EA037697B1

EA037697B1 - Treatment for parkinson's disease

Info

Publication number: EA037697B1
Application number: EA201892640A
Authority: EA
Inventors: Нитин Кришнаджи Дамле; Санджай Нандлалджи Мандхане; Манодж Атмарамджи Упадхя; Самеер Вишванатх Мехетре; Гаджанан Уттамрао Чхидревар; Прабал Сенгупта; Тринадха Рао Чхиттури
Original assignee: Сан Фарма Адвансед Ресёрч Компани Лимитед
Priority date: 2016-06-02
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2021-05-12
Also published as: EA201892640A1

Abstract

The invention relates to a method of treating or preventing Parkinson's disease in a subject comprising administering a compound of Formula Iwherein R1 is -NHC(O)C3-6cycloalkyl and R2 is hydrogen; or R1 and R2 along with the carbon atoms to which they are attached form a 6-membered aromatic ring, wherein the ring is substituted with one or more groups selected from hydrogen, halogen and C1-6alkyl; R3 and R4 are independently selected from the group comprising hydrogen, halogen, C1-3alkyl, OC1-3alkyl, NO2, SC1-3alkyl, C1-3haloalkyl, OC1-3haloalkyl and SC1-3haloalkyl; or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Description

Родственные заявкиRelated applications

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Индии № IN 201621019087, поданной 02 июня 2016 г., и IN 201621019185, поданной 02 июня 2016 г., которые включены в данный документ посредством ссылки.This application claims priority on the basis of Indian Patent Application No. IN 201621019087, filed June 02, 2016, and IN 201621019185, filed June 02, 2016, which are incorporated herein by reference.

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающему введение соединения формулы IThe present invention relates to a method of treating or preventing Parkinson's disease in a subject, comprising administering a compound of formula I

где R₁ представляет собой -NHC(О)С₃.₆циклоαлкил и R2 представляет собой водород;where R ₁ represents -NHC (O) C ₃ . ₆ cycloalkyl and R2 is hydrogen;

или R1 и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и C₁.₆aлкила;or R1 and R2 together with the carbon atoms to which they are attached form a six-membered aromatic ring, the ring being substituted by one or more groups selected from hydrogen, halogen and C ₁ . ₆ alkyl;

R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, C₁.₃алкил, OC₁.₃алкил, NO2, SC₁.₃алкил, C₁.₃галогеналкил, OC₁.₃галогеналкил и SC_1-3 галогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.R3 and R4 are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, C ₁ . ₃ alkyl, OC ₁ . ₃ alkyl, NO2, SC ₁ . ₃ alkyl, C ₁ . ₃ haloalkyl, OC ₁ . ₃ haloalkyl and SC _1-3 haloalkyl; or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Предпосылки создания изобретения c-Abl представляет собой нерецепторную тирозиновую протеинкиназу, которая вовлечена в различные клеточные процессы, которые включают регуляцию клеточного выживания, роста и подвижности. Ингибиторы c-Abl-киназы, такие как иматиниб (Gleevec®), нилотиниб (Tasigna®), дазатиниб (Sprycel®) и понатиниб (Iclusig®), были разработаны и поступили в продажу для клинического применения в лечении хронического миелоидного лейкоза.BACKGROUND OF THE INVENTION c-Abl is a non-receptor tyrosine protein kinase that is involved in a variety of cellular processes that include the regulation of cell survival, growth, and motility. Inhibitors of c-Abl kinase such as imatinib (Gleevec®), nilotinib (Tasigna®), dasatinib (Sprycel®) and ponatinib (Iclusig®) have been developed and marketed for clinical use in the treatment of chronic myeloid leukemia.

Недавние исследования продемонстрировали, что c-Abl выполняет важную роль в индуцированной оксидативным стрессом гибели нервных клеток (Wu et al., Cell Death Differ., 2016; 23:542-552). Сообщалось, что c-Abl участвует в развитии болезни Паркинсона (Gonfloni et al., Int. J. Cell Biol., 2012; 2012:1-7). Также известно, что c-Abl активируется дофаминергическим стрессом и дофаминергическими нейротоксинами, так например 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МРТР, который под воздействием ферментов in vivo превращается в его активную форму МРР⁺) вызывает фосфорилирование тирозина в паркине, что влечет за собой потерю паркином его активности как E3-лигазы. Это приводит к накоплению разных субстратов паркина и в конечном итоге к гибели дофаминергических нейронов (Ко et al., PNAS, 2010; 107: 16691-16696).Recent studies have demonstrated that c-Abl plays an important role in oxidative stress-induced neural cell death (Wu et al., Cell Death Differ., 2016; 23: 542-552). It has been reported that c-Abl is involved in the development of Parkinson's disease (Gonfloni et al., Int. J. Cell Biol., 2012; 2012: 1-7). It is also known that c-Abl is activated by dopaminergic stress and dopaminergic neurotoxins, for example, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP, which, under the influence of enzymes in vivo, is converted into its active form MPP ⁺ ) causes phosphorylation of tyrosine in parkin, which entails a loss of parkin activity as an E3 ligase. This leads to the accumulation of different parkin substrates and ultimately to the death of dopaminergic neurons (Ko et al., PNAS, 2010; 107: 16691-16696).

Болезнь Паркинсона (PD) является распространенным нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся накоплением белка во внутриклеточных включениях, называемых тельцами Леви и невритами Леви, и последующей утратой дофаминергических нейронов. Редкие семейные мутации дали представление об этом хроническом, прогрессирующем нейродегенеративном заболевании, например, мутации в α-синуклеине и LRRK2 вызывают развитие аутосомно-доминантной формы PD, а мутации в DJ-1, PINK1 и паркине приводят к развитию аутосомно-рецессивной формы PD. Паркин представляет собой E3-убиквитин-лигазу, и предполагается, что семейные мутации нарушают активность паркина как Б3-лигазы (Ko et al., PNAS, 2010; 107: 16691-16696).Parkinson's disease (PD) is a common neurodegenerative disease characterized by the accumulation of protein in intracellular inclusions called Lewy bodies and Lewy neuritis, and the consequent loss of dopaminergic neurons. Rare familial mutations have given insight into this chronic, progressive neurodegenerative disease, for example, mutations in α-synuclein and LRRK2 cause the development of an autosomal dominant form of PD, and mutations in DJ-1, PINK1, and parkin lead to the development of an autosomal recessive form of PD. Parkin is an E3 ubiquitin ligase, and familial mutations have been suggested to disrupt parkin's B3 ligase activity (Ko et al., PNAS, 2010; 107: 16691-16696).

Показано, что c-Abl контролирует разрушение двух белков, вовлеченных в патогенез PD, а именно паркина и α-синуклеина (Mahul-Mellier et al., Hum. Mol. Genet., 2014; 23:2858-2879). c-Abl фосфорилирует паркин по тирозину 143. Такое фосфорилирование ингибирует активность паркина как ЕЗ-у6иквитинлигазы, что приводит к накоплению AIMP2 и FBP1 (субстраты паркина) и утрате паркином его цитопротекторной функции, вызывающих гибель клеток (Ко et al., PNAS, 2010; 107:16691-16696; Imam et al., J. Neurosci., 2011; 31:157-163). В дополнение к этому c-Abl контролирует клиренс α-синуклеина, синаптического белка, который в значительной мере вовлечен в патогенез PD. Описана двунаправленная взаимосвязь между α-синуклеином и c-Abl in vivo, где повышение экспрессии α-синуклеина способствует фосфорилированию и последующей активации c-Abl. И наоборот, повышение экспрессии и активация c-Abl приводит к накоплению и агрегации α-синуклеина, согласно чему можно предположить, что ингибирование c-Abl может представлять собой жизнеспособную стратегию защиты дофаминергических нейронов от токсического воздействия накопленного α-синуклеина при PD (Hebron et al., Hum. Mol. Genet, 2013; 22:3315-3328; Hebron et al., Autophagy, 2013; 9:1249-1250).It has been shown that c-Abl controls the degradation of two proteins involved in the pathogenesis of PD, namely parkin and α-synuclein (Mahul-Mellier et al., Hum. Mol. Genet., 2014; 23: 2858-2879). c-Abl phosphorylates parkin at tyrosine 143. This phosphorylation inhibits the activity of parkin as E3-y6iquitin ligase, which leads to the accumulation of AIMP2 and FBP1 (parkin substrates) and the loss of parkin's cytoprotective function, causing cell death (Ko et al., PNAS, 2010; 107: 16691-16696; Imam et al., J. Neurosci., 2011; 31: 157-163). In addition, c-Abl controls the clearance of α-synuclein, a synaptic protein that is significantly implicated in the pathogenesis of PD. Described a bidirectional relationship between α-synuclein and c-Abl in vivo, where increased expression of α-synuclein promotes phosphorylation and subsequent activation of c-Abl. Conversely, upregulation and activation of c-Abl leads to accumulation and aggregation of α-synuclein, suggesting that inhibition of c-Abl may represent a viable strategy for protecting dopaminergic neurons from the toxic effects of accumulated α-synuclein in PD (Hebron et al. ., Hum. Mol. Genet, 2013; 22: 3315-3328; Hebron et al., Autophagy, 2013; 9: 1249-1250).

Известно, что такие ингибиторы c-Abl, как нилотиниб, проникают через гематоэнцефалический барьер и защищают дофаминергические нейроны в мышиной модели PD, индуцированного 1-метил-4фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (в данном документе называемым МРТР) (Karuppagounder et al., Sci. Rep. 2014; 4:4874). Показано, что нилотиниб усиливает клиренс а-синуклеина по пути аутофагии и защищает от индуцированной накоплением а-синуклеина потери дофаминергических нейронов в даннойC-Abl inhibitors such as nilotinib are known to cross the blood-brain barrier and protect dopaminergic neurons in a mouse PD model induced by 1-methyl-4phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (referred to herein as MPTP) (Karuppagounder et al. Sci. Rep. 2014; 4: 4874). It has been shown that nilotinib enhances the clearance of a-synuclein along the autophagy pathway and protects against the accumulation of a-synuclein-induced loss of dopaminergic neurons in this

- 1 037697 мышиной модели PD (Hebron et al., Hum. Mol. Genet, 2013; 22:3315-3328; Imam et al., J. Neurosci., 2011; 31:157-163). Кроме того, в US20150087653 раскрыт способ лечения нейродегенеративных заболеваний, включающий введение ингибиторов тирозинкиназ, таких как нилотиниб. Однако нилотиниб характеризуется несколькими существенными неблагоприятными эффектами, связанными с лекарственным средством. USFDA выпустило особое предупреждение в отношении капсул Tasigna, поскольку их применение для лечения связано с потенциально тяжелыми побочными эффектами со стороны сердца (удлинение интервала QT) и случаями скоропостижной смерти пациентов. Известно, что дазатиниб вызывает плевральный выпот и кровотечение. Понатиниб также связан с тяжелыми неблагоприятными эффектами, которые включают тромбоэмболию и закупорку сосудов. Иматиниб не является сильным ингибитором Ablкиназы. Более того, как для иматиниба, так и для дазатиниба, являющихся субстратом Р-гликопротеина (p-gp), показана низкая концентрация в мозге. Таким образом, существует потребность в сильном ингибиторе Abl-киназы, который может проникать через гематоэнцефалический барьер и не вызывает побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы.1,037697 PD mouse model (Hebron et al., Hum. Mol. Genet, 2013; 22: 3315-3328; Imam et al., J. Neurosci., 2011; 31: 157-163). In addition, US20150087653 discloses a method for treating neurodegenerative diseases comprising administering tyrosine kinase inhibitors such as nilotinib. However, nilotinib has several significant drug-related adverse effects. The USFDA has issued a special warning regarding Tasigna capsules because their use in treatment is associated with potentially severe cardiac side effects (prolonged QT interval) and sudden death of patients. Dasatinib is known to cause pleural effusion and bleeding. Ponatinib is also associated with severe adverse effects that include thromboembolism and vascular occlusion. Imatinib is not a potent Abl kinase inhibitor. Moreover, both imatinib and dasatinib, which are a substrate for P-glycoprotein (p-gp), are shown to have a low concentration in the brain. Thus, there is a need for a potent Abl kinase inhibitor that can cross the blood-brain barrier without causing cardiovascular side effects.

Краткое описание настоящего изобретенияBrief Description of the Present Invention

Настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы IThe present invention provides a method of treating or preventing Parkinson's disease in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of a compound of Formula I

Формула I где R1 представляет собой -NHC(О)С_3-6циклоαлкил, и R2 представляет собой водород;Formula I wherein R1 is —NHC (O) C _3-6 cycloalkyl and R2 is hydrogen;

или R1 и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и C_1-6алкила;or R1 and R2 together with the carbon atoms to which they are attached form a six-membered aromatic ring, the ring being substituted by one or more groups selected from hydrogen, halogen and C _1-6 alkyl;

R₃ и R4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, C_1-3алкил, OC_1-3алкил, NO2, SC_1-3алкил, C_1-3галогеналкил, OC_1-3гαлогеналкил и SC_1-3галогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.R ₃ and R4 are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, C _1-3 alkyl, OC _1-3 alkyl, NO2, SC _1-3 alkyl, C _1-3 haloalkyl, OC _1-3 halogenoalkyl and SC _1-3 haloalkyl; or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Описание графических материаловDescription of graphic materials

Фиг. 1 - микрофотоснимки коронарных срезов, на которых показаны нейроны, положительные по тирозингидроксилазе (ТН), демонстрирующие предупреждение нейродегенерации с помощью соединения формулы I.a;FIG. 1 is a photomicrograph of coronary sections showing neurons positive for tyrosine hydroxylase (TH) demonstrating prevention of neurodegeneration with a compound of formula I.a;

фиг. 2 - процентное значение площади ТН-положительных нейронов при введении соединения формулы La;fig. 2 - the percentage value of the area of TH-positive neurons with the introduction of a compound of formula La;

фиг. 3 - интегральная плотность ТН-иммунореактивности при введении соединения формулы I.a;fig. 3 - integral density of TH-immunoreactivity upon administration of a compound of formula I.a;

фиг. 4 - микрофотоснимки коронарных срезов, на которых показаны нейроны, положительные по тирозингидроксилазе (ТН), демонстрирующие предупреждение нейродегенерации с помощью соединения формулы I.b;fig. 4 is a photomicrograph of coronary sections showing neurons positive for tyrosine hydroxylase (TH) demonstrating prevention of neurodegeneration with a compound of formula I.b;

фиг. 5 - процентное значение площади ТН-положительных нейронов при введении соединения формулы I.b;fig. 5 - the percentage value of the area of TH-positive neurons with the introduction of a compound of formula I.b;

фиг. 6 - интегральная плотность ТН-иммунореактивности при введении соединения формулы I.b.fig. 6 - the integral density of TH-immunoreactivity upon administration of a compound of formula I.b.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы IIn one aspect, the present invention provides a method of treating or preventing Parkinson's disease in a subject comprising administering a therapeutically effective amount of a compound of Formula I

Формула I где R1 представляет собой -NHC(О)С_3-6циклоαлкил и R2 представляет собой водород;Formula I wherein R1 is —NHC (O) C _3-6 cycloalkyl and R2 is hydrogen;

или R1 и R2 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и C_1-3алкила;or R1 and R2 together with the carbon atoms to which they are attached form a six-membered aromatic ring, the ring being substituted by one or more groups selected from hydrogen, halogen and C _1-3 alkyl;

R₃ и R4 независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, C_1-3алкил, OC_1-3алкил, NO2, SC_1-3алкил, C_1-3галогеналкил, OC_1-3галогеналкил и SC_1-3галогеналкил; или его фармацевтически приемлемой соли.R ₃ and R4 are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, C _1-3 alkyl, OC _1-3 alkyl, NO2, SC _1-3 alkyl, C _1-3 haloalkyl, OC _1-3 haloalkyl and SC _1-3 haloalkyl; or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона у субъекта, включающий выбор субъекта, страдающего болезнью Паркинсона или подверженного риску развития болезни Паркинсона, и введение терапевтически эффективного количестIn another aspect, the present invention provides a method for treating or preventing Parkinson's disease in a subject, comprising selecting a subject suffering from Parkinson's disease or at risk of developing Parkinson's disease, and administering a therapeutically effective amount of

- 2 037697 ва соединения формулы I.- 2 037697 VA compounds of formula I.

Выражение терапевтически эффективное количество соединения формулы I, применяемое в данном документе, относится к количеству соединения формулы I, которое вызывает терапевтический эффект, для достижения которого его вводят.The expression therapeutically effective amount of a compound of Formula I, as used herein, refers to the amount of a compound of Formula I that produces a therapeutic effect for which it is administered.

Термин алкил относится к радикалу с насыщенной углеводородной цепью, который в остове содержит только атомы углерода и водорода, либо к линейному, либо разветвленному, и который присоединен к остальной части молекулы посредством одинарной связи, например, к метилу, этилу, н-пропилу, 1-метилэтилу (изопропилу), н-бутилу и н-пентилу.The term alkyl refers to a saturated hydrocarbon chain radical that contains only carbon and hydrogen atoms in the backbone, either linear or branched, and which is attached to the rest of the molecule through a single bond, for example, methyl, ethyl, n-propyl, 1 -methylethyl (isopropyl), n-butyl and n-pentyl.

Цифры в таком выражении, как C_1-6αлкил, означают, что в алкильной цепи присутствует от 1 до 6 атомов углерода.Numbers in an expression such as C _1-6 αalkyl indicate that there are from 1 to 6 carbon atoms in the alkyl chain.

Термин С_3-6циклоалкил относится к неароматической моноциклической кольцевой системе с 3-6 атомами углерода. Моноциклические кольца включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.The term C _3-6 cycloalkyl refers to a non-aromatic monocyclic ring system with 3-6 carbon atoms. Monocyclic rings include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.

Термин галогеналкил относится к алкильной цепи, замещенной одним или более радикалами, представляющими собой галоген, выбранными из хлорида, бромида, йодида и фторида.The term haloalkyl refers to an alkyl chain substituted with one or more halogen radicals selected from chloride, bromide, iodide, and fluoride.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где R₁ в соединении формулы I представляет собой -NHC(О)циклопропил, и R2 представляет собой водород.In one embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing Parkinson's disease comprising administering a therapeutically effective amount of a compound of Formula I wherein R ₁ in the compound of Formula I is —NHC (O) cyclopropyl and R2 is hydrogen.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где R₁ и R₂ в соединении формулы I вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, где кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и C_1-6aлкила. Предпочтительно ароматическое кольцо замещено водородом, т.е. является незамещенным.In another embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing Parkinson's disease comprising administering a therapeutically effective amount of a compound of Formula I wherein R ₁ and R ₂ in a compound of Formula I together with the carbon atoms to which they are attached form a six-membered aromatic ring, wherein the ring substituted with one or more groups selected from hydrogen, halogen and C _1-6 alkyl. Preferably, the aromatic ring is substituted with hydrogen, i. E. is unsubstituted.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где R1 и R2 в соединении формулы I вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, где кольцо замещено водородом, т.е. является незамещенным, и R₃ представляет собой хлор, a R4 представляет собой метил и присутствуют в качестве заместителей в положении 2 и 6 в кольце.In another embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing Parkinson's disease comprising administering a therapeutically effective amount of a compound of Formula I wherein R1 and R2 in a compound of Formula I together with the carbon atoms to which they are attached form a six-membered aromatic ring wherein the ring is substituted with hydrogen , i.e. is unsubstituted and R ₃ is chloro and R 4 is methyl and are substituted at positions 2 and 6 on the ring.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения болезни Паркинсона, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, где R₃ и R₄ в соединении формулы I выбраны из галогена и C_1-6αлкила. В предпочтительном варианте осуществления R3 и R4 представляют собой галоген и метил и присутствуют в качестве заместителей в положении 2 и 6 в кольце.In another embodiment, the present invention provides a method of treating or preventing Parkinson's disease comprising administering a therapeutically effective amount of a compound of Formula I, wherein R ₃ and R ₄ in the compound of Formula I are selected from halogen and C _1-6 α alkyl. In a preferred embodiment, R3 and R4 are halogen and methyl and are present as substituents at the 2 and 6 positions on the ring.

Химические названия некоторых предпочтительных соединений формулы I представлены ниже в табл. 1.The chemical names of some preferred compounds of Formula I are shown in Table 1 below one.

Таблица 1Table 1

№ соединения Connection No. Химическое название Chemical name I.a I.a ^’-(2-Xлop-6-мeτилбeнзoил)-4-мeτил-3-[2-(3хиноли л )этинил ] - бензогидразид ^ ’- (2-Chlor-6-methylbenzoyl) -4-methyl-3- [2- (3quinolyl) ethynyl] - benzohydrazide I.b I.b (5-{5-[Х'-(2-Хлор-6-метилбензоил)гидразинкарбонил]-2метилфенилэтинил } -пиридин-2-ил)амид циклопропанкарбоновой кислоты (5- {5- [X '- (2-Chloro-6-methylbenzoyl) hydrazinecarbonyl] -2methylphenylethynyl} -pyridin-2-yl) amide cyclopropanecarboxylic acid I.c I.c (5-{5-[Х'-(2-Хлор-6-метилбензоил)гидразинкарбонил]-2метил-фенилэтинил } -пиридин-2-ил)амид циклогексанкарбоновой кислоты (5- {5- [X '- (2-Chloro-6-methylbenzoyl) hydrazinecarbonyl] -2methyl-phenylethynyl} -pyridin-2-yl) cyclohexanecarboxylic acid amide Id Id (5-{5-[Х'-(2-Хлор-6-метилбензоил)гидразинкарбонил]-2метил-фенилэтинил } -пиридин-2-ил)амид (5- {5- [X '- (2-Chloro-6-methylbenzoyl) hydrazinecarbonyl] -2methyl-phenylethynyl} -pyridin-2-yl) amide циклобутанкарбоновой кислоты cyclobutanecarboxylic acid I.e I.e ^’-(2-Xлop-6-мeτилбeнзoил)-4-мeτил-3-[2-(6-xлop-3хиноли л )этинил ] - бензогидразид ^ ’- (2-Chlor-6-methylbenzoyl) -4-methyl-3- [2- (6-chloro-3quinolyl) ethynyl] - benzohydrazide If If ^’-(2-Xлop-6-мeτилбeнзoил)-4-мeτил-3-[2-(6-мeτил-3хиноли л )этинил ] - бензогидразид ^ '- (2-Chlor-6-methylbenzoyl) -4-methyl-3- [2- (6-methyl-3quinolyl) ethynyl] - benzohydrazide ig ig ^’-(2-Xлop-6-мeτилбeнзoил)-4-мeτил-3-[2-(6-φτop-3хиноли л )этинил ] - бензогидразид ^ '- (2-Chlor-6-methylbenzoyl) -4-methyl-3- [2- (6-phtop-3quinolyl) ethynyl] - benzohydrazide

Подходящими фармацевтически приемлемыми солями соединения согласно настоящему изобретению могут быть соли неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородSuitable pharmaceutically acceptable salts of a compound of the present invention may be salts of inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrogen bromide

- 3 037697 ная кислота, ортофосфорная кислота и т.п., или органических кислот, таких как, например, уксусная кислота, бензолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винная кислота, или аминокислот, таких как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота и т.п. Один или более атомов водорода соединения формулы I могут быть дейтерированными, т.е. замещенными атомом дейтерия.- 3 037697 acid, phosphoric acid, etc., or organic acids such as, for example, acetic acid, benzenesulfonic acid, methanesulfonic acid, benzoic acid, citric acid, glycolic acid, lactic acid, fumaric acid, succinic acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, malic acid, tartaric acid, or amino acids such as glutamic acid or aspartic acid, and the like. One or more hydrogen atoms of a compound of formula I may be deuterated, i. E. substituted with a deuterium atom.

В публикации WIPO WO 2012098416 ('публикация 416') раскрыта группа Маркуша из соединений, активных в качестве ингибиторов c-Abl-киназы, и их полезность при лечении таких видов рака, как хронический миелоидный лейкоз (CML). Соединения формулы I по настоящему изобретению можно получить способами, описанными в WO 2012098416 и WO 2016185490, которые включены в данный документ посредством ссылки.WIPO Publication WO 2012098416 ('Publication 416') discloses a Markush group of compounds active as c-Abl kinase inhibitors and their utility in the treatment of cancers such as chronic myeloid leukemia (CML). The compounds of formula I of the present invention can be prepared by the methods described in WO 2012098416 and WO 2016185490, which are incorporated herein by reference.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения формулы I по настоящему изобретению являются сильными ингибиторами Abl-киназы и успешно проникают через гематоэнцефалический барьер, в результате чего эффективно достигается высокое соотношение концентраций соединения формулы I в мозге и в плазме и высокий терапевтический индекс.The present inventors have found that the compounds of formula I of the present invention are potent inhibitors of Abl kinase and successfully cross the blood-brain barrier, thereby effectively achieving a high brain to plasma ratio of the compound of formula I and a high therapeutic index.

В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение формулы I в терапевтически эффективной дозе не вызывает побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы при его тестировании в отношении влияния in vitro на канал hERG и его влияния in vivo на параметры ECG, такие как интервал QT, интервал QTc, интервал QTcf и частоту сердечных сокращений у собак породы бигль в состоянии бодрствования и морских свинок. Обнаружено, что соединение формулы I является безопасным, поскольку оно не оказывает никакого ненадлежащего влияния на параметры ECG и частоту сердечных сокращений, как описано в данном документе в примерах.In particular, the inventors have found that a compound of Formula I at a therapeutically effective dose does not induce cardiovascular side effects when tested for in vitro effects on the hERG channel and its in vivo effects on ECG parameters such as QT interval , QTc interval, QTcf interval and heart rate in wakeful beagle dogs and guinea pigs. The compound of Formula I has been found to be safe as it does not have any undue effect on ECG parameters and heart rate as described herein in the examples.

Соединение формулы I можно вводить перорально в виде подходящей лекарственной формы. Подходящая лекарственная форма может включать таблетку, пеллеты, капсулу, саше, пеллеты в саше, пеллеты в капсуле, порошок, гранулы и т.п. Соединение формулы I может быть составлено в лекарственную форму для перорального применения, которая может содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, обычно хорошо известные специалисту в данной области. Фармацевтически приемлемые носители, которые можно применять для получения подходящей лекарственной формы, раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, шестнадцатое издание, Е. W. Martin (Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания, 1980 г.).The compound of Formula I can be administered orally in a suitable dosage form. A suitable dosage form may include a tablet, pellet, capsule, sachet, pellet sachet, pellet capsule, powder, granules, and the like. The compound of formula I can be formulated for oral administration, which may contain pharmaceutically acceptable excipients generally well known to those skilled in the art. Pharmaceutically acceptable carriers that can be used to prepare a suitable dosage form are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980).

Следующие примеры служат для иллюстрирования настоящего изобретения без ограничения настоящего изобретения по его объему.The following examples serve to illustrate the present invention without limiting the present invention by its scope.

Пример 1. Ингибирование Abl-киназыExample 1. Inhibition of Abl kinase

В конечной реакционной смеси объемом 25 цл Abl (человека) (5-10 мЕд) инкубировали с использованием 8 мМ MOPS с рН 7,0, 0,2 мМ EDTA, 50 цМ EAIYAAPFAKKK, 10 мМ Mg(OAc)2 и [y-³³P-ATP] [удельная активность приблизительно 500 число импульсов в минуту/пмоль, концентрация в соответствии с требованиями). Реакцию инициировали посредством добавления смеси MgATP. После инкубирования в течение 40 мин при комнатной температуре реакцию останавливали посредством добавления 5 мкл 3% раствора ортофосфорной кислоты. Затем 10 мкл реакционной смеси помещали в Р30 Filtermat и промывали три раза в течение 5 мин в 75 мМ ортофосфорной кислоте и один раз в метаноле перед высушиванием и подсчетом импульсов.In the final reaction mixture with a volume of 25 cl, Abl (human) (5-10 mU) was incubated using 8 mM MOPS with pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 50 cM EAIYAAPFAKKK, 10 mM Mg (OAc) 2 and [y- ³³ P-ATP] [specific activity approximately 500 cpm / pmol, concentration as required). The reaction was initiated by adding a mixture of MgATP. After incubation for 40 minutes at room temperature, the reaction was stopped by adding 5 μl of a 3% phosphoric acid solution. Then 10 μl of the reaction mixture was placed in a P30 Filtermat and washed three times for 5 minutes in 75 mm phosphoric acid and once in methanol before drying and counting.

Результаты для представленных соединений формулы I приведены в табл. 2.The results for the represented compounds of formula I are shown in table. 2.

Таблица 2. Сравнительные показатели активности ингибиторов тирозинкиназ в отношении c-AblTable 2. Comparative indicators of the activity of tyrosine kinase inhibitors in relation to c-Abl

1С₅₀ (нМ)1C ₅₀ (nM) La La Lb Lb Нилотиниб Nilotinib Понатиниб Ponatinib Дазатиниб Dasatinib Иматиниб Imatinib 0,9 0.9 0,6 0.6 18 eighteen 0,4 0,4 0,27 0.27 190 190

Пример 2. Фармакокинетические исследования в мозге и плазмеExample 2. Pharmacokinetic studies in the brain and plasma

Чтобы определить, проникает ли соединение формулы I.a через гематоэнцефалический барьер, мышам линии C57BL6 перорально вводили 30 мг/кг соединения формулы I.a, 100 мг/кг нилотиниба или 30 мг/кг дазатиниба. В моменты времени 1, 4 и 8 ч после обработки мышей анестезировали изофлураном и проводили забор 0,4 мл крови из ретроорбитального сплетения в пробирки фирмы Эппендорф, содержащие 8 мкл гепарина натрия в качестве противосвертывающего средства (100 МЕ/мл), и переносили в контейнеры со льдом. Образцы крови немедленно центрифугировали в течение 7 мин при 8500 об./мин, 4°С. Плазму отделяли в предварительно маркированные пробирки фирмы Эппендорф и хранили при 70°С до следующего анализа. Непосредственно после этого мышей умерщвляли, мозг целиком извлекали и ополаскивали с помощью охлажденного льдом фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) для удаления периферической крови и высушивали путем промокания. Образцы ткани мозга взвешивали и гомогенизировали в объеме PBS в соотношении 1:2 с применением гомогенизатора для тканей и хранили в маркированных флаконах при -70°С до следующего анализа. Концентрации соединения формулы I.a в мозге и плазме определяли с применением методики LC-MS.To determine whether a compound of formula I.a crosses the blood-brain barrier, C57BL6 mice were orally administered 30 mg / kg of a compound of formula I.a, 100 mg / kg nilotinib, or 30 mg / kg dasatinib. At time points 1, 4 and 8 h after treatment, the mice were anesthetized with isoflurane and 0.4 ml of blood was taken from the retroorbital plexus into Eppendorf tubes containing 8 μl of sodium heparin as an anticoagulant (100 IU / ml) and transferred to containers with ice. The blood samples were immediately centrifuged for 7 min at 8500 rpm, 4 ° C. Plasma was separated into pre-labeled Eppendorf tubes and stored at 70 ° C until next analysis. Immediately thereafter, the mice were sacrificed, the whole brains were removed and rinsed with ice-cold phosphate buffered saline (PBS) to remove peripheral blood and blotted dry. Brain tissue samples were weighed and homogenized in a volume of 1: 2 PBS using a tissue homogenizer and stored in labeled vials at -70 ° C until further analysis. Brain and plasma concentrations of the compound of formula I.a were determined using the LC-MS technique.

- 4 037697- 4 037697

Было обнаружено, что соотношение концентрации в мозге и концентрации в плазме было значительно выше для соединения формулы I.a, по сравнению с таковым для нилотиниба или дазатиниба (см. табл. 3).It was found that the ratio of brain concentration to plasma concentration was significantly higher for the compound of formula I.a, compared with that for nilotinib or dasatinib (see table. 3).

Таблица 3. Концентрация соединений в мозге и в плазмеTable 3. Concentration of compounds in the brain and in plasma

Соединения Connections Обработка* (мг/кг) Treatment* (mg / kg) Моменты времени (час) Moments in time (hour) Концентрация в плазме (иг соединения/мл плазмы) Plasma Concentration (Ig Compounds / ml Plasma) Концентрация в мозге (иг соединения/г ткани мозга) Concentration in the brain (Ig junction / g brain tissue) Соотношение концентрация в мозге/концентра ция в плазме Brain concentration / plasma concentration ratio Соединение формулы I.a Compound of formula I.a 30 thirty 1 one 4798 ±858 4798 ± 858 1901 ±959 1901 ± 959 0,40 0.40 4 four 3167 ±50 3167 ± 50 510±367 510 ± 367 0,16 0.16 8 eight 2715 ±379 2715 ± 379 435±157 435 ± 157 0,16 0.16 Нилотиниб Nilotinib 100 100 1 one 31683 ±7958 31683 ± 7958 380 ±70 380 ± 70 0,01 0.01 4 four 38813 ±11635 38813 ± 11635 487±126 487 ± 126 0,01 0.01 8 eight 16988 ±2133 16988 ± 2133 180 ±46 180 ± 46 0,01 0.01 Дазатиниб Dasatinib 30 thirty 1 one 553 ±550 553 ± 550 23,4 ± 0 23.4 ± 0 0,04 0.04 4 four 222 ±122 222 ± 122 25 ±5 25 ± 5 о,и oh and 8 eight BQL BQL 24 ±4 24 ± 4 - -

BQL - ниже предела количественного определенияBQL - Below Quantification Limit

Пример 3. Эффективность соединения формулы I.a в животной модели болезни ПаркинсонаExample 3. Efficacy of a Compound of Formula I.a in an Animal Model of Parkinson's Disease

Мышам линии C57BL/6 (возрастом 6-8 недель, с массой тела 25-30 г) перорально, с применением носителя вводили соединения формулы I.a (10 или 30 мг/кг, один раз в сутки) в течение 7 дней. На 7-ой день эти животные получали четыре внутрибрюшинные инъекции нейротоксина, 1-метил-4-фенил1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР-HCl; 17 мг/кг в пересчете на свободное основание; Sigma), в солевом растворе с интервалами по 2 ч. Ежедневное введение дозы соединения продолжали в течение 7 дополнительных дней после последней инъекции МРТР. Вкратце, соединение вводили 6 дней до введения МРТР, в день введения МРТР и 7 дней после введения МРТР. Всех животных умерщвляли через 7 дней после введения МРТР и ткани мозга обрабатывали для иммуногистохимической оценки. Для иммуногистохимического обнаружения тирозингидроксилазы (ТН) применяли стандартный авидин-биотиновый метод (Benno et al., Brain Res., 1982; 246: 225-236). На начальном этапе с применением криостата делали срезы мозга на уровне компактной части черного вещества (SNPc) и помещали на предметные стекла. Предметные стекла со срезами мозга промывали 3x5 мин в 0,1 М PBS. Срезы сначала инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с нормальной блокирующей сывороткой в 0,1 М PBS с 0,3% Triton Х100 и в течение еще 2 ч с кроличьими поликлональными антителами к мышиной тирозингидроксилазе (Invitrogen), разбавленными в соотношении 1:1000 в 0,1 М PBS с нормальной блокирующей сывороткой. Предметные стекла со срезами дополнительно промывали 3x5 мин в 0,1 М PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с биотинилированными антителами к иммуноглобулину кролика (набор ABC фирмы Vectastain®). Срезы ополаскивали 3x5 мин в 0,1 М PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с растворами А и В (набор ABC фирмы Vectastain®), разбавленными в соотношении 1:50 в 0,1 М PBS. Через 1 ч срезы промывали 3x5 мин в 0,1 М PBS и инкубировали в растворе 3,3'-диаминобензидин (DAB)/H₂O₂ (Sigma) в течение приблизительно 5-8 мин (за ходом процесса наблюдали под микроскопом на предмет оптимального соотношения сигнал/шум). Срезы сначала промывали 2x5 мин в 0,1 М PBS и затем 3x5 мин в воде качества Milli-Q. Предметные стекла накрывали покровными стеклами с добавлением глицерин-желатинового раствора и выдерживали при комнатной температуре в течение ночи для высушивания, после чего получали изображения окрашенных срезов мозга с применением присоединенной к микроскопу камеры и анализировали с применением программного обеспечения NIH ImageJ® (NIH, Бетесда, Мэриленд). Для осуществления анализа изображения преобразовывали до 8-битового разрешения и оптимальных яркости/контраста. На отдельных изображениях удаляли фоновые и ложные сигналы и проводили измерение площади, покрытой клеточными телами и волокнами. Рассчитывали процент данной области относительно общей площади изображения и интегральную плотность. Для определения наличия какой-либо межгрупповой или внутригрупповой изменчивости и статистической значимости полученные результаты сравнивали с применением GraphPad Prism® 6.0. Пероральное введение соединения формулы I.a в значительной степени препятствовало индуцированнойC57BL / 6 mice (6-8 weeks old, weighing 25-30 g) were orally administered with the vehicle using the compounds of formula Ia (10 or 30 mg / kg, once a day) for 7 days. On day 7, these animals received four intraperitoneal injections of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP-HCl; 17 mg / kg as free base; Sigma), in saline with at intervals of 2 hours. The daily dosing of the compound was continued for 7 additional days after the last injection of MPTP. Briefly, the compound was administered 6 days prior to MPTP administration, on the day of MPTP administration, and 7 days after MPTP administration. All animals were sacrificed 7 days after administration of MPTP and brain tissues were processed for immunohistochemical evaluation. For the immunohistochemical detection of tyrosine hydroxylase (TH), the standard avidin-biotin method was used (Benno et al., Brain Res., 1982; 246: 225-236). Initially, using a cryostat, brain sections were cut at the level of the substantia nigra compacta (SNPc) and placed on glass slides. Brain slides were washed for 3x5 min in 0.1 M PBS. Sections were first incubated for 30 min at room temperature with normal blocking serum in 0.1 M PBS with 0.3% Triton X100 and for another 2 h with rabbit polyclonal antibodies to mouse tyrosine hydroxylase (Invitrogen) diluted 1: 1000 in 0.1 M PBS with normal blocking serum. Slides with sections were additionally washed for 3x5 min in 0.1 M PBS and incubated for 1 h at room temperature with biotinylated antibodies to rabbit immunoglobulin (ABC kit from Vectastain®). Sections were rinsed for 3x5 min in 0.1 M PBS and incubated for 1 h at room temperature with solutions A and B (ABC kit from Vectastain®) diluted 1:50 in 0.1 M PBS. After 1 h, the sections were washed 3x5 min in 0.1 M PBS and incubated in a solution of 3,3'-diaminobenzidine (DAB) / H ₂ O ₂ (Sigma) for about 5-8 min (the process was observed under a microscope for optimal signal-to-noise ratio). Sections were first washed 2x5 min in 0.1 M PBS and then 3x5 min in Milli-Q quality water. Slides were covered with cover slips with the addition of a glycerol-gelatin solution and kept at room temperature overnight to dry, after which images of stained brain sections were obtained using a camera attached to a microscope and analyzed using NIH ImageJ® software (NIH, Bethesda, MD ). For analysis, images were converted to 8-bit resolution and optimal brightness / contrast. On individual images, background and false signals were removed and the area covered by cell bodies and fibers was measured. The percentage of this area relative to the total image area and the integral density were calculated. The results were compared using GraphPad Prism® 6.0 to determine if there was any intergroup or intragroup variability and statistical significance. Oral administration of a compound of formula Ia significantly inhibited the induced

- 5 037697- 5 037697

МРТР нейродегенерации, как видно из микрофотоснимков коронарных срезов, на которых видны ТНположительные нейроны (фиг. 1), определения процента площади ТН-положительных нейронов (фиг. 2) и интегральной плотности ТН-иммунореактивности (фиг. 3).MRTP of neurodegeneration, as seen from micrographs of coronary sections, which show TH-positive neurons (Fig. 1), determination of the percentage of the area of TH-positive neurons (Fig. 2) and integral density of TH-immunoreactivity (Fig. 3).

Пример 4. Эффективность соединения формулы I.b в животной модели болезни ПаркинсонаExample 4. Efficacy of a compound of formula I.b in an animal model of Parkinson's disease

Эффективность соединения формулы I.b в отношении лечения болезни Паркинсона тестировали тем же способом, который описан для соединения формулы I.a в примере 3 выше.The efficacy of the compound of formula I.b in the treatment of Parkinson's disease was tested in the same manner as described for the compound of formula I.a in example 3 above.

Для определения наличия какой-либо межгрупповой или внутригрупповой изменчивости и статистической значимости полученные результаты сравнивали с применением GraphPad Prism® 6.0. Пероральное введение соединения формулы I.b в значительной степени препятствовало индуцированной МРТР нейродегенерации, как видно из микрофотоснимков коронарных срезов, на которых видны ТНположительные нейроны (фиг. 4), определения процента площади ТН-положительных нейронов (фиг. 5) и интегральной плотности ТН-иммунореактивности (фиг. 6).The results were compared using GraphPad Prism® 6.0 to determine if there was any intergroup or intragroup variability and statistical significance. Oral administration of a compound of formula Ib significantly inhibited MRTP-induced neurodegeneration, as can be seen from micrographs of coronary sections showing TH-positive neurons (FIG. 4), determination of the percent area of TH-positive neurons (FIG. 5) and integral TH-immunoreactivity density ( Fig. 6).

Пример 5. Электрофизиологические процедуры - влияние на K⁺-канал hERGExample 5. Electrophysiological procedures - influence on the hERG ^{K + -channel}

Соединение формулы I.a и I.b тестировали на безопасность для сердечно-сосудистой системы в ходе теста in vitro для определения ингибирования на K⁺-канала hERG. В тестируемой концентрации соединения формулы I.a и I.b не демонстрировали какой-либо значимой величины ингибирования тока hERG.The compound of formula Ia and Ib was tested for cardiovascular safety in an in vitro test to determine inhibition of the ^{hERG K +} channel. At the tested concentration, the compounds of formula Ia and Ib did not show any significant amount of inhibition of hERG current.

Исследовали влияние in vitro соединений формулы I.a и I.b на ионные токи в эмбриональных клетках почки человека (НЕК293), стабильно экспрессирующих ген ether-a-go-go человека (hERG), к которым были подсоединены электроды для фиксации потенциала. Тестировали две концентрации соединений формулы I.a и I.b (1 и 10 мкМ) при температуре, близкой к физиологической.The effect of in vitro compounds of formulas I.a and I.b on ion currents in human embryonic kidney cells (HEK293), stably expressing the human ether-a-go-go gene (hERG), to which electrodes were connected for voltage clamping, were investigated. Tested two concentrations of compounds of formula I.a and I.b (1 and 10 μM) at a temperature close to physiological.

Клетки переносили в камеру регистрации сигналов и заливали контрольным раствором, представляющим собой среду-носитель (HEPES-забуференный физиологический солевой раствор + 1% диметилсульфоксида + 1% альбумина бычьей сыворотки). Раствор для заполнения микропипетки для записи результатов локальной фиксации потенциала целой клетки состоял из аспартата калия, 130 мМ; MgCl₂, 5 мМ; EGTA, 5 мМ; АТР, 4 мМ; HEPES, 10 мМ; рН регулировали до значения 7,2 с помощью 10 н. КОН. Раствор для заполнения микропипетки получали отдельными сериями, делили на аликвоты, хранили в замороженном состоянии и каждый день размораживали свежую аликвоту. Запись результатов проводили при температуре от 33 до 35°С с применением комбинации напрямую подключенных встроенного устройства для предварительного нагрева раствора, нагревательного устройства камеры и регулятора температуры с обратной связью. Температуру измеряли в камере регистрации сигналов с применением датчика терморезистора. Микропипетки для записи результатов фиксации потенциала изготовляли из стеклянных капиллярных трубок с применением устройства для вытягивания микропипеток Р-97 (Sutter Instruments, Новато, Калифорния). Для записи результатов измерений с целых клеток применяли серийный усилитель для локальной фиксации потенциала. Перед оцифровкой записи результатов измерения тока обрабатывали с помощью фильтра низких частот на уровне одной пятой от выборочной частоты.The cells were transferred to a signal recording chamber and flooded with a control solution, which is a carrier medium (HEPES-buffered physiological saline + 1% dimethyl sulfoxide + 1% bovine serum albumin). The solution for filling the micropipette for recording the results of local clamping of the potential of the whole cell consisted of potassium aspartate, 130 mm; MgCl ₂ , 5 mM; EGTA, 5 mM; ATP, 4 mM; HEPES, 10 mM; The pH was adjusted to 7.2 with 10 N. CON. The solution for filling the micropipette was prepared in separate batches, divided into aliquots, stored frozen and a fresh aliquot was thawed every day. The results were recorded at 33 to 35 ° C using a combination of a directly connected built-in solution preheating device, a chamber heater, and a closed loop temperature controller. The temperature was measured in a signal recording chamber using a thermistor sensor. Micropipettes for recording potential clamping results were made from glass capillary tubes using a P-97 micropipette stretcher (Sutter Instruments, Novato, Calif.). To record the measurement results from whole cells, we used a serial amplifier for local potential clamping. Before digitizing, the recordings of the current measurement results were processed using a low-pass filter at the level of one-fifth of the sampled frequency.

Клетки, стабильно экспрессирующие hERG, поддерживали при -80 мВ. Начальный ток и ток при ингибировании калиевого тока через канал hERG в состоянии покоя, обусловленный тестируемыми соединениями (формула I.a и I.b), измеряли с применением последовательности импульсов с фиксированными амплитудами (подготовительный импульс для приведения в заданное состояние +20 мВ в течение 1 с; реполяризующее тестовое изменение до -80 мВ (-0,5 В/с), повторяющееся с интервалами 5 с). Для оценки вклада эндогенных токов каждую запись результатов измерения заканчивали финальным внесением сверхмаксимальной концентрации вещества сравнения (Е-4031, 500 нМ). Чтобы определить эффективность тестируемых соединений в отношении ингибирования канала hERG из полученных данных вычитали остающийся неингибированным ток в цифровом формате в автономном режиме.Cells stably expressing hERG were maintained at -80 mV. The initial current and the current during inhibition of the potassium current through the hERG channel at rest, due to the test compounds (formulas Ia and Ib), were measured using a sequence of pulses with fixed amplitudes (preparatory pulse for conditioning +20 mV for 1 s; repolarizing test change to -80 mV (-0.5 V / s), repeated at 5 s intervals). To assess the contribution of endogenous currents, each recording of the measurement results was completed with the final addition of the supramaximal concentration of the reference substance (E-4031, 500 nM). To determine the efficacy of the test compounds in inhibiting the hERG channel, the remaining uninhibited current was subtracted from the data obtained in digital format in offline mode.

Соединение формулы I.a ингибировало ток через канал hERG на (среднее значение ± SEM) 2,1 ± 0,4% при 1 мкМ (n = 3) и на 9,7 ± 0,4% при 10 мкМ (n = 3) по сравнению с 1,0 ±0,6% (n = 3) в случае контроля, представляющего собой среду-носитель (см. табл. 4). Концентрации соединения формулы I.a выше 10 мкМ не тестировали в связи с пределом растворимости соединения в контроле, представляющем собой среду-носитель. При подобных условиях положительный контроль (терфенадин, 60 нМ) ингибировал калиевый ток через канал hERG на (среднее значение ± SD; n = 2) 82,8 ± 1,2%, подтверждая наличие слабого эффекта соединения формулы I.a при его очень высокой концентрации в отношении К⁺ канала hERG. Для сравнения, нилотиниб демонстрирует приблизительно 90% ингибирование при концентрации 1 мкМ (табл. 5).The compound of formula Ia inhibited the current through the hERG channel by (mean ± SEM) 2.1 ± 0.4% at 1 μM (n = 3) and by 9.7 ± 0.4% at 10 μM (n = 3) at compared with 1.0 ± 0.6% (n = 3) in the case of the control, which is a carrier medium (see table. 4). Concentrations of the compound of formula Ia above 10 μM were not tested due to the solubility limit of the compound in the vehicle control. Under these conditions, the positive control (terfenadine, 60 nM) inhibited the potassium current through the hERG channel by (mean ± SD; n = 2) 82.8 ± 1.2%, confirming the weak effect of the compound of formula Ia at its very high concentration in relation to the K ⁺ channel hERG. In comparison, nilotinib shows approximately 90% inhibition at 1 μM (Table 5).

- 6 037697- 6 037697

Таблица 4. Среднее процентное значение ингибирования тока через канал hERG при каждой _________концентрации соединения формулы I.a и I.bTable 4. Average percentage inhibition of current through the hERG channel at each _________ concentration of a compound of formula I.a and I.b

Соединение Compound Концентрация (мкМ) Concentration (μM) Среднее значение Mean SD SD SEM SEM N N Соединение I.a Compound I.a 0 0 1,0% 1.0% 1,0% 1.0% 0,6% 0.6% 3 3 1 one 2,1% 2.1% 0,7% 0.7% 0,4% 0.4% 3 3 10 10 9,7% 9.7% 0,7% 0.7% 0,4% 0.4% 3 3 Соединение I.b Compound I.b 0 0 1,6% 1.6% 0,3% 0.3% 0,2% 0.2% 3 3 0,3 0.3 5,6% 5.6% 1,3% 1.3% 0,8% 0.8% 3 3 1 one 12,9%* 12.9% * 4,1% 4.1% 2,4% 2.4% 3 3 3 3 25,0%* 25.0% * 6,0% 6.0% 3,4% 3.4% 3 3

* Значение статистически отличается от значения, полученного отдельно для среды-носителя.* The value is statistically different from the value obtained separately for the carrier medium.

Таблица 5. Проц Table 5. Percentage рентное значение ин Конц. (мкМ) rental value in Conc. (μM) ггибирован] 0,03 suppressed] 0.03 ия тока чер 0,1 iya toka black 0.1 )ез канал hE о,з ) without channel hE o, s KG нилот 1 KG nilot one инибом inib % ингибирования % inhibition 14,9 ±2 14.9 ± 2 43,9 ± 0,7 43.9 ± 0.7 70,4 ± 2,5 70.4 ± 2.5 89,7 ± 1,6 89.7 ± 1.6

# Данные фармакологического обзора CDER по NDA № 22-068 (капсула Tasigna®), ст. № 31# Data from the CDER pharmacological review according to NDA No. 22-068 (capsule Tasigna®), art. No. 31

Пример 6. Влияние соединения формулы I.a на интервалы QT, QTc и частоту сердечных сокращений у собак породы бигль в состоянии бодрствованияExample 6 Effect of a Compound of Formula I.a on QT Intervals, QTc and Heart Rate in Awake Beagle Dogs

Соединение формулы I.a подвергали тестированию in vivo для определения его влияния на интервалы QT, QT_cb, и QTcf и частоту сердечных сокращений у собак породы бигль в состоянии бодрствования.The compound of formula Ia was tested in vivo to determine its effect on the QT, QT _cb , and QTcf intervals and heart rate in waking beagle dogs.

Соединение формулы I.a вводили пероральным путем (р.о.) на трех уровнях дозирования, 5, 15 и 30 мг/кг, самцам и самкам собак породы бигль, регистрацию состояния которых проводили дистанционно в состоянии бодрствования. Рвота возникла у двух животных (1 самец и 1 самка), которых обрабатывали с применением соединения формулы I.a дозовой группы 30 мг/кг, через 14 мин после введения дозы. Следовательно, группу, которую обрабатывали с применением дозы 30 мг/кг, при анализе данных не рассматривали. При применении доз 5 и 15 мг/кг рвота не наблюдалась.The compound of formula I.a was administered by the oral route (po) at three dosage levels, 5, 15 and 30 mg / kg, male and female beagle dogs, the state of which was recorded remotely while awake. Vomiting occurred in two animals (1 male and 1 female), which were treated with a compound of formula I.a dose group 30 mg / kg, 14 minutes after dosing. Therefore, the group that was treated with a dose of 30 mg / kg was not considered in the data analysis. No vomiting was observed with doses of 5 and 15 mg / kg.

Измерения параметров ECG (интервал QT, интервал QTcb, интервал QTcf) и частоты сердечных сокращений проводили и записывали в течение 2 ч до введения лекарственного средства (исходный уровень) и непрерывно в течение не более 24 ч после введения. Каждое животное получало как средуноситель (плацебо), так и три разные дозы соединения формулы I.a в разные дни по схеме латинского квадрата с периодом отмывки минимум 96 ч. Чтобы получить фармакокинетические (PK) параметры в отдельный день проводили одно дополнительное пероральное введение дозы соединения формулы I.a для оценки концентраций соединения формулы I.a в плазме в разные моменты времени.Measurements of ECG parameters (QT interval, QTcb interval, QTcf interval) and heart rate were performed and recorded within 2 hours prior to drug administration (baseline) and continuously for no more than 24 hours after administration. Each animal received both the vehicle (placebo) and three different doses of the compound of formula Ia on different days according to the Latin square scheme with a washing period of at least 96 hours. To obtain the pharmacokinetic (PK) parameters, one additional oral dose of the compound of formula Ia was performed on a separate day to assess plasma concentrations of a compound of formula Ia at different time points.

Данные по параметрам ECG (интервал QT, интервал QTcb, интервал QTcf) и частоте сердечных сокращений статистически сравнивали следующим образом. Данные группы плацебо в моменты времени 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 ч сравнивали с исходными данными той же группы. Данные разных групп, лечение которых осуществляли с применением соединения формулы I.a, сравнивали с соответствующими данными группы плацебо.Data on ECG parameters (QT interval, QTcb interval, QTcf interval) and heart rate were statistically compared as follows. Data from the placebo group at time points 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 and 24 hours were compared with the baseline data of the same group. The data from the different groups treated with the compound of formula I.a were compared with the corresponding data from the placebo group.

Анализ ECG на основе объединенных данных самцов и самок собак указал на то, что по сравнению с исходным уровнем лечение с применением плацебо не оказывало статистически значимого влияния ни на один из параметров ECG (интервал QT, интервал QTcb, интервал QTcf), ни на частоту сердечных сокращений. Соединение формулы I.a в дозах 5 и 15 мг/кг не оказывало влияния на интервалы времени QT, QT_cb, QT_cf по сравнению с плацебо. Кроме того, другой параметр, такой как частота сердечных сокращений, оставался неизменным.ECG analysis based on pooled data from male and female dogs indicated that, compared with baseline, placebo treatment had no statistically significant effect on any of the ECG parameters (QT interval, QTcb interval, QTcf interval) or heart rate. reductions. The compound of formula Ia at doses of 5 and 15 mg / kg had no effect on the time intervals QT, QT _cb , QT _cf compared to placebo. In addition, another parameter, such as heart rate, remained unchanged.

В PK-анализе продемонстрировано дозозависимое системное воздействие соединения формулы I.a на животных, которым вводили разные дозы соединения формулы I.a. Значение AUC_0-inf находилось в диапазоне от 1925 до 4824, от 6776 до 12756 и от 25927 до 46749 ч.хнг/мл при применении соединения формулы I.a в дозах 5, 15 и 30 мг/кг соответственно. Значение C_max находилось в диапазоне от 1218 до 2033, от 2723 до 5323 и от 9825 до 9967 нг/мл при применении соединения формулы I.a в дозах 5, 15 и 30 мг/кг соответственно.PK assay demonstrated dose-dependent systemic effects of a compound of formula Ia in animals treated with different doses of a compound of formula Ia AUC _0-inf ranged from 1925 to 4824, 6776 to 12756, and 25927 to 46749 hng / ml when applied compounds of formula Ia at doses of 5, 15 and 30 mg / kg, respectively. The C _max value was in the range from 1218 to 2033, from 2723 to 5323 and from 9825 to 9967 ng / ml when using the compound of formula Ia at doses of 5, 15 and 30 mg / kg, respectively.

Результаты данного исследования указывают на то, что однократное пероральное введение соединения формулы I.a в дозе не более 15 мг/кг не оказывает влияния на функции сердечно-сосудистой сисThe results of this study indicate that a single oral administration of a compound of formula I.a at a dose not exceeding 15 mg / kg does not affect the function of the cardiovascular system.

- 7 037697 темы у собак породы бигль в состоянии бодрствования. Изменения в морфологии ECG отсутствовали при любом уровне дозы соединения формулы I.a. Отличия между полами в отношении влияния лечения на параметры ECG и частоту сердечных сокращений отсутствовали.- 7 037697 themes in waking beagle dogs. There were no changes in ECG morphology at any dose level of the compound of formula I.a. There were no differences between the sexes regarding the effect of treatment on ECG parameters and heart rate.

Пример 7. Влияние соединения формулы I.b на интервалы QT, QTc и частоту сердечных сокращений у морской свинки под наркозомExample 7. Effect of a compound of formula I.b on QT, QTc intervals and heart rate in an anesthetized guinea pig

Влияние соединения формулы I.b на интервалы QT, QTc и частоту сердечных сокращений изучали на морских свинках под наркозом.The effect of the compound of formula I.b on QT intervals, QTc and heart rate was studied in guinea pigs under general anesthesia.

Самцов морской свинки линии Данкин-Хартли с массой тела в диапазоне 300-400 г анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции уретана (1,5 г/кг). Осуществляли трахеотомию и животному позволяли дышать спонтанно на протяжении всего эксперимента. Левую яремную вену катетеризировали с применением полиэтиленового катетера, заполненного гепаринизированным солевым раствором (100 МЕ/мл), для введения лекарственного средства. Электроды помещали в положение отведения II и записывали исходную ECG.Male Dunkin-Hartley guinea pigs weighing in the range of 300-400 g were anesthetized by intraperitoneal injection of urethane (1.5 g / kg). A tracheotomy was performed and the animal was allowed to breathe spontaneously throughout the experiment. The left jugular vein was catheterized using a polyethylene catheter filled with heparinized saline (100 IU / ml) for drug administration. The electrodes were placed in lead II position and the baseline ECG was recorded.

Для разных животных дозы соединения формулы I.b отвешивали в зависимости от массы тела и готовили в 0,5 мл DMSO, а затем вводили путем медленной внутривенной инфузии в течение 10 мин. ECG записывали в ходе инфузии, длящейся не более 0,5 ч, и после ее завершения. Интервалы QT и RR измеряли с применением программного обеспечения PowerLab 4SP®. Данные анализировали на 1, 5 и 10 мин в ходе инфузии и через 5, 10, 15 и 30 мин после инфузии, рассчитывая среднее по 9 систолам.For different animals, the doses of the compound of formula I.b were weighed according to body weight and formulated in 0.5 ml of DMSO and then administered by slow intravenous infusion over 10 minutes. ECG was recorded during the infusion, lasting no more than 0.5 hours, and after its completion. QT and RR intervals were measured using PowerLab 4SP® software. Data were analyzed at 1, 5 and 10 minutes during infusion and 5, 10, 15 and 30 minutes after infusion, calculating the average of 9 systoles.

При внутривенном введении соединения формулы I.b в дозе 1 мг/кг изменение интервалов QT отсутствовало.When a compound of formula I.b was administered intravenously at a dose of 1 mg / kg, there was no change in QT intervals.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1. Применение соединения формулы I для лечения или предупреждения болезни Паркинсона1. Use of a compound of formula I for the treatment or prevention of Parkinson's disease

где R₁ представляет собой -NHC(О)С_3-6циклоαлкил и R₂ представляет собой водород;where R ₁ is —NHC (O) C _3-6 cycloalkyl and R ₂ is hydrogen;

или R1 и R₂ вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют шестичленное ароматическое кольцо, при этом кольцо замещено одной или более группами, выбранными из водорода, галогена и C_1-3алкила;or R 1 and R ₂ together with the carbon atoms to which they are attached form a six-membered aromatic ring, the ring being substituted by one or more groups selected from hydrogen, halogen and C _1-3 alkyl;

R₃ и R₄ независимо выбраны из группы, включающей водород, галоген, C_1-3алкил, OC_1-3 алкил, NO₂, SC_1-3алкил, C_1-3галогеналкил, OC_1-3галогеналкил и SC_1-3гαлогеналкил.R ₃ and R _{4 are} independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, C _1-3 alkyl, OC _1-3 alkyl, NO ₂ , SC _1-3 alkyl, C _1-3 haloalkyl, OC _1-3 haloalkyl and SC _{1 -3} halogenoalkyl.

2. Применение по п.1, где R₃ и R4 в соединении формулы I выбраны из галогена и C_1-3αлкила.2. Use according to claim 1, wherein R ₃ and R 4 in the compound of formula I are selected from halogen and C _1-3 α alkyl.

3. Применение по п.1, где R1 в соединении формулы I представляет собой -NHC(О)циклопропил и R2 представляет собой водород.3. Use according to claim 1, wherein R1 in the compound of formula I is —NHC (O) cyclopropyl and R2 is hydrogen.

4. Применение по п.1, где соединение формулы I представляет собой (5-!5-[И-(2-х1ор-6метилбензоил)гидразинкарбонил] -2-метилфенилэтинил} пиридин-2-ил)амид циклопропанкарбоновой кислоты.4. Use according to claim 1, wherein the compound of formula I is cyclopropanecarboxylic acid (5-! 5- [I- (2-x1op-6methylbenzoyl) hydrazinecarbonyl] -2-methylphenylethynyl} pyridin-2-yl) amide of cyclopropanecarboxylic acid.

5. Применение по п.1, где соединение формулы I представляет собой N'-(2-\лор-6-метилбензоил)-4метил-3 - [2-(3 -хинолил)этинил] бензогидразид.5. Use according to claim 1, wherein the compound of formula I is N '- (2- \ lor-6-methylbenzoyl) -4methyl-3 - [2- (3-quinolyl) ethynyl] benzohydrazide.