EA038617B1 - Chimeric and humanized anti-human ctla4 monoclonal antibodies and uses thereof - Google Patents

Abstract

This invention relates to an anti-CTLA4 antibody binding human CTLA4 comprising: (a) a light chain variable region comprising: (i) a complementarity determining region (CDR) 1 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36, 37 or 38; and, (iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23; and (b) a heavy chain variable region comprising: (i) a CDR1 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33, 34 or 35; and, (iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and to an antigen binding fragment of said antibody. The invention also relates to a pharmaceutical composition thereof for treating cancer and to a method of treating cancer comprising administering an effective amount of said pharmaceutical composition. The invention allows to carry out cancer immunotherapy with reduced autoimmune side effects compared to other immunotherapeutic agents.

Description

Область изобретенияScope of invention

Данное изобретение относится к химерным и гуманизированным антителам, которые связываются с молекулой CTLA-4 человека и к способам их использования.This invention relates to chimeric and humanized antibodies that bind to a human CTLA-4 molecule and methods of using them.

Уровень техникиState of the art

Иммунная система человека и других млекопитающих отвечает за обеспечение защиты от инфекции и болезней. Такая защита обеспечивается как гуморальным иммунным ответом, так и клеточным иммунным ответом. Гуморальный ответ приводит к синтезу антител и других биомолекул, которые способны распознавать и нейтрализовать чужие мишени (антигены). В противоположность этому, клеточный иммунный ответ включает активацию макрофагов, нейтрофилов, естественных клеток-киллеров (ЕКК) и антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов Т-клеток и высвобождают различные цитокины в ответ на распознавание антигена.The immune system in humans and other mammals is responsible for providing protection against infection and disease. This protection is provided by both the humoral immune response and the cellular immune response. The humoral response leads to the synthesis of antibodies and other biomolecules that are capable of recognizing and neutralizing foreign targets (antigens). In contrast, the cellular immune response involves the activation of macrophages, neutrophils, natural killer cells (NK cells) and antigen-specific cytotoxic T lymphocytes T cells and releases various cytokines in response to antigen recognition.

Способность Т-клеток оптимально опосредовать иммунный ответ против антигена требует двух различных сигнальных взаимодействий. Во-первых, антиген, который экспонируется на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК), должен быть представлен в антигенспецифичных наивных Т-клетках в виде ГКГС: пептидного комплекса [1, 2]. Такое представление подает сигнал через Т-клеточный рецептор (ТКР), который направляет Т-клетку для инициирования иммунного ответа, который будет специфичным для представленного антигена. Во-вторых, серия костимулирующих сигналов, опосредующих взаимодействие между АПК и различными поверхностными молекулами Т-клеток, запускает сначала активацию и пролиферацию Т-клеток и, в конечном счете, их ингибирование [3-5]. Таким образом, первый сигнал придает специфичность иммунному ответу, тогда как второй сигнал служит для определения характера, величины и продолжительности ответа при ограничении аутоиммунитета. Особое значение среди этих вторых сигнальных молекул является связывание между В7.1 (CD80) [6]) и В7.2 (CD86) [7-9] лигандами антигенпрезентирующих клеток и рецепторами CD28 и CTLA-4 [10-12] Т-лимфоцита.The ability of T cells to optimally mediate an immune response against an antigen requires two different signaling interactions. First, the antigen, which is exposed on the surface of antigen-presenting cells (APC), must be presented in antigen-specific naive T cells in the form of MHC: peptide complex [1, 2]. This presentation signals through the T cell receptor (TCR), which directs the T cell to initiate an immune response that will be specific for the antigen presented. Second, a series of costimulatory signals mediating the interaction between APC and various surface molecules of T cells, first triggers the activation and proliferation of T cells and, ultimately, their inhibition [3-5]. Thus, the first signal confers specificity on the immune response, while the second signal serves to determine the nature, magnitude and duration of the response while limiting autoimmunity. Of particular importance among these second signaling molecules is the binding between B7.1 (CD80) [6]) and B7.2 (CD86) [7-9] antigen-presenting cell ligands and CD28 and CTLA-4 [10-12] T lymphocyte receptors ...

Антиген цитотоксических Т-лимфоцитов-4 (CTLA-4) признан ключевым регулятором адаптивных иммунных ответов, который играет центральную роль в поддержании периферической толерантности и в формировании репертуара возникающих Т-клеточных реакций и, следовательно, терапевтической мишени для лечения рака и воспаления. Было показано, что лечение анти-CTLA-4 антителами является мощным инструментом для усиления противоопухолевого иммунитета в доклинических моделях [10]. Монотерапия антителом против CTLA-4 способствовала отторжению трансплантируемых опухолей различного происхождения.Cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) is recognized as a key regulator of adaptive immune responses, which plays a central role in maintaining peripheral tolerance and in shaping the repertoire of emerging T-cell responses and, therefore, a therapeutic target for the treatment of cancer and inflammation. It has been shown that treatment with anti-CTLA-4 antibodies is a powerful tool for enhancing anti-tumor immunity in preclinical models [10]. Anti-CTLA-4 antibody monotherapy promoted the rejection of transplanted tumors of various origins.

Основываясь на перспективных доклинических модельных исследованиях опухолей, клинический потенциал антител против CTLA-4 был исследован при различных злокачественных новообразованиях человека. Хотя анти-CTLA-4 (Ипилимумаб, продаваемый как Ервой) продемонстрировал эффективность при лечении меланомы, лечение и нацеливание CTLA-4 связано с токсичностью, подобной автоиммунной. Характерные побочные эффекты от ингибирования CTLA-4 обычно называются иммуноопосредованными нежелательными явлениями (иоНЯ), а наиболее распространенными иоНЯ являются кожная сыпь, гепатит, колит и эндокринопатии, особенно гипопитуитаризм. Таким образом, существует желание улучшить терапевтический потенциал анти-CTLA-4 антител, повышая эффективность при одновременном снижении ассоциированных иоНЯ.Based on promising preclinical tumor model studies, the clinical potential of anti-CTLA-4 antibodies has been investigated in a variety of human malignancies. Although anti-CTLA-4 (Ipilimumab, marketed as Ervoy) has been shown to be effective in treating melanoma, treating and targeting CTLA-4 is associated with autoimmune-like toxicity. Typical side effects of CTLA-4 inhibition are commonly referred to as immune-mediated adverse events (IADs), and the most common IONAs are skin rashes, hepatitis, colitis, and endocrinopathies, especially hypopituitarism. Thus, there is a desire to improve the therapeutic potential of anti-CTLA-4 antibodies by increasing the efficacy while decreasing the associated IONN.

Другой целью в области иммунотерапии и лечения опухолей является сочетание различных ингибиторов иммунного контроля для усиления противоопухолевой активности, особенно против слабо иммуногенных опухолей. Однако этот подход связан с риском дальнейшего увеличения аутоиммунных побочных эффектов, еще раз подчеркивая необходимость выборочной модуляции иммунитета к раку без усиления аутоиммунитета.Another goal in the field of immunotherapy and tumor treatment is the combination of various immune control inhibitors to enhance antitumor activity, especially against weakly immunogenic tumors. However, this approach carries the risk of further increasing autoimmune side effects, further highlighting the need to selectively modulate cancer immunity without enhancing autoimmunity.

Дальнейшие исследования лигандов рецептора CD28 привели к идентификации и характеристике серии связанных молекул В7 (суперсемейство В7) [32, 33]. В настоящее время существует несколько известных членов семейства: В7.1 (CD80), В7.2 (CD86), лиганд индуцибельного костимулятора (ICOS-L), лиганд запрограммированной клеточной гибели-1 (PD-L1; В7-Н1), лиганд запрограммированной клеточной гибели-2 (PD-L2; B7-DC), В7-Н3, В7-Н4 и В7-Н6 [35, 36].Further studies of the ligands of the CD28 receptor led to the identification and characterization of a series of bound B7 molecules (B7 superfamily) [32, 33]. Currently, there are several known family members: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), inducible costimulant ligand (ICOS-L), programmed cell death-1 ligand (PD-L1; B7-H1), programmed cell death-2 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 and B7-H6 [35, 36].

В7-Н1 широко экспрессируется в разных тканях человека и мыши, таких как сердце, плацента, мышцы, печень плода, селезенка, лимфатические узлы и тимус для обоих видов, а также печени, легких и почек только у мышей [37]. В7-Н1 (PD-L1, CD274) является особенно важным элементом суперсемейства В7, поскольку он играет ключевую роль в формировании иммунного ответа к опухолям [38; U.S. Pat. Nos. 6803192; 7794710; United States Patent Application Publication Nos. 20 05/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT Publication No. WO 01/39722; WO 02/086083].B7-H1 is widely expressed in various tissues of humans and mice, such as the heart, placenta, muscles, fetal liver, spleen, lymph nodes, and thymus for both species, as well as liver, lungs, and kidneys only in mice [37]. B7-H1 (PD-L1, CD274) is a particularly important element of the B7 superfamily, since it plays a key role in the formation of an immune response to tumors [38; U.S. Pat. Nos. 6803192; 7794710; United States Patent Application Publication Nos. 20 05/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT Publication No. WO 01/39722; WO 02/086083].

Программированная клеточная гибель-1 (PD-1) представляет собой рецептор В7-Н1, а также B7-DC. PD-1 представляет собой I тип мембранного белка расширенного семейства регуляторов CD28/CTLA-4 Т-клеток [39; United States Patent Application Publication No. 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; U.S. Pat. Nos. 6808710; 7101550; 7488802; 7635757; 7722868; PCT Publication No. WO 01/14557). По сравнению с CTLA-4, PD-1 в более широком плане отрицательно регулирует иммунные ответы. PD-1 экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках и моноцитах [40, 41] и на низких уровнях в естественных клетках киллерах (ЕКК) Т-клеток [42, 43].Programmed cell death-1 (PD-1) is a B7-H1 receptor as well as B7-DC. PD-1 is a type I membrane protein of the extended family of T-cell CD28 / CTLA-4 regulators [39; United States Patent Application Publication No. 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; U.S. Pat. Nos. 6808710; 7101550; 7488802; 7635757; 7722868; PCT Publication No. WO 01/14557). Compared to CTLA-4, PD-1 more broadly negatively regulates immune responses. PD-1 is expressed on activated T cells, B cells, and monocytes [40, 41] and at low levels in natural killer (NK) cells of T cells [42, 43].

- 1 038617- 1 038617

Было обнаружено, что взаимодействие В7-Н1 и PD-1 обеспечивает критический отрицательный костимулирующий сигнал к Т- и В-клеткам [43] и функционирует как индуктор гибели клеток [39]. Роль В7-Н1 и PD-1 в ингибировании активации и пролиферации Т-клеток предполагает, что эти биомолекулы могут служить терапевтическими мишенями для лечения воспаления и рака. Следовательно, было предложено и продемонстрировано использование анти-PD1 и анти-В7-Н1 для лечения инфекций и опухолей и повышения модуляции адаптивного иммунного ответа, что является эффективным для лечения ряда опухолей человека. Однако не все субъекты реагируют или имеют полные ответы на лечение анти-PD-1 или анти-В7-Н1, и поэтому существует большой интерес к комбинированию анти-PD-1 или анти-В7-Н1 с другими ингибиторами контрольных точек иммунного ответа для усиления противоопухолевой активности.It was found that the interaction of B7-H1 and PD-1 provides a critical negative co-stimulatory signal to T and B cells [43] and functions as an inducer of cell death [39]. The role of B7-H1 and PD-1 in inhibiting T cell activation and proliferation suggests that these biomolecules may serve as therapeutic targets for the treatment of inflammation and cancer. Therefore, the use of anti-PD1 and anti-B7-H1 for the treatment of infections and tumors and for increasing the modulation of the adaptive immune response has been proposed and demonstrated, which is effective for the treatment of a number of human tumors. However, not all subjects respond or have complete responses to anti-PD-1 or anti-B7-H1 treatment, and therefore there is great interest in combining anti-PD-1 or anti-B7-H1 with other immune checkpoint inhibitors to enhance antitumor activity.

4-1ВВ (также известный как CD137 и TNFRSF9) представляет собой другую молекулу контрольной точки иммунного ответа. Наилучшим образом охарактеризованная активность CD137 представляет собой костимуляторную активность для активированных Т-клеток. Сшивание CD137 усиливает пролиферацию Т-клеток, секрецию IL-2, выживаемость и цитолитическую активность. Кроме того, подобно анти-CTLA-4, анти-4-1ВВ антитела могут усиливать иммунную активность для устранения опухолей у мышей [27-29]. Однако, в отличие от тенденции анти-CTLA-4 антител к обострению аутоиммунных заболеваний, было показано, что раковые терапевтические анти-4-1ВВ мкАТ отменяют развитие аутоиммунных заболеваний у мышей, страдающих волчанкой, при которой они ингибируют продукцию анти-дцДНК-антител и снижают почечную патологию [25, 26]. Ранее, данные продемонстрировали, что можно уменьшить аутоиммунные побочные эффекты лечения анти-CTLA-4 в опухолевой модели рака толстой кишки мыши путем комбинированного лечения анти-CTLA-4 с анти-4-1ВВ антителом, одновременно повышая противоопухолевую активность [19]. Это демонстрирует, что можно компенсировать аутоиммунные побочные эффекты анти-CTLA-4-опухолевой терапии.4-1BB (also known as CD137 and TNFRSF9) is another immune response checkpoint molecule. The best characterized activity of CD137 is the co-stimulatory activity for activated T cells. Crosslinking CD137 enhances T cell proliferation, IL-2 secretion, survival, and cytolytic activity. In addition, like anti-CTLA-4, anti-4-1BB antibodies can enhance immune activity to eliminate tumors in mice [27-29]. However, in contrast to the tendency of anti-CTLA-4 antibodies to exacerbate autoimmune diseases, it has been shown that cancer therapeutic anti-4-1BB mAb abolish the development of autoimmune diseases in mice with lupus, in which they inhibit the production of anti-dsDNA antibodies and reduce renal pathology [25, 26]. Previously, data have demonstrated that it is possible to reduce the autoimmune side effects of anti-CTLA-4 treatment in a tumor model of mouse colon cancer by combining anti-CTLA-4 with an anti-4-1BB antibody while simultaneously increasing antitumor activity [19]. This demonstrates that it is possible to offset the autoimmune side effects of anti-CTLA-4 tumor therapy.

Доклинический скрининг античеловеческий CTLA-4 антител чреват трудностями, потому что in vitro иммунологические корреляты иногда малозначительны, о чем свидетельствует опыт с антимышиными CTLA-4 антителами. Те же антимышиные CTLA-4-антитела, которые индуцируют мощный противоопухолевый иммунитет in vivo, могут иметь непостоянные эффекты на Т-клетки in vitro. Ahtu-CTLA-4 антитела усиливали пролиферацию Т-клеток в ответ на аллоантиген, но подавляли пролиферацию Т-клеток в ответ на костимуляцию анти-CD 28 [30, 31]. Кроме того, взаимодействие CTLA-4 с антителом может способствовать или ингибировать пролиферацию различных субпопуляций Т-клеток в одной и той же культуре [32]. Это осложнение можно преодолеть, если изучить ответы Т-клеток человека на модели грызунов.Preclinical screening for anti-human CTLA-4 antibodies is fraught with difficulties because in vitro immunological correlates are sometimes insignificant, as evidenced by the experience with anti-mouse CTLA-4 antibodies. The same anti-mouse CTLA-4 antibodies that induce potent anti-tumor immunity in vivo may have intermittent effects on T cells in vitro. Ahtu-CTLA-4 antibodies increased the proliferation of T cells in response to the alloantigen, but suppressed the proliferation of T cells in response to co-stimulation of anti-CD 28 [30, 31]. In addition, the interaction of CTLA-4 with an antibody can promote or inhibit the proliferation of different subpopulations of T cells in the same culture [32]. This complication can be overcome by studying the responses of human T cells in rodent models.

Описанные в данном документе анти-CTLA-4 антитела представляют собой аннтитела с уменьшенными аутоиммунными побочными эффектами при использовании для усиления иммунных реакций и для использования в противоопухолевой терапии. Кроме того, эти антитела могут использоваться в комбинации с другими ингибиторами контрольных точек, такими как анти-PD-1 и анти-4-1ВВ, для усиления противоопухолевой активности при нейтрализации аутоиммунных побочных эффектов.The anti-CTLA-4 antibodies described herein are antibodies with reduced autoimmune side effects when used to enhance immune responses and for use in anticancer therapy. In addition, these antibodies can be used in combination with other checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 and anti-4-1BB to enhance anti-tumor activity while neutralizing autoimmune side effects.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Данное изобретение относится к композициям антител и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с человеческой молекулой CTLA-4, и их использованием для иммунотерапии рака с уменьшенными аутоиммунными побочными эффектами. В частности, изобретение относится к антителам с усиленной CTLA-4-блокирующей активностью для лигандов CTLA-4 В7.1 и В7.2, усиленной эффекторной функции или восстановленному связыванию с растворимым CTLA-4 относительно связанной с мембраной или иммобилизованной CTLA-4.This invention relates to antibody compositions and antigen binding fragments thereof that bind to the human CTLA-4 molecule and their use for cancer immunotherapy with reduced autoimmune side effects. In particular, the invention relates to antibodies with enhanced CTLA-4 blocking activity for CTLA-4 ligands B7.1 and B7.2, enhanced effector function, or restored binding to soluble CTLA-4 relative to membrane bound or immobilized CTLA-4.

Антитело содержит:The antibody contains:

(а) вариабельную область легкой цепи, содержащую (i) определяющую комплементарность область (CDR) 1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21; (ii) CDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, 37 или 38; и (iii) CDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23; и (b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (i) CDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24; (ii) CDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, 34 или 35; и (iii) CDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.(a) a light chain variable region comprising (i) a complementarity determining region (CDR) 1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, 37, or 38; and (iii) CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23; and (b) the variable region of the heavy chain containing (i) a CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, 34, or 35; and (iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26.

Антитело может также содержать вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, 28 или 29, и вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30, 31 или 32.An antibody may also comprise a heavy chain variable amino acid sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27, 28, or 29 and a light chain variable amino acid sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, 31 or 32.

Константные области тяжелой цепи иммуноглобулина антитела могут содержать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или 4. Константная область тяжелой цепи иммуноглобулина антитела может также содержать мутацию. Относительно последовательности цепи hIgG1 в SEQ ID NO: 3 мутация может быть M135Y, S137T, Т139Е, S181A, Е216А или K217A или их комбинацией. Преимущественно константная область тяжелой цепи иммуноглобулина антитела может содержать все шесть мутаций. Антитело может также содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, 11 или 13, и аминокислотную поThe constant region of the heavy chain of an immunoglobulin of an antibody may contain the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4. The constant region of the heavy chain of an immunoglobulin of an antibody may also contain a mutation. With respect to the sequence of the hIgG1 chain in SEQ ID NO: 3, the mutation may be M135Y, S137T, T139E, S181A, E216A, or K217A, or a combination thereof. The predominantly immunoglobulin heavy chain constant region of an antibody may contain all six mutations. The antibody may also contain a heavy chain amino acid sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, 11, or 13 and the amino acid sequence

- 2 038617 следовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, 17 или 19. Антитело может быть способным связывать человеческий CTLA-4. Антитело также может ингибировать связывание CTLA-4 человека с В7-1 или В7-2.- 2,038,617 light chain sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, 17, or 19. The antibody may be capable of binding human CTLA-4. The antibody can also inhibit the binding of human CTLA-4 to B7-1 or B7-2.

Кроме того, в данном документе предлагается антигенсвязывающий фрагмент антител, описанных в данном документе.In addition, this document provides an antigen-binding fragment of the antibodies described herein.

Также в данном документе представлена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество антител, описанных в данном документе.Also provided herein is a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective amount of the antibodies described herein.

Фармацевтическая композиция может содержать физиологически приемлемый носитель или наполнитель.The pharmaceutical composition may contain a physiologically acceptable carrier or excipient.

В другом аспекте, представленном в данном документе, представлены способы усиления одной или нескольких иммунных функций или ответов у субъекта, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиций aнти-CTLA-4 антитела и фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В конкретном варианте реализации изобретения, представленном в данном документе, предлагаются способы предотвращения, лечения и/или управления болезнью, в которой желательно активировать или усиливать одну или несколько иммунных функций или ответов. Болезнью может быть рак, который может быть злокачественной опухолью человека. В частности, злокачественное новообразование человека может быть меланомой, раком легкого, раком молочной железы, гепатоцеллюлярной карциномой, карциномой яичников, карциномой предстательной железы, ходжкинской или неходжкинской лимфомой, острой миелогенной лейкемией, хронической миелогенной лейкемией, острой лимфоцитарной лейкемией, хроническим лимфоцитарным лейкозом или почечно-клеточной карциномой. В другом варианте реализации изобретения, заболевание, подлежащее лечению, представляет собой инфекционное заболевание. Описанный в данном документе способ может минимизировать аутоиммунные побочные эффекты, связанные с иммунотерапией.In another aspect provided herein, methods of enhancing one or more immune functions or responses in a subject are provided, comprising administering to a subject in need thereof the anti-CTLA-4 antibody compositions and pharmaceutical compositions described herein. In a particular embodiment, provided herein, there are provided methods for preventing, treating and / or managing a disease in which it is desired to activate or enhance one or more immune functions or responses. The disease can be cancer, which can be a malignant tumor in a person. In particular, a human malignant neoplasm may be melanoma, lung cancer, breast cancer, hepatocellular carcinoma, ovarian carcinoma, prostate carcinoma, Hodgkin's or non-Hodgkin's lymphoma, acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, or acute lymphocytic leukemia. cell carcinoma. In another embodiment, the disease to be treated is an infectious disease. The method described herein can minimize the autoimmune side effects associated with immunotherapy.

В других конкретных вариантах осуществления способ включает комбинированную терапию, в которой композиции анти-CTLA-4 антитела, описанные в данном документе, вводят субъекту в сочетании с другой терапией, которая может активировать или усиливать одну или несколько иммунных функций или ответов. В другом варианте реализации изобретения композиции анти-CTLA-4 антитела, описанные в данном документе, вводят в качестве стимулятора в комбинации с антигенной композицией. В конкретном примере осуществления изобретения композиции антит-CTLA-4 антител, описанные в данном документе, вводят в комбинации с вакцинной композицией для индукции или активации или усиления иммунного ответа, вызванного вакцинной композицией.In other specific embodiments, the method includes a combination therapy in which the anti-CTLA-4 antibody compositions described herein are administered to a subject in combination with another therapy that can activate or enhance one or more immune functions or responses. In another embodiment, the anti-CTLA-4 antibody compositions described herein are administered as a stimulant in combination with an antigenic composition. In a specific embodiment, the anti-CTLA-4 antibody compositions described herein are administered in combination with a vaccine composition to induce or activate or enhance an immune response elicited by the vaccine composition.

В конкретном примере осуществления изобретения композиции анти-CTLA-4 антитела, описанные в данном документе, вводят субъекту в сочетании с одной или несколькими другими терапиями, которые нацелены на различные иммуномодулирующие пути. В предпочтительном варианте реализации изобретения активность терапии, нацеленной на другой иммуномодулирующий путь, является комплементарной или синергичной с композициями анти-CTLA-4 антител, описанных в данном документе. В одном случае композиции анти-CTLA-4 антител, описанные в данном документе, вводят в комбинации с другими ингибиторами контрольных точек или с небольшими онкоиммунологическими модуляторами, такими как ингибиторы индоламина 2,3-диоксигеназы (ИДО). В другом случае композиции αнти-CTLA-4 антител, описанные в данном документе, вводят в комбинации с иммуностимулирующими молекулами. Конкретные варианты осуществления изобретения включают комбинацию композиций aнти-CTLA-4 антител, описанных в данном документе, с анти-PD-1 (пембролизумаб (Кейтруда) или Ниволумаб (Опдиво)), анти-В7-Н1 (атезолизумаб (Тецентрик) или дурвалумаб), анти-В7-Н3, анти-В7-Н4, анти-LAGS, αнти-Tim3, анти-CD40, анти-ОХ40, анти-BTLA, анти-CD27, анти-ICOS или анти-41ВВ. В другом варианте реализации изобретения композиции анти-CTLA-4 антител, описанные в данном документе, и вторая иммуностимулирующая молекула объединяются в одно биспецифическое антитело.In a specific embodiment, the anti-CTLA-4 antibody compositions described herein are administered to a subject in combination with one or more other therapies that target various immunomodulatory pathways. In a preferred embodiment, the activity of therapy targeting another immunomodulatory pathway is complementary to or synergistic with the anti-CTLA-4 antibody compositions described herein. In one instance, the anti-CTLA-4 antibody compositions described herein are administered in combination with other checkpoint inhibitors or small oncoimmunological modulators such as indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) inhibitors. Alternatively, the α anti-CTLA-4 antibody compositions described herein are administered in combination with immunostimulatory molecules. Specific embodiments of the invention include a combination of anti-CTLA-4 antibody compositions described herein with anti-PD-1 (pembrolizumab (Keytruda) or Nivolumab (Opdivo)), anti-B7-H1 (atezolizumab (Tecentriq) or durvalumab) , anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-LAGS, α anti-Tim3, anti-CD40, anti-OX40, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS or anti-41BB. In another embodiment, the anti-CTLA-4 antibody compositions described herein and the second immunostimulatory molecule are combined into a single bispecific antibody.

В другом варианте реализации античеловеческое CTLA-4 антитело, описанное в данном документе, может преимущественно связываться с человеческим CTLA-4, экспрессируемым на поверхности клетки по отношению к растворимой молекуле CTLA-4. Античеловеческий CTLA-4 может связываться с человеческим CTLA-4 и преимущественно регулировать экспрессию В7.1 или В7.2 in vivo. Антитело может содержаться в композиции для использования при модуляции иммунных реакций (иммунотерапия) и лечении рака.In another embodiment, the anti-human CTLA-4 antibody described herein can preferentially bind to human CTLA-4 expressed on the cell surface against a soluble CTLA-4 molecule. Anti-human CTLA-4 can bind to human CTLA-4 and preferentially regulate B7.1 or B7.2 expression in vivo. The antibody can be contained in the composition for use in modulating immune responses (immunotherapy) and treating cancer.

Изобретение также относится к способу скрининга античеловеческий CTLA-4 мкАТ с предпочтительной активностью. Доклинический скрининг античеловеческий CTLA-4 мкАТ чреват затруднениями, поскольку иммунологические корреляции in vitro для иммунологии рака и аутоиммунного неблагоприятного воздействия не определены. Значительные аутоиммунные побочные эффекты наблюдались в клинических испытаниях с человеческим анти-CTLA-4 (Ипилимумаб), особенно в сочетании с αнти-PD-1. Чтобы идентифицировать aнти-CTLA-4 антитела, связанные с уменьшенной иммунной токсичностью, антитела, демонстрирующие противоопухолевую активность у гуманизированных мышей, могут быть подвергнуты скринингу на их способность уменьшать аутоиммунные побочные эффекты in vivo с использованием мышей с нокин гена CTLA-4 человека.The invention also provides a method for screening anti-human CTLA-4 mAb with preferred activity. Preclinical screening for anti-human CTLA-4 mAb is fraught with difficulties because in vitro immunological correlations for cancer immunology and autoimmune adverse effects have not been determined. Significant autoimmune side effects have been observed in clinical trials with human anti-CTLA-4 (Ipilimumab), especially when combined with α anti-PD-1. To identify anti-CTLA-4 antibodies associated with reduced immune toxicity, antibodies exhibiting anti-tumor activity in humanized mice can be screened for their ability to reduce autoimmune side effects in vivo using human CTLA-4 gene knockin mice.

В другом варианте реализации изобретение относится к способу скрининга античеловеческогоIn another embodiment, the invention relates to a method for screening anti-human

- 3 038617- 3 038617

CTLA-4 мкАТ с усиленным противоопухолевым эффектом, в котором антитела демонстрируют усиленное локальное деплетирование клеток Трег в опухолевой микросреде.CTLA-4 mAb with enhanced antitumor effect, in which antibodies demonstrate enhanced local depletion of Treg cells in the tumor microenvironment.

В еще одном варианте реализации изобретение относится к способам мониторинга блокирующих эффектов анτи-CTLA-4 антител in vivo путем контроля уровней экспрессии В7.1 и В7.2 на иммунных клетках, таких как антигенпрезентирующие клетки (АПК). Изобретение дополнительно рассматривает биомаркеры для измерения биологической активности анти-CTLA-4 in vivo и контроля явных ответов на лечение анти-CTLA-4 путем измерения экспрессии уровня В7.1 и В7.2 на иммунных клетках ex vivo.In another embodiment, the invention provides methods for monitoring the blocking effects of anti-CTLA-4 antibodies in vivo by monitoring B7.1 and B7.2 expression levels on immune cells such as antigen presenting cells (APCs). The invention further contemplates biomarkers for measuring the biological activity of anti-CTLA-4 in vivo and monitoring overt responses to anti-CTLA-4 treatment by measuring the expression of B7.1 and B7.2 levels on immune cells ex vivo.

Чтобы картировать CTLA-4-связывающий эпитоп исходного антитела L3D10 и гуманизированных вариантов, РР4631 и РР4637, использовался факт, что мышиные и человеческие белки CTLA-4 являются перекрестно-реактивными к В7-1, но не к анти-CTLA-4. Соответственно, был синтезирован ряд мутантов белка CTLA-4Fc человека, в котором кластеры аминокислот из белка CTLA-4 человека были заменены аминокислотами из белка CTLA-4 мыши. Поскольку анти-CTLA-4, используемые в данном исследовании, не связываются с мышиным CTLA-4, связывание античеловеческий CTLA-4 антител может быть отменено, когда ключевые остатки связывающего антитела эпитопа заменяются мышиными аминокислотами.To map the CTLA-4 binding epitope of the parent antibody L3D10 and the humanized variants, PP4631 and PP4637, the fact that murine and human CTLA-4 proteins are cross-reactive to B7-1 but not anti-CTLA-4 was used. Accordingly, a series of human CTLA-4Fc protein mutants were synthesized in which amino acid clusters from human CTLA-4 protein were replaced with amino acids from mouse CTLA-4 protein. Since the anti-CTLA-4 used in this study does not bind to murine CTLA-4, binding of anti-human CTLA-4 antibodies can be canceled when key residues of the antibody binding epitope are replaced with murine amino acids.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Фиг. 1. Схематическая диаграмма химерных (слева) и гуманизированных (справа) антител L3D10 с новой комбинацией мутаций в Fc-области IgG1.FIG. 1. Schematic diagram of chimeric (left) and humanized (right) antibodies L3D10 with a new combination of mutations in the Fc region of IgG1.

Положения мутаций в Fc-области идентифицируются по их номеру положения аминокислоты, а аминокислоты идентифицируются по их одному буквенному коду, причем буква перед номером представляет заменяемую аминокислоту и буква после числа представляет введенную аминокислоту. Вариабельная область антител изображена открытыми овалами, а последовательность человека изображена серыми прямоугольниками. V = вариабельная область; С = константная область; L = легкая цепь; Н = тяжелая цепь.The positions of mutations in the Fc region are identified by their amino acid position number, and amino acids are identified by their one letter code, with the letter before the number representing the amino acid being replaced and the letter after the number representing the introduced amino acid. The variable region of antibodies is depicted by open ovals, and the human sequence is depicted by gray rectangles. V = variable region; C = constant region; L = light chain; H = heavy chain.

Фиг. 2. CTLA-4 связывание химерных L3D10 и 10D1 с планшетом с иммобилизованной CTLA-4, как определено ИФА.FIG. 2. CTLA-4 binding of chimeric L3D10 and 10D1 to plate with immobilized CTLA-4, as determined by ELISA.

В планшеты для ИФА вносили 1 мкг/мл белка CTLA-4-His (Sino Biological, Китай). Данную концентрацию биотинилированных связывающих белков добавляли и связывание измеряли с использованием HRP-конъюгированного стрептавидина. 10D1-1 и -2 представляют собой две независимые материальные серии одного и того же антитела. B7.1-Fc представляет собой положительный контроль, a Fc представляет собой отрицательный контроль.1 μg / ml CTLA-4-His protein (Sino Biological, China) was added to ELISA plates. This concentration of biotinylated binding proteins was added and binding was measured using HRP-conjugated streptavidin. 10D1-1 and -2 are two independent material series of the same antibody. B7.1-Fc is a positive control and Fc is a negative control.

Фиг. 3. Конкурентный анализ L3D10. 10D1 менее эффективен в блокировании химерного связывания L3D10 с CTLA-4, чем химерный L3D10.FIG. 3. Competitive analysis L3D10. 10D1 is less effective in blocking chimeric binding of L3D10 to CTLA-4 than chimeric L3D10.

Эксперимент проводили, как изображено на фиг. 2, за исключением того, что биотинилированный химерный L3D10 смешивали с данной концентрацией немеченных CTLA-4-связывающих белков или CTLA-4-Fc перед добавлением к планшетам для ИФА. Обратите внимание, что гораздо лучше блокировать немеченным L3D10, чем 10D1, что свидетельствует о том, что эти сайты связывания антител не идентичны.The experiment was carried out as shown in FIG. 2, except that biotinylated chimeric L3D10 was mixed with this concentration of unlabeled CTLA-4 binding proteins or CTLA-4-Fc prior to addition to ELISA plates. Note that it is much better to block unlabeled L3D10 than 10D1, suggesting that these antibody binding sites are not identical.

Фиг. 4. Блокирование связывания CTLA-4 с планшет-иммобилизованной В7.1.FIG. 4. Blocking binding of CTLA-4 to plate-immobilized B7.1.

Белок B7.1Fc наносили на планшеты для ИФА в концентрации 0,5 мкг/мл. После промывки и блокирования биотинилированный белок CTLA-4-Fc добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл в присутствии заданных концентраций конкурирующих белков. Показанные данные представляют собой средние значения двух повторностей при оптической плотности 405 нм. В то время как B7.1-Fc, химерные L3D10 и CTLA-4-Fc блокируют взаимодействие CTLA-4: В7.1 дозозависимым образом, две отдельные серии 10D1антител не блокируются при всех тестируемых дозах. Биотинилирование CTLA-4 не разрушает эпитопы 10D1 на CTLA-4, так как оба участка 10D1 демонстрируют сильное связывание с биотинилированным CTLA-4 (данные не представлены).Protein B7.1Fc was applied to ELISA plates at a concentration of 0.5 μg / ml. After washing and blocking, biotinylated CTLA-4-Fc protein was added at a concentration of 0.25 μg / ml in the presence of predetermined concentrations of competing proteins. Data shown is the average of two replicates at an optical density of 405 nm. While B7.1-Fc, chimeric L3D10 and CTLA-4-Fc block the CTLA-4: B7.1 interaction in a dose-dependent manner, the two separate series of 10D1 antibodies are not blocked at all doses tested. Biotinylation of CTLA-4 does not disrupt 10D1 epitopes on CTLA-4, as both 10D1 regions show strong binding to biotinylated CTLA-4 (data not shown).

Фиг. 5. Блокирование связывания CTLA-4 с планшет-иммобилизованной В7.2.FIG. 5. Blocking binding of CTLA-4 to plate-immobilized B7.2.

Белок B7.2Fc наносили на планшеты для ИФА в концентрации 0,5 мкг/мл. После промывки и блокирования биотинилированный белок CTLA-4-Fc добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл в присутствии заданных концентраций конкурирующих белков. В то время как химерный L3D10 блокирует взаимодействие CTLA-4: В7.2 дозозависимым образом, две отдельные серии антител 10D1 не смогли полностью блокировать взаимодействие CTLA-4: В7.2 даже при самой высокой концентрации.The B7.2Fc protein was applied to ELISA plates at a concentration of 0.5 μg / ml. After washing and blocking, biotinylated CTLA-4-Fc protein was added at a concentration of 0.25 μg / ml in the presence of predetermined concentrations of competing proteins. While chimeric L3D10 blocks the CTLA-4: B7.2 interaction in a dose-dependent manner, two separate series of 10D1 antibodies failed to completely block the CTLA-4: B7.2 interaction even at the highest concentration.

Фиг. 6. Как 10D1, так и L3D10 эффективно блокируют взаимодействие B7-CTLA-4 с использованием растворимых В7-1 и В7-2 и иммобилизованных CTLA-4-Fc. Добавляли различные дозы античеловеческий CTLA-4 мкАТ вместе с 0,25 мкг/мл биотинилированного человеческого CTLA-4-Fc к планшетам с нанесенным человеческим B7-1Fc. Количество CTLA-4, связанного в планшетах, измеряли с использованием стрептовидина, конъюгированного с HRP. Показанные данные представляют собой средние значения двух повторностей и представляют собой два независимых эксперимента.FIG. 6. Both 10D1 and L3D10 effectively block the interaction of B7-CTLA-4 using soluble B7-1 and B7-2 and immobilized CTLA-4-Fc. Various doses of anti-human CTLA-4 mAb were added along with 0.25 μg / ml biotinylated human CTLA-4-Fc to human B7-1Fc coated plates. The amount of CTLA-4 bound to the plates was measured using streptovidin conjugated to HRP. Data shown are the mean of duplicate and represent two independent experiments.

Фиг. 7. Блокирование связывания CTLA-4 с поверхностью клетки, экспрессирующей В7.1.FIG. 7. Blocking the binding of CTLA-4 to the surface of the cell expressing B7.1.

К клеткам ЯКХ, экспрессирующим В7.1 добавляли биотинилированный белок CTLA-4-Fc в концентрации 0,5 мкг/мл в присутствии заданной концентрации конкурирующих белков. Связывание биотинилированного слитого белка с клетками ЯКХ, трансфицированных мышиными или человеческими В7-1 и В7-2, детектировалось при помощи проточной цитометрии. Количество связанных рецепторов измеряли сBiotinylated CTLA-4-Fc protein was added to NCC cells expressing B7.1 at a concentration of 0.5 μg / ml in the presence of a predetermined concentration of competing proteins. Binding of the biotinylated fusion protein to NCC cells transfected with murine or human B7-1 and B7-2 was detected by flow cytometry. The number of bound receptors was measured with

- 4 038617 использованием конъюгата фикоэритрин-стрептавидин. Показанные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции трипликатов. В то время как химерный L3D10 блокирует взаимодействие CTLA-4: В7.1 дозозависимым образом, две отдельные серии 10D1 антител не блокировались при всех тестируемых дозах.- 4038617 using phycoerythrin-streptavidin conjugate. Shown data represent the average value of the fluorescence intensity of triplicates. While chimeric L3D10 blocks the CTLA-4: B7.1 interaction in a dose-dependent manner, two separate series of 10D1 antibodies were not blocked at all doses tested.

Фиг. 8. Блокирование связывания CTLA-4 с поверхностью клеток, экспрессирующих мышиный В7.1.FIG. 8. Blocking the binding of CTLA-4 to the surface of cells expressing murine B7.1.

Слабое, но детектируемое блокирование взаимодействия мышиного В7-1-человеческого CTLA-4 при помощи 10D1, когда mB7-1 экспрессируется на клетках ЯКХ. Различные дозы античеловеческий CTLA-4 мкАТ добавляли вместе с 0,25 мкг/мл человеческого CTLA-4-Fc к клеткам ЯКХ, экспрессирующим мышиный В7-1. Показанные данные представляют собой средние значения и СОС или данные трипликатов и представляют собой два независимых эксперимента.Weak but detectable blocking of the interaction of murine B7-1-human CTLA-4 by 10D1 when mB7-1 is expressed on NCC cells. Various doses of anti-human CTLA-4 mAb were added along with 0.25 μg / ml human CTLA-4-Fc to NCC cells expressing murine B7-1. Data shown are mean values and SOS or triplicate data and represent two independent experiments.

Фиг. 9. Блокирование связывания CTLA-4 с поверхностью клетки, экспрессирующей В7.2.FIG. 9. Blocking the binding of CTLA-4 to the surface of the cell expressing B7.2.

К клеткам ЯКХ, экспрессирующим В7.2, добавляли биотинилированный белок CTLA-4-Fc в концентрации 0,5 мкг/мл в присутствии заданной концентрации конкурирующих белков. В то время как химерный L3D10 блокирует взаимодействие CTLA-4: В7.2 дозозависимым образом, две отдельные серии антител 10D1 не смогли полностью блокировать взаимодействие CTLA-4: В7.2 даже при самой высокой концентрации. Данные, показанные на этой фигуре, повторялись не менее 5 раз.Biotinylated CTLA-4-Fc protein at a concentration of 0.5 μg / ml in the presence of a predetermined concentration of competing proteins was added to NCC cells expressing B7.2. While chimeric L3D10 blocks the CTLA-4: B7.2 interaction in a dose-dependent manner, two separate series of 10D1 antibodies failed to completely block the CTLA-4: B7.2 interaction even at the highest concentration. The data shown in this figure was repeated at least 5 times.

Фиг. 10. 10D1 связывается с биотинилированным человеческим CTLA-4-Fc лучше, чем L3D10.FIG. 10. 10D1 binds to biotinylated human CTLA-4-Fc better than L3D10.

Различные дозы античеловеческого CTLA-4 мкАТ или контрольного IgG наносились на планшеты. Биотинилированный CTLA-4-Fc добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл. Количество CTLA-4, связанного в планшетах, измеряли с использованием стрептовидина, конъюгированного с HRP. Показанные данные представляют собой средние значения двух повторностей и представляют собой два независимых эксперимента.Various doses of anti-human CTLA-4 mAb or control IgG were applied to the plates. Biotinylated CTLA-4-Fc was added at a concentration of 0.25 μg / ml. The amount of CTLA-4 bound to the plates was measured using streptovidin conjugated to HRP. Data shown are the mean of duplicate and represent two independent experiments.

Фиг. 11. L3D10, но не 10D1 блокирует взаимодействие между полигистиндин-нацеленными CTLA-4 и клеткам ЯКХ, экспрессирующими человеческий В7-1.FIG. 11. L3D10, but not 10D1, blocks the interaction between polyhistindine-targeted CTLA-4 and human B7-1 expressing NCC cells.

Клетки ЯКХ, экспрессирующие человеческий В7-1 инкубировали с полигистидин-нацеленным CTLA-4, наряду с антителами заданной концентрации, количество CTLA-4-Fc детектировали с помощью ФЭ-стрептавидина и измеряли FACSCanto II. Показанные данные представляют собой средние значения интенсивности флуоресценции трех образцов и представляют собой два независимых эксперимента.NCC cells expressing human B7-1 were incubated with polyhistidine-targeted CTLA-4 along with antibodies of a predetermined concentration, the amount of CTLA-4-Fc was detected using PE-streptavidin and measured by FACSCanto II. The data shown is the mean of the fluorescence intensities of the three samples and represent two independent experiments.

Фиг. 12. Химерный L3D10 индуцирует полную ремиссию установленных опухолей в сингенной модели МС38.FIG. 12. Chimeric L3D10 induces complete remission of established tumors in the syngeneic MC38 model.

Верхняя панель изображает экспериментальную схему, а нижние панели показывают кинетику роста опухолей МС38 у мышей, которые получали либо контрольный IgG (нижняя левая панель, n=6), либо химерный L3D10 (нижняя правая панель, n=5).The upper panel depicts the experimental design and the lower panels show the kinetics of MC38 tumor growth in mice that received either control IgG (lower left panel, n = 6) or chimeric L3D10 (lower right panel, n = 5).

Фиг. 13. Терапевтический эффект химерных L3D10 и 10D1 в модели опухоли меланомы МС38.FIG. 13. Therapeutic effect of chimeric L3D10 and 10D1 in the MC38 melanoma tumor model.

Для исследования использовали мышей с нокин CTLA-4 человека массой тела около 20 г. Опухолевые клетки МС38 1 х 10⁶ инъецировали подкожно мышам CTLA-4^h/h, когда опухоль достигала диаметра 0,5 см, мышей с опухолью, рандомизировали в три группы с 5 или 6 мышами в каждой. Мышей затем лечили (и/п): инъекция/100 мкг 10D1, химерного L3D10 или контрольного hIgGFc на 7, 10, 13 и 16 дни, как показано стрелками. Показаны результаты двух экспериментов (левая и правая секции), и показанные данные представляют собой среднее значение и СО размера опухоли (n=6 на группу в левой секции, n=5 на группу в правой секции). L3D10 и 10D1 имеют сходный терапевтический эффект в этой модели и могут одновременно вызвать полную ремиссию образованных опухолей. Диаметры (d) опухоли рассчитывали по следующей формуле: D = D=^(ab). V = ab2/2, где а - наибольшая длина диаметра, ab - наименьшая длина диаметра. Статистический анализ проводили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа повторных измерений ANOVA (время обработки X). Для левой секции: P=1OD1 по сравнению с hIgGFc: 5.71e-07; L3D10 по сравнению с hIgGFc: Р=5.53е-07; 10D1 по сравнению с L3D10: Р=0,869.The study used human CTLA-4 knockin mice weighing about 20 g. MC38 tumor cells 1 x 10 ^{6 were} injected subcutaneously into CTLA-4 ^{h / h} mice, when the tumor reached a diameter of 0.5 cm, tumor-bearing mice were randomized into three groups with 5 or 6 mice each. The mice were then treated (ip): injection / 100 μg 10D1, chimeric L3D10 or control hIgGFc on days 7, 10, 13 and 16, as indicated by the arrows. Results of two experiments are shown (left and right sections), and data shown is the mean and SD of tumor size (n = 6 per group in the left section, n = 5 per group in the right section). L3D10 and 10D1 have a similar therapeutic effect in this model and can simultaneously induce complete remission of formed tumors. Tumor diameters (d) were calculated using the following formula: D = D = ^ (ab). V = ab2 / 2, where a is the largest length of the diameter, ab is the smallest length of the diameter. Statistical analysis was performed using repeated measures ANOVA (treatment time X). For the left section: P = 1OD1 versus hIgGFc: 5.71e-07; L3D10 versus hIgGFc: P = 5.53e-07; 10D1 versus L3D10: P = 0.869.

Фиг. 14. Эффективное подавление МС38 с помощью анти-CTLA-4 мкАТ у мышей CTLA-4^h/m.FIG. 14. Effective suppression of MC38 by anti-CTLA-4 mAb in CTLA-4 ^{h / m} mice.

Как и на фиг. 13, исключается использование гетерозиготных мышей CTLA-4^h/m. Показанные данные представляют собой средние значения и СОС диаметров опухолей (6 мышей на группу); 10D1 по сравнению с hIgGFc: Р=0,0011; L3D10 по сравнению с hIgGFc: Р=5.55е-05; 10D1 по сравнению с L3D10: Р=0,0346.As in FIG. 13 excludes the use of CTLA-4 ^{h / m} heterozygous mice. Data shown are mean values and SOS of tumor diameters (6 mice per group); 10D1 versus hIgGFc: P = 0.0011; L3D10 versus hIgGFc: P = 5.55e-05; 10D1 versus L3D10: P = 0.0346.

Фиг. 15. Терапевтический эффект химерных L3D10 и 10D1 в модели опухоли меланомы B16-F1.FIG. 15. Therapeutic effect of chimeric L3D10 and 10D1 in the B16-F1 melanoma tumor model.

Для исследования использовали мышей с нокин CTLA-4 человека массой тела около 20 г. Стрелки указывают время лечения (50 мкг /мышь/лечение). Данные представляют собой средние значения и СО размера опухоли (n=4 на группу). L3D10 обладают сходным терапевтическим эффектом в этой модели и способны задерживать рост опухоли в этой агрессивной и недостаточно иммуногенной модели опухоли.For the study, human CTLA-4 knockin mice weighing about 20 g were used. Arrows indicate treatment time (50 μg / mouse / treatment). Data represent mean and SD of tumor size (n = 4 per group). L3D10 have similar therapeutic effects in this model and are capable of delaying tumor growth in this aggressive and insufficiently immunogenic tumor model.

Фиг. 16. Анализ для измерения блокировки CTLA-4 in vivo.FIG. 16. Assay to measure CTLA-4 blocking in vivo.

B7.1 или В7.2 связывается на дендритных клетках, и клетки связываясь, снижают регуляцию CTLA-4 на поверхности Т-клеток. Однако связывание блокирующих анти-CTLA-4 антител препятствует связыванию В7.1/В7.2 с CTLA-4 и, таким образом, предотвращает подавление В7.1 и В7.2, что приводит к суммарному увеличению экспрессии В7.1/В7.2. Однако с химерной Т-клеткой экспрессирующей человечеB7.1 or B7.2 binds to dendritic cells and the cells bind downregulation of CTLA-4 on the surface of T cells. However, the binding of anti-CTLA-4 blocking antibodies interferes with the binding of B7.1 / B7.2 to CTLA-4 and thus prevents the suppression of B7.1 and B7.2, resulting in a net increase in B7.1 / B7.2 expression ... However, with a chimeric T cell expressing human

- 5 038617 ский и мышиный CTLA-4, антитела, которые связывают CTLA-4 человека, не препятствуют связыванию В7.1/В7.2 с мышиным CTLA-4, что восстанавливает ингибирование В7.1/В7.2.- 5 038617 mouse and mouse CTLA-4, antibodies that bind human CTLA-4 do not interfere with the binding of B7.1 / B7.2 to murine CTLA-4, which restores the inhibition of B7.1 / B7.2.

Фиг. 17A-F. 10D1 не блокирует взаимодействие B7-CTLA-4 in vivo.FIG. 17A-F. 10D1 does not block B7-CTLA-4 interaction in vivo.

Используя анализ, описанный на фиг. 11, клетки мышей, при лечении анти-CTLA-4 антителами, использовали для анализа экспрессии В7.1 и В7.2.Using the analysis described in FIG. 11, mouse cells treated with anti-CTLA-4 antibodies were used to analyze the expression of B7.1 and B7.2.

На фиг. 17А изображена схема эксперимента. Вкратце, мыши с учетом возраста и пола получали, интраперитонально, 500 мкг антител или их контроли. Через 24 ч после инъекции мышей умерщвляли, а клетки их селезенки окрашивали анти-CD11c, CD11b, анти-В7-1 и анти-В7-2 мкАТ.FIG. 17A is a schematic diagram of the experiment. Briefly, age and gender matched mice received, intraperitoneally, 500 μg of antibodies or controls. 24 hours after injection, mice were sacrificed, and their spleen cells were stained with anti-CD11c, CD11b, anti-B7-1 and anti-B7-2 mAb.

На фиг. 17В изображены для наглядности данные, показывающие фенотип CD11c^hi ДК, анализированных для экспрессии В7. На фиг. 17С изображены для наглядности гистограммы, показывающие уровни В7-1 на ДК мышей, которые получали контроль IgG1-Fc, L3D10 или 10D1. Данные на верхней панели показывают эффект антитела у гомозиготных нокин-мышей, тогда как на нижней панели показан эффект антител у гетерозиготных мышей.FIG. 17B depicts for clarity data showing the phenotype of CD11c ^hi DCs analyzed for B7 expression. FIG. 17C are depicted for clarity, histograms showing the levels of B7-1 on DC mice that received the control IgG1-Fc, L3D10 or 10D1. The data in the upper panel shows the antibody effect in homozygous nokin mice, while the lower panel shows the antibody effect in heterozygous mice.

На фиг. 17D, изображено как и на фиг. 17С, исключение экспрессии В7-2. Данные, показанные на фиг. 17С и D являются наглядными данными тех трех мышей на группу и повторялись один раз с тремя мышами на группу.FIG. 17D is shown as in FIG. 17C, exclusion of B7-2 expression. The data shown in FIG. 17C and D are pictorial data of those three mice per group and were repeated once with three mice per group.

На фиг. 17Е изображено, что у мышей гомозиготных по CTLA-4 человека, L3D10, но не 10D1 индуцировало экспрессию В7-1 (левая панель) и В7-2 (правая панель). Показанные данные являются суммированными из двух экспериментов с участием только 6 мышей на группу. В каждом эксперименте средние данные у контрольных мышей искусственно определяются как 100%, и в экспериментальных группах нормализуется против контроля.FIG. 17E depicts that in mice homozygous for human CTLA-4, L3D10 but not 10D1 induced the expression of B7-1 (left panel) and B7-2 (right panel). Data shown are summarized from two experiments with only 6 mice per group. In each experiment, the mean data in the control mice is artificially determined as 100%, and in the experimental groups is normalized against the control.

На фиг. 17F, как и фиг. 17Е, исключается использование гетерозиготных мышей. Ни L3D10, ни 10D1 не блокируют взаимодействие B7-CTLA-4 у мышей, которые кодоминантно экспрессируют как мышиные, так и человеческие гены CTLA-4.FIG. 17F as in FIG. 17E excludes the use of heterozygous mice. Neither L3D10 nor 10D1 blocks the B7-CTLA-4 interaction in mice that codominantly express both the murine and human CTLA-4 genes.

Фиг. 18. L3D10 связывается с человеческим, но не с мышиным CTLA-4.FIG. 18. L3D10 binds to human but not mouse CTLA-4.

Данные представляют собой точечные графики внутриклеточного окрашивания CTLA-4 среди гейтированных клеток CD3' CD43 с использованием клеток селезенки мышей CTLA-4^h/h (вверху) или CTLA4^m/m (внизу). В качестве контроля использовали антимышиный CTLA-4 мкАТ 4F10.Data are dot plots of intracellular CTLA-4 staining among gated CD3 'CD43 cells using CTLA-4 ^{h / h} (top) or CTLA4 ^{m / m} (bottom) mouse spleen cells. Antimouse CTLA-4 mAb 4F10 was used as a control.

Фиг. 19. Терапевтический эффект химерных L3D10 и 10D1 у мышей CTLA-^m.FIG. 19. Therapeutic effect of chimeric L3D10 and 10D1 in CTLA- ^ m mice.

На верхней панели изображена схема эксперимента. Мышей CTLA-4^h/h стимулировали клеточной линией МС38 рака толстой кишки и, когда опухоль достигла размера приблизительно 5 мм в диаметре, мышей обрабатывали 4 раза контрольным человеческим IgG-Fc, L3D10 или 10D1 и наблюдали размер опухоли после 6-недельного периода. На нижней панели изображена кинетика роста опухолей МС38 у мышей, которые получали либо контрольный IgG, либо химерный L3D10, либо 10D1 (n=6 на группу). Несмотря на очевидные различия активности блокирования CTLA-4 in vivo, как показано на фиг. 16, как L3D10, так и 10D1 демонстрируют сильную противоопухолевую активность против модели МС38 у химерных мышей CTLA-4^m/h.The top panel shows the scheme of the experiment. CTLA-4 ^{h / h} mice were stimulated with MC38 colon cancer cell line and when the tumor had reached a size of approximately 5 mm in diameter, the mice were treated 4 times with control human IgG-Fc, L3D10 or 10D1 and tumor size was observed after a 6 week period. The bottom panel depicts the kinetics of MC38 tumor growth in mice that received either control IgG, chimeric L3D10, or 10D1 (n = 6 per group). Despite the apparent differences in CTLA-4 blocking activity in vivo, as shown in FIG. 16, both L3D10 and 10D1 show potent anti-tumor activity against the MC38 model in CTLA-4 ^{m / h} chimeric mice.

Фиг. 20А, В. 10D1 и L3D10 оказывают сходное терапевтическое действие на рост меланомы В16.FIG. 20A, B. 10D1 and L3D10 have similar therapeutic effects on the growth of B16 melanoma.

1х10⁵ клеток опухоли В16 инъецировали (п/к) мышам CTLA-4^h/h (n=4-5) и лечили (и/п) с помощью 100 мкг (фиг. 20А) или 250 мкг (фиг. 20В) 10D1, L3D10 или контрольным IgGFc на 11, 14, 17 день (фиг. 20А) или на 2, 5 день и на 8 (фиг. 20В), как показано стрелками.1x10 ⁵ B16 tumor cells were injected (sc) into CTLA-4 mice ^{h / h} (n = 4-5) and treated (ip) with 100 μg (Fig.20A) or 250 μg (Fig.20B) 10D1 , L3D10 or control IgGFc on days 11, 14, 17 (Fig. 20A) or on days 2, 5 and 8 (Fig. 20B), as indicated by arrows.

Фиг. 20А, 10D1 по сравнению с hIgGFc: Р=0,0265; L3D10 по сравнению с hIgGFc: 10D1 по сравнению с L3D10: Р=0,0487; Р=0,302.FIG. 20A, 10D1 versus hIgGFc: P = 0.0265; L3D10 versus hIgGFc: 10D1 versus L3D10: P = 0.0487; P = 0.302.

Фиг. 20В, 10D1 сравнительно с hIgGFc: P=0,00616; L3D10 сравнительно с hIgGFc: Р=0,0269: 10D1 по сравнению с L3D10: Р=0,370. Данные представляют собой среднее значение ± СОС 4-5 мышей на группу. Статистический анализ проводили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа повторных измерений ANOVA.FIG. 20B, 10D1 versus hIgGFc: P = 0.00616; L3D10 versus hIgGFc: P = 0.0269: 10D1 versus L3D10: P = 0.370. Data represent the mean ± SOS of 4-5 mice per group. Statistical analysis was performed using repeated measures ANOVA.

Фиг. 21А, В. Иммунотерапевтические эффекты между L3D10 и 10D1 у CTLA-4^h/h (фиг. 21А) и CTLA4^m/h (фиг. 21В) мышей, которые умерщвлялись перед полным отторжением, чтобы оценить деплетирование Трег в микроокружении опухоли. Показанные данные представляют собой средние значения и СОС диаметров опухоли двух независимых экспериментов с участием 5 мышей на группу.FIG. 21A, B. Immunotherapeutic effects between L3D10 and 10D1 in CTLA-4 ^{h / h} (FIG. 21A) and CTLA4 ^{m / h} (FIG. 21B) mice that were sacrificed prior to complete rejection to assess Treg depletion in the tumor microenvironment. Data shown are the mean and SOS of tumor diameters of two independent experiments with 5 mice per group.

Фиг. 22A-F. Блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 не способствует раковой иммунотерапевтической активности анти-CTLA-4 мкАТ.FIG. 22A-F. Blocking the B7-CTLA-4 interaction does not contribute to the cancer immunotherapeutic activity of anti-CTLA-4 mAb.

На фиг. 22А изображен сравнительный иммунотерапевтический эффект, несмотря на значительную различную активность блокирования с помощью двух анти-CTLA-4 мкАТ. 5х 10⁵ опухолевых клеток МС38 вводили (п/к) мышам CTLA-4^h/h (n=6) и лечили (и/п) при помощи 100 мкг 10D1, L3D10 или контрольного hIgG-Fc на 7, 10, 13 и 16 дни, как показано стрелками. Данные представляют собой среднее значение ± СОС из шести мышей на группу. Статистический анализ проводили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа повторных измерений ANOVA. 10D1 по сравнению с hIgG-Fc: Р=5.71^е-07; L3D10 по сравнению с hIgG-Fc: Р=5.53^е-07; 10D1 по сравнению с L3D10: Р=0,869. Данные представляют собой три независимых эксперимента.FIG. 22A depicts the comparative immunotherapeutic effect despite the significantly different blocking activity of the two anti-CTLA-4 mAb. 5x 10 ⁵ MC38 tumor cells were injected (sc) into CTLA-4 ^{h / h} mice (n = 6) and treated (ip) with 100 μg 10D1, L3D10 or control hIgG-Fc on 7, 10, 13 and 16 days as shown by arrows. Data represent the mean ± SOS of six mice per group. Statistical analysis was performed using repeated measures ANOVA. 10D1 versus hIgG-Fc: P = 5.71 ^e-07 ; L3D10 versus hIgG-Fc: P = 5.53 ^e-07 ; 10D1 versus L3D10: P = 0.869. Data represent three independent experiments.

- 6 038617- 6 038617

Фиг. 22В. У мышей антитела не блокируют взаимодействие B7-CTLA-4 и не индуцируют устойчивое отторжение опухоли. Как и на фиг. 22А, исключается использование гетерозиготных мышей, которые экспрессировали как мышиный, так и человеческий CTLA-4. 10D1 по сравнению с hIgG-Fc: Р=0,0011; L3D10 по сравнению с hIgG-Fc: Р=5,55^е-05; 10D1 по сравнению с L3D10: Р=0,0346. Данные представляют собой три независимых эксперимента.FIG. 22B. In mice, antibodies do not block the B7-CTLA-4 interaction and do not induce sustained tumor rejection. As in FIG. 22A excludes the use of heterozygous mice that expressed both murine and human CTLA-4. 10D1 versus hIgG-Fc: P = 0.0011; L3D10 versus hIgG-Fc: P = 5.55 ^e-0 5; 10D1 versus L3D10: P = 0.0346. Data represent three independent experiments.

Фиг. 22C-F, блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 не способствует селективному деплетированию Трег в микроокружении опухоли. Фиг. 22С и D. Независимо от их способности блокировать взаимодействие B7-CTLA-4, L3D10 и 10D1 не удаляют Трег в селезенке. Показанные данные представляют собой % клеток Foxp3+ среди клеток селезенки CD4 Т-клеток в CTLA-4^h/h(фиг. 22С) и CTLA-4^m/h (фиг. 22D) мыши. n= 6. е и f, как L3D10, так и 10D1 удаляют Трег среди инфильтрирующих опухоль CD4 Т-клеток в CTLA-4^h/h (фиг. 22Е) и CTLA-4^m/h (фиг. 22F) мыши. Данные, показанные в c-f, представляют собой % от Трег в 17 (эксперимент 1) или 19 дней (эксперимент 2) после заражения опухолевыми клетками и через 10 или 12 дней после начала 4 анти-CTLA-4-терапии мкАТ, как показано стрелками.FIG. 22C-F, blocking the B7-CTLA-4 interaction does not contribute to the selective depletion of Treg in the tumor microenvironment. FIG. 22C and D. Regardless of their ability to block the interaction, B7-CTLA-4, L3D10 and 10D1 do not remove Treg in the spleen. Data shown is% Foxp3 + cells among CD4 T cell spleen cells in CTLA-4 ^{h / h} (FIG. 22C) and CTLA-4 ^{m / h} (FIG. 22D) mice. n = 6. e and f, both L3D10 and 10D1 remove Treg among tumor-infiltrating CD4 T cells in CTLA-4 ^{h / h} (Fig. 22E) and CTLA-4 ^{m / h} (Fig. 22F) mice. Data shown in cf represent% of Treg at 17 (experiment 1) or 19 days (experiment 2) after tumor cell challenge and 10 or 12 days after starting 4 anti-CTLA-4 mAb therapy as indicated by arrows.

Фиг. 23A-F. Оценка активности блокирования обычно используемых антимышиный CTLA-4 мкАТ 9Н10 и 9D9.FIG. 23A-F. Assessment of blocking activity of the commonly used anti-mouse CTLA-4 mAb 9H10 and 9D9.

Фиг. 23А и В изображают, что 9Н10 не блокирует взаимодействие B7-CTLA-4, если В7-1 (фиг. 23А) и В7-2 (фиг. 23В) наносились на планшеты. Биотинилированный мышиный CTLA-4-Fc слитый белок инкубировали на планшетах, с внесенным В7, в присутствии контрольного IgG или антимышиный CTLA-4 мкАТ 9D9 и 9Н10 заданной концентрации. Связывание CTLA-4 обнаруживается стрептавидином, конъюгированным с HRP. Показанные данные представляют собой две повторности двух независимых экспериментов.FIG. 23A and B show that 9H10 does not block the B7-CTLA-4 interaction when B7-1 (FIG. 23A) and B7-2 (FIG. 23B) were applied to the plates. Biotinylated mouse CTLA-4-Fc fusion protein was incubated on plates supplemented with B7 in the presence of control IgG or anti-mouse CTLA-4 mAb 9D9 and 9H10 of a predetermined concentration. Binding of CTLA-4 is detected by streptavidin conjugated to HRP. Data shown are replicates of two independent experiments.

Фиг. 23С и D изображают, что 9D9 и 9Н10 проявляют дифференциальное связывание с растворимыми (фиг. 23С) и связанными в планшетах CTLA-4-Fc (фиг. 23D). Показанные данные представляют собой две повторности по меньшей мере двух независимых экспериментов.FIG. 23C and D show that 9D9 and 9H10 show differential binding to soluble (FIG. 23C) and plate-bound CTLA-4-Fc (FIG. 23D). Data shown are replicates of at least two independent experiments.

Фиг. 23Е и F изображают эффекты антимышиный CTLA-4 мкАТ 9D9 и 9Н10 на уровнях В7-1 (фиг. 23Е) и В7-2 (фиг. 23F) на CD11chi ДК из клеток селезенки WT (CTLA-4^m/m) через 24 часа после лечения 500 мкг антител, и/п. Данные суммированы из шести независимых мышей на группу в двух независимых экспериментах с участием 3 мышей на каждую группу.FIG. 23E and F depict the effects of anti-mouse CTLA-4 mAb 9D9 and 9H10 at levels B7-1 (Fig.23E) and B7-2 (Fig.23F) on CD11chi DC from WT spleen cells (CTLA-4 ^{m / m} ) at 24 hours after treatment with 500 mcg of antibodies, i.p. Data are pooled from six independent mice per group in two independent experiments with 3 mice per group.

Фиг. 24A-D. Отдельные in vivo и in vivo блокирующие активности антимышиный CTLA-4 мкАТ 4F10.FIG. 24A-D. Separate in vivo and in vivo blocking activities of anti-mouse CTLA-4 mAb 4F10.

Фиг. 24А и В изображает влияние 4F10 на взаимодействие CTLA-4-Fc с планшетами, с нанесенным В7-1 (фиг. 24А) или В7-2 (фиг. 24В). Биотинилированный мышиный CTLA-4-Fc слитый белок инкубировали в планшетах, с нанесенным В7, в присутствии контрольного IgG или антимышиный CTLA-4 мкАТ 4F10 заданной концентрации. Связывание CTLA-4 обнаруживается стрептавидином, конъюгированным с HRP. Показанные данные представляют собой две повторности двух независимых экспериментовFIG. 24A and B depict the effect of 4F10 on the interaction of CTLA-4-Fc with plates coated with B7-1 (FIG. 24A) or B7-2 (FIG. 24B). Biotinylated murine CTLA-4-Fc fusion protein was incubated in plates coated with B7 in the presence of control IgG or anti-mouse CTLA-4 mAb 4F10 of a predetermined concentration. Binding of CTLA-4 is detected by streptavidin conjugated to HRP. Data shown are replicates of two independent experiments

Фиг. 24С и D изображено влияние 4F10 на экспрессию В7-1 и В7-2. Сводные данные по В7-1 (фиг. 24С) и В7-2 (фиг. 24D) от 6 мышей на группу. Уровни В7 в контрольной группе, обработанной IgG, искусственно определяются как 100%.FIG. 24C and D depict the effect of 4F10 on B7-1 and B7-2 expression. Summary data for B7-1 (FIG. 24C) and B7-2 (FIG. 24D) from 6 mice per group. B7 levels in the IgG-treated control group are artificially determined to be 100%.

Фиг. 25. Побочные эффекты химерных L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-l.FIG. 25. Side effects of chimeric L3D10 and 10D1 in combination with anti-PD-l.

На верхней панели изображена схема эксперимента. Для исследования использовались 10-дневные, только самки, мыши с нокин CTLA-4 человека, с весом тела более 4 г. Они получали указанные белки или их комбинации. Стрелки указывают время лечения (100 мкг /мышь/лечение). Показанные данные представляют собой средние значения и СО % веса. Химерные L3D10 и 10D1 обладают сравнимым терапевтическим эффектом рака у взрослых мышей (фиг. 13), но заметные побочные эффекты наблюдаются, когда 10D1 комбинируется с αнти-PD-1 мкАТ.The top panel shows the scheme of the experiment. For the study, we used 10-day-old, female only, mice with human CTLA-4 nokin, with a body weight of more than 4 g. They received the indicated proteins or their combinations. Arrows indicate treatment time (100 μg / mouse / treatment). Data shown are mean values and% by weight SD. Chimeric L3D10 and 10D1 have comparable cancer therapeutic effects in adult mice (Fig. 13), but noticeable side effects are observed when 10D1 is combined with α anti-PD-1 mAb.

Фиг. 26. Побочные эффекты химерных L3D10 и 10D1 в комбинации с aнти-PD-1. График изображает конечный вес тела на 42 день у мышей из эксперимента, изображенного на фиг. 25, которые получали либо контрольный IgG, 10D1 + αнти-PD-1, либо химерный L3D10 + анти-PD-1 (n=5 на группу). Значительное снижение веса наблюдается в комбинации анти-PD1+10D1, которое не наблюдалась в комбинации антиPD-1+химерный L3D10.FIG. 26. Side effects of chimeric L3D10 and 10D1 in combination with anti-PD-1. The graph depicts final body weight at day 42 in mice from the experiment depicted in FIG. 25 who received either control IgG, 10D1 + α anti-PD-1, or chimeric L3D10 + anti-PD-1 (n = 5 per group). Significant weight loss was observed in the anti-PD1 + 10D1 combination, which was not observed in the antiPD-1 + chimeric L3D10 combination.

Фиг. 27. Патологические эффекты химерного L3D10 и 10D1 в сочетании с антu-PD-1.FIG. 27. Pathological effects of chimeric L3D10 and 10D1 in combination with antu-PD-1.

Для дальнейшего изучения относительной токсичности L3D10 по сравнению с 10D1 при введении в комбинации с анти-PD-1 была рассмотрена общая анатомия мышей, описанных выше на фиг. 26. Матка/яичник/мочевой пузырь и тимус были заметно меньше у мышей, получавших 10D1 + PD-1, тогда как органы у мышей, обработанных L3D10 + антu-PD-1, были сопоставимы с контролем hIgG. В противоположность этому, сердца, иссеченные из мышей, обработанных 10D1, выглядели большими по размеру с заметно более белым видом.To further explore the relative toxicity of L3D10 versus 10D1 when administered in combination with anti-PD-1, the general anatomy of the mice described above in FIG. 26. Uterus / ovary / bladder and thymus were markedly smaller in mice treated with 10D1 + PD-1, while organs in mice treated with L3D10 + antu-PD-1 were comparable to hIgG control. In contrast, hearts excised from 10D1 treated mice appeared larger in size with a noticeably whiter appearance.

Фиг. 28A-D. Лечение 10D1 в комбинации с aнти-PD-1 приводит к аномальному эритропоэзу.FIG. 28A-D. Treatment with 10D1 in combination with anti-PD-1 results in abnormal erythropoiesis.

Учитывая различия в сердцах, наблюдаемые на фиг. 27, мы рассмотрели эритропоэз у мышей и наблюдали явные различия в мышах, получавших 10D1 + анти-PD-1 по сравнению с группами, получавших лечение L3D10 + анти-PD-1 или контрольным антителом (hIgG), которые были сравнительно аналогичными. Костный мозг мышей, получавших лечение 10D1 + αнти-PD-1, имел заметно более белый цвет (фиг.Given the differences in hearts observed in FIG. 27, we examined erythropoiesis in mice and observed clear differences in mice treated with 10D1 + anti-PD-1 versus L3D10 + anti-PD-1 or control antibody (hIgG) treated groups, which were comparatively similar. The bone marrow of mice treated with 10D1 + α anti-PD-1 was markedly whiter in color (Fig.

- 7 038617- 7 038617

28А), а изолированная кровь была почти полностью белой по цвету (фиг. 28В). В соответствии с этим, когда была проанализирована дифференцировка эритроцитов с использованием распределения маркеров CD119 и CD71, наблюдалось статистически значимое снижение количества клеток, находившихся на IV стадии развития у мышей, получавших 10D1 + αнтu-PD-1. Типичные профили FACS (проточной цитометрии) показаны на фиг. 28С, тогда как сводные данные изображены на фиг. 28D.28A), and the isolated blood was almost completely white in color (FIG. 28B). In accordance with this, when the differentiation of erythrocytes was analyzed using the distribution of markers CD119 and CD71, a statistically significant decrease in the number of cells at the IV stage of development was observed in mice receiving 10D1 + αnu-PD-1. Typical FACS (flow cytometry) profiles are shown in FIG. 28C, while summary data is depicted in FIG. 28D.

На фиг. 29. Анализ проточной цитометрии антиэритроцитарных антител.FIG. 29. Analysis of flow cytometry of anti-erythrocyte antibodies.

Образцы крови мышей NOD.SCID.n2rg^-/- (NSG) окрашивали образцами плазмы мышей, которые получали лечение антителом в течение перинатального периода. Сыворотка от мышей NSG и эритроциты этих же мышей использовались в качестве отрицательного контроля. Вся сыворотка использовалась в разведении 1:50. Эти данные показывают, что никакие мыши не продуцировали антиэритроцитарные антитела.Blood samples from NOD.SCID.n2rg ^{- / -} (NSG) mice were stained with plasma samples from mice that had received antibody treatment during the perinatal period. Serum from NSG mice and erythrocytes from the same mice were used as negative controls. All serum was used at a 1:50 dilution. These data indicate that no mice produced anti-erythrocyte antibodies.

Фиг. 30. Патология сердца у мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-1.FIG. 30. Cardiac pathology in mice treated with chimeric L3D10 and 10D1 in combination with anti-PD-1.

Чтобы дополнительно определить токсичность L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с анmи-PD-1, был проведен гистологический анализ сердца у мышей, изображенных на фиг. 26. Мыши, получавшие 10D1 + αнтu-PD-1, демонстрировали высокий уровень инфильтрации Т-клеток, который не наблюдался у мышей, получавших L3D10 + aнтu-PD-1, или мышей, получавших человеческий контрольный IgG.To further determine the toxicity of L3D10 versus 10D1 in combination with anti-PD-1, histological analysis of the heart was performed in the mice depicted in FIG. 26. Mice treated with 10D1 + α ntu-PD-1 exhibited a high level of T cell infiltration that was not observed in mice treated with L3D10 + antu-PD-1 or mice treated with human IgG control.

Фиг. 31. Патология легкого у мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-1.FIG. 31. Lung pathology in mice treated with chimeric L3D10 and 10D1 in combination with anti-PD-1.

Для дополнительного определения токсичности L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с антиPD-1, был проведен гистологический анализ сердца у мышей, изображенных на фиг. 26. Мыши, получавшие 10D1 + анти-PD-1, демонстрировали высокий уровень инфильтрации Т-клеток, который не наблюдался у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-1 или мышей, получавших человеческий контрольный IgG.To further determine the toxicity of L3D10 versus 10D1 in combination with anti-PD-1, histological analysis of the heart was performed in the mice depicted in FIG. 26. Mice treated with 10D1 + anti-PD-1 exhibited a high level of T cell infiltration that was not observed in mice treated with L3D10 + anti-PD-1 or mice treated with human IgG control.

Фиг. 32. Патология слюнной железы у мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-1.FIG. 32. Pathology of the salivary gland in mice treated with chimeric L3D10 and 10D1 in combination with anti-PD-1.

Для дополнительного определения токсикологии L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с антиPD-1, был проведен гистологический анализ слюны у мышей, описанных на фиг. 26. Мыши, получавшие 10D1 + анти-PD-1, показали гораздо более высокий уровень инфильтрации Т-клеток, чем наблюдавшийся у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-1 или мышей, получавших человеческий контрольный IgG.To further determine the toxicology of L3D10 versus 10D1 in combination with anti-PD-1, histological analysis of saliva was performed in the mice described in FIG. 26. Mice treated with 10D1 + anti-PD-1 showed a much higher rate of T cell infiltration than that observed in mice treated with L3D10 + anti-PD-1 or mice treated with human IgG control.

Фиг. 33A-F. Патология почек и печени у мышей, получавших химерные L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-1.FIG. 33A-F. Kidney and liver pathology in mice treated with chimeric L3D10 and 10D1 in combination with anti-PD-1.

Для дополнительного определения токсичности L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с антиPD-1, был проведен гистологический анализ почек и печени у мышей, описанных на фиг. 26. Фиг. 33А-С представляют собой срезы почки и фиг. 33D-E представляют собой срезы печени. Мыши, получавшие 10D1 + anti-PD-1, показали высокий уровень инфильтрации Т-клеток, чем наблюдемый у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-1 или мышей, получавших человеческий контрольный IgG.To further determine the toxicity of L3D10 versus 10D1 in combination with anti-PD-1, histological analysis of the kidneys and liver was performed in the mice described in FIG. 26. FIG. 33A-C are kidney sections and FIG. 33D-E are liver sections. Mice treated with 10D1 + anti-PD-1 showed a higher rate of T cell infiltration than that observed in mice treated with L3D10 + anti-PD-1 or mice treated with human IgG control.

Фиг. 34. Оценки токсичности мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1, в комбинации с антиPD-1.FIG. 34. Evaluations of the toxicity of mice treated with chimeric L3D10 and 10D1 in combination with antiPD-1.

Эти данные по тканям, если фиг. 30-33 суммировать, демонстрируют высокую оценку токсичности у мышей, получавших 10D1 + анти-PD-1 по сравнению с L3D10 + анти-PD-1, который имеет оценки лишь незначительно выше, чем контрольная мышиная группа hIgG.These tissue data, if FIG. 30-33 to summarize, demonstrate a high toxicity score in mice treated with 10D1 + anti-PD-1 versus L3D10 + anti-PD-1, which has scores only marginally higher than the hIgG control mouse group.

Фиг. 35. 10D1 + анти-PD-1 не обладают значительной токсичностью у мышей CTLA-4^h/m, о чем свидетельствует нормальный привес у мышей, которые получали лечение антителом в течение перинатального периода.FIG. 35.10D1 + anti-PD-1 did not show significant toxicity in CTLA-4 ^{h / m} mice, as evidenced by normal weight gain in mice that received antibody treatment during the perinatal period.

Мыши получали лечение с данным антителом или комбинациями на 10, 13, 16, 19 и 22 дни интраперитонально (100 мкг/мышь/инъекция/антитело). Мышей взвешивали по меньшей мере один раз в 3 дня.Mice were treated with this antibody or combinations on days 10, 13, 16, 19 and 22 intraperitoneally (100 μg / mouse / injection / antibody). Mice were weighed at least once every 3 days.

Фиг. 36. L3D10 и 10D1 показывают аналогичные паттерны связывания в планшетах с иммобилизированным CTLA-4.FIG. 36. L3D10 and 10D1 show similar binding patterns in CTLA-4 immobilized plates.

В планшеты для ИФА вносили 1 мкг/мл белка CTLA-4-His (Sino Biological, Китай). Данную концентрацию биотинилированных связывающих белков добавляли и связывание измеряли с использованием HRP-конъюгированного стрептавидина. 10D1-1 и -2 представляют собой две независимые серии веществ одного и того же антитела. hIgG-Fc представляет собой отрицательный контроль человеческого Ig.1 μg / ml CTLA-4-His protein (Sino Biological, China) was added to ELISA plates. This concentration of biotinylated binding proteins was added and binding was measured using HRP-conjugated streptavidin. 10D1-1 and -2 are two independent series of substances of the same antibody. hIgG-Fc is a negative control of human Ig.

Фиг. 37. L3D10 демонстрирует снижение связывание растворимого CTLA-4.FIG. 37. L3D10 shows reduced binding of soluble CTLA-4.

Заданную концентрацию античеловеческий CTLA-4 мкАТ вносили в планшет на ночь, после промывки и блокирования бычьим сывороточным альбумином, добавляли биотинилированный CTLA-4-Fc в концентрации 0,25 мкг/мл. После инкубации и промывки количество захваченного CTLA-4-Fc измеряли с помощью стрептавидина, меченного HRP.A predetermined concentration of anti-human CTLA-4 mAb was added to the plate overnight, after washing and blocking with bovine serum albumin, biotinylated CTLA-4-Fc was added at a concentration of 0.25 μg / ml. After incubation and washing, the amount of CTLA-4-Fc captured was measured with HRP-labeled streptavidin.

Фиг. 38. Выравнивание вариабельных областей гуманизированного антитела с исходной последовательностью антител L3D10.FIG. 38. Alignment of the variable regions of the humanized antibody with the original L3D10 antibody sequence.

Вариабельная область тяжелой цепи (верхняя часть) (SEQ ID NO: 62-64) и вариабельная область (нижняя) легкой цепи (SEQ ID NO: 70-72) последовательностей гуманизированного антитела выравниваThe variable region of the heavy chain (upper part) (SEQ ID NO: 62-64) and variable region (lower) of the light chain (SEQ ID NO: 70-72) of the sequences of the humanized antibody alignment

- 8 038617 ются с исходным антителом L3D10 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 57; легкая цепь: SEQ ID NO: 65) и соответствующие каркасные области человеческого антитела (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 58-61; легкая цепь: SEQ ID NO: 66-69). Обратные мутации к исходной последовательности мыши указаны желтым цветом. Новые аминокислоты, т.е. аминокислотные остатки, не присутствующие в последовательности исходного антитела или в соответствующей структуре человеческого антитела, выделены зеленым цветом. Мутации, вводимые в последовательности CDR2, показаны фиолетовыми. Последовательности CDR показаны красным цветом на основе www.bioinf.org.uk/abs/.- 8,038617 are linked to the parent L3D10 antibody (heavy chain: SEQ ID NO: 57; light chain: SEQ ID NO: 65) and corresponding human antibody framework regions (heavy chain: SEQ ID NO: 58-61; light chain: SEQ ID NO: 66-69). Reverse mutations to the original mouse sequence are indicated in yellow. New amino acids, i.e. amino acid residues not present in the sequence of the parent antibody or in the corresponding structure of the human antibody are highlighted in green. Mutations introduced into the CDR2 sequences are shown in purple. CDR sequences are shown in red based on www.bioinf.org.uk/abs/.

Фиг. 39А-В. Противоопухолевая активность гуманизированных антител L3D10 по сравнению с 10D1.FIG. 39A-B. Antitumor activity of humanized antibodies L3D10 compared with 10D1.

Используя модель опухоли мыши МС38 у мышей с нокин CTLA-4 человека, мы рассмотрели противоопухолевую активность гуманизированных антител L3D10 по сравнению с химерным антителом L3D10 и 10D1. На верхней панели изображен график лечения для эксперимента in vivo; мышам вводили в общей сложности 4 дозы антител каждые 3 дня, начиная с 7-го дня после инокуляции. Все гуманизированные антитела (n=6 на группу) полностью уничтожили опухоли и были сопоставимы с 10D1 (нижняя панель).Using the MC38 mouse tumor model in mice with human CTLA-4 knockin, we examined the antitumor activity of the humanized L3D10 antibodies versus the chimeric L3D10 and 10D1 antibodies. The top panel shows a treatment schedule for an in vivo experiment; mice were injected with a total of 4 doses of antibodies every 3 days, starting on the 7th day after inoculation. All humanized antibodies (n = 6 per group) completely eradicated tumors and were comparable to 10D1 (lower panel).

Фиг. 40. Противоопухолевая активность гуманизированных антител L3D10 у мышей CTLA-4^h/m.FIG. 40. Antitumor activity of humanized L3D10 antibodies in CTLA-4 ^{h / m} mice.

На верхней панели изображен график лечения для эксперимента in vivo; мыши CTLA-4^h/m получали контрольный hIg или одно из трех различных античеловеческий CTLA-4 мкАТ в дозах 30 мг (-30, сплошные линии) или 10 мг (-10, пунктирные линии) на инъекцию в указанные даты после инъекции опухоли МС38. Размеры опухоли измеряли один раз в три дня.The top panel shows a treatment schedule for an in vivo experiment; CTLA-4 ^{h / m} mice received control hIg or one of three different anti-human CTLA-4 mAb at doses of 30 mg (-30, solid lines) or 10 mg (-10, dashed lines) per injection on the indicated dates after injection of MC38 tumor ... Tumor sizes were measured every three days.

Фиг. 41. Терапевтический эффект анти-CTLA-4 мкАТ при минимальной опухолевой модели B16-F1.FIG. 41. Therapeutic effect of anti-CTLA-4 mAb in minimal tumor model B16-F1.

Используя модель опухоли мыши B16-F1 у мышей с нокин CTLA-4 человека, мы рассмотрели противоопухолевую активность гуманизированных антител L3D10. 1х10⁵ Bl6 опухолевых клеток вводили (п.к.) мышам CTLA-4 (n=5-6). В дни 2, 5 и 8 мыши получали лечение контрольным Ig, 10D1, химерным L3D10 или РР4637 и РР4638 (250 мкг/мышь, и/п). Распространяемость и размеры опухоли измерялись через день. 10D1 по сравнению с hIgGFc: Р=0,00616; L3D10 по сравнению с hIgGFc: Р=0,0269; 10D1 по сравнению с L3D10: Р=0,370; РР4637 по сравнению с hIgGFc: Р=0,0005; РР4637 по сравнению с 10D1: Р=0,805; РР4638 по сравнению с hIgGFc: Р=0,0016; РР4638 по сравнению с 10D1: Р=0,856. Данные представляют собой среднее значение ± СОС 5-6 мышей на группу. Размеры опухолей считались как 0 для мышей, у которых никогда не развилась опухоль.Using a B16-F1 mouse tumor model in mice with human CTLA-4 knockin, we examined the antitumor activity of humanized L3D10 antibodies. 1x10 ⁵ Bl6 tumor cells were injected (sc) into CTLA-4 mice (n = 5-6). On days 2, 5 and 8, mice were treated with control Ig, 10D1, chimeric L3D10 or PP4637 and PP4638 (250 μg / mouse, ip). The spread and size of the tumor was measured every other day. 10D1 versus hIgGFc: P = 0.00616; L3D10 versus hIgGFc: P = 0.0269; 10D1 versus L3D10: P = 0.370; PP4637 versus hIgGFc: P = 0.0005; PP4637 versus 10D1: P = 0.805; PP4638 versus hIgGFc: P = 0.0016; PP4638 versus 10D1: P = 0.856. Data represent the mean ± SOS of 5-6 mice per group. Tumor sizes were counted as 0 for mice that never developed a tumor.

Фиг. 42. Сравнение между 10D1, РР4631 и РР4637 самок для их комбинированной токсичности с анти-PD-I мкАТ.FIG. 42. Comparison between 10D1, PP4631 and PP4637 females for their combined toxicity with anti-PD-I mAb.

Самок мышей CTLA-4^h/h лечили на 10 или 11 день после рождения при помощи 4 инъекций антител (100 мкг/мышь/инъекция, один раз в три дня) или контролем Fc, как указано в условных обозначениях. Мышей взвешивали один раз каждые 3 дня. Приведенные данные представляют собой средние значения и СОС % привеса после периода 30 дней. Всех мышей умерщвляли на 43-й день для гистологического анализа. Количество мышей, используемых для каждой группы, показано в круглых скобках условных обозначений.Female CTLA-4 ^{h / h} mice were treated 10 or 11 days after birth with 4 injections of antibodies (100 μg / mouse / injection, once every three days) or an Fc control as indicated in the legend. The mice were weighed once every 3 days. Data shown are mean values and% average weight gain after a period of 30 days. All mice were sacrificed on day 43 for histological analysis. The number of mice used for each group is shown in parentheses in the legend.

Фиг. 43. Комбинированная терапия 10D1 и анти-PD-1 вызывает анемию, тогда как с РР4631 + anti-PD-1 или РР4637 + anti-PD-1 этого не происходит.FIG. 43. Combination therapy of 10D1 and anti-PD-1 causes anemia, whereas PP4631 + anti-PD-1 or PP4637 + anti-PD-1 does not.

Приведенные данные представляют собой гематокрит 43-дневных мышей, которые получили четыре лечения антител на 11, 14, 17 и 20 день в дозах 100 мкг/мышь/антитела.Data reported is the hematocrit of 43 day old mice that received four antibody treatments on days 11, 14, 17, and 20 at doses of 100 μg / mouse / antibody.

Фиг. 44А-В. Комбинированная терапия 10D1 + anti-PD-1 вызывает системную активацию Т-клеток, тогда как с РР4631 + anti-PD-1 или РР4637 + anti-PD-1 этого не происходитFIG. 44A-B. Combination therapy 10D1 + anti-PD-1 causes systemic activation of T-cells, whereas this does not happen with PP4631 + anti-PD-1 or PP4637 + anti-PD-1

Показанные данные представляют собой % CD4 (верхние панели) и CD8 Т-клеток (нижние панели) с фенотипами наивных клеток (CD44^loCD62^Lhl), клеток центральной памяти (CD44hiCD62Lhi) и эффекторных клеток памяти (CD44^hiCD62^Llo) Т-клеток в периферической крови (фиг. 44А) или в селезенке (фиг. 44В). Клетки получали от 43-дневных мышей, которые получали антитела 4 раза на 11, 14, 17 и 20 день в дозах 100 мкг/мышь/антитела.Data shown are% CD4 (upper panels) and CD8 T cells (lower panels) with phenotypes of naive cells (CD44 ^lo CD62 ^Lhl ), central memory cells (CD44hiCD62Lhi) and effector memory cells (CD44 ^h iCD62 ^Ll o) T cells in the peripheral blood (Fig. 44A) or in the spleen (Fig. 44B). Cells were obtained from 43-day-old mice that received antibodies 4 times on days 11, 14, 17 and 20 at doses of 100 μg / mouse / antibody.

Фиг. 45. Гуманизация L3D10 не влияет на связывание с иммобилизованным CTLA-4.FIG. 45. Humanization of L3D10 does not affect binding to immobilized CTLA-4.

Способность гуманизированных антител L3D10 связывать иммобилизованный CTLA-4 определяли, как описано на фиг. 36. На оси X показана концентрация анти-CTLA-4 мкАТ, добавленная в раствор. Гуманизация не влияет на связывание с иммобилизованным CTLA-4, и все три гуманизированных антитела продемонстрировали сходное связывание с исходным химерным антителом L3D10 и 10D1. Аналогичные закономерности наблюдались при использовании CTLA-4-Ig вместо CTLA-4-his.The ability of humanized L3D10 antibodies to bind immobilized CTLA-4 was determined as described in FIG. 36. The X-axis shows the concentration of anti-CTLA-4 mAb added to the solution. Humanization does not affect binding to immobilized CTLA-4, and all three humanized antibodies showed similar binding to the parent chimeric antibody L3D10 and 10D1. Similar patterns were observed when CTLA-4-Ig was used instead of CTLA-4-his.

Фиг. 46. Гуманизация дополнительно снижает связывание L3D10 с растворимым CTLA-4.FIG. 46. Humanization further reduces the binding of L3D10 to soluble CTLA-4.

Способность гуманизированных антител L3D10 связывать растворимый CTLA-4 определяли, как описано на фиг. 37. На оси X показана концентрация CTLA-4mkAT, нанесенных на планшеты для ИФА. Гуманизация дополнительно снижает связывание с растворимым CTLA-4 относительно исходного L3D10химерного антитела. Аналогичные закономерности наблюдались при использовании CTLA-4-Ig вместо CTLA-4-his.The ability of humanized L3D10 antibodies to bind soluble CTLA-4 was determined as described in FIG. 37. The X-axis shows the concentration of CTLA-4mkAT applied to ELISA plates. Humanization further reduces binding to soluble CTLA-4 relative to the original L3D10 chimeric antibody. Similar patterns were observed when CTLA-4-Ig was used instead of CTLA-4-his.

Фиг. 47А, В. РР4631, РР4638 и РР4637 не блокируют взаимодействия B7-CTLA-4 in vitro.FIG. 47A, B. PP4631, PP4638 and PP4637 do not block B7-CTLA-4 interactions in vitro.

На фиг. 47А изображено блокирование взаимодействия B7-1-CTLA-4 с помощью античеловеческогоFIG. 47A depicts anti-human blocking of B7-1-CTLA-4 interaction

- 9 038617- 9 038617

CTLA-4 мкАТ 10D1, РР4631, РР4637 и L3D10. B7-1Fc иммобилизировали в концентрации 0,5 мкг/мл. Биотинилированный CTLA-4-Fc добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл вместе с заданными дозами антител. Показанные данные представляют собой средние значения дупликатов при оптической плотности 405 нм.CTLA-4 μAT 10D1, PP4631, PP4637 and L3D10. B7-1Fc was immobilized at a concentration of 0.5 μg / ml. Biotinylated CTLA-4-Fc was added at a concentration of 0.25 μg / ml along with the prescribed doses of antibodies. The data shown is the mean duplicate values at an optical density of 405 nm.

На фиг. 47В изображено блокирование взаимодействия B7-2-CTLA-4 античеловеческого CTLA-4 мкАТ 10D1 и L3D10. Как и на фиг. 47А, исключается, что B7-2-Fc был иммобилизирован.FIG. 47B depicts the blocking of the interaction of B7-2-CTLA-4 anti-human CTLA-4 mAb 10D1 and L3D10. As in FIG. 47A, it is excluded that B7-2-Fc was immobilized.

Фиг. 48. РР4631 и РР4637 не блокируют взаимодействия B7-CTLA-4 in vivo, о чем свидетельствует отсутствие их влияния на экспрессию В7-1 и В7-2 на дендритных клетках.FIG. 48. PP4631 and PP4637 do not block B7-CTLA-4 interactions in vivo, as evidenced by their lack of effect on B7-1 and B7-2 expression on dendritic cells.

Сводные данные по уровням В7-1 (а) и В7-2 (b) от 3 мышей на группу. Уровни В7 в контрольной группе, обработанной IgG, искусственно определяются как 100%.Summary of B7-1 (a) and B7-2 (b) levels from 3 mice per group. B7 levels in the IgG-treated control group are artificially determined to be 100%.

Фиг. 49. РР4637, который обладает лучшим профилем безопасности в сочетании с анти-PD-1 мкАТ (см. фиг. 42), представляя собой наиболее эффективный при отторжении опухоли на основе отторжения опухоли при самых низких терапевтических дозах.FIG. 49. PP4637, which has the best safety profile when combined with anti-PD-1 mAb (see Fig. 42), being the most effective in tumor rejection based on tumor rejection at the lowest therapeutic doses.

Мыши CTLA-4^h/m получали контрольный IgFc или одно из трех различных античеловеческих CTLA-4 мкАТ при дозах 30 мкг (-30, сплошные линии) или 10 мкг (-10, пунктирные линии) на инъекцию в указанные даты. Размеры опухоли измеряли один раз в три дня. При 10 мкг/инъекции РР4637 (HL32) представляется наиболее эффективным в индуцировании отторжения опухоли.CTLA-4 ^{h / m} mice received control IgFc or one of three different anti-human CTLA-4 mAb at doses of 30 μg (-30, solid lines) or 10 μg (-10, dashed lines) per injection on the dates indicated. Tumor sizes were measured every three days. At 10 μg / injection, PP4637 (HL32) appears to be most effective in inducing tumor rejection.

Фиг. 50. Оценка чистоты гуманизированного антитела.FIG. 50. Evaluation of the purity of the humanized antibody.

Временно экспрессируемые гуманизированные L3D10 антитела очищали хроматографией на белке А и образцы из всех трех антител оценивали с помощью восстановленного и не восстановленного электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Очищенные белки продуцировали гель-полосы, указывающие на размер молекулы антитела как в восстановленных, так и невосстановленных условиях электрофореза в полиакриламидном геле. На полосах связанная, показана как непрерывающая колонка белка А, указывая, что большая часть белка антитела прилегает к колонке белка А.The transiently expressed humanized L3D10 antibodies were purified by protein A chromatography and samples from all three antibodies were evaluated by reconstituted and unreduced polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Purified proteins produced gel bands indicative of the size of the antibody molecule under both reduced and non-reduced polyacrylamide gel electrophoresis conditions. In the bands, bound, shown as a non-terminating Protein A column, indicating that most of the antibody protein is adjacent to the Protein A column.

Фиг. 51. Эксклюзионная хроматография (ВЭЖХ) временно экспрессированного белка.FIG. 51. Size exclusion chromatography (HPLC) of transiently expressed protein.

Образцы белка для каждого из гуманизированных антител анализировали с помощью ВЭЖХ после одностадийной хроматографии белка А. Верхняя панель: антитело РР4631. Средняя панель: антитело РР4637. Нижняя панель: антитело РР4638.Protein samples for each of the humanized antibodies were analyzed by HPLC after one-step protein A chromatography. Top panel: PP4631 antibody. Middle panel: PP4637 antibody. Bottom panel: PP4638 antibody.

Фиг. 52. Анализ при помощи капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (CE-SDS) временно экспрессированного белка.FIG. 52. Analysis by capillary electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) of the transiently expressed protein.

Образцы белка для каждого из гуманизированных антител анализировали с помощью CE-SDS после одностадийной хроматографии белка А. Левые панели показывают результаты в невосстановленных условиях, а правые панели показывают результаты при восстановленных условиях. Верхняя панель: антитело РР4631. Средняя панель: антитело РР4637. Нижняя панель: антитело РР4638.Protein samples for each of the humanized antibodies were analyzed by CE-SDS after one-step protein A chromatography. Left panels show results under unreduced conditions and right panels show results under reduced conditions. Top panel: PP4631 antibody. Middle panel: PP4637 antibody. Bottom panel: PP4638 antibody.

Фиг. 53А-С. Профиль заряда изоформ и дезамидирование гуманизированных антител L3D10, определяемых с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ)FIG. 53A-C. Isoform charge profile and deamidation of humanized L3D10 antibodies determined by capillary isoelectric focusing (CIEF)

Уровень деамидирования белка при высоком рН-стрессе определяли путем сравнения гуманизированных антител L3D10 до и после стресс-обработки высоким рН в течение двух разных периодов времени (5 и 12,5 ч), анализировали с помощью анализа КИЭФ. На фиг. 53А-С изображены профили для антител РР4631, РР4637 и РР4638 соответственно.The level of protein deamidation at high pH stress was determined by comparing humanized antibodies L3D10 before and after high pH stress treatment for two different time periods (5 and 12.5 h), analyzed by CIEF analysis. FIG. 53A-C depict the profiles for antibodies PP4631, PP4637 and PP4638, respectively.

Фиг. 54А-С. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).FIG. 54A-C. Differential Scanning Calorimetry (DSC).

Термический анализ гуманизированных антител L3D10. Чтобы определить термическую стабильность и температуры плавления различных антител, они подвергались термическому анализу дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). На фиг. 54А-С изображены нормализованные кривые ДСК для антител РР4631, РР4637 и РР4638 соответственно.Thermal analysis of humanized antibodies L3D10. To determine the thermal stability and melting points of various antibodies, they were subjected to thermal analysis by differential scanning calorimetry (DSC). FIG. 54A-C depict normalized DSC curves for PP4631, PP4637 and PP4638 antibodies, respectively.

Фиг. 55. Выравнивание внеклеточных доменов CTLA-4 человека, макаки и мыши.FIG. 55. Alignment of the extracellular domains of human, macaque and mouse CTLA-4.

Аминокислотные последовательности человека (Hm) (SEQ ID NO: 73), макаки (Mk) и мыши (Ms) внеклеточного домена белка CTLA-4 выравниваются, и консервативные аминокислоты (относительно человеческой последовательности) изображены с тире (-). В порядке отношения к выравниванию последовательность мыши имеет удаление и вставку (относительно последовательностей человека и обезьяны) в положениях, выделенных желтым цветом. Известный сайт связывания B7-1Ig показан жирным и подчеркнутым. Последовательности демонстрируют, что последовательности человека и обезьяны являются высококонсервативными, тогда как последовательность мыши имеет ряд аминокислотных различий. На основе этого выравнивания последовательности были разработаны 11 мутантных (M1-M11) (SEQ IDNOS: 40-50) человеческих CTLA-4Fc белков, которые включают мышиные специфические аминокислоты - аминокислоты, включенные в каждый мутантный белок.The human (Hm) (SEQ ID NO: 73), macaque (Mk) and mouse (Ms) amino acid sequences of the extracellular domain of the CTLA-4 protein are aligned, and conserved amino acids (relative to the human sequence) are depicted with a dash (-). In order of relation to alignment, the mouse sequence has deletion and insertion (relative to the human and monkey sequences) at the positions highlighted in yellow. The known B7-1Ig binding site is shown in bold and underlined. The sequences demonstrate that the human and monkey sequences are highly conserved, while the murine sequence has a number of amino acid differences. Based on this sequence alignment, 11 mutant (M1-M11) (SEQ IDNOS: 40-50) human CTLA-4Fc proteins were developed that include the murine specific amino acids - amino acids included in each mutant protein.

Фиг. 56А, В. Композиция аминокислотной последовательности ДТ и мутантных белков CTLA-4FC.FIG. 56A, B. Composition of DT amino acid sequence and CTLA-4FC mutant proteins.

ДНК-конструкции, кодирующие белок CTLA-4Fc ДТ (SEQ ID NO: 39) и 11 мутантных белков (SEQ ID NO: 40-50), включающие мышиные CTLA-4 аминокислоты, были сконструированы, как изображено. Аминокислотные последовательности предназначены для зрелых белков, включая часть Fc IgG1, но не сигнальный пептид. Известный сайт связывания B7-1Ig показан большими уквами и подчеркнут двумя линиями. Заменяемые мышиные аминокислотные остатки в мутанте показаны в нижнем регистре. Часть IgG1 Fc-белков подчеркнута.DNA constructs encoding CTLA-4Fc DT protein (SEQ ID NO: 39) and 11 mutant proteins (SEQ ID NO: 40-50) comprising murine CTLA-4 amino acids were constructed as depicted. The amino acid sequences are for mature proteins, including the Fc portion of IgG1, but not the signal peptide. The known B7-1Ig binding site is shown in large letters and underlined by two lines. The substituted murine amino acid residues in the mutant are shown in lower case. Part of the IgG1 Fc proteins is underlined.

- 10 038617- 10 038617

Фиг. 57. Мутация в M11 (AA103-106, YLGI>fcGm) избирательно отменяет связывание антитела с человеческим CTLA-4.FIG. 57. Mutation in M11 (AA103-106, YLGI> fcGm) selectively abolishes antibody binding to human CTLA-4.

Показанные данные представляют собой две повторности, изображающие связывание B7-1Fc (a), L3D10 (b), PP4631 (с) и РР4637 (d), связывающиеся с hCTLA-4-Fc, внесенными в планшеты (открытые круги), mCTLA-4-Fc (заполненные треугольники), M11 (заполненные круги) и IgG1-Fc (открытые треугольники).Data shown are duplicates depicting binding of B7-1Fc (a), L3D10 (b), PP4631 (c) and PP4637 (d) binding to hCTLA-4-Fc plated (open circles), mCTLA-4 -Fc (filled triangles), M11 (filled circles) and IgG1-Fc (open triangles).

Фиг. 58. Сопоставление L3D10, РР4631 и РР4637 с эпитопом, смежным с сайтом связывания В7-1, в 3-D структуре комплекса B7-1-CTLA-4.FIG. 58. Alignment of L3D10, PP4631 and PP4637 with an epitope adjacent to the B7-1 binding site in the 3-D structure of the B7-1-CTLA-4 complex.

Момент связывания В7-1 окрашен в красный цвет, а эпитоп антитела окрашен в фиолетовый. В7-1 изображен над CTLA-4 с заполненной пробелом лентой, a CTLA-4 изображается как незаполненная лента.The binding point of B7-1 is colored red, and the epitope of the antibody is colored purple. B7-1 is depicted above a CTLA-4 with a blank-filled tape, and CTLA-4 is depicted as a blank tape.

Фиг. 59. Композиция аминокислотной последовательности ДТ (SEQ ID NO: 39) и мутантных белков CTLA-4Fc, M12-M17 (SEQ ID NO: 51-56).FIG. 59. Composition of the amino acid sequence of DT (SEQ ID NO: 39) and mutant proteins CTLA-4Fc, M12-M17 (SEQ ID NO: 51-56).

Конструкции ДНК, кодирующие шесть мутантных белков CTLA-4Fc, M12-M17, включая мышиные CTLA-4 аминокислоты, были сконструированы, как показано. Аминокислотные последовательности предназначены для зрелых белков, включая часть Fc IgG1, но не сигнальный пептид. Известный сайт связывания B7-1Ig показан большими буквами и подчеркнут двумя линиями. Заменяемые мышиные аминокислотные остатки в мутанте показаны в нижнем регистре. Часть IgG1 Fc-белков подчеркнута.DNA constructs encoding six mutant CTLA-4Fc proteins, M12-M17, including murine CTLA-4 amino acids, were constructed as shown. The amino acid sequences are for mature proteins, including the Fc portion of IgG1, but not the signal peptide. The known B7-1Ig binding site is shown in large letters and underlined by two lines. The substituted murine amino acid residues in the mutant are shown in lower case. Part of the IgG1 Fc proteins is underlined.

Фиг. 60А-С. Мутационный анализ выявил различные требования к привязке для 10D1 (фиг. 60А), РР4631 (фиг. 60В) и РР4637 (фиг. 60С) к CTLA-4.FIG. 60A-C. Mutational analysis revealed different binding requirements for 10D1 (FIG. 60A), PP4631 (FIG. 60B), and PP4637 (FIG. 60C) for CTLA-4.

Мутанты CTLA-4Fc вносились на всю ночь при 4°С в концентрации 1 мкм/мл. После блокировки с помощью БСА добавляли концентрацию биотинилированных мкАТ анти-CTLA-4 и инкубировали в течение 2 ч. После промывки несвязанных антител, связанные антитела детектировались с помощью стрептавидина, меченного HRP.CTLA-4Fc mutants were applied overnight at 4 ° C at a concentration of 1 µm / ml. After blocking with BSA, a concentration of biotinylated anti-CTLA-4 mAb was added and incubated for 2 h. After washing unbound antibodies, bound antibodies were detected with HRP-labeled streptavidin.

Фиг. 61А, В. Терапевтический эффект анти-4-1ВВ и анти-CTLA-4 антител как при минимальном заболевании (фиг. 61А), так и при установленных опухолевых (фиг. 61В) моделях.FIG. 61A, B. Therapeutic effect of anti-4-1BB and anti-CTLA-4 antibodies in both minimal disease (Fig. 61A) and established tumor (Fig. 61B) models.

На фиг. 61А изображена терапия минимального заболевания. Мышам C57BL/6 инокулировали подкожно 5x105 клеток МС38. На 2, 9 и 16 дни после инъекции опухолевых клеток инъецировали контрольные антитела хомяка и IgG крысы, анти-CTLA-4 и/или анти-4-1ВВ антитела. Размеры опухоли измеряли путем физического обследования. Приведенные данные представляют собой кинетику роста опухолей, с каждой линией, представляющей рост опухоли у одной мыши. Представленные размеры представляют собой результат более длинного и короткого диаметра опухоли.FIG. 61A depicts minimal disease therapy. C57BL / 6 mice were inoculated subcutaneously with 5x105 MC38 cells. On days 2, 9 and 16 after tumor cell injection, hamster control antibodies and rat IgG, anti-CTLA-4 and / or anti-4-1BB antibodies were injected. Tumor sizes were measured by physical examination. Data reported are tumor growth kinetics, with each line representing tumor growth in one mouse. The dimensions shown are the result of a longer and shorter tumor diameter.

На фиг. 61В изображена терапия установленных опухолей. Как и на фиг. 61А, исключается, что терапия началась на 14-й день после индукции опухоли; все мыши имели установленные опухоли размером от 9 до 60 мм² до начала лечения с помощью мкАТ. Комбинированный эффект двух антител на установленные опухоли повторяли 3 раза.FIG. 61B depicts therapy for established tumors. As in FIG. 61A, it is excluded that therapy began on the 14th day after tumor induction; all mice had established tumors ranging in size from 9 to 60 mm ² prior to treatment with MAb. The combined effect of the two antibodies on established tumors was repeated 3 times.

Фиг. 62. CD8 Т-клетки, но не CD4 или ЕКК-клетки, являются значимыми для отторжения опухоли, вызванной антителом.FIG. 62. CD8 T cells, but not CD4 or NK cells, are important for antibody-induced tumor rejection.

Мыши-опухоленосители, деплетировались CD4, CD8 или ЕКК-клетками путем трех инъекций антител, специфических для CD4, CD8 или NK1.1, на 9, 12 и 16 дни после инокуляции опухолевых клеток (*). Терапевтические антитела (анти-CTLA-4 плюс анти-4-1ВВ) вводились на 9, 16 и 23 дни (вертикальные стрелки). Приведенные данные представляют собой средние значения и СОС размеров опухоли (n=3). Р<0,05 для CD8-деплетuрованной группы по сравнению с каждой из других групп (f).Tumor-bearing mice were depleted with CD4, CD8 or NK cells by three injections of antibodies specific for CD4, CD8 or NK1.1 at 9, 12 and 16 days after tumor cell inoculation (*). Therapeutic antibodies (anti-CTLA-4 plus anti-4-1BB) were administered on days 9, 16 and 23 (vertical arrows). The data presented are the mean values and SOS of the tumor size (n = 3). P <0.05 for the CD8-depleted group compared to each of the other groups (f).

Фиг. 63А, В. Комбинированная терапия уменьшала реакцию хозяина на анти-CTLA-4 антитела.FIG. 63A, B. Combination therapy decreased host response to anti-CTLA-4 antibodies.

Хомяковые антимышиные-CTLA-4 (фиг. 63А) или крысиные антимышиные-4-1ВВ (фиг. 63В) антитела вносились в планшеты для ИФА. К планшетам добавляли различные разведения групп из пяти мышей. Относительные количества связанных антител определяли с использованием реагента вторичной стадии (биотинилированные козьи антимышиные антитела, которые были деплетированы реакционной способностью к IgG крысы и хомяка путем абсорбции). Показанные данные представляют собой среднее значение и СОС оптической плотности при 490 нм. Аналогичное снижение реакции антител хозяина к антиCTLA-4 и 4-1ВВ наблюдалось, когда мыши без опухолей получали те же антитела (данные не показаны).Hamster anti-mouse-CTLA-4 (FIG. 63A) or rat anti-mouse-4-1BB (FIG. 63B) antibodies were added to ELISA plates. Various dilutions of groups of five mice were added to the plates. The relative amounts of bound antibodies were determined using a secondary step reagent (biotinylated goat anti-mouse antibodies that have been depleted by reactivity to rat and hamster IgG by absorption). The data shown is the mean and SOS optical density at 490 nm. A similar decrease in the response of the host antibodies to anti-CTLA-4 and 4-1BB was observed when mice without tumors received the same antibodies (data not shown).

Фиг. 64А, В. Комбинированная терапия анти-4-1ВВ и L3D10 (античеловеческий-CTLA-4) антителом у мышей с нокин CTLA-4 человека.FIG. 64A, B. Combination therapy with anti-4-1BB and L3D10 (anti-human-CTLA-4) antibody in human CTLA-4 knockin mice.

На фиг. 64А изображен терапевтический эффект. Мышам с нокин CTLA-4 человека подкожно инокулировали 5x105 опухолевых клеток МС38. Через два дня группы из 7 мышей получали крысиный и мышиный IgG, анти-4-1ВВ и мышиный IgG, L3D10 и крысиный IgG, или L3D10 и анти-4-1ВВ, как указано стрелками. Показанные данные представляют собой среднее значение объема опухоли и СОС (n=7). Все процедуры значительно уменьшали рост опухоли (Р<0,001), а в группе лечения с двойными антителами значительно уменьшался размер опухоли по сравнению с контролем (Р<0,0001) или антителом L3D10 (Р=0,0007) или применением анти-4-1ВВ антитела (Р=0,03). Все мыши-опухоленосители умерщвлялись, когда контрольная группа, обработанная IgG, достигла критериев раннего удаления.FIG. 64A depicts a therapeutic effect. Human CTLA-4 knockin mice were inoculated subcutaneously with 5x105 MC38 tumor cells. Two days later, groups of 7 mice received rat and mouse IgG, anti-4-1BB and mouse IgG, L3D10 and rat IgG, or L3D10 and anti-4-1BB as indicated by the arrows. Data shown represent the mean of tumor volume and SOS (n = 7). All procedures significantly reduced tumor growth (P <0.001), and the double antibody treatment group significantly reduced tumor size compared to controls (P <0.0001) or L3D10 antibody (P = 0.0007) or anti-4- 1BB antibodies (P = 0.03). All tumor-bearing mice were sacrificed when the IgG-treated control group met the early deletion criteria.

На фиг. 64В изображен длительный иммунитет у мышей, которые получали комбинированную тераFIG. 64B depicts long-term immunity in mice that received combined tera

- 11 038617 пию. Мыши без опухолей, в группе, получавшие двойные антитела, развивали длительный иммунитет к опухоли МС38. На 110 день после первого заражения опухолевыми клетками, получившие двойные антитела, мышам без опухоли или контрольным наивным мышам вводили подкожно 5x105 опухолевых клеток. Рост опухоли контролировали при медицинском осмотре. Обратите внимание, что все мыши, которые отвергли опухоли к первому осмотру, были полностью устойчивы к повторному заражению, в то время как у всех здоровых мышей был прогрессирующий рост опухоли.- 11 038617 piyu. Tumor-free mice in the double antibody group developed long-term immunity to MC38 tumor. On day 110 after the first infection with tumor cells, receiving double antibodies, mice without tumor or control naive mice were injected subcutaneously with 5x105 tumor cells. Tumor growth was monitored by physical examination. Note that all mice that rejected tumors by the first examination were completely resistant to re-infection, while all healthy mice had progressive tumor growth.

ОпределенияDefinitions

Используемый в данном документе термин антитело предназначен для обозначения молекулы иммуноглобулина, которая обладает сайтом распознавания антигена вариабельной области.As used herein, the term “antibody” is intended to mean an immunoglobulin molecule that has a variable region antigen recognition site.

Термин вариабельная область предназначен для выделения такой области иммуноглобулина из доменов, которые широко распространены среди антител (таких как Fc-домен антитела). Вариабельная область содержит гипервариабельную область, остатки которой ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из гипервариабельной области или CDR (т.е. обычно примерно с остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и приблизительно с остатками 27-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи, 44) и/или эти остатки из гипервариабельной петли (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи, 45). Каркасная область или FR остатки представляют собой эти же остатки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в данном документе.The term variable region is intended to isolate such an immunoglobulin region from domains that are common among antibodies (such as the Fc domain of an antibody). The variable region contains a hypervariable region, the residues of which are responsible for antigen binding. The hypervariable region contains amino acid residues from the hypervariable region or CDRs (i.e., typically with about residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), and 89-97 (L3) in the light chain variable domain and about residues 27- 35 (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) in the variable domain of the heavy chain, 44) and / or these residues from the hypervariable loop (i.e. residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) in the light chain variable region and 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the heavy chain variable region, 45). Framework region or FR residues are the same variable region residues other than hypervariable region residues as defined herein.

Термин антитело включает в себя моноклональные антитела, мультиспецифические антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, верблюжьи антитела, одноцепочечные антитела, дисульфидсвязанные Fvs (sdFv), внутриклеточные антитела и анти-идиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id и анти-анти-Id антитела к антителам по изобретению). В частности, такие антитела включают молекулы иммуноглобулина любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.The term antibody includes monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, synthetic antibodies, chimeric antibodies, camel antibodies, single chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv), intracellular antibodies, and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies for example, anti-Id and anti-anti-Id antibodies to antibodies of the invention). In particular, such antibodies include immunoglobulin molecules of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) or subclass.

Используемый в данном документе термин антигенсвязывающий фрагмент антитела относится к одной или нескольким частям антитела, которые содержат гипервариабельную область антител (CDR) и необязательно каркасные остатки, которые содержат антиген-распознающий участок вариабельной области и проявляют способность иммуноспецифически связывать антиген. Такие фрагменты включают Fab', F(ab'), Sub.2, Fv, одноцепочечные (ScFv) и их мутанты, природные варианты и слитые белки, содержащие сайт распознавания антигена вариабельной области антитела и гетерологичный белок (например, токсин, сайт распознавания антигена для другого антигена, фермент, рецептор или рецепторный лиганд и т.д.). Используемый в данном документе термин фрагмент относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминогрупп, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков или менее 250 смежных аминокислотных остатков.As used herein, the term antigen-binding antibody fragment refers to one or more portions of an antibody that contain a hypervariable region of antibodies (CDRs) and optionally framework residues that contain an antigen-recognition region of the variable region and exhibit the ability to immunospecifically bind antigen. Such fragments include Fab ', F (ab'), Sub.2, Fv, single chain (ScFv) and their mutants, natural variants and fusion proteins containing an antigen recognition site of an antibody variable region and a heterologous protein (e.g. toxin, antigen recognition site for another antigen, enzyme, receptor or receptor ligand, etc.). As used herein, the term “fragment” refers to a peptide or polypeptide comprising an amino acid sequence of at least 5 contiguous amino acid residues, at least 10 contiguous amino acid residues, at least 15 contiguous amino acid residues, at least 20 contiguous amino acid residues, at least at least 25 contiguous amino acid residues, at least 40 contiguous amino acid residues, at least 50 contiguous amino acid residues, at least 60 contiguous amino groups, at least 70 contiguous amino acid residues, at least 80 contiguous amino acid residues, at least 90 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, at least 150 contiguous amino acid residues, at least 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, or less than 250 contiguous amino acid residues v.

Человеческие, химерные или гуманизированные антитела особенно предпочтительны для использования in vivo у людей, однако мышиные антитела или антитела других видов могут быть преимущественно использованы для многих применений (например, в анализах in vitro или in situ, при раннем использовании in vivo и т.д.).Human, chimeric, or humanized antibodies are particularly preferred for in vivo use in humans, however, murine or other species of antibodies can be advantageously used for many applications (e.g., in vitro or in situ assays, early in vivo use, etc.) ).

Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела получают из различных молекул иммуноглобулина, таких как антитела, имеющие вариабельную область, полученную из антитела, отличного от человека, и константной области иммуноглобулина человека. Химерные антитела, содержащие один или несколько CDR из видов, не относящихся к человеку, и каркасных областей из молекулы иммуноглобулина человека, могут быть получены с использованием различных методов, известных в данной области, включая, например, трансплантацию антигенсвязывающей области (ЕР 239400; International Publication No. WO 91/09967; and U.S. Pat. Nos. 5225539, 5530101, and 5585089), венирование или перекладку (ЕР 592106; ЕР 519596; 46-48), перестановку цепей (U.S. Pat. No. 5565332).A chimeric antibody is a molecule in which different portions of an antibody are derived from different immunoglobulin molecules, such as antibodies having a variable region derived from a non-human antibody and a constant region of a human immunoglobulin. Chimeric antibodies containing one or more CDRs from non-human species and framework regions from a human immunoglobulin molecule can be obtained using various methods known in the art, including, for example, antigen binding region transplantation (EP 239400; International Publication No. WO 91/09967; and US Pat. Nos. 5225539, 5530101, and 5585089), veneering or reshaping (EP 592106; EP 519596; 46-48), chain reshuffling (US Pat. No. 5565332).

Изобретение относится, в частности, к гуманизированным антителам. Используемый в данном документе термин гуманизированное антитело относится к иммуноглобулину, содержащему каркасную область человека и один или несколько CDR от иммуноглобулина не человека (обычно мыши или крысы). Нечеловеческий иммуноглобулин, обеспечивающий CDR, называется донором, а человеческий иммуноглобулин, обеспечивающий структуру, называется акцептором. Константные области необязательно должны присутствовать, но если они есть, они должны быть по существу идентичными константным обThe invention relates, in particular, to humanized antibodies. As used herein, the term “humanized antibody” refers to an immunoglobulin comprising a human framework and one or more CDRs from a non-human (usually mouse or rat) immunoglobulin. The non-human immunoglobulin that provides the CDR is called the donor, and the human immunoglobulin that provides the structure is called the acceptor. Const regions do not have to be present, but if they are, they must be essentially identical to constant regions.

- 12 038617 ластям иммуноглобулина человека, т.е. по меньшей мере приблизительно на 85-90%, предпочтительно примерно на 95% или более идентичны. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу идентичны соответствующим частям естественных последовательностей человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Например, гуманизированное антитело не будет охватывать типичное химерное антитело, поскольку, например, вся вариабельная область химерного антитела является не человеческой. Говорят, что донорское антитело было гуманизировано в процессе гуманизации, поскольку ожидается, что результирующее гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое обеспечивает CDR. По большей части гуманизированными антителами являются человеческие иммуноглобулины (антитела-реципиенты), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменяются остатками гипервариабельной области из нечеловеческих видов (донорских антител), таких как мыши, крыса, кролик или примат, отличный от человека, имеющий желаемую специфичность, сродство и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменяются соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в антителе-реципиенте или в донорском антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу по меньшей мере одно и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или практически все гипервариабельные области соответствуют тем, которые имеет иммуноглобулин, отличный от человека, и все или практически все FR являются теми же последовательностями человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека, который иммуноспецифически связывается с полипептидом Fc.gamma.RIIB, который был изменен путем введения аминокислотных остатков, делеции или добавления (т.е. мутаций).- 12 038617 human immunoglobulin flippers, i.e. at least about 85-90%, preferably about 95% or more identical. Therefore, all parts of the humanized immunoglobulin, except possibly the CDRs, are substantially identical to the corresponding parts of the natural sequences of the human immunoglobulin. A humanized antibody is an antibody comprising a humanized light chain and a humanized immunoglobulin heavy chain. For example, a humanized antibody will not encompass a typical chimeric antibody since, for example, the entire variable region of a chimeric antibody is not human. The donor antibody is said to have been humanized during the humanization process, since the resulting humanized antibody is expected to bind to the same antigen as the donor antibody that provides the CDRs. For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibodies), in which residues of the recipient's hypervariable region are replaced by residues of the recipient's hypervariable region from non-human species (donor antibodies) such as a mouse, rat, rabbit or non-human primate having the desired specificity. affinity and ability. In some cases, framework region (FR) residues of a human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. In addition, humanized antibodies may contain residues that are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to further improve antibody performance. In general, a humanized antibody will contain substantially at least one and typically two variable domains in which all or substantially all of the hypervariable regions correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or substantially all of the FRs are the same sequences of human immunoglobulin. The humanized antibody will optionally also contain at least a portion of an immunoglobulin (Fc) constant region, typically a human immunoglobulin, that immunospecifically binds to an Fc.gamma.RIIB polypeptide that has been altered by amino acid residues, deletion or addition (i.e. mutations).

Подробное описание сущности изобретенияDetailed description of the essence of the invention

Было показано, что антитело против человеческого белка CTLA-4, Ипилимумаб, увеличивает выживаемость больных раком либо как единственный иммунотерапевтический агент, либо в сочетании с другими терапевтическими агентами, такими как, не ограничиваясь, анти-PD-1 антителом [13-15]. Однако терапевтический эффект связан со значительными побочными эффектами [13-18]. Существует большая потребность в разработке новых aнтит-CTLA-4 антител для достижения лучшего терапевтического эффекта и/или меньшего аутоиммунного неблагоприятного эффекта. Изобретатели обнаружили aнти-CTLA-4 антитело, которое, к удивлению, может быть использовано для индуцирования отторжения раковых клеток, одновременно уменьшает аутоиммунные побочные эффекты, связанные с иммунотерапией.An antibody against the human CTLA-4 protein, Ipilimumab, has been shown to increase cancer patient survival either as a sole immunotherapeutic agent or in combination with other therapeutic agents such as, but not limited to, an anti-PD-1 antibody [13-15]. However, the therapeutic effect is associated with significant side effects [13-18]. There is a great need for the development of new anti-CTLA-4 antibodies to achieve a better therapeutic effect and / or less autoimmune adverse effect. The inventors have discovered an anti-CTLA-4 antibody that surprisingly can be used to induce the rejection of cancer cells while also reducing the autoimmune side effects associated with immunotherapy.

В данном документе предлагаются композиции антител и их антигенсвязывающих фрагментов. Изобретение также относится к варианту реализации таких молекул, где молекула представляет собой моноклональное антитело, человеческое антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.This document provides compositions of antibodies and antigen-binding fragments thereof. The invention also provides an embodiment of such molecules, wherein the molecule is a monoclonal antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody.

В частности, изобретение относится к молекуле, содержащей антигенсвязывающий фрагмент антитела, который иммуноспецифически связывается с CTLA-4 и, в частности, с CTLA-4 человека, предпочтительно экспрессируемым на поверхности живой клетки при эндогенной или трансфицированной концентрации. Изобретение, в частности, относится к варианту реализации такой молекулы, где антигенсвязывающий фрагмент связывается с CTLA-4 и где живая клетка представляет собой Т-клетку.In particular, the invention relates to a molecule containing an antigen-binding antibody fragment that immunospecifically binds to CTLA-4, and in particular to human CTLA-4, preferably expressed on the surface of a living cell at an endogenous or transfected concentration. The invention particularly relates to an embodiment of such a molecule, wherein the antigen binding fragment binds to CTLA-4 and wherein the living cell is a T cell.

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые способны иммуноспецифически связываться с CTLA-4. В некоторых вариантах реализации такие молекулы дополнительно способны блокировать связывание В7.1 и В7.2 с CTLA-4.The present invention relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that are capable of immunospecifically binding to CTLA-4. In some embodiments, such molecules are further capable of blocking the binding of B7.1 and B7.2 to CTLA-4.

Изобретение также относится к варианту реализации таких молекул, где молекула представляет собой моноклональное антитело, человеческое антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Изобретение включает варианты реализации, в которых такие антитела представляют собой моноспецифические, биспецифические, триспецифические или мультиспецифические.The invention also provides an embodiment of such molecules, wherein the molecule is a monoclonal antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody. The invention includes embodiments in which such antibodies are monospecific, bispecific, trispecific, or multispecific.

Изобретение также относится к варианту реализации таких молекул или антител, которые связываются с CTLA-4 и где их антигенсвязывающий фрагмент содержит шесть CDR, где CDR содержит CDR анти-CTLA-4 антитела L3D10. Конкретно, антитело содержит три легкие цепи и три CDR тяжелой цепи анти-CTLA-4 антитела L3D10.The invention also provides an embodiment of such molecules or antibodies that bind to CTLA-4 and wherein the antigen-binding fragment thereof comprises six CDRs, wherein the CDR comprises the CDRs of anti-CTLA-4 antibody L3D10. Specifically, the antibody contains three light chains and three heavy chain CDRs of the anti-CTLA-4 antibody L3D10.

Изобретение также относится к варианту реализации вышеописанных антител, где антитело детектируется при помощи метки или содержит конъюгированный токсин, лекарственный препарат, рецептор, фермент, рецепторный лиганд.The invention also relates to an embodiment of the above-described antibodies, where the antibody is detected using a label or contains a conjugated toxin, drug, receptor, enzyme, receptor ligand.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество любой из вышеописанных композиций антител и физиологически приемлемый носитель или наполнитель. Предпочтительно композиции согласно изобретению содержат профилактически или терапевтически эффективное количество гуманизированных антител изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.The invention also provides a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of any of the above-described antibody compositions and a physiologically acceptable carrier or excipient. Preferably, the compositions of the invention comprise a prophylactically or therapeutically effective amount of the humanized antibodies of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

В конкретном варианте реализации термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в ФармаIn a specific embodiment, the term pharmaceutically acceptable means approved by a regulatory agency of the federal or state government, or listed in Pharma

- 13 038617 копее США или другой общепризнанной фармакопее для использования на животных и, более конкретно, на людях. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), наполнителю или носителю, с которым вводится лекарство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе масла, животные, растительные или синтетические, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода представляет собой предпочтительный носитель, когда фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и с подобное. Композиция, если желательно, может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-буферное средство. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным высвобождением и т.п.- 13,038,617 US kopecks or other generally recognized pharmacopoeia for use in animals and more specifically in humans. The term carrier refers to a diluent, an adjuvant (for example, Freund's adjuvant (complete and incomplete), excipient or carrier with which the drug is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids such as water and oils, including oils, animals, vegetable or synthetic such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc. Water is the preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerin can also be used as liquid carriers, especially for injection solutions Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerin monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerin, propylene, glycol, water , ethanol and the like. The composition, if desired, may also contain minor amounts properties of wetting or emulsifying agents or pH buffering agent. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release compositions, and the like.

Как правило, ингредиенты композиций согласно изобретению могут поставляться либо отдельно, либо смешиваться вместе в виде стандартной дозировки, например в виде сухого лиофилизированного порошка или концентрата без воды в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, указывая количество активного агента. Там, где композиция должна вводиться путем инфузии, ее можно внести в инфузионный флакон, содержащий воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. Когда композицию вводят путем инъекции, может быть предусмотрена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора, так что ингредиенты могут быть смешаны до введения.Typically, the ingredients of the compositions of the invention can either be supplied separately or mixed together in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or concentrate without water in a sealed container such as an ampoule or sachet, indicating the amount of active agent. Where the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed into an infusion bottle containing pharmaceutical grade water or saline. When the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline may be provided so that the ingredients can be mixed prior to administration.

Композиции согласно изобретению могут быть составлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соединения, образованные с анионами, такими как соединения, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и тех, которые образуются с катионами, такими как соединения, полученные из натрия, калия, аммония, кальций, гидроксида железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.The compositions according to the invention can be formulated in neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, compounds formed with anions such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and those formed with cations such as compounds derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, iron hydroxide, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc.

Изобретение также относится к применению описанных в данном документе композиций антител и их фармацевтических композиций для усиления иммунных реакций. Положительная модуляция иммунной системы особенно желательна при лечении рака и хронических инфекций, и, таким образом, настоящее изобретение имеет смысл при лечении таких расстройств. Используемый в данном документе термин рак относится к новообразованию или опухоли в результате аномального неконтролируемого роста клеток. Используемый в данном документе рак явно включает лейкозы и лимфомы. Термин относится к заболеванию, включающему клетки, которые могут метастазировать в дистальные участки.The invention also relates to the use of the antibody compositions and pharmaceutical compositions described herein for enhancing immune responses. Positive modulation of the immune system is particularly desirable in the treatment of cancer and chronic infections, and thus the present invention makes sense in the treatment of such disorders. As used herein, the term cancer refers to a neoplasm or tumor resulting from abnormal uncontrolled cell growth. Cancers as used herein clearly include leukemias and lymphomas. The term refers to a disease involving cells that can metastasize to distal sites.

Соответственно, способы и композиции согласно изобретению могут также быть полезны при лечении или профилактике различных видов рака или других аномальных пролиферативных заболеваний, включая (но не ограничиваясь ими) следующее: карциному, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почек, печени, легких, яичников, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; включая плоскоклеточную карциному; гематопоэтические опухоли лимфоидной линии, включая лейкемию, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Беркитта; гематопоэтические опухоли миелоидной линии, включая острые и хронические миелоидные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, включая меланому, семиномию, тетратокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, ксенодермальную пигментацию, кератоактантому, семиномию, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному. Также предполагается, что раковые образования, вызванные аберрациями при апоптозе, также будут лечиться способами и композициями согласно изобретению. Такие раки могут включать, но не ограничиваются ими, фолликулярные лимфомы, карциномы с мутациями р53, гормонозависимые опухоли молочной железы, предстательной железы и яичника и предраковые поражения, такие как семейный аденоматозный полипоз и миелодиспластические синдромы. В конкретных вариантах реализации злокачественные или диспролиферативные изменения (такие как метаплазии и дисплазии) или гиперпролиферативные нарушения лечатся или предотвращаются способами и композициями согласно изобретению в яичниках, мочевом пузыре, груди, толстой кишке, лёгком, коже, поджелудочной железе или матке. В других конкретных вариантах реализации саркома, меланома или лейкемия лечатся или предотвращаются способами и композициями согласно изобретению.Accordingly, the methods and compositions of the invention may also be useful in the treatment or prevention of various cancers or other abnormal proliferative diseases, including, but not limited to, the following: carcinoma, including bladder, breast, colon, kidney, liver, lungs, ovaries, pancreas, stomach, cervix, thyroid, and skin; including squamous cell carcinoma; hematopoietic tumors of the lymphoid lineage, including leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, B-cell lymphoma, T-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma; hematopoietic tumors of the myeloid lineage, including acute and chronic myeloid leukemias and promyelocytic leukemia; tumors of mesenchymal origin, including fibrosarcoma and rhabdomyosarcoma; other tumors, including melanoma, seminomia, tetratocarcinoma, neuroblastoma, and glioma; tumors of the central and peripheral nervous system, including astrocytoma, neuroblastoma, glioma, and schwannomas; tumors of mesenchymal origin, including fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, and osteosarcoma; and other tumors including melanoma, xenodermal pigmentation, keratoactantoma, seminomia, follicular thyroid cancer, and teratocarcinoma. It is also contemplated that cancers caused by aberrations in apoptosis will also be treated with the methods and compositions of the invention. Such cancers can include, but are not limited to, follicular lymphomas, carcinomas with p53 mutations, hormone-dependent tumors of the breast, prostate and ovary, and precancerous lesions such as familial adenomatous polyposis and myelodysplastic syndromes. In specific embodiments, malignant or dysproliferative changes (such as metaplasias and dysplasias) or hyperproliferative disorders are treated or prevented by the methods and compositions of the invention in the ovaries, bladder, breast, colon, lung, skin, pancreas, or uterus. In other specific embodiments, a sarcoma, melanoma, or leukemia is treated or prevented by the methods and compositions of the invention.

В другом варианте реализации изобретения композиции антител и их антигенсвязывающих фрагментов могут быть использованы с другими противоопухолевыми терапиями, включая, но не ограничиваясь ими, текущую стандартную и экспериментальную химиотерапию, гормональную терапию, биологическую терапию, иммунотерапию, лучевую терапию или хирургию. В некоторых вариантах осуществления молекулы согласно изобретению могут вводиться в комбинации с терапевтически или профилактически эффекIn another embodiment, the antibody compositions and antigen binding fragments thereof can be used with other anticancer therapies, including, but not limited to, current standard and experimental chemotherapy, hormonal therapy, biological therapy, immunotherapy, radiation therapy, or surgery. In some embodiments, the molecules of the invention can be administered in combination with a therapeutic or prophylactic effect

- 14 038617 тивным количеством одного или нескольких агентов, терапевтических антител или других агентов, известных специалистам в данной области для лечения и/или профилактики рака, аутоиммунного заболевания, инфекционных заболеваний или интоксикации. Такие агенты включают, например, любой из рассмотренных выше модификаторов биологического ответа, цитотоксинов, антиметаболитов, алкилирующих агентов, антибиотиков или антимитотических агентов, а также иммунотерапевтических средств.- 14,038617 an effective amount of one or more agents, therapeutic antibodies or other agents known to those skilled in the art for the treatment and / or prevention of cancer, autoimmune disease, infectious diseases or intoxication. Such agents include, for example, any of the biological response modifiers discussed above, cytotoxins, antimetabolites, alkylating agents, antibiotics or antimitotic agents, and immunotherapeutic agents.

В предпочтительном варианте реализации изобретения композиции антител и их антигенсвязывающих фрагментов могут быть использованы с другими противоопухолевыми иммунотерапиями. В таком варианте реализации молекулы согласно изобретению вводят в комбинации с молекулами, которые нарушают или усиливают альтернативные иммуномодулирующие пути (такие как TIM3, TIM4, ОХ40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, В7-Н3, В7-Н4, LIGHT, BTLA, ICOS, CD27 или LAG3) или модулируют активность молекул-эффекторов, таких как цитокины (например, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, GF-бета, ZFNy, Flt3, BLys) и хемокины (например, CCL21) для усиления иммуномодулирующих эффектов. Конкретные варианты реализации включают биспецифическое антитело, содержащее композиции антитCTLA-4 антитела, описанные в данном документе, и анти-PD-1 (пембролизумаб (Кейтруда)) или Ниволумаб (Опдиво)), анти-В7-Н1 (атезолизумаб (Тецентрик) или дирвалумаб), анти-В7-Н3, анти-В7-Н4, антиLIGHT, анти-LAG3, анти-TIM3, анти-TIM4 анти-CD40, анти-ОХ40, анти-GITR, анти-BTLA, анти-CD27, анти-ICOS или анти-4-1. В еще одном варианте реализации молекулы изобретения вводят в комбинации с молекулами, которые активируют различные стадии или аспекты иммунного ответа для достижения более широкого иммунного ответа. В более предпочтительном варианте реализации композиции антител и их антигенсвязывающих фрагментов объединены с анти-PD-1 или анти-4-1ВВ антителами без усиления аутоиммунных побочных эффектов.In a preferred embodiment of the invention, the compositions of antibodies and antigen-binding fragments thereof can be used with other antitumor immunotherapies. In such an embodiment, the molecules of the invention are administered in combination with molecules that disrupt or enhance alternative immunomodulatory pathways (such as TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, B7-H3 , B7-H4, LIGHT, BTLA, ICOS, CD27 or LAG3) or modulate the activity of effector molecules such as cytokines (e.g. IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL- 17, GF-beta, ZFNy, Flt3, BLys) and chemokines (eg CCL21) to enhance immunomodulatory effects. Specific embodiments include a bispecific antibody comprising the CTLA-4 antibody compositions described herein and anti-PD-1 (pembrolizumab (Keytruda)) or Nivolumab (Opdivo)), anti-B7-H1 (atezolizumab (Tecentriq) or dirvalumab ), anti-B7-H3, anti-B7-H4, antiLIGHT, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4 anti-CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS or anti-4-1. In yet another embodiment, the molecules of the invention are administered in combination with molecules that activate various steps or aspects of the immune response to achieve a broader immune response. In a more preferred embodiment, the compositions of antibodies and antigen-binding fragments thereof are combined with anti-PD-1 or anti-4-1BB antibodies without increasing autoimmune side effects.

Другой вариант реализации изобретения включает биспецифическое антитело, которое содержит антитело, связывающиеся с CTLA-4, соединенным с антителом, которое связывает другие иммуностимулирующие молекулы. Конкретные варианты реализации включают биспецифическое антитело, содержащее композиции, анти-CTLA-4 антитела, описанные в данном документе, и αнтu-PD-1, анти-В7-Н1, анти-В7Н3, анти-В7-Н4, анти-LIGHT, анти-LAG3, анти-TIM3, анти-TIM4, анти-CD40, анти-ОХ40, анти-GITR, анти-BTLA, анти-CD27, анти-ICOS или анти-4-1ВВ. Изобретение также относится к применению таких антител, которые используются для лечения рака.Another embodiment of the invention includes a bispecific antibody that contains an antibody that binds to CTLA-4 coupled to an antibody that binds other immunostimulatory molecules. Specific embodiments include a bispecific antibody comprising the compositions, anti-CTLA-4 antibodies described herein, and αnu-PD-1, anti-B7-H1, anti-B7H3, anti-B7-H4, anti-LIGHT, anti -LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4, anti-CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS or anti-4-1BB. The invention also relates to the use of such antibodies for use in the treatment of cancer.

Способы введения композиций антител согласно изобретению включают, но не ограничиваются ими, парентеральное введение (например, внутрикожные, внутримышечные, интраперитонеальные, внутривенные и подкожные), эпидуральные и мукозальные (например, интраназальные и оральные пути). В конкретном варианте реализации антитела согласно изобретению вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным способом, например путем инфузии или болюсной инъекции путем абсорбции через эпителиальные или слизистые оболочки (например, слизистой оболочки полости рта, слизистой оболочки прямой кишки и кишечника и т.д.), и они могут вводиться вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным.Methods for administering antibody compositions of the invention include, but are not limited to, parenteral (eg, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous and subcutaneous), epidural and mucosal (eg, intranasal and oral routes). In a specific embodiment, the antibodies of the invention are administered intramuscularly, intravenously, or subcutaneously. The compositions can be administered by any convenient route, for example, by infusion or by bolus injection by absorption through epithelial or mucous membranes (for example, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.), and they can be administered together with other biologically active agents. The introduction can be systemic or local.

Еще один вариант реализации изобретения касается контроля блокирующих эффектов анти-CTLA-4 антител in vivo путем контроля уровней экспрессии В7.1 и В7.2 на иммунных клетках, таких как антигенпрезентирующие клетки (АПК). CTLA-4 экспрессируется преимущественно среди Трег, где он подавляет аутоиммунные заболевания путем регуляции снижения уровня экспрессии В7-1 и В7-2 на АПК, таких как дендритные клетки. Поэтому повышение экспрессии молекул В7, В7.1 и В7.2, может быть индикатором блокады взаимодействий B7-CTLA-4 in vivo. В конкретном варианте реализации периферические или внутриопухолевые иммунные клетки удаляются из субъекта до и после лечения анти-CTLA-4 и анализируются ex vivo для снижения уровня В7.1 и/или В7.2 на поверхности иммунной клетки, где присутствие блокирующих анти-CTLA-4 антител предотвращает связывание В7.1/В7.2 эндогенным CTLA-4, что, в свою очередь, предотвращает снижение экспрессии В7.1 и В7.2, что приводит к увеличению общего уровня В7.1/В7.2. В предпочтительном варианте реализации уровень В7.1 и В7.1 измеряется на антигенпрезентирующих клетках. В наиболее предпочтительном варианте реализации уровень В7.1 и В7.1 измеряется на дендритных клетках.Another embodiment of the invention relates to the control of the blocking effects of anti-CTLA-4 antibodies in vivo by controlling the expression levels of B7.1 and B7.2 on immune cells, such as antigen presenting cells (APC). CTLA-4 is expressed predominantly among Tregs, where it suppresses autoimmune diseases by regulating downregulation of B7-1 and B7-2 expression on APCs such as dendritic cells. Therefore, an increase in the expression of B7, B7.1 and B7.2 molecules can be an indicator of the blockade of B7-CTLA-4 interactions in vivo. In a specific embodiment, peripheral or intratumoral immune cells are removed from the subject before and after anti-CTLA-4 treatment and analyzed ex vivo to reduce B7.1 and / or B7.2 levels on the surface of the immune cell, where anti-CTLA-4 blocking is present antibodies prevents the binding of B7.1 / B7.2 to endogenous CTLA-4, which, in turn, prevents a decrease in the expression of B7.1 and B7.2, which leads to an increase in the total level of B7.1 / B7.2. In a preferred embodiment, the B7.1 and B7.1 levels are measured on antigen-presenting cells. In the most preferred embodiment, the B7.1 and B7.1 levels are measured on dendritic cells.

В еще одном варианте реализации изменение (уменьшение) В7.1 и В7.2 на иммунных клетках после лечения анти-CTLA-4 используют в качестве биомаркера для измерения биологической активности антиCTLA-4 антител in vivo и мониторинга явных ответов на лечение анти-CTLA-4, путем измерения экспрессии уровня В7.1 и/или В7.2 на иммунных клетках и сравнения уровня экспрессии до и после лечения. В предпочтительном варианте реализации уровень экспрессии В7.1 и/или В7.2 контролируется все время в ходе терапии анти-CTLA-4.In another embodiment, the change (decrease) in B7.1 and B7.2 on immune cells after treatment with anti-CTLA-4 is used as a biomarker to measure the biological activity of anti-CTLA-4 antibodies in vivo and to monitor the apparent responses to treatment with anti-CTLA-4. 4 by measuring the expression level of B7.1 and / or B7.2 on immune cells and comparing the level of expression before and after treatment. In a preferred embodiment, the level of expression of B7.1 and / or B7.2 is monitored at all times during anti-CTLA-4 therapy.

ПримерыExamples of

Пример 1. Получение химерного анти-CTLA-4 антитела.Example 1. Obtaining a chimeric anti-CTLA-4 antibody.

Используя мышей с нокин CTLA-4 человека и мышей hu-PBL-Scid, ранее было продемонстрировано, что мышиные анти-CTLA-4 антитела уменьшали рост опухоли и определили L3D10 как наиболее эффективные среди тестируемых в планшетах мкАТ. Однако ни одно из полученных антител не могло достичь полного отторжения опухоли даже при использовании в относительно высоких дозах (>10 мг/кг) и до образования пальпируемых опухолей (как в начале второго дня) после индукции опухолевыми клеткамиUsing human CTLA-4 knockin mice and hu-PBL-Scid mice, it was previously demonstrated that mouse anti-CTLA-4 antibodies reduced tumor growth and identified L3D10 as the most effective of the mAb tested in the plates. However, none of the obtained antibodies could achieve complete tumor rejection even when used in relatively high doses (> 10 mg / kg) and before the formation of palpable tumors (as at the beginning of the second day) after induction by tumor cells

- 15 038617- 15 038617

[19-21].[19-21].

Поскольку мышиные антитела представляли собой подклассы IgG1, которые не обладают сильной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ), и поскольку АЗКЦ может участвовать в отторжении опухоли, Fc мкАТ модифицировали несколькими способами для достижения лучшего иммунотерапевтического эффекта. Во-первых, мышиный IgG1, который является слабым в АЗКЦ, был заменен для получения химерного антитела с человеческим IgG1, который обладает сильной АЗКЦ активностью. Вовторых, на основе известного уровня техники в литературе [22], три мутации (S298A, Е333А и К334А) были введены в СН для увеличения активности АЗКЦ. В-третьих, были введены три мутации (M252Y, S254T и Т256Е) для увеличения периода полувыведения антитела in vivo [23]. Конструкция нового химерного антитела изображена на фиг. 1, левая панель.Since murine antibodies are IgG1 subclasses that do not have strong antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), and since ADCC can be involved in tumor rejection, Fc mAb was modified in several ways to achieve a better immunotherapeutic effect. First, mouse IgG1, which is weak in ADCC, was replaced to produce a chimeric antibody with human IgG1, which has strong ADCC activity. Second, based on the prior art in the literature [22], three mutations (S298A, E333A and K334A) were introduced into the SN to increase the activity of ADCC. Third, three mutations (M252Y, S254T, and T256E) were introduced to increase the antibody half-life in vivo [23]. The construction of the novel chimeric antibody is depicted in FIG. 1, left panel.

Для конструирования антитела, вариабельные области гибридомы L3D10 были сначала идентифицированы посредством секвенирования ДНК с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Нуклеотидные последовательности были переведены в аминокислоты, перечисленные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Нормальная последовательность человеческого IgG1 Fc и последовательность Fc-мутанта описаны в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно. Аминокислоты и кодоны оптимизированной нуклеотидной последовательности в последовательностях тяжелой и легкой цепи раскрыты в SEQ ID NO: 5-8.For antibody construction, the variable regions of the L3D10 hybridoma were first identified by DNA sequencing using standard techniques known in the art. The nucleotide sequences were converted to the amino acids listed in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. The normal human IgG1 Fc sequence and Fc mutant sequence are described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively. The amino acids and codons of the optimized nucleotide sequence in the heavy and light chain sequences are disclosed in SEQ ID NOs: 5-8.

ДНК, соответствующая SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, была синтезирована и вставлена в векторы экспрессии, и векторы сконструированной последовательности были трансфицированы в клетки HEK293. Вкратце, клетки HEK293 высевали во встряхиваемую колбу за день до трансфекции и выращивали с использованием сред с известным химическим составом, не содержащих сыворотку. ДНК-конструкты для экспрессии трансфицировали в 0,5 л суспензии клеток HEK293, используя стандартную методику для временной трансфекции. Через 20 ч клетки отбирали для определения жизнеспособности и количества жизнеспособных клеток, и измеряли титр (Octet QKe, ForteBio). Дополнительные показания были получены во время серийных временных трансфекций. Культуру отбирали на 5-й день. Из серийный временных трансфекций, кондиционированную среду для L3D10 получали и осветляли путем центрифугирования и фильтрации. Супернатант пропускали через колонку с белком А и элюировали буфером с низким рН. Фильтрацию с использованием мембранного фильтра 0,2 мкм проводили перед аликвотированием. После очистки и фильтрации концентрацию белка рассчитывали по ОП280 и коэффициенту экстинкции. В общей сложности 43,2 мг Ig-белков получали из одного цикла трансфекции.DNA corresponding to SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 was synthesized and inserted into expression vectors, and sequence engineered vectors were transfected into HEK293 cells. Briefly, HEK293 cells were seeded in a shake flask the day before transfection and grown using serum-free media of known chemistry. DNA constructs for expression were transfected in 0.5 L of HEK293 cell suspension using standard transient transfection techniques. After 20 hours, cells were taken to determine the viability and the number of viable cells, and the titer was measured (Octet QKe, ForteBio). Additional indications were obtained during serial transient transfections. The culture was taken on the 5th day. From serial transient transfections, conditioned medium for L3D10 was prepared and clarified by centrifugation and filtration. The supernatant was passed through a Protein A column and eluted with a low pH buffer. Filtration using a 0.2 μm membrane filter was performed prior to aliquoting. After purification and filtration, the protein concentration was calculated using the OD280 and the extinction coefficient. A total of 43.2 mg Ig proteins were obtained from one round of transfection.

Пример 2. Сайты связывания химерного L3D10 антитела только частично перекрываются 10D1.Example 2. The binding sites of the chimeric L3D10 antibody are only partially overlapped by 10D1.

Было показано, что в клинике анти-CTLA-4-антитело, Ипилимумаб, улучшает выживаемость больных раком, но вызывает значительное аутоиммунное нежелательное явление. Для оценки сравнительных сайтов связывания химерного антитела L3D10 и 10D1, сравнивали связывание с CTLA-4 и способность антител конкурировать за связывание с CTLA-4. Хотя оба антитела связываются с иммобилизованными белками CTLA-4 при сопоставимом эффекте (фиг. 2), 10D1 не полностью блокирует связывание химерного L3D10 с CTLA-4 (фиг. 3). Как и ожидалось, немеченный L3D10 полностью блокирует связывание меченного L3D10, указывая, что сайты связывания антител L3D10 и 10D1 только частично перекрываются.Clinically, an anti-CTLA-4 antibody, Ipilimumab, has been shown to improve the survival of cancer patients but cause a significant autoimmune adverse event. To evaluate the comparative binding sites of chimeric antibodies L3D10 and 10D1, binding to CTLA-4 and the ability of antibodies to compete for binding to CTLA-4 were compared. Although both antibodies bind to immobilized CTLA-4 proteins with comparable effect (FIG. 2), 10D1 does not completely block the binding of chimeric L3D10 to CTLA-4 (FIG. 3). As expected, unlabeled L3D10 completely blocks the binding of labeled L3D10, indicating that the antibody binding sites L3D10 and 10D1 only partially overlap.

Пример 3. Более эффективное блокирование взаимодействий CTLA-4: В7.1 и CTLA-4: В7.2 посредством химерного антитела L3D10, по сравнению с 10D1Example 3. More Effective Blocking of CTLA-4: B7.1 and CTLA-4: B7.2 Interactions with Chimeric Antibody L3D10 Compared to 10D1

Сообщалось, что античеловеческий CTLA-4 мкАТ, 10D1, может блокировать взаимодействие B7CTLA-4, если растворимые В7-1 и В7-2 использовались для взаимодействия с иммобилизованным CTLA-4 (49). Так как В7-1 и В7-2 функционируют как костимулирующие поверхностно-молекулярные формы клетки, авторы изобретения оценили способность анти-CTLA-4 антител блокировать взаимодействие B7-CTLA-4 с использованием иммобилизованных В7-1 и В7-2. Используя конкурентный анализа ИФА, устанавливали способности L3D10 и 10D1 блокировать связывание слитого белка CTLA-4, CTLA-4-Ig, как с планшет-мобилизированными, так и с экспрессируемыми на поверхности клетки В7.1 и В7.2. Для этих экспериментов использовали химерное античеловеческий CTLA-4-mkAT с аффинностью (2,3 нМ), которое аналогично 10D1 (4 нМ) [49]. Для анализа иммобилизации в планшетах, B7.1Fc или B7.2Fc вносили в планшеты для ИФА в концентрации 1 мкг/мл на всю ночь при 4°С или на 2 ч при 37°С. Биотинилированный CTLA-4-Fc смешивали с заданными концентрациями B7.1-Fc, 10D1 или химерного L3D10. Количество CTLA-4-Fc, связанного с В7.1 в планшете, определяют с использованием стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Как изображено на фиг. 4, в то время как химерные L3D10, B7.1Fc и CTLA4-Fc эффективно блокировали взаимодействие CTLA-4-Fc: B7.1, две отдельные части материала 10D1 не смогли блокировать взаимодействие. L3D10 демонстрирует значительную блокировку связывания с иммобилизованной в планшете В7.1 в концентрациях всего лишь 0,2 мкг/мл, достигая 50% ингибирования (ИК₅₀) в концентрации около 3 мкг/мл. Аналогичным образом, L3D10 блокировал связывание CTLA-4-Fc в планшете с иммобилизованной В7.2 с ИК₅₀ в концентрации 0,03 мкг/мл, тогда как 10D1 из двух разных серий веществ проявляли минимальное блокирование ИК50 приблизительно при 200 мкг/мл (фиг. 5). Однако в соответствии с ранними сведениями [49], антитело 10D1 сильно ингибирует взаимодействие B7-1CTLA-4 в противоположном эксперименте, когда иммобилизованная в планшете CTLA-4 используется для взаимодействия с растворимым В7-1 (фиг. 6).The anti-human CTLA-4 mAb, 10D1, has been reported to block the interaction of B7CTLA-4 if soluble B7-1 and B7-2 were used to interact with immobilized CTLA-4 (49). Since B7-1 and B7-2 function as costimulatory surface molecular forms of cells, the inventors evaluated the ability of anti-CTLA-4 antibodies to block the interaction of B7-CTLA-4 using immobilized B7-1 and B7-2. Using competitive ELISA, the ability of L3D10 and 10D1 to block the binding of the fusion protein CTLA-4, CTLA-4-Ig, both to plate-mobilized and to those expressed on the cell surface B7.1 and B7.2, was established. For these experiments, we used chimeric antihuman CTLA-4-mkAT with an affinity (2.3 nM) similar to 10D1 (4 nM) [49]. For the analysis of immobilization in plates, B7.1Fc or B7.2Fc were added to ELISA plates at a concentration of 1 μg / ml overnight at 4 ° C or for 2 h at 37 ° C. Biotinylated CTLA-4-Fc was mixed with predetermined concentrations of B7.1-Fc, 10D1 or chimeric L3D10. The amount of CTLA-4-Fc bound to B7.1 in the plate is determined using streptavidin conjugated to horseradish peroxidase. As shown in FIG. 4, while chimeric L3D10, B7.1Fc, and CTLA4-Fc effectively blocked the CTLA-4-Fc: B7.1 interaction, two separate pieces of 10D1 material could not block the interaction. L3D10 demonstrates significant blocking of binding to immobilized B7.1 at concentrations as low as 0.2 μg / ml, reaching 50% inhibition (IC ₅₀ ) at a concentration of about 3 μg / ml. Similarly, L3D10 blocked the binding of CTLA-4-Fc to immobilized B7.2 tablet with IC ₅₀ at a concentration of 0.03 g / ml, whereas the two different 10D1 series substances showed minimal blocking IC50 at about 200 micrograms / ml (Figure . 5). However, according to early reports [49], antibody 10D1 strongly inhibits the interaction of B7-1CTLA-4 in the opposite experiment, when immobilized in the plate CTLA-4 is used to interact with soluble B7-1 (Fig. 6).

- 16 038617- 16 038617

Для экспериментов по связыванию с белками клеточной мембраны, когда В7.1 экспрессируется на поверхности клеток ЯКХ, L3D10 блокирует связывание CTLA-4-Fc, но 10D1 из двух разных серий веществ не проявляет подобного эффекта, даже при использовании в концентрации 512 мкг/мл (фиг. 7). В то время как намного менее мощные, чем у L3D10, высокие дозы 10D1 достигали примерно 25% блокирования между человеческим CTLA-4 и мышиным В7-1 (фиг. 8). Для В7.2, экспрессированного на поверхности клеток ЯКХ, L3D10 снова блокировался, тогда как 10D1 только частично блокировался, причем ингибирование менее 50% наблюдалось даже при использовании 10D1 в концентрации 512 Пмкг/ мл (фиг. 9).For cell membrane protein binding experiments, when B7.1 is expressed on the surface of NCC cells, L3D10 blocks CTLA-4-Fc binding, but 10D1 from two different series of substances does not show this effect, even when used at a concentration of 512 μg / ml ( Fig. 7). While much less potent than L3D10, high doses of 10D1 achieved approximately 25% blocking between human CTLA-4 and murine B7-1 (FIG. 8). For B7.2 expressed on the surface of NCC cells, L3D10 was blocked again, while 10D1 was only partially blocked, with less than 50% inhibition observed even with 10D1 at 512 Pmkg / ml (FIG. 9).

Потенциальным препятствием является то, что биотинилирование может повлиять на связывание 10D1 с CTLA-4-Fc. Для решения этой проблемы авторы изобретения сравнили связывание L3D10 и 10D1 с биотинилированным CTLA-4-Fc, используемым в анализе блокирования. Как изображено на фиг. 10, 10D1 более эффективен, чем L3D10 при связывании биотинилированного CTLA-4-Fc. Таким образом, неудача блокирования посредством 10D1 была обусловлена недостаточным связыванием с биотинилированным CTLA-4-Fc. Аналогичная картина наблюдается, когда полигистидиновый меченый CTLA-4 использовался для взаимодействия с человеческим В7-1, трансфицированным в клетки ЯКХ (фиг. 11). Взятые вместе, полученные данные предполагают, что способность антитела 10D1 блокировать взаимодействие B7-CTLA-4 в значительной степени зависит от используемого анализа с минимальной не детектируемой блокирующей активностью, если В7-1 и В7-2 иммобилизованы, тогда как антитело L3D10 является надежным блокатором для взаимодействия B7-CTLA-4 независимо от того, был ли иммобилизован белок В7.A potential obstacle is that biotinylation can interfere with the binding of 10D1 to CTLA-4-Fc. To solve this problem, the inventors compared the binding of L3D10 and 10D1 with biotinylated CTLA-4-Fc used in the blocking assay. As shown in FIG. 10, 10D1 is more efficient than L3D10 at binding to biotinylated CTLA-4-Fc. Thus, the failure of blocking by 10D1 was due to insufficient binding to biotinylated CTLA-4-Fc. A similar pattern was observed when polyhistidine-labeled CTLA-4 was used to interact with human B7-1 transfected into NCC cells (FIG. 11). Taken together, these findings suggest that the ability of the 10D1 antibody to block the B7-CTLA-4 interaction is highly dependent on the assay used, with minimal undetectable blocking activity if B7-1 and B7-2 are immobilized, whereas the L3D10 antibody is a reliable blocker for B7-CTLA-4 interactions regardless of whether the B7 protein was immobilized.

Пример 4. Химерное антитело L3D10 более эффективно, чем немодифицированное L3D10, в индукции отторжения опухоли.Example 4 Chimeric antibody L3D10 is more effective than unmodified L3D10 in inducing tumor rejection.

Ранее сообщалось, что мышиный L3D10 оказался неспособным вызвать полную ремиссию опухолей МС38, даже тогда, когда наблюдались значительные задержки (19 20).Чтобы определить, может ли химерный L3D10 вызвать полную ремиссию у сингенных мышей, 1х10⁶ MC38 опухолевых клеток трансплантировали сингенным мышам C57BL/6. Через неделю, когда опухоль достигает около 5 мм в диаметре, мышей лечили либо контрольным IgG, либо химерным L3D10 мкАТ в дозе, которая составляет лишь половину того, что использовалось в предыдущих исследованиях с мышиным L3D10. Как изображено на фиг. 12, несмотря на возможную иммуногенность последовательности Ig человека, было обнаружено, что химерный L3D10 вызывает полную ремиссию у всех тестируемых мышей. Поскольку лечение было начато, когда была установлена значительная опухолевая нагрузка, что намного сложнее, чем когда опухоли не были явными 19), эти эксперименты показывают, что химерный L3D10 является более эффективным, чем немодифицированный L3D10.It was previously reported that murine L3D10 was unable to induce complete remission of MC38 tumors, even when significant delays were observed.19 20 To determine whether chimeric L3D10 could induce complete remission in syngeneic mice, 1x10 ⁶ MC38 tumor cells were transplanted into syngeneic C57BL / 6. One week later, when the tumor reached about 5 mm in diameter, mice were treated with either control IgG or chimeric L3D10 mAb at a dose that is only half that used in previous studies with murine L3D10. As shown in FIG. 12, despite the possible immunogenicity of the human Ig sequence, chimeric L3D10 was found to induce complete remission in all mice tested. Since treatment was started when a significant tumor load was established, which is much more difficult than when tumors were not evident 19), these experiments show that chimeric L3D10 is more effective than unmodified L3D10.

Пример 5. Химерное антитело L3D10 обладает эквивалентной активностью как и 10D1, вызывая отторжение опухоли.Example 5. Chimeric antibody L3D10 has equivalent activity as 10D1 in inducing tumor rejection.

Доступность мышей с нокин гена CTLA-4 человека(20) обеспечивала беспрецедентную возможность протестировать биологическую активность химерного античеловеческий CTLA-4 антитела в клинике с использованием анти-CTLA-4 мкАТ, 10D1. В этой гуманизированной мышиной модели, ген CTLA-4, кодирующий продукт со 100% идентичностью к белку CTLA-4 человека экспрессируется под контролем мышиного эндогенного локуса CTLA-4. Когда противоопухолевую активность химерных L3D10 и 10D1 непосредственно сравнивали в МС38 опухолевой модели у мышей с нокин CTLA-4 человека, стало очевидным, что оба антитела были сопоставимы по вызыванию отторжения опухоли, тогда как опухоли в контрольной группе с IgG постепенно прогрессировали. На фиг. 13 изображены результаты лечения антителом на размер опухоли в двух экспериментах.The availability of human CTLA-4 gene knockin mice (20) provided an unprecedented opportunity to test the biological activity of chimeric anti-human CTLA-4 antibodies in the clinic using anti-CTLA-4 mAb, 10D1. In this humanized mouse model, the CTLA-4 gene encoding a product with 100% identity to the human CTLA-4 protein is expressed under the control of the mouse endogenous CTLA-4 locus. When the antitumor activities of chimeric L3D10 and 10D1 were directly compared in an MC38 tumor model in mice with human CTLA-4 knockin, it became apparent that both antibodies were comparable in induction of tumor rejection, while tumors in the IgG control group progressively progressed. FIG. 13 depicts the results of treatment with antibody for tumor size in two experiments.

Интересный вопрос заключается в том, должны ли анти-CTLA-4 мкАТ взаимодействовать со всеми CTLA-4 (т.е. достичь целевого насыщения), чтобы оказывать иммунотерапевтическое действие. F1 мыши из CTLA-4 и CTLA-4^m/m мыши экспрессируют как мышиный, так и человеческий CTLA-4-белок кодоминантным образом. Интересно, что, как изображено на фиг. 14, как химерные L3D10, так и 10D1 эффективно индуцировали отторжение опухоли, даже несмотря на то, что приблизительно 50% белка CTLA-4 (т.е. мышиной версии белка) не могут быть связаны античеловеческий CTLA-4 мкАТ. Важно отметить, что L3D10 является более терапевтически эффективным, чем 10D1 в этой терапии, т.е. когда дозы гена ограничены (Р<0,05).An interesting question is whether anti-CTLA-4 mAbs must interact with all CTLA-4s (i.e., reach target saturation) in order to have an immunotherapeutic effect. Mouse F1 from CTLA-4 and CTLA-4 ^{m / m} mice express both murine and human CTLA-4 protein in a codominant manner. Interestingly, as shown in FIG. 14, both chimeric L3D10 and 10D1 effectively induced tumor rejection, even though approximately 50% of the CTLA-4 protein (i.e., the murine version of the protein) could not bind to the anti-human CTLA-4 mAb. It is important to note that L3D10 is more therapeutically effective than 10D1 in this therapy, i.e. when gene doses are limited (P <0.05).

Предыдущие исследования продемонстрировали, что антимышиный CTLA-4 мкАТ не могут вызывать отторжение клеточной линии меланомы B16-F1 без комбинации с другими терапевтическими средствами. Таким образом, противоопухолевый эффект химерных антител L3D10 и 10D1 также тестировали с использованием этой более интенсивной опухолевой модели В16 у мышей с нокин CTLA-4 человека. Как изображено на фиг. 15, в то время как ни L3D10, ни Ипилимумаб не способны вызвать отторжение установленных опухолей, оба они вызывают статистически значимое замедление роста опухоли, в то время как различия между разными антителами не являются статистически значимыми.Previous studies have demonstrated that anti-mouse CTLA-4 mAb cannot induce rejection of the B16-F1 melanoma cell line without combination with other therapies. Thus, the antitumor effect of chimeric antibodies L3D10 and 10D1 was also tested using this more intense B16 tumor model in human CTLA-4 knockin mice. As shown in FIG. 15, while neither L3D10 nor Ipilimumab is able to induce rejection of established tumors, both of them cause a statistically significant slowdown in tumor growth, while the differences between different antibodies are not statistically significant.

Пример 6. Блокирование CTLA-4 in vivo.Example 6. Blocking CTLA-4 in vivo.

CTLA-4 экспрессируется преимущественно среди Трег, где он подавляет аутоиммунные заболевания с помощью регуляции В7-1 и В7-2 на дендритных клетках [50]. Поскольку целевая мутация CTLA-4 (50) и лечение с блокирующим анти-CTLA-4 мкАТ [51] активировали экспрессию В7-1 и В7-2 на дендритныхCTLA-4 is expressed predominantly among Tregs, where it suppresses autoimmune diseases by regulating B7-1 and B7-2 on dendritic cells [50]. Since the target CTLA-4 mutation (50) and treatment with the blocking anti-CTLA-4 mAb [51] activated the expression of B7-1 and B7-2 on dendritic

- 17 038617 клетках, было высказано предположение, что физиологическая функция CTLA-4 на Трег заключается в снижении В7 на ДК. Таким образом, усиление В7 использовалось как показание для блокады in vivo взаимодействий B7-CTLA-4 и способствовало разработке анализа с использованием Т-клеток у мышей CTLA4^м1, которые имели гомозиготный нокин человеческого гена CTLA-4.- 17,038617 cells, it was suggested that the physiological function of CTLA-4 on Treg is to reduce B7 on DC. Thus, amplification of B7 was used as an indication for in vivo blockade of B7-CTLA-4 interactions and contributed to the development of a T cell assay in CTLA4 ^m1 mice that had a homozygous human CTLA-4 gene knockin.

Как показано на фиг. 16, поверхностно-экспрессированный В7.1 или В7.2 связывает CTLA-4 на поверхности Т-клеток, что приводит к снижению регуляции экспрессии В7.1 и В7.2. Однако связывание блокирующих анти-CTLA-4 антител предотвращает связывание В7.1/В7.2, что предотвращает подавление В7.1 и В7.2, что приводит к общему увеличению экспрессии В7.1/В7.2. Однако с химерной Т-клеточной экспрессией человеческого и мышиного CTLA-4, антитела, которые связывают CTLA-4 человека, не препятствуют связыванию В7.1/В7.2 с мышиным CTLA-4, что восстанавливает ингибирование В7.1/В7.2.As shown in FIG. 16, surface-expressed B7.1 or B7.2 binds CTLA-4 on the surface of T cells, resulting in downregulation of B7.1 and B7.2 expression. However, the binding of anti-CTLA-4 blocking antibodies prevents the binding of B7.1 / B7.2, which prevents the suppression of B7.1 and B7.2, which leads to an overall increase in B7.1 / B7.2 expression. However, with chimeric T cell expression of human and murine CTLA-4, antibodies that bind human CTLA-4 do not interfere with B7.1 / B7.2 binding to murine CTLA-4, which restores B7.1 / B7.2 inhibition.

Описаны гуманизированные мыши CTLA-4, которые экспрессируют ген CTLA-4 с 100%-ной идентичностью к человеческому белку CTLA-4 под контролем эндогенного локуса CTLA-4 мыши (20). Гомозиготные нокин-мыши (CTLA-4^h/h) возвратно скрещивались с C57BL/6 в течение как минимум 10 поколений. Гетерозиготных мышей (CTLA-^m) получали путем скрещивания CTLA-4^h/h с мышами ДТ BALB/c.Humanized CTLA-4 mice have been described that express the CTLA-4 gene with 100% identity to the human CTLA-4 protein under the control of the endogenous mouse CTLA-4 locus (20). Homozygous nokin mice (CTLA-4 ^{h / h} ) were backcrossed with C57BL / 6 for at least 10 generations. Heterozygous mice (CTLA- ^ m) were obtained by crossing CTLA-4 ^{h / h} with DT BALB / c mice.

Для тестирования клинически доказанной терапевтики анти-CTLA-4 мкАТ, 10D1 вводили очень высокие дозы анти-CTLA-4 мкАТ (500 мкг/мышь, что составляет примерно 25 мг/кг или в 8 раз большую дозу, используемую в клинике) мышам CTLA-4^h/h или CTLA-4^m/h и получали клетки селезенки для измерения уровней В7-1 и В7-2 на CTLA-4 ДК через 24 часа после инъекции (фиг. 17А, В). Как показано на фиг. 17С-Е, по сравнению с мышами CTLA-4^h/h, которые получали человеческий IgG1-Fc, ДК мышей, получавших химерные L3D10, имели статистически достоверное увеличение экспрессии В7.1 в Т-клетках, экспрессирующих человеческий CTLA-4, но не в Т-клетках, экспрессирующих CTLA-4 как человека, так и мыши. Аналогичные результаты были получены для В7.2, как изображено на фиг. 17С-Е. Значение увеличения В7-2 сопоставимо с тем, что было достигнуто с использованием блокирования анти-CTLA-4 мкАТ в совместной культуре Трег-ДК человека [66].To test the clinically proven anti-CTLA-4 mAb therapy, 10D1 was injected with very high doses of anti-CTLA-4 mAb (500 μg / mouse, which is approximately 25 mg / kg or 8 times the dose used in the clinic) to CTLA- mice 4 ^{h / h} or CTLA-4 ^{m / h} and spleen cells were obtained to measure B7-1 and B7-2 levels on CTLA-4 DCs 24 hours after injection (Fig. 17A, B). As shown in FIG. 17C-E, compared to CTLA-4 ^{h / h} mice that received human IgG1-Fc, DCs of mice receiving chimeric L3D10 had a statistically significant increase in B7.1 expression in T cells expressing human CTLA-4, but not in T cells expressing CTLA-4 in both human and mouse. Similar results were obtained for B7.2 as depicted in FIG. 17C-E. The value of the increase in B7-2 is comparable to that achieved using the blocking of anti-CTLA-4 mAb in human Treg-DC co-culture [66].

Чтобы дополнительно подтвердить специфичность анализа in vivo, тестировали, может ли L3D10 регулировать В7 у мышей CTLA-4^m/h, в которых мышиный и человеческий CTLA-4 экспрессируются кодоминантно. Поскольку по меньшей мере 50% CTLA-4 не связывается с античеловеческим CTLA-4, ожидается, что они будут менее эффективны в блокировании взаимодействия B7-CTLA-4. Действительно, антитело не вызывало усиление В7-1 и В7-2 на ДК мышей CTLA-4 (фиг. 17С, D, F). Полное отсутствие блокирования при использовании L3D10 на мышах CTLA-4^m/h позволяет предположить, что CTLA-4 кодируется аллелем мыши, который не связывается с L3D10 (фиг. 18), является достаточным для снижения регуляции экспрессии В7. Таким образом, полученные данные показали, что при дозах, которые по меньшей мере в 8 раз превышают максимальную дозу, используемую в клинике, 10D1 не блокирует взаимодействие B7CTLA-4, когда В7 либо иммобилизуется в планшете, либо закрепляется на клеточной мембране как in vivo, так и in vitro.To further confirm the specificity of the in vivo assay, it was tested whether L3D10 could regulate B7 in CTLA-4 ^{m / h} mice in which murine and human CTLA-4 are codominantly expressed. Since at least 50% of CTLA-4 does not bind to anti-human CTLA-4, they are expected to be less effective in blocking the B7-CTLA-4 interaction. Indeed, the antibody did not induce an increase in B7-1 and B7-2 on DCs of CTLA-4 mice (Fig. 17C, D, F). The complete absence of blockage using L3D10 in CTLA-4 ^{m / h} mice suggests that CTLA-4 is encoded by a mouse allele that does not bind to L3D10 (FIG. 18) sufficient to downregulate B7 expression. Thus, the data obtained showed that at doses that are at least 8 times higher than the maximum dose used in the clinic, 10D1 does not block the interaction of B7CTLA-4, when B7 is either immobilized in the plate or is fixed on the cell membrane as in vivo. and in vitro.

Полное отсутствие блокирования при использовании L3D10 на мышах CTLA-4^m/h позволяет предположить, что CTLA-4 кодируется аллелем мыши, который не связывается с L3D10 (фиг. 18), является достаточным для снижения регуляции экспрессии В7. Для сравнения, 10D1 не увеличивал экспрессию В7.1 или В7.2. Согласно модели это предполагает, что L3D10 блокирует активность CTLA-4 in vivo, тогда как 10D1 - нет.The complete absence of blockage using L3D10 in CTLA-4 ^{m / h} mice suggests that CTLA-4 is encoded by a mouse allele that does not bind to L3D10 (FIG. 18) sufficient to downregulate B7 expression. In comparison, 10D1 did not increase B7.1 or B7.2 expression. According to the model, this suggests that L3D10 blocks CTLA-4 activity in vivo while 10D1 does not.

Однако, несмотря на очевидные различия в активности блокирования, L3D10 и 10D1 проявляют сильную противоопухолевую активность против модели МС38 у химерных мышей CTLA-4^m/h, как изображено на фиг. 19. В то время как опухоль постепенно прогрессировала у мышей, получавших контрольный Ig, полное отторжение достигалось одним из анти-CTLA-4 мкАТ. В нескольких экспериментах два антитела сравнимы в случае отторжения опухоли. В другой модели опухоли, меланоме В16, оба антитела индуцировали подобное замедление роста опухоли, хотя полное отторжение не достигалось ни с помощью одного, ни с помощью другого антитела (фиг. 20).However, despite the obvious differences in blocking activity, L3D10 and 10D1 show potent anti-tumor activity against the MC38 model in CTLA-4 ^{m / h} chimeric mice, as depicted in FIG. 19. While the tumor progressively progressed in the control Ig treated mice, complete rejection was achieved with one of the anti-CTLA-4 mAbs. In several experiments, the two antibodies are comparable in the case of tumor rejection. In another tumor model, B16 melanoma, both antibodies induced similar tumor growth retardation, although complete rejection was not achieved with either antibody (Fig. 20).

Пример 7. Противоопухолевые эффекты связаны с внутриопухолевым деплетированием Трег.Example 7. Antitumor effects are associated with intratumoral depletion of Treg.

Иммунная регуляция in vivo является результатом баланса между активацией иммунных клеток и иммунными контрольными точками. В частности, регуляторные Т-клетки (Трег) представляют собой субпопуляцию Т-клеток, которые регулируют иммунную систему, поддерживают толерантность к аутоантигенам и подавляют аутоиммунное заболевание. Недавние исследования показали, что терапевтическая эффективность антимышиного CTLA-4 мкАТ зависит от подкласса Fc и Fc-рецептора хозяина, который, в свою очередь, влияет на антителозависимую селективную цитотоксичность Трег в микросреде опухоли [52, 53]. Поскольку дифференциальная блокирующая активность CTLA-4 in vivo, по-видимому, не приводит к различиям в противоопухолевой активности, авторы изобретения попытались установить механизм(ы) действия, с помощью которого происходит противоопухолевое действие, и наблюдали за Трег в микросреде опухоли. Для этого взяли одну мышь с опухолью МС38 до того, как отторжения были завершены (фиг. 21), и проанализировали частоту Трег у нокин-мышей CTLA-4^h/h, которые получали контрольный Ig, 10D1 или L3D10. Хотя ни одно из антител не уменьшает Трег в селезенке (фиг. 22С), оба уменьшали Трег в микросреде опухоли (фиг. 22Е). Интересно, что 10D1, но не L3D10, увеличивал Трег в селезенке. Увеличение Treg в селезенке посредством 10D1 повторяет клинический вывод о том, что ИпилимуImmune regulation in vivo is the result of a balance between the activation of immune cells and immune checkpoints. In particular, regulatory T cells (Treg) are a subset of T cells that regulate the immune system, maintain tolerance to autoantigens, and suppress autoimmune disease. Recent studies have shown that the therapeutic efficacy of anti-mouse CTLA-4 mAb depends on the Fc and Fc receptor subclass of the host, which, in turn, affects the antibody-dependent selective cytotoxicity of Treg in the tumor microenvironment [52, 53]. Since the differential blocking activity of CTLA-4 in vivo does not appear to lead to differences in antitumor activity, the inventors attempted to establish the mechanism (s) of action by which the antitumor effect occurs and monitored Treg in the tumor microenvironment. To do this, took one mouse with MC38 tumor before rejection was complete (Fig. 21), and analyzed the Treg frequency in CTLA-4 ^{h / h} nokin mice that received control Ig, 10D1 or L3D10. Although none of the antibodies decreased Treg in the spleen (Fig. 22C), both decreased Treg in the tumor microenvironment (Fig. 22E). Interestingly, 10D1, but not L3D10, increased Treg in the spleen. The increase in Treg in the spleen by 10D1 reiterates the clinical finding that Ipilim

- 18 038617 маб увеличивал экспрессию FOXP3 при помощи лейкоцитов периферической крови [54]. Так как блокирующие и неблокирующие антитела сравнимы при деплетировании Трег в микросреде опухоли, блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 не способствует деплетированию Трег. Поскольку 10D1 не блокирует взаимодействие B7-CTLA-4 in vivo и все же оказывает терапевтический эффект у мышей CTLA-4^h/h с меланомой, блокирование этого взаимодействия не требуется для его терапевтического эффекта. Кроме того, поскольку два мкАТ с резко отличающимся эффектом блокирования имеют сравнимый терапевтический эффект и селективное деплетирование Трег в микросреде опухоли, блокирование взаимодействия CTLA-4-B7 не усиливает терапевтический эффект антитела.- 18 038617 mab increased the expression of FOXP3 using peripheral blood leukocytes [54]. Since blocking and non-blocking antibodies are comparable when Treg is depleted in the tumor microenvironment, blocking the B7-CTLA-4 interaction does not promote Treg depleting. Since 10D1 does not block the B7-CTLA-4 interaction in vivo and still has a therapeutic effect in CTLA-4 ^{h / h} mice with melanoma, blocking this interaction is not required for its therapeutic effect. In addition, since two MAb with sharply different blocking effect have comparable therapeutic effect and selective depletion of Treg in the tumor microenvironment, blocking the CTLA-4-B7 interaction does not enhance the therapeutic effect of the antibody.

Чтобы обосновать это наблюдение, проверили терапевтический эффект двух анти-CTLA-4 мкАТ у мышей CTLA-4^m/h, в которых античеловеческий CTLA-4 мкАТ может связываться с максимальным количеством 50% молекул CTLA-4 и в которых ни то, ни другое антитело не может блокировать взаимодействие B7-CTLA-4 для достижения регуляции В7 на дендритных клетках (фиг. 16). Опять же, оба антитела вызывают быстрое отторжение опухолей МС38, хотя L3D10 несколько эффективнее, чем 10D1 (фиг. 22В). Соответственно, оба антитела селективно уменьшают Трег в микросреде опухоли (фиг. 22D и 21F). Эти генетические данные также продемонстрировали несостоятельность блокирования CTLA-4 при отторжении опухоли и локальном деплетировании Трег и тем самым опровергли преобладающую гипотезу о том, что анти-CTLA-4 мкАТ индуцирует иммунитет против рака посредством блокирования взаимодействия B7-CTLA-4 [10].To substantiate this observation, the therapeutic effect of two anti-CTLA-4 mAb was tested in CTLA-4 ^{m / h} mice, in which anti-human CTLA-4 mAb can bind to a maximum of 50% of CTLA-4 molecules and in which neither one nor the other the antibody cannot block the B7-CTLA-4 interaction to achieve B7 regulation on dendritic cells (FIG. 16). Again, both antibodies induce rapid rejection of MC38 tumors, although L3D10 is slightly more potent than 10D1 (Fig. 22B). Accordingly, both antibodies selectively reduce Treg in the tumor microenvironment (FIGS. 22D and 21F). These genetic data also demonstrated the inadequacy of blocking CTLA-4 in tumor rejection and local depletion of Treg and thereby refuted the prevailing hypothesis that anti-CTLA-4 mAb induces cancer immunity by blocking the B7-CTLA-4 interaction [10].

Пример 8. Оценка активности блокирования широко используемых антимышиных CTLA-4 мкАТ 9H10 и 9D9Example 8. Evaluation of the blocking activity of the widely used anti-mouse CTLA-4 mAb 9H10 and 9D9

Было предложено, что CTLA-4 является внутренним отрицательным регулятором в регуляции Т-клеток на основе стимуляторного эффекта как интактного, так и Fab двух антимышиных CTLA-4 мкАТ [30, 31], 4F10 и 9Н10, хотя данные не были представлены для демонстрации того, что эти антитела блокируют взаимодействие B7-CTLA-4. Относительно недавно сообщалось, что третьи антимышиные CTLA-4 мкАТ, 9D9, оказывают терапевтическое действие на мышей-опухоленосителей и вызывает локальное деплетирование Трег в микросреде опухоли [52]. Поэтому были протестированы все три коммерчески доступные антимышиные CTLA-4 мкАТ, которые, как было показано, индуцируют отторжение опухоли из-за их способности блокировать взаимодействие B7-CTLA-4 в физиологически соответствующих конфигурациях. В качестве первого теста использовали увеличение количества анти-CTLA-4 мкАТ (до 2000кратного молярного избытка по сравнению с CTLA-4-Fc), чтобы блокировать связывание биотинилированного CTLA-4-Fc с иммобилизованными в планшетах В7-1 и В7-2. Как изображено на фиг. 23А, антимышиные CTLA-4 мкАТ 9Н10 не блокировали взаимодействие B7-1-CTLA-4 даже при самой высокой концентрации, хотя умеренное блокирование наблюдалась при использовании 9D9 в очень высоких концентрациях. Хотя мкАТ 9D9 эффективно блокировали взаимодействие B7-2-CTLA-4, 9Н10 оказались неэффективными (фиг. 23В). Интересно, что в то время как 9D9 демонстрирует сильное связывание с растворимым CTLA-4-Fc, 9H10 демонстрирует плохое связывание (фиг. 23с), хотя он более эффективен, чем 9D9 при связывании иммобилизованного мышиного CTLA-4-Fc (фиг. 23D). Поскольку отсутствие какой-либо блокирующей активности при использовании 9Н10 в этом анализе может просто отражать его плохое связывание с растворимым CTLA-4-Fc, снова использовали увеличение экспрессии В7-1 и В7-2 на дендритных клетках у мышей ДТ (CTLA-4^m/m) для измерения блокирования in vivo взаимодействия B7-CTLA-4. Как изображено на фиг. 23Е и F, 9Н10 не активировали экспрессию В7-1 на ДК, в то время как 9D9 увеличивали уровень В7-1 на 15% (Р<0,05). Интересно, что в то время как 9D9 явно повышал В7-2 на ДК, 9H10 не оказывал подобного эффекта. Поэтому 9Н10, первое и наиболее широко изученное опухолевое иммунотерапевтическое αнти-CTLA-4 мкАТ не блокирует взаимодействие B7-CTLA-4. Следовательно, блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 не способствует индукции противоопухолевого иммунитета с помощью антимышиного CTLA-4 мкАТ. Поскольку оба мкАТ показывают сопоставимый иммунотерапевтический эффект и сопоставимое уменьшение Трег в микросреде опухоли [52], локальное уменьшение Трег, а не блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 дает унифицированное объяснение терапевтического эффекта антимышиного CTLA-4 мкАТ. Интересно отметить, что в то время как 4F10 блокировал взаимодействие B7-CTLA-4 ш vitro, он не вызывал усиление В7 на ДК in vivo (фиг. 24).It has been suggested that CTLA-4 is an internal negative regulator in the regulation of T cells based on the stimulatory effect of both intact and Fab of two anti-mouse CTLA-4 mAbs [30, 31], 4F10 and 9H10, although data were not presented to demonstrate that that these antibodies block the B7-CTLA-4 interaction. Relatively recently, it was reported that a third anti-mouse CTLA-4 mAb, 9D9, has a therapeutic effect on tumor-bearing mice and causes local depletion of Treg in the tumor microenvironment [52]. Therefore, all three commercially available anti-mouse CTLA-4 mAbs were tested, which have been shown to induce tumor rejection due to their ability to block the B7-CTLA-4 interaction in physiologically appropriate configurations. As a first test, an increase in the amount of anti-CTLA-4 mAb (up to a 2000-fold molar excess over CTLA-4-Fc) was used to block the binding of biotinylated CTLA-4-Fc to B7-1 and B7-2 immobilized in plates. As shown in FIG. 23A, the anti-mouse CTLA-4 mAb 9H10 did not block the B7-1-CTLA-4 interaction even at the highest concentration, although moderate blocking was observed with very high concentrations of 9D9. Although 9D9 mAb effectively blocked the B7-2-CTLA-4 interaction, 9H10 was ineffective (Fig. 23B). Interestingly, while 9D9 shows strong binding to soluble CTLA-4-Fc, 9H10 shows poor binding (Fig.23c), although it is more effective than 9D9 at binding immobilized murine CTLA-4-Fc (Fig.23D) ... Since the lack of any blocking activity using 9H10 in this assay may simply reflect its poor binding to soluble CTLA-4-Fc, the increase in B7-1 and B7-2 expression on dendritic cells in DT mice (CTLA-4 ^{m / m} ) to measure in vivo blocking of the B7-CTLA-4 interaction. As shown in FIG. 23E and F, 9H10 did not activate B7-1 expression on DC, while 9D9 increased the B7-1 level by 15% (P <0.05). Interestingly, while 9D9 clearly increased B7-2 on DC, 9H10 did not. Therefore, 9H10, the first and most widely studied tumor immunotherapeutic α anti-CTLA-4 mAb, does not block the B7-CTLA-4 interaction. Therefore, blocking the B7-CTLA-4 interaction does not contribute to the induction of antitumor immunity using the anti-mouse CTLA-4 mAb. Since both mAbs show a comparable immunotherapeutic effect and a comparable decrease in Treg in the tumor microenvironment [52], a local decrease in Treg, rather than blocking the B7-CTLA-4 interaction, provides a unified explanation for the therapeutic effect of the anti-mouse CTLA-4 mAb. Interestingly, while 4F10 blocked the B7-CTLA-4 interaction in vitro, it did not induce an increase in B7 on DCs in vivo (Fig. 24).

В совокупности было продемонстрировано, что клинически доказанные терапевтические античеловеческие CTLA-4 мкАТ (10D1) и два антимышиных CTLA-4 мкАТ (9Н10 и 4F10) проявляют иммунотерапевтический эффект без блокирования взаимодействия B7-CTLA-4 в физиологически значимых условиях. Кроме того, такое блокирование не требовалась для отторжения опухоли даже для мкАТ (L3D10), которые могут сильно блокировать взаимодействие B7-CTLA-4. Поскольку терапевтический эффект по существу одинаковый для антител со 1000-кратным различием в блокировании взаимодействия B7-CTLA-4, такое блокирование не способствует терапевтическому действию против рака анти-CTLA-4 мкАТ. Эти данные опровергают гипотезу о том, что анти-CTLA-4 мкАТ обеспечивают иммунотерапевтический эффект посредством блокирования контрольной точки [55]. Из-за опровержения преобладающей гипотезы данные свидетельствуют о том, что терапевтический эффект анти-CTLA-4 мкАТ не может быть оптимизирован путем улучшения активности блокирования анти-CTLA-4 мкАТ. В этом контексте особенно интересноTaken together, it has been demonstrated that the clinically proven therapeutic anti-human CTLA-4 mAb (10D1) and two anti-mouse CTLA-4 mAb (9H10 and 4F10) exhibit immunotherapeutic effect without blocking the B7-CTLA-4 interaction under physiologically relevant conditions. In addition, such blocking was not required for tumor rejection even for mAb (L3D10), which can strongly block the B7-CTLA-4 interaction. Since the therapeutic effect is substantially the same for antibodies with a 1000-fold difference in blocking the B7-CTLA-4 interaction, such blocking does not contribute to the anti-CTLA-4 mAb therapeutic effect against cancer. These data contradict the hypothesis that anti-CTLA-4 mAb provides an immunotherapeutic effect by blocking the checkpoint [55]. Because of the rejection of the prevailing hypothesis, the data indicate that the therapeutic effect of anti-CTLA-4 mAb cannot be optimized by improving the anti-CTLA-4 mAb blocking activity. In this context, it is especially interesting

- 19 038617 отметить, что Тремелимумаб, превосходящий блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 [56], не достиг клинической точки в клиническом испытании фазы III [57]. Между тем, демонстрируя сильную корреляцию между отторжением опухолей локального деплетирования Трег и опровержением участия блокирования взаимодействия B7-CTLA-4 в опухолевом иммунитете, работа заявителей благоприятствует гипотезе о том, что локальное деплетирование Трег в опухолевой микросреде является основным механизмом терапевтического анmи-CTLA-4 мкАТ, и, следовательно, предлагаются новые подходы к разработке следующего поколения анти-CTLA-4 мкАТ для иммунотерапии рака.- 19 038617 note that Tremelimumab, which is superior in blocking the B7-CTLA-4 interaction [56], did not reach the clinical point in a phase III clinical trial [57]. Meanwhile, demonstrating a strong correlation between tumor rejection of local Treg depletion and rejection of the involvement of B7-CTLA-4 interaction blocking in tumor immunity, the work of the applicants favors the hypothesis that Treg local depletion in the tumor microenvironment is the main mechanism of therapeutic anti-CTLA-4 mAb and, therefore, new approaches are proposed for the development of the next generation anti-CTLA-4 mAb for cancer immunotherapy.

Наконец, накопление генетических данных мышей предполагает, что первоначальная концепция [30, 31] о том, что CTLA-4 отрицательно регулирует активацию Т-клеток и что такая регуляция достигнута посредством SHP-2 [58, 59[, возможно, нуждается в повторном рассмотрении [60]. Таким образом, хотя тяжелые аутоиммунные заболевания у мышей CTLA-4-были использованы для поддержки точки зрения о CTLA-4 как о внутриклеточном отрицательном регуляторе активации Т-клеток [61, 62], с тех пор появилось по меньшей мере три линии генетических данных, которые не согласуются с этой точкой зрения. Вопервых, специфическая для линии делеция гена CTLA-4 в Трег, но не в эффекторных Т-клетках, достаточна для повторения аутоиммунного фенотипа, наблюдаемого у мышей с делецией гена CTLA-4 в генеративной линии [50]. Эти данные свидетельствуют о том, что аутоиммунитет у мышей CTLA-4^-/- не был обусловлен отсутствием внутриклеточного отрицательного регулятора CTLA-4 в эффекторных Т-клетках. Вовторых, у химерных мышей, состоящих из клеток ДТ и CTLA-4 Т-клеток, аутоиммунный фенотип был предотвращен сосуществованием Т-клеток ДТ [63]. Эти данные снова убедительно утверждают, что аутоиммунные заболевания не были вызваны отсутствием внутриклеточного отрицательного регулятора. Отсутствие эффекта внутриклеточного отрицательного регулятора также подтверждается тем фактом, что у химерных мышей не наблюдалось преимущественного увеличения CTLA-4 Т -клеток во время вирусной инфекции [64]. В-третьих, Т-клеточная специфическая делеция Shp2, которая была предложена для опосредования отрицательной регуляции CTLA-4 [58, 59], оказывала скорее уменьшение, чем усиление активацииFinally, the accumulation of genetic data in mice suggests that the original concept [30, 31] that CTLA-4 negatively regulates T cell activation and that such regulation is achieved by SHP-2 [58, 59 [may need to be reconsidered [60]. Thus, although severe autoimmune diseases in CTLA-4-mice have been used to support the view of CTLA-4 as an intracellular negative regulator of T cell activation [61, 62], since then at least three lines of genetic data have emerged. which do not agree with this point of view. First, line-specific deletion of the CTLA-4 gene in Treg, but not in effector T cells, is sufficient to replicate the autoimmune phenotype observed in mice with a CTLA-4 gene deletion in the generative line [50]. These data indicate that autoimmunity in CTLA-4 ^{- / -} mice was not due to the absence of an intracellular down-regulator CTLA-4 in effector T cells. Second, in chimeric mice consisting of DT cells and CTLA-4 T cells, the autoimmune phenotype was prevented by the coexistence of DT T cells [63]. These data again strongly suggest that autoimmune diseases were not caused by the absence of an intracellular negative regulator. The lack of an intracellular negative regulator effect is also supported by the fact that in chimeric mice there was no preferential increase in CTLA-4 T cells during viral infection [64]. Third, the T-cell specific deletion of Shp2, which has been proposed to mediate downregulation of CTLA-4 [58, 59], has rather a decrease than an increase in activation.

Т-клеток [65]. В контексте этих генетических данных, о которых сообщалось, учитывая, что CTLA-4 предполагался как отрицательный регулятор для активации Т-клеток, данные, представленные в данном документе, требуют пересмотра блокирования контрольных точек CTLA-4 при иммунотерапии рака.T cells [65]. In the context of these reported genetic data, given that CTLA-4 has been proposed as a negative regulator for T cell activation, the data presented in this document warrants a revision of the blocking of CTLA-4 checkpoints in cancer immunotherapy.

Пример 9. Химерный L3D10 проявляет снижение иммунных нежелательных явлений при использовании в комбинации с другими иммунотерапевтическими антителами.Example 9 Chimeric L3D10 exhibits a reduction in immune side effects when used in combination with other immunotherapeutic antibodies.

Недавние клинические исследования показали, что комбинированная терапия между анти-PD-1 и анtu-CTLA-4 мкАТ дополнительно повышает уровень выживаемости пациентов с меланомой конечной стадии. Однако у 55% пациентов, получавших комбинированную терапию, развились 3 и 4 степени иммуноопосредованных нежелательных явлений (иоНЯ). Поэтому крайне важно устанавливать антитела с меньшей токсичностью. Авторы изобретения разработали модель in vivo, в которой анализируются иоНЯ, связанные с комбинированной терапией анти-CTLA-4 и анти-PD-1 мкАТ, наблюдаемых в клинике. В этой модели лечили мышей с нокин-геном CTLA-4 человека (CTLA-4^h/h) в течение перинатального периода высокими дозами анти-PD-1 и анти-CTLA-4 мкАТ. Было обнаружено, что, хотя молодые мыши переносят лечение отдельными мкАТ, комбинированная терапия с aнти-PD-1 и 10D1 вызывает тяжелые иоНЯ с множественным воспалением органов, анемией и, как изображено на фиг. 25, сильную задержку роста. Для сравнения, когда комбинировали с aнти-PD-1, химерный L3D10 проявлял только слабые иоНЯ, что подтверждается нормальным увеличением привеса.Recent clinical studies have shown that combination therapy between anti-PD-1 and antu-CTLA-4 mAb further improves the survival rate of patients with end-stage melanoma. However, 55% of patients receiving combination therapy developed grade 3 and 4 immune-mediated adverse events (IADE). Therefore, it is extremely important to install antibodies with less toxicity. The inventors have developed an in vivo model that analyzes IONNs associated with the combination therapy of anti-CTLA-4 and anti-PD-1 mAb observed in the clinic. In this model, mice with the human CTLA-4 knockin gene (CTLA-4 ^{h / h} ) were treated during the perinatal period with high doses of anti-PD-1 and anti-CTLA-4 mAb. Although juvenile mice tolerated treatment with individual MAb, it was found that combination therapy with anti-PD-1 and 10D1 causes severe IONN with multiple organ inflammation, anemia and, as depicted in FIG. 25, severe growth retardation. In comparison, when combined with anti-PD-1, chimeric L3D10 exhibited only weak IONN, as evidenced by a normal increase in weight gain.

Для дальнейшего изучения относительной токсичности химерного L3D10 по сравнению с 10D1 при введении в комбинации с анти-PD-1, были изучены патологические эффекты у нокин-мышей CTLA-4 через 42 дня после введения. Как изображено на фиг. 26, конечный вес тела (день 42) у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-1, был подобен мышам, получавшим отрицательное контрольное антитело hIgG. Однако для сравнения, вес мышей, получавших 10D1 + анти-PD-1, был намного ниже. Соответственно, когда была изучена общая анатомия этих мышей, матка/яичник/мочевой пузырь и тимус, то они были заметно меньше у мышей, получавших 10D1 + PD-1 (фиг. 27). Опять же, органы у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-1, были сопоставимы с контролем hIgG. Для сравнения, сердца, иссеченные из мышей, получавших 10D1, оказались немного большими по размеру с заметно более белым видом. В результате было решено изучить эритропоэз у мышей и наблюдались явные различия у мышей, получавших 10D1 + aнти-PD-1, относительно групп, получавших L3D10 + aнти-PD-1 или контрольное антитело, которые были довольно похожи. Как изображено на фиг. 27А, костный мозг мышей, получавших 10D1 + анти-PD-1, имел заметно более белый цвет, а изолированная кровь была почти полностью белой по цвету (фиг. 28b). В соответствии с этим более внимательно были изучены клетки крови, находящиеся на различных стадиях развития с использованием маркеров CD71 и CD119. Типичные профили FACS показаны на фиг. 28С, тогда как сводные данные изображены на фиг. 28D. Эти данные показали статистически значимое снижение количества клеток, находящихся на стадии IV развития у мышей, получавших 10D1 + aнти-PD-1 (фиг. 28D).To further investigate the relative toxicity of chimeric L3D10 versus 10D1 when administered in combination with anti-PD-1, pathological effects were studied in CTLA-4 nokin mice 42 days after administration. As shown in FIG. 26, final body weight (day 42) in mice treated with L3D10 + anti-PD-1 was similar to mice treated with hIgG negative control antibody. However, for comparison, the weights of mice treated with 10D1 + anti-PD-1 were much lower. Accordingly, when the general anatomy of these mice, uterus / ovary / bladder and thymus was examined, they were markedly smaller in mice treated with 10D1 + PD-1 (Fig. 27). Again, organs in mice treated with L3D10 + anti-PD-1 were comparable to hIgG controls. In comparison, hearts excised from 10D1-treated mice were slightly larger in size with a noticeably whiter appearance. As a result, it was decided to study erythropoiesis in mice and there were clear differences in mice treated with 10D1 + anti-PD-1 relative to the groups receiving L3D10 + anti-PD-1 or a control antibody, which were quite similar. As shown in FIG. 27A, the bone marrow of mice treated with 10D1 + anti-PD-1 was markedly whiter in color, and isolated blood was almost completely white in color (FIG. 28b). In accordance with this, blood cells at various stages of development were studied more closely using markers CD71 and CD119. Typical FACS profiles are shown in FIG. 28C, while summary data is depicted in FIG. 28D. These data showed a statistically significant decrease in the number of cells in developmental stage IV in mice treated with 10D1 + anti-PD-1 (Fig. 28D).

Чтобы исследовать возможный механизм анемии у мышей, получавших 10D1, тестировали, способно ли лечение 10D1 + PD-1 индуцировать антиэритроцитарные антитела. Как изображено на фиг. 29, антиэритроцитарные антитела не обнаружены. Таким образом, развитие специфических эритроцитарных аутоTo investigate a possible mechanism of anemia in mice treated with 10D1, it was tested whether treatment with 10D1 + PD-1 was able to induce anti-erythrocyte antibodies. As shown in FIG. 29, anti-erythrocyte antibodies were not detected. Thus, the development of specific erythrocyte autos

- 20 038617 антител не отвечает за анемию у мышей, получавших анти-PD-1+10D1.- 20,038617 antibodies are not responsible for anemia in mice treated with anti-PD-1 + 10D1.

Чтобы дополнительно определить токсикологию L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с антиPD-1, был проведен гистологический анализ сердца (фиг. 30), легких (фиг. 31), слюнной железы (фиг. 32) и почек и печени (фиг. 33) после фиксации в 10% формалине в течение не менее 24 ч. В каждой из изученных тканей мыши, получавшие 10D1 + анти-PD-1, демонстрировали высокий уровень инфильтрации Т-клеток. Показатель токсичности, основанный на выраженности воспаления, суммирован на фиг. 34, на котором изображены оценки высокой токсичности мышей, получавших 10D1 + анти-PD-1. по сравнению с L3D10 + анти-PD-1, который имеет оценки лишь незначительно выше, чем контрольная группа мышей с hIgG.To further determine the toxicology of L3D10 versus 10D1 in combination with antiPD-1, histological analysis of the heart (FIG. 30), lungs (FIG. 31), salivary gland (FIG. 32), and kidney and liver (FIG. 33) was performed. after fixation in 10% formalin for at least 24 hours. In each of the studied tissues, mice receiving 10D1 + anti-PD-1 showed a high level of T-cell infiltration. The toxicity score based on the severity of inflammation is summarized in FIG. 34, which depicts the high toxicity scores of mice treated with 10D1 + anti-PD-1. compared to L3D10 + anti-PD-1, which has scores only marginally higher than the control group of hIgG mice.

Пример 10. L3D10 снижает связывание растворимого CTLA-4.Example 10 L3D10 Reduces Soluble CTLA-4 Binding.

L3D10 и 10D1 показывают аналогичные паттерны связывания с иммобилизированной в планшете CTLA-4 (фиг. 36). В качестве возможного объяснения снижения токсичности L3D10 по сравнению с 10D1, в частности увеличение инфильтрации/активности Т-клеток, связанной с 10D1, было решено изучить связывание с растворимым CTLA-4. Заявители решили посмотреть на это, потому что связь между полиморфизмом CTLA-4 и множественными аутоиммунными заболеваниями связана с дефектным образованием растворимого CTLA-4 (Nature, 2003, 423:506-511) и подавлением экспрессии изоформы sCTLA-4, увеличившей возникновение диабета I типа у мышей ((Diabetes, 2011, 60:1955-1963). Кроме того, растворимый CTLA-4 (абатасепт и белатасепт) представляет собой широко используемый препарат для подавления иммунитета. В соответствии с этой идеей, когда изучалось относительное связывание с растворимым CTLA4, наблюдалось заметное снижение связывания L3D10 (фиг. 37).L3D10 and 10D1 show similar binding patterns to plate-immobilized CTLA-4 (FIG. 36). As a possible explanation for the decreased toxicity of L3D10 over 10D1, in particular the increase in infiltration / activity of T cells associated with 10D1, it was decided to study the binding to soluble CTLA-4. The applicants chose to look at this because the link between CTLA-4 polymorphism and multiple autoimmune diseases is associated with defective formation of soluble CTLA-4 (Nature, 2003, 423: 506-511) and suppression of sCTLA-4 isoform expression, which increased the occurrence of type I diabetes. in mice ((Diabetes, 2011, 60: 1955-1963). In addition, soluble CTLA-4 (abatacept and belatacept) is a widely used drug for suppressing immunity. In line with this idea, when the relative binding to soluble CTLA4 was studied, a marked decrease in L3D10 binding was observed (Fig. 37).

Было продемонстрировано, что анти-CTLA-4 мкАТ индуцируют устойчивое внедрение опухоли у гетерозиготных мышей CTLA-4^h/m, в которых только 50% молекул CTLA-4 могут связываться с античеловеческим CTLA-4 мкАТ. Чтобы определить, достаточно ли взаимодействия 50% CTLA-4 для индукции иоНЯ, лечили CTLA-4h/^m мышей анти-PD-1 + 10D1. Как изображено на фиг. 35, anti-PD-1 + 10D1 не смогли вызвать потерю веса у мышей CTLA-4^h/m. Таким образом, иоНЯ и иммунитет к раку могут быть генетически не связаны.It has been demonstrated that anti-CTLA-4 mAb induce sustained tumor invasion in heterozygous CTLA-4 ^{h / m} mice, in which only 50% of CTLA-4 molecules can bind to anti-human CTLA-4 mAb. To determine if the interaction of 50% CTLA-4 was sufficient to induce IONN, anti-PD-1 + 10D1 mice ^{were treated with CTLA-4h / m mice.} As shown in FIG. 35, anti-PD-1 + 10D1 failed to induce weight loss in CTLA-4 ^{h / m} mice. Thus, ION and cancer immunity may not be genetically related.

Активность in vivo демонстрирует, что L3D10 антитело сохраняет свою противоопухолевую активность, но проявляет сниженное аутоиммунное нежелательное явление, наблюдаемое с другими иммунотерапевтическими антителами, такими как 10D1, что указывает на возможность усиления противоопухолевой активности без обострения аутоиммунных нежелательных явлений. Соответственно, аутоиммунные побочные эффекты не являются необходимой ценой для иммунитета против рака, и представляется возможным не связывать эти два показателя. Характеристика L3D10 показала, что его способность блокировать взаимодействие CTLA-4 с В7.1 и В7.2 более эффективна, чем с 10D1, и это связано с различием в сайте связывания CTLA-4 между антителами. Кроме того, L3D10 был слит с Fc-доменом модифицированного человеческого IgG1, который имеет мутации, придающие сильную АЗКЦ активность, которая усиливает терапевтический эффект антитела. Дополнительная характеристика демонстрирует, что L3D10 и 10D1 связываются с иммобилизованным CTLA-4 с аналогичным профилем связывания. Однако L3D10 демонстрирует гораздо более низкую аффинность связывания с растворимым CTLA-4, чем 10D1. В совокупности полученные данные показывают, что антитело L3D10 обладает большим потенциалом для клинического применения при лечении больных раком с менее тяжелыми нежелательными явлениями.The in vivo activity demonstrates that the L3D10 antibody retains its antitumor activity, but exhibits a reduced autoimmune adverse event seen with other immunotherapeutic antibodies such as 10D1, indicating that it is possible to enhance antitumor activity without exacerbating autoimmune adverse events. Accordingly, autoimmune side effects are not a necessary cost for cancer immunity, and it seems possible not to link the two. Characterization of L3D10 showed that its ability to block the interaction of CTLA-4 with B7.1 and B7.2 is more effective than with 10D1, and this is due to the difference in the CTLA-4 binding site between antibodies. In addition, L3D10 was fused to the Fc domain of modified human IgG1, which has mutations that confer potent ADCC activity that enhances the therapeutic effect of the antibody. Additional characterization demonstrates that L3D10 and 10D1 bind to immobilized CTLA-4 with a similar binding profile. However, L3D10 shows a much lower binding affinity for soluble CTLA-4 than 10D1. Taken together, these data indicate that the L3D10 antibody has great potential for clinical use in the treatment of cancer patients with less severe adverse events.

Пример 11. Гуманизация L3D10.Example 11. Humanization of L3D10.

Процесс гуманизации начинается с создания моделированной трехмерной гомологичной структуры антител и создания профиля исходного антитела на основе структурного моделирования. Для реализации, акцепторные каркасные области идентифицировались на основе общей идентичности последовательности каркасной области, соответствия границ раздела, аналогично классифицированных канонических позиций CDR и наличия сайтов N-гликозилирования, которые необходимо было бы удалить. Для гуманизированной конструкции были выбраны одна легкая цепь (LC) и одна каркасная область тяжелой цепи (НС).The humanization process begins with the creation of a simulated three-dimensional homologous structure of antibodies and the creation of a profile of the original antibody based on structural modeling. For implementation, acceptor framework regions were identified based on shared framework sequence identity, interface correspondence, similarly classified canonical CDR positions, and the presence of N-glycosylation sites that would need to be removed. For the humanized construct, one light chain (LC) and one framework region of the heavy chain (HC) were selected.

Гуманизированные антитела конструировали путем создания множества гибридных последовательностей, которые сливают отдельные части последовательности исходного антитела с гуманизированной каркасной последовательностью, включая трансплантацию последовательностей CDR в каркасные области. Определенные последовательности CDR исходного антитела L3D10 представлены как SEQ ID NO: 2126, как указано в табл. 1A.Humanized antibodies were constructed by creating a plurality of fusion sequences that fuse separate portions of the parent antibody sequence to a humanized framework sequence, including grafting CDR sequences into the framework regions. The determined CDR sequences of the parent L3D10 antibody are shown as SEQ ID NO: 2126, as indicated in Table II. 1A.

- 21 038617- 21 038617

Таблица 1ATable 1A

Определенные последовательности CDR исходного антитела L3D10Determined CDR Sequences of Parent Antibody L3D10

Цепь антитела Antibody chain CDR CDR SEQ ID NO SEQ ID NO Вариабельная область легкой цепи Variable region light chain 1 1 21 21 2 2 22 22 3 3 23 23 Вариабельная область тяжелой цепи Variable region heavy chain 1 1 24 24 2 2 25 25 3 3 26 26

Используя 3D-модель, эти гуманизированные последовательности были методично проанализированы визуально и с помощью компьютерного моделирования для выделения последовательностей, которые, скорее всего, сохраняли бы связывание антигена. Цель заключалась в том, чтобы максимизировать количество гуманизированной последовательности в конечных гуманизированных антителах, сохраняя при этом первоначальную специфичность антител.Using a 3D model, these humanized sequences were methodically analyzed visually and using computer simulations to isolate sequences that are likely to retain antigen binding. The goal was to maximize the amount of humanized sequence in the final humanized antibodies while maintaining the original antibody specificity.

Три гуманизированные легкие цепи (LC1, LC2 и LC3) и три гуманизированные тяжелые цепи (НС1, НС2 и НС3) были разработаны на основе выбранных акцепторных каркасных областей. Каждая из трех последовательностей НС или LC была из одной и той же генеративной линии, с различными обратными мутациями к исходной последовательности мыши, как изображено на фиг. 38. Аминокислотные последовательности гуманизированной вариабельной области и их оптимизированная кодирующая нуклеотидная последовательность перечислены в SEQ ID NO: 9-20 Последовательности CDR2 как гуманизированной тяжелой, так и легкой цепей содержат аминокислотные изменения относительно исходной последовательности антител L3D10 и перечислены в SEQ ID NOS 33-38, как указано в табл. 1В.Three humanized light chains (LC1, LC2 and LC3) and three humanized heavy chains (HC1, HC2 and HC3) were designed based on the selected acceptor framework regions. Each of the three HC or LC sequences were from the same generative lineage, with different back mutations to the original mouse sequence, as depicted in FIG. 38. The amino acid sequences of the humanized variable region and their optimized coding nucleotide sequence are listed in SEQ ID NO: 9-20 The CDR2 sequences of both the humanized heavy and light chains contain amino acid changes relative to the original L3D10 antibody sequence and are listed in SEQ ID NOS 33-38. as indicated in table. 1B.

Таблица 1BTable 1B

CDR2 последовательности вариабельных областей гуманизированного антителаCDR2 sequences of variable regions of a humanized antibody

Последовательность антитела Antibody sequence Последовательность CDR2 Subsequence CDR2 SEQ ID NO SEQ ID NO НС1 HC1 YIWYDGNTNFHPSLKSR YIWYDGNTNFHPSLKSR 3 3 3 3 НС2 HC2 YIWYDGNTNFHSSLKSR YIWYDGNTNFHSSLKSR 34 34 НСЗ NSZ YIWYDGNTNFHSPLKSR YIWYDGNTNFHSPLKSR 35 35 LC1 LC1 AATNLQS AATNLQS 36 36 LC2 LC2 AATNLQD AATNLQD 37 37 LC3 LC3 AATSLQS AATSLQS 38 38

Легкие и тяжелые гуманизированные цепи теперь могут комбинироваться для создания вариантов полностью гуманизированных антител. Все возможные комбинации гуманизированных легкой и тяжелой цепи были проверены на уровень их экспрессии и антигенсвязывающую аффинность для идентификации антител, которые проявляют себя как аналогичные к исходным антителам.Humanized light and heavy chains can now be combined to create fully humanized antibody variants. All possible combinations of humanized light and heavy chains were tested for their level of expression and antigen binding affinity to identify antibodies that appear to be similar to the parent antibodies.

Был использован новый инструмент для расчета показателя гуманизации моноклональных антител [24]. Этот показатель означает, как выглядит подобная человеческой последовательность вариабельной области антитела, что является важным фактором при гуманизации антител. Показатели гуманизации для исходных и гуманизированных антител показаны в табл. 2 и 3. Основываясь на рассматриваемом методе, для тяжелых цепей показатель 79 или выше свидетельствует о подобии человеческой; для легких цепей показатель 86 или выше свидетельствует о подобии человеческой.A new tool was used to calculate the humanization index of monoclonal antibodies [24]. This figure refers to what the human-like sequence of an antibody variable region looks like, which is an important factor in the humanization of antibodies. Indicators of humanization for the original and humanized antibodies are shown in table. 2 and 3. Based on the method under consideration, a score of 79 or higher for heavy chains is indicative of a human similarity; for light chains, a score of 86 or higher indicates a human similarity.

Таблица 2table 2

Данные гуманизированной легкой цепи и показатели гуманизацииHumanized Light Chain Data and Humanization Indicators

Название цепи Chain name Примечание Note Полная длина (каркасная область + CDR) Пороговое значение = 86 Full Length (Wireframe + CDR) Threshold = 86 Только каркасные области Пороговое значение = 90 Wireframe regions only Threshold = 90 L2872 (Химерный исходный) L2872 (Chimeric original) Легкая цепь Light chain 71,3 71.3 78,2 78.2 L31O6(LC1) L31O6 (LC1) Равномерно гуманизированная Uniformly humanized 86,5 86.5 96,8 96.8 L3107 (LC2) L3107 (LC2) Равномерно гуманизированная Uniformly humanized 83,6 83.6 94,0 94.0 L3108 (LC3) L3108 (LC3) Равномерно гуманизированная Uniformly humanized 88,8 88.8 98,1 98.1

- 22 038617- 22 038617

Таблица 3Table 3

Данные гуманизированной тяжелой цепи и показатели гуманизацииHumanized Heavy Chain Data and Humanization Indicators

Название цепи Chain name Примечание Note Полная длина (каркасная область + CDR) Пороговое значение = 79 Full Length (Wireframe + CDR) Threshold = 79 Только каркасные области Пороговое значение = 84 Wireframe regions only Threshold = 84 Н2872 (Химерный исходный) Н2872 (Chimeric original) Исходный Original 62,0 62.0 70,3 70.3 Н3106 (НС1) H3106 (HC1) Равномерно гуманизированная Uniformly humanized 80,4 80.4 90,7 90.7 Н3107 (НС2) Н3107 (НС2) Равномерно гуманизированная Uniformly humanized 78,9 78.9 89,4 89.4 Н3108 (НСЗ) N3108 (NSZ) Равномерно гуманизированная Uniformly humanized 80,5 80.5 93,0 93.0

Г ены полной длины антител были сконструированы путем первого синтеза последовательностей вариабельной области. Последовательности были оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Эти последовательности вариабельной области затем клонировали в векторы экспрессии, которые уже содержат человеческие Fc-домены; для тяжелой цепи использовались каркасные последовательности hIgG1 (M252Y, S254T, Т256Е, S298A, Е333А, К334А). Кроме того, для сравнения вариабельной области исходных химерных тяжелых и легких цепей, были сконструированы химерные цепи полного размера, используя одни и те же каркасные Fc-последовательности.Full length antibody genes were constructed by first synthesizing variable region sequences. The sequences have been optimized for expression in mammalian cells. These variable region sequences were then cloned into expression vectors that already contain human Fc domains; for the heavy chain, hIgG1 framework sequences (M252Y, S254T, T256E, S298A, E333A, K334A) were used. In addition, to compare the variable region of the original chimeric heavy and light chains, full-length chimeric chains were constructed using the same Fc framework sequences.

Все 9 гуманизированных антител подвергались мелкомасштабному производству в 0,01л. Количество химерного исходного антитела также увеличивали для прямого сравнения. Плазмиды для указанных тяжелых и легких цепей трансфицировали в суспензионные клетки HEK293 с использованием химически определенных сред в отсутствие сыворотки для получения антител. Целые антитела в кондиционированной среде очищали с использованием среды MabSelect SuRe Protein A (GE Healthcare). 10 тестируемых антител показаны в табл. 4.All 9 humanized antibodies were subjected to small scale production in 0.01 L. The amount of the chimeric parent antibody was also increased for direct comparison. Plasmids for these heavy and light chains were transfected into suspension HEK293 cells using chemically defined media in the absence of serum to generate antibodies. Whole antibodies in conditioned medium were purified using MabSelect SuRe Protein A medium (GE Healthcare). 10 tested antibodies are shown in table. 4.

Таблица 4Table 4

Десять антител, воспроизведенных временно в клетках HEK293Ten antibodies replicated temporarily in HEK293 cells

Название антитела Antibody name Тяжелая цепь Heavy chain Легкая цепь Light chain пп# np # Выход (мг/мл) Yield (mg / ml) Гуманизированное НС1 + LC1 Humanized HC1 + LC1 Н3106 H3106 L3106 L3106 4630 4630 54 54 Гуманизированное НС1 + LC2 Humanized HC1 + LC2 Н3106 H3106 L3107 L3107 4631 4631 50 50 Гуманизированное НС1 + ГСЗ Humanized HC1 + NHS Н3106 H3106 L3108 L3108 4632 4632 45 45 Гуманизированное НС2 + LC1 Humanized HC2 + LC1 Н3107 H3107 L3106 L3106 4633 4633 37 37 Гуманизированное НС2 + LC2 Humanized HC2 + LC2 Н3107 H3107 L3107 L3107 4634 4634 44 44 Гуманизированное НС2 + ГСЗ Humanized НС2 + ГСЗ Н3107 H3107 L3108 L3108 4635 4635 40 40 Гуманизированное НСЗ + LC1 Humanized NSZ + LC1 Н3108 H3108 L3106 L3106 4636 4636 46 46 Гуманизированное НСЗ + LC2 Humanized NSZ + LC2 Н3108 H3108 L3107 L3107 4637 4637 55 55 Гуманизированное НСЗ + ГСЗ Humanized NHS + NHS Н3108 H3108 L3108 L3108 4638 4638 53 53 Химерное исходное Chimeric original Н2872 H2872 L2872 L2872 4629 4629 28 28

Аффинность 9 гуманизированных комбинаций антител и химерного исходного антитела к антигену (huCTLA-4) оценивали с помощью Octet. Кинетические эксперименты с множеством концентраций проводились на системе Octet Red96 (ForteBio). Биосенсоры анти-hIgG Fc (ForteBio, # 18-5064) гидратировали в разбавителе для образца (0,1% БСА в ФСБ и 0,02% Твин 20) и предварительно проводили кондиционирование при рН 1,7 Глицина. Антиген разбавляли с использованием 7-точечного 2-кратного серийного разведения, начинающегося с 600 нМ разбавителя для образца. Все антитела разбавляли до 10 мкг/мл разбавителем для образцов и затем иммобилизовали на биосенсоры анти-hIgG Fc в течение 120 с. После того как базовые линии были установлены в течение 60 с в образце-разбавителе, биосенсоры были перемещеныThe affinity of 9 humanized combinations of antibodies and a chimeric parental antibody to antigen (huCTLA-4) was assessed using Octet. Multiple concentration kinetic experiments were performed on an Octet Red96 system (ForteBio). Anti-hIgG Fc biosensors (ForteBio, # 18-5064) were hydrated in sample diluent (0.1% BSA in PBS and 0.02% Tween 20) and pre-conditioned at pH 1.7 Glycine. Antigen was diluted using a 7-point 2-fold serial dilution starting with 600 nM sample diluent. All antibodies were diluted to 10 μg / ml with sample diluent and then immobilized onto anti-hIgG Fc biosensors for 120 s. After baselines were established for 60 s in the diluent sample, the biosensors were moved

- 23 038617 в лунки, содержащие антиген, в последовательности концентраций для измерения ассоциации. Ассоциация наблюдалась в течение 120 с, и диссоциация наблюдалась в течение 180 с для каждого белка, представляющего интерес в разбавителе для образца. Аффинность связывания характеризовалась установкой кинетических сенсорных диаграмм к моновалентной связывающей модели (связывание 1:1). Полные кинетические измерения суммированы в табл. 5.- 23 038617 in the wells containing the antigen, in a sequence of concentrations to measure the association. Association was observed for 120 s and dissociation was observed for 180 s for each protein of interest in the sample diluent. Binding affinity was characterized by setting the kinetic sensory diagrams to a monovalent binding model (1: 1 binding). Complete kinetic measurements are summarized in table. 5.

Таблица 5Table 5

Кинетические измерения гуманизированных антител и исходных антителKinetic measurements of humanized antibodies and parent antibodies

ID Пробы Sample ID ID Образца ID Sample KD (M) KD (M) kon(l/Mc) kon (l / Mc) kdis(l/c) kdis (l / c) Полная Х^Л2 ^A complete X 2 Полная Х^Л2 ^A complete X 2 РР4629 RR4629 huCTLA4 huCTLA4 2,3E-09 2.3E-09 3,5E+05 3.5E + 05 8,0E-04 8.0E-04 0,0033 0.0033 0,9981 0.9981 РР4630 RR4630 huCTLA4 huCTLA4 l,3E-08 l, 3E-08 l,3E+05 l, 3E + 05 l,8E-03 l, 8E-03 0,0127 0.0127 0,9848 0.9848 РР4631 RR4631 huCTLA4 huCTLA4 6,9E-09 6.9E-09 2,4E+05 2.4E + 05 l,6E-03 l, 6E-03 0,0120 0.0120 0,9918 0.9918 РР4632 RR4632 huCTLA4 huCTLA4 l,2E-08 l, 2E-08 l,6E+05 l, 6E + 05 1.9E-03 1.9E-03 0,0109 0.0109 0,9915 0.9915 РР4633 RR4633 huCTLA4 huCTLA4 7.1E-09 7.1E-09 2,0E+05 2.0E + 05 l,4E-03 l, 4E-03 0,0106 0.0106 0,9933 0.9933 РР4634 RR4634 huCTLA4 huCTLA4 6,8E-09 6.8E-09 2,8E+05 2.8E + 05 1.9E-03 1.9E-03 0,0116 0.0116 0,9866 0.9866 РР4635 RR4635 huCTLA4 huCTLA4 8,4E-09 8.4E-09 2,4E+05 2.4E + 05 2,0E-03 2.0E-03 0,0077 0.0077 0,9934 0.9934 РР4636 RR4636 huCTLA4 huCTLA4 8,7E-09 8.7E-09 2,5E+05 2.5E + 05 2,2E-03 2.2E-03 0,0111 0.0111 0,9905 0.9905 РР4637 RR4637 huCTLA4 huCTLA4 6,4E-09 6.4E-09 3,2E+05 3.2E + 05 2,1E-O3 2.1E-O3 0,0173 0.0173 0,9884 0.9884 РР4638 RR4638 huCTLA4 huCTLA4 8,1E-O9 8.1E-O9 2,9E+05 2.9E + 05 2,3E-03 2,3E-03 0,0122 0.0122 0,9920 0.9920

Пример 12. Противоопухолевая активность гуманизированных анти-CTLA-4 антител.Example 12. Antitumor activity of humanized anti-CTLA-4 antibodies.

Основываясь на относительной аффинности связывания и показателях гуманизации, выбрали три антитела для дальнейшей оценки:Based on the relative binding affinity and humanization rates, three antibodies were selected for further evaluation:

РР4631 - высокая аффинность и хорошая экспрессия;PP4631 - high affinity and good expression;

РР4637 - высокая аффинность и хорошая экспрессия;PP4637 - high affinity and good expression;

РР4638 - немного более низкая аффинность, но наивысший показатель гуманизации.PP4638 - slightly lower affinity, but the highest indicator of humanization.

Материал для каждого из этих антител продуцировали с помощью временного синтеза в клетках HEK293 в масштабе 0,1 л с последующей очисткой белком А. Аффинность связывания очищенных антител была подтверждена при помощи Octet-анализа, как показано в табл. 6.Material for each of these antibodies was produced by transient synthesis in HEK293 cells at a scale of 0.1 L followed by protein A purification. The binding affinity of the purified antibodies was confirmed by Octet analysis as shown in Table II. 6.

Таблица 6Table 6

Кинетические измерения гуманизированных антител и исходных антителKinetic measurements of humanized antibodies and parent antibodies

Репликат Replicate ID Пробы Sample ID ID Образца ID Sample KD (M) KD (M) kon(l/Mc) kon (l / Mc) kdis(l/c) kdis (l / c) Полная Х^Л2 ^A complete X 2 Полная Х^Л2 ^A complete X 2 1 1 РР4631 RR4631 huCTLA4 huCTLA4 7,2E-09 7.2E-09 2,3E+05 2.3E + 05 l,6E-03 l, 6E-03 0,0274 0.0274 0,9894 0.9894 1 1 РР4637 RR4637 huCTLA4 huCTLA4 7.1E-09 7.1E-09 2.7E+05 2.7E + 05 1.9E-03 1.9E-03 0,0294 0.0294 0,9899 0.9899 1 1 РР4638 RR4638 huCTLA4 huCTLA4 9,4E-09 9.4E-09 2,3E+05 2.3E + 05 2,lE-03 2, LE-03 0,0211 0.0211 0,9919 0.9919 2 2 РР4631 RR4631 huCTLA4 huCTLA4 7,4E-09 7.4E-09 2,3E+05 2.3E + 05 l,7E-03 l, 7E-03 0,0191 0.0191 0,9919 0.9919 2 2 РР4637 RR4637 huCTLA4 huCTLA4 8,4E-09 8.4E-09 2,6E+05 2.6E + 05 2,2E-03 2.2E-03 0,0248 0.0248 0,9899 0.9899 2 2 РР4638 RR4638 huCTLA4 huCTLA4 l,lE-08 l, lE-08 2,lE+05 2, lE + 05 2,2E-03 2.2E-03 0,0150 0.0150 0,9934 0.9934

Была оценена противоопухолевая активность этих трех гуманизированных антител по сравнению с 10D1 и химерным антителом L3D10, используя сингенную модель опухоли мыши МС38 у мышей с нокин CTLA-4 человека, описанных выше в примере 5. На фиг. 39А изображен график лечения для эксперимента in vivo; мышам вводили в общей сложности 4 дозы антител каждые 3 дня, начиная с 7-го дня после введения. Как изображено на фиг. 39В, все гуманизированные антитела полностью уничтожили опухоль и были сопоставимы с 10D1.The antitumor activity of these three humanized antibodies was evaluated in comparison with 10D1 and chimeric antibody L3D10 using the syngeneic mouse tumor model MC38 in the human CTLA-4 knockin mice described in Example 5 above. FIG. 39A depicts a treatment schedule for an in vivo experiment; mice were injected with a total of 4 doses of antibodies every 3 days, starting on the 7th day after administration. As shown in FIG. 39B, all humanized antibodies completely destroyed the tumor and were comparable to 10D1.

В другом эксперименте оценивали противоопухолевую активность гуманизированных антител РР4631 и РР4637 по сравнению с 10D1 и химерным антителом L3D10 с использованием сингенной модели опухоли мыши МС38 у гетерозиготных мышей CTLA-4^h/m, описанных в примере 5 (фиг. 14) при двух разных дозах. Как изображено на фиг. 40, тогда как все мкАТ были неотличимы при использовании в концентрации 30 мкг/мышь/инъекция (1,5 мг/кг), РР4637 был более эффективен в концентрации 10 мкг/мышь/инъекция (0,5 мг/кг), тогда как РР4631 и 10D1 показали сравнимую активность.In another experiment, the antitumor activity of humanized antibodies PP4631 and PP4637 was assessed in comparison with 10D1 and chimeric antibody L3D10 using the syngeneic mouse tumor model MC38 in heterozygous CTLA-4 ^{h / m} mice described in example 5 (Fig. 14) at two different doses. As shown in FIG. 40, while all mAbs were indistinguishable when used at a concentration of 30 μg / mouse / injection (1.5 mg / kg), PP4637 was more effective at a concentration of 10 μg / mouse / injection (0.5 mg / kg), whereas PP4631 and 10D1 showed comparable activity.

Противоопухолевую активность гуманизированных антител по сравнению с 10D1 и химерным антителом L3D10 также продемонстрировали с использованием сингенной модели опухоли мышиной меланомы B16-F1 у мышей с нокин CTLA-4 человека, как изображено на фиг. 41. Мышам давали в общей сложности 3 дозы антител каждые 3 дня, начиная со 2-го дня после введения. Как изображено на фиг. 41, L3D10 и гуманизированные антитела замедляли рост опухоли и были сопоставимы с 10D1.The antitumor activity of the humanized antibodies relative to 10D1 and chimeric antibody L3D10 was also demonstrated using a syngeneic B16-F1 murine melanoma tumor model in human CTLA-4 knockin mice, as depicted in FIG. 41. Mice were given a total of 3 doses of antibodies every 3 days starting from the 2nd day after administration. As shown in FIG. 41, L3D10 and humanized antibodies slowed tumor growth and were comparable to 10D1.

- 24 038617- 24 038617

Пример 13. Гуманизированные клоны L3D10 поддерживают превосходные профили безопасности по сравнению с 10D1.Example 13 Humanized L3D10 clones maintain superior safety profiles over 10D1.

Чтобы проверить, можно ли поддерживать превосходные профили безопасности L3D10 после гуманизации, сравнили РР4631 и РР4637 с 10D1 для установления их нежелательных явлений при использовании в комбинации с анти-PD-i. Как изображено на фиг. 42, как РР4631, так и РР4637 менее токсичны, чем 10D1 при использовании в комбинации с анти-PD-1.To test whether the excellent safety profiles of L3D10 after humanization could be maintained, PP4631 and PP4637 were compared with 10D1 to establish their adverse events when used in combination with anti-PD-i. As shown in FIG. 42, both PP4631 and PP4637 are less toxic than 10D1 when used in combination with anti-PD-1.

В соответствии с нарушением эритропоэза, описанным на фиг. 28, мыши, получавшие 10D1 плюс анти-PD-I, анемичны на основании общего анализа крови (OAK), тогда как те, которые получали анти-PD-1 + РР4631 и анти-PD-1 + РР4637, имеют в основном обычные профили OAK, как изображено на фиг. 43. Более того, анализ профилей Т-клеток в лимфоцитах периферической крови (ЛПК) выявляет надежную системную активацию как CD4 Т-клеток, так и CD8 у мышей, которые получали 10D1 + anti-PD-1, но не те, которые получали анти-PD-1 + РР4631 или анти- PD-1 + РР4637 (фиг. 44), что также подтверждает идею о том, что мкАТ анти-CTLA-4 на основе L3D10 не вызывают системной активации Т-клеток.In accordance with the erythropoiesis disorder described in FIG. 28, mice receiving 10D1 plus anti-PD-I are anemic on the basis of complete blood count (OAK), while those receiving anti-PD-1 + PP4631 and anti-PD-1 + PP4637 have mostly normal profiles OAK as shown in FIG. 43. Moreover, analysis of T cell profiles in peripheral blood lymphocytes (PBL) reveals robust systemic activation of both CD4 T cells and CD8 in mice that received 10D1 + anti-PD-1, but not those that received anti -PD-1 + PP4631 or anti-PD-1 + PP4637 (Fig. 44), which also supports the idea that anti-CTLA-4 mAb based on L3D10 does not cause systemic T cell activation.

Пример 14. Характеристики связывания гуманизированных анти-CTLA-4 антител.Example 14. Binding characteristics of humanized anti-CTLA-4 antibodies.

Чтобы подтвердить, что гуманизированные антитела сохраняют свои характеристики связывания для CTLA-4, было изучено связывание с иммобилизованной и связанной в планшете CTLA-4. Как изображено на фиг. 45, гуманизация не влияет на связывание с иммобилизованным CTLA-4, и все три гуманизированных антитела демонстрируют сходное связывание с исходным химерным антителом L3D10. Однако гуманизация дополнительно снижает связывание L3D10 с растворимым CTLA-4, как показано на фиг. 46. Основываясь на уменьшении связывания с растворимым CTLA-4, предполагается, что три гуманизированных антитела будут вызывать равное отторжение опухоли с еще меньшими аутоиммунными побочными эффектами, чем L3D10.To confirm that humanized antibodies retain their binding characteristics for CTLA-4, binding to immobilized and plate bound CTLA-4 was examined. As shown in FIG. 45, humanization does not affect binding to immobilized CTLA-4, and all three humanized antibodies show similar binding to the parent chimeric L3D10 antibody. However, humanization further reduces the binding of L3D10 to soluble CTLA-4, as shown in FIG. 46. Based on the decreased binding to soluble CTLA-4, the three humanized antibodies are expected to induce equal tumor rejection with even fewer autoimmune side effects than L3D10.

Авторы продемонстрировали, что химерный L3D10 обладает 1000-кратной более высокой блокирующей активностью, чем 10D1. Интересной предоставляется возможность того, что блокирование взаимодействий B7-CTLA-4 может объяснить отсутствие иоНЯ. Как изображено на фиг. 47 и 48, ни РР4631, ни РР4637 не блокируют взаимодействия B7-CTL-A4 in vitro и in vivo. Тот факт, что РР4631 и РР4637 демонстрируют сниженные иоНЯ, также подтвердили, что блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 не отвечает за повышение безопасности L3D10.The authors demonstrated that chimeric L3D10 has 1000-fold higher blocking activity than 10D1. Interestingly, the possibility is presented that blocking B7-CTLA-4 interactions could explain the absence of ION. As shown in FIG. 47 and 48, neither PP4631 nor PP4637 block B7-CTL-A4 interactions in vitro and in vivo. The fact that PP4631 and PP4637 exhibit reduced IONL also confirmed that blocking the B7-CTLA-4 interaction is not responsible for increasing the safety of L3D10.

Учитывая предлагаемую роль CTLA-4 в защите от аутоиммунных заболеваний, было предложено уменьшить связывание с растворимым CTLA-4 в качестве основного механизма для улучшения профилей безопасности. Чтобы проверить эту гипотезу, использовали рост привеса среди самок мышей, которые получали анти-PD-1 + анти-CTLA-4 мкАТ в течение перинатального периода в качестве основного показателя для иоНЯ. Как изображено на фиг. 42, значительное снижение привеса наблюдалось у мышей, которые получали как 10D1, так и анти-PD-1, тогда как те, которые получили РР4637 + anti-PD-1, имели самый низкий иоНЯ, за которым следуют РР4631, а затем L3D10. Строгая обратная корреляция с уменьшенной привязкой к sCTLA-4 согласуется с центральной гипотезой.Given the proposed role of CTLA-4 in protection against autoimmune diseases, it has been proposed to reduce binding to soluble CTLA-4 as a major mechanism to improve safety profiles. To test this hypothesis, we used the increase in weight gain among female mice that received anti-PD-1 + anti-CTLA-4 mAb during the perinatal period as the main indicator for IONN. As shown in FIG. 42, a significant reduction in weight gain was observed in mice that received both 10D1 and anti-PD-1, while those that received PP4637 + anti-PD-1 had the lowest IoHN, followed by PP4631 and then L3D10. The strong inverse correlation with reduced binding to sCTLA-4 is consistent with the central hypothesis.

Пример 15. Определение технологических свойств гуманизированных анти-CTLA-4 антител.Example 15. Determination of technological properties of humanized anti-CTLA-4 antibodies.

Чтобы оценить потенциал развития и производства трех различных гуманизированных антител, был проведен ряд аналитических методов для характеристики различных антител.To assess the development and production potential of three different humanized antibodies, a number of analytical methods were performed to characterize the various antibodies.

Характеристика Characteristic Метод Method Производство Production Временная экспрессия в клетках НЕК293 с последующей 1ступенчатой очисткой белка А Temporary expression in HEK293 cells followed by 1-step purification of protein A Чистота Purity Эксклюзионная хроматография (ЭХ) Size exclusion chromatography (SEC) Чистота Purity Капиллярный электрофорез (в восстановленных и невосстановленных условиях) Capillary electrophoresis (under reduced and non-reduced conditions) Негликозилированный Non-glycosylated Капиллярный электрофорез (восстановленные условия) Capillary electrophoresis (reduced conditions) Деамидирование Deamidation Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (КИЭФ) и Capillary isoelectric focusing (CIEF) and жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ/МС) после ДМ-стресс-терапии liquid chromatography-mass spectrometry (LC / MS) after DM-stress therapy Т ермостабильность Thermal stability Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) Differential Scanning Calorimetry (DSC) Окисление Oxidation Пептидное картирование Peptide mapping Специфичность связывания Binding specificity ЯКХ, 293 пустой ячейки FACS YAKH, 293 empty cells FACS

В качестве исходной оценки были рассчитаны потенциальные значения молекулярной массы и изоэлектрической точки трех ведущих антител-кандидатов на основе аминокислотных последовательностей. Как показано в табл. 7, все антитела были довольно похожими, хотя антитело имело несколько более низкую ИЭТ.As a baseline estimate, the potential molecular weights and isoelectric points of the three leading candidate antibodies were calculated based on amino acid sequences. As shown in table. 7, all antibodies were quite similar, although the antibody had a slightly lower IEP.

- 25 038617- 25 038617

Таблица 7Table 7

Теоретические параметры трех гуманизированных антителTheoretical parameters of the three humanized antibodies

Название белка Squirrel name Теоретическая ММ (Da) Theoretical MM (Da) Т еоретическая НЭТ Theoretical NET РР4631 RR4631 (49647,8 + 23483,1) X 2 = 96614,0 (49647.8 + 23483.1) X 2 = 96614.0 7,9 7.9 РР4637 RR4637 (49644,9 + 23483,1) X 2 = 96611,1 (49644.9 + 23483.1) X 2 = 96611.1 7,65 7.65 РР4638 RR4638 (49644,9 + 23311,9) X 2 = 96568,7 (49644.9 + 23311.9) X 2 = 96568.7 7,9 7.9

Оценка выхода продукта.Estimation of the product yield.

Для оценки продуктивности различных антител клетки HEK293 временно трансфицировали векторами, экспрессирующими тяжелые и легкие цепи различных антител. Затем эти клетки культивировали во встряхиваемых колбах в течение 6 дней с использованием бессывороточной среды. Через 6 дней супернатант собирали и антитела очищали с помощью одностадийной хроматографии на белке А. Как следует из табл. 8, антитела РР4631 и РР4637 демонстрировали сходные выходы белка, тогда как антитело РР4638 получали с гораздо более низким относительным выходом.To evaluate the performance of various antibodies, HEK293 cells were transiently transfected with vectors expressing the heavy and light chains of various antibodies. The cells were then cultured in shake flasks for 6 days using serum-free medium. After 6 days, the supernatant was collected and the antibodies were purified using one-step protein A chromatography. As follows from the table. 8, PP4631 and PP4637 antibodies exhibited similar protein yields, while PP4638 antibody was produced in much lower relative yields.

Таблица 8Table 8

Оценка выхода гуманизированных антителEvaluation of the yield of humanized antibodies

Антитело Antibody Концентрация (мг/мл) Concentration (mg / ml) ОН 260/280 OH 260/280 Выход (мг/мл) Yield (mg / ml) РР4631 RR4631 1,280 1,280 0,53 0.53 126 126 РР4637 RR4637 4,532 4.532 0,53 0.53 118 118 РР4638 RR4638 0,729 0.729 0,57 0.57 56 56

Для оценки чистоты временно экспрессируемых антител образцы анализировали с помощью восстанавливающего и невосстанавливающего электрофореза в полиакриламидном геле. Как изображено на фиг. 50, образцы из всех трех антител продуцировали гель-полосы, указывающие на молекулу антитела, и образцы были относительно чистыми после очистки белком А.To assess the purity of the transiently expressed antibodies, samples were analyzed by reducing and non-reducing polyacrylamide gel electrophoresis. As shown in FIG. 50, samples from all three antibodies produced gel bands indicative of the antibody molecule, and the samples were relatively clear after purification with Protein A.

Эксклюзионная хроматография.Size exclusion chromatography.

Для дальнейшего изучения чистоты и агрегации различных антител после временной экспрессии, проводили эксклюзионную хроматографию очищенных белков. Вкратце, 50 мкг фильтрованного (с использованием фильтра 0,22 мкм) образца использовали для разделения с помощью ЭХ с использованием колонки TOSOH G3000 SWxl 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали ФСБ рН 7,4. Как показано в табл. 9, все гуманизированные антитела показывают чистоту более 90% после очистки белком А. Антитела РР4631 и РР4637 демонстрировали аналогичные низкие уровни агрегатов с более высокой молекулярной массой (ММ) и деградацию с образцами антител с большей частью белка в основном пике. В противоположность этому, антитело РР4638 имело более высокий уровень агрегации и некоторой деградации. Хроматограммы ЭХ изображены на фиг. 51.To further study the purity and aggregation of various antibodies after transient expression, size exclusion chromatography of the purified proteins was performed. Briefly, 50 μg of filtered (using a 0.22 µm filter) sample was used for SEC separation using a TOSOH G3000 SWxl 5 µm column. PBS, pH 7.4, was used as a mobile phase. As shown in table. 9, all humanized antibodies show greater than 90% purity after protein A purification. Antibodies PP4631 and PP4637 showed similar low levels of higher molecular weight (MW) aggregates and degradation with antibody samples with most of the protein in the main peak. In contrast, the PP4638 antibody had a higher level of aggregation and some degradation. SEC chromatograms are depicted in FIG. 51.

.Таблица 9.Table 9

Эксклюзионная хроматографияSize exclusion chromatography

Антитело Antibody Агрегация Aggregation Основной пик Main peak Деградация Degradation РР4631 RR4631 2,6% 2.6% 97,4% 97.4% 0 0 РР4637 RR4637 3,0% 3.0% 97,0% 97.0% 0 0 РР4638 RR4638 6,5% 6.5% 92,4% 92.4% 1,1% 1.1%

Капиллярный электрофорез (КЭ).Capillary electrophoresis (CE).

Капиллярный электрофорез использовали для количественного определения белка в пиковых полосах как в восстановленных, так и в невосстановленных условиях, а также количества негликозилированного белка тяжелой цепи. Вкратце, 100 мкг образца разбавляли в CE-SDS буфере для образца вместе с йодацетамидом (невосстановленные условия) или β-меркаптоэтанолом (восстановленные условия) вместе с 2 мкл стандартного белка 10 кДа. Образцы затем обрабатывали в течение 10 мин при 70°С. Для разделения РА-800, 50 мкм ВД использовался капилляр с голым плавлением кварца; общая длина 20,2 см; разделительное напряжение 15 кВ; ОП₂₂₀ для детектирования. Как показано в табл. 10, все три белка продемонстрировали высокий уровень чистоты, соответствующий SDS-PAGE, и все они были высокогликозилированы. Хроматограммы CE-SDS показаны на фиг. 52.Capillary electrophoresis was used to quantify the protein in the peak bands under both reduced and unreduced conditions, as well as the amount of non-glycosylated heavy chain protein. Briefly, 100 μg of sample was diluted in CE-SDS sample buffer along with iodoacetamide (unreduced conditions) or β-mercaptoethanol (reduced conditions) along with 2 μl of 10 kDa standard protein. The samples were then processed for 10 min at 70 ° C. For the separation of RA-800, 50 µm VD, a capillary with bare fusion of quartz was used; total length 20.2 cm; separation voltage 15 kV; OP ₂₂₀ for detection. As shown in table. 10, all three proteins exhibited high SDS-PAGE purity and were all highly glycosylated. Chromatograms of CE-SDS are shown in FIG. 52.

Таблица 10Table 10

Капиллярный электрофорезCapillary electrophoresis

Антитело Antibody Невосстановленные % Unrecovered% Востановленные % Refurbished% Негликозилированная тяжелая цепь Non-glycosylated heavy chain РР4631 RR4631 97,3 97.3 99,5 99.5 о,з oh, h РР4637 RR4637 97,2 97.2 99,5 99.5 0,4 0,4 РР4638 RR4638 96,9 96.9 99,4 99.4 0,4 0,4

Деамидирование: Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (КИЭФ) и жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ/МС).Deamidation: Capillary isoelectric focusing (CIEF) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC / MS).

Уровень деамидирования белка при высоком рН-стрессе определяли путем сравнения антител с и безThe level of protein deamidation at high pH stress was determined by comparing antibodies with and without

- 26 038617 высокочувствительной стресс-обработке в течение двух разных периодов времени (5 и 12,5 ч), а затем анализ КИЭФ и ЖХ/МС.- 26 038617 highly sensitive stress treatment for two different periods of time (5 and 12.5 h), followed by CIEF and LC / MS analysis.

Профиль заряда изоформ и изоэлектрические точки различных антител определяли с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ). Вкратце, образцы подвергали замене буфера в 20 мМ Tris pH 8,0, а затем 100 мкг белка образца смешивали с амфотерным электролитом, метилцеллюлозой вместе с маркерами ИЭТ 7,05 и ИЭТ 9,77. Для анализа использовали iCE3™ c ВД капилляров 100 мкм; 1,5 кВ плюс 3 кВ; ОП₂₈₀ для детектирования. Для деамидирования при стресс-обработке образцы обрабатывали 500 мМ NaHCO₃ в течение 5 или 12,5 ч, затем исследовали с помощью КИЭФ и ЖХ/МС. Результаты анализа показаны в табл. 11, а графики ЖХ/МС изображены на фиг. 53. Все три антитела показывают рассчитанное увеличение количества дезамидированных типов со стрессовыми условиями и соответствующие точки основного пика. Как рассчитано по аминокислотной последовательности, ИЭТ антитела РР4637 немного ниже, чем для РР4631 и РР4638 (табл. 7), а наблюдаемые более высокие ИЭТ по сравнению с рассчитанными ИЭТ предположительно указывает на гликозилирование.The charge profile of isoforms and isoelectric points of various antibodies were determined using capillary isoelectric focusing (CIEF). Briefly, samples were buffered in 20 mM Tris pH 8.0, and then 100 μg of sample protein was mixed with amphoteric electrolyte, methylcellulose, along with the markers IEP 7.05 and IEP 9.77. The iCE3 ™ was used for analysis with a capillary ID of 100 µm; 1.5 kV plus 3 kV; OP ₂₈₀ for detection. For deamidation during stress treatment, the samples were treated with 500 mM NaHCO ₃ for 5 or 12.5 h, then analyzed using CIEF and LC / MS. The analysis results are shown in table. 11 and the LC / MS plots are depicted in FIG. 53. All three antibodies show the calculated increase in the number of deamidated types with stress conditions and the corresponding main peak points. As calculated from the amino acid sequence, the IEP of the PP4637 antibody is slightly lower than for PP4631 and PP4638 (Table 7), and the observed higher IEP compared to the calculated IEP presumably indicates glycosylation.

Таблица 11Table 11

Изоэлектрическое фокусирование и деамидированиеIsoelectric focusing and deamidation

Антитело Antibody Пик ИЭТ Peak IET Время обработки ДМ Time of processing DM ДМ% DM% Главный пик % Main peak% Основные % Basic% РР4631 RR4631 8,28 8.28 Необработанный Untreated 17,3 17.3 71,9 71.9 з,о s, o 5 ч 5 h 27,1 27.1 65,4 65.4 3,0 3.0 12,5 ч 12.5 h 40,3 40.3 53,2 53.2 2,5 2.5 РР4637 RR4637 8,И 8, and Необработанный Untreated 18,1 18.1 79,0 79.0 2,9 2.9 5 ч 5 h 31,5 31.5 65,7 65.7 2,8 2.8 12,5 ч 12.5 h 44,0 44.0 53,8 53.8 2,2 2.2 РР4638 RR4638 8,36 8.36 Необработанный Untreated 22,5 22.5 69,6 69.6 2,3 2,3 5 ч 5 h 34,4 34.4 57,6 57.6 2,7 2.7 12,5 ч 12.5 h 45,9 45.9 46,5 46.5 2,3 2,3

Термический анализ дифференциальной сканирующей калориметрии.Thermal analysis of differential scanning calorimetry.

Чтобы определить термическую стабильность и температуры плавления различных антител, они подвергались термическому анализу дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Вкратце, 2 мг/мл образцов в ФСБ, рН 7,4, выводились на заданный температурный режим от 15 до 105°С со скоростью 1°С/мин. Изменения Ср с температурой контролировался как для проб, так и для буфера (в качестве фона). Кривые Ср в зависимости от температуры получали с вычитанием фона, а пики показывали TM (температуру плавления) аналитов. Как показано в табл. 12, все три антитела демонстрируют такую же высокую температуру плавления. Кривые ДСК для трех антител изображены на фиг. 54To determine the thermal stability and melting points of various antibodies, they were subjected to thermal analysis by differential scanning calorimetry (DSC). Briefly, 2 mg / ml samples in PBS, pH 7.4, were brought to a predetermined temperature range of 15 to 105 ° C at a rate of 1 ° C / min. Cp changes with temperature were monitored for both samples and buffer (as background). Curves Cp versus temperature were obtained with subtraction of the background, and the peaks indicated the TM (melting point) of the analytes. As shown in table. 12, all three antibodies exhibit the same high melting point. DSC curves for the three antibodies are depicted in FIG. 54

Таблица 12Table 12

Эксклюзионная хроматографияSize exclusion chromatography

Антитело Antibody Т_м (°C)T _m (° C) РР4631 RR4631 75,6 75.6 РР4637 RR4637 76,2 76.2 РР4638 RR4638 76,6 76.6

Окисление: Пептидное картирование.Oxidation: Peptide mapping.

Окислительную модификацию гуманизированных антител оценивали путем пептидного картирования с использованием ЖХ-МС с окислительным стрессом или без него. Образцы денатурировали при 65°С в присутствии 6 М GnCl (гуанидин хлорид) и 5 мМ β-МЕ (β-меркаптоэтанол), затем ацетилировали йодацетамидом. Обработанные образцы затем расщепляют трипсином (Promega, степень чистоты для секвенирования) при 55°С и расщепленную смесь разделяли методом обратно-фазной ЖХ на колонке С18 (ACQUITY UPLC BEH130 С18, 2,1x100 мм, 1,7 мкм) и анализировали с помощью масс-спектрометрии (Waters XEVO-G2S QTOF) с использованием инструментов анализа Masslynx и Biophatmlynx.Oxidative modification of humanized antibodies was assessed by peptide mapping using LC-MS with or without oxidative stress. The samples were denatured at 65 ° C in the presence of 6 M GnCl (guanidine chloride) and 5 mM β-ME (β-mercaptoethanol), then acetylated with iodoacetamide. The treated samples were then digested with trypsin (Promega, sequencing grade) at 55 ° C and the digested mixture was separated by reverse phase LC on a C18 column (ACQUITY UPLC BEH130 C18, 2.1x100 mm, 1.7 μm) and analyzed by mass -spectrometry (Waters XEVO-G2S QTOF) using Masslynx and Biophatmlynx analysis tools.

Для анализа окислительного стресса образцы обрабатывали 0,05% или 0,1% Н₂О₂ в течение 1 ч, затем исследовали с помощью ЖХ-МС. Результаты показаны в табл. 13-16.For the analysis of oxidative stress, samples were treated with 0.05% or 0.1% H ₂ O ₂ for 1 hour, then analyzed using LC-MS. The results are shown in table. 13-16.

- 27 038617- 27 038617

Таблица 13Table 13

Окисление гуманизированных антител на сайтах метионина. Верхняя панель: антитело РР4631. Средняя панель: антитело РР4637. Нижняя панель: антитело РР4638Oxidation of humanized antibodies at methionine sites. Top panel: PP4631 antibody. Middle panel: PP4637 antibody. Bottom panel: PP4638 antibody

Модификаторы Modifiers Номер фрагмента Fragment number начало Start конец the end Модификации сайтов Website modifications Последовательность Subsequence Окисление (%) РР4631 Oxidation (%) PP4631 Окисление 0 Oxidation 0 0,05% Н₂О₂ Окисление 10.05% H ₂ O ₂ Oxidation 1 0,1%Н₂О₂ Окисление 1 ч0.1% H ₂ O ₂ Oxidation 1 h Окисление М(1) Oxidation M (1) 1:Т001 1: T001 1 1 18 eighteen 4 4 DIQMTQSPSSLSASVGDR DIQMTQSPSSLSASVGDR 0,4 0,4 0,5 0.5 0,4 0,4 2:Т037 2: T037 425 425 447 447 436 436 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 0,6 0.6 1,6 1.6 2,7 2.7

Модификаторы Modifiers Номер фрагмента Fragment number начало Start конец the end Модификации сайтов Website modifications Последовательность Subsequence Окисление (%) РР4637 Oxidation (%) PP4637 Окисление 0 ч Oxidation 0 h 0,05% Н₂О₂ Окисление 1 ч0.05% H ₂ O ₂ Oxidation 1 h 0,1%Н₂О₂окисление 10.1% H ₂ O ₂ oxidation 1 Окисление М(1) Oxidation M (1) ЕТ001 ET001 1 1 18 eighteen 4 4 DIQMTQSPSSLSASVGDR DIQMTQSPSSLSASVGDR 0,4 0,4 0,5 0.5 0,5 0.5 2:Т036 2: T036 425 425 447 447 436 436 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 0,7 0.7 1,7 1.7 з,о s, o

Модификаторы Modifiers Номер фрагмента Fragment number начало Start конец the end Модификации сайтов Website modifications Последовательность Subsequence Окисление (%) РР4638 Oxidation (%) PP4638 Окисление 0 ч Oxidation 0 h 0,05% Н₂О₂ Окисление 1 ч0.05% H ₂ O ₂ Oxidation 1 h 0,1%Н₂О₂окисление 10.1% H ₂ O ₂ oxidation 1 Окисление М(1) Oxidation M (1) LT001 LT001 1 1 18 eighteen 4 4 DIQMTQSPSSLSASVGDR DIQMTQSPSSLSASVGDR 0,7 0.7 0,7 0.7 0,6 0.6 2:Т036 2: T036 425 425 447 447 436 436 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 0,9 0.9 1,6 1.6 2,8 2.8

Таблица 14Table 14

Окисление гуманизированного антитела РР4631 на сайтах триптофана.Oxidation of humanized antibody PP4631 at tryptophan sites.

Красные цифры указывают на обнаружение фрагментации;Red numbers indicate fragmentation detection;

- указывает, что ни один не обнаружен;- indicates that none were found;

указывает на обнаружение на чрезвычайно низких уровняхindicates detection at extremely low levels

Модификат оры Ora modifier Номер фрагмента Fragment number начало Start конец the end положение position Последовательность Subsequence Окисление (%) РР4631 Oxidation (%) PP4631 Окисление 0 ч Oxidation 0 h 0,05% Н₂О₂ окисление 1 ч0.05% H ₂ O ₂ oxidation 1 h 0,1%Н₂О₂ окисление 1 ч0.1% H ₂ O ₂ oxidation 1 h Окисление М(1) Oxidation M (1) 1:Т003 1: T003 25 25 39 39 35 35 ASENIYSNLAWYQQK ASENIYSNLAWYQQK 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 LT007 LT007 62 62 103 103 92 92 FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHL WGTPYTFGQGTK FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHL WGTPYTFGQGTK - - 0 0 0 0 1:Т013 1: T013 146 146 149 149 148 148 VQWK VQWK 0,2 0.2 0,2 0.2 0,1 0.1 2:Т001 2: T001 1 1 38 38 36 36 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTS YGLSWIR QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTS YGLSWIR 0 0 -- - -- - 2:Т003 2: T003 44 44 64 64 47/52 47/52 GLEWIGYIWYDGNTNFHPSLK GLEWIGYIWYDGNTNFHPSLK 0 0 0,2 0.2 0,2 0.2 2:Т009 2: T009 98 98 129 129 115 115 TEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTSVTVSS ASTK TEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTSVTVSS ASTK 0 0 0,1 0.1 0 0 2:Т012 2: T012 156 156 218 218 166 166 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSL S S VVT VP S S SLGTQT YICNVNHKP S NTK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSL S S VVT VP S S SLGTQT YICNVNHKP S NTK 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 2:Т020 2: T020 283 283 296 296 285 285 FNWYVDGVEVHNAK FNWYVDGVEVHNAK 4,5 4.5 3,9 3.9 3,9 3.9 2:Т023 2: T023 310 310 325 325 321 321 VVSVLTVLHQDWLNGK VVSVLTVLHQDWLNGK 0 0 0 0 0 0 2:Т033 2: T033 379 379 400 400 389 389 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK 2,2 2.2 2,6 2.6 2,7 2.7 2:Т037 2: T037 425 425 447 447 425 425 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1

- 28 038617- 28 038617

Таблица 15Table 15

Окисление гуманизированного антитела РР4637 на сайтах триптофана.Oxidation of humanized antibody PP4637 at tryptophan sites.

Красные цифры указывают на обнаружение фрагментации;Red numbers indicate fragmentation detection;

- указывает, что ни один не обнаружен;- indicates that none were found;

указывает на обнаружение на чрезвычайно низких уровняхindicates detection at extremely low levels

Модификат оры Ora modifier Номер фрагмента Fragment number начало Start конец the end положение position Последовательность Subsequence Окисление (%) РР4637 Oxidation (%) PP4637 Окисление 0 ч Oxidation 0 h 0,05% Н₂О₂ окисление 1 ч0.05% H ₂ O ₂ oxidation 1 h 0,1%Н₂О₂ окисление 1 ч0.1% H ₂ O ₂ oxidation 1 h Окисление М(1) Oxidation M (1) ЕТООЗ ETOOZ 25 25 39 39 35 35 ASENIYSNLAWYQQK ASENIYSNLAWYQQK 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 1:Т007 1: T007 62 62 103 103 92 92 FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHL WGTPYTFGQGTK FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHL WGTPYTFGQGTK - - - - 0 0 LT013 LT013 146 146 149 149 148 148 VQWK VQWK 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 2:Т001 2: T001 1 1 38 38 36 36 Q VQLQESGPGLVKPSETL SLTCTVSGF SLT SYGLSWIR Q VQLQESGPGLVKPSETL SLTCTVSGF SLT SYGLSWIR - - 0,1 0.1 - - 2:Т003 2: T003 44 44 64 64 47/52 47/52 GLEWIGYIWYDGNTNFHSPLK GLEWIGYIWYDGNTNFHSPLK 0 0 0 0 0,1 0.1 2:Т008 2: T008 98 98 129 129 115 115 TEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTLVTVS SASTK TEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTLVTVS SASTK 0,2 0.2 0,2 0.2 0,1 0.1 2:Т011 2: T011 156 156 218 218 166 166 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSL S S V VT VP S S SLGTQT YICNVNHK PSNTK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSL S S V VT VP S S SLGTQT YICNVNHK PSNTK - - 0 0 0 0 2:Т019 2: T019 283 283 296 296 285 285 FNWYVDGVEVHNAK FNWYVDGVEVHNAK 4,0 4.0 4,0 4.0 4,0 4.0 2:Т022 2: T022 310 310 325 325 321 321 VVSVLTVLHQDWLNGK VVSVLTVLHQDWLNGK 0 0 0 0 0 0 2:Т032 2: T032 379 379 400 400 389 389 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK 2,5 2.5 2,5 2.5 2,7 2.7 2:Т036 2: T036 425 425 447 447 425 425 WQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQK WQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQK 0,2 0.2 0 0 0,1 0.1

Таблица 16Table 16

Окисление гуманизированного антитела РР4638 на сайтах триптофана. Красные цифры указывают на обнаружение фрагментации; - указывает, что ни один не обнаружен;Oxidation of humanized antibody PP4638 at tryptophan sites. Red numbers indicate fragmentation detection; - indicates that none were found;

указывает на обнаружение на чрезвычайно низких уровняхindicates detection at extremely low levels

Модификат оры Ora modifier Номер фрагмента Fragment number начало Start конец the end положение position Последовательность Subsequence Окисление (%) PP4638 Oxidation (%) PP4638 Окисление 0 ч Oxidation 0 h 0,05% H₂O₂ окисление 1 ч0.05% H ₂ O ₂ oxidation 1 h 0,1%Н₂О₂ окисление 1 ч0.1% H ₂ O ₂ oxidation 1 h Окисление М(1) Oxidation M (1) ЕТ003 ET003 25 25 42 42 35 35 ASENIYSNLAWYQQKPGK ASENIYSNLAWYQQKPGK - - - - - - ЕТ006 ET006 62 62 103 103 92 92 FSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQHL WGTPYTFGGGTK FSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQHL WGTPYTFGGGTK 0 0 0 0 0 0 ЕТ012 ET012 146 146 149 149 148 148 VQWK VQWK 0,1 0.1 - - - - 2:Т001 2: T001 1 1 38 38 36 36 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT SYGLSWIR QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT SYGLSWIR 0 0 - - - - 2:Т003 2: T003 44 44 64 64 47/52 47/52 GLEWIGYIWYDGNTNFHSPLK GLEWIGYIWYDGNTNFHSPLK 0,1 0.1 0,2 0.2 0,2 0.2 2:Т008 2: T008 98 98 129 129 115 115 TEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTLVTVS SASTK TEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTLVTVS SASTK 0,3 0.3 о,з oh, h 0,4 0,4 2:Т011 2: T011 156 156 218 218 166 166 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSS VVTVPSS SLGTQTYICNVNHKP SNTK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSS VVTVPSS SLGTQTYICNVNHKP SNTK 0 0 0 0 0,2 0.2 2:Т019 2: T019 283 283 296 296 285 285 FNWYVDGVEVHNAK FNWYVDGVEVHNAK 3,7 3.7 4,1 4.1 4,1 4.1 2:Т022 2: T022 310 310 325 325 321 321 VVSVLTVLHQDWLNGK VVSVLTVLHQDWLNGK 0 0 0 0 0 0 2:Т032 2: T032 379 379 400 400 389 389 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK 2,6 2.6 2,9 2.9 2,7 2.7 2:Т036 2: T036 425 425 447 447 425 425 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 0 0 0 0 0 0

Специфичность связывания.Binding specificity.

Специфичность связывания различных антител определяли путем оценки способности обнаруживать неспецифическое связывание с двумя различными клеточными линиями, которые не экспрессируют CTLA-4 (ЯКХ и HEK293) относительно 10D1 при двух разных концентрациях. Вкратце, 100 или 20 мкг/мл образцов (или эталонного мкАТ) в ФСБ инкубировали с 3х10е⁶ клеток/мл (ЯКХ или HEK293). Меченное ФИТЦ кроличье антитело против IgG человека (Boster, Wuhuan, China) использовали для обнаружения, и связывание мишени мкАТ клетками измеряли FACS. Как показано в табл. 17, антитела РР4631 и РР4637 демонстрируют очень низкое связывание и хорошую специфичность, тогда как антитело РР4638 проявляет неспецифическую активность связывания с контрольными клеточными линиями.The binding specificity of the various antibodies was determined by evaluating the ability to detect non-specific binding to two different cell lines that do not express CTLA-4 (NCC and HEK293) relative to 10D1 at two different concentrations. Briefly, 100 or 20 μg / ml samples (or reference mAb) in PBS were incubated with 3x10 ⁶ cells / ml (NCC or HEK293). FITC-labeled rabbit anti-human IgG (Boster, Wuhuan, China) was used for detection, and target binding of mAb cells was measured by FACS. As shown in table. 17, PP4631 and PP4637 antibodies show very low binding and good specificity, while PP4638 antibody shows non-specific binding activity to control cell lines.

- 29 038617- 29 038617

Таблица 17Table 17

Специфичность связывания с клеточными линиями ЯКХ и HEK293Binding Specificity to NCC and HEK293 Cell Lines

Образцы Samples СИФ Cif ЯКХ YAKH НЕК 293 HEK 293 Только клетка Cage only 3,50583 3.50583 4,16546 4.16546 Только 2'^е АТOnly 2 ' ^e AT 4,00062 4,00062 4,68083 4.68083 10D1 (100 мкг/мл) 10D1 (100 μg / ml) 3,82459 3.82459 5,49435 5.49435 10D1 (20 мкг/мл) 10D1 (20 μg / ml) 3,70334 3.70334 4,95407 4.95407 РР4631 (100 мкг/мл) PP4631 (100 μg / ml) 10,8065 10.8065 7,76113 7.76113 РР4631 (20 мкг/мл) PP4631 (20 μg / ml) 5,03402 5.03402 5,5862 5.5862 РР4637 (100 мкг/мл) PP4637 (100 μg / ml) 15,0944 15.0944 10,5987 10.5987 РР4637 (20 мкг/мл) PP4637 (20 μg / ml) 5,89652 5.89652 5,78233 5.78233 РР4638 (100 мкг/мл) PP4638 (100 μg / ml) 83,4742 83.4742 36,8002 36.8002 РР4638 (20 мкг/мл) PP4638 (20 μg / ml) 15,3381 15.3381 9,86523 9.86523

Пример 16. Картирование эпитопов L3D10 и гуманизированных антител.Example 16. Mapping of L3D10 epitopes and humanized antibodies.

Чтобы картировать CTLA-4-связывающий эпитоп исходного антитела L3D10 и гуманизированных вариантов, РР4631 и РР4637, использовался, как преимущество тот факт, что мышиные и человеческие белки CTLA-4 являются перекрестно-реактивными к В7-1, но не к анти-CTLA-4 антителам. Соответственно, был разработан ряд мутантов человеческого белка CTLA-4Fc, в котором кластеры аминокислот из человеческого CTLA-4 белка были заменены мышиным CTLA-4 белком. Поскольку анти-CTLA-4 антитела, используемые в данном исследовании, не связываются с мышиным CTLA-4, связывание античеловеческих CTLA-4 антител осуществляется, когда ключевые остатки связывающего эпитопа антитела заменяются мышиными аминокислотами.To map the CTLA-4 binding epitope of the parent antibody L3D10 and the humanized variants, PP4631 and PP4637, it was taken advantage of the fact that murine and human CTLA-4 proteins are cross-reactive to B7-1 but not anti-CTLA- 4 antibodies. Accordingly, a series of human CTLA-4Fc protein mutants have been developed in which clusters of amino acids from human CTLA-4 protein have been replaced with murine CTLA-4 protein. Since the anti-CTLA-4 antibodies used in this study do not bind to murine CTLA-4, binding of anti-human CTLA-4 antibodies occurs when key residues of the antibody binding epitope are replaced with murine amino acids.

ДНК-векторы, кодирующие 11 мутантных белков CTLA-4Fc (M1-M11) (SEQ ID NO: 40-50), были сконструированы на основе последовательности CTLA-4Fc человека дикого типа, и белки были получены с помощью временной трансфекции в HEK293 в масштабе 0,01 мл с последующей очисткой с помощью одностадийной хроматографии на белке А.DNA vectors encoding 11 CTLA-4Fc mutant proteins (M1-M11) (SEQ ID NO: 40-50) were constructed based on the human wild-type CTLA-4Fc sequence and proteins were obtained by transient transfection in HEK293 at scale 0.01 ml followed by purification using one-step protein A chromatography.

Связывание анти-CTLA-4 антител с белками CTLA-4Fc осуществляли с помощью ИФА. Планшеты с внесенными белками CTLA-4Fc в концентрации 1 мкг/мл, биотинилированными антителами или слитым белок B7-1Fc затем использовались в растворимой фазе в анализе связывания, при этом количество связанного белка измеряли с использованием пероксидазы хрена (HRP) конъюгированной со стрептавидином.The binding of anti-CTLA-4 antibodies to CTLA-4Fc proteins was performed using ELISA. Plates loaded with CTLA-4Fc proteins at a concentration of 1 μg / ml, biotinylated antibodies or B7-1Fc fusion protein were then used in the soluble phase in the binding assay, with the amount of bound protein measured using streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP).

Ahtu-CTLA-4 антитела перекрестно не реагируют с мышиными CTLA-4, что, по-видимому, отражает различия в аминокислотной последовательности между человеческим и мышиным CTLA-4 во внеклеточном домене. На фиг. 55 изображено выравнивание CTLA-4 внеклеточных доменов человека, макаки и мыши, и выделение консервативной последовательности между человеком и макакой показывает многочисленные различия между последовательностями мыши и приматов. Из-за сохранения мотива связывания MYPPPY мышиные и человеческие CTLA-4 белки являются перекрестно-реактивными для B7-1 [72].Ahtu-CTLA-4 antibodies do not cross-react with murine CTLA-4, which appears to reflect differences in amino acid sequence between human and murine CTLA-4 in the extracellular domain. FIG. 55 depicts the alignment of CTLA-4 extracellular domains of human, macaque and mouse, and isolation of the conserved sequence between human and macaque reveals numerous differences between the sequences of the mouse and primates. Due to the retention of the MYPPPY binding motif, murine and human CTLA-4 proteins are cross-reactive for B7-1 [72].

Чтобы отобразить связывающий эпитоп анти-CTLA-4 антител, был создан ряд CTLA-4Fc-мутантных неперекрещивающихся белков, которые включают кластеры мышиных специфических аминокислот в человеческую последовательность CTLA-4. Аминокислоты, включенные в каждый из 11 мутантов, изображены на фиг. 55, а аминокислотные последовательности ДТ и мутантных белков CTLA-4Fc изображены на фиг. 56. Эти белки были получены путем временной трансфекции в клетках HEK293, и выход показан в табл. 18. Многие из мутаций, по-видимому, влияют на экспрессию белка, что видно из их выходов относительно человеческого белка CTLA-4Fc ДТ.To display the binding epitope of anti-CTLA-4 antibodies, a number of CTLA-4Fc mutant non-overlapping proteins have been generated that include clusters of murine specific amino acids into the human CTLA-4 sequence. The amino acids included in each of the 11 mutants are depicted in FIG. 55, and the amino acid sequences of DT and CTLA-4Fc mutant proteins are depicted in FIG. 56. These proteins were obtained by transient transfection in HEK293 cells, and the yield is shown in table. 18. Many of the mutations appear to affect protein expression as seen from their outputs relative to the human CTLA-4Fc DT protein.

- 30 038617- 30 038617

Таблица 18Table 18

Белки ДТ и мутантные CTLA-4Fc, полученные временно в клетках HEK293DT proteins and CTLA-4Fc mutants obtained temporarily in HEK293 cells

Название белка Squirrel name Выход (мг/мл) Yield (mg / ml) CTLA-4Fc ДТ контроль CTLA-4Fc DT control 0,72 0.72 Мутант 1 Mutant 1 1,29 1.29 Мутант 2 Mutant 2 0,03 0.03 Мутант 3 Mutant 3 0,21 0.21 Мутант 4 Mutant 4 о,и oh and Мутант 5 Mutant 5 1,89 1.89 Мутант 6 Mutant 6 0,38 0.38 Мутант 7 Mutant 7 0,25 0.25 Мутант 8 Mutant 8 1,61 1.61 Мутант 9 Mutant 9 0,01 0.01 Мутант 10 Mutant 10 0,04 0.04 Мутант 11 Mutant 11 1,70 1.70

Способность химерного L3D10 и гуманизированных антител РР4631 и РР4637 связывать иммобилизованные мутантные конструкты CTLA-4Fc впоследствии определяли с помощью ИФА, для этого в планшеты вносили мутантные конструкции CTLA-4 и биотинилированные анти-CTLA-4 антитела, или В7-1 Ig контрольный белок, и связывание измеряли с использованием конъюгированного с HRP стрептавидина. Результаты анализа связывания показаны в табл. 19-22. Как и ожидалось, все четыре связывающих белка демонстрировали хорошее дозозависимое связывание с белком ДТ CTLA-4Fc. Однако мутации, которые были введены в белки М9 и M10, по-видимому, изменяют общую структуру, и эти мутанты не смогли связывать B7-1Fc. Мутации, введенные в М2 и М4, также частично изменяли конформацию CTLA-4, как показано уменьшенным связыванием по отношению к белку ДТ. В соответствии с этим понятием все четырех из этих мутантов (М2, М4, М9 и М10) экспрессировались с гораздо меньшим выходом (табл. 18). Напротив, используя связывание с белком ДТ CTLA-4Fc и связывание белков B7-1Fc в качестве контролей, M11 явно выделяется как белок, который хорошо экспрессируется, эффективно связывает B7-1Fc, но не связывает два гуманизированных анти-CTLA-4 антитела. Его связывание с исходным L3D10 также уменьшается примерно в 100 раз (табл. 20). Как и ожидалось, мутации, которые влияют на общую структуру, также влияют на связывание с анти-CTLA-4 антителами.The ability of chimeric L3D10 and humanized antibodies PP4631 and PP4637 to bind immobilized mutant CTLA-4Fc constructs was subsequently determined using ELISA, for this, CTLA-4 mutant constructs and biotinylated anti-CTLA-4 antibodies, or B7-1 Ig control protein, and binding was measured using HRP-conjugated streptavidin. The results of the binding assay are shown in table. 19-22. As expected, all four binding proteins showed good dose-dependent binding to CTLA-4Fc DT protein. However, the mutations that were introduced into the M9 and M10 proteins appear to alter the overall structure, and these mutants were unable to bind B7-1Fc. The mutations introduced into M2 and M4 also partially altered the CTLA-4 conformation, as shown by reduced binding to the DT protein. Consistent with this concept, all four of these mutants (M2, M4, M9 and M10) were expressed with much lower yields (Table 18). In contrast, using CTLA-4Fc DT protein binding and B7-1Fc protein binding as controls, M11 clearly stands out as a protein that is well expressed, efficiently binds B7-1Fc but does not bind two humanized anti-CTLA-4 antibodies. Its binding to the original L3D10 also decreases by about 100 times (Table 20). As expected, mutations that affect overall structure also affect binding to anti-CTLA-4 antibodies.

Таблица 19. Целостность мутантов CTLA-4Ig, описывается их связыванием со слитым белком Ig B71. Связывание с белками CTLA-4Fc проводили с помощью ИФА, количеством связанного биотинилированного белка, измеренного стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Показанные значения представляют собой измерения ОП450. ДТ = CTLA-4Fc дикого типа. M1-M11 представляют собой мутантные белки CTLA-4Fc.Table 19. The integrity of CTLA-4Ig mutants is described by their binding to Ig B71 fusion protein. Binding to CTLA-4Fc proteins was performed using ELISA, the amount of bound biotinylated protein measured by streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP). Values shown are OD450 measurements. DT = CTLA-4Fc wild type. M1-M11 are CTLA-4Fc mutant proteins.

- 31 038617- 31 038617

Конц, белка Conc, squirrel ДТ DT Ml Ml М2 M2 М3 M3 М4 М4 М5 M5 Мб MB М7 M7 М8 М8 М9 M9 М10 M10 МИ MI 0 0 0,193 0.193 0,196 0.196 0,202 0.202 0,184 0.184 0,182 0.182 0,182 0.182 0,184 0.184 0,185 0.185 0,18 0.18 0,172 0.172 0,175 0.175 0,174 0.174 0 0 0,19 0.19 0,182 0.182 0,177 0.177 0,175 0.175 0,171 0.171 0,171 0.171 0,173 0.173 0,17 0.17 0,168 0.168 0,164 0.164 0,162 0.162 0,163 0.163 10 нг/мл 10 ng / ml 0,259 0.259 0,328 0.328 0,204 0.204 0,267 0.267 0,199 0.199 0,286 0.286 0,255 0.255 0,218 0.218 0,293 0.293 0,166 0.166 0,167 0.167 0,22 0.22 10 нг/мл 10 ng / ml 0,257 0.257 0,311 0.311 0,187 0.187 0,249 0.249 0,184 0.184 0,271 0.271 0,244 0.244 0,22 0.22 0,276 0.276 0,154 0.154 0,159 0.159 0,217 0.217 100 нг/мл 100 ng / ml 1,137 1.137 1,594 1.594 0,316 0.316 1,087 1.087 0,359 0.359 1,513 1.513 1,093 1.093 0,785 0.785 1,468 1,468 0,164 0.164 0,164 0.164 0,884 0.884 100 нг/мл 100 ng / ml 1,111 1.111 1,553 1,553 0,299 0.299 1,082 1,082 0,34 0.34 1,221 1,221 1,049 1.049 0,695 0.695 1,375 1,375 0,155 0.155 0,15 0.15 1,045 1.045 1 мкг/мл 1 μg / ml 2,813 2.813 3,147 3.147 1,179 1.179 3,147 3.147 1,375 1,375 2,877 2,877 3,053 3.053 2,703 2.703 3,253 3.253 0,199 0.199 0,171 0.171 3,053 3.053 1 мкг/мл 1 μg / ml 2,651 2.651 3,053 3.053 0,986 0.986 2,864 2.864 1,413 1.413 3,025 3.025 2,983 2.983 2,716 2.716 2,93 2.93 0,218 0.218 0,172 0.172 3,159 3.159

Таблица 20. Картирование эпитопов химерного L3D10-антитела. Связывание с белками CTLA-4Fc проводили с помощью ИФА, с количеством связанного биотинилированного белка, измеренного стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Показанные значения представляют собой измерения ОП450. ДТ = CTLA-4Fc дикого типа. M1-M11 представляют собой мутантные белки CTLA-4Fc.Table 20. Epitope mapping of the chimeric L3D10 antibody. Binding to CTLA-4Fc proteins was performed using ELISA, with the amount of bound biotinylated protein measured by streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP). Values shown are OD450 measurements. DT = CTLA-4Fc wild type. M1-M11 are CTLA-4Fc mutant proteins.

Конц, белка Conc, squirrel ДТ DT Ml Ml М2 M2 М3 M3 М4 М4 М5 M5 Мб MB М7 M7 М8 М8 М9 M9 М10 M10 МИ MI 0 0 0,202 0.202 0,196 0.196 0,2 0.2 0,187 0.187 0,184 0.184 0,189 0.189 0,192 0.192 0,198 0.198 0,187 0.187 0,179 0.179 0,179 0.179 0,183 0.183 0 0 0,195 0.195 0,187 0.187 0,185 0.185 0,18 0.18 0,176 0.176 0,176 0.176 0,176 0.176 0,176 0.176 0,17 0.17 0,166 0.166 0,166 0.166 0,167 0.167 10 нг/мл 10 ng / ml 1,433 1,433 2,47 2.47 0,375 0.375 0,62 0.62 0,507 0.507 1,539 1.539 1,033 1.033 0,714 0.714 1,233 1.233 0,18 0.18 0,18 0.18 0,202 0.202 10 нг/мл 10 ng / ml 1,518 1,518 2,432 2,432 0,317 0.317 0,587 0.587 0,356 0.356 1,366 1,366 0,976 0.976 0,738 0.738 1,237 1,237 0,171 0.171 0,169 0.169 0,203 0.203 100 нг/мл 100 ng / ml 3,053 3.053 3,253 3.253 1,384 1,384 2,318 2,318 2,142 2.142 2,841 2,841 2,699 2.699 2,495 2.495 2,909 2.909 0,295 0.295 0,215 0.215 0,635 0.635 100 нг/мл 100 ng / ml 3,025 3.025 3,239 3.239 1,164 1.164 2,354 2,354 1,409 1.409 2,991 2.991 2,771 2.771 2,483 2,483 2,841 2,841 0,304 0.304 0,216 0.216 0,759 0.759 1 мкг/мл 1 μg / ml 3,373 3.373 3,268 3.268 2,387 2,387 3,184 3.184 2,651 2.651 3,025 3.025 3,092 3.092 3,147 3.147 3,136 3.136 0,916 0.916 0,804 0.804 2,841 2,841 1 мкг/мл 1 μg / ml 3,114 3.114 2,967 2.967 2,619 2.619 3,124 3.124 2,659 2.659 3,034 3.034 3,072 3.072 2,991 2.991 3,034 3.034 0,916 0.916 0,868 0.868 2,983 2.983

Таблица 21. Картирование эпитопов гуманизированного антитела РР4631. Связывание с белками CTLA-4Fc проводили с помощью ИФА, с количеством связанного биотинилированного белка, измеренного стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Показанные значения представляют собой измерения ОП450. ДТ = CTLA-4Fc дикого типа. M1-M11 представляют собой мутантные белки CTLA-4Fc.Table 21. Epitope mapping of the humanized PP4631 antibody. Binding to CTLA-4Fc proteins was performed using ELISA, with the amount of bound biotinylated protein measured by streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP). Values shown are OD450 measurements. DT = CTLA-4Fc wild type. M1-M11 are CTLA-4Fc mutant proteins.

Конц, белка Conc, squirrel ДТ DT Ml Ml М2 M2 М3 M3 М4 М4 М5 M5 Мб MB М7 M7 М8 М8 М9 M9 М10 M10 МИ MI 10 нг/мл 10 ng / ml 0,312 0.312 2,264 2,264 0,207 0.207 0,198 0.198 0,194 0.194 0,407 0.407 0,22 0.22 0,194 0.194 0,247 0.247 0,177 0.177 0,181 0.181 0,172 0.172 10 нг/мл 10 ng / ml 0,29 0.29 2,297 2,297 0,184 0.184 0,178 0.178 0,174 0.174 0,378 0.378 0,202 0.202 0,185 0.185 0,222 0.222 0,154 0.154 0,16 0.16 0,164 0.164 100 нг/мл 100 ng / ml 1,077 1.077 2,827 2.827 0,203 0.203 0,27 0.27 0,219 0.219 1,371 1.371 0,459 0.459 0,281 0.281 0,725 0.725 0,171 0.171 0,17 0.17 0,172 0.172 100 нг/мл 100 ng / ml 0,841 0.841 3,061 3.061 0,194 0.194 0,264 0.264 0,208 0.208 1,589 1.589 0,42 0.42 0,277 0.277 0,801 0.801 0,154 0.154 0,155 0.155 0,159 0.159 1 мкг/мл 1 μg / ml 2,51 2.51 2,881 2,881 0,339 0.339 0,882 0.882 0,473 0.473 2,79 2.79 1,992 1.992 1,169 1.169 2,33 2.33 0,175 0.175 0,17 0.17 0,178 0.178 1 мкг/мл 1 μg / ml 2,471 2.471 2,958 2.958 0,263 0.263 1,121 1.121 0,573 0.573 2,795 2,795 2,016 2,016 1,243 1,243 2,642 2,642 0,167 0.167 0,169 0.169 0,185 0.185

Таблица 22. Картирование эпитопов гуманизированного антитела РР4637. Связывание с белками CTLA-4Fc проводили с помощью ИФА, с количеством связанного биотинилированного белка, измеренного стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Показанные значения представляют собой измерения ОП450. ДТ = CTLA-4Fc дикого типа. M1-M11 представляют собой мутантные белки CTLA-4Fc.Table 22. Epitope mapping of the humanized PP4637 antibody. Binding to CTLA-4Fc proteins was performed using ELISA, with the amount of bound biotinylated protein measured by streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP). Values shown are OD450 measurements. DT = CTLA-4Fc wild type. M1-M11 are CTLA-4Fc mutant proteins.

Конц, белка Conc, squirrel ДТ DT Ml Ml М2 M2 М3 M3 М4 М4 М5 M5 Мб MB М7 M7 М8 М8 М9 M9 М10 M10 МИ MI 10 нг/мл 10 ng / ml 0,597 0.597 2,307 2.307 0,195 0.195 0,544 0.544 0,189 0.189 1,239 1.239 0,603 0.603 0,19 0.19 0,5 0.5 0,373 0.373 0,169 0.169 0,157 0.157 10 нг/мл 10 ng / ml 0,535 0.535 2,244 2,244 0,162 0.162 0,195 0.195 0,435 0.435 1,188 1.188 0,516 0.516 0,535 0.535 0,47 0.47 0,148 0.148 0,15 0.15 0,152 0.152 100 нг/мл 100 ng / ml 1,947 1.947 2,632 2.632 0,182 0.182 0,389 0.389 0,248 0.248 2,601 2.601 1,296 1.296 0,521 0.521 2,001 2.001 0,15 0.15 0,15 0.15 0,152 0.152 100 нг/мл 100 ng / ml 2,229 2,229 2,186 2.186 0,175 0.175 0,364 0.364 0,221 0.221 2,425 2,425 0,875 0.875 0,405 0.405 2 2 0,137 0.137 0,139 0.139 0,148 0.148 1 мкг/мл 1 μg / ml 2,724 2.724 2,05 2.05 0,259 0.259 1,662 1,662 0,725 0.725 2,654 2.654 2,355 2,355 1,418 1,418 2,548 2,548 0,157 0.157 0,151 0.151 0,162 0.162 1 мкг/мл 1 μg / ml 2,742 2,742 2,297 2,297 0,274 0.274 1,549 1,549 0,724 0.724 2,84 2.84 2,374 2,374 1,369 1.369 2,69 2.69 0,147 0.147 0,143 0.143 0,165 0.165

Таблица 23. Исходные данные повторного исследования показывают специфическую потерю антигенного эпитопа только у M11. Как и в табл. 2-5, за исключением того, что дополнительные контроли были включены в указанную специфичность связывания.Table 23. Baseline data from retest show specific loss of antigenic epitope in M11 only. As in the table. 2-5, except that additional controls were included in the indicated binding specificity.

- 32 038617- 32 038617

БиотинL3D10Biotin L3D10

05/03/201603/05/2016

Биотин-ЬВ7-1Biotin-LB7-1

Биотин-HL 12Biotin-HL 12

Bhothh-HL32Bhothh-HL32

Конц. АТ 0 0 10 нг/мл 10 нг/мл 100 нг/мл Conc. AT 0 0 10 ng / ml 10 ng / ml 100 ng / ml hCTLA4-Fc Ml hCTLA4-Fc Ml М2 0.377 0.538 0.469 0.333 1.313 M2 0.377 0.538 0.469 0.333 1.313 М3 0.183 0.167 0.623 0.593 2.244 М3 0.183 0.167 0.623 0.593 2.244 М4 0.22 0.18 0.817 0.563 2.233 М4 0.22 0.18 0.817 0.563 2.233 М5 0.177 0.229 1.853 1.802 3.251 М5 0.177 0.229 1.853 1.802 3.251 Мб 0.183 0.177 1.244 1.331 3.032 Mb 0.183 0.177 1.244 1.331 3.032 М7 0.186 0.142 0.837 0.884 2.672 M7 0.186 0.142 0.837 0.884 2.672 М8 0.368 0.217 1.27 1.454 3.015 М8 0.368 0.217 1.27 1.454 3.015 М9 0.15 0.293 0.158 0.213 0.419 M9 0.15 0.293 0.158 0.213 0.419 М10 0.215 0.114 0.169 0.157 0.26 М10 0.215 0.114 0.169 0.157 0.26 Mil 0.171 0.155 0.19 0.194 0.752 Mil 0.171 0.155 0.19 0.194 0.752 0.18 0.177 1.705 1.799 3.316 0.18 0.177 1.705 1.799 3.316 0.187 0.222 2.692 2.779 3.195 0.187 0.222 2.692 2.779 3.195 100 нг/мл 100 ng / ml 3.458 3.458 3.567 3.567 1.37 1.37 2.535 2.535 2.356 2.356 3.316 3.316 3.032 3.032 2.875 2.875 3.157 3.157 0.346 0.346 0.272 0.272 0.746 0.746 1000 нг/мл 1000 ng / ml 3.567 3.567 3.509 3.509 2.833 2.833 3.333 3.333 3.08 3.08 3.413 3.413 3.282 3.282 3.299 3.299 3.352 3.352 1.124 1.124 0.945 0.945 2.888 2.888 1000 нг/мл 1000 ng / ml 3.672 3.672 3.509 3.509 2.755 2.755 3.299 3.299 3.145 3.145 3.537 3.537 3.316 3.316 3.352 3.352 3.435 3.435 1.181 1.181 0.941 0.941 2.914 2.914 0 0 0.195 0.195 0.2 0.2 0.202 0.202 0.193 0.193 0.192 0.192 0.197 0.197 0.195 0.195 0.198 0.198 0.192 0.192 0.186 0.186 0.185 0.185 0.186 0.186 0 0 0.192 0.192 0.185 0.185 0.181 0.181 0.192 0.192 0.178 0.178 0.178 0.178 0.178 0.178 0.187 0.187 0.173 0.173 0.169 0.169 0.168 0.168 0.161 0.161 10 нг/мл 10 ng / ml 0.316 0.316 0.37 0.37 0.216 0.216 0.304 0.304 0.22 0.22 0.345 0.345 0.279 0.279 0.258 0.258 0.326 0.326 0.177 0.177 0.176 0.176 0.239 0.239 1 10 нг/мл 1 10 ng / ml 0.31 0.31 0.356 0.356 0.21 0.21 0.414 0.414 0.26 0.26 0.331 0.331 0.279 0.279 0.253 0.253 0.297 0.297 0.159 0.159 0.167 0.167 0.236 0.236 100 нг/мл 100 ng / ml 1.581 1.581 1.882 1.882 0.333 0.333 1.245 1.245 0.527 0.527 1.813 1.813 1.235 1.235 0.899 0.899 1.557 1.557 0.176 0.176 0.172 0.172 1.092 1.092 100 нг/мл 100 ng / ml 1.525 1.525 1.928 1.928 0.323 0.323 1.345 1.345 0.489 0.489 1.735 1.735 1.385 1.385 0.987 0.987 1.643 1.643 0.162 0.162 0.155 0.155 1.283 1.283 1000 нг/мл 1000 ng / ml 3.76 3.76 3.6 3.6 1.167 1.167 3.435 3.435 1.973 1.973 3.316 3.316 3.413 3.413 3.101 3.101 3.635 3.635 0.232 0.232 0.185 0.185 3.568 3.568 1000 нг/мл 1000 ng / ml 3.6 3.6 3.673 3.673 1.316 1.316 3.51 3.51 2.009 2.009 3.459 3.459 3.413 3.413 3.183 3.183 3.635 3.635 0.215 0.215 0.181 0.181 3.673 3.673 10 нг/мл 10 ng / ml 0.451 0.451 2.812 2.812 0.207 0.207 0.202 0.202 0.194 0.194 0.626 0.626 0.23 0.23 0.207 0.207 0.327 0.327 0.197 0.197 0.205 0.205 0.181 0.181 10 нг/мл 10 ng / ml 0.417 0.417 2.693 2.693 0.181 0.181 0.179 0.179 0.177 0.177 0.642 0.642 0.22 0.22 0.195 0.195 0.32 0.32 0.158 0.158 0.182 0.182 0.162 0.162 100 нг/мл 100 ng / ml 1.868 1.868 3.568 3.568 0.212 0.212 0.29 0.29 0.256 0.256 2.618 2.618 0.589 0.589 0.345 0.345 1.532 1.532 0.172 0.172 0.174 0.174 0.171 0.171 100 нг/мл 100 ng / ml 1.938 1.938 3.317 3.317 0.203 0.203 0.274 0.274 0.247 0.247 2.126 2.126 0.571 0.571 0.305 0.305 1.419 1.419 0.155 0.155 0.155 0.155 0.162 0.162 1000 нг/мл 1000 ng / ml 2.99 2.99 3.568 3.568 0.268 0.268 1.181 1.181 0.712 0.712 2.922 2.922 2.187 2.187 1.329 1.329 2.817 2.817 0.181 0.181 0.17 0.17 0.177 0.177 1000 нг/мл 1000 ng / ml 3.033 3.033 3.51 3.51 0.268 0.268 1.184 1.184 0.759 0.759 3.071 3.071 2.358 2.358 1.475 1.475 2.869 2.869 0.144 0.144 0.171 0.171 0.187 0.187 10 нг/мл 10 ng / ml 0.983 0.983 2.654 2.654 0.202 0.202 0.218 0.218 0.197 0.197 1.409 1.409 0.429 0.429 0.218 0.218 0.727 0.727 0.176 0.176 0.176 0.176 0.17 0.17 10 нг/мл 10 ng / ml 0.955 0.955 2.604 2.604 0.184 0.184 0.2 0.2 0.168 0.168 1.359 1.359 0.389 0.389 0.21 0.21 0.761 0.761 0.148 0.148 0.154 0.154 0.152 0.152 100 нг/мл 100 ng / ml 2.669 2.669 3.007 3.007 0.232 0.232 0.534 0.534 0.319 0.319 2.908 2.908 1.839 1.839 0.523 0.523 2.669 2.669 0.145 0.145 0.161 0.161 0.16 0.16 100 нг/мл 100 ng / ml 2.741 2.741 3.158 3.158 0.203 0.203 0.554 0.554 0.374 0.374 2.895 2.895 1.741 1.741 0.478 0.478 2.604 2.604 0.145 0.145 0.148 0.148 0.157 0.157 1000 нг/мл 1000 ng / ml 3.183 3.183 3.146 3.146 0.327 0.327 1.837 1.837 1.019 1.019 2.966 2.966 2.817 2.817 1.72 1.72 3.042 3.042 0.173 0.173 0.163 0.163 0.174 0.174 1000 нг/мл 1000 ng / ml 3.209 БиотинL3D10 3.209 Biotin L3D10 3.316 Биотин -L3D10 3.316 Biotin -L3D10 0.321 БиотинhB7-l 0.321 BiotinhB7-l 1.867 Биотин -hB7-l 1.867 Biotin -hB7-l 1.015 БиотинHL12 1.015 Biotin HL12 3.196 Биотин -HL12 3.196 Biotin -HL12 2.857 БиотинHL32 2.857 BiotinHL32 1.766 1.766 3.051 3.051 0.143 0.143 0.163 0.163 0.187 0.187

Конц. АТ mCTLA4Conc. AT mCTLA4

-Fc hlg-Fc mCTLA 4-Fc hlg-Fc-Fc hlg-Fc mCTLA 4-Fc hlg-Fc

0 0 0 0 0.19 0.189 0.19 0.189 0.198 0.184 0.198 0.184 0.202 0.18 0.202 0.18 0.191 0.185 0.191 0.185 10 нг/мл 10 ng / ml 0.201 0.201 0.201 0.201 0.338 0.338 0.181 0.181 0.179 0.179 0.188 0.188 0.185 0.185 0.179 0.179 10 нг/мл 10 ng / ml 0.18 0.18 0.182 0.182 0.318 0.318 0.164 0.164 0.165 0.165 0.162 0.162 0.17 0.17 0.181 0.181 100 нг/мл 100 ng / ml 0.303 0.303 0.315 0.315 1.635 1.635 0.176 0.176 0.171 0.171 0.177 0.177 0.185 0.185 0.176 0.176 100 нг/мл 100 ng / ml 0.314 0.314 0.326 0.326 1.668 1.668 0.165 0.165 0.162 0.162 0.163 0.163 0.165 0.165 0.171 0.171 1000 нг/мл 1000 ng / ml 0.942 0.942 1.385 1.385 3.569 3.569 0.18 0.18 0.177 0.177 0.182 0.182 0.184 0.184 0.183 0.183 1000 нг/мл 1000 ng / ml 0.94 0.94 1.475 1.475 3.353 3.353 0.179 0.179 0.172 0.172 0.177 0.177 0.176 0.176 0.187 0.187 mCTLA4 mCTLA4 hlgG hlgG mCTLA4 mCTLA4 hlgG hlgG mCTLA4 mCTLA4 hlgG hlgG mCTLA4 mCTLA4 hlgG hlgG Bhothh-L3D10 Bhothh-L3D10 Биотин-БВ7-1 Biotin-BV7-1 Биотин-HL 12 Biotin-HL 12 Bhothh-HL32 Bhothh-HL32

Поскольку L3D10 сохранял значительное связывание с M11, была проведена проверка, специфично ли связывание. В планшеты вносили человеческие CTLA-4-Fc (hCTLA-4Fc), мышиные CTLA-4-Fc (mCTLA-4-Fc), контрольные IgG1-Fc или всем мутантные hCTLA-4-Fc и измеряли их связывание с B7-1Fc вместе с L3D10, РР4631 и РР4637. Основная часть данных представлена в табл. 23. Как изображено на фиг. 57, биотинилированный В7-1 связывает hCTLA-4, mCTLA-4 и M11 одинаково хорошо. Специфика анализа демонстрируется отсутствием связывания с IgG1-Fc. Интересно, в то время как связывание L3D10 с M11 сильнее, чем у IgG1-Fc и mCTLA-4-Fc, значительное связывание с IgG1-Fc предполагает, что химерное антитело, связывающееся с M11, может быть неспецифическим. В противоположность этому, ни одно из гуманизированных антител не связывается с контролем M11, mCTLA-4 и контрольным IgG1-Fc. Эти данные показывают, что мутации, введенные в М11, избирательно препятствовали связыванию L3D10, РР4631 и PP4637 с CTLA-4.Since L3D10 retained significant binding to M11, it was tested whether the binding is specific. Human CTLA-4-Fc (hCTLA-4Fc), murine CTLA-4-Fc (mCTLA-4-Fc), control IgG1-Fc or all mutant hCTLA-4-Fc were added to the plates and their binding to B7-1Fc was measured together with L3D10, PP4631 and PP4637. The bulk of the data is presented in table. 23. As shown in FIG. 57, biotinylated B7-1 binds hCTLA-4, mCTLA-4 and M11 equally well. The specificity of the assay is demonstrated by the lack of binding to IgG1-Fc. Interestingly, while the binding of L3D10 to M11 is stronger than that of IgG1-Fc and mCTLA-4-Fc, significant binding to IgG1-Fc suggests that the chimeric antibody that binds to M11 may be non-specific. In contrast, none of the humanized antibodies bind to the M11 control, mCTLA-4 and control IgG1-Fc. These data indicate that mutations introduced into M11 selectively prevented L3D10, PP4631 and PP4637 from binding to CTLA-4.

Используя известную сложную структуру 133, мы картировали эпитоп CTLA-4 в трехмерной структуре. Как изображено на фиг. 58, эпитоп, распознаваемый этими мкАТ, расположен в области, покрытой В7-1. Таким образом, связывание L3D10, РР4631 и РР4637 с CTLA-4 будет взаимоисключающим по сравнению с В7-1. Слабое блокирование РР4631 и РР4637 обусловлено более низкой авидностью, чем отли чающимися связывающими доменами.Using the known complex structure 133, we mapped the CTLA-4 epitope in a three-dimensional structure. As shown in FIG. 58, the epitope recognized by these mAbs is located in the region covered by B7-1. Thus, binding of L3D10, PP4631 and PP4637 to CTLA-4 will be mutually exclusive compared to B7-1. The weak blocking of PP4631 and PP4637 is due to lower avidity than the differing binding domains.

Воспользовавшись тем фактом, что мышиные и человеческие CTLA-4 являются перекрестнореактивными для В7-1, но античеловеческие CTLA-4 не перекрестно реагируют с белком CTLA-4 мыши, авторы изобретения смогли картировать связывающий эпитоп полученных антител L3D10 с помощью ИФА. Используя несколько мутантов человеческих белков CTLA-4Fc, в которых кластеры аминокислот из человеческого белка CTLA-4 были заменены аминокислотами из мышиного белка CTLA-4, было четкоTaking advantage of the fact that murine and human CTLA-4 are cross-reactive for B7-1, but anti-human CTLA-4 does not cross-react with the mouse CTLA-4 protein, we were able to map the binding epitope of the resulting L3D10 antibodies by ELISA. Using several mutants of human CTLA-4Fc proteins in which clusters of amino acids from human CTLA-4 protein have been replaced with amino acids from murine CTLA-4 protein, it was clear

- 33 038617 продемонстрировано, что, когда заменяем четыре аминокислоты, которые непосредственно соответствуют известному связывающему домену В7-1 CTLA-4, дозозависимое связывание антител в значительной степени прекращается. Тот факт, что связывающий эпитоп, непосредственно примыкает к В7-1-связывающему домену, хорошо коррелирует с установленной способностью антител L3D10 блокировать взаимодействия B7-CTLA-4 как in vitro, так и in vivo. Поскольку растворимый CTLA-4 образуется путем слияния С-концевых аминокислот внеклеточного домена IgV с внутриклеточным доменом, можно предположить, что антитело, которое связывается с полиморфными остатками С-концевых доменов (всего 18 аминокислот из С-конца), более вероятно, потеряет реакционную способность к растворимому CTLA-4, в котором большой внутриклеточный домен слит с С-концом внеклеточного домена.- 33 038617 demonstrated that when we replace four amino acids that directly correspond to the known binding domain B7-1 of CTLA-4, dose-dependent binding of antibodies is largely terminated. The fact that the binding epitope is directly adjacent to the B7-1 binding domain correlates well with the established ability of L3D10 antibodies to block B7-CTLA-4 interactions both in vitro and in vivo. Since soluble CTLA-4 is formed by fusion of the C-terminal amino acids of the extracellular domain of IgV with the intracellular domain, it can be assumed that an antibody that binds to polymorphic residues of the C-terminal domains (a total of 18 amino acids from the C-terminus) is more likely to lose reactivity to soluble CTLA-4 in which the large intracellular domain is fused to the C-terminus of the extracellular domain.

Чтобы дополнительно исследовать связывающий домен анти-CTLA-4 антител, были разработаны шесть дополнительных мутантных слитых белков CTLA-4-Fc, обозначенных М12-М17 (SEQ ID NO: 51-56) (фиг. 59), которые использовались для сравнения связывания анти-CTLA-4-антител 10D1 (фиг. 60А), РР4631 (фиг. 60В) иРР4637 (фиг. 60С). Как изображено на фиг. 60, мутации в M11, которые находятся в положениях y¹⁰³l¹⁰⁴i¹⁰⁶, нейтрализуют связывание с 10D1, РР4631 и РР4637, демонстрируя, что сайты связывания для 10D1, РР4631 и РР4637 включают в себя остатки y¹⁰³l¹⁰⁴i¹⁰⁶ Важно отметить, что дополнительная мутация в A²⁹>Y восстановила связывание CTLA-4 с мутациями в y¹⁰³l¹⁰⁴i¹⁰⁶ с РР4631 и РР4637. Эти данные показывают, что положение А²⁹ в CTLA-4 важно для связывания антител РР4631 и РР4637, но не 10D1.To further investigate the binding domain of anti-CTLA-4 antibodies, six additional mutant CTLA-4-Fc fusion proteins, designated M12-M17 (SEQ ID NO: 51-56) (FIG. 59), were developed and used to compare the binding of anti -CTLA-4 antibodies 10D1 (Fig. 60A), PP4631 (Fig. 60B) and PP4637 (Fig. 60C). As shown in FIG. 60, mutations in M11, which are located at positions y ¹⁰³ l ¹⁰⁴ i ¹⁰⁶ , neutralize binding to 10D1, PP4631 and PP4637, demonstrating that the binding sites for 10D1, PP4631 and PP4637 include residues y ¹⁰³ l ¹⁰⁴ i ¹⁰⁶ It is important to note that that an additional mutation in A ²⁹ > Y restored binding of CTLA-4 with mutations in y ¹⁰³ l ¹⁰⁴ and ¹⁰⁶ with PP4631 and PP4637. These data indicate that position A ²⁹ in CTLA-4 is important for the binding of antibodies PP4631 and PP4637, but not 10D1.

Пример 17. Ahtu-CTLA-4 мкАТ синергирует с анти-4-1ВВ в индуцировании отторжения опухоли.Example 17 Ahtu-CTLA-4 mAb synergizes with anti-4-1BB to induce tumor rejection.

Исследования на животных моделях показали, что противоопухолевый ответ, вызванный моноклональным анти-CTLA-4 (мкАТ), по меньшей мере частично обусловлен антигенспецифическим Т-клеточным ответом против нормальных само дифференцирующихся антигенов [73, 74]. Тенденция анти-CTLA-4 антител к обострению аутоиммунных заболеваний хорошо подтверждена у мышей [75-78]. Это определение было дополнительно подтверждено и оказалось основным ограничением в более поздних испытаниях на людях, в ходе которых у пациентов развивались тяжелые аутоиммунные проявления, требующие прекращения лечения [79]. С другой стороны, было показано, что раковые терапевтические анти4-1ВВ мкАТ прекращают развитие аутоиммунных заболеваний у мышей, подверженных волчанке [24, 25].Studies in animal models have shown that the antitumor response elicited by monoclonal anti-CTLA-4 (mAb) is at least in part due to an antigen-specific T-cell response against normal self-differentiating antigens [73, 74]. The tendency of anti-CTLA-4 antibodies to exacerbate autoimmune diseases has been well documented in mice [75-78]. This definition was further confirmed and proved to be a major limitation in later human trials in which patients developed severe autoimmune manifestations requiring discontinuation of treatment [79]. On the other hand, cancer therapeutic anti4-1BB mAbs have been shown to stop the development of autoimmune diseases in lupus-prone mice [24, 25].

Тот факт, что анти-4-1ВВ мкАТ могут стимулировать противоопухолевые реакции и уменьшать аутоиммунные проявления, повышает интригующую возможность того, что комбинация этого антитела с анти-CTLA-4 мкАТ может привести к отторжению рака без аутоиммунитета. В этом исследовании антиCTLA-4 и анти-4-1ВВ комбинировали для индукции отторжения крупных установленных опухолей.The fact that anti-4-1BB mAb can stimulate anti-tumor responses and reduce autoimmune manifestations raises the intriguing possibility that the combination of this antibody with anti-CTLA-4 mAb can lead to cancer rejection without autoimmunity. In this study, anti-CTLA-4 and anti-4-1BB were combined to induce rejection of large established tumors.

Комбинированное действие антимышиного CTLA-4 и антимышиного 4-1ВВ антител при индукции CD8 Т-клеточно-опосредованного отторжения опухоли.The combined effect of anti-mouse CTLA-4 and anti-mouse 4-1BB antibodies in the induction of CD8 T-cell-mediated tumor rejection.

Две модели, одна из которой минимальная болезнь и одна из крупных установленных опухолей, использовались для тестирования противоопухолевого эффекта комбинации антимышиный-4-1ВВ и антимышиный-СТЬА-4 мкАТ. Мышей C57BL/6 стимулировали подкожным введением клеток рака толстой кишки МС38 и в разное время после введения опухолевых клеток антитела вводили мышам, стимулированным опухолевыми клетками, и размер и частоту опухоли контролировали путем медицинского осмотра.Two models, one of which is minimal disease and one of the large established tumors, were used to test the antitumor effect of the combination of anti-mouse-4-1BB and anti-mouse-CTIA-4 mAb. C57BL / 6 mice were stimulated subcutaneously with MC38 colon cancer cells, and antibodies were administered to mice stimulated with tumor cells at various times after tumor cell administration, and tumor size and frequency were monitored by physical examination.

В модели минимальной болезни мыши получали хомячий IgG плюс крысиный IgG, анти-4-1ВВ плюс хомячий IgG (только анти-4-1ВВ), анти-CTLA-4 плюс крысиный IgG (только против CTLA-4 группа) или анти-4-1ВВ в сочетании с анти-CTLA-4, начиная с 48 ч после инокуляции опухолевых клеток. Антитела вводили интраперитонально (и/п) на 2, 9 и 16 дни. Лечение либо только 4-1ВВ или анти-CTLA-4 мкАТ приводило к задержке роста опухоли у 1 из 5 мышей в каждой группе, отвергающей опухоли, тогда как 4 из 5 мышей, получавших как анти-CTLA-4, так и анти-4-1ВВ мкАТ были без опухолей в конце эксперимента. На фиг. 61А изображены измерения роста опухоли для каждой мыши. Чтобы сравнить темпы роста между группами, к данным была применена линейная модель со случайными эффектами. Комбинированная терапия значительно уменьшала суточный рост размера опухоли на 4,6 мм²/сут по сравнению только с анти-CTLA-4 (р=0,0094). Кроме того, комбинированная терапия значительно уменьшала рост на 8,4 мм²/сут по сравнению с анти-4-1ВВ (р=0,0006). В дополнение к темпу роста, фактические размеры опухоли сравнивались между группами лечения через шесть недель после первоначальной индукции опухоли. Средний размер опухоли в течение шести недель был значительно меньше для мышей, учитывая комбинированную терапию (27,5 мм²) по сравнению с мышами, получавшими либо анти-CTLA-4 (137,8 мм, р=0,0251), либо анти-4-1ВВ отдельно (287,6, р = 0,0006). Таким образом, при установлении минимальной опухолевой нагрузки, комбинация анти-4-1ВВ и анти-CTLA-4 мкАТ приводит к значительной задержке роста опухоли по сравнению с анти-4-1ВВ или анти-CTLA-4 отдельно.In the minimal disease model, mice received hamster IgG plus rat IgG, anti-4-1BB plus hamster IgG (anti-4-1BB only), anti-CTLA-4 plus rat IgG (anti-CTLA-4 group only), or anti-4- 1BB in combination with anti-CTLA-4 starting 48 h after tumor cell inoculation. Antibodies were injected intraperitoneally (ip) on days 2, 9 and 16. Treatment with either 4-1BB alone or anti-CTLA-4 mAb resulted in delayed tumor growth in 1 out of 5 mice in each tumor-rejecting group, whereas 4 out of 5 mice treated with both anti-CTLA-4 and anti-4 -1BV mAb were tumor-free at the end of the experiment. FIG. 61A depicts tumor growth measurements for each mouse. To compare the growth rates between groups, a linear model with random effects was applied to the data. The combination therapy significantly reduced the daily tumor size growth by 4.6 mm ² / day compared to anti-CTLA-4 alone (p = 0.0094). In addition, the combination therapy significantly reduced growth by 8.4 mm ² / day compared to anti-4-1BB (p = 0.0006). In addition to growth rate, actual tumor sizes were compared between treatment groups six weeks after initial tumor induction. The mean tumor size at six weeks was significantly smaller for mice given the combination therapy (27.5 mm ² ) compared to mice receiving either anti-CTLA-4 (137.8 mm, p = 0.0251) or anti -4-1BB separately (287.6, p = 0.0006). Thus, when the minimum tumor burden is established, the combination of anti-4-1BB and anti-CTLA-4 mAb leads to a significant delay in tumor growth compared to anti-4-1BB or anti-CTLA-4 alone.

Чтобы определить, можно ли противоопухолевый эффект комбинированной терапии мкАТ небольшой опухолевой нагрузки применить как лечение при большей опухолевой нагрузке, мышей с установленными опухолями лечили антителами. Мышей дикого типа C57BL/6 стимулировали подкожной инокуляцией клеток рака толстой кишки МС38. Допускался рост опухолей в течение 14 дней, и в указанный срок, мышей с установленными опухолями (обычно >7 мм в диаметре) отбирали и случайным образом разделяли на четыре группы лечения: хомячий IgG плюс крысиный IgG, анти-4-1ВВ плюс хомячий IgG,To determine whether the antitumor effect of combination therapy with MAb of a low tumor load can be used as a treatment for a higher tumor load, mice with established tumors were treated with antibodies. Wild-type C57BL / 6 mice were stimulated by subcutaneous inoculation of MC38 colon cancer cells. Tumors were allowed to grow for 14 days, and at that time, mice with established tumors (usually> 7 mm in diameter) were selected and randomly divided into four treatment groups: hamster IgG plus rat IgG, anti-4-1BB plus hamster IgG,

- 34 038617 анти- CTLA-4 плюс крысиный IgG и анти-4-1ВВ мкАТ в комбинации с aHTu-CTLA-4 мкАТ. Антитела вводили и/п на 14, 21 и 28 дни после стимуляции опухоли. Как изображено на фиг. 61В, лечение анти-CTLA-4 мкАТ не препятствовало росту опухоли по сравнению с контрольным лечением IgG, хотя отторжение наблюдалось у одной из восьми мышей в группе. Лечение анти-4-1ВВ мкАТ несколько замедляло рост опухоли, но только одна из восьми мышей отторгала опухоль. В противоположность этому, комбинированная терапия с использованием анти-CTLA-4 и анти-4-1ВВ мкАТ привела к уничтожению опухолей у 7 из 8 мышей и предотвращению дальнейшего роста опухоли у оставшейся мыши. Как и ранее, темпы роста между группами сравнивались путем применения к данным линейной модели со случайными эффектами. Комбинированная терапия значительно уменьшала суточный рост размера опухоли на 10,6 мм²/сут по сравнению с анти-CTLA-4 (р<0,0001). Кроме того, комбинированная терапия значительно уменьшала рост на 6,2 мм /сут по сравнению с анти-4-1ВВ (р=0,0002). В дополнение к темпу роста, фактические размеры опухоли сравнивались между группами лечения через восемь недель после первоначальной стимуляции опухоли. Установленный средний размер опухоли на восьмой неделе был значительно меньше у мышей, получавших комбинированную терапию (-1,7 мм², 95% ДИ: -10,8, 7,5 мм²) по сравнению с мышами, получавшими либо анти-CτLA-4 (404,9 мм², 95% ДИ: 285,4, 524,4 мм²; р<0,0001), либо анти-4-1ВВ отдельно (228,4 мм², 95% CI: 200,4, 689,9 мм²; р=0,0004). Таким образом, комбинация мкАТ также, по-видимому, значительно замедляет рост опухоли по сравнению с анти-CTLA-4 или анти-4-1ВВ отдельно, так же и при больших опухолевых нагрузках.- 34 038617 anti-CTLA-4 plus rat IgG and anti-4-1BB mAb in combination with aHTu-CTLA-4 mAb. Antibodies were injected ip at 14, 21 and 28 days after tumor stimulation. As shown in FIG. 61B, anti-CTLA-4 mAb treatment did not inhibit tumor growth compared to IgG control treatment, although rejection was observed in one in eight mice in the group. Treatment with anti-4-1BB mAb somewhat slowed down tumor growth, but only one in eight mice rejected the tumor. In contrast, combination therapy with anti-CTLA-4 and anti-4-1BB mAb resulted in tumor destruction in 7 out of 8 mice and prevention of further tumor growth in the remaining mouse. As before, growth rates between groups were compared by applying a linear model with random effects to the data. The combination therapy significantly reduced the daily tumor size growth by 10.6 mm ² / day compared to anti-CTLA-4 (p <0.0001). In addition, the combination therapy significantly reduced growth by 6.2 mm / day compared to anti-4-1BB (p = 0.0002). In addition to growth rate, actual tumor sizes were compared between treatment groups eight weeks after initial tumor stimulation. The established mean tumor size at week 8 was significantly smaller in mice receiving combination therapy (-1.7 mm ² , 95% CI: -10.8, 7.5 mm ² ) compared with mice receiving either anti-CτLA- 4 (404.9 mm ² , 95% CI: 285.4, 524.4 mm ² ; p <0.0001), or anti-4-1BB alone (228.4 mm ² , 95% CI: 200.4 , 689.9 mm ² ; p = 0.0004). Thus, the combination of mAb also appears to significantly slow down tumor growth compared to anti-CTLA-4 or anti-4-1BB alone, as well as at high tumor loads.

Известно, что МС38 образует метастазы в печени. Чтобы оценить влияние терапевтических антител на метастазы в печени, все мыши, включенные в эксперименты, были проанализированы гистологически на предмет метастазирования печени. Как показано в табл. 24, приблизительно 60% мышей, получавших контрольный Ig, имели микрометастазы в печени. Лечение или анти-CTLA-4 или анти-4-1ВВ приводили к уменьшению скорости метастазирования, хотя снижение не достигало статистической значимости. Примечательно, что только у 1/22 мышей в группе, получавшей оба антитела, были метастазы в печени. Используя модель логистической регрессии, обнаружили, что вероятность метастазирования печени у мышей с учетом только анти-4-1ВВ была примерно в 4,7 раза выше, чем вероятность для мышей, получавших как анти-4-1ВВ, так и анти-CTLA-4 (95% ДИ: 1,6, 13,7; р=0,0050). Аналогичным образом, вероятность метастазирования печени была в 3,6 раза выше у мышей, получавших только анти-CTLA-4, по сравнению с мышами, получавшими оба лечения (95% ДИ: 1,3, 10,2; р=0,0174). Таким образом, комбинированная терапия значительно снижает метастазирование печени с помощью МС38 по сравнению с лечением только одним антителом.MC38 is known to form liver metastases. To evaluate the effect of therapeutic antibodies on liver metastases, all mice included in the experiments were analyzed histologically for liver metastases. As shown in table. 24, approximately 60% of mice treated with control Ig had liver micrometastases. Treatment with either anti-CTLA-4 or anti-4-1BB resulted in a decrease in the rate of metastasis, although the decrease did not reach statistical significance. Notably, only 1/22 of the mice in the group receiving both antibodies had liver metastases. Using a logistic regression model, we found that the likelihood of liver metastasis in mice given anti-4-1BB alone was about 4.7 times higher than the likelihood of mice receiving both anti-4-1BB and anti-CTLA-4 (95% CI: 1.6, 13.7; p = 0.0050). Likewise, the likelihood of liver metastasis was 3.6 times higher in mice treated with anti-CTLA-4 alone compared with mice treated with both treatments (95% CI: 1.3, 10.2; p = 0.0174 ). Thus, combination therapy significantly reduces liver metastasis with MC38 compared to treatment with antibody alone.

Таблица 24Table 24

Комбинированная терапия существенно снижает метастазы в печени*Combination therapy significantly reduces liver metastases *

Группа Group Лечение Treatment N N Количество мышей с метастазами (%) Number of mice with metastases (%) Групповое сравнение р-значение Group comparison p-value G1 G1 Хомячий IgG+ крысиный IgG Hamster IgG + rat IgG 19 19 11 (57,8%) 11 (57.8%) G2 G2 Ahth-CTLA-4 + крысиный IgG Ahth-CTLA-4 + rat IgG 18 eighteen 6 (33,3%) 6 (33.3%) по сравнению cGl: 0,1383 Compared to cGl: 0.1383 G3 G3 Анти-4-1ВВ + хомячий IgG Anti-4-1ВВ + Hamster IgG 21 21 8(38,1%) 8 (38.1%) по сравнению cGl: 0,2136 versus cGl: 0.2136 G4 G4 Ahth-CTLA-4 + анти-4-1 Ahth-CTLA-4 + anti-4-1 22 22 1 (4,5%) 1 (4.5%) по сравнению cGl: 0,0007 по сравнению cG2: 0,0174 по сравнению cG3: 0,0050 compared to cGl: 0.0007 vs. cG2: 0.0174 Compared to cG3: 0.0050

*Данные обобщены из 4 независимых экспериментов. После окрашивания Н&Е (гематоксилином-эозином) исследовали по меньшей мере по два среза печени.* Data summarized from 4 independent experiments. After staining with H&E (hematoxylin-eosin), at least two sections of the liver were examined.

Чтобы определить, какая субпопуляция иммунных клеток способствовала противоопухолевому эфTo determine which subpopulation of immune cells contributed to the antitumor effect

- 35 038617 фекту, вызванному комбинированной терапией мкАТ, основные субпопуляции лимфоцитов были дебетированы моноклональными антителами. Опухолевые клетки МС38 вводили подкожно. Когда опухоли были пальпируемы, мышей-опухоленосителей разделяли на четыре группы. Каждая группа получала серию интраперитонеальных инъекций антител для дебетирования различных субпопуляций иммунных клеток, включая деплетирование CD4 лимфоцитов с анти-CD4 мкАТ (GK 1.5), дебетирование CD8 Т-клеток с анти-CD8 мкАТ (2.4.3) и деплетирование ЕКК-клеток с антu-NK1.1 мкАТ (PK136), без деплетирования нормальным крысиным IgG. Кроме того, все мыши во всех группах получали анти-CTLA-4 плюс анти-4-1ВВ мкАТ один раз в неделю в течение трех недель. Адекватное деплетирование субпопуляций иммунных клеток оценивали с помощью проточной цитометрии периферической крови, взятой у мышей непосредственно перед завершением эксперимента (данные не показаны). Как и ожидалось, мыши без дебетирования иммунных клеток реагировали на лечение анти-CTLA-4 в комбинации с анти-4-1ВВ мкАТ (фиг. 62). Аналогичным образом, деплетирование ЕКК-клеток и CD4- Т-клеток не влияло на противоопухолевую активность комбинированной анти-CTLA-4 и анти-4-1ВВ терапии мкАТ. Однако деплетирование CD8- Т-клеток, тем не менее, останавливает противоопухолевую активность при комбинированной терапии антителами. На 28-й день установленный средний размер опухоли для мышей с дебетированием CD8- T-клеток (92,3 мм², 95% ДИ: 64,5, 120,1 мм²) был значительно выше средних размеров опухоли у мышей без деплетирования иммунных клеток (28,7 мм², 95% ДИ: -17,1, 74,4 мм²), мышей с дебетированными CD4- Т-клетками (16,7 мм², 95% ДИ: 1,0, 32,4 мм²) и мышей с истощенными ЕКК-клетками (9,3 мм², 95% ДИ: -8,3, 26,9 мм²). Эти данные демонстрируют, что противораковое действие анти-CTLA-4 и анти-4-1ВВ-моноклональных антител зависит от CD8 Т-клеток.- 35 038617 defect caused by the combination therapy with mAb, the main subpopulations of lymphocytes were debited with monoclonal antibodies. MC38 tumor cells were injected subcutaneously. When tumors were palpable, tumor-bearing mice were divided into four groups. Each group received a series of intraperitoneal injections of antibodies to debit various subpopulations of immune cells, including depleting CD4 lymphocytes with anti-CD4 mAb (GK 1.5), depleting CD8 T cells with anti-CD8 mAb (2.4.3), and depleting NK cells with anti -NK1.1 mAb (PK136), without depletion with normal rat IgG. In addition, all mice in all groups received anti-CTLA-4 plus anti-4-1BB mAb once a week for three weeks. Adequate depletion of subpopulations of immune cells was assessed using flow cytometry of peripheral blood taken from mice immediately before the end of the experiment (data not shown). As expected, mice without immune cell debiting responded to treatment with anti-CTLA-4 in combination with anti-4-1BB mAb (Fig. 62). Similarly, depletion of NK cells and CD4-T cells did not affect the antitumor activity of combined anti-CTLA-4 and anti-4-1BB mAb therapy. However, the depletion of CD8-T cells nevertheless stops the antitumor activity in combination therapy with antibodies. On day 28, the estimated mean tumor size for mice with CD8-T cell depletion (92.3 mm ² , 95% CI: 64.5, 120.1 mm ² ) was significantly higher than the mean tumor size in mice without immune depletion. cells (28.7 mm ² , 95% CI: -17.1, 74.4 mm ² ), mice with debit CD4-T cells (16.7 mm ² , 95% CI: 1.0, 32.4 mm ² ) and mice with depleted NK cells (9.3 mm ² , 95% CI: -8.3, 26.9 mm ² ). These data demonstrate that the anti-CTLA-4 and anti-4-1BB monoclonal antibodies are dependent on CD8 T cells for their anti-cancer effects.

Анти-4-1ВВ-антитело уменьшало ответ антител на ксеногенные анти-CTLA-4.Anti-4-1BB antibody reduced the antibody response to xenogeneic anti-CTLA-4.

Одним из препятствий для повторной терапии антителами является усиление гуморального иммунного ответа организма-хозяина к терапевтическим антителам. [81] Поскольку 4-1ВВ, как известно, снижает ответ антител на белки, оценивали влияние анти-4-1ВВ антител на гуморальный иммунный ответ организма-хозяина на анти-CTLA-4. Как изображено на фиг. 63, было обнаружено, что у мышей, получавших либо контрольный IgG, либо анти-4-1ВВ, практически, а то и совсем отсутствовал ответ на анти-антитела. В соответствии со способностью анти-CTLA-4 мкАТ обеспечивать CD4 Т-клеточные ответы [82], мыши, получавшие анти-CTLA-4 плюс крысиный IgG, развивали значительный гуморальный иммунный ответ организма-хозяина против введенного антитела 4F10 и крысиного IgG (фиг. 63А-В). Этот ответ был снижен более чем в 30 раз, когда анти-4-1ВВ вводили совместно с анти-CTLA-4 мкАТ. Эти данные свидетельствуют о том, что антит-4-1ВВ могут потенциально увеличить продолжительность других совместно вводимых терапевтических белков за счет снижения гуморального иммунного ответа организма-хозяина на терапевтические средства.One of the obstacles to re-therapy with antibodies is the enhancement of the host's humoral immune response to therapeutic antibodies. [81] Since 4-1BB is known to reduce the antibody response to proteins, the effect of anti-4-1BB antibodies on the host's humoral immune response to anti-CTLA-4 was evaluated. As shown in FIG. 63, it was found that mice receiving either control IgG or anti-4-1BB had little or no response to anti-antibodies. Consistent with the ability of anti-CTLA-4 mAb to mediate CD4 T cell responses [82], mice treated with anti-CTLA-4 plus rat IgG developed a significant humoral host immune response against injected 4F10 antibody and rat IgG (Fig. 63A-B). This response was reduced more than 30-fold when anti-4-1BB was co-administered with anti-CTLA-4 mAb. These data suggest that anti-4-1BB can potentially increase the duration of other co-administered therapeutic proteins by decreasing the host's humoral immune response to therapeutic agents.

У мышей с нокин CTLA-4 человека комбинация антимышиный 4-1ВВ и античеловеческий CTLA-4 антител вызывала отторжение опухоли и долговременный иммунитет к раку.In human CTLA-4 knockin mice, the combination of anti-mouse 4-1BB and anti-human CTLA-4 antibodies induced tumor rejection and long-term immunity to cancer.

Поскольку анти-4-1ВВ уменьшает образование антител против анти-CTLA-4, интересной проблемой является то, происходит ли усиление отторжения опухоли анти-4-1ВВ исключительно из-за его эффекта в подавлении гуморальной реакции. Этот человеческий ген CTLA-4 в нокин-мышах позволил нам проверить, может ли противоопухолевое действие античеловеческий CTLA-4 антител усиливаться анти-4-1ВВ антителом. Как изображено на фиг. 64А, в то время как оба, античеловеческий CTLA-4 (L3D10) и в отдельности анти-4-1ВВ (2А), вызывали замедление роста опухоли, комбинация двух антител привела к наиболее значимому отторжению опухоли. Соответственно, в группах, получавших анти-CTLA-4, 4-1ВВ или два антитела, 1/7, 2/7, 5/7, у мышей никогда не развивались опухоли, тогда как все мыши в группе, не получавшие антител, развивали опухоли. Поскольку анти-CTLA-4 антитело имеет мышиное происхождение, воздействие 4-1ВВ-антитела не может быть связано с его подавлением антител к терапевтическим антиCTLA-4 антителам. Более того, полученные данные также показали, что превосходный эффект комбинированной терапии, скорее всего, применим к иммунотерапии на основе анти-CTLA-4 антител.Since anti-4-1BB reduces the production of antibodies against anti-CTLA-4, an interesting issue is whether anti-4-1BB tumor rejection is enhanced solely for its effect in suppressing the humoral response. This human CTLA-4 gene in knockin mice allowed us to test whether the antitumor effect of anti-human CTLA-4 antibodies could be enhanced by an anti-4-1BB antibody. As shown in FIG. 64A, while both anti-human CTLA-4 (L3D10) and separately anti-4-1BB (2A) caused tumor growth retardation, the combination of the two antibodies resulted in the most significant tumor rejection. Accordingly, in the groups receiving anti-CTLA-4, 4-1BB or two antibodies, 1/7, 2/7, 5/7, the mice never developed tumors, while all mice in the group that did not receive antibodies developed tumors. Since the anti-CTLA-4 antibody is of murine origin, the effect of the 4-1BB antibody cannot be associated with its suppression of antibodies to therapeutic anti-CTLA-4 antibodies. Moreover, the findings also showed that the superior effect of combination therapy is likely to be applicable to anti-CTLA-4 antibody-based immunotherapy.

Чтобы проверить, были ли мыши, обработанные двумя антителами, не восприимчивы к дополнительной стимуляции опухолевыми клетками, их заражали опухолевыми клетками через 110 дней после первой стимуляции опухолевыми клетками. Как изображено на фиг. 64В, все пять мышей, получавших два антитела, отторгали опухолевые клетки в первом цикле и не развивали опухоль, тогда как у контрольных наивных мышей был прогрессирующий рост опухоли. Таким образом, комбинированная терапия также вызывала долговременный иммунитет к раковым клеткам.To test whether mice treated with the two antibodies were immune to additional tumor cell stimulation, they were challenged with tumor cells 110 days after the first tumor cell stimulation. As shown in FIG. 64B, all five mice treated with two antibodies rejected tumor cells in the first cycle and did not develop tumor, whereas naive control mice had progressive tumor growth. Thus, the combination therapy also produced long-term immunity to cancer cells.

Одним из препятствий для иммунотерапии на основе белка является иммунитет хозяина к терапевтическим белкам. В случае антител хозяин может монтировать антитела к ксенотипическим, аллотипическим и идиотипическим эпитопам [81]. Ксенотипический ответ может быть устранен полной гуманизацией, хотя другие ответы анти-антител требуют особых рассмотрений. Препятствие более очевидно для антиCTLA-4 антитела, поскольку оно является само по себе адъювантом. Предыдущая работа Mittler et al. продемонстрировала значительное подавление зависимого Т-клеточного гуморального иммунного ответа [83]. Полученные данные показывают, что совместное введение анти-4-1ВВ антител снижает ответ организма на анти-CTLA-4 антитело, что предполагает еще одно преимущество комбинированной терапии с использованием анти-CTLA-4 и анти-4-1ВВ антитела.One of the barriers to protein-based immunotherapy is host immunity to therapeutic proteins. In the case of antibodies, the host can mount antibodies to xenotypic, allotypic, and idiotypic epitopes [81]. The xenotypic response can be eliminated by complete humanization, although other anti-antibody responses require special consideration. The obstacle is more obvious with the anti-CTLA-4 antibody, as it is an adjuvant in itself. Previous work by Mittler et al. demonstrated significant suppression of the dependent T-cell humoral immune response [83]. The data obtained show that co-administration of anti-4-1BB antibodies decreases the body's response to the anti-CTLA-4 antibody, which suggests another advantage of combination therapy using anti-CTLA-4 and anti-4-1BB antibodies.

- 36 038617- 36 038617

В совокупности данные показывают, что комбинированная терапия aHTu-CTLA-4 и анти-4-1ВВ антителами предлагает три основных преимущества: повышенный эффект в отношении иммунитета к раку, взаимное подавление аутоиммунных побочных эффектов и улучшение ответов анти-антител.Taken together, the data indicate that combination therapy with aHTu-CTLA-4 and anti-4-1BB antibodies offers three main benefits: increased effect on cancer immunity, mutual suppression of autoimmune side effects, and improved anti-antibody responses.

Все публикации и патенты, упомянутые в данном изобретении, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана для включения посредством ссылки в полном объеме. Хотя изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами реализации, следует понимать, что оно может дополнительно модифицироваться, и данный документ предназначен для покрытия любых вариантов, применений или адаптаций согласно изобретению, следующих, в общем, принципам изобретения и таким отклонениям от существа изобретения, которые входят в известную или общепринятую практику в области техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, описанным выше.All publications and patents mentioned in this invention are incorporated into this document by reference to the same extent as if each individual publication or patent application were specifically and separately indicated for inclusion by reference in its entirety. While the invention has been described in connection with its specific embodiments, it should be understood that it may be further modified, and this document is intended to cover any variations, uses, or adaptations according to the invention, following generally the principles of the invention and such deviations from the spirit of the invention. which are well known or common practice in the field of technology to which the invention relates, and which can be applied to the main features described above.

СсылкиLinks

1. Townsend ARM, Tothbard J, Gotch FM, Bahadur G, Wraith D, McMichael AJ. The epitope of influenza nucleoprotein recognized by cytotoxic lymphocytes can be defined with short synthetic peptides. Cell. 1986; 44:959-68.1. Townsend ARM, Tothbard J, Gotch FM, Bahadur G, Wraith D, McMichael AJ. The epitope of influenza nucleoprotein recognized by cytotoxic lymphocytes can be defined with short synthetic peptides. Cell. 1986; 44: 959-68.

2. Zinkernagel RM, Doherty PC. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system. Nature. 1974; 248:701-2.2. Zinkernagel RM, Doherty PC. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system. Nature. 1974; 248: 701-2.

3. Lafferty KJ, Prowse SJ, Simeonovic CJ, Warren HS. Immunobiology of tissue transplantation: a return to the passenger leukocyte concept. Annu Rev Immunol. 1983; 1:143-73.3. Lafferty KJ, Prowse SJ, Simeonovic CJ, Warren HS. Immunobiology of tissue transplantation: a return to the passenger leukocyte concept. Annu Rev Immunol. 1983; 1: 143-73.

4. Liu Y, Linsley PS. Costimulation of T-cell growth. Curr Opin Immunol. 1992; 4(3):26570.4. Liu Y, Linsley PS. Costimulation of T-cell growth. Curr Opin Immunol. 1992; 4 (3): 26570.

5. Schwartz RH. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell. 1992;71(7): 1065-8.5. Schwartz RH. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA4, and B7 / BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell. 1992; 71 (7): 1065-8.

- 37 038617- 37 038617

6. Freeman GJ, Freedman AS, Segil JM, Lee G, Whitman JF, Nadler LM. B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells. J Immunol. 1989; 143(8):2714-22.6. Freeman GJ, Freedman AS, Segil JM, Lee G, Whitman JF, Nadler LM. B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells. J Immunol. 1989; 143 (8): 2714-22.

7. Freeman GJ, Gribben JG, Boussiotis VA, Ng JW, Restivo VA, Jr., Lombard LA, et al. Cloning of B7-2: a CTLA4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation [see comments]. Science. 1993;262(5135):909-11.7. Freeman GJ, Gribben JG, Boussiotis VA, Ng JW, Restivo VA, Jr., Lombard LA, et al. Cloning of B7-2: a CTLA4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation [see comments]. Science. 1993; 262 (5135): 909-11.

8. Hathcock KS, Laszlo G, Dickler HB, Bradshaw J, Linsley P, Hodes RJ. Identification of an alternative CTLA4 ligand costimulatory for T cell activation [see comments]. Science. 1993;262(5135):905-7.8. Hathcock KS, Laszlo G, Dickler HB, Bradshaw J, Linsley P, Hodes RJ. Identification of an alternative CTLA4 ligand costimulatory for T cell activation [see comments]. Science. 1993; 262 (5135): 905-7.

9. Wu Y, Guo Y, Liu Y. A major costimulatory molecule on antigen-presenting cells, CTLA4 ligand A, is distinct from B7. J Exp Med. 1993; 178(5): 1789-93.9. Wu Y, Guo Y, Liu Y. A major costimulatory molecule on antigen-presenting cells, CTLA4 ligand A, is distinct from B7. J Exp Med. 1993; 178 (5): 1789-93.

10. Leach DR, Krummel MF, Allison JP. Enhancement of antitumor immunity by CTLA4 blockade [see comments]. Science. 1996;271(5256): 1734-6.10. Leach DR, Krummel MF, Allison JP. Enhancement of antitumor immunity by CTLA4 blockade [see comments]. Science. 1996; 271 (5256): 1734-6.

11. Linsley PS, Brady W, Urnes M, Grosmaire LS, Damle NK, Ledbetter JA. CTLA4 is a second receptor for the В cell activation antigen B7. J Exp Med. 1991; 174(3):561-9.11. Linsley PS, Brady W, Urnes M, Grosmaire LS, Damle NK, Ledbetter JA. CTLA4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J Exp Med. 1991; 174 (3): 561-9.

12. Linsley PS, Clark EA, Ledbetter JA. T-cell antigen CD28 mediates adhesion with В cells by interacting with activation antigen B7/BB-1. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87(13):5031-5.12. Linsley PS, Clark EA, Ledbetter JA. T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7 / BB-1. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87 (13): 5031-5.

13. Hodi FS, Mihm MC, Soiffer RJ, Haluska FG, Butler M, Seiden MV, et al. Biologic activity of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinated metastatic melanoma and ovarian carcinoma patients. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(8):4712-7. PubMedPMID: 12682289.13. Hodi FS, Mihm MC, Soiffer RJ, Haluska FG, Butler M, Seiden MV, et al. Biologic activity of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinated metastatic melanoma and ovarian carcinoma patients. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100 (8): 4712-7. PubMedPMID: 12682289.

14. Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 2010;363(8):71123. Epub 2010/06/08. doi: 10.1056/NEJMoal003466. PubMed PMID: 20525992; PubMed Central РМСШ: PMC3549297.14. Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 2010; 363 (8): 71123. Epub 2010/06/08. doi: 10.1056 / NEJMoal003466. PubMed PMID: 20525992; PubMed Central RMSS: PMC3549297.

15. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R, Grob JJ, Cowey CL, Lao CD, et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med.15. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R, Grob JJ, Cowey CL, Lao CD, et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med.

2015;373(l):23-34. Epub 2015/06/02. doi: 10.1056/NEJMoal504030. PubMed PMID: 26027431.2015; 373 (l): 23-34. Epub 2015/06/02. doi: 10.1056 / NEJMoal504030. PubMed PMID: 26027431.

- 38 038617- 38 038617

16. Ribas A, Hodi FS, Callahan M, Konto C, Wolchok J. Hepatotoxicity with combination of vemurafenib and ipilimumab. N Engl J Med. 2013;368(14): 1365-6. Epub 2013/04/05. doi: 10.1056/NEJMcl302338. PubMed РМШ: 23550685.16. Ribas A, Hodi FS, Callahan M, Konto C, Wolchok J. Hepatotoxicity with combination of vemurafenib and ipilimumab. N Engl J Med. 2013; 368 (14): 1365-6. Epub 2013/04/05. doi: 10.1056 / NEJMcl302338. PubMed RMS: 23550685.

17. Delyon J, Mateus C, Lambert T. Hemophilia A induced by ipilimumab. N Engl J Med. 2011;365(18): 1747-8. Epub 2011/11/04. doi: 10.1056/NEJMcl 110923. PubMed PMID: 22047582.17. Delyon J, Mateus C, Lambert T. Hemophilia A induced by ipilimumab. N Engl J Med. 2011; 365 (18): 1747-8. Epub 2011/11/04. doi: 10.1056 / NEJMcl 110923. PubMed PMID: 22047582.

18. Fadel F, El Karoui K, Knebelmann B. Anti-CTLA4 antibody-induced lupus nephritis. N Engl J Med. 2009;361(2):211-2. Epub 2009/07/10. doi: 10.1056/NEJMc0904283. PubMed PMID: 19587352.18. Fadel F, El Karoui K, Knebelmann B. Anti-CTLA4 antibody-induced lupus nephritis. N Engl J Med. 2009; 361 (2): 211-2. Epub 2009/07/10. doi: 10.1056 / NEJMc0904283. PubMed PMID: 19587352.

19. Kocak E, Lute K, Chang X, May KF, Jr., Exten KR, Zhang H, et al. Combination therapy with anti-CTL antigen-4 and anti-4-ΙΒΒ antibodies enhances cancer immunity and reduces autoimmunity. Cancer Res. 2006;66(14):7276-84. Epub 2006/07/20. doi: 10,1158/00085472.CAN-05-2128. PubMed PMID: 16849577.19. Kocak E, Lute K, Chang X, May KF, Jr., Exten KR, Zhang H, et al. Combination therapy with anti-CTL antigen-4 and anti-4-ΙΒΒ antibodies enhances cancer immunity and reduces autoimmunity. Cancer Res. 2006; 66 (14): 7276-84. Epub 2006/07/20. doi: 10.1158 / 00085472.CAN-05-2128. PubMed PMID: 16849577.

20. Lute KD, May KF, Lu P, Zhang H, Kocak E, Mosinger B, et al. Human CTLA4-knock-in mice unravel the quantitative link between tumor immunity and autoimmunity induced by antiCTLA4 antibodies. Blood. 2005. PubMed PMID: 16037385.20. Lute KD, May KF, Lu P, Zhang H, Kocak E, Mosinger B, et al. Human CTLA4-knock-in mice unravel the quantitative link between tumor immunity and autoimmunity induced by antiCTLA4 antibodies. Blood. 2005. PubMed PMID: 16037385.

21. May KF, Roy chowdhury S, Bhatt D, Kocak E, Bai XF, Liu JQ, et al. Anti-human21. May KF, Roy chowdhury S, Bhatt D, Kocak E, Bai XF, Liu JQ, et al. Anti-human

CTLA4 monoclonal antibody promotes T cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies. Blood. 2005;105:1114-20. PubMed PMID: 15486062.CTLA4 monoclonal antibody promotes T cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies. Blood. 2005; 105: 1114-20. PubMed PMID: 15486062.

22. Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, et al. High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chern. 2001;276(9):6591-604. Epub 2000/11/30. doi: 10.1074/jbc.M009483200. PubMed PMID: 11096108.22. Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, et al. High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chern. 2001; 276 (9): 6591-604. Epub 2000/11/30. doi: 10.1074 / jbc.M009483200. PubMed PMID: 11096108.

23. Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, et al. Increasing the affinity of a human IgGl for the neonatal Fc receptor: biological consequences. J Immunol. 2002;169(9):5171-80. Epub 2002/10/23. PubMed PMID: 12391234.23. Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, et al. Increasing the affinity of a human IgGl for the neonatal Fc receptor: biological consequences. J Immunol. 2002; 169 (9): 5171-80. Epub 2002/10/23. PubMed PMID: 12391234.

24. Gao SH, Huang K, Tu H, Adler AS. Monoclonal antibody humanness score and its applications. BMC biotechnology. 2013;13:55. Epub 2013/07/06. doi: 10,1186/1472-6750-13-55 PubMed PMID: 23826749; PubMed Central PMCID: PMC3729710.24. Gao SH, Huang K, Tu H, Adler AS. Monoclonal antibody humanness score and its applications. BMC biotechnology. 2013; 13: 55. Epub 2013/07/06. doi: 10.1186 / 1472-6750-13-55 PubMed PMID: 23826749; PubMed Central PMCID: PMC3729710.

- 39 038617- 39 038617

25. Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, et al. Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 2002.8: 1405-1325. Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, et al. Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 2002.8: 1405-13

26. Foell J, Strahotin S, O'Neil SP, et al. CD137 costimulatory T cell receptor engagement reverses acute disease in lupus-prone NZB x NZW Fl mice. J Clin Invest 2003.111: 1505-1826. Foell J, Strahotin S, O'Neil SP, et al. CD137 costimulatory T cell receptor engagement reverses acute disease in lupus-prone NZB x NZW Fl mice. J Clin Invest 2003.111: 1505-18

27. Mel его I, Shuford WW, Newby SA, et al. Monoclonal antibodies against the 4-IBB T- cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 1997.3: 682-527. Mel I, Shuford WW, Newby SA, et al. Monoclonal antibodies against the 4-IBB T- cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 1997.3: 682-5

28. May KF, Jr., Chen L, Zheng P and Liu Y Anti-4-lBB monoclonal antibody enhances rejection of large tumor burden by promoting survival but not clonal expansion of tumor-specific CD8+ T cells. Cancer Res 2002,62: 3459-6528. May KF, Jr., Chen L, Zheng P and Liu Y Anti-4-lBB monoclonal antibody enhances rejection of large tumor burden by promoting survival but not clonal expansion of tumor-specific CD8 + T cells. Cancer Res 2002.62: 3459-65

29. Ye Z, Hellstrom I, Hayden-Ledbetter M, et al. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med 2002.8: 343-829. Ye Z, Hellstrom I, Hayden-Ledbetter M, et al. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med 2002.8: 343-8

30. Walunas, T.L., et al., CTLA4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity, 1994. 1(5): p. 405-13.30. Walunas, T.L., et al., CTLA4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity, 1994.1 (5): p. 405-13.

31. Krummel, M.F. and J.P. Allison, CD28 and CTLA4 have opposing effects on the response of T cells to stimulation. J Exp Med, 1995. 182(2): p. 459-65.31. Krummel, M.F. and J.P. Allison, CD28 and CTLA4 have opposing effects on the response of T cells to stimulation. J Exp Med, 1995.182 (2): p. 459-65.

32. Anderson, D.E., et al., Paradoxical inhibition of T-cell function in response to CTLA4 blockade; heterogeneity within the human T-cell population. Nat Med, 2000. 6(2): p. 211-4.32. Anderson, D.E., et al., Paradoxical inhibition of T-cell function in response to CTLA4 blockade; heterogeneity within the human T-cell population. Nat Med, 2000.6 (2): p. 211-4.

33. Coyle, A. J. et al. (2001) The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function, Nature Immunol. 2(3):203-209.33. Coyle, A. J. et al. (2001) The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function, Nature Immunol. 2 (3): 203-209.

34. Sharpe, A. H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116126.34. Sharpe, A. H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2: 116126.

35. Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223,1-223,7.35. Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6: 223.1-223.7.

36. Flajnik, M. F. et al. (2012) Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2.36. Flajnik, M. F. et al. (2012) Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616- 2.

37. Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298.37. Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17 (4): 288-298.

- 40 038617- 40 038617

38. Flies, D. В. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251-26038. Flies, D. B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30 (3): 251-260

39. Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11:3887-3895.39. Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11: 3887-3895.

40. Agata, Y. et al. (1996) Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes, Int. Immunol. 8(5):765-772.40. Agata, Y. et al. (1996) Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And In Lymphocytes, Int. Immunol. 8 (5): 765-772.

41. Yamazaki, T. et al. (2002) Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC, J. Immunol. 169:5538-5545.41. Yamazaki, T. et al. (2002) Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC, J. Immunol. 169: 5538-5545.

42. Nishimura, H. et al. (2000) Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice, J. Exp. Med. 191:891-898.42. Nishimura, H. et al. (2000) Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice, J. Exp. Med. 191: 891-898.

43. Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298.43. Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17 (4): 288-298.

44. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).44. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).

Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917.Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917.

46. Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498.46. Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498.

47. Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805.47 Studnicka et al. 1994 Protein Engineering 7: 805.

48. Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:96948. Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969

49. Keler, T. et al. Activity and safety of CTLA4 blockade combined with vaccines in cynomolgus macaques. J. Immunol. 171, 6251-6259 (2003).49. Keler, T. et al. Activity and safety of CTLA4 blockade combined with vaccines in cynomolgus macaques. J. Immunol. 171,6251-6259 (2003).

50. Wing, K. et al. CTLA4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 322, 271275, doi: 10.1126/science. 1160062 (2008).50. Wing, K. et al. CTLA4 control over Foxp3 + regulatory T cell function. Science 322, 271275, doi: 10.1126 / science. 1160062 (2008).

51. Schwartz, R. S. The new immunology—the end of immunosuppressive drug therapy? N. Engl. J. Med. 340, 1754-1756, doi:10.1056/NEJM199906033402209 (1999).51. Schwartz, R. S. The new immunology — the end of immunosuppressive drug therapy? N. Engl. J. Med. 340,1754-1756, doi: 10.1056 / NEJM199906033402209 (1999).

52. Simpson, T. R. et al. Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells codefines the efficacy of anti-CTLA4 therapy against melanoma. J. Exp. Med. 210, 1695-1710, doi: 10.1084/jem.20130579 (2013).52. Simpson, T. R. et al. Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells codefines the efficacy of anti-CTLA4 therapy against melanoma. J. Exp. Med. 210, 1695-1710, doi: 10.1084 / jem.20130579 (2013).

- 41 038617- 41 038617

53. Selby, M. J. et al. Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer immunology research 1, 32-42, doi:10.1158/2326-6066.CIR-13-0013 (2013).53. Selby, M. J. et al. Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer immunology research 1, 32-42, doi: 10.1158 / 2326-6066. CIR-13-0013 (2013).

54. Maker, A. V., Attia, P. & Rosenberg, S. A. Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA4 blockade. J. Immunol. 175, 7746-7754 (2005).54. Maker, A. V., Attia, P. & Rosenberg, S. A. Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA4 blockade. J. Immunol. 175, 7746-7754 (2005).

55. Korman, A. J., Peggs, K. S. & Allison, J. P. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Adv. Immunol. 90, 297-339, doi:10.1016/S0065-2776(06)90008-X (2006).55. Korman, A. J., Peggs, K. S. & Allison, J. P. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Adv. Immunol. 90, 297-339, doi: 10.1016 / S0065-2776 (06) 90008-X (2006).

56. Ribas, A. et al. Tremelimumab (CP-675,206), a cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 blocking monoclonal antibody in clinical development for patients with cancer. Oncologist 12, 873-883, doi: 10.1634/theoncologist. 12-7-873 (2007).56. Ribas, A. et al. Tremelimumab (CP-675.206), a cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 blocking monoclonal antibody in clinical development for patients with cancer. Oncologist 12, 873-883, doi: 10.1634 / theoncologist. 12-7-873 (2007).

57. Ribas, A. et al. Phase III randomized clinical trial comparing tremelimumab with standard-of-care chemotherapy in patients with advanced melanoma. J. Clin. Oncol. 31, 616-622, doi:10.1200/JC0.2012.44.6112 (2013).57. Ribas, A. et al. Phase III randomized clinical trial comparing tremelimumab with standard-of-care chemotherapy in patients with advanced melanoma. J. Clin. Oncol. 31, 616-622, doi: 10.1200 / JC0.2012.44.6112 (2013).

58. Lee, К. M. et al. Molecular basis of T cell inactivation by CTLA4 [In Process Citation], Science 282, 2263-2266 (1998).58. Lee, K. M. et al. Molecular basis of T cell inactivation by CTLA4 [In Process Citation], Science 282, 2263-2266 (1998).

59. Marengere, L. E. et al. Regulation of T cell receptor signaling by tyrosine phosphatase SYP association with CTLA4 [published errata appear in Science 1996 Dec 6;274(5293)1597 and 1997 Apr 4;276(5309):21], Science 272, 1170-1173 (1996).59. Marengere, L. E. et al. Regulation of T cell receptor signaling by tyrosine phosphatase SYP association with CTLA4 [published errata appear in Science 1996 Dec 6; 274 (5293) 1597 and 1997 Apr 4; 276 (5309): 21], Science 272, 1170-1173 (1996) ...

60. Liu, Y. Is CTLA4 a negative regulator for T-cell activation? Immunol. Today 18, 569572 (1997).60. Liu, Y. Is CTLA4 a negative regulator for T-cell activation? Immunol. Today 18, 569572 (1997).

61. Tivol, E. A. et al. Loss of CTLA4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA4. Immunity 3, 541-547 (1995).61. Tivol, E. A. et al. Loss of CTLA4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA4. Immunity 3, 541-547 (1995).

62. Waterhouse, P. et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA4 [see comments]. Science 270, 985-988 (1995).62. Waterhouse, P. et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA4 [see comments]. Science 270,985-988 (1995).

63. Bachmann, M. F., Kohler, G., Ecabert, В., Mak, T. W. & Kopf, M. Cutting edge: lymphoproliferative disease in the absence of CTLA4 is not T cell autonomous. J. Immunol. 163, 1128-1131 (1999).63. Bachmann, M. F., Kohler, G., Ecabert, B., Mak, T. W. & Kopf, M. Cutting edge: lymphoproliferative disease in the absence of CTLA4 is not T cell autonomous. J. Immunol. 163,1128-1131 (1999).

- 42 038617- 42 038617

64. Bachmann, M. F. et al. Normal pathogen-specific immune responses mounted by CTLA4-deficient T cells: a paradigm reconsidered. Eur. J. Immunol. 31, 450-458 (2001).64. Bachmann, M. F. et al. Normal pathogen-specific immune responses mounted by CTLA4-deficient T cells: a paradigm reconsidered. Eur. J. Immunol. 31,450-458 (2001).

65. Nguyen, T. V., Ke, Y., Zhang, E. E. & Feng, G. S. Conditional deletion of Shp2 tyrosine phosphatase in thymocytes suppresses both pre-TCR and TCR signals. J. Immunol. 177, 59905996 (2006).65. Nguyen, T. V., Ke, Y., Zhang, E. E. & Feng, G. S. Conditional deletion of Shp2 tyrosine phosphatase in thymocytes suppresses both pre-TCR and TCR signals. J. Immunol. 177,59905996 (2006).

66. Qureshi, O. S. et al. Trans-endocytosis of CD80 and CD86: a molecular basis for the cellextrinsic function of CTLA-4. Science 332, 600-603, doi: 10.1126/science. 1202947 (2011).66. Qureshi, O. S. et al. Trans-endocytosis of CD80 and CD86: a molecular basis for the cellextrinsic function of CTLA-4. Science 332, 600-603, doi: 10.1126 / science. 1202947 (2011).

67. Ueda, H. et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature 423, 506-511 (2003).67. Ueda, H. et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature 423, 506-511 (2003).

68. Magistrelli, G. et al. A soluble form of CTLA-4 generated by alternative splicing is expressed by nonstimulated human T cells. Eur. J. Immunol. 29, 3596-3602, doi:10.1002/(SICI)1521-4141(199911)29:ll&#60;3596::AID-IMMU3596&#62;3.0.CO;2-Y (1999).68. Magistrelli, G. et al. A soluble form of CTLA-4 generated by alternative splicing is expressed by nonstimulated human T cells. Eur. J. Immunol. 29, 3596-3602, doi: 10.1002 / (SICI) 1521-4141 (199911) 29: ll &#60; 3596 :: AID-IMMU3596 &#62;3.0.CO; 2-Y (1999).

69. Kremer, J. M. et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4Ig. N. Engl. J. Med. 349, 1907-1915, doi:10.1056/NEJMoa035075 (2003).69. Kremer, J. M. et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4Ig. N. Engl. J. Med. 349, 1907-1915, doi: 10.1056 / NEJMoa035075 (2003).

70. Abrams, J. R. et al. CTLA4Ig-mediated blockade of T-cell costimulation in patients with psoriasis vulgaris. J. Clin. Invest. 103, 1243-1252, doi:10.1172/JCI5857 (1999).70. Abrams, J. R. et al. CTLA4Ig-mediated blockade of T-cell costimulation in patients with psoriasis vulgaris. J. Clin. Invest. 103, 1243-1252, doi: 10.1172 / JCI5857 (1999).

71. Gerold, K. D. et al. The soluble CTLA-4 splice variant protects from type 1 diabetes and potentiates regulatory T-cell function. Diabetes 60, 1955-1963, doi: 10.2337/dbl 1-0130 (2011).71. Gerold, K. D. et al. The soluble CTLA-4 splice variant protects from type 1 diabetes and potentiates regulatory T-cell function. Diabetes 60, 1955-1963, doi: 10.2337 / dbl 1-0130 (2011).

72. Peach RJ, Bajorath J, Brady W, Leytze G, Greene J, Naemura J, et al. Complementarity determining region 1 (CDR1)- and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J Exp Med. 1994;180(6):2049-58.72. Peach RJ, Bajorath J, Brady W, Leytze G, Greene J, Naemura J, et al. Complementarity determining region 1 (CDR1) - and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J Exp Med. 1994; 180 (6): 2049-58.

73. van Elsas, A., Hurwitz, A. A. & Allison, J. P. Combination immunotherapy of В16 melanoma using anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation. J. Exp. Med. 190, 355-366 (1999).73. van Elsas, A., Hurwitz, AA & Allison, JP Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) -producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation. J. Exp. Med. 190, 355-366 (1999).

- 43 038617- 43 038617

74. van Elsas, A. et al. Elucidating the autoimmune and antitumor effector mechanisms of a treatment based on cytotoxic T lymphocyte antigen-4 blockade in combination with a В16 melanoma vaccine: comparison of prophylaxis and therapy. J. Exp. Med. 194, 481-489. (2001).74. van Elsas, A. et al. Elucidating the autoimmune and antitumor effector mechanisms of a treatment based on cytotoxic T lymphocyte antigen-4 blockade in combination with a B16 melanoma vaccine: comparison of prophylaxis and therapy. J. Exp. Med. 194, 481-489. (2001).

75. Karandikar, N. J., Vanderlugt, C. L., Walunas, T. L., Miller, S. D. & Bluestone, J. A. CTLA-4: a negative regulator of autoimmune disease. J. Exp. Med. 184, 783-788 (1996).75. Karandikar, N. J., Vanderlugt, C. L., Walunas, T. L., Miller, S. D. & Bluestone, J. A. CTLA-4: a negative regulator of autoimmune disease. J. Exp. Med. 184,783-788 (1996).

76. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C. & Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 12204-12209 (2000).76. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C. & Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97,12204-12209 (2000).

77. Hurwitz, A. A., Sullivan, T. J., Sobel, R. A. & Allison, J. P. Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) limits the expansion of encephalitogenic T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)-resistant BALB/c mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3013-3017 (2002).77. Hurwitz, A. A., Sullivan, T. J., Sobel, R. A. & Allison, J. P. Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) limits the expansion of encephalitogenic T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) -resistant BALB / c mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3013-3017 (2002).

78. Piganelli, J. D., Poulin, M., Martin, T., Allison, J. P. & Haskins, K. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CD 152) regulates self-reactive T cells in BALB/c but not in the autoimmune NOD mouse. J. Autoimmun. 14, 123-131 (2000).78. Piganelli, JD, Poulin, M., Martin, T., Allison, JP & Haskins, K. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CD 152) regulates self-reactive T cells in BALB / c but not in the autoimmune NOD mouse ... J. Autoimmun. 14, 123-131 (2000).

79. Phan, G. Q. et al. Cancer regression and autoimmunity induced by cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 blockade in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100, 8372-8377 (2003).79. Phan, G. Q. et al. Cancer regression and autoimmunity induced by cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 blockade in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100,8372-8377 (2003).

80. Eisenthal, A. et al. Antitumor effects of recombinant interleukin-6 expressed in eukaryotic cells. Cancer Immunol. Immunother. 36, 101-107 (1993).80. Eisenthal, A. et al. Antitumor effects of recombinant interleukin-6 expressed in eukaryotic cells. Cancer Immunol. Immunother. 36, 101-107 (1993).

81. Schroff, R. W., Foon, K. A., Beatty, S. M., Oldham, R. K. & Morgan, A. C., Jr. Human anti-murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy. Cancer Res. 45, 879-885 (1985).81. Schroff, R. W., Foon, K. A., Beatty, S. M., Oldham, R. K. & Morgan, A. C., Jr. Human anti-murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy. Cancer Res. 45, 879-885 (1985).

82. Kearney, E. R. et al. Antigen-dependent clonal expansion of a trace population of antigen- specific CD4+ T cells in vivo is dependent on CD28 costimulation and inhibited by CTLA-4. J. Immunol. 155, 1032-1036 (1995).82. Kearney, E. R. et al. Antigen-dependent clonal expansion of a trace population of antigen-specific CD4 + T cells in vivo is dependent on CD28 costimulation and inhibited by CTLA-4. J. Immunol. 155,1032-1036 (1995).

83. Mittler, R. S., Bailey, T. S., Klussman, K., Trailsmith, M. D. & Hoffmann, Μ. K. Anti-41BB monoclonal antibodies abrogate T cell-dependent humoral immune responses in vivo through the induction of helper T cell anergy. J. Exp. Med. 190, 1535-1540 (1999).83. Mittler, R. S., Bailey, T. S., Klussman, K., Trailsmith, M. D. & Hoffmann, A. K. Anti-41BB monoclonal antibodies abrogate T cell-dependent humoral immune responses in vivo through the induction of helper T cell anergy. J. Exp. Med. 190,1535-1540 (1999).

Claims (12)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Ahtu-CTLA-4 антитело, связывающее человеческий CTLA-4, содержащее:1. Ahtu-CTLA-4 antibody that binds human CTLA-4, containing: (а) вариабельную область легкой цепи, содержащую (i) определяющую комплементарность область (CDR) 1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21; (ii) CDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, 37 или 38; и (iii) CDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23; и (b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (i) CDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24; (ii) CDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33, 34 или 35; и (iii) CDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.(a) a light chain variable region comprising (i) a complementarity determining region (CDR) 1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, 37, or 38; and (iii) CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23; and (b) the variable region of the heavy chain containing (i) a CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, 34, or 35; and (iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26. 2. Ahtu-CTLA-4 антитело по п.1, в котором (a) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, 63 или 64; и (b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, 71 или 72.2. Ahtu-CTLA-4 antibody according to claim 1, in which (a) the variable region of the heavy chain contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62, 63 or 64; and (b) the variable region of the light chain contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70, 71 or 72. 3. Ahtu-CTLA-4 антитело по п.1, в котором:3. The Ahtu-CTLA-4 antibody of claim 1, wherein: (a) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, и CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 33;(a) the light chain CDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 and the heavy chain CDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33; - 44 038617 (b) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 37, и CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35; или (с) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38, и CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35.44 038617 (b) the light chain CDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 and the heavy chain CDR2 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35; or (c) the light chain CDR2 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 and the heavy chain CDR2 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35. 4. Ahtu-CTLA-4 антитело по п.3, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 62, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 71.4. The Ahtu-CTLA-4 antibody of claim 3, wherein the heavy chain comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 and the light chain comprises the amino acid sequence indicated in SEQ ID NO: 71. 5. Ahtu-CTLA-4 антитело по п.3, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71.5. The Ahtu-CTLA-4 antibody of claim 3, wherein the heavy chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64 and the light chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 71. 6. Ahtu-CTLA-4 антитело по п.3, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 72.6. The Ahtu-CTLA-4 antibody of claim 3, wherein the heavy chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64 and the light chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 72. 7. Ahtu-CTLA-4 антитело по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что антитело характеризуется сниженным связыванием с растворимым CTLA-4.7. Ahtu-CTLA-4 antibody according to any one of claims 1-6, characterized in that the antibody has reduced binding to soluble CTLA-4. 8. Антигенсвязывающий фрагмент анти-CTLA-4 антитела по любому из пп.1-7, связывающий человеческий CTLA-4.8. An antigen-binding fragment of an anti-CTLA-4 antibody according to any one of claims 1 to 7, which binds human CTLA-4. 9. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая терапевтически эффективное количество анти-CTLA-4 антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 и физиологически приемлемый носитель или наполнитель.9. A pharmaceutical composition for the treatment of cancer, comprising a therapeutically effective amount of an anti-CTLA-4 antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 8 and a physiologically acceptable carrier or excipient. 10. Способ лечения рака, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п.9 субъекту, нуждающемуся в этом.10. A method of treating cancer, comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition according to claim 9 to a subject in need thereof. 11. Способ по п.10, дополнительно включающий введение дополнительного агента, выбранного из группы, состоящей из анти-PD-1 и анти-4-1ВВ антител.11. The method of claim 10, further comprising administering an additional agent selected from the group consisting of anti-PD-1 and anti-4-1BB antibodies. 12. Способ по п.10, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция индуцирует удаление Трег и локальную активацию Т-клеток в микроокружении опухоли, но минимальную системную активацию Т-клеток.12. The method according to claim 10, characterized in that the pharmaceutical composition induces the removal of Treg and local activation of T cells in the tumor microenvironment, but minimal systemic activation of T cells.