EA039950B1 - Compounds useful for inhibiting cdk7 - Google Patents

Compounds useful for inhibiting cdk7 Download PDF

Info

Publication number
EA039950B1
EA039950B1 EA202090930A EA202090930A EA039950B1 EA 039950 B1 EA039950 B1 EA 039950B1 EA 202090930 A EA202090930 A EA 202090930A EA 202090930 A EA202090930 A EA 202090930A EA 039950 B1 EA039950 B1 EA 039950B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
compound
salt
patient
cytotoxic
Prior art date
Application number
EA202090930A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
EA202090930A1 (en
Inventor
Дэвид Эндрю Коутс
Карлос Монтеро
Бхарвин Кумар Рамешандра Пател
Дэвид Майкл Ремик
Випин Ядав
Original Assignee
Эли Лилли Энд Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эли Лилли Энд Компани filed Critical Эли Лилли Энд Компани
Priority claimed from PCT/US2018/060025 external-priority patent/WO2019099298A1/en
Publication of EA202090930A1 publication Critical patent/EA202090930A1/en
Publication of EA039950B1 publication Critical patent/EA039950B1/en

Links

Abstract

The invention provides novel CDK7 inhibitors and pharmaceutical compositions thereof:or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Description

Циклинзависимые киназы (CDK) являются основным классом киназ и играют важную роль в пролиферации раковых клеток и нерегулируемой онкогенной транскрипции. CDK7 связывается с циклином H и MATI с образованием тримерной циклин-активирующей киназы (CAK), которая выполняет свою функцию путем фосфорилирования других CDK, участвующих в контроле клеточного цикла. Эти комплексы контролируют специфические переходы между двумя последующими фазами клеточного цикла. CDK7 участвует как во временном контроле клеточного цикла, так и в транскрипционной активности. CDK7 участвует в процессе инициации транскрипции путем фосфорилирования субъединицы Rbp1 РНКполимеразы II (RNAPII). Неконтролируемая клеточная пролиферация и нерегулируемая транскрипция являются признаком рака. Селективное нацеливание на CDK7 может дать преимущество, одновременно ингибируя активную транскрипцию и прогрессирование клеточного цикла. Следовательно, CDK7 является многообещающей мишенью для лечения рака, в частности агрессивных и трудно поддающихся лечению раков.Cyclin-dependent kinases (CDKs) are a major class of kinases and play an important role in cancer cell proliferation and unregulated oncogenic transcription. CDK7 binds to cyclin H and MATI to form trimeric cyclin-activating kinase (CAK), which performs its function by phosphorylation of other CDKs involved in cell cycle control. These complexes control specific transitions between two subsequent phases of the cell cycle. CDK7 is involved in both temporal control of the cell cycle and transcriptional activity. CDK7 is involved in the process of transcription initiation by phosphorylation of the Rbp1 subunit of RNA polymerase II (RNAPII). Uncontrolled cell proliferation and unregulated transcription are hallmarks of cancer. Selective targeting of CDK7 may confer benefits while inhibiting active transcription and cell cycle progression. Therefore, CDK7 is a promising target for the treatment of cancer, in particular aggressive and difficult to treat cancers.

Низкомолекулярные ингибиторы CDK7 были описаны в литературе (см., например, WO 2015/154022, WO 2016/142855, WO 2016/160617, WO 2016/193939 и WO 2017/044858). Сохраняется потребность в обеспечении ингибиторов CDK7, которые можно применять при лечении клеточнопролиферативных расстройств, таких как рак. Кроме того, существует необходимость в предложении ингибиторов CDK7, которые являются селективными по отношению к CDK7 по сравнению с другими CDK.Small molecule inhibitors of CDK7 have been described in the literature (see, for example, WO 2015/154022, WO 2016/142855, WO 2016/160617, WO 2016/193939 and WO 2017/044858). There remains a need to provide CDK7 inhibitors that can be used in the treatment of cell proliferative disorders such as cancer. In addition, there is a need to provide CDK7 inhibitors that are selective for CDK7 over other CDKs.

Изобретение относится к новым соединениям, которые являются селективными ингибиторами CDK7. Указанные новые соединения могут удовлетворять потребность в сильнодействующем, эффективном лечении рака, особенно рака с нерегулируемой транскрипцией. Данное изобретение также может удовлетворять потребность в мощном, эффективном лечении рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, рака желудка, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи и/или глиом.The invention relates to new compounds that are selective inhibitors of CDK7. These new compounds may meet the need for a potent, effective treatment for cancer, especially cancer with unregulated transcription. The present invention can also meet the need for a powerful, effective treatment for urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastric cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematological cancers, sarcomas, skin cancers and/or gliomas.

В данном изобретении предложено соединение формулы или его фармацевтически приемлемая соль. Особенно предпочтительной является безилатная соль. Также предпочтительной является соль геми-эдизилат гидрат.The present invention provides a compound of the formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The non-sylate salt is especially preferred. Also preferred is the salt hemi-edisylate hydrate.

Данное изобретение также относится к способу лечения рака, в частности для лечения рака с нерегулируемой транскрипцией. Предпочтительно, указанный рак представляет собой рак уротелия, рак матки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак яичника, рак желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, раки шейки матки, рак простаты, гематологические раки, саркомы, раки кожи или глиомы. Более предпочтительно, указанный рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника или рак желудка. Наиболее предпочтительно, указанный рак представляет собой рак молочной железы.This invention also relates to a method for the treatment of cancer, in particular for the treatment of cancer with unregulated transcription. Preferably, said cancer is urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematologic cancers, sarcomas, skin cancers or gliomas. More preferably, said cancer is colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. Most preferably, said cancer is breast cancer.

В данном изобретении также предложен способ лечения рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легких, рака яичника, рака желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарного рака, рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легких, рака яичника, рака желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи или глиом у пациента, включающий тестирование на наличие по меньшей мере одной мутации с потерей функции в генах ARID1A, KMT2C, KMT2D и/или RB1 в биологическом образце от пациента и введение терапевтически эффективного количества соединения или его соли по данному изобретению, в частности, [(3S)-1-[(E)-4(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7- 1 039950 ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, если тесты указанного образца являются положительными по крайней мере на одну мутацию с потерей функции в любом из генов ARID1A, KMT2C, KMT2D и/или RB1. Предпочтительно, указанная соль представляет собой безилатную соль или соль геми-эдизилат гидрат. Более предпочтительно, указанный рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника или рак желудка. Наиболее предпочтительно, указанный рак представляет собой рак молочной железы. Предпочтительно, указанный биологический образец представляет собой образец опухоли, и указанный образец анализируют с помощью секвенирования генома/ДНК. Предпочтительно, указанный образец получают от пациента до первого введения указанного соединения или его соли, предпочтительно, [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата или его фармацевтически приемлемой соли пациенту. Предпочтительно, указанная соль представляет собой безилатную соль или соль геми-эдизилат гидрат. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген ARIDIA. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген KMT2C. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген KMT2D. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген RB1.The present invention also provides a method for treating urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer. , ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematological cancers, sarcomas, skin cancers, or gliomas in a patient, including testing for the presence of at least one loss-of-function mutation in the genes ARID1A, KMT2C, KMT2D and/or RB1 in a biological sample from a patient and administering a therapeutically effective amount of a compound or salt thereof of this invention, in particular [(3S)-1-[(E)-4(dimethylamino)but-2- enoyl]pyrrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-1 039950 yl)amino]piperidine-1-carboxylate or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient if tests of the specified sample are put positive for at least one loss-of-function mutation in any of the ARID1A, KMT2C, KMT2D, and/or RB1 genes. Preferably, said salt is a besylate salt or a hemi-edisylate hydrate salt. More preferably, said cancer is colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. Most preferably, said cancer is breast cancer. Preferably, said biological sample is a tumor sample and said sample is analyzed by genome/DNA sequencing. Preferably, said sample is obtained from the patient prior to the first administration of said compound or salt thereof, preferably [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[ (3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient. Preferably, said salt is a besylate salt or a hemi-edisylate hydrate salt. Preferably, said gene is an ARIDIA gene. Preferably, said gene is the KMT2C gene. Preferably, said gene is the KMT2D gene. Preferably, said gene is the RB1 gene.

В данном изобретении также предложен способ лечения рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легких, рака яичника, рака желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи или глиом у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения или его соли по данному изобретению, в частности, [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1карбоксилата или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, если биологический образец от указанного пациента содержит по крайней мере одну мутацию с потерей функции генах ARID1A, KMT2C, KMT2D и/или RB1. Предпочтительно, указанная соль представляет собой безилатную соль или соль геми-эдизилат гидрат. Более предпочтительно, указанный рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника или рак желудка. Наиболее предпочтительно, указанный рак представляет собой рак молочной железы. Предпочтительно, указанный биологический образец представляет собой образец опухоли, и указанный образец анализируют с помощью секвенирования генома/ДНК. Предпочтительно, указанный образец получают от пациента до первого введения указанного соединения или его соли, предпочтительно [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата или его фармацевтически приемлемой соли пациенту. Предпочтительно, указанная соль представляет собой безилатную соль или соль геми-эдизилат гидрат. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген ARID1A. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген KMT2C. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген KMT2D. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген RB1.The present invention also provides a method for treating urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematological cancers, sarcomas. , skin cancers or gliomas in a patient, comprising administering a therapeutically effective amount of a compound or salt thereof of this invention, in particular [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2enoyl]pyrrolidin-3-yl ] 4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient if the biological sample from said patient contains at least one mutation with loss of function in the ARID1A, KMT2C, KMT2D and/or RB1 genes. Preferably, said salt is a besylate salt or a hemi-edisylate hydrate salt. More preferably, said cancer is colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. Most preferably, said cancer is breast cancer. Preferably, said biological sample is a tumor sample and said sample is analyzed by genome/DNA sequencing. Preferably, said sample is obtained from the patient prior to the first administration of said compound or salt thereof, preferably [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[( 3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient. Preferably, said salt is a besylate salt or a hemi-edisylate hydrate salt. Preferably, said gene is the ARID1A gene. Preferably, said gene is the KMT2C gene. Preferably, said gene is the KMT2D gene. Preferably, said gene is the RB1 gene.

В данном изобретении также предложен способ лечения рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легких, рака яичника, рака желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи или глиом у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения или его соли по данному изобретению, в частности [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1карбоксилата или его фармацевтически приемлемой соли пациенту, если указанный пациент выбран для лечения если биологический образец от указанного пациента дал положительный результат тестирования по крайней мере, на одну мутацию с потерей функции генах ARID1A, KMT2C, KMT2D и/или RB1. Предпочтительно, указанная соль представляет собой безилатную соль или соль геми-эдизилат гидрат. Более предпочтительно, указанный рак выбран из группы, включающей колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника или рак желудка. Наиболее предпочтительно, указанный рак представляет собой рак молочной железы. Предпочтительно, указанный биологический образец представляет собой образец опухоли, и указанный образец анализируют с помощью секвенирования генома/ДНК. Предпочтительно, указанный образец получают от пациента до первого введения указанного соединения или его соли, предпочтительно, [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата или его фармацевтически приемлемой соли пациенту. Предпочтительно, указанная соль представляет собой безилатную соль или соль геми-эдизилат гидрат. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген ARID1A. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген KMT2C. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген KMT2D. Предпочтительно, указанный ген представляет собой ген RB1.The present invention also provides a method for treating urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematological cancers, sarcomas. , skin cancers, or gliomas in a patient, comprising administering a therapeutically effective amount of a compound or salt thereof of this invention, in particular [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2enoyl]pyrrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient if said patient is selected for treatment if a biological sample from said patient tested positive test result for at least one loss-of-function mutation in the ARID1A, KMT2C, KMT2D and/or RB1 genes. Preferably, said salt is a besylate salt or a hemi-edisylate hydrate salt. More preferably, said cancer is selected from the group consisting of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. Most preferably, said cancer is breast cancer. Preferably, said biological sample is a tumor sample and said sample is analyzed by genome/DNA sequencing. Preferably, said sample is obtained from the patient prior to the first administration of said compound or salt thereof, preferably [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[ (3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient. Preferably, said salt is a besylate salt or a hemi-edisylate hydrate salt. Preferably, said gene is the ARID1A gene. Preferably, said gene is the KMT2C gene. Preferably, said gene is the KMT2D gene. Preferably, said gene is the RB1 gene.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение по данному изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. В дополнительном варианте реализации изобретения указанная композиция дополнительно содержит один или более другой терапевтический агент. В дополнительном варианте реализации изобретения в данном изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая соединение по дан- 2 039950 ному изобретению, или его фармацевтически приемлемую соль, в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. В еще дополнительном варианте реализации изобретения в данном изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения рака с нерегулируемой транскрипцией, содержащая соединение по данному изобретению, или его фармацевтически приемлемую соль, в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. В указанных вариантах реализации изобретения указанный рак представляет собой рак уротелия, рак матки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак яичника, рак желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, раки шейки матки, рак простаты, гематологические раки, саркомы, раки кожи или глиомы.This invention also relates to a pharmaceutical composition containing a compound of this invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients. In an additional embodiment of the invention, the specified composition additionally contains one or more other therapeutic agents. In a further embodiment, the invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising a compound of the invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients. In yet a further embodiment, the invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of unregulated transcription cancer comprising a compound of the invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients. In said embodiments, said cancer is urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematologic cancers. , sarcomas, skin cancers or gliomas.

В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника или рак желудка. В более предпочтительном варианте реализации изобретения указаный рак представляет собой рак молочной железы.In a preferred embodiment of the invention, said cancer is colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. In a more preferred embodiment of the invention, said cancer is breast cancer.

Дополнительно, в данном изобретении предложено соединение по данному изобретению, или его фармацевтически приемлемая соль, для применения при лечении рака, дополнительно включающего проведение анализа in vitro с применением биологического образца от пациента, определение наличия по меньшей мере одной инактивирующей мутации в генах ARID1A, KMT2C, KMT2D и RB1, и введение терапевтически эффективного количества указанного соединения или его соли пациенту, если присутствует по меньшей мере одна инактивирующая мутация в любом из указанных генов. В указанном варианте реализации изобретения указанный рак представляет собой рак уротелия, рак матки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак яичника, рак желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, раки шейки матки, рак простаты, гематологические раки, саркомы, раки кожи или глиомы. Предпочтительно, указанный биологический образец представляет собой образец опухоли, и указанный образец анализируют с помощью секвенирования генома/ДНК. Предпочтительно, указанное соединение или его соль вводят пациенту при дозе от около 1 мг до 2 г. Предпочтительно, указанный образец получают от пациента до первого введения указанного соединения или его соли пациенту. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию инактивирующей мутации в гене ARID1A. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию инактивирующей мутации в гене KMT2C. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию инактивирующей мутации в гене KMT2D. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию инактивирующей мутации в гене RB1.Additionally, this invention provides a compound of this invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in the treatment of cancer, further comprising performing an in vitro assay using a biological sample from a patient, determining the presence of at least one inactivating mutation in the genes ARID1A, KMT2C, KMT2D and RB1, and administering a therapeutically effective amount of said compound or salt thereof to a patient if at least one inactivating mutation is present in any of said genes. In said embodiment, said cancer is urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematologic cancers , sarcomas, skin cancers or gliomas. Preferably, said biological sample is a tumor sample and said sample is analyzed by genome/DNA sequencing. Preferably, said compound or salt thereof is administered to the patient at a dose of about 1 mg to 2 g. Preferably, said sample is obtained from the patient prior to the first administration of said compound or salt thereof to the patient. Preferably, the patient is selected for the presence of an inactivating mutation in the ARID1A gene. Preferably, the patient is selected for the presence of an inactivating mutation in the KMT2C gene. Preferably, the patient is selected for the presence of an inactivating mutation in the KMT2D gene. Preferably, the patient is selected for the presence of an inactivating mutation in the RB1 gene.

Дополнительно, в данном изобретении предложено соединение по данному изобретению, или его фармацевтически приемлемая соль, для применения в лечении, в частности для лечения рака с нерегулируемой транскрипцией. В дополнительном варианте реализации изобретения в данном изобретении предложено применение соединения в соответствии с данным изобретением или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения рака с нерегулируемой транскрипцией. В указанных вариантах реализации изобретения указанный рак представляет собой рак уротелия, рак матки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак яичника, рак желудочнокишечного тракта, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, раки шейки матки, рак простаты, гематологические раки, саркомы, раки кожи или глиомы. В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный рак выбран из колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака яичника или рака желудка. В более предпочтительном варианте реализации изобретения указанный рак представляет собой рак молочной железы.Additionally, the present invention provides a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in therapy, in particular for the treatment of downregulated cancer. In a further embodiment, the present invention provides the use of a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a transcriptionally unregulated cancer medicament. In said embodiments, said cancer is urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematologic cancers, sarcomas , skin cancers or gliomas. In a preferred embodiment of the invention, said cancer is selected from colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. In a more preferred embodiment of the invention, said cancer is breast cancer.

В еще дополнительном варианте реализации изобретения в данном изобретении предложено соединение по данному изобретению, или его фармацевтически приемлемая соль, для применения в лечении, в частности для лечения рака. В дополнительном варианте реализации изобретения в данном изобретении предложено применение соединения по данному изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, для изготовления лекарственного средства для лечения рака. В указанных вариантах реализации изобретения указанный рак представляет собой рак уротелия, рак матки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак яичника, рак желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, раки шейки матки, рак простаты, гематологические раки, саркомы, раки кожи или глиомы. В предпочтительном варианте реализации изобретения указанный рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника или рак желудка. В более предпочтительном варианте реализации изобретения указанный рак представляет собой рак молочной железы. Дополнительно, в данном изобретении предложено применение указанного соединения для изготовления лекарственного средства для лечения рака уротелия, рака матки, колоректалього рака, рака молочной железы, рака легких, рака яичника, рака желудка, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, раков шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи или глиом, дополнительно включающего проведение анализа in vitro с применением биологического образца от пациента, определение наличия по меньшей мере одной инактивирующей мутации в генах ARID1A, KMT2C, KMT2D и RB1, и введение терапевтически эффективного количества указанного соединения или его соли пациенту, если присутствует по меньшей мере одна инактивирующая мутация в любом из указанных генов. Предпочтительно, указанный биологический образец представляет собой образец опухоли, и укаIn yet a further embodiment of the invention, the present invention provides a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in therapy, in particular for the treatment of cancer. In a further embodiment, the present invention provides the use of a compound of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer. In said embodiments, said cancer is urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematologic cancers. , sarcomas, skin cancers or gliomas. In a preferred embodiment of the invention, said cancer is colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. In a more preferred embodiment of the invention, said cancer is breast cancer. Additionally, the present invention provides the use of said compound for the manufacture of a medicament for the treatment of urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastric cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer. , hematological cancers, sarcomas, skin cancers, or gliomas, further comprising performing an in vitro assay using a biological sample from the patient, determining the presence of at least one inactivating mutation in the ARID1A, KMT2C, KMT2D, and RB1 genes, and administering a therapeutically effective amount of said compound, or salt thereof to a patient if at least one inactivating mutation is present in any of said genes. Preferably, said biological sample is a tumor sample, and

- 3 039950 занный образец анализируют с помощью секвенирования генома/ДНК. Предпочтительно, указанное соединение или его соль вводят пациенту при дозе от около 1 мг до 2 г. Предпочтительно, указанный образец получают от пациента до первого введения указанного соединения или его соли пациенту. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене ARID1A. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене KMT2C. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене KMT2D. Предпочтительно, пациента выбирают по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене RB1.- 3 039950 The sample is analyzed by genome/DNA sequencing. Preferably, said compound or salt thereof is administered to the patient at a dose of about 1 mg to 2 g. Preferably, said sample is obtained from the patient prior to the first administration of said compound or salt thereof to the patient. Preferably, the patient is selected for the presence of at least one inactivating mutation in the ARID1A gene. Preferably, the patient is selected for the presence of at least one inactivating mutation in the KMT2C gene. Preferably, the patient is selected for the presence of at least one inactivating mutation in the KMT2D gene. Preferably, the patient is selected for the presence of at least one inactivating mutation in the RB1 gene.

В данном изобретении предложено соединение по данному изобретению [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат в форме кристаллической соли. В данном изобретении также предложен кристаллический [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат геми-эдизилат гидрат. В данном изобретении также предложен [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4- [(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат геми-эдизилат гидрат в кристаллической форме, характеризующийся порошковой рентгенограммой с использованием излучения CuKa, имеющей характеристические пики при 2θ ± 0,2°, наблюдаемые при 18,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, включающей 21,5, 16,7 и 15,2°. В данном изобретении также предложен кристаллический [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат безилат. В данном изобретении также предложен [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилат безилат в кристаллической форме, характеризующийся порошковой рентгенограммой с использованием излучения CuKa, имеющей характеристические пики при 2θ ± 0,2°, наблюдаемые при 21,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, включающей 12,4, 17,3 и 15,8°. В данном изобретении также предложен кристаллический [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат гидрохлорид. В данном изобретении также предложен [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат гидрохлорид в кристаллической форме, характеризующийся порошковой рентгенограммой с использованием излучения CuKa, имеющей характеристические пики при 2θ ± 0,2°, наблюдаемые при 18,9° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, включающей 5,5, 15,5 и 9,7°.The present invention provides a compound of the present invention [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1 ,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate in the form of a crystalline salt. The present invention also provides crystalline [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5methylpyrazolo[1,5-a ]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate hemi-edisylate hydrate. The present invention also provides [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a] pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate hemi-edisylate hydrate in crystalline form characterized by X-ray powder diffraction using CuKa radiation having characteristic peaks at 2θ ± 0.2° observed at 18.5° in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 21.5, 16.7 and 15.2°. The present invention also provides crystalline [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a ]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate besylate. The present invention also provides [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a] pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate besylate in crystalline form characterized by X-ray powder diffraction using CuKa radiation having characteristic peaks at 2θ ± 0.2° observed at 21.5° in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 12.4, 17.3 and 15.8°. The present invention also provides crystalline [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5 -a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate hydrochloride. The present invention also provides [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a] pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate hydrochloride in crystalline form characterized by X-ray powder diffraction using CuKa radiation having characteristic peaks at 2θ ± 0.2° observed at 18.9° in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 5.5, 15.5 and 9.7°.

Данное изобретение включает также промежуточные соединения и способы, пригодные для синтеза соединения по данному изобретению.This invention also includes intermediates and methods useful for synthesizing a compound of this invention.

Термин лечение (или лечить), как используется в данном документе, относится к ограничению, замедлению, остановке или реверсированию развития или тяжести существующего симптома, состояния или расстройства.The term treatment (or treat), as used herein, refers to limiting, slowing, stopping, or reversing the development or severity of an existing symptom, condition, or disorder.

Как используется в данном документе, термины рак и раковый относятся или описывают физиологическое состояние у пациентов, которое как правило характеризуется нерегулируемой пролиферацией клеток. В данное определение включены доброкачественные и злокачественные опухоли. Под раком на ранней стадии или опухолью на ранней стадии подразумевается рак, который не является запущенным или метастатическим или классифицируется как рак на стадии 0, I или II. Примеры рака включают, но не ограничиваясь ими, рак уротелия, рак матки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак яичника, рак желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарный рак, рак поджелудочной железы, раки шейки матки, рак простаты, гематологические раки, саркомы, раки кожи или глиомы.As used herein, the terms cancer and cancerous refer to or describe a physiological condition in patients that is typically characterized by unregulated cell proliferation. This definition includes benign and malignant tumors. By early-stage cancer or early-stage tumor is meant cancer that is not advanced or metastatic, or is classified as stage 0, I, or II cancer. Examples of cancer include, but are not limited to, urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastrointestinal cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematologic cancers , sarcomas, skin cancers or gliomas.

Соединение по данному изобретению может вступать в реакцию с образованием фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемые соли и общие методики их получения хорошо известны в данной области техники (см, например, P. Stahl и др. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2-е исправленное издание (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge и др., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, Январь 1977).The compound of this invention may react to form pharmaceutically acceptable salts. Pharmaceutically acceptable salts and general procedures for their preparation are well known in the art (see, for example, P. Stahl et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd revised edition (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge et al., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No 1, January 1977).

Специалисту в данной области техники будет понятно, что соединение по данному изобретению, как проиллюстрировано в (I), или его фармацевтически приемлемая соль, состоит из основного фрагмента, который содержит один хиральный центр, как представлено * нижеThe person skilled in the art will appreciate that the compound of this invention as illustrated in (I), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, consists of a core moiety that contains one chiral center as shown * below

- 4 039950- 4 039950

Хотя в данном изобретении рассматриваются все индивидуальные энантиомеры, а также смеси энантиомеров указанных соединений, включая рацематы, предпочтительное соединение по данному изобретению представлено (II) нижеWhile this invention contemplates all individual enantiomers as well as mixtures of enantiomers of said compounds, including racemates, a preferred compound of this invention is shown in (II) below

или его фармацевтически приемлемые соли.or its pharmaceutically acceptable salts.

Специалистам в данной области техники понятно также, что обозначения Кана-Ингольда-Прелога (R) или (S) для всех хиральных центров варьируются в зависимости от характера замещения конкретного соединения. Отдельные энантиомеры можно получать, исходя из хиральных реагентов, или технологиями стереоселективного или стереоспецифического синтеза. В альтернативном варианте, отдельные энантиомеры могут быть выделены из смесей стандартными приемами хиральной хроматографии или кристаллизации в любой удобный момент синтеза соединений по данному изобретению. Отдельные энантиомеры соединений по данному изобретению представляют собой предпочтительный вариант реализации изобретения.Those skilled in the art will also appreciate that the Cahn-Ingold-Prelog designations (R) or (S) for all chiral centers vary depending on the nature of the substitution of a particular compound. Individual enantiomers can be prepared from chiral reagents or by stereoselective or stereospecific synthesis techniques. Alternatively, individual enantiomers may be isolated from mixtures by standard chiral chromatography or crystallization techniques at any convenient point in the synthesis of the compounds of this invention. The individual enantiomers of the compounds of this invention represent a preferred embodiment of the invention.

Соединение по данному изобретению предпочтительно составляют в виде фармацевтических композиций, вводимых различными путями. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники (см., например., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, и др., изд., 21е изд., Mack Publishing Co., 2005)). Более предпочтительной является фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулыThe compound of this invention is preferably formulated into pharmaceutical compositions administered by various routes. Such pharmaceutical compositions and methods for their preparation are well known in the art (see, for example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005). )). More preferred is a pharmaceutical composition containing a compound of formula

- 5 039950- 5 039950

или его фармацевтически приемлемую соль, и один или более фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents.

Предпочтительный вариант реализации данного изобретения представляет собойThe preferred embodiment of this invention is

или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Особенно предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к соединению (3S)-1-[(2Е)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил 4-{[5-метил-3-(пропан-2-ил)пиразоло[1,5a]пиримидин-7-ил] амино } пиперидин-1 -карбоксилатуA particularly preferred embodiment of the present invention relates to the compound (3S)-1-[(2E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl 4-{[5-methyl-3-(propane-2 -yl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-7-yl]amino } piperidine-1-carboxylate

- 6 039950 или его фармацевтически приемлемой соли. Особенно предпочтительны соль геми-эдизилат гидрат или соль безилат.- 6 039950 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Especially preferred is the hemi-edisylate hydrate salt or the besylate salt.

Другой особенно предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к соединению (3S)-1-[(2Е)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил 4-{[5-метил-3-(пропан-2-ил)пиразоло [ 1,5-A] пиримидин-7-ил] амино} пиперидин-1 -карбоксилатуAnother particularly preferred embodiment of the present invention relates to the compound (3S)-1-[(2E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl 4-{[5-methyl-3-(propane- 2-yl)pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-7-yl]amino}piperidine-1-carboxylate

Дополнительный особенно предпочтительный вариант реализации данного изобретения относится к соединению, (3R)-1-[(2Е)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил 4-{[5-метил-3-(пропан-2ил)πиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил]амино}πиперидин-1-карбоксилату (как показано на (III) ниже)An additional particularly preferred embodiment of this invention relates to the compound, (3R)-1-[(2E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl 4-{[5-methyl-3-(propane -2yl)pirazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl]amino}piperidine-1-carboxylate (as shown in (III) below)

или его фармацевтически приемлемой соли. Особенно предпочтительны соль геми-эдизилат гидрат или соль безилат.or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Especially preferred is the hemi-edisylate hydrate salt or the besylate salt.

Другой особенно предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к соединению (3R)-1-[(2Е)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил 4-{[5-метил-3-(пропан-2-ил)пиразоло [ 1,5-A] пиримидин-7-ил] амино} пиперидин-1 -карбоксилатуAnother particularly preferred embodiment of the present invention relates to the compound (3R)-1-[(2E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl 4-{[5-methyl-3-(propane- 2-yl)pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-7-yl]amino}piperidine-1-carboxylate

- 7 039950- 7 039950

(Ш)(W)

Соединения по данному изобретению, как правило, эффективны в широком интервале доз. Например, суточные дозы входят в диапазон от около 1 мг до около 2 г. В некоторых случаях более уместными могут быть уровни доз, находящиеся ниже нижнего предела указанного диапазона, тогда как в других случаях могут быть использованы более высокие дозы при сохранении благоприятного профиля пользы/риска, и, следовательно, вышеуказанный диапазон доз никоим образом не предназначен для ограничения данного изобретения. Следует понимать, что количество фактически введенного соединения определяет врач с учетом релевантных обстоятельств, включая подлежащее лечению патологическое состояние, выбранный способ введения, фактически вводимое соединение или соединения, возраст, массу и ответ конкретного пациента, а также тяжесть симптомов пациента.The compounds of this invention are generally effective over a wide dosage range. For example, daily doses range from about 1 mg to about 2 g. In some cases, dose levels below the lower end of this range may be more appropriate, while in other cases, higher doses may be used while maintaining a favorable benefit profile. risk, and therefore the above dosage range is not intended to limit the present invention in any way. It should be understood that the amount of compound actually administered is determined by the clinician, taking into account relevant circumstances including the condition to be treated, the mode of administration chosen, the compound or compounds actually administered, the age, weight and response of the individual patient, and the severity of the patient's symptoms.

Отдельные изомеры и энантиомеры могут быть отделены или разделены специалистом в данной области в любой удобный момент синтеза соединений по изобретению такими способами, как методики селективной кристаллизации или хиральная хроматография (см., например, J. Jacques и др., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc., 1981 и E.L. Eliel и S.H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds', Wiley-Interscience, 1994).The individual isomers and enantiomers may be separated or resolved by one of ordinary skill in the art at any convenient point in the synthesis of the compounds of the invention by methods such as selective crystallization techniques or chiral chromatography (see, for example, J. Jacques et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions , John Wiley and Sons, Inc., 1981 and E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds', Wiley-Interscience, 1994).

Кроме того, определенные промежуточные соединения, описанные в данном документе, могут содержать одну или более защитную группу. Переменные защитные группы могут быть в каждом случае одинаковыми или различными в зависимости от конкретных условий реакции и конкретных проводимых превращений. Условия постановки защиты и снятия защиты хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны в литературных источниках (см., например, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, четвертое издание, Peter G.M. Wuts и Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).In addition, certain intermediates described herein may contain one or more protecting groups. The variable protecting groups may be the same or different in each case, depending on the specific reaction conditions and the specific transformations being carried out. The conditions for protection and deprotection are well known to those skilled in the art and are described in the literature (see, for example, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, fourth edition, Peter G. M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).

Некоторые аббревиатуры определены следующим образом: 1H ЯМР обозначает 1H-ядерный магнитный резонанс; экв. обозначает эквивалент; ТГФ обозначает тетрагидрофуран; ДХМ обозначает дихлорметан; MeCN или ACN обозначает ацетонитрил; ДМСО обозначает диметилсульфоксид; МТБЭ обозначает метил-трет-бутиловый эфир; ТЭА обозначает триметиламин; HATU обозначает 1-[бис(диметиламино)метилен]-1-H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксид гексафторфосфат; MeOH обозначает метанол; ТСХ обозначает тонкослойную хроматографию; УФ обозначает ультрафиолет; Колонка ЖХ обозначает колонку жидкостной хроматографии; ДМЭА обозначает диметилметиламин; EtOAc обозначает этилацетат; ДМФА обозначает диметилформамид; СКО обозначает сильный катионный обмен; ок обозначает около или приблизительно; КДК обозначает круглодонную колбу; АТФ обозначает аденозинтрифосфат; DTT обозначает дитиотреитол; HEPES обозначает (4(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоту); ЭДТА обозначает этилендиаминтетрауксусную кислоту; ATCC обозначает Американскую коллекцию типовых культур; КТ обозначает комнатную температуру; ФСБ обозначает забуференный фосфатом солевой раствор; БСА обозначает альбумин бычьей сыворотки; ФБС обозначает фетальную бычью сыворотку; РНКаза обозначает рибонуклеазу; кДНК обозначает комплементарную ДНК; GST обозначает глутатион-S-трансферазу; His обозначает гистидин; GSH обозначает глутатион; и HBSS обозначает сбалансированный солевой раствор Хэнка.Some abbreviations are defined as follows: 1H NMR stands for 1 H nuclear magnetic resonance; equiv. denotes an equivalent; THF stands for tetrahydrofuran; DCM is dichloromethane; MeCN or ACN is acetonitrile; DMSO stands for dimethyl sulfoxide; MTBE stands for methyl tert-butyl ether; TEA stands for trimethylamine; HATU is 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1-H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxide hexafluorophosphate; MeOH is methanol; TLC stands for thin layer chromatography; UV stands for ultraviolet; LC column refers to a liquid chromatography column; DMEA stands for dimethylmethylamine; EtOAc is ethyl acetate; DMF stands for dimethylformamide; RMS stands for strong cation exchange; ok means about or approximately; FBC means round bottom flask; ATP stands for adenosine triphosphate; DTT stands for dithiothreitol; HEPES stands for (4(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid); EDTA stands for ethylenediaminetetraacetic acid; ATCC stands for American Type Culture Collection; RT stands for room temperature; PBS stands for phosphate buffered saline; BSA stands for bovine serum albumin; FBS stands for fetal bovine serum; RNase means ribonuclease; cDNA means complementary DNA; GST stands for glutathione-S-transferase; His is histidine; GSH stands for glutathione; and HBSS stands for Hank's Balanced Salt Solution.

Соединения по данному изобретению или их фармацевтически приемлемые соли могут быть получены посредством многочисленных способов, известных в данной области техники, а также Получений и примеров, описанных ниже. Конкретные стадии синтеза для каждого из описанных способов можно объединять различным образом или объединять со стадиями из других схем для получения соединений по данному изобретению или их фармацевтически приемлемых солей. Продукты каждой стадии на приведенных ниже схемах можно выделять традиционными способами, хорошо известными в данной облас- 8 039950 ти техники, включая экстракцию, упаривание, осаждение, хроматографию, фильтрование, растирание и кристаллизацию. Указанные реагенты и исходные материалы легко доступны специалистам в данной области техники.The compounds of this invention or their pharmaceutically acceptable salts can be obtained by numerous methods known in the art, as well as Preparations and examples described below. Specific synthetic steps for each of the methods described can be combined in various ways or combined with steps from other schemes to obtain the compounds of this invention or their pharmaceutically acceptable salts. The products of each step in the schemes below can be isolated by conventional methods well known in the art, including extraction, evaporation, precipitation, chromatography, filtration, trituration, and crystallization. These reagents and starting materials are readily available to those skilled in the art.

Следующие способы синтеза и примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение и представляют собой типичный синтез соединений по данному изобретению.The following synthesis methods and examples further illustrate the invention and represent a typical synthesis of the compounds of this invention.

Получения и примеры.Getting and examples.

Получение 1. Синтез 3-изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидин-5,7-диолаPreparation 1. Synthesis of 3-isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-5,7-diol

In^J '1+ Щ I k ηο^^ΌηIn^J '1+ Щ I k ηο^^Όη

Добавляли этилат натрия (979 г, 14,4 моль, 3,0 экв.) и диэтилмалонат (998 г, 6,23 моль, 3,0 экв.) при 23°C к раствору 4-изопропил-1H-пиразол-3-амина (600 г, 4,79 моль) в этаноле (4,2 л) и смесь нагревали до 80°C (внутренняя температура) в течение 15 ч. Смесь охлаждали до 25°C, добавляли 1М водный раствор HCl (2,0 л) (конечный рН 2,0), фильтровали, промывали твердое вещество водой (2,0 л) и сушили с получением 3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-5,7-диол (600 г, 65%) в виде белого твердого вещества. ИЭР/МС (m/z): 194 (M+H).Sodium ethoxide (979 g, 14.4 mol, 3.0 eq.) and diethylmalonate (998 g, 6.23 mol, 3.0 eq.) were added at 23°C to a solution of 4-isopropyl-1H-pyrazole-3 -amine (600 g, 4.79 mol) in ethanol (4.2 L) and the mixture was heated to 80°C (internal temperature) for 15 h. 0 L) (final pH 2.0), filtered, washed the solid with water (2.0 L) and dried to give 3-isopropylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine-5,7-diol (600 g, 65% ) as a white solid. ESI/MS (m/z): 194 (M+H).

Получение 2. Синтез 5,7-дихлор-3-изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидинаPreparation 2. Synthesis of 5,7-dichloro-3-isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine

Добавляли POCl3 (2,00 л, 25,8 моль, 10 экв.) И N,N-диметиланилин (162 мл, 2,58 моль, 1,0 экв.) к суспензии 3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-5,7-диола (500 г, 2,58 моль) в MeCN (1,25 л) при 50°C и смесь нагревали до 100°C в течение 36 ч. Охлаждали до 23°C, по каплям выливали в 1:1 лед/фосфатный буфер (1М, рН 8, 10 л) и перемешивали в течение 15 ч. Фильтровали, промывали твердое вещество водой (5,0 л) и сушили с получением 5,7-дихлор-3-изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидина (375 г, 63%) в виде коричневого твердого вещества. ИЭР/МС m/z (35Cl/37Cl) 230/232 [M+H]. 1H ЯМР (d6-ДМСО) δ 1,32 (д, 6H), 3,19 (дк, 1H), 7,58 (с, 1H), 8,31 (с, 1H).POCl 3 (2.00 L, 25.8 mol, 10 eq) and N,N-dimethylaniline (162 ml, 2.58 mol, 1.0 eq) were added to the suspension of 3-isopropylpyrazolo[1,5-a ]pyrimidine-5,7-diol (500 g, 2.58 mol) in MeCN (1.25 L) at 50°C and the mixture heated to 100°C for 36 h. Cooled to 23°C, poured dropwise in 1:1 ice/phosphate buffer (1M, pH 8, 10 L) and stirred for 15 hours. Filtered, washed the solid with water (5.0 L) and dried to give 5,7-dichloro-3-isopropyl- pyrazolo[1,5-a]pyrimidine (375 g, 63%) as a brown solid. ESI/MS m/z ( 35 Cl/ 37 Cl) 230/232 [M+H]. 1H NMR (d 6 -DMSO) δ 1.32 (d, 6H), 3.19 (dc, 1H), 7.58 (s, 1H), 8.31 (s, 1H).

Альтернативный способ синтеза 5,7-дихлор-3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидина.An alternative route for the synthesis of 5,7-dichloro-3-isopropylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine.

Добавляли этилат натрия (21% в этаноле) (17,9 мл, 47,9 ммоль) к раствору 4-изопропил-Шпиразол-5-амина(5 г, 39,9 ммоль) и диэтилмалоната (6,74 мл, 43,9 ммоль) в этаноле (150 мл) и перемешивали при комнатной температуре. Через 5 мин нагревали до 90°C и перемешивали. Через 18 ч охлаждали до комнатной температуры и упаривали при пониженном давлении. Растворяли остаток в воде и добавляли 1H соляную кислоту до рН 3. Отфильтровывали белый осадок и сушили при пониженном давлении при 50°C в течение 18 ч. Полученный твердый 3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-5,7-диол (4,92 г, 25,5 ммоль, 0,638) суспендировали в оксихлориде фосфора (48 мл) и добавляли N,N-диметиланилин (2,3 мл). Смесь кипятили с обратным холодильником при 110°C. Через 2 ч охлаждали до комнатной температуры и упаривали при пониженном давлении. Выливали остаток в лед/водный раствор и экстрагировали ДХМ (дважды). Объединяли органические слои, промывали солевым раствором и сушили над сульфатом магния. Фильтровали и упаривали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией (силикагель), элюируя смесью этилацетат:гексан с получением 5,7-дихлор-3изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидина (4,45 г, 19,3 ммоль) в виде коричневого твердого вещества. МС (m/z): 230,232 (M+1). 1H ЯМР (400,21 МГц, ДМСО): 8,31 (с, 1H), 7,58 (с, 1H), 3,19 (м, 1H), 1,32 (д, J=7,0 Гц, 6H).Sodium ethylate (21% in ethanol) (17.9 ml, 47.9 mmol) was added to a solution of 4-isopropyl-Spyrazole-5-amine (5 g, 39.9 mmol) and diethyl malonate (6.74 ml, 43. 9 mmol) in ethanol (150 ml) and stirred at room temperature. After 5 min, heated to 90°C and stirred. After 18 h, cooled to room temperature and evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in water and 1N hydrochloric acid was added to pH 3. The white precipitate was filtered off and dried under reduced pressure at 50°C for 18 h. 4.92 g, 25.5 mmol, 0.638) was suspended in phosphorus oxychloride (48 ml) and N,N-dimethylaniline (2.3 ml) was added. The mixture was refluxed at 110°C. After 2 h, cooled to room temperature and evaporated under reduced pressure. Pour the residue into ice/aqueous solution and extract with DCM (twice). The organic layers were combined, washed with brine and dried over magnesium sulfate. Filter and evaporate under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash chromatography (silica gel) eluting with ethyl acetate:hexane to give 5,7-dichloro-3isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine (4.45 g, 19.3 mmol) as a brown solid. MS (m/z): 230.232 (M+1). 1 H NMR (400.21 MHz, DMSO): 8.31 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 3.19 (m, 1H), 1.32 (d, J=7.0 Hz, 6H).

Получение 3. Синтез трет-бутил 4-[(5-хлор-3-изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилатаPreparation 3. Synthesis of tert-butyl 4-[(5-chloro-3-isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate

- 9 039950- 9 039950

Добавляли Ν,Ν-диизопропилэтиламин (189 мл, 140 г, 1080 ммоль, 2 экв.) и трет-бутил 4-аминопиперидин-1-карбоксилат (114 г, 570 ммоль, 1,05 экв.) к суспензии 5,7-дихлор-3-изопропил-пиразоло[1,5a]пиримидин (130 г, 542 ммоль) в 2-пропаноле (1,0 л) при 23°C и смесь перемешивали в течение 18 ч. Фильтровали, промывали твердое вещество МТБЭ (200 мл) и сушили с получением трет-бутил 4-[(5хлор-3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (182 г, выход 85%) в виде желтого твердого вещества. ИЭР/МС m/z (35Cl/37Cl) 394/396 [M+H]. 1H ЯМР (d6-ДМСО) δ 1,28 (д, 6H), 1,42 (с, 9H), 1,61 (м, 2H), 1,83 (м, 2H), 2,87 (м, 1H), 3,10 (дк, 1H), 3,32 (м, 1H), 3,85 (м, 1H), 3,98 (м, 2H), 6,34 (с, 1H), 8,01 (с, 1H), 8,07 (д, 1H).Ν,N-diisopropylethylamine (189 ml, 140 g, 1080 mmol, 2 eq.) and tert-butyl 4-aminopiperidine-1-carboxylate (114 g, 570 mmol, 1.05 eq.) were added to a suspension of 5,7- dichloro-3-isopropyl-pyrazolo[1,5a]pyrimidine (130 g, 542 mmol) in 2-propanol (1.0 L) at 23° C. and the mixture was stirred for 18 hours. Filtered, washed the solid with MTBE (200 ml) and dried to give tert-butyl 4-[(5chloro-3-isopropylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (182 g, 85% yield) as a yellow solid substances. ESI/MS m/z ( 35 Cl/ 37 Cl) 394/396 [M+H]. 1H NMR (d 6 -DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 1.42 (s, 9H), 1.61 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 2.87 (m , 1H), 3.10 (dc, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.98 (m, 2H), 6.34 (s, 1H), 8 .01 (s, 1H), 8.07 (d, 1H).

Получение 4. Синтез 4-[трет-бутоксикарбонил-(5-хлор-3-изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидин-7ил)амино]пиперидин-1-карбоксилатаPreparation 4 Synthesis of 4-[tert-butoxycarbonyl-(5-chloro-3-isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7yl)amino]piperidine-1-carboxylate

Добавляли К,Я-диизопропилэтиламин (69,1 мл, 51,2 г, 396 ммоль, 1 экв.), 4-диметиламинопиридин (4,84 г, 39,6 ммоль, 0,1 экв.) и ди-трет-бутилдикарбонат (200 мл, 190 г, 871 ммоль, 2,2 экв.) к раствору трет-бутил 4-[(5-хлор-3-изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (156 г, 396 ммоль) в ТГФ (936 мл) при 23°C и смесь нагревали при 50°C (внутренняя температура) в течение 21 ч. Охлаждали до 23°C и упаривали под вакуумом с получением трет-бутил 4-[третбутоксикарбонил-(5-хлор-3-изопропил-пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (195 г, 99%) в виде оранжевого твердого вещества. ИЭР/МС m/z (35Cl/37Cl) 438/440 [M+H-56]. 1H ЯМР (46-ДМСО) δ 1,20 (с, 9H), 1,31 (д, 6H), 1,35 (с, 9H), 1,46 (м, 2H), 1,88 (м, 2H), 2,75 (м, 1H), 3,19 (дк, 1H), 3,32 (м, 1H), 3,95 (м, 1H), 4,18 (м, 2H), 7,20 (с, 1H), 8,19 (с, 1H).K,R-diisopropylethylamine (69.1 ml, 51.2 g, 396 mmol, 1 eq.), 4-dimethylaminopyridine (4.84 g, 39.6 mmol, 0.1 eq.) and di-t- butyl dicarbonate (200 ml, 190 g, 871 mmol, 2.2 eq.) to a solution of tert-butyl 4-[(5-chloro-3-isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino] piperidine-1-carboxylate (156 g, 396 mmol) in THF (936 ml) at 23°C and the mixture was heated at 50°C (internal temperature) for 21 h. Cooled to 23°C and evaporated under vacuum to obtain tert -butyl 4-[tert-butoxycarbonyl-(5-chloro-3-isopropyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (195 g, 99%) as an orange solid. ESI/MS m/z ( 35 Cl/ 37 Cl) 438/440 [M+H-56]. 1H NMR (46-DMSO) δ 1.20 (s, 9H), 1.31 (d, 6H), 1.35 (s, 9H), 1.46 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 2.75 (m, 1H), 3.19 (dc, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.95 (m, 1H), 4.18 (m, 2H), 7, 20 (s, 1H), 8.19 (s, 1H).

Альтернативный способ синтеза 4-[трет-бутоксикарбонил-(5-хлор-3-изопропилпиразоло[1,5a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата.An alternative route for the synthesis of 4-[tert-butoxycarbonyl-(5-chloro-3-isopropylpyrazolo[1,5a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate.

Добавляли трет-бутил 4-аминопиперидин-1-карбоксилат (2,8 г, 14 ммоль) к раствору 5,7-дихлор-3изопропил-пиразоло[1,5-ц]пиримидина (3,1 г, 13 ммоль) в этаноле (32 мл). Нагревали при 80°C. Через 18 ч охлаждали до комнатной температуры и упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией (силикагель), элюируя смесью этилацетат:ДХМ с получением трет-бутил 4-[третбутоксикарбонил-(5-хлор-3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата в виде белого твердого вещества.Масс-спектр (m/z): 394,396 (M+1) Добавляли трет-бутоксикарбонил трет-бутил карбонат (1,14 г, 5,22 ммоль) к раствору трет-бутил 4-[(5-хлор-3-изопропил-пиразоло[1,5a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (940 мг, 2,386 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (290 мг, 2,33 ммоль) в ТГФ (7 мл). Смесь нагревали при 60°C. Через 30 минут охлаждали до комнатной температуры и упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией (силикагель), элюируя ДХМ с получением трет-бутил 4-[трет-бутоксикарбонил-(5-хлор-3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (1,1 г) в виде желтоватого масла. Массспектр (m/z): 438 (M-t-Bu). 1H ЯМР (400,13 МГц, d6-ДМСО): 8,19 (с, 1H), 7,20 (с, 1H), 5,76 (с, 1H), 4,17(м, 1H), 3,95 (м, 2H), 3,19 (м, 1H), 1,87 (м, 2H), 1,47 (м, 2H), 1,35 (с, 9H), 1-31 (д, 6H), 1,19 (с, 9H).tert-Butyl 4-aminopiperidine-1-carboxylate (2.8 g, 14 mmol) was added to a solution of 5,7-dichloro-3isopropyl-pyrazolo[1,5-c]pyrimidine (3.1 g, 13 mmol) in ethanol (32 ml). Heated at 80°C. After 18 h, cooled to room temperature and evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography (silica gel) eluting with ethyl acetate:DCM to give t-butyl 4-[t-butoxycarbonyl-(5-chloro-3-isopropylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidin-1 -carboxylate as a white solid. Mass spectrum (m/z): 394.396 (M+1) Add tert-butoxycarbonyl tert-butyl carbonate (1.14 g, 5.22 mmol) to a solution of tert-butyl 4-[ (5-chloro-3-isopropyl-pyrazolo[1,5a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (940 mg, 2.386 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (290 mg, 2.33 mmol) in THF (7 ml). The mixture was heated at 60°C. After 30 minutes, cooled to room temperature and evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography (silica gel) eluting with DCM to give t-butyl 4-[t-butoxycarbonyl-(5-chloro-3-isopropylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1- carboxylate (1.1 g) as a yellowish oil. Mass spectrum (m/z): 438 (Mt-Bu). 1H NMR (400.13 MHz, d 6 -DMSO): 8.19 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.95 (m, 2H), 3.19 (m, 1H), 1.87 (m, 2H), 1.47 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1-31 (d , 6H), 1.19 (s, 9H).

Получение 5. Синтез трет-бутил 4-[трет-бутоксикарбонил-(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилатаPreparation 5 Synthesis of tert-butyl 4-[tert-butoxycarbonyl-(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate

- 10 039950- 10 039950

Добавляли аддукт ДХМ [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия (II) (15,7 г, 19,3 ммоль, 0,05 экв.), трехосновный фосфат калия (245 г, 1160 ммоль, 3 экв.) и 2,4,6-триметил-1,3,5,2,4,6триоксатриборинан (50 мас.% в ТГФ, 75,3 мл, 67,6 г, 270 ммоль, 0,7 экв.) к раствору трет-бутил 4-[третбутоксикарбонил-(5-хлор-3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (190 г, 385 ммоль) в 1,4-диоксане (1,5 л) при 90°C (внутренняя температура). Через 5 дней охлаждали до 23°C, фильтровали через слой диатомовой земли и промывали твердое вещество ТГФ (3х 250 мл). Объединенные фильтраты обрабатывали Тиоловой смолой SiliaMetS® при 23°C (40-63 мкм; загрузка = 1,46 ммоль/г; 320 г, 467 ммоль) и нагревали до 65°C в течение 18 ч. Охлаждали до 23°C, фильтровали и смолу промывали ДХМ (2 х 250 мл). Объединенные фильтраты упаривали под вакуумом, растворяли остаток в МТБЭ (1 мл), промывали водой (200 мл), сушили (MgSO4) и упаривали под вакуумом с получением третбутил 4-[трет-бутоксикарбонил-(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин1-карбоксилата (182 г, 100%) в виде коричневого твердого вещества. ИЭР/МС (m/z): 474 (M+H).[1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II) adduct (15.7 g, 19.3 mmol, 0.05 eq.), tribasic potassium phosphate (245 g, 1160 mmol, 3 eq.) was added. ) and 2,4,6-trimethyl-1,3,5,2,4,6trioxatriborinan (50 wt.% in THF, 75.3 ml, 67.6 g, 270 mmol, 0.7 eq.) to a solution tert-butyl 4-[tert-butoxycarbonyl-(5-chloro-3-isopropylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (190 g, 385 mmol) in 1,4-dioxane ( 1.5 l) at 90°C (internal temperature). After 5 days, cooled to 23° C., filtered through a pad of diatomaceous earth and washed the solid with THF (3 x 250 ml). The combined filtrates were treated with SiliaMetS® thiol resin at 23°C (40-63 µm; loading = 1.46 mmol/g; 320 g, 467 mmol) and heated to 65°C for 18 hours. Cooled to 23°C, filtered and the resin was washed with DCM (2 x 250 ml). The combined filtrates were evaporated in vacuo, the residue was dissolved in MTBE (1 ml), washed with water (200 ml), dried (MgSO 4 ) and evaporated in vacuo to give tert-butyl 4-[tert-butoxycarbonyl-(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[ 1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine 1-carboxylate (182 g, 100%) as a brown solid. ESI/MS (m/z): 474 (M+H).

Получение 6. Синтез 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-амин ди гидрохлоридаPreparation 6 Synthesis of 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-7-amine dihydrochloride

Добавляли соляную кислоту в 2-пропаноле (5,50 моль/л, 349 мл, 1920 ммоль, 5 экв.) к суспензии трет-бутил 4-[трет-бутоксикарбонил-(3-изопропил-5-метилпиразоло][1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (182 г, 384 ммоль) в 2-пропаноле (1,4 л) при 23°C и смесь нагревали до 70°C (внутренняя температура) в течение 3 ч. Охлаждали до 23°C, фильтровали, промывали твердое вещество МТБЭ (2 х 200 мл) и сушили с получением 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-амин дигидрохлорида (95 г, выход 71%) в виде желтого твердого вещества. Объединяли маточные растворы, разбавляли МТБЭ (2 л), фильтровали, промывали твердое вещество МТБЭ (2х50 мл) и сушили с получением дополнительного материала (8,42 г, выход 15%). ИЭР/МС (m/z): 274 (M+H). 1H ЯМР (d6-ДМСО) δ 1,28 (д, 6H), 2,04 (м, 4H), 2,61 (с, 3H), 3,00 (м, 2H), 3,40 (м, 3H), 4,16 (м, 2H), 6,68 (с, 1H), 8,30 (с, 1H), 8,80 (м, 1H), 9,21 (м, 1H), 9,86 (м, 1H).Hydrochloric acid in 2-propanol (5.50 mol/l, 349 ml, 1920 mmol, 5 eq.) was added to a suspension of t-butyl 4-[t-butoxycarbonyl-(3-isopropyl-5-methylpyrazolo][1.5 -a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (182 g, 384 mmol) in 2-propanol (1.4 L) at 23°C and the mixture heated to 70°C (internal temperature) for 3 hours Cooled to 23°C, filtered, washed with MTBE solid (2 x 200 ml) and dried to give 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine- 7-amine dihydrochloride (95 g, 71% yield) as a yellow solid. The mother liquors were combined, diluted with MTBE (2 L), filtered, washed with MTBE solid (2 x 50 ml) and dried to give additional material (8.42 g, 15% yield). ESI/MS (m/z): 274 (M+H). 1H NMR (d 6 -DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 2.04 (m, 4H), 2.61 (s, 3H), 3.00 (m, 2H), 3.40 (m , 3H), 4.16 (m, 2H), 6.68 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.80 (m, 1H), 9.21 (m, 1H), 9 .86 (m, 1H).

Альтернативный способ синтеза 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин7-амин дигидрохлорида. Растворяли 7-хлор-3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин (2,1 кг, 10,0 моль) и диизопропилэтиламин (4,18 л, 2,4 экв.) в изопропаноле (16,8 л, 8 мл/г). В реакционную смесь загружали трет-бутил 4-аминопиперидин-1-карбоксилат (2,6 кг, 1,3 экв.) и нагревали до 75-80°C в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до 5-10°C и добавляли 4М раствор соляной кислоты в изопропаноле (17,5 л, 7,0 экв.). Нагревали до 40-45°C в течение 4 ч. Охлаждали до 25-30°C и смесь фильтровали с получением указанного соединения (2,25 кг, выход 72,7%). Материал использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 1H ЯМР (500 Мгц, D2O) δ 8,16 (с, 1H), 6,45 (с, 1H), 4,29-4,26 (м, 1H), 3,63 (д, J=15,0 Гц, 2H), 3,26 - 3,12 (м, 3H), 2,64 (с, 3H), 2,40 (д, J=15,0 Гц, 2H), 2,08 (дд, J=10,0, 25,0 Гц, 2H), 1,31 (д, J=5,0 Гц, 6H).Alternative route for the synthesis of 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine7-amine dihydrochloride. Dissolve 7-chloro-3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine (2.1 kg, 10.0 mol) and diisopropylethylamine (4.18 L, 2.4 eq.) in isopropanol (16, 8 L, 8 ml/g). The reaction mixture was loaded with tert-butyl 4-aminopiperidine-1-carboxylate (2.6 kg, 1.3 eq.) and heated to 75-80°C for 16 hours. The reaction mixture was cooled to 5-10°C and added 4M hydrochloric acid in isopropanol (17.5 L, 7.0 eq.). Heated to 40-45°C for 4 hours. Cooled to 25-30°C and the mixture was filtered to give the title compound (2.25 kg, 72.7% yield). The material was used in the next step without further purification. 1H NMR (500 MHz, D 2 O) δ 8.16 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.29-4.26 (m, 1H), 3.63 (d, J= 15.0 Hz, 2H), 3.26 - 3.12 (m, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.40 (d, J=15.0 Hz, 2H), 2.08 ( dd, J=10.0, 25.0 Hz, 2H), 1.31 (d, J=5.0 Hz, 6H).

Альтернативный способ синтеза 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин7-амина в виде свободного основания.Alternative route for the synthesis of 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine7-amine as free base.

Добавляли 1,4-диоксан (15 мл) к смеси трет-бутил 4-[трет-бутоксикарбонил-(5-хлор-3-изопропилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (689 мг, 1,39 ммоль), 2,4,6-триметилAdded 1,4-dioxane (15 ml) to a mixture of tert-butyl 4-[tert-butoxycarbonyl-(5-chloro-3-isopropylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (689 mg, 1.39 mmol), 2,4,6-trimethyl

- 11 039950- 11 039950

1,3,5,2,4,6-триоксатриборинана (350 мг, 2,79 ммоль) и трехосновного фосфата калия (1,2 г, 5,5 ммоль). Барботировали N2 через раствор в течение 5 мин. Добавляли аддукт ДХМ [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия (II) (60 мг, 0,072 ммоль). Нагревали при 110°C. Через 1,5 ч добавляли еще [1,1-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий (II) (60 мг, 0,072 ммоль) и нагревали при 100°C. Через 18 ч охлаждали до комнатной температуры, смесь фильтровали через слой целита, промывали этилацетатом и упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэшхроматографией (силикагель), элюируя смесью этилацетат:ДХМ с получением трет-бутил 4-[третбутоксикарбонил-(3-изоnропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (537 мг, 1,077 ммоль) в виде оранжеватого масла. Масс-спектр: (m/z): 474 (M+1).1,3,5,2,4,6-trioxatriborinan (350 mg, 2.79 mmol) and tribasic potassium phosphate (1.2 g, 5.5 mmol). N 2 was bubbled through the solution for 5 minutes. The DCM adduct [1,1'bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II) (60 mg, 0.072 mmol) was added. Heated at 110°C. After 1.5 h, more [1,1-bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium (II) (60 mg, 0.072 mmol) was added and heated at 100°C. After 18 hours, cooled to room temperature, the mixture was filtered through a pad of celite, washed with ethyl acetate and evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography (silica gel) eluting with ethyl acetate:DCM to give tert-butyl 4-[tert-butoxycarbonyl-(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (537 mg, 1.077 mmol) as an orange oil. Mass spectrum: (m/z): 474 (M+1).

По каплях добавляли трифторуксусную кислоту (2,5 мл, 33 ммоль) к раствору трет-бутил 4-[третбутоксикарбонил-(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат (537 мг, 1,077 ммоль) в ДХМ (12 мл). Перемешивали при комнатной температуре. Через 2 ч смесь упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали путем элюирования с помощью картриджа SCX-2 с 10% ДХМ:MeOH, затем MeOH (2H NH3). Упаривали основную фракцию при пониженном давлении с получением 3-изоnропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-амина (345 мг, 1,199 ммоль) в виде коричневатого твердого вещества. Масс-спектр (m/z): 274 (M+1). 1H ЯМР (400,13 МГц, ДМСО): 7,82 (с, 1H), 7,23 (д, 1H), 6,08 (с, 1H), 3,58 (м, 1H), 3,12 (м, 1H), 2,97 (м, 2H), 2,58 (м, 2H), 2,39 (с, 3H), 2,10 (м, 2H), 1,28 (д, 6H).Trifluoroacetic acid (2.5 mL, 33 mmol) was added dropwise to a solution of tert-butyl 4-[tert-butoxycarbonyl-(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidin-1 -carboxylate (537 mg, 1.077 mmol) in DCM (12 ml). Stirred at room temperature. After 2 hours the mixture was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by elution with an SCX-2 cartridge with 10% DCM:MeOH followed by MeOH (2H NH3). The main fraction was evaporated under reduced pressure to give 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-7-amine (345 mg, 1.199 mmol) as a brownish solid. Mass spectrum (m/z): 274 (M+1). 1H NMR (400.13 MHz, DMSO): 7.82 (s, 1H), 7.23 (d, 1H), 6.08 (s, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.12 (m, 1H), 2.97 (m, 2H), 2.58 (m, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.10 (m, 2H), 1.28 (d, 6H) .

Получение 7. Синтез [(3S)-1-трет-бутоксикарбонилпирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилатаPreparation 7 Synthesis of [(3S)-1-tert-butoxycarbonylpyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate

Добавляли фосген (20 мас.% в толуоле, 348 мл, 485 г, 981 ммоль, 2,4 экв.) к раствору трет-бутил (3S)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксилата (76,5 г, 409 ммоль) в ТГФ (765 мл), помещенному в трехгорлую круглодонную колбу, соединенную с бутылкой-ловушкой, содержащей 32% водный раствор NH4OH, при 23°C в течение 1 ч. Барботировали N2 через данную смесь в течение 30 мин и упаривали под вакуумом. Растворяли остаток в ДХМ (757 мл), охлаждали до 0°C (внутренняя температура) и добавляли (медленное добавление в течение 7 мин) суспензию 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5a]пиримидин-7-амин дигидрохлорида (94,6 г, 273,2 ммоль) в ДХМ (756,8 мл), предварительно обработанную триэтиламином (228 мл, 166 г, 1639 ммоль, 6 экв.). После добавления удаляли охлаждающую баню и гасили реакционную смесь через 30 мин 35% водным раствором HCl (20 мл) и 1М водным раствором HCl (300 мл) (конечный рН 7). Отделяли органический слой, промывали водой (300 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (300 мл), сушили (MgSO4) и упаривали под вакуумом. Остаток растворяли (ок. 180 г) в ДХМ (1,5 л), добавляли тиоловую смолу SiliaMetS® (40-63 мкм; загрузка = 1,46 ммоль/г; 10 г, 14,6 ммоль, 140 экв. на основе содержания Pd) при температуре 23°C, а затем смесь нагревали до 40°C в течение 2 ч. Фильтровали, промывали смолу ДХМ (2x10 мл) и упаривали объединенные фильтраты под вакуумом с получением [(3S)-1-трет-бутоксикарбонил-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (129 г, 97%) в виде желтого твердого вещества. ИЭР/МС (m/z): 487 (M+H). 1H ЯМР ^-ДМСО) δ 1,28 (д, 6H), 1,40 (с, 9H), 1,65 (м, 2H), .1,88 (м, 2H), 1,96 (м, 1H), 2,07 (м, 1H), 2,46 (с, 3H), 2,90 (м, 2H), 3,31 (м, 5H), 3,89 (м, 1H), 4,02 (м, 2H), 5,10 (м, 1H), 6,32 (с, 1H), 8,01 (с, 1H).Phosgene (20 wt% in toluene, 348 ml, 485 g, 981 mmol, 2.4 eq.) was added to a solution of tert-butyl (3S)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxylate (76.5 g, 409 mmol) in THF (765 ml) placed in a three-necked round bottom flask connected to a catch bottle containing 32% aqueous NH4OH solution at 23°C for 1 h. N 2 was bubbled through this mixture for 30 min and evaporated under vacuum. Dissolve the residue in DCM (757 ml), cool to 0°C (internal temperature) and add (slow addition over 7 min) suspension of 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1.5a] pyrimidine-7-amine dihydrochloride (94.6 g, 273.2 mmol) in DCM (756.8 ml) pre-treated with triethylamine (228 ml, 166 g, 1639 mmol, 6 eq.). After the addition, the cooling bath was removed and the reaction mixture was quenched after 30 min with 35% aqueous HCl (20 ml) and 1M aqueous HCl (300 ml) (final pH 7). The organic layer was separated, washed with water (300 ml) and saturated aqueous NaCl (300 ml), dried (MgSO 4 ) and evaporated under vacuum. The residue was dissolved (ca. 180 g) in DCM (1.5 L), SiliaMetS® thiol resin (40-63 µm; loading = 1.46 mmol/g; 10 g, 14.6 mmol, 140 eq. based on content of Pd) at 23°C, and then the mixture was heated to 40°C for 2 hours. Filtered, washed the resin with DCM (2x10 ml) and evaporated the combined filtrates under vacuum to obtain pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (129 g, 97%) as a yellow solid. ESI/MS (m/z): 487 (M+H). 1 H NMR ^-DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 1.40 (s, 9H), 1.65 (m, 2H), .1.88 (m, 2H), 1.96 (m , 1H), 2.07 (m, 1H), 2.46 (s, 3H), 2.90 (m, 2H), 3.31 (m, 5H), 3.89 (m, 1H), 4 .02 (m, 2H), 5.10 (m, 1H), 6.32 (s, 1H), 8.01 (s, 1H).

Альтернативный способ синтеза [(3S)-1-трет-бутоксикарбонилпирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата.Alternative route for the synthesis of [(3S)-1-tert-butoxycarbonylpyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate.

Растворяли трет-бутил (3S)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксилат (438 г, 1,3 экв.) в ацетонитриле (4,4 л, 10,0 мл/г) при 15-30°C. Добавляли триэтиламин (595 мл, 4,5 экв.) и затем 4-нитрофенилхлорформиат (490 г, 1,4 экв.) при 15-30°C. Нагревали до 35-40°C и смесь перемешивали в течение 4 ч. Охлаждали до 15-25°C и добавляли 3-изопропил-5-метил-N-(пиперидин-4-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-7амин (500 г, 1,8 моль). Перемешивали при 15-30°C в течение 5 ч. Упаривали при пониженном давлении.Dissolve tert-butyl (3S)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxylate (438 g, 1.3 eq.) in acetonitrile (4.4 L, 10.0 ml/g) at 15-30°C. Triethylamine (595 ml, 4.5 eq) was added followed by 4-nitrophenyl chloroformate (490 g, 1.4 eq) at 15-30°C. Heated to 35-40°C and the mixture was stirred for 4 hours Cooled to 15-25°C and added 3-isopropyl-5-methyl-N-(piperidin-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine -7amine (500 g, 1.8 mol). Stirred at 15-30°C for 5 hours. Evaporated under reduced pressure.

- 12 039950- 12 039950

Добавляли 2-метилтетрагидрофуран (4,4 л, 10,0 мл/г), перемешивали и фильтровали. Фильтрат промывали последовательно 2М NaOH (1,1 л, 2,5 мл/г, 4 раза) и насыщенным водным раствором NaCl (4,4 л, 10,0 мл/г). Сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали при пониженном давлении. Добавляли изопропиловый спирт (2,2 л, 5 мл/г) с получением раствора указанного соединения (660 г, выход 75,4%).2-methyltetrahydrofuran (4.4 L, 10.0 ml/g) was added, stirred and filtered. The filtrate was washed successively with 2M NaOH (1.1 L, 2.5 ml/g, 4 times) and saturated aqueous NaCl (4.4 L, 10.0 ml/g). Dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure. Isopropyl alcohol (2.2 L, 5 ml/g) was added to give a solution of the title compound (660 g, 75.4% yield).

Получение 8. Синтез [(3S)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилатаPreparation 8. Synthesis of [(3S)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7yl)amino]piperidine-1-carboxylate

Добавляли соляную кислоту в 2-пропаноле (5,50 моль/л, 217 мл, 1190 ммоль, 5 экв.) к суспензии [(3S)-1-трет-бутоксикарбонилпирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (116 г, 239 ммоль) в 2-пропаноле (755 мл) при 23°C и смесь нагревали до 70°C в течение 90 мин. Охлаждали до 23°C и упаривали под вакуумом. Суспендировали остаток в ДХМ (1,5 л), добавляли 1М водный раствор NaOH (400 мл) и 50% водный раствор NaOH (100 мл). Перемешивали в течение 15 мин. Органическую фазу разделяли, сушили (MgSO4) и упаривали под вакуумом. Остаток суспендировали (ок. 131 г) в МТБЭ/гексане (2:1, 900 мл) и смесь перемешивали в течение 18 ч. Фильтровали, промывали отфильтрованное твердое вещество гексаном (2 х 100 мл) и сушили с получением [(3S)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат (82,7 г, выход 90%) в виде желтого твердого вещества. ИЭР/МС (m/z): 387 (M+H). 1H ЯМР (de-ДМСО) δ 1,28 (д, 6H), 1,60 (м, 3H), 1,88 (м, 3H), 2,40 (с, 3H), 2,75 (м, 2H), 2,91 (м, 4H), 3,13 (дк, 1H), 3,78 (м, 1H), 4,02 (м, 2H), 5,10 (м, 1H), 6,14 (с, 1H), 7,41 (д, 1H), 7,87 (с, 1H).Hydrochloric acid in 2-propanol (5.50 mol/l, 217 ml, 1190 mmol, 5 eq) was added to the suspension of [(3S)-1-tert-butoxycarbonylpyrrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl- 5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7yl)amino]piperidine-1-carboxylate (116 g, 239 mmol) in 2-propanol (755 ml) at 23°C and the mixture was heated to 70°C for 90 min. Cooled to 23°C and evaporated under vacuum. The residue was suspended in DCM (1.5 L), 1M NaOH aqueous solution (400 ml) and 50% NaOH aqueous solution (100 ml) were added. Stirred for 15 min. The organic phase was separated, dried (MgSO 4 ) and evaporated under vacuum. The residue was suspended (ca. 131 g) in MTBE/hexane (2:1, 900 ml) and the mixture was stirred for 18 hours. Filtered, washed the filtered solid with hexane (2 x 100 ml) and dried to give [(3S)- pyrrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (82.7 g, 90% yield) as yellow solid. ESI/MS (m/z): 387 (M+H). 1 H NMR (de-DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 1.60 (m, 3H), 1.88 (m, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.75 (m , 2H), 2.91 (m, 4H), 3.13 (dc, 1H), 3.78 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 5.10 (m, 1H), 6 .14 (s, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.87 (s, 1H).

Альтернативный способ синтеза [(3S)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5а]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата. Добавляли 5,5М соляную кислоту в изопропиловом спирте (8,4 л, 5,0 мл/г) в раствор изопропилового спирта, содержащий (8)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил 4-((3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7-ил)амино)пиперидин1-карбоксилат (819 г) при 20-30°C. Реакционную смесь нагревали до 50-60°C в течение 5 ч. Охлаждали до 30-35°C, добавляли МТБЭ (8,2 л, 10 мл/г) и перемешивали в течение 1 ч. Фильтровали, добавляли влажный осадок к водному раствору гидроксида натрия (3,0 экв.) при 0-5°C и перемешивали в течение 30 мин. Добавляли 2-метилтетрагидрофуран (8,2 л, 10,0 мл/г) и перемешивали. Экстрагировали органическую фазу и промывали насыщенным водным раствором NaCl. Сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали при пониженном давлении до 1-2 объемов. Добавляли МТБЭ (2,46 л, 3 мл/г) и перемешивали в течение 3 ч. Фильтровали с получением указанного соединения (550 г). 1H ЯМР (400 МГц,Alternative route for the synthesis of [(3S)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate. 5.5 M hydrochloric acid in isopropyl alcohol (8.4 L, 5.0 ml/g) was added to the isopropyl alcohol solution containing (8)-1-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl 4-((3- isopropyl 5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino)piperidine1-carboxylate (819 g) at 20-30°C. The reaction mixture was heated to 50-60°C for 5 h. Cooled to 30-35°C, MTBE (8.2 L, 10 ml/g) was added and stirred for 1 h. Filtered, wet cake was added to the aqueous solution sodium hydroxide (3.0 equiv.) at 0-5°C and stirred for 30 min. 2-methyltetrahydrofuran (8.2 L, 10.0 ml/g) was added and stirred. The organic phase was extracted and washed with saturated aqueous NaCl. Dried over sodium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure to 1-2 volumes. MTBE (2.46 L, 3 ml/g) was added and stirred for 3 hours. Filtered to give the title compound (550 g). 1H NMR (400 MHz,

CDCI3) δ 7,82 (с, 1H), 6,12 (д, J=8,1 Гц, 1H), 5,78 (с, 1H), 5,27 - 5,13 (м, 1H), 4,26 - 4,01 (м, 2H), 3,74 - 3,59 (м, 1H), 3,36 - 3,23 (м, 1H), 3,14 -2,98 (м, 5H), 2,90 (ддд, J=11,1, 8,4, 5,4 Гц, 1H), 2,52 (с, 3H), 2,18 - 2,00 (м, 3H), 1,87 (дд, J=12,6, 6,4 Гц, 1H), 1,76 (с, 1H), 1,66 - 1,52 (м, 2H), 1,34 (д, J=6,9 Гц, 6H).CDCI3) δ 7.82 (s, 1H), 6.12 (d, J=8.1 Hz, 1H), 5.78 (s, 1H), 5.27 - 5.13 (m, 1H), 4.26 - 4.01 (m, 2H), 3.74 - 3.59 (m, 1H), 3.36 - 3.23 (m, 1H), 3.14 -2.98 (m, 5H ), 2.90 (ddd, J=11.1, 8.4, 5.4 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.18 - 2.00 (m, 3H), 1, 87 (dd, J=12.6, 6.4 Hz, 1H), 1.76 (s, 1H), 1.66-1.52 (m, 2H), 1.34 (d, J=6, 9 Hz, 6H).

Альтернативный способ синтеза [(3S)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5а]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата.Alternative route for the synthesis of [(3S)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate.

Добавляли фосген (1,14 мл, 20 мас.% в толуоле, 3,20 ммоль) к холодному (0°C) раствору трет-бутил (3S)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксилата (500 мг, 2,67 ммоль) и ТЭА (0,37 мл, 2,6 ммоль) в ТГФ (13 мл). Холодную баню удаляли и смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 30 мин смесь упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в ДХМ (11 мл). Этот раствор добавляли к раствору 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-амина (C, 365 мг, 100 мас.%, 0,365 г) и ТЭА (0,3 мл) в ДХМ (11 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 10 мин добавляли насыщенный водный раствор NaHCO3 и еще экстрагировали ДХМ. Органические слои объединяли и промывали насыщенным водным раствором NaCl, сушили над сульфатом магния, фильтровали и упаривали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэшхроматографией (силикагель), элюируя смесью ДХМ:MeOH с получением [(3S)-1-третбутоксикарбонилпирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (671 мг) в виде желтоватого масла. Масс-спектр (m/z): 487 (M+1).Phosgene (1.14 ml, 20 wt% in toluene, 3.20 mmol) was added to a cold (0°C) solution of tert-butyl (3S)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxylate (500 mg, 2.67 mmol ) and TEA (0.37 ml, 2.6 mmol) in THF (13 ml). The cold bath was removed and the mixture was stirred at room temperature. After 30 min the mixture was evaporated under reduced pressure and the residue was dissolved in DCM (11 ml). This solution was added to a solution of 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-7-amine (C, 365 mg, 100 wt%, 0.365 g) and TEA ( 0.3 ml) in DCM (11 ml). The mixture was stirred at room temperature. After 10 minutes, saturated aqueous NaHCO 3 was added and further extracted with DCM. The organic layers were combined and washed with saturated aqueous NaCl, dried over magnesium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash chromatography (silica gel) eluting with DCM:MeOH to give [(3S)-1-tert-butoxycarbonylpyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl )amino]piperidine-1-carboxylate (671 mg) as a yellowish oil. Mass spectrum (m/z): 487 (M+1).

По каплям добавляли трифторуксусную кислоту (2 мл, 26,45 ммоль) к раствору [(3S)-1-третбутоксикарбонилпирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7-ил)амино]пи- 13 039950 перидин-1-карбоксилата (671 мг, 1,269 ммоль) в ДХМ (12 мл). Перемешивали при комнатной температуре. Через 18 ч смесь упаривали при пониженном давлении. Остаток растворяли в ДХМ и органическую фазу промывали 10% водным раствором K2CO3. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и упаривали при пониженном давлении с получением [(3S)-пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (274 мг, 0,6593 ммоль) в виде белой пены. Масс-спектр (m/z): 387 (M+1). 1H ЯМР (400,13 МГц, d6-ДМСО): 7,87 (с, 1H), 7,42 (д, J=9,0 Гц, 1H), 6,13 (с, 1H), 5,00 (ддд, J=9,0, 5,2, 2,5 Гц, 1H), 4,02 (м, 2H), 3,77 (м, 1H), 3,13 (м, 1H), 2,89 (м, 4H), 2,72 (м, 2H), 2,40 (с, 3H), 1,87 (дд, J=6,8, 14,1 Гц, 2H), 1,63 (м, 3H), 1,28 (д, J=6,8 Гц, 6H).Trifluoroacetic acid (2 ml, 26.45 mmol) was added dropwise to a solution of [(3S)-1-tert-butoxycarbonylpyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine-7 -yl)amino]pi-13039950 peridin-1-carboxylate (671 mg, 1.269 mmol) in DCM (12 ml). Stirred at room temperature. After 18 hours the mixture was evaporated under reduced pressure. The residue was taken up in DCM and the organic phase was washed with 10% aqueous K 2 CO 3 solution. The organic phase was dried over magnesium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure to give [(3S)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino] piperidine-1-carboxylate (274 mg, 0.6593 mmol) as a white foam. Mass spectrum (m/z): 387 (M+1). 1 H NMR (400.13 MHz, d 6 -DMSO): 7.87 (s, 1H), 7.42 (d, J=9.0 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5 .00 (ddd, J=9.0, 5.2, 2.5 Hz, 1H), 4.02 (m, 2H), 3.77 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 2.89 (m, 4H), 2.72 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 1.87 (dd, J=6.8, 14.1 Hz, 2H), 1.63 (m, 3H), 1.28 (d, J=6.8 Hz, 6H).

Получение 9. Синтез [(3R)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]nиримидин-7ил)амино]пиперидин-1-карбоксилатаPreparation 9. Synthesis of [(3R)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]n-pyrimidin-7yl)amino]piperidine-1-carboxylate

Добавляли фосфен (1,14 мл, 20 мас.% в толуоле, 3,20 ммоль) к холодному (0°C) раствору третбутил (3R)-3-гидроксипирролидин-1-карбоксилата (500 мг, 2,67 ммоль) и ТЭА (0,37 мл, 2,6 ммоль) в ТГФ (13 мл). Холодную баню удаляли и смесь перемешивали при комнатной температуре.Phosphene (1.14 mL, 20 wt% in toluene, 3.20 mmol) was added to a cold (0°C) solution of tert-butyl (3R)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxylate (500 mg, 2.67 mmol) and TEA (0.37 ml, 2.6 mmol) in THF (13 ml). The cold bath was removed and the mixture was stirred at room temperature.

Через 30 мин смесь упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в ДХМ (11 мл). Этот раствор добавляли к раствору 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-7амина (365 мг, 100 мас.%, 0,365 г) и ТЭА (0,3 мл) в ДХМ (11 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 10 мин добавляли насыщенный водный раствор NaHCO3 и еще экстрагировали ДХМ. Органические слои объединяли и промывали насыщенным водным раствором NaCl, сушили над сульфатом магния, фильтровали и упаривали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток очищали флэш-хроматографией (силикагель), элюируя смесью гексан:этилацетат с получением [(3R)-1-третбутоксикарбонилпирролидин-3 -ил] 4-[(3 -изопропил-5 -метилпиразоло [1,5-a] пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (350 мг) в виде желтоватого масла. Масс-спектр (m/z): 487 (M+1).After 30 min the mixture was evaporated under reduced pressure and the residue was dissolved in DCM (11 ml). This solution was added to a solution of 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-7amine (365 mg, 100 wt%, 0.365 g) and TEA (0.3 ml ) in DCM (11 ml). The mixture was stirred at room temperature. After 10 minutes, saturated aqueous NaHCO 3 was added and further extracted with DCM. The organic layers were combined and washed with saturated aqueous NaCl, dried over magnesium sulfate, filtered and evaporated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash chromatography (silica gel) eluting with hexane:ethyl acetate to give [(3R)-1-tert-butoxycarbonylpyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7 -yl)amino]piperidine-1-carboxylate (350 mg) as a yellowish oil. Mass spectrum (m/z): 487 (M+1).

По каплях добавляли трифторуксусную кислоту (0,8 мл, 0,72 ммоль) к раствору [(3R)-1-третбутоксикарбонилпирролидин-3 -ил] 4-[(3 -изопропил-5 -метилпиразоло [1,5-a] пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (350 мг, 0,72 ммоль) в ДХМ (7 мл). Перемешивали при комнатной температуре. Через 45 мин смесь упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали путем элюирования с помощью картриджа SCX-2 с 10% ДХМ:MeOH, затем MeOH (2 H NH3). Упаривали основную фракцию при пониженном давлении с получением [(3R)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (246 мг) в виде коричневатого твердого вещества. Масс-спектр (m/z): 387 (M+1).Trifluoroacetic acid (0.8 mL, 0.72 mmol) was added dropwise to a solution of [(3R)-1-tert-butoxycarbonylpyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine -7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (350 mg, 0.72 mmol) in DCM (7 mL). Stirred at room temperature. After 45 min the mixture was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by elution with an SCX-2 cartridge with 10% DCM:MeOH followed by MeOH (2 H NH 3 ). The main fraction was evaporated under reduced pressure to give [(3R)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (246 mg) as a brownish solid. Mass spectrum (m/z): 387 (M+1).

Получение 10. Синтез 3-изопропил-5-метил-4Н-пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-онаPreparation 10. Synthesis of 3-isopropyl-5-methyl-4H-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-one

Растворяли 4-изопропил-1H-пиразол-5-амин (2,2 кг, 17,6 моль) и этилацетат (2,86 кг, 1,25 экв.) в уксусной кислоте (17,6 л, 8,0 мл/г). Смесь нагревали до 110-115°C а затем охлаждали до 35-40°C. Добавляли гептан и МТБЭ (44 л, 20 мл/г, соотношение 5/1). Фильтровали и промывали твердое вещество гептаном (4,4 л, 2 мл/г) с получением указанного соединения (2,28 кг, выход 85,5%). 1H ЯМР (500 МГц, ДМСО) δ 11,81 (с, 1H), 7,77 (с, 1H), 5,50 (с, 1H), 3,08 - 3,05 (м, 1H), 2,31 (с, 3H), 1,22 (д, J=5,0 Гц, 6H).Dissolve 4-isopropyl-1H-pyrazol-5-amine (2.2 kg, 17.6 mol) and ethyl acetate (2.86 kg, 1.25 eq.) in acetic acid (17.6 L, 8.0 ml /G). The mixture was heated to 110-115°C and then cooled to 35-40°C. Heptane and MTBE (44 L, 20 ml/g, ratio 5/1) were added. Filter and wash the solid with heptane (4.4 L, 2 ml/g) to give the title compound (2.28 kg, 85.5% yield). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 11.81 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 5.50 (s, 1H), 3.08 - 3.05 (m, 1H), 2 .31 (s, 3H), 1.22 (d, J=5.0 Hz, 6H).

Получение 11. Синтез 7-хлор-3-изопроnил-5-метилпиразоло[1,5-a]nиримидинаPreparation 11. Synthesis of 7-chloro-3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]nirimidine

Растворяли 3-изопропил-5-метил-4Н-пиразоло[1,5-а]пиримидин-7-он (2,1 кг, 11,0 моль) и N,NDissolve 3-isopropyl-5-methyl-4H-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-one (2.1 kg, 11.0 mol) and N,N

- 14 039950 диметиланилин (0,86 кг, 0,65 экв.) В ацетонитриле (8,4 л, 4 мл/г). Реакционную смесь нагревали до 5055°C и по каплям добавляли POCl3 (4,2 кг, 2,5 экв.). Температуру регулировали до 60-65°C и смесь перемешивали в течение 9 ч. Смесь охлаждали до 25-30°C и выливали в 2М калий-фосфатный буфер (рН 8,0, 42 л, 20 мл/г). Добавляли МТБЭ (23,9 л, 11,4 мл/г) и экстрагировали органическую фазу. Органическую фазу промывали последовательно 20% раствором лимонной кислоты (4,2 л, 2,0 мл/г) дважды, 10% водным раствором NaHCO3 (10,5 л, 5,0 мл/г) и насыщенным водным раствором NaCl (10,5 л, 5,0 мл/г). Органическую фазу сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали при пониженном давлении с получением указанного соединения (1,8 кг, выход 78%). 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 8,02 (с, 1H), 6,75 (с, 1H), 3,27 3,25 (м, 1H), 2,58 (с, 3H), 1,42 (д, J=8,0 Гц, 6H).- 14 039950 dimethylaniline (0.86 kg, 0.65 equiv.) in acetonitrile (8.4 l, 4 ml/g). The reaction mixture was heated to 5055°C and POCl 3 (4.2 kg, 2.5 eq.) was added dropwise. The temperature was adjusted to 60-65° C. and the mixture was stirred for 9 hours. The mixture was cooled to 25-30° C. and poured into 2M potassium phosphate buffer (pH 8.0, 42 L, 20 ml/g). MTBE (23.9 L, 11.4 ml/g) was added and the organic phase was extracted. The organic phase was washed successively with 20% citric acid solution (4.2 L, 2.0 ml/g) twice, 10% aqueous NaHCO 3 solution (10.5 L, 5.0 ml/g) and saturated aqueous NaCl solution (10 .5 l, 5.0 ml/g). The organic phase was dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure to give the title compound (1.8 kg, 78% yield). 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 8.02 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 3.27 3.25 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 1.42 (d, J=8.0 Hz, 6H).

Получение 12. 3 -Изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло [1,5-a] пиримидин-7-аминPreparation 12 3-Isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-7-amine

Добавляли 3-изопропил-5-метил-N-(4-пиперидил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-амин дигидрохлорид (2,2 кг, 6,4 моль) к 1М водному раствору гидроксида натрия (19,2 л, 3,0 экв.) при 10-15°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 15-20 мин, затем добавляли 2-метилтетрагидрофуран (4,70 л, 10,0 экв.) и перемешивали в течение 20-25 мин. Органическую фазу отделяли и водную фазу промывали 2метилтетрагидрофураном (6,6 л, 3,0 мл/г, 3 раза). Объединяли органические растворы и промывали насыщенным водным раствором NaCl (11 л, 5,0 мл/г). Органическую фазу сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали при пониженном давлении. Добавляли МТБЭ (6,6 л, 3,0 мл/г) и перемешивали при 25-30°C в течение 40 мин. Фильтровали с получением указанного соединения (1,5 кг, выход 85,7%). 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 7,81 (с, 1H), 6,10 (д, J=8,0 Гц 1H), 5,75 (с, 1H), 3,59-3,54 (м, 1H), 3,32-3,28 (м, 1H), 3,22-3,19 (м, 2H), 2,77-2,73 (м, 2H), 2,51 (с, 3H), 2,11 (д, J=8,0 Гц, 2H), 1,56-1,50 (м, 3H), 1,34 (д, J=8,0 Гц, 6H).Added 3-isopropyl-5-methyl-N-(4-piperidyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-amine dihydrochloride (2.2 kg, 6.4 mol) to 1M aqueous sodium hydroxide (19, 2 L, 3.0 eq.) at 10-15°C. The reaction mixture was stirred for 15-20 minutes, then 2-methyltetrahydrofuran (4.70 L, 10.0 eq.) was added and stirred for 20-25 minutes. The organic phase was separated and the aqueous phase was washed with 2-methyltetrahydrofuran (6.6 L, 3.0 ml/g, 3 times). The organic solutions were combined and washed with saturated aqueous NaCl (11 L, 5.0 ml/g). The organic phase was dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure. MTBE (6.6 L, 3.0 ml/g) was added and stirred at 25-30° C. for 40 minutes. Filter to give the title compound (1.5 kg, 85.7% yield). 1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.81 (s, 1H), 6.10 (d, J=8.0 Hz 1H), 5.75 (s, 1H), 3.59-3.54 (m, 1H), 3.32-3.28 (m, 1H), 3.22-3.19 (m, 2H), 2.77-2.73 (m, 2H), 2.51 (s , 3H), 2.11 (d, J=8.0 Hz, 2H), 1.56-1.50 (m, 3H), 1.34 (d, J=8.0 Hz, 6H).

Пример 1. Синтез [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилата.Example 1 Synthesis of [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine -7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate.

[*Следует отметить, что, как показано здесь в примере 1, хиральный центр изменил ориентацию и форма S энантиомера представлена иначе, чем, как показано выше в примерах в формуле (II).] Добавляли гидрохлорид (E)-4-(диметиламино)бут-2-еновой кислоты (15,0 г, 90,3 ммоль, 1,2 экв.), N,Nдиизопропилэтиламин (31,3 мл, 23,4 г, 181 ммоль, 2,4 экв.) и HATU (42,9 г, 113 ммоль, 1,5 экв.) к суспензии [(3S)-nирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин1-карбоксилата (29,1 г, 75,3 ммоль) в ТГФ (146 мл) при 23°C и смесь перемешивали в течение 90 мин. Разбавляли фосфатным буфером (0,5М, рН 9, 150 мл), экстрагировали ДХМ (2 х 375 мл), сушили (MgSO4) и упаривали под вакуумом. Полученный остаток очищали (ок. 95 г) хроматографией (загружали остаток, растворенный в 65 мл ДХМ; 330 г SiO2; элюент: МТБЭ/7 H NH3 в MeOH от 0% до 10%; ТСХ: МТБЭ/7 H NH3 в MeOH 5:1). Материал растворяли (ок. 40 г) в ДХМ (400 мл), промывали 1М водным раствором K2HPO4 (1 M, 80 мл), сушили (MgSO4) и упаривали под вакуумом. Остаток очищали (ок. 38 г) хроматографией (загружали остаток, адсорбированный на SiO2 (50 г); 330 г SiO2; элюент: МТБЭ/7 HNH3 в MeOH от 0 до 10%) с получением [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (28,1 г, 75%) в виде белого твердого вещества. ИЭР/МС (m/z): 498 (M+H). 1H ЯМР (CD3OD) δ 1,33 (д, 6H), 1,64 (м, 2H), 2,10 (м, 2H), 2,18 (м, 1H), 2,26 (м, 1H), 2,29 (с, 6H), 2,50 (с, 3H), 3,11 (м, 2H), 3,18 (дд, 2H), 3,29 (дк, 1H), 3,70 (м, 3H), 3,87 (м, 2H), 4,14 (м, 2H), 5,31 (м, 1H), 6,12 (с, 1H), 6,47 (м, 1H), 6,86 (м, 1H), 7,88 (с, 1H).[*It should be noted that, as shown here in Example 1, the chiral center changed orientation and the S form of the enantiomer is represented differently than as shown in the examples in formula (II) above.] Hydrochloride (E)-4-(dimethylamino) was added but-2-enoic acid (15.0 g, 90.3 mmol, 1.2 eq.), N,Ndiisopropylethylamine (31.3 ml, 23.4 g, 181 mmol, 2.4 eq.) and HATU ( 42.9 g, 113 mmol, 1.5 eq.) to a suspension of [(3S)-pirrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl )amino]piperidine 1-carboxylate (29.1 g, 75.3 mmol) in THF (146 ml) at 23° C. and the mixture was stirred for 90 min. Dilute with phosphate buffer (0.5M, pH 9, 150 ml), extract with DCM (2 x 375 ml), dry (MgSO 4 ) and evaporate in vacuo. The resulting residue was purified (ca. 95 g) by chromatography (charged the residue dissolved in 65 ml DCM; 330 g SiO 2 ; eluent: MTBE/7 H NH 3 in MeOH from 0% to 10%; TLC: MTBE/7 H NH 3 in MeOH 5:1). The material was dissolved (ca. 40 g) in DCM (400 ml), washed with 1M aqueous K 2 HPO 4 (1 M, 80 ml), dried (MgSO 4 ) and evaporated in vacuo. The residue was purified (ca. 38 g) by chromatography (loaded residue adsorbed on SiO 2 (50 g); 330 g SiO 2 ; eluent: MTBE/7 HNH 3 in MeOH 0 to 10%) to give [(3S)-1 -[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidin-1 -carboxylate (28.1 g, 75%) as a white solid. ESI/MS (m/z): 498 (M+H). 1H NMR (CD 3 OD) δ 1.33 (d, 6H), 1.64 (m, 2H), 2.10 (m, 2H), 2.18 (m, 1H), 2.26 (m, 1H), 2.29 (s, 6H), 2.50 (s, 3H), 3.11 (m, 2H), 3.18 (dd, 2H), 3.29 (dc, 1H), 3, 70 (m, 3H), 3.87 (m, 2H), 4.14 (m, 2H), 5.31 (m, 1H), 6.12 (s, 1H), 6.47 (m, 1H ), 6.86 (m, 1H), 7.88 (s, 1H).

- 15 039950- 15 039950

[a]D20=+49,9° (C=2,0, MeOH). Энантиомерный избыток (ее) = 97%. Rt (время удерживания)=2,79 мин (УФ); ЖХ Колонка: CHIRALPAK® AS (4,6 х 150 мм, 5 мкм); MeOH + 0,2% ДМЭА; Скорость потока: 1,0 мл/мин.[a]D 20 =+49.9° (C=2.0, MeOH). Enantiomeric excess (ee) = 97%. R t (retention time)=2.79 min (UV); LC Column: CHIRALPAK® AS (4.6 x 150 mm, 5 µm); MeOH + 0.2% DMEA; Flow rate: 1.0 ml/min.

Альтернативный способ синтеза [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата.Alternative route for the synthesis of [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl] 7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate.

Добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,36 мл, 2,1 ммоль) к раствору [(3S)-пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (170 мг, 0,4091 ммоль), гидрохлорида (E)-4-(диметиламино)бут-2-еновой кислоты (135 мг, 0,81512 ммоль) и HATU (317 мг, 0,8181 ммоль) в N,N-диметилформамиде (4 мл). Перемешивали при комнатной температуре. Через 5 мин смесь упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью картриджа SCX-2, элюируя 10% ДХМ:MeOH, затем MeOH (2H NH3). Упаривали основную фракцию при пониженном давлении и остаток очищали с помощью ISCO™ обращенно-фазовой Claricep C-series элюируя смесью NH4CO3 pH 9/ACN с получением [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-кαрбоксилата (129 мг, 0,255 ммоль) в виде белого твердого вещества. Масс-спектр (m/z): 498 (M+1). 1H ЯМР (400,13 МГц, MeOD): 7,88 (с, 1H), 6,85 (м, 1H), 6,47 (м, 1H), 6,12 (с, 1H), 3,91-3,52 (м, 5H), 3,13 (м, 1H), 3,03 (м, 2H), 2,94 (м, 1H), 2,39 (с, 3H), 2,15 (с, 6H), 2,06 (м, 1H), 1,88 (д, J=11,5 Гц, 2H), 1,66 (м, 2H), 1,28 (д, J=6,8 Гц, 6H).N,N-diisopropylethylamine (0.36 mL, 2.1 mmol) was added to a solution of [(3S)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7- yl)amino]piperidine-1-carboxylate (170mg, 0.4091mmol), (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic acid hydrochloride (135mg, 0.81512mmol) and HATU (317mg, 0.8181 mmol) in N,N-dimethylformamide (4 ml). Stirred at room temperature. After 5 minutes the mixture was evaporated under reduced pressure. The residue was purified with an SCX-2 cartridge eluting with 10% DCM:MeOH followed by MeOH (2H NH3). The major fraction was evaporated under reduced pressure and the residue was purified with an ISCO™ reverse phase Claricep C-series eluting with NH 4 CO 3 pH 9/ACN to give [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but -2-enoyl]pyrrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl-5methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidin-1-carboxylate (129 mg, 0.255 mmol) as white solid. Mass spectrum (m/z): 498 (M+1). 1H NMR (400.13 MHz, MeOD): 7.88 (s, 1H), 6.85 (m, 1H), 6.47 (m, 1H), 6.12 (s, 1H), 3.91 -3.52(m, 5H), 3.13(m, 1H), 3.03(m, 2H), 2.94(m, 1H), 2.39(s, 3H), 2.15( s, 6H), 2.06 (m, 1H), 1.88 (d, J=11.5 Hz, 2H), 1.66 (m, 2H), 1.28 (d, J=6.8 Hz, 6H).

Альтернативный способ синтеза [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата.Alternative route for the synthesis of [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl] 7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate.

Растворяли [(3S)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат (550 г, 1,4 моль) в ТГФ (5,5 л, 10,0 мл/г) при 15-30°C. Добавляли гидрохлорид (E)-4-(диметиламино)бут-2-еновой кислоты (278 г, 1,2 экв.) и ТЭА (1,17 л, 6,0 экв.) при 15-30°C и перемешивали в течение 40 мин. Добавляли 50% пропилфосфонового ангидрида в EtOAc (1,68 л, 1,2 экв.) при 15-30°C и перемешивали в течение 12 ч. Фильтровали и заменяли растворитель фильтрата на изопропилацетат при пониженном давлении. Добавляли 2М водный раствор NaOH (2,75 л, 5 мл/г) и перемешивали при 25-30°C в течение 20 мин. Экстрагировали органическую фазу и промывали насыщенным водным раствором NaCl (2,75 л, 5 мл/г). Сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали при пониженном давлении. Добавляли гептан (3,85 л, 7 мл/г) и ТГФ (16,5 л, 3 мл/г) при 15-30°C. Перемешивали в течение 1 ч и фильтровали с получением указанного соединения (440 г, выход 63,2%). 1H ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ 7,86 (с, 1H), 6,83 (д, J=10,7 Гц, 1H), 6,43 (дд, J=34,3, 14,9 Гц, 1H), 6,08 (с, 1H), 5,26 (д, J=24,2 Гц, 1H), 4,85 (с, 2H), 4,22 - 4,01 (м, 2H), 3,90 - 3,76 (м, 2H), 3,61 -3,47 (м, 1H), 3,36 - 3,21 (м, 2H), 3,17 3,11 (м, 2H), 3,12 - 2,98 (м, 2H), 2,47 (с, 3H), 2,28 -2,21 (м, 7H), 2,16 - 2,00 (м, 3H), 1,68 - 1,48 (м, 2H), 1,30 (д, J=6,2 Гц, 6H).Dissolved [(3S)-pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (550 g, 1.4 mol) in THF (5.5 L, 10.0 ml/g) at 15-30°C. (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic acid hydrochloride (278 g, 1.2 eq.) and TEA (1.17 L, 6.0 eq.) were added at 15-30°C and stirred in within 40 min. Add 50% propylphosphonic anhydride in EtOAc (1.68 L, 1.2 eq.) at 15-30° C. and stir for 12 hours. Filter and change the filtrate solvent to isopropyl acetate under reduced pressure. 2M NaOH aqueous solution (2.75 L, 5 ml/g) was added and stirred at 25-30° C. for 20 min. The organic phase was extracted and washed with saturated aqueous NaCl (2.75 L, 5 ml/g). Dried over Na2SO4, filtered and evaporated under reduced pressure. Heptane (3.85 L, 7 ml/g) and THF (16.5 L, 3 ml/g) were added at 15-30°C. Stirred for 1 h and filtered to give the title compound (440 g, 63.2% yield). 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.86 (s, 1H), 6.83 (d, J=10.7 Hz, 1H), 6.43 (dd, J=34.3, 14.9 Hz , 1H), 6.08 (s, 1H), 5.26 (d, J=24.2 Hz, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.22 - 4.01 (m, 2H) , 3.90 - 3.76 (m, 2H), 3.61 - 3.47 (m, 1H), 3.36 - 3.21 (m, 2H), 3.17 3.11 (m, 2H ), 3.12 - 2.98 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.28 - 2.21 (m, 7H), 2.16 - 2.00 (m, 3H), 1.68 - 1.48 (m, 2H), 1.30 (d, J=6.2 Hz, 6H).

Пример 2. Синтез [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5метилпиразоло [ 1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилат гидрохлоридаExample 2 Synthesis of [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine -7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate hydrochloride

[*Следует отметить, что, как показано здесь в примере 2, хиральный центр изменил ориентацию и форма S энантиомера представлена иначе, чем, как показано выше в примерах в формуле (II).] Добавляли HCl (1M в EtOAc (0,589 мл, 0,590 г, 0,589 ммоль, 1,07 экв.) к раствору [(зS)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил] пирролидин-3 -ил][*It should be noted that, as shown here in Example 2, the chiral center has changed orientation and the S form of the enantiomer is represented differently than as shown in the examples in formula (II) above.] HCl (1M in EtOAc (0.589 ml, 0.590 g, 0.589 mmol, 1.07 eq.) to a solution of [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]

4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)ами но]пиперидин-1-карбоксилата (0,283 г, 0,549 ммоль) в ацетоне (5,5 мл) при 23°C и смесь перемешивали в течение 5 ч. Упаривали при пониженном давлении с получением [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2еноил] пирролидин-3 -ил] 4-[(3 -изопропил-5-метилпиразоло [ 1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 карбоксилат гидрохлорида (0,244 г, 81%) в виде белого твердого вещества. ИЭР/МС (m/z): 498 (M+H).4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (0.283 g, 0.549 mmol) in acetone (5.5 ml) at 23° C and the mixture was stirred for 5 hours. Evaporated under reduced pressure to give [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl- 5-Methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1 carboxylate hydrochloride (0.244 g, 81%) as a white solid. ESI/MS (m/z): 498 (M+H).

1H ЯМР (CD3OD) δ 1,34 (д, 6H), 1,66 (м, 2H), 2,11 (м, 2H), 2,20 (м, 1H), 2,30 (м, 1H), 2,54 (с, 3H), 2,90 (с, 6H), 3,12 (м, 2H), 3,28 (дк, 1H), 3,74 (м, 4H), 3,95 (дд, 2H), 4,16 (м, 2H), 4,63 (м, 1H), 5,32 (м, 1H), 6,22 (с, 1H), 6,78 (м, 2H), 7,94 (с, 1H). 1 H NMR (CD3OD) δ 1.34 (d, 6H), 1.66 (m, 2H), 2.11 (m, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.30 (m, 1H ), 2.54 (s, 3H), 2.90 (s, 6H), 3.12 (m, 2H), 3.28 (dc, 1H), 3.74 (m, 4H), 3.95 (dd, 2H), 4.16 (m, 2H), 4.63 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 6.22 (s, 1H), 6.78 (m, 2H) , 7.94 (s, 1H).

Пример 3. Синтез [(3R)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5метилпиразоло [ 1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилатаExample 3 Synthesis of [(3R)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine -7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate

- 16 039950- 16 039950

(III)*(III)*

[*Следует отметить, что, как показано здесь в примере 3, хиральный центр изменил ориентацию и форма R энантиомера представлена иначе, чем, как показано выше в примерах в формуле (III).] Добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,4 мл, 2,0 ммоль) к раствору [(3R)-пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (170 мг, 0,43 ммоль), гидрохлорида (E)-4-(диметиламино)бут-2-еновой кислоты (150 мг, 0,90 ммоль) и HATU (343 мг, 0,87 ммоль) в ДМФА (4 мл). Перемешивали при комнатной температуре. Через 5 мин смесь упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали путем элюирования с помощью картриджа SCX-2 с 10% ДХМ:MeOH, затем MeOH (2H NH3). Упаривали основную фракцию при пониженном давлении и остаток очищали с помощью ISCO™ обращенно-фазовой Claricep C-series элюируя смесью NH4CO3 pH 9/ACN с получением [(3R)-1-[(E)-4-(диметuламuно)бут-2-еноил]пuрролидин-3-ил] 4-[(3-изопроnил-5-метилпиразоло[1,5-a]пuримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата (188 мг) в виде белого твердого вещества. Масс-спектр (m/z): 498 (M+1).[*It should be noted that, as shown here in Example 3, the chiral center changed orientation and the R form of the enantiomer is represented differently than as shown in the examples in formula (III) above.] N,N-diisopropylethylamine (0.4 ml , 2.0 mmol) to a solution of [(3R)-pyrrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl-5methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (170 mg, 0.43 mmol), (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic acid hydrochloride (150 mg, 0.90 mmol) and HATU (343 mg, 0.87 mmol) in DMF (4 mL) . Stirred at room temperature. After 5 minutes the mixture was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by elution with an SCX-2 cartridge with 10% DCM:MeOH followed by MeOH (2H NH 3 ). The major fraction was evaporated under reduced pressure and the residue was purified with an ISCO™ reverse phase Claricep C-series eluting with NH4CO3 pH 9/ACN to give [(3R)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2- enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (188 mg) as a white solid. Mass spectrum (m/z): 498 (M+1).

1H ЯМР (400,21 МГц, ДМСО): 7,86 (с, 1H), 7,41 (м, 1H), 6,63 (м, 1H), 6,37 (м, 1H), 6,13 (с, 1H), 5,16 (м, 1H), 4,09-3,92 (м, 2H), 3,78 (м, 2H), 3,56 (м, 2H), 3,13(м, 1H), 3,03 (м, 2H), 2,93 (м, 1H), 2,39 (с, 3H), 2,14 (с, 6H), 2,06 (м, 1H) 1,88 (м, 2H), 1,60 (м, 2H), 1,28 (д, J=6,8 Гц, 6H). 1 H NMR (400.21 MHz, DMSO): 7.86 (s, 1H), 7.41 (m, 1H), 6.63 (m, 1H), 6.37 (m, 1H), 6, 13 (s, 1H), 5.16 (m, 1H), 4.09-3.92 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.13 (m, 1H), 3.03 (m, 2H), 2.93 (m, 1H), 2.39 (s, 3H), 2.14 (s, 6H), 2.06 (m, 1H) 1.88 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.28 (d, J=6.8 Hz, 6H).

Пример 4. Синтез кристаллического [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-uл] 4[(3 -изопропил-5 -метилпиразоло [1,5-a] пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилат геми-эдизилат гидратаExample 4 Synthesis of crystalline [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-ul]4[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a ]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate hemi-edisylate hydrate

(II)*(II)*

[*Следует отметить, что, как показано здесь в примере 4, хиральный центр изменил ориентацию и форма S энантиомера представлена иначе, чем, как показано выше в примерах в формуле (II).] Помещали 2,0 г [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4- [(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5a]пирuмuдин-7-uл)амино]пиперидин-1-карбоксuлата в 8 мл ацетона при комнатной температуре при перемешивании магнитной мешалкой. В отдельном флаконе растворяли 505 мг гидрата 1,2-этандисульфоновой кислоты в 6 мл ацетона. Добавляли раствор кислоты к раствору свободного основания и перемешивали при комнатной температуре. Перемешивали образец так, чтобы смешивание было тщательным, добавляя дополнительный растворитель для разбавления суспензии, если это необходимо. Суспендировали в течение ночи при 50°C. После перемешивания в течение ночи оставшуюся густую суспензию белого твердого вещества охлаждали до 20°C. Выделяли твердые вещества путем вакуумной фильтрации на фильтровальной бумаге и полученный осадок белого твердого продукта сразу сушили на фильтре (2,1 г, выход 88%).[*It should be noted that, as shown here in Example 4, the chiral center changed orientation and the S form of the enantiomer is presented differently than as shown in the examples in formula (II) above.] 2.0 g of [(3S)-1 -[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5a]pyrumidin-7-yl)amino]piperidine-1 -carboxylate in 8 ml of acetone at room temperature with stirring with a magnetic stirrer. In a separate vial, 505 mg of 1,2-ethanedisulfonic acid hydrate was dissolved in 6 ml of acetone. The acid solution was added to the free base solution and stirred at room temperature. Mix the sample so that the mixing is thorough, adding additional solvent to dilute the suspension if necessary. Suspended overnight at 50°C. After stirring overnight, the remaining thick suspension of white solid was cooled to 20°C. The solids were isolated by vacuum filtration on filter paper and the resulting white solid precipitate was immediately dried on the filter (2.1 g, 88% yield).

Диаграммы РПД кристаллического твердого вещества получали на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavor, оснащенном источником CuKa (λ = 1,54060 А) и детектором Vantec, работающем при 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали от 4 до 40° 2Θ с шагом 0,008° 2Θ и скоростью сканирования 0,5 c/шаг, и с дивергенцией 0,6 мм, с неподвижной 5,28 мм антирассеивающей и 9,5 мм детекторной щелями. Сухой порошок упаковывали в кварцевый держатель образца и обеспечивали гладкую поверхность с помощью предметного стекла. Диаграммы дифракции кристаллической формы получали при комнатной температуре и относительной влажности. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности дифракционных пиковRPD diagrams of the crystalline solid were obtained on a Bruker D4 Endeavor X-ray powder diffractometer equipped with a CuKa source (λ = 1.54060 A) and a Vantec detector operating at 35 kV and 50 mA. The sample was scanned from 4 to 40° 2Θ with a step of 0.008° 2Θ and a scan rate of 0.5 s/step, and with a divergence of 0.6 mm, with a fixed 5.28 mm anti-scatter and 9.5 mm detector slits. The dry powder was packed in a quartz sample holder and a smooth surface was provided with a glass slide. Crystalline diffraction patterns were obtained at room temperature and relative humidity. It is well known in the field of crystallography that for any given crystal form, the relative intensities of the diffraction peaks

- 17 039950 могут варьироваться вследствие предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология и структура кристалла. Если присутствует влияние предпочтительной ориентации, интенсивности пиков изменяются, но характерные положения пиков полиморфа остаются неизменными. См., например, фармакопею США № 23, национальный формуляр № 18, стр. 1843-1844, 1995. Дополнительно, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной формы кристалла угловые положения пиков могут незначительно изменяться. Например, положения пиков смещаются из-за изменения температуры или влажности, при которой анализируется образец, смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В данном случае изменчивость положения пика в ± 0,2 2Θ учитывает эти потенциальные изменения, не мешая однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы сделано на основе любой уникальной комбинации отличительных пиков (в единицах ° 2θ), как правило, более выступающих пиков. Диаграммы дифракции кристаллической формы, записанные при комнатной температуре и относительной влажности, корректировали по стандартным пикам NIST 675 при 8,853 и 26,774° 2θ.- 17 039950 may vary due to the preferred orientation due to factors such as morphology and crystal structure. If the influence of the preferred orientation is present, the peak intensities change, but the characteristic peak positions of the polymorph remain unchanged. See, for example, USP No. 23, National Formulary No. 18, pp. 1843-1844, 1995. Additionally, it is also well known in the art of crystallography that, for any given crystal shape, peak angular positions may vary slightly. For example, peak positions shift due to a change in temperature or humidity at which the sample is analyzed, sample displacement, or the presence or absence of an internal standard. In this case, the variability of the peak position in ± 0.2 2Θ takes into account these potential changes, without interfering with the unambiguous identification of the indicated crystalline form. Crystal form confirmation is made based on any unique combination of distinctive peaks (in units of °2θ), usually more prominent peaks. Crystal form diffraction patterns recorded at room temperature and relative humidity were corrected for standard NIST 675 peaks at 8.853 and 26.774° 2θ.

Полученный образец кристаллического геми-эдизилат гидрата характеризовали диаграммой РПД, используя излучение CuKa, как имеющий пики дифракции (значения 2θ), описанные в таблице ниже, и, в частности, имеющий пик при 18,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 21,5°, 16,7° и 15,2°; с допуском для углов дифракции 0,2°.The resulting crystalline hemi-edisylate hydrate sample was characterized by an RPD pattern using CuKa radiation as having the diffraction peaks (2θ values) described in the table below, and in particular having a peak at 18.5° in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 21.5°, 16.7° and 15.2°; with a tolerance for diffraction angles of 0.2°.

Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического геми-эдизилат гидратаX-ray powder diffraction peaks of crystalline hemi-edisylate hydrate

Пример 5. Синтез кристаллического [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4[(3 -изопропил-5-метилпиразоло [ 1,5-а]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилат безилатаExample 5 Synthesis of crystalline [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a ]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate besylate

[*Следует отметить, что, как показано здесь в примере 5, хиральный центр изменил ориентацию и форма S энантиомера представлена иначе, чем как показано выше в примерах в формуле (II).] Помещали 1998 мг [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата в 15 мл ацетона при перемешивании при 1000 об/мин при комнатной температуре. Добавляли 650 мг бензолсульфоновой кислоты (растворенной в 5 мл ацетона). Перемешивали образец при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа, и через некоторое время раствор становился мутным и образовывалась густая суспензия белого твердого вещества. Выделяли белое твердое вещество выделяли путем вакуумного фильтрования на фильтровальной бумаге. Сушили образец в вакуумной печи в течение 1 ч при 70°C (2,23 г, выход 85%).[*It should be noted that, as shown here in Example 5, the chiral center changed orientation and the S form of the enantiomer is presented differently than as shown in the examples in formula (II) above.] 1998 mg of [(3S)-1-[( E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidin-1- carboxylate in 15 ml of acetone with stirring at 1000 rpm at room temperature. 650 mg benzenesulfonic acid (dissolved in 5 ml acetone) was added. The sample was stirred at 1000 rpm at room temperature for one hour and after a while the solution became cloudy and a thick suspension of white solid formed. A white solid was isolated by vacuum filtration on filter paper. Dry the sample in a vacuum oven for 1 hour at 70°C (2.23 g, 85% yield).

Синтез кристаллического [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат безилата.Synthesis of crystalline [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl] 4-[(3isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7 -yl)amino]piperidine-1-carboxylate besylate.

- 18 039950- 18 039950

Растворяли [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат (440 г, 1,1 моль) в EtOAc (1,4 л) и ацетоне (357 мл) при 15-30°C. Нагревали до 50-55°C. Растворяли моногидрат бензолсульфоновой кислоты (156 г, 0,89 экв.) в EtOAc (709 мл) и ацетоне (166 мл) и добавляли к реакционной смеси при 5-10 мл/мин при 50-55°C. Перемешивали в течение 1 ч. Охлаждали до 15-30°C и перемешивали в течение 12 ч. Фильтровали и сушили влажный осадок в атмосфере азота с получением указанного соединения (525 г, выход 72,9%). 1H ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ 7,89 (с, 1H), 7,85 - 7,79 (м, 2H), 7,43- 7,39 (м, 3H), 6,82 - 6,66 (м, 2H), 6,15 (с, 1H), 5,27 (д, J=21,5 Гц, 1H), 4,11 (д, J=32,9 Гц, 2H), 3,94 - 3,79 (м, 4H), 3,33- 3,18 (м, 2H), 3,10-2,97 (м, 2H), 2,84 (с, 6H), 2,49 (с, 3H), 2,25- 1,94 (м, 5H), 1,68 - 1,51 (м, 2H), 1,31 (д, J=6,8 Гц, 6H).[(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin- 7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate (440 g, 1.1 mol) in EtOAc (1.4 L) and acetone (357 ml) at 15-30°C. Heated to 50-55°C. Benzenesulfonic acid monohydrate (156 g, 0.89 eq) was dissolved in EtOAc (709 ml) and acetone (166 ml) and added to the reaction mixture at 5-10 ml/min at 50-55°C. Stir for 1 hour. Cool to 15-30° C. and stir for 12 hours. Filter and dry the wet cake under nitrogen to give the title compound (525 g, 72.9% yield). 1 H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.89 (s, 1H), 7.85-7.79 (m, 2H), 7.43-7.39 (m, 3H), 6.82-6 .66 (m, 2H), 6.15 (s, 1H), 5.27 (d, J=21.5 Hz, 1H), 4.11 (d, J=32.9 Hz, 2H), 3 .94-3.79(m, 4H), 3.33-3.18(m, 2H), 3.10-2.97(m, 2H), 2.84(s, 6H), 2.49 (s, 3H), 2.25-1.94 (m, 5H), 1.68-1.51 (m, 2H), 1.31 (d, J=6.8 Hz, 6H).

Получали диаграммы РПД кристаллического твердого вещества, по существу, как описано в примере 4. Полученный образец кристаллического безилата характеризовали диаграммой РПД, используя излучение CuKa, как имеющий пики дифракции (значения 2θ), описанные в таблице ниже, и, в частности, имеющий пик при 21,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, состоящей из 12,4, 17,3 и 15,8°; с допуском для углов дифракции 0,2°.The RPD patterns of the crystalline solid were obtained essentially as described in Example 4. The resulting crystalline besylate pattern was characterized by the RPD pattern using CuKa radiation as having the diffraction peaks (2θ values) described in the table below, and in particular having a peak at 21.5° in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 12.4, 17.3 and 15.8°; with a tolerance for diffraction angles of 0.2°.

Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического безилатаX-ray powder diffraction peaks of crystalline besylate

Пример 6. Синтез кристаллического [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4[(3-изопропил-5-метилпиразоло [1,5-a] пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1 -карбоксилат гидрохлоридаExample 6 Synthesis of crystalline [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl] 4[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a ]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1-carboxylate hydrochloride

[*Следует отметить, что, как показано здесь в примере 6, хиральный центр изменил ориентацию и форма S энантиомера представлена иначе, чем, как показано выше в примерах в формуле (II).] Помещали 557 мг [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1-карбоксилата в 4 мл ацетона при перемешивании при 1000 об/мин при комнатной температуре. Добавляли 1200 мкл HCl (1M в этилацетате, 1,07 экв.). Перемешивали образец при 1000 об/мин в течение ночи с получением густой суспензии белого твердого вещества. Выделяли белое твердое вещество выделяли путем вакуумного фильтрования на фильтровальной бумаге. Полученный осадок белого твердого продукта сразу сушили на фильтре в токе воздуха в течение 10 мин (385 мг, выход 64%).[*It should be noted that, as shown here in Example 6, the chiral center changed orientation and the S form of the enantiomer is presented differently than as shown in the examples in formula (II) above.] 557 mg of [(3S)-1-[ (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidin-1 -carboxylate in 4 ml of acetone with stirring at 1000 rpm at room temperature. 1200 μl HCl (1M in ethyl acetate, 1.07 eq.) was added. Stir the sample at 1000 rpm overnight to give a thick slurry of white solid. A white solid was isolated by vacuum filtration on filter paper. The resulting white solid precipitate was immediately dried on the filter in a stream of air for 10 min (385 mg, 64% yield).

Получали диаграммы РПД кристаллического твердого вещества, по существу, как описано в примере 4. Полученный образец кристаллического гидрохлорид гидрата характеризовали диаграммой РПД, используя излучение CuKa, как имеющий пики дифракции (значения 2θ), описанные в таблице ниже, и, в частности, имеющий пик при 18,9° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы,RPD patterns of the crystalline solid were obtained essentially as described in Example 4. The resulting crystalline hydrochloride hydrate sample was characterized by the RPD pattern using CuKa radiation as having the diffraction peaks (2θ values) described in the table below, and in particular having a peak at 18.9° in combination with one or more peaks selected from the group,

- 19 039950 состоящей из 5,5, 15,5 и 9,7°; с допуском для углов дифракции 0,2°.- 19 039950 consisting of 5.5, 15.5 and 9.7°; with a tolerance for diffraction angles of 0.2°.

Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического гидрохлоридаX-ray powder diffraction peaks of crystalline hydrochloride

Кристаллический Гидрохлорид Crystalline Hydrochloride Пик Peak Угол (°2-тета) +/- 0,2° Angle (°2-theta) +/- 0.2° Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика) Relative intensity (% of most intense peak) 1 one 5,5 5.5 79,40 % 79.40% 2 2 6,2 6.2 54,40 % 54.40% 3 3 9,2 9.2 31,50% 31.50% 4 4 9,7 9.7 56,10% 56.10% 5 5 И,1 I,1 26,70 % 26.70% 6 6 14,2 14.2 29,80 % 29.80% 7 7 15,5 15.5 61,70% 61.70% 8 eight 18,9 18.9 100,00% 100.00% 9 nine 19,5 19.5 30,80 % 30.80% 10 ten 23,4 23.4 40,40 % 40.40%

Биологические анализы.biological analyses.

Следующие анализы демонстрируют, что соединение по данному изобретению является ингибитором активности CDK7. Результаты данных анализов также показывают, что соединение по данному изобретению ингибирует сигнальную систему CDK7 в раковых клетках. Кроме того, соединение по данному изобретению ингибирует пролиферацию в раковых клеточных линиях и рост опухоли в модели ксенотрансплантата опухоли.The following assays demonstrate that the compound of this invention is an inhibitor of CDK7 activity. The results of these assays also show that the compound of this invention inhibits the CDK7 signaling system in cancer cells. In addition, the compound of this invention inhibits proliferation in cancer cell lines and tumor growth in a tumor xenograft model.

IC50 относится к концентрации агента, которая вызывает 50% максимального ингибирующего ответа, возможного для данного агента, или, альтернативно, к концентрации агента, которая вызывает 50% вытеснение специфического связывания лиганда с рецептором; Относительные значения IC50 определяли, используя единицу флуоресценции, путем расчета процентного ингибирования по отношению к встроенным контрольным лункам MIN и МАХ, а затем аппроксимировали данные ответа на дозу из десяти точек в логистическое уравнение с четырьмя параметрами.IC50 refers to the concentration of an agent that causes 50% of the maximum inhibitory response possible for that agent, or alternatively, the concentration of the agent that causes 50% displacement of specific ligand binding to the receptor; Relative IC50 values were determined using the unit of fluorescence by calculating percent inhibition relative to the MIN and MAX built-in control wells, and then fitting the ten-point dose response data into a four-parameter logistic equation.

Анализы активности киназы CDK7 и CDK9.Assays for CDK7 and CDK9 kinase activity.

Цель данного анализа заключается в измерении способности соединения по данному изобретению ингибировать киназную активность комплекса CDK7/циклин H/Mat1. Чтобы продемонстрировать, проявляют ли соединения, включенные в данное изобретение, какое-либо сродство к CDK7, CDK7 и CDK9, биохимические анализы проводили без предварительной инкубации фермента с указанным соединением или с предварительной предварительной инкубацией в течение 3 ч. Функциональные анализы подтверждают, проявляют ли соединения по данному изобретению способность ингибировать активности киназ CDK7 и CDK9. Все лиганды, растворители и реагенты, используемые в следующих анализах, легкодоступны из коммерческих источников или могут быть легко синтезированы специалистом в данной области техники. Определение IC50 для CDK7 и CDK9 определяли следующим образом.The purpose of this assay is to measure the ability of a compound of the invention to inhibit the kinase activity of the CDK7/cyclin H/Mat1 complex. To demonstrate whether the compounds included in this invention exhibit any affinity for CDK7, CDK7 and CDK9, biochemical assays were performed without pre-incubation of the enzyme with said compound or with a pre-incubation of 3 h. Functional assays confirm whether the compounds exhibit according to this invention the ability to inhibit the activities of CDK7 and CDK9 kinases. All ligands, solvents, and reagents used in the following assays are readily available from commercial sources or can be easily synthesized by one of skill in the art. The definition of IC50 for CDK7 and CDK9 was determined as follows.

Биохимический анализ на ингибирование CDK7/CyclinH/MAT1.Biochemical analysis for inhibition of CDK7/CyclinH/MAT1.

Активность IC50 ингибитора определяли с использованием анализов связывания с радиоактивными метками (FB) с использованием очищенного рекомбинантного фермента человека в присутствии АТФ/[33Р]АТФ и пептидного субстрата. Выбранные концентрации АТФ находятся на уровне или вблизи Km фермента для АТФ.IC50 inhibitor activity was determined using radiolabeled (FB) binding assays using purified recombinant human enzyme in the presence of ATP/[ 33 P]ATP and peptide substrate. Selected ATP concentrations are at or near the Km of the enzyme for ATP.

Реакции проводили в 96-луночных полистирольных планшетах в конечном объеме 25 мкл на лунку. Смешивали 5 мкл тестируемого соединения в 20% ДМСО, 10 мкл раствора субстрата (АТФ/33РАТФ и CDK7/9 tide) и 10 мкл раствора фермента. Раствор субстрата готовили так, что конечная концентрация составляла 100 мкМ АТФ/[33Р]АТФ (NEN 10 мкКи/мкл, 3000 Ки/ммоль) и 250 мкМ пептида CDK7/9 ((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1)), разведенные в киназном буфере 4 мМ MgCl2, 0,01% TRITON™ X-100, 2 мМ DTT и 20 мМ HEPES. Раствор фермента готовили так, что конечная концентрация составляла 1 нМ фермента CDK7/CyclinH/Mat1 [Proqinase 0366-0360-4 Lot 002)], разведенного в киназном буфере. Тестируемые соединения серийно разбавляли 1:3 в 20% ДМСО, чтобы создать кривую из 10 точек при начальной концентрации 20 мкМ. В качестве верхнего контроля использовали 20% буфер в ДМСО без тестируемого соединения (полная активность в отсутствие какого-либо ингибитора), 500 мМ ЭДТА использовали для определения уровня фона в отсутствие активности фермента (нижний контроль). После смешивания 5 мкл соединений с 10 мкл раствора фермента планшет инкубировали в течение 0 или 180 мин при 22°C. По истечении данного времени реакцию инициировали добавлением 10 мкл раствора субстрата и выдерживали в течение 50 мин при 22°C. Реакцию прекращали добавлением 80 мкл холодного 10% раствора ортофосфорной кислоты. Фильтровальные пластины (непрозрачные, нестерильные фильтровальные пластины) предварительно промывали 10 мкл 10% раствора ортофосфорной кислоты в каждую лунку. 100 мкл смеси переносили на фосфоцеллюлозный фильтр и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Фильтровальные пластины промывали 200 мкл 0,5% ортофос- 20 039950 форной кислоты 3 раза на процессоре фильтровальных пластин. Включение 33Pi (подсчет имп/мин) определяли путем добавления 80 мкл MICROSCINT™ в каждую лунку и считывания на счетчике через час. Данные обрабатывали с помощью инструмента GENEDATA SCREENER®. Данные анализировали с использованием нелинейного логистического уравнения с 4-параметрами (кривая логистическая концентрация-ответ с четырьмя параметрами)Reactions were performed in 96-well polystyrene plates in a final volume of 25 μl per well. 5 µl of test compound in 20% DMSO, 10 µl of substrate solution (ATP/33RATP and CDK7/9 tide) and 10 µl of enzyme solution were mixed. The substrate solution was prepared such that the final concentration was 100 μM ATP/[ 33 P]ATP (NEN 10 μCi/μl, 3000 Ci/mmol) and 250 μM CDK7/9 peptide ((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1)), diluted in kinase buffer 4 mm MgCl 2 , 0.01% TRITON™ X-100, 2 mm DTT and 20 mm HEPES. The enzyme solution was prepared so that the final concentration was 1 nM CDK7/CyclinH/Mat1 enzyme [Proqinase 0366-0360-4 Lot 002)] diluted in kinase buffer. Test compounds were serially diluted 1:3 in 20% DMSO to create a 10 point curve at an initial concentration of 20 μM. 20% buffer in DMSO without test compound was used as upper control (full activity in the absence of any inhibitor), 500 mM EDTA was used to determine the background level in the absence of enzyme activity (lower control). After mixing 5 µl of compounds with 10 µl of enzyme solution, the plate was incubated for 0 or 180 min at 22°C. After this time, the reaction was initiated by adding 10 μl of the substrate solution and kept for 50 min at 22°C. The reaction was terminated by adding 80 µl of cold 10% phosphoric acid solution. Filter plates (opaque, non-sterile filter plates) were prewashed with 10 µl of 10% phosphoric acid solution per well. 100 µl of the mixture was transferred to a phosphocellulose filter and incubated at room temperature for 45 min. The filter plates were washed with 200 µl of 0.5% orthophosphoric acid 3 times on a filter plate processor. 33 Pi incorporation (counts per minute) was determined by adding 80 µl of MICROSCINT™ to each well and reading on a counter one hour later. Data were processed using the GENEDATA SCREENER® tool. Data were analyzed using a 4-parameter non-linear logistic equation (four-parameter logistic concentration-response curve)

Y = ниж + [(верх - ниж)/1 + (х/IC50)угол], где Y - % ингибирования, X - концентрация, обеспечивающая у % ингибирование, ниж - минимальное значение у на кривой, верх - максимальное значение у на кривой, и угол - крутизна кривой при IC50.Y = lower + [(top - bottom) / 1 + (x / IC 50 ) angle], where Y is % inhibition, X is the concentration that provides y % inhibition, lower is the minimum y value on the curve, top is the maximum y value on the curve, and the angle is the steepness of the curve at IC 50 .

%Инг. = [(среднее Max - x/среднее Max - среднее Min)] 100.%ing. = [(Mean Max - x/Mean Max - Mean Min)] 100.

IC50: концентрация соединения, которая уменьшает заданный ответ (связывание лиганда, ответ фермента) на 50%.IC 50 : concentration of a compound that reduces a given response (ligand binding, enzyme response) by 50%.

Соединения, описанные в примерах 1 и 3, показывали IC50 0,0 1 73 мкМ и 0,0487 мкМ по отношению к CDK7 без предварительной инкубации соответственно. После 3 ч предварительной инкубации фермента CDK7 с примерами 1 и 3 они показывали IC50 0,00237 и 0,00506 мкМ соответственно. Эти данные показывают, что оба примера 1 и 3 ингибируют CDK7.The compounds described in examples 1 and 3 showed IC 50 0.0 1 73 μm and 0.0487 μm in relation to CDK7 without pre-incubation, respectively. After 3 hours of pre-incubation with the CDK7 enzyme with Examples 1 and 3, they showed IC 50s of 0.00237 and 0.00506 μM, respectively. These data show that both examples 1 and 3 inhibit CDK7.

Анализ на ингибирование активности киназы CDK9/CyclinT1.Assay for inhibition of CDK9/CyclinT1 kinase activity.

Активность IC50 ингибитора определяли с использованием анализов связывания с радиоактивными метками (FB) с использованием очищенного рекомбинантного фермента человека в присутствии АТФ и пептидного субстрата. Выбранные концентрации АТФ находятся на уровне или вблизи Km фермента для АТФ. Реакции проводили в 96-луночных полистирольных планшетах в конечном объеме 25 мкл на лунку. Смешивали 5 мкл тестируемого соединения в 20% ДМСО, 10 мкл раствора субстрата (АТФ/[33Р]АТФ и CDK7/9 tide) и 10 мкл раствора фермента. Раствор субстрата готовили так, что конечная концентрация составляла 100 мкМ АТФ/[33Р]АТФ (NEN 10 мкКи/мкл, 3000 Ки/ммоль) и 200 мкМ пептида CDK7/9 ((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1)), разведенные в киназном буфере 4 мМ MgCl2, 0,0025% TRITON™ X-100, 1,58 мМ DTT и 15,80 мМ HEPES. Раствор фермента готовили так, что конечная концентрация составляла 7,5 нМ фермента CDK9/cyclinT1 [Proqinase 0371-0345-1 Lot 004)], разведенного в киназном буфере. Тестируемые соединения серийно разбавляли 1:3 в 20% ДМСО, чтобы создать кривую из 10 точек при начальной концентрации 20 мкМ. В качестве верхнего контроля использовали 20% буфер в ДМСО без тестируемого соединения (полная активность в отсутствие какого-либо ингибитора), 500 мМ ЭДТА использовали для определения уровня фона в отсутствие активности фермента (нижний контроль). После смешивания 5 мкл соединений с 10 мкл раствора фермента планшет инкубировали в течение 0 или 180 мин при 22°C. По истечении данного времени реакцию инициировали добавлением 10 мкл раствора субстрата и выдерживали в течение 60 мин при 22°C. Реакцию прекращали добавлением 80 мкл холодного 10% раствора ортофосфорной кислоты. Фильтровальные пластины (непрозрачные, нестерильные фильтровальные пластины) предварительно промывали 10 мкл 10% раствора ортофосфорной кислоты в каждую лунку. 100 мкл смеси переносили на фосфоцеллюлозный фильтр и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Фильтровальные пластины промывали 200 мкл 0,5% ортофосфорной кислоты 3 раза на процессоре фильтровальных пластин. Добавляли 80 мкл MICROSCINT™ в каждую лунку и считывания на сцинтилляционном счетчике через час. Данные обрабатывали с помощью инструмента GENEDATA SCREENER®. Данные анализировали с использованием нелинейного логистического уравнения с 4-параметрами (кривая логистическая концентрация-ответ с четырьмя параметрами)IC50 inhibitor activity was determined using radiolabeled (FB) binding assays using purified recombinant human enzyme in the presence of ATP and peptide substrate. Selected ATP concentrations are at or near the K m of the enzyme for ATP. Reactions were performed in 96-well polystyrene plates in a final volume of 25 μl per well. 5 µl of test compound in 20% DMSO, 10 µl of substrate solution (ATP/[ 33 P]ATP and CDK7/9 tide) and 10 µl of enzyme solution were mixed. The substrate solution was prepared such that the final concentration was 100 μM ATP/[ 33 P]ATP (NEN 10 μCi/μl, 3000 Ci/mmol) and 200 μM CDK7/9 peptide ((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1)), diluted in kinase buffer 4 mM MgCl 2 , 0.0025% TRITON™ X-100, 1.58 mM DTT and 15.80 mM HEPES. The enzyme solution was prepared so that the final concentration was 7.5 nM CDK9/cyclinT1 enzyme [Proqinase 0371-0345-1 Lot 004)] diluted in kinase buffer. Test compounds were serially diluted 1:3 in 20% DMSO to create a 10 point curve at an initial concentration of 20 μM. 20% buffer in DMSO without test compound was used as upper control (full activity in the absence of any inhibitor), 500 mM EDTA was used to determine the background level in the absence of enzyme activity (lower control). After mixing 5 µl of compounds with 10 µl of enzyme solution, the plate was incubated for 0 or 180 min at 22°C. After this time, the reaction was initiated by adding 10 μl of substrate solution and kept for 60 min at 22°C. The reaction was terminated by adding 80 µl of cold 10% phosphoric acid solution. Filter plates (opaque, non-sterile filter plates) were prewashed with 10 µl of 10% phosphoric acid solution per well. 100 µl of the mixture was transferred to a phosphocellulose filter and incubated at room temperature for 45 min. The filter plates were washed with 200 μl of 0.5% phosphoric acid 3 times on a filter plate processor. Added 80 μl of MICROSCINT™ to each well and read on a scintillation counter one hour later. Data were processed using the GENEDATA SCREENER® tool. Data were analyzed using a 4-parameter non-linear logistic equation (four-parameter logistic concentration-response curve)

Y = ниж + [(верх - ниж)/1+(х/1С50)угол], где Y - % ингибирования, X - концентрация, обеспечивающая у% ингибирование, ниж - минимальное значение у на кривой, верх - максимальное значение у на кривой и угол - крутизна кривой при IC50.Y = lower + [(top - lower) / 1 + (x / 1C 50 ) angle], where Y is % inhibition, X is the concentration that provides y% inhibition, lower is the minimum y value on the curve, top is the maximum y value on the curve and the angle is the steepness of the curve at IC50.

%Инг. = [(среднее Max - x/среднее Max - среднее Min)] 100.%ing. = [(Mean Max - x/Mean Max - Mean Min)] 100.

IC50: концентрация соединения, которая уменьшает заданный ответ (связывание лиганда, ответ фермента) на 50%. Относительная IC50: концентрация, дающая половину максимального ответа соединения.IC50: concentration of a compound that reduces a given response (ligand binding, enzyme response) by 50%. Relative IC 50 : concentration giving half of the compound's maximum response.

Соединения, описанные в примерах 1 и 3, показывали IC50 5,93 мкМ и 2,45 мкМ по отношению к CDK9 (3 ч предварительной инкубации) соответственно. Эти данные показывают, что примеры 1 и 3 не сильно ингибируют активность CDK9.The compounds described in Examples 1 and 3 showed IC 50s of 5.93 μM and 2.45 μM against CDK9 (3 h pre-incubation), respectively. These data show that Examples 1 and 3 do not strongly inhibit CDK9 activity.

Взятые вместе, эти данные анализов выше, показывают, что соединения примеров 1 и 3 селективно ингибируют CDK7 по сравнению с CDK9.Taken together, these assay data above show that the compounds of Examples 1 and 3 selectively inhibit CDK7 over CDK9.

Механистические анализы клеток CDK7 и CDK9.Mechanistic analyzes of CDK7 and CDK9 cells.

Цель данных анализов заключается в измерении способности соединений ингибировать сигнальную систему CDK7 и CDK9 в раковых клетках in vitro.The purpose of these assays is to measure the ability of compounds to inhibit CDK7 and CDK9 signaling in cancer cells in vitro.

Клеточный анализ Acumen на основе фосфо-карбоксильных терминальных доменов (Rbp2) (Ser2) pCTD (S2).Cellular analysis of Acumen based on phospho-carboxylic terminal domains (Rbp2) (Ser2) pCTD (S2).

Клетки HCT116 (ATCC CCL-247) культивировали в модифицированной среде McCoy's 5A Medium с добавлением 10% ФБС, 1% NaPyr и 1% Pen/Strep и высевали (до конфлюэнтности на 70%) в 96луночные планшеты с плоским дном при плотность 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл. Затем клеткиHCT116 cells (ATCC CCL-247) were cultured in modified McCoy's 5A Medium supplemented with 10% FBS, 1% NaPyr and 1% Pen/Strep and seeded (to 70% confluence) in 96 well flat bottom plates at a density of 5000 cells per well in a volume of 100 µl. Then cells

- 21 039950 инкубировали в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур (5% CO2, 95% относительной влажности (OB) и 37°C) и оставляли для прикрепления к планшету. На следующее утро клетки дозировали соединениями. Ингибиторы соединений сначала солюбилизировали при 60 мкМ в культуральной среде, содержащей 0,6% ДМСО. Затем готовили серийные разведения соединения (1:3) в диапазоне от 60 до 0,003 мкМ. Клетки дозировали добавлением 50 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для анализа, содержащий прикрепленные клетки со 100 мкл среды, с получением конечной концентрации ДМСО 0,2% с диапазоном конечной концентрации соединения в диапазоне от 20 до 0,001 мкМ. Для максимальной точки использовали среду, содержащую 0,2% ДМСО, а для минимальной точки использовали контрольное соединение, разведенное до конечной концентрации 0,83 мкМ в культуральной среде, содержащей 0,2% ДМСО. После дозирования соединениями указанные клеточные планшеты инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 4 ч. Культуральную среду осторожно удаляли и клетки фиксировали, добавляя 100 мкл 4% параформальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки промывали один раз ФСБ и инкубировали с 100 мкл холодного MeOH в течение 15 мин при комнатной температуре для проникновения клеток. Клетки дважды промывали ФСБ (100 мкл/каждый) и блокировали с помощью 100 мкл/лунку 1% БСА/ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре. 50 мкл 1:1000 первичного антитела (Anti-phospho CTD Ser2 Abcam, № кат ab5095-100), разведенного в 1% БСА/ФСБ, добавляли на лунку, планшеты герметично закупоривали и инкубировали в течение ночи при 4°C.- 21 039950 were incubated overnight in a cell culture incubator (5% CO2, 95% relative humidity (OB) and 37°C) and left to attach to the plate. The next morning, cells were dosed with compounds. Compound inhibitors were first solubilized at 60 μM in culture medium containing 0.6% DMSO. Serial dilutions of the compound (1:3) were then prepared in the range from 60 to 0.003 μM. Cells were dosed by adding 50 µl from the serial dilution plate to an assay plate containing attached cells with 100 µl of medium to give a final DMSO concentration of 0.2% with a final compound concentration range of 20 to 0.001 µM. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO was used, and for the minimum point, a control compound diluted to a final concentration of 0.83 μM in culture medium containing 0.2% DMSO was used. After compound dosing, these cell plates were incubated at 37° C. and 5% CO2 for 4 h. The culture medium was carefully removed and the cells were fixed by adding 100 μl of 4% paraformaldehyde for 30 min at room temperature. Cells were washed once with PBS and incubated with 100 µl of cold MeOH for 15 min at room temperature to allow cell penetration. Cells were washed twice with PBS (100 μl/each) and blocked with 100 μl/well 1% BSA/PBS for 30 min at room temperature. 50 μl 1:1000 primary antibody (Anti-phospho CTD Ser2 Abcam, Cat # ab5095-100) diluted in 1% BSA/PBS was added per well, the plates were sealed and incubated overnight at 4°C.

На следующий день клетки промывали три раза ФСБ (100 мкл/лунку) и инкубировали с 50 мкл/лунку вторичного антитела (разбавление 1:2000, Козий анти кроличий IgM, ALEXA FLUOR™ 488) в ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки 3X ФСБ (100 мкл/лунку) на лунку добавляли 100 мкл 50 мкг/мл РНКазы и пропидий йодид при разведении 1:1000 в ФСБ. Планшеты запечатывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на рабочем столе (предохраняли от света). Планшеты анализировали на проницаемость на FL2 (средняя интенсивность) и FL3 (общая интенсивность). Флуоресцентные планшеты сканировали с помощью ACUMEN EXPLORER™ [лазерносканирующий флуоресцентный микропланшетный цитометр, изготовленный TTP LABTECH LTD], для измерения антифосфокарбоксильного концевого домена в Серине 2 (pCTD). Анализ изображения основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации положительных клеток. pCTD (S2) положительные клетки идентифицируются по средней интенсивности на 500-530 выше порога. Общая интенсивность в 575-640 от пропидия йодида/ДНК используется для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет% pCTD-положительных клеток.The next day, cells were washed three times with PBS (100 µl/well) and incubated with 50 µl/well secondary antibody (1:2000 dilution, Goat anti-rabbit IgM, ALEXA FLUOR™ 488) in PBS for 1 h at room temperature. After washing with 3X PBS (100 μl/well), 100 μl of 50 μg/ml RNase and propidium iodide were added per well at a 1:1000 dilution in PBS. The plates were sealed and incubated for 1 h at room temperature on a desktop (protected from light). The plates were analyzed for permeability by FL2 (mean intensity) and FL3 (total intensity). The fluorescent plates were scanned with an ACUMEN EXPLORER™ [Laser Scanning Fluorescent Microplate Cytometer manufactured by TTP LABTECH LTD] to measure the antiphosphocarboxylic terminal domain in Serine 2 (pCTD). Image analysis relies on cellular fluorescent signals to identify positive cells. pCTD (S2) positive cells are identified by mean intensity 500-530 above threshold. An overall intensity of 575-640 from propidium iodide/DNA is used to identify individual cells. The result of the analysis is % pCTD-positive cells.

IC50 определяли путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Соединения, описанные в примерах 1 и 3, показывали относительную IC50 > 20 мкМ и 3,52 мкМ по отношению к phosphoCTD (S2), соответственно. Эти данные показывают, что оба примера 1 и 3 не сильно ингибируют CDK9 в клетках.IC 50 was determined by curve fitting for a logistic equation with four parameters for each output using GENE DATA™. The compounds described in examples 1 and 3 showed a relative IC 50 >20 μM and 3.52 μM relative to phosphoCTD (S2), respectively. These data show that both examples 1 and 3 do not strongly inhibit CDK9 in cells.

Клеточный анализ Acumen на основе фосфо-карбоксильных терминальных доменов (Rbp2) (Ser5) pCTD (S5).Cellular analysis of Acumen based on phospho-carboxylic terminal domains (Rbp2) (Ser5) pCTD (S5).

Клетки HCT116 (ATCC CCL-247) культивировали в модифицированной среде McCoy's 5A Medium с добавлением 10% ФБС, 1% NaPyr и 1% Pen/Strep и высевали (до конфлюэнтности на 70%) в 96луночные планшеты с плоским дном при плотности 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл. Клетки инкубировали в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур (5% CO2, 95% относительной влажности (OB) и 37°C) и оставляли для прикрепления к планшету. На следующее утро клетки дозировали соединениями. Ингибиторы соединений солюбилизировали при 60 мкМ в культуральной среде, содержащей 0,6% ДМСО. Затем готовили серийные разведения соединения (1:3) в диапазоне от 60 до 0,003 мкМ. Клетки дозировали добавлением 50 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для анализа, содержащий прикрепленные клетки со 100 мкл среды, с получением конечной концентрации ДМСО 0,2% с диапазоном конечной концентрации соединения в диапазоне от 20 до 0,001 мкМ. Для максимальной точки использовали среду, содержащую 0,2% ДМСО, а для минимальной точки использовали контрольное соединение, разведенное до конечной концентрации 0,83 мкМ в культуральной среде, содержащей 0,2% ДМСО. После дозирования соединениями указанные клеточные планшеты инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 4 ч. Культуральную среду осторожно удаляли и клетки фиксировали, добавляя 100 мкл 4% параформальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки промывали один раз ФСБ и инкубировали с 100 мкл холодного MeOH в течение 15 мин при комнатной температуре для проникновения клеток. Снова клетки дважды промывали ФСБ (100 мкл/каждый) и блокировали с помощью 100 мкл/лунку 1% БСА/ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре. 50 мкл 1:1000 первичного антитела (Anti-phosphoCTD Ser5 Bethyl Laboratories № кат A300-655A), разведенного в 1% БСА/ФСБ, добавляли на лунку, планшеты герметично закупоривали и инкубировали в течение ночи при 4°C.HCT116 cells (ATCC CCL-247) were cultured in modified McCoy's 5A Medium supplemented with 10% FBS, 1% NaPyr, and 1% Pen/Strep and seeded (to 70% confluence) in 96-well flat bottom plates at a density of 5000 cells per well in a volume of 100 µl. Cells were incubated overnight in a cell culture incubator (5% CO2, 95% relative humidity (OB) and 37°C) and left to attach to the plate. The next morning, cells were dosed with compounds. Compound inhibitors were solubilized at 60 μM in culture medium containing 0.6% DMSO. Serial dilutions of the compound (1:3) were then prepared in the range from 60 to 0.003 μM. Cells were dosed by adding 50 µl from the serial dilution plate to an assay plate containing attached cells with 100 µl of medium to give a final DMSO concentration of 0.2% with a final compound concentration range of 20 to 0.001 µM. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO was used, and for the minimum point, a control compound diluted to a final concentration of 0.83 μM in culture medium containing 0.2% DMSO was used. After compound dosing, these cell plates were incubated at 37° C. and 5% CO2 for 4 h. The culture medium was carefully removed and the cells were fixed by adding 100 μl of 4% paraformaldehyde for 30 min at room temperature. Cells were washed once with PBS and incubated with 100 µl of cold MeOH for 15 min at room temperature to allow cell penetration. Again, cells were washed twice with PBS (100 μl/each) and blocked with 100 μl/well of 1% BSA/PBS for 30 min at room temperature. 50 μl 1:1000 primary antibody (Anti-phosphoCTD Ser5 Bethyl Laboratories cat # A300-655A) diluted in 1% BSA/PBS was added per well, the plates were sealed and incubated overnight at 4°C.

На следующий день клетки промывали три раза ФСБ (100 мкл/лунку) и инкубировали с 50 мкл/лунку вторичного антитела (разбавление 1:2000, козий антикроличий IgM, ALEXA FLUOR™ 488) в ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки 3X ФСБ (100 мкл/лунку) на лунку добавляли 100 мкл 50 мкг/мл РНКазы (Sigma) и пропидий йодид при разведении в ФСБ. Планшеты запечатывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на рабочем столе (предохраняли отThe next day, cells were washed three times with PBS (100 μl/well) and incubated with 50 μl/well secondary antibody (1:2000 dilution, goat anti-rabbit IgM, ALEXA FLUOR™ 488) in PBS for 1 hour at room temperature. After washing with 3X PBS (100 μl/well), 100 μl of 50 μg/ml RNase (Sigma) and propidium iodide were added per well when diluted in PBS. The plates were sealed and incubated for 1 h at room temperature on a desktop (protected from

- 22 039950 света). Планшеты анализировали на проницаемость на FL2 (средняя интенсивность) и FL3 (общая интенсивность). Флуоресцентные планшеты сканировали с помощью ACUMEN EXPLORER™ [лазерносканирующий флуоресцентный микропланшетный цитометр, изготовленный TTP LABTECH LTD], для измерения антифосфокарбоксильного концевого домена в серине 5 (pCTD). Анализ изображения основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации положительных клеток. pCTD (S5) положительные клетки идентифицируются по средней интенсивности на 500-530 выше порога. Общая интенсивность в 575-640 от пропидия йодида/ДНК используется для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет% pCTD-положительных клеток. IC50 определяли путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™.- 22 039950 light). The plates were analyzed for permeability by FL2 (mean intensity) and FL3 (total intensity). The fluorescent plates were scanned with ACUMEN EXPLORER™ [Laser Scanning Fluorescent Microplate Cytometer manufactured by TTP LABTECH LTD] to measure the antiphosphocarboxylic terminal domain in serine 5 (pCTD). Image analysis relies on cellular fluorescent signals to identify positive cells. pCTD (S5) positive cells are identified by mean intensity 500-530 above threshold. An overall intensity of 575-640 from propidium iodide/DNA is used to identify individual cells. The result of the analysis is % pCTD-positive cells. IC 50 was determined by curve fitting for a logistic equation with four parameters for each output using GENE DATA™.

Соединения, описанные в примерах 1 и 3, показывали относительную IC50 0,148 мкМ и 0,198 мкМ по отношению к pCTD Ser5 соответственно. Эти данные показывают, что оба примера 1 и 3 ингибируют клеточную активность CDK7.The compounds described in examples 1 and 3 showed a relative IC 50 of 0.148 μM and 0.198 μM with respect to pCTD Ser5, respectively. These data show that both examples 1 and 3 inhibit the cellular activity of CDK7.

Клеточный анализ Acumen на основе cMyc.Acumen cell assay based on cMyc.

Клетки HCT116 (ATCC CCL-247) культивировали в модифицированной среде McCoy's 5A Medium с добавлением 10% ФБС, 1% NaPyr и 1% Pen/Strep и высевали (до конфлюэнтности на 70%) в 96луночные планшеты с плоским дном при плотности 5000 клеток на лунку в объеме 100 мкл. Затем клетки инкубировали в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур (5% CO2, 95% относительной влажности (OB) и 37°C) и оставляли для прикрепления к планшету. На следующее утро клетки дозировали соединениями. Ингибиторы соединений солюбилизировали при 60 мкМ в культуральной среде, содержащей 0,6% ДМСО. Затем готовили серийные разведения соединения (1:3) в диапазоне от 60 мкМ до 0,003 мкМ. Клетки дозировали добавлением 50 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для анализа, содержащий прикрепленные клетки со 100 мкл среды, с получением конечной концентрации ДМСО 0,2% с диапазоном конечной концентрации соединения в диапазоне от 20 до 0,001 мкМ. Для максимальной точки использовали среду, содержащую 0,2% ДМСО, а для минимальной точки использовали контрольное соединение, разведенное до конечной концентрации 0,83 мкМ в культуральной среде, содержащей 0,2% ДМСО. После дозирования соединениями указанные клеточные планшеты инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 4 ч. Культуральную среду осторожно удаляли и клетки фиксировали, добавляя 100 мкл 4% параформальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки промывали один раз ФСБ и инкубировали с 100 мкл холодного MeOH в течение 15 мин при комнатной температуре для проникновения клеток. Снова клетки дважды промывали ФСБ (100 мкл/каждый) и блокировали с помощью 100 мкл/лунку 1% БСА/ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре. 50 мкл 1:1000 первичного антитела (антитело Anti-c-Myc [Y69] Abcam № кат ab32072), разведенного в 1% БСА/ФСБ, добавляли на лунку, планшеты герметично закупоривали и инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующий день клетки промывали три раза ФСБ (100 мкл/лунку) и инкубировали с 50 мкл/лунку вторичного антитела (разбавление 1:2000, козий антикроличий IgM, ALEXA FLUOR™ 488) в ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки 3X ФСБ (100 мкл/лунку) на лунку добавляли 100 мкл 50 мкг/мл РНКазы и пропидий йодид (Invitrogene) при разведении в ФСБ. Планшеты запечатывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на рабочем столе (предохраняли от света). Планшеты анализировали на проницаемость на FL2 (средняя интенсивность) и FL3 (общая интенсивность). Флуоресцентные планшеты сканировали с помощью ACUMEN EXPLORER™ [лазерносканирующий флуоресцентный микропланшетный цитометр, изготовленный TTP LABTECH LTD], для измерения антифосфокарбоксильного концевого домена в серине 5 (pCTD). Анализ изображения основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации положительных клеток. pCTD (S5) положительные клетки идентифицируются по средней интенсивности на 500-530 выше порога. Общая интенсивность в 575-640 от пропидия йодида/ДНК используется для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % pCTD-положительных клеток. IC50 определяли путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™.HCT116 cells (ATCC CCL-247) were cultured in modified McCoy's 5A Medium supplemented with 10% FBS, 1% NaPyr and 1% Pen/Strep and seeded (to 70% confluence) in 96 well flat bottom plates at a density of 5000 cells per well in a volume of 100 µl. The cells were then incubated overnight in a cell culture incubator (5% CO 2 , 95% relative humidity (OB) and 37° C.) and allowed to attach to the plate. The next morning, cells were dosed with compounds. Compound inhibitors were solubilized at 60 μM in culture medium containing 0.6% DMSO. Serial dilutions of the compound (1:3) were then prepared ranging from 60 μM to 0.003 μM. Cells were dosed by adding 50 µl from the serial dilution plate to an assay plate containing attached cells with 100 µl of medium to give a final DMSO concentration of 0.2% with a final compound concentration range of 20 to 0.001 µM. For the maximum point, medium containing 0.2% DMSO was used, and for the minimum point, a control compound diluted to a final concentration of 0.83 μM in culture medium containing 0.2% DMSO was used. After compound dosing, these cell plates were incubated at 37° C. and 5% CO2 for 4 h. The culture medium was carefully removed and the cells were fixed by adding 100 μl of 4% paraformaldehyde for 30 min at room temperature. Cells were washed once with PBS and incubated with 100 µl of cold MeOH for 15 min at room temperature to allow cell penetration. Again, the cells were washed twice with PBS (100 μl/each) and blocked with 100 μl/well of 1% BSA/PBS for 30 min at room temperature. 50 μl 1:1000 primary antibody (Anti-c-Myc antibody [Y69] Abcam # ab32072) diluted in 1% BSA/PBS was added per well, the plates were sealed and incubated overnight at 4°C. The next day, cells were washed three times with PBS (100 μl/well) and incubated with 50 μl/well secondary antibody (1:2000 dilution, goat anti-rabbit IgM, ALEXA FLUOR™ 488) in PBS for 1 hour at room temperature. After washing with 3X PBS (100 μl/well), 100 μl of 50 μg/ml RNase and propidium iodide (Invitrogene) were added per well when diluted in PBS. The plates were sealed and incubated for 1 h at room temperature on a desktop (protected from light). The plates were analyzed for permeability by FL2 (mean intensity) and FL3 (total intensity). The fluorescent plates were scanned with ACUMEN EXPLORER™ [Laser Scanning Fluorescent Microplate Cytometer manufactured by TTP LABTECH LTD] to measure the antiphosphocarboxylic terminal domain in serine 5 (pCTD). Image analysis relies on cellular fluorescent signals to identify positive cells. pCTD (S5) positive cells are identified by mean intensity 500-530 above threshold. An overall intensity of 575-640 from propidium iodide/DNA is used to identify individual cells. The result of the analysis is % pCTD-positive cells. IC 50 was determined by curve fitting for a logistic equation with four parameters for each output using GENE DATA™.

Соединения, описанные в примерах 1 и 3, показывали относительную IC50 0,0828 мкМ и 0,0573 мкМ по отношению к cMyc. Эти данные показывают, что оба примера 1 и 3 ингибируют транскрипцию cMyc в клетках HCT116.The compounds described in examples 1 and 3 showed a relative IC 50 of 0.0828 μM and 0.0573 μM relative to cMyc. These data show that both Examples 1 and 3 inhibit cMyc transcription in HCT116 cells.

Эксперимент по профилированию селективности: Proqinase WT Profiler.Selectivity profiling experiment: Proqinase WT Profiler.

Профиль ингибирования киназы соединением определяли путем измерения значений остаточной активности при четырех концентрациях без повторов в 320 анализах протеинкиназ дикого типа. Соединения тестировали при 20, 2, 0,2 и 0,02 мкМ без повторов. Конечная концентрация ДМСО во всех реакционных коктейлях (включая верхний и нижний контроль) составляла 1%.The kinase inhibition profile of the compound was determined by measuring residual activity at four concentrations without repeats in 320 wild-type protein kinase assays. Compounds were tested at 20, 2, 0.2 and 0.02 μM without repeats. The final concentration of DMSO in all reaction cocktails (including upper and lower controls) was 1%.

Анализ протеинкиназы.Protein kinase assay.

Радиометрический анализ протеинкиназы (33PANQINASE® Анализ активности, ProQinase) использовали для измерения киназной активности 320 протеинкиназ. Все анализы киназ проводили в 96луночном планшете FLASHPLATES™ в реакционном объеме 50 мкл. Реакционный коктейль пипетиро- 23 039950 вали в 4 этапа в следующем порядке:A radiometric protein kinase assay (33PANQINASE® Activity Assay, ProQinase) was used to measure the kinase activity of 320 protein kinases. All kinase assays were performed in a 96-well FLASHPLATES™ plate in a 50 µl reaction volume. The reaction cocktail was pipetted in 4 stages in the following order:

1) 10 мкл нерадиоактивного раствора АТФ (в Н2О);1) 10 µl of a non-radioactive ATP solution (in H 2 O);

2) 25 мкл смеси буфера для анализа/[у-33Р]-АТФ;2) 25 µl assay buffer/[y- 33 P]-ATP mixture;

3) 5 мкл тестируемого образца в 10% ДМСО;3) 5 µl of test sample in 10% DMSO;

4) 10 мкл смеси фермент/субстрат.4) 10 µl enzyme/substrate mixture.

Анализ для всех протеинкиназ содержит 70 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 3 мМ MgCl2, 3 мМ МпС12, 3 мкМ Na-ортованадат, 1,2 мМ DTT, АТФ (переменные количества, соответствующие кажущейся АТФ-Кт соответствующей киназы, см. табл. 1), [γ-33Ρ]-ΑΤΦ (ок. 8 х 1005 имп/мин на лунку), протеинкиназу (переменные количества; см. табл. 1) и субстрат (переменные количества; см. табл. 1). Все анализы РКС (кроме анализа PKC-mu и РКС-пи) дополнительно содержат 1 мМ СаС12, 4 мМ ЭДТА, 5 мкг/мл фосфатидилсерина и 1 мкг/мл 1,2-диолеилглицерина. Анализы CAMKID, САМК2А, САМК2В, CAMK2D, CAMK2G, САМК4, САМКК1, САМКК2, DAPK2, EEF2K, MYLK, MYLK2 и MYLK3 дополнительно содержат 1 мг/мл Кальмодулина и 0,5 мМ СаС12. Анализы PRKG1 и PRKG2 дополнительно содержат 1 мкм цГМФ. Анализ DNA-PK дополнительно содержит 2,5 мкг/мл ДНК.Assay for all protein kinases contains 70 mM HEPES-NaOH pH 7.5, 3 mM MgCl 2 , 3 mM MpCl 2 , 3 μM Na orthovanadate, 1.2 mM DTT, ATP (variable amounts corresponding to the apparent ATP-K t of the corresponding kinase , see Table 1), [γ- 33 P]-ΑΤΦ (approx. 8 x 1005 cpm/well), protein kinase (variable amounts; see Table 1), and substrate (variable amounts; see Table 1). one). All PKC assays (except PKC-mu and PKC-pi assays) additionally contain 1 mM CaCl 2 , 4 mM EDTA, 5 μg/ml phosphatidylserine, and 1 μg/ml 1,2-dioleylglycerol. The CAMKID, CAMK2A, CAMK2B, CAMK2D, CAMK2G, CAMK4, CAMKK1, CAMKK2, DAPK2, EEF2K, MYLK, MYLK2 and MYLK3 assays additionally contain 1 mg/ml Calmodulin and 0.5 mM CaCl 2 . The PRKG1 and PRKG2 assays additionally contain 1 µm cGMP. The DNA-PK assay additionally contains 2.5 μg/ml of DNA.

Реакционные коктейли протеинкиназы инкубировали при 30°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали с помощью 50 мкл 2% (об./об.) Н3РО4, планшеты отсасывали и дважды промывали 200 мкл 0,9% (об./об.) NaCl. Включение 33Pi (подсчет имп/мин) определяли с помощью сцинтилляционного счетчика для микропланшетов. Все анализы протеинкиназ выполняли с помощью роботизированной системы BeckmanCoulter ВЮМЕК® 2000/SL. Все протеинкиназы, предоставленные ProQinase, экспрессируются в клетках насекомых Sf9 или в E.coli в виде рекомбинантных GST-слитых белков или His-меченых белков, либо в виде полноразмерных, либо ферментативно активных фрагментов. Все киназы получали из кДНК человека и очищали с помощью аффинной хроматографии GSH или иммобилизованного металла. Аффинные метки удаляли из ряда киназ во время очистки. Чистоту протеинкиназ проверяли с помощью окрашивания SDS-PAGE/Coomassie, идентичность проверяли с помощью масс-спектроскопии. Киназы от внешних поставщиков (CAR - Cama Biosciences Inc.; INV - Life Technologies (Invitrogen Corporation™); MIL - Merck-Millipore (Millipore Corporation™), см. табл. 1) экспрессируются, очищаются и их качество контролируются данными поставщика. Концентрации ферментов и субстратов для анализов представлены в табл. 1.Protein kinase reaction cocktails were incubated at 30°С for 60 min. The reaction was stopped with 50 μl of 2% (v/v) H3PO4, the plates were aspirated and washed twice with 200 μl of 0.9% (v/v) NaCl. 33 Pi incorporation (counting cpm) was determined using a microplate scintillation counter. All protein kinase assays were performed using a BeckmanCoulter BUMEK® 2000/SL robotic system. All protein kinases provided by ProQinase are expressed in Sf9 insect cells or in E. coli as recombinant GST fusion proteins or His-tagged proteins, either as full length or enzymatically active fragments. All kinases were derived from human cDNA and purified by GSH or immobilized metal affinity chromatography. Affinity tags were removed from a number of kinases during purification. Protein kinase purity was checked by SDS-PAGE/Coomassie staining, identity was checked by mass spectroscopy. Kinases from external vendors (CAR - Cama Biosciences Inc.; INV - Life Technologies (Invitrogen Corporation™); MIL - Merck-Millipore (Millipore Corporation™), see Table 1) are expressed, purified and quality controlled by supplier data. The concentrations of enzymes and substrates for analyzes are presented in table. one.

Оценка необработанных данных.Raw data evaluation.

Для каждой киназы медианное значение числа импульсов в минуту в трех лунках определяли как нижний контроль (п=3). Данная величина отражает неспецифическое связывание радиоактивности с планшетом в отсутствие протеинкиназы, но в присутствии субстрата. Кроме того, для каждой киназы медианное значение числа импульсов в минуту в трех других лунках принимали за верхний контроль, т.е. полную активность в отсутствие какого-либо ингибитора (п=3). Разница между верхним и нижним контролем каждого фермента принимается за 100% активности. Как часть оценки данных, нижний контроль каждой киназы вычитали из верхнего контроля, а также из их соответствующих составных значений. Остаточную активность (в %) для каждой лунки соединения рассчитывали по следующей формуле:For each kinase, the median cpm of the three wells was defined as the lower control (n=3). This value reflects the non-specific binding of radioactivity to the plate in the absence of protein kinase but in the presence of a substrate. In addition, for each kinase, the median value of the number of pulses per minute in the other three wells was taken as the upper control, i.e. full activity in the absence of any inhibitor (n=3). The difference between the upper and lower control of each enzyme is taken as 100% activity. As part of the data evaluation, each kinase's lower control was subtracted from the upper control as well as from their respective composite values. The residual activity (in %) for each well of the compound was calculated using the following formula:

Ост. Активность (%) = 100 X [(сигнал соединения - нижний контроль)/ (верхний контроль - нижний контроль)].Rest Activity (%) = 100 X [(link signal - lower control)/(upper control - lower control)].

Нестандартные значения IC50 рассчитывали с использованием настраиваемой электронной таблицы Excel в сочетании с надстройкой XLFit. Из-за малого количества точек данных (4) XL-Fit вычисляет нестандартную 1С50, используя уравнение с четырьмя параметрами, в котором три параметра привязаны к фиксированным значениям. Уравнение представляет собойNon-standard IC50 values were calculated using a custom Excel spreadsheet in combination with the XLFit add-in. Due to the small number of data points (4), XL-Fit calculates the non-standard 1C 50 using a four parameter equation in which three parameters are tied to fixed values. The equation is

Y=B+(( А-В))/ [ 1 +(х/С)] ΛϋY \u003d B + (( A-B)) / [ 1 + (x / C)] Λ ϋ

А. Минимальное значение активности, также известное как Bottom. Фиксировано 0.A. The minimum activity value, also known as Bottom. Fixed 0.

В. Максимальное значение активности, также известное как Тор. Фиксировано 100.C. Maximum activity value, also known as Tor. Fixed 100.

С. Точка перегиба кривой.C. Curve inflection point.

D. Угловой коэффициент Хилла. Фиксировано 1.D. Hill Slope. Fixed 1.

Y. Зависимая переменная (т.е. то, что вы измеряете как сигнал).Y. Dependent variable (i.e. what you are measuring as a signal).

X. Независимая переменная (т.е. то, что вы контролируете, например, доза, концентрация и т.д.).X. Independent variable (i.e. what you control, such as dose, concentration, etc.).

Способ вычисления нестандартной IC50 состоит в том, чтобы назначать случайные значения параметру С и повторять его итеративно. Затем алгоритм измеряет различия в сумме квадратов невязок и будет искать последовательные последовательные итерации, где изменение невязок сходится. Как только предел сходимости достигнут, решение считается оптимальным и процесс аппроксимации заканчивается.The way to calculate the non-standard IC50 is to assign random values to parameter C and iterate over it. The algorithm then measures the differences in the sum of squares of the residuals and will look for successive iterations where the change in the residuals converges. As soon as the convergence limit is reached, the solution is considered optimal and the approximation process ends.

CDK12 и CDK13 (ProQinase) тестировали, по существу, как указано выше, но отдельно при 10 концентрациях (от 2х10'5М до 6x10’ М) с использованием полулогарифмических разведений. Для 10 точек анализ остаточной активности для каждой концентрации и значения IC50 соединения рассчитывали с использованием QUATTRO® WORKFLOW™ V3.1.1. Подходящей моделью для определения 1С50 была сигмоидальная реакция (переменный наклон) с параметрами top, зафиксированными на 100%, и bottom на 0%. Используемый метод аппроксимации был методом наименьших квадратов. Данные представлены в табл. 1 ниже.CDK12 and CDK13 (ProQinase) were tested essentially as above, but separately at 10 concentrations (from 2x10'5 M to 6x10'M) using semi-log dilutions. For 10 points, the analysis of residual activity for each concentration and the IC50 values of the compounds were calculated using QUATTRO® WORKFLOW™ V3.1.1. A suitable model for determining IC 50 was the sigmoid response (variable slope) with top fixed at 100% and bottom at 0%. The approximation method used was the least squares method. The data are presented in table. 1 below.

-24039950-24039950

Таблица 1Table 1

Киназа Kinase Киназа Kinase Конц. Киназы Conc. kinases Конц. АТФ Conc. ATP Субстрат substrate Субстрат substrate IC50 IC50 Название Name Семья Family нМ nM мкМ µM Название Name мкг/50 мкл µg/50 µl мкМ µM CDK7/CycH/MATl CDK7/CycH/MATl CMGC CMGC 3,3 3.3 3 3 RBER- CHKtide RBER- CHKtide 2 2 0,0928 0.0928 CDK9/CycTl CDK9/CycTl CMGC CMGC 2,2 2.2 1 one RBER- CHKtide RBER- CHKtide 2 2 6,32 6.32 CDKl/CycBl CDKl/CycBl CMGC CMGC 7 7 1 one RBER- CHKtide RBER- CHKtide 2 2 20,000 20,000 CDK2/CycEl CDK2/CycEl CMGC CMGC 1,5 1.5 1 one RBER- CHKtide RBER- CHKtide 1 one 20,000 20,000 CDK4/CycDl CDK4/CycDl CMGC CMGC 3,3 3.3 Э E RBER- CHKtide RBER- CHKtide 2 2 2,830 2,830 CDK6/CycDl CDK6/CycDl CMGC CMGC 3,2 3.2 э uh RBER- CHKtide RBER- CHKtide 2 2 8,079 8.079 CDK8/CycC CDK8/CycC CMGC CMGC 8,3 8.3 1 one RBER- IRStide RBER- IRStide 1 one 10,922 10.922 CDK16/CycY CDK16/CycY CMGC CMGC 3,2 3.2 0,3 0.3 GSK3(14- 27) GSK3(14- 27) 2 2 9,073 9.073 CDK19/CycC CDK19/CycC CMGC CMGC 30,9 30.9 Э E RBER- IRStide RBER- IRStide 2 2 7,414 7.414 CDK12/CycK CDK12/CycK CMGC CMGC 14,7 14.7 0,3 0.3 RBER- IRStide RBER- IRStide 2 2 14,780 14,780 CDK13/CycK CDK13/CycK CMGC CMGC 29,2 29.2 0,3 0.3 RBER- CDC25tide RBER- CDC25tide 1 one 20,000 20,000

Эти данные показывают, что соединение примера 1 является крайне селективным для CDK7 из репрезентативной панели киназ.These data show that Example 1 is highly selective for CDK7 from a representative panel of kinases.

Анализ клеточной пролиферации.Cell proliferation assay.

Данные в табл. 2 показывают, что соединение примера 1 ингибирует пролиферацию и жизнеспособность указанных линий опухолевых клеток. Клеточные линии высевали при плотности 5000 клеток на лунку в 100 мкл на лунку культуральной среды в белый 96-луночный планшет для культивирования клеток. См. табл. 2 для информации о клеточной линии и культуральной среде. Планшеты инкубировали при 37°C и 5% СО2. На следующий день готовили серийное разведение тестируемого соединения, разбавляя соединение 1:3 в ДМСО для 10 точек. Планшет с ДМСО в 1000 раз превышает конечную концентрацию. В дополнение к ингибитору CDK7 колонка только с ДМСО включена в качестве максимального контроля роста и крайняя колонка с 10 мкМ стауроспорина включена в качестве максимального контроля ингибирования роста. Затем готовили планшет с 10-кратным разбавлением, добавляя 2 мкл на лунку из 1000-кратного ДМСО-планшета к 198 мкл на лунку OMEM (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, № кат 31985-070). Клетки обрабатывали указанным соединением путем добавления 11 мкл на лунку из планшета 10X OMEM в клеточный планшет, содержащий 100 мкл на лунку питательной среды для конечной концентрации IX. Планшеты помещали обратно в инкубатор при 37°C и 5% CO2. Через семь дней после добавления соединения планшеты вынимали из инкубатора и оставляли для уравновешивания до комнатной температуры. Реагент CELL TITER GLO® размораживали при комнатной температуре и затем готовили путем смешивания одного флакона буфера для анализа с одним флаконом субстрата и осторожно взбалтывали для перемешивания. Затем реагент CELL TITER GLO® добавляли в клеточный планшет по 100 мкл на лунку и помещали на шейкер Titer Plate со скоростью 2 в течение 15 мин при комнатной температуре. После 15-минутной инкубации на шейкере считывали люминесценцию, 1 секунду на лунку с использованием Wallac VICTOR2™. Кривые нелинейной регрессии и сигмоидальной зависимости доза-ответ использовали для расчета концентрации половины максимального ингибирования (IC50) с помощью программного обеспечения Graphpad Prism 6.The data in the table. 2 shows that the compound of Example 1 inhibits the proliferation and viability of these tumor cell lines. Cell lines were seeded at a density of 5,000 cells per well in 100 μl per well of culture medium in a white 96-well cell culture plate. See table. 2 for cell line and culture media information. The plates were incubated at 37°C and 5% CO 2 . The next day, a serial dilution of the test compound was prepared by diluting the compound 1:3 in DMSO for 10 points. The DMSO tablet is 1000 times the final concentration. In addition to the CDK7 inhibitor, a DMSO-only column is included as a maximum growth control and an end column with 10 μM staurosporine is included as a maximum growth inhibition control. A 10-fold dilution plate was then prepared by adding 2 μl per well from a 1000x DMSO plate to 198 μl per well of OMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat # 31985-070). Cells were treated with the indicated compound by adding 11 μl per well from a 10X OMEM plate to a cell plate containing 100 μl per well of final concentration IX growth medium. The plates were placed back into the incubator at 37°C and 5% CO 2 . Seven days after compound addition, the plates were removed from the incubator and left to equilibrate to room temperature. CELL TITER GLO® reagent was thawed at room temperature and then prepared by mixing one vial of assay buffer with one vial of substrate and gently shaking to mix. The CELL TITER GLO® reagent was then added to the cell plate at 100 µl per well and placed on a Titer Plate shaker at a speed of 2 for 15 minutes at room temperature. After a 15 minute shaker incubation, luminescence was read, 1 second per well using Wallac VICTOR2™. Curves of non-linear regression and sigmoidal dose-response were used to calculate the concentration of half maximum inhibition (IC 50 ) using Graphpad Prism 6 software.

- 25 039950- 25 039950

Таблица 2table 2

Клеточн ая Линия Cell Line Г истолог ИЯ Histologist AND I 1С50 (мкМ)1С 5 0 (μM) Номер по Каталогу Catalog number Информация о Среде Environment Information НСТ116 NST116 Колорект альный Рак Colorectal Cancer 0,04601 0.04601 ATCC# CCL247 ATCC# CCL247 McCoy's 5A (Gibco 16600) + 10% ФБС (Hyclone SH30071.03) McCoy's 5A (Gibco 16600) + 10% PBS (Hyclone SH30071.03) MCF7 MCF7 Рак Молочно й Железы Mammary cancer 0,03201 0.03201 АТСС# НТВ22 ATCC# NTV22 RPMI 1640 с L-Глутамином (Gibco 11875) + 10% ФБС (Hyclone SH30071.03) RPMI 1640 with L-Glutamine (Gibco 11875) + 10% PBS (Hyclone SH30071.03) НСС1806 NSS1806 Рак Молочно й Железы Mammary cancer 0,02553 0.02553 ATCC# CRL2335 ATCC# CRL2335 RPMI 1640 с HEPES и LГлутамином (Gibco 22400) + 10% ФБС (Gibco № кат 10082) RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (Gibco 22400) + 10% PBS (Gibco cat no. 10082) NCI- Н460 NCI- H460 Рак Легких Cancer Lungs 0,0479 0.0479 АТСС# НТВ177 АТСС# NTV177 RPMI 1640 с HEPES и LГлутамином (Gibco 22400) + 10% ФБС (Gibco № кат 10082) RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (Gibco 22400) + 10% PBS (Gibco cat no. 10082) NCI- Н446 NCI- H446 Рак Легких Cancer Lungs 0,01419 0.01419 АТСС# НТВ171 ATCC# NTV171 RPMI 1640 с HEPES и LГлутамином (Gibco 22400) + 1 мМ Пирувата натрия (Gibco 11360)+ 10% ФБС (Hyclone SH30071.03) RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (Gibco 22400) + 1 mM Sodium pyruvate (Gibco 11360) + 10% PBS (Hyclone SH30071.03) А2780 A2780 Рак яичников ovarian cancer 0,02651 0.02651 ATCC# CRL2772 ATCC# CRL2772 RPMI 1640 с L-Глутамином (Gibco 11875)+ 10% ФБС (Hyclone SH30071.03) RPMI 1640 with L-Glutamine (Gibco 11875) + 10% FBS (Hyclone SH30071.03) SNU-16 SNU-16 Рак желудочн Окишечног о тракта Cancer of the gastrointestinal tract 0,02312 0.02312 ATCC# CRL5974 ATCC# CRL5974 RPMI 1640 с HEPES и LГлутамином (Gibco 22400) + 1 мМ Пирувата натрия (Gibco 11360)+ 10% ФБС (Hyclone SH30071.03) RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (Gibco 22400) + 1 mM Sodium pyruvate (Gibco 11360) + 10% PBS (Hyclone SH30071.03)

Эти данные показывают, что соединение примера I ингибирует рост линий раковых клеток in vitro из различных гистологий, включая толстую кишку, молочную железу, легкое, яичник и желудок, с зависимостью от дозы.These data show that the compound of Example I inhibits the growth of cancer cell lines in vitro from various histologies including colon, breast, lung, ovary and stomach in a dose dependent manner.

Модель ксенотрансплантата опухоли.Tumor xenograft model.

Цель данного анализа заключается в измерении уменьшения объема опухоли в ответ на соединение примера 1. Для оценки эффективности тестируемого соединения in vivo использовали несколько моделей ксенотрансплантата опухолей. Вкратце, 5-10 х 106 опухолевых клеток в смеси 1:1 MATRIGEL® (общий объем 0,2 мл) вводили подкожно самкам бестимусных мышей (Envigo, Harlan laboratories) для большинства моделей ксенотрансплантата опухолей. Альтернативные штаммы мышей использовали для создания ксенотрансплантатов MDAMB468 (NOD SCID Gamma, Jackson), CT26 и EMT6 (BALB/c, Envigo, Harlan Laboratories). После того как опухоли достигали желаемого размера ~ 300-500 мм3, животных рандомизировали в группы по 6-8 для исследований эффективности. Тестируемое соединение вводили через оральный зонд (ПО) при указанных дозах и графиках. Рост опухоли и массу тела контролировали с течением времени для оценки эффективности и признаков токсичности.The purpose of this assay is to measure tumor volume reduction in response to the compound of Example 1. Several tumor xenograft models were used to evaluate in vivo efficacy of a test compound. Briefly, 5-10 x 10 6 tumor cells in a 1:1 mixture of MATRIGEL® (total volume 0.2 ml) were injected subcutaneously in female nude mice (Envigo, Harlan laboratories) for most tumor xenograft models. Alternative mouse strains were used to create xenografts MDAMB468 (NOD SCID Gamma, Jackson), CT26 and EMT6 (BALB/c, Envigo, Harlan Laboratories). Once tumors had reached the desired size of ~300-500 mm 3 , animals were randomized into groups of 6-8 for efficacy studies. The test compound was administered via oral gavage (PO) at the indicated doses and schedules. Tumor growth and body weight were monitored over time to evaluate efficacy and signs of toxicity.

Тестируемое соединение составляли в 5% N-метил-2-пирролидона (НМП) в 1% гидроксиэтилцеллюлозы, 0,25% полисорбата 80, 0,05% противовспенивающего агента в очищенной воде (HEC) и вводили перорально через зонд (конечный объем 0,2 мл) при дозах, указанных в табл. 4. Тестируемое соединение составляли еженедельно и хранили при 4°C. Носители вводили контрольным группам в соответствии с графиками, использованными выше, используя объем 0,2 мл на дозу. Мышам вводили дозу через оральный зонд, а образцы опухоли собирали при прекращении и хранили при -80°C.The test compound was formulated in 5% N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) in 1% hydroxyethyl cellulose, 0.25% polysorbate 80, 0.05% antifoam in purified water (HEC) and administered orally via gavage (final volume 0. 2 ml) at the doses indicated in the table. 4. Test compound was made up weekly and stored at 4°C. Vehicles were administered to control groups according to the schedules used above, using a volume of 0.2 ml per dose. Mice were dosed via oral gavage and tumor samples were collected at termination and stored at -80°C.

Размер опухоли и массу тела регистрировали и анализировали раз в две недели. Кровь собирали с использованием карты DBS (сухое пятно крови) через 2 ч после введения дозы и при прекращении. Опухоли собирали при прекращении исследования, разрезали на 3 секции и либо мгновенно замораживали для анализа белка и экспозиции, либо помещали в RNAlater® для анализа РНК. Образцы тканей замораживали и хранили при -80°C.Tumor size and body weight were recorded and analyzed biweekly. Blood was collected using a DBS (dry blood spot) chart 2 hours post-dose and at discontinuation. Tumors were harvested at termination of the study, cut into 3 sections and either flash frozen for protein analysis and exposure or placed in RNAlater® for RNA analysis. Tissue samples were frozen and stored at -80°C.

Соединение примера 1 демонстрирует значительную противоопухолевую активность на моделях ксенотрансплантата рака человека (табл. 3).Example 1 demonstrates significant antitumor activity in human cancer xenograft models (Table 3).

- 26 039950- 26 039950

Таблица 3. Резюме эффективности in vivo одиночного агента примера 1 (AT/C) в различных моделяхTable 3 Summary of In Vivo Efficacy of Example 1 Single Agent (AT/C) in Various Models

ксенотрансплантата опухолей, п tumor xenograft, p ротестированных при различных уровнях дозы, как указано tested at various dose levels as indicated Модель Model Г истология Histology Мутации Mutations Доза Примера 1 (мг/кг) Dose of Example 1 (mg/kg) График Schedule Cp. ΔΤ/C cp. ΔΤ/C А2780 A2780 Яичник Ovary ARID! А ARID! BUT 20 20 QDx35 QDx35 -41 -41 COLO205 COLO205 Яичник Ovary 20 20 QDx28 QDx28 -4 -4 СТ26 ST26 Колоректальная colorectal 20 20 QDx24 QDx24 52 52 ЕМТ6 EMT6 Молочная железа Breast 20 20 QDx28 QDx28 17 17 Н441 H441 Легкое Lung 20 20 QDx35 QDx35 0 0 Н460 H460 Легкое Lung ARID! А ARID! BUT 20 20 QDx35 QDx35 16 sixteen НСС1806 NSS1806 Молочная железа Breast КМТ2С KMT2S 20 20 QDx28 QDx28 -87 -87 НСТ116 NST116 Колоректальная colorectal КМТ2С KMT2S 25 25 QDx21 QDx21 -17 -17 MDAMB468 MDAMB468 Молочная железа Breast ARID1A, RB1 ARID1A, RB1 20 20 QDx28 QDx28 -91 -91 MIAPACA2 MIAPACA2 Поджелудочная железа Pancreas ARID! А ARID! BUT 20 20 QDx35 QDx35 10 ten MKN45 MKN45 Желудок Stomach КМТ2С KMT2S 20 20 QDx35 QDx35 57 57 MDAMB231 MDAMB231 Молочная железа Breast 20 20 QDx35 QDx35 -25 -25

ΔT/C% рассчитывали, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли. Формула представляет собой 100*(T-T0)/(C-C0). Здесь T и C являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. T0 и C0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах. *: Значимо (p<0,05).ΔT/C% was calculated when the final tumor volume in the treated group was at or above the initial tumor volume. The formula is 100*(T-T0)/(C-C0). Here, T and C are the mean final tumor volumes in the treated or control group, respectively. T0 and C0 are the average initial volumes of tumors in these groups. *: Significant (p<0.05).

Исследование биомаркеров.Research of biomarkers.

Целью данного исследования является оценка потенциальных прогностических биомаркеров для соединений по данному изобретению.The aim of this study is to evaluate potential predictive biomarkers for the compounds of this invention.

Линии раковых клеток профилировали для оценки антипролиферативной активности тестируемого соединения in vitro. Информация о мутациях, количестве копий и экспрессии генов ARID1A, KMT2C, KMT2D и/или RB1 в линиях раковых клеток получена из базы данных COSMIC (cancer.sanger.ac.uk) и cBioportal (http://www.cbioportal.org/). Клетки культивировали в культуральной среде и высевали в 96луночный планшет в 100 мкл/лунку культуральной среды при 5000 клеток/лунку, затем инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение ночи. Клетки культивировали с использованием сред и условий, рекомендуемых поставщиком, хорошо известных в данной области техники, например, с RPMI 1640 с добавлением или без HEPES и L-глутамина (Thermo SH30255.01) и 1 мМ пирувата натрия и 10% ФСБ (Gibco № кат 10082). Планшет для промежуточного разведения 1000X готовили путем приготовления 10 мМ рабочего раствора тестируемого образца в ДМСО и выполнения разведений 1:3 в ДМСО для 10 точек. Планшет для дозирования 10X готовили путем добавления 2 мкл из планшета для промежуточного разведения 1000X к 198 мкл OPTIMEM® + 10% ФБС и тщательного перемешивания. Клеточный планшет затем обрабатывали путем добавления 11 мкл из дозирующего планшета 10X в клеточный планшет 100 мкл/лунку для конечной концентрации IX. Стауроспорин использовали в качестве максимального контроля ингибирования роста в конечной концентрации 5 мкМ. Клеточные планшеты инкубировали в течение 7 дней при 37°C, 5% CO2. Через семь дней после обработки буфер для анализа Cell Titer-Glo® (Promega № кат G7571) и субстрат вынимали из -20°C и оставляли для уравновешивания до комнатной температуры. Буфер для анализа добавляли к субстрату и осторожно перемешивали. Реагент CELL TITER-GLO® (100 мкл/лунку) добавляли в клеточный планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Через 15 мин люминесценцию считывали с помощью планшет-ридера. Данные анализировали в Excel и строили график в GraphPad Prism. Статистический анализ и значение р рассчитывали с использованием непараметрических t-тестов Манна-Уитни с использованием GraphPad Prism.Cancer cell lines were profiled to evaluate the antiproliferative activity of the test compound in vitro. Information on mutations, copy number and expression of ARID1A, KMT2C, KMT2D and/or RB1 genes in cancer cell lines obtained from the COSMIC database (cancer.sanger.ac.uk) and cBioportal (http://www.cbioportal.org/) . Cells were cultured in culture medium and seeded in a 96-well plate in 100 μl/well of culture medium at 5000 cells/well, then incubated at 37° C., 5% CO 2 overnight. Cells were cultured using vendor-recommended media and conditions well known in the art, such as RPMI 1640 with or without HEPES and L-glutamine (Thermo SH30255.01) and 1 mM sodium pyruvate and 10% PBS (Gibco no. cat 10082). A 1000X intermediate dilution plate was prepared by preparing a 10 mM test sample working solution in DMSO and making 1:3 dilutions in DMSO for 10 points. A 10X dosing plate was prepared by adding 2 µl from the 1000X intermediate dilution plate to 198 µl of OPTIMEM® + 10% FBS and mixing thoroughly. The cell plate was then processed by adding 11 μl from the 10X dosing plate to the 100 μl/well cell plate for a final concentration of IX. Staurosporine was used as the maximum growth inhibition control at a final concentration of 5 μM. Cell plates were incubated for 7 days at 37°C, 5% CO 2 . Seven days after treatment, Cell Titer-Glo® assay buffer (Promega cat no. G7571) and substrate were removed from -20° C. and left to equilibrate to room temperature. Assay buffer was added to the substrate and mixed gently. CELL TITER-GLO® reagent (100 µl/well) was added to the cell plate and incubated at room temperature for 15 min. After 15 min, luminescence was read using a plate reader. The data was analyzed in Excel and plotted in GraphPad Prism. Statistical analysis and p value were calculated using non-parametric Mann-Whitney t-tests using GraphPad Prism.

Резюме данных о пролиферации показано в табл. 4. Антипролиферативные эффекты тестируемого соединения подразделяются на нечувствительный (IC50 > 1 мкМ), цитостатический (IC50 <1 мкМ и % ингибирования <70%) или цитотоксический (IC50 <1 мкМ и% ингибирования > 70%). Клеточные линии, несущие мутации инактивации или потери функции (LOF) в гене ARID1A, KMT2C, KMT2D или RB1, продемонстрировали значительно более высокий цитотоксический ответ на пример 1 по сравнению сA summary of the proliferation data is shown in Table 1. 4. The antiproliferative effects of the test compound are classified as insensitive (IC 50 > 1 μM), cytostatic (IC 50 < 1 μM and % inhibition <70%) or cytotoxic (IC 50 < 1 μM and % inhibition > 70%). Cell lines carrying inactivation or loss of function (LOF) mutations in the ARID1A, KMT2C, KMT2D, or RB1 gene showed a significantly higher cytotoxic response to Example 1 compared to

- 27 039950 остальными клеточными линиями в панели (табл. 5). Напротив, клеточные линии без потери функции демонстрировали более высокий (%) цитостатический ответ в ответ на пример 1.- 27 039950 other cell lines in the panel (Table 5). In contrast, cell lines without loss of function showed a higher (%) cytostatic response in response to example 1.

Кроме того, ряд моделей ксенотрансплантата опухолей, несущих данные мутации, использовали для оценки эффективности примера 1 в качестве монотерапии (табл. 3).In addition, a number of tumor xenograft models carrying these mutations were used to evaluate the efficacy of Example 1 as monotherapy (Table 3).

Резюме исследований эффективности и противоопухолевой активности (AT/C) показано в табл. 3. Пример 1 продемонстрировал высокую эффективность на различных моделях опухолей, причем значительные регрессии отмечены на моделях опухолей, содержащих мутации в генах ARID1A, KMT2C или RB1. Взятые вместе, данные результаты показывают, что инактивирующие мутации в гене ARID1A, KMT2C, KMT2D или RB1 представляют потенциальную стратегию отбора пациентов для лечения с помощью примера 1 при множественных типах рака.A summary of efficacy and antitumor activity (AT/C) studies is shown in Table 1. 3. Example 1 demonstrated high efficiency in various tumor models, with significant regressions noted in tumor models containing mutations in the ARID1A, KMT2C or RB1 genes. Taken together, these results indicate that inactivating mutations in the ARID1A, KMT2C, KMT2D, or RB1 gene represent a potential strategy for selecting patients for treatment with Example 1 in multiple types of cancer.

Таблица 4. Резюме антипролиферативного log-GI50 (нМ) и ингибирования роста (%) примера 1 в различных линиях раковых клеток, как указаноTable 4 Summary of Antiproliferative Log-GI 50 (nM) and Growth Inhibition (%) of Example 1 in Various Cancer Cell Lines as Indicated

Клеточна я Линия Cell Line Информац ия о Среде Environment Information Гистология Histology Антипролиферативный эффект Antiproliferative effect LOFМутации в Гене(генах) LOFMutations in the Gene(s) ICso (мкМ) ICso (µM) % Инг. % Ing. Результат Result ARID1A ARID1A КМТ2С KMT2S KMT2D KMT2D RB1 RB1 22RV1 22RV1 А BUT ПРОСТАТА PROSTATE 0,028 0.028 77 77 Цитотокси ческий Cytotoxic Да Yes А2058 A2058 В AT КОЖА LEATHER 0,030 0.030 97 97 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd А2780 A2780 С With яичник ovary 0,052 0.052 74 74 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd А375 A375 в in КОЖА LEATHER 0,055 0.055 86 86 Цитотокси ческий Cytotoxic А549 A549 D D ЛЕГКОЕ LUNG 0,139 0.139 64 64 Цитостати ческий Cytostatic А673 A673 В AT КОСТИ BONES 0,014 0.014 96 96 Цитотокси ческий Cytotoxic AN3CA AN3CA Е E ЭНДОМЕТР ИЙ ENDOMETRIUM 0,050 0.050 67 67 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd AZ521 AZ521 F F ЖЕЛУДОК STOMACH 0,036 0.036 76 76 Цитотокси ческий Cytotoxic ВТ20 BT20 В AT МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,373 0.373 45 45 Цитостати ческий Cytostatic СЗЗА SPZA F F ЭНДОМЕТР ИЙ ENDOMETRIUM 0,014 0.014 79 79 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd САСО2 CACO2 В AT КИШКИ GUTS 0,189 0.189 60 60 Цитостати ческий Cytostatic CAOV3 CAOV3 В AT ЯИЧНИК OVARY 0,019 0.019 96 96 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd CCRFCEM CCRFCEM С With КРОВЬ BLOOD 0,040 0.040 96 96 Цитотокси ческий Cytotoxic COLO201 COLO201 с with кишки guts 0,123 0.123 61 61 Цитостати ческий Cytostatic COLO320 COLO320 С+ 0,8 мкг/мл Пуромицин а C+ 0.8 µg/ml Puromycin a кишки guts 0,189 0.189 73 73 Цитотокси ческий Cytotoxic CORL311 CORL311 С With ЛЕГКОЕ LUNG 0,095 0.095 75 75 Цитотокси ческий Cytotoxic CORL88 CORL88 С With ЛЕГКОЕ LUNG 4,200 4,200 34 34 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd СОУЗ 18 SOUZ 18 С With ЯИЧНИК OVARY >10 >10 40 40 Нечувстви тельный Insensitive

- 28 039950- 28 039950

CT26 CT26 C + 0,8 мкг/мл Пуромицин a C + 0.8 µg/ml Puromycin a кишки guts >10 >10 -47 -47 Нечувстви тельный Insensitive DMS114 DMS114 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,014 0.014 65 65 Цитостати ческий Cytostatic DMS273 DMS273 G G ЛЕГКОЕ LUNG 0,019 0.019 80 80 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd DMS53 DMS53 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,118 0.118 66 66 Цитостати ческий Cytostatic DMS79 DMS79 C + 0,8 мкг/мл Пуромицин a C + 0.8 µg/ml Puromycin a ЛЕГКОЕ LUNG 0,354 0.354 50 fifty Цитостати ческий Cytostatic Дд dd DU145 DU145 F F ПРОСТАТА PROSTATE 0,036 0.036 74 74 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd EBC1 EBC1 C + 1 мкг/мл Пуромицин a C + 1 µg/ml Puromycin a ЛЕГКОЕ LUNG 0,047 0.047 83 83 Цитотокси ческий Cytotoxic EGL1 EGL1 H H 0,041 0.041 95 95 Цитотокси ческий Cytotoxic EVSAT EVSAT G + 2 мкг/мл Пуромицин a G + 2 µg/ml Puromycin a МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА DAIRY GLAND 0,040 0.040 79 79 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd GL261 GL261 C C ГОЛОВНОЙ мозг Brain 0,038 0.038 85 85 Цитотокси ческий Cytotoxic HCC1143 HCC1143 C C МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST >10 >10 37 37 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd HCC1187 HCC1187 I I МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,027 0.027 73 73 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd HCC1569 HCC1569 C C МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА DAIRY GLAND 0,067 0.067 45 45 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd HCC1806 HCC1806 C C МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,014 0.014 99 99 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd HCC2218 HCC2218 C C МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА DAIRY GLAND 0,560 0.560 41 41 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd HCC4006 HCC4006 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,028 0.028 57 57 Цитостати ческий Cytostatic HCC44 HCC44 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,131 0.131 48 48 Цитостати ческий Cytostatic HCC70 HCC70 I I МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,038 0.038 89 89 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd HCC827 HCC827 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,055 0.055 69 69 Цитостати ческий Cytostatic HCT116 HCT116 J J КИШКИ GUTS 0,041 0.041 88 88 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd HCT8 HCT8 C C КИШКИ GUTS 0,981 0.981 3 3 Цитостати ческий Cytostatic HEC108 HEC108 F F ЭНДОМЕТР ИЙ ENDOMETRIUM 0,031 0.031 90 90 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd HEC1A HEC1A J J ЭНДОМЕТР ИЙ ENDOMETRIUM 0,162 0.162 56 56 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd Дд dd HEP3B217 HEP3B217 F F ПЕЧЕНЬ LIVER 0,033 0.033 66 66 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd HEPG2 HEPG2 F F ПЕЧЕНЬ LIVER 0,028 0.028 78 78 Цитотокси ческий Cytotoxic HEYA8 HEYA8 C C ЯИЧНИК OVARY 0,112 0.112 89 89 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd Дд dd HGC27 HGC27 F F ЖЕЛУДОК STOMACH 0,068 0.068 78 78 Цитотокси ческий Cytotoxic HL60 HL60 C C КРОВЬ BLOOD 0,045 0.045 87 87 Цитотокси ческий Cytotoxic HLE HLE В AT ПЕЧЕНЬ LIVER 0,030 0.030 77 77 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd HLF HLF в in ПЕЧЕНЬ LIVER 0,017 0.017 100 100 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd

- 29 039950- 29 039950

HOS HOS C C кости bones 0,090 0.090 72 72 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd HS294T HS294T К To КОЖА LEATHER 0,020 0.020 84 84 Цитотокси ческий Cytotoxic HS766T HS766T L L ПОДЖЕЛУД ОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА PANCREAS 0,062 0.062 72 72 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd НТ NT C C КРОВЬ BLOOD 0,131 0.131 64 64 Цитостати ческий Cytostatic HT1197 HT1197 E E МОЧЕВАЯ URINARY 0,281 0.281 55 55 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd Дд dd HUH1 HUH1 M M ПЕЧЕНЬ LIVER 0,128 0.128 72 72 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd HUH28 HUH28 A A БИЛИАРНАЯ BILIARY 2,896 2,896 32 32 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd Дд dd HUH7 HUH7 N N ПЕЧЕНЬ LIVER 0,175 0.175 64 64 Цитостати ческий Cytostatic IGROV1 IGROV1 C C ЯИЧНИК OVARY 0,072 0.072 70 70 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd IMR32 IMR32 0 0 ЦНС CNS 0,002 0.002 100 100 Цитотокси ческий Cytotoxic Да Yes JHH4 JHH4 В AT ПЕЧЕНЬ LIVER 0,166 0.166 65 65 Цитостати ческий Cytostatic JHH7 JHH7 c c ПЕЧЕНЬ LIVER 0,027 0.027 88 88 Цитотокси ческий Cytotoxic JURKAT JURKAT P P КРОВЬ BLOOD 0,061 0.061 98 98 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd K562 K562 c c КРОВЬ BLOOD >10 >10 -191 -191 Нечувстви тельный Insensitive KarpasllO 6 KarpasllO 6 c c КРОВЬ BLOOD 0,026 0.026 98 98 Цитотокси ческий Cytotoxic KARPAS2 99 KARPAS2 99 c c КРОВЬ BLOOD 0,069 0.069 78 78 Цитотокси ческий Cytotoxic KE97 KE97 c c КРОВЬ BLOOD 0,158 0.158 58 58 Цитостати ческий Cytostatic KELLY KELLY c c ЦНС CNS 0,058 0.058 80 80 Цитотокси ческий Cytotoxic KLE KLE Q Q ЭНДОМЕТР ИЙ ENDOMETRIUM 0,028 0.028 65 65 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd Дд dd KP4 KP4 L L ПОДЖЕЛУД ОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА PANCREAS 0,036 0.036 65 65 Цитостати ческий Cytostatic KPL1 KPL1 G + 2 мкг/мл Пуромицин a G + 2 µg/ml Puromycin a МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА DAIRY GLAND 0,668 0.668 43 43 Цитостати ческий Cytostatic KURAMO CHI KURAMO CHI C C ЯИЧНИК OVARY 0,052 0.052 88 88 Цитотокси ческий Cytotoxic KYSE150 KYSE150 R R ПИЩЕВОД ESOPHAGUS 0,042 0.042 64 64 Цитостати ческий Cytostatic KYSE180 KYSE180 C C ПИЩЕВОД ESOPHAGUS 0,103 0.103 68 68 Цитостати ческий Cytostatic KYSE270 KYSE270 R R ПИЩЕВОД ESOPHAGUS >10 >10 -180 -180 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd KYSE30 KYSE30 S S ПИЩЕВОД ESOPHAGUS 0,076 0.076 76 76 Цитотокси ческий Cytotoxic KYSE520 KYSE520 c c ПИЩЕВОД ESOPHAGUS >10 >10 50 fifty Нечувстви тельный Insensitive KYSE70 KYSE70 c c ПИЩЕВОД ESOPHAGUS 0,126 0.126 70 70 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd LI7 LI7 M M ПЕЧЕНЬ LIVER 0,132 0.132 76 76 Цитотокси ческий Cytotoxic LN18 LN18 T T ЦНС CNS 0,015 0.015 91 91 Цитотокси ческий Cytotoxic Да Yes LN229 LN229 T T ЦНС CNS 0,036 0.036 63 63 Цитостати ческий Cytostatic LNCAP LNCAP P P ПРОСТАТА PROSTATE 0,059 0.059 74 74 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd

- 30 039950- 30 039950

LS411N LS411N C C КИШКИ GUTS 1,000 1,000 45 45 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd Дд dd M14 M14 L L КОЖА LEATHER 0,032 0.032 85 85 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd MCF7 MCF7 F F МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,155 0.155 58 58 Цитостати ческий Cytostatic MDAMB1 57 MDAMB1 57 P P МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,866 0.866 39 39 Цитостати ческий Cytostatic MDAMB2 31 MDAMB2 31 u u МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 2,816 2.816 23 23 Нечувстви тельный Insensitive MDAMB4 53 MDAMB4 53 и and МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА DAIRY GLAND 0,039 0.039 56 56 Цитостати ческий Cytostatic MDAMB4 68 MDAMB4 68 в in МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,008 0.008 100 100 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Да Yes MDАРСА 2B MDARSA 2B и and ПРОСТАТА PROSTATE 6,273 6.273 17 17 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd MDST8 MDST8 в in кишки guts 0,049 0.049 88 88 Цитотокси ческий Cytotoxic MHCC97H MHCC97H V V ПЕЧЕНЬ LIVER 0,243 0.243 59 59 Цитостати ческий Cytostatic MHCC97L MHCC97L V V ПЕЧЕНЬ LIVER 0,526 0.526 45 45 Цитостати ческий Cytostatic MKN1 MKN1 с with ЖЕЛУДОК STOMACH 0,023 0.023 80 80 Цитотокси ческий Cytotoxic MKN45 MKN45 с with ЖЕЛУДОК STOMACH 0,056 0.056 79 79 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd MKN7 MKN7 с with ЖЕЛУДОК STOMACH >10 >10 39 39 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd MKN74 MKN74 с with ЖЕЛУДОК STOMACH 0,073 0.073 71 71 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd MOLT4 MOLT4 с with КРОВЬ BLOOD 0,040 0.040 99 99 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd MX1 MX1 с with МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,045 0.045 72 72 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd NCIH1048 NCIH1048 W W ЛЕГКОЕ LUNG 0,004 0.004 95 95 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd NCIH1092 NCIH1092 с with ЛЕГКОЕ LUNG 0,683 0.683 42 42 Цитостати ческий Cytostatic NCIH1155 NCIH1155 в in ЛЕГКОЕ LUNG 0,043 0.043 51 51 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd NCIH1299 NCIH1299 А BUT ЛЕГКОЕ LUNG 0,195 0.195 44 44 Цитостати ческий Cytostatic NCIH1436 NCIH1436 с with ЛЕГКОЕ LUNG 0,195 0.195 56 56 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd NCIH146 NCIH146 С+ 0,8 мкг/мл Пуромицин а C+ 0.8 µg/ml Puromycin a ЛЕГКОЕ LUNG 0,030 0.030 77 77 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd NCIH1666 NCIH1666 С With ЛЕГКОЕ LUNG 0,161 0.161 59 59 Цитостати ческий Cytostatic NCIH1703 NCIH1703 С With ЛЕГКОЕ LUNG 0,040 0.040 92 92 Цитотокси ческий Cytotoxic NCIH1734 NCIH1734 С With ЛЕГКОЕ LUNG 0,024 0.024 76 76 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd NCIH1975 NCIH1975 С With ЛЕГКОЕ LUNG 0,021 0.021 90 90 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd NCIH2030 NCIH2030 X X ЛЕГКОЕ LUNG 5,374 5.374 9 nine Нечувстви тельный Insensitive NCIH2081 NCIH2081 W W ЛЕГКОЕ LUNG 0,442 0.442 44 44 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd Да Yes NCIH209 NCIH209 С+ 0,8 мкг/мл Пуромицин а C+ 0.8 µg/ml Puromycin a ЛЕГКОЕ LUNG 0,040 0.040 83 83 Цитотокси ческий Cytotoxic NCIH2122 NCIH2122 С With ЛЕГКОЕ LUNG 0,078 0.078 85 85 Цитотокси ческий Cytotoxic NCIH2196 NCIH2196 С With ЛЕГКОЕ LUNG 0,123 0.123 63 63 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd

- 31 039950- 31 039950

NCIH2228 NCIH2228 c c ЛЕГКОЕ LUNG 0,276 0.276 57 57 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd NCIH226 NCIH226 c c ЛЕГКОЕ LUNG 1,197 1.197 43 43 Нечувстви тельный Insensitive NCIH2347 NCIH2347 C + 0,8 мкг/мл Пуромицин a C + 0.8 µg/ml Puromycin a ЛЕГКОЕ LUNG 0,661 0.661 45 45 Цитостати ческий Cytostatic NCIH358 NCIH358 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,042 0.042 93 93 Цитотокси ческий Cytotoxic NCIH441 NCIH441 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,014 0.014 84 84 Цитотокси ческий Cytotoxic NCIH446 NCIH446 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,013 0.013 95 95 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Да Yes NCIH460 NCIH460 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,047 0.047 97 97 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd NCIH520 NCIH520 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,082 0.082 77 77 Цитотокси ческий Cytotoxic NCIH522 NCIH522 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,107 0.107 50 fifty Цитостати ческий Cytostatic NCIH524 NCIH524 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,037 0.037 92 92 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd NCIH526 NCIH526 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,018 0.018 94 94 Цитотокси ческий Cytotoxic NCIH596 NCIH596 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,922 0.922 46 46 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd NCIH69 NCIH69 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,173 0.173 68 68 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd NCIH727 NCIH727 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,117 0.117 56 56 Цитостати ческий Cytostatic NCIH82 NCIH82 C C ЛЕГКОЕ LUNG 0,699 0.699 22 22 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd NIHOVCA R3 NIHOVCA R3 Y Y ЯИЧНИК OVARY 0,040 0.040 96 96 Цитотокси ческий Cytotoxic NUGC3 NUGC3 c c ЖЕЛУДОК STOMACH 0,030 0.030 81 81 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd Дд dd NUGC4 NUGC4 c c ЖЕЛУДОК STOMACH 0,019 0.019 83 83 Цитотокси ческий Cytotoxic OAW42 OAW42 z z ЯИЧНИК OVARY 0,136 0.136 88 88 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd OCUM1 OCUM1 N N ЖЕЛУДОК STOMACH 0,027 0.027 82 82 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd OV90 OV90 c c ЯИЧНИК OVARY 0,034 0.034 61 61 Цитостати ческий Cytostatic OVCAR5 OVCAR5 Y Y яичник ovary 0,086 0.086 74 74 Цитотокси ческий Cytotoxic OVCAR8 OVCAR8 c c яичник ovary 0,065 0.065 90 90 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd OZ oz AA AA ПЕЧЕНЬ LIVER 0,050 0.050 77 77 Цитотокси ческий Cytotoxic PANCI PANCI L L ПОДЖЕЛУД ОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА PANCREAS 0,071 0.071 47 47 Цитостати ческий Cytostatic PATU8988 T PATU8988T C C ПОДЖЕЛУД ОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА PANCREAS 0,201 0.201 55 55 Цитостати ческий Cytostatic PLCPRF5 PLCPRF5 BB BB ПЕЧЕНЬ LIVER >10 >10 41 41 Нечувстви тельный Insensitive Raw264.7 Raw264.7 c c 0,355 0.355 62 62 Цитостати ческий Cytostatic RKO RKO в in КИШКИ GUTS 0,118 0.118 61 61 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd RT112 RT112 P P МОЧЕВАЯ URINARY 0,032 0.032 87 87 Цитотокси ческий Cytotoxic SAOS2 SAOS2 cc cc КОСТИ BONES 0,028 0.028 66 66 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd SH10TC SH10TC c c ЖЕЛУДОК STOMACH 0,147 0.147 58 58 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd

- 32 039950- 32 039950

SHSY5Y SHSY5Y DD DD ЦНС CNS 0,059 0.059 95 95 Цитотокси ческий Cytotoxic SiHa Siha F F ЭНДОМЕТР ИЙ ENDOMETRIUM 0,105 0.105 58 58 Цитостати ческий Cytostatic SJRH30 SJRH30 C C МЯГКИЕ ТКАНИ SOFT FABRICS 0,039 0.039 62 62 Цитостати ческий Cytostatic SKHEP1 SKHEP1 BB BB ПЕЧЕНЬ LIVER 0,118 0.118 71 71 Цитотокси ческий Cytotoxic SKMEL28 SKMEL28 в in КОЖА LEATHER 0,098 0.098 61 61 Цитостати ческий Cytostatic SKMES1 SKMES1 F F ЛЕГКОЕ LUNG 0,028 0.028 80 80 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd SKOV3 SKOV3 J J яичник ovary >10 >10 27 27 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd SKUT1 SKUT1 E E МЯГКИЕ ТКАНИ SOFT FABRICS 0,041 0.041 89 89 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Да Yes SNU1 SNU1 C C ЖЕЛУДОК STOMACH 0,105 0.105 68 68 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd Дд dd SNU1079 SNU1079 EE EE БИЛИАРНАЯ BILIARY 0,038 0.038 89 89 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd SNU1196 SNU1196 EE EE БИЛИАРНАЯ BILIARY 0,043 0.043 68 68 Цитостати ческий Cytostatic SNU16 SNU16 C C ЖЕЛУДОК STOMACH 0,017 0.017 84 84 Цитотокси ческий Cytotoxic Да Yes SNU245 SNU245 EE EE БИЛИАРНАЯ BILIARY 1,089 1.089 -5 -5 Нечувстви тельный Insensitive SNU308 SNU308 EE EE БИЛИАРНАЯ BILIARY 0,184 0.184 61 61 Цитостати ческий Cytostatic SNU387 SNU387 X X ПЕЧЕНЬ LIVER >10 >10 12 12 Нечувстви тельный Insensitive SNU398 SNU398 M M ПЕЧЕНЬ LIVER 0,021 0.021 85 85 Цитотокси ческий Cytotoxic SNU423 SNU423 M M ПЕЧЕНЬ LIVER >10 >10 40 40 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd SNU449 SNU449 c c ПЕЧЕНЬ LIVER 1,521 1.521 8 eight Нечувстви тельный Insensitive Дд dd SNU475 SNU475 M M ПЕЧЕНЬ LIVER 3,917 3.917 28 28 Нечувстви тельный Insensitive SNU478 SNU478 EE EE БИЛИАРНАЯ BILIARY 0,032 0.032 92 92 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd SNU5 SNU5 FF FF ЖЕЛУДОК STOMACH 0,039 0.039 79 79 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd SNU739 SNU739 C C ПЕЧЕНЬ LIVER >10 >10 47 47 Нечувстви тельный Insensitive SNU869 SNU869 EE EE БИЛИАРНАЯ BILIARY 0,052 0.052 60 60 Цитостати ческий Cytostatic SW1271 SW1271 U U ЛЕГКОЕ LUNG 0,024 0.024 67 67 Цитостати ческий Cytostatic SW48 SW48 U U КИШКИ GUTS 0,005 0.005 89 89 Цитотокси ческий Cytotoxic Да Yes Дд dd SW480 SW480 U U КИШКИ GUTS 0,036 0.036 90 90 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd SW626 SW626 U U 1,105 1.105 39 39 Нечувстви тельный Insensitive SW780 SW780 U U МОЧЕВАЯ URINARY 0,074 0.074 68 68 Цитостати ческий Cytostatic SW837 SW837 U U КИШКИ GUTS 0,068 0.068 55 55 Цитостати ческий Cytostatic SW900 SW900 U U ЛЕГКОЕ LUNG 3,806 3.806 13 thirteen Нечувстви тельный Insensitive T47D T47D GG GG МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,045 0.045 68 68 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd T84 T84 HH HH КИШКИ GUTS 0,308 0.308 61 61 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd T98G T98G 0 0 ЦНС CNS 1,371 1.371 44 44 Нечувстви тельный Insensitive TCCSUP TCCSUP E E МОЧЕВАЯ URINARY 0,040 0.040 61 61 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd

- 33 039950- 33 039950

TFK1 TFK1 II II БИЛИАРНАЯ BILIARY 0,040 0.040 87 87 Цитотокси ческий Cytotoxic TGW TGW 0 0 ГОЛОВНОЙ МОЗГ HEAD BRAIN 0,070 0.070 63 63 Цитостати ческий Cytostatic THP1 THP1 C C КРОВЬ BLOOD 0,042 0.042 81 81 Цитотокси ческий Cytotoxic TOV112D TOV112D JJ JJ яичник ovary 0,025 0.025 81 81 Цитотокси ческий Cytotoxic TOV21G TOV21G C C яичник ovary 0,061 0.061 73 73 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd Дд dd TYKNU TYKNU 0 0 яичник ovary 0,072 0.072 83 83 Цитотокси ческий Cytotoxic Дд dd U118MG U118MG В AT цнс cns 1,170 1.170 42 42 Нечувстви тельный Insensitive U87MG U87MG 0 0 цнс cns 7,356 7.356 -5 -5 Нечувстви тельный Insensitive UACC812 UACC812 и and МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,076 0.076 58 58 Цитостати ческий Cytostatic Дд dd UACC893 UACC893 и and МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 4,150 4.150 -51 -51 Нечувстви тельный Insensitive Дд dd UMUC3 UMUC3 E E МОЧЕВАЯ URINARY 0,161 0.161 70 70 Цитотокси ческий Cytotoxic ZR751 ZR751 С With МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА BREAST 0,043 0.043 69 69 Цитостати ческий Cytostatic

A. RPMI 1640 (Gibco 11835, Gibco 22400-089, или Hyclone № кат SH30027 ) + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)A. RPMI 1640 (Gibco 11835, Gibco 22400-089, or Hyclone cat no. SH30027) + 10% FBS (Gibco cat no. 10082)

В. DMEM c L-Глутамином (Thermo № кат SH30022) + NaPyr + NEAA + HEPES + 10% ФБС (Gibco № кат 10082) C. RPMI 1640 c HEPES и L-Глутамином (Gibco 22400) + 1 мМ Пирувата натрия + 10% ФБС (Gibco № кат 10082) D. Среда F-12K (№ кат 30-2004) + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)B. DMEM with L-Glutamine (Thermo Cat No. SH30022) + NaPyr + NEAA + HEPES + 10% FBS (Gibco Cat No. 10082) C. RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (Gibco 22400) + 1 mM Sodium pyruvate + 10 % FBS (Gibco cat no. 10082) D. F-12K medium (cat no. 30-2004) + 10% FBS (Gibco cat no. 10082)

Е. EMEM (CellGro № кат 17-305-CV) + L-Глутамин + Пируват натрия + Гидрокарбонат натрия + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)E. EMEM (CellGro Cat No. 17-305-CV) + L-Glutamine + Sodium Pyruvate + Sodium Bicarbonate + 10% FBS (Gibco Cat No. 10082)

F. EMEM (CellGro № кат 17-305-CV) + L-Глутамин + Пируват натрия + Гидрокарбонат натрия + NEAA + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)F. EMEM (CellGro Cat No. 17-305-CV) + L-Glutamine + Sodium Pyruvate + Sodium Bicarbonate + NEAA + 10% PBS (Gibco Cat No. 10082)

G. DMEM (Gibco 11995) + 1 мМ Пирувата натрия + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)G. DMEM (Gibco 11995) + 1 mM sodium pyruvate + 10% PBS (Gibco cat no. 10082)

Н. DMEM С Высоким содержанием глюкозы (Hyclone № кат SH30022) + 10 % ИН ФБС (Gibco № кат 10082) + IX NEAA (Hyclone SH30328)H. DMEM High Glucose (Hyclone Cat # SH30022) + 10% IN PBS (Gibco Cat # 10082) + IX NEAA (Hyclone SH30328)

I. Модифицированный АТСС RPMI 1640 (Gibco А1049101) + 1 мМ Пирувата натрия + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)I. Modified ATCC RPMI 1640 (Gibco A1049101) + 1 mM Sodium Pyruvate + 10% PBS (Gibco cat no. 10082)

J. McCoy's 5А + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)J. McCoy's 5A + 10% FBS (Gibco cat no. 10082)

К. DMEM (Gibco 11965) + 10% ФБСK. DMEM (Gibco 11965) + 10% FBS

L. MEM Eagle с солью Эрла (Gibco 11095-080) + 1% NEAA + 1% NaPyr + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)L. MEM Eagle with Earle's Salt (Gibco 11095-080) + 1% NEAA + 1% NaPyr + 10% FBS (Gibco Cat # 10082)

М. RPMI-1640 с L-глутамином и HEPES + 10 % инактивированной нагреванием ФБСM. RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES + 10% heat-inactivated PBS

N. DMEM с L-Глутамином (Thermo № кат SH30022) + Пируват натрия + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)N. DMEM with L-Glutamine (Thermo Cat No. SH30022) + Sodium Pyruvate + 10% FBS (Gibco Cat No. 10082)

О. MEM (Gibco 11095) + Пируват натрия + NEAA + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)A. MEM (Gibco 11095) + Sodium Pyruvate + NEAA + 10% PBS (Gibco Cat # 10082)

Р. RPMI 1640 с HEPES и L-Глутамином (Thermo SH30255.01 или Gibco 11835) + 1 мМ Пирувата натрия + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)P. RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (Thermo SH30255.01 or Gibco 11835) + 1 mM Sodium Pyruvate + 10% PBS (Gibco cat no. 10082)

Q. DMEM:F12 с 2,5 мМ L-глутамина, 15 мМ HEPES + 0,5 мМ Пирувата натрия + 10% ФБСQ. DMEM:F12 with 2.5 mM L-Glutamine, 15 mM HEPES + 0.5 mM Sodium pyruvate + 10% PBS

R. 49% RPMI 1640 + 49% Ham's F12 + 2% инактивированной нагреванием ФБСR. 49% RPMI 1640 + 49% Ham's F12 + 2% heat inactivated PBS

S. 45% RPMI 1640 + 45% Ham's F12 + 10% инактивированной нагреванием ФБСS. 45% RPMI 1640 + 45% Ham's F12 + 10% heat inactivated PBS

Т. DMEM (Gibco 11965) + 1 мМ Пирувата натрия + 5% ФБС (Gibco № кат 10082)T. DMEM (Gibco 11965) + 1 mM sodium pyruvate + 5% PBS (Gibco cat no. 10082)

U. Leibovitz’s L15 (Gibco № кат 11415-064) + 10% ФБС (Gibco № кат 10082), без СО2U. Leibovitz’s L15 (Gibco cat no. 11415-064) + 10% FBS (Gibco cat no. 10082), CO2 free

V. DMEM с высоким содержанием Glu и L-gln + 10% инактивированной нагреванием ФБС + NaPyr + NEAA + HEPESV. DMEM high in Glu and L-gln + 10% heat-inactivated PBS + NaPyr + NEAA + HEPES

W. DMEM:F12 (1:1)+ ITS + 10 нМ Гидрокортизона + 10 нМ бета-эстрадиола + 4,5 мМ L-глутамина + 5% ФБС (Gibco № кат 10082)W. DMEM:F12 (1:1) + ITS + 10 nM Hydrocortisone + 10 nM beta-estradiol + 4.5 mM L-glutamine + 5% PBS (Gibco cat no. 10082)

X. RPMI-1640 с L-глутамином и HEPES + 10 % ФБСX. RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES + 10% PBS

Y. RPMI 1640 с HEPES и L-Глутамином (Gibco 22400) + 1 мМ Пирувата натрия + NEAA + 20% ФБС (Gibco № кат 10082)Y. RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (Gibco 22400) + 1 mM Sodium Pyruvate + NEAA + 20% PBS (Gibco cat no. 10082)

Z. DMEM + 2 мМ Глутамина + 1 мМ Пирувата натрия (NaPy) + 20 МЕ/л бычьего инсулина + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)Z. DMEM + 2 mM Glutamine + 1 mM Sodium Pyruvate (NaPy) + 20 IU/L bovine insulin + 10% PBS (Gibco cat no. 10082)

АА. Williams' Е media (Gibco № кат 12551) + 10% ФБСAA. Williams' E media (Gibco cat no. 12551) + 10% PBS

ВВ. МЕМ + 10% ФБС + NaPyr + NEAA + HEPES + 1,5 г/л NaHCOsVV. MEM + 10% FBS + NaPyr + NEAA + HEPES + 1.5 g/L NaHCOs

СС. McCoy's 5А (Gibco 16600) + 15% ФБС (Gibco № кат 10082)SS. McCoy's 5A (Gibco 16600) + 15% FBS (Gibco cat no. 10082)

DD. 1:1 MEM (11095): F12 (CellGro 10-080-CV) + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)D.D. 1:1 MEM (11095): F12 (CellGro 10-080-CV) + 10% FBS (Gibco cat no. 10082)

EE. RPMI-1640 с глутамином и HEPES (Hyclone № кат SH30255) + 10% ФБС (Gibco № кат 16000) + IX NaPyrEE. RPMI-1640 with glutamine and HEPES (Hyclone Cat # SH30255) + 10% PBS (Gibco Cat # 16000) + IX NaPyr

- 34 039950- 34 039950

Информация о Среде.Information about the environment.

FF. Среда Дульбекко в модификации Искова с L-глутамином, 25 мМ HEPES [GIB СО 12440-053] + 20% ФБСF.F. Dulbecco's medium modified by Iskov with L-glutamine, 25 mM HEPES [GIB CO 12440-053] + 20% FBS

GG. RPMI 1640 с HEPES и L-Глутамином (без фенолового-красного) + 1 мМ Пирувата натрия + 10% ФБС (Gibco № кат 10082)GG. RPMI 1640 with HEPES and L-Glutamine (no phenol red) + 1 mM Sodium Pyruvate + 10% PBS (Gibco cat no. 10082)

НН. 1:1 Hams F12: DMEM + L-Глутамин + 5% ФБС (Gibco № кат 10082)NN. 1:1 Hams F12: DMEM + L-Glutamine + 5% FBS (Gibco cat no. 10082)

II. RPMI-1640 (Hyclone № кат SH30027) + 10% Инактивированной нагреванием ФБС (Gibco № кат 10082)II. RPMI-1640 (Hyclone Cat No. SH30027) + 10% Heat Inactivated PBS (Gibco Cat No. 10082)

Л. Смесь 1:1 среды MCDB 105 с конечной концентрацией 1,5 г/л гидрокарбоната натрия и среды 199 с конечной концентрацией 2,2 г/л гидрокарбоната натрия + 15% ФБСK. 1:1 mixture of MCDB 105 medium with a final concentration of 1.5 g/l sodium bicarbonate and medium 199 with a final concentration of 2.2 g/l sodium bicarbonate + 15% PBS

Клеточные линии обрабатывали в течение 7 дней и анализировали с использованием анализаCell lines were treated for 7 days and analyzed using the assay

CellTiter-Glo®.CellTiter-Glo®.

Таблица 5. Распределение (%) антипролиферативных эффектов примера 1 среди линий раковых клеток, несущих мутации LOFTable 5. Distribution (%) of the antiproliferative effects of Example 1 among cancer cell lines carrying LOF mutations

Цитотоксический (1Сзо< 1 мкм, % Инг. >70) Cytotoxic (IC3 < 1 μm, % Ing. >70) Цитостатический (1Сзо< 1 мкм, % Инг. <70) Cytostatic (IC30 < 1 µm, % Ing. <70) Нечувствительный (1С5о>1 мкм, % Инг. <70) Insensitive (IC50 > 1 µm, % Ing. <70) Мутанты ARID1A ARID1A mutants 64%, п=25 64%, n=25 23%, п=9 23%, n=9 13%, п=5 13%, n=5 Мутанты KMT2D KMT2D mutants 76%, п=19 76%, n=19 12%, п=3 12%, n=3 12%, п=3 12%, n=3 Мутанты КМТ2С Mutants KMT2S 70%, п=7 70%, n=7 20%, п=2 20%, n=2 10%, п=1 10%, n=1 Мутанты RB1 RB1 mutants 54%, п=22 54%, n=22 37%, п=15 37%, n=15 10%, п=4 10%, n=4 Прочее Other 40%, п=41 40%, n=41 44%, п=45 44%, n=45 17%, п=17 17%, n=17

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

Claims (24)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Соединение формулы (I)1. Compound of formula (I) или его фармацевтически приемлемая соль.or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 2. Соединение по п.1 формулы (II) или его фармацевтически приемлемая соль.2. A compound according to claim 1 of formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 3. Соединение по п.2 формулы (II)3. Compound according to claim 2 of formula (II) - 35 039950- 35 039950 4. Соединение по п.1 формулы (III) или его фармацевтически приемлемая соль.4. A compound according to claim 1 of formula (III) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 5. Соединение по п.4 формулы (III)5. Compound according to claim 4 of formula (III) 6. Соединение или его соль по п.2, которое представляет собой хлоридную, безилатную или геми эдизилатную соль.6. The compound or salt thereof according to claim 2, which is the chloride, besylate or hemiedisylate salt. 7. Соединение или его соль по п.4, которое представляет собой хлоридную, безилатную или гемиэдизилатную соль.7. A compound or salt thereof according to claim 4 which is a chloride, besylate or hemiedisylate salt. 8. Соединение или его соль по п.2, которое представляет собой кристаллический [(3S)-1-[(E)-4(диметиламино)бут-2-еноил] пирролидин-3 -ил] 4-[(3 -изопропил-5 -метилпиразоло [1,5-a] пиримидин-7 ил)амино]пиперидин-1-карбоксилат безилат, характеризующийся порошковой рентгенограммой с использованием излучения CuKa, имеющей характеристические пики при 2Θ ± 0,2°, наблюдаемые при 21,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, включающей 12,4, 17,3 и 15,8°.8. The compound or salt thereof according to claim 2, which is crystalline [(3S)-1-[(E)-4(dimethylamino)but-2-enoyl]pyrrolidin-3-yl]4-[(3-isopropyl -5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7 yl)amino]piperidine-1-carboxylate besylate characterized by X-ray powder diffraction using CuKa radiation having characteristic peaks at 2Θ ± 0.2° observed at 21.5° in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 12.4, 17.3 and 15.8°. 9. Соединение или его соль по п.2, которое представляет собой [(3S)-1-[(E)-4-(диметиламино)бут-2-9. The compound or salt thereof according to claim 2, which is [(3S)-1-[(E)-4-(dimethylamino)but-2- - 36 039950 еноил]пирролидин-3-ил] 4-[(3-изопропил-5-метилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7-ил)амино]пиперидин-1карбоксилат геми-эдизилат гидрат, характеризующийся порошковой рентгенограммой с использованием излучения СиКа, имеющей характеристические пики при 2Θ ± 0,2°, наблюдаемые при 18,5° в комбинации с одним или более пиками, выбранными из группы, включающей 21,5, 16,7 и 15,2°.- 36 039950 enoyl]pyrrolidin-3-yl] 4-[(3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino]piperidine-1carboxylate hemi-edisylate hydrate, characterized by powder X-ray diffraction using CuCa radiation having characteristic peaks at 2Θ ± 0.2° observed at 18.5° in combination with one or more peaks selected from the group consisting of 21.5, 16.7 and 15.2°. 10. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-9 или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.10. A pharmaceutical composition containing a compound according to any one of claims 1 to 9, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients. 11. Фармацевтическая композиция по п.10, дополнительно содержащая один или более другой терапевтический агент.11. Pharmaceutical composition according to claim 10, additionally containing one or more other therapeutic agents. 12. Применение соединения или его соли по любому из пп.1-9 для лечения рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, рака желудка, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи или глиом.12. The use of a compound or salt thereof according to any one of claims 1 to 9 for the treatment of urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastric cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematological cancers, sarcomas, skin cancers or gliomas. 13. Применение по п.12, где указанный рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легких, рак яичника или рак желудка.13. Use according to claim 12, wherein said cancer is colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, or gastric cancer. 14. Применение по п.12 или 13, где указанный рак представляет собой рак молочной железы.14. Use according to claim 12 or 13, wherein said cancer is breast cancer. 15. Способ лечения рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, рака желудка, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи или глиом, включающий проведение анализа in vitro с применением биологического образца от пациента, определение наличия по меньшей мере одной инактивирующей мутации в генах ARID 1 А, КМТ2С, KMT2D и RB1 и введение терапевтически эффективного количества соединения или его соли по любому из пп.1-9 пациенту, если присутствует по меньшей мере одна инактивирующая мутация в любом из указанных генов.15. Method for treating urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastric cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, hematological cancers, sarcomas, skin cancers or gliomas, comprising conducting an in vitro assay using a biological sample from a patient, determining the presence of at least one inactivating mutation in the ARID 1 A, KMT2C, KMT2D and RB1 genes and administering a therapeutically effective amount of a compound or salt thereof according to any one of claims 1 to 9 to the patient, if at least one inactivating mutation is present in any of these genes. 16. Способ по п.15, где указанный биологический образец представляет собой образец опухоли и указанный образец анализируют с помощью секвенирования генома/ДНК.16. The method of claim 15, wherein said biological sample is a tumor sample and said sample is analyzed by genome/DNA sequencing. 17. Способ по п.15 или 16, где указанный образец получают от пациента до первого введения указанного соединения или его соли пациенту.17. The method according to claim 15 or 16, wherein said sample is obtained from the patient prior to the first administration of said compound or salt thereof to the patient. 18. Способ по любому из пп.15-17, где пациента выбирают для лечения по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене ARID 1 А.18. The method according to any one of claims 15-17, wherein the patient is selected for treatment by the presence of at least one inactivating mutation in the ARID 1A gene. 19. Способ по любому из пп.15-17, где пациента выбирают для лечения по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене КМТ2С.19. The method according to any one of claims 15-17, wherein the patient is selected for treatment by the presence of at least one inactivating mutation in the KMT2C gene. 20. Способ по любому из пп.15-17, где пациента выбирают для лечения по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене KMT2D.20. The method of any one of claims 15-17, wherein the patient is selected for treatment by the presence of at least one inactivating mutation in the KMT2D gene. 21. Способ по любому из пп.15-17, где пациента выбирают для лечения по наличию по меньшей мере одной инактивирующей мутации в гене RB 1.21. The method according to any one of claims 15-17, wherein the patient is selected for treatment by the presence of at least one inactivating mutation in the RB 1 gene. 22. Способ по любому из пп. 15-21, где указанное соединение или его соль вводят пациенту при дозе от около 1 мг до 2 г.22. The method according to any one of paragraphs. 15-21 wherein said compound or salt thereof is administered to a patient at a dose of about 1 mg to 2 g. 23. Применение соединения по любому из пп.1-9 или его фармацевтически приемлемой соли при изготовлении лекарственного средства для лечения рака уротелия, рака матки, колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, рака желудка, гепатобилиарного рака, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака простаты, гематологических раков, сарком, раков кожи или глиом.23. Use of a compound according to any one of claims 1 to 9 or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of urothelial cancer, uterine cancer, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, gastric cancer, hepatobiliary cancer, pancreatic cancer gland, cervical cancer, prostate cancer, hematological cancers, sarcomas, skin cancers or gliomas. 24. Применение по п.3, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, включающей колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника или рак желудка.24. Use according to claim 3, characterized in that said cancer is selected from the group consisting of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer or gastric cancer.
EA202090930A 2018-07-20 2018-11-09 Compounds useful for inhibiting cdk7 EA039950B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18382546 2018-07-20
PCT/US2018/060025 WO2019099298A1 (en) 2017-11-16 2018-11-09 Compounds useful for inhibiting cdk7

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA202090930A1 EA202090930A1 (en) 2020-08-06
EA039950B1 true EA039950B1 (en) 2022-03-31

Family

ID=63103887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202090930A EA039950B1 (en) 2018-07-20 2018-11-09 Compounds useful for inhibiting cdk7

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA039950B1 (en)
PT (1) PT3710446T (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015154022A1 (en) * 2014-04-05 2015-10-08 Syros Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
WO2016142855A2 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 Aurigene Discovery Technologies Limited Pyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazine and pyrazolo[1,5-a]pyrimidine derivatives as cdk inhibitors

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015154022A1 (en) * 2014-04-05 2015-10-08 Syros Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinase 7 (cdk7)
WO2016142855A2 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 Aurigene Discovery Technologies Limited Pyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazine and pyrazolo[1,5-a]pyrimidine derivatives as cdk inhibitors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINO R. CAIRA: "Crystalline Polymorphism of Organic Compounds", TOPICS IN CURRENT CHEMISTRY., SPRINGER, BERLIN., DE, vol. 198, 1 January 1998 (1998-01-01), DE , pages 163 - 208, XP008166276, ISSN: 0340-1022, DOI: 10.1007/3-540-69178-2_5 *

Also Published As

Publication number Publication date
PT3710446T (en) 2022-09-20
EA202090930A1 (en) 2020-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10787460B2 (en) (E)-1-(4-(dimethylamino)but-2-enoyl)pyrrolidin-3-yl 4-((3-isopropyl-5-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)amino)piperidine-1-carboxylate for inhibiting CDK7
TWI776835B (en) Amino-triazolopyridine compounds and their use in treating cancer
KR102587544B1 (en) condensed ring compounds
EP2364302B1 (en) Triazine analogs and their use as therapeutic agents and diagnostic probes
EP2018383B1 (en) Triazolopyrazine derivatives useful as anti-cancer agents
CA2453881C (en) 4-amino-6-phenyl-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine derivatives
KR101930182B1 (en) Aurora a kinase inhibitor
EP3947375B1 (en) Imidazolonylquinoline compounds and therapeutic uses thereof
CA2553243C (en) Pyrrolo pyrimidine derivatives useful for treating proliferative diseases
EA039950B1 (en) Compounds useful for inhibiting cdk7
CN112574208B (en) Substituted fused tricyclic derivatives, compositions and uses thereof
CN110167929A (en) Oxazole derivatives for treating cancer