurements were made in whole blood using AlphaTRAK glucometers. If the glucose concentration values according to the two measurements differed by more than 20 mg/dL, then a third value was recorded. The area under the curve (AUC) of blood glucose levels was calculated using the trapezoid method and for a period of 24 hours post-dose.

Однократная обработка мышей db/db с диабетом, которых не воздерживали от приема пищи, с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 7 в течение 6 ч обеспечивала нормализацию гипергликемии до концентраций глюкозы в крови при отсутствии воздерживания от приема пищи, наблюдаемых у эталонных мышей без ожирения, получавших обедненный рацион. Средняя концентрация глюкозы в крови через 24 ч после введения дозы у обработанных с помощью SEQ ID NO: 7 животных соответствовала исходному уровню (фиг. 22). Однократная обработка мышей db/db с диабетом с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 7 приводила к статистически значимому снижению AUC уровней глюкозы в крови по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель (однофакторный ANOVA, способ Даннета, P<0,001 SEQ ID NO: 7 по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель, фиг. 23, табл. 13).Single treatment of non-fasting diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 7 for 6 hours normalized hyperglycemia to blood glucose concentrations in the absence of fasting observed in reference mice without obesity, receiving a depleted diet. The mean blood glucose concentration 24 hours post-dose in animals treated with SEQ ID NO: 7 was at baseline (FIG. 22). Single treatment of diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 7 resulted in a statistically significant reduction in AUC of blood glucose levels compared to the diabetic vehicle group (one-way ANOVA, Dunnett's method, P<0.001 SEQ ID NO: 7 compared to the diabetic group - vehicle medium, Figure 23, Table 13).

2) Статистические анализы.2) Statistical analyses.

Статистические анализы проводили с помощью Sigmaplot 12.5. Однофакторный дисперсионный анализ и множественные сравнения (способ Даннетта) проводили со сравнением группы мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных средой-носителем (n=8), с мышами db/db с диабетом, ожирением, обработанными соединением (n=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо различными. Данные для группы без диабета, получавшей обедненный рацион - среду-носитель, приведены на фигурах, при этом они служат в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения, без диабета.Statistical analyzes were performed using Sigmaplot 12.5. One-way analysis of variance and multiple comparisons (Dunnett's method) were performed comparing a group of db/db diabetic, obese mice treated with vehicle (n=8) to db/db diabetic, obese mice treated with Compound (n=8) . If the difference in the mean values of the two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. Data for the non-diabetic group fed the lean carrier medium diet are shown in the figures, serving as a reference data set for the non-obese, non-diabetic condition.

Таблица 13Table 13

Эффекты, полученные в результате подкожной обработки с помощью SEQ ID NO: 7 у самок мышей db/db с диабетом, получавших корм. Данные представляют собой _____________средние значения ± SEM. n=8/группа_____________Effects obtained from subcutaneous treatment with SEQ ID NO: 7 in fed female diabetic db/db mice. Data are ______ means ± SEM. n=8/group_____________

Пример Доза Example Dose Db/db-среданоситель PBS db/db-environment PBS db/db-SEQ ID NO: 7 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 7 30 mcg/kg once AUC уровней глюкозы в крови (ммоль/л в течение 24 часов) AUC of blood glucose levels (mmol/L over 24 hours) 705,52±49,31 705.52±49.31 480,59±21,92 Р<0,001 480.59±21.92 P<0.001

Пример 14. Кратковременные эффекты SEQ ID NO: 11 в отношении уровня глюкозы в крови после подкожной обработки у самок мышей db/db с диабетом, получавших корм.Example 14 Short-term effects of SEQ ID NO: 11 on blood glucose after subcutaneous treatment in fed female diabetic db/db mice.

Здоровых самок мышей, получавших обедненный рацион BKS.Cg-(истощенные)/OlaHsd и склонных к диабету BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd с ожирением, заказывали в Envigo RMS Inc. с соблюдением условий группового содержания, доставляли в условиях группового содержания и оставляли в условиях группового содержания в одноразовых клетках типа коробки для обуви с подстилкой из древесной стружки до дня 15 фазы, предшествующей введению дозы. На момент начала исследования возраст мы- 37 040723 шей составлял примерно 12 недель.Healthy female mice fed a lean BKS.Cg-(depleted)/OlaHsd diet and diabetic BKS.Cg-+Lepr ^db /+Lepr ^db /OlaHsd obese mice were ordered from Envigo RMS Inc. under group conditions, delivered under group conditions and left in group conditions in disposable shoebox-type cages with wood chip bedding until day 15 of the pre-dose phase. At the start of the study, the mice were approximately 12 weeks old.

В день 15 фазы, предшествующей введению дозы, животных распределяли в группы обработки (n=8) и в новые клетки с обеспечением соответствия средних показателей HbA1c и массы тела среди всех групп db/db. Сопоставимую по возрасту группу, получавшую обедненный рацион, включали в исследование в качестве здорового эталона с обедненным рационом.On day 15 of the pre-dose phase, animals were assigned to treatment groups (n=8) and new cages to ensure that the mean HbA1c and body weights were consistent across all db/db groups. An age-matched lean diet group was included in the study as a lean healthy reference.

В день 1 фазы введения дозы мышей db/db один раз обрабатывали с помощью s.c. инъекции либо среды-носителя PBS, либо 30 мкг/кг тестируемого образца. Эталонную группу с обедненным рационом обрабатывали один раз с помощью s.c. инъекции среды-носителя PBS. Введение дозы начинали и завершали с 08:00 до 10:00 до полудня. Применяемый объем составлял 5 мл/кг и дозу регулировали согласно последнему показателю массы тела, зарегистрированному для каждого индивидуума.On day 1 of the dosing phase, db/db mice were treated once with s.c. injections of either PBS vehicle media or 30 µg/kg of test sample. The lean reference group was treated once with s.c. injection of PBS carrier medium. Dosing was started and ended between 08:00 and 10:00 am. The volume applied was 5 ml/kg and the dose was adjusted according to the last body weight recorded for each individual.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В день 1 фазы введения дозы примерно 5 мкл крови собирали путем отрезания кончика хвоста за 30 мин и в момент времени 0 перед определением любых других прижизненных показателей. В момент времени 0 мыши получали s.c. дозу среды-носителя PBS либо 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11. Дополнительные образцы крови собирали через 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения дозы. Измерения уровней глюкозы проводили в цельной крови с применением глюкометров AlphaTRAK. Если значения концентрации глюкозы согласно двум измерениям отличались на более чем 20 мг/дл, то регистрировали третье значение. Площадь под кривой зависимости (AUC) уровней глюкозы в крови рассчитывали с помощью способа трапеций и для периода, составляющего 24 ч после введения дозы.Animals had unlimited access to water and food during the experiment. On day 1 of the dosing phase, approximately 5 μl of blood was collected by tail-tip 30 minutes and at time 0 before any other vital signs were determined. At time 0, mice received s.c. carrier medium dose of PBS or 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11. Additional blood samples were collected at 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, and 24 hours post-dose . Glucose measurements were made in whole blood using AlphaTRAK glucometers. If the glucose concentration values according to the two measurements differed by more than 20 mg/dL, then a third value was recorded. The area under the curve (AUC) of blood glucose levels was calculated using the trapezoid method and for a period of 24 hours post-dose.

Однократная обработка мышей db/db с диабетом, которых не воздерживали от приема пищи, с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 в течение 6 ч обеспечивала нормализацию гипергликемии до концентраций глюкозы в крови при отсутствии воздерживания от приема пищи, наблюдаемых у эталонных мышей без ожирения, получавших обедненный рацион. Средние значения концентрации глюкозы в крови через 24 ч после введения дозы у обработанных с помощью SEQ ID NO: 11 животных по-прежнему были ниже исходных концентраций (фиг. 24). Однократная обработка мышей db/db с диабетом с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 11 приводила к статистически значимому снижению AUC уровней глюкозы в крови по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель (однофакторный ANOVA, способ Даннета, P<0,001 SEQ ID NO: 11 по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель, фиг. 25, табл. 14).A single treatment of non-fasting diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 for 6 hours normalized hyperglycemia to blood glucose concentrations in the absence of fasting observed in reference mice without obesity, receiving a depleted diet. Mean blood glucose concentrations 24 hours post-dose in SEQ ID NO: 11-treated animals were still below baseline (FIG. 24). Single treatment of diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 11 resulted in a statistically significant decrease in AUC of blood glucose levels compared to the diabetic vehicle group (one-way ANOVA, Dunnett's method, P<0.001 SEQ ID NO: 11 compared to the diabetic group - vehicle medium, Figure 25, Table 14).

2) Концентрации триацилглицерина в сыворотке крови у животных, получавших корм в утреннее время, перед умерщвлением.2) Serum triacylglycerol concentrations in animals fed in the morning before sacrifice.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В конечный момент времени исследования животных подвергали глубокой анестезии с помощью изофлурана, собирали образец крови с орбитального синуса и получали сыворотку крови для определения уровня триацилглицерина. Средние значения концентрации триацилглицерина в сыворотке крови через 24 ч после введения дозы у обработанных с помощью SEQ ID NO: 11 животных были статистически значимо ниже концентраций, наблюдаемых у животных группы с диабетом - среда-носитель (однофакторный ANOVA, способ Даннета, P=0,007 SEQ ID NO: 11 по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель, фиг. 26, табл. 14).Animals had unlimited access to water and food during the experiment. At the end time of the study, the animals were deeply anesthetized with isoflurane, a blood sample was collected from the orbital sinus, and serum was obtained for determination of triacylglycerol levels. Mean serum triacylglycerol concentrations 24 hours post-dose in SEQ ID NO: 11 treated animals were statistically significantly lower than those observed in the diabetic-vehicle group (one-way ANOVA, Dunnett's method, P=0.007 SEQ ID NO: 11 compared to the diabetic group - vehicle medium, Figure 26, Table 14).

3) Статистические анализы.3) Statistical analyses.

Статистические анализы проводили с помощью Sigmaplot 12.5. Однофакторный дисперсионный анализ и множественные сравнения (способ Даннетта) проводили со сравнением группы мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных средой-носителем (n=8, за исключением n=7 для анализа уровня триацилглицерина), с группой мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных соединением (n=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо различными. Данные для группы без диабета, получавшей обедненный рацион - среду-носитель, приведены на фигурах, при этом они служат в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения, без диабета.Statistical analyzes were performed using Sigmaplot 12.5. One-way analysis of variance and multiple comparisons (Dunnett's method) were performed comparing a group of db/db mice with diabetes, obesity, treated with vehicle medium (n=8, excluding n=7 for triacylglycerol level analysis), with a group of db/db mice with diabetes, obesity treated with compound (n=8). If the difference in the mean values of the two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. Data for the non-diabetic group fed the lean carrier medium diet are shown in the figures, serving as a reference data set for the non-obese, non-diabetic condition.

- 38 040723- 38 040723

Таблица 14Table 14

Эффекты, полученные в результате подкожной обработки с помощью SEQ ID NO: 11 у самок мышей db/db с диабетом, получавших корм. Данные представляют собой __________средние значения ± SEM. n=7-8/группа____________Effects obtained from subcutaneous treatment with SEQ ID NO: 11 in fed female diabetic db/db mice. Data are __________ means ± SEM. n=7-8/group____________

Пример Доза Example Dose Db/db-среданоситель PBS db/db-environment PBS db/db-SEQ ID NO: 11 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 11 30 mcg/kg once AUG уровней глюкозы в крови (ммоль/л в течение 24 часов) AUG of blood glucose levels (mmol/L over 24 hours) 763,59 ± 39,53 763.59 ± 39.53 391,06 ± 24,25 Р<0,001 391.06 ± 24.25 Р<0.001 Концентрация триацилглицерина в сыворотке крови перед умерщвлением (мг/дл) The concentration of triacylglycerol in serum before sacrifice (mg/dl) 192,13 ± 23,32 192.13 ± 23.32 108,88 ± 9,89 Р=0,007 108.88 ± 9.89 P=0.007

Пример 15. Кратковременные эффекты SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 26 в отношении уровня глюкозы в крови после подкожной обработки у самок мышей db/db с диабетом, получавших корм.Example 15 Short Term Effects of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 26 on blood glucose after subcutaneous treatment in female db/db mice with fed diabetes.

Животные имели неограниченный доступ к воде и корму в ходе эксперимента. В день 1 фазы введения дозы примерно 5 мкл крови собирали путем отрезания кончика хвоста за 30 мин и в момент времени 0 перед определением любых других прижизненных показателей. В момент времени 0 мыши получали s.c. дозу среды-носителя PBS либо 30 мкг/кг SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 26. Дополнительные образцы крови собирали через 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения дозы. Измерения уровней глюкозы проводили в цельной крови с применением глюкометров AlphaTRAK. Если значения концентрации глюкозы согласно двум измерениям отличались на более чем 20 мг/дл, то регистрировали третье значение. Площадь под кривой зависимости (AUC) уровней глюкозы в крови рассчитывали с помощью способа трапеций и для периода, составляющего 24 ч после введения дозы.Animals had unlimited access to water and food during the experiment. On day 1 of the dosing phase, approximately 5 μl of blood was collected by tail-tip 30 minutes and at time 0 before any other vital signs were determined. At time 0, mice received s.c. PBS carrier medium dose of either 30 µg/kg SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 26. Additional blood samples were collected at 0.25, 0 .5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, and 24 hours post-dose. Glucose measurements were made in whole blood using AlphaTRAK glucometers. If the glucose concentration values according to the two measurements differed by more than 20 mg/dL, then a third value was recorded. The area under the curve (AUC) of blood glucose levels was calculated using the trapezoid method and for a period of 24 hours post-dose.

Однократная обработка мышей db/db с диабетом, которых не воздерживали от приема пищи, с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 26 в течение 6 ч обеспечивала нормализацию гипергликемии до концентраций глюкозы в крови при отсутствии воздерживания от приема пищи, наблюдаемых у эталонных мышей без ожирения, получавших обед- 39 040723 ненный рацион. Средние значения концентрации глюкозы в крови через 24 ч после введения дозы у всех обработанных животных соответствовали исходному уровню или приближались к нему (фиг. 27). Однократная обработка мышей db/db с диабетом с помощью 30 мкг/кг SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 26 приводила к статистически значимому снижению AUC уровней глюкозы в крови по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель (однофакторный ANOVA, способ Даннетта, Р<0,001 все группы обработки по сравнению с группой с диабетом - среда-носитель, фиг. 28, табл. 15).Single treatment of non-fasted diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 26 within 6 hours normalized hyperglycemia to blood glucose concentrations in the absence of fasting observed in non-obese reference mice fed a lean diet. Mean blood glucose concentrations 24 hours post-dose in all treated animals were at or near baseline (FIG. 27). Single treatment of diabetic db/db mice with 30 μg/kg of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 26 resulted in a statistically significant decrease in AUC levels blood glucose versus diabetic-vehicle group (one-way ANOVA, Dunnett's method, P<0.001 all treatment groups versus diabetic-vehicle group, Figure 28, Table 15).

2) Статистические анализы.2) Statistical analyses.

Статистические анализы проводили с помощью Everstat 6.0.12. Однофакторный дисперсионный анализ и множественные сравнения (способ Даннетта) проводили со сравнением группы мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных средой-носителем (п=8), с каждой из мышей db/db с диабетом, ожирением, обработанных соединением (п=8). Если отличие в средних значениях у двух групп превышало 0,05, то их считали статистически значимо различными. Данные для группы без диабета, получавшей обедненный рацион - среду-носитель, приведены на фигурах, при этом они служат в качестве эталонного набора данных для состояния без ожирения, без диабета.Statistical analyzes were performed using Everstat 6.0.12. One-way analysis of variance and multiple comparisons (Dunnett's method) were performed comparing a group of db/db diabetic, obese mice treated with vehicle (n=8) to each of the compound-treated db/db diabetic, obese mice (n= 8). If the difference in the mean values of the two groups exceeded 0.05, then they were considered statistically significantly different. Data for the non-diabetic group fed the lean carrier medium diet are shown in the figures, serving as a reference data set for the non-obese, non-diabetic condition.

Таблица 15Table 15

Эффекты, полученные в результате подкожной обработки с помощью SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 26 у самок мышей db/db с диабетом, получавших корм. Данные представляют собой средние значения ± SEM. п=8/группаEffects obtained from subcutaneous treatment with SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, or SEQ ID NO: 26 in female fed diabetic db/db mice. Data are means ± SEM. n=8/group

Пример Доза Example Dose AUC уровней глюкозы в крови (ммоль/л в течение 24 часов) AUC of blood glucose levels (mmol/L over 24 hours) Db/db-среда-носитель PBS db/db-environment-bearer PBS 671,39 ± 15,42 671.39 ± 15.42 db/db-SEQ ID NO: 10 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 10 30 mcg/kg once 413,77 ± 37,33 Р<0,001 413.77 ± 37.33 P<0.001 db/db-SEQ ID NO: 12 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 12 30 mcg/kg once 334,37 ± 25,07 Р<0,001 334.37 ± 25.07 P<0.001 db/db-SEQ ID NO: 13 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 13 30 mcg/kg once 373,42 ± 13,99 Р<0,001 373.42 ± 13.99 P<0.001 db/db-SEQ ID NO: 16 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 16 30 mcg/kg once 321,96 ± 29,27 Р<0,001 321.96 ± 29.27 P<0.001 db/db-SEQ ID NO: 26 30 мкг/кг один раз db/db-SEQ ID NO: 26 30 mcg/kg once 416,25 ± 30,62 Р<0,001 416.25 ± 30.62 P<0.001

Пример 16.Example 16

Противоатеросклеротическая активность тройных агонистов GLP-1R/GCGR/GIPR у мышей с КО АроЕ.Antiatherosclerotic activity of GLP-1R/GCGR/GIPR triple agonists in ApoE KO mice.

Мышиную модель с нокаутом (КО) гена аполипопротеина Е (АроЕ) широко применяют для изучения атеросклероза. У таких мышей самопроизвольно развиваются атеросклеротические очаги, которые по морфологии подобны очагам, наблюдаемым у людей (Meir & Leitersdorf, 2004, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24:1006-1014, Rosenfeld et al. 2000, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 20:2587-2592).The apolipoprotein E (ApoE) knockout (KO) mouse model has been widely used to study atherosclerosis. These mice spontaneously develop atherosclerotic lesions that are morphologically similar to those seen in humans (Meir & Leitersdorf, 2004, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24:1006-1014, Rosenfeld et al. 2000, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol 20:2587-2592).

Животные.Animals.

Самцов мышей с КО АроЕ (B.129P2-apoetmlUnc/J) произвольным образом распределяли в группу контроля или группу обработки (N=15 на группу); мыши дикого типа (C57BL6/J) получали обработку средой-носителем и выступали в качестве второго здорового контроля.Male ApoE KO mice (B.129P2-apoetmlUnc/J) were randomly assigned to a control or treatment group (N=15 per group); wild-type mice (C57BL6/J) were treated with vehicle medium and acted as a second healthy control.

Процедура исследования.Research procedure.

Мыши с КО АроЕ и мыши дикого типа непрерывно получали инфузию в течение 16 недель с применением подкожных осмотических мини-насосов (ALZET™), заполненных средой-носителем (стерильный ацетатный буфер, pH 4,5), пептидами под SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11 (150 мкг/кг/день) либо лираглутидом (600 мкг/кг/день). Вес тела и потребление пищи отслеживали еженедельно на протяжении всего исследования.ApoE KO mice and wild-type mice were continuously infused for 16 weeks using subcutaneous osmotic mini-pumps (ALZET™) filled with vehicle (sterile acetate buffer, pH 4.5), peptides of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 11 (150 µg/kg/day) or liraglutide (600 µg/kg/day). Body weight and food intake were monitored weekly throughout the study.

Липидные параметры крови.Lipid parameters of the blood.

Образцы крови для анализа уровней липидов в крови забирали перед обработкой и в недели 7 и 16 для анализа уровней общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL) и холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL) (не показано).Blood samples for analysis of blood lipid levels were taken before treatment and at weeks 7 and 16 for analysis of total cholesterol, low density lipoprotein (LDL) cholesterol and high density lipoprotein (HDL) cholesterol (not shown).

Количественная оценка образования атеросклеротической бляшки.Quantification of atherosclerotic plaque formation.

Аорту вырезали и образование атеросклеротической бляшки на аорте измеряли в виде абсолютной и относительной площади бляшки (% окрашенной масляным красным области от общей площади по-40040723 верхности аорты) с применением количественного и автоматизированного анализа изображений.The aorta was excised and atherosclerotic plaque formation on the aorta was measured as absolute and relative plaque area (% of oil red stained area of total aortic surface area) using quantitative and automated image analysis.

Результаты показаны на фигурах.The results are shown in the figures.

Фиг. 29. Данные наблюдения потребления пищи и веса тела.Fig. 29. Observation data on food intake and body weight.

Фиг. 30. Данные площади аортальной бляшки.Fig. 30. Aortic plaque area data.

Фиг. 31. Данные уровня общего холестерина и LDL-холестерина в сыворотке крови.Fig. 31. Data on the level of total cholesterol and LDL-cholesterol in blood serum.

У самцов мышей с KO ApoE длительная обработка в течение 4 месяцев с помощью пептидов под SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 11 в дозе 150 мкг/кг/день приводила к значимому снижению количества атеросклеротических бляшек на 63 и 73% по сравнению с контролем со средой-носителем. Противоатеросклеротическая эффективность сопровождалась заметным снижением уровня LDL-холестерина.In male mice with KO ApoE, long-term treatment for 4 months with peptides according to SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 11 at a dose of 150 μg/kg/day resulted in a significant reduction in the number of atherosclerotic plaques by 63 and 73% compared with control with a carrier medium. Anti-atherosclerotic efficacy was accompanied by a marked decrease in LDL-cholesterol levels.

В отличие от этого, в 4 раза более высокая доза чистого агониста рецептора GLP-1 лираглутида обеспечивала значимое уменьшение образования аортальных бляшек, но только на 37%, при этом снижение уровня LDL-холестерина было гораздо менее выраженным.In contrast, a 4-fold higher dose of the pure GLP-1 receptor agonist liraglutide provided a significant reduction in aortic plaque formation, but only by 37%, while the reduction in LDL-cholesterol was much less pronounced.

Таблица 16Table 16

ПоследовательностиSequences

SEQ. ID SEQ. ID Последовательность Subsequence 1 1 H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W-L- V-K-G-R-NH2 H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W-L- V-K-G-R-NH2 2 2 H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K(gGlu-Palm)- E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-OH H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K(gGlu-Palm)- E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-OH 3 3 H-S-Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-K-Y-L-D-S-R-R-A-Q-D-F-V-Q-W-L- M-N-T-OH H-S-Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-K-Y-L-D-S-R-R-A-Q-D-F-V-Q-W-L- M-N-T-OH 4 4 H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L- K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2 H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L- K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2 5 5 Y-A-E-G-T-F-I-S-D-Y-S-I-A-M-D-K-I-H-Q-Q-D-F-V-N-W-LL—A—Q—К—G—К—К—N—D—W—К—Η—Ν—I —Т —Q—ОН Y-A-E-G-T-F-I-S-D-Y-S-I-A-M-D-K-I-H-Q-Q-D-F-V-N-W-LL—A—Q—K—G—K—K—N—D—W—K—H—N—I —T —Q—OH 6 6 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 7 7 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-QR-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-QR-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 8 8 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-QR-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-QR-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 9 9 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-QR-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-QR-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 10 10 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 11 eleven H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH2 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH2 12 12 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2

--

Claims

13 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH213 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-Palm]-E-E-Q- R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH2

14 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]- E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH214 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]- E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH2

15 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-PP-K-NH215 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-PP-K-NH2

16 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Palm]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH216 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Palm]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2

17 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Stea]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH217 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Stea]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2

18 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Palm]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH218 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Palm]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2

19 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Stea]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH219 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Stea]-E-E-Q-R-Q- Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2

20 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Palm ]-E-E-Q-R-Q- K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH220 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Palm ]-E-E-Q-R-Q- K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2

21 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Stea]-E-E-Q-R-Q- K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH221 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-Stea]-E-E-Q-R-Q- K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-K-NH2

22 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]- E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH222 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]- E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-H-P-S-Aib-K-P-P-P-K- NH2

23 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-PP-K-NH223 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]E-E-Q-R-Q-K-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-H-P-S-Aib-K-P-PP-K-NH2

24 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-PP-P-K-NH224 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-PP-P-K-NH2

25 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-PP-P-K-NH225 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-P-S-Aib-K-PP-P-K-NH2

26 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]- E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-26 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-gGlu-AEEA-Palm]- E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P-

K-NH2K-NH2

27 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]- E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P- K-NH227 H-Aib-H-G-T-F-T-S-D-L-S-K-L-K[gGlu-AEEA-gAAA-Palm]- E-E-Q-R-Q-Aib-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-P-S-Aib-K-P-P-P- K-NH2

28 H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L—S-K-Q-K[gGlu-Stea]-D-E-Q-R-A- K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH228 H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L—S-K-Q-K[gGlu-Stea]-D-E-Q-R-A- K-E-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2

29 Y-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L—S-K-Q-K[gGlu-Stea]-D-E-Q-R-A- K-E-F-I-E-W-L-K-S-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH229 Y-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L—S-K-Q-K[gGlu-Stea]-D-E-Q-R-A- K-E-F-I-E-W-L-K-S-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Соединение формулы I1. Compound of formula I

H₂N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X2 0-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-X2 9-GlyX31-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R¹ I, где X14 представляет собой аминокислотный остаток с функционализированной группой -NH2 боковой цепи, выбранный из группы, состоящей из Lys, Orn, Dab или Dap, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью -Z-C(O)-R⁵, гдеH ₂ N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X2 0-Glu-Phe-Ile-Glu -Trp-Leu-Lys-Ala-X2 9-GlyX31-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R ¹ I, where X14 is an amino acid residue with a functionalized -NH2 side chain group selected from a group consisting of Lys, Orn, Dab or Dap, where the -NH2 side chain group is functionalized with -ZC(O)-R ⁵ where

Z представляет собой линкер во всех стереоизомерных формах иZ is a linker in all stereoisomeric forms and

R⁵ представляет собой фрагмент, содержащий не более 50 атомов углерода и гетероатомы, выбранные из N и O;R ⁵ is a fragment containing not more than 50 carbon atoms and heteroatoms selected from N and O;

- 42 040723- 42 040723

R1 представляет собой NH₂ или OH, или его физиологически приемлемая соль.R1 is NH ₂ or OH, or a physiologically acceptable salt thereof.

2. Соединение по п.1, где R¹ представляет собой NH2, или его физиологически приемлемая соль.2. A compound according to claim 1, wherein R ¹ is NH2, or a physiologically acceptable salt thereof.

3. Соединение по любому из пп.1, 2, где пептидное соединение характеризуется относительной активностью, составляющей по меньшей мере 5% по сравнению с относительной активностью природного глюкагона в отношении рецептора глюкагона.3. A compound according to any one of claims 1, 2, wherein the peptide compound has a relative activity of at least 5% compared to the relative activity of natural glucagon for the glucagon receptor.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где пептидное соединение проявляет относительную активность, составляющую по меньшей мере 7% по сравнению с относительной активностью GLP-1(7-36)-амида в отношении рецептора GLP-1.4. The compound according to any one of claims 1 to 3, wherein the peptide compound exhibits a relative activity of at least 7% compared to the relative activity of GLP-1(7-36)-amide for the GLP-1 receptor.

5. Соединение по любому из пп.1-4, где пептидное соединение проявляет относительную активность, составляющую по меньшей мере 4% по сравнению с относительной активностью GIP в отношении рецептора GIP.5. A compound according to any one of claims 1 to 4, wherein the peptidic compound exhibits a relative activity of at least 4% relative to the relative activity of GIP for the GIP receptor.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где6. Connection according to any one of claims 1-5, where

X14 представляет собой Lys, где группа -NH₂ боковой цепи функционализирована группой -Z-C(O)R⁵, гдеX14 is Lys, where the side chain -NH ₂ group is functionalized with a -ZC(O)R ⁵ group, where

7. Соединение по любому из пп.1-5, где7. Connection according to any one of claims 1-5, where

8. Соединение по любому из пп.1-5, где8. Connection according to any one of claims 1-5, where

X14 представляет собой Lys, где группа -NH₂ боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила,X14 is Lys where the side chain -NH ₂ group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4 -((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino ]ethoxy}ethoxy)acetyl, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino]ethoxy}ethoxy)acetyl,

R¹ представляет собой NH2, или его физиологически приемлемая соль.R ¹ is NH2, or a physiologically acceptable salt thereof.

9. Соединение по любому из пп.1-5, где9. Connection according to any one of claims 1-5, where

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-, (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетила,X14 is Lys where the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl-, (S)-4-carboxy-4- ((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino] ethoxy}ethoxy)acetyl, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyrylamino]ethoxy}ethoxy)acetylamino]ethoxy}ethoxy)acetyl,

10. Соединение по любому из пп.1-8, где10. Connection according to any one of claims 1-8, where

X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-;X14 is Lys wherein the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino)butyryl-;

X20 представляет собой Lys или Aib;X20 is Lys or Aib;

11. Соединение по любому из пп.1-8, где11. Connection according to any one of claims 1-8, where

- 43 040723- 43 040723

X20 представляет собой Lys;X20 is Lys;

R1 представляет собой NH₂, или его физиологически приемлемая соль.R1 is NH ₂ or a physiologically acceptable salt thereof.

12. Соединение по любому из пп.1-8, где12. Connection according to any one of claims 1-8, where

X20 представляет собой Lys;X20 is Lys;

X31 представляет собой His;X31 is His;

13. Соединение по любому из пп.1-8, где X14 представляет собой Lys, где группа -NH2 боковой цепи функционализирована с помощью (S)-4-карбокси-4-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламинобутириламино)бутирил-, (S)-4-карбокси-4-октадеканоиламинобутирил-;13. A compound according to any one of claims 1-8, wherein X14 is Lys, wherein the side chain -NH2 group is functionalized with (S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylaminobutyrylamino) butyryl-, (S)-4-carboxy-4-octadecanoylaminobutyryl-;

X20 представляет собой Lys;X20 is Lys;

X29 представляет собой Gly;X29 is Gly;

14. Соединение по любому из пп.1-8, где14. Connection according to any one of claims 1-8, where

X20 представляет собой Ab;X20 is Ab;

15. Соединение по любому из пп.1-8, где15. Connection according to any one of claims 1-8, where

X20 представляет собой Aib;X20 is Aib;

X31 представляет собой Pro;X31 is Pro;

16. Соединение по любому из пп.1-8, где16. Connection according to any one of claims 1-8, where

X20 представляет собой Aib;X20 is Aib;

X29 представляет собой D-Ala;X29 is D-Ala;

17. Соединение по любому из пп.1-16, выбранное из соединений под SEQ ID NO: 6-27, а также их физиологически приемлемых солей.17. A compound according to any one of claims 1-16, selected from the compounds of SEQ ID NOs: 6-27, as well as their physiologically acceptable salts.

18. Соединение по п.1, где соединение представлено SEQ ID NO: 6 или его физиологически приемлемой солью.18. A compound according to claim 1, wherein the compound is represented by SEQ ID NO: 6 or a physiologically acceptable salt thereof.

19. Соединение по п.1, где соединение представлено SEQ ID NO: 9 или его физиологически приемлемой солью.19. A compound according to claim 1, wherein the compound is represented by SEQ ID NO: 9 or a physiologically acceptable salt thereof.

20. Соединение по п.1, где соединение представлено SEQ ID NO: 11 или его физиологически приемлемой солью.20. A compound according to claim 1, wherein the compound is represented by SEQ ID NO: 11 or a physiologically acceptable salt thereof.

21. Применение соединения по любому из пп.1-20 в терапии.21. The use of a compound according to any one of claims 1-20 in therapy.

22. Применение соединения по любому из пп.1-20 в качестве фармацевтического препарата.22. The use of a compound according to any one of claims 1 to 20 as a pharmaceutical preparation.

23. Применение по любому из пп.21, 22, где соединение присутствует в качестве активного средства в фармацевтической композиции вместе по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем.23. The use according to any one of claims 21, 22, wherein the compound is present as the active agent in the pharmaceutical composition together with at least one pharmaceutically acceptable carrier.

--