EA038215B1 - Method for quantitative determination of yellow fever virus antigen by enzyme immunoassay using specific yolk antibodies and biotin-labelled detector antibodies - Google Patents
Method for quantitative determination of yellow fever virus antigen by enzyme immunoassay using specific yolk antibodies and biotin-labelled detector antibodies Download PDFInfo
- Publication number
- EA038215B1 EA038215B1 EA201800391A EA201800391A EA038215B1 EA 038215 B1 EA038215 B1 EA 038215B1 EA 201800391 A EA201800391 A EA 201800391A EA 201800391 A EA201800391 A EA 201800391A EA 038215 B1 EA038215 B1 EA 038215B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- yellow fever
- fever virus
- antigen
- igy
- virus antigen
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, вакцинологии и вирусологии и предназначено для лабораторной идентификации антигена вируса желтой лихорадки в инфицированных тканях, культурах клеток и в препаратах живой и инактивированной вакцины вируса желтой лихорадки. Изобретение может быть использовано в производстве инактивированной вакцины вируса желтой лихорадки (из штамма 17 D) для контроля содержания антигена данного вируса - основного показателя качества вакцины как профилактического препарата, вызывающего защитный иммунитет (иммуногенность вакцины).SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, immunology, vaccinology and virology and is intended for laboratory identification of yellow fever virus antigen in infected tissues, cell cultures and in preparations of live and inactivated yellow fever virus vaccines. The invention can be used in the production of an inactivated yellow fever virus vaccine (from strain 17 D) to control the antigen content of this virus - the main indicator of the quality of a vaccine as a prophylactic drug that induces protective immunity (vaccine immunogenicity).
Уровень техникиState of the art
Переход на производство и использование более безопасной вакцины против желтой лихорадки, а именно, инактивированной (взамен живой вакцины, которая эффективна, но обладает известными недостатками в плане безопасности), требует применения метода количественного определения антигена инактивированного вируса желтой лихорадки при производстве и составлении формуляции вакцины (Monath T.P. et al. An inactivated cell-culture vaccine against yellow fever//N. Engl. J. Med. - 2011. - Vol. 364. - P. 1326-1333). Методом выбора является иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием моно- или поликлональных специфических антител млекопитающих (Thomas P. Monath, et al. Inactivates yellow fever 17 D vaccine: development and nonclinical safety, immunogenicity and protective activity//Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 3827-3840). Однако известно, что использование антител млекопитающих для систем ИФА сопряжено с рядом негативных моментов, прежде всего с возможностью неспецифических взаимодействий данных антител с другими компонентами ИФА (вторичными антителами, ферментным конъюгатом), что выражается в получении ложноположительных результатов анализа (Schade R. et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine// ATLA. -2005. - Vol. 33. - P. 129-154).The transition to the production and use of a safer yellow fever vaccine, namely an inactivated vaccine (instead of a live vaccine that is effective, but has known safety deficiencies), requires the use of a method for quantifying the antigen of inactivated yellow fever virus in the production and formulation of the vaccine ( Monath TP et al. An inactivated cell-culture vaccine against yellow fever // N. Engl. J. Med. - 2011. - Vol. 364. - P. 1326-1333). The method of choice is enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using mono- or polyclonal specific mammalian antibodies (Thomas P. Monath, et al. Inactivates yellow fever 17 D vaccine: development and nonclinical safety, immunogenicity and protective activity // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 3827-3840). However, it is known that the use of mammalian antibodies for ELISA systems is associated with a number of negative aspects, primarily with the possibility of nonspecific interactions of these antibodies with other ELISA components (secondary antibodies, enzyme conjugate), which results in false positive analysis results (Schade R. et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine // ATLA. -2005. - Vol. 33. - P. 129-154).
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Задача, решаемая изобретением, заключается в конструировании системы иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющей количественно определять антиген вируса желтой лихорадки (штамм 17 D) в инфицированных тканях, культурах клеток и вакцинных препаратах.The problem to be solved by the invention is to design an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system that allows quantitative determination of the yellow fever virus antigen (strain 17 D) in infected tissues, cell cultures and vaccine preparations.
Поставленная задача решается за счет того, что в качестве иммуносорбента при проведении ИФА используются препараты высокоактивных аффинно очищенных специфических антител класса Y (IgY), полученные авторами изобретения из яичных желтков иммунизированных куриц, функционально соответствующих антителам (IgG) млекопитающих, а в качестве вторичных (детекторных) антител - препараты тех же IgY, модифицированные меткой (предпочтительно, биотином) для возможности детекции.The problem is solved due to the fact that preparations of highly active affinity purified specific antibodies of class Y (IgY) obtained by the authors of the invention from egg yolks of immunized chickens, functionally corresponding to antibodies (IgG) of mammals, are used as an immunosorbent during ELISA, and as secondary (detector ) antibodies - preparations of the same IgY modified with a label (preferably biotin) for the possibility of detection.
Решение задачи обеспечивается установленной авторами возможностью получения из яичных желтков куриц, иммунизированных вирусом желтой лихорадки, специфических антител класса IgY. Предлагаемый метод сокращает срок получения антител за счет более короткого цикла иммунизации при одновременном увеличении выхода антител за счет того, что кладка яиц каждым продуцентом происходит ежедневно или через день в течение 3-4 месяцев, а содержание антител в одном желтке соответствует количеству антител в 25-30 мл специфической сыворотки, получаемой в результате кровопускания у иммунизированного животного. Несмотря на принципиальное сходство двух аналогов (IgG млекопитающих и IgY птиц, чьи биохимические характеристики хорошо изучены), IgY обладает рядом преимуществ, особенно ценных для его использования в диагностических целях в качестве иммунных реагентов: 1) высокая иммунореактивность птиц по отношению к чужеродным белкам инфекционного происхождения (вирусных, бактериальных, паразитарных), а также к белкам токсинов и ядов; 2) низкая перекрестная реактивность с белками млекопитающих за счёт большой филогенетической дистанции между птицами и млекопитающими, которая выражается в неспособности IgY активировать систему комплемента млекопитающих, а также в неспособности связываться с ревматоидным фактором, Fcрецепторами, что обеспечивает низкий уровень неспецифических реакций; 3) более низкая себестоимость, поскольку одна курица-несушка может производить около 40 г IgY антител в год. Таким образом, варианты ИФА на основе специфических антител птиц представляют собой перспективный класс диагностических систем, в частности, для определения вирусных антигенов, включая антиген вируса желтой лихорадки.The solution to the problem is provided by the established by the authors the possibility of obtaining specific antibodies of the IgY class from egg yolks of chickens immunized with the yellow fever virus. The proposed method shortens the period for obtaining antibodies due to a shorter immunization cycle with a simultaneous increase in the yield of antibodies due to the fact that egg laying by each producer occurs daily or every other day for 3-4 months, and the content of antibodies in one yolk corresponds to the number of antibodies in 25 30 ml of specific serum obtained as a result of bloodletting from an immunized animal. Despite the fundamental similarity of the two analogs (mammalian IgG and avian IgY, whose biochemical characteristics are well studied), IgY has a number of advantages, especially valuable for its use for diagnostic purposes as immune reagents: 1) high immunoreactivity of birds in relation to foreign proteins of infectious origin (viral, bacterial, parasitic), as well as proteins toxins and poisons; 2) low cross-reactivity with mammalian proteins due to the large phylogenetic distance between birds and mammals, which is expressed in the inability of IgY to activate the complement system of mammals, as well as in the inability to bind to the rheumatoid factor, F-receptors, which provides a low level of nonspecific reactions; 3) lower cost, since one laying hen can produce about 40 g of IgY antibodies per year. Thus, ELISA variants based on specific antibodies of birds represent a promising class of diagnostic systems, in particular, for the determination of viral antigens, including the antigen of the yellow fever virus.
Вирус желтой лихорадки содержит в своем составе 11 белков: 3 структурных - белки С, М, Е, и 8 неструктурных белков - NS1, NS2A, NS2B, NS2K, NS3, NS4A, NS4B, NS5. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве антигена вируса желтой лихорадки могут быть использованы структурные белки С, М, Е. Предлагаемая система ИФА предпочтительно предназначена для определения антигена вируса желтой лихорадки в вакцинных препаратах (преимущественно в инактивированных, поскольку в живой вакцине наличие установленной дозы вируса обычно определяется биологическим путём - титрованием на культуре клеток). Таким образом, способ по настоящему изобретению может быть применен при производстве инактивированной вакцины против вируса желтой лихорадки. Дополнительно, предлагаемая система ИФА может также использоваться для определения антигена вируса желтой лихорадки в любых вируссодержащих субстратах (тканях, культурах клеток и т.д.). При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:The yellow fever virus contains 11 proteins: 3 structural - proteins C, M, E, and 8 non-structural proteins - NS1, NS2A, NS2B, NS2K, NS3, NS4A, NS4B, NS5. In preferred embodiments of the invention, structural proteins C, M, E can be used as the antigen of the yellow fever virus. biologically - titration on cell culture). Thus, the method of the present invention can be applied to the production of an inactivated yellow fever virus vaccine. Additionally, the proposed ELISA system can also be used to determine the antigen of the yellow fever virus in any virus-containing substrates (tissues, cell cultures, etc.). When implementing the invention, the following technical results are achieved:
- 1 038215 усовершенствована методика (ИФА) измерения количества антигена вируса желтой лихорадки, в частности данная методика обеспечивает повышение специфичности определения антигена из-за снижения неспецифических взаимодействий, а также упрощенный дизайн ИФА;- 1 038215 improved technique (ELISA) for measuring the amount of yellow fever virus antigen, in particular, this technique provides an increase in the specificity of antigen determination due to a decrease in nonspecific interactions, as well as a simplified ELISA design;
разработан способ, позволяющий с высокой достоверностью измерять количество антигена вируса желтой лихорадки в процессе изготовления инактивированной вакцины против желтой лихорадки, что абсолютно необходимо и входит в процесс производства вакцины.a method has been developed that makes it possible to measure with high reliability the amount of yellow fever virus antigen during the production of an inactivated yellow fever vaccine, which is absolutely necessary and is part of the vaccine production process.
Использование разработанного способа позволяет составлять формуляцию инактивированной вакцины против желтой лихорадки, точно контролируя количество антигена в дозе вакцины согласно данным по иммуногенности вакцины, что также является абсолютно необходимым при производстве вакцины.The use of the developed method makes it possible to formulate an inactivated vaccine against yellow fever, precisely controlling the amount of antigen in the vaccine dose according to the data on the immunogenicity of the vaccine, which is also absolutely necessary in the production of the vaccine.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
В описании изобретения термины включает и включающий интерпретируются как означающие включает, помимо всего прочего. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как состоит только из.In the specification, the terms include and inclusive are interpreted to mean includes, but not limited to. These terms are not intended to be construed as consisting only of.
Термин антитело эквивалентен термину иммуноглобулин и означает гликопротеин, состоящий из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, соединенных дисульфидными связями.The term antibody is equivalent to the term immunoglobulin and means a glycoprotein consisting of two heavy chains and two light chains linked by disulfide bonds.
Штамм 17 D вируса желтой лихорадки используется для производства живой вакцины против желтой лихорадки в России и за рубежом. Данный штамм также используется для изготовления экспериментальных серий инактивированной вакцины против желтой лихорадки, а в дальнейшем будет использоваться для изготовления коммерческих серий данной вакцины.The 17 D yellow fever virus strain is used for the production of a live vaccine against yellow fever in Russia and abroad. This strain is also used for the production of experimental batches of inactivated vaccines against yellow fever, and in the future will be used for the production of commercial batches of this vaccine.
Иммуноглобулины, как и другие белки, могут быть ковалентно модифицированы многими способами с использованием различных меток, пригодных для конкретного биологического анализа. В качестве меток для обеспечения детекции в ИФА могут быть использованы ферменты, биотин, флуорофоры или радиоактивные изотопы.Immunoglobulins, like other proteins, can be covalently modified in many ways using a variety of labels suitable for a particular biological assay. Enzymes, biotin, fluorophores, or radioactive isotopes can be used as labels to ensure detection in ELISA.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.Unless otherwise specified, technical and scientific terms in this application have the standard meanings generally accepted in the scientific and technical literature.
Нижеследующие примеры осуществления изобретения приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples of the invention are provided for the purpose of revealing the characteristics of the present invention and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention.
Необходимые для осуществления изобретения антитела IgY получают из желтков яиц иммунизированных куриц 5-6-месячного возраста. Куриц иммунизируют коммерческой живой вакциной против желтой лихорадки, приготовленной из штамма 17 D. IgY выделяют из желтка яиц последовательно высаливанием с помощью сульфата натрия (Е.М. Akita, S. Nakai. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain. J. Immunol. Methods. 1993, 160: 207-214) и аффинной хроматографией. Часть IgY используют для сенсибилизации твёрдой фазы (иммунопанель для ИФА), другую часть IgY связывают с биотином (Е. Harlow and D. Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, 341) и используют как детекторные антитела в ИФА при определении антигена вируса желтой лихорадки.The IgY antibodies required for carrying out the invention are obtained from the egg yolks of immunized hens of 5-6 months of age. Chickens are immunized with a commercial live yellow fever vaccine prepared from D. strain 17. IgY is isolated from egg yolk sequentially by salting out with sodium sulfate (E. M. Akita, S. Nakai. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 1993, 160: 207-214) and affinity chromatography. Part of IgY is used for sensitization of the solid phase (immunopanel for ELISA), the other part of IgY is bound to biotin (E. Harlow and D. Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, 341) and is used as detector antibodies in ELISA for determination of antigen of yellow virus fever.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение IgY.Example 1. Obtaining IgY.
1. Иммунизация куриц.1. Immunization of chickens.
Используют несущихся куриц породы Леггорн 5-6-месячного возраста. Иммуноген представляет собой сконцентрированную в 5 раз коммерческую живую вакцину против желтой лихорадки, приготовленной из штамма 17 D (производство ФГБНУ ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва). Цикл иммунизации включает трехкратное введение иммуногена (по 1,0 мл в 4 точки пекторальных мышц) с интервалами в 2 недели. Сбор яиц начинают через 2-4 недели после завершения полного цикла иммунизации. Яйца хранят до 2 месяцев при 4°C; желтки хранят неопределенно долгое время при -20°C.Laying hens of the Leghorn breed of 5-6 months of age are used. Immunogen is a 5 times concentrated commercial live vaccine against yellow fever prepared from the 17 D strain (produced by the Chumakov FNCIRIP RAS, Moscow). The immunization cycle includes three doses of immunogen (1.0 ml each at 4 points of the pectoral muscles) at intervals of 2 weeks. The collection of eggs begins 2-4 weeks after the completion of the full immunization cycle. Eggs are stored for up to 2 months at 4 ° C; The yolks are stored indefinitely at -20 ° C.
2. Выделение IgY из желтков методом высаливания сульфатом натрия (Na2SO4).2. Isolation of IgY from yolks by salting out with sodium sulfate (Na 2 SO 4 ).
2.1. Прибавляют к одному куриному желтку (средний объем 15-20 мл) 9 объемов охлажденной воды для инъекций (ФС 42-2620-97).2.1. Add 9 volumes of chilled water for injection (FS 42-2620-97) to one chicken yolk (average volume 15-20 ml).
2.2. Гомогенизируют смесь осторожным перемешиванием и выдерживают раствор 18 ч при + 4°C.2.2. Homogenize the mixture by gentle stirring and incubate the solution for 18 h at + 4 ° C.
2.3. Отделяют раствор, содержащий IgY, от преципитата фильтрованием через фильтровальную бумагу Whatman с высокой скоростью фильтрации.2.3. Separate the solution containing IgY from the precipitate by filtration through Whatman filter paper at a high filtration rate.
2.4. Разбавляют фильтрат водой для инъекций до объема 175 мл.2.4. Dilute the filtrate with water for injection to a volume of 175 ml.
2.5. Помещают емкость с раствором на роторную мешалку с подогревом до 40°C и медленно добавляют 33,5 г Na2SO4 (хч) при постоянном перемешивании.2.5. Place the container with the solution on a rotary stirrer heated to 40 ° C and slowly add 33.5 g of Na 2 SO 4 (reagent grade) with constant stirring.
2.6. Продолжают перемешивание в течение 15 мин после полного растворения.2.6. Stirring is continued for 15 minutes after complete dissolution.
2.7. Переносят раствор в центрифужный стакан и центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин при +25°C.2.7. Transfer the solution to a centrifuge beaker and centrifuge at 10000 g for 20 min at + 25 ° C.
2.8. Удаляют надосадочную жидкость.2.8. Remove the supernatant.
2.9. Подсушивают хорошо видимый осадок при комнатной температуре.2.9. The well-visible precipitate is dried at room temperature.
2.10. Растворяют осадок в 20 мл стандартного фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2-7,4 при +25°C.2.10. Dissolve the precipitate in 20 ml of standard phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.2-7.4 at + 25 ° C.
- 2 038215- 2 038215
2.11. Медленно добавляют в раствор 2,8 г Na2SO4 (хч).2.11. Slowly add 2.8 g of Na 2 SO 4 (reagent grade) to the solution.
2.12. Выдерживают раствор 15 мин при +25°C после полного исчезновения осадка.2.12. The solution is kept for 15 min at + 25 ° C after the complete disappearance of the precipitate.
2.13. Центрифугируют раствор при 12000 g в течение 10 мин при +25°C.2.13. The solution is centrifuged at 12000 g for 10 min at + 25 ° C.
2.14. Удаляют надосадочную жидкость.2.14. Remove the supernatant.
2.15. Подсушивают осадок при комнатной температуре.2.15. Dry the precipitate at room temperature.
2.16. Растворяют осадок в 5,0 мл ФСБ.2.16. Dissolve the precipitate in 5.0 ml of PBS.
2.17. Переносят осадок в диализный мешок (диаметр 1,0 см).2.17. Transfer the sediment into a dialysis bag (diameter 1.0 cm).
2.18. Проводят диализ против 2 Л ФСБ при + 4°C.2.18. Dialysis is performed against 2 L FSB at + 4 ° C.
2.19. Стерилизуют полученный препарат IgY фильтрацией через фильтр Millipore (0,45 мкм).2.19. The resulting IgY preparation is sterilized by filtration through a Millipore filter (0.45 μm).
2.20. Сохраняют стерильный препарат IgY при +4°C (несколько месяцев) или при -20°C (неопределенно долго).2.20. Store the sterile IgY preparation at + 4 ° C (several months) or at -20 ° C (indefinitely).
Среднее содержание белка в препаратах составляет 5-10 мг/мл (определение по поглощению при 280 нм).The average protein content in the preparations is 5-10 mg / ml (determined by absorbance at 280 nm).
3. Очистка IgY на аффинной колонке HiTrap (GE Healthcare) согласно инструкции производителя.3. Purification of IgY on a HiTrap affinity column (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions.
Объём колонки: 5 мл.Column volume: 5 ml.
Связывающая способность: 100 мг IgY.Binding capacity: 100 mg IgY.
Скорость элюции: 5 мл/мин (максимальная скорость: 20 мл/мин).Elution rate: 5 ml / min (maximum rate: 20 ml / min).
Связывающий буфер: 20 мМ фосфат натрия + 0,5М K2SO4, рН 7,5.Binding buffer: 20 mM sodium phosphate + 0.5M K 2 SO 4 , pH 7.5.
Буфер для элюции: 20 мМ фосфат натрия, рН 7,5.Elution buffer: 20 mM sodium phosphate, pH 7.5.
Очищающий буфер: 20 мМ фосфат натрия, рН 7,5 с 30% изопропанола.Cleansing buffer: 20 mM sodium phosphate, pH 7.5 with 30% isopropanol.
Перед использованием указанные буферы стерилизуют через фильтр 0,45 мкм. К препарату IgY (после высаливания из куриного желтка) добавляют K2SO4 до концентрации 0,5М, рН доводят до 7,5. Перед нанесением на колонку полученный препарат стерилизуют через фильтр 0,45 мкм.These buffers are sterilized through a 0.45 µm filter prior to use. K2SO4 is added to the IgY preparation (after salting out from chicken yolk) to a concentration of 0.5 M, the pH is adjusted to 7.5. Before being applied to the column, the obtained preparation is sterilized through a 0.45 µm filter.
Процедура очистки IgY (проводят при комнатной температуре).IgY purification procedure (carried out at room temperature).
3.1. Промывают колонку минимум 5 объёмами каждого из указанных буферов (последовательно): связывающим, для элюции и очищающим.3.1. Wash the column with a minimum of 5 volumes of each of the specified buffers (sequentially): binding, elution and purification.
3.2. Уравновешивают колонку 5 объёмами связывающего буфера.3.2. Equilibrate the column with 5 volumes of binding buffer.
3.3. Наносят образец.3.3. Sample is applied.
3.4. Промывают колонку минимум 10 объёмами связывающего буфера (или до полного отсутствия белка в элюате).3.4. Wash the column with at least 10 volumes of binding buffer (or until there is no protein in the eluate).
3.5. Элюируют IgY 10 объёмами буфера для элюции.3.5. Elute IgY with 10 volumes of elution buffer.
3.6. Определяют содержание белка в аффинно очищенном препарате IgY (по поглощению при 280 нм), стерилизуют через фильтр 0,45 мкм, хранят при +4-8°C до 1 года. Для неопределённо длительного хранения добавляют глицерин (до 50%) и хранят при -20°C.3.6. Determine the protein content in the affinity purified IgY preparation (by absorption at 280 nm), sterilize through a 0.45 μm filter, store at + 4-8 ° C for up to 1 year. For indefinitely long storage, add glycerin (up to 50%) and store at -20 ° C.
Пример 2. Биотинилирование препаратов IgY к антигену вируса желтой лихорадки.Example 2. Biotinylation of IgY preparations to yellow fever virus antigen.
1) Готовят раствор N-гидроксисукцинимидобиотина (Sigma, H1759-250MG): 10 мг в диметилсульфоксиде (Sigma, D2650-100 мл).1) Prepare a solution of N-hydroxysuccinimidobiotin (Sigma, H1759-250MG): 10 mg in dimethyl sulfoxide (Sigma, D2650-100 ml).
2) Готовят раствор IgY в концентрации 3 мг/мл в 0,1М натрий-боратном буфере, рН 8,8.2) Prepare a solution of IgY at a concentration of 3 mg / ml in 0.1 M sodium borate buffer, pH 8.8.
3) Смешивают растворы, полученные на этапах 1 и 2, из расчета 750 мкг биотина на 3 мг IgY. Тщательно перемешивают и оставляют на 4 ч при комнатной температуре.3) Mix the solutions obtained in stages 1 and 2, at the rate of 750 μg of biotin per 3 mg of IgY. Mix thoroughly and leave for 4 hours at room temperature.
4) Добавляют 60 мкл 1М раствора NH4Cl на 750 мкг биотина, инкубируют 10 мин при комнатной температуре.4) Add 60 μl of 1M NH 4 Cl solution per 750 μg of biotin, incubate for 10 min at room temperature.
5) Диализуют против 0,1М фосфатно-солевого буфера, рН 7,2.5) Dialyzed against 0.1M PBS, pH 7.2.
6) Стерилизуют через фильтр 0,45 мкм, хранят при +4-8°C до 1 года. Для неопределённо длительного хранения добавляют глицерин (до 50%) и хранят при -20°C.6) Sterilized through a 0.45 micron filter, stored at + 4-8 ° C for up to 1 year. For indefinitely long storage, add glycerin (up to 50%) and store at -20 ° C.
Пример 3. ИФА для определения антигена вируса желтой лихорадки в препаратах вакцины вируса желтой лихорадки.Example 3. ELISA for the determination of the antigen of the yellow fever virus in the preparations of the yellow fever virus vaccine.
В предпочтительных вариантах изобретения используется прямой вариант ИФА (двойной сэндвич).In preferred embodiments of the invention, a direct ELISA (double sandwich) variant is used.
1) Иммунопанель с высокой сорбционной ёмкостью (Costar, кат. № 9018) сенсибилизируют аффинно очищенным IgY к антигену вируса желтой лихорадки: в каждую лунку панели вносят по 0,1 мл раствора IgY к антигену вируса желтой лихорадки в концентрации 10 мкг/мл в карбонат-гидрокарбонатном буфере рН 9,6 (Sigma, кат. № С3041-100 САР), панель накрывают крышкой и инкубируют 18 ч при +48°C или 3 ч при +37°C.1) An immunopanel with a high sorption capacity (Costar, cat. No. 9018) is sensitized with affinity purified IgY to the antigen of the yellow fever virus: 0.1 ml of an IgY solution to the antigen of the yellow fever virus is added to each well of the panel at a concentration of 10 μg / ml in carbonate -hydrocarbonate buffer pH 9.6 (Sigma, cat. No. С3041-100 CAP), cover the panel and incubate for 18 h at + 48 ° C or 3 h at + 37 ° C.
2) Содержимое лунок вытряхивают, панель постукивают по нескольким слоям фильтровальной бумаги (в положении вверх дном) для удаления остатков иммуносорбента (IgY). Лунки промывают 2 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2 (Sigma, кат. № Р4417-100ТАВ) с 0,05% Tween-20 (Sigma, кат. № Р1379-100 мл) - ФСБ-Т, внося раствор до края лунок и сразу же удаляют его. Вносят в лунки по 0,2 мл 1% раствора фетальной сыворотки телёнка (Gibco или аналог) в ФСБ (ФСБ-ФС), панель накрывают крышкой и инкубируют 1 ч при температуре +37°C. Это процедура блокирования свободных сайтов лунок панели индифферентным белком.2) The contents of the wells are shaken out, the panel is tapped on several layers of filter paper (in an upside-down position) to remove residual immunosorbent (IgY). The wells are washed 2 times with phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.2 (Sigma, cat. No. P4417-100TAB) with 0.05% Tween-20 (Sigma, cat. No. P1379-100 ml) - PBS-T, adding solution to the edge of the wells and immediately remove it. Add to the wells 0.2 ml of 1% solution of fetal calf serum (Gibco or analog) in FSB (FSB-FS), cover the panel and incubate for 1 h at + 37 ° C. This is a procedure for blocking the free sites of the wells of the panel with an indifferent protein.
3) Блокирующий раствор удаляют, лунки промывают 2 раза ФСБ-Т, как описано выше. Вносят по3) The blocking solution is removed, the wells are washed 2 times with PBS-T, as described above. Contribute by
- 3 038215- 3 038215
0,1 мл исследуемого препарата вируса желтой лихорадки (вакцины) в разведениях, начиная, например, с0.1 ml of the investigational yellow fever virus preparation (vaccine) in dilutions starting, for example, with
1:2, в ФСБ-ФС с 0,05% Tween-20 (ИФА-буфер), по 2 лунки на разведение. Параллельно разведениям исследуемого препарата вносят по 0,1 мл ИФА-буфера - негативный контроль. Панель накрывают крышкой и инкубируют 2 ч при +37°C или 18 ч при +4-8°C. Это фаза связывания определяемого антигена с иммуносорбентом.1: 2, in FSB-FS with 0.05% Tween-20 (ELISA buffer), 2 wells per dilution. In parallel to the dilutions of the test drug, 0.1 ml of ELISA buffer is added - negative control. The panel is covered with a lid and incubated for 2 h at + 37 ° C or 18 h at + 4-8 ° C. This is the phase of binding of the antigen to be determined with the immunosorbent.
4) Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 4 раза ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл детекторных антител - IgY к антигену вируса желтой лихорадки, меченному биотином в разведении, подобранном шахматным титрованием, в ИФА-буфере. Панель накрывают крышкой и инкубируют 1 ч при +37°C. Это фаза детекции определяемого антигена, связанного с иммуносорбентом.4) The contents of the wells are removed, the wells are washed 4 times with PBS-T, as described above. Introduce into the wells 0.1 ml of detector antibodies - IgY to the antigen of the yellow fever virus, labeled with biotin in a dilution, selected by a chessboard titration, in an ELISA buffer. Cover the panel with a lid and incubate for 1 h at + 37 ° C. This is the phase of detection of the detectable antigen associated with the immunosorbent.
5) Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 5 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл стрептавидин-пероксидазного конъюгата (Sigma, S5512-1MG) в ИФА-буфере в рабочем разведении, которое подбирается титрованием в отдельном опыте. Панель накрывают крышкой и инкубируют 45 мин при +37°C. Это фаза выявления комплекса иммуносорбент + определяемый антиген + детекторные меченые антитела.5) The contents of the wells are removed, the wells are washed 5 times with PBS-T, as described above. Add to the wells 0.1 ml of streptavidin-peroxidase conjugate (Sigma, S5512-1MG) in ELISA buffer in a working dilution, which is selected by titration in a separate experiment. The panel is covered with a lid and incubated for 45 min at + 37 ° C. This is the phase of detection of the complex immunosorbent + detectable antigen + detector labeled antibodies.
6) Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 5 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл готового субстрат-индикаторного раствора - тетраметилбензидина (ТМБ, Sigma, кат. № TO440100 мл). Панель инкубируют в темноте 25-30 мин при комнатной температуре.6) The contents of the wells are removed, the wells are washed 5 times with PBS-T, as described above. Add to the wells 0.1 ml of the ready-made substrate-indicator solution - tetramethylbenzidine (TMB, Sigma, cat. No. TO440100 ml). The panel is incubated in the dark for 25-30 minutes at room temperature.
7) Вносят в лунки по 0,05 мл 2М раствора серной кислоты (остановка ферментной реакции).7) Add 0.05 ml of 2M sulfuric acid solution to the wells (stopping the enzymatic reaction).
8) Результат немедленно считывают в ИФА-ридере (любая доступная модель) по абсорбции на длине волны 450 нм. Результат считается положительным при отношении оптической плотности лунок с определяемым антигеном вируса желтой лихорадки (его наивысшее разведение) к оптической плотности контрольных лунок (ИФА-буфер) > 2,1 (P/N). Количество антигена вируса желтой лихорадки в исследуемом образце выражают в виде титра (конечное разведение с P/N > 2,1), либо вычисляют в весовых единицах (например, мкг/мл) по концентрации белка в исходном препарате и величине его титра.8) The result is immediately read in an ELISA reader (any available model) by absorbance at 450 nm. The result is considered positive when the ratio of the optical density of the wells with the detected yellow fever virus antigen (its highest dilution) to the optical density of the control wells (ELISA buffer)> 2.1 (P / N). The amount of yellow fever virus antigen in the test sample is expressed as a titer (final dilution with P / N> 2.1), or calculated in weight units (for example, μg / ml) according to the protein concentration in the original preparation and the value of its titer.
В таблице представлены данные определения антигена вируса желтой лихорадки: титрование в ИФА коммерческой серии живой вакцины желтой лихорадки. В качестве иммуносорбента использован желточный IgY, полученный в результате иммунизации куриц живой вакциной желтой лихорадки (коммерческая серия), в качестве детекторных антител - тот же биотинилированный IgY.The table shows the data for the determination of the antigen of the yellow fever virus: ELISA titration of a commercial batch of live yellow fever vaccine. The yolk IgY obtained as a result of immunization of chickens with a live yellow fever vaccine (commercial series) was used as an immunosorbent, and the same biotinylated IgY was used as detector antibodies.
Из таблицы следует, что согласно критерию положительности результата (P/N > 2,1) титр антигена вируса желтой лихорадки (ЖЛ) равен 1:64.____________It follows from the table that according to the criterion of the positive result (P / N> 2.1), the yellow fever virus (YF) antigen titer is 1:64 .____________
Антиген Разведения антигенаAntigen Antigen dilution
* - Оптическая плотность при 450 нм.* - Optical density at 450 nm.
Суммируя вышеизложенное, особенностью изобретения является использование в качестве иммуносорбента для количественного определения антигена вируса желтой лихорадки в ИФА аффинно очищенных препаратов IgY из яичных желтков иммунизированных куриц, которые обладают высокой специфической активностью по отношению к определяемому антигену и низкой перекрестной реактивностью с белками млекопитающих за счёт большой филогенетической дистанции между птицами и млекопитающим, и детекторных желточных IgY, меченных биотином. Преимущества данной системы детекции антигенов (в частности, антигена вируса желтой лихорадки) заключаются в упрощенном дизайне ИФА (одни и те же антитела используются для первичного связывания антигена и для детекции связавшегося комплекса), экономичности (полный отказ от использования млекопитающих), а также обеспечении более низкого неспецифического фона и, соответственно, более высокой достоверности результатов анализа. Предлагаемая система ИФА на основе желточных антител IgY обладает высокой чувствительностью (примерно 3,2 Ig БОЕ/0,5 мл, где БОЕ - бляшкообразующая единица) и специфичностью, что обеспечивает достоверное определение антигена вируса желтой лихорадки в препаратах коммерческой живой вакцины против желтой лихорадки (данные таблицы, демонстрирующие титрование коммерческой живой вакцины против желтой лихорадки).Summarizing the above, a feature of the invention is the use as an immunosorbent for the quantitative determination of the antigen of the yellow fever virus in ELISA of affinity purified IgY preparations from egg yolks of immunized chickens, which have high specific activity in relation to the detected antigen and low cross-reactivity with mammalian proteins due to high phylogenetic the distance between birds and mammals, and the biotin-labeled yolk IgY detector. The advantages of this system for the detection of antigens (in particular, the antigen of the yellow fever virus) are in a simplified ELISA design (the same antibodies are used for the primary binding of the antigen and for the detection of the bound complex), cost-effectiveness (complete rejection of the use of mammals), as well as providing more low non-specific background and, accordingly, higher reliability of the analysis results. The proposed ELISA system based on yolk antibodies IgY has a high sensitivity (approximately 3.2 Ig PFU / 0.5 ml, where PFU is a plaque-forming unit) and specificity, which provides reliable determination of the yellow fever virus antigen in preparations of a commercial live vaccine against yellow fever ( (See table data showing titration of a commercial live yellow fever vaccine).
Несмотря на то что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are provided for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the spirit of the present invention.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201800391A EA038215B1 (en) | 2018-06-09 | 2018-06-09 | Method for quantitative determination of yellow fever virus antigen by enzyme immunoassay using specific yolk antibodies and biotin-labelled detector antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201800391A EA038215B1 (en) | 2018-06-09 | 2018-06-09 | Method for quantitative determination of yellow fever virus antigen by enzyme immunoassay using specific yolk antibodies and biotin-labelled detector antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201800391A1 EA201800391A1 (en) | 2019-12-30 |
| EA038215B1 true EA038215B1 (en) | 2021-07-26 |
Family
ID=69061843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201800391A EA038215B1 (en) | 2018-06-09 | 2018-06-09 | Method for quantitative determination of yellow fever virus antigen by enzyme immunoassay using specific yolk antibodies and biotin-labelled detector antibodies |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA038215B1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2435865C2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-12-10 | Рочестер Инвестмент Партнерс | Method of microorganism detection in biological sample |
| RU2500422C2 (en) * | 2010-08-06 | 2013-12-10 | Олег Ильич Эпштейн | Combined drug for treating viral infections and method of treating viral infections |
| EA023397B1 (en) * | 2010-05-26 | 2016-05-31 | Селекта Байосайенсиз, Инк. | Synthetic nanocarrier combination vaccines |
| US20170158753A1 (en) * | 2014-06-25 | 2017-06-08 | Integrated Biotherapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins from multiple filovirus species |
| RU2016109642A (en) * | 2013-08-30 | 2017-10-06 | Иммьюноджен Инк. | ANTIBODIES AND ANALYSIS METHODS FOR DETECTING THE FOLIC ACID RECEPTOR 1 |
-
2018
- 2018-06-09 EA EA201800391A patent/EA038215B1/en unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2435865C2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-12-10 | Рочестер Инвестмент Партнерс | Method of microorganism detection in biological sample |
| EA023397B1 (en) * | 2010-05-26 | 2016-05-31 | Селекта Байосайенсиз, Инк. | Synthetic nanocarrier combination vaccines |
| RU2500422C2 (en) * | 2010-08-06 | 2013-12-10 | Олег Ильич Эпштейн | Combined drug for treating viral infections and method of treating viral infections |
| RU2016109642A (en) * | 2013-08-30 | 2017-10-06 | Иммьюноджен Инк. | ANTIBODIES AND ANALYSIS METHODS FOR DETECTING THE FOLIC ACID RECEPTOR 1 |
| US20170158753A1 (en) * | 2014-06-25 | 2017-06-08 | Integrated Biotherapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins from multiple filovirus species |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201800391A1 (en) | 2019-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Roeder et al. | Detection and typing of foot-and-mouth disease virus by enzyme-linked immunosorbent assay: a sensitive, rapid and reliable technique for primary diagnosis | |
| Marquardt et al. | An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring antibodies in chickens infected with infectious bursal disease virus | |
| IE48400B1 (en) | Process for immunologic determination tests | |
| TR201814658T4 (en) | Concentrate of G (IgG) immunoglobulins devoid of anti-A and anti-B antibodies and IgG polyreactive. | |
| Gispen et al. | Immunofluorescence test for IgM rubella antibodies in whole serum after absorption with anti-gammaFc. | |
| de Matancourt et al. | Antibody response to the rubella virus structural proteins in infants with the congenital rubella syndrome | |
| CN106771182A (en) | Brucella abortus IgM subclass antibodies indirect ELISA testing kits | |
| RU2082417C1 (en) | Antiviral agent, vaccine based on thereof, method of its preparing, therapeutic agent and method of detection of rna-viruses | |
| Sarov et al. | Detection of specific IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent cytomegalovirus infection | |
| Anacker et al. | Indirect hemagglutination test for detection of antibody to Rickettsia rickettsii in sera from humans and common laboratory animals | |
| EA038215B1 (en) | Method for quantitative determination of yellow fever virus antigen by enzyme immunoassay using specific yolk antibodies and biotin-labelled detector antibodies | |
| CN102898517B (en) | Anti-West Nile virus non-structural protein 1 antibodies and application thereof | |
| Flaegstad et al. | Neutralization test for BK virus: Plaque reduction detected by immunoperoxidase staining | |
| Mascart-Lemone et al. | Kinetics of anti-Campylobacter jejuni monomeric and polymeric immunoglobulin A1 and A2 responses in serum during acute enteritis | |
| BR112019021004A2 (en) | kit and processes for indirect elisa testing based on crude native hapten and the use of lyophilized controls for confirmatory diagnoses of bovine brucellosis in blood serum and milk per animal and tank and selection and lyophilization process | |
| Nandapalan et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to infectious bronchitis virus | |
| EA036385B1 (en) | Method for quantitative determination of 1–3 type poliovirus d-antigen by enzyme immunoassay using specific yolk antibodies and biotin-labelled detector antibodies | |
| US4296024A (en) | Human immune serum globulin with high hepatitis A antibody titer | |
| RU2339694C2 (en) | Diagnostic test system for revealing of virus of bird flu a/h5n1 | |
| AU649473B2 (en) | Enterovirus peptides | |
| Bos et al. | Antitreponemal IgE in early syphilis. | |
| Payne et al. | Enzyme-linked immunosorbent assays for the measurement of specific antibodies in experimentally induced ovine toxoplasmosis | |
| Ozawa | Studies on the properties of African horse-sickness virus | |
| Forghani et al. | Radioimmunoassay of measles virus antigen and antibody in SSPE brain tissue | |
| CN116790509B (en) | Monoclonal hybridoma cell strain secreting anti-porcine pseudorabies virus gB protein antibody and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title |