EA040241B1 - ANTIBODY DIRECTED AGAINST CGRP AND METHODS FOR ITS PRODUCTION AND USE - Google Patents

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США № 61/488660 (№ патентного реестра 67858.730300), поданной 20 мая 2011 года под названием Композиции антител против CGRP и их применение, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.This application claims priority of US Provisional Application No. 61/488660 (Patent Registry No. 67858.730300), filed May 20, 2011, titled Anti-CGRP Antibody Compositions and Uses Them, incorporated herein by reference in its entirety.

Настоящая заявка содержит список последовательностей, представленный в формате ASCII через EFS-Web и полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки. Название указанной ASCII-копии, созданной 18 мая 2012 г., -67858o730301.txt, а ее размер составляет 203815 байт.This application contains a sequence listing provided in ASCII format via EFS-Web and incorporated herein by reference in its entirety. The name of the specified ASCII copy created on May 18, 2012 is -67858o730301.txt and its size is 203815 bytes.

Уровень техникиState of the art

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к антителам и их фрагментам (в том числе Fab-фрагментам), обладающим специфичностью связывания с пептидом, связанным с геном кальцитонина человека (Calcitonin Gene Related Peptide, в дальнейшем CGRP). Настоящее изобретение также относится к способам профилактики или лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP, путем введения указанных антител или их фрагментов.The present invention relates to antibodies and fragments thereof (including Fab fragments) having binding specificity to a peptide associated with the human calcitonin gene (Calcitonin Gene Related Peptide, hereinafter CGRP). The present invention also relates to methods for the prevention or treatment of diseases and disorders associated with CGRP, by introducing these antibodies or fragments thereof.

Описание данной области техникиDescription of the technical field

Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), продуцируется в виде многофункционального нейропептида длиной 37 аминокислот. В организме человека существуют две формы CGRP - CGRPальфа и CGRP-бета, обладающие аналогичной активностью. CGRP-альфа и CGRP-бета человека отличаются тремя аминокислотами и происходят из различных генов. Семейство пептидов CGRP включает амилин, адреномедуллин и кальцитонин, хотя рецепторы и биологическая активность каждого из них отличаются. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9): 1261-68 (2001).The calcitonin gene-related peptide (CGRP) is produced as a 37 amino acid multifunctional neuropeptide. There are two forms of CGRP in the human body, CGRP-alpha and CGRP-beta, which have similar activity. Human CGRP-alpha and CGRP-beta differ in three amino acids and come from different genes. The CGRP family of peptides includes amylin, adrenomedullin, and calcitonin, although the receptors and biological activity of each differ. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9): 1261-68 (2001).

CGRP высвобождается из многочисленных тканей, например, тройничных нервов, которые при активации высвобождают нейропептиды в мозговые оболочки, опосредуя нейрогенное воспаление, которое характеризуется расширением сосудов, выходом жидкости из сосудов и разрушением тучных клеток. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11): 1073-75 (2004). Биологические эффекты CGRP опосредованы рецептором CGRP (CGRP-R), состоящим из компонента, семикратно проходящего через мембрану, в сочетании с рецептор-ассоциированным мембранным белком (RAMP). Для CGRP-R также требуется активность белка рецепторного компонента (RCP), необходимая для эффективного соединения с аденилатциклазой через G-белки и продукции цАМФ. Doods, Н., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9): 1261-68 (2001).CGRP is released from numerous tissues, such as the trigeminal nerves, which, when activated, release neuropeptides into the meninges, mediating neurogenic inflammation, which is characterized by vasodilation, vasodilation, and mast cell destruction. Durham, P. L., New Eng. J. Med., 350 (11): 1073-75 (2004). The biological effects of CGRP are mediated by the CGRP receptor (CGRP-R), consisting of a seven-fold membrane-passing component, in combination with a receptor-associated membrane protein (RAMP). CGRP-R also requires receptor component protein (RCP) activity to efficiently bind to adenylate cyclase via G proteins and produce cAMP. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9): 1261-68 (2001).

Мигрень является нейро-сосудистым расстройством, поражающим приблизительно 10% взрослого населения в США, и, как правило, сопровождающимся интенсивными головными болями. Примерно 2030% страдающих мигренью испытывают ауру, включающую очаговые неврологические явления, предшествующие и/или сопровождающие это событие. Считают, что CGRP играет заметную роль в развитии мигрени. Например, выявлено, что концентрации CGRP в плазме повышаются в крови яремной вены в течение фазы головной боли при мигрени, в отличие от других нейропептидов. Кроме того, согласно Arulmozhi et al., у лиц, страдающих мигренью, выявлено следующее: (1) строгая корреляция между концентрацией CGRP в плазме и мигренью; (2) вливание CGRP приводит к мигренеподобной головной боли; (3) повышены исходные уровни CGRP; и (4) изменения уровней CGRP в плазме во время приступов мигрени значительно коррелируют с интенсивностью головной боли. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005).Migraine is a neurovascular disorder affecting approximately 10% of the adult population in the US and is usually accompanied by intense headaches. Approximately 20-30% of migraine sufferers experience an aura that includes focal neurological events preceding and/or accompanying the event. It is believed that CGRP plays a significant role in the development of migraine. For example, plasma concentrations of CGRP have been found to increase in jugular blood during the headache phase of migraine, in contrast to other neuropeptides. In addition, according to Arulmozhi et al., migraine sufferers show the following: (1) a strong correlation between plasma CGRP concentration and migraine; (2) CGRP infusion leads to migraine-like headache; (3) increased baseline CGRP levels; and (4) changes in plasma CGRP levels during migraine attacks correlate significantly with headache intensity. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005).

Одним из эффективных средств для лечения мигрени является введение триптанов, являющихся семейством лекарственных средств на основе триптамина, включающим суматриптан и ризатриптан. Члены указанного семейства обладают сродством к различным рецепторам серотонина, включая 5-HT1B, 5-HT_1d и 5-HT1F. Члены указанного семейства лекарственных средств селективно сужают сосуды головного мозга, а также оказывают сосудосуживающее действие на коронарные сосуды. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11): 1073-75 (2004). Существует теоретический риск коронарного спазма у пациентов с установленным заболеванием сердца после введения, и после приема триптанов изредка могут возникать кардиологические события. Следует отметить, что они противопоказаны для больных коронарной недостаточностью.One effective treatment for migraine is the administration of triptans, which are a family of tryptamine-based drugs including sumatriptan and rizatriptan. Members of this family have affinity for various serotonin receptors, including 5-HT1B, 5-HT _1d and 5-HT1F. Members of this family of drugs selectively constrict cerebral vessels and also exert a vasoconstrictive effect on the coronary vessels. Durham, PL, New Eng. J. Med., 350 (11): 1073-75 (2004). There is a theoretical risk of coronary spasm in patients with established cardiac disease following administration, and cardiac events may occasionally occur following triptan administration. It should be noted that they are contraindicated for patients with coronary insufficiency.

Аналогичным образом, боль часто можно устранить путем введения некоторых наркотических средств или нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Тем не менее, введение указанных терапевтических средств может привести к определенным отрицательным последствиям. НПВП способны вызывать почечную недостаточность, желудочно-кишечное кровотечение и дисфункцию печени. Наркотики способны вызывать тошноту, рвоту, нарушения психики и привыкание. Таким образом, для избегания некоторых из этих отрицательных последствий желательно выявить альтернативные способы лечения боли.Similarly, pain can often be relieved by the administration of certain narcotic drugs or non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). However, the introduction of these therapeutic agents can lead to certain negative consequences. NSAIDs can cause kidney failure, gastrointestinal bleeding, and liver dysfunction. Drugs can cause nausea, vomiting, mental disorders and addiction. Thus, in order to avoid some of these negative consequences, it is desirable to identify alternative treatments for pain.

Считается, что CGRP играет роль при многочисленных заболеваниях и нарушениях, включая, но не ограничиваясь мигренью, головными болями и болью.CGRP is believed to play a role in numerous diseases and disorders, including but not limited to migraines, headaches, and pain.

Например, согласно сообщениям, CGRP может коррелировать или даже являться причиной гиперактивности мочевого пузыря. Доказательства того, что CGRP может коррелировать с гиперактивностью мочевого пузыря, включают тот факт, что CGRP присутствует в мочевыводящих путях, DRG и спинном мозге (Wharton et al., 1986 Neurosci (3): 727), а также то, что афферентные С-волокна важны для проведения импульсов, участвующих в мочеиспускании, в спинной мозг (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol SciFor example, CGRP has been reported to be correlated with or even a cause of overactive bladder. Evidence that CGRP may correlate with bladder overactivity includes the fact that CGRP is present in the urinary tract, DRG, and spinal cord (Wharton et al., 1986 Neurosci (3): 727) and that afferent C- fibers are important for conducting urinary impulses to the spinal cord (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci

- 1 040241 (112): 128). Кроме того, сообщалось, что внутрипузырное введение ботокса подавляет CGRP и значительно снижает интервал между сокращениями в модели боли в мочевом пузыре, вызванной уксусной кислотой (Chuang et al., 2004 J Urol (172): 1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182): 786).- 1 040241 (112): 128). In addition, intravesical Botox has been reported to suppress CGRP and significantly reduce the interval between contractions in a model of acetic acid-induced bladder pain (Chuang et al., 2004 J Urol (172): 1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182): 786).

Доказательством того, что CGRP может являться причиной указанного состояния, является недавно опубликованная патентная заявка, содержащая данные, предположительно указывающие на то, что раскрытое в ней антитело против CGRP снижало количество сокращений мочевого пузыря в модели гиперактивности мочевого пузыря, вызванной скипидаром (Pfizer WO 2011/024113)).Evidence that CGRP may be the cause of this condition comes from a recently published patent application containing data purportedly indicating that an anti-CGRP antibody disclosed therein reduced the number of bladder contractions in a model of turpentine-induced overactive bladder (Pfizer WO 2011/ 024113)).

В связи с предполагаемой вовлеченностью CGRP в указанные и другие расстройства в данной области техники остается потребность в композициях и способах, используемых для профилактики или лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP, при отсутствии побочных эффектов. В данной области техники остается потребность в композициях или способах, снижающих или подавляющих заболевания или расстройства, связанные с CGRP, например мигрени, головные боли, гиперактивность мочевого пузыря и боль.In view of the alleged involvement of CGRP in these and other disorders, there remains a need in the art for compositions and methods useful in the prevention or treatment of diseases and disorders associated with CGRP, in the absence of side effects. There remains a need in the art for compositions or methods that reduce or suppress diseases or disorders associated with CGRP, such as migraines, headaches, overactive bladder and pain.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение направлено на специфические антитела и их фрагменты, обладающие специфичностью связывания с CGRP, в частности антитела, обладающие желательной эпитопной специфичностью, высоким сродством или авидностью и/или функциональными свойствами. Еще один вариант воплощения настоящего изобретения относится к антителам, описанным здесь, включающим последовательности V_H, V_L и CDR-полипептидов, описанные здесь, и полинуклеотиды, кодирующие их. Предпочтительный вариант воплощения настоящего изобретения направлен на химерные или гуманизированные антитела и их фрагменты (в том числе Fab-фрагменты), способные связываться с CGRP и/или ингибировать биологическую активность, опосредованную связыванием CGRP с рецептором CGRP (CGRP-R).The present invention is directed to specific antibodies and fragments thereof having CGRP binding specificity, in particular antibodies having the desired epitope specificity, high affinity or avidity and/or functional properties. Another embodiment of the present invention relates to antibodies described herein, including sequences of V _H , V _L and CDR polypeptides described here, and polynucleotides encoding them. A preferred embodiment of the present invention is directed to chimeric or humanized antibodies and fragments thereof (including Fab fragments) capable of binding to CGRP and/or inhibiting biological activity mediated by CGRP binding to the CGRP receptor (CGRP-R).

В другом предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения рассматриваются полноразмерные антитела и их Fab-фрагменты, ингибирующие продукцию цАМФ, зависимую от CGRPальфа, CGRP-бета и CGRP крысы. В дополнительном предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения рассматриваются полноразмерные антитела и их Fab-фрагменты, снижающие расширение сосудов у реципиента после введения.In another preferred embodiment, the present invention contemplates full-length antibodies and Fab fragments thereof that inhibit cAMP production dependent on rat CGRPalpha, CGRP-beta and rat CGRP. In a further preferred embodiment, the present invention contemplates full-length antibodies and Fab fragments thereof that reduce vasodilatation in the recipient after administration.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения химерные или гуманизированные антитела и их фрагменты (в том числе Fab-фрагменты), способные связываться с CGRP, можно применять в рамках способов, направленных на снижение, лечение или профилактику мигреней (с аурой или без нее), рака или опухолей, ангиогенеза, связанного с раковым или опухолевым ростом, ангиогенеза, связанного с выживанием рака или опухоли, потери массы тела, боли, гемиплегических мигреней, кластерных головных болей, мигренозной невралгии, хронических головных болей, головных болей напряжения, общих головных болей, приливов, хронической пароксизмальной гемикрании, вторичных головных болей вследствие основной структурной проблемы в области головы или шеи, черепной невралгии, синусных головных болей (например, связанных с синуситом) и головных болей или мигреней, вызванных аллергией. Антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению особенно полезны при лечении, профилактике, улучшении, контроле или снижении риска одного или более из следующих состояний или заболеваний: гиперактивность мочевого пузыря и другие заболевания мочевыделительной системы, включая инфекции, боли мочевого пузыря; хроническая боль; нейрогенное воспаление и боль при воспалении; невропатическая боль; боль в глазах; зубная боль; послеоперационная боль, боль, связанная с травмой, боль, связанная с ожогом, сахарный диабет; инсулиннезависимый сахарный диабет и другие воспалительные аутоиммунные заболевания, сосудистые расстройства; воспаление; артрит; гиперреактивность бронхов, астма; шок; сепсис; синдром отмены опиатов; устойчивость к морфину; приливы у мужчин и женщин; аллергический дерматит; псориаз; энцефалит; травма головного мозга; эпилепсия; нейродегенеративные заболевания; кожные заболевания, включая зуд, нейрогенное кожное покраснение, розовые угри и эритема; воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника, цистит; дисменорея и другие состояния, которые потенциально можно лечить, или предотвращать, или уменьшать их симптомы за счет антагонизма рецепторов CGRP. Особое значение имеет острое или профилактическое лечение головной боли, в том числе мигрени и кластерной головной боли, и других состояний, связанных с болью, а также гиперактивности мочевого пузыря.In yet another embodiment of the present invention, chimeric or humanized antibodies and fragments (including Fab fragments) capable of binding to CGRP can be used in methods aimed at reducing, treating or preventing migraines (with or without aura), cancer or tumors, angiogenesis associated with cancerous or tumor growth, angiogenesis associated with cancer or tumor survival, weight loss, pain, hemiplegic migraines, cluster headaches, migraine neuralgia, chronic headaches, tension headaches, general headaches, hot flashes, chronic paroxysmal hemicrania, secondary headaches due to an underlying structural problem in the head or neck, cranial neuralgia, sinus headaches (eg, associated with sinusitis), and headaches or migraines caused by allergies. The antibodies and antibody fragments of the present invention are particularly useful in treating, preventing, improving, controlling, or reducing the risk of one or more of the following conditions or diseases: overactive bladder and other diseases of the urinary system, including infections, bladder pain; chronic pain; neurogenic inflammation and inflammation pain; neuropathic pain; Pain in the eyes; toothache; postoperative pain, trauma-related pain, burn-related pain, diabetes mellitus; non-insulin-dependent diabetes mellitus and other inflammatory autoimmune diseases, vascular disorders; inflammation; arthritis; bronchial hyperreactivity, asthma; shock; sepsis; opiate withdrawal syndrome; morphine resistance; hot flashes in men and women; allergic dermatitis; psoriasis; encephalitis; brain injury; epilepsy; neurodegenerative diseases; skin disorders including pruritus, neurogenic skin erythema, rosacea and erythema; inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, cystitis; dysmenorrhea and other conditions that can potentially be treated or prevented or their symptoms reduced by CGRP receptor antagonism. Of particular importance is the acute or prophylactic treatment of headache, including migraine and cluster headache, and other conditions associated with pain, as well as overactive bladder.

В еще одном варианте воплощения изобретения химерные или гуманизированные антитела и их фрагменты (в том числе Fab-фрагменты), способные связываться с CGRP, можно предпочтительно применять в рамках способов, направленных на уменьшение, лечение или профилактику желудочнопищеводного рефлюкса и висцеральной боли, связанной с желудочно-пищеводным рефлюксом, диспепсией, синдромом раздраженного кишечника, воспалительным заболеванием кишечника, болезнью Крона, илеитом, язвенным колитом, почечной коликой, дисменореей, циститом, менструальным периодом, родами, менопаузой, простатитом или панкреатитом.In yet another embodiment of the invention, chimeric or humanized antibodies and fragments (including Fab fragments) capable of binding to CGRP can be preferably used in methods aimed at reducing, treating or preventing gastroesophageal reflux and visceral pain associated with gastro - esophageal reflux, dyspepsia, irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ileitis, ulcerative colitis, renal colic, dysmenorrhea, cystitis, menstrual period, childbirth, menopause, prostatitis or pancreatitis.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения указанные антитела и их гуманизированные варианты можно получить из иммунных клеток (В-лимфоцитов) кролика и отобрать на основе их гомологии (идентичности последовательности) с последовательностями эмбрионального типа человека. Для указанных антител может требоваться минимальная (или может вообще не требоваться) модификаIn yet another embodiment of the present invention, said antibodies and their humanized variants can be obtained from rabbit immune cells (B-lymphocytes) and selected based on their homology (sequence identity) with human germline sequences. These antibodies may require minimal (or no) modification.

- 2 040241 ция последовательности, что облегчает сохранение функциональных свойств после гуманизации. Еще один вариант воплощения настоящего изобретения направлен на фрагменты антител против CGRP, включая V_H, V_L и CDR-полипептиды, например, полученные из иммунных клеток кролика, и полинуклеотиды, кодирующие их, а также применение указанных фрагментов антител и полинуклеотидов, кодирующих их, для создания новых антител и полипептидных композиций, способных связываться с CGRP и/или комплексами CGRP/CGRP-R.- 2 040241 sequence, which facilitates the preservation of functional properties after humanization. Another embodiment of the present invention is directed to anti-CGRP antibody fragments, including V _H , V _L and CDR polypeptides, for example, derived from rabbit immune cells, and polynucleotides encoding them, as well as the use of these antibody fragments and polynucleotides encoding them, to create new antibodies and polypeptide compositions capable of binding to CGRP and/or CGRP/CGRP-R complexes.

Настоящее изобретение также рассматривает конъюгаты антител против CGRP и их связывающих фрагментов, конъюгированных с одной или более функциональных или обнаруживаемых молекул. Настоящее изобретение также рассматривает способы получения указанных химерных или гуманизированных антител против CGRP или антител против комплексов CGRP/CGRP-R и их связывающих фрагментов. В одном варианте воплощения связывающие фрагменты включают, но не ограничиваются Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv-фрагментами, SMIP (иммунофармацевтическими средствами на основе низкомолекулярных соединений), камелизированными антителами, нанотелами и IgNAR.The present invention also contemplates conjugates of anti-CGRP antibodies and their binding fragments conjugated to one or more functional or detectable molecules. The present invention also contemplates methods for producing said chimeric or humanized anti-CGRP antibodies or antibodies against CGRP/CGRP-R complexes and their binding fragments. In one embodiment, binding fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fv, scFv fragments, SMIP (Small Molecular Weight Immunopharmaceuticals), camelized antibodies, nanobodies, and IgNARs.

Варианты воплощения настоящего изобретения относятся к применению антител против CGRP и их связывающих фрагментов для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP или его аномальной экспрессией. Настоящее изобретение также относится к применению фрагментов антител против CGRP для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP или его аномальной экспрессией. Другие варианты воплощения настоящего изобретения относятся к продукции антител против CGRP или их фрагментов в рекомбинантных клетках-хозяевах, например, таких клетках млекопитающих как клетки СНО, NSO или HEK 293 или клетках дрожжей (например, диплоидных дрожжей, например, диплоидных Pichia) и других штаммах дрожжей.Embodiments of the present invention relate to the use of anti-CGRP antibodies and binding fragments thereof for the treatment of diseases and disorders associated with CGRP or its abnormal expression. The present invention also relates to the use of anti-CGRP antibody fragments for the treatment of diseases and disorders associated with CGRP or its abnormal expression. Other embodiments of the present invention relate to the production of anti-CGRP antibodies or fragments thereof in recombinant host cells, e.g. mammalian cells such as CHO, NSO or HEK 293 cells or yeast cells (e.g. diploid yeast, e.g. diploid Pichia) and other strains. yeast.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фиг. 1 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab1.In FIG. 1 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length antibody Ab1.

На фиг. 2 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab2.In FIG. 2 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab2 antibody.

На фиг. 3 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab3.In FIG. 3 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab3 antibody.

На фиг. 4 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab4.In FIG. 4 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab4 antibody.

На фиг. 5 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab5.In FIG. 5 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab5 antibody.

На фиг. 6 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab6.In FIG. 6 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab6 antibody.

На фиг. 7 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab7.In FIG. 7 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab7 antibody.

На фиг. 8 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab8.In FIG. 8 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab8 antibody.

На фиг. 9 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab9.In FIG. 9 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab9 antibody.

На фиг. 10 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab10.In FIG. 10 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab10 antibody.

На фиг. 11 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab11.In FIG. 11 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab11 antibody.

На фиг. 12 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab12.In FIG. 12 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab12 antibody.

На фиг. 13 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab13.In FIG. 13 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab13 antibody.

На фиг. 14 представлены полинуклеотидные и полипептидные последовательности, соответствующие полноразмерному антителу Ab14.In FIG. 14 shows the polynucleotide and polypeptide sequences corresponding to the full-length Ab14 antibody.

На фиг. 15 представлены данные твердофазного ИФА по связыванию CGRP-альфа, полученные согласно протоколу, описанному в примере 1 ниже, для антител Ab1, Ab2, Ab3 и Ab4.In FIG. 15 shows CGRP-alpha binding ELISA data obtained according to the protocol described in Example 1 below for antibodies Ab1, Ab2, Ab3 and Ab4.

На фиг. 16 представлены данные твердофазного ИФА по связыванию CGRP-альфа, полученные согласно протоколу, описанному в примере 1 ниже для антител Ab5, Ab6, Ab7 и Ab8.In FIG. 16 shows CGRP-alpha binding ELISA data obtained according to the protocol described in Example 1 below for antibodies Ab5, Ab6, Ab7 and Ab8.

На фиг. 17 представлены данные твердофазного ИФА по связыванию CGRP-альфа, полученные согласно протоколу, описанному в примере 1 ниже для антител Ab9, Ab10 и Ab14.In FIG. 17 shows CGRP-alpha binding ELISA data obtained according to the protocol described in Example 1 below for antibodies Ab9, Ab10 and Ab14.

На фиг. 18 представлены данные твердофазного ИФА по связыванию CGRP-альфа, полученные согласно протоколу, описанному в примере 1 ниже для антител Ab11, Ab12 и Ab13.In FIG. 18 shows CGRP-alpha binding ELISA data obtained according to the protocol described in Example 1 below for antibodies Ab11, Ab12 and Ab13.

На фиг. 19 продемонстрировано ингибирование CGRP-альфа-зависимой продукции цАМФ антителами Ab1, Ab2 и Ab4, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 19 shows the inhibition of CGRP-alpha-dependent cAMP production by Ab1, Ab2 and Ab4 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 20 продемонстрировано ингибирование CGRP-альфа-зависимой продукции цАМФ антителом Ab3, полученным в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 20 demonstrates the inhibition of CGRP-alpha-dependent cAMP production by Ab3 generated according to the protocol described in Example 1 below.

- 3 040241- 3 040241

На фиг. 21 продемонстрировано ингибирование CGRP-альфа-зависимой продукции цАМФ антителами Ab5 и Ab6, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 21 shows the inhibition of CGRP-alpha-dependent cAMP production by Ab5 and Ab6 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 22 продемонстрировано ингибирование CGRP-альфа-зависимой продукции цАМФ антителами Ab7, Ab8, Ab9 и Ab10, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 22 shows inhibition of CGRP-alpha dependent cAMP production by Ab7, Ab8, Ab9 and Ab10 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 23 продемонстрировано ингибирование CGRP-альфа-зависимой продукции цАМФ антителами Ab11, Ab12 и Ab13, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 23 shows inhibition of CGRP-alpha-dependent cAMP production by Ab11, Ab12 and Ab13 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 24 продемонстрировано ингибирование CGRP-альфа-зависимой продукции цАМФ антителом Ab14, полученным в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 24 shows inhibition of CGRP-alpha-dependent cAMP production by Ab14 prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 25 продемонстрировано ингибирование CGRP-бета-зависимой продукции цАМФ антителами Ab1, Ab2 и Ab3, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 25 shows inhibition of CGRP-beta-dependent cAMP production by antibodies Ab1, Ab2 and Ab3 prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 26 продемонстрировано ингибирование CGRP-бета-зависимой продукции цАМФ антителами Ab4, Ab5 и Ab6, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 26 demonstrates the inhibition of CGRP-beta-dependent cAMP production by Ab4, Ab5 and Ab6 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 27 продемонстрировано ингибирование CGRP-бета-зависимой продукции цАМФ антителами Ab7 и Ab8, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 27 shows inhibition of CGRP-beta-dependent cAMP production by Ab7 and Ab8 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 28 продемонстрировано ингибирование CGRP-бета-зависимой продукции цАМФ антителами Ab9, Ab10 и Ab14, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 28 shows inhibition of CGRP beta dependent cAMP production by Ab9, Ab10 and Ab14 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 29 продемонстрировано ингибирование CGRP-бета-зависимой продукции цАМФ антителами Ab11, Ab12 и Ab13, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 29 shows inhibition of CGRP beta-dependent cAMP production by Ab11, Ab12 and Ab13 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 30 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителами Ab1, Ab2, Ab4 и Ab5, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 30 shows inhibition of rat CGRP-dependent cAMP production by Ab1, Ab2, Ab4 and Ab5 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 31 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителами Ab3 и Ab6, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 31 shows inhibition of rat CGRP-dependent cAMP production by Ab3 and Ab6 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 32 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителами Ab7 и Ab8, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 32 shows inhibition of rat CGRP-dependent cAMP production by Ab7 and Ab8 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 33 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителом Ab9, полученным в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 33 shows inhibition of rat CGRP-dependent cAMP production by Ab9 prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 34 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителом Ab10, полученным в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 34 shows inhibition of rat CGRP dependent cAMP production by Ab10 prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 35 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителами Ab11 и Ab12, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 35 shows inhibition of rat CGRP-dependent cAMP production by Ab11 and Ab12 antibodies prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 36 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителом Ab13, полученным в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 36 shows inhibition of rat CGRP dependent cAMP production by Ab13 prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 37 продемонстрировано ингибирование продукции цАМФ, зависимой от CGRP крысы, антителом Ab14, полученным в соответствии с протоколом, описанным в примере 1 ниже.In FIG. 37 shows inhibition of rat CGRP dependent cAMP production by Ab14 prepared according to the protocol described in Example 1 below.

На фиг. 38 продемонстрировано ингибирование связывания CGRP, меченого радиоактивной меткой, с CGRP-R антителами Ab1-Ab13, полученными в соответствии с протоколом, описанным в примере 6 ниже.In FIG. 38 shows inhibition of binding of radiolabeled CGRP to CGRP-R antibodies Ab1-Ab13 prepared according to the protocol described in Example 6 below.

На фиг. 39 продемонстрировано снижение расширения сосудов при введении антител Ab3 и Ab6, полученных в соответствии с протоколом, описанным в примере 7 ниже, после введения капсайцина в модели крысы по сравнению с контрольным антителом.In FIG. 39 demonstrates the reduction in vasodilatation with administration of Ab3 and Ab6 antibodies prepared according to the protocol described in Example 7 below after administration of capsaicin in a rat model compared to a control antibody.

На фиг. 40 продемонстрировано снижение расширения сосудов при введении антитела Ab6, полученного в соответствии с протоколом, описанным в примере 7 ниже, в различных концентрациях после введения капсайцина в модели крысы по сравнению с контрольным антителом.In FIG. 40 demonstrates the reduction in vasodilatation with administration of the Ab6 antibody, prepared according to the protocol described in Example 7 below, at various concentrations after administration of capsaicin in a rat model compared to a control antibody.

На фиг. 41А-С показано положительное действие Ab3 на емкость мочевого пузыря во время вливания физиологического раствора. Животным вводили Ab3 или антитело отрицательного контроля, затем выполняли мониторинг во время вливания физиологического раствора в мочевой пузырь. ICI (график А) увеличился, a MF (график В) снизилась, что указывало на увеличение емкости мочевого пузыря. Различия в AM (график С) были в пределах стандартного отклонения и не являлись статистически значимыми. Звездочки указывают на статистически значимое улучшение (р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента для независимых выборок, сравнение с антителом отрицательного контроля). Обозначения: закрашенные столбики - лечение Ab3 (10 мг/кг); светлые столбики - антитело отрицательного контроля (10 мг/кг). Показатели ошибки означают стандартное отклонение. Сокращения: ICI - интервал между сокращениями; MF - частота мочеиспускания; AM - амплитуда мочеиспускания.In FIG. 41A-C show the positive effect of Ab3 on bladder capacity during saline infusion. Animals were treated with Ab3 or a negative control antibody, then monitored during infusion of saline into the bladder. ICI (graph A) increased and MF (graph B) decreased, indicating an increase in bladder capacity. The differences in AM (plot C) were within the standard deviation and were not statistically significant. Asterisks indicate a statistically significant improvement (p<0.05 by Student's t-test for independent samples, compared with negative control antibody). Legend: filled bars - Ab3 treatment (10 mg/kg); light bars - negative control antibody (10 mg/kg). Error rates mean standard deviation. Abbreviations: ICI - interval between contractions; MF - frequency of urination; AM - micturition amplitude.

На фиг. 42 показано действие Ab2 в модели невропатической боли. Механическую аллодинию индуцировали посредством операции Чанга (перевязка спинномозговых нервов L5/L6) и сравнивали степень чувствительности у животных, обработанных Ab2 (заштрихованные столбики), и контрольных животных (закрашенные столбики). Более высокие значения указывают на меньшую чувствительность. Средняя чувствительность была аналогична в день 13 (до введения Ab2), но улучшилась в дни 14 и 17. Показатели ошибки означают стандартную ошибку среднего.In FIG. 42 shows the action of Ab2 in a neuropathic pain model. Mechanical allodynia was induced by Chang's operation (L5/L6 spinal nerve ligation) and the degree of sensitivity was compared between Ab2-treated animals (solid bars) and control animals (solid bars). Higher values indicate less sensitivity. Mean sensitivity was similar on day 13 (before Ab2 administration) but improved on days 14 and 17. Error rates mean standard error of the mean.

На фиг. 43 показано обезболивающее действие Ab2 и морфина. Болевую чувствительность оценивали по времени отдергивания хвоста (ось у, секунды) для животных, которым вводили морфин (светлые квадраты), Ab2 (10 мг/кг, закрашенные треугольники) или среду-носитель (отрицательный контроль,In FIG. 43 shows the analgesic effects of Ab2 and morphine. Pain sensitivity was assessed by tail flick time (y-axis, seconds) for animals treated with morphine (open squares), Ab2 (10 mg/kg, solid triangles), or vehicle medium (negative control,

- 4 040241 светлые круги). Животные вырабатывали устойчивость к морфину и демонстрировали время отдергивания хвоста, аналогичное времени у контрольных животных, к 4 дню. В противоположность этому, животные, получавшие Ab2, демонстрировали устойчивое улучшение времени отдергивания хвоста в течение всего эксперимента (до дня 7). Улучшение у животных, получавших Ab2, было статистически значимым (р<0,05 согласно однофакторному дисперсионному анализу с последующим тестом Даннетта, сравнение со средой-носителем, помечено звездочками). Показатели ошибки означают стандартную ошибку среднего.- 4 040241 light circles). Animals developed resistance to morphine and exhibited a tail flick time similar to control animals by day 4. In contrast, animals treated with Ab2 showed a sustained improvement in tail flick time throughout the experiment (up to day 7). The improvement in animals treated with Ab2 was statistically significant (p<0.05 by one-way ANOVA followed by Dunnett's test, comparison with vehicle, marked with asterisks). The error rates mean the standard error of the mean.

На фиг. 44 показано обезболивающее действие Ab2 в зависимости от дозировки. В день 0 (после первого анализа времени отдергивания хвоста), крысам вводили антитело Ab2 в дозировке 1 мг/кг (закрашенные квадраты), 3 мг/кг (закрашенные треугольники вершиной вниз), или 10 мг/кг (закрашенные треугольники вершиной вверх), или среду-носитель (светлые круги), или антитело отрицательного контроля (светлые квадраты). Время отдергивания хвоста крысами в ответ на болезненный тепловой раздражитель оценивали ежедневно (более продолжительное время указывает на относительную нечувствительность к боли). Время отдергивания хвоста повышалось за счет введения Ab2 в зависимости от дозы. Звездочки указывают на статистически значимое увеличение времени отдергивания хвоста (р<0,05 согласно однофакторному дисперсионному анализу с последующим тестом Даннетта, сравнение со средойносителем). Показатели ошибки означают стандартную ошибку среднего.In FIG. 44 shows the analgesic effect of Ab2 as a function of dosage. On day 0 (after the first tail-flick time analysis), rats were treated with Ab2 at 1 mg/kg (solid squares), 3 mg/kg (closed triangles pointing down), or 10 mg/kg (filled triangles pointing up), or carrier medium (open circles) or negative control antibody (open squares). Tail flick time in response to a painful thermal stimulus was assessed daily (longer times indicate relative insensitivity to pain). Tail flick time was increased by administration of Ab2 in a dose dependent manner. Asterisks indicate a statistically significant increase in tail-flick time (p<0.05 by one-way ANOVA followed by Dunnett's test, vehicle comparison). The error rates mean the standard error of the mean.

На фиг. 45 показано обезболивающее действие Ab2 в комбинации с морфином и при отмене морфина после развития устойчивости к морфину. В день 0 (после первого анализа времени отдергивания хвоста) крысам вводили антитело Ab2 в дозировке 10 мг/кг (закрашенные квадраты и закрашенные треугольники) или среду-носитель (светлые круги). Затем крысам ежедневно вводили морфин в дни 1-10 (закрашенные квадраты) или только в дни 1-4 (закрашенные треугольники). Время отдергивания хвоста вначале значительно увеличилось у мышей, получавших морфин, но снизилась в последующие дни, что указывало на устойчивость к морфину. Однако у мышей, для которых отменили морфин после дня 4, время отдергивания хвоста увеличилось и оставалось повышенным в дни 5-8. Показатели ошибки означают стандартную ошибку среднего.In FIG. 45 shows the analgesic effect of Ab2 in combination with morphine and in morphine withdrawal after development of morphine resistance. On day 0 (after the first tail-flick time analysis), rats were dosed with 10 mg/kg Ab2 antibody (solid squares and solid triangles) or vehicle medium (open circles). The rats were then treated with morphine daily on days 1-10 (solid squares) or only on days 1-4 (solid triangles). Tail flick time initially increased significantly in mice treated with morphine, but decreased on subsequent days, indicating morphine resistance. However, in mice that were discontinued with morphine after day 4, tail flick time increased and remained elevated on days 5-8. The error rates mean the standard error of the mean.

На фиг. 46 показано действие Ab2 в модели висцеральной боли у крыс. Висцеральную боль количественно оценивали, измеряя порог растяжения толстой кишки (более высокие значения указывают на меньшую чувствительность) для животных, не получавших препаратов (светлый столбик), или животных, получавших TNBS для стимуляции хронической гиперчувствительности толстой кишки, которые получали антитело отрицательного контроля (закрашенные столбики) или Ab2 (заштрихованные столбики). Гиперчувствительность облегчалась на 27% у животных, получавших Ab2, и порог растяжения значительно улучшился за счет введения Ab2 (р<0,05 согласно t-критерию Стьюдента по сравнению с группой, получавшей TNBS + отрицательный контроль). Показатели ошибки означают стандартную ошибку среднего.In FIG. 46 shows the effect of Ab2 in a rat visceral pain model. Visceral pain was quantified by measuring the threshold for colonic distension (higher values indicate less sensitivity) in untreated animals (light bars) or animals treated with TNBS to stimulate chronic colonic hypersensitivity that received a negative control antibody (solid bars). ) or Ab2 (shaded bars). Hypersensitivity was alleviated by 27% in animals treated with Ab2, and the stretch threshold was significantly improved by administration of Ab2 (p<0.05 by Student's t-test compared with the group treated with TNBS + negative control). The error rates mean the standard error of the mean.

Подробное описание предпочтительных вариантов воплощенияDetailed Description of Preferred Embodiments

ОпределенияDefinitions

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами, протоколами, линиями клеток, видами или родами животных и реагентами, описанными здесь, поскольку все это может изменяться. Кроме того, следует понимать, что терминология, которая используется здесь, служит лишь для целей описания конкретных вариантов воплощения и не должна рассматриваться в качестве ограничивающей объем настоящего изобретения, которые должны ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Как используется здесь, формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если контекст не диктует иное в явной форме. Так, например, ссылка на клетку включает множество таких клеток, а ссылка на указанный белок включает ссылку на один или более белков и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники, и так далее. Если иное не указано явным образом, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют значения, совпадающие с общепринятыми среди специалистов в области, к которой относится настоящее изобретение.It should be understood that the present invention is not limited to the specific methods, protocols, cell lines, animal species or genera, and reagents described herein, as all of these may vary. In addition, it should be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments only and should not be construed as limiting the scope of the present invention, which should only be limited by the appended claims. As used here, the singular forms include the plural entities being designated, unless the context explicitly dictates otherwise. Thus, for example, a reference to a cell includes a plurality of such cells, and a reference to a specified protein includes a reference to one or more proteins and their equivalents known to those skilled in the art, and so on. Unless otherwise expressly indicated, all technical and scientific terms used in this document have the same meanings as generally accepted among specialists in the field to which the present invention relates.

Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP): как используется здесь, CGRP охватывает не только следующие аминокислотные последовательности CGRP-альфа и CGRP-бета Homo sapiens, доступные в American Peptides (Саннивейл, штат Калифорния, США) и Bachem (Торранс, штат Калифорния, США):Calcitonin gene-related peptide (CGRP): As used herein, CGRP covers more than the following amino acid sequences CGRP-alpha and CGRP-beta Homo sapiens available from American Peptides (Sunnyvale, CA, USA) and Bachem (Torrance, CA) , USA):

CGRP-альфа: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 281), где N-концевой фенилаланин амидирован;CGRP-alpha: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAAF-NH2 (SEQ ID NO: 281) wherein the N-terminal phenylalanine is amidated;

CGRP-бета: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 282), где N-концевой фенилаланин амидирован;CGRP-beta: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 282) wherein the N-terminal phenylalanine is amidated;

но и любые мембрано-связанные формы этих аминокислотных последовательностей CGRP, а также мутантные формы (мутеины), сплайс-варианты, изоформы, ортологи, гомологи и варианты указанной последовательности.but also any membrane-bound forms of these CGRP amino acid sequences, as well as mutant forms (muteins), splice variants, isoforms, orthologs, homologues, and variants of said sequence.

Виды дрожжей, компетентные по спариванию: в настоящем изобретении предполагается широкий охват любых диплоидных или тетраплоидных дрожжей, которые можно вырастить в культуре. ТакиеMating Competent Yeast Species: The present invention contemplates a broad scope for any diploid or tetraploid yeast that can be grown in culture. Such

- 5 040241 виды дрожжей могут существовать в гаплоидной, диплоидной или другой полиплоидной форме. Клетки данной плоидности могут, при соответствующих условиях, размножаться в этой форме на протяжении неопределенного количества поколений. Диплоидные клетки могут также спорулировать, образуя гаплоидные клетки. Последовательное спаривание может привести к получению тетраплоидных штаммов за счет дальнейшего спаривания или слияния клеток диплоидных штаммов. Настоящее изобретение предусматривает использование гаплоидных дрожжей, а также диплоидных или других полиплоидных клеток дрожжей, полученных, например, путем спаривания или слияния сферопластов.- 5 040241 yeast species can exist in haploid, diploid or other polyploid form. Cells of a given ploidy can, under appropriate conditions, reproduce in this form for an indefinite number of generations. Diploid cells can also sporulate to form haploid cells. Sequential mating can result in tetraploid strains through further mating or cell fusion of diploid strains. The present invention provides for the use of haploid yeast, as well as diploid or other polyploid yeast cells obtained, for example, by mating or fusion of spheroplasts.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения дрожжи, компетентные по спариванию, являются членом семейства Saccharomycetaceae, которое включает роды Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; и Zygosaccharomyces. Другие типы дрожжей, потенциально применимых в настоящем изобретении, включают Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium и Filobasidella.In one embodiment of the present invention, the mating competent yeast is a member of the Saccharomycetaceae family, which includes the genera Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazakhstan; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; and Zygosaccharomyces. Other types of yeast potentially useful in the present invention include Yarrowia; Rhodosporidium; Candida Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; bullera; Leucosporidium and Filobasidella.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения дрожжи, компетентные по спариванию, являются членом рода Pichia. В другом предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения дрожжи рода Pichia, компетентные по спариванию, принадлежат к одному из следующих видов: Pichia pastoris, Pichia methanolica и Hansenula polymorpha (Pichia angusta). В особенно предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения дрожжи рода Pichia, компетентные по спариванию, принадлежат к виду Pichia pastoris.In a preferred embodiment of the present invention, the mating competent yeast is a member of the genus Pichia. In another preferred embodiment of the present invention, mating-competent yeasts of the genus Pichia belong to one of the following species: Pichia pastoris, Pichia methanolica and Hansenula polymorpha (Pichia angusta). In a particularly preferred embodiment of the present invention, mating competent yeasts of the genus Pichia belong to the species Pichia pastoris.

Гаплоидная дрожжевая клетка: клетка, содержащая одну копию каждого гена с его нормальной геномной (хромосомной) комплементарной цепью.Haploid yeast cell: A cell containing one copy of each gene with its normal genomic (chromosomal) complementary chain.

Полиплоидная дрожжевая клетка: клетка, содержащая более одной копии каждого гена с его нормальной геномной (хромосомной) комплементарной цепью.Polyploid yeast cell: A cell containing more than one copy of each gene with its normal genomic (chromosomal) complementary chain.

Диплоидная дрожжевая клетка: клетка, содержащая две копии (аллеля) практически каждого гена с его нормальной геномной комплементарной цепью, обычно получаемая путем слияния (спаривания) двух гаплоидных клеток.Diploid yeast cell: A cell containing two copies (alleles) of virtually every gene with its normal genomic complementary strand, usually produced by the fusion (pairing) of two haploid cells.

Тетраплоидная дрожжевая клетка: клетка, содержащая четыре копии (аллеля) практически каждого гена с его нормальной геномной комплементарной цепью, обычно получаемая путем слияния (спаривания) двух гаплоидных клеток. Тетраплоиды могут нести две, три, четыре или более различных экспрессионных кассеты. Такие тетраплоиды можно получить у S.cerevisiae путем селективного спаривания гомозиготных гетероталличных а/а и альфа/альфа-диплоидов, а у Pichia - путем последовательного спаривания гаплоидов с получением ауксотрофных диплоидов. Например, гаплоид [met his] можно спарить с гаплоидом [ade his], получая диплоид [his], а гаплоид [met arg] можно спарить с гаплоидом [ade arg], получая диплоид [arg]; затем скрещивание диплоид [his] x диплоид [arg] позволяет получить тетраплоидный прототроф. Специалист в данной области техники должен понимать, что сведения о преимуществах и применении диплоидных клеток также могут быть применимы к тетраплоидным клеткам.Tetraploid yeast cell: A cell containing four copies (alleles) of virtually every gene with its normal genomic complementary chain, usually obtained by the fusion (pairing) of two haploid cells. Tetraploids can carry two, three, four or more different expression cassettes. Such tetraploids can be obtained in S. cerevisiae by selective mating of homozygous heterothallic a/a and alpha/alpha diploids, and in Pichia by sequential mating of haploids to produce auxotrophic diploids. For example, a haploid [met his] can be paired with a haploid [ade his] to produce a diploid [his], and a haploid [met arg] can be paired to a haploid [ade arg] to produce a diploid [arg]; then crossing diploid [his] x diploid [arg] produces a tetraploid prototroph. One of skill in the art will appreciate that the benefits and uses of diploid cells may also be applicable to tetraploid cells.

Спаривание дрожжей: процесс, при котором две гаплоидные дрожжевые клетки естественным образом сливаются, образуя одну диплоидную дрожжевую клетку.Yeast mating: The process by which two haploid yeast cells naturally fuse to form one diploid yeast cell.

Мейоз: процесс, при котором диплоидная дрожжевая клетка подвергается редукционному делению, образуя четыре гаплоидных споры. Каждая спора затем может прорасти и образовать линию гаплоидных вегетативно растущих клеток.Meiosis: The process in which a diploid yeast cell undergoes reductional division, producing four haploid spores. Each spore can then germinate and form a line of haploid vegetatively growing cells.

Селектируемый маркер: селектируемый маркер является геном или фрагментом гена, придающим клетке, принимающей указанный ген, например, за счет трансформации, фенотип роста (физическую характеристику роста). Селективный маркер позволяет указанной клетке выжить и развиваться в селективной ростовой среде в условиях, когда клетки, не получившие указанного селективного маркерного гена, не могут расти. Селективные маркерные гены в целом делятся на несколько типов, в том числе положительные селективные маркерные гены, например ген, придающий клетке устойчивость к антибиотику или другому лекарственному средству, температуре при скрещивании двух мутантов, чувствительных к температуре (ts-мутантов) или трансформации ts-мутанта; отрицательные селективные маркерные гены, например ген биосинтеза, который придает клетке способность к росту в среде без определенного питательного вещества, необходимого для всех клеток, которые не содержат указанного гена биосинтеза, или мутантный ген биосинтеза, придающий клетке неспособность получать ростовое преимущество перед клетками, не имеющими гена дикого типа; и т.п. Подходящие маркеры включают, но не ограничиваются ими: ZEO; G418; LYS3; МЕТ1; МЕТ3a; ADE1; ADE3; URA3; и т.п.Selectable marker: A selectable marker is a gene or gene fragment that confers a growth phenotype (a physical characteristic of growth) to a cell receiving said gene, for example by transformation. The selectable marker allows said cell to survive and develop in a selective growth medium under conditions where cells that do not receive said selectable marker gene cannot grow. Selectable marker genes are broadly classified into several types, including positive selective marker genes, such as a gene that confers resistance to an antibiotic or other drug in a cell, temperature by crossing two temperature-sensitive mutants (ts-mutants), or transforming a ts-mutant ; negative selective marker genes, such as a biosynthetic gene that gives the cell the ability to grow in an environment without a specific nutrient required for all cells that do not contain the specified biosynthetic gene, or a mutated biosynthetic gene that makes the cell unable to gain a growth advantage over cells that do not have wild-type gene; and so on. Suitable markers include, but are not limited to: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; and so on.

Экспрессирующий вектор: указанные ДНК-векторы содержат элементы, которые облегчают манипулирование экспрессией чужеродного белка в клетке-хозяине-мишени. В целях удобства манипулирование последовательностями и продукция ДНК для трансформации сначала выполняется в бактериальном хозяине, например Е. coli, и, как правило, векторы должны содержать последовательности для облегчения таких манипуляций, включая бактериальный сайт инициации репликации и соответствующий бактериальный селективный маркер. Селективные маркеры кодируют белки, необходимые для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращенных в селективной культуральной среде.Expression vector: These DNA vectors contain elements that facilitate the manipulation of foreign protein expression in the target host cell. For convenience, sequence manipulation and production of DNA for transformation is first performed in a bacterial host, such as E. coli, and generally vectors should contain sequences to facilitate such manipulation, including a bacterial origin of replication and an appropriate bacterial selectable marker. Selectable markers encode proteins necessary for the survival or growth of transformed host cells grown in a selective culture medium.

- 6 040241- 6 040241

Клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим селективный ген, не выживут в указанной культуральной среде. Типичные селективные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, (b) восполняют ауксотрофную недостаточность или (с) поставляют критические питательные вещества, недоступные в сложных средах. Типичные векторы и способы трансформации дрожжей описаны, например, в Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.Host cells not transformed with the vector containing the selection gene will not survive in said culture medium. Typical selective genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, (b) compensate for auxotrophic deficiencies, or (c) supply critical nutrients not available in difficult environments. Exemplary yeast transformation vectors and methods are described in, for example, Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Экспрессирующие векторы для использования в способах по изобретению также должны включать специфические последовательности дрожжей, в том числе селективный ауксотрофный или лекарственный маркер для идентификации трансформированных штаммов дрожжей. Лекарственный маркер препарат можно в дальнейшем использовать для амплификации количества копий вектора в дрожжевой клетке-хозяине.Expression vectors for use in the methods of the invention should also include specific yeast sequences, including a selectable auxotrophic or drug marker for identifying transformed yeast strains. The drug marker drug can then be used to amplify the number of copies of the vector in the yeast host cell.

Интересующая исследователя последовательность, кодирующая полипептид, функционально связана с регуляторными последовательностями транскрипции и трансляции, обеспечивающими экспрессию полипептида в дрожжевых клетках. Указанные компоненты вектора могут включать один или более из энхансерного элемента, промотора и терминатора транскрипции, но не ограничиваются ими. Кроме того, можно включать последовательности для секреции полипептида, например сигнальную последовательность и т.п. Дрожжевой сайт инициации репликации не обязателен, поскольку векторы экспрессии часто интегрируются в геном дрожжей. В одном варианте воплощения настоящего изобретения представляющий интерес полипептид функционально связан или объединен с последовательностями, обеспечивающими оптимизированную секрецию полипептида из диплоидных клеток дрожжей.The sequence of interest to the researcher, encoding the polypeptide, is functionally linked to the transcriptional and translational regulatory sequences that ensure the expression of the polypeptide in yeast cells. These vector components may include, but are not limited to, one or more of an enhancer element, a promoter, and a transcription terminator. In addition, sequences for secreting the polypeptide, such as a signal sequence and the like, may be included. A yeast origin of replication is not required as expression vectors are often integrated into the yeast genome. In one embodiment, the polypeptide of interest is operably linked to or combined with sequences that provide optimized secretion of the polypeptide from diploid yeast cells.

Нуклеиновые кислоты являются функционально связанными, если они вступают в функциональное взаимодействие с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК сигнальной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде белкапредшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию этой последовательности. В общем случае функционально связанные означает, что связанные последовательности ДНК непрерывны, а в случае секреторного лидера, непрерывны и в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть непрерывными. Связывание осуществляют лигированием в подходящих сайтах рестрикции или, в качестве альтернативы, с помощью способа ПЦР/рекомбинации, известного специалистам в данной области техники (Gateway® Technology; Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния, США). Если такие сайты отсутствуют, в соответствии с общепринятой практикой используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.Nucleic acids are operably linked if they enter into a functional interaction with another nucleotide sequence. For example, a DNA signal sequence is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a precursor protein involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of that sequence. In general, operably linked means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader, contiguous and in-frame. However, enhancers do not have to be continuous. Binding is accomplished by ligation at suitable restriction sites, or alternatively by a PCR/recombination method known to those skilled in the art (Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). If such sites are not present, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with common practice.

Промоторы являются нетранслируемыми последовательностями, расположенными выше (5') стартового кодона структурного гена (обычно в пределах приблизительно от 100 до 1000 п.о.), которые контролируют транскрипцию и трансляцию определенных нуклеотидных последовательностей, с которыми они функционально связаны. Такие промоторы делятся на несколько классов: индуцибельные, конститутивные и репрессируемые промоторы (повышающие уровни транскрипции в ответ на отсутствие репрессора). Индуцибельные промоторы могут инициировать повышенные уровни транскрипции ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на некоторые изменения условий культивирования, например, в присутствии или в отсутствие питательного вещества или при изменении температуры.Promoters are non-translated sequences located upstream (5') of the start codon of a structural gene (typically within about 100 to 1000 bp) that control transcription and translation of the specific nucleotide sequences to which they are operably linked. Such promoters are divided into several classes: inducible, constitutive and repressible promoters (increasing transcription levels in response to the absence of a repressor). Inducible promoters can initiate increased levels of transcription of the DNA under their control in response to certain changes in culture conditions, such as in the presence or absence of a nutrient, or a change in temperature.

Фрагмент дрожжевого промотора может также служить в качестве сайта гомологичной рекомбинации и интеграции экспрессирующего вектора в указанный сайт генома дрожжей; в качестве альтернативы, в качестве сайта гомологичной рекомбинации используется селективный маркер. Трансформация Pichia описана в Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.The yeast promoter fragment may also serve as a site for homologous recombination and integration of the expression vector into said site in the yeast genome; alternatively, a selectable marker is used as the homologous recombination site. Pichia transformation is described in Cregg et al. (1985) Mol. cell. Biol. 5:3376-3385.

Примеры подходящих промоторов Pichia включают промотор АОХ1 (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); промотор ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13): 1097-108); промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); и промотор FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216(1): 93-102). Промотор GAP является сильным конститутивным промотором, а промоторы АОХ и FLD1 являются индуцибельными.Examples of suitable Pichia promoters include the AOX1 promoter (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); ICL1 promoter (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13): 1097-108); glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) promoter (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); and the FLD1 promoter (Shen et al. (1998) Gene 216(1): 93-102). The GAP promoter is a strong constitutive promoter, and the AOX and FLD1 promoters are inducible.

Другие промоторы дрожжей включают ADH1, промотор алкогольдегидрогеназы II, GAL4, РНО3, РНО5, Pyk и химерные промоторы, полученные из них. Кроме того, в настоящем изобретении можно применять не-дрожжевые промоторы, например промоторы млекопитающих, насекомых, растений, рептилий, амфибий, вирусов и птиц. В наиболее типичном случае промотор включает промотор млекопитающих (потенциально эндогенный для экспрессируемых генов) или включает дрожжевой или вирусный промотор, который обеспечивает эффективную транскрипцию в дрожжевых системах.Other yeast promoters include ADH1, alcohol dehydrogenase II promoter, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk, and chimeric promoters derived therefrom. In addition, non-yeast promoters such as mammalian, insect, plant, reptile, amphibian, viral, and avian promoters can be used in the present invention. Most typically, the promoter comprises a mammalian promoter (potentially endogenous to the expressed genes) or includes a yeast or viral promoter that provides for efficient transcription in yeast systems.

Интересующие исследователя полипептиды можно рекомбинантно получать не только напрямую, но и в качестве гибридного полипептида с гетерологичным полипептидом, например сигнальной последовательностью или другим полипептидом, содержащим специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. В общем случае сигнальная последовательность может являться компонентом вектора или частью кодирующей последовательности полипептида, вставленной в вектор. Предпочтительно выбираемой гетерологичной сигнальной последовательностью является последовательPolypeptides of interest can be produced recombinantly not only directly, but also as a hybrid polypeptide with a heterologous polypeptide, such as a signal sequence or other polypeptide containing a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide. In general, the signal sequence may be a component of the vector or part of a polypeptide coding sequence inserted into the vector. Preferably, the heterologous signal sequence chosen is the sequence

- 7 040241 ность, распознаваемая и подвергаемая процессингу посредством одного из стандартных путей, доступных в клетке-хозяине. Считается, что сигнальная последовательность пре-про-фактора альфа S. cerevisiae является эффективной при секреции различных рекомбинантных белков из P. pastoris. Другие дрожжевые сигнальные последовательности включают сигнальную последовательность альфа-фактора спаривания, сигнальную последовательность инвертазы и сигнальные последовательности, полученные из других секретируемых полипептидов дрожжей. Кроме того, указанные сигнальные пептидные последовательности можно модифицировать для обеспечения повышенной секреции в диплоидных дрожжевых экспрессионных системах. Другие представляющие интерес сигнальные последовательности для секреции также включают сигнальные последовательности млекопитающих, которые могут быть гетерологичными по отношению к секретируемому белку или могут являться нативной последовательностью секретируемого белка. Сигнальные последовательности включают последовательности предшественников пептидов, а в некоторых случаях могут включать последовательности пропептидов. Многие такие сигнальные последовательности известны в данной области техники, включая сигнальные последовательности, обнаруженные в цепях иммуноглобулина, например последовательность пре-про-токсина K28, РНА-Е, FACE, MCP-1 человека, сигнальные последовательности человеческого сывороточного альбумина, тяжелую цепь Ig человека, легкую цепь Ig человека и т.п. Например, см. Hashimoto et al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); и Kobayashi et al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).- 7 040241 a property recognized and processed through one of the standard pathways available in the host cell. The S. cerevisiae pre-pro factor alpha signal sequence is believed to be effective in the secretion of various recombinant proteins from P. pastoris. Other yeast signal sequences include the alpha mating factor signal sequence, the invertase signal sequence, and signal sequences derived from other secreted yeast polypeptides. In addition, these signal peptide sequences can be modified to provide increased secretion in diploid yeast expression systems. Other secretion signal sequences of interest also include mammalian signal sequences, which may be heterologous to the secreted protein or may be native to the secreted protein. Signal sequences include sequences of precursor peptides, and in some cases may include sequences of propeptides. Many such signal sequences are known in the art, including signal sequences found in immunoglobulin chains, e.g., human pre-protoxin K28, PHA-E, FACE, MCP-1, human serum albumin signal sequences, human Ig heavy chain, a human Ig light chain; and the like. For example, see Hashimoto et al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); and Kobayashi et al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).

Транскрипцию можно увеличить путем инсерции последовательности активатора транскрипции в вектор. Указанные активаторы являются цис-действующими элементами ДНК, обычно длиной от приблизительно 10 до 300 п.о., которые действуют на промотор, усиливая транскрипцию с него. Энхансеры транскрипции являются сравнительно независимыми по отношению к ориентации и положению, обнаруживаясь 5'- и 3'- по отношению к единице транскрипции в пределах интрона, а также внутри самой кодирующей последовательности. Энхансер можно внедрить в экспрессирующий вектор в 5' или 3'-направлении от кодирующей последовательности, однако предпочтительно в 5'-направлении от промотора.Transcription can be increased by inserting a transcription activator sequence into a vector. Said activators are cis-acting DNA elements, typically about 10 to 300 bp in length, that act on a promoter to increase transcription from it. Transcriptional enhancers are relatively independent of orientation and position, being found 5' and 3' to the transcription unit within the intron as well as within the coding sequence itself. The enhancer can be inserted into the expression vector 5' or 3' from the coding sequence, but preferably 5' from the promoter.

Векторы для экспрессии, используемые в клетках-хозяевах эукариот, также могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны в 3'-направлении от кодона терминации транскрипции в нетранслируемых областях эукариотической или вирусной ДНК или кДНК. Указанные области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК.Expression vectors used in eukaryotic host cells may also contain sequences necessary for terminating transcription and stabilizing the mRNA. Such sequences are typically accessible 3' from a transcription termination codon in untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA.

Для конструирования подходящих векторов, содержащих один или более из вышеперечисленных компонентов, используют стандартные техники лигирования или способы ПЦР/рекомбинации. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, оптимизируют и повторно лигируют в форме, желательной для получения требуемых плазмид, или обрабатывают с помощью способов рекомбинации. Для анализа с целью подтверждения правильности последовательностей сконструированных плазмид смеси, полученные при лигировании, используют для трансформации клеток-хозяев, и в случае необходимости выполняют отбор успешных трансформантов по устойчивости к антибиотикам (например, ампициллину или зеоцину). Плазмиды из трансформантов выделяют, анализируют с помощью гидролиза эндонуклеазой рестрикции и/или секвенируют.Suitable vectors containing one or more of the above components are constructed using standard ligation techniques or PCR/recombination methods. The isolated plasmids or DNA fragments are digested, optimized and religated in the form desired to obtain the desired plasmids, or processed using recombination techniques. For analysis to validate the sequences of the constructed plasmids, ligation mixtures are used to transform host cells and, if necessary, select successful transformants for antibiotic resistance (eg, ampicillin or zeocin). Plasmids from transformants are isolated, analyzed by restriction endonuclease digestion and/or sequenced.

В качестве альтернативы рестрикции и лигированию фрагментов для инсерции последовательностей ДНК в вектор можно использовать способы рекомбинации, основанные на att-сайтах и ферментах рекомбинации. Такие способы описаны, например, в статье Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 55:913-949; и известны специалистам в данной области техники. Такие способы используют межмолекулярную рекомбинацию ДНК, опосредуемую смесью рекомбинантных белков, кодируемых фагом лямбда и Е. coli. Рекомбинация происходит между специфическими сайтами присоединения (att) на взаимодействующих молекулах ДНК. Описание att-сайтов см. в Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. Сегменты ДНК, фланкирующие сайты рекомбинации, меняются местами таким образом, что после рекомбинации указанные att-сайты являются гибридными последовательностями, состоящими из последовательностей, предоставленных каждым исходным вектором. Рекомбинация может происходить между ДНК любой топологии.As an alternative to restriction and ligation of fragments, recombination techniques based on att sites and recombination enzymes can be used to insert DNA sequences into a vector. Such methods are described, for example, in Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 55:913-949; and known to those skilled in the art. Such methods use intermolecular DNA recombination mediated by a mixture of recombinant proteins encoded by lambda phage and E. coli. Recombination occurs between specific attachment sites (att) on interacting DNA molecules. For a description of att sites, see Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. The DNA segments flanking the recombination sites are interchanged such that, after recombination, said att sites are hybrid sequences consisting of the sequences provided by each parent vector. Recombination can occur between DNA of any topology.

Att-сайты можно внедрить в интересующую исследователя последовательность путем лигирования интересующей последовательности с соответствующим вектором; получения ПНР-продукта, содержащего сайты att В, за счет использования специфических праймеров; получения библиотеки кДНК клонированной в соответствующем векторе, содержащем att-сайты; и т.п.Att sites can be introduced into the researcher's sequence of interest by ligating the sequence of interest to an appropriate vector; obtaining a NDP product containing att B sites through the use of specific primers; obtaining a cDNA library cloned into an appropriate vector containing att sites; and so on.

Фолдинг, как используется здесь, относится к трехмерной структуре полипептидов и белков, где взаимодействия между аминокислотными остатками стабилизируют структуру. Хотя нековалентные взаимодействия играют важную роль в определении структуры, обычно исследуемые белки содержат внутри- и/или межмолекулярные ковалентные дисульфидные связи, образованные двумя остатками цистеина. Для естественных белков и полипептидов или их производных и вариантов правильный фолдинг обычно является механизмом, приводящим к оптимальной биологической активности; его можно контролировать с помощью анализов активности, например связывания лигандов, ферментативной активности и т.д.Folding, as used herein, refers to the three-dimensional structure of polypeptides and proteins, where interactions between amino acid residues stabilize the structure. Although non-covalent interactions play an important role in structure determination, commonly studied proteins contain intra- and/or intermolecular covalent disulfide bonds formed by two cysteine residues. For natural proteins and polypeptides or their derivatives and variants, correct folding is usually the mechanism leading to optimal biological activity; it can be monitored by activity assays, eg ligand binding, enzymatic activity, etc.

- 8 040241- 8 040241

В некоторых случаях, например, если желательный продукт имеет синтетическое происхождение, анализы, основанные на биологической активности, имеют меньшее значение. Правильный фолдинг таких молекул можно определить на основе физических свойств, энергетических соображений, моделирования и т.п.In some cases, for example, if the desired product is of synthetic origin, assays based on biological activity are of lesser value. The correct folding of such molecules can be determined based on physical properties, energy considerations, modeling, and the like.

Хозяина для экспрессии можно дополнительно модифицировать путем внедрения последовательностей, кодирующих один или более ферментов, улучшающих фолдинг и образование дисульфидных связей, т.е. фолдаз, шаперонинов и т.д. Такие последовательности можно конститутивно или индуцибельно экспрессировать в дрожжевой клетке-хозяине с помощью векторов, маркеров и т.д., как известно в данной области техники. В предпочтительном случае последовательности, включая транскрипционные регуляторные элементы, достаточные для желательной картины экспрессии, стабильно интегрированы в геном дрожжей путем сайт-специфической методологии.The host for expression can be further modified by introducing sequences encoding one or more enzymes that improve folding and disulfide bonding, ie. foldase, chaperonins, etc. Such sequences can be constitutively or inducibly expressed in the yeast host cell using vectors, markers, etc., as is known in the art. Preferably, sequences, including transcriptional regulatory elements sufficient for the desired expression pattern, are stably integrated into the yeast genome by a site-specific methodology.

Например, PDI эукариот является не только эффективным катализатором окисления цистеина белка и изомеризации дисульфидных связей, но также проявляет шаперонную активность. Совместная экспрессия PDI может облегчить продукцию активных белков, содержащих множественные дисульфидные связи. Кроме того, представляет интерес экспрессия BIP (белок, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулинов); циклофилина; и т.п. В одном варианте воплощения настоящего изобретения каждый из гаплоидных родительских штаммов экспрессирует собственный фермент фолдинга, например, один штамм может экспрессировать BIP, а другой штамм может экспрессировать PDI или их комбинации.For example, eukaryotic PDI is not only an effective catalyst for protein cysteine oxidation and disulfide bond isomerization, but also exhibits chaperone activity. Co-expression of PDI can facilitate the production of active proteins containing multiple disulfide bonds. In addition, the expression of BIP (Immunoglobulin Heavy Chain Binding Protein) is of interest; cyclophilin; and so on. In one embodiment of the present invention, each of the haploid parental strains expresses its own folding enzyme, for example, one strain may express BIP and another strain may express PDI, or combinations thereof.

Термины желательный белок или желательное антитело взаимозаменяемы и в целом относятся к исходному антителу, специфичному по отношению к мишени, т.е. CGRP, или химерному или гуманизированному антителу, или его связывающему фрагменту, получаемому из него, как описано здесь. Термин антитело предназначен для включения любой молекулярной структуры определенной формы, содержащей полипептидную цепь, которая соответствует эпитопу и распознает его, причем одно или более нековалентных связывающих взаимодействий стабилизируют комплекс между указанной молекулярной структурой и эпитопом. Молекула-прототип антитела является иммуноглобулином, и все типы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD и т.д., из всех источников, например человека, грызунов, кролика, коровы, овцы, свиньи, собаки, других млекопитающих, кур, других птиц и т.д., считаются антителами. Предпочтительным источником для продукции антител, пригодным в качестве исходного материала согласно изобретению, являются кролики. Описаны кодирующие последовательности различных антител; другие последовательности можно найти с помощью способов, известных в данной области техники. Их примеры включают химерные антитела, антитела человека и антитела других млекопитающих, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела (например, scFv), камелизированные антитела, нанотела, IgNAR (одноцепочечные антитела, полученные от акул), иммунофармацевтические средства на основе модульных белков малого размера (SMIP) и такие фрагменты антител как Fab, Fab', F(ab')2 и т.п. См. Streltsov VA, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an earlydevelopmental isotype, Protein Sci. 2005 Nov; 14(11): 2901-9. Epub 2005 Sep 30; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar 9; 374 (6518): 168-73; Nuttall SD, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 Aug; 38(4): 313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8; Gill DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 Dec; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct 19.The terms desired protein or desired antibody are used interchangeably and generally refer to the parent antibody specific for the target, i.e. CGRP, or a chimeric or humanized antibody, or a binding fragment derived from it, as described here. The term antibody is intended to include any molecular structure of defined shape containing a polypeptide chain that matches and recognizes an epitope, wherein one or more non-covalent binding interactions stabilize the complex between said molecular structure and the epitope. The prototype antibody molecule is an immunoglobulin, and all types of immunoglobulins, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., from all sources, such as human, rodent, rabbit, cow, sheep, pig, dog, other mammal, chicken , other birds, etc., are considered antibodies. A preferred source for the production of antibodies suitable as starting material according to the invention are rabbits. The coding sequences of various antibodies have been described; other sequences can be found using methods known in the art. Examples of these include chimeric antibodies, human and other mammalian antibodies, humanized antibodies, single chain antibodies (e.g. scFv), camelized antibodies, nanobodies, IgNARs (single chain antibodies derived from sharks), small modular protein (SMIP) immunopharmaceuticals and antibody fragments such as Fab, Fab', F(ab')2, and the like. See Streltsov VA, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an earlydevelopmental isotype, Protein Sci. Nov 2005; 14(11): 2901-9. Epub 2005 Sep 30; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar 9; 374 (6518): 168-73; Nuttall SD, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 Aug; 38(4): 313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8; Gill DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. Dec 2006; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct 19.

Например, антитела или антиген-связывающие фрагменты можно продуцировать с помощью генной инженерии. С помощью этой техники, как и при других способах, антитело-продуцирующие клетки сенсибилизируют желательным антигеном или иммуногеном. Матричную РНК, выделенную из антитело-продуцирующих клеток, используют в качестве матрицы для получения кДНК с помощью ПЦРамплификации. Библиотеку векторов, каждый из которых содержит один ген тяжелой цепи и один ген легкой цепи, сохраняющие первоначальную антигенную специфичность, получают путем инсерции соответствующих участков амплифицированной кДНК иммуноглобулина в экспрессирующие векторы. Комбинаторную библиотеку конструируют путем объединения библиотеки генов тяжелых цепей с библиотекой генов легких цепей. Это приводит к получению библиотеки клонов, которые совместно экспрессируют тяжелую и легкую цепи (аналогичные Fab-фрагменту или антиген-связывающему фрагменту молекулы антитела). Векторы, которые несут эти гены, совместно переносят в клетку-хозяина путем трансфекции. При индукции синтеза генов антитела в трансфицированной клетке-хозяине белки тяжелых и легких цепей подвергаются самосборке, образуя активные антитела, которые можно обнаружить путем скрининга с антигеном или иммуногеном.For example, antibodies or antigen-binding fragments can be produced using genetic engineering. With this technique, as with other methods, antibody-producing cells are sensitized with the desired antigen or immunogen. Messenger RNA isolated from antibody-producing cells is used as a template for obtaining cDNA using PCR amplification. A library of vectors, each containing one heavy chain gene and one light chain gene, retaining their original antigenic specificity, is obtained by inserting the appropriate portions of the amplified immunoglobulin cDNA into expression vectors. A combinatorial library is constructed by combining a library of heavy chain genes with a library of light chain genes. This results in a library of clones that co-express the heavy and light chains (similar to a Fab fragment or an antigen-binding fragment of an antibody molecule). The vectors that carry these genes are co-transferred into the host cell by transfection. Upon induction of antibody gene synthesis in a transfected host cell, the heavy and light chain proteins self-assemble to form active antibodies that can be detected by screening with an antigen or immunogen.

Последовательности, кодирующие интересующие исследователя антитела, включают нативные последовательности, а также нуклеиновые кислоты, последовательность которых в силу вырожденности генетического кода не идентична последовательности раскрытых нуклеиновых кислот, и их варианты. Варианты полипептидов могут включать аминокислотные (АК) замены, добавления или делеции. Аминокислотные замены могут быть консервативными аминокислотными заменами или заменами для устранения несущественных аминокислот, например для модификации сайта гликозилирования или миниThe sequences encoding the antibodies of interest to the researcher include native sequences, as well as nucleic acids, the sequence of which, due to the degeneracy of the genetic code, is not identical to the sequence of the disclosed nucleic acids, and their variants. Polypeptide variants may include amino acid (AA) substitutions, additions, or deletions. Amino acid substitutions can be conservative amino acid substitutions or substitutions to eliminate non-essential amino acids, for example to modify the glycosylation site or mini

- 9 040241 мизации неправильного фолдинга путем замены или делеции одного или более остатков цистеина, ненужных для функционирования. Можно сконструировать варианты, сохраняя или повышая биологическую активность определенной области белка (например, функционального домена, каталитических аминокислотных остатков и т.д.). Варианты также включают фрагменты полипептидов, раскрытые здесь, в частности, биологически активные фрагменты и/или фрагменты, соответствующие функциональным доменам. Известны техники мутагенеза клонированных генов in vitro. Настоящее изобретение также включает полипептиды, модифицированные с помощью обычных молекулярно-биологических техник с целью улучшения их устойчивости к протеолитической деградации или оптимизации свойств растворимости, или для их лучшего соответствия требованиям, предъявляемым к терапевтическим агентаам.- 9 040241 Misfolding misfolding by replacement or deletion of one or more cysteine residues unnecessary for functioning. Variants can be engineered to retain or increase the biological activity of a specific region of a protein (eg, functional domain, catalytic amino acid residues, etc.). Options also include fragments of the polypeptides disclosed here, in particular, biologically active fragments and/or fragments corresponding to functional domains. Techniques for in vitro mutagenesis of cloned genes are known. The present invention also includes polypeptides modified by conventional molecular biology techniques to improve their resistance to proteolytic degradation or to optimize their solubility properties, or to better suit the requirements of therapeutic agents.

Химерные антитела можно получить рекомбинантными способами путем объединения вариабельных областей легких и тяжелых цепей (V_L и V_H), полученных из антитело-продуцирующих клеток одного вида, с константными областями легких и тяжелых цепей из другого вида. Обычно в химерных антителах используют вариабельные области грызунов или кролика и константные области человека с целью получения антитела с доменами преимущественно человеческого происхождения. Продукция таких химерных антител хорошо известна в данной области техники, и ее можно осуществить с помощью стандартных средств (как описано, например, в патенте США № 5624659, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки). Кроме того, предполагается, что константные области человека в составе химерных антител по изобретению можно выбирать из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.Chimeric antibodies can be made by recombinant methods by combining light and heavy chain variable regions (V _L and V _H ) derived from antibody-producing cells of one species with light and heavy chain constant regions from another species. Typically, rodent or rabbit variable regions and human constant regions are used in chimeric antibodies to produce an antibody with domains predominantly of human origin. The production of such chimeric antibodies is well known in the art and can be accomplished by standard means (as described, for example, in US Pat. No. 5,624,659, incorporated herein by reference in its entirety). In addition, it is contemplated that the human constant regions in the chimeric antibodies of the invention may be selected from IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 constant regions.

Гуманизированные антитела сконструированы таким образом, что их иммуноглобулиновые домены более подобны доменам человека, и включают только гипервариабельные области антитела животного происхождения. Это достигается путем тщательного изучения последовательности гипервариабельных петель вариабельных областей моноклонального антитела и их адаптации к структуре цепей антитела человека.Humanized antibodies are designed so that their immunoglobulin domains are more similar to human domains, and include only the hypervariable regions of an animal-derived antibody. This is achieved by carefully studying the sequence of hypervariable loops of the variable regions of a monoclonal antibody and adapting them to the structure of human antibody chains.

Хотя указанный способ на первый взгляд сложен, его просто осуществить на практике. См., например, патент США № 6187287, полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки.Although this method is at first glance complicated, it is easy to implement in practice. See, for example, US Pat. No. 6,187,287, incorporated herein by reference in its entirety.

В дополнение к целым иммуноглобулинам (или их рекомбинантным аналогам), можно синтезировать фрагменты иммуноглобулинов, включающие сайт связывания эпитопа (например, Fab', F(ab')₂ или другие фрагменты). Фрагмент или минимальные иммуноглобулины можно сконструировать с использованием техник рекомбинантных иммуноглобулинов. Например, Fv-иммуноглобулины для использования в настоящем изобретении можно получить путем синтеза гибридной вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи. Кроме того, представляют интерес комбинации антител, например диатела, которые содержат два Fv с различной специфичностью. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения фрагменты иммуноглобулинов включают SMIP (низкомолекулярные иммунофармацевтические средства), камелизированные антитела, нанотела и IgNAR.In addition to whole immunoglobulins (or recombinant analogues thereof), immunoglobulin fragments can be synthesized that include an epitope binding site (eg, Fab', F(ab') ₂ or other fragments). Fragment or minimal immunoglobulins can be constructed using recombinant immunoglobulin techniques. For example, Fv immunoglobulins for use in the present invention can be obtained by synthesizing a hybrid light chain variable region and a heavy chain variable region. Also of interest are combinations of antibodies, such as diabodies, which contain two Fvs with different specificities. In yet another embodiment of the present invention, immunoglobulin fragments include SMIPs (small molecular weight immunopharmaceuticals), camelized antibodies, nanobodies, and IgNARs.

Иммуноглобулины и их фрагменты можно модифицировать после трансляции, например, путем добавления эффекторных групп, например, химических линкеров, обнаруживаемых молекул, например, флуоресцентных красителей, ферментов, токсинов, субстратов, биолюминесцентных материалов, радиоактивных материалов, хемилюминесцентных групп и т.п., или фрагментов, обеспечивающих специфическое связывание, например, стрептавидина, авидина или биотина и т.п., которые можно применять в способах и композициях по настоящему изобретению. Примеры дополнительных эффекторных молекул приведены ниже.Immunoglobulins and their fragments can be modified after translation, for example, by adding effector groups, for example, chemical linkers, detectable molecules, for example, fluorescent dyes, enzymes, toxins, substrates, bioluminescent materials, radioactive materials, chemiluminescent groups, and the like, or fragments providing specific binding, for example, streptavidin, avidin or biotin, and the like, which can be used in the methods and compositions of the present invention. Examples of additional effector molecules are shown below.

Полинуклеотидная последовательность соответствует полипептидной последовательности, если трансляция полинуклеотидной последовательности в соответствии с генетическим кодом приводит к получению указанной полипептидной последовательности (т.е. полинуклеотидная последовательность кодирует полипептидную последовательность); одна полинуклеотидная последовательность соответствует другой полинуклеотидной последовательности, если указанные две последовательности кодируют одну и ту же полипептидную последовательность.A polynucleotide sequence corresponds to a polypeptide sequence if translation of the polynucleotide sequence according to the genetic code results in said polypeptide sequence (i.e., the polynucleotide sequence encodes a polypeptide sequence); one polynucleotide sequence corresponds to another polynucleotide sequence if the two sequences encode the same polypeptide sequence.

Гетерологичная область или домен ДНК-конструкта является идентифицируемым сегментом ДНК в более крупной молекуле ДНК, не присутствующим в связи с указанной более крупной молекулой в природе. Таким образом, если гетерологичная область кодирует ген млекопитающего, указанный ген обычно фланкирован ДНК, которая не фланкирует указанную геномную ДНК млекопитающего в геноме организма-источника. Другим примером гетерологичной области является конструкт, где сама кодирующая последовательность не встречается в природе (например, кДНК, где геномная кодирующая последовательность содержит интроны или синтетические последовательности, содержащие кодоны, отличающиеся от нативного гена). Аллельные вариации или природные мутации не приводят к появлению гетерологичной области ДНК, как определено здесь.A heterologous region or domain of a DNA construct is an identifiable segment of DNA within a larger DNA molecule that is not naturally present in association with said larger molecule. Thus, if the heterologous region encodes a mammalian gene, said gene is typically flanked by DNA that does not flank said mammalian genomic DNA in the genome of the source organism. Another example of a heterologous region is a construct where the coding sequence itself does not occur naturally (eg cDNA where the genomic coding sequence contains introns or synthetic sequences containing codons that differ from the native gene). Allelic variations or naturally occurring mutations do not result in a heterologous region of DNA as defined herein.

Кодирующая последовательность является последовательностью кодонов в рамке считывания, которые (с учетом генетического кода) соответствуют или кодируют последовательность белка или пептида. Две кодирующие последовательности соответствуют друг другу, если указанные последовательности или комплементарные им последовательности кодируют одни и те же аминокислотные последовательности. Кодирующую последовательность в сочетании с соответствующими регуляторными последовательностями можно транскрибировать и транслировать в полипептид. Сигнал полиаденилирования иA coding sequence is a sequence of in-frame codons that (taking into account the genetic code) correspond to or encode for a protein or peptide sequence. Two coding sequences match if said sequences or their complementary sequences encode the same amino acid sequences. The coding sequence, in combination with appropriate regulatory sequences, can be transcribed and translated into a polypeptide. Polyadenylation signal and

- 10 040241 последовательность терминации транскрипции обычно расположены в З'-направлении от кодирующей последовательности. Промоторная последовательность является регуляторной областью ДНК, способной связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию расположенной ниже (в 3'направлении) кодирующей последовательности. Промоторные последовательности, как правило, содержат дополнительные сайты связывания регуляторных молекул (например, факторов транскрипции), которые влияют на транскрипцию кодирующей последовательности. Кодирующая последовательность находится под контролем промоторной последовательности или функционально связана с промотором, если РНК-полимераза связывается с промоторной последовательностью в клетке и транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, которая затем, в свою очередь, транслируется в белок, кодируемый кодирующей последовательностью.- 10 040241 transcription termination sequences are usually located in the 3' direction from the coding sequence. A promoter sequence is a regulatory region of DNA capable of binding RNA polymerase in a cell and initiating transcription of the downstream (3' direction) coding sequence. Promoter sequences typically contain additional binding sites for regulatory molecules (eg, transcription factors) that affect the transcription of the coding sequence. A coding sequence is under the control of a promoter sequence or is operably linked to a promoter if the RNA polymerase binds to the promoter sequence in the cell and transcribes the coding sequence into mRNA, which is then in turn translated into the protein encoded by the coding sequence.

Векторы используются для введения чужеродного вещества, например ДНК, РНК или белка, в организм или клетку-хозяина. Типичные векторы включают рекомбинантные вирусы (для полинуклеотидов) и липосомы (для полипептидов). ДНК-вектор является репликоном, например плазмидой, фагом или космидой, к которому можно присоединить другой полинуклеотидный сегмент, вызывая репликацию присоединенного сегмента. Экспрессирующий вектор является ДНК-вектором, содержащим регуляторные последовательности, управляющие синтезом полипептида соответствующей клеткойхозяином. Это обычно подразумевает промотор, связывающий РНК-полимеразу и инициирующий транскрипцию мРНК, а также сайты связывания рибосом и сигналы инициации для управления трансляцией мРНК в полипептид(ы). Внедрение полинуклеотидной последовательности в экспрессирующий вектор в надлежащем сайте и в правильной рамке считывания с последующей трансформацией соответствующей клетки-хозяина с помощью указанного вектора дает возможность продукции полипептида, кодируемого указанной полинуклеотидной последовательностью.Vectors are used to introduce a foreign substance such as DNA, RNA or protein into a host organism or cell. Typical vectors include recombinant viruses (for polynucleotides) and liposomes (for polypeptides). A DNA vector is a replicon, such as a plasmid, phage, or cosmid, to which another polynucleotide segment can be attached, causing the attached segment to replicate. An expression vector is a DNA vector containing regulatory sequences that direct the synthesis of the polypeptide by the appropriate host cell. This usually includes a promoter that binds the RNA polymerase and initiates the transcription of the mRNA, as well as ribosome binding sites and initiation signals to direct the translation of the mRNA into the polypeptide(s). Insertion of a polynucleotide sequence into an expression vector at the proper site and in the correct reading frame, followed by transformation of the appropriate host cell with said vector, allows production of the polypeptide encoded by said polynucleotide sequence.

Амплификация полинуклеотидных последовательностей является продукцией множественных копий определенной нуклеотидной последовательности in vitro. Амплифицированная последовательность обычно представлена в форме ДНК. Различные техники проведения такой амплификации описаны в обзорной статье Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294). Полимеразная цепная реакция или ПЦР является прототипом амплификации нуклеиновых кислот, и использование ПЦР здесь следует рассматривать примером других подходящих техник амплификации.Amplification of polynucleotide sequences is the production of multiple copies of a particular nucleotide sequence in vitro. The amplified sequence is usually in the form of DNA. Various techniques for performing such amplification are described in the review article Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294). Polymerase chain reaction or PCR is the prototype for nucleic acid amplification, and the use of PCR here should be considered an example of other suitable amplification techniques.

Общая структура антител позвоночных хорошо изучена к настоящему времени (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Антитела состоят из двух одинаковых легких полипептидных цепей с молекулярной массой приблизительно 23000 дальтон (легкой цепи) и двух одинаковых тяжелых цепей с молекулярной массой 53000-70000 (тяжелой цепи). Указанные четыре цепи соединены дисульфидными связями в Y-конфигурацию, где легкие цепи сгруппированы с тяжелыми цепями, начиная с горловины указанной Y''-конфигурации. Фрагменты-ветви Y-конфигурации обозначают как Fabобласть; стеблевой фрагмент Y''-конфигурации обозначают как Fc-область. Аминокислотная последовательность ориентирована от N-конца в верхней части Y''-конфигурации до С-конца в нижней части каждой цепи. N-конец содержит вариабельную область, обладающую специфичностью к антигену, вызвавшему синтез антитела и составляющую приблизительно 100 аминокислот в длину; существуют небольшие различия между легкими и тяжелыми цепями и от антитела к антителу.The general structure of vertebrate antibodies has been well studied to date (Edelman, G. M., Ann. N. Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Antibodies consist of two identical polypeptide light chains with a molecular weight of approximately 23,000 daltons (light chain) and two identical heavy chains with a molecular weight of 53,000-70,000 (heavy chain). These four chains are connected by disulfide bonds in a Y-configuration, where the light chains are grouped with heavy chains, starting from the neck of the specified Y''-configuration. The branch fragments of the Y-configuration are referred to as the Fab region; the stem fragment of the Y'' configuration is referred to as the Fc region. The amino acid sequence is oriented from the N-terminus at the top of the Y''-configuration to the C-terminus at the bottom of each chain. The N-terminus contains a variable region with specificity for the antigen that caused the synthesis of the antibody and is approximately 100 amino acids in length; there are small differences between light and heavy chains and from antibody to antibody.

Вариабельная область каждой цепи связана с константной областью, которая распространяется на оставшуюся длину цепи и в рамках определенного класса антител не меняется в зависимости от специфичности антитела (т.е. от антигена, вызвавшего синтез антитела). Существует пять известных основных классов константных областей, определяющих класс молекулы иммуноглобулина (IgG, IgM, IgA, IgD, и IgE, соответствующие константным областям тяжелой цепи γ, μ, α, δ и ε (гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон). Константная область или класс определяет последующую эффекторную функцию антитела, в том числе активацию комплемента (Kabat, E. А., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)) и другие типы клеточного ответа (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983)), в то время как вариабельная область определяет антиген, с которым взаимодействует антитело. Легкие цепи классифицируются или как к (каппа), или как λ (лямбда). Каждый класс тяжелой цепи можно получить с легкой цепью каппа или лямбда. Легкая и тяжелая цепи ковалентно связаны друг с другом, и хвостовые фрагменты двух тяжелых цепей соединены друг с другом посредством ковалентных дисульфидных связей, если иммуноглобулины получают с помощью или гибридом, или В-клеток.The variable region of each chain is associated with a constant region that extends to the remaining length of the chain and, within a certain class of antibodies, does not change depending on the specificity of the antibody (ie, the antigen that caused the synthesis of the antibody). There are five known major classes of constant regions that define the class of the immunoglobulin molecule (IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, corresponding to heavy chain constant regions γ, μ, α, δ, and ε (gamma, mu, alpha, delta, or epsilon). The constant region or class defines the subsequent effector function of the antibody, including complement activation (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)) and other types of cellular response (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983)), while the variable region defines the antigen with which the antibody interacts Light chains are classified as either k (kappa) or λ (lambda) Each class of heavy chain can be made with a kappa or lambda light chain The light and heavy chains are covalently linked to each other, and the tail fragments of the two heavy chains are connected to each other after by means of covalent disulfide bonds if the immunoglobulins are produced by either hybridomas or B cells.

Выражение вариабельная область или VR относится к доменам в пределах каждой пары легкой и тяжелой цепей антитела, которые вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном. Каждая тяжелая цепь несет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь несет на одном конце вариабельный домен (V_L), а на другом конце - константный домен; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи.The term variable region or VR refers to the domains within each pair of antibody light and heavy chains that are directly involved in antibody-antigen binding. Each heavy chain carries at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains. Each light chain carries a variable domain (V _L ) at one end and a constant domain at the other end; the light chain constant domain is aligned with the first heavy chain constant domain, and the light chain variable domain is aligned with the heavy chain variable domain.

Выражения область, определяющая комплементарность, гипервариабельная область или CDR относятся к одной или более гипервариабельных или определяющих комплементарность областейThe terms complementarity-determining region, hypervariable region, or CDR refer to one or more hypervariable or complementarity-determining regions.

- 11 040241 (CDR), присутствующих в вариабельных областях легких или тяжелых цепей антитела (см. Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Указанные выражения включают гипервариабельные области, соответствующие определению Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983), или гипервариабельные петли трехмерных структур антител (Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). CDR каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга посредством каркасных областей и вместе с CDR другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта. В пределах CDR присутствуют избранные аминокислоты, описанные как области, определяющие селективность (SDR), которые представляют собой критические контактные остатки, используемые CDR при взаимодействии антитело-антиген (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).- 11 040241 (CDR) present in the variable regions of the light or heavy chains of an antibody (see Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). These expressions include hypervariable regions as defined by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983), or hypervariable loops of three-dimensional antibody structures (Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987 )). The CDRs of each strand are held in close proximity to each other by framework regions and, together with the CDRs of the other strand, contribute to the formation of an antigen-binding site. Within the CDR are selected amino acids, described as selectivity determining regions (SDRs), which are critical contact residues used by CDRs in antibody-antigen interactions (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).

Выражения каркасная область или FR относятся к одной или более каркасных областей, присутствующих в вариабельных областях легких и тяжелых цепей антитела (см. Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Указанные выражения относятся к областям аминокислотной последовательности, расположенным между CDR в пределах вариабельных областей легких и тяжелых цепей антитела.Framework or FR expressions refer to one or more framework regions present in the variable regions of the light and heavy chains of an antibody (see Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ( 1987)). These expressions refer to regions of the amino acid sequence located between the CDRs within the variable regions of the light and heavy chains of the antibody.

Антитела против CGRP и их связывающие фрагменты, обладающие связывающей активностью по отношению к CGRPAnti-CGRP antibodies and their binding fragments having binding activity against CGRP

Антитело Ab3.Ab3 antibody.

В одном варианте воплощения настоящее изобретение включает гуманизированные антитела, обладающие специфичностью связывания по отношению к CGRP, последовательность вариабельной области легкой цепи которых содержит последовательность, представленную ниже:In one embodiment, the present invention includes humanized antibodies having binding specificity for CGRP, the light chain variable region sequence of which contains the sequence shown below:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ГО NO: 21).QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ GO NO: 21).

Настоящее изобретение также включает гуманизированные антитела, обладающие специфичностью связывания по отношению к CGRP, последовательность легкой цепи которых содержит последовательность, представленную ниже:The present invention also includes humanized antibodies having binding specificity for CGRP, the light chain sequence of which contains the sequence shown below:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQI<PGI<VPI<QLIYSTSTLASGVQVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQI<PGI<VPI<QLIYSTSTLASGV

PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ Ш NO: 22).PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ W NO: 22).

Настоящее изобретение также включает гуманизированные антитела, обладающие специфичностью связывания по отношению к CGRP, последовательность вариабельной области тяжелой цепи которых содержит последовательность, представленную ниже:The present invention also includes humanized antibodies having binding specificity for CGRP, the heavy chain variable region sequence of which contains the sequence shown below:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGIEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGI

NDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQIDNO: 23).NDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQIDNO: 23).

Настоящее изобретение также включает гуманизированные антитела, обладающие специфичностью связывания по отношению к CGRP, последовательность тяжелой цепи которых содержит последовательность, представленную ниже:The present invention also includes humanized antibodies having binding specificity for CGRP, the heavy chain sequence of which contains the sequence shown below:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNT

YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).YYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).

Кроме того, настоящее изобретение рассматривает антитела, включающие одну или более из полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; и SEQ ID NO: 27, соответствующие областям, определяющим комплементарность (CDR, или гипервариабельным областям) последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21 или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 22, и/или одной или более из полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; и SEQ ID NO: 30, которые соответствуют областям, определяющим комплементарность (CDR, или гипервариабельным областям) последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, или последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 24, или комбинации указанных полипептидных поIn addition, the present invention contemplates antibodies comprising one or more of the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; and SEQ ID NO: 27 corresponding to the complementarity determining regions (CDRs or hypervariable regions) of the light chain variable region sequence of SEQ ID NO: 21 or the light chain sequence of SEQ ID NO: 22 and/or one or more of the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; and SEQ ID NO: 30, which correspond to the complementarity determining regions (CDRs or hypervariable regions) of the heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 23, or the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 24, or a combination of the indicated polypeptide sequences.

- 12 040241 следовательностей. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела по изобретению или их фрагменты включают или, в качестве альтернативы, состоят из комбинаций одного или более из CDR, последовательностей вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи и последовательностей тяжелой и легкой цепи, приведенных выше, включая все из них.- 12 040241 sequences. In yet another embodiment, the antibodies of the invention, or fragments thereof, comprise or alternatively consist of combinations of one or more of the CDRs, the light chain variable region and heavy chain variable region sequences, and the heavy and light chain sequences set forth above, including all of them.

Настоящее изобретение также рассматривает фрагменты антитела, обладающего специфичностью связывания с CGRP. В одном варианте воплощения настоящего изобретения фрагменты антител по изобретению включают или, в качестве альтернативы, состоят из полипептидной последовательности SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения фрагменты антител по изобретению включают или, в качестве альтернативы, состоят из полипептидной последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.The present invention also contemplates antibody fragments having binding specificity for CGRP. In one embodiment, the antibody fragments of the invention comprise or alternatively consist of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22. In another embodiment, the antibody fragments of the invention comprise or alternatively , consist of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24.

В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения фрагменты антитела, обладающие специфичностью связывания с CGRP, включают или, в качестве альтернативы, состоят из одной или более полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; и SEQ ID NO: 27, которые соответствуют областям, определяющим комплементарность (CDR, или гипервариабельным областям) последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21 или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 22.In a further embodiment of the invention, antibody fragments having CGRP binding specificity comprise or alternatively consist of one or more of the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; and SEQ ID NO: 27, which correspond to the complementarity determining regions (CDRs or hypervariable regions) of the light chain variable region sequence of SEQ ID NO: 21 or the light chain sequence of SEQ ID NO: 22.

В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения фрагменты антитела, обладающие специфичностью связывания с CGRP, включают или, в качестве альтернативы, состоят из одной или более полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; и SEQ ID NO: 30, которые соответствуют областям, определяющим комплементарность (CDR, или гипервариабельным областям) последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 или последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 24.In a further embodiment of the present invention, antibody fragments having CGRP binding specificity comprise or alternatively consist of one or more of the polypeptide sequences of SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; and SEQ ID NO: 30, which correspond to the complementarity determining regions (CDRs or hypervariable regions) of the heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 23 or the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 24.

Настоящее изобретение также рассматривает фрагменты антител, включающие один или более из фрагментов антител, описанных здесь. В одном варианте воплощения настоящего изобретения фрагменты антител, обладающие специфичностью связывания с CGRP, включают или, в качестве альтернативы, состоят из одного, двух, трех или более, в том числе всех следующих фрагментов антител: вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21; вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23; областей, определяющих комплементарность (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; и SEQ ID NO: 27) вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21; и областей, определяющих комплементарность (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; и SEQ ID NO: 30) вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23.The present invention also contemplates antibody fragments comprising one or more of the antibody fragments described herein. In one embodiment, the antibody fragments having CGRP binding specificity comprise or alternatively consist of one, two, three or more, including all of the following antibody fragments: light chain variable region of SEQ ID NO: 21; heavy chain variable region SEQ ID NO: 23; complementarity determining regions (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; and SEQ ID NO: 27) of the light chain variable region of SEQ ID NO: 21; and complementarity determining regions (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; and SEQ ID NO: 30) of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 23.

В особенно предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения химерное антитело против CGRP является Ab3, включающее или, в качестве альтернативы, состоящее из SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24, и обладающее по меньшей мере одной из биологических активностей, изложенных здесь.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the chimeric anti-CGRP antibody is Ab3 comprising or alternatively consisting of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 24 and having at least one of the biological activities set forth herein.

В другом, особенно предпочтительном, варианте воплощения настоящего изобретения фрагменты антител включают или, в качестве альтернативы, состоят из Fab-фрагментов (антигенсвязывающих фрагментов), обладающих специфичностью связывания с CGRP. По отношению к антителу Ab3, Fabфрагмент включает последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21 и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23. Указанный вариант воплощения настоящего изобретения дополнительно рассматривает добавления, делеции и варианты SEQ ID NO: 21 и/или SEQ ID NO: 23 в указанном Fab, при условии сохранения специфичности связывания с CGRP.In another particularly preferred embodiment of the present invention, the antibody fragments comprise or alternatively consist of Fab fragments (antigen binding fragments) having CGRP binding specificity. With respect to the Ab3 antibody, the Fab fragment comprises the light chain variable region sequence of SEQ ID NO: 21 and the heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 23. This embodiment of the present invention further contemplates additions, deletions, and variants of SEQ ID NO: 21 and/or SEQ ID NO: 23 in the indicated Fab, as long as the specificity of binding to CGRP is maintained.

В одном варианте воплощения изобретения, описанном здесь (ниже), Fab-фрагменты можно получить путем ферментативного гидролиза Ab3 (например, папаином). В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, например, Ab3, или их Fab-фрагменты можно продуцировать путем экспрессии в клетках млекопитающих, например клетках СНО, NSO или НЕК 293, системах на основе клеток грибов, насекомых или микроорганизмов, например клеток дрожжей (например, диплоидных дрожжей, например, диплоидных Pichia) и других штаммах дрожжей. Подходящие виды Pichia включают вид Pichia pastoris, но не ограничиваются им.In one embodiment of the invention described here (below), Fab fragments can be obtained by enzymatic hydrolysis of Ab3 (eg, papain). In yet another embodiment of the invention, anti-CGRP antibodies, such as Ab3, or Fab fragments thereof, can be produced by expression in mammalian cells, such as CHO, NSO, or HEK 293 cells, fungal, insect, or microorganism cell systems, such as yeast cells. (eg diploid yeast, eg diploid Pichia) and other yeast strains. Suitable Pichia species include, but are not limited to, Pichia pastoris.

В еще одном варианте воплощения фрагменты антител могут находиться в одной или более из следующих неограничивающих форм: Fab, Fab', F(ab')₂, Fv и формы одноцепочечных Fv-антител. В предпочтительном варианте воплощения антитела против CGRP, описанные здесь, дополнительно включают последовательность константной каппа-области легкой цепи, включающую последовательность, представленную ниже:In yet another embodiment, antibody fragments may be in one or more of the following non-limiting forms: Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fv, and single chain Fv antibody forms. In a preferred embodiment, the anti-CGRP antibodies described herein further comprise a light chain kappa constant region sequence comprising the sequence shown below:

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV

TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 283).TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 283).

В еще одном предпочтительном варианте воплощения антитела против CGRP, описанные здесь, дополнительно включают полипептидную последовательность константной гамма-1-области тяжелой цепи, включающую последовательность, представленную ниже:In yet another preferred embodiment, the anti-CGRP antibodies described herein further comprise a heavy chain gamma 1 constant region polypeptide sequence comprising the sequence shown below:

- 13 040241- 13 040241

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 284).ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 284).

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение рассматривает выделенное антитело против CGRP, включающее последовательность VH-полипептида, выбранную из: SEQ ID NO: 23 и 24, или ее вариант, и дополнительно включающее последовательность VL-полипептида, выбранную из: SEQ ID NO: 21 и 22, или ее вариант, где один или более из каркасных остатков (FR-остатков) в указанном V_Hили VL-полипептиде замещен остатком другой аминокислоты, что приводит к получению антитела против CGRP, специфически связывающего CGRP. Настоящее изобретение рассматривает гуманизированные и химерные формы указанных антител. Химерные антитела могут включать Fc, полученный из константных областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 или IgG19.In yet another embodiment, the present invention contemplates an isolated anti-CGRP antibody comprising a VH polypeptide sequence selected from: SEQ ID NOs: 23 and 24, or a variant thereof, and further comprising a VL polypeptide sequence selected from: SEQ ID NO: 21 and 22, or a variant thereof, wherein one or more of the framework residues (FR residues) in said V _H or VL polypeptide is substituted with a different amino acid residue, resulting in an anti-CGRP antibody that specifically binds CGRP. The present invention contemplates humanized and chimeric forms of these antibodies. Chimeric antibodies may include an Fc derived from IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18, or IgG19 constant regions.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения, антитела или V_H- или VL-полипептиды происходят или выбраны из одной или более популяций В-клеток кролика до начала процесса гуманизации, упомянутого здесь.In one embodiment of the present invention, the antibodies or V _H or VL polypeptides are derived from or selected from one or more rabbit B cell populations prior to the start of the humanization process referred to herein.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP и их фрагменты не обладают специфичностью связывания с CGRP-R. В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP и их фрагменты ингибируют связывание CGRP с CGRP-R. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP и их фрагменты ингибируют связывание CGRP с CGRP-R, и/или его дополнительными белками, и/или мультимерами и/или оказывают антагонистическое действие на их биологические эффекты.In another embodiment, the anti-CGRP antibodies and fragments thereof do not have binding specificity for CGRP-R. In a further embodiment of the present invention, anti-CGRP antibodies and fragments thereof inhibit the binding of CGRP to CGRP-R. In yet another embodiment of the present invention, anti-CGRP antibodies and fragments thereof inhibit the binding of CGRP to CGRP-R and/or its accessory proteins and/or multimers and/or antagonize their biological effects.

Как указано здесь, антитела и их фрагменты можно модифицировать после трансляции путем добавления эффекторных групп, например химических линкеров, обнаруживаемых молекул, например флуоресцентных красителей, ферментов, субстратов, биолюминесцентных материалов, радиоактивных материалов и хемилюминесцентных групп, или функциональных групп, например стрептавидина, авидина, биотина, цитотоксина, цитотоксического агента и радиоактивных материалов.As stated herein, antibodies and fragments thereof can be modified after translation by adding effector groups, such as chemical linkers, detectable molecules, such as fluorescent dyes, enzymes, substrates, bioluminescent materials, radioactive materials, and chemiluminescent groups, or functional groups, such as streptavidin, avidin, biotin, cytotoxin, cytotoxic agent and radioactive materials.

Антитела или их фрагменты также можно химически модифицировать с целью получения дополнительных преимуществ, например повышенной растворимости, стабильности и времени циркуляции (период полужизни in vivo) полипептида, или пониженной иммуногенности (см. патент США № 4179337). Химические группы для модификации можно выбрать из водорастворимых полимеров, например полиэтиленгликоля, сополимеров этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозы, декстрана, поливинилового спирта и т.п. Антитела и их фрагменты можно модифицировать по случайным положениям в пределах молекулы или в заданных положениях в пределах молекулы; они могут включать одну, две, три или более присоединенных химических групп.Antibodies or fragments thereof can also be chemically modified to provide additional benefits, such as increased solubility, stability, and circulation time (in vivo half-life) of the polypeptide, or reduced immunogenicity (see US Pat. No. 4,179,337). Chemical groups for modification can be selected from water-soluble polymers, for example, polyethylene glycol, ethylene glycol/propylene glycol copolymers, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, and the like. Antibodies and their fragments can be modified at random positions within a molecule or at predetermined positions within a molecule; they may include one, two, three or more attached chemical groups.

Указанный полимер может обладать любой молекулярной массой и быть разветвленным или неразветвленным. Для полиэтиленгликоля предпочтительная молекулярная масса составляет от приблизительно 1 кДа до приблизительно 100 кДа (термин приблизительно указывает, что в препаратах полиэтиленгликоля некоторые молекулы могут весить больше, некоторые - меньше установленной молекулярной массы) для простоты обращения и производства. Можно использовать другие размеры в зависимости от желательного терапевтического профиля (например, желательной продолжительности замедленного высвобождения, действия на биологическую активность, если таковое имеет место, простоты обращения, степени или отсутствия антигенности и других известных эффектов полиэтиленгликоля на терапевтический белок или его аналог). Например, полиэтиленгликоль может обладать средней молекулярной массой, приблизительно равной 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 17500, 18000, 18500, 19000, 19500, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000 или 100000 кДа. Разветвленные полиэтиленгликоли описаны, например, в патенте США № 5643575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); и Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), раскрытие каждого из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.The specified polymer may have any molecular weight and be branched or unbranched. For polyethylene glycol, the preferred molecular weight is from about 1 kDa to about 100 kDa (the term roughly indicates that in polyethylene glycol formulations, some molecules may weigh more, some less than the stated molecular weight) for ease of handling and manufacturing. Other sizes may be used depending on the desired therapeutic profile (e.g., desired duration of sustained release, effect on biological activity, if any, ease of handling, degree or lack of antigenicity, and other known effects of polyethylene glycol on the therapeutic protein or analogue thereof). For example, polyethylene glycol may have an average molecular weight of approximately 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000 10,000, 10500, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 17500, 18000, 18500, 19000, 19500, 20,000, 25000, 30000, 35000, 40000, 40000, 40000 , 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000 or 100000 kDa. Branched polyethylene glycols are described, for example, in US patent No. 5643575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); and Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), the disclosure of each of which is incorporated herein by reference.

Существует несколько способов присоединения, доступных для специалистов в данной области техники, см., например, ЕР 0401384, включенный в настоящий документ посредством ссылки (присоединение ПЭГ к Г-КСФ), см. также Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (сообщение о пегилировании ГМ-КСФ с помощью трезилхлорида). Например, полиэтиленгликоль можно ковалентно связать через аминокислотные остатки с помощью реакционноспособной группы, например свободной аминогрупThere are several attachment methods available to those skilled in the art, see for example EP 0401384 incorporated herein by reference (PEG to G-CSF attachment), see also Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (report on PEGylation of GM-CSF with tresyl chloride). For example, polyethylene glycol can be covalently linked through amino acid residues using a reactive group, such as a free amino group.

- 14 040241 пы или карбоксильной группы. Реакционноспособные группы являются группами, с которыми можно связать молекулу активированного полиэтиленгликоля. Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу, могут включать остатки лизина и остатки N-концевой аминокислоты; остатки, содержащие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспарагиновой кислоты, остатки глутаминовой кислоты и остаток С-концевой аминокислоты. Кроме того, в качестве реакционноспособной группы для присоединения молекул полиэтиленгликоля можно использовать сульфгидрильные группы. Для терапевтических целей является предпочтительным присоединение к аминогруппе, например к группе N-концевой аминокислоты или лизина.- 14 040241 py or carboxyl group. Reactive groups are groups to which an activated polyethylene glycol molecule can be linked. Amino acid residues containing a free amino group may include lysine residues and N-terminal amino acid residues; residues containing a free carboxyl group may include aspartic acid residues, glutamic acid residues, and a C-terminal amino acid residue. In addition, sulfhydryl groups can be used as a reactive group for attaching polyethylene glycol molecules. For therapeutic purposes, it is preferred to attach to an amino group, such as an N-terminal amino acid or lysine group.

Как указано выше, полиэтиленгликоль можно присоединить к белкам посредством связи с любым из ряда аминокислотных остатков. Например, полиэтиленгликоль можно связать с полипептидами посредством ковалентных связей с остатками лизина, гистидина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или цистеина. Одну или более реакционноспособных химических групп можно использовать для присоединения полиэтиленгликоля к специфическим аминокислотным остаткам (например, лизина, гистидина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или цистеина) или к аминокислотному остатку более чем одного типа (например, лизина, гистидина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина и их комбинациям).As stated above, polyethylene glycol can be attached to proteins by bonding to any of a number of amino acid residues. For example, polyethylene glycol can be linked to polypeptides through covalent bonds with lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, or cysteine residues. One or more reactive chemical groups can be used to attach the polyethylene glycol to specific amino acid residues (eg, lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, or cysteine) or to more than one type of amino acid residue (eg, lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid). , cysteine and their combinations).

В качестве альтернативы антитела или их фрагменты могут обладать повышенным временем полужизни in vivo за счет объединения с альбумином (включая, но не ограничиваясь, рекомбинантным человеческим сывороточным альбумином или его фрагментами или вариантами (см., например, патент США № 5876969, выданный 2 марта 1999 г., патент ЕР 0413622 и патент США № 5766883, выданный 16 июня 1998 г., которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки)) или другими циркулирующими белками крови, например трансферрином или ферритином. В предпочтительном варианте воплощения полипептиды и/или антитела по настоящему изобретению (включая их фрагменты или варианты) объединяют со зрелой формой человеческого сывороточного альбумина (т.е. аминокислотами 1585 человеческого сывороточного альбумина, как показано на фиг. 1 и 2 патента ЕР 0322094), который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Полинуклеотиды, кодирующие гибридные белки по изобретению, также входят в рамки изобретения.Alternatively, antibodies or fragments thereof may have an increased in vivo half-life by association with albumin (including, but not limited to, recombinant human serum albumin or fragments or variants thereof (see, for example, US Pat. EP 0413622 and US Pat. No. 5,766,883, issued June 16, 1998, which are incorporated herein by reference in their entirety)) or other circulating blood proteins, such as transferrin or ferritin. In a preferred embodiment, the polypeptides and/or antibodies of the present invention (including fragments or variants thereof) are combined with the mature form of human serum albumin (i.e. amino acids 1585 of human serum albumin as shown in Figures 1 and 2 of EP 0322094), which is incorporated herein by reference in its entirety. The polynucleotides encoding the fusion proteins of the invention are also within the scope of the invention.

Что касается обнаруживаемых групп, другие типичные ферменты включают пероксидазу хрена, ацетилхолинэстеразу, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу и люциферазу, но не ограничиваются ими. Дополнительные типичные флуоресцентные материалы включают родамин, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, умбеллиферон, дихлортриазиниламин, фикоэритрин и дансилхлорид, но не ограничиваются ими. Дополнительные типичные хемилюминесцентные группы включают люминол, но не ограничиваются им. Дополнительные типичные биолюминесцентные материалы включают люциферин и экворин, но не ограничиваются ими. Дополнительные типичные радиоактивные материалы включают иод-125 (¹²⁵I), углерод-14 (¹⁴С), серу-35 (³⁵S), тритий (³Н) и фосфор-32 (³²Р), но не ограничиваются ими.With regard to detectable groups, other exemplary enzymes include, but are not limited to, horseradish peroxidase, acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, and luciferase. Additional exemplary fluorescent materials include, but are not limited to, rhodamine, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, umbelliferone, dichlorotriazinylamine, phycoerythrin, and dansyl chloride. Additional exemplary chemiluminescent groups include, but are not limited to, luminol. Additional exemplary bioluminescent materials include, but are not limited to, luciferin and aequorin. Additional exemplary radioactive materials include but are not limited to iodine-125 ( ¹²⁵ I), carbon-14 ( ¹⁴ C), sulfur-35 ( ³⁵ S), tritium ( ³ H), and phosphorus-32 ( ³² P).

Что касается функциональных групп, типичные цитотоксические агенты включают метотрексат, аминоптерин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин; алкилирующие агенты, например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), митомицин С, ломустин (CCNU), 1-метилнитрозомочевину, циклофосфамид, хлорметин, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С, цис-дихлордиаминплатину (II) (DDP), цисплатин и карбоплатин (параплатин), антрациклины, включая даунорубицин (ранее дауномицин), доксорубицин (адриамицин), деторубицин, карминомицин, идарубицин, эпирубицин, митоксантрон и бисантрен; антибиотики, например, дактиномицин (ранее актиномицин D), блеомицин, калихемицин, митрамицин и антрамицин (АМС); и антимитотические агенты, например, алкалоиды барвинка, винкристин и винбластин, но не ограничиваются ими. Другие цитотоксические агенты включают паклитаксел (таксол), рицин, экзотоксин Pseudomonas, гемцитабин, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, этопозид, тенопозид, колхицин, дигидроксиантрациндион, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, прокарбазин, гидроксимочевину, аспарагиназу, кортикостероиды, митотан (O,P'-(DDD)), интерфероны и смеси указанных цитотоксических агентов.With regard to functional groups, typical cytotoxic agents include methotrexate, aminopterin, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil, decarbazine; alkylating agents, e.g. mechlorethamine, thiotepa, chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU), mitomycin C, lomustine (CCNU), 1-methylnitrosourea, cyclophosphamide, chlormethine, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C, cis-dichlorodiaminplatinum (II) ( DDP), cisplatin and carboplatin (paraplatin), anthracyclines including daunorubicin (formerly daunomycin), doxorubicin (adriamycin), detorubicin, carminomycin, idarubicin, epirubicin, mitoxantrone and bisantrene; antibiotics, eg dactinomycin (formerly actinomycin D), bleomycin, calichemiacin, mithramycin, and anthramycin (AMC); and antimitotic agents such as, but not limited to, vinca alkaloids, vincristine and vinblastine. Other cytotoxic agents include paclitaxel (Taxol), ricin, Pseudomonas exotoxin, gemcitabine, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, etoposide, tenoposide, colchicine, dihydroxyanthracindione, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin , procarbazine, hydroxyurea, asparaginase, corticosteroids, mitotane (O,P'-(DDD)), interferons and mixtures of these cytotoxic agents.

Дополнительные цитотоксические агенты включают такие химиотерапевтические агенты как карбоплатин, цисплатин, паклитаксел, гемцитабин, калихеамицин, доксорубицин, 5-фторурацил, митомицин С, актиномицин D, циклофосфамид, винкристин и блеомицин, но не ограничиваются ими. Токсичные ферменты растений и бактерий, например рицин, дифтерийный токсин и токсин Pseudomonas, можно конъюгировать с гуманизированными или химерными антителами или их связывающими фрагментами с целью получения реагентов для уничтожения клеток определенного типа (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).Additional cytotoxic agents include, but are not limited to, chemotherapeutic agents such as carboplatin, cisplatin, paclitaxel, gemcitabine, calicheamicin, doxorubicin, 5-fluorouracil, mitomycin C, actinomycin D, cyclophosphamide, vincristine, and bleomycin. Toxic plant and bacterial enzymes, such as ricin, diphtheria toxin, and Pseudomonas toxin, can be conjugated to humanized or chimeric antibodies, or binding fragments thereof, to produce reagents to kill specific cell types (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 5419 (1980)).

Другие цитотоксические агенты включают цитотоксические рибонуклеазы, как описано Goldenberg в патенте США № 6653104. Варианты воплощения настоящего изобретения также относятся к радиоиммуноконъюгатам, где радионуклид, излучающий альфа- или бета-частицы, стабильно присоединен к антителу или его связывающим фрагментам с использованием или без использования комплексообразователя. Такие радионуклиды включают бета-излучающие агенты, например фосфор-32 (³²Р), скандий-47Other cytotoxic agents include cytotoxic ribonucleases as described by Goldenberg in US Pat. No. 6,653,104. Embodiments of the present invention also relate to radioimmunoconjugates wherein an alpha or beta particle emitting radionuclide is stably attached to an antibody or its binding fragments with or without the use of a complexing agent. . Such radionuclides include beta-emitting agents, such as phosphorus-32 ( ³² R), scandium-47

- 15 040241 (⁴⁷Sc), медь-67 (⁶⁷Cu), галлий-67 (⁶⁷Ga), иттрий-88 (⁸⁸Y), иттрий-90 (⁹⁰Y), иод-125 (¹²⁵I), иод-131 (1311), самарий-153 (¹⁵³Sm), лютеций-177 (¹⁷⁷Lu), рений-186 (¹⁸⁶Re) или рений-188 (¹⁸⁸Re), и альфа-излучающие агенты, например астат-211 (²¹¹At), свинец-212 (²¹²Pb), висмут-212 (²¹²Bi) или -213 (²¹³Bi) или актиний-225 (²²⁵Ас).- 15 040241 ( ⁴⁷ Sc), copper-67 ( ⁶⁷ Cu), gallium-67 ( ⁶⁷ Ga), yttrium-88 ( ⁸⁸ Y), yttrium-90 ( ⁹⁰ Y), iodine-125 ( ¹²⁵ I), iodine- 131 (1311), samarium-153 ( ¹⁵³ Sm), lutetium-177 ( ¹⁷⁷ Lu), rhenium-186 ( ¹⁸⁶ Re) or rhenium-188 ( ¹⁸⁸ Re), and alpha emitting agents such as astatine-211 ( ²¹¹ At ), lead-212 ( ²¹² Pb), bismuth-212 ( ²¹² Bi) or -213 ( ²¹³ Bi) or actinium-225 ( ²²⁵ As).

В данной области техники известны способы конъюгирования антитела или его связывающего фрагмента с обнаруживаемой группой и т.п., например способы, описанные в Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); и Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).Methods are known in the art for conjugating an antibody or binding fragment thereof to a detectable group and the like, such as those described in Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); and Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).

Варианты воплощения, описанные здесь, дополнительно включают варианты и эквиваленты, практически гомологичные антителам, фрагментам антител, диателам, SMIP, камелизированным антителам, нанотелам, IgNAR, полипептидам, вариабельным областям и CDR, описанным здесь. Указанные варианты могут содержать, например, мутации консервативной замены (т.е. замены одной или более аминокислот на аналогичные аминокислоты). Например, консервативная замена относится к замене аминокислоты на другую аминокислоту, принадлежащую к тому же общему классу, например одной кислой аминокислоты на другую кислую аминокислоту, одной основной аминокислоты на другую основную аминокислоту или одной нейтральной аминокислоты на другую нейтральную аминокислоту. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области техники.The embodiments described herein further include those substantially homologous to the antibodies, antibody fragments, diabodies, SMIPs, camelized antibodies, nanobodies, IgNARs, polypeptides, variable regions, and CDRs described herein. These variants may contain, for example, conservative substitution mutations (ie substitution of one or more amino acids for similar amino acids). For example, a conservative substitution refers to the substitution of an amino acid for another amino acid belonging to the same general class, such as one acidic amino acid for another acidic amino acid, one basic amino acid for another basic amino acid, or one neutral amino acid for another neutral amino acid. Conservative amino acid substitutions are well known in the art.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение рассматривает полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 90% или большей гомологией последовательности с любой одной или более из полипептидных последовательностей фрагментов антител, вариабельных областей и CDR, представленных здесь. Более предпочтительно настоящее изобретение рассматривает полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 95% или большей гомологией последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% или большей гомологией последовательности, а еще более предпочтительно по меньшей мере 99% или большей гомологией последовательности с любой одной или более из полипептидных последовательностей фрагментов антител, вариабельных областей и CDR, представленных здесь. Способы определения гомологии между нуклеотидными и аминокислотными последовательностями хорошо известны специалистам в данной области техники.In yet another embodiment, the present invention contemplates polypeptide sequences having at least 90% or greater sequence homology with any one or more of the antibody fragment, variable region, and CDR polypeptide sequences provided herein. More preferably, the present invention contemplates polypeptide sequences having at least 95% or more sequence homology, even more preferably at least 98% or more sequence homology, and even more preferably at least 99% or more sequence homology with any one or more from the polypeptide sequences of antibody fragments, variable regions and CDRs presented here. Methods for determining homology between nucleotide and amino acid sequences are well known to those skilled in the art.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение дополнительно рассматривает вышеописанные полипептидные гомологи фрагментов антител, вариабельных областей и CDR, представленные здесь и дополнительно обладающие активностью против CGRP. Неограничивающие примеры активности против CGRP приведены ниже.In another embodiment, the invention further contemplates the above-described polypeptide homologues of antibody fragments, variable regions, and CDRs provided herein that additionally have activity against CGRP. Non-limiting examples of anti-CGRP activity are given below.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение дополнительно рассматривает получение и применение антиидиотипических антител, связывающих любую из вышеуказанных последовательностей. В типичном варианте воплощения такое антиидиотипическое антитело можно ввести субъекту, получавшему антитело против CGRP, для регуляции, снижения или нейтрализации действия антитела против CGRP. Такие антиидиотипические антитела также можно применять для лечения аутоиммунного заболевания, характеризующегося наличием антител против CGRP. Другим примером применения таких антиидиотипических антител является обнаружение антител против CGRP по настоящему изобретению, например для мониторинга уровней антител против CGRP, присутствующих в крови или других биологических жидкостях субъекта.In yet another embodiment, the present invention further contemplates the production and use of anti-idiotypic antibodies that bind any of the above sequences. In an exemplary embodiment, such an anti-idiotypic antibody can be administered to a subject receiving an anti-CGRP antibody to regulate, reduce, or neutralize the effect of the anti-CGRP antibody. Such anti-idiotypic antibodies can also be used to treat an autoimmune disease characterized by the presence of antibodies against CGRP. Another example of the use of such anti-idiotypic antibodies is the detection of anti-CGRP antibodies of the present invention, for example, to monitor the levels of anti-CGRP antibodies present in the blood or other body fluids of a subject.

Настоящее изобретение также рассматривает антитела против CGRP, включающие любую из полипептидных или полинуклеотидных последовательностей, описанных здесь, замещенную на любую из других полинуклеотидных последовательностей, описанных здесь. Например, но не ограничиваясь этим, настоящее изобретение рассматривает антитела, включающие комбинацию любой из последовательностей вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, описанных здесь, и дополнительно рассматривает антитела, полученные в результате замещения любой из последовательностей CDR, описанных здесь, любой другой из последовательностей CDR, описанных здесь.The present invention also contemplates anti-CGRP antibodies comprising any of the polypeptide or polynucleotide sequences described herein substituted with any of the other polynucleotide sequences described herein. For example, but not limited to, the present invention contemplates antibodies comprising a combination of any of the light chain variable region and heavy chain variable region sequences described herein, and further contemplates antibodies resulting from substituting any of the CDR sequences described herein with any other of the CDR sequences described here.

Дополнительные типичные варианты воплощения настоящего изобретенияAdditional Exemplary Embodiments of the Present Invention

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение рассматривает одно или более антител против CGRP человека или фрагменты указанных антител, специфически связывающиеся с тем(и) же перекрывающим(ми)ся линейным(и) или конформационным(и) эпитопом(ми) и/или конкурирующие за связывание с тем(и) же перекрывающим(ми)ся линейным(и) или конформационным(и) эпитопом(ми) интактного полипептида CGRP человека или его фрагмента, что и антитело против CGRP человека, выбранное из Ab1, Ab2, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 или Ab14. В предпочтительном варианте воплощения антитело против CGRP человека или его фрагмент специфически связывается с тем(и) же перекрывающим(ми)ся линейным(и) или конформационным(и) эпитопом(ми) и/или конкурирует за связывание с тем(и) же перекрывающим(ми)ся линейным(и) или конформационным(и) эпитопом(ми) интактного полипептида CGRP человека или его фрагмента, что и Ab6, Ab13 или Ab14.In yet another embodiment, the present invention contemplates one or more anti-human CGRP antibodies, or fragments of said antibodies, specifically binding to the same overlapping linear(s) or conformational(s) epitope(s) and/or competing for binding to the same overlapping linear(s) or conformational(s) epitope(s) of an intact human CGRP polypeptide or fragment thereof as an anti-human CGRP antibody selected from Ab1, Ab2, Ab4, Ab5 , Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 or Ab14. In a preferred embodiment, the anti-human CGRP antibody or fragment thereof specifically binds to the same overlapping linear or conformational epitope(s) and/or competes for binding to the same overlapping epitope(s). (mi) linear(s) or conformational(s) epitope(s) of an intact human CGRP polypeptide or fragment thereof, as Ab6, Ab13 or Ab14.

Предпочтительный вариант воплощения настоящего изобретения направлен на химерные или гуманизированные антитела и их фрагменты (в том числе Fab-фрагменты), обладающие специфичностью связывания с CGRP и ингибирующие биологическую активность, опосредованную связыванием CGRP с рецептором CGRP. В особенно предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения химерA preferred embodiment of the present invention is directed to chimeric or humanized antibodies and fragments thereof (including Fab fragments) having CGRP binding specificity and inhibiting biological activity mediated by CGRP binding to the CGRP receptor. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the chimeras

- 16 040241 ные или гуманизированные антитела против CGRP выбраны из Ab3.- 16 040241 Humanized or anti-CGRP antibodies selected from Ab3.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения рассматривается способ снижения, лечения или профилактики заболеваний или нарушений, ассоциированных с CGRP, путем воздействия на указанную биологическую активность, опосредованную CGRP, тем самым избегая биологической активности, опосредованной связыванием CGRP с CGRP-R. В одном варианте воплощения заболевание или расстройство, ассоциированное с CGRP, является мигренью или другим расстройством, при котором CGRP вызывает боль, головную боль, рак, гиперактивность мочевого пузыря или потерю массы тела. Здесь представлен дополнительный нелимитирующий список заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP.In another embodiment, the present invention contemplates a method of reducing, treating, or preventing CGRP-associated diseases or disorders by affecting said CGRP-mediated biological activity, thereby avoiding the biological activity mediated by CGRP binding to CGRP-R. In one embodiment, the disease or disorder associated with CGRP is migraine or other disorder in which CGRP causes pain, headache, cancer, overactive bladder, or weight loss. Here is an additional non-limiting list of diseases and disorders associated with CGRP.

Еще один предпочтительный вариант воплощения настоящего изобретения рассматривает применение последовательностей Fab-полипептидов для лечения мигреней и головных болей у пациента. Неограничивающие типы мигреней и головных болей, которые можно лечить с помощью последовательностей Fab-полипептидов, приведены в настоящем раскрытии.Another preferred embodiment of the present invention contemplates the use of Fab polypeptide sequences for the treatment of migraines and headaches in a patient. Non-limiting types of migraines and headaches that can be treated with Fab polypeptide sequences are provided in this disclosure.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело против CGRP человека является антителом, специфически связывающимся с теми же перекрывающимися линейными или конформационными эпитопами интактного полипептида CGRP или его фрагмента, который(е) специфически связывает(ют)ся с Ab6, Ab13 или Ab14, согласно картированию эпитопов с использованием перекрывающихся линейных пептидных фрагментов, охватывающих всю длину нативного полипептида CGRP человека.In yet another embodiment of the present invention, an anti-human CGRP antibody is an antibody that specifically binds to the same overlapping linear or conformational epitopes of an intact CGRP polypeptide or fragment thereof that(s) specifically bind(s) to Ab6, Ab13, or Ab14, as mapped epitopes using overlapping linear peptide fragments spanning the entire length of the native human CGRP polypeptide.

Настоящее изобретение также направлено на антитело против CGRP, связывающееся с тем же эпитопом CGRP и/или конкурирующее за связывание с CGRP с антителом против CGRP, что и антитело или фрагмент антитела, раскрытые здесь, включая антитело против CGRP, выбранное из Ab1, Ab2, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 или Ab14, но не ограничиваясь им.The present invention is also directed to an anti-CGRP antibody that binds to the same CGRP epitope and/or competes for binding to CGRP with an anti-CGRP antibody as the antibody or antibody fragment disclosed herein, including an anti-CGRP antibody selected from Ab1, Ab2, Ab4 , Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 or Ab14, but not limited to.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение также направлено на выделенное антитело или фрагмент антитела против CGRP, включающее один или более из CDR, содержащихся в последовательностях VH-полипептида, выбранных из 23, или 24, или их варианта, и/или одного или более из CDR, содержащихся в последовательностях VL-полипептида, выбранных из 21, или 22, или их варианта.In yet another embodiment, the present invention is also directed to an isolated anti-CGRP antibody or antibody fragment comprising one or more of the CDRs contained in the VH polypeptide sequences selected from 23 or 24 or variant thereof and/or one or more of CDRs contained in VL polypeptide sequences selected from 21 or 22 or a variant thereof.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело против CGRP человека, обсуждаемое в двух предыдущих абзацах, включает по меньшей мере 2 области, определяющие комплементарность (CDR) в каждой вариабельной области легкой и тяжелой цепи, идентичные областям, содержащимся в антителе против CGRP человека Ab3.In one embodiment of the present invention, the anti-human CGRP antibody discussed in the previous two paragraphs comprises at least 2 complementarity determining regions (CDRs) in each light and heavy chain variable region identical to those contained in the anti-human CGRP antibody Ab3.

В предпочтительном варианте воплощения антитело против CGRP человека, обсуждаемое выше, включает по меньшей мере 2 области, определяющие комплементарность (CDR) в каждой вариабельной области легкой и тяжелой цепи, идентичные областям, содержащимся в Ab3. В еще одном варианте воплощения все CDR антитела против CGRP человека, обсуждаемого выше, идентичны CDR, содержащимся в антителе против CGRP человека Ab3. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения все CDR антитела против CGRP человека, обсуждаемого выше, идентичны CDR, содержащимся в антителе против CGRP человека Ab3.In a preferred embodiment, the anti-human CGRP antibody discussed above comprises at least 2 complementarity determining regions (CDRs) in each light and heavy chain variable region, identical to those contained in Ab3. In yet another embodiment, the CDRs of the anti-human CGRP antibody discussed above are all identical to the CDRs contained in the anti-human CGRP antibody Ab3. In a preferred embodiment of the present invention, all CDRs of the anti-human CGRP antibody discussed above are identical to those contained in the anti-human CGRP antibody Ab3.

Настоящее изобретение также предусматривает, что одно или более из антител против CGRP человека, обсуждаемых выше, агликозилированы; что антитела содержат Fc-область, модифицированную с целью изменения эффекторной функции, времени полужизни, протеолиза и/или гликозилирования; что антитела являются антителами человека, гуманизированными, одноцепочечными или химерными; и являются гуманизированным антителом, происходящим от антитела кролика (исходного антитела) против CGRP человека.The present invention also provides that one or more of the anti-human CGRP antibodies discussed above are aglycosylated; that the antibodies contain an Fc region modified to alter effector function, half-life, proteolysis and/or glycosylation; that the antibodies are human, humanized, single chain, or chimeric; and is a humanized antibody derived from a rabbit antibody (parental antibody) against human CGRP.

Кроме того, изобретение рассматривает одно или более антител против CGRP человека, где каркасные области (FR) в вариабельных областях легких и тяжелых цепей указанного антитела, соответственно, являются FR человека, немодифицированными или модифицированными путем замены одного или более остатков FR человека в вариабельных областях легких или тяжелых цепей соответствующими остатками FR исходного антитела кролика, и где указанные FR человека происходят от последовательностей вариабельных областей легких и тяжелых цепей антитела человека, выбранных из библиотеки последовательностей антител эмбрионального типа человека на основании высокого уровня их гомологии с соответствующими вариабельными областями легких или тяжелых цепей кролика по сравнению с другими последовательностями антител эмбрионального типа человека, содержащимися в библиотеке.In addition, the invention contemplates one or more antibodies against human CGRP, where the framework regions (FR) in the variable regions of the light and heavy chains of the specified antibody, respectively, are human FR, unmodified or modified by replacing one or more human FR residues in the variable regions of the lung or heavy chains of the corresponding FR residues of the parent rabbit antibody, and wherein said human FRs are derived from human antibody light and heavy chain variable region sequences selected from a human germline antibody sequence library based on their high level of homology with the corresponding rabbit light or heavy chain variable regions compared to other human germline antibody sequences contained in the library.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитело или фрагмент против CGRP человека специфически связывается с CGRP-экспрессирующими клетками человека и/или циркулирующими растворимыми молекулами CGRP in vivo, включая CGRP, экспрессированный на клетках или клетками человека у пациента при заболевании, ассоциированном с клетками, экспрессирующими CGRP.In one embodiment of the present invention, an anti-human CGRP antibody or fragment specifically binds to human CGRP-expressing cells and/or circulating soluble CGRP molecules in vivo, including CGRP expressed on human cells or cells in a patient with a disease associated with CGRP-expressing cells. .

В еще одном варианте воплощения указанное заболевание выбрано из мигреней (с аурой или без нее), потери массы тела, рака или опухолей, ангиогенеза, связанного с раковым или опухолевым ростом, ангиогенеза, связанного с выживанием рака или опухоли, гемиплегических мигреней, кластерных головных болей, мигренозной невралгии, хронических головных болей, головных болей напряжения, общих головных болей, приливов, хронической пароксизмальной гемикрании, вторичных головных болей вследствие основной структурной проблемы в области головы или шеи, черепной невралгии, синусныхIn yet another embodiment, said disease is selected from migraines (with or without aura), weight loss, cancer or tumors, angiogenesis associated with cancer or tumor growth, angiogenesis associated with cancer or tumor survival, hemiplegic migraines, cluster headaches , migraine neuralgia, chronic headaches, tension headaches, general headaches, flushing, chronic paroxysmal hemicrania, secondary headaches due to an underlying structural problem in the head or neck, cranial neuralgia, sinus

- 17 040241 головных болей (например, связанных с синуситом), головных болей или мигреней, вызванных аллергией, боли, воспалительной боли, боли в постоперационном разрезе, комплексного регионального болевого синдрома, раковой боли, боли при первичном или метастатическом раке костей, боли при переломе, хронической боли, боли при остеопорозном переломе, боли в результате ожога, остеопороза, подагрической боли в суставах, боли в животе, боли, связанной с кризисом серповидных клеток и другой ноцицептической боли, а также гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, цирроза печени, нейрогенной боли, невропатической боли, ноцицептической боли, невралгии тройничного нерва, постгерпетической невралгии, фантомной боли конечностей, фибромиалгии, менструальной боли, овариалгии, рефлекторной симпатической дистрофии, нейрогенной боли, боли при остеоартрите или ревматоидном артрите, боли в пояснице, диабетической невропатии, пояснично-крестцовом радикулите, или боли или висцеральной боли, связанной с: желудочно-пищеводным рефлюксом, диспепсией, синдромом раздраженного кишечника, раздраженной толстой кишкой, спазмами толстой кишки, слизистым колитом, воспалительным заболеванием кишечника, болезнью Крона, илеитом, язвенным колитом, почечной коликой, дисменореей, циститом, менструальным периодом, родами, менопаузой, простатитом, панкреатитом, почечной коликой, дисменореей, циститом, в том числе интерстициальным циститом (IC), операцией, связанной с кишечной непроходимостью, дивертикулитом, перитонитом, перикардитом, гепатитом, аппендицитом, колитом, холециститом, эндометриозом, хроническим и/или острым панкреатитом, инфарктом миокарда, боли в почках, плевральной боли, простатите, боли в области таза, травмы органа, хронической ноцицептивной боли, хронической невропатической боли, хронической воспалительной боли, фибромиалгии, приступа неконтролируемой боли и постоянной боли.- 17 040241 headaches (for example, associated with sinusitis), headaches or migraines caused by allergies, pain, inflammatory pain, pain in the postoperative section, complex regional pain syndrome, cancer pain, pain from primary or metastatic bone cancer, fracture pain , chronic pain, osteoporotic fracture pain, burn pain, osteoporosis, gouty joint pain, abdominal pain, pain associated with sickle cell crisis and other nociceptive pain, as well as hepatocellular carcinoma, breast cancer, liver cirrhosis, neurogenic pain, neuropathic pain, nociceptive pain, trigeminal neuralgia, postherpetic neuralgia, phantom limb pain, fibromyalgia, menstrual pain, ovaryalgia, reflex sympathetic dystrophy, neurogenic pain, osteoarthritis or rheumatoid arthritis pain, low back pain, diabetic neuropathy, lumbosacral sciatica, or pain or visceral pain, Anna with: gastroesophageal reflux, dyspepsia, irritable bowel syndrome, irritable bowel, colon spasms, mucosal colitis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ileitis, ulcerative colitis, renal colic, dysmenorrhea, cystitis, menstrual period, childbirth, menopause , prostatitis, pancreatitis, renal colic, dysmenorrhea, cystitis, including interstitial cystitis (IC), ileus surgery, diverticulitis, peritonitis, pericarditis, hepatitis, appendicitis, colitis, cholecystitis, endometriosis, chronic and/or acute pancreatitis , myocardial infarction, kidney pain, pleural pain, prostatitis, pelvic pain, organ trauma, chronic nociceptive pain, chronic neuropathic pain, chronic inflammatory pain, fibromyalgia, bout of uncontrollable pain, and persistent pain.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения указанное заболевание является раковой болью, возникающей в результате злокачественного новообразования или рака, предпочтительно выбранного из одного или более из аденокарциномы железистой ткани, бластомы эмбриональной ткани органов, карциномы эпителиальной ткани, лейкоза в тканях, образующих клетки крови, лимфомы лимфатической ткани, миеломы костного мозга, саркомы в соединительной или опорной ткани, рака надпочечников, лимфомы, связанной со СПИДом, анемии, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного мозга, рака молочной железы, карциноидных опухолей, рака шейки матки, химиотерапии, рака толстой кишки, цитопении, рака эндометрия, рака пищевода, рака желудка, рака головы, рака шеи, гепатобилиарного рака, рака почки, лейкоза, рака печени, рака легких, лимфомы, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, опухолей нервной системы, рака ротовой полости, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака прямой кишки, рака кожи, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, рака уретры, рака костей, сарком соединительной ткани, рака костной ткани, рака кроветворных клеток, рака костного мозга, множественной миеломы, лейкоза, первичного или вторичного рака костей, опухолей, метастазирующих в кость, опухолей, прорастающих в нерв и полые органы, опухолей, расположенных возле нервных структур. Кроме того, в предпочтительном случае раковая боль включает висцеральную боль, предпочтительно висцеральную боль, возникающую в результате рака поджелудочной железы и/или метастазов в брюшную полость. Кроме того, в предпочтительном случае раковая боль включает соматическую боль, предпочтительно соматическую боль, вызванную одним или более из следующего: рака костей, метастазов в кости, послеоперационной раковой боли, сарком соединительной ткани, рака костной ткани, рака кроветворных клеток костного мозга, множественной миеломы, лейкоза, первичного или вторичного рака костей.In yet another embodiment of the present invention, said disease is cancer pain resulting from a malignant neoplasm or cancer, preferably selected from one or more of glandular tissue adenocarcinoma, organ fetal tissue blastoma, epithelial tissue carcinoma, leukemia in blood cell-forming tissues, lymphomas. lymphatic tissue, bone marrow myeloma, sarcoma in connective or supporting tissue, adrenal cancer, AIDS-related lymphoma, anemia, bladder cancer, bone cancer, brain cancer, breast cancer, carcinoid tumors, cervical cancer, chemotherapy, cancer colon, cytopenia, endometrial cancer, esophageal cancer, stomach cancer, head cancer, neck cancer, hepatobiliary cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lung cancer, lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, tumors of the nervous system, cancer of the oral cavity, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, rectal cancer colon, skin cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, urethral cancer, bone cancer, connective tissue sarcoma, bone tissue cancer, hematopoietic cell cancer, bone marrow cancer, multiple myeloma, leukemia, primary or secondary bone cancer, tumors , metastasizing to the bone, tumors growing into the nerve and hollow organs, tumors located near the nerve structures. In addition, in the preferred case, cancer pain includes visceral pain, preferably visceral pain resulting from pancreatic cancer and/or metastases in the abdominal cavity. In addition, in the preferred case, cancer pain includes somatic pain, preferably somatic pain, caused by one or more of the following: bone cancer, bone metastases, postoperative cancer pain, connective tissue sarcomas, bone cancer, bone marrow hematopoietic cell cancer, multiple myeloma , leukemia, primary or secondary bone cancer.

Кроме того, настоящее изобретение рассматривает антитела или фрагменты против CGRP человека, непосредственно или косвенно присоединенные к обнаруживаемой метке или терапевтическому агенту.In addition, the present invention contemplates anti-human CGRP antibodies or fragments linked directly or indirectly to a detectable label or therapeutic agent.

Настоящее изобретение также рассматривает одну или более из нуклеотидных последовательностей, приводящих к экспрессии антитела или фрагмента антитела против CGRP человека, как представлено выше, в том числе последовательностей, содержащих или, в качестве альтернативы, состоящих из предпочтительных кодонов дрожжей или человека. Настоящее изобретение также рассматривает векторы (в том числе плазмидные или рекомбинантные вирусные векторы), включающие указанную (указанные) нуклеотидную(е) последовательность(и). Настоящее изобретение также рассматривает клеткихозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, экспрессирующие по меньшей мере одно из антител, представленных выше, в том числе клетки млекопитающих, дрожжей, бактерий и насекомых. В предпочтительном варианте воплощения клетка-хозяин является дрожжевой клеткой. В другом предпочтительном варианте воплощения указанная дрожжевая клетка является диплоидной дрожжевой клеткой. В более предпочтительном варианте воплощения указанная дрожжевая клетка является клеткой дрожжей Pichia.The present invention also contemplates one or more of the nucleotide sequences resulting in the expression of an anti-human CGRP antibody or antibody fragment as set forth above, including sequences containing or alternatively consisting of preferred yeast or human codons. The present invention also contemplates vectors (including plasmid or recombinant viral vectors) comprising the specified (specified) nucleotide(s) sequence(s). The present invention also contemplates host cells or recombinant host cells expressing at least one of the antibodies provided above, including mammalian, yeast, bacteria and insect cells. In a preferred embodiment, the host cell is a yeast cell. In another preferred embodiment, said yeast cell is a diploid yeast cell. In a more preferred embodiment, said yeast cell is a Pichia yeast cell.

Настоящее изобретение также рассматривает способ лечения, включающий введение пациенту с заболеванием или состоянием, связанным с клетками, экспрессирующими CGRP, терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного антитела или фрагмента против CGRP человека, описанного здесь. Настоящее изобретение также предусматривает, что указанный способ лечения может включать введение двух или более антител против CGRP или их фрагментов, раскрытых здесь. Если пациенту вводят более одного антитела, указанные множественные антитела можно вводить одновременно, или согласованно, или со сдвигом по отношению друг к другу. Заболевания, которые можно лечить, представлены в неограничивающем списке, изложенном выше и в других разделах настоящего документа. ВThe present invention also contemplates a method of treatment comprising administering to a patient with a disease or condition associated with cells expressing CGRP a therapeutically effective amount of at least one anti-human CGRP antibody or fragment described herein. The present invention also provides that the specified method of treatment may include the introduction of two or more antibodies against CGRP or their fragments disclosed here. If more than one antibody is administered to a patient, said multiple antibodies may be administered simultaneously, or concurrently, or offset from each other. Diseases that can be treated are presented in the non-limiting list set forth above and in other sections of this document. IN

- 18 040241 предпочтительном варианте воплощения указанное заболевание выбрано из мигрени, головной боли, потери массы тела, боли, раковой боли или невропатической боли. В еще одном варианте воплощения лечение дополнительно включает введение другого терапевтического агента или схемы лечения, выбранной из химиотерапии, лучевой терапии, введения цитокинов или генной терапии.In a preferred embodiment, said disease is selected from migraine, headache, weight loss, pain, cancer pain or neuropathic pain. In yet another embodiment, the treatment further comprises administering another therapeutic agent or treatment regimen selected from chemotherapy, radiation therapy, cytokine administration, or gene therapy.

В неограничивающем варианте воплощения настоящего изобретения указанный другой терапевтический агент или схема лечения включает таксол (паклитаксел) или его производные, соединения платины, например, карбоплатин или цисплатин, антрациклины, например, доксорубицин, алкилирующие агенты, например, циклофосфамид, антиметаболиты, например, 5-фторурацил, или этопозид.In a non-limiting embodiment of the present invention, said other therapeutic agent or regimen includes taxol (paclitaxel) or derivatives thereof, platinum compounds such as carboplatin or cisplatin, anthracyclines such as doxorubicin, alkylating agents such as cyclophosphamide, antimetabolites such as 5- fluorouracil, or etoposide.

Настоящее изобретение также рассматривает способ визуализации in vivo, обнаруживающий присутствие клеток, экспрессирующих CGRP, включающий введение диагностически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против CGRP человека. В одном варианте воплощения указанное введение дополнительно включает введение радионуклида или флуорофора, что облегчает обнаружение антитела в очагах заболевания, экспрессирующих CGRP. В другом варианте воплощения результаты указанного способа визуализации in vivo используют для облегчения составления соответствующей схемы лечения, в том числе схем лечения, включающих лучевую терапию, химиотерапию или их комбинацию.The present invention also contemplates an in vivo imaging method detecting the presence of cells expressing CGRP, comprising administering a diagnostically effective amount of at least one anti-human CGRP antibody. In one embodiment, said administration further comprises administering a radionuclide or a fluorophore that facilitates detection of the antibody in disease foci expressing CGRP. In another embodiment, the results of said in vivo imaging method are used to facilitate the formulation of an appropriate treatment regimen, including treatment regimens involving radiation therapy, chemotherapy, or a combination thereof.

Антагонистическую по отношению к CGRP активность антител против CGRP по настоящему изобретению и их фрагментов, обладающих специфичностью связывания с CGRP, можно также описать по их силе связывания или их сродству к CGRP. В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP по настоящему изобретению и их фрагменты, обладающие специфичностью связывания с CGRP, связываются с CGRP с константой диссоциации (KD), меньшей или равной 5х10^-7 М, 10^-7 М, 5х10^-8 М, 10^-8 М, 5х10^-9 М, 10^-9 М, 5х10^-10 М, 10^-10 М, 5х10^-11 М, 10^-11 М, 5х10^-12 М, 10^-12 М, 5х10^-13 М или 10^-13 М. Предпочтительно антитела против CGRP и их фрагменты связывают CGRP с константой диссоциации, меньшей или равной 10^-11 М, 5х10^-12 М или 10^-12 М. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP по настоящему изобретению и их фрагменты, обладающие специфичностью связывания с CGRP, связываются с линейным или конформационным эпитопом CGRP.The CGRP antagonistic activity of the anti-CGRP antibodies of the present invention and fragments thereof having CGRP binding specificity can also be described by their binding strength or their affinity for CGRP. In one embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies of the present invention and fragments thereof having CGRP binding specificity bind to CGRP with a dissociation constant (KD) less than or equal to 5x10 ^-7 M, 10 ^-7 M, 5x10 ^-8 M, 10 ^-8 M, 5x10 ^-9 M, 10 ^-9 M, 5x10 ^-10 M, 10 ^-10 M, 5x10 ^-11 M, 10 ^-11 M, 5x10 ^-12 M, 10 ^-12 M, 5x10 ^-13 M or 10 ^-13 M. Preferably, the anti-CGRP antibodies and fragments thereof bind CGRP with a dissociation constant less than or equal to 10 ^-11 M, 5 x 10 ^-12 M, or 10 ^-12 M. In another embodiment, the anti-CGRP antibodies of the present invention and their fragments with CGRP binding specificity bind to a linear or conformational CGRP epitope.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антагонистическая по отношению к CGRP активность антител против CGRP по настоящему изобретению и их фрагментов, обладающих специфичностью связывания с CGRP, характеризуется связыванием с CGRP со скоростью диссоциации, меньшей или равной 10^-4 с^-1, 5х10^-5 с^-1, 10^-5 с^-1, 5х10^-6 с^-1, 10^-6 с^-1, 5х10^-7 с^-1 или 10^-7 с^-1.In yet another embodiment of the present invention, the CGRP antagonist activity of the anti-CGRP antibodies of the present invention and their fragments having specificity for binding to CGRP is characterized by binding to CGRP with a dissociation rate less than or equal to 10 ^-4 s ^-1 .5 x 10 ^-5 s ^-1 , 10 ^-5 s ^-1 , 5x10 ^-6 s ^-1 , 10 ^-6 s ^-1 , 5x10 ^-7 s ^-1 or 10 ^-7 s ^-1 .

В другом варианте воплощения настоящего изобретения антагонистическая по отношению к CGRP активность антител против CGRP по настоящему изобретению и их фрагментов, обладающих специфичностью связывания с CGRP, характеризуется проявлением активности против CGRP путем предотвращения, облегчения или снижения симптомов или, в качестве альтернативы, лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с CGRP. Здесь представлены неограничивающие примеры заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP.In another embodiment of the present invention, the CGRP antagonistic activity of the anti-CGRP antibodies of the present invention and fragments thereof having specificity for binding to CGRP is characterized by exhibiting anti-CGRP activity by preventing, alleviating, or reducing symptoms, or, alternatively, treating diseases or disorders. associated with CGRP. Here are non-limiting examples of diseases and disorders associated with CGRP.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды антител против CGRPPolynucleotides encoding anti-CGRP antibody polypeptides

Антитело Ab3.Ab3 antibody.

Настоящее изобретение также направлено на полинуклеотиды, кодирующие полипептиды антител, обладающих специфичностью связывания с CGRP. В одном варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды по изобретению включают или, в качестве альтернативы, состоят из следующей полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21:The present invention is also directed to polynucleotides encoding antibody polypeptides having binding specificity for CGRP. In one embodiment of the present invention, the polynucleotides of the invention comprise or alternatively consist of the following polynucleotide sequence encoding the light chain variable region polypeptide sequence of SEQ ID NO: 21:

CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT

CACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTACACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTA

TCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGC ATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCAC CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGA TTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATTATTCTACATCCACTCTGGC ATCTGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCAC

T (SEQ ID NO: 161).T (SEQ ID NO: 161).

В одном варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды по изобретению включают или, в качестве альтернативы, состоят из следующей полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 22:In one embodiment, the polynucleotides of the invention comprise or alternatively consist of the following polynucleotide sequence encoding the light chain polypeptide sequence of SEQ ID NO: 22:

- 19 040241- 19 040241

CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGC ATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCAC CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGA TTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACG TACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 162).CAAGTGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGT CACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGATAACAACTACCTAGCCTGGTA TCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCAACTGATCTATTCTACATCCACTCTGGC ATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCAC CATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGA TTGTAGTAGTGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACG TACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 162).

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды по изобретению включают или, в качестве альтернативы, состоят из следующей полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23:In yet another embodiment of the present invention, the polynucleotides of the invention comprise or alternatively consist of the following polynucleotide sequence encoding the heavy chain variable region polypeptide sequence of SEQ ID NO: 23:

GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGG TCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGAT AACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTC CAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGT ATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 163).GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGG TCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGAT AACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTC CAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGT ATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 163).

В одном варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды по изобретению включают или, в качестве альтернативы, состоят из следующей полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 24:In one embodiment of the present invention, the polynucleotides of the invention comprise or alternatively consist of the following polynucleotide sequence encoding the heavy chain polypeptide sequence of SEQ ID NO: 24:

- 20 040241- 20 040241

GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGG TCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGAT AACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTC CAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGT ATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCG CCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA CCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ Ш NO: 164).GAGGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACTCGACCTCAGTAGCTACTACATGCAATGGG TCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCAATGAT AACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTC CAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGT ATTTCTGTGCTAGAGGGGACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCG CCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTG GGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGA CGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA CCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCT CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ Ш NO: 164).

В другом варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды, кодирующие фрагменты антитела, обладающие специфичностью связывания с CGRP, включают или, в качестве альтернативы, состоят из одной или более полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; и SEQ ID NO: 167, соответствующих полинуклеотидам, кодирующим области, определяющие комплементарность (CDR, или гипервариабельные области) последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21 или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 22.In another embodiment of the present invention, polynucleotides encoding antibody fragments having specificity for binding to CGRP comprise or alternatively consist of one or more of the polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; and SEQ ID NO: 167 corresponding to the polynucleotides encoding the complementarity determining regions (CDRs, or hypervariable regions) of the light chain variable region sequence of SEQ ID NO: 21 or the light chain sequence of SEQ ID NO: 22.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды, кодирующие фрагменты антитела, обладающие специфичностью связывания с CGRP, включают или, в качестве альтернативы, состоят из одной или более полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; и SEQ ID NO: 170, соответствующих полинуклеотидам, кодирующим области, определяющие комплементарность (CDR, или гипервариабельные области) последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 или последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 24.In another embodiment of the present invention, polynucleotides encoding antibody fragments having specificity for binding to CGRP comprise or alternatively consist of one or more of the polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; and SEQ ID NO: 170 corresponding to polynucleotides encoding complementarity determining regions (CDRs or hypervariable regions) of the heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 23 or the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 24.

Настоящее изобретение также рассматривает полинуклеотидные последовательности, включающие одну или более из полинуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагменты антител, описанные здесь. В одном варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды, кодирующие фрагменты антител, обладающие специфичностью связывания с CGRP, включают или, в качестве альтернативы, состоят из одного, двух, трех или более, в том числе всех следующих полинуклеотидов, кодирующих фрагменты антител: полинуклеотида SEQ ID NO: 161, кодирующего последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21; полинуклеотида SEQ ID NO: 162, кодирующего последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 22; полинуклеотида SEQ ID NO: 163, кодирующего последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23; полинуклеотида SEQ ID NO: 164, кодирующего последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 24; полинуклеотидов, кодирующих области, определяющие комплементарность (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; и SEQ ID NO: 167) последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21 или последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 22; и полинуклеотидов, кодирующих области, определяющие комплементарность (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; и SEQ ID NO: 170) последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23 или последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 24.The present invention also contemplates polynucleotide sequences comprising one or more of the polynucleotide sequences encoding the antibody fragments described herein. In one embodiment of the present invention, polynucleotides encoding antibody fragments having CGRP binding specificity comprise or alternatively consist of one, two, three or more, including all of the following polynucleotides encoding antibody fragments: polynucleotide SEQ ID NO : 161, encoding the sequence of the variable region of the light chain SEQ ID NO: 21; a polynucleotide of SEQ ID NO: 162 encoding a light chain sequence of SEQ ID NO: 22; a polynucleotide of SEQ ID NO: 163 encoding the heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 23; a polynucleotide of SEQ ID NO: 164 encoding the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 24; polynucleotides encoding complementarity determining regions (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; and SEQ ID NO: 167) light chain variable region sequences of SEQ ID NO: 21 or light chain sequences of SEQ ID NO: 22; and polynucleotides encoding the complementarity determining regions (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; and SEQ ID NO: 170) of the heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 23 or the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 24.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения полинуклеотиды по изобретеIn a preferred embodiment of the present invention, the polynucleotides of the invention

- 21 040241 нию включают или, в качестве альтернативы, состоят из полинуклеотидов, кодирующих Fab-фрагменты (антигенсвязывающие фрагменты), обладающие специфичностью связывания с CGRP. По отношению к антителу Ab3, полинуклеотиды, кодирующие полноразмерное антитело Ab3, включают или, в альтернативном случае, состоят из полинуклеотида SEQ ID NO: 162, кодирующего последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 22, и полинуклеотида SEQ ID NO: 164, кодирующего последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 24.- 21 040241 include or, alternatively, consist of polynucleotides encoding Fab fragments (antigen-binding fragments) with binding specificity for CGRP. With respect to the Ab3 antibody, the polynucleotides encoding the full-length Ab3 antibody comprise or alternatively consist of the polynucleotide of SEQ ID NO: 162 encoding the light chain sequence of SEQ ID NO: 22 and the polynucleotide of SEQ ID NO: 164 encoding the heavy chain sequence chains SEQ ID NO: 24.

Еще один вариант воплощения настоящего изобретения рассматривает указанные полинуклеотиды, внедренные в экспрессирующий вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, например клетках СНО, NSO, НЕК 293 или системах на основе клеток грибов, насекомых или микроорганизмов, например клеток дрожжей, например дрожжей Pichia. Подходящие виды Pichia включают вид Pichia pastoris, но не ограничиваются им. В одном варианте воплощения изобретения, описанном здесь (ниже), Fabфрагменты можно получить путем ферментативного гидролиза Ab3 (например, папаином), после экспрессии указанных полноразмерных полинуклеотидов в подходящем хозяине. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, например, Ab3, или их Fab-фрагменты можно продуцировать путем экспрессии полинуклеотидов Ab3 в клетках млекопитающих, например, клетках СНО, NSO или НЕК 293, системах на основе клеток грибов, насекомых или микроорганизмов, например, клеток дрожжей (например, диплоидных дрожжей, например, диплоидных Pichia) и других штаммах дрожжей. Подходящие виды Pichia включают вид Pichia pastoris, но не ограничиваются им.Another embodiment of the present invention contemplates said polynucleotides inserted into an expression vector for expression in mammalian cells, e.g. CHO, NSO, HEK 293 cells, or fungal, insect or microbial cell systems, e.g. yeast cells, e.g. Pichia yeast. Suitable Pichia species include, but are not limited to, Pichia pastoris. In one embodiment described herein (below), Fab fragments can be obtained by enzymatic hydrolysis of Ab3 (eg, with papain), after expression of said full-length polynucleotides in a suitable host. In yet another embodiment of the invention, anti-CGRP antibodies, e.g. Ab3, or Fab fragments thereof can be produced by expression of Ab3 polynucleotides in mammalian cells, e.g. CHO, NSO or HEK 293 cells, fungal, insect or microbial cell systems, for example, yeast cells (eg diploid yeast, eg diploid Pichia) and other strains of yeast. Suitable Pichia species include, but are not limited to, Pichia pastoris.

В одном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на выделенный полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность VH антитела против CGRP, выбранную из SEQ ID NO: 23 и 24, или кодирующий ее вариант, где по меньшей мере один каркасный остаток (FR-остаток) замещен аминокислотой, присутствующей в соответствующем положении VH-полипептида антитела кролика против CGRP, или путем консервативной аминокислотной замены.In one embodiment, the present invention is directed to an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide encoding an anti-CGRP antibody VH amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 23 and 24, or encoding a variant thereof, wherein at least one framework residue (FR residue) is substituted an amino acid present at the appropriate position of the VH polypeptide of the rabbit anti-CGRP antibody, or by a conservative amino acid substitution.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на выделенный полинуклеотид, включающий полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность V_L антитела против CGRP 21 и 22, или кодирующую ее вариант, где по меньшей мере один каркасный остаток (FR-остаток) замещен аминокислотой, присутствующей в соответствующем положении VLполипептида антитела кролика против CGRP, или путем консервативной аминокислотной замены.In yet another embodiment, the present invention is directed to an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide sequence encoding the V _L amino acid sequence of antibodies against CGRP 21 and 22, or encoding a variant thereof, wherein at least one framework residue (FR residue) is substituted with an amino acid present in the corresponding position of the VL polypeptide of the rabbit anti-CGRP antibody, or by a conservative amino acid substitution.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на один или более гетерологичных полинуклеотидов, включающих последовательность, кодирующую полипептиды, содержащиеся в SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24.In yet another embodiment, the present invention is directed to one or more heterologous polynucleotides comprising a sequence encoding polypeptides contained in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 24.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на выделенный полинуклеотид, экспрессирующий полипептид, содержащий по меньшей мере один CDR-полипептид, происходящий от антитела против CGRP, причем указанный экспрессированный полипептид сам по себе специфически связывает CGRP или специфически связывает CGRP при экспрессии в сочетании с еще одной полинуклеотидной последовательностью, экспрессирующей полипептид, содержащий по меньшей мере один CDR-полипептид, происходящий от антитела против CGRP, причем указанный по меньшей мере один CDR выбран из CDR, содержащихся в V_L- или VH-полипептидах SEQ ID NO: 21, 22, 23 или 24.In yet another embodiment, the present invention is directed to an isolated polynucleotide expressing a polypeptide comprising at least one CDR polypeptide derived from an anti-CGRP antibody, said expressed polypeptide itself specifically binding to CGRP or specifically binding to CGRP when expressed in combination with another one polynucleotide sequence expressing a polypeptide containing at least one CDR polypeptide derived from an anti-CGRP antibody, said at least one CDR being selected from the CDRs contained in the V _L or VH polypeptides of SEQ ID NOs: 21, 22, 23 or 24.

Кроме того, рассматриваются клетки-хозяева и векторы, включающие указанные полинуклеотиды.In addition, host cells and vectors containing these polynucleotides are contemplated.

Кроме того, настоящее изобретение рассматривает векторы, включающие полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей, а также отдельные области, определяющие комплементарность (CDR или гипервариабельные участки), как изложено здесь, а также клетки-хозяева, включающие последовательности указанных векторов. В одном варианте воплощения настоящего изобретения клетка-хозяин является дрожжевой клеткой. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения указанная дрожжевая клеткахозяин принадлежит к роду Pichia.In addition, the present invention contemplates vectors comprising polynucleotide sequences encoding polypeptide sequences of heavy and light chain variable regions, as well as separate complementarity determining regions (CDRs or hypervariable regions) as set forth herein, as well as host cells comprising sequences of these vectors. . In one embodiment of the present invention, the host cell is a yeast cell. In yet another embodiment of the present invention, said yeast host cell belongs to the genus Pichia.

Скрининг и выделение В-клетокScreening and isolation of B cells

В одном варианте воплощения настоящее изобретение рассматривает получение и выделение клональной популяции антиген-специфических В-клеток, которые можно использовать для выделения по меньшей мере одной клетки, специфичной по отношению к антигену CGRP, которую можно использовать для продукции моноклонального антитела против CGRP, специфичного к желательному антигену CGRP, или нуклеотидной последовательности, соответствующей такому антителу. Способы получения и выделения указанной клональной популяции антиген-специфичных В-клеток изложены, например, в патентной публикации США № 2007/0269868 Carvalho-Jensen et al., раскрытие которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Способы получения и выделения указанной клональной популяции антиген-специфических В-клеток также описаны здесь в примерах. В данной области техники известны способы обогащения клеточной популяции по размеру или плотности. См., например, патент США 5627052. Эти этапы можно использовать в дополнение к обогащению популяции клеток по антигенной специфичности.In one embodiment, the present invention contemplates the generation and isolation of a clonal population of antigen-specific B cells that can be used to isolate at least one cell specific for a CGRP antigen that can be used to produce an anti-CGRP monoclonal antibody specific for the desired a CGRP antigen, or a nucleotide sequence corresponding to such an antibody. Methods for obtaining and isolating said clonal population of antigen-specific B cells are set forth, for example, in US Patent Publication No. 2007/0269868 Carvalho-Jensen et al. Methods for obtaining and isolating the specified clonal population of antigen-specific b-cells are also described here in the examples. Methods for enriching a cell population for size or density are known in the art. See, for example, US Pat. No. 5,627,052. These steps can be used in addition to enriching a population of cells for antigen specificity.

Способы гуманизации антителMethods for Humanizing Antibodies

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение рассматривает способы гуманизации тяжелых и легких цепей антител. Способы гуманизации тяжелых и легких цепей антител, которые можноIn yet another embodiment, the present invention contemplates methods for humanizing antibody heavy and light chains. Methods for humanizing antibody heavy and light chains that can be

- 22 040241 применять к антителам против CGRP, изложены, например, в публикации патентной заявки США № 2009/0022659 Olson et al. и в патенте США № 7935340 Garcia-Martinez et al., раскрытие каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.- 22 040241 apply to anti-CGRP antibodies are set forth, for example, in US Patent Application Publication No. 2009/0022659 Olson et al. and US Pat. No. 7,935,340 to Garcia-Martinez et al., the disclosure of each of which is hereby incorporated by reference in its entirety.

Способы получения антител и их фрагментовMethods for obtaining antibodies and their fragments

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение рассматривает способы получения антител против CGRP и их фрагментов. Способы получения антител против CGRP и их фрагментов, секретируемых из полиплоидных, предпочтительно диплоидных или тетраплоидных штаммов дрожжей, компетентных по спариванию, изложены, например, в публикации патентной заявки США № 2009/0022659 Olson et al. и в патенте США № 7935340 Garcia-Martinez et al., раскрытие каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.In yet another embodiment, the present invention contemplates methods for producing anti-CGRP antibodies and fragments thereof. Methods for producing anti-CGRP antibodies and fragments thereof secreted from polyploid, preferably diploid or tetraploid, mating competent yeast strains are described, for example, in US Patent Application Publication No. 2009/0022659 Olson et al. and US Pat. No. 7,935,340 to Garcia-Martinez et al., the disclosure of each of which is hereby incorporated by reference in its entirety.

Другие способы получения антител хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, способы получения химерных антител в настоящее время хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США № 4816567 Cabilly et al.; Morrison et al., P.N.A.S. USA, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984), раскрытие каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки).Other methods for producing antibodies are well known to those skilled in the art. For example, methods for making chimeric antibodies are now well known in the art (see, for example, US Pat. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G. L. et al., Nature, 312:643-46 (1984, the disclosure of each of which is hereby incorporated by reference in its entirety).

Аналогично другие способы получения гуманизированных антител в настоящее время хорошо известны в данной области техники (см., например, патенты США № 5530101, 5585089, 5693762 и 6180370 Queen et al.; патенты США № 5225539 и 6548640 Winter; патенты США № 6054297, 6407213 и 6639055 Carter et al.; патент США № 6632927 Adair; Jones, Р.Т. et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al., Science, 239:1534-36 (1988), раскрытие каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки).Similarly, other methods for producing humanized antibodies are now well known in the art (see, for example, US Pat. and 6,639,055 Carter et al., U.S. Patent No. 6,632,927 Adair, Jones, P. T. et al., Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann, L., et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al., Science, 239:1534-36 (1988, the disclosure of each of which is hereby incorporated by reference in its entirety).

Полипептиды антител по настоящему изобретению, обладающие специфичностью связывания с CGRP, также можно получить путем конструирования с использованием стандартных техник, хорошо известных специалистам в данной области техники, экспрессирующего вектора, включающего оперон и последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела, причем последовательность ДНК, кодирующая CDR, необходимые для специфичности антитела, получена из источника клеток нечеловеческого происхождения, предпочтительно из В-клеток кролика, а последовательность ДНК, кодирующая оставшиеся фрагменты цепи антитела, получена из источника клеток человеческого происхождения.The antibody polypeptides of the present invention having binding specificity for CGRP can also be obtained by constructing, using standard techniques well known to those skilled in the art, an expression vector comprising an operon and a DNA sequence encoding an antibody heavy chain, wherein the DNA sequence encoding a CDR necessary for the specificity of the antibody is derived from a non-human cell source, preferably rabbit B cells, and the DNA sequence encoding the remaining fragments of the antibody chain is derived from a human cell source.

Второй экспрессирующий вектор получают с использованием тех же стандартных средств, хорошо известных специалистам в данной области техники, причем указанный экспрессирующий вектор содержит оперон и последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь антитела, причем последовательность ДНК, кодирующая CDR, необходимые для специфичности антитела, получена из источника клеток нечеловеческого происхождения, предпочтительно из В-клеток кролика, а последовательность ДНК, кодирующая оставшиеся фрагменты цепи антитела, получена из источника клеток человеческого происхождения.A second expression vector is prepared using the same standard means well known to those skilled in the art, wherein said expression vector contains an operon and a DNA sequence encoding an antibody light chain, wherein the DNA sequence encoding the CDRs required for antibody specificity is derived from a cell source of non-human origin, preferably from rabbit B cells, and the DNA sequence encoding the remaining fragments of the antibody chain is derived from a cell source of human origin.

Указанные векторы экспрессии трансфицируют в клетку-хозяина с помощью стандартных техник, хорошо известных специалистам в данной области техники, с целью получения трансфицированной клетки-хозяина, причем указанную трансфицированную клетку-хозяина культивируют с помощью стандартных техник, хорошо известных специалистам в данной области техники, с целью получения указанных полипептидов антител.Said expression vectors are transfected into a host cell using standard techniques well known to those skilled in the art to obtain a transfected host cell, said transfected host cell being cultured using standard techniques well known to those skilled in the art, with the purpose of obtaining these antibody polypeptides.

Клетку-хозяина можно совместно трансфицировать двумя экспрессирующими векторами, описанными выше, причем первый экспрессирующий вектор содержит ДНК, кодирующую оперон и полипептид, происходящий от легкой цепи, а второй вектор содержит ДНК, кодирующую оперон, и полипептид, происходящий от тяжелой цепи. Указанные два вектора содержат различные селективные маркеры, но предпочтительно достигают практически равной экспрессии полипептидов тяжелой и легкой цепей. В качестве альтернативы можно использовать единственный вектор, включающий ДНК, кодирующую полипептиды как тяжелой, так и легкой цепей. Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей могут содержать кДНК и/или геномную ДНК.The host cell can be co-transfected with the two expression vectors described above, wherein the first expression vector contains DNA encoding an operon and a light chain-derived polypeptide, and the second vector contains DNA encoding an operon and a heavy chain-derived polypeptide. These two vectors contain different selectable markers, but preferably achieve substantially equal expression of the heavy and light chain polypeptides. Alternatively, a single vector containing DNA encoding both heavy and light chain polypeptides can be used. The heavy and light chain coding sequences may comprise cDNA and/or genomic DNA.

Клетки-хозяева, используемые для экспрессии полипептидов антител, могут являться бактериальной клеткой, например Е. coli, или эукариотической клеткой, например P. pastoris. В одном варианте воплощения настоящего изобретения для этой цели можно использовать клетку млекопитающего хорошо определенного типа, например миеломную клетку, линию клеток яичника китайского хомячка (СНО), линию клеток NSO или линию клеток HEK293.The host cells used to express the antibody polypeptides can be a bacterial cell, such as E. coli, or a eukaryotic cell, such as P. pastoris. In one embodiment of the present invention, a well-defined type of mammalian cell may be used for this purpose, such as a myeloma cell, a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell line, an NSO cell line, or a HEK293 cell line.

Общие способы конструирования векторов, способы трансфекции, необходимые для получения клетки-хозяина, и способы культивирования, необходимые для получения полипептидов антител из указанных клеток-хозяев, включают стандартные техники. Хотя в предпочтительном случае линия клеток, используемая для получения антитела, является линией клеток млекопитающего, в качестве альтернативы можно использовать любую другую подходящую линию клеток, например бактериальную линию клеток, например бактериальный штамм, происходящий от E. coli, или дрожжевую клеточную линию.The general methods for constructing vectors, the transfection methods necessary to obtain a host cell, and the culture methods necessary to obtain antibody polypeptides from said host cells include standard techniques. Although the cell line used to produce the antibody is preferably a mammalian cell line, any other suitable cell line may alternatively be used, for example a bacterial cell line, such as a bacterial strain derived from E. coli, or a yeast cell line.

Аналогично, после получения полипептиды антител можно очистить в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области техники, например фильтрацией в тангенциальном потоке, осаждением сульфатом аммония, аффинной колоночной хроматографией и т.п.Similarly, once obtained, antibody polypeptides can be purified according to standard procedures known in the art, such as tangential flow filtration, ammonium sulfate precipitation, affinity column chromatography, and the like.

Полипептиды антител, описанные здесь, также можно использовать для разработки и синтеза пепThe antibody polypeptides described here can also be used to design and synthesize pe

- 23 040241 тида или непептидных миметиков, потенциально пригодных для тех же терапевтических вариантов применения, что и полипептиды антител по изобретению. См., например, статью Saragobi et al., Science, 253:792795 (1991), содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.- 23 040241 types or non-peptide mimetics potentially suitable for the same therapeutic uses as the antibody polypeptides of the invention. See, for example, Saragobi et al., Science, 253:792795 (1991), the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Скрининговые анализыScreening tests

Настоящее изобретение также включает скрининговые анализы, предназначенные для помощи при выявлении заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP, у пациентов, проявляющих симптомы заболевания или расстройства, ассоциированного с CGRP.The present invention also includes screening assays designed to aid in the detection of CGRP-associated diseases and disorders in patients exhibiting symptoms of a CGRP-associated disease or disorder.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP по настоящему изобретению или их CGRP-связывающие фрагменты применяют для обнаружения присутствия CGRP в биологическом образце, полученном от пациента, проявляющего симптомы заболевания или расстройства, ассоциированного с CGRP. Наличие CGRP или его повышенные уровни по сравнению с уровнями CGRP до заболевания в сопоставимом биологическом образце может быть благоприятным для диагностики заболевания или расстройства, ассоциированного с CGRP.In one embodiment, the anti-CGRP antibodies of the present invention, or CGRP-binding fragments thereof, are used to detect the presence of CGRP in a biological sample obtained from a patient exhibiting symptoms of a CGRP-associated disease or disorder. The presence of, or elevated levels of, CGRP relative to pre-disease levels of CGRP in a comparable biological sample may be beneficial in diagnosing a CGRP-associated disease or disorder.

Еще один вариант воплощения настоящего изобретения обеспечивает диагностический или скрининговый анализ для помощи при диагностике заболеваний или расстройств, ассоциированных с CGRP у пациентов, проявляющих симптомы заболевания или расстройства, ассоциированного с CGRP, описанного в данном документе, включая анализ уровня экспрессии CGRP в биологическом образце от указанного пациента с использованием посттрансляционно модифицированного антитела против CGRP или его связывающего фрагмента. Антитело против CGRP или его связывающий фрагмент можно посттрансляционно модифицировать с целью внедрения обнаруживаемой группы, например группы, представленной выше в настоящем раскрытии.Yet another embodiment of the present invention provides a diagnostic or screening assay to aid in the diagnosis of CGRP-associated diseases or disorders in patients exhibiting symptoms of the CGRP-associated disease or disorder described herein, including analysis of the level of CGRP expression in a biological sample from said patient using a post-translationally modified anti-CGRP antibody or binding fragment thereof. An anti-CGRP antibody, or binding fragment thereof, can be post-translationally modified to introduce a detectable moiety, such as the moiety described above in this disclosure.

Уровень CGRP в биологическом образце определяют с использованием модифицированного антитела против CGRP или его связывающего фрагмента, как изложено здесь, и путем сравнения уровня CGRP в биологическом образце со стандартным уровнем CGRP (например, уровнем в нормальных биологических образцах). Опытный врач должен понимать, что среди нормальных биологических образцов может существовать некоторая изменчивость, и принимать это во внимание при оценке результатов. В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP по настоящему изобретению можно применять для установления связи уровней экспрессии CGRP с определенной стадией развития рака. Специалист в данной области техники может измерить CGRP у многочисленных субъектов с целью установления диапазонов экспрессии CGRP, соответствующих клинически определенным стадиям развития рака. Эти диапазоны позволят специалисту в данной области техники измерить CGRP у субъекта с диагнозом рака и установить связь уровней у каждого субъекта с диапазоном, соответствующим стадии указанного рака. Специалист в данной области техники должен понимать, что путем измерения CGRP у пациента через различные промежутки времени можно определить прогрессирование рака.The level of CGRP in a biological sample is determined using a modified anti-CGRP antibody or binding fragment thereof, as set forth herein, and by comparing the level of CGRP in the biological sample with a standard level of CGRP (eg, the level in normal biological samples). The experienced clinician should be aware that some variability may exist among normal biological specimens and take this into account when evaluating results. In one embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies of the present invention can be used to associate CGRP expression levels with a specific stage of cancer development. One skilled in the art can measure CGRP in multiple subjects in order to establish ranges of CGRP expression corresponding to clinically defined cancer stages. These ranges will allow one of skill in the art to measure CGRP in a subject diagnosed with cancer and to correlate the levels in each subject with a range corresponding to the stage of said cancer. One of skill in the art would understand that by measuring CGRP in a patient at various time intervals, cancer progression can be determined.

Вышеописанный анализ можно также применять для мониторинга заболевания или расстройства, где уровень CGRP, полученный в биологическом образце от пациента, предположительно страдающего заболеванием или расстройством, ассоциированным с CGRP, сравнивают с уровнем CGRP в предшествующих биологических образцах от этого же пациента с целью выявления изменений уровня CGRP у указанного пациента, например в связи со схемой лечения.The above assay can also be used to monitor a disease or disorder, where the level of CGRP obtained in a biological sample from a patient suspected of having a disease or disorder associated with CGRP is compared with the level of CGRP in previous biological samples from the same patient in order to detect changes in the level of CGRP. in said patient, for example in connection with a treatment regimen.

Настоящее изобретение также направлено на способ визуализации in vivo, обнаруживающий присутствие клеток, экспрессирующих CGRP, включающий введение диагностически эффективного количества диагностической композиции. Указанную визуализацию in vivo можно применять, например, для обнаружения или визуализации CGRP-экспрессирующих опухолей или метастазов, и в рамках планирования схемы для разработки эффективного протокола лечения рака. Протокол лечения может включать, например, одно или более из лучевой терапии, химиотерапии, цитокиновой терапии, генной терапии и терапии антителами, а также применения антитела против CGRP или его фрагмента.The present invention is also directed to an in vivo imaging method detecting the presence of cells expressing CGRP, comprising administering a diagnostically effective amount of a diagnostic composition. Such in vivo imaging can be used, for example, to detect or visualize CGRP-expressing tumors or metastases, and as part of regimen planning to develop an effective cancer treatment protocol. The treatment protocol may include, for example, one or more of radiation therapy, chemotherapy, cytokine therapy, gene therapy and antibody therapy, as well as the use of an anti-CGRP antibody or fragment thereof.

Настоящее изобретение также обеспечивает набор для обнаружения связывания антитела против CGRP по изобретению с CGRP. В частности, указанный набор можно применять для обнаружения присутствия CGRP, специфически реагирующего с антителом против CGRP по изобретению или его иммунореактивным фрагментом. Указанный набор может также включать антитело, связанное с подложкой, вторичное антитело, реагирующее с антигеном, и реагент для обнаружения реакции вторичного антитела с антигеном. Такой набор может являться набором для твердофазного ИФА и при необходимости может содержать субстрат, первичные и вторичные антитела и любые другие необходимые реагенты, например обнаруживаемые группы, субстраты ферментов и цветные реагенты, например, как описано здесь. Диагностический набор также может быть представлен в виде набора для иммуноблоттинга. Диагностический набор также может быть представлен в виде набора для хемилюминесцентного анализа (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, штат Мэриленд, США). Диагностический набор также может быть представлен в виде набора для лантаноидного обнаружения (PerkinElmer, Сан-Хосе, штат Калифорния, США).The present invention also provides a kit for detecting the binding of an anti-CGRP antibody of the invention to CGRP. In particular, said kit can be used to detect the presence of CGRP that specifically reacts with an anti-CGRP antibody of the invention or an immunoreactive fragment thereof. Said kit may also include an antibody bound to a support, a secondary antibody reactive with the antigen, and a reagent for detecting the reaction of the secondary antibody with the antigen. Such a kit may be a ELISA kit and optionally may contain a substrate, primary and secondary antibodies, and any other necessary reagents, such as detectable groups, enzyme substrates, and color reagents, for example, as described here. The diagnostic kit can also be presented as a Western blot kit. The diagnostic kit is also available as a chemiluminescent assay kit (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA). The diagnostic kit is also available as a lanthanide detection kit (PerkinElmer, San Jose, CA, USA).

Квалифицированный врач должен понимать, что биологический образец включает сыворотку, плазму, мочу, слюну, мазок со слизистых, плевральную жидкость, синовиальную жидкость и спинномозговую жидкость, но не ограничивается ими.The qualified physician should understand that the biological sample includes, but is not limited to, serum, plasma, urine, saliva, mucosal swab, pleural fluid, synovial fluid, and cerebrospinal fluid.

- 24 040241- 24 040241

Способы облегчения или уменьшения симптомов, или лечения, или предотвращения заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRPMethods for alleviating or reducing symptoms, or treating or preventing diseases and disorders associated with CGRP

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их фрагменты можно применять для облегчения или снижения симптомов, или лечения, или предотвращения заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP. Антитела против CGRP, описанные здесь, или их фрагменты, а также комбинации также можно вводить в терапевтически эффективном количестве пациентам, нуждающимся в лечении заболеваний и расстройств, ассоциированных с CGRP, в виде фармацевтической композиции, как более подробно описано ниже.In another embodiment, the anti-CGRP antibodies described herein, or fragments thereof, can be used to alleviate or reduce symptoms, or treat or prevent diseases and disorders associated with CGRP. Anti-CGRP antibodies described herein, or fragments thereof, as well as combinations, can also be administered in a therapeutically effective amount to patients in need of treatment of CGRP-associated diseases and disorders in the form of a pharmaceutical composition, as described in more detail below.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения описанные здесь антитела против CGRP или их фрагменты можно применять для облегчения или снижения симптомов или лечения или профилактики мигреней (с аурой или без нее), потери массы тела, рака или опухолей, ангиогенеза, связанного с раковым или опухолевым ростом, ангиогенеза, связанного с выживанием рака или опухоли, боли, гемиплегических мигреней, кластерных головных болей, мигренозной невралгии, хронических головных болей, головных болей напряжения, общих головных болей, приливов, хронической пароксизмальной гемикрании, вторичных головных болей вследствие основной структурной проблемы в области головы или шеи, черепной невралгии, синусных головных болей (например, связанных с синуситом), и головных болей или мигреней, вызванных аллергией.In another embodiment, the anti-CGRP antibodies described herein, or fragments thereof, can be used to alleviate or reduce the symptoms of, or treat or prevent migraines (with or without aura), weight loss, cancer or tumors, angiogenesis associated with cancer or tumor growth, angiogenesis associated with cancer or tumor survival, pain, hemiplegic migraines, cluster headaches, migraine neuralgia, chronic headaches, tension headaches, general headaches, hot flushes, chronic paroxysmal hemicrania, secondary headaches due to an underlying structural problem in the area head or neck, cranial neuralgia, sinus headaches (such as those associated with sinusitis), and headaches or migraines caused by allergies.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их фрагменты в комбинации со вторым агентом или без него можно применять для облегчения или снижения симптомов, или лечения, или предотвращения следующего неограничивающего списка заболеваний и расстройств: боли, воспалительной боли, боли в постоперационном разрезе, комплексного регионального болевого синдрома, раковой боли, боли при первичном или метастатическом раке костей, боли при переломе, хронической боли, боли при остеопорозном переломе, боли в результате ожога, остеопорозе, подагрической боли в суставах, боли в животе, боли, связанной с кризисом серповидных клеток и другой ноцицептической боли, а также гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, цирроза печени, нейрогенной боли, невропатической боли, ноцицептической боли, невралгии тройничного нерва, постгерпетической невралгии, фантомной боли конечностей, фибромиалгии, менструальной боли, овариалгии, рефлекторной симпатической дистрофии, нейрогенной боли, боли при остеоартрите или ревматоидном артрите, боли в пояснице, диабетической невропатии, пояснично-крестцовом радикулите, или боли или висцеральной боли, связанной с: желудочно-пищеводным рефлюксом, диспепсией, синдромом раздраженного кишечника, раздраженной толстой кишкой, спазмами толстой кишки, слизистым колитом, воспалительным заболеванием кишечника, болезнью Крона, илеитом, язвенным колитом, почечной коликой, дисменореей, циститом, менструальным периодом, родами, менопаузой, простатитом, панкреатитом, почечной коликой, дисменореей, циститом, в том числе интерстициальным циститом (IC), операцией, связанной с кишечной непроходимостью, дивертикулитом, перитонитом, перикардитом, гепатитом, аппендицитом, колитом, холециститом, эндометриозом, хроническим и/или острым панкреатитом, инфарктом миокарда, боли в почках, плевральной боли, простатите, боли в области таза, травмы органа, хронической ноцицептивной боли, хронической невропатической боли, хронической воспалительной боли, фибромиалгии, приступа неконтролируемой боли и постоянной боли, а также раковой боли, возникающей в результате злокачественного новообразования или рака, предпочтительно выбранного из одного или более из: аденокарциномы железистой ткани, бластомы эмбриональной ткани органов, карциномы эпителиальной ткани, лейкоза в тканях, образующих клетки крови, лимфомы лимфатической ткани, миеломы костного мозга, саркомы в соединительной или опорной ткани, рака надпочечников, лимфомы, связанной со СПИДом, анемии, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного мозга, рака молочной железы, карциноидных опухолей, рака шейки матки, химиотерапии, рака толстой кишки, цитопении, рака эндометрия, рака пищевода, рака желудка, рака головы, рака шеи, гепатобилиарного рака, рака почки, лейкоза, рака печени, рака легких, лимфомы, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, опухолей нервной системы, рака ротовой полости, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака прямой кишки, рака кожи, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы, рака уретры, рака костей, сарком соединительной ткани, рака костной ткани, рака кроветворных клеток, рака костного мозга, множественной миеломы, лейкоза, первичного или вторичного рака костей, опухолей, метастазирующих в кости, опухолей, прорастающих в нервы и полые органы, опухолей, расположенных вблизи нервных структур. Кроме того, в предпочтительном случае раковая боль включает висцеральную боль, предпочтительно висцеральную боль, возникающую в результате рака поджелудочной железы и/или метастазов в брюшную полость. Кроме того, в предпочтительном случае раковая боль включает соматическую боль, предпочтительно соматическую боль, вызванную одним или более заболеваний из рака костей, метастазов в кости, послеоперационной раковой боли, сарком соединительной ткани, рака костной ткани, рака кроветворных клеток костного мозга, множественной миеломы, лейкоза, первичного или вторичного рака костей.In one embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies described herein, or fragments thereof, in combination with or without a second agent, can be used to alleviate or reduce symptoms, or treat or prevent the following non-limiting list of diseases and disorders: pain, inflammatory pain, pain in the postoperative section, complex regional pain syndrome, cancer pain, pain from primary or metastatic bone cancer, fracture pain, chronic pain, osteoporotic fracture pain, burn pain, osteoporosis, gouty joint pain, abdominal pain, pain, associated with sickle cell crisis and other nociceptive pain, as well as hepatocellular carcinoma, breast cancer, liver cirrhosis, neurogenic pain, neuropathic pain, nociceptive pain, trigeminal neuralgia, postherpetic neuralgia, phantom limb pain, fibromyalgia, menstrual pain, ovaryalgia, reflex pain sympathetic dystrophy, neurogenic pain, osteoarthritis or rheumatoid arthritis pain, lower back pain, diabetic neuropathy, sciatica, or pain or visceral pain associated with: gastroesophageal reflux, dyspepsia, irritable bowel syndrome, irritable colon, colonic spasms colon, mucosal colitis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ileitis, ulcerative colitis, renal colic, dysmenorrhea, cystitis, menstrual period, childbirth, menopause, prostatitis, pancreatitis, renal colic, dysmenorrhea, cystitis, including interstitial cystitis (IC) , surgery associated with intestinal obstruction, diverticulitis, peritonitis, pericarditis, hepatitis, appendicitis, colitis, cholecystitis, endometriosis, chronic and / or acute pancreatitis, myocardial infarction, kidney pain, pleural pain, prostatitis, pelvic pain, organ trauma , chronic nociceptive pain, chronic neuropathic pain, chronic inflammatory pain, fibromyalgia, attack of uncontrollable pain and persistent pain, as well as cancerous pain resulting from malignancy or cancer, preferably selected from one or more of: adenocarcinoma of glandular tissue, blastoma of embryonic tissue of organs, carcinoma of epithelial tissue, leukemia in tissues, blood cells, lymphomas of lymphatic tissue, bone marrow myelomas, sarcomas in connective or supporting tissue, adrenal cancer, AIDS-related lymphoma, anemia, bladder cancer, bone cancer, brain cancer, breast cancer, carcinoid tumors, cervical cancer uterine cancer, chemotherapy, colon cancer, cytopenia, endometrial cancer, esophageal cancer, stomach cancer, head cancer, neck cancer, hepatobiliary cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lung cancer, lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, tumors of the nervous system , oral cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, cancer rectal cancer, skin cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, urethral cancer, bone cancer, connective tissue sarcoma, bone tissue cancer, hematopoietic cell cancer, bone marrow cancer, multiple myeloma, leukemia, primary or secondary bone cancer, tumors that metastasize to bones, tumors that invade nerves and hollow organs, tumors located near nerve structures. In addition, in the preferred case, cancer pain includes visceral pain, preferably visceral pain resulting from pancreatic cancer and/or metastases in the abdominal cavity. In addition, in the preferred case, cancer pain includes somatic pain, preferably somatic pain, caused by one or more of bone cancer, bone metastases, postoperative cancer pain, connective tissue sarcoma, bone cancer, bone marrow hematopoietic cell cancer, multiple myeloma, leukemia, primary or secondary bone cancer.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их фрагменты в комбинации со вторым агентом или без него можно применять для облегчения или снижения симптомов, или лечения, или предотвращения следующего неограничивающего спиIn yet another embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies described herein, or fragments thereof, in combination with or without a second agent, can be used to alleviate or reduce symptoms, or treat or prevent the next non-limiting sleep disorder.

- 25 040241 ска заболеваний и расстройств: рака или опухолей, ангиогенеза, ассоциированного с раковым или опухолевым ростом, ангиогенеза, ассоциированного с выживанием рака или опухоли.- 25 040241 ska diseases and disorders: cancer or tumors, angiogenesis associated with cancerous or tumor growth, angiogenesis associated with cancer or tumor survival.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их фрагменты в комбинации со вторым агентом или без него можно применять для облегчения или снижения симптомов, или лечения, или предотвращения следующего неограничивающего списка заболеваний и расстройств: нейрогенной, невропатической или ноцицептической боли. Невропатическая боль может включать невралгию тройничного нерва, постгерпетическую невралгию, фантомную боль конечностей, фибромиалгию, менструальную боль, овариалгию, рефлекторную симпатическую дистрофию и нейрогенную боль, но не ограничивается ими. В других предпочтительных вариантах воплощения это боль при остеоартрите или ревматоидном артрите, боль в пояснице, диабетическая невропатия, пояснично-крестцовый радикулит и другая невропатическая боль.In yet another embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies described herein, or fragments thereof, in combination with or without a second agent, can be used to alleviate or reduce symptoms, or treat or prevent the following non-limiting list of diseases and disorders: neurogenic, neuropathic, or nociceptive pain. Neuropathic pain may include, but is not limited to, trigeminal neuralgia, postherpetic neuralgia, phantom limb pain, fibromyalgia, menstrual pain, ovariangia, reflex sympathetic dystrophy, and neurogenic pain. In other preferred embodiments, it is osteoarthritis or rheumatoid arthritis pain, low back pain, diabetic neuropathy, sciatica, and other neuropathic pain.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP и их фрагменты в комбинации со вторым агентом или без него можно применять для облегчения или снижения симптомов, или лечения, или предотвращения следующего неограничивающего списка заболеваний и расстройств: гиперактивности мочевого пузыря и других состояний мочевыделительной системы, желудочно-пищеводного рефлюкса и висцеральной боли, связанной с желудочно-пищеводным рефлюксом, диспепсией, синдромом раздраженного кишечника, воспалительным заболеванием кишечника, болезнью Крона, илеитом, язвенным колитом, почечной коликой, дисменореей, циститом, менструальным периодом, родами, менопаузой, простатитом, пруритом или панкреатитом.In yet another embodiment of the present invention, anti-CGRP antibodies and fragments thereof, in combination with or without a second agent, can be used to alleviate or reduce symptoms, or treat or prevent the following non-limiting list of diseases and disorders: overactive bladder and other conditions of the urinary system, gastroesophageal reflux and visceral pain associated with gastroesophageal reflux, dyspepsia, irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ileitis, ulcerative colitis, renal colic, dysmenorrhea, cystitis, menstrual period, childbirth, menopause, prostatitis, pruritus or pancreatitis.

Кроме того, рассматриваемые антитела и фрагменты антител против CGRP можно применять отдельно или в сочетании с другими активными агентами, например, опиоидами и неопиоидными анальгетиками, например, НПВС, для обезболивания или усиления эффективности другого анальгетика или для предотвращения или облегчения устойчивости к специфическому анальгетику, например, морфину или родственным опиоидным анальгетикам. Доказательством роли CGRP в блокировании/обращении развития морфин-индуцированного обезболивания является тот факт, что CGRP8-37 и антагонист рецептора CGRP (BIBN4096BS), согласно сообщениям, предотвращает/обращает развитие устойчивости к морфину - (Powell et al., 2000 J Brit J Pharmacol (131):875; Menard et al., 1996 J Neurosci (16):2342; Wang et al., 2009 FASEB J (23):2576; Wang et al., 2010 Pain (151):194).In addition, the subject anti-CGRP antibodies and antibody fragments can be used alone or in combination with other active agents, e.g. opioids and non-opioid analgesics, e.g. , morphine or related opioid analgesics. Evidence for a role for CGRP in blocking/reversing the development of morphine-induced pain relief is the fact that CGRP8-37 and the CGRP receptor antagonist (BIBN4096BS) have been reported to prevent/reverse the development of morphine resistance - (Powell et al., 2000 J Brit J Pharmacol (131):875; Menard et al., 1996 J Neurosci (16):2342; Wang et al., 2009 FASEB J (23):2576; Wang et al., 2010 Pain (151):194).

Рассматриваемые антитела потенциально можно объединить с любым опиоидным анальгетиком или НПВС или другим анальгетиком, потенциально являющимся другим антителом, с целью повышения или усиления контроля над болью, или обращения или подавления устойчивости к анальгетику, например, опиоидному анальгетику. Это может дать возможность введения такого анальгетика на более длительный срок или в пониженных дозах, тем самым потенциально облегчая неблагоприятные побочные эффекты, связанные с ним.The antibodies in question can potentially be combined with any opioid analgesic or NSAID or other analgesic, potentially another antibody, to increase or enhance pain control, or reverse or suppress resistance to an analgesic, such as an opioid analgesic. This may allow the administration of such an analgesic for a longer duration or at lower doses, thereby potentially alleviating the adverse side effects associated with it.

Термин опиоидный анальгетик в данном описании относится ко всем лекарственным средствам, природным или синтетическим, обладающим морфиноподобным действием. Синтетические и полусинтетические опиоидные анальгетики являются производными пяти классов химических соединений: фенантренов; фенилгептиламинов; фенилпиперидинов; морфинанов; и бензоморфанов, все из которых находятся в рамках указанного термина. Примеры опиоидных анальгетиков включают кодеин, дигидрокодеин, диацетилморфин, гидрокодон, гидроморфон, оксиморфон, леворфанол, альфентанил, бупренорфин, буторфанол, фентанил, суфентанил, меперидин, метадон, налбуфин, пропоксифен и пентазоцин или их фармацевтически приемлемые соли.The term opioid analgesic as used herein refers to all drugs, natural or synthetic, that have a morphine-like effect. Synthetic and semi-synthetic opioid analgesics are derivatives of five classes of chemical compounds: phenanthrenes; phenylheptylamines; phenylpiperidines; morphinans; and benzomorphans, all of which are within the specified term. Examples of opioid analgesics include codeine, dihydrocodeine, diacetylmorphine, hydrocodone, hydromorphone, oxymorphone, levorphanol, alfentanil, buprenorphine, butorphanol, fentanyl, sufentanil, meperidine, methadone, nalbuphine, propoxyphene, and pentazocine or their pharmaceutically acceptable salts.

Термин НПВС относится к нестероидному противовоспалительному соединению. НПВС классифицируются на основании их способности ингибировать циклооксигеназу. Циклооксигеназа 1 и циклооксигеназа 2 являются двумя основными изоформами циклооксигеназы, и большинство стандартных НПВС являются смешанными ингибиторами двух указанных изоформ. Большинство стандартных НПВС подпадают под одну из следующих пяти структурных категорий: (1) производные пропионовой кислоты, например ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производные уксусной кислоты, например толметин и сулиндак; (3) производные фенамовой кислоты, например мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; (4) производные бифенилкарбоновой кислоты, например дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамы, например пироксикам, судоксикам и изоксикам. Описан еще один класс НПВС, селективно ингибирующих циклооксигеназу 2. Ингибиторы Сох-2 описаны, например, в патентах США № 5616601; 5604260; 5593994; 5550142; 5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944; и 5130311, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки. Некоторые типичные ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб (SC-58635), DUP-697, флосулид (CGP-28238), мелоксикам, 6-метокси-2-нафтилуксусную кислоту (6-MNA), рофекоксиб, МК-966, набуметон (пролекарство 6-MNA), нимесулид, NS-398, SC-5766, SC-58215, Т-614 или их комбинации.The term NSAID refers to a non-steroidal anti-inflammatory compound. NSAIDs are classified based on their ability to inhibit cyclooxygenase. Cyclooxygenase 1 and cyclooxygenase 2 are the two main isoforms of cyclooxygenase, and most standard NSAIDs are mixed inhibitors of these two isoforms. Most standard NSAIDs fall into one of the following five structural categories: (1) propionic acid derivatives such as ibuprofen, naproxen, naprosyn, diclofenac, and ketoprofen; (2) acetic acid derivatives such as tolmetin and sulindac; (3) fenamic acid derivatives such as mefenamic acid and meclofenamic acid; (4) biphenylcarboxylic acid derivatives such as diflunisal and flufenisal; and (5) oxicams, eg piroxicam, sudoxicam and isoxicam. Another class of NSAIDs that selectively inhibit cyclooxygenase 2 has been described. Cox-2 inhibitors are described, for example, in US Pat. Nos. 5,616,601; 5604260; 5593994; 5550142; 5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944; and 5130311, all of which are incorporated herein by reference. Some exemplary COX-2 inhibitors include celecoxib (SC-58635), DUP-697, flossulide (CGP-28238), meloxicam, 6-methoxy-2-naphthylacetic acid (6-MNA), rofecoxib, MK-966, nabumetone (prodrug 6-MNA), nimesulide, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614, or combinations thereof.

В некоторых вариантах воплощения можно принимать аспирин и/или ацетаминофен в сочетании с рассматриваемым антителом или фрагментом против CGRP. Аспирин является еще одним типом нестероидного противовоспалительного соединения.In some embodiments, aspirin and/or acetaminophen may be administered in combination with the anti-CGRP antibody or fragment in question. Aspirin is another type of non-steroidal anti-inflammatory compound.

В типичном случае неограничивающие заболевания и расстройства, которые можно лечить и/или предотвращать путем введения антител против CGRP по настоящему изобретению, включают боль, выTypically, non-limiting diseases and disorders that can be treated and/or prevented by administering the anti-CGRP antibodies of the present invention include pain,

- 26 040241 званную любым состоянием, связанным с нейрогенной, невропатической, воспалительной, термической или ноцицептической болью. В предпочтительном случае указанное расстройство ассоциировано с повышенным уровнем CGRP в области боли. В некоторых вариантах воплощения предпочтительному лечению подвергают невропатическую боль, рефлекторную невралгию тройничного нерва, постгерпетическую невралгию, фантомную боль конечностей, фибромиалгию, рефлекторную симпатическую дистрофию и состояния с нейрогенной болью. В других вариантах воплощения предпочтительному лечению подвергают раковую боль, в частности, боль при раке костей, боль при остеоартрите или ревматоидном артрите, боль в пояснице, боль в послеоперационном разрезе, боль при переломе, боль при остеопорозном переломе, остеопороз, подагрическую боль в суставах, диабетическую невропатию, поясничнокрестцовый радикулит, боли, связанные с кризисом серповидных клеток, мигрень и другую нейропатическую и/или ноцицептическую боль. Таким образом, настоящее изобретение включает способы лечения, предотвращения и/или облегчения любого заболевания или расстройства, ассоциированного с активностью CGRP или стимуляцией CGRP (включая любое из вышеупомянутых типичных заболеваний, расстройств и состояний) за счет применения антител и фрагментов антител по изобретению. Терапевтические способы по настоящему изобретению включают введение субъекту любого состава, содержащего антитело против CGRP, как раскрыто здесь, по отдельности или в сочетании с другим активным агентом.- 26 040241 called any condition associated with neurogenic, neuropathic, inflammatory, thermal or nociceptive pain. Preferably, said disorder is associated with elevated levels of CGRP in the area of pain. In some embodiments, neuropathic pain, trigeminal reflex neuralgia, postherpetic neuralgia, phantom limb pain, fibromyalgia, reflex sympathetic dystrophy, and neurogenic pain conditions are the preferred treatments. In other embodiments, the preferred treatment is cancer pain, such as bone cancer pain, osteoarthritis or rheumatoid arthritis pain, low back pain, incisional pain, fracture pain, osteoporotic fracture pain, osteoporosis, arthritic joint pain, diabetic neuropathy, sciatica, sickle cell crisis pain, migraine and other neuropathic and/or nociceptive pain. Thus, the present invention includes methods of treating, preventing and/or alleviating any disease or disorder associated with CGRP activity or CGRP stimulation (including any of the above-mentioned typical diseases, disorders and conditions) through the use of antibodies and antibody fragments of the invention. Therapeutic methods of the present invention include administering to a subject any formulation containing an anti-CGRP antibody as disclosed herein, alone or in combination with another active agent.

Субъект, которому вводят фармацевтический состав, может являться, например, любым человеком или животным, не являющимся человеком, нуждающимся в таком лечении, профилактике и/или облегчении, или субъектом, который мог бы в другом случае получить благоприятный эффект от ингибирования или ослабления CGRP-опосредованной активности. Например, субъектом может быть человек, которому поставлен диагноз или который предположительно подвергается риску любого из вышеуказанных заболеваний или расстройств. Настоящее изобретение также включает применение любого из фармацевтических составов, раскрытых здесь, при производстве лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или облегчения любого заболевания или расстройства, ассоциированного с активностью CGRP (включая любые из вышеупомянутых типичных заболеваний, расстройств и состояний).The subject to whom the pharmaceutical composition is administered can be, for example, any human or non-human animal in need of such treatment, prevention and/or alleviation, or a subject that might otherwise benefit from inhibition or attenuation of CGRP- mediated activity. For example, the subject may be a human who has been diagnosed with or is suspected of being at risk for any of the above diseases or disorders. The present invention also includes the use of any of the pharmaceutical compositions disclosed herein in the manufacture of a medicament for the treatment, prevention and/or amelioration of any disease or disorder associated with CGRP activity (including any of the aforementioned typical diseases, disorders and conditions).

ВведениеIntroduction

В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их CGRP-связывающие фрагменты, а также комбинации указанных антител или фрагментов антител вводят субъекту в концентрации между приблизительно 0,1 и 100,0 мг/кг массы тела субъектареципиента. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их CGRP-связывающие фрагменты, а также комбинации указанных антител или фрагментов антител вводят субъекту в концентрации приблизительно 0,4 мг/кг массы тела субъектареципиента. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их CGRP-связывающие фрагменты, а также комбинации указанных антител или фрагментов антител вводят субъекту-реципиенту с частотой раз в двадцать шесть недель или менее, например раз в шестнадцать недель или менее, раз в восемь недель или менее, раз в четыре недели или менее, раз в две недели или менее, раз в неделю или менее или раз в день или менее.In one embodiment, the anti-CGRP antibodies described herein, or CGRP-binding fragments thereof, as well as combinations of these antibodies or antibody fragments, are administered to a subject at a concentration between about 0.1 and 100.0 mg/kg body weight of the recipient subject. In a preferred embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies described herein, or CGRP-binding fragments thereof, as well as combinations of these antibodies or antibody fragments, are administered to a subject at a concentration of approximately 0.4 mg/kg body weight of the recipient subject. In a preferred embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies described herein, or their CGRP-binding fragments, as well as combinations of these antibodies or antibody fragments, are administered to the recipient subject at a frequency of once every twenty-six weeks or less, for example, once every sixteen weeks or less, every eight weeks or less, every four weeks or less, every two weeks or less, once a week or less, or once a day or less.

Fab-фрагменты можно вводить раз в две недели или менее, раз в неделю или менее, раз в день или менее, несколько раз в день и/или раз в несколько часов. В одном варианте воплощения настоящего изобретения пациент получает Fab-фрагменты в количестве от 0,1 до 40 мг/кг в день в разделенных дозах от 1 до 6 раз в день или в форме с замедленным высвобождением, эффективной для получения желательных результатов.Fab fragments can be administered once every two weeks or less, once a week or less, once a day or less, several times a day and/or every few hours. In one embodiment of the present invention, the patient receives Fab fragments in an amount of 0.1 to 40 mg/kg per day in divided doses of 1 to 6 times per day or in a sustained release form effective to obtain the desired results.

Следует понимать, что концентрация антитела или Fab, вводимого данному пациенту, может быть больше или меньше, чем типичные вводимые концентрации, представленные выше.It should be understood that the concentration of the antibody or Fab administered to a given patient may be greater or less than the typical administration concentrations presented above.

Специалист в данной области техники может экспериментально определить эффективную дозировку и частоту приема в рабочем порядке, например, руководствуясь настоящим раскрытием и информацией в Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C, & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; and Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.One skilled in the art can experimentally determine the effective dosage and frequency of administration on a routine basis, for example, as guided by this disclosure and information in Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C, & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins; and Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Philadelphia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams & Wilkins.

В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их CGRP-связывающие фрагменты, а также комбинации указанных антител или фрагментов антител вводят субъекту в фармацевтическом составе.In yet another embodiment of the present invention, the anti-CGRP antibodies described herein, or their CGRP-binding fragments, as well as combinations of these antibodies or antibody fragments, are administered to a subject in a pharmaceutical formulation.

Фармацевтическая композиция относится к химической или биологической композиции, подходящей для введения млекопитающему. Такие композиции можно специально составить для введения посредством одного или более из ряда путей, включая буккальное, накожное, эпидуральное, ингаляционное, внутриартериальное, внутрисердечное, интрацеребровентрикулярное, внутрикожное, внутримышечное, интраназальное, внутриглазное, внутрибрюшинное, интраспинальное, интратекальное, внутривенное, пероральное, парентеральное, ректальное (путем клизмы или суппозитория), подкожное, субдермальное, сублингвальное, трансдермальное и трансмукозальное введение, но не ограничиваясь ими. Кроме того, введение можно осуществлять с помощью инъекции, порошка, жидкости, геля, капель илиA pharmaceutical composition refers to a chemical or biological composition suitable for administration to a mammal. Such compositions can be specifically formulated for administration via one or more of a number of routes, including buccal, dermal, epidural, inhalation, intra-arterial, intracardiac, intracerebroventricular, intradermal, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraspinal, intrathecal, intravenous, oral, parenteral, rectal (by enema or suppository), subcutaneous, subdermal, sublingual, transdermal and transmucosal administration, but not limited to. In addition, administration can be by injection, powder, liquid, gel, drops, or

- 27 040241 других средств для введения.- 27 040241 other agents for administration.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения антитела против CGRP, описанные здесь, или их CGRP-связывающие фрагменты, а также комбинации указанных антител или фрагментов антител можно необязательно вводить субъекту в комбинации с одним или более активных агентов. Такие активные агенты включают анальгетики, антигистаминные, жаропонижающие, противовоспалительные агенты, антибиотики, противовирусные и антицитокиновые агенты. Активные агенты включают агонисты, антагонисты и модуляторы ФНО-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-α, IFN-γ, BAFF, CXCL13, IP-10, ФРЭС, ЕРО, ЭФР, HRG, фактор роста гепатоцитов (ФРГ), гепцидин, в том числе антитела, активные против любого из вышеперечисленных агентов, а также антитела, активные против любого из их рецепторов. Активные агенты также включают 2-арилпропионовые кислоты, ацеклофенак, ацеметацин, ацетилсалициловую кислоту (аспирин), алклофенак, альминопрофен, эмоксипин, ампирон, арилалкановые кислоты, азапропазон, бенорилат, беноксапрофен, бромфенак, карпрофен, целекоксиб, холинсалицилат магния, клофезон, ингибиторы СОХ-2, дексибупрофен, декскетопрофен, диклофенак, дифлунизал, дроксикам, этензамид, этодолак, эторикоксиб, физаламин, фенамовые кислоты, фенбуфен, фенопрофен, флуфенамовую кислоту, флуноксапрофен, флурбипрофен, ибупрофен, ибупроксам, индометацин, индопрофен, кебузон, кетопрофен, кеторолак, лорноксикам, локсопрофен, люмиракоксиб, магния салицилат, меклофенамовую кислоту, мефенамовую кислоту, мелоксикам, метамизол, метилсалицилат, мофебутазон, набуметон, напроксен, N-арилантраниловые кислоты, фактор роста нервов (NGF), оксаметацин, оксапрозин, оксикамы, оксифенбутазон, парекоксиб, феназон, фенилбутазон, пироксикам, пирпрофен, профены, проглуметацин, производные пиразолидина, рофекоксиб, салицилсалицилат, салициламид, салицилаты, вещество Р, сульфинпиразон, сулиндак, супрофен, теноксикам, тиапрофеновую кислоту, толфенамовую кислоту, толметин и вальдекоксиб, но не ограничиваются ими.In one embodiment, the anti-CGRP antibodies described herein, or CGRP-binding fragments thereof, as well as combinations of said antibodies or antibody fragments, can optionally be administered to a subject in combination with one or more active agents. Such active agents include analgesics, antihistamines, antipyretics, anti-inflammatory agents, antibiotics, antiviral and anticytokine agents. Active agents include agonists, antagonists and modulators of TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-α, IFN-γ, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, hepatocyte growth factor (HGF), hepcidin, including antibodies active against any of the above agents, as well as antibodies active against any of their receptors. Active agents also include 2-arylpropionic acids, aceclofenac, acemethacin, acetylsalicylic acid (aspirin), alklofenac, alminoprofen, emoxipine, ampirone, arylalkanoic acids, azapropazone, benorylate, benoxaprofen, bromfenac, carprofen, celecoxib, magnesium choline salicylate, COX inhibitors, 2, dexibuprofen, dexketoprofen, diclofenac, diflunisal, droxicam, etensamide, etodolac, etoricoxib, fisalamine, fenamic acids, fenbufen, fenoprofen, flufenamic acid, flunoxaprofen, flurbiprofen, ibuprofen, ibuproxam, indomethacin, indoprofen, kebusone, ketoprofen, loroxamorolac, loxoprofen, lumiracoxib, magnesium salicylate, meclofenamic acid, mefenamic acid, meloxicam, metamizole, methyl salicylate, mofebutazone, nabumetone, naproxen, N-arylanthranilic acids, nerve growth factor (NGF), oxamethacin, oxaprozin, oxicams, oxyphenbutazone, parecoxib, phenazone, phenylbutazone , piroxicam, pirprofen, profens, proglumethacin, pyrazolidine derivatives, rofecoxib, but are not limited to salicyl salicylate, salicylamide, salicylates, substance P, sulfinpyrazone, sulindac, suprofen, tenoxicam, thiaprofenic acid, tolfenamic acid, tolmetin, and valdecoxib.

Антигистаминный агент может быть любым соединением, противодействующим действию гистамина или его высвобождению из клеток (например, тучных клеток). Антигистаминные агенты включают акривастин, астемизол, азатадин, азеластин, бетатастин, бромфенирамин, буклизин, цетиризин, аналоги цетиризина, хлорфенирамин, клемастин, CS 560, ципрогептадин, дезлоратадин, дексхлорфенирамин, эбастин, эпинастин, фексофенадин, HSR 609, гидроксизин, левокабастин, лоратидин, метскополамин, мизоластин, норастемизол, фениндамин, прометазин, пириламин, терфенадин и траниласт, но не ограничиваются ими.The antihistamine agent can be any compound that opposes the action of histamine or its release from cells (eg, mast cells). Antihistamine agents include acrivastine, astemizole, azatadine, azelastine, betatastine, brompheniramine, buclizine, cetirizine, cetirizine analogs, chlorpheniramine, clemastine, CS 560, cyproheptadine, desloratadine, dexchlorpheniramine, ebastine, epinastine, fexofenadine, HSR 609, hydroxystin, levoribadine, levoribadine but not limited to methscopolamine, mizolastine, norastemizole, phenindamine, promethazine, pyrilamine, terfenadine and tranilast.

Антибиотики включают амикацин, аминогликозиды, амоксициллин, ампициллин, ансамицины, арсфенамин, азитромицин, азлоциллин, азтреонам, бацитрацин, карбацефем, карбапенемы, карбенициллин, цефаклор, цефадроксил, цефалексин, цефалотин, цефамандол, цефазолин, цефдинир, цефдиторен, цефепим, цефиксим, цефоперазон, цефотаксим, цефокситин, цефподоксим, цефпрозил, цефтазидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефтобипрол, цефтриаксон, цефуроксим, цефалоспорины, хлорамфеникол, циластатин, ципрофлоксацин, кларитромицин, клиндамицин, клоксациллин, колистин, ко-тримоксазол, далфопристин, демеклоциклин, диклоксациллин, диритромицин, дорипенем, доксициклин, эноксацин, эртапенем, эритромицин, этамбутол, флуклоксациллин, фосфомицин, фуразолидон, фузидиевую кислоту, гатифлоксацин, гелданамицин, гентамицин, гликопептиды, гербимицин, имипенем, изониазид, канамицин, левофлоксацин, линкомицин, линезолид, ломефлоксацин, лоракарбеф, макролиды, мафенид, меропенем, метициллин, метронидазол, мезлоциллин, миноциклин, монобактамы, моксифлоксацин, мупироцин, нафциллин, неомицин, нетилмицин, нитрофурантоин, норфлоксацин, офлоксацин, оксациллин, окситетрациклин, паромомицин, пенициллин, пенициллины, пиперациллин, платензимицин, полимиксин В, полипептиды, пронтозил, пиразинамид, хинолоны, хинупристин, рифампицин, рифампин, рокситромицин, спектиномицин, стрептомицин, сульфацетамид, сульфаметизол, сульфаниламид, сульфасалазин, сульфисоксазол, сульфонамиды, тейкопланин, телитромицин, тетрациклин, тетрациклины, тикарциллин, тинидазол, тобрамицин, триметоприм, триметоприм-сульфаметоксазол, тролеандомицин, тровафлоксацин и ванкомицин, но не ограничиваются ими.Antibiotics include amikacin, aminoglycosides, amoxicillin, ampicillin, anamycin, arsfenamin, azithromycin, azlocillin, azreonons, bacitrasin, carbacepham, carbapenem, carbenicillin, cephaglexil, cephalexin, cephamandol, cephasolin, cephasolin, cephasolin, cephasolin, cephasolin, cephasolin, cephasolin, cephasolin, cephasoline, cephasolin, cephasoline, cephasoline цефотаксим, цефокситин, цефподоксим, цефпрозил, цефтазидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефтобипрол, цефтриаксон, цефуроксим, цефалоспорины, хлорамфеникол, циластатин, ципрофлоксацин, кларитромицин, клиндамицин, клоксациллин, колистин, ко-тримоксазол, далфопристин, демеклоциклин, диклоксациллин, диритромицин, дорипенем, doxycycline, enoxacin, ertapenem, erythromycin, ethambutol, flucloxacillin, fosfomycin, furazolidone, fusidic acid, gatifloxacin, geldanamycin, gentamicin, glycopeptides, herbimycin, imipenem, isoniazid, kanamycin, levofloxacin, lincomycin, linezolid, lomefloxacin, loracarbefenem, macrolides , methicillin, metronidazole, mezlocillin, minocycline, monoba ctamas, moxifloxacin, mupirocin, nafcillin, neomycin, netilmicin, nitrofurantoin, norfloxacin, ofloxacin, oxacillin, oxytetracycline, paromomycin, penicillin, penicillins, piperacillin, platenmycin, polymyxin B, polypeptides, prontosil, pyrazinamide, quinolones, quinupristin, rifampin, roxymitsin, roxymitsin , spectinomycin, streptomycin, sulfacetamide, sulfamethizole, sulfanilamide, sulfasalazine, sulfisoxazole, sulfonamides, teicoplanin, telithromycin, tetracycline, tetracyclines, ticarcillin, tinidazole, tobramycin, trimethoprim, trimethoprim-sulfamethoxazole, troleandomycin, trovafloxacin, and vancomycin.

Активные агенты также включают альдостерон, беклометазон, бетаметазон, кортикостероиды, кортизол, кортизона ацетат, дезоксикортикостерона ацетат, дексаметазон, флудрокортизона ацетат, глюкокортикоиды, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон, стероиды и триамцинолон. Кроме того, рассматривается любая подходящая комбинация указанных активных агентов.Active agents also include aldosterone, beclomethasone, betamethasone, corticosteroids, cortisol, cortisone acetate, deoxycorticosterone acetate, dexamethasone, fludrocortisone acetate, glucocorticoids, hydrocortisone, methylprednisolone, prednisolone, prednisone, steroids, and triamcinolone. In addition, any suitable combination of these active agents is contemplated.

Фармацевтический наполнитель или фармацевтически приемлемый наполнитель является носителем, обычно жидким, используемым для получения состава активного терапевтического агента. В одном варианте воплощения настоящего изобретения активный терапевтический агент является гуманизированным антителом, описанным здесь, или одним или более из его фрагментов. Наполнитель обычно не обеспечивает фармакологическую активность состава, хотя может обеспечивать химическую и/или биологическую стабильность и характеристики высвобождения. Типичные составы можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995, включенном в настоящий документ посредством ссылки.A pharmaceutical excipient or pharmaceutically acceptable excipient is a carrier, usually a liquid, used to formulate an active therapeutic agent. In one embodiment of the present invention, the active therapeutic agent is a humanized antibody as described herein, or one or more fragments thereof. The excipient generally does not provide the pharmacological activity of the formulation, although it may provide chemical and/or biological stability and release characteristics. Exemplary formulations can be found, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, ^19th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995, incorporated herein by reference.

Как используется здесь, термин фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель включает всевозможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты, которые являются физиологичеAs used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier or excipient includes various solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption-retarding agents that are physiologically

- 28 040241 ски совместимыми. В одном варианте воплощения носитель подходит для парентерального введения. Предпочтительно, носитель может быть пригоден для внутривенного, внутрибрюшинного, внутримышечного или сублингвального введения. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Использование таких сред и агентов в комбинации с фармацевтически активными веществами хорошо известно в данной области техники. Кроме того, поскольку любая обычная среда или агент несовместима с активным соединением, рассматривается их использование в фармацевтических композициях по изобретению. В композиции можно также включать дополнительные активные соединения.- 28 040241 ski compatible. In one embodiment, the carrier is suitable for parenteral administration. Preferably, the carrier may be suitable for intravenous, intraperitoneal, intramuscular or sublingual administration. Pharmaceutically acceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for immediate preparation of sterile injectable solutions or dispersions. The use of such media and agents in combination with pharmaceutically active substances is well known in the art. In addition, since any conventional medium or agent is incompatible with the active compound, their use in the pharmaceutical compositions of the invention is contemplated. Additional active compounds may also be included in the compositions.

Фармацевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Настоящее изобретение предусматривает, что фармацевтическая композиция присутствует в лиофилизированной форме. Композицию можно составить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного агента. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси. Настоящее изобретение также рассматривает включение стабилизатора в состав фармацевтической композиции. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования ПАВ.Pharmaceutical compositions generally must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage. The present invention provides that the pharmaceutical composition is present in lyophilized form. The composition can be formulated as a solution, microemulsion, liposome, or other ordered structure suitable for high drug concentration. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (eg glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol) and suitable mixtures thereof. The present invention also contemplates the inclusion of a stabilizer in the pharmaceutical composition. Proper fluidity can be maintained, for example, by maintaining the required particle size in the case of a dispersion and by using a surfactant.

Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, например, маннит, сорбит, или хлорид натрия. Длительное поглощение композиций, вводимых путем инъекции, можно осуществить путем включения в композицию агента, замедляющего поглощение, например, солей моностеарата и желатина. Кроме того, в состав с замедленным высвобождением, например в композицию, включающую полимер для медленного высвобождения, можно включить щелочной полипептид. Активные соединения можно изготовить в комбинации с носителями, защищающими соединение от быстрого высвобождения, такими как препараты контролируемого высвобождения, включая импланты и микрокапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры, полимолочную кислоту и сополимеры полимолочной и полигликолевой кислот (PLG). Многие способы изготовления таких составов известны специалистам в данной области техники.In many cases, it is preferable to include isotonic agents, eg sugars, polyhydric alcohols, eg mannitol, sorbitol, or sodium chloride, in the composition. Long-term absorption of injectable compositions can be accomplished by including an absorption delaying agent, such as monostearate and gelatin salts, in the composition. In addition, an alkaline polypeptide can be included in a sustained release formulation, for example in a composition comprising a slow release polymer. The active compounds can be formulated in combination with carriers that protect the compound from rapid release, such as controlled release formulations, including implants and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, for example, ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, polylactic acid, and copolymers of polylactic and polyglycolic acids (PLG). Many methods for making such compositions are known to those skilled in the art.

В каждом из упомянутых вариантов воплощения соединения можно вводить в различных лекарственных формах. Рассматриваются любые биологически приемлемые лекарственные формы, известные специалистам в данной области техники, и их комбинации. Примеры таких лекарственных форм включают, без ограничения, восстанавливаемые порошки, эликсиры, жидкости, растворы, суспензии, эмульсии, порошки, гранулы, частицы, микрочастицы, диспергируемые гранулы, облатки, препараты для ингаляции, аэрозоль для ингаляции, пластыри, препараты частиц для ингаляции, импланты, депоимпланты, препараты для инъекций (в том числе подкожных, внутримышечных, внутривенных и внутрикожных), вливаний и их комбинации.In each of the mentioned embodiments, the compounds may be administered in various dosage forms. Any biologically acceptable dosage forms known to those skilled in the art and combinations thereof are contemplated. Examples of such dosage forms include, without limitation, reconstituted powders, elixirs, liquids, solutions, suspensions, emulsions, powders, granules, particles, microparticles, dispersible granules, cachets, inhalants, aerosols for inhalation, patches, particulate preparations for inhalation, implants, depoimplants, preparations for injections (including subcutaneous, intramuscular, intravenous and intradermal), infusions and combinations thereof.

Вышеуказанное описание различных иллюстрированных вариантов воплощения не следует считать исчерпывающим или жестко ограничивающим настоящее изобретение раскрытой формой. Несмотря на то, что здесь описаны конкретные варианты воплощения и примеры настоящего изобретения в целях иллюстрации, специалисты в данной области техники должны понимать, что возможны различные эквивалентные модификации, входящие в рамки изобретения. Информацию об изобретении, представленную здесь, можно применять для других целей, отличающихся от описанных выше примеров.The foregoing description of the various illustrated embodiments is not intended to be exhaustive or to severely limit the present invention to the disclosed form. While specific embodiments and examples of the present invention are described herein for purposes of illustration, those skilled in the art will appreciate that various equivalent modifications are possible and fall within the scope of the invention. The information about the invention presented here can be used for other purposes than the examples described above.

Указанные и другие изменения можно вносить в изобретение в свете вышеприведенного подробного описания. В общем случае термины, использованные в следующей далее формуле изобретения, не следует интерпретировать как ограничения изобретения конкретными вариантами воплощения, раскрытыми в настоящем документе и пунктах формулы изобретения. Соответственно настоящее изобретение не ограничивается указанным раскрытием, и рамки изобретения должны определяться исключительно прилагаемой формулой изобретения.These and other changes can be made to the invention in light of the above detailed description. In general, the terms used in the following claims should not be interpreted as limiting the invention to the specific embodiments disclosed herein and in the claims. Accordingly, the present invention is not limited to the above disclosure, and the scope of the invention is to be determined solely by the appended claims.

Настоящее изобретение можно реализовать способами, отличающимися от способов, явным образом описанных в вышеприведенном описании и примерах. В свете вышеприведенной информации возможны различные модификации и изменения настоящего изобретения, которые, таким образом, находятся в рамках прилагаемой формулы изобретения.The present invention may be practiced in ways other than those expressly described in the foregoing description and examples. In light of the above information, various modifications and variations of the present invention are possible, which are thus within the scope of the appended claims.

Некоторые аспекты информации, относящейся к способам получения клональной популяции антиген-специфичных В-клеток, были раскрыты в предварительной патентной заявке США № 60/801412, поданной 19 мая 2006 года, раскрытие которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.Certain aspects of information relating to methods for obtaining a clonal population of antigen-specific B cells were disclosed in US Provisional Application No. 60/801412, filed May 19, 2006, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Некоторые аспекты информации, относящейся к гуманизации моноклональных антител кролика и предпочтительных модификаций последовательности для поддержания сродства связывания с антигеном, были раскрыты в международной заявке № PCT/US 2008/064421, что соответствует международной публикации WO/2008/144757 под названием Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and HumanizedSome aspects of information relating to the humanization of rabbit monoclonal antibodies and preferred sequence modifications to maintain antibody binding affinity have been disclosed in International Application No. PCT/US 2008/064421, which corresponds to International Publication WO/2008/144757 titled Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and humanized

- 29 040241- 29 040241

Rabbit Antibodies, поданной 21 мая 2008 г., раскрытие которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.Rabbit Antibodies, filed May 21, 2008, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety.

Некоторые аспекты информации, относящейся к получению антител или их фрагментов с помощью дрожжей, компетентных по спариванию, и соответствующим способам, были раскрыты в патентной заявке США № 11/429053, поданной 8 мая 2006 года (публикация патентной заявки США № US2006/0270045), раскрытие которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.Certain aspects of information relating to the production of antibodies or fragments thereof using mating-competent yeast and related methods have been disclosed in US Patent Application No. 11/429053, filed May 8, 2006 (US Patent Application Publication No. US2006/0270045), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Некоторые полинуклеотиды и полипептиды антител против CGRP раскрыты в списке последовательностей, прилагаемом к настоящей подаваемой патентной заявке, и раскрытие указанного списка последовательностей полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.Certain anti-CGRP antibody polynucleotides and polypeptides are disclosed in the sequence listing accompanying this patent application, and the disclosure of said sequence listing is incorporated herein by reference in its entirety.

Полное раскрытие каждого документа (включая патенты, заявки на патенты, журнальные статьи, рефераты, учебные пособия, книги или другие источники), цитируемого в разделах Уровень техники, Подробное описание изобретения и Примеры, полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.The entire disclosure of each document (including patents, patent applications, journal articles, abstracts, tutorials, books, or other sources) cited in the Background, Detailed Description, and Examples sections is incorporated herein by reference in its entirety.

Следующие примеры представлены с целью обеспечить специалистов в данной области техники полным раскрытием и описанием способов реализации и применения рассматриваемого изобретения и не предназначены для ограничения рамок и сущности изобретения. Были предприняты усилия для обеспечения точности используемых чисел (например, количеств, температуры, концентраций и т.д.), однако следует допускать возможность некоторых экспериментальных ошибок и отклонений. Если не указано иное, доли являются массовыми долями, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура приведена в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному.The following examples are presented to provide those skilled in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the subject invention and are not intended to limit the scope and spirit of the invention. Efforts have been made to ensure the accuracy of the numbers used (eg, amounts, temperatures, concentrations, etc.), but some experimental error and variation should be allowed for. Unless otherwise indicated, fractions are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric pressure.

ПримерыExamples

Пример 1 Получение антител, связывающих CGRP.Example 1 Obtaining antibodies that bind CGRP.

За счет применения протокола отбора антител, описанного здесь, можно получить расширенную панель антител.By applying the antibody selection protocol described here, an expanded panel of antibodies can be obtained.

Стратегия иммунизацииImmunization strategy

Кроликов иммунизировали CGRPa человека (American Peptides, Саннивейл, штат Калифорния, США и Bachem, Торранс, штат Калифорния, США). Иммунизация состояла из первой подкожной (п/к) инъекции 100 мкг антигена, смешанного с 100 мкг KLH в полном адъюванте Фрейнда (CFA) (Sigma) с последующими двумя стимуляциями, разнесенными во времени на две недели, каждая из которых содержала 50 мкг антигена, смешанного с 50 мкг в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) (Sigma). У животных выполняли отбор крови в день 55 и определяли титры в сыворотке крови с помощью твердофазного ИФА (распознавание антигена) и путем ингибирования CGRP-зависимого повышения уровня цАМФ в SK-N-MC.Rabbits were immunized with human CGRPa (American Peptides, Sunnyvale, CA, USA and Bachem, Torrance, CA, USA). Immunization consisted of a first subcutaneous (SC) injection of 100 µg of antigen mixed with 100 µg of KLH in complete Freund's adjuvant (CFA) (Sigma) followed by two stimulations separated in time by two weeks, each containing 50 µg of antigen, mixed with 50 µg in incomplete Freund's adjuvant (IFA) (Sigma). Animals were bled on day 55 and serum titers were determined by solid phase ELISA (antigen recognition) and by inhibition of CGRP-dependent increase in cAMP levels in SK-N-MC.

Оценка титра при отборе антителаEstimation of the titer in the selection of antibodies

С целью выявления и описания характеристик антител, связывающихся с CGRPa человека, растворы антител тестировали с помощью твердофазного ИФА. Вкратце, планшеты, покрытые нейтравидином (Thermo Scientific), покрывали CGRPa человека, биотинилированным по N-концу (50 мкл на лунку, 1 мкг/мл), разбавленным буфером для твердофазного ИФА (0,5% желатина рыбьей кожи в PBS, рН 7,4) в течение приблизительно 1 ч при комнатной температуре или, в качестве альтернативы, в течение ночи при 4°C.In order to identify and characterize antibodies that bind to human CGRPa, antibody solutions were tested using solid-phase ELISA. Briefly, neutravidin-coated plates (Thermo Scientific) were coated with human CGRPa, N-terminally biotinylated (50 µl per well, 1 µg/ml), diluted with ELISA buffer (0.5% fish skin gelatin in PBS, pH 7 ,4) for approximately 1 hour at room temperature, or alternatively overnight at 4°C.

Затем планшеты дополнительно блокировали буфером для твердофазного ИФА в течение 1 ч при комнатной температуре и промывали буфером для промывки (PBS, 0,05% твин-20). Протестированные образцы сыворотки последовательно разбавляли буфером для твердофазного ИФА. Пятьдесят микролитров разбавленных образцов сыворотки переносили в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение часа. После указанного инкубирования планшет промывали буфером для промывки. Для развития ответа в лунки добавляли специализированный Fc-HARP против антител кролика (разбавление 1:5000 в буфере для твердофазного ИФА) и инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. После этапа 3-кратной промывки раствором для промывки планшет обрабатывали субстратом ТМВ в течение 2 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию с помощью 0,5 М HCl. Поглощение в лунках считывали при 450 нм.The plates were then further blocked with ELISA buffer for 1 hour at room temperature and washed with wash buffer (PBS, 0.05% Tween-20). Serum samples tested were serially diluted with ELISA buffer. Fifty microliters of diluted serum samples were transferred to wells and incubated at room temperature for one hour. After this incubation, the plate was washed with wash buffer. To develop a response, specialized anti-rabbit Fc-HARP was added to the wells (1:5000 dilution in ELISA buffer) and incubated for 45 min at room temperature. After a 3-fold washing step with the wash solution, the plate was treated with TMB substrate for 2 min at room temperature and the reaction was stopped with 0.5 M HCl. The absorbance in the wells was read at 450 nm.

Определение титра образцов сыворотки крови по функциональной активности (ингибирование CGRP-зависимых уровней цАМФ)Determination of the titer of blood serum samples by functional activity (inhibition of CGRP-dependent cAMP levels)

С целью выявления и описания характеристик антител с функциональной активностью выполняли анализ ингибирования CGRP-зависимого повышения уровней цАМФ с использованием электрохемилюминесценции (Meso Scale Discovery, MSD). Вкратце, препараты антител, подлежащие тестированию, последовательно разбавляли в буфере для анализа MSD (Hepes, MgC12, pH 7,3, 1 мг/мл блокатора A, Meso Scale Discovery) в 96-луночном круглодонном полистирольном планшете (Costar). В указанный планшет добавляли CGRPa человека (конечная концентрация 10 нг/мл), разбавленный буфером для анализа MSD, и инкубировали в течение часа при 37°C. Согласно указаниям изготовителя аналитического набора использовали соответствующие контроли. Клетки нейроэпителиомы человека (SK-N-MC, АТСС) отделяли с помощью раствора ЭДТА (5 мМ в PBS) и промывали ростовой средой (MEM, 10% FBS, антибиотики)In order to identify and characterize antibodies with functional activity, an analysis of the inhibition of CGRP-dependent increase in cAMP levels was performed using electrochemiluminescence (Meso Scale Discovery, MSD). Briefly, antibody preparations to be tested were serially diluted in MSD assay buffer (Hepes, MgC12, pH 7.3, 1 mg/ml blocker A, Meso Scale Discovery) in a 96-well round bottom polystyrene plate (Costar). Human CGRPa (final concentration 10 ng/mL) diluted with MSD assay buffer was added to the plate and incubated for one hour at 37°C. Appropriate controls were used according to the assay kit manufacturer's instructions. Human neuroepithelioma cells (SK-N-MC, ATCC) were separated with EDTA solution (5 mM in PBS) and washed with growth medium (MEM, 10% FBS, antibiotics)

- 30 040241 посредством центрифугирования. Количество клеток доводили до 2 млн клеток на мл в буфере для анализа и добавляли IBMX (3-изобутил-1-метилксантин, Sigma) до конечной концентрации 0,2 мМ непосредственно перед загрузкой клеток в планшет для анализа цАМФ. После инкубирования раствора антитела против CGRPa человека в течение одного часа 20 мкл раствора, содержащего клетки, переносили в планшет для анализа цАМФ. Все образцы тестировали в двух повторностях с соответствующими контролями. Десять микролитров клеток добавляли в лунки и инкубировали планшет в течение 30 мин при встряхивании и комнатной температуре. Во время инкубирования клеток с раствором CGRP готовили стоп-раствор путем получения раствора TAG-меченого цАМФ (MSD) в лизирующем буфере (MSD) в разбавлении 1:200. Для остановки инкубирования клеток с CGRP к клеткам добавляли 20 мкл стопраствора и инкубировали планшет в течение 1 ч при встряхивании и комнатной температуре. Буфер для считывания (MSD) разбавляли в четыре раза водой и добавляли 100 мкл в каждую лунку планшета. Затем планшет считывали с помощью Sector Imager 2400 (MSD) и использовали программное обеспечение Prism для аппроксимации данных и определения IC₅₀.- 30 040241 by centrifugation. Cells were adjusted to 2 million cells per ml in assay buffer and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma) was added to a final concentration of 0.2 mM just prior to loading the cells into the cAMP assay plate. After incubating the anti-human CGRPa antibody solution for one hour, 20 μl of the cell-containing solution was transferred to a cAMP assay plate. All samples were tested in duplicate with appropriate controls. Ten microliters of cells were added to the wells and the plate was incubated for 30 minutes with shaking at room temperature. While the cells were incubated with the CGRP solution, a stop solution was prepared by preparing a solution of TAG-labeled cAMP (MSD) in lysis buffer (MSD) at a dilution of 1:200. To stop the incubation of cells with CGRP, 20 μl of stop solution was added to the cells and the plate was incubated for 1 hour with shaking and room temperature. Reading buffer (MSD) was diluted four times with water and 100 μl was added to each well of the plate. The plate was then read with a Sector Imager 2400 (MSD) and Prism software was used to fit the data and determine the IC ₅₀ .

Сбор тканиcollection of tissue

После установления приемлемых титров кролика(ов) умерщвляли. Селезенку, лимфатические узлы и цельную кровь собирали и обрабатывали следующим образом.After establishing acceptable titers, the rabbit(s) were sacrificed. Spleen, lymph nodes and whole blood were collected and processed as follows.

Селезенку и лимфатические узлы перерабатывали в суспензию отдельных клеток путем диссоциации ткани и продавливания через стерильную проволочную сетку с размером ячеек 70 мкм (Fisher) плунжером 20-мл шприца. Клетки собирали в PBS. Клетки дважды промывали центрифугированием. После последней промывки определяли плотность клеток с помощью трипанового синего. Клетки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин, супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в соответствующем объеме 10% диметилсульфоксида (ДМСО, Sigma) в FBS (Hyclone) и разливали по 1 мл/флакон. Флаконы хранили при минус 70°C в камере медленной заморозки в течение 24 ч и хранили в жидком азоте.The spleen and lymph nodes were processed into a single cell suspension by tissue dissociation and forcing through a sterile 70 μm wire mesh (Fisher) with a 20 ml syringe plunger. Cells were collected in PBS. Cells were washed twice by centrifugation. After the last wash, the cell density was determined using trypan blue. The cells were centrifuged at 1500 rpm for 10 min, the supernatant was removed. Cells were resuspended in an appropriate volume of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma) in FBS (Hyclone) and dispensed at 1 ml/vial. The vials were stored at minus 70°C in a slow freezer for 24 h and stored in liquid nitrogen.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли путем смешивания цельной крови с равными частями среды с низким содержанием глюкозы, описанной выше, не содержавшей FBS. 35 мл смеси цельной крови осторожно наслаивали на 8 мл Lympholyte Rabbit (Cedarlane) в 45-мл конической пробирке (Corning) и центрифугировали в течение 30 минут при 2500 об/мин при комнатной температуре без тормозной системы. После центрифугирования слои МПК тщательно удаляли с помощью стеклянной пипетки Пастера (VWR), объединяли и помещали в чистый 50-мл флакон. Клетки дважды промывали модифицированной средой, описанной выше, путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре, и определяли плотность клеток путем окрашивания трипановым синим. После последней промывки клетки ресуспендировали в соответствующем объеме 10% ДМСО/FBS-среды и замораживали, как описано выше.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by mixing whole blood with equal parts of the low glucose medium described above without FBS. 35 ml of the whole blood mixture was carefully layered onto 8 ml of Lympholyte Rabbit (Cedarlane) in a 45 ml conical tube (Corning) and centrifuged for 30 minutes at 2500 rpm at room temperature without a brake system. After centrifugation, the MIC layers were carefully removed with a glass Pasteur pipette (VWR), pooled and placed in a clean 50 ml vial. The cells were washed twice with the modified medium described above by centrifugation at 1500 rpm for 10 minutes at room temperature, and the cell density was determined by staining with trypan blue. After the last wash, the cells were resuspended in an appropriate volume of 10% DMSO/FBS medium and frozen as described above.

Отбор, обогащение и условия культивирования В-клетокSelection, enrichment and culture conditions of B cells

В день создания культуры В-клеток МПК спленоциты или флаконы с клетками лимфоузлов подвергали оттаиванию для использования. Флаконы извлекали из резервуара LN2 и помещали в водяную баню при 37°C до оттаивания. Содержание флаконов переносили в 15-мл коническую центрифужную пробирку (Corning) и медленно добавляли в пробирку 10 мл модифицированной среды RPMI, описанной выше. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об/мин, супернатант удаляли. Клетки ресуспендировали в 10 мл свежей среды. Плотность и жизнеспособность клеток определяли с помощью трипанового синего.On the day the B cell culture was established, the PBMC splenocytes or lymph node cell flasks were thawed for use. The vials were removed from the LN2 reservoir and placed in a water bath at 37° C. until thawed. The contents of the vials were transferred to a 15 ml conical centrifuge tube (Corning) and 10 ml of the modified RPMI medium described above was slowly added to the tube. The cells were centrifuged for 5 min at 2000 rpm, the supernatant was removed. Cells were resuspended in 10 ml of fresh medium. Cell density and viability were determined using trypan blue.

Скрининг культуры В-клеток по распознаванию антигена (твердофазный ИФА)Screening of B-cell culture for antigen recognition (solid-phase ELISA)

Для идентификации лунок, продуцирующих антитела против CGRPa человека, использовали тот же протокол, что описан для определения титра образцов сыворотки по распознаванию антигена (твердофазный ИФА), со следующими изменениями. Вкратце, планшеты, покрытые нейтравидином, покрывали смесью CGRPa человека, биотинилированного по N- и С-концу (50 мкл на лунку, по 1 мкг/мл каждого из них). Образцы супернатанта В-клеток (50 мкл) тестировали без предварительного разбавления.To identify wells producing antibodies against human CGRPa, the same protocol was used as described for determining the titer of serum samples by antigen recognition (solid-phase ELISA), with the following changes. Briefly, neutravidin-coated plates were coated with a mixture of human CGRPa biotinylated at the N- and C-terminus (50 μl per well, 1 μg/ml each). B cell supernatant samples (50 μl) were tested without pre-dilution.

Выявление функциональной активности в супернатантах В-клеток с использованием CGRP-зависимой продукции цАМФDetection of functional activity in B-cell supernatants using CGRP-dependent cAMP production

Для выявления функциональной активности в супернатантах В-клеток использовали процедуру, аналогичную описанной для определения функционального титра образцов сыворотки, со следующими изменениями. Вкратце, вместо разбавленных образцов поликлональной сыворотки использовали супернатант В-клеток (20 мкл).To detect functional activity in B cell supernatants, a procedure similar to that described for determining the functional titer of serum samples was used, with the following modifications. Briefly, B cell supernatant (20 µl) was used instead of diluted polyclonal serum samples.

Выделение антиген-специфических В-клетокIsolation of antigen-specific B cells

Планшеты, содержавшие интересующие лунки, извлекали из холодильника при -70°C, клетки из каждой лунки восстанавливали путем пяти промывок 200 мкл среды (10% полная RPMI, 55 мкМ ВМЕ) на лунку. Восстановленные клетки осаждали центрифугированием, супернатант осторожно удаляли. Осажденные клетки ресуспендировали в 100 мкл среды. Для выявления клеток, экспрессирующих антитела, магнитные гранулы, покрытые стрептавидином (М280 Dynabeads, Invitrogen) покрывали комбинацией CGRPa человека, биотинилированного по N- и С-концу. Отдельные партии биотинилированногоThe plates containing the wells of interest were removed from the refrigerator at -70° C., cells from each well were regenerated by five washes with 200 μl medium (10% complete RPMI, 55 μM BME) per well. The recovered cells were pelleted by centrifugation, and the supernatant was carefully removed. The precipitated cells were resuspended in 100 µl of medium. To detect antibody-expressing cells, streptavidin-coated magnetic beads (M280 Dynabeads, Invitrogen) were coated with a combination of human CGRPa biotinylated at the N- and C-terminus. Individual batches of biotinylated

- 31 040241- 31 040241

CGRPa человека оптимизировали путем последовательного разбавления. Затем 100 мкл, содержащие приблизительно 4х10Е7 покрытых гранул, смешивали с ресуспендированными клетками. К указанной смеси добавляли 15 мкл H&L IgG-FITC козы против антител кролика (Jackson ImmunoResearch), разбавленных средой 1:100.Human CGRPa was optimized by serial dilution. Then 100 µl containing approximately 4x10E7 coated beads were mixed with the resuspended cells. To this mixture was added 15 μl of H&L goat anti-rabbit IgG-FITC (Jackson ImmunoResearch) diluted 1:100 with medium.

Двадцать микролитров клеток/гранул/суспензии H&L против антител кролика удаляли и распределяли в виде 5 мкл капель по однолуночным предметным стеклам, предварительно обработанным Sigmacote (Sigma) в общей сложности от 35 до 40 капель на стекло. Для погружения капель использовали непроницаемый барьер из парафинового масла (JT Baker); стекло инкубировали в течение 90 мин в инкубаторе при 37°C и 4% CO2 в темноте.Twenty microliters of anti-rabbit H&L cells/beads/suspension were removed and dispensed as 5 µl drops onto single well slides pretreated with Sigmacote (Sigma) for a total of 35 to 40 drops per slide. An impermeable paraffin oil barrier (JT Baker) was used to immerse the droplets; the glass was incubated for 90 min in an incubator at 37°C and 4% CO2 in the dark.

Специфические В-клетки, продуцирующие антитело, можно было идентифицировать по флуоресцентному кольцу вокруг них, получаемому за счет секреции антител, распознавания биотинилированного антигена, связанного с гранулами, и последующего обнаружения с помощью реагента для флуоресцентного обнаружения IgG. После выявления клетки, представляющей интерес, ее извлекали с помощью микроманипулятора (Eppendorf). Одиночную клетку, синтезирующую и экспортирующую антитело, переносили в микроцентрифужную пробирку, замораживали с помощью сухого льда и хранили при минус 70°C.Specific antibody-producing B cells could be identified by a fluorescent ring around them produced by antibody secretion, recognition of a biotinylated bead-bound antigen, and subsequent detection with an IgG fluorescent detection reagent. Once a cell of interest was identified, it was removed using a micromanipulator (Eppendorf). A single cell synthesizing and exporting the antibody was transferred to a microcentrifuge tube, frozen with dry ice, and stored at minus 70°C.

Амплификация и секвенирование последовательностей антител из антиген-специфичных В-клетокAmplification and sequencing of antibody sequences from antigen-specific B cells

Последовательности антител восстанавливали с помощью комбинированного способа на основе ОТ-ПЦР из одиночной выделенной В-клетки. Для отжига консервативных и константных областей генов иммуноглобулина-мишени (тяжелых и легких цепей), например последовательностей иммуноглобулинов кролика, разработали праймеры, содержащие сайты рестрикции; для амплификации последовательности антител использовали восстановление на основе двухэтапной вложенной ПЦР. Ампликоны из каждой лунки анализировали на восстановление и целостность по размеру. Затем полученные фрагменты расщепляли с помощью AluI для фингерпринта клональных свойств последовательности. Идентичные последовательности демонстрировали общую картину фрагментации при электрофоретическом анализе. Затем исходные фрагменты ампликона тяжелой и легкой цепей расщепляли по сайтам рестрикции, содержащимся в праймерах для ПЦР, и клонировали в экспрессирующий вектор. Вектор, содержащий субклонированные фрагменты ДНК, амплифицировали и очищали. Последовательность субклонированных тяжелых и легких цепей проверяли до экспрессии.Antibody sequences were recovered using a combined RT-PCR method from a single isolated B cell. For annealing of conserved and constant regions of target immunoglobulin genes (heavy and light chains), such as rabbit immunoglobulin sequences, primers were designed containing restriction sites; two-step nested PCR recovery was used to amplify the antibody sequence. Amplicons from each well were analyzed for recovery and size integrity. The resulting fragments were then digested with AluI to fingerprint the clonal properties of the sequence. Identical sequences showed a common pattern of fragmentation in electrophoretic analysis. The original heavy and light chain amplicon fragments were then cleaved at the restriction sites contained in the PCR primers and cloned into an expression vector. The vector containing the subcloned DNA fragments was amplified and purified. The sequence of the subcloned heavy and light chains was verified prior to expression.

Рекомбинантная продукция моноклонального антитела с желательной антигенной специфичностью и/или функциональными свойствамиRecombinant production of a monoclonal antibody with desired antigenic specificity and/or functional properties

Для определения антигенной специфичности и функциональных свойств антител, восстановленных из специфических В-клеток, векторы, контролирующие экспрессию желательных последовательностей спаренных тяжелых и легких цепей, трансфицировали в клетки HEK-293.To determine the antigenic specificity and functional properties of antibodies recovered from specific B cells, vectors controlling the expression of the desired paired heavy and light chain sequences were transfected into HEK-293 cells.

Распознавание антигена рекомбинантными антителами согласно твердофазному ИФАAntigen recognition by recombinant antibodies according to solid-phase ELISA

С целью оценки способности рекомбинантных экспрессируемых антител связываться с CGRPa человека растворы антител тестировали с помощью твердофазного ИФА. Все этапы инкубирования выполняли при комнатной температуре. Вкратце, планшеты Immulon IV (Thermo Scientific) покрывали раствором, содержащим CGRPa (1 мкг/мл в PBS) в течение 2 ч. Затем планшеты, покрытые CGRPa, трижды промывали буфером для промывки (PBS, 0,05% Твин-20). Затем планшеты блокировали с использованием блокирующего раствора (PBS, 0,5% желатина рыбьей кожи, 0,05% Твин-20) в течение приблизительно 1 ч. Затем удаляли блокирующий раствор и инкубировали планшеты с последовательными разведениями тестируемого антитела в течение приблизительно 1 ч. В конце указанного инкубирования планшет трижды промывали буфером для промывки и дополнительно инкубировали с раствором вторичного антитела (конъюгированный с пероксидазой и аффинно очищенный F(аb')₂-фрагмент антитела козы против IgG человека, специфичный по отношению к Fc-фрагменту (Jackson Immunoresearch) в течение приблизительно 45 мин и трижды промывали. В этот момент добавляли раствор субстрата (ТМВ-субстрат пероксидазы, BioFX) и инкубировали в течение 3-5 мин в темноте. Реакцию останавливали добавлением раствора HCl (0,5 М) и считывали планшет при 450 нм с использованием планшет-ридера.To assess the ability of recombinant expressed antibodies to bind to human CGRPa, antibody solutions were tested using solid-phase ELISA. All incubation steps were performed at room temperature. Briefly, Immulon IV plates (Thermo Scientific) were coated with a solution containing CGRPa (1 μg/ml in PBS) for 2 hours. CGRPa-coated plates were then washed three times with wash buffer (PBS, 0.05% Tween-20). The plates were then blocked using a blocking solution (PBS, 0.5% fish skin gelatin, 0.05% Tween-20) for approximately 1 hour. The blocking solution was then removed and the plates were incubated with serial dilutions of the test antibody for approximately 1 hour. At the end of this incubation, the plate was washed three times with wash buffer and additionally incubated with a secondary antibody solution (peroxidase-conjugated and affinity purified F(ab') ₂ fragment of goat anti-human IgG antibody specific for the Fc fragment (Jackson Immunoresearch) in for approximately 45 min and washed three times.At this point, a substrate solution (TMB-substrate peroxidase, BioFX) was added and incubated for 3-5 min in the dark.The reaction was stopped by adding a solution of HCl (0.5 M) and the plate was read at 450 nm using a tablet reader.

Результаты: фиг. 15-18 демонстрируют, что антитела Ab1-Ab14 против CGRP связывались с CGRPa и распознавали его.Results: Fig. 15-18 demonstrate that anti-CGRP Ab1-Ab14 binds to and recognizes CGRPa.

Оценка функциональных характеристик рекомбинантных антител путем модуляции CGRP-зависимых внутриклеточных уровней цАМФ и перекрестной реакционноспособности с CGRP крысыEvaluation of functional characteristics of recombinant antibodies by modulation of CGRP-dependent intracellular cAMP levels and cross-reactivity with rat CGRP

Для оценки способности рекомбинантного экспрессируемого антитела ингибировать CGRPaопосредованные повышенные клеточные уровни анализа цАМФ использовали аналитический набор на основе электрохемилюминесценции (Meso Scale Discovery, MSD). Вкратце, препараты антител, подлежащие тестированию, последовательно разбавляли в буфере для анализа MSD (Hepes, MgCl₂, pH 7,3, 1 мг/мл блокатора A, Meso Scale Discovery) в 96-луночном круглодонном полистирольном планшете (Costar). В указанный планшет добавляли CGRPa человека (конечная концентрация 25 нг/мл), разбавленный буфером для анализа MSD, и инкубировали в течение одного часа при 37°C. Согласно указаниям изготоAn electrochemiluminescence assay (Meso Scale Discovery, MSD) was used to evaluate the ability of a recombinant expressed antibody to inhibit CGRPa-mediated elevated cellular levels of cAMP assay. Briefly, antibody preparations to be tested were serially diluted in MSD assay buffer (Hepes, MgCl ₂ , pH 7.3, 1 mg/ml blocker A, Meso Scale Discovery) in a 96-well round bottom polystyrene plate (Costar). Human CGRPa (final concentration 25 ng/mL) diluted with MSD assay buffer was added to the plate and incubated for one hour at 37°C. According to manufacturer's instructions

- 32 040241 вителя аналитического набора использовали соответствующие контроли. Клетки нейроэпителиомы человека (SK-N-MC, АТСС) отделяли с помощью раствора ЭДТА (5 мМ) и промывали ростовой средой (MEM, 10% FBS, антибиотики) посредством центрифугирования. Количество клеток доводили до 2 млн клеток на мл в буфере для анализа и добавляли IBMX (3-изобутил-1-метилксантин, 50 мМ, Sigma) до конечной концентрации 0,2 мМ непосредственно перед загрузкой клеток в планшет для анализа цАМФ. Раствор антитела против CGRPa человека инкубировали в течение 1ч, после чего 20 мкл раствора, содержащего клетки, переносили в планшет для анализа цАМФ. Все образцы тестировали в двух повторностях с соответствующими контролями. Десять микролитров клеток добавляли в лунки и инкубировали планшет в течение 30 мин при встряхивании. Во время инкубирования клеток с раствором CGRP готовили стоп-раствор путем получения раствора TAG-меченого цАМФ (MSD) в лизирующем буфере (MSD) в разбавлении 1:200. Для остановки инкубирования клеток с CGRP к клеткам добавляли 20 мкл стопраствора и инкубировали планшет в течение 1 ч при встряхивании. Буфер для считывания (MSD) разбавляли в четыре раза водой и добавляли 100 мкл в каждую лунку планшета. Затем планшет считывали с помощью Sector Imager 2400 (MSD) и использовали программное обеспечение Prism для аппроксимации данных и определения IC₅₀.- 32 040241 Assay kit makers used appropriate controls. Human neuroepithelioma cells (SK-N-MC, ATCC) were separated with EDTA solution (5 mM) and washed with growth medium (MEM, 10% FBS, antibiotics) by centrifugation. The cell count was adjusted to 2 million cells per ml in assay buffer and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine, 50 mM, Sigma) was added to a final concentration of 0.2 mM just prior to loading the cells into the cAMP assay plate. The anti-human CGRPa antibody solution was incubated for 1 hour, after which 20 μl of the solution containing the cells was transferred to a cAMP assay plate. All samples were tested in duplicate with appropriate controls. Ten microliters of cells were added to the wells and the plate was incubated for 30 minutes with shaking. While the cells were incubated with the CGRP solution, a stop solution was prepared by preparing a solution of TAG-labeled cAMP (MSD) in lysis buffer (MSD) at a dilution of 1:200. To stop the incubation of cells with CGRP, 20 μl of stop solution was added to the cells and the plate was incubated for 1 hour with shaking. Reading buffer (MSD) was diluted four times with water and 100 μl was added to each well of the plate. The plate was then read with a Sector Imager 2400 (MSD) and Prism software was used to fit the data and determine the IC ₅₀ .

Для проверки способности рекомбинантных антител противодействовать человеческому CGRPP выполнили аналогичный анализ с замещением агониста CGRP (конечная концентрация CGRPP 10 нг/мл). Оценка рекомбинантных антител по отношению к распознаванию и ингибированию синтеза цАМФ, опосредованного CGRP крысы, проводили с использованием CGRP крысы (конечная концентрация 5 нг/мл) и линии клеток крысы L6 (АТСС).To test the ability of recombinant antibodies to antagonize human CGRPP, a similar CGRP agonist displacement assay was performed (final CGRPP concentration 10 ng/mL). Evaluation of recombinant antibodies with respect to recognition and inhibition of cAMP synthesis mediated by rat CGRP was performed using rat CGRP (final concentration 5 ng/ml) and rat L6 cell line (ATCC).

Результаты: фиг. 19-37 демонстрируют, что антитела Ab1-Ab14 против CGRP ингибировали повышенные уровни цАМФ в клетке, опосредованные CGRPa, CGRPP и CGRP крысы.Results: Fig. 19-37 demonstrate that anti-CGRP antibodies Ab1-Ab14 inhibited elevated cellular levels of cAMP mediated by rat CGRPa, CGRPP and CGRP.

Пример 2. Ферментативное получение Fab-фрагментов.Example 2 Enzymatic Preparation of Fab Fragments.

Гидролиз папаином проводили с использованием иммобилизованного папаина (Thermo/Pierce) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, очищенные антитела инкубировали в цистеин/HClбуфере с иммобилизованным папаином при 37°C и осторожном встряхивании. Гидролиз контролировали путем отбора аликвот и анализа отщепления тяжелой цепи с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Для остановки реакции удаляли иммобилизованный папаин, смесь промывали с помощью 50 мМ Трис, рН 7,5 и фильтровали. Негидролизованное полноразмерное антитело и Fc-фрагменты удаляли с помощью колонки MabSelectSure (GE).Papain hydrolysis was performed using immobilized papain (Thermo/Pierce) according to the manufacturer's instructions. Briefly, purified antibodies were incubated in cysteine/HCl buffer with immobilized papain at 37° C. with gentle shaking. Hydrolysis was monitored by taking aliquots and analyzing heavy chain cleavage by SDS-PAGE. To stop the reaction, immobilized papain was removed, the mixture was washed with 50 mm Tris, pH 7.5 and filtered. Non-digested full-length antibody and Fc fragments were removed using a MabSelectSure (GE) column.

Пример 3. Экспрессия в дрожжевых клетках.Example 3 Expression in yeast cells.

Конструирование экспрессирующих векторов Pichia pastoris для тяжелой и легкой цепи.Construction of Pichia pastoris heavy and light chain expression vectors.

Фрагменты гуманизированной легкой и тяжелой цепи коммерчески синтезировали и субклонировали в экспрессирующем векторе pGAP. Экспрессирующий вектор pGAP использовал GAP-промотор для контроля экспрессии иммуноглобулиновой цепи и лидерную последовательность человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) для экспорта. Кроме того, указанный вектор содержал обычные элементы, например, бактериальный сайт инициации репликации и копию гена устойчивости к канамицину, придававшего P. pastor is устойчивость к антибиотику G418. G418 обеспечивал средство отбора штаммов, содержавших желательный экспрессирующий вектор, интегрированный в их геном.Humanized light and heavy chain fragments were commercially synthesized and subcloned into the pGAP expression vector. The pGAP expression vector used the GAP promoter to control immunoglobulin chain expression and a human serum albumin (HSA) leader sequence for export. In addition, the vector contained the usual elements, for example, a bacterial origin of replication and a copy of the kanamycin resistance gene that conferred resistance to the antibiotic G418 in P. pastor. G418 provided a means of selecting strains containing the desired expression vector integrated into their genome.

Трансформация экспрессирующих векторов в гаплоидные штаммы-хозяева met1 и lys3 Pichia pastorisTransformation of expression vectors into haploid met1 and lys3 host strains of Pichia pastoris

Все способы, используемые для трансформации гаплоидных штаммов P. pastoris и манипуляции половым циклом P. pastoris выполняли, как описано в Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, and Cregg, JM, Eds. 1998. Humana Press, Totowa, NJ). Перед трансформацией каждый вектор переводили в линейную форму в пределах последовательностей GAP-промотора для стимуляции интеграции вектора в локус GAP-промотора генома P. pastoris. Гаплоидные штаммы трансфицировали с помощью электропорации и отбирали успешные трансформанты на чашках с YPDS (дрожжевой экстракт, пептон, декстроза с сорбитом) агаром с G418. Количество копий генов тяжелых и легких цепей определяли в гаплоидных штаммах с помощью саузерн-блоттинга. Затем скрещивали гаплоидные штаммы и осуществляли отбор по способности расти в отсутствие маркеров аминокислот (т.е. Lys и Met). Затем полученные диплоидные клоны подвергали окончательному саузерн-блоттингу для подтверждения количества копий генов тяжелых и легких цепей. Клон, экспрессировавший интересующее антитело, выбирали с помощью биосенсоров на основе белка А, использующих интерферометрию в биослое для контроля экспрессии (Octet, ForteBio).All methods used to transform P. pastoris haploid strains and manipulate the P. pastoris reproductive cycle were performed as described in Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, and Cregg, JM, Eds. 1998. Humana Press, Totowa, NJ) . Prior to transformation, each vector was linearized within the GAP promoter sequences to promote vector integration into the GAP promoter locus of the P. pastoris genome. Haploid strains were transfected by electroporation and successful transformants were selected on YPDS (yeast extract, peptone, dextrose with sorbitol) G418 agar plates. The copy number of heavy and light chain genes was determined in haploid strains using Southern blotting. Haploid strains were then crossed and selected for their ability to grow in the absence of amino acid markers (ie, Lys and Met). The resulting diploid clones were then subjected to a final Southern blot to confirm the copy number of the heavy and light chain genes. A clone expressing the antibody of interest was selected using protein A biosensors using biolayer interferometry to control expression (Octet, ForteBio).

Пример 4. Экспрессия Ab3 в Pichia pastoris.Example 4 Expression of Ab3 in Pichia pastoris.

Для экспрессии полноразмерного антитела сконструировали три штамма Pichia. Для всех штаммов, экспрессирующих полноразмерное антитело, создали гаплоидные штаммы, а затем выполнили их скрещивание. Один гаплоидный штамм экспрессировал полноразмерную последовательность легкой цепи, а другой гаплоидный штамм экспрессировал полноразмерную последовательность тяжелой цепи. Каждый диплоидный штамм использовали для получения исследовательского банка клеток и для экспрессии в биореакторе.Three strains of Pichia were engineered to express the full length antibody. For all strains expressing the full length antibody, haploid strains were created and then crossed. One haploid strain expressed the full length light chain sequence and the other haploid strain expressed the full length heavy chain sequence. Each diploid strain was used to prepare a research cell bank and for expression in a bioreactor.

- 33 040241- 33 040241

Вначале размножали инокулят с помощью исследовательского банка клеток в среде, состоящей из следующих питательных веществ (%, мас./об.): дрожжевой экстракт 3%, безводная декстроза 4%, YNB 1,34%, биотин 0,004% и 100 мМ фосфат калия. Для получения инокулята для ферментеров банк клеток размножали приблизительно в течение 24 ч в инкубаторе с качалкой при 30°C и 300 об/мин. Затем 10% инокулят добавляли в резервуары Labfors с рабочим объемом 2,5 л, содержащие 1 л стерильной ростовой среды. Ростовая среда состояла из следующих питательных веществ: сульфат калия 18,2 г/л, одноосновный фосфат аммония 36,4 г/л, двухосновный фосфат калия 12,8 г/л, гептагидрат сульфата магния 3,72 г/л, дигидрат цитрата натрия 10 г/л, глицерин 40 г/л, дрожжевой экстракт 30 г/л, микроэлементы РТМ1 4,35 мл/л и пеногаситель 204 1,67 мл/л Раствор микроэлементов РТМ1 состоял из следующих компонентов: пентагидрат сульфата меди 6 г/л, иодид натрия 0,08 г/л, гидрат сульфата марганца 3 г/л, дигидрат молибдата натрия 0,2 г/л, борная кислота 0,02 г/л, хлорид кобальта 0,5 г/л, хлорид цинка 20 г/л, гептагидрат сульфата железа (II) 65 г/л, биотин 0,2 г/л и серная кислота 5 мл/л.First, the inoculum was propagated using a research cell bank in a medium consisting of the following nutrients (%, w/v): yeast extract 3%, anhydrous dextrose 4%, YNB 1.34%, biotin 0.004% and 100 mM potassium phosphate . To obtain the inoculum for the fermenters, the cell bank was expanded for approximately 24 h in a shaker incubator at 30° C. and 300 rpm. The 10% inoculum was then added to 2.5 L working volume Labfors reservoirs containing 1 L of sterile growth medium. The growth medium consisted of the following nutrients: potassium sulfate 18.2 g/l, monobasic ammonium phosphate 36.4 g/l, dibasic potassium phosphate 12.8 g/l, magnesium sulfate heptahydrate 3.72 g/l, sodium citrate dihydrate 10 g/l, glycerol 40 g/l, yeast extract 30 g/l, trace elements RTM1 4.35 ml/l and defoamer 204 1.67 ml/l The solution of trace elements PTM1 consisted of the following components: copper sulfate pentahydrate 6 g/l , sodium iodide 0.08 g/l, manganese sulfate hydrate 3 g/l, sodium molybdate dihydrate 0.2 g/l, boric acid 0.02 g/l, cobalt chloride 0.5 g/l, zinc chloride 20 g /l, iron (II) sulfate heptahydrate 65 g/l, biotin 0.2 g/l and sulfuric acid 5 ml/l.

Параметры управления процессом в биореакторе устанавливали следующим образом: перемешивание 1000 об/мин, воздушный поток 1,35 стандартных литров в минуту, температура 28°C, рН поддерживали на уровне шести с помощью гидроксида аммония. Дополнительную подачу кислорода не осуществляли.Process control parameters in the bioreactor were set as follows: agitation 1000 rpm, air flow 1.35 standard liters per minute, temperature 28°C, pH was maintained at six with ammonium hydroxide. Additional oxygen supply was not carried out.

Культуры для ферментации выращивали в течение приблизительно 12-16 ч до израсходования исходного глицерина, на что указывал пик концентрации растворенного кислорода. Культуры поддерживали без источника углерода в течение приблизительно 3 ч после пика растворенного кислорода. После указанного периода голодания в реактор добавляли болюс этанола из расчета конечной концентрации этанола 1% (мас./об.). Культуры для ферментации оставляли уравновешиваться в течение 15-30 мин. Подачу питательной среды начинали через 30 мин после болюсного добавления этанола и устанавливали на постоянной скорости 1 мл/мин на 40 мин, затем насос среды контролировали с помощью датчика этанола, поддерживая концентрацию этанола 1% в течение оставшегося времени, с использованием датчиказонда этанола (Raven Biotech). Питательная среда состояла из следующих компонентов: дрожжевой экстракт 50 г/л, глюкоза 500 г/л, гептагидрат сульфата магния 3 г/л, и микроэлементы РТМ1 12 мл/л.The fermentation cultures were grown for approximately 12-16 hours until the initial glycerol was consumed, as indicated by the dissolved oxygen peak. The cultures were maintained without a carbon source for approximately 3 hours after the dissolved oxygen peak. After this fasting period, a bolus of ethanol was added to the reactor at a final ethanol concentration of 1% (w/v). The fermentation cultures were left to equilibrate for 15-30 minutes. Culture medium flow was started 30 min after the ethanol bolus and set at a constant rate of 1 ml/min for 40 min, then the medium pump was controlled with an ethanol probe, maintaining an ethanol concentration of 1% for the remainder of the time, using an ethanol probe probe (Raven Biotech ). The nutrient medium consisted of the following components: yeast extract 50 g/l, glucose 500 g/l, magnesium sulfate heptahydrate 3 g/l, and PTM1 trace elements 12 ml/l.

Пример 5. Способы гуманизации антител.Example 5 Methods for humanizing antibodies.

Способы гуманизации антител были описаны ранее в опубликованном патенте США № 7935340, раскрытие которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых случаях требовалось определение необходимости дополнительных остатков каркасных областей кролика для поддержания активности. В некоторых случаях для минимизации потерь сродства или активности гуманизированных антител все еще требовались некоторые критические остатки каркасных областей кролика. В этих случаях для получения желательной активности было необходимо вновь заменить одну или несколько аминокислот каркасной области из последовательностей эмбрионального типа человека на исходные аминокислоты кролика. Указанные изменения определяли экспериментально с целью идентификации остатков последовательности кролика, необходимых для сохранения сродства и активности. Они располагались в конце гуманизированной аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи.Methods for humanizing antibodies have been previously described in US Pat. No. 7,935,340, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. In some cases, it was necessary to determine the need for additional remnants of the framework regions of the rabbit to maintain activity. In some cases, some critical rabbit framework residues were still required to minimize loss of affinity or activity of humanized antibodies. In these cases, to obtain the desired activity, it was necessary to again replace one or more frame region amino acids from human germline sequences with the original rabbit amino acids. These changes were determined experimentally in order to identify rabbit sequence residues necessary to maintain affinity and activity. They were located at the end of the humanized amino acid sequence of the heavy and light chain variable regions.

Пример 6. Ингибирование связывания CGRP с его клеточным рецептором.Example 6 Inhibition of CGRP binding to its cellular receptor.

Для оценки способности рекомбинантно экспрессируемых антител ингибировать связывание CGRP с его клеточным рецептором выполняли анализ связывания радиоактивного лиганда, как описано ранее (Elshourbagy et al., Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al., Peptides, 16:421 (1995)). Использовали мембранные препараты рекомбинантных рецепторов CGRP человека, рецептора, подобного рецептору кальцитонина, и RAMP1 (Chemiscreen, Millipore). Разбавления антител предварительно инкубировали с CGRPa человека, меченным ¹²⁵I (0,03 нМ) в течение 30 мин при комнатной температуре. Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 0,1 мкМ CGRPa человека. Мембраны фильтровали и промывали. Затем выполняли подсчет частиц на фильтрах для определения специфически связанного CGRPa человека, меченного ¹²⁵I.To assess the ability of recombinantly expressed antibodies to inhibit CGRP binding to its cellular receptor, a radioactive ligand binding assay was performed as previously described (Elshourbagy et al., Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al., Peptides, 16:421 (1995)) . Membrane preparations of recombinant human CGRP receptors, calcitonin receptor-like receptor, and RAMP1 (Chemiscreen, Millipore) were used. Antibody dilutions were pre-incubated with human CGRPa labeled with ¹²⁵ I (0.03 nM) for 30 min at room temperature. Non-specific binding was assessed in the presence of 0.1 μM human CGRPa. The membranes were filtered and washed. Filter particle counts were then performed to determine specifically bound human CGRPa labeled with ¹²⁵ I.

Результаты: фиг. 38 демонстрирует, что антитела Ab1-Ab13 против CGRP ингибировали связывание CGRP с его клеточным рецептором.Results: Fig. 38 demonstrates that anti-CGRP antibodies Ab1-Ab13 inhibited the binding of CGRP to its cellular receptor.

Пример 7. Ингибирование нейрогенного расширения сосудов антителами против CGRP у крыс.Example 7 Inhibition of neurogenic vasodilation by anti-CGRP antibodies in rats.

CGRP является мощным сосудорасширяющим фактором (Nature 313: 54-56 (1985) и Br J. Clin. Pharmacol. 26(6):691-5. (1988)). Для оценки антител против CGRP использовали фармакодинамический анализ для неинвазивного измерения активности, антагонистической рецептору CGRP. Данная модель основана на изменениях в кожном кровотоке, измеряемых с помощью лазерной допплеровской визуализации после наружного применения раствора капсаицина. Капсаицин активирует транзиторный рецепторный потенциал рецептора ваниллоидов 1 типа (TRPV-1), приводя к нейрогенному воспалению и расширению сосудов за счет локального высвобождения вазоактивных медиаторов, включая CGRP и вещество Р (Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)).CGRP is a potent vasodilator (Nature 313: 54-56 (1985) and Br J. Clin. Pharmacol. 26(6):691-5. (1988)). To evaluate anti-CGRP antibodies, a pharmacodynamic assay was used to non-invasively measure CGRP receptor antagonist activity. This model is based on changes in skin blood flow measured by laser Doppler imaging after topical application of a capsaicin solution. Capsaicin activates the transient receptor potential of the vanilloid type 1 (TRPV-1) receptor, leading to neurogenic inflammation and vasodilation through the local release of vasoactive mediators, including CGRP and substance P (Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)) .

На день до анализа расширения сосудов животным в/б (внутрибрюшинно) вводили тестируемый агент или контроль. После введения дозы животных брили и депилировали в области поясницы со стороны спины на площади приблизительно 2x6 см. Затем животных возвращали в клетки на ночь. В деньOn the day prior to the analysis of vasodilation, the animals were intraperitoneally injected with the test agent or control. After dosing, the animals were shaved and depilated in the lumbar region of the back over an area of approximately 2x6 cm. The animals were then returned to their cages overnight. In a day

- 34 040241 анализа, приблизительно через 24 ч после введения дозы, животных анестезировали газообразным изофлураном, помещали на термостатируемую грелку-матрац и оснащали носовым конусом для непрерывной доставки изофлурана. Для наблюдения за расширением сосудов использовали лазерный допилеровский тепловизор. Пучок когерентного красного света, генерируемого 633-нм гелий-неоновым лазером, направляли на выбритую прямоугольную область площадью 2x6 см и сканировали в режиме среднего разрешения. Вначале получали исходную доплеровскую сканограмму и заранее определяли расположение размещения О-кольца путем выявления двух областей с одинаково низким потоком. На выбранные области помещали два резиновых О-кольца (диаметром ~1 см) и выполняли исходное сканирование. Непосредственно после завершения сканирования в области каждого из двух О-колец наносили 1 мг капсаицина в 5 мкл раствора этанол: ацетон (1:1). Допплеровское сканирование повторяли через 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20; 22,5; 25; 27,5 и 30 мин после нанесения капсаицина. Процентное изменение по сравнению с исходным средним потоком в каждом из двух О-колец наносили на график результатов расширения сосудов, обусловленного капсаицином.- 34 040241 analysis, approximately 24 hours after dosing, animals were anesthetized with gaseous isoflurane, placed on a temperature-controlled heating pad and equipped with a nose cone for continuous delivery of isoflurane. To monitor vasodilatation, a laser Doppler thermal imager was used. A beam of coherent red light generated by a 633 nm helium neon laser was directed to a shaved rectangular area of 2x6 cm and scanned in medium resolution mode. Initially, an initial Doppler scan was obtained and the location of the O-ring placement was predetermined by identifying two areas of equally low flow. Two rubber O-rings (~1 cm in diameter) were placed on the selected areas and the initial scan was performed. Immediately after completion of the scan, 1 mg of capsaicin in 5 μl of ethanol:acetone (1:1) solution was applied in the region of each of the two O-rings. Doppler scanning was repeated after 2.5; 5; 7.5; 10; 12.5; 15; 17.5; 20; 22.5; 25; 27.5 and 30 minutes after capsaicin application. The percentage change from baseline to average flow in each of the two O-rings was plotted on the results of capsaicin-induced vasodilation.

Для тестирования способности рекомбинантно экспрессируемых антител ингибировать связывание CGRP с его клеточным рецептором выполняли анализ связывания радиоактивного лиганда, как описано ранее.To test the ability of recombinantly expressed antibodies to inhibit the binding of CGRP to its cellular receptor, a radioactive ligand binding assay was performed as previously described.

Результаты: фиг. 39 демонстрирует, что антитело Ab3 против CGRP снижали расширение сосудов в указанной модели после введения капсаицина.Results: Fig. 39 demonstrates that anti-CGRP antibody Ab3 reduced vasodilation in this model following capsaicin administration.

Пример 8. Действие введения антитела против CGRP на гиперактивность мочевого пузыря.Example 8 Effect of administering an anti-CGRP antibody on overactive bladder.

Эксперименты проводили с целью оценки потенциальной эффективности введения антитела против CGRP на удержание мочи в мочевом пузыре и гиперактивность мочевого пузыря. Удержание мочи в мочевом пузыре является равновесием между закрытием уретры и активностью сжимающей мышцы, а гиперактивность мочевого пузыря является состоянием, характеризующимся неотложными позывами, недержанием мочи, частым мочеиспусканием и никтурией. Некоторые бессистемные данные, приведенные в литературе, указывают, что CGRP может быть вовлечен в удержание мочи и может коррелировать с и, возможно, являться причиной патологической гиперактивности мочевого пузыря. Соответственно, существовала надежда, что антитела против CGRP по изобретению, особенно учитывая их высокое сродство к CGRP, потенциально могли помочь предотвратить или смягчить это, иногда инвалидизирующее, состояние. (Доказательство того, что CGRP может участвовать в гиперактивности мочевого пузыря, включает тот факт, что CGRP присутствует в мочевыводящих путях, DRG и спинном мозге (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727). Кроме того, афферентные С-волокна важны для проведения импульсов, участвующих в мочеиспускании, в спинной мозг (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112): 128), a CGRP влияет на указанные волокна. Кроме того, сообщалось, что внутрипузырное введение ботокса подавляет CGRP и значительно снижает интервал между сокращениями в модели боли в мочевом пузыре, вызванной уксусной кислотой (Chuang et al., 2004 J Urol (172): 1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182): 786)). Кроме того, недавно сообщалось, что введение антитела против CGRP якобы снижало количество сокращений мочевого пузыря в модели гиперактивности мочевого пузыря, индуцированной скипидаром (Pfizer заявка на патент РСТ WO 2011/024113)).Experiments were performed to evaluate the potential effectiveness of the introduction of antibodies against CGRP on retention of urine in the bladder and overactive bladder. Urinary retention in the bladder is a balance between urethral closure and constrictor muscle activity, and overactive bladder is a condition characterized by urgency, urinary incontinence, urinary frequency, and nocturia. Some anecdotal evidence reported in the literature indicates that CGRP may be involved in urinary retention and may correlate with and possibly cause pathological overactive bladder. Accordingly, it was hoped that the anti-CGRP antibodies of the invention, especially given their high affinity for CGRP, could potentially help prevent or mitigate this sometimes disabling condition. (Evidence that CGRP may be involved in bladder overactivity includes the fact that CGRP is present in the urinary tract, DRG, and spinal cord (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727). In addition, afferent C fibers are important for the conduction of urinary impulses to the spinal cord (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112): 128), and CGRP affects these fibers. In addition, intravesical Botox has been reported to suppress CGRP and significantly reduce interval between contractions in the acetic acid bladder pain model (Chuang et al., 2004 J Urol (172): 1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182): 786)). In addition, it has recently been reported that administration of an anti-CGRP antibody allegedly reduced the number of bladder contractions in a model of turpentine-induced overactive bladder (Pfizer patent application PCT WO 2011/024113)).

Материалы и способы.Materials and methods.

Животные.Animals.

Самок крыс Sprague-Dawley (247-299 г) (Charles River Faboratories, Сен-Жермен-сюр-л'Арбрель, Франция) доставили в лабораторию не позднее по меньшей мере за 5 дней до экспериментов с целью их акклиматизации в лабораторных условиях. Их разместили по 3 на клетку (полипропиленовые клетки типа Е размером 1032 см²) и содержали с неограниченным доступом к пище (корм для грызунов Teklad 2016 global rodents, Harlan 03800 Гана, Франция) и воде. Подстилку из опилок (Souralit 2912 плюс, Souralit, 17080 Жирона, Испания) для клеток грызунов меняли два раза в неделю. Животных содержали при комнатной температуре (20±2°C) с циклом чередования свет-темнота 12/12 ч (светлая фаза с 7 до 19 ч) и относительной влажности 40-70%.Female Sprague-Dawley rats (247-299 g) (Charles River Faboratories, Saint-Germain-sur-l'Arbrell, France) were brought to the laboratory at least 5 days before the experiments in order to acclimatize them in the laboratory. They were housed 3 per cage (1032 ^cm2 type E polypropylene cages) and kept with unlimited access to food (rodent food Teklad 2016 global rodents, Harlan 03800 Ghana, France) and water. The sawdust bedding (Souralit 2912 plus, Souralit, 17080 Girona, Spain) for the rodent cages was changed twice a week. Animals were kept at room temperature (20±2°C) with a light-dark cycle of 12/12 h (light phase from 7 to 19 h) and a relative humidity of 40-70%.

Лабораторное оборудование.Laboratory equipment.

Катетеры для мочевого пузыря присоединяли с помощью Т-трубки к тензодатчику MX 860 Novatrans III Gold (Medex Medical SARL, Нант-Каркефу, Франция) и шприцевому насосу (70-2208 Model II plus, Harvard Apparatus, Лез-Юлис, Франция и Razel R-99E, Fisher Bioblock, Илькирш, Франция). Внутрипузырное давление непрерывно регистрировали с использованием интерфейса PowerFab (ADInstruments Pty Ltd, Касл-Хилл, Австралия) и программного обеспечения Chart®, работающего на ПК. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Microsoft Excel ®.Bladder catheters were connected with a T-tube to an MX 860 Novatrans III Gold load cell (Medex Medical SARL, Nantes Carquef, France) and a syringe pump (70-2208 Model II plus, Harvard Apparatus, Les Ulis, France and Razel R -99E, Fisher Bioblock, Illkirche, France). Intravesical pressure was continuously recorded using a PowerFab interface (ADInstruments Pty Ltd, Castle Hill, Australia) and Chart® software running on a PC. Data was analyzed using Microsoft Excel® software.

Тестируемые соединения.Tested compounds.

Тестируемое антитело против CGRP (Ab3).Anti-CGRP antibody to be tested (Ab3).

Антитело отрицательного контроля (антитело против дигитоксина).Negative control antibody (anti-digitoxin antibody).

Реактивы.Reagents.

Физиологический раствор (0,9% NaCl) (№ партии 11043411, № CAS 7647-14-5) приобрели в BBraun через Centravet (Лапалис, Франция).Saline (0.9% NaCl) (Lot # 11043411, CAS # 7647-14-5) was purchased from BBraun via Centravet (Lapalis, France).

- 35 040241- 35 040241

Анестетик.Anesthetic.

Уретан (№ партии ВСВС9294, № CAS 51-79-6) и фенобарбитал натрия (№ партии 150А1, № CAS 76-74-4) были поставлены Sigma-Aldrich (Сен-Кантен-Фаллавье, Франция) и Centravet (Лапалис, Франция) соответственно.Urethane (Lot No. BCBC9294, CAS No. 51-79-6) and Sodium Phenobarbital (Lot No. 150A1, CAS No. 76-74-4) were supplied by Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, France) and Centravet (Lapalice, France). ) respectively.

Экспериментальные группы.experimental groups.

В экспериментах использовали две экспериментальные группы по 10 крыс. Каждой группе вводили 10 мг/кг контроля или антитела против CGRP.The experiments used two experimental groups of 10 rats. Each group was administered 10 mg/kg control or anti-CGRP antibody.

Схема исследования.Study scheme.

Экспериментальная процедура.experimental procedure.

Самкам крыс вводили тестируемое антитело или антитело отрицательного контроля внутривенно в дозе 10 мг/кг за 18 ч до экспериментов с использованием инъекции в хвостовую вену. Пятнадцать часов спустя крыс анестезировали уретаном (1,2 г/кг, подкожно (п/к). Через 3 ч после п/к введения уретана в мочевой пузырь вводили полиэтиленовый катетер (с внутренним и наружным диаметром 0,58 и 0,96 мм, соответственно) через купол и закрепляли кисетным швом. Температуру тела поддерживали при 37±2°C (контроллер TCAT-2LV, Physitemp, ADInstruments Pty Ltd., Касл-Хилл, Австралия) в течение всего эксперимента.Female rats were administered test antibody or negative control antibody intravenously at a dose of 10 mg/kg 18 hours prior to experiments using tail vein injection. Fifteen hours later, rats were anesthetized with urethane (1.2 g/kg, s.c.). 3 hours after s.c. injection of urethane, a polyethylene catheter (with an inner and outer diameter of 0.58 and 0.96 mm) was inserted into the bladder. , respectively) through the dome and secured with a purse-string suture Body temperature was maintained at 37±2°C (TCAT-2LV controller, Physitemp, ADInstruments Pty Ltd., Castle Hill, Australia) throughout the experiment.

Цистометрический эксперимент.cystometric experiment.

Цистометрические исследования проводили на наркотизированных самках крыс после операции. Физиологический раствор при комнатной температуре непрерывно вливали в мочевой пузырь при постоянной скорости потока (2 мл/ч) в течение по меньшей мере 30 мин.Cystometric studies were performed on anesthetized female rats after surgery. Saline at room temperature was continuously infused into the bladder at a constant flow rate (2 ml/hr) for at least 30 minutes.

В конце цистометрических экспериментов животных умерщвляли с помощью смертельной инъекции (1 мл) пентобарбитала натрия (54,7 мг/мл) (№ CAS 76-74-4) с последующим смещением шейных позвонков.At the end of the cystometric experiments, the animals were euthanized by a lethal injection (1 ml) of sodium pentobarbital (54.7 mg/ml) (CAS No. 76-74-4) followed by dislocation of the cervical vertebrae.

Цистометрические параметры.cystometric parameters.

Измеряемыми цистометрическими параметрами являлись:The measured cystometric parameters were:

амплитуда мочеиспускания (AM), т.е. давление между пороговым давлением и максимальным давлением мочеиспускания (мм рт.ст.), интервал между сокращениями (ICI), т.е. время между двумя последовательными мочеиспусканиями (с), частота мочеиспускания (MF), т.е. количество сокращений мочеиспускания/15 мин (пиков/15 мин). Критерии исключения.voiding amplitude (AM), i.e. pressure between threshold pressure and maximum micturition pressure (mmHg), interval between contractions (ICI), i.e. time between two successive urinations (s), frequency of urination (MF), i.e. number of urination contractions/15 min (peaks/15 min). exclusion criteria.

Двух крыс исключили из экспериментов: одну из них исключили ввиду гиперактивности мочевого пузыря во время внутрипузырного вливания физиологического раствора, а другую потому что глубина анестезии менялась в ходе эксперимента, что вызывало модификации цистометрического профиля.Two rats were excluded from the experiments: one of them was excluded due to overactive bladder during intravesical saline infusion, and the other because the depth of anesthesia changed during the experiment, which caused modifications in the cystometric profile.

Анализ результатов.Analysis of results.

Для каждой крысы рассчитывали значения AM и ICI как среднее за последние четыре-пять мочеиспусканий во время вливания физиологического раствора. Значения MF рассчитывали как среднее по количеству мочеиспусканий, полученных для двух 15-минутных интервалов во время вливания физиологического раствора.For each rat, AM and ICI values were calculated as the average of the last four to five voids during saline infusion. MF values were calculated as the average of the number of urinations obtained for two 15-minute intervals during saline infusion.

Результаты представлены в виде средние значения ± стандартная ошибка среднего (± sem). Фигуры и статистические анализы выполняли с использованием GraphPad Prism® (версия 4; GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, штат Калифорния, США).Results are presented as means ± standard error of the mean (± sem). Figures and statistical analyzes were performed using GraphPad Prism® (version 4; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Статистическое сравнение значений (вливание физиологического раствора) в группе антитела против CGRP по сравнению с контрольной группой антител проводили с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок.Statistical comparison of values (saline infusion) in the anti-CGRP antibody group compared to the control antibody group was performed using Student's t-test for independent samples.

Р < 0,05 принимали за статистическую значимость.P < 0.05 was taken as statistical significance.

Результаты.Results.

Как показано на фиг. 41, ICI был значительно выше, a MF - значительно ниже в группе, обработанной антителом против CGRP (фиг. 41А и В, соответственно; р<0,05, t-критерий Стъюдента для независимых выборок). Значимого различия для AM между группами не наблюдали (фиг. 41С, р>0,05, tкритерий Стъюдента для независимых выборок).As shown in FIG. 41, ICI was significantly higher and MF significantly lower in the anti-CGRP antibody treated group (FIGS. 41A and B, respectively; p<0.05, Student's t-test for independent samples). No significant difference was observed for AM between groups (Fig. 41C, p>0.05, Student's t test for independent samples).

Эти результаты показывают, что антитела против CGRP можно применять для предотвращения или облегчения гиперактивности мочевого пузыря, улучшения удержания мочи и лечения связанных с ними состояний мочевыделительной системы.These results indicate that anti-CGRP antibodies can be used to prevent or alleviate overactive bladder, improve urinary retention, and treat associated urinary conditions.

Пример 9. Облегчение невропатической боли у крыс.Example 9 Relief of neuropathic pain in rats.

Повреждение периферических нервов часто приводит к хронической рефлекторной боли невропатического происхождения. Указанный болевой синдром состоит из чувствительности к внешним раздражителям (например, механическим и/или тепловым), которые обычно не вызывают боли. Как следствие, невропатическая боль не поддается традиционным подходам к обезболиванию, что затрудняет ее лечение. Невропатическую боль можно экспериментально смоделировать у животных с помощью хирургической травмы периферических нервов. Модель Чанга является одной из таких систем, где невропатическую боль индуцируют путем перевязки спинномозговых нервов L5 и L6.Peripheral nerve damage often results in chronic reflex pain of neuropathic origin. Said pain syndrome consists of sensitivity to external stimuli (eg, mechanical and/or thermal) that usually do not cause pain. As a consequence, neuropathic pain defies traditional approaches to pain relief, making it difficult to treat. Neuropathic pain can be experimentally modeled in animals using surgical trauma to the peripheral nerves. The Chang model is one such system where neuropathic pain is induced by ligation of the L5 and L6 spinal nerves.

- 36 040241- 36 040241

В данном примере перевязку спинномозгового нерва проводили на самцах крыс Sprague Dawley. У них тестировали болевую чувствительность на 13-й день (подтверждение аллодинии), а затем вновь после каждого введения Ab2 с помощью теста механической аллодинии фон Фрея для оценки возможной активности против аллодинии.In this example, spinal nerve ligation was performed on male Sprague Dawley rats. They were tested for pain sensitivity on day 13 (confirmation of allodynia), and then again after each administration of Ab2 using the von Frey mechanical allodynia test to assess possible anti-allodynia activity.

Способы.Ways.

Самцов крыс Sprague Dawley (Harlan Laboratories) массой 200-225 г по прибытии вынимали из коробок и размещали в клетках. Каждое животное подвергали санитарному осмотру, включая оценку состояния шерсти, конечностей и отверстий. Каждое животное также проверяли на предмет любых аномальных признаков позы или при движении. Обнаружено, что все животные были здоровы, и их включили в исследование.Male Sprague Dawley rats (Harlan Laboratories) weighing 200-225 g were taken out of the boxes on arrival and housed in cages. Each animal was subjected to a sanitary examination, including an assessment of the condition of the coat, limbs and holes. Each animal was also checked for any abnormal signs of posture or movement. All animals were found to be healthy and included in the study.

Крыс акклиматизировали в течение минимум двух дней до начала экспериментальных процедур, за исключением рандомизации массы тела, которую зарегистрировали на следующий день после прибытия. Животных содержали по отдельности в прозрачных поликарбонатных стандартных клетках или прозрачных поликарбонатных клетках-микроизоляторах с сертифицированной облученной контактной подстилкой. Доступ к пище и воде предоставили без ограничений. Климат-контроль установили на поддержание температуры 18-26°C (64-79°F) при относительной влажности от 30 до 70%. Поддерживали цикл свет:темнота 12:12 ч.The rats were acclimatized for a minimum of two days prior to the start of the experimental procedures, with the exception of body weight randomization, which was recorded the day after arrival. Animals were housed individually in transparent polycarbonate standard cages or transparent polycarbonate microisolator cages with certified irradiated contact bedding. Access to food and water was provided without restrictions. Climate control was set to maintain a temperature of 18-26°C (64-79°F) with a relative humidity of 30 to 70%. The light:dark cycle was maintained at 12:12 h.

Исходный порог тестировали у крыс с помощью нитей фон Фрея в дни акклиматизации -4 или -1.Baseline threshold was tested in rats with von Frey filaments on acclimatization days -4 or -1.

В день 0 животных подвергли процедуре перевязки спинномозгового нерва. Все операции выполняли асептически. Перед операцией крыс анестезировали. Область спины брили и подготавливали для асептической операции. Крыс помещали в положение лежа на брюхе и делали надрез чуть левее средней линии в области L4 - S2. Левые околопозвоночные мышцы отделяли от остистых отростков (L4 - S2). Перегибали дугоотростчатый сустав L6 - S1 и осторожно обрезали поперечный отросток, чтобы обеспечить пространство для доступа к спинномозговым нервам L4 и L5. Левые спинномозговые нервы L5 и L6 выделяли и перевязывали 6,0 шелковыми швами. Затем закрывали разрез соответствующим шовным материалом и зажимами для кожных ран. После операции животным вводили раствор Рингера с лактатом (3,0-5,0 мл) путем подкожной инъекции.On day 0, the animals were subjected to a spinal nerve ligation procedure. All operations were performed aseptically. The rats were anesthetized before the operation. The back area was shaved and prepared for aseptic surgery. The rats were placed in the prone position and an incision was made just to the left of the midline in the area L4 - S2. The left paravertebral muscles were separated from the spinous processes (L4 - S2). The L6-S1 facet joint was kinked and the transverse process was carefully trimmed to provide space for access to the L4 and L5 spinal nerves. The left spinal nerves L5 and L6 were isolated and tied with 6.0 silk sutures. The incision was then closed with appropriate suture material and skin wound clamps. After the operation, the animals were given lactated Ringer's solution (3.0-5.0 ml) by subcutaneous injection.

У всех животных из групп 1 и 2 проводили тест фон Фрея в дни -4 или -1, 13, 14 и 17. Измерение в день 13 выполняли перед введением дозы. Тест механической аллодинии фон Фрея оценивает антиноцицептивные свойства обезболивающих соединений. В данном тесте животных вначале приучают к испытательной камере, чтобы они были достаточно спокойны для оценки их болевого порога. Лаборант, не имеющий информации об экспериментальных группах, оказывает легкое давление на левую заднюю лапу крысы с использованием набора градуированных нейлоновых нитей (нитей фон Фрея) с увеличивающимся диаметром. Нитями перпендикулярно нажимают на брюшную поверхность лапы, пока они не согнутся. При ощущении боли крыса реагирует путем отдергивания лапы. Порог аллодинии определяли с помощью способа Chaplan вверх-вниз (Chaplan et al., J Neurosci Methods, 53:55-63, 1994), обеспечивающего точную силу для отдергивания для каждой крысы с помощью психофизической шкалы тестирования.All animals from Groups 1 and 2 underwent a von Frey test on days -4 or -1, 13, 14 and 17. The measurement on day 13 was performed before dosing. The von Frey mechanical allodynia test evaluates the antinociceptive properties of analgesic compounds. In this test, the animals are first accustomed to the test chamber so that they are calm enough to assess their pain threshold. The laboratory assistant, unaware of the experimental groups, applies light pressure to the left hind paw of the rat using a set of graduated nylon threads (von Frey threads) with increasing diameter. The threads are pressed perpendicularly on the abdominal surface of the paw until they are bent. When pain is felt, the rat reacts by withdrawing its paw. The allodynia threshold was determined using the Chaplan up-down method (Chaplan et al., J Neurosci Methods, 53:55-63, 1994) providing an accurate withdrawal force for each rat using a psychophysical testing scale.

Животных распределяли на две экспериментальные группы на 13 день, основываясь на показателях фон Фрея. Животных, у которых показатель фон Фрея превышал 6 г, исключили из исследования. Средние показатели фон Фрея для каждой группы изучали для гарантии того, что средние значения и стандартное отклонение удовлетворяли предположению однородности. Дозы однократно вводили путем в/б инъекции в день 13 (через 13 дней после операции) для группы 1 (Ab2) и группы 2 (антитело отрицательного контроля) (11 животных в каждой группе; Ab2 и антитела отрицательного контроля вводили в дозе 10 мг/кг). Группа 1 получила дополнительную в/в болюсную (для вывода из наркоза) инъекцию Ab2 в день 17 до тестирования поведения.Animals were assigned to two experimental groups on day 13 based on von Frey scores. Animals with a von Frey value greater than 6 g were excluded from the study. Von Frey means for each group were studied to ensure that the means and standard deviation met the assumption of uniformity. Doses were given as a single ip injection on day 13 (13 days postoperatively) for group 1 (Ab2) and group 2 (negative control antibody) (11 animals per group; Ab2 and negative control antibodies were administered at a dose of 10 mg/day). kg). Group 1 received an additional IV bolus (to wake up from anesthesia) injection of Ab2 on day 17 prior to behavior testing.

Образцы крови группы 1 для получения плазмы собирали в день 17 и анализировали титр Ab2.Group 1 blood samples for plasma were collected on day 17 and analyzed for Ab2 titer.

За исключением ожидаемых наблюдений в области операции и приволакивания лапы, связанных с операцией Чанга, аномальных наблюдений зафиксировано не было. Оказалось, что лечение не оказывало отрицательного влияния на общее состояние здоровья животного и не нарушало нормального увеличения массы тела, ожидаемого у крыс этого возраста.With the exception of the expected sightings in the operative area and paw tucking associated with Chang's operation, no anomalous sightings were recorded. It turned out that the treatment did not adversely affect the general health of the animal and did not interfere with the normal increase in body weight expected in rats of this age.

Результаты.Results.

У всех животных, подвергавшихся исходному тестированию до операции в день 0, показатель фон Фрея составлял 15 (не приведено), что указывало на нормальную чувствительность. На 13-й день (перед введением антитела) показатели фон Фрея у всех животных были ниже 6 г, что указывало на развившуюся чувствительность к внешним механическим раздражителям, за исключением двух животных, исключенных из исследования. Средние показатели фон Фрея на 13 день составляли менее 3 г (фиг. 42, левая группа столбиков). После тестирования в день 13 животным вводили Ab2 или антитело отрицательного контроля (10 мг/кг). В дни 14 и 17 повторно тестировали показатели фон Фрея, и они были выше в Ab2обработанных животных, чем в контрольной группе (фиг. 42, средняя и правая группы столбиков соответственно).All animals subjected to preoperative baseline testing on day 0 had a von Frey score of 15 (not shown), indicating normal sensitivity. On the 13th day (before the administration of the antibody), the von Frey values in all animals were below 6 g, indicating that they had developed sensitivity to external mechanical stimuli, with the exception of two animals that were excluded from the study. Von Frey's mean readings on day 13 were less than 3 g (Fig. 42, left panel of bars). After testing on day 13, animals were treated with Ab2 or a negative control antibody (10 mg/kg). On days 14 and 17, von Frey scores were retested and were higher in the Ab2 treated animals than in the control group (FIG. 42, middle and right bar groups, respectively).

Эти результаты показывают, что лечение антителом против CGRP, например Ab2, может помочь предотвратить или облегчить нейропатическую боль.These results indicate that treatment with an anti-CGRP antibody such as Ab2 may help prevent or alleviate neuropathic pain.

- 37 040241- 37 040241

Пример 10. Первый эксперимент по оценке действия введения антитела против CGRP на анальгезию (модель подергивания хвоста).Example 10 First Experiment to Evaluate the Effect of Administering Anti-CGRP Antibodies on Analgesia (Tail-twitch Model).

Три различных эксперимента (примеры 10-12) проводили с целью оценки потенциальной эффективности введения антитела против CGRP на анальгезию или боль. Во всех указанных экспериментах использовали модель реакции подергивания хвоста грызунов (также называемую отдергиванием хвоста), поскольку реакция подергивания хвоста грызуна на тепловое излучение является широко используемой моделью для обнаружения потенциально полезных анальгетиков. Этот анализ особенно полезен для различения морфиноподобных анальгетиков центрального действия (активных) и неопиоидных противовоспалительных средств или противовоспалительных средств периферического действия (неактивных). Модель животного, а также способы и материалы, использованные здесь, описаны ниже.Three different experiments (examples 10-12) were performed to evaluate the potential effectiveness of the introduction of antibodies against CGRP on analgesia or pain. All of these experiments used the rodent tail flick response model (also referred to as tail flick) because the rodent tail flick response to thermal radiation is a widely used model for detecting potentially useful analgesics. This assay is particularly useful in distinguishing between centrally acting morphine-like analgesics (active) and non-opioid or peripherally acting anti-inflammatory drugs (inactive). The animal model, as well as the methods and materials used herein, are described below.

Материалы и способы.Materials and methods.

Животные: самцы крыс Sprague Dawley массой 150±20 г.Animals: male Sprague Dawley rats weighing 150±20 g.

Тестируемое антитело против CGRP: Ab2Anti-CGRP antibody tested: Ab2

Среда-носитель: 15 мМ гистидина, 250 мМ сорбита, рН 5,5.Carrier medium: 15 mM histidine, 250 mM sorbitol, pH 5.5.

Анальгетик: морфин.Analgesic: morphine.

Процедуры реакции подергивания хвоста: время (в секундах), необходимое для того, чтобы вызвать реакцию подергивания хвоста, вызванную сфокусированным тепловым излучением, измеряли как болевой порог в группах из 10 самцов крыс Sprague Dawley массой 150±20 г. Исходное тестирование реакции подергивания хвоста выполнили в день 0. Крыс, характеризовавшихся реакцией подергивания хвоста 3-5 с, включили в исследование и распределили по сбалансированным экспериментальным группам на основании исходных реакций подергивания хвоста. Использовали 15-секундную отсечку во избежание повреждения тканей.Tail twitch response procedures: The time (in seconds) required to elicit a tail twitch response induced by focused thermal radiation was measured as pain threshold in groups of 10 male Sprague Dawley rats weighing 150±20 g. Baseline tail twitch response testing was performed on day 0. Rats exhibiting a tail-twitch response of 3-5 s were included in the study and assigned to balanced experimental groups based on baseline tail-twitch responses. A 15 second cutoff was used to avoid tissue damage.

Развитие устойчивости к морфину.Development of resistance to morphine.

Каждая из 3 групп по 10 самцов крыс Sprague Dawley получала среду-носитель - физиологический раствор (2 мл/кг) 2 раза в день (утром и вечером) путем в/б введения. Кроме того, одной из 3 групп дополнительно в/б вводили анальгетик (морфин) в дозе 5 мг/кг 2 раза в день в течение 7 последовательных дней. Второй из 3 групп крыс в/б вводили антитело против CGRP по изобретению (Ab2) в дозе 10 мг/кг в виде однократного болюса в день 0. Затем каждую крысу в различных группах тестировали на реакцию подергивания хвоста раз в день через 30 мин после утренней дозы.Each of 3 groups of 10 male Sprague Dawley rats received a carrier medium - saline (2 ml/kg) 2 times a day (morning and evening) by intravenous administration. In addition, one of the 3 groups received an additional intravenous injection of an analgesic (morphine) at a dose of 5 mg/kg 2 times a day for 7 consecutive days. The second of 3 groups of rats received ip an anti-CGRP antibody of the invention (Ab2) at a dose of 10 mg/kg as a single bolus on day 0. Each rat in the various groups was then tested for tail twitch response once a day 30 min after morning doses.

Для сравнения групп, получавших контрольную среду-носитель и тестируемое соединение, использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующим t-критерием Даннетта. Р<0,05 считали значимым.A one-way analysis of variance followed by Dunnett's t-test was used to compare vehicle control and test compound groups. P<0.05 was considered significant.

Результаты указанных экспериментов показаны на фиг. 43. Результаты показывают, что тестируемое антитело против CGRP при введении в дозе 10 мг/кг вызывало значимый длительный обезболивающий эффект при термическом болевом раздражителе. Конечные образцы крови всех протестированных крыс собирали путем пункции сердца и впоследствии анализировали на титр Ab2.The results of these experiments are shown in FIG. 43. The results show that the test anti-CGRP antibody, when administered at a dose of 10 mg/kg, produced a significant long-term analgesic effect on a thermal noxious stimulus. Final blood samples from all tested rats were collected by cardiac puncture and subsequently analyzed for Ab2 titer.

Пример 11. Второй эксперимент по подергиванию хвоста для оценки действия антитела против CGRP на анальгезию (титрование дозы антитела).Example 11 Second tail twitch experiment to evaluate the effect of anti-CGRP antibody on analgesia (titering the dose of antibody).

Второй набор экспериментов по подергиванию хвоста проводили с целью оценки действия различных доз антитела против CGRP на анальгезию с помощью антитела против CGRP по изобретению (Ab2). Крысы, используемые в указанных экспериментах, были аналогичны крысам, использованным в предыдущем эксперименте; протокол подергивания хвоста также был практически аналогичен. В указанном эксперименте сравнивали анальгезию в различных группах животных, получавших различные дозировки антитела против CGRP с целью оценки влияния дозировки на анальгезию. Во второй серии экспериментов сравнивали пять групп подопытных животных следующим образом. Первая контрольная группа животных получала только среду-носитель (15 мМ гистидина, 250 мМ сорбита, рН 5,5), 3 группы животных получали различные дозировки одного и того же антитела против CGRP, содержащегося в среденосителе (Ab2, соответственно вводимое в дозировках 1 мг/кг, 3 мг/кг или 10 мг/кг в день 0), а пятая группа животных получала 10 мг/кг антитела отрицательного контроля (антитела против дигитоксина) также в день 0.A second set of tail twitch experiments was performed to evaluate the effect of various doses of anti-CGRP antibody on analgesia with an anti-CGRP antibody of the invention (Ab2). The rats used in these experiments were similar to those used in the previous experiment; the tail twitch protocol was also almost the same. This experiment compared analgesia in different groups of animals treated with different dosages of anti-CGRP antibodies in order to evaluate the effect of dosage on analgesia. In the second series of experiments, five groups of experimental animals were compared as follows. The first control group of animals received only the carrier medium (15 mM histidine, 250 mM sorbitol, pH 5.5), 3 groups of animals received different dosages of the same anti-CGRP antibody contained in the medium (Ab2, respectively administered at dosages of 1 mg /kg, 3mg/kg or 10mg/kg on day 0), and the fifth group of animals received 10mg/kg negative control antibodies (anti-digitoxin antibodies) also on day 0.

Протоколы подергивания хвоста в остальном выполнялись практически как описано выше. Для сравнения групп, получавших контрольную среду-носитель, антитело отрицательного контроля и тестируемое антитело против CGRP, оценку результатов вновь выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим t-критерием Даннетта. Р<0,05 считали значимым.Tail twitch protocols were otherwise performed essentially as described above. To compare groups treated with vehicle control, negative control antibody, and test anti-CGRP antibody, results were again evaluated using one-way analysis of variance followed by Dunnett's t-test. P<0.05 was considered significant.

Результаты указанных экспериментов показаны на фиг. 44. На ней видно, что более высокие дозировки тестируемого антитела (антитело Ab2 против CGRP по изобретению) оказывали обезболивающее действие лучше, чем более низкие дозировки. Как и ожидалось, антитело отрицательного контроля не оказывало заметного влияния на анальгезию по сравнению с контрольными группами.The results of these experiments are shown in FIG. 44. It can be seen that higher dosages of the test antibody (anti-CGRP antibody Ab2 of the invention) provided better pain relief than lower dosages. As expected, the negative control antibody had no significant effect on analgesia compared to the control groups.

Пример 12. Третий эксперимент по подергиванию хвоста для оценки действия совместного введения антитела против CGRP и морфина на анальгезию.Example 12 Third tail twitch experiment to evaluate the effect of co-administration of anti-CGRP antibody and morphine on analgesia.

Третий набор экспериментов по подергиванию хвоста также проводили с целью оценки действияA third set of tail twitch experiments was also conducted to evaluate the effect

- 38 040241 совместного введения антитела против CGRP и морфина на анальгезию. В указанных экспериментах первой группе животных вводили только ту же среду-носитель в дозировке 5 мл/кг. Второй группе животных вводили морфин в дни 1-10 в дозировке 5 мг/кг два раза в день, причем таким животным в день 0 также вводили антитело Ab2 против CGRP в дозировке 10 мг/кг. Третьей группе животных вводили морфин только в дни 1-4 также в дозировке 5 мг/кг два раза в день и дополнительно вводили антитело Ab2 в день 0 в дозировке 10 мг/кг. Все препараты вводили в/б.- 38 040241 co-administration of anti-CGRP antibody and morphine for analgesia. In these experiments, the first group of animals received only the same carrier medium at a dosage of 5 ml/kg. The second group of animals received morphine on days 1-10 at a dosage of 5 mg/kg twice a day, and such animals on day 0 were also injected with Ab2 antibody against CGRP at a dosage of 10 mg/kg. The third group of animals received morphine only on days 1-4, also at a dosage of 5 mg/kg twice a day, and additionally received Ab2 antibody on day 0 at a dosage of 10 mg/kg. All drugs were administered intramuscularly.

Эксперименты по подергиванию хвоста выполняли в каждой из указанных групп животных ежедневно в дни 0-10. Для сравнения групп, получавших контрольную среду-носитель, антитело отрицательного контроля и тестируемое антитело против CGRP, оценку результатов указанных экспериментов по подергиванию хвоста вновь выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим t-критерием Даннетта. Р<0,05 считали значимым.Tail twitching experiments were performed in each of these groups of animals daily on days 0-10. To compare the groups treated with vehicle control, negative control antibody, and test anti-CGRP antibody, the results of these tail twitch experiments were again evaluated using one-way analysis of variance followed by Dunnett's t-test. P<0.05 was considered significant.

Сводные результаты указанного сравнения показаны на фиг. 45. Животные, обработанные Ab2, получавшие ежедневную дозу морфина в течение всего эксперимента, демонстрировали устойчивость к морфину, и после дня 5 время подергивания хвоста уменьшилось почти до уровня контрольных животных, получавших среду-носитель. В противоположность этому, у животных, обработанных Ab2, получавших морфин только до дня 4, время подергивания хвоста улучшилось на 5-й день и оставалось улучшенным до дня 8. Результаты показывают, что введение антитела против CGRP могло оказывать обезболивающее действие даже после начала устойчивости к морфину, которое могло быть более выраженным при отмене морфина.A summary of the results of this comparison is shown in FIG. 45. Ab2-treated animals treated with a daily dose of morphine throughout the experiment showed morphine tolerance, and after day 5, tail twitching time was reduced almost to the level of vehicle control animals. In contrast, in Ab2-treated animals receiving morphine only until day 4, tail twitch time improved on day 5 and remained improved until day 8. The results indicate that the administration of anti-CGRP antibody could have an analgesic effect even after the onset of resistance to morphine, which could be more pronounced with morphine withdrawal.

Пример 13. Облегчение висцеральной боли у крыс.Example 13 Relief of visceral pain in rats.

Пациенты, страдающие от синдрома раздраженного кишечника (СРК), демонстрируют более низкий висцеральный сенсорный порог при растяжении толстой кишки с помощью баллона (Ritchie, Gut, 1973, 14:125-32). Предполагают, что при СРК усиливается болевая чувствительность оси головной мозгкишечник при нормальной картине активации. Ранее было показано, что введение тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS) в проксимальный отдел толстой кишки вызвало хроническую гиперчувствительность толстой кишки, измеряемой у бодрствующих крыс по снижению порога болевой чувствительности в ответ на растяжение толстой кишки (Diop et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 302:1013-22). Указанная хроническая гиперчувствительность обнаруживалась в дистальном невоспаленном отделе толстой кишки и сохранялась в течение 21 дня. Это имитировало некоторые характеристики СРК и поэтому может использоваться в качестве модели для экспериментального исследования патофизиологических аспектов этого расстройства. Указанный анализ используют для определения потенциального антигиперчувствительного действия соединений против TNBS-индуцированной гиперчувствительности толстой кишки.Patients suffering from irritable bowel syndrome (IBS) exhibit a lower visceral sensory threshold when ballooning the colon (Ritchie and Gut, 1973, 14:125-32). It is assumed that pain sensitivity of the brain–intestinal axis increases in IBS with a normal pattern of activation. Administration of trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) to the proximal colon has previously been shown to cause chronic colonic hypersensitivity as measured in awake rats as a reduction in pain threshold in response to colonic distension (Diop et al., J. Pharmacol. Exp. Ther ., 2002, 302:1013-22). This chronic hypersensitivity was found in the distal non-inflammatory colon and persisted for 21 days. This mimicked some of the characteristics of IBS and can therefore be used as a model for experimental investigation of the pathophysiological aspects of this disorder. This assay is used to determine the potential anti-hypersensitivity effect of the compounds against TNBS-induced colonic hypersensitivity.

Несколько исследований подразумевали участие CGRP в висцеральной боли (Friese et al., Regul Pept 1997;70:l-7; Gschossmann et al., Neurogastroenterol Motil 2001; 13:229-36; Julia and Bueno, Am J Physiol 1997;272:G141-6; Plourde et al., Am J Physiol 1997; 273:G191-6). CGRP является наиболее распространенным пептидом капсаицин-чувствительных афферентных волокон желудочно-кишечного происхождения, что составляет до 80% от общей иммунореактивности пептида (Clague et al., Neurosci Lett 1985;56:63-8; Sternini et al., Gastroenterology 1987;93:852-62). Кроме того, инъекция CGRP вызывает гиперчувствительность толстой кишки в модели TNBS (Delafoy et al., 2006, Gut 55:940-5), которая устраняется за счет пептида-антагониста CGRP (CGRP 8-37).Several studies implicated CGRP in visceral pain (Friese et al., Regul Pept 1997;70:l-7; Gschossmann et al., Neurogastroenterol Motil 2001; 13:229-36; Julia and Bueno, Am J Physiol 1997;272: G141-6; Plourde et al., Am J Physiol 1997; 273:G191-6). CGRP is the most abundant peptide in capsaicin-responsive afferent fibers of gastrointestinal origin, accounting for up to 80% of the total peptide immunoreactivity (Clague et al., Neurosci Lett 1985;56:63-8; Sternini et al., Gastroenterology 1987;93: 852-62). In addition, injection of CGRP causes colonic hypersensitivity in the TNBS model (Delafoy et al., 2006, Gut 55:940-5), which is abolished by a CGRP antagonist peptide (CGRP 8-37).

В настоящем примере описано тестирование антитела против CGRP в модели висцеральной боли (TNBS-индуцированной хронической гиперчувствительности толстой кишки) у крыс.This example describes testing of an anti-CGRP antibody in a rat model of visceral pain (TNBS-induced chronic hypersensitivity of the colon).

Способы.Ways.

В данное исследование включали самцов крыс Sprague-Dawley массой 390-450 г на дату операции. Их содержали в комнате с контролируемой температурой (19,5-24,5°C) и относительной влажностью (4565%) при 12-ч цикле свет/темнота. Животных содержали по 2 или 3 на клетку и наблюдали во время периода акклиматизации (по меньшей мере 5 дней) перед испытанием. Каждую крысу идентифицировали по хвостовой метке. Исследование проводили в соответствии с рекомендациями Комитета по исследованиям и этическим проблемам I.A.S.P. (1983) и Европейскими методическими руководствами 2010/63/UE.This study included male Sprague-Dawley rats weighing 390-450 g at the date of surgery. They were kept in a temperature controlled room (19.5-24.5°C) and relative humidity (4565%) on a 12 hour light/dark cycle. Animals were kept 2 or 3 per cage and observed during the acclimatization period (at least 5 days) prior to testing. Each rat was identified by a tail mark. The study was conducted in accordance with the recommendations of the I.A.S.P. Research and Ethics Committee. (1983) and European Guidelines 2010/63/UE.

Чувствительность толстой кишки индуцировали путем хирургического введения тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS, 50 мг/кг) за 7 дней до тестирования поведения. Животных подвергали операции натощак (24 ч). Вкратце, под анестезией (ацепромазин 5 мг/кг/кетамин 30 мг/кг) выполняли инъекцию TNBS (50 мг/кг, 1 мл/кг) в проксимальную часть толстой кишки (в 1 см от слепой кишки). После операции животных возвращали в их клетки в регулируемой среде и кормили без ограничения до даты тестирования через 7 дней. Наивных животных (крыс, не подвергавшихся операции) размещали в тех же условиях.Colon sensitivity was induced by surgical administration of trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS, 50 mg/kg) 7 days prior to behavior testing. The animals were operated on an empty stomach (24 h). Briefly, under anesthesia (acepromazine 5 mg/kg/ketamine 30 mg/kg), TNBS (50 mg/kg, 1 ml/kg) was injected into the proximal colon (1 cm from the caecum). Postoperatively, animals were returned to their cages in a controlled environment and fed ad libitum until the test date 7 days later. Naive animals (rats not subjected to surgery) were placed under the same conditions.

Животным внутривенно вводили антитело Ab2 против CGRP или антитело отрицательного контроля (и то, и другое в дозе 10 мг/кг) за 24 ч до определения порога толстой кишки. В данное исследование включили три группы крыс.Animals were injected intravenously with anti-CGRP Ab2 antibody or negative control antibody (both at 10 mg/kg) 24 h prior to colonic threshold determination. This study included three groups of rats.

Группа 1. Наивная группа, состоявшая из животных, не подвергавшихся операции или обработке TNBS в день -7 и получавших контрольное антитело за 24 ч (т.е. в день -1) до тестирования (т.е. измереGroup 1. A naive group consisting of animals that did not undergo surgery or TNBS treatment on day -7 and received a control antibody 24 hours (i.e., day -1) before testing (i.e., measuring

--

Claims (65)

ния порога растяжения толстой кишки в день 0) (n=7).colonic distension threshold on day 0) (n=7). Группа 2. Группа TNBS, состоявшая из животных, подвергавшихся операции в день -7 и получавших контрольное антитело за 24 ч (т.е. в день -1) до тестирования (т.е. измерения порога растяжения толстой кишки в день 0) (n=8).Group 2: TNBS group consisting of animals undergoing surgery on day -7 and treated with a control antibody 24 h (i.e., day -1) prior to testing (i.e., measurement of colonic distension threshold on day 0) ( n=8). Группа 3. Обработанная группа, состоявшая из животных, подвергавшихся операции в день -7 и получавших Ab2 за 24 ч (т.е. в день -1) до дня тестирования (т.е. измерения порога растяжения толстой кишки в день 0) (n=8).Group 3. Treatment group consisting of animals undergoing surgery on day -7 and treated with Ab2 24 h (i.e., day -1) prior to the day of testing (i.e., measurement of colonic distension threshold on day 0) ( n=8). Через семь дней (день 7) после инъекции TNBS чувствительность толстой кишки оценивали путем измерения давления внутри толстой кишки, необходимого для вызывания поведенческой реакции при растяжении толстой кишки вследствие раздувания баллона, введенного в толстую кишку. Тесты проводил экспериментатор, не имеющий информации о составе групп. Указанная реакция характеризуется подниманием задней части тела животных и четко видимым сжатием брюха, соответствующим сильным сокращениям (Al Chaer et al., Gastroenterology 2000, 119:1276-1285) и использовалась в качестве маркера боли (Bourdu et al., Gastroenterology, 2005:128, 1996-2008). Баллон (5 см) вводили ректально минимально инвазивным образом на 10 см от ануса натощак (24 ч) бодрствующим животным, а катетер приклеивали к основанию хвоста. Затем крыс помещали в середину коробки из плексигласа и присоединяли катетер к электронному баростату. После 30 мин периода акклиматизации со вставленным баллоном давление в толстой кишке постепенно повышали от 5 до 75 мм ртутного столба (отсечка) на 5 мм рт.ст. каждые 30 с до проявления болевого поведения. Выполняли четыре определения, через 30, 50, 70 и 90 мин после введения баллона.Seven days (Day 7) after TNBS injection, colonic sensitivity was assessed by measuring intracolonic pressure required to elicit a behavioral response to colonic distension due to inflation of the balloon inserted into the colon. The tests were carried out by an experimenter who had no information about the composition of the groups. This response is characterized by a lifting of the back of the animal's body and a clearly visible contraction of the abdomen corresponding to strong contractions (Al Chaer et al., Gastroenterology 2000, 119:1276-1285) and has been used as a pain marker (Bourdu et al., Gastroenterology, 2005:128 , 1996-2008). The balloon (5 cm) was administered rectally in a minimally invasive manner 10 cm from the anus on an empty stomach (24 h) to awake animals, and the catheter was glued to the base of the tail. The rats were then placed in the middle of a plexiglass box and the catheter was attached to an electronic barostat. After a 30 min acclimatization period with the balloon inserted, colonic pressure was gradually increased from 5 to 75 mmHg (cut-off) by 5 mmHg. every 30 s until the onset of pain behavior. Four determinations were made, 30, 50, 70, and 90 minutes after balloon insertion. Используя данные по каждому тестированию, рассчитывали процентную активность по отношению к гиперчувствительности толстой кишки, индуцированной введением TNBS в толстую кишку, следующим образом . . Порог растяжения_{Об ботка}-Порог растяжения _TNBS (Процент активности) =-------------------------------------------х100 обработка Порог растяжения _Наие - Порог растяжения _TNBS Using the data from each test, the percent activity relative to colonic hypersensitivity induced by colonic administration of TNBS was calculated as follows. . _Stretch Threshold Treatment - Stretch Threshold _TNBS (Percent Activity) =------------------------------- ------x100 processing Stretch Threshold _Naie - Stretch Threshold _TNBS Порог растяжения_Об_раб_отка является среднеарифметическим значением для обработанной группы; порог растяжения _TNBS является среднеарифметическим значением для группы TNBS, а порог растяжения_Наив является среднеарифметическим значением для наивной группы.The _elongation threshold _{for retract processing} is the arithmetic mean of the processed group; _{the TNBS} stretch threshold is the arithmetic mean of the TNBS group, and the _Naive stretch threshold is the arithmetic mean of the naive group. Результаты.Results. Способность антитела против CGRP облегчать висцеральную боль тестировали в модели крысы, у которой индуцировали хроническую гиперчувствительность толстой кишки введением TNBS. Висцеральную боль количественно оценивали, измеряя порог растяжения толстой кишки, т.е. внутрибрюшное давление, которое животные могли терпеть, не демонстрируя поведенческой реакции (сокращения мышц). Более высокие значения порога растяжения толстой кишки указывали на меньшую чувствительность. Как и ожидалось, обработка TNBS приводила к значительно сниженному порогу растяжения толстой кишки по сравнению с наивными животными (фиг. 46, сравнение среднего столбика (обработка TNBS) и левого столбика (наивные)). Введение Ab2 улучшало порог растяжения толстой кишки по сравнению с контрольными животными (фиг. 46, сравнение правого столбика (обработка Ab2) и среднего столбика (контроль)). Улучшение при введении Ab2 было статистически значимым (р<0,05 согласно tкритерию Стьюдента по сравнению с TNBS + группой отрицательного контроля). Рассчитанная активность Ab2 против гиперчувствительности составила 27% (что указывает на степень облегчения TNBSиндуцированной гиперчувствительности).The ability of an anti-CGRP antibody to alleviate visceral pain was tested in a rat model in which chronic colonic hypersensitivity was induced by TNBS administration. Visceral pain was quantified by measuring the colonic distension threshold, ie. intra-abdominal pressure that animals could tolerate without showing a behavioral response (muscle contraction). Higher colonic distension threshold values indicated less sensitivity. As expected, TNBS treatment resulted in a significantly reduced colonic distension threshold compared to naive animals (FIG. 46, comparison of middle bar (TNBS treatment) and left bar (naive)). Ab2 administration improved colonic distension threshold compared to control animals (FIG. 46, comparison of right bar (Ab2 treatment) and middle bar (control)). The improvement with the introduction of Ab2 was statistically significant (p<0.05 according to Student's t-test compared with TNBS + negative control group). The calculated activity of Ab2 against hypersensitivity was 27% (indicating the degree of relief of TNBS-induced hypersensitivity). Данные результаты показывают, что антитела против CGRP можно применять для предотвращения или облегчения висцеральной боли.These results indicate that anti-CGRP antibodies can be used to prevent or alleviate visceral pain. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела, содержащие (i) вариабельный полипептид легкой (VL) цепи, содержащий CDR1 VL SEQ ID NO: 25, CDR2 VL SEQ ID NO: 26, CDR3 VL SEQ ID NO: 27; и вариабельный полипептид тяжелой (VH) цепи, содержащий CDR1 VH SEQ ID NO: 28, CDR2 VH SEQ ID NO: 29 и CDR3 VH SEQ ID NO: 30.1. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment comprising (i) a light (VL) chain variable polypeptide comprising CDR1 VL SEQ ID NO: 25, CDR2 VL SEQ ID NO: 26, CDR3 VL SEQ ID NO: 27; and a heavy (VH) chain variable polypeptide comprising CDR1 VH SEQ ID NO: 28, CDR2 VH SEQ ID NO: 29, and CDR3 VH SEQ ID NO: 30. 2. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по п.1, которые содержат полипептид вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 21 и полипептид вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 23.2. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claim 1, which comprises a light chain variable region polypeptide of SEQ ID NO: 21 and a heavy chain variable region polypeptide of SEQ ID NO: 23. 3. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по п.1, которые включают полипептид легкой цепи SEQ ID NO: 22 и полипептид тяжелой цепи SEQ ID NO: 24.3. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claim 1, which comprises a light chain polypeptide of SEQ ID NO: 22 and a heavy chain polypeptide of SEQ ID NO: 24. 4. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по п.1 или 2, где указанное антитело представляет собой моновалентное антитело.4. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claim 1 or 2, wherein said antibody is a monovalent antibody. 5. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по пп.1, 2 или 4, где указанный фрагмент выбран из фрагмента Fab, фрагмента Fab' и фрагмента F(ab')₂.5. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claim 1, 2 or 4, wherein said fragment is selected from a Fab fragment, a Fab' fragment and a F(ab') _{2 fragment} . 6. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по пп.1-4 или 5, который (i) агликозилирован или (ii) гликозилирован, при условии, что, если указанное антитело или фрагмент гликози6. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claims 1 to 4 or 5 which is (i) aglycosylated or (ii) glycosylated, provided that if said antibody or glycosy fragment - 40 040241 лированы, они будут содержать только остатки маннозы.- 40 040241 are lylated, they will only contain mannose residues. 7. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по пп.1-4 или 5, которые не являются Nгликозилированными.7. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claims 1 to 4 or 5 that is not N-glycosylated. 8. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по пп.1-4 или 5, которые содержат область Fc, которая была модифицирована для изменения эффекторной функции, периода полужизни, протеолиза и/или гликозилирования.8. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claims 1-4 or 5, which contains an Fc region that has been modified to alter effector function, half-life, proteolysis and/or glycosylation. 9. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по пп.1-4 или 5, который представляет собой гуманизированное, одноцепочечное или химерное антитело.9. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claims 1 to 4 or 5, which is a humanized, single chain or chimeric antibody. 10. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по пп.1-4 или 5, которые специфически связываются с клетками человека, экспрессирующими CGRP и/или с циркулирующими растворимыми молекулами CGRP in vivo.10. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claims 1 to 4 or 5, which specifically binds to human cells expressing CGRP and/or to circulating soluble CGRP molecules in vivo. 11. Антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по п.10, которые специфически связываются с CGRP, экспрессируемым на клетках человека или клетками человека у пациента с заболеванием, расстройством, состоянием или симптомом, связанным с клетками, которые связывают CGRP.11. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claim 10 that specifically binds to CGRP expressed on human cells or human cells in a patient with a disease, disorder, condition or symptom associated with cells that bind CGRP. 12. Антитело против CGRP человека или его фрагмент по п.11, где заболевание, расстройство, состояние или симптом представляет собой мигрень.12. An anti-human CGRP antibody or fragment thereof according to claim 11, wherein the disease, disorder, condition, or symptom is migraine. 13. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.11, где заболевание, расстройство, состояние или симптом представляет собой мигрень с аурой или без нее.13. The anti-human CGRP antibody or antibody fragment of claim 11, wherein the disease, disorder, condition, or symptom is migraine with or without aura. 14. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.11, где заболевание, расстройство, состояние или симптом представляет собой хроническую мигрень, частые эпизодические мигрени или менструальные мигрени.14. The anti-human CGRP antibody or antibody fragment of claim 11, wherein the disease, disorder, condition, or symptom is chronic migraine, frequent episodic migraine, or menstrual migraine. 15. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.11, где заболевание, расстройство, состояние или симптом представляет собой кластерную головную боль.15. The anti-human CGRP antibody or antibody fragment of claim 11, wherein the disease, disorder, condition, or symptom is cluster headache. 16. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.1, который прямо или опосредовано присоединен к детектируемой метке или терапевтическому агенту.16. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claim 1, which is directly or indirectly attached to a detectable label or therapeutic agent. 17. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.1, где указанный фрагмент антитела представляет собой scFv, верблюжье тело, нанотело или IgNAR (одноцепочечное антитело, полученное от акулы).17. The anti-human CGRP antibody or antibody fragment of claim 1, wherein said antibody fragment is scFv, camel body, nanobody, or IgNAR (single chain antibody derived from shark). 18. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.1 или 2, которые содержат константный домен человеческого антитела.18. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claim 1 or 2, which contains the constant domain of a human antibody. 19. Фрагмент антитела против CGRP человека по п.18, где константный домен человеческого антитела представляет собой константный домен человеческого антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.19. An anti-human CGRP antibody fragment according to claim 18, wherein the human antibody constant domain is the constant domain of a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibody. 20. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.18, где Fc-область представляет собой IgG1, который содержит мутацию, которая изменяет или устраняет гликозилирование.20. The anti-human CGRP antibody or antibody fragment of claim 18, wherein the Fc region is an IgG1 that contains a mutation that alters or abolishes glycosylation. 21. Антитело против CGRP или фрагмент антитела по любому из пп.1,2,3,4 или 5, которые содержатся в конъюгате, содержащем детектируемый фрагмент или цитотоксический фрагмент.21. An anti-CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1,2,3,4 or 5 which is contained in a conjugate containing a detectable fragment or a cytotoxic fragment. 22. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.21, где указанный детектируемый фрагмент представляет собой флуоресцентный краситель, фермент, субстрат, биолюминесцентный материал, радиоактивный материал или хемилюминесцентный материал.22. The anti-human CGRP antibody or antibody fragment of claim 21, wherein said detectable fragment is a fluorescent dye, enzyme, substrate, bioluminescent material, radioactive material, or chemiluminescent material. 23. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по п.21, где указанный цитотоксический фрагмент представляет собой цитотоксин, цитотоксический агент или радиоактивный материал.23. The anti-human CGRP antibody or antibody fragment of claim 21, wherein said cytotoxic fragment is a cytotoxin, cytotoxic agent, or radioactive material. 24. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по любому из пп.1-4 или 5, которые экспрессируются в Pichia pastoris.24. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1 to 4 or 5 which is expressed in Pichia pastoris. 25. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по любому из пп.1-4 или 5, которые экспрессируются в клетках СНО.25. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1 to 4 or 5 which is expressed in CHO cells. 26. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по любому из пп.1-5, где указанное антитело ингибирует ассоциацию CGRP с CGRP-R и/или его мультимерами и/или противодействует биологическим эффектам CGRP.26. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1 to 5, wherein said antibody inhibits the association of CGRP with CGRP-R and/or its multimers and/or counteracts the biological effects of CGRP. 27. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по любому из пп.1-5, где связывание указанного антитела с CGRP характеризуется скоростью диссоциации (Koff), меньшей или равной 10’⁴ S’¹, 5x10’5 S’¹, 10^-5 S’¹, 5x10’6 S’¹, 10’6 S’¹, 5х10’⁷ S’¹ или 10’⁷ S’¹.27. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1 to 5, wherein the binding of said antibody to CGRP is characterized by a dissociation rate (Koff) less than or equal to 10' ⁴ S' ¹ , 5x10'5 S' ¹ , 10 ^{- 5} S' ¹ , 5x10'6 S' ¹ , 10'6 S' ¹ , 5x10' ⁷ S' ¹ or 10' ⁷ S' ¹ . 28. Антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по пп.1-4 или 5, где указанное антитело ингибирует продукцию комплекса CGRP с CGRP-R и/или его мультимерами.28. An anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claims 1 to 4 or 5, wherein said antibody inhibits the production of a complex of CGRP with CGRP-R and/or its multimers. 29. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество антитела против CGRP человека или фрагмента антитела по любому из пп.1-28.29. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of an anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1-28. 30. Фармацевтическая композиция по п.29, которая подходит для инъекций.30. A pharmaceutical composition according to claim 29 which is suitable for injection. 31. Фармацевтическая композиция по п.29, которая дополнительно содержит по меньшей мере один стабилизатор.31. The pharmaceutical composition of claim 29, which further comprises at least one stabilizer. 32. Фармацевтическая композиция по п.29, которая является лиофилизированной.32. Pharmaceutical composition according to claim 29, which is lyophilized. 33. Нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело против человеческого CGRP или фрагмент антитела по любому из пп.1-28.33. A nucleic acid that encodes an anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1-28. 34. Нуклеиновая кислота по п.33, которая состоит из предпочтительных кодонов дрожжей или 34. Nucleic acid according to claim 33, which consists of the preferred codons of yeast or - 41 040241 человека.- 41 040241 people. 35. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.33.35. An expression vector containing the nucleic acid according to claim 33. 36. Экспрессионный вектор по п.35, который представляет собой плазмиду или рекомбинантный вирусный вектор.36. The expression vector according to claim 35, which is a plasmid or a recombinant viral vector. 37. Рекомбинантная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело против CGRP человека или фрагмент антитела по любому из пп.1-28.37. A recombinant cell containing a nucleic acid that encodes an anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1-28. 38. Клетка по п.37, которая выбрана из клетки млекопитающих, дрожжей, бактерий, грибов и насекомых.38. A cell according to claim 37, which is selected from mammalian, yeast, bacteria, fungal and insect cells. 39. Клетка по п.38, которая представляет собой дрожжевую клетку.39. The cell according to claim 38, which is a yeast cell. 40. Клетка по п.39, которая представляет собой диплоидную дрожжевую клетку.40. A cell according to claim 39, which is a diploid yeast cell. 41. Дрожжевая клетка по п.39, которая представляет собой дрожжи Pichia.41. A yeast cell according to claim 39, which is Pichia yeast. 42. Способ лечения заболевания, расстройства, состояния или симптома, связанного с клетками, которые экспрессируют CGRP, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против человеческого CGRP или фрагмента антитела по любому из пп.1-5.42. A method of treating a disease, disorder, condition, or symptom associated with cells that express CGRP, comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of an anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to any one of claims 1-5. 43. Способ по п.42, в котором заболевание, расстройство, состояние или симптом, ассоциированный с клетками, которые экспрессируют CGRP, характеризуется повышенным CGRP, связанным с вазодилатацией, и выбирается из мигрени (с аурой или без), состояния с CGRP-ассоциированной болью, потери веса, рака, опухолей, гиперактивного мочевого пузыря, недержания мочи, зуда, псориаза, язвы, сердечного заболевания, ангиогенеза, связанного с раком, ангиогенеза, связанного с ростом опухоли или устойчивостью опухоли, мигреней, хронических мигреней, частых эпизодических мигреней, менструальных мигреней, гемиплегических мигреней, кластерных головных болей, мигренозной невралгии, хронических головных болей, головных болей напряжения, общих головных болей, приливов, хронической пароксизмальной гемикрании, вторичных головных болей на основе структурной проблемы в голове или шее, черепной невралгии, синусовых головных болей, включая синусовые головные боли, связанные с синуситом, аллергических головных болей, аллергической мигрени, боль, ВНЧС (височнонижнечелюстного заболевания суставов), воспалительной боли, висцеральной боли, боли после разреза, комплексного регионарного болевого синдрома, раковой боли, боли при первичном или метастатическом раке кости, боли при переломе, остеопоротической боли при переломе, боли в результате ожога, остеопороза, боли в суставах при подагре, боли, связанной с серповидно-клеточными кризами, боли, связанной с гепатоцеллюлярной карциномой, боли, связанной с раком молочной железы, боли, связанной с циррозом печени, нейрогенной боли, невропатической боли, ноцицептивной боли, невралгии тройничного нерва, постгерпетической невралгии, фантомной боли в конечностях, фибромиалгии, менструальной боли, овариалгии, рефлекторной симпатической дистрофии, нейрогенной боли, остеоартрита или ревматоидного артрита, боли в пояснице, диабетической невропатии, ишиаса или висцеральной боли, связанной с гастроэзофагеальным рефлюксом, диспепсии, синдрома раздраженного кишечника, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, илеита, язвенного колита, почечной колики, дисменореи, цистита, менструального периода, родов, менопаузы, простатита и панкреатита.43. The method of claim 42, wherein the disease, disorder, condition, or symptom associated with cells that express CGRP is characterized by elevated CGRP associated with vasodilation and is selected from migraine (with or without aura), a CGRP-associated condition pain, weight loss, cancer, tumors, overactive bladder, urinary incontinence, pruritus, psoriasis, ulcers, heart disease, angiogenesis associated with cancer, angiogenesis associated with tumor growth or tumor resistance, migraines, chronic migraines, frequent episodic migraines, menstrual migraines, hemiplegic migraines, cluster headaches, migraine neuralgia, chronic headaches, tension headaches, general headaches, hot flashes, chronic paroxysmal hemicrania, secondary headaches based on a structural problem in the head or neck, cranial neuralgia, sinus headaches, including sinus headaches associated with sinusitis, allergic headaches, allergic migraine, pain, TMJ (temporomandibular joint disease), inflammatory pain, visceral pain, incision pain, complex regional pain syndrome, cancer pain, pain from primary or metastatic bone cancer, fracture pain, osteoporotic fracture pain, pain resulting from burns, osteoporosis, gout joint pain, pain associated with sickle cell crises, pain associated with hepatocellular carcinoma, pain associated with breast cancer, pain associated with liver cirrhosis, neurogenic pain, neuropathic pain, nociceptive pain, trigeminal neuralgia, postherpetic neuralgia, phantom limb pain, fibromyalgia, menstrual pain, ovariangia, reflex sympathetic dystrophy, neurogenic pain, osteoarthritis or rheumatoid arthritis, low back pain, diabetic neuropathy, sciatica or visceral pain associated with gastroesophageal reflux, dyspepsia, irritable bowel syndrome, in inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ileitis, ulcerative colitis, renal colic, dysmenorrhea, cystitis, menstruation, childbirth, menopause, prostatitis and pancreatitis. 44. Способ по п.42, где заболевание, расстройство, состояние или симптом, связанные с клетками, которые экспрессируют CGRP, характеризуются повышенным CGRP, связанным с вазодилатацией, и выбирают из гиперактивного мочевого пузыря, недержания мочи, боли, хронической боли, нейрогенного воспаления и воспалительной боли, невропатической боли, глазной боли, зубной боли, послеоперационной боли, связанной с травмой боли, диабета, инсулиннезависимого сахарного диабета и других воспалительных аутоиммунных расстройств, сосудистых расстройств, воспаления, артрита, гиперреактивности бронхов, астмы, шока, сепсиса, синдрома отмены опиатов, резистентности к морфину, приливов у мужчин и женщин, аллергического дерматита, псориаза, энцефалита, травмы головного мозга, эпилепсии, нейродегенеративных заболеваний, кожных заболеваний, включая зуд, нейрогенного покраснения кожи, розацеа кожи, эритемы, воспалительного заболевания кишечника, синдрома раздраженного кишечника, цистита и дисменореи.44. The method of claim 42, wherein the disease, disorder, condition, or symptom associated with cells that express CGRP is characterized by increased CGRP associated with vasodilation and is selected from overactive bladder, urinary incontinence, pain, chronic pain, neurogenic inflammation and inflammatory pain, neuropathic pain, ocular pain, toothache, postoperative pain, trauma-related pain, diabetes, non-insulin dependent diabetes mellitus and other inflammatory autoimmune disorders, vascular disorders, inflammation, arthritis, bronchial hyperreactivity, asthma, shock, sepsis, withdrawal syndrome opiates, morphine resistance, hot flashes in men and women, allergic dermatitis, psoriasis, encephalitis, brain injury, epilepsy, neurodegenerative diseases, skin diseases including pruritus, neurogenic erythema, skin rosacea, erythema, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome , cystitis and dysmenorrhea. 45. Способ по п.42, в котором заболевание, расстройство, состояние или симптом, ассоциированный с клетками, которые экспрессируют CGRP, характеризуется повышенным CGRP, связанным с вазодилатацией, и выбирается из боли, гиперактивного мочевого пузыря, недержания мочи, головной боли и мигрени.45. The method of claim 42, wherein the disease, disorder, condition, or symptom associated with cells that express CGRP is characterized by elevated CGRP associated with vasodilation and is selected from pain, overactive bladder, urinary incontinence, headache, and migraine . 46. Способ по п.42, в котором лечение дополнительно включает введение другого терапевтического агента, выбранного из антигистаминных, противовоспалительных агентов, анальгетиков и антибиотиков.46. The method of claim 42, wherein the treatment further comprises administering another therapeutic agent selected from antihistamines, anti-inflammatory agents, analgesics, and antibiotics. 47. Способ по п.46, в котором анальгетик представляет собой НПВП, опиоидный анальгетик или антитело.47. The method of claim 46, wherein the analgesic is an NSAID, an opioid analgesic, or an antibody. 48. Способ по п.47, в котором анальгетик представляет собой опиоид, и способ используется для снижения или предотвращения толерантности к опиоиду.48. The method of claim 47 wherein the analgesic is an opioid and the method is used to reduce or prevent tolerance to the opioid. 49. Способ по п.48, в котором опиоид представляет собой морфин или производное морфина.49. The method of claim 48 wherein the opioid is morphine or a morphine derivative. 50. Способ по п.46, где другим анальгетиком является антитело к NGF (фактор роста нервов).50. The method of claim 46, wherein the other analgesic is an anti-NGF (nerve growth factor) antibody. 51. Способ по п.42, отличающийся тем, что антитело против CGRP человека или фрагмент антитела вводят в терапевтическом режиме для лечения конкретного заболевания или состояния, связанного с бо51. The method of claim 42, wherein the anti-human CGRP antibody or antibody fragment is administered in a therapeutic regimen to treat a specific disease or condition associated with human - 42 040241 лью, который включает введение другого терапевтического агента.- 42 040241 pour, which includes the introduction of another therapeutic agent. 52. Способ по п.51, в котором другое терапевтическое средство представляет собой анальгетик.52. The method of claim 51 wherein the other therapeutic agent is an analgesic. 53. Способ по п. 52, где другой анальгетик представляет собой НПВП, опиоидный анальгетик или антитело.53. The method of claim 52, wherein the other analgesic is an NSAID, an opioid analgesic, or an antibody. 54. Способ по п.53, где НПВП содержит ингибитор циклооксигеназы 1 и/или циклооксигеназы 2.54. The method of claim 53 wherein the NSAID contains an inhibitor of cyclooxygenase 1 and/or cyclooxygenase 2. 55. Способ по п.54, где НПВС выбирают из (1) производных пропионовой кислоты, включая ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производных уксусной кислоты, включая толметин и сулиндак; (3) производных фенамовой кислоты, включая мефенамовую кислоту и меклофенамовую кислоту; (4) производных бифенилкарбоновой кислоты, включая дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамов, включая пироксим, судоксикам и изоксикам.55. The method according to item 54, where NSAIDs are selected from (1) derivatives of propionic acid, including ibuprofen, naproxen, naprosin, diclofenac and ketoprofen; (2) acetic acid derivatives, including tolmetin and sulindac; (3) fenamic acid derivatives including mefenamic acid and meclofenamic acid; (4) biphenylcarboxylic acid derivatives including diflunisal and flufenisal; and (5) oxicams, including piroxime, sudoxcam, and isoxicam. 56. Способ по п.52, где другой анальгетик представляет собой фенантрен, фенилгептиламин, фенилпиперидин, морфинан или соединение бензоморфана.56. The method of claim 52, wherein the other analgesic is phenanthrene, phenylheptylamine, phenylpiperidine, morphinan, or a benzomorphan compound. 57. Способ по п.52, отличающийся тем, что другой анальгетик представляет собой опиоидный анальгетик, выбранный из кодеина, дигидрокодеина, диацетилморфина, гидрокодона, гидроморфона, леворфанола, оксиморфона, альфентанила, бупренорфина, буторфанола, фентанила, суфентанила, метадона, налбуфина, пропоксифена и пентазоцина, и их фармацевтически приемлемые соли.57. The method of claim 52, wherein the other analgesic is an opioid analgesic selected from codeine, dihydrocodeine, diacetylmorphine, hydrocodone, hydromorphone, levorphanol, oxymorphone, alfentanil, buprenorphine, butorphanol, fentanyl, sufentanil, methadone, nalbuphine, propoxyphene and pentazocine, and their pharmaceutically acceptable salts. 58. Способ получения антитела против CGRP человека или фрагмента антитела по пп.1-4 или 5 в дрожжевой культуре, состоящей из диплоидных дрожжевых клеток, которые секретируют в культуральную среду по меньшей мере 10-25 мг/л указанного антитела или фрагмента антитела, включающий:58. A method for producing an anti-human CGRP antibody or antibody fragment according to claims 1-4 or 5 in a yeast culture consisting of diploid yeast cells that secrete at least 10-25 mg/l of the indicated antibody or antibody fragment into the culture medium, comprising : a) введение по меньшей мере одного экспрессионного вектора, содержащего один или несколько гетерологичных полинуклеотидов, кодирующих указанное антитело, функционально связанных с промотором и сигнальной последовательностью, в гаплоидные клетки дрожжей;a) introducing at least one expression vector containing one or more heterologous polynucleotides encoding said antibody, operably linked to a promoter and a signal sequence, into haploid yeast cells; b) получение диплоидных дрожжевых клеток из указанных гаплоидных дрожжевых клеток путем спаривания или слияния сферопластов;b) obtaining diploid yeast cells from said haploid yeast cells by mating or fusion of spheroplasts; c) отбор диплоидных дрожжевых клеток, которые секретируют указанное антитело или фрагмент антитела в культуральную среду;c) selecting diploid yeast cells that secrete said antibody or antibody fragment into the culture medium; d) получение стабильных диплоидных дрожжевых культур из указанных диплоидных дрожжевых клеток со стадии (с); а такжеd) obtaining stable diploid yeast cultures from said diploid yeast cells from step (c); and e) выделение указанного антитела или фрагмента антитела из стабильных диплоидных дрожжевых культур со стадии (d).e) isolating said antibody or antibody fragment from stable diploid yeast cultures from step (d). 59. Способ по п.58, в котором указанный род дрожжей представляет собой Pichia.59. The method of claim 58 wherein said yeast genus is Pichia. 60. Способ по п.59, в котором вид Pichia выбран из Pichia pastoris, Pichia methanolica и Hansenula polymorpha (Pichia angusta).60. The method of claim 59 wherein the Pichia species is selected from Pichia pastoris, Pichia methanolica and Hansenula polymorpha (Pichia angusta). 61. Способ по п.59, в котором вид Pichia представляет собой Pichia pastoris.61. The method of claim 59 wherein the Pichia species is Pichia pastoris. 62. Выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую V_H антитела, по п. 1 или 2, где аминокислотная последовательность VH представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.62. An isolated polynucleotide containing an antibody V _H coding sequence according to claim 1 or 2, wherein the VH amino acid sequence is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. 63. Клетка-хозяин, которая содержит и экспрессирует полинуклеотид по 62.63. A host cell that contains and expresses a polynucleotide at 62. 64. Клетка-хозяин по п.63, которая дополнительно содержит и экспрессирует полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 V_L антитела.64. The host cell of claim 63, which further comprises and expresses a polynucleotide comprising a sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 V _L of the antibody. 65. Выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность VL антитела по п.1 или 2, где указанная аминокислотная последовательность VL является аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21.65. An isolated polynucleotide comprising a sequence encoding the VL amino acid sequence of an antibody according to claim 1 or 2, wherein said VL amino acid sequence is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. --