EA040482B1

EA040482B1 - HUMANIZED ANTIBODY FOR TREATMENT OR PREVENTION OF COGNITIVE DISORDERS, METHOD FOR ITS PRODUCTION AND AGENT FOR TREATMENT OR PREVENTION OF COGNITIVE DISORDERS WITH ITS USE

Info

Publication number: EA040482B1
Application number: EA201991726
Authority: EA
Inventors: Хироси Эгути; Такаси МУРАКАМИ; Наоко Намики; Акира ТАНОКУРА; Джинн Э. Бейкер; Баттёр Софи Парментье; Анжела Мари Яблонски; Даниэль Стивен Малашок; Карл Мечковски; Гопалан Рагхунатхан (рагху)
Original assignee: Тэидзин Фарма Лимитед; Мерк Шарп И Доум Корп.
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2022-06-09

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross-references to related applications

Данная заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Японии № 2017/035594, поданной февраля 2017 г., содержание которой включено посредством ссылки в полном объеме.This application claims priority from Japanese Patent Application No. 2017/035594, filed February 2017, the contents of which are incorporated by reference in their entirety.

Перечень последовательностейSequence listing

Данная заявка содержит перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 27 февраля 2018 г., называется 063785-06-5002-WO-SeqLstg-_ST25.txt и имеет размер 323584 байт.This application contains a sequence listing filed electronically in ASCII format and incorporated herein in its entirety by reference. The specified ASCII copy created on February 27, 2018 is named 063785-06-5002-WO-SeqLstg-_ST25.txt and is 323584 bytes in size.

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу для применения при терапевтическом или профилактическом лечении когнитивных расстройств, способу получения гуманизированного антитела, терапевтическому или профилактическому агенту от когнитивных расстройств, в котором используется указанное антитело, и способам лечения или предотвращения когнитивных расстройств с помощью терапевтических агентов, раскрытых в данном документе. Более конкретно, данное изобретение относится к новому гуманизированному антителу против фосфорилированного тау-белка, обладающему превосходным эффектом улучшения когнитивной функции, способу получения гуманизированного антитела, терапевтическому или профилактическому агенту от когнитивных расстройств, содержащему гуманизированное антитело, и способам лечения или предотвращения когнитивных расстройств с помощью гуманизированных антител против фосфорилированного тау-белка.The present invention relates to a humanized antibody for use in the therapeutic or prophylactic treatment of cognitive disorders, a method for producing a humanized antibody, a therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders that uses the specified antibody, and methods for treating or preventing cognitive disorders using therapeutic agents disclosed in this document. More specifically, the present invention relates to a novel humanized anti-phosphorylated tau antibody having an excellent effect of improving cognitive function, a method for producing a humanized antibody, a therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders containing a humanized antibody, and methods for treating or preventing cognitive disorders using humanized antibodies against phosphorylated tau protein.

Уровень техникиState of the art

Когнитивное расстройство или слабоумие представляет собой состояние, при котором развитый интеллект ухудшается по какой-то приобретенной причине, что приводит к затруднениям с социальной адаптацией. Когнитивные расстройства классифицируются как нейродегенеративные заболевания, сосудистые когнитивные заболевания, прионные заболевания, инфекционные заболевания, метаболические/эндокринные заболевания, травматические и церебральные хирургические заболевания и токсические заболевания (см. Toshifumi Kishimoto & Shigeki Takahashi (edit.), STEP Series Seishinka (Японский документ), 2th edition, Kaibashobo, 2008, p. 103-104). По состоянию на 2010 г. в Японии насчитывалось около 2,1 млн пациентов с деменцией, при этом показатель распространенности заболеваемости составлял от 8 до 10% или даже более 10% среди пожилых людей старше 65 лет, и это было признано серьезной проблемой во всемирном стареющем обществе (Takashi Asada, Igaku no Ayumi (Японский документ), supplementary volume, Cognitive disorders, Ishiyaku Publishing, 2011, p. 5-10). Данные об основных заболеваниях когнитивных расстройств показывают, что большинство из них являются нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера (БА) и лобно-височная лобарная дегенерация (ЛВЛД), при этом около 35% являются БА, около 15% являются комбинацией БА и цереброваскулярного заболевания и 5% являются ЛВЛД (Id.) Когнитивные расстройства, связанные с нейродегенеративными заболеваниями, характеризуются незаметным ухудшением памяти и/или изменениями личности, которое прогрессирует в течение по меньшей мере шести месяцев или более. Нейродегенеративные процессы сильно коррелируют со степенью нарушения когнитивной функции, а связанные с ними системные характеристики представляют собой наличие нейрофибриллярных клубков (NFT) (Alistair Burns et al. (edit.), Dementia, 3rd edition, 2005, CRC Press, p. 408-464).Cognitive impairment or dementia is a condition in which a developed intellect deteriorates for some acquired reason, resulting in difficulties with social adaptation. Cognitive disorders are classified as neurodegenerative diseases, vascular cognitive diseases, prion diseases, infectious diseases, metabolic/endocrine diseases, traumatic and cerebral surgical diseases, and toxic diseases (see Toshifumi Kishimoto & Shigeki Takahashi (edit.), STEP Series Seishinka (Japanese document) , 2nd edition, Kaibashobo, 2008, pp. 103-104). As of 2010, there were about 2.1 million patients with dementia in Japan, with a prevalence of 8 to 10% or even more than 10% among older people over 65, and this has been recognized as a major problem in the global aging society (Takashi Asada, Igaku no Ayumi (Japanese paper), supplementary volume, Cognitive disorders, Ishiyaku Publishing, 2011, p. 5-10). Data on the underlying diseases of cognitive disorders show that most of them are neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and frontotemporal lobar degeneration (FTLD), with about 35% being AD, about 15% being a combination of AD and cerebrovascular disease and 5% are CVLD (Id.) Cognitive disorders associated with neurodegenerative diseases are characterized by insidious memory impairment and/or personality changes that progress over a period of at least six months or more. Neurodegenerative processes are highly correlated with the degree of cognitive impairment, and associated systemic characteristics are the presence of neurofibrillary tangles (NFTs) (Alistair Burns et al. (edit.), Dementia, 3rd edition, 2005, CRC Press, p. 408-464 ).

Тау-белок представляет собой белок, кодируемый геном МАРТ, который находится на хромосоме 17 (17q21) в геноме человека. Тау-белок является одним из белков, связывающих микротрубочки, в избытке экспрессируемых в центральной нервной системе. Было обнаружено, что тау является основным составляющим белком в парных спиральных филаментах и прямых филаментах, образующих NFT при БА, одном из наиболее выраженных нейродегенеративных заболеваний, а его внутриклеточное накопление было продемонстрировано при различных невропатологических состояниях.Tau protein is a protein encoded by the MART gene, which is located on chromosome 17 (17q21) in the human genome. Tau is one of the microtubule-binding proteins overexpressed in the central nervous system. Tau has been found to be the major constituent protein in paired helical filaments and straight filaments that form NFTs in AD, one of the most prominent neurodegenerative diseases, and its intracellular accumulation has been demonstrated in a variety of neuropathological conditions.

Тау был впервые связан с нейродегенеративными заболеваниями на основании связи между мутациями в гене МАРТ и накоплением тау при лобно-височной деменции с паркинсонизмом, сцепленной с хромосомой 17 (FTDP-17). Сообщалось о более чем 40 генных мутациях в гене МАРТ в отношении FTDP-17 (Tetsuaki Arai, Shinkei Naika (Японский документ), vol.72, special number, (suppl. 6), 2010, p. 46-51). Предполагается, что эти генные мутации изменяют соотношения между изоформами тау или изменяют структуру и изменяют взаимодействие между мутантным тау и микротрубочками, способствуя тем самым развитию патологии. Однако в отличие от наследственных нейродегенеративных заболеваний мутации в МАРТ редко наблюдаются при спорадических нейродегенеративных заболеваниях, таких как БА. Кроме того, тау, накопленный при нейродегенеративных заболеваниях, характеризуется высокой степенью модификации путем фосфорилирования. Кроме того, у пациентов с легкими когнитивными нарушениями (MCI) наблюдается корреляция между уровнем фосфорилированного тау в спинномозговой жидкости и степенью атрофии гипофиза, что позволяет предположить, что фосфорилированный тау является высоконадежным биомаркером нейродегенерации у пациентов с таупатией (Wendy Noble et al., Expert Opinion on Drug Discovery, 2011, vol. 6, № 8, p. 797-810). На основании этих результатов были предприняты попытки разработать лечение с использованием ингибиторов против киназ, которые являются ферментами, участвующими в фосфорилировании, и, в частности, против бета GSK-3, для ингиби- 1 040482 рования избыточного фосфорилирования тау (Id). Однако стоит вопрос о возможных побочных эффектах, поскольку киназы, такие как бета GSK-3, участвуют не только в патологических состояниях, но и в регуляции функций в нормальных физиологических процессах. Фактически, некоторые сайты, в которых тау фосфорилируется с помощью бета GSK-3, совпадают с сайтами фосфорилирования тау, наблюдаемыми в эмбриональном и нормальном мозге человека (Burnes et. al. выше), что указывает на возможность того, что эта стратегия может влиять на нормальную функцию тау.Tau was first associated with neurodegenerative diseases based on the association between mutations in the MART gene and tau accumulation in chromosome 17-linked frontotemporal dementia with parkinsonism (FTDP-17). More than 40 gene mutations have been reported in the MART gene for FTDP-17 (Tetsuaki Arai, Shinkei Naika (Japanese document), vol. 72, special number, (suppl. 6), 2010, p. 46-51). These gene mutations are thought to alter the ratios between tau isoforms or alter the structure and alter the interaction between the mutant tau and microtubules, thereby contributing to the development of pathology. However, unlike in inherited neurodegenerative diseases, mutations in MART are rarely seen in sporadic neurodegenerative diseases such as AD. In addition, tau accumulated in neurodegenerative diseases is highly modified by phosphorylation. In addition, in patients with mild cognitive impairment (MCI), there is a correlation between the level of phosphorylated tau in the cerebrospinal fluid and the degree of pituitary atrophy, suggesting that phosphorylated tau is a highly reliable biomarker of neurodegeneration in patients with tauopathy (Wendy Noble et al., Expert Opinion on Drug Discovery, 2011, vol. 6, no. 8, pp. 797-810). Based on these results, attempts have been made to develop treatment using inhibitors against kinases, which are enzymes involved in phosphorylation, and in particular against GSK-3 beta, to inhibit excessive tau (Id) phosphorylation. However, there is the question of possible side effects, since kinases such as beta GSK-3 are involved not only in pathological conditions, but also in the regulation of functions in normal physiological processes. In fact, some of the sites at which tau is phosphorylated by GSK-3 beta coincide with the tau phosphorylation sites seen in human embryonic and normal brains (Burnes et. al. supra), suggesting that this strategy may influence the normal tau function.

Хотя считалось, что происхождение внеклеточного тау связано с утечкой из дегенерированных нервных клеток в результате гибели клеток, недавние исследования показали, что после избыточного внутриклеточного фосфорилирования тау процессируется, а затем активно секретируется из клетки. Считается, что фосфорилированный тау, секретируемый из клетки, дефосфорилируется в определенных сайтах фосфорилирования и впоследствии действует на мускариновые рецепторы M1 и М3 окружающих клеток, что приводит к различным эффектам, таким как стимулирование внутриклеточного фосфорилирования тау и содействие гибели клеток (Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry, 2010, vol. 285, № 42, p. 32539-32548; и Venessa Plouffe et al., PLoS ONE, 2012, vol. 7, p. 36873). Сообщалось об экспериментах, связанных с иммунотерапией таупатий с использованием тау-белка в качестве мишени, как попытках, направленных на выполнение специфического действия против тау (см. Noble выше, Kishimoto выше, Asada выше и Burns выше).Although the origin of extracellular tau was thought to be related to leakage from degenerated nerve cells as a result of cell death, recent studies have shown that after excessive intracellular phosphorylation, tau is processed and then actively secreted from the cell. It is believed that phosphorylated tau secreted from the cell is dephosphorylated at specific phosphorylation sites and subsequently acts on the M1 and M3 muscarinic receptors of surrounding cells, resulting in various effects such as stimulating intracellular tau phosphorylation and promoting cell death (Miguel Diaz-Hernandes et al. ., Journal of Biological Chemistry, 2010, vol.285, no.42, pp.32539-32548 and Venessa Plouffe et al., PLoS ONE, 2012, vol.7, p.36873). Experiments involving immunotherapy of taupathies using tau as a target have been reported as attempts to perform a specific action against tau (see Noble supra, Kishimoto supra, Asada supra, and Burns supra).

Основными симптомами когнитивных расстройств человека являются ухудшение памяти и нарушение когнитивных функций, что особенно важно с учетом роли когнитивной функции в способности к суждению, коммуникации и исполнению на основе памяти. С другой стороны, моторная функция, хотя она и является симптомом, характерным для лобно-височной деменции с паркинсонизмом, сцепленной с хромосомой 17 (FTDP-17), и болезни Альцгеймера в терминальной стадии, не обязательно является основным симптомом, проявляющимся при когнитивных расстройствах. Следовательно, основной проблемой, которую следует учитывать при лечении когнитивных расстройств, является улучшение когнитивных функций. При этом в настоящее время существуют подходящие животные модели для исследования нарушений когнитивной функции, связанных с таупатией, которые позволили бы идентифицировать терапевтический или профилактический агент для лечения когнитивных расстройств. Кроме того, не существует такого агента, который проявлял бы специфические и превосходные эффекты против когнитивных расстройств.The main symptoms of human cognitive disorders are memory impairment and impairment of cognitive functions, which is especially important given the role of cognitive function in the ability to judge, communicate and perform based on memory. On the other hand, motor function, although a symptom characteristic of chromosome 17-linked frontotemporal dementia with parkinsonism (FTDP-17) and end-stage Alzheimer's disease, is not necessarily the main symptom present in cognitive disorders. Therefore, the main problem to be considered in the treatment of cognitive disorders is the improvement of cognitive functions. At the same time, suitable animal models for the study of cognitive impairment associated with tauopathy currently exist, which would allow the identification of a therapeutic or prophylactic agent for the treatment of cognitive disorders. In addition, there is no such agent that would show specific and superior effects against cognitive disorders.

В связи с терапевтическими и профилактическими применениями против когнитивных расстройств у людей существует потребность в гуманизированном антителе против фосфорилированного тау-белка, которое не только обладает высокой аффинностью связывания с фосфорилированным тау, но также проявляет пониженную антигенность для организма человека.In connection with therapeutic and prophylactic applications against cognitive disorders in humans, there is a need for a humanized anti-phosphorylated tau antibody that not only has high binding affinity for phosphorylated tau, but also exhibits reduced antigenicity in humans.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

На этом фоне среди большого числа фосфорилированных сайтов в тау-белке, которые могут подвергаться аномальному фосфорилированию в условиях болезни Альцгеймера, авторы данного изобретения сосредоточились на фосфорилированном сайте остатка серина в положении 413 (Ser413) и преуспели в получении поликлонального антитела кролика и моноклонального антитела мыши, которые являются специфичными к Ser413-фосфорилированному тау. Авторы данного изобретения также вводили моноклональные антитела мыши модельным мышам с когнитивными расстройствами, которые демонстрировали аномальную экспрессию фосфорилированных тау-белков, и подтвердили, что наблюдалось улучшение когнитивных функций (WO 2013/180238 A).Against this background, among the large number of phosphorylated sites in the tau protein that may undergo abnormal phosphorylation in the setting of Alzheimer's disease, the inventors of the present invention focused on the phosphorylated site of the serine residue at position 413 (Ser413) and succeeded in obtaining a rabbit polyclonal antibody and a mouse monoclonal antibody, which are specific for Ser413-phosphorylated tau. The present inventors also administered mouse monoclonal antibodies to cognitively impaired model mice that showed abnormal expression of phosphorylated tau proteins and confirmed that cognitive improvement was observed (WO 2013/180238 A).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к белкам, таким как антитела, которые содержат антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с тау-белком, который является фосфорилированным по остатку серина 413 (pS413-тау). В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие белки. В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложены клетки, которые содержат такие нуклеиновые кислоты, кодирующие белки. В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложены способы лечения таупатии (например, болезни Альцгеймера) путем введения нуждающемуся в этом пациенту белков, нуклеиновых кислот или клеток, описанных в данном документе.In some embodiments, the invention relates to proteins, such as antibodies, that contain an antigen-binding portion that specifically binds to a tau protein that is phosphorylated at serine 413 (pS413-tau). In some embodiments, the present invention provides nucleic acids encoding proteins. In some embodiments, the present invention provides cells that contain such nucleic acids encoding proteins. In some embodiments, the invention provides methods for treating tauopathy (eg, Alzheimer's disease) by administering to a patient in need thereof the proteins, nucleic acids, or cells described herein.

Соответственно в некоторых аспектах изобретение относится к гуманизированному антителу или его фрагменту или производному, которое вызывает реакцию антиген-антитело с тау-белком или таупептидом, фосфорилированным по меньшей мере в аминокислотном остатке, соответствующем Ser413 SEQ ID NO: 1. В некоторых случаях гуманизированное антитело или его фрагмент или производное имеет равновесную константу диссоциации, равную 1,86x10’8 М или менее, для тау-белка или тау-пептида.Accordingly, in some aspects, the invention provides a humanized antibody, or fragment or derivative thereof, that elicits an antigen-antibody reaction with a tau protein or taupeptide phosphorylated at least at the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1. In some instances, a humanized antibody or its fragment or derivative has an equilibrium dissociation constant of 1.86x10'8 M or less for a tau protein or tau peptide.

В дополнительных аспектах гуманизированное антитело или его фрагмент или производное имеет улучшенную селективную аффинность с фосфорилированным тау-белком (или тау-пептидом, например SEQ ID NO: 8) по сравнению с нефосфорилированным тау-белком (или тау-пептидом, например SEQ ID NO: 69).In additional aspects, a humanized antibody or fragment or derivative thereof has improved selective affinity for a phosphorylated tau protein (or tau peptide, e.g. SEQ ID NO: 8) compared to a non-phosphorylated tau protein (or tau peptide, e.g. SEQ ID NO: 69).

В дополнительном аспекте гуманизированное антитело или его фрагмент или производное, описанные в данном документе, обладают улучшенной способностью проникать в мозг при введении в кровь.In a further aspect, a humanized antibody, or fragment or derivative thereof, described herein has an improved ability to enter the brain when administered into the blood.

В дополнительном аспекте гуманизированное антитело или его фрагмент или производное содер- 2 040482 жат следующие CDR:In a further aspect, the humanized antibody or fragment or derivative thereof contains the following CDRs:

в качестве последовательности CDR-H1 аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более гомологии с последовательностью 1М;as the sequence of CDR-H1, an amino acid sequence having 80% or more homology with the 1M sequence;

в качестве последовательности CDR-H2 аминокислотную последовательность, имеющую 84% или более гомологии с последовательностью 2М или 2Н1;as a sequence of CDR-H2, an amino acid sequence having 84% or more homology with a 2M or 2H1 sequence;

в качестве последовательности CDR-H3 аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более гомологии с последовательностью 3М;as the sequence of CDR-H3, an amino acid sequence having 80% or more homology with the 3M sequence;

в качестве последовательности CDR-L1 аминокислотную последовательность, имеющую 87% или более гомологии с последовательностью 4L1 или 4М;as a sequence of CDR-L1, an amino acid sequence having 87% or more homology with a 4L1 or 4M sequence;

в качестве последовательности CDR-L2 аминокислотную последовательность, имеющую 85% или более гомологии с последовательностью 5М; и в качестве последовательности CDR-L3 аминокислотную последовательность, имеющую 77% или более гомологии с последовательностью 6М.as the sequence of CDR-L2, an amino acid sequence having 85% or more homology with the 5M sequence; and as a CDR-L3 sequence, an amino acid sequence having 77% or more homology with the 6M sequence.

В дополнительном аспекте гуманизированное антитело или его фрагмент или производное содержат следующие CDR:In an additional aspect, the humanized antibody or fragment or derivative thereof contains the following CDRs:

в качестве последовательности CDR-H1 аминокислотную последовательность последовательности 1М;as the sequence of CDR-H1, the amino acid sequence of the sequence 1M;

в качестве последовательности CDR-H2 аминокислотную последовательность последовательности 2Н1 или аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности 2Н1 тем, что Ala в положении 15 заменен на Asp;as the sequence of CDR-H2, the amino acid sequence of the 2H1 sequence or an amino acid sequence that differs from the 2H1 sequence in that Ala at position 15 is replaced by Asp;

в качестве последовательности CDR-H3 аминокислотную последовательность последовательности 3М;as the sequence of CDR-H3, the amino acid sequence of the 3M sequence;

в качестве последовательности CDR-L1 аминокислотную последовательность последовательности 4L1 или аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности 4L1 тем, что Ser в положении 5 заменен на Asn;as a sequence of CDR-L1, an amino acid sequence of a 4L1 sequence or an amino acid sequence that differs from the 4L1 sequence in that Ser at position 5 is replaced by Asn;

в качестве последовательности CDR-L2 аминокислотную последовательность последовательности 5М; и в качестве последовательности CDR-L3 аминокислотную последовательность последовательности 6М.as the sequence of CDR-L2, the amino acid sequence of the sequence 5M; and as a CDR-L3 sequence, the amino acid sequence of the 6M sequence.

В дополнительном аспекте гуманизированное антитело или его фрагмент или производное имеют следующие CDR:In a further aspect, a humanized antibody, or fragment or derivative thereof, has the following CDRs:

(1) в качестве последовательности CDR-H1 аминокислотную последовательность 1М;(1) as a sequence of CDR-H1 amino acid sequence 1M;

в качестве последовательности CDR-H2 аминокислотную последовательность 2Н1;as the sequence of CDR-H2, the amino acid sequence of 2H1;

в качестве последовательности CDR-H3 аминокислотную последовательность 3М;as the sequence of CDR-H3, the amino acid sequence of 3M;

в качестве последовательности CDR-L1 аминокислотную последовательность 4L1;as the sequence of CDR-L1, the amino acid sequence of 4L1;

в качестве последовательности CDR-L2 аминокислотную последовательность 5М; и в качестве последовательности CDR-L3 аминокислотную последовательность 6М, или (2) в качестве последовательности CDR-H1 аминокислотную последовательность 1М;as the sequence of CDR-L2 amino acid sequence 5M; and as the sequence of CDR-L3, the amino acid sequence of 6M, or (2) as the sequence of CDR-H1, the amino acid sequence of 1M;

в качестве последовательности CDR-L1 аминокислотную последовательность 4М;as the sequence of CDR-L1 amino acid sequence 4M;

в качестве последовательности CDR-L2 аминокислотную последовательность 5М; и в качестве последовательности CDR-L3 аминокислотную последовательность 6М, или (3) в качестве последовательности CDR-H1 аминокислотную последовательность 1М;as the sequence of CDR-L2 amino acid sequence 5M; and as the sequence of CDR-L3, the amino acid sequence of 6M, or (3) as the sequence of CDR-H1, the amino acid sequence of 1M;

в качестве последовательности CDR-H2 аминокислотную последовательность 2М;as the sequence of CDR-H2 amino acid sequence 2M;

в качестве последовательности CDR-L2 аминокислотную последовательность 5М; и в качестве последовательности CDR-L3 аминокислотную последовательность 6М.as the sequence of CDR-L2 amino acid sequence 5M; and as the sequence of CDR-L3, the amino acid sequence of 6M.

В дополнительных аспектах гуманизированное антитело или его фрагмент или производное содержат в качестве вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более гомологии с последовательностью, выбранной из последовательностей VH11, VH12, VH47, VH61, VH62, VH64 и VH65; и в качестве вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более гомологии с последовательностью, выбранной из последовательностей VL15, VL36, VL46, VL47, VL48 и VL50.In additional aspects, the humanized antibody or fragment or derivative thereof comprises, as a heavy chain variable region, an amino acid sequence having 90% or more homology with a sequence selected from the sequences VH11, VH12, VH47, VH61, VH62, VH64, and VH65; and as a light chain variable region, an amino acid sequence having 90% or more homology with a sequence selected from the sequences of VL15, VL36, VL46, VL47, VL48 and VL50.

В дополнительном аспекте гуманизированное антитело или его фрагмент или производное содержат в качестве вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность последовательности VH65 или аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности VH65 включением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из замены Ala на Thr в положении 28 (нумерация Rabat: Н28), замены Asn на Ser в положении 30 (нумерация Rabat: H30), замены Val на Gly в положении 49 (нумерация Rabat: H49), замены Ala на Asp в положении 64 (нумерация Rabat:In a further aspect, the humanized antibody or fragment or derivative thereof comprises, as a heavy chain variable region, an amino acid sequence of the VH65 sequence, or an amino acid sequence that differs from the VH65 sequence by including one or more substitutions selected from the group consisting of a substitution of Ala for Thr at position 28 ( Rabat numbering: H28), substitutions of Asn for Ser at position 30 (Rabat numbering: H30), substitutions of Val for Gly at position 49 (Rabat numbering: H49), substitutions of Ala for Asp at position 64 (Rabat numbering:

- 3 040482- 3 040482

H61) и замены Gln на Lys в положении 78 (нумерация Rabat: H75); и в качестве вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность последовательности VL47 или аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности VL47 включением одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из замены Asp на Glu в положении 17 (нумерация Rabat: L17), замены Ser на Asn в положении 28 (нумерация Rabat: L27A), замены Gln на Leu в положении 42 (нумерация Rabat: L37), замены Gln на Arg в положении 50 (нумерация Rabat: L45) и замены Arg на Leu в положении 51 (нумерация Rabat: L46).H61) and replacing Gln with Lys at position 78 (Rabat numbering: H75); and as a light chain variable region, an amino acid sequence of the VL47 sequence, or an amino acid sequence that differs from the VL47 sequence by including one or more substitutions selected from the group consisting of Asp to Glu substitution at position 17 (Rabat numbering: L17), Ser to Asn substitution at position 28 (Rabat numbering: L27A), replacing Gln with Leu at position 42 (Rabat numbering: L37), replacing Gln with Arg at position 50 (Rabat numbering: L45), and replacing Arg with Leu at position 51 (Rabat numbering: L46 ).

В дополнительном аспекте гуманизированное антитело или его фрагмент или производное содержат любые из следующих комбинаций последовательностей:In a further aspect, the humanized antibody, or fragment or derivative thereof, comprises any of the following combinations of sequences:

(а) последовательность VH11 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL15 в качестве вариабельной области легкой цепи;(a) a VH11 sequence as the heavy chain variable region and a VL15 sequence as the light chain variable region;

(b) последовательность VH11 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL36 в качестве вариабельной области легкой цепи;(b) a VH11 sequence as the heavy chain variable region and a VL36 sequence as the light chain variable region;

(с) последовательность VH11 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL46 в качестве вариабельной области легкой цепи;(c) the VH11 sequence as the heavy chain variable region and the VL46 sequence as the light chain variable region;

(d) последовательность VH11 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL47 в качестве вариабельной области легкой цепи;(d) a VH11 sequence as the heavy chain variable region and a VL47 sequence as the light chain variable region;

(е) последовательность VH11 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL48 в качестве вариабельной области легкой цепи;(e) a VH11 sequence as the heavy chain variable region and a VL48 sequence as the light chain variable region;

(f) последовательность VH11 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL50 в качестве вариабельной области легкой цепи;(f) a VH11 sequence as the heavy chain variable region and a VL50 sequence as the light chain variable region;

(g) последовательность VH12 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL48 в качестве вариабельной области легкой цепи;(g) a VH12 sequence as the heavy chain variable region and a VL48 sequence as the light chain variable region;

(h) последовательность VH47 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL48 в качестве вариабельной области легкой цепи;(h) a VH47 sequence as the heavy chain variable region and a VL48 sequence as the light chain variable region;

(i) последовательность VH61 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL48 в качестве вариабельной области легкой цепи;(i) the VH61 sequence as the heavy chain variable region and the VL48 sequence as the light chain variable region;

(j) последовательность VH62 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL48 в качестве вариабельной области легкой цепи;(j) the VH62 sequence as the heavy chain variable region and the VL48 sequence as the light chain variable region;

(k) последовательность VH64 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL47 в качестве вариабельной области легкой цепи;(k) the VH64 sequence as the heavy chain variable region and the VL47 sequence as the light chain variable region;

(l) последовательность VH64 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL48; и (m) последовательность VH65 в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательность VL47.(l) the VH64 sequence as the heavy chain variable region and the VL48 sequence; and (m) a VH65 sequence as a heavy chain variable region and a VL47 sequence.

В дополнительном аспекте изобретение относится к агенту для лечения или предотвращения деменции, содержащему гуманизированное антитело или его фрагмент или производное, как описано в данном документе.In a further aspect, the invention relates to an agent for treating or preventing dementia, comprising a humanized antibody, or fragment or derivative thereof, as described herein.

В дополнительном аспекте изобретение предоставляет способы и агенты для лечения или предотвращения деменции или таупатии, включая болезнь Альцгеймера, кортикобазальную дегенерацию, прогрессирующий надъядерный паралич, Болезнь Пика, аргирофильную зернистую деменцию (аргирофильную зернистую болезнь), множественную системную таупатию с пресенильной деменцией (MSTD), лобно-височную деменцию и паркинсонизм, сцепленные с хромосомой 17 (FTDP-17), деменцию с нейрофибриллярными клубками, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией (DNTC), таупатию белого вещества с глобулярными глиальными включениями (WMT-GGI) или лобно-височную лобарную дегенерацию с патологией тау (FTLD-тау).In a further aspect, the invention provides methods and agents for treating or preventing dementia or tauopathy, including Alzheimer's disease, corticobasal degeneration, progressive supranuclear palsy, Pick's disease, argyrophilic granular dementia (argyrophilic granular disease), multiple systemic tauopathy with presenile dementia (MSTD), frontal Chromosome 17-linked temporal dementia and parkinsonism (FTDP-17), neurofibrillary tangle dementia, diffuse neurofibrillary tangles with calcification (DNTC), white matter tauopathy with globular glial inclusions (WMT-GGI), or frontotemporal lobar degeneration with pathology tau (FTLD-tau).

В дополнительном аспекте в изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие гуманизированное антитело или его фрагмент или производное, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.In a further aspect, the invention provides pharmaceutical compositions comprising a humanized antibody, or fragment or derivative thereof, as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

В дополнительном аспекте изобретение относится к антителам против pSer413 тау, содержащимIn a further aspect, the invention relates to antibodies against pSer413 tau containing

а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий vhCDR1, содержащую SEQ ID NO: 86, vhCDR2, содержащую SEQ ID NO: 115, и vhCDR3, содержащую SEQ ID NO: 88; иa) a heavy chain variable domain containing vhCDR1 containing SEQ ID NO: 86, vhCDR2 containing SEQ ID NO: 115, and vhCDR3 containing SEQ ID NO: 88; And

b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий набор vlCDR, выбранный из группы, состоящей изb) a light chain variable domain containing a vlCDR set selected from the group consisting of

i) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 102, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;i) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 102, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

ii) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 91, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;ii) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 91, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

iii) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 92, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;iii) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 92, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

iv) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 93, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;iv) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 93, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

- 4 040482- 4 040482

v) vlCDRl, содержащей SEQ ID NO: 94, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;v) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 94, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

vi) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 95, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;vi) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 95, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

vii) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 96, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;vii) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 96, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

viii) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 97, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;viii) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 97, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

ix) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 98, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;ix) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 98, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

x) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 99, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83;x) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 99, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83;

xi) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 100, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SEQ ID NO: 83; и xii) vlCDR1, содержащей SEQ ID NO: 101, vlCDR2, содержащей SEQ ID NO: 82, и vlCDR3, содержащей SeQ ID NO: 83.xi) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 100, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SEQ ID NO: 83; and xii) vlCDR1 containing SEQ ID NO: 101, vlCDR2 containing SEQ ID NO: 82, and vlCDR3 containing SeQ ID NO: 83.

В некоторых случаях антитело имеет отношение связывания антитела с фосфорилированным пептидом SEQ ID NO: 8 к связыванию антитела с нефосфорилированным пептидом SEQ ID NO: 69, равное по меньшей мере около 40.In some instances, an antibody has a ratio of antibody binding to the phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 8 to antibody binding to the non-phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 69 of at least about 40.

В дополнительных аспектах изобретение относится к антителам против pSer413 тау, содержащимIn additional aspects, the invention relates to antibodies against pSer413 tau containing

а) вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 116 и SEQ ID NO: 117; иa) a heavy chain variable domain selected from SEQ ID NO: 116 and SEQ ID NO: 117; And

b) вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111,b) a light chain variable domain selected from SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 , SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111,

SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 114.SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 and SEQ ID NO: 114.

В дополнительном аспекте антитела по изобретению содержат константный домен тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 144.In a further aspect, the antibodies of the invention comprise a heavy chain constant domain selected from SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 and SEQ ID NO: 144.

В дополнительном аспекте антитела по изобретению содержат константный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 80.In a further aspect, the antibodies of the invention comprise a light chain constant domain selected from SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 80.

В дополнительном аспекте антитела по изобретению содержат константный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 116 и SEQ ID NO: 117.In a further aspect, the antibodies of the invention comprise a light chain constant domain selected from SEQ ID NO: 116 and SEQ ID NO: 117.

В дополнительном аспекте антитела по изобретению содержат вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 114.In a further aspect, the antibodies of the invention comprise a light chain variable domain selected from SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 and SEQ ID NO: 114.

В дополнительном аспекте антитела содержат тяжелые и легкие цепи, выбранные из парIn a further aspect, the antibodies comprise heavy and light chains selected from pairs

LC SEQ ID NO: 184 иLC SEQ ID NO: 184 and

LC SEQ ID NO: 185 иLC SEQ ID NO: 185 and

НС SEQ ID NO: 144;HC SEQ ID NO: 144;

НС SEQ ID NO: 145;HC SEQ ID NO: 145;

НС SEQ ID NO: 146;HC SEQ ID NO: 146;

НС SEQ ID NO: 147;HC SEQ ID NO: 147;

НС SEQ ID NO: 148;HC SEQ ID NO: 148;

НС SEQ ID NO: 149;HC SEQ ID NO: 149;

НС SEQ ID NO: 150;HC SEQ ID NO: 150;

НС SEQ ID NO: 151;HC SEQ ID NO: 151;

НС SEQ ID NO: 152;HC SEQ ID NO: 152;

НС SEQ ID NO: 153;HC SEQ ID NO: 153;

НС SEQ ID NO: 154;HC SEQ ID NO: 154;

НС SEQ ID NO: 155;HC SEQ ID NO: 155;

НС SEQ ID NO: 156;HC SEQ ID NO: 156;

НС SEQ ID NO: 157;HC SEQ ID NO: 157;

НС SEQ ID NO: 158;HC SEQ ID NO: 158;

НС SEQ ID NO: 159;HC SEQ ID NO: 159;

НС SEQ ID NO: 160;HC SEQ ID NO: 160;

НС SEQ ID NO: 161;HC SEQ ID NO: 161;

НС SEQ ID NO: 144;HC SEQ ID NO: 144;

НС SEQ ID NO: 145;HC SEQ ID NO: 145;

НС SEQ ID NO: 146;HC SEQ ID NO: 146;

НС SEQ ID NO: 147;HC SEQ ID NO: 147;

НС SEQ ID NO: 148;HC SEQ ID NO: 148;

- 5 040482- 5 040482

LC SEQ ID NO: 185 иLC SEQ ID NO: 185 and

НС SEQ ID NO: 149;HC SEQ ID NO: 149;

НС SEQ ID NO: 150;HC SEQ ID NO: 150;

НС SEQ ID NO: 151;HC SEQ ID NO: 151;

НС SEQ ID NO: 152;HC SEQ ID NO: 152;

НС SEQ ID NO: 153;HC SEQ ID NO: 153;

НС SEQ ID NO: 154;HC SEQ ID NO: 154;

НС SEQ ID NO: 155;HC SEQ ID NO: 155;

НС SEQ ID NO: 156;HC SEQ ID NO: 156;

НС SEQ ID NO: 157;HC SEQ ID NO: 157;

НС SEQ ID NO: 158;HC SEQ ID NO: 158;

НС SEQ ID NO: 159;HC SEQ ID NO: 159;

НС SEQ ID NO: 160; иHC SEQ ID NO: 160; And

НС SEQ ID NO: 161.HC SEQ ID NO: 161.

В дополнительном аспекте антитело по изобретению имеет легкую цепь, содержащую или состоя щую из SEQ ID NO: 184, и тяжелую цепь, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 144.In a further aspect, an antibody of the invention has a light chain comprising or consisting of SEQ ID NO: 184 and a heavy chain comprising or consisting of SEQ ID NO: 144.

В дополнительном аспекте антитело по изобретению имеет легкую цепь, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 184, и тяжелую цепь, содержащую или состоящую из SEQ ID NO: 152.In a further aspect, an antibody of the invention has a light chain comprising or consisting of SEQ ID NO: 184 and a heavy chain comprising or consisting of SEQ ID NO: 152.

В дополнительном аспекте изобретение относится к композициям нуклеиновых кислот, содержа щимIn a further aspect, the invention relates to nucleic acid compositions containing

а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, выбранную из SEQ ID NO:162,a) a first nucleic acid encoding a light chain selected from SEQ ID NO:162,

SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO:168,SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168,

SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO:174,SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174,

SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO:180,SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180,

SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184 и SEQ ID NO: 185; иSEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184 and SEQ ID NO: 185; And

b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, выбранную из SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160 и SEQ ID NO: 161.b) a second nucleic acid encoding a heavy chain selected from SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160 and SEQ ID NO: 161.

В дополнительном аспекте изобретение относится к композициям вектора экспрессии, содержащим первую и вторую нуклеиновые кислоты, причем первая нуклеиновая кислота содержится в первом векторе экспрессии, а вторая нуклеиновая кислота содержится во втором векторе экспрессии.In a further aspect, the invention relates to expression vector compositions comprising first and second nucleic acids, wherein the first nucleic acid is contained in the first expression vector and the second nucleic acid is contained in the second expression vector.

В дополнительном аспекте изобретение относится к композиции вектора экспрессии, в которой первая нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота содержатся в одном векторе экспрессии.In a further aspect, the invention relates to an expression vector composition wherein the first nucleic acid and the second nucleic acid are contained in the same expression vector.

В дополнительном аспекте изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим композицию вектора экспрессии, и способам получения антитела против pSer413 тау, включающим культивирование клетки-хозяина в условиях, в которых указанное антитело экспрессируется, и выделение указанного антитела.In a further aspect, the invention relates to host cells comprising an expression vector composition and methods for producing an anti-pSer413 tau antibody, comprising culturing the host cell under conditions in which said antibody is expressed and isolating said antibody.

В дополнительном аспекте изобретение относится к способам лечения таупатии у субъекта, включающим введение антител по изобретению.In a further aspect, the invention relates to methods for treating tauopathy in a subject, comprising administering the antibodies of the invention.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

Изобретение может быть лучше понято из следующего подробного описания при прочтении вместе с прилагаемыми графическими материалами. В графические материалы включены следующие фигуры.The invention may be better understood from the following detailed description when read in conjunction with the accompanying drawings. The following figures are included in the graphics.

Фиг. 1А и 1В вместе демонстрируют выравнивание различных изоформ тау-белка человека, полученное с помощью ClustalW.Fig. 1A and 1B together show the alignment of different isoforms of human tau protein obtained using ClustalW.

Фиг. 2А демонстрирует выравнивание последовательностей вариабельной области легкой цепи с выделением последовательностей CDR11, CDR-L2 и CDR-L3 в соответствии с системой нумерации Kabat для нескольких связывающих белков против pS413-тау в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения.Fig. 2A shows the alignment of light chain variable region sequences to isolate CDR11, CDR-L2, and CDR-L3 sequences according to the Kabat numbering system for several anti-pS413-tau binding proteins, in accordance with some embodiments of the invention.

Фиг. 2В демонстрирует выравнивание последовательностей вариабельной области тяжелой цепи с выделением последовательностей CDRH1, CDR-H2 и CDR-H3 в соответствии с системой нумерации Kabat для нескольких связывающих белков против pS413-тау в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения.Fig. 2B shows a heavy chain variable region sequence alignment to isolate CDRH1, CDR-H2, and CDR-H3 sequences according to the Kabat numbering system for several anti-pS413-tau binding proteins, in accordance with some embodiments of the invention.

Фиг. 3 иллюстрирует аффинность селективного связывания нескольких антител против pS413-тау к фосфорилированному пептиду PD17P относительно нефосфорилированного пептида PD17 в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения.Fig. 3 illustrates the selective binding affinity of several anti-pS413-tau antibodies for a phosphorylated PD17P peptide relative to a non-phosphorylated PD17 peptide, in accordance with some embodiments of the invention.

Фиг. 4 иллюстрирует аффинность связывания нескольких антител против pS413-тау к фосфорилированному тау в гомогенате ткани головного мозга от пациента с болезнью Альцгеймера в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения.Fig. 4 illustrates the binding affinity of several anti-pS413-tau antibodies for phosphorylated tau in a brain tissue homogenate from an Alzheimer's disease patient, in accordance with some embodiments of the invention.

Фиг. 5А и 5В демонстрируют фармакокинетику вариантов гуманизированных антител в плазме мыши в течение времени. Фиг. 5А демонстрирует, что пять исходных вариантов гуманизированных антител 2, 5, 6, 9 и 10 продемонстрировали быстрое выведение из плазмы мыши. Фиг. 5В демонстрирует, что три позже разработанных варианта гуманизированных антител L15H11, L46H11 и L47H65 продемон- 6 040482 стрировали профили фармакокинетики, сопоставимые с химерными антителами.Fig. 5A and 5B show the pharmacokinetics of humanized antibody variants in mouse plasma over time. Fig. 5A shows that the five original humanized antibody variants 2, 5, 6, 9 and 10 exhibited rapid clearance from mouse plasma. Fig. 5B demonstrates that three later developed humanized antibody variants L15H11, L46H11 and L47H65 exhibited pharmacokinetic profiles comparable to chimeric antibodies.

Фиг. 6А и 6В демонстрируют, что различные варианты гуманизированных антител характеризуются разной интрацеребральной миграцией. Фиг. 6А демонстрирует концентрацию различных гуманизированных антител в гомогенате ткани головного мозга. Фиг. 6В демонстрирует отношение уровня репрезентативных гуманизированных антител в головном мозге к уровню соответствующих антител в плазме.Fig. 6A and 6B demonstrate that different variants of humanized antibodies are characterized by different intracerebral migration. Fig. 6A shows the concentration of various humanized antibodies in a brain tissue homogenate. Fig. 6B shows the ratio of representative humanized antibodies in the brain to the level of the corresponding antibodies in plasma.

Фиг. 7А и 7В представляют выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи (фиг. 7А) и вариабельной области тяжелой цепи (фиг. 7В) репрезентативных вариантов гуманизированных антител с родительским антителом мыши.Fig. 7A and 7B are amino acid sequence alignments of the light chain variable region (FIG. 7A) and heavy chain variable region (FIG. 7B) of representative humanized antibody variants with the mouse parent antibody.

Фиг. 8A-8D демонстрируют, что родительское антитело мыши (фиг. 8А и 8В) и химерное антитело (фиг. 8С и 8D) связываются с фосфорилированным пептидом (фиг. 8А и 8С), но не с нефосфорилированным аналогом (фиг. 8В и 8D).Fig. 8A-8D demonstrate that the mouse parental antibody (FIGS. 8A and 8B) and the chimeric antibody (FIGS. 8C and 8D) bind to the phosphorylated peptide (FIGS. 8A and 8C), but not to the non-phosphorylated analog (FIGS. 8B and 8D). .

Фиг. 9А-9С демонстрируют связывание репрезентативных вариантов гуманизированных антител с пептидом pS413.Fig. 9A-9C demonstrate the binding of representative humanized antibody variants to the pS413 peptide.

Фиг. 10А-10Е демонстрируют сравнимые характеристики связывания родительского антитела мыши (фиг. 10А), химерного антитела (фиг. 10В) и выбранных вариантов гуманизированных антител (фиг. 10С-10Е) с S413-фосфорилированным тау-белком в гомогенатах ткани головного мозга от пациентов с болезнью Альцгеймера.Fig. 10A-10E show comparable binding characteristics of mouse parental antibody (FIG. 10A), chimeric antibody (FIG. 10B), and selected humanized antibody variants (FIGS. 10C-10E) to S413-phosphorylated tau protein in brain tissue homogenates from patients with Alzheimer's disease.

Фиг. 11А-11Е демонстрируют вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей некоторых из гуманизированных антител против pSer413-тау-белка по изобретению.Fig. 11A-11E show heavy chain variable regions and light chain variable regions of some of the humanized anti-pSer413 tau antibodies of the invention.

Фиг. 12A-12C демонстрирует ряд различных константных доменов IgG человека, которые находят применение в комбинациях вариабельных доменов тяжелых цепей и вариабельных доменов легких цепей антител против pSer413 тау. Human_IgG1_ представляет собой константный домен (СН1-шарнир-СН2CH3) человеческого IgG1 дикого типа. Human_IgG1_L234A_L235A представляет собой константный домен (СН1-шарнир-СН2-CH3) человеческого IgG1 дикого типа с двумя аминокислотными заменами, L234A и L235A (иногда называемыми мутациями LALA), которые снижают/устраняют эффекторную функцию. Human_IgG1_L234A_L235A_D265S представляет собой константный домен (СН1-шарнирСН2-СНЗ) человеческого IgG1 дикого типа с тремя аминокислотными заменами, L234A, L235A и D265S, которые снижают/устраняют эффекторную функцию. Human_IgG1_YTE_ или Human_IgG1_YTE (M252Y_S254T_T256E) представляет собой константный домен (СШ-шарнир-СЖ-СТЗ) человеческого IgG1 дикого типа с тремя аминокислотными заменами, M252Y, S254T, Т256Е, которые увеличивают период полужизни антител в сыворотке. Human_IgG1_N297A_ представляет собой константный домен (СШ-шарнир-СЖ-СТЗ) человеческого IgG1 дикого типа с аминокислотной заменой N297A, которая устраняет сайт гликозилирования и снижает/устраняет эффекторную функцию. Human_IgG1_N297Q_ представляет собой константный домен (СН1-шарнир-СН2-CH3) человеческого IgG1 дикого типа с аминокислотной заменой N297Q, которая устраняет сайт гликозилирования и снижает/устраняет эффекторную функцию. _Human_IgG2 представляет собой константный домен (СН1-шарнир-СН2-CH3) человеческого IgG2 дикого типа. _Human_IgG4 представляет собой константный домен (СН1-шарнир-СН2CH3) человеческого IgG4 дикого типа. Human_IgG4_S228P_ представляет собой константный домен (СН1-шарнир-СН2-CH3) человеческого IgG4 дикого типа с аминокислотной заменой S228P для предотвращения обмена плечами.Fig. 12A-12C show a number of different human IgG constant domains that find use in combinations of heavy chain variable domains and light chain variable domains of anti-tau pSer413 antibodies. Human_IgG1_ is the constant domain (CH1-hinge-CH2CH3) of wild-type human IgG1. Human_IgG1_L234A_L235A is a constant domain (CH1-hinge-CH2-CH3) of wild-type human IgG1 with two amino acid substitutions, L234A and L235A (sometimes referred to as LALA mutations), that reduce/eliminate effector function. Human_IgG1_L234A_L235A_D265S is a constant domain (CH1-hingeCH2-CH3) of wild-type human IgG1 with three amino acid substitutions, L234A, L235A and D265S, that reduce/eliminate effector function. Human_IgG1_YTE_ or Human_IgG1_YTE (M252Y_S254T_T256E) is a constant domain (SH-Hinge-SJ-STZ) of wild-type human IgG1 with three amino acid substitutions, M252Y, S254T, T256E, which increase the serum half-life of antibodies. Human_IgG1_N297A_ is a constant domain (SH-Hinge-SF-STZ) of wild-type human IgG1 with the N297A amino acid substitution that eliminates the glycosylation site and reduces/eliminates effector function. Human_IgG1_N297Q_ is a constant domain (CH1-hinge-CH2-CH3) of wild-type human IgG1 with the N297Q amino acid substitution that eliminates the glycosylation site and reduces/eliminates effector function. _Human_IgG2 is the constant domain (CH1-hinge-CH2-CH3) of wild-type human IgG2. _Human_IgG4 is the constant domain (CH1-hinge-CH2CH3) of wild-type human IgG4. Human_IgG4_S228P_ is a constant domain (CH1-hinge-CH2-CH3) of wild-type human IgG4 with the S228P amino acid substitution to prevent shoulder exchange.

Фиг. 13A-13E демонстрирует полноразмерные тяжелые цепи для вариабельных областей Н11 и Н65 в сочетании с каркасами с фиг. 12. Косая (/) указывает на соединение вариабельного и константного доменов, a CDR подчеркнуты.Fig. 13A-13E show full-length heavy chains for the H11 and H65 variable regions in combination with the scaffolds of FIG. 12. A slash (/) indicates a junction of the variable and constant domains, and the CDRs are underlined.

Фиг. 14A-14D демонстрирует полноразмерные легкие цепи для 12 различных вариабельных доменов легкой цепи с константными доменами легкой цепи каппа или лямбда человека. Косая (/) указывает на соединение вариабельного и константного доменов, а CDR подчеркнуты.Fig. 14A-14D show full length light chains for 12 different light chain variable domains with human kappa or lambda light chain constant domains. A slash (/) indicates a junction between the variable and constant domains, and the CDRs are underlined.

Фиг. 15 изображает матрицу возможных комбинаций тяжелых и легких цепей по изобретению. А в поле указывает, что используется константный домен тяжелой цепи Human_IgG1_. В в поле указывает, что используется константный домен тяжелой цепи Human_IgG1_L234A_L235A. С в поле указывает, что используется константный домен тяжелой цепи Human_IgG1_L234A_L235A_D265S. D в поле означает, что используется константный домен тяжелой цепи Human_IgG1_YTE_. E в поле означает, что используется константный домен тяжелой цепи Human_IgG1_N297A_. F в поле означает, что используется константный домен тяжелой цепи Human_IgG1_N297Q. G в поле означает, что используется константный домен тяжелой цепи _Human_IgG2. H в поле означает, что используется константный домен тяжелой цепи _Human_IgG4. I в поле означает, что используется константный домен тяжелой цепи Human_IgG4_S228P_. J в поле означает, что используется константный домен IgG1 человека с от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотными заменами.Fig. 15 depicts a matrix of possible combinations of heavy and light chains according to the invention. And the field indicates that the heavy chain constant domain Human_IgG1_ is used. B in the field indicates that the heavy chain constant domain Human_IgG1_L234A_L235A is used. The C in the field indicates that the heavy chain constant domain Human_IgG1_L234A_L235A_D265S is used. A D in the field means that the heavy chain constant domain Human_IgG1_YTE_ is used. An E in the field means that the heavy chain constant domain Human_IgG1_N297A_ is used. An F in the field means that the Human_IgG1_N297Q heavy chain constant domain is used. A G in the field indicates that the _Human_IgG2 heavy chain constant domain is being used. An H in the field indicates that the _Human_IgG4 heavy chain constant domain is being used. I in the field means that the heavy chain constant domain Human_IgG4_S228P_ is used. A J in the field means that a human IgG1 constant domain with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid substitutions is used.

Подробное описание сущности изобретенияDetailed Description of the Invention

Обзор.Review.

Настоящее изобретение относится к антителам, которые содержат антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с тау-белком, который является фосфорилированным по остатку серина 413 (pSer413-тау). Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, и клетки, которые содержатThe present invention relates to antibodies that contain an antigen-binding portion that specifically binds to a tau protein that is phosphorylated at serine 413 (pSer413-tau). Also proposed are nucleic acids encoding proteins and cells that contain

- 7 040482 такие нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы и композиции используются для лечения таупатий (например, болезни Альцгеймера).- 7 040482 such nucleic acids. In some embodiments, the proposed methods and compositions are used to treat taupathies (eg, Alzheimer's disease).

Ген МАРТ, кодирующий тау, был идентифицирован как состоящий из 13 экзонов, расположенных в геноме, которые могут экспрессироваться в виде множества различных изоформ белка посредством альтернативного сплайсинга (см. Arai выше). Тау-белок содержит N-концевой кислотный домен, содержащий 0-2 повторяющихся последовательности (N) из 29 аминокислот в зависимости от альтернативного сплайсинга экзона 2 и экзона 3 (N0-N2), промежуточный домен, богатый пролином, и С-концевой домен, связывающий микротрубочки (кодируемый экзонами 9-12), содержащий 3 (3R) или 4 (4R) повторяющихся последовательности (R), которые способствуют связыванию микротрубочек (Burns выше и Arai выше). Следовательно, тау человека имеет шесть типичных изоформ: 3R0N (352 аминокислоты), 3R1N (381 аминокислота), 3R2N (410 аминокислот), 4R0N (383 аминокислоты), 4R1N (412 аминокислот) и 4R2N (441 аминокислота) - в зависимости от количества 29-аминокислотных повторяющихся последовательностей (N) и связывающих микротрубочки повторяющихся последовательностей (R), которые он содержит. Из этих изоформ только 3R0N присутствует в эмбриональном мозге, тогда как все шесть изоформ присутствуют в мозге взрослого человека, причем 4R является наиболее распространенной (Burns выше). Разница между изоформами 3R и 4R обусловлена тем, удален ли экзон 10 посредством альтернативного сплайсинга (3R) или присутствует (4R). Чтобы однозначно идентифицировать положение аминокислотного остатка в любой из этих изоформ тау, номера аминокислот (от 1 до 441) самой длинной изоформы, т.е. 4R2N (определенной в SEQ ID NO: 1), используются в качестве референса.The MART gene encoding tau has been identified as consisting of 13 exons located in the genome that can be expressed as many different protein isoforms through alternative splicing (see Arai above). The tau protein contains an N-terminal acid domain containing 0-2 repeat sequences (N) of 29 amino acids depending on alternative splicing of exon 2 and exon 3 (N0-N2), a proline-rich intermediate domain, and a C-terminal domain, microtubule-binding (encoded by exons 9-12) containing 3 (3R) or 4 (4R) repeat sequences (R) that promote microtubule binding (Burns above and Arai above). Therefore, human tau has six typical isoforms: 3R0N (352 amino acids), 3R1N (381 amino acids), 3R2N (410 amino acids), 4R0N (383 amino acids), 4R1N (412 amino acids) and 4R2N (441 amino acids) - depending on the amount of 29 -amino acid repeat sequences (N) and microtubule-binding repeat sequences (R) it contains. Of these isoforms, only 3R0N is present in the fetal brain, while all six isoforms are present in the adult brain, with 4R being the most common (Burns above). The difference between 3R and 4R isoforms is due to whether exon 10 is removed by alternative splicing (3R) or present (4R). To uniquely identify the position of an amino acid residue in any of these tau isoforms, the amino acid numbers (from 1 to 441) of the longest isoform, i. 4R2N (as defined in SEQ ID NO: 1) are used as reference.

Например, Ser413 относится к остатку серина в аминокислотном положении 413 в 4R2N (определенной в SEQ ID NO: 1), что соответствует серину в положении 384 в 4R1N (определенной в SEQ ID NO: 2), в положении 355 в 4R0N (определенной в SEQ ID NO: 3), в положении 382 в 3R2N (определенной в SEQ ID NO: 4), в положении 353 в 3R1N (определенной в SEQ ID NO: 5) и в положении 324 в 3R0N (определенной в SeQ ID NO: 6).For example, Ser413 refers to the serine residue at amino acid position 413 in 4R2N (as defined in SEQ ID NO: 1), which corresponds to the serine at position 384 in 4R1N (as defined in SEQ ID NO: 2), at position 355 in 4R0N (as defined in SEQ ID NO: 3), at position 382 in 3R2N (as defined in SEQ ID NO: 4), at position 353 in 3R1N (as defined in SEQ ID NO: 5), and at position 324 in 3R0N (as defined in SeQ ID NO: 6) .

Тау имеет фосфорилированный аминокислотный остаток в положении, соответствующем остатку серина в положении 413 (Ser413 при фосфорилировании называется в данном документе pSer413) аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1 (и, таким образом, тау-белок, фосфорилированный по Ser413, представляет собой pSer413 тау или pSer413-Tay), который является сайтом, специфически фосфорилированным при БА. Как показано ранее в WO 2013/180238, введение антител, которые участвуют в специфических реакциях антиген-антитело с PSer413-тау, трансгенным мышам, у которых при созревании развивается нарушение когнитивной функции, приводило к восстановлению когнитивных функций почти до того же уровня, что и у контрольной группы. Интересно, что введение такой же концентрации моноклонального антитела против тау-белка, имеющего фосфорилированный аминокислотный остаток в положении, соответствующем Ser396 аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, которое имеет большую аффинность к эквивалентному антигену, чем вышеуказанное антитело, не приводило к достаточному улучшению когнитивных функций. Поскольку не было конкретной информации об области, включающей аминокислотный остаток в положении, соответствующем Ser413 аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, в отношении структуры и функций тау, это был совершенно неожиданный результат, что антитело, которое связывается с этой областью, имело такой сильный эффект улучшения когнитивной функции.Tau has a phosphorylated amino acid residue at a position corresponding to a serine residue at position 413 (Ser413 when phosphorylated is referred to herein as pSer413) of the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1 (and thus a tau protein phosphorylated at Ser413 is pSer413 tau or pSer413-Tay), which is a site specifically phosphorylated in AD. As shown previously in WO 2013/180238, administration of antibodies that are involved in specific antigen-antibody reactions with PSer413-tau to transgenic mice that develop cognitive impairment upon maturation resulted in recovery of cognitive functions to almost the same level as at the control group. Interestingly, administration of the same concentration of an anti-tau monoclonal antibody having a phosphorylated amino acid residue at the position corresponding to Ser396 of the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1, which has a greater affinity for the equivalent antigen than the above antibody, did not result in sufficient improvement of cognitive functions. Since there was no specific information about the region comprising the amino acid residue at the position corresponding to Ser413 of the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1 in relation to the structure and functions of tau, it was a completely unexpected result that an antibody that binds to this region had such a strong effect of improving cognitive function.

Соответственно данное изобретение направлено на гуманизированные и оптимизированные антитела против pSer413-тау, пригодные в качестве терапевтического или профилактического агента для лечения когнитивных расстройств, таких как таупатия, у субъекта-человека.Accordingly, the present invention is directed to humanized and optimized anti-pSer413-tau antibodies useful as a therapeutic or prophylactic agent for the treatment of cognitive disorders such as tauopathy in a human subject.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению проявляет высокую аффинность связывания с фосфорилированным тау, в то же время имея значительно сниженную антигенность для организма человека, и может эффективно применяться в качестве терапевтического или профилактического агента при когнитивных расстройствах, таких как таупатия, у субъектачеловека. Кроме того, модификации аминокислот в CDR по сравнению с мышиными CDR снижают дезамидирование, приводя к повышенной стабильности; см. примеры 8, 9 и 10.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention exhibits high binding affinity for phosphorylated tau while having significantly reduced antigenicity in humans, and can be effectively used as a therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders such as tauopathy in a human subject. In addition, amino acid modifications in CDRs, compared to murine CDRs, reduce deamidation, resulting in increased stability; see examples 8, 9 and 10.

Определения.Definitions.

В контексте данного документа каждый из следующих терминов имеет значение, приписываемое ему в этом разделе.In the context of this document, each of the following terms has the meaning ascribed to it in this section.

В контексте данного документа форма единственного числа используется для обозначения одного или более чем одного (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера элемент означает один элемент или более одного элемента.In the context of this document, the singular form is used to refer to one or more than one (i.e., at least one) grammatical entity. By way of example, element means one element or more than one element.

В контексте данного документа подразумевается, что термин около, используемый в отношении измеряемого значения, такого как количество, временная длительность и т.п., включает вариации ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1% и еще более предпочтительно ±0,1% от указанного значения, так как такие вариации являются подходящими для осуществления раскрытых способов.In the context of this document, the term about, when used in relation to a measurable value such as quantity, time duration, etc., is intended to include variations of ±20% or ±10%, more preferably ±5%, even more preferably ±1% and even more preferably ±0.1% of the specified value, since such variations are suitable for the implementation of the disclosed methods.

Под абляцией в данном документе подразумевается снижение или устранение активности. ТакимBy ablation, as used herein, is meant the reduction or elimination of activity. So

- 8 040482 образом, например, абляция связывания FcyR означает, что аминокислотный вариант Fc-области характеризуется менее чем 50% начального связывания по сравнению с Fc-областью, не содержащей конкретный вариант, при этом предпочтительной является потеря 70-80-90-95-98% активности и в общем случае активность находится ниже уровня выявляемого связывания в анализе Biacore.- 8 040482 Thus, for example, ablation of FcyR binding means that the amino acid variant Fc region has less than 50% initial binding compared to the Fc region not containing the specific variant, with a loss of 70-80-90-95- 98% activity and generally activity below detectable binding in the Biacore assay.

Термин АЗКЦ или антитело-зависимая клеточноопосредованная цитотоксичность в контексте данного документа означает клеточно-опосредованную реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. АЗКЦ коррелирует со связыванием с FcyRIIIa; повышение связывания с FcyRIIIa приводит к повышению активности АЗКЦ. Как обсуждается в данном документе, многие варианты осуществления изобретения полностью устраняют активность АЗКЦ.The term ADCC or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity as used herein means a cell-mediated reaction in which non-specific cytotoxic cells that express FcyR recognize the bound antibody on the target cell and subsequently cause lysis of the target cell. ADCC correlates with binding to FcyRIIIa; increased binding to FcyRIIIa leads to an increase in ADCC activity. As discussed herein, many embodiments of the invention completely eliminate ADCC activity.

Термин АЗКФ или антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз в контексте данного документа означает клеточно-опосредованную реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают фагоцитоз клетки-мишени.The term ADCP or antibody-dependent cell-mediated phagocytosis as used herein means a cell-mediated reaction in which non-specific cytotoxic cells that express FcyR recognize the bound antibody on the target cell and subsequently induce phagocytosis of the target cell.

Под антигенсвязывающим доменом или АСД в данном документе подразумевается набор из шести определяющих комплементарность областей (CDR, от англ. Complementary Determining Regions), которые, являясь частью полипептидной последовательности, специфически связывают целевой антиген, как обсуждается в данном документе. Таким образом, антигенсвязывающий домен связывает целевой антиген, как описано в данном документе. Как известно в данной области техники, эти CDR обычно присутствуют в виде первого набора CDR вариабельного домена тяжелой цепи (vhCDRs, или VHCDR, или CDR-HC) и второго набора CDR вариабельного домена легкой цепи (vlCDR, или V_LCDR, или CDR-LC), каждый из которых содержит три CDR: vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 для тяжелой цепи и vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3 для легкой цепи. CDR присутствуют в вариабельных доменах тяжелой цепи и вариабельных доменах легкой цепи соответственно и вместе образуют Fv-область. Таким образом, в некоторых случаях шесть CDR антигенсвязывающего домена представлены вариабельным доменом тяжелой цепи и вариабельным доменом легкой цепи. В формате Fab набор из 6 CDR представлен двумя различными полипептидными последовательностями, вариабельным доменом тяжелой цепи (vh или V_H, содержащим vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3) и вариабельным доменом легкой цепи (vl или V_L, содержащим vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) с С-концом домена vh, присоединенным к N-концу домена CH1 тяжелой цепи, и С-концом домена vl, присоединенным к N-концу константного домена легкой цепи (и таким образом образующим легкую цепь). В формате scFv домены vh и vl ковалентно соединяются, как правило, посредством использования линкера, как указано в данном документе, в одну полипептидную последовательность, которая может представлять собой (начиная с N-конца) vh-линкер-vl или vl-линкер-vh, причем первый вариант обычно является предпочтительным (включая необязательные доменные линкеры на каждой стороне, в зависимости от используемого формата. Как известно в данной области техники, CDR разделены каркасными областями в каждом из вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи: FR1-vlCDR1-FR2-vlCDR2-FR3-vlCDR3-FR4, и для вариабельного домена тяжелой цепи они представляют собой FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR4 с каркасными областями, демонстрирующими высокую идентичность с последовательностями зародышевой линии человека. Антигенсвязывающие домены по изобретению включают Fab, Fv и scFv.An antigen-binding domain or ADA is herein understood to mean a set of six Complementary Determining Regions (CDRs) that, as part of a polypeptide sequence, specifically bind a target antigen as discussed herein. Thus, the antigen-binding domain binds the target antigen as described herein. As known in the art, these CDRs are typically present as a first set of heavy chain variable CDRs (vhCDRs or VHCDRs or CDR-HCs) and a second set of light chain variable CDRs (vlCDRs or V _L CDRs or CDRs- LC), each containing three CDRs: vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 for the heavy chain and vlCDR1, vlCDR2 and vlCDR3 for the light chain. The CDRs are present in the heavy chain variable domains and the light chain variable domains, respectively, and together form the Fv region. Thus, in some cases, the six CDRs of the antigen-binding domain are represented by a heavy chain variable domain and a light chain variable domain. In Fab format, a set of 6 CDRs is represented by two different polypeptide sequences, a heavy chain variable domain (vh or V _H containing vhCDR1, vhCDR2 and vhCDR3) and a light chain variable domain (vl or V _L containing vlCDR1, vlCDR2 and vlCDR3) with C the -terminus of the vh domain attached to the N-terminus of the heavy chain CH1 domain, and the C-terminus of the vl domain attached to the N-terminus of the light chain constant domain (and thus forming a light chain). In scFv format, the vh and vl domains are covalently joined, typically by using a linker as defined herein, into a single polypeptide sequence, which may be (from the N-terminus) vh-linker-vl or vl-linker-vh , with the first option generally preferred (including optional domain linkers on each side, depending on the format used. As is known in the art, CDRs are separated by framework regions in each of the heavy chain variable domains and the light chain variable domains: FR1-vlCDR1- FR2-vlCDR2-FR3-vlCDR3-FR4 and for the heavy chain variable domain they are FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR4 with framework regions showing high identity with human germline sequences.The antigen binding domains of the invention include Fab, Fv and scFv.

Под модификацией в данном документе подразумевается аминокислотная замена, вставка и/или делеция в полипептидной последовательности или изменение фрагмента, химически связанного с белком. Например, модификация может представлять собой измененную углеводную или ПЭГ-структуру, присоединенную к белку. Под аминокислотной модификацией в данном документе подразумевается аминокислотная замена, вставка и/или делеция в полипептидной последовательности. Для ясности, если не указано иное, модификация аминокислоты всегда относится к аминокислоте, кодируемой ДНК, например к 20 аминокислотам, которые имеют кодоны в ДНК и РНК.By modification is meant herein an amino acid substitution, insertion and/or deletion in a polypeptide sequence, or a change in a moiety chemically linked to a protein. For example, the modification may be an altered carbohydrate or PEG structure attached to the protein. By amino acid modification, as used herein, is meant an amino acid substitution, insertion and/or deletion in a polypeptide sequence. For clarity, unless otherwise indicated, amino acid modification always refers to the amino acid encoded by DNA, eg the 20 amino acids that have codons in DNA and RNA.

Под аминокислотной заменой или заменой в данном документе подразумевается замена аминокислоты в конкретном положении в родительской полипептидной последовательности другой аминокислотой. В частности, в некоторых вариантах осуществления замена представляет собой аминокислоту, которая не встречается в природе в конкретном положении, либо не встречается в природе в указанном организме или в любом организме. Например, замена M252Y относится к варианту полипептида, в данном случае к Fc-варианту, в котором метионин в положении 252 заменен тирозином. Для ясности белок, который был сконструирован с изменением кодирующей нуклеотидной последовательности, но не с изменением исходной аминокислоты (например, замена CGG (кодирующего аргинин) на CGA (также кодирующий аргинин) для повышения уровней экспрессии в организме хозяина), не является аминокислотной заменой, т.е. несмотря на создание нового гена, кодирующего такой же белок, если белок имеет такую же аминокислоту в указанной конкретной позиции, которая была в нем изначально, это не является аминокислотной заменой.By amino acid substitution or substitution, as used herein, is meant the replacement of an amino acid at a particular position in the parent polypeptide sequence with another amino acid. In particular, in some embodiments, the substitution is an amino acid that does not occur naturally at a particular position, or does not occur naturally in said organism or in any organism. For example, the substitution M252Y refers to a polypeptide variant, in this case an Fc variant, in which the methionine at position 252 is replaced by a tyrosine. For the sake of clarity, a protein that has been engineered to change the coding nucleotide sequence but not the original amino acid (e.g., changing CGG (coding for arginine) to CGA (also encoding for arginine) to increase expression levels in the host) is not an amino acid substitution, that is .e. despite the creation of a new gene encoding the same protein, if the protein has the same amino acid at that particular position as it originally had, it is not an amino acid substitution.

В контексте данного документа под термином вариантный белок, или вариант белка, или вариант подразумевается белок, который отличается от родительского белка за счет по меньшей мере однойIn the context of this document, the term variant protein, or protein variant, or variant means a protein that differs from the parent protein by at least one

- 9 040482 аминокислотной модификации. Вариант белка может относиться к самому белку, композиции, содержащей белок, или к аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Предпочтительно вариант белка имеет по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с родительским белком, например от около одной до около семидесяти аминокислотных модификаций, и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных модификаций по сравнению с родительским белком. Как описано ниже, в некоторых вариантах осуществления родительский полипептид, например родительский полипептид Fc, представляет собой человеческую последовательность дикого типа, такую как Fc-области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Вариант последовательности белка в данном документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере около 80% идентичности с последовательностью родительского белка, наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере около 95-98-99% идентичности. Вариант белка может относиться к самому варианту белка, композициям, содержащим вариант белка, или последовательности ДНК, которая его кодирует.- 9 040482 amino acid modification. A protein variant may refer to the protein itself, the composition containing the protein, or the amino acid sequence that encodes it. Preferably, the protein variant has at least one amino acid modification compared to the parent protein, such as from about one to about seventy amino acid modifications, and preferably from about one to about five amino acid modifications compared to the parent protein. As described below, in some embodiments, the parent polypeptide, eg, the parent Fc polypeptide, is a wild-type human sequence, such as Fc regions from IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4. The protein sequence variant herein will preferably have at least about 80% identity with the parent protein sequence, most preferably at least about 90% identity, more preferably at least about 95-98-99% identity. A protein variant may refer to the protein variant itself, compositions containing the protein variant, or the DNA sequence that encodes it.

Соответственно в контексте данного документа под вариантом антитела или вариантным антителом подразумевается антитело, которое отличается от родительского антитела за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Также в контексте данного документа под вариантом IgG или вариантным IgG подразумевается антитело, которое отличается от родительского IgG (опять же, во многих случаях от последовательности IgG человека) за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации, и в контексте данного документа под вариантом иммуноглобулина или вариантным иммуноглобулином подразумевается последовательность иммуноглобулина, которая отличается от последовательности родительского иммуноглобулина за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации. В контексте данного документа под вариантом Fc или вариантным Fc подразумевается белок, содержащий аминокислотную модификацию в Fc-домене. Fc-варианты по данному изобретению определены в соответствии с аминокислотными модификациями, которые их составляют. Таким образом, например, M252Y или 252Y представляет собой Fc-вариант с заменой тирозина в положении 252 относительно родительского Fc-полипептида, в котором нумерация соответствует индексу EU. Аналогично M252Y/S254T/T256E определяет Fc-вариант с заменами M252Y, S254T и Т256Е относительно родительского Fc-полипептида. Идентичность аминокислоты ДТ (дикого типа) может быть неопределенной, и в этом случае вышеупомянутый вариант обозначается как 252Y/254T/256E. Следует отметить, что порядок, в котором приведены замены, является произвольным, т.е., например, 252Y/254T/256E является тем же Fc-вариантом, что и 254T/252Y/256E, и т.д. Для всех положений, обсуждаемых в данном изобретении, которые относятся к антителам, если не указано иное, нумерация аминокислотных положений соответствует Kabat для нумерации вариабельных доменов и соответствует индексу EU для константных доменов, включая Fc-домен. Индекс EU или EU-индекс в схеме нумерации Kabat или EU относится к нумерации антител EU (Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 63:78-85, полностью включенная в данный документ посредством ссылки). Модификация может представлять собой добавление, делецию или замену. Замены могут включать аминокислоты природного происхождения и в некоторых случаях синтетические аминокислоты.Accordingly, in the context of this document, a variant antibody or variant antibody means an antibody that differs from the parent antibody by at least one amino acid modification. Also in the context of this document, an IgG variant or variant IgG means an antibody that differs from the parental IgG (again, in many cases from the human IgG sequence) by at least one amino acid modification, and in the context of this document, an immunoglobulin variant or variant by immunoglobulin is meant an immunoglobulin sequence that differs from the parental immunoglobulin sequence by at least one amino acid modification. In the context of this document, an Fc variant or Fc variant refers to a protein containing an amino acid modification in the Fc domain. The Fc variants of this invention are defined according to the amino acid modifications that constitute them. Thus, for example, M252Y or 252Y is an Fc variant with a tyrosine substitution at position 252 relative to the parent Fc polypeptide, in which the numbering corresponds to the index EU. Similarly, M252Y/S254T/T256E defines an Fc variant with substitutions M252Y, S254T and T256E relative to the parent Fc polypeptide. The amino acid identity of DT (wild type) may be uncertain, in which case the above variant is designated as 252Y/254T/256E. It should be noted that the order in which the substitutions are given is arbitrary, i.e., for example, 252Y/254T/256E is the same Fc variant as 254T/252Y/256E, etc. For all provisions discussed in this invention that relate to antibodies, unless otherwise indicated, the numbering of amino acid positions corresponds to Kabat for the numbering of variable domains and corresponds to the EU index for constant domains, including the Fc domain. The EU suffix or EU-index in the Kabat or EU numbering scheme refers to EU antibody numbering (Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 63:78-85, incorporated herein by reference in its entirety) . The modification may be an addition, deletion or substitution. Substitutions may include naturally occurring amino acids and, in some cases, synthetic amino acids.

В контексте данного документа термин белок означает по меньшей мере две ковалентно связанные аминокислоты, что включает белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Пептидильная группа может содержать аминокислоты природного происхождения и пептидные связи.In the context of this document, the term protein means at least two covalently linked amino acids, which includes proteins, polypeptides, oligopeptides and peptides. The peptidyl group may contain naturally occurring amino acids and peptide bonds.

В контексте данного документа под Fab или областью Fab подразумевается полипептид, который содержит домены VH, CH1, VL и CL иммуноглобулина. Fab может относиться к этой области отдельно или к этой области в контексте полноразмерного антитела, фрагмента антитела или слитого белка Fab.As used herein, a Fab or Fab region refers to a polypeptide that contains the VH, CH1, VL, and CL domains of an immunoglobulin. The Fab may refer to this region alone, or to this region in the context of a full length antibody, antibody fragment, or Fab fusion protein.

В контексте данного документа термин Fv, фрагмент Fv или область Fv означает полипептид, который содержит домены VL и VH одного антигенсвязывающего домена (АСД). Как будет понятно специалистам в данной области техники, они, как правило, состоят из двух цепей или могут быть объединены (обычно с помощью линкера, как обсуждается в данном документе) для образования scFv.As used herein, the term Fv, Fv fragment, or Fv region means a polypeptide that contains the VL and VH domains of a single antigen-binding domain (ADD). As will be understood by those skilled in the art, they are typically two strands or can be combined (usually via a linker, as discussed herein) to form scFvs.

В контексте данного документа термины аминокислота и идентичность аминокислоты означают одну из 20 аминокислот природного происхождения, которые кодируются ДНК и РНК.In the context of this document, the terms amino acid and amino acid identity mean one of the 20 naturally occurring amino acids that are encoded by DNA and RNA.

Под эффекторной функцией в контексте данного документа подразумевается биохимическое событие, которое возникает в результате взаимодействия Fc-области антитела с Fc-рецептором или лигандом. Эффекторные функции включают, но не ограничиваются, АЦЗК, АЗКФ и КЗЦ.By effector function, in the context of this document, is meant a biochemical event that results from the interaction of the Fc region of an antibody with an Fc receptor or ligand. Effector functions include, but are not limited to, ACCA, ADCP, and CDC.

Под Fc-гамма-рецептором, FcyR или FcgammaR в контексте данного документа подразумевается любой член семейства белков, который связывает Fc-область антитела IgG и кодируется геном FcyR. У людей это семейство включает без ограничения FcyRI (CD64), включая изоформы FcyRIa, FcyRIb, и FcyRIc; FcyRII (CD32), включая изоформы FcyRIIa (включая аллотипы Н131 и R131), FcyRIIb (включая FcyRIIb-1 и FcYRIIb-2) и FcyRIIc; и FcyRIII (CD16), включая изоформы FcyRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcyRIIIb (включая аллотипы FcyRIIb-NA1 и FcYRIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol. Lett, 82:57-65, полностью включена посредством ссылки), а также любые неизвестные FcyR или изоформы или аллотипы FcyR человека. В некоторых случаях, как указано в данном документе, связывание с однимUnder the Fc-gamma receptor, FcyR or FcgammaR in the context of this document means any member of the family of proteins that binds the Fc region of an IgG antibody and is encoded by the FcyR gene. In humans, this family includes, but is not limited to, FcyRI (CD64), including the FcyRIa, FcyRIb, and FcyRIc isoforms; FcyRII (CD32), including FcyRIIa (including H131 and R131 allotypes), FcyRIIb (including FcyRIIb-1 and FcYRIIb-2) and FcyRIIc isoforms; and FcyRIII (CD16), including the isoforms FcyRIIIa (including the V158 and F158 allotypes) and FcyRIIIb (including the FcyRIIb-NA1 and FcYRIIb-NA2 allotypes) (Jefferis et al., 2002, Immunol. Lett, 82:57-65, fully incorporated by references), as well as any unknown FcyR or human FcyR isoforms or allotypes. In some cases, as noted in this document, linking to one

- 10 040482 или более рецепторами FcyR снижается или устраняется. Например, уменьшение связывания с FcyRIIIa снижает АЗКЦ, а в некоторых случаях желательно уменьшение связывания с FcyRIIIa и FcyRIIb.- 10 040482 or more FcyR receptors are reduced or eliminated. For example, reduced binding to FcyRIIIa reduces ADCC, and in some cases, reduced binding to FcyRIIIa and FcyRIIb is desirable.

В контексте данного документа термин FcRn или неонатальный Fc-рецептор означает белок, который связывает Fc-область антитела IgG и кодируется, по меньшей мере частично, геном FcRn. FcRn может быть из любого организма, включая, но не ограничиваясь этим, людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. Как известно в данной области техники, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, которые часто называют тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2микроглобулин, а тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если в данном документе не указано иное, FcRn или белок FcRn относится к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином.In the context of this document, the term FcRn or neonatal Fc receptor means a protein that binds the Fc region of an IgG antibody and is encoded at least in part by the FcRn gene. The FcRn may be from any organism, including, but not limited to, humans, mice, rats, rabbits, and monkeys. As is known in the art, a functional FcRn protein contains two polypeptides, often referred to as a heavy chain and a light chain. The light chain is a beta-2 microglobulin and the heavy chain is encoded by the FcRn gene. Unless otherwise specified herein, an FcRn or FcRn protein refers to a FcRn heavy chain complex with beta-2-microglobulin.

В контексте данного документа под родительским полипептидом подразумевается исходный полипептид, который впоследствии модифицируют для получения варианта. Родительский полипептид может представлять собой полипептид природного происхождения или вариант или сконструированную версию полипептида природного происхождения. Родительский полипептид может относиться к самому полипептиду, композициям, которые содержат родительский полипептид, или к аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Соответственно в контексте данного документа родительский иммуноглобулин означает немодифицированный полипептид иммуноглобулина, который модифицирован для получения варианта, а родительское антитело в контексте данного документа означает немодифицированное антитело, которое модифицировано для получения варианта антитела. Следует отметить, что родительское антитело включает известные коммерческие, рекомбинантно продуцируемые антитела, как описано ниже.In the context of this document, the parent polypeptide means the original polypeptide, which is subsequently modified to obtain a variant. The parent polypeptide may be a naturally occurring polypeptide or a variant or engineered version of a naturally occurring polypeptide. Parental polypeptide can refer to the polypeptide itself, compositions that contain the parent polypeptide, or the amino acid sequence that encodes it. Accordingly, in the context of this document, parental immunoglobulin means an unmodified immunoglobulin polypeptide that has been modified to produce a variant, and parental antibody, as used herein, means an unmodified antibody that has been modified to produce a variant antibody. It should be noted that the parent antibody includes known commercial, recombinantly produced antibodies, as described below.

Под константной областью тяжелой цепи в данном документе подразумевается часть СН1шарнир-СН2-CH3 антитела, как правило, из IgG1, IgG2 или IgG4 человека.By heavy chain constant region, as used herein, is meant the CH1 hinge-CH2-CH3 portion of an antibody, typically from human IgG1, IgG2, or IgG4.

В контексте данного документа термин антиген-мишень означает молекулу, которая специфически связана с вариабельной областью данного антитела. В данном случае антиген-мишень представляет собой тау-белок, фосфорилированный в положении Ser413 (pSer413-Tay).As used herein, the term target antigen means a molecule that is specifically associated with the variable region of a given antibody. In this case, the target antigen is a tau protein phosphorylated at position Ser413 (pSer413-Tay).

В контексте данного документа под клеткой-мишенью подразумевается клетка, которая экспрессирует антиген-мишень.In the context of this document, a target cell refers to a cell that expresses a target antigen.

Под вариабельной областью в контексте данного документа подразумевается область иммуноглобулина, которая содержит один или более Ig-доменов, по существу кодируемых любым из генов V.kappa., V.lamda. и/или VH, которые составляют генетические локусы каппа, лямбда и тяжелой цепи иммуноглобулинов соответственно.By variable region, as used herein, is meant an immunoglobulin region that contains one or more Ig domains substantially encoded by any of the V.kappa., V.lamda genes. and/or VH, which make up the kappa, lambda, and immunoglobulin heavy chain genetic loci, respectively.

Под диким типом или ДТ в данном документе подразумевается аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, которая встречается в природе, включая аллельные вариации. Белок ДТ имеет аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была намеренно модифицирована.By wild type or WT, as used herein, is meant an amino acid sequence or nucleotide sequence that occurs naturally, including allelic variations. The DT protein has an amino acid sequence or a nucleotide sequence that has not been intentionally modified.

В контексте данного документа термин тау-белок означает любую из шести изоформ тау-белка человека, имеющих аминокислотные последовательности, определенные в SEQ ID NO: 1-6, т.е. 4R2N (определена в SEQ ID NO: 1), 4R1N (определена в SEQ ID NO: 2), 4R0N (определена в SEQ ID NO: 3), 3R2N (определена в SEQ ID NO: 4), 3R1N (определена в SEQ ID NO: 5) и 3R0N (определена в SEQ ID NO: 6), а также их генные варианты. Как объяснено в разделе Уровень техники изобретения выше, с FTDP-17, которое является наследственным нейродегенеративным заболеванием, связанным с когнитивными расстройствами, было связано более 40 мутаций. Однако сайты мутаций в тау-белке не должны ограничиваться участками, связанными с FTDP-17. Число аминокислотных мутаций, введенных в аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-6, не должно быть ограничено, но может составлять от 1 до 50, в частности от 1 до 30, более конкретно от 1 до 10. Однако аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотной последовательности, определенной в остатке серина в положении 413 SEQ ID NO: 1 (Ser413), предпочтительно должен быть сохранен. Тау-белок согласно данному изобретению также включает белки, имеющие сходство или идентичность, составляющие 80% или более, с аминокислотной последовательностью тау-белка человека, определенной в SEQ ID NO: 1 в соответствии с методом BLAST (с условиями PBLAST по умолчанию, предоставленными NCBI), и их изоформы. Такие тау-белки включают тау, полученные от видов, отличных от человека, таких как шимпанзе, макаки, лошади, свиньи, собаки, мыши, кролики и крысы. Можно получить терапевтический или профилактический агент, нацеленный на тау, полученный от такого отличного от человека животного, с целью улучшения когнитивной функции целевого животного.As used herein, the term tau protein means any of the six human tau protein isoforms having the amino acid sequences defined in SEQ ID NOs: 1-6, i.e. 4R2N (defined in SEQ ID NO: 1), 4R1N (defined in SEQ ID NO: 2), 4R0N (defined in SEQ ID NO: 3), 3R2N (defined in SEQ ID NO: 4), 3R1N (defined in SEQ ID NO: 4), NO: 5) and 3R0N (defined in SEQ ID NO: 6), as well as their gene variants. As explained in the Background of the Invention section above, more than 40 mutations have been associated with FTDP-17, which is an inherited neurodegenerative disease associated with cognitive impairment. However, mutation sites in the tau protein should not be limited to FTDP-17 related sites. The number of amino acid mutations introduced in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-6 should not be limited, but may be from 1 to 50, in particular from 1 to 30, more specifically from 1 to 10. However, the amino acid residue corresponding to the amino acid sequence defined at the serine residue at position 413 of SEQ ID NO: 1 (Ser413) should preferably be retained. The tau protein of the present invention also includes proteins having a similarity or identity of 80% or more to the human tau amino acid sequence determined in SEQ ID NO: 1 according to the BLAST method (with default PBLAST terms provided by NCBI ), and their isoforms. Such tau proteins include those derived from non-human species such as chimpanzees, macaques, horses, pigs, dogs, mice, rabbits and rats. A tau-targeting therapeutic or prophylactic agent derived from such a non-human animal can be made to improve the cognitive function of the target animal.

В контексте данного документа термин тау-пептид означает пептид, содержащий часть аминокислотной последовательности тау-белка. Положение и длина аминокислотной последовательности таупептида, полученной из белка тау, не должны быть ограничены, но предпочтительно должны содержать, например, серию из по меньшей мере трех последовательных аминокислот, в частности по меньшей мере пяти последовательных аминокислот, более конкретно по меньшей мере восьми последовательных аминокислот, полученных из аминокислотных остатков, соответствующих номерам аминокислот с 410 по 421 SEQ ID NO: 1, по меньшей мере, включая аминокислоту, соответствующую Ser413. Длина тау- 11 040482 пептида также не должна быть ограничена, но предпочтительно должна иметь длину в четыре или более аминокислот, в частности шесть или более, более конкретно восемь или более.In the context of this document, the term tau peptide means a peptide containing part of the amino acid sequence of a tau protein. The position and length of the amino acid sequence of the taupeptide derived from the tau protein should not be limited, but should preferably contain, for example, a series of at least three consecutive amino acids, in particular at least five consecutive amino acids, more specifically at least eight consecutive amino acids derived from amino acid residues corresponding to amino acid numbers 410 to 421 of SEQ ID NO: 1, at least including the amino acid corresponding to Ser413. The length of the tau 11 040482 peptide should also not be limited, but should preferably be four or more amino acids in length, in particular six or more, more in particular eight or more.

Используемый в данном документе термин тау в целом означает тау-белок или тау-пептид.As used herein, the term tau generally means tau protein or tau peptide.

Термин белок против pSer413-тау означает антитело, описанное в данном документе, которое предпочтительно связывается с тау-белком, фосфорилированным по серину в положении 413, по сравнению со связыванием тау-белка, не фосфорилированного по серину в положении 413. Белок тау, фосфорилированный по Ser413, может быть человеческим и/или мышиным.The term pSer413-tau protein means an antibody described herein that preferentially binds to a tau protein phosphorylated at position 413 at serine over binding to a tau protein not phosphorylated at position 413 at serine. Tau protein phosphorylated at position 413 Ser413 may be human and/or murine.

В контексте данного документа под положением подразумевается местоположение в последовательности белка. Положения могут быть пронумерованы последовательно или в соответствии с установленным форматом, например индексом EU для нумерации антител.In the context of this document, position refers to a location in a protein sequence. The positions may be numbered sequentially or according to an established format, such as the EU index for antibody numbering.

В контексте данного документа под остатком подразумевается положение в белке и связанная с ним аминокислотная идентичность. Например, аспарагин 297 (также называемый Asn297 или N297) представляет собой остаток в положении 297 антитела IgG1 человека.In the context of this document, a residue refers to a position in a protein and its associated amino acid identity. For example, asparagine 297 (also referred to as Asn297 or N297) is a residue at position 297 of a human IgG1 antibody.

В контексте данного изобретения положение аминокислотного остатка в тау-белке или тау-пептиде указывается посредством номера аминокислоты, который определяется на основе аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, в целях ясности. Например, аминокислотный остаток, соответствующий Ser413 SEQ ID NO: 1, означает остаток серина в положении 413 SEQ ID NO: 1 (4R2N), положении 384 SEQ ID NO: 2 (4R1N), положении 355 SEQ ID NO: 3 (4R0N), положении 382 SEQ ID NO: 4 (3R2N), положении 353 SEQ ID NO: 5 (3R1N) или положении 324 SEQ ID NO: 6 (3R0N). Соответствие положений аминокислотных остатков между изоформами тау показано в табл. 1 ниже.In the context of the present invention, the position of an amino acid residue in a tau protein or tau peptide is indicated by an amino acid number, which is determined based on the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1, for the sake of clarity. For example, the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1 means the serine residue at position 413 of SEQ ID NO: 1 (4R2N), position 384 of SEQ ID NO: 2 (4R1N), position 355 of SEQ ID NO: 3 (4R0N), position 382 of SEQ ID NO: 4 (3R2N), position 353 of SEQ ID NO: 5 (3R1N), or position 324 of SEQ ID NO: 6 (3R0N). Table 1 shows the correspondence between amino acid residue positions between tau isoforms. 1 below.

Таблица 1Table 1

Изоформы тау-белка человекаHuman tau isoforms

Изоформа Isoform 4R2N 4R2N 4R1N 4R1N 4R0N 4R0N 3R2N 3R2N 3R1N 3R1N 3R0N 3R0N Последователь Follower SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID ность ness NO: 1 NO: 1 NO: 2 NO: 2 NO: 3 NO: 3 NO: 4 NO: 4 NO: 5 NO: 5 NO: 6 NO: 6 Аминокислотный amino acid остаток remainder Аминокислотный номер Amino acid number Asn Asn 410 410 381 381 352 352 379 379 350 350 321 321 Vai Vai 411 411 382 382 353 353 380 380 351 351 322 322 Ser Ser 412 412 383 383 354 354 381 381 352 352 323 323 Ser Ser 413 413 384 384 355 355 382 382 353 353 324 324 Thr Thr 414 414 385 385 356 356 383 383 354 354 325 325 Gly gly 415 415 386 386 357 357 384 384 355 355 326 326 Ser Ser 416 416 387 387 358 358 385 385 356 356 327 327 He He 417 417 388 388 359 359 386 386 357 357 328 328 Asp asp 418 418 389 389 360 360 387 387 358 358 329 329 Met Met 419 419 390 390 361 361 388 388 359 359 330 330 Vai Vai 420 420 391 391 362 362 389 389 360 360 331 331 Asp asp 421 421 392 392 363 363 390 390 361 361 332 332

Хотя в табл. 1 показаны положения аминокислотных остатков этих изоформ, соответствующие положениям с 410 по 421 аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, соответствие положений аминокислотных остатков в других областях можно легко понять на основании, например, фиг. 1А и 1В. Специалист в данной области техники сможет определить соответствующие положения аминокислот в изоформах или гомологах, используя попарное выравнивание последовательностей, такое как метод Нидлмана-Вунша или метод Смита-Уотермана, или множественное выравнивание последовательностей, такое как метод ClustalW или метод PRRP. В качестве примера анализа соответствующих положений на фиг. 1А и 1В показано выравнивание аминокислотных последовательностей шести изоформ человека (с обозначением однобуквенным кодом) на основе ClustalW. Эти фигуры указывают, что структура вокруг аминокислотного остатка, соответствующего Ser413 аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, является консервативной среди шести изоформ.Although in Table. 1 shows the amino acid residue positions of these isoforms corresponding to positions 410 to 421 of the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1, the correspondence of amino acid residue positions in other regions can be easily understood based on, for example, FIG. 1A and 1B. One skilled in the art will be able to determine the corresponding positions of amino acids in isoforms or homologues using pairwise sequence alignments such as the Needleman-Wunsch method or the Smith-Waterman method, or multiple sequence alignments such as the ClustalW method or the PRRP method. As an example of the analysis of the respective positions in FIG. 1A and 1B show the alignment of the amino acid sequences of six human isoforms (denoted by a single letter code) based on ClustalW. These figures indicate that the structure around the amino acid residue corresponding to the Ser413 amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1 is conserved among the six isoforms.

Антитела по данному изобретению обычно являются выделенными или рекомбинантными. Термин выделенный, используемый для описания различных полипептидов, описанных в данном документе, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или извлечен из клетки или клеточной культуры, из которой он был экспрессирован. Обычно выделенный полипептид получают с помощью по меньшей мере одного этапа очистки. Выделенное антитело относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих различные антигенные специфичности. Рекомбинантный означает, что антитела созданы с использованием технологий рекомбинантных нуклеиновых кислот в экзогенных клетках-хозяевах.The antibodies of this invention are usually isolated or recombinant. The term isolated, as used to describe the various polypeptides described herein, means a polypeptide that has been identified and separated and/or recovered from the cell or cell culture from which it was expressed. Typically, an isolated polypeptide is obtained by at least one purification step. An isolated antibody refers to an antibody that is substantially free of other antibodies having different antigenic specificities. Recombinant means that the antibodies are created using recombinant nucleic acid technologies in exogenous host cells.

Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности в отношении последовательности белка определяется как процент аминокислотных остатков в кандидатской последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной (родительской) последовательности после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения наибольшего процента идентичности последовательности и без учета каких-либо консервативных замен как частиPercent (%) amino acid sequence identity with respect to a protein sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in a particular (parent) sequence after sequence alignment and gaps, if necessary, to achieve the highest percentage of sequence identity and regardless of what - any conservative substitutions as part

- 12 040482 идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть выполнено различными способами, известными специалисту в данной области техники, например, с помощью общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить нужные параметры для выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Одной конкретной программой является программа ALIGN-2, описанная в пунктах публикации США № 20160244525, включенной в данный документ посредством ссылки. Другое приблизительное выравнивание для последовательностей нуклеиновых кислот обеспечивается алгоритмом локальной гомологии Смита и Уотермана (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981)). Этот алгоритм может быть применен к аминокислотным последовательностям с использованием оценочной матрицы, разработанной Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl., 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, и нормализованной Gribskov, Nucl. Acids. Res., 14(6):6745-6763 (1986).- 12 040482 sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be performed in a variety of ways known to one of skill in the art, for example using open source software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR). Those skilled in the art can determine the desired alignment parameters, including any algorithms necessary to achieve maximum alignment over the entire length of the compared sequences. One particular program is the ALIGN-2 program described in US Publication No. 20160244525, incorporated herein by reference. Another approximate alignment for nucleic acid sequences is provided by Smith and Waterman's local homology algorithm (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981)). This algorithm can be applied to amino acid sequences using a scoring matrix developed by Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl., 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and normalized Gribskov, Nucl. Acids. Res. 14(6):6745-6763 (1986).

Пример реализации этого алгоритма для определения процента идентичности последовательности предоставлен Genetics Computer Group (Мэдисон, Висконсин) в служебном приложении BestFit. Параметры по умолчанию для этого метода описаны в Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, версия 8 (1995) (доступная от Genetics Computer Group, Мэдиссон, штат Висконсин). Другой способ установления процента идентичности в контексте данного изобретения заключается в использовании пакета программ MPSRCH, защищенного авторским правом Эдинбургского университета, разработанного Джоном Ф. Коллинзом и Шейном С. Стурроком и распространяемого IntelliGenetics, Inc. (Маунтин Вью, штат Калифорния). Из этого набора пакетов может быть использован алгоритм Смита-Уотермана, если для оценочной таблицы используются параметры по умолчанию (например, штраф за открытие гэпа, равный 12, штраф за продление гэпа, равный 1 и гэп, равный 6). Из сгенерированных данных значение соответствие (англ. - Match) отражает идентичность последовательности. Другие подходящие программы для вычисления процента идентичности или сходства между последовательностями в целом известны в данной области техники; например, другой программой выравнивания является BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP могут использоваться с использованием следующих параметров по умолчанию: генетический код=стандарт; фильтр=отсутствует; цепь=обе; отсечение=60; ожидание=10; матрица=BLOSUM62; описания=50 последовательностей; сортировать по=ВЫСШИЙ БАЛЛ; базы данных=неопределенная, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+переводы GenBank CDS+Swiss protein+Spupdate+PIR. Подробную информацию об этих программах можно найти по адресу в интернете: http://перед blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.An example implementation of this algorithm for determining percent sequence identity is provided by the Genetics Computer Group (Madison, WI) in the BestFit service application. The default parameters for this method are described in the Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (available from Genetics Computer Group, Madison, WI). Another way to establish percent identity in the context of this invention is to use the MPSRCH software package, copyrighted by the University of Edinburgh, developed by John F. Collins and Shane S. Sturrock and distributed by IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, California). From this set of packets, the Smith-Waterman algorithm can be used if default parameters are used for the scoring table (eg gap opening penalty of 12, gap extension penalty of 1 and gap of 6). From the generated data, the Match value reflects sequence identity. Other suitable programs for calculating percent identity or similarity between sequences are generally known in the art; for example, another alignment program is BLAST, used with default parameters. For example, BLASTN and BLASTP can be used using the following default parameters: genetic code=standard; filter=none; chain=both; cutoff=60; wait=10; matrix=BLOSUM62; descriptions=50 sequences; sort by=HIGHEST SCORE; databases=undefined, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS+Swiss protein+Spupdate+PIR transfers. Detailed information about these programs can be found on the Internet at: http://pre-blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

Степень идентичности между аминокислотной последовательностью по данному изобретению (последовательностью изобретения) и родительской аминокислотной последовательностью рассчитывают как число точных совпадений в выравнивании двух последовательностей, деленное на длину последовательности изобретения или длину родительской последовательности в зависимости от того, что является самым коротким. Результат выражают в процентах идентичности.The degree of identity between the amino acid sequence of the invention (sequence of the invention) and the parent amino acid sequence is calculated as the number of exact matches in the alignment of the two sequences divided by the length of the invention sequence or the length of the parent sequence, whichever is shortest. The result is expressed as a percentage of identity.

В некоторых вариантах осуществления две или более аминокислотных последовательностей имеют по меньшей мере 50, 60, 70, 80 или 90% идентичности. В некоторых вариантах осуществления две или более аминокислотных последовательностей имеют по меньшей мере 95, 97, 98, 99 или даже 100% идентичности.In some embodiments, two or more amino acid sequences have at least 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% identity. In some embodiments, two or more amino acid sequences are at least 95%, 97%, 98%, 99% or even 100% identical.

Специфическое связывание, или специфически связывается, или специфический в отношении конкретного антигена или эпитопа означает связывание, которое заметно отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу сходной структуры, которая не обладает активностью связывания. Например, специфическое связывание может быть определено путем конкуренции с контрольной молекулой, сходной с мишенью.Specific binding, or specific binding, or specific for a particular antigen or epitope means binding that is markedly different from non-specific interaction. Specific binding can be measured, for example, by determining the binding of the molecule compared to the binding of a control molecule, which is usually a molecule of similar structure that has no binding activity. For example, specific binding can be determined by competition with a control molecule similar to the target.

Термин K_assoc или K_a в контексте данного документа относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин K_dis или K_d в контексте данного документа относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин KD в контексте данного документа предназначен для обозначения константы диссоциации, получаемой из соотношения K_d к K_a (т.е. K_d/K_a), и выражается в молярной концентрации (М). Значения K_D для антител можно определить с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления способ определения KD антитела заключается в использовании поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием биосенсорной системы, такой как система BIACORE®. В определенных вариантах осуществления значение KD измеряют с фосфорилированным тау-белком. В некоторых вариантах осуществления значение KD измеряют с фосфорилированным пептидом. В некоторых вариантах осуществления значение KD измеряют с иммобилизованным антигеном (например, фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным пептидом). В других вариантах осуществления значение K_D измеряют с иммобилизованным антителом (например, родительским антителомThe term K _assoc or K _a as used herein refers to the rate of association of a particular antibody-antigen interaction, while the term K _dis or K _d as used herein refers to the rate of dissociation of a particular antibody-antigen interaction. The term KD in the context of this document is intended to mean the dissociation constant obtained from the ratio of K _d to K _a (ie K _d /K _a ), and is expressed in molar concentration (M). Antibody K _D values can be determined using methods well known in the art. In some embodiments, a method for determining the KD of an antibody is to use surface plasmon resonance, for example, using a biosensor system such as the BIACORE® system. In certain embodiments, the KD value is measured with phosphorylated tau protein. In some embodiments, the KD value is measured with a phosphorylated peptide. In some embodiments, the KD value is measured with an immobilized antigen (eg, phosphorylated tau protein or phosphorylated peptide). In other embodiments, the K _D value is measured with an immobilized antibody (e.g., the parent antibody

- 13 040482 мыши, химерным антителом или вариантами гуманизированного антитела). В других вариантах осуществления значение K_D измеряют с фосфорилированным тау-белком в качестве аналита. В других вариантах осуществления значение K_D измеряют с фосфорилированным пептидом в качестве аналита. В определенных вариантах осуществления значение K_D измеряют в режиме двухвалентного связывания. В других вариантах осуществления значение K_D измеряют в режиме одновалентного связывания.- 13 040482 mice, chimeric antibody or humanized antibody variants). In other embodiments, the K _D value is measured with phosphorylated tau protein as the analyte. In other embodiments, the K _D value is measured with a phosphorylated peptide as the analyte. In certain embodiments, the K _D value is measured in bivalent binding mode. In other embodiments, the K _D value is measured in univalent binding mode.

Заболевание включает состояние здоровья животного, включая человека, при котором животное не может поддерживать гомеостаз, и если заболевание не улучшается, то здоровье животного продолжает ухудшаться.A disease includes a state of health in an animal, including a human, in which the animal cannot maintain homeostasis, and if the disease does not improve, then the health of the animal continues to decline.

Напротив, расстройство у животного, включая человека, включает состояние здоровья, при котором животное способно поддерживать гомеостаз, но состояние здоровья животного менее благоприятное, чем оно было бы в отсутствие расстройства. При отсутствии лечения расстройство не обязательно приводит к дальнейшему ухудшению состояния здоровья животного.In contrast, a disorder in an animal, including humans, includes a health condition in which the animal is able to maintain homeostasis, but the animal's health is less favorable than it would be in the absence of the disorder. Left untreated, the disorder does not necessarily lead to further deterioration in the health of the animal.

Термины лечение, процесс лечения, лечить и т.п. относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома или снижения вероятности заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного воздействия, связанного с заболеванием. В контексте данного документа термин лечение охватывает любое лечение заболевания у млекопитающих, в частности у человека, и включает в себя (а) предотвращение появления заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого это заболевание еще не диагностировано;Terms treatment, treatment process, treat, etc. relate to obtaining the desired pharmacological and/or physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof, or reducing the likelihood of a disease or symptom thereof, and/or may be therapeutic in terms of partially or completely curing a disease and/or an adverse effect associated with the disease. As used herein, the term treatment encompasses any treatment of a disease in a mammal, in particular a human, and includes (a) preventing the onset of a disease in a subject who may be predisposed to the disease but who has not yet been diagnosed with the disease;

(b) ингибирование заболевания, т.е. прекращение его развития или прогрессии; и (с) облегчение заболевания, т.е. регрессию заболевания и/или облегчение одного или более симптомов заболевания.(b) inhibition of the disease, ie. cessation of its development or progression; and (c) alleviating the disease, ie. regression of the disease and/or alleviation of one or more symptoms of the disease.

Лечение также подразумевает доставку агента для обеспечения фармакологического эффекта даже в отсутствие заболевания или патологического состояния. Например, лечение включает доставку композиции, которая может вызывать иммунный ответ или придавать иммунитет, в отсутствие болезненного состояния, например, в случае вакцинации.Treatment also involves the delivery of an agent to provide a pharmacological effect even in the absence of a disease or pathological condition. For example, treatment includes delivering a composition that can elicit an immune response or confer immunity in the absence of a disease state, such as in the case of vaccination.

Используемый в данном документе термин млекопитающее относится к любому млекопитающему, включая, но не ограничиваясь этим, млекопитающих отряда Rodentia, таких как мыши и хомяки, и млекопитающих отряда Logomorpha, таких как кролики. В некоторых вариантах осуществления млекопитающие относятся к отряду Carnivora, включая кошачьих (кошки) и собачьих (собаки). В некоторых вариантах осуществления млекопитающие относятся к отряду Artiodactyla, включая крупный рогатый скот (коровы) и свиней (свиньи), или отряду Perssodactyla, включая лошадиных (лошади). Наиболее предпочтительно, чтобы млекопитающие были из отряда Primates, Ceboids или Simoids (обезьяны) или из отряда Anthropoids (люди и высшие приматы). В некоторых вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека.As used herein, the term mammal refers to any mammal, including, but not limited to, mammals of the order Rodentia, such as mice and hamsters, and mammals of the Order Logomorpha, such as rabbits. In some embodiments, the mammals belong to the order Carnivora, including felines (cats) and canines (dogs). In some embodiments, the mammals belong to the order Artiodactyla, including cattle (cows) and pigs (pigs), or the order Perssodactyla, including equids (horses). Most preferably, the mammals are from the order Primates, Ceboids or Simoids (monkeys) or from the order Anthropoids (humans and higher primates). In some embodiments, the mammal is a human.

Используемый в данном документе термин регрессия, а также его производные слова, не обязательно подразумевают 100% или полную регрессию. Скорее, существуют различные степени регрессии, которые специалисты в данной области техники расценивают как имеющие потенциальную пользу или терапевтический эффект. В этом отношении раскрытые способы могут обеспечить любое количество любого уровня регрессии таупатии у млекопитающего. Кроме того, регрессия, обеспечиваемая способом по изобретению, может включать регрессию одного или более патологических состояний или симптомов заболевания, например таупатии. Кроме того, в целях данного описания регрессия может включать задержку начала заболевания, задержку появления симптома и/или задержку начала патологического состояния. Что касается прогрессирующих заболеваний и расстройств, то регрессия может включать замедление прогрессирования заболевания или расстройства, замедление прогрессирования симптома заболевания или расстройства и/или замедление прогрессирования патологического состояния.As used in this document, the term regression, as well as its derivatives, do not necessarily imply 100% or complete regression. Rather, there are varying degrees of regression that those skilled in the art regard as having a potential benefit or therapeutic effect. In this regard, the disclosed methods can provide any amount of any level of regression of tauopathy in a mammal. In addition, the regression provided by the method of the invention may include the regression of one or more pathological conditions or symptoms of a disease, such as tauopathy. In addition, for the purposes of this description, regression may include a delay in the onset of a disease, a delay in the onset of a symptom, and/or a delay in the onset of a pathological condition. With respect to progressive diseases and disorders, regression may include slowing the progression of a disease or disorder, slowing the progression of a symptom of a disease or disorder, and/or slowing the progression of a pathological condition.

Эффективное количество или терапевтически эффективное количество композиции включает такое количество композиции, которое является достаточным для оказания благоприятного эффекта для субъекта, которому вводят композицию. Эффективное количество средства доставки включает это количество, достаточное для эффективного связывания или доставки композиции.An effective amount or a therapeutically effective amount of a composition includes an amount of the composition that is sufficient to provide a beneficial effect to the subject to whom the composition is administered. An effective amount of a delivery agent includes that amount sufficient to effectively bind or deliver the composition.

Под индивидуумом, хозяином, субъектом или пациентом подразумевается любой субъектмлекопитающее, для которого требуется диагностика, лечение или терапия, в особенности люди. Другие субъекты могут включать крупный рогатый скот, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей и т.д.By subject, host, subject, or patient is meant any mammalian subject for whom diagnosis, treatment, or therapy is required, especially humans. Other subjects may include cattle, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, and the like.

В контексте данного документа термин в комбинации с относится к применениям, в которых, например, первое лекарственное средство вводится в течение всего курса введения второго лекарственного средства;In the context of this document, the term in combination with refers to applications in which, for example, the first drug is administered during the entire course of administration of the second drug;

в которых первое лекарственное средство вводится в течение периода времени, который перекрывается с периодом введения второго лекарственного средства, например, когда введение первого лекарственного средства начинается до введения второго лекарственного средства и введение первого лекар- 14 040482 ственного средства заканчивается до завершения введения второго лекарственного средства;in which the first drug is administered for a period of time that overlaps with the period of administration of the second drug, for example, when the administration of the first drug begins before the administration of the second drug and the administration of the first drug ends before the completion of the administration of the second drug;

в которых введение второго лекарственного средства начинается до введения первого лекарственного средства и введение второго лекарственного средства заканчивается до завершения введения первого лекарственного средства;wherein the administration of the second drug begins before the administration of the first drug and the administration of the second drug ends before the completion of the administration of the first drug;

в которых введение первого лекарственного средства начинается до введения второго лекарственного средства, а введение второго лекарственного средства заканчивается до завершения введения первого лекарственного средства;in which the administration of the first drug begins before the administration of the second drug, and the administration of the second drug ends before the completion of the administration of the first drug;

в которых введение второго лекарственного средства начинается до введения первого лекарственного средства, а введение первого лекарственного средства заканчивается до завершения введения второго лекарственного средства.in which the administration of the second drug begins before the administration of the first drug, and the administration of the first drug ends before the completion of the administration of the second drug.

Соответственно термин в комбинации также может относиться к режимам, предполагающим введение двух или более лекарственных средств. В контексте данного документа термин в комбинации с также относится к введению двух или более лекарственных средств, которые могут вводиться в одном или в разных составах, одинаковым или разными путями, а также в одинаковой или разной дозированной форме.Accordingly, the term in combination may also refer to regimens involving the administration of two or more drugs. As used herein, the term in combination with also refers to the administration of two or more drugs, which may be administered in the same or different formulations, by the same or different routes, and in the same or different dosage form.

Термин кодирующий относится к характерному свойству конкретных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, предназначенном, чтобы служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющем определенную последовательность нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот, а также к биологическим свойствам, вытекающим из этого. Таким образом, ген кодирует белок, если, например, транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, приводит к выработке белка в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно предоставляется в перечнях последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут рассматриваться как кодирующие белок или другой продукт этого гена или кДНК.The term coding refers to the characteristic property of particular nucleotide sequences in a polynucleotide, such as a gene, cDNA, or mRNA, intended to serve as templates for the synthesis of other polymers and macromolecules in biological processes, having a particular nucleotide sequence (i.e., rRNA, tRNA, and mRNA) or a specific sequence of amino acids, as well as the biological properties resulting from this. Thus, a gene encodes a protein if, for example, transcription and translation of the mRNA corresponding to that gene results in the production of a protein in a cell or other biological system. Both a coding strand whose nucleotide sequence is identical to an mRNA sequence and is commonly provided in sequence listings, and a non-coding strand used as a template for transcription of a gene or cDNA can be considered to encode a protein or other product of that gene or cDNA.

Термин нуклеиновая кислота включает молекулы РНК или ДНК, имеющие более одного нуклеотида в любой форме, включая одноцепочечную, двухцепочечную, олигонуклеотид или полинуклеотид. Термин нуклеотидная последовательность включает упорядочение нуклеотидов в олигонуклеотиде или полинуклеотиде в одноцепочечной форме нуклеиновой кислоты.The term nucleic acid includes RNA or DNA molecules having more than one nucleotide in any form, including single-stranded, double-stranded, oligonucleotide or polynucleotide. The term nucleotide sequence includes the ordering of nucleotides in an oligonucleotide or polynucleotide in a single stranded form of a nucleic acid.

Под конструкцией нуклеиновой кислоты подразумевается последовательность нуклеиновой кислоты, которая была сконструирована так, чтобы содержать одну или более функциональных единиц, не встречающихся вместе в природе. Примеры включают кольцевые, линейные, двухцепочечные молекулы внехромосомной ДНК (плазмиды), космиды (плазмиды, содержащие последовательности COS из фага лямбда), вирусные геномы, включая ненативные последовательности нуклеиновых кислот, и т.п.By "nucleic acid construct" is meant a nucleic acid sequence that has been designed to contain one or more functional units that do not occur together in nature. Examples include circular, linear, double-stranded extrachromosomal DNA molecules (plasmids), cosmids (plasmids containing COS sequences from lambda phage), viral genomes including non-native nucleic acid sequences, and the like.

Используемый в данном документе термин функционально связанный включает полинуклеотид, функционально связанный со вторым полинуклеотидом, например одноцепочечный или двухцепочечный фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий два полинуклеотида, расположенных внутри фрагмента нуклеиновой кислоты таким образом, что по меньшей мере один из двух полинуклеотидов способен оказывать физиологическое воздействие, которым он характеризуется, на другой. Например, промотор, функционально связанный с кодирующей областью гена, способен стимулировать транскрипцию кодирующей области. Порядок, определенный при указании функциональной связи, не важен. Например, фразы: промотор функционально связан с нуклеотидной последовательностью и нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором используются в данном документе взаимозаменяемо и считаются эквивалентными. В некоторых случаях, когда нуклеиновая кислота, кодирующая желаемый белок, дополнительно содержит промотор/регуляторную последовательность, промотор/регуляторная последовательность располагается на 5'-конце желаемой кодирующей белок последовательности, так что она управляет экспрессией желаемого белка в клетке.As used herein, the term operably linked includes a polynucleotide operably linked to a second polynucleotide, such as a single-stranded or double-stranded nucleic acid fragment containing two polynucleotides located within the nucleic acid fragment such that at least one of the two polynucleotides is capable of exerting a physiological effect that it is characterized, on the other. For example, a promoter operably linked to the coding region of a gene is capable of driving transcription of the coding region. The order specified when specifying a functional relationship is not important. For example, the phrases: a promoter is operably linked to a nucleotide sequence and a nucleotide sequence is operably linked to a promoter are used interchangeably herein and are considered equivalent. In some cases, where the nucleic acid encoding the desired protein further comprises a promoter/regulatory sequence, the promoter/regulatory sequence is located at the 5' end of the desired protein-coding sequence so that it directs the expression of the desired protein in the cell.

Термины олигонуклеотид, полинуклеотид и молекула нуклеиновой кислоты, взаимозаменяемо употребляемые в данном документе, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, как рибонуклеотидов, так и дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, этот термин включает в себя, но не ограничивается этим, одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. Основная цепь полинуклеотида может содержать сахара и фосфатные группы (которые обычно могут быть найдены в РНК или ДНК) или модифицированные или замещенные сахарные или фосфатные группы.The terms oligonucleotide, polynucleotide, and nucleic acid molecule, used interchangeably herein, refer to the polymeric form of nucleotides of any length, both ribonucleotides and deoxyribonucleotides. Thus, the term includes, but is not limited to, single-, double-, or multi-stranded DNA or RNA, genomic DNA, cDNA, DNA-RNA hybrids, or a polymer containing purine and pyrimidine bases or other natural, chemically or biochemically modified , unnatural or derivatized nucleotide bases. The backbone of a polynucleotide may contain sugars and phosphate groups (which can usually be found in RNA or DNA) or modified or substituted sugar or phosphate groups.

Термин рекомбинантный применительно к полинуклеотиду означает, что полинуклеотид является продуктом различных комбинаций этапов клонирования, рестрикции или лигирования и других процедур, приводящих к получению конструкции, отличной и/или отличающейся от полинуклеотида, обнаруживаемого в природе. Эти термины, соответственно, включают реплики исходной полинуклеотидной конструкции и потомство исходной вирусной конструкции.The term recombinant in relation to a polynucleotide means that the polynucleotide is the product of various combinations of cloning, restriction or ligation steps and other procedures resulting in a construct different and/or different from the polynucleotide found in nature. These terms respectively include replicas of the original polynucleotide construct and progeny of the original viral construct.

Используемый в данном документе термин промотор включает последовательность ДНК, функ- 15 040482 ционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей транскрибированию, такой как последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая желаемую молекулу. Промотор обычно расположен выше последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащей транскрибированию, и обеспечивает сайт для специфического связывания РНК-полимеразой и другими факторами транскрипции.As used herein, the term promoter includes a DNA sequence operably linked to a nucleic acid sequence to be transcribed, such as a nucleic acid sequence encoding a desired molecule. The promoter is usually located upstream of the nucleic acid sequence to be transcribed and provides a site for specific binding by RNA polymerase and other transcription factors.

Вектор способен переносить последовательности генов в клетки-мишени. Как правило, векторная конструкция, вектор экспрессии и вектор переноса гена означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией представляющего интерес гена и которая может переносить последовательности генов в клетки-мишени, что может быть достигнуто путем геномной интеграции всего или части вектора, или временного или наследуемого поддержания вектора как внехромосомного элемента. Таким образом, этот термин включает клонирующие и экспрессионные носители, а также интегрирующиеся векторы.The vector is capable of transferring gene sequences to target cells. In general, vector construct, expression vector and gene transfer vector means any nucleic acid construct capable of directing the expression of a gene of interest and which can transfer gene sequences to target cells, which can be achieved by genomic integration of all or part of the vector, either temporally or heritable maintenance of the vector as an extrachromosomal element. Thus, this term includes cloning and expression carriers, as well as integrating vectors.

Используемый в данном документе термин регуляторный элемент включает нуклеотидную последовательность, которая контролирует некоторые аспекты экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот. Примеры регуляторных элементов в качестве иллюстрации включают энхансер, участок внутренней посадки рибосомы (IRES), интрон, точку начала репликации, сигнал полиаденилирования (рА), промотор, энхансер, последовательность терминации транскрипции и вышележащий регуляторный домен, которые вносят вклад в репликацию, транскрипцию и/или посттранскрипционный процессинг последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых случаях регуляторные элементы могут также включать цис-регуляторные элементы ДНК, а также подвижные элементы (ПЭ). Специалисты в данной области техники способны выбрать и использовать эти и другие регуляторные элементы в экспрессионной конструкции с помощью обычных экспериментов. Экспрессионные конструкции могут быть получены с использованием генетического рекомбинантного подхода или синтетически с использованием хорошо известной методологии.As used herein, the term regulatory element includes a nucleotide sequence that controls certain aspects of the expression of nucleic acid sequences. Illustrative examples of regulatory elements include an enhancer, an internal ribosome entry site (IRES), an intron, an origin of replication, a polyadenylation signal (pA), a promoter, an enhancer, a transcription termination sequence, and an upstream regulatory domain that contribute to replication, transcription and/or or post-transcriptional processing of a nucleic acid sequence. In some cases, regulatory elements may also include cis-regulatory DNA elements as well as transposable elements (PEs). Those skilled in the art are able to select and use these and other regulatory elements in an expression construct using routine experimentation. Expression constructs can be generated using a genetic recombinant approach or synthetically using well known methodology.

Контрольный элемент или контрольная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, участвующую во взаимодействии молекул, способствующих функциональной регуляции полинуклеотида, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию или деградацию полинуклеотида. Регулирование может влиять на частоту, скорость или специфичность процесса и может быть усиливающим или ингибирующим по своей природе. Контрольные элементы, известные в данной области техники, включают, например, регуляторные последовательности транскрипции, такие как промоторы и энхансеры. Промотор представляет собой область ДНК, способную в определенных условиях связывать РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию кодирующей области, обычно расположенной ниже по ходу транскрипции (в направлении 3') от промотора.A control element or control sequence is a nucleotide sequence involved in the interaction of molecules that contribute to the functional regulation of a polynucleotide, including replication, duplication, transcription, splicing, translation or degradation of the polynucleotide. Regulation may affect the frequency, rate or specificity of the process and may be reinforcing or inhibitory in nature. Control elements known in the art include, for example, transcription control sequences such as promoters and enhancers. A promoter is a region of DNA capable, under certain conditions, of binding RNA polymerase and initiating transcription of a coding region, usually located downstream of the transcription (in the 3' direction) from the promoter.

В контексте данного документа утверждение о том, что аминокислотный остаток является фосфорилированным, означает, что фосфатная группа связана сложноэфирной связью с боковой цепью аминокислотного остатка. Типичные аминокислотные остатки, которые могут быть фосфорилированы, включают серин (Ser), треонин (Thr) и тирозин (Tyr).As used herein, a statement that an amino acid residue is phosphorylated means that the phosphate group is ester-linked to the side chain of the amino acid residue. Typical amino acid residues that can be phosphorylated include serine (Ser), threonine (Thr) and tyrosine (Tyr).

Антитела.Antibodies.

Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые связывают тау-белок человека, который был фосфорилирован в положении 413.The present invention relates to antibodies and antigen-binding fragments that bind a human tau protein that has been phosphorylated at position 413.

Традиционные структурные единицы антитела обычно содержат тетрамер. Каждый тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (обычно имеющую молекулярную массу около 25 кДа) и одну тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу около 50-70 кДа). Легкие цепи человека классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Настоящее изобретение относится к антителам, обычно на основе класса IgG, который имеет несколько подклассов, включая, но не ограничиваясь ими, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В целом IgG1, IgG2 и IgG4 используются чаще, чем IgG3. Следует отметить, что IgG1 имеет разные аллотипы с полиморфизмом в 356 (D или Е) и 358 (L или М). Последовательности, приведенные в данном документе, используют аллотип 356D/358L, однако другой аллотип включен в данный документ. Т.е. любая последовательность, содержащая Fc-домен IgG1, включенный в данный документ, может иметь аллотип 356Е/358М, заменяющий 356D/358L.The traditional structural units of an antibody usually contain a tetramer. Each tetramer typically consists of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one light chain (typically having a molecular weight of about 25 kDa) and one heavy chain (typically having a molecular weight of about 50-70 kDa). Human light chains are classified as kappa and lambda light chains. The present invention relates to antibodies, usually based on the IgG class, which has several subclasses, including, but not limited to, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. In general, IgG1, IgG2 and IgG4 are used more frequently than IgG3. It should be noted that IgG1 has different allotypes with polymorphisms in 356 (D or E) and 358 (L or M). The sequences given in this document use the 356D/358L allotype, however, a different allotype is included in this document. Those. any sequence containing an IgG1 Fc domain included herein may have the 356E/358M allotype replacing 356D/358L.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, точная нумерация и размещение CDR могут отличаться в разных системах нумерации. Однако следует понимать, что раскрытие последовательности вариабельной тяжелой и/или вариабельной легкой цепи включает раскрытие связанных (характерных) CDR. Соответственно раскрытие каждой вариабельной области тяжелой цепи является раскрытием vhCDR (например, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3), а раскрытие каждой вариабельной области легкой цепи является раскрытием vlCDR (например, vlCDR1, V1CDR2 и V1CDR3).As will be understood by those skilled in the art, the precise numbering and placement of the CDRs may differ in different numbering systems. However, it should be understood that disclosure of a variable heavy and/or variable light chain sequence includes disclosure of associated (characteristic) CDRs. Accordingly, each heavy chain variable region opening is a vhCDR (eg, vhCDR1, vhCDR2, and vhCDR3) and each light chain variable region opening is a vlCDR (eg, vlCDR1, V1CDR2, and V1CDR3).

Способы идентификации последовательности каждой из CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 антитела включают Метод Kabat (Rabat et al., The Journal of Immunology, 1991, vol. 147, № 5, p. 1709-1719) и метод Chothia (Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, vol. 273, № 4, p. 927-948). Эти методы известны специалистам в данной области техники, их краткое изложение доступно, например, на веб-сайте Dr. Andrew C.R. Martin's Group (http://www.bioinf.org.uk/abs/).Methods for identifying the sequence of each of the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 antibodies include the Kabat Method (Rabat et al., The Journal of Immunology, 1991, vol. 147, no. 5, pp. 1709-1719) and the Chothia method (Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, vol. 273, no. 4, pp. 927-948). These methods are known to those skilled in the art, and a summary of them is available, for example, on the website of Dr. Andrew C.R. Martin's Group (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

- 16 040482- 16 040482

Полезное сравнение нумерации CDR приведено ниже (см. Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol.,A useful comparison of CDR numbering is given below (see Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol.,

27(1):55-77 (2003)). __________________________________________________________________27(1):55-77 (2003)). __________________________________________________________________

Kabat+ Kabat+ IMGT IMGT Kabat Kabat AbM AbM Chothia Chothia Контакт Contact Chothia Chothia vhCDRl vhCDRl 26-35 26-35 27-38 27-38 31-35 31-35 26-35 26-35 26-32 26-32 30-35 30-35 vhCDR2 vhCDR2 50-65 50-65 56-65 56-65 50-65 50-65 50-58 50-58 52-56 52-56 47-58 47-58 vhCDR3 vhCDR3 95-102 95-102 105-117 105-117 95-102 95-102 95-102 95-102 95-102 95-102 93-101 93-101 vlCDRl vlCDRl 24-34 24-34 27-38 27-38 24-34 24-34 24-34 24-34 24-34 24-34 30-36 30-36 V1CDR2 V1CDR2 50-56 50-56 56-65 56-65 50-56 50-56 50-56 50-56 50-56 50-56 46-55 46-55 V1CDR3 V1CDR3 89-97 89-97 105-117 105-117 89-97 89-97 89-97 89-97 89-97 89-97 89-96 89-96

В данном описании система нумерации Kabat обычно используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1-113 вариабельной области тяжелой цепи), а система нумерации EU для константных областей, таких как Fc-области (например, Kabat et al. выше (1991)).In this specification, the Kabat numbering system is generally used to denote a residue in a variable domain (approximately residues 1-107 of the light chain variable region and residues 1-113 of the heavy chain variable region), and the EU numbering system for constant regions such as Fc regions (e.g. , Kabat et al supra (1991)).

Данное изобретение предоставляет ряд различных наборов CDR. В этом случае полный набор CDR содержит три CDR вариабельного домена тяжелой цепи и три CDR вариабельного домена легкой цепи, например vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3. Они могут быть частью большего вариабельного домена легкой цепи или тяжелой цепи соответственно. Кроме того, как более полно описано в данном документе, вариабельные домены тяжелой цепи и вариабельные домены легкой цепи могут находиться в отдельных полипептидных цепях, когда используется тяжелая цепь и легкая цепь (например, когда используются Fab), или в одной полипептидной цепи в случае последовательности scFv.The present invention provides a number of different sets of CDRs. In this case, the complete set of CDRs contains three heavy chain variable domain CDRs and three light chain variable domain CDRs, eg vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 and vhCDR3. They may be part of a larger light chain or heavy chain variable domain, respectively. In addition, as more fully described herein, the heavy chain variable domains and the light chain variable domains may be in separate polypeptide chains when a heavy chain and a light chain are used (for example, when Fabs are used), or in the same polypeptide chain in the case of a sequence scFv.

CDR вносят вклад в образование антигенсвязывающего или, более конкретно, эпитопсвязывающего сайта антител. Эпитоп относится к детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Эпитопы представляют собой группы молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахара, и обычно имеют специфические структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Один антиген может иметь более одного эпитопа.CDRs contribute to the formation of the antigen-binding, or more specifically, epitope-binding site of antibodies. An epitope refers to a determinant that interacts with a specific antigen-binding site in the variable region of an antibody molecule known as a paratope. Epitopes are groups of molecules, such as amino acids or sugar side chains, and usually have specific structural characteristics as well as specific charge characteristics. One antigen may have more than one epitope.

В данном случае эпитоп содержит не только аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании антител по изобретению, но также фосфорилирование по Ser413.In this case, the epitope contains not only amino acid residues directly involved in the binding of antibodies according to the invention, but also phosphorylation at Ser413.

Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь, ответственную за эффекторную функцию. Kabat et al. собрали многочисленные первичные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. Основываясь на степени консервативности последовательностей, они классифицировали отдельные первичные последовательности как CDR и каркасную область и составили их список (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, № 91-3242, E.A. Kabat et al., полностью включена посредством ссылки).The carboxy-terminal portion of each chain defines a constant region primarily responsible for effector function. Kabat et al. collected numerous primary sequences of the variable regions of the heavy chains and light chains. Based on the degree of sequence conservation, they classified and listed individual primary sequences as CDRs and frameworks (see SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, no. 91-3242, E.A. Kabat et al., incorporated by reference in full) .

В подклассе иммуноглобулинов IgG имеется несколько доменов иммуноглобулинов в тяжелой цепи. Под доменом иммуноглобулина (Ig) в данном документе подразумевается область иммуноглобулина, имеющая характерную третичную структуру. В данном изобретении интерес представляют домены тяжелой цепи, в том числе константные домены тяжелой цепи (СН) и шарнирные домены. В контексте антител IgG каждый изотипов IgG имеет три области СН. Соответственно домены СН в контексте IgG являются следующими: СН1 относится к положениям 118-220 в соответствии с индексом EU, как в Kabat. CH2 относится к положениям 237-340 в соответствии с индексом EU, как в Kabat, a CH3 относится к положениям 341-447 в соответствии с индексом EU, как в Kabat.Within the IgG immunoglobulin subclass, there are several immunoglobulin domains in the heavy chain. An immunoglobulin (Ig) domain, as used herein, refers to an immunoglobulin region having a characteristic tertiary structure. In the present invention, heavy chain domains, including heavy chain constant domains (CH) and hinge domains, are of interest. In the context of IgG antibodies, each IgG isotype has three CH regions. Accordingly, the CH domains in the context of IgG are as follows: CH1 refers to positions 118-220 according to the EU index, as in Kabat. CH2 refers to positions 237-340 under the EU suffix, as in Kabat, and CH3 refers to positions 341-447 under the EU suffix, as in Kabat.

Другим типом домена Ig тяжелой цепи является шарнирная область. Под шарниром, или шарнирной областью, или шарнирной областью антитела, или шарнирной областью иммуноглобулина в данном документе подразумевается гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно домен CH1 IgG заканчивается в положении 220 по EU, а домен СН2 IgG начинается с остатка в положении 237 по EU. Таким образом, для IgG шарнир антитела в данном описании определен как включающий положения от 221 (D221 в IgG1) до 236 (G236 в IgG1), где нумерация соответствует индексу EU, как в Kabat. В некоторых вариантах осуществления, например, в контексте Fc-области, включен нижний шарнир, причем нижний шарнир обычно относится к положениям 226 или 230. Как отмечено в данном документе, в шарнирной области также могут быть осуществлены pI-варианты.Another type of heavy chain Ig domain is the hinge region. By hinge, or hinge region, or antibody hinge region, or immunoglobulin hinge region, as used herein, is meant a flexible polypeptide containing amino acids between the first and second constant domains of an antibody. Structurally, the IgG CH1 domain ends at EU position 220 and the IgG CH2 domain begins at EU position 237. Thus, for IgG, the antibody hinge is defined herein to include positions 221 (D221 in IgG1) to 236 (G236 in IgG1), where the numbering corresponds to the EU index, as in Kabat. In some embodiments, for example in the context of the Fc region, a lower hinge is included, with the lower hinge typically at positions 226 or 230. As noted herein, pI variants can also be implemented in the hinge region.

Легкая цепь обычно содержит два домена: вариабельный домен легкой цепи (содержащий CDR легкой цепи и вместе с вариабельными доменами тяжелой цепи, образующий Fv-область) и константную область легкой цепи (часто называемую CL или Ск).A light chain typically contains two domains: a light chain variable domain (containing the light chain CDRs and, together with the heavy chain variable domains, forming the Fv region) and a light chain constant region (often referred to as CL or Ck).

Другой областью, представляющей интерес для дополнительных замен, описанной ниже, является Fc-область.Another region of interest for additional substitutions, described below, is the Fc region.

- 17 040482- 17 040482

Таким образом, данное изобретение относится к различным доменам антител. Как описано в данном документе и известно в данной области техники, антитела по изобретению содержат различные домены в тяжелой и легкой цепях, которые также могут перекрываться. Эти домены включают, но не ограничиваются ими, домен Fc, домен СН1, домен СН2, домен CH3, шарнирный домен, константный домен тяжелой цепи (домен CH1-шарнир-Fc или СН1-шарнир-СН2-CH3) вариабельный домен тяжелой цепи, вариабельный домен легкой цепи, константный домен легкой цепи, домены Fab и домены scFv.Thus, this invention relates to various domains of antibodies. As described herein and known in the art, the antibodies of the invention contain distinct domains in the heavy and light chains, which may also overlap. These domains include, but are not limited to, Fc domain, CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain, hinge domain, heavy chain constant domain (CH1-hinge-Fc domain or CH1-hinge-CH2-CH3) heavy chain variable domain, variable light chain domain, light chain constant domain, Fab domains, and scFv domains.

Таким образом, домен Fc содержит домен -СН2-СНЗ и необязательно шарнирный домен. Тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен, который содержит домен СН1шарнир-Fc, содержащий СН2-СНЗ. Легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. scFv содержит вариабельный домен тяжелой цепи, линкер scFv и вариабельный домен легкой цепи. Некоторые варианты осуществления изобретения содержат по меньшей мере один домен scFv, который, хотя и не встречается в природе, обычно включает вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, связанные вместе линкером scFv. Как указано в данном документе, в то время как домен scFv обычно от N- до С-конца ориентирован как vh-scFv линкер-vl, этот порядок можно изменить для любого из доменов scFv (или доменов, сконструированных с использованием последовательностей vh и vl из Fab) на vl-scFv линкер-vh.Thus, the Fc domain contains a -CH2-CH3 domain and optionally a hinge domain. The heavy chain contains a heavy chain variable domain and a constant domain which contains a CH1 hinge-Fc domain containing CH2-CH3. The light chain contains a light chain variable domain and a light chain constant domain. scFv contains a heavy chain variable domain, an scFv linker, and a light chain variable domain. Some embodiments of the invention contain at least one scFv domain, which, although not naturally occurring, typically includes a heavy chain variable domain and a light chain variable domain linked together by an scFv linker. As stated herein, while the scFv domain is typically oriented N- to C-terminally as a vh-scFv linker-vl, this order can be reversed for any of the scFv domains (or domains constructed using the vh and vl sequences from Fab) to vl-scFv linker-vh.

Как показано в данном документе, существует ряд подходящих линкеров scFv, которые можно использовать, включая традиционные пептидные связи, создаваемые рекомбинантными технологиями. Линкерный пептид может преимущественно содержать следующие аминокислотные остатки: Gly, Ser, Ala или Thr. Линкерный пептид должен иметь длину, достаточную для связывания двух молекул таким образом, чтобы они принимали правильную конформацию относительно друг друга, чтобы они сохраняли желаемую активность. В одном варианте осуществления линкер имеет длину от около 1 до 50 аминокислот, предпочтительно от около 1 до 30 аминокислот. В одном варианте осуществления могут использоваться линкеры длиной от 1 до 20 аминокислот, причем в некоторых вариантах осуществления могут использоваться от около 5 до около 10 аминокислот. Полезные линкеры включают глицин-сериновые полимеры, включая, например, (GS)_n, (GSGGS)_n, (GGGGS)_n и (GGGS)_n, где n представляет собой целое число, по меньшей мере единицу (и, как правило, от 3 до 4), глицин-аланиновые полимеры, аланинсериновые полимеры и другие гибкие линкеры. В альтернативном варианте различные непротеиновые полимеры, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, могут быть использованы в качестве линкеров.As shown in this document, there are a number of suitable scFv linkers that can be used, including traditional peptide bonds created by recombinant technologies. The linker peptide may advantageously contain the following amino acid residues: Gly, Ser, Ala or Thr. The linker peptide must be long enough to link the two molecules so that they assume the correct conformation relative to each other so that they retain the desired activity. In one embodiment, the linker is about 1 to 50 amino acids in length, preferably about 1 to 30 amino acids in length. In one embodiment, linkers from 1 to 20 amino acids in length can be used, and in some embodiments, from about 5 to about 10 amino acids can be used. Useful linkers include glycine-serine polymers including, for example, (GS) _n , (GSGGS) _n , (GGGGS) _n , and (GGGS) _n , where n is an integer, at least one (and typically from 3 to 4), glycine-alanine polymers, alanine serine polymers, and other flexible linkers. Alternatively, various non-protein polymers, including but not limited to polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, polyoxyalkylenes, or copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol, can be used as linkers.

Другие линкерные последовательности могут включать любую последовательность любой длины домена CL/CH1, но не все остатки домена CL/CH1; например, первые 5-12 аминокислотных остатков доменов CL/CH1. Линкеры могут быть получены из легкой цепи иммуноглобулина, например Ск или Сλ. Линкеры могут быть получены из тяжелых цепей иммуноглобулина любого изотипа, включая, например, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Ca1, Ca2, Cδ, Cε и Cμ. Линкерные последовательности также могут быть получены из других белков, таких как Ig-подобные белки (например, TCR, FcR, KIR), последовательности, полученные из шарнирной области, и другие природные последовательности из других белков.Other linker sequences may include any sequence of any length of the CL/CH1 domain, but not all residues of the CL/CH1 domain; for example, the first 5-12 amino acid residues of the CL/CH1 domains. Linkers can be derived from an immunoglobulin light chain, such as CK or Cλ. Linkers can be derived from immunoglobulin heavy chains of any isotype, including, for example, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Ca1, Ca2, Cδ, Cε, and Cμ. Linker sequences can also be derived from other proteins, such as Ig-like proteins (eg, TCR, FcR, KIR), sequences derived from the hinge region, and other naturally occurring sequences from other proteins.

В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой доменный линкер, используемый для связывания вместе любых двух доменов, как описано в данном документе. Хотя может быть использован любой подходящий линкер, во многих вариантах осуществления используется глицинсериновый полимер, включая, например, (GS)_n, (GSGGS)_n, (GGGGS)_n и (GGGS)_n, где n является целым числом, равным по меньшей мере единице (и обычно от 3 до 4 до 5), а также любая пептидная последовательность, которая обеспечивает рекомбинантное присоединение двух доменов с достаточной длиной и гибкостью, чтобы каждый домен сохранял свою биологическую функцию.In some embodiments, the linker is a domain linker used to link any two domains together, as described herein. While any suitable linker may be used, many embodiments use a glycineserine polymer, including, for example, (GS) _n , (GSGGS) _n , (GGGGS) _n , and (GGGS) _n , where n is an integer equal to at least unit (and usually 3 to 4 to 5), as well as any peptide sequence that allows recombinant attachment of two domains with sufficient length and flexibility so that each domain retains its biological function.

Химерные и гуманизированные антитела.Chimeric and humanized antibodies.

В некоторых вариантах осуществления антитела в данном документе могут быть получены из смеси от разных видов, например химерное антитело и/или гуманизированное антитело. В целом как химерные антитела, так и гуманизированные антитела относятся к антителам, которые объединяют области более чем одного вида. Например, химерные антитела традиционно включают вариабельную(ые) область(области) от мыши (или крысы, в некоторых случаях) и константную(ые) область(области) от человека. Гуманизированные антитела обычно относятся к нечеловеческим антителам, у которых каркасные области вариабельного домена были заменены на последовательности, обнаруживаемые в антителах человека. Как правило, в гуманизированном антителе все антитело, кроме CDR, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или является идентичным такому антителу за исключением его CDR. CDR, некоторые или все из которых кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими из организма, отличного от человека, прививаются в каркас бета-складчатости вариабельной области антитела человека для создания антитела, специфичность которого определяется привитыми CDR. Создание таких антител описано, например, в WO 92/11018, Jones, 1986, Nature, 321:522-525; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536, полностью включенных посредством ссылки. Обратная мутация выбранных акцепторных каркасных остатков на соответствующие донорные остатки часто требуется для восстановIn some embodiments, the antibodies herein may be derived from a mixture from different species, such as a chimeric antibody and/or a humanized antibody. In general, both chimeric antibodies and humanized antibodies refer to antibodies that combine regions of more than one species. For example, chimeric antibodies traditionally include variable(s) region(s) from a mouse (or rat, in some cases) and constant(s) region(s) from a human. Humanized antibodies generally refer to non-human antibodies in which the variable domain framework regions have been replaced with sequences found in human antibodies. Typically, in a humanized antibody, all of the antibody, except for the CDR, is encoded by a polynucleotide of human origin or is identical to such an antibody except for its CDR. The CDRs, some or all of which are encoded by nucleic acids derived from a non-human organism, are grafted into the beta-fold framework of a human antibody variable region to generate an antibody whose specificity is determined by the grafted CDRs. The creation of such antibodies is described, for example, in WO 92/11018, Jones, 1986, Nature, 321:522-525; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536, incorporated by reference in its entirety. Backmutation of selected acceptor framework residues to the corresponding donor residues is often required to restore

- 18 040482 ления аффинности, утерянной в исходной привитой конструкции (US 5530101, US 5585089, US 5693761, US 5693762, US 6180370, US 5859205, US 5821337, US 6054297, US 6407213, полностью включены посредством ссылки). Оптимально гуманизированное антитело также будет содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека, и, таким образом, обычно будет содержать Fc-область человека. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием мышей с генетически сконструированной иммунной системой (Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog., 20:639-654, полностью включена посредством ссылки). Разнообразные методики и методы гуманизации и изменения формы нечеловеческих антител хорошо известны в данной области техники (см. Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of В Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) и ссылки, цитируемые там, целиком включены посредством ссылки). Методы гуманизации включают, но не ограничиваются ими, методы, описанные в Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol., 160:1029-1035; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285-9; Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng, 11:321-8, полностью включены посредством ссылки. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей нечеловеческого антитела могут включать методы изменения поверхности, как описано, например, в Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:969-973, полностью включенной посредством ссылки.- 18 040482 to correct the affinity lost in the original graft construct (US 5530101, US 5585089, US 5693761, US 5693762, US 6180370, US 5859205, US 5821337, US 6054297, US 6407213, incorporated by reference in their entirety). An optimally humanized antibody will also contain at least a portion of an immunoglobulin constant region, typically a human immunoglobulin, and thus will typically contain a human Fc region. Humanized antibodies can also be generated using mice with genetically engineered immune systems (Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog., 20:639-654, incorporated by reference in its entirety). A variety of techniques and techniques for humanizing and reshaping non-human antibodies are well known in the art (see Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) and references cited therein. , incorporated by reference in their entirety). Humanization methods include, but are not limited to, those described in Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol., 160:1029-1035; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285-9; Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng, 11:321-8, incorporated by reference in its entirety. Humanization or other means of reducing the immunogenicity of non-human antibody variable regions may include surface alteration techniques as described, for example, in Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:969-973, incorporated by reference in its entirety.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи из конкретного гена тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии и/или вариабельную область легкой цепи из конкретного гена легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии. Например, такие антитела могут содержать или состоять из антитела человека, содержащего вариабельные области тяжелой или легкой цепи, которые являются продуктом или получены из определенной последовательности зародышевой линии. Антитело человека, которое является продуктом или получено из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, можно идентифицировать как таковое путем сравнения аминокислотной последовательности антитела человека с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека и выбора последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, которая наиболее близка по последовательности (т.е. имеет наибольший процент идентичности) к последовательности антитела человека. Антитело человека, которое является продуктом или получено из определенной последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, может содержать аминокислотные различия по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, вследствие естественных соматических мутаций или преднамеренного введения сайт-направленной мутации. Однако гуманизированное антитело, как правило, по меньшей мере на 80% идентично по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют антитело как происходящее из последовательностей человека, при сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, последовательностями зародышевой линии мыши). В определенных случаях гуманизированное антитело может быть по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичным по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, гуманизированное антитело, полученное из конкретной последовательности зародышевой линии человека, будет иметь не более 10-20 аминокислотных отличий от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека. В некоторых случаях гуманизированное антитело может иметь не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотного отличия с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.In some embodiments, the antibodies of the invention comprise a heavy chain variable region from a specific germline immunoglobulin heavy chain gene and/or a light chain variable region from a specific germline immunoglobulin light chain gene. For example, such antibodies may contain or consist of a human antibody containing heavy or light chain variable regions that are the product of or derived from a specific germline sequence. A human antibody that is the product of or derived from a human germline immunoglobulin sequence can be identified as such by comparing the amino acid sequence of the human antibody with the amino acid sequences of human germline immunoglobulins and selecting the human germline immunoglobulin sequence that is closest in sequence (i.e. has the highest percentage of identity) to the human antibody sequence. A human antibody that is the product of or derived from a specific human germline immunoglobulin sequence may contain amino acid differences from the germline sequence, for example, due to natural somatic mutations or the deliberate introduction of a site-directed mutation. However, a humanized antibody is typically at least 80% identical in amino acid sequence to the amino acid sequence encoded by the human germline immunoglobulin gene and contains amino acid residues that identify the antibody as being derived from human sequences when compared to other germline immunoglobulin amino acid sequences. species (eg, mouse germline sequences). In certain cases, a humanized antibody may be at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or even at least 96%, 97%, 98% or 99% amino acid sequence identical to the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene. Typically, a humanized antibody derived from a particular human germline sequence will have no more than 10-20 amino acid differences from the amino acid sequence encoded by the human germline immunoglobulin gene. In some cases, a humanized antibody may have no more than 5, or even no more than 4, 3, 2, or 1 amino acid differences from the amino acid sequence encoded by the germline immunoglobulin gene.

В одном варианте осуществления родительское антитело имеет созревшую аффинность, как известно в данной области техники. Для гуманизации и созревания аффинности могут быть использованы структурно-ориентированные методы, например, как описано в патенте США № 7657380. Методы на основе селекции могут быть использованы для гуманизации и/или созревания аффинности вариабельных областей антител, включая без ограничения методы, описанные в Wu et al., 1999, J. Mol. Biol., 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem., 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem., 271(37):22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering, 16(10):753-759, полностью включенных посредством ссылки. Другие методы гуманизации могут включать прививание только частей CDR, включая без ограничения методы, описанные в Tan et al., 2002, J. Immunol., 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol., 169:3076-3084, полностью включенных посредством ссылки.In one embodiment, the parent antibody is affinity matured, as is known in the art. Structure-based methods can be used to humanize and affinity mature, for example, as described in US Pat. al., 1999, J. Mol. Biol., 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem., 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem., 271(37):22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering, 16(10):753-759, incorporated by reference in its entirety. Other humanization methods may include grafting only parts of the CDR, including, without limitation, the methods described in Tan et al., 2002, J. Immunol., 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol., 169:3076-3084, incorporated by reference in its entirety.

Термин антитело используется в самом широком смысле и включает, например, интактный иммуноглобулин или антигенсвязывающую часть. Антигенсвязывающие участки могут быть получены с помощью технологий рекомбинантных ДНК или ферментативного или химического расщепления интактных антител. Таким образом, термин антитело включает традиционные тетрамерные антитела изThe term antibody is used in its broadest sense and includes, for example, an intact immunoglobulin or an antigen-binding portion. Antigen-binding sites can be obtained using recombinant DNA technologies or enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies. Thus, the term antibody includes traditional tetrameric antibodies from

- 19 040482 двух тяжелых цепей и двух легких цепей, а также антигенсвязывающие фрагменты, такие как Fv, Fab и scFv. В некоторых случаях изобретение относится к биспецифическим антителам, которые содержат по меньшей мере один антигенсвязывающий домен, как указано в данном документе.- 19 040482 two heavy chains and two light chains, as well as antigen-binding fragments such as Fv, Fab and scFv. In some cases, the invention relates to bispecific antibodies that contain at least one antigen-binding domain, as described in this document.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению предпочтительно должно проявлять улучшенную кинетику в плазме. Улучшение кинетики в плазме гуманизированного антитела в данном документе означает, что параметр, представляющий кинетику гуманизированного антитела в плазме, изменяется по сравнению с негуманизированным антителом, соответствующим гуманизированному антителу. Примеры параметров, представляющих кинетику в плазме, включают период полужизни в плазме, среднее время удержания в плазме и клиренс из плазмы.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention should preferably exhibit improved plasma kinetics. An improvement in plasma kinetics of a humanized antibody herein means that a parameter representing the plasma kinetics of a humanized antibody is changed compared to a non-humanized antibody corresponding to a humanized antibody. Examples of parameters representing plasma kinetics include plasma half-life, mean plasma retention time, and plasma clearance.

Такой параметр, как измененный, означает, что параметр увеличивается или уменьшается. Негуманизированное антитело, соответствующее гуманизированному антителу, означает негуманизированное антитело, используемое в качестве основы для получения гуманизированного антитела, например антитела мыши или химерного антитела.A parameter such as changed means that the parameter is being increased or decreased. A non-humanized antibody corresponding to a humanized antibody means a non-humanized antibody used as a basis for making a humanized antibody, such as a mouse antibody or a chimeric antibody.

Термин химерное антитело относится к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела и одну или более областей из одного или более других антител. Антитело с привитыми CDR представляет собой антитело, содержащее одну или более CDR, полученных из антитела определенного вида или изотипа, и каркас другого антитела того же или другого вида или изотипа.The term chimeric antibody refers to an antibody that contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibodies. A CDR-grafted antibody is an antibody containing one or more CDRs derived from an antibody of a particular species or isotype and a backbone of another antibody of the same or different species or isotype.

Композиции.Compositions.

В данном изобретении предложен ряд различных антигенсвязывающих доменов (обычно включаемых в антитела), которые связываются с тау-белком человека, который фосфорилируется по Ser413 (pSer413), в реакции антиген-антитело.The present invention provides a number of different antigen-binding domains (usually included in antibodies) that bind to a human tau protein that is phosphorylated at Ser413 (pSer413) in an antigen-antibody reaction.

Реакция антиген-антитело измеряется по аффинности антитела к фосфорилированному тау-белку или фосфорилированному тау-пептиду, т.е. по равновесной константе диссоциации (KD). В определенных вариантах осуществления значение KD измеряют с фосфорилированным тау-белком. В некоторых вариантах осуществления значение KD измеряют с фосфорилированным тау-пептидом. В одном варианте осуществления фосфорилированный тау-пептид фосфорилирован только в одном остатке (например, SEQ ID NO: 75). В другом варианте осуществления фосфорилированный пептид фосфорилирован во множестве остатков (например, SEQ ID NO: 76 или SEQ ID NO: 78). В некоторых вариантах осуществления значение KD измеряют с иммобилизованным антигеном (например, фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом), и в этом случае измерение аффинности включает компонент авидности, т.е. происходит в режиме двухвалентного связывания. В других вариантах осуществления значение KD измеряют с иммобилизованным антителом (например, родительским антителом мыши, химерным антителом или вариантами гуманизированного антитела), и в этом случае измерение аффинности не включает компонент авидности, т.е. происходит в режиме одновалентного связывания. В других вариантах осуществления значение KD измеряют с иммобилизованным антителом и с фосфорилированным тау-белком в качестве аналита. В других вариантах осуществления значение KD измеряют с иммобилизованным антителом и с фосфорилированным тау-пептидом в качестве аналита. В определенных вариантах осуществления значение KD измеряют в режиме двухвалентного связывания. В других вариантах осуществления значение KD измеряют в режиме одновалентного связывания.The antigen-antibody response is measured by the affinity of the antibody for a phosphorylated tau protein or a phosphorylated tau peptide, i. according to the equilibrium dissociation constant (KD). In certain embodiments, the KD value is measured with phosphorylated tau protein. In some embodiments, the KD value is measured with a phosphorylated tau peptide. In one embodiment, the phosphorylated tau peptide is phosphorylated at only one residue (eg, SEQ ID NO: 75). In another embodiment, the phosphorylated peptide is phosphorylated at multiple residues (eg, SEQ ID NO: 76 or SEQ ID NO: 78). In some embodiments, the KD value is measured with an immobilized antigen (eg, phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide), in which case the affinity measurement includes an avidity component, i. occurs in the mode of bivalent bonding. In other embodiments, the KD value is measured with an immobilized antibody (eg, mouse parent antibody, chimeric antibody, or humanized antibody variants), in which case the affinity measurement does not include an avidity component, i. occurs in the mode of univalent binding. In other embodiments, the KD value is measured with the immobilized antibody and with phosphorylated tau as analyte. In other embodiments, the KD value is measured with the immobilized antibody and with the phosphorylated tau peptide as analyte. In certain embodiments, the KD value is measured in bivalent binding mode. In other embodiments, the KD value is measured in univalent binding mode.

Таким образом, в определенных вариантах осуществления значение KD составляет 5x10’8 М или менее; в некоторых вариантах осуществления значение KD составляет 5x10’9 М или менее; в других вариантах осуществления значение KD составляет 5x10’¹⁰ М или менее; в других вариантах осуществления значение KD составляет 1,86x10’8 М или менее; в других вариантах осуществления значение KD составляет 2x10’9 М или менее; в других вариантах осуществления значение KD составляет 2x10’10 М или менее. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, связывается с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом с KD, равной 5x10’8 М или менее, измеренной с иммобилизованным антителом и фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом в качестве аналита. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, связывается с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным таупептидом с KD, равной 5x10’9 М или менее, измеренной с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом и антителом в качестве аналита. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, связывается с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом с KD, равной 2x10’9 М или менее, измеренной с фосфорилированным таубелком или фосфорилированным тау-пептидом и антителом в качестве аналита. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, связывается с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом с KD, равной 5x10’¹⁰ М или менее, измеренной с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом и антителом в качестве аналита. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, связывается с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом с KD, равной 2x10’¹⁰ М или менее, измеренной с фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом и антителом в качестве аналита.Thus, in certain embodiments, the implementation of the value of KD is 5x10'8 M or less; in some embodiments, the implementation of the value of KD is 5x10'9 M or less; in other embodiments, the implementation of the value of KD is 5x10' ¹⁰ M or less; in other embodiments, the implementation of the value of KD is 1.86x10'8 M or less; in other embodiments, the implementation of the value of KD is 2x10'9 M or less; in other embodiments, the implementation of the value of KD is 2x10'10 M or less. In a specific embodiment, an antibody described herein binds to a phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide with a KD of 5x10'8 M or less, measured with the immobilized antibody and phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide as the analyte. . In another specific embodiment, an antibody described herein binds to a phosphorylated tau protein or a phosphorylated tau peptide with a KD of 5x10'9 M or less, measured with the phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide and the antibody as analyte. In another specific embodiment, an antibody described herein binds to a phosphorylated tau protein or a phosphorylated tau peptide with a KD of 2x10'9 M or less, measured with the phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide and the antibody as analyte. In another specific embodiment, an antibody described herein binds to a phosphorylated tau protein or a phosphorylated tau peptide with a KD of ^5x10'10 M or less, measured with the phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide and the antibody as analyte. . In another specific embodiment, an antibody described herein binds to a phosphorylated tau protein or a phosphorylated tau peptide with a KD of ^2x10'10 M or less, measured with the phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide and the antibody as analyte. .

- 20 040482- 20 040482

Кроме того, как указано в данном документе, антитела по изобретению предпочтительно связываются с тау-пептидами или белками, которые фосфорилированы в положении S413, по сравнению с белками или пептидами, которые не содержат фосфат в положении 413.In addition, as stated herein, antibodies of the invention preferentially bind to tau peptides or proteins that are phosphorylated at position S413, compared to proteins or peptides that do not contain a phosphate at position 413.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению представляет собой антитело, которое может вызывать реакцию антиген-антитело с фосфорилированным таубелком или фосфорилированным тау-пептидом по данному изобретению.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention is an antibody that can elicit an antigen-antibody reaction with a phosphorylated tau protein or a phosphorylated tau peptide of the present invention.

Фосфорилированные тау-белки и тау-пептиды, с которыми гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению может вызывать реакцию антиген-антитело, представляют собой те, которые фосфорилированы по аминокислотному остатку, который специфически фосфорилируется при нейродегенеративных заболеваниях, таких как БА. В частности, такие тау-белки и тау-пептиды фосфорилированы по меньшей мере по сериновому остатку в положении 413 аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1 (Ser413), и также могут быть фосфорилированы по одному или более из аминокислотных остатков, соответствующих номерам аминокислот от 410 до 421, т.е. одному или более аминокислотным остаткам, соответствующим остатку серина в положении 412 (Ser412), остатку треонина в положении 414 (Thr414) и остатку серина в положении 416 (Ser416) аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1. Такие типичные фосфорилированные пептиды включают, но не ограничиваются ими, pSer412/pSer413 (Cys-), который имеет аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7; pSer413 (Cys-), который имеет аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 8; и pSer409/pSer412/pSer413 (Cys-), который имеет аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 9.Phosphorylated tau proteins and tau peptides with which the humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention can elicit an antigen-antibody reaction are those that are phosphorylated at an amino acid residue that is specifically phosphorylated in neurodegenerative diseases such as AD. In particular, such tau proteins and tau peptides are phosphorylated at at least a serine residue at position 413 of the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1 (Ser413) and may also be phosphorylated at one or more of the amino acid residues corresponding to numbers amino acids from 410 to 421, i.e. one or more amino acid residues corresponding to the serine residue at position 412 (Ser412), the threonine residue at position 414 (Thr414), and the serine residue at position 416 (Ser416) of the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1. Such exemplary phosphorylated peptides include, but not limited to, pSer412/pSer413 (Cys-), which has the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 7; pSer413 (Cys-), which has the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 8; and pSer409/pSer412/pSer413 (Cys-), which has the amino acid sequence as defined in SEQ ID NO: 9.

Фосфорилированный тау-пептид по данному изобретению можно использовать для получения гуманизированного антитела против фосфорилированного тау по данному изобретению или в качестве антигена для изучения реактивности.The phosphorylated tau peptide of the invention can be used to produce a humanized anti-phosphorylated tau antibody of the invention, or as an antigen for reactivity studies.

Фосфорилированный тау-пептид по данному изобретению может быть получен специалистом в данной области техники с использованием соответствующих методов синтеза или методов генной инженерии. Примеры способов получения фосфорилированного пептида посредством синтеза включают метод Boc (Wakamiya Т., Chemistry Letters, vol. 22, p. 1401, 1993), Fmoc method (Perich J.W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol. 40, p. 134-140, 1992) и JP 3587390 B и WO 2013/180238, хотя специалист в данной области техники может использовать любые другие способы в зависимости от обстоятельств. Примеры способов получения фосфорилированного пептида с помощью генной инженерии включают способ, в котором получают генетический материал (ДНК или РНК), имеющий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую получаемый пептид или его предшественник, и после необязательных этапов, таких как внесение в вектор экспрессии и добавление последовательности промотора, вносят в организм подходящего хозяина для экспрессии или подвергают бесклеточному способу синтеза белка. В этом случае пептид можно фосфорилировать в желаемом сайте, вызывая реакцию фосфорилирования в организме хозяина с помощью ферментов, таких как киназы, которые могут быть либо присущими хозяину, либо их экспрессия может быть обусловлена генной инженерией, или выделяя целевой пептид из организма хозяина и затем вызывая реакцию фосфорилирования с использованием ферментов, таких как киназы. В последнем случае реакция фосфорилирования может быть вызвана in vitro путем воздействия на целевой пептид фермента, который, как известно, играет роль в реакции фосфорилирования тау, такого как гликогенсинтазакиназа 3 (GSK3) или циклинзависимая протеинкиназа 5 (CDK5). Из числа пептидов, фосфорилируемых в организме хозяина или in vitro в соответствии с вышеуказанными способами, пептиды, фосфорилированные по желаемому аминокислотному остатку, могут быть выделены, например, путем выбора тех, которые специфически связываются с антителом против фосфорилированного тау, указанным выше, посредством реакции антитело-антиген.The phosphorylated tau peptide of this invention can be obtained by a person skilled in the art using appropriate synthetic or genetic engineering methods. Examples of methods for obtaining a phosphorylated peptide through synthesis include the Boc method (Wakamiya T., Chemistry Letters, vol. 22, p. 1401, 1993), the Fmoc method (Perich J.W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol. 40, p. 134 -140, 1992) and JP 3587390 B and WO 2013/180238, although a person skilled in the art can use any other methods depending on the circumstances. Examples of methods for producing a phosphorylated peptide by genetic engineering include a method in which genetic material (DNA or RNA) is obtained having a nucleic acid sequence encoding the resulting peptide or a precursor thereof, and after optional steps such as insertion into an expression vector and addition of a promoter sequence , introduced into the body of a suitable host for expression or subjected to a cell-free method of protein synthesis. In this case, the peptide can be phosphorylated at the desired site, causing a phosphorylation reaction in the host with enzymes such as kinases, which can either be native to the host or genetically engineered, or by isolating the target peptide from the host and then causing phosphorylation reaction using enzymes such as kinases. In the latter case, the phosphorylation reaction can be induced in vitro by exposing the target peptide to an enzyme known to play a role in the tau phosphorylation reaction, such as glycogen synthase kinase 3 (GSK3) or cyclin-dependent protein kinase 5 (CDK5). From among the peptides phosphorylated in the host or in vitro according to the above methods, peptides phosphorylated at the desired amino acid residue can be isolated, for example, by selecting those that specifically bind to the anti-phosphorylated tau antibody mentioned above by an antibody reaction. -antigen.

Фосфорилированный тау-пептид по данному изобретению может быть модифицирован по своей N-концевой последовательности и/или С-концевой последовательности веществом, имеющим другие функции, подходящие для желаемых целей. Например, фосфорилированный тау-пептид по данному изобретению может быть дополнен в N-конце и/или С-конце, например, остатком метионина, ацетильной группой или пироглутаминовой кислотой, или модифицирован в N-конце и/или С-конце, например, флуоресцентным материалом. В альтернативном варианте N-конец и/или С-конец фосфорилированного тау-пептида по данному изобретению можно модифицировать, например, пептидом или белком. Примеры пептидов, пригодных для такой модификации, включают подходящие последовательности меток (обычно гистидиновую метку или метку FLAG), пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, которые могут распознаваться Т-клеточным рецептором (ТКР) или главным комплексом гистосовместимости (ГКГС), белки, полученные из вирусов или бактерий, или пептиды, имеющие последовательности, полученные из таких белков. Кроме того, фосфорилированный тау-пептид по данному изобретению включает те, которые имеют по меньшей мере один аминокислотный остаток, отличный от N-концевых и С-концевых остатков, модифицированный любым другим соединением или пептидом. Специалист в данной области техники сможет осуществить такую модификацию фосфорилированного тау-пептида, используя любые известные методы, такие как методы, описанные в Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, US, Academic Press, 1996.The phosphorylated tau peptide of this invention may be modified in its N-terminal sequence and/or C-terminal sequence with a substance having other functions suitable for the desired purposes. For example, the phosphorylated tau peptide of the invention may be amended at the N-terminus and/or C-terminus, e.g., with a methionine residue, an acetyl group, or pyroglutamic acid, or modified at the N-terminus and/or C-terminus, e.g., with a fluorescent material. Alternatively, the N-terminus and/or C-terminus of the phosphorylated tau peptide of this invention may be modified, for example, with a peptide or protein. Examples of peptides suitable for such modification include suitable tag sequences (usually a histidine tag or FLAG tag), peptides having amino acid sequences that can be recognized by the T cell receptor (TCR) or major histocompatibility complex (MHC), proteins derived from viruses or bacteria, or peptides having sequences derived from such proteins. In addition, the phosphorylated tau peptide of this invention includes those having at least one amino acid residue other than the N-terminal and C-terminal residues modified with any other compound or peptide. One skilled in the art will be able to effect such a modification of the phosphorylated tau peptide using any known methods, such as those described in Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, US, Academic Press, 1996.

- 21 040482- 21 040482

Специалист в данной области техники сможет провести измерение реакции антиген-антитело, выбрав подходящий анализ связывания в системе твердой фазы или жидкой фазы. Примеры таких анализов включают, но не ограничиваются ими, твердофазный иммуноферментный анализ (твердофазный ИФА), иммуноферментный анализ (ИФА), поверхностный плазмонный резонанс (ППР), резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) и резонансный перенос энергии люминесценции (LRET). Измерение аффинности связывания антиген-антитело может быть выполнено, например, путем мечения антитела и/или антигена, например, ферментом, флуоресцентным материалом, люминесцентным материалом или радиоизотопом, и определения реакции антиген-антитело с использованием метода, подходящего для определения физических и/или химических свойств, характерных для используемой метки.One skilled in the art will be able to measure the antigen-antibody response by selecting the appropriate binding assay in a solid phase or liquid phase system. Examples of such assays include, but are not limited to, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), surface plasmon resonance (SPR), fluorescence resonance energy transfer (FRET), and luminescence resonance energy transfer (LRET). The measurement of antigen-antibody binding affinity can be performed, for example, by labeling the antibody and/or antigen with, for example, an enzyme, fluorescent material, luminescent material, or radioisotope, and determining the antigen-antibody reaction using a method suitable for determining physical and/or chemical properties specific to the label being used.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению предпочтительно должно иметь улучшенную аффинность селективного связывания с фосфорилированным таубелком или тау-пептидом по сравнению с его аффинностью связывания с нефосфорилированным таубелком или тау-пептидом. Улучшение аффинности селективного связывания антитела с фосфорилированным тау-белком или тау-пептидом в этом контексте означает, что отношение аффинности связывания антитела с фосфорилированным тау-белком или тау-пептидом к его аффинности связывания с соответствующим нефосфорилированным тау-белком или тау-пептидом увеличивается. Такая селективная аффинность связывания может быть проанализирована, например, с использованием планшета, на котором иммобилизован фосфорилированный тау-белок или тау-пептид, и планшета, на котором иммобилизован соответствующий нефосфорилированный тау-белок или тау-пептид, путем измерения аффинности связывания антитела к каждому из этих белков или пептидов, например, с помощью твердофазного ИФА (например, в виде значения ОП (оптической плотности) поглощения длины волны излучения) и деления значения аффинности связывания (например, значения ОП поглощения), полученного для фосфорилированного белка тау или пептида тау, на значение, полученное для соответствующего нефосфорилированного тау-белка или тау-пептида. Конкретные условия для твердофазного ИФА могут быть такими, как описано в разделе Примеры ниже.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention should preferably have an improved selective binding affinity for a phosphorylated tau protein or tau peptide as compared to its binding affinity for a non-phosphorylated tau protein or tau peptide. An improvement in the selective binding affinity of an antibody to a phosphorylated tau protein or tau peptide in this context means that the ratio of the antibody's binding affinity to the phosphorylated tau protein or tau peptide to its binding affinity to the corresponding unphosphorylated tau protein or tau peptide is increased. Such selective binding affinity can be analyzed, for example, using a plate immobilized with a phosphorylated tau protein or tau peptide and a plate immobilized with the corresponding unphosphorylated tau protein or tau peptide by measuring the binding affinity of the antibody to each of the of these proteins or peptides, for example, using a solid-phase ELISA (for example, in the form of an OD (optical density) value of the absorbance of the wavelength of the radiation) and dividing the binding affinity value (for example, the OD value of the absorbance) obtained for the phosphorylated tau protein or tau peptide by the value obtained for the corresponding non-phosphorylated tau protein or tau peptide. Specific conditions for the solid phase ELISA may be as described in the Examples section below.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау согласно данному изобретению предпочтительно должно иметь отношение селективной аффинности связывания к фосфорилированному таубелку или тау-пептиду к аффинности связывания для нефосфорилированного тау-белка или тау-пептида, равное по меньшей мере около 40 или более, в частности по меньшей мере около 50 или более, более конкретно по меньшей мере около 60 или более, при условии, что селективная аффинность связывания получается в соответствии со способом, описанным в примере 2 ниже. В одном варианте осуществления отношение рассчитывают путем сравнения аффинности связывания антител против pSer413 с фосфорилированным пептидом, таким как SEQ ID NO: 8, с аффинностью связывания с нефосфорилированным пептидом SEQ ID NO: 69.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention should preferably have a ratio of selective binding affinity for phosphorylated tau protein or tau peptide to binding affinity for non-phosphorylated tau protein or tau peptide of at least about 40 or more, in particular at least about 50 or more, more specifically at least about 60 or more, provided that the selective binding affinity is obtained in accordance with the method described in Example 2 below. In one embodiment, the ratio is calculated by comparing the binding affinity of anti-pSer413 antibodies to a phosphorylated peptide, such as SEQ ID NO: 8, with the binding affinity to a non-phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 69.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению предпочтительно должно проявлять улучшенную способность проникать в мозг при введении в кровь. Улучшение способности антитела проникать в мозг при введении в кровь в этом контексте означает, что когда антитело вводят в кровь человека или любого другого млекопитающего (например, мыши или крысы), соотношение концентрация антител в мозге к концентрации антител в плазме увеличивается. Способность антитела проникать в мозг может быть проанализирована, например, путем введения антитела животному (например, мыши или крысе) через кровь и после предварительно определенного периода (например, одна неделя) сбора крови и подготовки гомогената ткани мозга, измерения концентрации антител в каждом из полученного образца плазмы и полученного образца гомогената мозга с использованием известного метода (например, сэндвич-ИФА с использованием поликлонального античеловеческого антитела) и деления концентрации антитела в мозге на концентрацию антитела в плазма. Конкретные условия для твердофазного ИФА могут быть такими, как описано в разделе Примеры ниже. Известно, что концентрация антитела, поступающего в мозг, обычно составляет около 0,1-0,3% от концентрации в плазме.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention should preferably exhibit an improved ability to enter the brain when administered to the blood. Improving the ability of an antibody to enter the brain when injected into the blood in this context means that when the antibody is injected into the blood of a human or any other mammal (eg, mice or rats), the ratio of antibody concentration in the brain to the concentration of antibodies in plasma is increased. The ability of an antibody to enter the brain can be assayed, for example, by administering the antibody to an animal (e.g., mouse or rat) via blood and after a predetermined period (e.g., one week) of collecting blood and preparing a brain tissue homogenate, measuring the concentration of antibodies in each of the resulting the plasma sample and the resulting brain homogenate sample using a known method (for example, sandwich ELISA using a polyclonal anti-human antibody) and dividing the concentration of antibody in the brain by the concentration of antibody in plasma. Specific conditions for the solid phase ELISA may be as described in the Examples section below. It is known that the concentration of antibody entering the brain is usually about 0.1-0.3% of the plasma concentration.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау согласно данному изобретению предпочтительно должно иметь отношение концентрации антитела в мозге к концентрации антитела в плазме крови, равное 0,30% или более, в частности 0,35% или более, более конкретно 0,40% или более, еще более конкретно 0,45% или более, при условии, что соотношение получено в соответствии со способом, описанным в п.7 примера 7: анализ внутрицеребральной миграции в разделе примеров ниже.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention should preferably have a ratio of antibody concentration in brain to antibody concentration in blood plasma of 0.30% or more, in particular 0.35% or more, more specifically 0.40% or more, still more specifically, 0.45% or more, provided that the ratio is obtained in accordance with the method described in paragraph 7 of example 7: analysis of intracerebral migration in the examples section below.

Антигенсвязывающие домены по изобретению.Antigen binding domains of the invention.

В данном изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые предпочтительно связываются с тау-белком pSer413 человека по сравнению с тау-белками, которые не фосфорилированы в Ser413, как описано в данном документе.The present invention provides antigen binding domains that preferentially bind to the human pSer413 tau protein over tau proteins that are not phosphorylated at Ser413 as described herein.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 91; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 91; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 92; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющуюIn one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 92; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having

- 22 040482- 22 040482

SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 93; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 93; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 94; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 94; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 95; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 95; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 96; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 96; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 97; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 97; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 98; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 98; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 99; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 99; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 100; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 100; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 101; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 101; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены антигенсвязывающие домены, которые содержат vlCDR1, имеющую SEQ ID NO: 102; vlCDR2, имеющую SEQ ID NO: 82; vlCDR3, имеющую SEQ ID NO: 83; vhCDR1, имеющую SEQ ID NO: 86; vhCDR2, имеющую SEQ ID NO: 115; и vhCDR3, имеющую SEQ ID NO: 88.In one embodiment, the invention provides antigen binding domains that comprise vlCDR1 having SEQ ID NO: 102; vlCDR2 having SEQ ID NO: 82; vlCDR3 having SEQ ID NO: 83; vhCDR1 having SEQ ID NO: 86; vhCDR2 having SEQ ID NO: 115; and vhCDR3 having SEQ ID NO: 88.

В изобретении предложены антигенсвязывающие домены к тау-белку pSer413 человека. Как показано в примерах, предложен ряд гуманизированных вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые могут быть объединены в любой комбинации и могут быть добавлены к константным доменам IgG человека в любой комбинации.The invention provides antigen-binding domains for the human pSer413 tau protein. As shown in the examples, a number of humanized heavy chain variable domains and light chain variable domains are provided that can be combined in any combination and can be added to human IgG constant domains in any combination.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46 (SEQ ID NO: 84) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116) для создания Fv-домена, который связывает pSer413 тау. В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46 light chain variable domain (SEQ ID NO: 84) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116) to create an Fv domain that binds pSer413 tau. In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46 (SEQ ID NO: 84) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46 light chain variable domain (SEQ ID NO: 84) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL47 (SEQ ID NO: 104) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL47 light chain variable domain (SEQ ID NO: 104) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL47 (SEQ ID NO: 104) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122,In one embodiment, the Ta1505-VL47 light chain variable domain (SEQ ID NO: 104) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122,

- 23 040482- 23 040482

123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.123, 124, 125 and 126, and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34A (SEQ ID NO: 105) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_G34A light chain variable domain (SEQ ID NO: 105) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34A (SEQ ID NO: 105) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_G34A light chain variable domain (SEQ ID NO: 105) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34S (SEQ ID NO: 106) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_G34S light chain variable domain (SEQ ID NO: 106) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34S (SEQ ID NO: 106) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_G34S light chain variable domain (SEQ ID NO: 106) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34T (SEQ ID NO: 107) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_G34T light chain variable domain (SEQ ID NO: 107) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34T (SEQ ID NO: 107) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_G34T light chain variable domain (SEQ ID NO: 107) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33Q (SEQ ID NO: 108) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33Q light chain variable domain (SEQ ID NO: 108) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33Q (SEQ ID NO: 108) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33Q light chain variable domain (SEQ ID NO: 108) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33Q_G34A (SEQ ID NO: 109) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33Q_G34A light chain variable domain (SEQ ID NO: 109) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33Q_G34A (SEQ ID NO: 109) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33Q_G34A light chain variable domain (SEQ ID NO: 109) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33D (SEQ ID NO: 110) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33D light chain variable domain (SEQ ID NO: 110) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33D (SEQ ID NO: 110) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33D light chain variable domain (SEQ ID NO: 110) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33SIn one embodiment, the light chain variable domain Ta1505-VL46_N33S

- 24 040482 (SEQ ID NO: 111) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116).- 24 040482 (SEQ ID NO: 111) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116).

В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118,In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NO: 118,

119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 and 126, and the human kappa light chain constant domain is represented by

SEQ ID NO: 52.SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33S (SEQ ID NO: 111) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33S light chain variable domain (SEQ ID NO: 111) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33T (SEQ ID NO: 112) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33T light chain variable domain (SEQ ID NO: 112) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_N33T (SEQ ID NO: 112) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_N33T light chain variable domain (SEQ ID NO: 112) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_S28N (SEQ ID NO: 113) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_S28N light chain variable domain (SEQ ID NO: 113) is combined with the Ta1505-VH11 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_S28N (SEQ ID NO: 113) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_S28N light chain variable domain (SEQ ID NO: 113) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34A_S28N (SEQ ID NO: 114) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the light chain variable domain Ta1505-VL46_G34A_S28N (SEQ ID NO: 114) is combined with the heavy chain variable domain Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи Ta1505-VL46_G34A_S28N (SEQ ID NO: 114) комбинируют с вариабельным доменом тяжелой цепи Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). В этом варианте осуществления константный домен тяжелой цепи человека выбран из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 и 126, а константный домен каппа легкой цепи человека представлен SEQ ID NO: 52.In one embodiment, the Ta1505-VL46_G34A_S28N light chain variable domain (SEQ ID NO: 114) is combined with the Ta1505-VH65 heavy chain variable domain (SEQ ID NO: 117). In this embodiment, the human heavy chain constant domain is selected from SEQ ID NOs: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, and 126 and the human kappa light chain constant domain is represented by SEQ ID NO: 52.

Гуманизированное антитело против фосфорилированного тау согласно данному изобретению также должно предпочтительно иметь вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, имеющие специфические аминокислотные последовательности, в частности, указанные ниже.The humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention should also preferably have a heavy chain variable region and a light chain variable region having specific amino acid sequences, in particular as indicated below.

В качестве вариабельной области тяжелой цепи антитело по данному изобретению предпочтительно должно содержать аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более, в частности 85% или более, более конкретно 90% или более, еще более конкретно 95% или более, еще более конкретно 100%, идентичности с последовательностью, выбранной из последовательности VH11 (определенной в SEQ ID NO: 18), последовательности VH12 (указанной в SEQ ID NO: 20), последовательности VH47 (определенной в SEQ ID NO: 22), последовательности VH61 (определенной в SEQ ID NO: 24), последовательности VH62 (определенной в SEQ ID NO: 26), последовательности VH64 (определенной в SEQ ID NO: 28) и последовательности VH65 (определенной в SEQ ID NO: 30). В одном варианте осуществления антитело по данному изобретению может содержать в качестве вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность последовательности VH65 или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности VH65 посредством одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из: замены Ala в положении 28 (№ по Kabat: H28) на Thr; замены Asn в положении 30 (№ по Kabat: Н30) на Ser; замены Val в положении 49 (№ по Kabat: H49) на Gly; замены Ala в положении 64 (№ по Kabat: H61) на Asp и замены Gln в положении 78 (№ по Kabat: H75) на Lys.As a heavy chain variable region, an antibody of the present invention should preferably contain an amino acid sequence having 80% or more, in particular 85% or more, more specifically 90% or more, even more specifically 95% or more, even more specifically 100%, identity with a sequence selected from VH11 sequence (as defined in SEQ ID NO: 18), VH12 sequence (as defined in SEQ ID NO: 20), VH47 sequence (as defined in SEQ ID NO: 22), VH61 sequence (as defined in SEQ ID NO: : 24), a VH62 sequence (as defined in SEQ ID NO: 26), a VH64 sequence (as defined in SEQ ID NO: 28), and a VH65 sequence (as defined in SEQ ID NO: 30). In one embodiment, an antibody of the invention may comprise, as a heavy chain variable region, an amino acid sequence of the VH65 sequence, or an amino acid sequence derived from the VH65 sequence by one or more substitutions selected from the group consisting of: Ala substitution at position 28 (Kabat no. : H28) to Thr; substitutions of Asn at position 30 (Kabat no.: H30) with Ser; replacing Val at position 49 (Kabat no.: H49) with Gly; substitutions of Ala at position 64 (Kabat no.: H61) with Asp; and substitutions of Gln at position 78 (Kabat no.: H75) with Lys.

В качестве вариабельной области легкой цепи антитело по данному изобретению предпочтительно должно содержать аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более, в частности 85% или более, более конкретно 90% или более, еще более конкретно 95% или более, еще более конкретно 100%, идентичности с последовательностью, выбранной из последовательности VL15 (определенной в SEQ ID NO: 32), последовательности VL36 (определенной в SEQ ID NO: 34), последовательности VL46 (определенной в SEQ ID NO: 36), последовательности VL47 (определенной в SEQ ID NO: 38), последоваAs a light chain variable region, an antibody of the present invention should preferably contain an amino acid sequence having 80% or more, in particular 85% or more, more specifically 90% or more, even more specifically 95% or more, even more specifically 100%, identity with a sequence selected from VL15 sequence (defined in SEQ ID NO: 32), VL36 sequence (defined in SEQ ID NO: 34), VL46 sequence (defined in SEQ ID NO: 36), VL47 sequence (defined in SEQ ID NO: : 38), follow

- 25 040482 тельности VL48 (определенной в SEQ ID NO: 40) и последовательности VL50 (определенной в SEQ ID NO: 42). В одном варианте осуществления антитело по данному изобретению может содержать в качестве вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность последовательности VL47 или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности VL47 посредством одной или более замен, выбранных из группы, состоящей из замены Asp в положении 17 (№ по Kabat: L17) на Glu; замены Ser в положении 28 (№ по Kabat: L27A) на Asn; замены Gln в положении 42 (№ по Kabat: L37) на Leu; замены Gln в положении 50 (№ по Kabat: L45) на Arg; и замены Arg в положении 51 (№ по Kabat: L46) на Leu.- 25 040482 the VL48 identity (as defined in SEQ ID NO: 40) and the VL50 sequence (as defined in SEQ ID NO: 42). In one embodiment, an antibody of the invention may comprise, as a light chain variable region, an amino acid sequence of the VL47 sequence, or an amino acid sequence derived from the VL47 sequence by one or more substitutions selected from the group consisting of an Asp substitution at position 17 (Kabat no.: L17) on Glu; substitutions Ser at position 28 (Kabat no.: L27A) with Asn; replacing Gln at position 42 (Kabat no.: L37) with Leu; replacing Gln at position 50 (Kabat no.: L45) with Arg; and replacing Arg at position 51 (Kabat no.: L46) with Leu.

В другом варианте осуществления гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению может содержать любую комбинацию, выбранную из (1) последовательности VH11 (SEQ ID NO: 116) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL15 (SEQ ID NO: 32) в качестве вариабельной области легкой цепи;In another embodiment, a humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention may comprise any combination selected from (1) a VH11 sequence (SEQ ID NO: 116) as a heavy chain variable region and a VL15 sequence (SEQ ID NO: 32) as a variable region. light chain regions;

(2) последовательности VH11 (SEQ ID NO: 116) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL36 (SEQ ID NO: 34) в качестве вариабельной области легкой цепи;(2) the VH11 sequence (SEQ ID NO: 116) as the heavy chain variable region and the VL36 sequence (SEQ ID NO: 34) as the light chain variable region;

(3) последовательности VH11 (SEQ ID NO: 116) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL46 (SEQ ID NO: 36) в качестве вариабельной области легкой цепи;(3) the VH11 sequence (SEQ ID NO: 116) as the heavy chain variable region and the VL46 sequence (SEQ ID NO: 36) as the light chain variable region;

(4) последовательности VH11 (SEQ ID NO: 116) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL47 (SEQ ID NO: 38) в качестве вариабельной области легкой цепи;(4) a VH11 sequence (SEQ ID NO: 116) as the heavy chain variable region and a VL47 sequence (SEQ ID NO: 38) as the light chain variable region;

(5) последовательности VH11 (SEQ ID NO: 116) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL48 (SEQ ID NO: 40) в качестве вариабельной области легкой цепи;(5) the VH11 sequence (SEQ ID NO: 116) as the heavy chain variable region and the VL48 sequence (SEQ ID NO: 40) as the light chain variable region;

(6) последовательности VH11 (SEQ ID NO: 116) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL50 (SEQ ID NO: 42) в качестве вариабельной области легкой цепи;(6) the VH11 sequence (SEQ ID NO: 116) as the heavy chain variable region and the VL50 sequence (SEQ ID NO: 42) as the light chain variable region;

(7) последовательности VH12 (SEQ ID NO: 20) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL48 (SEQ ID NO: 40) в качестве вариабельной области легкой цепи;(7) the VH12 sequence (SEQ ID NO: 20) as the heavy chain variable region and the VL48 sequence (SEQ ID NO: 40) as the light chain variable region;

(8) последовательности VH47 (SEQ ID NO: 22) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL48 (SEQ ID NO: 40) в качестве вариабельной области легкой цепи;(8) the VH47 sequence (SEQ ID NO: 22) as the heavy chain variable region and the VL48 sequence (SEQ ID NO: 40) as the light chain variable region;

(9) последовательности VH61 (SEQ ID NO: 24) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL48 (SEQ ID NO: 40) в качестве вариабельной области легкой цепи;(9) the VH61 sequence (SEQ ID NO: 24) as the heavy chain variable region and the VL48 sequence (SEQ ID NO: 40) as the light chain variable region;

(10) последовательности VH62 (SEQ ID NO: 26) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL48 (SEQ ID NO: 40) в качестве вариабельной области легкой цепи;(10) VH62 sequence (SEQ ID NO: 26) as heavy chain variable region and VL48 sequence (SEQ ID NO: 40) as light chain variable region;

(11) последовательности VH64 (SEQ ID NO: 28) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL47 (SEQ ID NO: 38) в качестве вариабельной области легкой цепи;(11) VH64 sequence (SEQ ID NO: 28) as heavy chain variable region and VL47 sequence (SEQ ID NO: 38) as light chain variable region;

(12) последовательности VH64 (SEQ ID NO: 28) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL48 (SEQ ID NO: 40) в качестве вариабельной области легкой цепи;(12) the VH64 sequence (SEQ ID NO: 28) as the heavy chain variable region and the VL48 sequence (SEQ ID NO: 40) as the light chain variable region;

(13) последовательности VH65 (SEQ ID NO: 117) в качестве вариабельной области тяжелой цепи и последовательности VL47 (SEQ ID NO: 37) в качестве вариабельной области легкой цепи;(13) the VH65 sequence (SEQ ID NO: 117) as the heavy chain variable region and the VL47 sequence (SEQ ID NO: 37) as the light chain variable region;

Выбирая аминокислотные последовательности CDR и/или вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи из указанных выше и комбинируя их с аминокислотными последовательностями каркасных областей и/или константных областей тяжелой цепи и легкой цепи человека в случае необходимости, специалист в данной области техники сможет сконструировать гуманизированное антитело против фосфорилированного тау в соответствии с данным изобретением. Аминокислотные последовательности каркасных областей и/или константных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека могут быть выбраны, например, из подтипов IgG, IgA, IgM, IgE и IgD человека или их вариантов.By selecting the amino acid sequences of the CDRs and/or the heavy chain and light chain variable regions from the above and combining them with the amino acid sequences of the human heavy chain and light chain framework regions and/or constant regions, as appropriate, one skilled in the art will be able to design a humanized antibody against phosphorylated tau according to the invention. The amino acid sequences of the framework regions and/or constant regions of the heavy chain and light chain of a human antibody can be selected, for example, from human IgG, IgA, IgM, IgE and IgD subtypes or variants thereof.

Специфические антитела против pSer413 тау.Specific antibodies against pSer413 tau.

В изобретении предложен ряд специфических антител, включающих следующие пары последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи:The invention provides a number of specific antibodies, including the following pairs of heavy chain and light chain sequences:

mAb-aPTl: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:144 mAb-aPT2: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:145 mAb-аРТЗ: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:146 mAb-aPT4: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:147 mAb-aPT5: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:148 mAb-aPT6: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:149 mAb-aPT7: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:150 mAb-aPT8: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:151mAb-aPTl: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:144 mAb-aPT2: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:145 mAb-aPT3: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO: 146 mAb-aPT4: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:147 mAb-aPT5: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:148 mAb-aPT6: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO :149 mAb-aPT7: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:150 mAb-aPT8: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:151

- 26 040482 mAb-aPT9: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:152 mAb-aPT10: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:153 mAb-aPTll: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:154 mAb-aPT12: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:155 mAb-aPT13: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:156 mAb-aPT14: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:157 mAb-aPT15: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:158 mAb-aPT16: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:159 mAb-aPT17: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:160 mAb-aPT18: LC SEQ ID NO:184 и НС SEQ ID NO:161 mAb-aPT19: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:144 mAb-aPT20: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:145 mAb-aPT21: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:146 mAb-aPT22: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:147 mAb-aPT23: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:148 mAb-aPT24: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:149 mAb-aPT25: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:150 mAb-aPT26: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:151 mAb-aPT27: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:152 mAb-aPT28: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:153 mAb-aPT29: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:154 mAb-аРТЗО: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:155 mAb-aPT31: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:156 mAb-aPT32: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:157 mAb-аРТЗЗ: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:158 mAb-aPT34: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:159 mAb-aPT35: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:160 mAb-aPT36: LC SEQ ID NO:185 и НС SEQ ID NO:161- 26 040482 mAb-aPT9: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:152 mAb-aPT10: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:153 mAb-aPTll: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:154 mAb-aPT12: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:155 mAb-aPT13: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:156 mAb-aPT14: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:157 mAb-aPT15: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:158 mAb-aPT16: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:159 mAb-aPT17: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:160 mAb-aPT18: LC SEQ ID NO:184 and HC SEQ ID NO:161 mAb-aPT19: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:144 mAb-aPT20: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:145 mAb-aPT21: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:146 mAb-aPT22: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:147 mAb-aPT23: LC SEQ ID NO: 185 and HC SEQ ID NO:148 mAb-aPT24: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:149 mAb-aPT25: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:150 mAb-aPT26: LC SEQ ID NO :185 and HC SEQ ID NO:151 mAb-aPT27: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:152 mAb-aPT28: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:153 mAb-aPT29: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:154 mA b-aPT3O: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:155 mAb-aPT31: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:156 mAb-aPT32: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO: 157 mAb-aPT33: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:158 mAb-aPT34: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:159 mAb-aPT35: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO :160 mAb-aPT36: LC SEQ ID NO:185 and HC SEQ ID NO:161

Антитела, которые конкурируют за связывание.Antibodies that compete for binding.

В дополнение к антигенсвязывающим доменам и содержащим их антителам, которые связываются с тау-белком человека, фосфорилированным в положении 413 (pSer413), изобретение относится к анти телам, которые конкурируют за связывание с перечисленными в данном документе антителами.In addition to antigen-binding domains and antibodies containing them that bind to the human tau protein phosphorylated at position 413 (pSer413), the invention provides antibodies that compete for binding with the antibodies listed herein.

Гуманизированное антитело, которое вызывает конкурентное связывание pSer413 тау с гуманизированным антителом против фосфорилированного тау по данному изобретению, также входит в объем данного изобретения. Используемый в данном документе термин конкурентное связывание означает, что, когда два или более моноклональных антитела связываются с антигеном, связывание одного из антител с антигеном ингибирует связыванием другого антитела с антигеном. Конкурентное связывание обычно может быть измерено, например, путем добавления к постоянному количеству (концентрации) моноклонального антитела другого моноклонального антитела с варьирующимся его количеством (концентрацией) и определения количества (концентрации) последнего моноклонального антитела, при котором степень связывания предыдущего моноклонального антитела, имеющегося в постоянном количестве, уменьшается. Степень его ингибирования может быть выражена в единицах IC₅₀ или Ki. Гуманизированное антитело, которое вызывает конкурентное связывание с гуманизированным антителом против фосфорилированного тау по данному изобретению, означает антитело, имеющее IC₅₀, равную 1 мкМ или менее, в частности 100 нМ или менее, более конкретно 10 нМ или менее, при измерении связывания антиген-антитело с использованием гуманизированного антитела против фосфорилированного тау по данному изобретению в концентрации 10 нМ.A humanized antibody that competitively binds pSer413 tau to a humanized anti-phosphorylated tau antibody of the invention is also within the scope of the invention. As used herein, the term competitive binding means that when two or more monoclonal antibodies bind to an antigen, the binding of one of the antibodies to the antigen is inhibited by the binding of the other antibody to the antigen. Competitive binding can usually be measured, for example, by adding another monoclonal antibody with a varying amount (concentration) to a constant amount (concentration) of a monoclonal antibody and determining the amount (concentration) of the last monoclonal antibody at which the degree of binding of the previous monoclonal antibody present in the constant quantity is decreasing. The degree of its inhibition can be expressed in units of IC ₅₀ or Ki. A humanized antibody that elicits competitive binding to a humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention means an antibody having an IC ₅₀ of 1 μM or less, in particular 100 nM or less, more specifically 10 nM or less, as measured by antigen-antibody binding. using a humanized anti-phosphorylated tau antibody of the invention at a concentration of 10 nM.

Исследования конкурентного связывания могут проводиться, как известно в данной области техники, обычно с использованием анализов связывания SPR/Biacore® или Octet®, a также твердофазного ИФА и клеточных исследований.Competitive binding assays can be carried out as is known in the art, typically using SPR/Biacore® or Octet® binding assays as well as ELISA and cell assays.

В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антител, демонстрирующих конкурентное связывание, имеют по меньшей мере 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности по меньшей мере с одной из вариабельных областей, описанных в данном документе, и в константныхIn some embodiments, the heavy and light chain variable domains of antibodies demonstrating competitive binding have at least 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% identity with at least one of the variable regions described herein and in constant

- 27 040482 доменах имеют по меньшей мере 99 или 100% идентичности с последовательностью IgG человека, описанной на фиг. 13.- 27 040482 domains have at least 99% or 100% identity with the human IgG sequence described in FIG. 13.

Аминокислотные замены.amino acid substitutions.

В дополнение к последовательностям, описанным в данном документе, в изобретении предложены антигенсвязывающие домены и содержащие их антитела, которые могут иметь одну или более аминокислотных замен по сравнению с родительской исходной последовательностью.In addition to the sequences described herein, the invention provides antigen-binding domains and antibodies containing them, which may have one or more amino acid substitutions compared to the parent parent sequence.

Таким образом, например, для всех перечисленных в данном документе вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи могут быть созданы дополнительные варианты. Как указано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления набор из 6 CDR может иметь 0, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных модификаций (с аминокислотными заменами, находящими конкретное применение). В этих вариантах осуществления, как правило, одна CDR имеет не более 1 или 2 аминокислотных замен, а мутированные последовательности сохраняют связывание с тау-белком pSer413. Однако, когда аминокислотные варианты вносятся в CDR последовательностей, описанных в данном документе, полученные CDR не относятся к CDR мыши, описанным в PCT/JP13/65090 и приведенным в SEQ ID NO: 81, 82 и 83 (CDR вариабельной области легкой цепи) и SEQ ID NO: 86, 87 и 88 (CDR вариабельной области тяжелой цепи).Thus, for example, additional variants can be created for all of the heavy and light chain variable domains listed herein. As stated herein, in some embodiments, a set of 6 CDRs may have 0, 1, 2, 3, 4, or 5 amino acid modifications (with amino acid substitutions that find particular use). In these embodiments, as a rule, one CDR has no more than 1 or 2 amino acid substitutions, and the mutated sequences retain binding to the pSer413 tau protein. However, when amino acid variants are introduced into the CDRs of the sequences described herein, the resulting CDRs do not apply to the mouse CDRs described in PCT/JP13/65090 and listed in SEQ ID NOS: 81, 82 and 83 (light chain variable region CDR) and SEQ ID NOs: 86, 87 and 88 (heavy chain variable region CDR).

В некоторых случаях могут быть сделаны изменения в каркасной(ых) области(областях) вариабельных доменов тяжелой и/или легкой цепей. В этом варианте предпочтительные варианты в каркасных областях (например, исключая CDR) сохраняют по меньшей мере около 80, 85, 90 или 95% идентичности последовательности с зародышевой линией человека. Таким образом, например, идентичные CDR, как описано в данном документе, могут быть объединены с различными каркасными последовательностями из последовательностей зародышевой линии человека при условии, что каркасные области сохраняют по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% идентичности последовательности с зародышевой линией человека.In some cases, changes can be made in the framework(s) region(s) of the variable domains of the heavy and/or light chains. In this embodiment, preferred variants in the framework regions (eg, excluding CDRs) retain at least about 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with the human germline. Thus, for example, identical CDRs as described herein can be combined with different framework sequences from human germline sequences, provided that the framework regions retain at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with the human germline. .

В некоторых вариантах осуществления для гуманизированных легких цепей, описанных в данном документе, наиболее близкой зародышевой линией легкой цепи человека является IGKV2-30, которая на 81% идентична последовательностям, представленным в данном документе. Таким образом, дополнительные варианты могут быть созданы в каркасных областях легких цепей при условии, что идентичность составляет по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% с IGKV2-30.In some embodiments, for the humanized light chains described herein, the closest human light chain germline is IGKV2-30, which is 81% identical to the sequences provided herein. Thus, additional variants can be created in the framework regions of the light chains, provided that the identity is at least 80%, 85%, 90% or 95% with IGKV2-30.

Для гуманизированных тяжелых цепей в данном случае наиболее близкая зародышевая линия человека для тяжелой цепи представляет собой IGHV3-73, которая на 85% идентична последовательностям, представленным в данном документе. Таким образом, дополнительные варианты могут быть созданы в каркасных областях легких цепей при условии, что идентичность составляет по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% с IGHV3-73.For humanized heavy chains in this case, the closest human germline for the heavy chain is IGHV3-73, which is 85% identical to the sequences presented herein. Thus, additional variants can be created in the framework regions of the light chains, provided that the identity is at least 80%, 85%, 90% or 95% with IGHV3-73.

В альтернативном варианте CDR могут иметь аминокислотные модификации (например, из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных модификаций в наборе CDR (т.е. CDR могут быть модифицированы при условии, что общее количество изменений в наборе из 6 CDR составляет менее 6 аминокислотных модификаций, причем любая комбинация CDR изменяется; например, может быть одно изменение в vlCDR1, два в vhCDR2, ни одного в vhCDR3 и т.д.)), а также изменения в каркасных областях при условии, что каркасные области сохраняют, по меньшей мере, 80, 85 или 90% идентичности с последовательностью зародышевой линии человека, а полученные CDR не относятся к CDR мыши, описанным в PCT/JP13/65090 и приведенным в SEQ ID NO: 81, 82 и 83 (CDR вариабельной области легкой цепи) и SEQ ID NO: 86, 87 и 88 (CDR вариабельной области тяжелой цепи).Alternatively, CDRs may have amino acid modifications (e.g., from 1, 2, 3, 4, or 5 amino acid modifications in a set of CDRs (i.e., CDRs can be modified provided that the total number of changes in a set of 6 CDRs is less than 6 amino acid modifications, with any combination of CDRs changing, for example, there may be one change in vlCDR1, two in vhCDR2, none in vhCDR3, etc.)), as well as changes in the framework regions, provided that the framework regions retain at least at least 80%, 85%, or 90% identity with the human germline sequence, and the resulting CDRs are not related to the mouse CDRs described in PCT/JP13/65090 and listed in SEQ ID NOS: 81, 82, and 83 (light chain variable region CDR) and SEQ ID NOs: 86, 87 and 88 (heavy chain variable region CDR).

Как правило, процент идентичности для сравнения между антителами против pSer413 тау составляет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере около 95, 96, 97, 98 или 99%. Процент идентичности может быть определен вдоль всей аминокислотной последовательности, например всей тяжелой цепи или легкой цепи или вдоль части цепей. Например, в определение антител против pSer413-тау по изобретению включены те, которые имеют идентичность вдоль всей вариабельной области (например, где идентичность составляет 95 или 98% вдоль вариабельных областей) или вдоль всей константной области.Typically, the percent identity for comparison between anti-pSer413 tau antibodies is at least 75%, at least 80%, at least 90%, preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. Percent identity can be determined along the entire amino acid sequence, such as the entire heavy chain or light chain, or along a portion of the chains. For example, included in the definition of anti-pSer413-tau antibodies of the invention are those that have identity along the entire variable region (eg, where the identity is 95 or 98% along the variable regions) or along the entire constant region.

Нуклеиновые кислоты по изобретению.Nucleic acids of the invention.

Также предоставлены композиции нуклеиновых кислот, кодирующие антитела против pSer413 тау по изобретению, а также векторы экспрессии, содержащие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные композициями нуклеиновой кислоты и/или вектора экспрессии. Как будет понятно специалистам в данной области техники, последовательности белка, приведенные в данном документе, могут кодироваться любым числом возможных последовательностей нуклеиновых кислот вследствие вырожденности генетического кода.Also provided are nucleic acid compositions encoding anti-pSer413 tau antibodies of the invention, as well as expression vectors containing nucleic acids, and host cells transformed with nucleic acid and/or expression vector compositions. As will be understood by those skilled in the art, the protein sequences provided herein may be encoded by any number of possible nucleic acid sequences due to the degeneracy of the genetic code.

Таким образом, в изобретении дополнительно предложены композиции нуклеиновых кислот, кодирующих антигенсвязывающие домены и содержащие их антитела. Как будет понятно специалистам в данной области техники, в случае антигенсвязывающих доменов композиции нуклеиновых кислот обычно содержат первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен легкой цепи. В случае scFv может быть получена одна нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, разделенные белковым линкером. В случае традиционных антител композиции нуклеиновых кислот обычно со- 28 040482 держат первую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, которые после экспрессии в клетке самопроизвольно собираются в традиционный тетрамерный формат из двух тяжелых цепей и двух легких цепей.Thus, the invention further provides compositions of nucleic acids encoding antigen-binding domains and containing antibodies. As will be appreciated by those skilled in the art, in the case of antigen binding domains, nucleic acid compositions typically comprise a first nucleic acid encoding a heavy chain variable domain and a second nucleic acid encoding a light chain variable domain. In the case of scFv, a single nucleic acid encoding heavy and light chain variable domains separated by a protein linker can be generated. In the case of conventional antibodies, nucleic acid compositions typically comprise a first nucleic acid encoding a heavy chain and a second nucleic acid encoding a light chain, which, upon expression in a cell, spontaneously assemble into the traditional tetrameric format of two heavy chains and two light chains.

Как известно в данной области техники, нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты изобретения, могут быть включены в векторы экспрессии, как известно в данной области техники, и в зависимости от клеток-хозяев использованы для получения гетеродимерных антител по изобретению. Как будет понятно специалистам в данной области техники, эти две нуклеиновые кислоты могут быть включены в один вектор экспрессии или в два разных вектора экспрессии. Как правило, нуклеиновые кислоты функционально связаны с любым количеством регуляторных элементов (промоторы, точки начала репликации, селективные маркеры, сайты связывания рибосом, индукторы и т.д.). Векторы экспрессии могут быть внехромосомными или интегрирующимися векторами.As is known in the art, nucleic acids encoding components of the invention can be incorporated into expression vectors as is known in the art and, depending on the host cells, used to generate heterodimeric antibodies of the invention. As will be understood by those skilled in the art, the two nucleic acids may be included in one expression vector or in two different expression vectors. Typically, nucleic acids are operably linked to any number of regulatory elements (promoters, replication origins, selectable markers, ribosome binding sites, inducers, etc.). Expression vectors can be extrachromosomal or integrating vectors.

Затем нуклеиновые кислоты и/или векторы экспрессии по изобретению трансформируют в любое количество различных типов клеток-хозяев, как это хорошо известно в данной области техники, включая клетки млекопитающих, бактерий, дрожжей, насекомых и/или грибов, при этом клетки млекопитающих (например, клетки СНО) находят применение во многих вариантах осуществления.The nucleic acids and/or expression vectors of the invention are then transformed into any number of different types of host cells, as is well known in the art, including mammalian, bacterial, yeast, insect, and/or fungal cells, wherein the mammalian cells (e.g., CHO cells) find use in many embodiments.

Антитела по изобретению получают путем культивирования клеток-хозяев, содержащих вектор(ы) экспрессии, как это хорошо известно в данной области техники. После получения выполняются традиционные этапы очистки антител.The antibodies of the invention are obtained by culturing host cells containing the expression vector(s), as is well known in the art. Once received, conventional antibody purification steps are performed.

Биологические и биохимические анализы.Biological and biochemical analyses.

Антитела против pSer413 тау по изобретению можно анализировать в отношении эффективности несколькими способами. Предварительно антитела можно исследовать в отношении связывания с таубелком человека или пептидами, которые фосфорилированы в положении S413, с использованием методик, известных в данной области техники, таких как методики твердофазного ИФА (см., например, пример 2 (1)), Octet, Biacore или FACS, в которых связывание с фосфорилированными пептидами (например, SEQ ID NO: 8) сравнивают со связыванием с нефосфорилированными пептидами (например, SEQ ID NO: 69), как описано в данном документе.Anti-pSer413 tau antibodies of the invention can be analyzed for efficacy in several ways. Previously, antibodies can be tested for binding to human tau protein or peptides that are phosphorylated at position S413 using techniques known in the art, such as ELISA techniques (see, for example, Example 2 (1)), Octet, Biacore or FACS in which binding to phosphorylated peptides (eg, SEQ ID NO: 8) is compared to binding to non-phosphorylated peptides (eg, SEQ ID NO: 69), as described herein.

В некоторых вариантах осуществления эффективность связывания антител, раскрытых в данном документе, измеряют с помощью анализа Biacore. В определенных вариантах осуществления значение K_Dизмеряют с фосфорилированным тау-белком. В некоторых вариантах осуществления значение K_D измеряют с фосфорилированным тау-пептидом. В одном варианте осуществления фосфорилированный таупептид фосфорилируется только в одном остатке (например, SEQ ID NO: 75). В другом варианте осуществления фосфорилированный пептид фосфорилируется во множестве остатков (например, SEQ ID NO: 76 или SEQ ID NO: 78). В некоторых вариантах осуществления значение K_D измеряют с иммобилизованным антигеном (например, фосфорилированным тау-белком или фосфорилированным тау-пептидом) и в этом случае измерение аффинности включает компонент авидности, т.е. происходит в режиме двухвалентного связывания. В других вариантах осуществления значение K_D измеряют с иммобилизованным антителом (например, родительским антителом мыши, химерным антителом или вариантами гуманизированного антитела) и в этом случае измерение аффинности не включает компонент авидности, т.е. происходит в режиме одновалентного связывания. В других вариантах осуществления значение K_D измеряют с иммобилизованным антителом и с фосфорилированным тау-белком в качестве аналита. В других вариантах осуществления значение K_D измеряют с иммобилизованным антителом и с фосфорилированным таупептидом в качестве аналита. В определенных вариантах осуществления значение K_D измеряют в режиме двухвалентного связывания. В других вариантах осуществления значение K_D измеряют в режиме одновалентного связывания.In some embodiments, the binding efficiency of the antibodies disclosed herein is measured using a Biacore assay. In certain embodiments, the K _D value is measured with phosphorylated tau protein. In some embodiments, the K _D value is measured with a phosphorylated tau peptide. In one embodiment, the phosphorylated taupeptide is phosphorylated at only one residue (eg, SEQ ID NO: 75). In another embodiment, the phosphorylated peptide is phosphorylated at multiple residues (eg, SEQ ID NO: 76 or SEQ ID NO: 78). In some embodiments, the K _D value is measured with an immobilized antigen (eg, phosphorylated tau protein or phosphorylated tau peptide), in which case the affinity measurement includes an avidity component, i. occurs in the mode of bivalent bonding. In other embodiments, the K _D value is measured with an immobilized antibody (eg, mouse parent antibody, chimeric antibody, or humanized antibody variants), in which case the affinity measurement does not include an avidity component, i. occurs in the mode of univalent binding. In other embodiments, the K _D value is measured with the immobilized antibody and with phosphorylated tau as analyte. In other embodiments, the K _D value is measured with the immobilized antibody and with the phosphorylated taupeptide as analyte. In certain embodiments, the K _D value is measured in bivalent binding mode. In other embodiments, the K _D value is measured in univalent binding mode.

Кроме того, антитела против pSer413 тау по изобретению также можно анализировать в отношении аффинности связывания в гомогенатах мозга человека с БА, а также анализировать в исследованиях нейтрализации БА-полученных посевных культур тау в анализе агрегации тау P301L в HEC293 и/или в моделях посева и распространения БА-полученного тау с использованием нейронов iPSC человека в микрофлюидных камерах.In addition, anti-tau pSer413 antibodies of the invention can also be analyzed for binding affinity in AD human brain homogenates, as well as analyzed in TA-derived tau seed neutralization studies in the HEC293 tau P301L aggregation assay and/or seeding and spreading models. BA-derived tau using human iPSC neurons in microfluidic chambers.

Кроме того, антитела против pSer413 тау по изобретению также можно использовать в иммуногистохимических анализах образцов мозга пациентов с БА.In addition, the pSer413 tau antibodies of the invention can also be used in immunohistochemical analyzes of brain samples from AD patients.

Кроме того, антитела против pSer413 тау по изобретению можно анализировать в отношении эффективности на животных моделях когнитивных расстройств, включая болезнь Альцгеймера (БА). Животные для исследования терапевтических или профилактических агентов от когнитивных расстройств по изобретению включают животные модели когнитивных расстройств, в частности животные модели таупатий. Животные модели таупатий представляют собой животных, экспрессирующих тау нормального типа или мутантный тау в головном мозге, и, в частности, животные модели, демонстрирующие нарушение когнитивной функции. Такие животные, экспрессирующие тау нормального типа или мутантный тау в мозге, могут быть получены с помощью генной инженерии; типичным примером являются трансгенные мыши (мыши Tg). Животные модели, такие как мыши Tg, которые экспрессируют мутантный тау, полезны в качестве моделей генетических наследственных таупатий, но в случае изучения эффекта терапевтического агента или профилактического агента от спорадических таупатий, которые со- 29 040482 ставляют большинство случаев среди людей, предпочтительно эффект проявляется у мышей Tg, экспрессирующих тау нормального типа. Наиболее подходящими в качестве мышей Tg, экспрессирующих тау нормального типа, являются мыши, полученные в примерах получения по данному изобретению, но также можно использовать мышей Tg, описанных Kambe et al. (Neurobiology of Disease, vol. 42, p. 404414, 2011) и Kimura et al. (The EMBO J., vol. 26, p. 5143-5152, 2007), обе из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте и конкретно для создания и использования трансгенных мышей. Однако, хотя у мышей по Kambe et al. наблюдается нарушение когнитивной функции, оно появляется после 14 и 20 месяцев соответственно, а следовательно, начало проявляется уже в процессе старения и эффекты старения также могут быть способствующими факторами, в то время как эффекты и затраты на долгосрочное разведение также вызывают осложнения.In addition, anti-tau pSer413 antibodies of the invention can be tested for efficacy in animal models of cognitive disorders, including Alzheimer's disease (AD). Animals for research into therapeutic or prophylactic agents for cognitive disorders of the invention include animal models of cognitive disorders, in particular animal models of taupathies. Animal models of taupathies are animals expressing normal-type tau or mutant tau in the brain, and in particular, animal models showing impaired cognitive function. Such animals expressing normal type tau or mutant tau in the brain can be obtained by genetic engineering; transgenic mice (Tg mice) are a typical example. Animal models, such as Tg mice that express mutant tau, are useful as models for genetic hereditary taupathies, but when studying the effect of a therapeutic agent or prophylactic agent for sporadic taupathies, which account for the majority of cases in humans, the effect is preferably seen in Tg mice expressing normal-type tau. The most suitable Tg mice expressing normal type tau are those produced in the preparation examples of this invention, but the Tg mice described by Kambe et al. can also be used. (Neurobiology of Disease, vol. 42, p. 404414, 2011) and Kimura et al. (The EMBO J., vol. 26, p. 5143-5152, 2007), both of which are incorporated herein by reference in their entirety and specifically for the creation and use of transgenic mice. However, although in mice according to Kambe et al. cognitive impairment is observed, it appears after 14 and 20 months, respectively, and therefore the onset is already manifested in the aging process and the effects of aging can also be contributing factors, while the effects and costs of long-term dilution also cause complications.

Предпочтительным методом исследования действия терапевтического агента или профилактического агента на когнитивные расстройства в соответствии с изобретением в животной модели является метод исследования когнитивной функции, такой как тест на обучение памяти. Такой метод может быть тестом с водным лабиринтом Морриса, пошаговым тестом обучения или тестом распознавания нового объекта, но предпочтительно он представляет собой комбинацию тестов для поведенческих измерений, таких как тест открытого поля, чтобы принять во внимание условия количества поведения и беспокойства животных.A preferred method for testing the effect of a therapeutic agent or prophylactic agent on cognitive impairment in an animal model is a cognitive function test, such as a memory learning test. Such a method may be a Morris water maze test, a step-by-step learning test, or a novel object recognition test, but is preferably a combination of tests for behavioral measurements, such as an open field test, to take into account the conditions of animal behavior and anxiety.

В качестве способов исследования действия терапевтического агента или профилактического агента на когнитивные расстройства в соответствии с изобретением можно использовать методы исследования уровней тау-белка или фосфорилированного тау в ткани мозга во время введения в животной модели когнитивного расстройства. При БА и других нейродегенеративных заболеваниях уровни экспрессии таубелка или повышенное патологическое фосфорилирование тау связаны с патологией (Khalid Iqbal et al., Cur. Alzheimer Res., vol. 7, p. 654-664, 2010). Также хорошо известно, что снижение экспрессии тау и аномальные уровни фосфорилированного тау у некоторых патологических модельных животных приводят к улучшению когнитивной функции и моторной функции (K. Santa Cruz et al., Science, 30, vol. 9, p. 476-481, 2005; Sylvie Le Corre et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, vol. 103, p. 9673-9678, 2006). В качестве метода изучения изменений в тау-белке или фосфорилированном тау это может быть достигнуто с помощью такого метода, как вестерн-блоттинг с использованием гомогената ткани мозга, как описано в примерах, но специалист в данной области может выбрать другой подходящий метод, такой как твердофазный ИФА (Xiyun Chai et al., J. Biol. Chem., vol. 286, p. 34457-34467, 2011) или иммуногистохимический метод (David J. Irwin et al., BRAIN, vol. 135, p. 807-818, 2012).Methods for testing the effect of a therapeutic agent or prophylactic agent on cognitive impairment according to the invention may use methods for testing levels of tau or phosphorylated tau in brain tissue during administration in an animal model of cognitive impairment. In AD and other neurodegenerative diseases, tau protein expression levels or increased abnormal tau phosphorylation are associated with pathology (Khalid Iqbal et al., Cur. Alzheimer Res., vol. 7, p. 654-664, 2010). It is also well known that decreased tau expression and abnormal levels of phosphorylated tau in some pathological animal models lead to improved cognitive and motor function (K. Santa Cruz et al., Science, 30, vol. 9, p. 476-481, 2005 ; Sylvie Le Corre et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, vol. 103, p. 9673-9678, 2006). As a method to study changes in tau protein or phosphorylated tau, this can be achieved by a technique such as Western blot using a brain tissue homogenate as described in the examples, but one skilled in the art may choose another suitable technique such as solid phase ELISA (Xiyun Chai et al., J. Biol. Chem., vol. 286, p. 34457-34467, 2011) or immunohistochemical method (David J. Irwin et al., BRAIN, vol. 135, p. 807-818 , 2012).

Составы.Compositions.

Составы антител, используемых согласно настоящему изобретению, готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (которые в целом описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]) в форме лиофилизированных составов или водных растворов.Antibody formulations used in the present invention are prepared for storage by mixing an antibody having the desired purity with optional pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers (which are generally described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. [ 1980]) in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions.

Терапевтический или профилактический агент от когнитивных расстройств в соответствии с данным изобретением может быть составлен в форме фармацевтической композиции, содержащей, помимо гуманизированного антитела против фосфорилированного тау в соответствии с данным изобретением, фармацевтически приемлемый носитель и/или другие вспомогательные вещества. Состав с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или других вспомогательных веществ может быть изготовлен с использованием способа, описанного, например, в University of the Sciences in Philadelphia, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Такой терапевтический или профилактический агент может быть предоставлен в виде жидкой композиции, приготовленной растворением, суспендированием или эмульгированием ингредиентов в стерильной водной среде или масляной среде или в виде лиофилизированной композиции. Среда или растворитель для приготовления такого состава могут представлять собой водную среду, примеры которой включают дистиллированную воду для инъекций и физиологический солевой раствор, который при желании можно использовать с добавлением осморегулирующего агента (например, D-глюкозы, D-сорбита, D-маннита и хлорида натрия) и/или в сочетании с подходящим растворяющим средством, таким как спирт (например, этанол), полиспирт (например, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), или неионогенным поверхностно-активным веществом (например, полисорбатом 80 или полиоксиэтиленовым гидрогенизированным касторовым маслом 50). Такой состав также может быть приготовлен с маслянистой средой или растворителем, примеры которых включают кунжутное масло и соевое масло, которые необязательно можно использовать в сочетании с растворяющим средством, таким как бензилбензоат и бензиловый спирт. Такие жидкие лекарственные средства часто могут быть приготовлены с использованием соответствующих добавок, таких как буферные агенты (например, фосфатные буферные агенты и ацетатные буферные агенты), смягчающие агенты (например, хлорид бензалкония и гидрохлорид прокаина), стабилизаторы (например, человеческий сывороточный альбумин и полиэтиленгликоль), консерванты (например, аскорбиновая кислота, эриторбиновая кислота и их соли), красители (например, хлорофилл-в-каротин меди, красный № 2 и синий № 1), антисептические агенты (например, сложные эфиры параоксибензойнойThe therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders according to the invention may be formulated as a pharmaceutical composition containing, in addition to the humanized anti-phosphorylated tau antibody according to the invention, a pharmaceutically acceptable carrier and/or other excipients. A formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or other excipients can be prepared using the method described, for example, in the University of the Sciences in Philadelphia, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Such a therapeutic or prophylactic agent may be provided as a liquid composition prepared by dissolving, suspending or emulsifying the ingredients in a sterile aqueous or oily medium, or as a lyophilized composition. The medium or solvent for preparing such a formulation may be an aqueous medium, examples of which include distilled water for injection and physiological saline, which may optionally be used with the addition of an osmoregulatory agent (e.g., D-glucose, D-sorbitol, D-mannitol, and chloride sodium) and/or in combination with a suitable solvent such as an alcohol (eg ethanol), a polyalcohol (eg propylene glycol or polyethylene glycol), or a non-ionic surfactant (eg polysorbate 80 or polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50). Such a formulation may also be prepared with an oily medium or solvent, examples of which include sesame oil and soybean oil, which may optionally be used in combination with a solvent such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Such liquid formulations can often be formulated using appropriate additives such as buffering agents (eg, phosphate buffering agents and acetate buffering agents), emollients (eg, benzalkonium chloride and procaine hydrochloride), stabilizers (eg, human serum albumin and polyethylene glycol). ), preservatives (eg, ascorbic acid, erythorbic acid, and their salts), dyes (eg, copper chlorophyll-b-carotene, red #2 and blue #1), antiseptic agents (eg, esters of paraoxybenzoic

- 30 040482 кислоты, фенол, хлорид бензетония и бензалкония хлорид), загустители (например, гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и их соли), стабилизаторы (например, человеческий сывороточный альбумин, маннит и сорбит) и средства, устраняющие запахи (например, ментоловые и цитрусовые ароматы). Различные формы терапевтических или профилактических агентов включают твердые препараты, такие как порошки, таблетки, гранулы, капсулы, пилюли, суппозитории и пастилки. Для твердого препарата для перорального применения могут быть использованы добавки, такие как наполнители (например, кристаллическая целлюлоза, лактоза и крахмал), смазывающие вещества (например, стеарат магния и тальк), связующие вещества (гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, макрогол и т.п.) и дезинтеграторы (например, крахмал и карбоксиметилцеллюлоза кальция). При необходимости могут быть использованы добавки, такие как антисептики (например, бензиловый спирт, хлорбутанол, метилпараоксибензоат и пропилпараоксибензоат), антиоксиданты, красители, подсластители и т.п. Другие альтернативные формы включают терапевтические агенты или профилактические средства для нанесения на слизистые оболочки; такие составы часто содержат добавки, такие как чувствительные к давлению адгезивы, чувствительные к давлению усилители, регуляторы вязкости, загущающие агенты и т.п. (например, муцин, агар, желатин, пектин), каррагинан, альгинат натрия, камедь рожкового дерева, ксантановую камедь, трагакантовую камедь, гуммиарабик, хитозан, пуллулан, воскообразный крахмал, сукральфат, целлюлозу и ее производные (такие как гидроксипропилметилцеллюлоза), сложные эфиры полиглицерина и жирных кислот, сополимеры акриловая кислота-алкил(мет)акрилатил и их соли и полиглицериновые сложные эфиры жирных кислот), главным образом, для придания свойств адсорбции или удержания в слизистой оболочке. Однако форма, растворитель и добавки для терапевтического агента или профилактического агента, вводимого в организм, не ограничиваются этим и специалист в данной области техники может сделать соответствующий выбор.- 30 040482 acids, phenol, benzethonium chloride and benzalkonium chloride), thickeners (for example, hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose and their salts), stabilizers (for example, human serum albumin, mannitol and sorbitol) and odor removers (for example, menthol and citrus aromas ). Various forms of therapeutic or prophylactic agents include solid preparations such as powders, tablets, granules, capsules, pills, suppositories and lozenges. For a solid oral preparation, additives such as excipients (e.g., crystalline cellulose, lactose, and starch), lubricants (e.g., magnesium stearate and talc), binders (hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, macrogol, etc.) can be used. and disintegrants (eg, starch and calcium carboxymethylcellulose). If necessary, additives such as antiseptics (eg, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl paraoxybenzoate and propyl paraoxybenzoate), antioxidants, colorants, sweeteners, and the like can be used. Other alternative forms include therapeutic agents or mucosal prophylactic agents; such formulations often contain additives such as pressure sensitive adhesives, pressure sensitive enhancers, viscosity regulators, thickening agents, and the like. (e.g. mucin, agar, gelatin, pectin), carrageenan, sodium alginate, locust bean gum, xanthan gum, gum tragacanth, gum arabic, chitosan, pullulan, waxy starch, sucralfate, cellulose and its derivatives (such as hydroxypropyl methylcellulose), esters polyglycerol and fatty acids, copolymers of acrylic acid-alkyl(meth)acrylatyl and their salts and polyglycerol esters of fatty acids), mainly to impart adsorption or retention properties in the mucosa. However, the form, solvent, and additives for the therapeutic agent or prophylactic agent administered to the body are not limited to this, and the person skilled in the art can make an appropriate choice.

Терапевтическое или профилактическое средство от когнитивных расстройств по данному изобретению может содержать, в дополнение к гуманизированному антителу против фосфорилированного тау по данному изобретению, другие известные лекарственные средства, обладающие эффектом лечения или предотвращения когнитивных расстройств, и, в частности, лекарственные средства, имеющие эффект подавления прогрессирования когнитивных расстройств. В альтернативном варианте терапевтический или профилактический агент от когнитивных расстройств в соответствии с данным изобретением, содержащий гуманизированное антитело против фосфорилированного тау в соответствии с данным изобретением, можно комбинировать с другим терапевтическим или профилактическим агентом, содержащим известное лекарственное средство, обладающее эффектом лечения или предотвращения когнитивных расстройств, и, в частности, лекарственное средство, обладающее эффектом ингибирования прогрессирования когнитивных расстройств, для получения в форме набора. Ингредиенты, обладающие эффектами ингибирования прогрессирования когнитивных расстройств, включают, но не ограничиваются ими, донепезил, галантамин, мемантин и ривастигмин. Дозировка ингредиента, обладающего эффектом ингибирования прогрессирования когнитивных расстройств, и дозировка терапевтического или профилактического агента, содержащего ингредиент, обладающий эффектом ингибирования прогрессирования когнитивных расстройств, могут находиться в пределах дозировок, используемых для нормальной терапии, но могут быть увеличены или уменьшены в зависимости от условий.The therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders of the present invention may contain, in addition to the humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention, other known drugs having the effect of treating or preventing cognitive disorders, and in particular, drugs having the effect of suppressing the progression cognitive disorders. Alternatively, a therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders according to the present invention containing a humanized anti-phosphorylated tau antibody according to the present invention may be combined with another therapeutic or prophylactic agent containing a known drug having the effect of treating or preventing cognitive disorders, and in particular, a drug having an effect of inhibiting the progression of cognitive disorders, to be obtained in the form of a kit. Ingredients having effects of inhibiting the progression of cognitive impairment include, but are not limited to, donepezil, galantamine, memantine, and rivastigmine. The dosage of the ingredient having the effect of inhibiting the progression of cognitive disorders and the dosage of the therapeutic or prophylactic agent containing the ingredient having the effect of inhibiting the progression of cognitive disorders may be within the dosage range used for normal therapy, but may be increased or decreased depending on the conditions.

Хотя авторы данного изобретения указали экспериментальные результаты, в WO 2013/180238 A (патентный документ 4), которые демонстрируют, что антитело проявляет лекарственный эффект, воздействуя на мозг через гематоэнцефалический барьер, даже при периферическом введении путем внутрибрюшинного введения, также возможно приготовить состав, который эффективно доставляет гуманизированное антитело против фосфорилированного тау по данному изобретению, которое содержится в терапевтическом или профилактическом агенте для лечения когнитивных расстройств по данному изобретению, в ткань мозга. Такие составы также охватываются терапевтическим или профилактическим агентом от когнитивных расстройств согласно изобретению. Известны способы эффективной доставки антител или пептидов в ткани мозга через гематоэнцефалический барьер, такие как способы добавления нацеливающих веществ или способы инкапсулирования в липосомах или наночастицах. Вещества, которые следует использовать для нацеливания, включают вещества, которые подвергаются полному или частичному изменению характеристик заряда в результате связывания с антителом или пептидами, белками или другими соединениями, обладающими свойством связывания со специфическим рецептором или транспортером. Примеры пептидов, белков или других соединений, имеющих свойство связываться со специфическим рецептором или мембранным белком, включают лиганды, которые связываются с рецепторными лигандами или мембранными белками, и их аналоги, а также антитела, соединенияагонисты/соединения-антагонисты/аллостерические модуляторы, которые связываются с рецепторными лигандами или мембранными белками, и их соединения-аналоги. Примеры рецепторных лигандов или мембранных белков в качестве мишеней для пептида, белка или другого соединения, обладающего свойством связывания со специфическим рецептором или транспортером, включают рецептор трансферрина (TfR), рецептор инсулина (IR), рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR) белок, связанный с рецептором ЛПНП (LRP), и рецептор дифтерийного токсина (НВ-EGF) без каких-либо конкретных ограничений (Angela R. Jones et al., Pharm. Res., 2007, vol. 24, № 9, p. 1759-1771). Вещество для нацеливанияAlthough the inventors of the present invention have indicated experimental results, in WO 2013/180238 A (patent document 4), which demonstrate that the antibody exhibits a drug effect by acting on the brain through the blood-brain barrier, even when administered peripherally by intraperitoneal administration, it is also possible to prepare a composition that effectively delivers the humanized anti-phosphorylated tau antibody of the present invention, which is contained in the therapeutic or prophylactic agent for treating cognitive disorders of the present invention, to the brain tissue. Such compositions are also covered by the therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders according to the invention. Methods are known for effectively delivering antibodies or peptides to brain tissue across the blood-brain barrier, such as methods for adding targeting agents or methods for encapsulation in liposomes or nanoparticles. Substances that should be used for targeting include those that undergo a complete or partial change in charge characteristics as a result of binding to an antibody or peptides, proteins or other compounds that have the property of binding to a specific receptor or transporter. Examples of peptides, proteins, or other compounds that have the ability to bind to a specific receptor or membrane protein include ligands that bind to receptor ligands or membrane proteins and their analogs, as well as antibodies, agonist/antagonist compounds/allosteric modulators that bind to receptor ligands or membrane proteins, and their analogue compounds. Examples of receptor ligands or membrane proteins as targets for a peptide, protein, or other compound having the property of binding to a specific receptor or transporter include transferrin receptor (TfR), insulin receptor (IR), insulin-like growth factor receptor (IGFR) protein associated with LDL receptor (LRP), and diphtheria toxin receptor (HB-EGF) without any particular limitation (Angela R. Jones et al., Pharm. Res., 2007, vol. 24, no. 9, p. 1759-1771) . substance to target

- 31 040482 может быть химически добавлено к антителу для использования в качестве терапевтического или профилактического агента для лечения когнитивных расстройств в соответствии с изобретением, причем этот способ может быть соответствующим образом осуществлен специалистом в данной области техники со ссылкой на известный метод, такой как описанный, например, в Hermanson et al., Bioconjugate techniques, USA, Academic Press, 1996. Вещество для нацеливания также может быть связано с липосомами или наночастицами, инкапсулирующими антитело или пептид (Sonu Bhaskar et al., Particle and Fibre Toxicology, 2010, 7:3). Кроме того, когда вещество для нацеливания представляет собой пептид или белок, оно может быть получено в виде подходящего слитого белка специалистом в данной области техники с использованием методов генной инженерии либо путем получения слитого пептида путем химического синтеза пептидов, либо путем объединения нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность пептида или белка, с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность для используемого антитела или пептида.- 31 040482 can be chemically added to an antibody for use as a therapeutic or prophylactic agent for the treatment of cognitive disorders in accordance with the invention, and this method can be appropriately carried out by a person skilled in the art with reference to a known method, such as described, for example , in Hermanson et al., Bioconjugate techniques, USA, Academic Press, 1996. The targeting agent can also be associated with liposomes or nanoparticles encapsulating the antibody or peptide (Sonu Bhaskar et al., Particle and Fiber Toxicology, 2010, 7:3 ). In addition, when the targeting agent is a peptide or protein, it can be obtained as a suitable fusion protein by a person skilled in the art using genetic engineering methods, either by obtaining a fusion peptide by chemical synthesis of peptides, or by combining a nucleic acid containing a nucleotide a sequence encoding the amino acid sequence of the peptide or protein, with a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence for the antibody or peptide used.

Терапевтический или профилактический агент согласно данному изобретению можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, перорально или парентерально, с целью улучшения симптомов. Для перорального введения может быть выбрана лекарственная форма, такая как гранулы, порошок, таблетки, капсулы, жидкое лекарственное средство, сироп, эмульсия, суспендирующий агент или эликсир. Для парентерального введения можно приготовить трансназальный агент и выбрать жидкое лекарственное средство, суспензию или твердую композицию. Инъекция может быть приготовлена в виде другой формы парентерального введения, причем инъекцию выбирают из подкожной инъекции, внутривенной инъекции, инфузии, внутримышечной инъекции, внутрицеребровентрикулярной инъекции или внутрибрюшинной инъекции. Другие составы, используемые для парентерального введения, включают суппозитории, сублингвальные агенты, чрескожные агенты и агенты для введения через слизистую оболочку, отличные от трансназальных агентов. Кроме того, внутрисосудистое местное введение возможно путем добавления или нанесения покрытия на стент или внутрисосудистый обтуратор.The therapeutic or prophylactic agent of the present invention may be administered orally or parenterally to a patient in need thereof in order to improve symptoms. For oral administration, a dosage form such as granules, powder, tablets, capsules, liquid drug, syrup, emulsion, suspending agent or elixir may be selected. For parenteral administration, a transnasal agent can be prepared and a liquid drug, suspension, or solid formulation can be selected. The injection may be prepared as another form of parenteral administration, the injection being selected from subcutaneous injection, intravenous injection, infusion, intramuscular injection, intracerebroventricular injection, or intraperitoneal injection. Other formulations used for parenteral administration include suppositories, sublingual agents, transdermal agents, and transmucosal agents other than transnasal agents. In addition, local intravascular administration is possible by adding or coating a stent or intravascular obturator.

Доза агента для лечения или предотвращения согласно изобретению будет отличаться в зависимости от возраста пациента, пола, массы тела и симптомов, терапевтического эффекта, способа введения, времени лечения или типов активных ингредиентов в медицинской композиции, но обычно его можно вводить в диапазоне от 0,1 мг до 1 г и предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 200 мг активного соединения на введение для взрослых. Однако, поскольку доза будет варьироваться в зависимости от множества условий, могут быть достаточными более низкие дозы, чем упомянутые выше, или могут потребоваться дозы, превышающие эти диапазоны. Агент для лечения или предотвращения согласно изобретению может проявлять эффект в течение короткого периода введения.The dose of the agent for treating or preventing according to the invention will differ depending on the age of the patient, sex, body weight and symptoms, therapeutic effect, route of administration, time of treatment, or types of active ingredients in the medical composition, but usually it can be administered in the range of 0.1 mg to 1 g, and preferably in the range of 0.5 to 200 mg of active compound per adult administration. However, since the dose will vary depending on a variety of conditions, lower doses than those mentioned above may be sufficient, or doses in excess of these ranges may be required. The agent for treatment or prevention according to the invention may be effective within a short period of administration.

Введение антител.Introduction of antibodies.

После получения антитела по изобретению находят применение при лечении когнитивных расстройств, таких как таупатии. Как обсуждалось в данном документе, внутриклеточное накопление таубелка было продемонстрировано при различных невропатологических состояниях. Заболевания, вызванные таким внутриклеточным накоплением тау, в совокупности называют таупатиями (см. выше Arai, полностью включенную в данное описание посредством ссылки, и для описанных в данном документе расстройств). Таупатии включают нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (БА), кортикобазальную дегенерацию (CBD) или кортикобазальный синдром (CBS), прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, аргирофильную зернистую деменцию (болезнь аргирофильного зерна), множественную системную таупатию с деменцией (MSTD), лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, сцепленную с хромосомой 17 (FTDP-17), нейрофибриллярную клубочковую деменцию, диффузные нейрофибриллатные клубки с кальцификацией (DNTC), таупатию белого вещества с глобулярными глиальными включениями (WMT-GGI), лобно-височную лобарную дегенерацию с таупозитивными включениями (FTLD-тау). Таупатии также включают ненейродегенеративные заболевания, включая инфекционные заболевания, такие как последствия энцефалита Экономо и подострый склерозирующий панэнцефалит; и вызванные травмой состояния, такие как энцефалопатия боксеров.Once produced, the antibodies of the invention find use in the treatment of cognitive disorders such as taupathies. As discussed herein, intracellular accumulation of tau protein has been demonstrated in a variety of neuropathological conditions. Diseases caused by such intracellular accumulation of tau are collectively referred to as taupathies (see above, Arai, incorporated herein by reference in its entirety, and for the disorders described herein). Taupopathies include neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD), corticobasal degeneration (CBD) or corticobasal syndrome (CBS), progressive supranuclear palsy, Pick's disease, argyrophilic granular dementia (argyrophilic granule disease), multiple systemic taupopathy with dementia (MSTD), frontotemporal dementia with chromosome 17-linked parkinsonism (FTDP-17), neurofibrillary glomerular dementia, diffuse neurofibrillate tangles with calcification (DNTC), white matter tauopathy with globular glial inclusions (WMT-GGI), frontotemporal lobar degeneration with taupositive inclusions (FTLD-tau). Taupopathies also include non-neurodegenerative diseases, including infectious diseases such as the sequelae of Economo's encephalitis and subacute sclerosing panencephalitis; and trauma-induced conditions such as boxer encephalopathy.

Когнитивные расстройства определяются как тип интеллектуального нарушения, которое включает состояние, когда однажды развитая или приобретенная интеллектуальная функция снизилась (New Psychiatry (Nankodo's Essential Well-Advanced Series) (Японская книга), под редакцией Kunitoshi Kamijima and Shin-ichi Niwa, Nankodo Co., Ltd., 2008, p. 69-70), но считаются в широком смысле заболеваниями, проявляющими интеллектуальные нарушения и/или ухудшение памяти. При диагностике нейродегенеративных заболеваний, таких как БА, определяется, является ли состояние нейродегенеративным, например, путем анализа того, существуют ли нейрофибриллярные клубки (NFT), посредством гистологического анализа после смерти, в то время как врачи диагностируют когнитивные расстройства, особенно такие, как нейродегенеративные заболевания, с использованием различных средств, например нейропсихологических исследований с помощью обследований, таких как переработанная шкала деменции Хасегавы (HDS-R) и исследование мини-психического состояния (MMSE); нейропсихологических исследований посредством наблюдений, таких как оценка клинической деменции (CDR) или этап функциональной оценки (FAST); биохимических исследований, основанных, например, на повышении уровней тау иCognitive impairment is defined as a type of intellectual impairment that includes a condition where once developed or acquired intellectual function has declined (New Psychiatry (Nankodo's Essential Well-Advanced Series) (Japanese Book), edited by Kunitoshi Kamijima and Shin-ichi Niwa, Nankodo Co., Ltd., 2008, pp. 69-70), but are considered broadly as diseases that exhibit intellectual impairment and/or memory impairment. When diagnosing neurodegenerative diseases such as AD, it is determined whether the condition is neurodegenerative, for example, by analyzing whether neurofibrillary tangles (NFTs) exist, through histological analysis after death, while doctors diagnose cognitive disorders, especially such as neurodegenerative diseases, using various means, for example, neuropsychological studies using surveys such as the revised Hasegawa Dementia Scale (HDS-R) and Mini-Mental State Examination (MMSE); neuropsychological studies through observations such as the clinical dementia assessment (CDR) or the functional assessment phase (FAST); biochemical studies based, for example, on increasing the levels of tau and

- 32 040482 фосфорилированного тау или увеличении уровня Αβ в спинномозговой жидкости; и визуальной оценки на основе информации, полученной, например, с помощью KT головы, МРТ головы, SPECT или PET. Терапевтический или профилактический агент от когнитивных расстройств в соответствии с данным изобретением вводится пациенту, у которого врач диагностировал когнитивное расстройство, и оказывает эффект улучшения состояния пациента по сравнению с состоянием перед введением, контроля прогрессирования состояния посредством введения или поддержания состояния на уровне или восстановления состояния до уровня до введения на основании по меньшей мере одного из диагностических индексов нейродегенеративного заболевания.- 32 040482 phosphorylated tau or an increase in the level of Αβ in the cerebrospinal fluid; and visual evaluation based on information obtained from, for example, head CT, head MRI, SPECT, or PET. The therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders according to the present invention is administered to a patient in whom a physician has diagnosed a cognitive disorder, and has the effect of improving the condition of the patient compared to the condition before administration, controlling the progression of the condition by introducing or maintaining the condition at the level, or restoring the condition to the level prior to administration based on at least one of the diagnostic indices of a neurodegenerative disease.

Терапевтический или профилактический агент от когнитивных расстройств в соответствии с данным изобретением может также оказывать эффект улучшения когнитивной функции, или ингибирования снижения когнитивной функции, или поддержания когнитивной функции у человека или животного, не являющегося человеком. Примеры таких животных, отличных от человека, предпочтительно должны представлять собой животных, экспрессирующих тау, имеющий высокую гомологию с тау человека, и включают, но не ограничиваются ими, шимпанзе, макаку, лошадь, свинью, собаку, мышь, кролика, крысу и кошку.The therapeutic or prophylactic agent for cognitive disorders according to the present invention may also have the effect of improving cognitive function, or inhibiting cognitive decline, or maintaining cognitive function in a human or non-human animal. Examples of such non-human animals should preferably be animals expressing tau having high homology to human tau and include, but are not limited to, chimpanzee, macaque, horse, pig, dog, mouse, rabbit, rat, and cat.

ПримерыExamples

Пример 1. Получение антитела.Example 1 Obtaining an antibody.

1. Антитело мыши (родительское антитело).1. Mouse antibody (parent antibody).

Мышиное антитело Та1505 использовали в качестве родительского антитела для химерного антитела и гуманизированного антитела. Детали мышиного антитела Та1505 описаны в примерах международной публикации № WO 2013/180238 A. Аминокислотная последовательность легкой цепи (L-цепи) антитела мыши Та1505 определена в SEQ ID NO: 44, а нуклеотидная последовательность, кодирующая ее, определена в SEQ ID NO: 45. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (Н-цепи) антитела мыши Та1505 определена в SEQ ID NO: 46, а нуклеотидная последовательность, кодирующая ее, определена в SEQ ID NO: 47.The mouse antibody Ta1505 was used as the parent antibody for the chimeric antibody and the humanized antibody. Details of the mouse antibody Ta1505 are described in the examples of International Publication No. WO 2013/180238 A. The amino acid sequence of the light chain (L chain) of the mouse antibody Ta1505 is defined in SEQ ID NO: 44, and the nucleotide sequence encoding it is defined in SEQ ID NO: 45 The amino acid sequence of the heavy chain (H chain) of mouse antibody Ta1505 is defined in SEQ ID NO: 46, and the nucleotide sequence encoding it is defined in SEQ ID NO: 47.

2. Химерное антитело.2. Chimeric antibody.

Химерное антитело было получено путем объединения вариабельных областей легкой цепи (L-цепи) и тяжелой цепи (Н-цепи) антитела мыши Та1505 с соответственно константными областями L-цепи и Н-цепи иммуноглобулина (Ig) G1 (k) человека. Аминокислотная последовательность легкой цепи (L-цепи) химерного антитела определена в SEQ ID NO: 48, а нуклеотидная последовательность, кодирующая ее, определена в SEQ ID NO: 49. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (Н-цепи) химерного антитела определена в SEQ ID NO: 50, а нуклеотидная последовательность, кодирующая ее, определена в SEQ ID NO: 51. Во всем описании это химерное антитело упоминается как химерное антитело или химерное антитело Та1505.The chimeric antibody was generated by combining the light chain (L-chain) and heavy chain (H-chain) variable regions of the mouse Ta1505 antibody with human immunoglobulin (Ig) G1(k) L-chain and H-chain constant regions, respectively. The amino acid sequence of the light chain (L chain) of the chimeric antibody is defined in SEQ ID NO: 48, and the nucleotide sequence encoding it is defined in SEQ ID NO: 49. The amino acid sequence of the heavy chain (H chain) of the chimeric antibody is defined in SEQ ID NO: : 50, and the nucleotide sequence encoding it is defined in SEQ ID NO: 51. Throughout the description, this chimeric antibody is referred to as a chimeric antibody or a chimeric Ta1505 antibody.

3. Гуманизированное антитело.3. Humanized antibody.

Конструирование VL и VH.Construction of VL and VH.

Первичные последовательности, имеющие высокую гомологию, были отобраны из человеческой зародышевой линии, и гуманизация была осуществлена с помощью прививания определяющей комплементарность области (CDR) для конструирования множества гуманизированных антител.Primary sequences with high homology were selected from the human germline and humanization was performed by grafting a complementarity determining region (CDR) to construct a plurality of humanized antibodies.

Подробно, человеческие структуры, имеющие высокую гомологию, были отобраны из базы данных; область CDR мышиного антитела Та1505 была вставлена в каждый из каркасов; замены аминокислот проводили, например, для снижения иммуногенности при сохранении активности. Тем самым были сконструированы аминокислотные последовательности различных вариабельных областей легкой цепи (VL) и вариабельных областей тяжелой цепи (VH). Номера SEQ ID аминокислотных последовательностей VL и номера SEQ ID нуклеотидных последовательностей кодирующих их генов приведены в табл. 2А, а номера SEQ ID аминокислотных последовательностей VH и нуклеотидных последовательностей кодирующих их генов приведены в табл. 2В. Выравнивания аминокислотных последовательностей VL и VH показаны на фиг. 2А и 2В соответственно.In detail, human structures having high homology were selected from a database; the mouse antibody Ta1505 CDR region was inserted into each of the scaffolds; amino acid substitutions were made, for example, to reduce immunogenicity while maintaining activity. Thus, the amino acid sequences of various light chain variable regions (VL) and heavy chain variable regions (VH) were constructed. The SEQ ID numbers of the VL amino acid sequences and the SEQ ID numbers of the nucleotide sequences of the genes encoding them are shown in Table 1. 2A, and the SEQ ID numbers of the amino acid sequences of VH and the nucleotide sequences of the genes encoding them are given in table. 2B. Amino acid sequence alignments of VL and VH are shown in FIG. 2A and 2B, respectively.

Таблица 2АTable 2A

Вариабельная область легкой цепи (VL)Light chain variable region (VL)

Кодовое название code name Аминокислотная последовательность Amino acid sequence Нуклеотидная последовательность Nucleotide sequence VL15 VL15 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:33 VL3 6 VL36 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:35 VL4 6 VL4 6 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:37 VL4 7 VL4 7 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:39 VL4 8 VL4 8 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:41 VL50 VL50 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:43

- 33 040482- 33 040482

Таблица 2ВTable 2B

Вариабельная область тяжелой цепи (VH)Heavy chain variable region (VH)

Кодовое название code name Аминокислотная последовательность Amino acid sequence Нуклеотидная последовательность Nucleotide sequence VH11 VH11 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:19 VH12 VH12 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:21 VH4 7 VH4 7 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:23 VH61 VH61 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:25 VH62 VH62 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:27 VH64 VH64 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:29 VH65 VH65 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:31

Выбор комбинации VL и VH на основе оценки иммуногенности VL и VH, сконструированных с помощью описанной выше процедуры, объединяли произвольно, и показатель иммуногенности (показатель DRB1) каждой комбинации рассчитывали с помощью программного обеспечения для анализа in vitro Epibase (Lonza). Комбинации VL и VH, которые будут использоваться в последующих экспериментах, были выбраны из комбинаций, демонстрирующих низкую иммуногенность с показателями иммуногенности, равными или меньшими, чем заданное значение (показатель DRB1: 1500). Выбранные комбинации VL и VH приведены в табл. 3А, а показатели иммуногенности (показатель DRB1) этих комбинаций приведены в табл. 3В.The selection of the combination of VL and VH based on the immunogenicity score of the VL and VH constructed using the above procedure was randomly pooled, and the immunogenicity score (DRB1 score) of each combination was calculated using Epibase in vitro assay software (Lonza). Combinations of VL and VH to be used in subsequent experiments were selected from combinations showing low immunogenicity with immunogenicity scores equal to or less than the target value (DRB1 score: 1500). Selected combinations of VL and VH are given in table. 3A and the immunogenicity scores (DRB1 score) of these combinations are shown in Table 3A. 3B.

Таблица 3АTable 3A

Выбранные комбинации VL и VHSelected combinations of VL and VH

Вариабельная область тяжелой цепи (VH) Heavy chain variable region (VH) НИ NO Н12 H12 Н47 H47 Н61 H61 Н62 H62 Н64 H64 Н65 H65 Вариабельная область легкой цепи (VL) Light chain variable region (VL) L15 L15 L15H11 L15H11 L36 L36 L36H11 L36H11 L46 L46 L46H11 L46H11 L47 L47 L47H11 L47H11 L47H64 L47H64 L47H65 L47H65 L48 L48 L48H11 L48H11 L48H12 L48H12 L48H47 L48H47 L48H61 L48H61 L48H62 L48H62 L48H64 L48H64 L50 L50 L50H11 L50H11

Таблица 3ВTable 3B

Показатель иммуногенности (показатель DRB1)Immunogenicity score (DRB1 score)

Вариабельная область тяжелой цепи (VH) Heavy chain variable region (VH) НИ NO Н12 H12 Н47 H47 Н61 H61 Н62 H62 Н64 H64 Н65 H65 Вариабельная Variable L15 L15 1495 1495 О И X о цепи oh and x oh chains (VL) (VL) L36 L36 1437 1437 L46 L46 1463 1463 L47 L47 1333 1333 1382 1382 1426 1426 L48 L48 1417 1417 1352 1352 1433 1433 1383 1383 1433 1433 1466 1466 L50 L50 1475 1475

Экспрессионная культура и очистка гуманизированных антител.Expression culture and purification of humanized antibodies.

Для каждой комбинации VL и VH, выбранной с помощью вышеописанной процедуры, были получены гены, кодирующие аминокислотные последовательности VL и VH. Ген VL был слит в рамке с геном константной области (CL) L-цепи каппа иммуноглобулина человека (ее аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность определены в SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53 соответственно), а ген VH был слит в рамке с геном константной области (СН) Н-цепи гамма-1 иммуноглобулина человека (ее аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность определены в SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 55 соответственно), так что в каждом сайте связывания не должны возникать мутация или дефект. 5'-Концы гена VL и гена VH были слиты в рамке соответственно с сигнальной последовательностью, полученной из гена L-цепи каппа иммуноглобулина человека (ее аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность определены в SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 соответственно), и сигнальной последовательностью, полученной из гена Н-цепи гамма-1 иммуноглобулина человека (ее аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность определены в SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 59 соответственно), так что в каждом сайте связывания не должны возникать мутация или дефект.For each combination of VL and VH, selected using the above procedure, genes encoding the amino acid sequences of VL and VH were obtained. The VL gene was fused in frame with the constant region (CL) gene of the human kappa immunoglobulin L chain (its amino acid sequence and nucleotide sequence are defined in SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53, respectively), and the VH gene was fused in frame with constant region (CH) genome of the human immunoglobulin gamma-1 H chain (its amino acid sequence and nucleotide sequence are defined in SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55, respectively), so that no mutation or defect should occur at each binding site. The 5' ends of the VL gene and the VH gene were fused in frame, respectively, to a signal sequence derived from the human immunoglobulin kappa L chain gene (its amino acid sequence and nucleotide sequence are defined in SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57, respectively), and a signal sequence derived from the human immunoglobulin gamma-1 H chain gene (its amino acid sequence and nucleotide sequence are defined in SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59, respectively), so that no mutation or defect should occur at each binding site .

Конструкции нуклеиновых кислот, кодирующие соответственно слитые с сигнальной последовательностью L- и Н-цепи, сконструированные по вышеописанной методике, каждую включали в вектор экспрессии для экспрессии в клетках животных и затем культивировали с использованием ExpiCHO (производства Thermo Fisher Scientific KK) в соответствии со стандартным протоколом для экспрессии антител. Каждую культуру осветляли центрифугированием, и полученный супернатант культуры нано- 34 040482 сили на аффинную колонку с белком А для очистки гуманизированного антитела. Фракцию, элюированную кислотным раствором, имеющим рН от 2,8 до 3,5, быстро нейтрализовали, концентрировали и наносили на колонку для гель-фильтрации с целью удаления агрегата. Буфер был заменен на фосфатносолевой буферный раствор (PBS) для сбора основной фракции, которую разбавляли растворителем до соответствующей концентрации и затем использовали в следующих исследованиях.Nucleic acid constructs encoding L and H chains fused to a signal sequence, respectively, constructed as described above, were each inserted into an expression vector for expression in animal cells, and then cultured using ExpiCHO (manufactured by Thermo Fisher Scientific KK) according to a standard protocol. for antibody expression. Each culture was clarified by centrifugation and the resulting culture supernatant was applied to a protein A affinity column to purify the humanized antibody. The fraction eluted with an acidic solution having a pH of 2.8 to 3.5 was quickly neutralized, concentrated and applied to a gel filtration column to remove the aggregate. The buffer was changed to phosphate buffered saline (PBS) to collect the main fraction, which was diluted with solvent to the appropriate concentration and then used in the following studies.

В следующих описаниях название каждого гуманизированного антитела, полученного с помощью вышеописанной процедуры, может быть сокращено с использованием комбинации кодовых названий его VL и VH. Например, гуманизированное антитело, получаемое с использованием L15 в качестве VL и H11 в качестве VH, обозначают как L15H11.In the following descriptions, the name of each humanized antibody produced by the above procedure may be abbreviated using a combination of its VL and VH code names. For example, a humanized antibody made using L15 as VL and H11 as VH is referred to as L15H11.

В следующих исследованиях 3% БСА/PBS использовали в качестве растворителя для корректировки концентрации антитела, если не указано иное.In the following studies, 3% BSA/PBS was used as diluent to adjust antibody concentration unless otherwise noted.

Пример 2. Твердофазный ИФА аффинности связывания антигенного пептида.Example 2. Antigenic peptide binding affinity solid phase ELISA.

1. Твердофазный ИФА аффинности связывания с антигенным пептидом.1. Solid phase ELISA binding affinity to antigenic peptide.

Некоторые из гуманизированных антител, имеющих комбинации VL и VH, приведенные в табл. 3А, анализировали в отношении аффинности связывания с антигенным пептидом с помощью иммуноферментного анализа (твердофазного ИФА).Some of the humanized antibodies with combinations of VL and VH, are shown in table. 3A was analyzed for binding affinity to the antigenic peptide using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Нефосфорилированный тау-пептид PD17 (Ser413) и фосфорилированный тау-пептид PD17P (pSer413), в котором Ser413 был фосфорилирован, каждый разбавляли охлажденным PBS до 1 мкг/мл, затем каждый из полученных растворов распределяли в планшет при 50 мкл/лунку и оставляли при 4°С в течение ночи. Раствор удаляли и затем распределяли блокирующий буфер (3% бычий сывороточный альбумин (BCA)-PBS) при 270 мкл/лунку, а планшет оставляли стоять при 4°С в течение ночи. После того как раствор был удален, раствор антитела постепенно разбавляли 3% БСА-PBS и затем добавляли в планшет в количестве 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить возможность прохождения реакции при комнатной температуре в течение 90 мин. Аминокислотные последовательности нефосфорилированного таупептида PD17 (Ser413) и фосфорилированного тау-пептида PD17P (pSer413) определены в SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 8 соответственно.The unphosphorylated tau peptide PD17 (Ser413) and the phosphorylated tau peptide PD17P (pSer413) in which Ser413 was phosphorylated were each diluted with chilled PBS to 1 µg/mL, then each of the resulting solutions were dispensed into a plate at 50 µl/well and left at 4°C during the night. The solution was removed and then distributed blocking buffer (3% bovine serum albumin (BCA)-PBS) at 270 μl/well, and the plate was left to stand at 4°C during the night. After the solution was removed, the antibody solution was gradually diluted with 3% BSA-PBS and then added to the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 90 minutes. The amino acid sequences of the non-phosphorylated tau peptide PD17 (Ser413) and the phosphorylated tau peptide PD17P (pSer413) are defined in SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 8, respectively.

Каждую лунку промывали трис-буферным солевым раствором с Tween 20 (TBS-T), который содержит 0,05% Tween 20. Козий античеловеческий IgG, меченый щелочной фосфатазой (производства SigmaAldrich Co. LLC.), разбавленный в 2000 раз буфером для разведения (3% БСА-PBS), добавляли в планшет при 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить возможность прохождения реакции при комнатной температуре в течение 60 мин. После промывания TBS-Т хромогенный раствор (1 мг/мл раствора п-нитрофенилфосфата (pNPP)) добавляли в планшет при 100 мкл/лунку для проявления цвета в течение 40 мин. Поглощение (значение оптической плотности (ОП)) измеряли при длине волны, равной 405 нм.Each well was washed with Tween 20 Tris Buffered Saline (TBS-T), which contains 0.05% Tween 20. Alkaline phosphatase labeled goat anti-human IgG (manufactured by SigmaAldrich Co. LLC.) diluted 2000-fold with dilution buffer ( 3% BSA-PBS) was added to the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 60 minutes. After washing with TBS-T, a chromogenic solution (1 mg/ml p-nitrophenyl phosphate (pNPP) solution) was added to the plate at 100 µl/well to develop color for 40 minutes. Absorption (optical density (OD) value) was measured at a wavelength of 405 nm.

Реакционную способность оценивали, определяя отношение значения ОП каждого антитела к значению ОП 0,25 нМ химерного антитела и оценивая полученное соотношение по следующей трехбалльной шкале:Reactivity was evaluated by determining the ratio of the OD value of each antibody to the OD value of 0.25 nM chimeric antibody and evaluating the resulting ratio on the following three-point scale:

+: достаточная реактивность (0,6<отношение ОП), ±: очень слабая реактивность (0,15<отношение ОП<0,6), и+: sufficient reactivity (0.6<OD ratio), ±: very weak reactivity (0.15<OD ratio<0.6), and

-: нет реактивности (отношение ОП<0,15).-: no reactivity (ratio OD<0.15).

В табл. 4А показаны результаты оценки реактивности антител с фосфорилированным тау-пептидом PD17P. В табл. 4В показаны результаты оценки реактивности антител с нефосфорилированным таупептидом PD17. По сравнению с химерным антителом все гуманизированные антитела проявляли более высокую реакционную способность с фосфорилированным тау-пептидом PD17P, но более низкую реакционную способность с нефосфорилированным тау-пептидом PD17. Эти результаты демонстрируют, что гуманизированные антитела обладают селективной реактивностью с фосфорилированным тау-пептидом.In table. 4A shows the results of an assessment of the reactivity of antibodies with phosphorylated PD17P tau peptide. In table. 4B shows the results of an assessment of the reactivity of antibodies with non-phosphorylated taupeptide PD17. Compared to the chimeric antibody, all humanized antibodies showed higher reactivity with the phosphorylated PD17P tau peptide, but lower reactivity with the non-phosphorylated PD17 tau peptide. These results demonstrate that humanized antibodies have selective reactivity with phosphorylated tau peptide.

Таблица 4АTable 4A

Твердофазный ИФА реакционной способности с фосфорилированным пептидом PD17PSolid phase ELISA reactivity with phosphorylated peptide PD17P

Вариабельная область тяжелой цепи (VH) Heavy chain variable region (VH) VH11 VH11 VH12 VH12 VH47 VH47 VH61 VH61 VH62 VH62 VH64 VH64 VH65 VH65 Вариабельная область легкой цепи (VL) Light chain variable region (VL) VL15 VL15 + + VL3 6 VL36 + + VL4 6 VL46 + + VL4 7 VL4 7 + + VL4 8 VL4 8 + + + + + + + + + + + + VL5 0 VL5 0 + +

- 35 040482- 35 040482

Таблица 4ВTable 4B

Твердофазный ИФА реакционной способности с нефосфорилированным пептидом PD17Solid phase ELISA reactivity with non-phosphorylated PD17 peptide

Вариабельная область тяжелой цепи (VH) Heavy chain variable region (VH) VH11 VH11 VH12 VH12 VH47 VH47 Н61 H61 VH62 VH62 VH64 VH64 VH65 VH65 Вариабельная область легкой цепи Light chain variable region VL15 VL15 - - VL3 6 VL36 - - (VL) (VL) VL4 6 VL4 6 - - VL47 VL47 - - VL4 8 VL4 8 - - - - - - - - - - - - VL5 0 VL5 0 - -

2. Твердофазный ИФА аффинности селективного связывания с фосфорилированным тау-пептидом.2. Solid phase selective binding affinity ELISA for phosphorylated tau peptide.

Некоторые из гуманизированных антител, имеющих комбинации VL и VH, приведенные в табл. 3А, были проанализированы в отношении селективной аффинности связывания гуманизированных антител против тау с фосфорилированным тау-пептидом с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием химерного антитела Та1505 в качестве эталонного антитела.Some of the humanized antibodies with combinations of VL and VH, are shown in table. 3A were analyzed for selective binding affinity of humanized anti-tau antibodies to phosphorylated tau peptide by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the chimeric Ta1505 antibody as reference antibody.

Раствор, содержащий 1 мкг/мл нефосфорилированного пептида PD17 или фосфорилированного пептида PD17P, помещали в планшет при 50 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°С в течение ночи. После удаления раствора блокирующий буфер (3% бычьего сывороточного альбумина (BCA)-PBS) дозировали при 270 мкл/лунку и планшет оставляли стоять при 4°С в течение ночи, чтобы тем самым получить планшеты, в которых нефосфорилированный пептид PD17 или фосфорилированный пептид PD17P был иммобилизован в каждой лунке.A solution containing 1 μg/ml of non-phosphorylated PD17 peptide or phosphorylated PD17P peptide was plated at 50 μl/well and left to stand at 4°C overnight. After removal of the solution, blocking buffer (3% bovine serum albumin (BCA)-PBS) was dosed at 270 μl/well and the plate was left to stand at 4° C. overnight to thereby obtain plates in which the unphosphorylated PD17 peptide or the phosphorylated PD17P peptide was immobilized in each well.

Ряд из пяти концентраций каждого антитела готовили 4-кратным серийным разведением, начиная с начальной концентрации, равной 0,6 мкг/мл (4 нМ). Каждый раствор добавляли в лунку планшетов при 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить прохождение реакции при комнатной температуре в течение 1 ч. После процесса промывки козий античеловеческий IgG, меченый щелочной фосфатазой (производства SigmaAldrich Co. LLC.), разводили в 2000 раз, а затем добавляли в каждую лунку при 50 мкл/лунку, чтобы дополнительно провести реакцию в течение 1 ч.A series of five concentrations of each antibody was prepared by 4-fold serial dilution starting with an initial concentration of 0.6 μg/ml (4 nM). Each solution was added to a well of the plates at 50 μl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 1 hour. After the washing process, alkaline phosphatase labeled goat anti-human IgG (manufactured by SigmaAldrich Co. LLC.) was added to each well at 50 µl/well to allow an additional 1 hour reaction.

После процесса промывки в каждую лунку добавляли раствор п-нитрофенилфосфата (pNPP) 1 мг/мл при 100 мкл/лунку для проведения реакции в течение 20 мин. Поглощение (ОП) измеряли при длине волны, равной 405 нм.After the washing process, a solution of p-nitrophenyl phosphate (pNPP) 1 mg/ml at 100 µl/well was added to each well to carry out the reaction for 20 minutes. Absorption (OD) was measured at a wavelength of 405 nm.

Данные оптической плотности (ОП) при соответствующих концентрациях каждого полученного антитела анализировали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro версии 6,5 (Molecular Devices Corporation), чтобы определить следующие числовые значения от А до D, которые были приписаны четырехпараметрической кривой логистической регрессии, показанной ниже,Optical density (OD) data at respective concentrations of each antibody produced was analyzed using SoftMax Pro software version 6.5 (Molecular Devices Corporation) to determine the following numerical values from A to D, which were assigned to the four parameter logistic regression curve shown below,

где x представляет концентрацию антитела, а y представляет поглощение (значение ОП).where x represents the concentration of the antibody and y represents the absorbance (OD value).

Значение поглощения ОП нефосфорилированного пептида PD17 в концентрации 1 нМ вносили в уравнение для расчета концентрации x каждого антитела, соответствующей величине оптической плотности. Поскольку концентрация PD17 составляла 1 нМ, масштабный коэффициент аффинности связывания с фосфорилированным тау-пептидом PD17P, основанный на аффинности связывания с PD17 для каждого пептида, рассчитывали как 1/x и использовали в качестве показателя аффинности селективного связывания с фосфорилированным тау-пептидом.The absorbance value of the OD of the non-phosphorylated PD17 peptide at a concentration of 1 nM was entered into the equation to calculate the concentration x of each antibody corresponding to the optical density value. Because the concentration of PD17 was 1 nM, the PD17P phosphorylated tau peptide binding affinity scale factor, based on the PD17 binding affinity for each peptide, was calculated as 1/x and used as a measure of selective binding affinity for the phosphorylated tau peptide.

Результаты показаны на графике фиг. 3. Аффинность связывания химерного антитела Та1505 с фосфорилированным тау-пептидом PD17P была в 30 раз сильнее, чем у нефосфорилированного пептида PD17. Напротив, селективная аффинность связывания в гуманизированных антителах проявляла высокую селективность с масштабным коэффициентом от 40 до 210 раз. Результаты показывают, что гуманизированные антитела обладают специфической аффинностью связывания с фосфорилированным пептидом.The results are shown in the graph of FIG. 3. The binding affinity of the Ta1505 chimeric antibody to the phosphorylated PD17P tau peptide was 30 times stronger than that of the non-phosphorylated PD17 peptide. In contrast, selective binding affinity in humanized antibodies showed high selectivity with a scale factor of 40 to 210 times. The results show that the humanized antibodies have a specific binding affinity for the phosphorylated peptide.

3. Твердофазный ИФА аффинности селективного связывания с сайтом фосфорилирования Ser413 с использованием фосфорилированного тау-пептида.3. Solid phase selective binding affinity ELISA for the Ser413 phosphorylation site using a phosphorylated tau peptide.

Гуманизированные антитела, имеющие комбинации VL и VH, приведенные в табл. 3А, каждое анализировали в отношении его способности селективно связываться с сайтом фосфорилирования Ser413 среди основных сайтов фосфорилирования белка с помощью твердофазного ИФА с использованием различных фосфорилированных пептидов.Humanized antibodies having combinations of VL and VH, are shown in table. 3A, each was analyzed for its ability to selectively bind to the Ser413 phosphorylation site among major protein phosphorylation sites by solid phase ELISA using various phosphorylated peptides.

Использовали двенадцать фосфорилированных пептидов, как показано в табл. 5. В столбце под на- 36 040482 званием эпитоп указан(ы) фосфорилированный(е) сайт(ы) тау-белка 4R2N-Tnna (например, pS46 в пептиде № 1 указывает, что сайт Ser46 является фосфорилированным эпитопом, а описания нескольких эпитопов указывают, что один пептид имеет два или три сайта фосфорилирования) за исключением того, что пептид № 12 имеет эпитоп, содержащий сайт Ser413, но не являющийся фосфорилированным (PD17).Used twelve phosphorylated peptides, as shown in table. 5. The column labeled epitope indicates the phosphorylated site(s) of the 4R2N-Tnna tau protein (e.g., pS46 in peptide #1 indicates that the Ser46 site is a phosphorylated epitope, and descriptions of several epitopes indicate that one peptide has two or three phosphorylation sites) except that peptide #12 has an epitope that contains the Ser413 site but is not phosphorylated (PD17).

Таблица 5Table 5

Пептид для анализа специфического связывания с сайтом фосфорилирования тау-белка Ser413Peptide for analysis of specific binding to the phosphorylation site of the tau protein Ser413

Пептид № Peptide No. Эпитоп epitope Аминокислотная последовательность (однобуквенный код) Amino acid sequence (single letter code) SEQ ID NO: SEQID NO: 1 1 pS4 6 PS4 6 H-GLKE(pS)PLQT-OH H-GLKE(pS)PLQT-OH 61 61 2 2 pS199 pS199 H-SGYS(pS)PGSPGC-OH H-SGYS(pS)PGSPGC-OH 62 62 3 3 pS202 pS202 H-SSPG(pS)PGTPC-OH H-SSPG(pS)PGTPC-OH 63 63 4 4 pT212/pS214 pT212/pS214 H-GCGSPGTPGSRSR(pT)P(pS)LPTPPTREPK-OH H-GCGSPGTPGSSRSR(pT)P(pS)LPTPPTREPK-OH 64 64 5 5 pT217 pT217 H-GC-GSRSRTPSLP(pT)PPTREPKKVAVV-OH H-GC-GSRSRTPSLP(pT)PPTREPKKVAVV-OH 65 65 6 6 pT231 pT231 H-KVAVVR(pT)PPKSPS-OH H-KVAVVR(pT)PPKSPS-OH 66 66 7 7 pS396/pS400 /pS404 pS396/pS400 /pS404 H-GC-RENAKAKTDHGAEIVYK(pS)PVV(pS)GDT (pS)PRHL-OH H-GC-RENAKAKTDHGAEIVYK(pS)PVV(pS)GDT (pS)PRHL-OH 67 67 8 8 pS412 pS412 H-NV(pS)STGSC-OH H-NV(pS)STGSC-OH 68 68 9 9 pS412/pS413 pS412/pS413 H-PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD-OH H-PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD-OH 7 7 10 10 pS413 pS413 H-PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD-OH (PD17P) H-PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD-OH (PD17P) 8 8 11 eleven pS409/pS412 /pS413 pS409/pS412 /pS413 H-PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD-OH H-PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD-OH 9 9 12 12 S413 S413 H-PRHLSNVSSTGSIDMVD-OH (PD17) H-PRHLSNVSSTGSIDMVD-OH (PD17) 69 69

Двенадцать пептидов, приведенных в табл. 5, т.е. пептиды с 1 по 12, или конъюгаты этих пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА) или гемоцианином лимфы улитки (KLH), каждый разбавляли PBS, охлажденным до 4°С, до 1 мкг/мл, и полученный раствор распределяли по планшетам в количестве 50 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°С в течение ночи. Раствор удаляли и затем распределяли блокирующий буфер (3% БСА-PBS) при 270 мкл/лунку и планшет оставляли стоять при 4°С в течение ночи. После удаления раствора очищенное антитело разбавляли 3% БСА-PBS до 150 нг/мл, а затем добавляли в планшет при 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить возможность прохождения реакции при комнатной температуре в течение 90 мин. Каждую лунку промывали трис-буферным солевым раствором (TBS-T), содержащим 0,05% Tween 20. Козий античеловеческий IgG (H+L)-, меченый щелочной фосфатазой (производства Sigma-Aldrich Со. LLC.), разбавленный в 2000 раз буфером для разведения (3% БСА-PBS), добавляли в планшет при 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить возможность прохождения реакции при комнатной температуре в течение 60 мин. После промывания TBS-T хромогенный раствор (1 мг/мл раствора pNPP) добавляли в планшет при 100 мкл/лунку для развития цвета в течение 40 мин. Поглощение (значение ОП) измеряли при длине волны измерения, равной 405 нм, и эталонной длине волны, равной 550 нм.The twelve peptides listed in Table. 5, i.e. peptides 1 to 12, or conjugates of these peptides with bovine serum albumin (BSA) or keyhole limpet hemocyanin (KLH), each was diluted with PBS chilled to 4°C to 1 μg/ml, and the resulting solution was dispensed into plates in an amount of 50 µl/well and left to stand at 4°C during the night. The solution was removed and then blocking buffer (3% BSA-PBS) was distributed at 270 μl/well and the plate was left to stand at 4°C overnight. After removing the solution, the purified antibody was diluted with 3% BSA-PBS to 150 ng/ml and then added to the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 90 minutes. Each well was washed with Tris buffered saline (TBS-T) containing 0.05% Tween 20. Goat anti-human IgG (H+L)- labeled with alkaline phosphatase (manufactured by Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluted 2000 times dilution buffer (3% BSA-PBS) was added to the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 60 minutes. After washing with TBS-T, a chromogenic solution (1 mg/ml pNPP solution) was added to the plate at 100 µl/well to develop color for 40 minutes. The absorbance (OD value) was measured at a measurement wavelength of 405 nm and a reference wavelength of 550 nm.

Реакционную способность оценивали по следующей трехбалльной шкале:Reactivity was assessed on the following three-point scale:

+: достаточная реактивность (1,0<значение ОП), ±: очень слабая реактивность (0,5<значение ОП<1,0), и+: sufficient reactivity (1.0<OD value), ±: very little reactivity (0.5<OD value<1.0), and

-: нет реактивности (значение ОП<0,5).-: no reactivity (OD value<0.5).

Результаты представлены в табл. 6. Все гуманизированные антитела показали сильную аффинность связывания только с пептидом № 9 (pSer412/pSer413: PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD), пептидом № 10 (pSer413: PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD) и пептидом № И (pSer409/pSer412/pSer413:The results are presented in table. 6. All humanized antibodies showed strong binding affinity only for peptide #9 (pSer412/pSer413: PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD), peptide #10 (pSer413: PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD) and peptide #I (pSer409/pSer412/ pSer413:

PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD), но не связывались с другими пептидами, у которых сайт, соответствующий Ser413 белка тау, не был фосфорилирован. Характер и сила связывания были практически такими же, как у химеры (химерное антитело Та1505). Эти результаты показывают, что гуманизированные антитела обладают аффинностью связывания, специфичной для белка тау, имеющего фосфорилированный сайт Ser413.PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD), but did not bind to other peptides in which the site corresponding to Ser413 of the tau protein was not phosphorylated. The nature and strength of binding were practically the same as those of the chimera (chimeric antibody Ta1505). These results indicate that the humanized antibodies have a binding affinity specific for the tau protein having a phosphorylated Ser413 site.

-37 040482-37 040482

Таблица 6Table 6

Результаты твердофазного ИФА реактивности с различными фосфорилированными тау-пептидамиResults of solid phase ELISA reactivity with various phosphorylated tau peptides

Антитело Antibody № пептида в таблице 5 No. of peptide in table 5 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 eleven 12 12 химера chimera - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L15H11 L15H11 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L36H11 L36H11 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L46H11 L46H11 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L47H11 L47H11 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L48H11 L48H11 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L50H11 L50H11 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L48H12 L48H12 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L48H47 L48H47 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L48H61 L48H61 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L48H62 L48H62 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L47H64 L47H64 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L48H64 L48H64 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - - L47H65 L47H65 - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - -

Пример 3. Твердофазный ИФА аффинности связывания с антигенным белком.Example 3. Solid phase ELISA binding affinity to antigenic protein.

Некоторые из гуманизированных антител, имеющих комбинации VL и VH, приведенные в табл. 3А, анализировали в отношении аффинности связывания с антигенным белком с помощью твердофазного ИФА.Some of the humanized antibodies with combinations of VL and VH, are shown in table. 3A was analyzed for binding affinity to antigenic protein by solid phase ELISA.

Чтобы получить фосфорилированный тау-белок pTau, тау-белок 4R2N экспрессировали в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы. Кроме того, для получения гиперфосфорилированного тау-белка hpTau был получен рекомбинантный бакуловирус, способный одновременно экспрессировать тау-белок и GSK3e.To obtain the phosphorylated tau protein pTau, the 4R2N tau protein was expressed in insect cells using a baculovirus system. In addition, to obtain hyperphosphorylated tau protein hpTau, a recombinant baculovirus was obtained that can simultaneously express tau protein and GSK3e.

При получении рекомбинантного бакуловируса использовали векторы pFastBac1 и pFastBac Dual. Для фосфорилированного тау-белка pTau в pFastBac1 была встроена кДНК, кодирующая тау-белок 4R2N, имеющий His-меченный С-конец. Для гиперфосфорилированного тау-белка hpTau в pFastBac Dual вставляли кДНК, кодирующую тау-белок 4R2N, имеющий His-меченный С-конец, и кДНК, кодирующую GSK3e. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность His-меченого таубелка 4R2N определены в SEQ ID NO: 70 и 71 соответственно. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность GSK3e определены в SEQ ID NO: 72 и 73 соответственно.Recombinant baculovirus was obtained using pFastBac1 and pFastBac Dual vectors. For the phosphorylated tau protein pTau, a cDNA encoding the 4R2N tau protein having a His-tagged C-terminus was inserted into pFastBac1. For the hyperphosphorylated tau protein hpTau, a cDNA encoding the His-tagged C-terminus 4R2N tau protein and a cDNA encoding GSK3e were inserted into pFastBac Dual. The amino acid sequence and nucleotide sequence of the His-tagged 4R2N tau protein are defined in SEQ ID NOs: 70 and 71, respectively. The amino acid sequence and nucleotide sequence of GSK3e are defined in SEQ ID NOs: 72 and 73, respectively.

Полученные векторы каждый вводили в клеточную линию Sf9 путем липофекции и клетки культивировали для получения рекомбинантных бакуловирусов. Полученные рекомбинантные бакуловирусы затем использовали для инфицирования клеточной линии Sf9 или Tn5, чтобы тем самым экспрессировать фосфорилированный тау-белок (pTau) и гиперфосфорилированный тау-белок (hpTau).The resulting vectors were each introduced into the Sf9 cell line by lipofection and the cells were cultured to produce recombinant baculoviruses. The resulting recombinant baculoviruses were then used to infect an Sf9 or Tn5 cell line, thereby expressing phosphorylated tau (pTau) and hyperphosphorylated tau (hpTau).

Клетки, экспрессирующие желаемый белок, собирали и подвергали ультразвуковой обработке и центрифугированию для получения клеточного лизата, который затем наносили на колонку Ni-NTA для очистки тау-белка. Концентрацию очищенного тау-белка определяли в анализе бицинхониновой кислоты (ВСА), используя бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандартного образца.Cells expressing the desired protein were harvested and sonicated and centrifuged to obtain a cell lysate, which was then applied to a Ni-NTA column to purify the tau protein. Purified tau protein concentration was determined in a bicinchoninic acid (BCA) assay using bovine serum albumin (BSA) as a standard.

Полученный гиперфосфорилированный тау-белок (hpTau) и фосфорилированный тау-белок (pTau) разбавляли охлажденным PBS до 1 мкг/мл, затем разбавленные растворы распределяли по планшету при 50 мкл/лунку и оставляли стоять при 4°С в течение ночи. После того как растворы были удалены, блокирующий буфер (3% БСА-PBS) затем дозировали при 270 мкл/лунку и планшет оставляли стоять при 4°С в течение ночи. После удаления буферного раствора серию растворов антител, приготовленных путем серийного разбавления 3% БСА-PBS, добавляли в планшет в количестве 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить возможность прохождения реакции при комнатной температуре в течение 90 мин.The resulting hyperphosphorylated tau protein (hpTau) and phosphorylated tau protein (pTau) were diluted with chilled PBS to 1 μg/ml, then the diluted solutions were dispensed onto the plate at 50 μl/well and left to stand at 4° C. overnight. After the solutions were removed, blocking buffer (3% BSA-PBS) was then dosed at 270 μl/well and the plate was left to stand at 4°C overnight. After buffer solution was removed, a series of antibody solutions prepared by serial dilution with 3% BSA-PBS were added to the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 90 minutes.

Лунки затем промывали трис-буферным солевым раствором (TBS-T), содержащим 0,05% Tween 20. Козий античеловеческий IgG, меченый щелочной фосфатазой (производства Sigma-Aldrich Co. LLC.), разбавленный в 2000 раз буфером для разведения (3% БСА-PBS), добавляли в планшет при 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить возможность прохождения реакции при комнатной температуре в течение 60 мин. После промывания TBS-T хромогенный раствор (1 мг/мл раствора pNPP) добавляли в планшет при 100 мкл/лунку для проявления цвета в течение 40 мин. Поглощение (значение ОП) измеряли при длине волны, равной 405 нм.The wells were then washed with Tris-buffered saline (TBS-T) containing 0.05% Tween 20. Alkaline phosphatase labeled goat anti-human IgG (manufactured by Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluted 2000-fold with dilution buffer (3% BSA-PBS) was added to the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 60 minutes. After washing with TBS-T, a chromogenic solution (1 mg/ml pNPP solution) was added to the plate at 100 µl/well to develop color for 40 minutes. Absorption (OD value) was measured at a wavelength of 405 nm.

- 38 040482- 38 040482

В табл. 7А приведены результаты оценки реактивности гуманизированных антител с гиперфосфорилированным тау-белком hpTau. В табл. 7В приведены результаты оценки реактивности гуманизированных антител с фосфорилированным тау-белком рТап. Результаты показывают, что все гуманизированные антитела обладают высокой реакционной способностью как с гиперфосфорилированным таубелком hpTau, так и с фосфорилированным тау-белком рТаи по сравнению с химерным антителом.In table. 7A shows the results of reactivity evaluation of humanized antibodies with hyperphosphorylated hpTau tau. In table. 7B shows the results of evaluating the reactivity of humanized antibodies with phosphorylated tau pTap. The results show that all humanized antibodies are highly reactive with both hyperphosphorylated hpTau tau and phosphorylated pTau tau compared to the chimeric antibody.

Таблица 7АTable 7A

Результат твердофазного ИФА реактивности с гиперфосфорилированным тау-белком hpTauThe result of solid-phase ELISA reactivity with hyperphosphorylated tau protein hpTau

VH11 VH11 VH12 VH12 VH47 VH47 VH61 VH61 VH62 VH62 VH64 VH64 VH65 VH65 VL15 VL15 + + VL3 6 VL36 + + VL4 6 VL4 6 + + VL47 VL47 + + VL48 VL48 + + + + + + + + + + + + VL50 VL50 + +

Таблица 7ВTable 7B

Результат твердофазного ИФА реактивности с фосфорилированным тау-белком рТаиThe result of solid-phase ELISA reactivity with phosphorylated tau protein pTai

VH11 VH11 VH12 VH12 VH47 VH47 VH61 VH61 VH62 VH62 VH64 VH64 VH65 VH65 VL15 VL15 + + VL3 6 VL36 + + VL4 6 VL4 6 + + VL47 VL47 + + VL4 8 VL4 8 + + ± ± + + + + + + + + VL5 0 VL5 0 + +

Пример 4. Анализ аффинности связывания ПИР.Example 4 PIR binding affinity assay.

Некоторые из гуманизированных антител, имеющих комбинации VL и VH, приведенные в табл. ЗА, подвергали анализу аффинности связывания с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ПИР) с использованием химерного антитела Tai505 в качестве эталонного антитела.Some of the humanized antibodies with combinations of VL and VH, are shown in table. 3A were subjected to surface plasmon resonance (SIR) binding affinity analysis using the Tai505 chimeric antibody as a reference antibody.

Гиперфосфорилированный тау-белок 4R2N (hpTau; см. пример 3) использовали в качестве белкаантигена, а нефосфорилированный тау-белок продуцировали с помощью Escherichia coli (Тау: Hisмеченный нефосфорилированный тау-белок 4R0N: ATGen Со. Ltd., кат. № ATGP0795) использовали в качестве отрицательного контроля. В качестве антигенных пептидов использовали монофосфорилированный тау-пептид (1хР), в котором только Ser413 был фосфорилирован, и трифосфорилированный таупептид (ЗхР), в котором Ser409 и Ser412 были дополнительно фосфорилированы в дополнение к Ser413. Аминокислотные последовательности этих пептидов приведены в табл. 8. Используемый пептид отрицательного контроля представлял собой нефосфорилированный тау-пептид (Non Р), аминокислотная последовательность которого также приведена в табл. 8. Аминокислотная последовательность His-меченного нефосфорилированного тау-белка 4R0N определена в SEQ ID NO: 74.Hyperphosphorylated 4R2N tau protein (hpTau; see Example 3) was used as the antigen protein, and non-phosphorylated tau protein was produced with Escherichia coli (Tau: His labeled non-phosphorylated 4R0N tau protein: ATGen Co. Ltd. Cat. No. ATGP0795) was used as a negative control. The antigenic peptides used were monophosphorylated tau peptide (1xP), in which only Ser413 was phosphorylated, and triphosphorylated taupeptide (3xP), in which Ser409 and Ser412 were additionally phosphorylated in addition to Ser413. The amino acid sequences of these peptides are given in table. 8. The negative control peptide used was a non-phosphorylated tau peptide (Non P), the amino acid sequence of which is also shown in Table 1. 8. The amino acid sequence of the His-tagged non-phosphorylated tau protein 4R0N is determined in SEQ ID NO: 74.

Аминокислотные последовательности монофосфорилированного тау-пептида 1хР, трифосфорилированного тау-пептида ЗхР и нефосфорилированного тау-пептида Non Р определены в SEQ ID NO: 75, 76 и 77 соответственно.The amino acid sequences of monophosphorylated tau peptide 1xP, triphosphorylated tau peptide 3xP and non-phosphorylated tau peptide Non P are defined in SEQ ID NOS: 75, 76 and 77, respectively.

Таблица 8Table 8

Антигенный пептид, используемый в SPRAntigenic peptide used in SPR

Кодовое название code name Аминокислотная последовательность (однобуквенный код) Amino acid sequence (single letter code) SEQ ID NO: SEQID NO: 1^ХР1 ^X R TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC 75 75 ЗхР ZxR TSPRHL(pS) NV(pS) (pS)TGSIDMVDSPC TSPRHL(pS) NV(pS) (pS)TGSIDMVDSPC 76 76 Без Р Without R TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC 77 77

Аффинность связывания гиперфосфорилированного тау-белка 4R2N (hpTau), нефосфорилированного тау-белка 4R0N, монофосфорилированного тау-пептида 1хР, трифосфорилированного тау-пептида ЗхР и нефосфорилированного тау-пептида Non Р с каждым антителом измеряли с помощью ППР-системы Biacore Т200 (GE Healthcare Japan) в соответствии с инструкцией по оценке, прилагаемой к системе.The binding affinity of hyperphosphorylated tau protein 4R2N (hpTau), nonphosphorylated tau protein 4R0N, monophosphorylated tau peptide 1xP, triphosphorylated tau peptide 3xP, and nonphosphorylated tau peptide Non P with each antibody was measured using a Biacore T200 SPR system (GE Healthcare Japan ) in accordance with the assessment instructions supplied with the system.

Аффинность связывания измеряли способом, включающим приготовление сенсорного чипа NT А (включая слой карбоксиметилдекстрана, на котором уже иммобилизована нитрилотриуксусная кислота (NTА): код № BR-1005-32);Binding affinity was measured by a method comprising preparing an NT A sensor chip (including a layer of carboxymethyl dextran on which nitrilotriacetic acid (NTA) is already immobilized: code no. BR-1005-32);

-39040482 иммобилизацию каждого из вышеупомянутых пептидов, слитых с His-меткой, и каждого из антигенных пептидов, приведенных в табл. 8, на сенсорном чипе ковалентными связями посредством реакции аминного сочетания с использованием набора для аминного сочетания (GE Healthcare Japan, код № BR-1006-33); и измерение кинетики связывания антител с иммобилизованными белками и пептидами.-39040482 immobilization of each of the above peptides fused with His-tag, and each of the antigenic peptides shown in table. 8, on a sensor chip by covalent bonds through an amine coupling reaction using an amine coupling kit (GE Healthcare Japan, Code No. BR-1006-33); and measuring the binding kinetics of antibodies to immobilized proteins and peptides.

Каждый из белков hpTau или тау с His-меткой иммобилизовали на сенсорном чипе, используя буфер HBS-N (код № BR-1003-69) в качестве раствора реакции иммобилизации и позволяя раствору хлорида никеля реагировать с сенсорным чипом NTA для связывание Ni с NTA. Затем сенсорный чип активировали смешанным раствором гидрохлорида И-этил-Н'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (1-этил3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлорида: EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Раствор каждого из His-меченых белков, доведенный до концентрации от 100 до 500 нг/мл буфером 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) (0,01 М HEPES, 150 мМ КС1, 2 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, pH 7,2), наносили на сенсорный чип, в результате чего белок был иммобилизован на сенсорном чипе через ковалентные связи с Ni-NTA. Оставшуюся активную NHS блокировали этаноламином и ионы Ni удаляли раствором ЭДТА (связывание аффинности амина с Ni; см. международную публикацию № WO 2005/022156). Антигенные пептиды (1хР, ЗхР и Non Р) были иммобилизованы на сенсорном чипе путем активации сенсорного чипа NTA смешанным раствором Ν-3τηπ-Ν'-(3диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) гидрохлорида и N-гидроксисукцинимида (NHS), а затем наносили раствор антигенного пептида, разбавленного 10 мМ натрий-ацетатным буфером (pH: 4-4,5) до 110 мкМ на сенсорный чип, посредством чего пептид был ковалентно связан с сенсорным чипом. Оставшийся активный NHS блокировали этаноламином. Таким образом, были получены сенсорные чипы, иммобилизованные соответственно белками и пептидами, упомянутыми выше.Each of the His-tagged hpTau or tau proteins was immobilized on the sensor chip using HBS-N buffer (code no. BR-1003-69) as the immobilization reaction solution and allowing the nickel chloride solution to react with the NTA sensor chip to bind Ni to the NTA. The sensor chip was then activated with a mixed solution of N-ethyl-H'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (1-ethyl3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride: EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). A solution of each of the His-tagged proteins adjusted to a concentration of 100 to 500 ng/mL with 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (0.01 M HEPES, 150 mM KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.2) was applied to the sensor chip, as a result of which the protein was immobilized on the sensor chip through covalent bonds with Ni-NTA. The remaining active NHS was blocked with ethanolamine and the Ni ions were removed with an EDTA solution (amine affinity binding to Ni; see International Publication No. WO 2005/022156). Antigenic peptides (1xP, 3xP and Non P) were immobilized on the sensor chip by activating the NTA sensor chip with a mixed solution of Ν-3τηπ-N'-(3dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) hydrochloride and N-hydroxysuccinimide (NHS), and then applying the antigenic solution peptide diluted with 10 mM sodium acetate buffer (pH: 4-4.5) to 110 μM per sensor chip, whereby the peptide was covalently linked to the sensor chip. The remaining active NHS was blocked with ethanolamine. Thus, sensor chips immobilized with the proteins and peptides mentioned above, respectively, were obtained.

Буфер CAPS (pH 10,5) наносили на эти сенсорные чипы при 37°С для стабилизации иммобилизованных белков или пептидов на поверхностях сенсорных чипов. Раствор каждого антитела, приготовленный с буфером HEPES (pH 7,2) в качестве раствора для реакции специфического связывания, наносили на поверхность сенсорного чипа в концентрациях от 0,2 до 1 нМ (около расчетной константы диссоциации связывания [K_D]) в течение 150 с (одинаковые в рамках одной оценки) для реакции и измеряли кинетику связывания. Полученные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Biacore для анализа (Biacore Т200 Evaluation Software, версия 3.0).CAPS buffer (pH 10.5) was applied to these sensor chips at 37° C. to stabilize the immobilized proteins or peptides on the surfaces of the sensor chips. A solution of each antibody, prepared with HEPES buffer (pH 7.2) as a solution for the specific binding reaction, was applied to the surface of the sensor chip at concentrations of 0.2 to 1 nM (about the calculated binding dissociation constant [K _D ]) for 150 s (same within the same evaluation) for the reaction and measured the kinetics of binding. The obtained data were analyzed using the Biacore analysis software (Biacore T200 Evaluation Software, version 3.0).

Кинетику связывания каждого антитела корректировали путем вычитания кинетики связывания нефосфорилированного белка 4R0N с сенсорным чипом в качестве отрицательного контроля из кинетики связывания антигенного белка 4R2N (hpTau) с сенсорным чипом. Кинетику связывания каждого антигенного пептида корректировали путем вычитания кинетики связывания нефосфорилированного пептида Non Р с сенсорным чипом в качестве отрицательного контроля из кинетики связывания каждого из пептидов антигена 1хР и ЗхР. Никакого связывания каждого антитела с нефосфорилированным тау-белком 4R0N или нефосфорилированным пептидом Non Р в диапазоне концентраций образца, подвергаемых измерению, не наблюдалось.The binding kinetics of each antibody was corrected by subtracting the binding kinetics of the non-phosphorylated 4R0N protein to the sensor chip as a negative control from the binding kinetics of the antigenic 4R2N protein (hpTau) to the sensor chip. The binding kinetics of each antigenic peptide was corrected by subtracting the binding kinetics of the non-phosphorylated Non P peptide to the sensor chip as a negative control from the binding kinetics of each of the 1xP and 3xP antigen peptides. No binding of each antibody to the non-phosphorylated 4R0N tau protein or non-phosphorylated Non P peptide was observed over the sample concentration range measured.

В табл. 9А приведена активность связывания гуманизированных антител с фосфорилированным тау-белком 4R2N (hpTau). В табл. 9В приведены результаты активности связывания гуманизированных антител с монофосфорилированным тау-пептидом 1хР и трифосфорилированным тау-пептидом ЗхР. Результаты демонстрируют, что каждое гуманизированное антитело проявляло высокую активность связывания со всеми из гиперфосфорилированного тау-белка hpTau, монофосфорилированного тау-пептида 1хР и трифосфорилированного тау-пептида ЗхР.In table. 9A shows the binding activity of humanized antibodies to phosphorylated tau protein 4R2N (hpTau). In table. 9B shows the results of binding activity of humanized antibodies to the monophosphorylated 1xP tau peptide and the triphosphorylated 3xP tau peptide. The results demonstrate that each humanized antibody exhibited high binding activity to all of the hyperphosphorylated tau protein hpTau, the monophosphorylated tau peptide 1xP, and the triphosphorylated tau peptide 3xP.

Таблица 9АTable 9A

Активность связывания гуманизированных антител с фосфорилированным таубелком (hpTau) (модель связывания 1:1)Binding activity of humanized antibodies to phosphorylated tau protein (hpTau) (1:1 binding model)

Образец Sample hpTau KD (М) hpTau KD (M) химера chimera 1,70Е-10 1.70E-10 L15H11 L15H11 1,50Е-10 1.50E-10 L36H11 L36H11 1,40Е-10 1.40E-10 L46H11 L46H11 1,ЗОЕ-10 1,ZOE-10 L47H11 L47H11 1,80Е-10 1.80E-10 L48H12 L48H12 1,60Е-10 1.60E-10 L48H47 L48H47 1,40Е-10 1.40E-10 L48H64 L48H64 1,00Е-10 1.00E-10 L47H65 L47H65 1,50Е-10 1.50E-10 L48H11 L48H11 1,40Е-10 1.40E-10 L48H61 L48H61 1,70Е-10 1.70E-10 L48H62 L48H62 1,ЗОЕ-10 1,ZOE-10 L50H11 L50H11 1,50Е-10 1.50E-10

-40040482-40040482

Таблица 9ВTable 9B

Активность связывания гуманизированных антител с фосфорилированными пептидами (1 хР, 3xP) (модель связывания 1:1)Binding activity of humanized antibodies to phosphorylated peptides (1 x P, 3 x P) (1:1 binding model)

Образец Sample 1^ХР KD (М)1 ^X R KD (M) ЗхР KD (М) ZxR KD (M) химера chimera 4,60Е-11 4.60E-11 2,20Е-11 2.20E-11 L15H11 L15H11 3,90Е-11 3.90E-11 1,90Е-11 1.90E-11 L36H11 L36H11 4,70Е-11 4.70E-11 1,90Е-11 1.90E-11 L46H11 L46H11 4,80Е-11 4.80E-11 1,70Е-11 1.70E-11 L47H11 L47H11 6,20Е-11 6.20E-11 2,20Е-11 2.20E-11 L48H12 L48H12 6,50Е-11 6.50E-11 2,70Е-11 2.70E-11 L48H47 L48H47 5,80Е-11 5.80E-11 2,20Е-11 2.20E-11 L48H64 L48H64 5,00Е-11 5.00E-11 1,50Е-11 1.50E-11 L47H65 L47H65 5,40Е-11 5.40E-11 1,90Е-11 1.90E-11 L48H11 L48H11 6,00Е-11 6.00E-11 2,00Е-11 2.00E-11 L48H61 L48H61 1,80Е-10 1.80E-10 2,40Е-11 2.40E-11 L48H62 L48H62 5,20Е-11 5.20E-11 2,00Е-11 2.00E-11 L50H11 L50H11 4,80Е-11 4.80E-11 1,90Е-11 1.90E-11

Пример 5. Анализ аффинности связывания pSer413-Tau в гомогенате мозга пациента с БА.Example 5 Binding affinity analysis of pSer413-Tau in an AD patient brain homogenate.

Среди гуманизированных антител, имеющих комбинации VL и VH, приведенные в табл. 3А, L15H11, L46H11 и L47H65 были оценены в отношении аффинности связывания с фосфорилированным тау-белком Ser413 (pSer413-Tau), полученным из клинического образца пациента с болезнью Альцгеймера (БА), в жидкой фазе, с использованием мышиного антитела Та1505 и химерного антитела в качестве эталонных антител.Among humanized antibodies having combinations of VL and VH, are given in table. 3A, L15H11, L46H11, and L47H65 were evaluated for binding affinity to the phosphorylated tau protein Ser413 (pSer413-Tau) obtained from an Alzheimer's disease (AD) patient clinical specimen in liquid phase using the mouse Ta1505 antibody and the chimeric antibody in as reference antibodies.

Гуманизированные антитела, антитела мыши и химерные антитела были биотинилированы с использованием N-гидроксисукцинимид-LC-биотина (NHS-LC-биотин) (Thermo Fisher Scientific K.K.) с последующим диализом с помощью PBS.Humanized antibodies, mouse antibodies and chimeric antibodies were biotinylated using N-hydroxysuccinimide-LC-biotin (NHS-LC-biotin) (Thermo Fisher Scientific K.K.) followed by dialysis with PBS.

Замороженную ткань гиппокампа (160 мг) из головного мозга пациента с БА на стадии V/VI Браака добавляли к 0,8 мл TBS-I (трис-буферный солевой раствор, коктейль с ингибитором протеазы, коктейль с ингибитором фосфатазы) и обрабатывали ультразвуком в ледяной воде. Обработанный ультразвуком раствор центрифугировали при 3000xg при 4°С в течение 10 мин и супернатант собирали и дополнительно ультрацентрифугировали при 100000xg при 4°С в течение 15 мин для получения гомогената мозга. Набор Innotest pTau (pT181) (Fijirebio Inc.) использовали в качестве системы твердофазного ИФА фосфорилированного тау-белка Ser413 (pSer413-Tau), но биотинилированное антитело, включенное в набор (помеченное как CONJ1), было заменено биотинилированными антителами, полученными выше.Frozen hippocampal tissue (160 mg) from the brain of a Braak stage V/VI AD patient was added to 0.8 ml TBS-I (Tris buffered saline, protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail) and sonicated in ice-cold water. The sonicated solution was centrifuged at 3000xg at 4°C for 10 min and the supernatant was collected and further ultracentrifuged at 100000xg at 4°C for 15 min to obtain a brain homogenate. The Innotest pTau (pT181) kit (Fijirebio Inc.) was used as a Ser413 phosphorylated tau (pSer413-Tau) phosphorylated ELISA system, but the biotinylated antibody included in the kit (labeled CONJ1) was replaced with the biotinylated antibodies prepared above.

Каждое из биотинилированных антител, полученных выше, превращали в раствор с концентрацией 0,1 нМ и добавляли в иммобилизованный МТ-планшет НТ7 (включенный в набор) вместе с 1000-кратным разведением гомогената мозга. Полученный образец перемешивали и инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день планшет промывали и в планшет добавляли меченный HRP стрептавидин (включенный в набор как CONJ2) с последующей инкубацией в течение 1 ч. После промывки добавляли красящий реагент ТМВ с последующей инкубацией с защитой от света при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем реакцию останавливали с помощью раствора ограничителя реакции (включенного в набор в качестве раствора STOP) и измеряли оптическую плотность при длине волны, равной 450 нм. Результаты представлены на фиг. 4.Each of the biotinylated antibodies obtained above was made into a solution at a concentration of 0.1 nM and added to an immobilized HT7 MT plate (included in the kit) along with a 1000-fold dilution of the brain homogenate. The resulting sample was stirred and incubated at 4°C overnight. The next day, the plate was washed and HRP labeled streptavidin (included in the kit as CONJ2) was added to the plate, followed by incubation for 1 hour. After washing, TMB staining reagent was added, followed by incubation with light protection at room temperature for 30 minutes. The reaction was then stopped with a reaction limiter solution (included in the kit as a STOP solution) and the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm. The results are shown in FIG. 4.

Как показано на графике на фиг. 4, все гуманизированные антитела L15H11, L46H11 и L47H65 проявляют высокую аффинность связывания с фосфорилированным тау-белком Ser413 (pSer413-Tau), полученным из клинического образца пациента с БА.As shown in the graph in FIG. 4, all humanized antibodies L15H11, L46H11 and L47H65 show high binding affinity to the phosphorylated tau protein Ser413 (pSer413-Tau) obtained from a clinical specimen from an AD patient.

Пример 6. Исследование кинетики в крови.Example 6. Study of kinetics in the blood.

Пять исходных вариантов гуманизированных антител были исследованы в отношении фармакокинетики у нормальных мышей по сравнению с коммерчески доступным антителом герцептин (Genentech, южный Сан-Франциско, штат Калифорния) и химерным антителом Та1505. Легкая цепь и тяжелая цепь каждого варианта гуманизированного антитела приведены в табл. 10 ниже.Five original humanized antibody variants were studied for pharmacokinetics in normal mice compared to the commercially available Herceptin antibody (Genentech, South San Francisco, CA) and the Ta1505 chimeric antibody. The light chain and heavy chain of each humanized antibody variant are shown in Table 1. 10 below.

- 41 040482- 41 040482

Таблица 10Table 10

Легкая цепь и тяжелая цепь некоторых исходных вариантов гуманизированных антителLight chain and heavy chain of some original variants of humanized antibodies

Антитело Antibody LC LC HC HC Вариант 2 Option 2 LI (SEQ ID NO:130) LI (SEQ ID NO:130) H2 (SEQ ID NO:134) H2 (SEQ ID NO:134) Вариант 5 Option 5 L2 (SEQ ID NO:131) L2 (SEQ ID NO:131) Hl (SEQ ID NO:133) Hl (SEQ ID NO:133) Вариант 6 Option 6 L2 (SEQ ID NO:131) L2 (SEQ ID NO:131) H2 (SEQ ID NO:134) H2 (SEQ ID NO:134) Вариант 9 Option 9 L3 (SEQ ID NO:132) L3 (SEQ ID NO:132) Hl (SEQ ID NO:133) Hl (SEQ ID NO:133) Вариант 10 Option 10 L3 (SEQ ID NO:132) L3 (SEQ ID NO:132) H2 (SEQ ID NO:134) H2 (SEQ ID NO:134)

Антитела вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг 11-недельным самцам мышей C57BL/6J (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Плазма была получена из крови, собранной через 1, 3, 8, 24 и 72 ч после введения дозы. Размер выборки составлял 2 животных на антитело.Antibodies were administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg to 11-week-old male C57BL/6J mice (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Plasma was obtained from blood collected at 1, 3, 8, 24 and 72 hours post-dose. The sample size was 2 animals per antibody.

Сэндвич-ИФА с поликлональными антителами против IgG человека использовали для определения концентрации антител в плазме. Калибровочную кривую строили путем серийного разбавления каждого антитела мышиной плазмой.Sandwich ELISA with polyclonal antibodies against human IgG was used to determine the concentration of antibodies in plasma. A calibration curve was generated by serial dilution of each antibody with mouse plasma.

Плазму разбавляли в 1000 раз и измеряли концентрацию антител.The plasma was diluted 1000 times and the antibody concentration was measured.

мкг/мл Раствора PBS поликлональных козьих античеловеческих антител IgG (Fc) пипеткой переносили в 96-луночный планшет (MaxSorp (NUNC)) и оставляли стоять при 4°С в течение ночи. Затем проводили блокирование 3% БСА/PBS для приготовления планшета с иммобилизованными козьими поликлональными античеловеческими антителами IgG (Fc). Мышиную плазму использовали для серийного разбавления антител и получения стандартного вещества. Плазму и стандартное вещество разводили 3% БСА/PBS и пипетировали в планшет с иммобилизованными козьими поликлональными античеловеческими антителами IgG (Fc) из расчета 50 мкл/лунку. Смеси давали прореагировать при комнатной температуре в течение 1,5 ч и планшет затем промывали TBS-T (TBS, 0,05% Твин 20). Затем раствор, приготовленный разбавлением меченных щелочной фосфатазой поликлональных антител против человеческого IgG (H+L) (Southern Biotech, кат. № 2087-04) в 2000 раз, с 3% БСА/PBS, пипетировали при 50 мкл/лунку и обеспечивали прохождение реакции в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшет промывали TBS-T, добавляли красящий реагент при 100 мкл/лунку и планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого использовали ридер планшетов для измерения поглощения при 405 и 550 нм.μg/ml PBS solution of polyclonal goat anti-human IgG antibodies (Fc) was pipetted into a 96-well plate (MaxSorp (NUNC)) and left to stand at 4°C overnight. Blocking was then performed with 3% BSA/PBS to prepare a plate with immobilized goat polyclonal anti-human IgG (Fc) antibodies. Mouse plasma was used to serially dilute the antibodies and obtain a standard substance. Plasma and standard were diluted with 3% BSA/PBS and pipetted into a plate with immobilized goat polyclonal anti-human IgG (Fc) antibodies at a rate of 50 μl/well. The mixture was allowed to react at room temperature for 1.5 h and the plate was then washed with TBS-T (TBS, 0.05% Tween 20). Then, a solution prepared by diluting alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG (H+L) polyclonal antibody (Southern Biotech, cat. no. 2087-04) 2000-fold with 3% BSA/PBS was pipetted at 50 µl/well and the reaction was allowed to proceed. for 1 h at room temperature. The plate was then washed with TBS-T, staining reagent was added at 100 μl/well and the plate was incubated for 1 hour at room temperature. Thereafter, a plate reader was used to measure absorbance at 405 and 550 nm.

Калибровочную кривую строили со стандартным веществом и использовали для расчета концентрации антител в плазме. Результаты проиллюстрированы на фиг. 5А.A calibration curve was built with a standard substance and used to calculate the concentration of antibodies in plasma. The results are illustrated in FIG. 5A.

Первоначально исследованные гуманизированные варианты (варианты 2, 5, 6, 9 и 10) показали быстрое снижение концентрации в плазме через 8 ч после введения по сравнению с уровнем герцептина и химерного антитела, который оставался высоким и стабильным до 3 суток после инъекции. Эти исходные гуманизированные антитела имели более короткий период полужизни и плохой ФК-профиль по сравнению с химерным антителом, что, вероятно, связано с высокими значениями pI этих вариантов.Initially investigated humanized variants (variants 2, 5, 6, 9 and 10) showed a rapid decrease in plasma concentration after 8 hours after injection compared with the level of Herceptin and chimeric antibody, which remained high and stable up to 3 days after injection. These original humanized antibodies had a shorter half-life and a poor PK profile compared to the chimeric antibody, which is likely due to the high pI values of these variants.

Дополнительное улучшение требовалось для достижения ФК химерного антитела.Further improvement was required to achieve the PK of the chimeric antibody.

Среди гуманизированных антител, имеющих комбинации VL и VH, приведенные в табл. 3А, L15H11, L46H11 и L4 7H65 были подвергнуты исследованию кинетики в крови. Использованными эталонными антителами были химерное антитело Та1505 и известные гуманизированные антитела, использованные в клинических испытаниях для лечения БА, которые были получены путем рекомбинантной экспрессии на основе информации об аминокислотной последовательности, раскрытой в патентной информации или в информации баз данных. В частности, база данных международной информационной системы ImMunoGeneTics (зарегистрированный товарный знак) (IMGT) (http://www.imgt.org) была указана для соланезумаба (антитело против Άβ, Eli Lilly and Company); аминокислотную последовательность VH2Vk3, раскрытую в WO 2014/200921 Ά1, использовали для IPN007 (N-концевое антитело против Tau, Bristol-Myers Squibb iPierian); и аминокислотную последовательность VH32VL21, раскрытую в WO 2015/091656 Ά1, использовали для MAb3221 (антитело против Tau-pS422, Roche Diagnostics K.K.).Among humanized antibodies having combinations of VL and VH, are given in table. 3A, L15H11, L46H11 and L4 7H65 were subjected to a blood kinetics study. The reference antibodies used were the Ta1505 chimeric antibody and known humanized antibodies used in clinical trials for the treatment of AD, which were generated by recombinant expression based on amino acid sequence information disclosed in patent information or database information. In particular, the ImMunoGeneTics International Information System (registered trademark) (IMGT) database (http://www.imgt.org) was listed for solanezumab (anti-Άβ antibody, Eli Lilly and Company); the amino acid sequence VH2Vk3 disclosed in WO 2014/200921 Ά1 was used for IPN007 (N-terminal anti-Tau antibody, Bristol-Myers Squibb iPierian); and the amino acid sequence VH32VL21 disclosed in WO 2015/091656 Ά1 was used for MAb3221 (anti-Tau-pS422 antibody, Roche Diagnostics K.K.).

Каждое из антител вводили внутрибрюшинно самцам мышей C57BL/6J в возрасте 11 недель (Charles River Laboratories Japan, Inc.) в концентрации 10 мг/кг каждое. Кровь брали через 1, 3, 8 и 24 ч, а затем на 3 и 7 сутки после введения для сбора плазмы. Каждое антитело было протестировано в трех повторностях (N=3).Each of the antibodies was intraperitoneally administered to 11 week old C57BL/6J male mice (Charles River Laboratories Japan, Inc.) at a concentration of 10 mg/kg each. Blood was taken after 1, 3, 8 and 24 hours, and then on days 3 and 7 after administration to collect plasma. Each antibody was tested in triplicate (N=3).

Концентрацию антитела в плазме измеряли с помощью сэндвич-ИФА с использованием поликлонального античеловеческого антитела. В частности, раствор PBS, содержащий 1 мкг/мл козьего античеловеческого поликлонального антитела IgG (Fc) (Southern Biotech), добавляли в 96-луночный планшет (Max Sorp (NUNC)) для иммобилизации при 4°С в течение ночи с последующим блокированием с 3% БСА-PBS, чтобы таким образом получить планшет имобиллизованного козьего античеловеческого поликлонального антитела IgG (Fc).Plasma antibody concentration was measured by sandwich ELISA using a polyclonal anti-human antibody. Specifically, a PBS solution containing 1 μg/ml goat anti-human IgG polyclonal antibody (Fc) (Southern Biotech) was added to a 96-well plate (Max Sorp (NUNC)) for immobilization at 4°C overnight followed by blocking with 3% BSA-PBS to thereby obtain an immobilized goat anti-human polyclonal IgG (Fc) plate.

Отдельно ряд стандартных образцов антител известных концентраций готовили путем серийногоSeparately, a number of standard antibody samples of known concentrations were prepared by serial

- 42 040482 разведения каждого антитела плазмой, взятой у мыши, которой антитело не вводили, и измеряли для получения калибровочной кривой.- 42 040482 dilutions of each antibody with plasma taken from a mouse that did not receive the antibody and measured to obtain a calibration curve.

Образцы плазмы и стандартные образцы, подлежащие измерению, разбавляли в 10000 раз и добавляли в планшет с иммобилизированным козьим античеловеческим поликлональным антителом IgG (Fc), при 50 мкл/лунку для реакции при комнатной температуре в течение 1 ч и 30 мин, и планшет затем промывали TBS-T (трис-буферный солевой раствор, 0,05% Tween 20). Впоследствии раствор меченного щелочной фосфатазой античеловеческого поликлонального антитела IgG (H+L) (Southern Biotech), разбавленного в 2000 раз 3% БСА-PBS, добавляли в планшет при 50 мкл/лунку, чтобы обеспечить прохождение реакции при комнатная температуре в течение 1 ч. После промывания TBS-T хромогенный раствор (1 мг/мл раствора pNPP) добавляли в планшет при 100 мкл/лунку с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем измеряли поглощение с помощью планшет-ридера при длине волны измерения, равной 405 нм и эталонной длине волны, равной 550 нм. Калибровочная кривая была подготовлена на основе результатов измерения стандартных образцов, и концентрация антител в каждом образце плазмы была рассчитана с использованием калибровочной кривой.Plasma samples and standard samples to be measured were diluted 10,000 times and added to the plate with immobilized goat anti-human IgG polyclonal antibody (Fc), at 50 μl/well for reaction at room temperature for 1 h and 30 min, and the plate was then washed TBS-T (Tris buffered saline, 0.05% Tween 20). Subsequently, a solution of alkaline phosphatase labeled anti-human IgG polyclonal antibody (H+L) (Southern Biotech) diluted 2000-fold with 3% BSA-PBS was added to the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 1 hour. After washing with TBS-T, a chromogenic solution (1 mg/ml pNPP solution) was added to the plate at 100 μl/well, followed by incubation at room temperature for 1 hour. Then, absorbance was measured using a plate reader at a measurement wavelength of 405 nm and a reference wavelength of 550 nm. A calibration curve was prepared based on the measurement results of standard samples, and the antibody concentration in each plasma sample was calculated using the calibration curve.

Фиг. 5В представляет собой график, показывающий изменения концентрации антител в плазме с течением времени. Как видно из графика, гуманизированные антитела L15H11 (LC SEQ ID NO: 32, НС SEQ ID NO: 18), L46H11 (LC SEQ ID NO: 36, НС SEQ ID NO: 18) и L47H65 (LC SEQ ID NO: 38, HC SEQ ID NO: 30) (все используют IgG1 человека (SEQ ID NO: 135) и каппа человека (SEQ ID NO: 79)) показали практически такую же кинетику в крови, как и у химерного антитела Та1505. Кинетика этих гуманизированных антител L15H11, L46H11 и L47H65 в крови была сопоставима с таковой у известных гуманизированных антител IPN007 и MAb3221 и значительно превосходила таковую у известного гуманизированного антитела соланезумаба.Fig. 5B is a graph showing changes in plasma antibody concentration over time. As can be seen from the graph, humanized antibodies L15H11 (LC SEQ ID NO: 32, HC SEQ ID NO: 18), L46H11 (LC SEQ ID NO: 36, HC SEQ ID NO: 18) and L47H65 (LC SEQ ID NO: 38, HC SEQ ID NO: 30) (all using human IgG1 (SEQ ID NO: 135) and human kappa (SEQ ID NO: 79)) showed substantially the same blood kinetics as the Ta1505 chimeric antibody. The blood kinetics of these humanized antibodies L15H11, L46H11 and L47H65 were comparable to those of the known humanized antibodies IPN007 and MAb3221 and significantly superior to those of the known humanized antibody solanezumab.

Пример 7. Анализ интрацеребральной миграции.Example 7 Analysis of intracerebral migration.

Было проведено исследование для анализа концентрации гуманизированных вариантов в мозге с улучшенной фармакокинетикой в плазме.A study was conducted to analyze the concentration of humanized variants in the brain with improved plasma pharmacokinetics.

Кровь собирали у мышей, которым инъецировали родительское антитело мыши, химерное антитело или варианты гуманизированного антитела (L15H11, L36H11, L46H11, L48H12, L48H47, L48H64, L47H65 или L48H11) через 1 неделю после введения антител. Затем животных анестезировали смесью 3-х анестетиков, лапаротомизировали и обескровливали через брюшную аорту. Затем собирали ткани мозга. Эту собранную ткань мозга разделяли на левое и правое полушария, замораживали на сухом льду/этаноле и хранили при -80°С. Каждое замороженное полушарие взвешивали и переносили в пробирку объемом 2 мл. Затем добавляли 0,8 мл TBS-I (трис-буферный солевой раствор, коктейль с ингибитором протеазы и коктейль с ингибитором фосфатазы) и смесь обрабатывали ультразвуком в ледяной воде. Обработанную ультразвуком смесь центрифугировали при 3000xg и 4°С в течение 10 мин и собирали супернатант. Супернатант дополнительно центрифугировали при 100000xg и 4°С в течение 15 мин для получения гомогената мозга.Blood was collected from mice injected with parental mouse antibody, chimeric antibody, or humanized antibody variants (L15H11, L36H11, L46H11, L48H12, L48H47, L48H64, L47H65, or L48H11) 1 week after antibody administration. Then the animals were anesthetized with a mixture of 3 anesthetics, laparotomized and bled through the abdominal aorta. The brain tissue was then collected. This collected brain tissue was divided into left and right hemispheres, frozen on dry ice/ethanol and stored at -80°C. Each frozen hemisphere was weighed and transferred to a 2 ml tube. Then 0.8 ml TBS-I (Tris buffered saline, protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail) was added and the mixture was sonicated in ice water. The sonicated mixture was centrifuged at 3000xg and 4°C for 10 min and the supernatant was collected. The supernatant was further centrifuged at 100,000xg and 4°C for 15 min to obtain a brain homogenate.

мкг/мл Раствора PBS поликлональных козьих античеловеческих антител IgG (Fc) пипеткой переносили в 96-луночный планшет (MaxSorp (NUNC)) и оставляли стоять при 4°С в течение ночи. Затем проводили блокирование 3% БСА/PBS для приготовления планшета с иммобилизованными козьими поликлональными античеловеческими антителами IgG (Fc). Гомогенат мозга, полученный от мышей, которым не вводили антитела, использовали для серийного разбавления антител и получения стандартного вещества.μg/ml PBS solution of polyclonal goat anti-human IgG antibodies (Fc) was pipetted into a 96-well plate (MaxSorp (NUNC)) and left to stand at 4°C overnight. Blocking was then performed with 3% BSA/PBS to prepare a plate with immobilized goat polyclonal anti-human IgG (Fc) antibodies. A brain homogenate obtained from mice that were not injected with antibodies was used to serially dilute the antibodies and obtain a standard substance.

Гомогенат мозга и стандартное вещество разводили в 10 раз и пипетировали в планшет с иммобилизованными козьими поликлональными античеловеческими антителами IgG (Fc) из расчета 50 мкл/лунку. Смеси давали прореагировать при комнатной температуре в течение 2 ч и планшет затем промывали TBS-T (TBS, 0,025% Твин 20). Затем раствор, приготовленный разбавлением меченных щелочной фосфатазой поликлональных антител против человеческого IgG (H+L) (Sigma, кат. № SAB3701337-1MG) в 2000 раз, с 3% БСА/PBS, пипетировали при 50 мкл/лунку и обеспечивали прохождение реакции в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшет промывали TBS-T, добавляли красящий реагент pNPP (Sigma, кат. № Р7998) при 100 мкл/лунку и планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого использовали ридер планшетов для измерения поглощения при 405 и 550 нм.The brain homogenate and the standard substance were diluted 10 times and pipetted into a plate with immobilized goat polyclonal anti-human IgG (Fc) antibodies at a rate of 50 μl/well. The mixture was allowed to react at room temperature for 2 hours and the plate was then washed with TBS-T (TBS, 0.025% Tween 20). Then, a solution prepared by diluting alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG (H+L) polyclonal antibodies (Sigma, cat. no. SAB3701337-1MG) 2000-fold with 3% BSA/PBS was pipetted at 50 µl/well and the reaction was allowed to proceed in for 1 h at room temperature. The plate was then washed with TBS-T, the pNPP staining reagent (Sigma, cat. no. P7998) was added at 100 μl/well and the plate was incubated for 1 hour at room temperature. Thereafter, a plate reader was used to measure absorbance at 405 and 550 nm.

Калибровочную кривую строили со стандартным веществом и использовали для расчета концентрации антител в гомогенате мозга. Определяли концентрацию антител на массу мозга (объем всего мозга) и рассчитывали отношение к концентрации в плазме.A calibration curve was built with a standard substance and used to calculate the concentration of antibodies in the brain homogenate. The antibody concentration per brain mass (whole brain volume) was determined and the ratio to plasma concentration was calculated.

Фиг. 6А демонстрирует, что варианты гуманизированных антител с хорошей фармакокинетикой (например, L15H11, L46H11 и L47H65 согласно фиг. 5В) имели улучшенную концентрацию в мозге.Fig. 6A demonstrates that humanized antibody variants with good pharmacokinetics (eg, L15H11, L46H11, and L47H65 of FIG. 5B) had improved concentration in the brain.

Интрацеребральную миграцию каждого из гуманизированных антител L15H11, L46H11 и L47H65 анализировали с использованием химерного антитела Та1505 и известных гуманизированных антител соланезумаба, IPN007 и MAb3221, которые использовались в клинических испытаниях для лечения БА, в качестве эталонных антител.The intracerebral migration of each of the humanized antibodies L15H11, L46H11 and L47H65 was analyzed using the chimeric antibody Ta1505 and the known humanized antibodies of solanezumab, IPN007 and MAb3221, which were used in clinical trials for the treatment of AD, as reference antibodies.

Через одну неделю после введения каждого антитела из примера 6 у мышей брали кровь, затем ихOne week after administration of each antibody from Example 6, mice were bled and then

- 43 040482 подвергали лапаротомии под наркозом тремя типами смешанных анестетиков. После смерти от обескровливания из брюшной полой вены собирали ткани головного мозга. Собранные ткани мозга разделяли на правое и левое полушария, которые замораживали в этаноле в сухом льду и хранили при -80°С. Каждое из замороженных полушарий взвешивали и переносили в пробирку объемом 2 мл, в которую добавляли 0,8 мл TBS-I (трис-буферный солевой раствор, коктейль с ингибитором протеазы и коктейль с ингибитором фосфатазы). Каждое полушарие затем обрабатывали ультразвуком в ледяной воде. Обработанный ультразвуком раствор центрифугировали при 3000xg при 4°С в течение 10 мин и супернатант собирали и дополнительно ультрацентрифугировали при 100000xg при 4°С в течение 15 мин для получения гомогената мозга.- 43 040482 were subjected to laparotomy under anesthesia with three types of mixed anesthetics. After death from exsanguination, brain tissue was collected from the vena cava. The collected brain tissues were divided into right and left hemispheres, which were frozen in ethanol in dry ice and stored at -80°C. Each of the frozen hemispheres was weighed and transferred to a 2 ml tube to which 0.8 ml TBS-I (Tris buffered saline, protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail) was added. Each hemisphere was then sonicated in ice water. The sonicated solution was centrifuged at 3000xg at 4°C for 10 min and the supernatant was collected and further ultracentrifuged at 100000xg at 4°C for 15 min to obtain a brain homogenate.

Уровень антител в гомогенате мозга измеряли с помощью антигенного твердофазного ИФА с использованием поликлонального античеловеческого антитела. В частности, раствор PBS, содержащий 10 мкг/мл козьего античеловеческого антитела Fc IgG, добавляли в 96-луночный планшет (Max Sorp (NUNC)) для иммобилизации при 4°С в течение ночи с последующим блокированием 3% БСА-PBS для получения иммобилизованного планшета.The level of antibodies in the brain homogenate was measured using antigenic solid-phase ELISA using a polyclonal anti-human antibody. Specifically, a PBS solution containing 10 μg/ml goat anti-human Fc IgG was added to a 96-well plate (Max Sorp (NUNC)) for immobilization at 4° C. overnight followed by blocking with 3% BSA-PBS to obtain an immobilized tablet.

Отдельно ряд стандартных образцов антител известных концентраций готовили путем серийного разведения каждого антитела гомогенатом мозга, полученного от мыши, которой антитело не вводили, и измеряли для получения калибровочной кривой.Separately, a series of standard antibody samples of known concentrations were prepared by serially diluting each antibody with brain homogenate obtained from a mouse that did not receive the antibody and measured to obtain a calibration curve.

Гомогенаты мозга и стандартные образцы, подлежащие измерению, каждый раз разбавляли в 10 раз 3% БСА-PBS с 0,1% обезжиренного молока и добавляли в иммобилизованный планшет PD17 (Р) при 50 мкл/лунку для реакции при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшет промывали TBS-T (TBS, 0,05% Tween 20). Впоследствии раствор античеловеческого поликлонального антитела, меченного щелочной фосфатазой IgG (H+L) (Sigma-Aldrich Co. LLC, кат. № SAB3701337, 1 мг), разбавленного в 2000 раз 0,1% обезжиренным молоком и 3% БСА-PBS, добавляли в планшет при 50 мкл/лунку для обеспечения прохождения реакции при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывания планшета TBS-T, pNPP (Sigma-Aldrich Co. LLC, кат. № P7998, 100 мл) добавляли в качестве хромогенного субстрата при 100 мкл/лунку с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем измеряли поглощение с помощью планшет-ридера при длине волны измерения, равной 405 нм, и эталонной длине волны, равной 550 нм. Калибровочную кривую готовили на основе результатов измерения стандартных образцов, уровень антител в каждом образце гомогената мозга определяли с использованием калибровочной кривой и оценивали как уровень антител в мозге.Brain homogenates and standard samples to be measured were diluted 10-fold each time with 3% BSA-PBS with 0.1% skim milk and added to a PD17 (P) immobilized plate at 50 µl/well to react at room temperature for 2 hours The plate was then washed with TBS-T (TBS, 0.05% Tween 20). Subsequently, a solution of an anti-human polyclonal antibody labeled with alkaline phosphatase IgG (H+L) (Sigma-Aldrich Co. LLC, cat. no. SAB3701337, 1 mg) diluted 2000 times with 0.1% skim milk and 3% BSA-PBS was added into the plate at 50 µl/well to allow the reaction to proceed at room temperature for 1 hour. After washing the plate with TBS-T, pNPP (Sigma-Aldrich Co. LLC, cat. no. µl/well, followed by incubation at room temperature for 1 hour. Absorbance was then measured using a plate reader at a measurement wavelength of 405 nm and a reference wavelength of 550 nm. A calibration curve was prepared based on the measurement results of standard samples, the level of antibodies in each sample of the brain homogenate was determined using the calibration curve and evaluated as the level of antibodies in the brain.

Кроме того, уровень антител в плазме определяли, используя кровь, собранную перед лапаротомией, таким же образом, как в примере 6, и рассчитывали отношение уровня антител в мозге к уровню в плазме.In addition, the plasma antibody level was determined using the blood collected before laparotomy in the same manner as in Example 6, and the ratio of the brain antibody level to the plasma level was calculated.

Фиг. 6В представляет собой график, показывающий отношение уровня каждого антитела в мозге к уровню соответствующего антитела в плазме. Соотношения концентраций антител в мозге к концентрациям антител в плазме гуманизированных антител L15H11, L46H11 и L47H65 были высокими по сравнению с соотношениями химерного антитела Та1505 и известных гуманизированных антител IPN007, MAb3221 и соланезумаба. Результаты показывают, что эти гуманизированные антитела характеризуются высокой миграцией в мозг.Fig. 6B is a graph showing the ratio of the level of each antibody in the brain to the level of the corresponding antibody in plasma. The brain to plasma antibody concentration ratios of the humanized antibodies L15H11, L46H11 and L47H65 were high compared to the ratios of the chimeric Ta1505 antibody and the known humanized antibodies IPN007, MAb3221 and solanezumab. The results show that these humanized antibodies are characterized by high migration to the brain.

Пример 8. Дополнительная разработка селективных гуманизированных антител.Example 8 Further development of selective humanized antibodies.

Последующие мутации были введены в последовательность CDR1 VL46 для удаления горячей точки дезамидирования и/или для возврата последовательности CDR к родительской последовательности мыши. Табл. 11 обобщает мутации, введенные в CDR1 VL46.Subsequent mutations were introduced into the VL46 CDR1 sequence to remove the deamidation hotspot and/or to return the CDR sequence to the mouse parent sequence. Tab. 11 summarizes the mutations introduced in CDR1 VL46.

- 44 040482- 44 040482

Таблица 11Table 11

Мутации, введенные в CDR1 VL46Mutations introduced in CDR1 VL46

Мутация Mutation Цель Target VL46_G34A (SEQ ID NO:105) VL46_G34A (SEQ ID NO:105) Удаление дезамидирования Removal of deamidation VL46_G34S (SEQ ID NO:106) VL46_G34S (SEQ ID NO:106) Удаление дезамидирования Removal of deamidation VL46_G34T (SEQ ID NO:107) VL46_G34T (SEQ ID NO:107) Удаление дезамидирования Removal of deamidation VL46_N33Q (SEQ ID NO:108) VL46_N33Q (SEQ ID NO:108) Удаление дезамидирования Removal of deamidation VL46_N33Q_G34A (SEQ ID NO:109) VL46_N33Q_G34A (SEQ ID NO:109) Удаление дезамидирования Removal of deamidation VL46_N33D (SEQ ID NO:110) VL46_N33D (SEQ ID NO:110) Имитирование полного дезамидирования Imitation of a complete deamidation VL46_N33S (SEQ ID NO:111) VL46_N33S (SEQ ID NO:111) Удаление дезамидирования Removal of deamidation VL46_N33T (SEQ ID NO:112) VL46_N33T (SEQ ID NO:112) Удаление дезамидирования Removal of deamidation VL46_S28N (SEQ ID NO:113) VL46_S28N (SEQ ID NO:113) Возвращение CDR1 LC мыши Return of the CDR1 LC mouse VL46_G34A_S28N (SEQ ID NO:114) VL46_G34A_S28N (SEQ ID NO:114) Удаление дезамидирования и возвращение CDR1 LC мыши Removal of deamidation and return of CDR1 LC mouse

Кроме того, различные изотипы IgG, включая IgG1 и IgG4 с мутацией S228P, были протестированы в новых созданных вариантах гуманизированных антител. В табл. 12 представлены легкая цепь и тяжелая цепь новых созданных вариантов гуманизированных антител вместе с родительским антителом мыши и химерным антителом.In addition, various IgG isotypes, including IgG1 and IgG4 with the S228P mutation, have been tested in newly engineered humanized antibody variants. In table. 12 shows the light chain and heavy chain of the newly engineered humanized antibody variants along with the mouse parental antibody and the chimeric antibody.

Таблица 12Table 12

Легкая цепь и тяжелая цепь специфических антителLight chain and heavy chain of specific antibodies

Мышиное х [МАРТ_Н] mAh (Та1505) IgG2a/ каппа (HY) Mouse x [MART_N] mAh (Ta1505) IgG2a / kappa (HY) ms IgG2a ms IgG2a Химерное человеческое/мышиное [МАРТ_Н] mAb (Та1505) IgGl/ каппа (СХ) Chimeric human/mouse [MART_N] mAb (Ta1505) IgGl/kappa (CX) chim. IgGl chim. IgGl Химерное человеческое/мышиное [МАРТ_Н] mAb (Та1505) IgG4 S228P/ каппа (СХ) Chimeric human/mouse [MART_N] mAb (Ta1505) IgG4 S228P/ kappa (CX) chim. IgG4 chim. IgG4 Гуманизированное х [МАРТ_Н] mAb (Та1505 VL46/VH11) IgGl/ каппа (СХ) Humanized x [MART_N] mAb (Ta1505 VL46/VH11) IgGl/ kappa (CX) hu VL46/VH11 IgGl hu VL46/VH11 IgGl Гуманизированное х [МАРТ_Н] mAb (Та1505 VL46/VH11) lgG4 Э228Р/каппа (СХ) Humanized x [MART_N] mAb (Ta1505 VL46/VH11) lgG4 E228R/kappa (SH) hu VL46/VH11 lgG4 hu VL46/VH11 lgG4 Гуманизированное х [МАРТ_Н] mAb (Та1505VL46 G34A/VH11) IgGl/каппа (СХ) Humanized x [MART_H] mAb (Ta1505VL46 G34A/VH11) IgGl/kappa (CX) hu VL46/VH11 G34A IgGl hu VL46/VH11 G34A IgGl Гуманизированное х [МАРТ_Н] mAb (Та1505VL46_G34A/VH11) lgG4 Э228Р/каппа (СХ) Humanized x [MART_N] mAb (Ta1505VL46_G34A/VH11) lgG4 E228R/kappa (SH) hu VL46/VH11 G34A lgG4 hu VL46/VH11 G34A lgG4 Гуманизированное х МАРТ_Н] mAb (Tai505VL46_G34S/VH11) lgG4 Э228Р/каппа (СХ) Humanized x MART_N] mAb (Tai505VL46_G34S/VH11) lgG4 E228R/kappa (CX) hu VL46/VH11 G34S lgG4 hu VL46/VH11 G34S lgG4 Гуманизированное х [МАРТ Н] mAb (Та1505VL46_G34T/VH11) lgG4S228P/ каппа (СХ) Humanized x [MART H] mAb (Ta1505VL46_G34T/VH11) lgG4S228P/kappa (CX) hu VL46/VH11 G34T lgG4 hu VL46/VH11 G34T lgG4 Гуманизированное х [МАРТ_Н] mAb (Та 1505-VL46_N33Q/VH11) lgG4S228Р/каппа (СХ) Humanized x [MART_N] mAb (Ta 1505-VL46_N33Q/VH11) lgG4S228P/kappa (CX) hu VL46/VH11 N33Q lgG4 hu VL46/VH11 N33Q lgG4 Гуманизированное х [МАРТ_Н] mAb (Та1505VL46_N33Q G34A/VH11) lgG4 S228P/ каппа (СХ) Humanized x [MART_N] mAb (Ta1505VL46_N33Q G34A/VH11) lgG4 S228P/ kappa (CX) hu VL46/VH11 N33Q G34A lgG4 hu VL46/VH11 N33Q G34A lgG4 Гуманизированное х МАРТ_Н] mAb (Та1505VL46_N33D/VH11) lgG4 Э228Р/каппа (СХ) Humanized x MART_N] mAb (Ta1505VL46_N33D/VH11) lgG4 E228R/kappa (SH) hu VL46/VH11 N33D lgG4 hu VL46/VH11 N33D lgG4 Гуманизированное х [МАРТ_Н] mAb (Та1505- Humanized x [MART_N] mAb (Ta1505- hu VL46/VH11 N33S hu VL46/VH11 N33S

- 45 040482- 45 040482

VL46_N33S/VH11) lgG4 Б228Р/каппа (CX) VL46_N33S/VH11) lgG4 B228R/kappa (CX) lgG4 lgG4 Гуманизированное x [MAPT_H] mAb (Tal505VL46_N33T/VH11) lgG4 8228Р/каппа (CX) Humanized x [MAPT_H] mAb (Tal505VL46_N33T/VH11) lgG4 8228P/kappa (CX) hu VL46/VH11 N33T lgG4 hu VL46/VH11 N33T lgG4 Гуманизированное x MAPT_H] mAb (Tal505- VL46/ VH11A64D) lgG4 3228Р/каппа (CX) Humanized x MAPT_H] mAb (Tal505- VL46/ VH11A64D) lgG4 3228P/kappa (CX) hu VL46/VH11 A64D lgG4 hu VL46/VH11 A64D lgG4 Гуманизированное x [MAPT_H] mAb (Tal505- VL46S28N/VH11) lgG4 S228P/ каппа (CX) Humanized x [MAPT_H] mAb (Tal505- VL46S28N/VH11) lgG4 S228P/ kappa (CX) hu VL46/VH11 S28N lgG4 hu VL46/VH11 S28N lgG4 Гуманизированное x [MAPT_H] mAb (Tal505 VL47/VH65) IgGl/ каппа (CX) Humanized x [MAPT_H] mAb (Tal505 VL47/VH65) IgGl/ kappa (CX) hu VL47/ VH65 IgGl hu VL47/ VH65 IgGl Гуманизированное x [MAPT_H] mAb (Tal505VL46 G34A S28N/VH11) IgGl/каппа (CX) Humanized x [MAPT_H] mAb (Tal505VL46 G34A S28N/VH11) IgGl/kappa (CX) hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl Гуманизированное x MAPT_H] mAb (Tal505VL46 G34A S28N/VH11) lgG4 Б228Р/каппа (CX) Humanized x MAPT_H] mAb (Tal505VL46 G34A S28N/VH11) lgG4 B228R/kappa (CX) hu VL46/VH11G34A S28N lgG4 hu VL46/VH11G34A S28N lgG4

Пример 9. Анализ связывания Biacore™ новых созданных вариантов гуманизированных антител.Example 9 Biacore™ Binding Assay of Newly Generated Humanized Antibody Variants.

Аффинность связывания новых созданных вариантов гуманизированных антител измеряли с использованием биосенсоров Biacore™ T200 и 4000 (GE Healthcare, Чикаго, штат Иллинойс). Следующий подвижный буфер: 10 мМ HEPES (GE Healthcare, BR100671), 150 мМ NaCl (GE Healthcare, BR100671), 0,05% об./об. ПАВ Р20 (GE Healthcare, BR100671), 2 мМ DTT (Sigma, 10708984001, Сент-Луис, штат Миссури) и 1 мМ ЭДТА (GE Healthcare, 28995043) - был использован для иммобилизации, разбавления образца и сбора данных, если не указано иное.The binding affinity of the newly engineered humanized antibody variants was measured using the Biacore™ T200 and 4000 biosensors (GE Healthcare, Chicago, IL). The following running buffer: 10 mM HEPES (GE Healthcare, BR100671), 150 mM NaCl (GE Healthcare, BR100671), 0.05% v/v Surfactant P20 (GE Healthcare, BR100671), 2 mM DTT (Sigma, 10708984001, St. Louis, MO) and 1 mM EDTA (GE Healthcare, 28995043) - was used for immobilization, sample dilution and data collection unless otherwise noted .

Иммобилизованный белок относится к рекомбинантному фосфорилированному белку тау человека, иммобилизованному на чипе; термин иммобилизованный пептид 1хР относится к фосфорилированному пептиду (TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC, SEQ ID NO: 75), иммобилизованному на чипе. Оба этих метода имеют авидный компонент для измерения аффинности. 4хР пептидный аналит имеет антитело, захваченное на чипе, и 4х фосфорилированный пептид (GAEIVYK(pS) PWSGDT (pS ) PRHLSNVS (pS) TGSIDMVD(pS) PQLATLADEVSASLAKQ GL, SEQ ID NO: 78) в растворе.Immobilized protein refers to recombinant phosphorylated human tau protein immobilized on a chip; the term 1xP immobilized peptide refers to a phosphorylated peptide (TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC, SEQ ID NO: 75) immobilized on a chip. Both of these methods have an avid component for measuring affinity. The 4xP peptide analyte has the antibody captured on the chip and the 4xphosphorylated peptide (GAEIVYK(pS) PWSGDT (pS) PRHLSNVS (pS) TGSIDMVD(pS) PQLATLADEVSASLAKQ GL, SEQ ID NO: 78) in solution.

Связывание антител с иммобилизованным фосфорилированным тау-белком измеряли с использованием сенсорных чипов серии S NTA (GE Healthcare, BR100034). Подвижный буфер для иммобилизации представлял собой 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl₂, 0,05% об./об. ПАВ Р20, pH 7,4 (GE Healthcare, BR100671), а скорость потока составляла 10 мкл/мин. 350 мМ ЭДТА впрыскивали в течение 1 мин для очистки чипа, а затем в течение 2 мин вводили 0,5 мМ NiCl₂ (GE Healthcare, набор реагентов NTA) для подготовки чипа к захвату his-меченого белка. Чип активировали в соответствии с инструкциями производителя с использованием набора для иммобилизации по аминогруппе (GE Healthcare, BR100633), затем 300 нМ фосфорилированного тау-белка (80AWB) вводили до тех пор, пока желаемое количество белка не было иммобилизовано. Чип был заблокирован этаноламином из набора для иммобилизации по аминогруппе. В каждом эксперименте использовали несколько уровней иммобилизованного фосфорилированного тау-белка. Самый низкий уровень варьировал от 54 резонансных единиц (RU) до 452 RU, а самый высокий уровень варьировал от 463 RU до 1020 RU. Чтобы измерить аффинность связывания антитела Та1505 с иммобилизованным фосфорилированным тау-белком, был приготовлен 5-членный 3-кратный ряд разведений каждого антитела, что привело к концентрациям от 0,37 до 30 нМ. Каждую концентрацию и несколько чистых буферных растворов вводили в течение 3 мин при скорости потока, равной 45 мкл/мин. Диссоциацию антитела отслеживали в течение 15 мин, затем поверхность восстанавливали путем инъекции от 30 с до 1 мин 100 мМ CAPS (Sigma, С6070), 1 М KCl (Sigma, P9541), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT pH 10,5.Antibody binding to immobilized phosphorylated tau protein was measured using S NTA sensor chips (GE Healthcare, BR100034). The immobilization buffer was 10 mM HEPES, 150 mM NaCl ₂ , 0.05% v/v. Surfactant P20, pH 7.4 (GE Healthcare, BR100671), and the flow rate was 10 µl/min. 350 mM EDTA was injected for 1 min to clean the chip, followed by 0.5 mM NiCl ₂ (GE Healthcare, NTA reagent kit) for 2 min to prepare the chip for capture of his-tagged protein. The chip was activated according to the manufacturer's instructions using an amino immobilization kit (GE Healthcare, BR100633), then 300 nM phosphorylated tau protein (80AWB) was injected until the desired amount of protein was immobilized. The chip was blocked with ethanolamine from the amino group immobilization kit. Several levels of immobilized phosphorylated tau protein were used in each experiment. The lowest level ranged from 54 Resonant Units (RU) to 452 RU, while the highest level ranged from 463 RU to 1020 RU. To measure the binding affinity of the Ta1505 antibody to the immobilized phosphorylated tau protein, a 5-member, 3-fold dilution series of each antibody was prepared, resulting in concentrations ranging from 0.37 to 30 nM. Each concentration and several blank buffers were injected over 3 minutes at a flow rate of 45 µl/min. The dissociation of the antibody was monitored for 15 min, then the surface was repaired by 30 s to 1 min injection of 100 mM CAPS (Sigma, C6070), 1 M KCl (Sigma, P9541), 1 mM EDTA, 2 mM DTT pH 10.5.

Связывание антител с иммобилизованным фосфорилированным тау-петидом измеряли с использованием сенсорного чипа серии S СМ3 (GE Healthcare, BR100536). Чип активировали с использованием набора для иммобилизации по аминогруппе, затем 30 мкг/мл фосфорилированного тау-пептида (SEQ ID NO: 75) в 10 мМ ацетате натрия, pH 5,0 вводили до иммобилизации 51 RU. Чип был блокирован этаноламином. Эталонную поверхность отрицательного контроля готовили аналогичным образом, используя нефосфорилированный тау-пептид (TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC, SEQ ID NO: 77). Чтобы измерить аффинность связывания антитела Та1505 с иммобилизованным фосфорилированным тау-пептид, был приготовлен 5-членный 3-кратный ряд разведений каждого антитела, что привело к концентрациям от 0,37 до 30 нМ. Каждую концентрацию и несколько чистых буферных растворов вводили в течение 3 мин при скорости потока, равной 45 мкл/мин. Диссоциацию антитела отслеживали в течение 15 мин. Поверхность восстанавливали посредством 30-секундной инъекции 100 мМ соляной кислоты (Fisher Scientific, SA56-1,Antibody binding to immobilized phosphorylated tau peptide was measured using a CM3 S series sensor chip (GE Healthcare, BR100536). The chip was activated using an amino group immobilization kit, then 30 μg/ml of phosphorylated tau peptide (SEQ ID NO: 75) in 10 mM sodium acetate, pH 5.0 was injected prior to immobilization with 51 RU. The chip was blocked with ethanolamine. A negative control reference surface was prepared in a similar manner using non-phosphorylated tau peptide (TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC, SEQ ID NO: 77). To measure the binding affinity of the Ta1505 antibody to the immobilized phosphorylated tau peptide, a 5-member, 3-fold dilution series of each antibody was prepared, resulting in concentrations ranging from 0.37 to 30 nM. Each concentration and several blank buffers were injected over 3 minutes at a flow rate of 45 µl/min. The dissociation of the antibody was monitored for 15 minutes. The surface was repaired with a 30 second injection of 100 mM hydrochloric acid (Fisher Scientific, SA56-1,

- 46 040482- 46 040482

Волтэм, штат Массачусетс).Waltham, Massachusetts).

Связывание фосфорилированного тау-пептида с иммобилизованным антителом измеряли с использованием сенсорных чипов серии S CM5 (GE Healthcare, 29149603). Чип активировали с использованием набора для иммобилизации по аминогруппе, затем вводили от 1 до 3 мкг/мл антитела в 10 мМ ацетате натрия, pH 5,0 (Ge Healthcare, BR100351), до тех пор, пока не было иммобилизовано от 280 до 9100 RU антител. Чип был блокирован этаноламином. Чтобы измерить аффинность связывания фосфорилированного тау-пептида (SEQ ID NO: 78) с иммобилизованными антителами Та1505, был приготовлен 6-членный 2,5-кратный ряд разведений пептида, что привело к концентрациям от 5,1 до 500 нМ. Образцы и несколько чистых буферных растворов вводили со скоростью 30-50 мкл/мин в течение 3 мин и диссоциацию отслеживали в течение 15 мин. Поверхность восстанавливали посредством 30-секундной инъекции 20 мМ ацетата натрия, pH 4,5, либо без корректировки, либо с доведением pH до 3,5 соляной кислотой.Binding of the phosphorylated tau peptide to the immobilized antibody was measured using S-series CM5 sensor chips (GE Healthcare, 29149603). The chip was activated using an amino immobilization kit, then 1 to 3 μg/ml of antibody in 10 mM sodium acetate, pH 5.0 (Ge Healthcare, BR100351) was injected until 280 to 9100 RU were immobilized antibodies. The chip was blocked with ethanolamine. To measure the binding affinity of the phosphorylated tau peptide (SEQ ID NO: 78) to immobilized Ta1505 antibodies, a 6-mer, 2.5-fold dilution series of the peptide was prepared, resulting in concentrations ranging from 5.1 to 500 nM. Samples and several blank buffer solutions were injected at a rate of 30-50 µl/min over 3 min and dissociation was monitored for 15 min. The surface was restored by a 30 second injection of 20 mM sodium acetate, pH 4.5, either without adjustment or by adjusting the pH to 3.5 with hydrochloric acid.

Данные обрабатывали и корректировали с использованием оценочного программного обеспечения Biacore™ T200 версии 2.0 или оценочного программного обеспечения Biacore™ 4000 версии 1.1 (GE Healthcare). Данные дважды корректировали путем вычитания ответа от отрицательной контрольной проточной ячейки и вычитания ответа от инъекции буфера или среднего ответа от двух инъекций буфера. Затем данные были согласованы с моделью 1:1 связывания для определения константы скорости ассоциации, k_a (М¹с¹, где М равно молярности и с равно секундам) и константы скорости диссоциации, kd (с¹). Эти константы скорости были использованы для расчета равновесной константы диссоциации, K_D(M)=kd/k_a. В табл. 13 приведены значения K_D новых созданных вариантов гуманизированных антител по сравнению со значениями родительского антитела мыши и химерного антитела.Data were processed and corrected using Biacore™ T200 evaluation software version 2.0 or Biacore™ 4000 evaluation software version 1.1 (GE Healthcare). Data were corrected twice by subtracting the response from the negative control flow cell and subtracting the response from the buffer injection or the average response from two buffer injections. The data were then matched to a 1:1 binding model to determine the association rate constant, k _a (M ¹ c ¹ , where M is molarity and c is seconds) and the dissociation rate constant, kd (c ¹ ). These rate constants were used to calculate the equilibrium dissociation constant, K _D (M)=kd/k _a . In table. 13 shows the K _D values of the newly generated humanized antibody variants compared to those of the mouse parental antibody and the chimeric antibody.

Таблица 13Table 13

Значения K_D (нМ) антител к фосфорилированному тау-белку или пептидуK _D values (nM) of antibodies to phosphorylated tau protein or peptide

Иммобилизо ванный белок immobilized protein Иммобилизо ванный 1хР пептид Immobiliso bathroom 1xP peptide Пептиданалит 4хР Peptidanalit 4xR мс IgG2a ms IgG2a 0,43 0.43 0, 03 0.03 17,5 17.5 хим. IgGl chem. IgGl 0,46 0.46 0, 04 0.04 27,2 27.2 хим. IgG4 chem. IgG4 0,58 0.58 0, 06 0.06 28,5 28.5 hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144) hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144) 0,46 0.46 0, 06 0.06 24,3 24.3 hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:152) hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:152) 0,70 0.70 0, 09 0.09 39, 3 39, 3 hu VL46 G34A (SEQ ID NO: 166)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144) hu VL46 G34A (SEQ ID NO: 166)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144) 0,28 0.28 н/д n/a н/д n/a hu VL46 G34A (SEQ ID NO: 166) / VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) hu VL46 G34A (SEQ ID NO: 166) / VH11 IgG4 (SEQ ID NO: 151) 0,52 0.52 0, 09 0.09 36,2 36.2 hu VL46 G34S (SEQ ID NO: 168) / VH11 IgG4(SEQ ID NO:151) hu VL46 G34S (SEQ ID NO: 168) / VH11 IgG4 (SEQ ID NO: 151) н/с n/s н/с n/s н/д n/a hu VL46 G34T (SEQ ID NO:170)/ VH11 IgG4(SEQ ID NO:151) hu VL46 G34T (SEQ ID NO:170)/ VH11 IgG4(SEQ ID NO:151) 0,75 0.75 0, 13 0.13 н/д n/a hu VL46 N33Q (SEQ ID NO:172)/ VH11 IgG4 ( SEQ ID NO:151) hu VL46 N33Q (SEQ ID NO:172)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) 1,27 1.27 0, 14 0.14 н/д n/a hu VL46 N33Q G34A (SEQ ID NO: 174) / VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) hu VL46 N33Q G34A (SEQ ID NO: 174) / VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) 3,40 3.40 0,31 0.31 н/д n/a hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 IgG4(SEQ ID NO:151) hu VL46 (SEQ ID NO:163)/ VH11 IgG4(SEQ ID NO:151) н/с n/s 1,78 1.78 н/д n/a hu VL46 N33S (SEQ ID NO:178)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) hu VL46 N33S (SEQ ID NO:178)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) 2,31 2.31 0,29 0.29 н/д n/a hu VL46 N33T (SEQ ID NO:180)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) hu VL46 N33T (SEQ ID NO:180)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) 1,31 1.31 0, 18 0.18 н/д n/a

- 47 040482- 47 040482

hu VL4 6 A64D/VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) hu VL4 6 A64D/VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) 0,77 0.77 0,16 0.16 н/д n/a hu VL46 S28N (SEQ ID NO:183)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) hu VL46 S28N (SEQ ID NO:183)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) 0,42 0.42 0, 10 0.10 32,5 32.5 hu VL47 (SEQ ID NO:164)/ VH65 IgGl (SEQ ID NO:153) hu VL47 (SEQ ID NO:164)/ VH65 IgGl (SEQ ID NO:153) 0,45 0.45 0, 06 0.06 н/д n/a hu VL46 G34A S28N (SEQ ID NO:184)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144) hu VL46 G34A S28N (SEQ ID NO:184)/ VH11 IgGl (SEQ ID NO:144) 0,43 0.43 н/д n/a н/д n/a hu VL46 G34A S28N (SEQ ID NO:184)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) hu VL46 G34A S28N (SEQ ID NO:184)/ VH11 IgG4 (SEQ ID NO:151) 0, 80 0.80 н/д n/a н/д n/a

Пример 10. Твердофазный ИФА связывания родительского антитела мыши, химерного антитела и некоторых вариантов гуманизированных антител.Example 10 Solid phase ELISA binding of parental mouse antibody, chimeric antibody, and some variants of humanized antibodies.

Связывание родительского мышиного антитела, химерного антитела и новых созданных вариантов гуманизированного антитела с фосфорилированным пептидом (PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD, SEQ ID NO: 79) и соответствующим нефосфорилированным пептидом (PRHLSNVSTGSIDMVD, SEQ ID NO: 80) анализировали методом твердофазного ИФА.The binding of the parental mouse antibody, the chimeric antibody, and the newly engineered humanized antibody variants to the phosphorylated peptide (PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD, SEQ ID NO: 79) and the corresponding non-phosphorylated peptide (PRHLSNVSTGSIDMVD, SEQ ID NO: 80) was analyzed by solid phase ELISA.

мкл 1 мкг/мл Фосфорилированного или нефосфорилированного пептида в PBS добавляли в каждую лунку планшетов для твердофазного ИФА и планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующие сутки планшеты промывали 3 раза и блокировали 200 мкл суперблока при 4°С в течение ночи. На третьи сутки планшеты промывали 3 раза. Затем 50 мкл антител в серийном разведении 1:3 в буфере для твердофазного ИФА, начиная с 10 мкг/мл, добавляли в каждую лунку планшета, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем промывали 3 раза. 50 мкл Разведенного 1:3000 козьего антимышиного-HRP (Southern Biotech, 1030-05) были добавлены для измерения родительского антитела мыши. 50 мкл Разведенного 1:3000 козьего антимышиного-HRP (Jackson Immunologics, 109-036-098) добавляли для измерения химерного антитела и гуманизированного антитела. Планшеты для твердофазного ИФА инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин, промывали 3 раза, затем проявляли с помощью ABTS при комнатной температуре в течение 5 мин. После этого использовали ридер планшетов для измерения поглощения при 405 нм.μl of 1 μg/ml Phosphorylated or non-phosphorylated peptide in PBS was added to each well of the ELISA plates and the plates were incubated at 4° C. overnight. The next day, the plates were washed 3 times and blocked with 200 μl of superblock at 4° C. overnight. On the third day, the plates were washed 3 times. Then, 50 µl of antibody in a 1:3 serial dilution in ELISA buffer starting at 10 µg/ml was added to each well of the plate, incubated at room temperature for 1 hour, then washed 3 times. 50 µl of 1:3000 diluted goat anti-mouse-HRP (Southern Biotech, 1030-05) was added to measure the parental mouse antibody. 50 µl of 1:3000 diluted goat anti-mouse-HRP (Jackson Immunologics, 109-036-098) was added to measure the chimeric antibody and the humanized antibody. ELISA plates were incubated at room temperature for 45 minutes, washed 3 times, then developed with ABTS at room temperature for 5 minutes. Thereafter, a plate reader was used to measure absorbance at 405 nm.

Фиг. 8А и 8В демонстрируют, что родительское антитело, генерируемое гибридомным или рекомбинантным способом, связывается с фосфорилированным пептидом (фиг. 8А), но не с нефосфорилированным пептидом (фиг. 8В). Аналогично химерные антитела (с каркасом IgG1 или IgG4) связываются с фосфорилированным пептидом (фиг. 8С), но не с нефосфорилированным пептидом (фиг. 8D).Fig. 8A and 8B demonstrate that the parental antibody generated by the hybridoma or recombinant method binds to the phosphorylated peptide (FIG. 8A) but not to the non-phosphorylated peptide (FIG. 8B). Similarly, chimeric antibodies (IgG1 or IgG4 backbone) bind to the phosphorylated peptide (FIG. 8C) but not to the non-phosphorylated peptide (FIG. 8D).

На фиг. 9А-9С показано, что большинство новых созданных вариантов гуманизированных антител связываются с фосфорилированным пептидом с аффинностью, сравнимой с химерным антителом IgG4, тогда как несколько вариантов теряют аффинность связывания с фосфорилированным пептидом. В частности, на фиг. 9В вариант huVL46/VHll N33D IgG4, который имитирует полное дезамидирование аминокислоты N33-D, имеет значительно сниженное связывание с фосфорилированным пептидом, что позволяет предположить, что полностью дезамидированное антитело значительно потеряет свою аффинность связывания с фосфорилированным тау-белком. Таким образом, снижение дезамидирования в N33 в вариантах гуманизированных антител является обязательным.In FIG. 9A-9C show that most of the newly generated humanized antibody variants bind to the phosphorylated peptide with comparable affinity to the chimeric IgG4 antibody, while several variants lose binding affinity to the phosphorylated peptide. In particular, in FIG. 9B, the huVL46/VHll N33D IgG4 variant, which mimics complete deamidation of the N33-D amino acid, has significantly reduced binding to the phosphorylated peptide, suggesting that a fully deamidated antibody will significantly lose its binding affinity to the phosphorylated tau protein. Thus, reducing deamidation at N33 in humanized antibody variants is mandatory.

Пример 11. Антигенсвязывающий анализ новых созданных вариантов гуманизированных антител в гомогенатах мозга пациентов с болезнью Альцгеймера.Example 11 Antigen-binding analysis of newly engineered humanized antibody variants in brain homogenates of Alzheimer's patients.

Родительское антитело мыши, химерное антитело и выбранные варианты гуманизированных антител оценивали в отношении их способности к связыванию с фосфорилированным тау-белком Ser413 (pSer413-Tau), полученным из клинических образцов в жидкой фазе пациентов с болезнью Альцгеймера (БА).The mouse parental antibody, the chimeric antibody, and selected humanized antibody variants were evaluated for their ability to bind to the phosphorylated Ser413 tau protein (pSer413-Tau) obtained from clinical specimens in the liquid phase of Alzheimer's disease (AD) patients.

Как показано на фиг. 10А-10Е, присутствие антител на pSer413-Tau определяли по разнице между общим и свободным связыванием антигена, выявляемым с использованием мышиного биотинилированного антитела IgG2a-Ta1505 после инкубации образцов мозга с БА с увеличением концентрации контрольного IgG человека (Sigma, кат. № 12511) и выбранных вариантов антител соответственно.As shown in FIG. 10A-10E, the presence of antibodies to pSer413-Tau was determined by the difference between total and free antigen binding detected using mouse biotinylated IgG2a-Ta1505 antibody after incubation of brain samples with AD with an increase in the concentration of control human IgG (Sigma cat. no. 12511) and selected antibody variants, respectively.

Выявление с помощью того же самого мышиного биотинилированного антитела IgG2a Ta1505 позволяет проводить прямое сравнение эффективности связывания между вариантами антител. Антитело IgG2a мыши Та1505 биотинилировали с использованием N-гидроксисукцинимид-LC-биотuна (NHS-LCбиотин) (Thermo Fisher Scientific K.K.) с последующим диализом с помощью PBS.Detection with the same mouse biotinylated IgG2a Ta1505 antibody allows direct comparison of binding efficiency between antibody variants. Mouse Ta1505 IgG2a antibody was biotinylated using N-hydroxysuccinimide-LC-biotin (NHS-LCbiotin) (Thermo Fisher Scientific K.K.) followed by dialysis with PBS.

Замороженную префронтальную ткань коры головного мозга (100 мг) из мозга пациента с БА добавляли к 1 мл TBS-I (трис-буферный солевой раствор, кат. № ВР2471-1, Thermo Fisher Scientific), соFrozen prefrontal cortex tissue (100 mg) from the brain of an AD patient was added to 1 ml of TBS-I (Tris buffered saline, cat. no. BP2471-1, Thermo Fisher Scientific), co

- 48 040482 держащего коктейль с ингибитором протеазы и фосфатазы (Thermo Fisher Scientific, кат. № 1861281), и лизировали в ледяной воде с использованием Qiagen Tissue Lyzer II. Гомогенизированный образец центрифугировали при 27000 g (ротор TLA-55) при 4°С в течение 20 мин в ультрацентрифуге Beckman Coulter Optima Max-ХР и супернатант собирали и дополнительно центрифугировали при 150000xg (ротор TLA-55) при 4°С в течение 20 мин в ультрацентрифуге Beckman Coulter Optima Мах-ХР для получения гранулы, называемой фракцией Р2. Фракцию Р2 повторно суспендировали в буфере для гомогенизации TBS-I с помощью ультразвука. Концентрацию белка во фракции Р2 определяли с использованием набора для анализа белка Pierce™ БСА (Thermo Fisher Scientific, кат. № 23225) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию белка доводили до 4 мкг/мл.- 48 040482 holding a protease-phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific cat. no. 1861281) and lysed in ice water using a Qiagen Tissue Lyzer II. The homogenized sample was centrifuged at 27,000 g (TLA-55 rotor) at 4°C for 20 min in a Beckman Coulter Optima Max-XP ultracentrifuge and the supernatant was collected and further centrifuged at 150,000xg (TLA-55 rotor) at 4°C for 20 min in a Beckman Coulter Optima Max-XP ultracentrifuge to obtain a granule called the P2 fraction. The P2 fraction was resuspended in TBS-I homogenization buffer by sonication. Protein concentration in the P2 fraction was determined using the Pierce™ BSA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 23225) according to the manufacturer's instructions. The protein concentration was adjusted to 4 μg/ml.

Набор INNOTEST® pTau (pT181) (Fijirebio Inc., кат. № 81581) использовали в качестве системы твердофазного ИФА для фосфорилированного белка Tau Ser413 (pSer413-Tau), но биотинилированное антитело, включенное в набор (обозначенное как CONJ1), было заменено на биотинилированные мышиные антитела к IgG2a Ta1505, как описано выше.The INNOTEST® pTau (pT181) kit (Fijirebio Inc. cat. no. 81581) was used as an ELISA system for phosphorylated Tau Ser413 protein (pSer413-Tau), but the biotinylated antibody included in the kit (designated CONJ1) was changed to biotinylated mouse antibodies to IgG2a Ta1505 as described above.

Родительское антитело мыши, химерное антитело, варианты гуманизированного антитела или контрольный IgG человека разводили до 200 нМ из исходного раствора в буфере для разбавителя образца (предоставлен набором INNOTEST®). Растворы антител затем серийно разбавляли и инкубировали с фракциями Р2 головного мозга с БА, предварительно разведенными в 1/1000 в аналитическом планшете, в течение 4 ч при комнатной температуре. Смесь антитело-антиген затем добавляли в планшет МТ с иммобилизованным антителом НТ7 (включенный в набор) вместе с разведенным биотинилированным антителом мыши Та1505 IgG2a (1/10 в CONJ DIL 1, предоставленном набором INNOTEST®). Полученный образец перемешивали и инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день планшет промывали и в планшет добавляли меченный HRP стрептавидин (включенный в набор как CONJ2) с последующей инкубацией в течение 1 ч. После промывки добавляли красящий реагент ТМВ с последующей инкубацией с защитой от света при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем реакцию останавливали с помощью раствора ограничителя реакции (включенного в набор в качестве раствора STOP) и измеряли оптическую плотность при длине волны, равной 450 нм.Mouse parental antibody, chimeric antibody, humanized antibody variants, or control human IgG were diluted to 200 nM from the stock solution in Sample Diluent Buffer (provided by the INNOTEST® kit). The antibody solutions were then serially diluted and incubated with BA brain P2 fractions previously diluted 1/1000 in the assay plate for 4 hours at room temperature. The antibody-antigen mixture was then added to the MT plate with immobilized HT7 antibody (included in the kit) along with diluted biotinylated mouse Ta1505 IgG2a antibody (1/10 in CONJ DIL 1 provided by the INNOTEST® kit). The resulting sample was stirred and incubated at 4°C overnight. The next day, the plate was washed and HRP labeled streptavidin (included in the kit as CONJ2) was added to the plate, followed by incubation for 1 hour. After washing, TMB staining reagent was added, followed by incubation with light protection at room temperature for 30 minutes. The reaction was then stopped with a reaction limiter solution (included in the kit as a STOP solution) and the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm.

Нелинейный анализ кривой концентрация-ответ, показанный на фиг. 10А-10Е, позволяет определить концентрацию каждого антитела, необходимую для 50% занятости Tau pSer413 в гомогенатах мозга с БА, а также процент максимального уровня занятости для каждого антитела. На фиг. 10А-10Е продемонстрированы сопоставимые характеристики связывания, включая уровень занятости in vitro и максимальное связывание тау-антигена pSer413, для родительского антитела мыши, химерного антитела и выбранных вариантов гуманизированных антител в гомогенатах мозга пациентов с БА.The non-linear analysis of the concentration-response curve shown in FIG. 10A-10E allows determination of the concentration of each antibody required for 50% Tau pSer413 occupancy in AD brain homogenates, as well as the percentage of maximum occupancy for each antibody. In FIG. 10A-10E show comparable binding characteristics, including in vitro occupancy rate and maximum binding of the pSer413 tau antigen, for mouse parental antibody, chimeric antibody, and selected humanized antibody variants in AD patient brain homogenates.

Пример 12. Анализ стабильности и чистоты новых созданных вариантов гуманизированных антител.Example 12 Analysis of Stability and Purity of Newly Generated Humanized Antibody Variants.

Стабильность различных антител определяли путем измерения температуры плавления (Tm1) и температуры агрегации (Tagg) с помощью нано-DSF. Чистоту каждого антитела измеряли с помощью SEC и невосстанавливающего капиллярного SDS (NR-cSDS).The stability of various antibodies was determined by measuring the melting temperature (Tm1) and aggregation temperature (Tagg) using nano-DSF. The purity of each antibody was measured by SEC and non-reducing capillary SDS (NR-cSDS).

Определение Тт и Tagg. Tm и Tagg определяли с помощью нано-DSF с использованием дифференциального сканирующего флуориметра Prometheus NT.48 (Nanotemper Technologies), управляемого программным обеспечением PR.ThermControl v2.0.4. Мощность возбуждения составляла 40%, а температура повышалась с 20 до 95°С со скоростью 1°С/мин. Tm и Tagg были автоматически измерены. Образцы готовили посредством разбавления до 1 мг/мл в 20 мМ ацетате натрия, pH 5,5, буфере и всасывали капиллярным способом в стеклянный капилляр Prometheus (PR-L002).Definition of Tm and Tagg. Tm and Tagg were determined using nano-DSF using a Prometheus NT.48 differential scanning fluorometer (Nanotemper Technologies) controlled by PR.ThermControl v2.0.4 software. The excitation power was 40%, and the temperature was increased from 20 to 95°C at a rate of 1°C/min. Tm and Tagg were automatically measured. Samples were prepared by diluting to 1 mg/mL in 20 mM sodium acetate, pH 5.5 buffer and aspirating into a Prometheus glass capillary (PR-L002).

Определение чистоты посредством SEC: SEC проводили на системе ACQUITY UPLC Н-класса. Используемая колонка представляла собой колонку ACQUITY UPLC Protein ВЕН SEC (№ партии 186005225, 1,7 мкм, 200А, 4,6x150 мм) от Waters (Милфорд, штат Массачусетс). Температура колонки составляла 25°С, и образец 10 мкл вводили при 1 мг/мл, используя системную скорость потока, равную 0,5 мл/мин. Подвижная фаза представляла собой 100 мМ фосфата натрия, 200 мМ хлорида натрия и 0,02% азида натрия, pH 7,0. Данные были определены количественно при 214 и 280 нм и проанализированы с использованием программного обеспечения Empower 3. Белковую стандартную смесь ВЕН200 SEC (№ партии 186006518) от Waters (Милфорд, штат Массачусетс) вводили в дозе 10 мкг и измеряли разрешение USP, теоретические значения и хвосты.Purity determination by SEC: SEC was performed on an H-class ACQUITY UPLC system. The column used was an ACQUITY UPLC Protein BEN SEC column (lot no. 186005225, 1.7 µm, 200A, 4.6x150 mm) from Waters (Milford, MA). The column temperature was 25° C. and a 10 μl sample was injected at 1 mg/ml using a system flow rate of 0.5 ml/min. The mobile phase was 100 mM sodium phosphate, 200 mM sodium chloride and 0.02% sodium azide, pH 7.0. Data were quantified at 214 and 280 nm and analyzed using Empower 3 software. BEN200 SEC protein standard mix (lot no. 186006518) from Waters (Milford, Massachusetts) was dosed at 10 µg and USP resolution, theoretical values, and tails were measured. .

Определение чистоты посредством NR-cSDS. Для оценки чистоты посредством NR-cSDS 5 мкл каждого образца в концентрации 1 мг/мл смешивали в 96-луночном планшете с 35 мкл буфера для загрузки (буфер для образцов НТ Protein Express (Perkin Elmer)), содержащего 50 мМ йодацетамида. Планшет инкубировали при 70°С в течение 20 мин и в каждую лунку добавляли 75 мкл воды. Каждый образец анализировали в системе LabChip GXII (Perkin Elmer) с использованием экспрессионного чипа НТ Protein (Perkin Elmer). Электроферограммы получали путем измерения флуоресценции образца в динамике по времени и интегрировали с использованием программного обеспечения LabChip GX V4.1.1619.0 SP1 (Perkin Elmer).Determination of purity by NR-cSDS. For purity evaluation by NR-cSDS, 5 µl of each sample at 1 mg/ml was mixed in a 96-well plate with 35 µl of loading buffer (HT Protein Express Sample Buffer (Perkin Elmer)) containing 50 mM iodoacetamide. The plate was incubated at 70° C. for 20 min and 75 μl of water was added to each well. Each sample was analyzed on a LabChip GXII system (Perkin Elmer) using an HT Protein expression chip (Perkin Elmer). Electropherograms were obtained by measuring sample fluorescence over time and integrated using LabChip GX V4.1.1619.0 SP1 software (Perkin Elmer).

В табл. 14 представлена стабильность и чистота исследуемых антител.In table. 14 shows the stability and purity of the tested antibodies.

- 49 040482- 49 040482

Таблица 14Table 14

Стабильность и чистота различных антител_______________Stability and purity of various antibodies _______________

Стабильность ЧистотаStability Purity

Tml tml Tagg tagg % чистоты по SEC % Purity by SEC % чистоты по NR-cSDS % Purity by NR-cSDS мс IgG2a ms IgG2a 65, 0 65.0 н/д n/a 99, 1 99.1 100 100 хим. IgGl chem. IgGl н/д n/a н/д n/a 96, 2 96.2 н/д n/a хим. IgG4 chem. IgG4 н/д n/a н/д n/a 95, 3 95.3 н/д n/a hu VL46/VH11 IgGl hu VL46/VH11 IgGl 68,5 68.5 69, 5 69.5 99, 0 99.0 100 100 hu VL46/VH11 IgG4 (эт.) hu VL46/VH11 IgG4 (fl.) 66, 8 66, 8 66, 0 66.0 98,4 98.4 100 100 hu VL46/VH11 G34A IgGl hu VL46/VH11 G34A IgGl 65, 9 65.9 66, 2 66.2 100 100 100 100 hu VL46/VH11 G34A IgG4 hu VL46/VH11 G34A IgG4 64, 0 64.0 63, 8 63, 8 100 100 98,0 98.0 hu VL46/VH11 G34A IgG4 hu VL46/VH11 G34A IgG4 65, 3 65, 3 66, 6 66.6 100 100 100 100 hu VL46/VH11 G34S IgG4 hu VL46/VH11 G34S IgG4 н/д n/a н/д n/a н/д n/a 100, 0 100.0 hu VL46/VH11 G34T IgG4 hu VL46/VH11 G34T IgG4 65, 8 65.8 66, 5 66.5 н/д n/a 99, 3 99.3 hu VL46/VH11 N33Q IgG4 hu VL46/VH11 N33Q IgG4 65, 2 65.2 67,1 67.1 99, 6 99.6 100 100 hu VL46/VH11 N33Q G34A IgG4 hu VL46/VH11 N33Q G34A IgG4 н/д n/a н/д n/a н/д n/a 100 100 hu VL46/VH11 N33D IgG4 hu VL46/VH11 N33D IgG4 н/д n/a н/д n/a н/д n/a 100 100 hu VL46/VH11 N33S IgG4 hu VL46/VH11 N33S IgG4 н/д n/a н/д n/a н/д n/a 99, 8 99.8 hu VL46/VH11 N33T IgG4 hu VL46/VH11 N33T IgG4 н/д n/a н/д n/a н/д n/a 100 100 hu VL46/VH11 A64D IgG4 hu VL46/VH11 A64D IgG4 н/д n/a н/д n/a н/д n/a 100 100 hu VL46/VH11 S28N IgG4 hu VL46/VH11 S28N IgG4 68, 1 68.1 67,8 67.8 99, 6 99.6 100 100 hu VL47/VH65 IgGl hu VL47/VH65 IgGl 59, 6 59.6 60,2 60.2 99, 9 99.9 100 100 hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl 65, 5 65.5 66, 7 66, 7 100 100 97,0 97.0 hu VL46/VH11 G34A S28N IgG4 hu VL46/VH11 G34A S28N IgG4 63, 8 63, 8 65, 0 65.0 100 100 97,0 97.0

Все новые созданные варианты гуманизированных антител сохраняли или улучшали стабильность и чистоту по сравнению с родительским антителом мыши или химерными антителами. Один из исходных гуманизированных вариантов huVL47/VH65 _IgG1 отличался сниженной стабильностью, измеренной с помощью Tm1/Tagg.All of the newly created humanized antibody variants retained or improved stability and purity compared to the mouse parental antibody or chimeric antibodies. One of the original humanized huVL47/VH65 _IgG1 variants had reduced stability as measured by Tm1/Tagg.

Пример 13. Анализ дезамидирования новых созданных вариантов гуманизированных антител.Example 13 Deamidation Assay of Newly Generated Humanized Antibody Variants.

Определяли уровень дезамидирования аминокислоты N33 в CDR1 легкой цепи различных антител.The level of deamidation of amino acid N33 in the light chain CDR1 of various antibodies was determined.

- 50 040482- 50 040482

Исследовали стрессовые условия, такие как инкубация при 50°С или pH 10. Инкубацию при 4°С проводили в качестве контроля.Investigated stressful conditions such as incubation at 50°C or pH 10. Incubation at 4°C was performed as a control.

Инкубация при 4 и 50°С. Образцы, приготовленные в 20 мМ ацетате натрия, pH 5,5, при 2 мг/мл, выдерживали при 50°С в камере с контролируемой температурой стабильности в течение одной недели.Incubation at 4 and 50°C. Samples prepared in 20 mM sodium acetate, pH 5.5, at 2 mg/mL were kept at 50° C. in a temperature controlled stability chamber for one week.

Образцы хранили при 4°С для контроля 4°С в целях сравнения.Samples were stored at 4°C to control 4°C for comparison purposes.

Инкубация при pH 10. Образцы, приготовленные в 20 мМ ацетате натрия, pH 5,5, при 2 мг/мл, доводили до pH 10 с использованием 0,5 М NaOH и выдерживали при 25°C в течение 1 недели в климатической камере с контролируемой температурой. После этого проводили замену буфера образцов на 20 мМ ацетат натрия, pH 5,5, с использованием обессоливающих колонок Zeba Spin (7К MWCO, Thermo Fisher 2 мл, 89890).Incubation at pH 10 Samples prepared in 20 mM sodium acetate, pH 5.5 at 2 mg/mL were adjusted to pH 10 using 0.5 M NaOH and maintained at 25° C. for 1 week in a climate chamber with controlled temperature. Thereafter, the sample buffer was changed to 20 mM sodium acetate, pH 5.5 using Zeba Spin desalting columns (7K MWCO, Thermo Fisher 2 ml, 89890).

Анализ дезамидирования с помощью пептидного картирования. Для картирования пептидов с помощью масс-спектрометрии 100 мкг каждого образца денатурировали с помощью 30 мкл 8 М раствора гуанидина/1 М трис гидрохлорида (15:1), восстанавливали с помощью 2 мкл 1 М DTT в течение 30 мин при 60°С и алкилировали с 5 мкл 1 М йодацетамида в течение 45 мин в темноте. Перед расщеплением проводили замену буфера образцов на 50 мМ бикарбонат аммония, используя картриджи ZEBA с молекулярной массой 7 килодальтон. Образцы распределяли по разным пробиркам и обрабатывали ферментом параллельно с 2 мкг трипсина и химотрипсина в течение 2 ч при 37°С. Ферментация была остановлена посредством добавления 3 мкл 5 М гидрохлорида к каждому образцу. 2 мкл Образца впрыскивали в 1x50 мм колонку Waters UPLC с пептидом ВЕН-С18 (часть № 186005592), поддерживаемую при 40°С. Данные были получены в Dionex/QE plus MS с использованием линейного градиента в течение 50 мин от 2 до 36% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте. Образцы были проанализированы с использованием PEAKS DB (Bioinformatics Solutions Inc.) для поиска в базе данных, а также PepFinder (Thermo Fisher Scientific) и ручной проверки для оценки процентного изменения. В табл. 15 приведен процент дезамидирования аминокислоты N33 в CDR1 легкой цепи исследуемых антител.Deamidation analysis by peptide mapping. For peptide mapping by mass spectrometry, 100 µg of each sample was denatured with 30 µl of 8 M guanidine/1 M Tris hydrochloride solution (15:1), reduced with 2 µl of 1 M DTT for 30 min at 60°C, and alkylated with 5 µl of 1 M iodoacetamide for 45 min in the dark. Prior to digestion, sample buffer was exchanged with 50 mM ammonium bicarbonate using 7 kilodalton ZEBA cartridges. The samples were divided into different tubes and treated with the enzyme in parallel with 2 μg of trypsin and chymotrypsin for 2 h at 37°C. Fermentation was stopped by adding 3 μl of 5 M hydrochloride to each sample. 2 μl of Sample was injected into a 1x50 mm Waters UPLC column with BEN-C18 peptide (part # 186005592) maintained at 40°C. Data were acquired in Dionex/QE plus MS using a 50 min linear gradient from 2% to 36% acetonitrile in 0.1% formic acid. Samples were analyzed using PEAKS DB (Bioinformatics Solutions Inc.) to search the database, as well as PepFinder (Thermo Fisher Scientific) and manual check to estimate percent change. In table. 15 shows the percentage of deamidation of amino acid N33 in the light chain CDR1 of the tested antibodies.

Таблица 15Table 15

Процент дезамидирования N33 в CDR1 легкой цепи при различных условияхPercent deamidation of N33 in light chain CDR1 under various conditions

Контроль 4 °C Control 4 °C 50°C 50°C pH 10 pH 10 мс IgG2a ms IgG2a 41,1 41.1 36, 9 36.9 31,7 31.7 hu VL46/VH11 IgGl hu VL46/VH11 IgGl 33, 0 33.0 33, 9 33, 9 31,8 31.8 hu VL46/VH11 IgG4 hu VL46/VH11 IgG4 32,0 32.0 31,0 31.0 37,9 37.9 hu VL46/VH11 G34A IgG4 hu VL46/VH11 G34A IgG4 <1% <1% н/д n/a <1% <1% hu VL46/VH11 G34T IgG4 hu VL46/VH11 G34T IgG4 <1% <1% н/д n/a <1% <1% hu VL46/VH11 N33Q IgG4 hu VL46/VH11 N33Q IgG4 <1% <1% н/д n/a <1% <1% hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl hu VL46/VH11 G34A S28N IgGl <1% <1% 1,2 1.2 1% 1% hu VL46/VH11 G34A S28N IgG4 hu VL46/VH11 G34A S28N IgG4 <1% <1% 2,1 2.1 1% 1%

По сравнению с родительским антителом мыши и исходным гуманизированным вариантным антителом IgGl или IgG4 (VL4 6/VH11) новые созданные варианты гуманизированного антитела демонстрируют значительное снижение уровня дезамидирования N33 в CDR1 легкой цепи.Compared to the parent mouse antibody and the original humanized IgGl or IgG4 variant antibody (VL46/VH11), the newly engineered humanized antibody variants show a significant reduction in the level of N33 deamidation in the light chain CDR1.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Антитело против pSer413 тау, содержащее1. An antibody against pSer413 tau containing

а) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 116; иa) heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 116; And

b) вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 103.b) a light chain variable domain selected from SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 , SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, and SEQ ID NO: 103.

2. Антитело против pSer413 тау, содержащее2. An antibody against pSer413 tau containing

а) вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 117; иa) heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 117; And

Ь) вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 103.b) a light chain variable domain selected from SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 , SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, and SEQ ID NO: 103.

3. Антитело против pSer413, содержащее3. Antibody against pSer413 containing

а) вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 116; иa) a heavy chain variable domain selected from SEQ ID NO: 116; And

b) вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 103, где отношение связывания антитела с фосфорилированным пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 8 к связыванию антитела с нефосфорилированным пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 69 равно по меньшей мере около 40.b) a light chain variable domain selected from SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 , SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, and SEQ ID NO: 103, wherein the ratio of antibody binding to a phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 8 to antibody binding to a non-phosphorylated a peptide of SEQ ID NO: 69 is at least about 40.

-51 040482-51 040482

4. Антитело против pSer413, содержащее4. Antibody against pSer413 containing

b) вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105,b) a light chain variable domain selected from SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105,

SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111,SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111,

SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 103, где отношение связывания антитела с фосфорилированным пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 8 к связыванию антитела с нефосфорилированным пептидом с последовательностью SEQ ID NO: 69 равно по меньшей мере около 40.SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, and SEQ ID NO: 103, wherein the ratio of antibody binding to a phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 8 to antibody binding to a non-phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 69 is at least about 40.

5. Антитело против pSer413 тау по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело содержит константный домен тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 143.5. An anti-pSer413 tau antibody according to any one of the preceding claims, wherein said antibody comprises a heavy chain constant domain selected from SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO : 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 and SEQ ID NO: 143.

6. Антитело против pSer413 тау по любому из предыдущих пунктов, где указанное антитело содержит константный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 80.6. An anti-pSer413 tau antibody according to any of the preceding claims, wherein said antibody comprises a light chain constant domain selected from SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 80.

7. Антитело против pSer413 тау по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 114 и указанный вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 116.7. An anti-pSer413 tau antibody according to any one of the preceding claims, wherein said light chain variable domain is SEQ ID NO: 114 and said heavy chain variable domain is SEQ ID NO: 116.

8. Антитело против pSer413 тау по любому из предыдущих пунктов, где легкая цепь указанного ан титела имеет SEQ ID NO: 184, а тяжелая цепь указанного антитела имеет SEQ ID NO: 144.8. An anti-pSer413 tau antibody according to any one of the preceding claims, wherein said antibody's light chain is SEQ ID NO: 184 and said antibody's heavy chain is SEQ ID NO: 144.

9. Антитело против pSer413 тау по любому из предыдущих пунктов, где указанная легкая цепь име ет SEQ ID NO: 184, а тяжелая цепь указанного антитела имеет SEQ ID NO: 152.9. An anti-pSer413 tau antibody according to any one of the preceding claims, wherein said light chain is SEQ ID NO: 184 and said antibody heavy chain is SEQ ID NO: 152.

10. Антитело против pSer413 тау по любому из предыдущих пунктов, где указанная тяжелая цепь и указанная легкая цепь выбраны из пар10. An anti-pSer413 tau antibody according to any one of the preceding paragraphs, wherein said heavy chain and said light chain are selected from pairs

LC SEQ ID NO: 184 иLC SEQ ID NO: 184 and

LC SEQ ID NO: 185 иLC SEQ ID NO: 185 and

НС SEQ ID NO: 144;HC SEQ ID NO: 144;

НС SEQ ID NO: 145;HC SEQ ID NO: 145;

НС SEQ ID NO: 146;HC SEQ ID NO: 146;

НС SEQ ID NO: 147;HC SEQ ID NO: 147;

НС SEQ ID NO: 148;HC SEQ ID NO: 148;

НС SEQ ID NO: 149;HC SEQ ID NO: 149;

НС SEQ ID NO: 150;HC SEQ ID NO: 150;

НС SEQ ID NO: 151;HC SEQ ID NO: 151;

НС SEQ ID NO: 152;HC SEQ ID NO: 152;

НС SEQ ID NO: 153;HC SEQ ID NO: 153;

НС SEQ ID NO: 154;HC SEQ ID NO: 154;

НС SEQ ID NO: 155;HC SEQ ID NO: 155;

НС SEQ ID NO: 156;HC SEQ ID NO: 156;

НС SEQ ID NO: 157;HC SEQ ID NO: 157;

НС SEQ ID NO: 158;HC SEQ ID NO: 158;

НС SEQ ID NO: 159;HC SEQ ID NO: 159;

НС SEQ ID NO: 160;HC SEQ ID NO: 160;

НС SEQ ID NO: 161;HC SEQ ID NO: 161;

НС SEQ ID NO: 144;HC SEQ ID NO: 144;

НС SEQ ID NO: 145;HC SEQ ID NO: 145;

НС SEQ ID NO: 146;HC SEQ ID NO: 146;

НС SEQ ID NO: 147;HC SEQ ID NO: 147;

НС SEQ ID NO: 148;HC SEQ ID NO: 148;

НС SEQ ID NO: 149;HC SEQ ID NO: 149;

НС SEQ ID NO: 150;HC SEQ ID NO: 150;

НС SEQ ID NO: 151;HC SEQ ID NO: 151;

НС SEQ ID NO: 152;HC SEQ ID NO: 152;

НС SEQ ID NO: 153;HC SEQ ID NO: 153;

НС SEQ ID NO: 154;HC SEQ ID NO: 154;

НС SEQ ID NO: 155;HC SEQ ID NO: 155;

НС SEQ ID NO: 156;HC SEQ ID NO: 156;

НС SEQ ID NO: 157;HC SEQ ID NO: 157;

НС SEQ ID NO: 158;HC SEQ ID NO: 158;

НС SEQ ID NO: 159;HC SEQ ID NO: 159;

НС SEQ ID NO: 160; иHC SEQ ID NO: 160; And

НС SEQ ID NO: 161.HC SEQ ID NO: 161.

11. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь антитела по любому из предшест вующих пунктов.11. A nucleic acid molecule encoding an antibody light chain according to any one of the preceding claims.

12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь антитела по любому из предшествующих пунктов.12. Nucleic acid molecule encoding the heavy chain of an antibody according to any one of the preceding claims.

- 52 040482- 52 040482

13. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.11.13. An expression vector containing the nucleic acid molecule according to claim 11.

14. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.12.14. An expression vector containing the nucleic acid molecule according to claim 12.

15. Клетка-хозяин для получения антитела, содержащая вектор экспрессии по пп.13 и 14.15. Host cell for producing antibodies, containing the expression vector according to claims 13 and 14.

16. Способ получения антитела против pSer413 тау, включающий культивирование указанной клетки-хозяина по п.15 в условиях, в которых происходит экспрессия указанного антитела, и выделение указанного антитела.16. A method for producing an anti-pSer413 tau antibody, comprising culturing said host cell according to claim 15 under conditions under which said antibody is expressed and isolating said antibody.

17. Применение антитела против pSer413 тау по любому из пп.1-10 для получения лекарственного средства, подходящего для лечения таупатии у пациента.17. Use of an anti-tau pSer413 antibody according to any one of claims 1 to 10 for the preparation of a medicament suitable for the treatment of tauopathy in a patient.

18. Применение по п.17, где таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера, кортикобазальную дегенерацию, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, аргирофильную зернистую деменцию (аргирофильную зернистую болезнь), множественную системную таупатию с пресенильной деменцией (MSTD), лобно-височную деменцию и паркинсонизм, сцепленные с хромосомой 17 (FTDP-17), деменцию с нейрофибриллярными клубками, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией (DNTC), таупатию белого вещества с глобулярными глиальными включениями (WMT-GGI) или лобновисочную лобарную дегенерацию с патологией тау (FTLD-тау), последствия энцефалита Экономо, подострый склерозирующий панэнцефалит и энцефалопатию боксеров.18. The use of claim 17 wherein the tauopathy is Alzheimer's disease, corticobasal degeneration, progressive supranuclear palsy, Pick's disease, argyrophilic granular dementia (argyrophilic granular disease), multiple systemic tauopathy with presenile dementia (MSTD), frontotemporal dementia, and parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17), dementia with neurofibrillary tangles, diffuse neurofibrillary tangles with calcification (DNTC), white matter tauopathy with globular glial inclusions (WMT-GGI), or frontotemporal lobar degeneration with tau pathology (FTLD-tau), consequences of Economo's encephalitis, subacute sclerosing panencephalitis and boxer's encephalopathy.