EA040348B1 - PHARMACEUTICAL COMBINATION AND METHOD FOR TREATMENT OR PREVENTION OF DIABETES MELLITUS - Google Patents

Description

Область техникиTechnical field

Данное изобретение относится к комбинации для лечения или предупреждения сахарного диабета, содержащей конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат двойного агониста GLP-1 (глюкагоноподобный пептид-1)/глюкагона длительного действия, и к способу предупреждения или лечения сахарного диабета, включающему введение указанной комбинации.The present invention relates to a combination for the treatment or prevention of diabetes mellitus, comprising a long-acting insulin conjugate and a long-acting GLP-1 (glucagon-like peptide-1)/glucagon dual agonist conjugate, and to a method for the prevention or treatment of diabetes mellitus, comprising administering said combination.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Инсулин представляет собой пептид, секретируемый бета-клетками поджелудочной железы, который играет важную роль в регуляции уровня сахара крови в организме. Сахарный диабет представляет собой метаболическое заболевание, при котором секреция инсулина недостаточна или он не выполняет свои нормальные функции, что приводит к повышению уровней глюкозы крови. При диабете 2 типа инсулин не секретируется должным образом или секретируемый инсулин не подвергается нормальному процессингу в организме и уровни глюкозы в крови не контролируются, вследствие чего происходит их повышение. Диабет 2 типа обычно лечат с помощью гипогликемических агентов, содержащих в качестве активного ингредиента химическое вещество, а некоторых пациентов лечат путем введения инсулина. Напротив, при диабете 1 типа введение инсулина является необходимым.Insulin is a peptide secreted by the beta cells of the pancreas that plays an important role in regulating blood sugar levels in the body. Diabetes mellitus is a metabolic disease in which insulin secretion is insufficient or does not perform its normal functions, resulting in elevated blood glucose levels. In type 2 diabetes, insulin is not secreted properly or secreted insulin is not processed normally in the body and blood glucose levels are not controlled, resulting in an increase. Type 2 diabetes is usually treated with hypoglycemic agents containing a chemical as the active ingredient, and some patients are treated with insulin. In contrast, in type 1 diabetes, insulin administration is necessary.

Инсулинотерапия, которая широко применяется в настоящее время, представляет собой способ, при котором инсулин вводят путем инъекции до и после приема пищи. В настоящее время инсулин выпускают в виде инъекций и главным образом вводят путем подкожной инъекции, при этом способ введения отличается в зависимости от продолжительности действия. Введение инсулина обеспечивает более быстрый гипогликемический эффект, чем прием лекарств, и может безопасно применяться даже в условиях, когда лекарства недоступны. Кроме того, нет ограничения размера дозы, однако введение инсулина необходимо осуществлять три раза в сутки. Таким образом, существуют такие недостатки, как страх пациента перед иглами, неудобство введения, симптомы гипогликемии и набор лишнего веса вследствие введения инсулина на протяжении длительного времени. Набор лишнего веса повышает риск сердечнососудистых заболеваний, что может привести к побочному эффекту, заключающемуся в сниженной функции контроля глюкозы крови.Insulin therapy, which is widely used at present, is a method in which insulin is administered by injection before and after a meal. At present, insulin is produced as an injection and is mainly administered by subcutaneous injection, with the method of administration differing depending on the duration of action. Insulin administration provides a more rapid hypoglycemic effect than drug administration and can be used safely even in settings where drugs are not available. In addition, there is no limitation on the size of the dose, however, the administration of insulin must be carried out three times a day. Thus, there are disadvantages such as patient fear of needles, inconvenience of insertion, symptoms of hypoglycemia, and weight gain due to long-term insulin administration. Gaining excess weight increases the risk of cardiovascular disease, which can lead to the side effect of reduced blood glucose control.

Двойной агонист, способный связываться с рецепторами двух пептидов, GLP-1 и глюкагона, в настоящее время изучается как механизм одновременного лечения и диабета, и ожирения. Двойной агонист GLP-1 и глюкагона снижает потребление пищи, как GLP-1, обеспечивает чувство насыщения, обладает липолитической функцией, как глюкагон, способствует снижению уровня сахара крови и демонстрирует высокую эффективность в отношении снижения массы тела, и, таким образом, высока возможность его применения в качестве нового терапевтического агента.A dual agonist capable of binding to two peptide receptors, GLP-1 and glucagon, is currently being studied as a mechanism for the simultaneous treatment of both diabetes and obesity. The dual agonist of GLP-1 and glucagon reduces food intake like GLP-1, provides a feeling of satiety, has a lipolytic function like glucagon, promotes blood sugar lowering, and shows high efficacy in reducing body weight, and thus the possibility of its use as a new therapeutic agent.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что инсулин и двойной агонист неудобны в связи с необходимостью ежедневного введения пациенту из-за короткого периода полувыведения, и для решения указанных проблем, предложили в качестве способа поддержания активности белкового препарата и в то же время достижения повышенной стабильности, белковый конъюгат длительного действия, в котором обычный физиологически активный полипептид и Fc-область иммуноглобулина ковалентно связаны друг с другом посредством непептидильного полимерного линкера (патент Кореи №10-0725315). В частности, авторы изобретения подтвердили, что устойчивость эффектов in vivo как конъюгата инсулина длительного действия, так и конъюгата двойного агониста длительного действия значительно повышается (патент Кореи № 10-1058290, заявка на патент Кореи № 10-2014-0022909 и заявка на патент Кореи № 10-2012-0139579).The inventors of the present invention have found that insulin and a dual agonist are inconvenient due to the need for daily administration to a patient due to the short half-life, and to solve these problems, proposed as a way to maintain the activity of a protein drug and at the same time achieve increased stability, a protein conjugate long-acting, in which a normal physiologically active polypeptide and the Fc region of an immunoglobulin are covalently linked to each other through a non-peptidyl polymeric linker (Korean Patent No. 10-0725315). In particular, the inventors confirmed that the persistence of the in vivo effects of both the long-acting insulin conjugate and the long-acting dual agonist conjugate is significantly enhanced (Korean Patent No. 10-1058290, Korean Patent Application No. 10-2014-0022909, and Korean Patent Application No. 10-2012-0139579).

Однако, такие побочные эффекты, как набор лишнего веса при введении двойного агониста GLP1/глюкагона, представляют проблему. Таким образом, по-прежнему сохраняется необходимость в разработке терапевтического агента для лечения диабета, вызывающего меньше побочных эффектов, который можно вводить реже и в меньшей дозировке.However, side effects such as weight gain with dual GLP1/glucagon agonist administration are problematic. Thus, there continues to be a need to develop a therapeutic agent for diabetes that causes fewer side effects, which can be administered less frequently and at a lower dosage.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Техническая задачаTechnical task

Авторы изобретения приложили множество усилий для разработки терапевтического агента для диабета, который может снижать высокие уровни глюкозы крови, подавлять набор лишнего веса и снижать риск гипогликемии, что требуется для лечения диабета. В результате авторы данного изобретения попробовали комбинированное введение, при котором одновременно вводят инсулин и двойной агонист рецепторов GLP-1/глюкагона и конкретно обнаружили, что комбинированное введение инсулина длительного действия и GLP-1/глюкагона длительного действия может максимизировать соблюдение пациентом схемы лечения, уменьшить дозу лекарственного средства инсулина, снизить риск гипогликемии и помогает снизить уровень глюкозы в крови и массу тела, и таким образом, пришли к данному изобретению.The inventors have made many efforts to develop a therapeutic agent for diabetes, which can reduce high blood glucose levels, suppress weight gain and reduce the risk of hypoglycemia, which is required for the treatment of diabetes. As a result, the inventors of the present invention tried a combined administration in which insulin and a dual GLP-1/glucagon receptor agonist are administered simultaneously, and specifically found that the combined administration of long-acting insulin and long-acting GLP-1/glucagon can maximize patient compliance, reduce the dose the drug insulin, reduce the risk of hypoglycemia, and help reduce blood glucose and body weight, and thus came to the present invention.

Техническое решениеTechnical solution

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая комбинация для лечения или предупреждения сахарного диабета, содержащая конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат двойного агониста GLP-1(глюкагон-подобный пептид-1)/глюкагона длительного действия, где конъюгат инсулина длительного действия представляет собой конъюгат, в котором инсулин связан с Fc-областьюThe present invention provides a pharmaceutical combination for the treatment or prevention of diabetes mellitus comprising a long acting insulin conjugate and a long acting GLP-1(glucagon-like peptide-1)/glucagon dual agonist conjugate, wherein the long acting insulin conjugate is a conjugate wherein the insulin associated with the Fc region

- 1 040348 иммуноглобулина посредством непептидильного полимера; где конъюгат двойного агониста GLP1/глюкагона длительного действия представляет собой конъюгат, в котором двойной агонист GLP1/глюкагона связан с Fc-областью иммуноглобулина посредством непептидильного полимера, где инсулин представляет собой аналог инсулина, в котором аминокислота в положении 14 А-цепи (SEQ ID N0 37) инсулина заменена глутаминовой кислотой; и где двойной агонист GLP-1/глюкагона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 40, 63 и 64, и одновременно активирует рецептор GLP-1 и рецептор глюкагона.- 1 040348 immunoglobulin via non-peptidyl polymer; wherein the long-acting GLP1/glucagon dual agonist/glucagon conjugate is a conjugate wherein the GLP1/glucagon dual agonist is linked to the Fc region of an immunoglobulin via a non-peptidyl polymer, wherein insulin is an analog of insulin in which the amino acid at position 14 of the A chain (SEQ ID N0 37) insulin replaced by glutamic acid; and wherein the GLP-1/glucagon dual agonist comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 40, 63 and 64 and simultaneously activates the GLP-1 receptor and the glucagon receptor.

В одном воплощении настоящего изобретения указанная комбинация дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.In one embodiment of the present invention, said combination further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

В другом воплощении настоящего изобретения двойной агонист рецепторов глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1)/глюкагона длительного действия в комбинации по изобретению имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.40, а аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо.In another embodiment of the present invention, the long acting glucagon-like peptide-1 (GLP-1)/glucagon dual agonist in the combination of the invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO.40 and the amino acids at positions 16 and 20 form a ring.

В еще одном воплощении настоящего изобретения непептидильный полимер в комбинации по изобретению выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации.In another embodiment of the present invention, the non-peptidyl polymer in the combination of the invention is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid and their combinations.

Согласно еще одному воплощению Fc-область иммуноглобулина в комбинации по изобретению является агликозилированной.According to another embodiment, the Fc region of the immunoglobulin in the combination of the invention is aglycosylated.

В другом воплощении настоящего изобретения Fc-область иммуноглобулина в комбинации по изобретению содержит от одного до четырех участков, выбранных из группы, состоящей из доменов CH1, CH2, СН3 и СН4; и возможно Fc-область иммуноглобулина дополнительно содержит шарнирный участок.In another embodiment of the present invention, the Fc region of an immunoglobulin in the combination of the invention comprises one to four regions selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3, and CH4 domains; and possibly the immunoglobulin Fc region further comprises a hinge region.

В предпочтительном воплощении Fc-область иммуноглобулина в указанной комбинации представляет собой Fc-область, имеющую происхождение из IgG, IgA, IgD, IgE или IgM; и возможно каждый из доменов Fc-области иммуноглобулина представляет собой гибрид доменов, имеющих разное происхождение, выбранное из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.In a preferred embodiment, the Fc region of the immunoglobulin in said combination is an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM; and possibly each of the immunoglobulin Fc region domains is a hybrid of domains of different origin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.

В предпочтительном воплощении Fc-область иммуноглобулина в указанной комбинации представляет собой димер или мультимер, состоящий из одноцепочечных полипептидов, состоящих из доменов, имеющих одинаковое происхождение.In a preferred embodiment, the Fc region of the immunoglobulin in said combination is a dimer or multimer consisting of single chain polypeptides composed of domains having the same origin.

Согласно еще одному воплощению настоящего изобретения, непептидильный полимерный линкер в комбинации по настоящему изобретению представляет собой PEG (полиэтиленгликоль).According to another embodiment of the present invention, the non-peptidyl polymeric linker in the combination of the present invention is PEG (polyethylene glycol).

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен способ предупреждения или лечения диабета, включающий введение комбинации, как определено выше, субъекту, подверженному высокому риску сахарного диабета или страдающему сахарным диабетом.In addition, the present invention provides a method for preventing or treating diabetes, comprising administering a combination as defined above to a subject at high risk of diabetes mellitus or suffering from diabetes mellitus.

В одном воплощении стадию введения в указанном способе осуществляют путем комбинированного введения конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия.In one embodiment, the administration step of said method is carried out by the combined administration of a long acting insulin conjugate and a long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate.

В предпочтительном воплощении указанное комбинированное введение осуществляют путем одновременного, последовательного введения или введения в обратном порядке конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия.In a preferred embodiment, said combined administration is carried out by simultaneous, sequential or reverse administration of a long acting insulin conjugate and a long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate.

Полезный эффект изобретенияUseful effect of the invention

Конъюгат инсулина или его аналога длительного действия и конъюгат агониста GLP-1/глюкагона длительного действия демонстрируют превосходный терапевтический эффект в отношении диабета, в частности, комбинированное введение эффективно в качестве терапевтического средства против диабета, которое способно одновременно стимулировать два пептидных рецептора, рецептор инсулина и GLP1 и глюкагона, для повышения устойчивости и стабильности in vivo, значительного снижения вводимой дозы, уменьшения гипогликемии и набора веса благодаря стабильному контролю уровней глюкозы крови, а также обеспечивающего соблюдение схемы лечения. В частности, данное изобретение может существенно улучшить стабильность в крови, обеспечивает устойчивый эффект лекарственного средства и уменьшает частоту введения, таким образом обеспечивая максимальное удобство для пациента.A long acting insulin or analogue thereof conjugate and a long acting GLP-1 agonist/glucagon conjugate show an excellent therapeutic effect on diabetes, in particular, the combined administration is effective as a therapeutic agent against diabetes, which is able to simultaneously stimulate two peptide receptors, the insulin receptor and GLP1 and glucagon, to improve robustness and stability in vivo, significantly reduce the administered dose, reduce hypoglycemia and weight gain through stable control of blood glucose levels, and ensure compliance with the treatment regimen. In particular, the present invention can significantly improve blood stability, provide a sustained drug effect, and reduce the frequency of administration, thus maximizing patient comfort.

Описание графических материаловDescription of graphic materials

На фиг. 1 представлен график AUC (площадь под кривой), демонстрирующий изменение глюкозы натощак, измеренное при подкожном введении двойного агониста GLP/глюкагона длительного действия, конъюгированного с Fc иммуноглобулина, и аналога инсулина, конъюгированного с Fc, мышам db/db один раз каждые два дня в течение 4 недель в отдельности или при комбинированном введении.In FIG. 1 is a graph of AUC (area under the curve) showing the change in fasting glucose measured by subcutaneous administration of a long-acting dual GLP/glucagon agonist, Fc-conjugated immunoglobulin and an Fc-conjugated insulin analog, to db/db mice once every two days in for 4 weeks alone or in combination.

На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий изменение массы тела, которую измеряли до и после подкожного введения двойного агониста GLP/глюкагона длительного действия, конъюгированного с Fc иммуноглобулина, и аналога инсулина, конъюгированного с Fc, мышам db/db один раз каждые два дня в течение 4 недель в отдельности или при комбинированном введении.In FIG. 2 is a graph showing the change in body weight measured before and after subcutaneous administration of a dual GLP/glucagon long-acting Fc-conjugated immunoglobulin immunoglobulin and an Fc-conjugated insulin analogue to db/db mice once every two days for 4 weeks. singly or in combination.

- 2 040348- 2 040348

Предпочтительное воплощение изобретенияPreferred embodiment of the invention

Для решения вышеописанных задач в одном аспекте согласно данному изобретению предложена комбинация для лечения сахарного диабета, содержащая инсулин и двойной агонист GLP-1/глюкагона.To achieve the above objectives, in one aspect, the present invention provides a combination for the treatment of diabetes mellitus comprising insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist.

Вышеуказанный инсулин представляет собой конъюгат длительного действия, в котором инсулин и биосовместимое вещество или носитель связаны посредством линкера. Двойной агонист GLP1/глюкагона представляет собой двойной агонист GLP-1/глюкагона длительного действия и может быть конъюгатом двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия, в котором двойной агонист GLP-1/глюкагона и биосовместимое вещество или носитель связаны посредством линкера. Комбинация по данному изобретению отличается комбинированным введением инсулина и двойного агониста GLP1/глюкагона. Инсулин и двойной агонист GLP-1/глюкагона по данному изобретению отличаются длительным характером действия.The above insulin is a long acting conjugate in which the insulin and a biocompatible substance or carrier are linked via a linker. The GLP1/glucagon dual agonist is a long acting GLP-1/glucagon dual agonist and may be a long acting GLP-1/glucagon dual agonist conjugate wherein the GLP-1/glucagon dual agonist and a biocompatible substance or carrier are linked via a linker. The combination of this invention is characterized by the combined administration of insulin and a dual GLP1/glucagon agonist. The insulin and dual GLP-1/glucagon agonist of the present invention are characterized by a long duration of action.

В комбинации по данному изобретению молярное соотношение двойного агониста GLP1/глюкагона и инсулина может варьировать от 1: 0,05 до 1:50, но не ограничивается этим соотношением, при условии, что эффект данного изобретения сохраняется. Предпочтительно, инсулин и двойной агонист GLP-1/глюкагона имеют длительный характер действия и находятся в форме конъюгата, в котором биосовместимое вещество или носитель присоединены.In the combination of the present invention, the molar ratio of the dual GLP1 agonist/glucagon and insulin may vary from 1:0.05 to 1:50, but is not limited to this ratio, provided that the effect of the present invention is maintained. Preferably, the insulin and the GLP-1/glucagon dual agonist are long acting and are in the form of a conjugate in which a biocompatible substance or carrier is attached.

В данном изобретении инсулин представляет собой аналог инсулина, представляющий собой вещество, полученное посредством замены аминокислоты в положении 14 А-цепи (SEQ ID NO 37) инсулина глутаминовой кислотой. В данном изобретении инсулин представляет собой инсулин длительного действия, задействующий технологии длительного действия для преодоления короткого периода полувыведения. Предпочтительно, он может представлять собой аналог инсулина длительного действия, который можно вводить раз в неделю.In the present invention, insulin is an insulin analog, which is a substance obtained by replacing the amino acid at position 14 of the A chain (SEQ ID NO 37) of insulin with glutamic acid. In the present invention, the insulin is a long-acting insulin using long-acting technologies to overcome the short half-life. Preferably, it may be a long-acting insulin analog that can be administered once a week.

В данном описании термин аналог инсулина относится к пептиду, имеющему замену одной аминокислоты нативной последовательности.As used herein, the term insulin analogue refers to a peptide having a single native sequence amino acid substitution.

Аналог инсулина представляет собой аналог инсулина с заменой аминокислоты А-цепи, имеющий более низкий инсулиновый порог и пониженную аффинность связывания с рецептором инсулина по сравнению с диким типом. Аминокислотная последовательность нативного инсулина следующая. А цепь:An insulin analog is an insulin analog with an A-chain amino acid substitution having a lower insulin threshold and reduced binding affinity for the insulin receptor compared to wild-type. The amino acid sequence of native insulin is as follows. And the chain:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-TyrCys-Asn (SEQ ID NO: 37)Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-TyrCys-Asn (SEQ ID NO: 37)

В цепь:In chain:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CysGly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 38)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CysGly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr- Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 38)

Несмотря на то, что инсулин, применяемый в воплощении изобретения, представляет собой аналог инсулина, полученный при помощи генетической рекомбинации, данное изобретение им не ограничивается. Предпочтительно, способ получения аналога инсулина включает генетическую рекомбинацию, а также твердофазный способ, но не ограничивается ими.Although the insulin used in the embodiment of the invention is an insulin analogue obtained by genetic recombination, the present invention is not limited thereto. Preferably, the method for producing an insulin analogue includes, but is not limited to, genetic recombination as well as a solid phase method.

Аналог инсулина представляет собой пептид, имеющий такую же функциональную способность контролировать содержание глюкозы в крови in vivo, как инсулин.An insulin analog is a peptide having the same functional ability to control blood glucose in vivo as insulin.

Агонист инсулина по данному изобретению относится к веществу, которое проявляет такую же биологическую активность, как инсулин, связываясь с рецептором инсулина in vivo, независимо от структуры инсулина.An insulin agonist of the present invention refers to a substance that exhibits the same biological activity as insulin by binding to the insulin receptor in vivo, regardless of the structure of the insulin.

Аналог инсулина по данному изобретению демонстрирует гомологию аминокислотной последовательности с А-цепью и В-цепью нативного инсулина, соответственно, и по меньшей мере один аминокислотный остаток может быть измененной формой, выбранной из группы, состоящей из замены (например, альфа-метилирования, альфа-гидроксилирования), делеции (например, дезаминирования) или модификации (например, N-метилирования) и их комбинаций, и может относиться к пептиду, способному контролировать уровень глюкозы в крови.The insulin analogue of this invention shows amino acid sequence homology with the A chain and B chain of native insulin, respectively, and at least one amino acid residue may be an altered form selected from the group consisting of substitution (e.g., alpha-methylation, alpha- hydroxylation), deletion (eg, deamination), or modification (eg, N-methylation), and combinations thereof, and may refer to a peptide capable of controlling blood glucose levels.

Вариант инсулина по данному изобретению относится к пептиду, имеющему одну аминокислотную последовательность, отличную от таковой инсулина, и обладающему функцией контроля уровней глюкозы крови в организме.The insulin variant of the present invention relates to a peptide having one amino acid sequence different from that of insulin and having the function of controlling blood glucose levels in the body.

Способы получения варианта инсулина можно применять по отдельности или в комбинации. Например, данное изобретение охватывает пептид, имеющий одну аминокислоту, отличную от аминокислоты нативного пептида, имеющий дезаминированный концевой аминокислотный остаток и обладающий функцией контроля уровней глюкозы крови в организме.Methods for producing an insulin variant may be used alone or in combination. For example, the present invention encompasses a peptide having one amino acid different from the native peptide, having a deaminated terminal amino acid residue, and having the function of controlling blood glucose levels in the body.

Конкретно, аналог инсулина является таким, в котором аминокислота в положении 14 цепи А была заменена другой аминокислотой, а именно заменена глутаминовой кислотой. Кроме того, в объем данного изобретения входит аналог инсулина, имеющий делецию по меньшей мере одной аминокислоты, но может входить любой аналог инсулина, без ограничений.Specifically, an insulin analogue is one in which the amino acid at position 14 of chain A has been replaced by another amino acid, namely glutamic acid. In addition, an insulin analogue having at least one amino acid deletion is included within the scope of this invention, but any insulin analogue may be included without limitation.

Аналог инсулина по настоящему изобретению комбинирован с биосовместимым веществом или носителем для увеличения периода полувыведения по сравнению с инсулином дикого типа.The insulin analogue of the present invention is combined with a biocompatible agent or carrier to increase the half-life compared to wild-type insulin.

- 3 040348- 3 040348

В данном изобретении двойной агонист GLP-1/глюкагона представляет собой производные оксинтомодулина, нативного двойного агониста GLP-1/глюкагона, которые обладают двойной активностью GLP-1/глюкагона. В данном изобретении двойной агонист GLP-1/глюкагона представляет собой двойной агонист GLP-1/глюкагона, задействующий технологию длительного действия для преодоления короткого периода полувыведения и, предпочтительно, двойной агонист GLP-1/глюкагона длительного действия, который можно вводить один раз в неделю.In the present invention, the GLP-1/glucagon dual agonist are derivatives of oxyntomodulin, a native GLP-1/glucagon dual agonist, that have dual GLP-1/glucagon activity. In the present invention, the GLP-1/glucagon dual agonist is a GLP-1/glucagon dual agonist employing long-acting technology to overcome the short half-life, and preferably a long-acting GLP-1/glucagon dual agonist that can be administered once a week .

В данном описании термин оксинтомодулин обозначает пептид, имеющий происхождение от предшественника глюкагона, пре-глюкагона, и включает нативный оксинтомодулин, его предшественники, производные, фрагменты и варианты. Предпочтительно, он может иметь аминокислотную последовательность SEQ ^{Ш N0: 39} (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).As used herein, the term oxyntomodulin refers to a peptide derived from the precursor of glucagon, pre-glucagon, and includes native oxyntomodulin, its precursors, derivatives, fragments and variants. Preferably, it may have the amino acid sequence SEQ ^{III N0: 39} (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNIA).

Термин производное оксинтомодулина включает пептиды, производные пептидов или пептидомиметики, которые получены путем добавления, делеции или замены аминокислот оксинтомодулина для высокого уровня активации рецептора GLP-1 и рецептора глюкагона по сравнению с нативным оксинтомодулином. Предпочтительно, производное оксинтомодулина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No. 40 и, более предпочтительно, его 16-я и 20-я аминокислоты образуют кольцо.The term oxyntomodulin derivative includes peptides, peptide derivatives, or peptidomimetics that are made by adding, deleting, or substituting amino acids of oxyntomodulin for a high level of GLP-1 receptor and glucagon receptor activation compared to native oxyntomodulin. Preferably, the oxyntomodulin derivative has the amino acid sequence of SEQ ID No. 40 and more preferably its 16th and 20th amino acids form a ring.

Каждый из способов получения производных оксинтомодулина можно применять в отдельности или в комбинации. Например, данное изобретение охватывает пептид, имеющий одну или более аминокислот, отличных от аминокислот нативного пептида, имеющий дезаминированный N-концевой аминокислотный остаток и обладающий функцией активации как рецептора GLP-1, так и рецептора глюкагона.Each of the methods for preparing oxyntomodulin derivatives can be used alone or in combination. For example, the invention encompasses a peptide having one or more amino acids other than the native peptide, having a deaminated N-terminal amino acid residue, and having the function of activating both the GLP-1 receptor and the glucagon receptor.

Согласно данному изобретению, инсулин и двойной агонист GLP-1/глюкагона длительного действия находятся в форме конъюгата, в котором биосовместимое вещество или носитель присоединены к инсулину или двойному агонисту посредством линкера. Представитель указанного инсулина или двойного агониста GLP-1/глюкагона с длительным действием может увеличивать период полувыведения или биодоступность по сравнению с формой, в которой последовательность инсулина или двойного агониста не относится к длительному типу действия, но в остальном такая же. Согласно данному изобретению, инсулин длительного действия находится в форме, в которой Fc-область иммуноглобулина соединена с аналогом инсулина, в котором аминокислота в положении 14 А-цепи инсулина заменена глутаминовой кислотой, посредством непептидильного полимера в качестве линкера. Двойной агонист GLP1/глюкагона длительного действия может быть, без ограничения, композицией, в которой Fc-область иммуноглобулина соединена с аминокислотами в положении 30 двойного агониста GLP-1/глюкагона посредством непептидильного полимера в качестве линкера.According to the invention, insulin and a long acting GLP-1/glucagon dual agonist are in the form of a conjugate in which a biocompatible substance or carrier is attached to the insulin or dual agonist via a linker. A representative of said insulin or a long acting GLP-1/glucagon dual agonist may increase half-life or bioavailability compared to a form in which the sequence of the insulin or dual agonist is not of the long acting type but is otherwise the same. According to the present invention, long acting insulin is in a form in which the Fc region of an immunoglobulin is linked to an insulin analogue in which the amino acid at position 14 of the insulin A chain is replaced by glutamic acid via a non-peptidyl polymer as a linker. The long acting GLP1/glucagon dual agonist can be, without limitation, a composition in which the immunoglobulin Fc region is linked to the amino acids at position 30 of the GLP-1/glucagon dual agonist via a non-peptidyl polymer as a linker.

Авторы данного изобретения обнаружили, что комбинированное введение инсулина и двойного агониста GLP-1/глюкагона может предотвращать набор лишнего веса, ассоциированный с введением инсулина в отдельности, риск гипогликемии может быть снижен благодаря снижению количества инсулина, а также комбинированное введение двух лекарственных средств может уменьшать побочные эффекты и оказывать усиленное влияние по сравнению с введением каждого лекарственного средства в отдельности для проявления лучшего эффекта снижения уровней глюкозы в крови по сравнению с введением двойного агониста в отдельности. Авторы изобретения также подтвердили, что комбинацию для комбинированного введения можно применять в качестве эффективного терапевтического средства, при этом уменьшая побочные эффекты обычных терапевтических средств для диабета.The present inventors have found that the combined administration of insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist can prevent the weight gain associated with insulin alone, the risk of hypoglycemia can be reduced by lowering the amount of insulin, and the combined administration of the two drugs can reduce side effects. effects and have an enhanced effect compared with the administration of each drug alone to show a better effect of lowering blood glucose levels compared with the administration of a dual agonist alone. The inventors also confirmed that the combination for combined administration can be used as an effective therapeutic agent while reducing the side effects of conventional therapeutic agents for diabetes.

В данном документе термин биосовместимое вещество или носитель относится к веществам, которые могут увеличивать продолжительность действия инсулина или аналога инсулина или двойного агониста GLP-1/глюкагона, когда биосовместимое вещество и носитель напрямую или опосредовано ковалентно или нековалентно связаны с инсулином или аналогом инсулина или двойным агонистом GLP1/глюкагона по данному изобретению для образования конъюгата. Например, при образовании конъюгата вещество, способное увеличивать период полувыведения инсулина или аналога инсулина или двойного агониста GLP-1/глюкагона in vivo, может представлять собой биосовместимое вещество или носитель по данному изобретению. Биосовместимое вещество или носитель, который можно использовать для увеличения периода полувыведения представляет собой вещества, связывающиеся с неонатальным Fc рецептором (FcRn). Биосовместимое вещество или носитель представляет собой биосовместимое вещество, которое увеличивает период полувыведения in vivo благодаря ковалентной или нековалентной связи.As used herein, the term biocompatible substance or carrier refers to substances that can increase the duration of action of an insulin or insulin analog or dual GLP-1/glucagon agonist when the biocompatible substance and carrier are directly or indirectly covalently or non-covalently linked to the insulin or insulin analog or dual agonist. GLP1/glucagon of this invention to form a conjugate. For example, when forming a conjugate, a substance capable of increasing the half-life of insulin or an insulin analogue or dual GLP-1/glucagon agonist in vivo may be a biocompatible substance or carrier of the present invention. A biocompatible substance or carrier that can be used to increase the half-life is a substance that binds to the neonatal Fc receptor (FcRn). A biocompatible substance or carrier is a biocompatible substance that increases the in vivo half-life through a covalent or non-covalent bond.

В данном изобретении способы, которыми биосовместимое вещество или носитель присоединяют к инсулину или двойному агонисту, включают способы генетической рекомбинации, а также присоединение in vivo с помощью полимеров или низкомолекулярных химических веществ, но не ограничиваются ими. Вещество, связывающееся с FcRn, представляет собой Fc-область иммуноглобулина.In the present invention, methods by which a biocompatible substance or carrier is attached to insulin or a dual agonist include, but are not limited to, genetic recombination methods, as well as in vivo attachment using polymers or small molecular weight chemicals. The FcRn binding agent is the Fc region of an immunoglobulin.

В данном изобретении используют методику связывания с пептидом с использованием в качестве носителя антитела или фрагмента антитела для увеличения периода полувыведения in vivo. Можно использовать антитело или фрагмент антитела, имеющий сайт связывания FcRn. В данном изобретении можно использовать методику CovX-body, разработанную компанией CovX, в которой используют каталитическое антитело, и методику, которая увеличивает период полувыведения in vivo с использованиемThe present invention uses a peptide coupling technique using an antibody or antibody fragment as a carrier to increase the in vivo half-life. An antibody or antibody fragment having an FcRn binding site can be used. The present invention can use the CovX-body technique developed by CovX, which uses a catalytic antibody, and a technique that increases the in vivo half-life using

- 4 040348- 4 040348

Fc-фрагментов. Когда используют Fc-фрагмент, линкер, связывающийся с Fc-фрагменту и пептиду, и способ его связывания могут включать, без ограничения, полиэтиленгликоль или ему подобное, однако возможен любой способ химического связывания. Кроме того, соотношение связывания Fc-фрагмента и инсулина по данному изобретению может составлять 1:1 или 1:2, но не ограничиваться такими соотношениями.Fc fragments. When an Fc fragment is used, the linker that binds to the Fc fragment and the peptide and the method of linking it may include, without limitation, polyethylene glycol or the like, however, any method of chemical linkage is possible. In addition, the binding ratio of the Fc fragment and insulin according to this invention may be 1:1 or 1:2, but is not limited to such ratios.

Используемые типы линкеров и способ связывания могут представлять собой присоединение полиэтиленгликоля и тому подобного, но не ограничиваться ими, и также возможны любые способы химического присоединения.The types of linkers used and the coupling method may be, but are not limited to, polyethylene glycol attachment and the like, and any chemical attachment methods are also possible.

Линкер, связывающийся с носителем, который применяют для увеличения периода полувыведения in vivo, может включать полиэтиленгликоли, жирные кислоты, сахара, полимеры, низкомолекулярные соединения, нуклеотиды и их комбинации и может представлять собой любую химическую связь, такую как нековалентная химическая связь или ковалентная химическая связь, без ограничений.The carrier-binding linker used to increase the in vivo half-life may include polyethylene glycols, fatty acids, sugars, polymers, small molecules, nucleotides, and combinations thereof, and may be any chemical bond such as a non-covalent chemical bond or a covalent chemical bond. , no limits.

Композиция, которая может увеличивать биодоступность или непрерывно поддерживать активность, может включать композицию с замедленным высвобождением микрочастицами, наночастицами и тому подобным, с использованием PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот), гиалуроновой кислоты, хитозана и тому подобного.A composition that can increase bioavailability or continuously maintain activity may include a sustained release composition of microparticles, nanoparticles, and the like using PLGA (lactic acid glycolic acid), hyaluronic acid, chitosan, and the like.

Кроме того, в различных аспектах композиция, способная повышать биодоступность или непрерывно поддерживать активность, может представлять собой такую композицию, как импланты, средства для ингаляции, трансназальные композиции или пластыри.In addition, in various aspects, a composition capable of increasing bioavailability or sustaining activity may be a composition such as implants, inhalants, transnasal compositions, or patches.

В данном изобретении инсулин, вводимый в комбинации с двойным агонистом GLP-1/глюкагона, представляет собой аналог инсулина.In the present invention, insulin administered in combination with a dual GLP-1/glucagon agonist is an insulin analogue.

В данном изобретении примеры двойного агониста GLP-1/глюкагона, которые можно вводить в комбинации с инсулином или аналогом инсулина и его композицией длительного действия, включают производные оксинтомодулина.In the present invention, examples of a dual GLP-1/glucagon agonist that can be administered in combination with insulin or an insulin analogue and a long acting formulation thereof include oxyntomodulin derivatives.

Вещество-носитель, которое можно применять в данном изобретении представляет собой Fcобласть иммуноглобулина. В приведенном в качестве примера воплощении данного изобретения двойной агонист GLP-1/глюкагона длительного действия связан с носителем посредством непептидильного полимера в качестве линкера. В другом приведенном в качестве примера воплощении изобретения вещество-носитель, связанное с непептидильным полимерным линкером, представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина.The carrier substance that can be used in the present invention is the Fco region of an immunoglobulin. In an exemplary embodiment of the present invention, the long acting GLP-1/glucagon dual agonist is linked to the carrier via a non-peptidyl polymer as a linker. In another exemplary embodiment of the invention, the carrier substance associated with the non-peptidyl polymeric linker is an immunoglobulin Fc fragment.

В данном изобретении конъюгат инсулина длительного действия (или, для краткости, конъюгат инсулина) или двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия (для краткости, конъюгат двойного агониста) представлен формой, в которой инсулин или двойной агонист связан с Fc-областью иммуноглобулина и демонстрирует устойчивость и безопасность. Связывание Fc-области иммуноглобулина с инсулином или двойным агонистом представляет собой связывание с использованием непептидильного полимера в качестве линкера. В данном изобретении Fc иммуноглобулина можно использовать взаимозаменяемо с фрагментами иммуноглобулина.In the present invention, a long acting insulin conjugate (or insulin conjugate for short) or a long acting GLP-1/glucagon dual agonist (dual agonist conjugate for short) is a form in which the insulin or dual agonist is bound to the Fc region of an immunoglobulin and demonstrates stability and security. Linking the Fc region of an immunoglobulin to insulin or a dual agonist is a link using a non-peptidyl polymer as a linker. In the present invention, an immunoglobulin Fc can be used interchangeably with immunoglobulin fragments.

Термин непептидильный полимер относится к биосовместимому полимеру, включающему два или более повторяющихся блоков, связанных друг с другом посредством любой ковалентной связи, за исключением пептидной связи. В данном изобретении непептидильный полимер можно использовать взаимозаменяемо с непептидильным линкером.The term non-peptidyl polymer refers to a biocompatible polymer comprising two or more repeating units linked to each other by any covalent bond, except for a peptide bond. In the present invention, a non-peptidyl polymer can be used interchangeably with a non-peptidyl linker.

Непептидильный полимер, полезный в данном изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации. Биодеградируемый полимер может представлять собой полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, полисахарид, декстран, поливинилэтиловый эфир, полимолочную кислоту (PLA) или сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) и предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль. Кроме того, в объем данного изобретения могут входить их производные, известные в области техники, и производные, легко получаемые способом, известным в области техники.The non-peptidyl polymer useful in the present invention may be selected from the group consisting of a biodegradable polymer, a lipid polymer, chitin, hyaluronic acid, and combinations thereof. The biodegradable polymer may be polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, polylactic acid (PLA) or lactic-glycolic acid (PLGA), and is preferably polyethylene glycol. In addition, the scope of this invention may include their derivatives known in the technical field, and derivatives easily obtained by a method known in the technical field.

Пептидный линкер, который используют в слитом белке, полученном стандартным способом слияния в рамке считывания, имеет недостатки, состоящие в том, что он легко расщепляется in vivo протеолитическим ферментом и, таким образом, ожидаемый эффект, состоящий в увеличении носителем периода полувыведения активного лекарственного средства из сыворотки не достигается в достаточной мере. Напротив, в данном изобретении для поддержания периода полувыведения пептида из сыворотки можно использовать полимер, обладающий устойчивостью к протеолитическим ферментам, схожий с таковой носителя. Таким образом, в данном изобретении можно использовать любой непептидильный полимер без ограничений, при условии, что он представляет собой полимер, обладающий указанной функцией, то есть полимер, обладающий устойчивостью к протеолитическому ферменту in vivo. Непептидильный полимер имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа, предпочтительно от 1 до 20 кДа. Непептидильный полимер согласно данному изобретению, связанный с Fc-областью иммуноглобулина, может представлять собой один тип полимера или комбинацию различных типов полимеров. Непептидильный полимер, используемый в данном изобретении, имеет реакционноспособную группу, спо- 5 040348 собную связываться с Fc-областью иммуноглобулина и белковым лекарственным средством. Непептидильный полимер имеет реакционноспособную группу на обоих концах, которая предпочтительно выбрана из группы, состоящей из реакционноспособной альдегидной группы, пропиональдегидной группы, бутиральдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного. Сукцинимидное производное может представлять собой сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. В частности, когда непептидильный полимер имеет реакционноспособную группу, представленную реакционноспособной альдегидной группой на обоих своих концах, он эффективно связывается обоими концами с физиологически активным полипептидом и иммуноглобулином с минимальными неспецифическими реакциями. Конечный продукт, полученный посредством восстановительного алкилирования с помощью альдегидной связи, является более стабильным, чем тот, который присоединен амидной связью. Альдегидная реакционноспособная группа избирательно реагирует по N-концу при низких значениях рН и связывается с остатком лизина с образованием ковалентной связи при высоких значениях рН, таких как рН 9,0. Реакционноспособные группы на обоих концах непептидильного полимера могут быть одинаковыми или различаться между собой. Например, непептидильный полимер может иметь малеимидную группу на одном конце и альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу на другом конце. Когда в качестве непептидильного полимера используют полиэтиленгликоль, имеющий на обоих своих концах реакционноспособную гидрокси-группу, гидрокси-группу можно активировать в различные реакционноспособные группы при помощи известных химических реакций или можно использовать имеющийся в продаже полиэтиленгликоль, имеющий модифицированные реакционноспособные группы для получения конъюгата GLP-1/глюкагона длительного действия по данному изобретению.The peptide linker that is used in the fusion protein obtained by the standard in-frame fusion method has the disadvantages that it is easily cleaved in vivo by the proteolytic enzyme and thus the expected effect of increasing the half-life of the active drug from serum is not reached sufficiently. In contrast, in the present invention, a polymer having resistance to proteolytic enzymes similar to that of the carrier can be used to maintain the serum half-life of the peptide. Thus, any non-peptidyl polymer can be used in the present invention without limitation, as long as it is a polymer having the specified function, i.e., a polymer that is resistant to the proteolytic enzyme in vivo. The non-peptidyl polymer has a molecular weight in the range of 1 to 100 kDa, preferably 1 to 20 kDa. The non-peptidyl polymer of the invention associated with the Fc region of an immunoglobulin may be a single type of polymer or a combination of different types of polymers. The non-peptidyl polymer used in the present invention has a reactive group capable of binding to the Fc region of an immunoglobulin and a protein drug. The non-peptidyl polymer has a reactive group at both ends, which is preferably selected from the group consisting of a reactive aldehyde group, a propionaldehyde group, a butyraldehyde group, a maleimide group, and a succinimide derivative. The succinimide derivative may be succinimidyl propionate, hydroxysuccinimidyl, succinimidylcarboxymethyl or succinimidyl carbonate. In particular, when a non-peptidyl polymer has a reactive group represented by an aldehyde reactive group at both of its ends, it effectively binds both ends to a physiologically active polypeptide and an immunoglobulin with minimal non-specific reactions. The end product obtained by reductive alkylation with an aldehyde bond is more stable than that attached with an amide bond. The aldehyde reactive group selectively reacts at the N-terminus at low pH and binds to the lysine residue to form a covalent bond at high pH, such as pH 9.0. The reactive groups at both ends of the non-peptidyl polymer may be the same or different. For example, a non-peptidyl polymer may have a maleimide group at one end and an aldehyde group, propionaldehyde group, or butyraldehyde group at the other end. When a polyethylene glycol having a reactive hydroxy group at both of its ends is used as the non-peptidyl polymer, the hydroxy group can be activated into various reactive groups by known chemical reactions, or a commercially available polyethylene glycol having modified reactive groups can be used to obtain a GLP-1 conjugate. /glucagon long-acting according to this invention.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина обладает преимуществами в том, что касается получения, очистки и выхода конъюгата, поскольку молекулярная масса относительно невелика по сравнению с общей молекулярной массой, а также благодаря значительному увеличению однородности материала и снижению потенциальной возможности индуцировать антигенность в крови, поскольку аминокислотные последовательности у каждого антитела отличаются, а Fab-фрагмент, обладающий резко выраженной неоднородностью, удален.In addition, the Fc region of an immunoglobulin has advantages in terms of preparation, purification and yield of the conjugate, since the molecular weight is relatively small compared to the total molecular weight, and also due to a significant increase in material uniformity and a decrease in the potential to induce antigenicity in the blood, since the amino acid sequences of each antibody are different, and the Fab fragment, which has a pronounced heterogeneity, has been removed.

Термин Fc-область иммуноглобулина, используемый в данном документе, означает константный участок 2 тяжелой цепи (СН2) и константный участок 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, не включая вариабельные области тяжелой и легкой цепей, константный участок 1 тяжелой цепи (СН1) и константный участок 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Он может также включать шарнирный участок в константной области тяжелой цепи. Также Fc-область иммуноглобулина по данному изобретению может содержать всю или часть Fc-области, включая константный участок 1 тяжелой цепи (СН1) и/или константный участок 1 легкой цепи (CL1), не включая вариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, при условии, что он обладает физиологическим эффектом, по существу схожим или превосходящим таковой нативного белка. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может представлять собой фрагмент, имеющий делецию относительно большой части аминокислотной последовательности СН2 и/или СН3. Это означает, что Fc-область иммуноглобулина по данному изобретению может включать (1) СН1 домен, СН2 домен, СН3 домен и СН4 домен, (2) СН1 домен и СН2 домен, (3) СН1 домен и СН3 домен, (4) СН2 домен и СН3 домен, (5) комбинацию одного или нескольких доменов и шарнирного участка иммуноглобулина (или части шарнирного участка) и (6) димер каждого домена константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина по данному изобретению включает нативную аминокислотную последовательность, а также производное этой последовательности (мутированную последовательность). Производное аминокислотной последовательности имеет отличающуюся последовательность в результате делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены одного или нескольких аминокислотных остатков нативной последовательности или их комбинации. Например, подходящей мишенью для модификации могут служить аминокислотные остатки Fc IgG в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, важны для связывания.The term immunoglobulin Fc region as used herein means heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of an immunoglobulin, not including heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and region 1 of the light chain (CL1) of an immunoglobulin. It may also include a hinge region in the heavy chain constant region. Also, the Fc region of an immunoglobulin of the invention may comprise all or part of an Fc region, including heavy chain constant region 1 (CH1) and/or light chain constant region 1 (CL1), excluding the immunoglobulin heavy and light chain variable regions, provided that it has a physiological effect substantially similar to or superior to that of the native protein. In addition, the Fc region of an immunoglobulin may be a fragment having a deletion of a relatively large portion of the CH2 and/or CH3 amino acid sequence. This means that the Fc region of an immunoglobulin of the present invention may include (1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain, (2) a CH1 domain and a CH2 domain, (3) a CH1 domain and a CH3 domain, (4) a CH2 domain and CH3 domain, (5) a combination of one or more domains and an immunoglobulin hinge region (or part of a hinge region), and (6) a dimer of each heavy chain constant region and light chain constant region domain. In addition, the Fc-region of the immunoglobulin according to this invention includes a native amino acid sequence, as well as a derivative of this sequence (mutated sequence). A derivative of an amino acid sequence has a different sequence as a result of a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of one or more amino acid residues of the native sequence, or a combination thereof. For example, IgG Fc amino acid residues at positions 214-238, 297-299, 318-322, or 327-331, which are known to be important for binding, may be suitable targets for modification.

Кроме того, возможны различные виды производных, включая такую, в которой удален участок, способный образовывать дисульфидную связь, или удалены некоторые аминокислотные остатки на Nконце нативной Fc-формы или к нему добавлен остаток метионина. Кроме того, для устранения эффекторных функций может быть произведена делеция сайта связывания комплемента, такого как сайт связывания Clq и сайта ADCC (антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность). Методики получения таких производных последовательности Fc-области иммуноглобулина изложены в международных публикациях WO97/34631 и WO 96/32478. В области техники известны аминокислотные замены в белках и пептидах, которые не изменяют полностью активность молекулы (Н. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, VakIle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly, в обоих направлениях. Кроме того, при желании Fc-область может быть модифицирована путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и тому подобного. Описанные вышеIn addition, various types of derivatives are possible, including one in which a site capable of forming a disulfide bond is removed, or some amino acid residues are removed from the N-terminal native Fc form, or a methionine residue is added to it. In addition, a complement binding site, such as the Clq binding site and the ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) site, can be deleted to abolish effector functions. Methods for obtaining such derivatives of the immunoglobulin Fc region sequence are described in international publications WO97/34631 and WO 96/32478. Amino acid substitutions in proteins and peptides are known in the art that do not completely change the activity of the molecule (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most common substitutions are Ala/Ser, VakIle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg , Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly, in both directions. In addition, if desired, the Fc region can be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation, and the like. described above

- 6 040348 производные Fc представляют собой производные, проявляющие биологические активности, идентичные Fc-области по данному изобретению или улучшенную структурную стабильность, например, к нагреванию, рН и так далее, в сравнении с Fc-областью.- 6 040348 Fc derivatives are derivatives exhibiting identical biological activities to the Fc region of the present invention or improved structural stability, eg to heat, pH, etc., compared to the Fc region.

Кроме того, указанные Fc-области могут быть получены из нативных форм, выделенных от человека и других животных, включая крупный рогатый скот, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс или морских свинок, или могут быть рекомбинантными или представлять собой производные, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. Так, они могут быть получены из нативного иммуноглобулина путем выделения целого иммуноглобулина из организма человека или животного и последующей обработки их протеолитическим ферментом. Папаин разрезает нативный иммуноглобулин на фрагменты Fab и Fc, a обработка пепсином приводит к образованию фрагментов pFc' и F(ab)2. Эти фрагменты можно подвергать, например, эксклюзионной хроматографии для выделения фрагментов Fc или pFc'. Предпочтительно, Fc-область человеческого происхождения представляет собой Fc-область рекомбинантного иммуноглобулина, полученного из микроорганизма.In addition, said Fc regions may be derived from native forms isolated from humans and other animals, including cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, or guinea pigs, or may be recombinant or derived, derived from transformed animal or microorganism cells. Thus, they can be obtained from native immunoglobulin by isolating the whole immunoglobulin from a human or animal body and then treating them with a proteolytic enzyme. Papain cuts native immunoglobulin into Fab and Fc fragments, and treatment with pepsin leads to the formation of pFc' and F(ab)2 fragments. These fragments can be subjected to, for example, size exclusion chromatography to isolate Fc or pFc' fragments. Preferably, the Fc region of human origin is the Fc region of a recombinant immunoglobulin derived from a microorganism.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может быть представлена формой, имеющей нативные углеводные цепи, повышенное количество углеводных цепей по сравнению с нативной формой или пониженное количество углеводных цепей по сравнению с нативной формой или может быть представлен дегликозилированной формой. Увеличение, уменьшение или удаление углеводных цепей Fc иммуноглобулина может достигаться способами, обычно используемыми в области техники, такими как химический способ, ферментативный способ и генно-инженерный способ с использованием микроорганизмов. Удаление углеводных цепей в Fc-области приводит к резкому снижению аффинности связывания с частью Clq первого компонента комплемента С1 и снижению или потере антитело-зависимой клеточноопосредованной цитотоксичности или комплемент-зависимой цитотоксичности, таким образом, не индуцируя ненужных иммунных ответов in vivo. В связи с этим Fc-область иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может быть более подходящей для задач данного изобретения в качестве носителя лекарственного средства.In addition, the Fc region of an immunoglobulin may be a form having native carbohydrate chains, an increased amount of carbohydrate chains compared to the native form, or a reduced amount of carbohydrate chains compared to the native form, or may be a deglycosylated form. The increase, decrease or removal of carbohydrate chains Fc immunoglobulin can be achieved by methods commonly used in the technical field, such as chemical method, enzymatic method and genetically engineered method using microorganisms. Removal of carbohydrate chains in the Fc region results in a dramatic decrease in binding affinity for the Clq portion of the first component of complement C1 and a reduction or loss of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, thus not inducing unnecessary immune responses in vivo. In this regard, the Fc region of an immunoglobulin in deglycosylated or aglycosylated form may be more suitable for the purposes of this invention as a drug carrier.

В данном документе термин дегликозилирование относится к ферментативному удалению углеводных группировок в Fc-области, а термин агликозилирование означает, что Fc-область продуцируется в негликозилированной форме прокариотом, предпочтительно, Е. coli.As used herein, the term deglycosylation refers to the enzymatic removal of carbohydrate moieties in the Fc region, and the term aglycosylation means that the Fc region is produced in a non-glycosylated form by a prokaryote, preferably E. coli.

При этом, Fc-область иммуноглобулина может иметь происхождение из человека или других животных, включая крупный рогатый скот, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, и предпочтительно из человека.Wherein, the Fc region of the immunoglobulin may be of human or other animal origin, including cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, and guinea pigs, and preferably from humans.

Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может представлять собой Fc-область, имеющую происхождение из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или созданную из их комбинаций или быть их гибридом. Предпочтительно, она имеет происхождение из IgG или IgM, которые являются наиболее распространенными белками в крови человека и, наиболее предпочтительно, из IgG, который, как известно, увеличивает период полувыведения лиганд-связывающих белков, но не ограничивается ими.In addition, the Fc region of an immunoglobulin may be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE and IgM, or created from combinations thereof, or be a hybrid thereof. Preferably, it is derived from IgG or IgM, which are the most abundant proteins in human blood, and most preferably from IgG, which is known to increase the half-life of ligand-binding proteins, but is not limited to them.

С другой стороны, термин комбинация в данном документе означает, что полипептиды, кодирующие Fc-области одноцепочечных иммуноглобулинов одного происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. Это означает, что димер или мультимер могут быть образованы из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD и Fc IgE.On the other hand, the term combination herein means that polypeptides encoding Fc regions of single chain immunoglobulins of one origin are linked to a single chain polypeptide of another origin to form a dimer or multimer. This means that a dimer or multimer can be formed from two or more fragments selected from the group consisting of Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD and Fc IgE fragments.

В данном описании термин гибрид означает, что в Fc-области одноцепочечного иммуноглобулина присутствует последовательность, соответствующая по меньшей мере двум Fc-фрагментам различного происхождения. В данном изобретении возможны различные типы гибридов. Это означает, что возможен гибрид, состоящий из 1-4 доменов, выбранных из группы, состоящей из CH1, CH2, СН3 и СН4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE и Fc IgD, и может включать шарнирный участок.As used herein, the term hybrid means that the Fc region of a single chain immunoglobulin contains a sequence corresponding to at least two Fc fragments of different origin. Various types of hybrids are possible in the present invention. This means that a fusion of 1-4 domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible and may include a hinge region.

С другой стороны, IgG может также подразделяться на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и в данном изобретении возможна их комбинация или гибридизация. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительна Fc-область IgG4, обладающая выраженной эффекторной функцией, такой как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC).On the other hand, IgG may also be subclassed as IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and combination or hybridization is possible in the present invention. The IgG2 and IgG4 subclasses are preferred, and the Fc region of IgG4 having a pronounced effector function such as complement-dependent cytotoxicity (CDC) is most preferred.

Это означает, что Fc-область иммуноглобулина для носителя лекарственного средства по данному изобретению может быть, например, агликозилированной Fc-областью, имеющей происхождение из IgG4 человека, но не ограничиваться ей. Fc-область, имеющая происхождение из человека, является предпочтительной по сравнению с Fc-областью, имеющей происхождение из источников, отличных от человека, которая может вызывать нежелательные иммунные ответы, например может выступать в качестве антигена в человеческом организме для образования нового антитела.This means that the Fc region of an immunoglobulin for a drug carrier of the present invention may be, for example, an aglycosylated Fc region derived from human IgG4, but is not limited thereto. A human-derived Fc region is preferred over a non-human Fc region that can elicit unwanted immune responses, such as acting as an antigen in the human body to form a new antibody.

Способ получения инсулина длительного действия по данному изобретению не имеет конкретных ограничений. Например, детали способа получения и их эффекты описаны, например, в патентах Кореи 10-1330868, 10-1324828, 10-1058290, опубликованных заявках на патент Кореи 10-2011-0111267 и заявке на патент Кореи 10-2014-0022909.The method for producing long-acting insulin according to the present invention is not particularly limited. For example, the details of the production method and their effects are described in, for example, Korean Patent 10-1330868, 10-1324828, 10-1058290, Korean Published Patent Application 10-2011-0111267, and Korean Patent Application 10-2014-0022909.

В воплощении данного изобретения конъюгат аналога инсулина длительного действия получали путем осуществления моно-пегилирования Fc-области иммуноглобулина по N-концу и такой же моди- 7 040348 фикации фенилананина в положении 1 цепи В инсулина и аналога инсулина (Пример 8).In an embodiment of the present invention, a long acting insulin analogue conjugate was prepared by mono-pegylation of the immunoglobulin Fc region at the N-terminus and the same modification of the phenylananine at position 1 of the B chain of the insulin and insulin analogue (Example 8).

Способ получения двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия по данному изобретению не имеет конкретных ограничений. Например, детали способа получения и их эффекты описаны, например, в заявке на патент Кореи 10-2012-0139579. В воплощении данного изобретения конъюгат аналога инсулина длительного действия получали путем осуществления моно-пегилирования Fc-области иммуноглобулина по N-концу и такой же модификации остатка цистеина в положении 30 двойного агониста GLP-1/глюкагона.The method for producing a long acting GLP-1/glucagon dual agonist of the present invention is not particularly limited. For example, the details of the production method and their effects are described in, for example, Korean Patent Application No. 10-2012-0139579. In an embodiment of the present invention, a long acting insulin analog conjugate was prepared by mono-pegylation of the immunoglobulin Fc region at the N-terminus and the same modification of the cysteine residue at position 30 of the dual GLP-1/glucagon agonist.

В другом аспекте данного изобретения предложена комбинация, содержащая инсулин длительного действия и конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия.In another aspect of the invention, there is provided a combination comprising a long acting insulin and a long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate.

Когда такой конъюгат инсулина длительного действия и двойной агонист GLP-1/глюкагона длительного действия вводят в комбинации, конъюгат инсулина длительного действия действует на рецептор инсулина, а конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона одновременно действует на рецептор глюкагон-подобного пептида-1 и рецептор глюкагона для снижения уровней глюкозы в крови по сравнению с введением каждого из них в отдельности и демонстрирует стабильное изменение. Также комбинированное введение указанных выше конъюгатов может снизить опасность гипогликемии, которая может возникнуть при введении одного инсулина, и снизить общую дозу инсулина благодаря пептиду, стимулирующему секрецию инсулина. Применение конъюгата инсулина длительного действия и двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия имеет большое преимущество, заключающееся в том, что позволяет значительно снизить число введений пациентам с хроническим заболеванием, которым в противном случае необходимы ежедневные введения, благодаря увеличению периода полувыведения из крови и устойчивости in vivo, и, таким образом, повысить качество жизни пациента. Таким образом, это очень эффективно в лечении диабета. Фармацевтическая комбинация по данному изобретению имеет превосходную устойчивость in vivo и пороговую дозу и позволяет значительно снизить дозировку, используемую при комбинированном введении.When such a long-acting insulin conjugate and a long-acting GLP-1/glucagon dual agonist are administered in combination, the long-acting insulin conjugate acts on the insulin receptor and the GLP-1/glucagon dual agonist conjugate simultaneously acts on the glucagon-like peptide-1 receptor and the insulin receptor. glucagon to lower blood glucose levels compared with the introduction of each of them alone and shows a stable change. Also, the combined administration of the above conjugates can reduce the risk of hypoglycemia, which can occur with the introduction of insulin alone, and reduce the total dose of insulin due to the peptide that stimulates insulin secretion. The use of a long-acting insulin/long-acting dual GLP-1/glucagon agonist conjugate has the great advantage of significantly reducing the number of doses to chronically ill patients who otherwise require daily doses, due to increased blood half-life and stability. in vivo, and thus improve the patient's quality of life. Thus, it is very effective in the treatment of diabetes. The pharmaceutical combination of the present invention has excellent in vivo stability and dose threshold and allows a significant reduction in the dosage used in combination administration.

Конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия можно вводить одновременно, последовательно или в обратном порядке, и вводить одновременно в комбинации соответствующего эффективного количества. Также, предпочтительно, конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия можно вводить одновременно, последовательно или в обратном порядке после хранения в отдельных контейнерах.The long acting insulin conjugate and the long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate may be administered simultaneously, sequentially or in reverse order, and administered simultaneously in an appropriate effective amount combination. Also preferably, the long acting insulin conjugate and the long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate may be administered simultaneously, sequentially or in reverse order after being stored in separate containers.

Конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия, которые представляют собой комбинацию для комбинированного введения по данному изобретению, могут быть в форме набора для лечения диабета, который либо включен в один контейнер, либо хранится в отдельных контейнерах. Такой набор может включать в себя фармацевтически приемлемый носитель и инструкцию по применению набора.The long acting insulin conjugate and the long acting dual GLP-1 agonist/glucagon conjugate which are the combined administration combination of this invention may be in the form of a diabetes kit which is either included in one container or stored in separate containers. Such a kit may include a pharmaceutically acceptable carrier and instructions for use of the kit.

В данном изобретении термин диабет относится к метаболическим заболеваниям, при которых секреция инсулина недостаточна или не осуществляются его нормальные функции, которые отличаются повышенными уровнями глюкозы крови. Комбинированное введение комбинации по данному изобретению субъекту может контролировать уровни глюкозы крови для лечения сахарного диабета.In the present invention, the term diabetes refers to metabolic diseases in which insulin secretion is insufficient or its normal functions are not carried out, which are characterized by elevated blood glucose levels. Combined administration of a combination of this invention to a subject can control blood glucose levels for the treatment of diabetes mellitus.

В данном документе термин предупреждение относится ко всем действиям, которые подавляют или замедляют развитие диабета благодаря комбинированному введению комбинации по данному изобретению. Лечение относится ко всем действиям, которые смягчают, улучшают или облегчают симптомы диабета благодаря комбинированному введению комбинации по данному изобретению. Лечение диабета применимо к любому млекопитающему, которое страдает сахарным диабетом, и его примеры включают не только человека и приматов, но также крупный рогатый скот, например коров, свиней, овец, лошадей, собак и кошек, без каких-либо ограничений, предпочтительно к человеку.As used herein, the term prevention refers to all actions that suppress or delay the development of diabetes by the combined administration of the combination of this invention. Treatment refers to all activities that alleviate, ameliorate or alleviate the symptoms of diabetes through the combined administration of a combination of this invention. Treatment of diabetes is applicable to any mammal that suffers from diabetes, and examples include not only humans and primates, but also cattle, such as cows, pigs, sheep, horses, dogs and cats, without any limitation, preferably to humans .

В данном документе термин введение относится к введению пациенту количества заданного вещества подходящим способом. Комбинацию по данному изобретению можно вводить любым стандартным способом, при условии, что она способна достигнуть нужной ткани. Например, это может быть внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, пероральное, местное, интраназальное, внутрилегочное или ректальное введение, не ограничиваясь приведенным списком. Однако, поскольку пептиды при пероральном введении подвергаются перевариванию, активные ингредиенты комбинации для перорального введения должны иметь покрытие или защиту от деградации в желудке. Предпочтительно, комбинацию можно вводить в форме инъекций. Кроме того, комбинацию длительного действия можно вводить с помощью любого устройства, которое может транспортировать активное вещество в клетку-мишень.As used herein, the term administration refers to administering to a patient an amount of a given substance in an appropriate manner. The combination of this invention may be administered by any standard route, provided that it is capable of reaching the desired tissue. For example, it can be intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, intrapulmonary, or rectal, but not limited to. However, since the peptides are digested upon oral administration, the active ingredients of the oral combination must be coated or protected from degradation in the stomach. Preferably, the combination can be administered in the form of injections. In addition, the long-acting combination can be administered using any device that can transport the active agent to the target cell.

Помимо различных факторов, таких как заболевание, которое необходимо лечить, путь введения, возраст, пол, масса тела пациента и тяжесть заболевания, вводимая доза и частота введения фармацевтической комбинации по данному изобретению определяются типом активного ингредиента.In addition to various factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, body weight of the patient and the severity of the disease, the dose to be administered and the frequency of administration of the pharmaceutical combination of this invention is determined by the type of active ingredient.

Фармацевтическая комбинация по данному изобретению может дополнительно включать в себя фармацевтически приемлемый носитель. В данном изобретении термин фармацевтически приемлемый носитель относится к разбавителю или носителю, который не подавляет биологическую активность иThe pharmaceutical combination of this invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. In this invention, the term pharmaceutically acceptable carrier refers to a diluent or carrier that does not inhibit biological activity and

- 8 040348 свойства вводимого соединения и не вызывает раздражения организма. Для перорального введения носитель может включать связывающий агент, смазывающий агент, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизирующий агент, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель и корригент. В инъекционных препаратах носитель может включать забуферивающий агент, консервант, анальгетик, солюбилизирующий агент, изотонический агент и стабилизатор. Для препаратов для местного введения носитель может включать основу, эксципиент, смазывающий агент и консервант.- 8 040348 properties of the administered compound and does not irritate the body. For oral administration, the carrier may include a binding agent, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a coloring agent, and a flavoring agent. In injectable preparations, the carrier may include a buffering agent, a preservative, an analgesic, a solubilizing agent, an isotonic agent, and a stabilizer. For topical preparations, the carrier may include a base, an excipient, a lubricant, and a preservative.

Комбинации по данному изобретению могут быть изготовлены в виде различных лекарственных форм в комбинации с вышеупомянутыми фармацевтически приемлемыми носителями. Например, фармацевтическая комбинация для перорального введения может быть изготовлена в виде таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов или облаток. Фармацевтическая комбинация для инъекций может быть изготовлена в виде однодозовых ампул или в многодозовом контейнере. Фармацевтическая комбинация также может быть изготовлена в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул и препаратов длительного действия.The combinations of this invention may be formulated in various dosage forms in combination with the aforementioned pharmaceutically acceptable carriers. For example, a pharmaceutical combination for oral administration may be in the form of tablets, lozenges, capsules, elixirs, suspensions, syrups, or cachets. The pharmaceutical combination for injection may be presented in single dose ampoules or in a multi-dose container. The pharmaceutical combination can also be formulated into solutions, suspensions, tablets, pills, capsules and long acting preparations.

С другой стороны, примеры носителя, эксципиента и разбавителя, подходящих для фармацевтических комбинаций, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, фармацевтические комбинации могут дополнительно включать наполнители, противосвертывающие агенты, смазывающие агенты, увлажняющие агенты, корригенты и антисептики.On the other hand, examples of carrier, excipient and diluent suitable for pharmaceutical combinations include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum arabic, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose , microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils. In addition, pharmaceutical combinations may further include excipients, anticoagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, and antiseptics.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ предупреждения или лечения диабета, включающий введение комбинации, содержащей инсулин и двойной агонист GLP-1/глюкагона, субъекту, подверженному высокому риску сахарного диабета или страдающему сахарным диабетом.In another aspect of the present invention, there is provided a method for preventing or treating diabetes, comprising administering a combination containing insulin and a dual GLP-1/glucagon agonist to a subject at high risk for or suffering from diabetes mellitus.

Комбинация и сахарный диабет являются такими, как описано выше.The combination and diabetes mellitus are as described above.

Стадию введения можно осуществлять, без ограничения, путем комбинированного введения конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия. Каждый из них можно вводить одновременно, последовательно или в обратном порядке, и вводить одновременно в соответствующем эффективном количестве.The administering step can be performed, without limitation, by the combined administration of a long acting insulin conjugate and a long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate. Each of them can be entered simultaneously, sequentially or in reverse order, and enter simultaneously in an appropriate effective amount.

Комбинация по данному изобретению, включающая и конъюгат инсулина длительного действия, и конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия может значительно снижать уровни глюкозы крови и не вызывает побочных эффектов набора веса, несмотря на введение раз в неделю, и таким образом, ее можно применять в предупреждении и лечении диабета.The combination of the present invention, comprising both a long-acting insulin conjugate and a long-acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate, can significantly reduce blood glucose levels and does not cause weight gain side effects despite being administered once a week, and thus can be used in the prevention and treatment of diabetes.

Далее данное изобретение будет описано более подробно на примерах. Данные примеры предназначены исключительно для иллюстрации данного изобретения, объем которого не ограничивается данными примерами. ПРИМЕР 1. Получение векторов, экспрессирующих одноцепочечный аналог инсулина.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by examples. These examples are intended solely to illustrate the present invention, the scope of which is not limited to these examples. EXAMPLE 1. Obtaining vectors expressing a single-chain analogue of insulin.

Для получения аналога инсулина, в котором заменена аминокислота А-цепи или В-цепи инсулина, используя в качестве матрицы вектор, экспрессирующий нативный инсулин, синтезировали прямой и обратный олигонуклеотиды (табл. 2) и затем провели PCR (полимеразная цепная реакция), таким образом амплифицируя ген соответствующего аналога.To prepare an insulin analogue in which the amino acid of the A chain or B chain of insulin is substituted, using the native insulin expression vector as a template, forward and reverse oligonucleotides were synthesized (Table 2), and then PCR (polymerase chain reaction) was performed, thus amplifying the gene of the corresponding analogue.

Измененные последовательности аминокислот А-цепи или В-цепи и обозначения соответствующих аналогов представлены в табл.1. Так, аналог 1 представляет собой форму, в которой глицин в положении 1 А-цепи заменен на аланин, а аналог 4 представляет собой форму, в которой глицин в положении 8 Вцепи заменен на аланин.Altered amino acid sequences of the A-chain or B-chain and designations of the corresponding analogues are presented in table.1. Thus analog 1 is the form in which the glycine at position 1 of the A chain is replaced by alanine, and analog 4 is the form in which the glycine at position 8 of the B chain is replaced by alanine.

Таблица 1Table 1

Аналог Analog Модифицированная последовательность Modified Sequence Аналог 1 Analogue 1 A’GaA A'GaA Аналог 2 Analogue 2 A²UA ^A2UA Аналог 3 Analogue 3 a¹⁹y^aa ¹⁹ y^a Аналог 4 Analogue 4 b⁸g^ab ⁸ g^a Аналог 5 Analogue 5 B²³G -a AB ²³ G-a A Аналог 6 Analogue 6 B²⁴F -a AB ²⁴ F-a A Аналог 7 Analogue 7 B²⁵F -a AB ²⁵ F-a A Аналог 8 Analogue 8 A¹⁴Y -a EA ¹⁴ Y -a E Аналог 9 Analogue 9 A^I4YaNA ^I4 YaN

Праймеры для амплификации аналогов инсулина представлены в табл. 2.Primers for the amplification of insulin analogues are presented in table. 2.

- 9 040348- 9 040348

Таблица 2table 2

Аналог Analog Последовательность Subsequence SEQ Ш NO SEQ W NO Аналог 1 Analogue 1 5’ GGGTCCCTGCAGAAGCGTGCGATTGTGGAACAATGCTGT 3’ 5’ GGGTCCCTGCAGAAGCGTGCGATTGTGGAACAATGCTGT 3’ SEQ ID NO 1 SEQID NO 1 5 ’ ACAGCATTGTTCCACAATCGCACGCTTCTGCAGGGACCC 3 ’ 5'ACAGCATTGTTCCACAATCGCACGCTTCTGCAGGGACCCC 3' SEQ ID NO 2 SEQID NO 2 Аналог 2 Analogue 2 5’ TCCCTGCAGAAGCGTGGCGCGGTGGAACAATGCTGTACC 3’ 5 ’ GGTACAGCATTGTTCCACCGCGCCACGCTTCTGCAGGGA 3 ’ 5’ TCCCTGCAGAAGCGTGGCGCGGTGGAACAATGCTGTACC 3’ 5' GGTACAGCATTGTTCCACCGCGCCACGCTTCTGCAGGGA 3' SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 4 SEQID NO 3 SEQID NO 4 Аналог 3 Analogue 3 5’ CTCTACCAGCTGGAAAACGCGTGTAACTGAGGATCC 3’ 5’ GGATCCTCAGTTACACGCGTTTTCCAGCTGGTAGAG 3’ 5’ CTCTACCAGCTGGAAAACGCGTGTAACTGAGGATCC 3’ 5’ GGATCTCAGTTACACGCGTTTTCCAGCTGGTAGAG 3’ SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 6 SEQID NO 5 SEQ ID NO 6 Аналог 4 Analogue 4 5’ GTTAACCAACACTTGTGTGCGTCACACCTGGTGGAAGCT 3’ 5 ’ AGCTTCCACCAGGTGTGACGCACACAAGTGTTGGTTAAC 3 ’ 5' GTTAACCAACACTTGTGTGTGCGTCACACCTGGTGGAAGCT 3' 5' AGCTTCCACCAGGTGTGACGCACACAAGTGTTGGTTAAC 3' SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 7 SEQID NO 8 Аналог 5 Analogue 5 5’ CTAGTGTGCGGGGAACGAGCGTTCTTCTACACACCCAAG 3’ 5’ CTTGGGTGTGTAGAAGAACGCTCGTTCCCCGCACACTAG 3’ 5' CTAGTGTGCGGGGAACGAGCGTTCTTCTACACACCCAAG 3' 5’ CTTGGGTGTGTAGAAGAACGCTCGTTCCCCGCACACTAG 3’ SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 10 SEQ ID NO 9 SEQID NO 10 Аналог 6 Analogue 6 5’ GTGTGCGGGGAACGAGGCGCGTTCTACACACCCAAGACC 3’ 5’ GGTCTTGGGTGTGTAGAACGCGCCTCGTTCCCCGCACAC 3’ 5’ GTGTGCGGGGAACGAGGCGCGTTCTACACACCCAAGACC 3’ 5’ GGTCTTGGGTGTGTAGAACGCGCCTCGTTCCCCGCACAC 3’ SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 12 SEQID NO eleven SEQID NO 12 Аналог 7 Analogue 7 5’ TGCGGGGAACGAGGCTTCGCGTACACACCCAAGACCCGC 3’ 5’ GCGGGTCTTGGGTGTGTACGCGAAGCCTCGTTCCCCGCA 3’ 5’ TGCGGGGAACGAGGCTTCGCGTACACACCCAAGACCCGC 3’ 5’ GCGGGTCTTGGGTGTGTACGCGAAGCCTCGTTCCCCCGCA 3’ SEQ ID NO 13 SEQ ID NO 14 SEQID NO 13 SEQID NO 14 Аналог 8 Analogue 8 5 ’-CCAGCATCTGCTCCCTCGAACAGCTGGAGAACTACTG-3 ’ 5 ’ -Cagtagttctccagctgttcgagggagcagatgctgg-З ’ 5'-CCAGCATCTGCTCCCTCGAACAGCTGGAGAACTACTG-3' 5 '-Cagtagttctctccagctgttcgagggagcagatgctgg-З ' SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 16 SEQID NO 15 SEQID NO 16 Аналог 9 Analogue 9 5 ’ -CAGCATCTGCTCCCTCAACCAGCTGGAGAACTAC-3 ’ 5 ’ -Gtagttctccagctggttgagggagcagatgctg-3 ’ 5'-CAGCATCTGCTCCCTCAACCAGCTGGAGAACTAC-3' 5'-Gtagttctccagctggttgagggagcagatgctg-3' SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 18 SEQID NO 17 SEQID NO 18

Условия PCR для амплификации аналога инсулина: 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 68°С в течение 6 мин, с повторением данной процедуры 18 раз. Фрагмент аналога инсулина, полученный в указанных условиях, встраивали в экспрессирующий вектор рЕТ22Ь для экспрессии в клетке в форме телец включения. Полученный таким образом экспрессирующий вектор обозначили рЕТ22b-аналоги Инсулина 1-9. Экспрессирующий вектор включает в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность аналогов инсулина с 1 по 9 под контролем промотора Т7; экспрессирующий вектор экспрессировался в хозяине в форме телец включения.PCR conditions for insulin analog amplification: 95° C. for 30 s, 55° C. for 30 s, and 68° C. for 6 min, repeating this procedure 18 times. An insulin analogue fragment prepared under the indicated conditions was inserted into the expression vector pET22b for expression in the cell in the form of inclusion bodies. The expression vector thus obtained was designated pET22b insulin analogues 1-9. The expression vector includes a nucleic acid encoding the amino acid sequence of insulin analogues 1 to 9 under the control of the T7 promoter; the expression vector was expressed in the host in the form of inclusion bodies.

Последовательности ДНК и белковые последовательности каждого из аналогов инсулина с 1 по 9 приведены ниже в табл. 3.The DNA sequences and protein sequences of each of insulin analogs 1 through 9 are shown in Table 1 below. 3.

Таблица 3Table 3

Аналог Analog Последовательность Subsequence SEQ ID NO SEQ ID NO Аналог 1 Analogue 1 ДНК DNA ТТС GTT AAC САА САС TTG TGT GGC ТСА САС CTG GTG GAA GCT СТС ТАС СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC ТТС ТТС ТАС АСА ССС AAG АСС CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GCG ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC ТСС CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GCG ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 19 19 белок protein Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Ala lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Ala lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 20 20 Аналог 2 Analogue 2 ДНК DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC ТСА CAC CTG GTG GAA GCT СТС TAC СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC ТТС ТТС TAC АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT 21 21

- 10 040348- 10 040348

GGT GCA GGC AGC CTG CAG ССС TTG GCC CTG GAG GGG ТСС CTG CAG AAG CGT GGC GCG GTG GAA САА TGC TGT ACC AGC АТС TGC ТСС СТС ТАС С AG CTG GAG AAC ТАС TGC AAC GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TSS CTG CAG AAG CGT GGC GCG GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC C AG CTG GAG AAC TAC TGC AAC Аналог 3 Аналог 4 Analogue 3 Analogue 4 белок ДНК белок ДНК protein DNA protein DNA Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ala Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn TTC GTT AAC САА CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT СТС ТАС СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC ТАС АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC ТСС CTC TAC CAG CTG GAG AAC GCG TGC AAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Ala Cys Asn TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GCG TCA CAC CTG GTG GAA GCT СТС ТАС СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC ТАС АСА CCC AAG ACC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ala Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC GCG TGC AAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Ala Cys Asn TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GCG TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC 22 23 24 25 22 23 24 25 CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC белок protein Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Ala Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Ala Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 26 26 Аналог 5 Analogue 5 ДНК DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC СТА GTG TGC GGG GAA CGA GCG TTC TTC TAC АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GCG TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC 27 27 белок protein Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Ala Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Ala Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 28 28 Аналог 6 Analogue 6 ДНК DNA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC 29 29

- 11 040348- 11 040348

белок protein CTG GTG GAA GCT СТС ТАС СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC GCG ТТС ТАС АСА ССС AAG АСС CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC TCC СТС TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Ala Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC GCG TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Ala Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 30 thirty Аналог 7 Аналог 8 Аналог 9 Analogue 7 Analogue 8 Analogue 9 ДНК белок ДНК белок ДНК белок DNA protein DNA protein DNA protein TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT СТС TAC СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC GCG TAC АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT СТС TAC СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC TCC CTC GAA CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Glu Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC TCC CTC AAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC GCG TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC GAA CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Glu Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC TAC STA GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC ATC TGC TCC CTC AAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser 31 32 33 34 35 36 31 32 33 34 35 36 Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Asn Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Asn Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

Пример 2. Экспрессия слитых полипептидов рекомбинантных аналогов инсулина.Example 2 Expression of Recombinant Insulin Analog Fusion Polypeptides.

Экспрессию рекомбинантных аналогов инсулина осуществляли под контролем промотора Т7. Е. coli BL21-DE3 (Е coli В F-dcm ompT hsdS (rB-mB-)gal DE3.); Nova Zen) трансформировали каждым векThe expression of recombinant insulin analogs was carried out under the control of the T7 promoter. E. coli BL21-DE3 (E coli B F-dcm ompT hsdS (rB-mB-)gal DE3.); Nova Zen) transformed every century

- 12 040348 тором, экспрессирующим рекомбинантный аналог инсулина. Трансформацию проводили согласно способу, рекомендованному Novagene. Отдельные одиночные колонии, трансформированные каждым рекомбинантным экспрессирующим вектором, инокулировали в среду 2XLuria broth (LB), содержащую ампициллин (50/мл), и инкубировали при 37°С в течение 15 ч. Культуру рекомбинантного штамма и среду 2Х LB, содержащую 30% глицерин, смешивали в соотношении 1:1 (об./об.). Затем разливали по 1 мл культуры в криопробирки и хранили при -140°С. Их использовали как исходные клетки для получения рекомбинантного химерного белка.- 12 040348 a torus expressing a recombinant insulin analogue. The transformation was carried out according to the method recommended by Novagene. Individual single colonies transformed with each recombinant expression vector were inoculated into 2XLuria broth (LB) medium containing ampicillin (50/ml) and incubated at 37°C for 15 h. Culture of the recombinant strain and 2X LB medium containing 30% glycerol , mixed in a ratio of 1:1 (v/v). Then, 1 ml of the culture was poured into cryovials and stored at -140°C. They were used as starting cells for obtaining a recombinant chimeric protein.

Для экспрессии рекомбинантного аналога инсулина растворяли 1 ампулу исходных клеток, инокулировали в 500 мл среды 2XLuria broth и культивировали при встряхивании при 37°С в течение 14-16 часов. При достижении OD600 (оптическая плотность) значения 5,0 или выше культуру останавливали и использовали в качестве посевного материала. Посевной материал вносили в 17 л среды для ферментации, используя 50 л ферментер (MSJ-U2, BEMARUBISHI, Япония), и запускали ферментацию исходной партии. Условия культивирования: температура 37°С, объем воздуха 20 л/мин (об./об./мин), скорость перемешивания 500 об/мин, значение рН 6,7 поддерживали с помощью 30% водного раствора аммиака. Когда в процессе ферментации питательные элементы в культуральной среде становились ограниченными, осуществляли подпитку культуры путем добавления питательного раствора. За ростом штаммов следили по значениям OD и вносили IPTG (изопропилтиогалактозид) в конечной концентрации 500 М при значениях OD 100 или выше. После внесения культивирование осуществляли на протяжении от 23 до 25 часов. После завершения культивирования рекомбинантный штамм собирали путем центрифугирования и хранили при -80°С до применения.For the expression of the recombinant insulin analogue, 1 ampoule of the original cells was dissolved, inoculated into 500 ml of 2XLuria broth medium and cultured with shaking at 37°C for 14-16 hours. When an OD600 (optical density) of 5.0 or higher was reached, the culture was stopped and used as inoculum. The inoculum was added to 17 L of fermentation medium using a 50 L fermenter (MSJ-U2, BEMARUBISHI, Japan) and fermentation of the original batch was started. Culture conditions: temperature 37° C., air volume 20 l/min (rpm/rpm), stirring speed 500 rpm, pH value 6.7 was maintained with 30% aqueous ammonia solution. When the nutrients in the culture medium became limited during fermentation, the culture was fed by adding a nutrient solution. The growth of the strains was monitored by OD values and IPTG (isopropylthiogalactoside) was added at a final concentration of 500 M at OD values of 100 or higher. After making the cultivation was carried out for 23 to 25 hours. After completion of cultivation, the recombinant strain was collected by centrifugation and stored at -80° C. until use.

Пример 3. Количество и рефолдинг рекомбинантных аналогов инсулина.Example 3 Quantity and Refolding of Recombinant Insulin Analogs.

Чтобы перевести рекомбинантные аналоги инсулина, экспрессированные в Примере 2, в растворимую форму, их подвергали рефолдингу после разрушения клеток. 100 г (масса во влажном состоянии) клеточного осадка ресуспендировали в 1 л лизирующего буфера (50 мМ Tris-HCl (pH 9,0), 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (рН 8,0), 1 мМ EDTA (рН 8,0), 0,2 М NaCl и 0,5% Triton Х-100). Клетки разрушали с помощью микрофлюидизатора М-110ЕН (АС Technology Corp. модель М1475С) под давлением 15000 psi (фунт на квадратный дюйм). Лизат разрушенных клеток центрифугировали при 7000 об/мин при 4°С в течение 20 минут для отделения супернатанта и ресуспендировали в 3 л отмывочного буфера (0,5% Triton Х-100 и 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,2 М NaCl, 1 мМ EDTA). Осадок центрифугировали при 7000 об/мин при 4°С в течение 20 мин и ресуспендировали в дистиллированной воде и затем центрифугировали аналогичным образом. Собирали осадок, ресуспендировали в 400 мл буферного раствора (1 М глицин, 3,78 г цистеин-НС1, рН 10,6) и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч). Чтобы собрать ресуспендированный рекомбинантный аналог инсулина, добавляли 400 мл 8М мочевины и затем перемешивали при 40°С в течение 1 ч. Для рефолдинга солюбилизированного рекомбинантного аналога инсулина его центрифугировали при 7000 об/мин при 4°С в течение 30 мин. Затем собирали супернатант, к которому добавляли 2 л дистиллированной воды при скорости тока 1000 мл/час с помощью перистальтического насоса и перемешивали при 4°С в течение 16 ч.To convert the recombinant insulin analogs expressed in Example 2 into a soluble form, they were refolded after cell disruption. 100 g (wet weight) cell pellet was resuspended in 1 L lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 0), 0.2 M NaCl and 0.5% Triton X-100). Cells were disrupted using an M-110EH microfluidizer (AC Technology Corp. model M1475C) at 15,000 psi (psi). The lysate of destroyed cells was centrifuged at 7000 rpm at 4°C for 20 minutes to separate the supernatant and resuspended in 3 L of wash buffer (0.5% Triton X-100 and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0 .2 M NaCl, 1 mM EDTA). The pellet was centrifuged at 7000 rpm at 4°C for 20 min and resuspended in distilled water and then centrifuged in the same way. The pellet was collected, resuspended in 400 ml buffer solution (1 M glycine, 3.78 g cysteine-HC1, pH 10.6) and then stirred at room temperature for 1 h). To collect the resuspended recombinant insulin analogue, 400 ml of 8M urea was added and then stirred at 40°C for 1 hour. To refold the solubilized recombinant insulin analogue, it was centrifuged at 7000 rpm at 4°C for 30 minutes. The supernatant was then collected, to which 2 L of distilled water was added at a flow rate of 1000 ml/h using a peristaltic pump and stirred at 4°C for 16 h.

Пример 4. Очистка с помощью катионообменной хроматографии.Example 4 Purification by Cation Exchange Chromatography.

Прошедший рефолдинг образец наносили на колонку Source S (GE healthcare, Inc.), уравновешенную 20 мМ цитратом натрия, содержащемся на месте, уравновешивали 45% этаноловым (рН 2,0) буфером, содержащим 4% этанол. Белок аналога инсулина элюировали линейным градиентом (0-100%) 20 мМ буферного раствора цитрата натрия (рН 2,0), содержащего 45% этанол и 0,5 М хлорид калия (10 объемов колонки).The refolded sample was applied to a Source S column (GE healthcare, Inc.) equilibrated with 20 mM sodium citrate in situ, equilibrated with 45% ethanol (pH 2.0) buffer containing 4% ethanol. The insulin analog protein was eluted with a linear gradient (0-100%) of 20 mM sodium citrate buffer (pH 2.0) containing 45% ethanol and 0.5 M potassium chloride (10 column volumes).

Пример 5. Обработка трипсином и карбоксипептидазой В.Example 5 Trypsin and Carboxypeptidase B Treatment

Удаляли соль из образца посредством элюирования с обессоливающей колонки и заменяли буферным раствором (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0). К полученному образцу белка добавляли трипсин, взятый в молярном соотношении 1000, и карбоксипептидазу В, взятую в молярном соотношении 2000, и затем перемешивали при 16°С в течение 16 ч. Для завершения реакции снижали рН до 3,5 с помощью 1М цитрата натрия (рН 2,0).The salt was removed from the sample by eluting with a desalting column and replaced with a buffer solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Trypsin, taken in a molar ratio of 1000, and carboxypeptidase B, taken in a molar ratio of 2000, were added to the resulting protein sample, and then stirred at 16°C for 16 h. To complete the reaction, the pH was lowered to 3.5 with 1 M sodium citrate ( pH 2.0).

Пример 6. Очистка с помощью катионообменной хроматографии.Example 6 Purification by Cation Exchange Chromatography.

После завершения реакции образец вновь наносили на колонку Source S (GE healthcare, Inc.), уравновешенную 20 мМ буферным раствором цитратом натрия (рН 2,0), содержащим 45% этанол. Затем белок аналога инсулина элюировали линейным градиентом (0-100%) 20 мМ буферного раствора цитрата натрия (рН 2,0), содержащего 45% этанол и 0,5 М хлорид калия (10 объемов колонки).After completion of the reaction, the sample was reapplied to a Source S column (GE healthcare, Inc.) equilibrated with 20 mM sodium citrate buffer (pH 2.0) containing 45% ethanol. The insulin analog protein was then eluted with a linear gradient (0-100%) of 20 mM sodium citrate buffer (pH 2.0) containing 45% ethanol and 0.5 M potassium chloride (10 column volumes).

Пример 7. Очистка с помощью анионообменной хроматографии.Example 7 Purification by anion exchange chromatography.

Удаляли соль из образца посредством элюирования с обессоливающей колонки и заменяли буферным раствором (10 мМ Tris-HCl, рН 7,5). Для выделения очищенного аналога инсулина из образца, полученного в Примере 6, образец наносили на анионообменную колонку (Source Q: GE healthcare, Inc.), уравновешенную 10 мМ трис-буферным раствором (рН 7,5). Затем белок аналога инсулина элюировали линейным градиентом (0-100%) 10 мМ трис- буферного раствора, рН 7,5, содержащего 0,5 М хлорид натрия (10 объемов колонки).The salt was removed from the sample by eluting with a desalting column and replaced with a buffer solution (10 mM Tris-HCl, pH 7.5). To isolate the purified insulin analogue from the sample prepared in Example 6, the sample was applied to an anion exchange column (Source Q: GE healthcare, Inc.) equilibrated with 10 mM Tris buffer (pH 7.5). The insulin analog protein was then eluted with a linear gradient (0-100%) of 10 mM Tris buffer pH 7.5 containing 0.5 M sodium chloride (10 column volumes).

- 13 040348- 13 040348

Степень чистоты очищенного аналога инсулина анализировали с помощью белкового электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (SDS-PAGE) и хроматографии высокого давления (HPLC), а аминокислотные замены подтверждали при помощи пептидного картирования и анализа молекулярной массы каждого пика.The purity of the purified insulin analogue was analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel protein electrophoresis (SDS-PAGE) and high pressure chromatography (HPLC), and amino acid substitutions were confirmed by peptide mapping and analysis of the molecular weight of each peak.

В результате подтвердили, что аминокислотная последовательность была изменена в соответствии с целевым назначением соответствующего аналога инсулина.As a result, it was confirmed that the amino acid sequence was changed in accordance with the intended purpose of the corresponding insulin analogue.

Пример 8. Получение конъюгата инсулина длительного действия.Example 8. Obtaining a long-acting insulin conjugate.

В данном примере получали конъюгат инсулина длительного действия для аналога последовательности (Glu в положении 14 А-цепи) нативного аналога инсулина, типичного аналога инсулина.In this example, a long acting insulin conjugate was prepared for the analog sequence (Glu at position 14 of the A chain) of a native insulin analog, a typical insulin analog.

Для пегилирования с помощью PEG 3.4K ALD2 PEG (NOF, Japan) бета-цепи аналога инсулина по N-концу проводили реакцию между аналогом инсулина и PEG в молярном соотношении 1:4 и концентрации аналога инсулина 5 мг/мл при 4 ~8°С в течение приблизительно 2 ч. При этом реакцию осуществляли в 50 мМ цитрате натрия рН 6,0 с 40 ~ 60% изопропанола, и реакцию осуществляли посредством добавления восстанавливающего агента цианоборогидрида натрия в концентрации 3,0~20,0 мМ. Реакционный раствор очищали с помощью колонки SP-HP (GE Healthcare, США), содержащей этанол в цитрате натрия (рН 3,0).For pegylation with PEG 3.4K ALD2 PEG (NOF, Japan) of the insulin analog beta chain at the N-terminus, a reaction was performed between the insulin analog and PEG in a molar ratio of 1:4 and an insulin analog concentration of 5 mg/ml at 4 ~ 8°C for about 2 hours. Meanwhile, the reaction was carried out in 50 mM sodium citrate pH 6.0 with 40 ~ 60% isopropanol, and the reaction was carried out by adding a reducing agent sodium cyanoborohydride at a concentration of 3.0 ~ 20.0 mM. The reaction solution was purified using an SP-HP column (GE Healthcare, USA) containing ethanol in sodium citrate (pH 3.0).

Чтобы получить конъюгат аналога инсулина и Fc-фрагмента иммуноглобулина осуществляли реакцию между очищенным монопегилированным аналогом инсулина и Fc-фрагментом иммуноглобулина в молярном соотношении от 1:1 до 1:2 при общей концентрации белка 20 мг/мл при 25°С в течение приблизительно 12~16 часов. При этом буфер для реакции представлял собой 100 мМ HEPES, рН 8,2, к которому был добавлен 20 мМ цианоборогидрид натрия в качестве восстанавливающего реагента для получения конъюгата аналога инсулина, модифицированного PEG по N-концу Fc-фрагмента.In order to prepare the insulin analogue and immunoglobulin Fc conjugate, the purified mono-pegylated insulin analogue and immunoglobulin Fc were reacted in a molar ratio of 1:1 to 1:2 at a total protein concentration of 20 mg/mL at 25°C for approximately 12~ 16 hours. The reaction buffer was 100 mM HEPES, pH 8.2, to which 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent to prepare an insulin analog conjugate modified with PEG at the N-terminus of the Fc fragment.

По окончании реакции реакционный раствор наносили на колонку Q HP (GE Healthcare, США) и вначале очищали конъюгат аналога инсулина и Fc-фрагмента иммуноглобулина с помощью буфера трисHCl (рН 7,5) с градиентом концентрации NaCl.After the completion of the reaction, the reaction solution was applied to a Q HP column (GE Healthcare, USA) and the conjugate of the insulin analog and immunoglobulin Fc fragment was first purified using TrisHCl buffer (pH 7.5) with a NaCl concentration gradient.

Затем получали конъюгат аналога инсулина и Fc-фрагмента иммуноглобулина с помощью Source 15ISO (GE Healthcare, США) в качестве второй колонки. При этом конъюгат аналога инсулина и Fcфрагмента иммуноглобулина элюировали с помощью градиента концентрации сульфата аммония в TrisHCl (рН 7,5).Then, a conjugate of an insulin analogue and an immunoglobulin Fc fragment was obtained using Source 15ISO (GE Healthcare, USA) as the second column. In this case, the conjugate of the insulin analogue and the immunoglobulin Fc fragment was eluted using an ammonium sulfate concentration gradient in TrisHCl (pH 7.5).

Пример 9. Синтез производных оксинтомодулина.Example 9 Synthesis of oxyntomodulin derivatives.

В данном примере синтезировали производные оксинтомодулина, имеющие следующие аминокислотные последовательности (табл.4).In this example, oxyntomodulin derivatives were synthesized having the following amino acid sequences (Table 4).

Таблица 4Table 4

SEQ 1D NO. SEQ 1D NO. Аминокислотная последовательность Amino acid sequence SEQ ID NO. 39 SEQID NO. 39 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNIA SEQ ID NO. 40 SEQID NO. 40 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC SEQ ID NO. 41 SEQID NO. 41 CA-SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNTKRNRNNIA SEQ ID NO. 42 SEQID NO. 42 CA-SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNTGPSSGAPPPS CA-SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNTGPSSGAPPPS SEQ ID NO. 43 SEQID NO. 43 C A-GQGTFTSD YSRYLEEEAVRLFIEWLKNGGP S S GAPPPS C A-GQGTFTSD YSRYLEEEAVRLFIEWLKNGGP S S GAPPPS SEQ ID NO. 44 SEQID NO. 44 CA-GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS CA-GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS SEQ ID NO. 45 SEQID NO. 45 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSKYLD CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSKYLD SEQ ID NO. 46 SEQID NO. 46 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWLMNTK CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWLMNTK SEQ ID NO. 47 SEQID NO. 47 CA-SQGTFTSDLSRQLEEEAVRLFIEWLMNK CA-SQGTFTSDLSRQLEEEAVRLFIEWLMNK SEQ ID NO. 48 SEQID NO. 48 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIEWLMNTKRNRNNIA CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIEWLMNTKRNRNNIA SEQ TD NO. 49 SEQ TD NO. 49 CA-SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFTEWLMNGGPSSGAPPPSK CA-SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFTEWLMNGGPSSGAPPPSK SEQ ID NO. 50 SEQID NO. 50 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSRYLDK CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSRYLDK SEQ ID NO. 51 SEQID NO. 51 CA-SQGTFTSDYSRYLDGGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVK CA-SQGTFTSDYSRYLDGGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVK SEQ ID NO. 52 SEQID NO. 52 CA-SQGTFTSDYSRYLDXEAVXLFIEWLMNTK CA-SQGTFTSDYSRYLDXEAVXLFIEWLMNTK SEQ ID NO. 53 SEQID NO. 53 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIXWLMNTKRNRNNIA CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIXWLMNTKRNRNNIA SEQ TD NO. 54 SEQ TD NO. 54 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFTXWLMNTKRNRNNTA CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFTXWLMNTKRNRNTA SEQ ID NO. 55 SEQID NO. 55 CA-SQGTFTSDLSRQLEGGGHSQGTFTSDLSRQLEK CA-SQGTFTSDLSRQLEGGGHSQGTFTSDLSRQLEK SEQ ID NO. 56 SEQID NO. 56 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNTKRNRNIA SEQ ID NO. 57 SEQID NO. 57 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK SEQ ID NO. 58 SEQID NO. 58 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNTKRNRNIA SEQ ID NO. 59 SEQID NO. 59 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK

- 14 040348- 14 040348

SEQ ID NO. 60 SEQID NO. 60 CA-SQGTFTSDYSRQLEEEAVRLFIEWVRNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSRQLEEEAVRLFIEWVRNTKRNRNIA SEQ ID NO 61 SEQ ID NO 61 DA-SQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTK DA-SQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTK SEQ ID NO. 62 SEQID NO. 62 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVCWLMNT HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVCWLMNT SEQ ID NO. 63 SEQID NO. 63 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC SEQ ID NO. 64 SEQID NO. 64 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC SEQ ID NO 65 SEQ ID NO 65 HAibQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT HAibQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT SEQ ID NO. 66 SEQID NO. 66 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT SEQ ID NO. 67 SEQID NO. 67 H(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA H(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA SEQ ID NO. 68 SEQID NO. 68 CA-SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA SEQ ID NO. 69 SEQID NO. 69 CA-(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA CA-(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA SEQ ID NO. 70 SEQID NO. 70 C A-Aib QGTFT SD YSK YLDEKRAKEF VQWLMNTC C A-Aib QGTFT SD YSK YLDEKRAKEF VQWLMNTC SEQ ID NO. 71 SEQID NO. 71 HAibQGTFTSDYAKYLDEKRAKEFVQWLMNTC HAibQGTFTSDYAKYLDEKRAKEFVQWLMNTC SEQ ID NO. 72 SEQID NO. 72 YAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC YAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC

в табл.4 аминокислоты, отмеченные жирным и подчеркнутые, обозначают образование кольца, а аминокислоты, обозначенные как X, означают ненативную аминокислоту, альфа-метил-глутаминовую кислоту. Кроме того, СА обозначает 4-имидазоацетил, a DA обозначает дезамино-гистидил.in Table 4, amino acids marked in bold and underlined denote ring formation, and amino acids marked as X denote the non-native amino acid, alpha-methyl-glutamic acid. In addition, CA is 4-imidazoacetyl and DA is desamino-histidyl.

Пример 10. Получение конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия.Example 10 Preparation of a long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate.

В данном примере получали конъюгат длительного действия варианта нативного оксинтомодулина, типичного двойного агониста GLP-1/глюкагона.In this example, a long acting variant conjugate of native oxyntomodulin, a typical GLP-1/glucagon dual agonist, was prepared.

Вначале, для пегилирования с помощью MAL-10K-ALD PEG аминокислотной последовательности двойного агониста GLP-1/глюкагона по остатку цистеина в положении 30 и (SEQ ID NO: 40: HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC, аминокислоты, показанные жирным шрифтом, означают формирование кольца, Aib означает 2-метилаланин), осуществляли реакцию между двойным агонистом GLP-1/глюкагона и MAL-10K-ALD (NOF, Япония) PEG в молярном соотношении от 1:1 до 1:3 при концентрации белка 3~5 мг/мл при комнатной температуре в течение приблизительно 3 часов. При этом реакцию осуществляли при условиях, когда к 50 мМ трис-буферу (рН 8,0) добавляли изопропанол. По окончании реакции реакционный раствор наносили на колонку SP HP (GE, США) и очищали монопегилированный по цистеину двойной агонист GLP-1/глюкагона. Способ очистки осуществляли с использованием буферного раствора цитрата натрия (рН 3,0), содержащего этанол и градиент концентрации хлорида калия.First, for PEGylation with MAL-10K-ALD PEG, the amino acid sequence of the dual GLP-1/glucagon agonist at the cysteine residue at position 30 and (SEQ ID NO: 40: HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC, amino acids in bold indicate ring formation, Aib means 2 -methylalanine), a reaction was carried out between the GLP-1/glucagon dual agonist and MAL-10K-ALD (NOF, Japan) PEG in a molar ratio of 1:1 to 1:3 at a protein concentration of 3~5 mg/ml at room temperature in for approximately 3 hours. The reaction was carried out under conditions where isopropanol was added to 50 mM Tris buffer (pH 8.0). After completion of the reaction, the reaction solution was applied to a SP HP column (GE, USA) and the cysteine monopegylated GLP-1/glucagon dual agonist was purified. The purification method was carried out using a buffer solution of sodium citrate (pH 3.0) containing ethanol and a concentration gradient of potassium chloride.

Затем осуществляли реакцию между очищенным монопегилированным двойным агонистом GLP1/глюкагона и Fc-фрагментом иммуноглобулина в молярном соотношении от 1:2 до 1:5 при концентрации белка приблизительно 20 мг/мл при 4~8°С в течение 12-16 ч. Реакцию осуществляли в условиях, когда в 100 мМ буферный раствор фосфата калия (рН 6,0) в качестве восстанавливающего реагента добавляли 20 мМ SCB (цианоборогидрид натрия). По окончании реакции, в качестве реакционного раствора, для первоначальной очистки конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона и Fc-фрагмента иммуноглобулина использовали SOURCE Q (GE, США). Очистку осуществляли с использованием 20 мМ бистрис-буфера, рН 6,8 и градиента концентрации хлорида натрия. Затем проводили окончательную очистку конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона и Fc-фрагмента иммуноглобулина с помощью колонки Source ISO. Для очистки конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона и Fc-фрагмента иммуноглобулина использовали 20 мМ трис-буфер, рН 7,5, содержащий 1М сульфат аммония и градиент концентрации 20 мМ Трис-буфера, рН 7,5.The purified mono-PEGylated GLP1/glucagon dual agonist was then reacted with immunoglobulin Fc in a molar ratio of 1:2 to 1:5 at a protein concentration of approximately 20 mg/mL at 4~8°C for 12-16 hours. under conditions where 20 mM SCB (sodium cyanoborohydride) was added as a reducing agent to 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). At the end of the reaction, SOURCE Q (GE, USA) was used as the reaction solution for the initial purification of the GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate and immunoglobulin Fc fragment. Purification was performed using 20 mM bistris buffer, pH 6.8, and a sodium chloride concentration gradient. The final purification of the GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate and immunoglobulin Fc fragment was then carried out using a Source ISO column. 20 mM Tris buffer, pH 7.5 containing 1 M ammonium sulfate and a concentration gradient of 20 mM Tris buffer, pH 7.5, was used to purify the GLP-1/glucagon dual agonist/glucagon conjugate and immunoglobulin Fc fragment.

Пример 11. Оценка эффекта комбинированного введения конъюгата двойного агониста GLP1/глюкагона с Fc иммуноглобулина и конъюгата аналога инсулина с Fc иммуноглобулина.Example 11 Evaluation of the effect of combined administration of an immunoglobulin GLP1 dual agonist/glucagon conjugate with an immunoglobulin Fc and an insulin analogue with an immunoglobulin Fc conjugate.

Данный тест провели для определения динамики уровня глюкозы крови и изменения массы тела при комбинированном введении конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия и конъюгата аналога инсулина длительного действия, полученных в примерах 9 и 10. 42 крысам db/db (7недельного возраста) дали акклиматизироваться в течение 2 недель при свободном доступе к корму и воде и затем животных поделили на 7 групп по 6 животных. В соответствии с вводимыми веществами, всего было 7 групп, включая группу, получавшую носитель, группу, получавшую только конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг), группу, получавшую только конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 и 17,6 нмоль/кг), группу, получавшую комбинацию конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия с Fc иммуноглобулина (2,2, 4,4 и 8,8 нмоль/кг). Все исследуемые вещества вводили подкожно дважды в сутки. Уровень глюкозы крови определяли с помощью глюкометра после 4-часового голодания случайным образом дважды в неделю, за исключением суток, когда осуществляли введение. Уровень глюкозы крови в каждой группе сравнивали с помощью графика AUC (площадь под кривой), показывающего изменение глюкозы натощак в течение 4 недель (фиг. 1) по сравнению с группой, получавшей носитель. В каждой группе сравни- 15 040348 вали изменение массы после введения лекарственного средства на протяжении 4 недель относительно массы до введения (фиг. 2).This test was performed to determine the dynamics of blood glucose levels and changes in body weight with the combined administration of the long-acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate and the long-acting insulin analog conjugate prepared in examples 9 and 10. 42 db/db rats (7 weeks of age) were given acclimatize for 2 weeks with free access to food and water, and then the animals were divided into 7 groups of 6 animals. According to the administered substances, there were a total of 7 groups, including the vehicle group, the immunoglobulin GLP-1/glucagon dual agonist/glucagon conjugate immunoglobulin (1.4 nmol/kg) group, the insulin analog Fc conjugate alone immunoglobulin (8.8 and 17.6 nmol/kg), a group receiving a combination of a long-acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate with immunoglobulin Fc (2.2, 4.4 and 8.8 nmol/kg). All test substances were administered subcutaneously twice a day. The blood glucose level was determined using a glucometer after a 4-hour fast, randomly twice a week, except for the day when the administration was carried out. The blood glucose levels in each group were compared using an AUC (area under the curve) plot showing the change in fasting glucose over 4 weeks (FIG. 1) compared to the vehicle group. In each group, weight change was compared after drug administration over a period of 4 weeks relative to pre-administration weight (FIG. 2).

Как показано на фиг. 1, по сравнению с группами, получавшими введение конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг) или конъюгата аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 нмоль/кг) в отдельности, в группе, получавшей комбинированное введение двух веществ в том же количестве (конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг) или конъюгата аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 нмоль/кг)), наблюдали синергетический эффект. Кроме того, в группе, получавшей комбинированное введение, наблюдали эффект снижения уровня глюкозы крови, сходный с введением конъюгата аналога инсулина с Fc иммуноглобулина в более высокой дозе (17,6 нмоль/кг).As shown in FIG. 1 compared with groups treated with dual GLP-1 agonist/glucagon immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) or insulin analog immunoglobulin Fc conjugate (8.8 nmol/kg) alone, in the group treated with the combined administration of two substances in the same amount (dual GLP-1 agonist/glucagon conjugate with immunoglobulin Fc (1.4 nmol/kg) or insulin analog conjugate with immunoglobulin Fc (8.8 nmol/kg)), a synergistic effect was observed. In addition, in the combined administration group, a blood glucose-lowering effect similar to administration of an insulin analog conjugate with immunoglobulin Fc at a higher dose (17.6 nmol/kg) was observed.

Применительно к изменению массы тела (фиг. 2), конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина вызывал увеличение массы тела при повторяющемся введении на протяжении 4 недель, тогда как в группе, получавшей комбинированное введение, и в группе, которой вводили только конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина длительного действия, происходило снижение массы тела.In terms of body weight change (FIG. 2), the insulin analog immunoglobulin Fc conjugate caused an increase in body weight with repeated administration for 4 weeks, while in the group receiving combined administration and in the group administered only with the dual GLP-agonist conjugate 1/glucagon with long-acting immunoglobulin Fc, there was a decrease in body weight.

Кроме того, как показало сравнение группы, получавшей конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина в отдельности, с группой, которая получала такое же количество аналога инсулина с Fc иммуноглобулина в комбинации с конъюгатом двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина, набор веса вследствие введения инсулина мог быть предотвращен посредством совместного введения с конъюгатом двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина. Кроме того, даже при сравнении группы, получавшей только конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (17,6 нмоль/кг), с группой, получавшей комбинированное лечение (конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг), конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 нмоль/кг)), можно быть отметить эффект снижения массы тела.In addition, when comparing the group receiving the insulin analogue immunoglobulin Fc conjugate alone with the group receiving the same amount of insulin analogue immunoglobulin Fc in combination with the GLP-1/glucagon dual agonist immunoglobulin Fc conjugate, weight gain due to administration of insulin could be prevented by co-administration with a GLP-1 dual agonist/glucagon immunoglobulin Fc conjugate. In addition, even when comparing the group treated with only insulin analogue with immunoglobulin Fc (17.6 nmol/kg) with the group receiving combination treatment (dual agonist GLP-1/glucagon with immunoglobulin Fc (1.4 nmol/kg ), an insulin analog conjugate with an immunoglobulin Fc (8.8 nmol/kg)), the effect of reducing body weight can be noted.

Данные результаты показывают, что комбинация, включающая как конъюгат инсулина длительного действия, так и конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия, обладает превосходной способностью контролировать уровень глюкозы крови и не имеет побочных эффектов в виде набора лишнего веса вследствие введения инсулина и обеспечивает лучший терапевтический эффект при сравнении с группами, получавшими стандартный инсулин и двойной агонист GLP-1/глюкагона, соответственно.These results show that the combination of both long-acting insulin conjugate and long-acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate has excellent blood glucose control and no side effects of weight gain due to insulin administration and provides better therapeutic effect when compared with standard insulin and dual GLP-1/glucagon agonist groups, respectively.

Claims (11)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Фармацевтическая комбинация для лечения или предупреждения сахарного диабета, содержащая конъюгат инсулина длительного действия и конъюгат двойного агониста GLP-1(глюкагон-подобный пептид-1)/глюкагона длительного действия, где конъюгат инсулина длительного действия представляет собой конъюгат, в котором инсулин связан с Fc-областью иммуноглобулина посредством непептидильного полимера;1. Pharmaceutical combination for the treatment or prevention of diabetes mellitus, containing a long-acting insulin conjugate and a long-acting GLP-1(glucagon-like peptide-1)/glucagon dual agonist conjugate, where the long-acting insulin conjugate is a conjugate in which insulin is bound to the Fc region of an immunoglobulin via a non-peptidyl polymer; где конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия представляет собой конъюгат, в котором двойной агонист GLP-1/глюкагона связан с Fc-областью иммуноглобулина посредством непептидильного полимера, где инсулин представляет собой аналог инсулина, в котором аминокислота в положении 14 А-цепи (SEQ ID NO: 37) инсулина заменена глутаминовой кислотой; и где двойной агонист GLP-1/глюкагона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 40, 63 и 64, и одновременно активирует рецептор GLP-1 и рецептор глюкагона.where the long acting GLP-1/glucagon dual agonist/glucagon conjugate is a conjugate in which the GLP-1/glucagon dual agonist is linked to the Fc region of an immunoglobulin via a non-peptidyl polymer, wherein insulin is an analog of insulin in which the amino acid at position 14 of the A chain (SEQ ID NO: 37) insulin replaced with glutamic acid; and wherein the GLP-1/glucagon dual agonist comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 40, 63 and 64 and simultaneously activates the GLP-1 receptor and the glucagon receptor. 2. Комбинация по п.1, где комбинация дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.2. The combination of claim 1, wherein the combination further comprises a pharmaceutically acceptable carrier. 3. Комбинация по п.1, где двойной агонист рецепторов глюкагон-подобного пептида-1 (GLP1)/глюкагона длительного действия имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, а аминокислоты в положениях 16 и 20 образуют кольцо.3. The combination of claim 1, wherein the long acting glucagon-like peptide-1 (GLP1)/glucagon dual receptor agonist has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 and the amino acids at positions 16 and 20 form a ring. 4. Комбинация по п.1, в которой непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации.4. Combination according to claim 1, wherein the non-peptidyl polymer is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid and their combinations. 5. Комбинация по п.1, в которой Fc-область иммуноглобулина является агликозилированной.5. The combination of claim 1, wherein the immunoglobulin Fc region is aglycosylated. 6. Комбинация по п.5, в которой Fc-область иммуноглобулина содержит от одного до четырех участков, выбранных из группы, состоящей из доменов CH1, CH2, СН3 и СН4; и где Fc-область иммуноглобулина дополнительно содержит шарнирный участок.6. The combination according to claim 5, in which the Fc-region of the immunoglobulin contains from one to four sites selected from the group consisting of domains CH1, CH2, CH3 and CH4; and wherein the immunoglobulin Fc region further comprises a hinge region. 7. Комбинация по п.6, в которой Fc-область иммуноглобулина представляет собой Fc-область, имеющую происхождение из IgG, IgA, IgD, IgE или IgM; и возможно где каждый из доменов Fc-области иммуноглобулина представляет собой гибрид доменов, имеющих разное происхождение, выбранное из7. The combination according to claim 6, in which the Fc region of the immunoglobulin is an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM; and possibly where each of the immunoglobulin Fc region domains is a hybrid of domains having different origins selected from - 16 040348 группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.- 16 040348 group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM. 8. Комбинация по π.7, в которой Fc-область иммуноглобулина представляет собой димер или мультимер, состоящий из одноцепочечных полипептидов, состоящих из доменов, имеющих одинаковое происхождение.8. The combination according to π.7, wherein the immunoglobulin Fc region is a dimer or multimer consisting of single chain polypeptides composed of domains having the same origin. 9. Комбинация по п.3, где непептидильный полимерный линкер представляет собой PEG (полиэтиленгликоль).9. The combination according to claim 3, where the non-peptidyl polymeric linker is PEG (polyethylene glycol). 10. Способ предупреждения или лечения диабета, включающий введение комбинации по любому из пи. 1 -9 субъекту, подверженному высокому риску сахарного диабета или страдающему сахарным диабетом.10. A method for preventing or treating diabetes, comprising administering a combination of any of pi. 1-9 to a subject at high risk of diabetes mellitus or suffering from diabetes mellitus. И. Способ по п.10, в котором стадию введения осуществляют путем комбинированного введения конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия.I. The method of claim 10 wherein the step of administering is by combined administration of a long acting insulin conjugate and a long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate. 12. Способ по п.11, где комбинированное введение осуществляют путем одновременного последовательного введения или введения в обратном порядке конъюгата инсулина длительного действия и конъюгата двойного агониста GLP-1/глюкагона длительного действия.12. The method of claim 11, wherein the combined administration is by simultaneous sequential or reverse administration of a long acting insulin conjugate and a long acting GLP-1 dual agonist/glucagon conjugate. а Носительa Carrier -ч Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина-h GLP-1/glucagon dual agonist immunoglobulin Fc conjugate AS (14 нмоль/кг)AS (14 nmol/kg) Конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 нмоль/кг)Insulin analog conjugate with immunoglobulin Fc (8.8 nmol/kg) Конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (17,6 нмоль/кг)Insulin analog conjugate with immunoglobulin Fc (17.6 nmol/kg) Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг) + конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (2,2 нмоль/кг)GLP-1 dual agonist/glucagon immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) + insulin analogue immunoglobulin Fc conjugate (2.2 nmol/kg) I Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг) + конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (4,4 нмоль/кг)I GLP-1 dual agonist/glucagon immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) + insulin analogue immunoglobulin Fc conjugate (4.4 nmol/kg) [V* Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг) + конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 нмоль/кг)[V* GLP-1 dual agonist/glucagon immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) + insulin analogue immunoglobulin Fc conjugate (8.8 nmol/kg) Фиг. 1Fig. 1 □ Носитель f 'i | Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг) ·” Конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 нмоль/кг) ⁷; Конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (17,6 нмоль/кг)□ Carrier f 'i | GLP-1 dual agonist/glucagon immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) ·” Insulin analogue immunoglobulin Fc conjugate (8.8 nmol/kg) ⁷ ; Insulin analog conjugate with immunoglobulin Fc (17.6 nmol/kg) - Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина : I_; (1,4 нмоль/кг) + конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (2,2 нмоль/кг)- Conjugate of the double agonist GLP-1/glucagon with Fc immunoglobulin : I _; (1.4 nmol/kg) + insulin analog immunoglobulin Fc conjugate (2.2 nmol/kg) ДИ Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулинаCI Immunoglobulin GLP-1 Dual Agonist/Glucagon Conjugate with Fc ДМ· (1,4 нмоль/кг) + конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (4,4 нмоль/кг)DM (1.4 nmol/kg) + insulin analog conjugate with immunoglobulin Fc (4.4 nmol/kg) SS Конъюгат двойного агониста GLP-1/глюкагона с Fc иммуноглобулина (1,4 нмоль/кг) + конъюгат аналога инсулина с Fc иммуноглобулина (8,8 нмоль/кг)SS GLP-1 dual agonist/glucagon immunoglobulin Fc conjugate (1.4 nmol/kg) + insulin analogue immunoglobulin Fc conjugate (8.8 nmol/kg) Фиг. 2Fig. 2 Евразийская патентная организация, ЕАПВEurasian Patent Organization, EAPO Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2Russia, 109012, Moscow, Maly Cherkassky per., 2