EA040545B1 - ANTI-PRLR ANTIBODIES AND THEIR APPLICATIONS - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention belongs

Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые специфично связываются с рецептором пролактина (PRLR), а также к конъюгатам антитела с лекарственным средством, содержащим такие антитела, и способам их применения.The present invention relates to antibodies and antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor (PRLR), as well as antibody-drug conjugates containing such antibodies, and methods of using them.

Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of the invention

Пролактин является гормоном роста, имеющим полипептидную природу, который проявляет свою активность путем взаимодействия с рецептором пролактина (PRLR). Рецептор пролактина является единственным трансмембранным рецептором, принадлежащим к надсемейству рецепторов к цитокинам I класса. Связывание пролактина с PRLR приводит к димеризации рецептора и передаче сигнала внутрь клетки. Передача сигнала с участием PRLR ассоциирована с различными процессами, такими как развитие молочной железы, лактация, репродукция и иммуномодуляция. Кроме того, высокие уровни экспрессии PRLR обнаружены в опухолях молочной железы, предстательной железы и в других типах опухолей.Prolactin is a polypeptide growth hormone that exerts its activity by interacting with the prolactin receptor (PRLR). The prolactin receptor is the only transmembrane receptor belonging to the class I cytokine receptor superfamily. Binding of prolactin to PRLR leads to receptor dimerization and signal transduction into the cell. PRLR signaling is associated with various processes such as breast development, lactation, reproduction, and immunomodulation. In addition, high levels of PRLR expression have been found in tumors of the breast, prostate, and other types of tumors.

Блокада передачи сигнала с участием PRLR была предложена в качестве средства для лечения рака молочной железы и рака предстательной железы (см., например, Damiano and Wasserman, апрель 2013 г., Clin. Cancer Res., 19(7):1644-1650). Антитела к PRLR упоминаются, например, в Патентах США № 7867493 и 7422899. Тем не менее в данной области техники существует потребность в инновационных антагонистах PRLR, таких как антитела к PRLR, для лечения рака и других нарушений, ассоциированных с экспрессией PRLR и/или сигнальными путями с участием PRLR.PRLR signaling blockade has been proposed as a treatment for breast and prostate cancer (see, e.g., Damiano and Wasserman, April 2013, Clin. Cancer Res., 19(7):1644-1650) . Anti-PRLR antibodies are mentioned, for example, in US Pat. pathways involving PRLR.

Краткое изложение сущности изобретенияBrief summary of the invention

В настоящем изобретении предложены антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, связывающие человеческий рецептор пролактина (PRLR). Антитела по настоящему изобретению применяются, в частности, для направленного воздействия на опухолевые клетки, экспрессирующие PRLR. Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению и их антигенсвязывающие фрагменты могут использоваться отдельно в немодифицированной форме или могут быть являться частью конъюгата антитела с лекарственным средством или биспецифичного антитела.The present invention provides antibodies and antigen-binding antibody fragments that bind the human prolactin receptor (PRLR). The antibodies of the present invention are used, in particular, to target tumor cells expressing PRLR. Anti-PRLR antibodies of the present invention and antigen-binding fragments thereof may be used alone in unmodified form or may be part of an antibody-drug conjugate or bispecific antibody.

Антитела по настоящему изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут включать только антигенсвязывающую часть антитела (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv), а также могут быть модифицированы, чтобы влиять на функциональность, например устранять остаточные эффекторные функции (Reddy et al., 2000, J. Immunol., 19(164):1925-1933).The antibodies of the present invention may be full-length (eg, an IgG1 or IgG4 antibody) or may include only the antigen-binding portion of the antibody (eg, a Fab fragment, F(ab') ₂ or scFv), and may also be modified to affect functionality, such as eliminate residual effector functions (Reddy et al., 2000, J. Immunol., 19(164):1925-1933).

Примеры антител к PRLR по настоящему изобретению перечислены в табл. 1 и 2 настоящего документа. В табл. 1 содержатся идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR), вариабельных областей легкой цепи (LCVR), определяющих комплементарность участков тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и определяющих комплементарность участков легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) в типичных антителах к PRLR. В табл. 2 показаны идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в типичных антителах к PRLR.Examples of antibodies to PRLR of the present invention are listed in table. 1 and 2 of this document. In table. 1 contains amino acid sequence identifiers for heavy chain variable regions (HCVR), light chain variable regions (LCVR), heavy chain complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2, and HCDR3), and light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2, and LCDR3) in exemplary antibodies to PRLR. In table. 2 shows the nucleic acid sequence identifiers encoding HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 in exemplary anti-PRLR antibodies.

В настоящем изобретении предложены антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат, HCVR, содержащую любую аминокислотную последовательность, выбранную аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor, which contain, HCVR containing any amino acid sequence selected from the HCVR amino acid sequences listed in table. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат LCVR, содержащую любую аминокислотную последовательность, выбранную аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor, which contain an LCVR containing any amino acid sequence selected from the LCVR amino acid sequences listed in Table. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), содержащих любую из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предложены также антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, содержащуюся в любом из иллюстративных антител к PRLR, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбирают из группы, состоящей из 18/26, 66/74, 274/282, 290/298 и 370/378.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor, which contain a pair of amino acid sequences HCVR and LCVR (HCVR/LCVR) containing any of the amino acid sequences of HCVR listed in table. 1, paired with any of the LCVR amino acid sequences listed in table. 1. In certain embodiments, the present invention also provides antibodies and antigen-binding antibody fragments that comprise the HCVR/LCVR amino acid sequence pair contained in any of the exemplary anti-PRLR antibodies listed in Table 1. 1. In certain embodiments, the HCVR/LCVR amino acid sequence pair is selected from the group consisting of 18/26, 66/74, 274/282, 290/298, and 370/378.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат в тяжелой цепи участок CDR1 (HCDR1), содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor and contain a heavy chain CDR1 (HCDR1) region containing any amino acid sequence selected from the HCDR1 amino acid sequences listed in Table 1. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

- 1 040545- 1 040545

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат в тяжелой цепи участок CDR2 (HCDR2), содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor and contain a heavy chain CDR2 (HCDR2) region containing any amino acid sequence selected from the HCDR2 amino acid sequences listed in Table 1. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат в тяжелой цепи CDR3 (HCDR3), содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments of antibodies that specifically bind to the prolactin receptor, which contain in the heavy chain CDR3 (HCDR3) containing any amino acid sequence selected from the HCDR3 amino acid sequences listed in table. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат в легкой цепи участок CDR1 (LCDR1), содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor and contain a CDR1 (LCDR1) region in the light chain containing any amino acid sequence selected from the LCDR1 amino acid sequences listed in Table 1. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат в легкой цепи участок CDR2 (LCDR2), содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor and contain a CDR2 (LCDR2) region in the light chain containing any amino acid sequence selected from the LCDR2 amino acid sequences listed in Table 1. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат в легкой цепи участок CDR3 (LCDR3), содержащий любую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в табл. 1, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor and contain a CDR3 (LCDR3) region in the light chain containing any amino acid sequence selected from the LCDR3 amino acid sequences listed in Table 1. 1, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCDR3 и LCDR3 (HCDR3/LCDR3), содержащих любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в табл. 1, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, содержащуюся в любом из иллюстративных антител к PRLR, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3 выбирают из группы, состоящей из 24/32, 72/80, 280/288, 296/304 и 376/384.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor, which contain a pair of amino acid sequences HCDR3 and LCDR3 (HCDR3/LCDR3) containing any of the amino acid sequences of HCDR3 listed in table. 1, paired with any of the LCDR3 amino acid sequences listed in Table. 1. In certain embodiments, the present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that comprise the HCDR3/LCDR3 amino acid sequence pair contained in any of the exemplary anti-PRLR antibodies listed in Table 1. 1. In certain embodiments, the HCDR3/LCDR3 amino acid sequence pair is selected from the group consisting of 24/32, 72/80, 280/288, 296/304, and 376/384.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат набор из шести CDR (например, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в любом из иллюстративных антител к PRLR, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 выбирают из группы, состоящей из 20-22-24-28-30-32, 68-70-72-76-78-80, 276-278-280-284-286-288, 292-294-296-300302-304 и 372-374-376-380-382-384.The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor, which contain a set of six CDRs (e.g., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contained in any of the exemplary anti-PRLR antibodies listed in tab. 1. In certain embodiments of the invention, the set of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 is selected from the group consisting of 20-22-24-28-30-32, 68-70-72-76-78-80 , 276-278-280-284-286-288, 292-294-296-300302-304 and 372-374-376-380-382-384.

В настоящем изобретении предложены также антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат набор из шести CDR (например, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR в любом из иллюстративных антител к PRLR, перечисленных в табл. 1. Например, настоящее изобретение включает антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, специфично связывающиеся с рецептором пролактина, которые содержат набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, содержащийся в паре последовательности аминокислот HCVR/LCVR, которую выбирают из группы, состоящей из 18/26, 66/74, 274/282, 290/298 и 370/378. Способы и приемы идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны специалистам и могут применяться для идентификации CDR в определенных последовательностях аминокислот HCVR и/или LCVR, раскрытых в настоящем документе. Типичные правила, которые могут быть использованы для идентификации границ CDR, включают, например, определение Кэбата, определение Чотиа и определение AbM. В общем виде определение Кэбата основывается на вариабельности последовательности, определение Чотиа основывается на расположении структурных петлевых участков и определение AbM представляет собой компромиссное решение между подходами Кэбата и Чотиа. См., например, Последовательность белков, представляющих имму- 2 040545 нологический интерес, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд. (1991); Al-Lazikani et al.,The present invention also provides antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor, which contain a set of six CDRs (for example, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contained in the HCVR/LCVR amino acid sequence pair in any of illustrative antibodies to PRLR listed in table. 1. For example, the present invention includes antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind to the prolactin receptor, which contain a set of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contained in an amino acid sequence pair HCVR/LCVR, which is selected from the group, consisting of 18/26, 66/74, 274/282, 290/298 and 370/378. Methods and techniques for identifying CDRs in HCVR and LCVR amino acid sequences are well known to those skilled in the art and can be used to identify CDRs in certain HCVR and/or LCVR amino acid sequences disclosed herein. Typical rules that can be used to identify CDR boundaries include, for example, the definition of Kabat, the definition of Chothia, and the definition of AbM. In general, Kabat's definition is based on sequence variability, Chothia's definition is based on the location of structural loops, and AbM's definition is a compromise between Kabat's and Chothia's approaches. See, for example, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991); Al-Lazikani et al.,

J. Mol. Biol., 273:927-948 (1997); и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:9268-9272 (1989). Также доступны открытые базы данных для идентификации последовательностей CDR в антителе.J. Mol. Biol., 273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Open databases are also available for identifying CDR sequences in an antibody.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к PRLR или их части. Например, в настоящем изобретении предложены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности HCVR, перечисленные в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из каких-либо последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих HCVR и перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding anti-PRLR antibodies or portions thereof. For example, the present invention provides nucleic acid molecules encoding any of the HCVR amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences encoding HCVR and listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности LCVR, перечисленные в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из каких-либо последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих LCVR и перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCVR amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences encoding LCVR and listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности HCDR1, перечисленные в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из каких-либо последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих HCDR1 и перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR1 amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences encoding HCDR1 and listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности HCDR2, перечисленные в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из каких-либо последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих HCDR2 и перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR2 amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences encoding HCDR2 and listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности HCDR3, перечисленные в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из каких-либо последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих HCDR3 и перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR3 amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from any of the nucleic acid sequences encoding HCDR3 and listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности LDR1, перечисленные в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из полинуклеотидных последовательностей LCDR1, перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LDR1 amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from the LCDR1 polynucleotide sequences listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LDR2, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из полинуклеотидных последовательностей LCDR2, перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LDR2 amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from the LCDR2 polynucleotide sequences listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LDR3, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из полинуклеотидных последовательностей LCDR3, перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LDR3 amino acid sequences listed in Table 1. 1. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains a polynucleotide sequence selected from the LCDR3 polynucleotide sequences listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HCVR, отличающиеся тем, что HCVR содержит набор из трех CDR (например, HCDR1-HCDR2-HCDR3), причем набор последовательностей аминокислот HCDR1-HCDR2-HCDR3 определяется любым из иллюстративных антител к PRLR, перечисленных в табл. 1.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding HCVR, characterized in that the HCVR contains a set of three CDRs (e.g., HCDR1-HCDR2-HCDR3), wherein the set of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3 is determined by any of the exemplary anti-PRLR antibodies listed in table. 1.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие LCVR, отличающиеся тем, что LCVR содержит набор из трех CDR (например, LCDR1-LCDR2-LCDR3), причем набор последовательностей аминокислот LCDR1-LCDR2-LCDR3 определяется любым из иллюстративных антител к PRLR, перечисленных в табл. 1.The present invention also provides nucleic acid molecules encoding LCVR, characterized in that the LCVR contains a set of three CDRs (for example, LCDR1-LCDR2-LCDR3), wherein the set of amino acid sequences LCDR1-LCDR2-LCDR3 is determined by any of the exemplary anti-PRLR antibodies listed in table. 1.

В настоящем изобретении предложены также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HCVR и LCVR, отличающиеся тем, что HCVR содержит любую из аминокислотных последовательностейThe present invention also provides nucleic acid molecules encoding HCVR and LCVR, characterized in that HCVR contains any of the amino acid sequences

- 3 040545- 3 040545

HCVR, перечисленных в табл. 1, и тем, что LCVR содержит любую из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит любую полинуклеотидную последовательность, выбранную из полинуклеотидных последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%, и любую полинуклеотидную последовательность, выбранную из полинуклеотидных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 2, или существенно сходную последовательность с уровнем идентичности, составляющим не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В некоторых вариантах осуществления изобретения согласно данному аспекту изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR и LCVR, причем HCVR и LCVR получены из одного из антител к PRLR, перечисленных в табл. 1.HCVR listed in Table. 1, and the fact that LCVR contains any of the LCVR amino acid sequences listed in table. 1. In some embodiments of the invention, the nucleic acid molecule contains any polynucleotide sequence selected from the HCVR polynucleotide sequences listed in table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%, and any polynucleotide sequence selected from the LCVR polynucleotide sequences listed in Table. 2, or a substantially similar sequence with an identity level of at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%. In some embodiments of the invention according to this aspect of the invention, the nucleic acid molecule encodes HCVR and LCVR, and HCVR and LCVR derived from one of the antibodies to PRLR listed in table. 1.

В настоящем изобретении предложены также рекомбинантные векторы экспрессии, способные экспрессировать полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела к PRLR. Например, настоящее изобретение включает рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие любую из вышеупомянутых молекул нуклеиновых кислот, т.е. молекул нуклеиновых кислот, кодирующих любую из последовательностей HCVR, LCVR, и/или CDR, показанных в табл. 1. Также в объем настоящего изобретения включены клетки-хозяева, в которые были введены такие векторы, а также способы получения антител или частей этих антител путем культивирования клеток-хозяев в условиях, позволяющих получать антитела или части антител, и выделение полученных с помощью этих способов антител и частей антител.The present invention also provides recombinant expression vectors capable of expressing a polypeptide containing the heavy or light chain variable region of an anti-PRLR antibody. For example, the present invention includes recombinant expression vectors containing any of the aforementioned nucleic acid molecules, ie. nucleic acid molecules encoding any of the HCVR, LCVR, and/or CDR sequences shown in Table. 1. Also included within the scope of the present invention are host cells into which such vectors have been introduced, as well as methods for producing antibodies or parts of these antibodies by culturing host cells under conditions that allow the production of antibodies or parts of antibodies, and isolating the antibodies obtained using these methods. antibodies and parts of antibodies.

Настоящее изобретение включает антитела к PRLR с модифицированным профилем гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть использована модификация, направленная на удаление нежелательных участков, или антитела без фукозной группы на олигосахаридной цепи для усиления функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Shiedel et al. (2002), JBC, 277:26733). В других вариантах может применяться модификация, представляющая собой галактозилирование, для модификации комплементзависимой цитотоксичности (CDC).The present invention includes antibodies to PRLR with a modified glycosylation profile. In some embodiments, a modification to remove undesired regions or an antibody without a fucose group on the oligosaccharide chain may be used to enhance the function of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) (see Shiedel et al. (2002), JBC, 277:26733) . In other embodiments, a galactosylation modification may be used to modify complement dependent cytotoxicity (CDC).

В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантное человеческое антитело человека или его фрагмент, специфично связывающий рецептор пролактина, и фармацевтически приемлемый носитель. В близком аспекте изобретения предложена композиция, представляющая собой комбинацию антитела к PRLR и второго терапевтического агента. В одном варианте осуществления изобретения второй терапевтический агент является любым агентом, обеспечивающим преимущество в комбинации с антителом к PRLR. В настоящем изобретении предложены также конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC), содержащие антитело к PRLR, конъюгированное с цитотоксическим агентом. Примеры комбинированной терапии, комбинированных лекарственных форм и ADC, содержащих антитела к PRLR по настоящему изобретению, описаны в других документах.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a recombinant human human antibody or fragment thereof that specifically binds the prolactin receptor and a pharmaceutically acceptable carrier. In a related aspect of the invention, a composition is provided that is a combination of an anti-PRLR antibody and a second therapeutic agent. In one embodiment, the second therapeutic agent is any agent that provides an advantage in combination with an anti-PRLR antibody. The present invention also provides antibody drug conjugates (ADC) containing an anti-PRLR antibody conjugated to a cytotoxic agent. Examples of combination therapy, combination dosage forms and ADCs containing the anti-PRLR antibodies of the present invention are described elsewhere.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения, направленные на уничтожение опухолевых клеток или на уменьшение роста опухолевых клеток с помощью использования антитела к PRLR или антигенсвязывающей части антитела согласно настоящему изобретению. Терапевтические способы согласно настоящему аспекту изобретения включают введение терапевтически эффективного количества лекарственного препарата, содержащего антитело или антигенсвязывающую часть антитела согласно изобретению, нуждающемуся в таком лечении пациенту. Нарушением, по поводу которого проводится лечение, является любое заболевание или состояние, течение которого улучшается, облегчается, подавляется или предотвращается в результате направленного воздействия на PRLR и/или подавления опосредованного пролактином сигнального пути с участием PRLR.In another aspect of the present invention, methods of treatment are provided for killing tumor cells or reducing the growth of tumor cells using an anti-PRLR antibody or an antigen-binding portion of an antibody of the present invention. Therapeutic methods of this aspect of the invention comprise administering a therapeutically effective amount of a medicament containing an antibody or antigen-binding portion of an antibody of the invention to a patient in need of such treatment. A treatable disorder is any disease or condition that is ameliorated, alleviated, suppressed, or prevented by targeting PRLR and/or downregulating a prolactin-mediated signaling pathway involving PRLR.

Другие варианты осуществления изобретения становятся очевидными при рассмотрении подробного описания изобретения.Other embodiments of the invention become apparent upon consideration of the detailed description of the invention.

Подробное описаниеDetailed description

Перед тем как перейти к описанию настоящего изобретения, важное понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными частными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена лишь описания частных вариантов осуществления изобретения, и не является ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.Before describing the present invention, it is important to understand that the present invention is not limited to the particular methods and experimental conditions described, as such methods and conditions may vary. It should also be understood that the terminology used herein is only intended to describe particular embodiments of the invention, and is not limiting, since the scope of the present invention is limited only by the appended claims.

Все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют значение, обыкновенно принятое специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение, если не определено иным образом. В настоящем документе термин приблизительно используется в отношении определенного указанного численного значения и означает, что значение может отличаться от указанного количества не более чем на 1%. Например, в настоящем документе приблизительно 100 включает и 99, и 101, и все промежуточные значения (например, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 и т.д.).All technical and scientific terms used herein have the meaning generally accepted by those skilled in the art to which the present invention pertains, unless otherwise defined. In this document, the term is used approximately in relation to a certain specified numerical value and means that the value may differ from the specified amount by no more than 1%. For example, in this document, approximately 100 includes both 99 and 101, and all values in between (eg, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).

Хотя при практическом использовании или при испытаниях настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем докуWhile any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention,

- 4 040545 менте, далее описаны предпочтительные способы и материалы.- 4 040545 mente, the preferred methods and materials are described below.

Определения.Definitions.

Выражение рецептор пролактина, PRLR и аналогичные термины, используемые в настоящем документе, относятся к человеческому рецептору пролактина, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 404. Выражение PRLR включает мономерные и мультимерные молекулы рецептора пролактина. В настоящем документе выражение мономерный человеческий рецептор пролактина означает белок PRLR или его часть, который не содержит и не обладает мультимеризующими и существует в нормальных условиях как отдельная молекула PRLR без прямого физического соединения с другой молекулой PRLR. Примером мономерной молекулы рецептора пролактина является молекула, упоминаемая в настоящем документе как hPRLR.mmh, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 401 (см., например, пример 3). В настоящем документе, выражение димерный человеческий PRLR означает конструкцию, содержащую две молекулы PRLR, соединенные линкером, ковалентной связью, нековалентной связью или через мультимеризующий домен, например домен антитела Fc. Примером димерной молекулы PRLR является молекула, упоминаемая в настоящем документе как hPRLR.mFc, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 402 (например, пример 3).The expression prolactin receptor, PRLR and similar terms used herein refer to the human prolactin receptor comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 404. The expression PRLR includes monomeric and multimeric prolactin receptor molecules. As used herein, the expression "monomeric human prolactin receptor" means a PRLR protein or portion thereof that does not contain or possess multimerizing and exists under normal conditions as a single PRLR molecule without a direct physical connection to another PRLR molecule. An example of a monomeric prolactin receptor molecule is the molecule referred to herein as hPRLR.mmh, containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 401 (see, for example, example 3). As used herein, the term "dimeric human PRLR" refers to a construct containing two PRLR molecules connected by a linker, covalent bond, non-covalent bond, or through a multimerizing domain, such as an Fc antibody domain. An example of a dimeric PRLR molecule is the molecule referred to herein as hPRLR.mFc containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 402 (eg Example 3).

Все упоминания белков, полипептидов и фрагментов белков относятся к человеческой версии соответствующего белка, полипептида или части белка, кроме случаев, когда в явной форме указано их нечеловеческое происхождение. Таким образом, выражение PRLR означает человеческий PRLR, если не указано, что этот рецептор имеет нечеловеческое происхождение, например мышиный PRLR, обезьяний PRLR и т.д.All references to proteins, polypeptides, and protein fragments refer to the human version of the corresponding protein, polypeptide, or protein portion, unless explicitly stated to be non-human. Thus, the expression PRLR means human PRLR unless the receptor is stated to be of non-human origin, such as mouse PRLR, monkey PRLR, etc.

В настоящем документе, выражение экспрессируемый на клеточной поверхности PRLR означает один или несколько белков рецептора пролактина или его внеклеточный домен, экспрессируемый на поверхности клетки in vitro или in vivo, так что, по крайней мере, часть белка PRLR находится на внеклеточной стороне клеточной мембраны и доступна для антигенсвязывающей части антитела. Экспрессируемый на клеточной поверхности PRLR может включать или состоять из белка рецептора пролактина, экспрессируемого на поверхности клетки, которая в норме экспрессирует белок PRLR. Альтернативно экспрессируемый на клеточной поверхности PRLR может содержать или состоять из белка PRLR, экспрессируемого на поверхности клетки, которая в норме не экспрессирует человеческий PRLR на своей поверхности, но экспрессирует его в результате искусственного применения методов инженерии.As used herein, cell surface expressed PRLR means one or more prolactin receptor proteins or its extracellular domain expressed on the cell surface in vitro or in vivo such that at least a portion of the PRLR protein is located on the extracellular side of the cell membrane and is accessible for the antigen-binding portion of an antibody. Cell surface expressed PRLR may include or consist of a prolactin receptor protein expressed on the surface of a cell that normally expresses the PRLR protein. Alternatively, a cell surface-expressed PRLR may comprise or consist of a PRLR protein expressed on the surface of a cell that does not normally express human PRLR on its surface, but expresses it through artificially engineered techniques.

В настоящем документе выражение антитело к PRLR включает моновалентные антитела, обладающие моноспецифичностью, а также биспецифичные антитела, содержащие первый домен, связывающий PRLR, и второй домен, связывающий второй (целевой) антиген, причем домен, связывающий PRLR, содержит любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, перечисленных в табл. 1 в настоящем документе. Выражение антитело к PRLR включает также конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC), содержащие антитело к PRLR или антигенсвязывающий фрагмент антитела, конъюгированного с лекарственным средством или токсином (т.е. цитотоксическим агентом). Выражение антитело к PRLR также включает конъюгаты антитела с радионуклидом (ARC), содержащие антитело к PRLR или антигенсвязывающий фрагмент такого антитела, конъюгированного с радиоТерииномантитело в настоящем документе означает любую антигенсвязывающую молекулу или молекулярный комплекс, включающий по крайней мере один участок, определяющий комплементарность (CDR), в частности, связывающийся или взаимодействующий с определенным антигеном (например, PRLR). Термин антитело включает молекулы иммуноглобулина, включающие четыре полипептидные цепи, две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, соединенные дисульфидными связями, а также образованные ими мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена CH1, CH2 и CH₃. Каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи (сокращенно LCVR или V_L) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (C_L1). Области V_H и V_L могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), рассеянные между участками с более консервативными последовательностями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая область V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении с N-концевой области до C-концевой области в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных вариантах осуществления изобретения области FR антитела к PRLR (или антигенсвязывающего фрагмента антитела) идентичны последовательностям зародышевой линии человека или могу быть модифицированными в естественных условиях или искусственно. Консенсусную аминокислотную последовательность можно определить посредством прямого сравнительного анализа двух или нескольких участков CDR.As used herein, the term "anti-PRLR antibody" includes monovalent antibodies having monospecificity, as well as bispecific antibodies containing a first PRLR binding domain and a second (target) antigen binding domain, wherein the PRLR binding domain comprises any of the HCVR/LCVR sequences. or CDR listed in the table. 1 in this document. The term anti-PRLR antibody also includes antibody drug conjugates (ADC) containing an anti-PRLR antibody or an antigen-binding fragment of an antibody conjugated to a drug or toxin (ie, a cytotoxic agent). The expression "anti-PRLR antibody" also includes antibody radionuclide conjugates (ARC) containing an anti-PRLR antibody or an antigen-binding fragment of such an antibody conjugated to a radiotheriino-antibody as used herein means any antigen-binding molecule or molecular complex comprising at least one complementarity determining region (CDR) , in particular, binding or interacting with a specific antigen (for example, PRLR). The term antibody includes immunoglobulin molecules comprising four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains connected by disulfide bonds, as well as the multimers (eg, IgM) formed by them. Each heavy chain includes a heavy chain variable region (abbreviated as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains CH1, CH2 and CH ₃ . Each light chain includes a light chain variable region (abbreviated as LCVR or V _L ) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one domain (C _L 1). The V _H and V _L regions can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs) scattered between regions with more conserved sequences called framework regions (FRs). Each V _H and V _L region consists of three CDRs and four FRs, arranged from N-terminal region to C-terminal region in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. In various embodiments, the FR regions of an anti-PRLR antibody (or antigen-binding antibody fragment) are identical to human germline sequences, or may be naturally or artificially modified. The consensus amino acid sequence can be determined by direct comparison of two or more CDR regions.

В настоящем документе термин антитело включает также антигенсвязывающие фрагменты полных молекул антитела. Термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и т.п. в настоящем документе включают любой природный, полученный в результате ферментативной реакции, синтетический или генно-инженерный полипептид или гликопротеид, который специфично связывается с антигеном с формированием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антиAs used herein, the term antibody also includes antigen-binding fragments of complete antibody molecules. The terms antigen-binding portion of an antibody, antigen-binding fragment of an antibody, and the like. herein include any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic, or engineered polypeptide or glycoprotein that specifically binds to an antigen to form a complex. antigen-binding fragments

- 5 040545 тела могут быть получены, например, из полных молекул антитела с помощью любых подходящих стандартных способов, таких как протеолитическое расщепление, или генно-инженерных методов, включающих манипуляции и экспрессию ДНК вариабельных и в некоторых случаях константных областей антитела. Такая ДНК известна и/или может быть легко получена, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (включая, например, фаговую библиотеку антител) либо синтезирована. ДНК может быть секвенирована и подвергнута химическим манипуляциям либо манипуляциям с использованием молекулярно-биологических методов, например, для реаранжировки одного или нескольких вариабельных и/или константных доменов с формированием подходящей конфигурации, для введения кодонов, создания цистеиновых остатков, модификации, добавления или исключения аминокислот и т.д.- 5 040545 bodies can be obtained, for example, from complete antibody molecules using any suitable standard methods, such as proteolytic cleavage, or genetic engineering methods, including manipulation and expression of DNA variable and in some cases constant regions of the antibody. Such DNA is known and/or can be readily obtained, for example, from commercial sources, DNA libraries (including, for example, an antibody phage library), or synthesized. The DNA can be sequenced and subjected to chemical manipulations or manipulations using molecular biological methods, for example, to rearrange one or more variable and/or constant domains into an appropriate configuration, to introduce codons, create cysteine residues, modify, add or exclude amino acids, and etc.

Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают (i) фрагменты Fab;Non-limiting examples of antigen-binding fragments include (i) Fab fragments;

(ii) фрагменты F(ab')2;(ii) F(ab')2 fragments;

(iii) фрагменты Fd;(iii) Fd fragments;

(iv) фрагменты Fv;(iv) Fv fragments;

(v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv);(v) single chain Fv molecules (scFv);

(vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область антитела (например, выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR), например пептид CDR3) или пептид с ограниченной конформационной свободой FR3CDR3-FR4.(vi) dAb fragments; and (vii) minimal recognition units consisting of amino acid residues that mimic the hypervariable region of an antibody (e.g., a distinct complementarity determining region (CDR), such as a CDR3 peptide) or a FR3CDR3-FR4 conformationally restricted peptide.

Другие молекулы, полученные методами молекулярной инженерии, такие как домен-специфичные антитела, однодоменные антитела, антитела, полученные в результате удаления домена, химерные антитела, антитела с привитым CDR, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные нанотела, бивалентные нанотела и т.д.), иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (SMIP) и вариабельные области IgNAR акулы также включены в выражение антигенсвязывающий фрагмент антитела в настоящем документе.Other molecularly engineered molecules such as domain specific antibodies, single domain antibodies, domain deletion antibodies, chimeric antibodies, CDR grafted antibodies, diabodies, tribodies, tetrabodies, minibodies, nanobodies (e.g., monovalent nanobodies, bivalent nanobodies, etc.), small modular protein (SMIP) immunopharmaceuticals, and shark IgNAR variable regions are also included in the expression antigen-binding antibody fragment herein.

Антигенсвязывающий фрагмент, как правило, содержит по крайней мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотный состав и обычно содержит по крайней мере один CDR, смежный по или находящийся в пределах последовательности одного или нескольких каркасных участков. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен VH, ассоциированный с доменом V_L, домены VH и V_L могут быть расположены относительно друг друга в любой подходящей конфигурации. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. Альтернативно антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен VH или VL.An antigen binding fragment typically contains at least one variable domain. The variable domain may be of any size or amino acid composition, and typically contains at least one CDR contiguous or within the sequence of one or more framework regions. In antigen binding fragments having a VH domain associated with a V _L domain, the VH and V _L domains may be positioned relative to each other in any suitable configuration. For example, the variable region may be dimeric and contain VH-VH, VH-VL, or VL-VL dimers. Alternatively, an antigen-binding fragment of an antibody may comprise a VH or VL monomeric domain.

В определенных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по крайней мере один вариабельный домен, соединенный ковалентной связью по крайней мере с одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут быть обнаружены в антигенсвязывающем фрагменте антитела согласно настоящему изобретению, включают (i) Vh-Ch1;In certain embodiments, an antigen-binding fragment of an antibody may comprise at least one variable domain covalently linked to at least one constant domain. Non-limiting exemplary variable and constant domain configurations that can be found in an antigen-binding fragment of an antibody of the present invention include (i) Vh-Ch1;

(ii) Vh-Ch2;(ii) Vh-Ch2;

(iii) Vh-Ch3;(iii) Vh-Ch3;

(iv) Vh-Ch1-Ch2;(iv) Vh-Ch1-Ch2;

(v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3;(v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3;

(vi) Vh-Ch2-Ch3;(vi) Vh-Ch2-Ch3;

(vii) Vh-Cl;(vii) Vh-Cl;

(viii) Vl-Ch1;(viii) Vl-Ch1;

(ix) Vl-Ch2;(ix) Vl-Ch2;

(x) Vl-CH₃;(x) Vl-CH ₃ ;

(xi) Vl-Ch1-Ch2;(xi) Vl-Ch1-Ch2;

(xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3;(xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3;

(xiii) Vl-Ch2-Ch3; и (xiv) Vl-Cl.(xiii) Vl-Ch2-Ch3; and (xiv) Vl-Cl.

В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, включая любую из упомянутых выше иллюстративных конфигураций, вариабельные и константные домены могут быть связаны друг с другом либо непосредственно, либо через полный или частичный шарнирный или линкерный участок. Шарнирный участок может состоять не менее чем из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, что приводит к гибкой или полугибкой связи между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по данному изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) с любой из вышеперечисленных конфигураций вариабельного и константного доменов в нековалентной ассоциации друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами VH или V_L (наприIn any configuration of the variable and constant domains, including any of the exemplary configurations mentioned above, the variable and constant domains may be linked to each other either directly or through a complete or partial hinge or linker region. A hinge region may be at least 2 (e.g., 5, 10, 15, 20, 40, 60 or more) amino acids, resulting in a flexible or semi-flexible bond between adjacent variable and/or constant domains in a single polypeptide molecule. In addition, an antigen-binding fragment of an antibody of the invention may comprise a homodimer or heterodimer (or other multimer) with any of the above variable and constant domain configurations in non-covalent association with each other and/or with one or more VH or V _L monomeric domains (e.g.

- 6 040545 мер, посредством дисульфидной связи).- 6 040545 measures, through a disulfide bond).

Антигенсвязывающие фрагменты, как и полноразмерные антитела, могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными (например, биспецифичными). Мультиспецифичный антигенсвязывающий фрагмент антитела, как правило, содержит не менее двух различных вариабельных доменов, при этом каждый вариабельный домен способен специфично связываться с отдельным антигеном или с другим эпитопом на том же антигене. Любой мультиспецифичный формат антитела, включая иллюстративные биспецифичные форматы антитела согласно настоящему изобретению, может быть адаптирован к использованию в контексте антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению при использовании стандартных приемов, доступных специалисту в данной области.Antigen binding fragments, like full length antibodies, can be monospecific or multispecific (eg, bispecific). A multispecific antigen-binding fragment of an antibody typically contains at least two different variable domains, with each variable domain being able to specifically bind to a single antigen or to a different epitope on the same antigen. Any multispecific antibody format, including exemplary bispecific antibody formats of the present invention, can be adapted for use in the context of an antigen binding fragment of the present invention using standard techniques available to one of skill in the art.

Антитела по настоящему изобретению могут функционировать посредством механизма комплементзависимой цитотоксичности (CDC) или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). Термин комплементзависимая цитотоксичность (CDC) относится к лизису экспрессирующих антиген клеток антителом, описанным в изобретении, в присутствии комплемента. Термин антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC) относится к опосредованной клеткой реакции, в которой неспецифичные цитотоксические клетки, экспрессирующие рецепторы Fc (FcRs) (например, клетки естественного киллера (NK-клетки), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на целевой клетке, что приводит к лизису целевой клетки. CDC и ADCC могут быть измерены с помощью методов, которые известны и доступны специалистам в данной области отрасли (см., например, патент США № 5500362 и 5821337; и Clynes et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., (США), 95:652-656). Константная область антитела важна для способности антитела фиксировать комплемент и участвовать в клеточноопосредованной цитотоксичности. Таким образом, изотип антитела может быть выбран исходя из того, желательно ли, чтобы антитело опосредовало цитотоксичность.The antibodies of the present invention can function through the mechanism of complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). The term complement-dependent cytotoxicity (CDC) refers to the lysis of antigen-expressing cells by an antibody of the invention in the presence of complement. The term antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) refers to a cell-mediated reaction in which non-specific cytotoxic cells expressing Fc receptors (FcRs) (e.g., natural killer cells (NK cells), neutrophils, and macrophages) recognize bound antibody on the target cell, which leads to lysis of the target cell. CDC and ADCC can be measured using methods known and available to those skilled in the art (see, for example, US Pat. Nos. 5,500,362 and 5,821,337; and Clynes et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), 95:652-656). The constant region of an antibody is important for the ability of an antibody to fix complement and participate in cell-mediated cytotoxicity. Thus, the antibody isotype can be selected based on whether it is desirable for the antibody to mediate cytotoxicity.

В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению являются человеческими антителами. Термин человеческое антитело в настоящем документе включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела, описанные в изобретении, могут включать аминокислотные остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, в результате мутаций, возникших в результате случайного или сайтспецифичного мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, на участке CDR и в частности CDR3. Однако термин человеческое антитело в настоящем документе не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, например мыши, были привиты на последовательности каркасных участков человека.In certain embodiments, the antibodies of the present invention are human antibodies. The term human antibody as used herein includes antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies of the invention may include amino acid residues of amino acids not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., from mutations resulting from in vitro random or site-specific mutagenesis or in vivo somatic mutation), for example, at the CDR region and at particular CDR3. However, the term human antibody as used herein does not include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted onto human framework sequences.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела согласно настоящему изобретению могут быть рекомбинантными человеческими антителами. Термин рекомбинантное человеческое антитело в настоящем документе включает все человеческие антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными методами, например антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, которым была трансфицирована клетка-хозяин (как описано далее), антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных человеческих антител (как описано далее), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992), Nucl. Acids. Res., 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, включающим соединение последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей гена иммуноглобулина зародышевой линии человека. В определенных вариантах осуществления изобретения, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают in vitro мутагенезу (или когда используется животное, трансгенное для последовательностей Ig человека, in vivo соматическому мутагенезу), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и V_L рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, после получения и будучи родственными зародышевой линии человека в последовательностях V_H и V_L, могут существовать в не являющимся природным репертуаре зародышевой линии антитела человека in vivo.In some embodiments, the antibodies of the present invention may be recombinant human antibodies. The term recombinant human antibody as used herein includes all human antibodies produced, expressed, generated, or isolated by recombinant methods, e.g., antibodies expressed using a recombinant expression vector that has been transfected into a host cell (as described below), combinatorial human antibodies (as described below), antibodies isolated from an animal (e.g., mouse) that is transgenic for human immunoglobulin genes (see, e.g., Taylor et al. (1992), Nucl. Acids. Res., 20: 6287-6295), or antibodies produced, expressed, made or isolated by any other method, which involves joining human immunoglobulin gene sequences with other DNA sequences. Such recombinant human antibodies have variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin gene sequences. In certain embodiments, however, such recombinant human antibodies are subjected to in vitro mutagenesis (or, when an animal transgenic for human Ig sequences is used, in vivo somatic mutagenesis), and thus the amino acid sequences of the VH and V _L regions of the recombinant antibodies are sequences , which, when produced and related to the human germline in the sequences V _H and V _L , may exist in the non-natural germline repertoire of the human antibody in vivo.

Человеческие антитела могут существовать в двух формах, ассоциированных с неоднородностью шарнирного участка. В одной форме молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию массой приблизительно 150-160 килодальтон, в которой димеры удерживаются рядом друг с другом межцепочечной дисульфидной связью между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связаны межцепочечными дисульфидными связями и образуется молекула массой приблизительно 75-80 килодальтон, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепи (полу). Эти формы было чрезвычайно трудно разделить даже после аффинной очистки.Human antibodies can exist in two forms associated with hinge heterogeneity. In one form, the immunoglobulin molecule contains a stable four-chain construct of approximately 150-160 kilodaltons in which the dimers are held adjacent to each other by an interchain disulfide bond between the heavy chains. In the second form, the dimers are not linked by interchain disulfide bonds and a molecule weighing approximately 75-80 kilodaltons is formed, consisting of covalently linked light and heavy chains (semi). These forms were extremely difficult to separate even after affine purification.

Частота присутствия второй формы в различных интактных изотипах IgG происходит, в частности, из-за структурных различий, ассоциированных с изотипом шарнирного участка антитела. Замена одной аминокислоты на шарнирном участке IgG4 человека может значительно уменьшить присутствие второй формы (Angal et al. (1993), Molecular Immunology, 30:105) до уровня, обычно наблюдаемого при исполь- 7 040545 зовании шарнира человеческого IgGl. Настоящее изобретение включает антитела, имеющие одну или несколько мутаций на шарнирном участке, в области CH2 или CH3, которые могут быть желательными, например, при получении антитела для повышения выхода желаемой формы антитела.The frequency of the presence of the second form in various intact IgG isotypes is due, in part, to structural differences associated with the antibody hinge isotype. A single amino acid change at the human IgG4 hinge can significantly reduce the presence of the second form (Angal et al. (1993), Molecular Immunology, 30:105) to levels normally seen with the human IgGl hinge. The present invention includes antibodies having one or more mutations in the hinge region, in the CH2 or CH3 region, which may be desirable, for example, in the preparation of an antibody to increase the yield of the desired form of the antibody.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть выделенными антителами. В настоящем документе выделенное антитело означает антитело, которое было идентифицировано и отделено или извлечено по крайней мере из одного компонента природной среды. Например, в целях настоящего изобретения выделенным антителом является антитело, которое было отделено или удалено по крайней мере из одного компонента организма, ткани или клетки, в которой антитело в естественных условиях существует или образуется. Термин выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела являются антителами, подвергнутыми по крайней мере одному этапу очистки или выделения. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения выделенное антитело может по существу не содержать другой клеточный материал и/или химические соединения.The antibodies of the present invention may be isolated antibodies. As used herein, an isolated antibody means an antibody that has been identified and isolated or recovered from at least one component of the natural environment. For example, for purposes of the present invention, an isolated antibody is an antibody that has been isolated or removed from at least one component of an organism, tissue, or cell in which the antibody naturally exists or is produced. The term isolated antibody also includes an antibody in situ in a recombinant cell. Isolated antibodies are antibodies that have undergone at least one purification or isolation step. In certain embodiments, the isolated antibody may be substantially free of other cellular material and/or chemical compounds.

Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению могут содержать одну или несколько аминокислотных замен, инсерций и/или делеций в каркасном участке и/или участках CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены антитела. Такие мутации могут быть легко установлены путем сравнения аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, в открытых базах данных последовательностей антител. Настоящее изобретение включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, полученные из любой аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящем документе, причем одна или несколько аминокислот в одном или нескольких каркасных участках и/или участках CDR в результате мутации изменены на соответствующий остаток последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело, или на соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии человека, или на замену консервативной аминокислоты соответствующего(их) остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности в настоящем документе объединены под названием мутации зародышевой линии). Специалист в данной области техники может легко получить антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител начиная с последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, раскрытых в настоящем документе, которые содержат одну или несколько индивидуальных мутаций зародышевой линии или их комбинацию. В определенных вариантах осуществления изобретения все остатки, которые входят в состав каркасного участка или участка CDR в пределах VH и/или VL, мутировали к первоначальному виду, в котором они присутствовали в оригинальной последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело. В других вариантах осуществления изобретения только определенные остатки мутировали к первоначальному виду в оригинальную последовательность зародышевой линии, например только мутировавшие остатки обнаружены в первых 8 аминокислотах участка FR1 или в последних 8 аминокислотах участка FR4 или только мутировавшие остатки обнаружены на участках CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления изобретения один или несколько каркасных участков и/или остатков CDR мутировали с образованием соответствующего(их) остатка(ов) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, отличающейся от последовательности зародышевой линии, из которой антитело было первоначально получено). Кроме того, антитела согласно настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию двух или больше мутаций зародышевой линии в каркасном участке и/или участках CDR, например, в котором отдельные остатки мутировали с образованием соответствующих остатков определенной последовательности зародышевой линии, в то время как определенные другие остатки, отличающиеся от оригинальной последовательности зародышевой линии, сохранялись или мутировали с образованием соответствующего остатка другой последовательности зародышевой линии. Полученные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или несколько мутаций зародышевой линии, могут быть легко испытаны на наличие одного или нескольких желаемых свойств, например улучшенной специфичности связывания, повышенной аффинности связывания, улучшенных или усиленных антагонистических или агонистических биологических свойств (в зависимости от обстоятельств), сниженной иммуногенности. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, полученные этим общим способом, включены в настоящее изобретение.The anti-PRLR antibodies of the present invention may contain one or more amino acid substitutions, insertions and/or deletions in the framework and/or CDR regions of the heavy and light chain variable domains compared to the corresponding germline sequences from which the antibodies were derived. Such mutations can be readily identified by comparing the amino acid sequences described herein with germline sequences available, for example, in public antibody sequence databases. The present invention includes antibodies and antigen-binding antibody fragments derived from any amino acid sequence disclosed herein, wherein one or more amino acids in one or more framework regions and/or CDR regions are mutated to the corresponding residue of the germline sequence from which it was an antibody is generated, either to the corresponding residue of another human germline sequence, or to a conservative amino acid substitution of the corresponding germline residue(s) (such sequence changes are collectively referred to herein as germline mutations). One of skill in the art can easily make antibodies and antigen-binding antibody fragments starting from the heavy and light chain variable region sequences disclosed herein that contain one or more individual germline mutations, or a combination thereof. In certain embodiments, all residues that are part of a framework or CDR region within VH and/or VL are mutated to the original form in which they were present in the original germline sequence from which the antibody was derived. In other embodiments, only certain residues are mutated back to their original form in the original germline sequence, for example, only mutated residues are found in the first 8 amino acids of the FR1 region or in the last 8 amino acids of the FR4 region, or only mutated residues are found in the CDR1, CDR2, or CDR3 regions. In other embodiments, one or more framework regions and/or CDR residues have been mutated to form the corresponding residue(s) of a different germline sequence (i.e., a germline sequence that differs from the germline sequence from which the antibody was originally received). In addition, the antibodies of the present invention may contain any combination of two or more germline mutations in the framework region and/or CDR regions, for example, in which certain residues are mutated to form the corresponding residues of a particular germline sequence, while certain other residues, different from the original germline sequence were retained or mutated to form the corresponding residue of a different germline sequence. The resulting antibodies and antigen-binding fragments containing one or more germline mutations can be readily tested for one or more desired properties, such as improved binding specificity, increased binding affinity, improved or enhanced antagonistic or agonistic biological properties (as applicable), reduced immunogenicity. Antibodies and antigen-binding antibody fragments obtained by this general method are included in the present invention.

Настоящее изобретение также включает антитела к PRLR, содержащие варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе и имеющих одну или несколько консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает антитела к PRLR, имеющие аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативными заменами аминокислот относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, показанных в табл. 1.The present invention also includes anti-PRLR antibodies containing variants of any of the HCVR, LCVR and/or CDR amino acid sequences disclosed herein and having one or more conservative substitutions. For example, the present invention includes anti-PRLR antibodies having the amino acid sequences of HCVR, LCVR, and/or CDR, e.g., 10 or less, 8 or less, 6 or less, 4 or less, etc. conservative amino acid substitutions relative to any of the amino acid sequences of HCVR, LCVR and/or CDR shown in table. 1.

Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфичным антигенсвязывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Единственный антиген может иметь несколько эпитопов. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными областями антигена и оказывать различные биологические эффекты. Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образуется при пространст- 8 040545 венном сопоставлении аминокислот из различных сегментов линейной полипептидной цепи. При определенных обстоятельствах эпитоп может включать функциональные группы сахаридов, фосфорильных или сульфонильных групп на антигене.The term epitope refers to an antigenic determinant that interacts with a specific antigen-binding site in the variable region of an antibody molecule known as a paratope. A single antigen can have multiple epitopes. Thus, different antibodies can bind to different regions of the antigen and have different biological effects. Epitopes may be conformational or linear. A conformational epitope is formed by a spatial comparison of amino acids from different segments of a linear polypeptide chain. Under certain circumstances, the epitope may include functional groups of saccharides, phosphoryl or sulfonyl groups on the antigen.

Термин существенная идентичность или по существу идентичный, относящийся к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, указывает, что при оптимальном выравнивании с соответствующими инсерциями или делециями нуклеотидов с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) существует идентичность нуклеотидной последовательности не менее приблизительно 95% и более предпочтительно не менее приблизительно 96, 97, 98 или 99% нуклеотидных оснований, измеренная при использовании любого известного алгоритма проверки идентичности последовательностей, например FASTA, BLAST или Gap, как обсуждается ниже. Молекула нуклеиновой кислоты, обладающая существенной идентичностью по отношению к референтной молекуле нуклеиновой кислоты в определенных случаях может кодировать полипептид, имеющий ту же или существенно сходную аминокислотную последовательность как и полипептид, закодированный референтной молекулой нуклеиновой кислоты.The term substantial identity or substantially identical, referring to a nucleic acid or fragment thereof, indicates that, when optimally aligned with corresponding nucleotide insertions or deletions with another nucleic acid (or its complementary strand), there is a nucleotide sequence identity of at least about 95%, and more preferably at least about 96%, 97%, 98%, or 99% nucleotide bases, as measured using any known sequence identity verification algorithm, such as FASTA, BLAST, or Gap, as discussed below. A nucleic acid molecule that is substantially identical to a reference nucleic acid molecule may, in certain instances, encode a polypeptide having the same or substantially similar amino acid sequence as the polypeptide encoded by the reference nucleic acid molecule.

В отношении полипептидов термин существенное сходство или существенно сходный означает, что для двух пептидных последовательностей при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT при использовании штрафа за открытие гэпа по умолчанию идентичность последовательностей составляет не менее 95%, более предпочтительно 98 или 99%. Предпочтительно когда положения неидентичных остатков отличаются консервативными заменами аминокислоты. Консервативная замена аминокислоты означает замену, в которой аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (R-группа) с сходными химическими свойствами (например, применительно к заряду или гидрофобности). В целом консервативная замена аминокислоты существенно не изменяет функциональные свойства белка. В случаях где две или больше последовательности аминокислот отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности последовательности или степень сходства могут быть увеличены для исправления консервативной природы замены. Средства для внесения такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области техники. См, например, Pearson (1994), Methods Mol. Biol., 24:307-331.With respect to polypeptides, the term significant similarity or substantially similar means that for two peptide sequences when optimally aligned, for example, using the GAP or BESTFIT programs using the default gap penalty, the sequence identity is at least 95%, more preferably 98 or 99% . Preferably, the positions of non-identical residues differ by conservative amino acid substitutions. A conservative amino acid substitution means a substitution in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (eg, in terms of charge or hydrophobicity). In general, conservative amino acid substitution does not significantly change the functional properties of the protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent sequence identity or degree of similarity may be increased to correct for the conservative nature of the substitution. Means for making such adjustments are well known to those skilled in the art. See, for example, Pearson (1994), Methods Mol. Biol., 24:307-331.

Примеры групп аминокислот, имеющих боковые цепи с сходными химическими свойствами, включают (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин;Examples of groups of amino acids having side chains with similar chemical properties include (1) aliphatic side chains: glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine;

(2) алифатически-гидроксильные боковые цепи: серин и треонин;(2) aliphatic hydroxyl side chains: serine and threonine;

(3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глютамин;(3) amide-containing side chains: asparagine and glutamine;

(4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан;(4) aromatic side chains: phenylalanine, tyrosine and tryptophan;

(5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин;(5) main side chains: lysine, arginine and histidine;

(6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат; и (7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин.(6) acidic side chains: aspartate and glutamate; and (7) sulfur-containing side chains: cysteine and methionine.

Предпочтительными консервативно замещающими группами аминокислот являются валин-лейцинизолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и глютаминаспарагин. Альтернативно консервативной заменой является любое изменение с положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия PAM250, описанной Gonnet et al. (1992), Science, 256:1443-1445. Умеренно консервативная замена - это любое изменение, имеющее неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия PAM250.Preferred conservative amino acid substitution groups are valine-leucine isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, glutamate-aspartate, and glutamine-sparagine. Alternatively, a conservative substitution is any change with a positive value in the PAM250 log-likelihood matrix described by Gonnet et al. (1992), Science, 256:1443-1445. A moderately conservative substitution is any change that has a non-negative value in the PAM250 log-likelihood matrix.

Для измерения сходства последовательностей полипептидов, также называемого идентичностью последовательностей, как правило, используют программное обеспечение для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков сопоставляет сходные последовательности, используя меры сходства, присвоенные различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные замены аминокислот. Например, программное обеспечение GCG включает программы, такие как Gap и Bestfit, которые могут использоваться с параметрами по умолчанию для определения степени гомологии последовательностей или идентичности последовательностей близкородственных полипептидов, например гомологичных полипептидов различных видов организмов или белком дикого типа и его мутантным вариантом. См, например, программное обеспечение GCG, версию 6.1. Для сравнения полипептидных последовательностей может применяться также программное обеспечение FASTA с использованием рекомендуемых параметров или параметров по умолчанию, программы GCG, версия 6.1. Программа FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивание и определения процента идентичности последовательностей в областях с наилучшим совпадением запрашиваемой и исследуемой последовательностей (Pearson (2000), см. выше). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности согласно изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей различных организмов, является компьютерная программа BLAST, в частности BLASTP или TBLASTN, с помощью параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410; и Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-402.Sequence analysis software is typically used to measure sequence similarity of polypeptides, also referred to as sequence identity. Protein analysis software matches similar sequences using measures of similarity assigned to various substitutions, deletions, and other modifications, including conservative amino acid substitutions. For example, the GCG software includes programs such as Gap and Bestfit that can be used with default parameters to determine the degree of sequence homology or sequence identity of closely related polypeptides, such as homologous polypeptides from different species, or a wild-type protein and a mutant variant thereof. See, for example, GCG software version 6.1. For comparison of polypeptide sequences, the FASTA software can also be used using the recommended parameters or the default parameters, GCG software version 6.1. The FASTA program (eg, FASTA2 and FASTA3) provides alignment and percent sequence identity determinations in regions with the best match between the query and test sequences (Pearson (2000), supra). Another preferred algorithm for comparing a sequence according to the invention with a database containing a large number of sequences from different organisms is the BLAST computer program, in particular BLASTP or TBLASTN, using default parameters. See, for example, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410; and Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-402.

pH-зависимое связывание.pH dependent binding.

Настоящее изобретение включает антитела к PRLR с pH-зависимыми характеристиками связывания. Например, антитело к PRLR согласно настоящему изобретению может демонстрировать сниженноеThe present invention includes anti-PRLR antibodies with pH dependent binding characteristics. For example, an anti-PRLR antibody of the present invention may show reduced

- 9 040545 связывание с рецептором пролактина при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. Альтернативно антитела к PRLR согласно настоящему изобретению проявляют повышенное связывание с рецептором пролактина при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. Выражение кислый pH включает значения pH менее приблизительно 6,2, например приблизительно 6.0, 5.95, 5.9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0 или меньше. В настоящем документе выражение нейтральный pH означает pH приблизительно от 7,0 приблизительно до 7,4. Выражение нейтральный pH включает значения pH приблизительно 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 и 7.4.- 9 040545 binding to the prolactin receptor at acidic pH compared to neutral pH. Alternatively, the anti-PRLR antibodies of the present invention show increased binding to the prolactin receptor at acidic pH compared to neutral pH. The term acidic pH includes pH values less than about 6.2, such as about 6.0, 5.95, 5.9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0 or less. As used herein, neutral pH means a pH of about 7.0 to about 7.4. The expression neutral pH includes pH values of approximately 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 and 7.4.

В определенных случаях сниженное связывание с PRLR при кислом pH по сравнению с нейтральным pH выражают как отношения значения K_D связывания антитела с PRLR при кислом pH к значению K_D связывания антитела с PRLR при нейтральном pH (или наоборот). Например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела могут рассматриваться, как проявляющие сниженное связывание с рецептором пролактина при кислом pH по сравнению с нейтральным pH в целях настоящего изобретения, если для антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела отношение K_D в кислой/нейтральной среде составляет приблизительно 3,0 или выше. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления изобретения отношение K_D в кислой/нейтральной среде в кислой/нейтральной среде для антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению может быть приблизительно 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 или выше.In certain cases, reduced binding to PRLR at acidic pH compared to neutral pH is expressed as the ratio of the K _D value of antibody binding to PRLR at acidic pH to the K _D value of antibody binding to PRLR at neutral pH (or vice versa). For example, an antibody or antigen-binding antibody fragment may be considered to exhibit reduced binding to the prolactin receptor at acidic pH compared to neutral pH for the purposes of the present invention if the antibody or antigen-binding antibody fragment has an acidic/neutral K _D ratio of approximately 3.0 or higher. In some exemplary embodiments, the acid/neutral acid/neutral K _D ratio for an antibody or antigen-binding fragment of an antibody of the present invention may be approximately 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 , 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 or higher.

Антитела с pH-зависимыми характеристиками связывания могут быть получены, например, путем скрининга популяции антител для определения сниженного (или повышенного) связывания с определенным антигеном при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. Кроме того, модификации антигенсвязывающего домена на уровне аминокислоты может приводить к созданию антитела с pH-зависимыми свойствами. Например, при замене одной или нескольких аминокислот в антигенсвязывающем домене (например, в CDR) на остаток гистидина может быть получено антитело со сниженным связыванием антигена при кислом pH по сравнению с нейтральным pH.Antibodies with pH-dependent binding characteristics can be obtained, for example, by screening a population of antibodies to determine reduced (or increased) binding to a particular antigen at acidic pH compared to neutral pH. In addition, modifications of the antigen-binding domain at the amino acid level can lead to the creation of an antibody with pH-dependent properties. For example, by replacing one or more amino acids in an antigen-binding domain (eg, in a CDR) with a histidine residue, an antibody with reduced antigen binding at acidic pH compared to neutral pH can be obtained.

Варианты антител к PRLR, содержащие Fc.Anti-PRLR antibody variants containing Fc.

Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения предложены антитела к PRLR, содержащие домен Fc, содержащий одну или несколько мутаций, усиливающих или ослабляющих связывание антитела с рецептором FcRn, например, при кислом pH по сравнению с нейтральным pH. Например, настоящее изобретение включает антитела к PRLR, содержащие мутацию на участке C_H2 или C_H3 домена Fc, причем мутация(ии) увеличивает(ют) аффинность домена Fc к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где pH находится в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут привести к увеличению периода полувыведения антитела из сыворотки в случае введения антитела животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например, модификацию в положении 250 (например, E или Q), 250 и 428 (например, L или F), 252 (например, LA7F/W или T), 254 (например, S или T) и 256 (например, S/R/Q/E/D или T); или модификацию в положении 428, и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K), и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428 или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434.In certain embodiments, the present invention provides anti-PRLR antibodies comprising an Fc domain containing one or more mutations that increase or decrease the binding of the antibody to the FcRn receptor, eg, at acidic pH versus neutral pH. For example, the present invention includes anti-PRLR antibodies containing a mutation in the C _H 2 or _CH 3 region of the Fc domain, wherein the mutation(s) increase(s) the affinity of the Fc domain for FcRn in an acidic environment (e.g., in the endosome where the pH is at range from about 5.5 to about 6.0). Such mutations can lead to an increase in the serum half-life of the antibody when the antibody is administered to an animal. Non-limiting examples of such Fc modifications include, for example, modification at position 250 (for example, E or Q), 250 and 428 (for example, L or F), 252 (for example, LA7F/W or T), 254 (for example, S or T ) and 256 (for example, S/R/Q/E/D or T); or a modification at position 428 and/or 433 (eg H/L/R/S/P/Q or K) and/or 434 (eg H/F or Y); or a modification at position 250 and/or 428 or a modification at position 307 or 308 (e.g. 308F, V308F) and 434.

В одном варианте осуществления изобретения модификации включают модификации 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S);In one embodiment, the modifications include modifications 428L (eg, M428L) and 434S (eg, N434S);

модификации 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F);modifications 428L, 259I (for example, V259I) and 308F (for example, V308F);

модификации 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y);modifications 433K (for example, H433K) and 434 (for example, 434Y);

модификации в положениях 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254T и 256E);modifications at positions 252, 254, and 256 (for example, 252Y, 254T, and 256E);

модификации 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификации в положениях 307 и/или 308 (например, 308F или 308P).modifications 250Q and 428L (for example, T250Q and M428L); and modifications at positions 307 and/or 308 (eg, 308F or 308P).

Например, настоящее изобретение включает антитела к PRLR, содержащие домен Fc, содержащий одну или несколько пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей изFor example, the present invention includes antibodies to PRLR containing an Fc domain containing one or more pairs or groups of mutations selected from the group consisting of

250Q и 248L (например, T250Q и M248L);250Q and 248L (for example, T250Q and M248L);

252Y, 254T и 256E (например, M252Y, S254T и T256E);252Y, 254T and 256E (eg M252Y, S254T and T256E);

428L и 434S (например, M428L и N434S); и428L and 434S (eg M428L and N434S); And

433K и 434F (например, H433K и N434F).433K and 434F (eg H433K and N434F).

Все возможные комбинации вышеперечисленных мутаций домена Fc и других мутаций в вариабельных доменах антитела, предложенных в настоящем изобретения, входят в объем настоящего изобретения.All possible combinations of the above Fc domain mutations and other mutations in the variable domains of an antibody provided by the present invention are within the scope of the present invention.

Биологические характеристики антител.Biological characteristics of antibodies.

Настоящее изобретение включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые с высокой аффинностью связывают человеческий мономерный PRLR. Например, настоящее изобретение включает антитела к PRLR, связывающие человеческий мономерный PRLR (например, hPRLR.mmh) с K_D менее приблизительно 4,0 нМ согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в приThe present invention includes antibodies and antigen-binding fragments that bind human monomeric PRLR with high affinity. For example, the present invention includes anti-PRLR antibodies that bind human monomeric PRLR (e.g., hPRLR.mmh) with a K _D of less than about 4.0 nM as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, e.g., using a quantification format described in

- 10 040545 мере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения предложены антитела к PRLR, которые связывают человеческий мономерный PRLR при 37°C с K_D менее приблизительно 4 нМ, менее приблизительно 3 нМ, менее приблизительно 2 нМ, менее приблизительно 1 нМ, менее приблизительно 900 пМ, менее приблизительно 800 пМ, менее приблизительно 700 пМ, менее приблизительно 600 пМ, менее приблизительно 500 пМ, менее приблизительно 400 пМ, менее приблизительно 300 пМ, согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа.- 10 040545 measure 3 in this document, or using a substantially similar method of quantitative analysis. In certain embodiments, anti-PRLR antibodies are provided that bind human monomeric PRLR at 37° C. with a K _D of less than about 4 nM, less than about 3 nM, less than about 2 nM, less than about 1 nM, less than about 900 pM, less than about 800 pM, less than about 700 pM, less than about 600 pM, less than about 500 pM, less than about 400 pM, less than about 300 pM, as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the quantitation format described in Example 3 herein, or using a substantially similar assay method.

Настоящее изобретение также включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, связывающие человеческий мономерный рецептор пролактина (например, hPRLR.mmh) с диссоциативным периодом полувыведения (t1/2) более приблизительно 5 мин согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при в 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения предложены антитела к PRLR, которые связывают человеческий мономерный рецептор пролактина при 37°C с t1/2 более приблизительно 5 мин, более приблизительно 6 мин, более приблизительно 8 мин, более приблизительно 10 мин, более приблизительно 12 мин, более приблизительно 14 мин, более приблизительно 16 мин, более приблизительно 18 мин, более приблизительно 20 мин, более приблизительно 30 мин, более приблизительно 40 мин или дольше, согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа.The present invention also includes antibodies and antigen-binding fragments that bind the human monomeric prolactin receptor (e.g., hPRLR.mmh) with a dissociative half-life (t1/2) of greater than about 5 minutes as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, e.g. , using the assay format described in Example 3 herein, or using a substantially similar assay method. In certain embodiments, anti-PRLR antibodies are provided that bind the human monomeric prolactin receptor at 37°C with a t1/2 of greater than about 5 minutes, greater than about 6 minutes, greater than about 8 minutes, greater than about 10 minutes, greater than about 12 minutes, greater than 14 minutes, more than about 16 minutes, more than about 18 minutes, more than about 20 minutes, more than about 30 minutes, more than about 40 minutes or longer, as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the format quantitative analysis described in example 3 in this document, or using a substantially similar method of quantitative analysis.

Настоящее изобретение также включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые с высокой аффинностью связывают человеческий димерный рецептор пролактина (например, hPRLR.mFc).The present invention also includes antibodies and antigen-binding fragments that bind the human dimeric prolactin receptor (eg, hPRLR.mFc) with high affinity.

Например, настоящее изобретение включает антитела к PRLR, связывающие человеческий димерный рецептор пролактина с K_D менее приблизительно 250 пМ согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения предложены антитела к PRLR, которые связывают человеческий димерный рецептор пролактина при 37°C с K_D менее приблизительно 250 пМ, менее приблизительно 200 пМ, менее приблизительно 180 пМ, менее приблизительно 160 пМ, менее приблизительно 140 пМ, менее приблизительно 120 пМ, менее приблизительно 100 пМ, менее приблизительно 80 пМ, менее приблизительно 70 пМ или менее приблизительно 60 пМ, согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа.For example, the present invention includes anti-PRLR antibodies that bind the human dimeric prolactin receptor with a K _D of less than about 250 pM as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the assay format described in Example 3 herein. , or using a substantially similar quantitation method. In certain embodiments, anti-PRLR antibodies are provided that bind the human prolactin dimeric receptor at 37° C. with a K _D of less than about 250 pM, less than about 200 pM, less than about 180 pM, less than about 160 pM, less than about 140 pM, less than about 120 pM, less than about 100 pM, less than about 80 pM, less than about 70 pM, or less than about 60 pM, as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the assay format described in Example 3 in herein, or using a substantially similar assay method.

Настоящее изобретение включает также антитела и антигенсвязывающие фрагменты, связывающие человеческий димерный рецептор пролактина (например, hPRLR.mFc) с диссоциативным периодом полувыведения (t1/2) более приблизительно 55 мин согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения предложены антитела к PRLR, которые связывают человеческий димерный рецептор пролактина при 37°C с t1/2 более приблизительно 55 мин, более приблизительно 60 мин, более приблизительно 65 мин, более приблизительно 70 мин, более приблизительно 75 мин, более приблизительно 80 мин, более приблизительно 85 мин, более приблизительно 90 мин, более приблизительно 95 мин, более приблизительно 100 мин, более приблизительно 120 мин, более приблизительно 140 мин, более приблизительно 160 мин или дольше согласно результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 3 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа.The present invention also includes antibodies and antigen-binding fragments that bind the human dimeric prolactin receptor (e.g., hPRLR.mFc) with a dissociative half-life (t1/2) of greater than about 55 minutes as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, when using the assay format described in Example 3 herein, or when using a substantially similar assay method. In certain embodiments, anti-PRLR antibodies are provided that bind the human dimeric prolactin receptor at 37° C. with a t1/2 of greater than about 55 minutes, greater than about 60 minutes, greater than about 65 minutes, greater than about 70 minutes, greater than about 75 minutes, greater than more than about 80 minutes, more than about 85 minutes, more than about 90 minutes, more than about 95 minutes, more than about 100 minutes, more than about 120 minutes, more than about 140 minutes, more than about 160 minutes or longer as measured by surface plasmon resonance at 25 or 37°C, for example, using the assay format described in Example 3 herein, or using a substantially similar assay method.

Настоящее изобретение также включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, который связывают рецептор пролактина и блокируют сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих PRLR человека. Например, настоящее изобретение включает антитела к PRLR, блокирующие сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих PRLR человека, при IC₅₀ менее чем приблизительно 1,3 нМ, согласно измерениям с использованием количественного анализа блокирования сигнального пути с участием пролактина, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 5 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа Согласно определенным вариантам осуществления изобретения предложены антитела к PRLR, которые блокируют сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих человеческий PRLR при IC₅₀ менее приблизительно 1,3 нМ, менее приблизительно 1,2 нМ, менее приблизительно 1,0 нМ, менее приблизительно 900 пМ, менее приблизительно 800 пМ, менее приThe present invention also includes antibodies and antigen-binding fragments that bind the prolactin receptor and block the signaling pathway involving prolactin in cells expressing human PRLR. For example, the present invention includes anti-PRLR antibodies that block the prolactin signaling pathway in cells expressing human PRLR with an IC ₅₀ of less than about 1.3 nM as measured using a prolactin signaling blockage assay, e.g., using the assay format described in Example 5 herein, or using a substantially similar assay method. In certain embodiments, anti-PRLR antibodies are provided that block prolactin signaling in cells expressing human PRLR with an _IC50 of less than about 1, 3 nM, less than about 1.2 nM, less than about 1.0 nM, less than about 900 pM, less than about 800 pM, less than

- 11 040545 близительно 600 пМ, менее приблизительно 400 пМ, менее приблизительно 200 пМ, менее приблизительно 100 пМ, менее приблизительно 80 пМ, менее приблизительно 60 пМ, менее приблизительно 40 пМ, менее приблизительно 20 пМ, согласно результатам количественного анализа блокирования сигнального пути с участием пролактина, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 5 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа.- 11 040545 about 600 pM, less than about 400 pM, less than about 200 pM, less than about 100 pM, less than about 80 pM, less than about 60 pM, less than about 40 pM, less than about 20 pM, according to the results of quantitative analysis of blocking the signaling pathway with involving prolactin, for example, using the assay format described in Example 5 herein, or using a substantially similar assay method.

Настоящее изобретение также включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, связывающие PRLR, но не блокирующие сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих человеческий рецептор пролактина. В настоящем документе антитело или часть антитела, связанная антигеном, не блокирует сигнальный путь с участием пролактина, если при анализе блокирования сигнального пути с участием пролактина, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 5 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа, антитело не проявляет или проявляет лишь несущественную блокирующую активность. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела не блокируют сигнальный путь с участием пролактина, если IC₅₀ антитела превышает приблизительно 10 нМ или превышает приблизительно 100 нМ согласно результатам количественного анализа блокирования сигнального пути с участием пролактина, например, при использовании формата количественного анализа, описанного в примере 5 в настоящем документе, или при использовании существенно сходного метода количественного анализа.The present invention also includes antibodies and antigen binding fragments that bind PRLR but do not block the prolactin signaling pathway in cells expressing the human prolactin receptor. As used herein, an antibody, or an antigen-bound portion of an antibody, does not block a prolactin signaling pathway if, in a prolactin signaling pathway block assay, for example, using the assay format described in Example 5 herein, or using a substantially similar assay method, the antibody exhibits no or only insignificant blocking activity. In certain embodiments, the antibody or antigen-binding fragment of an antibody does not block the prolactin signaling pathway if the IC ₅₀ of the antibody is greater than about 10 nM or greater than about 100 nM as measured by a prolactin signaling blocking assay, for example, using a quantification format, described in example 5 in this document, or using a substantially similar method of quantitative analysis.

Антитела, согласно настоящему изобретению могут обладать одним или несколькими из вышеупомянутых биологических характеристик или комбинацией этих характеристик. Приведенный выше перечень биологических характеристик антител, описанных в изобретении, не является исчерпывающим. Другие биологические характеристики свойств антител согласно настоящему изобретению будут очевидны для специалиста в данной области техника при рассмотрении настоящего изобретения, включая приведенные в документе иллюстративные примеры.Antibodies of the present invention may have one or more of the aforementioned biological characteristics, or a combination of these characteristics. The above list of biological characteristics of the antibodies described in the invention is not exhaustive. Other biological characteristics of the properties of antibodies according to the present invention will be apparent to a person skilled in the art when considering the present invention, including the illustrative examples provided in the document.

Конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC).Antibody drug conjugates (ADC).

В настоящем изобретении предложены конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC), содержащие антитело к PRLR или антигенсвязывающий фрагмент антитела, конъюгированные с терапевтической группой, например цитотоксическим агентом, химиотерапевтическим препаратом или радиоизотопом.The present invention provides antibody drug conjugates (ADCs) comprising an anti-PRLR antibody or an antigen-binding fragment of an antibody conjugated to a therapeutic moiety, such as a cytotoxic agent, a chemotherapeutic drug, or a radioisotope.

Цитотоксические агенты включают любой агент, который вреден для роста, жизнеспособности или размножения клеток. Примеры подходящих цитотоксических агентов и химиотерапевтических агентов, которые могут образовывать конъюгаты с антителами к PRLR согласно данному аспекту изобретения, включают, например, 1-(2-хлороэтил)-1,2-диметансульфонил гидразид, 1,8-дигидроксибицикло[7.3.1 ]тридека-4,9-диен-2,6-диен- 13-он, 1 -дигидротестостерон, 5-фтороурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, 9-аминокамптотецин, актиномицин D, аманитин, аминоптерин, ангуидин, антрациклин, антрамицин (АМС), ауристатин, блеомицин, бусульфан, масляную кислоту, калихеамицин, камптотецин, карминомицин, кармустин, цемадотин, цисплатин, колхицин, комбретастатин, циклофосфамид, цитарабин, цитохалазин B, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, диацентоксипентилдоксорубицин, дибромоманнитол, дигидрокси антрацин дион, дизоразол, доластатин (например, доластатин 10), доксорубицин, дуокармицин, эхиномицин, элеутеробин, эметин, эпотилон, эсперамицин, эстрамустин, бромид этидия, этопозид, фтороурацил, гельданмицин, грамицидин D, глюкокортикоид, иринотекан, ингибиторы белка кинезина (KSP), лептомицины, лейрозин, лидокаин, ломустин (CCNU), маитанзиноиды, меклоретамин, мелфалан, меркатопурин, метоптерин, метотрексат, митрамицин, митомицин, митоксантрон, N8-ацетилспермидин, подофиллотоксин, прокаин, пропранолол, птередин, пуромицин, пирролобензодиазепин (PBD), ризокцин, стрептозотоцин, таллисомицин, таксол, тенопозид, тетракаин, тиотепа хлорамбуцил, томаимицин, топотекан, тубулизин, винбластин, винкристин, виндезин, винорельбин и производные любого из вышеперечисленных веществ. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения цитотоксическим агентом, образующим конъюгат с антителом к PRLR, является майтанзиноид, например DM1 или DM4, производное томаимицина или производное доластатина. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения цитотоксическим агентом, образующим конъюгат с антителом к PRLR, является ауристатин, например MMAE, MMAF или их производные. В объеме настоящего изобретения предусмотрены также другие цитотоксические агенты, известные специалистам в данной области, включая, например, имеющие белковую природу токсины, такие как рицин, токсин C. difficile, экзотоксин Pseudomonas, рицин, дифтерийный токсин, ботулотоксин, бриодин, сапорин, токсины лаконоса (т.е. фитолаккатоксин и фитоллакагенин) и другие, описанные в публикации Sapra et al., Pharmacol & Therapeutics, 2013, 138:452-469.Cytotoxic agents include any agent that is detrimental to the growth, viability or reproduction of cells. Examples of suitable cytotoxic agents and chemotherapeutic agents that can form conjugates with anti-PRLR antibodies according to this aspect of the invention include, for example, 1-(2-chloroethyl)-1,2-dimethanesulfonyl hydrazide, 1,8-dihydroxybicyclo[7.3.1] trideca-4,9-diene-2,6-dien-13-one, 1-dihydrotestosterone, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, 9-aminocamptothecin, actinomycin D, amanitin, aminopterin, anguidin, anthracycline, anthramycin (AMS), auristatin, bleomycin, busulfan, butyric acid, calicheamycin, camptothecin, carminomycin, carmustine, cemadotin, cisplatin, colchicine, combretastatin, cyclophosphamide, cytarabine, cytochalasin B, dactinomycin, daunorubicin, decarbazine, diocentoxypentyldoxorubicin, dibromoanthrate, dione disorazole, dolastatin (eg, dolastatin 10), doxorubicin, duocarmycin, echinomycin, eleutherobin, emetine, epothilone, esperamycin, estramustine, ethidium bromide, etoposide, fluorouracil, geldanmycin, gramicidin D, glucocorticoid, irinotecan, kinesin protein (KSP) inhibitors, leptomycins, leurosin, lidocaine, lomustine (CCNU), maytansinoids, meclorethamine, melphalan, mercatopurine, metopterin, methotrexate, mitramycin, mitomycin, mitoxantrone, N8-acetylspermidine, podophyllotoxin, procaine, propranolol, pteridine, puromycin, pyrrolobenzodiazepine (PBD), risoccin, streptozotocin, thallisomycin, taxol, tenoposide, tetracaine, thiotepa chlorambucil, tomaimicin, topotecan, tubulizin, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and derivatives of any of the above substances. In certain embodiments, the anti-PRLR antibody-conjugated cytotoxic agent is a maytansinoid, such as DM1 or DM4, a tomamycin derivative, or a dolastatin derivative. In certain embodiments, the anti-PRLR antibody-conjugated cytotoxic agent is auristatin, such as MMAE, MMAF, or derivatives thereof. Other cytotoxic agents known to those skilled in the art are also contemplated within the scope of the present invention, including, for example, proteinaceous toxins such as ricin, C. difficile toxin, Pseudomonas exotoxin, ricin, diphtheria toxin, botulinum toxin, bryodin, saporin, laconus toxins. (i.e. phytolaccatoxin and phytollacagenin) and others described in Sapra et al., Pharmacol & Therapeutics, 2013, 138:452-469.

Настоящее изобретение также включает конъюгаты антитела с радионуклидом (ARC), содержащие антитела к PRLR, конъюгированные с одним или несколькими радионуклидами. Примерами радионуклидов, которые могут использоваться в контексте данного аспекта изобретения, включают, не ограничиваясь перечисленным, например, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ¹³¹I,¹⁸⁶Re, ²²⁷Th, ²²²Rn, ²²³Ra, ²²⁴Ra и ⁹⁰Y.The present invention also includes antibody radionuclide conjugates (ARC) containing anti-PRLR antibodies conjugated to one or more radionuclides. Examples of radionuclides that can be used in the context of this aspect of the invention include, but are not limited to, for example, ²²⁵ Ac, ²¹² Bi, ²¹³ Bi, ¹³¹ I, ¹⁸⁶ Re, ²²⁷ Th, ²²² Rn, ²²³ Ra, ²²⁴ Ra, and ⁹⁰ Y.

В определенных вариантах осуществления данного изобретения предложены ADC, которые содерIn certain embodiments of the present invention, ADCs are provided that contain

- 12 040545 жат антитело к PRLR, конъюгированное с цитотоксическим агентом (например, любой из перечисленных выше цитотоксических агентов) через молекулу линкера. Для создания или конструирования ADC согласно настоящему изобретению может быть использована любая линкерная молекула или линкерная технология, известная специалистам в данной области техники. В определенных вариантах осуществления изобретения линкер является расщепляемым линкером. Согласно другим вариантам осуществления изобретения линкер является нерасщепляемым линкером. Примеры линкеров, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения, включают линкеры, содержащие или состоящие из, например, MC (6-малеимидокапроил), MP (малемеидопропаноил), вал-цит (цитруллин-валин), вал-ала (аланин-валин), дипептидный участок в линкере, расщепляемом протеазой, ала-фен (аланин-фенилаланин), дипептидный участок в линкере, расщепляемом протеазой, PAB (п-аминобензилоксикарбонил), SPP (N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентаноат), SMCC (N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циkлогексан-1-карбоксилат), SIAB (N-сукцинимидил (4-йод-ацетил)аминобензоат) и их варианты и комбинации. Дополнительные примеры линкеров, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения, описаны, например, в патенте США № 7754681 и в публикации Ducry, BioconjugateChem., 2010, 21:5-13 и ссылках, цитируемых в этих источниках.- 12 040545 an anti-PRLR antibody conjugated to a cytotoxic agent (eg, any of the cytotoxic agents listed above) via a linker molecule. Any linker molecule or linker technology known to those skilled in the art can be used to create or construct an ADC according to the present invention. In certain embodiments of the invention, the linker is a cleavable linker. According to other embodiments of the invention, the linker is a non-cleavable linker. Examples of linkers that can be used in the context of the present invention include linkers containing or consisting of, for example, MC (6-maleimidocaproyl), MP (malemeidopropanoyl), val-cyte (citrulline-valine), val-ala (alanine-valine) , dipeptide site in protease-cleavable linker, ala-phen (alanine-phenylalanine), dipeptide site in protease-cleavable linker, PAB (p-aminobenzyloxycarbonyl), SPP (N-succinimidyl 4-(2-pyridylthio)pentanoate), SMCC ( N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), SIAB (N-succinimidyl (4-iodo-acetyl)aminobenzoate), and variants and combinations thereof. Additional examples of linkers that can be used in the context of the present invention are described, for example, in US patent No. 7754681 and in the publication Ducry, BioconjugateChem., 2010, 21:5-13 and references cited in these sources.

Настоящее изобретение включает ADC, в которых линкер соединяет антитело к PRLR или связывающую антиген молекулу с лекарственным средством или цитотоксином путем присоединения к определенной аминокислоте в антителе или связывающей антиген молекуле. Примеры присоединения аминокислот, которые могут использоваться в контексте данного аспекта изобретения, включают, например, лизин (см., например, патент США № 5208020; США № 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; США № 5714586; США № 2013/0101546; и США № 2012/0585592), цистеин (см., например, США № 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; США № 2013/0101546; и США № 7750116), селеноцистеин (см., например, WO 2008/122039; и Hoferef et al., Proc. Natl. Acad. Sci, США, 2008, 705:12451-12456), формилглицин (см., например, Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci, США, 2013, 110:46-51; и Rabuka et al., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067), неприродные аминокислоты (см., например, WO 2013/068874 и WO 2012/166559) и кислые аминокислоты (см., например, WO 2012/05982). Линкеры могут быть также конъюгированы с антигенсвязывающим белком путем присоединения к углеводам (см., например, США № 2008/0305497, WO 2014/065661; и публикацию Ryan et al., Food & Agriculture Immunol, 2001, 73:127-130) и дисульфидным линкерам (см., например, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611; и публикацию Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313).The present invention includes ADCs in which a linker connects an anti-PRLR antibody or antigen-binding molecule to a drug or cytotoxin by attaching to a specific amino acid in the antibody or antigen-binding molecule. Examples of amino acid attachment that can be used in the context of this aspect of the invention include, for example, lysine (see, for example, US patent No. 5208020; US No. 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358- 361; WO 2005/089808; US No. 5714586; US No. 2013/0101546; and US No. 2012/0585592), cysteine (see e.g. /053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US No. 2013/0101546; and US No. 7750116), selenocysteine (see, for example, WO 2008/122039; and Hoferef et al., Proc. Natl. Acad. Sci , USA, 2008, 705:12451-12456), formylglycine (see, for example, Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 2013, 110:46-51; and Rabuka et al., Nat Protocols, 2012, 10:1052-1067), non-natural amino acids (see e.g. WO 2013/068874 and WO 2012/166559) and acidic amino acids (see, for example, WO 2012/05982). Linkers can also be conjugated to an antigen binding protein by attachment to carbohydrates (see, for example, US No. 2008/0305497, WO 2014/065661; and Ryan et al., Food & Agriculture Immunol, 2001, 73:127-130) and disulfide linkers (see, for example, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611; and Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313).

Согласно определенным вариантам осуществления изобретения в настоящем изобретении предложены ADC, в котором антитело к PRLR согласно настоящему изобретению конъюгировано с композицией линкер-лекарственное средство, как описано в международной заявке на патент № PCT/US14/29757, поданной 14 марта 2014 г. (например, соединение 7, также называемое в настоящем документе M0026).In certain embodiments, the present invention provides an ADC wherein an anti-PRLR antibody of the present invention is conjugated to a linker-drug composition as described in International Patent Application No. PCT/US14/29757 filed March 14, 2014 (e.g., compound 7, also referred to herein as M0026).

В контексте настоящего изобретения для создания ADC, содержащего антитело к PRLR и описанного в настоящем документе, может быть использован любой известный в данной области техники способ образования конъюгата между химической группой и пептидом, полипептидом или другой макромолекулой. Иллюстративным способом образования конъюгата антитела с лекарственным средством является способ с использованием линкера, как описано в примере 6 в настоящем документе. Варианты этого иллюстративного способа очевидны специалистам в данной области техники и включены в объем настоящего изобретения.In the context of the present invention, any method known in the art for forming a conjugate between a chemical group and a peptide, polypeptide or other macromolecule can be used to create an ADC containing an anti-PRLR antibody described herein. An exemplary method for forming an antibody drug conjugate is the linker method as described in Example 6 herein. Variations of this exemplary method will be apparent to those skilled in the art and are included within the scope of the present invention.

Направленное воздействие ADC на клетки с низким уровнем экспрессии рецептора пролактина.Targeted action of ADC on cells with a low level of expression of the prolactin receptor.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что ADC, содержащие антитело к PRLR, конъюгированное с цитотоксическим агентом, способны направленно воздействовать и уничтожать клетки с относительно низким уровнем экспрессии PRLR на клеточной поверхности. Например, в настоящем документе в примере 7 показано, что ADC, содержащий антитело к PRLR H1H6953N, конъюгированное с DM1, подавлял рост клеток T47D (экспрессирующих рецептор пролактина в количестве, лишь 12-кратно превышающем фоновый уровень) при IC₅₀ 1,3 нМ и уничтожал 78% клеток. В отличие от этого ADC против других ассоциированных с опухолями антигенов, таких как ErbB2, как правило, требуют намного более высоких уровней экспрессии антигена-мишени на клетках для сопоставимой активности, приводящей к гибели клеток. Например, при применении конъюгата, содержащего антитело к ErbB2 и DM1, гибель клеток при IC₅₀ в субнаномолярном диапазоне была достигнута только в случае клеток с уровнем экспрессии ErbB2, от 200-кратно до приблизительно 400-кратно превышавшим фоновый уровень (см., например, табл. 14-17 в настоящем документе). Способность уничтожать опухолевые клетки с относительно низким уровнем экспрессии ассоциированных с опухолью антигенов, к которым относится рецептор пролактина, означает, что ADC, содержащие антитело к PRLR согласно настоящему изобретению, могут обеспечивать значимую терапевтическую пользу при применении в более низкой дозе и/или менее частом введении по сравнению с ADC, оказывающими направленное воздействие на другие опухолевые антигены, например ErbB2.The present inventors have surprisingly found that ADCs containing an anti-PRLR antibody conjugated to a cytotoxic agent are able to target and kill cells with relatively low levels of PRLR expression on the cell surface. For example, Example 7 herein shows that an ADC containing DM1-conjugated anti-PRLR antibody H1H6953N inhibited the growth of T47D cells (expressing prolactin receptor at only 12-fold background levels) at an _IC50 of 1.3 nM and destroyed 78% of the cells. In contrast, ADCs against other tumor-associated antigens, such as ErbB2, typically require much higher levels of target antigen expression on cells for comparable cell death activity. For example, when using a conjugate containing an antibody to ErbB2 and DM1, cell death at an IC ₅₀ in the subnanomolar range was achieved only in the case of cells with an ErbB2 expression level of 200-fold to approximately 400-fold higher than the background level (see, for example, tables 14-17 in this document). The ability to kill tumor cells with relatively low levels of expression of tumor-associated antigens, which include the prolactin receptor, means that ADCs containing an anti-PRLR antibody of the present invention may provide significant therapeutic benefit when used at a lower dose and/or less frequent administration. compared to ADCs targeting other tumor antigens such as ErbB2.

Соответственно в настоящем изобретении предложены конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC), которые содержат антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, специфично свяAccordingly, the present invention provides antibody drug conjugates (ADCs) that contain an antibody or an antigen-binding fragment of an antibody that specifically binds

- 13 040545 зывающий человеческий PRLR, конъюгированные с цитотоксическим агентом, отличающиеся тем, что ADC эффективно уничтожают клетки (например, опухолевые клетки) с низким уровнем экспрессии PRLR. В близких вариантах осуществления изобретения настоящее изобретение включает способы, применяемые для эффективного уничтожения клеток с низким уровнем экспрессии PRLR. Способы согласно данному аспекту изобретения включают введение клеток в контакт с конъюгатами антитела с лекарственными средствами (ADC), содержащими антитело к PRLR, конъюгированное с цитотоксическим агентом. Введение клеток в контакт может быть выполнено in vitro или in vivo, например, путем введения ADC, содержащего антитело к PRLR, нуждающемуся в таком лечении пациенту, причем введение обуславливает контакт ADC с клетками, экспрессирующими рецептор пролактина.- 13 040545 inducing human PRLR conjugated to a cytotoxic agent, characterized in that the ADCs effectively kill cells (eg tumor cells) with a low level of PRLR expression. In related embodiments of the invention, the present invention includes methods used to effectively kill cells with low levels of PRLR expression. Methods according to this aspect of the invention include contacting cells with antibody drug conjugates (ADCs) containing an anti-PRLR antibody conjugated to a cytotoxic agent. The introduction of cells into contact can be performed in vitro or in vivo, for example, by introducing an ADC containing an antibody to PRLR in need of such treatment to a patient, and the introduction causes contact of the ADC with cells expressing the prolactin receptor.

В определенных контекстах, предполагаемых в объеме настоящего изобретения, низкий уровень PRLR означает уровень экспрессии, превышающий фоновый уровень менее чем 30-кратно. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения, предложены ADC, содержащие антитело к PRLR, которые эффективно уничтожают клетки с уровнем экспрессии PRLR, превышающем фоновый уровень менее чем 30-кратно, 25-кратно, 20-кратно, 18-кратно, 16-кратно, 14-кратно, 12-кратно, 8-кратно или менее. В настоящем документе термин фон означает (неспецифичный) сигнал, производимый, когда клетки взаимодействуют с изотипическим контрольным антителом (т.е. не обладающим специфичностью в отношении PRLR).In certain contexts contemplated within the scope of the present invention, a low level of PRLR means an expression level less than 30-fold above the background level. In certain embodiments, there are provided ADCs comprising an anti-PRLR antibody that are effective in killing cells with a PRLR expression level less than 30-fold, 25-fold, 20-fold, 18-fold, 16-fold, 14-fold above baseline. times, 12 times, 8 times or less. As used herein, the term background means a (non-specific) signal produced when cells interact with an isotype control antibody (ie, not specific for PRLR).

В определенных других контекстах низкий уровень PRLR может быть выражен количеством молекул PRLR из расчета на одну клетку. Например, в настоящем документе клетка с низким уровнем экспрессии PRLR экспрессирует менее приблизительно 1 млн копий PRLR на клетку. В определенных вариантах осуществления изобретения низкий уровень экспрессии PRLR означает менее приблизительно 900000 копий, менее приблизительно 800000 копий, менее приблизительно 700000 копий, менее приблизительно 600000 копий, менее приблизительно 500000 копий, менее приблизительно 400000 копий, менее приблизительно 300000 копий, менее приблизительно 200000 копий, менее приблизительно 100000 копий, менее приблизительно 90000 копий, менее приблизительно 80000 копий, менее приблизительно 70000 копий, менее приблизительно 60000 копий, менее приблизительно 50000 копий, менее приблизительно 40000 копий, менее приблизительно 30000 копий, менее приблизительно 20000 копий или менее приблизительно 10000 копий PRLR на клетку.In certain other contexts, a low level of PRLR can be expressed as the number of PRLR molecules per cell. For example, as used herein, a low PRLR expressing cell expresses less than about 1 million copies of PRLR per cell. In certain embodiments, low PRLR expression means less than about 900,000 copies; less than about 800,000 copies; less than about 700,000 copies; less than about 600,000 copies; less than about 500,000 copies; less than about 400,000 copies; less than about 300,000 copies; less than about 100,000 copies, less than about 90,000 copies, less than about 80,000 copies, less than about 70,000 copies, less than about 60,000 copies, less than about 50,000 copies, less than about 40,000 copies, less than about 30,000 copies, less than about 20,000 copies, or less than about 10,000 copies PRLR on a cell.

В настоящем документе эффективное уничтожение означает, что ADC характеризуется IC₅₀ менее приблизительно 20 нМ, или менее приблизительно 1 нМ (например, менее приблизительно 0,9 нМ, менее приблизительно 0,8 нМ, менее приблизительно 0,7 нМ, менее приблизительно 0,6 нМ, менее приблизительно 0,5 нМ, менее приблизительно 0,4 нМ или менее приблизительно 0,3 нМ) в количественном анализе киллинга опухолевых клеток, например количественном анализе, описанном в примере 7 в настоящем документе, или в существенно сходном количественном анализе. Согласно данному аспекту изобретения компонент ADC, представляющий собой антитело к PRLR, может быть любым антителом к PRLR, включая антитела к PRLR, содержащие любые аминокислотные последовательности CDR или HCVR/LCVR, показанные в табл. 1 в настоящем документе. Кроме того, цитотоксический компонент конъюгата ADC может быть любым цитотоксическим агентом, например DM1, или любым другим цитотоксическим агентом, упомянутым в настоящем документе.As used herein, effective killing means that the ADC has an IC ₅₀ of less than about 20 nM, or less than about 1 nM (e.g., less than about 0.9 nM, less than about 0.8 nM, less than about 0.7 nM, less than about 0, 6 nM, less than about 0.5 nM, less than about 0.4 nM, or less than about 0.3 nM) in a tumor cell killing assay, such as the assay described in Example 7 herein, or in a substantially similar assay. According to this aspect of the invention, the anti-PRLR antibody component of the ADC may be any anti-PRLR antibody, including anti-PRLR antibodies containing any of the CDR or HCVR/LCVR amino acid sequences shown in Table 1. 1 in this document. In addition, the cytotoxic component of the ADC conjugate can be any cytotoxic agent, such as DM1, or any other cytotoxic agent mentioned herein.

ADC согласно настоящему изобретению способны подавлять рост опухоли и/или уменьшить размер опухоли у животных с опухолями, экспрессирующими PRLR (PRLR+). Например, как показано в примере 8 в настоящем документе введение ADC, содержащих антитело к PRLR и DM1, мышам с ксенотрансплантатом рака молочной железы PRLR+, привело к уменьшению опухоли до необнаружимого уровня. Таким образом, настоящее изобретение включает антитела к PRLR и ADC, содержащие такие антитела, отличающиеся тем, что введение антител или ADC животному с опухолью PRLR+ (например, с частотой приблизительно один раз в неделю и в дозе приблизительно от 1 до 15 мг/кг) приводит к подавлению роста опухоли и/или уменьшению размера опухоли (например, подавление роста опухоли на 100% или больше) к 52-му дню после введения или ранее.The ADCs of the present invention are capable of suppressing tumor growth and/or reducing tumor size in animals with tumors expressing PRLR (PRLR+). For example, as shown in Example 8 herein, administration of anti-PRLR and DM1 antibody-containing ADCs to PRLR+ breast cancer xenograft mice resulted in tumor shrinkage to an undetectable level. Thus, the present invention includes antibodies to PRLR and ADC containing such antibodies, characterized in that the administration of antibodies or ADC to an animal with a PRLR+ tumor (for example, at a frequency of about once a week and at a dose of about 1 to 15 mg/kg) results in suppression of tumor growth and/or reduction in tumor size (eg, suppression of tumor growth by 100% or more) by or before 52 days post-administration.

Направленное воздействие на цитокиновый рецептор класса I.Directed action on the class I cytokine receptor.

PRLR принадлежит семейству цитокиновых рецепторов класса I. Как разъясняется выше и продемонстрировано на рабочих примерах в настоящем документе, неожиданно обнаружилось, что конъюгаты антитела с лекарственным средством (ADC), содержащие антитела к PRLR, могут эффективно направленно воздействовать и уничтожать клетки с низким уровнем экспрессии PRLR (см. пример 7 в настоящем документе). Кроме того, показано, что по сравнению с другими цитокиновыми рецепторами класса I (IL-4R и IL-6R) ADC способны также активно уничтожать клеточные линии с относительно низким уровнем экспрессии антигена-мишени (см. пример 9 в настоящем документе). Это свойство отличает их от ADC, направленных против других белков, экспрессируемых на клеточной поверхности, таких как ErbB2, где для эффективного уничтожения клеток требуется высокий уровень экспрессии мишени. Кроме того, неожиданно обнаружилось также, что интернализация антител к PRLR опухолевыми клетками (например, опухолевыми клетками T47D) происходит существенно быстрее, чем интернализация антител к Her2, и что это свойство коррелирует с более быстрой интернализацией и разрушением PRLR на клеточной поверхности клеток по сравнению с расположенным на клеточной поверхности рецептором Her2.PRLR belongs to the class I family of cytokine receptors. As explained above and demonstrated in the working examples herein, it has surprisingly been found that antibody drug conjugates (ADCs) containing anti-PRLR antibodies can effectively target and kill cells with low levels of PRLR expression. (see example 7 in this document). In addition, compared to other class I cytokine receptors (IL-4R and IL-6R), ADCs have also been shown to be able to actively kill cell lines with relatively low levels of target antigen expression (see Example 9 herein). This property distinguishes them from ADCs directed against other proteins expressed on the cell surface, such as ErbB2, where a high level of expression of the target is required for effective cell killing. In addition, it has also surprisingly been found that internalization of anti-PRLR antibodies by tumor cells (e.g., T47D tumor cells) is substantially faster than internalization of anti-Her2 antibodies, and that this property correlates with faster internalization and destruction of PRLR on the cell surface of cells compared to the Her2 receptor located on the cell surface.

- 14 040545- 14 040545

С учетом результатов, изложенных в настоящем документе, изобретатели полагают, что способность направленно воздействовать и уничтожать клетки с низким уронем экспрессии антигена на клеточной поверхности может быть общим свойством ADC, направленных против цитокиновых рецепторов I в целом и в частности против цитокиновых определенных рецепторов класса I, которые быстро подвергаются интернализации. Таким образом, настоящее изобретение включает способы направленного воздействия на цитокиновые рецепторы класса I (т.е. цитокиновые рецепторы класса I, быстро подвергающиеся интернализации) и способы уничтожения клеток, экспрессирующих цитокиновые рецепторы класса I, например клеток с низким уровнем экспрессии цитокиновых рецепторов класса I.In view of the results disclosed herein, the inventors believe that the ability to target and kill cells with low levels of cell surface antigen expression may be a common property of ADCs directed against cytokine I receptors in general, and in particular against certain class I cytokine receptors. which are rapidly internalized. Thus, the present invention includes methods for targeting class I cytokine receptors (i.e., class I cytokine receptors that are rapidly internalized) and methods for killing cells expressing class I cytokine receptors, such as cells with low expression of class I cytokine receptors.

Способы согласно этому аспекту изобретения включают введение клетки, экспрессирующей цитокиновый рецептор класса I, с ADC, который содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, специфично связывающий цитокиновый рецептор класса I. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения клетка-мишень имеет низкий уровень экспрессии (в том смысле, в каком экспрессия определяется в настоящем документе) цитокинового рецептора класса I и/или цитокинового рецептора класса I, который быстро интернализуется и разрушается (например, интернализуемого быстрее, чем референтная молекула на клеточной поверхности, например Her2). Также в настоящее изобретение включены конъюгированные с цитотоксическим агентом антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, которые специфично связывают цитокиновый рецептор класса I. В контексте данного аспекта изобретения может быть использован любой из цитотоксических агентов, линкеров и/или ADC-связанных технологий, описанных где-либо в настоящем документе. В настоящем документе цитокиновый рецептор класса I (также иногда называемый как цитокиновый рецептор типа 1) означает трансмембранный рецептор, экспрессируемый на клеточной поверхности и реагирующий на цитокины с четырьмя альфа-спиральными цепями. Как разъясняется ниже, цитокиновые рецепторы класса I могут быть гетеродимерными или гомодимерными. В настоящем документе термин цитокиновый рецептор класса I включает и гетеродимерные, и гомодимерные рецепторы.Methods according to this aspect of the invention include administering a class I cytokine receptor-expressing cell with an ADC that contains an antibody or an antigen-binding antibody fragment that specifically binds a class I cytokine receptor. as defined herein) a class I cytokine receptor and/or a class I cytokine receptor that is rapidly internalized and degraded (eg, internalized faster than a cell surface reference molecule, eg Her2). Also included in the present invention are cytotoxic agent-conjugated antibodies or antigen-binding antibody fragments that specifically bind a class I cytokine receptor. In the context of this aspect of the invention, any of the cytotoxic agents, linkers, and/or ADC-related technologies described elsewhere in this document. As used herein, class I cytokine receptor (also sometimes referred to as type 1 cytokine receptor) means a transmembrane receptor expressed on the cell surface and responsive to four alpha helical chain cytokines. As explained below, class I cytokine receptors may be heterodimeric or homodimeric. As used herein, the term class I cytokine receptor includes both heterodimeric and homodimeric receptors.

Гетеродимерные цитокиновые рецепторы класса I состоят из цитокин-специфичной цепи и общей цепи. Соответственно такие гетеродимерные цитокиновые рецепторы класса I могут быть классифицированы на основании типа общей цепи, используемой рецептором для передачи сигнала. Примерами категорий гетеродимерных цитокиновых рецепторов класса I являются (i) гетеродимерные рецепторы, содержащие общую гамма-цепь, такие как IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-13R и IL-15R;Class I heterodimeric cytokine receptors consist of a cytokine-specific chain and a common chain. Accordingly, such heterodimeric class I cytokine receptors can be classified based on the type of common chain used by the receptor for signal transduction. Examples of categories of heterodimeric class I cytokine receptors are (i) heterodimeric receptors containing a common gamma chain, such as IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-13R and IL-15R;

(ii) гетеродимерные рецепторы, содержащие общую бета-цепь, такие как GM-CSF, IL-3R и IL-5R; и (iii) gp130-содержащие гетеродимерные рецепторы, такие как IL-6R, IL-11R, рецептор CNTF, рецептор фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), рецептор онкостатина M (OSM) и рецептор IL-12.(ii) heterodimeric receptors containing a common beta chain, such as GM-CSF, IL-3R and IL-5R; and (iii) gp130-containing heterodimeric receptors such as IL-6R, IL-11R, CNTF receptor, leukemia inhibitory factor (LIF) receptor, oncostatin M (OSM) receptor, and IL-12 receptor.

Гомодимерные цитокиновые рецепторы класса I включают рецептор фактора роста (GH), рецептор эритропоэтина (EPO), рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), рецептор лептина и PRLR.Class I homodimeric cytokine receptors include the growth factor receptor (GH), the erythropoietin receptor (EPO), the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) receptor, the leptin receptor, and PRLR.

В определенных вариантах осуществления изобретения данного аспекта изобретения ADC содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, специфично связывающие гетеродимерный цитокиновый рецептор класса I. Согласно другим вариантам осуществления данного аспекта изобретения ADC содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, специфично связывающие гомодимерный цитокиновый рецептор класса I.In certain embodiments of this aspect of the invention, the ADC comprises an antibody or antigen-binding antibody fragment that specifically binds a class I heterodimeric cytokine receptor.

Настоящее изобретение включает способы уничтожения клетки с низким уровнем экспрессии гетеродимерного цитокинового рецептора класса I. Способы согласно данному аспекту изобретения введение клетки с низким уровнем экспрессии гетеродимерного цитокинового рецептора класса I в контакт с ADC, содержащим антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфично связывают гетеродимерный цитокиновый рецептор класса I.The present invention includes methods of killing a cell that is low in expression of a heterodimeric class I cytokine receptor. The methods of this aspect of the invention are contacting a cell with low expression of a heterodimeric class I cytokine receptor with an ADC containing an antibody or antigen-binding antibody fragment that specifically binds the heterodimeric cytokine receptor class I.

Альтернативно настоящее изобретение включает способы уничтожения клетки с низким уровнем экспрессии гомодимерного цитокинового рецептора класса I. Способы согласно данному аспекту изобретения введение клетки с низким уровнем экспрессии гомодимерного цитокинового рецептора класса I в контакт с ADC, содержащим антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфично связывают гомодимерный цитокиновый рецептор класса I.Alternatively, the present invention includes methods of killing a cell that is low in expression of a class I homodimeric cytokine receptor. class I receptor.

Картирование эпитопов и связанные технологии.Epitope mapping and related technologies.

Эпитоп, с которым связываются антитела по настоящему изобретению, может состоять из единственной непрерывной последовательности из 3 или большего количества (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) аминокислот белка PRLR. Альтернативно эпитоп может состоять из множества не-непрерывных аминокислот (или аминокислотных последовательностей) рецептора пролактина. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитоп расположен на пролактинсвязывающем домене PRLR или вблизи этого домена. В других вариантах осуществления изобретения эпитоп расположен за пределами пролактин-связывающего домена PRLR, например, на таком месте на поверхности PRLR, в котором антитело, связавшееся с таким эпитопом, не препятствует связыванию пролактина с PRLR.The epitope to which the antibodies of the present invention bind may consist of a single contiguous sequence of 3 or more (e.g., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more) amino acids of the PRLR protein. Alternatively, an epitope may be composed of a plurality of non-contiguous amino acids (or amino acid sequences) of the prolactin receptor. In some embodiments, the epitope is located on or near the prolactin-binding domain of PRLR. In other embodiments, the epitope is located outside the prolactin-binding domain of PRLR, for example, at a location on the surface of the PRLR where an antibody bound to that epitope does not prevent prolactin from binding to PRLR.

Для того чтобы определить, взаимодействует ли антитело с одной или несколькими аминокислоTo determine if an antibody interacts with one or more amino acids

- 15 040545 тами полипептила или белка могут быть использованы разнообразные приемы, известные специалистам в данной области техники. Примеры таких приемов включают, например, стандартный эпитопперекрестный конкурентный количественный анализ, описанный в публикации Antibodies, Harlow-Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold. Spring Harb., Нью-Йорк), аланин-сканирующий мутационный анализ, пептидный блоттинг (Reineke, 2004, Methods Mol. Biol., 248:443-463) и анализ расщепления пептидов. Кроме того, могут использоваться следующие способы: эксцизия эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer, 2000, Protein Science, 9:487-496). Другой способ, который может использоваться для идентификации аминокислот в составе полипептида, с которым взаимодействует антитело, представляет собой водородно-дейтериевый обмен с масс-спектрометрической детекцией. В общих чертах метод водородно-дейтериевого обмена включает введение дейтериевой метки в интересующий белок с последующим связыванием антитела с меченым дейтерием белком.- 15 040545 polypeptyl or protein can be used in a variety of ways known to experts in this field of technology. Examples of such techniques include, for example, the standard epitope cross-competitive assay described in Antibodies, Harlow-Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold. Spring Harb., New York), alanine scanning mutation analysis, peptide blotting (Reineke, 2004 , Methods Mol. Biol., 248:443-463) and peptide digestion assay. In addition, the following methods can be used: epitope excision, epitope extraction, and chemical modification of antigens (Tomer, 2000, Protein Science, 9:487-496). Another method that can be used to identify amino acids within a polypeptide with which an antibody interacts is hydrogen-deuterium exchange with mass spectrometric detection. In general terms, the method of hydrogen-deuterium exchange involves the introduction of a deuterium label into the protein of interest, followed by binding of the antibody to the deuterium labeled protein.

Затем комплекс белок/антитело переносят в воду, чтобы создать условия для водороднодейтериевого обмена во всех аминокислотных остатках кроме остатков, защищенных антителом (которые остаются меченными дейтерием). После диссоциации антитела белок-мишень подвергается расщеплению протеазой и масс-спектрометрическому анализу, посредством которого обнаруживают меченые дейтерием остатки, соответствующие специфичным аминокислотам, с которыми взаимодействует антитело. См., например, Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267(2):252-259; Engen, Smith (2001), Anal. Chem., 73:256A-265A.The protein/antibody complex is then transferred to water to allow for hydrogen/deuterium exchange at all amino acid residues except those protected by the antibody (which remain labeled with deuterium). After dissociation of the antibody, the target protein is subjected to protease digestion and mass spectrometric analysis, by which deuterium-labeled residues corresponding to the specific amino acids with which the antibody interacts are detected. See, for example, Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267(2):252-259; Engen, Smith (2001), Anal. Chem., 73:256A-265A.

Настоящее изобретение далее включает антитела к PRLR, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается любое из специфичных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе (например, антител, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, показанных в табл. 1 в настоящем документе). Аналогично настоящее изобретение включает также антитела к PRLR, конкурирующие за связывание с PRLR с любым из специфичных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе (например, антител, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, показанных в табл. 1 в настоящем документе).The present invention further includes anti-PRLR antibodies that bind to the same epitope that any of the specific exemplary antibodies described herein binds (eg, antibodies comprising any of the amino acid sequences shown in Table 1 herein). Similarly, the present invention also includes anti-PRLR antibodies that compete for PRLR binding with any of the specific exemplary antibodies described herein (eg, antibodies comprising any of the amino acid sequences shown in Table 1 herein).

Используя стандартные методы, известные специалистам в данной области техники и проиллюстрированные в настоящем документе, можно легко определить, связывается ли антитело с тем же эпитопом, с которым связывается референтное антитело к PRLR, или конкурирует с ним за связывание. Например, чтобы определить, связывается ли испытуемое антитело с тем же эпитопом, с которым связывается референтное антитело к PRLR согласно изобретению, референтному антителу позволяют связаться с белком PRLR. Затем оценивают способность испытуемого антитела связываться с молекулой PRLR. Если испытуемое антитело способно связываться с PRLR после насыщения связывания с референтным антителом к PRLR, можно заключить, что испытуемое антитело и референтное антитело к PRLR связываются с разными эпитопами. С другой стороны, если испытуемое антитело не связывается с молекулой PRLR после насыщения связывания с референтным антителом к PRLR, то испытуемое антитело может связываться с тем же эпитопом, с которым связывается референтное антитело к PRLR согласно изобретению. После этого могут быть проведены дополнительные стандартные испытания (например, анализы мутантных пептидов и анализы связывания), чтобы проверить, обусловлено ли наблюдаемое отсутствие связывания испытуемого антитела в действительности связыванием с тем же эпитопом, с которым связывается референтное антитело, или же отсутствие связывания вызвано стерической блокадой (или другим феноменом). При проведении таких экспериментов могут применяться методы ИФА (ELISA), радиоиммуноанализ, BiaCore, проточная цитометрия или любой другой метод количественного анализа связывания антитела, доступный для специалиста. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения два антитела связываются с одни и тем же эпитопом (или частично совпадающими эпитопами), если, например, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела подавляет связывание другого антитела не менее чем на 50%, но предпочтительно на 75, 90 или даже 99%, согласно результатам анализа конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990, 50:1495-1502). Альтернативно полагают, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если по существу все мутации, затрагивающие аминокислоты в антигене, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, уменьшают или устраняют связывание другого антитела. Считается, что два антитела имеют частично совпадающие эпитопы, лишь если субпопуляция мутаций, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, уменьшают или устраняют связывание другого антитела.Using standard methods known to those skilled in the art and illustrated herein, it can be readily determined whether an antibody binds to or competes with the same epitope that a reference anti-PRLR antibody binds to. For example, to determine if a test antibody binds to the same epitope that a reference anti-PRLR antibody of the invention binds to, the reference antibody is allowed to bind to the PRLR protein. The ability of the test antibody to bind to the PRLR molecule is then evaluated. If the test antibody is able to bind to PRLR after saturation of binding to the anti-PRLR reference antibody, it can be concluded that the test antibody and the anti-PRLR reference antibody bind to different epitopes. On the other hand, if the test antibody does not bind to the PRLR molecule after saturation of binding to the anti-PRLR reference antibody, then the test antibody can bind to the same epitope that the anti-PRLR reference antibody of the invention binds to. After that, additional standard tests (e.g., mutant peptide assays and binding assays) can be performed to check whether the observed lack of binding of the test antibody is actually due to binding to the same epitope to which the reference antibody binds, or whether the lack of binding is due to steric blockade. (or other phenomenon). When conducting such experiments, ELISA methods (ELISA), radioimmunoassay, BiaCore, flow cytometry, or any other method of quantitative analysis of antibody binding available to a person skilled in the art can be used. In accordance with certain embodiments of the present invention, two antibodies bind to the same epitope (or overlapping epitopes) if, for example, a 1-, 5-, 10-, 20-, or 100-fold excess of one antibody inhibits binding of the other antibody not less than 50%, but preferably 75%, 90% or even 99%, according to the results of the analysis of competitive binding (see, for example, Junghans et al., Cancer Res. 1990, 50:1495-1502). Alternatively, two antibodies are considered to bind to the same epitope if substantially all mutations affecting amino acids in the antigen that reduce or eliminate the binding of one antibody reduce or eliminate the binding of the other antibody. Two antibodies are considered to have overlapping epitopes only if a subset of mutations that reduce or eliminate the binding of one antibody reduce or eliminate the binding of another antibody.

Чтобы определить, конкурирует ли антитело за связывание (или имеет место перекрестная конкуренция за связывание) с референтным антителом к PRLR, вышеописанная методология применяется в двух ориентациях. В первой ориентации референтному антителу позволяют связаться с белком PRLR в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания испытуемого антитела с молекулой PRLR. Во второй ориентации испытуемому антителу позволяют связаться с молекулой в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания референтного антитела с молекулой PRLR. Если в обеих ориентациях только первое (насыщающее) антитело способно связаться с молекулой PRLR, то делают заключение о конкуренции между испытуемым и референтным антителами за связывание с PRLR. Как очевидно для специалиста, антитело, конкурирующее за связывание с референтным антителом, не всегдаTo determine if an antibody competes for binding (or cross-competes for binding) with a reference anti-PRLR antibody, the above methodology is applied in two orientations. In the first orientation, the reference antibody is allowed to bind to the PRLR protein under saturating conditions, followed by evaluation of the test antibody's binding to the PRLR molecule. In the second orientation, the test antibody is allowed to bind to the molecule under saturating conditions, followed by evaluation of reference antibody binding to the PRLR molecule. If in both orientations only the first (saturating) antibody is able to bind to the PRLR molecule, then competition between the test and reference antibodies for binding to PRLR is made. As will be apparent to those skilled in the art, an antibody competing for binding to a reference antibody is not always

- 16 040545 будет связываться с тем же эпитопом, что и референтное антитело, но может стерически заблокировать связывание референтного антитела посредством связывания с частично совпадающим или соседним эпитопом.- 16 040545 will bind to the same epitope as the reference antibody, but may sterically block reference antibody binding by binding to an overlapping or adjacent epitope.

Получение человеческих антител.Obtaining human antibodies.

Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению могут быть полностью человеческими антителами. Специалистам известны способы создания моноклональных антител, в том числе полностью человеческих моноклональных антител. В контексте настоящего изобретения любые такие известные способы могут применяться для получения человеческих антител, специфично связывающихся с человеческим PRLR.Anti-PRLR antibodies of the present invention may be fully human antibodies. Those skilled in the art are aware of methods for generating monoclonal antibodies, including fully human monoclonal antibodies. In the context of the present invention, any such known methods can be used to obtain human antibodies that specifically bind to human PRLR.

Например, используя технологию VELOCIMMUNE™ или любой другой сходный известный способ создания полностью человеческих моноклональных антител, вначале выделяют высокоаффинные химерные антитела к PRLR, имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Как описано ниже в экспериментальной части, антитела характеризуют и выбирают исходя из желательных характеристик, включающих аффинность, блокирующую лиганд активность, селективность, эпитоп и т.д. При необходимости мышиные константные области заменяют желаемой человеческой константной областью, например, дикого типа, или модифицированными IgG1 или IgG4, чтобы создать полностью человеческое антитело к PRLR. В то время как выбранная константная область может варьировать в соответствии с конкретным применением, характеристики высоко аффинного связывания с антигеном и специфичности в отношении мишени локализованы в вариабельной области. В определенных случаях полностью человеческие антитела к PRLR выделяют непосредственно из содержащих антиген B-лимфоцитов.For example, using VELOCIMMUNE™ technology or any other similar known method for making fully human monoclonal antibodies, high affinity anti-PRLR chimeric antibodies having a human variable region and a mouse constant region are first isolated. As described below in the experimental section, antibodies are characterized and selected based on desirable characteristics, including affinity, ligand-blocking activity, selectivity, epitope, and so on. If necessary, the mouse constant regions are replaced with the desired human constant region, eg wild-type, or modified IgG1 or IgG4, to generate a fully human anti-PRLR antibody. While the selected constant region may vary according to the particular application, the characteristics of high affinity antigen binding and target specificity are localized in the variable region. In certain instances, fully human anti-PRLR antibodies are isolated directly from antigen-bearing B-lymphocytes.

Биоэквиваленты.Bioequivalents.

Антитела к PRLR и антигенсвязывающие фрагменты антитела по настоящему изобретению включают белки с аминокислотными последовательностями, отличающимися от содержащихся в описанных антителах, но сохраняющими способность к связыванию человеческого PRLR. Такие варианты антител и фрагментов антител включают одну или несколько дополнительных аминокислот, делеций или замен аминокислот по сравнению с исходной последовательностью, но демонстрируют биологическую активность по существу эквивалентной активности описанных антител. Аналогично последовательности ДНК, кодирующие антитела к PRLR по настоящему изобретению, включают последовательности, содержащие одно или несколько добавленных нуклеотидов, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с предложенной последовательностью, но при этом кодируют антитело к PRLR или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые по существу биоэквивалентны антителу к PRLR или фрагменту антитела согласно настоящему изобретению. Примеры таких вариантов аминокислотных последовательностей и последовательностей ДНК обсуждаются выше.Anti-PRLR antibodies and antigen-binding antibody fragments of the present invention include proteins with amino acid sequences that differ from those contained in the described antibodies, but retain the ability to bind human PRLR. Such variants of antibodies and antibody fragments include one or more additional amino acids, deletions or amino acid substitutions compared to the original sequence, but exhibit biological activity substantially equivalent to that of the described antibodies. Similarly, the DNA sequences encoding the anti-PRLR antibodies of the present invention include sequences containing one or more added nucleotides, deletions or nucleotide substitutions compared to the proposed sequence, but encode an anti-PRLR antibody or an antigen-binding fragment of an antibody that is substantially bioequivalent to an anti-PRLR antibody. PRLR or antibody fragment of the present invention. Examples of such variants of amino acid sequences and DNA sequences are discussed above.

Два антигенсвязывающих белка, или антитела, считают биоэквивалентными, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, скорость и степень всасывания которых статистически значимо не различаются при введении в той же молярной дозе при сходных экспериментальных условиях в однократной дозе или многократно. Некоторые антитела будут считаться эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени всасывания, но не по скорости всасывания, и тем не менее могут считаться биоэквивалентными, потому что такие различия по скорости всасывания являются предусмотренными и отражены в справочной информации, не существенны для достижения эффективных концентраций лекарства в организме, например, при хроническом использовании и считаются с медицинской точки зрения незначимыми для определенного изучаемого лекарственного средства.Two antigen-binding proteins, or antibodies, are considered bioequivalent if, for example, they are pharmaceutical equivalents or pharmaceutical alternatives, the rate and extent of absorption of which are not statistically significantly different when administered at the same molar dose under similar experimental conditions in a single dose or multiple times. Some antibodies will be considered equivalents or pharmaceutical alternatives if they are equivalent in absorption but not in absorption rate, and yet may be considered bioequivalent because such differences in absorption rate are intended and reflected in the reference information are not essential to achieve effective concentrations of a drug in the body, such as from chronic use, and are considered medically insignificant for the particular study drug.

В одном варианте осуществления изобретения два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если между ними отсутствуют клинически значимые различия по безопасности, чистоте и активности.In one embodiment of the invention, two antigen-binding proteins are bioequivalent if there are no clinically significant differences between them in terms of safety, purity, and potency.

В одном варианте осуществления изобретения два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если пациента можно один или несколько раз переводить с лечения референтным препаратом на биологический препарат без ожидаемого повышения риска нежелательных эффектов, включающих клинически значимое изменение иммуногенности или сниженную эффективность по сравнению с продолжением лечения без такого перехода.In one embodiment of the invention, two antigen-binding proteins are bioequivalent if the patient can be switched from treatment with a reference drug to a biological drug one or more times without an expected increase in the risk of adverse effects, including a clinically significant change in immunogenicity or reduced efficacy compared to continuing treatment without such a switch.

В одном варианте осуществления изобретения два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если у них общий механизм или механизмы действия для условия или условий использования в той степени, до которой такие механизмы известны.In one embodiment, two antigen-binding proteins are bioequivalent if they share a common mechanism or mechanisms of action for the condition or conditions of use, to the extent that such mechanisms are known.

Биоэквивалентность может быть продемонстрирована с использованием in vivo и in vitro методов. Меры по биоэквивалентности включают, например, (a) испытание in vivo у людей или других млекопитающих, у которых концентрацию антител или их метаболитов как функцию от времени измеряют в крови, плазме, сыворотке или другой биологической жидкости;Bioequivalence can be demonstrated using in vivo and in vitro methods. Measures for bioequivalence include, for example, (a) in vivo testing in humans or other mammals in which the concentration of antibodies or their metabolites as a function of time is measured in blood, plasma, serum or other biological fluid;

(b) испытание in vitro, которое было скоррелированным и являлось обоснованно предсказательным применительно к данным о биодоступности в организме человека in vivo;(b) an in vitro test that was correlated and reasonably predictive of in vivo human bioavailability data;

- 17 040545 (c) испытание in vivo у людей или других млекопитающих, у которых измеряют соответствующий острый фармакологический эффект антитела (или его мишени) как функцию от времени; и (d) в хорошо контролируемом клиническом исследовании, которое показало безопасность, эффективность, биодоступность или биоэквивалентность антитела.- 17 040545 (c) an in vivo test in humans or other mammals in which the corresponding acute pharmacological effect of the antibody (or its target) is measured as a function of time; and (d) in a well-controlled clinical trial that has demonstrated the safety, efficacy, bioavailability, or bioequivalence of the antibody.

Биоэквивалентные варианты антител к PRLR согласно изобретению могут быть сконструированы, например, посредством замещения остатков или последовательностей или удаления концевых или внутренних остатков или последовательностей, которые не нужны для биологической активности. Например, остатки цистеина, не существенные для биологической активности, могут быть удалены или заменены другими аминокислотами, чтобы не допустить образования ненужных или неправильных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела могут включать варианты антител к PRLR, содержащие измененные аминокислоты, что приводит к изменению характеристик гликозилирования антител, например мутации, которые устраняют или удаляют гликозилирование.Bioequivalent variants of the anti-PRLR antibodies of the invention can be constructed, for example, by substituting residues or sequences or deleting terminal or internal residues or sequences that are not needed for biological activity. For example, cysteine residues that are not essential for biological activity can be removed or replaced with other amino acids to prevent the formation of unnecessary or incorrect intramolecular disulfide bridges during renaturation. In other contexts, bioequivalent antibodies may include variants of anti-PRLR antibodies containing altered amino acids that alter the glycosylation characteristics of the antibody, such as mutations that abrogate or remove glycosylation.

Селективность в отношении определенных видов и перекрестная реактивность у разных видов.Selectivity for certain species and cross-reactivity in different species.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предложены антитела к PRLR, которые связываются с человеческим PRLR, но не связываются с PRLR других видов. Настоящее изобретение включает также антитела к PRLR, которые связываются с человеческим PRLR и с PRLR одного или нескольких видов, не относящихся к человеку. Например, антитела к PRLR согласно изобретению могут связываться с человеческим рецептором пролактина и могут связываться или не связываться в зависимости от обстоятельств с одним или несколькими рецепторами мыши, крысы, морской свинки, хомяка, песчанки, свиньи, кошки, собаки, кролика, козы, овцы, коровы, лошади, верблюда, яванского макака, мартышки, макаки-резуса или шимпанзе. Согласно определенным иллюстративным вариантам осуществления изобретения предложены антитела к PRLR, которые специфично связывают PRLR человека и PRLR яванского макака (например, Macaca fascicularis). Другие антитела к PRLR согласно изобретению, описанные в изобретении, связываются с человеческим PRLR, но не связываются или лишь слабо связываются с PRLR яванского макака.In certain embodiments, the present invention provides anti-PRLR antibodies that bind to human PRLR but do not bind to other PRLR species. The present invention also includes anti-PRLR antibodies that bind to human PRLR and to PRLR of one or more non-human species. For example, the anti-PRLR antibodies of the invention can bind to the human prolactin receptor and may or may not bind, as appropriate, to one or more mouse, rat, guinea pig, hamster, gerbil, pig, cat, dog, rabbit, goat, sheep receptors. , cow, horse, camel, cynomolgus monkey, monkey, rhesus monkey or chimpanzee. In certain illustrative embodiments, anti-PRLR antibodies are provided that specifically bind human PRLR and cynomolgus monkey (eg, Macaca fascicularis) PRLR. Other anti-PRLR antibodies of the invention described herein bind to human PRLR but do not or only weakly bind to cynomolgus monkey PRLR.

Мультиспецифичные антитела.multispecific antibodies.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными (например, биспецифичными). Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными в отношении разных эпитопов одного полипептида-мишени или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфичные в отношении нескольких полипептидов-мишеней. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol., 22:238-244. Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению могут быть соединены с или могут экспрессироваться совместно с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком. Например, антитело или фрагмент антитела могут быть функционально соединены (например, посредством химического сопряжения, сплайсинга, нековалентной ассоциации или иначе) с одним или несколькими другими молекулярными группами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, с образованием биспецифичного или мультиспецифичного антитела со второй специфичностью связывания.The antibodies of the present invention may be monospecific or multispecific (eg, bispecific). Multispecific antibodies may be specific for different epitopes of a single target polypeptide or may contain antigen-binding domains specific for multiple target polypeptides. See, for example, Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol., 22:238-244. The anti-PRLR antibodies of the present invention may be linked to or may be co-expressed with another functional molecule, such as another peptide or protein. For example, an antibody or antibody fragment can be operably linked (eg, by chemical coupling, splicing, non-covalent association, or otherwise) with one or more other molecular groups, such as another antibody or antibody fragment, to form a bispecific or multispecific antibody with a second binding specificity. .

Настоящее изобретение включает биспецифичные антитела, у которых один домен иммуноглобулина связывает человеческий PRLR, а другой домен иммуноглобулина является специфичным в отношении второго антигена. PRLR-связывающий домен может содержать любую из аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR или CDR, показанных в табл. 1 в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления изобретения PRLR-связывающий домен связывает человеческий PRLR и блокирует связывание пролактина с PRLR. В других вариантах PRLR-связывающий домен связывает человеческий PRLR, но не блокирует связывание пролактина с PRLR.The present invention includes bispecific antibodies in which one immunoglobulin domain binds human PRLR and the other immunoglobulin domain is specific for a second antigen. The PRLR binding domain may comprise any of the HCVR/LCVR or CDR amino acid sequences shown in Table 1. 1 in this document. In certain embodiments, the PRLR binding domain binds human PRLR and blocks the binding of prolactin to PRLR. In other embodiments, the PRLR binding domain binds human PRLR but does not block prolactin binding to PRLR.

Иллюстративным форматом биспецифичного антитела, которое может использоваться в контексте настоящего изобретения, является использование первого домена иммуноглобулина (Ig) C_H3 и второго домена IgC_H3, причем первый и второй домены IgC_H3 отличаются от друг друга по крайней мере одной аминокислотой, при этом различие по крайней мере на одну аминокислоту уменьшает связывание биспецифичного антитела с белком A по сравнению с биспецифичным антителом, у которого отсутствует различие по аминокислотному составу. В одном варианте осуществления изобретения первый домен IgC_H3 связывает Белок A и второй домен IgC_H3 содержит мутацию, которая уменьшает или отменяет связывание белка A, например модификацию H95R (нумерация экзона по системе IMGT); H435R (нумерация EC). Второй домен CH3 может дополнительно содержать модификацию Y96F (IMGT; Y436F EC). Дополнительные модификации, которые могут быть обнаружены во втором домене CH3, включаютAn exemplary bispecific antibody format that can be used in the context of the present invention is the use of a first C _H 3 immunoglobulin (Ig) domain and a second IgC _H 3 domain, wherein the first and second IgC _H 3 domains differ from each other by at least one amino acid, with In this case, a difference of at least one amino acid reduces the binding of the bispecific antibody to protein A compared to a bispecific antibody that does not have a difference in amino acid composition. In one embodiment, the first IgCH _H 3 domain binds Protein A and the second IgCH _H 3 domain contains a mutation that reduces or abolishes protein A binding, such as an H95R modification (IMGT exon numbering); H435R (EC numbering). The second CH3 domain may further comprise the Y96F (IMGT; Y436F EC) modification. Additional modifications that can be found in the second CH3 domain include

D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I EC) в случае антител IgG1;D16E, L18M, N44S, K52N, V57M and V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M and V422I EC) in the case of IgG1 antibodies;

N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I EC) в случае антител IgG2; иN44S, K52N and V82I (IMGT; N384S, K392N and V422I EC) for IgG2 antibodies; And

Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I EC) в случае антител IgG4.Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q and V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q and V422I EC) in the case of IgG4 antibodies.

Описанные выше варианты биспецифичного формата антитела входят в объем настоящего изобретения.The variants of the bispecific antibody format described above are within the scope of the present invention.

- 18 040545- 18 040545

Другие иллюстративные биспецифичные форматы, которые могут использоваться в контексте настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь перечисленным, например, форматы scFv или биспецифичные форматы диатела, сплайсинг IgG-scFv, двойной вариабельный домен (DVD)-Ig, квадрогибридому, структуру выступы-во-впадины, общую легкую цепь (например, общую легкую цепь с выступами-во-впадинах и т.д.), CrossMab, CrossFab, (SEED)тело, лейциновую застежку, дуотело, IgG1/IgG2, Fab двойного действия (DAF)-IgG и Mab² (см., например, Кляйн et al., 2012, mAbs, 4:6, 1-11; и ссылки, процитированные в эти документах, для ознакомления с вышеизложенными форматами). Биспецифичные антитела могут также быть сконструированы при использовании конъюгации между пептидом и нуклеиновой кислотой, причем, например, для создания сайт-специфичных конъюгатов антитела с олигонуклеотидом используются неприродные аминокислоты с ортогональной химической реактивностью, из которых затем в результате самосборки образуются мультимерные комплексы, имеющие определенный состав, валентность и геометрию (см., например, Kazane et al., J. Chem. Soc. [Epub: 4 декабря 2012]).Other illustrative bispecific formats that can be used in the context of the present invention include, but are not limited to, for example, scFv formats or diabody bispecific formats, IgG-scFv splicing, double variable domain (DVD)-Ig, quadrohybridoma, bump-in-trough structure , common light chain (e.g., common light chain with ledge-in-gallows, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, leucine zipper, duobody, IgG1/IgG2, dual action Fab (DAF)-IgG, and Mab ² (see, for example, Klein et al., 2012, mAbs, 4:6, 1-11; and references cited in those documents for the above formats). Bispecific antibodies can also be constructed using conjugation between a peptide and a nucleic acid, and, for example, to create site-specific conjugates of an antibody with an oligonucleotide, non-natural amino acids with orthogonal chemical reactivity are used, from which multimeric complexes are then formed as a result of self-assembly, having a certain composition, valency and geometry (see, for example, Kazane et al., J. Chem. Soc. [Epub: December 4, 2012]).

Терапевтический препарат и введение.Therapeutic drug and administration.

В изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела к PRLR или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению. В состав фармацевтических композиций согласно изобретению входят подходящие носители, вспомогательные вещества и другие агенты, которые обеспечивают улучшенный перенос, доставку, переносимость и т.п. В фармакологических руководствах можно найти многочисленные соответствующие лекарственные формы, известные всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания. Эти лекарственные формы включают, например, порошки, пасты, мази, гели, воски, масла, липиды, липидсодержащие везикулы (катионные или анионные) (например, LIPOFECTIN™, LifeTechnologies, Карлсбад, Калифорния), конъюгаты ДНК, безводные адсорбирующие пасты, эмульсии типа масло в воде и вода в масле, эмульсии карбовакс (полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al., Compendium of excipients for parenteral formulations (Справочник по вспомогательным веществам для парентеральных лекарственных форм), PDA (1998), J. Pharm. Sci. Technol., 52:238-311.The invention provides pharmaceutical compositions containing anti-PRLR antibodies or antigen-binding fragments of the present invention. The pharmaceutical compositions of the invention include suitable carriers, excipients, and other agents that provide improved transfer, delivery, tolerability, and the like. Many relevant dosage forms known to all pharmaceutical chemists can be found in pharmacological manuals: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. These dosage forms include, for example, powders, pastes, ointments, gels, waxes, oils, lipids, lipid-containing vesicles (cationic or anionic) (e.g., LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA conjugates, anhydrous adsorbent pastes, emulsions such as oil in water and water in oil, carbovax emulsions (polyethylene glycols of various molecular weights), semi-solid gels and semi-solid mixtures containing carbovax. See also Powell et al., Compendium of excipients for parenteral formulations, PDA (1998), J. Pharm. sci. Technol., 52:238-311.

Доза антитела, вводимая пациенту, может варьироваться в зависимости от возраста и размера пациента, подлежащего лечению заболевания, состояний, способов введения и т.п. Предпочтительная доза, как правило, рассчитывается по массе тела или площади поверхности тела. Для взрослых пациентов может быть предпочтительным внутривенное введение антитела согласно настоящему изобретению, причем, как правило, однократная доза составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг массы тела, более предпочтительно от приблизительно 0,02 до приблизительно 7 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,03 до приблизительно 5 мг/кг массы тела или от приблизительно 0,05 до приблизительно 3 мг/кг массы тела. Частота и продолжительность лечения могут быть скорректированы в зависимости от тяжести и продолжительности состояния. Эффективные дозировки и графики введения антитела к PRLR могут быть определены эмпирически; например, может проводиться периодическая оценка изменений в состоянии пациента с последующей корректировкой дозы. Кроме того, может быть выполнен межвидовой пересчет дозировок с помощью способов, известных в данной области техники (например, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res., 8:1351).The dose of the antibody administered to a patient may vary depending on the age and size of the patient, the disease being treated, conditions, routes of administration, and the like. The preferred dose is usually calculated by body weight or body surface area. For adult patients, intravenous administration of an antibody of the present invention may be preferred, with typically a single dose of about 0.01 to about 20 mg/kg body weight, more preferably about 0.02 to about 7 mg/kg body weight. , from about 0.03 to about 5 mg/kg of body weight, or from about 0.05 to about 3 mg/kg of body weight. The frequency and duration of treatment may be adjusted according to the severity and duration of the condition. Effective dosages and schedules for administering an anti-PRLR antibody can be determined empirically; for example, periodic evaluation of changes in the patient's condition may be carried out, followed by dose adjustment. In addition, cross-species dosage conversions can be performed using methods known in the art (eg, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res., 8:1351).

Известны различные системы доставки, которые могут использоваться для введения фармацевтической композиции согласно изобретению, например инкапсуляция в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантных клетках, способных экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецептором эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:4429-4432). Способы введения включают, не ограничиваясь перечисленным, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, перидуральный и оральный способы. Композиция может вводиться любым удобным способом, например, посредством инфузии или струйного вливания, всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки органов (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и может вводиться вместе с другими биологически активными веществами. Введение может быть системным или местным.Various delivery systems are known that can be used to administer the pharmaceutical composition of the invention, such as encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing mutant viruses, receptor-mediated endocytosis (see, for example, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:4429-4432). Routes of administration include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The composition may be administered by any convenient route, for example, by infusion or bolus, absorption through the epithelial or mucocutaneous linings of organs (eg, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.), and may be administered with other biologically active substances. The introduction can be systemic or local.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть доставлена подкожно или внутривенно стандартной иглой и шприцем. Кроме того, относительно подкожной поставки для доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению вполне может применяться шприц-ручка. Такая шприц-ручка может быть предназначена для однократного или многократного использования. Шприц-ручка для многоразового использования обычно применяется со сменным картриджем, в котором находится фармацевтическая композиция. После введения всей содержащейся в картридже фармацевтической композиции и опорожнения картриджа пустой картридж может быть извлечен и заменен на новый картридж с фармацевтической композицией. Шприц-ручка снова готова к использованию. В одноразовой шприце-ручке сменный картридж отсутствует. Одноразовая шприц-ручка поставляется предварительно наполненной фармацевтической композицией, которая находится в резервуаре шприца. После освобождения резервуара от фармацевтической композиции шприц-ручка подлежит утилизации.The pharmaceutical composition of the present invention can be delivered subcutaneously or intravenously with a standard needle and syringe. In addition, with respect to subcutaneous delivery, a pen may well be used to deliver the pharmaceutical composition of the present invention. Such a pen can be designed for single use or multiple use. A reusable pen is usually used with a replaceable cartridge that contains a pharmaceutical composition. After all of the pharmaceutical composition contained in the cartridge has been administered and the cartridge has been emptied, the empty cartridge can be removed and replaced with a new pharmaceutical composition cartridge. The syringe pen is ready for use again. There is no replaceable cartridge in a disposable syringe pen. The disposable pen is supplied with a pre-filled pharmaceutical composition in the syringe reservoir. After the reservoir is emptied of the pharmaceutical composition, the syringe pen must be disposed of.

Для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению приFor subcutaneous delivery of a pharmaceutical composition according to the present invention when

- 19 040545 меняются многочисленные разнообразные шприц-ручки для многократного использования и автоинъекторы. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Вудсток, Великобритания), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Бергдорф, Швейцария), HUMALOG MIX 75/25™, HUMALOG™, HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Индианаполис, Индиана), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), BD™ (Becton Dickinson, Франклин Лэйкс, Нью-Джерси), OPTIPEN™, OPTIPENPRO™, OPTIPENSTARLET™, и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Франкфурт, Германия) и многие другие устройства. Примеры одноразовых шприц-ручек, используемых для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным, SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинжектор SURECLICK™ (Amgen, СаузендОукс, Калифорния), PENLET™ (Haselmeier, Штутгарт, Германия), EPIPEN (Dey, L.P.), HUMIRA™ (Abbott Labs, Эббот-Парк, Иллинойс) и многие другие устройства.- 19 040545 many different reusable pens and auto-injectors are exchanged. Examples include, but are not limited to, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™, HUMALOG™, HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey ), OPTIPEN™, OPTIPENPRO™, OPTIPENSTARLET™, and OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany) and many other devices. Examples of disposable pens used for subcutaneous delivery of the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) and KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ auto-injector (Amgen, SouthernOaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, Illinois) and many other devices.

В определенных ситуациях для доставки фармацевтической композиции может применяться система с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления изобретения может использоваться насос (см. Langer выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201). В другом варианте осуществления изобретения могут использоваться полимерные материалы (см. Медицинское применение систем с контролируемым высвобождением, под ред. Langer, Wise, 1974, CRC Pres., Бока-Ратон, Флорида). В еще одном варианте осуществления изобретения система с контролируемым высвобождением может быть помещена вблизи мишени для композиции, при этом требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, 1984, в публикации Медицинское применение систем с контролируемым высвобождением выше, издание 2, с. 115-138). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.In certain situations, a controlled release system may be used to deliver the pharmaceutical composition. In one embodiment, a pump may be used (see Langer supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201). In another embodiment of the invention, polymeric materials may be used (see Medical Applications of Controlled Release Systems, ed. Langer, Wise, 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida). In yet another embodiment of the invention, the controlled release system can be placed near the target of the composition, requiring only a fraction of the systemic dose (see, for example, Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release Systems supra, edition 2, p. 115-138). Other controlled release systems are reviewed by Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.

Инъекционные препараты могут включать лекарственные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных инфузий и т.д. Эти инъекционные препараты могут быть получены с помощью известных способов. Например, инъекционные препараты могут быть получены путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела или его описанных выше солей в стерильной водной среде или масляной питательной среде, традиционно используемой для инъекций. В качестве водной среды для инъекций могут быть использованы, например, физиологический раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные вещества, и т.д., которые могут использоваться в комбинации с соответствующими солюбилизирующим агентом, таким как спирт (например, этанол), полиспирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80, HCO-50 (полиэтиленоксид (50 моль) аддукт гидрогенизируемого касторового масла)) и т.д. В качестве масляной среды используется, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., которые могут применяться в комбинации с соответствующим солюбилизирующим агентом, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Приготовленным таким образом препаратом для инъекции предпочтительно заполняют соответствующие ампулы.Injectable preparations may include dosage forms for intravenous, subcutaneous, intradermal and intramuscular injections, drip infusions, etc. These injectable preparations can be obtained using known methods. For example, injectable preparations can be prepared by dissolving, suspending, or emulsifying the antibody, or its salts described above, in a sterile aqueous or oily medium commonly used for injection. As the aqueous injection medium, for example, physiological saline, an isotonic solution containing glucose and other excipients, etc. can be used, which can be used in combination with an appropriate solubilizing agent such as alcohol (for example, ethanol), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyethylene oxide (50 mol) hydrogenated castor oil adduct)) and the like. As the oil medium, for example, sesame oil, soybean oil, etc. are used, which can be used in combination with an appropriate solubilizing agent such as benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. The injectable preparation thus prepared is preferably filled into appropriate ampoules.

Предпочтительно готовить описанные выше фармацевтические композиции для перорального или парентерального введения в виде лекарственных форм в стандартной дозе, подходящей для корректировки дозы действующих веществ. Такие лекарственные формы в стандартной дозе включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, препараты для инъекций (ампулы), суппозитории и т.д. Количество вышеупомянутого антитела в стандартной дозе обычно составляет от приблизительно 5 мг до приблизительно 500 мг в стандартной дозе лекарственной формы; предпочтительное содержание вышеупомянутого антитела составляет от приблизительно 5 мг до приблизительно 100 мг, особенно в лекарственных формах для инъекции, и от приблизительно 10 мг до приблизительно 250 мг в других лекарственных формах.It is preferable to prepare the above-described pharmaceutical compositions for oral or parenteral administration in the form of dosage forms in a unit dose suitable for adjusting the dose of active substances. Such unit dosage forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, and the like. The amount of the aforementioned antibody in a dosage unit is typically from about 5 mg to about 500 mg per dosage unit; the preferred content of the aforementioned antibody is from about 5 mg to about 100 mg, especially in injection dosage forms, and from about 10 mg to about 250 mg in other dosage forms.

Терапевтическое применение антител.Therapeutic use of antibodies.

Настоящее изобретение включает способы, включающие введение нуждающемуся в лечении пациенту данной терапевтической композиции, содержащей антитело к PRLR или конъюгата антитела с лекарственным средством, включающего антитела к PRLR (например, антитела к PRLR или ADC, содержащих любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, показанные в табл. 1 в настоящем документе). Терапевтическая композиция может содержать любое антитело к PRLR, антигенсвязывающие фрагменты этих антител или ADC согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.The present invention includes methods comprising administering to a patient in need of treatment a given therapeutic composition comprising an anti-PRLR antibody or an antibody-drug conjugate comprising anti-PRLR antibodies (e.g., anti-PRLR or ADC antibodies comprising any of the HCVR/LCVR or CDR sequences shown in Table 1 in this document). The therapeutic composition may contain any anti-PRLR antibody, antigen-binding fragments of these antibodies or ADC according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Антитела и ADC согласно настоящему изобретению используются, среди прочего, для лечения, профилактики и/или уменьшения интенсивности любого заболевания или нарушения, связанного или опосредованного экспрессией или активностью рецептора пролактина, а также могущего быть излеченным посредством блокирования взаимодействия между PRLR и пролактином, или подавления активности PRLR и/или участия PRLR в сигнальном пути, и/или путем содействия интернализации рецептора и/или снижения численности рецепторов на клеточной поверхности.The antibodies and ADCs of the present invention are used, inter alia, for the treatment, prevention and/or amelioration of any disease or disorder associated with or mediated by the expression or activity of the prolactin receptor, and which can be cured by blocking the interaction between PRLR and prolactin, or suppressing the activity PRLR and/or PRLR involvement in the signaling pathway, and/or by promoting receptor internalization and/or downregulation of cell surface receptors.

Например, антитела и ADC согласно настоящему изобретению используются для лечения опухолей, экспрессирующих рецептор пролактина и/или зависимых от сигнальных путей с участием пролакFor example, the antibodies and ADCs of the present invention are used to treat tumors that express the prolactin receptor and/or are dependent on prolactin signaling pathways.

- 20 040545 тина, например опухолей молочной железы. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению могут также использоваться для лечения первичных и/или метастатических опухолей, образующихся в головном мозге и мягких мозговых оболочках, ротоглотке, легких и в бронхиальном дереве, желудочно-кишечном тракте, мужских и женских половых путях, мышцах, костях, коже и придатках кожи, соединительной ткани, селезенке, иммунной системе, кроветворной системе и костном мозге, в печени и мочевых путях и специальных сенсорных органах, таких как глаз. В определенных вариантах осуществления изобретения антитела и ADC согласно настоящему изобретению используются для лечения одного или нескольких следующих онкологических заболеваний: почечно-клеточной карциномы, карциномы поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака предстательной железы, злокачественной глиомы, остеогенной саркомы, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка (например, рака желудка с амплификацией гена MET), злокачественной мезотелиомы, множественной миеломы, рака яичников, мелкоклеточного рака легких, не мелкоклеточного рака легких, синовиальной саркомы, рака щитовидной железы, рака молочной железы или меланомы.- 20 040545 slime, for example breast tumors. The antibodies and antigen-binding fragments of the present invention can also be used to treat primary and/or metastatic tumors in the brain and meninges, oropharynx, lungs and bronchial tree, gastrointestinal tract, male and female genital tract, muscles, bones , skin and skin appendages, connective tissue, spleen, immune system, hematopoietic system and bone marrow, liver and urinary tract, and special sensory organs such as the eye. In certain embodiments, the antibodies and ADCs of the present invention are used to treat one or more of the following cancers: renal cell carcinoma, pancreatic carcinoma, head and neck cancer, prostate cancer, malignant glioma, osteogenic sarcoma, colorectal cancer , gastric cancer (eg, gastric cancer with MET gene amplification), malignant mesothelioma, multiple myeloma, ovarian cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, synovial sarcoma, thyroid cancer, breast cancer, or melanoma.

Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению также используются для лечения или профилактики одного или нескольких заболеваний или нарушений, выбранных из группы, включающей эндометриоз, аденомиоз, негормональную контрацепцию у женщин, доброкачественные заболевания молочных желез и масталгию, подавление лактации, доброкачественную гипертрофию предстательной железы, фиброзные опухоли, гипер- и нормопролактинемической алопеции и в составе гормональной терапии, направленной на подавление пролиферации эпителиальных клеток в молочных железах.Anti-PRLR antibodies of the present invention are also useful in the treatment or prevention of one or more diseases or disorders selected from the group consisting of endometriosis, adenomyosis, non-hormonal contraception in women, benign breast disease and mastalgia, lactation suppression, benign prostatic hypertrophy, fibroid tumors. , hyper- and normoprolactinemic alopecia and as part of hormone therapy aimed at suppressing the proliferation of epithelial cells in the mammary glands.

В контексте способов лечения, описанных в настоящем документе, антитело к PRLR может применяться в режиме монотерапии (т.е. как единственный терапевтический агент) или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами (примеры которых описаны в других разделах данного документа).In the context of the treatments described herein, an anti-PRLR antibody may be used alone (i.e., as the sole therapeutic agent) or in combination with one or more additional therapeutic agents (examples of which are described elsewhere in this document).

Настоящее изобретение включает способы идентификации пациентов, которые могут быть пролечены антителами или ADC согласно настоящему изобретению, посредством анализа, направленного на выявление высокого уровня экспрессии PRLR в одной или нескольких тканях пациента, таких как опухолевая ткань. Близкий вариант осуществления настоящего изобретения включает способы лечения рака, характеризующегося высоким уровнем экспрессии PRLR. Например, настоящее изобретение включает способы лечения, включающие введение антитела к PRLR согласно настоящему изобретению, или ADC, содержащего такое антитело (например, любого из ADC, содержащего антитело к PRLR, описанного в других разделах настоящего документа), пациенту с опухолью, в которой был идентифицирован высокий уровень экспрессии PRLR. В определенных вариантах осуществления изобретения для идентификации высокого уровня экспрессии PRLR в опухоли применяется иммуногистохимическое исследование полученного при биопсии образца или другие методы визуализации, например иммуно-ПЭТ и т.д.The present invention includes methods for identifying patients who can be treated with the antibodies or ADCs of the present invention by assaying for high levels of PRLR expression in one or more tissues of the patient, such as tumor tissue. A related embodiment of the present invention includes methods for treating cancer characterized by high levels of PRLR expression. For example, the present invention includes methods of treatment comprising administering an anti-PRLR antibody of the present invention, or an ADC containing such an antibody (e.g., any of the ADCs containing an anti-PRLR antibody described elsewhere herein) to a patient with a tumor in which a high level of PRLR expression was identified. In certain embodiments, immunohistochemistry of a biopsy sample or other imaging techniques such as immuno-PET, etc. are used to identify high levels of PRLR expression in a tumor.

Комбинированная терапия и лекарственные формы.Combination therapy and dosage forms.

Настоящее изобретение включает композиции и лекарственные формы, содержащие любое из антител к PRLR, описанное в настоящем документе, в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, и способы лечения, включающие введение такой комбинации пациенту.The present invention includes compositions and dosage forms comprising any of the anti-PRLR antibodies described herein in combination with one or more additional therapeutically active ingredients, and methods of treatment comprising administering such combination to a patient.

Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению могут быть включены в состав лекарственной формы и/или могут быть введены в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, выбранными из группы, состоящей из следующих веществ: антагонист EGFR (например, антитело к EGFR (например, цетуксимаб или панитумумаб) или низкомолекулярный ингибитор EGFR (например, гефинитиб или эрлотиниб)), антагонист другого члена семейства рецепторов EGFR, например Her2/ErbB2, ErbB3 или ErbB4 (например, антитело к ErbB2 (например, трастузумаб или T-DM1 (KADCYLA®)), антитело к ErbB3, или антитело к ErbB4, или низкомолекулярный ингибитор рецепторов ErbB2, ErbB3 или ErbB4), антагонист EGFRvlll (например, антитело, специфично связывающее EGFRvlll), антагонист cMET (например, антитело к cMET), антагонист IGF1R (например, антитело к IGF1R), ингибитор B-raf (например, вемурафениб, сорафениб, GDC-0879, PLX-4720), ингибитор PDGFR-α (например, антитело к PDGFR-α), ингибитор PDGFR-β (например, антитело к PDGFR-β антитело или низкомолекулярный ингибитор киназы, например иматиниба мезилат или сунитиниба малат), ингибитор лиганда PDGF (например, антитело к PDGF-A, -B, -C или -D, аптамер, миРНК и т.д.), антагонист VEGF (например, VEGF-Trap, например, афлиберсепт (см. патент США 7087411), также упомянутый в настоящем документе как ингибирующий VEGF химерный белок, антитело к VEGF (например, бевацизумаб), низкомолекулярный ингибитор киназы рецептора VEGF (например, сунитиниб, сорафениб или пазопаниб)), антагонист DLL4 (например, антитело к DLL4, предложенное в патенте США 2009/0142354, например, REGN421), антагонист Ang2 (например, антитело к Ang2, предложенное в патенте США 2011/0027286, например H1H685P), антагонист FOLH1 (например, антитело к FOLM), антагонист STEAP1 или STEAP2 (например, антитело к STEAP1 или антитело к STEAP2), антагонист TMPRSS2 (например, антитело к TMPRSS2), антагонист MSLN (например, антитело к MSLN), антагонист CA9 (например, антитело к CA9), антагонист уроплакина (например, анти-уроплакин (например, антитело кAnti-PRLR antibodies of the present invention may be formulated and/or administered in combination with one or more additional therapeutically active ingredients selected from the group consisting of the following: an EGFR antagonist (e.g., an anti-EGFR antibody (e.g., cetuximab or panitumumab) or a small molecule EGFR inhibitor (eg, gefinitib or erlotinib)), an antagonist of another member of the EGFR receptor family, such as Her2/ErbB2, ErbB3, or ErbB4 (eg, an anti-ErbB2 antibody (eg, trastuzumab or T-DM1 (KADCYLA®) ), an anti-ErbB3 antibody, or an anti-ErbB4 antibody, or a small molecule inhibitor of the ErbB2, ErbB3, or ErbB4 receptor), an EGFRvlll antagonist (eg, an antibody that specifically binds EGFRvlll), a cMET antagonist (eg, an anti-cMET antibody), an IGF1R antagonist (eg, an antibody to IGF1R), B-raf inhibitor (eg, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α inhibitor (eg, anti-PDGFR-α antibody), PDGFR inhibitor -β (eg, anti-PDGFR-β antibody or small molecule kinase inhibitor, such as imatinib mesylate or sunitinib malate), PDGF ligand inhibitor (eg, anti-PDGF-A, -B, -C, or -D, aptamer, siRNA, etc. .d.), VEGF antagonist (e.g. VEGF-Trap, e.g. aflibercept (see US Pat. No. 7,087,411), also referred to herein as a VEGF-inhibiting chimeric protein, an anti-VEGF antibody (e.g., bevacizumab), a small molecule VEGF receptor kinase inhibitor (e.g., sunitinib, sorafenib, or pazopanib)), a DLL4 antagonist (e.g., an anti-DLL4 antibody, US 2009/0142354, e.g. REGN421), Ang2 antagonist (e.g. anti-Ang2 antibody as proposed in US 2011/0027286, e.g. H1H685P), FOLH1 antagonist (e.g. anti-FOLM antibody), STEAP1 or STEAP2 antagonist (e.g. , anti-STEAP1 antibody or anti-STEAP2 antibody), TMPRSS2 antagonist (eg, anti-TMPRSS2 antibody), MSLN antagonist (eg, anti-MSLN antibody), CA9 antagonist (eg, anti-CA9 antibody), uroplakin antagonist (eg, anti-uroplakin (eg , an antibody to

- 21 040545- 21 040545

UPK3A)), антагонист MUC16 (например, антитело к MUC16), антагонист Tn-антигена (например, антитело к Tn), антагонист CLEC12A (например, антитело к CLEC12A), антагонист TNFRF17 (например, антитело к TNFRF17), антагонист LGR5 (например, антитело к LGR5), моновалентный антагонист CD20 (например, моновалентное антитело к CD20, такое как ритуксимаб) и т.д. Другие агенты, которые могут принести пользу при введении в комбинации с антителами согласно изобретению, включают, например, тамоксифен, ингибиторы ароматазы и ингибиторы цитокина, включая низкомолекулярные ингибиторы цитокина и антитела, связывающиеся с цитокинами, например L-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, или с соответствующими рецепторами цитокинов.UPK3A)), MUC16 antagonist (e.g. anti-MUC16 antibody), Tn antigen antagonist (e.g. anti-Tn antibody), CLEC12A antagonist (e.g. anti-CLEC12A antibody), TNFRF17 antagonist (e.g. anti-TNFRF17 antibody), LGR5 antagonist (e.g. , an anti-LGR5 antibody), a monovalent CD20 antagonist (eg, a monovalent anti-CD20 antibody such as rituximab), etc. Other agents that may be useful when administered in combination with antibodies of the invention include, for example, tamoxifen, aromatase inhibitors, and cytokine inhibitors, including small molecule cytokine inhibitors and antibodies that bind to cytokines, such as L-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, or corresponding cytokine receptors.

Настоящее изобретение включает композиции и лекарственные формы, содержащие любое из антител к PRLR, описанных в настоящем документе, в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (Cytoxan™);The present invention includes compositions and dosage forms containing any of the anti-PRLR antibodies described herein in combination with one or more chemotherapeutic agents. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (Cytoxan™);

алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфон и пипосульфан;alkylsulfonates such as busulfan, improsulfone and piposulfan;

азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа, и уредопа;aziridines such as benzodopa, carbokwon, meturedopa, and uredopa;

этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентриофосфороамид и триметиломеламин;ethyleneimines and methylamelamines, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenetriophosphoramide, and trimethylomelamin;

хлорметины, например хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксид гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин;chlormethines, eg chlorambucil, chlornaphasine, chlorphosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembicine, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uramustine;

нитромочевины, такая как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицины, актиномицин, отрамицин, азамерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромонинцины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксоЩ-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идамбицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родоубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, триамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналы, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; средства, восполняющие недостаток фолиевой кислоты, такие как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK™; разоксан; сизафрран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид; (Ara-C); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например, паклитаксел (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, НьюДжерси) и доксетаксел (TAXOTER™, Aventis, Энтони, Франция); хлорамбицил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; и капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных веществ. Также в настоящее определение включают антигормональные агенты, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, например антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-имидазолы, ингибирующие ароматазу, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (Fareston); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных веществ.nitroureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; antibiotics such as aclacinomycins, actinomycin, otramycin, azamerin, bleomycins, cactinomycin, calicheamicin, carabicin, carminomycin, carcinophyllin, chromonicins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-Norleucine, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idambicin, marcellomycin, mitomycin, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycin, peplomycin, porfiromycin, puromycin, quelamycin, rhodoubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogs such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogues such as fludarabine, 6-mercaptopurine, triamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluridine, enocytabine, floxuridine; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; antiadrenals such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid supplements such as folinic acid; aceglatone; aldofosfamide glycoside; aminolevulinic acid; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraksat; defofamine; demecolcin; diaziquon; elfornitin; elliptinium acetate; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidamine; mitoguazone; mitoxantrone; mopidamol; nitracrine; pentostatin; phenamet; pyrarubicin; podophyllic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK™; razoxane; sizafrran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2,2',2-trichlorotriethylamine; urethane; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; hacytosine; arabinoside; (Ara-C); cyclophosphamide; thiotepa; taxanes, eg paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and doxetaxel (TAXOTER™, Aventis, Anthony, France); chlorambicil; gemcitabine; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogues such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitomycin C; mitoxantrone; vincristine; vinorelbine; navelbin; novantron; teniposide; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; CPT-11; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO); retinoic acid; esperamycins; and capecitabine; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the foregoing. Also included within the present definition are antihormonal agents that act to regulate or inhibit the action of hormones on tumors, e.g. antiestrogens, including e.g. , onapriston and toremifene (Fareston); and antiandrogens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the foregoing.

Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению могут быть включены в состав лекарственной формы и/или могут быть введены в комбинации с противовирусными средствами, антибиотиками, аналгезирующими средствами, кортикостероидами, стероидами, кислородом, антиоксидантами, ингибиторами ЦОГ, кардиопротекторами, металлохелатами, ИФН-гамма и/или НПВС.Anti-PRLR antibodies of the present invention may be formulated and/or may be administered in combination with antivirals, antibiotics, analgesics, corticosteroids, steroids, oxygen, antioxidants, COX inhibitors, cardioprotectors, metal chelates, IFN-gamma and/ or NSAIDs.

Дополнительный(ые) терапевтически активный(ые) компонент(ы), например любой из упомянутых выше агентов или его производные, может(могут) применяться непосредственно до, одновременно или вскоре после введения антитела к PRLR, описанного в настоящем изобретении; в целях настоящего изобретения такие схемы введения рассматриваются как назначение антитела к PRLR в комбинации с дополнительным терапевтически активным компонентом). Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, в которых антитела к PRLR согласно настоящему изобретению включены в состав,Additional(s) therapeutically active(s) component(s), for example any of the above agents or derivatives thereof, may be used immediately before, simultaneously with or shortly after the introduction of antibodies to PRLR described in the present invention; for the purposes of the present invention, such administration regimens are considered to be the administration of an anti-PRLR antibody in combination with an additional therapeutically active ingredient). The present invention includes pharmaceutical compositions in which the anti-PRLR antibodies of the present invention are formulated,

- 22 040545 содержащий одно или несколько дополнительных терапевтически активных компонентов, как описано в других разделах настоящего документа.- 22 040545 containing one or more additional therapeutically active components, as described in other sections of this document.

Схемы применения.Application schemes.

Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, многократные дозы антитела к PRLR (или фармацевтической композиции, включающей комбинацию антитела к PRLR с любым из дополнительных терапевтически активных веществ, упомянутых в настоящем документе) могут быть введены пациенту в течение определенного интервала времени. Способы согласно этому аспекту изобретения включают последовательное введение пациенту многократных доз антитела к PRLR согласно изобретению. В настоящем документе последовательное введение означает, что каждая доза антитела к PRLR вводится пациенту в различные моменты времени, например в разные дни, разделенные заданным интервалом (например, в часах, днях, неделях или месяцах). Настоящее изобретение включает способы, предусматривающие последовательное введение пациенту однократной начальной дозы антитела к PRLR с последующим введением одной или нескольких доз антитела к PRLR второй очереди и возможным последующим введением одной или нескольких доз антитела к PRLR третьей очереди.In certain embodiments of the present invention, multiple doses of an anti-PRLR antibody (or a pharmaceutical composition comprising a combination of an anti-PRLR antibody with any of the additional therapeutically active agents mentioned herein) may be administered to a patient over a period of time. Methods according to this aspect of the invention include sequential administration of multiple doses of an anti-PRLR antibody of the invention to a patient. As used herein, sequential administration means that each dose of an anti-PRLR antibody is administered to a patient at different times, eg, on different days separated by a predetermined interval (eg, hours, days, weeks, or months). The present invention includes methods comprising sequentially administering to a patient a single initial dose of an anti-PRLR antibody, followed by one or more doses of a second line anti-PRLR antibody, and possibly subsequent administration of one or more doses of a third line anti-PRLR antibody.

Термины начальная доза, доза второй очереди и доза третьей очереди относятся к временной последовательности введения антитела к PRLR, описанного в настоящем изобретении. Таким образом начальная доза является дозой, введенной в начале схемы лечения (также называемая основной дозой); дозы второй очереди являются дозами, введенными после начальной дозы; и дозы третьей очереди являются дозами, введенными после доз второй очереди. Начальные дозы, дозы второй и третьей очередей могут содержать одинаковое количество антитела к PRLR, но обычно могут различаться по частоте введения. Однако в определенных вариантах осуществления изобретения количество антител к PRLR, содержащихся в начальной дозе, дозах второй очереди и дозах третьей очереди варьирует в ходе лечения (например, увеличивается или уменьшается в зависимости от ситуации). В определенных вариантах осуществления изобретения в начале схемы лечения вводят две или более доз (например, 2, 3, 4, или 5) в качестве насыщающих доз с последующим более редким введением дальнейших доз (так называемых поддерживающих доз).The terms initial dose, second line dose, and third line dose refer to the time sequence of administration of the anti-PRLR antibody described in the present invention. Thus, the initial dose is the dose administered at the beginning of the treatment regimen (also called the main dose); second-order doses are doses administered after the initial dose; and third line doses are doses administered after the second line doses. Initial doses, doses of the second and third lines may contain the same amount of antibodies to PRLR, but usually may differ in frequency of administration. However, in certain embodiments, the amount of anti-PRLR antibodies contained in the initial dose, second line doses, and third line doses varies over the course of treatment (eg, increases or decreases depending on the situation). In certain embodiments of the invention, two or more doses (eg, 2, 3, 4, or 5) are administered as loading doses at the start of the treatment regimen, followed by more infrequent administration of further doses (so-called maintenance doses).

В частных примерах вариантов осуществления настоящего изобретения каждая доза второй и/или третьей очереди вводится через 1-26 (например, 1, 11/₂, 2, 21/2, 3, 31/₂, 4, 41/2, 5, 51/2, 6, 61/₂, 7, 71/2, 8, 81/2, 9, 91/2, 10, 101/2, 11, 111/2, 12, 121/2, 13, 131/2, 14, 141/2, 15, 151/2, 16, 161/2, 17, 171/2, 18, 181/2, 19, 191/2, 20, 201/2, 21, 211/2, 22, 221/2, 23, 231/2, 24, 241/2, 25, 251/2, 26, 261/2 или больше) недель после предыдущей дозы. В настоящем документе фраза непосредственно предыдущая доза означает в последовательности многократных введений дозу антитела к PRLR, введенную пациенту до введения непосредственно следующей дозы в последовательности без промежуточных доз.In particular examples of embodiments of the present invention, each dose of the second and / or third queue is administered through 1-26 (for example, 1, _11/2 , 2, 21/2, 3, 31/2, ₄ , 41/2, 5, 51 /2, 6, 61/ ₂ , 7, 71/2, 8, 81/2, 9, 91/2, 10, 101/2, 11, 111/2, 12, 121/2, 13, 131/2 , 14, 141/2, 15, 151/2, 16, 161/2, 17, 171/2, 18, 181/2, 19, 191/2, 20, 201/2, 21, 211/2, 22 , 221/2, 23, 231/2, 24, 241/2, 25, 251/2, 26, 261/2 or more) weeks after the previous dose. As used herein, the phrase "immediately previous dose" means, in a multiple dose sequence, the dose of an anti-PRLR antibody administered to a patient prior to the immediately following dose in the sequence without intermediate doses.

Способы согласно данному аспекту изобретения могут включать введение пациенту любого количества доз второй и/или третьей очереди антитела к PRLR. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения пациенту вводят только дозу второй очереди. В других вариантах осуществления изобретения пациенту вводят две или большее количество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) доз второй очереди. Аналогично в определенных вариантах осуществления изобретения пациенту вводят только дозу третьей очереди. В других вариантах осуществления изобретения пациенту вводят две или большее количество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) доз третьей очереди. Схема введения может применяться в течение неопределенного срока в течение всей жизни конкретного пациента или до тех пор, пока пациент не перестанет нуждаться в таком лечении или лечение перестанет приносить пользу.The methods of this aspect of the invention may include administering any number of second and/or third doses of the anti-PRLR antibody to the patient. For example, in certain embodiments of the invention, only the dose of the second line is administered to the patient. In other embodiments, the patient is administered two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more) doses of the second line. Similarly, in certain embodiments of the invention, only the dose of the third line is administered to the patient. In other embodiments, the patient is administered two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more) doses of the third line. The administration regimen may be used indefinitely throughout the lifetime of a particular patient or until the patient no longer needs such treatment or the treatment no longer benefits.

В вариантах осуществления изобретения, включающих многократные дозы второй очереди, каждая доза второй очереди может быть введена с такой же частотой, как и другие дозы второй очереди. Например, каждая доза второй очереди может быть введена пациенту чрез 1-2 недели или 1-2 месяца после непосредственно предыдущей дозы. Аналогично в вариантах осуществления изобретения, включающих многократные дозы третьей очереди, каждая доза третьей очереди может быть введена с такой же частотой, как и другие дозы третьей очереди. Например, каждая доза третьей очереди может быть введена пациенту чрез 2-12 недель после непосредственно предыдущей дозы. В определенных вариантах осуществления изобретения частота введения дозы второй или третьей очереди пациенту может изменяться на протяжении курса лечения. Частота введения может корректироваться во время курса лечения врачом в зависимости от потребностей отдельного пациента после клинического обследования.In embodiments involving multiple second-line doses, each second-line dose may be administered at the same frequency as the other second-line doses. For example, each second line dose may be administered to a patient 1-2 weeks or 1-2 months after the immediately preceding dose. Similarly, in embodiments of the invention involving multiple third line doses, each third line dose may be administered at the same frequency as the other third line doses. For example, each third line dose may be administered to a patient 2-12 weeks after the immediately previous dose. In certain embodiments, the frequency of administering a second or third dose to a patient may vary over the course of treatment. The frequency of administration may be adjusted during the course of treatment by the physician, depending on the needs of the individual patient after clinical examination.

Настоящее изобретение включает схемы введения, в которых пациенту вводят от 2 до 6 насыщающих доз с первой частотой (например, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, один раз в два месяца и т.д.), с последующим более редким введением двух или более поддерживающих доз. Например, согласно этому аспекту изобретения, если насыщающие дозы вводятся с частотой один раз в месяц, то поддерживающие дозы могут вводиться пациенту один раз в шесть недель, один раз в два месяца, один раз в три месяца и т.д.The present invention includes administration schedules in which 2 to 6 loading doses are administered to the patient at a first frequency (e.g., once a week, once every two weeks, once every three weeks, once a month, once every two months, and etc.), followed by less frequent administration of two or more maintenance doses. For example, according to this aspect of the invention, if loading doses are administered at a frequency of once a month, then maintenance doses can be administered to the patient once every six weeks, once every two months, once every three months, and so on.

Диагностическое применение антител.Diagnostic use of antibodies.

Антитела к PRLR согласно настоящему изобретению могут также использоваться для обнаружения и/или измерения количества рецепторов пролактина или экспрессирующих PRLR клеток в образце, например, в диагностических целях. Например, антитело к PRLR или его фрагмент может использоватьсяThe anti-PRLR antibodies of the present invention can also be used to detect and/or measure the amount of prolactin receptors or PRLR expressing cells in a sample, for example for diagnostic purposes. For example, an anti-PRLR antibody or fragment thereof can be used

- 23 040545 для диагностирования состояния или заболевания, характеризующегося аберрантной экспрессией (например, чрезмерной экспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т.д.). Примеры диагностического количественного анализа рецептора пролактина могут включать, например, введение полученного у пациента образца в контакт с антителом к PRLR согласно настоящему изобретению, при этом антитело к PRLR должно быть помечено обнаружимой меткой или репортерной группой. Альтернативно для диагностики может применяться немеченное антитело к PRLR в комбинации с обнаружимо меченым вторичным антителом. В качестве обнаружимой метки или репортерной группы могут быть использованы радиоизотоп, такой как ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S или ¹²⁵I; флуоресцентная или хемолюминесцентная группа, например резорцинфталеин или родамин; или фермент, такой как как щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Примеры специфичных анализов, которые могут использоваться для обнаружения или измерения рецептора пролактина в образце, включают твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА; ELISA), радиоиммуноанализ (РИА), иммуно-ПЭТ (например, ⁸⁹Zr, ⁶⁴Cu и т.д.) и сортировку клеток с активацией флуоресценцией (FACS).- 23 040545 for diagnosing a condition or disease characterized by aberrant expression (eg, overexpression, underexpression, lack of expression, etc.). Examples of diagnostic assays for prolactin receptor may include, for example, contacting a patient-derived sample with an anti-PRLR antibody of the present invention, the anti-PRLR antibody being labeled with a detectable label or reporter group. Alternatively, an unlabeled anti-PRLR antibody in combination with a detectably labeled secondary antibody can be used for diagnosis. As a detectable label or reporter group, a radioisotope such as ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S or ¹²⁵ I can be used; a fluorescent or chemiluminescent group such as resorcinphthalein or rhodamine; or an enzyme such as alkaline phosphatase, betagalactosidase, horseradish peroxidase or luciferase. Examples of specific assays that can be used to detect or measure the prolactin receptor in a sample include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immuno-PET (e.g., ⁸⁹ Zr, ⁶⁴ Cu, etc.) and sorting cells with fluorescence activation (FACS).

Образцы, которые могут использоваться в диагностических анализах PRLR согласно настоящему изобретению, включают любой образец ткани или жидкости, взятый у пациента, содержащий обнаружимые количества белка PRLR или его фрагментов в норме или патологии. Обычно вначале измеряют содержание рецептора пролактина в образце, полученном у здорового пациента (т.е. пациента, у которого отсутствует заболевание или состояние, ассоциированное с патологическим количеством или патологической активностью рецептора пролактина), чтобы установить исходный или стандартный уровень рецептора. Затем будет выполнено сравнение этого исходного уровня PRLR с содержанием PRLR в образцах, полученных у лиц с диагностированным или предполагаемым заболеванием или состоянием, связанным с PRLR.Samples that may be used in the PRLR diagnostic assays of the present invention include any tissue or fluid sample taken from a patient containing detectable amounts of PRLR protein or fragments in normal or pathological conditions. Usually, the content of the prolactin receptor in a sample obtained from a healthy patient (i.e., a patient who does not have a disease or condition associated with an abnormal amount or abnormal activity of the prolactin receptor) is measured first to establish a baseline or standard level of the receptor. This baseline PRLR level will then be compared with PRLR levels in samples obtained from individuals with a diagnosed or suspected PRLR-related disease or condition.

ПримерыExamples

Следующие примеры показаны, чтобы представить специалистам в отрасли полную информацию и описание получения и использования способов и композиций согласно настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения объема изобретения, как его представляют авторы. Были приложены усилия для обеспечения точности количественных показателей (например, количеств, температуры и т.д.), но необходимо принимать во внимание некоторые ошибки и отклонения при проведении экспериментов. Если не указано иное, то они являются весовыми частями, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура выражена в градусах Цельсия и давление является атмосферным или близким к атмосферному.The following examples are shown to provide those skilled in the art with a thorough understanding and description of the preparation and use of the methods and compositions of the present invention, and are not intended to limit the scope of the invention as claimed by the authors. Efforts have been made to ensure the accuracy of quantities (eg quantities, temperatures, etc.), but some errors and variations in experimentation must be taken into account. Unless otherwise indicated, they are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is expressed in degrees Celsius, and pressure is atmospheric or near atmospheric.

Пример 1. Создание антител к PRLR.Example 1. Creation of antibodies to PRLR.

Антитела к PRLR были получены путем иммунизации мыши VELOCIMMUNE® (т.е. генноинженерной мыши, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой каппа цепи человеческого иммуноглобулина) иммуногеном, содержащим растворимый димерный эктодомен человеческого PRLR. Для мониторинга антительного иммунного ответа использовали PRLR-специфичный иммуноанализ. Когда желаемый иммунный ответ был достигнут, у животного получили спленоциты и слили их с клетками мышиной миеломы, чтобы сохранить жизнеспособность и получить линию гибридомных клеток. Затем был проведен скрининг и отбор гибридомных клеточных линий, чтобы идентифицировать клеточные линии, в которых образуются химерные антитела к PRLR. С помощью этого приема были получены несколько химерных антител к PRLR (т.е. антител, обладающих человеческими вариабельными доменами и мышиными константными доменами). Кроме того, несколько полностью человеческих антител к PRLR были выделены непосредственно из антиген-положительных B-лимфоцитов без слияния с миеломными клетками, как описано в патенте США 2007/0280945 A1.Anti-PRLR antibodies were generated by immunizing a VELOCIMMUNE® mouse (ie, a genetically engineered mouse containing DNA encoding human immunoglobulin heavy chain and kappa light chain variable regions) with an immunogen containing a soluble dimeric human PRLR ectodomain. A PRLR-specific immunoassay was used to monitor the antibody response. When the desired immune response was achieved, splenocytes were obtained from the animal and fused with mouse myeloma cells to maintain viability and obtain a hybridoma cell line. The hybridoma cell lines were then screened and selected to identify cell lines that produce chimeric anti-PRLR antibodies. Several chimeric anti-PRLR antibodies (ie, antibodies having human variable domains and mouse constant domains) have been generated using this technique. In addition, several fully human anti-PRLR antibodies have been isolated directly from antigen-positive B-lymphocytes without fusion with myeloma cells, as described in US 2007/0280945 A1.

Ниже в примерах подробно описаны некоторые биологические свойства иллюстративных антител к PRLR, полученных в соответствии со способами, описанными в настоящем примере.The Examples below detail some of the biological properties of exemplary anti-PRLR antibodies prepared according to the methods described in this Example.

Пример 2. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и соответствующие им нуклеотидные последовательности.Example 2 Heavy and Light Chain Variable Region Amino Acid Sequences and Their Corresponding Nucleotide Sequences.

В табл. 1 показаны идентификаторы аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи и CDR отдельных антител к PRLR согласно настоящему изобретению. Соответствующие идентификаторы нуклеотидных последовательностей показаны в табл. 2.In table. 1 shows the amino acid sequence identifiers for the heavy and light chain variable regions and CDRs of individual anti-PRLR antibodies of the present invention. The corresponding identifiers of the nucleotide sequences are shown in table. 2.

- 24 040545- 24 040545

Таблица 1Table 1

Идентификаторы аминокислотных последовательностей № Идентификатора последовательностиAmino Acid Sequence Identifiers Sequence Identifier No.

Обозначение антитела Antibody designation HCVR HCVR HCDR1 HCDR1 HCDR2 HCDR2 HCDR3 HDDR3 LCVR LCVR LCDR1 LCDR1 LCDR2 LCDR2 LCDR3 LCDR3 Н1Н6762Р H1H6762R 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 12 12 14 14 16 16 Н1Н6765Р H1H6765R 18 18 20 20 22 22 24 24 26 26 28 28 30 thirty 32 32 Н1Н6774Р H1H6774R 34 34 36 36 38 38 40 40 42 42 44 44 46 46 48 48 Н1Н6781Р H1H6781R 50 50 52 52 54 54 56 56 58 58 60 60 62 62 64 64 Н1Н6782Р H1H6782R 66 66 68 68 70 70 72 72 74 74 76 76 78 78 80 80 Н1Н6783Р H1H6783R 82 82 84 84 86 86 88 88 90 90 92 92 94 94 96 96 Н1Н6785Р H1H6785R 98 98 100 100 102 102 104 104 106 106 108 108 110 110 112 112 Н1Н6790Р H1H6790R 114 114 116 116 118 118 120 120 122 122 124 124 126 126 128 128 Н1Н6792Р H1H6792R 130 130 132 132 134 134 136 136 138 138 140 140 142 142 144 144 Н1Н6793Р H1H6793R 146 146 148 148 150 150 152 152 154 154 156 156 158 158 160 160 Н1Н6795Р H1H6795R 162 162 164 164 166 166 168 168 170 170 172 172 174 174 176 176 Н1Н6797Р H1H6797R 178 178 180 180 182 182 184 184 186 186 188 188 190 190 192 192 Н1Н6800Р H1H6800R 194 194 196 196 198 198 200 200 202 202 204 204 206 206 208 208 Н1Н6801Р H1H6801R 210 210 212 212 214 214 216 216 218 218 220 220 222 222 224 224 Н1Н6803Р H1H6803R 226 226 228 228 230 230 232 232 234 234 236 236 238 238 240 240 Н1Н6804Р H1H6804R 242 242 244 244 246 246 248 248 250 250 252 252 254 254 256 256 Н1Н6807Р H1H6807R 258 258 260 260 262 262 264 264 266 266 268 268 270 270 272 272 H1M6953N H1M6953N 274 274 276 276 278 278 280 280 282 282 284 284 286 286 288 288 H2M6958N2 H2M6958N2 290 290 292 292 294 294 296 296 298 298 300 300 302 302 304 304 H2M6959N2 H2M6959N2 306 306 308 308 310 310 312 312 314 314 316 316 318 318 320 320 H2M6960N H2M6960N 322 322 324 324 326 326 328 328 330 330 332 332 334 334 336 336 H2M6966N H2M6966N 338 338 340 340 342 342 344 344 346 346 348 348 350 350 352 352 H2M6967N H2M6967N 354 354 356 356 358 358 360 360 362 362 364 364 366 366 368 368 H2M6975N H2M6975N 370 370 372 372 374 374 376 376 378 378 380 380 382 382 384 384 H2M6976N H2M6976N 386 386 388 388 390 390 392 392 394 394 396 396 398 398 400 400

Таблица 2table 2

Идентификаторы нуклеотидных последовательностей № идентификатора последовательности нуклеиновой кислотыNucleotide sequence identifiers Nucleic acid sequence identifier number

Обозначение антитела Antibody designation HCVR HCVR HCDR1 HCDR1 HCDR2 HCDR2 HCDR3 HDDR3 LCVR LCVR LCDR1 LCDR1 LCDR2 LCDR2 LCDR3 LCDR3 Н1Н6762Р H1H6762R 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 И AND 13 13 15 15 Н1Н6765Р H1H6765R 17 17 19 19 21 21 23 23 25 25 27 27 29 29 31 31 Н1Н6774Р H1H6774R 33 33 35 35 37 37 39 39 41 41 43 43 45 45 47 47 Н1Н6781Р H1H6781R 49 49 51 51 53 53 55 55 57 57 59 59 61 61 63 63 Н1Н6782Р H1H6782R 65 65 67 67 69 69 71 71 73 73 75 75 77 77 79 79 Н1Н6783Р H1H6783R 81 81 83 83 85 85 87 87 89 89 91 91 93 93 95 95 Н1Н6785Р H1H6785R 97 97 99 99 101 101 103 103 105 105 107 107 109 109 111 111 Н1Н6790Р H1H6790R 113 113 115 115 117 117 119 119 121 121 123 123 125 125 127 127 Н1Н6792Р H1H6792R 129 129 131 131 133 133 135 135 137 137 139 139 141 141 143 143 Н1Н6793Р H1H6793R 145 145 147 147 149 149 151 151 153 153 155 155 157 157 159 159 Н1Н6795Р H1H6795R 161 161 163 163 165 165 167 167 169 169 171 171 173 173 175 175 Н1Н6797Р H1H6797R 177 177 179 179 181 181 183 183 185 185 187 187 189 189 191 191 Н1Н6800Р H1H6800R 193 193 195 195 197 197 199 199 201 201 203 203 205 205 207 207 Н1Н6801Р H1H6801R 209 209 211 211 213 213 215 215 217 217 219 219 221 221 223 223 Н1Н6803Р H1H6803R 225 225 227 227 229 229 231 231 233 233 235 235 237 237 239 239 Н1Н6804Р H1H6804R 241 241 243 243 245 245 247 247 249 249 251 251 253 253 255 255 Н1Н6807Р H1H6807R 257 257 259 259 261 261 263 263 265 265 267 267 269 269 271 271 H1M6953N H1M6953N 273 273 275 275 277 277 279 279 281 281 283 283 285 285 287 287 H2M6958N2 H2M6958N2 289 289 291 291 293 293 295 295 297 297 299 299 301 301 303 303 H2M6959N2 H2M6959N2 305 305 307 307 309 309 311 311 313 313 315 315 317 317 319 319 H2M6960N H2M6960N 321 321 323 323 325 325 327 327 329 329 331 331 333 333 335 335 H2M6966N H2M6966N 337 337 339 339 341 341 343 343 345 345 347 347 349 349 351 351 H2M6967N H2M6967N 353 353 355 355 357 357 359 359 361 361 363 363 365 365 367 367 H2M6975N H2M6975N 369 369 371 371 373 373 375 375 377 377 379 379 381 381 383 383 H2M6976N H2M6976N 385 385 387 387 389 389 391 391 393 393 395 395 397 397 399 399

В настоящем документе антитела, как правило, упоминаются согласно следующей номенклатуре: префикс Fc (например, H1H, H1M, H2M и т.д.), далее числовой идентификатор (например, 6762, 6953, 6958 и т.д.) с последующим суффиксом P или N, как показано в табл. 1 и 2. Таким образом, согласно данной номенклатуре антитело может быть указано в настоящем документе как, например, H1H6762P, H1M6953N, H2M6958N и т.д. Префиксы H1H, H1M и H2M на обозначениях антитела, используемых в настоящем документе, указывают определенный изотип области Fc антитела. Например, антитело H1H имеет человеческий IgG1 Fc, антитело H1M имеет мышиный IgG1 Fc и антитело H2M имеет мышиный IgG2 Fc (все вариабельные области являются полностью человеческими, на то указывает первый 'H' в обозначении антитела). Как очевидно для специалиста, антитело, имеющее опре- 25 040545 деленный изотип Fc, может быть преобразовано в антитело с другим изотипом Fc (например, антитело с мышиным IgG1 Fc может быть преобразовано в антитело с человеческим IgG4 и т.д.), но в любом случае вариабельные домены (включая CDR), которые в табл. 1 и 2 обозначены числовыми идентификаторами, остаются теми же, и ожидается, что свойства связывания, будут идентичными или существенно сходными независимо от природы участка Fc.Antibodies are generally referred to herein according to the following nomenclature: Fc prefix (e.g., H1H, H1M, H2M, etc.), followed by a numeric identifier (e.g., 6762, 6953, 6958, etc.) followed by a suffix P or N, as shown in the table. 1 and 2. Thus, according to this nomenclature, an antibody may be referred to herein as, for example, H1H6762P, H1M6953N, H2M6958N, etc. The prefixes H1H, H1M, and H2M on antibody designations used herein indicate the specific isotype of the Fc region of the antibody. For example, the H1H antibody has a human IgG1 Fc, the H1M antibody has a mouse IgG1 Fc, and the H2M antibody has a mouse IgG2 Fc (all variable regions are fully human, as indicated by the first 'H' in the antibody designation). As will be apparent to those skilled in the art, an antibody having a particular Fc isotype can be converted to an antibody with a different Fc isotype (e.g., a mouse IgG1 Fc antibody can be converted to a human IgG4 antibody, etc.), but anyway variable domains (including CDR) which in tab. 1 and 2 are designated by numerical identifiers remain the same and the binding properties are expected to be identical or substantially similar regardless of the nature of the Fc region.

Контрольные конструкции, используемые в следующих примерах.Control constructs used in the following examples.

В сравнительных целях в описанные ниже эксперименты были включены контрольные конструкции.For comparative purposes, control constructs were included in the experiments described below.

Контроль I: человеческое антитело к PRLR с вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей, имеющими аминокислотные последовательности соответствующих доменов he.06.642-2, показанные в WO2008/02295A2.Control I: human anti-PRLR antibody with heavy and light chain variable domains having the amino acid sequences of the respective he.06.642-2 domains shown in WO2008/02295A2.

Контроль II: человеческое антитело к ErbB2 с вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей, имеющими аминокислотные последовательности соответствующих доменов 4D5v8, показанные в публикации Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., США, 89:4285-4289.Control II: human anti-ErbB2 antibody with heavy and light chain variable domains having the amino acid sequences of the respective 4D5v8 domains shown in Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285-4289.

Пример 3. Аффинность связывания, определенного методом поверхностного плазменного резонанса, и кинетические константы человеческих моноклональных антител к PRLR.Example 3 Surface Plasma Resonance Binding Affinity and Kinetic Constants of Human Anti-PRLR Monoclonal Antibodies.

Аффинность связывания и кинетические константы человеческого моноклинального антитела к PRLR определяли методом поверхностного плазмонного резонанса при 25 и 37°C. На сенсорной поверхности с антителами к человеческому Fc захватывали антитела, экспрессированные как Fc человеческого IgG1 (т.е. обозначения H1H) (формат захвата моноклонального антитела (mAb)), и на сенсорную поверхность инъекционно наносили растворимый мономерный (hPRLR.mmh; SEQ ID NO: 401 или Macaca fascicularis(mf) PRLR.mmh; SEQ ID NO: 403) или димерный (hPRLR.mFc; SEQ ID NO: 402) белок PRLR. Измерения проводились на приборе T200 BiaCore. Кинетические константы скорости ассоциации (k_a) и диссоциации (k_d) были определены путем обработки и аппроксимации данных к модели связывания в соотношении 1: 1 при использовании программного обеспечения для аппроксимации кривых Scrubber 2,0. Равновесные константы диссоциации связывания (KD) и полупериод диссоциации (t_1/2) были вычислены из кинетических констант скорости какThe binding affinity and kinetic constants of the human anti-PRLR monoclinal antibody were determined by surface plasmon resonance at 25 and 37°C. Anti-human Fc antibodies were captured on the touch surface with antibodies expressed as human IgG1 Fc (i.e. designations H1H) (monoclonal antibody (mAb) capture format), and soluble monomeric (hPRLR.mmh; SEQ ID NO) was injected onto the touch surface. : 401 or Macaca fascicularis(mf) PRLR.mmh; SEQ ID NO: 403) or dimeric (hPRLR.mFc; SEQ ID NO: 402) PRLR protein. The measurements were carried out on a T200 BiaCore instrument. The kinetic rate constants of association (k _a ) and dissociation (k _d ) were determined by processing and fitting the data to a 1:1 binding model using Scrubber 2.0 curve fitting software. Binding equilibrium dissociation constants (KD) and dissociation half-life (t _1/2 ) were calculated from the kinetic rate constants as

KD(M)=kd/ka; и t_1/2(мин)=(In2/(60*k_d)KD(M)=kd/ka; and t _1/2 (min)=(In2/(60*k _d )

Результаты показаны в табл. 3 и 4.The results are shown in table. 3 and 4.

Таблица 3Table 3

Определенные на приборе Biacore аффинности связывания Fc человеческих моноклональных антител (mAbs) при 25°C Связывание при 25°C / Формат захвата антителаBiacore Fc Binding Affinities of Human Monoclonal Antibodies (mAbs) at 25°C Binding at 25°C / Antibody Capture Format

Антитело Antibody Аналит analyte k_a (Me¹)k _a (Me ¹ ) M^cl) ^Mcl ) K_D (молярный)K _D (molar) ТУ» (мин) TU "(min) H1H6953N H1H6953N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 7.92E+05 7.92E+05 2.12E-04 2.12E-04 2.68E-10 2.68E-10 54.5 54.5 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 7.11E+05 7.11E+05 4.77E-05 4.77E-05 6.70E-11 6.70E-11 242.2 242.2 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 7.27E+05 7.27E+05 3.19E-04 3.19E-04 4.38E-10 4.38E-10 36.3 36.3 H1H6958N2 H1H6958N2 hPRLR.mmh hPRLR.mmh 2.33E+05 2.33E+05 2.72E-04 2.72E-04 1.17E-09 1.17E-09 42.5 42.5 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.22E+05 4.22E+05 3.66E-05 3.66E-05 8.67E-11 8.67E-11 315.8 315.8 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.95E+05 1.95E+05 2.80E-04 2.80E-04 1.44E-09 1.44E-09 41.3 41.3 H1H6959N2 H1H6959N2 hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.79E+05 1.79E+05 3.60E-02 3.60E-02 2.02E-07 2.02E-07 0.3 0.3 3.59E+05 3.59E+05 5.18E-04 5.18E-04 1.45E-09 1.45E-09 22.3 22.3

- 26 040545- 26 040545

hPRLR.mFc hPRLR.mFc mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.29E+05 1.29E+05 1.67E-02 1.67E-02 1.29E-07 1.29E-07 0.7 0.7 H1H6960N H1H6960N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.08E+05 1.08E+05 7.29E-04 7.29E-04 6.74E-09 6.74E-09 15.8 15.8 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 2.52E+05 2.52E+05 3.56E-05 3.56E-05 1.41E-10 1.41E-10 324.4 324.4 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 9.40E+04 9.40E+04 5.83E-04 5.83E-04 6.20E-09 6.20E-09 19.8 19.8 H1H6966N H1H6966N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 8.52E+05 8.52E+05 2.57E-04 2.57E-04 3.02E-10 3.02E-10 44.9 44.9 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 9.31 E+05 9.31 E+05 4.08E-05 4.08E-05 4.39E-11 4.39E-11 282.9 282.9 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 7.82E+05 7.82E+05 3.25E-04 3.25E-04 4.16E-10 4.16E-10 35.6 35.6 H1H6967N H1H6967N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 2.46E+05 2.46E+05 3.32E-04 3.32E-04 1.35E-09 1.35E-09 34.8 34.8 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.07E+05 4.07E+05 4.45E-05 4.45E-05 1.10E-10 1.10E-10 259.3 259.3 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.90E+05 1.90E+05 5.85E-04 5.85E-04 3.08E-09 3.08E-09 19.7 19.7 H1H6975N H1H6975N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.5OE+O5 1.5OE+O5 7.35E-05 7.35E-05 4.90E-10 4.90E-10 157.1 157.1 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 2.87E+05 2.87E+05 1.97E-05 1.97E-05 6.84E-11 6.84E-11 587.8 587.8 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.15E+05 1.15E+05 1.31E-04 1.31E-04 1.14E-09 1.14E-09 88.2 88.2 H1H6976N H1H6976N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 5.44E+05 5.44E+05 8.64E-04 8.64E-04 1.59E-09 1.59E-09 13.4 13.4 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.12E+06 1.12E+06 1.01E-04 1.01E-04 9.06E-11 9.06E-11 114.4 114.4 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 4.66E+05 4.66E+05 8.14E-04 8.14E-04 1.75E-09 1.75E-09 14.2 14.2 H1H6762P H1H6762P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 6.92E+05 6.92E+05 1.79E-04 1.79E-04 2.59E-10 2.59E-10 64 64 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 6.51 E+05 6.51E+05 6.45E-05 6.45E-05 9.92E-11 9.92E-11 179 179 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 4.08E+05 4.08E+05 2.08E-04 2.08E-04 5.11E-10 5.11E-10 55 55 H1H6765P H1H6765P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 9.07E+05 9.07E+05 1.13E-04 1.13E-04 1.24E-10 1.24E-10 102 102 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 8.69E+05 8.69E+05 3.41 E-05 3.41 E-05 3.92E-11 3.92E-11 339 339 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 5.27E+05 5.27E+05 1.34E-04 1.34E-04 2.54E-10 2.54E-10 86 86 H1H6774P H1H6774P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 7.15E+05 7.15E+05 8.18E-04 8.18E-04 1.14E-09 1.14E-09 14 14 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 7.98E+05 7.98E+05 8.94E-05 8.94E-05 1.12E-10 1.12E-10 129 129 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 4.95E+05 4.95E+05 8.75E-04 8.75E-04 1.77E-09 1.77E-09 13 13 H1H6781P H1H6781P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 2.08E+05 2.08E+05 1.27E-04 1.27E-04 6.10E-10 6.10E-10 91 91 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 2.57E+05 2.57E+05 6.05E-05 6.05E-05 2.36E-10 2.36E-10 191 191 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.43E+05 1.43E+05 1.41E-04 1.41E-04 9.86E-10 9.86E-10 82 82 H1H6782P H1H6782P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 3.60E+05 3.60E+05 2.47E-04 2.47E-04 6.85E-10 6.85E-10 47 47 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 3.17E+05 3.17E+05 7.13E-05 7.13E-05 2.25ΕΊ0 2.25ΕΊ0 162 162 2.66E+05 2.66E+05 2.79E-04 2.79E-04 1.05E-09 1.05E-09 41 41

- 27 040545- 27 040545

mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh Н1Н6783Р H1H6783R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 2.88E+05 2.88E+05 4.13E-04 4.13E-04 1.43E-09 1.43E-09 28 28 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 2.64E+05 2.64E+05 8.77E-05 8.77E-05 3.32E-10 3.32E-10 132 132 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.89E+05 1.89E+05 3.41 E-04 3.41 E-04 1.81E-09 1.81E-09 34 34 Н1Н6785Р H1H6785R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 3.01 E+05 3.01 E+05 1.71E-04 1.71E-04 5.67E-10 5.67E-10 68 68 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 2.63E+05 2.63E+05 6.07E-05 6.07E-05 2.31E-10 2.31E-10 190 190 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 2.27E+05 2.27E+05 1.67E-04 1.67E-04 7.38E-10 7.38E-10 69 69 Н1Н6790Р H1H6790R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 5.65E+05 5.65E+05 7.99E-04 7.99E-04 1.41E-09 1.41E-09 14 14 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 5.42E+05 5.42E+05 1.04E-04 1.04E-04 1.92E-10 1.92E-10 111 111 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 3.89E+05 3.89E+05 7.93E-04 7.93E-04 2.04E-09 2.04E-09 15 15 Н1Н6792Р H1H6792R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 3.24E+05 3.24E+05 7.94E-04 7.94E-04 2.45E-09 2.45E-09 15 15 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 3.03 E+05 3.03 E+05 9.48E-05 9.48E-05 3.13E-10 3.13E-10 122 122 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 2.36E+05 2.36E+05 9.83E-04 9.83E-04 4.17E-09 4.17E-09 12 12 Н1Н6793Р H1H6793R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 2.35E+O5 2.35E+O5 3.32E-04 3.32E-04 1.41E-09 1.41E-09 35 35 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 2.29E+05 2.29E+05 7.57E-05 7.57E-05 3.31E-10 3.31E-10 153 153 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.77E+O5 1.77E+O5 3.93E-04 3.93E-04 2.22E-09 2.22E-09 29 29 Н1Н6795Р H1H6795R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.17E+06 1.17E+06 1.77E-03 1.77E-03 1.52E-09 1.52E-09 7 7 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.54E+06 1.54E+06 8.41 E-05 8.41 E-05 5.45E-11 5.45E-11 137 137 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 8.44E+05 8.44E+05 1.97E-03 1.97E-03 2.33E-09 2.33E-09 6 6 Н1Н6797Р H1H6797R hPRLR.mmh hPRLR.mmh L13E+06 L13E+06 1.96E-03 1.96E-03 1.73E-09 1.73E-09 6 6 hPRLR.mFc mfPRLR.mmh hPRLR.mFc mfPRLR.mmh 9.82E+05 9.82E+05 1.19E-04 1.19E-04 1.22E-10 1.22E-10 97 97 6.70E+05 6.70E+05 2.09E-03 2.09E-03 3.12E-09 3.12E-09 6 6 Н1Н6800Р H1H6800R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 4.21 E+05 4.21 E+05 4.09E-04 4.09E-04 9.72E-10 9.72E-10 28 28 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.73E+05 4.73E+05 8.69E-05 8.69E-05 1.84E-10 1.84E-10 133 133 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 3.03E+05 3.03E+05 3.80E-04 3.80E-04 1.25E-09 1.25E-09 30 thirty Н1Н6801Р H1H6801R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 8.46E+05 8.46E+05 7.56E-04 7.56E-04 8.94E-10 8.94E-10 15 15 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 6.75E+05 6.75E+05 1.09E-04 1.09E-04 1.61E-10 1.61E-10 106 106 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 6.57E+05 6.57E+05 1.23E-03 1.23E-03 1.88E-09 1.88E-09 9 9 Н1Н6803Р H1H6803R hPRLR.mmh hPRLR.mmh 8.24E+04 8.24E+04 1.37E-04 1.37E-04 1.67E-09 1.67E-09 84 84 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.04E+05 1.04E+05 6.29E-05 6.29E-05 6.07E-10 6.07E-10 184 184 2.09E-04 2.09E-04 3.37E-09 3.37E-09 55 55 Н1Н6804Р Н1Н6807Р H1H6804R H1H6807R mfPRLR.mmh hPRLR.mmh hPRLR.mFc mfPRLR.mmh hPRLR.mmh hPRLR.mFc mfPRLR.mmh hPRLR.mmh hPRLR.mFc mfPRLR.mmh hPRLR.mmh hPRLR.mFc 4.53E+05 4.51 E+05 3.31 E+05 7.61 E+05 6.80E+05 4.53E+05 4.51E+05 3.31 E+05 7.61E+05 6.80E+05 6.34E-04 8.69E-05 6.57E-04 1.44E-04 5.46E-05 6.34E-04 8.69E-05 6.57E-04 1.44E-04 5.46E-05 1.40E-09 1.93E-10 1.99E-09 1.89E-10 8.03E-11 1.40E-09 1.93E-10 1.99E-09 1.89E-10 8.03E-11 18 133 18 80 212 18 133 18 80 212 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 4.37E+05 4.37E+05 1.51 E-04 1.51 E-04 3.46E-10 3.46E-10 76 76 Контроль I Control I hPRLR.mmh hPRLR.mmh 5.11 E+05 5.11 E+05 7.44E-04 7.44E-04 1.46E-09 1.46E-09 15.5 15.5 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.72E+05 4.72E+05 7.53E-05 7.53E-05 1.59E-10 1.59E-10 153.5 153.5 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 2.38E+05 2.38E+05 6.14E-03 6.14E-03 2.59E-08 2.59E-08 1.9 1.9

NB=Связывание не наблюдается в условиях эксперимента.NB=No binding observed under experimental conditions.

- 28 040545- 28 040545

Таблица 4Table 4

Определенные на приборе Biacore аффинности связывания Fc человеческих моноклональных антител (mAbs) при 37°CBiacore instrument determined Fc binding affinities of human monoclonal antibodies (mAbs) at 37°C

Связывание при 37°C / Формат захвата антителаBinding at 37°C / Antibody Capture Format

Антитело Antibody Аналит analyte k_a (Me¹)k _a (Me ¹ ) ^kd (c¹) ^k d (c ¹ ) KD (молярный) KD (molar) Т^мин) T^min) H1H6953N H1H6953N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.10E+06 1.10E+06 1.22E-03 1.22E-03 1.11E-09 1.11E-09 9.4 9.4 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.47E+06 1.47E+06 1.70E-04 1.70E-04 1.16E-10 1.16E-10 68.0 68.0 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 9.47E+05 9.47E+05 2.56E-03 2.56E-03 2.71 E-09 2.71 E-09 4.5 4.5 H1H6958N2 H1H6958N2 hPRLR.mmh hPRLR.mmh 4.13E+05 4.13E+05 1.31E-03 1.31E-03 3.16E-09 3.16E-09 8.8 8.8 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 8.29E+05 8.29E+05 1.39E-04 1.39E-04 1.67E-10 1.67E-10 83.3 83.3 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 3.28E+05 3.28E+05 1.34E-03 1.34E-03 4.08E-09 4.08E-09 8.6 8.6 H1H6959N2 H1H6959N2 hPRLR.mmh hPRLR.mmh 4.06E+04 4.06E+04 2.77E-02 2.77E-02 6.81 E-07 6.81E-07 0.4 0.4 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 5.09E+05 5.09E+05 2.30E-03 2.30E-03 4.51 E-09 4.51 E-09 5.0 5.0 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 4.46E+04 4.46E+04 1.65E-02 1.65E-02 3.70E-07 3.70E-07 0.7 0.7 H1H6960N H1H6960N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.22E+05 1.22E+05 1.98E-03 1.98E-03 1.62E-08 1.62E-08 5.8 5.8 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 2.94E+05 2.94E+05 1.47E-04 1.47E-04 5.OOE-10 5.OOE-10 78.7 78.7 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 8.64E+04 8.64E+04 1.28E-03 1.28E-03 1.49E-08 1.49E-08 9.0 9.0 H1H6966N H1H6966N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.58E+06 1.58E+06 9.60E-04 9.60E-04 6.07E-10 6.07E-10 12.0 12.0 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.88E+06 1.88E+06 1.27E-04 1.27E-04 6.72E-11 6.72E-11 91.3 91.3 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.22E+06 1.22E+06 1.20E-03 1.20E-03 9.82E-10 9.82E-10 9.6 9.6 H1H6967N H1H6967N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 4.24E+05 4.24E+05 9.33E-04 9.33E-04 2.20E-09 2.20E-09 12.4 12.4 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 9.07E+05 9.07E+05 9.73E-05 9.73E-05 1.07E-10 1.07E-10 118.8 118.8 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 3.56E+05 3.56E+05 1.62E-03 1.62E-03 4.54E-09 4.54E-09 7.1 7.1 H1H6975N H1H6975N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 2.11 E+05 2.11 E+05 2.73E-04 2.73E-04 1.29E-09 1.29E-09 42.3 42.3 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 3.86E+05 3.86E+05 7.09E-05 7.09E-05 1.84E-10 1.84E-10 163.0 163.0 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.40E+05 1.40E+05 3.17E-04 3.17E-04 2.27E-09 2.27E-09 36.4 36.4

- 29 040545- 29 040545

H1H6976N H1H6976N hPRLR.mmh hPRLR.mmh 7.77E+05 7.77E+05 3.14E-03 3.14E-03 4.04E-09 4.04E-09 3.7 3.7 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.37E+06 1.37E+06 1.40E-04 1.40E-04 1.02E-10 1.02E-10 82.6 82.6 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 6.03E+05 6.03E+05 3.16E-03 3.16E-03 5.24E-09 5.24E-09 3.7 3.7 H1H6762P H1H6762P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 9.48E+05 9.48E+05 4.55E-04 4.55E-04 4.80E-10 4.80E-10 25 25 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 8.01 E+05 8.01 E+05 1.03E-04 1.03E-04 1.28E-10 1.28E-10 112 112 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 6.79E+05 6.79E+05 5.58E-04 5.58E-04 8.23E-10 8.23E-10 21 21 H1H6765P H1H6765P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.25E+06 1.25E+06 3.66E-04 3.66E-04 2.92E-10 2.92E-10 32 32 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 8.01 E+05 8.01 E+05 1.03E-04 1.03E-04 1.28E-10 1.28E-10 112 112 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.06E+06 1.06E+06 5.37E-05 5.37E-05 5.04E-11 5.04E-11 215 215 H1H6774P H1H6774P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.07E+06 1.07E+06 3.17E-03 3.17E-03 2.95E-09 2.95E-09 4 4 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.41E+06 1.41E+06 1.94E-04 1.94E-04 1.38E-10 1.38E-10 60 60 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 7.23E+05 7.23E+05 3.61 E-03 3.61 E-03 5.00E-09 5.00E-09 3 3 H1H6781P H1H6781P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 3.39E+05 3.39E+05 3.09E-04 3.09E-04 9.10E-10 9.10E-10 37 37 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.36E+05 4.36E+05 9.84E-05 9.84E-05 2.26E-10 2.26E-10 117 117 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 2.47E+05 2.47E+05 2.67E-04 2.67E-04 1.08E-09 1.08E-09 43 43 H1H6782P H1H6782P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 5.57E+05 5.57E+05 7.16E-04 7.16E-04 1.28E-09 1.28E-09 16 16 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 5.98E+05 5.98E+05 1.30E-04 1.30E-04 2.17E-10 2.17E-10 89 89 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 3.85E+05 3.85E+05 7.67E-04 7.67E-04 1.99E-09 1.99E-09 15 15 H1H6783P H1H6783P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 4.11 E+05 4.11 E+05 1.61E-03 1.61E-03 3.91 E-09 3.91 E-09 7 7 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.91 E+05 4.91 E+05 1.38E-04 1.38E-04 2.82E-10 2.82E-10 83 83 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 2.73E+05 2.73E+05 1.30E-03 1.30E-03 4.74E-09 4.74E-09 9 9 H1H6785P H1H6785P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 4.26E+05 4.26E+05 4.84E-04 4.84E-04 1.14E-09 1.14E-09 24 24 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.56E+05 4.56E+05 1.17E-04 1.17E-04 2.56E-10 2.56E-10 99 99 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 2.97E+05 2.97E+05 4.50E-04 4.50E-04 1.52E-09 1.52E-09 26 26 H1H6790P H1H6790P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 9.40E+05 9.40E+05 3.29E-03 3.29E-03 3.50E-09 3.50E-09 4 4 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 6.46E+05 6.46E+05 1.98E-04 1.98E-04 3.06E-10 3.06E-10 58 58 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 6.15E+05 6.15E+05 3.21 E-03 3.21 E-03 5.22E-09 5.22E-09 4 4

- 30 040545- 30 040545

H1H6792P H1H6792P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 4.35E+05 4.35E+05 2.29E-03 2.29E-03 5.27E-09 5.27E-09 5 5 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.99E+05 4.99E+05 1.76E-04 1.76E-04 3.52E-10 3.52E-10 66 66 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 3.05E+05 3.05E+05 2.86E-03 2.86E-03 9.37E-09 9.37E-09 4 4 H1H6793P H1H6793P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 3.39E+05 3.39E+05 1.02E-03 1.02E-03 3.02E-09 3.02E-09 11 eleven hPRLR.mFc hPRLR.mFc 4.10E+05 4.10E+05 1.42E-04 1.42E-04 3.47E-10 3.47E-10 81 81 2.33E+05 2.33E+05 1.07E-03 1.07E-03 4.59E-09 4.59E-09 11 eleven mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh H1H6795P H1H6795P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.36E+06 1.36E+06 5.20E-03 5.20E-03 3.81 E-09 3.81 E-09 2 2 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.94E+06 1.94E+06 7.77E-05 7.77E-05 4.02E-11 4.02E-11 149 149 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 9.73E+05 9.73E+05 5.99E-03 5.99E-03 6.16E-09 6.16E-09 2 2 H1H6797P H1H6797P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.29E+06 1.29E+06 8.22E-03 8.22E-03 6.37E-09 6.37E-09 1 1 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.80E+06 1.80E+06 1.25E-04 1.25E-04 6.91E-11 6.91E-11 93 93 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 9.14E+05 9.14E+05 9.06E-03 9.06E-03 9.90E-09 9.90E-09 1 1 H1H6800P H1H6800P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 8.08E+05 8.08E+05 1.19E-03 1.19E-03 1.47E-09 1.47E-09 10 10 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 6.44E+05 6.44E+05 1.47E-04 1.47E-04 2.29E-10 2.29E-10 79 79 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 4.39E+05 4.39E+05 1.09E-03 1.09E-03 2.48E-09 2.48E-09 11 eleven H1H6801P H1H6801P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 9.51 E+05 9.51E+05 4.41 E-03 4.41 E-03 4.63E-09 4.63E-09 3 3 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 7.93E+05 7.93E+05 2.21 E-04 2.21 E-04 2.79E-10 2.79E-10 52 52 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 7.11 E+05 7.11 E+05 7.71 E-03 7.71 E-03 1.08E-08 1.08E-08 1 1 H1H6803P H1H6803P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.29E+05 1.29E+05 3.64E-04 3.64E-04 2.83E-09 2.83E-09 32 32 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.34E+05 1.34E+05 6.20E-05 6.20E-05 4.61E-10 4.61E-10 186 186 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 8.73E+04 8.73E+04 6.36E-04 6.36E-04 7.28E-09 7.28E-09 18 18 H1H6804P H1H6804P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 6.07E+05 6.07E+05 3.85E-03 3.85E-03 6.34E-09 6.34E-09 3 3 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 5.54E+05 5.54E+05 2.05E-04 2.05E-04 3.69E-10 3.69E-10 56 56 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 4.55E+05 4.55E+05 4.26E-03 4.26E-03 9.35E-09 9.35E-09 3 3 H1H6807P H1H6807P hPRLR.mmh hPRLR.mmh 1.08E+06 1.08E+06 3.36E-04 3.36E-04 3.10E-10 3.10E-10 34 34 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 1.22E+06 1.22E+06 1.10E-04 1.10E-04 9.00E-11 9.00E-11 105 105 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 8.02E+05 8.02E+05 3.59E-04 3.59E-04 4.48E-10 4.48E-10 32 32

-31 040545-31 040545

Контроль I Control I hPRLR.mmh hPRLR.mmh 5.99Е+05 5.99E+05 2.42Е-03 2.42E-03 4.04Е-09 4.04Е-09 4.8 4.8 hPRLR.mFc hPRLR.mFc 8.47Е+05 8.47E+05 2.14Е-04 2.14Е-04 2.53Е-10 2.53E-10 54.0 54.0 mfPRLR.mmh mfPRLR.mmh 1.53Е+05 1.53E+05 1.54Е-02 1.54Е-02 1.01Е-07 1.01Е-07 0.8 0.8

NB=Связывание не наблюдается в условиях эксперимента.NB=No binding observed under experimental conditions.

Как показано в табл. 3 и 4, для нескольких антител согласно изобретению аффинность к человеческому и обезьяньему белкам PRLR находится в субнаномолярном диапазоне и аффинность превышает аффинность контрольного антитела к PRLR (контроль I). Например, при 37°C многие антитела к PRLR согласно изобретению связывались с мономерным человеческим согласно настоящему изобретению при значениях KD менее 4 нМ и времени T1/2, превышавшем 5 мин, и с димерным человеческим PRLR при значениях KD менее 250 пМ и времени T1/2, превышавшем 60 мин. Эти характеристики связывания существенно лучше наблюдавшихся для контрольного антитела I в тех же экспериментальных условиях.As shown in Table. 3 and 4, for several antibodies of the invention, the affinity for human and simian PRLR proteins is in the subnanomolar range and the affinity is greater than that of the control PRLR antibody (Control I). For example, at 37°C, many anti-PRLR antibodies of the invention bind to monomeric human of the invention at KD values of less than 4 nM and T1/2 times greater than 5 min, and to dimeric human PRLR at KD values of less than 250 pM and T1/2 times. 2 exceeding 60 min. These binding characteristics are significantly better than those observed for control antibody I under the same experimental conditions.

Пример 4A. Антитела к PRLR связываются с клеточными линиями, в которых происходит эндогенная сверхэкспрессия PRLR.Example 4A. Anti-PRLR antibodies bind to cell lines in which PRLR is endogenously overexpressed.

Далее определяли способность антител к PRLR выборочно связываться с клеточными линиями, экспрессирующими PRLR. С помощью метода трансфекции, опосредованной Lipofectamine 2000, в клетки HEK293 были стабильно введены конструкции человеческого, обезьяньего Macaca fascicularis и мышиного PRLR с меткой HA. Трансфектанты (HEK293/hPRLR, HEK293/mfPRLR и HEK293/mPRLR) отбирали в течение по крайней мере 2 недель в полной ростовой среде плюс G418.Next, the ability of anti-PRLR antibodies to selectively bind to cell lines expressing PRLR was determined. Using a Lipofectamine 2000-mediated transfection method, HA-tagged human, simian Macaca fascicularis, and mouse PRLR constructs were stably introduced into HEK293 cells. Transfectants (HEK293/hPRLR, HEK293/mfPRLR and HEK293/mPRLR) were selected for at least 2 weeks in complete growth medium plus G418.

Экспрессию рецептора пролактина на поверхности клеток 293/hPRLR оценивали методом FACS. Вкратце 1 х 10⁵ клеток инкубировали в присутствии контрольного антитела I в концентрации 10 мкг/мл или контроля изотипа в течение 30 мин на льду в буфере для разбавления антител. После двух промывок буфером для разбавления антитела клетки инкубировали в присутствии PE, конъюгированного с вторичными антителами к человеческим антителам в концентрации 10 мкг/мл в течение 30 мин на льду. После двух дополнительных промывок образцы были пропущены через цитометр Hypercyt® и проанализированы в ForeCyt™ (IntelliCyt, Альбукерке, Нью-Мексико). Средние интенсивности флуоресценции (CHO; MFI) выражали как кратное изменение выше уровней контроля изотипа (фона). Связывание FACS подтвердило, что контрольное антитело I селективно связалось с клетками, экспрессирующими 293/hPRLR, при СИФ, 30-кратно превышающей фона (контроль изотипа) и менее чем 2-кратным связыванием на родительских клетках.Expression of the prolactin receptor on the surface of 293/hPRLR cells was assessed by FACS. Briefly, 1 x 10 ⁵ cells were incubated in the presence of control antibody I at a concentration of 10 μg/ml or isotype control for 30 min on ice in antibody dilution buffer. After two washes with antibody dilution buffer, cells were incubated in the presence of PE conjugated with secondary antibodies to human antibodies at a concentration of 10 μg/ml for 30 min on ice. After two additional washes, samples were run through a Hypercyt® Cytometer and analyzed in ForeCyt™ (IntelliCyt, Albuquerque, NM). Average fluorescence intensities (CHO; MFI) were expressed as fold change above isotype control (background) levels. FACS binding confirmed that control antibody I bound selectively to cells expressing 293/hPRLR with an SIF 30-fold greater than background (isotype control) and less than 2-fold binding on parental cells.

Было также количественно определено количество копий PRLR на клеточной поверхности клеточных линий T47D, MCF7 и MCF7/hPRLR со сверхэкспрессией PRLR. Вкратце 1 х 105 клеток инкубировали в присутствии антитела к PRLR H1H6953N-Alexa647 в концентрации 100 нМ в течение 30 мин на льду в буфере для разбавления антител. После двух промывок буфером для разбавления антитела клетки инкубировали в присутствии РЕ, конъюгированного с вторичными антителами к человеческим антителам в концентрации 10 мкг/мл в течение 30 мин на льду. После двух дополнительных промывок образцы пропускали через цитометр Hypercyt® и анализировали в ForeCyt™ (IntelliCyt, Альбукерке, Нью-Мексико). Полученное для каждой клеточной линии значений СИФ преобразовывали в молекулы эквивалентного растворимого флуорохрома (MESF) Alexa647, используя набор QuantumAlexaFluor647 MESF согласно инструкциям производителя (Bangs Laboratories, Inc, Фишерс, Индиана). Для определения среднего числа флуорофоров из расчета на белок H1H6953N-A647 (отношение F/P) использовали комплект антител к человеческому IgG Simply Cellular anti-Human IgG человека согласно инструкциям производителя (Bangs Laboratories, Inc, Фишерс, Индиана). Значения MESF делили на отношение F/P для определения количества копий PRLR на клеточной поверхности или для определения антигенсвязывающей способности H1H6953N на каждой клеточной линии. С помощью этого метода для разных клеточных линий было определено приблизительное количество копий PRLR на клеточной поверхности: T47D=27,000; MCF7=3,000; и MCF7/hPRLR=190,000.The number of PRLR copies on the cell surface of T47D, MCF7 and MCF7/hPRLR overexpressing PRLR cell lines was also quantified. Briefly, 1 x 105 cells were incubated in the presence of 100 nM anti-PRLR antibody H1H6953N-Alexa647 for 30 min on ice in antibody dilution buffer. After two washes with antibody dilution buffer, cells were incubated in the presence of PE conjugated with secondary antibodies to human antibodies at a concentration of 10 μg/ml for 30 min on ice. After two additional washes, samples were run through a Hypercyt® Cytometer and analyzed in ForeCyt™ (IntelliCyt, Albuquerque, NM). The SIF values obtained for each cell line were converted to Alexa647 equivalent soluble fluorochrome (MESF) molecules using the QuantumAlexaFluor647 MESF kit according to the manufacturer's instructions (Bangs Laboratories, Inc, Fishers, Ind.). The Simply Cellular anti-Human IgG human IgG kit was used to determine the average number of fluorophores per H1H6953N-A647 protein (F/P ratio) according to the manufacturer's instructions (Bangs Laboratories, Inc, Fishers, Ind.). The MESF values were divided by the F/P ratio to determine the number of PRLR copies on the cell surface or to determine the antigen-binding capacity of H1H6953N on each cell line. Using this method, the approximate number of PRLR copies on the cell surface was determined for different cell lines: T47D=27,000; MCF7=3.000; and MCF7/hPRLR=190,000.

Далее антитела к PRLR согласно настоящему изобретению были испытаны методом FACS на селективное связывание с генно-инженерными клеточными линиями HEK293, характеризующимися сверхэкспрессией PRLR, с клеточными линиями HEK293, не экспрессирующими PRLR, и с наивной клеточной линией, экспрессирующей PRLR (T47D). Результаты показаны в табл. 5.Further, anti-PRLR antibodies of the present invention were tested by FACS for selective binding to engineered HEK293 cell lines overexpressing PRLR, to HEK293 cell lines not expressing PRLR, and to a naive cell line expressing PRLR (T47D). The results are shown in table. 5.

- 32 040545- 32 040545

Таблица 5Table 5

Связывание антител к PRLR на клеточной поверхности, определенное методом FACSAnti-PRLR antibody binding on the cell surface, determined by FACS

Связывание клеток, определенное методом FACS (кратность относительно фона)Cell binding determined by FACS method (fold against background)

Антитело Antibody HEK293 HEK293 НЕК293/ hPRLR HEK293/ hPRLR НЕК293/ mfPRLR HEK293/ mfPRLR НЕК293/ mPRLR HEK293/ mPRLR T47D T47D Без окрашивания Without staining 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Только вторичные антитела Only secondary antibodies 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Контроль 1 Control 1 1 1 31 31 13 13 7 7 30 thirty *Н1Н6762Р *H1H6762R 1 1 36 36 26 26 2 2 38 38 *Н1Н6765Р *H1H6765R 2 2 38 38 27 27 1 1 40 40 Н1Н6774Р H1H6774R 1 1 1 1 29 29 1 1 39 39 *Н1Н6781Р *H1H6781R 1 1 37 37 26 26 1 1 40 40 Н1Н6782Р H1H6782R 3 3 41 41 32 32 4 4 43 43 *Н1Н6783Р *H1H6783R 1 1 37 37 27 27 1 1 38 38 *Н1Н6785Р *H1H6785R 1 1 37 37 26 26 2 2 40 40 *Н1Н6790Р *H1H6790R 1 1 37 37 24 24 1 1 34 34 *Н1Н6792Р *H1H6792R 1 1 37 37 28 28 3 3 37 37 Н1Н6793Р H1H6793R 2 2 2 2 32 32 2 2 43 43 Н1Н6795Р H1H6795R 1 1 1 1 22 22 1 1 34 34 Н1Н6797Р H1H6797R 1 1 1 1 25 25 2 2 38 38 *Н1Н6800Р *H1H6800R 1 1 35 35 29 29 1 1 41 41 Н1Н6801Р H1H6801R 7 7 47 47 88 88 56 56 45 45 *Н1Н6803Р *H1H6803R 1 1 39 39 28 28 1 1 39 39 Н1Н6804Р H1H6804R 1 1 1 1 29 29 1 1 34 34 *Н1Н6807Р *H1H6807R 2 2 32 32 27 27 2 2 34 34 *H1H6953N *H1H6953N 2 2 37 37 29 29 2 2 40 40 *H1H6958N2 *H1H6958N2 1 1 35 35 30 thirty 1 1 37 37 H1H6959N2 H1H6959N2 1 1 6 6 11 eleven 2 2 9 9 *Η1Η6960Ν *Η1Η6960Ν 1 1 29 29 23 23 1 1 33 33 *H1H6966N *H1H6966N 1 1 29 29 18 18 1 1 31 31 *H1H6967N *H1H6967N 1 1 38 38 28 28 2 2 41 41 *H1H6975N *H1H6975N 1 1 38 38 29 29 1 1 46 46 H1H6976N H1H6976N 1 1 8 8 29 29 1 1 37 37 Изотип контр. I Isotype counter. I 1 1 1 1 1 1 1 1 Н/Д N/A Изотип контр.II Isotype control II 1 1 1 1 Н/Д N/A Н/Д N/A 1 1

* Обозначает антитела со специфичным связыванием с клеточными линиями HEK293/hPRLR, HEK293/mfPRLR и T47D и менее чем 2-кратное повышение связывания с родительскими клетками HEK293.* Denotes antibodies with specific binding to HEK293/hPRLR, HEK293/mfPRLR and T47D cell lines and less than a 2-fold increase in binding to HEK293 parental cells.

Как показано в табл. 5, большинство антител к человеческому специфически связались с клетками HEK293/PRLR при >25-кратном превышении фонового уровня при несущественном связывании с родительской линией. Антитела, связавшиеся с человеческим рецептором пролактина, аналогичным образом связывались с обезьяньим (macaca fasciculahs) PRLR на клетках HEK293/mfPRLR. Антитела, прочно связывавшиеся с клетками HEK293/hPRLR, аналогичным образом устойчиво связывались с PRLR на клетках T47D с нативной экспрессией PRLR. Перекрестная реактивность с PRLR грызунов не наблюдалась.As shown in Table. 5, most of the anti-human antibodies specifically bound to HEK293/PRLR cells at >25-fold above background levels with no significant binding to the parent line. Antibodies bound to the human prolactin receptor similarly bound to simian (macaca fasciculahs) PRLR on HEK293/mfPRLR cells. Antibodies that bind strongly to HEK293/hPRLR cells similarly bind stably to PRLR on T47D cells with native expression of PRLR. Cross-reactivity with rodent PRLR was not observed.

Подводя итог, антитела согласно настоящему изобретению продемонстрировали прочное связывание с человеческим и обезьяньим рецептором пролактина на инженерных клеточных линиях и также с эндогенно экспрессируемым PRLR.In summary, the antibodies of the present invention showed strong binding to the human and simian prolactin receptor in engineered cell lines and also to endogenously expressed PRLR.

Пример 4B. Антитела к PRLR подвергаются in vitro интернализации клетками, экспрессирующими PRLR.Example 4B. Anti-PRLR antibodies are internalized in vitro by cells expressing PRLR.

В этом примере оценивали интернализацию антител к PRLR клеткам, экспрессирующим рецептор пролактина (T47D). Вкратце 20000 клеток T47D были засеяны на покрытый коллагеном 96луночный планшет. На следующий день клетки инкубировали совместно с антителами к человеческому PRLR-антителами (в концентрации 10 мкг/мл) в течение 30 мин на льду с последующими двумя промывками фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Далее клетки инкубировали на льду в течение 30 мин с вторичными антителами к hFcFab, конъюгированными с alexa488, с последующими двумя дополнительными промывками PBS. Для интернализации антитела помещали на 1 ч в буфер для интернализации при 37°C (PBS +2% FBS) или оставили при 4°C. Клетки были зафиксированы в 4% формальдегиде, ядра окрашивали реактивом DRAQ5 (клеточный сигнал) и получали изображения на приборе ImageXpress microXL (Molecular Devices). Для определения интенсивности окрашивания цельных клеток с alexa488 при 37°C (связывание) и интенсивности окрашивания с alexa488 во внутриклеточных везикулах при 37°C (интернализация) использовали программное обеспечение для анализа изображений Columbus (Perkin Elmer). В табл. 6 показаны значения интенсивности окрашивания, выраженные в процентах отIn this example, the internalization of antibodies to PRLR cells expressing the prolactin receptor (T47D) was evaluated. Briefly, 20,000 T47D cells were seeded onto a collagen-coated 96-well plate. The next day, cells were co-incubated with anti-human PRLR antibodies (at a concentration of 10 μg/ml) for 30 min on ice, followed by two washes with phosphate buffered saline (PBS). Cells were then incubated on ice for 30 min with alexa488-conjugated anti-hFcFab secondary antibodies, followed by two additional washes with PBS. For internalization, the antibodies were placed for 1 h in the buffer for internalization at 37°C (PBS +2% FBS) or left at 4°C. Cells were fixed in 4% formaldehyde, nuclei stained with DRAQ5 reagent (cell signal) and imaged on an ImageXpress microXL instrument (Molecular Devices). Columbus image analysis software (Perkin Elmer) was used to determine the staining intensity of whole cells with alexa488 at 37°C (binding) and the staining intensity with alexa488 in intracellular vesicles at 37°C (internalization). In table. 6 shows the staining intensity values expressed as a percentage of

- 33 040545 антитела H1H6975N, продемонстрировавшего самую высокую степень интернализации.- 33 040545 antibody H1H6975N, which showed the highest degree of internalization.

Таблица 6Table 6

Клеточная линия: T47D [mAbl 1мкт/мл (0.67 нМ) Cell line: T47D [mAbl 1µt/ml (0.67 nM) Антитело Antibody % от интернализации по сравнению с контрольным ι антителом I % of internalization compared to control ι antibody I % от общего связывания по сравнению с контрольным антителом I % of total binding compared to control antibody I Контрольное антитело к PRLR I Anti-PRLR I control antibody 100.0 100.0 100.0 100.0 H1H6975N H1H6975N 214.2 214.2 225.9 225.9 Н1Н6800Р H1H6800R 198.3 198.3 186.8 186.8 Н1Н6803Р H1H6803R 190.5 190.5 205.5 205.5 Н1Н6762Р H1H6762R 186.3 186.3 176.7 176.7 Н1Н6765Р H1H6765R 186.3 186.3 191.3 191.3 Н1Н6793Р H1H6793R 179.9 179.9 177.9 177.9 Н1Н6782Р H1H6782R 179.3 179.3 209.9 209.9 H1H6976N H1H6976N 169.5 169.5 180.4 180.4 Н1Н6785Р H1H6785R 169.1 169.1 168.0 168.0 H1H6958N2 H1H6958N2 169.0 169.0 161.5 161.5 H1H6967N H1H6967N 168.6 168.6 158.6 158.6 Н1Н6781Р H1H6781R 165.1 165.1 166.2 166.2 Н1Н6774Р H1H6774R 162.3 162.3 173.7 173.7 Н1Н6783Р H1H6783R 160.7 160.7 165.8 165.8 Н1Н6792Р H1H6792R 155.9 155.9 110.6 110.6 H1H6953N H1H6953N 153.9 153.9 164.2 164.2 Н1Н6795Р H1H6795R 150.7 150.7 123.4 123.4 Н1Н6801Р H1H6801R 148.9 148.9 155.7 155.7 Н1Н6807Р H1H6807R 147.0 147.0 152.7 152.7 Н1Н6790Р H1H6790R 146.9 146.9 122.8 122.8 Н1Н6797Р H1H6797R 145.2 145.2 151.2 151.2 Н1Н6804Р H1H6804R 138.9 138.9 149.6 149.6 H1H6966N H1H6966N 137.2 137.2 111.3 111.3 H1H6960N H1H6960N 120.0 120.0 89.7 89.7 H1H6959N2 H1H6959N2 15.3 15.3 2.0 2.0

За исключением H1H6959N2 все протестированные антитела связывались с T47D и почти 100% от всех связавшихся mAbs были интернализованы в течение 1 ч. Общая интенсивность окрашивания интернализованных антител для большинства антител была выше, чем для контрольного антитела к человеческому PRLR (контроль I).With the exception of H1H6959N2, all antibodies tested bound to T47D and almost 100% of all bound mAbs were internalized within 1 hour. The overall staining intensity of internalized antibodies for most antibodies was higher than for the control anti-human PRLR antibody (Control I).

Пример 5. Антитела к PRLR подавляют опосредованную пролактином активацию рецептора в клетках, экспрессирующих человеческий PRLR.Example 5 Antibodies to PRLR suppress prolactin-mediated receptor activation in cells expressing human PRLR.

Для исследования способности антител к PRLR блокировать опосредованную пролактином (PRL) активацию рецептора использовали анализ репортерного гена люциферазы. Эндокринный гормон пролактин связывается с внеклеточным доменом когнатного рецептора PRLR, инициируя быструю гомодимеризацию и активируя несколько нисходящих сигнальных каскадов.Luciferase reporter gene assay was used to investigate the ability of anti-PRLR antibodies to block prolactin-mediated (PRL) receptor activation. The endocrine hormone prolactin binds to the extracellular domain of the cognate PRLR receptor, initiating rapid homodimerization and activating several downstream signaling cascades.

В этом примере инженерную клеточную линию использовали для определения способности антител к PRLR блокировать активацию лиганда рецептора пролактина. Вкратце посредством последовательных циклов Lipofectamine® 2000-опосредованной трансфекции были созданы клеточные линии HEK293/hPRLR/STAT5-Luc со стабильным включением кассетной конструкции, экспрессирующей человеческий PRLR и STAT5-зависимого репортера люциферазы (LifeTechnologies, Карлсбад, Калифорния). Клетки отбирали в течение по крайней мере двух недель в присутствии G418 (hPRLR) в концентрации и гигромицина B в концентрации 100 мкг/мл (STAT5-Luc). При проведении количественного анализа STAT5-Luc использовали 2x105 клеток HEK293/hPRLR/STAT5-Luc, засеянных в полную ростовую среду в 96-луночном планшете с PDL-покрытием, которые выращивали в течение ночи при 37°C и 5% CO2. Для построения кривых ингибирования антител клетки инкубировали (в течение 6 ч при 37°C) в присутствии серийно разбавленных антител к человеческому PRLR (от 100 нМ до 24 пМ) в присутствии постоянного пролактина с концентрацией 5 нМ до регистрации сигнала. Кривые зависимости эффекта от дозы пролактина получали при добавлении к клеткам серийно разбавленного пролактина (в концентрации от 100 нМ до 24 пМ) и регистрации сигнала после 6-часовой инкубации (37°C) в отсутствие антител. Также оценивали способность антител активировать рецептор пролактина в отсутствие лиганда.In this example, an engineered cell line was used to determine the ability of PRLR antibodies to block prolactin receptor ligand activation. Briefly, HEK293/hPRLR/STAT5-Luc cell lines were generated through sequential cycles of Lipofectamine® 2000-mediated transfection with stable incorporation of a cassette construct expressing human PRLR and a STAT5 dependent luciferase reporter (Life Technologies, Carlsbad, CA). Cells were harvested for at least two weeks in the presence of G418 (hPRLR) at a concentration and hygromycin B at a concentration of 100 μg/ml (STAT5-Luc). STAT5-Luc quantitation used 2x105 HEK293/hPRLR/STAT5-Luc cells seeded in complete growth media in a 96-well PDL-coated plate grown overnight at 37°C and 5% CO2. To plot antibody inhibition curves, cells were incubated (for 6 h at 37°C) in the presence of serially diluted anti-human PRLR antibodies (100 nM to 24 pM) in the presence of 5 nM constant prolactin until signal was detected. Dose-effect curves of prolactin were obtained by adding serially diluted prolactin (at a concentration of 100 nM to 24 pM) to the cells and recording the signal after a 6-hour incubation (37°C) in the absence of antibodies. The ability of antibodies to activate the prolactin receptor in the absence of a ligand was also evaluated.

Для измерения активности люциферазы использовали реактив ONE-Glo™ (Promega, Мадисон, W1). Относительные световые единицы (OCE; RLU) были измерены на люминометре Victor (Perkin Elmer, Шелтон, Коннектикут). Для определения значений EC50/IC50 на приборе GraphPad Prism использовали 4-параметрическое логистическое уравнение и построенную по 8 точкам кривую ответа. Показаны процент блокирования и процент активации для самой высокой дозы антитела. Результаты показаны в табл. 7.The ONE-Glo™ reagent (Promega, Madison, W1) was used to measure luciferase activity. Relative light units (OCE; RLU) were measured with a Victor luminometer (Perkin Elmer, Shelton, Conn.). To determine the EC50/IC50 values on the GraphPad Prism instrument, a 4-parameter logistic equation and an 8-point response curve were used. Percent blocking and per cent activation are shown for the highest dose of antibody. The results are shown in table. 7.

- 34 040545- 34 040545

Таблица 7Table 7

IC₅₀ и процент блокирования опосредованного PRL сигнала антителами к PRLRIC ₅₀ and Percentage of PRL Mediated Signal Blocking by Anti-PRLR Antibodies

Антитело Antibody ICso блокирования 5 нМ PRL [М] ICso blocking 5 nM PRL [M] Процент блокирования при дозе антитела 100 нМ Percent blocking at 100 nM antibody dose 4146762Р 4146762Р 7 1QF-11 7 1QF-11 100 100 Н1Н6765Р H1H6765R 3A0F-11 3A0F-11 100 100 4146774Р 4146774Р NR NR 0 0 4146781Р 4146781Р 2.70F.-11 2.70F.-11 100 100 ----Н1Н6782Р---- ----H1H6782R---- -------NB------- -------NB------- 0 0 Н146783Р Н146783Р ND ND 59 59 4146785Р 4146785Р 3.45Е-10 3.45E-10 100 100 Н1Н6790Р H1H6790R 7 06F-10 706F-10 100 100 4146792Р 4146792Р 5.70Е-10 5.70E-10 100 100 4146793Р 4146793R ND ND 65 65 4146795Р 4146795Р NR NR 0 0 4146797Р 4146797Р NR NR 0 0 Н146800Р H146800R 3 55E-1O 3 55E-1O 100 100 Н1Н6801Р H1H6801R 1.40E-10 1.40E-10 100 100 414680Щ 414680Sch 6 27F.-10 6 27F.-10 100 100 4146804Р 4146804R 7 89F-09 789F-09 100 100 4146807Р 4146807R 6 OOF-10 6OOF-10 100 100 4146953N 4146953N 1.05E-10 1.05E-10 100 100 H1H6958N2 H1H6958N2 1.98E-10 1.98E-10 100 100 4146959N2 4146959N2 ND ND 52 52 4146960N 4146960N 1 58F.-09 158F.-09 100 100 4146966N 4146966N ND ND 54 54 4146967N 4146967N 7 68F-10 768F-10 100 100 4146975N 4146975N 2.41 F-10 2.41 F-10 100 100 4146976N 4146976N ND ND 22 22 КонтпольТ KontpolT 1.33F-09 1.33F-09 100 100

NB: блокирование отсутствовало;NB: no blocking;

ND: не определено из-за неполного блокирования.ND: not defined due to incomplete blocking.

Как показано в табл. 7, большинство антител согласно настоящему изобретению блокировали активацию репортера STAT5 при значениях IC50 в диапазоне от 22 пМ до 8 нМ. Все ингибирующие антитела блокировали активацию до исходных уровней (блокирование составило 100%). Кроме того, антитела, протестированные с помощью этого анализа, не активировали STAT5 в отсутствие лиганда PRL.As shown in Table. 7, most of the antibodies of the present invention blocked STAT5 reporter activation with IC50 values ranging from 22 pM to 8 nM. All inhibitory antibodies blocked activation to baseline levels (blocking was 100%). In addition, the antibodies tested by this assay did not activate STAT5 in the absence of PRL ligand.

Подводя итоги, данные этого примера демонстрируют, что большинство антител к PRLR согласно изобретению блокируют опосредованную пролактином активацию рецептора. Кроме того, большинство антител ингибируют активацию рецептора более эффективно, чем контрольные антитела к PRLR I. Например, несколько антител к PRLR согласно настоящему изобретению блокировали опосредованный пролактином сигнал при IC₅₀ менее приблизительно 1,3 нМ. С другой стороны, некоторые другие антитела к PRLR согласно изобретению несмотря на способность связывать рецептор пролактина не проявили блокирующую пролактин активность. Такое отсутствие блокирования со стороны антител к PRLR может найти использование в различных терапевтических ситуациях, в которых желательно направленное взаимодействие с рецептором пролактина без нарушения нормальной передачи сигнала с участием пролактина.In summary, the data of this example demonstrate that most of the anti-PRLR antibodies of the invention block prolactin-mediated receptor activation. In addition, most antibodies inhibit receptor activation more effectively than control anti-PRLR I antibodies. For example, several anti-PRLR antibodies of the present invention blocked a prolactin-mediated signal with an IC ₅₀ of less than about 1.3 nM. On the other hand, some other anti-PRLR antibodies according to the invention, despite the ability to bind the prolactin receptor, did not show prolactin blocking activity. This lack of blocking by anti-PRLR antibodies may find use in a variety of therapeutic situations in which targeted interaction with the prolactin receptor is desirable without disrupting normal prolactin signaling.

Пример 6. Получение и определение характеристик конъюгатов антитела к PRLR с лекарственным средством.Example 6 Preparation and Characterization of Anti-PRLR Antibody Drug Conjugates.

Отобранные антитела к PRLR были конъюгированы с майтанзиноидом DM1 через линкер SMCC с использованием способов, изложенных в патенте США № 5208020 и заявке на патент США № 2010/0129314. Конъюгаты были очищены методом гель-хроматографии и подвергнуты стерилизующему фильтрованию. Все исходные материалы и растворители были приобретены у коммерческих поставщиков и использовались без очистки, если не указано иное.Selected anti-PRLR antibodies were conjugated to DM1 maytansinoid via an SMCC linker using the methods described in US Patent No. 5,208,020 and US Patent Application No. 2010/0129314. The conjugates were purified by gel chromatography and subjected to sterilizing filtration. All starting materials and solvents were purchased from commercial suppliers and used without purification unless otherwise noted.

Для определения концентрации белка и линкера/полезной нагрузки использовали спектральный анализ в УФ-диапазоне и масс-спектрометрию MALDI-TOF. Гель-хроматография показала, что все используемые конъюгаты на >95% являлись мономерными, и ВЭЖХ с обращенной фазой показала, что содержание неконъюгированной линкерной полезной нагрузки составляет <0,5%. Результаты в пересчете на белок показаны в табл. 8 и 9. Все конъюгированные антитела были проанализированы с использованием УФ-спектрофотометра для определения значений линкерной полезной нагрузки в соответствии сUV spectral analysis and MALDI-TOF mass spectrometry were used to determine protein and linker/payload concentrations. Size exclusion chromatography indicated that all conjugates used were >95% monomeric, and reverse phase HPLC indicated that the content of unconjugated linker payload was <0.5%. The results in terms of protein are shown in table. 8 and 9. All conjugated antibodies were analyzed using a UV spectrophotometer to determine linker payload values according to

- 35 040545- 35 040545

Hamblett et al., 2004, Clinical Cancer Research, 10(20):7063-7070 и посредством определения разности масс, нативной по сравнению с массой конъюгата.Hamblett et al., 2004, Clinical Cancer Research, 10(20):7063-7070 and by determining the difference in mass, native versus conjugate mass.

Таблица 8Table 8

Концентрации белка в неконъюгированных антителах к PRLRProtein concentrations in unconjugated anti-PRLR antibodies

Соединение Compound ε252 нм (см¹ М¹)ε252 nm (cm ¹ M ¹ ) ε280 нм (см¹ М¹)ε280 nm (cm ¹ M ¹ ) SMCC-DM1 SMCC-DM1 26790 26790 5700 5700 Антитело (неконъюгированное) Antibody (unconjugated) ε252 нм (см¹ М¹)ε252 nm (cm ¹ M ¹ ) ε280 нм (см^-1 М¹)ε280 nm (cm ^-1 M ¹ ) H1H6958N2 H1H6958N2 74462 74462 195440 195440 H1H6959N2 H1H6959N2 77485 77485 209420 209420 H1H6960N H1H6960N 84926 84926 214460 214460 H1H6953N H1H6953N 80673 80673 220420 220420 Н1Н6975Р H1H6975R 81120 81120 199804 199804 Контроль изотипа Isotype control 84723 84723 218360 218360

Таблица 9Table 9

Концентрации полезной нагрузки/антитела с линкером для конъюга_______тов, образованных антителом к PRLR и SMCC-DM1_______Payload/antibody concentrations with linker for _______ anti-PRLR antibody and SMCC-DM1 conjugates_______

Конъюгат антитела Antibody conjugate Полезная нагрузка: антитело молярное отношение (УФ) Payload: antibody molar ratio (UV) Полезная нагрузка: антитело молярное отношение (МС) Payload: antibody molar ratio (ms) Выход % Exit % H1H6958N2-DM1 H1H6958N2-DM1 4.0 4.0 3.4 3.4 64 64 H1H6959N2-DM1 H1H6959N2-DM1 3.8 3.8 3.3 3.3 64 64 H1H6960N-DM1 H1H6960N-DM1 3.6 3.6 3.0 3.0 64 64 H1H6953N-DM1 H1H6953N-DM1 3.2 3.2 2.7 2.7 52 52 H1H6803P-DM1 H1H6803P-DM1 ND ND 3.1 3.1 55 55 H1H6762P-DM1 H1H6762P-DM1 ND ND 2.9 2.9 70 70 H1H6765P-DM1 H1H6765P-DM1 ND ND 2.3 2.3 55 55 H1H6782P-DM1 H1H6782P-DM1 ND ND 2.8 2.8 65 65 H1H6793P-DM1 H1H6793P-DM1 ND ND 3.8 3.8 55 55 H1H6975P-DM1 H1H6975P-DM1 3.0 3.0 3.4 3.4 60 60 H1H6800P-DM1 H1H6800P-DM1 3.0 3.0 3.2 3.2 50 50 Контроль изотипа- Isotype control- 3.3 3.3 3.3 3.3 80 80 DM1 DM1

ND: не определено.ND: not determined.

Этот пример иллюстрирует конъюгацию антител к PRLR согласно настоящему изобретению с DM1 через линкер SMCC. Было рассчитано молярное отношение полезной нагрузки к антителу, составившее для конъюгированных антител по этому примеру от приблизительно 2,3 до приблизительно 3,8 для конъюгированных антител согласно данному примеру. Выраженный в процентах выход антител согласно изобретению составил приблизительно 50-70%.This example illustrates the conjugation of anti-PRLR antibodies of the present invention to DM1 via an SMCC linker. The payload to antibody molar ratio was calculated to be from about 2.3 to about 3.8 for the conjugated antibodies of this example for the conjugated antibodies of this example. The percentage yield of antibodies according to the invention was approximately 50-70%.

Пример 7. Конъюгаты антитела к PRLR с лекарственным средством эффективно уничтожают клетки с низкими или умеренными уровнями экспрессии PRLR и также клетки с высоким уровнем экспрессии PRLR.Example 7 Anti-PRLR antibody drug conjugates effectively kill cells with low or moderate levels of PRLR expression and also cells with high levels of PRLR expression.

Чтобы определить относительную киллерную активность ADC, содержащих антитела к PRLR, по сравнению со сходными ADC, содержащими антитела к ErbB2, был проведен анализ киллинга клеток, принадлежащих к нескольким клеточным линиям, экспрессирующим PRLR, ErbB2 или оба рецептора.To determine the relative killing activity of ADCs containing anti-PRLR antibodies compared to similar ADCs containing anti-ErbB2 antibodies, a killing assay was performed on cells belonging to several cell lines expressing PRLR, ErbB2, or both receptors.

Для оценки способности конъюгированных антител к PRLR снижать жизнеспособность клеток были получены клетки с повышенным уровнем экспрессией рецептора пролактина, включая HEK293, PC3, MCF7 и NCI-N87, были сгенерированы. Для сравнения были получены также клетки PC3 и T47D с повышенным уровнем экспрессии ErbB2 и клеточная линия MCF7, характеризуемая повышенной экспрессией рецепторов hPRLR и hErbB2. Вкратце, для того чтобы создать клетки HEK293, экспрессирующие человеческий PRLR (HEK293/hPRLR) или человеческий рецептор ErbB2 (HEK293/hErbB2), использова- 36 040545 ли методологию трансфекции, опосредованной Lipofectamine® 2000. Для получения клеток PC3, экспрессирующих человеческий PRLR (PC3/hPRLR) или человеческий рецептор ErbB2 (PC3/hErbB2), использовали Lipofectamine LTX с Реагентом Плюс. Для получения клеток MCF7, экспрессирующих человеческий PRLR (MCF7/hPRLR), клеток NCI-N87, экспрессирующих человеческий PRLR (NCI-N87/hPRLR), клеток T47D с повышенным уровнем экспрессии человеческого ErbB2 (T47D/hErbB2) и клеток MCF7, экспрессирующих человеческий PRLR и человеческий ErbB2 (MCF7/hPRLR/hErbB2), использовали опосредованную лентивирусом трансдукцию. Селекцию всех линий проводили в течение по крайней мере 2 недель в полной ростовой среде с добавлением соответствующих реактивов для отбора. Популяции со стабильной экспрессией обогащали для экспрессии PRLR посредством FACS с использованием контрольного антитела к PRLR I.To assess the ability of conjugated antibodies to PRLR to reduce cell viability, cells with an increased level of expression of the prolactin receptor, including HEK293, PC3, MCF7 and NCI-N87, were generated. For comparison, PC3 and T47D cells with an increased level of ErbB2 expression and the MCF7 cell line characterized by an increased expression of hPRLR and hErbB2 receptors were also obtained. Briefly, Lipofectamine® 2000 mediated transfection methodology was used to generate HEK293 cells expressing human PRLR (HEK293/hPRLR) or human ErbB2 receptor (HEK293/hErbB2). To generate PC3 cells expressing human PRLR (PC3 /hPRLR) or human ErbB2 receptor (PC3/hErbB2) used Lipofectamine LTX with Reagent Plus. To obtain MCF7 cells expressing human PRLR (MCF7/hPRLR), NCI-N87 cells expressing human PRLR (NCI-N87/hPRLR), T47D cells overexpressing human ErbB2 (T47D/hErbB2) and MCF7 cells expressing human PRLR and human ErbB2 (MCF7/hPRLR/hErbB2) used lentivirus mediated transduction. All lines were selected for at least 2 weeks in complete growth medium supplemented with appropriate selection reagents. Stable expression populations were enriched for PRLR expression by FACS using a control anti-PRLR I antibody.

Для анализа экспрессии рецепторов PRLR и ErbB2 на клеточной поверхности клеток использовали FACS и контрольное антитело к PRLR I или контрольное антитело к HER2 II соответственно. Кроме того, была определена эндогенная экспрессия PRLR на клеточной поверхности линии T47D#11, варианта линии T47D, отобранной, как продемонстрировавшей наиболее агрессивный опухолевый рост in vivo. Приблизительно 1 х 10⁶ клеток инкубировали в присутствии контрольного антитела к PRLR I в концентрации 10 мкг/мл (контроль I), контрольного антитела к ErbB2 II (контроль II), или изотипа контроля в течение 30 мин на льду в буфере для разбавления антител. После двух промывок буфером для разбавления антитела клетки инкубировали в присутствии PE, конъюгированного с вторичными антителами к человеческим антителам в концентрации 10 мкг/мл в течение 30 мин на льду. После двух дополнительных промывок образцы пропускали через цитометр AccuriC6 (BD) с программным обеспечением FlowJo (TreeStar, Inc., Ашленд, Орегон). Результаты, отражающие относительную экспрессию, показаны в табл. 10.To analyze the expression of PRLR and ErbB2 receptors on the cell surface of cells, FACS and a control antibody to PRLR I or a control antibody to HER2 II, respectively, were used. In addition, endogenous expression of PRLR was determined on the cell surface of the T47D#11 line, a variant of the T47D line selected as having the most aggressive tumor growth in vivo. Approximately 1 x 10 ⁶ cells were incubated in the presence of 10 µg/mL anti-PRLR I antibody (control I), anti-ErbB2 II antibody (control II), or isotype control for 30 min on ice in antibody dilution buffer. After two washes with antibody dilution buffer, cells were incubated in the presence of PE conjugated with secondary antibodies to human antibodies at a concentration of 10 μg/ml for 30 min on ice. After two additional washes, samples were run through an AccuriC6 Cytometer (BD) with FlowJo software (TreeStar, Inc., Ashland, OR). The results, reflecting the relative expression, are shown in table. 10.

Таблица 10 Экспрессия человеческого рецептора пролактина на клеточной поверхности (эндогенные и инженерные клеточные линии)Table 10 Cell surface expression of the human prolactin receptor (endogenous and engineered cell lines)

Клеточная линия cell line Определение связывания методом FACS (кратность СИФ относительно контроля изотипа) Determination of binding by FACS Без окрашива НИЯ Without staining NIA Вторичное антитело secondary antibody Контроль изотипа Isotype control Антитело к PRLR (Контроль I) Anti-PRLR antibody (Control I) Антитело к ЕгЬВ2 (Контроль II) Antibody to ErbB2 (Control II) 293 293 IX IX IX IX IX IX IX IX 28Х 28X 293/hErbB2 293/hErbB2 IX IX IX IX IX IX IX IX 215Х 215X 293/hPRLR 293/hPRLR IX IX IX IX IX IX 18Х 18X 18Х 18X РСЗ RSH IX IX IX IX IX IX IX IX 41Х 41X PC3/hErbB2 PC3/hErbB2 IX IX IX IX IX IX IX IX 23 8Х 23 8X PC3/hPRLR PC3/hPRLR IX IX IX IX IX IX 13Х 13X 31Х 31X T47D T47D IX IX IX IX IX IX 12Х 12X 87Х 87X T47D#11 T47D#11 IX IX IX IX IX IX ЮХ YUH ND ND T47D/hErbB2 T47D/hErbB2 IX IX IX IX IX IX 12Х 12X 437Х 437X SK-BR-3 SK-BR-3 IX IX IX IX IX IX IX IX 600Х 600X MCF7 MCF7 IX IX IX IX IX IX зх sx 42Х 42X MCF7/hPRLR MCF7/hPRLR IX IX IX IX IX IX 55Х 55X 36Х 36X MCF7/hPRLR/hErbB2 MCF7/hPRLR/hErbB2 IX IX IX IX IX IX 55Х 55X 349Х 349X NCI-N87 NCI-N87 IX IX IX IX IX IX IX IX 1,400Х 1,400X NCI-N87/hPRLR NCI-N87/hPRLR IX IX IX IX IX IX 6Х 6X 1,400Х 1,400X

В целом поверхностная экспрессия экзогенного PRLR варьировала от 6-кратного до 55-кратного превышения фона, большинство инженерных клеток продемонстрировали 12-18-кратный уровень экспрессии рецептора пролактина по сравнению с фоном. Экспрессия эндогенного PRLR 3-кратно превышала фоновое значение в клетках MCF7, но не обнаруживалась в родительских линиях HEK293, PC3 и NCI-N87. Экспрессия эндогенного PRLR была 12-кратно превышала фоновые значения в клеточной линии T47D и 10-кратно в варианте клеточной линии T47D#11. Экспрессия ErbB2 была обнаружена во всех клеточных линиях, экспрессирующих PRLR, и 18-1400-кратрно превышала фоновое значение.In general, surface expression of exogenous PRLR ranged from 6-fold to 55-fold excess of background, most of the engineered cells showed 12-18-fold levels of prolactin receptor expression compared to background. Expression of endogenous PRLR was 3-fold higher than background in MCF7 cells, but was not detected in parental lines HEK293, PC3, and NCI-N87. Endogenous PRLR expression was 12-fold higher than background values in the T47D cell line and 10-fold in the T47D#11 cell line variant. ErbB2 expression was found in all PRLR expressing cell lines and was 18-1400-fold higher than background.

Далее, способность конъюгата с лекарственным средством, содержащего антитело к PRLR и DM1 антитела (т.е. антитела к PRLR, конъюгированного с DM1 через нерасщепляемый линкер (SMCC)) уменьшать жизнеспособность клетки определяли с помощью клеточного анализа in vitro. 96-Луночные планшеты с PDL-покрытием засеивали клетками по 1500-10000 клеток в лунке и выращивали в полной ростовой среде в течение ночи. Для построения кривых жизнеспособности клеток к клеткам добавляли ADC или свободный DM1 (в форме метилдисульфидного производного DM1-SMe) до конечных концентраций от 500 нМ до 5 пМ и инкубировали в течение 3 суток. Клеточные линии 293, PC3 и T47D в течение последних 1-3 ч инкубировали в присутствии CCK8 (Dojindo, Роквилль, Мэриленд) и определялиFurther, the ability of a drug conjugate containing an anti-PRLR antibody and a DM1 antibody (ie, an anti-PRLR antibody conjugated to DM1 through a non-cleavable linker (SMCC)) to decrease cell viability was determined by in vitro cell assay. PDL-coated 96-well plates were seeded with cells at 1500-10000 cells per well and grown in complete growth medium overnight. To plot cell viability curves, ADC or free DM1 (in the form of methyl disulfide derivative DM1-SMe) was added to cells to final concentrations from 500 nM to 5 pM and incubated for 3 days. Cell lines 293, PC3 and T47D were incubated for the last 1-3 h in the presence of CCK8 (Dojindo, Rockville, MD) and determined

- 37 040545 оптическую плотность при длине волны 450 нМ (OD₄₅₀) на приборе Flexstation3 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Клетки MCF7 обрабатывали красителем для ядер клеток Hoechst33342 и фиксировали 4% формальдегидом. Изображения получали на приборе ImageXpress micro XL (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния) и для подсчета ядер использовали программное обеспечение для анализа изображений Columbus Image (Perkin Elmer, Шелтон, Коннектикут). Из значений, полученных для всех лунок, вычитали фоновые значения OD₄₅₀ (РСЗ, 293, и T47D) или количество ядер (MCF7) в клетках, обработанных дигитонином (40 нМ), и жизнеспособность клеток выражали в процентах от значений, полученных для необработанных контрольных образцов. Для определения значений 1С₅₀ использовали 4-параметрическое логистическое уравнение и построенную по 10 точкам кривую ответа (GraphPad Prism). Значения 1С₅₀ и проценты уничтоженных клеток показаны в табл. 11 и 12.- 37 040545 optical density at a wavelength of 450 nm (OD ₄₅₀ ) on the Flexstation3 instrument (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). MCF7 cells were treated with Hoechst33342 nuclear stain and fixed with 4% formaldehyde. Images were acquired on an ImageXpress micro XL instrument (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) and Columbus Image image analysis software (Perkin Elmer, Shelton, Conn.) was used to count nuclei. Baseline OD ₄₅₀ values (PC3, 293, and T47D) or number of nuclei (MCF7) in cells treated with digitonin (40 nM) were subtracted from the values obtained for all wells, and cell viability was expressed as a percentage of the values obtained from untreated controls. samples. _IC50 values were determined using a 4-parameter logistic equation and a 10-point response curve (GraphPad Prism). Values IC ₅₀ and the percentage of destroyed cells are shown in table. 11 and 12.

Таблица 11Table 11

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных антителом к PRLR и лекарственным средством DM1Cell killing efficiency with anti-PRLR antibody and DM1 drug conjugates

Конъюгат антитела с лекарственным средством Antibody drug conjugate 293 293 293/PRLR 293/PRLR PC3 PC3 PC3/PRLR PC3/PRLR IC50 IC50 % уничт ожени я % fire destruction IC50 IC50 % уничт ожени я % fire destruction IC50 IC50 % уничто женим % destroy IC50 IC50 % уничто жения % destruction DM1 (свободное лекарство) DM1 (free drug) 0.27 0.27 98 98 0.36 0.36 97 97 0.47 0.47 91 91 0.59 0.59 80 80 H1H6953N-DM1 H1H6953N-DM1 100 100 88 88 0.28 0.28 95 95 110 110 78 78 0.86 0.86 67 67 H1H6958N2-DM1 H1H6958N2-DM1 75 75 98 98 0.10 0.10 95 95 150 150 83 83 0.43 0.43 83 83 H1H6959N2-DM1 H1H6959N2-DM1 75 75 100 100 4.82 4.82 95 95 150 150 79 79 11.6 11.6 82 82 H1H6960N-DM1 H1H6960N-DM1 75 75 100 100 0.38 0.38 95 95 150 150 80 80 1.13 1.13 82 82 H1H6975N-DM1 H1H6975N-DM1 100 100 87 87 ND ND ND ND 200 200 71 71 2.70 2.70 68 68 H1H6762P-DM1 H1H6762P-DM1 100 100 89 89 ND ND ND ND 250 250 78 78 0.98 0.98 66 66 H1H6765P-DM1 H1H6765P-DM1 100 100 86 86 ND ND ND ND 200 200 70 70 0.57 0.57 70 70 H1H6782P-DM1 H1H6782P-DM1 100 100 86 86 ND ND ND ND 300 300 67 67 0.92 0.92 64 64 H1H6793P-DM1 H1H6793P-DM1 100 100 84 84 ND ND ND ND 200 200 72 72 3.65 3.65 65 65 H1H6800P-DM1 H1H6800P-DM1 150 150 85 85 ND ND ND ND 150 150 72 72 1.37 1.37 68 68 H1H6803P-DM1 H1H6803P-DM1 300 300 7 7 ND ND ND ND 150 150 72 72 2.32 2.32 70 70 Контроль I-DM1 I-DM1 control 100 100 92 92 0.28 0.28 95 95 >100 >100 79 79 7.28 7.28 80 80 Изотип контр. - DM1 Isotype counter. - DM1 100 100 60 60 100 100 93 93 125 125 78 78 110 110 63 63

Значения 1С₅₀ показаны в нМ;IC ₅₀ values are shown in nM;

ND: не определено.ND: not determined.

Таблица 12Table 12

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных антителом к PRLR и лекарственным средством DM1Cell killing efficiency with anti-PRLR antibody and DM1 drug conjugates

Конъюгат антитела с лекарственным средством Antibody drug conjugate T47D T47D MCF7 MCF7 MCF7/PRLR MCF7/PRLR 1С₅₀ 1C ₅₀ % уничтоже НИЯ % destruction IC50 IC50 % уничтоже НИЯ % destruction 1С₅₀ 1C ₅₀ % уничтоже НИЯ % destruction DM1 (свободное лекарство) DM1 (free drug) 0.45 0.45 86 86 1.17 1.17 83 83 1.47 1.47 88 88 H1H6953N-DM1 H1H6953N-DM1 1.64 1.64 79 79 100 100 55 55 0.29 0.29 76 76 H1H6958N2- DM1 H1H6958N2- DM1 1.34 1.34 71 71 100 100 77 77 0.19 0.19 77 77 H1H6959N2- DM1 H1H6959N2- DM1 48.90 48.90 71 71 100 100 82 82 0.47 0.47 80 80 H1H6960N-DM1 H1H6960N-DM1 5.10 5.10 71 71 100 100 77 77 0.29 0.29 78 78 H1H6975N-DM1 H1H6975N-DM1 6.90 6.90 80 80 150 150 73 73 0.49 0.49 87 87 H1H6762P-DM1 H1H6762P-DM1 12.60 12.60 80 80 110 110 64 64 0.46 0.46 83 83 H1H6765P-DM1 H1H6765P-DM1 1.63 1.63 78 78 150 150 68 68 0.18 0.18 84 84 H1H6782P-DM1 H1H6782P-DM1 4.19 4.19 74 74 120 120 57 57 0.65 0.65 85 85 H1H6793P-DM1 H1H6793P-DM1 11.10 11.10 53 53 125 125 67 67 0.54 0.54 87 87 H1H6800P-DM1 H1H6800P-DM1 3.20 3.20 79 79 150 150 65 65 0.40 0.40 85 85 H1H6803P-DM1 H1H6803P-DM1 8.61 8.61 77 77 150 150 60 60 0.44 0.44 84 84 Контроль I-DM1 I-DM1 control 24.50 24.50 65 65 100 100 46 46 0.59 0.59 75 75 Изотип контр.DM1 Isotype control DM1 150 150 61 61 120 120 66 66 100 100 84 84

Значения 1С₅₀ показаны в нМ.IC ₅₀ values are shown in nM.

-38040545-38040545

Как показано в табл. 11 и 12, несколько конъюгатов, образованных антителом к PRLR и DM1, эффективно снижали жизнеспособность клеток при многочисленных фоновых показателях при низких IC50, составляющих всего 100 пМ. Иллюстративное конъюгированное антитело к PRLR, H1H6958N2-DM1, снижало жизнеспособность клеток HEK293, PC3 и MCF7, экспрессирующих рецептор пролактина, при IC₅₀ в субнаномолярном диапазоне от 100 до 460 пМ, и обеспечивало уничтожение клеток T47D с эндогенной экспрессией PRLR при IC₅₀=1,3 нМ. Аналогично контрольное конъюгированное антитело к PRLRI (контроль I-DM1) лишь в несколько раз превосходило по активности H1H6958N2-DM1 во всех клеточных линиях. Незаслепленные контроли по изотипу и неконъюгированные антитела не оказывали влияния на жизнеспособность клетки.As shown in Table. 11 and 12, several anti-PRLR and DM1 antibody conjugates effectively reduced cell viability at multiple backgrounds at low IC50s as low as 100 pM. An exemplary anti-PRLR conjugated antibody, H1H6958N2-DM1, reduced the viability of prolactin receptor-expressing HEK293, PC3, and MCF7 cells with an _IC50 in the subnanomolar range of 100 to 460pM, and caused endogenous PRLR-expressing T47D cells to be killed at an _IC50 =1. 3 nM. Similarly, the control conjugated anti-PRLRI antibody (control I-DM1) was only several times more active than H1H6958N2-DM1 in all cell lines. Unblinded isotype controls and unconjugated antibodies had no effect on cell viability.

Дополнительно в клеточной линии T47D оценивали влияние лиганда рецептора пролактина, PRL, на уничтожение клеток конъюгатом PRLR-SMCC-DM1. Клетки T47D инкубировали одновременно с PRL (в концентрации 15 нМ) и либо не блокирующим антителом к PRLR (H1H6782P), либо с антителом, блокирующим рецептор (H1H6958N2). Результаты показаны в табл. 13.Additionally, in the T47D cell line, the effect of the prolactin receptor ligand, PRL, on cell killing by the PRLR-SMCC-DM1 conjugate was evaluated. T47D cells were incubated simultaneously with PRL (at a concentration of 15 nM) and either non-blocking anti-PRLR antibody (H1H6782P) or receptor blocking antibody (H1H6958N2). The results are shown in table. 13.

Таблица 13Table 13

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных антителом к PRLR и лекарственным средством DM1, в _______________присутствии лиганда PRLR (PRL)_______________Cell killing efficiency with anti-PRLR antibody and DM1 drug conjugates in _______________presence of PRLR ligand (PRL)_______________

НЕК293 HEK293 T47D T47D Обработка Treatment ICso (нМ) ICso (nM) % уничтожения % destruction 1С₅о (нМ)1C ₅ o (nM) % уничтожения % destruction Me-SS-May Свободный DM1 Me-SS-May Free DM1 0.6 0.6 94 94 0.30 0.30 100 100 Контроль изотипа-SMCC-DMl Isotype control-SMCC-DMl 100 100 78 78 300 300 94 94 Контроль изотипа-SMCC-DMl +15nMPRL Isotype control-SMCC-DMl +15nMPRL 170 170 82 82 97 97 89 89 H1H6958N2-SMCC-DM1 H1H6958N2-SMCC-DM1 90 90 88 88 1.0 1.0 100 100 H1H6958N2-SMCC-DM1 +15nMPRL H1H6958N2-SMCC-DM1+15nMPRL ПО BY 86 86 3.0 3.0 100 100 H1H6782P-SMCC-DM1 H1H6782P-SMCC-DM1 90 90 83 83 1.0 1.0 98 98 H1H6782P-SMCC-DM1 + 15пМ PRL H1H6782P-SMCC-DM1 + 15pM PRL 70 70 78 78 2.0 2.0 97 97

Как показано в табл. 13, присутствие PRL оказало лишь незначительное влияние на уничтожение клеток, опосредованное конъюгатом антитела к PRLR с лекарственным средством; наблюдалось 2-3-кратное снижение эффективности уничтожения клеток протестированными моноклональными антителами.As shown in Table. 13, the presence of PRL had only a minor effect on anti-PRLR antibody-drug-mediated cell killing; there was a 2-3 fold decrease in cell killing efficiency of the tested monoclonal antibodies.

Выполнена оценка активности конъюгированных антител к PRLR по сравнению с аналогичными конъюгированными антителами ErbB2, коэкспрессируемыми на клеточной поверхности. Оба рецептора, PRL и ErbB2, экспрессируются большинством злокачественных опухолей молочной железы, и конъюгаты, образованные антителом к ErbB2 и DM1, продемонстрировали клиническую эффективность при направленном воздействии на ErbB2(+) клетки рака молочной железы (Hurvitz et al., 2013). Контрольное антитело к ErbB2 (контроль II), конъюгированное с DM1 (контроль II-DM1), было изучено в in vitro анализе жизнеспособности клеточных линий, полученных, как описано выше. В табл. 14-17 показана эффективность уничтожения клеток конъюгированными антителами к PRLR по сравнению с конъюгированными антителами к ErbB2.The activity of conjugated antibodies to PRLR was evaluated in comparison with similar conjugated ErbB2 antibodies co-expressed on the cell surface. Both receptors, PRL and ErbB2, are expressed by most breast cancers, and anti-ErbB2 and DM1 antibody conjugates have demonstrated clinical efficacy in targeting ErbB2(+) breast cancer cells (Hurvitz et al., 2013). A control anti-ErbB2 antibody (Control II) conjugated to DM1 (Control II-DM1) was studied in an in vitro viability assay of cell lines prepared as described above. In table. 14-17 show the cell killing efficiency of anti-PRLR conjugated antibodies compared to anti-ErbB2 conjugated antibodies.

- 39 040545- 39 040545

Таблица 14Table 14

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных лекарственным средством DM1 и антителом к PRLR и лекарственным средством DM1 и антителом к ErbB2Cell killing efficiency with DM1 drug and anti-PRLR antibody and DM1 drug and anti-ErbB2 antibody conjugates

Конъюгат антитела с лекарственным средством Antibody drug conjugate 293 293 293/ЕгЬВ2 293/ErbB2 293/PRLR 293/PRLR ICso ICso % уничтожени я % destroyed ICso ICso % уничтожени я % destroyed ICso ICso % уничтожения % destruction DM1 (свободное лекарство) DM1 (free drug) 0.5 0.5 95 95 0.26 0.26 100 100 0.82 0.82 95 95 H1H6953N-DM1 (антитело к PRLR-DM1) H1H6953N-DM1 (anti-PRLR-DM1 antibody) 100 100 92 92 120 120 98 98 0.43 0.43 93 93 Контроль II-DM1 (антитело KErbB2-DMl) Control II-DM1 (antibody KErbB2-DMl) 100 100 89 89 2.0 2.0 98 98 100 100 88 88 Контроль изотипа-DMl Isotype control-DMl 150 150 86 86 ПО BY 98 98 150 150 86 86 Экспрессия PRLR PRLR expression IX IX IX IX 18Х 18X Экспрессия ЕгЬВ2 Expression of ErbB2 28Х 28X 215Х 215X 18Х 18X

Значения IC50 показаны в нМ.IC50 values are shown in nM.

Таблица 15Table 15

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных лекарственным средством DM1 и антителом к PRLR и лекарственным средством DM1 и антителом к ErbB2 (продолжение)Cell killing efficiency with DM1 drug and anti-PRLR antibody and DM1 drug and anti-ErbB2 antibody conjugates (continued)

Конъюгат антитела с лекарственным средством Antibody drug conjugate РСЗ RSH РСЗ/ЕгЬВ2 PC3/ErbB2 PC3/PRLR PC3/PRLR ICso ICso % уничтожения % destruction ICso ICso % уничтожения % destruction ICso ICso % уничтожения % destruction DM1 (свободное лекарство) DM1 (free drug) 0.44 0.44 88 88 0.42 0.42 85 85 0.24 0.24 82 82 H1H6953N-DM1 (антитело к PRLR-DM1) H1H6953N-DM1 (anti-PRLR-DM1 antibody) 100 100 80 80 80 80 73 73 0.68 0.68 76 76 Контроль II-DM1 (антитело KErbB2-DMl) Control II-DM1 (antibody KErbB2-DMl) 90 90 80 80 1.1 1.1 80 80 100 100 62 62 Контроль изотипа-DMl Isotype control-DMl 85 85 82 82 90 90 71 71 100 100 62 62 Экспрессия PRLR PRLR expression IX IX IX IX 13Х 13X Экспрессия ЕгЬВ2 Expression of ErbB2 41Х 41X 238Х 238X 31Х 31X

Значения IC₅₀ показаны в нМ.IC ₅₀ values are shown in nM.

- 40 040545- 40 040545

Таблица 16Table 16

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных лекарственным средством DM1 и антителом к PRLR и лекарственным средством DM1 и антителом к ЕгЬВ2 (продолжение)Cell killing efficiency with DM1 drug and anti-PRLR antibody and DM1 drug and anti-ErbB2 antibody conjugates (continued)

Конъюгат антитела с лекарственным средством Antibody drug conjugate T47D T47D T47D/ErbB2 T47D/ErbB2 SK-BR-3 SK-BR-3 MCF7 MCF7 ICso ICso % уничтож ения % destruction ICso ICso % уничтож ения % destruction IC50 IC50 % уничтож ения % destruction ICso ICso % уничтож ения % destruction DM1 (свободное лекарство) DM1 (free drug) 0.21 0.21 80 80 0.18 0.18 71 71 0.39 0.39 74 74 0.54 0.54 78 78 H1H6953N-DM1 (антитело к PRLRDM1) H1H6953N-DM1 (anti-PRLRDM1 antibody) 1.3 1.3 78 78 2.4 2.4 80 80 100 100 77 77 82 82 74 74 Контроль II-DM1 (антитело к ЕгЬВ2DM1) Control II-DM1 (antibody to ErbB2DM1) 100 100 59 59 1.18 1.18 81 81 0.48 0.48 81 81 80 80 68 68 Контроль изотипаDM1 DM1 isotype control 100 100 62 62 120 120 75 75 ПО BY 76 76 100 100 65 65 Экспрессия PRLR PRLR expression 12Х 12X 12Х 12X IX IX ЗХ ZX Экспрессия ЕгЬВ2 ErbB2 expression 87Х 87X 43 7Х 43 7X 600Х 600X 42Х 42X

Значения 1С₅₀ показаны в нМ.IC ₅₀ values are shown in nM.

Таблица 17Table 17

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных лекарственным средством DM1 и антителом к PRLR и лекарственным средством DM1 и антителом к ЕгЬВ2 (продолжение)Cell killing efficiency with DM1 drug and anti-PRLR antibody and DM1 drug and anti-ErbB2 antibody conjugates (continued)

Конъюгат антитела с лекарственным средством Antibody drug conjugate MCF7/PRLR MCF7/PRLR MCF/PRLR +ЕгЬВ2 MCF/PRLR + ErbB2 NCI-N87 NCI-N87 NCI-N87/PRLR NCI-N87/PRLR ICso ICso % уничтожения % destruction ICso ICso % уничтоже-ния % destruction ICso ICso % уничтоже-ния % destruction ICso ICso % уничтожения % destruction DM1 (свободное лекарство) DM1 (free drug) 1.85 1.85 79 79 0.82 0.82 77 77 0.84 0.84 95 95 1.45 1.45 98 98 H1H6953N-DM1 (антитело к PRLRDM1) H1H6953N-DM1 (anti-PRLRDM1 antibody) 0.33 0.33 76 76 0.33 0.33 77 77 90 90 83 83 2.9 2.9 94 94 Контроль II-DM1 (антитело к ЕгЬВ2DM1) Control II-DM1 (antibody to ErbB2DM1) 100 100 56 56 0.63 0.63 76 76 0.22 0.22 95 95 0.66 0.66 94 94 Контроль изотипаDM1 DM1 isotype control 150 150 61 61 100 100 70 70 90 90 85 85 85 85 88 88 Экспрессия PRLR PRLR expression 55Х 55X 55Х 55X IX IX 6Х 6X Экспрессия ЕгЬВ2 Expression of ErbB2 36Х 36X 349Х 349X 1400Х 1400X 1400Х 1400X

Значения 1С₅₀ показаны в нМ.IC ₅₀ values are shown in nM.

Конъюгаты антител к PRLR-DM1 эффективно уничтожали клетки даже при относительно низких уровнях экспрессии PRLR. Например, антитело H1H6953N-DM1 (антитело к PRLR-DM1) подавляло рост клеток T47D (с уровнем экспрессии PRLR лишь 12-кратно превышавшим фон) при 1С5о=1,3 нМ и обеспечило уничтожение 78% клеток. Это же антитело подавляло рост клеток 293/hPRLR (с уровнем экспрессии PRLR лишь 18-кратно превышавшим фон) при 1С₅₀=0,43 нМ и обеспечило уничтожение 93% клеток. Эквивалентное уничтожение клеток конъюгатом DM1 с антителом к ЕгЬВ2 (контроль II) наблюдалось только в клетках с уровнем экспрессии рецептора, 200-400-кратно превышавшим фоновый уровень (см., например, линию PC3/hErbB2 с уровнем экспрессии ЕгЬВ2, 238-кратно превышающим фоновую экспрессию, и линию T47D/hErbB2 с уровнем экспрессии ЕгЬВ2, 437-кратно превышающим фоновую экспрессию). Таким образом, эти данные указывают на способность конъюгатов, образованных антителом к PRLR и лекарственным средством, оказывать эффективное направленное воздействие и уничтожать опухолевые клетки с относительно низким уровнем экспрессии PRLR, в то время как конъюгаты, образованные антителом к ЕгЬВ2 и лекарственным средством, эффективны только против опухолей с очень высокими уровнями экспрессии ЕгЬВ2.Anti-PRLR-DM1 antibody conjugates effectively killed cells even at relatively low levels of PRLR expression. For example, the H1H6953N-DM1 antibody (an anti-PRLR-DM1 antibody) suppressed the growth of T47D cells (PRLR expression level only 12-fold higher than background) at IC5o=1.3 nM and resulted in 78% cell killing. The same antibody inhibited the growth of 293/hPRLR cells (PRLR expression level only 18-fold higher than background) at IC ₅₀ =0.43 nM and ensured the destruction of 93% of the cells. Equivalent cell killing by DM1 conjugate with anti-ErbB2 antibody (control II) was observed only in cells with the receptor expression level 200-400-fold higher than the background level (see, for example, the PC3/hErbB2 line with the ErbB2 expression level 238-fold higher than the background level). expression, and the T47D/hErbB2 line with an ErbB2 expression level 437-fold higher than background expression). Thus, these data indicate the ability of conjugates formed by an anti-PRLR antibody and a drug to effectively target and kill tumor cells with a relatively low level of PRLR expression, while conjugates formed by an antibody to ErbB2 and a drug are effective only against tumors with very high levels of ErbB2 expression.

Наконец, было выполнено сравнение активности конъюгатов антител к PRLR, связанных с DM1 через нерасщепляемый линкер SMCC, с активностью конъюгатов антител к PRLR, связанных с ММАЕ через расщепляемый линкер: mc-vc-PAB (поставщик Concortis, Сан-Диего, Калифорния). В этом эксперименте использовали клеточные линии РСЗ, PC3/hPRLR, MCF7/ATCC и MCF7/PRLR. Результаты показаны в табл. 18.Finally, the activity of anti-PRLR antibody conjugates linked to DM1 via a non-cleavable SMCC linker was compared with that of anti-PRLR antibody conjugates linked to MMAE via a cleavable linker: mc-vc-PAB (supplied by Concortis, San Diego, CA). The cell lines used in this experiment were PC3, PC3/hPRLR, MCF7/ATCC and MCF7/PRLR. The results are shown in table. 18.

-41 040545-41 040545

Таблица 18Table 18

Эффективность уничтожения клеток при использовании конъюгатов, образованных лекарственным средством и антителом к PRLRCell killing efficiency with anti-PRLR drug-antibody conjugates

PC3 PC3 PC3/hPRLR PC3/hPRLR MCF7/ATCC MCF7/ATCC MCF7/PRLR MCF7/PRLR IC₅₀ (нМ)IC ₅₀ (nM) % унич тоже НИЯ % uni too NIA IC₅o (нМ)IC ₅ o (nM) % унич тоже НИЯ % kill also NIA 1С₅₀ (нМ)1С ₅₀ (nM) % унич тоже НИЯ % kill also NIA 1С₅о (нМ)1C ₅ o (nM) % унич тоже НИЯ % kill also NIA Свободный DM1 Free DM1 0.5 0.5 90 90 1.0 1.0 70 70 3.0 3.0 80 80 1.9 1.9 86 86 Свободный ММАЕ Free MMAE 1.4 1.4 90 90 1.0 1.0 77 77 2.4 2.4 83 83 1.5 1.5 95 95 Контроль изотипа 1SMCC-DM1 Isotype control 1SMCC-DM1 95 95 79 79 100 100 79 79 100 100 71 71 100 100 76 76 Контроль изотипа 1mc-VC-PAB-MMAE Isotype control 1mc-VC-PAB-MMAE 200 200 33 33 145 145 55 55 143 143 23 23 143 143 21 21 H1H6953N-SMCC- DM1 H1H6953N-SMCC- DM1 90 90 81 81 0.4 0.4 83 83 80 80 70 70 0.1 0.1 80 80 HlH6953N-mc-VCРАВ-ММАЕ HlH6953N-mc-VCAV-MMAE 130 130 49 49 0.2 0.2 80 80 150 150 42 42 0.1 0.1 85 85 H1H6958N2-SMCC- DM1 H1H6958N2-SMCC- DM1 110 110 81 81 0.5 0.5 79 79 90 90 72 72 0.2 0.2 83 83 Hl H6958N2-mc-VCРАВ-ММАЕ Hl H6958N2-mc-VCAV-MMAE 100 100 39 39 0.5 0.5 82 82 150 150 53 53 0.2 0.2 88 88 H1H6765P-SMCC- DM1 H1H6765P-SMCC- DM1 80 80 80 80 0.3 0.3 83 83 90 90 71 71 0.1 0.1 81 81 HlH6765P-mc-VCPAB-MMAE HlH6765P-mc-VCPAB-MMAE 150 150 29 29 0.40 0.40 85 85 150 150 38 38 0.2 0.2 86 86

Как показано в табл. 18, при использовании нерасщепляемых конъюгатов с DM1 (H1H6953-SMCCDM1, H1H6958N2-SMCC-DM1 и H1H6765-SMCC-DM1) и конъюгатов с расщепляемым MMAE (H1H6953 mc vc PAB MMAE, H1H6958N2 mc VC PAB MMAE и H1H6765-mc-VC-PAB- MMAE) наблюдалось почти эквивалентное уничтожение клеток.As shown in Table. 18 when using non-cleavable DM1 conjugates (H1H6953-SMCCDM1, H1H6958N2-SMCC-DM1 and H1H6765-SMCC-DM1) and cleavable MMAE conjugates (H1H6953 mc vc PAB MMAE, H1H6958N2 mc VC PAB MMAE and H1H-6765-PAB - MMAE) almost equivalent cell killing was observed.

Были также протестированы дополнительные токсины (DM4, MeNHC3-May и MMD), конъюгированные с антителами к PRLR, в клеточных линиях T47D и MCF7/hPRLR, и результаты этих испытаний показаны в табл. 19 (уничтожение клеточных линий 293 и T47D) и 20 (уничтожение клеточных линий MCF7/ATCC и MCF7/PRLR) (ND не обнаружено).Additional toxins (DM4, MeNHC3-May and MMD) conjugated with anti-PRLR antibodies were also tested in T47D and MCF7/hPRLR cell lines and the results of these tests are shown in Table 1. 19 (destruction of cell lines 293 and T47D) and 20 (destruction of cell lines MCF7/ATCC and MCF7/PRLR) (ND not detected).

- 42 040545- 42 040545

Таблица 19Table 19

Конъюгаты, образованные антителом к PRLR и лекарственным средством способность к уничтожению клеток (клеточные линии 293 и T47D)Anti-PRLR antibody and cell killing drug conjugates (cell lines 293 and T47D)

Клеточная линия cell line 293 293 T47D T47D Антитело Antibody Линкер Linker Лекарственный препарат medicinal product IC50 нМ IC50 nM % унич тоже НИЯ % omission also NIA IC50 нМ IC50 nM % унич тоже НИЯ % omission also NIA Свободный Free DM1 (Me-SS-May) DM1 (Me-SS-May) 1.2 1.2 95 95 1.5 1.5 100 100 MMAE MMAE 0.9 0.9 100 100 1 1 100 100 DM4 DM4 0.6 0.6 100 100 0.5 0.5 100 100 MMD mmd 0.9 0.9 100 100 2 2 100 100 MeNHC3-May MeNHC3-May 60 60 90 90 90 90 100 100 Контроль изотипа I Isotype I control SMCC SMCC DM1 DM1 150 150 80 80 140 140 50 50 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE 300 300 30 thirty 300 300 20 20 MMD mmd 300 300 70 70 140 140 70 70 MeNHC3-May MeNHC3-May 300 300 30 thirty 300 300 30 thirty SPDB SPDB DM4 DM4 50 50 90 90 30 thirty 100 100 H1H6953N H1H6953N SMCC SMCC DM1 DM1 100 100 90 90 1.5 1.5 100 100 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE ND ND ND ND 1.0 1.0 80 80 MMD mmd ПО BY 70 70 1.0 1.0 90 90 MeNHC3-May MeNHC3-May 300 300 20 20 1.0 1.0 90 90 H1H6958N2 H1H6958N2 SMCC SMCC DM1 DM1 100 100 90 90 2 2 100 100 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE ND ND ND ND 1 1 90 90 SPDB SPDB DM4 DM4 ND ND ND ND 1 1 100 100 Н1Н6975Р H1H6975R SMCC SMCC DM1 DM1 80 80 90 90 2 2 100 100 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMD mmd 110 110 80 80 3 3 90 90 Н1Н6782Р H1H6782R SMCC SMCC DM1 DM1 120 120 80 80 3 3 100 100 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMD mmd 230 230 70 70 2 2 90 90 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MeNHC3-May MeNHC3-May 60 60 90 90 2 2 90 90 Н1Н6765Р H1H6765R SMCC SMCC DM1 DM1 85 85 100 100 1 1 90 90 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE ND ND ND ND 1 1 90 90

- 43 040545- 43 040545

Таблица 20Table 20

Конъюгаты, образованные антителом к PRLR и лекарственным средством способность к уничтожению клеток (клеточные линии MCF7/ATCC и MCF7/PRLR)Anti-PRLR antibody and cell killing drug conjugates (MCF7/ATCC and MCF7/PRLR cell lines)

Клеточная линия cell line MCF7/ATCC MCF7/ATCC MCF7/PRLR MCF7/PRLR Антитело Antibody Линкер Linker Лекарственный препарат medicinal product ICso нМ ICso nM % уничто жения % destruction ICso нМ ICso nM % уничт ожен ия % destroyed Свободный Free DM1 (Me-SSMay) DM1 (Me-SSMay) 1.3 1.3 80 80 0.8 0.8 80 80 MMAE MMAE 2.4 2.4 80 80 1.5 1.5 95 95 DM4 DM4 1.3 1.3 90 90 2 2 90 90 MMD mmd 2 2 90 90 0.4 0.4 90 90 MeNHC3-May MeNHC3-May 100 100 70 70 50 50 80 80 Контроль изотипа 1 Isotype 1 control SMCC SMCC DM1 DM1 300 300 60 60 150 150 70 70 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE 140 140 20 20 140 140 20 20 MMD mmd 300 300 40 40 70 70 75 75 MeNHC3-May MeNHC3-May 300 300 30 thirty 200 200 55 55 SPDB SPDB DM4 DM4 70 70 80 80 80 80 90 90 H1H6953N H1H6953N SMCC SMCC DM1 DM1 90 90 70 70 0.3 0.3 80 80 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE 150 150 40 40 0.1 0.1 85 85 MMD mmd 300 300 50 50 0.2 0.2 90 90 MeNHC3-May MeNHC3-May 150 150 60 60 0.2 0.2 80 80 H1H6958N2 H1H6958N2 SMCC SMCC DM1 DM1 70 70 70 70 0.2 0.2 80 80 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE 150 150 50 50 0.2 0.2 90 90 SPDB SPDB DM4 DM4 25 25 80 80 0.8 0.8 90 90 Н1Н6975Р H1H6975R SMCC SMCC DM1 DM1 200 200 70 70 0.2 0.2 80 80 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMD mmd 150 150 50 50 0.2 0.2 90 90 Н1Н6782Р H1H6782R SMCC SMCC DM1 DM1 250 250 70 70 0.3 0.3 80 80 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMD mmd 200 200 50 50 0.3 0.3 90 90 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MeNHC3-May MeNHC3-May 250 250 50 50 0.2 0.2 80 80 Н1Н6765Р H1H6765R SMCC SMCC DM1 DM1 150 150 70 70 0.3 0.3 90 90 mc-VC-PAB mc-VC-PAB MMAE MMAE 150 150 40 40 0.2 0.2 90 90

Все изученные конъюгаты, образованные лекарственным средством и антителом к PRLR, независимо от использованных токсина и линкера, специфично уничтожали протестированные клетки. IC50 применительно к жизнеспособности клеток T47D составляла от 0,6 до 3.4 нМ, и I_C50 применительно к жизнеспособности клеток MCF7/hPRLRIC₅₀ составляла 0,2 до 0,8 нМ.All drug-anti-PRLR antibody conjugates studied, regardless of the toxin and linker used, specifically killed the tested cells. The IC50 in relation to the viability of T47D cells ranged from 0.6 to 3.4 nM, and the _IC50 in relation to the viability of MCF7/hPRLRIC ₅₀ cells was 0.2 to 0.8 nM.

Пример 8. Конъюгаты антитела к PRLR с лекарственным средством эффективно подавляют рост опухоли in vivo.Example 8 Anti-PRLR antibody drug conjugates effectively inhibit tumor growth in vivo.

Для определения эффективности конъюгатов, образованных антителом к PRLR с лекарственным средством-DM1 в условиях in vivo, были проведены исследования на мышах со сниженным иммунитетом с ксенотрансплантатами рака молочной железы с экспрессией PRLR (PRLR+).To determine the efficacy of anti-PRLR drug-DM1 conjugates in vivo, studies were conducted in immunocompromised mice with PRLR-expressing breast cancer xenografts (PRLR+).

Вкратце клетки MCF7/PRLR (ATCCHTB-22, трансфецированные полноразмерным hPRLR, как описано ранее) в количестве 20х10⁶ были имплантировали подкожно самкам бестимусной мыши NCr в жировую ткань в левой молочной железе. В других исследованиях 10х10⁶ клеток PC3/PRLR (ATCCCRL-1435, трансфицированные полноразмерным hPRLR, как описано ранее) были имплантированы подкожно в левый бок самцов мыши SCID. Кроме того, в левый бок самок мыши CB17 SCID были подкожно имплантированы 10х10⁶ клеток родительской линии T47D (ATCCHTB-133) или 7,5х10¹⁰ клеток линии T47D#11 (ATCCHTB-133, после серийного пассирования in vivo, как описано ниже) были подкожно внедрены в левый фланг мышей CB17 SCID женского пола. Все мыши были приобретены в питомнике Taconic (Гудзон, Нью-Йорк). В дополнение к каждой порции клеток животным были введены гранулы эст- 44 040545 рогена с замедленным (90-дневным) высвобождением (1,7 мг/гранула; Innovative Research America, Сарасота, Флорида). После того как средний объем опухоли достиг 250 мм³, мыши были рандомизированы по группам по 7 животных в группе и получали конъюгаты антитела к PRLR с лекарственным средством согласно изобретению либо контрольные препараты. Контрольные препараты представляли собой носитель PBS, свободный метилдисульфид DM1 (DM1-SMe) и контроль изотипа 1-DM1.Briefly, 20 x 10 ⁶ MCF7/PRLR cells (ATCCHTB-22 transfected with full-length hPRLR as previously described) were implanted subcutaneously in female NCr Nude mice in the adipose tissue in the left mammary gland. In other studies, 10x10 ⁶ PC3/PRLR cells (ATCCCRL-1435 transfected with full-length hPRLR as described previously) were implanted subcutaneously in the left flank of male SCID mice. In addition, 10 x ^{10 6} cells of the parental T47D line (ATCCHTB-133) or 7.5 x ^{10 10} cells of the T47D#11 line (ATCCHTB-133, after serial in vivo passaging as described below) were subcutaneously implanted in the left flank of female CB17 SCID mice. injected subcutaneously into the left flank of female CB17 SCID mice. All mice were purchased from Taconic Nursery (Hudson, New York). In addition to each portion of the cells, the animals were injected with sustained (90-day) release estrogen beads (1.7 mg/bead; Innovative Research America, Sarasota, FL). After the average tumor volume reached 250 mm ³ mice were randomized into groups of 7 animals per group and received conjugates of antibodies to PRLR drug according to the invention or control drugs. Control preparations were vehicle PBS, free DM1 methyl disulfide (DM1-SMe), and isotype control 1-DM1.

В исследовании многократных доз животным вводили конъюгат один раз в неделю в течение трех недель, объемы опухоли и массу тела измеряли дважды в неделю в течение всего исследования. В исследованиях с многократным дозированием исследуемые ADC вводили в дозе 5 и/или 15 мг/кг. В исследованиях однократной дозы мышам однократно ввели дозу исследуемого ADC, объемы опухоли и массы тела проверяли дважды в неделю в течение всего исследования. В исследованиях однократной дозы исследуемые ADC вводили в дозе 1, 2.5, 5 и 15 мг/кг. Для каждой группы рассчитывали средний размер опухоли и также подавление роста опухоли относительно группы, получавшей носитель. Опухоли измеряли кронциркулем два раза в неделю, пока средний размер в группе, получавшей носитель, не достиг 1000 мм³. Размер опухоли рассчитывали по формуле (длинах ширина²)/ 2In the multiple dose study, the animals were administered the conjugate once a week for three weeks, tumor volumes and body weights were measured twice a week throughout the study. In multiple dosing studies, study ADCs were administered at 5 and/or 15 mg/kg. In single dose studies, mice were dosed once with study ADC, tumor volumes and body weights were checked twice a week throughout the study. In single dose studies, study ADCs were administered at 1, 2.5, 5, and 15 mg/kg. For each group, the mean tumor size and also tumor growth suppression were calculated relative to the vehicle group. Tumors were measured with calipers twice a week until the median size in the vehicle group reached 1000 mm ³ . Tumor size was calculated using the formula (lengths width ² )/ 2

Подавление роста опухоли рассчитывали по следующей формуле:Tumor growth suppression was calculated using the following formula:

^{(1 -((Т}конечная^-Тначальная)^/(^Сконечная^-Сначальная⁾)^{)х 100}, где T (экспериментальная группа) и C (контрольная группа) отражают среднюю массу опухоли в день, кода в группе, получавшей носитель, объем опухоли достиг 1000 мм³. ^{(1 -((T} final ^-T initial) ^/ ( ^{C final -C} initial ⁾ ) ^{) x 100} , where T (experimental group) and C (control group) reflect the average mass of the tumor per day, code in the group treated with the vehicle, the tumor volume reached 1000 mm ³ .

Животные наблюдались до дня 52. Результаты показаны в табл. 21-25 (исследование многократных доз) и табл. 26 (исследование однократной дозы). NT=не исследовано в показанном эксперименте.Animals were observed until day 52. The results are shown in table. 21-25 (study of multiple doses) and table. 26 (single dose study). NT=not tested in the experiment shown.

Таблица 21Table 21

Размер опухоли и подавление роста опухоли после многократного введения доз конъюгата, образованного антителом к PRLR и лекарственным средством, и контрольных препаратов - опухоли MCF7/PRLR (исследование № 1) (бестимусные мыши линии NCr - данные, полученные в день 52)Tumor Size and Tumor Growth Inhibition after Multiple Doses of Anti-PRLR Antibody Drug Conjugate and MCF7/PRLR Tumor Controls (Study #1) (NCr Nude Mice - Data Obtained on Day 52)

Группа Group Доза (мг/кг) Dose (mg/kg) Конечный размер опухоли мм³ (среднее значение ± СОС)Final tumor size mm ³ (mean ± SOS) Среднее подавление роста опухоли (%) Mean tumor growth suppression (%) Носитель Carrier — — 1068 ±384 1068±384 - - Свободный DM1 Free DM1 0.2 0.2 625 ±141 625±141 57 57 Контроль изотипа Ab-DMl Ab-DMl isotype control 5 5 NT NT NT NT 15 15 300 ±141 300±141 96 96 H1H6958N2 H1H6958N2 15 15 483 ± 46 483 ± 46 74 74 H1H6958N2-DM1 H1H6958N2-DM1 5 5 51 ±33 51±33 128 128 15 15 0±0 0±0 133 133 H1H6953N H1H6953N 15 15 421 ±23 421±23 79 79 H1H6953N-DM1 H1H6953N-DM1 5 5 107 ±45 107±45 120 120 15 15 0±0 0±0 133 133 H1H6975N H1H6975N 15 15 659 ±144 659±144 51 51 H1H6975N-DM1 H1H6975N-DM1 5 5 125 ±46 125±46 118 118 15 15 0±0 0±0 135 135 Н1Н6782Р H1H6782R 15 15 NT NT NT NT H1H6782P-DM1 H1H6782P-DM1 5 5 15 15 Н1Н6765Р H1H6765R 15 15 NT NT NT NT H1H6765P-DM1 H1H6765P-DM1 5 5 15 15

- 45 040545- 45 040545

Таблица 22 Размер опухоли и подавление роста опухоли после многократного введения доз конъюгата, образованного антителом к PRLR и лекарственным средством, и контрольных препаратов - опухоли MCF7/PRLR (исследование № 2) (бестимусные мыши линии NCr - данные, полученные в день 63)Table 22 Tumor Size and Tumor Growth Inhibition after Multiple Doses of Anti-PRLR Antibody Drug Conjugate and MCF7/PRLR Tumor Controls (Study #2) (NCr Nude Mice - Data Obtained on Day 63)

- 46 040545- 46 040545

Таблица 23Table 23

Размер опухоли и подавление роста опухоли после многократного введения доз конъюгата, образованного антителом к PRLR и лекарственным средством, и контрольных препаратов - опухоли PC3/PRLR (исследование № 1) (мыши линии SCID - данные, полученные в день 63)Tumor Size and Tumor Growth Suppression after Multiple Doses of Anti-PRLR Antibody Drug Conjugate and PC3/PRLR Tumor Controls (Study #1) (SCID Mice - Data Obtained on Day 63)

Группа Group Доза (мг/кг) Dose (mg/kg) Конечный размер опухоли мм³ (среднее значение ±СОС)Final tumor size mm ³ (mean ± SOS) Среднее подавление роста опухоли (%) Mean tumor growth suppression (%) Носитель Carrier — — 1311 ±257 1311±257 - - Свободный DM1 Free DM1 0.2 0.2 1361 ±120 1361±120 -5 -5 Контроль изотипа АЬDM1 ALDM1 isotype control 5 5 1379 ±128 1379±128 -7 -7 15 15 1091 ±93 1091±93 19 19 H1H6958N2 H1H6958N2 15 15 1507 ±106 1507±106 -19 -19 H1H6958N2-DM1 H1H6958N2-DM1 5 5 1247 ±171 1247±171 5 5 15 15 808 ±83 808±83 46 46 H1H6953N H1H6953N 15 15 1306±127 1306±127 0 0 H1H6953N-DM1 H1H6953N-DM1 5 5 1058 ±138 1058±138 23 23 15 15 892 ± 53 892 ± 53 39 39 H1H6975N H1H6975N 15 15 1185 ±97 1185±97 12 12 H1H6975N-DM1 H1H6975N-DM1 5 5 973 ±169 973±169 31 31 15 15 895 ± 63 895 ± 63 38 38 Н1Н6782Р H1H6782R 15 15 NT NT NT NT H1H6782P-DM1 H1H6782P-DM1 5 5 15 15 Н1Н6765Р H1H6765R 15 15 NT NT NT NT H1H6765P-DM1 H1H6765P-DM1 5 5 15 15

- 47 040545- 47 040545

Таблица 24Table 24

Размер опухоли и подавление роста опухоли после многократного введения доз конъюгата, образованного антителом к PRLR и лекарственным средством, и контрольных препаратов - опухоли PC3/PRLR (исследование № 2) (мыши линии SCID - данные, полученные в день 55)Tumor size and tumor growth inhibition after multiple doses of anti-PRLR antibody drug conjugate and PC3/PRLR tumor controls (study #2) (SCID mice - data obtained on day 55)

Группа Group Доза (мг/кг) Dose (mg/kg) Конечный размер опухоли мм³ (среднее значение ±СОС)Final tumor size mm ³ (mean ±SOS) Среднее подавление роста опухоли (%) Mean tumor growth suppression (%) Носитель Carrier - - 1222 ±99 1222±99 0 0 Свободный DM1 Free DM1 0.2 0.2 1147 ±59 1147±59 7 7 Контроль изотипа АЬ- DM1 Isotype control AL- DM1 5 5 1052±101 1052±101 16 16 15 15 1049 ±127 1049±127 16 16 H1H6958N2 H1H6958N2 15 15 917 ±253 917±253 28 28 H1H6958N2-DM1 H1H6958N2-DM1 5 5 566 ± 63 566 ± 63 61 61 15 15 230 ± 22 230±22 94 94 H1H6953N H1H6953N 15 15 NT NT NT NT H1H6953N-DM1 H1H6953N-DM1 5 15 5 15 H1H6975N H1H6975N 15 15 NT NT NT NT H1H6975N-DM1 H1H6975N-DM1 5 15 5 15 Н1Н6782Р H1H6782R 15 15 1154±212 1154±212 6 6 H1H6782P-DM1 H1H6782P-DM1 5 5 490 ± 63 490 ± 63 69 69 15 15 321 ±33 321±33 85 85

- 48 040545- 48 040545

Таблица 25Table 25

Размер опухоли и подавление роста опухоли после многократного введения доз конъюгата, образованного антителом к PRLR и лекарственным средством, и контрольных препаратов - опухоли T47D#11 (мыши линии SCID - данные, полученные в день 66)Tumor Size and Tumor Growth Inhibition after Multiple Doses of Anti-PRLR Antibody Drug Conjugate and T47D#11 Tumor Controls (SCID Mice - Data Obtained on Day 66)

Группа Group Доза (мг/кг) Dose (mg/kg) Конечный размер опухоли мм³ (среднее значение ±СОС)Final tumor size mm ³ (mean ±SOS) Среднее подавление роста опухоли (%) Mean tumor growth suppression (%) Носитель Carrier — — 1234 ±88 1234±88 0 0 Свободный DM1 Free DM1 0.2 0.2 1433 ±23 1433±23 -19 -19 Контроль изотипа АЬ- DM1 Isotype control AL- DM1 5 5 1340±176 1340±176 -9 -9 15 15 1678 ±67 1678±67 -42 -42 H1H6958N2 H1H6958N2 15 15 1259 ±122 1259±122 -3 -3 H1H6958N2-DM1 H1H6958N2-DM1 5 5 168 ± 19 168 ± 19 102 102 15 15 44 ±5 44±5 112 112 H1H6953N H1H6953N 15 15 NT NT NT NT H1H6953N-DM1 H1H6953N-DM1 5 5 15 15 H1H6975N H1H6975N 15 15 NT NT NT NT H1H6975N-DM1 H1H6975N-DM1 5 5 15 15 Н1Н6782Р H1H6782R 15 15 1537 ±111 1537±111 -29 -29 H1H6782P-DM1 H1H6782P-DM1 5 5 293 ± 20 293 ± 20 90 90 15 15 124 ±36 124±36 106 106 Н1Н6765Р H1H6765R 15 15 1278 ±164 1278±164 -3 -3 H1H6765P-DM1 H1H6765P-DM1 5 5 183 ±28 183±28 100 100 15 15 69 ± 12 69 ± 12 111 111

Таблица 26Table 26

Размер опухоли и подавление роста опухоли после введения однократной дозы конъюгата, образованного антителом к PRLR и лекарственным средством, и контрольных препаратов - опухоли MCF7/PRLR (дан____________________ные, полученные в день 55)____________________Tumor size and tumor growth inhibition after administration of a single dose of Anti-PRLR Antibody Drug Conjugate and MCF7/PRLR Tumor Controls (Data obtained on Day 55)____________________

Группа Group Доза (мг/кг) Dose (mg/kg) Конечный размер опухоли мм³ (среднее значение ± СОС)Final tumor size mm ³ (mean ± SOS) Среднее подавление роста опухоли (%) Mean tumor growth suppression (%) Носитель Carrier __ __ 710 ±249 710±249 0 0 Контроль изотипа Ab-DMl Ab-DMl isotype control 15 15 514 ±86 514±86 38 38 H1H6958N2 H1H6958N2 15 15 703 ±160 703±160 1 1 H1H6958N2-1 H1H6958N2-1 1 1 274 ±142 274±142 86 86 H1H6958N2-1 H1H6958N2-1 2.5 2.5 172 ±53 172±53 109 109 H1H6958N2-1 H1H6958N2-1 5 5 107 ±26 107±26 120 120 H1H6958N2-1 H1H6958N2-1 15 15 33 ±23 33±23 136 136

Обсуждение.Discussion.

В этом примере первоначально была выполнена оценка способности 5 иллюстративных к PRLR, конъюгированных с DM1, уменьшать объем опухолей MCF7/PRLR и PC3/PRLR в исследованиях с многократным введением доз. В первом исследовании многократных доз (табл. 21) антитела H1H6958N2-DM1,In this example, the ability of 5 exemplary DM1-conjugated PRLRs to shrink MCF7/PRLR and PC3/PRLR tumors was initially evaluated in multiple dose studies. In the first multiple dose study (Table 21), the H1H6958N2-DM1 antibody,

- 49 040545- 49 040545

H1H6953N-DM1 и H1H6975N-DM1 в обеих дозах, 5 и 15 мг/кг, эффективно подавляли рост опухоли MCF7/PRLR. При введении в самой высокой дозе все три антитела, конъюгированные с DM1, уменьшили опухоли до необнаружимого уровня, причем выраженное в процентах уменьшение объема опухоли составило приблизительно 133-135%. Этот результат был воспроизведен во втором исследовании многократных доз (табл. 22), в котором антитело H1H6958N2-DM1 тестировали параллельно с двумя дополнительными иллюстративными антителами к PRLR, конъюгированными с DM1: H1H6782P и H1H6765P. В этом втором исследовании рост опухоли тоже снизился до необнаружимого уровня после назначения самой высокой дозы 15 мг/кг, причем выраженное в процентах уменьшение объема опухоли составило приблизительно 136-137%. Хотя лечение неконъюгированными антителами к PRLR привело к умеренному уменьшению объема опухоли (на 17-79%) по сравнению с группой, получавшей носитель, наибольшее подавление размеров опухоли наблюдалось в группах, получавших конъюгаты антитела с лекарственным средством.H1H6953N-DM1 and H1H6975N-DM1 at both doses of 5 and 15 mg/kg effectively inhibited MCF7/PRLR tumor growth. When administered at the highest dose, all three DM1-conjugated antibodies shrank tumors to an undetectable level, with a percentage reduction in tumor volume of approximately 133-135%. This result was replicated in a second multiple dose study (Table 22) in which the H1H6958N2-DM1 antibody was tested in parallel with two additional exemplary DM1-conjugated anti-PRLR antibodies: H1H6782P and H1H6765P. In this second study, tumor growth also decreased to an undetectable level after administration of the highest dose of 15 mg/kg, with a percentage reduction in tumor volume of approximately 136-137%. Although treatment with unconjugated anti-PRLR antibodies resulted in a modest reduction in tumor volume (17-79%) compared to the vehicle group, the greatest suppression of tumor size was observed in the antibody drug conjugate groups.

Затем противоопухолевую эффективность этих же иллюстративных антител к PRLR, конъюгированных с DM1, оценивали в исследованиях многократных доз на мышах с ксенотрансплантатами PC3/PRLR, экспрессирующими PRLR (табл. 23 и 24). После того как опухоли росли в течение 21 дня, проводилось лечение мышей. Все антитела: H1H6958N2-DM1, H1H6953N-DM1 и H1H6975N-DM1 обеспечивали подавление роста опухоли, наиболее выраженное после применения в самой высокой дозе 15 мг/кг (табл. 23). Противоопухолевый эффект наблюдался также во втором исследовании, в котором антитело H1H6958N2-DM1 исследовали параллельно с антителами H1H6765P-DM1 и H1H6782P-DM1 после 15-дневного роста опухоли. После введения в самой высокой дозе степень подавления опухоли в разных исследованиях составляла от 8 до 98% (табл. 24). По сравнению с этими данными контроль изотипа, конъюгированный с DM1, обеспечивал подавление опухоли лишь на 16%, причем конечные объемы опухоли не различались значимо от объемов опухоли у контрольных животных, получавших носитель.The antitumor efficacy of the same exemplary DM1-conjugated anti-PRLR antibodies was then evaluated in multiple dose studies in mice with PRLR-expressing PC3/PRLR xenografts (Tables 23 and 24). After the tumors had grown for 21 days, the mice were treated. All antibodies: H1H6958N2-DM1, H1H6953N-DM1 and H1H6975N-DM1 provided suppression of tumor growth, most pronounced after application at the highest dose of 15 mg/kg (Table 23). An antitumor effect was also observed in a second study in which the H1H6958N2-DM1 antibody was tested in parallel with the H1H6765P-DM1 and H1H6782P-DM1 antibodies after 15 days of tumor growth. After administration at the highest dose, tumor suppression rates ranged from 8% to 98% in different studies (Table 24). Compared to these data, the DM1-conjugated isotype control provided only 16% tumor suppression, with end-point tumor volumes not significantly different from tumor volumes in vehicle-treated controls.

Дальнейшая оценка конъюгатов антитела PRLR с лекарственным препаратом, которые вводили многократно в дозах 5 и 15 мг/кг, проводилась на мышах с ксенотрансплантатами T47D#11, эндогенно экспрессирующими рецептор пролактина (табл. 25). Как и в других моделях опухоли лечение начинали, когда размер опухоли составил в среднем 200 мм³. Результаты, полученные в этой модели опухоли, согласуются с более ранними результатами и убедительно демонстрируют противоопухолевую активность антител к PRLR, конъюгированных с DM1. Например, конъюгаты H1H6958N2-DM1, H1H6765P-DM1 и H1H6782P-DM1 в дозах 5 и 15 мг/кг эффективно подавляли рост опухоли. Конъюгаты антител к PRLR-DM1 в дозе 5 мг/кг подавляли опухоль на 89-100%, тогда как эти же конъюгаты в дозе 15 мг/кг подавляли рост опухоли на 106-112%. Важно отметить, что неконъюгированные антитела к PRLR не обладали противоопухолевой эффективностью в этой эндогенной модели опухоли, что указывает на значение конъюгирования с DM1 в возникновении противоопухолевой эффективности. Кроме того, эффективность конъюгатов антитела к PRLR с лекарственным средством была высокоспецифичной, так как контрольные конъюгаты с лекарственным препаратом не влияли на рост опухоли.Further evaluation of PRLR antibody drug conjugates administered multiple times at doses of 5 and 15 mg/kg was performed in mice with T47D#11 xenografts endogenously expressing the prolactin receptor (Table 25). As in other tumor models, treatment was started when the tumor size averaged 200 mm ³ . The results obtained in this tumor model are consistent with earlier results and strongly demonstrate the antitumor activity of DM1-conjugated anti-PRLR antibodies. For example, conjugates H1H6958N2-DM1, H1H6765P-DM1 and H1H6782P-DM1 at doses of 5 and 15 mg/kg effectively suppressed tumor growth. Conjugates of antibodies to PRLR-DM1 at a dose of 5 mg/kg suppressed the tumor by 89-100%, while the same conjugates at a dose of 15 mg/kg suppressed tumor growth by 106-112%. Importantly, unconjugated anti-PRLR antibodies did not have antitumor efficacy in this endogenous tumor model, indicating the importance of DM1 conjugation in generating antitumor efficacy. In addition, the efficacy of anti-PRLR antibody drug conjugates was highly specific, as control drug conjugates had no effect on tumor growth.

В последнем примере H1H6958N2, конъюгат антитела к PRLR с DM1, оценивали у мышей с ксенотрансплантатами MCF7/PRLR в исследовании однократной дозы (табл. 26). Как и в исследованиях многократных доз, перед тем как ввести однократную дозу, ожидали увеличения размера опухолей приблизительно до 200 мм³. В этом исследовании конъюгат H1H6958N2-DM1 вводили в дозах 1, 2.5, 5 и 15 мг/кг. Как показано в табл. 26, в том исследовании наблюдался дозозависимый противоопухолевый эффект в широком диапазоне доз. Противоопухолевым эффектом обладали все изученные дозы, причем доза 1 мг/кг вызывала значимое уменьшение объема опухоли относительно опухолей у животных из контрольной группы, получавших носитель. Далее, хотя контроль изотипа I-DM1 в дозе 15 мг/кг контроль изотипаIn the last example, H1H6958N2, an anti-PRLR antibody DM1 conjugate, was evaluated in MCF7/PRLR xenograft mice in a single dose study (Table 26). As in the multiple dose studies, tumors were expected to increase in size to approximately 200 mm ³ before a single dose was administered. In this study, the H1H6958N2-DM1 conjugate was administered at doses of 1, 2.5, 5, and 15 mg/kg. As shown in Table. 26, a dose-dependent antitumor effect was observed in that study over a wide range of doses. All doses studied had an antitumor effect, with a dose of 1 mg/kg causing a significant reduction in tumor volume relative to tumors in vehicle control animals. Further, although I-DM1 isotype control at 15 mg/kg isotype control

I-DM1 тоже обладал некоторым противоопухолевым эффектом (подавление роста опухоли ~38%), конъюгат антитела к PRLR-DM1 в дозах 2,5 мг/кг, и обеспечивал значимое уменьшение объема опухоли (все изученные дозы выше 1 мг/кг вызывали подавление роста опухоли на >100%). Противоопухолевая эффективность однократных доз 5 и 15 мг/кг была сопоставимой с наблюдавшейся после многократного введения соответствующих доз, что иллюстрирует активность конъюгата антитела к PRLR-DM1.I-DM1 also had some antitumor effect (suppression of tumor growth ~38%), anti-PRLR-DM1 conjugate at doses of 2.5 mg/kg, and provided a significant reduction in tumor volume (all studied doses above 1 mg/kg caused growth suppression tumors by >100%. The antitumor efficacy of single doses of 5 and 15 mg/kg was comparable to that observed after repeated administration of the respective doses, illustrating the activity of the anti-PRLR-DM1 antibody conjugate.

В заключение этот пример иллюстрирует, что конъюгаты антитела к PRLR согласно настоящему изобретению являлись сильнодействующими ингибиторами роста опухоли и в различных протестированных моделях опухоли оказались способны уменьшать размер опухоли до необнаружимого уровня.In conclusion, this example illustrates that the anti-PRLR antibody conjugates of the present invention were potent inhibitors of tumor growth and, in various tumor models tested, were able to reduce tumor size to an undetectable level.

Пример 9. Конъюгаты антител к цитокиновым рецепторам класса I с лекарственным средством, эффективно уничтожающие клеточные линии с низким уровнем экспрессии антигена-мишени.Example 9 Class I Cytokine Receptor Antibodies Drug Conjugates Efficiently Killing Cell Lines with Low Levels of Target Antigen Expression.

Как обсуждалось в настоящем документе, конъюгаты антитела к PRLR с лекарственным средством эффективно уничтожают клеточные линии, экспрессирующие рецептор пролактина, включая линии с относительно низким уровнем экспрессии антигена-мишени. Как отмечалось выше, рецептор пролактина принадлежит к семейству цитокиновых рецепторов класса I, включающему IL-4R и IL-6R. Подобно рецептору пролактина, IL-4R и IL-6R являются односторонними трансмембранными рецепторами; IL-4RAs discussed herein, anti-PRLR antibody drug conjugates are effective in killing cell lines expressing the prolactin receptor, including lines with relatively low levels of expression of the target antigen. As noted above, the prolactin receptor belongs to the family of class I cytokine receptors, including IL-4R and IL-6R. Like the prolactin receptor, IL-4R and IL-6R are one-way transmembrane receptors; IL-4R

- 50 040545 участвует в передаче сигнала IL-4 и IL-13, в то время как IL-6R участвует в передаче сигнала IL-6 через совместный комплекс с рецептором gp130. Для дополнительного подтверждения общей концепции о том, что ADC с направленным воздействием на цитокиновые рецепторы класса I могут использоваться для эффективного уничтожения клеток, включая клетки с низким уровнем экспрессии антигена-мишени, была выполнена оценка конъюгатов, образованных лекарственных средством и антителами к IL-4R и IL-6R, на предмет способности уничтожать клетки.- 50 040545 is involved in IL-4 and IL-13 signaling, while IL-6R is involved in IL-6 signaling through a co-complex with the gp130 receptor. To further confirm the general concept that ADCs targeting class I cytokine receptors can be used to effectively kill cells, including cells with low levels of expression of the target antigen, conjugates formed by the drug and anti-IL-4R antibodies were evaluated and IL-6R for cell killing ability.

Вначале была выполнена количественная оценка антигенов на поверхности клеток с эндогенной или рекомбинантной экспрессией IL-4R или IL-6R методом FACS. Вкратце приблизительно 1 млн клеток KG-1 (IL-4R+), HEK293/IL-4R и Ramos (IL-6R+) инкубировали в присутствии иллюстративных антител к IL-4R (H4H083P2; см. патент США № 7608693) и антител к IL-6R (W6A9-5; см. патент США № 7582298) в течение 30 мин на льду. После промывки добавляли PE, конъюгированный с вторичными антителами к человеческим антителам в концентрации 10 мкг/мл на 30 мин с последующей второй промывкой, затем образцы анализировали на цитометре AccuriC6 (BD) с программным обеспечением FlowJo (TreeStar, Inc., Ашленд, Орегон). Результаты, отражающие относительную экспрессию IL-4R и IL-6R на клеточной поверхности, рассчитывали как среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), превышавшую уровень контроля изотипа. Уровни экспрессии показаны в табл. 27.First, antigens were quantified on the surface of cells with endogenous or recombinant expression of IL-4R or IL-6R by FACS. Briefly, approximately 1 million KG-1 (IL-4R+), HEK293/IL-4R and Ramos (IL-6R+) cells were incubated in the presence of exemplary anti-IL-4R antibodies (H4H083P2; see US Pat. No. 7,608,693) and anti-IL- 6R (W6A9-5; see US Pat. No. 7,582,298) for 30 minutes on ice. After washing, PE conjugated with secondary antibodies to human antibodies at a concentration of 10 μg/ml was added for 30 min, followed by a second wash, then the samples were analyzed on an AccuriC6 cytometer (BD) with FlowJo software (TreeStar, Inc., Ashland, Oregon). The results, reflecting the relative expression of IL-4R and IL-6R on the cell surface, were calculated as the mean fluorescence intensity (MFI) above the isotype control level. The expression levels are shown in table. 27.

Таблица 27Table 27

Относительная экспрессия IL-4R и IL-6R на поверхности клеток в клеточных линиях с эндогенной или рекомбинантной экспрессиейRelative cell surface expression of IL-4R and IL-6R in cell lines with endogenous or recombinant expression

IL-4R и IL-6RIL-4R and IL-6R

Уровень экспрессии в клеточной линии; кратность по сравнению с фоном The level of expression in the cell line; multiplicity compared to the background Экспрессия рецептора Receptor expression НЕК293 HEK293 НЕК293/ IL4R HEK293/ IL4R KG-1 KG-1 Ramos Ramos IL-4R IL-4R 2 2 50 50 1 1 4 4 IL-6R IL-6R 1 1 1 1 7 7 1 1

Как показано в табл. 27, клетки HEK293 и Ramos эндогенно экспрессировали IL-4R на уровне, 2- и 4-кратно превышавшем фоновые значения соответственно, в то время как уровень экспрессии IL-4R в инженерной клеточной лини HEK293/IL-4R более чем 50-кратрно превышал фоновые значения. Экспрессия IL-4R не была выявлена по сравнению с фоновым значением В клеточной линии KG-1 экспрессия IL-4R не превышала фоновые значения. В клеточной линии KG-1, но не в линиях Ramos или HEK293, уровень экспрессии IL-6R 7-кратно превышал фоновые значения.As shown in Table. 27, HEK293 and Ramos cells endogenously expressed IL-4R at levels 2- and 4-fold higher than background, respectively, while IL-4R expression in the engineered HEK293/IL-4R cell line was more than 50-fold higher than background. values. IL-4R expression was not detected compared to background In the KG-1 cell line, IL-4R expression did not exceed background values. In the KG-1 cell line, but not in the Ramos or HEK293 lines, the expression level of IL-6R was 7-fold higher than background values.

Далее были получены конъюгаты иллюстративных антител к IL-4R (H4H083P2) и к IL-6R (W6A9-5) антитела с цитотоксическим препаратом, DM1, и выполнена количественная оценка цитотоксичности конъюгатов. Вкратце клетками, принадлежащими к линиям HEK293/IL-4R, Ramos или KG-1, а также к родительской линии HEK293, засевали 96-луночные планшеты с покрытием PDL, по 1500-10000 клеток на лунку. К клеткам добавляли конъюгаты или свободный DM1 (в форме метилдисульфидного производного DM1-SMe) до конечных концентраций от 300 нМ до 15 пМ и инкубировали в течение 3 суток. В течение последних 1-3 ч клетки инкубировали в присутствии CCK8 (Dojindo, Роквилль, Мэриленд) и определяли оптическую плотность при длине волны 450 нМ (OD₄₅₀) на приборе Flexstation3 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Из значений, полученных для всех лунок, вычитали фоновые значения OD450, полученные для клеток, обработанных дигитонином (40 нМ), и жизнеспособность клеток выражали в процентах от значений, полученных для необработанных контрольных образцов. Для определения значений IC50 использовали 4-параметрическое логистическое уравнение и построенную по 10 точкам кривую ответа (GraphPad Prism). Результаты представлены в табл. 28.The exemplary anti-IL-4R (H4H083P2) and anti-IL-6R (W6A9-5) antibodies were then conjugated to the cytotoxic drug, DM1, and the cytotoxicity of the conjugates was quantified. Briefly, cells belonging to the HEK293/IL-4R, Ramos, or KG-1 lines, as well as the HEK293 parental line, were seeded in 96-well PDL-coated plates at 1500-10000 cells per well. Conjugates or free DM1 (in the form of DM1-SMe methyl disulfide derivative) were added to cells to final concentrations from 300 nM to 15 pM and incubated for 3 days. For the last 1-3 hours, cells were incubated in the presence of CCK8 (Dojindo, Rockville, MD) and absorbance was determined at 450 nM (OD ₄₅₀ ) on a Flexstation3 instrument (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Baseline OD450 values obtained from cells treated with digitonin (40 nM) were subtracted from the values obtained for all wells, and cell viability was expressed as a percentage of the values obtained from untreated controls. IC50 values were determined using a 4-parameter logistic equation and a 10-point response curve (GraphPad Prism). The results are presented in table. 28.

- 51 040545- 51 040545

Таблица 28 Способность конъюгатов, образованных лекарственным средством и антителом к IL4R или IL6R, к уничтожению клеток, принадлежащих к клеточным линиям, экспрессирующим IL4R и IL-6RTable 28 Ability of anti-IL4R or IL6R drug-antibody conjugates to kill cells belonging to cell lines expressing IL4R and IL-6R

Конъюгат антитела с лекарственным средством Antibody drug conjugate НЕК293 HEK293 НЕК293/ ЬП dD HEK293/ LP dD KG-1 KG-1 Ramos Ramos IC50 (нМ) IC50 (nM) % уничт ожен ИЯ % destroyed IC50 (нМ) IC50 (nM) % унич тоже НИЯ % kill also NIA IC50 (нМ) IC50 (nM) % унич тоже НИЯ % kill also NIA IC50 (нМ) IC50 (nM) % уничт ожен ИЯ % destroyed DM1 (свободное лекарство) DM1 (free drug) 0.27 0.27 100 100 0.33 0.33 98 98 1.26 1.26 89 89 0.34 0.34 100 100 Контроль изотипа-DMl Isotype control-DMl 70 70 89 89 по By 91 91 100 100 74 74 60 60 91 91 Конъюгат антитела к IL-4RHDM1 Antibody conjugate to IL-4RHDM1 80 80 91 91 0.22 0.22 95 95 90 90 83 83 18 18 91 91 Конъюгат антитела к IL-6R и DM1 Antibody conjugate to IL-6R and DM1 100 100 88 88 70 70 92 92 38 38 77 77 70 70 94 94

Уровни экспрессии рецепторов: кратность относительно контроля изотипаReceptor expression levels: fold relative to isotype control

IL-4RIL-4R

IL-6R тIL-6R t

Как показано в табл. 28, конъюгаты, образованные антителом к IL-4R и DM1, снижали жизнеспособность клеток Ramos при IC₅₀ 18 нМ, хотя экспрессия IL-4R на поверхности клеток лишь 4-крано превышала фоновые значения. Конъюгаты, образованные антителом к IL-4R и DM1, снижали жизнеспособность клеток HEK293/IL-4R с высоким уровнем экспрессии IL-4R при IC₅₀=0,22 нМ. Конъюгат антитела к IL-4R с DM1 оказывал умеренное, но воспроизводимое влияние на жизнеспособность клеток KG-1 (с уровнем экспрессии IL-6R, 7-кратно превышающим фоновые значения) при IC₅₀ 3 8 нМ по сравнению с IC₅₀ 100 нМ, измеренной для эквивалентного конъюгата, образованного контролем изотипа и лекарст венным средством.As shown in Table. 28, anti-IL-4R and DM1 antibody conjugates reduced the viability of Ramos cells with an IC ₅₀ of 18 nM, although IL-4R expression on the cell surface was only 4-fold higher than background values. Conjugates formed by antibody to IL-4R and DM1, reduced the viability of HEK293/IL-4R cells with a high level of expression of IL-4R at IC ₅₀ =0.22 nm. The anti-IL-4R antibody-DM1 conjugate had a modest but reproducible effect on the viability of KG-1 cells (with an IL-6R expression level 7-fold higher than background values) at an IC ₅₀ of 3 8 nM compared to an IC ₅₀ of 100 nM measured for the equivalent conjugate formed by the isotype control and the drug.

В итоге данный пример демонстрирует, что конъюгаты, образованные антителами к IL-4R или IL6R антител и лекарственным средством, продемонстрировали выраженную и воспроизводимую цитотоксичность даже в отношении клеточных линий с умеренным уровнем экспрессии рецепторов. Этот результат аналогичен результату, полученному для конъюгата, образованного антителом к PRLR и лекарственным средством, где эффективное уничтожение клеток было достигнуто даже в отношении клеточных линий с низким уровнем экспрессии PRLR (см., например, пример 7 в настоящем документе). Таким образом, данный пример дополнительно подтверждает концепцию изобретения, согласно которой конъюгаты, образованные лекарственным средством и антителом к цитокиновым рецепторам класса I, в целом могут являться эффективными терапевтическими агентами, направленными против клеточных линий и опухолей, экспрессирующих цитокиновые рецепторы класса I, даже при низком уровне экспрессии.In summary, this example demonstrates that anti-IL-4R or IL6R antibodies and drug conjugates exhibited marked and reproducible cytotoxicity even against cell lines with moderate levels of receptor expression. This result is similar to that obtained with an anti-PRLR antibody drug conjugate, where effective cell killing was achieved even for cell lines with low PRLR expression (see, for example, Example 7 herein). Thus, this example further supports the concept of the invention, according to which conjugates formed by a drug and an antibody to class I cytokine receptors, in general, can be effective therapeutic agents directed against cell lines and tumors expressing class I cytokine receptors, even at low levels. expression.

Объем настоящего изобретения не ограничивается описанными в настоящем документе частными вариантами осуществления. В действительности различные модификации изобретения в дополнение к описанным в настоящем документе должны быть очевидны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания и рисунков. Такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.The scope of the present invention is not limited to the particular embodiments described herein. Indeed, various modifications of the invention in addition to those described herein should be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and drawings. Such modifications are within the scope of the appended claims.

Claims (40)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые связываются с экспрессируемым на клеточной поверхности рецептором пролактина (PRLR) человека и блокируют сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих PRLR человека, отличающиеся тем, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержат определяющий комплементарность участок тяжелой цепи (HCDR)-1 с последовательностью SEQ ID NO: 292;1. An isolated antibody or antigen-binding antibody fragment that binds to the cell surface-expressed human prolactin receptor (PRLR) and blocks the signaling pathway involving prolactin in cells expressing human PRLR, characterized in that the antibody or antigen-negative antibody fragment contains a complementarity-determining region of severe chain (HCDR)-1 with the sequence of SEQ ID NO: 292; HCDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 294;HCDR2 with the sequence of SEQ ID NO: 294; HCDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 296, и включают определяющий комплементарность участок легкой цепи (LCDR)-1 с последовательностью SEQ ID NO: 300;HCDR3 with the sequence of SEQ ID NO: 296, and include the light chain complementarity determining region (LCDR)-1 with the sequence of SEQ ID NO: 300; LCDR2 с последовательностью SEQ ID NO: 302; иLCDR2 with SEQ ID NO: 302; And LCDR3 с последовательностью SEQ ID NO: 304.LCDR3 with SEQ ID NO: 304. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п.1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела блокируют сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспресси-2. An antibody or antigen-binding antibody fragment according to claim 1, wherein the antibody or antigen-binding antibody fragment blocks a signaling pathway involving prolactin in cells expressing - 52 040545 рующих PRLR человека, с IC₅₀ меньше, чем приблизительно 600 пМ.- 52 040545 human PRLRs with an IC ₅₀ less than about 600 pM. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п.1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела блокируют сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих PRLR человека, с IC₅₀ меньше, чем приблизительно 400 пМ.3. The antibody or antigen-negative antibody fragment of claim 1, wherein the antibody or antigen-negative antibody fragment blocks prolactin signaling in cells expressing human PRLR with an IC ₅₀ of less than about 400 pM. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п.1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела блокируют сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих PRLR человека, с IC₅₀ меньше, чем приблизительно 200 пМ.4. The antibody or antigen-negative antibody fragment of claim 1, wherein the antibody or antigen-negative antibody fragment blocks prolactin signaling in cells expressing human PRLR with an IC ₅₀ of less than about 200 pM. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п.1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела блокируют сигнальный путь с участием пролактина в клетках, экспрессирующих PRLR человека, с IC50 меньше, чем приблизительно 40 пМ.5. The antibody or antigen-negative antibody fragment of claim 1, wherein the antibody or antigen-negative antibody fragment blocks prolactin signaling in cells expressing human PRLR with an IC50 of less than about 40 pM. 6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по п.1, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) с последовательностью SEQ ID NO: 290; и вариабельную область легкой цепи (LCVR), с последовательностью SEQ ID NO: 298.6. The antibody or antigennegative fragment of the antibody according to claim 1, where the antibody or antigennegative fragment of the antibody contain a heavy chain variable region (HCVR) with the sequence of SEQ ID NO: 290; and light chain variable region (LCVR), with the sequence of SEQ ID NO: 298. 7. Конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC), предназначенный для ингибирования роста опухолевых клеток на опухолевых клетках, экспрессирующих PRLR, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.1-6, конъюгированные с цитотоксическим агентом.7. An antibody drug conjugate (ADC) for inhibiting tumor cell growth on tumor cells expressing PRLR, comprising the antibody or antigen-binding antibody fragment of any one of claims 1 to 6 conjugated to a cytotoxic agent. 8. Конъюгат по п.7, где цитотоксический агент является майтанозиноидом.8. The conjugate of claim 7 wherein the cytotoxic agent is a maytanosinoid. 9. Конъюгат по п.8, где майтанзиноид является DM1, DM4 или производным этих соединений.9. The conjugate of claim 8 wherein the maytansinoid is DM1, DM4 or a derivative thereof. 10. Конъюгат по п.8 или 9, где майтанзиноид конъюгирован с антителом через расщепляемый линкер.10. The conjugate of claim 8 or 9, wherein the maytansinoid is conjugated to the antibody via a cleavable linker. 11. Конъюгат по п.8 или 9, где майтанзиноид конъюгирован с антителом через нерасщепляемый линкер.11. The conjugate of claim 8 or 9, wherein the maytansinoid is conjugated to the antibody via a non-cleavable linker. 12. Конъюгат по п.7, где цитотоксический агент выбирают из группы, включающей 1-(2-хлорэтил)1,2-диметансульфонил гидразид, 1,8-дигидрокси-бицикло[7.3.1]тридека-4,9-диен-2,6-диин-13-он, 1-дегидротестостерон, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, 9-аминокамптотецин, актиномицин D, аманитин, аминоптерин, ангуидин, антрациклин, антрамицин (AMC), ауристатин, блеомицин, бусульфан, масляную кислоту, калихемицин, камптотецин, карминомицин, кармустин, цемадотин, цисплатин, колхицин, комбретастатин, циклофосфамид, цитарабин, цитохаласин В, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, диацетоксипентилдоксорубицин, дибромоманнитол, дигидроксиантрациндион, дизоразол, доластатин, доластатин 10, доксорубицин, дуокармицин, эхиномицин, элеутеробин, эметин, эпотилон, эсперамицин, эстрамустин, этидия бромид, этопозид, фторурацил, гелданамицин, грамицидин D, глюкокортикоид, иринотекан, ингибитор кинезина веретена деления (KSP), лептомицин, лейрозин, лидокаин, ломустин (CCNU), мехлорэтамин, мелфалан, меркаптопурин, метоптерин, метотрексат, митрамицин, митомицин, митоксантрон, N8-ацетилспермидин, подофиллотоксин, прокаин, пропранолол, птеридин, пуромицин, пирролобензодиазепин (PBD), ризоксин, стрептозотоцин, таллисомицин, таксол, тенопозид, тетракаин, тиоэпахлорамбуцил, томаимицин, топотекан, тубульсин, винбластин, винкристин, виндезин, винорельбин.12. The conjugate of claim 7 wherein the cytotoxic agent is selected from the group consisting of 1-(2-chloroethyl)1,2-dimethanesulfonyl hydrazide, 1,8-dihydroxy-bicyclo[7.3.1]trideca-4,9-diene 2,6-diin-13-one, 1-dehydrotestosterone, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, 9-aminocamptothecin, actinomycin D, amanitin, aminopterin, anguidin, anthracycline, anthramycin (AMC), auristatin, bleomycin, busulfan, butyric acid, calichemiacin, camptothecin, carminomycin, carmustine, cemadotin, cisplatin, colchicine, combretastatin, cyclophosphamide, cytarabine, cytochalasin B, dactinomycin, daunorubicin, decarbazine, diacetoxypentyldoxorubicin, dibromomannitol, dihydroxyanthracindione, disorazole, dolastatin, dolastatin, dolastatin , echinomycin, eleuterobine, emetine, epothilone, esperamycin, estramustine, ethidium bromide, etoposide, fluorouracil, geldanamycin, gramicidin D, glucocorticoid, irinotecan, spindle kinesin inhibitor (KSP), leptomycin, leurosine, lidocaine, lomustine (CCNU), mechlorethamine, melphalan, merk Aptopurine, Metopterin, Methotrexate, Mithramycin, Mitomycin, Mitoxantrone, N8-Acetylspermidine, Podophyllotoxin, Procaine, Propranolol, Pteridine, Puromycin, PBD, Risoxin, Streptozotocin, Tallisomycin, Taxol, Tenoposide, Tetracaine, Thioepachlorambucil, Tomaimicanum , vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine. 13. Конъюгат по любому из пп.7-12, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела конъюгированы с цитотоксическим агентом через линкер, содержащий MC (6-малеимидокапроил), MP (малеимидопропаноил), вал-цит (валин-цитрулиин), вал-ала (валин-аланин), дипептид, расщепляемый протеазой, ала-фен (аланин-фенилаланин), PAB (п-аминобензилоксикарбонил), SPP (N-сукциниимидил 4-(2-пиридилтио)пентаноат), SMCC (N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1карбоксилат), SIAB (N-сукцинимидил (4-йод-ацетил)аминобензоат).13. The conjugate according to any one of claims 7-12, where the antibody or antigen-binding fragment of the antibody is conjugated to a cytotoxic agent through a linker containing MC (6-maleimidocaproyl), MP (maleimidopropanoyl), val-cyte (valine-citrulline), val-ala (valine-alanine), protease-cleavable dipeptide, ala-phen (alanine-phenylalanine), PAB (p-aminobenzyloxycarbonyl), SPP (N-succiniimidyl 4-(2-pyridylthio)pentanoate), SMCC (N-succinimidyl 4-( N-maleimidomethyl)cyclohexane-1carboxylate), SIAB (N-succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate). 14. Конъюгат по п.8 или 9, где майтанзиноид конъюгирован с антителом или с его антигенсвязывающим фрагментом через линкер, представляющий собой N-сукцинимидил 4-(N-мαлеимидометил)циклогексан-1карбоксилат (SMCC).14. The conjugate of claim 8 or 9, wherein the maytansinoid is conjugated to the antibody or its antigen-binding fragment via a linker which is N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1carboxylate (SMCC). 15. Применение конъюгата по любому из пп.7-14 для уничтожения клеток с низким уровнем экспрессии PRLR на клеточной поверхности.15. Use of a conjugate according to any one of claims 7 to 14 to kill cells with a low level of PRLR expression on the cell surface. 16. Применение по п.15, где клетки являются опухолевыми клетками.16. Use according to claim 15, wherein the cells are tumor cells. 17. Применение по п.16, где клетки являются клетками опухоли молочной железы.17. Use according to claim 16, wherein the cells are breast tumor cells. 18. Применение по любому из пп.15-17, где опухолевые клетки экспрессируют менее 1 млн копий рецептора пролактина на клетку.18. Use according to any one of claims 15-17, wherein the tumor cells express less than 1 million copies of the prolactin receptor per cell. 19. Применение по п.18, где опухолевые клетки экспрессируют между 10000 и 500000 копий рецептора пролактина на клетку.19. Use according to claim 18, wherein the tumor cells express between 10,000 and 500,000 copies of the prolactin receptor per cell. 20. Применение выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из пп.1-6 для лечения рака, экспрессирующего PRLR или зависимого от сигнального пути с участием пролактина.20. The use of an isolated antibody or an antigen-binding antibody fragment according to any one of claims 1 to 6 for the treatment of cancer expressing PRLR or dependent on a signaling pathway involving prolactin. 21. Применение по п.20, где рак выбирают из группы, включающей почечноклеточную карциному, карциному поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак предстательной железы, злокачественную глиому, остеосаркому, рак толстой и прямой кишки, рак желудка, злокачественную мезотелиому, мно-21. Use according to claim 20, wherein the cancer is selected from the group consisting of renal cell carcinoma, pancreatic carcinoma, head and neck cancer, prostate cancer, malignant glioma, osteosarcoma, colon and rectal cancer, gastric cancer, malignant mesothelioma, multiple - 53 040545 жественную миелому, рак яичника, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, синовиальную саркому, рак щитовидной железы, рак молочной железы и меланому.- 53 040545 female myeloma, ovarian cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, synovial sarcoma, thyroid cancer, breast cancer and melanoma. 22. Применение по п.21, где рак является раком молочной железы.22. Use according to claim 21, wherein the cancer is breast cancer. 23. Применение по любому из пп.20-22 для ингибирования или уменьшения роста опухоли.23. Use according to any one of claims 20-22 for inhibiting or reducing tumor growth. 24. Применение выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из пп.1-6 для in vitro или ex vivo диагностики рака, экспрессирующего PRLR или зависимого от сигнального пути с участием пролактина.24. The use of an isolated antibody or an antigen-binding antibody fragment according to any one of claims 1 to 6 for in vitro or ex vivo diagnosis of cancer expressing PRLR or dependent on a signaling pathway involving prolactin. 25. Применение по п.24, где рак выбирают из группы, включающей почечноклеточную карциному, карциному поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак предстательной железы, злокачественную глиому, остеосаркому, рак толстой и прямой кишки, рак желудка, злокачественную мезотелиому, множественную миелому, рак яичника, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, синовиальную саркому, рак щитовидной железы, рак молочной железы и меланомы.25. Use according to claim 24, wherein the cancer is selected from the group consisting of renal cell carcinoma, pancreatic carcinoma, head and neck cancer, prostate cancer, malignant glioma, osteosarcoma, colon and rectal cancer, gastric cancer, malignant mesothelioma, multiple myeloma , ovarian cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, synovial sarcoma, thyroid cancer, breast cancer and melanoma. 26. Применение по п.25, где рак является раком молочной железы.26. Use according to claim 25, wherein the cancer is breast cancer. 27. Фармацевтическая композиция, включающая выделенное антитело, или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.1-6, или конъюгат по любому из пп.7-14, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель для уничтожения опухолей или уменьшения роста опухоли.27. A pharmaceutical composition comprising an isolated antibody, or an antigen-binding antibody fragment according to any one of claims 1-6, or a conjugate according to any one of claims 7-14, and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent for killing tumors or reducing tumor growth. 28. Фармацевтическая композиция по п.27, где опухоль выбирают из группы, включающей опухоль почки, опухоль поджелудочной железы, опухоль головы и шеи, опухоль молочной железы, опухоль предстательной железы, опухоль толстой кишки, опухоль желудочно-кишечного тракта, опухоль яичников, опухоль легкого и опухоль кожи.28. The pharmaceutical composition according to claim 27, wherein the tumor is selected from the group consisting of kidney tumor, pancreatic tumor, head and neck tumor, breast tumor, prostate tumor, colon tumor, gastrointestinal tumor, ovarian tumor, tumor lung and skin tumor. 29. Фармацевтическая композиция по п.28, где опухоль представляет собой опухоль молочной железы.29. The pharmaceutical composition of claim 28, wherein the tumor is a breast tumor. 30. Применение конъюгата по любому из пп.7-14 для лечения рака, экспрессирующего PRLR или зависимого от сигнального пути с участием пролактина.30. The use of a conjugate according to any one of claims 7 to 14 for the treatment of cancer expressing PRLR or dependent on a signaling pathway involving prolactin. 31. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают рецептор пролактина (PRLR) и блокируют опосредованный пролактином сигнальный путь в клетках, экспрессирующих PRLR человека, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три определяющих комплементарность участка (CDR) в вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 290; и три определяющих комплементарность участка в вариабельной области легкой цепи (LCVR) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 298.31. An isolated antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the prolactin receptor (PRLR) and blocks prolactin-mediated signaling in cells expressing human PRLR, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof contains three complementarity-determining regions (CDRs) in the heavy chain variable region ( HCVR) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 290; and three complementarity determining regions in the light chain variable region (LCVR) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 298. 32. Конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC), содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают рецептор пролактина (PRLR) человека, при этом антитело или его фрагмент конъюгированы с цитотоксическим агентом, где ADC ингибирует рост экспрессирующих PRLR клеток, а антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три определяющих комплементарность участка (CDR) в вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 290; и три определяющих комплементарность участка в вариабельной области легкой цепи (LCVR) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 298.32. An antibody drug conjugate (ADC) comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds the human prolactin receptor (PRLR), wherein the antibody or fragment thereof is conjugated to a cytotoxic agent, wherein the ADC inhibits the growth of PRLR-expressing cells and the antibody or its antigen-binding fragment contains three complementarity-determining regions (CDRs) in the heavy chain variable region (HCVR) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 290; and three complementarity determining regions in the light chain variable region (LCVR) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 298. 33. Конъюгат по п.7, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую SEQ ID NO: 290, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую SEQ ID NO: 298.33. The conjugate of claim 7, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region (HCVR) comprising SEQ ID NO: 290 and a light chain variable region (LCVR) comprising SEQ ID NO: 298. 34. Конъюгат по п.12, где цитотоксическим агентом является ауристатин.34. The conjugate of claim 12 wherein the cytotoxic agent is auristatin. 35. Конъюгат по п.7, который уничтожает экспрессирующие PRLR клетки с уровнем экспрессии, менее чем в 30 раз превышающим фоновый уровень.35. The conjugate of claim 7 which kills PRLR-expressing cells at an expression level less than 30 times background. 36. Конъюгат по п.7, который уничтожает экспрессирующие PRLR клетки с уровнем экспрессии, менее чем в 20 раз превышающим фоновый уровень.36. The conjugate of claim 7 which kills PRLR-expressing cells at an expression level less than 20 times background. 37. Конъюгат по п.7, который уничтожает экспрессирующие PRLR клетки с уровнем экспрессии, более чем в 12 раз, но менее чем в 30 раз превышающим фоновый уровень.37. The conjugate of claim 7 which kills PRLR-expressing cells at an expression level greater than 12 times but less than 30 times background. 38. Применение конъюгата по п.7 при изготовлении лекарственного средства для уничтожения клеток с низким уровнем экспрессии PRLR человека на клеточной поверхности, при этом конъюгат содержит антитело к PRLR или его антигенсвязывающий фрагмент.38. Use of the conjugate according to claim 7 in the manufacture of a medicament for killing cells with a low level of human PRLR expression on the cell surface, wherein the conjugate contains an anti-PRLR antibody or an antigen-binding fragment thereof. 39. Применение конъюгата по п.7 при изготовлении лекарственного средства для лечения рака.39. The use of the conjugate according to claim 7 in the manufacture of a drug for the treatment of cancer. 40. Применение по п.39, где раком является рак молочной железы.40. Use according to claim 39, wherein the cancer is breast cancer.