EA040195B1 - ENHANCED TRANSPORT OF THERAPEUTIC MOLECULES THROUGH THE HEMATOENCEPHALIC BARRIER - Google Patents

Description

Уровень техникиState of the art

Распределение макромолекул по всему организму в целом опосредовано диффузией, причем макромолекулы, содержащиеся в крови, диффундируют в ткани через эндотелиальные клетки, содержащие высокое количество отверстий, выстилающие капиллярную сосудистую сеть. В высоко васкуляризированном головном мозге не происходит свободная диффузия макромолекул. В эндотелиальных клетках капилляров головного мозга отсутствуют отверстия, наблюдаемые у клеток остальной части кровеносной системы, и они имеют плотные межклеточные контакты, характерные для высокоспециализированных эндотелиальных клеток. Эти плотные контакты предназначены для предотвращения свободной диффузии молекул, больших чем 400 кДа, от люминальной к аблюминальной поверхности капилляра. В дополнение к этому, капилляры содержат различные транспортные системы, такие как транспортеры органических анионов (OATS) и системы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), которые активно устанавливают градиенты для транспортировки молекул, которые иначе могут диффундировать через эндотелиальные клетки. Комбинация ограничительных барьеров предотвращает поступление занесенных агентов, включая, например, токсины и вирусы, а также ограничивает диффузию терапевтических соединений. В дополнение к этому эти ограничительные гематоэнцефалические барьеры (ГЭБ) эффективно блокируют пассивную доставку потенциально терапевтических белков, пептидов и небольших молекул в паренхиму головного мозга в фармакологически терапевтических дозах.The distribution of macromolecules throughout the body as a whole is mediated by diffusion, with macromolecules contained in the blood diffusing into tissues through endothelial cells containing a high number of holes lining the capillary vasculature. In a highly vascularized brain, there is no free diffusion of macromolecules. Endothelial cells in brain capillaries lack the openings seen in cells in the rest of the circulatory system and have tight intercellular junctions characteristic of highly specialized endothelial cells. These tight junctions are designed to prevent free diffusion of molecules larger than 400 kDa from the luminal to abluminal surface of the capillary. In addition, capillaries contain various transport systems such as organic anion transporters (OATS) and multidrug resistance systems (MDR) that actively establish gradients to transport molecules that might otherwise diffuse through endothelial cells. The combination of restrictive barriers prevents the entry of introduced agents, including, for example, toxins and viruses, and also limits the diffusion of therapeutic compounds. In addition, these restrictive blood-brain barriers (BBBs) effectively block the passive delivery of potentially therapeutic proteins, peptides, and small molecules to the brain parenchyma at pharmacologically therapeutic doses.

Одна из успешных стратегий для обеспечения транспорта терапевтических молекул через эндотелиальные клетки ГЭБ заключалась в том, чтобы воспользоваться преимуществами рецепторопосредованного трансцитоза (RMT). В этой стратегии используются антитела или молекулы, которые связываются специфически с белками на эндотелиальных клетках ГЭБ, которые, как правило, вовлечены в транспорт молекул через эндотелиальные клетки ГЭБ. Такие антитела используются в качестве молекул-переносчиков для доставки соединенных с ними грузов, в то время как они подвергаются трансцитозу через эндотелиальные клетки ГЭБ. Примеры применений этой технологии включают использование антител к трансферриновому рецептору и инсулиновым рецепторам (Yu et al., 2011, Science Translational Medicine, vol. 3). В этих двух случаях производили слияние RMT-антител на С-конце с доменами терапевтических белков и было показано, что они транспортируют молекулы через ГЭБ. К сожалению, широко используемые RMT-мишени - трансферриновые и инсулиновые рецепторы - в высокой степени и широко экспрессированы в многочисленных тканях. Эта широкая направленная экспрессия приводит к короткому периоду полувыведения из крови, что в свою очередь ограничивает время воздействия на эндотелиальные клетки ГЭБ и вследствие этого дозированное поступление молекулы в головной мозг. В дополнение к этому, эти антитела затрагивают особо важные для метаболизма функции клеток, вследствие этого создавая потенциальную угрозу безопасности.One successful strategy to ensure transport of therapeutic molecules across BBB endothelial cells has been to take advantage of receptor-mediated transcytosis (RMT). This strategy uses antibodies or molecules that bind specifically to proteins on BBB endothelial cells that are typically involved in the transport of molecules across BBB endothelial cells. Such antibodies are used as carrier molecules to deliver their associated cargoes while they undergo transcytosis through BBB endothelial cells. Examples of applications of this technology include the use of antibodies to the transferrin receptor and insulin receptors (Yu et al., 2011, Science Translational Medicine, vol. 3). In these two cases, RMT antibodies were fused at the C-terminus to therapeutic protein domains and were shown to transport molecules across the BBB. Unfortunately, the widely used RMT targets - transferrin and insulin receptors - are highly and widely expressed in numerous tissues. This broad targeted expression leads to a short half-life from the blood, which in turn limits the time of exposure to the endothelial cells of the BBB and, as a result, the dosed delivery of the molecule to the brain. In addition, these antibodies affect cell functions that are critical for metabolism, thereby creating a potential safety hazard.

Направляющие фрагменты с улучшенными свойствами, в которых используются молекулы, участвующие в активном транспорте через ГЭБ, для пересечения ГЭБ, например сайты связывания, полученные из молекул антител, которые проникают через ГЭБ, были бы очень полезными для доставки терапевтических средств в головной мозг.Enhanced targeting moieties that use molecules involved in active transport across the BBB to cross the BBB, such as binding sites derived from antibodies that cross the BBB, would be very useful for delivering therapeutic agents to the brain.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того факта, что слитый белок, содержащий антитело, проникающее через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), например аТМЕМ30А (CDC-50A)-связывающее антитело (такое как, например, однодоменное антитело FC5), как было обнаружено, значительно усиливает транспорт через ГЭБ по сравнению с моновалентным VHH. Первоначальные экспериментальные исследования по связыванию и транспорту через эндотелиальные клетки ГЭБ показали, что FC5, однодоменное VHH антитело ламы (sdAb), может облегчать транспорт через слой эндотелиальных клеток ГЭБ (см., например, патент США 7943129). Период полувыведения VHH из крови, как известно, является кратким из-за низкого молекулярного веса и отсутствия Fc-домена (Jain, M., Kamal, N., Batra, S.K. (2007), Trends in biotechnology 25(7), 307-316; Batra, S.K., Jain, M., Wittel, U.A., Chauhan, S.C., Colcher, D. (2002), Current opinion in biotechnology 13(6), 603-608). На удивление период полувыведения из крови этого конструкта значительно увеличили за счет слияния однодоменного антитела, проникающего через ГЭБ, с N-концом человеческого Fc, что приводило к образованию конструкта, наподобие бивалентного антитела. При встраивании такого сайта связывания в Fc-конструкт образуется бивалентная молекула с потенциалом к бивалентному связыванию, при этом каждый связывающий фрагмент связывается с предполагаемой мишенью, например TMEM30A, который экспрессируется на клеточной поверхности. Бивалентное связывание может привести к значительному изменению кажущейся аффинности связывания из-за эффекта авидности (Reynolds, J.A. (1979), Biochemistry 18(2), 264-269; Hubble, J. (1999), Molecular immunology 36(1), 13-18). Как продемонстрировано в данном документе, аффинность взаимодействия увеличивалась. Учитывая это увеличение аффинности, не ожидали обнаружить то, что присоединение Fc для образования бивалентной молекулы значительно увеличит транспорт через ГЭБ. Увеличение транспорта не ожидали потому что, хотя присоединение Fc-домена может продлить бета-фазу фармакокинетики в силу увеличения массы, что предотвращает почечную фильтрацию молекулы и способствует рециркуляции антитела in vivo за счет связывания с FcRn, дополнительное увеличение кажущейся аффинности могло также оказывать противоположныйThe present invention is based at least in part on the discovery that a fusion protein containing an antibody that crosses the blood-brain barrier (BBB), such as an aTMEM30A (CDC-50A)-binding antibody (such as, for example, a single-domain FC5 antibody), has been found to significantly enhance transport across the BBB compared to monovalent VHH. Initial experimental studies on binding and transport across BBB endothelial cells showed that FC5, a single domain llama VHH antibody (sdAb), can facilitate transport across the BBB endothelial cell layer (see, for example, US Pat. No. 7,943,129). The blood half-life of VHH is known to be short due to the low molecular weight and lack of an Fc domain (Jain, M., Kamal, N., Batra, S.K. (2007), Trends in biotechnology 25(7), 307- 316; Batra, S.K., Jain, M., Wittel, U.A., Chauhan, S.C., Colcher, D. (2002), Current opinion in biotechnology 13(6), 603-608). Surprisingly, the blood half-life of this construct was significantly increased by fusing the BBB-crossing single-domain antibody to the N-terminus of human Fc, resulting in a bivalent antibody-like construct. Inserting such a binding site into an Fc construct produces a bivalent molecule with bivalent binding potential, with each binding moiety binding to the intended target, eg TMEM30A, which is expressed on the cell surface. Bivalent binding can result in a significant change in apparent binding affinity due to the avidity effect (Reynolds, J.A. (1979), Biochemistry 18(2), 264-269; Hubble, J. (1999), Molecular immunology 36(1), 13- 18). As demonstrated in this document, the affinity of the interaction increased. Given this increase in affinity, it was not expected to find that the addition of Fc to form a bivalent molecule would significantly increase transport across the BBB. The increase in transport was not expected because although Fc domain attachment may prolong the beta phase of pharmacokinetics by virtue of an increase in mass, which prevents renal filtration of the molecule and promotes in vivo recycling of the antibody by binding to FcRn, an additional increase in apparent affinity could also have the opposite effect.

- 1 040195 эффект в силу выведения циркулирующих связывающих молекул после связывания с высоко экспрессированной мишенью. Однако к наибольшему удивлению, как продемонстрировано в данном документе, было обнаружено, что слитые белки в конформации сайт связывания-Fc (от амино- к карбоксильному концу, т.е. сайт связывания слит с N-концом Fc) имели более высокую активность, чем белки в конформации Fc-сайт связывания (сайт связывания слит с C-концом Fc). Эта соответствовало действительности, несмотря на то что слитые белки, состоящие из Fc-сайта связывания (сайт связывания слит с C-концом Fc), проявили более высокую степень связывания с эндотелиальными клетками в первоначальных экспериментальных исследованиях, выполненных in vitro. Также предложены моновалентные варианты конструктов сайт связывания-Fc.- 1 040195 effect due to the elimination of circulating binding molecules after binding to a highly expressed target. However, most surprisingly, as demonstrated herein, fusion proteins in binding site-Fc conformation (amino to carboxyl, i.e. binding site fused to the N-terminus of Fc) were found to have higher activity than proteins in conformation Fc-binding site (binding site fused to the C-terminus of Fc). This was true despite the fact that fusion proteins consisting of an Fc binding site (the binding site is fused to the C-terminus of Fc) showed higher binding to endothelial cells in initial experimental studies performed in vitro. Monovalent variants of the binding site-Fc constructs are also provided.

В соответствии с этим в одном аспекте настоящее изобретение относится к связывающей молекуле, содержащей по меньшей мере одно фармакологически активное средство и по меньшей мере один сайт связывания, например сайт связывания, обеспечивающий перенос через ГЭБ, который связывается с ТМЕМ30А, отличающейся тем, что по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с ТМЕМ30А, слит i) непосредственно или ii) через промежуточную аминокислотную последовательность с N-концом Fc-фрагмента.Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a binding molecule containing at least one pharmacologically active agent and at least one binding site, for example, a binding site that provides transfer through the BBB, which binds to TMEM30A, characterized in that at least at least one binding site that binds to TMEM30A is fused i) directly or ii) via an intermediate amino acid sequence to the N-terminus of the Fc fragment.

В одном варианте реализации связывающая молекула содержит по меньшей мере два сайта связывания.In one embodiment, the implementation of the binding molecule contains at least two binding sites.

В одном варианте реализации по меньшей мере один сайт связывания содержит аминокислотную последовательность FC5. В одном варианте реализации связывающая молекула содержит по меньшей мере два или по меньшей мере три (например, два или три) сайта связывания, которые связываются с ТМЕМ30А. В одном варианте реализации связывающая молекула содержит по меньшей мере три или по меньшей мере четыре (например, три или четыре) сайта связывания, которые связываются с ТМЕМ30А.In one embodiment, the implementation of at least one binding site contains the amino acid sequence of FC5. In one embodiment, the binding molecule contains at least two or at least three (eg two or three) binding sites that bind to TMEM30A. In one embodiment, the binding molecule contains at least three or at least four (eg, three or four) binding sites that bind to TMEM30A.

В одном варианте реализации по меньшей мере один сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ (например, сайт связывания, полученный из молекул антител, которые проникают через ГЭБ), слит на уровне гена непосредственно с Fc-фрагментом.In one embodiment, at least one BBB-transfer site (eg, a binding site derived from antibody molecules that cross the BBB) is fused at the gene level directly to the Fc fragment.

В одном варианте реализации по меньшей мере один сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ (например, сайт связывания, полученный из молекул антител, которые проникают через ГЭБ), слит на уровне гена с Fc-фрагментом через промежуточную аминокислотную последовательность, состоящую пептидного линкера.In one embodiment, at least one BBB-transporting site (e.g., a binding site derived from antibody molecules that cross the BBB) is fused at the gene level to the Fc fragment via an intermediate amino acid sequence consisting of a peptide linker.

В одном варианте реализации по меньшей мере один сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ (например, сайт связывания, полученный из молекул антител, которые проникают через ГЭБ), слит на уровне гена с Fc-фрагментом через промежуточную аминокислотную последовательность, состоящую из пептидного линкера.In one embodiment, at least one BBB-transporting site (e.g., a binding site derived from antibody molecules that cross the BBB) is fused at the gene level to the Fc fragment via an intermediate amino acid sequence consisting of a peptide linker.

В одном варианте реализации два сайта, обеспечивающие перенос через ГЭБ (например, сайты связывания, полученные из молекул антител, которые проникают через ГЭБ), слиты с N-концом двух разных Fc-фрагментов всей Fc-области через аминокислотную последовательность, содержащую пептидный линкер.In one embodiment, two BBB-transporting sites (e.g., binding sites derived from antibody molecules that cross the BBB) are fused to the N-terminus of two different Fc fragments of the entire Fc region via an amino acid sequence containing a peptide linker.

В одном варианте реализации по меньшей мере один сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ (например, сайт связывания, полученный из молекул антител, которые проникают через ГЭБ), слит с N-концом молекулы scFc.In one embodiment, at least one BBB-transfer site (eg, a binding site derived from antibody molecules that cross the BBB) is fused to the N-terminus of the scFc molecule.

В одном варианте реализации по меньшей мере одно фармакологически активное средство слито с С-концом Fc-области.In one embodiment, at least one pharmacologically active agent is fused to the C-terminus of the Fc region.

В одном варианте реализации по меньшей мере одно фармакологически активное средство представляет собой небольшое химическое соединение.In one embodiment, at least one pharmacologically active agent is a small chemical compound.

В одном варианте реализации небольшое химическое соединение слито со связывающей молекулой по остатку цистеина. В одном варианте реализации остаток цистеина представляет собой встроенный остаток цистеина.In one embodiment, the small chemical is fused to the binding molecule at a cysteine residue. In one embodiment, the cysteine residue is an inserted cysteine residue.

В одном варианте реализации по меньшей мере одно фармакологически активное средство представляет собой полипептид.In one embodiment, at least one pharmacologically active agent is a polypeptide.

В одном варианте реализации по меньшей мере одно фармакологически активное средство содержит антигенсвязывающий сайт (например, антигенсвязывающий сайт, полученный из антитела, не проникающего через ГЭБ).In one embodiment, at least one pharmacologically active agent contains an antigen-binding site (eg, an antigen-binding site derived from an antibody that does not cross the BBB).

В одном варианте реализации фармакологически активное средство выбирают из группы, состоящей из молекулы scFv, молекулы Fab и однодоменного антитела.In one embodiment, the pharmacologically active agent is selected from the group consisting of an scFv molecule, a Fab molecule, and a single domain antibody.

В одном варианте реализации по меньшей мере одно фармакологически активное средство слито на уровне гена со связывающей молекулой.In one embodiment, at least one pharmacologically active agent is fused at the gene level to a binding molecule.

В одном варианте реализации по меньшей мере одно фармакологически активное средство ковалентно связано со связывающей молекулой.In one embodiment, at least one pharmacologically active agent is covalently linked to the binding molecule.

В одном варианте реализации сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ, слит на уровне гена через промежуточную аминокислотную последовательность, содержащую VH-домен молекулы антитела.In one embodiment, the BBB transfer site is fused at the gene level through an intermediate amino acid sequence containing the VH domain of the antibody molecule.

В одном варианте реализации сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ, слит на уровне гена через промежуточную аминокислотную последовательность, содержащую Vt-домен молекулы антитела.In one embodiment, the BBB transfer site is fused at the gene level through an intermediate amino acid sequence containing the Vt domain of the antibody molecule.

- 2 040195- 2 040195

В одном варианте реализации по меньшей мере один сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ, слит на уровне гена с N-концом VH-домена интактной молекулы антитела.In one embodiment, at least one BBB-transfer site is fused at the gene level to the N-terminus of the VH domain of an intact antibody molecule.

В одном варианте реализации по меньшей мере один сайт, обеспечивающий перенос через ГЭБ, слит на уровне гена с N-концом VL-домена интактной молекулы антитела.In one embodiment, at least one BBB-transfer site is fused at the gene level to the N-terminus of the VL domain of an intact antibody molecule.

В одном варианте реализации два сайта, обеспечивающие перенос через ГЭБ, слиты на уровне гена с N-концом VH-домена и VL-домена интактной молекулы антитела.In one embodiment, the two BBB transfer sites are fused at the gene level to the N-terminus of the VH domain and the VL domain of an intact antibody molecule.

В одном варианте реализации промежуточная аминокислотная последовательность дополнительно содержит пептидный линкер.In one embodiment, the intermediate amino acid sequence further comprises a peptide linker.

В одном варианте реализации фармацевтически активное средство выбирают из группы, состоящей из нейроактивного пептида, небольшого химического соединения и вариабельной области антитела, которое связывается с мишенью в центральной нервной системе.In one embodiment, the pharmaceutically active agent is selected from the group consisting of a neuroactive peptide, a small chemical compound, and an antibody variable region that binds to a target in the central nervous system.

В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения неврологического нарушения, включающему введение субъекту связывающей молекулы настоящего изобретения.In one embodiment, the present invention relates to a method of treating a neurological disorder comprising administering to a subject a binding molecule of the present invention.

В одном варианте реализации неврологическое нарушение представляет собой болезнь накопления. В одном варианте реализации неврологическое нарушение представляет собой хроническую боль. В одном варианте реализации неврологическое нарушение представляет собой эпилепсию. В одном варианте реализации неврологическое нарушение представляет собой рассеянный склероз. В одном варианте реализации неврологическое нарушение представляет собой болезнь - протеинопатию. В одном варианте реализации нарушение представляет собой демиелинизирующее нарушение.In one embodiment, the neurological disorder is a storage disease. In one embodiment, the neurological disorder is chronic pain. In one embodiment, the neurological disorder is epilepsy. In one embodiment, the neurological disorder is multiple sclerosis. In one embodiment, the implementation of the neurological disorder is a disease - proteinopathy. In one embodiment, the disorder is a demyelinating disorder.

В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к использованию связывающей молекулы настоящего изобретения при производстве лекарственного препарата для лечения неврологического нарушения.In another embodiment, the present invention relates to the use of a binding molecule of the present invention in the manufacture of a medicament for the treatment of a neurological disorder.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фиг. 1 проиллюстрированы схематические изображения однодоменного антитела Fc5, состоящего из тяжелой цепи, (a) отдельно, (b) слитого либо на N-конце (FC5-Fc), либо (c) на С-конце (Fc-FC5) с agly Fc-доменом человеческого IgG1, а также возможных антителоподобных конструктов, которые включают в качестве фармацевтически активного фрагмента домен, не проникающий через ГЭБ (d, e). Молекулы (f) и (g) иллюстрируют присоединение однодоменного антитела Fc5, состоящего из тяжелой цепи, к полной молекуле антитела; может произойти слияние однодоменного антитела, состоящего из тяжелой цепи, например, с V_L- или VH-доменом или и тем, и другим доменом.In FIG. 1 illustrates schematic representations of a heavy chain Fc5 single domain antibody, (a) alone, (b) fused either at the N-terminus (FC5-Fc) or (c) at the C-terminus (Fc-FC5) with agly Fc- domain of human IgG1, as well as possible antibody-like constructs that include a domain that does not penetrate the BBB as a pharmaceutically active fragment (d, e). Molecules (f) and (g) illustrate the attachment of a heavy chain Fc5 single domain antibody to a full antibody molecule; a heavy chain single domain antibody may be fused to, for example, a V _L or VH domain or both.

На фиг. 2a-c проиллюстрирован электрофорез 2,5 мкг каждого очищенного белка на 4-12% Bis-Tris SDS PAGE. На каждом геле отмечены стандарты молекулярного веса для SDS PAGE от 10-220 кДа. На панели A показана дорожка для электрофореза в невосстанавливающих (1) и восстанавливающих условиях (2) для FC5, на панели B показана дорожка в невосстанавливающих (1) и восстанавливающих условиях (2) для FC5-Fc и на панели C показана дорожка в невосстанавливающих (1) и восстанавливающих условиях (2) для Fc-FC5.In FIG. 2a-c illustrate electrophoresis of 2.5 μg of each purified protein on 4-12% Bis-Tris SDS PAGE. Molecular weight standards for SDS PAGE from 10-220 kDa are marked on each gel. Panel A shows the non-reducing (1) and reducing (2) electrophoresis lane for FC5, panel B shows the non-reducing (1) and reducing (2) lane for FC5-Fc, and panel C shows the non-reducing lane ( 1) and reducing conditions (2) for Fc-FC5.

На фиг. 3 проиллюстрирована повышенная скорость транспорта Fc5Fc, FcFC5 и FC5 in vitro через трансформированные SV40 эндотелиальные клетки ГЭБ крысы по сравнению с контрольными антителами 12F6A (hIgG1), CRL2434 (mIgG1) и C37H (V_HH только).In FIG. 3 illustrates the increased transport rate of Fc5Fc, FcFC5 and FC5 in vitro through SV40-transformed rat BBB endothelial cells compared to control antibodies 12F6A (hIgG1), CRL2434 (mIgG1) and C37H (V _HH only).

Фиг. 4a-c. На панели 4(a) проиллюстрировано связывание Fc5-Fc (о), Fc-FC5 () или нерелевантного контрольного верблюжьего V_HH, слитого с N-концами huFc agly домена (V_HH-Fc) (A), с трансформированными SV40 эндотелиальными клетками ГЭБ крысы. На панели (4b) показано связывание Fc5-Fc (о) и Fc-FC5 () с крысиными эндотелиальными клетками ГЭБ первичной культуры. На панели 4c показано связывание Fc5-Fc с крысиным (□) или человеческим (◊) и Fc-FC5 с крысиным (▲) или человеческим (·) ТМЕМ30А с транзиентной экспрессией в клетках EBNA293.Fig. 4a-c. Panel 4(a) illustrates binding of Fc5-Fc (o), Fc-FC5 (), or irrelevant control camel V _HH fused to the N-terminus of the huFc agly domain (V _HH -Fc) (A), to SV40-transformed endothelial cells BBB of the rat. Panel (4b) shows the binding of Fc5-Fc (o) and Fc-FC5 () to primary culture rat BBB endothelial cells. Panel 4c shows Fc5-Fc binding to rat (□) or human (◊) and Fc-FC5 to rat (▲) or human (·) TMEM30A with transient expression in EBNA293 cells.

Фиг. 5a-c. На панели 5a проиллюстрирована способность Fc5, ковалентно сшитого с даларгином (FC5-Dal), подавлять боль в модели Hargreaves на животных. Скорость отдергивания лапы выражают в виде процента максимально возможного эффекта (%МРЕ) на основе временного интервала 20 с. Отрицательный контроль показывает скорость отдергивания для противоположной невоспаленной контрольной лапы (•) и положительный контроль показывает высокую скорость отдергивания воспаленной лапы, когда крысе IV вводят только PBS (о). Эффективность однократной IV дозы () Fc5-Dal при 21 мг/кг сравнивается с тремя IV дозами Fc5-Dal при 7 мг/кг (□) в отношении подавления скорости отдергивания лапы в модели Hargreaves на животных. На панели 5b показана средняя площадь под кривой для ответа %МРЕ против времени, затраченного для каждой оцениваемой лапы. На панели 5с показаны дополнительные эксперименты для отрицательного контроля, в которых крысам вводили IV три дозы 7 мг/кг в моменты времени 0, 1 и 2 ч либо нерелевантного VHH-Dal (серые маркеры-прямоугольники) или FC5 отдельно (маркеры-прямоугольники без заливки). Также показаны данные для противоположной контрольной лапы (маркеры-круги со сплошной заливкой). %МРЕ для подавления скорости отдергивания лапы определяли в модели Hargreaves на животных.Fig. 5a-c. Panel 5a illustrates the ability of Fc5 covalently linked to dalargin (FC5-Dal) to suppress pain in the Hargreaves animal model. Paw withdrawal rate is expressed as a percentage of maximum possible effect (% MPE) based on a time interval of 20 s. The negative control shows a withdrawal rate for the opposite non-inflamed control paw (x) and the positive control shows a high withdrawal rate for the inflamed paw when PBS alone is administered to the IV rat (o). The efficacy of a single IV dose () of Fc5-Dal at 21mg/kg is compared to three IV doses of Fc5-Dal at 7mg/kg (□) in suppressing paw withdrawal speed in an animal model of Hargreaves. Panel 5b shows the mean area under the curve for the %MPE response versus time spent for each paw evaluated. Panel 5c shows additional negative control experiments in which rats were given IV doses of three 7 mg/kg at time points 0, 1, and 2 h of either irrelevant VHH-Dal (gray box markers) or FC5 alone (unshaded box markers). ). Data for the opposite control paw (solid circle markers) is also shown. The %MPE for paw withdrawal rate suppression was determined in the Hargreaves animal model.

Фиг. ба-d. Эффективность Fc-FC5-Dal оценивали в модели Hargreaves. Крысам вводили IV дозы при 2 мг/кг в момент времени 0 на панели 6a и в моменты времени 0 и 2 ч на панели 6B. На панелях 6С и 6D каждой крысе вводили IV дозы при 6,5 мг/кг в момент времени 0.Fig. ba-d. The efficacy of Fc-FC5-Dal was evaluated in the Hargreaves model. Rats were dosed IV at 2 mg/kg at time 0 in panel 6a and at time 0 and 2 h in panel 6B. In panels 6C and 6D, each rat was dosed IV at 6.5 mg/kg at time 0.

- 3 040195- 3 040195

Фиг. 7a-d. В модели Hargreaves сравнивали эффективность Fc5-Fc-Dal с отрицательным контролемFig. 7a-d. Hargreaves model compared Fc5-Fc-Dal to negative control

Fc-Dal. Крысам в момент времени 0 вводили IV разовую концентрацию Fc5-Fc-Dal или Fc-Dal при 0,5,Fc-Dal. Rats at time 0 were injected with an IV single concentration of Fc5-Fc-Dal or Fc-Dal at 0.5,

2,5 или 6,0 мг/кг. Данные представлены на панелях 7a и 7b в виде процента максимально возможного эффекта (МРЕ) за указанное время или на панелях 7c и 7d в виде относительной площади под кривой.2.5 or 6.0 mg/kg. Data are presented in panels 7a and 7b as percentage of maximum possible effect (MPE) over time, or in panels 7c and 7d as relative area under the curve.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Слитый белок, содержащий по меньшей мере одно однодоменное антитело, проникающее через ГЭБ, например, которое связывается с ТМЕМ30А (CDC-50A) (как, например, один домен FC5), как было обнаружено, значительно усиливает транспорт через ГЭБ по сравнению с моновалентным V_HH. В частности, конформация сайт связывания-Fc (от амино- к карбоксильному концу) позволила продемонстрировать повышенную активность. Основываясь, по меньшей мере частично, на факте значительного повышения транспорта, в данном документе описаны молекулы, характеризующиеся повышенным транспортом через гематоэнцефалический барьер, способы повышения транспорта через гематоэнцефалический барьер и способы лечения с использованием таких молекул.A fusion protein containing at least one single-domain antibody that crosses the BBB, e.g., which binds to TMEM30A (CDC-50A) (such as one FC5 domain), has been found to significantly enhance transport across the BBB compared to monovalent V _H.H. In particular, the conformation of the binding site-Fc (from the amino to the carboxyl end) allowed to demonstrate increased activity. Based at least in part on the fact that there is a significant increase in transport, this document describes molecules having increased transport across the blood-brain barrier, methods for increasing transport across the blood-brain barrier, and methods of treatment using such molecules.

Перед дальнейшим описанием настоящего изобретения для удобства ниже описаны определенные выражения.Before describing the present invention further, certain expressions are described below for convenience.

I. Определения.I. Definitions.

Как используется в данном документе, выражение белок или полипептид относится к полимеру из двух или нескольких природных аминокислот или неприродных аминокислот.As used herein, the expression protein or polypeptide refers to a polymer of two or more natural amino acids or non-natural amino acids.

Выражение аминокислота включает аланин (Ala или A); аргинин (Arg или R); аспарагин (Asn или N); аспарагиновую кислоту (Asp или D); цистеин (Cys или C); глутамин (Gln или Q); глутаминовую кислоту (Glu или E); глицин (Gly или G); гистидин (His или H); изолейцин (Ile или I): лейцин (Leu или L); лизин (Lys или K); метионин (Met или M); фенилаланин (Phe или F); пролин (Pro или P); серин (Ser или S); треонин (Thr или T); триптофан (Trp или W); тирозин (Tyr или Y); и валин (Val или V). Нетрадиционные аминокислоты также находятся в пределах объема настоящего изобретения и включают норлейцин, омитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как описаны в Ellman et al., Meth. Enzym., 202:301-336 (1991). Для создания таких не встречающихся в природе аминокислотных остатков можно использовать методики Noren et al., Science, 244:182 (1989); и Ellman et al. выше. Вкратце эти методики включают химическую активацию супрессорной тРНК с помощью не встречающегося в природе аминокислотного остатка с последующей транскрипцией и трансляцией РНК in vitro. Введение нетрадиционной аминокислоты также можно достичь с использованием методов химии пептидов, известных в настоящем уровне техники. Как используется в данном документе, выражение полярная аминокислота включает аминокислоты, которые имеют суммарный нулевой заряд, но имеют ненулевые частичные заряды в разных участках их боковых цепей (например, M, F, W, S, Y, N, Q, C). Эти аминокислоты могут участвовать в гидрофобных взаимодействиях и электростатических взаимодействиях. Как используется в данном документе, выражение заряженная аминокислота включает аминокислоты, которые могут иметь ненулевой суммарный заряд на боковых цепях (например, R, K, H, E, D). Эти аминокислоты могут участвовать в гидрофобных взаимодействиях и электростатических взаимодействиях.The expression amino acid includes alanine (Ala or A); arginine (Arg or R); asparagine (Asn or N); aspartic acid (Asp or D); cysteine (Cys or C); glutamine (Gln or Q); glutamic acid (Glu or E); glycine (Gly or G); histidine (His or H); isoleucine (Ile or I): leucine (Leu or L); lysine (Lys or K); methionine (Met or M); phenylalanine (Phe or F); proline (Pro or P); serine (Ser or S); threonine (Thr or T); tryptophan (Trp or W); tyrosine (Tyr or Y); and valine (Val or V). Non-traditional amino acids are also within the scope of the present invention and include norleucine, omitin, norvaline, homoserine, and other analogs of amino acid residues such as those described in Ellman et al., Meth. Enzym., 202:301-336 (1991). The techniques of Noren et al., Science, 244:182 (1989) can be used to create such non-naturally occurring amino acid residues; and Ellman et al. higher. Briefly, these techniques involve the chemical activation of a suppressor tRNA with a non-naturally occurring amino acid residue, followed by in vitro transcription and translation of the RNA. Introduction of a non-traditional amino acid can also be achieved using peptide chemistry techniques known in the art. As used herein, the expression polar amino acid includes amino acids that have a net charge of zero but have non-zero partial charges at different regions of their side chains (e.g., M, F, W, S, Y, N, Q, C). These amino acids can participate in hydrophobic interactions and electrostatic interactions. As used herein, the term charged amino acid includes amino acids that may have a non-zero net charge on their side chains (eg, R, K, H, E, D). These amino acids can participate in hydrophobic interactions and electrostatic interactions.

Как используется в данном документе выражение линкерный пептид относится к аминокислотным последовательностям, которые соединяют или связывают две полипептидные последовательности, например которые связывают два полипептидных домена, причем в природе не встречается соединение или связывание этими аминокислотными последовательности двух полипептидных доменов. В одном варианте реализации линкерный пептид является синтетическим. Как используется в данном документе выражение синтетический относится к аминокислотным последовательностям, которые не встречаются в природе.As used herein, the term "linker peptide" refers to amino acid sequences that connect or link two polypeptide sequences, for example, that link two polypeptide domains, and the connection or linking of two polypeptide domains by these amino acid sequences does not occur naturally. In one embodiment, the implementation of the linker peptide is synthetic. As used herein, the expression synthetic refers to amino acid sequences that do not occur naturally.

Линкерные пептиды настоящего изобретения соединяют две аминокислотные последовательности через пептидные связи. В одном варианте реализации линкерный пептид соединяет фрагмент, проникающий через ГЭБ, со вторым фрагментом, например с доменом или областью Fc-фрагмента. В одном варианте реализации линкерный пептид настоящего изобретения соединяет фармакологически активный фрагмент со вторым фрагментом в линейную последовательность, например со вторым фрагментом, который представляет собой фрагмент, проникающий через ГЭБ, или доменом или областью Fc-фрагмента. В другом варианте реализации линкерный пептид соединяет два фармакологически активных фрагмента. В одном варианте реализации линкерный пептид соединяет или обеспечивает слияние на уровне гена одного или нескольких доменов или областей Fc-фрагментов с отличным от Fc фрагментом.The linker peptides of the present invention connect two amino acid sequences via peptide bonds. In one embodiment, the implementation of the linker peptide connects a fragment that penetrates the BBB, with a second fragment, such as a domain or region of the Fc fragment. In one embodiment, the linker peptide of the present invention links the pharmacologically active fragment to a second fragment in a linear sequence, for example, to a second fragment that is a BBB-penetrating fragment or an Fc fragment domain or region. In another embodiment, the implementation of the linker peptide connects two pharmacologically active fragments. In one embodiment, the implementation of the linker peptide connects or provides a fusion at the gene level of one or more domains or regions of Fc fragments with a non-Fc fragment.

В отношении полипептидов линейная последовательность или последовательность представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от амино- до карбоксильного конца, в которой остатки, соседствующие друг с другом, являются смежными в первичной структуре полипептида.In relation to polypeptides, a linear sequence or sequence is the order of amino acids in a polypeptide in the direction from the amino to the carboxyl end, in which the residues adjacent to each other are adjacent in the primary structure of the polypeptide.

Как используется в данном документе, выражения соединенный, слитый или слияние используются взаимозаменяемо. Эти выражения относятся к объединению более двух элементов или компонентов любыми способами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные способы. Как используется в данном документе, выражение ковалентно слитый или ковалентно связанный означает, что определенные фрагменты либо непосредственно ковалентно связаны друг с другом, либо же косвенно ковалентно соединены друг с другом через промежуточный фрагмент или фрагменты, такие как линкер- 4 040195 ный пептид или фрагмент. В предпочтительном варианте реализации фрагменты ковалентно слиты. Одним из типов ковалентной связи является пептидная связь. Способы химической конъюгации (например, с использованием гетеробифункциональных сшивающих средств) известны в настоящем уровне техники. Слитые фрагменты могут также быть слиты на уровне гена. Как используется в данном документе, выражение слиты на уровне гена, связаны на уровне гена или слияние на уровне гена относится к линейному, ковалентному соединению или присоединению двух или нескольких белков, полипептидов, или их фрагментов через отдельные пептидные остовы, посредством генетической экспрессии одной полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки, полипептиды или фрагменты. Такое слияние на уровне гена приводит к экспрессии одной непрерывной генетической последовательности. Предпочтительные слияния на уровне генов происходят в рамке считывания, т.е. происходит слияние двух или больше открытых рамок считывания (ОРС) с образованием непрерывной более длинной ОРС, таким образом, что сохраняется правильная рамка считывания первоначальных ОРС. Таким образом, полученный в результате рекомбинантный слитый белок представляет собой один полипептид, содержащий два или более белковых сегмента, которые соответствуют полипептидам, кодируемым первоначальными ОРС (соединение этих сегментов таким образом обычно не встречается в природе). В данном случае один полипептид расщепляется на протяжении процессинга с получением димерных молекул, содержащих две полипептидные цепи.As used herein, the expressions joined, merged, or merge are used interchangeably. These expressions refer to the combination of more than two elements or components by any means, including chemical conjugation or recombinant methods. As used herein, the expression covalently fused or covalently linked means that certain fragments are either directly covalently linked to each other, or indirectly covalently linked to each other through an intermediate fragment or fragments, such as a linker peptide or fragment. In a preferred embodiment, the fragments are covalently fused. One type of covalent bond is a peptide bond. Chemical conjugation methods (eg, using heterobifunctional crosslinkers) are known in the art. Fusion fragments can also be fused at the gene level. As used herein, the expression gene-level fusion, gene-level linkage, or gene-level fusion refers to the linear, covalent joining or attachment of two or more proteins, polypeptides, or fragments thereof through separate peptide backbones, through the genetic expression of a single polynucleotide molecule. encoding these proteins, polypeptides or fragments. This fusion at the gene level results in the expression of one continuous genetic sequence. Preferential fusions at the gene level occur in frame, ie. two or more open reading frames (ORFs) merge to form a continuous longer ORF, such that the correct reading frame of the original ORFs is maintained. Thus, the resulting recombinant fusion protein is a single polypeptide containing two or more protein segments that correspond to the polypeptides encoded by the original ORFs (combining these segments in this manner is not normally found in nature). In this case, one polypeptide is cleaved during processing to obtain dimeric molecules containing two polypeptide chains.

Исследуемые полипептиды содержат по меньшей мере один фармакологически активный фрагмент. Фармакологически активный фрагмент относится к фрагменту, способному оказывать биологическое воздействие или принимать участие в биологических реакциях. Например, выражение фармакологически активный фрагмент относится к фармакологически активным молекулам или их участкам, которые связываются с компонентами биологической системы (например, белками в биологической жидкости, или на поверхности клеток, или в клеточном матриксе), и их связывание приводит к биологическому эффекту (например, который выражается в изменении активного фрагмента и/или компонента, с которыми он связывается (например, расщепление активного фрагмента и/или компонента, с которыми он связывается, передача сигнала или усиление или ингибирование биологического ответа в клетке или у субъекта)). Предпочтительными фармацевтически активными фрагментами являются терапевтические фрагменты.The investigated polypeptides contain at least one pharmacologically active fragment. A pharmacologically active moiety refers to a moiety capable of exerting a biological effect or participating in biological reactions. For example, the expression pharmacologically active fragment refers to pharmacologically active molecules or regions thereof that bind to components of a biological system (for example, proteins in a biological fluid, or on the surface of cells, or in a cell matrix), and their binding results in a biological effect (for example, which is expressed in a change in the active fragment and/or component to which it binds (for example, cleavage of the active fragment and/or component to which it binds, signal transduction, or enhancement or inhibition of a biological response in a cell or subject)). Preferred pharmaceutically active moieties are therapeutic moieties.

Иллюстративные фармакологически активные фрагменты могут содержать, например, лекарственное средство, антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела или его участок (например, F(ab), scFv, VH-домен или VL-домен) (например, для обеспечения, индукции или блокирования биологического ответа), лиганд-связывающий участок рецептора или рецептор-связывающий участок лиганда, фермент и т.д. В одном варианте реализации фармакологически активный фрагмент содержит зрелую форму белка. В другом варианте реализации фармакологически активный фрагмент содержит участок непроцессированного белка, который сохраняет биологическую активность. Другие иллюстративные фармакологически активные фрагменты включают терапевтически полезные аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты, включая, но без ограничений, полинуклеотиды, олигонуклеотиды, углеводы и липиды. Иллюстративные фармакологически активные фрагменты настоящего изобретения включают нейротрофические факторы, факторы роста, ферменты, антитела, нейромедиаторы, нейромодуляторы, антибиотики, противовирусные средства, противогрибковые средства, визуализирующие или детектируемые средства, изотопы и химиотерапевтические средства и т.п. Фармакологически активные фрагменты настоящего изобретения также включают лекарственные средства, пролекарства и прекурсоры, которые могут активироваться по доставке терапевтического средства в ткань-мишень. Подразумевается, что выражение фармакологически активные фрагменты не включает фрагмент, проникающий через ГЭБ. Фармакологически активные средства представляют собой фрагменты, не проникающие через ГЭБ.Exemplary pharmacologically active fragments may comprise, for example, a drug, an antigen-binding fragment of an antibody molecule, or a portion thereof (e.g., F(ab), scFv, VH domain, or VL domain) (e.g., to mediate, induce, or block a biological response), a ligand-binding site of a receptor, or a receptor-binding site of a ligand, an enzyme, etc. In one embodiment, the pharmacologically active fragment contains the mature form of the protein. In another embodiment, the pharmacologically active fragment contains a full length protein region that retains biological activity. Other exemplary pharmacologically active moieties include therapeutically useful amino acids, peptides, proteins, nucleic acids including, but not limited to, polynucleotides, oligonucleotides, carbohydrates, and lipids. Exemplary pharmacologically active fragments of the present invention include neurotrophic factors, growth factors, enzymes, antibodies, neurotransmitters, neuromodulators, antibiotics, antivirals, antifungals, imaging or detectable agents, isotopes, and chemotherapeutic agents, and the like. Pharmacologically active fragments of the present invention also include drugs, prodrugs and precursors that can be activated upon delivery of a therapeutic agent to a target tissue. It is understood that the expression pharmacologically active fragments does not include a fragment that penetrates the BBB. Pharmacologically active agents are fragments that do not penetrate the BBB.

Связывающие молекулы настоящего изобретения представляют собой химерные или слитые белки. Такие белки содержат первую аминокислотную последовательность, соединенную со второй аминокислотной последовательностью, соединение которых в природе не встречается. Аминокислотные последовательности, как правило, могут присутствовать в отдельных белках, которые объединяются в слитом полипептиде или они, как правило, могут присутствовать в одном и том же белке, но по-новому располагаются в слитом полипептиде. Химерный белок можно создать с использованием способов, хорошо известных в настоящем уровне техники, например, путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области кодируются в желаемом взаиморасположении.The binding molecules of the present invention are chimeric or fusion proteins. Such proteins contain a first amino acid sequence connected to a second amino acid sequence, the connection of which does not occur in nature. Amino acid sequences can typically be present in separate proteins that are combined in a fusion polypeptide, or they can typically be present in the same protein but re-arranged in a fusion polypeptide. The chimeric protein can be created using methods well known in the art, for example, by chemical synthesis or by creating and translating a polynucleotide in which the peptide regions are encoded in the desired relationship.

Полипептиды настоящего изобретения представляют собой связывающие молекулы, т.е. которые включают домены связывания или сайты связывания, полученные из антител, проникающих через ГЭБ. Антитело, проникающее через ГЭБ, облегчает проникновение через ГЭБ присоединенного к нему фрагмента. Иллюстративные сайты связывания антитела, проникающего через ГЭБ, описаны в патенте США 7943129. В одном варианте реализации антитело, проникающее через ГЭБ, связывается с ТМЕМ30А. Выражения домен связывания или сайт связывания, как используется в данном документе, относятся к участку, области или сайту полипептида, который опосредует специфическое связывание с молекулой-мишенью (например, сайт связывания ТМЕМ30А или другой сайт, который облегчает про- 5 040195 никновение через ГЭБ). Иллюстративные домены связывания включают антигенсвязывающий сайт (например, VH- и/или VL-домен) или молекулы, содержащие такой сайт связывания (например, антитело или однодоменное антитело).The polypeptides of the present invention are binding molecules, ie. which include binding domains or binding sites derived from antibodies that cross the BBB. An antibody that penetrates the BBB facilitates the penetration of the fragment attached to it through the BBB. Exemplary binding sites for a BBB penetrating antibody are described in US Pat. No. 7,943,129. In one embodiment, the BBB penetrating antibody binds to TMEM30A. The expression binding domain or binding site, as used herein, refers to a site, region, or site on a polypeptide that mediates specific binding to a target molecule (e.g., a TMEM30A binding site or other site that facilitates entry across the BBB) . Exemplary binding domains include an antigen binding site (eg, a VH and/or VL domain) or molecules containing such a binding site (eg, an antibody or a single domain antibody).

Полипептиды настоящего изобретения являются моновалентными или поливалентными, что касается фрагмента, проникающего через ГЭБ, например, содержат по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или больше фрагментов, проникающих через ГЭБ.The polypeptides of the present invention are monovalent or polyvalent in terms of BBB-penetrating moiety, eg, contain at least 1, 2, 3, 4, 5 or more BBB-penetrating moieties.

Фармакологически активные фрагменты, как описано в данном документе, могут также содержать домены связывания или сайты связывания, например, которые получают из молекулы антитела (например, VH- и/или VL-домен из антитела, которое не проникает через ГЭБ), молекул, содержащих такой сайт связывания (например, антитело или однодоменное антитело), рецептор-связывающего домена лиганда, лиганд-связывающего домена рецептора или каталитического домена. Выражение лиганд-связывающий домен, как используется в данном документе, относится к нативному рецептору (например, рецептору клеточной поверхности), или области, или их производному, сохраняющему, по меньшей мере, качественно лиганд-связывающую способность и предпочтительно биологическую активность соответствующего нативного рецептора. Выражение рецептор-связывающий домен, как используется в данном документе, относится к нативному лиганду, или области, или их производному, сохраняющему, по меньшей мере, качественно рецептор-связывающую способность и предпочтительно биологическую активность соответствующего нативного лиганда.Pharmacologically active fragments, as described herein, may also contain binding domains or binding sites, for example, which are derived from an antibody molecule (for example, a VH and/or VL domain from an antibody that does not cross the BBB), molecules containing such a binding site (eg, an antibody or a single domain antibody), a ligand receptor binding domain, a receptor ligand binding domain, or a catalytic domain. The expression ligand-binding domain, as used herein, refers to a native receptor (e.g., cell surface receptor), or region, or derivative thereof, retaining at least qualitatively the ligand-binding capacity and preferably the biological activity of the corresponding native receptor. The expression receptor-binding domain, as used herein, refers to a native ligand, or region, or derivative thereof, retaining at least qualitatively the receptor-binding ability and preferably the biological activity of the respective native ligand.

В одном варианте реализации полипептиды настоящего изобретения представляют собой модифицированные антитела. Как используется в данном документе, выражение модифицированное антитело включает синтетические формы антител, которые изменены таким образом, что они не встречаются в природе, например антитела, которые включают по меньшей мере два участка тяжелой цепи, а не две полные тяжелые цепи (как, например, антитела с удаленными доменами или миниантитела); мультиспецифические формы антител (например, биспецифические, триспецифические и т.д.), измененные таким образом, чтобы связываться с двумя или более разными антигенами, например с ТМЕМ30А и терапевтически значимым целевым сайтом связывания), соединенные с Fc-фрагментами, доменами, областями или scFc-областями.In one embodiment, the implementation of the polypeptides of the present invention are modified antibodies. As used herein, the term modified antibody includes synthetic forms of antibodies that are modified so that they do not occur naturally, such as antibodies that include at least two heavy chain regions rather than two full heavy chains (such as domain-deleted antibodies or mini-antibodies); multispecific antibody forms (e.g., bispecific, trispecific, etc.) modified to bind to two or more different antigens, e.g., TMEM30A and a therapeutically relevant target binding site) linked to Fc fragments, domains, regions, or scFc regions.

Как используется в данном документе, выражение Fc-область необходимо определить как участок полипептида, который соответствует Fc-области нативного иммуноглобулина, т.е. которая образуется путем димерной ассоциации соответствующих Fc-доменов (или Fc-фрагментов) двух его тяжелых цепей. Нативная Fc-область является гомодимерной и содержит две полипептидные цепи. В отличие от этого выражение Fc-область, слитая на уровне гена или одноцепочечная Fc-область (scFc-область), как используется в данном документе, относится к синтетической димерной Fc-области, состоящей из Fc-доменов (или Fc-фрагментов), соединенных на уровне гена в пределах одной полипептидной цепи (т.е. кодируемых одной непрерывной генетической последовательностью), как описано, например, в заявке на патент США 20110243966. В одном варианте реализации при использовании scFc-области связывающая молекула является моновалентной, что касается фрагмента, проникающего через ГЭБ.As used herein, the expression Fc region is to be defined as the region of the polypeptide that corresponds to the Fc region of native immunoglobulin, ie. which is formed by dimeric association of the corresponding Fc domains (or Fc fragments) of its two heavy chains. The native Fc region is homodimeric and contains two polypeptide chains. In contrast, the expression Fc region fused at the gene level or single-stranded Fc region (scFc region), as used herein, refers to a synthetic dimeric Fc region consisting of Fc domains (or Fc fragments), linked at the gene level within a single polypeptide chain (i.e., encoded by a single contiguous genetic sequence) as described, for example, in US Patent Application 20110243966. passing through the BBB.

Как используется в данном документе, выражение Fc-домен относится к участку одной тяжелой цепи иммуноглобулина, начинающейся с шарнирной области непосредственно выше сайта расщепления папаином (т.е. остаток 216 в IgG, учитывая, что первым остатком константной области тяжелой цепи является 114) и заканчивающейся на С-конце антитела. В соответствии с этим полный Fc-домен содержит, по меньшей мере, шарнирный домен, CH2-домен и CH3-домен. Как используется в данном документе, выражение Fc-область относится к димеризованным Fc-доменам, которые имеют сходство с Fc-областью нативных антител (например, несмотря на то, имеет ли она традиционную структуру из двух полипептидных цепей или выступает в качестве одноцепочечной Fc-области).As used herein, the term Fc domain refers to the region of a single immunoglobulin heavy chain starting at the hinge region immediately upstream of the papain cleavage site (i.e. residue 216 in IgG, given that the first residue of the heavy chain constant region is 114) and ending at the C-terminus of the antibody. Accordingly, a complete Fc domain contains at least a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain. As used herein, the term Fc region refers to dimerized Fc domains that resemble the Fc region of native antibodies (e.g., whether it has a conventional two-chain polypeptide structure or acts as a single-stranded Fc region). ).

Как используется в данном документе, выражение участок Fc-домена или Fc-фрагмент включает аминокислотную последовательность Fc-домена или последовательность, полученную из Fc-домена. В определенных вариантах реализации Fc-фрагмент содержит по меньшей мере один из шарнирного (например, верхняя, средняя и/или нижняя шарнирная область) домена, CH2-домена, CH3-домена, CH4-домена или варианта, участка или их фрагмента. В других вариантах реализации Fc-фрагмент содержит полный Fc-домен (т.е. шарнирный домен, CH2-домен и CH3-домен). В одном варианте реализации Fc-фрагмент содержит шарнирный домен (или его участок), слитый с CH3-доменом (или его участком). В другом варианте реализации Fc-фрагмент содержит CH2-домен (или его участок), слитый с CH3-доменом (или его участком). В другом варианте реализации Fc-фрагмент состоит из CH3-домена или его участка. В другом варианте реализации Fc-фрагмент состоит из шарнирного домена (или его участка) и CH3-домена (или его участка). В другом варианте реализации Fc-фрагмент состоит из CH2-домена (или его участка) и CH3-домена. В другом варианте реализации Fc-фрагмент состоит из шарнирного домена (или его участка) и CH2-домена (или его участка). В одном варианте реализации в Fcфрагменте отсутствует, по меньшей мере, участок CH2-домена (например, весь или часть CH2-домена).As used herein, the expression Fc domain region or Fc fragment includes the amino acid sequence of an Fc domain or a sequence derived from an Fc domain. In certain embodiments, an Fc fragment comprises at least one of a hinge (eg, upper, middle, and/or lower hinge) domain, a CH2 domain, a CH3 domain, a CH4 domain, or a variant, region, or fragment thereof. In other embodiments, the Fc fragment contains the entire Fc domain (ie, hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain). In one embodiment, the Fc fragment contains a hinge domain (or portion thereof) fused to a CH3 domain (or portion thereof). In another embodiment, the Fc fragment contains a CH2 domain (or portion thereof) fused to a CH3 domain (or portion thereof). In another embodiment, the Fc fragment consists of a CH3 domain or portion thereof. In another embodiment, the Fc fragment consists of a hinge domain (or portion thereof) and a CH3 domain (or portion thereof). In another embodiment, the Fc fragment consists of a CH2 domain (or portion thereof) and a CH3 domain. In another embodiment, the Fc fragment consists of a hinge domain (or portion thereof) and a CH2 domain (or portion thereof). In one embodiment, the Fc fragment is missing at least a portion of the CH2 domain (eg, all or part of the CH2 domain).

В одном варианте реализации связывающая молекула настоящего изобретения содержит полную Fc-область, несмотря на то, присутствует ли она в виде одной полипептидной цепи (scFc-молекула) или в форме дикого типа в виде двух полипептидных цепей.In one embodiment, the binding molecule of the present invention contains the entire Fc region, whether present as a single polypeptide chain (scFc molecule) or in wild-type form as two polypeptide chains.

- 6 040195- 6 040195

Специфически связанные относится к двум молекулам, образующим комплекс, который относительно стабилен в физиологических условиях. Специфическое связывание отличается высокой аффинностью и низкой и умеренной емкостью в отличие от неспецифического связывания, которое обычно характеризуется низкой аффинностью с умеренной и высокой емкостью. Как правило, связывание считается специфическим, если константа аффинности КА превышает 10⁶ М^-1 или более предпочтительно превышает 10⁸ М^-1. В случае необходимости можно уменьшить уровень неспецифического связывания, по сути не оказывая влияния на специфическое связывание, за счет варьирования условий связывания. Специалист в данной области техники использованием стандартных методик может оптимизировать соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, достаточное для связывания, концентрация блокирующего средства (например, сывороточный альбумин, молочный казеин) и т.д.Specifically bound refers to two molecules forming a complex that is relatively stable under physiological conditions. Specific binding is characterized by high affinity and low to moderate capacity, in contrast to non-specific binding, which is generally low affinity with moderate to high capacity. Generally, binding is considered specific if the affinity constant of KA is greater than 10 ⁶ M ^-1 or more preferably greater than 10 ⁸ M ^-1 . If necessary, you can reduce the level of non-specific binding, essentially without affecting the specific binding, by varying the binding conditions. One of ordinary skill in the art can optimize appropriate binding conditions such as concentration of molecules, ionic strength of solution, temperature, sufficient time for binding, concentration of blocking agent (e.g., serum albumin, milk casein), etc., by using standard techniques.

В одном варианте реализации Fc-фрагмент настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, участок Fc-молекулы, которая, как известно в настоящем уровне техники, требуется для связывания FcRn, называемого в данном документе связывающим партнером неонатального рецептора (FcRn). Связывающий партнер FcRn представляет собой молекулу или ее участок, который может специфически связываться FcRn-рецептором с последующим активным транспортом связывающего партнера FCRn через FcRn-рецептор.In one embodiment, an Fc fragment of the present invention comprises at least a portion of an Fc molecule known in the art to be required for FcRn binding, herein referred to as neonatal receptor (FcRn) binding partner. An FcRn binding partner is a molecule or portion thereof that can specifically bind to the FcRn receptor, followed by active transport of the FCRn binding partner through the FcRn receptor.

Связывающие партнеры FcRn настоящего изобретения охватывают молекулы, которые могут специфически связываться FcRn-рецептором, включая целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты, которые включают всю область связывания FcRn-рецептора. В другом варианте реализации домен или область Fc-фрагмента связывающей молекулы настоящего изобретения модифицируют таким образом, что происходит слабое, минимальное связывание или вообще не происходит связывания с FcRn. Область FC-участка IgG, которая связывается с FcRn-рецептором, была описана на основе рентгеноструктурного анализа (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379). Главная площадь контакта FC с FcRn находится недалеко от места соединения CH2- и СНЗ-доменов. Все контакты Fc-FcRn находятся в пределах одной тяжелой цепи Ig. Связывающие партнеры FcRn включают целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты IgG, которые включают всю область связывания FcRn. Главные контактные сайты включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 СН2-домена и аминокислотные остатки 385-387, 428, и 433-436 СН3-домена. Все ссылки на нумерацию аминокислот иммуноглобулинов, или фрагментов иммуноглобулинов, или областей основаны на Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.The FcRn binding partners of the present invention encompass molecules that can specifically bind to the FcRn receptor, including whole IgG, an IgG Fc fragment, and other fragments that include the entire FcRn receptor binding region. In another embodiment, the domain or region of the Fc fragment of the binding molecule of the present invention is modified such that there is little, minimal or no binding to FcRn. The IgG FC region that binds to the FcRn receptor has been described based on X-ray analysis (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379). The main area of contact between FC and FcRn is located near the junction of the CH2 and CH3 domains. All Fc-FcRn contacts are within the same Ig heavy chain. FcRn binding partners include whole IgG, an IgG Fc fragment, and other IgG fragments that include the entire FcRn binding region. The main contact sites include amino acid residues 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, and 314 of the CH2 domain and amino acid residues 385-387, 428, and 433-436 of the CH3 domain. All references to the amino acid numbering of immunoglobulins or immunoglobulin fragments or regions are based on Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

Fc-область IgG можно модифицировать в соответствии с хорошо известными методиками, такими как сайт-направленный мутагенез и т.п., для получения модифицированного IgG или Fc-фрагментов или их участков, которые будут связываться FcRn. Такие модификации включают модификации вдали от контактных сайтов FcRn, а также модификации в пределах контактных сайтов, которые сохраняют или даже усиливают связывание с FcRn. Например, в человеческом IgG1 Fc (Fc γ1) могут замещаться следующие одиночные аминокислотные остатки без значительной потери Fc-связывающей аффинности к FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A и K447A, где, например, P238A представляет пролин дикого типа, замещенный аланином в положении с номером 238.The Fc region of an IgG can be modified according to well known techniques such as site directed mutagenesis and the like to produce modified IgG or Fc fragments or portions thereof that will bind FcRn. Such modifications include modifications away from the FcRn contact sites as well as modifications within the contact sites that retain or even increase binding to FcRn. For example, in human IgG1 Fc (Fc γ1), the following single amino acid residues can be substituted without significant loss of Fc-binding affinity for FcRn: E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278AA, D280A, V282A, E283A, H285A, N2866A, T2890A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R30A, R297A, S298A, YP L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A and K447A, where, for example, P238A is a wild-type proline substituted with alanine at position number 238.

Некоторые из вышеприведенных мутаций могут придавать Fc-фрагменту новые функциональные свойства. Например, один вариант реализации включает N297A с удалением высококонсервативного сайта N-гликозилирования. Эффект этой мутации заключается в уменьшении степени гликозилирования, вследствие чего снижается эффекторная функция и/или иммуногенность. В качестве дополнительного примера новых функциональных свойств, возникающих в результате мутаций, описанных выше, в некоторых случаях можно больше повысить аффинность к FcRn, чем аффинность дикого типа. Эта повышенная аффинность может отражать повышенную скорость ассоциации, сниженную скорость диссоциации или как повышенную скорость ассоциации, так и сниженную скорость диссоциации. Мутации, которые, как считается, придают повышенную аффинность к FcRn, включают T256A, T307A, E380A и N434A (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:6591).Some of the above mutations may confer new functional properties on the Fc fragment. For example, one embodiment includes N297A with the removal of a highly conserved N-glycosylation site. The effect of this mutation is to reduce the degree of glycosylation, resulting in reduced effector function and/or immunogenicity. As a further example of the new functional properties resulting from the mutations described above, in some cases, it is possible to increase the affinity for FcRn more than wild-type affinity. This increased affinity may reflect an increased rate of association, a reduced rate of dissociation, or both an increased rate of association and a reduced rate of dissociation. Mutations thought to confer increased affinity for FcRn include T256A, T307A, E380A and N434A (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:6591).

В одном варианте реализации связывающий партнер FcRn представляет собой полипептид, включающий последовательность PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:), и в некоторых случаях дополнительно включающий последовательность, выбранную из HQSLGTQ (SEQ ID NO:), HQNLSDGK (SEQ ID NO:), HQNISDGK (SEQ ID NO:) или VISSHLGQ (SEQ ID NO:) (патент США № 5739277).In one embodiment, the FcRn binding partner is a polypeptide comprising the sequence PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:), and in some cases further comprising a sequence selected from HQSLGTQ (SEQ ID NO:), HQNLSDGK (SEQ ID NO:), HQNISDGK (SEQ ID NO:) or VISSHLGQ (SEQ ID NO:) (US patent No. 5739277).

Специалисты в данной области техники знакомы со многими другими Fc-мутантами или их аналогами, которые характеризуются измененной эффекторной функцией и/или FcRn-связыванием. В допол- 7 040195 нение к этому способы химической модификации константных областей иммуноглобулинов (например, пегилирование) или их фрагментов (см., например, Aslam и Dent, 1998, Bioconjugation: Protein CouplingThose skilled in the art are familiar with many other Fc mutants, or analogues thereof, that have altered effector function and/or FcRn binding. In addition, methods for chemically modifying immunoglobulin constant regions (eg, PEGylation) or fragments thereof (see, for example, Aslam and Dent, 1998, Bioconjugation: Protein Coupling

Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London) хорошо известны в настоящем уровне техники, например в заявке на патент США 20120003210.Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London) are well known in the art, for example in US Patent Application 20120003210.

В одном варианте реализации Fc-фрагмент, домен или область, к которой присоединяют фрагмент, проникающий через ГЭБ, подвергают агликозилированию с использованием способов, известных в настоящем уровне техники, например, путем подвергания мутациям остатков, которые обычно являются гликозилированными или путем изменения экспрессии полипептида таким образом, что гликозилирование не происходит. В качестве примера один конкретный вариант реализации включает мутацию N297A, приводящую к удалению высококонсервативного сайта N-гликозилирования. В другом варианте реализации Fc-фрагмент включает мутацию в положении 299, например мутацию T299, приводящую к замене другой аминокислоты, как описано в патенте США 7863419. В дополнение к аланину могут замещаться другие аминокислоты на аминокислоты дикого типа в положениях, описанных выше, или которые, как известно в настоящем уровне техники, подавляют функцию Fc.In one embodiment, the Fc fragment, the domain or region to which the BBB-penetrating fragment is attached, is aglycosylated using methods known in the art, for example, by mutating residues that are normally glycosylated or by altering the expression of the polypeptide so so that glycosylation does not occur. By way of example, one particular embodiment includes the N297A mutation resulting in the deletion of a highly conserved N-glycosylation site. In another embodiment, the Fc fragment comprises a mutation at position 299, such as a T299 mutation, resulting in a different amino acid substitution as described in US Pat. No. 7,863,419. , as known in the present state of the art, suppress Fc function.

В другом варианте реализации в исследуемые связывающие молекулы могут вводиться мутации, раскрытые в Armour, K.L., Clark, M.R., Hadley, A.G., Williamson L.M. (1999), Eur. J. Immunol., 29:2613-2624.In another embodiment, mutations disclosed in Armour, K.L., Clark, M.R., Hadley, A.G., Williamson L.M. can be introduced into the binding molecules under investigation. (1999), Euro. J. Immunol., 29:2613-2624.

Мутации могут вводиться по отдельности в Fc, приводя к образованию нескольких сотен Fc-фрагментов, отличных от нативного Fc. Дополнительно могут совместно вводиться комбинации двух, трех или более этих отдельных мутаций, приводя к образованию в сотни раз больше потенциальных Fc-областей. Более того мутации может подвергаться один из FC-фрагментов конструкта настоящего изобретения, а другой Fc-фрагмент может совсем не подвергаться мутации или они оба могут подвергаться мутации, но с использованием разных мутаций.Mutations can be introduced singly into Fc, resulting in several hundred Fc fragments other than native Fc. Additionally, combinations of two, three, or more of these individual mutations can be co-administered, resulting in hundreds of times more potential Fc regions. Moreover, one of the Fc fragments of the construct of the present invention may be mutated and the other Fc fragment may not be mutated at all, or both may be mutated but using different mutations.

Также в химерном белке настоящего изобретения предполагается использовать пептидомиметики, по меньшей мере, участка константной области иммуноглобулина, например пептидомиметик Fc-фрагмента или пептидомиметик связывающего партнера FcRn. В одном варианте реализации пептидомиметик идентифицируют с использованием фагового дисплея или посредством скрининга химической библиотеки (см., например, McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:4363; EP 0589877 B1).Also contemplated in the chimeric protein of the present invention are peptidomimetics of at least a portion of an immunoglobulin constant region, such as an Fc fragment peptidomimetic or an FcRn binding partner peptidomimetic. In one embodiment, the peptidomimetic is identified using phage display or by chemical library screening (see, e.g., McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:4363; EP 0589877 B1).

В другом варианте реализации Fc-область настоящего изобретения (например, scFc-область) содержит, по меньшей мере, участок Fc-молекулы, который, как известно в настоящем уровне техники, требуется для связывания FcyR.In another embodiment, the Fc region of the invention (eg, scFc region) contains at least a region of the Fc molecule known in the art to be required for FcyR binding.

В одном варианте реализации Fc-область настоящего изобретения (например, scFc-область) содержит, по меньшей мере, участок Fc-молекулы, который, как известно в настоящем уровне техники, требуется для связывания белка A. В одном варианте реализации Fc-область настоящего изобретения (например, scFc-область) содержит, по меньшей мере, участок Fc-молекулы, который, как известно в настоящем уровне техники, требуется для связывания белка G. В одном варианте реализации такая молекула не связывается с FcRn.In one embodiment, the Fc region of the present invention (e.g., scFc region) contains at least a region of the Fc molecule known in the art to be required for protein A binding. In one embodiment, the Fc region of the present of the invention (eg, scFc region) contains at least a portion of an Fc molecule known in the art to be required for protein G binding. In one embodiment, such a molecule does not bind to FcRn.

Как изложено в данном документе, специалисту в настоящем уровне техники будет понятно, что можно также модифицировать Fc-домен за счет включения одной или нескольких аминокислотных замен (замещений, присоединений или делеций) таким образом, что он будет отличаться по аминокислотной последовательности от Fc-фрагмента дикого типа. В настоящем уровне техники известны многие такие замены или изменения. В определенных иллюстративных вариантах реализации Fc-фрагмент сохраняет эффекторную функцию (например, связывание FcyR) и в определенных вариантах реализации Fc-фрагмент характеризуется отсутствием или снижением эффекторной функции.As set forth herein, one skilled in the art will appreciate that it is also possible to modify the Fc domain by including one or more amino acid substitutions (substitutions, additions, or deletions) such that it differs in amino acid sequence from the Fc fragment wild type. Many such substitutions or modifications are known in the present state of the art. In certain exemplary embodiments, the Fc fragment retains effector function (eg, FcyR binding), and in certain embodiments, the Fc fragment has no or reduced effector function.

Fc-домены или фрагменты полипептида настоящего изобретения можно получить из любого изотипа (A, E, G или M) и можно получить из разных иммуноглобулиновых молекул. Например, Fc-домен или фрагмент полипептида может содержать CH2- и/или CH3-домен, полученный из молекулы IgG1, и шарнирную область, полученную из молекулы IgG3. В другом примере Fc-домен или фрагмент может содержать химерную шарнирную область, частично полученную из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В другом примере Fc-домен или фрагмент может содержать химерную шарнирную область, частично полученную из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.Fc domains or fragments of the polypeptide of the present invention can be obtained from any isotype (A, E, G or M) and can be obtained from different immunoglobulin molecules. For example, an Fc domain or polypeptide fragment may comprise a CH2 and/or CH3 domain derived from an IgG1 molecule and a hinge region derived from an IgG3 molecule. In another example, an Fc domain or fragment may comprise a chimeric hinge region derived in part from an IgG1 molecule and in part from an IgG3 molecule. In another example, an Fc domain or fragment may comprise a chimeric hinge region derived in part from an IgG1 molecule and in part from an IgG4 molecule.

Полипептиды, содержащие линкерные пептиды настоящего изобретения, можно получить с использованием методик, которые известны в настоящем уровне техники. В одном варианте реализации полипептиды настоящего изобретения получают с помощью рекомбинантной ДНК, т.е. получают с использованием технологии рекомбинантной ДНК. В данном документе более подробно изложены иллюстративные методики получения полипептидов настоящего изобретения.Polypeptides containing the linker peptides of the present invention can be obtained using techniques that are known in the present prior art. In one embodiment, the implementation of the polypeptides of the present invention is obtained using recombinant DNA, ie. obtained using recombinant DNA technology. This document sets out in more detail illustrative methods for obtaining polypeptides of the present invention.

Как используется в данном документе, выражение фармацевтически приемлемый носитель означает химическую композицию или соединение, с которым можно комбинировать активный ингредиент и который после комбинации можно использовать для введения активного ингредиента субъекту. Как используется в данном документе, выражение физиологически приемлемый сложный эфир или соль означает сложный эфир или соль из активного ингредиента, который совместим с любыми другими ингреAs used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" means a chemical composition or compound with which an active ingredient can be combined and which, once combined, can be used to administer the active ingredient to a subject. As used herein, the expression physiologically acceptable ester or salt means an ester or salt of an active ingredient that is compatible with any other ingredients.

- 8 040195 диентами фармацевтической композиции, который не оказывает вредного воздействия на субъекта, которому необходимо вводить композицию. Как используется в данном документе, фармацевтически приемлемый носитель также включает, но без ограничений, один или несколько из следующего перечня: вспомогательные вещества; поверхностно-активные вещества; диспергирующие средства; инертные разбавители; средства для гранулирования и дезинтегрирующие средства; связывающие средства; смазывающие средства; подсластители; ароматизирующие средства; окрашивающие средства; консерванты; физиологически разлагаемые композиции, такие как желатин; водные растворы и растворители; масляные растворы и растворители; суспендирующие средства; диспергирующие или увлажняющие средства; эмульгирующие средства, мягчительные средства; буферы; соли; загустители; наполнители; эмульгирующие средства; антиоксиданты; стабилизаторы; и фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы. Другие дополнительные ингредиенты, которые можно включить в фармацевтические композиции настоящего изобретения, известны в настоящем уровне техники и описаны, например, в Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., который включен в данный документ посредством ссылки.- 8 040195 dients of a pharmaceutical composition that does not adversely affect the subject to whom the composition is to be administered. As used herein, a pharmaceutically acceptable carrier also includes, but is not limited to, one or more of the following: excipients; surfactants; dispersing agents; inert diluents; granulating agents and disintegrating agents; binding agents; lubricants; sweeteners; flavoring agents; coloring agents; preservatives; physiologically degradable compositions such as gelatin; aqueous solutions and solvents; oil solutions and solvents; suspending agents; dispersing or wetting agents; emulsifiers, emollients; buffers; salt; thickeners; fillers; emulsifying agents; antioxidants; stabilizers; and pharmaceutically acceptable polymeric or hydrophobic materials. Other additional ingredients that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention are known in the art and are described in, for example, Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., which is incorporated herein. through a link.

Как используется в данном документе, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для получения терапевтического ответа.As used herein, an effective amount is an amount sufficient to produce a therapeutic response.

Как используется в данном документе, выражение протеинопатия относится к нарушениям, которые отличаются наличием неправильно упакованных белков или агрегированных белков, причем нарушения имеют генетический компонент.As used herein, the term proteinopathy refers to disorders that are characterized by the presence of misfolded proteins or aggregated proteins, the disorders having a genetic component.

II. Антитела, проникающие через ГЭБ.II. Antibodies that cross the BBB.

В одном варианте реализации фрагмент, проникающий через ГЭБ, представляет собой фрагмент, который описан патенте США 7943129. Например, в одном варианте реализации фрагмент, проникающий через ГЭБ, содержит аминокислотную последовательность, изложенную в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58 (FC5), SEQ ID NO: 86 (FC44) и SEQ ID NO: 87 (FC7), как изложено в патенте США 7943129. В одном варианте реализации фрагмент, проникающий через ГЭБ, представляет собой FC5-фрагмент. FC5 представляет собой антитело, состоящее из тяжелых цепей (НСА, также называемое антителом, состоящим из двух тяжелых цепей, VHH или однодоменным антителом), полученное из верблюдовых. По сравнению со стандартными иммуноглобулинами IgG-типа, состоящими из четырех цепей, которые также продуцируются верблюдовыми, в этих антителах отсутствуют легкие цепи и CH1-домены стандартных иммуноглобулинов. Одним из отличительных признаков этих встречающихся в природе антител, состоящих из тяжелых цепей, является численно преобладающее присутствие Glu, Arg и Gly соответственно в положениях 44, 45 и 47 (нумерация по Kabat) на границе с V_L их вариабельного домена (обозначенного V_Hh)· Те же самые положения в вариабельном домене тяжелой цепи стандартных антител, состоящих из четырех цепей (обозначенных VH), почти исключительно заняты Gly, Leu и Trp. Считается, что эти различия отвечают за высокую растворимость и стабильность вариабельного домена (VHH) верблюжьего НСА по сравнению с относительной нерастворимостью VH-домена стандартных антител, состоящих из четырех цепей. Двумя более ключевыми признаками верблюжьих VHH-доменов являются их сравнительно более длинный CDR3 и высокая частота встречаемости цистеиновых пар в CDR. Оказывается, что цистеиновые пары опосредуют образование дисульфидного мостика и следовательно вовлечены в модуляцию поверхностной топологии антигенсвязывающего центра. В кристаллической структуре комплекса верблюжьего sdAb-лизоцима жесткая петля, выступающая из sdAb и частично стабилизированная дисульфидной связью CDR, выходит за пределы антигенсвязывающего центра и глубоко проникает в активный сайт лизоцима (Desmyter et al., Nature Struct. Biol., 3, 803-811 (1996)).In one embodiment, the BBB-penetrating fragment is a fragment as described in US Pat. No. 7,943,129. For example, in one embodiment, the BBB-penetrating fragment contains the amino acid sequence set forth in a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 58 (FC5), SEQ ID NO: 86 (FC44) and SEQ ID NO: 87 (FC7) as set forth in US Pat. No. 7,943,129. In one embodiment, the BBB-penetrating fragment is an FC5 fragment. FC5 is a heavy chain antibody (HCA, also called dual heavy chain antibody, VHH or single domain antibody) derived from camelids. Compared to standard four-chain IgG immunoglobulins also produced by camelids, these antibodies lack the light chains and CH1 domains of standard immunoglobulins. One of the hallmarks of these naturally occurring heavy chain antibodies is the numerically predominant presence of Glu, Arg, and Gly at positions 44, 45, and 47, respectively (Kabat numbering), at the border with the V _L of their variable domain (denoted V _H h )· The same positions in the heavy chain variable domain of standard four chain antibodies (designated VH) are almost exclusively occupied by Gly, Leu and Trp. These differences are believed to be responsible for the high solubility and stability of the variable domain (VHH) of camelid HCA compared to the relative insolubility of the VH domain of standard four-chain antibodies. Two more key features of camel VHH domains are their comparatively longer CDR3 and the high frequency of cysteine pairs in the CDR. It appears that cysteine pairs mediate the formation of a disulfide bridge and are therefore involved in modulating the surface topology of the antigen-binding site. In the crystal structure of the camel sdAb-lysozyme complex, a rigid loop protruding from the sdAb and partially stabilized by the CDR disulfide bond extends beyond the antigen-binding site and penetrates deeply into the lysozyme active site (Desmyter et al., Nature Struct. Biol., 3, 803-811 (1996)).

В одном варианте реализации антитело, проникающее через ГЭБ, связывается с ТМЕМ30А (C6orf67, CDC50A). Иллюстративные фрагменты, которые связываются с ТМЕМ30А, известны или могут быть получены с использованием способов, хорошо известных в настоящем уровне техники. Например, аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность ТМЕМ30А или ее участок, можно использовать для получения антител, которые специфически распознают аминокислотную последовательность ТМЕМ30А, или для скрининга связывающих фрагментов, которые специфически связываются с ТМЕМ30А, из библиотеки сайтов связывания. Сайты связывания из таких антител или полученных из библиотек можно использовать в связывающей молекуле настоящего изобретения. Аминокислотная последовательность ТМЕМ30А показана ниже.In one embodiment, the BBB penetrating antibody binds to TMEM30A (C6orf67, CDC50A). Exemplary fragments that bind to TMEM30A are known or can be obtained using methods well known in the art. For example, an amino acid sequence containing the TMEM30A amino acid sequence or a portion thereof can be used to generate antibodies that specifically recognize the TMEM30A amino acid sequence, or to screen for binding fragments that specifically bind to TMEM30A from a library of binding sites. Binding sites from such antibodies or derived from libraries can be used in the binding molecule of the present invention. The amino acid sequence of TMEM30A is shown below.

- 9 040195- 9 040195

ШОВНШООШВВОВФВйШФАййШ ||||||||/1||||1ΒΙΙ|β ||||||Ι||||Α|||||ίΙ®SHOVNSHOOSHVVOOVFVySHFAYSH ||||||||/1||||1ΒΙΙ|β ||||||Ι||||Α|||||ίΙ®

0ИИ|ЖжяЖ1ИЖи/ЯЖ1^0II|ZhzhaZh1IZhI/Zh1^

Полипептиды настоящего изобретения могут содержать вариабельную область или ее участок (например, VL- и/или V_H-домен), полученный из антитела, которое связывается с ТМЕМ30А, с использованием принятых в настоящем уровне техники протоколов. Например, вариабельный домен можно получить из антитела, которое продуцирует не относящееся к человеку млекопитающее, например мышь, морскую свинку, примата, кролика или крысу, путем иммунизации млекопитающего антигеном или его фрагментом. См. Harlow и Lane выше, который включен посредством ссылки во всех отношениях. Иммуноглобулин можно получить путем многократных подкожных или внутрибрюшинных инъекций соответствующего антигена (например, очищенных опухолеассоциированных антигенов или клеток или клеточных экстрактов, содержащих такие антигены) и адъюванта. Эта иммунизация, как правило, вызывает иммунный ответ, который включает продукцию антиген-реактивных антител активированными спленоцитами или лимфоцитами.The polypeptides of the present invention may contain a variable region or portion thereof (eg, VL and/or V _H domain) derived from an antibody that binds to TMEM30A using protocols accepted in the present art. For example, a variable domain can be obtained from an antibody that is produced by a non-human mammal, such as a mouse, guinea pig, primate, rabbit, or rat, by immunizing the mammal with an antigen or fragment thereof. See Harlow and Lane above, which is incorporated by reference in all respects. Immunoglobulin can be obtained by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections of the appropriate antigen (eg, purified tumor-associated antigens or cells or cell extracts containing such antigens) and an adjuvant. This immunization typically elicits an immune response that includes the production of antigen-reactive antibodies by activated splenocytes or lymphocytes.

Тогда как вариабельную область можно получить из поликлональных антител, собранных из сыворотки иммунизированного млекопитающего, часто желательно выделить отдельные лимфоциты из селезенки, лимфоузлов или периферической крови для обеспечения гомогенных препаратов моноклональных антител (МАТ), из которых получают желаемую вариабельную область. Для получения поликлональных антител, как правило, используют кроликов или морских свинок. Для получения моноклональных антител, как правило, используют мышей. Моноклональные антитела к фрагменту можно получить путем инъекции фрагмента антигена мыши, получения гибридом и скрининга гибридом на антитело, которое специфически связывается с антигеном. В этом широко известном процессе (Kohler et al. (1975), Nature, 256:495) происходит слияние относительно короткоживущих или подвергающихся гибели лимфоцитов мыши, которой вводили антиген, с линией иммортализованных опухолевых клеток (например, линия миеломных клеток), таким образом, с получением гибридных клеток или гибридом, которые как являются иммортализованными, так и способны продуцировать антитело, генетически кодируемое B-клеткой. Полученные в результате гибриды разделяют на отдельные генетические штаммы за счет селекции, разведения и повторного выращивания, при этом каждый отдельный штамм содержит специфические гены для образования одного антитела. Они продуцируют антитела, которые являются гомогенными по отношению к желаемому антигену и применительно к их чистому генетическому происхождению их называют моноклональными.While the variable region can be obtained from polyclonal antibodies collected from the serum of an immunized mammal, it is often desirable to isolate single lymphocytes from the spleen, lymph nodes, or peripheral blood to provide homogeneous monoclonal antibody (MAB) preparations from which the desired variable region is obtained. To obtain polyclonal antibodies, as a rule, rabbits or guinea pigs are used. To obtain monoclonal antibodies, as a rule, use mice. Monoclonal antibodies to the fragment can be made by injecting the mouse antigen fragment, generating hybridomas, and screening the hybridomas for an antibody that specifically binds to the antigen. In this well-known process (Kohler et al. (1975), Nature, 256:495), relatively short-lived or dying lymphocytes of an antigen-inoculated mouse are fused with an immortalized tumor cell line (e.g., a myeloma cell line), thus to produce hybrid cells or hybridomas that are both immortal and capable of producing the antibody genetically encoded by the B cell. The resulting hybrids are separated into separate genetic strains by selection, breeding and re-cultivation, with each individual strain containing specific genes for the formation of a single antibody. They produce antibodies that are homogeneous with respect to the desired antigen and are referred to as monoclonal in relation to their pure genetic origin.

Клетки гибридомы, полученные таким образом, можно сеять и выращивать в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание не слитых, родительских миеломных клеток. Для специалистов в данной области техники будет понятно, что для образования, селекции и выращивания гибридом коммерчески доступны из множества источников реактивы, линии клеток и среды и составлены стандартизованные протоколы на надлежащем уровне. В целом культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, анализируют на продукцию моноклональных антител к желаемому антигену. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют путем иммунопреципитации или путем in vitro анализа, такого как радиоиммунный анализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). После идентификации клеток гибридомы, которые продуцируют антитела с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, можно субклонировать клоны с использованием методик предельного разведения и выращивать с использованием стандартных способов (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-103 (Academic Press, 1986)). Дополнительно будет понятно, что из культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки можно выделитьHybridoma cells thus obtained can be seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of non-fused, parental myeloma cells. Those skilled in the art will appreciate that reagents, cell lines and media are commercially available from a variety of sources and standardized protocols have been drawn up to an appropriate level for the formation, selection and cultivation of hybridomas. In general, the culture medium in which the hybridoma cells are grown is analyzed for the production of monoclonal antibodies to the desired antigen. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Once hybridoma cells have been identified that produce antibodies with the desired specificity, affinity, and/or activity, clones can be subcloned using limiting dilution techniques and grown using standard methods (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-103 (Academic Press , 1986)). Additionally, it will be understood that from the culture medium, ascitic fluid or serum can be isolated

- 10 040195 моноклональные антитела, секретируемые субклонами, с помощью стандартных методик очистки, таких как, например, аффинная хроматография (например, аффинная хроматография на белке-A, белке-G или белке-L), гидроксиапатитная хроматографии, гель-электрофорез или диализ.- 10 040195 monoclonal antibodies secreted by subclones using standard purification techniques such as, for example, affinity chromatography (eg protein-A, protein-G or protein-L affinity chromatography), hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis or dialysis.

В некоторых случаях можно проводить скрининг антител на связывание со специфической областью или желаемым фрагментом антигена без связывания с другими неперекрывающимися фрагментами антигена. Последний скрининг можно осуществить путем определения связывания антитела с коллекцией делеционных мутантов антигена и определения, какой делеционный мутант связывается с антителом. Связывание можно оценить, например, с помощью вестерн-блоттинга или ИФА. Наименьший фрагмент, который, как показано, специфически связывается с антителом, определяет эпитоп антитела. Альтернативно специфичность эпитопа можно определить путем конкурентного анализа, в котором тестируемое и контрольное антитело конкурируют за связывание с антигеном. Если тестируемые и контрольные антитела конкурируют, тогда они связываются с одинаковым эпитопом или эпитопами, которые располагаются достаточно близко, так что связывание одного антитела препятствует связыванию другого.In some cases, antibodies can be screened for binding to a specific region or desired antigen fragment without binding to other non-overlapping antigen fragments. The latter screening can be done by determining the binding of the antibody to a collection of deletion mutants of the antigen and determining which deletion mutant binds to the antibody. Binding can be assessed, for example, by Western blotting or ELISA. The smallest fragment shown to specifically bind to an antibody defines the epitope of the antibody. Alternatively, epitope specificity can be determined by a competitive assay in which test and control antibodies compete for binding to an antigen. If test and control antibodies compete, then they bind to the same epitope or epitopes that are close enough that binding of one antibody prevents binding of the other.

ДНК, кодирующую желаемое моноклональное антитело, можно без труда выделить и секвенировать с использованием любых стандартных методик, описанных выше для выделения последовательностей доменов константной области (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Выделенные и субклонированные клетки гибридомы выступают в качестве предпочтительного источника такой ДНК. Конкретнее, выделенную ДНК (которая может быть синтетической, как описано в данном документе) можно использовать для клонирования желаемых последовательностей вариабельной области для встраивания в полипептиды настоящего изобретения.DNA encoding the desired monoclonal antibody can be readily isolated and sequenced using any of the standard techniques described above for isolating constant region domain sequences (e.g., using oligonucleotide probes that are capable of specifically binding to genes encoding heavy and light chains of mouse antibodies) . Isolated and subcloned hybridoma cells act as the preferred source of such DNA. More specifically, isolated DNA (which may be synthetic as described herein) can be used to clone desired variable region sequences for insertion into the polypeptides of the present invention.

В других вариантах реализации сайт связывания получают из полностью человеческого антитела. Человеческие или по сути человеческие антитела могут вырабатываться у трансгенных животных (например, мышей), которые неспособны к продукции эндогенных иммуноглобулинов (см., например, патенты США № 6075181, 5939598, 5591669 и 5589369, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). Например, было описано, что гомозиготная делеция области антитела, связывающей тяжелые цепи, у химерных мышей и мышей с терминальной мутацией приводит к полному ингибированию эндогенной продукции антител. Перенос генной матрицы иммуноглобулина человека таким мышам с терминальной мутацией будет приводить к продукции человеческих антител при антигенной стимуляции. Другие предпочтительные способы выработки человеческих антител с использованием мышей SCID раскрыты в патенте США № 5811524, который включен в данный документ посредством ссылки. Будет понятно, что также можно выделить связанный с этими человеческими антителами генетический материал и производить с ним манипуляции, как описано в данном документе.In other embodiments, the binding site is derived from a fully human antibody. Human or substantially human antibodies can be produced in transgenic animals (e.g., mice) that are incapable of producing endogenous immunoglobulins (see, e.g., US Pat. . For example, it has been described that homozygous deletion of the heavy chain binding region of an antibody in chimeric and terminally mutated mice results in complete inhibition of endogenous antibody production. Transfer of the human immunoglobulin gene template to such terminally mutated mice will result in the production of human antibodies upon antigen challenge. Other preferred methods for generating human antibodies using SCID mice are disclosed in US Pat. No. 5,811,524, which is incorporated herein by reference. It will be appreciated that it is also possible to isolate and manipulate the genetic material associated with these human antibodies as described herein.

Еще одни высокоэффективные способы выработки рекомбинантных антител раскрыты Newman, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992). Конкретно этот метод приводит к выработке приматизированных антител, которые содержат вариабельные домены обезьяны и человеческие константные последовательности. Этот источник включен в данный документ посредством ссылки в ее полноте. Более того этот метод также описан в принадлежащих одному и тому же правообладателю патентах США № 5658570, 5693780 и 5756096, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.Still other highly efficient methods for generating recombinant antibodies are disclosed by Newman, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992). This particular method results in the production of primatized antibodies that contain monkey variable domains and human constant sequences. This source is incorporated herein by reference in its entirety. Moreover, this technique is also described in US Pat.

В другом варианте реализации путем микроманипуляции можно отобрать лимфоциты и выделить вариабельные гены. Например, мононуклеары периферической крови можно выделить из иммунизированного млекопитающего и культивировать в течение примерно 7 суток in vitro. Можно провести скрининг культур на специфические антитела, которые удовлетворяют критериям скрининга. Можно выделить клетки из положительных лунок. Отдельные Ig-продуцирующие B-клетки можно выделить с помощью FACS или за счет идентификации в анализе комплемент-опосредованного образования гемолитических бляшек. С Ig-продуцирующими B-клетками можно производить микроманипуляции в пробирке, а гены VH и VL можно амплифицировать с использованием, например, RT-PCR. Гены VH и VL можно клонировать в вектор для экспрессии антитела и трансфицировать в клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки) для экспрессии.In another embodiment, lymphocytes can be selected by micromanipulation and variable genes isolated. For example, peripheral blood mononuclear cells can be isolated from an immunized mammal and cultured for about 7 days in vitro. Cultures can be screened for specific antibodies that meet the screening criteria. Cells can be isolated from positive wells. Individual Ig-producing B cells can be isolated by FACS or by identification in a complement-mediated hemolytic plaque formation assay. Ig-producing B cells can be micromanipulated in vitro, and the VH and VL genes can be amplified using, for example, RT-PCR. The VH and VL genes can be cloned into a vector for antibody expression and transfected into cells (eg, eukaryotic or prokaryotic cells) for expression.

Альтернативно вариабельные (V) домены можно получить из библиотек последовательностей вариабельных генов из предпочтительного животного. Для идентификации элементов, которые имеют желаемые характеристики связывания, можно провести скрининг библиотек, экспрессирующих произвольные комбинации доменов, например VH- и/или VL-доменов, с использованием желаемого антигена. Способы такого скрининга хорошо известны в настоящем уровне техники. Например, репертуары генов антител можно клонировать в λ вектор экспрессии на основе бактериофага λ (Huse, WD et al. (1989), Science, 2476:1275). В дополнение к этому, можно провести скрининг клеток (Francisco et al. (1994), PNAS, 90:10444; Georgiou et al. (1997), Nat. Biotech., 15:29; Boder, Wittrup (1997), Nat. Biotechnol., 15:553; Boder et al. (2000), PNAS, 97:10701; Daugtherty, P. et al. (2000), J. Immunol. Methods., 243:211) или вирусов (например, Hoogenboom, HR. (1998), Immunotechnology 4:1; Winter et al. (1994), Annu Rev Immunol, 12:433; Griffiths, A.D. (1998), Curr. Opin. Biotechnol., 9:102), экспрессирующих антитела на их поверхности.Alternatively, variable (V) domains can be obtained from libraries of variable gene sequences from a preferred animal. To identify elements that have the desired binding characteristics, libraries expressing arbitrary combinations of domains, eg VH and/or VL domains, can be screened using the desired antigen. Methods for such screening are well known in the art. For example, antibody gene repertoires can be cloned into the λ bacteriophage λ expression vector (Huse, WD et al. (1989), Science, 2476:1275). In addition, cell screening can be performed (Francisco et al. (1994), PNAS, 90:10444; Georgiou et al. (1997), Nat. Biotech., 15:29; Boder, Wittrup (1997), Nat. Biotechnol., 15:553; Boder et al. (2000), PNAS, 97:10701; Daugtherty, P. et al. (2000), J. Immunol. Methods., 243:211) or viruses (e.g., Hoogenboom, HR (1998), Immunotechnology 4:1; Winter et al. (1994), Annu Rev Immunol, 12:433; Griffiths, A. D. (1998), Curr. Opin. Biotechnol., 9:102), expressing antibodies to their surfaces.

Специалисты в данной области техники также поймут, что ДНК, кодирующую вариабельные домены антител, можно также получить из библиотек антител, экспрессированных в фаге, дрожжах или бак- 11 040195 териях, с использованием способов, известных в настоящем уровне техники. Иллюстративные способы изложены, например, в EP 368684 B1; патенте США № 5969108; Hoogenboom et al. (2000), Immunol. Today, 21:371; Nagy et al. (2002), Nat. Med., 8:801; Huie et al. (2001), PNAS, 98:2682; Lui et al. (2002), J. Mol. Biol., 315:1063, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. В нескольких публикациях (например, Marks et al. (1992), Bio/Technology, 10:779-783) в качестве стратегии для конструирования больших фаговых библиотек была описана продукция высокоаффинных человеческих антител за счет рекомбинации цепей, а также комбинаторного инфицирования и in vivo рекомбинации. В другом варианте реализации для замены бактериофага можно использовать рибосомный дисплей в качестве платформы дисплея (см., например, Hanes et al. (1998), PNAS, 95:14130; Hanes, Pluckthun (1999), Curr. Top. Microbiol. Immunol., 243:107; He, Taussig. (1997), Nuc. Acids Res., 25:5132; Hanes et al. (2000), Nat. Biotechnol., 18:1287; Wilson et al. (2001), PNAS, 98:3750; или Irving et al. (2001), J. Immunol. Methods, 248:31).Those skilled in the art will also appreciate that DNA encoding antibody variable domains can also be obtained from antibody libraries expressed in phage, yeast, or bacteria using methods known in the art. Illustrative methods are set forth, for example, in EP 368684 B1; US patent No. 5969108; Hoogenboom et al. (2000), Immunol. Today, 21:371; Nagy et al. (2002), Nat. Med. 8:801; Huie et al. (2001), PNAS, 98:2682; Louis et al. (2002), J. Mol. Biol., 315:1063, each of which is incorporated herein by reference. Several publications (e.g. Marks et al. (1992), Bio/Technology, 10:779-783) have described the production of high affinity human antibodies by strand recombination as well as combinatorial infection and in vivo as a strategy for constructing large phage libraries. recombination. In another embodiment, a ribosome display can be used as a display platform to replace the bacteriophage (see, e.g., Hanes et al. (1998), PNAS, 95:14130; Hanes, Pluckthun (1999), Curr. Top. Microbiol. Immunol. , 243:107; He, Taussig. (1997), Nuc. Acids Res., 25:5132; Hanes et al. (2000), Nat. Biotechnol., 18:1287; Wilson et al. (2001), PNAS, 98:3750 or Irving et al (2001) J Immunol Methods 248:31).

Иллюстративные библиотеки для скрининга представляют собой библиотеки человеческих вариабельных генов. Также можно использовать VL- и VH-домены из источника, не относящегося к человеку. Библиотеки могут быть наивными, полученными от иммунизированных субъектов или полусинтетическими (Hoogenboom, Winter (1992)., J. Mol. Biol., 227:381; Griffiths et al. (1995), EMBO J., 13:3245; de Kruif et al. (1995), J. Mol. Biol., 248:97; Barbas et al. (1992), PNAS, 89:4457). В одном варианте реализации для создания библиотеки молекул нуклеиновых кислот, имеющих большую гетерогенность, можно вводить мутации в иммуноглобулиновые домены (Thompson et al. (1996), J. Mol. Biol., 256:77; Lamminmaki et al. (1999), J. Mol. Biol., 291:589; Caldwell, Joyce (1992), PCR Methods Appl., 2:28; Caldwell, Joyce (1994), PCR Methods Appl., 3:S136). Для отбора высокоаффинных вариантов можно использовать стандартные методики скрининга. В другом варианте реализации для повышения авидности антител можно осуществлять замены в последовательностях V_H и VL, например, с использованием информации, полученной от кристаллических структур, с использованием методик, известных в настоящем уровне техники.Exemplary screening libraries are human variable gene libraries. It is also possible to use VL and VH domains from a non-human source. Libraries can be naive, derived from immunized subjects, or semi-synthetic (Hoogenboom, Winter (1992), J. Mol. Biol., 227:381; Griffiths et al. (1995), EMBO J., 13:3245; de Kruif et al (1995) J Mol Biol 248:97 Barbas et al (1992) PNAS 89:4457). In one embodiment, mutations in immunoglobulin domains can be introduced to create a library of nucleic acid molecules having greater heterogeneity (Thompson et al. (1996), J. Mol. Biol., 256:77; Lamminmaki et al. (1999), J Mol. Biol., 291:589; Caldwell, Joyce (1992), PCR Methods Appl., 2:28; Caldwell, Joyce (1994), PCR Methods Appl., 3:S136). Standard screening techniques can be used to select high affinity variants. In another embodiment, to increase the avidity of antibodies, substitutions can be made in the V _H and VL sequences, for example, using information obtained from crystal structures using techniques known in the present art.

Другая иллюстративная библиотека представляет собой библиотеку верблюжьих антител, которая содержит однодоменные антитела. Иллюстративные однодоменные молекулы включают выделенный вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) антитела, т.е. вариабельный домен тяжелой цепи без вариабельного домена легкой цепи, и выделенный вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, т.е. вариабельный домен легкой цепи без вариабельного домена тяжелой цепи. Иллюстративные однодоменные антитела, которые используются в связывающих молекулах настоящего изобретения, включают, например, вариабельный домен тяжелой цепи антитела верблюдовых (примерно от 118 до 136 аминокислотных остатков), как описано в Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448 (1993); и Dumoulin et al., Protein Science, 11:500-515 (2002). Другие иллюстративные однодоменные антитела включают отдельно VH- или VL-домены, также известные как Dabs® (Domantis Ltd., Cambridge, UK). Другие же однодоменные антитела включают антитела акулы (например, Ig-NAR акулы). Ig-NAR акулы содержат гомодимер одного вариабельного домена (V-NAR) и пять С-подобных константных доменов (C-NAR), отличающиеся тем, что разнообразие сконцентрировано в удлиненной CDR3-области, отличающейся по длине на 5-23 остатка. У видов верблюдовых (например, лам) вариабельная область тяжелой цепи, называемая V_HH, образует весь антигенсвязывающий домен. Главные различия между вариабельными областями V_HH верблюдовых и областями, полученными из стандартных антител (V_H), включают (a) большее количество гидрофобных аминокислот на контактной поверхности V_H легкой цепи по сравнению с соответствующей областью на V_HH, (b) более длинный CDR3 в V_HH, и (c) частую встречаемость дисульфидной связи между CDR1 и CDR3 в V_HH.Another exemplary library is a camel antibody library that contains single domain antibodies. Exemplary single domain molecules include an isolated heavy chain variable domain (V _H ) of an antibody, i. a heavy chain variable domain without a light chain variable domain, and an isolated light chain variable domain (VL) of an antibody, i. a light chain variable domain without a heavy chain variable domain. Exemplary single domain antibodies that are used in the binding molecules of the present invention include, for example, the camelid antibody heavy chain variable domain (about 118 to 136 amino acid residues) as described in Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448 ( 1993); and Dumoulin et al., Protein Science, 11:500-515 (2002). Other exemplary single domain antibodies include separately VH or VL domains, also known as Dabs® (Domantis Ltd., Cambridge, UK). Other single domain antibodies include shark antibodies (eg shark Ig-NAR). Shark Ig-NARs contain a single variable domain homodimer (V-NAR) and five C-like constant domains (C-NARs), characterized in that diversity is concentrated in an extended CDR3 region that differs in length by 5-23 residues. In camelid species (eg, llamas), the heavy chain variable region, called V _HH , forms the entire antigen-binding domain. The main differences between camelid V _HH variable regions and those derived from standard antibodies (V _H ) include (a) more hydrophobic amino acids on the V _H light chain contact surface compared to the corresponding region on V _HH , (b) longer CDR3 in V _HH , and (c) the frequent occurrence of a disulfide bond between CDR1 and CDR3 in V _HH .

Способы получения однодоменных связывающих молекул описаны в патентах США № 6005079 и 6765087, оба из которых включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные однодоменные антитела, содержащие VHH-домены, включают Nanobodies® (Ablynx NV, Ghent, Belgium).Methods for making single domain binding molecules are described in US Pat. Nos. 6,005,079 and 6,765,087, both of which are incorporated herein by reference. Exemplary single domain antibodies containing VHH domains include Nanobodies® (Ablynx NV, Ghent, Belgium).

Более того последовательности вариабельных областей, обладающие полезными свойствами для получения полипептидов настоящего изобретения, можно получить из множество разных источников. Например, как обсуждалось выше, множество последовательностей человеческих генов доступны в форме открытых для общего доступа банков. Были опубликованы многие последовательности антител и генов, кодирующих антитела (например, антитела, которые, как известно, обладают клинически полезными свойствами), и с использованием принятых в настоящем уровне техники методик из этих последовательностей можно синтезировать подходящие последовательности вариабельных областей (например, последовательности V_L и V_H).Moreover, variable region sequences having useful properties for producing the polypeptides of the present invention can be obtained from a variety of different sources. For example, as discussed above, a variety of human gene sequences are available in the form of public banks. Many sequences of antibodies and genes encoding antibodies (e.g., antibodies known to have clinically useful properties) have been published, and using techniques accepted in the art, suitable variable region sequences (e.g., V _L sequences) can be synthesized from these sequences. and V _H ).

В другом варианте реализации домен связывания полипептида настоящего изобретения состоит из VH-домена, например, полученного у верблюдовых, который является стабильным в отсутствие VL-цепи (Hamers-Casterman et al. (1993), Nature, 363:446; Desmyter et al. (1996), Nat. Struct. Biol., 3:803; Decanniere et al. (1999), Structure, 7:361; Davies et al. (1996), Protein Eng., 9:531; Kortt et al. (1995), J. Protein Chem., 14:167).In another embodiment, the binding domain of the polypeptide of the present invention consists of a VH domain, e.g., derived from camelids, that is stable in the absence of the VL chain (Hamers-Casterman et al. (1993), Nature, 363:446; Desmyter et al. (1996) Nat Struct Biol 3:803 Decanniere et al (1999) Structure 7:361 Davies et al (1996) Protein Eng 9:531 Kortt et al ( 1995), J. Protein Chem., 14:167).

Полипептид настоящего изобретения может содержать вариабельный домен или CDR(s), полученThe polypeptide of the present invention may contain a variable domain or CDR(s) obtained

- 12 040195 ные из полностью мышиного, полностью человеческого, химерного, гуманизированного, нечеловекообразных приматов или приматизированного антитела. С использованием принятых в настоящем уровне техники методик можно изменить антитела, не относящиеся к человеческим, или их фрагменты, или домены для снижения их иммуногенности. Гуманизированные антитела представляют собой антитела, полученные из антител, не относящихся к человеческим, которые модифицировали так, чтобы они сохранили или в значительной степени сохранили свойства связывания исходного антитела, но которые являются менее иммуногенными для людей, чем исходные антитела, не относящиеся к человеческим. В случае гуманизированных антител-мишеней этого можно достичь различными способами, включая (a) пересадку полных вариабельных доменов, не относящихся к человеческим, в человеческие константные области для создания химерных антител-мишеней;- 12 040195 from a fully murine, fully human, chimeric, humanized, non-human primate or primatized antibody. Non-human antibodies, or fragments or domains thereof, can be altered using techniques adopted in the present state of the art to reduce their immunogenicity. Humanized antibodies are antibodies derived from non-human antibodies that have been modified to retain or substantially retain the binding properties of the parent antibody, but are less immunogenic in humans than the parent non-human antibody. In the case of humanized target antibodies, this can be achieved in various ways, including (a) grafting full non-human variable domains into human constant regions to generate chimeric target antibodies;

(b) пересадку по меньшей мере части одной или нескольких не относящихся к человеческим областей, определяющих комплементарность (CDR), в каркас человеческого антитела и константные области с или без сохранения особо важных остатков каркаса;(b) grafting at least a portion of one or more non-human complementarity determining regions (CDRs) into a human antibody framework and constant regions, with or without retaining critical framework residues;

(c) трансплантацию полных вариабельных доменов, не относящихся к человеческим, но маскируя их с помощью фрагмента, характерного для человеческого антитела, за счет замены поверхностных остатков.(c) transplantation of complete non-human variable domains, but masking them with a fragment characteristic of a human antibody by replacing surface residues.

Такие способы раскрыты в Morrison et al. (1984), PNAS, 81:6851-5; Morrison et al. (1988), Adv. Immunol., 44:65-92; Verhoeyen et al. (1988), Science, 239:1534-1536; Padlan (1991), Molec. Immun., 28:489-498; Padlan (1994), Molec. Immun., 31:169-217; и патентах США № 5585089, 5693761 и 5693762, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.Such methods are disclosed in Morrison et al. (1984), PNAS, 81:6851-5; Morrison et al. (1988), Adv. Immunol., 44:65-92; Verhoeyen et al. (1988), Science, 239:1534-1536; Padlan (1991), Molec. Immun. 28:489-498; Padlan (1994), Molec. Immun., 31:169-217; and US Pat. Nos. 5,585,089, 5,693,761, and 5,693,762, all of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Для уменьшения иммуногенности полипептида настоящего изобретения также можно использовать деиммунизацию. Как используется в данном документе, выражение деиммунизация включает модификацию Т-клеточных эпитопов (см., например, WO 9852976 A1, WO 0034317 A2). Например, анализируют последовательности VH и VL и составляют карту человеческих Т-клеточных эпитопов из каждой V-области, на которой показана локализация эпитопов по отношению к областям, определяющим комплементарность (CDR), и другим ключевым остаткам в пределах последовательности. Для того чтобы идентифицировать альтернативные аминокислотные замены с низком риском изменения активности конечного антитела, анализируют отдельные Т-клеточные эпитопы из карты Т-клеточных эпитопов. Конструируют ряд альтернативных последовательностей VH и VL, содержащих комбинации аминокислотных замен, и эти последовательности впоследствии встраивают в ряд полипептидов настоящего изобретения, которые тестируют на функциональность. Как правило, составляют и тестируют от 12 до 24 вариантов антител. Полные гены тяжелых и легких цепей, содержащие модифицированные человеческие V- и C-области, затем клонируют в векторы экспрессии и последующие плазмиды вводят в линии клеток для получения полного антитела. Антитела затем сравнивают в соответствующих биохимических и биологических анализах и идентифицируют оптимальный вариант.Deimmunization can also be used to reduce the immunogenicity of a polypeptide of the present invention. As used herein, the term deimmunization includes the modification of T-cell epitopes (see, for example, WO 9852976 A1, WO 0034317 A2). For example, the VH and VL sequences are analyzed and a map of human T cell epitopes from each V region is plotted showing the location of the epitopes in relation to complementarity determining regions (CDRs) and other key residues within the sequence. In order to identify alternative amino acid substitutions with a low risk of altering the activity of the final antibody, individual T-cell epitopes are analyzed from the T-cell epitope map. A number of alternative VH and VL sequences are constructed containing combinations of amino acid substitutions and these sequences are subsequently inserted into a number of polypeptides of the present invention that are tested for functionality. Typically, 12 to 24 antibody variants are made up and tested. The complete heavy and light chain genes containing the modified human V and C regions are then cloned into expression vectors and subsequent plasmids are introduced into cell lines to generate the complete antibody. The antibodies are then compared in appropriate biochemical and biological assays and the optimal variant is identified.

В одном варианте реализации вариабельные домены, используемые в полипептиде настоящего изобретения, изменяют за счет по меньшей мере частичной замены одного или нескольких CDR. В другом варианте реализации в некоторых случаях могут изменять вариабельные домены, например, за счет частичной замены каркасной области и изменения последовательности. При составлении гуманизированной вариабельной области CDR можно получить из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого получают каркасные области, однако подразумевается, что CDR будут получены из антитела другого класса и предпочтительно из антитела из другого вида. Возможно, не понадобится заменять все CDR на полные CDR из донорской вариабельной области для переноса антигенсвязывающей способности одного вариабельного домена на другой. Скорее, возможно, только понадобится перенос тех остатков, которые необходимы для поддержания активности связывающего домена. Учитывая объяснения, изложенные в патентах США № 5585089, 5693761 и 5693762, вполне в пределах компетенции специалистов в данной области техники находится получение функционального антигенсвязывающего сайта со сниженной иммуногенностью либо за счет проведения обычного исследования, либо за счет тестирования методом проб и ошибок.In one embodiment, the implementation of the variable domains used in the polypeptide of the present invention, change due to at least partial replacement of one or more CDRs. In another embodiment, the variable domains may be altered in some cases, for example, by partially replacing the framework region and altering the sequence. When constructing a humanized variable region, the CDRs may be derived from an antibody of the same class, or even subclass, as the antibody from which the framework regions are derived, however, it is understood that the CDRs will be derived from a different class of antibody, and preferably from an antibody from a different species. It may not be necessary to replace all CDRs with full CDRs from the donor variable region to transfer the antigen-binding capacity of one variable domain to another. Rather, it may only be necessary to transfer those residues that are necessary to maintain the activity of the binding domain. Given the explanations set forth in US Pat.

FC5, который является иллюстративным ТМЕМ30А-связывающим фрагментом, можно встроить в полипептид настоящего изобретения. Аминокислотная последовательность Fc5 изложена ниже.FC5, which is an exemplary TMEM30A binding fragment, can be inserted into a polypeptide of the present invention. The amino acid sequence of Fc5 is set out below.

EVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMEVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTM

GWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRF TISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTS TATPLRV---DYWGKGTQVTVSSGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRF TISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTS TATPLRV---DYWGKGTQVTVSS

III. Выборочные линкерные пептиды.III. Selected linker peptides.

Полипептиды настоящего изобретения в некоторых случаях включают по меньшей мере один линкерный пептид. В одном варианте реализации в полипептиде полипептида настоящего изобретения присутствуют два или более линкерных пептидов. В другом варианте реализации полипептид настоящего изобретения содержит 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 линкерных пептидов.The polypeptides of the present invention in some cases include at least one linker peptide. In one embodiment, two or more linker peptides are present in a polypeptide of the present invention. In another embodiment, the implementation of the polypeptide of the present invention contains 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 linker peptides.

Линкерные пептиды настоящего изобретения могут встречаться один раз в заданном положенииLinker peptides of the present invention may occur once at a given position

- 13 040195 или могут встречаться многократно (т.е. последовательность линкерного пептида может повторяться х раз в последовательности) в заданном положении в рекомбинантном полипептиде. Например, в одном варианте реализации линкерный пептид настоящего изобретения повторяется в заданном положении в полипептиде от 1 до 10 раз (включительно). В другом варианте реализации линкерный пептид встречается в заданном положении в полипептиде 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз.- 13 040195 or may occur multiple times (ie the sequence of the linker peptide may be repeated x times in sequence) at a given position in the recombinant polypeptide. For example, in one embodiment, the implementation of the linker peptide of the present invention is repeated at a given position in the polypeptide from 1 to 10 times (inclusive). In another embodiment, the linker peptide occurs at a given position in the polypeptide 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 times.

Линкерные пептиды настоящего изобретения могут иметь разную длину. В одном варианте реализации длина линкерного пептида настоящего изобретения составляет от примерно 5 до примерно 75 аминокислот. В другом варианте реализации длина линкерного пептида настоящего изобретения составляет от примерно 5 до примерно 50 аминокислот. В другом варианте реализации длина линкерного пептида настоящего изобретения составляет от примерно 10 до примерно 40 аминокислот. В другом варианте реализации длина линкерного пептида настоящего изобретения составляет от примерно 15 до примерно 35 аминокислот. В другом варианте реализации длина линкерного пептида настоящего изобретения составляет от примерно 15 до примерно 20 аминокислот. В другом варианте реализации длина линкерного пептида настоящего изобретения составляет 15 аминокислот.The linker peptides of the present invention can be of various lengths. In one embodiment, the length of the linker peptide of the present invention is from about 5 to about 75 amino acids. In another embodiment, the length of the linker peptide of the present invention is from about 5 to about 50 amino acids. In another embodiment, the length of the linker peptide of the present invention is from about 10 to about 40 amino acids. In another embodiment, the length of the linker peptide of the present invention is from about 15 to about 35 amino acids. In another embodiment, the length of the linker peptide of the present invention is from about 15 to about 20 amino acids. In another embodiment, the length of the linker peptide of the present invention is 15 amino acids.

Линкерные пептиды так часто используются в белковой инженерии, что они стали стандартными компонентами сборки в синтетической биологии (см., например, Anderson, J.C. et al., Journal of Biological Engineering, 2010, 4:1; и веб-сайт partsregistry, на котором приводится перечень стандартных биологических компонентов, используемых в генетических конструктах).Linker peptides are so commonly used in protein engineering that they have become standard assembly components in synthetic biology (see, for example, Anderson, J.C. et al., Journal of Biological Engineering, 2010, 4:1; and the partsregistry website, where a list of standard biological components used in genetic constructs is given).

Некоторые примеры текущих, принятых в настоящем уровне техники применений для линкерных пептидов включают применения в молекулах scFv (Freund et al., FEBS, 1993, 320:97); одноцепочечных иммуноглобулиновых молекулах (Shu et al., 1993, PNAS, USA, 90:7995); миниантителах (Hu et al., 1996, Cancer Res., 56:3055); CH2-антителах с удаленными доменами (Mueller, B.M. et al., 1990, PNAS, USA, 87:5702); одноцепочечных биспецифических антителах (Schlerethe et al., 2005, Cancer Res., 65:2882); полноразмерных IgG-подобных биспецифических антителах (Marvin, J.S. et al., 2005, Acta Pharmacol Sin 26:649; источники, цитированные в данном документе, а также Michaelson, J.S. et al., 2009, MAbs., 1:128; и Orcutt K.D. et al., 2010, Protein Eng Des Sel., 23:221); слитых белках scFv (deGraaf et al., 2002, British Journal of Cancer, 86:811); разработке анализов комплементации фрагментов белка (Remy, I. et al., 2007, BioTechiques, 42:137).Some examples of current, state of the art applications for linker peptides include applications in scFv molecules (Freund et al., FEBS, 1993, 320:97); single chain immunoglobulin molecules (Shu et al., 1993, PNAS, USA, 90:7995); miniantibodies (Hu et al., 1996, Cancer Res., 56:3055); domain-deleted CH2 antibodies (Mueller, B.M. et al., 1990, PNAS, USA, 87:5702); single chain bispecific antibodies (Schlerethe et al., 2005, Cancer Res., 65:2882); full-length IgG-like bispecific antibodies (Marvin, J.S. et al., 2005, Acta Pharmacol Sin 26:649; references cited herein and Michaelson, J.S. et al., 2009, MAbs., 1:128; and Orcutt K.D. et al., 2010, Protein Eng Des Sel., 23:221); scFv fusion proteins (deGraaf et al., 2002, British Journal of Cancer, 86:811); development of protein fragment complementation assays (Remy, I. et al., 2007, BioTechiques, 42:137).

Другие иллюстративные линкерные пептиды включают те пептиды, которые восстанавливают ксилозу (например, как раскрыто в PCT/US11/66947), и их можно использовать в настоящих связывающих молекулах.Other exemplary linker peptides include those that reduce xylose (eg, as disclosed in PCT/US11/66947) and can be used in the present linking molecules.

Линкерные пептиды можно присоединять к N- или к C-концу (или к обоим) полипептидов, к которым их присоединяют.Linker peptides can be attached to the N- or C-terminus (or both) of the polypeptides to which they are attached.

IV. Иллюстративные фармацевтически активные фрагменты.IV. Illustrative pharmaceutically active fragments.

В зависимости от болезни, или нарушения, или состояния, на которые нацелено лечение, можно успешно доставлять in vivo множество грузов с лекарственными средствами, например фармакологически активными средствами или эквивалентно фармацевтически активными фрагментами с использованием связывающих молекул настоящего изобретения, например связывающих молекул, содержащих сайты, обеспечивающие перенос через ГЭБ в соответствии с настоящим изобретением, например нацеленные на ТМЕМ30А. Как используется в данном документе, выражения фармацевтически активный фрагмент и фармакологическое соединение должны относиться к любому фрагменту или соединению, приносящему пользу в лечении или уменьшении неблагоприятных последствий болезни или нарушения. Например, лечение может быть направлено на болезни или нарушения, включая нейродегенеративные болезни, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз (БАС, болезнь Лу Герига), эпилепсия, вызывающая боль, болезни накопления и рассеянный склероз.Depending on the disease or disorder or condition being treated, a variety of drug shipments, e.g., pharmacologically active agents or equivalently pharmaceutically active moieties, can be successfully delivered in vivo using the binding molecules of the present invention, e.g., binding molecules containing sites providing transport through the BBB in accordance with the present invention, for example, targeting TMEM30A. As used herein, the expressions pharmaceutically active moiety and pharmacological compound should refer to any moiety or compound that is beneficial in the treatment or reduction of adverse effects of a disease or disorder. For example, treatment may be directed to diseases or disorders including neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS, Lou Gehrig's disease), epilepsy causing pain, storage diseases, and multiple sclerosis.

Иллюстративные фармацевтически активные молекулы включают фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF) и инсулиноподобный фактор роста (IGF). В дополнение к этому другими соединениями, которые, как было показано, имеют терапевтический потенциал и могут доставляться с помощью антител настоящего изобретения, являются нейропептиды, включая, но без ограничений, вещество Р, нейропептид Y, даларгин, альфа-синуклеин, вазоактивный интестинальный пептид (ВИП), гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК), дофамин, холецистокинин (ХЦК), эндорфины, энкефалины и тиреотропин-рилизинг-гормон (ТРГ). Дополнительно иллюстративные терапевтические средства могут включать цитокины, анксиолитические средства, противосудорожные средства, полинуклеотиды и трансгены, включая, например, малые интерферирующие РНК, которые можно использовать для таких нервных нарушений, включая, но без ограничений, психические болезни, такие как, например, тревожность, депрессия, шизофрения и нарушения сна, а также эпилепсии, судорожные расстройства, инсульт и цереброваскулярные нарушения, энцефалит и менингит, нарушения памяти и познавательных способностей, острая или хроническая боль (например, не поддающаяся лечению) и физическая травма.Exemplary pharmaceutically active molecules include nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), and insulin-like growth factor (IGF). In addition, other compounds that have been shown to have therapeutic potential and can be delivered using the antibodies of the present invention are neuropeptides, including, but not limited to, substance P, neuropeptide Y, dalargin, alpha-synuclein, vasoactive intestinal peptide ( VIP), gamma-aminobutyric acid (GABA), dopamine, cholecystokinin (CCK), endorphins, enkephalins, and thyrotropin-releasing hormone (TRH). Additionally, exemplary therapeutic agents may include cytokines, anxiolytics, anticonvulsants, polynucleotides, and transgenes, including, for example, small interfering RNAs that can be used for such neurological disorders, including, but not limited to, mental illnesses such as, for example, anxiety, depression, schizophrenia and sleep disturbances, as well as epilepsy, convulsive disorders, stroke and cerebrovascular disorders, encephalitis and meningitis, memory and cognition disorders, acute or chronic pain (eg, untreatable), and physical trauma.

В одном варианте реализации фармацевтически активный фрагмент содержит антигенсвязывающий сайт, который не связывается с ТМЕМ30А. В определенных вариантах реализации полипептиды настоя- 14 040195 щего изобретения имеют по меньшей мере один сайт связывания, специфичный к молекуле-мишени, отличной от ТМЕМ30А, которая опосредует биологический эффект. В одном варианте реализации сайт связывания регулирует активацию или ингибирование реакций в клетках (например, за счет связывания с рецептором клеточной поверхности, за счет того что в результате происходит прохождение активирующего или ингибирующего сигнала). В одном варианте реализации сайт связывания способен инициировать передачу сигнала, который приводит к гибели клетки (например, за счет клеточного пути, индуцированного сигналом, за счет фиксации комплемента или воздействия на груз (например, токсичный груз), который присутствует на связывающей молекуле) или который влияет на болезнь или нарушение у субъекта (например, за счет того что он опосредует или стимулирует уничтожение клеток, стимулирует фибринолиз, или стимулирует образование сгустка, или влияет на количество вещества, которое будет биодоступным. В другом варианте реализации полипептиды настоящего изобретения имеют по меньшей мере один сайт связывания, специфичный к антигену, который хотят элиминировать частично или полностью, например антиген клеточной поверхности или растворимый антиген).In one embodiment, the pharmaceutically active fragment contains an antigen-binding site that does not bind to TMEM30A. In certain embodiments, the polypeptides of the present invention have at least one binding site specific for a target molecule other than TMEM30A that mediates the biological effect. In one embodiment, the binding site regulates the activation or inhibition of responses in cells (eg, by binding to a cell surface receptor, resulting in an activating or inhibitory signal). In one embodiment, the binding site is capable of initiating signal transduction that results in cell death (e.g., via a signal-induced cellular pathway, complement fixation, or exposure to a cargo (e.g., toxic cargo) that is present on the binding molecule) or that affects a disease or disorder in a subject (e.g., by mediating or promoting cell death, promoting fibrinolysis, or promoting clot formation, or affecting the amount of a substance that will be bioavailable. In another embodiment, the polypeptides of the present invention have at least one binding site specific for the antigen that is desired to be eliminated partially or completely, such as cell surface antigen or soluble antigen).

В других же вариантах реализации полипептид настоящего изобретения связывается с молекулой, которая обладает полезными свойствами для лечения неврологической болезни или нарушения. Например, полипептид может связываться с антигеном, который присутствует на нервной клетке (например, нейрон, глиальная клетка или a). В определенных вариантах реализации антиген, связанный с неврологическим нарушением, может быть связан с аутоиммунным или воспалительным нарушением, описанным выше. Как используется в данном документе, выражение неврологическая болезнь или нарушение включает нарушения или состояния у субъекта, отличающиеся тем, что нервная система в равной степени дегенерирует (например, нейродегенеративные нарушения, а также нарушения, при которых нервная система не в состоянии развиваться надлежащим образом или не в состоянии регенерировать после повреждения, например повреждения спинного мозга). Примеры неврологических нарушений, которые можно диагностировать, предотвращать или лечить с помощью способов и композиций настоящего изобретения, включают, но без ограничений, рассеянный склероз, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, нейропатическую боль, травматическое повреждение головного мозга, синдром Гийена-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (ХВДП).In other embodiments, the implementation of the polypeptide of the present invention is associated with a molecule that has useful properties for the treatment of a neurological disease or disorder. For example, the polypeptide can bind to an antigen that is present on a nerve cell (eg, a neuron, glial cell, or a). In certain embodiments, an antigen associated with a neurological disorder may be associated with an autoimmune or inflammatory disorder as described above. As used herein, the term neurological disease or disorder includes disorders or conditions in a subject characterized in that the nervous system is equally degenerative (e.g., neurodegenerative disorders, as well as disorders in which the nervous system fails to develop properly or fails to able to regenerate after injury, such as spinal cord injury). Examples of neurological disorders that can be diagnosed, prevented, or treated using the methods and compositions of the present invention include, but are not limited to, multiple sclerosis, Huntington's disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, neuropathic pain, traumatic brain injury, Guillain-Barré syndrome, and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).

Дополнительные иллюстративные фармакологически активные фрагменты обсуждаются дополнительно ниже.Additional illustrative pharmacologically active fragments are discussed further below.

i. Антигенсвязывающие участки.i. antigen binding sites.

В определенных вариантах реализации фармацевтически активный фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий участок (сайт связывания), например, антитела или однодоменного антитела. В одном варианте реализации антигенсвязывающий участок направляет композицию в клетки или ткань определенного типа клеток.In certain embodiments, the pharmaceutically active fragment contains at least one antigen-binding site (binding site), for example, an antibody or a single domain antibody. In one embodiment, the antigen binding site directs the composition to cells or tissue of a specific cell type.

В других вариантах реализации сайт связывания фармацевтически активного фрагмента настоящего изобретения может содержать антигенсвязывающий участок или фрагмент. Выражение антигенсвязывающий участок относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина, антителу или варианту антитела, который связывает антиген или конкурирует с интактным антителом (т.е. с интактным антителом, из которого их получили) за связывание антигена (т.е. специфическое связывание). Например, антигенсвязывающие фрагменты можно получить из антител или вариантов антител, описанных выше.In other embodiments, the binding site of a pharmaceutically active fragment of the present invention may contain an antigen-binding site or fragment. The term antigen-binding site refers to an immunoglobulin polypeptide fragment, antibody, or antibody variant that binds an antigen or competes with an intact antibody (i.e., the intact antibody from which it was derived) for antigen binding (i.e., specific binding). For example, antigen-binding fragments can be obtained from antibodies or antibody variants described above.

Антигенсвязывающие участки можно получить с помощью рекомбинантных или биохимических способов, которые хорошо известны в настоящем уровне техники. Иллюстративные антиген-связывание фрагменты включают VH и/или V_L (если и той, и другой вариабельной области отдельно достаточно для связывания антигена), Fv, Fab, Fab' и (Fab')₂.Antigen binding sites can be obtained using recombinant or biochemical methods, which are well known in the present level of technology. Illustrative antigen-binding fragments include VH and/or V _L (if both variable regions alone are sufficient for antigen binding), Fv, Fab, Fab' and (Fab') ₂ .

В других вариантах реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения может содержать сайт связывания из одноцепочечной связывающей молекулы (например, одноцепочечной вариабельной области или scFv). Методики, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США № 4694778; Bird, Science, 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5879-5883 (1988); и Ward et al., Nature, 334:544-554 (1989)), можно адаптировать для получения одноцепочечных связывающих молекул. Одноцепочечные антитела образуются за счет соединения фрагментов тяжелой и легкой цепи FV-области через аминокислотный мостик, что приводит к образованию одноцепочечного антитела. Также можно использовать методики для сборки функциональных Fv-фрагментов у E.coli (Skerra et al., Science, 242:1038-1041 (1988)).In other embodiments, the pharmaceutically active fragment of the present invention may contain a binding site from a single chain binding molecule (eg, single chain variable region or scFv). Methods described for the production of single chain antibodies (U.S. Patent No. 4,694,778; Bird, Science, 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5879-5883 (1988) ; and Ward et al., Nature, 334:544-554 (1989)), can be adapted to produce single-stranded binding molecules. Single chain antibodies are formed by connecting fragments of the heavy and light chain of the FV region through an amino acid bridge, which leads to the formation of a single chain antibody. You can also use methods for the assembly of functional Fv fragments in E. coli (Skerra et al., Science, 242:1038-1041 (1988)).

В определенных вариантах реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит один или несколько сайтов связывания или областей, содержащих или состоящих из последовательности одноцепочечной вариабельной области (scFv). Последовательности одноцепочечной вариабельной области включают один полипептид, имеющий один или несколько антигенсвязывающих сайтов, например VL-домен, соединенный через линкерный пептид с VH-доменом. V_L- и/или VH-домены можно получить из антител, известных в настоящем уровне техники, или их вариантов. Молекулы ScFv можно сконструировать в ориентации V_H-линкер-V_Lили ориентации V_L-линкер-V_H.In certain embodiments, the pharmaceutically active fragment of the present invention comprises one or more binding sites or regions containing or consisting of a single chain variable region (scFv) sequence. Single chain variable region sequences include a single polypeptide having one or more antigen binding sites, such as a VL domain connected via a linker peptide to a VH domain. V _L - and/or VH domains can be obtained from antibodies known in the present level of technology, or variants thereof. ScFv molecules can be designed in the V _H -linker-V _L orientation or the V _L -linker-V _H orientation.

В определенных вариантах реализации молекула scFv, используемая в фармацевтически активном фрагменте настоящего изобретения, представляет собой стабилизированную молекулу scFv. В одномIn certain embodiments, the scFv molecule used in the pharmaceutically active moiety of the present invention is a stabilized scFv molecule. In one

- 15 040195 варианте реализации стабилизированная молекула scFv может содержать линкерный пептид, размещенный между VH-доменом и VL-доменом, и отличается тем, что VH- и VL-домены соединяются посредством дисульфидной связи между аминокислотой в V_H- и аминокислотой в VL-домене. В других вариантах реализации стабилизированная молекула scFv может содержать scFv-линкер, имеющий оптимизированную длину или композицию. В других же вариантах реализации стабилизированная молекула scFv может содержать V_H- или VL-домен, имеющий по меньшей мере одну стабилизирующую(ие) аминокислотную(ые) замену(ы). Еще в одном варианте реализации стабилизированная молекула scFv может иметь по меньшей мере два вышеперечисленных стабилизирующих признака.- 15 040195 embodiment, the stabilized scFv molecule may contain a linker peptide located between the VH domain and the VL domain, and is characterized in that the VH and VL domains are connected via a disulfide bond between the amino acid in the V _H - and the amino acid in the VL domain . In other embodiments, the stabilized scFv molecule may contain an scFv linker having an optimized length or composition. In other embodiments, the stabilized scFv molecule may contain a V _H - or VL domain having at least one stabilizing(s) amino acid(s) substitution(s). In yet another embodiment, the stabilized scFv molecule may have at least two of the above stabilizing features.

Стабилизированные молекулы ScFv имеют улучшенную стабильность белка или придают улучшенную стабильность белка полипептиду, с которым они функционально связаны. Иллюстративные стабилизированные молекулы ScFv, которые могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения, описаны в заявке на патент США № 11/725970, поданной 19 марта 2007 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в ее полноте.Stabilized ScFv molecules have improved protein stability or confer improved protein stability on the polypeptide to which they are operably linked. Exemplary stabilized ScFv molecules that may be present in the polypeptides of the present invention are described in US Patent Application No. 11/725,970, filed March 19, 2007, which is incorporated herein by reference in its entirety.

В определенных иллюстративных вариантах реализации фармацевтически активные фрагменты настоящего изобретения включают по меньшей мере одну молекулу scFv, которая функционально связана через линкерный пептид с C-концом и/или N-концом Fc-области.In certain exemplary embodiments, the pharmaceutically active fragments of the present invention comprise at least one scFv molecule that is operably linked via a linker peptide to the C-terminus and/or N-terminus of the Fc region.

В одном варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит по меньшей мере одну CDR из антитела, которое распознает желаемую мишень. В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит по меньшей мере две CDR из антитела, которое распознает желаемую мишень. В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит по меньшей мере три CDR из антитела, которое распознает желаемую мишень. В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит по меньшей мере четыре CDR из антитела, которое распознает желаемую мишень. В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит по меньшей мере пять CDR из антитела, которое распознает желаемую мишень. В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит все шесть CDR из антитела, которое распознает желаемую мишень. В одном варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит полную аминокислотную последовательность молекулы антитела, которая распознает желаемую мишень (например, в случае биспецифической, четырехвалентной молекулы антитела).In one embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains at least one CDR from an antibody that recognizes the desired target. In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains at least two CDRs from an antibody that recognizes the desired target. In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains at least three CDRs from an antibody that recognizes the desired target. In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains at least four CDRs from an antibody that recognizes the desired target. In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains at least five CDRs from an antibody that recognizes the desired target. In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains all six CDRs from an antibody that recognizes the desired target. In one embodiment, a pharmaceutically active fragment of the present invention contains the complete amino acid sequence of an antibody molecule that recognizes the desired target (eg, in the case of a bispecific, tetravalent antibody molecule).

Иллюстративные антитела, из которых можно получить сайты связывания для использования в фармацевтически активном фрагменте настоящего изобретения, известны в настоящем уровне техники. Например, антитела, которые в настоящее время одобрены FDA для использования в лечении, можно использовать для получения сайтов связывания. В одном варианте реализации иллюстративный сайт связывания получают из антитела к Lingo (см., например, PCT/US2008/000316).Exemplary antibodies from which binding sites can be derived for use in a pharmaceutically active moiety of the present invention are known in the art. For example, antibodies that are currently approved by the FDA for use in treatment can be used to generate binding sites. In one embodiment, an exemplary binding site is derived from an anti-Lingo antibody (see, for example, PCT/US2008/000316).

В других аспектах фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения может содержать модифицированную молекулу антитела или антигенсвязывающий сайт (или их участки), полученные из модифицированной формы антитела. Такие иллюстративные формы включают, например, миниантитела, диатела, триотела, нанотела, camelids, Dabs, четырехвалентные антитела, интрадиатела (например, Jendreyko et al., 2003, J. Biol. Chem., 278:47813), слитые белки (например, слитые белки антитело-цитокин, белки, слитые, по меньшей мере, с участком Fc-рецептора) и биспецифические антитела. Другие модифицированные антитела описаны, например, в патенте США № 4745055; EP 256654; Faulkner et al., Nature, 298:286 (1982); EP 120694; EP 125023; Morrison, J., Immun., 123:793 (1979); Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res., 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2:239 (1984); Morrison, Science, 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851 (1984); EP 255694, EP 266663 и WO 88/03559. Реаранжированные иммуноглобулиновые цепи также известны. См., например, патент США № 4444878, WO 88/03565 и EP 68763 и источники, цитированные в данном документе.In other aspects, a pharmaceutically active fragment of the present invention may contain a modified antibody molecule or an antigen-binding site (or portions thereof) derived from a modified form of an antibody. Such exemplary forms include, for example, minibodies, diabodies, tribodies, nanobodies, camelids, Dabs, tetravalent antibodies, intradiabodies (e.g., Jendreyko et al., 2003, J. Biol. Chem., 278:47813), fusion proteins (e.g., antibody-cytokine fusion proteins, proteins fused to at least an Fc receptor site) and bispecific antibodies. Other modified antibodies are described, for example, in US patent No. 4745055; EP 256654; Faulkner et al. Nature 298:286 (1982); EP 120694; EP 125023; Morrison, J., Immun., 123:793 (1979); Kohler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980); Raso et al. Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science, 229:1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); EP 255694, EP 266663 and WO 88/03559. Rearranged immunoglobulin chains are also known. See, for example, US patent No. 4444878, WO 88/03565 and EP 68763 and sources cited in this document.

В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит антигенсвязывающий сайт или область, которая представляет собой диатело или антигенсвязывающий сайт, полученный из него. Диатела представляют собой димерные, четырехвалентные молекулы, причем каждая молекула состоит из полипептида, похожего на молекулы ScFv, но обычно имеет короткий линкер из аминокислотных остатков (например, менее чем 10 и предпочтительно 1-5), соединяющих оба вариабельных домена таким образом, что V_L- и VH-домены на одной и той же полипептидной цепи не могут взаимодействовать. Вместо этого V_L- и VH-домены одной полипептидной цепи взаимодействуют с V_H- и VL-доменами (соответственно) на второй полипептидной цепи (см., например, WO 02/02781). В одном варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит диатело, которое функционально связано с N-концом и/или С-концом по меньшей мере одной Fc-области, слитой на уровне гена (т.е. scFc-области).In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains an antigen-binding site or region, which is a diabody or an antigen-binding site derived from it. Diabodies are dimeric, tetravalent molecules, with each molecule consisting of a polypeptide similar to ScFv molecules, but typically having a short linker of amino acid residues (e.g. less than 10 and preferably 1-5) linking both variable domains such that V _L - and VH-domains on the same polypeptide chain cannot interact. Instead, the V _L and VH domains of one polypeptide chain interact with the V _H and VL domains (respectively) on the second polypeptide chain (see, for example, WO 02/02781). In one embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention comprises a diabody that is operably linked to the N-terminus and/or C-terminus of at least one Fc region fused at the gene level (ie scFc region).

В определенных вариантах реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит сайт связывания антитела, не обеспечивающий перенос через ГЭБ (например, однодоменная связывающая молекула, которая не связывает ТЕМЕ30А, такая как однодоменное антитело).In certain embodiments, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains an antibody binding site that does not allow transport across the BBB (eg, a single domain binding molecule that does not bind TEME30A, such as a single domain antibody).

- 16 040195 ii. Связывающие молекулы неиммуноглобулиновой природы.- 16 040195 ii. Binding molecules of non-immunoglobulin nature.

В определенных других вариантах реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит один или несколько сайтов связывания, полученных из связывающих молекул неиммуноглобулиновой природы. Как используется в данном документе, выражение неиммуноглобулиновой природы связывающие молекулы представляют собой связывающие молекулы, чьи сайты связывания включают аминокислотную последовательность, полученную из полипептида, отличного от иммуноглобулина. Примеры связывающих молекул, содержащих сайты связывания, полученные не из молекул антител, включают сайты, связывающие рецептор, и сайты, связывающие лиганд, которые обсуждаются более подробно ниже.In certain other embodiments, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains one or more binding sites derived from non-immunoglobulin binding molecules. As used herein, the expression of a non-immunoglobulin nature binding molecules are binding molecules whose binding sites include an amino acid sequence derived from a polypeptide other than immunoglobulin. Examples of binding molecules containing binding sites not derived from antibody molecules include receptor binding sites and ligand binding sites, which are discussed in more detail below.

Фармацевтически активные фрагменты неиммуноглобулиновой природы могут содержать аминокислотные последовательности, которые получают из представителя суперсемейства иммуноглобулинов, который не является иммуноглобулином (например, Т-клеточный рецептор или белок клеточной адгезии (например, CTLA-4, N-CAM, телокин)). В других вариантах реализации аминокислотные последовательности могут составлять топологию белка, которая не основана на укладке цепи иммуноглобулинов (например, такая как у белков с анкириновым повтором или фибронектинов), но которая тем не менее способна специфически связываться с мишенью.Pharmaceutically active fragments of a non-immunoglobulin nature may contain amino acid sequences that are derived from a member of the immunoglobulin superfamily that is not an immunoglobulin (eg, T-cell receptor or cell adhesion protein (eg, CTLA-4, N-CAM, telokin)). In other embodiments, amino acid sequences may constitute a protein topology that is not based on the folding of an immunoglobulin chain (eg, such as ankyrin repeat proteins or fibronectins), but that is nevertheless capable of specifically binding to a target.

Фармацевтически активные фрагменты неиммуноглобулиновой природы можно идентифицировать путем отбора или выделения варианта, связывающего мишень, из библиотеки связывающих молекул, имеющих разнообразные сайты связывания, полученные искусственным способом. С использованием полностью произвольных подходов (например, ПЦР пониженной точности, перетасовка экзонов или направленная эволюция) или при помощи принятых в данной области техники стратегий конструирования можно составить разнообразные библиотеки. Например, положения аминокислот, которые обычно вовлекаются, когда сайт связывания взаимодействует со своей родственной молекулой-мишенью, можно рандомизировать путем вставки вырожденных кодонов, тринуклеотидов, произвольных пептидов или полных петель в соответствующих положениях в пределах нуклеиновой кислоты, которая кодирует сайт связывания (см., например, публикацию заявки на патент США 20040132028). Локализацию положений аминокислот можно идентифицировать путем исследования кристаллической структуры сайта связывания в комплексе с молекулой-мишенью. Возможные положения для рандомизации включают петли, плоские поверхности, спирали и связывающие полости сайта связывания. В определенных вариантах реализации аминокислоты в пределах сайта связывания, которые являются вероятными кандидатами для введения разнообразия, можно идентифицировать по их гомологии с укладкой цепи иммуноглобулинов. Например, для создания библиотеки молекул, связывающих фибронектин, можно рандомизировать остатки в пределах CDR-подобных петель фибронектина (см., например, Koide et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151 (1998)). Другие участки сайта связывания, которые можно рандомизировать, включают плоские поверхности. Отбор можно производить с помощью принятых в данной области техники способов, таких как фаговый дисплей, дрожжевой дисплей или рибосомный дисплей.Pharmaceutically active fragments of a non-immunoglobulin nature can be identified by selecting or isolating a target-binding variant from a library of binding molecules having a variety of artificially generated binding sites. A variety of libraries can be constructed using completely arbitrary approaches (eg, reduced fidelity PCR, exon shuffling, or directed evolution) or using art-recognized construction strategies. For example, amino acid positions that are normally involved when the binding site interacts with its cognate target molecule can be randomized by inserting degenerate codons, trinucleotides, arbitrary peptides, or complete loops at appropriate positions within the nucleic acid that encodes the binding site (see, for example, U.S. Patent Application Publication 20040132028). The localization of amino acid positions can be identified by examining the crystal structure of the binding site in complex with the target molecule. Possible positions for randomization include loops, flat surfaces, coils, and binding site binding cavities. In certain embodiments, amino acids within the binding site that are likely candidates for introducing diversity can be identified by their homology with the immunoglobulin chain fold. For example, to create a library of fibronectin binding molecules, residues within CDR-like fibronectin loops can be randomized (see, for example, Koide et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151 (1998)). Other areas of the binding site that can be randomized include flat surfaces. Selection can be made using methods accepted in the art, such as phage display, yeast display, or ribosome display.

В одном варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит сайт связывания из молекулы, связывающей фибронектин. Молекулы, связывающие фибронектин (например, молекулы, содержащие домены фибронектина типа I, II или III), демонстрируют CDR-подобные петли, которые в отличие от иммуноглобулинов не зависят от внутрицепочечных дисульфидных связей. Способы получения полипептидов на основе фибронектина описаны, например, в WO 01/64942 и в патентах США № 6673901, 6703199, 7078490 и 7119171, которые включены в данный документ посредством ссылки. В одном иллюстративном варианте реализации полипептидом на основе фибронектина является AdNectin® (Adnexus Therpaeutics, Waltham, MA).In one embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains a binding site from a fibronectin binding molecule. Fibronectin-binding molecules (eg, those containing fibronectin type I, II, or III domains) exhibit CDR-like loops that, unlike immunoglobulins, do not depend on intrachain disulfide bonds. Methods for producing polypeptides based on fibronectin are described, for example, in WO 01/64942 and US Pat. In one exemplary embodiment, the fibronectin polypeptide is AdNectin® (Adnexus Therpaeutics, Waltham, MA).

В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит сайт связывания из Affibody® (Abcam, Cambridge, MA). Аффитела получают из иммуноглобулин-связывающих доменов стафилококкового белка A (SPA) (см. например, Nord et al., Nat. Biotechnol., 15:772-777 (1997)). Способы получения сайтов связывания аффитела описаны в патентах США 6740734 и 6602977; и в WO 00/63243, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains a binding site from Affibody® (Abcam, Cambridge, MA). Affitels are derived from the immunoglobulin-binding domains of staphylococcal protein A (SPA) (see, for example, Nord et al., Nat. Biotechnol., 15:772-777 (1997)). Methods for obtaining affitel binding sites are described in US Pat. Nos. 6,740,734 and 6,602,977; and WO 00/63243, each of which is incorporated herein by reference.

В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит сайт связывания из Anticalin® (Pieris AG, Friesing, Germany). Антикалины (также известные как липокалины) являются представителями разнообразного семейства белков, имеющих структуру типа β-бочонка, чья функция заключается в связывании молекул-мишеней в области бочонка/петли. Сайты связывания липокалина можно сконструировать путем рандомизации последовательностей петель, соединяющих цепи бочонка (см. например, Schlehuber et al., Drug Discov. Today, 10:23-33 (2005); Beste et al., PNAS, 96:1898-1903 (1999)). Сайты связывания антикалина, которые используются в связывающих молекулах настоящего изобретения, можно получить исходя из полипептидов семейства липокалинов, которые подвергаются мутациям в четырех сегментах, которые соответствуют положениям последовательностей линейной полипептидной последовательности, содержащей аминокислоты в положениях от 28 до 45, от 58 до 69, от 86 до 99 и от 114 до 129 билин-связывающего белка (ВВР) Pieris brassica. Другие способы получения сайтов связывания антикалина описаны в WO 99/16873 и WO 05/019254, каждый из которыхIn another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains a binding site from Anticalin® (Pieris AG, Friesing, Germany). Anticalins (also known as lipocalins) are members of a diverse family of β-barrel-type proteins whose function is to bind target molecules in the barrel/loop region. Lipocalin binding sites can be designed by randomizing the loop sequences connecting the barrel chains (see, for example, Schlehuber et al., Drug Discov. Today, 10:23-33 (2005); Beste et al., PNAS, 96:1898-1903 ( 1999)). The anticalin binding sites that are used in the binding molecules of the present invention can be derived from lipocalin family polypeptides that undergo mutations in four segments that correspond to the sequence positions of a linear polypeptide sequence containing amino acids at positions 28 to 45, 58 to 69, from 86 to 99 and 114 to 129 bilin-binding protein (BBP) Pieris brassica. Other methods for obtaining anticalin binding sites are described in WO 99/16873 and WO 05/019254, each of which

- 17 040195 включен в данный документ посредством ссылки.- 17 040195 is incorporated herein by reference.

В другом варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит сайт связывания из богатого цистеином полипептида. Богатые цистеином домены, которые используются в практике настоящего изобретения, как правило, не образуют структуру α-спирали, β-листа или β-бочонка. Как правило, дисульфидные связи способствуют укладке домена в трехмерную структуру. Обычно богатые цистеином домены имеют по меньшей мере две дисульфидные связи, чаще по меньшей мере три дисульфидные связи. Иллюстративным богатым цистеином полипептидом является A-домен белка. A-домены (иногда называемые повторы типа комплемента ) содержат примерно 30-50 или 30-65 аминокислот. В некоторых вариантах реализации домены включают примерно 35-45 аминокислот и в некоторых случаях примерно 40 аминокислот. В пределах 30-50 аминокислот находится примерно 6 остатков цистеина. Из шести цистеинов дисульфидные связи, как правило, обнаруживаются между следующими цистеинами: C1 и C3, C2 и C5, C4 и C6. Домен составляет лиганд-связывающий фрагмент. Остатки цистеина домена связываются посредством дисульфидной связи с образованием компактного, стабильного, функционально независимого фрагмента. Кластеры этих повторов составляют лигандсвязывающий домен, и дифференциальная кластеризация может придавать специфичность по отношению к связыванию лиганда. Иллюстративные белки, содержащие А-домены, включают, например, компоненты комплемента (например, C6, C7, C8, C9 и фактор I), сериновые протеазы (например, энтеропептидазу, матриптазу и корин), трансмембранные белки (например, ST7, LRP3, LRP5 и LRP6) и эндоцитируемые рецепторы (например, сортилин-подобный рецептор, LDL-рецептор, VLDLR, LRP1, LRP2 и ApoER2). Способы получения A-доменных белков с желаемой специфичностью связывания раскрыты, например, в WO 02/088171 и WO 04/044011, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.In another embodiment, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains a binding site from a cysteine-rich polypeptide. The cysteine-rich domains that are used in the practice of the present invention generally do not form an α-helix, β-sheet, or β-barrel structure. As a rule, disulfide bonds contribute to the stacking of the domain into a three-dimensional structure. Typically, cysteine-rich domains have at least two disulfide bonds, more commonly at least three disulfide bonds. An exemplary cysteine-rich polypeptide is the A-domain of a protein. A-domains (sometimes called complement type repeats) contain approximately 30-50 or 30-65 amino acids. In some embodiments, domains include about 35-45 amino acids, and in some cases about 40 amino acids. There are approximately 6 cysteine residues within 30-50 amino acids. Of the six cysteines, disulfide bonds are typically found between the following cysteines: C1 and C3, C2 and C5, C4 and C6. The domain constitutes the ligand-binding fragment. The cysteine residues of the domain are linked via a disulfide bond to form a compact, stable, functionally independent fragment. Clusters of these repeats constitute the ligand-binding domain, and differential clustering can confer specificity for ligand binding. Exemplary proteins containing A domains include, for example, complement components (e.g., C6, C7, C8, C9, and factor I), serine proteases (e.g., enteropeptidase, matriptase, and corin), transmembrane proteins (e.g., ST7, LRP3, LRP5 and LRP6) and endocytosed receptors (eg, sortilin-like receptor, LDL receptor, VLDLR, LRP1, LRP2, and ApoER2). Methods for obtaining A-domain proteins with the desired binding specificity are disclosed, for example, in WO 02/088171 and WO 04/044011, each of which is incorporated herein by reference.

В других вариантах реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения содержит сайт связывания из повторяющегося белка. Повторяющиеся белки представляют собой белки, которые содержат последовательные копии небольших (например, от примерно 20 до примерно 40 аминокислотных остатков) структурных единиц или повторов, которые складываются вместе с образованием непрерывных доменов. За счет регуляции количества повторов в белке можно модифицировать повторяющиеся белки, чтобы они подходили для определенного целевого сайта связывания. Иллюстративные повторяющиеся белки включают сконструированные белки с анкириновым повтором (т.е. DARPins®, Molecular Partners, Zurich, Switzerland) (см., например, Binz et al., Nat. Biotechnol., 22:575582 (2004)) или богатые лейцином повторяющиеся белки (т.е. LRRP) (см., например, Pancer et al., Nature, 430:174-180 (2004)). Все установленные до настоящего времени третичные структуры единиц с анкириновым повтором имеют общую характерную особенность, состоящую из Р-шпильки с последующими двумя антипараллельными а-спиралями, и заканчивающуюся петлей, соединяющей данную единицу повтора со следующей. Домены, построенные из единиц с анкириновым повтором, образуются путем укладки единиц повтора с образованием протяженной и изогнутой структуры. Сайты связывания LRRP входят в состав адаптивной иммунной системы морских миног и других бесчелюстных рыб и имеют сходство с антителами в том отношении, что они образуются путем рекомбинации ряда генов богатых лейцином повторов на протяжении созревания лимфоцитов. Способы получения сайтов связывания DARpin или LRRP описаны в WO 02/20565 и WO 06/083275, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.In other embodiments, the pharmaceutically active fragment of the present invention contains a binding site from a repeating protein. Repeat proteins are proteins that contain consecutive copies of small (eg, about 20 to about 40 amino acid residues) building blocks or repeats that are added together to form continuous domains. By regulating the number of repeats in a protein, repeat proteins can be modified to suit a specific target binding site. Illustrative repeat proteins include engineered ankyrin repeat proteins (i.e. DARPins®, Molecular Partners, Zurich, Switzerland) (see, e.g., Binz et al., Nat. Biotechnol., 22:575582 (2004)) or leucine-rich repetitive proteins (i.e., LRRP) (see, for example, Pancer et al., Nature, 430:174-180 (2004)). All the tertiary structures of ankyrin repeat units established so far share a common feature consisting of a P-hairpin followed by two antiparallel a-helices, ending in a loop connecting this repeat unit to the next. Domains built from ankyrin repeat units are formed by stacking repeat units to form an extended and curved structure. LRRP binding sites are part of the adaptive immune system of sea lampreys and other jawless fish and are similar to antibodies in that they are formed by recombination of a number of leucine-rich repeat genes during lymphocyte maturation. Methods for obtaining DARpin or LRRP binding sites are described in WO 02/20565 and WO 06/083275, each of which is incorporated herein by reference.

Другие сайты связывания неиммуноглобулиновой природы, которые можно использовать в связывающих молекулах настоящего изобретения, включают сайты связывания, полученные из Src-гомологичных доменов (например, SH2- или SH3-доменов), PDZ-доменов, бета-лактамазы, высокоаффинных ингибиторов протеазы или небольших белковых каркасов, соединенных дисульфидной связью, таких как токсины скорпиона. Способы получения сайтов связывания, полученных из этих молекул, были раскрыты в данном уровне техники (см., например, Silverman et al., Nat. Biotechnol., 23(12):1493-4 (2005); Panni et al., J. Biol. Chem., 277:21666-21674 (2002); Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17:170-175 (1999); Legendre et al., Protein Sci., 11:1506-1518 (2002); Stoop et al., Nat. Biotechnol., 21:1063-1068 (2003); и Vita et al., PNAS, 92:6404-6408 (1995)). Другие же сайты связывания можно получить из домена связывания, выбранного из группы, состоящей из EGF-подобного домена, Kringle-домена, PAN-домена, Gla-домена, SRCR-домена, домена Кунитца/ингибитора трипсина поджелудочной железы быка, домена ингибитора сериновой протеазы типа Kazal, домена Trefoil (P-типа), домена C-типа фактора фон Виллебранда, анафилатоксин-подобного домена, CUB-домена, повтора тиреоглобулина типа I, домена LDLрецептора класса A, Sushi-домена, Link-домена, домена тромбоспондина типа I, иммуноглобулинподобного домена, лектинового домена С-типа, МАМ-домена, домена А-типа фактора фон Виллебранда, домена соматомедина В, корового домена WAP-типа, содержащего 4 дисульфидные связи, С-домена F5/8-типа, домена гемопексина, EGF-подобного домена типа ламинина, С2-домена, CTLA-4-домена и других таких доменов, известных специалистам в данной области техники, а также производных и/или их вариантов. Дополнительные полипептиды неиммуноглобулиновой природы включают Avimers® (Avidia, Inc., Mountain View, CA; см. публикацию международной заявки РСТ № WO 06/055689 и публи- 18 040195 кацию патента США 2006/0234299), Telobodies® (Biotech Studio, Cambridge, MA), Evibodies® (Evogenix,Other binding sites of a non-immunoglobulin nature that can be used in the binding molecules of the present invention include binding sites derived from Src homologous domains (e.g., SH2 or SH3 domains), PDZ domains, beta-lactamase, high-affinity protease inhibitors, or small protein disulfide-linked scaffolds, such as scorpion toxins. Methods for obtaining binding sites derived from these molecules have been disclosed in the art (see, for example, Silverman et al., Nat. Biotechnol., 23(12):1493-4 (2005); Panni et al., J Biol Chem., 277:21666-21674 (2002), Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17:170-175 (1999), Legendre et al., Protein Sci., 11:1506-1518 (2002 ); Stoop et al., Nat. Biotechnol., 21:1063-1068 (2003); and Vita et al., PNAS, 92:6404-6408 (1995)). Other binding sites may be derived from a binding domain selected from the group consisting of EGF-like domain, Kringle domain, PAN domain, Gla domain, SRCR domain, Kunitz/bovine pancreatic trypsin inhibitor domain, serine protease inhibitor domain Kazal type, Trefoil domain (P-type), von Willebrand factor C-type domain, anaphylatoxin-like domain, CUB-domain, thyroglobulin repeat type I, class A LDL receptor domain, Sushi-domain, Link-domain, type I thrombospondin domain , immunoglobulin-like domain, C-type lectin domain, MAM domain, von Willebrand factor A-type domain, somatomedin B domain, WAP-type core domain containing 4 disulfide bonds, F5/8-type C-domain, hemopexin domain, EGF laminin-like domain, C2 domain, CTLA-4 domain, and other such domains known to those skilled in the art, as well as derivatives and/or variants thereof. Additional polypeptides of a non-immunoglobulin nature include Avimers® (Avidia, Inc., Mountain View, CA; see PCT Publication No. WO 06/055689 and US Patent Publication 2006/0234299), Telobodies® (Biotech Studio, Cambridge, MA), Evibodies® (Evogenix,

Sydney, Australia; см. патент США № 7166697) и Microbodies® (Nascacell Technologies, Munich, Germany).Sydney, Australia; see US Pat. No. 7,166,697) and Microbodies® (Nascacell Technologies, Munich, Germany).

iii. Связывающие участки рецепторов или лигандов.iii. Binding sites of receptors or ligands.

В других аспектах фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения представляет собой лиганд-связывающий участок рецептора и/или рецептор-связывающий участок лиганда.In other aspects, the pharmaceutically active fragment of the present invention is a ligand-binding site of a receptor and/or a receptor-binding site of a ligand.

В других иллюстративных вариантах реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения может содержать один или несколько лиганд-связывающих доменов или рецепторсвязывающих доменов, полученных из одного или нескольких из следующих белков.In other exemplary embodiments, a pharmaceutically active fragment of the present invention may comprise one or more ligand-binding domains or receptor-binding domains derived from one or more of the following proteins.

a. Цитокины и рецепторы цитокинов.a. Cytokines and cytokine receptors.

Цитокины оказывают плейотропный эффект на пролиферацию, дифференцировку и функциональную активацию лимфоцитов. В слитых белках настоящего изобретения можно использовать различные цитокины или их рецептор-связывающие участки. Иллюстративные цитокины включают интерлейкины (например, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-13 и ИЛ-18), колониестимулирующие факторы (КСФ) (например, гранулоцитарный КСФ (Г-КСФ), гранулоцитарномакрофагальный КСФ (ГМ-КСФ) и моноцитарно-макрофагальный КСФ (М-КСФ)), фактор некроза опухоли (ФНО) альфа и бета, антиген цитотоксического Т-лимфоцита 4 (CTLA-4) и интерфероны, такие как интерферон-α, β или γ (патенты США № 4925793 и 4929554).Cytokines have a pleiotropic effect on the proliferation, differentiation, and functional activation of lymphocytes. Various cytokines or their receptor binding sites can be used in the fusion proteins of the present invention. Exemplary cytokines include interleukins (e.g., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 , IL-13 and IL-18), colony-stimulating factors (CSF) (eg, granulocyte-CSF (G-CSF), granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF), and monocyte-macrophage-CSF (M-CSF)), tumor necrosis factor (TNF) ) alpha and beta, cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), and interferons such as interferon-α, β or γ (US Pat. Nos. 4,925,793 and 4,929,554).

Рецепторы цитокинов, как правило, состоят из лиганд-специфической альфа-цепи и обычной бетацепи. Иллюстративные рецепторы цитокинов включают рецепторы для ГМ-КСФ, ИЛ-3 (патент США № 5639605), ИЛ-4 (патент США № 5599905), ИЛ-5 (патент США № 5453491), рецептор ИЛ-10, IFNy (EP 0240975) и семейство рецепторов ФНО (например, ФНОа (например, TNFR-1 (EP 417563), TNFR-2 (EP 417014)-рецептор лимфотоксина бета).Cytokine receptors typically consist of a ligand-specific alpha chain and a conventional beta chain. Exemplary cytokine receptors include receptors for GM-CSF, IL-3 (US Pat. No. 5,639,605), IL-4 (US Pat. No. 5,599,905), IL-5 (US Pat. No. 5,453,491), IL-10 receptor, IFNy (EP 0240975) and the TNF receptor family (eg, TNFa (eg, TNFR-1 (EP 417563), TNFR-2 (EP 417014) lymphotoxin receptor beta).

b. Адгезивные белки.b. adhesive proteins.

Адгезивные молекулы представляют собой мембраносвязанные белки, которые позволяют клеткам взаимодействовать друг с другом. В слитый белок настоящего изобретения можно встраивать различные адгезивные белки, включая хоминг-рецепторы лейкоцитов и клеточные адгезивные молекулы или их рецептор-связывающие участки. Хоминг-рецепторы лейкоцитов экспрессируются на клеточных поверхностях лейкоцитов на протяжении воспаления и включают β-1 интегрины (например, VLA-1, 2, 3, 4, 5 и 6), которые опосредуют связывание с компонентами внеклеточного матрикса, и в2-интегрины (например, LFA-1, LPAM-1, CR3 и CR4), которые связывают молекулы клеточной адгезии (САМ) на сосудистом эндотелии. Иллюстративные САМ включают ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 и MAdCAM-1. Другие САМ включают молекулы семейства селектина, включая E-селектин, L-селектин и P-селектин.Adhesion molecules are membrane-bound proteins that allow cells to interact with each other. A variety of adhesion proteins can be incorporated into the fusion protein of the present invention, including leukocyte homing receptors and cell adhesion molecules or their receptor binding sites. Leukocyte homing receptors are expressed on leukocyte cell surfaces during inflammation and include β-1 integrins (eg, VLA-1, 2, 3, 4, 5, and 6), which mediate binding to components of the extracellular matrix, and β2 integrins (eg, , LFA-1, LPAM-1, CR3, and CR4) that bind cell adhesion molecules (CAMs) to the vascular endothelium. Exemplary CAMs include ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, and MAdCAM-1. Other CAMs include molecules of the selectin family, including E-selectin, L-selectin and P-selectin.

c. Хемокины.c. Chemokines.

В слитый белок настоящего изобретения можно также встраивать хемокины, хемотаксические белки, которые стимулируют миграцию лейкоцитов по направлению к очагу инфекции. Иллюстративные хемокины включают макрофагальные белки воспаления (MIP-1-a и MIP-1-P), хемотаксический фактор нейтрофилов и RANTES (хемокин, регулируемый активацией, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками).Chemokines, chemotactic proteins that stimulate the migration of leukocytes towards the site of infection, can also be incorporated into the fusion protein of the present invention. Exemplary chemokines include macrophage inflammatory proteins (MIP-1-a and MIP-1-P), neutrophil chemotactic factor, and RANTES (an activation-regulated chemokine expressed and secreted by normal T cells).

d. Гормоны.d. Hormones.

Иллюстративные гормоны роста для использования в качестве фармакологически активных фрагментов в слитых белках настоящего изобретения включают ренин, гормон роста человека (ГРЧ; патент США № 5834598), N-метионил гормон роста человека; гормон роста крупного рогатого скота; фактор, стимулирующий выделение гормона роста; паратиреоидный гормон (ПТГ); тиреотропный гормон (ТТГ); тироксин; проинсулин и инсулин (патенты США № 5157021 и 6576608); фолликулостимулирующий гормон (ФСГ); кальцитонин, лютеинизирующий гормон (ЛГ), лептин, глюкагоны; бомбезин; соматропин; мюллеров ингибирующий фактор; релаксин и прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид; пролактин; плацентарный лактоген; белок ОВ; или мюллеров ингибирующий фактор.Exemplary growth hormones for use as pharmacologically active moieties in the fusion proteins of the present invention include renin, human growth hormone (hGH; US Pat. No. 5,834,598), N-methionyl human growth hormone; bovine growth hormone; a factor that stimulates the release of growth hormone; parathyroid hormone (PTH); thyroid-stimulating hormone (TSH); thyroxine; proinsulin and insulin (US Pat. Nos. 5,157,021 and 6,576,608); follicle stimulating hormone (FSH); calcitonin, luteinizing hormone (LH), leptin, glucagons; bombesin; somatropin; mullerian inhibitory factor; relaxin and prorelaxin; gonadotropin-associated peptide; prolactin; placental lactogen; OB protein; or mullerian inhibitory factor.

e. Рецепторы и лиганды.e. Receptors and ligands.

В одном варианте реализации фармацевтически активный фрагмент настоящего изобретения объединяет сайт(ы) связывания лиганда или рецептора (например, внеклеточный домен (ECD) рецептора) по меньшей мере с одной Fc-областью, слитой на уровне гена (т.е. scFc-областью). В определенных вариантах реализации сайт связывания или домен лиганд-связывающего участка рецептора можно получить из рецептора, связанного антителом или вариантом антитела. В других вариантах реализации лигандсвязывающий участок рецептора получают из рецептора, выбранного из группы, состоящей из рецептора суперсемейства иммуноглобулинов (Ig) (например, растворимого Т-клеточного рецептора, например mTCR® (Medigene AG, Munich, Germany), рецептора суперсемейства ФНО-рецепторов, описанных выше (например, растворимого рецептора ФНОа иммуноадгезина), рецептора семейства рецепторов глиального нейротрофического фактора (GDNF) (например, GFRa3), рецептора супер семейства сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR), рецептора суперсемейства рецептоных тирозинкиназ (TK), рецептора суперсемейства лиганд-зависимых (LG) рецепторов, рецептора суперсемейства хемокиновых рецепторов, суперсемейства ИЛ-1/толл-подобных рецепторов (TLR) и суперсемейства цитокиновых рецепторов.In one embodiment, a pharmaceutically active fragment of the present invention combines a ligand or receptor binding site(s) (e.g., the extracellular domain (ECD) of the receptor) with at least one Fc region fused at the gene level (i.e., scFc region) . In certain embodiments, the binding site or domain of the ligand-binding site of the receptor can be derived from a receptor bound by an antibody or antibody variant. In other embodiments, the ligand-binding site of the receptor is derived from a receptor selected from the group consisting of an immunoglobulin (Ig) superfamily receptor (e.g., a soluble T cell receptor, e.g., mTCR® (Medigene AG, Munich, Germany), a TNF receptor superfamily receptor, described above (e.g., soluble TNFa immunoadhesin receptor), glial neurotrophic factor receptor (GDNF) family receptor (e.g., GFRa3), G protein-coupled receptor (GPCR) superfamily receptor, receptor tyrosine kinase (TK) superfamily receptor, ligand superfamily receptor α-dependent (LG) receptors, the chemokine receptor superfamily receptor, the IL-1/toll-like receptor (TLR) superfamily, and the cytokine receptor superfamily.

- 19 040195- 19 040195

В других вариантах реализации сайт связывания или домен рецептор-связывающего участка лиганда можно получить из лиганда, связанного антителом или вариантом антитела. Например, лиганд может связывать рецептор, выбранный из группы, состоящей из рецептора суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), рецептора суперсемейства ФНО-рецепторов, рецептора суперсемейства сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR), рецептора суперсемейства рецепторных тирозинкиназ (TK), рецептора суперсемейства лиганд-зависимых (LG) рецепторов, рецептора суперсемейства хемокиновых рецепторов, суперсемейства ИЛ-1/толл-подобных рецепторов (TLR) и суперсемейства цитокиновых рецепторов. В одном иллюстративном варианте реализации сайт связывания рецептор-связывающего участка лиганда получают из лиганда, принадлежащего супер семейству лигандов ФНО (например, CD40L).In other embodiments, the binding site or domain of the receptor-binding site of the ligand can be derived from a ligand bound by an antibody or antibody variant. For example, the ligand may bind a receptor selected from the group consisting of an immunoglobulin (Ig) superfamily receptor, a TNF receptor superfamily receptor, a G protein-coupled receptor (GPCR) superfamily receptor, a tyrosine kinase receptor (TK) superfamily receptor, a ligand- dependent (LG) receptors, the chemokine receptor superfamily receptor, the IL-1/toll-like receptor (TLR) superfamily, and the cytokine receptor superfamily. In one exemplary embodiment, the ligand receptor binding site is derived from a ligand belonging to the TNF super ligand family (eg, CD40L).

В слитые белки настоящего изобретения можно встроить факторы роста или их рецепторы (их рецептор-связывающие или лиганд-связывающие участки). Иллюстративные факторы роста включают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его изоформы (патент США № 5194596); факторы роста фибробластов (FGF), включая aFGF и bFGF; предсердный натрийуретический фактор (ANF); факторы роста гепатоцитов (HGF; патенты США № 5227158 и 6099841), нейротрофические факторы, такие как нейротрофический фактор голоного мозга (BDNF), лиганды нейротрофического фактора глиальных клеток (например, GDNF, нейротурин, артемин и персефин), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β фактор роста тромбоцитов (PDGF) (патенты США № 4889919, 4845075, 5910574 и 5877016); трансформирующие факторы роста (ФНО), такие как ФНО-альфа и ФНО-бета (WO 90/14359), остеиндуктивные факторы, включая костный морфогенетический белок (BMP); инсулиноподобные факторы роста-I и -II (IGF-I и IGF-II; патенты США № 6403764 и 6506874); эритропоэтин (ЕРО); тромбопоэтин (ТРО; фактор стволовых клеток (SCF), тромбопоэтин (ТРО, c-Mpl лиганд) и полипептиды Wnt (патент США № 6159462).Growth factors or their receptors (their receptor-binding or ligand-binding sites) can be inserted into the fusion proteins of the present invention. Exemplary growth factors include vascular endothelial growth factor (VEGF) and isoforms thereof (US Pat. No. 5,194,596); fibroblast growth factors (FGFs), including aFGF and bFGF; atrial natriuretic factor (ANF); hepatocyte growth factors (HGF; US Pat. Nos. 5,227,158 and 6,099,841), neurotrophic factors such as bare brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell-derived neurotrophic factor ligands (eg, GDNF, neuroturin, artemin, and persephin), neurotrophin-3, -4 , -5 or -6 (NT-3, NT-4, NT-5 or NT-6), or a nerve growth factor such as NGF-β Platelet Growth Factor (PDGF) (US Pat. 5877016); transforming growth factors (TNF) such as TNF-alpha and TNF-beta (WO 90/14359), osteoinductive factors including bone morphogenetic protein (BMP); insulin-like growth factors-I and -II (IGF-I and IGF-II; US Pat. Nos. 6,403,764 and 6,506,874); erythropoietin (EPO); thrombopoietin (TPO; stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO, c-Mpl ligand) and Wnt polypeptides (US Pat. No. 6,159,462).

Иллюстративные рецепторы факторов роста, которые можно использовать в качестве фармакологически активных фрагментов настоящего изобретения, включают рецепторы EGF; рецепторы VEGF (например, Flt1 или Flk1/KDR), рецепторы PDGF (WO 90/14425); рецепторы HGF (патенты США № 5648273 и 5686292) и нейротрофические рецепторы, включая низкоаффинный рецептор (LNGFR), также называемый p75^NTR или р75, который связывает NGF, BDNF и NT-3, и высокоаффинные рецепторы, которые являются представителями семейства trk рецепторных тирозинкиназ (например, trkA, trkB (EP 455460), trkC (EP 522530)).Exemplary growth factor receptors that can be used as pharmacologically active moieties of the present invention include EGF receptors; VEGF receptors (eg Flt1 or Flk1/KDR), PDGF receptors (WO 90/14425); HGF receptors (US Pat. Nos. 5,648,273 and 5,686,292) and neurotrophic receptors, including the low affinity receptor (LNGFR), also called p75 ^NTR or p75, which binds NGF, BDNF, and NT-3, and high affinity receptors, which are members of the trk family of receptor tyrosine kinases ( e.g. trkA, trkB (EP 455460), trkC (EP 522530)).

f. Лекарственные средства.f. Medicines.

В другом варианте реализации фармакологически активное средство представляет собой лекарственное вещество, которое используется в лечении, терапии, предотвращении или диагностике болезни или используется по-другому для улучшения физического или психического самочувствия. Такие лекарственные средства могут быть химическими соединениями, и такие иллюстративные соединения описаны более подробно в данном документе.In another embodiment, the pharmacologically active agent is a drug that is used in the treatment, therapy, prevention, or diagnosis of a disease, or is otherwise used to improve physical or mental well-being. Such drugs may be chemical compounds, and such exemplary compounds are described in more detail herein.

Настоящее изобретение можно применить для доставки других средств для лечения нарушений, оказывающих влияние на нервную систему, и его можно также применить в диагностических целях. Предпочтительные классы средств для лечения нарушений ЦНС включают лекарственные средства, оказывающие воздействие на синаптические и эффекторные окончания; общие и местные анальгетики и анестетики, такие как опиоидные анальгетики и антагонисты;The present invention can be applied to deliver other agents for the treatment of disorders affecting the nervous system, and it can also be used for diagnostic purposes. Preferred classes of agents for the treatment of CNS disorders include drugs that act on synaptic and effector endings; general and local analgesics and anesthetics such as opioid analgesics and antagonists;

снотворные средства и седативные средства;sleeping pills and sedatives;

лекарственные средства для лечения психических нарушений, таких как депрессия, шизофрения; противоэпилептические средства и противосудорожные средства;medicines for the treatment of mental disorders such as depression, schizophrenia; antiepileptics and anticonvulsants;

болезнь Хантингтона, старение и болезнь Альцгеймера;Huntington's disease, aging and Alzheimer's disease;

нейропротекторные средства (такие как антагонисты возбуждающих аминокислот и нейротропные факторы) и нейрорегенеративные средства;neuroprotective agents (such as excitatory amino acid antagonists and neurotrophic factors) and neuroregenerative agents;

трофические факторы, такие как нейротрофический фактор головного мозга, цилиарный нейротрофический фактор или фактор роста нервов;trophic factors such as brain-derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor, or nerve growth factor;

лекарственные средства, направленные на лечение повреждения ЦНС или инсульта;medicines for the treatment of CNS damage or stroke;

лекарственные средства для лечения наркозависимости и злоупотребления наркотиками;medicines for the treatment of drug dependence and drug abuse;

аутокоиды и противовоспалительные лекарственные средства;autocoids and anti-inflammatory drugs;

химиотерапевтические средства от паразитарных инфекций и заболеваний бактериального происхождения;chemotherapeutic agents for parasitic infections and diseases of bacterial origin;

иммунодепрессивные средства и противоопухолевые лекарственные средства;immunosuppressive agents and anticancer drugs;

гормоны и антагонисты гормонов;hormones and hormone antagonists;

тяжелые металлы и антагонисты тяжелых металлов;heavy metals and heavy metal antagonists;

антагонисты неметаллических токсичных средств;antagonists of non-metallic toxic agents;

цитостатики для лечения рака;cytostatics for cancer treatment;

диагностические вещества для использования в медицинской радиологии;diagnostic substances for use in medical radiology;

иммуноактивные и иммунореактивные средства радиотерапии; и множество других средств, таких как трансмиттеры, агонисты и антагонисты их соответствующих рецепторов, их соответствующие прекурсоры или метаболиты;immunoactive and immunoreactive radiotherapy agents; and a variety of other agents such as transmitters, agonists and antagonists of their respective receptors, their respective precursors or metabolites;

- 20 040195 антибиотики, антиспазматики, антигистаминные средства, противотошнотные средства, релаксанты, возбуждающие средства, смысловые и антисмысловые олигонуклеотиды, церебральные дилататоры, психотропные средства, противоманиакальные средства, вазодилататоры и вазоконстрикторы, антигипертензивные средства, средства для лечения мигрени, снотворные средства, гипер- или гипогликемические средства, минеральные или питательные средства, лекарственные средства против ожирения, анаболики и противоастматические средства.- 20 040195 Antibiotics, antispasmodics, antihistamines, antinausea, relaxants, stimulants, sense and antisense oligonucleotides, cerebral dilators, psychotropic agents, antimanic agents, vasodilators and vasoconstrictors, antihypertensive agents, migraine agents, hypnotics, hyper- or hypoglycemic agents, mineral or nutritional agents, anti-obesity drugs, anabolics and anti-asthma agents.

Типичными активными ингредиентами (например, лекарственными средствами) может быть любое вещество, оказывающее воздействие на нервную систему или используемое для диагностических исследований нервной системы. Они описаны в Gilman et al. (1990), Goodman and Gilman's - Фармакологические Основы Терапии, Pergamon Press, New York и включают следующие средства:Typical active ingredients (eg drugs) can be any substance that affects the nervous system or is used for diagnostic studies of the nervous system. They are described in Gilman et al. (1990), Goodman and Gilman's - Pharmacological Fundamentals of Therapy, Pergamon Press, New York and includes the following remedies:

ацетилхолиновые и синтетические холиновые сложные эфиры, встречающиеся в природе холиномиметические алкалоиды и их синтетические родственные соединения: антихолинэстеразные средства, средства, возбуждающие ганглии, атропин, скополамин и родственные антимускариновые лекарственные средства, катехоламины и симпатомиметические лекарственные средства, такие как эпинефрин, норэпинефрин и дофамин, адренергические агонисты, антагонисты адренергических рецепторов, трансмиттеры, такие как ГАМК, глицин, глутамат, ацетилхолин, дофамин, 5-гидрокситриптамин и гистамин, нейроактивные пептиды;acetylcholine and synthetic choline esters, naturally occurring cholinomimetic alkaloids and their synthetic congeners: anticholinesterase agents, ganglion stimulants, atropine, scopolamine and related antimuscarinic drugs, catecholamines and sympathomimetic drugs such as epinephrine, norepinephrine and dopamine, adrenergic agonists, adrenergic receptor antagonists, transmitters such as GABA, glycine, glutamate, acetylcholine, dopamine, 5-hydroxytryptamine and histamine, neuroactive peptides;

анальгетики и анестетики, такие как опиоидные анальгетики и антагонисты; средства для премедикации и анестезирующие средства, такие как бензодиазепины, барбитураты, антигистаминные средства, фенотиазины и бутилфеноны; опиоиды; противорвотные средства; антихолинергические лекарственные средства, такие как атропин, скополамин или гликопирролат; кокаин; производные хлорала; этхлорвинол; глютетимид; метиприлон; мепробамат; паральдегид; дисульфирам; морфин, фентанил и налоксон;analgesics and anesthetics such as opioid analgesics and antagonists; sedatives and anesthetics such as benzodiazepines, barbiturates, antihistamines, phenothiazines and butylphenones; opioids; antiemetics; anticholinergic drugs such as atropine, scopolamine or glycopyrrolate; ***e; chloral derivatives; ethchlorvinol; glutethimide; metiprilone; meprobamate; paraldehyde; disulfiram; morphine, fentanyl and naloxone;

антитуссивные средства центрального действия;antitussive agents of central action;

психиатрические лекарственные средства, такие как фенотиазины, тиоксантены и другие гетероциклические соединения (например, галоперидол); трициклические антидепрессанты, такие как дезимипрамин и имипрамин; атипичные антидепрессанты (например, флуоксетин и тразодон), ингибиторы моноаминоксидазы, такие как изокарбоксазид; соли лития; анксиолитики, такие как хлордиазепоксид и диазепам;psychiatric drugs such as phenothiazines, thioxanthenes and other heterocyclic compounds (eg haloperidol); tricyclic antidepressants such as demipramine and imipramine; atypical antidepressants (eg fluoxetine and trazodone), monoamine oxidase inhibitors such as isocarboxazid; lithium salts; anxiolytics such as chlordiazepoxide and diazepam;

противоэпилептические средства, включая гидантоины, противоконвульсивные барбитураты, иминостильбены (такие как карбамазепин), сукцинимиды, вальпроевая кислота, оксазолидиндионы и бензодиазепины;antiepileptics, including hydantoins, anticonvulsant barbiturates, iminostilbenes (such as carbamazepine), succinimides, valproic acid, oxazolidinediones, and benzodiazepines;

противопаркинсонические лекарственные средства, такие как L-ДОФА/КАРБИДОПА, апоморфин, амантадин, эрголины, селегилины, ропинирол, бромокриптина мезилат и антихолинергические средства;antiparkinsonian drugs such as L-DOPA/CARBIDOPA, apomorphine, amantadine, ergolines, selegilines, ropinirole, bromocriptine mesylate and anticholinergics;

противоспастические средства, такие как баклофен, диазепам и дантролен;antispastic agents such as baclofen, diazepam and dantrolene;

нейропротекторные средства, такие как антагонисты возбуждающих аминокислот, нейротрофические факторы и нейротрофический фактор головного мозга, цилиарный нейротрофический фактор или фактор роста нервов; нейротрофин (NT) 3 (NT3); NT4 и NT5; ганглиозиды; нейрорегенеративные средства;neuroprotective agents such as excitatory amino acid antagonists, neurotrophic factors and brain-derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor or nerve growth factor; neurotrophin (NT) 3 (NT3); NT4 and NT5; gangliosides; neuroregenerative agents;

лекарственные средства для лечения наркозависимости и злоупотребления наркотиками, включающие антагонисты опиоидных рецепторов и антидепрессанты;drugs for the treatment of drug dependence and drug abuse, including opioid receptor antagonists and antidepressants;

аутокоиды и противовоспалительные лекарственные средства, такие как гистамин, брадикинин, каллидин и их соответствующие агонисты и антагонисты;autocoids and anti-inflammatory drugs such as histamine, bradykinin, kallidine and their respective agonists and antagonists;

химиотерапевтические средства от паразитарных инфекций и заболеваний бактериального происхождения;chemotherapeutic agents for parasitic infections and diseases of bacterial origin;

противоопухолевые лекарственные средства, включая алкилирующие средства (например, нитрозомочевины) и антиметаболиты; хлорметины, этиленамины и метилмеламины; алкилсульфонаты; аналоги фолиевой кислоты; аналоги пиримидинов, аналоги пуринов, алкалоиды барвинка; и антибиотики.anticancer drugs, including alkylating agents (eg, nitrosoureas) and antimetabolites; chlormethines, ethyleneamines and methylmelamines; alkylsulfonates; folic acid analogues; pyrimidine analogs, purine analogs, vinca alkaloids; and antibiotics.

Настоящее изобретение также полезно для доставки противотошнотных средств, релаксантов, возбуждающих средств, смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов, церебральных дилататоров, психотропных средств, вазодилататоров и вазоконстрикторов, антигипертензивных средств, средств для лечения мигрени, гипер- или гипогликемических средств, минеральных или питательных средств, лекарственных средств против ожирения, анаболиков и противоастматических средств, противовоспалительных лекарственных средств, таких как фенилбутазон, индометацин, напроксен, ибупрофен, флурбипрофен, диклофенак, дексаметазон, преднизон и преднизолон; церебральных вазодилататоров, таких как солоктидиум, винкамин, нафтидрофурила оксалат, ко-дэргокрин мезилат, цикланделат, папаверин, никотиновая кислота, противоинфекционных средств, таких как эритромицина стеарат и цефалексин, адренокортикотропного гормона, аденозиндезаминазы, рибонуклеазы, щелочной фосфатазы, ангиотензина, антител, аргиназы, аргининдезаминазы, аспарагиназы, церулеина, кальцитонина, химотрипсина, холецистокинина, факторов свертывания крови, динорфинов, эндорфинов, энкефалинов, эритропоэтина, гастрин-высвобождающего пептида, глюкагона, гемоглобина, гипоталамических рилизинг-факторов, интерферона, катакальцина, мотилина, нейропептида Y, нейротензина, не встречающихся в природе опиоидов, окситоцина, раболя, паратиреоидного гормона, пептидов пролактина, растворимого CD-4, соматомедина,The present invention is also useful for the delivery of anti-nausea agents, relaxants, stimulants, sense and antisense oligonucleotides, cerebral dilators, psychotropic agents, vasodilators and vasoconstrictors, antihypertensive agents, migraine agents, hyper- or hypoglycemic agents, mineral or nutritional agents, drugs anti-obesity, anabolic and anti-asthma drugs, anti-inflammatory drugs such as phenylbutazone, indomethacin, naproxen, ibuprofen, flurbiprofen, diclofenac, dexamethasone, prednisone and prednisolone; cerebral vasodilators such as soloctidium, vincamine, naftidrofuryl oxalate, co-dergocrine mesylate, cyclandelate, papaverine, nicotinic acid, anti-infectives such as erythromycin stearate and cephalexin, adrenocorticotropic hormone, adenosine deaminase, ribonuclease, alkaline phosphatase, angiotensin, antibodies, arginase, arginine deaminase, asparaginase, cerulein, calcitonin, chymotrypsin, cholecystokinin, coagulation factors, dynorphins, endorphins, enkephalins, erythropoietin, gastrin-releasing peptide, glucagon, hemoglobin, hypothalamic releasing factors, interferon, catacalcin, motilin, neuropeptide Y, neurotensin, not naturally occurring opioids, oxytocin, rabola, parathyroid hormone, prolactin peptides, soluble CD-4, somatomedin,

- 21 040195 соматостатина, соматотропина, супероксиддисмутазы, тиреотропного гормона, тканевого активатора плазминогена, трипсина, вазопрессина и аналогов таких пептидов, а также других подходящих ферментов, гормонов, белков, полипептидов, конъюгатов фермент-белок, конъюгатов антитело-гаптен, вирусных эпитопов и т.д.- 21 040195 somatostatin, somatotropin, superoxide dismutase, thyroid stimulating hormone, tissue plasminogen activator, trypsin, vasopressin and analogues of such peptides, as well as other suitable enzymes, hormones, proteins, polypeptides, enzyme-protein conjugates, antibody-hapten conjugates, viral epitopes, etc. .d.

V. Иллюстративные структуры полипептидов.V. Exemplary polypeptide structures.

Иллюстративные структуры связывающих молекул настоящего изобретения показаны на прилагаемых фигурах. Например, фиг. 1 включает варианты реализации, в которых не иллюстрируется фармацевтически активный фрагмент (например, скелеты FC5Fc и FcFC5, к которым можно присоединять фармацевтически активные фрагменты), а также варианты реализации, в которых фармацевтически активный фрагмент представляет собой сайт связывания антитела. Например, в одном варианте реализации скелет связывающей молекулы настоящего изобретения (т.е. а конструкт, к которому можно присоединить фармацевтически активный фрагмент) содержит два фрагмента, обеспечивающих перенос через ГЭБ, которые ковалентно соединены (например, слиты на уровне гена) с Fc-областью, доменом или фрагментом. Фрагменты, обеспечивающие перенос через ГЭБ, могут соединяться непосредственно или через линкерный пептид. В предпочтительном варианте реализации фрагменты, обеспечивающие перенос через ГЭБ, могут соединяться с N-концом Fc-области, домена или фрагмента. В одном варианте реализации дополнительные связывающие фрагменты (например, фармакологически активные фрагменты, не относящиеся к ТМЕМ30А, в форме молекул scFv) могут также соединяться с С-концом Fc-области, домена или фрагмента.Exemplary structures of the binding molecules of the present invention are shown in the accompanying figures. For example, FIG. 1 includes embodiments in which a pharmaceutically active fragment is not illustrated (e.g., FC5Fc and FcFC5 backbones to which pharmaceutically active fragments can be attached), as well as embodiments in which the pharmaceutically active fragment is an antibody binding site. For example, in one embodiment, the backbone of the binding molecule of the present invention (i.e., a construct to which a pharmaceutically active moiety can be attached) contains two BBB transport moieties that are covalently linked (e.g., fused at the gene level) to an Fc- area, domain, or fragment. Fragments that provide transfer through the BBB can be connected directly or through a linker peptide. In a preferred embodiment, BBB transport moieties may be fused to the N-terminus of an Fc region, domain, or fragment. In one embodiment, additional binding fragments (eg, non-TMEM30A pharmacologically active fragments in the form of scFv molecules) can also be linked to the C-terminus of an Fc region, domain, or fragment.

В другом варианте реализации дополнительные фрагменты, обеспечивающие перенос через ГЭБ, могут соединяться с С-концом Fc-области, домена или фрагмента. Фрагменты, обеспечивающие перенос через ГЭБ, могут соединяться непосредственно или через линкерный пептид.In another implementation, additional fragments that provide transfer through the BBB, can be connected to the C-terminus of the Fc region, domain or fragment. Fragments that provide transfer through the BBB can be connected directly or through a linker peptide.

В другом варианте реализации связывающая молекула настоящего изобретения содержит фрагмент, проникающий через ГЭБ, который на N-конце слит с VH-доменом интактной молекулы антитела. В другом варианте реализации связывающая молекула настоящего изобретения содержит фрагмент, проникающий через ГЭБ, который на N-конце слит с VL-доменом интактной молекулы антитела. Еще в одном варианте реализации связывающая молекула настоящего изобретения содержит два фрагмента, обеспечивающих перенос через ГЭБ, которые на С-конце слиты с интактной молекулой антитела. Фрагменты, обеспечивающие перенос через ГЭБ, могут соединяться непосредственно или через линкерный пептид.In another embodiment, the binding molecule of the present invention comprises a BBB-penetrating fragment that is N-terminally fused to the VH domain of an intact antibody molecule. In another embodiment, the binding molecule of the present invention comprises a BBB-penetrating fragment that is N-terminally fused to the VL domain of an intact antibody molecule. In yet another embodiment, the binding molecule of the present invention comprises two BBB transport moieties that are C-terminally fused to an intact antibody molecule. Fragments that provide transfer through the BBB can be connected directly or through a linker peptide.

Понятно, что к любым из этих конструктов можно присоединить фармацевтически активные фрагменты (или дополнительные фармакологически активные фрагменты) с использованием способов, известных в настоящем уровне техники.It is understood that pharmaceutically active fragments (or additional pharmacologically active fragments) can be attached to any of these constructs using methods known in the present state of the art.

В одном варианте реализации полипептиды настоящего изобретения содержат только один фармацевтически активный фрагмент (с образованием молекулы, которая является мономерной по отношению к фармацевтически активному фрагменту, но которая является мультимерной (например, димерной) по отношению к фрагментам, обеспечивающим перенос через ГЭБ). В другом варианте реализации полипептид настоящего изобретения содержит несколько фармакологически активных фрагментов, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше фармакологически активных фрагментов. Фармацевтически активные фрагменты могут быть одинаковые или разные.In one embodiment, the polypeptides of the present invention contain only one pharmaceutically active moiety (to form a molecule that is monomeric with respect to the pharmaceutically active moiety, but that is multimeric (eg, dimeric) with respect to the moieties that provide transport through the BBB). In another embodiment, the implementation of the polypeptide of the present invention contains several pharmacologically active fragments, for example 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more pharmacologically active fragments. The pharmaceutically active moieties may be the same or different.

В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтически активный фрагмент функционально связан через линкерный пептид с N-концом Fc-домена, области или фрагмента. В другом варианте реализации фармакологически активный фрагмент функционально связан через линкерный пептид с С-концом Fc-домена, области или фрагмента.In one embodiment of the present invention, the pharmaceutically active fragment is operably linked via a linker peptide to the N-terminus of an Fc domain, region, or fragment. In another embodiment, the pharmacologically active fragment is operably linked via a linker peptide to the C-terminus of the Fc domain, region, or fragment.

В других вариантах реализации два или больше фармацевтически активных фрагментов последовательно соединены друг с другом (например, через линкерный пептид). В одном варианте реализации тандемный повтор фармацевтически активных фрагментов функционально связан через линкерный пептид либо с С-концом, либо с N-концом Fc-области, домена или фрагмента.In other embodiments, two or more pharmaceutically active fragments are connected in series to each other (eg, via a linker peptide). In one embodiment, the tandem repeat of the pharmaceutically active fragments is operably linked via a linker peptide to either the C-terminus or N-terminus of an Fc region, domain, or fragment.

Другие способы конъюгирования, соединения и связывания белков с фармакологически активными соединениями хорошо известны в данной области. Например, см. Wu, A.M., Senter, P.D., Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates, Nat. Biotechnol., 2005 September, 23(9):1137-46; Trail, P.A., King, H.D., Dubowchik, G.M., Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cancer, Cancer Immunol Immunother., 2003 May, 52(5):328-37; Saito, G., Swanson, J.A., Lee, K.D., Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities, Adv. Drug Deliv. Rev., 2003 Feb., 10, 55(2):199-215. Точно так же можно обеспечить настоящие антитела в комбинации с липосомой, наночастицами или другими аналогичными носителями, нагруженными фармацевтически активным соединением. Способы получения таких композиций известны в данной области (см., например, Sugano et al., Antibody Targeting of Doxorubicin-loaded Liposomes Suppresses the Growth and Metastatic Spread of Established Human Lung Tumor Xenografts in Severe Combined Immunodeficient Mice Cancer Research, 60, 6942-6949, Dec. 15, 2000; и Martin et al., Nanomaterials in Analytical Chemistry, Analytical Chemistry News&Features, May 1, 1998, p. 322A-327A).Other methods for conjugating, connecting and linking proteins to pharmacologically active compounds are well known in the art. For example, see Wu, A.M., Senter, P.D., Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates, Nat. Biotechnol., 2005 September, 23(9):1137-46; Trail, P.A., King, H.D., Dubowchik, G.M., Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cancer, Cancer Immunol Immunother., 2003 May, 52(5):328-37; Saito, G., Swanson, J.A., Lee, K.D., Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities, Adv. drug deliv. Rev., 2003 Feb., 10, 55(2):199-215. Similarly, the present antibodies can be provided in combination with a liposome, nanoparticles, or other similar carrier loaded with a pharmaceutically active compound. Methods for preparing such compositions are known in the art (see, for example, Sugano et al., Antibody Targeting of Doxorubicin-loaded Liposomes Suppresses the Growth and Metastatic Spread of Established Human Lung Tumor Xenografts in Severe Combined Immunodeficient Mice Cancer Research, 60, 6942- 6949, Dec. 15, 2000 and Martin et al., Nanomaterials in Analytical Chemistry, Analytical Chemistry News & Features, May 1, 1998, p. 322A-327A).

Во многих эффекторных молекулах отсутствуют подходящие функциональные группы, с которыми могут соединяться связывающие полипептиды. В одном варианте реализации эффекторная молекула,Many effector molecules lack suitable functional groups to which binding polypeptides can bind. In one embodiment, the effector molecule,

- 22 040195 например, лекарственное средство или пролекарство, присоединяется к полипептиду через связывающую молекулу. В одном варианте реализации связывающая молекула содержит химическую связь, которая обеспечивает активацию цитотоксичности в определенном месте. Подходящие химические связи хорошо известны в настоящем уровне техники и включают дисульфидные связи, кислотно-лабильные связи, фотолабильные связи, пептидаза-лабильные связи, тиоэфирные связи, которые образовались между сульфгидрильными и малеинимидовыми группами, и эстераза-лабильные связи. Наиболее предпочтительно, чтобы связывающая молекула содержала дисульфидную связь или тиоэфирную связь. В соответствии с настоящим изобретением связывающая молекула предпочтительно содержит реакционноспособную химическую группу. Особенно предпочтительными реакционноспособными химическими группами являются сложноэфирные группы N-сукцинимидила и сложноэфирные группы N-сульфосукцинимидила. В предпочтительном варианте реализации реакционноспособная химическая группа может ковалентно связываться с эффектором посредством образования дисульфидных связей между тиоловыми группами. В одном варианте реализации эффекторную молекулу модифицируют таким образом, чтобы она включала тиоловую группу. Специалист в данной области техники понимает, что, тиоловая группа содержит атом серы, связанный с атомом водорода и, как правило, в данном уровне техники также называется сульфгидрильной группой, которую можно обозначить как --SH или RSH.- 22 040195 for example, a drug or prodrug is attached to the polypeptide through a binding molecule. In one embodiment, the binding molecule contains a chemical bond that provides activation of cytotoxicity at a specific site. Suitable chemical bonds are well known in the art and include disulfide bonds, acid labile bonds, photolabile bonds, peptidase labile bonds, thioether bonds that have formed between sulfhydryl and maleimide groups, and esterase labile bonds. Most preferably, the linking molecule contains a disulfide bond or a thioether bond. In accordance with the present invention, the binding molecule preferably contains a reactive chemical group. Particularly preferred reactive chemical groups are N-succinimidyl ester groups and N-sulfosuccinimidyl ester groups. In a preferred embodiment, the reactive chemical group may be covalently bonded to the effector via the formation of disulfide bonds between the thiol groups. In one embodiment, the effector molecule is modified to include a thiol group. The person skilled in the art understands that the thiol group contains a sulfur atom bonded to a hydrogen atom and is generally also referred to in the art as a sulfhydryl group, which can be referred to as --SH or RSH.

В одном варианте реализации для соединения эффекторной молекулы с полипептидом настоящего изобретения можно использовать связывающую молекулу. Связывающая молекула может быть расщепляемой или нерасщепляемой. В одном варианте реализации расщепляемая связывающая молекула представляет собой редокс-расщепляемую связывающую молекулу, так что связывающая молекула расщепляется в условиях с более низким окислительно-восстановительным потенциалом, как, например, в цитоплазме и других областях с более высокой концентрацией молекул со свободными сульфгидрильными группами. Примеры связывающих молекул, которые могут расщепляться вследствие изменения окислительно-восстановительного потенциала, включают молекулы, содержащие дисульфидные связи. Стимул, который способствует расщеплению, может появляться при внутриклеточном поглощении связывающего белка настоящего изобретения, при котором более низкий окислительно-восстановительный потенциал цитоплазмы облегчает расщепление связывающей молекулы. В другом варианте реализации снижение pH запускает высвобождение майтанзиноидного груза в клетку-мишень. Снижение pH вовлечено во многие физиологические и патологические процессы, такие как миграция эндосом, опухолевый рост, воспаление и ишемия миокарда. pH падает от физиологического 7,4 до 5-6 в эндосомах или 4-5 в лизосомах. Примеры кислоточувствительных связывающих молекул, которые можно использовать для адресной доставки в лизосомы или эндосомы раковых клеток, включают молекулы с поддающимися кислотному гидролизу связями, такими как те, что обнаружены в ацеталях, кеталях, ортоэфирах, гидразонах, тритилах, cis-аконитилах или тиокарбамоилах (см., например, Willner et al. (1993), Bioconj. Chem., 4:521-7; патенты США № 4569789, 4631190, 5306809 и 5665358). Другие иллюстративные кислоточувствительные связывающие молекулы включают дипептидные последовательности Phe-Lys и Val-Lys (King et al. (2002), J. Med. Chem., 45:4336-43). Стимулом к расщеплению при внутриклеточном поглощении может служить перенос в эндосомальные компартменты с низким pH (например, лизосомы). Другие иллюстративные поддающиеся кислотному гидролизу связывающие молекулы представляют собой молекулы, которые содержат две или более поддающихся кислотному гидролизу связей для присоединения двух или более майтанзиноидов (King et al. (1999), Bioconj. Chem., 10:279-88; WO 98/19705).In one embodiment, a binding molecule can be used to link an effector molecule to a polypeptide of the present invention. The binding molecule may be cleavable or non-cleavable. In one embodiment, the cleavable binding molecule is a redox cleavable binding molecule such that the binding molecule is cleaved under lower redox conditions, such as in the cytoplasm and other areas with a higher concentration of molecules with free sulfhydryl groups. Examples of binding molecules that can be cleaved due to a change in redox potential include molecules containing disulfide bonds. A stimulus that promotes cleavage may occur with intracellular uptake of the binding protein of the present invention, whereby the lower redox potential of the cytoplasm facilitates cleavage of the binding molecule. In another embodiment, lowering the pH triggers the release of the maytansinoid cargo into the target cell. The decrease in pH is involved in many physiological and pathological processes such as endosome migration, tumor growth, inflammation and myocardial ischemia. The pH drops from physiological 7.4 to 5-6 in endosomes or 4-5 in lysosomes. Examples of acid sensitive binding molecules that can be used for targeted delivery to lysosomes or endosomes of cancer cells include molecules with acid hydrolyzable bonds such as those found in acetals, ketals, orthoesters, hydrazones, trityl, cis-aconitils, or thiocarbamoyls (see ., for example, Willner et al (1993) Bioconj Chem 4:521-7, US Pat. Other illustrative acid-sensitive binding molecules include the Phe-Lys and Val-Lys dipeptide sequences (King et al. (2002), J. Med. Chem., 45:4336-43). The stimulus for degradation upon intracellular uptake may be transport to low pH endosomal compartments (eg, lysosomes). Other exemplary acid hydrolysable binding molecules are molecules that contain two or more acid hydrolysable linkages for attaching two or more maytansinoids (King et al. (1999), Bioconj. Chem., 10:279-88; WO 98/19705 ).

Расщепляемые связывающие молекулы могут быть чувствительными к расщепляющим средствам биологического происхождения, которые ассоциированы с определенной клеткой-мишенью, например, лизосомальным или опухолеассоциированным ферментам. Примеры связывающих молекул, которые могут расщепляться ферментативным путем, включают, но без ограничений, пептиды и сложные эфиры. Иллюстративные расщепляемые ферментами связывающие молекулы включают молекулы, которые чувствительны к опухолеассоциированным протеазам, таким как катепсин В или плазмин (Dubowchik et al. (1999), Pharm. Ther., 83:67-123; Dubowchik et al. (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:3341-52; de Groot et al., (2000), J. Med. Chem., 43:3093-102; de Groot et al. (1999), 42:5277-83). Сайты расщепления катепсина В включают дипептидные последовательности валин-цитруллин и фенилаланин-лизин (Doronina et al. (2003), Nat. Biotech., 21(7):778-84); Dubowchik et al. (2002), Bioconjug. Chem., 13:855-69). Другие иллюстративные расщепляемые ферментами сайты включают сайты, которые образуются олигопептидными последовательностями, состоящие из 4-16 аминокислот (например, Suc-e-Ala-Leu-Ala-Leu), которые распознаются протеазами типа trouse (trouse proteases), такими как олигопептидаза Тимета (Thimet Oliogopeptidase (TOP)), фермент, который предпочтительно вырабатывают нейтрофилы, макрофаги и другие гранулоциты.Cleavable binding molecules may be sensitive to biologically derived cleavage agents that are associated with a particular target cell, such as lysosomal or tumor-associated enzymes. Examples of binding molecules that can be enzymatically cleaved include, but are not limited to, peptides and esters. Exemplary enzyme-cleavable binding molecules include molecules that are sensitive to tumor-associated proteases such as cathepsin B or plasmin (Dubowchik et al. (1999), Pharm. Ther., 83:67-123; Dubowchik et al. (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:3341-52; de Groot et al., (2000), J. Med. Chem., 43:3093-102; de Groot et al. (1999), 42:5277-83 ). Cleavage sites for cathepsin B include the dipeptide sequences valine-citrulline and phenylalanine-lysine (Doronina et al. (2003), Nat. Biotech., 21(7):778-84); Dubowchik et al. (2002), Bioconjug. Chem., 13:855-69). Other exemplary enzyme-cleavable sites include those generated by 4-16 amino acid oligopeptide sequences (e.g., Suc-e-Ala-Leu-Ala-Leu) that are recognized by trouse proteases such as Thimet oligopeptidase ( Thimet Oliogopeptidase (TOP)), an enzyme that is preferentially produced by neutrophils, macrophages and other granulocytes.

В определенных отдельных аспектах связывающий полипептид настоящего изобретения является мультиспецифическим, например, имеет по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с первой молекулой или эпитопом молекулы и по меньшей мере второй сайт связывания, который связывается со второй молекулой или со вторым эпитопом первой молекулы. Мультиспецифические связывающие молекулы настоящего изобретения могут содержать по меньшей мере два сайта связывания. В определенных вариантах реализации по меньшей мере два сайта связывания мультиспецифических свя- 23 040195 зывающих молекул настоящего изобретения представляют собой сайты, обеспечивающие перенос черезIn certain specific aspects, the binding polypeptide of the present invention is multispecific, e.g., has at least one binding site that binds to a first molecule or epitope of the molecule and at least a second binding site that binds to a second molecule or a second epitope of the first molecule. Multispecific binding molecules of the present invention may contain at least two binding sites. In certain embodiments, the at least two binding sites of the multispecific binding molecules of the present invention are cross-transfer sites.

ГЭБ.GEB.

VI. Синтез связывающих молекул.VI. Synthesis of binding molecules.

После отбора структуры полипептида настоящего изобретения для получения полипептида доступно множество способов. Такие способы включают, но без ограничений, методы химического синтеза и методы экспрессии рекомбинантной ДНК.Once the structure of the polypeptide of the present invention has been selected, a variety of methods are available to obtain the polypeptide. Such methods include, but are not limited to, chemical synthesis methods and recombinant DNA expression methods.

В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к конструкту на основе нуклеиновой кислоты, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидную молекулу настоящего изобретения. Понятно, что из-за вырожденности кода множество последовательностей нуклеиновых кислот будут кодировать аминокислотную последовательность данного полипептида. Желаемый полинуклеотид можно получить с использованием способов, известных в настоящем уровне техники (например, путем твердофазного синтеза ДНК de novo или путем ПЦР-мутагенеза ранее полученного полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид).In one embodiment, the present invention relates to a nucleic acid construct comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide molecule of the present invention. It is understood that, due to the degeneracy of the code, many nucleic acid sequences will encode the amino acid sequence of a given polypeptide. The desired polynucleotide can be obtained using methods known in the art (for example, by de novo solid phase DNA synthesis or by PCR mutagenesis of a previously obtained polynucleotide encoding the target polypeptide).

Олигонуклеотид-опосредованный мутагенез является одним из способов получения замены, вставки внутри рамки считывания или изменения (например, измененный кодон) для введения кодона, кодирующего аминокислотную замену (например, во фрагмент Fc-варианта). Например, исходную ДНК полипептида изменяют за счет гибридизации олигонуклеотида, кодирующего желаемую мутацию, с одноцепочечной ДНК-матрицей. После гибридизации для синтеза полной второй комплементарной цепи матрицы используют ДНК-полимеразу, которая встраивает олигонуклеотидный праймер. В одном варианте реализации для получения полинуклеотида, кодирующего полипептид настоящего изобретения, достаточно генной инженерии, например ПЦР-мутагенеза на основе праймера, чтобы внести изменение согласно определениям в данном документе.Oligonucleotide-mediated mutagenesis is one method of producing a substitution, an in-frame insertion, or a change (eg, an altered codon) to introduce a codon encoding an amino acid substitution (eg, into a fragment of an Fc variant). For example, the original DNA of a polypeptide is altered by hybridizing an oligonucleotide encoding the desired mutation to a single-stranded DNA template. After hybridization, a DNA polymerase is used to synthesize the complete second complementary strand of the template, which inserts the oligonucleotide primer. In one embodiment, to obtain a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention, genetic engineering, such as primer-based PCR mutagenesis, is sufficient to make a change according to the definitions herein.

Для получения рекомбинанта полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, встраивают в соответствующее средство экспрессии, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности, или в случае вектора на основе РНК-вируса - необходимые элементы для репликации и трансляции.To obtain a recombinant, a polynucleotide sequence encoding a polypeptide is inserted into an appropriate expression means, i. a vector that contains the necessary elements for transcription and translation of the inserted coding sequence, or in the case of an RNA virus-based vector, the necessary elements for replication and translation.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, встраивают в вектор в надлежащую рамку считывания. Вектор экспрессии затем трансфицируют в подходящую клетку-мишень, в которой будет экспрессироваться полипептид. Методы трансфекции, известные в настоящем уровне техники, включают, но без ограничений, преципитацию фосфатом кальция (Wigler et al., 1978, Cell, 14:725) и электропорацию (Neumann et al., 1982, EMBO J., 1:841). Для экспрессии полипептида, описанного в данном документе, в эукариотических клетках можно использовать множество векторных систем, использующих механизмы экспрессии хозяина. В одном варианте реализации эукариотическая клетка - это клетка животного, включая клетки млекопитающих (например, клетки CHO, BHK, Cos, HeLa). При экспрессии полипептида в эукариотической клетке ДНК, кодирующая полипептид, может также кодировать сигнальную последовательность, которая обеспечивает секрецию полипептида. Специалист в данной области техники поймет, что тогда, когда происходит трансляция белка, происходит отщепление сигнальной последовательности клеткой с образованием зрелого полипептида. В одном варианте реализации настоящее изобретение относится к зрелым полипептидам, содержащим линкерный пептид настоящего изобретения. Альтернативно, в случае если сигнальная последовательность не включена, полипептид можно выделить путем лизиса клеток.The nucleic acid encoding the polypeptide is inserted into the vector in the correct reading frame. The expression vector is then transfected into a suitable target cell in which the polypeptide will be expressed. Transfection methods known in the art include, but are not limited to, calcium phosphate precipitation (Wigler et al., 1978, Cell, 14:725) and electroporation (Neumann et al., 1982, EMBO J., 1:841) . To express the polypeptide described herein in eukaryotic cells, you can use a variety of vector systems that use the mechanisms of expression of the host. In one embodiment, the eukaryotic cell is an animal cell, including mammalian cells (eg, CHO, BHK, Cos, HeLa cells). When the polypeptide is expressed in a eukaryotic cell, the DNA encoding the polypeptide may also encode a signal sequence that allows secretion of the polypeptide. One skilled in the art will appreciate that when translation of a protein occurs, the signal sequence is cleaved by the cell to form the mature polypeptide. In one embodiment, the implementation of the present invention relates to Mature polypeptides containing the linker peptide of the present invention. Alternatively, if the signal sequence is not included, the polypeptide can be isolated by cell lysis.

Полипептид настоящего изобретения также может синтезироваться в трансгенном животном, таком как грызун, коза, овца, свинья или корова. Выражение трансгенные животные относится к животным, не относящимся к человеку, в геном которых был встроен чужеродный ген. Этот ген присутствует в зародышевых тканях, но передается от родителя к потомству. Экзогенные гены вводят в эмбрионы на стадии одной клетки (Brinster et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:4438). Способы получения трансгенных животных известны в настоящем уровне техники, включая трансгенику, с помощью которой получают иммуноглобулиновые молекулы (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:6376; McKnight et al., 1983, Cell, 34:335; Brinster et al., 1983, Nature, 306:332; Ritchie et al., 1984, Nature 312:517; Baldassarre et al., 2003, Theriogenology, 59:831; Robl et al., 2003, Theriogenology, 59:107; Malassagne et al., 2003, Xenotransplantation, 10(3):267).The polypeptide of the present invention can also be synthesized in a transgenic animal such as a rodent, goat, sheep, pig or cow. The expression transgenic animals refers to non-human animals into whose genome a foreign gene has been inserted. This gene is present in germline tissues but is passed from parent to offspring. Exogenous genes are introduced into embryos at the single cell stage (Brinster et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:4438). Methods for producing transgenic animals are known in the art, including transgenics that produce immunoglobulin molecules (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:6376; McKnight et al., 1983, Cell , 34:335; Brinster et al., 1983, Nature 306:332; Ritchie et al., 1984, Nature 312:517; Baldassarre et al., 2003, Theriogenology, 59:831; Robl et al., 2003, Theriogenology, 59:107; Malassagne et al., 2003, Xenotransplantation, 10(3):267).

Векторы экспрессии могут кодировать метки, которые облегчают очистку или идентификацию полипептидов, полученных с помощью рекомбинантных методов. Примеры включают, но без ограничений, вектор pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J., 2:1791), с помощью которого кодирующую последовательность полипептида, описанного в данном документе, можно лигировать в вектор в рамку считывания с областью, кодирующей lac, таким образом, чтобы получить гибридный белок; векторы pGEX можно использовать для экспрессии белков с меткой - глутатион-S-трансферазой (GST). Эти белки обычно растворимы и могут быть легко очищены из клеток путем адсорбции на глутатион-агарозных гранулах с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы включают сайты расщепления (например, PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)) для облегчения удаления метки после очистки.Expression vectors may encode labels that facilitate the purification or identification of polypeptides produced by recombinant methods. Examples include, but are not limited to, the pUR278 vector (Ruther et al., 1983, EMBO J., 2:1791), by which the coding sequence for a polypeptide described herein can be ligated into a vector in frame with a lac-coding region. so as to obtain a fusion protein; pGEX vectors can be used to express glutathione-S-transferase (GST) tagged proteins. These proteins are usually soluble and can be easily purified from cells by adsorption onto glutathione-agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione. Vectors include cleavage sites (eg, PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)) to facilitate label removal after purification.

В целях настоящего изобретения можно использовать многочисленные различные принятые в на- 24 040195 стоящем уровне техники векторные системы экспрессии.For the purposes of the present invention, numerous different vector expression systems of the present art can be used.

Эти векторы экспрессии, как правило, способны реплицироваться в организмах-хозяевах либо как эписомы, либо как составляющая часть хромосомной ДНК хозяина. Векторы экспрессии могут содержать последовательности для контроля экспрессии, включая, но без ограничений, промоторы (например, эндогенные или гетерологичные промоторы), энхансеры, сигнальные последовательности, сплайссигнальные последовательности, энхансерные элементы и последовательности для терминации транскрипции. Предпочтительно последовательности для контроля экспрессии представляют собой эукариотические промоторные системы, присутствующие в векторах, которые способны обеспечить трансформацию или трансфекцию эукариотических клеток-хозяев. В векторах экспрессии могут также использоваться ДНК-элементы, которые получают из вирусов животных, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус полиомы, аденовирус, вирус Vaccinia, бакуловирус, ретровирусы (RSV, MMTV или MOMLV), цитомегаловирус (CMV) или вирус SV40. Другие векторы включают использование полицистронных систем с внутренним сайтом связывания рибосомы.These expression vectors are generally able to replicate in host organisms either as episomes or as an integral part of the host's chromosomal DNA. Expression vectors may contain expression control sequences, including, but not limited to, promoters (eg, endogenous or heterologous promoters), enhancers, signal sequences, splice signal sequences, enhancer elements, and transcription termination sequences. Preferably, the expression control sequences are eukaryotic promoter systems present in the vectors that are capable of transforming or transfecting eukaryotic host cells. Expression vectors can also use DNA elements that are derived from animal viruses such as bovine papilloma virus, polyoma virus, adenovirus, Vaccinia virus, baculovirus, retroviruses (RSV, MMTV or MOMLV), cytomegalovirus (CMV), or SV40 virus. . Other vectors include the use of polycistronic systems with an internal ribosome binding site.

Для обнаружения клеток, трансформированных с помощью желаемых последовательностей ДНК, векторы экспрессии обычно содержат селективные маркеры (например, маркеры устойчивости к ампициллину, устойчивости к гигромицину, устойчивости к тетрациклину или устойчивости к неомицину) (см., например, Itakura et al., патент США 4704362). Можно провести селекцию клеток, в которых произошла интеграция ДНК в хромосомы, за счет введения одного или нескольких маркеров, которые обеспечивают возможность селекции трансфицированных клеток-хозяев. Маркер может придавать ауксотрофному хозяину свойства, характерные для прототрофов, устойчивость к биоцидам (например, антибиотикам) или устойчивость к тяжелым металлам, таким как медь. Ген селектируемого маркера можно либо непосредственно присоединять к последовательностям ДНК, которые необходимо экспрессировать, или вводить в ту же самую клетку путем котрансформации.To detect cells transformed with the desired DNA sequences, expression vectors typically contain selectable markers (e.g., ampicillin resistance, hygromycin resistance, tetracycline resistance, or neomycin resistance markers) (see, e.g., Itakura et al., US Pat. 4704362). It is possible to select for cells that have integrated DNA into chromosomes by introducing one or more markers that allow selection of transfected host cells. The marker can confer prototrophic properties to the auxotrophic host, resistance to biocides (eg antibiotics), or resistance to heavy metals such as copper. The selectable marker gene can either be directly attached to the DNA sequences to be expressed or introduced into the same cell by co-transformation.

В других предпочтительных вариантах реализации полипептиды настоящего изобретения можно экспрессировать с использованием полицистронных конструктов. В этих экспрессирующих системах из одного полицистронного конструкта можно получить многочисленные представляющие интерес генные продукты, как, например, многочисленные полипептиды мультимерных связывающих белков. Для обеспечения относительно высоких уровней полипептидов настоящего изобретения в эукариотических клетках-хозяевах в этих системах преимущественно используется сайт внутренней посадки рибосомы (IRES). Сходные последовательности IRES раскрыты в патенте США № 6193980, который также включен в данный документ. Специалисты в данной области техники поймут, что для эффективного получения полного набора полипептидов, раскрытых в настоящей заявке, можно использовать такие экспрессирующие системы.In other preferred embodiments, the polypeptides of the present invention can be expressed using polycistronic constructs. In these expression systems, multiple gene products of interest, such as multiple multimeric binding protein polypeptides, can be generated from a single polycistronic construct. In order to provide relatively high levels of the polypeptides of the present invention in eukaryotic host cells, these systems advantageously use an internal ribosome entry site (IRES). Similar IRES sequences are disclosed in US Pat. No. 6,193,980, which is also incorporated herein. Those skilled in the art will appreciate that such expression systems can be used to efficiently produce the full set of polypeptides disclosed in this application.

В более общем смысле, как только получили вектор или последовательность ДНК, кодирующую полипептид, можно вводить вектор экспрессии в соответствующую клетку-хозяина. Т.е. клетку-хозяина можно трансформировать. Введение плазмиды в клетку-хозяина можно осуществить посредством различных методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Они включают, но без ограничений, трансфекцию (включая электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, преципитацию фосфатом кальция, слияние клеток с заключенной ДНК, микроинъекцию и инфицирование интактным вирусом. См., Ridgway, A.A.G., Mammalian Expression Vectors, chapter 24.2, p. 470-472, Vectors, Rodriguez and Denhardt, eds. (Butterworths, Boston, Mass., 1988). Наиболее предпочтительно введение плазмиды в клетку-хозяина осуществлять посредством электропорации. Трансформированные клетки выращивают в условиях, подходящих для получения легких цепей и тяжелых цепей, и анализируют синтез тяжелых и/или легких цепей. Иллюстративные методы анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА) или флюоресцентно-активируемую клеточную сортировку (FACS), иммуногистохимию и т.п.More generally, once a vector or DNA sequence encoding a polypeptide has been obtained, the expression vector can be introduced into an appropriate host cell. Those. the host cell can be transformed. Introduction of a plasmid into a host cell can be accomplished by various methods well known to those skilled in the art. These include, but are not limited to, transfection (including electrophoresis and electroporation), protoplast fusion, calcium phosphate precipitation, cell DNA fusion, microinjection, and infection with intact virus. See, Ridgway, A.A.G., Mammalian Expression Vectors, chapter 24.2, p. 470-472, Vectors, Rodriguez and Denhardt, eds. (Butterworths, Boston, Mass., 1988). Most preferably, the introduction of the plasmid into the host cell is by electroporation. The transformed cells are grown under conditions suitable for the production of light chains and heavy chains, and the synthesis of heavy and/or light chains is analyzed. Exemplary assay methods include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) or fluorescence activated cell sorting (FACS), immunohistochemistry, and the like.

Как используется в данном документе, выражение трансформация следует использовать в широком смысле в отношении введения ДНК в реципиентную клетку-хозяина, которое изменяет генотип и вследствие этого приводит к изменению реципиентной клетки.As used herein, the term transformation should be used in a broad sense to refer to the introduction of DNA into a recipient host cell that alters the genotype and thereby results in a change in the recipient cell.

В том же ключе клетки-хозяева относятся к клеткам, которые были трансформированы с помощью векторов, сконструированных с использованием методов рекомбинантной ДНК, и кодирующие по меньшей мере один гетерологичный ген. При описаниях процессов выделения полипептидов из рекомбинантных хозяев, выражения клетка и культура клеток используются взаимозаменяемо для обозначения источника полипептида, если, конечно, не указано иное. Другими словами, выделение полипептида из данных клеток может означать выделение либо из всех осажденных клеток, либо из культуры клеток, содержащей как среду, так и суспендированные клетки.In the same vein, host cells refer to cells that have been transformed with vectors constructed using recombinant DNA techniques and encoding at least one heterologous gene. In describing processes for isolating polypeptides from recombinant hosts, the expressions cell and cell culture are used interchangeably to refer to the source of the polypeptide, unless, of course, otherwise indicated. In other words, isolation of the polypeptide from these cells may mean isolation either from all precipitated cells or from a cell culture containing both medium and suspended cells.

Источником линии клеток-хозяев, используемых для экспрессии белка, наиболее предпочтительно являются млекопитающие; специалисты в данной области техники обладают способностью, чтобы предпочтительно определить отдельные линии клеток-хозяев, которые являются наиболее подходящими для экспрессии в них желаемого генного продукта. Иллюстративные линии клеток-хозяев включают, но без ограничений, DG44 и DUXB11 (линии клеток яичника китайского хомячка, DHFR-минус), HELA (карцинома шейки матки человека), CVI (линия клеток почки обезьяны), COS (производное CVI с антигеномThe source of the host cell line used to express the protein is most preferably mammalian; those skilled in the art have the ability to preferentially identify individual host cell lines that are most suitable for expressing the desired gene product. Exemplary host cell lines include, but are not limited to, DG44 and DUXB11 (Chinese Hamster Ovary cell lines, DHFR-minus), HELA (human cervical carcinoma), CVI (monkey kidney cell line), COS (CVI derivative with antigen

- 25 040195- 25 040195

SV40 Т), R1610 (фибробласты китайского хомячка), BALBC/3T3 (фибробласты мыши), HAK (линия клеток почки хомячка), SP2/O (миелома мыши), P3x63-Ag3.653 (миелома мыши), BFA-1c1BPT (эндотелиальные клетки быка), RAJI (человеческие лимфоциты) и 293 (почка человека). СНО-клетки являются особенно предпочтительными. Линии клеток-хозяев, как правило, доступны из коммерческих источников, американской коллекции тканевых культур или из опубликованной литературы.SV40 T), R1610 (Chinese hamster fibroblasts), BALBC/3T3 (mouse fibroblasts), HAK (hamster kidney cell line), SP2/O (mouse myeloma), P3x63-Ag3.653 (mouse myeloma), BFA-1c1BPT (endothelial bovine cells), RAJI (human lymphocytes) and 293 (human kidney). CHO cells are particularly preferred. Host cell lines are generally available from commercial sources, the American Tissue Culture Collection, or from the published literature.

Гены, кодирующие полипептиды настоящего изобретения, также можно экспрессировать не только в клетках млекопитающих, но и в других клетках, таких как бактериальные, дрожжевые или растительные. В этом отношении будет понятно, что также можно трансформировать различные одноклеточные микроорганизмы, такие как бактерии; т.е. те микроорганизмы, которые способны расти в культурах или за счет брожения. Бактерии, которые чувствительны к трансформации, включают представителей enterobacteriaceae, таких как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, таких как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Дополнительно понятно, что при экспрессии в бактериях полипептиды, как правило, становятся частью телец включения. Полипептиды необходимо выделить, подвергнуть очистке и затем из них необходимо собрать функциональные молекулы.The genes encoding the polypeptides of the present invention can also be expressed not only in mammalian cells, but also in other cells, such as bacterial, yeast or plant. In this regard, it will be understood that it is also possible to transform various single-celled microorganisms such as bacteria; those. those microorganisms that are able to grow in cultures or through fermentation. Bacteria that are susceptible to transformation include members of the enterobacteriaceae such as strains of Escherichia coli or Salmonella; Bacillaceae such as Bacillus subtilis; pneumococcus; Streptococcus and Haemophilus influenzae. It is further understood that when expressed in bacteria, polypeptides typically become part of inclusion bodies. Polypeptides must be isolated, purified, and then functional molecules must be assembled from them.

В дополнение к прокариотам также можно использовать эукариотические микроорганизмы. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, наиболее широко используются среди эукариотических микроорганизмов, хотя обычно доступно множество других штаммов. Для экспрессии в Saccharomyces, например, широко используется плазмида YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). Эта плазмида уже содержит ген TRP1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, которые утратили способность расти в присутствии триптофана, например ATCC № 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms can also be used. Saccharomyces cerevisiae, or common baker's yeast, is the most widely used among eukaryotic microorganisms, although many other strains are commonly available. For expression in Saccharomyces, for example, the YRp7 plasmid is widely used (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). This plasmid already contains the TRP1 gene, which provides a selectable marker for a mutant strain of yeast that has lost the ability to grow in the presence of tryptophan, such as ATCC #44076 or PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).

Наличие повреждения trp1, характерного для генома дрожжевой клетки-хозяина, создает эффективные условия для обнаружения трансформации путем выращивания в отсутствие триптофана. Также можно использовать другие дрожжи-хозяева, такие как Pichia. Также по желанию используют векторы экспрессии дрожжей, имеющие последовательности для контроля экспрессии (например, промоторы), точку начала репликации, стоп-кодоны и т.п. Типичные промоторы включают 3-фосфоглицераткиназу и другие гликолитические ферменты. Индуцибельные промоторы дрожжей включают в числе прочих промоторы гена алкогольдегидразы, изоцитохрома C и ферменты, отвечающие за утилизацию метанола, мальтозы и галактозы.The presence of trp1 damage, characteristic of the yeast host cell genome, creates effective conditions for the detection of transformation by growing in the absence of tryptophan. Other host yeasts such as Pichia can also be used. Also, optionally, yeast expression vectors are used having sequences to control expression (eg, promoters), an origin of replication, stop codons, and the like. Exemplary promoters include 3-phosphoglycerate kinase and other glycolytic enzymes. Inducible yeast promoters include, among others, promoters of the alcohol dehydrase gene, isocytochrome C, and enzymes responsible for the utilization of methanol, maltose, and galactose.

Альтернативно полипептид-кодирующие нуклеотидные последовательности можно встраивать в трансгены для введения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., например, Deboer et al., US 5741957, Rosen, US 5304489 и Meade et al., US 5849992). Подходящие трансгены включают кодирующие последовательности для полипептидов, которые функционально связаны с промотором и энхансером из гена, специфичного для молочной железы, такого как казеин или бета-лактоглобулин.Alternatively, polypeptide-encoding nucleotide sequences can be inserted into transgenes for introduction into the genome of the transgenic animal and subsequent expression in the milk of the transgenic animal (see, e.g., Deboer et al. . Suitable transgenes include coding sequences for polypeptides that are operably linked to a promoter and enhancer from a breast-specific gene such as casein or beta-lactoglobulin.

Производство in vitro позволяет в промышленном масштабе получить большие количества желаемых полипептидов. Методы культивирования клеток млекопитающих в больших масштабах в условиях тканевой культуры известны в настоящем уровне техники и включают гомогенную суспензионную культуру, например, в аэролифтном реакторе или в реакторе с непрерывным перемешиванием или культуру иммобилизованных или заключенных клеток, например, в полые волокна, микрокапсулы, на агарозных микрогранулах или керамических картриджах. При необходимости и/или желании растворы полипептидов можно очистить с использованием общепринятых методов хроматографии, например гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или (иммуно-)аффинной хроматографии, например, после избирательного биосинтеза полипептида с синтетической шарнирной областью или до или после этапа HIC-хроматографии, описанной в данном документе. Для облегчения последующей очистки в некоторых случаях можно присоединять или включать в состав полипептидной последовательности последовательность с аффинной меткой (например, меткой His(6)).In vitro production allows large quantities of the desired polypeptides to be produced on an industrial scale. Methods for culturing mammalian cells on a large scale under tissue culture conditions are known in the art and include homogeneous suspension culture, e.g. microbeads or ceramic cartridges. If necessary and/or desired, polypeptide solutions can be purified using conventional chromatographic techniques, e.g., size exclusion filtration, ion exchange chromatography, DEAE-cellulose chromatography, or (immuno-)affinity chromatography, e.g., after selective biosynthesis of a polypeptide with a synthetic hinge region, or before or after the HIC chromatography step described herein. To facilitate subsequent purification, in some cases, a sequence with an affinity tag (eg, a His(6) tag) may be added to or incorporated into the polypeptide sequence.

Специалист в данной области техники сможет легко синтезировать меньшие пептиды для использования в связи с настоящим изобретением. Стандартные методики получения синтетических пептидов хорошо известны в настоящем уровне техники. Пептиды можно синтезировать с использованием способа твердофазного пептидного синтеза (SPPS) Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964), который включен в данный документ посредством ссылки) или с использованием стандартных способов решения, хорошо известных в настоящем уровне техники (см., например, Bodanzsky, M., Principles of Peptide Synthesis 2nd revised ed. (Springer-Verlag, 1988 и 1993), который включен в данный документ посредством ссылки). Альтернативно можно использовать методы одновременного синтеза множества пептидов (SMPS), хорошо известные в настоящем уровне техники. Пептиды полученные по способу Merrifield можно синтезировать с использованием автоматизированных синтезаторов пептидов, такие как Applied Biosystems 431 А-01 Peptide Synthesizer (Mountain View, Calif) или с использованием ручного способа пептидного синтеза, описанных Houghten, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 82:5131 (1985), который включен в данный документ посредством ссылки.One of skill in the art will readily be able to synthesize smaller peptides for use in connection with the present invention. Standard techniques for the preparation of synthetic peptides are well known in the art. Peptides can be synthesized using the Merrifield Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) method (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964), which is incorporated herein by reference) or using standard solution methods well known in the art. techniques (see, for example, Bodanzsky, M., Principles of Peptide Synthesis 2nd revised ed. (Springer-Verlag, 1988 and 1993), which is incorporated herein by reference). Alternatively, multiple peptide simultaneous synthesis (SMPS) methods well known in the art can be used. Merrifield-derived peptides can be synthesized using automated peptide synthesizers such as the Applied Biosystems 431 A-01 Peptide Synthesizer (Mountain View, Calif) or using the manual peptide synthesis method described by Houghten, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 82:5131 (1985), which is incorporated herein by reference.

Пептиды можно синтезировать с использованием аминокислот или аминокислотных аналогов, актив- 26 040195 ные группы которых при необходимости защищают с использованием, например, t-бутилбикарбонатной (t-BOC) группы или флуоренилметоксикарбонильной (FMOC) группы. Аминокислоты и аминокислотные аналоги можно коммерчески приобрести (Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtec) или синтезировать с использованием способов, известных в настоящем уровне техники. Пептиды, синтезированные с использованием твердофазного метода, могут связываться со смолами, включая 4-метилбензгидриламин (MBHA), 4-(оксиметил)-фенилацетамидометил и сополимер стирола с 1% дивинилбензола с 4-гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой (смола Ванга), все из которых коммерчески доступны, или с полимером р-нитробензофеноноксима (оксимная смола), который можно синтезировать, как описано De Grado, Kaiser, J. Org. Chem. 47:3258 (1982), который включен в данный документ посредством ссылки.Peptides can be synthesized using amino acids or amino acid analogues whose active groups are optionally protected using, for example, a t-butyl bicarbonate (t-BOC) group or a fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) group. Amino acids and amino acid analogs can be purchased commercially (Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtec) or synthesized using methods known in the art. Peptides synthesized using the solid phase method can bind to resins including 4-methylbenzhydrylamine (MBHA), 4-(hydroxymethyl)-phenylacetamidomethyl, and a styrene-1% divinylbenzene copolymer with a 4-hydroxymethylphenoxymethyl anchor group (Vang resin), all of which are commercially available. available, or with the polymer p-nitrobenzophenone oxime (oxime resin), which can be synthesized as described by De Grado, Kaiser, J. Org. Chem. 47:3258 (1982), which is incorporated herein by reference.

VII. Очистка связывающих молекул.VII. Purification of binding molecules.

После экспрессии полипептиды настоящего изобретения можно очистить в соответствии со стандартными методиками в данном уровне техники, включая, например, фракционирование сульфатом аммония, аффинную колоночную хроматографию, ВЭЖХ-очистку, гель-электрофорез и т.п. (см. в целом Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Вновь синтезированный пептид можно также очистить с использованием способа, такого как обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), или других способов разделения на основе размера или заряда пептида. Кроме того, очищенный пептид можно охарактеризовать с использованием этих и других хорошо известных способов, таких как аминокислотный анализ и масс-спектрометрия.Once expressed, the polypeptides of the present invention can be purified according to standard techniques in the art, including, for example, ammonium sulfate fractionation, affinity column chromatography, HPLC purification, gel electrophoresis, and the like. (See generally Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y. (1982)). The newly synthesized peptide can also be purified using a method such as reverse phase high performance liquid chromatography (RP HPLC) or other size separation methods. or charge of the peptide In addition, the purified peptide can be characterized using these and other well known methods such as amino acid analysis and mass spectrometry.

Для фармацевтических целей предпочтительно использовать по сути чистые белки с гомогенностью по меньшей мере примерно от 90 до 95% и наиболее предпочтительно использовать белки с гомогенностью от 98 до 99% или больше.For pharmaceutical purposes, it is preferable to use substantially pure proteins with at least about 90% to 95% homogeneity, and most preferably to use proteins with 98 to 99% or greater homogeneity.

VIII. Способы введения.VIII. Methods of administration.

Специалистам в данной области техники хорошо известны или они без труда определят способы получения и введения полипептидов настоящего изобретения субъекту.Those skilled in the art are well aware of or will readily recognize methods for preparing and administering the polypeptides of the present invention to a subject.

Композиции для введения субъекту включают молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую связывающую молекулу настоящего изобретения (для применений в качестве генной терапии), а также полипептидные молекулы.Compositions for administration to a subject include nucleic acid molecules that contain a nucleotide sequence encoding a binding molecule of the present invention (for gene therapy applications) as well as polypeptide molecules.

Способы введения включают, но без ограничений, внутрикожные, внутримышечные, внутрибрюшинные, внутривенные, подкожные, интраназальные, эпидуральные и оральные пути. Конъюгаты можно вводить с помощью любого подходящего пути, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем поглощения через эпителиальные или кожно-слизистые выстилающие оболочки (например, слизистая оболочка полости рта, слизистая оболочка прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить совместно с другими фармакологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.Routes of administration include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The conjugates may be administered by any suitable route, for example, by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (eg, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.) and may be administered together with other pharmacologically active agents. The introduction can be systemic or local.

При определенных обстоятельствах фармацевтические композиции настоящего изобретения, возможно, желательно вводить непосредственно в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая внутрижелудочковые и подоболочечные инъекции; внутрижелудочковые инъекции может облегчать внутрижелудочковый катетер, например, присоединенной к резервуару, такому как резервуар Оммайя.Under certain circumstances, the pharmaceutical compositions of the present invention may be desirable to be administered directly to the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injections; intraventricular injections may be facilitated by an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir.

Ингаляционное или назальное введение также можно использовать, например, за счет использования ингалятора или распылителя и состава с аэрозольным средством.Inhalation or nasal administration can also be used, for example, through the use of an inhaler or nebulizer and an aerosol formulation.

В другом варианте реализации конъюгаты можно доставлять в системе контролируемого высвобождения. В одном варианте реализации можно использовать помпу (см. Langer выше; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgety, 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl., J. Med., 321:574 (1989)). Еще в одном варианте реализации систему контролируемого высвобождения можно помещать вблизи терапевтической мишени, т.е. головного мозга, и, таким образом, потребуется только фракция системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, p. 115-138 (1984)).In another embodiment, the conjugates can be delivered in a controlled release system. In one embodiment, a pump may be used (see Langer supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgety, 88:507 (1980); Saudek et al. , N. Engl., J. Med., 321:574 (1989)). In yet another embodiment, the controlled release system can be placed in the vicinity of the therapeutic target, i. brain, and thus only a fraction of the systemic dose is required (see, for example, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, p. 115-138 (1984)).

Другие системы контролируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (Science, 249:1527-1533 (1990)).Other controlled release systems are discussed in a review by Langer (Science, 249:1527-1533 (1990)).

Субъект представляет собой предпочтительно животное, включая, но без ограничений, животные, такие как коровы, свиньи, лошади, куры, кошки, собаки и т.д., и представляет собой предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человека.The subject is preferably an animal, including but not limited to animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs, etc., and is preferably a mammal, most preferably a human.

Обычно подходящие фармацевтические композиции для инъекции могут содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), в некоторых случаях стабилизирующее средство (например, человеческий альбумин) и т.д. Однако в других способах, совместимых с идеей настоящего изобретения, полипептиды могут доставляться непосредственно в место нахождения популяции нежелательных клеток, вследствие этого увеличивая степень воздействия терапевтического средства на пораженную ткань.In general, suitable pharmaceutical compositions for injection may contain a buffer (eg, an acetate, phosphate, or citrate buffer), a surfactant (eg, polysorbate), in some cases a stabilizing agent (eg, human albumin), and the like. However, in other ways consistent with the idea of the present invention, the polypeptides can be delivered directly to the location of the population of unwanted cells, thereby increasing the degree of exposure of the therapeutic agent to the affected tissue.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленглиPreparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol

- 27 040195 коль, растительные масла, такие как оливковое масло и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды. В рассматриваемом изобретении фармацевтически приемлемые носители включают, но без ограничений, 0,01-0,1 М и предпочтительно 0,05 М фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор. Другие общепринятые растворы для парентерального введения включают натрий-фосфатные растворы, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла. Растворы для внутривенного введения включают жидкость и добавки питательных веществ, добавки электролитов, такие как на основе раствора Рингера с декстрозой и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы и т.п.- 27 040195 kohl, vegetable oils such as olive oil and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous vehicles include water, alcoholic/aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffer media. In the present invention, pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, 0.01-0.1M and preferably 0.05M phosphate buffer or 0.8% saline. Other common parenteral solutions include sodium phosphate solutions, dextrose Ringer's solution, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's solution, or fatty oils. Intravenous solutions include liquid and nutrient supplements, electrolyte supplements such as those based on dextrose Ringer's solution, and the like. Preservatives and other additives may also be present, such as, for example, antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents and inert gases, and the like.

Более конкретно фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного использования, включают стерильные водные растворы (в случае растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. В таких случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы обеспечить возможность введения без труда через шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и предпочтительно защищенной против контаминации микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или диспергирующая среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерол, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащее жидкое состояние можно поддерживать, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, за счет поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и за счет использования поверхностно-активных веществ.More specifically, pharmaceutical compositions suitable for injectable use include sterile aqueous solutions (if soluble in water) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions. In such cases, the composition must be sterile and must be fluid to the extent that it can be administered without difficulty via a syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage, and preferably protected against contamination by microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (eg glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof. The proper liquid state can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the desired particle size in the case of a dispersion, and by using surfactants.

Предотвращение действия микроорганизмов можно достичь с помощью различных противобактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлоробутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические средства, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированное поглощение инъецируемых композиций можно обеспечить за счет включения в композицию средства, которое задерживает поглощение, например, алюминия моностеарата и желатина.Prevention of the action of microorganisms can be achieved with various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases it is preferable to include isotonic agents such as sugars, polyols such as mannitol, sorbitol or sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of injectable compositions can be achieved by including in the composition an agent that delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.

В любом случае стерильные инъецируемые растворы можно получить за счет включения активного соединения (например, полипептида самого по себе или в комбинации с другими активными средствами) в требуемом количестве в соответствующем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных в данном документе, при необходимости с последующей стерилизацией путем фильтрации. В целом дисперсии получают за счет включения активного соединения в стерильный раствор, который содержит основную диспергирующую среду и другие требуемые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, которыя позволяет получить порошок из активного ингредиента с любым дополнительным желаемым ингредиентом из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрацией. Препараты для инъекций подвергают обработке, помещают в контейнеры, такие как ампулы, пакеты, бутылки, шприцы или флаконы, и герметизируют в стерильных условиях в соответствии со способами, известными в настоящем уровне техники. Дополнительно препараты можно упаковать и продать в форме набора, который предпочтительно будет содержать этикетки или листки-вкладыши в упаковке с указанием, что сопутствующие композиции являются полезными для лечения субъекта, страдающего от или предрасположенного к аутоиммунным или неопластическим нарушениям.In any case, sterile injectable solutions can be obtained by incorporating the active compound (e.g., the polypeptide alone or in combination with other active agents) in the required amount in an appropriate solvent with one or a combination of the ingredients listed herein, if necessary, followed by sterilization. by filtering. In general, dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile solution which contains the basic dispersion medium and other required ingredients from those listed above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and freeze drying, which allows the preparation of a powder of the active ingredient with any additional desired ingredient from its solution, previously sterilized by filtration. Formulations for injection are processed, placed in containers such as ampoules, pouches, bottles, syringes or vials, and sealed under sterile conditions in accordance with methods known in the art. Additionally, formulations may be packaged and sold in kit form, which will preferably include labels or package inserts stating that the accompanying compositions are useful in treating a subject suffering from or predisposed to autoimmune or neoplastic disorders.

Эффективные дозы композиций настоящего изобретения для лечения состояний изменяются в зависимости от многих разных факторов, включая способы введения, целевого участка введения, физиологического состояния пациента, от того, является ли пациент человеком или животным, других вводимых лекарственных препаратов и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, но также можно лечить млекопитающих, не относящихся к человеку, включая трансгенных млекопитающих.Effective dosages of compositions of the present invention for treating conditions will vary depending on many different factors, including routes of administration, target site of administration, physiological state of the patient, whether the patient is human or animal, other drugs administered, and whether the treatment is prophylactic or therapeutic. Typically, the patient is a human, but non-human mammals, including transgenic mammals, may also be treated.

Для оптимизации безопасности и эффективности лечебные дозы можно титровать с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области техники. В одном варианте реализации полипептид настоящего изобретения представляет собой полипептид, который ранее вводили пациентам, но который модифицировали за счет включения линкерного пептида настоящего изобретения вместо традиционного линкерного пептида. В таких случаях доза вводимого полипептида будет согласована с дозой, которая, как было ранее обнаружено, является безопасной и эффективной, т.е. стандартом лечения.To optimize safety and efficacy, therapeutic doses can be titrated using conventional methods known to those skilled in the art. In one embodiment, the implementation of the polypeptide of the present invention is a polypeptide that has previously been administered to patients, but which has been modified to include a linker peptide of the present invention instead of the traditional linker peptide. In such cases, the dose of the administered polypeptide will be consistent with the dose previously found to be safe and effective, i. standard of care.

Полипептиды настоящего изобретения можно вводить неоднократно. Интервалы между однократными дозами могут быть еженедельно, ежемесячно или ежегодно. Интервалы могут также быть нерегулярными в соответствии с измерением уровней полипептида, мишени полипептида или антигена в крови пациента. В некоторых способах для достижения определенной концентрации in vivo дозу регулируют. Альтернативно полипептиды можно вводить в качестве состава с замедленным высвобождением; в случае чего введение необходимо осуществлять реже. Доза и частота изменяются в зависимости от периодаThe polypeptides of the present invention can be administered repeatedly. Intervals between single doses may be weekly, monthly or yearly. The intervals may also be irregular according to the measurement of levels of the polypeptide, target polypeptide or antigen in the patient's blood. In some methods, the dose is adjusted to achieve a certain concentration in vivo. Alternatively, the polypeptides can be administered as a sustained release formulation; in which case the introduction should be carried out less frequently. Dose and frequency vary with period

- 28 040195 полувыведения полипептида у пациента.- 28 040195 half-life of the polypeptide in the patient.

Доза и частота введения могут изменяться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При применении в профилактических целях композиции, содержащие полипептиды настоящего изобретения или их смесь, вводят пациенту, который еще не находится в болезненном состоянии, для повышения устойчивости пациента. Такое количество получило определение профилактическая эффективная доза. Можно вводить относительно низкую дозу с относительно редкими интервалами в течение продолжительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца их жизни.The dose and frequency of administration may vary depending on whether the treatment is prophylactic or therapeutic. When used prophylactically, compositions containing the polypeptides of the present invention, or a mixture thereof, are administered to a patient who is not yet in a diseased state to increase patient tolerance. This amount has been defined as a prophylactic effective dose. A relatively low dose may be administered at relatively infrequent intervals over an extended period of time. Some patients continue to receive treatment for the rest of their lives.

При применении в терапевтических целях можно вводить относительно высокую дозу за относительно короткие интервалы, что иногда требуется осуществлять до тех пор, пока не произойдет замедление темпа или остановка прогрессирования болезни, и предпочтительно до тех пор, пока частично или полностью не произойдет ослабление симптомов болезни у пациента.When used therapeutically, a relatively high dose can be administered at relatively short intervals, which is sometimes required until the rate or progression of the disease is slowed or stopped, and preferably until the patient's symptoms of the disease are partially or completely relieved. .

Дополнительно будет понятно, что молекулы настоящего изобретения можно использовать в сочетании или комбинации со средством или средствами (например, для обеспечения схемы комбинированного лечения). Иллюстративные средства, с которыми можно комбинировать молекулу настоящего изобретения, включают средства, которые представляют современный стандарт лечения в отношении определенного нарушения, которое лечат. Такие средства могут иметь химическую или биологическую природу. Выражение биологический препарат или биологическое средство относится к любому фармацевтически активному средству, полученному из живых организмов и/или их продуктов, которое предназначено для использования в качестве терапевтического средства.Additionally, it will be appreciated that the molecules of the present invention may be used in combination or in combination with an agent or agents (eg, to provide a combination treatment regimen). Exemplary agents with which a molecule of the present invention may be combined include agents that represent the current standard of care for the particular disorder being treated. Such agents may be of a chemical or biological nature. The term biological preparation or biological agent refers to any pharmaceutically active agent derived from living organisms and/or their products, which is intended for use as a therapeutic agent.

Полипептиды настоящего изобретения можно в некоторых случаях вводить в комбинации с другими средствами, которые являются эффективными в лечении нарушения или состояния, которое необходимо лечить (например, профилактическое или терапевтическое лечение). Как используется в данном документе, введение полипептидов настоящего изобретения в сочетании или комбинации со вспомогательной терапией означает последовательное, проведенное одновременно, коэкстенсивное, параллельное, сопутствующее или проводимое одновременно введение или применение терапии и раскрываемых полипептидов. Специалисты в данной области техники понимают, что для повышения общей эффективности лечения можно рассчитать по времени введение или применение различных компонентов схем комбинированного лечения. Например, в стандартных, хорошо известных курсах лечения можно вводить химиотерапевтические или биологические средства в сочетании с исследуемыми связывающими молекулами. Специалист в данной области техники (например, врач) на основе подобранной вспомогательной терапии и идей настоящего описания сможет без труда подобрать эффективные схемы комбинированного лечения без неоправданного проведения исследований.The polypeptides of the present invention may, in some instances, be administered in combination with other agents that are effective in treating the disorder or condition being treated (eg, prophylactic or therapeutic treatment). As used herein, administration of the polypeptides of the present invention in combination or combination with an adjuvant therapy means sequential, concurrent, co-extensive, concurrent, concomitant or concurrent administration or administration of a therapy and the disclosed polypeptides. Those skilled in the art will appreciate that the administration or use of the various components of combination treatment regimens can be timed to improve the overall effectiveness of treatment. For example, standard, well-known treatments may administer chemotherapeutic or biological agents in combination with the binding molecules under investigation. A person skilled in the art (for example, a physician) based on the selected adjuvant therapy and the ideas of the present description will be able to easily select effective combination treatment regimens without undue research.

В одном варианте реализации полипептид можно получить у пациента за счет введения в виде молекулы нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты можно вводить с использованием методик, известных в настоящем уровне техники, включительно посредством вектора, плазмиды, липосомы, инъекции ДНК, электропорации, генной пушки, внутривенной инъекции или инфузии в печеночную артерию. Векторы для использования генной терапии в вариантах реализации известны в настоящем уровне техники.In one embodiment, the polypeptide can be obtained from a patient by administration as a nucleic acid molecule. Nucleic acid molecules can be administered using techniques known in the art, including vector, plasmid, liposome, DNA injection, electroporation, gene gun, intravenous injection, or hepatic artery infusion. Vectors for the use of gene therapy in embodiments are known in the present state of the art.

Количество средства, которое необходимо использовать в комбинации с полипептидами настоящего изобретения, можно изменять в зависимости от субъекта или можно вводить в соответствии с тем, что известно в настоящем уровне техники. См. например, Bruce A. Chabner et al., Antineoplastic Agents, в Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed., 1996). В другом варианте реализации вводят количество такого средства, которое согласуется со стандартом лечения.The amount of agent to be used in combination with the polypeptides of the present invention may vary depending on the subject, or may be administered as is known in the art. See, for example, Bruce A. Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed., 1996). In another embodiment, an amount of such agent is administered that is consistent with the standard of care.

Как обсуждалось ранее, полипептиды настоящего изобретения можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения in vivo нарушений, характерных для млекопитающих. В этом отношении будет понятно, что молекулу настоящего изобретения можно составить таким образом, чтобы облегчить введение и обеспечить стабильность активного средства. Предпочтительно фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают фармацевтически приемлемый, нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический солевой раствор, нетоксичные буферы, консерванты и т.п. В контексте настоящей заявки следует понимать, что фармацевтически эффективное количество полипептида настоящего изобретения, конъюгированного или неконъюгированного с терапевтическим средством, означает количество, достаточное для достижения эффективного связывания с антигеном и для достижения полезного эффекта, например для ослабления симптомов болезни или нарушения или для обнаружения вещества или клетки. В случае опухолевых клеток будет предпочтительно, чтобы полипептид мог взаимодействовать с избранными иммунореактивными антигенами на неопластических или иммунореактивных клетках и обеспечивать увеличение гибели этих клеток. Разумеется, что для обеспечения фармацевтически эффективного количества полипептида, фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить в однократных или многократных дозах.As previously discussed, the polypeptides of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount for the in vivo treatment of disorders occurring in mammals. In this regard, it will be understood that the molecule of the present invention can be formulated in such a way as to facilitate administration and ensure the stability of the active agent. Preferably, pharmaceutical compositions according to the present invention include a pharmaceutically acceptable, non-toxic, sterile carrier such as physiological saline, non-toxic buffers, preservatives, and the like. In the context of this application, it is to be understood that a pharmaceutically effective amount of a polypeptide of the present invention, whether conjugated or unconjugated to a therapeutic agent, means an amount sufficient to achieve effective binding to an antigen and to achieve a beneficial effect, for example, to ameliorate the symptoms of a disease or disorder, or to detect a substance or cells. In the case of tumor cells, it will be preferred that the polypeptide be able to interact with selected immunoreactive antigens on neoplastic or immunoreactive cells and provide an increase in the death of these cells. Of course, to provide a pharmaceutically effective amount of the polypeptide, the pharmaceutical compositions of the present invention can be administered in single or multiple doses.

В соответствии с объемом настоящего раскрытия молекулу настоящего изобретения можно вводить человеку или другому животному в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве,Within the scope of the present disclosure, a molecule of the present invention may be administered to a human or other animal in accordance with the aforementioned treatments in an amount

- 29 040195 достаточном для получения терапевтического или профилактического эффекта.- 29 040195 sufficient to obtain a therapeutic or prophylactic effect.

Способ введения и дозировочные формы, разумеется, будут влиять на терапевтические количества соединений, которые являются подходящими и эффективными для применения в конкретном лечении. Терапевтически эффективное количество представляет собой количество, необходимое для предотвращения, задержания или снижения тяжести продолжающейся болезни, или количество, необходимое для остановки или снижения тяжести продолжающейся болезни. Специалисту в данной области техники будет совершенно очевидно, что это количество будет изменяться с учетом факторов, таких как вес и здоровье реципиента, тип клеток, которые подвергают трансформации, способ введения настоящих композиций и тип нарушения, которое лечат.The route of administration and dosage forms will, of course, affect the therapeutic amounts of compounds that are appropriate and effective for use in a particular treatment. A therapeutically effective amount is the amount needed to prevent, delay, or lessen the severity of an ongoing disease, or the amount needed to stop or lessen the severity of an ongoing disease. One of ordinary skill in the art will appreciate that this amount will vary based on factors such as the weight and health of the recipient, the type of cells being transformed, the mode of administration of the present compositions, and the type of disorder being treated.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций настоящего изобретения. В некоторых случаях такой(ие) контейнер(ы) может(могут) сопровождаться пояснительной запиской в форме, предписанной правительственным учреждением, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем пояснительная записка отражает разрешение данным учреждением производства, использования или продажи для введения человеку.The present invention also provides a pharmaceutical package or kit containing one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical compositions of the present invention. In some cases, such container(s) may be accompanied by an explanatory note in the form prescribed by a government agency that regulates the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products, the explanatory note reflecting that agency's authorization of manufacture, use, or sale for introduction to man.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Содержания всех ссылок, патентов и опубликованных заявок на патент, цитированных по всей настоящей заявке, включены в данный документ посредством ссылки.The present invention is further illustrated by the following examples, which should not be considered as limiting. The contents of all references, patents, and published patent applications cited throughout this application are incorporated herein by reference.

ПримерыExamples

Экспрессия, очистка и характеристика молекул Fc5.Expression, purification and characterization of Fc5 molecules.

FC5 экспрессировали в E.coli и очищали с использованием осмотического шока для высвобождения растворимого белка из периплазматического пространства. Затем происходил захват растворимого His-меченого FC5 из лизата на никелевую колонку путем катионного обмена на fractogel SE с последующей гель-фильтрацией на superdex 200. Верблюжий V_HH характеризовали с использованием SDS PAGE (фиг. 2a-c). FC5-Fc, Fc-FC5 и FC5-scram-Fc экспрессировались в клеточных линиях DG44 CHO в соответствии с ранее описанными способами. Целевые белки, содержащие hFc, выделяли из среды, в которой культивировали клетки CHO (1 л), путем доведения pH до 7,0 и захвата белка на 5 мл колонку HiTrap rProteinA FF (GE heathcare), которую предварительно эквилибровали. Все очищенные белки характеризовали в отношении уровней эндотоксина до инъекции, чтобы не допустить эндотоксин-зависимого генерализованного открытия ГЭБ. Результаты показаны в табл. 1. Нейроактивные пептиды: даларгин, галанин или нейропептид Y - присоединяли к целевой молекуле (FC5, FC5-Fc) с использованием сукцининмидил-4-(К-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC), бифункционального химического линкера, с использованием способов, описанных в Uto et al., 1991 (Uto, I., Ishimatsu, Т., Hirayama, H., Ueda, S., Tsuruta, J., Kambara, T. (1991), Journal of immunological methods, 138(1), 87-94). Каждый пептид, который необходимо было присоединить, синтезировали с помощью аналога цистеамина на С-конце. Это обеспечивало поперечное сшивание С-конца пептида через свободный цистеин с лизином боковых цепей на белке с использованием SMCC-бифункционального сшивающего химического вещества. После поперечного сшивания каждую меченую молекулу очищали с помощью препаративной гель-фильтрации на основе S-200 для удаления любых агрегатов, которые образовались на протяжении реакции поперечного сшивания. Среднее количество пептидов: даларгина, нейропептида Y или галанина, соединенных с каждым FC5-доменом или FC5-Fc-доменами, - определяли с помощью масс-спектрометрии. В табл. 1 показано среднее количество пептидов, соединенных с FC5-, FC5-Fc- или Fc-FCS-доменами.FC5 was expressed in E. coli and purified using osmotic shock to release soluble protein from the periplasmic space. Soluble His-labeled FC5 was then captured from the lysate onto a nickel column by cation exchange on fractogel SE followed by gel filtration on superdex 200. Camel V _HH was characterized using SDS PAGE (Fig. 2a-c). FC5-Fc, Fc-FC5 and FC5-scram-Fc were expressed in DG44 CHO cell lines according to previously described methods. Target proteins containing hFc were isolated from the medium in which CHO cells were cultured (1 L) by adjusting the pH to 7.0 and capturing the protein on a 5 ml HiTrap rProteinA FF (GE heathcare) column, which had previously been equilibrated. All purified proteins were characterized for pre-injection endotoxin levels to prevent endotoxin-dependent generalized BBB opening. The results are shown in table. 1. Neuroactive peptides: dalargin, galanin or neuropeptide Y - were attached to the target molecule (FC5, FC5-Fc) using succininmidyl-4-(K-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), a bifunctional chemical linker, using methods described in Uto et al., 1991 (Uto, I., Ishimatsu, T., Hirayama, H., Ueda, S., Tsuruta, J., Kambara, T. (1991), Journal of immunological methods, 138( 1), 87-94). Each peptide to be attached was synthesized with a cysteamine analog at the C-terminus. This allowed cross-linking of the C-terminus of the peptide via the free cysteine to the lysine side chains on the protein using the SMCC bifunctional cross-linking chemical. After crosslinking, each labeled molecule was purified using S-200 preparative gel filtration to remove any aggregates that formed during the crosslinking reaction. The average number of peptides: dalargin, neuropeptide Y or galanin, connected to each FC5 domain or FC5-Fc domains, was determined using mass spectrometry. In table. 1 shows the average number of peptides linked to FC5, FC5-Fc or Fc-FCS domains.

Фармакокинетика молекул, содержащих Fc5, в системном русле.Pharmacokinetics of Fc5-containing molecules in the systemic pathway.

Для того чтобы понять, как воздействуют антитела, содержащие FC5, на эндотелий ГЭБ, определяли фармакокинетику данных молекул у крыс. Животным вводили внутрибрюшинно 3 мг/кг FC5 Vhh, слитого либо на N-конце (FC5-Fc), либо на C-конце (Fc-FC5) с человеческим Fc-доменом. Концентрации Fc5-Fc или Fc-FC5 в плазме определяли в различные моменты времени с помощью ИФА. Для определения периода полувыведения каждого конструкта в бета-фазе анализировали результаты (табл. 2). Результаты продемонстрировали, что период полувыведения Fc5-Fc и Fc-FC5 длится значительно дольше при гибридизации с человеческим Fc, чем для FC5 V_HH отдельно, так как хорошо известно, что Fc вызывает рециркуляцию и большая масса предотвращает почечную фильтрацию (Holt, L.J., Herring, С., Jespers, L.S., Woolven, B.P., Tomlinson, I.M. (2003), Trends in biotechnology, 21(11), 484-490).In order to understand how FC5-containing antibodies act on the BBB endothelium, the pharmacokinetics of these molecules in rats were determined. Animals were injected intraperitoneally with 3 mg/kg FC5 Vhh fused either at the N-terminus (FC5-Fc) or at the C-terminus (Fc-FC5) with the human Fc domain. Plasma Fc5-Fc or Fc-FC5 concentrations were determined at various time points by ELISA. The results were analyzed to determine the half-life of each construct in the beta phase (Table 2). The results demonstrated that the half-life of Fc5-Fc and Fc-FC5 is significantly longer when hybridized to human Fc than for FC5 V _HH alone, as it is well known that Fc induces recirculation and the large mass prevents renal filtration (Holt, LJ, Herring , C., Jespers, LS, Woolven, BP, Tomlinson, IM (2003), Trends in biotechnology, 21(11), 484-490).

Скорость транспорта молекул, содержащих Fc, in vitro.The rate of transport of Fc-containing molecules in vitro.

Авторы использовали in vitro слой эндотелиальных клеток ГЭБ для моделирования in vivo скоростей прохождения через ГЭБ для каждого белка, содержащего FC5. В модели in vitro используется монослой иммортализованных эндотелиальных клеток головного мозга взрослых крыс (SV-ARBEC) в анализе монослойной системы, плотность которой была валидирована с помощью небольших молекул (Garberg, P., Ball, M., Borg, N., Cecchelli, R., Fenart, L., Hurst, R.D., Lindmark, Т., Mabondzo, A., Nilsson, J.E., Raub, T.J., Stanimirovic, D., Terasaki, Т., Oberg, J.O., Osterberg, T. (2005), Toxicol In Vitro 19(3), 299-334). Способы определений скоростей проникновения in vitro почти такие же, как описаны в (Caram-Salas, N., Boileau, E., Far- 30 040195 rington, G.K., Garber, E., Brunette, E., Abulrob, А., Stanimirovic, D., Methods in molecular biology 763, ed.The authors used an in vitro layer of BBB endothelial cells to model in vivo BBB transit rates for each FC5 containing protein. An in vitro model uses a monolayer of immortalized adult rat brain endothelial cells (SV-ARBEC) in a monolayer system analysis whose density has been validated with small molecules (Garberg, P., Ball, M., Borg, N., Cecchelli, R ., Fenart, L., Hurst, R.D., Lindmark, T., Mabondzo, A., Nilsson, J.E., Raub, T.J., Stanimirovic, D., Terasaki, T., Oberg, J.O., Osterberg, T. (2005) , Toxicol In Vitro 19(3), 299-334). Methods for determining in vitro penetration rates are almost the same as described in (Caram-Salas, N., Boileau, E., Far-30 040195 rington, G.K., Garber, E., Brunette, E., Abulrob, A., Stanimirovic , D., Methods in molecular biology 763, ed.

2010, 383-401). Определяли скорости проникновения через слой клеток для FC5, FC5-Fc и Fc-FC52010, 383-401). Cell layer permeation rates were determined for FC5, FC5-Fc and Fc-FC5

SV-ARBEC. Результаты показаны на фиг. 3.SV-ARBEC. The results are shown in FIG. 3.

Аффинность связывания молекул Fc5 к ТМЕМ30А.Binding affinity of Fc5 molecules to TMEM30A.

Аффинность связывания каждой молекулы оценивали в отдельном анализе с помощью проточной цитометрии с использованием свежевыделенных крысиных эндотелиальных клеток ГЭБ и крысиных эндотелиальных клеток ГЭБ, трансформированных SV40 (Caram-Salas, N., Boileau, E., Farrington, G.K., Garber, E., Brunette, E., Abulrob, А., Stanimirovic, D., Methods in molecular biology 763, ed. 2010, 383-401), а также клеток Hek293, которые подвергались временной трансфекции с использованием ранее идентифицированной мишени - ТМЕМ30А. Кривые связывания для каждой линии клеток показаны на фиг. 4a-c, и рассчитанные значения аффинности приведены в табл. 3. Результаты показывают, что аффинность связывания Fc5Fc крысиными эндотелиальными клетками ГЭБ первичной культуры составляет 11 нМ, тогда как связывание с линией клеток, трансформированной SV40, приводит к значению EC₅₀ 75 нМ, т.е. связывание примерно в 7 раз слабее. При этом связывание с линией клеток Hek293 крысы, которую подвергали временной трансформации ТМЕМ30А, приводит к аффинности примерно 1700 нМ, что почти в 170 раз слабее, чем связывание с линией эндотелиальных клеток ГЭБ первичной культуры. При измерении с помощью проточной цитометрии, эти данные показывают, что кажущаяся аффинность FC5-Fc существенно увеличивается по сравнению с FC5 VHH, который используется отдельно, что предполагает бидентантное связывание FC5-Fc с клетками, экспрессирующими ТМЕМ30А, о чем свидетельствует авидность.The binding affinity of each molecule was assessed in a separate flow cytometry assay using freshly isolated rat BBB endothelial cells and SV40-transformed rat BBB endothelial cells (Caram-Salas, N., Boileau, E., Farrington, GK, Garber, E., Brunette , E., Abulrob, A., Stanimirovic, D., Methods in molecular biology 763, ed. 2010, 383-401), as well as Hek293 cells that were transiently transfected using a previously identified target, TMEM30A. Binding curves for each cell line are shown in FIG. 4a-c, and the calculated affinity values are shown in table. 3. The results show that the binding affinity of Fc5Fc to primary culture rat BBB endothelial cells is 11 nM, while binding to the SV40-transformed cell line results in an EC ₅₀ value of 75 nM, i.e. binding is about 7 times weaker. At the same time, binding to the rat Hek293 cell line, which was subjected to temporary transformation by TMEM30A, leads to an affinity of about 1700 nM, which is almost 170 times weaker than binding to the BBB endothelial cell line of the primary culture. When measured by flow cytometry, these data show that the apparent affinity of FC5-Fc is significantly increased compared to FC5 VHH, which is used alone, suggesting bidentate binding of FC5-Fc to cells expressing TMEM30A, as evidenced by avidity.

Оценка эффективности в моделях на животных.Evaluation of efficacy in animal models.

Для оценки того, какое воздействие будет оказывать димеризация доменов FC5 V_HH на способность молекул выполнять функцию транспортера для доставки молекулярного груза через ГЭБ посредством RMT, в моделях на животных оценивали активность этих молекул. Известно, что на эффективность транспорта могут влиять многочисленные факторы, например, сообщалось, что снижение аффинности антитела к трансферриновому рецептору даже в несколько раз оказывало положительное влияние на способность молекулы эффективно проникать через ГЭБ (Yu, Y.J., Zhang, Y., Kenrick, M., Hoyte, K., Luk, W., Lu, Y., Atwal, J., Elliott, J.M., Prabhu, S., Watts, R.J., Dennis, M.S., Science translational medicine 3(84), 84ra44). В соответствии с этой концепцией предполагалось, что значительное повышение аффинности после Fc-димеризации FC5 V_HH будет отрицательно влиять на способность Fc5 V_HH эффективно выполнять функцию транспортной молекулы через ГЭБ. Следовательно, в модели in vivo оценивали активность молекул, к которым был присоединен нейроактивный пептид, причем каждая молекула имела разную FC5-валентность.In order to assess what effect the dimerization of the FC5 V _HH domains would have on the ability of the molecules to act as a transporter to deliver molecular cargo across the BBB via RMT, the activity of these molecules was evaluated in animal models. It is known that numerous factors can affect the efficiency of transport, for example, it was reported that a decrease in the affinity of an antibody for the transferrin receptor, even several times, had a positive effect on the ability of the molecule to effectively penetrate the BBB (Yu, YJ, Zhang, Y., Kenrick, M. , Hoyte, K., Luk, W., Lu, Y., Atwal, J., Elliott, JM, Prabhu, S., Watts, RJ, Dennis, MS, Science translational medicine 3(84), 84ra44). In accordance with this concept, it was assumed that a significant increase in affinity after Fc-dimerization of FC5 V _HH would negatively affect the ability of Fc5 V _HH to effectively function as a transport molecule through the BBB. Therefore, the activity of molecules to which the neuroactive peptide was attached was evaluated in an in vivo model, with each molecule having a different FC5 valency.

Модель Hargreaves позволяет измерить повышенную чувствительность к термической боли, индуцированной путем инъекции адъюванта Фрейнда в лапу. Подавление термической боли может произойти в результате связывания пептида даларгина, состоящего из шести аминокислот, с болевыми мюрецепторами, экспрессированными в околоводопроводном участке головного мозга. Даларгин, который вводят внутривенно, не способен пересекать ГЭБ и не приводит к подавлению боли, однако ICV-инъекция позволяет даларгину диффундировать к мю-рецепторам, блокировать мю-рецепторы и вследствие этого блокировать боль. Таким образом, чтобы обеспечить транспорт через ГЭБ и подавление боли, даларгин, который вводят внутривенно, необходимо присоединить к рецептор-опосредованному транспортеру. Для оценки транспорта даларгина через ГЭБ, опосредованного молекулами, содержащими Fc5, использовали модель на животных Hargreaves для сравнения активности различных молекулярных форм Fc5 V_HH, соединенных с даларгином. Молекулой отрицательного контроля для FC5-даларгин была молекула EG2-даларгин, а для FC5-Fc-даларгин - Fc-FC5-даларгин.The Hargreaves model measures hypersensitivity to thermal pain induced by injection of Freund's adjuvant into the paw. Suppression of thermal pain may result from the binding of the six amino acid dalargin peptide to pain mureceptors expressed in the periaqueductal region of the brain. Dalargin, which is administered intravenously, is not able to cross the BBB and does not lead to pain suppression, however, ICV injection allows dalargin to diffuse to the mu receptors, block the mu receptors, and therefore block pain. Thus, intravenous dalargin must be coupled to a receptor-mediated transporter to allow transport across the BBB and suppress pain. To assess the transport of dalargin across the BBB mediated by Fc5-containing molecules, the Hargreaves animal model was used to compare the activity of different molecular forms of Fc5 V _HH coupled to dalargin. The negative control molecule for FC5-dalargin was EG2-dalargin and for FC5-Fc-dalargin was Fc-FC5-dalargin.

Для обеспечения сопоставимости препаратов положительного и отрицательного контролей FC5-Dal и EG2-Dal характеризовали путем масс-спектрометрии, чтобы показать, что соотношение пептидов на основе даларгина, соединенных с каждым VHH, было сопоставимым (табл. 1).To ensure comparability of positive and negative control preparations, FC5-Dal and EG2-Dal were characterized by mass spectrometry to show that the ratio of dalargin-based peptides coupled to each VHH was comparable (Table 1).

До внутривенной (IV) инъекции каждую молекулу первоначально тестировали путем интрацеребровентрикулярной (ICV) инъекции в качестве положительного контроля, чтобы удостовериться, что все соединенные молекулы функционально активны и способны подавлять боль. Предполагалось, что тестируемые молекулы как отрицательного, так и положительного контроля, будут подавлять боль после ICV инъекции, поскольку молекулы инъецируют непосредственно в цереброспинальную жидкость, они и способны диффундировать по направлению, и блокировать околоводопроводные болевые мюрецепторы. Во всех случаях при оценке путем ICV инъекции FC5-Dal, EG2-Dal, FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal или даларгина отдельно имели похожую активность на основе количества доставленного даларгина. На следующем этапе каждую меченую даларгином молекулу и соответствующий меченый даларгином контрольный белок оценивали в отношении эффективности после IV введения. Первоначально сравнивали эффективность Fc5-Dal по отношению к контролю (EG2-Dal). Результаты показывают достижение полного подавления боли, аналогичного уровню подавления, который можно наблюдать с использованием отдельно морфина (фиг. 5a и 5b). Интересно отметить, что необходимы три дозы Fc5-Dal при 7,5 мг/кг на дозу до наблюдения первоначального подавления боли. В дополнение к этому в контрольной группе неPrior to intravenous (IV) injection, each molecule was initially tested by intracerebroventricular (ICV) injection as a positive control to ensure that all coupled molecules were functionally active and capable of suppressing pain. Both the negative and positive control molecules tested were expected to suppress pain after ICV injection because the molecules are injected directly into the cerebrospinal fluid and are able to diffuse directionally and block the periaqueductal nociceptors. In all cases assessed by ICV, injections of FC5-Dal, EG2-Dal, FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal, or dalargin alone had similar potency based on the amount of dalargin delivered. In the next step, each dalargin-labeled molecule and the corresponding dalargin-labeled control protein were evaluated for efficacy after IV administration. Initially compared the effectiveness of Fc5-Dal in relation to the control (EG2-Dal). The results show the achievement of complete pain suppression, similar to the level of suppression that can be observed using morphine alone (Fig. 5a and 5b). Interestingly, three doses of Fc5-Dal at 7.5 mg/kg per dose are required before initial pain suppression is observed. In addition, the control group did not

- 31 040195 выявили подавление боли даже после введения животным одинакового количества три раза при 7,5 мг/кг.- 31 040195 showed pain suppression even after administering the same amount to animals three times at 7.5 mg/kg.

Эти данные демонстрируют и подтверждают, что FC5 способен выполнять функцию рецепторопосредованного транспортера, транспортирующего даларгин через ГЭБ в паренхиму головного мозга и позволяющего даларгину связываться и блокировать болевые мю-рецепторы, тогда как с использованием контрольного EG2-даларгина подавление боли выявлено не было. Эти данные кратко изложены в табл. 4.These data demonstrate and confirm that FC5 is able to act as a receptor-mediated transporter, transporting dalargin through the BBB to the brain parenchyma and allowing dalargin to bind and block nociceptive mu-receptors, whereas pain suppression was not detected with the control EG2-dalargin. These data are summarized in Table. 4.

Димеризованные формы FC5, FC5-Fc и Fc-FC5 продемонстрировали очень разные аффинности связывания по отношению к ТМЕМ30А на эндотелиальных клетках ГЭБ (табл. 3). Для определения, коррелирует ли повышение аффинности с повышением активности, оценивали как FC5-Fc-dal, так и Fc-FC5-dal в отношении подавления боли на модели боли Hargreaves. После IV инъекции Fc-FC5-dal был неэффективным (фиг. 6a-d), тогда как FC5-Fc-dal (фиг. 7a и 7c) был высокоэффективным в подавлении боли. В дополнение к этому, отрицательный контроль Fc-Dal был неэффективным in vivo (фиг. 7b и 7d). FC5-Fc был эффективным в ослаблении боли в течение первого часа даже с использованием однократной дозы первоначально при 0,5 мг/кг, причем после первых 0,5 ч МРЕ в среднем составлял 50%. При сравнении активности Fc5-dal с FC5-Fc-dal результаты показали, что однократная доза Fc5-dal при 21 мг/кг обеспечивала примерно такой же уровень подавления боли, как и FC5-Fc-Dal при 0,5 мг/кг. В зависимости от молярного соотношения инъецированного даларгина FC5Fc-Dal был примерно в 80 раз более активным, чем FC5-Dal по способности к подавлению боли в модели Hargreaves. Второй дозы Fc5-Fc-Dal при 2,5 мг/кг было достаточно, чтобы обеспечить максимально возможное подавление боли у одного животного. Наблюдаемая повышенная биологическая активность FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal и FC5-Dal на модели боли Hargreaves коррелирует с более высокой аффинностью и более высокой эффективностью Fc5-Fc, что кратко изложено в табл. 2.The dimerized forms of FC5, FC5-Fc and Fc-FC5 showed very different binding affinities for TMEM30A on BBB endothelial cells (Table 3). To determine if increased affinity correlated with increased activity, both FC5-Fc-dal and Fc-FC5-dal were evaluated for pain suppression in the Hargreaves pain model. After IV injection, Fc-FC5-dal was ineffective (FIGS. 6a-d), while FC5-Fc-dal (FIGS. 7a and 7c) was highly effective in suppressing pain. In addition, the Fc-Dal negative control was ineffective in vivo (FIGS. 7b and 7d). FC5-Fc was effective in relieving pain within the first hour, even using a single dose initially at 0.5 mg/kg, with MPE averaging 50% after the first 0.5 h. When comparing the activity of Fc5-dal with FC5-Fc-dal, the results showed that a single dose of Fc5-dal at 21 mg/kg provided approximately the same level of pain suppression as FC5-Fc-Dal at 0.5 mg/kg. Depending on the molar ratio of injected dalargin, FC5Fc-Dal was about 80 times more potent than FC5-Dal in pain suppression capacity in the Hargreaves model. A second dose of Fc5-Fc-Dal at 2.5 mg/kg was sufficient to provide the greatest possible pain suppression in one animal. The observed increased biological activity of FC5-Fc-Dal, Fc-FC5-Dal, and FC5-Dal in the Hargreaves pain model correlates with higher affinity and higher potency of Fc5-Fc, as summarized in Table 1. 2.

В дополнение к этому похожей эффективности в отношении подавления боли можно достичь с использованием других нейроактивных пептидов. Например, галанин, 3,2 кДа пептид, состоящий из 29 аминокислот, соединенный с FC5 или FC5-Fc, с идентичными химическими свойствами, которые описаны выше, подавлял хроническую боль в модели Hargreaves. В отличие от этого галанин, соединенный только с Fc, неспособен был обеспечить эффективное облегчение боли. Результаты как для положительного контроля с использованием ICV, так для и IV инъекций кратко изложены в табл. 6. Для подтверждения активности соединенного галанина в отношении связывания с родственными рецепторами GalR1 и GalR2 и подавления боли с использованием как отрицательного контроля, так и тестируемых молекул тестировали все молекулы, и было показано, что они подавляют боль после ICV инъекции (табл. 6). При IV инъекции только галанин, соединенный с молекулами, содержащими Fc5, либо FC5, либо FC5-Fc были способны подавлять боль in vivo. Присутствовала значительная разница в дозировке галанина, соединенного с FC5, по отношению к FC5-Fc, которая требовалась для ослабления боли в модели Hargreaves на животных. Галанин-FC5 в однократной дозе 6 мг/кг (табл. 6) приводил к 8% МРЕ, тогда как однократная доза Fc5-Fc-Gal приводила к а 45% МРЕ.In addition, similar pain suppression efficacy can be achieved using other neuroactive peptides. For example, galanin, a 3.2 kDa 29 amino acid peptide coupled to FC5 or FC5-Fc, with identical chemical properties as described above, suppressed chronic pain in the Hargreaves model. In contrast, galanin coupled to Fc alone was unable to provide effective pain relief. The results for both the positive control using ICV and IV injections are summarized in Table 1. 6. To confirm the activity of conjugated galanin in binding to cognate receptors GalR1 and GalR2 and suppressing pain using both negative control and test molecules, all molecules were tested and were shown to suppress pain after ICV injection (Table 6). When injected IV, only galanin coupled to molecules containing Fc5, either FC5 or FC5-Fc was able to suppress pain in vivo. There was a significant difference in dosage of galanin coupled to FC5 versus FC5-Fc required to relieve pain in the Hargreaves animal model. Galanin-FC5 at a single dose of 6 mg/kg (Table 6) resulted in 8% MPE, while a single dose of Fc5-Fc-Gal resulted in a 45% MPE.

Внутрибрюшинное введение пентилентетразола (PTZ) индуцирует судороги у крыс и использовалось в качестве модели эпилептических судорог (Chen, J.W., Naylor, D.E., Wasterlain, C.G., Advances in the pathophysiology of status epilepticus., Acta Neurol. Scand. Suppl., 2007, 186, 7-15; Werner, F.M., Covenas, R., Neuropeptides involved in schizophrenia, Curr. Top. Neurochem., 2005, 4, 35-49; Werner, F.M., Covenas, R., Focus on Neuropeptide Research, Covenas, Mangas and Narvaez, eds.; Transworld Reasearch Network: Trivandrum, 2007, p. 299-339; Werner, F.M., Covenas, R., Classical neurotransmiters and neuropeptides involved in major depression, Int. J. Neurosci., 2010, 120, 455-70). Известно, что нейроактивные пептиды, такие как галанин и нейропептид Y, обеспечивают защиту от судорог, индуцированных PTZ (Mazarati 1998a; Mazarati, A.M., Hohmann, J.G., Bacon, A., Liu, H., Sankar, R., Steiner, R.A., Wynick, D. et al., Modulation of hippocampal excitability and seizures by galanin, the Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 2000, 20(16), 6276-81; Mazarati et al.; Mazarati A., Liu H., Soomets U., Sankar R., Shin D., Katsumori H., Langel U., Wasterlain C.G., Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus, J. Neurosci., 1998, 18:10070-10077). Эти исследования показали, что элиминация галанина из гиппокампа крыс ассоциирована с развитием самоподдерживающегося эпилептического состояния. В дополнение к этому инъекция галанина в гиппокампальную область головного мозга может подавлять судороги (Mazarati A., Liu H., Soomets U., Sankar R., Shin D., Katsumori H., Langel U., Wasterlain C.G., Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus, J. Neurosci, 1998, 18:10070-10077; Mazarati A.M., Halaszi E., Telegdy G., Anticonvulsive effects of galanin administered into the central nervous system upon the picrotoxinkindled seizure syndrome in rats, Brain Res., 1992, 589:164-166). Однако нейроактивные пептиды, которые вводят внутривенно, не могут пересекать ГЭБ и имеют краткий период полувыведения в силу их небольшого размера (Jain, Kamal, Batra, Trends Biotechnol., vol. 25. ed., 2007:307-16; Batra, Jain, Wittel, Chauhan, Colcher, Curr. Opin. Biotechnol., vol. 13, ed., 2002:603-8). Эффективность галанина оценивали в модели с использованием PTZ путем тестирования галанина, соединенного как с FC5, однодоменным антителом, так и с FC5-Fc. Хотя ожидалось, что оба конструкта будут усиливать транспорт через ГЭБ, в данном документе было показано, что конструкт FC5-Fc имел повышенную практическую аффинность из-за авидного связывания с его предполагаемой мишенью ТМЕМ30А и имел намного более продолжительный период полувы- 32 040195 ведения в силу увеличенного размера и Fc-зависимой рециркуляции.Intraperitoneal administration of pentylenetetrazole (PTZ) induces seizures in rats and has been used as a model for epileptic seizures (Chen, J.W., Naylor, D.E., Wasterlain, C.G., Advances in the pathophysiology of status epilepticus., Acta Neurol. Scand. Suppl., 2007, 186 , 7-15; Werner, F.M., Covenas, R., Neuropeptides involved in schizophrenia, Curr. Top. Neurochem., 2005, 4, 35-49; Werner, F.M., Covenas, R., Focus on Neuropeptide Research, Covenas, Mangas and Narvaez, eds.; Transworld Reasearch Network: Trivandrum, 2007, pp. 299-339; Werner, F. M., Covenas, R., Classical neurotransmiters and neuropeptides involved in major depression, Int. J. Neurosci., 2010, 120, 455-70). Neuroactive peptides such as galanin and neuropeptide Y are known to confer protection against PTZ-induced seizures (Mazarati 1998a; Mazarati, A.M., Hohmann, J.G., Bacon, A., Liu, H., Sankar, R., Steiner, R.A. , Wynick, D. et al., Modulation of hippocampal excitability and seizures by galanin, the Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 2000, 20(16), 6276-81; Mazarati et al.; Mazarati A ., Liu H., Soomets U., Sankar R., Shin D., Katsumori H., Langel U., Wasterlain C.G., Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus, J. Neurosci. , 1998, 18:10070-10077). These studies have shown that the elimination of galanin from the rat hippocampus is associated with the development of a self-sustaining epileptic state. In addition, injection of galanin into the hippocampal region of the brain can suppress seizures (Mazarati A., Liu H., Soomets U., Sankar R., Shin D., Katsumori H., Langel U., Wasterlain C.G., Galanin modulation of seizures and seizure modulation of hippocampal galanin in animal models of status epilepticus, Mazarati A.M., Halaszi E., Telegdy G., Anticonvulsive effects of galanin administered into the central nervous system upon the picrotoxinkindled seizure syndrome in rats, Brain Res., 1992, 589:164-166). However, intravenously administered neuroactive peptides cannot cross the BBB and have a short half-life due to their small size (Jain, Kamal, Batra, Trends Biotechnol., vol. 25. ed., 2007:307-16; Batra, Jain, Wittel, Chauhan, Colcher, Curr. Opin. Biotechnol., vol. 13, ed., 2002:603-8). The efficacy of galanin was evaluated in a PTZ model by testing galanin coupled to both FC5, a single domain antibody, and FC5-Fc. Although both constructs were expected to enhance transport across the BBB, this document showed that the FC5-Fc construct had increased practical affinity due to avid binding to its putative target TMEM30A and had a much longer half-life due to oversized and Fc-dependent recirculation.

В модели судорог, индуцированных PTZ, представляющее интерес средство вводят либо IV, либо путем непосредственной инъекции в гиппокамп. Инъекция в гиппокамп позволяет доставить средство непосредственно в место приложения действия, позволяя галанину связываться с родственными для него рецепторами и блокировать начало судороги. В дополнение к этому непосредственная инъекция в гиппокамп каждой молекулы служит в качестве положительного контроля, чтобы показать, что галанин, соединенный с каждой молекулой, Fc, FC5 или FC5-Fc, сохраняет активность, подавляющую судороги.In the PTZ-induced seizure model, the agent of interest is administered either IV or by direct injection into the hippocampus. Injection into the hippocampus allows the drug to be delivered directly to the site of action, allowing galanin to bind to its cognate receptors and block the onset of convulsions. In addition, direct injection into the hippocampus of each molecule serves as a positive control to show that galanin coupled to each molecule, Fc, FC5 or FC5-Fc, retains seizure-inhibiting activity.

Для получения близкого молярного эквивалента доз галанина варьировали дозами каждой вводимой молекулы. Для исследования положительного контроля самцы крыс линии Вистар (в возрасте 4-6 недель) получали интрагиппокампальную инъекцию одного из следующих веществ: вальпроевая кислота, Gal-Cya или FC5-Gal в конечном объеме 5 мкл, через 15 мин спустя IP инъекции 50 мг/кг PTZ для индукции судорог.To obtain close molar equivalent doses of galanin, the doses of each administered molecule were varied. For a positive control study, male Wistar rats (4-6 weeks of age) received an intrahippocampal injection of one of the following: valproic acid, Gal-Cya, or FC5-Gal in a final volume of 5 μl, 15 min after an IP injection of 50 mg/kg PTZ for seizure induction.

Для оценки эффективности галанина, соединенного с FC5, FC5-Fc или Fc для пересечения ГЭБ, каждую из этих молекул инъецировали системно, как подробно представлено на фиг. 7a и 7b. Для системного исследования крысы получали 1, 2 или 3 внутривенные инъекции (через хвостовую вену) Gal-Cya или FC5Gal или однократную дозу либо FC5-Fc-Gal, либо Fc-Gal. В каждом случае после IP внутрибрюшинно вводили PTZ в дозе 50 мг/кг и в течение 30 мин регистрировали движения крыс.To evaluate the effectiveness of galanin coupled to FC5, FC5-Fc, or Fc to cross the BBB, each of these molecules was injected systemically, as detailed in FIG. 7a and 7b. For the systemic study, rats received 1, 2, or 3 intravenous injections (via the tail vein) of Gal-Cya or FC5Gal, or a single dose of either FC5-Fc-Gal or Fc-Gal. In each case, after IP, PTZ was intraperitoneally administered at a dose of 50 mg/kg, and movements of rats were recorded for 30 min.

Затем рассматривали все зарегистрированные движения, а время до начала судорог и продолжительность судорог измерял беспристрастный исследователь для каждого из трех характерных изменений поведения: первое судорожное мышечное движение (FMJ; которое характеризуется подергиваниями ушами, головой и плечами), первая клоническая судорога (FCJ; которая характеризуется минимальными судорогами, клонусом мышц головы и передних конечностей, непроизвольными движениями всего тела и скачкообразными движениями с рефлексом выпрямления) и первое тоническое генерализованное разгибание (TGE; которое характеризуется потерей способности к выпрямлению, сгибанию или разгибанию передних конечностей и задних конечностей и клонусом всего туловища).All recorded movements were then considered, and the time to onset of seizures and the duration of seizures were measured by an impartial investigator for each of three characteristic behavioral changes: the first convulsive muscle movement (FMJ; which is characterized by twitching of the ears, head and shoulders), the first clonic seizure (FCJ; which is characterized by minimal cramps, clonus of the muscles of the head and forelimbs, involuntary movements of the whole body and jerky movements with an extension reflex) and first tonic generalized extension (TGE; which is characterized by loss of the ability to straighten, flex or extend the forelimbs and hind limbs and clonus of the entire trunk).

В табл. 7a) показаны результаты для инъекций в гиппокамп каждой молекулы. IP инъекции 50 мг/кг PTZ приводили к быстрому началу каждого типа судороги: миоклонической, клонической и генерализованной тонической судороги с очень быстрым прогрессированием от наименее серьезного FMJ до наиболее серьезной формы судороги - генерализованной тонической судороги. Вальпроевая кислота - небольшая молекула, которая, как известно, частично подавляет начало судорог, индуцированных PTZ (Pollack G.M., Shen D.D., J. Pharmacol. Methods. (1985) Apr., 13(2):135-46), значительно задерживала развитие всех трех типов судорог, но не полностью предотвращала начало судорог, причем наблюдалась задержка начала миоклонических и клонических судорог примерно на 100 с. Инъекция в гиппокамп галанина отдельно или соединенного с FC5 приводила к значительной задержке миоклонических судорог и полному предотвращению более серьезных клонических и генерализованных тонических судорог.In table. 7a) shows the results for hippocampal injections of each molecule. IP injections of 50 mg/kg PTZ resulted in rapid onset of each type of seizure: myoclonic, clonic, and generalized tonic seizures with very rapid progression from the least severe FMJ to the most severe form of seizure, generalized tonic seizure. Valproic acid, a small molecule known to partially inhibit the onset of PTZ-induced seizures (Pollack G.M., Shen D.D., J. Pharmacol. Methods. (1985) Apr., 13(2):135-46), significantly delayed the development of all three types of seizures, but did not completely prevent the onset of seizures, and there was a delay in the onset of myoclonic and clonic seizures by about 100 s. Injection into the hippocampus of galanin alone or combined with FC5 resulted in a significant delay in myoclonic seizures and complete prevention of more serious clonic and generalized tonic seizures.

Результаты, полученные с внутривенным введением каждой молекулы, показаны в табл. 7b). PTZ приводит к быстрому началу каждого типа судорог, а IV введение вальпроевой кислоты при 11,2 мг/кг подавляет начало миоклонических и клонических судорог. Внутривенное введение галанина и галанина-Fc, варианта нейроактивного пептида с коротким и длинным периодом полувыведения, не приводило или приводило к очень незначительной задержке начала судороги соответственно. FC5-галанин, который вводили при 6 мг/кг, за 1 ч до ведения PTZ, приводил к значительный задержке миоклонической судороги и полному подавлению клонических и генерализованных клонических судорог. Однократная доза Fc5-Fc-галанина за 2 ч до введения PTZ также приводила к значительной задержке миоклонической судороги и полному подавлению клонических и генерализованных клонических судорог.The results obtained with intravenous administration of each molecule are shown in table. 7b). PTZ results in rapid onset of each type of seizure, and IV administration of valproic acid at 11.2 mg/kg suppresses the onset of myoclonic and clonic seizures. Intravenous administration of galanin and galanin-Fc, a neuroactive peptide variant with a short and a long half-life, resulted in no or very slight delay in the onset of seizures, respectively. FC5-galanin given at 6 mg/kg, 1 hour before PTZ, resulted in a significant delay in myoclonic seizures and complete suppression of clonic and generalized clonic seizures. A single dose of Fc5-Fc-galanin 2 hours prior to PTZ administration also resulted in a significant delay in myoclonic seizures and complete suppression of clonic and generalized clonic seizures.

Исходя из этих результатов можно сделать несколько выводов. Галанин, соединенный с FC5, Fc или FC5-Fc, сохраняет эквивалентную активность, как показано при ICV введении в модели Hargreaves (табл. 4 и 5). В дополнение к этому в табл. 7a) показано, что FC5-галанин проявил эквивалентную активность в расчете на моль относительно галанина отдельно при инъекции в гиппокамп крыс в модели судорог с использованием PTZ. В отличие от этого галанин отдельно или как молекула с большим периодом полувыведения, присоединенная к молекуле hFc, не пересекает эффективно гематоэнцефалический барьер и не подавляет индуцированные PTZ судороги. Только в случае присоединения к FC5 либо в виде FC5-галанина, либо в виде FC5-Fc-галанина, галанин способен пересекать ГЭБ и эффективно задерживать и подавлять индуцированные PTZ судороги. Галанин, соединенный с FC5-Fc, проявляет намного большую эффективность, чем галанин, соединенный с FC5 отдельно, в ослаблении судорог на основе сравнения дозировок в пересчете на моли; конкретно, он по меньшей мере в 16 раз более эффективен. В дополнение к этому FC5-Fc-галанин показал большую задержку по времени до начала первой миоклонической судороги по сравнению с FC5-галанином. Эти результаты указывают на то, что более оптимальный период полувыведения и практическое увеличение аффинности FC5-Fc к своей мишени улучшает доставку галанина через ГЭБ и приводит к более эффективному ослаблению судорог в модели судорог с использованием PTZ, чем FC5-галанина.Based on these results, several conclusions can be drawn. Galanin coupled to FC5, Fc or FC5-Fc retained equivalent activity as shown by ICV administration in the Hargreaves model (Tables 4 and 5). In addition to this, in Table. 7a) shows that FC5-galanin showed equivalent activity per mole relative to galanin alone when injected into the rat hippocampus in a PTZ seizure model. In contrast, galanin alone or as a long half-life molecule attached to an hFc molecule does not effectively cross the blood-brain barrier and does not suppress PTZ-induced seizures. Only when attached to FC5, either as FC5-galanin or FC5-Fc-galanin, is galanin able to cross the BBB and effectively delay and suppress PTZ-induced seizures. Galanin coupled to FC5-Fc appears to be much more effective than galanin coupled to FC5 alone in attenuating seizures on a mole basis; specifically, it is at least 16 times more efficient. In addition, FC5-Fc-galanin showed a greater delay in time to the onset of the first myoclonic seizure compared to FC5-galanin. These results indicate that a more optimal half-life and a practical increase in the affinity of FC5-Fc for its target improves BBB delivery of galanin and results in more effective attenuation of seizures in the PTZ seizure model than FC5-galanin.

- 33 040195- 33 040195

Таблица 1Table 1

Характеристика экспрессированных и очищенных молекулCharacterization of Expressed and Purified Molecules

Молекула плазмида plasmid molecule FC5⁽¹⁾ (EAG233 3)FC5 ⁽¹⁾ (EAG233 3) FC5-Fc⁽²⁾ (EAG2345)FC5-Fc ⁽²⁾ (EAG2345) Fc-FC5⁽²⁾ (EAG2304)Fc-FC5 ⁽²⁾ (EAG2304) Fc Fc Расчетный Mwt (Дальтоны) Calculated Mwt (Daltons) 15,375 15.375 78,725 78.725 78,924 78.924 51,896 51.896 Эндотоксин (ЕЭ/мг) Endotoxin (EU/mg) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 LS Mwt (Дальтоны) LS Mwt (Daltons) 16,860 16,860 77,530 77.530 78,950 78.950 57,800 57,800 Чистота-% площадь пика на аналитической SEC Purity-% Peak Area on Analytical SEC 99,7 99.7 98,9 98.9 95,0 95.0 99,7 99.7 Avg связанные Avg related пептиды peptides даларгина ⁽³⁾ dalargin ⁽³⁾ 1,5 1.5 1,5 1.5 1,5 1.5 1,0 1.0

(1) Содержит myc-метку EQKLISEEDL, С-концы (1202 mwt), С-концевую His-метку 5Н.(1) Contains myc-tag EQKLISEEDL, C-terminals (1202 mwt), C-terminal His-tag 5H.

(2) Fc-доменами являются человеческий IgG1 и agly (все Fc-домены содержат точечную мутацию Т299А в последовательности hIgG для удаления Fc N-гликозилирования).(2) The Fc domains are human IgG1 and agly (all Fc domains contain a T299A point mutation in the hIgG sequence to remove Fc N-glycosylation).

(3) Оцененный по MS для определения среднего количества молекул даларгина, ковалентно связанных с FC5-Fc-доменами.(3) Assessed by MS to determine the average number of dalargin molecules covalently associated with FC5-Fc domains.

Таблица 2table 2

Определения фармакокинетического периода полувыведения FC5-Pharmacokinetic half-life determinations for FC5-

FC5-Fc FC5-Fc доменов, слитых с hFc Fc-FC5 domains fused to hFc Fc-FC5 hlgGl hlgGl Формат анализа Analysis Format Флуоресценция Fluorescence ИФ Флуоресценция А IF Fluorescence A Флуоресценция ИФ А Fluorescence IF A Период полувыве дения в бетафазе(ч) Half-life in beta phase (h) 39,4 39.4 35,7 38,6 35.7 38.6 43,5 48 43.5 48

Период полувыведения определяли посредством обнаружения человеческого Fc в крысиной сыворотке с помощью ИФА или с помощью AL680-меченых молекул и уровня флуоресценции, который определялся в сыворотке. Не наблюдали никакой разницы между молекулами, для которых определяли период полувыведения посредством флуоресценции по сравнению с ИФА. Молекулы вводили внутрибрюшинно при 3 мг/кг.The half-life was determined by detecting human Fc in rat serum using ELISA or using AL680-labeled molecules and the level of fluorescence, which was determined in serum. No difference was observed between molecules for which the half-life was determined by fluorescence compared with ELISA. Molecules were administered intraperitoneally at 3 mg/kg.

- 34 040195- 34 040195

Таблица 3 Общие результаты по аффинностям связывания и относительной эффективности Fc5-Dal, FC5-Fc-Dal и Fc-FC5-Dal в модели Hargreaves, которые показывают наличие корреляции между эффективностью и аффинностью для эндотелиальных клеток ГЭБTable 3 Overall results on binding affinities and relative potencies of Fc5-Dal, FC5-Fc-Dal, and Fc-FC5-Dal in the Hargreaves model, showing a correlation between potency and affinity for BBB endothelial cells

Аффинность (нМ)Affinity (nM)

Молекула FC5 FC5-Fc Fc-FC5Molecule FC5 FC5-Fc Fc-FC5

Первичная культура ЭК ГЭБ крысы Primary culture of rat BEB EC >2000 >2000 И AND 1700 1700 SV-ARBEC SV-ARBEC 75 75 ND ND эндотелиальные клетки аорты крысы endothelial rat aortic cells 1700 1700 Кратность изменения Multiplicity of change 1 1 80 80 <0,1 <0.1

активности по сравнению с FC5-Dal в модели Hargreavesactivity compared to FC5-Dal in the Hargreaves model

Таблица 4Table 4

Общие результаты по подавлению хронической боли даларгином отдельно или в соединении с FC5 в модели HargreavesOverall results of chronic pain suppression with dalargin alone or in combination with FC5 in the Hargreaves model

ICV IVICV IV

молекула molecule Доза (мкг) Dose (mcg) % МРЕ % MPE Доза (мг/кг) Dose (mg/kg) % МРЕ % MPE PBS PBS 5 5 0 + 0,8 0+0.8 800 (мкл) 800 (µl) 0 + 0,6 0+0.6 Даларгин Dalargin 2 2 35+1 35+1 0,34 х 3 инъекции 0.34 x 3 injections 0,3 ± 0,3 0.3±0.3 FC5 FC5 69,75 69.75 0 + 2 0+2 7x3 инъекции 7x3 injections 1,9 + 0,3 1.9 + 0.3 EG2 А20.1 EG2 A20.1 69,75 69.75 0 + 2 0+2 7x3 инъекции 7,84 х 3 инъекции 7x3 injections 7.84 x 3 injections 0+1,3 2,2 + 0,3 0+1.3 2.2+0.3 РС5-Даларгин PC5-Dalargin 74,4 74.4 47 + 2 47+2 7x3 инъекции 7x3 injections 41 + 0,5 41 + 0.5 ЕО2-Даларгин А20.1-Даларгин FC5 + Даларгин EO2-Dalargin A20.1-Dalargin FC5 + Dalargin 74,4 74.4 31 ± 1 31±1 7x3 инъекции 2,49 х 3 инъекции (0,65 мкг + 7 мг/кг) х 3 инъекции 7x3 injections 2.49 x 3 injections (0.65 mcg + 7 mg/kg) x 3 injections 2,0 + 0 3,1 + 0 0+1,6 2.0+0 3.1+0 0+1.6

Подавление хронической боли выражали как процент максимально возможного эффекта (%МРЕ). Значение основано на площади под кривой для животного с подавлением боли относительно противоположной контрольной лапы на протяжении измерения. Эффективность молекул, которые вводили либо ICV, либо IV показана в виде процента максимально возможного эффекта (%МРЕ) в модели Hargreaves. A20.1 и EG2 представляют собой однодоменные антитела, не связанные cFC5, которые не проявляют кажущуюся аффинность к эндотелиальным клеткам ГЭБ. Значения дозы в мг/кг для внутривенного (IV) введения указаны на инъекцию с последующим количеством инъекций.Chronic pain suppression was expressed as a percentage of maximum possible effect (%MPE). The value is based on the area under the curve for an animal with pain suppression relative to the opposite control paw throughout the measurement. The efficacy of molecules administered with either ICV or IV is shown as a percentage of maximum possible effect (%MPE) in the Hargreaves model. A20.1 and EG2 are non-cFC5 single domain antibodies that show no apparent affinity for BBB endothelial cells. Dose values in mg/kg for intravenous (IV) administration are given per injection followed by the number of injections.

Таблица 5Table 5

Общие результаты по подавлению хронической боли даларгином, соединенным с Fc, или даларгином, соединенным с FC5-Fc, в модели HargreavesOverall results of chronic pain suppression with Fc-coupled dalargin or FC5-Fc-coupled dalargin in the Hargreaves model

ICV_______________ IV_____________________ молекула__________Доза (мг) % МРЕ______Доза (мг/кг) % МРЕ______ICV_______________ IV_____________________ Molecule__________Dose (mg) % MPE______Dose (mg/kg) % MPE______

FC5-Fc-Dal 11,5 43 + 3 6 46 ± 2FC5-Fc-Dal 11.5 43 + 3 6 46 ± 2

Fc Dal 9,3 55 ±2 6 5 ±2Fc Dal 9.3 55 ±2 6 5 ±2

FC5-Fc + FC5-Fc-Dal 2,5 + 6 32 ± 7FC5-Fc + FC5-Fc-Dal 2.5 + 6 32 ± 7

Во втором эксперименте перед добавлением FC5-Fc-Dal вводили IV дозу несвязанного FC5-Fc в указанных концентрациях.In the second experiment, before adding FC5-Fc-Dal, an IV dose of unbound FC5-Fc was administered at the indicated concentrations.

- 35 040195- 35 040195

Таблица 6Table 6

Подавление хронической боли галанином, соединенным с либо с Fc, FC5-Fc, либо FC5 в модели HargreavesChronic pain suppression with galanin coupled to either Fc, FC5-Fc, or FC5 in the Hargreaves model

ICV IVICV IV

молекула molecule Доза (мкг) Dose (mcg) % MPE % MPE (мг/кг) (mg/kg) % MPE % MPE галанин galanin 2 2 54 i 1 54 i 1 1 1 0±l 0±l Fc-Gal Fc-Gal 11,2 11.2 49 ± 1 49±1 6 6 2i 1 2i 1 FC5-Gal FC5-Gal 10,87 10.87 49 ±2 49±2 6 6 8± 1 8 ± 1 FC5-Fc-Gal FC5-Fc-Gal 11,4 11.4 49 ±2 49±2 6 6 45 i 2 45 i 2

В случае многократных доз FC5-Gal дозы вводили с интервалом в 1 ч. В третьем эксперименте IV дозу несоединенного FC5-Fc инъецировали IV перед добавлением FC5-Fc-Dal в указанных концентрациях.In the case of multiple doses of FC5-Gal, the doses were administered at 1 hour intervals. In the third experiment, an IV dose of uncombined FC5-Fc was injected IV prior to the addition of FC5-Fc-Dal at the indicated concentrations.

Таблица 7Table 7

Сравнение времени до начала судорог с использованием инъекции в гиппокамп а) или IV инъекции b) в PTZ-модели на крысахComparison of time to seizure onset using hippocampal injection a) or IV injection b) in a rat PTZ model

молекула molecule Доза (мкг) Dose (mcg) a) Инъекция в гиппокамп Время в секундах до начала судорог a) Injection into the hippocampus Time in seconds before the onset of seizures Миоклонические (секунды) Myoclonic (seconds) Клонические clonic Тонические Г енерализованные tonic Generalized только PTZ PTZ only 50 мг/кг 50 mg/kg 0±2 0±2 0i6 0i6 0±0,5 0±0.5 Вальпроевая кислота Valproic acid 11,2 11.2 100 i 6 100 i 6 100 i 9 100 i 9 2i 1 2i 1 галанин galanin 1,82 1.82 104 i0 104 i0 предотвращенные prevented предотвращенные prevented FC5- FC5- 11,9 11.9 82 i 4 82 i 4 предотвращенные prevented предотвращенные prevented

галанинgalanin

b) Внутривенная инъекцияb) Intravenous injection

Время в секундах до начала судорогTime in seconds before the onset of seizures

молекула molecule Доза (мг/кг) Dose (mg/kg) Миоклонические (секунды) Myoclonic (seconds) Клонические clonic Тонические Г енерализованны е______________________ tonic Generalized ______________________ только PTZ PTZ only 50 мг/кг 50 mg/kg 0±1 0±1 0i3 0i3 0 i 0,5 0 i 0.5 Вальпроевая Valproic 11,2 11.2 100 ±3 100±3 100 ±3 100±3 100 ±0 100±0 кислота acid галанин galanin 1 х 2 инъекц ни 1 x 2 injections 0.5 i 5 0.5 i 5 0i2 0i2 2i4 2i4 Fc-Gal Fc-Gal 6 6 2± 1 2 ± 1 18i2 18i2 17i2 17i2 РС5-галанин PC5-galanin 6x3 инъекц ИИ 6x3 injection AI 47 i 3 47 i 3 предотвращенные prevented предотвращенные prevented FC5-Fc- FC5-Fc- 6 6 101 i 28 101 and 28 предотвращенные предотвращенные prevented prevented галанин galanin После IP введения PTZ After IP introduction PTZ крысам rats исследовали время до начала researched time to start судорог каждого указанного типа: seizures of each specified type:

FMJ, FCJ и TGE. Типы судорог описаны более подробно выше.FMJ, FCJ and TGE. The types of seizures are described in more detail above.

а) С помощью PTZ, который вводят IP, устанавливают контрольное время для каждого типа судорог. С помощью инъекции в гиппокамп вальпроевой кислоты, галанина или FC5-галанина до IP инъек ции PTZ устанавливают максимальное влияние, которое может оказывать каждая из этих молекул на время до начала судорог каждого типа.a) Using the PTZ, which is entered IP, set the control time for each type of seizure. By injecting valproic acid, galanin, or FC5-galanin into the hippocampus prior to PTZ IP injection, the maximum effect that each of these molecules can have before the onset of each type of seizure is established.

b) С помощью IV введения вальпроевой кислоты, положительного контроля, галанина (1x3 инъекционные дозы, причем каждую дозу вводили с интервалом в 1 ч и прекращали вводить за 45 мин до введения PTZ) или FC5-галанина (1x3 дозы, причем каждую дозу вводили с интервалом в 1 ч и прекращали вводить за 45 мин до введения PTZ), FC5-Fc-Gal или Fc-Gal (оба вводили за 2 ч до IP инъекции PTZ) измеряют влияние, которое может оказывать каждая из этих молекул на IV введение. Fc-Gal служит в качестве отрицательного контроля как молекула, в которой отсутствует FC5 F(ab)-фрагмент, но которая имеет похожую с FC5-Fc in vivo PK.b) Via IV administration of valproic acid, a positive control, galanin (1x3 injection doses, with each dose administered 1 hour apart and stopped 45 min before PTZ administration) or FC5-galanin (1x3 doses, each dose administered with 1 h interval and stopped 45 min prior to PTZ administration), FC5-Fc-Gal or Fc-Gal (both administered 2 h prior to PTZ IP injection) measures the impact that each of these molecules can have on IV administration. Fc-Gal serves as a negative control as a molecule that lacks the FC5 F(ab) fragment but has a similar PK to FC5-Fc in vivo.

- 36 040195- 36 040195

Seql: Последовательность Fc5-agly (T299A)hFc. (pEAG2345)Seql: Fc5-agly (T299A)hFc sequence. (pEAG2345)

DVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRrrW GGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATP LRVDYWGKGTQVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRrrW GGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATP LRVDYWGKGTQVTVSSAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Seq2: Последовательность agly (T299A) hFc-FC5. (pEAG2403)Seq2: Sequence agly (T299A) hFc-FC5. (pEAG2403)

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPGKEREFVSRnWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL KPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDYWGKGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPGKEREFVSRnWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL KPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDYWGKGTQVTVSS

Seq3: Последовательность скремблированного FC5-agly (T299A)hFc (pYL605)Seq3: Sequence of scrambled FC5-agly (T299A)hFc (pYL605)

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPGKEREFVSRnWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL KPEDTADYYCAADAGSTGSYGSFDYWGKGTQVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSDVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYT MGWFRQAPGKEREFVSRnWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL KPEDTADYYCAADAGSTGSYGSFDYWGKGTQVTVSS

Эквиваленты.Equivalents.

Специалисты в данной области техники примут во внимание или будут в состоянии выявить с проведением не более чем обычного эксперимента многие эквиваленты конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в данном документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения.Those skilled in the art will recognize, or be able to identify with no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the present invention described herein. Such equivalents are intended to be embraced by the following claims.

Claims (21)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Связывающая молекула, проникающая через гематоэнцефалический барьер, представляющая собой химерный белок, содержащий (a) фармакологически активное средство, выбранное из нейроактивного пептида и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; и (b) два однодоменных антитела, которые связываются с TMEM30A, где каждое из указанных двух однодоменных антител, которые связываются с TMEM30A, слито i) непосредственно или ii) через промежуточную аминокислотную последовательность с N-концом первого IgG-Fc-домена и второго IgG-Fcдомена соответственно.1. A binding molecule that penetrates the blood-brain barrier, which is a chimeric protein containing (a) a pharmacologically active agent selected from a neuroactive peptide and an antibody or its antigen-binding fragment; and (b) two single domain antibodies that bind to TMEM30A, wherein each of said two single domain antibodies that bind to TMEM30A is fused i) directly or ii) via an intermediate amino acid sequence to the N-terminus of the first IgG-Fc domain and the second IgG -Fc domain respectively. 2. Связывающая молекула по п.1, где указанные два однодоменных антитела, которые связываются с TMEM30A, содержат аминокислотную последовательность FC5, приведенную в SEQ ID NO: 10.2. The binding molecule of claim 1, wherein said two single domain antibodies that bind to TMEM30A comprise the FC5 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. 3. Связывающая молекула по п.1, где указанные два однодоменных антитела, которые связываются с TMEM30A, состоят из аминокислотной последовательности FC5.3. The binding molecule of claim 1, wherein said two single domain antibodies that bind to TMEM30A consist of the amino acid sequence FC5. 4. Связывающая молекула по п.1, где каждое из указанных двух однодоменных антител, которые связываются с TMEM30A, слито непосредственно с первым IgG-Fc-доменом и вторым IgG-Fc-доменом соответственно.4. The binding molecule of claim 1, wherein each of said two single domain antibodies that bind to TMEM30A is fused directly to the first IgG-Fc domain and the second IgG-Fc domain, respectively. 5. Связывающая молекула по п.1, где каждое из указанных двух однодоменных антител, которые связываются с TMEM30A, слито с первым IgG-Fc-доменом и вторым IgG-Fc-доменом соответственно через промежуточную аминокислотную последовательность.5. The binding molecule of claim 1, wherein said two single domain antibodies that bind to TMEM30A are each fused to a first IgG-Fc domain and a second IgG-Fc domain, respectively, through an intermediate amino acid sequence. 6. Связывающая молекула по п.1, где указанное фармакологически активное средство слито с указанным однодоменным антителом.6. The binding molecule of claim 1, wherein said pharmacologically active agent is fused to said single domain antibody. 7. Связывающая молекула по п.1, где указанное фармакологически активное средство слито с C-концом указанного первого IgG-Fc-домена или второго IgG-Fc-домена.7. The binding molecule of claim 1, wherein said pharmacologically active agent is fused to the C-terminus of said first IgG-Fc domain or second IgG-Fc domain. 8. Связывающая молекула по п.1, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взяты из антитела, не являющегося антителом, которое связывает TMEM30A.8. The binding molecule of claim 1, wherein said antibody or antigen-binding fragment thereof is from a non-antibody that binds TMEM30A. 9. Связывающая молекула по п.8, где указанный антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из молекулы scFv, диатела, молекулы Fab и однодоменного антитела.9. The binding molecule of claim 8, wherein said antigen binding fragment is selected from the group consisting of an scFv molecule, a diabody, a Fab molecule, and a single domain antibody. 10. Связывающая молекула по п.1, где указанное фармакологически активное средство ковалентно связано с по меньшей мере одним из указанных двух однодоменных антител TMEM30A.10. The binding molecule of claim 1, wherein said pharmacologically active agent is covalently linked to at least one of said two TMEM30A single domain antibodies. 11. Связывающая молекула по п.1, где указанное фармакологически активное средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с мишенью в центральной нервной системе.11. The binding molecule of claim 1, wherein said pharmacologically active agent is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a target in the central nervous system. 12. Связывающая молекула по любому из пп.1-11, где каждый из указанных первого IgG-Fc-домена12. The binding molecule according to any one of claims 1-11, where each of the specified first IgG-Fc domain - 37 040195 и второго IgG-Fc-домена представляет собой Fc-домен антитела IgG1.- 37 040195 and the second IgG-Fc domain is the Fc domain of an IgG1 antibody. 13. Связывающая молекула по любому из пп.1-11, где каждый из указанных первого IgG-Fc-домена и второго IgG-Fc-домена содержит CH2-домен и CH3-домен.13. A binding molecule according to any one of claims 1 to 11, wherein said first IgG-Fc domain and second IgG-Fc domain each comprise a CH2 domain and a CH3 domain. 14. Связывающая молекула по п.13, где каждый из указанных CH2-домена и CH3-домена взят из антитела IgG1.14. The binding molecule of claim 13, wherein said CH2 domain and CH3 domain are each from an IgG1 antibody. 15. Связывающая молекула по любому из пп.1-11, где каждый из указанных первого IgG-Fc-домена и второго IgG-Fc-домена содержит шарнирную область, CH2-домен и CH3-домен.15. A binding molecule according to any one of claims 1-11, wherein said first IgG-Fc domain and second IgG-Fc domain each comprise a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain. 16. Связывающая молекула по п.15, где каждый из указанных шарнирной области, CH2-домена и CH3-домена взят из антитела IgG1.16. The binding molecule of claim 15, wherein each of said hinge region, CH2 domain, and CH3 domain is from an IgG1 antibody. 17. Связывающая молекула по п.1, где каждый из указанных первого IgG-Fc-домена и второго IgGFc-домена содержит шарнирную область, CH2-домен и CH3-домен из антитела IgG и где указанные два однодоменных антитела, которые связываются с TMEM30A, содержат аминокислотную последовательность FC5 (SEQ ID NO: 10).17. The binding molecule of claim 1, wherein said first IgG-Fc domain and second IgGFc domain each comprise a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain from an IgG antibody, and wherein said two single-domain antibodies that bind to TMEM30A contain the amino acid sequence FC5 (SEQ ID NO: 10). 18. Связывающая молекула по п.1, где каждый из указанных первого IgG-Fc-домена и второго IgGFc-домена содержит шарнирную область, CH2-домен и CH3-домен из антитела IgG и где указанные два однодоменных антитела, которые связываются с TMEM30A, состоят из аминокислотной последовательности FC5 (SEQ ID NO: 10).18. The binding molecule of claim 1, wherein said first IgG-Fc domain and second IgGFc domain each comprise a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain from an IgG antibody, and wherein said two single-domain antibodies that bind to TMEM30A consist of the amino acid sequence FC5 (SEQ ID NO: 10). 19. Связывающая молекула по п.1, содержащая SEQ ID NO: 1.19. The binding molecule according to claim 1, containing SEQ ID NO: 1. 20. Применение связывающей молекулы по любому из пп.1-19 в производстве лекарственного средства для лечения хронической боли.20. The use of a binding molecule according to any one of claims 1 to 19 in the manufacture of a medicament for the treatment of chronic pain. 21. Применение связывающей молекулы по любому из пп.1-19 в производстве лекарственного средства для лечения эпилепсии.21. The use of a binding molecule according to any one of claims 1 to 19 in the manufacture of a medicament for the treatment of epilepsy.