EA037184B1 - Lipid comprising docosapentaenoic acid - Google Patents

Abstract

The present invention relates to extracted plant lipid or microbial lipid comprising docosapentaenoic acid, and processes for producing the extracted lipid.

Description

(54) ЛИПИД, СОДЕРЖАЩИЙ ДОКОЗАПЕНТАЕНОВУЮ КИСЛОТУ (31) 2014902471; 20140104761; РСТ/ AU2014/050433; 14/575,756 (32) 2014.06.27; 2014.12.18; 2014.12.18;(54) LIPID CONTAINING DOCOSAPENTAENIC ACID (31) 2014902471; 20140104761; PCT / AU2014 / 050433; 14 / 575,756 (32) 2014.06.27; 2014.12.18; 2014.12.18;

2014.12.18 (33) AU; AR; AU; US (43) 2017.06.30 (86) PCT/AU2015/050340 (87) WO 2015/196250 2015.12.30 (71)(73) Заявитель и патентовладелец:2014.12.18 (33) AU; AR; AU; US (43) 2017.06.30 (86) PCT / AU2015 / 050340 (87) WO 2015/196250 2015.12.30 (71) (73) Applicant and patentee:

КОММОНВЕЛТ САЙНТИФИКCOMMONVELT SIGNIFIC

ЭНД ИНДАСТРИЭЛ РИСЕРЧ ОРГАНИЗЭЙШН; НУСИД ПТИ ЛТД; ГРЕЙНЗ РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ КОРПОРЕЙШН (AU) (72) Изобретатель:AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANIZATION; NUSID PTI LTD; GRANES RESERVE AND DIVELOPMENT CORPORATION (AU) (72) Inventor:

Петри Джеймс Робертсон, Сингх Суриндер Пал, Шреста Пушкар, Макаллистер Джейсон Тимоти (AU), Дивайн Малколм Дэвид (СА), Де Фейтер Роберт Чарльз (AU) (74) Представитель:Petrie James Robertson, Singh Surinder Pal, Shresta Pushkar, McAllister Jason Timothy (AU), Devine Malcolm David (CA), De Feyter Robert Charles (AU) (74) Representative:

Рыбина Н.А., Рыбин В.Н. (RU) (56) US-A1-20100227924Rybina N.A., Rybin V.N. (RU) (56) US-A1-20100227924

WO-A1-2002092540WO-A1-2002092540

WO-A2-2007005727WO-A2-2007005727

WO-A1-2010147900WO-A1-2010147900

WO-A1-2010057246WO-A1-2010057246

WO-A2-2013185184WO-A2-2013185184

WO-A1-2005103253WO-A1-2005103253

037184 В1037184 B1

037184 Bl (57) Изобретение относится к экстрагированному растительному липиду или микробному липиду, содержащему докозапентаеновую кислоту, и способам получения экстрагированного липида.037184 Bl (57) The invention relates to an extracted plant lipid or microbial lipid containing docosapentaenoic acid and methods for producing the extracted lipid.

Область изобретенияScope of invention

Настоящее изобретение относится к липиду, содержащему докозапентаеновую кислоту, полученную из растительных клеток или микробных клеток, и способам получения и применения липида.The present invention relates to a lipid containing docosapentaenoic acid obtained from plant cells or microbial cells, and methods for producing and using the lipid.

Уровень техники изобретенияBackground of the invention

Длинноцепочечные омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ДЦ-ПНЖК) на сегодняшний день широко признаны как значимые соединения для здоровья человека и животных. Указанные жирные кислоты могут быть получены из пищевых источников или путем превращения линолевой (ЛК, 18:2ω6) или α-линоленовой (АЛК, 18:3 ω3) жирных кислот, обе из которых рассматриваются как незаменимые жирные кислоты в рационе человека. Хотя человек и многие другие позвоночные животные могут превращать ЛК или АЛК, полученные из растительных источников, в С22, они осуществляют такое превращение с очень низкой скоростью. Кроме того, большинству современных обществ присуще несбалансированное питание, в котором по меньшей мере 90% полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) составляют ω6 жирные кислоты, вместо соотношения 4:1 или менее для ω6:ω3 жирных кислот, которое считается идеальным (Trautwein, 2001). Непосредственным пищевым источником ДЦ-ПНЖК, например эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5ω3), докозапентаеновой кислоты (ДПК) и докозагексаеновой кислоты (ДГК, 22:6ω3), для человека в основном является рыба или рыбий жир. Таким образом, медицинские работники рекомендуют регулярно включать рыбу, содержащую значительные уровни ДЦ-ПНЖК в рацион человека. Все чаще полученные из рыбьего жира ДЦ-ПНЖК вводят, например, в пищевые продукты и детское питание. Однако за счет уменьшения глобальной и национальной ловли рыбы необходимы альтернативные источники указанных благоприятно влияющих на здоровье масел.Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) are widely recognized today as important compounds for human and animal health. These fatty acids can be obtained from food sources or by converting linoleic (LA, 18: 2ω6) or α-linolenic (ALA, 18: 3 ω3) fatty acids, both of which are considered essential fatty acids in the human diet. Although humans and many other vertebrates can convert plant-derived LA or ALA to C22, they do this at a very low rate. In addition, most modern societies have an unbalanced diet in which at least 90% of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are ω6 fatty acids, instead of a ratio of 4: 1 or less for ω6: ω3 fatty acids, which is considered ideal (Trautwein, 2001) ... The direct food source of DC-PUFA, for example, eicosapentaenoic acid (EPA, 20: 5ω3), docosapentaenoic acid (DPA) and docosahexaenoic acid (DHA, 22: 6ω3), for humans is mainly fish or fish oil. Thus, health professionals recommend regularly including fish containing significant levels of DC-PUFA in the human diet. More and more often, DC-PUFA obtained from fish oil are introduced, for example, into food products and baby food. However, by reducing global and national fishing, alternative sources of these health benefits are needed.

Цветковые растения, в противоположность животным, не обладают способностью синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты с длиной цепи более 18 атомов углерода. В частности, культивируемые и садовые растения, наряду с другими покрытосеменными, не содержат ферментов, необходимых для синтеза ω3 жирных кислот с более длинной цепью, например ЭПК, докозапентаеновой кислоты (ДПК, 22:5ω3) и ДГК, полученных из АЛК. Важной целью в биотехнологии растений, таким образом, является создание культивируемые растений, которые вырабатывают существенные количества ДЦПНЖК, таким образом обеспечивая альтернативный источник этих соединений.Flowering plants, in contrast to animals, do not have the ability to synthesize polyunsaturated fatty acids with a chain length of more than 18 carbon atoms. In particular, cultivated and garden plants, along with other angiosperms, do not contain the enzymes necessary for the synthesis of ω3 longer chain fatty acids, such as EPA, docosapentaenoic acid (DPC, 22: 5ω3) and DHA derived from ALA. An important goal in plant biotechnology, therefore, is to create cultivated plants that produce significant amounts of LCPUFA, thus providing an alternative source of these compounds.

Пути биосинтеза ДЦ-ПНЖК.Pathways of DC-PUFA biosynthesis.

Биосинтез ДЦ-ПНЖК в организмах, таких как микроводоросли, мхи и грибы, обычно происходит как серия реакций кислород-зависимой десатурации и элонгации (фиг. 1). Самый распространенный путь получения ЭПК в указанных организмах включает Δ6-десаmурацию, Δ6-элонгацию и Δ5-десатурацию (называется путем Δ6-десатурации), тогда как в менее распространенном пути используется Δ9элонгация, Δ8-десатурация и Δ5-десатурация (носит название пути Δ9-десаmурации). Указанные последовательные реакции десатурации и элонгации могут начинаться с субстрата Δ6 жирной кислоты ЛК, схематически проиллюстрированного в верхней левой части фиг. 1 (ω6) или субстрата ω3 АЛК до ЭПК, проиллюстрированного на нижней правой части фиг. 1 (ω3). Если начальная Δ6-десатурация осуществляется на субстрате ω6 ЛК, продукт серии из трех ферментов ДЦ-ПНЖК будет представлять собой ω6 жирную арахидоновую кислоту (АРК). Организмы, синтезирующие ДЦ-ПНЖК, могут превращать ω6 жирных кислот в ω3 жирные кислоты с использованием ω3-десатуразы, что проиллюстрировано как стадия Δ 17-десатуразы на фиг. 1, для превращения арахидоновой кислоты (АРК, 20:4ω6) в ЭПК. Некоторые члены семейства ω3-десатуразы могут воздействовать на различные субстраты, варьирующие от ЛК до АРК. Растительные ω3-десатуразы часто специфично катализируют Δ15-десатурацию ЛК до АЛК, тогда как грибковые и дрожжевые ω3-десатуразы могут быть специфичными в отношении Δ 17-десатурации АРК до ЭПК (Pereira et al., 2004а; Zank et al., 2005). Некоторые отчеты наводят на мысль о том, что могут существовать неспецифичные ω3-десатуразы, способные превращать широкий спектр ω6 субстратов в соответствующие ω3 продукты (Zhang et al., 2008).The biosynthesis of DC-PUFA in organisms such as microalgae, mosses and fungi usually occurs as a series of reactions of oxygen-dependent desaturation and elongation (Fig. 1). The most common pathways for EPA production in these organisms include Δ6 desaturation, Δ6 elongation, and Δ5 desaturation (called the Δ6 desaturation pathway), while the less common pathway uses Δ9 elongation, Δ8 desaturation, and Δ5 desaturation (referred to as the Δ9 desaturation pathway). desamuration). These sequential desaturation and elongation reactions may start from the Δ6 fatty acid LC substrate, schematically illustrated in the upper left of FIG. 1 (ω6) or ω3 ALA substrate to EPA illustrated in the lower right portion of FIG. 1 (ω3). If the initial Δ6-desaturation is carried out on the substrate ω6 LA, the product of a series of three enzymes DC-PUFA will be ω6 fatty arachidonic acid (ARA). Organisms synthesizing DC-PUFA can convert ω6 fatty acids to ω3 fatty acids using ω3 desaturase, as illustrated as the Δ 17 desaturase step in FIG. 1, for the conversion of arachidonic acid (ARA, 20: 4ω6) to EPA. Some members of the ω3 desaturase family can act on a variety of substrates ranging from LA to ARA. Plant ω3 desaturases often specifically catalyze Δ15 desaturation of LA to ALA, whereas fungal and yeast ω3 desaturases may be specific for Δ 17 desaturation of ARA to EPA (Pereira et al., 2004a; Zank et al., 2005). Several reports suggest that there may be nonspecific ω3 desaturases capable of converting a wide range of ω6 substrates into corresponding ω3 products (Zhang et al., 2008).

Превращение ЭПК в ДГК в таких организмах происходит путем Δ5-элонгации ЭПК с образованием ДПК, после чего следует Δ4-десатурация с образованием ДГК (фиг. 1). И наоборот, млекопитающие используют так называемый путь Шпрехера, в котором ДНК превращается в ДГК в ходе трех отдельных реакций, независимых от Δ4-десатуразы (Sprecher et al., 1995).The conversion of EPA to DHA in such organisms occurs by Δ5-elongation of EPA with the formation of duodenum, followed by Δ4-desaturation with the formation of DHA (Fig. 1). Conversely, mammals use the so-called Sprecher pathway, in which DNA is converted to DHA in three separate reactions independent of Δ4 desaturase (Sprecher et al., 1995).

Фронт-энд десатуразы, в общем найденные в растениях, мхах, микроводорослях и низших животных, например Caenorhabditis elegans, в основном принимают субстраты жирных кислот, этерифицированных в положении sn-2 фосфатидилхолинового (ФХ) субстрата. Указанные десатуразы, таким образом, известны как ацил-ФХ, связанные с липидом, фронт-энд десатуразы (Domergue et al., 2003). И наоборот, фронт-энд десатуразы высших животных в общем принимают субстраты ацил-КоА, где жирнокислотный субстрат связан с КоА вместо ФХ (Domergue et al., 2005). Известно, что некоторые десатуразы микроводорослей и одна растительная десатураза используют жирнокислотные субстраты, этерифицированные до КоА (табл. 2).Front-end desaturases, generally found in plants, mosses, microalgae and lower animals such as Caenorhabditis elegans, primarily accept fatty acid substrates esterified at the sn-2 position of the phosphatidylcholine (PC) substrate. These desaturases are thus known as lipid-associated front-end desaturase acyl-PCs (Domergue et al., 2003). Conversely, the front-end desaturases of higher animals generally accept acyl-CoA substrates, where the fatty acid substrate is bound to CoA instead of PC (Domergue et al., 2005). It is known that some desaturases of microalgae and one plant desaturase use fatty acid substrates esterified to CoA (Table 2).

Каждая реакция элонгации ПНЖК состоит из четырех стадий, катализируемых многокомпонентным белковым комплексом: вначале реакция конденсации приводит к добавлению модуля 2С из мало- 1 037184 нил-КоА к жирной кислоте, результатом чего является образование β-кетоацильного промежуточного соединения. Далее оно восстанавливается НАДФ-Н, с последующей дегидратацией и образованием еноильного промежуточного соединения. В конце, данное промежуточное соединение повторно восстанавливается с образованием удлиненной жирной кислоты. В общем, считается, что стадия конденсации в числе указанных четырех реакций является специфичной для субстрата, а другие стадии - нет. На практике это означает, что природный аппарат элонгации растения способен к элонгации ПНЖК при условии, что введен конденсационный фермент (обычно под названием элонгаза), специфичный в отношении ПНЖК, хотя эффективность природного аппарата элонгации растения с точки зрения элонгации неприродных субстратов ПНЖК может быть низкой. В 2007 году была опубликована информация относительно идентификации и описания цикла элонгации дегидратазы дрожжей (Denic и Weissman, 2007).Each polyunsaturated fatty acid elongation reaction consists of four stages catalyzed by a multicomponent protein complex: first, the condensation reaction leads to the addition of a 2C module from a malo- 1037184 nyl-CoA to a fatty acid, resulting in the formation of a β-ketoacyl intermediate. It is then reduced with NADPH, followed by dehydration and the formation of an enoyl intermediate. Finally, this intermediate is re-reduced to form an extended fatty acid. In general, the condensation step of these four reactions is considered to be substrate specific, while the other steps are not. In practice, this means that the natural plant elongation apparatus is capable of PUFA elongation, provided that a condensation enzyme (usually called elongase) specific for PUFA is introduced, although the efficiency of the natural plant elongation apparatus in terms of elongation of non-natural PUFA substrates may be low. In 2007, information was published regarding the identification and description of the yeast dehydratase elongation cycle (Denic and Weissman, 2007).

Десатурация ПНЖК в растениях, мхах и микроводорослях естественным путем происходит на жирнокислотных субстратах, в основном в пуле ацил-ФХ, тогда как элонгация происходит на субстратах в пуле ацил-КоА. Перенос жирных кислот от молекул ацил-ФХ к носителю КоА выполняется фосфолипазами (ФЛА), тогда как перенос жирных кислот ацил-КоА к носителю ФХ выполняется лизофосфатидилхолин ацилтрансферазами (ЛФХАТ) (Singh et al., 2005).Desaturation of PUFA in plants, mosses and microalgae occurs naturally on fatty acid substrates, mainly in the acyl-PC pool, while elongation occurs on substrates in the acyl-CoA pool. The transfer of fatty acids from the acyl-PC molecules to the CoA carrier is performed by phospholipases (PLA), while the transfer of acyl-CoA fatty acids to the PC carrier is carried out by lysophosphatidylcholine acyltransferases (LPCAT) (Singh et al., 2005).

Сконструированная выработка ДЦ-ПНЖК.Designed production of DC-PUZhK.

Большая часть метаболического конструирования ДЦ-ПНЖК осуществлялась с использованием аэробного пути Δ6-десатурация/элонгация. О биосинтезе γ-линоленовой кислоты (ГЛК, 18:3 ω6) в табаке с использованием Δ6-десатуразы из цианобактерии Synechocystis впервые сообщалось в 1996 г. (Reddy и Thomas, 1996). Позже ГЛК была получена в культивируемых растениях, таких как сафлор (73% ГЛК в масле из семян; WO 2006/127789) и соя (28% ГЛК; Sato et al., 2004). Выработка ДЦ-ПНЖК, например ЭПК и ДГК, включает более сложное конструирование за счет увеличения количества вовлеченных стадий десатурации и элонгации. О выработке ЭПК в наземном растении впервые сообщалось Qi et al. (2004), которые ввели гены, кодирующие Δ9-элонгазу из Isochrysis galbana, Δ8-десатуразу из Euglena gracilis и Δ5-десаmуразу из Mortierella alpina в Arabidopsis с получением до 3% ЭПК. Данная работа была завершена Abbadi et al. (2004), которые сообщали о выработке до 0,8% ЭПК в зерне льна с использованием генов, кодирующих Δ6-десатуразу и Δ6-элонгазу из Physcomitrella patens и Δ5-десатуразу из Phaeodactylum tricornutum.Most of the metabolic construction of DC-PUFAs was carried out using the aerobic Δ6-desaturation / elongation pathway. The biosynthesis of γ-linolenic acid (GLA, 18: 3 ω6) in tobacco using Δ6 desaturase from the cyanobacterium Synechocystis was first reported in 1996 (Reddy and Thomas, 1996). Later, GLA was obtained in cultivated plants such as safflower (73% GLA in seed oil; WO 2006/127789) and soybeans (28% GLA; Sato et al., 2004). The production of DC-PUFAs, such as EPA and DHA, involves more sophisticated design by increasing the number of desaturation and elongation steps involved. EPA production in a terrestrial plant was first reported by Qi et al. (2004), who introduced genes encoding Δ9-elongase from Isochrysis galbana, Δ8-desaturase from Euglena gracilis, and Δ5-desamurase from Mortierella alpina into Arabidopsis, yielding up to 3% EPA. This work was completed by Abbadi et al. (2004), who reported the production of up to 0.8% EPA in flaxseed using genes encoding Δ6-desaturase and Δ6-elongase from Physcomitrella patens and Δ5-desaturase from Phaeodactylum tricornutum.

Первый отчет о получении ОДЦ-ДГК содержится в WO 04/017467, где раскрыта выработка 3% ДГК в зародышах сои, но не семени, посредством введения генов, кодирующих Δ6-десатуразу Saprolegnia diclina, Δ6-десатуразу Mortierella alpina, Δ5-десатуразу Mortierella alpina, Δ4-десаmуразу Saprolegnia diclina, Δ 17-десатуразу Saprolegnia diclina, Δ6-элонгазу Mortierella alpina и Δ5-элонгазу Pavlova lutheri. Максимальный уровень ЭПК в эмбрионах, также вырабатывающих ДГК, составлял 19,6%, указывая на низкую эффективность превращения ЭПК в ДГК (WO 2004/071467). Это открытие было подобно опубликованному Robert et al. (2005), где выход превращения ЭПК в ДГК был низким, с выработкой 3% ЭПК и 0,5% ДГК в Arabidopsis с использованием Δ5/6-дсаτуразы Danio rerio, Δ6-элонгазы Caenorhabditis elegans, и Δ5-элонгазы и Δ4-десатуразы Pavlova salina. Также в 2005 г. Wu et al. опубликовали сообщение о выработке 25% АРК, 15% ЭПК и 1,5% ДГК в Brassica juncea с использованием Δ6-десатуразы Pythium irregulare, Δ5-десатуразы Thraustochytrid, Δ6-элонгазы Physcomitrella patens, Δ12-десатуразы Calendula officianalis, Δ5-элонгазы Thraustochytrid, Δ 17-десатуразы Phytophthora infestans, элонгазы ДЦ-ПНЖК Oncorhyncus mykiss, Δ4-десатуразы Thraustochytrid и ЛФХАТ Thraustochytrid (Wu et al., 2005). Краткое описание усилий по получению урожая семян масличных культур, которые синтезирует ω3 ДЦ-ПНЖК, приведено в Venegas-Caleron et al. (2010) и Ruiz-Lopez et al. (2012). Как указано Ruiz-Lopez et al. (2012), на дату публикации результаты по получению ДГК в трансгенных растениях даже отдаленно не напоминают уровни, наблюдаемых в рыбьем жире. Позже Petrie et al. (2012) сообщали о выработке около 15% ДГК в семенах Arabidopsis thaliana, и в WO2013/185184 сообщалось о выработке некоторых масел из семян, содержащих от 7 до 20% ДГК. Однако не существует сообщений о выработке растительных масел, содержащих более 20% ДГК.The first report on the production of ODC-DHA is contained in WO 04/017467, which discloses the production of 3% DHA in soybean embryos, but not in the seed, through the introduction of genes encoding Saprolegnia diclina Δ6 desaturase, Mortierella alpina Δ6 desaturase, Mortierella alpina Δ5 desaturase , Δ4-desamurase Saprolegnia diclina, Δ 17-desaturase Saprolegnia diclina, Δ6-elongase Mortierella alpina, and Δ5-elongase Pavlova lutheri. The maximum level of EPA in embryos also producing DHA was 19.6%, indicating a low conversion efficiency of EPA to DHA (WO 2004/071467). This discovery was similar to that published by Robert et al. (2005), where the yield of conversion of EPA to DHA was low, with 3% EPA and 0.5% DHA production in Arabidopsis using Danio rerio Δ5 / 6-dsaturase, Caenorhabditis elegans Δ6-elongase, and Δ5-elongase and Δ4-desaturase Pavlova salina. Also in 2005, Wu et al. published a report on the production of 25% ARA, 15% EPA and 1.5% DHA in Brassica juncea using Δ6-desaturase Pythium irregulare, Δ5-desaturase Thraustochytrid, Δ6-desaturase Physcomitrella patens, Δ12-desaturase Calendula officianalis, Δ5-elongase, Thraustochytrid Phytophthora infestans Δ 17 desaturase, Oncorhyncus mykiss DC PUFA elongase, Thraustochytrid Δ4 desaturase, and Thraustochytrid LPKHAT (Wu et al., 2005). A summary of efforts to harvest oilseeds synthesized by ω3 DC-PUFA is given in Venegas-Caleron et al. (2010) and Ruiz-Lopez et al. (2012). As indicated by Ruiz-Lopez et al. (2012), at the date of publication, the results for DHA production in transgenic plants do not even remotely resemble the levels observed in fish oil. Later, Petrie et al. (2012) reported about 15% DHA production in Arabidopsis thaliana seeds, and WO2013 / 185184 reported the production of some oils from seeds containing 7 to 20% DHA. However, there are no reports of the production of vegetable oils containing more than 20% DHA.

Не существует сообщений о выработке ДПК в рекомбинантных клетках на значимых уровнях без сопутствующей выработки ДГК. В действительности, авторам настоящего изобретения неизвестно о какой-либо опубликованной наводящей мысли или идее выработки ДПК в рекомбинантные клетках без выработки ДГК.There are no reports of the production of duodenum in recombinant cells at significant levels without concomitant DHA production. In fact, the present inventors are not aware of any published clue or idea of producing duodenum in recombinant cells without producing DHA.

Таким образом, остается потребность в более эффективной выработке ДЦ-ПНЖК в рекомбинантных клетках, в частности ДПК в семенах растений масличных культур.Thus, there remains a need for a more efficient production of DC-PUFA in recombinant cells, in particular, duodenum in oil seeds.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Некоторые организмы вырабатывают масло с содержанием ДПК более чем 1-2% и, таким образом, существуют ограниченные возможности выработки ДПК в больших масштабах в природных источниках, если они вообще существуют. Авторами настоящего изобретения идентифицированы способы и растения для выработки липида с намного более высокими уровнями ДПК, чем в природных источниках.Some organisms produce oil with more than 1–2% WPC and thus there is limited, if any, production of WPC on a large scale from natural sources. The present inventors have identified methods and plants for the production of lipid with much higher levels of Duodenum than in natural sources.

В первом аспекте изобретения предлагается экстрагированный липид, предпочтительно экстрагированный растительный липид или экстрагированный микробный липид, содержащий жирные кислоты вIn a first aspect, the invention provides an extracted lipid, preferably an extracted plant lipid or an extracted microbial lipid containing fatty acids in

- 2 037184 этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие αлиноленовую кислоту (АЛК) и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), и при этом уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 35%. В вариантах реализации данного аспекта, уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7, около 8, около 9, около 10, около 12, около 15, около 18, около 20, около 22, около 24, около 26, около 28, около 30, от около 7 до около 28%, от около 7 до около 25%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25% или от около 16 до около 22%.- 2,037184 esterified form, where fatty acids include oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids including linoleic acid (LA), ω3 fatty acids including α-linolenic acid (ALA) and docosapentaenoic acid (DPA), and optionally one or more of stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA) and eicosatetraenoic acid (ETA), and the level of DPA in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 7 to 35%. In embodiments of this aspect, the level of DPC in the total fatty acid content of the extracted lipid is about 7, about 8, about 9, about 10, about 12, about 15, about 18, about 20, about 22, about 24, about 26, about 28, about 30, about 7 to about 28%, about 7 to about 25%, about 10 to 35%, about 10 to about 30%, about 10 to about 25%, about 10 to about 22 %, about 14 to 35%, about 16 to 35%, about 16 to about 30%, about 16 to about 25%, or about 16 to about 22%.

В варианте реализации упомянутого выше аспекта ДГК присутствует на уровне менее чем 2 или менее чем 0,5% от общего содержания жирных кислот экстрагированного липида и более предпочтительно отсутствует в общем содержании жирных кислот липида.In an embodiment of the above aspect, DHA is present at less than 2% or less than 0.5% of the total fatty acid content of the extracted lipid, and more preferably absent in the total fatty acid content of the lipid.

В другом аспекте изобретения предлагается экстрагированный липид, предпочтительно экстрагированный растительный липид или экстрагированный микробный липид, содержащий жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и при этом по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицированы в положении sn-2 ТАГ. В варианте реализации изобретения экстрагированный липид дополнительно обладает одним или более или всеми признаками из (i) он содержит жирные кислоты, включая олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие кислоту линолевую (ЛК), ω 3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), (ii) по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 48%, от 35 до около 60% или от 35 до около 50% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицированы в положении sn-2 ТАГ, и (iii) уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до 35%, или от около 7 до 35%, или от около 20,1 до 35%. В вариантах реализации данного аспекта уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7, около 8, около 9, около 10, около 12, около 15, около 18, около 20, около 22, около 24, около 26, около 28, около 30%, от около 7 до около 28%, от около 7 до около 25%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25% или от около 16 до около 22%. В предпочтительных вариантах реализации изобретения экстрагированный липид обладает признаками (i) и (ii), (i) и (iii) или (ii) и (iii), более предпочтительно всеми из (i), (ii) и (iii). Предпочтительно экстрагированный липид дополнительно характеризуется уровнем пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, который составляет от около 2 до 16%, и, при этом, уровень миристиновой кислоты (С14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, если она присутствует, составляет менее 1%.In another aspect, the invention provides an extracted lipid, preferably an extracted plant lipid or an extracted microbial lipid, comprising fatty acids in an esterified form, the fatty acids comprising docosapentaenoic acid (DPA) and wherein at least 35% DPA esterified in the form of triacylglyceride (TAG) , esterified at the sn-2 position of TAG. In an embodiment, the extracted lipid further has one or more or all of the features of (i) it contains fatty acids including oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids including linoleic acid (LA), ω 3 fatty acids including α-linolenic acid (ALA), and optionally one or more of stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA) and eicosatetraenoic acid (ETA), (ii) at least about 40, at least about 45, at least about 48% , from 35 to about 60% or from 35 to about 50% of the duodenum esterified in the form of triacylglyceride (TAG) are esterified at the sn-2 position of the TAG, and (iii) the level of duodenum in the total fatty acids of the extracted lipid is from about 1 to 35%, or about 7 to 35%, or about 20.1 to 35%. In embodiments of this aspect, the level of DPC in the total fatty acid content of the extracted lipid is about 7, about 8, about 9, about 10, about 12, about 15, about 18, about 20, about 22, about 24, about 26, about 28 about 30%, about 7 to about 28%, about 7 to about 25%, about 10 to 35%, about 10 to about 30%, about 10 to about 25%, about 10 to about 22 %, about 14 to 35%, about 16 to 35%, about 16 to about 30%, about 16 to about 25%, or about 16 to about 22%. In preferred embodiments, the extracted lipid has features (i) and (ii), (i) and (iii) or (ii) and (iii), more preferably all of (i), (ii) and (iii). Preferably, the extracted lipid is further characterized by the level of palmitic acid in the total fatty acid content of the extracted lipid, which is from about 2 to 16%, and, furthermore, the level of myristic acid (C14: 0) in the total fatty acid content of the extracted lipid, if present, is less than 1%.

Варианты реализации каждого из описанных выше аспектов более подробно раскрыты ниже. Как будет понятно квалифицированному специалисту, любые из признаков описанного варианта реализации изобретения, которые являются шире соответствующего признака в упомянутом выше аспекте, не применяются к данному аспекту.Embodiments of each of the above aspects are disclosed in more detail below. As will be understood by the skilled person, any of the features of the described embodiment that are broader than the corresponding feature in the above aspect do not apply to this aspect.

В варианте реализации изобретения экстрагированный липид обладает одним или более из следующих признаков:In an embodiment of the invention, the extracted lipid has one or more of the following features:

i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 18%, от около 2 до 16%, от около 2 до 15% или от около 3 до около 10%, ii) уровень миристиновой кислоты (С14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее 6, менее 3, менее 2, менее 1 или около 0,1%, iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до около 30%, от около 3 до около 30%, от около 6 до около 30%, от 1 до около 20%, от около 30 до около 60%, от около 45 до около 60%, около 30 или от около 15 до около 30%, iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, от около 4 до около 20%, от около 4 до около 17% или от около 5 до около 10%,i) the level of palmitic acid in the total fatty acid of the extracted lipid is about 2 to 18%, about 2 to 16%, about 2 to 15%, or about 3 to about 10%, ii) the level of myristic acid (C14: 0) in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than 6, less than 3, less than 2, less than 1, or about 0.1%, iii) the level of oleic acid in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 1 to about 30%, from about 3 to about 30%, about 6 to about 30%, 1 to about 20%, about 30 to about 60%, about 45 to about 60%, about 30 or about 15 to about 30%, iv ) the level of linoleic acid (LA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 4 to about 35%, from about 4 to about 20%, from about 4 to about 17%, or from about 5 to about 10%,

v) уровень α-линоленовой кислоты (АПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, от около 7 до около 40%, от около 10 до около 35%, от около 20 до около 35%, от около 4 до 16% или от около 2 до 16%, vi) уровень γ-линоленовой кислоты (ГЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4, менее чем около 3, менее чем около 2, менее чем около 1, менее чем около 0,5%, от 0,05 до около 7%, от 0,05 до около 4%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%, vii) уровень стеаридоновой кислоты (СДК) в общем содержании жирных кислот экстрагированногоv) the level of α-linolenic acid (APA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 4 to about 40%, from about 7 to about 40%, from about 10 to about 35%, from about 20 to about 35%, about 4 to 16%, or about 2 to 16%, vi) the level of γ-linolenic acid (GLA) in the total fatty acids of the extracted lipid is less than 4, less than about 3, less than about 2, less than about 1 less than about 0.5%, 0.05 to about 7%, 0.05 to about 4%, 0.05 to about 3%, or 0.05 to about 2%, vii) stearidonic acid level (SDA) in the total fatty acid content of the extracted

- 3 037184 липида составляет менее чем около 10, менее чем около 8, менее чем около 7, менее чем около 6, менее чем около 4, менее чем около 3%, от около 0,05 до около 7%, от около 0,05 до около 6%, от около 0,05 до около 4%, от около 0,05 до около 3%, от около 0,05 до около 10% или от 0,05 до около 2%, viii) уровень эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 6, менее чем около 5, менее чем около 4, менее чем около 1, менее чем около 0,5%, от 0,05 до около 6%, от 0,05 до около 5%, от 0,05 до около 4%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%, ix) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее 4, менее 2%, менее чем около 1%, от 0,05 до 4%, от 0,05 до 3% или от 0,05 до около 2% или от 0,05 до около 1%,3,037184 lipids are less than about 10, less than about 8, less than about 7, less than about 6, less than about 4, less than about 3%, from about 0.05 to about 7%, from about 0, 05 to about 6%, about 0.05 to about 4%, about 0.05 to about 3%, about 0.05 to about 10%, or 0.05 to about 2%, viii) eicosatetraenoic acid level (ETA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than about 6, less than about 5, less than about 4, less than about 1, less than about 0.5%, from 0.05 to about 6%, from 0 , 05 to about 5%, 0.05 to about 4%, 0.05 to about 3%, or 0.05 to about 2%, ix) the level of eicosatrienoic acid (ETRA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than 4, less than 2%, less than about 1%, from 0.05 to 4%, from 0.05 to 3%, or from 0.05 to about 2%, or from 0.05 to about 1%,

х) уровень эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 15%, менее чем 4%, менее чем около 3, менее чем около 2%, от 0,05 до 10%, от 0,05 до 5%, от 0,05 до 3% или от 0,05 до 2%, xi) липид содержит ω6-докозаnентаеновую кислоту (22:5Δ^4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот, xii) липид содержит менее 0,1% ω6-докозапентаеновой кислоты (22:5Δ^4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот, xiii) липид содержит менее 0,1% одной или более или всех из СДК, ЭПК и ЭТК в числе содержащихся в нем жирных кислот, xiv) уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, от около 4 до около 20%, от около 6% до около 20% или от около 6% до около 12%, xv) уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, от около 4 до около 35%, от около 8 до около 25%, от 8 до около 22%, от около 15 до около 40% или от около 15 до около 35%, xvi) уровень общих поли ненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, от около 30 до около 75%, от около 50 до около 75%, около 60, около 65, около 70, около 75% или от около 60 до около 75%, xvii) уровень общих ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 35 до около 50%, от около 20 до около 35%, от около 6 до 20%, менее чем 20%, менее чем около 16, менее чем около 10%, от около 1 до около 16%, от около 2 до около 10% или от около 4 до около 10%, xviii) уровень новых ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 10, менее чем около 8, менее чем около 6%, менее чем 4%, от около 1 до около 20%, от около 1 до около 10%, от 0,5 до около 8% или от около 0,5 до 4%, xix) уровень общих ω 3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 36 до около 65%, от 36 до около 70%, от около 40 до около 60%, от около 30 до около 60%, от около 35 до около 60%, от 40 до около 65%, от около 30 до около 65%, от около 35 до около 65%, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65 или около 70%, хх) уровень новых ω 3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 21 до около 45%, от 21 до около 45%, от около 23 до около 35%, от около 25 до около 35%, от около 27 до около 35%, около 23, около 25, около 27, около 30, около 34, около 40 или около 45%, xxi) соотношение общих ω6 жирных кислот: общих ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляеоот от около 1,0 до около 3,0, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 1,0, около 0,1, от около 0,1 до около 0,4 или около 0,2, xxii) соотношение новых ω6 жирных кислот: новых ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1,0 до около 3,0, от около 0,02 до около 0,1, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 0,02, около 0,05, около 0,1, около 0,2 или около 1,0, xxiii) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80%, от около 60 до около 98%, от около 70 до около 95% или от около 75 до около 90%, xxiv) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения АЛК в СДК под действием Δ6-десатуразы по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70%, от около 30 до около 70%, от около 35 до около 60% или от около 50 до около 70%, xxv) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения СДК в кислотуx) The level of eicosapentaenoic acid (EPA) in the total fatty acids of the extracted lipid is 4 to 15%, less than 4%, less than about 3, less than about 2%, from 0.05 to 10%, from 0.05 to 5%, 0.05 to 3%, or from 0.05 to 2%, xi) the lipid comprises ω6-dokozanentaenovuyu acid (22: 5Δ ^{4,7,10,13,16)} including therein contained fatty acids, xii) the lipid comprises less than 0,1% ω6-docosapentaenoic acid (22: 5Δ ^{4,7,10,13,16)} include fatty acids contained in it, xiii) the lipid comprises less than 0.1% of one or more or all of the SDA, EPA and ETA in the number of fatty acids it contains, xiv) the level of total saturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 4 to about 25%, from about 4 to about 20%, from about 6% to about 20% or about 6% to about 12%, xv) the level of total monounsaturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 4 to about 40%, from about 4 to about 35%, from about 8 to about 25%, 8 to about 22%, about 15 to about 40%, or about 15 to about 35%, xvi) the level of total polyunsaturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 20 to about 75%, about 30 to about 75%, about 50 to about 75%, about 60, about 65, about 70, about 75%, or about 60 to about 75%, xvii) the level of total ω6 fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 35 to about 50%, from about 20 to about 35%, from about 6 to 20%, less than 20%, less than about 16, less than about 10%, from about 1 to about 16%, from about 2 to about 10%, or about 4 to about 10%, xviii) the level of new ω6 fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than about 10, less than about 8, less than about 6%, less than 4% , from about 1 to about 20%, from about 1 to about 10%, from 0.5 to about 8%, or from about 0.5 to 4%, xix) the level of total ω 3 fatty acids in the total content of fatty acids t of the extracted lipid is from 36 to about 65%, from 36 to about 70%, from about 40 to about 60%, from about 30 to about 60%, from about 35 to about 60%, from 40 to about 65%, from about 30 to about 65%, about 35 to about 65%, about 35, about 40, about 45, about 50, about 55, about 60, about 65 or about 70%, xx) new ω 3 fatty acid levels in total the fatty acid content of the extracted lipid is 21 to about 45%, 21 to about 45%, about 23 to about 35%, about 25 to about 35%, about 27 to about 35%, about 23, about 25, about 27, about 30, about 34, about 40, or about 45%, xxi) the ratio of total ω6 fatty acids: total ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is from about 1.0 to about 3.0, from about 0, 1 to about 1, about 0.1 to about 0.5, less than about 0.50, less than about 0.40, less than about 0.30, less than about 0.20, less than about 0.15 , about 1.0, about 0.1, about 0.1 to about 0.4, or about 0.2, xxii) resp. wearing new ω6 fatty acids: new ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is from about 1.0 to about 3.0, from about 0.02 to about 0.1, from about 0.1 to about 1, from about 0.1 to about 0.5, less than about 0.50, less than about 0.40, less than about 0.30, less than about 0.20, less than about 0.15, about 0.02, about 0.05, about 0.1, about 0.2, or about 1.0, xxiii) the fatty acid composition of the lipid is based on the efficiency of the conversion of oleic acid to LA by Δ12 desaturase at least about 60, at least about 70, at least about 80%, about 60 to about 98%, about 70 to about 95%, or about 75 to about 90%, xxiv) the fatty acid composition of the lipid is based on the efficiency of conversion of ALA to CDA by Δ6 desaturase by at least about 30, at least about 40, at least about 50, at least about 60, at least about 70%, about 30 to about 70%, about 35 to about 60%, or about 50 to about about 70%, xxv) the fatty acid composition of the lipid is based on the efficiency of converting SDA into acid

- 4 037184- 4 037184

ЭТК под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 88% или от около 75 до около 85%, xxvi) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения ЭТК в ЭПК под действием Δ5-десатуразы по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере околоETA by Δ6-elongase at least about 60, at least about 70, at least about 75%, about 60 to about 95%, about 70 to about 88%, or about 75 to about 85%, xxvi ) the fatty acid composition of the lipid is based on the efficiency of conversion of ETA to EPA by Δ5-desaturase at least about 60, at least about 70, at least about

75%, от около 60 до около 99%, от около 70 до около 99% или от около 75 до около 98%, xxvii) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, от около 50 до около 99%, от около 85 до около 99%, от около 50 до около 95% или от около 85 до около 95%, xxviii) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ДПК по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25%, около 20, около 25, около 30%, от около 10 до около 50%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25% или от около 20 до около 30%, xxix) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения ЛК в ДПК по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 40%, около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50%, от около 15 до около 50%, от около 20 до около 40% или от около 20 до около 30%, ххх) состав жирных кислот липида основывается на эффективности превращения АЛК в ДПК по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 30%, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60%, от около 22 до около 70%, от около 17 до около 55%, от около 22 до около 40% или от около 24 до около 40%, xxxi) общие жирные кислоты в экстрагированном липиде содержат менее чем 1,5% С20:1, менее чем 1% С20:1 или около 1% С20:1, xxxii) содержание триацилглицерида (ТАГ) в липиде составляет по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере 95%, от около 70 до около 99% или от около 90 до около 99%, xxxiii) липид содержит диацилглицерид (ДАГ), причем ДАГ предпочтительно содержит ДПК, xxxiv) липид содержит менее чем около 10, менее чем около 5, менее чем около 1% или от около 0,001 до около 5% свободных (неэтерифицированных) жирных кислот и/или фосфолипида, или по существу не содержит их, xxxv) по меньшей мере 70, по меньшей мере 72 или по меньшей мере 80% этерифицированной ДПК в форме ТАГ находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ, xxxvi) наиболее распространенными ДПК-содержащими видами ТАГ в липиде являются ДПК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), липид, содержащий три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:18), и xxxvii) уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7, около 8, около 9, около 10, около 12, около 15, около 18, около 20, около 22, около 24, около 26, около 28, около 31%, от около 7 до около 31%, от около 7 до около 28%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25% или от около 16 до около 22%, причем уровень ДГК необязательно составляет менее чем 0,5% от общего содержания жирных кислот экстрагированного липида.75%, about 60 to about 99%, about 70 to about 99%, or about 75 to about 98%, xxvii) the fatty acid composition of the lipid is based on the efficiency of conversion of EPA to DPC by Δ5-elongase at least about 80 at least about 85%, at least about 90%, about 50 to about 99%, about 85 to about 99%, about 50 to about 95%, or about 85 to about 95%, xxviii) composition fatty acids lipid based on the efficiency of converting oleic acid to DPC at least about 10, at least about 15, at least about 20, at least about 25%, about 20, about 25, about 30%, about 10 to about 50%, about 10 to about 30%, about 10 to about 25%, or about 20 to about 30%, xxix) the fatty acid composition of the lipid is based on the efficiency of converting LA to DPC at least about 15, at least about 20, at least about 22, at least about 25, at least about 30, at least about 40%, about 25, about 30, about 3 5, about 40, about 45, about 50%, about 15 to about 50%, about 20 to about 40%, or about 20 to about 30%, xxx) the fatty acid composition of the lipid is based on the efficiency of the conversion of ALA to DPC by at least about 17, at least about 22, at least about 24, at least about 30%, about 30, about 35, about 40, about 45, about 50, about 55, about 60%, about 22 to about 70%, about 17 to about 55%, about 22 to about 40%, or about 24 to about 40%, xxxi) the total fatty acids in the extracted lipid contain less than 1.5% C20: 1, less than 1 % C20: 1 or about 1% C20: 1, xxxii) the content of triacylglyceride (TAG) in the lipid is at least about 70, at least about 80, at least about 90, at least 95%, from about 70 to about 99% or about 90 to about 99%, xxxiii) the lipid contains diacylglyceride (DAG), and the DAG preferably contains DPC, xxxiv) the lipid contains less than about 10, less than about 5, less than about 1%, or about 0.001 to about 5% or substantially free of free (non-esterified) fatty acids and / or phospholipid, xxxv) at least 70, at least 72, or at least 80% of the esterified DPA in the form of TAG is in the sn- position 1 or sn-3 TAG, xxxvi), the most common DPC-containing TAG species in lipid are DPC / 18: 3/18: 3 (TAG 58:12), a lipid containing tri-DPC TAG (TAG 66:18), and xxxvii) the level of DPC in the total fatty acid content of the extracted lipid is about 7, about 8, about 9, about 10, about 12, about 15, about 18, about 20, about 22, about 24, about 26, about 28, about 31 %, about 7 to about 31%, about 7 to about 28%, about 10 to 35%, about 10 to about 30%, about 10 to about 25%, about 10 to about 22%, from about 14 to 35%, about 16 to 35%, about 16 to about 30%, about 16 to about 25%, or about 16 to about 22%, with the DHA level optionally being less than 0.5% of the total extractable fatty acid content bath lipid.

В другом варианте реализации экстрагированный липид обладает одним или более из следующих признаков:In another embodiment, the extracted lipid has one or more of the following features:

i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 2 до 15%, ii) уровень миристиновой кислоты (С14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет около 0,1%, iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 1 до 30%, iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 4 до 20%,i) the level of palmitic acid in the total fatty acid of the extracted plant lipid is between 2 and 15%, ii) the level of myristic acid (C14: 0) in the total fatty acid of the extracted plant lipid is about 0.1%, iii) the level of oleic acid in the total fatty acid content of the extracted plant lipid is 1 to 30%, iv) the level of linoleic acid (LA) in the total fatty acid content of the extracted plant lipid is 4 to 20%,

v) уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 4 до 40%, vi) уровень γ-линоленовой кислоты (ГЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 0,05 до 7%, vii) уровень стеаридоновой кислоты (СДК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 0,05 до 10%, viii) уровень эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем 6%, ix) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭтрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем 4%,v) the level of α-linolenic acid (ALA) in the total fatty acids of the extracted plant lipid is 4 to 40%, vi) the level of γ-linolenic acid (GLA) in the total fatty acids of the extracted plant lipid is 0.05 to 7 %, vii) the level of stearidonic acid (SDA) in the total fatty acids of the extracted plant lipid is from 0.05 to 10%, viii) the level of eicosatetraenoic acid (ETA) in the total fatty acids of the extracted plant lipid is less than 6%, ix ) the level of eicosatrienoic acid (EtrA) in the total fatty acid content of the extracted plant lipid is less than 4%,

- 5 037184- 5 037184

х) экстрагированный растительный липид содержит менее чем 0,1% ω6-докозапентаеновой кислоты (22:5Δ^4,7,10,13,16) в числе содержащихся в нем жирных кислот, xi) уровень новых ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем 10%, xii) соотношение общего содержания ω6 жирных кислот: общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 1,0 до 3,0 или от 0,1 до 1, xiii) соотношение новых ω6 жирных кислот:новых ω 3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 1,0 до 3,0, от 0,02 до 0,1 или от 0,1 до 1, xiv) состав жирных кислот экстрагированного растительного липида основывается на эффективности превращения олеиновой кислоты в ДПК по меньшей мере 10%, xv) состав жирных кислот экстрагированного растительного липида основывается на эффективности превращения ЛК в ДПК по меньшей мере 15%, xvi) состав жирных кислот экстрагированного растительного липида основывается на эффективности превращения АЛК в ДПК по меньшей мере 17%, xvii) общие жирные кислоты в экстрагированном растительном липиде содержат менее чем 1,5% С20:1 и xviii) содержание триацилглицеридов (ТАГ) экстрагированного растительного липида составляет по меньшей мере 70% и может характеризоваться одним или более из следующих признаков:x) the extracted vegetable lipid comprises less than 0.1% ω6-docosapentaenoic acid (22: 5Δ ^{4,7,10,13,16)} include fatty acids contained therein, xi) the rate of new ω6 fatty acids in the total fatty acid content of the extracted plant lipid is less than 10%, xii) the ratio of the total ω6 fatty acids: the total ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted plant lipid is 1.0 to 3.0 or 0.1 to 1, xiii) the ratio new ω6 fatty acids: new ω 3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted plant lipid is 1.0 to 3.0, 0.02 to 0.1, or 0.1 to 1, xiv) the fatty acid composition of the extracted plant lipid lipid is based on a conversion efficiency of oleic acid to DPC of at least 10%, xv) the fatty acid composition of the extracted plant lipid is based on a conversion efficiency of LA to DPC of at least 15%, xvi) fatty acid composition of the extracted of this plant lipid is based on a conversion efficiency of ALA to DPC of at least 17%, xvii) the total fatty acids in the extracted plant lipid contain less than 1.5% C20: 1 and xviii) the triacylglyceride (TAG) content of the extracted plant lipid is at least 70% and may be characterized by one or more of the following:

xix) экстрагированный растительный липид содержит диацилглицерид (ДАГ), который содержит ДПК, хх) экстрагированный растительный липид содержит менее чем 10% свободных (неэтерифицированных) жирных кислот и/или фосфолипида или по существу не содержит их, xxi) по меньшей мере 70% ДПК, этерифицированной в форме ТАГ, находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ, xxii) наиболее распространенные ДПК-содержащие виды ТАГ в экстрагированном растительном липиде представляют собой ДПК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12) и xxiii) экстрагированный растительный липид содержит три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:18).xix) the extracted plant lipid contains diacylglyceride (DAG), which contains DPA, xx) the extracted plant lipid contains less than 10% free (non-esterified) fatty acids and / or phospholipid, or essentially does not contain them, xxi) at least 70% of DPA esterified in the form of TAG is in position sn-1 or sn-3 TAG, xxii) the most common DPC-containing TAG species in the extracted plant lipid are DPC / 18: 3/18: 3 (TAG 58:12) and xxiii ) the extracted plant lipid contains tri-DPA TAG (TAG 66:18).

В варианте реализации уровень эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет от 0,05 до 10%.In an embodiment, the level of eicosapentaenoic acid (EPA) in the total fatty acid content of the extracted plant lipid is between 0.05 and 10%.

В дальнейшем варианте реализации уровень ДГК в общем содержании жирных кислот экстрагированного растительного липида составляет менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1% или от 0,1 до 2%, более предпочтительно она не определяется. Предпочтительно растение или его часть, такая как семя, или микробная клетка не содержит полинуклеотида, кодирующего Δ4-десатуразу, или не содержит полипептида Δ4-десатуразы. В другом варианте реализации экстрагированный липид находится в форме масла, причем липид составляет по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98% или от около 95 до около 98 мас.% масла.In a further embodiment, the level of DHA in the total fatty acid content of the extracted plant lipid is less than 2%, preferably less than 1%, or from 0.1 to 2%, more preferably undetectable. Preferably, a plant or part thereof, such as a seed, or a microbial cell does not contain a polynucleotide encoding a Δ4 desaturase, or does not contain a Δ4 desaturase polypeptide. In another embodiment, the extracted lipid is in the form of an oil, the lipid comprising at least about 90%, at least about 95%, at least about 98%, or about 95 to about 98% by weight of the oil.

Предпочтительно экстрагированный липид представляет собой липид из масла семян вида Brassica или липид из масла семян Camelina sativa.Preferably, the extracted lipid is a Brassica seed oil lipid or a Camelina sativa seed oil lipid.

В предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения выше липид или масло, предпочтительно масло семян, более предпочтительно масло семян вида Brassica или масло семян Camelina sativa обладает следующими признаками: в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень ДПК составляет от около 7 до 30% или от 7 до 35%, уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем 1%, уровень олеиновой кислоты составляет от 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, соотношение общего содержания ω6 жирных кислот:общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до около 3,0, и содержание триацилглицеридов (ТАГ) липида составляет по меньшей мере около 70%, и необязательно липид по существу не содержит холестерина и/или липид содержит три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15). Более предпочтительно липид или масло, предпочтительно масло семян, дополнительно обладает одним или более или всеми из следующих признаков: по меньшей мере 70% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ), АЛК присутствует на уровне от 4 до 40% от общего содержания жирных кислот, ГЛК присутствует и/или уровень ГЛК составляет менее чем 4% от общего содержания жирных кислот, уровень СДК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 4%, уровень ЭПК составляет от 0,05 до около 10%, уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, соотношение новых ω6 жирных кислот: новых ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 0,03 до около 3,0, предпочтительно менее чем около 0,50, состав жирных кислот ли- 6 037184 пида основывается на: эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12десатуразы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения СДК в ЭТК кислоту под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы от около 50 до около 95%, и эффективности превращения олеиновой кислоты в ДПК по меньшей мере около 10%. Наиболее предпочтительно по меньшей мере 81% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ).In a preferred embodiment of the first aspect of the invention, the above is a lipid or oil, preferably a seed oil, more preferably a seed oil of the Brassica species or a seed oil of Camelina sativa, has the following characteristics: in the total fatty acid content of the lipid or oil, the DPA level is from about 7 to 30% or from 7 to 35%, palmitic acid level is about 2 to about 16%, myristic acid level is less than 1%, oleic acid level is 1 to about 30%, LA level is about 4 to about 35%, ALA is present , the level of total saturated fatty acids in the total fatty acids of the extracted lipid is about 4 to about 25%, the ratio of the total ω6 fatty acids: the total ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is from 0.05 to about 3.0 , and the content of triacylglycerides (TAG) of the lipid is at least about 70%, and optionally the lipid is not substantially co holds cholesterol and / or lipid contains tri-DPA TAG (TAG 66:15). More preferably, the lipid or oil, preferably seed oil, further possesses one or more or all of the following characteristics: at least 70% of the DPA is esterified at the sn-1 or sn-3 position of the triacylglyceride (TAG), ALA is present at a level of 4 to 40 % of total fatty acids, GLA is present and / or GLA is less than 4% of total fatty acids, SDA is 0.05 to about 10%, ETA is less than about 4%, EPA is between 0.05 to about 10%, the level of total monounsaturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 4 to about 35%, the level of total polyunsaturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 20 to about 75%, the ratio of new ω6 fatty acids: new ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is from about 0.03 to about 3.0, preferably less than about 0.50, the composition of fatty acids li-6 037184 pida is based on: the efficiency of conversion of oleic acid to LA under the action of Δ12 desaturase at least about 60%, the efficiency of conversion of SDA to ETA acid under the action of Δ6-elongase at least about 60%, the efficiency of conversion of EPA into DPC under the action of Δ5-elongase from about 50 to about 95%, and the efficiency of conversion of oleic acid to DPA at least about 10%. Most preferably, at least 81% of the DPA is esterified at the sn-1 or sn-3 position of the triacylglyceride (TAG).

В другом предпочтительном варианте реализации описанного выше второго аспекта изобретения липид или масло, предпочтительно масло семян, более предпочтительно масло семян вида Brassica или масло семян Camelina sativa, содержащее ДПК, обладает следующими признаками: в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем 1%, уровень олеиновой кислоты составляет от около 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, общий уровень насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, соотношение общего содержания ω6 жирных кислот:общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до около 3,0, содержание триацилглицеридов (ТАГ) липида составляет по меньшей мере около 70%, и необязательно липид содержит три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15), причем по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ. Более предпочтительно липид или масло, предпочтительно масло семян, дополнительно обладает одним или более или всеми из следующих признаков: АЛК присутствует на уровне от 4 до 40% от общего содержания жирных кислот, ГЛК присутствует, и/или уровень ГЛК составляет менее чем 4% от общего содержания жирных кислот, уровень СДК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 4%, уровень ЭПК составляет от 0,05 до около 10%, уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, соотношение новых ω6 жирных кислот: новых ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 0,03 до около 3,0, предпочтительно менее чем около 0,50, состав жирных кислот липида основан на эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения СДК в кислоту ЭТК под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Д5-элонгазы от около 50 до около 95%, эффективности превращения олеиновой кислоты в ДПК по меньшей мере около 10%.In another preferred embodiment of the above second aspect of the invention, the lipid or oil, preferably seed oil, more preferably seed oil of the Brassica species or Camelina sativa seed oil containing WPC, has the following characteristics: in the total fatty acid content of the lipid or oil, the level of palmitic acid is from about 2 to about 16%, the level of myristic acid is less than 1%, the level of oleic acid is from about 1 to about 30%, the LA level is from about 4 to about 35%, ALA is present, the total level of saturated fatty acids in the total content fatty acids of the extracted lipid is from about 4 to about 25%, the ratio of total ω6 fatty acids: total ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is from 0.05 to about 3.0, the content of triacylglycerides (TAG) of the lipid is at least about 70%, and optionally the lipid contains tri-DPA TAG (TAG 66:15), pr and wherein at least 35% of the duodenum esterified in the form of triacylglyceride (TAG) is esterified at the sn-2 position of the TAG. More preferably, the lipid or oil, preferably seed oil, further has one or more or all of the following: ALA is present at a level of 4 to 40% of the total fatty acids, GLA is present, and / or the GLA level is less than 4% of total fatty acids, SDA level is 0.05 to about 10%, ETA level is less than about 4%, EPA level is 0.05 to about 10%, total monounsaturated fatty acids level in total fatty acids of extracted lipid is from about 4 to about 35%, the level of total polyunsaturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 20 to about 75%, the ratio of new ω6 fatty acids: new ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is from about 0 03 to about 3.0, preferably less than about 0.50, the fatty acid composition of the lipid is based on the conversion efficiency of oleic acid to LA under the action of Δ12-desaturase at least about 60%, the efficiency of conversion of SDA to acid ETA under the action of Δ6-elongase at least about 60%, the efficiency of conversion of EPA to DPC under the action of D5-elongase from about 50 to about 95%, the conversion efficiency oleic acid in WPC at least about 10%.

В контексте экстрагированного липида или масла по изобретению, в варианте реализации изобретения уровень ДПК в экстрагированном липиде или масле не повышен или является в существенной мере таким же, как уровень ДПК в липиде или масле части растения или микроба до экстракции. Другими словами, после экстракции не проводилось процедур для повышения уровня ДПК в липиде или масле относительно других жирных кислот. Как будет очевидно, липид или масло впоследствии могут быть обработаны фракционированием или другими методами, с целью модификации состава жирных кислот.In the context of the extracted lipid or oil of the invention, in an embodiment of the invention, the level of DPA in the extracted lipid or oil is not increased or is substantially the same as the level of DPA in the lipid or oil of the plant or microbe part prior to extraction. In other words, after extraction, no procedures were performed to increase the level of duodenum in the lipid or oil relative to other fatty acids. As will be apparent, the lipid or oil can subsequently be treated by fractionation or other methods to modify the fatty acid composition.

В другом предпочтительном варианте реализации липид или масло, предпочтительно масло семян и более предпочтительно масло семян Brassica, такое как горчичное масло или рапсовое масло или масло семян С. sativa, обладает следующими признаками: в общем содержании жирных кислот липида или масла уровень ДПК составляет от около 7 до 35%, уровень пальмитиновой кислоты составляет от около 2 до около 16%, уровень миристиновой кислоты составляет менее чем около 6% и предпочтительно менее чем 1%, уровень олеиновой кислоты составляет от около 1 до около 30%, уровень ЛК составляет от около 4 до около 35%, АЛК присутствует, уровень СДК составляет от около 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 6%, уровень ЭПК составляет от около 0,05 до около 10%. ДГК определяется или предпочтительно не определяется в липиде или масле. Предпочтительно ДГК, если она присутствует, присутствует на уровне не более чем 2 или не более чем 0,5% от общего содержания жирных кислот липида или масла и более предпочтительно отсутствует в общем содержании жирных кислот липида или масла. Необязательно, липид по существу не содержит холестерина и/или липид содержит триДПК ТАГ (ТАГ 66:15). Более предпочтительно липид или масло, предпочтительно масло семян, дополнительно обладает одним или более или всеми из следующих признаков: по меньшей мере 70% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ), АЛК присутствует на уровне от 4 до 40% от общего содержания жирных кислот, ГЛК присутствует и/или уровень ГЛК составляет менее чем 4% от общего содержания жирных кислот, уровень СДК составляет от 0,05 до около 10%, уровень ЭТК составляет менее чем около 4%, уровень ЭПК составляет от 0,05 до около 10%, уровень общих ненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, соотношение новых ω6 жирных кислот:новых ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 0,03 до около 3,0, предпочтительно менее чем около 0,50, состав жирных кислот липиIn another preferred embodiment, the lipid or oil, preferably seed oil and more preferably Brassica seed oil, such as mustard oil or rapeseed oil or C. sativa seed oil, has the following characteristics: in the total fatty acid content of the lipid or oil, the DPA level is from about 7 to 35%, palmitic acid level is about 2 to about 16%, myristic acid level is less than about 6% and preferably less than 1%, oleic acid level is about 1 to about 30%, LA level is about 4 to about 35%, ALA is present, the SDA level is from about 0.05 to about 10%, the ETA level is less than about 6%, the EPA level is from about 0.05 to about 10%. DHA is detected or preferably not detected in lipid or oil. Preferably, DHA, if present, is present at a level of no more than 2 or no more than 0.5% of the total fatty acid content of the lipid or oil, and more preferably absent in the total fatty acid content of the lipid or oil. Optionally, the lipid is substantially free of cholesterol and / or the lipid contains triDPA TAG (TAG 66:15). More preferably, the lipid or oil, preferably seed oil, further possesses one or more or all of the following characteristics: at least 70% of the DPA is esterified at the sn-1 or sn-3 position of the triacylglyceride (TAG), ALA is present at a level of 4 to 40 % of total fatty acids, GLA is present and / or GLA is less than 4% of total fatty acids, SDA is 0.05 to about 10%, ETA is less than about 4%, EPA is between 0.05 to about 10%, the level of total unsaturated fatty acids in the total fatty acids of the extracted lipid is from about 4 to about 35%, the level of total polyunsaturated fatty acids in the total fatty acids of the extracted lipid is from about 20 to about 75%, the ratio of new ω6 fatty acids: new ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is from about 0.03 to about 3.0, preferably less than about 0.50, const av fatty acids lipi

- 7 037184 да основывается на: эффективности превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12десатуразы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения СДК в ЭТК кислоту под действием Δ6-элонгазы по меньшей мере около 60%, эффективности превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы от около 50 до около 95% и эффективности превращения олеиновой кислоты в ДПК по меньшей мере около 10%. В варианте реализации по меньшей мере 81% ДПК этерифицировано в положении sn-1 или sn-3 триацилглицерида (ТАГ). В качестве альтернативы по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме ТАГ, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.- 7 037184 yes is based on: the efficiency of conversion of oleic acid to LA under the action of Δ12desaturase at least about 60%, the efficiency of conversion of SDA to ETA acid under the action of Δ6-elongase at least about 60%, the efficiency of conversion of EPA into DPA under the action of Δ5- elongase from about 50 to about 95% and the efficiency of conversion of oleic acid to WPC at least about 10%. In an embodiment, at least 81% of the DPA is esterified at the sn-1 or sn-3 position of the triacylglyceride (TAG). Alternatively, at least 35% of the TAG esterified DPA is esterified at the sn-2 position of the TAG.

В дальнейшем варианте реализации экстрагированный липид по изобретению дополнительно содержит один или более стеролов, предпочтительно растительных стеролов.In a further embodiment, the extracted lipid of the invention further comprises one or more sterols, preferably plant sterols.

В другом варианте реализации экстрагированный липид находится в форме масла и содержит менее чем около 10, менее чем около 7 мг стеролов/г масла, от около 1,5 до около 10 мг стеролов/г масла или от около 1,5 до около 7 мг стеролов/г масла.In another embodiment, the extracted lipid is in the form of an oil and contains less than about 10, less than about 7 mg sterols / g oil, about 1.5 to about 10 mg sterols / g oil, or about 1.5 to about 7 mg sterols / g oil.

Примеры стеролов, которые могут присутствовать в экстрагированном липиде, включают, не обязательно ограничиваясь ими, один или более или все из следующего: кампэстрол/24-метилхолестерин, Δ5стигмастерол, эбурикол, в-ситостерол/24-этилхолестерин, Δ5-авенастерол/изофукостерол, Δ7стигмастерол/стигмаст-7-ен-3в-ол и Δ7-авенастерол.Examples of sterols that may be present in the extracted lipid include, but are not necessarily limited to, one or more or all of the following: campestrol / 24-methylcholesterol, Δ5stigmasterol, eburicol, β-sitosterol / 24-ethylcholesterol, Δ5-avenasterol / isofucosterol, Δ7 / stigmast-7-en-3v-ol and Δ7-avenasterol.

В варианте реализации вид растения представляет собой один из перечисленных в табл. 11, например рапс, и уровень стеролов является около таким же, как приведенный в табл. 11 для данного конкретного вида растений. Виды растений могу представлять собой В. napus, горчицу (В. juncea) или С. sativa и содержат уровень стеролов около найденного в экстрагированном масле горчицы дикого типа В. napus, горчицы или С. sativa соответственно.In an embodiment, the plant species is one of those listed in table. 11, for example rapeseed, and the level of sterols is about the same as shown in table. 11 for this particular plant species. The plant species may be B. napus, mustard (B. juncea) or C. sativa, and contain sterol levels close to that found in the extracted wild-type mustard oil B. napus, mustard or C. sativa, respectively.

В варианте реализации экстрагированный растительный липид содержит один или более или все из кампэстерола/24-метилхолестерина, Δ5-стигмастерола, эбурикола, в-ситостерола/24-этилхолестерина, Δ5-авенастерола/изофукостерола, Δ7-стигмастерола/стигмаст-7-ен-3β-ола и Δ7-авенастерола, или содержит уровень стеролов, по существу такой же, как в масле рапса дикого типа.In an embodiment, the extracted plant lipid comprises one or more or all of campesterol / 24-methylcholesterol, Δ5-stigmasterol, eburicol, β-sitosterol / 24-ethylcholesterol, Δ5-avenasterol / isofucosterol, Δ7-stigmasterol / stigmast-3β-7-ene- α-ol and Δ7-avenasterol, or contains sterol levels substantially the same as in wild-type rapeseed oil.

В варианте реализации экстрагированный липид содержит уровень стеролов, по существу такой же, как в масле рапса, горчичном масле или масле С. sativa дикого типа.In an embodiment, the extracted lipid contains a sterol level substantially the same as in rapeseed oil, mustard oil, or wild type C. sativa oil.

В варианте реализации экстрагированный липид содержит менее чем около 0,5, менее чем около 0,25 мг холестерина/г масла, от около 0 до около 0,5 мг холестерина/г масла или от около 0 до около 0,25 мг холестерина/г масла, или по существу не содержит холестерина.In an embodiment, the extracted lipid contains less than about 0.5, less than about 0.25 mg cholesterol / g oil, about 0 to about 0.5 mg cholesterol / g oil, or about 0 to about 0.25 mg cholesterol / g oil, or essentially no cholesterol.

В дальнейшем варианте реализации липид представляет собой масло, предпочтительно масло из масличной культуры. Примеры таких масел включают, без ограничения, масло вида Brassica, например масло рапса или масло горчицы, масло Gossypium hirsutum, масло Linum usitatissimum, масло вида Helianthus, масло Carthamus tinctorius, масло Glycine max, масло Zea mays, масло Arabidopsis thaliana, масло Sorghum bicolor, масло Sorghum vulgare, масло Avena sativa, масло вида Trifolium, масло Elaesis guineenis, масло Nicotiana benthamiana, масло Hordeum vulgare, масло Lupinus angustifolius, масло Oryza sativa, масло Oryza glaberrima, масло Camelina sativa, масло Crambe abyssinica, масло Miscanthus x giganteus, или масло Miscanthus sinensis. Более предпочтительно масло представляет собой масло вида Brassica, масло Camelina sativa или масло Glycine max (сои). В варианте реализации липид содержит или представляет собой масло вида Brassica, такое как масло Brassica napus или масло Brassica juncea, масло Gossypium hirsutum, масло Linum usitatissimum, масло вида Helianthus, масло Carthamus tinctorius, масло Glycine max, масло Zea mays, масло Elaesis guineenis, масло Nicotiana benthamiana,, масло Lupinus angustifolius, масло Camelina sativa, масло Crambe abyssinica, масло Miscanthus x giganteus или масло Miscanthus sinensis. В дальнейшем варианте реализации масло представляет собой масло рапса, масло горчицы (В. juncea), масло сои (Glycine max), масло Camelina sativa или масло Arabidopsis thaliana. В альтернативном варианте реализации масло представляет собой масло растения, кроме масла A. thaliana и/или кроме масла С. sativa. В варианте реализации масло растения представляет собой масло, кроме масла G. max (сои). В варианте реализации масло было получено из растения, выращенного в стандартных условиях, например, как описано в примере 1, или из растения, выращенного в поле или в теплице в стандартных условиях.In a further embodiment, the lipid is an oil, preferably an oilseed oil. Examples of such oils include, but are not limited to, Brassica oil such as rapeseed or mustard oil, Gossypium hirsutum oil, Linum usitatissimum oil, Helianthus spp. Oil, Carthamus tinctorius oil, Glycine max oil, Zea mays oil, Arabidopsis thaliana oil, Sorghum bicolor oil , Sorghum vulgare oil, Avena sativa oil, Trifolium oil, Elaesis guineenis oil, Nicotiana benthamiana oil, Hordeum vulgare oil, Lupinus angustifolius oil, Oryza sativa oil, Oryza glaberrima oil, Camelina sativa oil, Crambigan abythus oil, Miscellaneous oil, Misth. or Miscanthus sinensis oil. More preferably the oil is Brassica species oil, Camelina sativa oil or Glycine max (soybean) oil. In an embodiment, the lipid comprises or is a Brassica spp. Oil such as Brassica napus oil or Brassica juncea oil, Gossypium hirsutum oil, Linum usitatissimum oil, Helianthus spp. Oil, Carthamus tinctorius oil, Glycine max oil, Zea mays oil, Elaesis guineenis oil, Nicotiana benthamiana oil, Lupinus angustifolius oil, Camelina sativa oil, Crambe abyssinica oil, Miscanthus x giganteus oil or Miscanthus sinensis oil. In a further embodiment, the oil is rapeseed oil, mustard oil (B. juncea), soybean oil (Glycine max), Camelina sativa oil, or Arabidopsis thaliana oil. In an alternative embodiment, the oil is a plant oil other than A. thaliana oil and / or other than C. sativa oil. In an embodiment, the plant oil is an oil other than G. max oil (soybean). In an embodiment, the oil was obtained from a plant grown under standard conditions, for example, as described in example 1, or from a plant grown in a field or greenhouse under standard conditions.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида или микробного липида, включающий стадии:In a further aspect of the present invention, there is provided a method for producing an extracted plant lipid or microbial lipid, comprising the steps of:

i) получение части растения, предпочтительно семени Brassica или семени Camelina sativa, или микробных клеток, содержащих липид, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и, при этом, жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, которые включают линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, которые включают αлиноленовую кислоту (АЛК) и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом, что уровень ДПК в общем содержании жирных кислот липида из части растения или микробных клеток составляет от около 7 до 35%, и ii) экстракцию липида из части растения или микробных клеток,i) obtaining a plant part, preferably a Brassica seed or a Camelina sativa seed, or microbial cells containing a lipid, the lipid comprising fatty acids in esterified form, and wherein the fatty acids include oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids, which include linoleic acid (LA), ω3 fatty acids, which include α-linolenic acid (ALA) and docosapentaenoic acid (DPA), and optionally one or more of stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA) and eicosatetraenoic acid (ETA), moreover, that the level of DPC in the total fatty acid content of the lipid from the plant part or microbial cells is from about 7 to 35%, and ii) extraction of the lipid from the plant part or microbial cells,

- 8 037184 причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 35%. В варианте реализации изобретения уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 20% или от 20,1 до 35%. В варианте реализации изобретения уровень ДПК составляет от 7 до 20% или от 20,1 до 30%, предпочтительно от 20,1 до 35%, более предпочтительно от 30 до 35%. В варианте реализации изобретения уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 8 до 20% или от 10 до 20%, предпочтительно от 11 до 20% или от 12 до 20%.- 8 037184 wherein the level of duodenum in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 7 to 35%. In an embodiment, the level of DPA in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 7 to 20%, or from 20.1 to 35%. In an embodiment, the WPC level is 7 to 20%, or 20.1 to 30%, preferably 20.1 to 35%, more preferably 30 to 35%. In an embodiment of the invention, the level of DPA in the total fatty acid content of the extracted lipid is 8 to 20% or 10 to 20%, preferably 11 to 20% or 12 to 20%.

В варианте реализации описанного выше аспекта изобретения предлагается способ получения экстрагированного растительного липида или микробного липида, включающий стадии:In an embodiment of the above aspect of the invention, there is provided a method for producing an extracted plant lipid or microbial lipid, comprising the steps of:

i) получение части растения, предпочтительно семени Brassica, семени С. sativa или микробных клеток, содержащих липид, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и, при этом, состав жирных кислот липида включает олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и одну или больше из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом, что (i) уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 7 до 30% или от 7 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%, (ii) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 2 до 16%, (iii) уровень миристиновой кислоты (С14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 6%, предпочтительно менее чем 1%, (iv) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 1 до 30%, (v) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 35%, (vi) уровень α-линоленовую кислоту (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 40%, (vii) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭтрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4%, (viii) общий уровень насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 25%, (ix) соотношение общего содержания ω6 жирных кислот:общего содержания ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 и 1, (х) содержание триацилглицеридов (ТАГ) липида составляет по меньшей мере 70% и (xi) по меньшей мере 70% ДПК, этерифицированной в форме ТАГ, находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ, и ii) экстракцию липида из части растения, причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 30% или от 7 до 35%, предпочтительно от 30 до 35%. Предпочтительно по меньшей мере 81 или по меньшей мере 90% ДПК, этерифицированной в форме ТАГ, находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ.i) obtaining a plant part, preferably Brassica seed, C. sativa seed or microbial cells containing a lipid, the lipid containing fatty acids in esterified form, and wherein the fatty acid composition of the lipid comprises oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids, including linoleic acid (LA), ω3 fatty acids, including α-linolenic acid (ALA) and docosapentaenoic acid (DPA), and one or more of stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA) and eicosatetraenoic acid (ETA), moreover that (i) the level of DPC in the total fatty acid content of the extracted lipid is from 7 to 30% or from 7 to 35%, preferably from 30 to 35%, (ii) the level of palmitic acid in the total fatty acid content of the extracted lipid is from 2 up to 16%, (iii) the level of myristic acid (C14: 0) in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than 6%, preferably less than 1%, (iv) the level of oleic acid in the total fatty acid content of the extracted lipid is 1 to 30%, (v) the level of linoleic acid (LA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is 4 to 35%, (vi) the level of α-linolenic acid (ALA) in the total content fatty acids of the extracted lipid is 4 to 40%, (vii) the level of eicosatrienoic acid (EtrA) in the total fatty acids of the extracted lipid is less than 4%, (viii) the total level of saturated fatty acids in the total fatty acids of the extracted lipid is between 4 to 25%, (ix) the ratio of the total ω6 fatty acids: the total ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is between 0.05 and 1, (x) the triacylglyceride (TAG) content of the lipid is at least 70%, and (xi) at least 70% of the DPA esterified in the TAG form is at the sn-1 or sn-3 position of the TAG, and ii) lipid extraction from the plant part, the DPA level in the total content and the fatty acids of the extracted lipid is from about 7 to 30%, or from 7 to 35%, preferably from 30 to 35%. Preferably, at least 81 or at least 90% of the DPA esterified in the TAG form is at the sn-1 or sn-3 position of the TAG.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения экстрагированного липида, включающий стадии:In another aspect of the present invention, there is provided a method for producing an extracted lipid, comprising the steps of:

i) получение содержащих липид клеток, предпочтительно части растения, содержащей клетки, или микробных клеток, более предпочтительно семени Brassica или семени С. sativa, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме и при этом жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК), притом, что по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, и ii) экстракцию липида из клеток, причем по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ. В варианте реализации экстрагированный липид, полученный по способу, дополнительно характеризуется одним или более или всеми из следующего: (i) он содержит жирные кислоты, включающие олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω 3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК) и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), (ii) по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 48%, от 35 до около 60% или от 35 до около 50%, ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, и (iii) уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до 35% или от около 7 до 35% или от около 20,1 до 35%. В вариантах реализации данного аспекта уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 7, около 8, около 9, около 10, около 12, около 15, около 18, около 20, около 22, около 24, около 26, около 28, около 30%, от около 7 до около 28%, от около 7 до около 25%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25% или от около 16 до около 22%. В предпочтительных вариантах реализации экстрагированный липид характеризуется (i) и (ii), (i) и (iii) или (ii) и (iii), более предпочтительно всеми из (i), (ii) и (iii). Предпочтительно экстрагированный липид до- 9 037184 полнительно характеризуется уровнем пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, который составляет от около 2 до 16%, причем уровень миристиновой кислоты (С14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, если она присутствует, составляет менее чем 1%.i) obtaining lipid-containing cells, preferably a plant part containing cells or microbial cells, more preferably Brassica seed or C. sativa seed, wherein the lipid contains fatty acids in esterified form and wherein the fatty acids comprise docosapentaenoic acid (DPA), moreover, that at least 35% of the DPC esterified in the form of triacylglyceride (TAG) is esterified at the sn-2 position of the TAG, and ii) extraction of the lipid from the cells, with at least 35% of the DPC esterified in the form of triacylglyceride (TAG), in total the fatty acid content of the extracted lipid, esterified at the sn-2 position of the TAG. In an embodiment, the extracted lipid obtained by the method is further characterized by one or more or all of the following: (i) it contains fatty acids including oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids including linoleic acid (LA), ω 3 fatty acids , including α-linolenic acid (ALA) and optionally one or more of stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA) and eicosatetraenoic acid (ETA), (ii) at least about 40, at least about 45, at least at least about 48%, from 35 to about 60%, or from 35 to about 50%, DPC esterified in the form of triacylglyceride (TAG) esterified at the sn-2 position of the TAG, and (iii) the level of DPC in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 1 to 35%, or from about 7 to 35%, or from about 20.1 to 35%. In embodiments of this aspect, the level of DPC in the total fatty acid content of the extracted lipid is about 7, about 8, about 9, about 10, about 12, about 15, about 18, about 20, about 22, about 24, about 26, about 28 about 30%, about 7 to about 28%, about 7 to about 25%, about 10 to 35%, about 10 to about 30%, about 10 to about 25%, about 10 to about 22 %, about 14 to 35%, about 16 to 35%, about 16 to about 30%, about 16 to about 25%, or about 16 to about 22%. In preferred embodiments, the extracted lipid is characterized by (i) and (ii), (i) and (iii) or (ii) and (iii), more preferably all of (i), (ii) and (iii). Preferably, the extracted lipid is additionally characterized by a palmitic acid level in the total fatty acid content of the extracted lipid which is from about 2 to 16%, the level of myristic acid (C14: 0) in the total fatty acid content of the extracted lipid, if present, is less than 1%.

В варианте реализации упомянутого выше аспекта изобретения предлагается способ получения экстрагированного липида, включающий стадии:In an embodiment of the above aspect of the invention, there is provided a method for producing an extracted lipid, comprising the steps of:

i) получение содержащих липид клеток, предпочтительно части растения, содержащей клетки, или микробных клеток, более предпочтительно семени Brassica или семени С. sativa, причем липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и, при этом, жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и дополнительно включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), и одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), причем (i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 2 до 16%, (ii) уровень миристиновой кислоты (С14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 1%, (iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 1 до 30%, (iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 35%, (v) уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 40%, (vi) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭтрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее 4%; (vii) уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 25%, (viii) соотношение общих ω6 жирных кислот:общих ω3 жирных кислот в содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 0,05 до около 1%, (ix) содержание триацилглицерида (ТАГ) в липиде составляет по меньшей мере около 70%, и (х) по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, и ii) экстракцию липида из части растения, причем по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.i) obtaining lipid-containing cells, preferably a plant part containing cells or microbial cells, more preferably Brassica seed or C. sativa seed, wherein the lipid contains fatty acids in esterified form, and wherein the fatty acids include docosapentaenoic acid (DPA) and additionally include oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids including linoleic acid (LA), ω3 fatty acids including α-linolenic acid (ALA), and one or more of stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA), and eicosatetraenoic acid (ETA), wherein (i) the level of palmitic acid in the total fatty acid content of the extracted lipid is between 2% and 16%, (ii) the level of myristic acid (C14: 0) in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than 1% , (iii) the level of oleic acid in the total fatty acid content of the extracted lipid is 1 to 30%, (iv) the level of linoleic acid (LA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is 4 to 35%, (v) the level of α-linolenic acid (ALA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is 4 to 40%, (vi) the level of eicosatrienoic acid (EtrA) in the total content the fatty acid of the extracted lipid is less than 4%; (vii) the level of total saturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is 4 to 25%, (viii) the ratio of total ω6 fatty acids: total ω3 fatty acids in the fatty acid content of the extracted lipid is 0.05 to about 1% , (ix) the content of triacylglyceride (TAG) in the lipid is at least about 70%, and (x) at least 35% DPA esterified in the form of triacylglyceride (TAG) esterified at the sn-2 position of the TAG, and ii) extraction a lipid from a plant part, wherein at least 35% of the DPA esterified in the form of triacylglyceride (TAG), in the total fatty acid content of the extracted lipid, is esterified at the sn-2 position of the TAG.

Стадия получения части растения или микробных клеток может включать сбор урожая частей растения, предпочтительно семени, с растений, которые образуют части растения, выделение микробных клеток из культур таких клеток или получение частей растения или микробных клеток путем приобретения у производителя или поставщика, или посредством импорта. Способ может включать стадию определения состава жирных кислот липида в образце частей растения или микробных клеток или экстрагированного липида.The step of obtaining plant parts or microbial cells may include harvesting plant parts, preferably seed, from plants that form plant parts, isolating microbial cells from cultures of such cells, or obtaining plant parts or microbial cells by purchase from a manufacturer or supplier, or by import. The method may include the step of determining the fatty acid composition of a lipid in a sample of plant parts or microbial cells or an extracted lipid.

В предпочтительном варианте реализации экстрагированный липид, полученный способом по изобретению, обладает, если это уместно, одним или более признаков, определенных в данном описании, например как определено выше для первых двух аспектов.In a preferred embodiment, the extracted lipid obtained by the method of the invention exhibits, if appropriate, one or more of the features defined herein, eg, as defined above for the first two aspects.

Варианты реализации раскрытых выше аспектов изобретения описаны более подробно ниже. Квалифицированному специалисту будет понятно, что никакие из признаков, описанных в вариантах реализации изобретения, которые являются шире, чем соответствующий признак в упомянутом выше аспекте, не применяются к этому аспекту.Embodiments of the above aspects of the invention are described in more detail below. The skilled artisan will understand that none of the features described in the embodiments of the invention that are broader than the corresponding feature in the above aspect apply to this aspect.

В варианте реализации часть растения является семенем, предпочтительно семенем масличной культуры. Примеры таких семян включают, без ограничения, семя вида Brassica, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, вида Helianthus, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, вида Trifolium, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa или Crambe abyssinica, предпочтительно семя вида Brassica, семя С. sativa или семя G. max (сои), более предпочтительно семя Brassica napus, В. juncea или С. sativa. В варианте реализации часть растения является семенем, предпочтительно масличной культуры, такой как вид Brassica, такой как Brassica napus или Brassica juncea, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, вид Helianthus, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Lupinus angustifolius, Camelina sativa или Crambe abyssinica, предпочтительно семенем Brassica napus, В juncea или C. sativa. В варианте реализации семя представляет собой семя рапса, семя горчицы, семя сои, семя Camelina sativa или семя Arabidopsis thaliana. В альтернативном варианте реализации семя представляет собой семя кроме семени A. thaliana и/или кроме С. sativa. В варианте реализации семя представляет собой семя, кроме семени сои. В варианте реализации часть растения представляет собой семя вида Brassica. Часть растения предпочтительно представляет собой семя вида Brassica или семя Camelina sativa. В варианте реализации семя было получено от растения, выращенного в стандартных условиях, например, как описано в примере 1, или от растения, выращенного в поле или в теплице в стандартных условиях.In an embodiment, the plant portion is a seed, preferably an oilseed. Examples of such seeds include, but are not limited to, seed from Brassica spp., Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus spp., Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, Trifolium s. , Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa or Crambe abyssinica, preferably Brassica seed, C. sativa seed or G. max (soybean) seed, more preferably Brassica napus, B. juncea or C. sativa seed ... In an embodiment, the plant part is a seed, preferably an oilseed crop such as Brassica species such as Brassica napus or Brassica juncea, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus species, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Elaesis guineenis, Nicotiana bentham angustifolius, Camelina sativa or Crambe abyssinica, preferably with the seed of Brassica napus, B juncea or C. sativa. In an embodiment, the seed is rape seed, mustard seed, soybean seed, Camelina sativa seed, or Arabidopsis thaliana seed. In an alternative embodiment, the seed is a seed other than A. thaliana and / or C. sativa seed. In an embodiment, the seed is a seed other than a soybean seed. In an embodiment, the plant portion is a seed of the Brassica species. The plant part is preferably a seed of the Brassica species or a seed of Camelina sativa. In an embodiment, the seed was obtained from a plant grown under standard conditions, for example, as described in example 1, or from a plant grown in a field or in a greenhouse under standard conditions.

В другом варианте реализации семя содержит по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 26 мг, от около 18 до около 100 мг, от около 22 до около 70 мг, около 80 мг,In another embodiment, the seed contains at least about 18, at least about 22, at least about 26 mg, about 18 to about 100 mg, about 22 to about 70 mg, about 80 mg,

- 10 037184 от около 30 до около 80 мг или от около 24 до около 50 мг ДПК на 1 г семени.10 037184 about 30 to about 80 mg, or about 24 to about 50 mg of WPC per gram of seed.

В дальнейшем варианте реализации часть растения, такая как семя, содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:In a further embodiment, a plant part, such as a seed, contains exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes:

i) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iv) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,i) ω3 desaturase, Δ6 desaturase, Δ5 desaturase, Δ6 elongase and Δ5 elongase, ii) Δ15 desaturase, Δ6 desaturase, Δ5 desaturase, Δ6 elongase and Δ5 elongase, iii) Δ12 desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, iv) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

v) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) Δ12-десаmураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десаmураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения.v) ω3 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, vi) Δ15 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, vii) Δ12 desamurase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, viii) Δ12 desaturase, ω3 desaturase and / or Δ15 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desamurase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, each the polynucleotide is operably linked to one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a cell of a plant part.

В дальнейшем варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, содержат экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов;In a further embodiment, a plant part such as a seed or recombinant cells such as microbial cells comprises exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes;

i) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатурαза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгаза, ii) Δ12-десатурαза, Δ6-десатурαза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатурαза, ω3-десатурαза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгαза, iv) ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза,i) ω3-desaturase and / or Δ 15-desaturase, Δ6-desaturαza, Δ5-desaturαza, Δ6-elongαza and Δ5-elongase, ii) Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturαza, Δ6-elongase and Δ5-elongase , iii) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongaza, iv) ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturαza, Δ9-elongase and Δ5-elongase,

v) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгαза, vi) Δ12-десатурαза, ω3-десатурαза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ9-элонгαза и Δ5-элонгαза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения или клетках.v) Δ12-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongαse, vi) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturαse, Δ9-elongαse, and Δ5-elongαse, each polynucleotide being operably linked to one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a plant part cell or cells.

В варианте реализации если часть растения или клетка содержит липид, который содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты содержат докозапентаеновую кислоту (ДПК) и/или докозагексаеновую кислоту (ДГК), причем по меньшей мере 35% ДПК и/или ДГК (если она присутствует), этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), ^тарифицировано в положении sn2 ТАГ, то часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), и, при этом, полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, которые способны управлять экспрессией полинуклеотйда в клетке части растения или клетках. В дальнейшем варианте реализации клетка содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:In an embodiment, if a part of a plant or a cell contains a lipid that contains fatty acids in esterified form, the fatty acids containing docosapentaenoic acid (DPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA), and at least 35% DPA and / or DHA (if it is present) esterified in the form of a triacylglyceride (TAG), and is charged at the sn2 position of the TAG, then a part of the plant, such as a seed, or recombinant cells, such as microbial cells, contains an exogenous polynucleotide encoding 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LPAAT ), and, in this case, the polynucleotide is operably linked to one or more promoters that are capable of directing the expression of the polynucleotide in a cell of a plant part or cells. In a further embodiment, the cell contains exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes:

i) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатураза, Δ6-десатурαза,Δ5- десатураза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгаза, ii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д15-десатураза, Δ6-десатураза,Δ5- десатураза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгаза, iii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатурαза, Δ6-десатураза,Δ5- десатураза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгаза, iv) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ2-десатурαза, ω3-десатурαза и/или Δ15десатураза, Δ6-десатурαза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгαза,i) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), ω3-desaturase, Δ6-desaturαse, Δ5-desaturase, Δ6-elongαse and Δ5-elongase, ii) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (D15-desaturase) Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongαse and Δ5-elongase, iii) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (LPAAT), Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongαse and Δ5-elongase, ) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (LFAAT), Δ2-desaturαse, ω3-desaturαse and / or Δ15desaturase, Δ6-desaturαse, Δ5-desaturase, Δ6-elongαse and Δ5-elongαse,

v) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатурαза, Δ8-десатурαза,Δ5- десатураза, Δ9-элонгαза и Δ5-элонгаза, vi) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ15-десатурαза, Δ8-десатурαза,Δ5- десатураза, Δ9-элонгαза и Δ5-элонгаза, vii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, Δ8-десатурαза,Δ5- десатураза, Δ9-элонгαза, Δ5-элонгаза и необязательно Δ4-десатураза, viii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатурαза, ω3-десатурαза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке. Предпочтительно ЛФААТ может использовать полиненасыщенный С22 жирный ацил-КоА субстрат, такой как ДПК-КоА.v) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), ω3-desaturαse, Δ8-desaturαse, Δ5-desaturase, Δ9-elongαse and Δ5-elongase, vi) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase), Δ15 Δ8-desaturαse, Δ5-desaturase, Δ9-elongαse and Δ5-elongase, vii) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (LPAAT), Δ12-desaturase, Δ8-desaturαse, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and optional elongase, Δ5- Δ4-desaturase, viii) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (LFAAT), Δ12-desaturαse, ω3-desaturαse and / or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturαse, Δ9-elongase and Δ5-elongase, each the polynucleotide is operably linked to one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a cell. Preferably, the LFAAT can use a polyunsaturated C22 fatty acyl-CoA substrate such as DPA-CoA.

Предпочтительно растение или его часть, такая как семя, или микробная клетка не содержит полинуклеотида, кодирующего Δ4-десатуразу, или не содержит полипептида Δ4-десатуразы.Preferably, a plant or part thereof, such as a seed, or a microbial cell does not contain a polynucleotide encoding a Δ4 desaturase, or does not contain a Δ4 desaturase polypeptide.

- 11 037184- 11 037184

В варианте реализации Δ12-дезатураза дополнительно обладает ω3-десатуразной и/или Δ15десатуразной активностью, т.е. виды активности обеспечиваются единым полипептидом. В качестве альтернативы, Δ12-десатураза не обладает ω3-десатуразной активностью и не обладает Δ15-десатуразной активностью, т.е. Δ12-десатураза представляет собой отдельный полипептид от полипептида, обладающего ω3-десатуразной и/или Δ15-десатуразной активностью.In an embodiment, Δ12-desaturase additionally has ω3-desaturase and / or Δ15desaturase activity, i.e. activities are provided by a single polypeptide. Alternatively, Δ12 desaturase has no ω3 desaturase activity and no Δ15 desaturase activity, i. E. Δ12 desaturase is a separate polypeptide from a polypeptide having ω3 desaturase and / or Δ15 desaturase activity.

Еще в одном варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, обладает одним или более или всеми из следующих признаков:In yet another embodiment, a plant part, such as a seed, or recombinant cells, such as microbial cells, has one or more or all of the following traits:

i) Δ12-десатураза превращает олеиновую кислоту в линолевую кислоту в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 90% или от около 75 до около 85%, ii) ω3-десатураза превращает ω6 жирные кислоты в ω3 жирные кислоты в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 85%, от около 65 до около 95%, от около 75 до около 91% или от около 80 до около 91%, iii) Δ6-десатураза превращает АЛК в СДК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70%, от около 30 до около 70%, от около 35 до около 60% или от около 50 до около 70%, iv) Δ6-десаmураза превращает линолевую кислоту в γ-линоленовую кислоту в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью менее чем около 5, менее чем около 2,5, менее чем около 1%, от около 0,1 до около 5%, от около 0,5 до около 2,5% или от около 0,5 до около 1%,i) Δ12 desaturase converts oleic acid to linoleic acid in one or more cells of a plant part or in recombinant cells with an efficiency of at least about 60, at least about 70, at least about 80%, about 60 to about 95% , from about 70 to about 90%, or from about 75 to about 85%, ii) ω3 desaturase converts ω6 fatty acids to ω3 fatty acids in one or more cells of a plant part or in recombinant cells with an efficiency of at least about 65, at least about 75, at least about 85%, about 65 to about 95%, about 75 to about 91%, or about 80 to about 91%, iii) Δ6 desaturase converts ALA to CDA in one or more cells parts of a plant or in recombinant cells with an efficiency of at least about 20, at least about 30, at least about 40, at least about 50, at least about 60, at least about 70%, from about 30 to about 70%, about 35 to about 60%, or about 50 to about 70%, iv) Δ6-dec amurase converts linoleic acid to γ-linolenic acid in one or more cells of a plant part or in recombinant cells with an efficiency of less than about 5, less than about 2.5, less than about 1%, about 0.1 to about 5%, about 0.5 to about 2.5%, or about 0.5 to about 1%,

v) Δ6-элонгаза превращает СДК в ЭТК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 80% или от около 75 до около 80%, vi) Δ5-десаmураза превращает ЭТК в ЭПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90%, от около 60 до около 95%, от около 70 до около 95% или от около 75 до около 95%, vii) Δ5-элонгаза превращает ЭПК в ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках с эффективностью по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85, по меньшей мере около 90%, от около 50 до около 90% или от около 85 до около 95%, ix) эффективность превращения олеиновой кислоты в ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках составляет по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 25%, около 20, около 25, около 30%, от около 10 до около 50%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25% или от около 20 до около 30%,v) Δ6-elongase converts SDC to ETC in one or more cells of a plant part or in recombinant cells with an efficiency of at least about 60, at least about 70, at least about 75%, from about 60 to about 95%, from about 70 to about 80%, or about 75 to about 80%, vi) Δ5-desamurase converts ETA to EPA in one or more cells of a plant part or in recombinant cells with an efficiency of at least about 60, at least about 70, at least about 75, at least about 80, at least about 90%, about 60 to about 95%, about 70 to about 95%, or about 75 to about 95%, vii) Δ5-elongase converts EPA to DPC in one or more cells of a part of a plant or in recombinant cells with an efficiency of at least about 80, at least about 85, at least about 90%, from about 50 to about 90%, or from about 85 to about 95%, ix ) efficiency of conversion of oleic acid to duodenum in one or more cells of a plant part or in recombinant cells is at least about 10, at least about 15, at least about 20, at least about 25%, about 20, about 25, about 30%, about 10 to about 50%, about 10 to about 30 %, about 10 to about 25%, or about 20 to about 30%,

х) эффективность превращения ЛК в ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках составляет по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 30%, около 25, около 30, около 35%, от около 15 до около 50%, от около 20 до около 40% или от около 20 до около 30%, xi) эффективность превращения АЛК в ДПК в одной или более клеток части растения или в рекомбинантных клетках составляет по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 30%, около 30, около 35, около 40%, от около 17 до около 55%, от около 22 до около 35% или от около 24 до около 35%, xi) одна или более клеток части растения или рекомбинантных клеток содержат по меньшей мере около на 25, по меньшей мере около на 30%, от около 25 до около 40% или от около 27,5 до около 37,5% больше жирных кислот ω3, чем соответствующие клетки без экзогенных полинуклеотидов, xii) Δ6-десатураза предпочтительно уменьшает степень насыщенности α-линоленовую кислоту (АЛК) относительно линолевой кислоты (ЛК), xiii ) Δ6-элонгаза дополнительно обладает активностью Δ9-элонгазы, xiv ) Δ12-десатураза дополнительно обладает активностью Δ 15-десатуразы, xv) Δ6-десаmураза дополнительно обладает активностью Δ8-десатуразы, xvi) Δ8-десаmураза дополнительно обладает активностью Δ6-десаmуразы или не обладает активностью Δ6-десаmуразы, xvii) Δ 15-десатураза дополнительно обладает активностью ω3-десаmуразы в отношении ГЛК, xvii i) ω3-десаmураза дополнительно обладает активностью Δ15-десатуразы в отношении ЛК, xix ) ω 3-десатураза уменьшает степень насыщенности ЛК и/или ГЛК, хх) ω3-десаmураза предпочтительно уменьшает степень насыщенности ГЛК относительно ЛК, xxi) одна или более или все десатуразы, предпочтительно Δ6-десаmураза и/или Δ5-десатураза, обла-x) the efficiency of converting LA to DPC in one or more cells of a plant part or in recombinant cells is at least about 15, at least about 20, at least about 22, at least about 25, at least about 30%, about 25, about 30, about 35%, about 15 to about 50%, about 20 to about 40%, or about 20 to about 30%, xi) the efficiency of converting ALA to DPC in one or more cells of a plant part or recombinant cells is at least about 17, at least about 22, at least about 24, at least about 30%, about 30, about 35, about 40%, from about 17 to about 55%, from about 22 to about 35%, or about 24 to about 35%, xi) one or more cells of the plant part or recombinant cells contain at least about 25, at least about 30%, about 25 to about 40%, or about 27 , 5 to about 37.5% more fatty acids ω3 than the corresponding cells without exogenous polynucleotides, xii) Δ6-desaturase is preferable significantly reduces the degree of saturation of α-linolenic acid (ALA) relative to linoleic acid (LA), xiii) Δ6-elongase additionally has a Δ9-elongase activity, xiv) Δ12-desaturase additionally has a Δ15-desaturase activity, xv) Δ6-desamurase additionally possesses ∆8-desamurase activity, xvi) ∆8-desamurase additionally has a ∆6-desamurase activity or does not have a ∆6-desamurase activity, xvii) ∆ 15-desaturase additionally has an ω3-desamurase activity against GLA, xvii i) ω3-desamurase additionally has a ∆15 activity -desaturase in relation to LA, xix) ω 3-desaturase decreases the saturation of LA and / or GLA, xx) ω3-desamurase preferably reduces the saturation of GLA relative to LA, xxi) one or more or all desaturase, preferably Δ6-desamurase and / or Δ5-desaturase, region

- 12 037184 дают более высокой активностью на субстрате ацил-КоА, чем на соответствующем субстрате ацилфосфатидилхолина (ацил-ФХ), xxii) Δ6-десатураза обладает более высокой Δ6-десатуразной активностью в отношении АЛК, чем- 12 037184 give a higher activity on the acyl-CoA substrate than on the corresponding acylphosphatidylcholine (acyl-PC) substrate, xxii) Δ6-desaturase has a higher Δ6-desaturase activity against ALA than

ЛК как жирнокислотного субстрата, xxiii) Δ6-десатураза обладает более высокой Δ6-десатуразной активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата, xxiv) Δ6-десатураза обладает по меньшей мере в 2 раза более высокой Δ6-десатуразной активностью, по меньшей мере в 3 раза более высокой активностью, по меньшей мере в 4 раза более высокой активностью или по меньшей мере в 5 раз более высокой активностью в отношении АЛК как субстрата, по сравнению с ЛК, xxv) Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата, xxvi) Δ6-десатураза обладает по меньшей мере в 5 раз более высокой активностью Δ6-десатуразы или, по меньшей мере в 10 раз более высокой активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата, xxvii) десатураза представляет собой фронт-энд десатуразу, xxviii) Δ6-десатураза не обладает обнаружимой активностью Δ5-десатуразы в отношении ЭТК.LA as a fatty acid substrate, xxiii) Δ6-desaturase has a higher Δ6-desaturase activity against ALA-CoA as a fatty acid substrate than against ALA attached to the sn-2 position of PC as a fatty acid substrate, xxiv) Δ6-desaturase has a at least 2 times higher Δ6-desaturase activity, at least 3 times higher activity, at least 4 times higher activity, or at least 5 times higher activity against ALA as a substrate, compared to LA, xxv) Δ6-desaturase has a higher activity against ALA-CoA as a fatty acid substrate than against ALA attached to the sn-2 position of PC as a fatty acid substrate, xxvi) Δ6-desaturase has at least 5 times more high activity of Δ6-desaturase or at least 10 times higher activity against ALA-CoA as a fatty acid substrate than with respect to ALA attached to the sn-2 position of PC, to as a fatty acid substrate, xxvii) desaturase is a front-end desaturase, xxviii) Δ6-desaturase has no detectable Δ5-desaturase activity against ETA.

Еще в одном варианте реализации часть растения, такая как семя, предпочтительно семя Brassica или семя С. sativa, или рекомбинантная клетка, такая как микробные клетки, обладает одним или более или всеми из следующих признаков:In yet another embodiment, a plant part, such as a seed, preferably a Brassica seed or a C. sativa seed, or a recombinant cell, such as a microbial cell, has one or more or all of the following traits:

i) Δ12-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 4, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 4, ii) ω3 -десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 6, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 6, iii) Δ6-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 9, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 9, iv) Δ6-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 16, ее биологически активный фрагмент, такой как SEQ ID NO: 17, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 16 и/или SEQ ID NO: 17,i) Δ12 desaturase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 50% identical to SEQ ID NO: 4, ii) ω3 desaturase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, its biologically active fragment, or an amino acid sequence at least 50% identical to SEQ ID NO: 6, iii) Δ6-desaturase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, its biologically active fragment, or the sequence amino acids at least 50% identical to SEQ ID NO: 9, iv) Δ6-elongase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, a biologically active fragment thereof, such as SEQ ID NO: 17, or an amino acid sequence of at least 50% identical to SEQ ID NO: 16 and / or SEQ ID NO: 17,

v) Δ5-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 20, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 20, и vi) Δ5-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 25, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 25.v) Δ5-desaturase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, a biologically active fragment or amino acid sequence at least 50% identical to SEQ ID NO: 20, and vi) Δ5-elongase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, its biologically active fragment, or amino acid sequence at least 50% identical to SEQ ID NO: 25.

В варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, дополнительно содержит(ат) экзогенный полинуклеотид, кодирующий диацилглицеридацилтрансферазу (ДГАТ), моноацилглицеридацилтрансферазу (МГАТ), глицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ГФАТ), 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФКАТ), предпочтительно ЛФКАТ, которая может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат С22, такой как ДПК-КоА. ацил-КоА:лизофосфатидилхолинацилтрансферазу (ЛФХАТ), фосфолипазу A2 (РЛК₂), фосфолипазу С (PLC), фосфолипазу D (PLD), СДП-холин диацилглицеридхолин фосфотрансферазу (ХФТ), фосфатидилхолин диацилглицерид ацилтрансферазу (ФДАТ), фосфатидилхолин: диацилглицерид холин фосфотрансферазу (ФДХТ), ацил-КоА синтетазу (АКС) или комбинацию двух или более из указанных ферментов.In an embodiment, a plant part, such as a seed, or recombinant cells, such as microbial cells, further comprises (at) an exogenous polynucleotide encoding diacylglyceride acyltransferase (DHAT), monoacylglyceride acyltransferase (MGAT), glyceride-3-phosphatacyltransferase Α-3-phosphate acyltransferase (LPKAT), preferably LPKAT, which can use a polyunsaturated fatty acyl-CoA substrate C22, such as DPA-CoA. acyl-CoA: lizofosfatidilholinatsiltransferazu (LFHAT), phospholipase A2 (WLL _2), phospholipase C (PLC), phospholipase D (PLD), PSD-choline diatsilglitseridholin phosphotransferase (HFT), phosphatidylcholine diacylglycerol acyltransferase (PDAT), phosphatidylcholine: diacylglycerol choline phosphotransferase ( PDCT), acyl-CoA synthetase (ACS), or a combination of two or more of these enzymes.

В другом варианте реализации часть растения, такая как семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, дополнительно содержит(ат) введенную мутацию или экзогенный полинуклеотид, который в клетке части растения отрицательно регулирует выработку и/или активность эндогенного фермента, выбранного среди FAE1, ДГАТ, МГАТ, ГФАТ, ЛФКАТ, ЛФХАТ, РЛК₂, PLC, PLD, ХФТ, ФДАТ, тиоэстеразы, например FATB или Δ12-десатуразы, или комбинации двух или более из указанных ферментов.In another embodiment, the plant part, such as a seed, or recombinant cells, such as microbial cells, further comprises an introduced mutation or an exogenous polynucleotide that, in the cell of the plant part, negatively regulates the production and / or activity of an endogenous enzyme selected from FAE1, DHAT, MGAT, GPAT, LPKAT, LPKHAT, RLK ₂ , PLC, PLD, CPT, PDAT, thioesterase, for example FATB or Δ12 desaturase, or a combination of two or more of these enzymes.

В дальнейшем варианте реализации по меньшей мере один или предпочтительно все промоторы представляют собой специфичные для семени промоторы. В варианте реализации по меньшей мере один или все промоторы получены из гена биосинтеза или аккумуляции масла, такого как ген, кодирующий олеозин, или из генов хранения белка в семени, таких как ген, кодирующий конлинин.In a further embodiment, at least one or preferably all of the promoters are seed specific promoters. In an embodiment, at least one or all of the promoters are derived from an oil biosynthesis or accumulation gene, such as a gene encoding oleosin, or from protein storage genes in a seed, such as a gene encoding conlinin.

- 13 037184- 13 037184

В другом варианте реализации промотор(ы), направляющий(ие) экспрессию экзогенных полинуклеотидов, которые кодируют Δ5-элонгазу, инициирует экспрессию полинуклеотидов в развивающемся семени растения или рекомбинантных клетках, таких как микробные клетки, перед или достигает пика экспрессии перед промотором(ами), направляющим(и) экспрессию экзогенных полинуклеотидов, кодирующих Δ12-десатуразу и ω3-десатуразу.In another embodiment, the promoter (s) directing the expression of exogenous polynucleotides that encode the Δ5 elongase initiates the expression of the polynucleotides in the developing plant seed or recombinant cells, such as microbial cells, before or peaking before the promoter (s), directing (and) the expression of exogenous polynucleotides encoding Δ12-desaturase and ω3-desaturase.

В дальнейшем варианте реализации экзогенные полинуклеотиды ковалентно соединены в молекулу ДНК, предпочтительно молекулу Т-ДНК, интегрированную в геном клеток части растения или рекомбинантных клеток, таких как микробные клетки, причем количество таких молекул ДНК, интегрированных в геном клеток части растения или рекомбинантных клеток, предпочтительно составляет не более одной, двух или трех, или составляет две или три.In a further embodiment, the exogenous polynucleotides are covalently linked into a DNA molecule, preferably a T-DNA molecule integrated into the genome of cells of a plant part or recombinant cells, such as microbial cells, the number of such DNA molecules integrated into the genome of cells of a plant part or recombinant cells, preferably is no more than one, two or three, or is two or three.

Еще в одном варианте реализации часть растения содержит по меньшей мере два различных экзогенных полинуклеотида, каждый из которых кодирует Δ6-десатуразу с такой же или другой последовательностью аминокислот.In yet another embodiment, the plant part contains at least two different exogenous polynucleotides, each of which encodes a Δ6 desaturase with the same or a different amino acid sequence.

В дальнейшем варианте реализации общее содержание масла в части растения, содержащей экзогенные полинуклеотиды, составляет по меньшей мере около 40 или по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70%, от около 50 до около 80% или от около 80 до около 100% от общего содержания масла в соответствующей части растения, в которой отсутствуют экзогенные полинуклеотиды. В дальнейшем варианте реализации масса семени, содержащего экзогенные полинуклеотиды, составляет по меньшей мере около 40, меньшей мере около 50, меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70%, от около 50 до около 80% или от около 80 до 100% от массы соответствующего семени, не содержащего экзогенных полинуклеотидов.In a further embodiment, the total oil content of the plant part containing exogenous polynucleotides is at least about 40, or at least about 50, at least about 60, at least about 70%, about 50 to about 80%, or about 80 to about 100% of the total oil content in the corresponding part of the plant, which lacks exogenous polynucleotides. In a further embodiment, the weight of the seed containing exogenous polynucleotides is at least about 40, at least about 50, at least about 60, at least about 70%, about 50 to about 80%, or about 80 to 100% of the mass of the corresponding seed, which does not contain exogenous polynucleotides.

В другом варианте реализации липид находится в форме масла, предпочтительно масла из семян масличной культуры, причем по меньшей мере около 90 или по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 98% или от около 95 до около 98 мас.% липида составляют триацилглицериды.In another embodiment, the lipid is in the form of an oil, preferably an oilseed oil, with at least about 90, or at least about 95, at least about 98%, or from about 95 to about 98% by weight of the lipid triacylglycerides.

В дальнейшем варианте реализации способ дополнительно включает обработку липида с целью повышения уровня ДПК как процента от общего содержания жирных кислот. Например, обработка включает гидролиз этерифицированных жирных кислот с образованием свободных жирных кислот или переэтерификацию. Например, липид, такой как масло рапса, может быть подвергнут обработке с целью превращения жирных кислот в масле в алкиловые эфиры, например метиловые или этиловые эфиры, которые далее могут быть фракционированы с обогащением липида или масла ДПК. В вариантах реализации состав жирных кислот липида после такой обработки включает по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80 или по меньшей мере 90% ДПК. В варианте реализации изобретения уровень ДГК в общем содержании жирных кислот липида после обработки составляет менее чем 2,0 или менее чем 0,5%, предпочтительно она не определяется в липиде.In a further embodiment, the method further comprises treating the lipid to increase the duodenum level as a percentage of the total fatty acid content. For example, treatment includes hydrolysis of esterified fatty acids to form free fatty acids or transesterification. For example, a lipid such as rapeseed oil can be treated to convert the fatty acids in the oil to alkyl esters, such as methyl or ethyl esters, which can then be fractionated to enrich the lipid or WPC oil. In embodiments, the fatty acid composition of the lipid after such treatment comprises at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, or at least 90% DPC. In an embodiment of the invention, the level of DHA in the total fatty acid content of the lipid after treatment is less than 2.0% or less than 0.5%, preferably it is not detectable in the lipid.

Кроме того, предлагается липид или масло, содержащее липид, такой как свободные жирные кислоты или алкиловые эфиры, полученные с применением способа по изобретению.In addition, there is provided a lipid or oil containing a lipid, such as free fatty acids or alkyl esters, obtained using the method of the invention.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения метиловых или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, включающий введение триацилглицеридов в реакцию с метанолом или этанолом, в экстрагированном растительном липиде или в ходе процесса экстракции соответственно, причем экстрагированный растительный липид содержит этерифицированные жирные кислоты в форме ТАГ, и, при этом, жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие αлиноленовую кислоту (АЛК), и докозапентаеновую кислоту (ДПК), и необязательно одну или более из стеаридоновой кислоты (СДК), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозапентаеновой кислоты (ДПК) и эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК), притом, что уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 7 до 35%, предпочтительно от 20,1 до 30% или от 20,1 до 35%, с получением таким образом метила или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот.In another aspect of the present invention, there is disclosed a method for preparing methyl or ethyl esters of polyunsaturated fatty acids, comprising reacting triacylglycerides with methanol or ethanol in an extracted plant lipid or during an extraction process, respectively, wherein the extracted plant lipid comprises esterified fatty acids in the form of TAG, and wherein the fatty acids include oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids including linoleic acid (LA), ω3 fatty acids including α linolenic acid (ALA), and docosapentaenoic acid (DPA), and optionally one or more of stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosapentaenoic acid (DPA) and eicosatetraenoic acid (ETA), while the level of DPA in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 7 to 35%, preferably from 20.1 to 30% or from 20.1 to 35%, thus obtaining methyl or ethyl esters of poly unsaturated fatty acids.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения метиловых или этиловых эфиров докозапентаеновой кислоты (ДПК), включающий введение триацилглицеридов (ТАГ) в реакцию с метанолом или этанолом, в экстрагированном растительном липиде или в ходе процесса экстракции соответственно, причем экстрагированный растительный липид содержит жирные кислоты в этерифицированной форме, и, при этом, жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК), причем по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме ТАГ, этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, с получением таким образом метиловых или этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот.In another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing methyl or ethyl esters of docosapentaenoic acid (DPA), comprising reacting triacylglycerides (TAG) with methanol or ethanol in an extracted plant lipid or during an extraction process, respectively, wherein the extracted plant lipid contains fatty acids in esterified form, and the fatty acids include docosapentaenoic acid (DPA), with at least 35% of the DPA esterified in the TAG form being esterified at the sn-2 position of the TAG, thereby obtaining methyl or ethyl esters of polyunsaturated fatty acids.

В предпочтительном варианте реализации липид, который используется в способе согласно описанным выше двум аспектам, обладает одним или более признаков, определенных в данном описании в контексте экстрагированного липида или масла по изобретению.In a preferred embodiment, the lipid used in the method according to the above two aspects has one or more of the characteristics defined herein in the context of the extracted lipid or oil of the invention.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается масличное растение или его часть, такая как семя, предпочтительно растение Brassica или растение С. sativa, содержащее липид в семени, или микробная клетка, содержащая:In another aspect of the present invention, there is disclosed an oil plant or part thereof, such as a seed, preferably a Brassica plant or a C. sativa plant containing a lipid in a seed, or a microbial cell comprising:

а) липид, содержащий жирные кислоты в этерифицированной форме иa) a lipid containing fatty acids in esterified form and

- 14 037184- 14 037184

б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:b) exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes:

i) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или λ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза иi) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or λ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and

Δ5-элонгаза или ii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза иΔ5-desaturase or ii) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and

Δ5-элонгаза, iii) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза или iv) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более специфических для семени промоторов, способных управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения, или с одним или более промоторов, способных направлять экспрессию указанных полинуклеотидов в микробной клетке, и, при этом, жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК) и необязательно γ-линоленовую кислоту (ГЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линоленовую кислоту (АЛК), стеаридоновую кислоту (СДК), и докозапентаеновую кислоту (ДПК) и необязательно эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК) и/или эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК), притом, что уровень ДПК в общем содержании жирных кислот липида семени или микробной клетки составляет от 7 до 35%. В предпочтительном варианте реализации данного аспекта ДГК присутствует на уровне менее чем 2 или менее чем 0,5% от общего содержания жирных кислот липида семени и экстрагированного липида и более предпочтительно не определяется в общем содержании жирных кислот липидов.Δ5-elongase, iii) ω3-desaturase and / or Δ 15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, or iv) ω3-desaturase and / or Δ 15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, each polynucleotide is operably linked to one or more seed-specific promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in the developing plant seed, or to one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in microbial cell, and, in this case, fatty acids include oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids, including linoleic acid (LA) and optionally γ-linolenic acid (GLA), ω3 fatty acids, including α-linolenic acid (ALA), stearidonic acid (SDA), and docosapentaenoic acid (DPA) and optionally eicosapentaenoic acid (EPA) and / or eicosatetraenoic acid (ETA), while the level of DPA in the total fatty acids of the lipid of the semen or microbial cell with puts from 7 to 35%. In a preferred embodiment of this aspect, DHA is present at a level of less than 2 or less than 0.5% of the total fatty acid of the seed lipid and the extracted lipid, and more preferably is not determined in the total fatty acid of the lipid.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается клетка, предпочтительно клетка в или из растения, такого как растение масличной культуры, или его части, такой как семя, или растение масличной культуры или его часть, предпочтительно растение Brassica или растение С. sativa, или микробная клетка, содержащие:In another aspect, the present invention provides a cell, preferably a cell in or from a plant, such as an oilseed plant, or part thereof, such as a seed, or an oilseed plant or part thereof, preferably a Brassica plant or a C. sativa plant, or a microbial cell, containing:

а) жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают докозапентаеновую кислоту (ДПК) и при этом по меньшей мере 35% ДПК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ, иa) fatty acids in esterified form, the fatty acids comprising docosapentaenoic acid (DPA) and wherein at least 35% of the DPA esterified as triacylglyceride (TAG) is esterified at the sn-2 position of the TAG, and

б) экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:b) exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes:

i) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатураза, Δ6-десатураза,Δ5- десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ15-десатураза, Δ6-десатураза,Δ5- десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, Δ6-десатураза,Δ5- десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iv) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,i) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, ii) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFA-desaturase), Δ15 Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, iii) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (LPAAT), Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, iv ) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

v) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ω3-десатураза, Δ8-десатураза,Δ5- десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза,Δ5- десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, Δ8-десатураза,Δ5- десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке. Предпочтительно ЛФААТ может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат С22, такой как ДПК-КоА, и уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до 35% или от около 7 до 35% или от около 20,1 до 35%. В вариантах реализации по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 48%, от 35 до около 60% или от 35 до около 50% ДПК и/или ДГК, этерифицированной в форме триацилглицерида (ТАГ), этерифицировано в положении sn-2 ТАГ.v) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), ω3-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, vi) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (LFA-desaturase), Δ 15 , Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, vii) 1-acylglyceride-3-phosphatacyltransferase (LPAAT), Δ12-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, viii) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, each polynucleotide being functionally linked to one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a cell. Preferably, the LFAAT can use a C22 polyunsaturated fatty acyl-CoA substrate, such as DPA-CoA, and the level of DPA in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 1 to 35%, or from about 7 to 35%, or from about 20.1 to 35 %. In embodiments, at least about 40, at least about 45, at least about 48%, 35 to 60%, or 35 to 50% DPA and / or DHA esterified as triacylglyceride (TAG) esterified in position sn-2 TAG.

В предпочтительных вариантах реализации каждого из упомянутых выше двух аспектов изобретения Δ15-десатураза представляет собой грибковую Δ 15-десатуразу, и ω3-десатураза представляет собой грибковую ω3-десатуразу.In preferred embodiments of each of the above two aspects of the invention, Δ15 desaturase is fungal Δ15 desaturase, and ω3 desaturase is fungal ω3 desaturase.

В предпочтительном варианте реализации растение масличной культуры, микробная клетка или клетка по изобретению обладает, если это уместно, одним или более признаков, определенных в данном описании, например, как определено выше для экстрагированного растительного липида, экстрагированного микробного липида или способа их получения.In a preferred embodiment, an oilseed plant, microbial cell or cell according to the invention possesses, as appropriate, one or more of the characteristics defined herein, for example, as defined above for an extracted plant lipid, an extracted microbial lipid, or a method for producing them.

Примеры растений масличной культуры включают, без ограничения, вид Brassica, Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, вид Helianthus, Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana,Examples of oilseed plants include, but are not limited to, Brassica spp., Gossypium hirsutum, Linum usitatissimum, Helianthus spp., Carthamus tinctorius, Glycine max, Zea mays, Arabidopsis thaliana,

- 15 037184- 15 037184

Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, вид Trifolium, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa или Crambe abyssinica. В варианте реализации растение масличной культуры представляет собой растение вида Brassica, растение С. sativa или растение G. max (соя). В варианте реализации масличное растение представляет собой растение рапса, В. juncea, Glycine max, Camelina sativa или Arabidopsis thaliana. В альтернативном варианте реализации растение масличной культуры представляет собой растение, кроме A. thaliana и/или кроме С. sativa. В варианте реализации растение масличной культуры представляет собой растение, кроме G. max (сои). Предпочтительно растение представляет собой растение вида Brassica или Camelina sativa. В варианте реализации растение масличной культуры находится в поле или было выращено в поле или было выращено в теплице в стандартных условиях, например, как описано в примере 1.Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Avena sativa, Trifolium species, Elaesis guineenis, Nicotiana benthamiana, Hordeum vulgare, Lupinus angustifolius, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Camelina sativa or Crambe abyssinica. In an embodiment, the oilseed plant is a Brassica plant, a C. sativa plant, or a G. max plant (soybean). In an embodiment, the oil plant is a rapeseed plant, B. juncea, Glycine max, Camelina sativa, or Arabidopsis thaliana. In an alternative embodiment, the oilseed plant is a plant other than A. thaliana and / or other than C. sativa. In an embodiment, the oilseed plant is a plant other than G. max (soybean). Preferably the plant is a Brassica or Camelina sativa plant. In an embodiment, the oilseed plant is in the field, or has been grown in the field, or has been grown in a greenhouse under standard conditions, for example, as described in Example 1.

В варианте реализации одна или более десатураз, применяемых в способе по изобретению или присутствующих в клетке или растении или его части по изобретению, способны использовать субстрат ацил-КоА. В предпочтительном варианте реализации одна или более из Δ6-десатуразы, Δ5-десаmуразы и Δ8-десатуразы, если они присутствуют, способны использовать субстрат ацил-КоА, предпочтительно каждая из i) Δ6-десаmуразы и Δ5-десатуразы или ii) Δ5-десатуразы и Δ8-десатуразы способна использовать субстрат ацил-КоА. В варианте реализации Δ12-десатураза и/или ω3-десатураза способны использовать субстрат ацил-КоА. Субстрат ацил-КоА предпочтительно представляет собой АЛК-КоА для Δ6десатуразы, ЭТК-КоА для Δ5-десатуразы, ЭТрК-КоА для Δ8-десаmуразы, олеоил-КоА для Δ8-десатуразы или один или более из ЛК-КоА, ГЛК-КоА и АРК-КоА для ω3-десатуразы.In an embodiment, one or more desaturases used in the method of the invention or present in a cell or plant or part thereof according to the invention are capable of using an acyl-CoA substrate. In a preferred embodiment, one or more of Δ6-desaturase, Δ5-desamurase and Δ8-desaturase, if present, are capable of using an acyl-CoA substrate, preferably each of i) Δ6-desamurase and Δ5-desaturase, or ii) Δ5-desaturase, and Δ8-desaturase is able to utilize the acyl-CoA substrate. In an embodiment, Δ12-desaturase and / or ω3-desaturase are capable of using an acyl-CoA substrate. The acyl-CoA substrate is preferably ALK-CoA for Δ6 desaturase, ETC-CoA for Δ5 desaturase, ETRK-CoA for Δ8 desaturase, oleoyl-CoA for Δ8 desaturase, or one or more of LA-CoA, GLK-CoA and ARA -KoA for ω3-desaturase.

В варианте реализации зрелое, собранное в процессе сбора урожая семя растения содержит ДПК в количестве по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, предпочтительно по меньшей мере около 32 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, более предпочтительно по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени или по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени или от около 30 до около 80 мг на 1 г семени.In an embodiment, the mature, harvested seed of the plant contains WPC in an amount of at least about 28 mg per gram of seed, preferably at least about 32 mg per gram of seed, at least about 36 mg per gram of seed, at least about 40 mg per gram of seed, more preferably at least about 44 mg per gram of seed, or at least about 48 mg per gram of seed, about 80 mg per gram of seed, or about 30 to about 80 mg for 1 g of seed.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения раскрывается растение Brassica napus, Bjuncea или Camelina sativa, которое способно давать семя, содержащее ДПК, причем собранное в процессе сбора урожая, зрелое семя растения содержит ДПК в количестве по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, предпочтительно по меньшей мере около 32 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, более предпочтительно по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени или по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени или от около 30 до около 80 мг на 1 г семени.In a further aspect of the present invention, there is disclosed a Brassica napus, Bjuncea or Camelina sativa plant that is capable of producing a WPC-containing seed, wherein the harvested mature seed of the plant contains WPC in an amount of at least about 28 mg per gram of seed, preferably at least about 32 mg per gram of seed, at least about 36 mg per gram of seed, at least about 40 mg per gram of seed, more preferably at least about 44 mg per gram of seed, or at least about 48 mg per gram of seed, about 80 mg per gram of seed, or about 30 to about 80 mg per gram of seed.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается клетка растения по изобретению, содержащая экзогенные полинуклеотиды, раскрытые в данном описании.In another aspect of the present invention, a plant cell of the invention is disclosed comprising the exogenous polynucleotides disclosed herein.

Также раскрыта часть растения, предпочтительно семя, или рекомбинантные клетки, такие как микробные клетки, которые обладают одним или более из следующих признаков:Also disclosed is a plant part, preferably a seed, or recombinant cells such as microbial cells that exhibit one or more of the following traits:

i) получена из растения по изобретению, ii) содержит липид, раскрытый в настоящем документе, или iii) может использоваться в способе по изобретению.i) obtained from a plant according to the invention, ii) contains a lipid disclosed herein, or iii) can be used in a method according to the invention.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения раскрывается зрелое, собранное в процессе сбора урожая семя Brassica napus, В. juncea или Camelina sativa, содержащее ДПК, с содержанием влаги от около 4 до около 15 мас.%, предпочтительно от около 6 до около 8 мас.% или от около 4 до около 8 мас.%, более предпочтительно от около 4 до около 6 мас.%, причем содержание ДПК в семени составляет по меньшей мере около 28 мг на 1 г семени, предпочтительно по меньшей мере около 32 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 36 мг на 1 г семени, по меньшей мере около 40 мг на 1 г семени, более предпочтительно по меньшей мере около 44 мг на 1 г семени или по меньшей мере около 48 мг на 1 г семени, около 80 мг на 1 г семени или от около 30 около 80 мг на 1 г семени.In yet another aspect, the present invention discloses a mature, harvested seed of Brassica napus, B. juncea or Camelina sativa containing WPC having a moisture content of about 4 to about 15 wt%, preferably about 6 to about 8 wt. % or about 4 to about 8 wt.%, more preferably from about 4 to about 6 wt.%, and the content of WPC in the seed is at least about 28 mg per gram of seed, preferably at least about 32 mg per 1 g seed, at least about 36 mg per gram of seed, at least about 40 mg per gram of seed, more preferably at least about 44 mg per gram of seed, or at least about 48 mg per gram of seed, about 80 mg per gram of seed, or from about 30 to about 80 mg per gram of seed.

В варианте реализации клетка по изобретению, растение масличной культуры по изобретению, растение Brassica napus, В. juncea или Camelina sativa по изобретению, часть растения по изобретению или семя по изобретению могут применяться для получения экстрагированного липида, обладающего одним или более или всеми признаками, определенными в настоящем документе.In an embodiment, a cell according to the invention, an oil plant according to the invention, a Brassica napus, B. juncea or Camelina sativa plant according to the invention, a part of a plant according to the invention, or a seed according to the invention can be used to produce an extracted lipid having one or more or all of the characteristics defined in this document.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения растения или клетки по изобретению, которые могут применяться для получения экстрагированного липида по изобретению, причем способ включает:In yet another aspect of the present invention, there is disclosed a method for producing a plant or cell according to the invention that can be used to obtain an extracted lipid according to the invention, the method comprising

а) анализ уровня ДПК в липиде, продуцированном одной или более частями растения, такими как семена, или рекомбинантными клетками, такими как микробные клетки, от нескольких растений или рекомбинантных клеток, таких как микробные клетки, причем каждое растение или рекомбинантная клетка, такая как микробная клетка, содержит один или более экзогенных полинуклеотидов, кодирующих один из следующих наборов ферментов;a) analysis of the level of duodenum in a lipid produced by one or more parts of a plant, such as seeds, or recombinant cells, such as microbial cells, from several plants or recombinant cells, such as microbial cells, each plant or recombinant cell, such as microbial a cell contains one or more exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes;

i) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ6-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,i) ω3 desaturase, Δ6 desaturase, Δ5 desaturase, Δ6 elongase and Δ5 elongase, ii) Δ15 desaturase, Δ6 desaturase, Δ6 desaturase, Δ6 elongase and Δ5 elongase, iii) Δ12 desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

- 16 037184 iv) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и- 16 037184 iv) Δ12-desaturase, ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and

Δ5-элонгаза,Δ5-elongase,

v) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза или ix) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,v) ω3 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, vi) Δ15 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, vii) Δ12 desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, viii) Δ12-desaturase, ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase or ix) ω3- desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

х) Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, xi) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными управлять экспрессией указанных полинуклеотидов в клетке части растения или рекомбинантной клетке, иx) Δ 15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, xi) Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, each polynucleotide being functionally linked with one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a plant part cell or a recombinant cell, and

б) идентификацию из множества растений или рекомбинантных клеток растения или рекомбинантной клетки, которые могут применяться для получения экстрагированного растительного липида или клеточного липида по изобретению в одной или более их частей, иb) identifying from a plurality of plants or recombinant cells of a plant or recombinant cell that can be used to obtain the extracted plant lipid or cell lipid according to the invention in one or more parts thereof, and

в) необязательно, получение потомства растений или рекомбинантных клеток от идентифицированного растения или рекомбинантной клетки, или их семени.c) optionally, obtaining progeny of plants or recombinant cells from the identified plant or recombinant cell, or their seed.

В варианте реализации растение или рекомбинантная клетка дополнительно содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий ЛФААТ, как определено в данном описании.In an embodiment, the plant or recombinant cell further comprises an exogenous polynucleotide encoding LFAAT as defined herein.

Предпочтительно растение-потомок принадлежит, по меньшей мере, по второму или третьему поколению относительно идентифицированного растения и предпочтительно является гомозиготным по одному или более полинуклеотидам. Более предпочтительно один или более полинуклеотидов присутствуют в растении-потомке только в одном инсерционном локусе. Таким образом, в изобретении предлагается способ, который может применяться в качестве способа скрининга для идентификации растения или его семени из множества трансформированных растений или семян кандидатов, причем идентифицированное растение или его растение-потомок вырабатывает липид по изобретению, предпочтительно в семени. Такое растение или растение-потомок или его семя отбирают, если оно вырабатывает липид по изобретению, в частности, с указанным уровнем ДПК, или не отбирают, если оно не вырабатывает липида по изобретению.Preferably, the offspring plant is at least a second or third generation relative to the identified plant, and is preferably homozygous for one or more polynucleotides. More preferably, one or more polynucleotides are present in the progeny plant at only one insertion locus. Thus, the invention provides a method that can be used as a screening method for identifying a plant or its seed from a plurality of transformed plants or candidate seeds, the identified plant or its progeny plant producing a lipid of the invention, preferably in a seed. Such a plant or progeny plant or its seed is selected if it produces a lipid according to the invention, in particular, with a specified level of duodenum, or is not selected if it does not produce a lipid according to the invention.

В варианте реализации экзогенные полинуклеотиды, которые присутствуют в клетке, такой как микробная клетка, или растении или его части, как определено в данном описании, становятся стабильно интегрированными в геном клетки, растения или части растения, такой как семя. Предпочтительно экзогенный(е) полинуклеотид(ы) становится стабильно интегрированным в геном клетки, растения или части растения, такой как семя, в одном локусе в геноме, и предпочтительно является гомозиготными для вставки. Более предпочтительно растение, часть растения или семя дополнительно характеризуется тем, что в нем отсутствуют экзогенные полинуклеотиды, кроме одной или более молекул Т-ДНК.In an embodiment, exogenous polynucleotides that are present in a cell, such as a microbial cell, or a plant or part thereof, as defined herein, become stably integrated into the genome of a cell, plant, or plant part, such as a seed. Preferably, the exogenous polynucleotide (s) becomes stably integrated into the genome of a cell, plant, or plant part, such as a seed, at one locus in the genome, and is preferably homozygous for insertion. More preferably, the plant, plant part or seed is further characterized in that it contains no exogenous polynucleotides other than one or more T-DNA molecules.

Таким образом, никакие экзогенные векторные последовательности не интегрированы в геном, кроме последовательностей Т-ДНК.Thus, no exogenous vector sequences are integrated into the genome, except for the T-DNA sequences.

В варианте реализации, перед стадией а) способ включает введение одного или более экзогенных полинуклеотидов в одну или более клеток растения.In an embodiment, prior to step a), the method comprises introducing one or more exogenous polynucleotides into one or more plant cells.

Дополнительно предлагается растение, полученное с применением способа по изобретению, и семена такого растения.Additionally, there is provided a plant obtained using the method according to the invention and the seeds of such a plant.

В варианте реализации растение по изобретению обладает как мужской, так и женской фертильностью, предпочтительно с уровнями как мужской, так и женской фертильности, которые составляют по меньшей мере 70% относительно соответствующего растения дикого типа, или предпочтительно являются такими же. В варианте реализации пыльца, вырабатываемая растением по изобретению или растением, полученным из семени по изобретению, является на 90-100% жизнеспособной по данным окрашивания красителем для определения жизнеспособности. Например, жизнеспособность пыльцы можно оценить, как описано в примере 1.In an embodiment, the plant of the invention has both male and female fertility, preferably with both male and female fertility levels that are at least 70% relative to the corresponding wild-type plant, or are preferably the same. In an embodiment, pollen produced by a plant of the invention or a plant derived from a seed of the invention is 90-100% viable as determined by viability staining. For example, pollen viability can be assessed as described in Example 1.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения семени, включающий:In another aspect of the present invention, a method for producing a seed is disclosed, comprising:

а) выращивание растения по изобретению или растения, которое образует часть по изобретению, предпочтительно в поле как часть популяции размером по меньшей мере 1000 или 2000 или 3000 таких растений или на площади по меньшей мере 1, или 2, или 3 га со стандартной плотностью насаждения, или, в качестве альтернативы, в теплице со стандартными условиями,a) growing a plant according to the invention or a plant that forms a part according to the invention, preferably in the field as part of a population of at least 1000 or 2000 or 3000 such plants or on an area of at least 1 or 2 or 3 hectares with a standard planting density , or, alternatively, in a greenhouse with standard conditions,

б) сбор урожая семени с растения или растений иb) harvesting the seed from the plant or plants, and

в) необязательно, экстракцию липида из семени предпочтительно с получением масла с общим выходом ДПК по меньшей мере 60, или 70, или 80 кг ДПК на 1 га.c) optionally, extraction of the lipid from the seed, preferably to obtain an oil with a total WPC yield of at least 60, or 70, or 80 kg WPC per hectare.

В варианте реализации растение, клетка растения, часть растения или семя или рекомбинантная клетка по изобретению обладает одним или более из следующих признаков:In an embodiment, a plant, plant cell, plant part or seed, or a recombinant cell of the invention has one or more of the following characteristics:

i) масло является таким, как раскрыто в настоящем документе, или ii) часть растения или семя или рекомбинантная клетка могут применяться в способе по изобрете-i) the oil is as disclosed herein, or ii) a plant part or seed or recombinant cell can be used in the method of the invention

- 17 037184 нию.- 17 037184 niyu.

Например, семя может применяться для получения растения по изобретению. Растение может быть выращено в поле или в теплице со стандартными условиями, например, как описано в примере 1.For example, the seed can be used to produce a plant according to the invention. The plant can be grown in the field or in a greenhouse under standard conditions, for example, as described in example 1.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения раскрывается липид или масло, продуцированные или полученные с применением способа по изобретению, из клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, В. juncea, G. max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению или растения, клетки растения, части растения или семени по изобретению. Предпочтительно липид или масло очищают для удаления загрязняющих веществ, таких как нуклеиновая кислота (ДНК и/или РНК), белок и/или углевод, или пигментов, таких как хлорофилл. Кроме того, липид или масло могут быть очищены с целью увеличения содержания ТАГ, например, путем удаления свободных жирных кислот (СЖК) или фосфолипида.A further aspect of the present invention discloses a lipid or oil produced or obtained using the method of the invention from a cell of the invention, an oil plant of the invention, a plant of the Brassica species, Brassica napus, B. juncea, G. max or Camelina sativa of the invention, a plant part of the invention, a seed of the invention or a plant, a plant cell, a plant part or a seed of the invention. Preferably, the lipid or oil is purified to remove contaminants such as nucleic acid (DNA and / or RNA), protein and / or carbohydrate, or pigments such as chlorophyll. In addition, the lipid or oil can be purified to increase the TAG content, for example, by removing free fatty acids (FFA) or phospholipid.

В варианте реализации липид или масло получены экстракцией масла из масличной культуры. Примеры масла из масличных культур включают, без ограничения, масло рапса (Brassica napus, подвид Brassica rapa), горчичное масло (Brassica juncea), масло другого вида Brassica, масло подсолнечника (Helianthus annus), льняное масло (Linum usitatissimum), соевое масло (Glycine max), сафлоровое масло (Carthamus tinctorius), кукурузное масло (Zea mays), масло табака (Nicotiana tabacum), арахисовое масло (Arachis hypogaea), пальмовое масло, хлопковое масло (Gossypium hirsutum), кокосовое масло (Cocos nucifera), масло авокадо (Persea americana), оливковое масло (Olea europaea), масло кешью (Anacardium occidentale), масло макадамии (Macadamia intergrifolia), миндальное масло (Prunus amygdalus) или масло семени Arabidopsis (Arabidopsis thaliana).In an embodiment, the lipid or oil is obtained by extracting oil from an oilseed crop. Examples of oilseed oil include, but are not limited to, rapeseed oil (Brassica napus, subspecies Brassica rapa), mustard oil (Brassica juncea), another Brassica species oil, sunflower oil (Helianthus annus), linseed oil (Linum usitatissimum), soybean oil ( Glycine max), safflower oil (Carthamus tinctorius), corn oil (Zea mays), tobacco oil (Nicotiana tabacum), peanut oil (Arachis hypogaea), palm oil, cottonseed oil (Gossypium hirsutum), coconut oil (Cocos nucifera), oil avocado (Persea americana), olive oil (Olea europaea), cashew oil (Anacardium occidentale), macadamia oil (Macadamia intergrifolia), almond oil (Prunus amygdalus), or Arabidopsis seed oil (Arabidopsis thaliana).

В варианте реализации клетка (рекомбинантная клетка) по изобретению или применяемая согласно изобретению представляет собой микробную клетку, такую как клетка, подходящая для ферментации, предпочтительно маслянистая микробная клетка, способная аккумулировать триацилглицериды до уровня по меньшей мере 25% в пересчете на массу. Предпочтительными процессами ферментации являются анаэробные процессы ферментации, как хорошо известные из уровня техники. Подходящие ферментирующие клетки, обычно микроорганизмы, способны ферментировать, т.е. превращать сахара, такие как глюкоза или мальтоза, прямо или косвенно, в желательные жирные кислоты. Примеры ферментирующих микроорганизмов включают грибковые организмы, такие как дрожжи. В данном описании дрожжи включают виды Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, виды Candida, виды Kluveromyces, виды Pichia, виды Hansenula, виды Trichoderma, Lipomyces starkey и предпочтительно Yarrowia lipolytica.In an embodiment, the cell (recombinant cell) according to the invention or used according to the invention is a microbial cell, such as a cell suitable for fermentation, preferably an oily microbial cell capable of accumulating triacylglycerides to a level of at least 25% by weight. The preferred fermentation processes are anaerobic fermentation processes, as are well known in the art. Suitable fermenting cells, usually microorganisms, are capable of fermenting, i. E. convert sugars such as glucose or maltose, directly or indirectly, into desired fatty acids. Examples of fermenting microorganisms include fungal organisms such as yeast. As used herein, yeast includes Saccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Candida spp., Kluveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., Trichoderma spp., Lipomyces starkey, and preferably Yarrowia lipolytica.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения раскрывается жирная кислота, продуцированная или полученная с применением способа по изобретению из клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, В. juncea, G. max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, или растения, клетки растения, части растения или семени по изобретению. Предпочтительно жирная кислота представляет собой ДПК. Жирная кислота может находиться в смеси жирных кислот, состав жирных кислот в которой является таким, как описано в настоящем документе, или смесь может быть обогащена таким образом, чтобы жирная кислота, предпочтительно ДПК, составляла по меньшей мере 40 или по меньшей мере 90% от содержания жирных кислот в смеси. В варианте реализации жирная кислота является неэтерифицированной. В качестве альтернативы, жирная кислота этерифицирована с применением, например, метильной, этильной, пропильной или бутильной групп.In a further aspect of the present invention, there is disclosed a fatty acid produced or obtained using the method according to the invention from a cell according to the invention, an oil plant according to the invention, a plant of the Brassica species, Brassica napus, B. juncea, G. max or Camelina sativa according to the invention, a plant part according to the invention, a seed according to the invention, or a plant, plant cell, part of a plant or seed according to the invention. Preferably the fatty acid is DPA. The fatty acid can be present in a fatty acid mixture, the fatty acid composition of which is as described herein, or the mixture can be enriched such that the fatty acid, preferably DPA, constitutes at least 40% or at least 90% of the content of fatty acids in the mixture. In an embodiment, the fatty acid is unesterified. Alternatively, the fatty acid is esterified using, for example, methyl, ethyl, propyl or butyl groups.

Дополнительно раскрывается жмых, полученный из семени по изобретению или полученный из растения по изобретению. Предпочтительный жмых включает, но не ограничиваясь этим, жмых Brassica napus, В. juncea, Camelina sativa или Glycine max. В варианте реализации жмых содержит экзогенный(е) полинуклеотид(ы) и/или генетические конструкции, как раскрыто в настоящем документе. В предпочтительном варианте реализации в жмыхе остается часть липида или масла, выработанного в семени, из которого получен жмых, но на низком уровне (например, менее чем 2 мас.%) после экстракции большей части липида или масла. Жмых может применяться в качестве корма для животных или в качестве ингредиента в производстве пищевых продуктов.Further disclosed is a cake obtained from a seed according to the invention or obtained from a plant according to the invention. Preferred cake includes, but is not limited to, cake from Brassica napus, B. juncea, Camelina sativa, or Glycine max. In an embodiment, the cake contains exogenous (s) polynucleotide (s) and / or genetic constructs as disclosed herein. In a preferred embodiment, the cake retains a portion of the lipid or oil produced in the seed from which the cake is derived, but at a low level (eg, less than 2 wt%) after most of the lipid or oil has been extracted. The cake can be used as animal feed or as an ingredient in food production.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается композиция, содержащая одно или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, В. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению или жмыха по изобретению. В вариантах реализации композиция содержит носитель, подходящий для фармацевтического, пищевого или сельскохозяйственного применения, соединение для обработки семени, удобрение, другой пищевой продукт или питательный ингредиент, или дополнительный белок или витамины.In another aspect of the present invention, a composition is disclosed comprising one or more of a lipid or oil of the invention, a fatty acid of the invention, a cell of the invention, an oil plant of the invention, a plant of the Brassica species, Brassica napus, B. juncea, Glycine max or Camelina sativa according to the invention, a part of a plant according to the invention, a seed according to the invention or a cake according to the invention. In embodiments, the composition comprises a carrier suitable for pharmaceutical, food or agricultural use, a seed treatment compound, fertilizer, other food or nutritional ingredient, or additional protein or vitamins.

Кроме того, раскрыты продукты питания (корма), косметика или химические вещества, содержащие одно или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, В. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению или композиции по изобретению. Предпочтительным продуктом пиIn addition, food (feed), cosmetics or chemicals are disclosed containing one or more of a lipid or oil according to the invention, a fatty acid according to the invention, cells according to the invention, an oilseed plant according to the invention, plants of the species Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max or Camelina sativa according to the invention, a plant part according to the invention, a seed according to the invention, a cake according to the invention, or a composition according to the invention. The preferred food pi

- 18 037184 тания является детская смесь, содержащая липид или масло по изобретению.- 18 037184 Tania is an infant formula containing a lipid or oil according to the invention.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения продукта питания, предпочтительно детской смеси, включающий смешивание одного или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, В. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению или композиции по изобретению по меньшей мере с еще одним питательным ингредиентом. Способ может включать стадии смешивания, термической обработки, выпечки, экструдирования, эмульгации или другой обработки продукта питания или упаковка продукта питания или анализа содержания липида или масла в продукте питания.In another aspect of the present invention, there is disclosed a method for preparing a food product, preferably an infant formula, comprising mixing one or more of a lipid or oil according to the invention, a fatty acid according to the invention, a cell according to the invention, an oil plant according to the invention, a plant of the Brassica species, Brassica napus, B juncea, Glycine max or Camelina sativa according to the invention, a plant part according to the invention, a seed according to the invention, a cake according to the invention, or a composition according to the invention with at least one other nutritive ingredient. The method may include the steps of mixing, heat treating, baking, extruding, emulsifying, or otherwise treating the food, or packaging the food or analyzing the lipid or oil content of the food.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ лечения или предупреждения состояния, при котором ПНЖК, предпочтительно ДПК, оказывают благоприятное воздействие, причем указанный способ включает введение субъекту одного или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, В. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению, композиции по изобретению или корма по изобретению. В предпочтительном варианте реализации ПНЖК вводят в форме фармацевтической композиции, содержащей этиловый эфир ПНЖК. Субъект может быть человеком или животным.In another aspect of the present invention, there is disclosed a method of treating or preventing a condition in which PUFA, preferably DPC, have a beneficial effect, said method comprising administering to a subject one or more of a lipid or oil of the invention, a fatty acid of the invention, a cell of the invention, an oil plant crops according to the invention, plants of the species Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max or Camelina sativa according to the invention, plant parts according to the invention, seed according to the invention, cake according to the invention, compositions according to the invention or feed according to the invention. In a preferred embodiment, the PUFA is administered in the form of a pharmaceutical composition containing an ethyl ester of the PUFA. The subject can be human or animal.

Примеры состояний, при которых ПНЖК оказывают благоприятное воздействие, включают, без ограничения, повышенные уровни триглицеридов в сыворотке, повышенные уровни холестерина в сыворотке, например повышенные уровни ЛПНП холестерина, сердечную аритмию, ангиопластику, воспаление, астму, псориаз, остеопороз, камни в почках, СПИД, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Крона, шизофрению, рак, плодный алкогольный синдром, синдром гиперактивности и дефицита внимания, муковисцидоз, фенилкетонурию, униполярную депрессию, агрессивную враждебность, адренолейкодистрофию, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, диабет, ожирение, болезнь Альцгеймера, хроническое обструктивное заболевание легких, язвенный колит, рестеноз после ангиопластики, экзему, гипертонию, агрегацию тромбоцитов, желудочно-кишечное кровотечение, эндометриоз, предменструальный синдром, миалгический энцефаломиелит, хроническую усталость после вирусных инфекций или заболевание глаз.Examples of conditions in which PUFAs have beneficial effects include, but are not limited to, elevated serum triglyceride levels, elevated serum cholesterol levels, such as elevated LDL cholesterol levels, cardiac arrhythmias, angioplasty, inflammation, asthma, psoriasis, osteoporosis, kidney stones, AIDS, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, schizophrenia, cancer, fetal alcohol syndrome, attention deficit hyperactivity disorder, cystic fibrosis, phenylketonuria, unipolar depression, aggressive hostility, adrenoleukodystrophy, coronary artery disease, heart disease, hypertension, obesity, , chronic obstructive pulmonary disease, ulcerative colitis, restenosis after angioplasty, eczema, hypertension, platelet aggregation, gastrointestinal bleeding, endometriosis, premenstrual syndrome, myalgic encephalomyelitis, chronic fatigue after viral infections, or eye disease.

Также раскрыто применение одного или более из липида или масла по изобретению, жирной кислоты по изобретению, клетки по изобретению, растения масличной культуры по изобретению, растения вида Brassica, Brassica napus, В. juncea, Glycine max или Camelina sativa по изобретению, части растения по изобретению, семени по изобретению, жмыха по изобретению, композиции по изобретению или корма по изобретению для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, при котором ПНЖК, предпочтительно ДПК, оказывают благоприятное воздействие.Also disclosed is the use of one or more of a lipid or oil according to the invention, a fatty acid according to the invention, a cell according to the invention, an oil plant according to the invention, a plant of the species Brassica, Brassica napus, B. juncea, Glycine max or Camelina sativa according to the invention, a plant part according to the invention, the seed according to the invention, the oil cake according to the invention, the composition according to the invention or the feed according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a condition in which PUFA, preferably DPC, have a beneficial effect.

Получение лекарственного средства может включать смешивание масла по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем, с целью лечения состояния, раскрытого в настоящем документе. Способ может включать, во-первых, очистку и/или переэтерификацию масла, и/или фракционирование масла, с целью повышения уровня ДПК. В конкретном варианте реализации способ включает обработку липида или масла, например масла рапса, с целью превращения жирных кислот в масле в алкиловые эфиры, например метиловые или этиловые эфиры. Дальнейшая обработка, например фракционирование или дистилляция, может применяться для обогащения липида или масла ДПК. В предпочтительном варианте реализации лекарственное средство содержит этиловые эфиры ДПК. В еще более предпочтительном варианте реализации уровень этиловых эфиров ДПК в лекарственном средстве составляет от 30 до 50%. Лекарственное средство может дополнительно содержать этиловые эфиры ЭПК, например, от 30 до 50% или по меньшей мере 90% от общего содержания жирных кислот в лекарственном средстве. Такие лекарственные средства пригодны для введения субъектам-людям или животным при лечении медицинских состояний, как раскрыто в настоящем документе.Formulation of a medicament may include mixing an oil of the invention with a pharmaceutically acceptable carrier to treat a condition disclosed herein. The method may include, firstly, refining and / or transesterification of the oil, and / or fractionating the oil in order to increase the WPC level. In a specific embodiment, the method comprises treating a lipid or oil, such as rapeseed oil, to convert the fatty acids in the oil to alkyl esters, such as methyl or ethyl esters. Further processing, such as fractionation or distillation, can be used to enrich the WPC lipid or oil. In a preferred embodiment, the medicament contains ethyl esters of duodenum. In an even more preferred embodiment, the level of ethyl esters of DPA in the drug is from 30% to 50%. The drug may additionally contain EPA ethyl esters, for example, from 30 to 50% or at least 90% of the total fatty acid content of the drug. Such drugs are suitable for administration to human or animal subjects in the treatment of medical conditions as disclosed herein.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрывается способ торговли семенем, включающий получение семени по изобретению и торговли полученным семенем с получением денежной выгоды.In another aspect of the present invention, there is disclosed a method of trading seed comprising obtaining a seed according to the invention and trading the resulting seed for monetary gain.

В варианте реализации получение семени включает культивацию растений по изобретению и/или сбор урожая семени с растений.In an embodiment, obtaining seed comprises cultivating the plants of the invention and / or harvesting seed from the plants.

В другом варианте реализации получение семени дополнительно включает помещение семени в емкость и/или хранение семени.In another embodiment, obtaining the seed further comprises placing the seed in a container and / or storing the seed.

В дальнейшем варианте реализации получение семени дополнительно включает перевозку семени в другое место.In a further embodiment, obtaining the seed further comprises transporting the seed to another location.

Еще в одном варианте реализации способ дополнительно включает перевозку семени в другое место после продажи семени.In yet another embodiment, the method further comprises transporting the seed to another location after the seed is sold.

В дальнейшем варианте реализации торговля осуществляется с использованием электронных средств, например компьютера.In a further embodiment, trading is carried out using electronic means, such as a computer.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения раскрывается способ получения бункеров с семенем,In yet another aspect of the present invention, a method is disclosed for producing seed hoppers,

- 19 037184 включающий:- 19 037184 including:

а) валкование, рядковое компостирование и/или жатву наземных частей растений, содержащих семя по изобретению,a) swathing, row composting and / or reaping of the ground parts of plants containing the seed according to the invention,

б) молотьбу и/или веяние частей растений, с отделением семени от остатка частей растения, иb) threshing and / or blowing of plant parts, separating the seed from the rest of the plant parts, and

в) просеивание и/или сортировку семени, отделенного на стадии б), и загрузку просеянного и/или сортированного семени в бункеры, с получением таким образом бункеров с семенем.c) sifting and / or sorting the seed separated in step b) and loading the sifted and / or sorted seed into hoppers, thus obtaining hoppers with seed.

В варианте реализации, если это уместно, липид или масло, предпочтительно масло из семян, по изобретению или пригодные в соответствии с изобретением содержат такие уровни жира, как раскрыто в таблицах в разделе Примеров.In an embodiment, if appropriate, a lipid or oil, preferably seed oil, according to the invention or suitable according to the invention, contains fat levels as disclosed in the tables in the Examples section.

Любой вариант реализации в настоящем документе следует интерпретировать как применимый, с соответствующими поправками, к любому другому варианту, если конкретно не указано иное.Any implementation in this document should be interpreted as applicable, mutatis mutandis, to any other implementation, unless specifically indicated otherwise.

Контекст настоящего изобретения не должен ограничиваться конкретными вариантами, раскрытыми в настоящем документе, которые приведены только с целью иллюстрации. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы очевидно находятся в пределах контекста изобретения, раскрытого в настоящем документе.The context of the present invention should not be limited to the specific options disclosed herein, which are provided for illustrative purposes only. Functionally equivalent products, compositions and methods are obviously within the context of the invention disclosed herein.

В настоящем документе, если конкретно не указано иное или из контекста очевидно не следует иное, ссылка на единственную стадию, композицию вещества, группу стадий или группу композиций вещества должна быть интерпретирована как включающая единственное и множественное число (т. е., одна или более) таких стадий, композиций вещества, групп стадий или групп композиций вещества.In this document, unless otherwise specifically indicated or the context clearly does not indicate otherwise, a reference to a single stage, composition of a substance, a group of stages or a group of compositions of a substance should be interpreted as including the singular and plural (i.e., one or more) such steps, compositions of matter, groups of steps, or groups of compositions of matter.

Изобретение дополнительно раскрыто посредством следующих не ограничивающих примеров со ссылкой на прилагаемые графические материалы.The invention is further disclosed by means of the following non-limiting examples with reference to the accompanying drawings.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

Фиг. 1 - аэробные пути биосинтеза ДПК.FIG. 1 - aerobic pathways of duodenal biosynthesis.

Фиг. 2 - карта участка вставки Т-ДНК от левой до правой границ pJP3416-GA7. ПГ обозначает правую границу; ЛГ, левая граница; ТЕР, участок терминатора транскрипции/полиаденилирования; ПРО, промотор; кодирующие участки показаны над стрелками, промоторы и терминаторы - под стрелками. Micpu-Δ6D, Δ6-десатураза Micromonas pusilla; Pyrco-Δ6Е, Δ6-элонгаза Pyramimonas cordata; Pavsa-Δ5D, Δ5-десатураза Pavlova salina; Picpa-ω3D, ω3-десатураза Pichia pastoris; Pavsa-Δ4D, Δ4-десатураза P. salina; Lack1-Δ12D, Δ12-десатураза Lachancea kluyveri; Pyrco-Δ5E, Δ5-элонгаза Pyramimonas cordata. HOC обозначает участок терминатора транскрипции/полиаденилирования нопалинсинтетазы Agrobacterium tumefaciens; FP1, укороченный промотор напина Brassica napus; FAE1, промотор Arabidopsis thaliana FAE1; Лектин, участок терминатора транскрипции/полиаденилирования лектина Glycine max; Cnl1 и Cnl2 обозначает промотор или терминатор конлинина 1 или конлинина 2 Linum usitatissimum. УПМ обозначает участок прикрепления к матриксу Rb7 из Nicotiana tabacum.FIG. 2 is a map of the T-DNA insertion site from the left to right borders of pJP3416-GA7. PG indicates the right border; LH, left border; TEP, transcription / polyadenylation terminator region; PRO, promoter; coding regions are shown above the arrows, promoters and terminators below the arrows. Micpu-Δ6D, Micromonas pusilla Δ6 desaturase; Pyrco-Δ6E, Δ6-elongase Pyramimonas cordata; Pavsa-Δ5D, Pavlova salina Δ5-desaturase; Picpa-ω3D, ω3-desaturase of Pichia pastoris; P. salina Pavsa-Δ4D, Δ4 desaturase; Lack1-Δ12D, Lachancea kluyveri Δ12 desaturase; Pyrco-Δ5E, Δ5-elongase Pyramimonas cordata. HOC is the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthetase transcription / polyadenylation terminator region; FP1, a truncated Brassica napus napin promoter; FAE1, Arabidopsis thaliana FAE1 promoter; Lectin, Glycine max lectin transcription / polyadenylation terminator site; Cnl1 and Cnl2 denote the Linum usitatissimum conlinin 1 or conlinin 2 promoter or terminator. UPM denotes the site of attachment to the matrix of Rb7 from Nicotiana tabacum.

Фиг. 3(А) - основная структура фитостерина с кольцом и нумерацией боковой цепи; (В) - химические структуры некоторых фитостеринов.FIG. 3 (A) - basic structure of phytosterol with a ring and side chain numbering; (B) - chemical structures of some phytosterols.

Фиг. 4 - карта участка вставки Т-ДНК между левой и правой границами pJP3662. ПГ обозначает правую границу; ЛГ, левая граница; ТЕР, участок терминатора транскрипции/полиаденилирования, ПРО, промотор; кодирующие участки указаны над стрелками, промоторы и терминаторы - под стрелками. Micpu-Δ6D, Micromonas pusilla Δ6-десатураза; Pyrco-Δ6E, Pyramimonas cordata Δ6-элонгаза; Pavsa-Δ5D, Pavlova salina Δ5-десатураза; Picpa-ω3D, Pichia pastoris ω3-десатураза; Lack1-Δ12D, Lachancea kluyveri Δ12-десатураза; Pyrco-Δ5E, Pyramimonas cordata Δ5-элонгаза. HOC обозначает участок терминатора транскрипции/полиаденилирования нопалинсинтетазы Agrobacterium tumefaciens; FP1, укороченный промотор напина; Brassica napus FAE1, промотор FAE1 Arabidopsis thaliana; Лектин, участок терминатора транскрипции/полиаденилирования лектина Glycine max; Cnl1 обозначает промотор или терминатор конлинина 1 Linum usitatissimum. УПМ обозначает участок присоединения к матриксу Rb7 Nicotiana tabacum.FIG. 4 is a map of the T-DNA insertion site between the left and right borders of pJP3662. PG indicates the right border; LH, left border; TEP, transcription / polyadenylation terminator region, PRO, promoter; coding regions are indicated above the arrows, promoters and terminators below the arrows. Micpu-Δ6D, Micromonas pusilla Δ6-desaturase; Pyrco-Δ6E, Pyramimonas cordata Δ6-elongase; Pavsa-Δ5D, Pavlova salina Δ5-desaturase; Picpa-ω3D, Pichia pastoris ω3-desaturase; Lack1-Δ12D, Lachancea kluyveri Δ12-desaturase; Pyrco-Δ5E, Pyramimonas cordata Δ5-elongase. HOC is the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthetase transcription / polyadenylation terminator region; FP1, a truncated napin promoter; Brassica napus FAE1, Arabidopsis thaliana FAE1 promoter; Lectin, Glycine max lectin transcription / polyadenylation terminator site; Cnl1 refers to the Linum usitatissimum conlinin 1 promoter or terminator. UPM denotes the site of attachment to the Rb7 matrix of Nicotiana tabacum.

Ключ к перечню последовательностейKey to sequence listing

SEQ ID NO: 1 - последовательность нуклеотидов pJP3416-GA7. SEQ ID NO: 2 - последовательность нуклеотидов pGA7-mod_B. SEQ ID NO: 3 - ЭПК кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ12-десатуразы Lachancea kluyveri в растениях. SEQ ID NO: 4 - Δ12-десатураза Lachancea kluyveri;SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of pJP3416-GA7. SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of pGA7-mod_B. SEQ ID NO: 3 — EPA codon optimized open reading frame for expression of Lachancea kluyveri Δ12 desaturase in plants. SEQ ID NO: 4-Lachancea kluyveri Δ12 desaturase;

SEQ ID NO: 5 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии ω3десатуразы Pichia pastoris в растениях;SEQ ID NO: 5 — Codon-optimized open reading frame for expression of Pichia pastoris ω3 desaturase in plants;

SEQ ID NO: 6 - ω3-десатураза Pichia pastoris;SEQ ID NO: 6 Pichia pastoris ω3 desaturase;

SEQ ID NO: 7 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ6-десатуразу Micromonas pusilla;SEQ ID NO: 7 — open reading frame encoding Micromonas pusilla Δ6 desaturase;

SEQ ID NO: 8 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ6десатуразы Micromonas pusilla в растениях (версия 2);SEQ ID NO: 8 — Codon-optimized open reading frame for expression of Micromonas pusilla Δ6 desaturase in plants (version 2);

SEQ ID NO: 9 - Δ6-десатураза Micromonas pusilla;SEQ ID NO: 9 Micromonas pusilla Δ6 desaturase;

SEQ ID NO: 10 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ6-десатуразу Ostreococcus lucimarinus;SEQ ID NO: 10 — open reading frame encoding Ostreococcus lucimarinus Δ6 desaturase;

SEQ ID NO: 11 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ6- 20 037184 десатуразы Ostreococcus lucimarinus в растениях;SEQ ID NO: 11 — Codon-Optimized Open Reading Frame for Expression of Δ6-20 037184 Ostreococcus lucimarinus Desaturase in Plants;

SEQ ID NO: 12 - Δ6-десатураза Ostreococcus lucimarinus;SEQ ID NO: 12-Ostreococcus lucimarinus Δ6 desaturase;

SEQ ID NO: 13 - Δ6-десатураза Ostreococcus tauri;SEQ ID NO: 13-Ostreococcus tauri Δ6 desaturase;

SEQ ID NO: 14 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ6-элонгазу Pyramimonas cordata;SEQ ID NO: 14 — open reading frame encoding Pyramimonas cordata Δ6 elongase;

SEQ ID NO: 15 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ6-элонгазы Pyramimonas cordata в растениях (укороченная на 3'-конце и кодирующая функциональную элонгазу) (версия 1);SEQ ID NO: 15 — Codon-optimized open reading frame for expression of Pyramimonas cordata Δ6-elongase in plants (truncated at the 3'-end and encoding functional elongase) (version 1);

SEQ ID NO: 16 - Δ6-элонгаза Pyramimonas cordata;SEQ ID NO: 16-Pyramimonas cordata Δ6 elongase;

SEQ ID NO: 17 - укороченная Δ6-элонгаза Pyramimonas cordata;SEQ ID NO: 17 — Truncated Pyramimonas cordata Δ6 elongase;

SEQ ID NO: 18 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ5-десатуразу Pavlova salina;SEQ ID NO: 18 — open reading frame encoding Pavlova salina Δ5 desaturase;

SEQ ID NO: 19 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ5десатуразы Pavlova salina в растениях;SEQ ID NO: 19 — Codon-optimized open reading frame for expression of Pavlova salina Δ5 desaturase in plants;

SEQ ID NO: 20 - Δ5-десатураза Pavlova salina;SEQ ID NO: 20-Pavlova salina Δ5 desaturase;

SEQ ID NO: 21 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ5-десатуразу Pyramimonas cordata;SEQ ID NO: 21 — open reading frame encoding Pyramimonas cordata Δ5 desaturase;

SEQ ID NO: 22 - Δ5-десатураза Pyramimonas cordata;SEQ ID NO: 22-Pyramimonas cordata Δ5 desaturase;

SEQ ID NO: 23 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ5-элонгазу Pyramimonas cordata;SEQ ID NO: 23 — open reading frame encoding Pyramimonas cordata Δ5 elongase;

SEQ ID NO: 24 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ5-элонгазы Pyramimonas cordata в растениях;SEQ ID NO: 24 — Codon-optimized open reading frame for expression of Pyramimonas cordata Δ5-elongase in plants;

SEQ ID NO: 25 - Δ5-элонгаза Pyramimonas cordata;SEQ ID NO: 25 - Pyramimonas cordata Δ5 elongase;

SEQ ID NO: 26 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ4-десатуразу Pavlova salina;SEQ ID NO: 26 — open reading frame encoding Pavlova salina Δ4 desaturase;

SEQ ID NO: 27 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ4десатуразы Pavlova salina в растениях;SEQ ID NO: 27 — Codon-optimized open reading frame for expression of Pavlova salina Δ4 desaturase in plants;

SEQ ID NO: 28 - Δ4-десатураза Pavlova salina;SEQ ID NO: 28-Pavlova salina Δ4 desaturase;

SEQ ID NO: 29 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ9-элонгазу Isochrysis galbana;SEQ ID NO: 29 — open reading frame encoding Isochrysis galbana Δ9 elongase;

SEQ ID NO: 30 - кодон-оптимизированная открытая рамка считывания для экспрессии Δ9-элонгазы Emiliania huxleyi в растениях;SEQ ID NO: 30 — Codon Optimized Open Reading Frame for Expression of Emiliania huxleyi Δ9 Elongase in Plants;

SEQ ID NO: 32 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ9-элонгазу Pavlova pinguis;SEQ ID NO: 32 — open reading frame encoding Pavlova pinguis Δ9 elongase;

SEQ ID NO: 33 - Δ9-элонгаза Pavlova pinguis;SEQ ID NO: 33-Pavlova pinguis Δ9 elongase;

SEQ ID NO: 34 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ9-элонгазу Pavlova salina;SEQ ID NO: 34 — open reading frame encoding Pavlova salina Δ9 elongase;

SEQ ID NO: 35 - Δ9-элонгаза Pavlova salina;SEQ ID NO: 35-Pavlova salina Δ9 elongase;

SEQ ID NO: 36 - открытая рамка считывания, кодирующая Δ8-десатуразу Pavlova salina;SEQ ID NO: 36 — open reading frame encoding Pavlova salina Δ8 desaturase;

SEQ ID NO: 37 - Δ8-десатураза Pavlova salina;SEQ ID NO: 37-Pavlova salina Δ8 desaturase;

SEQ ID NO: 38 - вирусный супрессор V2;SEQ ID NO: 38 — V2 Viral Suppressor;

SEQ ID NO: 39 - открытая рамка считывания, кодирующая вирусный супрессор V2;SEQ ID NO: 39 — open reading frame encoding viral suppressor V2;

SEQ ID NO: 40 - ЛФКАТ2 Arabidopsis thaliana;SEQ ID NO: 40-LFKAT2 Arabidopsis thaliana;

SEQ ID NO: 41 - ЛФКАТ Limnanthes alba;SEQ ID NO: 41-LPKAT Limnanthes alba;

SEQ ID NO: 42 - ЛФКАТ Saccharomyces cerevisiae;SEQ ID NO: 42-Saccharomyces cerevisiae LPKAT;

SEQ ID NO: 43 - ЛФКАТ Micromonas pusilla;SEQ ID NO: 43-LFKAT Micromonas pusilla;

SEQ ID NO: 44 - ЛФКАТ Mortierella alpina;SEQ ID NO: 44-LPKAT Mortierella alpina;

SEQ ID NO: 45 - ЛФКАТ Braccisa napus;SEQ ID NO: 45-LFKAT Braccisa napus;

SEQ ID NO: 46 - ЛФКАТ Brassica napus;SEQ ID NO: 46 — LFKAT Brassica napus;

SEQ ID NO: 47 - ω3 десатураза Phytophthora infestans;SEQ ID NO: 47-ω3 desaturase of Phytophthora infestans;

SEQ ID NO: 48 - ω3 десатураза Thalassiosira pseudonana;SEQ ID NO: 48 - ω3 Thalassiosira pseudonana desaturase;

SEQ ID NO: 49 - ω3 десатураза Pythium irregulare;SEQ ID NO: 49-ω3 Pythium irregulare desaturase;

SEQ ID NO: 50-58 - олигонуклеотидные праймеры/зонды.SEQ ID NO: 50-58 - Oligonucleotide primers / probes.

Подробное описание сущности изобретенияDetailed description of the essence of the invention

Общие методы и определения.General methods and definitions.

Если конкретно не определенно иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, следует понимать как имеющие такое же значение, как обычно придает им средний специалист в данной области (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, синтезе жирных кислот, трансгенных растениях, рекомбинантных клетках, химии белка и биохимии).Unless specifically defined otherwise, all technical and scientific terms used herein are to be understood as having the same meaning as usually given to them by those of ordinary skill in the art (e.g., in cell culture, molecular genetics, fatty acid synthesis, transgenic plants , recombinant cells, protein chemistry and biochemistry).

Если не указано иное, белок, культура клеток и иммунологические методы, используемые в настоящем изобретении, представляют собой стандартные методики, хорошо известные специалистам из уровня техники. Такие методики описаны и объяснены в литературных источниках, например J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (редактор), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (редакторы), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 и 1996), F.M. Ausubel et al. (редакторы), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все издания до сегодняшнего дня), Ed Harlow and David Lane (редакторы), Antibodies: A Laboratory Manual,Unless otherwise indicated, the protein, cell culture and immunological methods used in the present invention are standard techniques well known to those skilled in the art. Such techniques are described and explained in literature, for example J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 ), TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all editions to date), Ed Harlow and David Lane (editors), Antibodies: A Laboratory Manual.

- 21 037184- 21 037184

Cold Spring Harbour Laboratory, (1988) и J.E. Coligan et al. (редакторы), Current Protocols in Immunology,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) and J.E. Coligan et al. (editors), Current Protocols in Immunology,

John Wiley & Sons (включая все издания до сегодняшнего дня).John Wiley & Sons (including all editions to date).

Термин и/или, например X и/или Y, следует понимать, как подразумевающий любой из X и Y или X или Y, и следует интерпретировать как явно поддерживающий оба значения или любое из значений.The term and / or, for example X and / or Y, is to be understood to mean either X and Y or X or Y, and is to be interpreted as explicitly supporting both or either of the meanings.

В настоящем документе термин около, если только не указано противоположное, подразумевает +/- 10%, более предпочтительно +/- 5%, более предпочтительно +/- 1% от приведенного значения.In this document, the term about, unless otherwise indicated, means +/- 10%, more preferably +/- 5%, more preferably +/- 1% of the stated value.

В настоящем документе слово включают или вариации, например включает или включающий, следует понимать, как обозначающие включение заявленного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.In this document, the word includes or variations, for example, includes or including, should be understood to mean the inclusion of the claimed element, integer or stage, or group of elements, integers or stages, but not exclusion of any other element, integer or stage, or group elements, integers or stages.

Некоторые определения.Some definitions.

В настоящем документе термины экстрагированный растительный липид и выделенный растительный липид обозначают липидную композицию, которая извлечена, например, путем измельчения, из растения или его части, такой как семя. Экстрагированный липид может представлять собой относительно неочищенную композицию, полученную, например, путем измельчения семени растения, или в большей степени очищенную композицию, из которой большинство, если не все из одного или более или каждого из воды, нуклеиновых кислот, белков и углеводов, происходящих из растительного материала, удалены. Ниже раскрыты примеры способов очистки. В варианте реализации экстрагированный или выделенный растительный липид содержит по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90 или по меньшей мере около 95% (мас./мас.) липида в композиции. Липид может быть твердым или жидким при комнатной температуре, если он представляет собой жидкость, то называется маслом. В варианте реализации экстрагированный липид по изобретению не смешивается с другим липидом, например ДПК, продуцированной другим источником (например, ДПК из рыбьего жира). В варианте реализации после экстракции одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДПК, пальмитиновая кислота:ДПК, линолевая кислота:ДПК, и общие ω6 жирные кислоты:общие ω3 жирные кислоты, в существенной мере не изменяются (например, не более чем 10 или 5% изменений), по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. В другом варианте реализации экстрагированный растительный липид не обрабатывается процедурой, такой как гидрогенизация или фракционирование, которая может изменить одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДПК, пальмитиновая кислота:ДПК, линолевая кислота:ДПК и общие ω6 жирные кислоты:общие ω3 жирные кислоты, по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. Если экстрагированный растительный липид по изобретению содержится в масле, масло может дополнительно содержать молекулы, не являющиеся жирными кислотами, например стеролы.As used herein, the terms extracted plant lipid and isolated plant lipid mean a lipid composition that is extracted, for example, by grinding, from a plant or part thereof, such as a seed. The extracted lipid can be a relatively crude composition obtained, for example, by grinding a plant seed, or a more purified composition, of which most, if not all of one or more or each of water, nucleic acids, proteins and carbohydrates derived from plant material removed. Examples of cleaning methods are disclosed below. In an embodiment, the extracted or isolated plant lipid comprises at least about 60, at least about 70, at least about 80, at least about 90, or at least about 95% (w / w) lipid in the composition. A lipid can be solid or liquid at room temperature, if it is a liquid, it is called oil. In an embodiment, the extracted lipid of the invention is immiscible with another lipid, eg, duodenum produced by another source (eg, duodenum from fish oil). In an embodiment, after extraction, one or more or all of the ratios of oleic acid: DPA, palmitic acid: DPA, linoleic acid: DPA, and total ω6 fatty acids: total ω3 fatty acids are substantially unchanged (for example, no more than 10 or 5% change), compared to the ratio in an intact seed or cell. In another embodiment, the extracted plant lipid is not processed by a procedure, such as hydrogenation or fractionation, that may alter one or more or all of the ratios of oleic acid: DPA, palmitic acid: DPA, linoleic acid: DPA, and total ω6 fatty acids: total ω3 fatty acids. acid, compared to the ratio in an intact seed or cell. If the extracted plant lipid of the invention is contained in an oil, the oil may additionally contain non-fatty acid molecules such as sterols.

В настоящем документе термины экстрагированное растительное масло и выделенное растительное масло обозначают вещество или композицию, содержащую экстрагированный растительный липид или выделенный растительный липид, которая является жидкой при комнатной температуре. Масло получают из растения или его части, например семени. Экстрагированное или выделенное масло может представлять собой относительно неочищенную композицию, полученную, например, путем измельчения семени растения, или в большей степени очищенную композицию, из которой большинство, если не все, из одного или более или каждого из воды, нуклеиновых кислот, белков и углеводов, происходящих из растительного материала, удалены. Композиция может содержать другие компоненты, которые могут быть липидными или не липидными. В варианте реализации масляная композиция содержит по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90 или по меньшей мере около 95% (мас./мас.) экстрагированного растительного липида. В варианте реализации экстрагированное масло по изобретению не смешивается с другим маслом, таким как ДПК, продуцированная другим источником (например, ДПК из рыбьего жира). В варианте реализации после экстракции одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДПК, пальмитиновая кислота:ДПК, линолевая кислота:ДПК и общие ω6 жирные кислоты:общие ω3 жирные кислоты существенно не изменяются (например, не более чем 10 или 5% изменений), по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. В другом варианте реализации экстрагированное масло растения не обрабатывают процедурой, такой как гидрогенизация или фракционирование, которая может изменять одно или более или все из соотношений олеиновая кислота:ДПК, пальмитиновая кислота:ДПК, линолевая кислота:ДПК и общие ω6 жирные кислоты:общие ω 3 жирные кислоты, по сравнению с соотношением в интактном семени или клетке. Экстрагированное растительное масло по изобретению может содержать молекулы, не являющиеся жирными кислотами, например стеролы.As used herein, the terms extracted vegetable oil and isolated vegetable oil mean a substance or composition containing an extracted vegetable lipid or an isolated vegetable lipid that is liquid at room temperature. The oil is obtained from a plant or part of it, such as a seed. The extracted or isolated oil can be a relatively crude composition obtained, for example, by grinding a plant seed, or a more purified composition, of which most, if not all, of one or more or each of water, nucleic acids, proteins and carbohydrates originating from plant material are removed. The composition may contain other components, which may be lipid or non-lipid. In an embodiment, the oil composition comprises at least about 60, at least about 70, at least about 80%, at least about 90, or at least about 95% (w / w) of the extracted plant lipid. In an embodiment, the extracted oil of the invention is not miscible with another oil, such as WPC produced by another source (eg, WPC from fish oil). In an embodiment, after extraction, one or more or all of the ratios of oleic acid: DPA, palmitic acid: DPA, linoleic acid: DPA, and total ω6 fatty acids: total ω3 fatty acids do not change significantly (for example, no more than 10 or 5% change ), compared to the ratio in an intact seed or cell. In another embodiment, the extracted plant oil is not treated with a procedure, such as hydrogenation or fractionation, which may alter one or more or all of the ratios of oleic acid: DPA, palmitic acid: DPA, linoleic acid: DPA, and total ω6 fatty acids: total ω 3 fatty acids compared to the ratio in an intact seed or cell. The extracted vegetable oil of the invention may contain non-fatty acid molecules such as sterols.

В данном описании такие термины, как экстрагированный микробный липид или экстрагированное микробное масло имеют значение, аналогичное соответствующим терминам экстрагированный растительный липид и экстрагированное растительное масло соответственно, причем основное различие состоит в источнике липида или масла.As used herein, terms such as extracted microbial lipid or extracted microbial oil have the same meaning as the corresponding terms extracted vegetable lipid and extracted vegetable oil, respectively, with the main difference being the source of the lipid or oil.

В настоящем документе масло представляет собой композицию, которая содержит в основномIn this document, an oil is a composition that contains mainly

- 22 037184 липид и является жидкой при комнатной температуре. Например, масло по изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90 мас.% липида. Обычно очищенное масло содержит по меньшей мере 90 мас.% триацилглицеридов (ТАГ) от содержания липида в масле. Незначительные компоненты масла, такие как диацилглицериды (ДАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), фосфолипид и стеролы, могут присутствовать, как раскрыто в настоящем документе.- 22 037184 lipid and is liquid at room temperature. For example, the oil of the invention preferably contains at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least 90% by weight lipid. Typically, the refined oil contains at least 90% by weight triacylglycerides (TAG) based on the lipid content of the oil. Minor oil components such as diacylglycerides (DAGs), free fatty acids (FFAs), phospholipids, and sterols may be present as disclosed herein.

В настоящем документе термин жирная кислота обозначает карбоновую кислоту (или органическую кислоту), часто с длинным алифатическим хвостом, насыщенным или ненасыщенным. Обычно жирные кислоты содержат цепь углерод-углеродных связей длиной по меньшей мере 8 атомов углерода, более предпочтительно длиной по меньшей мере 12 атомов углерода. Предпочтительные жирные кислоты по изобретению содержат углеродные цепи длиной 18-22 атомов углерода (жирные кислоты C18, С20, С22), более предпочтительно 20-22 атома углерода (С20, С22) и наиболее предпочтительно 22 атома углерода (С22). Большинство встречающихся в природе жирных кислот содержит четное количество атомов углерода, поскольку в их биосинтезе принимает участие ацетат, содержащий два атома углерода. Жирные кислоты могут быть в свободном состоянии (неэтерифицированные) или в этерифицированной форме, например, как часть триглицерида, диацилглицерида, моноацилглицерида, связи с ацил-КоА (тиоэфир) или другой формы связи. Жирная кислота может быть этерифицированной как фосфолипид, например формы фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерида, фосфатидилинозитола или дифосфатидилглицерида. В варианте реализации жирная кислота этерифицирована метильной или этильной группой, например метил или этиловый эфир ПНЖК С20 или С22. Предпочтительными жирными кислотами являются метиловые или этиловые эфиры ЭПК или ДПК или ЭПК, ДПК и ДГК или ЭПК и ДПК.As used herein, the term fatty acid denotes a carboxylic acid (or organic acid), often with a long, aliphatic tail, saturated or unsaturated. Typically, fatty acids contain a chain of carbon-carbon bonds of at least 8 carbon atoms in length, more preferably at least 12 carbon atoms in length. Preferred fatty acids of the invention contain carbon chains of 18-22 carbon atoms long (C18, C20, C22 fatty acids), more preferably 20-22 carbon atoms (C20, C22) and most preferably 22 carbon atoms (C22). Most naturally occurring fatty acids contain an even number of carbon atoms, since they are biosynthesized with two-carbon acetate. Fatty acids can be in a free state (non-esterified) or in an esterified form, for example, as part of a triglyceride, diacylglyceride, monoacylglyceride, acyl-CoA (thioether) linkage, or other form of linkage. The fatty acid can be esterified as a phospholipid, for example, a form of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglyceride, phosphatidylinositol, or diphosphatidylglyceride. In an embodiment, the fatty acid is esterified with a methyl or ethyl group, such as methyl or ethyl ester of C20 or C22 PUFA. Preferred fatty acids are methyl or ethyl esters of EPA or DPA or EPA, DPA and DHA or EPA and DPA.

Насыщенные жирные кислоты не содержат двойных связей или других функциональных групп вдоль цепи. Термин насыщенный обозначает водород, с тем, что все атомы углерода (кроме группы карбоновой кислоты [-СООН]) содержат максимально возможное количество водорода. Другими словами, омега (ω) конец содержит 3 атома водорода (CH3-), и каждый атом углерода в пределах цепи содержит 2 атома водорода (-CH2-).Saturated fatty acids do not contain double bonds or other functional groups along the chain. The term saturated means hydrogen, so that all carbon atoms (except for the carboxylic acid group [-COOH]) contain the maximum possible amount of hydrogen. In other words, the omega (ω) end contains 3 hydrogen atoms (CH3-), and each carbon atom within the chain contains 2 hydrogen atoms (-CH2-).

Ненасыщенные жирные кислоты по форме сходны с насыщенными жирными кислотами, за исключением того, что одна или более алкеновых функциональных групп присутствуют вдоль цепи, причем каждый алкен заменяет одинарную связь -СН2-СН2- части цепи двойной связью -СН=СН- (т.е. углерод присоединен двойной связью к другому атому углерода). Два следующих атома углерода в цепи, которые присоединены к каждой из сторон двойной связи, могут присутствовать в цис- или трансконфигурации, предпочтительно в цис-конфигурации. В варианте реализации состав жирных кислот липида или масла по изобретению включает менее чем 1% жирных кислот, содержащих двойные углеродуглеродные связи в трансконфигурации (трансжирные кислоты).Unsaturated fatty acids are similar in form to saturated fatty acids, except that one or more alkene functional groups are present along the chain, with each alkene replacing a single -CH2-CH2- bond of the chain with a -CH = CH- double bond (i.e. . carbon is double bonded to another carbon atom). The next two carbon atoms in the chain, which are attached to each side of the double bond, can be present in the cis or trans configuration, preferably in the cis configuration. In an embodiment, the lipid or oil fatty acid composition of the invention comprises less than 1% fatty acids containing carbon double bonds in the trans configuration (trans fatty acids).

В настоящем документе термин мононенасыщенная жирная кислота обозначает жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 12 атомов углерода в углеродной цепи, и только одну алкеновую группу (двоййая углерод-углеродная связь) в цепи. В настоящем документе термины полиненасыщенная жирная кислота или ПНЖК обозначают жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 12 атомов углерода в углеродной цепи и по меньшей мере две алкеновые группы (двойные углеродуглеродные связи).As used herein, the term monounsaturated fatty acid means a fatty acid that contains at least 12 carbon atoms in the carbon chain and only one alkene group (carbon-carbon double bond) in the chain. As used herein, the terms polyunsaturated fatty acid or PUFA mean a fatty acid that contains at least 12 carbon atoms in its carbon chain and at least two alkene groups (carbon double bonds).

В настоящем документе термины длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота и ДЦПНЖК обозначают жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 20 атомов углерода в углеродной цепи и по меньшей мере две двойных углерод-углеродных связи, и таким образом включают ОДЦПНЖК. В настоящем документе термины полиненасыщенная жирная кислота с очень длинной цепью и ОДЦ-ПНЖК обозначают жирную кислоту, которая содержит по меньшей мере 22 атома углерода в углеродной цепи и по меньшей мере три двойных углерод-углеродных связи. Обычно количество атомов углерода в углеродной цепи жирных кислот относится к неразветвленной углеродной цепи. Если углеродная цепь разветвлена, количество атомов углерода исключает атомы углерода боковых групп. В одном варианте реализации длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота представляет собой ω3 жирную кислоту, т.е. содержит десатурацию (двойную углерод-углеродную связь) в положении третьей углерод-углеродной связи от метильного конца жирной кислоты. В другом варианте реализации длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота представляет собой ω6 жирную кислоту, т.е. содержит десатурацию (двойную углерод-углеродную связь) в положении шестой углерод-углеродной связи от метильного конца жирной кислоты. В другом варианте реализации длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота выбрана из группы, состоящей из арахидоновой кислоты (АРК, 20:4Δ5,8,11,14; ω6), эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК, 20:4Δ8,11,14,17, ω3), эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК, 20:5Δ5,8,11,14,17; ω3), докозапентаеновой кислоты (ДПК, 22:5Δ7,10,13,16,19, ω3) или докозагексаеновой кислоты (ДГК, 22:6Δ4,7,10,13,16,19, ω3). Кроме того, ДЦ-ПНЖК могут представлять собой дигомо-γлинолевую кислоту (ДГЛК) или эйкозатриеновую кислоту (ЭТрК, 20:3Δ11,14,17, ω3). Будет очевидно, что ДЦ-ПНЖК, полученная в соответствии с изобретением, может быть смесью любых или всех упомяAs used herein, the terms long chain polyunsaturated fatty acid and LCPUFA denote a fatty acid that contains at least 20 carbon atoms in a carbon chain and at least two carbon-carbon double bonds, and thus includes ODCPUFA. As used herein, the terms very long chain polyunsaturated fatty acid and ODC-PUFA mean a fatty acid that contains at least 22 carbon atoms in the carbon chain and at least three carbon-carbon double bonds. Typically, the number of carbon atoms in a fatty acid carbon chain refers to an unbranched carbon chain. If the carbon chain is branched, the number of carbon atoms excludes the carbon atoms of the side groups. In one embodiment, the long chain polyunsaturated fatty acid is an ω3 fatty acid, i. E. contains desaturation (double carbon-carbon bond) at the position of the third carbon-carbon bond from the methyl end of the fatty acid. In another embodiment, the long chain polyunsaturated fatty acid is an ω6 fatty acid, i. E. contains desaturation (double carbon-carbon bond) at the position of the sixth carbon-carbon bond from the methyl end of the fatty acid. In another embodiment, the long chain polyunsaturated fatty acid is selected from the group consisting of arachidonic acid (ARA, 20: 4Δ5,8,11,14; ω6), eicosatetraenoic acid (ETA, 20: 4Δ8,11,14,17, ω3), eicosapentaenoic acid (EPA, 20: 5Δ5,8,11,14,17; ω3), docosapentaenoic acid (DPA, 22: 5Δ7,10,13,16,19, ω3) or docosahexaenoic acid (DHA, 22: 6Δ4,7 , 10,13,16,19, ω3). In addition, DC-PUFA can be dihomo-γ-linoleic acid (DGLA) or eicosatrienoic acid (ETRA, 20: 3Δ11,14,17, ω3). It will be obvious that the DC-PUFA obtained in accordance with the invention can be a mixture of any or all of the

- 23 037184 нутых выше соединений, и может содержать другую ДЦ-ПНЖК или производные любой из перечисленных ДЦ-ПНЖК. В предпочтительном варианте реализации ω3 жирные кислоты представляют собой, по меньшей мере, ДПК или ДПК и ДГК, или ЭПК, ДПК и ДГК, или ЭПК и ДПК. В варианте реализации ДПК присутствует на уровне от около 7 до 30 или 35%, и ДГК присутствует или отсутствует, или, если она присутствует, то присутствует на уровне менее чем 2,0%, предпочтительно менее чем 1,0%, более предпочтительно менее чем 0,5% от общего состава жирных кислот в композиции и наиболее предпочтительно отсутствует или не поддается обнаружению. Это может обеспечиваться отсутствием активности Δ4-десатуразы в клетке. В варианте реализации уровень ДПК превышает ЭПК, более предпочтительно превышает уровень каждой из ЭПК и ДГК, наиболее предпочтительно превышает суммарный уровень ЭПК и ДГК. В данном варианте реализации ДГК может отсутствовать или, если она присутствует, то присутствует на уровне менее чем 0,5% от состава общих жирных кислот.- 23 037184 of the above compounds, and may contain other DC-PUFA or derivatives of any of the listed DC-PUFA. In a preferred embodiment, the ω3 fatty acids are at least DPA or DPA and DHA, or EPA, DPA and DHA, or EPA and DPA. In an embodiment, DPA is present at a level of from about 7 to 30 or 35%, and DHA is present or absent, or, if present, is present at a level of less than 2.0%, preferably less than 1.0%, more preferably less than 0.5% of the total fatty acid composition in the composition, and most preferably is absent or undetectable. This can be due to the lack of Δ4-desaturase activity in the cell. In an embodiment, the DPA level exceeds EPA, more preferably exceeds the level of each of EPA and DHA, most preferably exceeds the total level of EPA and DHA. In this embodiment, DHA may be absent or, if present, is present at a level of less than 0.5% of the total fatty acid composition.

Дополнительно, в настоящем документе термины длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота (ДЦ-ПНЖК) и полиненасыщенная жирная кислота с очень длинной цепью (ОДЦ-ПНЖК) обозначают жирную кислоту, находящуюся в свободном состоянии (неэтерифицированную) или в этерифицированной форме, например, как часть триглицерида (триглицерид), диацилглицерида, моноацилглицерида, связи с ацил-КоА (тиоэфир) или другой формы связи. В триглицериде, ДЦ-ПНЖК или ОДЦ-ПНЖК, такие как ДПК, могут быть этерифицированы в положениях sn-1/3 или sn-2, или триглицерид может содержать две или три ацильных группы, выбранные из ацильных групп ДЦ-ПНЖК и ОДЦПНЖК. Например, триглицерид может содержать ДПК как в sn-1, так и в sn-3 положениях. Жирная кислота может быть этерифицированной как фосфолипид, например формы фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерида, фосфатидилинозитола или дифосфатидилглицерида. Поэтому, ДЦ-ПНЖК может присутствовать как смесь форм в липиде клетки или очищенного масла или липиде, экстрагированном из клеток, тканей или организмов. В предпочтительных вариантах реализации изобретения раскрывается масло, содержащее по меньшей мере 75 или по меньшей мере 85% триацилглицеридов, причем остаток представляет собой другие формы липида, такие как упомянутые выше, в которых присутствуют, по меньшей мере, указанные триацилглицериды, содержащие ДЦ-ПНЖК. Впоследствии масло может быть дополнительно очищено или обработано, например гидролизом с сильным основанием, с целью высвобождения свободных жирных кислот, или переэтерификацией, дистилляцией и т.п.Additionally, as used herein, the terms long-chain polyunsaturated fatty acid (LTC-PUFA) and very long-chain polyunsaturated fatty acid (LTC-PUFA) denote a fatty acid that is free (non-esterified) or esterified, for example, as part of a triglyceride ( triglyceride), diacylglyceride, monoacylglyceride, linkage with acyl-CoA (thioether) or other form of linkage. In a triglyceride, DC-PUFA or ODC-PUFA, such as DPA, may be esterified at the sn-1/3 or sn-2 positions, or the triglyceride may contain two or three acyl groups selected from the acyl groups of DC-PUFA and ODCPUFA. For example, a triglyceride can contain DPA at both the sn-1 and sn-3 positions. The fatty acid can be esterified as a phospholipid, for example, a form of phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglyceride, phosphatidylinositol, or diphosphatidylglyceride. Therefore, DC-PUFA can be present as a mixture of forms in cell lipid or purified oil or lipid extracted from cells, tissues or organisms. In preferred embodiments of the invention, an oil is disclosed containing at least 75% or at least 85% triacylglycerides, the remainder being other lipid forms, such as those mentioned above, in which at least said triacylglycerides containing DC-PUFA are present. Subsequently, the oil can be further refined or treated, for example by hydrolysis with a strong base to release free fatty acids, or transesterification, distillation, and the like.

В настоящем документе выражение общие ω6 жирные кислоты или общее содержание ω6 жирных кислот или подобное обозначает сумму всех ω6 жирных кислот, этерифицированных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержания жирных кислот. Указанные ω6 жирных кислот включают (если они присутствуют) ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК и ω6-ДПК, но исключают любые ω 3 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Все ω6 жирные кислоты, присутствующие в растениях, семенах, липиде или маслах по изобретению, входят в класс полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).As used herein, the expression total ω6 fatty acids or total ω6 fatty acids or the like denotes the sum of all ω6 fatty acids, esterified and non-esterified, in the extracted lipid, oil, recombinant cell, plant part or seed, as defined by the context, expressed as a percentage of the total fatty acid content. Said ω6 fatty acids include (if present) LA, GLA, DGLA, ARA, EDA, and ω6-DPA, but exclude any ω 3 fatty acids and monounsaturated fatty acids. All ω6 fatty acids present in plants, seeds, lipids or oils according to the invention are included in the class of polyunsaturated fatty acids (PUFAs).

В настоящем документе выражение новые ω6 жирные кислоты или содержание новых ω6 жирных кислот или подобное обозначает сумму всех ω6 жирных кислот, за исключением ЛК, этерифицированных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержания жирных кислот. Такие новые ω6 жирные кислоты представляют собой жирные кислоты, продуцированные в клетках, растениях, частях растения и семенах по изобретению посредством экспрессии генетических конструкций (экзогенные полинуклеотиды), введенных в клетки, и включают (если они присутствуют) ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК и ω6-ДПК, но исключают ЛК и любые ω3 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Характерное общее содержание ω6 жирных кислот и содержание новых ω6 жирных кислот определяется по превращению жирных кислот в образце в МЭЖК и результатам анализа ГХ, как раскрыто в примере 1.As used herein, the expression new ω6 fatty acids or new ω6 fatty acid content or the like denotes the sum of all ω6 fatty acids, excluding LA, esterified and non-esterified, in the extracted lipid, oil, recombinant cell, plant part or seed, as defined by the context, expressed as a percentage of total fatty acids. Such new ω6 fatty acids are fatty acids produced in cells, plants, plant parts and seeds of the invention by expression of genetic constructs (exogenous polynucleotides) introduced into cells, and include (if present) GLA, DGLA, ARA, EDA and ω6-DPA, but exclude LA and any ω3 fatty acids and monounsaturated fatty acids. Representative total ω6 fatty acids and new ω6 fatty acids are determined from the conversion of fatty acids in the sample to FAME and the results of GC analysis as disclosed in Example 1.

В настоящем документе выражение общие ω3 жирные кислоты или общее содержание ω3 жирных кислот или подобное обозначает сумму всех ω3 жирных кислот, этерифицированных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержания жирных кислот. Такие ω 3 жирных кислот включают (если они присутствуют) АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК и исключают любые ω6 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Все ω 3 жирные кислоты, присутствующие в растениях, семенах, липиде или маслах по изобретению, входят в класс полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).As used herein, the expression total ω3 fatty acids or total ω3 fatty acids or the like denotes the sum of all ω3 fatty acids, esterified and non-esterified, in an extracted lipid, oil, recombinant cell, plant part or seed, as defined by the context, expressed as a percentage of the total fatty acid content. Such ω 3 fatty acids include (if present) ALA, SDA, ETRA, ETA, EPA, DPA, and DHA, and exclude any ω6 fatty acids and monounsaturated fatty acids. All ω 3 fatty acids present in plants, seeds, lipids or oils according to the invention belong to the class of polyunsaturated fatty acids (PUFAs).

В настоящем документе выражение новые ω3 жирные кислоты или содержание новых ω3 жирных кислот или подобное обозначает сумму всех ω 3 жирных кислот, за исключением АЛК, этерифицированных и неэтерифицированных, в экстрагированном липиде, масле, рекомбинантной клетке, части растения или семени, как определяется контекстом, выраженную как процент от общего содержанияAs used herein, the expression new ω3 fatty acids or new ω3 fatty acid content or the like denotes the sum of all ω 3 fatty acids, excluding ALA, esterified and non-esterified, in an extracted lipid, oil, recombinant cell, plant part or seed, as defined by the context, expressed as a percentage of the total

- 24 037184 жирных кислот. Такие новые ω3 жирные кислоты представляют собой ω3 жирные кислоты, продуцированные в клетках, растениях, частях растений и семенах по изобретению посредством экспрессии генетических конструкций (экзогенные полинуклеотиды), введенных в клетки, и включают (если они присутствуют) СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК, но исключают АЛК и любые ω6 жирные кислоты и мононенасыщенные жирные кислоты. Характерное общее содержание ω3 жирных кислот и содержание новых ω3 жирных кислот определяется по превращению жирных кислот в образце в МЭЖК и результатам анализа ГХ, как описано в примере 1.- 24 037184 fatty acids. Such new ω3 fatty acids are ω3 fatty acids produced in cells, plants, plant parts and seeds of the invention through the expression of genetic constructs (exogenous polynucleotides) introduced into cells, and include (if present) SDA, ETRK, ETC, EPA , DPA and DHA, but exclude ALA and any ω6 fatty acids and monounsaturated fatty acids. Representative total ω3 fatty acids and new ω3 fatty acids are determined from the conversion of fatty acids in the sample to FAME and the results of GC analysis as described in Example 1.

Как будет понятно квалифицированному специалисту, термин получение части растения в качестве стадии в способе по изобретению может включать получение одной или более частей растения для использования в способе. Получение части растения включает сбор урожая части растения с растения, например, с помощью комбайна или приобретение части растения или получение части растения от поставщика. В другом примере, получение части растения может быть приобретением растения у коголибо другого, кто собрал урожай части растения.As will be understood by the skilled artisan, the term obtaining a plant part as a step in a method of the invention may include obtaining one or more plant parts for use in the method. Receiving a plant part involves harvesting a plant part from a plant, for example, using a combine, or purchasing a plant part or obtaining a plant part from a supplier. In another example, obtaining a plant part may be purchasing a plant from someone else who harvested a plant part.

Белки десатураза, элонгаза и ацилтрансфераза и гены, кодирующие их, которые могут применяться в соответствии с изобретением, представляют собой любые из известных в уровне техники или их гомологи или производные. Примеры таких генов и размер кодируемых белков приведены в табл. 1. Ферменты десатуразы, для которых продемонстрировано участие в биосинтезе ДЦ-ПНЖК, все принадлежат к группе так называемых фронт-энд десатураз. Предпочтительными белками или комбинациями белков являются кодируемые генетическими конструкциями, предложенными в данном описании как SEQ ID NO: 1 и 2.The proteins desaturase, elongase and acyltransferase and the genes encoding them that can be used in accordance with the invention are any of those known in the art, or their homologues or derivatives. Examples of such genes and the size of the encoded proteins are shown in table. 1. Desaturase enzymes, which have been shown to participate in the biosynthesis of DC-PUFA, all belong to the group of so-called front-end desaturases. Preferred proteins or combinations of proteins are those encoded by the genetic constructs provided herein as SEQ ID NOs: 1 and 2.

В настоящем документе термин фрон-энд десатураза обозначает член класса ферментов, который вводит двойную связь между карбоксильной группой и уже имеющейся ненасыщенной частью ацильной цепи липидов, причем он структурно характеризуется присутствием N-концевого домена цитохром b5, вместе с типичным доменом десатуразы жирных кислот, который содержит три в высокой степени консервативных гистидиновых бокса (Napier et al., 1997).As used herein, the term frontend desaturase denotes a member of a class of enzymes that introduces a double bond between a carboxyl group and an already present unsaturated part of the acyl chain of lipids, and is structurally characterized by the presence of an N-terminal cytochrome b5 domain, together with a typical fatty acid desaturase domain, which contains three highly conserved histidine boxes (Napier et al., 1997).

Активность любой из элонгаз или десатураз для применения в изобретении может быть протестирована путем экспрессии гена, кодирующего фермент, в клетке, такой как, например, растительная клетка, или предпочтительно в соматических эмбрионах или трансгенных растениях, и определения наличия у клетки повышенной способности к выработке ДЦ-ПНЖК по сравнению со сравнимой клеткой, эмбрионом или растением, в которых фермент не экспрессируется.The activity of any of the elongases or desaturases for use in the invention can be tested by expressing the gene encoding the enzyme in a cell, such as, for example, a plant cell, or preferably in somatic embryos or transgenic plants, and determining whether the cell has an increased ability to produce DC -PUFA versus a comparable cell, embryo or plant in which the enzyme is not expressed.

В одном варианте реализации изобретения одна или более десатураз и/или элонгаз для применения в изобретении, могут быть выделены из микроводорослей, т.е. их аминокислотная последовательность идентична полипептиду, который может быть выделен из микроводорослей.In one embodiment, one or more desaturases and / or elongases for use in the invention may be isolated from microalgae, i. E. their amino acid sequence is identical to a polypeptide that can be isolated from microalgae.

Хотя некоторые ферменты конкретно описаны в настоящем документе как бифункциональные, отсутствие такого термина не обязательно означает, что конкретный фермент не обладает другой активностью, кроме конкретно определенной.Although some enzymes are specifically described herein as bifunctional, the absence of such a term does not necessarily mean that a particular enzyme has no activity other than that specifically defined.

Таблица 1Table 1

Клонированные гены, принимающие участие в биосинтезе ДЦ-ПНЖКCloned genes involved in the biosynthesis of DC-PUFA

Фермент Enzyme Тип организма Type of organism Вид View Номера доступа Access numbers Размер белка (ак) Protein size (ak) Ссылки Links А4-десатураза A4 desaturase Простейшие The simplest Eugiena gracilis Eugiena gracilis AY278558 AY278558 541 541 Meyer et al., 2003 Meyer et al., 2003 Водоросли Seaweed Pavlova lutherii Pavlova lutherii AY332747 AY332747 445 445 Tonon et aL, 2003 Tonon et aL, 2003 Isochrysis galbana Isochrysis galbana AAV33631 AAV33631 433 433 Pereira et al., 2004b Pereira et al., 2004b Pavlova salina Pavlova salina AAY15136 AAY15136 447 447 Zhou et at, 2007 Zhou et at, 2007 Траустохитрй диевые Traustohitry diium Thraustochytrium aureum Thraustochytrium aureum AAN75707 AAN75708 AAN75709 AAN75710 AAN75707 AAN75708 AAN75709 AAN75710 515 515 Отсутствуют Absent вид Thraustochytrium ATCC21685 Thraustochytrium species ATCC21685 AAM0968 8 AAM0968 8 519 519 Qiuet al., 2001 Qiuet al., 2001 А5-десатураза A5-desaturase Млекопитающ не Mammal not Homo sapiens Homo sapiens AF199596 AF199596 444 444 Cho etai; 1999b Leonard et al,, 2000b Cho etai; 1999b Leonard et al ,, 2000b Нематода Nematode Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans AFI 1440, NM_06935 0 AFI 1440, NM_06935 0 447 447 Michaelson et al., 1998b; Watts and Browse, 1999b ' Michaelson et al. 1998b; Watts and Browse, 1999b '

- 25 037184- 25 037184

Грибы Mushrooms Mortierella alpina Mortierella alpina AF067654 AF067654 446 446 Michaelson et al., 1998a; Knutzon etal, 1998 Michaelson et al., 1998a; Knutzon etal, 1998 Pythium irregplare Pythium irregplare AF419297 AF419297 456 456 Hong et al., 2002a Hong et al., 2002a Dictyostelivm discoideum Dictyostelivm discoideum AB022O97 AB022O97 467 467 Saito et al, 2000 Saito et al, 2000 Saprolegnia diclina Saprolegnia diclina 470 470 WO02081668 WO02081668 Диатомовые Diatoms Phaeodactylum tricornutum Phaeodactylum tricornutum AY082392 AY082392 469 469 Domergue et al, 2002 Domergue et al, 2002 Водоросли Seaweed вид Thraustochytrium Thraustochytrium species AF489588 AF489588 439 439 Qiu etaL, 2001 Qiu etaL, 2001 Thraustochytrium aureum Thraustochytrium aureum 439 439 WO02081668 WO02081668 Isochrysis galbana Isochrysis galbana 442 442 WO0208I668 WO0208I668 Мох Moss Marchanlia polymorpha Marchanlia polymorpha AY583465 AY583465 484 484 Kajikawa et al, 2004 Kajikawa et al, 2004 Δ6-десатураза Δ6-desaturase Млекопитающ ие Mammals Homo sapiens Homo sapiens NM01340 2 NM01340 2 444 444 Cho etal, 1999a; Leonard et al, 2000 Cho etal, 1999a; Leonard et al, 2000 Mus musculus Mus musculus NM_01969 9 NM_01969 nine 444 444 Cho etal, 1999a Cho etal, 1999a Нематода Nematode Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans Z70271 Z70271 443 443 Napier etal, 1998 Napier etal, 1998 Растения Plants Borago officinales Borago officinales U79010 U79010 448 448 Sayanova et al., 1997 Sayanova et al., 1997 Echium Echium AY055117 AY055118 AY055117 AY055118 Garcia-Maroto et al., 2002 Garcia-Maroto et al., 2002 Primula vialii Primula vialii AY234127 AY234127 453 453 Sayanova et al, 2003 Sayanova et al, 2003 Anemone leveillei Anemone leveillei AF536525 AF536525 446 446 Whitney et al., 2003 Whitney et al., 2003 Мхи Mosses Ceratodon purpureas Ceratodon purpureas AJ250735 AJ250735 520 520 Sperling et al., 2000 Sperling et al., 2000 Marchanlia polymorpha Marchanlia polymorpha AY583463 AY583463 481 481 Kajikawa et al., 2004 Kajikawa et al., 2004 Physcomitrella patens Physcomitrella patens CAA11033 CAA11033 525 525 Girkeetal, 1998 Girkeetal, 1998 Грибы Mushrooms Mortierella alpina Mortierella alpina AF110510 AB020032 AF110510 AB020032 457 457 Huang et al., 1999; Sakuradani et al., 1999 Huang et al. 1999; Sakuradani et al., 1999 Pythium irregulare Pythium irregulare AF419296 AF419296 459 459 Hong et al., 2002a Hong et al., 2002a Mucor circinelloides Mucor circinelloides AB052086 AB052086 467 467 NCBi* NCBi * вид Rhizopus Rhizopus species AY320288 AY320288 458 458 Zhang et aL, 2004 Zhang et aL, 2004 Saprolegnia diclina Saprolegnia diclina 453 453 WO0208I668 WO0208I668 Диатомовые Diatoms Phaedactylum tricornutum Phaedactylum tricornutum AY082393 AY082393 477 477 Domergue a al, 2002 Domergue a al, 2002 Бактерии Bacteria Synechocysiis Synechocysiis LI 1421 LI 1421 359 359 Reddy et al., 1993 Reddy et al., 1993 Водоросли Seaweed Thraustochytrium aureum Thraustochytrium aureum 456 456 WO02081668 WO02081668 Бифункциона льная Δ5/Δ6десатураза Bifunctional Δ5 / Δ6 desaturase Рыба Fish Danio rerio Danio rerio AF309556 AF309556 444 444 Hastings et al.,2001 Hastings et al., 2001 С20 Δ8десатураза C20 Δ8 desaturase Водоросли Seaweed Euglena gracilis Euglena gracilis AFI 39720 AFI 39720 419 419 Wallis and Browse, 1999 Wallis and Browse, 1999 Растения Plants Borago officinales Borago officinales AAG43277 AAG43277 446 446 Sperling et al, 2001 Sperling et al, 2001 А6-элонгаза A6-elongase Нематода Nematode Caenorhabdiiis elegans Caenorhabdiiis elegans NM_06928 8 NM_06928 8 288 288 Beaudoin et al., 2000 Beaudoin et al., 2000 Мхи Mosses Physcomitrella patens Physcomitrella patens AF428243 AF428243 290 290 Zank et al., 2002 Zank et al., 2002 Marchanlia polymorpha Marchanlia polymorpha AY583464 AY583464 290 290 Kajikawa et al., 2004 Kajikawa et al., 2004

- 26 037184- 26 037184

Грибы Mushrooms Mortierella aipina Mortierella aipina AF206662 AF206662 318 318 Parker-Barnes et al., 2000 Parker-Barnes et al., 2000 Водоросли Seaweed Pavlova lutheri** Pavlova lutheri ** 501 501 WO 03078639 WO 03078639 Thraustochytrium Thraustochytrium AX951565 AX951565 271 271 WO 03093482 WO 03093482 вид Thraustochylrium * * view Thraustochylrium * * AX214454 AX214454 271 271 WO 0159128 WO 0159128 пнжкэлонгаза PNzhkelongaza Млекопитающ ие Mammals Homo sapiens Homo sapiens AF231981 AF231981 299 299 Leonard et al., 2000b; Leonard et al., 2002 Leonard et al., 2000b; Leonard et al., 2002 Rattus norvegicus Rattus norvegicus AB071985 AB071985 299 299 Inagaki et al., 2002 Inagaki et al., 2002 Rattus norvegicus** Rattus norvegicus ** AB071986 AB071986 267 267 Inagaki et al., 2002 Inagaki et al., 2002 Mus musculus Mus musculus AFI70907 AFI70907 279 279 Tvrdik et al., 2000 Tvrdik et al., 2000 Mus musculus Mus musculus AF17O908 AF17O908 292 292 Tvrdik et al., 2000 Tvrdik et al., 2000 Рыба Fish Danio rerio Danio rerio AF532782 AF532782 291 (282) 291 (282) Agaba et a|._t 2004Agaba et a |. _t 2004 Danio rerio** Danio rerio ** NMJ9953 2 NMJ9953 2 266 266 Lo et al., 2003 Lo et al., 2003 Червь Worm Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans Z68749 Z68749 309 309 Abbott et al., 1998 Beaudoin et al., 2000 Abbott et al., 1998 Beaudoin et al., 2000 Водоросли Seaweed Thraustochytrium aureum** Thraustochytrium aureum ** AX464802 AX464802 272 272 WO 0208401-A2 WO 0208401-A2 Pavlova lutheri** Pavlova lutheri ** 320 320 WO 03078639 WO 03078639 Д9-элонгаза D9-elongase Водоросли Seaweed Isochrysis galbana Isochrysis galbana AF390174 AF390174 263 263 Qi et al., 2002 Qi et al., 2002 Euglena gracilis Euglena gracilis 258 258 WO 08/128241 WO 08/128241 Д5-элонгаза D5-elongase Водоросли Seaweed Ostreococcus tauri Ostreococcus tauri AAV67798 AAV67798 300 300 Meyer et al., 2004 Meyer et al., 2004 Pyramimonas cordala Pyramimonas cordala 268 268 WO 2010/057246 WO 2010/057246 вид Pavlova CCMP459 view Pavlova CCMP459 AAV33630 AAV33630 277 277 Pereira et al., 2004b Pereira et al., 2004b Pavlova salina Pavlova salina AAY15135 AAY15135 302 302 Robert et al,, 2009 Robert et al ,, 2009 Диатомовые Diatoms Thalassiosira pseudonana Thalassiosira pseudonana AAV67800 AAV67800 358 358 Meyer et al., 2004 Meyer et al., 2004 Рыба Fish Oncorhynchus mykiss Oncorhynchus mykiss CAM55862 CAM55862 295 295 WO 06/008099 WO 06/008099 Мох Moss Marchantia polymorpha Marchantia polymorpha BAE71129 BAE71129 348 348 Kajikawa et al., 2006 Kajikawa et al., 2006

* http://o.ncbi.nlm.nih.gov/.* http://o.ncbi.nlm.nih.gov/.

** Функция не доказана/не продемонстрирована.** Function not proven / demonstrated.

Десатуразы.Desaturases.

В настоящем документе термин десатураза обозначает фермент, который способен вводить двойную углерод-углеродную связь в ацильную группу жирнокислотного субстрата, который обычно находится в этерифицированной форме, например эфиры ацил-КоА. Ацильная группа может быть этерифицирована до фосфолипида, например фосфатидилхолин (ФХ), или до белка-носителя ацила (БНА), или, в предпочтительном варианте реализации, до КоА. Десатуразы в общем могут быть разделены на три группы соответственно. В одном варианте реализации десатураза представляет собой фронт-энд десатуразу.As used herein, the term desaturase refers to an enzyme that is capable of introducing a carbon-carbon double bond into the acyl group of a fatty acid substrate, which is usually in esterified form, for example, acyl-CoA esters. The acyl group can be esterified to a phospholipid, for example phosphatidylcholine (PC), or to an acyl carrier protein (BHA), or, in a preferred embodiment, to CoA. Desaturases can be broadly classified into three groups, respectively. In one embodiment, the desaturase is a front-end desaturase.

В настоящем документе Δ4-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 4-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ4-десатураза, по меньшей мере, способна трансформировать ДПК в ДГК. Предпочтительно Δ4-десатураза способна преобразовывать ДПК-КоА в ДГК-КоА, т.е. она является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ4-десатураза способна преобразовывать ДПК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ в ДГК-ФХ. Предпочтительно Δ4десатураза обладает более высокой активностью в отношении ДПК-КоА, чем в отношении ДПК-ФХ. Стадия десатурации с образованием ДГК из ДПК катализируется Δ4-десатуразой в организмах, не относящихся к млекопитающим, и ген, кодирующий данный фермент, выделен от вида пресноводных простейших Euglena gracilis и морских видов Thraustochytrium (Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003). В одном варианте реализации Δ4-десатураза содержит последовательность аминокислот, соответствующую представленной в SEQ ID NO: 28, или Δ4-десатуразе вида Thraustochytrium, ее биологически активному фрагменту или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 28. В варианте реализации растение, часть растения (такая как семя) или клетка по изобретению или применяемые согласно изобретению, которые продуцируют высокие уровни ДПК, например ДПК составляет от 5 до 35% от общего содержания экстрагируемых жирных кислот, не содержат гена, кодирующего функциональную Δ4-десатуразу.As used herein, Δ4 desaturase refers to a protein that undergoes a desaturation reaction with the introduction of a carbon-carbon double bond at the 4th carbon-carbon bond position from the carboxyl terminus of a fatty acid substrate. Δ4-desaturase is at least capable of transforming duodenum to DHA. Preferably, the Δ4 desaturase is capable of converting DPA-CoA to DHA-CoA, i. E. it is acyl-CoA desaturase. In an embodiment, Δ4 desaturase is capable of converting duplex esterified at the sn-2 position of PC to DHA-PC. Preferably, Δ4 desaturase has a higher activity against DPA-CoA than against DPA-PC. The desaturation stage with DHA formation from the duodenum is catalyzed by Δ4-desaturase in non-mammalian organisms, and the gene encoding this enzyme has been isolated from the freshwater protozoan Euglena gracilis and the marine species Thraustochytrium (Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003). In one embodiment, the Δ4 desaturase comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 28 or a Thraustochytrium Δ4 desaturase, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 80% identical to SEQ ID NO: 28. In an embodiment implementations of a plant, a part of a plant (such as a seed) or a cell according to the invention or used according to the invention, which produce high levels of DPA, for example, DPA is from 5 to 35% of the total content of extracted fatty acids, do not contain the gene encoding functional Δ4 desaturase.

В настоящем документе Δ5-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 5-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. В варианте реализации жирнокислотный субстрат представляет собой ЭТК, и фермент продуцирует ЭПК. Предпочтительно Δ5-десатураза способна трансформировать ЭТК-КоА в ЭПК-КоА, т.е. является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ5-десатураза способна трансформировать ЭТК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ. ПредпочAs used herein, Δ5-desaturase refers to a protein that performs a desaturation reaction by introducing a carbon-carbon double bond at the 5th carbon-carbon bond position from the carboxyl terminus of the fatty acid substrate. In an embodiment, the fatty acid substrate is ETA and the enzyme produces EPA. Preferably, the Δ5 desaturase is capable of transforming ETA-CoA to EPA-CoA, i. E. is acyl-CoA desaturase. In an embodiment, Δ5-desaturase is capable of transforming ETC esterified at the sn-2 position of PC. Prefer

- 27 037184 тительно Δ5-десатураза обладает более высокой активностью в отношении ЭТК-КоА, чем в отношении ЭТК-ФХ. Примеры Δ5-десатураз приведены в Ruiz-Lopez et al. (2012) и Petrie et al. (2010a) а также в табл. 1 настоящего документа. В одном варианте реализации последовательность аминокислот Δ5десатуразы соответствует представленной в SEQ ID NO: 20, ее биологически активному фрагменту или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 20. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ5-десатуразы соответствует представленной SEQ ID NO: 22, ее биологически активному фрагменту, или последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 53% идентична SEQ ID NO: 22. В другом варианте реализации Δ5-десатураза получена из вида Thraustochytrium или Emiliania huxleyi.- 27 037184 Thus, Δ5-desaturase has a higher activity against ETC-CoA than against ETC-PC. Examples of Δ5-desaturases are given in Ruiz-Lopez et al. (2012) and Petrie et al. (2010a) and also in tab. 1 of this document. In one embodiment, the amino acid sequence of the Δ5 desaturase is as set forth in SEQ ID NO: 20, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 80% identical to SEQ ID NO: 20. In another embodiment, the amino acid sequence of the Δ5 desaturase is as set forth in SEQ ID NO: 22, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence that is at least 53% identical to SEQ ID NO: 22. In another embodiment, the Δ5 desaturase is derived from the species Thraustochytrium or Emiliania huxleyi.

В настоящем документе Δ6-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 6-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. В варианте реализации жирнокислотный субстрат представляет собой АЛК, и фермент продуцирует СДК. Предпочтительно Δ6-десатураза способна преобразовывать АЛК-КоА в СДК-КоА, т.е. является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ6десатураза способна преобразовывать АЛК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ. Предпочтительно Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении АЛК-КоА, чем в отношении АЛКФХ. Кроме того, Δ6-десатураза может обладать активностью Δ5-десаmуразы, и при этом носить название Δ5/Δ6 бифункциональной десатуразы, при условии, что она обладает более высокой активностью Δ6десатуразы в отношении АЛК, чем активностью Δ5-десаmуразы в отношении ЭТК. Примеры Δ6десатураз приведены в Ruiz-Lopez et al. (2012) и Petrie et al. (2010a), a также в табл. 1 настоящего документа. Предпочтительные Δ6-десатуразы получены из Micromonas pusilla, Pythium irregulare или Ostreococcus taurii.As used herein, Δ6-desaturase refers to a protein that performs a desaturation reaction by introducing a carbon-carbon double bond at the 6th carbon-carbon bond position from the carboxyl terminus of the fatty acid substrate. In an embodiment, the fatty acid substrate is ALA and the enzyme produces SDA. Preferably, the Δ6 desaturase is capable of converting ALA-CoA to SDK-CoA, i. E. is acyl-CoA desaturase. In an embodiment, Δ6 desaturase is capable of converting ALA esterified at the sn-2 position of PC. Preferably, Δ6 desaturase has a higher activity against ALA-CoA than against ALCP. In addition, Δ6-desaturase can have a Δ5-desaturase activity, and at the same time be called a Δ5 / Δ6 bifunctional desaturase, provided that it has a higher Δ6 desaturase activity against ALA than the activity of Δ5-desamurase against ETA. Examples of Δ6 desaturases are given in Ruiz-Lopez et al. (2012) and Petrie et al. (2010a), as well as in tab. 1 of this document. Preferred Δ6 desaturases are derived from Micromonas pusilla, Pythium irregulare or Ostreococcus taurii.

В варианте реализации Δ6-десатураза дополнительно характеризуется наличием по меньшей мере двух, предпочтительно всех трех и предпочтительно в растительной клетке, из следующего: i) более высокая активность Δ6-десатуразы в отношении α-линоленовой кислоты (АЛК, 18:3Δ9,12,15, ω3), чем в отношении линолевой кислоты (ЛК, 18:2Δ9,12, ω6) в качестве жирнокислотного субстрата; ii) более высокая активность Δ6-десатуразы в отношении АЛК-КоА в качестве жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной в положении sn-2 ФХ, в качестве жирнокислотного субстрата; и iii) активность Δ8-десатуразы в отношении ЭТрК. Примеры таких Δ6-десатураз приведены в табл. 2.In an embodiment, Δ6-desaturase is further characterized by the presence of at least two, preferably all three, and preferably in a plant cell, of the following: i) a higher activity of Δ6-desaturase towards α-linolenic acid (ALA, 18: 3Δ9,12,15 , ω3) than in relation to linoleic acid (LC, 18: 2Δ9,12, ω6) as a fatty acid substrate; ii) a higher activity of Δ6-desaturase in relation to ALA-CoA as a fatty acid substrate than in relation to ALA attached at position sn-2 of PC, as a fatty acid substrate; and iii) the activity of Δ8-desaturase against ETRK. Examples of such Δ6-desaturases are given in table. 2.

В варианте реализации Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении ω3 субстрата, чем в отношении соответствующего ω6 субстрата, и обладает активностью в отношении АЛК с образованием октадекатетраеновой кислоты (стеаридоновая кислота, СДК, 18:4Δ6,9,12,15, ω3), с эффективностью по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%, при экспрессии из экзогенного полинуклеотида в рекомбинантной клетке, такой как растительная клетка, или по меньшей мере 35% при экспрессии в дрожжевой клетке. В одном варианте реализации Δ6-десатураза обладает более высокой активностью, например по меньшей мере около в 2 раза более высокой активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК, чем в отношении ЛК как жирнокислотного субстрата. В другом варианте реализации Δ6-десатураза обладает более высокой активностью, например по меньшей мере около в 5 раз более высокой активностью Δ6-десатуразы или по меньшей мере в 10 раз более высокой активностью в отношении АЛК-КоА как жирнокислотного субстрата, чем в отношении АЛК, присоединенной в положении sn-2 ФХ, как жирнокислотного субстрата. В другом варианте реализации, Δ6-десатураза обладает активностью в отношении обоих жирнокислотных субстратов - АЛК-КоА и АЛК, присоединенных в положении sn-2 ФХ.In an embodiment, Δ6-desaturase has a higher activity against the ω3 substrate than against the corresponding ω6 substrate, and has activity against ALA to form octadecatetraenoic acid (stearidonic acid, SDA, 18: 4Δ6,9,12,15, ω3) , with an efficiency of at least 30%, more preferably at least 40%, or most preferably at least 50%, when expressed from an exogenous polynucleotide in a recombinant cell, such as a plant cell, or at least 35% when expressed in a yeast cell ... In one embodiment, Δ6-desaturase has a higher activity, for example, at least about 2 times the activity of Δ6-desaturase for ALA than for LA as a fatty acid substrate. In another embodiment, Δ6 desaturase has a higher activity, for example, at least about 5 times the activity of Δ6 desaturase, or at least 10 times higher activity against ALA-CoA as a fatty acid substrate than against ALA. attached at the sn-2 position of PC as a fatty acid substrate. In another embodiment, Δ6 desaturase is active against both ALA-CoA and ALA fatty acid substrates attached at the sn-2 position of PC.

Таблица 2table 2

Десатуразы, которые продемонстрировали активность на субстрате ацил-КоАDesaturases that have been shown to be active on the acyl-CoA substrate

Фермент Enzyme Тип организма Type of organism Вид View Номера доступа Access numbers Размер белка (ак) Protein size (ak) Ссылки Links Дб-десатураза Db desaturase Водоросли Seaweed Mantoniella squamata Mantoniella squamata CAQ30479 CAQ30479 449 449 Hoffinann et al., 2008 Hoffinann et al., 2008 Ostreococcus tauri Ostreococcus tauri AAW7O159 AAW7O159 456 456 Doipergue et al., 2005 Doipergue et al., 2005 Micromonas pusilla Micromonas pusilla EEH58637 EEH58637 Petrie et al., 2010a (SEQ ID Petrie et al., 2010a (SEQ ID

- 28 037184- 28 037184

NO: 13) NO: 13) А5-десатураза A5-desaturase Водоросли Seaweed Mantoniella squamata Mantoniella squamata CAQ30478 CAQ30478 482 482 Hoffmann et al., 2008 Hoffmann et al., 2008 Растение Plant Anemone leveillei Anemone leveillei Отсутствует Is absent Sayanova et al., 2007 Sayanova et al., 2007 ω3-десатураза ω3-desaturase Грибы Mushrooms Pythium aphanidermatum Pythium aphanidermatum FW362186.1 FW362186.1 359 359 Xue et al., 2012; WO2008/054565 Xue et al., 2012; WO2008 / 054565 Грибы (оомицет) Mushrooms (oomycete) Phytophthora sojae Phytophthora sojae FW362214.1 FW362214.1 363 363 Xue et al., 2012; WO2008/054565 Xue et al., 2012; WO2008 / 054565 Грибы (оомицет) Mushrooms (oomycete) Phytophthora rumorum Phytophthora rumorum FW362213.1 FW362213.1 361 361 Xue et a!., 2012; WO2008/054565 Xue et a!., 2012; WO2008 / 054565

В одном варианте реализации Δ6-десатураза не обладает обнаружимой активностью Δ5-десатуразы в отношении ЭТК. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ6-десатуразы представлена SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, их биологически активным фрагментом, или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 77% идентичной SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ6-десатуразы представлена SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, их биологически активным фрагментом или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 67% идентичной одной или обеим из SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13. Кроме того, Δ6-десатураза может обладать активностью Δ8-десатуразы.In one embodiment, Δ6-desaturase has no detectable Δ5-desaturase activity against ETA. In another embodiment, the amino acid sequence of the Δ6 desaturase is represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 13, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 77% identical to SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13. In another embodiment, the amino acid sequence of the Δ6-desaturase is SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13, a biologically active fragment or amino acid sequence thereof that is at least 67% identical to one or both of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13. In addition, Δ6 desaturase may have Δ8 desaturase activity.

В настоящем документе Δ8-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 8-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ8-Десатураза, по меньшей мере, способна превращать ЭТрК в ЭТК. Предпочтительно Δ8-десатураза способна преобразовывать ЭТрК-КоА в ЭТК-КоА, т.е. является ацил-КоА десатуразой. В варианте реализации Δ8-десатураза способна преобразовывать ЭТрК, этерифицированную в положении sn-2 ФХ. Предпочтительно Δ8-десатураза обладает более высокой активностью в отношении ЭТрК-КоА, чем в отношении ЭТрК-ФХ. Кроме того, Δ8-десатураза может обладать активностью Δ8-десатуразы, и при этом носить название Δ6/Δ8 бифункциональной десатуразы, при условии, что она обладает более высокой активностью Δ8-десатуразы в отношении ЭТрК, чем активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК. Примеры Δ8-десатураз приведены в табл. 1. В одном варианте реализации последовательность аминокислот Δ8-десатуразы соответствует представленной SEQ ID NO: 37, ее биологически активным фрагментом или последовательности аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 37.As used herein, Δ8 desaturase refers to a protein that performs a desaturation reaction by introducing a carbon-carbon double bond at the 8th carbon-carbon bond position from the carboxyl terminus of the fatty acid substrate. Δ8-Desaturase is at least capable of converting ETRC to ETA. Preferably, the Δ8 desaturase is capable of converting ETRK-CoA to ETC-CoA, i. E. is acyl-CoA desaturase. In an embodiment, Δ8 desaturase is capable of converting ETRK esterified at the sn-2 position of PC. Preferably, Δ8 desaturase has a higher activity against ETRK-CoA than against ETPK-PC. In addition, Δ8 desaturase may have a Δ8 desaturase activity, and be called a Δ6 / Δ8 bifunctional desaturase, provided that it has a higher Δ8 desaturase activity for ETRK than the activity of Δ6 desaturase for ALA. Examples of Δ8-desaturases are given in table. 1. In one embodiment, the amino acid sequence of the Δ8 desaturase is as shown in SEQ ID NO: 37, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 80% identical to SEQ ID NO: 37.

В настоящем документе ω3-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 3ой углерод-углеродной связи от метилового конца жирнокислотного субстрата. Таким образом, ω3-десатураза может превращать ЛК в АЛК и ГЛК в СДК (все С18 жирные кислоты), или ДГЛК в ЭТК и/или АРК в ЭПК (С20 жирные кислоты). Некоторые ω3-десатуразы (группа I) обладают активностью только на C18 субстратах, таких как растительные и цианобактериальные ω3-десатуразы. Такие ω3-десатуразы также являются Δ15десатуразами. Другие ω 3-десатуразы проявляют активность на субстратах С20 без активности (группа II) или с некоторой активностью (группа III) на субстратах C18. Такие ω3-десатуразы также являются Δ 17десатуразами. Предпочтительными ω3-десатуразами является группа III типа, которая превращает ЛК в АЛК, ГЛК в СДК, ДГЛК в ЭТК и АРК в ЭПК, например Pichia pastoris ω3-десатураза (SEQ ID NO: 6). Примеры ω3-десатураз включают описанные Pereira et al. (2004a) (ω3-десатураза Saprolegnia diclina, группа II), Horiguchi et al. (1998), Berberich et al. (1998) и Spychalla et al. (1997) (ω3-десатураза С. elegans, группа III). В предпочтительном варианте реализации ω3-десатураза представляет собой грибковую ω3десатуразу. В настоящем документе грибковая ω3-десатураза обозначает ω3-десатуразу, которая получена из грибкового источника, в том числе оомицетного источника, или ее вариант с последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичной ей. Гены, кодирующие многочисленные ω3десатуразы, выделены из грибковых источников, таких как, например, Phytophthora infestans (номер доступа CAJ30870, WO2005083053; SEQ ID NO: 47), Saprolegnia diclina (номер доступа AAR20444, Pereira et al., 2004а и US 7211656), Pythium irregulare (WO2008022963, группа II; SEQ ID NO: 49), Mortierella alpina (Sakuradani et al., 2005; номер доступа BAD91495; WO2006019192), Thalassiosira pseudonana (Armbrust et al., 2004; номер доступа ХР_002291057; WO2005012316, SEQ ID NO: 48), Lachancea kluyveri (также известный как Saccharomyces kluyveri; Oura et al., 2004; номер доступа AB118663). Xue et al. (2012) описывает ω3-десатуразы из оомицетов Pythium aphanidermatum, Phytophthora sojae и Phytophthora ramorum, способные эффективно превращать жирнокислотные субстраты ω6 в соответствующие ω3 жирные кислоты, с предпочтением в отношении субстратов С20, т.е. обладающие более выраженной активностью Δ 17-десатуразы, чем активностью Δ 15-десатуразы. Такие ферменты не обладают активностью Δ12десатуразы, но способны использовать жирных кислот в ацил-КоА и фосфолипидной фракции в качестве субстратов.As used herein, ω3 desaturase refers to a protein that undergoes a desaturation reaction by introducing a carbon-carbon double bond at the position of the 3rd carbon-carbon bond from the methyl end of the fatty acid substrate. Thus, ω3 desaturase can convert LA to ALA and GLA to SDA (all C18 fatty acids), or DGLA to ETA and / or ARA to EPA (C20 fatty acids). Some ω3 desaturases (group I) are active only on C18 substrates, such as plant and cyanobacterial ω3 desaturases. Such ω3 desaturases are also Δ15 desaturases. Other ω 3 desaturases are active on C20 substrates without activity (group II) or with some activity (group III) on C18 substrates. Such ω3 desaturases are also Δ 17 desaturases. Preferred ω3 desaturases are type III group which converts LA to ALA, GLA to SDA, DGLA to ETA and ARA to EPA, for example Pichia pastoris ω3 desaturase (SEQ ID NO: 6). Examples of ω3 desaturases include those described by Pereira et al. (2004a) (Saprolegnia diclina ω3-desaturase, group II), Horiguchi et al. (1998) Berberich et al. (1998) and Spychalla et al. (1997) (C. elegans ω3-desaturase, group III). In a preferred embodiment, the ω3 desaturase is fungal ω3 desaturase. In this document, fungal ω3 desaturase means ω3 desaturase, which is obtained from a fungal source, including an oomycete source, or a variant thereof with an amino acid sequence at least 95% identical to it. Genes encoding numerous ω3 desaturases have been isolated from fungal sources such as, for example, Phytophthora infestans (accession number CAJ30870, WO2005083053; SEQ ID NO: 47), Saprolegnia diclina (accession number AAR20444, Pereira et al., 2004a and US 7211656), Pythium irregulare (WO2008022963, group II; SEQ ID NO: 49), Mortierella alpina (Sakuradani et al., 2005; accession number BAD91495; WO2006019192), Thalassiosira pseudonana (Armbrust et al., 2004; accession number XP_0022912316; WO20050 NO: 48), Lachancea kluyveri (also known as Saccharomyces kluyveri; Oura et al., 2004; accession number AB118663). Xue et al. (2012) describes ω3 desaturases from oomycetes Pythium aphanidermatum, Phytophthora sojae, and Phytophthora ramorum, capable of efficiently converting fatty acid substrates ω6 into the corresponding ω3 fatty acids, with preference for C20 substrates, i.e. having a more pronounced activity of Δ 17-desaturase than the activity of Δ 15-desaturase. These enzymes do not possess the activity of Δ12 desaturase, but are capable of using fatty acids in the acyl-CoA and phospholipid fraction as substrates.

В более предпочтительном варианте реализации грибковая ω3-десатураза представляет собой ω3- 29 037184 десатуразу/Δ 15-десатуразу Pichia pastoris (также известна как Komagataella pastoris) (Zhang et al., 2008;In a more preferred embodiment, the fungal ω3 desaturase is Pichia pastoris ω3-29 037184 desaturase / Δ15 desaturase (also known as Komagataella pastoris) (Zhang et al., 2008;

номер доступа EF116884; SEQ ID NO: 6) или полипептид, который по меньшей мере на 95% идентичен ей.access number EF116884; SEQ ID NO: 6) or a polypeptide that is at least 95% identical thereto.

В варианте реализации ω3-десатураза способна осуществлять по меньшей мере одну из следующих трансформаций: АРК в ЭПК, ДГЛК в ЭТК, ГЛК в СДК, АРК в ЭПК и ДГЛК в ЭТК, АРК в ЭПК и ГЛК в СДК или все три из них.In an embodiment, ω3 desaturase is capable of at least one of the following transformations: ARA to EPA, DGLA to ETC, GLA to SDA, ARA to EPA and DGLA to ETC, ARA to EPA and GLA to SDK, or all three of them.

В одном варианте реализации ω3-десатураза обладает активностью Δ 17-десатуразы в отношении жирной кислоты С20, которая содержит по меньшей мере три двойных углерод-углеродных связи, предпочтительно АРК. В другом варианте реализации ω3-десатураза обладает активностью Δ 15-десатуразы в отношении жирной кислоты C18, которая содержит три двойных углерод-углеродных связи, предпочтительно ГЛК. Предпочтительно оба вида активности присутствуют.In one embodiment, ω3 desaturase has Δ 17 desaturase activity on a C20 fatty acid that contains at least three carbon-carbon double bonds, preferably ARA. In another embodiment, ω3 desaturase has Δ 15 desaturase activity on a C18 fatty acid that contains three carbon-carbon double bonds, preferably GLA. Preferably both activities are present.

В настоящем документе Δ12-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 12-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ12-Десатуразы обычно превращают олеоилфосфатидилхолин или олеоил-КоА в линолеоил-фосфатидилхолин (18:1-ФХ) или линолеоил-КоА (18:1КоА) соответственно. Подкласс, использующий связанный с ФХ субстрат, называют фосфолипидзависимыми Δ12-десатуразами, второй подкласс - ацил-КоА-зависимыми Δ12-десатуразами. Растительные и грибковые Δ12-десатуразы обычно относятся к первому подклассу, тогда как животные Δ12десатуразы относятся ко второму подклассу, например Δ12-десатуразы, кодируемые генами, которые клонированы из насекомых Zhou et al. (2008). Множество других последовательностей Δ12-десатуразы могут быть легко идентифицированы посредством поиска в базах данных последовательностей.As used herein, Δ12-desaturase refers to a protein that performs a desaturation reaction with the introduction of a carbon-carbon double bond at the 12th carbon-carbon bond position from the carboxyl terminus of the fatty acid substrate. Δ12-Desaturases usually convert oleoylphosphatidylcholine or oleoyl-CoA to linoleoylphosphatidylcholine (18: 1-PC) or linoleoyl-CoA (18: 1KoA), respectively. The subclass using a substrate associated with PC is called phospholipid-dependent Δ12 desaturases, the second subclass is called acyl-CoA-dependent Δ12 desaturases. Plant and fungal Δ12 desaturases generally belong to the first subclass, while animal Δ12 desaturases belong to the second subclass, for example, Δ12 desaturases, encoded by genes cloned from insects by Zhou et al. (2008). Many other Δ12 desaturase sequences can be easily identified by searching the sequence databases.

В настоящем документе Δ15-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 15-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Многочисленные гены, кодирующие Δ15-десатуразы, клонированы из растительных и грибковых видов. Например, в US5952544 раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие растительные Δ15-десатуразы (FAD3). Эти ферменты содержит мотивы аминокислот, которые были характерны для растительных Δ15-десатураз. В WO200114538 раскрыт ген, кодирующий FAD3 сои. Множество других последовательностей Δ 15-десатуразы могут быть легко идентифицированы посредством поиска в базах данных последовательностей.As used herein, Δ15 desaturase refers to a protein that performs a desaturation reaction by introducing a carbon-carbon double bond at the 15th carbon-carbon bond position from the carboxyl terminus of the fatty acid substrate. Numerous genes encoding Δ15 desaturases have been cloned from plant and fungal species. For example, US5952544 discloses nucleic acids encoding plant Δ15 desaturases (FAD3). These enzymes contain amino acid motifs that were characteristic of plant Δ15-desaturases. WO200114538 discloses a gene encoding soybean FAD3. Many other Δ 15-desaturase sequences can be easily identified by searching the sequence databases.

В настоящем документе Δ17-десатураза обозначает белок, который осуществляет реакцию десатурации, с введением двойной углерод-углеродной связи в положении 17-й углерод-углеродной связи от карбоксильного конца жирнокислотного субстрата. Δ17-Десатураза также расценивается как ω3десатураза, если она действует на субстрат С20, с введением десатурации в положении связи ω3.As used herein, Δ17 desaturase refers to a protein that performs a desaturation reaction by introducing a carbon-carbon double bond at the 17th carbon-carbon bond from the carboxyl terminus of the fatty acid substrate. Δ17-Desaturase is also regarded as ω3 desaturase if it acts on the C20 substrate, with the introduction of desaturation at the position of the ω3 bond.

В предпочтительном варианте реализации Δ12-десатураза и/или λ 15-десатураза представляет собой грибковую Δ12-десатуразу или грибковую λ15-десатуразу. В настоящем документе грибковая Δ12десатураза или грибковая Δ 15-десатураза обозначает Д12-десатуразу или Δ15-десатуразу, полученную из грибкового источника, в том числе оомицетного источника, или ее вариант, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 95% идентична ей. Гены, кодирующие многочисленные десатуразы, выделены из грибковых источников. В US 7211656 раскрыта Δ12-десатураза из Saprolegnia diclina. В WO2009016202 раскрыты грибковые десатуразы из Helobdella robusta, Laccaria bicolor, Lottia gigantea, Microcoleus chthonoplastes, Monosiga brevicollis, Mycosphaerella fijiensis, Mycospaerella graminicola, Naegleria gruben, Nectria haematococca, Nematostella vectensis, Phycomyces blakesleeanus, Trichoderma resii, Physcomitrella patens, Postia placenta, Selaginella moellendorffii и Microdochium nivale. В WO2005/012316 раскрыта Δ12-десатураза из Thalassiosira pseudonana и других грибов. В WO2003/099216 раскрыты гены, кодирующие грибковые Δ12-десатуразы и Δ15-десатуразы, выделенные из Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea и Mortierella alpina. В WO2007133425 раскрыты грибковые Δ15 десатуразы, выделенные из: Saccharomyces kluyveri, Mortierella alpina, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme и Magnaporthe grisea. Предпочтительная Δ12 десатураза выделена из Phytophthora sojae (Ruiz-Lopez et al., 2012).In a preferred embodiment, Δ12 desaturase and / or λ15 desaturase is fungal Δ12 desaturase or fungal λ15 desaturase. In this document, fungal Δ12 desaturase or fungal Δ15 desaturase means D12 desaturase or Δ15 desaturase obtained from a fungal source, including an oomycete source, or a variant thereof, the amino acid sequence of which is at least 95% identical thereto. Genes encoding numerous desaturases have been isolated from fungal sources. US 7211656 discloses a Δ12 desaturase from Saprolegnia diclina. In WO2009016202 discloses fungal desaturases from Helobdella robusta, Laccaria bicolor, Lottia gigantea, Microcoleus chthonoplastes, Monosiga brevicollis, Mycosphaerella fijiensis, Mycospaerella graminicola, Naegleria gruben, Nectria haematococca, Nematostella vectensis, Phycomyces blakesleeanus, Trichoderma resii, Physcomitrella patens, Postia placenta, Selaginella moellendorffii and Microdochium nivale. WO2005 / 012316 discloses a Δ12 desaturase from Thalassiosira pseudonana and other fungi. WO2003 / 099216 discloses genes encoding fungal Δ12 desaturase and Δ15 desaturase isolated from Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea and Mortierella alpina. WO2007133425 discloses fungal Δ15 desaturases isolated from: Saccharomyces kluyveri, Mortierella alpina, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme and Magnaporthe grisea. The preferred Δ12 desaturase has been isolated from Phytophthora sojae (Ruiz-Lopez et al., 2012).

Отличным подклассом грибковых Δ12-десатураз и грибковых Δ15-десатураз являются бифункциональные грибковые Δ12/Δ15-десатуразы. Гены, кодирующие их, клонированы из Fusarium monoliforme (номер доступа DQ272516, Damude et al., 2006), Acanthamoeba castellanii (номер доступа EF017656, Sayanova et al., 2006), Perkinsus marinus (WO2007042510), Claviceps purpurea (номер доступа EF536898, Meesapyodsuk et al., 2007) и Coprinus cinereus (номер доступа AF269266, Zhang et al., 2007).An excellent subclass of fungal Δ12 desaturases and fungal Δ15 desaturases are bifunctional fungal Δ12 / Δ15 desaturases. The genes encoding them were cloned from Fusarium monoliforme (accession number DQ272516, Damude et al., 2006), Acanthamoeba castellanii (accession number EF017656, Sayanova et al., 2006), Perkinsus marinus (WO2007042510), Claviceps purpurea (accession number EF5368 Meesapyodsuk et al., 2007) and Coprinus cinereus (accession number AF269266, Zhang et al., 2007).

В другом варианте реализации ω3-десатураза обладает, по меньшей мере, некоторой активностью, предпочтительно большей активностью, в отношении субстрата ацил-КоА, чем субстрата соответствующего ацил-ФХ. В настоящем документе соответствующий субстрат ацил-ФХ обозначает этерифицированный жирной кислотой в положении sn-2 фосфатидилхолин (ФХ), в котором жирная кислота представляет собой такую же жирную кислоту, как в субстрате ацил-КоА. Например, субстрат ацил-КоА может представлять собой АРК-КоА, и соответствующий субстрат ацил-ФХ представляет собой sn-2 АРК- 30 037184In another embodiment, ω3 desaturase has at least some activity, preferably greater activity, on the acyl-CoA substrate than on the corresponding acyl-PC substrate. As used herein, the corresponding acyl-PC substrate means phosphatidylcholine (PC) esterified with a fatty acid at the sn-2 position, in which the fatty acid is the same fatty acid as in the acyl-CoA substrate. For example, the acyl-CoA substrate may be ARA-CoA, and the corresponding acyl-PC substrate is sn-2 ARK-30 037184

ФХ. В варианте реализации активность, по меньшей мере, двукратно выше. Предпочтительно ω3десатураза обладает, по меньшей мере, некоторой активностью в отношении субстрата ацил-КоА и соответствующего субстрата ацил-ФХ, и обладает активностью в отношении субстратов С18 и С20. Примеры таких ω3-десаmураз известны среди клонированных грибковых десатураз, перечисленных выше.FH. In an embodiment, the activity is at least twice as high. Preferably, ω3 desaturase has at least some activity on the acyl-CoA substrate and the corresponding acyl-PC substrate, and has activity on the C18 and C20 substrates. Examples of such ω3 desaturases are known among the cloned fungal desaturases listed above.

В другом варианте реализации ω3-десатураза содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 6, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 60% идентична SEQ ID NO: 12, предпочтительно по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6.In another embodiment, ω3 desaturase comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence that is at least 60% identical to SEQ ID NO: 12, preferably at least 90% or at least 95% identical to SEQ ID NO: 6.

Еще в одном варианте реализации десатураза для использования в настоящем изобретении обладает более высокой активностью в отношении субстрата ацил-КоА, чем соответствующего субстрата ацилФХ. В другом варианте реализации десатураза для использования в настоящем изобретении обладает более высокой активностью в отношении субстрата ацил-ФХ, чем соответствующего субстрата ацилКоА, но обладает некоторой активностью в отношении обоих субстратов. Как очерчено выше, соответствующий субстрат ацил-ФХ обозначает ^тарифицированный жирной кислотой в положении sn-2 фосфатидилхолин (ФХ), в котором жирная кислота является такой же, как жирная кислота в субстрате ацилКоА. В варианте реализации более высокая активность обозначает, по меньшей мере, двукратно более высокую активность. В варианте реализации десатураза представляет собой Δ5 или Δ6-десатуразу, или ω3-десатуразу, примеры которых раскрыты, без ограничения, в табл. 2. Чтобы протестировать, на какой субстрат действует десатураза, а именно, на субстрат ацил-КоА или ацил-ФХ, могут быть проведены анализы на дрожжевых клетка, как описано в Domergue et al. (2003 и 2005). Кроме того, способность десатуразы действовать на субстрат ацил-КоА может предполагаться, если элонгаза, которая экспрессируется вместе с десатуразой, демонстрирует эффективность ферментного превращения в растительных клетках по меньшей мере около 90%, если элонгаза катализирует элонгацию продукта десатуразы. На этой основе, Δ5-десатураза и λ4-десатуразы, экспрессирующиеся из конструкта GA7 (см. пример 2, фиг. 2 и SEQ ID NO: 1) и их варианты (пример 3) способны к десатурации соответствующих ацил-КоА субстратов, ЭТК-КоА и ДПК-КоА.In yet another embodiment, the desaturase for use in the present invention has a higher activity on the acyl-CoA substrate than the corresponding acyl PC substrate. In another embodiment, the desaturase for use in the present invention has a higher activity on the acyl-PC substrate than the corresponding acylCoA substrate, but has some activity on both substrates. As outlined above, the corresponding substrate acyl-PC is a fatty acid-charged at position sn-2 phosphatidylcholine (PC), in which the fatty acid is the same as the fatty acid in the acylCoA substrate. In an embodiment, higher activity means at least twice the activity. In an embodiment, the desaturase is Δ5 or Δ6 desaturase, or ω3 desaturase, examples of which are disclosed, without limitation, in table. 2. To test which substrate the desaturase acts on, namely acyl-CoA or acyl-PC, yeast cell assays can be performed as described in Domergue et al. (2003 and 2005). In addition, the ability of desaturase to act on the acyl-CoA substrate can be expected if the elongase, which is expressed with desaturase, exhibits an enzymatic conversion efficiency in plant cells of at least about 90% if the elongase catalyzes the elongation of the desaturase product. On this basis, Δ5-desaturase and λ4-desaturase expressed from the GA7 construct (see example 2, FIG. 2 and SEQ ID NO: 1) and their variants (example 3) are capable of desaturation of the corresponding acyl-CoA substrates, ETA- CoA and DPK-CoA.

Элонгазы.Elongazy.

Биохимические доказательства наводят на мысль о том, что элонгация жирной кислоты состоит из 4 стадий: конденсация, восстановление, дегидратация и второе восстановление. В контексте данного изобретения, элонгаза обозначает полипептид, катализирующий стадию конденсации в присутствии других членов комплекса элонгации, в подходящих физиологических условиях. Показано, что гетерологичная или гомологичная экспрессия в клетке только конденсирующего компонента (элонгаза) комплекса элонгации белка требуется для элонгации соответствующей ацильной цепи. Поэтому введенная элонгаза может успешно рекрутировать восстанавливающую и дегидратирующую активность из трансгенного хозяина с целью осуществления успешной элонгации ацила. Считается, что за специфичность реакции элонгации относительно длины цепи и степени десатурации жирнокислотных субстратов отвечает компонент конденсации. Кроме того, считается, что данный компонент является ограничивающим скорость в реакции элонгации.Biochemical evidence suggests that fatty acid elongation has 4 stages: condensation, reduction, dehydration, and second reduction. In the context of the present invention, elongase means a polypeptide that catalyzes the condensation step in the presence of other members of the elongation complex under suitable physiological conditions. It has been shown that heterologous or homologous expression in the cell of only the condensing component (elongase) of the protein elongation complex is required for elongation of the corresponding acyl chain. Therefore, the administered elongase can successfully recruit reducing and dehydrating activity from the transgenic host in order to effect successful acyl elongation. It is believed that the condensation component is responsible for the specificity of the elongation reaction with respect to the chain length and the degree of desaturation of fatty acid substrates. In addition, this component is believed to be the rate limiting component in the elongation reaction.

В настоящем документе Δ5-элонгаза, по меньшей мере, способна превращать ЭПК в ДПК. Примеры Δ5-элонгаз включают раскрытые в WO2005/103253. В одном варианте реализации Δ5-элонгаза обладает активностью в отношении ЭПК с образованием ДПК с эффективностью по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 80 или 90%. В дополнительном варианте реализации последовательность аминокислот Δ5-элонгазы представлена SEQ ID NO: 25, ее биологически активным фрагментом, или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 47% идентичной SEQ ID NO: 25. В дальнейшем варианте реализации Δ6-элонгаза происходит из Ostreococcus taurii или Ostreococcus lucimarinus (US2010/088776).As used herein, the Δ5-elongase is at least capable of converting EPA to DPC. Examples of Δ5 elongases include those disclosed in WO2005 / 103253. In one embodiment, the Δ5-elongase has EPA activity to form DPC with an efficiency of at least 60%, more preferably at least 65%, more preferably at least 70%, or most preferably at least 80 or 90%. In a further embodiment, the amino acid sequence of the Δ5-elongase is represented by SEQ ID NO: 25, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 47% identical to SEQ ID NO: 25. In a further embodiment, the Δ6-elongase is derived from Ostreococcus taurii, or Ostreococcus lucimarinus (US2010 / 088776).

В настоящем документе Δ6-элонгаза, по меньшей мере, способна превращать СДК в ЭТК. Примеры Δ6-элонгаз включают перечисленные в табл. 1. В одном варианте реализации элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 16, ее биологически активный фрагмент (например, фрагмент, раскрытый как SEQ ID NO: 17), или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 55% идентичную одной или обеим из SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17. В варианте реализации Δ6-элонгаза получена из Physcomitrella patens (Zank et al., 2002; номер доступа AF428243) или Thalassiosira pseudonana (Ruiz-Lopez et al., 2012).As used herein, the Δ6-elongase is at least capable of converting SDA to ETC. Examples of Δ6-elongases include those listed in table. 1. In one embodiment, elongase comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 16, a biologically active fragment thereof (eg, a fragment disclosed as SEQ ID NO: 17), or an amino acid sequence at least 55% identical to one or both from SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17. In an embodiment, the Δ6 elongase is obtained from Physcomitrella patens (Zank et al., 2002; accession number AF428243) or Thalassiosira pseudonana (Ruiz-Lopez et al., 2012).

В настоящем документе Δ9-элонгаза, по меньшей мере, способна превращать АЛК в ЭТрК. Примеры Δ9-элонгаз включают приведенные в табл. 1. В одном варианте реализации последовательность аминокислот Δ9-элонгазы представлена SEQ ID NO: 43, ее биологически активным фрагментом, или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO: 43. В другом варианте реализации Δ9-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 31, ее биологически активный фрагмент или последовательности аминокислот, которая по меньшей мереAs used herein, the Δ9-elongase is at least capable of converting ALA to ETrK. Examples of Δ9-elongases include those given in table. 1. In one embodiment, the amino acid sequence of the Δ9-elongase is represented by SEQ ID NO: 43, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 80% identical to SEQ ID NO: 43. In another embodiment, the Δ9-elongase comprises the amino acid sequence represented in SEQ ID NO: 31, a biologically active fragment thereof or an amino acid sequence that is at least

- 31 037184 на 81% идентична SEQ ID NO: 31. В другом варианте реализации Δ9-элонгаза содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 33, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей на мере 50% идентичную SEQ ID NO: 33. В другом варианте реализации последовательность аминокислот Δ9-элонгазы представлена SEQ ID NO: 35, ее биологически активным фрагментом, или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 50% идентичной SEQ ID NO: 35. В дальнейшем варианте реализации Δ9-элонгаза обладает более высокой активностью в отношении ω6 субстрата, чем соответствующего ω3 субстрата, или наоборот.- 31 037184 81% identical to SEQ ID NO: 31. In another embodiment, the Δ9 elongase comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 50% identical to SEQ ID NO : 33. In another embodiment, the amino acid sequence of the Δ9-elongase is represented by SEQ ID NO: 35, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 50% identical to SEQ ID NO: 35. In a further embodiment, the Δ9-elongase has more high activity in relation to the substrate ω6 than the corresponding substrate ω3, or vice versa.

В настоящем документе термин обладает более высокой активностью в отношении субстрата ω6, чем соответствующего субстрата ω3 обозначает относительную активность фермента в отношении субстратов, которая отличается по активности ω3 десатуразы. Предпочтительно субстрат ω6 представляет собой ЛК и субстрат ω3 представляет собой АЛК.As used herein, the term has a higher activity on substrate ω6 than the corresponding substrate ω3 denotes a relative enzyme activity on substrates that differs in ω3 desaturase activity. Preferably, the ω6 substrate is LA and the ω3 substrate is ALA.

Элонгаза с активностью Δ6-элонгазы и Δ9-элонгазы, по меньшей мере, способна (i) превращать СДК в ЭТК и (ii) превращать АЛК в ЭТрК, а также обладает более высокой активностью Δ6-элонгазы, чем активностью Δ9-элонгазы. В одном варианте реализации элонгаза обладает эффективностью превращения СДК с образованием ЭТК, которая составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, и/или эффективностью превращения АЛК с образованием ЭТрК, которая составляет по меньшей мере 6% или более предпочтительно по меньшей мере 9%. В другом варианте реализации элонгаза обладает активностью Δ6-элонгазы по меньшей мере около в 6,5 раз превышающей активность λ9-элонгазы. В дальнейшем варианте реализации элонгаза не обладает обнаружимой активностью Δ5-элонгазы.Elongase with Δ6-elongase and Δ9-elongase activity is at least capable of (i) converting SDC to ETC and (ii) converting ALA to ETRK, and also has a higher Δ6-elongase activity than Δ9-elongase activity. In one embodiment, the elongase has an efficiency for converting SDA to ETC that is at least 50%, more preferably at least 60%, and / or an efficiency for converting ALA to form ETRC that is at least 6% or more preferably at least 9%. In another embodiment, the elongase has a Δ6 elongase activity at least about 6.5 times the λ9 elongase activity. In a further embodiment, elongase has no detectable Δ5-elongase activity.

Другие ферменты.Other enzymes.

Трансгены, введенные в рекомбинантную клетку, такую как микробная клетка, или трансгенное растение или его часть, могут дополнительно кодировать ЛФААТ. В настоящем документе термин 1ацилглицерид-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФКАТ), также называемый ацилтрансферазой лизофосфатидиновой кислоты или ацил-КоА-лизофосфатидат-ацилтрансферазой, обозначает белок, который ацилирует sn-1-ацилглицерид-3-фосфат sn-1 G-3-P в положении sn-2, с образованием фосфатидной кислоты (ФК). Таким образом, термин активность 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазы обозначает ацилирование (sn-1 G-3-P) в положении sn-2, с образованием ФК (ЕС 2.3.1.51). Предпочтительными ЛФКАТ являются такие, которые могут использовать полиненасыщенный С22 ацил-КоА в качестве субстрата, для переноса полиненасыщенной группы ацила С22 в положение sn-2 ЛФК, с образованием ФК. В варианте реализации полиненасыщенный С22 ацил-КоА представляет собой ДПК-КоА. Примеры таких ЛФКАТ приведены в примере 6 и могут быть протестированы, как раскрыто в настоящем документе. В варианте реализации последовательность аминокислот ЛФКАТ, пригодная в соответствии с изобретением, представлена любой из SEQ ID NO: 40-46, ее биологически активным фрагментом или последовательностью аминокислот, по меньшей мере на 40% идентичной любой из SEQ ID NO: 40-46. В другом варианте реализации ЛФААТ не содержит последовательности аминокислот, представленной в любой из SEQ ID NO: 44. В предпочтительном варианте реализации ЛФААТ, пригодная в соответствии с изобретением, которая может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат С22, предпочтительно ДПК-КоА, содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 41, 42 и 44, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 40% идентичную любой одной или более из SEQ ID NO: 41, 42 и 44. В предпочтительном варианте реализации ЛФААТ, пригодная в соответствии с изобретением, которая может использовать полиненасыщенный жирный ацил-КоА субстрат С22, предпочтительно ДПК-КоА, содержит последовательность аминокислот, представленную любой из SEQ ID NO: 41 или 42, ее биологически активный фрагмент или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 40% идентичную любой одной или более из SEQ ID NO: 41 и 42. В варианте реализации изобретения ЛФААТ предпочтительно представляет собой ЛФААТ Mortierella alpina, последовательность аминокислот которой приведена как SEQ ID NO: 44, или другую ЛФААТ, которая способна использовать ДПК-КоА в качестве субстрата для переноса ДПК в ЛПК, с образованием ФК, содержащей ДПК в положении sn-2.Transgenes introduced into a recombinant cell, such as a microbial cell, or a transgenic plant or part thereof, may additionally encode LFAAT. As used herein, the term 1acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LPAT), also called lysophosphatidic acid acyltransferase or acyl-CoA-lysophosphatidate acyltransferase, denotes a protein that sn-acylates sn-1-acylglyceride-1-3-phosphatidate-P position sn-2, with the formation of phosphatidic acid (PA). Thus, the term 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase activity means the acylation of (sn-1 G-3-P) at the sn-2 position to form PK (EC 2.3.1.51). Preferred PPATs are those that can use the polyunsaturated C22 acyl-CoA as a substrate to transfer the polyunsaturated C22 acyl group to the sn-2 position of the PPA to form FA. In an embodiment, the polyunsaturated C22 acyl-CoA is DPA-CoA. Examples of such LFKAT are shown in Example 6 and can be tested as disclosed herein. In an embodiment, the amino acid sequence of LPKAT useful in accordance with the invention is represented by any of SEQ ID NOs: 40-46, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 40% identical to any of SEQ ID NOs: 40-46. In another embodiment, the LPAAT does not contain the amino acid sequence depicted in any of SEQ ID NO: 44. In a preferred embodiment, the LPAAT useful according to the invention, which can use a polyunsaturated fatty acyl-CoA substrate C22, preferably DPA-CoA, contains the sequence amino acids shown in any of SEQ ID NOs: 41, 42 and 44, a biologically active fragment or amino acid sequence thereof, at least 40% identical to any one or more of SEQ ID NOs: 41, 42 and 44. In a preferred embodiment An LPAAT suitable according to the invention, which can use a polyunsaturated fatty acyl-CoA substrate C22, preferably DPA-CoA, contains an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 41 or 42, a biologically active fragment thereof or an amino acid sequence of at least 40% identical to any one or more of SEQ ID NOs: 41 and 42. In an embodiment of the invention tenia LFAAT is preferably the LFAAT Mortierella alpina, the amino acid sequence of which is given as SEQ ID NO: 44, or another LFAAT that is capable of using DPA-CoA as a substrate for transferring DPA into LPA, with the formation of a PK containing DPA at position sn-2 ...

Трансгены, введенные в рекомбинантную клетку, трансгенное растение или его часть могут дополнительно кодировать ДГАТ. В настоящем документе термин диацилглицерид ацилтрансфераза (ЕС 2.3.1.20; ДГАТ), обозначает белок, который переносит жирную группу ацила из ацил-КоА к диацилглицеридьному субстрату, с образованием триацилглицерида. Поэтому, термин активность диацилглицерид ацилтрансферазы обозначает перенос ацил-КоА к диацилглицериду, с образованием триацилглицерида. Существует три известных вида ДГАТ, обозначенных как ДГАТ1, ДГАТ2 и ДГАТ3 соответственно. Полипептиды ДГАТ1 обычно содержат 10 трансмембранных доменов, ДГАТ2 обычно содержат 2 трансмембранных домена, тогда как ДГАТ3 обычно является растворимым. Примеры полипептидов ДГАТ1 включают полипептиды, кодируемые генами ДГАТ1 из Aspergillus fumigatus (номер доступа ХР_755172), Arabidopsis thaliana (CAB44774), Ricinus communis (AAR11479), Vernicia fordii (ABC94472), Vernonia galamensis (ABV21945, ABV21946), Euonymus alatus (AAV31083), Caenorhabditis elegans (AAF82410), Rattus norvegicus (NP_445889), Homo sapiens (NP_036211), а также их варианты и/или муTransgenes introduced into a recombinant cell, transgenic plant, or part of it can additionally encode DHAT. As used herein, the term diacylglyceride acyltransferase (EC 2.3.1.20; DHAT) means a protein that transfers a fatty acyl group from acyl-CoA to a diacylglyceride substrate to form triacylglyceride. Therefore, the term diacylglyceride acyltransferase activity refers to the transfer of acyl-CoA to diacylglyceride to form triacylglyceride. There are three known types of DGAT, designated DGAT1, DGAT2 and DGAT3, respectively. DHAT1 polypeptides usually contain 10 transmembrane domains, DHAT2 usually contain 2 transmembrane domains, while DHAT3 is usually soluble. Examples of DHAT1 polypeptides include those encoded by the DHAT1 genes from Aspergillus fumigatus (accession number XP_755172), Arabidopsis thaliana (CAB44774), Ricinus communis (AAR11479), Vernicia fordii (ABC94472), Vernonia galonym2. Caenorhabditis elegans (AAF82410), Rattus norvegicus (NP_445889), Homo sapiens (NP_036211), as well as their variants and / or mu

- 32 037184 танты. Примеры полипептидов ДГ АТ2 включают полипептиды, кодируемые генами ДГ АТ2 из Arabidopsis thaliana (номер доступа NP_566952), Ricinus communis (AAY16324), Vernicia fordii (ABC94474), Mortierella ramanniana (AAK84179), Homo sapiens (Q96PD7, Q58HT5), Bos taurus (Q70VD8), Mus musculus (AAK84175), Micromonas CCMP1545, а также их варианты и/или мутанты. Примеры полипептидов ДГАТ3 включают полипептиды, кодируемые генами ДГАТ3 из арахиса (Arachis hypogaea, Saha, et al., 2006), а также их варианты и/или мутанты.- 32 037184 tants. Examples of DG AT2 polypeptides include those encoded by DG AT2 genes from Arabidopsis thaliana (accession number NP_566952), Ricinus communis (AAY16324), Vernicia fordii (ABC94474), Mortierella ramanniana (AAK84179), Homo sapiens, Q96Turus taurus ), Mus musculus (AAK84175), Micromonas CCMP1545, as well as their variants and / or mutants. Examples of DGAT3 polypeptides include those encoded by the DGAT3 genes from peanuts (Arachis hypogaea, Saha, et al., 2006), as well as variants and / or mutants thereof.

Полипептиды/пептиды.Polypeptides / peptides.

Термины полипептид и белок в общем используются равнозначно.The terms polypeptide and protein are generally used interchangeably.

Полипептид или класс полипептидов может быть определен по степени идентичности (% идентичности) его последовательности аминокислот референтной последовательности аминокислот, или по большему % идентичности одной референтной последовательности аминокислот, чем другой. % идентичности полипептида референтной последовательность аминокислот обычно определяется анализом GAP (Needleman и Wunsch, 1970; программа GCG) с параметрами штраф на открытие промежутка = 5, и штрафом на продление промежутка = 0,3. Длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 15 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 15 аминокислот. Более предпочтительно длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 50 аминокислот и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 50 аминокислот. Более предпочтительно длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 100 аминокислот и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 100 аминокислот. Даже более предпочтительно длина последовательности запроса составляет по меньшей мере 250 аминокислот и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка длиной по меньшей мере 250 аминокислот. Даже более предпочтительно анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении их полной длины. Полипептид или класс полипептидов может обладать такой же ферментной активностью или иной активностью или не обладать активностью референтного полипептида. Предпочтительно полипептид обладает ферментной активностью по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75 или по меньшей мере 90% от активности референтного полипептида.A polypeptide or class of polypeptides can be determined by the degree of identity (% identity) of its amino acid sequence to a reference amino acid sequence, or by a greater% identity of one reference amino acid sequence than another. The% polypeptide identity to the reference amino acid sequence is usually determined by GAP analysis (Needleman and Wunsch, 1970; GCG program) with gap opening penalty = 5 and gap extension penalty = 0.3. The query sequence is at least 15 amino acids in length, and the GAP analysis aligns the two sequences over a stretch of at least 15 amino acids. More preferably, the query sequence is at least 50 amino acids in length and the GAP analysis aligns the two sequences over a stretch of at least 50 amino acids. More preferably, the query sequence is at least 100 amino acids in length and the GAP analysis aligns the two sequences over a stretch of at least 100 amino acids. Even more preferably, the query sequence is at least 250 amino acids in length and the GAP analysis aligns the two sequences over a stretch of at least 250 amino acids. Even more preferably, the GAP analysis aligns the two sequences over their full length. A polypeptide or class of polypeptides may have the same enzymatic activity or a different activity, or may not have the activity of the reference polypeptide. Preferably, the polypeptide has an enzymatic activity of at least 10, at least 50, at least 75, or at least 90% of the activity of the reference polypeptide.

Биологически активный фрагмент представляет собой часть полипептида, определенного в настоящем документе, которая сохраняет определенную активность полноразмерного референтного полипептида, например, обладающую активностью десатуразы и/или элонгазы или другой ферментной активностью. Биологически активные фрагменты в настоящем документе исключают полноразмерный полипептид. Биологически активные фрагменты могут быть частью любого размера до тех пор, пока они сохраняют определенную активность. Предпочтительно биологически активный фрагмент сохраняет по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75 или по меньшей мере 90% активности полноразмерного белка.A biologically active fragment is a portion of a polypeptide as defined herein that retains the defined activity of a full-length reference polypeptide, for example, having desaturase and / or elongase activity or other enzymatic activity. Biologically active fragments herein exclude a full-length polypeptide. Biologically active fragments can be part of any size as long as they retain a certain activity. Preferably, the biologically active fragment retains at least 10, at least 50, at least 75, or at least 90% of the activity of the full-length protein.

Относительно определенного полипептида или фермента, необходимо понимать, что % идентичности, превышающий раскрытые в настоящем документе, включает предпочтительные варианты. Таким образом, если это уместно, в свете минимума % идентичности предпочтительно, чтобы полипептид/фермент содержал последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 60, более предпочтительно по меньшей мере на 65, более предпочтительно по меньшей мере на 70, более предпочтительно по меньшей мере на 75, более предпочтительно по меньшей мере на 76, более предпочтительно по меньшей мере на 80, более предпочтительно по меньшей мере на 85, более предпочтительно по меньшей мере на 90, более предпочтительно по меньшей мере на 91, более предпочтительно по меньшей мере на 92, более предпочтительно по меньшей мере на 93, более предпочтительно по меньшей мере на 94, более предпочтительно по меньшей мере на 95, более предпочтительно по меньшей мере на 96, более предпочтительно по меньшей мере на 97, более предпочтительно по меньшей мере на 98, более предпочтительно по меньшей мере на 99, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8 и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична указанной в связи с ней SEQ ID NO.With respect to a particular polypeptide or enzyme, it should be understood that% identity greater than those disclosed herein includes preferred variants. Thus, if appropriate, in light of the minimum% identity, it is preferred that the polypeptide / enzyme contains an amino acid sequence that is at least 60, more preferably at least 65, more preferably at least 70, more preferably at least 75, more preferably at least 76, more preferably at least 80, more preferably at least 85, more preferably at least 90, more preferably at least 91, more preferably at least 92 , more preferably at least 93, more preferably at least 94, more preferably at least 95, more preferably at least 96, more preferably at least 97, more preferably at least 98, more preferably at least 99, more preferably at least 99.1, more preferably at least 99.2, more n preferably at least 99.3, more preferably at least 99.4, more preferably at least 99.5, more preferably at least 99.6, more preferably at least 99.7, more preferably at least 99.8% and even more preferably at least 99.9% identical to SEQ ID NO.

Варианты/мутанты аминокислотной последовательности полипептидов, раскрытых в настоящем документе, могут быть получены посредством введения подходящих модификаций нуклеотидов в нуклеиновую кислоту, раскрытую в настоящем документе, или синтеза целевого полипептида in vitro. Такие варианты/мутанты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков в пределах последовательности аминокислот. Комбинация делеции, вставки и замены может быть осуществлена таким образом, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечный пептидный продукт обладает желательной ферментной активностью.Amino acid sequence variants / mutants of the polypeptides disclosed herein can be prepared by introducing suitable nucleotide modifications into the nucleic acid disclosed herein or by in vitro synthesis of the target polypeptide. Such variants / mutants include, for example, deletions, insertions or substitutions of residues within the amino acid sequence. The combination of deletion, insertion and substitution can be carried out in such a way as to obtain the final construct, provided that the final peptide product has the desired enzymatic activity.

Мутантные (модифицированные) пептиды могут быть получены с применением любой техники, известной из уровня техники. Например, полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, может быть обработан методами мутагенеза in vitro или тасования ДНК, как подробно описано Harayama (1998).Mutant (modified) peptides can be obtained using any technique known in the art. For example, a polynucleotide disclosed herein can be processed by in vitro mutagenesis or DNA shuffling techniques, as detailed by Harayama (1998).

- 33 037184- 33 037184

Скрининг продуктов, получаемых из видоизмененной/модифицированной ДНК, может быть с легкостью проведен с применением способов, раскрытых в настоящем документе, для определения того, обладают ли они, например, десатуразной или элонгазной активностью.Screening of products derived from altered / modified DNA can be easily performed using the methods disclosed herein to determine whether they have, for example, desaturase or elongase activity.

При конструировании мутантов последовательности аминокислот, местоположение сайта мутации и природа мутации будут зависеть от характеристики(ик), которую модифицируют. Сайты для мутации могут быть модифицированы индивидуально или посерийно, например, посредством: (1) замены вначале выбранных консервативных аминокислот, а затем более радикальных замен, в зависимости от достигнутых результатов, (2) удаления остатка-мишени или (3) вставки других остатков, смежных с размещенным сайтом.When constructing amino acid sequence mutants, the location of the mutation site and the nature of the mutation will depend on the characteristic (IC) that is being modified. The sites for mutation can be modified individually or serially, for example, by: (1) replacing initially selected conservative amino acids, and then more radical substitutions, depending on the results achieved, (2) removing the target residue, or (3) inserting other residues, adjacent to the hosted site.

Делеции в аминокислотной последовательности в общем варьируют от около 1 до 15 остатков, более предпочтительно от около 1 до 10 остатков и обычно около от 1 до 5 смежных остатков.Deletions in the amino acid sequence generally range from about 1 to 15 residues, more preferably from about 1 to 10 residues, and usually from about 1 to 5 contiguous residues.

В мутантах замены удален по меньшей мере один остаток аминокислоты в молекуле полипептида, и другой остаток вставлен на его место. Наиболее интересные положения для мутагенеза посредством замены включают сайты, которые не являются консервативными в природных десатуразах или элонгазах. Эти сайты предпочтительно заменяются относительно консервативным образом для того, чтобы сохранить активность фермента. Такие консервативные замены проиллюстрированы в табл. 3 под заголовком примеры замен.In substitution mutants, at least one amino acid residue in the polypeptide molecule has been removed and another residue inserted in its place. The most interesting positions for mutagenesis by substitution include sites that are not conserved in natural desaturases or elongases. These sites are preferably replaced in a relatively conservative manner in order to maintain enzyme activity. Such conservative substitutions are illustrated in table. 3 under the heading examples of substitutions.

В предпочтительном варианте мутантный/вариантный полипептид содержит только или не более чем один или два или три или четыре консервативные модификации аминокислоты, по сравнению с природным полипептидом. Подробности консервативных модификаций аминокислот приведены в табл. 3. Как будет понятно квалифицированному специалисту, такие незначительные модификации могут в разумных пределах быть спрогнозированы как не влияющие на активность полипептида, при экспрессии в рекомбинантной клетке.In a preferred embodiment, the mutant / variant polypeptide contains only or no more than one or two or three or four conservative amino acid modifications as compared to the naturally occurring polypeptide. Details of conservative amino acid modifications are given in table. 3. As will be understood by the skilled artisan, such minor modifications can reasonably be predicted as not affecting the activity of the polypeptide when expressed in a recombinant cell.

Таблица 3Table 3

Примеры замен аминокислотExamples of amino acid substitutions

Исходный остаток Original residue Примеры замен Examples of substitutions Ala (А) Ala (A) val; leu; ile; gly val; leu; ile; gly Arg(R) Arg (R) lys lys Asn(N) Asn (N) gin; his gin; his Asp (D) Asp (D) glu glu Cys (С) Cys (C) ser ser Gln(Q) Gln (Q) asn; his asn; his Glu (E) Glu (E) asp asp Gly(G) Gly (G) pto, ala pto, ala His (H) His (H) asn; gin asn; gin Пе (I) Pe (I) leu; val; ala leu; val; ala Leu (L) Leu (L) ile; val; met; ala; phe ile; val; met; ala; phe Lys(K) Lys (K) arg arg Met (M) Met (M) leu; phe leu; phe Phe (F) Phe (F) leu; val; ala leu; val; ala Pro (P) Pro (P) gly gly Ser(S) Ser (S) thr thr Thr(T) Thr (T) ser ser Tip(W) Tip (W) tyr tyr Tyr(Y) Tyr (Y) trp; phe trp; phe Val (V) Val (V) ile; leu; met; phe; ala ile; leu; met; phe; ala

Полинуклеотиды.Polynucleotides.

Кроме того, в изобретении предлагается применение полинуклеотидов, которые могут представлять собой, например, ген, выделенный полинуклеотид, химерную генетическую конструкцию, такую как молекула Т-ДНК или химерная ДНК. Это может быть ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, двухцепочечная или одноцепочечная, а также комбинированная с углеводом, липидами, белком или другими материалами для осуществления конкретной активности, раскрытой в настоящем документе. Термин полинуклеотид используется в настоящем документе равнозначно с термином молекула нуклеиновой кислоты.In addition, the invention provides the use of polynucleotides, which can be, for example, a gene, an isolated polynucleotide, a chimeric genetic construct such as a T-DNA molecule or a chimeric DNA. It can be DNA or RNA of genomic or synthetic origin, double-stranded or single-stranded, as well as combined with carbohydrate, lipids, protein or other materials to carry out the specific activity disclosed herein. The term polynucleotide is used herein interchangeably with the term nucleic acid molecule.

В варианте реализации полинуклеотид является неприродным. Примеры неприродных полинуклеотидов включают, но не ограничиваясь этим, мутировавшие (например, с применением способов, описанных в данном описании), и полинуклеотиды, в которых открытая рамка считывания, кодирующая белок,In an embodiment, the polynucleotide is unnatural. Examples of unnatural polynucleotides include, but are not limited to, mutated (e.g., using the methods described herein) and polynucleotides in which an open reading frame encoding a protein

- 34 037184 функционально связана с промотором, с которым она не связана в природе (как, например, в конструкциях, описанных в данном описании).- 34 037184 is operably linked to a promoter to which it is not naturally associated (such as in the constructs described herein).

В настоящем документе термин ген используется в самом широком контексте и включает дезоксирибонуклеотидные последовательности, содержащие транскрибированный участок и, в случае трансляции, участок кодирования белка структурного гена, включая последовательности, размещенные смежно с кодирующим участком на 5'- и 3'-концах на расстоянии по меньшей мере около 2000 пар оснований на любом конце, которые принимают участие в экспрессии гена. В этом отношении, ген содержит контрольные сигналы, например промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые в природе ассоциированы с данным геном, или гетерологичные контрольные сигналы, и в этом случае ген носит название химерного гена. Последовательности, которые размещены на 5'-конце кодирующего белок участка, и которые присутствуют на мРНК, обозначаются как 5' нетранслируемые последовательности. Последовательности, которые размещены на 3'-конце или ниже по отношению к кодирующему белок участку, и которые присутствуют на мРНК, обозначаются как 3' нетранслируемые последовательности. Термин ген включает кДНК и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующий участок, который может прерываться некодирующими последовательностями под названием интроны или промежуточные участки или промежуточные последовательности. Интроны представляют собой сегменты гена, которые транскрибированы в ядерную РНК (гетерогенную ядерную РНК, гяРНК). Интроны могут содержать регуляторные элементы, например энхансеры. Интроны удаляют или сращивают с ядерным или первичным транскриптом; таким образом, интроны отсутствуют в транскрипте матричной РНК (мРНК). Функция мРНК в ходе трансляции состоит в конкретизации последовательности или порядка аминокислот в возникающем полипептиде. Термин ген включает синтетическую или слитую молекулу, кодирующую все или часть белков, раскрытых в настоящем документе, и комплементарную нуклеотидную последовательность к любому из упомянутого выше.In this document, the term gene is used in the broadest context and includes deoxyribonucleotide sequences containing a transcribed region and, in the case of translation, a protein coding region of a structural gene, including sequences located adjacent to the coding region at the 5 'and 3' ends at a distance of at least about 2000 base pairs at either end that are involved in gene expression. In this regard, a gene contains control signals, for example promoters, enhancers, termination and / or polyadenylation signals, which are naturally associated with a given gene, or heterologous control signals, in which case the gene is called a chimeric gene. Sequences that are located at the 5 'end of the protein coding region and that are present on the mRNA are referred to as 5' untranslated sequences. Sequences that are located 3 'or downstream of the protein coding region and that are present on the mRNA are referred to as 3' untranslated sequences. The term gene includes cDNA and genomic forms of a gene. The genomic form or clone of a gene contains a coding region that can be interrupted by non-coding sequences called introns or intermediate regions or intermediate sequences. Introns are segments of a gene that are transcribed into nuclear RNA (heterogeneous nuclear RNA, hnRNA). Introns can contain regulatory elements such as enhancers. Introns are removed or spliced into a nuclear or primary transcript; thus, introns are absent in the messenger RNA (mRNA) transcript. The function of mRNA during translation is to specify the sequence or order of amino acids in the nascent polypeptide. The term “gene” includes a synthetic or fusion molecule encoding all or part of the proteins disclosed herein and a complementary nucleotide sequence to any of the above.

В настоящем документе химерная ДНК или химерная генетическая конструкция или подобное выражение обозначает любую молекулу ДНК, которая не является природной молекулой ДНК в ее природном местоположении, также обозначаемую в настоящем документе как конструкция ДНК. Обычно химерная ДНК или химерный ген содержит регуляторную и транскрибируемую или кодирующую белок последовательности, которые не найдены функционально связанными друг с другом в природе, т.е. которые гетерологичны по отношению друг к другу. Соответственно химерная ДНК или химерный ген могут содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из одного источника, но организованные отличным образом от найденных в природе.As used herein, chimeric DNA or chimeric genetic construct or similar expression means any DNA molecule that is not a naturally occurring DNA molecule in its natural location, also referred to herein as a DNA construct. Typically, a chimeric DNA or chimeric gene contains regulatory and transcribed or protein-coding sequences that are not found to be operably linked to each other in nature, i. E. which are heterologous in relation to each other. Accordingly, a chimeric DNA or chimeric gene may contain regulatory sequences and coding sequences that are derived from different sources, or regulatory sequences and coding sequences that are derived from a single source, but organized differently from those found in nature.

Эндогенный ген обозначает природный ген в его естественном положении в геноме организма. В настоящем документе молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, рекомбинантный полинуклеотид или их вариации обозначают молекулу нуклеиновой кислоты, которая конструируется или модифицируется с помощью технологии рекомбинантной ДНК, Термины чужеродный полинуклеотид или экзогенный полинуклеотид или гетерологичный полинуклеотид и подобные обозначают любую нуклеиновую кислоту, которая введена в геном клетки с помощью экспериментальных манипуляций. Чужеродные или экзогенные гены могут представлять собой гены, вставленные в неприродный организм, природные гены, которые введены в новое местоположение в пределах природного хозяина, или химерные гены. Трансген представляет собой ген, который введен в геном процедурой трансформации. Термины генетически модифицированный, трансгенный и их вариации включают введение генов в клетки посредством трансформации или трансдукции, мутацию генов в клетках и модификацию или модулирование регуляции гена в клетке или организмах, с которыми осуществлялись указанные действия, или их потомстве. Геномный участок в настоящем документе обозначает положение в пределах генома, в котором трансген или группа трансгенов (также обозначенная в настоящем документе как кластер) вставлены в клетку или ее предка. Такие участки включают только нуклеотиды, которые введены путем вмешательства человека, например, способами, раскрытыми в настоящем документе.Endogenous gene refers to a naturally occurring gene in its natural position in the genome of an organism. As used herein, a recombinant nucleic acid molecule, a recombinant polynucleotide or variations thereof means a nucleic acid molecule that is constructed or modified using recombinant DNA technology, The terms foreign polynucleotide or exogenous polynucleotide or heterologous polynucleotide and the like mean any nucleic acid introduced into a cell using experimental manipulations. Foreign or exogenous genes can be genes inserted into a non-natural organism, natural genes that are introduced at a new location within a natural host, or chimeric genes. A transgene is a gene that has been introduced into the genome by a transformation procedure. The terms genetically modified, transgenic and their variations include the introduction of genes into cells by transformation or transduction, mutation of genes in cells and modification or modulation of gene regulation in the cell or organisms with which these actions were performed, or their progeny. A genomic region herein refers to a position within a genome at which a transgene or group of transgenes (also referred to herein as a cluster) is inserted into a cell or its ancestor. Such regions include only nucleotides that are introduced by human intervention, for example, by the methods disclosed herein.

Термин экзогенный в контексте полинуклеотида обозначает полинуклеотид, присутствующий в клетке в измененном количестве, по сравнению с его природным состоянием. В одном варианте реализации клетка представляет собой клетку, которая в природе не содержат полинуклеотида. Однако клетка может быть клеткой, которая содержит неэндогенный полинуклеотид, что приводит к изменению уровня выработки кодируемого полипептида. Экзогенный полинуклеотид включает полинуклеотиды, которые не отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки или неклеточной системы экспрессии, в которой он присутствует, и полинуклеотиды, продуцированные в таких клетках или неклеточных системах, которые впоследствии были очищены, по меньшей мере, от некоторых других компонентов. Экзогенный полинуклеотид (нуклеиновая кислота) может представлять собой непрерывную цепь нуклеотидов, существующую в природе, или содержать два или более смежных нуклеотидных участков из различных источников (природных и/или синтетических), соединенных таким образом, чтобы образовать единый полинуклеотид. Обычно такие химерные полинуклеотиды содержат, по меньшей мере, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, функционально связанный с промотором, подхо- 35 037184 дящим для управления транскрипцией открытой рамки считывания в целевой клетке.The term exogenous in the context of a polynucleotide means a polynucleotide present in a cell in an altered amount from its natural state. In one embodiment, the cell is a cell that does not naturally contain a polynucleotide. However, the cell can be a cell that contains a non-endogenous polynucleotide, which results in a change in the level of production of the encoded polypeptide. An exogenous polynucleotide includes polynucleotides that are not separated from other components of a transgenic (recombinant) cell or noncellular expression system in which it is present, and polynucleotides produced in such cells or noncellular systems that have subsequently been purified from at least some other components ... An exogenous polynucleotide (nucleic acid) can be a contiguous chain of nucleotides found in nature, or contain two or more contiguous nucleotide regions from different sources (natural and / or synthetic), connected in such a way as to form a single polynucleotide. Typically, such chimeric polynucleotides contain at least an open reading frame encoding a polypeptide operably linked to a promoter suitable for directing transcription of the open reading frame in a target cell.

Относительно раскрытых полинуклеотидов, необходимо понимать, что более высокий % идентичности, чем раскрытые выше, будет включать предпочтительные варианты. Таким образом, если это уместно, в свете минимального % идентичности полинуклеотид предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60, более предпочтительно по меньшей мере на 65, более предпочтительно по меньшей мере на 70, более предпочтительно по меньшей мере на 75, более предпочтительно по меньшей мере на 80, более предпочтительно по меньшей мере на 85, более предпочтительно по меньшей мере на 90, более предпочтительно по меньшей мере на 91, более предпочтительно по меньшей мере на 92, более предпочтительно по меньшей мере на 93, более предпочтительно по меньшей мере на 94, более предпочтительно по меньшей мере на 95, более предпочтительно по меньшей мере на 96, более предпочтительно по меньшей мере на 97, более предпочтительно по меньшей мере на 98, более предпочтительно по меньшей мере на 99, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8 и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична соответствующей указанной SEQ ID NO.With respect to the disclosed polynucleotides, it should be understood that higher% identity than those disclosed above will include preferred variants. Thus, if appropriate, in light of the minimum% identity, the polynucleotide preferably contains a polynucleotide sequence that is at least 60, more preferably at least 65, more preferably at least 70, more preferably at least 75, more preferably at least 80, more preferably at least 85, more preferably at least 90, more preferably at least 91, more preferably at least 92, more preferably at least 93, more preferably at at least 94, more preferably at least 95, more preferably at least 96, more preferably at least 97, more preferably at least 98, more preferably at least 99, more preferably at least by 99.1, more preferably at least 99.2, more preferably at least 99.3, more preferably at least 99.4, more preferably at least 99.5, more preferably at least 99.6, more preferably at least 99.7, more preferably at least 99.8 and even more preferably at least 99.9% identical to the corresponding SEQ ID NO.

Полинуклеотиды могут содержать, по сравнению с встречающимися в природе молекулами, одну или больше мутаций, которые представляют собой делеции, вставки или замены нуклеотидных остатков. Полинуклеотиды, которые содержат мутации относительно референтной последовательности, могут быть природными (т.е. выделенными из природного источника) или синтетическими (например, полученными в результате сайт-направленного мутагенеза или тасования ДНК из нуклеиновой кислоты, как раскрыто выше). Таким образом, очевидно, что полинуклеотиды могут быть получены из природного источника или могут быть рекомбинантными. Предпочтительными полинуклеотидами являются содержащие кодирующие участки, которые кодон-оптимизированы для трансляции в клетках растения, как известно из уровня техники.Polynucleotides may contain, as compared to naturally occurring molecules, one or more mutations, which are deletions, insertions or substitutions of nucleotide residues. Polynucleotides that contain mutations relative to the reference sequence can be natural (i.e., isolated from a natural source) or synthetic (e.g., obtained by site-directed mutagenesis or DNA shuffling from a nucleic acid, as disclosed above). Thus, it is obvious that the polynucleotides can be obtained from a natural source or can be recombinant. Preferred polynucleotides are those containing coding regions that are codon-optimized for translation in plant cells, as is known in the art.

Рекомбинантные векторы.Recombinant vectors.

Рекомбинантная экспрессия может применяться для получения рекомбинантных клеток или растений или частей растения по изобретению. Рекомбинантные векторы содержат гетерологичные полинуклеотидные последовательности, т.е. полинуклеотидные последовательности, которые в природе не найдены смежными с молекулами полинуклеотида, раскрытыми в настоящем документе, которые предпочтительно получены из других видов, нежели те из которых получена(ы) молекула(ы) полинуклеотида. Вектор может представлять собой РНК или ДНК, и обычно является плазмидой. Плазмидные векторы обычно содержат дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, которые обеспечивают простоту селекции, амплификации и трансформации кассеты экспрессии в прокариотных клетках, например, полученные из pUC векторы, полученные из pSK векторы, полученные из pGEM векторы, полученные из pSP векторы, полученные из pBS векторы, или предпочтительно бинарные векторы, содержащие один или более участков Т-ДНК. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот включают источники репликации для обеспечения автономной репликации вектора, гены селекционных маркеров, предпочтительно кодирующие резистентность к антибиотику или гербициду, уникальные множественные сайты клонирования, обеспечивающие множественные сайты вставки последовательностей нуклеиновых кислот или генов, кодируемых в конструкции нуклеиновой кислоты, и последовательности, которые повышают активность трансформации прокариотных и эукариотных (особенно растительных) клеток. Рекомбинантный вектор может содержать более чем один полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, например три, четыре, пять или шесть полинуклеотидов, раскрытых в настоящем документе, в комбинации предпочтительно химерную генетическую конструкцию, описанную в данном описании, в которой каждый полинуклеотид функционально связан с последовательностями контроля экспрессии, которые активны в целевой клетке. Предпочтительно контроль экспрессии последовательностей включает или представляет собой все из гетерологичных промоторов, т.е. гетерологичных в отношении кодирующих участков, которые они контролируют. Более чем один полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, например 3, 4, 5 или 6 полинуклеотидов, предпочтительно 7 или 8 полинуклеотидов, каждый из которых кодирует другой полипептид, предпочтительно ковалентно соединены в едином рекомбинантном векторе, предпочтительно в пределах единой молекулы Т-ДНК, которая в дальнейшем может быть введена как единая молекула в клетку, с получением рекомбинантной клетки по изобретению, и предпочтительно интегрирована в геном рекомбинантной клетки, например, в трансгенном растении. Интеграция в геном может осуществляться в ядерном геноме или в пластидном геноме трансгенного растения. Таким образом, полинуклеотиды, соединенные таким способом, будут унаследованы вместе как единый генетический локус у потомка рекомбинантной клетки или растения. Рекомбинантный вектор или растение может содержать два или более таких рекомбинантных векторов, каждый из которых содержит несколько полинуклеотидов, например каждый рекомбинантный вектор содержит 3, 4, 5 или 6 полинуклеотидов.Recombinant expression can be used to produce recombinant cells or plants or plant parts of the invention. Recombinant vectors contain heterologous polynucleotide sequences, i.e. polynucleotide sequences that are not naturally found contiguous to the polynucleotide molecules disclosed herein, which are preferably derived from species other than those from which the polynucleotide molecule (s) are derived. The vector can be RNA or DNA, and is usually a plasmid. Plasmid vectors usually contain additional nucleic acid sequences that allow for ease of selection, amplification and transformation of an expression cassette in prokaryotic cells, for example, pUC-derived vectors, pSK-derived vectors, pGEM-derived vectors, pSP-derived vectors, pBS-derived vectors, or preferably binary vectors containing one or more T-DNA regions. Additional nucleic acid sequences include sources of replication to allow autonomous replication of the vector, breeding marker genes preferably encoding antibiotic or herbicide resistance, unique multiple cloning sites providing multiple insertion sites for nucleic acid sequences or genes encoded in a nucleic acid construct, and sequences that increase the activity of transformation of prokaryotic and eukaryotic (especially plant) cells. A recombinant vector may contain more than one polynucleotide disclosed herein, such as three, four, five, or six polynucleotides disclosed herein, in combination, preferably a chimeric genetic construct described herein, wherein each polynucleotide is operably linked to control sequences expressions that are active in the target cell. Preferably, the expression control of the sequences includes or is all of the heterologous promoters, i. E. heterologous with respect to the coding regions that they control. More than one polynucleotide disclosed herein, for example 3, 4, 5 or 6 polynucleotides, preferably 7 or 8 polynucleotides, each of which encodes a different polypeptide, preferably covalently linked in a single recombinant vector, preferably within a single T-DNA molecule, which can then be introduced as a single molecule into the cell to obtain a recombinant cell according to the invention, and is preferably integrated into the genome of the recombinant cell, for example, in a transgenic plant. Integration into the genome can be carried out in the nuclear genome or in the plastid genome of a transgenic plant. Thus, polynucleotides linked in this way will be inherited together as a single genetic locus in the offspring of the recombinant cell or plant. A recombinant vector or plant may contain two or more such recombinant vectors, each of which contains several polynucleotides, for example, each recombinant vector contains 3, 4, 5, or 6 polynucleotides.

Функционально связанный в настоящем документе обозначает функциональное взаимоотношениеFunctionally linked in this document denotes a functional relationship

- 36 037184 между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Обычно это обозначает функциональное взаимоотношение транскрипционального регуляторного элемента (промотора) и транскрибируемой последовательности. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке. В общем, транскрипциональные регуляторные элементы промотора, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются cis-действующими. Однако для некоторых транскрипциональных регуляторных элементов, таких как энхансеры, нет необходимости быть физически смежными или расположенными в непосредственной близости от кодирующих последовательностей, транскрипцию которых они увеличивают.- 36 037184 between two or more segments of nucleic acid (eg DNA). This usually means a functional relationship between a transcriptional regulatory element (promoter) and a transcribed sequence. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence, such as a polynucleotide disclosed herein, if it stimulates or modulates the transcription of the coding sequence in a suitable cell. In general, transcriptional promoter regulatory elements that are operably linked to the transcribed sequence are physically adjacent to the transcribed sequence, i. E. they are cis-operable. However, some transcriptional regulatory elements, such as enhancers, do not need to be physically contiguous or located in close proximity to the coding sequences for which they increase transcription.

Если присутствуют несколько промоторов, каждый промотор независимо может быть таким же или отличным. Предпочтительно по меньшей мере 3 и максимум до 6 различных промоторных последовательностей применяются в рекомбинантном векторе, чтобы управлять экспрессией экзогенных полинуклеотидов.If multiple promoters are present, each promoter can independently be the same or different. Preferably, at least 3 and up to a maximum of 6 different promoter sequences are used in the recombinant vector to direct the expression of exogenous polynucleotides.

Кроме того, рекомбинантные молекулы, например химерные ДНК или генетические конструкции, могут содержать: (а) один или более секреторных сигналов, кодирующих сигнальные пептидные последовательности, чтобы позволить экспрессируемому полипептиду, раскрытому в настоящем документе, секретироваться из клетки, которая вырабатывает полипептид, или которая обеспечивает локализацию экспрессируемого полипептида, например, для удержания полипептида в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) клетки или переноса в пластиду, и/или (б) слитые последовательности, которые приводят к экспрессии молекул нуклеиновых кислот как слитых белков. Примеры подходящих сигнальных сегментов включают любой сигнальный сегмент, способный направлять секрецию или локализацию полипептида, раскрытого в настоящем документе. Дополнительно, рекомбинантные молекулы могут содержать промежуточные и/или нетранслируемые последовательности, вокруг и/или в пределах последовательностей нуклеиновых кислот молекул нуклеиновых кислот, раскрытых в настоящем документе.In addition, recombinant molecules, such as chimeric DNA or genetic constructs, may contain: (a) one or more secretory signals encoding signal peptide sequences to allow an expressed polypeptide disclosed herein to be secreted from a cell that produces the polypeptide, or that provides localization of the expressed polypeptide, for example, for retention of the polypeptide in the endoplasmic reticulum (ER) of the cell or transfer to the plastid, and / or (b) fusion sequences that result in the expression of nucleic acid molecules as fusion proteins. Examples of suitable signal segments include any signal segment capable of directing the secretion or localization of a polypeptide disclosed herein. Additionally, recombinant molecules can contain intermediate and / or untranslated sequences around and / or within the nucleic acid sequences of the nucleic acid molecules disclosed herein.

Чтобы упростить идентификацию трансформантов, желательно, чтобы конструкция нуклеиновой кислоты содержала ген селекционного или скринингового маркера как, или в дополнение к чужеродному или экзогенному полинуклеотиду. Ген маркера обозначает ген, который придает отличный фенотип клеткам, экспрессирующим ген маркера, таким образом, что трансформированные клетки отличаются от клеток, не содержащих маркера. Ген селекционного маркера предоставляет признак, по которому можно осуществлять селекцию на основании резистентности к селекционному агенту (например, гербицид, антибиотик, излучение, тепло или другой вид обработки, повреждающий нетрансформированные клетки). Ген пригодного для скрининга маркера (или репортерный ген) обеспечивает признак, по которому можно идентифицировать, посредством наблюдения или тестирования, например посредством скрининга (например, активность β-глюкуронидазы, люциферазы, зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ) или другого фермента, отсутствующую в нетрансформированных клетках). Ген маркера и целевая нуклеотидная последовательность не должны быть связаны. Фактически выбор маркера не является критическим, до тех пор, пока он функционален (т.е. селективен) в сочетании с клетками выбора, такими как растительная клетка.To facilitate the identification of transformants, it is desirable that the nucleic acid construct contains a selection or screening marker gene as, or in addition to, a foreign or exogenous polynucleotide. Marker gene refers to a gene that confers a distinct phenotype on cells expressing the marker gene, such that the transformed cells are different from cells lacking the marker. The breeding marker gene provides a trait that can be selected based on resistance to the breeding agent (eg, herbicide, antibiotic, radiation, heat, or other treatment that damages untransformed cells). A screenable marker gene (or reporter gene) provides a trait that can be identified by observation or testing, for example, by screening (for example, β-glucuronidase, luciferase, green fluorescent protein (GFP), or other enzyme activity not present in untransformed cells ). The marker gene and target nucleotide sequence must not be linked. In fact, the choice of marker is not critical as long as it is functional (ie, selective) in combination with cells of choice, such as a plant cell.

Примерами селекционных маркеров являются маркеры, которые обеспечивают резистентность к антибиотикам, например резистентность к ампициллину, эритромицину, хлорамфениколу или тетрациклину, предпочтительно резистентность к канамицину. Примеры селекционных маркеров для селекции растений-трансформантов включают, без ограничения, ген hyg, который кодирует резистентность к гигромицину В; ген неомицин фосфотрансферазы (nptII), обеспечивающий резистентность к канамицину, паромомицину, G418; ген глутатион-S-трансферазы из печени крыс, обеспечивающий резистентность к гербицидам-производным глутатиона, таким как, например, раскрытые в ЕР 256223; гена глутаминсинтетазы, при чрезмерной экспрессии обеспечивающий резистентность к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, например, раскрытый в WO 87/05327, ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, обеспечивающий резистентность к селекционному агенту фосфинотрицину, например, раскрытый в ЕР 275957, ген, кодирующий 5-енолшикимат-3-фосфат синтазу (ЭШФС), обеспечивающий переносимость N-фосфонометилглицина, например, раскрытый Hinchee et al. (1988), или предпочтительно ген bar, обеспечивающий резистентность к биалафосу, например, раскрытый в WO91/02071.Examples of breeding markers are markers that confer antibiotic resistance, for example ampicillin, erythromycin, chloramphenicol or tetracycline resistance, preferably kanamycin resistance. Examples of breeding markers for breeding transformant plants include, but are not limited to, the hyg gene, which encodes hygromycin B resistance; gene neomycin phosphotransferase (nptII), providing resistance to kanamycin, paromomycin, G418; a rat liver glutathione S-transferase gene conferring resistance to glutathione-derived herbicides such as those disclosed in EP 256223; a glutamine synthetase gene, when overexpressed, confers resistance to glutamine synthetase inhibitors such as phosphinothricin, for example, disclosed in WO 87/05327, an acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes, conferring resistance to the selection agent phosphinothricin, for example, cod. enolshikimate-3-phosphate synthase (ESPS), which mediates the tolerability of N-phosphonomethylglycine, for example, disclosed by Hinchee et al. (1988), or preferably a bar gene conferring bialaphos resistance, for example disclosed in WO91 / 02071.

Предпочтительно конструкция нуклеиновой кислоты стабильно инкорпорирована в геном клетки, например растительной клетки. Соответственно нуклеиновая кислота может содержать подходящие элементы, которые позволяют молекуле инкорпорироваться в геном, предпочтительно последовательности правой и левой границ молекулы Т-ДНК, или конструкция размещена в подходящем векторе, который может быть инкорпорирован в хромосому клетки.Preferably, the nucleic acid construct is stably incorporated into the genome of a cell, for example a plant cell. Accordingly, the nucleic acid may contain suitable elements that allow the molecule to be incorporated into the genome, preferably the sequence of the right and left boundaries of the T-DNA molecule, or the construct is placed in a suitable vector that can be incorporated into the chromosome of the cell.

Экспрессия.Expression.

В настоящем документе вектор экспрессии представляет собой вектор ДНК, который способен трансформировать клетку-хозяина и осуществлять экспрессию одной или более указанных молекул полинуклеотида. Векторы экспрессии по настоящему изобретению могут управлять экспрессией гена в растительных клетках или в рекомбинантных клетках, таких как микробные клетки. Векторы экспрессии,As used herein, an expression vector is a DNA vector that is capable of transforming a host cell and expressing one or more of said polynucleotide molecules. The expression vectors of the present invention can direct the expression of a gene in plant cells or in recombinant cells such as microbial cells. Expression vectors,

- 37 037184 пригодные в соответствии с изобретением, содержат регуляторные последовательности, например последовательности для контроля транскрипции, последовательности для контроля трансляции, источники репликации и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с рекомбинантной клеткой и которые управляют экспрессией молекул полинуклеотида по настоящему изобретению. В частности, полинуклеотиды или векторы, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, содержат последовательности для контроля транскрипции. Последовательности для контроля транскрипции представляют собой последовательности, которые управляют инициацией, элонгацией и терминацией транскрипции. Особенно важными последовательностями для контроля транскрипции являются такие, которые управляют инициацией транскрипции, например последовательности промотора и энхансера. Подходящие последовательности для контроля транскрипции включают любую последовательность для контроля транскрипции, которая может функционировать по меньшей мере в одной из рекомбинантных клеток по настоящему изобретению. Выбор используемых регуляторных последовательностей зависит от организма-мишени, такого как растение, и/или органа-мишени или целевой ткани. Такие регуляторные последовательности могут быть получены из любого эукариотного организма, такого как растения, или вирусы растений, или могут быть химически синтезированы. Множество таких последовательностей для контроля транскрипции известно специалистам из уровня техники. Особенно предпочтительными последовательностями для контроля транскрипции являются промоторы, активно направляющие транскрипцию в растениях, конститутивно или специфичным для стадии и/или ткани образом, в зависимости от использования растения или его частей.- 37 037184 suitable in accordance with the invention, contain regulatory sequences, for example sequences for control of transcription, sequences for translation control, sources of replication and other regulatory sequences, which are compatible with the recombinant cell and which direct the expression of polynucleotide molecules of the present invention. In particular, polynucleotides or vectors suitable in accordance with the present invention contain sequences for controlling transcription. Transcriptional control sequences are sequences that direct the initiation, elongation, and termination of transcription. Particularly important sequences for transcriptional control are those that direct the initiation of transcription, for example, promoter and enhancer sequences. Suitable transcriptional control sequences include any transcriptional control sequence that can function in at least one of the recombinant cells of the present invention. The choice of regulatory sequences used depends on the target organism, such as a plant, and / or the target organ or target tissue. Such regulatory sequences can be obtained from any eukaryotic organism, such as plants or plant viruses, or can be chemically synthesized. Many such transcriptional control sequences are known to those skilled in the art. Particularly preferred sequences for controlling transcription are promoters that actively direct transcription in plants, in a constitutive or stage and / or tissue specific manner, depending on the use of the plant or its parts.

Целый ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции растительных клеток или получения трансгенных растений, описаны, например, в Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; и Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Обычно векторы экспрессии в растениях содержат, например, один или более клонированных генов растения под транскрипциональным контролем 5' и 3' регуляторных последовательностей и доминантный селекционный маркер. Дополнительно, такие векторы экспрессии в растениях могут содержать регуляторный участок промотора (например, регуляторный участок, управляющий индуцибельной или конститутивной, регулируемой условиями окружающей среды или стадией развития, или клеточно- или тканеспецифичной экспрессией), старт-сайт инициации транскрипции, сайт связывания с рибосомой, сигнал процессинга РНК, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.A variety of vectors suitable for the stable transfection of plant cells or the production of transgenic plants are described, for example, in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; and Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Typically, plant expression vectors contain, for example, one or more cloned plant genes under transcriptional control of 5 'and 3' regulatory sequences and a dominant selection marker. Additionally, such expression vectors in plants may contain a promoter regulatory region (e.g., a regulatory region that drives an inducible or constitutive, environmental or developmental stage or cell or tissue specific expression), a transcription initiation start site, a ribosome binding site, an RNA processing signal, a transcription termination site, and / or a polyadenylation signal.

Описан целый ряд конститутивных промоторов, которые активны в клетках растения. Подходящие промоторы для конститутивной экспрессии в растениях включают, без ограничения, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), 35S мозаичного вируса норичника шишковатого (FMV) и индуцибельный светом промотор из маленькой субъединицы рибулозо-1,5-бис-фосфат карбоксилазы.A number of constitutive promoters have been described that are active in plant cells. Suitable promoters for constitutive expression in plants include, but are not limited to, the 35S Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) promoter, the 35S Pinus Mosaic Virus (FMV), and the light inducible promoter from the small subunit of ribulose 1,5-bis-phosphate carboxylase.

С целью экспрессии в исходных тканях растения, таких как лист, семя, корень или стебель, промоторам, используемым в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно свойственна относительно высокая экспрессия в этих конкретных тканях. Множество примеров хорошо известно из уровня техники. Кроме того, различные промоторы растительных генов, которые регулируются в ответ на экологические, гормональные, химические и/или связанные с развитием сигналы, могут использоваться для экспрессии генов в клетках растения, или может быть предпочтительным использование органспецифичных промоторов.For the purpose of expression in the original tissues of the plant, such as leaf, seed, root or stem, the promoters used in accordance with the present invention preferably exhibit relatively high expression in these specific tissues. Many examples are well known in the art. In addition, various plant gene promoters that are regulated in response to environmental, hormonal, chemical and / or developmental signals may be used to express genes in plant cells, or organ-specific promoters may be preferred.

В настоящем документе термин промотор, специфичный для семени или его вариации обозначает промотор, который предпочтительно по сравнению с другими тканями растения направляет транскрипцию гена в развивающемся семени растения, предпочтительно растения виду Brassica, Camelina sativa или G. max. В варианте реализации промотор, специфичный для семени, экспрессируется по меньшей мере в 5 раз активнее в развивающемся семени растения относительно листьев и/или стеблей растения, и предпочтительно экспрессируется активнее в эмбрионе развивающегося семени, по сравнению с другими тканями растения. Предпочтительно промотор только направляет экспрессию целевого гена в развивающемся семени, и/или экспрессия целевого гена в других частях растения, таких как листья, не может быть обнаружена нозерн-блоттингом и/или ОТ-ПЦР. Обычно промотор управляет экспрессией генов в процессе роста и развития семени, в частности, в ходе фазы синтеза и аккумуляции запасных веществ в семени. Такие промоторы могут управлять экспрессией гена в целом запасном органе растения или только в его части, например оболочке семени или семядоле(ях), предпочтительно в эмбрионах, в семенах двудольных растений или эндосперме или алейроновом слое семян однодольных растений.As used herein, the term seed-specific promoter or variations thereof means a promoter that preferentially directs gene transcription in the developing seed of a plant, preferably a Brassica, Camelina sativa or G. max plant, over other plant tissues. In an embodiment, the seed-specific promoter is expressed at least 5-fold more actively in the developing seed of the plant relative to the leaves and / or stems of the plant, and is preferably expressed more actively in the embryo of the developing seed than in other plant tissues. Preferably, the promoter only directs the expression of the target gene in the developing seed, and / or expression of the target gene in other parts of the plant, such as leaves, cannot be detected by Northern blotting and / or RT-PCR. Typically, the promoter controls gene expression during seed growth and development, in particular during the synthesis and accumulation phase of storage substances in the seed. Such promoters can direct the expression of a gene in the entire storage organ of a plant, or only in a part thereof, for example the seed coat or cotyledon (s), preferably in embryos, in dicotyledonous plant seeds, or in the endosperm or aleurone layer of monocotyledonous plant seeds.

Предпочтительные промоторы специфичной для семени экспрессии включают: i) промоторы из генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в биосинтезе жирных кислот и их аккумуляции в семенах, например десатуразы и элонгазы жирных кислот, ii) промоторы из генов, кодирующих запасные белки для хранения в семени, и iii) промоторы из генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в биосинтезе углеводов и их аккумуляции в семенах. Подходящими специфичными для семени промоторами являются промотор гена напина масличного рапса (US 5608152), промотор USP Vicia faba (Baumlein et al., 1991), промотор олеозина Arabidopsis (WO98/45461), промотор фазеолийа Phaseolus vulgaris (US 5504200), промотор Все4 Brassica (WO91/13980) или промотор легумина LeB4 из Vicia faba (BaumPreferred seed-specific expression promoters include: i) promoters from genes encoding enzymes involved in fatty acid biosynthesis and accumulation in seeds, for example fatty acid desaturase and elongase, ii) promoters from genes encoding storage proteins for storage in the seed, and iii) promoters from genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of carbohydrates and their accumulation in seeds. Suitable seed-specific promoters are the oilseed napin gene promoter (US 5608152), the Vicia faba USP promoter (Baumlein et al., 1991), the Arabidopsis oleosin promoter (WO98 / 45461), the Phaseolus vulgaris phaseolia promoter (US All Brass 5504,200), the (WO91 / 13980) or the LeB4 legumin promoter from Vicia faba (Baum

- 38 037184 lein et al., 1992), и промоторы, которые обеспечивают специфичную для семени экспрессию в однодольных, таких как маис, ячмень, пшеница, рожь, рис, и т.п. В качестве подходящих следует отметить такие промоторы: промотор гена Ipt2 или Ipt1 ячменя (WO95/15389 и WO95/23230) или промоторы, раскрытые в WO99/16890 (промоторы из гена гордеина ячменя, гена глютелина риса, гена оризина риса, гена проламина риса, гена глиадина пшеницы, гена глютелина пшеницы, гена зеина маиса, гена глютелина овса, гена казирина сорго, гена секалина ржи). Другие промоторы включают раскрытые Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US20070192902 и US20030159173. В варианте реализации специфичный для семени промотор предпочтительно экспрессируется в определенных частях семени, таких как эмбрион, семядоля(и) или эндосперм. Примеры таких специфичных промоторов включают, без ограничения, промотор FP1 (Ellerstrom et al., 1996), промотор легумина гороха (Perrin et al., 2000), промотор фитогемагглютинина боба (Perrin et al., 2000), промоторы конлинин 1 и конлинин 2 для генов, кодирующих запасные белки 2S льна (Cheng et al., 2010), промотор гена FAE1 из Arabidopsis thaliana, промотор BnGLP гена глобулинподобного белка Brassica napus, промотор LPXR гена пероксиредоксина из Linum usitatissimum.- 38 037184 lein et al., 1992), and promoters that provide seed-specific expression in monocots such as maize, barley, wheat, rye, rice, and the like. As suitable, the following promoters should be mentioned: the promoter of the Ipt2 or Ipt1 gene of barley (WO95 / 15389 and WO95 / 23230) or the promoters disclosed in WO99 / 16890 (promoters from the gene of barley hordein, rice glutelin gene, rice oryzin gene, rice prolamin gene, wheat gliadin gene, wheat glutelin gene, maize zein gene, oat glutelin gene, sorghum casirin gene, rye sekalin gene). Other promoters include those disclosed by Broun et al. (1998) Potenza et al. (2004), US20070192902 and US20030159173. In an embodiment, the seed-specific promoter is preferably expressed in certain portions of the seed, such as the embryo, cotyledon (s), or endosperm. Examples of such specific promoters include, but are not limited to, the FP1 promoter (Ellerstrom et al., 1996), the pea legumin promoter (Perrin et al., 2000), the bean phytohemagglutinin promoter (Perrin et al., 2000), the conlinin 1 and conlinin 2 promoters. for genes encoding flax 2S storage proteins (Cheng et al., 2010), the FAE1 gene promoter from Arabidopsis thaliana, the BnGLP promoter of the Brassica napus globulin-like protein gene, and the LPXR promoter of the peroxiredoxin gene from Linum usitatissimum.

5' Нетранслируемая лидерная последовательность может быть получена из промотора, выбранного для экспрессии гетерологичной последовательности гена полинуклеотида по настоящему изобретению, или предпочтительно является гетерологичной относительно участка, кодирующего фермент, который вырабатывается, и может быть специфично модифицирована, при желании, таким образом, чтобы увеличить трансляцию мРНК. Обзор оптимизации экспрессии трансгенов см. в Koziel et al. (1996). Дополнительно, 5' нетранслируемые участки могут быть получены из РНК вирусов растений (среди прочего, вирус мозаики табака, вирус гравировки табака, вирус карликовой мозаичности маиса, вирус мозаики люцерны), из подходящих эукариотных генов, растительных генов (лидер гена связывающегося белка а/b хлорофилла пшеницы и маиса), или из синтетической последовательности гена. Настоящее изобретение не ограничивается конструкциями, в которых нетранслируемый участок получен из 5' нетранслируемой последовательности, сопровождающей последовательность промотора. Дополнительно, лидерная последовательность может быть получена из неродственного промотора или кодирующей последовательности. Лидерные последовательности, пригодные в контексте настоящего изобретения, включают лидер Hsp70 маиса (US 5362865 и US 5859347) и омега-элемент вируса мозаики табака (TMV).The 5 'untranslated leader sequence can be derived from a promoter selected to express a heterologous gene sequence of a polynucleotide of the present invention, or is preferably heterologous with respect to the region encoding the enzyme that is produced and can be specifically modified, if desired, in such a way as to increase translation mRNA. For a review of the optimization of transgenic expression see Koziel et al. (1996). Additionally, 5 'untranslated regions can be obtained from RNA of plant viruses (among others, tobacco mosaic virus, tobacco engraving virus, maize mosaic virus, alfalfa mosaic virus), from suitable eukaryotic genes, plant genes (the leader of the binding protein a / b chlorophyll of wheat and maize), or from a synthetic gene sequence. The present invention is not limited to constructs in which the untranslated region is derived from the 5 'untranslated sequence accompanying the promoter sequence. Additionally, the leader sequence can be derived from an unrelated promoter or coding sequence. Leader sequences useful in the context of the present invention include the maize Hsp70 leader (US 5362865 and US 5859347) and the tobacco mosaic virus (TMV) omega element.

Терминация транскрипции обеспечивается 3' нетранслируемой последовательностью ДНК, функционально связанной в химерном векторе с целевым полинуклеотидом. 3' Нетранслируемый участок рекомбинантной молекулы ДНК содержит сигнал полиаденилирования, функционирующий в растениях, чтобы обеспечить добавление аденилатных нуклеотидов к 3'-концу РНК. 3' Нетранслируемые участки могут быть получены из различных генов, которые экспрессируются в клетках растений. 3' Нетранслируемый участок нопалинсинтетазы, 3' нетранслируемый участок из маленькой субъединицы гена Rubisco гороха, 3' нетранслируемый участок из гена запасного белка 7S семени сои или гена конлинина льна обычно используются в таком случае.Termination of transcription is provided by a 3 'untranslated DNA sequence operably linked in the chimeric vector to the target polynucleotide. The 3 'untranslated region of the recombinant DNA molecule contains a polyadenylation signal that functions in plants to allow the addition of adenylate nucleotides to the 3' end of RNA. 3 'Untranslated regions can be obtained from various genes that are expressed in plant cells. A 3 'untranslated region of nopaline synthetase, 3' an untranslated region from a small subunit of the Rubisco gene of pea, 3 'an untranslated region from a soybean 7S storage protein gene or a flax conlinin gene are commonly used in this case.

3' Транскрибируемые, нетранслируемые участки, содержащие полиаденилатный сигнал индуцирующих опухоль (Ti) Agrobacterium плазмидных генов, также являются подходящими.3 'Transcribed, untranslated regions containing the polyadenylate signal of Agrobacterium tumor-inducing (Ti) plasmid genes are also suitable.

Технологии рекомбинантной ДНК могут применяться для улучшения экспрессии трансформированной молекулы полинуклеотида, посредством манипуляции, например количеством копий молекулы полинуклеотида в пределах клетки-хозяина, эффективностью, с которой такие молекулы полинуклеотида транскрибируются, эффективностью, с которой образующиеся в результате копии транслируются, и эффективностью посттрансляционных модификаций. Рекомбинантные методы, пригодные для увеличения экспрессии молекул полинуклеотида, раскрытых в настоящем документе, включают, без ограничения, интеграцию молекулы полинуклеотида в одну или более хромосом клетки-хозяина, введение стабилизирующих последовательностей в мРНК, замены или модификации сигналов контроля транскрипции (например, промоторы, операторы, энхансеры), замены или модификации сигналов контроля трансляции (например, сайты связывания с рибосомой, последовательности Шайна-Дальгарно), модификацию молекул полинуклеотида для соответствия использованию кодонов в клетке-хозяине и делеция последовательностей, которые дестабилизируют транскрипты.Recombinant DNA technologies can be used to enhance expression of a transformed polynucleotide molecule by manipulating, for example, the number of copies of a polynucleotide molecule within a host cell, the efficiency with which such polynucleotide molecules are transcribed, the efficiency with which the resulting copies are translated, and the efficiency of post-translational modifications. Recombinant methods suitable for increasing the expression of polynucleotide molecules disclosed herein include, without limitation, integrating a polynucleotide molecule into one or more chromosomes of a host cell, introducing stabilizing sequences into mRNA, replacing or modifying transcription control signals (e.g., promoters, operators , enhancers), substitutions or modifications of translation control signals (e.g., ribosome binding sites, Schein-Dalgarno sequences), modification of polynucleotide molecules to match codon usage in the host cell, and deletion of sequences that destabilize transcripts.

Трансгенные растения.Transgenic plants.

Термин растение в настоящем документе как имя существительное обозначает целые растения, но при использовании в качестве прилагательного (растительный) обозначает любую субстанцию, в которой присутствует, полученную из, происходящую из или связанную с растением, например органы растения (такие как листья, стебли, корни, цветки), единичные клетки (такие как пыльца), семена, растительные клетки, и т.п. Термин часть растения обозначает все части растения, которые содержат ДНК растения, в том числе вегетативные структуры, например листья или стебли, корни, цветочные органы или структуры, пыльца, семя, части семени, такие как эмбрион, эндосперм, щиток зародыша или оболочка семени, ткань растения, такую как сосудистая ткань, клетки и их потомство, до тех пор, пока часть растения синтезирует липид по изобретению.The term plant as a noun herein denotes whole plants, but when used adjectively (vegetable) denotes any substance in which it is present, derived from, derived from, or associated with a plant, for example plant organs (such as leaves, stems, roots , flowers), single cells (such as pollen), seeds, plant cells, etc. The term plant part refers to all parts of a plant that contain plant DNA, including vegetative structures such as leaves or stems, roots, flower organs or structures, pollen, seed, parts of a seed such as an embryo, endosperm, germ plate or seed coat, plant tissue such as vascular tissue, cells and their progeny, as long as the plant part synthesizes the lipid of the invention.

Трансгенное растение, генетически модифицированное растение или их вариации обозначают растение, которое содержит генетическую конструкцию (трансген), не найденную в растении дикого типа такого же вида, разновидности или сорта. Трансгенные растения в контексте настоящего изобретеA transgenic plant, a genetically modified plant or a variation thereof means a plant that contains a genetic construct (transgene) not found in a wild-type plant of the same species, variety or variety. Transgenic Plants in the Context of the Present Invention

- 39 037184 ния включают растения и их потомство, генетически модифицированные с применением рекомбинантных методов, что приводит к выработке липида или по меньшей мере одного полипептида, раскрытого в настоящем документе в целевом растении или органе растения. Трансгенные клетки растения и трансгенные части растения имеют соответствующее значение. Трансген в настоящем документе имеет обычное значение для данной области биотехнологии и содержит генетическую последовательность, которая получена или модифицирована технологией рекомбинации ДНК или РНК, и которая введена в клетку растения. Трансген может содержать генетические последовательности, полученные из клетки растения, которая может принадлежать к тому же виду, разновидности или сорту, что и клетка растения, в которую введен трансген, или к другому виду, разновидности или сорту, или из клетки, не являющейся растительной. Обычно трансген вводят в клетку, например растительную, посредством манипуляции человеком, например трансформации, причем может применяться любой способ на усмотрение специалиста в данной области.39 037184 include plants and their progeny that have been genetically modified using recombinant techniques to produce a lipid or at least one polypeptide disclosed herein in a target plant or plant organ. Transgenic plant cells and transgenic plant parts have a corresponding meaning. A transgene as used herein has its ordinary meaning in the art of biotechnology and contains a genetic sequence that has been obtained or modified by DNA or RNA recombination technology and has been introduced into a plant cell. The transgene may contain genetic sequences derived from a plant cell, which may be of the same species, variety or variety as the plant cell into which the transgene is introduced, or a different species, variety or variety, or from a non-plant cell. Typically, the transgene is introduced into a cell, for example a plant, by human manipulation, such as transformation, and any method at the discretion of a person skilled in the art can be used.

Термины семя и зерно в настоящем документе используются равнозначно. Зерно обозначает зрелое семя, например, собранное в процессе сбора урожая семя, или семя, которое еще находится на растении, но готово для сбора урожая, а также может обозначать семя после набухания или прорастания согласно контексту. Зрелое семя или семя обычно содержит влагу в количестве менее чем около 18-20%, предпочтительно менее чем 10%. Содержание влаги в семени Brassica, например семени рапса в зрелом состоянии, обычно составляет около 4-8% или 6-8%, предпочтительно от около 4 до около 6%. Развивающееся семя в настоящем документе обозначает семя до наступления зрелости, обычно найденное в репродуктивных структурах растения после оплодотворения или цветения, но может также обозначать такие семена до наступления зрелости, которые выделены из растения.The terms seed and grain are used interchangeably in this document. A grain denotes a mature seed, such as a seed harvested during harvest, or a seed that is still on the plant but ready to be harvested, and may also denote a seed after it has swollen or germinated according to the context. A mature seed or seed usually contains less than about 18-20% moisture, preferably less than 10% moisture. The moisture content of a Brassica seed, such as a mature rapeseed, is typically about 4-8% or 6-8%, preferably about 4 to about 6%. A developing seed herein means a seed before maturity, usually found in the reproductive structures of a plant after fertilization or flowering, but may also mean such pre-maturity seeds that are isolated from the plant.

В настоящем документе термин получение части растения или получение семени обозначает любые средства для получения части растения или семени соответственно, в том числе сбор урожая частей растения или семян с растений в поле или в закрытом пространстве, таком как теплица или камера для роста, или покупку или получение от поставщика частей растения или семян. Стандартные условия роста в теплице включают дневную температуру 22-24°С и ночную температуру 16-18°С с естественным солнечным светом. Семя может быть пригодным для высадки, т.е. способным к прорастанию и образованию растения-потомка, или, альтернативно, обработано таким образом, что больше не может прорасти, например расколотое, шлифованное или смолоченное семя, которое пригодно для применения при получении пищевых продуктов или в питании, или для экстракции липида по изобретению.As used herein, the term obtaining a plant part or obtaining a seed means any means for obtaining a plant part or seed, respectively, including harvesting plant parts or seeds from plants in a field or enclosed space such as a greenhouse or growth chamber, or purchasing or obtaining plant parts or seeds from the supplier. Typical growing conditions in a greenhouse include daytime temperatures of 22-24 ° C and night temperatures of 16-18 ° C with natural sunlight. The seed may be suitable for planting, i.e. capable of germinating and forming a progeny plant, or, alternatively, treated in such a way that it can no longer germinate, for example, chopped, ground or ground seed, which is suitable for use in food preparation or nutrition, or for lipid extraction according to the invention.

В настоящем документе термин запасающий орган растения обозначает часть растения, специализирующуюся на хранении энергии в форме, например, белков, углеводов, жирных кислот и/или масел. Примерами запасающих органов растения являются семя, плод, клубневидные корни и клубни. Предпочтительным запасающим органом растения является семя.As used herein, the term plant storage organ means a part of a plant specialized in storing energy in the form of, for example, proteins, carbohydrates, fatty acids and / or oils. Examples of plant storage organs are seed, fruit, tuberous roots and tubers. The preferred storage organ of the plant is the seed.

Растения или части растений по изобретению или применяемые в соответствии с изобретением предпочтительно являются фенотипически нормальными. В настоящем документе термин фенотипически нормальный обозначает генетически модифицированное растение или орган растения, особенно запасающий орган, такой как семя, клубень или плод, не обладающий в существенной мере сниженной способностью к росту и воспроизведению по сравнению с немодифицированным растением или органом растения. В варианте реализации генетически модифицированное растение или орган растения, которые являются фенотипически нормальными, обладают способностью к росту или воспроизводству, по существу такой же, как изогенное растение или орган, не содержащие экзогенного(ых) полинуклеотида(ов). Предпочтительно биомасса, темпы роста, скорость прорастания, размер запасающего органа, жизнеспособность пыльцы, фертильность мужских и женских растений, размер семени и/или количество образованных жизнеспособных семян составляет не менее 90% от показателей растения, не содержащего указанного экзогенного полинуклеотида, при выращивании в идентичных условиях. Предпочтительно жизнеспособность пыльцы растения по изобретению или растений, полученных из семени по изобретению, составляет около 100% относительно жизнеспособности пыльцы соответствующего растения дикого типа. Данный термин не охватывает признаков растения, которое может отличаться от растения дикого типа, но которые не влияют отрицательно на полноценность растения с точки зрения коммерческих целей, например фенотип балерины листьев саженца.Plants or plant parts according to the invention or used according to the invention are preferably phenotypically normal. As used herein, the term phenotypically normal means a genetically modified plant or plant organ, especially a storage organ such as a seed, tuber or fruit, which does not have a substantially reduced ability to grow and reproduce as compared to an unmodified plant or plant organ. In an embodiment, a genetically modified plant or plant organ that is phenotypically normal has the ability to grow or reproduce substantially the same as an isogenic plant or organ that does not contain exogenous polynucleotide (s). Preferably, the biomass, growth rate, germination rate, storage organ size, pollen viability, fertility of male and female plants, seed size and / or the number of viable seeds formed is at least 90% of that of a plant that does not contain the specified exogenous polynucleotide, when grown in identical conditions. Preferably, the viability of the pollen of a plant of the invention or of plants obtained from a seed of the invention is about 100% relative to that of the corresponding wild-type plant. This term does not cover traits of a plant that may differ from a wild-type plant, but which do not adversely affect the usefulness of the plant from a commercial point of view, for example, the phenotype of the sapling leaf ballerina.

Растения, раскрытые или включенные для использования в практике настоящего изобретения, включают однодольные растения и двудольные растения. В предпочтительных вариантах реализации растения по настоящему изобретению представляют собой урожайные растения (например, злаковые и зернобобовые, маис, пшеницу, картофели, тапиоку, рис, сорго, просо, маниоку, ячмень или горох) или другие бобовые. Растения могут быть выращены для получения съедобных корней, клубней, листьев, стеблей, цветков или плода. Растения могут быть овощными или декоративными растениями. Растения по изобретению или пригодные в соответствии с изобретением могут представлять собой кукурузу (Zea mays), рапс (Brassica napus, подвид Brassica rapa), горчицу (Brassica juncea), лен (Linum usitatissimum), люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cerale), сорго (Sorghum bicolour, Sorghum vulgare), подсолнечник (Helianthus annus), пшеницу (Tritium aestivum), сою (Glycine max), табак (Nicotiana tabacum), картофель (Solarium tuberosum), арахис (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium hirsutum),Plants disclosed or included for use in the practice of the present invention include monocotyledonous plants and dicotyledonous plants. In preferred embodiments, the plants of the present invention are crops (eg, cereals and pulses, maize, wheat, potatoes, tapioca, rice, sorghum, millet, cassava, barley, or peas) or other legumes. Plants can be grown to produce edible roots, tubers, leaves, stems, flowers, or fruit. Plants can be vegetable or ornamental plants. Plants according to the invention or suitable according to the invention may be corn (Zea mays), rapeseed (Brassica napus, subspecies Brassica rapa), mustard (Brassica juncea), flax (Linum usitatissimum), alfalfa (Medicago sativa), rice (Oryza sativa ), rye (Secale cerale), sorghum (Sorghum bicolour, Sorghum vulgare), sunflower (Helianthus annus), wheat (Tritium aestivum), soybeans (Glycine max), tobacco (Nicotiana tabacum), potatoes (Solarium tuberosum), peanuts (Arachis hypogaea), cotton (Gossypium hirsutum),

- 40 037184 сладкий картофель (Lopmoea batatus), маниоку (Manihot esculenta), кофе (вид Cofea), кокосовый орех (Cocos nucifera), ананас (Anana comosus), цитрусовое дерево (вид Citrus), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia senensis), банан (вид Musa), авокадо (Persea americana), смоковницу (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifer indica), маслину (Olea europaea), папайю (Carica papaya), кэшью (Anacardium occidentale), макадамию (Macadamia intergrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), сахарную свеклу (Beta vulgaris), овес или ячмень.- 40 037184 sweet potato (Lopmoea batatus), cassava (Manihot esculenta), coffee (Cofea species), coconut (Cocos nucifera), pineapple (Anana comosus), citrus tree (Citrus species), cocoa (Theobroma cacao), tea ( Camellia senensis), banana (Musa species), avocado (Persea americana), fig tree (Ficus casica), guava (Psidium guajava), mango (Mangifer indica), olive (Olea europaea), papaya (Carica papaya), cashew (Anacardium occ ), macadamia (Macadamia intergrifolia), almonds (Prunus amygdalus), sugar beets (Beta vulgaris), oats or barley.

В предпочтительном варианте реализации растение представляет собой покрытосеменное растение.In a preferred embodiment, the plant is an angiosperm plant.

В варианте реализации растение представляет собой растение масличной культуры, предпочтительно урожайное растение масличной культуры. В настоящем документе растение масличной культуры представляет собой вид растения, используемый для коммерческого получения масел из семян растения. Растение масличной культуры может представлять собой масличный рапс (например, рапс), маис, подсолнечник, сою, сорго, лен (семя льна) или сахарную свеклу. Кроме того, растение масличной культуры может быть другими представителями Brassica, хлопчатником, арахисом, маком, горчицей, клещевиной обыкновенной, кунжутом, подсолнечником, сафлором, Camelina, Crambe или дающим орехи растением. Растение может вырабатывать высокие уровни масла в плоде, например маслина, масличная пальма или кокосовый орех. Садовые растения, к которым может быть применено настоящее изобретение, представляют собой салат, эндивий или крестоцветные овощи, включая капусту, брокколи или цветную капусту. Настоящее изобретение может быть применено к табаку, тыквенным, моркови, землянике, помидору или перцу.In an embodiment, the plant is an oilseed plant, preferably an oilseed crop. As used herein, an oilseed plant is a plant species used for the commercial production of oils from plant seeds. The oilseed plant can be oilseed rape (eg rapeseed), maize, sunflower, soy, sorghum, flax (flaxseed), or sugar beet. In addition, the oilseed plant may be other Brassica, cotton, peanuts, poppy seeds, mustard, castor bean, sesame, sunflower, safflower, Camelina, Crambe, or a nut-producing plant. The plant can produce high levels of oil in the fruit, such as olive, oil palm, or coconut. Garden plants to which the present invention can be applied are lettuce, endive or cruciferous vegetables, including cabbage, broccoli or cauliflower. The present invention can be applied to tobacco, pumpkin, carrot, strawberry, tomato or pepper.

В еще одном предпочтительном варианте реализации нетрансгенное растение, используемое для получения трансгенного растения по изобретению, вырабатывает масло, особенно в семени, которое содержит: i) менее 20, менее 10 или менее 5% жирных кислот 18:2 и/или ii) менее 10 или менее 5% жирных кислот 18:3.In yet another preferred embodiment, the non-transgenic plant used to produce the transgenic plant of the invention produces an oil, especially in the seed, that contains: i) less than 20, less than 10, or less than 5% 18: 2 fatty acids and / or ii) less than 10 or less than 5% fatty acids 18: 3.

В предпочтительном варианте реализации трансгенное растение или его часть являются гомозиготным по всем и каждому гену (экзогенный полинуклеотид), которые были введены (трансгену), таким образом, что его потомство не разделяется для желательного фенотипа. Кроме того, трансгенное растение может быть гетерозиготным по введенному(ым) трансгену(ам), предпочтительно однородно гетерозиготным по трансгену, например, в потомстве F1, которое выращено из гибридного семени. Такие растения могут обеспечивать преимущества, например гибридную силу, хорошо известную из уровня техники, или могут применяться в разведении или обратном скрещивании растений.In a preferred embodiment, the transgenic plant, or part of it, is homozygous for all and every gene (exogenous polynucleotide) that has been introduced (transgene), such that its offspring are not segregated for the desired phenotype. In addition, the transgenic plant may be heterozygous for the introduced transgene (s), preferably uniformly heterozygous for the transgene, for example in the F1 progeny that is grown from hybrid seed. Such plants can provide benefits such as hybrid vigor, well known in the art, or can be used in breeding or backcrossing plants.

Если это уместно, трансгенное растение или его часть могут содержать дополнительные трансгены, кодирующие ферменты, которые принимают участие в выработке ДЦ-ПИЖК, такие как, без ограничения, Δ6-десатураза, Δ9-элонгаза, Δ8-десатураза, Δ6-элонгаза, Δ5-десатураза, ω3-десатураза, Δ5-элонгаза, диацилглицерид ацилтрансфераза, ЛФКАТ, Δ 17-десатураза, Δ15-десатураза и/или Δ12-десатураза. Примеры таких ферментов с одним или более из указанных видов активности известны из уровня техники и включают раскрытые в настоящем документе. В конкретных примерах трансгенное растение, по меньшей мере, содержит набор экзогенных полинуклеотидов, кодирующих:If appropriate, the transgenic plant or part of it may contain additional transgenes encoding enzymes that are involved in the production of DC-FFA, such as, without limitation, Δ6-desaturase, Δ9-elongase, Δ8-desaturase, Δ6-elongase, Δ5- desaturase, ω3-desaturase, Δ5-elongase, diacylglyceride acyltransferase, LPKAT, Δ 17-desaturase, Δ15-desaturase and / or Δ12-desaturase. Examples of such enzymes with one or more of these activities are known in the art and include those disclosed herein. In specific examples, the transgenic plant at least contains a set of exogenous polynucleotides encoding:

а) Δ5-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-элонгазу и Δ6-элонгазу,a) Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-elongase and Δ6-elongase,

б) Δ5-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-элонгазу и Δ9-элонгазу,b) Δ5-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-elongase and Δ9-elongase,

в) Δ5-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ6-элонгазу и Δ15-десатуразу,c) Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-elongase and Δ15-desaturase,

г) Δ5-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ9-элонгазу и Δ15-десатуразу,d) Δ5-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-elongase, Δ9-elongase and Δ15-desaturase,

д) Δ5-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ6-элонгазу и Δ 17-десатуразу,e) Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-elongase, Δ6-elongase and Δ17-desaturase,

е) Δ5-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-элонгазу, Δ9-элонгазу и Δ 17-десатуразу,f) Δ5-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-elongase, Δ9-elongase and Δ17-desaturase,

ж) ω3-десатуразу или Δ15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,g) ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

з) ω3-десатуразу или Δ15-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу и Δ5-элонгазу,h) ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase,

и) Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу или Δ15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,i) Δ12-desaturase, ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

й) Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу или Δ15-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу и Δ5-элонгазу,j) Δ12-desaturase, ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase,

к) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), ω3-десатуразу, Δ6-десатуразу,Δ5- десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,j) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

л) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ15-десатуразу, Δ6-десатуразу,Δ5- десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,k) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

м) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, Δ6-десатуразу,Δ5десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,l) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

н) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу и/или Δ15десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу,m) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase,

о) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), ω3-десатуразу, Δ8-десатуразу,Δ5десатуразу, Δ9-элонгазу и Δ5-элонгазу,o) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), ω3-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase,

п) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ15-десатуразу, Δ8-десатуразу,Δ5- 41 037184 десатуразу, Δ9-элонгазу и Δ5-элонгазу,n) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5- 41 037184 desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase,

р) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5десатуразу, Δ9-элонгазу и Δ5-элонгазу илиp) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ12-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, or

с) 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу и/или Δ15десатуразу, Δ8-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ9-элонгазу и Δ5-элонгазу.c) 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LFAAT), Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase.

В варианте реализации экзогенные полинуклеотиды кодируют набор полипептидов, которые представляют собой Δ6-десатуразу Pythium irregulare, Δ5-дезатуразу Thraustochytrid или Δ5-дезатуразу Emiliana huxleyi, Δ6-элонгазу Physcomitrella patens, Δ5-элонгазу Thraustochytrid или Δ5-элонгазу Ostreocccus taurii и ω3-десатуразу Phytophthora infestans или ω3-десатуразу Pythium irregulare.In an embodiment, the exogenous polynucleotides encode a set of polypeptides that are Pythium irregulare Δ6 desaturase, Thraustochytrid Δ5 desaturase or Emiliana huxleyi Δ5 desaturase, Physcomitrella patens Δ6 elongase, Phraustochytrella patens Δ5 elongase, Thraustochytrid Δ5 elongase, or Phythostra O5 elongase, or O5 elongase. infestans or ω3-desaturase Pythium irregulare.

В варианте реализации растения по изобретению или применяемые в соответствии с изобретением выращены в поле, предпочтительно как популяция размером по меньшей мере 1000, 1000000 или 2000000 растений, которые по существу одинаковы, или на площади по меньшей мере 1 или 2 га. Плотность насаждения варьирует в соответствии с видом растения, разновидностью растения, климатом, условиями почвы, нормами применения удобрений и другими факторами, как известно из уровня техники. Например, рапс обычно выращивают с плотностью насаждения 1,2-1,5 млн растений на 1 га. Урожай растений собирают, как известно из уровня техники, что может включать валкование, рядковое компостирование и/или жатву плодов растений, с последующей молотьбой и/или веянием растительного материала для отделения семени от остальных частей растения, часто в форме мякины. Альтернативно, урожай семени может быть собран с растений в поле в ходе единственного процесса, а именно комбайнирования.In an embodiment, the plants according to the invention or used according to the invention are grown in the field, preferably as a population of at least 1,000, 1,000,000 or 2,000,000 plants that are substantially the same, or on an area of at least 1 or 2 hectares. Planting density varies according to plant species, plant variety, climate, soil conditions, fertilization rates and other factors, as is known in the art. For example, rapeseed is usually grown at a planting density of 1.2-1.5 million plants per hectare. Plants are harvested as is known in the art, which may involve swathing, row composting and / or harvesting the fruit of the plants, followed by threshing and / or blowing the plant material to separate the seed from the rest of the plant, often in the form of chaff. Alternatively, the seed crop can be harvested from the plants in the field in a single process, namely combining.

Трансформация растений.Plant transformation.

Трансгенные растения могут быть получены с применением методов, известных из уровня техники, таких как в общем описаны в A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), и P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).Transgenic plants can be obtained using methods known in the art, such as those generally described in A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), and P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

В настоящем документе термины стабильно трансформирующий, стабильно трансформированный и их вариации обозначают интеграцию экзогенных молекул нуклеиновых кислот в геном клетки таким образом, что они передаются клеткам потомства в процессе деления клетки, без необходимости в проведении положительной селекции на предмет их присутствия. Стабильные трансформанты или их потомство могут быть отобраны любыми средствами, известными из уровня техники, такими как саузерн-блоты на хромосомной ДНК или гибридизация геномной ДНК in situ. Предпочтительно трансформацию растений осуществляют так, как описано в примерах в данном описании.In this document, the terms stably transforming, stably transformed and their variations mean the integration of exogenous nucleic acid molecules into the cell genome in such a way that they are passed on to progeny cells during cell division, without the need for positive selection for their presence. Stable transformants or their progeny can be selected by any means known in the art, such as Southern blots on chromosomal DNA or in situ hybridization of genomic DNA. Preferably, the transformation of plants is carried out as described in the examples in this description.

Опосредованный Agrobacterium перенос представляет собой широко применяемую систему для введения генов в клетки растения, поскольку ДНК может быть введена в клетки в цельных тканях растения или органах растения или эксплантах в культуре ткани, с целью временной экспрессии или стабильной интеграции ДНК в геном клетки растения. Использование опосредованных Agrobacterium интегрирующихся векторов для растений с целью введения ДНК в клетки растения хорошо известно из уровня техники (см., например, US 5177010, US 5104310, US 5004863 или US 5159135), включая методы погружения цветков с использованием Agrobacterium или других бактерий, которые могут переносить ДНК в клетки растения. Участок ДНК для переноса определяется последовательностями границы, причем промежуточная ДНК (Т-ДНК) обычно вставляется в геном растения. В дальнейшем, интеграция Т-ДНК представляет собой относительно точный процесс, приводящих к нескольким реорганизациям. В тех разновидностях растений, в которых опосредованная Agrobacterium трансформация является эффективной, она является способом выбора благодаря легкой и определенной природе переноса гена. Предпочтительные векторы трансформации Agrobacterium способны к репликации в Е. coli, также как Agrobacterium, позволяя осуществить необходимые манипуляции, как было описано (Klee et al., в Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, p. 179-203 (1985)).Agrobacterium mediated transfer is a widely used system for introducing genes into plant cells because DNA can be introduced into cells in whole plant tissues or plant organs or explants in tissue culture for the purpose of transient expression or stable integration of DNA into the plant cell genome. The use of Agrobacterium mediated plant integrating vectors to introduce DNA into plant cells is well known in the art (see, for example, US 5177010, US 5104310, US 5004863 or US 5159135), including flower immersion techniques using Agrobacterium or other bacteria that can transfer DNA into plant cells. The region of DNA to be transferred is determined by the sequences of the boundary, with an intermediate DNA (T-DNA) usually inserted into the plant genome. Further, the integration of T-DNA is a relatively precise process, leading to several reorganizations. In those plant varieties in which Agrobacterium-mediated transformation is effective, it is the mode of choice due to the easy and definite nature of gene transfer. Preferred Agrobacterium transformation vectors are capable of replication in E. coli, as well as Agrobacterium, allowing for the necessary manipulations as described (Klee et al., In Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, p. 179-203 (1985)).

Способы ускорения, которые могут применяться, включают, например, баллистическую трансфекцию и т.п. Один из примеров способа доставки трансформирующих молекул нуклеиновых кислот в клетки растения представляет собой баллистическую трансфекцию. Данный способ рассмотрен Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небиологические частицы (микрочастицы) в нем могут быть покрыты нуклеиновыми кислотами и доставлены в клетки движущей силой. Примеры частиц включают состоящие из вольфрама, золота, платины и т.п. Конкретное преимущество баллистической трансфекции, в дополнение к тому, что она является эффективным средством воспроизводимой трансформации однодольных, является то, что не требуется ни выделения протопластов, ни восприимчивости к инфекции Agrobacterium.Acceleration methods that can be used include, for example, ballistic transfection and the like. One example of a method for delivering transforming nucleic acid molecules into plant cells is ballistic transfection. This method is reviewed by Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Non-biological particles (microparticles) in it can be coated with nucleic acids and delivered to cells by a driving force. Examples of particles include tungsten, gold, platinum, and the like. A particular advantage of ballistic transfection, in addition to being an effective means of reproducible transformation of monocots, is that neither protoplast isolation nor susceptibility to Agrobacterium infection is required.

В другом альтернативном варианте реализации пластиды могут быть стабильно трансформированы. Способы, раскрытые для трансформации пластиды в высших растениях, включают доставку с помощью генной пушки частицы ДНК, содержащей селекционный маркер, и нацеливание ДНК на геном пластиды посредством гомологичной рекомбинации (US 5451513, US 5545818, US 5877402, US 5932479 и WO 99/05265).In another alternative embodiment, the plastids can be stably transformed. Methods disclosed for transforming plastids in higher plants include delivering with a gene gun a DNA particle containing a selection marker and targeting the DNA to the plastid genome by homologous recombination (US 5451513, US 5545818, US 5877402, US 5932479 and WO 99/05265) ...

- 42 037184- 42 037184

Другие способы превращения клетки могут также применяться и включают, без ограничения, введение ДНК в растения прямым переносом ДНК в пыльцу, прямой инъекцией ДНК в репродуктивные органы растения или прямой инъекцией ДНК в клетки незрелых эмбрионов, с последующей регидратацией высушенных эмбрионов.Other methods of converting cells can also be used and include, without limitation, the introduction of DNA into plants by direct transfer of DNA into pollen, direct injection of DNA into the reproductive organs of the plant, or direct injection of DNA into cells of immature embryos, followed by rehydration of the dried embryos.

Регенерация, развитие и культивирование растений из одинарных трансформантов протопласта растения или из различных трансформированных эксплантов хорошо известны из уровня техники (Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). Такая регенерация и процесс роста обычно включают стадии селекции трансформированных клеток, культивирования таких индивидуальных клеток через обычные стадии эмбрионального развития, в том числе стадию укоренения саженца. Трансгенные эмбрионы и семена регенерируют подобным образом. Полученные трансгенные укоренившиеся побеги в дальнейшем высаживают в подходящую среду для роста растения, такую как грунт.Regeneration, development and cultivation of plants from single transformants of the plant protoplast or from various transformed explants are well known in the art (Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). Such a regeneration and growth process usually includes the stages of selection of transformed cells, culturing such individual cells through the usual stages of embryonic development, including the stage of rooting a seedling. Transgenic embryos and seeds are regenerated in a similar way. The resulting transgenic rooted shoots are subsequently planted in a suitable medium for plant growth, such as soil.

Развитие или регенерация растений, содержащих чужеродный, экзогенный ген, хорошо известны из уровня техники. Предпочтительно регенерируемые растения являются самоопыляющимися, чтобы обеспечить гомозиготные трансгенные растения. В другом случае, пыльцу, полученную от регенерируемых растений, скрещивают с выращенными из семян растениями важных с агрономической точки зрения линий. С другой стороны, пыльца растений таких важных линий используется для опыления регенерируемых растений. Трансгенное растение по настоящему изобретению, содержащее желательную экзогенную нуклеиновую кислоту, культивируют с применением способов, хорошо известных специалисту в данной области.The development or regeneration of plants containing a foreign, exogenous gene is well known in the art. Preferably, the regenerated plants are self-pollinating to provide homozygous transgenic plants. Alternatively, pollen obtained from regenerated plants is crossed with seed-grown plants of agronomically important lines. On the other hand, pollen from such important lines is used to pollinate regenerated plants. The transgenic plant of the present invention containing the desired exogenous nucleic acid is cultured using methods well known to one of ordinary skill in the art.

Чтобы подтвердить присутствие трансгенов в трансгенных клетках и растениях, может быть осуществлена амплификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализ методом саузернблота, с применением способов, известных специалистам в данной области. Продукты экспрессии трансгенов могут быть обнаружены любым из множества путей, в зависимости от природы продукта, и включают вестерн-блот и ферментный анализ. Как только трансгенные растения получены, их можно выращивать для получения тканей или частей растения, содержащих желательный фенотип. Ткань растения или части растения могут быть собраны как урожай, и/или собрано семя. Семя может служить источником выращивания дополнительных растений с тканями или частями, которые обладают желательными характеристиками.To confirm the presence of transgenes in transgenic cells and plants, amplification by polymerase chain reaction (PCR) or Southern blot analysis can be performed using methods known to those of skill in the art. Transgenic expression products can be detected in any of a variety of ways, depending on the nature of the product, and include Western blotting and enzymatic analysis. Once the transgenic plants are obtained, they can be grown to obtain plant tissues or parts containing the desired phenotype. Plant tissue or plant parts can be harvested and / or seed harvested. The seed can serve as a source of growing additional plants with tissues or parts that have the desired characteristics.

Трансгенное растение, полученное с применением Agrobacterium или других способов трансформации, обычно содержит единственный генетический локус на одной хромосоме. Такие трансгенные растения могут носить название гемизиготных по введенному(ым) гену(ам). Более предпочтительным является трансгенное растение, гомозиготное по введенному(ым) гену(ам); т.е. трансгенное растение, которое содержит два дополнительных гена, один ген в таком же локусе на каждой хромосоме из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено путем самооплодотворения гемизиготного трансгенного растения, проращивания части полученных семян и анализа полученных растений на предмет присутствия целевого гена.A transgenic plant obtained using Agrobacterium or other transformation methods usually contains a single genetic locus on a single chromosome. Such transgenic plants may be called hemizygous for the introduced gene (s). More preferred is a transgenic plant homozygous for the introduced gene (s); those. a transgenic plant that contains two additional genes, one gene at the same locus on each chromosome of a pair of chromosomes. A homozygous transgenic plant can be obtained by self-fertilizing a hemizygous transgenic plant, germinating a portion of the resulting seeds, and analyzing the resulting plants for the presence of the target gene.

Кроме того, необходимо понимать, что два различных трансгенных растения, которые содержат два независимо сегрегирующих экзогенных гена или локуса, могут быть скрещены (спарены) с целью получения потомства, которое содержит оба набора генов или локусов. Самооплодотворение подходящего потомка F1 может давать растения, гомозиготные по обоим экзогенным генам или локусам. Обратное скрещивание с материнским растением и уничтожение нетрансгенного растения также рассматриваются, как вегетативное разведение. Описание других способов разведения, которые обычно используются для различных признаков и урожая, можно найти в Fehr, в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).In addition, it should be understood that two different transgenic plants that contain two independently segregating exogenous genes or loci can be crossed (mated) to produce offspring that contains both sets of genes or loci. Self-fertilization of a suitable F1 offspring can produce plants homozygous for both exogenous genes or loci. Backcrossing with the mother plant and killing the non-transgenic plant is also considered vegetative breeding. Descriptions of other breeding methods that are commonly used for different traits and yields can be found in Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

Повышение уровней экзогенной РНК и стабилизированная экспрессия.Increased levels of exogenous RNA and stabilized expression.

Супрессоры сайленсинга.Silence suppressors.

В варианте реализации растительная клетка, растение или часть растения содержит экзогенный полинуклеотид, кодирующий белок супрессора сайленсинга.In an embodiment, the plant cell, plant, or plant part comprises an exogenous polynucleotide encoding a silencing suppressor protein.

Посттранскрипциональный сайленсинг гена (ПТСГ) представляет собой специфичный для последовательности нуклеотидов механизм защиты, который может быть нацелен как на клеточные, так и на вирусные мРНК с целью разложения. ПТСГ возникает в растениях или грибах, стабильно или временно трансформированных чужеродной (гетерологичной) или эндогенной ДНК, и приводит к уменьшению аккумуляции молекул РНК, последовательность которых сходна с введенной нуклеиновой кислотой.Post-transcriptional gene silencing (PTSG) is a nucleotide sequence-specific defense mechanism that can target both cellular and viral mRNAs for degradation. PTSH occurs in plants or fungi that are stably or temporarily transformed by foreign (heterologous) or endogenous DNA, and leads to a decrease in the accumulation of RNA molecules, the sequence of which is similar to the introduced nucleic acid.

Широко изучен тот факт, что соэкспрессия супрессора сайленсинга с целевым трансгеном будет повышать уровни присутствующей в клетке РНК, которая транскрибирована из трансгена. Хотя это доказанный факт для клеток in vitro, значимые побочные эффекты наблюдаются во многих исследованиях соэкспрессии в цельных растениях. Более конкретно, как описано в Mallory et al. (2002), Chapman et al. (2004), Chen et al. (2004), Dunoyer et al. (2004), Zhang et al. (2006), Lewsey et al. (2007) и Meng et al. (2008) растения, экспрессирующие супрессоры сайленсинга, в общем под контролем конститутивных промоторов, часто являются фенотипически аномальными до такой степени, что они непригодны для коммерческого производства.It has been widely studied that co-expression of the silencing suppressor with the target transgene will increase the levels of RNA present in the cell, which is transcribed from the transgene. Although this is a proven fact for cells in vitro, significant side effects have been observed in many co-expression studies in whole plants. More specifically, as described in Mallory et al. (2002), Chapman et al. (2004), Chen et al. (2004), Dunoyer et al. (2004), Zhang et al. (2006), Lewsey et al. (2007) and Meng et al. (2008) plants expressing silencing suppressors, generally under the control of constitutive promoters, are often phenotypically abnormal to the point of being unsuitable for commercial production.

- 43 037184- 43 037184

Недавно было обнаружено, что уровни молекул РНК могут быть увеличены и/или уровни молекул РНК могут быть стабилизированы на протяжении множества поколений посредством ограничения экспрессии супрессора сайленсинга семенем растения или его частью (WO2010/057246). В настоящем документе белок-супрессор сайленсинга или БСС представляет собой любой полипептид, который может экспрессироваться в клетке растения, что повышает уровень продукта экспрессии другого трансгена в клетке растения, особенно в последующих поколениях, полученных от изначально трансформированного растения. В варианте реализации БСС представляет собой вирусный супрессор сайленсинга или его мутант. Большое количество вирусных супрессоров сайленсинга известно из уровня техники и включает, без ограничения, Р19, V2, Р38, Ре-Ро и RPV-P0. В варианте реализации вирусный супрессор сайленсинга содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 38, ее биологически активный фрагмент, или последовательность аминокислот по меньшей мере на 50% идентичную SEQ ID NO: 38, которая дополнительно обладает активностью супрессора сайленсинга.It has recently been found that the levels of RNA molecules can be increased and / or the levels of RNA molecules can be stabilized over multiple generations by limiting the expression of the silencing suppressor by the plant seed or part of it (WO2010 / 057246). As used herein, a silencing suppressor protein or BSS is any polypeptide that can be expressed in a plant cell that increases the level of the expression product of another transgene in the plant cell, especially in subsequent generations from the initially transformed plant. In an embodiment, BCC is a viral silencing suppressor or a mutant thereof. A large number of viral silencing suppressors are known in the art and include, but are not limited to, P19, V2, P38, Pe-Po, and RPV-P0. In an embodiment, the viral silencing suppressor comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, a biologically active fragment thereof, or an amino acid sequence at least 50% identical to SEQ ID NO: 38, which further has a silencing suppressor activity.

В настоящем документе термины стабилизирующий экспрессию стабильно экспрессируемый, стабилизированная экспрессия и их вариации обозначают уровень молекулы РНК, по существу такой же или превышающий уровень в растениях-потомках на протяжении следующих поколений, например по меньшей мере 3, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 поколений, по сравнению с изогенными растениями, которые не содержат экзогенного полинуклеотида, кодирующего супрессор сайленсинга. Однако данный(ые) термин(ы) не исключае(ю)т возможности некоторого снижения уровней молекулы РНК в следующих поколениях, по сравнению с предыдущим поколением, например снижение не менее 10% на поколение.As used herein, the terms expression stabilizing, stably expressed, stabilized expression and their variations mean the level of the RNA molecule substantially the same or higher than the level in the offspring plants over the next generations, for example at least 3, at least 5 or at least 10 generations, compared to isogenic plants that do not contain an exogenous polynucleotide encoding a silencing suppressor. However, this term (s) does not exclude the possibility of some decrease in the levels of the RNA molecule in the next generations, compared with the previous generation, for example, a decrease of at least 10% per generation.

Супрессор может быть выбран из любого источника, например растения, вируса, млекопитающего, и т.п.; см. WO2010/057246 относительно перечня вирусов, из которых может быть получен супрессор и обозначения белка (например, В2, Р14 и т.д.) или кодирующего участка для супрессора из каждого конкретного вируса. Множественные копии супрессора могут быть использованы. Различные супрессоры могут использоваться совместно (например, в тандеме).The suppressor can be selected from any source, for example, a plant, virus, mammal, and the like; see WO2010 / 057246 for a list of viruses from which a suppressor can be derived and designating a protein (eg, B2, P14, etc.) or coding region for a suppressor from each particular virus. Multiple copies of the suppressor can be used. Various suppressors can be used together (eg in tandem).

Молекулы РНК.RNA molecules.

По существу любая молекула РНК, которую желательно экспрессировать в семени растения, может быть соэкспрессирована с супрессором сайленсинга. Кодируемые полипептиды могут принимать участие в метаболизме масла, крахмала, углеводов, питательных веществ и т.п. или могут быть ответственными за синтез белков, пептидов, жирных кислот, липидов, восков, масел, крахмалов, сахара, углеводов, вкусоароматических веществ, ароматических веществ, токсинов, каротиноидов, гормонов, полимеров, флавоноидов, запасаемых белков, феноловых кислот, алкалоидов, лигнина, таннинов, целлюлозы, гликопротеинов, гликолипидов и т.д., предпочтительно биосинтез или сборку ТАГ.Essentially any RNA molecule that is desired to be expressed in a plant seed can be co-expressed with a silencing suppressor. The encoded polypeptides can be involved in the metabolism of oil, starch, carbohydrates, nutrients, and the like. or may be responsible for the synthesis of proteins, peptides, fatty acids, lipids, waxes, oils, starches, sugar, carbohydrates, flavors, aromas, toxins, carotenoids, hormones, polymers, flavonoids, stored proteins, phenolic acids, alkaloids, lignin , tannins, cellulose, glycoproteins, glycolipids, etc., preferably TAG biosynthesis or assembly.

В конкретном примере растения вырабатывают повышенные уровни ферментов для продуцирования масла в растениях, например видах Brassica, таких как рапс, или подсолнечнике, сафлоре, льне, хлопчатнике, соевом бобе, Camelina или маисе.In a specific example, plants produce increased levels of enzymes to produce oil in plants, for example Brassica species such as rapeseed, or sunflower, safflower, flax, cotton, soybean, Camelina, or maize.

Уровни выработки ДЦ-ПНЖК.Production levels of DC-PUFA.

Уровни ДЦ-ПНЖК или комбинации ДЦ-ПНЖК, вырабатываемые в рекомбинантной клетке или части растения, например семени, имеют большое значение. Уровни могут быть выражены, как состав (в процентах) общих жирных кислот, которые представляют собой конкретные ДЦ-ПНЖК или группу родственных ДЦ-ПНЖК, например ω3 ДЦ-ПНЖК или ω6 ДЦ-ПНЖК, или ОДЦ-ПНЖК, или другие, что может быть определено способами, известными из уровня техники. Кроме того, уровень может быть выражен, как содержание ДЦ-ПНЖК, например как процент ДЦ-ПНЖК в сухой массе материала, содержащего рекомбинантные клетки, например процент от массы семени, который представляет ДЦ-ПНЖК. Необходимо понимать, что уровень ДЦ-ПНЖК, вырабатываемой в масличной культуре, может быть значительно более высоким в показателях содержания ДЦ-ПНЖК, чем в овоще или семени, которое не выращивалось для целей получения масла, хотя оба могут иметь сходный состав ДЦ-ПНЖК и оба могут использоваться в качестве источников ДЦ-ПНЖК для потребления человеком или животным.The levels of DC-PUFA or a combination of DC-PUFA produced in a recombinant cell or plant part, such as a seed, are of great importance. Levels can be expressed as a composition (percentage) of total fatty acids, which are specific DC-PUFAs or a group of related DC-PUFAs, for example ω3 DC-PUFA or ω6 DC-PUFA, or ODC-PUFA, or others, which may be determined by methods known in the art. In addition, the level can be expressed as the content of DC-PUFA, for example, as the percentage of DC-PUFA in the dry weight of the material containing recombinant cells, for example, the percentage of the weight of the seed, which is DC-PUFA. It should be understood that the level of DC-PUFA produced in an oilseed crop can be significantly higher in terms of DC-PUFA content than in a vegetable or seed that was not grown for oil production, although both may have a similar composition of DC-PUFA and both can be used as sources of DC-PUFA for human or animal consumption.

Уровни ДЦ-ПНЖК могут быть определены любым из способов, известных в данной области. В предпочтительном способе общий липид извлекают из клеток, тканей или организмов, и жирную кислоту превращают в метиловые эфиры перед анализом газовой хроматографией (ГХ). Такие методы описаны в примере 1. Положение пика на хроматограмме может использоваться для идентификации каждой конкретной жирной кислоты, и площадь каждого пика интегрируют для определения количества. В настоящем документе, если не указано иное, процент конкретной жирной кислоты в образце определяют, выражая площадь пика указанной жирной кислоты как процент от общей площади пиков жирных кислот на хроматограмме. По существу, это соответствует массовому проценту (мас./мас.). Идентичность жирных кислот может быть подтверждена ГХ-МС. Общие липиды могут быть выделены методами, известными из уровня техники, для очистки фракций, например фракции ТАГ. Например, тонкослойная хроматография (ТСХ) может быть выполнена в аналитическом масштабе, чтобы отделить ТАГ от других фракций липида, таких как ДАГ, ацил-КоА или фосфолипид, для того, чтобы определить состав жирных кислот конкретно для ТАГ.DC-PUFA levels can be determined by any of the methods known in the art. In a preferred method, the total lipid is recovered from cells, tissues or organisms and the fatty acid is converted to methyl esters prior to analysis by gas chromatography (GC). Such methods are described in Example 1. The position of the peak on the chromatogram can be used to identify each specific fatty acid, and the area of each peak is integrated to determine the amount. In this document, unless otherwise indicated, the percentage of a particular fatty acid in a sample is determined by expressing the peak area of the indicated fatty acid as a percentage of the total fatty acid peak area in the chromatogram. Essentially, this corresponds to the weight percentage (w / w). The identity of the fatty acids can be confirmed by GC-MS. Total lipids can be isolated by methods known in the art to purify fractions, eg, TAG fractions. For example, thin layer chromatography (TLC) can be performed on an analytical scale to separate TAG from other lipid fractions such as DAG, acyl-CoA or phospholipid, in order to determine the fatty acid composition specifically for TAG.

В одном варианте реализации общая сумма АРК, ЭПК, ДНК и ДГК в жирных кислотах экстрагиро- 44 037184 ванного липида составляет от около 21 до около 40% общих жирных кислот в клетке. В дальнейшем варианте реализации общие жирных кислот в клетке содержат менее 1% С20:1. В предпочтительных вариантах реализации экстрагируемый ТАГ в клетке содержит жирных кислот в количествах, указанных в настоящем документе. Каждая из возможных комбинаций признаков, определяющих липид, раскрытый в настоящем документе, также включена.In one embodiment, the total sum of ARA, EPA, DNA and DHA in the fatty acids of the extracted lipid is about 21 to about 40% of the total fatty acids in the cell. In a further embodiment, the total fatty acids in the cell contain less than 1% C20: 1. In preferred embodiments, the extractable TAG in the cell contains fatty acids in the amounts specified herein. Each of the possible combinations of lipid defining traits disclosed herein is also included.

Дополнительно, уровень выработки ДЦ-ПНЖК в рекомбинантной клетке, растении или части растения, например семени, может быть выражен как процент превращения конкретного жирнокислотного субстрата в один или более жирнокислотных продуктов, который в настоящем документе дополнительно носит название эффективности превращения или эффективности фермента. Данный параметр основан на жирнокислотном составе липида, экстрагированного из клетки, растения, части растения или семени, т.е. количестве образованной ДЦ-ПНЖК (в том числе другой ДЦ-ПНЖК, полученной из нее), выраженном как процент от одного или более жирнокислотных субстратов (в том числе все другие жирные кислоты, полученные из него). Общая формула для процента превращения: 100 х (сумма процентов продукта ДЦ-ПНЖК и всех продуктов, полученных из него)/(сумма процентов жирнокислотного субстрата и всех продуктов, полученных из него). Относительно ДПК, например, это может быть выражено как соотношение уровня ДПК (в виде процента от общего содержания жирных кислот в липиде) к уровню жирнокислотного субстрата (например ОК, ЛК, АЛК, СДК, ЭТК или ЭПК) и всех продуктов, включая ДПК, полученных из субстрата. Процент превращения или эффективность превращения могут быть выражены для единой ферментной стадии в пути, а также для части или целого пути.Additionally, the level of DC-PUFA production in a recombinant cell, plant, or plant part, such as a seed, can be expressed as the percent conversion of a particular fatty acid substrate to one or more fatty acid products, which is further referred to herein as conversion efficiency or enzyme efficiency. This parameter is based on the fatty acid composition of a lipid extracted from a cell, plant, plant part or seed, i.e. the amount of DC-PUFA formed (including other DC-PUFA derived from it), expressed as a percentage of one or more fatty acid substrates (including all other fatty acids derived from it). The general formula for the percent conversion: 100 x (the sum of the percentages of the DC-PUFA product and all products derived from it) / (the sum of the percent of the fatty acid substrate and all products derived from it). With respect to DPC, for example, this can be expressed as the ratio of the level of DPC (as a percentage of the total fatty acids in the lipid) to the level of the fatty acid substrate (e.g. TC, LA, ALA, SDA, ETA, or EPA) and all products including DPC. obtained from the substrate. The percent conversion or conversion efficiency can be expressed for a single enzymatic step in the pathway, as well as for part or all of the pathway.

Специфическая эффективность превращения вычислена в настоящем документе по следующим формулам.Specific conversion efficiencies are calculated herein using the following formulas.

1. ОК в ДПК = 100 х (%ДГК+%ДПК)/(сумма% для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).1. OK in WPC = 100 x (% DHA +% WPC) / (sum% for OK, LC, GLA, DGLK, ARK, EDK, ALA, SDK, ETRK, ETC, EPA, DPK and DHA).

2. ЛК в ДПК = 100 х (%ДГК+ДПК)/(сумма% для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).2. LA in WPC = 100 x (% DHA + WPC) / (sum% for LA, GLA, DGLA, ARA, EDC, ALA, SDK, ETRK, ETK, EPA, DPA and DHA).

3. АЛК в ДПК = 100 х (%ДГК+%ДПК)/(сумма% для АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).3. ALA in WPC = 100 x (% DHA +% WPC) / (sum% for ALA, SDK, ETRK, ETC, EPA, WPC and DHA).

4. ЭПК в ДПК = 100 х (%ДГК+ДПК)/(сумма% для ЭПК, ДПК и ДГК).4. EPA in DPA = 100 x (% DHA + DPA) / (sum% for EPA, DPA and DHA).

5. ДПК в ДГК (эффективность Δ4-десатуразы) = 100 х (%ДГК)/(сумма% для ДПК и ДГК).5. DPA in DHA (efficiency of Δ4-desaturase) = 100 x (% DHA) / (sum% for DPA and DHA).

6. Эффективность Δ12-десатуразы = 100 х (сумма% для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма% для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).6. Efficiency of Δ12-desaturase = 100 x (sum% for LA, GLA, DGLA, ARA, EDK, ALA, SDK, ETRK, ETC, EPA, DPK and DHA) / (sum% for OK, LC, GLA, DGLK, ARK, EDK, ALK, SDK, ETRK, ETC, EPK, DPK and DHK).

7. Эффективность ω3-десатуразы = 100 х (сумма% для АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма% ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).7. Efficiency of ω3-desaturase = 100 x (sum% for ALA, SDK, ETRK, ETK, EPA, DPA and DHA) / (sum% LA, GLA, DGLK, ARA, EDK, ALK, SDK, ETRK, ETC, EPA , DPK and DHA).

8. ОК в АЛК = 100 х (сумма% для АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма% для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЭДК, АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).8. OK in ALK = 100 x (sum% for ALK, SDK, ETRK, ETK, EPK, DPK and DHK) / (sum% for OK, LC, GLK, DGLK, ARK, EDK, ALK, SDK, ETRK, ETC , EPA, DPA and DHA).

9. Эффективность Δ6-десатуразы (на ω3 субстрате АЛК) = 100 х (сумма% для СДК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(% АЛК, СДК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).9. Efficiency of Δ6-desaturase (on ω3 substrate ALA) = 100 x (sum% for SDA, ETC, EPA, DPA and DHA) / (% ALA, SDC, ETRC, ETC, EPA, DPA and DHA).

10. Эффективность Δ6-элонгазы (на ω3 субстрате СДК) = 100 х (сумма% для ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма% для СДК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).10. Efficiency of Δ6-elongase (on ω3 substrate SDK) = 100 x (sum% for ETC, EPA, DPA and DHA) / (sum% for SDC, ETC, EPA, DPA and DHA).

11. Эффективность Δ5-десатуразы (на ω3 субстрате ЭТК) = 100 х (сумма% для ЭПК, ДПК и ДГК)/(сумма % для ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК).11. The efficiency of Δ5-desaturase (on ω3 substrate ETA) = 100 x (sum% for EPA, DPA and DHA) / (sum% for ETA, EPA, DPA and DHA).

12. Эффективность Δ5-элонгазы (на ω3 субстрате ЭПК) = 100 х (сумма% для ДПК и ДГК)/(сумма% для ЭПК, ДПК и ДГК).12. Efficiency of Δ5-elongase (on ω3 EPA substrate) = 100 x (sum% for DPA and DHA) / (sum% for EPA, DPA and DHA).

Жирнокислотный состав липида, предпочтительно масла из семян, по изобретению также отличается соотношением ω6 жирных кислот:ω3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот, для любых общих ω6 жирных кислот:общих ω3 жирных кислот или для новых ω6 жирных кислот: ω3 новых жирных кислот. Термины общие ω6 жирные кислоты, общие ω3 жирные кислоты, новые ω6 жирные кислоты и новые ω 3 жирные кислоты имеют значения, определенные в настоящем документе. Соотношения вычисляют на основе состава жирных кислот в липиде, экстрагированном из клетки, растения, части растения или семени липида, способом, пример которого приведен в настоящем документе. Желательно присутствие в липиде более высокого уровня ω3 жирных кислот, чем ω6 жирных кислот, и таким образом соотношение ω6: ω3 менее 1,0 является предпочтительным. Соотношение 0,0 указывает на полное отсутствие определенных ω6 жирных кислот; соотношение 0,03 было достигнуто. Такие низкие значения соотношения могут быть достигнуты посредством сочетанного использования Δ6-десатуразы с предпочтением в отношении субстрата ω3, вместе с ω3-десатуразой, особенно грибковой ω3-десатуразой, такой как ω3-десатураза Pichia pastoris, пример которого приведен в настоящем документе.The fatty acid composition of the lipid, preferably seed oil, according to the invention is also characterized by the ratio ω6 fatty acids: ω3 fatty acids in total fatty acids, for any total ω6 fatty acids: total ω3 fatty acids or for new ω6 fatty acids: ω3 new fatty acids. The terms total ω6 fatty acids, total ω3 fatty acids, new ω6 fatty acids and new ω 3 fatty acids have the meanings defined herein. The ratios are calculated based on the fatty acid composition of a lipid extracted from a cell, plant, plant part or seed lipid, in a manner exemplified herein. It is desirable for the lipid to have a higher level of ω3 fatty acids than ω6 fatty acids, and thus an ω6: ω3 ratio of less than 1.0 is preferred. A ratio of 0.0 indicates the complete absence of certain ω6 fatty acids; a ratio of 0.03 has been achieved. Such low ratios can be achieved by the combined use of Δ6 desaturase with preference for substrate ω3, together with ω3 desaturase, especially fungal ω3 desaturase such as Pichia pastoris ω3 desaturase exemplified herein.

Дополнительно, выход ДЦ-ПНЖК на массу семени может быть вычислен на основании общего содержания масла в семени и % ДПК в масле. Например, если содержание масла в семени рапса составляет около 40% (мас./мас.) и около 12% от общего содержания жирных кислот в масле составляет ДПК, то содержание ДПК в семени составляет около 4,8% или около 48 мг на 1 г семени. При содержании ДПКAdditionally, the yield of DC-PUFA per seed weight can be calculated based on the total oil content of the seed and the% WPC in oil. For example, if the oil content of rapeseed is about 40% (w / w) and about 12% of the total fatty acids in the oil is WPC, then the WPC content of the seed is about 4.8%, or about 48 mg per 1 g seed. With the content of the WPC

- 45 037184 около 21% семя рапса или семя Camelina sativa имеет уровень ДПК около 84 мг на 1 г семени. В настоящем изобретении таким образом раскрываются растения Brassica napus, В. juncea и Camelina sativa, и полученные из них семена, которые содержат по меньшей мере около 80 мг или по меньшей мере около 84 мг ДПК на 1 г семени. Содержание влажности в семени стандартное для собранного в процессе сбора урожая зрелого семени после сушки (4-15% влажности). В изобретении также раскрывается способ получения масла, включающий получение семени и извлечение масла из семени, применение масла и способы получения семени, включающие сбор урожая семян с растений по изобретению.- 45 037184 about 21% rapeseed or Camelina sativa seed has a DPK level of about 84 mg per gram of seed. The present invention thus discloses the plants of Brassica napus, B. juncea and Camelina sativa, and the seeds obtained therefrom, which contain at least about 80 mg or at least about 84 mg of WPC per gram of seed. The moisture content in the seed is standard for the mature seed harvested during the harvest after drying (4-15% moisture). The invention also discloses a method for producing an oil comprising obtaining a seed and extracting oil from a seed, using the oil, and methods for producing a seed comprising harvesting seeds from the plants of the invention.

Кроме того, может быть вычислено количество ДПК, вырабатываемое на 1 га, если выход семени с гектара известен или может быть оценен. Например, рапс в Австралии обычно дает около 2,5 т семени на 1 га, что при содержании масла 40% дает около 1000 кг масла. При содержании ДПК 20,1% в конечном масле, это обеспечивает около 200 кг ДПК на 1 га. Если содержание масла снижается на 50%, это все еще обеспечивает около 100 кг ДПК на 1 га.In addition, the amount of WPC produced per hectare can be calculated if the seed yield per hectare is known or can be estimated. For example, rapeseed in Australia usually yields about 2.5 tonnes of seed per hectare, which with an oil content of 40% yields about 1000 kg of oil. With a WPC content of 20.1% in the final oil, this provides about 200 kg WPC per 1 ha. If the oil content is reduced by 50%, this still provides about 100 kg of WPC per hectare.

Полученные на сегодняшний день доказательства свидетельствуют о том, что некоторые десатуразы, гетерологично экспрессируемые в дрожжах или растениях, обладают относительно низкой активностью в комбинации с некоторыми элонгазами. Данную ситуацию можно улучшить, придавая десатуразе способность использовать форму ацил-КоА жирной кислоты в качестве субстрата в синтезе ДЦ-ПНЖК, и это считается предпочтительным в рекомбинантных клетках, особенно в клетках растения. Особенно предпочтительная комбинация для эффективного синтеза ДПК представляет собой грибковую ω3десатуразу, например, такую как ω3-десатураза Pichia pastoris (SEQ ID NO: 6), которая представляет собой Δ6-десатуразу с предпочтением в отношении ω3 ацильных субстратов, например, такую как Δ6десатураза Micromonas pusilla (SEQ ID NO: 9), или ее варианты с идентичностью последовательности аминокислот по меньшей мере 95%.Evidence to date suggests that some desaturases expressed heterologously in yeast or plants have relatively low activity in combination with some elongases. This situation can be improved by giving desaturase the ability to use the acyl-CoA form of the fatty acid as a substrate in the synthesis of DC-PUFA, and this is considered preferable in recombinant cells, especially in plant cells. A particularly preferred combination for efficient DPC synthesis is fungal ω3 desaturase, such as, for example, Pichia pastoris ω3 desaturase (SEQ ID NO: 6), which is a Δ6 desaturase with preference for ω3 acyl substrates, such as Micromonas pusilla Δ6 desaturase (SEQ ID NO: 9), or variants thereof with at least 95% amino acid sequence identity.

В настоящем документе термин по существу не содержащий означает, что композиция (например, липид или масло) содержит небольшое количество (например, менее чем около 0,5%, менее чем около 0,25%, менее чем около 0,1% или менее чем около 0,01%) или не содержит определенного компонента. В варианте реализации по существу не содержащий означает, что компонент невозможно обнаружить с помощью шаблонной методики анализа, например конкретная жирная кислота (например, ω6докозапентаеновая кислота) не может быть обнаружена с помощью газовой хроматографии, как в общих чертах описано в примере 1.As used herein, the term substantially free means that the composition (e.g., lipid or oil) contains a small amount (e.g., less than about 0.5%, less than about 0.25%, less than about 0.1% or less than about 0.01%) or does not contain a specific component. In an embodiment, substantially free means that the component cannot be detected using a routine assay method, for example, a particular fatty acid (e.g., ω6 doocosapentaenoic acid) cannot be detected using gas chromatography, as outlined in Example 1.

В варианте реализации изобретения экстрагированный липид, экстрагированное масло, растение или его часть, такая как семя (по изобретению или применяемое в процессе/способе по изобретению), продукт питания или композиция по изобретению не содержит все-цис-6,9,12,15,18генэйкозапентаеновой кислоты (n-3 ГПК).In an embodiment of the invention, the extracted lipid, extracted oil, plant or part thereof, such as a seed (according to the invention or used in the process / method according to the invention), food or composition according to the invention does not contain all-cis-6,9,12,15 , 18geneicosapentaenoic acid (n-3 HPA).

Получение масел.Obtaining oils.

Способы, которые шаблонно практикуются в данной области, могут применяться для выделения, обработки и анализа масел, продуцированных клетками, растениями, семенами и т.п., по настоящему изобретению. Обычно семени растения термически обрабатывают, прессуют и экстрагируют, чтобы продуцировать неочищенное масло, которое далее дегуммируют, рафинируют, отбеливают и дезодорируют. В общем, методы измельчения семени известны из уровня техники. Например, семена масличных культур могут быть смягчены посредством обрызгивания их водой для повышения содержания влажности, например, до 8,5%, и провальцованы с помощью гладкого валика с щелями размером 0,23-0,27 мм. В зависимости от вида семени, перед измельчением можно не добавлять воду. Применение нагревания инактивирует ферменты, облегчает дальнейший разрыв клетки, объединение масляных капелек, и обеспечивает агломерацию частиц белка, все из этого упрощают процесс экстракции.Methods that are routinely practiced in the art can be used to isolate, process, and analyze oils produced by cells, plants, seeds, and the like, according to the present invention. Typically, plant seeds are thermally treated, pressed and extracted to produce a crude oil that is further degummed, refined, bleached and deodorized. In general, seed grinding techniques are known in the art. For example, oilseeds can be softened by spraying them with water to increase the moisture content, for example to 8.5%, and rolled with a smooth roller with 0.23-0.27 mm gaps. Depending on the type of seed, you may not need to add water before grinding. Applying heat inactivates enzymes, facilitates further cell rupture, pooling of oil droplets, and agglomeration of protein particles, all of which simplify the extraction process.

В варианте реализации большинство масла из семени высвобождается при пропускании сквозь винтовой пресс. Жмых, выходящий из винтового пресса, в дальнейшем экстрагируют, например, гексаном, с использованием колонки с сопроводительным теплоконтролем. Альтернативно, неочищенное масло, полученное в ходе операции прессования, может быть пропущено сквозь резервуар для осаждения с проволочным дренажным верхом с прорезями, чтобы удалить твердые вещества, которые попадают в масло в ходе операции прессования. Осветленное масло может быть пропущено сквозь рамный и фильтр-пресс для удаления любых оставшихся тонких механических включений. При желании, масло после процесса экстракции может быть объединено с осветленным маслом, с получением смешанного сырого масла.In an embodiment, most of the seed oil is released when passed through a screw press. The cake leaving the screw press is further extracted, for example, with hexane, using a column with an accompanying heat control. Alternatively, the crude oil obtained from the pressing operation can be passed through a slotted wire-top sedimentation tank to remove solids that enter the oil during the pressing operation. The clarified oil can be passed through a frame and filter press to remove any remaining fine solids. If desired, the oil after the extraction process can be combined with the clarified oil to form a blended crude oil.

Как только растворитель десорбирован из неочищенного масла, прессованные и экстрагированные порции объединяют и обрабатывают обычными процедурами обработки масла. В настоящем документе термин очищенный, используемый в связи с липидом или маслом по изобретению, обычно означает, что экстрагированный липид или масло прошли одну или более стадий обработки, которые повышают степень чистоты липидного/масляного компонента. Например, стадия очистки может включать одно или более или все из группы, состоящей из дегуммирования, дезодорирования, отбеливания, сушки и/или фракционирования экстрагированного масла. Однако в настоящем документе термин очищенный не включает процесс переэтерификации или другой процесс, модифицирующий состав жирных кислот липида или масла по изобретению для увеличения содержания ДПК как процента от общего содержанияOnce the solvent has been stripped from the crude oil, the compressed and extracted portions are combined and processed with conventional oil processing procedures. As used herein, the term refined as used in connection with a lipid or oil of the invention generally means that the extracted lipid or oil has undergone one or more processing steps that increase the purity of the lipid / oil component. For example, the purification step can include one or more or all of the group consisting of degumming, deodorizing, bleaching, drying, and / or fractionating the extracted oil. However, as used herein, the term purified does not include a transesterification process or other process that modifies the fatty acid composition of a lipid or oil of the invention to increase WPC content as a percentage of total content.

- 46 037184 жирных кислот. Другими словами, состав жирных кислот очищенного липида или масла по существу такой же, как состав неочищенного липида или масла.- 46 037184 fatty acids. In other words, the fatty acid composition of the purified lipid or oil is substantially the same as the composition of the crude lipid or oil.

Дегуммирование.Degumming.

Дегуммирование представляет собой раннюю стадию рафинации масел, и его основная цель состоит в удалении из масла большинства фосфолипидов, которые могут присутствовать, как около 1-2% от общего экстрагированного липида. Добавление к неочищенному маслу ~2% воды, обычно содержащей фосфорную кислоту, при 70-80°С приводит к отделению большинства фосфолипидов, в сопровождении следовых металлов и пигментов. Нерастворимый материал, который удаляется, в основном представляет собой смесь фосфолипидов и триацилглицеридов, и также известен как лецитин. Дегуммирование может выполняться посредством добавления концентрированной фосфорной кислоты к неочищенному маслу из семян, чтобы перевести неспособные к гидратации фосфатиды в способную к гидратации форму, и образовать хелаты металлов, которые присутствуют в незначительных количествах. Смолу отделяют от масла из семян центрифугированием.Degumming is an early stage in the refining of oils, and its main purpose is to remove most phospholipids from the oil, which may be present as about 1-2% of the total extracted lipid. The addition of ~ 2% of water, usually containing phosphoric acid, to the crude oil at 70-80 ° C leads to the separation of most phospholipids, accompanied by trace metals and pigments. The insoluble material that is removed is mainly a mixture of phospholipids and triacylglycerides, and is also known as lecithin. Degumming can be performed by adding concentrated phosphoric acid to the crude seed oil to convert the incapable of hydration phosphatides into a hydratable form and form metal chelates that are present in minor amounts. The resin is separated from the seed oil by centrifugation.

Щелочная рафинация.Alkaline refining.

Щелочная рафинация представляет собой один из способов очистки для обработки неочищенного масла, который иногда также называют нейтрализацией. Она обычно следует за дегуммированием и предшествует отбеливанию. После дегуммирования, масло из семян может быть обработано добавлением достаточного количества раствора щелочи, чтобы оттитровать все жирные кислоты и фосфорные кислоты, с последующим удалением образовавшегося мыла. Подходящие щелочные материалы включают натрия гидроксид, калия гидроксид, натрия карбонат, лития гидроксид, кальция гидроксид, кальция карбонат и аммония гидроксид. Данный способ обычно осуществляют при комнатной температуре с удалением фракции свободных жирных кислот. Мыло удаляют центрифугированием или экстракцией в растворитель для мыла, и нейтрализованное масло промывают водой. При необходимости, избыток щелочи в масле может быть нейтрализован подходящей кислотой, такой как хлористоводородная кислота или серная кислота.Alkaline refining is one of the refining methods for processing crude oil, sometimes also referred to as neutralization. It usually follows degumming and precedes bleaching. After degumming, the seed oil can be processed by adding enough alkali solution to titrate all fatty acids and phosphoric acids, and then removing the resulting soap. Suitable alkaline materials include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, lithium hydroxide, calcium hydroxide, calcium carbonate, and ammonium hydroxide. This process is usually carried out at room temperature to remove the free fatty acid fraction. The soap is removed by centrifugation or extraction in a soap solvent and the neutralized oil is washed with water. If necessary, excess alkali in the oil can be neutralized with a suitable acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid.

Отбеливание.Whitening.

Отбеливание представляет собой способ очистки, при котором масла нагревают до 90-120°С, выдерживая при этой температуре в течение 10-30 мин в присутствии отбеливающей глины (0,2-2,0%) и в отсутствие кислорода, в атмосфере азота или пара или в вакууме. Данная стадия обработки масла разработана таким образом, чтобы удалять нежелательные пигменты (каротиноиды, хлорофилл, госсипол, и т.д.), причем способ дополнительно удаляет продукты окисления, следовые металлы, соединения серы и следы мыла.Bleaching is a cleaning method in which oils are heated to 90-120 ° C, holding at this temperature for 10-30 minutes in the presence of bleaching clay (0.2-2.0%) and in the absence of oxygen, in a nitrogen atmosphere or steam or in a vacuum. This stage of oil treatment is designed to remove unwanted pigments (carotenoids, chlorophyll, gossypol, etc.), and the process further removes oxidation products, trace metals, sulfur compounds and traces of soap.

Дезодорирование.Deodorization.

Дезодорирование представляет собой обработку масел и жиров при высокой температуре (200260°С) и низком давлении (0,1-1 мм рт. ст.). Это обычно достигается посредством введения пара в масло из семян со скоростью около 0,1 мл/мин/100 мл масла из семян. Около через 30 мин орошения, маслу из семян дают остыть под вакуумом. Масло из семян обычно переносят в стеклянный контейнер и пропускают аргон, после чего хранят при низких температурах. Такая обработка улучшает цвет масла из семян и удаляет большинство летучих субстанций или пахучих соединений, включая оставшиеся свободные жирные кислоты, моноацилглицериды и продукты окисления.Deodorization is the treatment of oils and fats at high temperatures (200-260 ° C) and low pressure (0.1-1 mm Hg). This is usually achieved by injecting steam into the seed oil at a rate of about 0.1 ml / min / 100 ml of seed oil. After about 30 minutes of irrigation, the seed oil is allowed to cool under vacuum. The seed oil is usually transferred to a glass container and sparged with argon and then stored at low temperatures. This treatment improves the color of the seed oil and removes most volatile substances or odors, including residual free fatty acids, monoacylglycerides and oxidation products.

Винтеризация.Winterization.

Винтеризация представляет собой способ, иногда применяемый в коммерческом производстве масел с целью разделения масел и жиров на твердые (стеарин) и жидкие (олеин) фракции посредством кристаллизации при температурах ниже температуры окружающей среды. Первоначально его применяли к хлопковому маслу для получения продукта, не содержащего твердых веществ. Обычно данный способ применяют для уменьшения содержания насыщенных жирных кислот в масле.Winterization is a process sometimes used in the commercial production of oils for the purpose of separating oils and fats into solid (stearin) and liquid (olein) fractions by crystallization at temperatures below ambient temperature. It was originally applied to cottonseed oil to produce a solid-free product. Typically, this method is used to reduce the saturated fatty acid content of the oil.

Переэтерификация.Transesterification.

В данном документе переэтерификация обозначает способ обмена жирных кислот в пределах и между ТАГ или переноса жирных кислот на другой спирт с образованием эфира. Это может включать первичное высвобождение жирных кислот из ТАГ в форме свободных жирных кислот или прямое получение эфиров жирных кислот, предпочтительно метиловых эфиров или этиловых эфиров жирных кислот. В ходе реакции переэтерификации ТАГ со спиртом, таким как метанол или этанол, алкильная группа спирта образует эфирную связь с ацильными группами (включая ДПК) ТАГ. В случае сочетания со способом фракционирования, переэтерификация может применяться для модификации жирнокислотного состава липидов (Marangoni et al., 1995). Для переэтерификации могут использоваться химические (например, катализируемые сильной кислотой или основанием), или ферментные средства, причем последние включают липазы, которые могут быть специфичными для положения (sn-1/3 или sn-2 специфичными) жирной кислоты в ТАГ, или с предпочтением в отношении некоторых жирных кислот по сравнению с другими (Speranza et al., 2012). Фракционирование жирных кислот, с целью повышения концентрации ДЦ-ПНЖК в масле может быть осуществлено любым из способов, известных из уровня техники, таких как, например, кристаллизация вымораживанием, образование комплексов с использованием мочевины, молекулярная дистилляция, экстракция сверхкритической жидкостью, противоточная хроматография иIn this document, transesterification means a method of exchanging fatty acids within and between TAGs or transferring fatty acids to another alcohol to form an ester. This may include the primary release of fatty acids from the TAG in the form of free fatty acids or the direct production of fatty acid esters, preferably methyl esters or fatty acid ethyl esters. During the transesterification reaction of the TAG with an alcohol such as methanol or ethanol, the alkyl group of the alcohol forms an ester bond with the acyl groups (including DPA) of the TAG. When combined with a fractionation method, transesterification can be used to modify the fatty acid composition of lipids (Marangoni et al., 1995). For transesterification, chemical (for example, catalyzed by a strong acid or base) or enzymatic agents can be used, the latter including lipases, which can be specific for the position (sn-1/3 or sn-2 specific) of the fatty acid in the TAG, or with preference for some fatty acids versus others (Speranza et al., 2012). Fractionation of fatty acids in order to increase the concentration of DC-PUFA in oil can be carried out by any of the methods known in the art, such as, for example, freeze crystallization, complexation using urea, molecular distillation, supercritical fluid extraction, countercurrent chromatography, and

- 47 037184 образование комплексов с ионом серебра. Образование комплексов с мочевиной является предпочтительным способом вследствие его простоты и эффективности с точки зрения снижения уровня насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в масле (Gamez et al., 2003). Вначале ТАГ в масле расщепляют на составляющие жирные кислоты, часто в форме эфиров жирных кислот, посредством гидролиза в условиях катализа кислотой или основанием, в результате чего 1 моль ТАГ реагирует по меньшей мере с 3 моль спирта (например, этанола для этиловых эфиров или метанола для метиловых эфиров), причем используют избыток спирта, чтобы позволить разделение образовавшихся алкиловых эфиров и глицерина, который также образуется, или с помощью липаз. Такие свободные жирные кислоты или эфиры жирных кислот, которые обычно остаются в неизмененном виде в составе жирных кислот после обработки, в дальнейшем могут быть смешаны с этанольным раствором мочевины для образования комплексов. Насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты легко образуют комплексы с мочевиной, кристаллизуются при охлаждении и впоследствии могут быть удалены фильтрацией. Фракция, не образовавшая комплексы с мочевиной, таким образом, обогащается ДЦ-ПНЖК.- 47 037184 the formation of complexes with the silver ion. Complexation with urea is the preferred method due to its simplicity and effectiveness in reducing the level of saturated and monounsaturated fatty acids in oil (Gamez et al., 2003). First, TAGs in oil are cleaved into their constituent fatty acids, often in the form of fatty acid esters, by hydrolysis under catalysis conditions with an acid or base, whereby 1 mol of TAG reacts with at least 3 mol of alcohol (for example, ethanol for ethyl esters or methanol for methyl esters), and using an excess of alcohol to allow the separation of the formed alkyl esters and glycerol, which is also formed, or with the help of lipases. Such free fatty acids or fatty acid esters, which usually remain unchanged in the fatty acid composition after treatment, can then be mixed with an ethanolic urea solution to form complexes. Saturated and monounsaturated fatty acids readily complex with urea, crystallize upon cooling, and can subsequently be removed by filtration. The fraction that has not formed complexes with urea is thus enriched with DC-PUFA.

Продукты питания (корма).Food (feed).

Настоящее изобретение включает композиции, которые могут использоваться в качестве продуктов питания (кормов). Для целей настоящего изобретения продукты питания (корма) включают любой продукт питания или препарат для потребления человеком или животным, который при попадании в организм: (а) служит целям питания или образования тканей или снабжения энергией; и/или (б) поддерживает, восстанавливает или способствует надлежащему пищевому статусу или метаболической функции. Продукты питания (корма) по изобретению включают питательные составы для младенцев и/или детей младшего возраста, такие как, например, молочная смесь для детского питания, и жмых по изобретению.The present invention includes compositions that can be used as food (feed). For the purposes of the present invention, food (feed) includes any food or preparation for human or animal consumption that, when ingested: (a) serves the purpose of nourishing or tissue formation or energy supply; and / or (b) maintains, restores, or promotes proper nutritional status or metabolic function. Food products (feed) according to the invention include nutritional compositions for infants and / or young children, such as, for example, infant formula and cake according to the invention.

Продукты питания (корма) по изобретению включают, например, клетку по изобретению, растение по изобретению, часть растения по изобретению, семя по изобретению, экстракт по изобретению, продукт способа по изобретению, продукт процесса ферментации по изобретению, или композицию вместе с подходящим(и) носителем(ями). Термин носитель используется в самом широком смысле и включает любой компонент, который может иметь или не иметь пищевого значения. Как будет понятно квалифицированному специалисту, носитель должен быть пригодным для использования (или используемым в достаточно низкой концентрации) в продукте питания (корме), таким образом, что он не оказывает вредного влияния на организм, потребляющий продукт питания (корм).Food (feed) according to the invention includes, for example, a cell according to the invention, a plant according to the invention, a part of a plant according to the invention, a seed according to the invention, an extract according to the invention, a product of a method according to the invention, a product of a fermentation process according to the invention, or a composition together with a suitable (and ) by the bearer (s). The term carrier is used in its broadest sense and includes any component that may or may not be nutritive. As will be understood by the skilled artisan, the carrier must be suitable for use (or used in a sufficiently low concentration) in the food (feed) such that it does not adversely affect the organism consuming the food (feed).

Продукт питания (корм) по настоящему изобретению включает масло, эфир жирной кислоты или жирную кислоту, полученную прямо или косвенно с применением способов, клеток или растений, раскрытых в настоящем документе.The food product (feed) of the present invention includes an oil, fatty acid ester or fatty acid obtained directly or indirectly using the methods, cells or plants disclosed herein.

Дополнительно, композиция может находиться в твердой или жидкой форме. Кроме того, композиция может содержать съедобные микронутриенты, белок, углеводы, витамины и/или минералы в количествах, желательных для конкретного применения. Количества этих ингредиентов будут варьировать в зависимости от того, предназначается ли композиция для применения у здоровых индивидуумов или для применения у индивидуумов с особыми потребностями, например индивидуумов, страдающих метаболическими расстройствами, и т.п.Additionally, the composition can be in solid or liquid form. In addition, the composition may contain edible micronutrients, protein, carbohydrates, vitamins and / or minerals in amounts desired for a particular application. The amounts of these ingredients will vary depending on whether the composition is intended for use in healthy individuals or for use in individuals with special needs, such as individuals suffering from metabolic disorders and the like.

Примеры подходящих носителей, имеющих пищевое значение, включают, без ограничения, макронутриенты, например съедобные жиры, углеводы и белки. Примеры таких съедобных жиров включают, без ограничения, кокосовое масло, масло бурачника, грибное масло, масло черной смородины, соевое масло, а также моно- и диглицериды. Примеры таких углеводов включают (без ограничения) глюкозу, съедобную лактозу и гидролизованный крахмал. Дополнительно, примеры белков, которые могут использоваться в питательном составе по изобретению, включают (без ограничения) белки сои, обработанную электродиализом сыворотку, обработанное электродиализом снятое молоко, молочную сыворотку или гидролизаты указанных белков.Examples of suitable carriers of nutritional value include, but are not limited to, macronutrients such as edible fats, carbohydrates, and proteins. Examples of such edible fats include, but are not limited to, coconut oil, borage oil, mushroom oil, black currant oil, soybean oil, and mono- and diglycerides. Examples of such carbohydrates include, but are not limited to, glucose, edible lactose, and hydrolyzed starch. Additionally, examples of proteins that can be used in the nutritional composition of the invention include, but are not limited to, soy proteins, electrodialysis treated whey, electrodialysis treated skim milk, milk whey, or hydrolysates of these proteins.

Относительно витаминов и минералов, следующее может быть добавлено к композициям пищевых продуктов (кормов) по настоящему изобретению: кальций, фосфор, калий, натрий, хлорид, магний, марганец, железо, медь, цинк, селен, йод, витамины А, Е, D, С и витамины группы В. Кроме того, другие такие витамины и минералы могут быть добавлены.Regarding vitamins and minerals, the following can be added to the food (feed) compositions of the present invention: calcium, phosphorus, potassium, sodium, chloride, magnesium, manganese, iron, copper, zinc, selenium, iodine, vitamins A, E, D , C and B vitamins. In addition, other such vitamins and minerals can be added.

Компоненты, используемые в композициях продукта питания (корма) по настоящему изобретению, могут быть полуочищенными или очищенными. Под полуочищенным или очищенным подразумевается материал, который получен посредством очистки природного материала или синтеза de novo.The components used in the food (feed) compositions of the present invention can be semi-refined or refined. By semi-purified or purified is meant material that is obtained by purification of natural material or de novo synthesis.

Дополнительно, композиция пищевого продукта (корма) по настоящему изобретению может быть добавлена к пище даже в том случае, если нет необходимости в добавках к рациону. Например, композиция может быть добавлена к пище любого типа, в том числе (без ограничения) маргарин, модифицированное масло, сыры, молоко, йогурт, шоколад, конфеты, легкие закуски, масла для салатов, масла для приготовления пищи, кулинарные жиры, мясо, рыба и напитки.Additionally, the food (feed) composition of the present invention can be added to food even if no dietary supplements are needed. For example, the composition can be added to any type of food, including but not limited to margarine, modified butter, cheeses, milk, yogurt, chocolate, candy, snacks, salad oils, cooking oils, cooking fats, meat, fish and drinks.

Дополнительно, жирные кислоты, продуцированные в соответствии с настоящим изобретением или клетками-хозяевами, трансформированными таким образом, что в них содержатся и экспрессируются целевые гены, могут использоваться в качестве пищевых добавок для животных, с целью модификации состава жирных кислот в ткани, яйце или молоке животного до более желательного для потребления че- 48 037184 ловеком или животным. Примеры таких животных включают овцу, крупный рогатый скот, лошадей, домашнюю птицу, например кур, и т.п.Additionally, fatty acids produced in accordance with the present invention or host cells transformed to contain and express target genes can be used as food additives for animals to modify the composition of fatty acids in tissue, egg or milk. animal to more desirable for human consumption by humans or animals. Examples of such animals include sheep, cattle, horses, poultry such as chickens, and the like.

К тому же, продукты питания (корма) по изобретению могут использоваться в аквакультуре, с целью повышения уровней жирных кислот в организме рыбы или ракообразных, таких как, например, креветки, для потребления человеком или животным. Предпочтительно рыба является лососем.In addition, the food (feed) according to the invention can be used in aquaculture to increase the levels of fatty acids in the body of fish or crustaceans, such as, for example, shrimp, for human or animal consumption. Preferably the fish is salmon.

Предпочтительные продукты питания (корма) по изобретению представляют собой растения, семя и другие части растения, например листья и стебли, которые непосредственно могут использоваться в качестве пищи или корма для человека или животных. Например, животные могут непосредственно пастись на таких растениях, выращиваемых в поле, или им могут скармливаться более точные количества в ходе контролируемого кормления. Изобретение включает применение таких растений и частей растения в качестве пищи для повышения уровней ДЦ-ПНЖК в организме человека и животных.Preferred food (feed) according to the invention are plants, seeds and other plant parts, for example leaves and stems, which can be directly used as food or feed for humans or animals. For example, animals can graze directly on such plants grown in the field, or they can be fed more precise amounts through controlled feeding. The invention includes the use of such plants and plant parts as food for increasing the levels of DC-PUFA in humans and animals.

В варианте реализации изобретения продукт питания представляет собой детскую смесь, содержащую липид или масло по изобретению. В настоящем документе детская смесь обозначает не существующую в природе композицию, которая, по меньшей мере, частично удовлетворяет потребность младенца в питательных веществах. Младенец обозначает субъекта-человека в возрасте от момента рождения до не более чем одного года и включает младенцев со скорректированным возрастом от 0 до 12 месяцев. Выражение скорректированный возраст обозначает хронологический возраст младенца минус количество времени, на которое младенец родился недоношенным. Таким образом, скорректированный возраст представляет собой возраст младенца, как если бы он родился доношенным. В настоящем документе не существующий в природе означает, что продукт не найден в природе, но создан вмешательством человека. В настоящем документе детская смесь по изобретению исключает чистое грудное молоко человека (Koletzko et al., 1988) и чистое молоко, выработанное животными, хотя детская смесь по изобретению может содержать компоненты, полученные из молока, такие как молочный белок или углеводы, например белок сыворотки или лактозу. Детская смесь по изобретению исключает встречающиеся в природе виды мяса, такие как телятина, мясо морских котиков, китовое мясо, или рыбу, хотя детская смесь по изобретению может содержать компоненты из указанных источников, такие как белки. Детская смесь по изобретению всегда содержит липид, содержащий ДПК по изобретению, предпочтительно на уровне от 0,05 до около 0,5 мас.% от общего содержания жирных кислот. ДПК может присутствовать в виде ТАГ, в виде фосфолипида или в виде неэтерифицированной жирной кислоты или их смеси. Липид или масло по изобретению может быть введен в детскую смесь с применением способов, известных из уровня техники. Например, квалифицированный специалист может с легкостью получить детскую смесь по изобретению, в общем с применением способов, описанных в WO 2008/027991, US20150157048, US2015094382 и US20150148316, в которых ДПК добавляют в дополнение к или вместо одной или более полиненасыщенных жирных кислот, описанных в указанных документах.In an embodiment of the invention, the food product is an infant formula containing a lipid or oil according to the invention. As used herein, infant formula refers to a non-naturally occurring composition that at least partially satisfies an infant's nutritional needs. Infant refers to a human subject ranging in age from birth to no more than one year of age, and includes age-adjusted infants from 0 to 12 months. Adjusted age refers to the chronological age of the infant minus the amount of time the infant was born prematurely. Thus, the adjusted age represents the age of the infant as if it were born full-term. In this document, non-naturally occurring means that the product is not found in nature, but is created by human intervention. In this document, the infant formula of the invention excludes pure human breast milk (Koletzko et al., 1988) and pure milk produced by animals, although the infant formula of the invention may contain components derived from milk such as milk protein or carbohydrates such as whey protein or lactose. The infant formula of the invention excludes naturally occurring meats such as veal, fur seal meat, whale meat, or fish, although the infant formula of the invention may contain components from these sources such as proteins. The infant formula of the invention always contains the lipid containing the WPC of the invention, preferably at a level of 0.05 to about 0.5% by weight, based on the total fatty acid content. DPA can be present as a TAG, as a phospholipid, or as a non-esterified fatty acid, or a mixture thereof. The lipid or oil of the invention can be incorporated into infant formula using methods known in the art. For example, a skilled artisan can readily prepare an infant formula of the invention, generally using the methods described in WO 2008/027991, US20150157048, US2015094382 and US20150148316, in which WPC is added in addition to or instead of one or more polyunsaturated fatty acids described in specified documents.

В одном примере детская смесь содержит ДПК (т.е. омега-3 ДПК, как описано в настоящем документе), необязательно с пробиотиками, особенно полидекстрозой (ПДТ) и галактоолигосахаридами (ГОС), лактоферрин из источника, не принадлежащего к человеческому роду, и другие длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (ДЦ-ПНЖК). В некоторых вариантах реализации изобретения питательный состав дополнительно содержит СДК и/или гамма-линоленовую кислоту (ГЛК). В некоторых вариантах реализации изобретения детская смесь содержит до 7 г/100 кКал источника жиров или липидов, более предпочтительно от около 3 г/100 кКал до около 7 г/100 кКал источника жиров или липидов, причем источник жиров или липидов содержит по меньшей мере около 0,5 г/100 кКал, и более предпочтительно от около 1,5 г/100 кКал до около 7 г/100 кКал источника белка или эквивалента белка, более предпочтительно от около 1 г/100 кКал до около 7 г/100 кКал источника белка или источника эквивалента белка; и по меньшей мере около 5 г/100 кКал углевода, более предпочтительно от около 5 г до около 25 г/100 кКал углевода. Дополнительно детская смесь может содержать один или более или все из 1) по меньшей мере около 10 мг/100 кКал лактоферрина, более предпочтительно от около 10 мг/100 кКал до около 200 мг/100 кКал лактоферрина; 2) от около 0,1 г/100 кКал до около 1 г/100 кКал пробиотической композиции, содержащей ПДТ и ГОС; и 3) по меньшей мере около 5 мг/100 кКал дополнительной ДЦ-ПНЖК (т.е. ДЦ-ПНЖК, не являющейся ДПК), включая ДГК, более предпочтительно от около 5 мг/100 кКал до около 75 мг/100 кКал дополнительной ДЦ-ПНЖК, включая ДГК.In one example, the infant formula contains DPA (i.e. omega-3 DPA as described herein), optionally with probiotics, especially polydextrose (PDT) and galactooligosaccharides (GOS), lactoferrin from a non-human source, and other long-chain polyunsaturated fatty acids (DC-PUFA). In some embodiments, the nutritional composition further comprises SDA and / or gamma-linolenic acid (GLA). In some embodiments, the infant formula contains up to 7 g / 100 kCal of fat or lipid source, more preferably from about 3 g / 100 kCal to about 7 g / 100 kCal of fat or lipid source, wherein the fat or lipid source comprises at least about 0.5 g / 100 kcal, and more preferably from about 1.5 g / 100 kcal to about 7 g / 100 kcal protein source or protein equivalent, more preferably from about 1 g / 100 kcal to about 7 g / 100 kcal source protein or source of protein equivalent; and at least about 5 g / 100 kcal carbohydrate, more preferably about 5 g to about 25 g / 100 kcal carbohydrate. Additionally, infant formula may contain one or more or all of 1) at least about 10 mg / 100 kcal lactoferrin, more preferably from about 10 mg / 100 kcal to about 200 mg / 100 kcal lactoferrin; 2) from about 0.1 g / 100 kcal to about 1 g / 100 kcal of a probiotic composition containing PDT and GOS; and 3) at least about 5 mg / 100 kcal of additional DC-PUFA (i.e., non-DPA DC-PUFA), including DHA, more preferably from about 5 mg / 100 kcal to about 75 mg / 100 kcal additional DC-PUFA, including DHA.

В варианте реализации изобретения соотношение ДПК:ДГК в общем содержании жирных кислот детской смеси составляет от 1:3 до 2:1. Кроме того, может присутствовать ЭПК, но предпочтительно она отсутствует. Если она присутствует, то соотношение ЭПК:ДПК в общем содержании жирных кислот предпочтительно составляет менее чем 1:2, более предпочтительно менее чем 1:5. Дополнительно, АРК может отсутствовать, но предпочтительно она присутствует, и предпочтительно соотношение АРК:ДПК в общем содержании жирных кислот составляет от 1:3 до 2:1. Более предпочтительно уровни каждой ДЦ-ПНЖК в детской смеси приблизительно такие же, как найдены в любом грудном молоке человека, которому от природы присущи вариации, в зависимости от возраста матери, генетических факторов, употребления с пищей и алиментарного статуса; например, см. Koletzko et al. (1988). В предпочтительном варианте реализации изобретения детская смесь не содержит обнаружимых уровней генэйкозапентаеновой кислоты (ГПК, 21:5ω3).In an embodiment of the invention, the ratio of DPA: DHA in the total fatty acid content of the infant formula is from 1: 3 to 2: 1. In addition, EPA may be present, but is preferably absent. If present, the ratio of EPA: DPA in the total fatty acid content is preferably less than 1: 2, more preferably less than 1: 5. Additionally, ARA may be absent, but is preferably present, and preferably the ratio of ARA: DPA in the total fatty acid content is from 1: 3 to 2: 1. More preferably, the levels of each DC-PUFA in infant formula are approximately the same as found in any human breast milk, which naturally exhibits variations depending on maternal age, genetic factors, dietary intake and nutritional status; for example see Koletzko et al. (1988). In a preferred embodiment, the infant formula does not contain detectable levels of heneicosapentaenoic acid (HPA, 21: 5ω3).

- 49 037184- 49 037184

Детская формула может обозначать, например, жидкости, порошки, гели, пасты, твердые вещества, концентраты, суспензии или готовые к употреблению формы энтеральных смесей, пероральных смесей, смесей для младенцев.Infant formula can refer to, for example, liquids, powders, gels, pastes, solids, concentrates, suspensions or ready-to-use forms of enteral mixtures, oral mixtures, infant formula.

Пробиотики, пригодные в соответствии с настоящим документом, могут включать полидекстрозу, порошок полидекстрозы, лактулозу, лактосахарозу, раффинозу, глюкоолигосахарид, инулин, фруктоолигосахарид, изомальтоолигосахарид, олигосахариды сои, лактосахарозу, ксилоолигосахарид, хитоолигосахарид, манноолигосахарид, арибиноолигосахарид, сиаллилолигосахарид, фукоолигосахарид, галактоолигосахарид и генциоолигосахариды.Probiotics useful in accordance herewith may include polydextrose, polydextrose powder, lactulose, lactosucrose, raffinose, glucooligosaccharides, inulin, fructooligosaccharide, isomaltooligosaccharides, oligosaccharides of soy, lactosucrose, xylooligosaccharide, chitooligosaccharides, mannooligosaccharide, aribinooligosaharid, sialliloligosaharid, fucooligosaccharides, galactooligosaccharide and gentsiooligosaharidy ...

Кроме того, лактоферрин может быть введен в питательный состав согласно настоящему документу. Лактоферрины представляют собой одноцепочечные полипептиды размером приблизительно 80 кДа, содержащие 1-4 гликана, в зависимости от вида. 3-D структура лактоферрина у различных видов в высокой степени сходна, но не идентична. Каждый лактоферрин содержит две гомологичные части, под названием N- и С-доли, что обозначает N-концевую и С-концевую часть молекулы соответственно.In addition, lactoferrin can be incorporated into a nutritional formulation according to this document. Lactoferrins are approximately 80 kDa single chain polypeptides containing 1-4 glycans, depending on the species. The 3-D structure of lactoferrin in different species is highly similar, but not identical. Each lactoferrin contains two homologous parts, called the N- and C-lobes, which means the N-terminal and C-terminal part of the molecule, respectively.

Источник белка или эквивалента белка может быть любым, который применяется в уровне техники, например обезжиренное молоко, белок сыворотки, казеин, соевый белок, гидролизованный белок, аминокислоты и т.п. Источники белка из коровьего молока, пригодные согласно настоящему документу, включают, но не ограничиваясь этим, порошок молочного белка, концентраты молочного белка, изоляты молочного белка, сухие вещества обезжиренного молока, обезжиренное молоко, сухое обезжиренное молоко, белок сыворотки, изоляты белка сыворотки, концентраты белка сыворотки, сладкую сыворотку, кислую сыворотку, казеин, кислый казеин, казеинат (например, натрий казеинат, натрий кальций казеинат, кальций казеинат) и любые их комбинации.The protein source or protein equivalent can be any source as used in the art, for example, skim milk, whey protein, casein, soy protein, hydrolyzed protein, amino acids, and the like. Cow's milk protein sources useful herein include, but are not limited to, milk protein powder, milk protein concentrates, milk protein isolates, skim milk solids, skim milk, skimmed milk powder, whey protein, whey protein isolates, concentrates whey protein, sweet whey, sour whey, casein, sour casein, caseinate (eg sodium caseinate, sodium calcium caseinate, calcium caseinate), and any combination thereof.

Подходящие источники углеводов могут представлять собой любые, применяемые в уровне техники, например лактоза, глюкоза, фруктоза, сухие вещества кукурузного сиропа, мальтодекстрины, сахароза, крахмал, сухие вещества рисового сиропа и т.п. Количество углеводного компонента в питательном составе составляет по меньшей мере около 5 г/100 кКал и обычно может варьировать от около 5 г до около 25 г/100 кКал. В некоторых вариантах реализации изобретения количество углевода составляет от около 6 г до около 22 г/100 кКал. В других вариантах реализации изобретения количество углевода составляет от около 12 г до около 14 г/100 кКал. В некоторых вариантах реализации изобретения сухие вещества кукурузного сиропа являются предпочтительными. Кроме того, может быть желательным введение в питательный состав гидролизованных, частично гидролизованных и/или высокогидролизованных углеводов за счет их легкой усвояемости. Конкретно, гидролизованные углеводы с меньшей вероятностью будут содержать аллергенные эпитопы. Неограничивающие примеры углеводных материалов, пригодных для применения согласно настоящему документу, включают гидролизованные или интактные, природные или химически модифицированные виды крахмала из кукурузы, тапиоки, риса или картофеля, в восковых или невосковых формах. Неограничивающие примеры подходящих углеводов включают различные виды гидролизованного крахмала, а именно гидролизованный кукурузный крахмал, мальтодекстрин, мальтозу, кукурузный сироп, глюкозу, сухие вещества кукурузного сиропа, глюкозу и различные другие полимеры глюкозы и их комбинации. Неограничивающие примеры других подходящих углеводов включают те, которые часто называют сахарозой, лактозой, фруктозой, кукурузным сиропом с высоким содержанием фруктозы, неусваиваемыми олигосахаридами, например фруктоолигосахаридами, и их комбинации.Suitable carbohydrate sources can be any used in the art, for example lactose, glucose, fructose, corn syrup solids, maltodextrins, sucrose, starch, rice syrup solids, and the like. The amount of carbohydrate component in the nutritional formulation is at least about 5 g / 100 kcal and can typically range from about 5 g to about 25 g / 100 kcal. In some embodiments, the amount of carbohydrate is from about 6 g to about 22 g / 100 kcal. In other embodiments, the amount of carbohydrate is from about 12 g to about 14 g / 100 kcal. In some embodiments, corn syrup solids are preferred. In addition, it may be desirable to add hydrolyzed, partially hydrolyzed and / or highly hydrolyzed carbohydrates to the nutritional composition due to their easy digestibility. Specifically, hydrolyzed carbohydrates are less likely to contain allergenic epitopes. Non-limiting examples of carbohydrate materials suitable for use herein include hydrolyzed or intact, naturally occurring or chemically modified corn, tapioca, rice or potato starch, in waxy or non-waxy forms. Non-limiting examples of suitable carbohydrates include various types of hydrolyzed starch, namely hydrolyzed corn starch, maltodextrin, maltose, corn syrup, glucose, corn syrup solids, glucose, and various other glucose polymers and combinations thereof. Non-limiting examples of other suitable carbohydrates include those often referred to as sucrose, lactose, fructose, high fructose corn syrup, indigestible oligosaccharides such as fructooligosaccharides, and combinations thereof.

Кроме того, один или более витаминов и/или минералов предпочтительно могут быть добавлены в детскую смесь в количествах, достаточных, чтобы удовлетворять ежедневные пищевые потребности субъекта. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что потребность в витаминах и минералах будет варьировать, например, в соответствии с возрастом ребенка. Питательный состав необязательно может содержать, но не ограничиваясь этим, один или более из следующих витаминов или их производных: витамин B1 (тиамин, тиамина пирофосфат, ТПФ, тиамина трифосфат, ТТФ, тиамина гидрохлорид, тиамина мононитрат), витамин В2 (рибофлавин, флавин мононуклеотид, ФМН, аденин флавин динуклеотид, ФАД, лактофлавин, овофлавин), витамин B3 (ниацин, никотиновая кислота, никотинамид, ниацинамид, никотинамид аденин динуклеотид, НАД, никотиновой кислоты мононуклеотид, НикМН, пиридин-3-карбоновая кислота), прекурсор витамина В3, триптофан, витамин В6 (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксина гидрохлорид), пантотеновая кислота (пантотенат, пантенол), фолат (фолиевая кислота, фолацин, птероглутаминовая кислота), витамин В12 (кобаламин, метилкобаламин, дезоксиаденозилкобаламин, цианокобаламин, гидроксикобаламин, аденозилкобаламин), биотины, витамин С (аскорбиновая кислота), витамин А (ретинол, ретинил ацетат, ретинил пальмитат, эфиры ретинила и других длинноцепочечных жирных кислот, ретиналь, ретиноевая кислота, эфиры ретинола), витамин D (кальциферол, холекальциферол, витамин 3, 1,25,-дигидроксивитамин D), витамин Е (α-токоферол, αтокоферола ацетат, α-токоферола сукцинат, α-токоферола никотинат, α-токоферол), витамин K (витамин K1, филлохинон, нафтохинон, витамин K2, менахинон-7, витамин K3, менахинон-4, менадион, менахинон-8, менахинон-8Н, менахинон-9, менахинон-9Н, менахинон-10, менахинон-11, менахинон-12, менахинон-13), холин, инозитол, β-каротин и любые их комбинации. Кроме того, питательный состав необя- 50 037184 зательно может содержать, но не ограничиваясь этим, один или более из следующих минералов или их производных: бор, кальций, кальция ацетат, кальция глюконат, кальция хлорид, кальция лактат, кальция фосфат, кальция сульфат, хлорид, хром, хрома хлорид, хрома пиколинат, медь, меди сульфат, меди глюконат, меди сульфат, фторид, железо, железа карбонил, железа(П), железа(Ш), железа(Ш) ортофосфат, тритурация железа, железа полисахарид, йодид, йод, магний, магния карбонат, магния гидроксид, магния оксид, магния стеарат, магния сульфат, марганец, молибден, фосфор, калий, калия фосфат, калия йодид, калия хлорид, калия ацетат, селен, сера, натрий, натрия докузат, натрия хлорид, натрия селенат, натрия молибдат, цинк, цинка оксид, цинка сульфат и их смеси. Неограничивающие примеры производных минеральных соединений включают соли, щелочные соли, эфиры и хелаты любого минерального соединения. Минералы могут быть добавлены в питательные составы в форме солей, таких как кальция фосфат, кальция глицерилфосфат, натрия цитрат, калия хлорид, калия фосфат, магния фосфат, железа (II) сульфат, магния сульфат, меди сульфат, марганца сульфат и натрия селенат. Дополнительные витамины и минералы могут быть добавлены, как известно из уровня техники.In addition, one or more vitamins and / or minerals may preferably be added to the infant formula in amounts sufficient to meet the daily nutritional needs of the subject. One of ordinary skill in the art will understand that the need for vitamins and minerals will vary, for example, according to the age of the child. The nutritional composition may optionally contain, but is not limited to, one or more of the following vitamins or their derivatives: vitamin B1 (thiamine, thiamine pyrophosphate, TPP, thiamine triphosphate, TTF, thiamine hydrochloride, thiamine mononitrate), vitamin B2 (riboflavin, flavin mononucleotide , FMN, adenine flavine dinucleotide, FAD, lactoflavin, ovoflavin), vitamin B3 (niacin, nicotinic acid, nicotinamide, niacinamide, nicotinamide adenine dinucleotide, NAD, nicotinic acid mononucleotide, NikMN, pyridinic acid), precursor 3-precursor tryptophan, vitamin B6 (pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine hydrochloride), pantothenic acid (pantothenate, panthenol), folate (folic acid, folacin, pteroglutamic acid), vitamin B12 (cobalamin, methylcobalaminosylamine, desocobalaminosylamino) biotins, vitamin C (ascorbic acid), vitamin A (retinol, retinyl acetate, retinyl palmitate, retinyl esters and other long-chain fatty acids, retinal, retinoic acid, retinol esters), vitamin D (calciferol, cholecalciferol, vitamin 3, 1.25, -dihydroxyvitamin D), vitamin E (α-tocopherol, α-tocopherol acetate, α-tocopherol succinate, α-tocopherol nicotinate, α-tocopherol), vitamin K (vitamin K1, phylloquinone, naphthoquinone, vitamin K2, menaquinone-7, vitamin K3, menaquinone-4, menadione, menaquinone-8, menaquinone-8H, menaquinone-9, menaquinone-9H, menaquinone -10, menaquinone-11, menaquinone-12, menaquinone-13), choline, inositol, β-carotene and any combinations thereof. In addition, the nutritional composition optionally may contain, but is not limited to, one or more of the following minerals or their derivatives: boron, calcium, calcium acetate, calcium gluconate, calcium chloride, calcium lactate, calcium phosphate, calcium sulfate, chloride, chromium, chromium chloride, chromium picolinate, copper, copper sulfate, copper gluconate, copper sulfate, fluoride, iron, iron carbonyl, iron (P), iron (III), iron (III) orthophosphate, trituration of iron, iron polysaccharide, iodide, iodine, magnesium, magnesium carbonate, magnesium hydroxide, magnesium oxide, magnesium stearate, magnesium sulfate, manganese, molybdenum, phosphorus, potassium, potassium phosphate, potassium iodide, potassium chloride, potassium acetate, selenium, sulfur, sodium, sodium docusate, sodium chloride, sodium selenate, sodium molybdate, zinc, zinc oxide, zinc sulfate and mixtures thereof. Non-limiting examples of derivatives of mineral compounds include salts, alkali salts, esters, and chelates of any mineral compound. Minerals can be added to nutritional formulations in the form of salts such as calcium phosphate, calcium glyceryl phosphate, sodium citrate, potassium chloride, potassium phosphate, magnesium phosphate, iron (II) sulfate, magnesium sulfate, copper sulfate, manganese sulfate, and sodium selenate. Additional vitamins and minerals can be added as is known in the art.

В варианте реализации изобретения детская смесь по изобретению или полученная в соответствии с изобретением, не содержит грудного молока человека или животного или экстракта из него, содержащего ДПК.In an embodiment of the invention, the infant formula according to the invention or obtained in accordance with the invention does not contain human or animal breast milk or an extract from it containing WPC.

В другом варианте реализации изобретения уровень омега-6 ДПК в общем содержании жирных кислот детской смеси составляет менее чем 2, предпочтительно менее чем 1% или от 0,1 до 2%, более предпочтительно она отсутствует.In another embodiment, the level of omega-6 DPA in the total fatty acid content of the infant formula is less than 2, preferably less than 1%, or from 0.1 to 2%, more preferably absent.

Композиции.Compositions.

Настоящее изобретение дополнительно включает композиции, особенно фармацевтические композиции, содержащие одну или более жирных кислот и/или масел, полученных с применением способов по изобретению, предпочтительно в форме этиловых эфиров жирных кислот.The present invention further includes compositions, especially pharmaceutical compositions, containing one or more fatty acids and / or oils obtained using the methods of the invention, preferably in the form of ethyl esters of fatty acids.

Фармацевтическая композиция может содержать одну или более жирных кислот и/или масел, в комбинации со стандартным, известным, нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом или растворителем, таким как фосфатно-солевой буфер, вода, этанол, полиолы, растительные масла, увлажняющий агент или эмульсия, например эмульсия вода/масло. Композиция может находиться в жидкой или твердой форме. Например, композиция может находиться в форме таблетки, капсулы, проглатываемой жидкости или порошка, инъекционной форме или в форме мази или крема для местного применения. Необходимая текучесть может поддерживаться, например, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и использованием поверхностно-активных веществ. Кроме того, может быть желательным введение изотонических агентов, например сахара, натрия хлорида и т.п. Кроме таких инертных разбавителей, композиция может содержать адъюванты, такие как увлажнители, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы.The pharmaceutical composition may contain one or more fatty acids and / or oils, in combination with a standard, known, non-toxic pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant or solvent such as phosphate buffered saline, water, ethanol, polyols, vegetable oils, wetting agent or emulsion for example a water / oil emulsion. The composition can be in liquid or solid form. For example, the composition can be in the form of a tablet, capsule, swallowable liquid or powder, injectable form, or in the form of a topical ointment or cream. The required fluidity can be maintained, for example, by maintaining the required particle size in the case of dispersions and the use of surfactants. In addition, it may be desirable to administer isotonic agents such as sugar, sodium chloride, and the like. In addition to such inert diluents, the composition may contain adjuvants such as humectants, emulsifiers and suspending agents, sweeteners, flavors and aromas.

Суспензии, в дополнение к активным соединениям, могут содержать суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, сложные эфиры сорбита и полиоксиэтилен сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, мета-гидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант или смеси этих субстанций.Suspensions, in addition to the active compounds, may contain suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohols, esters of sorbitol and polyoxyethylene sorbitan, microcrystalline cellulose, aluminum meta-hydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, or mixtures of these substances.

Твердые лекарственные формы, такие как таблетки и капсулы, могут быть получены с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Например, жирные кислоты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть таблетированы с обычными основами таблеток, такими как лактоза, сахароза и кукурузный крахмал, в комбинации со связующими веществами, такими как акация, кукурузный крахмал или желатин, дезинтегрантами, такими как картофельный крахмал или альгиновая кислота, и смазывающими веществами, такими как стеариновая кислота или магния стеарат. Капсулы могут быть получены путем объединения этих вспомогательных веществ в желатиновой капсуле с антиоксидантами и подходящей жирной(ыми) кислотой(ами).Solid dosage forms such as tablets and capsules can be prepared using methods well known in the art. For example, the fatty acids obtained in accordance with the present invention can be tableted with conventional tablet bases such as lactose, sucrose and corn starch, in combination with binders such as acacia, corn starch or gelatin, disintegrants such as potato starch or alginic acid, and lubricants such as stearic acid or magnesium stearate. Capsules can be prepared by combining these excipients in a gelatin capsule with antioxidants and suitable fatty acid (s).

Для внутривенного введения, жирные кислоты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, или их производные, могут быть введены в коммерческие препараты.For intravenous administration, fatty acids obtained in accordance with the present invention, or derivatives thereof, can be incorporated into commercial preparations.

Типичные дозы конкретной жирной кислоты составляют от 0,1 мг до 20 г, при введении от 1 до 5 раз в день (до 100 г ежедневно), и предпочтительно находятся в интервале от около 10 мг до около 1, 2, 5 или 10 г ежедневно (в виде одной или нескольких доз). Как известно из уровня техники, желательно вводить по меньшей мере около 300 мг/день жирной кислоты, особенно ДЦ-ПНЖК. Однако необходимо понимать, что любое количество жирной кислоты будет благоприятным для субъекта.Typical dosages of a particular fatty acid are from 0.1 mg to 20 g, when administered 1 to 5 times a day (up to 100 g daily), and preferably ranges from about 10 mg to about 1, 2, 5 or 10 g daily (in one or more doses). As is known in the art, it is desirable to administer at least about 300 mg / day of a fatty acid, especially DC-PUFA. However, it should be understood that any amount of fatty acid will be beneficial to the subject.

Возможные способы введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению включают, например, энтеральный (например, пероральный и ректальный) и парентеральный. Например, жидкий препарат может быть введен перорально или ректально. Дополнительно, гомогенная смесь может быть полностью диспергирована в воде, предварительно смешанной в стерильных условиях с физиологически приемлемыми разбавителями, консервантами, буферами или пропеллентами для получения спрея или средства для ингаляций.Possible routes of administration for the pharmaceutical compositions of the present invention include, for example, enteral (eg, oral and rectal) and parenteral. For example, a liquid preparation can be administered orally or rectally. Additionally, the homogeneous mixture can be completely dispersed in water, premixed under sterile conditions with physiologically acceptable diluents, preservatives, buffers or propellants to form a spray or inhaler.

Дозы композиции для введения пациенту могут быть определены обычным специалистом в данной области и зависят от различных факторов, таких как масса тела пациента, возраст пациента, общее состояние здоровья пациента, анамнез пациента, иммунный статус пациента и т.п.The dosage of the composition for administration to a patient can be determined by one of ordinary skill in the art and will depend on various factors such as the patient's body weight, the patient's age, the patient's general health, the patient's history, the patient's immune status, and the like.

- 51 037184- 51 037184

Дополнительно, композиции по настоящему изобретению могут применяться для косметических целей. Они могут добавляться к существующим косметическим композициям таким образом, что образуется смесь, или жирная кислота, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться в качестве единственного активного ингредиента в косметической композиции.Additionally, the compositions of the present invention can be used for cosmetic purposes. They can be added to existing cosmetic compositions in such a way that a mixture is formed, or the fatty acid obtained in accordance with the present invention can be used as the only active ingredient in the cosmetic composition.

ПримерыExamples of

Пример 1. Материалы и методы.Example 1. Materials and methods.

Экспрессия генов в клетках растения в системе временной экспрессии.Expression of genes in plant cells in a transient expression system.

Экзогенные генетические конструкции экспрессируют в клетках растения в системе временной экспрессии, как по существу описано Voinnet et al. (2003) и Wood et al. (2009).Exogenous genetic constructs are expressed in plant cells in a transient expression system as essentially described by Voinnet et al. (2003) and Wood et al. (2009).

Анализ жирных кислот методом газовой хроматографии (ГХ) МЭЖК анализируют методом газовой хроматографии с помощью газового хроматографа Agilent Technologies 7890A GC (Пало-Альто, Калифорния, США), оборудованного колонкой SGE-BPX70 (70% цианопропил полисилфенилин-силоксана, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мм) длиной 30 м, ПИД (плазменно-ионизационным детектором), инжектором с разделением/без разделения, а также серийным аутосемплером Agilent Technologies 7693 и инжектором. Гелий используют в качестве газа-носителя. Образцы вводят инжекцией в методе с разделением (соотношение 50:1) при температуре печи 150°С. После инжекции температуру печи поддерживают на уровне 150°С в течение 1 мин, затем повышают до 210°С со скоростью 3°С/мин, снова повышают до 240°С со скоростью 50°С/мин и окончательно поддерживают в течение 1,4 мин на уровне 240°С. Площадь пиков определяют с помощью программного обеспечения Agilent Technologies ChemStation (версия Rev B.04.03 (16), Пало-Альто, Калифорния, США), на основании ответа известного количества внешнего стандарта GLC-411 (Nucheck) и внутреннего стандарта С17:0-МЕ.Analysis of Fatty Acids by Gas Chromatography (GC) FAMEs are analyzed by gas chromatography using an Agilent Technologies 7890A GC gas chromatograph (Palo Alto, CA, USA) equipped with an SGE-BPX70 column (70% cyanopropyl polysylphenylin-siloxane, inner diameter 0.25 mm, film thickness 0.25 mm) 30 m long, FID (Plasma Ionization Detector), split / splitless injector, as well as a serial Agilent Technologies 7693 autosampler and injector. Helium is used as a carrier gas. Samples are injected in a split method (50: 1 ratio) at an oven temperature of 150 ° C. After injection, the furnace temperature is maintained at 150 ° C for 1 min, then increased to 210 ° C at a rate of 3 ° C / min, again increased to 240 ° C at a rate of 50 ° C / min, and finally maintained for 1.4 min at 240 ° C. Peak areas are determined using Agilent Technologies ChemStation software (Rev B.04.03 (16), Palo Alto, CA, USA) based on the response of a known amount of external standard GLC-411 (Nucheck) and internal standard C17: 0-ME ...

Анализ липидов методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).Lipid analysis by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).

Общие липиды экстрагируют из лиофилизированных развивающихся семян через 12 дней после цветения (дпц) и зрелых семян после добавления известного количества три-С17:0-ТАГ в качестве внутреннего стандарта для количественной оценки. Экстрагированные липиды растворяют в 1 мл 10 мМ бутилированного гидрокситолуола в смеси бутанол/метанол (1:1, об./об.) на 5 мг сухого материала и анализируют с помощью жидкостного хроматографа серии Agilent 1200 с ЖХ и ионизацией электрораспылением с помощью ЖХ-МС 6410b с тремя квадрупольными линзами. Липиды хроматографически разделяют с использованием колонки Ascentis Express RP-Amide (50 χ 2,1 мм, 2,7 мкм, Supelco) в режиме бинарного градиента со скоростью потока 0,2 мл/мин. Подвижные фазы: А) 10 мМ аммония формиата в смеси Н₂О:метанол:тетрагидрофуран (50:20:30 об./об./об.); В) 10 мМ аммония формиата в смеси H₂O/метанол/тетрагидрофуран (5:20:75, об./об./об.). Перечни для мониторинга множественных реакций (ММР) основаны на следующих основных жирных кислотах: 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 18:4, 20:1, 20:2, 20:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5, 22:6, с использованием энергии столкновения 30 В и фрагментора 60 В. Индивидуальные ТАГ согласно ММР идентифицируют на основании иона аммонизированного прекурсора и иона продукта, образованного в результате потери нейтральных частиц 22:6. Количество ТАГ определяют с использованием 10 мкМ внешнего стандарта тристеарина.Total lipids are extracted from lyophilized developing seeds 12 days post-flowering (DPC) and mature seeds after adding a known amount of tri-C17: 0-TAG as an internal standard for quantification. The extracted lipids are dissolved in 1 ml of 10 mM butylated hydroxytoluene in butanol / methanol (1: 1, v / v) per 5 mg dry material and analyzed using an Agilent 1200 series liquid chromatograph with LC and electrospray ionization by LC-MS 6410b with three quadrupole lenses. Lipids were chromatographically separated using an Ascentis Express RP-Amide column (50 x 2.1 mm, 2.7 μm, Supelco) in a binary gradient mode with a flow rate of 0.2 ml / min. Mobile phases: A) 10 mM ammonium formate in a mixture of H ₂ O: methanol: tetrahydrofuran (50:20:30 v / v / v); C) 10 mM ammonium formate in a mixture of H ₂ O / methanol / tetrahydrofuran (5:20:75, v / v / v). Multiple Reaction Monitoring Lists (MMPs) are based on the following essential fatty acids: 16: 0, 18: 0, 18: 1, 18: 2, 18: 3, 18: 4, 20: 1, 20: 2, 20: 3 , 20: 4, 20: 5, 22: 4, 22: 5, 22: 6, using a collision energy of 30 V and a fragmenter of 60 V. neutral particles 22: 6. The amount of TAG is determined using a 10 μM external tristearin standard.

Определение профиля липидов с помощью ЖХ-МС.Determination of lipid profile by LC-MS.

Экстрагированные общие липиды были проанализированы с применением ЖХ серии Agilent 1200, соединенной с устройством для ионизации электрораспылением (Agilent, Пало-Альто, Калифорния, США). Инжекцию 5 мкл каждого экстракта общих липидов разделяли хроматографически с помощью ВЭЖХ колонки Ascentis Express RP-Amide 50 χ 2,1 мм, 2,7 мкм (Sigma-Aldrich, Касл-Хилл, Австралия) с применением бинарного градиента со скоростью потока 0,2 мл/мин. Подвижные фазы: А) 10 мМ аммония формиата в Н₂О:метаноле:тетрагидрофуране (50:20:30, об./об./об.); В) 10 мМ аммония формиата в Н₂О:метаноле:тетрагидрофуране (5:20:75, об/об./об.). Выбранные нейтральные липиды (ТАГ и ДАГ) и фосфолипиды (ФЛ, в том числе ФХ, ФЭ, ФИ, ФС, ФА, ФГ) были проанализированы с помощью мониторинга множественных реакций (ММР) с применением энергии столкновения 30 В и энергии фрагментации 60 В. Нейтральные липиды исследовали на предмет следующих основных жирных кислот: 16:0 (пальмитиновая кислота), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1ω9 (олеиновая кислота, ОК), 18:2ω6 (линолевая кислота, ЛК), 18:3ω3 (α-линоленовая кислота, АЛК), 18:4ω3 (стеаридоновая кислота, СДК), 20:1, 20:2, 20:3, 20:4ω3, 20:5ω3, 22:4ω3, 22:5ω3, 22:6ω3, в то время как фосфолипиды сканировали на предмет наличия молекул C16, C₁₈, C₂₀ и С₂₂ с двойными связями 0-3, 0-4, 0-5, 4-6 соответственно.The extracted total lipids were analyzed using an Agilent 1200 Series LC coupled to an electrospray ionization device (Agilent, Palo Alto, CA, USA). An injection of 5 μL of each total lipid extract was separated by chromatography using an Ascentis Express RP-Amide 50 χ 2.1 mm, 2.7 μm HPLC column (Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia) using a binary gradient at a flow rate of 0.2 ml / min. Mobile phases: A) 10 mM ammonium formate in H ₂ O: methanol: tetrahydrofuran (50:20:30, v / v / v); C) 10 mM ammonium formate in H ₂ O: methanol: tetrahydrofuran (5:20:75, v / v / v). Selected neutral lipids (TAG and DAG) and phospholipids (PL, including PC, FE, PI, PS, PA, FG) were analyzed by monitoring multiple reactions (MMP) using collision energy 30 V and fragmentation energy 60 V. Neutral lipids were tested for the following essential fatty acids: 16: 0 (palmitic acid), 18: 0 (stearic acid), 18: 1ω9 (oleic acid, OC), 18: 2ω6 (linoleic acid, LA), 18: 3ω3 ( α-linolenic acid, ALA), 18: 4ω3 (stearidonic acid, SDA), 20: 1, 20: 2, 20: 3, 20: 4ω3, 20: 5ω3, 22: 4ω3, 22: 5ω3, 22: 6ω3, while the phospholipids were scanned for C16, C ₁₈ , C ₂₀ and C ₂₂ molecules with 0-3, 0-4, 0-5, 4-6 double bonds, respectively.

Отдельные ММР ТАГ были идентифицированы на основе аммонизированного иона-прекурсора и иона продукта, образованного в результате потери нейтронов 20:1, СДК, ЭПК и ДГК. ТАГ и ДАГ количественно определяли с применением 50 мкМ тристеарина и дистеарина в качестве внешних стандартов. ФЛ количественно определяли с использованием 10 мкМ внешних стандартов ди-18:0-ФХ, ди-17:0-ФА, ди-17:0-ФЭ, 17:0-17:1-ФГ, ди-18:1-ФИ и ди-17:0-ФС (Avanti Polar Lipids, Алабастер, Алабама, США). Для выбранных видов ТАГ, ДАГ и ФЛ проводили дальнейшее подтверждение с помощью МС/МС 6520 Q-TOF.The individual MMDs of TAGs were identified based on the ammoniated precursor ion and the product ion formed as a result of a 20: 1 neutron loss, SDC, EPA, and DHA. TAG and DAG were quantified using 50 μM tristearin and distearin as external standards. PL was quantitatively determined using 10 μM external standards di-18: 0-PC, di-17: 0-FA, di-17: 0-PE, 17: 0-17: 1-FG, di-18: 1-PI and di-17: 0-FS (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA). For the selected TAG, DAG, and PL species, further confirmation was performed using MS / MS 6520 Q-TOF.

Определение профиля жирных кислот и содержания масла в семени.Determination of the fatty acid profile and oil content of the seed.

Если необходимо определить содержание масла в семени, семена сушат в эксикаторе в течение 24If it is necessary to determine the oil content of the seed, the seeds are dried in a desiccator for 24

- 52 037184 ч, и около 4 мг семени переносят в стекляйный флакон емкостью 2 мл, с покрытой тефлоном навинчивающейся крышкой. 0,05 мг тригептадеканоина, растворенного в 0,1 мл толуола, добавляют во флакон в качестве внутреннего стандарта.- 52,037184 hours, and about 4 mg of semen is transferred into a 2 ml glass vial with a Teflon-coated screw cap. 0.05 mg of triheptadecanoin dissolved in 0.1 ml of toluene is added to the vial as an internal standard.

МЭЖК семени получают, добавляя 0,7 мл 1н. метанольного HCl (Supelco) во флакон, содержащий материал семени, кратковременно обрабатывают вихревым перемешиванием и инкубируют при 80°С в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры, 0,3 мл 0,9% (мас./об.) раствора NaCl и 0,1 мл гексана добавляют во флакон и тщательно перемешивают в течение 10 мин в Heidolph Vibramax 110. МЭЖК собирают в стеклянную вставку емкостью 0,3 мл и анализируют методом ГХ с плазменноионизационным детектором (ПИД), как было упомянуто ранее.FAME of seed is obtained by adding 0.7 ml of 1N. methanol HCl (Supelco) in a vial containing semen material, vortexed briefly and incubated at 80 ° C for 2 hours.After cooling to room temperature, 0.3 ml of 0.9% (w / v) NaCl solution and 0.1 ml of hexane is added to the vial and mixed thoroughly for 10 minutes in a Heidolph Vibramax 110. The FAMEs are collected in a 0.3 ml glass insert and analyzed by plasma ionization detector (FID) GC as previously mentioned.

Площадь пика отдельного МЭЖК вначале корректируют на основании ответа в виде площади пика известного количества таких же МЭЖК, присутствующих в коммерческом стандарте GLC-411 (NUCHEK PREP, INC., США). GLC-411 содержит равные количества 31 жирной кислоты (мас.%), в интервале от С8:0 до С22:6. В случае жирных кислот, которые отсутствуют в стандарте, изобретатели использовали ответы в виде площади пика наиболее сходного МЭЖК. Например, ответ в виде площади пика МЭЖК 16:1d9 использовали для 16:1d7 и ответ МЭЖК С22:6 использовали для С22:5.The peak area of an individual FAME is first corrected based on the peak area response of a known amount of the same FAME present in the commercial standard GLC-411 (NUCHEK PREP, INC., USA). GLC-411 contains equal amounts of 31 fatty acids (wt%) ranging from C8: 0 to C22: 6. In the case of fatty acids that are absent in the standard, the inventors used the peak area responses of the most similar FAME. For example, a 16: 1d9 FAME peak area response was used for 16: 1d7 and a C22: 6 FAME response was used for C22: 5.

Скорректированные значения площади пика используют для вычисления массы каждого МЭЖК в образце в сравнении с массой внутреннего стандарта. Масло хранится в основном в форме ТАГ, и его массу вычисляют на основании массы МЭЖК. Общее количество моль глицерина определяют путем вычисления количества моль каждого МЭЖК и деления общего количества моль МЭЖК на три. Содержание ТАГ вычисляют как сумму глицерина и жирных ацильных фрагментов с использованием соотношения: мас.% масла = 100 х ((41 х общее количество моль МЭЖК/3) + (общее количество грамм МЭЖК - (15 х общее количество моль МЭЖК)))/грамм семени, где 41 и 15 - молекулярная масса остатка глицерида и метильной группы соответственно.The corrected peak area values are used to calculate the mass of each FAME in the sample versus the mass of the internal standard. The oil is stored primarily in the form of TAG and its mass is calculated based on the mass of the FAME. The total moles of glycerol are determined by calculating the moles of each FAME and dividing the total moles of FAME by three. The TAG content is calculated as the sum of glycerol and fatty acyl fragments using the ratio: wt% oil = 100 x ((41 x total moles FAME / 3) + (total grams of FAME - (15 x total moles FAME))) / gram of seed, where 41 and 15 are the molecular weights of the glyceride residue and methyl group, respectively.

Анализ содержания стеролов в образцах масла.Analysis of sterol content in oil samples.

Образцы около по 10 мг масла, вместе с добавленной аликвотой С24:0 монола в качестве внутреннего стандарта, омыляют с помощью 4 мл 5% раствора KOH в 80% МеОН и нагревания до 80°С, выдерживания в течение 2 ч при этой температуре, в покрытой тефлоном стеклянной пробирке с навинчивающейся крышкой. После охлаждения реакционной смеси добавляют 2 мл воды Milli-Q, и стеролы экстрагируют 2 мл смеси гексан:дихлорметан (4:1, об./об.) при встряхивании и вихревом перемешивании. Смесь центрифугируют, экстракт стеролов извлекают и промывают 2 мл воды Milli-Q. Затем экстракт стеролов отделяют после встряхивания и центрифугирования. Экстракт упаривают в потоке газообразного азота, и стеролы силилируют с использованием 200 мл N,O-бис-(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА) при нагревании до 80°С, выдерживая в течение 2 ч при этой температуре.Samples of about 10 mg of oil, together with an added aliquot of C24: 0 monol as an internal standard, are saponified with 4 ml of 5% KOH solution in 80% MeOH and heating to 80 ° C, incubating for 2 h at this temperature, in Teflon coated glass test tube with screw cap. After the reaction mixture was cooled, 2 ml of Milli-Q water was added and the sterols were extracted with 2 ml of hexane: dichloromethane (4: 1, v / v) with shaking and vortexing. The mixture is centrifuged, the sterol extract is recovered and washed with 2 ml of Milli-Q water. Then the sterol extract is separated after shaking and centrifugation. The extract is evaporated in a stream of nitrogen gas, and the sterols are silylated using 200 ml of N, O-bis- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) while heating to 80 ° C, keeping for 2 h at this temperature.

Для анализа стеролов методом ГХ/ГХ-МС, производные стерол-О-триметилсилила (стерол-OTMSi) сушат в потоке газообразного азота на термоблоке при 40°С, а затем повторно растворяют в хлороформе или гексане непосредственно перед анализом методом ГХ/ГХ-МС. Производные стерол-OTMS анализируют газовой хроматографией (ГХ) с помощью газового хроматографа Agilent Technologies 6890A GC (Пало-Альто, Калифорния, США), оборудованного капиллярной колонкой из кварцевого стекла Supelco Equity™-1 (15 м х 0,1 мм внутренний диаметр, толщина пленки 0,1 мкм), ПИД и инжектором с расщеплением/без расщепления, а также серийным аутосемплером Agilent Technologies 7683B и инжектором. В качества газа-носителя используют гелий. Инжекцию образцов осуществляют в режиме без расщепления при температуре печи 120°С. После инжекции температуру печи повышают до 270°С со скоростью 10°С/мин, и в конце до 300°С со скоростью 5°С/мин. Площадь пиков определяют с помощью программного обеспечения Agilent Technologies ChemStation (Пало-Альто, Калифорния, США). Результаты ГХ содержат ошибку ±5% от значений площади пика отдельных компонентов.For sterol GC / GC-MS analysis, sterol-O-trimethylsilyl derivatives (sterol-OTMSi) are dried in a nitrogen gas stream on a thermoblock at 40 ° C and then redissolved in chloroform or hexane just prior to GC / GC-MS analysis. ... Sterol-OTMS derivatives were analyzed by gas chromatography (GC) using an Agilent Technologies 6890A GC gas chromatograph (Palo Alto, CA, USA) equipped with a Supelco Equity ™ -1 quartz glass capillary column (15 mx 0.1 mm ID, 0.1 μm film thickness), FID and split / non-split injector, and Agilent Technologies 7683B serial autosampler and injector. Helium is used as a carrier gas. Samples are injected in a non-splitting mode at an oven temperature of 120 ° C. After injection, the furnace temperature is increased to 270 ° C at a rate of 10 ° C / min, and finally to 300 ° C at a rate of 5 ° C / min. Peak areas are determined using Agilent Technologies ChemStation software (Palo Alto, CA, USA). GC results contain an error of ± 5% of the peak area values of the individual components.

Анализы методом ГХ-масс-спектрометрии (ГХ-МС) выполняют с помощью приборов для ГХ-МС Finnigan Thermoquest GCQ и Finnigan Thermo Electron Corporation, притом, что обе системы оборудованы инжектором для введения проб непосредственно на колонку, и программного обеспечения Thermoquest Xcalibur (Остин, Техас, США). Каждый из приборов для ГХ оборудован капиллярной колонкой, полярность которой сходна с описанной выше. Индивидуальные компоненты идентифицируют, используя данные масс-спектрометрии и сравнивая данные времени удерживания с полученными для аутентичных и лабораторных стандартов. Полную методику холостого анализа осуществляют параллельно с серией образцов.GC-MS (GC-MS) analyzes are performed using Finnigan Thermoquest GCQ and Finnigan Thermo Electron Corporation GC / MS instruments, both equipped with a direct on-column sample injector, and Thermoquest Xcalibur software (Austin , Texas, USA). Each GC instrument is equipped with a capillary column with a polarity similar to that described above. Individual components are identified using mass spectrometry data and comparing retention time data with those obtained for authentic and laboratory standards. The complete blank assay procedure is performed in parallel with a batch of samples.

Условия ОТ-ПЦР.RT-PCR conditions.

Амплификацию методом ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) обычно осуществляют с использованием системы ОТ-ПЦР Superscript III One-Step (Invitrogen) в объеме 25 мкл, с использованием 10 пмоль прямого праймера и 30 пмоль обратного праймера, MgSO₄ до конечной концентрации 2,5 мМ, 400 нг общей РНК с буфером и нуклеотидными компонентами согласно инструкциям производителя. Типичные температурные режимы представляли собой: 1 цикл при температуре 45°С в течение 30 мин для возникновения обратной транскрипции; затем 1 цикл при температуре 94°С в течение 2 мин, и далее 40 циклов с температурой 94°С в течение 30 с, 52°С в течение 30 с, 70°С в течение 1 мин; затем 1 циклReverse transcriptase PCR (RT-PCR) amplification is typically performed using a Superscript III One-Step RT-PCR system (Invitrogen) in a volume of 25 μl, using 10 pmol forward primer and 30 pmol reverse primer, MgSO ₄ to a final concentration of 2 , 5 mM, 400 ng total RNA with buffer and nucleotide components according to manufacturer's instructions. Typical temperature conditions were: 1 cycle at 45 ° C for 30 min for reverse transcription to occur; then 1 cycle at 94 ° C for 2 min, and then 40 cycles with 94 ° C for 30 s, 52 ° C for 30 s, 70 ° C for 1 min; then 1 cycle

- 53 037184 при температуре 72°С в течение 2 мин перед охлаждением реакционных смесей до 5°С.- 53 037184 at a temperature of 72 ° C for 2 min before cooling the reaction mixtures to 5 ° C.

Определение количества копий трансгенов с помощью цифровой ПЦР.Determination of the number of copies of transgenes using digital PCR.

Для определения количества копий трансгенов в трансгенном растении применяли метод ПЦР, как описано ниже. Кроме того, данный метод может быть применен для определения, является ли растение трансгенным по генетическим конструкциям, описанным в данном описании. Около квадратного сантиметра листовой ткани получают от каждого индивидуального растения и помещают в коллекционную микропробирку (Qiagen). Далее образцы сушат вымораживанием в течение 24-48 ч. Для разрушения образцов с целью экстракции ДНК, к каждому высушенному образцу добавляют шарики из нержавеющей стали, и пробирки встряхивают на лизаторе для тканей Qiagen. 375 мкл буфера для экстракции (0,1 М Трис-HCl, рН 8, 0,05 М ЭДТА, рН 8, и 1,25% НДС) добавляют в каждую пробирку, смеси инкубируют при 65°С в течение 1 ч и затем охлаждают перед добавлением 187 мкл 6 М аммония ацетата в каждую пробирку (4°С) при тщательном перемешивании. Далее образцы центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. Супернатант из каждой пробирки переносят в новые микропробирки, каждая из которых содержит 220 мкл изопропанола, для осаждения ДНК при комнатной температуре в течение 5 мин. ДНК собирают центрифугированием пробирок при 3000 об/мин в течение 30 мин, гранулы ДНК промывают 320 мкл 70% этанола и сушат перед ресуспендированием ДНК в 225 мкл воды. Нерастворенный материал гранулируют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, и 150 мкл каждого супернатанта переносят на 96-луночные планшеты для длительного хранения.To determine the copy number of the transgenes in the transgenic plant, the PCR method was used as described below. In addition, this method can be applied to determine if a plant is transgenic for the genetic constructs described herein. About a square centimeter of leaf tissue is obtained from each individual plant and placed in a collection microtube (Qiagen). Samples are then freeze dried for 24-48 hours. To disrupt the samples for DNA extraction, stainless steel beads are added to each dried sample and the tubes are shaken on a Qiagen tissue lysator. 375 μl of extraction buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 8, 0.05 M EDTA, pH 8, and 1.25% VAT) is added to each tube, the mixtures are incubated at 65 ° C for 1 hour and then chill before adding 187 μl of 6 M ammonium acetate to each tube (4 ° C.) with vigorous stirring. Then the samples are centrifuged for 30 minutes at 3000 rpm. The supernatant from each tube is transferred to new microtubes, each containing 220 μl of isopropanol, to precipitate the DNA at room temperature for 5 minutes. DNA is harvested by centrifugation of tubes at 3000 rpm for 30 min, the DNA pellets are washed with 320 μl of 70% ethanol and dried before resuspending the DNA in 225 μl of water. The undissolved material is granulated by centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes, and 150 μl of each supernatant is transferred to 96-well plates for long-term storage.

Для эффективного и количественного проведения цифровой ПЦР (ddPCR) ДНК расщепляют рестрикционными ферментами перед проведением реакций амплификации, чтобы гарантировать физическое разделение нескольких копий трансгенов или множественных инсерций. Таким образом, аликвоты препаратов ДНК расщепляют с помощью EcoRI и BamHI, вместе взятых, в объеме 20 мкл, с применением 10х буфера EcoRI, 5 мкл ДНК и около 4 единиц каждого фермента на образец, с инкубацией протяжении на ночи при 37°С.For efficient and quantitative digital PCR (ddPCR), DNA is digested with restriction enzymes prior to amplification reactions to ensure that multiple copies of transgenes or multiple insertions are physically separated. Thus, aliquots of the DNA preparations were digested with EcoRI and BamHI combined in a volume of 20 μl using 10x EcoRI buffer, 5 μl DNA and about 4 units of each enzyme per sample, incubated overnight at 37 ° C.

Праймеры, применяемые в этих реакциях ПЦР, были сконструированы с применением программного обеспечения Primer3, чтобы подтвердить, что предсказано отсутствие взаимодействия между праймерами для референтных генов и генов-мишеней, или такое взаимодействие не создает проблем при используемых условиях. Референтным геном в анализе был ген рапса Hmg (группа высокой подвижности), присутствующий в одном экземпляре в геноме рапса (Weng et al., 2004). Поскольку рапс является аллотетраплоидом, было допущено наличие 4 копий гена Hmg, т.е. 2 аллелей каждого из двух генов, в Brassica napus. В реакциях референтного гена применяли пару праймеров и содержащий двойную метку зонд, как указано ниже: смысловой праймер, GCGAAGCACATCGAGTCA (SEQ ID NO: 50); антисмысловой праймер, Can12 GGTTGAGGTGGTAGCTGAGG (SEQ ID NO: 51); Hmg-P3 5'Hex/TCTCTAC/zen/CCGTCTCACATGACGC/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 52). Размер продукта амплификации составлял 73 пары оснований.The primers used in these PCR reactions were designed using the Primer3 software to confirm that no interaction between the primers for the reference and target genes is predicted, or such interaction does not pose a problem under the conditions used. The reference gene in the analysis was the rapeseed gene Hmg (high mobility group), which is present in one copy in the rapeseed genome (Weng et al., 2004). Since rape is an allotetraploid, 4 copies of the Hmg gene were assumed, i.e. 2 alleles of each of the two genes, in Brassica napus. In the reactions of the reference gene, a pair of primers and a double-labeled probe were used as follows: sense primer, GCGAAGCACATCGAGTCA (SEQ ID NO: 50); antisense primer, Can12 GGTTGAGGTGGTAGCTGAGG (SEQ ID NO: 51); Hmg-P3 5'Hex / TCTCTAC / zen / CCGTCTCACATGACGC / 3IABkFQ / -3 '(SEQ ID NO: 52). The size of the amplification product was 73 bp.

В одной реакции амплификации гена-мишени, в ходе которой обнаруживали ген селекционного маркера ФФТ для скрининга всех трансгенных растений, смысловой праймер представлял собой Can17, ATACAAGCACGGTGGATGG (SEQ ID NO: 53); антисмысловой праймер, Can18 TGGTCTAACAGGTCTAGGAGGA (SEQ ID NO: 54); зонд, РРТ-Р3 5'/FAM/TGGCAAAGA/zen/GATTTCGAGCTTCCTGC/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 55). Размер данного продукта амплификации гена-мишени составлял 82 пары оснований. В некоторых случаях, параллельно выполняли второй анализ гена-мишени, чтобы обнаружить частичные инсерции Т-ДНК. В ходе такого второго анализа обнаруживали участок гена Δ6-десатуразы с помощью смыслового праймера, Can23 CAAGCACCGTAGTAAGAGAGCA (SEQ ID NO: 56), антисмыслового праймера, Can24 CAGACAGCCTGAGGTTAGCA (SEQ ID NO: 57); зонда, D6des-P3 5'/FAM/TCCCCACTT/zen/CTTAGCGAAAGGAACGA/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO: 58). Размер данного продукта амплификации гена-мишени составлял 89 пар оснований. В реакциях шаблонно использовали 2 мкл расщепленных препаратов ДНК. Состав реакционной смеси на образец: референтный смысловой праймер (10 пМ), 1 мкл; референтный антисмысловой праймер (10 пМ), 1 мкл; зонд референтного гена (10 пМ), 0,5 мкл; смысловой праймер гена-мишени (10 пМ), 1 мкл; антисмысловой праймер гена-мишени (10 пМ), 1 мкл; зонд гена-мишени (10 пМ), 0,5 мкл; смесь реактивов ddPCR, 12,5 мкл; вода 5,5 мкл, в общем объеме 25 мкл.In one amplification reaction of the target gene, in which the PPT selection marker gene was found for screening all transgenic plants, the sense primer was Can17, ATACAAGCACGGTGGATGG (SEQ ID NO: 53); antisense primer, Can18 TGGTCTAACAGGTCTAGGAGGA (SEQ ID NO: 54); probe, PPT-P3 5 '/ FAM / TGGCAAAGA / zen / GATTTCGAGCTTCCTGC / 3IABkFQ / -3' (SEQ ID NO: 55). The size of this target gene amplification product was 82 bp. In some cases, a second assay of the target gene was performed in parallel to detect partial T-DNA insertions. In this second assay, a region of the Δ6 desaturase gene was detected using a sense primer, Can23 CAAGCACCGTAGTAAGAGAGCA (SEQ ID NO: 56); an antisense primer, Can24 CAGACAGCCTGAGGTTAGCA (SEQ ID NO: 57); probe, D6des-P3 5 '/ FAM / TCCCCACTT / zen / CTTAGCGAAAGGAACGA / 3IABkFQ / -3' (SEQ ID NO: 58). The size of this target gene amplification product was 89 bp. In the reactions, 2 μL of digested DNA preparations were used as a template. The composition of the reaction mixture per sample: reference sense primer (10 pM), 1 μl; reference antisense primer (10 pM), 1 μl; reference gene probe (10 pM), 0.5 μl; sense primer of the target gene (10 pM), 1 μl; antisense primer of the target gene (10 pM), 1 μl; target gene probe (10 pM), 0.5 μl; ddPCR reagent mix, 12.5 μl; water 5.5 μl, in a total volume of 25 μl.

Далее смеси помещали в генератор капелек QX100, который делил каждый образец на 20000 капелек в диапазоне нл. Это проделывали в 8-луночных картриджах до тех пор, пока все образцы не были обработаны и перенесены на 96-луночный ПЦР планшет. Затем планшет опечатывали термоусадочной прокалываемой фольгой с помощью устройства для запечатывания планшетов. После этого образцы обрабатывали со следующими условиями реакции: 95°С, 10 мин, подъем со скоростью 2,5°С/с; затем 39 циклов при 94°С, 30 с подъем со скоростью 2,5°С/с; 61°С, 1 мин, подъем со скоростью 2,5°С/с; 98°С, 10 мин, с последующим охлаждением до 12°С. После реакций амплификации ДНК в капельках, планшеты помещали на устройство для считывания капелек QX100, с помощью которого анализировали каждую капельку индивидуально с применением двухцветной системы обнаружения (набор для обнаруженияThe mixtures were then placed in a QX100 droplet generator, which divided each sample into 20,000 droplets in the nL range. This was done in 8-well cartridges until all samples were processed and transferred to a 96-well PCR plate. The plate was then sealed with heat shrink pierce foil using a plate sealer. After that, the samples were treated with the following reaction conditions: 95 ° C, 10 min, rise at a rate of 2.5 ° C / s; then 39 cycles at 94 ° C, 30 s rise at a rate of 2.5 ° C / s; 61 ° C, 1 min, rise at a rate of 2.5 ° C / s; 98 ° С, 10 min, followed by cooling to 12 ° С. After amplification reactions of DNA in droplets, the plates were placed on a QX100 droplet reader, with which each droplet was analyzed individually using a two-color detection system (detection kit

- 54 037184- 54 037184

FAM или Hex). Цифровые данные ПЦР капельки рассматривали как 1-D график, на котором каждая капелька образца была нанесена на график интенсивности флуоресценции, или 2-D график, на который наносили флуоресценцию (FAM) против флуоресценции (Hex) для каждой капельки. С помощью программного обеспечения измеряли количество положительных и отрицательных капелек для каждого флюорофора (FAM или Hex) в каждом образце. Далее с помощью программного обеспечения аппроксимировали фракцию положительных капелек к алгоритму Пуассона, чтобы определить концентрацию целевой молекулы ДНК в единицах копий/мкл входа. Вариацию количества копий вычисляли с применением формулы: CNV = (А/В) · Nb, где концентрация А = концентрация гена-мишени, В = концентрация референтного гена и Nb = 4, количество копий референтного гена в геноме.FAM or Hex). The digital PCR data of the droplets was viewed as a 1-D plot in which each sample droplet was plotted on a fluorescence intensity plot, or a 2-D plot on which fluorescence (FAM) versus fluorescence (Hex) was plotted for each droplet. The software measured the number of positive and negative droplets for each fluorophore (FAM or Hex) in each sample. Then, using the software, the fraction of positive droplets was approximated to the Poisson algorithm to determine the concentration of the target DNA molecule in copy units / μl of input. The copy number variation was calculated using the formula: CNV = (A / B) · Nb, where concentration A = concentration of the target gene, B = concentration of the reference gene and Nb = 4, the number of copies of the reference gene in the genome.

Оценка жизнеспособности пыльцы.Pollen viability assessment.

Флуоресцеина диацетат (ФДА) растворяли в ацетоне в концентрации 2 мг/мл с получением запасного раствора. Разведения ФДА готовили непосредственно перед использованием, по каплям добавляя запасной раствор ФДА к 2 мл раствора сахарозы (0,5 М) до насыщения, на которое указывало появление устойчивой мутности.Fluorescein diacetate (PDA) was dissolved in acetone at a concentration of 2 mg / ml to obtain a stock solution. PDA dilutions were prepared immediately prior to use by adding a PDA stock solution dropwise to 2 ml sucrose solution (0.5 M) until saturation indicated by the appearance of persistent turbidity.

Пропидия йодид (ПЙ) растворяли в стерильной дистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл с получением запасного раствора. Непосредственно перед использованием 100 мкл запасного раствора добавляли к 10 мл стерильной дистиллированной воды с получением рабочего раствора. Для проверки соотношения жизнеспособной и нежизнеспособной пыльцы, запасные растворы ПЙ и ФДА смешивали в соотношении 2:3.Propidium iodide (PI) was dissolved in sterile distilled water at a concentration of 1 mg / ml to obtain a stock solution. Immediately before use, 100 μl of the stock solution was added to 10 ml of sterile distilled water to obtain a working solution. To check the ratio of viable and nonviable pollen, stock solutions of PY and PDA were mixed in a ratio of 2: 3.

Растения рапса и горчицы, трансгенные и дикого типа, выращивали в стандартных условиях в теплице при 22±2°С с фотопериодом 16 ч в сутки. Зрелые бутоны, которые были готовы раскрыться на следующий день, маркировали и собирали на следующее утро в 9-10 ч. Пыльцу из раскрытых цветков окрашивали смесью ФДА/ПЙ и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica MZFLIII. Использовали эмиссионный фильтр с пропусканием в длинноволновой области спектра GFP-2 510 нм (пропускание красного и зеленого света) с фильтром возбуждения 480/40 нм для обнаружения жизнеспособной и нежизнеспособной пыльцы. Нежизнеспособная пыльца, которая захватывала краситель ПЙ, имела красный цвет под флуоресцентным микроскопом, тогда как жизнеспособная пыльца при окрашивании ПЙ и ФДА имела ярко-зеленый цвет.Rape and mustard plants, transgenic and wild type, were grown under standard conditions in a greenhouse at 22 ± 2 ° C with a photoperiod of 16 h per day. Mature buds that were ready to open the next day were marked and harvested the next morning at 9-10 am. Pollen from the opened flowers were stained with PDA / PY and visualized with a Leica MZFLIII fluorescence microscope. Used an emission filter with a transmission in the long wavelength region of the spectrum GFP-2 510 nm (transmission of red and green light) with an excitation filter 480/40 nm to detect viable and non-viable pollen. The non-viable pollen that captured the PY dye was red under a fluorescence microscope, while the viable pollen when stained with PY and PDA had a bright green color.

Пример 2. Стабильная экспрессия трансгенного пути ДГК в семенах Camelina sativa.Example 2. Stable expression of the transgenic DHA pathway in the seeds of Camelina sativa.

Бинарный вектор pJP3416-GA7 (см. фиг. 2 и SEQ ID NO: 1) вводят в A. tumefaciens, штамм AGL1, и клетки из культуры трансформированного Agrobacterium используют для обработки цветущего растения С. sativa, с применением способа погружения цветков для трансформации (Lu и Kang, 2008). После выращивания и созревания растений урожай семян T1 с обработанных растений собирают, высевают в грунт, и полученные в результате растения обрабатывают путем опрыскивания гербицидом BASTA для селекции трансгенных растений, которые экспрессируют ген селекционного маркера bar на Т-ДНК pJP3416-GA7. Выжившие растения T1, толерантные к гербициду, выращивают до состояния зрелости после того, как им давали возможность самооплодотворения, и собирают урожай образовавшегося семени T₂. Пять трансгенных растений были получены, только три из них содержали полную Т-ДНК.Binary vector pJP3416-GA7 (see FIG. 2 and SEQ ID NO: 1) is introduced into A. tumefaciens strain AGL1, and cells from a culture of transformed Agrobacterium are used to treat a flowering C. sativa plant using a submerged transformation method ( Lu and Kang, 2008). After the plants have grown and matured, the T1 seed is harvested from the treated plants, sown in the ground, and the resulting plants are sprayed with BASTA herbicide to select transgenic plants that express the selection marker gene bar on T-DNA pJP3416-GA7. Surviving herbicide-tolerant T1 plants are grown to maturity after being allowed to self-fertilize and the resulting T ₂ seed is harvested. Five transgenic plants were obtained, only three of them contained full T-DNA.

Липид экстрагируют из пула около 20 семян каждого из трех растений, которые содержали полную Т-ДНК. Два из объединенных в пул образцов содержали очень низкие, едва обнаружимые уровни ДГК, но третий пул образцов содержал около 4,7% ДГК. Таким образом, липид был извлечен от 10 индивидуальных семян T2 данного растения, и состав жирных кислот проанализирован методом ГХ. Данные относительно состава жирных кислот индивидуальных семян для данной трансформированной линии также приведены в табл. 4. Компилированные данные из профилей (табл. 4) общего липида семян приведены в табл. 5.Lipid is extracted from a pool of about 20 seeds from each of the three plants, which contained total T-DNA. Two of the pooled samples contained very low, barely detectable levels of DHA, but the third pool of samples contained about 4.7% DHA. Thus, lipid was recovered from 10 individual T2 seeds of a given plant, and the fatty acid composition was analyzed by GC. Data on the composition of fatty acids of individual seeds for this transformed line are also shown in table. 4. Compiled data from profiles (Table 4) of the total lipid of seeds are shown in Table. five.

ДГК присутствовала в шести из 10 индивидуальных семян. Четыре другие семени не содержали ДГК и были приняты в качестве нулевых сегрегантов, не содержащих Т-ДНК, на основании гемизиготности инсерции Т-ДНК в материнском растении. Экстрагированный липид из единственного семени с наиболее высоким уровнем ДГК содержал 9,0% ДГК, в то время как суммарный процент для ЭПК, ДПК и ДГК составил 11,4%.DHA was present in six out of 10 individual seeds. Four other seeds did not contain DHA and were adopted as null segregants without T-DNA based on the hemizygosity of the T-DNA insertion in the mother plant. The extracted lipid from the single seed with the highest DHA level contained 9.0% DHA, while the combined percentage for EPA, DPC and DHA was 11.4%.

- 55 037184- 55 037184

Таблица 4Table 4

Состав жирных кислот общего липида семян из трансгенных семян T2 Camelina sativa, трансформированных Т-ДНК из pJP3416-GA7. Состав жирных кислот приведен для объединенной в пул серии (FD5.46) семени и для 10 отдельных семян, ранжированных (слева направо) от самого высокого до самого низкого ________________________уровня ДГК________________________Fatty acid composition of the total lipid of seeds from transgenic T2 Camelina sativa seeds transformed with T-DNA from pJP3416-GA7. Fatty acid compositions are given for a pooled batch (FD5.46) seed and for 10 individual seeds ranked (left to right) from highest to lowest ________________________ DHA ________________________

Жирная кислота Fatty acid Пул FD5.46 Pool FD5.46 #2 # 2 #4 #four #8 #8 #7 # 7 #9 #nine #1 #one #3 # 3 #5 #five #6 # 6 #10 #ten 14:0 14: 0 0 0 0,2 0.2 0,2 0.2 0,1 0.1 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 0,1 0.1 0,2 0.2 0,2 0.2 16:0 16: 0 11,6 11.6 12,1 12.1 12,3 12.3 12,1 12.1 13,2 13.2 123 123 12,8 12.8 11,9 11.9 11,4 11.4 11,5 11.5 11,7 11.7 16:1 16: 1 0,2 0.2 0,0 0.0 0,1 0.1 0,1 0.1 0,0 0.0 0,2 0.2 0,0 0.0 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 0,2 0.2 16:3 16: 3 0,3 0.3 0 0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 18:0 18: 0 3,7 3.7 3,3 3.3 3,2 3.2 3,2 3.2 3,0 3.0 3,1 3.1 3,2 3.2 3,3 3.3 3,1 3.1 3,2 3.2 3,2 3.2 18:1 18: 1 10,8 10.8 8,0 8.0 8,0 8.0 8,6 8.6 8,5 8.5 9,4 9.4 11,0 11.0 10,2 10.2 8,3 8.3 9,4 9.4 8,6 8.6 18:1Δ11 18: 1Δ11 1,7 1.7 1,3 1,3 1,4 1.4 1,4 1.4 1,7 1.7 1,4 1.4 1,5 1.5 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 18:2 18: 2 24,7 24.7 18,2 18.2 19,5 19.5 19,2 19.2 18,5 18.5 20,1 20.1 23,8 23.8 32,2 32.2 30,3 30.3 29,8 29.8 31,6 31.6 18:3ω3 18: 3ω3 27,4 27.4 26,7 26.7 26,6 26.6 27,3 27.3 28,9 28.9 28,2 28.2 27,4 27.4 28,3 28.3 29,2 29.2 29,5 29.5 28,2 28.2 18:3ω6 18: 3ω6 0,2 0.2 1,4 1.4 0,3 0.3 0,3 0.3 0,4 0,4 0,2 0.2 0,5 0.5 0,0 0.0 0,5 0.5 0,4 0,4 0,6 0.6 20:0 20: 0 1,6 1.6 1,4 1.4 1,3 1,3 1,4 1.4 1,2 1,2 1,4 1.4 1,4 1.4 1,8 1.8 2,1 2.1 1,9 1.9 2,0 2.0 18:4ω3 18: 4ω3 2,2 2.2 6,8 6.8 6,4 6.4 5,7 5.7 7,2 7.2 5,7 5.7 4,1 4.1 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 20:1Δ11 20: 1Δ11 5,3 5.3 4,4 4.4 4,6 4.6 4,8 4.8 3,3 3.3 4,1 4.1 3,5 3.5 4,4 4.4 6,1 6.1 5,8 5.8 5,5 5.5 20:1 iso 20: 1 iso 0,4 0,4 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 ο,ο ο, ο 0,5 0.5 0,6 0.6 0,5 0.5 0,5 0.5 20:2ω6 20: 2ω6 0,8 0.8 0,8 0.8 0,9 0.9 0,8 0.8 0,6 0.6 0,8 0.8 0,7 0.7 1,3 1,3 1,5 1.5 1,4 1.4 1,4 1.4 20:3ω3 20: 3ω3 0,6 0.6 0,8 0.8 0,8 0.8 0,8 0.8 0,7 0.7 0,8 0.8 0,7 0.7 0,6 0.6 0,7 0.7 0,7 0.7 0,6 0.6 22:0 22: 0 0,4 0,4 0,5 0.5 0,5 0.5 0,5 0.5 0,4 0,4 0,5 0.5 0,5 0.5 0,6 0.6 0,6 0.6 0,6 0.6 0,6 0.6 20:4ω3 20: 4ω3 0,2 0.2 0,3 0.3 0.3 0.3 0,3 0.3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0.5 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 22:1 22: 1 1,1 1.1 1,1 1.1 1,2 1,2 1,1 1.1 0,5 0.5 0,9 0.9 0,8 0.8 1,6 1.6 2,2 2.2 1,9 1.9 2,0 2.0 20:5ω3 20: 5ω3 0,7 0.7 1,3 1,3 1,6 1.6 1,5 1.5 1,6 1.6 1,1 1.1 1,7 1.7 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,1 0.1 22:2ω6 22: 2ω6 0,1 0.1 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,2 0.2 0,3 0.3 0,2 0.2 0,2 0.2 22:4ω6+22:3ω3 22: 4ω6 + 22: 3ω3 0,3 0.3 0,2 0.2 0,3 0.3 0,3 0.3 0,0 0.0 0,3 0.3 0,0 0.0 0,4 0,4 0,6 0.6 0,5 0.5 0,5 0.5 24:0 24: 0 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 0,3 0.3 0,0 0.0 0,3 0.3 0,0 0.0 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 24:1 24: 1 0,3 0.3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,3 0.3 0,0 0.0 0,3 0.3 0,0 0.0 0,5 0.5 0,6 0.6 θ,5 θ, 5 0,5 0.5 22:5ω3 22: 5ω3 0,3 0.3 1,1 1.1 1,2 1,2 1,1 1.1 1,1 1.1 0,9 0.9 0,8 0.8 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 22:6ω3 22: 6ω3 4,7 4.7 9,0 9.0 8,5 8.5 S3 S3 83 83 7,1 7.1 4,9 4.9 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0

- 56 037184- 56 037184

Таблица 5Table 5

Компилированные данные из профилей общего липида семян для трансгенного семени, приведенного в табл. 4. Вычисления не включают незначительных жирных кислот, включенных в табл. 4Compiled data from the total lipid profiles of the seeds for the transgenic seed shown in table. 4. Calculations do not include minor fatty acids included in table. four

Параметр Parameter Пул FD5.46 Pool FD5.46 #2 # 2 #4 #four #8 #8 #7 # 7 #9 #nine #1 #one #3 # 3 #5 #five #6 # 6 #10 #ten Общие шЗ ( % от общих ЖК) General SHZ (% of total LCD) 36,1 36.1 46 46 45,4 45.4 45 45 48,2 48.2 44,2 44.2 40,1 40.1 28,9 28.9 29,9 29.9 30,2 30.2 28,9 28.9 Общие шб ( % от общих жю Common sb (% of total zhu 25,8 25.8 20,4 20.4 20,7 20,7 20,3 20.3 19,5 19.5 21,1 21.1 25 25 33,7 33,7 32,6 32.6 31,8 31.8 33,8 33.8 Соотношение ®3/ω6 Ratio ®3 / ω6 1,40 1.40 2,25 2.25 2,19 2.19 2,22 2.22 2,47 2.47 2,09 2.09 1,60 1.60 0,86 0.86 0,92 0.92 0,95 0.95 0,86 0.86 Соотношение ω6/ω3 The ratio ω6 / ω3 0,71 0.71 0,44 0.44 0,46 0.46 0,45 0.45 0,40 0.40 0,48 0.48 0,62 0.62 1,17 1.17 1,09 1.09 1,05 1.05 1,17 1.17 Общие новые m3 ( % от общих ЖК) General new m3 (% of total LCD) 8,1 8.1 18,5 18.5 18 18 16,9 16.9 18,6 18.6 15,2 15.2 12 12 0 0 0 0 0 0 ОД OD Общие новые ®6 ( % от общих ЖК} General new ®6 (% of total LCD} 1,1 1.1 2,2 2.2 1,2 1,2 1,1 1.1 1 one 1 one 1,2 1,2 1,5 1.5 2,3 2,3 2 2 2,2 2.2 Соотношение новых соЗЛоб Ratio of new SOPs 7,36 7.36 8,41 8.41 15,00 15.00 15,36 15.36 18,60 18.60 15,20 15.20 10,00 10.00 0,05 0.05 Соотношение новых ωό/ω3 The ratio of new ωό / ω3 0,14 0.14 0,12 0.12 0,07 0.07 0,07 0.07 0,05 0.05 0,07 0.07 0,10 0.10 22,00 22.00 Эффективность превращения ОК в ЭПК Efficiency of converting OK to EPA 8,2 % 8.2% 15,6 % 15.6% 15,5 % 15.5% 15,1 % 15.1% 15,1 % 15.1% 12,8 % 12.8% 10,5 % 10.5% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,1 % 0.1% Эффективность превращения ОК в ДГК Efficiency of conversion of OA to DHA 6,7 % 6.7% 12,3 % 12.3% 11,6 % 11.6% 11,5 % 11.5% 11,4 % 11.4% 10,0 % 10.0% 7,0% 7.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% Эффективность превращения ЛК в ЭПК The efficiency of the conversion of LA into EPA 9,2 % 9.2% 17,2 % 17.2% 17,1 % 17.1% 16,7 % 16.7% 16,2 % 16.2% 13,9 % 13.9% 11,4 % 11.4% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,2 % 0.2% Эффективность превращения ЛК в ДГК Efficiency of conversion of LA to DHA 7,6 % 7.6% 13,6 % 13.6% 12,9 % 12.9% 12,7 % 12.7% 12,3 % 12.3% 10,9 % 10.9% 7,5 % 7.5% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% Эффективность превращения АЛК в ЭПК Efficiency of conversion of ALA to EPA 15,8% 15.8% 24,8 % 24.8% 24,9 % 24.9% 24,2 % 24.2% 22,8 % 22.8% 20,6 % 20.6% 18,5 % 18.5% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,3 % 0.3% Эффективность превращения АЛК в ДГК Efficiency of conversion of ALA to DHA 13,0 % 13.0% 19,6 % 19.6% 18,7 % 18.7% 18,4 % 18.4% 17,2 % 17.2% 16,1 % 16.1% 12,2 % 12.2% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% 0,0 % 0.0% Общие насыщенные жирные кислоты Total Saturated Fatty Acids 17,6 17.6 17,8 17.8 17,8 17.8 17,6 17.6 18 18 17,8 17.8 18,1 18.1 18,2 18.2 17,7 17.7 17,8 17.8 18,1 18.1 Общие мононенасыщенные жирные кислоты Total Monounsaturated Fatty Acids 19,8 19.8 15,5 15.5 16 16 16,6 16.6 14,3 14.3 16,6 16.6 16,8 16.8 18,7 18.7 19,3 19.3 19,6 19.6 18,6 18.6 Общие полиненасыщенные жирные кислоты Total polyunsaturated fatty acids 62,5 62.5 66,6 66.6 66,4 66.4 65,6 65.6 67,7 67.7 65,6 65.6 65,1 65.1 63 63 63,1 63.1 62,5 62.5 63,2 63.2 Общие С20 General C20 9,6 9.6 9,3 9.3 9,8 9.8 9,9 9.9 8,1 8.1 8,9 8.9 8,5 8.5 8,6 8.6 11 eleven 10,3 10.3 10,1 10.1 Общие С22 General C22 5,4 5.4 10,3 10.3 10 ten 9,7 9,7 9,4 9.4 8,3 8.3 5,7 5.7 0,6 0.6 0,9 0.9 0,7 0.7 0,7 0.7 Соотношение Общие С20/С22 Ratio General C20 / C22 1,78 1.78 0,90 0.90 0,98 0.98 1,02 1.02 0,86 0.86 1,07 1.07 14,9 14.9 14,33 14.33 12,22 12.22 14,71 14.71 14,43 14.43

Гомозиготное семя данной линии получают в поколении Т4. До 10,3% ДГК вырабатывается в событии FD5-46-18-110 со средней величиной 7,3% ДГК, наблюдаемой для всего поколения Т4. Последующее поколение (Т5) было получено с целью дополнительного тестирования стабильности выработки ПНЖК на протяжении нескольких поколений, особенно ДГК. Обнаружено, что наблюдаемые максимальные уровни ДГК были стабильными в пятом поколении, даже несмотря на то, что содержание ДГК в пуле семени не стабилизировалось до поколения Т4 из-за присутствия многочисленных трансгенных локусов. Дополнительно, партии семени Т5 проращивали на средах МС in vitro вместе с семенем материнской С. sativa, причем очевидных различий в эффективности или скорости прорастания не наблюдалось. Дальнейшие поколения трансгенной линии (поколения Т6, Т7 и т.д) не проявляли снижения уровня ДГК в семени. Трансгенные растения обладали полноценной мужской и женской фертильностью, и пыльца продемонстрировала около 100% жизнеспособности относительно растений дикого типа. Анализ содержания масла в семенах, содержащих различные уровни ДГК, не выявил корреляции между уровнем ДГК и содержанием масла, в противоположность корреляции, наблюдаемой для Arabidopsis thaliana.The homozygous seed of this line is obtained in the T4 generation. Up to 10.3% DHA is produced in the FD5-46-18-110 event with an average of 7.3% DHA observed for the entire T4 generation. The next generation (T5) was obtained for the purpose of additional testing of the stability of PUFA production over several generations, especially DHA. It was found that the observed maximum DHA levels were stable in the fifth generation, even though the DHA content in the seed pool did not stabilize until the T4 generation due to the presence of numerous transgenic loci. Additionally, batches of T5 seed were germinated on MC in vitro media together with maternal C. sativa seed with no apparent difference in efficacy or germination rate. Further generations of the transgenic line (generations T6, T7, etc.) did not show a decrease in the level of DHA in the seed. The transgenic plants had full male and female fertility, and the pollen showed about 100% viability relative to wild-type plants. Analysis of oil content in seeds containing different levels of DHA did not reveal a correlation between DHA level and oil content, in contrast to the correlation observed for Arabidopsis thaliana.

В нескольких дальнейших трансгенных линиях, содержание ДГК в отдельных семенах от независимых событий превышало 12%. Соотношение трансгенных:нулевых для этих линий составляло около от 3:1 до 15:1. Анализ характерных профилей жирных кислот для образцов с наиболее высоким содержанием ДГК от каждой конструкции выявил только 1,2-1,4% ГЛК при отсутствии других новых ω6 РНЖК. И наоборот, было обнаружено, что новые ω3 ПНЖК (СДК) ω3 ДЦ-ПНЖК (ЭТК, ЭПК, ДПК,In several further transgenic lines, the DHA content in individual seeds from independent events exceeded 12%. The transgenic: nil ratio for these lines was about 3: 1 to 15: 1. Analysis of characteristic profiles of fatty acids for samples with the highest DHA content from each construct revealed only 1.2-1.4% GLA in the absence of other new ω6 RNA. Conversely, it was found that new ω3 PUFA (SDA) ω3 DC-PUFA (ETC, EPA, DPK,

- 57 037184- 57 037184

ДГК) аккумулируются до 18,5% при уровне ДНК 9,6% в общем содержании жирных кислот. Степень Δ6десатурации составляла 32%, и содержание ЭПК составляло 0,8% от общего содержания жирных кислот.DHA) accumulate up to 18.5% at a DNA level of 9.6% in the total fatty acid content. The desaturation rate Δ6 was 32%, and the EPA content was 0.8% of the total fatty acid content.

Эффективность Δ5-элонгации составляла 93%, и эффективность Δ6-элонгации составляла 60%. ДГК была обнаружена в полярной фракции липидов семени линий GA7.The Δ5 elongation efficiency was 93% and the Δ6 elongation efficiency was 60%. DHA was found in the polar lipid fraction of the GA7 seed lines.

Было отмечено, что наблюдаемые соотношения сегрегации (от ~3:1 до ~15:1) указывают на то, что один или максимум два трансгенных локуса были необходимы для выработки ДГК в С. saliva на уровнях, подобных уровням в рыбьем жире. Это имеет важное значение для простоты разведения трансгенного признака, а также для стабильности трансгена.It was noted that the observed segregation ratios (~ 3: 1 to ~ 15: 1) indicate that one or a maximum of two transgenic loci were required for DHA production in C. saliva at levels similar to those in fish oil. This is important for the ease of breeding the transgenic trait, as well as for the stability of the transgene.

Гомозиготное семя высаживают в несколько теплиц с целью получения в сумме свыше 600 индивидуальных растений. Масло экстрагировали из семени с применением различных способов, в том числе аппарата Сокслета, экстракции ацетоном и гексаном.Homozygous seed is planted in several greenhouses in order to obtain a total of over 600 individual plants. The oil was extracted from the seed using a variety of methods, including Soxhlet, acetone and hexane extraction.

Проводили ¹³С ЯМР анализ региоспецифичности для масла семени трансгенной С. saliva с целью определения позиционного распределения ω3 ДЦ-ПНЖК в ТАГ. Событие с около равным содержанием ЭПК и ДГК было выбрано для максимизации ответа на данные жирные кислоты, причем соотношение sn-1,3 к sn-2 было найдено на уровне 0,75:0,25 для ЭПК и 0,86:0,14 для ДГК, притом, что объективное распределение должно было бы составлять 0,66:0,33. Т.е. 75% ЭПК и 86% ДГК были расположены в положении sn-1,3 ТАГ. Это показывает, что обе жирные кислоты были предпочтительно локализованы в положениях ТАГ С. saliva, хотя предпочтение для ЭПК было выражено слабее, чем для ДГК. Тот факт, что ДГК была предпочтительно найдена в sn-1,3, был сходен с результатами, о которых ранее сообщалось для семени A. thaliana (Petrie el al., 2012). ^{A 13} C NMR analysis of regiospecificity for the seed oil of transgenic C. saliva was carried out in order to determine the positional distribution of ω3 DC-PUFA in TAG. An event with about equal EPA and DHA was chosen to maximize the response to these fatty acids, with a sn-1.3 to sn-2 ratio found at 0.75: 0.25 for EPA and 0.86: 0.14 for DHA, while the objective distribution should have been 0.66: 0.33. Those. 75% of EPA and 86% of DHA were located at the sn-1,3 position of TAG. This indicates that both fatty acids were preferentially localized to the TAG positions of C. saliva, although the preference for EPA was less pronounced than for DHA. The fact that DHA was preferentially found in sn-1,3 was similar to the results previously reported for A. thaliana seed (Petrie el al., 2012).

Поскольку количество независимых трансгенных линий, полученных в раскрытых выше экспериментах с трансформацией, было низким, дальнейшие трансформации С. saliva были осуществлены с применением конструкции мотива GA7-modB (пример 3). Получено большее количество трансформантов, и идентифицированы гомозиготные линии, вырабатывающие ДГК в количестве более 20,1%.Since the number of independent transgenic lines obtained in the above-disclosed transformation experiments was low, further transformations of C. saliva were carried out using the GA7-modB motif construct (Example 3). A greater number of transformants were obtained, and homozygous lines producing DHA in an amount of more than 20.1% were identified.

Пример 3. Модификации Т-ДНК, кодирующих пути ДГК в семенах растений.Example 3. Modifications of T-DNA encoding DHA pathways in plant seeds.

Для улучшения уровня выработки ДГК в В. napus по сравнению с уровнями, описанными в WO2013/185184, бинарные векторы pJP3416-GA7-modA, pJP3416-GA7-modB, pJP3416-GA7-modC, pJP3416-GA7-modD, pJP3416-GA7-modE и pJP3416-GA7-modF были сконструированы, как описано в WO2013/185184, и протестированы на трансгенных растениях. Эти бинарные векторы представляют собой варианты конструкции pJP3416-GA7 и были сконструированы с целью дальнейшего повышения синтеза ДГК в семенах растений, особенно путем улучшения функций Δ6-десатуразы и Δ6-элонгазы. Наблюдалась аккумуляция СДК в некоторых семенах, трансформированных конструкцией GA7, вследствие относительно низкой эффективности Δ6 элонгации, по сравнению с Δ5-элонгазой, поэтому, среди прочих модификаций, положение двух генов элонгазы было поменяно в Т-ДНК.To improve the level of DHA production in B. napus in comparison with the levels described in WO2013 / 185184, the binary vectors pJP3416-GA7-modA, pJP3416-GA7-modB, pJP3416-GA7-modC, pJP3416-GA7-modD, pJP3416-GA7- modE and pJP3416-GA7-modF were constructed as described in WO2013 / 185184 and tested in transgenic plants. These binary vectors are constructs of pJP3416-GA7 and were designed to further enhance DHA synthesis in plant seeds, especially by improving the functions of Δ6 desaturase and Δ6 elongase. The accumulation of SDC was observed in some seeds transformed with the GA7 construct, due to the relatively low efficiency of Δ6 elongation compared to Δ5-elongase, therefore, among other modifications, the position of two elongase genes was changed in T-DNA.

Две последовательности, кодирующие элонгазы в pJP3416-GA7, были поменяны местами на ТДНК, с получением pJP3416-GA7-modA первым клонированием новой кассеты Δ6-элонгазы P. cordala между сайтами SbfI pJP3416-GA7, для замены кассеты Δ5-элонгазы P. cordala. Данная конструкция была дополнительно модифицирована посредством обмена промотора FP1, управляющего Δ6-десатуразой М, pusilla, с промотором конлинина Cnl2 (pLuCnl2), чтобы получить pJP3416-GA7-modB. Данная модификация была осуществлена с целью увеличения экспрессии Δ6-десатуразы, и таким образом эффективности фермента. Считается, что промотор Cn12 может давать более высокую экспрессию трансгена в В. napus, чем укороченный промотор напина.The two sequences encoding the elongases in pJP3416-GA7 were swapped with TDNA, resulting in pJP3416-GA7-modA by first cloning a new P. cordala Δ6 elongase cassette between the SbfI sites of pJP3416-GA7 to replace the P. cordala Δ5 elongase cassette. This construct was further modified by exchanging the FP1 promoter driving Δ6-desaturase M, pusilla, with the conlinin Cnl2 promoter (pLuCnl2) to obtain pJP3416-GA7-modB. This modification was carried out in order to increase the expression of Δ6-desaturase, and thus the efficiency of the enzyme. It is believed that the Cn12 promoter may result in higher transgene expression in B. napus than the truncated napin promoter.

Получены 8 трансгенных событий pJP3416-GA7-modB A. lhaliana и 15 трансгенных событий pJP3416-GA7-modG A. lhaliana. Наблюдается от 3,4 до 7,2% ДГК в пуле семени pJP3416-GA7-modB и от 0,6 до 4,1% ДГК в пуле семени Т2 pJP3416-GA7-modG. Некоторые из событий pJP3416-GA7-modB с наиболее высоким уровнем высевают на селекционные среды, и выжившие саженцы отбирают для следующего поколения. Семя анализируют на предмет содержания ДГК. Поскольку объединенные в пул семена Т1 представляют популяции, сегрегированные по трансгенам, и включают любые нулевые сегреганты, ожидается, что в гомозиготном семени растений-потомков уровни ДГК будут выше, до 30% от общего содержания жирных кислот в масле семени. Другие модифицированные конструкции использовались для трансформации A. lhaliana. Хотя получено только небольшое количество трансформированных линий, ни одна из них не давала более высоких уровней ДГК, чем конструкция modB.Eight transgenic events pJP3416-GA7-modB A. lhaliana and 15 transgenic events pJP3416-GA7-modG A. lhaliana were obtained. There is 3.4 to 7.2% DHA in the pJP3416-GA7-modB seed pool and 0.6 to 4.1% DHA in the T2 seed pool of pJP3416-GA7-modG. Some of the pJP3416-GA7-modB events with the highest level are sown on breeding media and surviving seedlings are selected for the next generation. The seed is analyzed for DHA content. Since the pooled T1 seeds represent transgenic segregated populations and include any null segregants, DHA levels in homozygous seed of offspring plants are expected to be higher, up to 30% of the total fatty acids in the seed oil. Other modified constructs were used to transform A. lhaliana. Although only a small number of transformed lines were obtained, none of them produced higher levels of DHA than the modB construct.

Конструкцию pJP3416-GA7-modB дополнительно применяли для генерации трансформированных растений В. napus сорта Oscar и серии сортовых линий, обозначенных NX002, NX003, NX005, NX050, NX052 и NX054. Всего было получено 1558 трансформированных растений, включая 77 независимых трансформированных растений (Т0) для трансформации Oscar, и 1480 независимых растений для сортовых линий, включая 189 для NX005, которая представляет собой линию с высоким содержанием олеиновой кислоты в масле семян благодаря мутациям в генах FAD2. Другие сортовые линии содержали более высокие уровни ЛК и АЛК. Трансгенные растения, которые продемонстрировали более 4 копий Т-ДНК по данным метода цифровой ПЦР (пример 1), были отброшены; около 25% растений Т0 было отброшено по данному критерию. Около 53% трансгенных растений Т0 содержали 1 или 2 копии Т-ДНК, по даннымThe pJP3416-GA7-modB construct was additionally used to generate transformed B. napus plants cv. Oscar and a series of varietal lines designated NX002, NX003, NX005, NX050, NX052 and NX054. A total of 1558 transformed plants were obtained, including 77 independent transformed plants (T0) for Oscar transformation, and 1480 independent plants for varietal lines, including 189 for NX005, which is a line with a high content of oleic acid in seed oil due to mutations in the FAD2 genes. Other cultivar lines contained higher levels of LA and ALA. Transgenic plants that showed more than 4 copies of T-DNA by digital PCR (Example 1) were discarded; about 25% of T0 plants were discarded according to this criterion. About 53% of transgenic T0 plants contained 1 or 2 copies of T-DNA, according to

- 58 037184 метода цифровой ПЦР, 12% содержали около 3 копии, и 24% - 4 или более копий. Урожай семян (семя Т1) был собран около с 450 трансгенных линий после самоопыления, достигнутого путем изолирования растений мешочками во время цветения, чтобы избежать скрещивания. Урожай семян Т1 собран с остальных трансгенных растений после созревания. Около 1-2% линий растений были стерильными с точки зрения мужской или женской фертильности и не давали жизнеспособных семян; такие растения Т0 были отброшены.- 58 037184 digital PCR method, 12% contained about 3 copies, and 24% contained 4 or more copies. The seed (T1 seed) was harvested from about 450 transgenic lines after self-pollination, achieved by isolating the plants with pouches during flowering to avoid crossbreeding. T1 seeds are harvested from the rest of the transgenic plants after maturation. About 1-2% of the plant lines were sterile in terms of male or female fertility and did not produce viable seeds; such T0 plants were discarded.

Пулы семени (по 20 семян Т1 в каждом пуле) тестировали на предмет уровней ДГК в пуле масла семян, и линии, которые продемонстрировали самые высокие уровни, отбирали. В частности, были отобраны линии с содержанием ДГК по меньшей мере 2% от общего содержания жирных кислот в пуле семян Т1. Около 15% трансгенных линий было отобрано таким образом; остальные 85% были отброшены. Некоторые из них были обозначены как линии СТ132-5 (сорт Oscar), CT133.15-15, -24, -63, -77, -103, -129 и -130 (в NX005). Отобранные линии в NX050 включали СТ136-4, -8, -12, -17, -19, -25, -27, -49 и -51. Обеспечивали набухание двадцати семян из отобранных линий, включая СТ132.5 и 11 семян СТ133.15, и через два дня экстрагировали масло из половины семядоли каждого из индивидуальных семян. Вторую половину семядоль с эмбриональными осями содержат и культивируют на средах, чтобы сохранить конкретные линии потомков. Состав жирных кислот в масле определяют; данные для СТ132.5 приведены в табл. 6. Уровень ДГК в 10 из проанализированных 20 семян, по данным анализа методом ГХ, находится в интервале 7-20% от общего содержания жирных кислот. Другие семена содержали менее 7% ДГК и могли содержать частичную (неполную) копию Т-ДНК из pJP3416-GA7-modB. По-видимому, трансгенная линия содержит множественные вставки трансгена, которые были генетически разъединены. Семена трансгенной линии СТ133.15 продемонстрировали уровни ДГК в интервале 0-5%. Семена без ДГК, вероятно, были нулевыми сегрегантами. Эти данные подтверждают, что конструкция modB функционирует надлежащим образом для получения ДГК в семени рапса.Seed pools (20 T1 seeds in each pool) were tested for DHA levels in the seed oil pool, and lines that showed the highest levels were selected. In particular, lines were selected with a DHA content of at least 2% of the total fatty acid content in the T1 seed pool. About 15% of transgenic lines were selected in this way; the remaining 85% were discarded. Some of them were designated as CT132-5 (Oscar variety), CT133.15-15, -24, -63, -77, -103, -129 and -130 (in NX005). Selected lines in NX050 included CT136-4, -8, -12, -17, -19, -25, -27, -49, and -51. Twenty seeds from the selected lines were allowed to swell, including CT132.5 and 11 CT133.15 seeds, and two days later, oil was extracted from half of the cotyledon of each of the individual seeds. The other half of the cotyledon with embryonic axes is kept and cultured on media to preserve specific lineages of offspring. The composition of fatty acids in the oil is determined; data for ST132.5 are given in table. 6. The level of DHA in 10 of the analyzed 20 seeds, according to GC analysis, is in the range of 7-20% of the total fatty acid content. Other seeds contained less than 7% DHA and may contain a partial (incomplete) copy of the T-DNA from pJP3416-GA7-modB. Apparently, the transgenic line contains multiple transgene inserts that have been genetically separated. Seeds of the transgenic line CT133.15 showed DHA levels in the range of 0-5%. Seeds without DHA were likely zero segregants. These data confirm that the modB construct functions properly to generate DHA in rapeseed.

Двадцать или 40 индивидуальных семян (семена Т2), полученных от каждого из множества растений Т1 после самоопыления, от отобранных трансформированных линий, индивидуально тестировали на предмет состава жирных кислот. Были идентифицированы семена, содержащие уровни ДГК выше 20% (табл. 7). Два репрезентативных образца, СТ136-27-18-2 и СТ136-27-18-19, содержали 21,2 до 22,7% ДГК соответственно. Общее содержание ω3 жирных кислотных в этих семенах составило около 60% как процент от общего содержания жирных кислот, и содержание ω6 составило менее чем 10%. Другие наборы по 20 или 40 семян Т2 от каждого из растений Т1 тестировали на предмет состава жирных кислот. Семена, содержащие до 34,3% ДГК, были идентифицированы, например, среди семени СТ136-27-47-25 (табл. 9). Состав жирных кислот для масла семян, полученного из СТ136-27-47-25, приведен в табл. 9. Состав жирных кислот включал 34,3% ДГК, вместе с около 1,5% ДПК, 0,6% ЭПК и 0,5% ЭТК. Уровень СДК составлял около 7,5%, АЛК - около 21,9%, и ЛК - около 6,9%. Новые ω6 ПНЖК продемонстрировали 1,1% ГЛК, при отсутствии обнаружимых ω6-С20 или -С22 ДЦ-ПНЖК. Общие насыщенные жирные кислоты: 9,6%; мононенасыщенные жирные кислоты, 12,5%; общие ПНЖК, 75,2%; общие ω6 ПНЖК (включая ЛК), 7,2%; общие ω3 ПНЖК, 66,9%; соотношение общего содержания ω6:ω3 жирных кислот, 9.3:1; новые ω6:новые ω3 жирные кислоты, 37:1. Эффективность каждой из стадий ферментации от олеиновой кислоты к ДГК была такой, как указано ниже: Δ12-десатураза, 90%; Δ15/ω3-десатураза, 89%; Δ6-десатураза, 67%; Δ6-элонгаза, 83%; Δ5-десатураза, 99%; Δ5-элонгаза, 98%; Δ4-десатураза, 96%. Общая эффективность превращения олеиновой кислоты в ДГК составила около 50%. Таким образом, было очевидно, что семена, вырабатывающие ДГК в диапазоне 20,1-35% от общего содержания жирных кислот в масле семян могли бы быть идентифицированы и отобраны, в том числе семена, содержащие от 20,1 до 30% ДГК или от 30 до 35% ДГК в общем содержании жирных кислот.Twenty or 40 individual seeds (T2 seeds) obtained from each of a plurality of T1 plants after self-pollination, from selected transformed lines, were individually tested for fatty acid composition. Seeds have been identified containing DHA levels above 20% (Table 7). Two representative samples, CT136-27-18-2 and CT136-27-18-19, contained 21.2 to 22.7% DHA, respectively. The total ω3 fatty acid content of these seeds was about 60% as a percentage of the total fatty acid content, and the ω6 content was less than 10%. Other sets of 20 or 40 T2 seeds from each of the T1 plants were tested for fatty acid composition. Seeds containing up to 34.3% DHA were identified, for example, among the CT136-27-47-25 seed (Table 9). The composition of fatty acids for seed oil obtained from CT136-27-47-25 is shown in table. 9. The fatty acid composition was 34.3% DHA, along with about 1.5% DPA, 0.6% EPA and 0.5% ETA. SDC was about 7.5%, ALA was about 21.9%, and LA was about 6.9%. New ω6 PUFAs demonstrated 1.1% GLA, in the absence of detectable ω6-C20 or -C22 DC-PUFAs. Total saturated fatty acids: 9.6%; monounsaturated fatty acids, 12.5%; total PUFA, 75.2%; total ω6 PUFA (including LA), 7.2%; total ω3 PUFA, 66.9%; the ratio of the total content of ω6: ω3 fatty acids, 9.3: 1; new ω6: new ω3 fatty acids, 37: 1. The efficiency of each of the oleic acid to DHA fermentation steps was as follows: Δ12 desaturase, 90%; Δ15 / ω3 desaturase 89%; Δ6-desaturase, 67%; Δ6 elongase, 83%; Δ5-desaturase, 99%; Δ5-elongase, 98%; Δ4 desaturase, 96%. The overall conversion efficiency of oleic acid to DHA was about 50%. Thus, it was evident that seeds producing DHA in the range of 20.1-35% of the total fatty acids in seed oil could be identified and selected, including seeds containing from 20.1 to 30% DHA or from 30 to 35% DHA in total fatty acids.

Содержание масла в некоторых семенах было снижено от около 44% в семенах дикого типа до около 31-39% в некоторых из вырабатывающих ДГК семян, но было сходным с уровнями дикого типа в других вырабатывающих ДГК семенах.Oil content in some seeds was reduced from about 44% in wild-type seeds to about 31-39% in some of the DHA-producing seeds, but was similar to wild-type levels in other DHA-producing seeds.

Различные трансформированные линии растений, которые вырабатывали ДГК на уровнях по меньшей мере 10% в семени Т2, скрещивали и добивались самоопыления потомства F1, чтобы получить потомство F2, гомозиготное по множественным инсерциям Т-ДНК. Масло семян из гомозиготного семени проанализирован и обнаружили, что ДГК составляет 30 или 35% от общего содержания жирных кислот в масле семени.Various transformed plant lines that produced DHA at levels of at least 10% in T2 seed were crossed and self-pollinated F1 offspring to produce F2 offspring homozygous for multiple T-DNA insertions. The seed oil from the homozygous seed was analyzed and found that DHA accounts for 30 or 35% of the total fatty acids in the seed oil.

ТАГ в масле, полученном из СТ136-27-18-2 и СТ136-27-18-19, проанализировали региоспецифичным методом ¹³С ЯМР на предмет позиционного распределения ДГК в глицериновой основе молекул ТАГ. ДГК была преимущественно присоединена в положении sn-1,3. Более чем 70%, фактически более чем 90% ДГК находилось в положении sn-1,3.TAGs in oil obtained from CT136-27-18-2 and CT136-27-18-19 were analyzed by the regiospecific ¹³ C NMR method for the positional distribution of DHA in the glycerol base of TAG molecules. DHA was predominantly attached at the sn-1,3 position. More than 70%, in fact more than 90% of the DHA was in the sn-1,3 position.

В нескольких дальнейших трансгенных линиях содержание ДГК в индивидуальных семенах от независимых событий превышало 12%. Соотношение трансгенных:нулевых для этих линий составляло около 3:1, что соответствовало одному трансгенному локусу, или 15:1, что соответствовало двум трансгенным локусам. Анализ характерных профилей жирных кислот для образцов от каждой конструкции с наиболее высокими уровнями ДГК выявил только 1,2-1,4% ГЛК при отсутствии других обнаружимыхIn several further transgenic lines, the DHA content in individual seeds from independent events exceeded 12%. The ratio of transgenic: null for these lines was about 3: 1, which corresponded to one transgenic locus, or 15: 1, which corresponded to two transgenic loci. Analysis of characteristic fatty acid profiles for samples from each construct with the highest DHA levels revealed only 1.2-1.4% GLA in the absence of other detectable

- 59 037184 новых ω6 ПНЖК. В противоположность этому, новые ω3 ПНЖК (СДК) и ω3 ДЦ-ПНЖК (ЭТК, ЭПК, ДПК, ДГК) аккумулировались до суммарного уровня 25,8% для конструкции modF и 21,9% для конструкции modG, по сравнению с 18,5% для GA7-трансформированного семени. Уровни ДГК в масле из этих семян составляли 9,6, 12,4 и 11,5% соответственно. Степень Δ6-десатурации была ниже в GA7трансформированных семенах, чем в modF- и modG-трансформированных семенах (32% против 47% и 43%), что приводило к снижению уровня АЛК в семенах modF и modG, по сравнению с GA7. Другим значимым отличием была аккумуляция ЭПК в семени modF (3,3% против 0,8% в двух других трансгенных семенах), и это отображалось в снижении степени Δ5-элонгации, наблюдаемом в семени modF (80%), по сравнению с семенами GA7 и modG (93 и 94%). Наблюдалось небольшое увеличение степени Δ6-элонгации в этих семенах (66% против 60 и 61%), хотя количество СДК фактически увеличивалась вследствие несколько более активной Δ6-десатурации. ДГК была обнаружена в полярной фракции липидов семени линий GA7.- 59 037184 new ω6 PUFA. In contrast, the new ω3 PUFA (SDA) and ω3 DC-PUFA (ETC, EPA, DPA, DHA) accumulated to a total level of 25.8% for the modF construct and 21.9% for the modG construct, compared with 18.5 % for GA7-transformed seed. DHA levels in oil from these seeds were 9.6%, 12.4%, and 11.5%, respectively. The degree of Δ6-desaturation was lower in GA7-transformed seeds than in modF- and modG-transformed seeds (32% versus 47% and 43%), which led to a decrease in ALA levels in modF and modG seeds, compared to GA7. Another significant difference was the accumulation of EPA in the modF seed (3.3% versus 0.8% in the other two transgenic seeds), and this was reflected in the decrease in the degree of Δ5-elongation observed in the modF seed (80%) compared to GA7 seeds. and modG (93 and 94%). There was a slight increase in the degree of Δ6-elongation in these seeds (66% versus 60 and 61%), although the amount of SDC actually increased due to slightly more active Δ6-desaturation. DHA was found in the polar lipid fraction of the GA7 seed lines.

Проанализирован состав жирных кислот в липиде семени Т1 для 70 независимых трансгенных растений B. napus сортовой линии NX54, трансформированной конструкцией modB Т-ДНК. Обнаружено, что одно из этих трансгенных растений дает семя, содержащее ДПК, но в масле семян ДГК отсутствовала. В семени Т1 данной линии (СТ-137-2) вырабатывалось около 4% ДПК, при отсутствии обнаружимой ДГК в пуле семени Т1. Изобретателями был изучен вопрос о том, вызвано ли это инактивацией гена Δ4десатуразы в конкретной инсерционной Т-ДНК в результате спонтанной мутации. Анализ методом ПЦР и секвенирование ДНК показали присутствие делеции, которая была определена как удаленные нуклеотиды 12988-15317 Т-ДНК мотива GA7-modB (SEQ ID NO: 2). Удаленные нуклеотиды соответствуют части промотора Linus Cn12, направляющего экспрессию участка кодирования Δ4-десатуразы, а также самого по себе участка кодирования Δ4-десатуразы, объясняя, почему семена, трансформированные Т-ДНК и содержащие делецию, не вырабатывали ДГК.The composition of fatty acids in the T1 seed lipid was analyzed for 70 independent transgenic plants of B. napus cultivar line NX54 transformed with the modB T-DNA construct. One of these transgenic plants was found to produce a seed containing DPA, but no DHA was present in the seed oil. In the T1 seed of this line (ST-137-2), about 4% of the duodenum was produced, in the absence of detectable DHA in the T1 seed pool. The inventors have investigated the question of whether this is caused by inactivation of the Δ4desaturase gene in a particular insertional T-DNA as a result of spontaneous mutation. Analysis by PCR and DNA sequencing showed the presence of a deletion, which was identified as deleted nucleotides 12988-15317 T-DNA motif GA7-modB (SEQ ID NO: 2). The deleted nucleotides correspond to a portion of the Linus Cn12 promoter directing the expression of the Δ4 desaturase coding region, as well as the Δ4 desaturase coding region itself, explaining why seeds transformed with T-DNA and containing the deletion did not produce DHA.

Около 50 семян Т1 от данной трансгенной линии прорастили, и один появившийся котиледон из каждого проанализировали на предмет состава жирных кислот в остаточном масле. Отобранные саженцы, демонстрирующие более чем 5% ДПК, в дальнейшем были выращены до состояния зрелости, и собран урожай семени Т2. Состав жирных кислот в пуле семени проиллюстрирован в табл. 8, причем в этих линиях наблюдалось более чем 7% ДПК. Семя Т4 было получено от линии СТ-137-2 ДПК В. napus и проанализировано на предмет профиля жирных кислот. До 13% ДПК наблюдалось в пуле образцов зрелого семени.About 50 T1 seeds from this transgenic line germinated, and one emerging cotyledon from each was analyzed for the composition of fatty acids in the residual oil. Selected seedlings showing more than 5% WPC were subsequently grown to maturity and the T2 seed was harvested. The composition of fatty acids in the seed pool is illustrated in table. 8, with more than 7% of the duodenum being observed in these lines. The T4 seed was obtained from the CT-137-2 DPK line of B. napus and analyzed for the fatty acid profile. Up to 13% DPC was observed in the pool of mature seed samples.

Масло из семян, которое содержало около 10% ДПК, обрабатывали мягкой щелочью для гидролиза жирных кислот.The seed oil, which contained about 10% WPC, was treated with a mild alkali to hydrolyze the fatty acids.

Другая трансгенная линия, обозначенная В0003-514, демонстрировала около 10-16% ДПК в семени Т2. Было отобрано семя, содержащее 15,8% ДПК, 0,2-0,9% ДГК и 0,1-2,5% ЭПК. Популяция семени Т2 демонстрировала соотношение сегрегации 1:2:1 для высокого содержания:низкого содержания:отсутствия ДПК, указывая на присутствие одинарного генетического локуса для выработки ДПА в указанной трансгенной линии.Another transgenic line, designated B0003-514, showed about 10-16% duodenum in T2 seed. Seed was selected containing 15.8% DPA, 0.2-0.9% DHA and 0.1-2.5% EPA. The T2 seed population showed a segregation ratio of 1: 2: 1 for high content: low content: no duodenum, indicating the presence of a single genetic locus for the production of DPA in the indicated transgenic line.

Масло было экстрагировано с помощью винтового пресса из образцов семян, вырабатывающих ДЦПНЖК, с получением таким образом жмыха.The oil was extracted using a screw press from seed samples producing LCPUFA, thus obtaining a cake.

Дизайн конструкции.Construction design.

Хотя фокус данного эксперимента находился на демонстрации выработки ДГК и ДПК в видах масличной культуры, отмеченные выше результаты также были интересными с точки зрения перспективы дизайна конструкции. Во-первых, переключение локализации участка, кодирующего Δ6- и Δ5-элонгазу в конструкции modF приводит к предусмотренным модификациям профиля, когда аккумулируется больше ЭПК вследствие более низкой степени Δ5-элонгации.Although the focus of this experiment was on demonstrating DHA and WPC production in oilseed species, the results noted above were also interesting from a structural design perspective. First, switching the localization of the region encoding the Δ6 and Δ5 elongase in the modF design leads to the intended profile modifications when more EPA accumulates due to the lower degree of Δ5 elongation.

Сопутствующее увеличение степени Δ6-элонгации наблюдалось, но не приводило к более низким уровням СДК. Это было результатом повышения степени Δ6-десатурации в трансформированном modF семени, вызванной добавлением дополнительной экспрессионной кассеты Δ6-десатуразы М. pusilla, а также заменой укороченного промотора напина (FP1) более активным промотором конлинина 2 льна. Несколько менее выраженное повышение степени Δ6-десатурации, наблюдаемое в случае конструкта modG, было вызвано капитализацией на кассете Δ5-элонгазы с высокой экспрессией в GA7. Переключение положений участков, кодирующих Δ6-десатуразу и Δ5-элонгазу, приводило к более высокой степени Δ6-десатурации. Активность Δ5-элонгазы не снижалась в этом случае благодаря замене промотора FP1 промотором Cn12.A concomitant increase in the degree of Δ6 elongation was observed, but did not lead to lower SDR levels. This was the result of an increase in the degree of Δ6 desaturation in the transformed modF seed caused by the addition of an additional M. pusilla Δ6 desaturase expression cassette, as well as the replacement of the truncated napin promoter (FP1) with the more active flax conlinin 2 promoter. The slightly less pronounced increase in the degree of Δ6-desaturation observed in the case of the modG construct was caused by capitalization on the cassette of Δ5-elongase with high expression in GA7. Switching the positions of the regions encoding Δ6-desaturase and Δ5-elongase resulted in a higher degree of Δ6-desaturation. The Δ5-elongase activity did not decrease in this case due to the replacement of the FP1 promoter with the Cn12 promoter.

Эти данные подтверждают, что конструкции modB, modF и modG эффективны с точки зрения выработки ДГК в семени Camelina, относительно Arabidopsis и рапса.These data confirm that the modB, modF and modG constructs are efficient in terms of DHA production in Camelina seed, relative to Arabidopsis and rapeseed.

Авторы изобретения считали, что, в общем, эффективность ограничивающей скорость ферментной активности в биохимическом пути ДГК может быть более высокой в мультикопийных Т-ДНК трансформантах, по сравнению с однокопийными Т-ДНК трансформантами, или может быть увеличена путем инсерции в Т-ДНК нескольких генов, кодирующих фермент, который может быть ограничивающим в биохимическом пути. Доказательства возможной важности мультикопийных трансформантов наблюда- 60 037184 лись в семенах Arabidopsis, трансформированных конструкцией GA7, в которых событие с наиболее высоким выходом ДГК содержало три инсерции Т-ДНК в геноме хозяина. Несколько генов могут быть идентичными, или предпочтительно представляют собой различные варианты, которые кодируют один и тот же полипептид или находятся под контролем различных промоторов с перекрывающимися паттернами экспрессии. Например, повышенная экспрессия может быть достигнута путем экспрессии несколь ких участков, кодирующих Δ6-десатуразу, даже если вырабатывается один и тот же белок. Например, в pJP3416-GA7-modF и pJP3416-GA7-modC, две версии Δ6-десатуразы М. pusilla присутствовали и экспрессировались различными промоторами. В кодирующих последовательностях кодоны использовались по-разному и, таким образом, их нуклеотидные последовательности были различными, чтобы снизить потенциал сайленсинга или эффекты косупрессии, но приводили к выработке одного и того же белка.The inventors believed that, in general, the efficiency of rate-limiting enzyme activity in the biochemical pathway of DHA could be higher in multicopy T-DNA transformants compared to single-copy T-DNA transformants, or could be increased by insertion of several genes into T-DNA. encoding an enzyme that can be restrictive in the biochemical pathway. Evidence of the possible importance of multicopy transformants was observed in Arabidopsis seeds transformed with construct GA7, in which the event with the highest DHA yield contained three T-DNA insertions in the host genome. Several genes may be identical, or preferably are different variants that encode the same polypeptide or are under the control of different promoters with overlapping expression patterns. For example, increased expression can be achieved by expressing several regions encoding Δ6 desaturase, even if the same protein is produced. For example, in pJP3416-GA7-modF and pJP3416-GA7-modC, two versions of M. pusilla Δ6 desaturase were present and expressed by different promoters. In the coding sequences, codons were used in different ways and thus their nucleotide sequences were different in order to reduce the potential for silencing or the effects of co-suppression, but resulted in the production of the same protein.

Таблица 6Table 6

Состав жирных кислот липида при прорастании трансгенных семян Т1 В. napus, содержащих Т-ДНК из конструкции GA7-modB. Липиды дополнительно содержали по 0,1-0,3% каждой из С16:1, С16:3, С24:0 иLipid fatty acid composition during germination of B. napus T1 transgenic seeds containing T-DNA from the GA7-modB construct. Lipids additionally contained 0.1-0.3% of each of C16: 1, C16: 3, C24: 0 and

С24:1 и не содержали С20:1Δ11C24: 1 and did not contain C20: 1Δ11

Семя о фе чг ч,ое ϋ 0U “Ί 0,1 4,21,8Seed about fe chg h, oe ϋ 0U “Ί 0.1 4.21.8

0,1 4,74,00.1 4.74.0

0,1 3,71,80.1 3.71.8

0,1 4,62,90.1 4.62.9

0,1 4,01,70.1 4.01.7

0,1 3,51,60.1 3.5 1.6

0,1 6,01,70.1 6.01.7

0,1 4,92,70.1 4.92.7

0,1 3,92,40.1 3.92.4

0,1 3,72,10.1 3.72.1

0,1 5,73,80.1 5.73.8

0,1 4,62,40.1 4.62.4

0,1 4,34,20.1 4.34.2

0,1 6,34,00.1 6.34.0

0,1 5,13,30.1 5.13.3

0,1 4,44,00.1 4.44.0

0,2 7,24,90.2 7.24.9

0,1 4,02,30.1 4.02.3

оо ю аз оо з ϋ з сoo yu az oo z ϋ z s

29,9 2,5 9,9 0,1 23,0 2,3 7,4 0,3 55,1 1,9 4,7 0,2 22,1 1,8 6,6 0,4 27,4 2,1 8,1 0,3 59,8 2,0 4,3 0,1 16,6 2,6 23,9 1,0 12,9 1,4 11,7 0,3 41,6 1,7 21,5 0,0 30,9 1,7 19,2 0,4 41,2 2,4 26,7 2,1 25,5 1,7 16,1 0,3 19,4 1,6 9,2 0,1 10,5 2,3 8,4 0,3 16,8 2,4 11,2 0,3 16,2 1,5 11,6 0,2 15,0 2,1 8,9 0,3 64,8 1,2 7,2 0,129.9 2.5 9.9 0.1 23.0 2.3 7.4 0.3 55.1 1.9 4.7 0.2 22.1 1.8 6.6 0.4 27, 4 2.1 8.1 0.3 59.8 2.0 4.3 0.1 16.6 2.6 23.9 1.0 12.9 1.4 11.7 0.3 41.6 1 , 7 21.5 0.0 30.9 1.7 19.2 0.4 41.2 2.4 26.7 2.1 25.5 1.7 16.1 0.3 19.4 1.6 9.2 0.1 10.5 2.3 8.4 0.3 16.8 2.4 11.2 0.3 16.2 1.5 11.6 0.2 15.0 2.1 8, 9 0.3 64.8 1.2 7.2 0.1

38,4 0,5 0,8 1,0 29,3 1,0 4,3 1,1 15,2 0,8 1,8 1,4 26,5 1,0 7,2 1,0 26,4 0,6 2,8 1,0 18,5 0,6 0,5 1,3 23,2 0,6 5,4 0,8 34,3 0,9 5,0 0,9 23,4 0,7 0,0 1,238.4 0.5 0.8 1.0 29.3 1.0 4.3 1.1 15.2 0.8 1.8 1.4 26.5 1.0 7.2 1.0 26, 4 0.6 2.8 1.0 18.5 0.6 0.5 1.3 23.2 0.6 5.4 0.8 34.3 0.9 5.0 0.9 23.4 0 , 7 0.0 1.2

23,6 0,7 2,1 1,1 7,2 1,3 0,3 1,2 28,9 0,8 3,9 1,123.6 0.7 2.1 1.1 7.2 1.3 0.3 1.2 28.9 0.8 3.9 1.1

45,5 1,0 0,2 1,1 31,1 1,3 3,9 0,8 28,8 1,0 4,5 0,9 33,5 0,9 2,8 1,145.5 1.0 0.2 1.1 31.1 1.3 3.9 0.8 28.8 1.0 4.5 0.9 33.5 0.9 2.8 1.1

25,9 1,4 5,1 0,9 12,5 1,0 3,5 1,525.9 1.4 5.1 0.9 12.5 1.0 3.5 1.5

0,1 2,1 0,32,80.1 2.1 0.32.8

0,1 1,9 0,46,90.1 1.9 0.46.9

0,1 0,3 0,511,30.1 0.3 0.5 11.3

0,1 0,8 0,511,20.1 0.8 0.5 11.2

0,1 1,5 0,37,60.1 1.5 0.37.6

0,0 0,7 0,36,00.0 0.7 0.36.0

0,2 0,6 0,42,60.2 0.6 0.4 2.6

0,2 2,4 0,54,10.2 2.4 0.5 4.1

0,1 2,2 0,40,00.1 2.2 0.40.0

0,1 1,5 0,43,60.1 1.5 0.4 3.6

0,2 0,3 0,84,80.2 0.3 0.84.8

0,1 1,9 0,43,90.1 1.9 0.43.9

0,1 5,2 0,42,60.1 5.2 0.4 2.6

0,1 2,3 0,64,60.1 2.3 0.64.6

0,1 2,1 0,63,20.1 2.1 0.63.2

0,2 3,7 0,44,60.2 3.7 0.44.6

0,0 1,6 0,84,90.0 1.6 0.84.9

0,1 0,0 0,70,00.1 0.0 0.70.0

0,3 0,1 0,5 3,9 1,0 0,0 1,7 9,5 0,0 0,0 0,0 0,0 1,9 0,0 1,7 8,70.3 0.1 0.5 3.9 1.0 0.0 1.7 9.5 0.0 0.0 0.0 0.0 1.9 0.0 1.7 8.7

1,5 0,0 1,8 12,2 0,0 0,0 0,0 0,01.5 0.0 1.8 12.2 0.0 0.0 0.0 0.0

1,1 0,0 1,7 9,91.1 0.0 1.7 9.9

1,3 0,0 1,8 13,8 0,0 0,1 0,0 0,0 0,6 0,0 0,7 6,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,6 0,0 1,1 6,2 0,3 0,2 0,4 3,41.3 0.0 1.8 13.8 0.0 0.1 0.0 0.0 0.6 0.0 0.7 6.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0, 6 0.0 1.1 6.2 0.3 0.2 0.4 3.4

1,8 0,1 2,5 18,1 1,5 0,1 1,8 15,1 0,7 0,1 1,3 12,1 2,1 0,0 2,2 15,0 0,0 0,0 0,0 0,01.8 0.1 2.5 18.1 1.5 0.1 1.8 15.1 0.7 0.1 1.3 12.1 2.1 0.0 2.2 15.0 0, 0 0.0 0.0 0.0

Таблица 7Table 7

Состав жирных кислот липида в трансгенных семенах Т2 В. napus содержащих Т-ДНК из конструкции GA7-modBComposition of lipid fatty acids in T2 transgenic seeds of B. napus containing T-DNA from the GA7-modB construct

Образец (семя Т2) СТ136-27-18-1 СТ136-27-18-2 СТ136-27-18-3 СТ136-27-18-4 СТ136-27-18-5 СТ136-27-18-6 СТ136-27-18-7 СТ136-27-18-8 СТ136-27-18-9 СТ136-27-18-10 СТ136-27-18-11 СТ136-27-18-12 СТ136-27-18-13 СТ136-27-18-14 СТ136-27-18-15 СТ136-27-18-18 СТ136-27-18-19 СТ136-27-18-20Sample (seed T2) ST136-27-18-1 ST136-27-18-2 ST136-27-18-3 ST136-27-18-4 ST136-27-18-5 ST136-27-18-6 ST136-27 -18-7 ST136-27-18-8 ST136-27-18-9 ST136-27-18-10 ST136-27-18-11 ST136-27-18-12 ST136-27-18-13 ST136-27- 18-14 ST136-27-18-15 ST136-27-18-18 ST136-27-18-19 ST136-27-18-20

5,0 5.0 2,6 2.6 25,4 25.4 3,6 3.6 6,7 6,7 0,2 0.2 37,5 37.5 1,4 1.4 1,0 1.0 0,1 0.1 2,1 2.1 0,8 0.8 0,4 0,4 0,9 0.9 10,2 10.2 53,4 53.4 7,1 7.1 0,13 0.13 60,5 60.5 7,1 7.1 2,8 2.8 16,9 16.9 4,3 4.3 5,5 5.5 0,4 0,4 29,1 29.1 5,4 5.4 0,8 0.8 0,1 0.1 1,2 1,2 0,5 0.5 0,5 0.5 1,9 1.9 21,2 21.2 59,8 59.8 6,1 6.1 0,10 0.10 66,0 66.0 5,4 5.4 2,5 2.5 26,5 26.5 3,8 3.8 6,4 6.4 0,4 0,4 26,4 26.4 4,7 4.7 1,0 1.0 0,1 0.1 0,7 0.7 1,1 1.1 0,6 0.6 1,2 1,2 17,3 17.3 52,0 52.0 6,9 6.9 0,13 0.13 58,9 58.9 5,3 5.3 2,4 2.4 34,7 34,7 4,0 4.0 5,9 5.9 0,3 0.3 30,3 30.3 1,3 1,3 1,1 1.1 0,1 0.1 1,1 1.1 1,5 1.5 0,3 0.3 0,4 0,4 9,3 9.3 44,4 44.4 6,3 6.3 0,14 0.14 50,7 50.7 4,8 4.8 2,7 2.7 34,5 34.5 •3,8 • 3.8 5,6 5.6 0,3 0.3 23,5 23.5 3,9 3.9 1,2 1,2 0,1 0.1 0,7 0.7 1,1 1.1 0,5 0.5 1,1 1.1 14,2 14.2 45,1 45.1 6,0 6.0 0,13 0.13 51,1 51.1 5,0 5.0 2,1 2.1 54,3 54.3 3,8 3.8 5,7 5.7 0,2 0.2 18,2 18.2 0,6 0.6 1,5 1.5 0,1 0.1 1,1 1.1 0,7 0.7 0,1 0.1 0,2 0.2 4,4 4.4 25,5 25.5 6,1 6.1 0,24 0.24 31,5 31.5 5,3 5.3 2,1 2.1 43,8 43.8 4,2 4.2 5,6 5.6 0,4 0,4 18,3 18.3 2,2 2.2 1,3 1,3 0,2 0.2 0,6 0.6 1,5 1.5 0,4 0,4 0,5 0.5 11,6 11.6 35,2 35.2 6,2 6.2 0,18 0.18 41,4 41.4 5,4 5.4 2,7 2.7 25,8 25.8 4,1 4.1 6,7 6,7 0,4 0,4 26,6 26.6 5,7 5.7 1,0 1.0 0,1 0.1 0,6 0.6 1,3 1,3 0,6 0.6 1.2 1.2 15,8 15.8 51,9 51.9 7,1 7.1 0,14 0.14 59,0 59.0 4,6 4.6 1,6 1.6 53,8 53.8 3,7 3.7 17,5 17.5 0,5 0.5 9,2 9.2 0,5 0.5 1,6 1.6 0,3 0.3 0,6 0.6 0,4 0,4 0,1 0.1 о,1 oh, 1 3,7 3.7 14,5 14.5 18,3 18.3 1,26 1.26 32,8 32.8 4,8 4.8 2,4 2.4 44,1 44.1 3,7 3.7 5,4 5.4 0,4 0,4 19,1 19.1 2,3 2,3 1,1 1.1 0,1 0.1 0,6 0.6 1,5 1.5 0,5 0.5 0,8 0.8 11,4 11.4 36,1 36.1 5,9 5.9 0,16 0.16 42,0 42.0 5,1 5.1 2,2 2.2 48,3 48.3 4,1 4.1 10,9 10.9 0,7 0.7 12,5 12.5 1,2 1,2 1,3 1,3 0,2 0.2 0,5 0.5 1,5 1.5 0,3 0.3 0,3 0.3 9,1 9.1 25,3 25.3 11,8 11.8 0,47 0.47 37,1 37.1 5,3 5.3 2,7 2.7 23,3 23.3 3,7 3.7 6,0 6.0 0,4 0,4 27,9 27.9 4,9 4.9 0,9 0.9 0,1 0.1 0,7 0.7 1,3 1,3 0,8 0.8 1,5 1.5 18,5 18.5 55,7 55,7 6,6 6.6 0,12 0.12 62,2 62.2 5,5 5.5 3,4 3.4 30,7 30.7 5,6 5.6 5,1 5.1 0,4 0,4 23,1 23.1 3,5 3.5 1,1 1.1 0,1 0.1 1,2 1,2 1,1 1.1 0,6 0.6 1,2 1,2 14,9 14.9 45,8 45.8 5,5 5.5 0,12 0.12 51,3 51.3 5,4 5.4 2,3 2,3 23,9 23.9 3,5 3.5 6,0 6.0 0,4 0,4 30,1 30.1 3,7 3.7 1,0 1.0 0,1 0.1 1,0 1.0 0,7 0.7 0,6 0.6 U U 18,2 18.2 55,5 55.5 6,6 6.6 0,12 0.12 62,1 62.1 5,0 5.0 2,3 2,3 45,4 45.4 4,0 4.0 5,3 5.3 0,4 0,4 16,2 16.2 2,3 2,3 1,2 1,2 0,1 0.1 0,5 0.5 1,9 1.9 0,6 0.6 0,7 0.7 12,3 12.3 34,4 34.4 5,8 5.8 0,17 0.17 40,3 40.3 5,1 5.1 2,3 2,3 29,0 29.0 3,6 3.6 5,7 5.7 0,4 0,4 26,5 26.5 3,8 3.8 1,1 1.1 0,2 0.2 0,8 0.8 0,8 0.8 0,6 0.6 1,0 1.0 17,4 17.4 50,8 50.8 6,3 6.3 0,12 0.12 57,1 57.1 5,8 5.8 2,3 2,3 19,7 19.7 4,2 4.2 6,7 6,7 0,7 0.7 23,7 23,7 7,7 7,7 0,9 0.9 0,1 0.1 0,4 0,4 0,7 0.7 0,6 0.6 1.7 1.7 22,7 22.7 57,6 57.6 7,5 7.5 0,13 0.13 65,1 65.1 5,7 5.7 2,9 2.9 23,2 23.2 4,0 4.0 5,6 5.6 0,3 0.3 35,8 35.8 2,4 2.4 1,0 1.0 о,1 oh, 1 1.3 1.3 1.1 1.1 0.5 0.5 1.0 1.0 13,0 13.0 55,1 55.1 6,1 6.1 0,11 0.11 61,2 61.2

АРК (С20:4ω6) и ДПКω6 не были обнаружены ни в одном из образцов. Кроме того, образцы содержали 0,1% С14:0, около 0,2% или 0,3% С16:1, около 0,1-0,3% С16:3, от около 0,7% до 1,0% С20:0, околоARA (C20: 4ω6) and DPKω6 were not found in any of the samples. In addition, the samples contained 0.1% C14: 0, about 0.2% or 0.3% C16: 1, about 0.1-0.3% C16: 3, from about 0.7% to 1.0 % C20: 0, about

0,3% С22:0, причем некоторые образцы содержали следовые количества (< 0,1%) С20:1Δ13, С22:3ω3, С24:0 и С24:10.3% C22: 0, with some samples containing trace amounts (<0.1%) C20: 1Δ13, C22: 3ω3, C24: 0 and C24: 1

- 61 037184- 61 037184

Таблица 8Table 8

Состав жирных кислот липида в трансгенных семенах Т2 В. napus, трансформированных Т-ДНК из конструкции GA7-modB, с мутацией в гене Δ4-десатуразы. Липиды дополнительно содержали около 0,1% 14:0, 0,2% 16:3, 0,2-0,4% ГЛК, 0,1% 20:1Δ13, 0,3-0,4% 22:0, а АРК, DPAω6 (22:5ω6), 16:2 и 22:1 не были обнаруженыLipid fatty acid composition in transgenic T2 seeds of B. napus transformed with T-DNA from the GA7-modB construct, with a mutation in the Δ4-desaturase gene. Lipids additionally contained about 0.1% 14: 0, 0.2% 16: 3, 0.2-0.4% GLA, 0.1% 20: 1Δ13, 0.3-0.4% 22: 0, and ARC, DPAω6 (22: 5ω6), 16: 2 and 22: 1 were not detected

© 0 © 0 £ С £ C «5 0 "five 0 05 С 05 C «Й и “Y and и and ГП GP 1 ж и 1 g and S S 9 <ч * и 9 <h * and Ό е * и Ό e * and СП 9 S и Joint venture nine S and 1 и one and СП £ и SP £ and 9 rj ri и 9 rj ri and СП 9 ri η и SP 9 ri η and е и e and сч V count V СП я ri η и SP i ri η and СП а и Joint venture and 3 и 3 and © © сч и © © mid and СТ-137-2-34 ST-137-2-34 5,3 5.3 0,2 0.2 3,7 3.7 26,8 26.8 3,1 3.1 12,4 12.4 29,1 29.1 0,8 0.8 2,5 2.5 0,8 0.8 о,1 oh, 1 0,0 0.0 1,1 1.1 1,7 1.7 0,8 0.8 0,0 0.0 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 10,0 10.0 0,0 0.0 СТ-137-2-38 ST-137-2-38 5,3 5.3 0,2 0.2 4,2 4.2 24,4 24.4 3,0 3.0 12,6 12.6 29,4 29.4 0,9 0.9 2,5 2.5 0,8 0.8 0,1 0.1 0,0 0.0 1,3 1,3 2,2 2.2 0,9 0.9 0,0 0.0 0,1 0.1 0,2 0.2 0,1 0.1 10,8 10.8 0,0 0.0 СТ-137-2-48 ST-137-2-48 5,0 5.0 0,2 0.2 4,2 4.2 24,1 24.1 3,1 3.1 11,9 11.9 31,0 31.0 0,9 0.9 2,4 2.4 0,9 0.9 0,1 0.1 0,0 0.0 1,5 1.5 2,0 2.0 1,0 1.0 0,0 0.0 0,1 0.1 0,1 0.1 0,1 0.1 10,5 10.5 0,0 0.0 СТ-137-2-51 ST-137-2-51 5,7 5.7 0,2 0.2 4,6 4.6 22,3 22.3 3,4 3.4 12,3 12.3 34,5 34.5 1,0 1.0 2,0 2.0 0,8 0.8 0,1 0.1 0,0 0.0 1,9 1.9 1,2 1,2 0,5 0.5 0,0 0.0 0,1 0.1 0,2 0.2 0,2 0.2 7,7 7,7 0,0 0.0 СТ-137-2-59 ST-137-2-59 5,4 5.4 0.2 0.2 3,9 3.9 25,7 25.7 3,4 3.4 12,9 12.9 27,8 27.8 0,9 0.9 2,6 2.6 0,8 0.8 0,1 0.1 0,0 0.0 1,0 1.0 1,9 1.9 0,9 0.9 0,0 0.0 0,1 0.1 0,2 0.2 0,1 0.1 11,0 11.0 0,0 0.0

Таблица 9Table 9

Состав жирных кислот масла из семени Т2 В. napus, трансформированного Т-ДНК из мотива GA7-modBFatty acid composition of oil from T2 seed of B. napus transformed with T-DNA from GA7-modB motif

Образцы масла из семян дополнительно содержали 0,1% С14:0; 0,2% С16:1; 0,1% С20:3ω6; не содержали С22:1 и С22:2ω6; содержали 0,1% С24:0 и 0,2% С24:1, 2,6% других жирных кислот.The seed oil samples additionally contained 0.1% C14: 0; 0.2% C16: 1; 0.1% C20: 3ω6; did not contain C22: 1 and C22: 2ω6; contained 0.1% C24: 0 and 0.2% C24: 1, 2.6% other fatty acids.

Пример 4. Анализ ТАГ из трансгенного семени A. thaliana, вырабатывающего ДГК.Example 4. Analysis of TAG from transgenic seed of A. thaliana, producing DHA.

Позиционное распределение ДГК в ТАГ из трансформированного семени A. thaliana определяли методом ЯМР. Общий липид экстрагируют около из 200 мг семени, вначале раздавливая его под слоем гексана, с последующим переносом давленного семени в стеклянную пробирку, содержащую 10 мл гексана. Пробирку нагревают около до 55°С на водяной бане, после чего обрабатывают вихревым перемешиванием и центрифугируют. Гексановый раствор извлекают, и процедуру повторяют с дополнительными порциями 4 х 10 мл. Экстракты объединяют, упаривают с помощью роторного испарителя, и ТАГ в экстрагированном липиде очищают от полярных липидов путем пропускания сквозь короткую колонку с кремния диоксидом, с использованием 20 мл 7% диэтилового эфира в гексане. Позиционное распределение ацильной группы на очищенном ТАГ определяют количественно, как было описано ранее (Petrie et al., 2010a и b).The positional distribution of DHA in TAG from transformed A. thaliana seed was determined by NMR. The total lipid is extracted from about 200 mg of semen, first by crushing it under a layer of hexane, followed by transferring the crushed semen into a glass tube containing 10 ml of hexane. The tube is heated to about 55 ° C in a water bath, then vortexed and centrifuged. The hexane solution is removed and the procedure is repeated with additional portions of 4 x 10 ml. The extracts are combined, evaporated using a rotary evaporator, and the TAG in the extracted lipid is purified from polar lipids by passing through a short silica column using 20 ml of 7% diethyl ether in hexane. The positional distribution of the acyl group on the purified TAG is quantified as previously described (Petrie et al., 2010a and b).

Анализ продемонстрировал, что большая часть ДГК в общем масле из семян расположена в положениях sn-1/3 ТАГ, и небольшое количество обнаружено в положении sn-2. В противоположность этому, ТАГ из вырабатывающих АРК семян продемонстрировали, что 50% АРК (20:4Δ^5,8,11,4) расположены в положении sn-2 масла трансгенного рапса, тогда как ожидаемая величина для случайного распределения составляет только 33% (Petrie et al., 2012).The analysis demonstrated that most of the DHA in the total seed oil is located at the sn-1/3 positions of the TAG, and a small amount is found at the sn-2 position. In contrast, TAGs from ARA-producing seeds demonstrated that 50% of ARA (20: 4Δ ^5,8,11,4 ) are located at the sn-2 position of transgenic rapeseed oil, while the expected value for a random distribution is only 33% (Petrie et al., 2012).

Дополнительно, общий липид из трансгенного семени A. thaliana был проанализирован ЖХ-МС с тройной квадрупольной линзой, чтобы определить основные ДГК-содержащие разновидности триацилглицерида (ТАГ). Обнаружено, что разновидности ТАГ с наиболее высоким содержанием ДГК представляют собой ДГК-18:3-18:3 (ТАГ 58:12; номенклатура не описывает позиционного распределения), и на втором месте находится ДГК-18:3-18:2 (ТАГ 58:11). Три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) наблюдается в общем масле семян, хотя и с низкими, но обнаружимыми уровнями. Другие основные ДГК-содержащие разновидности ТАГ включали ДГК-34:3 (ТАГ 56:9), ДГК-36:3 (ТАГ 58:9), ДГК-36:4 (ТАГ 58:10), ДГК-36:7 (ТАГ 58:13) и ДГК-38:4 (ТАГ 60:10). Идентичность двух основных ДГК-содержащих ТАГ была дополнительно подтверждена квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) МС/МС.Additionally, the total lipid from the transgenic seed of A. thaliana was analyzed by LC-MS with a triple quadrupole lens to determine the main DHA-containing species of triacylglyceride (TAG). It was found that the TAG varieties with the highest DHA content are DHA-18: 3-18: 3 (TAG 58:12; the nomenclature does not describe positional distribution), and in second place is DHA-18: 3-18: 2 (TAG 58:11). Tri-DHA TAG (TAG 66:18) is observed in total seed oil, albeit with low detectable levels. Other major DHA-containing TAG varieties included DHA-34: 3 (TAG 56: 9), DHA-36: 3 (TAG 58: 9), DHA-36: 4 (TAG 58:10), DHA-36: 7 ( TAG 58:13) and DHK-38: 4 (TAG 60:10). The identity of the two main DHA-containing TAGs was further confirmed by quadrupole time-of-flight (Q-TOF) MS / MS.

Пример 5. Анализ содержания и состава стеролов в маслах.Example 5. Analysis of the content and composition of sterols in oils.

Фитостерины из 12 образцов растительного масла, приобретенных из коммерческих источников в Австралии, охарактеризованы методами ГХ и ГХ-МС как производные О-триметилсилилового эфира (OTMSi-эфир), как раскрыто в примере 1. Стеролы идентифицировали по данным удерживания, интерпретацией масс-спектров и сравнением с литературными данными и данными масс-спектроскопии лабораторных стандартов. Количество стеролов определяют с использованием внутреннего стандарта 5в(Н)холан-24-ола. Базовая структура фитостерина и химическая структура некоторых из идентифицированных стеролов проиллюстрированы на фиг. 3 и в табл. 10.Phytosterols from 12 vegetable oil samples purchased from commercial sources in Australia were characterized by GC and GC-MS methods as derivatives of O-trimethylsilyl ether (OTMSi-ether), as disclosed in example 1. Sterols were identified by retention data, interpretation of mass spectra and comparison with literature data and data of mass spectroscopy of laboratory standards. The amount of sterols is determined using an internal standard 5b (H) cholan-24-ol. The basic structure of phytosterol and the chemical structure of some of the identified sterols are illustrated in FIG. 3 and in table. ten.

Анализировали растительные масла кунжута (Sesamum indicum), маслины (Olea europaea), подсолнечника (Helianthus annus), клещевины (Ricinus communis), рапса (Brassica napus), сафлора (Carthamus tinctorius), арахиса (Arachis hypogaea), льна (Linum usitatissimum) и сои (Glycine max). В порядке снижения относительного содержания, во всех образцах масла, основными фитостеринами были β-ситостерол (интервал 28-55% от общего содержания стеролов), Δ5-авенастерол (изофукостерол) (3-24%), кампэстеAnalyzed vegetable oils of sesame (Sesamum indicum), olives (Olea europaea), sunflower (Helianthus annus), castor oil plant (Ricinus communis), rapeseed (Brassica napus), safflower (Carthamus tinctorius), peanuts (Arachisoga hypimea), flax and soy (Glycine max). In order of decreasing relative content, in all oil samples, the main phytosterols were β-sitosterol (range 28-55% of total sterols), Δ5-avenasterol (isofucosterol) (3-24%), campeste

- 62 037184 рол (2-33%), Δ5-стигмастерол (0,7-18%), Δ7-стигмастерол (1-18%) и Δ7-авенастерол (0,1-5%). Были идентифицированы несколько других минорных стеролов: холестерин, брассикастерол, чалинастерол, кампестанол и эбурикол. Дополнительно, были обнаружены четыре С29:2 и два С30:2 стерола, но необходимо дальнейшее исследование для окончательной идентификации этих минорных компонентов. Кроме того, в некоторых из масел присутствовали несколько других неидентифицированных стеролов, но из-за очень низкого их содержания масс-спектры не были достаточно интенсивными, чтобы позволить идентификацию их структуры.- 62 037184 roll (2-33%), Δ5-stigmasterol (0.7-18%), Δ7-stigmasterol (1-18%) and Δ7-avenasterol (0.1-5%). Several other minor sterols have been identified: cholesterol, brassicasterol, chalinasterol, campestanol, and eburicol. Additionally, four C29: 2 and two C30: 2 sterols have been identified, but further research is needed to definitively identify these minor components. In addition, several other unidentified sterols were present in some of the oils, but due to their very low content, the mass spectra were not intense enough to allow identification of their structure.

Таблица 10Table 10

Названия по ИЮПАК/систематические названия идентифицированных стероловIUPAC names / systematic names of identified sterols

Стерол № Sterol No. Общее название(я) Common name (s) ИЮПАК/систематическое IUPAC / systematic название name 1 one холестерин cholesterol холест-5-ен-З β-ол cholest-5-en-C β-ol 2 2 брассикастерол brassicasterol 24-мeгилxoлecτa-5,22E-диeн-Зβ-oл 24-megylcholecta-5,22E-diene-3β-ol 3 3 чалинастерол / 24-метиленхолестерин chalinasterol / 24-methylenecholesterol 24-метилхолеста-5,24(28)Е-диен3β-οπ 24-methylcholesta-5.24 (28) E-diene 3β-οπ 4 four кампэстерол / 24-метилхолестерин campesterol / 24-methylcholesterol 24-метилхолест-5-ен-3 β-ол 24-methylcholest-5-en-3 β-ol 5 five кампэстанол / 24-метилхолестанол campestanol / 24-methylcholestanol 24-метилхолестан-З β-ол 24-methylcholestan-3 β-ol 7 7 Δ5 -стигмастерол Δ5 -stigmasterol 24-этилхолеста-5,22Е-диен^-ол 24-ethylcholesta-5,22E-diene ^ -ol 9 nine эргост-7-ен-З β-ол ergost-7-en-Z β-ol 24-мeτилxoлecτ-7-eн-Зβ-oл 24-methylcholecτ-7-en-Zβ-ol 11 eleven эбурикол eburicol 4,4,14-триметилэргоста-8,24(28)- ΛΗβΗ-3β-οπ 4,4,14-trimethylergosta-8.24 (28) - ΛΗβΗ-3β-οπ 12 12 β-ситостерол / 24-этилхолестерин β-sitosterol / 24-ethylcholesterol 24-этилхолест-5-ен-3 β-ол 24-ethylcholest-5-en-3 β-ol 13 thirteen О5-авенастерол / изофукостерол O5-avenasterol / isofucosterol 24-эτилxoлecτa-5_J24(28)Z-диeн-Зβол24-ethylcholecta-5 _J 24 (28) Z-diene-Zβol 19 19 П7-стигмастерол / стигмаст-7-ен-ЗЬ-ол P7-stigmasterol / stigmast-7-en-Zb-ol 24-этилхолест-7-ен-3 β-ол 24-ethylcholest-7-en-3 β-ol 20 twenty О7-авенастерол O7-avenasterol 24-этилхолеста-7,24(28)-диен-3 βол 24-ethylcholesta-7.24 (28) -diene-3 βol

Содержание стеролов, выраженное как мг/г масла, в порядке уменьшения количества было следующим: масло рапса (6,8 мг/г), кунжутное масло (5,8 мг/г), льняное масло (4,8-5,2 мг/г), масло подсолнечника (3,7-4,1 мг/г), арахисовое масло (3,2 мг/г), сафлоровое масло (3,0 мг/г), соевое масло (3,0 мг/г), оливковое масло (2,4 мг/г), касторовое масло (1,9 мг/г). Состав стеролов в % и общее содержание стеролов приведены в табл. 11.The sterol content, expressed as mg / g oil, in decreasing order of quantity, was as follows: rapeseed oil (6.8 mg / g), sesame oil (5.8 mg / g), linseed oil (4.8-5.2 mg / g), sunflower oil (3.7-4.1 mg / g), peanut oil (3.2 mg / g), safflower oil (3.0 mg / g), soybean oil (3.0 mg / g ), olive oil (2.4 mg / g), castor oil (1.9 mg / g). The composition of sterols in% and the total content of sterols are shown in table. eleven.

В общем, среди всех образцов масла из семян основным фитостерином был β-ситостерол (интервал 30-57% от общего содержания стеролов). Для масел наблюдался широкий интервал доли других основных стеролов: кампэстерол (2-17%), Δ5-стигмастерол (0,7-18%), Δ5-авенастерол (4-23%), Δ7стигмастерол (1-18%). Масла различных видов содержали другой профиль стеролов, причем некоторые профили были весьма отличными. В случае масла рапса оно содержало самую высокую долю кампэстерола (33,6%), в то время как образцы других видов в общем содержали более низкие уровни, например до 17% в арахисовом масле.In general, among all seed oil samples, β-sitosterol was the major phytosterol (range 30-57% of total sterols). For oils, a wide range of the proportion of other major sterols was observed: campesterol (2-17%), Δ5-stigmasterol (0.7-18%), Δ5-avenasterol (4-23%), Δ7 stigmasterol (1-18%). The different types of oils contained a different sterol profile, with some profiles being quite different. In the case of rapeseed oil, it contained the highest proportion of campesterol (33.6%), while samples of other species generally contained lower levels, for example up to 17% in peanut butter.

Сафлоровое масло содержало относительно высокую долю Δ7-стигмастерола (18%), в то время как содержание данного стерола обычно было низким в маслах других видов, до 9% в масле подсолнечника. Поскольку они являются характерными для каждого вида, профили стеролов могут, таким образом, использоваться как вспомогательные для идентификации конкретных овощных или растительных масел и проверки их неподдельности или подделки другими маслами.Safflower oil contained a relatively high proportion of Δ7-stigmasterol (18%), while the content of this sterol was usually low in other oils, up to 9% in sunflower oil. Since they are specific to each species, the sterol profiles can thus be used as an aid to identify specific vegetable or vegetable oils and to check whether they are genuine or counterfeit with other oils.

Сравнивали по два образца из подсолнечника и сафлора, в каждом случае один из них был получен холодным прессованием семян и был нерафинированным, в то время как другой не был получен холодным прессованием и был рафинированным. Хотя наблюдались некоторые отличия, два источника масел имели подобный состав стеролов и общее содержание стеролов, указывая на то, что обработка и рафинация оказывают небольшое влияние на эти два параметра. Содержание стеролов варьировало в три раза между образцами и находилось в диапазоне от 1,9 до 6,8 мг/г. Масло рапса имело самое высокое, а касторовое масло - самое низкое содержание стеролов.Compared two samples from sunflower and safflower, in each case one of them was obtained by cold pressing of seeds and was unrefined, while the other was not obtained by cold pressing and was refined. Although some differences were observed, the two sources of oils had similar sterol composition and total sterol content, indicating that processing and refining had little effect on these two parameters. The sterol content varied threefold between samples and ranged from 1.9 to 6.8 mg / g. Rapeseed oil had the highest and castor oil had the lowest sterol content.

Пример 6. Повышение аккумуляции ДГК и ДПК в положении sn-2 ТАГ.Example 6. Increased accumulation of DHA and DPA in the sn-2 position of TAG.

Авторы настоящего изобретения считали, что аккумуляция ДГК и/или ДПК в положении sn-2 в ТАГ могла бы быть увеличена путем соэкспрессии 1-ацилглицерид-3-фосфатацилтрансферазы (ЛФААТ) с путем биосинтеза ДГК или ДПК, например, как обеспечивается конструкцией GA7 или ее вариантами. Предпочтительными ЛФААТ являются такие, которые могут воздействовать на полиненасыщенный С22The authors of the present invention believed that the accumulation of DHA and / or DPA at the sn-2 position in TAG could be increased by co-expression of 1-acylglyceride-3-phosphate acyltransferase (LPAAT) with the biosynthetic pathway of DHA or DPA, for example, as provided by the GA7 construct or its options. Preferred LPAATs are those that can act on the polyunsaturated C22

- 63 037184 жирный ацил-КоА как субстрат, предпочтительно ДГК-КоА и/или ДПК-КоА, особенно те, которые могут использовать как ДГК-КоА, так и ДПК-КоА в качестве субстратов, приводя к увеличению инсерции полиненасыщенной цепи С22 в положении sn-2 ЛФХ с образованием ФХ, относительно эндогенного ЛФААТ. Цитоплазматические ферменты ЛФААТ часто демонстрируют разнообразные предпочтения в отношении субстрата, особенно, если виды синтезируют и аккумулируют необычные жирные кислоты в ТАГ. Было показано, что ЛФААТ2 из Limnanthes douglasii использует эрукоил-КоА (С22:1-КоА) в качестве субстрата для синтеза ФХ, в противоположность ЛФААТ 1 тех же видов, которые не могли бы утилизировать субстрат С22 (Brown et al., 2002).- 63 037184 fatty acyl-CoA as a substrate, preferably DHA-CoA and / or DPA-CoA, especially those that can use both DHA-CoA and DPA-CoA as substrates, leading to an increase in the insertion of the C22 polyunsaturated chain at position sn-2 LPH with the formation of PC, relative to endogenous LPAAT. Cytoplasmic LPAAT enzymes often exhibit a variety of substrate preferences, especially if species synthesize and accumulate unusual fatty acids in TAG. It was shown that LFAAT2 from Limnanthes douglasii uses erucoyl-CoA (C22: 1-CoA) as a substrate for PC synthesis, in contrast to LFAAT 1 of the same species, which could not utilize substrate C22 (Brown et al., 2002).

Таблица 11Table 11

Содержание и состав стеролов в проанализированных растительных маслахThe content and composition of sterols in the analyzed vegetable oils

Общее название стерола Common name for sterol Кунжут Sesame Олива Olive Подсолнечник Sunflower Клещевина Castor oil plant Рапс Rape Сафлор Safflower Арахне Arachne Лен (семя льна) Flax (flax seed) Соя Soy холестерин cholesterol 0,2 0.2 0,8 0.8 0,2 0.2 0,1 0.1 0,3 0.3 0,2 0.2 0,2 0.2 0,4 0,4 0,2 0.2 брассикастерол brassicasterol 0,1 0.1 0,0 0.0 0,0 0.0 о,3 oh, 3 0,1 0.1 0,0 0.0 0,0 0.0 0,2 0.2 0,0 0.0 чалинастерол / 24-метиленхолестерин chalinasterol / 24-methylenecholesterol 1,5 1.5 0,1 0.1 0,3 0.3 1,1 1.1 2,4 2.4 0,2 0.2 0,9 0.9 1,5 1.5 0,8 0.8 кампэстерол / 24-метилхолестерин campesterol / 24-methylcholesterol 16,2 16.2 2,4 2.4 7,4 7.4 8,4 8.4 33,6 33.6 12,1 12.1 17,4 17.4 15,7 15.7 16,9 16.9 кампэстанол / 24-метилхолестанол campestanol / 24-methylcholestanol 0,7 0.7 0,3 0.3 0,3 0.3 0,9 0.9 0,2 0.2 0,8 0.8 0,3 0.3 0,2 0.2 0,7 0.7 С29:2* C29: 2 * 0,0 0.0 0,0 0.0 0,1 0.1 0,0 0.0 0,1 0.1 0,5 0.5 0,0 0.0 U U од od Д5-стигмастерол D5-stigmasterol 6,4 6.4 1,2 1,2 7,4 7.4 18,6 18.6 0,7 0.7 7,0 7.0 6,9 6.9 5,1 5.1 17,6 17.6 неизвестен unknown 0,5 0.5 1,3 1,3 0,7 0.7 0,8 0.8 0,7 0.7 0,7 0.7 0,4 0,4 0,7 0.7 1,3 1,3 эргост-7-ен-Зр-ол ergost-7-en-Zr-ol 0,1 0.1 0,1 0.1 1,9 1.9 0,2 0.2 0,4 0,4 2,7 2.7 1,4 1.4 1,4 1.4 1,0 1.0 неизвестен unknown 0,0 0.0 1,3 1,3 0,9 0.9 1,2 1,2 0,9 0.9 1,8 1.8 1,2 1,2 0,7 0.7 0,7 0.7 эбурикол eburicol 1,6 1.6 1,8 1.8 4,1 4.1 1,5 1.5 1,0 1.0 1,9 1.9 1,2 1,2 3,5 3.5 0,9 0.9 β-ситостерол / β-sitosterol / 24-этилхолестерин 24-ethylcholesterol 55,3 55.3 45,6 45.6 43,9 43.9 37,7 37.7 50,8 50.8 40,2 40.2 57,2 57.2 29,9 29.9 40,2 40.2 Д5-авенастерол / изофукостерол D5-avenasterol / isofucosterol 8,6 8.6 16,9 16.9 7,2 7.2 19,3 19.3 4,4 4.4 7,3 7.3 5,3 5.3 23,0 23.0 3,3 3.3 тритерпеновый спирт triterpene alcohol 0,0 0.0 2,4 2.4 0,9 0.9 0,0 0.0 0,0 0.0 1,6 1.6 0,0 0.0 0,0 0.0 0,9 0.9 тритерпеновый спирт triterpene alcohol 0,0 0.0 0,0 0.0 0,7 0.7 0,0 0.0 0,0 0.0 2,8 2.8 0,0 0.0 0,0 0.0 0,0 0.0 Д7-стигмастерол / D7-stigmasterol / стигмаст-7-ен-Зр-ол stigmast-7-en-Zr-ol 2,2 2.2 7,1 7.1 9,3 9.3 2,3 2,3 0,9 0.9 10,5 10.5 1,1 1.1 7,9 7.9 5,6 5.6 Д7-авенастерол D7-avenasterol 1,3 1,3 0,1 0.1 4,0 4.0 0,6- 0.6- 0,2 0.2 2,0 2.0 0,7 0.7 0,4 0,4 0,6 0.6 Общее содержание стеролов (мг/г масла) Total sterols (mg / g oil) 5,8 5.8 2,4 2.4 4,1 4.1 1,9 1.9 6,8 6.8 3,2 3.2 3,2 3.2 4,8 4.8 3,0 3.0

С29:2*обозначает стерол С29 с двумя двойными связями.C29: 2 * refers to a C29 sterol with two double bonds.

Рассматривались известные ЛФКАТ, и многие были выбраны для тестирования, в том числе те, от которых не ожидалось увеличения инкорпорации ДГК в положении sn-2, в качестве контроля. Известные ЛФКАТ включали: ЛФКАТ2: Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 40, номер доступа ABG48392, Kim et al., 2005), ЛФКАТ Limnanthes alba (SEQ ID NO: 41, номер доступа ААС49185, Lassner et al., 1995), Slc1p Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 42, номер доступа NP_010231, Zou et al., 1997), ЛФКАТ 1 Mortierella alpina (SEQ ID NO: 44, номер доступа AED33305; US 7879591) и ЛФКАТ Brassica napus (SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46, номера доступа ADC97479 и ADC97478 соответственно).Known LPKATs were considered and many were selected for testing, including those that were not expected to increase the incorporation of DHA at the sn-2 position, as controls. Known LPKATs included: LPKAT2: Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 40, accession number ABG48392, Kim et al., 2005), LPKAT Limnanthes alba (SEQ ID NO: 41, accession number AAC49185, Lassner et al., 1995), Slc1p Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 42, accession number NP_010231, Zou et al., 1997), LPKAT 1 Mortierella alpina (SEQ ID NO: 44, accession number AED33305; US 7879591) and LPKAT Brassica napus (SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46, accession numbers ADC97479 and ADC97478, respectively).

ЛФКАТ2 Arabidopsis (также обозначенная ЛФАТ2) представляет собой локализованный в эндоплазматическом ретикулуме фермент, который продемонстрировал активность в отношении субстратов C16 и C18, однако активность в отношении субстратов С20 или С22 не тестировалась (Kim et al., 2005). ЛФКАТ2 Limnanthes alba продемонстрировала вставку ацильной цепи С22:1 в положение sn-2 ФК, хотя способность использовать ДГК или ДПК в качестве субстрата не тестировалась (Lassner et al., 1995). Выбранная ЛФКАТ S. cerevisiae Slc1p продемонстрировала активность в виде использования 22:1-КоА в дополнение к 18:1-КоА в качестве субстратов, указывая на широкую специфичность в отношении субстратов с учетом длины цепи (Zou et al., 1997). Снова, ДГК-КоА, ДПК-КоА и другие ДЦ-ПНЖК не тестировались в качестве субстратов. Ранее было продемонстрировано, что ЛФКАТ Mortierella обладает активностью в отношении жирнокислотных субстратов ЭПК и ДГК в трансгенном Yarrowia lipolytica (US 7879591), но их активность в растительных клетках неизвестна.Arabidopsis LPKAT2 (also designated LPAT2) is an endoplasmic reticulum localized enzyme that has been shown to be active on substrates C16 and C18, but activity on substrates C20 or C22 has not been tested (Kim et al., 2005). LPKAT2 Limnanthes alba demonstrated the insertion of the C22: 1 acyl chain at the sn-2 position of PK, although the ability to use DHA or DPC as a substrate has not been tested (Lassner et al., 1995). The selected LPKAT S. cerevisiae Slc1p showed activity in the form of the use of 22: 1-CoA in addition to 18: 1-CoA as substrates, indicating broad substrate specificity based on chain length (Zou et al., 1997). Again, DHA-CoA, DPA-CoA, and other DC-PUFAs have not been tested as substrates. It was previously demonstrated that Mortierella LPKAT has activity against the fatty acid substrates EPA and DHA in the transgenic Yarrowia lipolytica (US 7879591), but their activity in plant cells is unknown.

Дополнительные ЛФКАТ были идентифицированы изобретателями. Micromonas pusilla представляет собой микроводоросль, которая вырабатывает и аккумулирует ДГК в масле, хотя позиционное распределение ДГК на ТАГ в данном виде не было подтверждено. ЛФКАТ Micromonas pusilla (SEQ ID NO: 43, номер доступа ХР002501997) была идентифицирована посредством поиска среди геномных последовательностей Micromonas pusilla, с использованием ЛФКАТ2 Arabidopsis в качестве последовательности запроса ВЛК-ST. Возникли несколько последовательностей-кандидатов, и последовательность ХР002501997 была синтезирована для тестирования в отношении С22 ДЦ-ПНЖК. ЛФКАТ Ricinus communis была аннотирована как предполагаемая ЛФКАТ в последовательности генома клещевины (Chan et al., 2010). Четыре кандидата на ЛФКАТ из генома клещевины были синтезированы и протестированы на неочищенных лизатах листьев инфильтрованной ткани листа N. benthamiana. Раскрытая в настоящем документе последовательность-кандидат продемонстрировала активность ЛФКАТ.Additional LFKAT have been identified by the inventors. Micromonas pusilla is a microalga that produces and accumulates DHA in oil, although the positional distribution of DHA to TAG has not been confirmed in this species. Micromonas pusilla LPKAT (SEQ ID NO: 43, accession number XP002501997) was identified by searching the genomic sequences of Micromonas pusilla using Arabidopsis LPKAT2 as the FLK-ST query sequence. Several candidate sequences emerged and the sequence XP002501997 was synthesized for testing against C22 DC-PUFA. LPKAT Ricinus communis was annotated as a putative LPKAT in the castor bean genome sequence (Chan et al., 2010). Four candidates for LPKAT from the castor bean genome were synthesized and tested on crude leaf lysates of infiltrated N. benthamiana leaf tissue. The candidate sequence disclosed herein demonstrated APCAT activity.

Целый ряд кандидатов на ЛФКАТ был выровнен с известным ЛФКАТ на филогенетическом дереве. Следует отметить, что предполагаемая ЛФКАТ Micromonas не группируется с предполагаемыми С22 ЛФКАТ, но имеет дивергирующую последовательность.A number of LPKAT candidates have been aligned with the well-known LPKAT on a phylogenetic tree. It should be noted that the putative LFKAT Micromonas is not grouped with the putative C22 LFKAT of Micromonas, but has a diverging sequence.

В качестве первичного анализа различных ЛФКАТ на Предмет их способности использовать ДГККоА и/или ДПК-КоА в качестве субстрата, получены химерные генетические конструкции для конститутивной экспрессии экзогенных ЛФКАТ в листьях N. benthamiana, каждая под контролем промотора 35S, как раскрыто ниже: 35S:Arath-ЛФАТ2 (Arabidopsis ER ЛФКАТ); 35S::Limal-ЛФКАТ (ЛФКАТ LimnanthesAs a primary analysis of various LPATs for their ability to use DHCKoA and / or DPK-CoA as a substrate, chimeric genetic constructs were obtained for constitutive expression of exogenous LPATs in N. benthamiana leaves, each under the control of the 35S promoter, as disclosed below: 35S: Arath -LFAT2 (Arabidopsis ER LFKAT); 35S :: Limal-LFKAT (LFKAT Limnanthes

- 64 037184 alba); 35S:Sacce-Slc1p (ЛФКАТ S, cerevisiae); 35S:Micpu-ЛФКАТ (ЛФКАТ Micromonas pusilla); 35S:Moral-ЛФКАТ1 (ЛФКАТ Mortierella alpina); 35S:Brana-LPAAT1.13 (Brassica napus ЛФААТ1.13); 35S:Brana-LPAAT1,5 (Brassica napus ЛФААТ1,5). Конструкции 35S:p19, не содержащие экзогенной ЛФКАТ, использовали в эксперименте в качестве контроля: его включали в каждую инокуляцию N. benthamiana. Каждую из указанных конструкций вводили с помощью Agrobacterium в листья N. benthamiana, как раскрыто в примере 1, и через 5 дней после инфильтрации обработанные зоны листьев вырезали и измельчали для получения лизата листьев. Каждый лизат содержит экзогенную ЛФКАТ, а также эндогенные ферменты для синтеза ЛФК. Реакционные смеси получали in vitro, по отдельности добавляя меченые ¹⁴С ОК и ДГК к лизатам. Реакционные смеси инкубировали при 25°С и уровень инкорпорации меченных ¹⁴С жирных кислот в ФК определяют методом ТСХ. Оценивали способность каждой ЛФКАТ использовать ДГК относительно АРК и жирных кислот С18. Обнаружено, что ЛФКАТ пенника лугового (Limnanthes alba), Mortierella и Saccharomyces обладают активностью в отношении субстрата ДГК, ричем радиомеченая ФК возникает в случае этих, но не других ЛФКАТ. Активность всех ЛФКАТ была подтверждена контрольным потреблением олеиновой кислоты.- 64 037184 alba); 35S: Sacce-Slc1p (LPKAT S, cerevisiae); 35S: Micpu-LFKAT (LFKAT Micromonas pusilla); 35S: Moral-LFKAT1 (LFKAT Mortierella alpina); 35S: Brana-LPAAT1.13 (Brassica napus LPAAT1.13); 35S: Brana-LPAAT1.5 (Brassica napus LPAAT1.5). The 35S: p19 constructs, lacking exogenous LPKAT, were used in the experiment as a control: it was included in each N. benthamiana inoculation. Each of these constructs was introduced with Agrobacterium into the leaves of N. benthamiana as disclosed in Example 1, and 5 days after infiltration, the treated leaf zones were excised and pulverized to obtain a leaf lysate. Each lysate contains exogenous LPKAT, as well as endogenous enzymes for the synthesis of LPA. Reaction mixtures were prepared in vitro, separately adding ¹⁴ C-labeled OK and DHA to lysates. The reaction mixtures were incubated at 25 ° C, and the level of incorporation of ¹⁴ C-labeled fatty acids into FA was determined by TLC. The ability of each LPKAT to use DHA relative to ARA and C18 fatty acids was evaluated. It was found that LFKAT of meadow foam (Limnanthes alba), Mortierella, and Saccharomyces have activity against the substrate DHA, and radiolabeled PK occurs in the case of these, but not other LFKATs. The activity of all LPKAT was confirmed by control consumption of oleic acid.

Для тестирования активности ЛФКАТ в семенах, некоторое количество кодирующих белок последовательностей или ЛФКАТ вставляли в бинарный вектор под контролем промотора конлинина (pLuCn12). Получающиеся в результате генетические конструкции, содержащие химерные гены Cn12Arath-ЛФКАТ (отрицательный контроль), Cn12:Limal-ЛФКАТ, Cn2:Sacce-Slc1p и Cn12MoralЛФКАТ соответственно, далее использовали для трансформации растений A. thaliana, образующих ДГК в семени, чтобы получить стабильные трансформанты, экспрессирующие ЛФКАТ и трансгенный путь ДНК в специфичной для семени форме, чтобы протестировать, будет ли увеличиваться инкорпорация ДГК в положении sn-2 ТАГ. Кроме того, конструкции используются для трансформации растений В. napus и С. sativa, которые уже содержат конструкцию GA7 и ее варианты (примеры 2 и 3), с целью получения потомства, несущего материнские и ЛФКАТ генетические конструкции. Протестировано увеличение инкорпорации ДГК и/или ДПК в положении sn-2 ТАГ относительно инкорпорации в растениях без кодирующих ЛФКАТ трансгенов. Содержание масла также повышается в семенах, особенно в случае семян, вырабатывающих более высокие уровни ДГК, нейтрализуя тенденцию, наблюдаемую в семени Arabidopsis, как раскрыто в примере 2.To test the activity of LPKAT in seeds, a number of protein-coding sequences or LPKAT were inserted into a binary vector under the control of the conlinin promoter (pLuCn12). The resulting genetic constructs containing the chimeric genes Cn12Arath-LPKAT (negative control), Cn12: Limal-LPKAT, Cn2: Sacce-Slc1p and Cn12Moral LPKAT, respectively, were then used to transform A. thaliana plants producing DHA in seed to obtain stable transformants expressing LPKAT and the transgenic DNA pathway in a seed-specific form to test whether the incorporation of DHA at the sn-2 position of TAG will increase. In addition, the constructs are used to transform B. napus and C. sativa plants, which already contain the GA7 construct and its variants (examples 2 and 3), in order to obtain offspring carrying maternal and LFKAT genetic constructs. An increase in the incorporation of DHA and / or DPA at the sn-2 position of TAG relative to incorporation in plants without LPKAT-encoding transgenes was tested. The oil content is also increased in the seeds, especially in the case of seeds producing higher levels of DHA, neutralizing the tendency observed in Arabidopsis seed, as disclosed in example 2.

Специфичную для семян конструкцию pCn12:Moral-LPAAT1 использовали для трансформации уже трансгенной линии Arabidopsis thaliana, которая была гомозиготной по Т-ДНК из конструкции GA7 и семя которой содержало около 15% ДГК в липидах семени (Petrie et al., 2012). Для этого применяли ген селекционного маркера канамицина в конструкции pCn12:Moral-LPAAT1, который был отличен от гена селекционного маркера bar, уже присутствующего в трансгенной линии. Были отобраны трансгенные саженцы, устойчивые к канамицину, и выращены до состояния зрелости в теплице. Урожай семян Т2 был собран, и состав жирных кислот в общих липидах семян проанализирован методом ГХ (табл. 12). Три фенотипа наблюдали среди 33 независимо трансформированных линий. В первой группе (6/33 линий) содержание ДПК существенно повышалось до значительно более высокого уровня, чем уровень ДГК, до около 10,6% в общих липидах семян. Это происходило за счет ДГК, содержание которой было существенно снижено в данной группе линий. В двух линиях из указанной первой группы суммарное содержание ДПК + ДГК был снижено, но не в других 4 линиях. Во второй группе (5/33), уровни ДПК и ДГК были равными, с около таким же суммарным содержанием ДПК + ДГК, как и в семени материнского растения. В третьей группе уровни ДПК и ДГК были сходны с уровнями в семенах материнских растений. Одно из возможных объяснений для повышенного уровня ДПК в первой и второй группах состоит в том, что ЛФААТ вытесняет Δ4-десатуразу на субстрате ДПК-КоА и преимущественно инкорпорирует ДПК в ФХ и далее в ТАГ, относительно Δ4-десатурации. Второе возможное объяснение состоит в том, что Δ4-десатурация частично ингибируется.The seed-specific pCn12: Moral-LPAAT1 construct was used to transform an already transgenic Arabidopsis thaliana line that was homozygous for T-DNA from construct GA7 and whose seed contained about 15% DHA in seed lipids (Petrie et al., 2012). For this, the gene for the selection marker kanamycin was used in the pCn12: Moral-LPAAT1 construct, which was different from the gene for the selection marker bar, which was already present in the transgenic line. Transgenic seedlings resistant to kanamycin were selected and grown to maturity in a greenhouse. The T2 seed was harvested and the composition of fatty acids in the total lipids of the seeds was analyzed by GC (Table 12). Three phenotypes were observed among 33 independently transformed lines. In the first group (6/33 lines), the content of duodenum was significantly increased to a significantly higher level than the level of DHA, up to about 10.6% in the total lipids of seeds. This was due to DHA, the content of which was significantly reduced in this group of lines. In two lines from this first group, the total content of DPA + DHA was reduced, but not in the other 4 lines. In the second group (5/33), the levels of DPA and DHA were equal, with about the same total DPA + DHA content as in the seed of the mother plant. In the third group, the levels of DPA and DHA were similar to those in the seeds of the mother plants. One of the possible explanations for the increased level of duodenum in the first and second groups is that LFAAT displaces Δ4-desaturase on the substrate duplex-CoA and mainly incorporates duplex in PC and further in TAG, relative to Δ4-desaturation. A second possible explanation is that Δ4 desaturation is partially inhibited.

Собирали семена растений Arabidopsis, трансформированных Т-ДНК конструкцией GA7, которые были дополнительно трансформированы вектором pCn12::Moral-LPAAT, и из семян экстрагировали масло. Далее фракцию ТАГ выделяли из экстрагированного масла методами ТСХ и выделяли с пластинки ТСХ. Полученные образцы ТАГ и образцы масла семян до фракционирования анализированы при помощи расщепления липазой Rhizopus, чтобы определить позиционное распределение ДГК. Липаза специфична в отношении ацильных групп, этерифицированных в положении sn-1 или sn-3 ТАГ. Это осуществляли путем приготовления эмульсии каждого образца липида в 5% аравийской камеди, с применением устройства для обработки ультразвуком, и добавляя раствор липазы Rhizopus в 0,1 М Трис-HCl, рН 7,7, содержащий 5 мМ CaCl₂, с инкубацией смесей при 30°С и непрерывном встряхивании. Реакцию в каждой реакционной смеси останавливали, добавляя хлороформ:метанол (2/1, об./об.) и один объем 0,1 М KCl к каждой смеси. Липид экстрагировали в хлороформную фракцию, и определяли относительные количества sn-2 МАГ, sn-1/3 ФФХ, ДАГ и компонентов ТАГ полученного липида разделением на пропитанной 2,3% борной кислотой пластинке ТСХ с применением гексана/диэтилового эфира/уксусной кислоты (50/50/1, об./об.). Полосы липидов визуализировали, обрызгивая 0,01% примулином в ацетоне/воде (80/20, об./об.) на пластинке ТСХ с визуализацией в УФ-свете. Отдельные полосы липидов иден- 65 037184 тифицировали на основании пятен липидных стандартов, нанесенных на такую же пластинку ТСХ. ТСХ полосы липидов собирали в стеклянные флаконы, и получали из них метиловые эфиры жирных кислот с применением 1н. метанольной HCl (Supelco), с инкубацией при 80°С в течение 2 ч. Состав жирных кислот индивидуальных липидов был проанализирован ГХ.Seeds of Arabidopsis plants transformed with T-DNA construct GA7 were harvested, further transformed with the vector pCn12 :: Moral-LPAAT, and oil was extracted from the seeds. Then, the TAG fraction was isolated from the extracted oil by TLC methods and isolated from a TLC plate. The resulting TAG samples and seed oil samples prior to fractionation were analyzed by digestion with Rhizopus lipase to determine the positional distribution of DHA. The lipase is specific for acyl groups esterified at the sn-1 or sn-3 position of the TAG. This was done by emulsifying each lipid sample in 5% gum arabic using a sonicator and adding a solution of Rhizopus lipase in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.7, containing 5 mM CaCl ₂ , incubating the mixtures at 30 ° C and continuous shaking. The reaction in each reaction mixture was stopped by adding chloroform: methanol (2/1, v / v) and one volume of 0.1 M KCl to each mixture. The lipid was extracted into the chloroform fraction, and the relative amounts of sn-2 MAG, sn-1/3 PPC, DAG and TAG components of the obtained lipid were determined by separation on a TLC plate impregnated with 2.3% boric acid using hexane / diethyl ether / acetic acid (50 / 50/1, v / v). Lipid bands were visualized by spraying with 0.01% primulin in acetone / water (80/20, v / v) on a TLC plate with visualization under UV light. Separate bands of lipid ID 65 037184 were identified based on the spots of lipid standards applied to the same TLC plate. TLC lipid bands were collected in glass vials, and methyl esters of fatty acids were obtained from them using 1N. methanol HCl (Supelco), incubated at 80 ° C for 2 h. The fatty acid composition of individual lipids was analyzed by GC.

Данный анализ продемонстрировал, что ДГК в семенах материнских растений, трансформированных GA7 (линии 22-2-1-1 и 22-2-38-7), преимущественно была этерифицирована в положении sn-1 или sn-3 ТАГ. И наоборот, липиды в семени NY11 и NY15, трансформированном как конструкцией GA7, так и трансгеном, кодирующим ЛФААТ, были обогащены ДГК в sn-2, причем 35% ДГК в одной из линий и 48% ДГК в другой линии были этерифицированы в положении sn-2 ТАГ, т.е. после расщепления липазой ДГК присутствовала, как sn-2-MAT (табл. 13). Аналогичные результаты получены для семени В. napus и В. juncea, трансформированного как Т-ДНК из конструкции GA7-modB, так и геном, кодирующим ЛФААТ, и вырабатывающего ДГК, а также для семени В. napus и В. juncea, вырабатывающего ДПК.This analysis demonstrated that DHA in the seeds of GA7-transformed mother plants (lines 22-2-1-1 and 22-2-38-7) was predominantly esterified at the sn-1 or sn-3 position of TAG. Conversely, lipids in NY11 and NY15 seed transformed with both GA7 construct and the transgene encoding LPAAT were enriched with DHA in sn-2, with 35% DHA in one lineage and 48% DHA in another line esterified at position sn -2 TAG, i.e. after lipase digestion, DHA was present as sn-2-MAT (Table 13). Similar results were obtained for the seed of B. napus and B. juncea transformed with both T-DNA from the GA7-modB construct and the gene encoding LPAAT and producing DHA, as well as for the seed of B. napus and B. juncea, which produces duodenum.

Для того чтобы определить, существует ли предпочтение ЛФААТ Mortierella или другой ЛФААТ в отношении ДПК-КоА или ДГК-КоА, in vitro получали реакционные смеси, добавляя по отдельности ¹⁴Смеченый-ДПК-КоА или -ДГК-КоА к лизатам листьев N. benthamiana, временно экспрессирующих ЛФААТ-кандидата под контролем конститутивного промотора, как изложено выше. Реакционные смеси инкубировали при 25°С, и уровни инкорпорации меченных ¹⁴С жирных кислот в ФХ определяли ТСХ методом анализа липидов. Оценивали способность каждой ЛФААТ использовать ДГК-КоА относительно ДПК-КоА. Гены, кодирующие ЛФААТ с доказано высокой ДГК инкорпорирующей активностью ЛФААТ, применяли для получения трансформированных ДГК-вырабатывающих растений рапса и семени.In order to determine whether there is a preference for Mortierella LPAAT or another LPAAT for DPA-CoA or DHA-CoA, in vitro reaction mixtures were prepared by adding separately ¹⁴ Labeled-DPA-CoA or -DHA-CoA to the leaf lysates of N. benthamiana, temporarily expressing a candidate LPAAT under the control of a constitutive promoter, as described above. The reaction mixtures were incubated at 25 ° C, and the levels of incorporation of ¹⁴ C-labeled fatty acids in PC were determined by TLC lipid analysis. The ability of each LPAAT to use DHA-CoA relative to DPA-CoA was assessed. The genes encoding LFAAT with a proven high DHA-incorporating activity of LFAAT were used to obtain transformed DHA-producing rape and seed plants.

Гены, кодирующие ЛФААТ с высокой активностью использования ДПК-КоА, применяли для трансформации ДПК-вырабатывающих растений и семени, чтобы увеличить количество ДПК, этерифицированной в положении sn-2 ТАГ.Genes encoding LFAAT with high activity of using DPA-CoA were used to transform DPA-producing plants and seeds in order to increase the amount of DPA esterified at the sn-2 position of TAG.

Таблица 12Table 12

Состав жирных кислот (% от общих жирных кислот) трансгенных семян A. thaliana, трансформированных конструкцией ЛФААТ1, а также Т-ДНК из конструкции GA7 для выработки ДГК. С20:4ω6 в семенах не обнаруживалась. Кроме того, семена содержали 0,3-0,9% С22:0 и 0,4-1,5% С22:1Fatty acid composition (% of total fatty acids) of transgenic A. thaliana seeds transformed with LFAAT1 construct, as well as T-DNA from GA7 construct for DHA production. C20: 4ω6 was not detected in seeds. In addition, the seeds contained 0.3-0.9% C22: 0 and 0.4-1.5% C22: 1

о и about and о «5 0 o “5 0 90 V 90 V 45 45 еч 90 и ech 90 and 1 90 V 1 90 V 1 «в υ 1 "in υ о о гч V o o hh V 1 9S one 9S ,-4 S , -4 S й th 1 ГЧ © г) У one MS © d) Y ·*: о у ·*: OU 1 о ГЧ у 1 about MS ID © С ID © WITH 3 ёч гч 3 eh hh 1 ri г» и 1 ri r "and NY-1 NY-1 9,3 9.3 3,2 3.2 9,1 9.1 6,8 6.8 9,4 9.4 0,5 0.5 23,8 23.8 1,6 1.6 4Д 4D 7,9 7.9 5,1 5.1 0,6 0.6 0,9 0.9 0,6 0.6 1,2 1,2 7,9 7.9 4,5 4.5 NY-2 NY-2 10,7 10.7 3,3 3.3 6,5 6.5 4,4 4.4 7,6 7.6 0,3 0.3 28,1 28.1 1,9 1.9 4,3 4.3 8,5 8.5 3,7 3.7 0,7 0.7 1,1 1.1 1,1 1.1 1,4 1.4 1,1 1.1 11,6 11.6 NY-3 NY-3 9,3 9.3 2,8 2.8 6,3 6.3 3,4 3.4 10,3 10.3 0,2 0.2 32,8 32.8 2,2 2.2 2,7 2.7 6,2 6.2 3,6 3.6 1,1 1.1 1,9 1.9 1,4 1.4 0,7 0.7 1,0 1.0 10,7 10.7 NY-4 NY-4 11,4 11.4 3,5 3.5 4,5 4.5 3,1 3.1 7,0 7.0 0,3 0.3 32,5 32.5 2,1 2.1 4,7 4.7 5,5 5.5 2,3 2,3 1,0 1.0 1,9 1.9 0,8 0.8 1,1 1.1 0,9 0.9 143 143 NY-5 NY-5 14,6 14.6 4,5 4.5 7,0 7.0 7,7 7,7 6,7 6,7 0,3 0.3 20,7 20,7 2,2 2.2 5,7 5.7 5,4 5.4 4,8 4.8 0,4 0,4 0,9 0.9 0,8 0.8 1,2 1,2 1,0 1.0 11,7 11.7 NY-6 NY-6 7,8 7.8 2,7 2.7 12,5 12.5 2,2 2.2 18,0 18.0 од od 24,9 24.9 1,8 1.8 0,7 0.7 15,5 15.5 3,1 3.1 1,4 1.4 1,2 1,2 0,5 0.5 0,3 0.3 3,0 3.0 0,8 0.8 NY-7 NY-7 9,3 9.3 2,9 2.9 6,7 6,7 3,8 3.8 9,2 9.2 0,2 0.2 31,5 31.5 2,1 2.1 3,2 3.2 7,5 7.5 3,7 3.7 0,9 0.9 1,6 1.6 1,3 1,3 0,8 0.8 1,1 1.1 10,9 10.9 NY-8 NY-8 8,8 8.8 3,2 3.2 8,2 8.2 5,5 5.5 11,0 11.0 0,3 0.3 25,3 25.3 1,9 1.9 3,0 3.0 8,3 8.3 5,4 5.4 1,0 1.0 1,2 1,2 0,8 0.8 0,8 0.8 6,1 6.1 6,0 6.0 NY-9 NY-9 12,3 12.3 3,7 3.7 5,0 5.0 4,6 4.6 7,1 7.1 0,2 0.2 28,3 28.3 2,3 2,3 4,2 4.2 5,6 5.6 3,8 3.8 0,8 0.8 1,6 1.6 0,7 0.7 1,1 1.1 1,2 1,2 13,8 13.8 NY-10 NY-10 8,6 8.6 3,2 3.2 8,5 8.5 3,1 3.1 9,7 9,7 0,3 0.3 31,5 31.5 1,6 1.6 3,4 3.4 8,7 8.7 2,8 2.8 1,0 1.0 1,3 1,3 0,9 0.9 1,1 1.1 10,6 10.6 1,0 1.0 NY-11 NY-11 11,5 11.5 3,2 3.2 4,5 4.5 2,5 2.5 7,1 7.1 0,3 0.3 33,3 33.3 2,1 2.1 3,9 3.9 5,7 5.7 1,9 1.9 0,9 0.9 2,0 2.0 0,7 0.7 0,8 0.8 1,0 1.0 15,6 15.6 NY-12 NY-12 8,7 8.7 3,2 3.2 7,5 7.5 5,1 5.1 8,5 8.5 0,2 0.2 26,8 26.8 2,0 2.0 3,7 3.7 8,7 8.7 5,1 5.1 0,9 0.9 1,2 1,2 1,1 1.1 1,2 1,2 10,0 10.0 2,6 2.6 NY-13 NY-13 11,5 11.5 3,4 3.4 5,2 5.2 3,4 3.4 8,3 8.3 0,3 0.3 30,0 30.0 2,2 2.2 5,0 5.0 6,2 6.2 3,2 3.2 0,9 0.9 1,7 1.7 1,5 1.5 1,1 1.1 1,0 1.0 11,6 11.6 NY-14 NY-14 9,2 9.2 2,9 2.9 6,6 6.6 2,0 2.0 10,3 10.3 0,2 0.2 34,7 34,7 1,9 1.9 3,3 3.3 7,7 7,7 1,6 1.6 1,2 1,2 1,8 1.8 1,2 1,2 0,9 0.9 0,8 0.8 11,1 11.1 NY-15 NY-15 10,9 10.9 3,3 3.3 4,6 4.6 2,7 2.7 7,0 7.0 0,3 0.3 34,1 34.1 1,9 1.9 5,1 5.1 5,5 5.5 2,0 2.0 0,9 0.9 1,8 1.8 0,8 0.8 1,0 1.0 1,0 1.0 14,7 14.7 NY-16 NY-16 10,5 10.5 3,4 3.4 6,0 6.0 4,6 4.6 7,8 7.8 0,3 0.3 30,3 30.3 1,8 1.8 4,4 4.4 5,4 5.4 2,9 2.9 0,7 0.7 1,5 1.5 0,9 0.9 1,1 1.1 13 thirteen 14,2 14.2 NY-17 NY-17 9,1 9.1 2,4 2.4 5,9 5.9 2,5 2.5 10,4 10.4 0,2 0.2 35,4 35.4 1,6 1.6 3,6 3.6 6,4 6.4 2,1 2.1 1,1 1.1 1,9 1.9 1,2 1,2 1,0 1.0 0,9 0.9 11,7 11.7 NY-18 NY-18 9,7 9,7 3,6 3.6 8,8 8.8 6,2 6.2 12,1 12.1 0,3 0.3 21,0 21.0 1,9 1.9 4,0 4.0 8,3 8.3 5,9 5.9 0,8 0.8 0,9 0.9 0,6 0.6 1,0 1.0 5,7 5.7 5,1 5.1 NY-19 NY-19 8,4 8.4 3,1 3.1 12,0 12.0 3,1 3.1 14,6 14.6 0,2 0.2 28,8 28.8 1,7 1.7 1,6 1.6 11,3 11.3 3,2 3.2 1,0 1.0 1,4 1.4 0,6 0.6 0,6 0.6 3,9 3.9 1,2 1,2 NY-20 NY-20 10,1 10.1 3,2 3.2 5,4 5.4 3,3 3.3 8,9 8.9 0,3 0.3 32,8 32.8 2,1 2.1 4Д 4D 5,5 5.5 2,8 2.8 1,0 1.0 1,9 1.9 1,1 1.1 0,9 0.9 М M 12,1 12.1 NY-21 NY-21 10,5 10.5 3,6 3.6 5,6 5.6 3,8 3.8 8,2 8.2 0,3 0.3 31,9 31.9 2,0 2.0 4,6 4.6 5,9 5.9 2,8 2.8 0,9 0.9 1,7 1.7 0,8 0.8 1,о 1, o 0,9 0.9 12,5 12.5 NY-22 NY-22 8,4 8.4 3,3 3.3 7,4 7.4 2,3 2,3 9,4 9.4 0,2 0.2 33,5 33.5 1,8 1.8 3.4 3.4 8,8 8.8 2,2 2.2 1,2 1,2 1,7 1.7 1,3 1,3 1,0 1.0 5,5 5.5 6,1 6.1

Таблица 13Table 13

Присутствие ДГК в положении sn-2 ТАГ или в общем масле трансгенных семян A. thaliana, трансформированных геном Cn12::Moral-ЛФААТ, а также Т-ДНК из конструкта GA7, демонстрирующее позиционное распределение ДГК в ТАГ. Кроме того, в составе жирных кислот ТАГ и sn-2 МАГ присутствовало 00,4% каждой из 14:0, 16:1ω13t, 16:2, 16:3, 22:0 и 24:0. В семенах не были обнаружены С20:3ω6, С20:4ω6The presence of DHA at the sn-2 position of TAG or in the total oil of transgenic A. thaliana seeds transformed with the Cn12 :: Moral-LFAAT gene, as well as T-DNA from the GA7 construct, demonstrating the positional distribution of DHA in TAG. In addition, the fatty acids TAG and sn-2 MAG contained 00.4% of each of 14: 0, 16: 1ω13t, 16: 2, 16: 3, 22: 0, and 24: 0. C20: 3ω6, C20: 4ω6 were not found in seeds

Образец Sample © £ 0 © £ 0 § 45 и § 45 and © 5 © five и and & и & and гч ж и gh f and 'g а и 'g a and 3 и 3 and © © еч и © © ech and 05 и 05 and < © гч и < © rh and < © гч и < © rh and гч © гч и rh © rh and 3 **> © гч υ 3 **> © gh υ 1 © гч и one © rh and ri гч и ri hh and № 3 «л © гч и No. 3 "l © rh and 8 «Λ гч гч и 8 "Λ hh hh and 1 гч гч и one hh hh and 3 гч г» и 3 rh g "and 3 ч» гч гч и 3 h " hh hh and 22-2-1*1 ТАГ 22-2-1 * 1 TAG 12,2 0,4 4,4 6,4 3,9 7,2 0,8 28,8 1,6 4,3 9,7 2,3 0,7 1,3 1,0 0,6 2,1 0,0 0,7 10,1 0,6 0,1 0,3 8,3 2,5 10,1 0,7 53,9 0,2 6,5 0,3 0,1 0,1 0,3 0,2 0,0 3,8 0,0 2,3 9,1 12.2 0.4 4.4 6.4 3.9 7.2 0.8 28.8 1.6 4.3 9.7 2.3 0.7 1.3 1.0 0.6 2, 1 0.0 0.7 10.1 0.6 0.1 0.3 8.3 2.5 10.1 0.7 53.9 0.2 6.5 0.3 0.1 0.1 0.3 0.2 0.0 3, 8 0.0 2.3 9.1 2-МАГ 2-MAG ДГК в sn-2 = 30% DHA in sn-2 = 30% 22-2-38-7 масло 22-2-38-7 oil 10,0 0,2 3,7 6,0 2,7 6,4 0,4 33,8 1,6 3,7 11,3 1,8 0,8 1,3 0,9 0,6 1,2 0,7 11,6 0,5 0,1 0,3 9,7 2,4 11,1 0,6 60,0 0,1 3,6 0,3 0,1 0,1 0,4 0,2 0,0 2,1 0,1 1,3 6,7 10.0 0.2 3.7 6.0 2.7 6.4 0.4 33.8 1.6 3.7 11.3 1.8 0.8 1.3 0.9 0.6 1, 2 0.7 11.6 0.5 0.1 0.3 9.7 2.4 11.1 0.6 60.0 0.1 3.6 0.3 0.1 0.1 0.4 0.2 0.0 2, 1 0.1 1.3 6.7 2-МАГ 2-MAG ДГК в sn-2 = 19% DHA in sn-2 = 19% Дополнительно η Additionally, η расформированные геном, кодирующим ЛФААТ Mortierella alpina. disbanded by the gene encoding the LPAAT Mortierella alpina. ΝΥ11-ΤΑΓ ΝΥ11-ΤΑΓ 11,0 0,2 3,4 6,0 2,8 9,2 0,3 34,8 1,6 3,6 6,3 1,8 1,0 1,8 0,7 0,6 0,9 0,0 0,1 0,6 12,2 0,7 0,1 0,2 6,7 1,1 11,8 0,3 49,8 0,2 3,7 0,5 1,5 0,3 1,6 0,6 0,1 0,8 0,1 0,2 1,6 17,8 11.0 0.2 3.4 6.0 2.8 9.2 0.3 34.8 1.6 3.6 6.3 1.8 1.0 1.8 0.7 0.6 0, 9 0.0 0.1 0.6 12.2 0.7 0.1 0.2 6.7 1.1 11.8 0.3 49.8 0.2 3.7 0.5 1.5 0.3 1.6 0.6 0.1 0, 8 0.1 0.2 1.6 17.8 2-МАГ 2-MAG ДГК в sn-2 = 48% DHA in sn-2 = 48% NY-15-масло NY-15-oil 11,0 0,0 3,3 4,6 2,8 6,9 0,3 33,6 2,0 5,1 5,5 2,1 0,9 1,9 0,7 0,6 0,9 0,4 0,9 14,9 0,8 0,1 0,3 6,4 1,3 11,4 0,3 50,2 0,2 4,9 0,4 1,4 0,2 1,5 0,6 0,1 0,9 0,0 0,2 1,6 16,7 11.0 0.0 3.3 4.6 2.8 6.9 0.3 33.6 2.0 5.1 5.5 2.1 0.9 1.9 0.7 0.6 0, 9 0.4 0.9 14.9 0.8 0.1 0.3 6.4 1.3 11.4 0.3 50.2 0.2 4.9 0.4 1.4 0.2 1.5 0.6 0.1 0, 9 0.0 0.2 1.6 16.7 2-МАГ 2-MAG ДГК в sn-2 = 37% DHA in sn-2 = 37%

Пример 7. Дальнейший анализ трансгенных семян Camelina sativa.Example 7. Further analysis of transgenic seeds of Camelina sativa.

- 66 037184- 66 037184

Общее содержание липидов.Total lipid content.

Семя С. sativa, гомозиготное по Т-ДНК из конструкции GA7 и содержащее ДГК в общем содержании жирных кислот, было проанализировано на предмет содержания состава общих липидов и как указано ниже. Для семян выполняли две последовательные стадии экстракции растворителем, вначале с применением гексана, и затем с применением хлороформа/метанола. В ходе экстракции и анализа не добавляли антиоксидантов. Метод экстракции Сокслета, который обычно применяется для извлечения липидов из семени путем длительного нагревания и кипячения с обратным холодильником смеси липида/растворителя, в данном случае не применялся из-за потенциального разложения или окисления ω3 ПНЖК, таких как ДГК.Seed of C. sativa, homozygous for T-DNA from construct GA7 and containing DHA in total fatty acids, was analyzed for total lipid composition and as indicated below. The seeds were subjected to two successive solvent extraction steps, first with hexane and then with chloroform / methanol. No antioxidants were added during extraction and analysis. The Soxhlet extraction method, which is commonly used to extract lipids from semen by prolonged heating and refluxing a lipid / solvent mixture, was not used in this case due to the potential degradation or oxidation of ω3 PUFAs such as DHA.

Г ексан применяли в качестве растворителя для первой экстракции, поскольку он является промышленным стандартом для масличных культур. Кроме того, он преимущественно экстрагирует ТАГсодержащее масло за счет своих сольватирующих свойств и относительно слабой солюбилизации полярных липидов, особенно при комнатной температуре. Трансформированные и контрольные семена Camelina (130 и 30 г соответственно) смачивали гексаном и измельчали при помощи электрической агатовой ступки и пестика (Retsch Muhle, Германия). Смеси переносили в делительные воронки и четыре раза экстрагировали с применением общего объема 800 мл гексана, включая статическую экстракцию на протяжении ночи для третьей экстракции. Для каждой экстракции экстракты фильтровали сквозь фильтр из стекловолокна GFC под вакуумом для удаления мелких частиц, после чего выпаривали на ротационном испарителе при 40°С под вакуумом. Экстракты объединяли в пул с получением богатых ТАГ гексановых экстрактов.Hexane was used as a solvent for the first extraction because it is the industry standard for oilseeds. In addition, it preferentially extracts TAG-containing oil due to its solvating properties and relatively weak solubilization of polar lipids, especially at room temperature. Transformed and control Camelina seeds (130 and 30 g, respectively) were moistened with hexane and ground using an electric agate mortar and pestle (Retsch Muhle, Germany). The mixtures were transferred to separatory funnels and extracted four times using a total volume of 800 ml of hexane, including static extraction overnight for the third extraction. For each extraction, the extracts were filtered through a GFC glass filter under vacuum to remove fines and then evaporated on a rotary evaporator at 40 ° C. under vacuum. The extracts were pooled to give TAG-rich hexane extracts.

После экстракции гексаном оставшийся жмых семян далее экстрагировали с применением хлороформа-метанола (ХМ, 1:1 об./об.) по такой же методике, как проводили экстракцию гексаном. Затем жмых удаляли фильтрацией, и объединенные экстракты выпаривали на роторном испарителе. Объединенные в пул неочищенные ХМ общего липида затем растворяли с применением однофазной смеси метанола-хлороформа-воды (2:1:0.8, об./об./об.). Фракции разделяли добавлением хлороформа-воды (конечное соотношение растворителей, 1:1:0,9 об./об./об. метанола/хлороформа/воды). Очищенный липид в каждом экстракте, распределенный в нижней хлороформной фазе, концентрировали с применением роторного испарения, и получали ХМ экстракты, богатые полярными липидами. Содержание липида в каждом из этих экстрактов определяли гравиметрически.After extraction with hexane, the remaining seed cake was further extracted using chloroform-methanol (XM, 1: 1 v / v) in the same manner as the extraction with hexane. Then the cake was removed by filtration, and the combined extracts were evaporated on a rotary evaporator. The pooled crude CM of total lipid was then dissolved using a single phase methanol-chloroform-water mixture (2: 1: 0.8, v / v / v). Fractions were separated by addition of chloroform-water (final solvent ratio, 1: 1: 0.9 v / v / v methanol / chloroform / water). The purified lipid in each extract, dispersed in the lower chloroform phase, was concentrated using rotary evaporation to obtain XM extracts rich in polar lipids. The lipid content of each of these extracts was determined gravimetrically.

Для анализа состава жирных кислот аликвоты гексановых и ХМ экстрактов транс-метилировали по способу Christie et al. (1982) с получением метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), применяя метанол-хлороформ-конц. хлористоводородную кислоту (3 мл, 10:1:1, 80°С, 2 ч). МЭЖК экстрагировали гексаном-хлороформом (4:1, 3 х 1,8 мл). Кроме того, образцы жмыха семени (1-2 г), оставшегося после экстракции гексаном и ХМ, транс-метилировали для гравиметрического измерения содержания любого остаточного липида в виде МЭЖК. Общее содержание липидов в семени вычисляли, суммируя содержание липидов в гексановых и ХМ экстрактах и содержание МЭЖК в трансметилированном жмыхе после экстракции растворителями.To analyze the composition of fatty acids, aliquots of hexane and XM extracts were trans-methylated according to the method of Christie et al. (1982) to obtain methyl esters of fatty acids (FAME) using methanol-chloroform-conc. hydrochloric acid (3 ml, 10: 1: 1, 80 ° C, 2 h). FAME was extracted with hexane-chloroform (4: 1, 3 x 1.8 ml). In addition, samples of seed cake (1-2 g) remaining after extraction with hexane and XM were trans-methylated for gravimetric measurement of any residual lipid in the form of FAME. The total lipid content in the seed was calculated by summing the lipid content in the hexane and HM extracts and the FAME content in the transmethylated oil cake after solvent extraction.

Трансгенные семена содержали несколько меньшее количество общих липидов, на уровне 36,2% от массы семени, по сравнению с семенами Camelina sativa дикого типа, 40,9% от массы семени. Для семян, включая семена масличных культур, общие липиды определяли как сумму экстрагированного растворителями липида, полученного последовательной экстракцией гексаном, а затем хлороформом-метанолом, и остаточного липида, высвобожденного трансметилированием экстрагированного жмыха после экстракции растворителями, как описано в качестве примера в данном описании. Такие общие липиды состояли по большей части из липидов, содержащих жирные кислоты, таких как триацилглицериды и полярные липиды, и небольших количеств липидов, не содержащих жирных кислот, таких как фитостерины и жирные спирты, которые могут присутствовать в свободной неэтерифицированной форме или могут быть этерифицированы жирными кислотами. Кроме того, любые эфиры стеролов или эфиры восков и углеводороды, такие как каротиноиды, например β-каротин, также входили в экстрагируемый растворителями липид, если они присутствовали. Они были включены в общее гравиметрическое определение и были показаны в анализе ТСХ-ПИД (табл. 14).The transgenic seeds contained slightly lower total lipids, at 36.2% of the seed weight, compared to wild-type Camelina sativa seeds, 40.9% of the seed weight. For seeds, including oilseeds, total lipids were defined as the sum of solvent-extracted lipid obtained by sequential extraction with hexane and then chloroform-methanol and residual lipid released by transmethylation of the extracted oil cake after solvent extraction, as described by way of example herein. Such total lipids consisted mostly of fatty acid lipids such as triacylglycerides and polar lipids, and small amounts of fatty acid free lipids such as phytosterols and fatty alcohols, which may be present in free non-esterified form or may be esterified with fatty acids. acids. In addition, any sterol esters or wax esters and hydrocarbons such as carotenoids, eg β-carotene, were also included in the solvent-extractable lipid, if present. They were included in the general gravimetric determination and were shown in the TLC-FID analysis (Table 14).

Из общих липидов, 31-38% липидов от массы семени было экстрагировано гексаном для трансгенных и контрольных семян соответственно, что отвечает 86 и 92% общих липидов в семенах. С помощью экстракции ХМ извлекали еще 4,8 и 2,4% (от массы семени), в основном богатый полярными липидами экстракт из трансгенных и контрольных семян соответственно. Остаточный липид, высвобождающийся трансметилированием оставшегося после экстракции растворителями жмыха семян масличной культуры, составил 0,3 и 0,4% от массы семени соответственно. Т.е. первая и вторая экстракция растворителями суммарно извлекает 99% от общего содержимого липидов в семени (т.е. 36,2 или 40,9% от массы семени, что в основном представляет собой липид, содержащий жирные кислоты, например триглицериды и полярные липиды, состоящие из глико- и фосфолипидов (см. следующий раздел - анализ классов липидов)).Of the total lipids, 31-38% of the lipids by weight of the seed was extracted with hexane for transgenic and control seeds, respectively, which corresponds to 86 and 92% of the total lipids in the seeds. With the help of XM extraction, an additional 4.8 and 2.4% (based on the weight of the seed) were recovered, mainly the extract rich in polar lipids from the transgenic and control seeds, respectively. Residual lipid released by transmethylation of oilseed cake remaining after extraction with solvents was 0.3 and 0.4% of the seed weight, respectively. Those. the first and second solvent extractions together extract 99% of the total lipid content in the seed (i.e. 36.2 or 40.9% of the seed mass, which is mainly a lipid containing fatty acids, for example triglycerides and polar lipids consisting of from glyco- and phospholipids (see the next section - analysis of lipid classes)).

Анализ классов липидов.Analysis of lipid classes.

- 67 037184- 67 037184

Классы липидов в гексановых и ХМ экстрактах были проанализированы тонкослойной хроматографией с обнаружением при помощи плазменно-ионизационного детектора (ТСХ-ПИД; Iatroscan Mark V, Iatron Laboratories, Токио, Япония), с применением гексана/диэтилового эфира/ледяной уксусной кислоты (70:10:0,1, об./об./об.) в качестве системы растворителей для проявления, в сочетании с кремния диоксидом Chromarod S-III на кварцевых палочках. Подходящие калибровочные кривые получали с применением репрезентативных стандартов, полученных от Nu-Chek Prep, Inc. (Элизайан, Миннесота, США). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения SIC-480II (Версия SISC: 7.0-Е). Различные виды фосфолипидов разделяли с применением очищенной фосфолипидной фракции, полученной после колоночной хроматографии на кремния диоксиде, с проявлением палочек в хлороформе/метаноле/ледяной уксусной кислоте/воде (85:17:5:2, об./об./об.) перед обнаружением с помощью ПИД.The lipid classes in the hexane and XM extracts were analyzed by TLC with detection using a plasma ionization detector (TLC-FID; Iatroscan Mark V, Iatron Laboratories, Tokyo, Japan) using hexane / diethyl ether / glacial acetic acid (70:10 : 0.1, v / v / v) as a solvent system for developing, in combination with Chromarod S-III silicon dioxide on quartz sticks. Fitting calibration curves were obtained using representative standards obtained from Nu-Chek Prep, Inc. (Elysian, Minnesota, USA). The data were processed using the SIC-480II software (SISC version: 7.0-E). Different types of phospholipids were separated using a purified phospholipid fraction obtained after column chromatography on silica, with development of rods in chloroform / methanol / glacial acetic acid / water (85: 17: 5: 2, v / v / v) before detection by PID.

Для отделения ТАГ, гликолипидных и фосфолипидных фракций от ХМ экстрактов применяли гель кремния диоксида 60 (100-200 меш) (0,3-1 г) в короткой стеклянной колонке или пипетке Пастера, заполненной стекловатой, чтобы очистить 10 мг очищенного ХМ экстракта липидов. Остаточную фракцию ТАГ в ХМ экстракте элюировали с применением 20 мл 10% диэтилового эфира в гексане, гликолипиды элюировали 20 мл ацетона, и фосфолипиды элюировали в две стадии, вначале 10 мл метанола, и затем 10 мл метанола-хлороформа-воды (5:3:2). Указанная вторая элюация увеличивает выход фосфолипидов. Выход каждой фракции определяли гравиметрически, и чистоту проверяли ТСХ-ПИД. Все экстракции и фракции хранили в дихлорметане при -20°С до дальнейшего анализа ГХ и ГХ-МС.To separate TAG, glycolipid and phospholipid fractions from XM extracts, silica gel 60 (100-200 mesh) (0.3-1 g) was used in a short glass column or a Pasteur pipette filled with glass wool to purify 10 mg of purified XM lipid extract. The residual TAG fraction in the XM extract was eluted using 20 ml of 10% diethyl ether in hexane, glycolipids were eluted with 20 ml acetone, and phospholipids were eluted in two stages, first with 10 ml of methanol and then with 10 ml of methanol-chloroform-water (5: 3: 2). This second elution increases the yield of phospholipids. The yield of each fraction was determined gravimetrically and the purity was checked by TLC-FID. All extractions and fractions were stored in dichloromethane at -20 ° C until further analysis by GC and GC-MS.

Богатые ТАГ гексановые экстракты от каждого из трансгенных и контрольных семян содержали около 96% ТАГ. ХМ экстракты содержали остаточные количества ТАГ 44 и 13 мас.% ХМ экстрактов соответственно для трансгенных семян и семян дикого типа. В противоположность гексановым экстрактам, ХМ экстракты были богаты полярными липидами, а именно фосфолипидами и гликолипидами, содержание которых соответствовало 50 и 76 мас.% ХМ экстрактов соответственно для трансгенных и контрольных семян (табл. 14). Основным фосфолипидом был фосфатидилхолин (ФХ), который составлял 70-79% общих фосфолипидов, далее следовал фосфатидилэтаноламин (ФЭ, 7-13%), при относительно низких уровнях фосфатидиновой кислоты (ФК, 2-5%) и фосфатидилсерина (ФС, < 2%). Существуют процедурные преимущества при подаче ответа на окончательное заключение эксперта до 7 июля 2015 г.The TAG-rich hexane extracts from each of the transgenic and control seeds contained about 96% TAG. XM extracts contained residual amounts of TAG 44 and 13 wt% XM extracts for transgenic and wild-type seeds, respectively. In contrast to the hexane extracts, the XM extracts were rich in polar lipids, namely, phospholipids and glycolipids, the content of which corresponded to 50 and 76 wt% of the XM extracts for transgenic and control seeds, respectively (Table 14). The main phospholipid was phosphatidylcholine (PC), which accounted for 70-79% of total phospholipids, followed by phosphatidylethanolamine (PE, 7-13%), with relatively low levels of phosphatidinic acid (PC, 2-5%) and phosphatidylserine (PS, <2 %). There are procedural advantages in filing a response to the final expert opinion before 7 July 2015.

Состав жирных кислот.Fatty acid composition.

В общем для семян, вырабатывающих ДГК и/или ДПК, авторы изобретения наблюдали состав жирных кислот общих липидов в семенах, по данным прямого трансметилирования общих липидов в семени, сходный с составом липидов во фракции ТАГ. Это было результатом того, что более 90% общих липидов, присутствующих в семени, находились в форме ТАГ.In general, for seeds producing DHA and / or DPA, the inventors observed a fatty acid composition of total lipids in the seed, as measured by direct transmethylation of total lipids in the seed, similar to the lipid composition of the TAG fraction. This was a result of the fact that over 90% of the total lipids present in the seed were in the TAG form.

Состав жирных кислот различных классов липидов в гексановых и ХМ экстрактах определяли газовой хроматографией (ГХ) и методом ГХ-МС с применением прибора для ГХ Agilent Technologies 6890A (Пало-Альто, Калифорния, США), оборудованного капиллярной колонкой из плавленого кварца Supelco Equity™-1 (15 м χ 0,1 мм в.д., толщина пленки 0,1 мкм, Беллефонт, Пенсильвания, США), ПИД, инжектором с расщеплением/без расщепления, аутосемлером Agilent Technologies серии 7683В и инжектором. Газом-носителем был гелий. Образцы вводили инжекцией в режиме без расщепления при температуре печи 120°С. После инжекции температуру печи повышали до 270°С со скоростью 10°С/мин, и в конце до 300°С со скоростью 5°С/мин. Элюированные соединения определяли количественно с помощью программного обеспечения Agilent Technologies ChemStation (Пало-Альто, Калифорния, США). Результаты ГХ содержали ошибку не более чем ±5% площади пика индивидуальных соединений.The composition of fatty acids of various classes of lipids in hexane and XM extracts was determined by gas chromatography (GC) and GC-MS using an Agilent Technologies 6890A GC instrument (Palo Alto, California, USA) equipped with a Supelco Equity ™ fused silica capillary column - 1 (15 m χ 0.1 mm id, 0.1 μm film thickness, Bellefont, PA, USA), PID, split / no split injector, Agilent Technologies 7683B series autosampler and injector. The carrier gas was helium. The samples were injected in a non-splitting mode at an oven temperature of 120 ° C. After injection, the furnace temperature was increased to 270 ° C at a rate of 10 ° C / min, and finally to 300 ° C at a rate of 5 ° C / min. Eluted compounds were quantified using Agilent Technologies ChemStation software (Palo Alto, California, USA). GC results contained an error of no more than ± 5% of the peak area of the individual compounds.

Таблица 14Table 14

Состав класса липидов (% от общих липидов, полученный для каждой стадии экстракции) в гексановых и ХМ экстрактах трансгенного и контрольного семени Camelina sativa. ЭС, ЭВ и УВ не разделялиComposition of the lipid class (% of total lipids obtained for each stage of extraction) in hexane and XM extracts of transgenic and control Camelina sativa seed. ES, EV and HC did not separate

Класс липидов Lipid class Трансгенные семена Transgenic seeds Контрольные семена Control Seeds Гексановый Hexane хм hmm Гексановый Hexane ХМ XM ЭС/ЭВ/УВ* ES / EV / HC * 1,0 1.0 1,4 1.4 1,0 1.0 1,4 1.4 ТАГ TAG 95,6 95.6 44,2 44.2 96,0 96.0 13,1 13.1 СЖК SZhK 0,9 0.9 1,3 1,3 0,8 0.8 1,4 1.4 Н/о** But** 0,9 0.9 1,1 1.1 0,8 0.8 1,2 1,2 СТ ST 0,5 0.5 0,7 0.7 0,4 0,4 0,4 0,4 МАГ MAG 0,7 0.7 1,1 1.1 0,8 0.8 6,2 6.2 ФЛ FL 0,3 0.3 50,3 50.3 0,3 0.3 76,3 76.3 Всего Total 100,0 100.0 100,0 100.0 100,0 100.0 100,0 100.0

Сокращения: эфиры стеролов (ЭС), эфиры восков (ЭВ), углеводороды (УВ), триацилглицериды (ТАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), не определено (н/о), стеролы (СТ), моноацилглицериды (МАГ), полярные липиды (ПЛ), состоящие из гликолипидов и фосфолипидов; ЭС, ЭВ и УВ из этой сисAbbreviations: sterol esters (ES), wax esters (EV), hydrocarbons (HC), triacylglycerides (TAG), free fatty acids (FFA), not defined (n / a), sterols (ST), monoacylglycerides (MAG), polar lipids (PL), consisting of glycolipids and phospholipids; ES, EV and UV from this system

- 68 037184 темы элюировались вместе; может содержать жирные спирты и диацилглицериды (ДАГ).- 68,037184 threads eluted together; may contain fatty alcohols and diacylglycerides (DAG).

Анализы методом ГХ-масс-спектрометрии (ГХ-МС) выполняли на приборе ГХ-МС с квадрупольными линзами Finnigan Trace ultra (модель: ThermoQuest Trace DSQ, Thermo Electron Corporation). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения ThermoQuest Xcalibur (Остин, Техас, США). Прибор для ГХ был оборудован инжектором на колонке и капиллярной колонкой HP-5 Ultra Agilient J & W (50 м χ 0,32 мм в.д., толщина пленки 0,17 мкм, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) с полярностью, сходной с описанной выше. Индивидуальные компоненты были идентифицированы с применением данных масс-спектра и сравнением времени удерживания с полученным для аутентичных и лабораторных стандартов. Холостой анализ по полной методике проводили параллельно с серией об разцов.GC-MS analyzes were performed on a Finnigan Trace ultra quadrupole GC-MS instrument (model: ThermoQuest Trace DSQ, Thermo Electron Corporation). The data were processed using ThermoQuest Xcalibur software (Austin, Texas, USA). The GC instrument was equipped with an on-column injector and an HP-5 Ultra Agilient J&W capillary column (50 m χ 0.32 mm id, 0.17 μm film thickness, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) with polarity similar to that described above. Individual components were identified using mass spectrum data and comparing retention times with those obtained for authentic and laboratory standards. A blank analysis according to the complete method was carried out in parallel with a series of samples.

Данные состава жирных кислот в различных классах липидов в экстрактах приведены в табл. 15. В ДГК-вырабатывающем семени Camelina ДГК распределяются на основные липидные фракции (ТАГ, фосфолипиды и гликолипиды) в пропорции, варьирующей от 1,6 до 6,8%, С обратной корреляцией между долями ДГК и АЛК. Богатый ТАГ гексановый экстракт из трансгенного семени содержал 6,8% ДГК и 41% АЛК (табл. 15). Богатый полярными липидами ХМ экстракт содержал 4,2% ДГК и 50% АЛК, т.е. относительно меньшее количество ДГК и больше АЛК. Остаточные ТАГ из богатого полярными липидами ХМ экстракта содержали 6% ДГК и 40% АЛК. Гликолипидная фракция, выделенная из ХМ экстракта, содержала 3% ДГК и 39% АЛК, и фосфолипидная фракция содержала самый низкий уровень ДГК (1,6%) и самые высокие уровни АЛК (54%). Трансгенное семя Camelina содержало более высокие уровни АЛК и более низкие уровни ЛК (линолевая кислота, 18:2ω6), по сравнению с контрольными семенами, в основных классах липидов (ТАГ, гликолипиды и фосфолипиды). Доли АЛК и ЛК составляли: АЛК 39-54% и ЛК 4-9% для трансгенных семян и АЛК 12-32% и ЛК 20-29% для контрольных семян. Относительный уровень эруковой кислоты (22:1ω9) был ниже во всех фракциях из трансгенных семян, чем в контрольных семенах, например 1,3% против 2,7% в гексановых экстрактах (табл. 15).The data on the composition of fatty acids in different classes of lipids in the extracts are given in table. 15. In the DHA-producing seed of Camelina, DHA is distributed into the main lipid fractions (TAGs, phospholipids and glycolipids) in a proportion ranging from 1.6 to 6.8%, with an inverse correlation between the proportions of DHA and ALA. The TAG-rich hexane extract from the transgenic seed contained 6.8% DHA and 41% ALA (Table 15). The CM extract, rich in polar lipids, contained 4.2% DHA and 50% ALA, i.e. relatively less DHA and more ALA. Residual TAGs from the polar lipid-rich CM extract contained 6% DHA and 40% ALA. The glycolipid fraction isolated from the HM extract contained 3% DHA and 39% ALA, and the phospholipid fraction contained the lowest DHA level (1.6%) and the highest ALA levels (54%). Transgenic Camelina seed contained higher levels of ALA and lower levels of LA (linoleic acid, 18: 2ω6) compared to control seeds in the main lipid classes (TAGs, glycolipids, and phospholipids). The shares of ALA and LA were: ALA 39-54% and LA 4-9% for transgenic seeds and ALA 12-32% and LA 20-29% for control seeds. The relative level of erucic acid (22: 1ω9) was lower in all fractions from transgenic seeds than in control seeds, for example, 1.3% versus 2.7% in hexane extracts (Table 15).

Состав стеролов в семенах.The composition of the sterols in the seeds.

Для определения содержания и состава стеролов в экстрагированных липидах, образцы, содержащие около 10 мг общих липидов из богатого ТАГ гексанового экстракта и богатого полярными липидами ХМ экстракта омыляли с применением 4 мл 5% KOH в 80% МеОН и нагревали в течение 2 ч при 80°С в покрытой тефлоном стеклянной пробирке с навинчивающейся пробкой. После охлаждения реакционных смесей добавляли 2 мл воды Milli-Q, стеролы и спирты экстрагировали трижды по 2 мл гексана:дихлорметана (4:1, об./об.), встряхивая и перемешивая вихревым перемешиванием. Смеси центрифугировали, и каждый экстракт в органичной фазе промывали 2 мл воды Milli-Q, встряхивая и центрифугируя. После отбора верхнего, стерол-содержащего органического слоя, растворитель выпаривали при помощи потока газообразного азота, а стеролы и спирты силилировали с применением 200 мкл бис(триметилсилил)трифторацетамида (БСТФА, Sigma-Aldrich), нагревая в течение 2 ч при 80°С в закупоренном ГХ флаконе. Таким способом свободные гидроксильные группы превращали в их триметилсилиловые эфиры. Производные стерол- и спирт-OTMSi сушили в потоке газообразного азота на нагревательном блоке (40°С) и повторно растворяли в дихлорметане (ДХМ) непосредственно перед анализом ГХ/ГХ-МС, как изложено выше.To determine the content and composition of sterols in the extracted lipids, samples containing about 10 mg of total lipids from the TAG-rich hexane extract and the polar lipid-rich XM extract were saponified using 4 ml of 5% KOH in 80% MeOH and heated for 2 h at 80 ° C. C in a Teflon-lined glass vial with a screw cap. After cooling the reaction mixtures, 2 ml of Milli-Q water was added, sterols and alcohols were extracted three times with 2 ml of hexane: dichloromethane (4: 1, v / v), shaking and stirring by vortex stirring. The mixtures were centrifuged and each organic phase extract was washed with 2 ml of Milli-Q water, shaking and centrifugation. After the selection of the upper sterol-containing organic layer, the solvent was evaporated using a stream of nitrogen gas, and sterols and alcohols were silylated using 200 μL of bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA, Sigma-Aldrich), heating for 2 h at 80 ° С in a sealed GC vial. In this way, free hydroxyl groups were converted into their trimethylsilyl ethers. The sterol- and alcohol-OTMSi derivatives were dried under a stream of nitrogen gas on a heating block (40 ° C) and redissolved in dichloromethane (DCM) immediately prior to GC / GC-MS analysis as described above.

Таблица 15Table 15

Состав жирных кислот (% общих жирных кислот) липидных экстрактов и фракции из трансгенных и контрольных семян С. sativaFatty acid composition (% total fatty acids) of lipid extracts and fractions from transgenic and control seeds of C. sativa

Трансгенные семена Transgenic seeds Контрольные семена Control Seeds Жирная кислота Fatty acid Гексан Hexane ХМ XM Жмых Cake Гексан Hexane ХМ XM Жмых Cake ТАГ TAG Общие Are common ТАГ TAG ГЛ GL ФЛ FL Остаточн ые Residual ТАГ TAG Общие Are common ТАГ TAG ГЛ GL ФЛ FL Остаточн ые Residual 16:1ω7 16: 1ω7 0,1 0.1 0,2 0.2 0,1 0.1 0,2 0.2 0,1 0.1 0,2 0.2 о,1 oh, 1 0,2 0.2 0,2 0.2 - - - - 0,3 0.3 16:0 16: 0 6,2 6.2 12,8 12.8 6,8 6.8 21,3 21.3 19,4 19.4 10,4 10.4 6,7 6,7 12,8 12.8 7,8 7.8 29,6 29.6 13,7 13.7 10,3 10.3 18:4ω3 18: 4ω3 3,7 3.7 з,з h, h 3,4 3.4 2,1 2.1 2,9 2.9 3,6 3.6 - - - - - - 18:2ω6 18: 2ω6 7,1 7.1 3,9 3.9 8,8 8.8 7,2 7.2 3,7 3.7 8,8 8.8 22,2 22.2 28,4 28.4 29,4 29.4 20,8 20.8 29,3 29.3 27,9 27.9 18:3ω3 18: 3ω3 41,9 41.9 50,3 50.3 39,9 39.9 38,6 38.6 54,1 54.1 38,9 38.9 32,0 32.0 20,6 20.6 19,7 19.7 13,0 13.0 12,3 12.3 20,0 20.0 18:1ω9 18: 1ω9 11,1 11.1 4,7 4.7 9,6 9.6 7,2 7.2 2,8 2.8 8,1 8.1 14,0 14.0 25,4 25.4 13,3 13.3 14,7 14.7 35,7 35,7 14,3 14.3 18:1(07 18: 1 (07 1,4 1.4 2,3 2,3 2,1 2.1 3,7 3.7 3,4 3.4 2,8 2.8 1,0 1.0 1,5 1.5 2,2 2.2 4,0 4.0 2,8 2.8 2,2 2.2 18:0 18: 0 3,2 3.2 4,0 4.0 3,0 3.0 4,5 4.5 5,7 5.7 3,1 3.1 3,0 3.0 2,7 2.7 2,9 2.9 5,7 5.7 3,6 3.6 2,7 2.7 20:5(03 20: 5 (03 0,4 0,4 0,2 0.2 0,3 0.3 - - 0,3 0.3 - - - - - - 20:4(03 20: 4 (03 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,2 0.2 0,3 0.3 - - - - - - - - 20:2(06 20: 2 (06 0,7 0.7 0,7 0.7 0,8 0.8 0,6 0.6 0,4 0,4 0,7 0.7 1,8 1.8 0,8 0.8 2,1 2.1 1,2 1,2 - - 1,8 1.8 20:3(03 20: 3 (03 0,8 0.8 1,2 1,2 0,9 0.9 0,6 0.6 1,3 1,3 0,5 0.5 0,9 0.9 0,3 0.3 - - - - 0,4 0,4

20:1ω9/11 20: 1ω9 / 11 11,6 11.6 6,1 6.1 10,9 10.9 5,1 5.1 1,3 1,3 8,4 8.4 12,5 12.5 3,0 3.0 11,1 11.1 4,2 4.2 1,7 1.7 9,4 9.4 20:1ω7 20: 1ω7 0,6 0.6 0,8 0.8 1,4 1.4 0,6 0.6 0,2 0.2 1,1 1.1 0,6 0.6 0,6 0.6 2,0 2.0 1,3 1,3 - - 1,8 1.8

- 69 037184- 69 037184

20:0 20: 0 1,3 1,3 0,8 0.8 1,4 1.4 0,6 0.6 0,1 0.1 1,4 1.4 1,5 1.5 0,7 0.7 2,0 2.0 1,4 1.4 - - 1,8 1.8 22:6ω3 22: 6ω3 6,8 6.8 4,2 4.2 6,1 6.1 3,0 3.0 1,6 1.6 5,4 5.4 - - - - - - - - - - 22:5ω3 22: 5ω3 о,з oh h 1,1 1.1 0,4 0,4 0,6 0.6 1,4 1.4 0,3 0.3 - - - - - - - - - - - - 22:1ω9 22: 1ω9 1,3 1,3 1,0 1.0 1,8 1.8 0,6 0.6 0,1 0.1 1,5 1.5 2,7 2.7 0,7 0.7 3,6 3.6 0,9 0.9 - - 2,9 2.9 22:0 22: 0 о,3 oh, 3 0,2 0.2 о,з oh h 0,6 0.6 ο,ι ο, ι 0,7 0.7 0,3 0.3 0,2 0.2 0,7 0.7 0,8 0.8 0,8 0.8 24:1ω9 24: 1ω9 0,3 0.3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,6 0.6 0,3 0.3 0,6 0.6 0,3 0.3 0,6 0.6 0,7 0.7 0,9 0.9 0,5 0.5 ι,ο ι, ο 24:0 24: 0 0,1 0.1 0,4 0,4 0,2 0.2 0,9 0.9 0,4 0,4 1,1 1.1 Ο,ι Ο, ι 0,4 0,4 0,5 0.5 1,4 1.4 0,4 0,4 1,3 1,3 другие * others * 0,4 0,4 ι,ο ι, ο ι,ο ι, ο 1,4 1.4 0,5 0.5 1,8 1.8 0,3 0.3 1,1 1.1 0,9 0.9 0,1 0.1 1,1 1.1 Всего Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Сокращения: триацилглицериды (ТАГ), гликолипиды (ГЛ), фосфолипиды (ФЛ);Abbreviations: triacylglycerides (TAG), glycolipids (GL), phospholipids (PL);

общие: богатый полярными липидами экстракт, содержащий ГЛ и ПЛ из ХМ экстракта;general: an extract rich in polar lipids containing GL and PL from the HM extract;

ТАГ, ГЛ и ФЛ разделяли хроматографией на колонке с кремния диоксидом из ХМ экстрактов;TAG, GL, and PL were separated by chromatography on a silica column from XM extracts;

* суммарное содержание минорных жирных кислот.* total content of minor fatty acids.

Основными стеролами как в трансгенных, так и в контрольных семенах были 24-этилхолестерин (ситостерол, 43-54% от общих стеролов), 24-метилхолестерин (кампэстерол, 20-26%) с более низкими уровнями холестерина (5-8%), брассикастерол (2-7%), изофукостерол (Δ5-авенастерол, 4-6%), стигмастерол (0,5%-3%), холест-7-ен-3в-ол, (0,2-0,5%), 24-метилхолестанол (кампэстанол, 0,4-1%) и 24дегидрохолестерин (0,5-2%) (табл. 16). Эти девять стеролов отвечают за 86-95% общих стеролов, тогда как остальные компоненты, являющиеся стеролами, идентифицированы только частично по количеству атомов углерода и двойных связей. Общие профили стеролов были сходными для трансгенных и контрольных семян, как в случае гексановых, так и в случае ХМ экстрактов.The main sterols in both transgenic and control seeds were 24-ethylcholesterol (sitosterol, 43-54% of total sterols), 24-methylcholesterol (campesterol, 20-26%) with lower cholesterol levels (5-8%), brassicasterol (2-7%), isofucosterol (Δ5-avenasterol, 4-6%), stigmasterol (0.5% -3%), cholest-7-en-3v-ol, (0.2-0.5% ), 24-methylcholestanol (campestanol, 0.4-1%) and 24dehydrocholesterol (0.5-2%) (Table 16). These nine sterols are responsible for 86-95% of total sterols, while the rest of the sterol components are identified only partially by the number of carbon atoms and double bonds. The overall sterol profiles were similar for transgenic and control seeds for both hexane and XM extracts.

Анализ жирных спиртов.Analysis of fatty alcohols.

Жирные спирты из семян были дериватизированы и проанализированы на предмет стеролов. Серии жирных спиртов от С16-С22, с сопутствующими изо-разветвленными жирными спиртами были идентифицированы как в гексановых, так и ХМ экстрактах. Сходные профили наблюдались для трансгенных и контрольных семян, с некоторой вариацией в долях наблюдаемых индивидуальных компонентов. Фитол, образованный из хлорофилла, был основным алифатическим спиртом и отвечал за 47 и 37% общих жирных спиртов в гексановых фракциях из трансгенных и контрольных семян соответственно. Спирты с нечетной длиной цепи присутствовали с более высокими уровнями в ХМ экстракте (37-38% от общего содержания жирных спиртов), чем в гексановом экстракте (16-23%). Изо-17:0 (16-38%) преобладал над 17:0 (0,3-5,7%). Содержание других спиртов с нечетной длиной цепи составляло 19:0 (4,5-6,5%). Другие обнаруженные спирты включали изо-16:0, 16:0, изо-18:0, 18:1, 18:0, с незначительными уровнями изо20:0, 20:1, 20:0, а также присутствовали изо-22:0, 22:1 и 22:0.Fatty alcohols from seeds were derived and analyzed for sterols. Fatty alcohol series from C16-C22, with concomitant iso-branched fatty alcohols, have been identified in both hexane and XM extracts. Similar profiles were observed for transgenic and control seeds, with some variation in the proportion of observed individual components. Phytol, formed from chlorophyll, was the main aliphatic alcohol and was responsible for 47 and 37% of the total fatty alcohols in the hexane fractions from transgenic and control seeds, respectively. Odd chain alcohols were present at higher levels in the XM extract (37-38% of the total fatty alcohols) than in the hexane extract (16-23%). Iso-17: 0 (16-38%) prevailed over 17: 0 (0.3-5.7%). The content of other alcohols with an odd chain length was 19: 0 (4.5-6.5%). Other alcohols found included iso-16: 0, 16: 0, iso-18: 0, 18: 1, 18: 0, with minor levels of iso20: 0, 20: 1, 20: 0, and iso-22 were also present: 0, 22: 1 and 22: 0.

Обсуждение.Discussion.

Результаты показывают, что измельчение с помощью механизированной ступки и пестика с многократной экстракцией гексаном при комнатной температуре было эффективным с точки зрения извлечения большей части ТАГ-содержащего масла из трансгенных семян. В дополнение к маслу из трансгенных семян, содержащему умеренные уровни ДГК, трансгенные семени также содержали значительно более высокие уровни АЛК в основных классах липидов (триацилглицериды, гликолипиды и фосфолипиды) по сравнению с контрольными семенами. Это показало, что активность Δ15-десатуразы значительно повышалась в трансгенных семенах в ходе развития семени. Интересно, что существовали некоторые небольшие отличия в составе жирных кислот и долях ДГК в различных экстрактах и фракциях, причем уровни ДГК были выше в богатом ТАГ гексановом экстракте и ТАГ из ХМ экстракта (6-6,8%) и ниже во фракциях полярных липидов (3% в гликолипидах и 1,6% в фосфолипидах). Уровень 16:0 был выше во фракциях полярных липидов, гликолипидов и фосфолипидов в ХМ экстрактах (19-21%) по сравнению с богатым ТАГ гексановым экстрактом и ТАГ из ХМ экстракта (6-7%).The results show that milling with a mechanized mortar and pestle with repeated extraction with hexane at room temperature was effective in recovering most of the TAG-containing oil from transgenic seeds. In addition to transgenic seed oil containing moderate levels of DHA, transgenic seeds also contained significantly higher ALA levels in the major lipid classes (triacylglycerides, glycolipids, and phospholipids) compared to control seeds. This showed that the activity of Δ15-desaturase was significantly increased in transgenic seeds during seed development. Interestingly, there were some slight differences in the composition of fatty acids and the proportions of DHA in various extracts and fractions, with DHA levels being higher in the TAG-rich hexane extract and TAG from the HM extract (6-6.8%) and lower in the polar lipid fractions ( 3% in glycolipids and 1.6% in phospholipids). The 16: 0 level was higher in the polar lipid, glycolipid, and phospholipid fractions in the XM extracts (19-21%) compared to the TAG-rich hexane extract and the TAG from the XM extract (6-7%).

- 70 037184- 70 037184

Таблица 16Table 16

Состав стеролов (% от общих стеролов) в трансгенных и контрольных семенах CamelinaSterol composition (% of total sterols) in transgenic and control Camelina seeds

Трансгенные семена Transgenic seeds Контрольные семена Control Seeds Стеролы Sterols Гексан Hexane ХМ XM Гексан Hexane хм hmm 24-дегидрохолестерин 24-dehydrocholesterol 0,8 0.8 1,8 1.8 0,5 0.5 1,4 1.4 Холестерин Cholesterol 5,7 5.7 7,6 7.6 4,7 4.7 7,2 7.2 Брассикастерол Brassicasterol 4,4 4.4 6,5 6.5 1,9 1.9 4,2 4.2 Холест-7-ен-З β-ол Cholest-7-en-Z β-ol 0,2 0.2 0,5 0.5 0,3 0.3 0,4 0,4 Кампэстерол Campesterol 24,5 24.5 20,8 20.8 25,7 25.7 21,7 21,7 Кампэстанол Campestanol 0,4 0,4 1,1 1.1 0,4 0,4 0,9 0.9 Сигмастерол Sigmasterol 1,0 1.0 2,6 2.6 0,5 0.5 1,6 1.6 Ситостерол Sitosterol 54,3 54.3 43,7 43,7 53,8 53.8 42,9 42.9 Д5-авенастерол D5-avenasterol 4,2 4.2 5,2 5.2 4,7 4.7 5,5 5.5 Сумма Amount 95,5 95.5 89,6 89.6 92,6 92.6 85,9 85.9 Другие Others UNI С28 Idb UNI С28 Idb 0,6 0.6 1,2 1,2 0,7 0.7 1,2 , 1.2, UN2 С29 Idb UN2 C29 Idb 1,2 1,2 2,0 2.0 1,2 1,2 2,4 2.4 UN3 С29 2db UN3 C29 2db 0,9 0.9 1,8 1.8 1,3 1,3 2,4 2.4 UN4 С28 Idb UN4 C28 Idb 0,3 0.3 0,9 0.9 0,6 0.6 1,1 1.1 UN5C302db UN5C302db 1,2 1,2 1,8 1.8 1,4 1.4 1,8 1.8 UN6C29 ldb + C30 2db UN6C29 ldb + C30 2db 0,3 0.3 2,7 2.7 2,2 2.2 5,2 5.2 Сумма других The sum of others 4,5 4.5 10,4 10.4 7,4 7.4 14,1 14.1 Всего Total 100 100 100 100 100 100 100 100

Сокращения: Н/о означает неизвестный стерол;Abbreviations: N / A means unknown sterol;

число после С указывает на количество атомов углерода; db обозначает количество двойных связей.the number after C indicates the number of carbon atoms; db stands for the number of double bonds.

Состав стеролов в трансгенных семенах и контрольных семенах был сходным к найденному в рафинированном масле Camelina (Shukla et al., 2002), присутствовали те же основные стеролы, указывая на то, что добавленные гены не влияли на синтез стеролов в семенах. Уровень холестерина в масле Camelina был выше встречающегося в большинстве растительных масел. Присутствовал брассикастерол, который является характерным стеролом, найденным в семействе Brassicaceae, которое включает Camelina sativa.The sterol composition in transgenic seeds and control seeds was similar to that found in refined Camelina oil (Shukla et al., 2002), the same basic sterols were present, indicating that the added genes did not affect sterol synthesis in seeds. The cholesterol level in Camelina oil was higher than that found in most vegetable oils. Included was brassicasterol, which is a characteristic sterol found in the Brassicaceae family, which includes Camelina sativa.

Пример 8. Выработка ДЦ-ПНЖК в семенах Brassica juncea.Example 8. Production of DC-PUFA in seeds of Brassica juncea.

Трансгенные растения Brassica juncea получали с применением конструкции GA7-modB (пример 3) для выработки ДГК, как указано ниже. Семена В. juncea сорта, чувствительного к длительному световому дню, стерилизовали с применением газообразного хлора, как описано Kereszt et al. (2007). Стерилизованные семени проращивали средах МС с 1/2 активности (Murashige and Skoog, 1962), затвердевших с 0,8% агара, с коррекцией рН до 5,8, и выращивали при 24°С и флуоресцентном освещении (50 мкЕ/м²с) с фотопериодом 16/8 ч (свет/темнота) в течение 6-7 дней. Черешки котиледонов со стеблем 2-4 мм были выделены из этих саженцев в асептических условиях и использовались в качестве эксплантов. Agrobacterium tumefaciens штамм AGL1 трансформировали бинарной конструкцией GA7. Культура Agrobacterium была высеяна и обработана для инфицирования, как описано Belide et al. (2013). Для всех трансформаций около 50 свежевыделенных котиледонных черешков инфицировали 10 мл культуры А. tumefaciens в течение 6 мин. Инфицированные черешки промокали стерильной фильтровальной бумагой для удаления избытка A. tumefaciens и переносили в среды для совместного культивирования (МС, содержащие 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК и 100 мкМ ацетосирингона, также содержащие L-цистеин (50 мг/л), аскорбиновую кислоту (15 мг/л) и МЭС (250 мг/л)). Все планшеты опечатывали микропористой лентой и инкубировали в темноте при 24°С в течение 48 ч совместного культивирования. Далее экспланты переносили в предселекционную среду (агар МС, содержащий 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК, 3 мг/л AgNO₃, 250 мг/л цефотаксима и 50 мг/л тиментина) и культивировали в течение 4-5 дней при 24°С с фотопериодом 16/8 ч, после чего экспланты переносили в селекционную среду (агар МС, содержащий 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК, 3 мг/л AgNO₃, 250 мг/л цефотаксима, 50 мг/л тиментина и 5 мг/л ФФТ) и культивировали в течение 4 недель при 24°С с фотопериодом 16/8 ч. Экспланты с зеленым каллусом переносили в среду для регенерации побегов (агар МС, содержащий 2,0 мг/л БА, 3 мг/л AgNO₃, 250 мг/л цефотаксима, 50 мг/л тимен- 71 037184 тина и 5 мг/л ФФТ) и культивировали еще на протяжении 2 недель. Маленькие почки регенерирующих побегов переносили в среду МС без гормонов (агар МС, содержащий 3 мг/л AgNO₃, 250 мг/л цефотаксима, 50 мг/л тиментина и 5 мг/л ФФТ) и культивировали еще в течение 2-3 недель.Transgenic Brassica juncea plants were generated using the GA7-modB construct (Example 3) to generate DHA as described below. Seeds of B. juncea, cultivar sensitive to long daylight hours, were sterilized using chlorine gas as described by Kereszt et al. (2007). Sterilized seeds were germinated MS media with 1/2 activity (Murashige and Skoog, 1962) solidified with 0.8% agar, adjusted to pH 5.8, and grown at 24 ° C and the fluorescent light (50 MKE / m ² s ) with a photoperiod of 16/8 h (light / dark) for 6-7 days. Cotyledon stalks with a stem of 2-4 mm were isolated from these seedlings under aseptic conditions and used as explants. Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 was transformed with the binary construct GA7. The Agrobacterium culture was seeded and treated for infection as described by Belide et al. (2013). For all transformations, about 50 freshly isolated cotyledon petioles were infected with 10 ml of A. tumefaciens culture for 6 min. Infected petioles were blotted with sterile filter paper to remove excess A. tumefaciens and transferred to coculture media (MS containing 1.5 mg / L BA, 0.01 mg / L NCC, and 100 μM acetosyringone, also containing L-cysteine (50 mg / L), ascorbic acid (15 mg / L) and MES (250 mg / L)). All plates were sealed with microporous tape and incubated in the dark at 24 ° C for 48 hours of co-culture. Then the explants were transferred to a pre-breeding medium (MS agar containing 1.5 mg / L BA, 0.01 mg / L NCC, 3 mg / L AgNO ₃ , 250 mg / L cefotaxime, and 50 mg / L tymentin) and cultured for 4-5 days at 24 ° C with a photoperiod of 16/8 h, after which the explants were transferred to the selection medium (MS agar containing 1.5 mg / L BA, 0.01 mg / L NCC, 3 mg / L AgNO ₃ , 250 mg / L cefotaxime, 50 mg / L tymentin and 5 mg / L PPT) and cultured for 4 weeks at 24 ° C with a photoperiod of 16/8 h. Explants with green callus were transferred to a medium for shoot regeneration (MC agar containing 2.0 mg / l BA, 3 mg / l AgNO ₃ , 250 mg / l cefotaxime, 50 mg / l thimene-71 037184 tin and 5 mg / l PPT) and cultured for another 2 weeks. Small buds of regenerating shoots were transferred to MS medium without hormones (MS agar containing 3 mg / L AgNO ₃ , 250 mg / L cefotaxime, 50 mg / L tymentin, and 5 mg / L PPT) and cultured for another 2-3 weeks.

Потенциально трансгенные побеги размером по меньшей мере 1,5 см выделяли и переносили в среду для корнеобразования (агар МС, содержащий 0,5 мг/л НКК, 3 мг/л AgNO₃, 250 мг/л цефотаксима и 50 мг/л тиментина) и культивировали в течение 2-3 недель. Трансгенные побеги с большим количеством корней, подтвержденные ПЦР, переносили в грунт в теплице и выращивали с фотопериодом 16/8 ч (свет/темнота) при 22°С. Были получены три подтвержденных трансгенных растения. Трансформированные растения выращивали в теплице, позволяли им самоопылиться и собирали урожай семян Т1. Состав жирных кислот липида анализировали в пулах семян Т1 от каждого из трансформированных растений Т0, и обнаружили присутствие 2,8% ДПК и 7,2% ДГК в одной линии, обозначенной JT1-4, тогда как другая линия, обозначенная JT1-6, продемонстрировала 2,6% ДПК.Potentially transgenic shoots at least 1.5 cm in size were isolated and transferred to rooting medium (MS agar containing 0.5 mg / L NCC, 3 mg / L AgNO ₃ , 250 mg / L cefotaxime and 50 mg / L tymentin) and cultured for 2-3 weeks. Transgenic shoots with a large number of roots, confirmed by PCR, were transferred to soil in a greenhouse and grown with a photoperiod of 16/8 h (light / dark) at 22 ° C. Three confirmed transgenic plants were obtained. The transformed plants were grown in a greenhouse, allowed to self-pollinate, and harvested T1 seeds. The lipid fatty acid composition was analyzed in the T1 seed pools from each of the transformed T0 plants, and the presence of 2.8% DPA and 7.2% DHA was found in one line, designated JT1-4, while the other line, designated JT1-6, showed 2.6% WPC.

Масло семян из индивидуальных семян Т1 проанализировали на предмет состава жирных кислот; часть данных приведена в табл. 17. Несколько семян Т1 вырабатывали ДГК на уровне от 10% до около 21% от общего содержания жирных кислот, включая JT1-4-A-13, JT1-4-A-5 и JT1-4-B-13. Удивительно и неожиданно было обнаружено, что некоторые из семян Т1 содержали ДПК на уровнях от 10% до около 18% от общего содержания жирных кислот, при отсутствии обнаружимой ДГК (< 0,1%). Авторы изобретения сделали вывод о том, что ген Δ4-десатуразы в Т-ДНК, вставленной в этих растениях, инактивировался в результате спонтанной мутации, сходной с описанной в примере 2. Семена Т1 проращивали, и один появляющийся котиледон с каждого анализировали на предмет состава жирных кислот в оставшемся масле. Остальную часть каждого саженца сохраняли и выращивали до состояния зрелости, чтобы получить семя Т2.Seed oil from individual T1 seeds was analyzed for fatty acid composition; some of the data are given in table. 17. Several T1 seeds produced DHA at levels ranging from 10% to about 21% of total fatty acids, including JT1-4-A-13, JT1-4-A-5, and JT1-4-B-13. Surprisingly and unexpectedly, it was found that some of the T1 seeds contained DPA at levels from 10% to about 18% of the total fatty acids, with no detectable DHA (<0.1%). The inventors concluded that the Δ4 desaturase gene in the T-DNA inserted in these plants was inactivated by a spontaneous mutation similar to that described in Example 2. T1 seeds were germinated, and one emerging cotyledone from each was analyzed for the composition of fatty acids in the remaining oil. The rest of each seedling was stored and grown to maturity to produce a T2 seed.

Трансгенные растения, которые были гомозиготными по единичным инсерциям Т-ДНК, были идентифицированы и отобраны. Растения одной отобранной линии, обозначенной JT1-4-17, содержали единичную инсерцию Т-ДНК и вырабатывали ДГК и только низкие уровни ДПК, тогда как растения из второй отобранной линии, обозначенной JT1-4-34, также содержали единичную инсерцию Т-ДНК, но вырабатывали ДПК без выработки ДГК. Авторами изобретения был сделан вывод о том, что оригинальный трансформант содержал две отдельных Т-ДНК, одна из которых обеспечивала выработку ДГК, а другая обеспечивала выработку ДПК без ДГК. Растения В. juncea, вырабатывающие ДГК в семени, были скрещены с растениями, вырабатывающими ДПК в семени. Потомство F1 включало растения, которые были гетерозиготными по обеим инсерциям Т-ДНК. В семенах этих растений-потомков наблюдалась выработка около 20% ДГК и около 6% ДПК, с общим содержанием ДГК + ДПК 26%. Растения F1 самоопылялись, и ожидалось, что потомство, гомозиготное по обеим инсерциям Т-ДНК, будет вырабатывать до 35% ДГК и ДПК.Transgenic plants that were homozygous for single T-DNA insertions were identified and selected. Plants from one selected line, designated JT1-4-17, contained a single T-DNA insertion and produced DHA and only low levels of DPC, while plants from a second selected line, designated JT1-4-34, also contained a single T-DNA insertion. but produced DPA without producing DHA. The authors of the invention concluded that the original transformant contained two separate T-DNAs, one of which provided the production of DHA, and the other provided the production of DPA without DHA. B. juncea plants producing DHA in the seed were crossed with plants producing DPC in the seed. The F1 offspring included plants that were heterozygous for both T-DNA insertions. In the seeds of these offspring plants, the production of about 20% DHA and about 6% DPA was observed, with a total DHA + DPA content of 26%. F1 plants self-pollinated, and offspring homozygous for both T-DNA insertions were expected to produce up to 35% DHA and duodenum.

Около 18% ДПК наблюдалось в липиде пула семени потомства Т3, обозначенного JT1-4-34-11. Подобным образом, около 17,5% ДГК наблюдалось в липиде пула семени потомства Т3 JT1-4-17-20. Состав жирных кислот пула семени JT1-4 Т1, единичного семени Т1, пула семени Т2, единичного семени Т2 и пула семени Т3, единичного семени Т3 приведен в табл. 18-21. JT1-4 Т3 сегрегант JT-1-4-34-11 содержал в пуле семени Т3 18% ДПК, и единичное семя от данного конкретного сегреганта содержало около 26% ДПК, в каждом случае как процент от общего содержания жирных кислот.About 18% of the duodenum was observed in the lipid of the T3 progeny seed pool, designated JT1-4-34-11. Likewise, about 17.5% DHA was observed in the lipid of the seed pool of the T3 progeny JT1-4-17-20. The fatty acid composition of the JT1-4 T1 seed pool, T1 single seed, T2 seed pool, T2 single seed and T3 seed pool, T3 single seed is shown in Table 1. 18-21. JT1-4 T3 segregants JT-1-4-34-11 contained 18% DPA in the T3 seed pool, and a single seed from that particular segregante contained about 26% DPA, in each case as a percentage of total fatty acids.

Следующие параметры были вычислены для масла из семени, содержащего 17,9% ДНК: общие насыщенные жирные кислоты, 6,8%, общие мононенасыщенные жирные кислоты, 36,7%; общие полиненасыщенные жирные кислоты, 56,6%, общие ω6 жирные кислоты, 7,1%; новые ω6 жирные кислоты, 0,4% из которых составляла ГЛК; общие ω3 жирные кислоты, 46,5%; новые ω3 жирные кислоты, 24,0%; соотношение общих ω6:общих ω3 жирных кислот, 6,5; соотношение новых ω6:новых ω3 жирных кислот, 60; эффективность превращения олеиновой кислоты в ЛК под действием Δ12-десатуразы, 61%; эффективность превращения АЛК в СДК под действием Δ6-десатуразы, 51%; эффективность превращения СДК в кислоту ЭТК под действием Δ6-элонгазы, 90%; эффективность превращения ЭТК в ЭПК под действием Δ5-десатуразы, 87%; эффективность превращения ЭПК в ДПК под действием Δ5-элонгазы, 98%.The following parameters were calculated for seed oil containing 17.9% DNA: total saturated fatty acids, 6.8%, total monounsaturated fatty acids, 36.7%; total polyunsaturated fatty acids, 56.6%, total ω6 fatty acids, 7.1%; new ω6 fatty acids, 0.4% of which was GLA; total ω3 fatty acids, 46.5%; new ω3 fatty acids, 24.0%; the ratio of total ω6: total ω3 fatty acids, 6.5; the ratio of new ω6: new ω3 fatty acids, 60; efficiency of conversion of oleic acid to LA under the action of Δ12-desaturase, 61%; efficiency of conversion of ALA to SDA under the action of Δ6-desaturase, 51%; the efficiency of converting SDA into ETC acid under the action of Δ6-elongase, 90%; the efficiency of conversion of ETC to EPA under the action of Δ5-desaturase, 87%; the efficiency of conversion of EPA to DPC under the action of Δ5-elongase, 98%.

Для получения большего количества трансгенных растений В. juncea с конструкцией modB, трансформацию повторяли пять раз, и регенерировали 16 предполагаемых трансгенных побегов/саженцев. Провели анализ семени Т1, чтобы определить содержание ДПК и ДГК.To obtain more transgenic B. juncea plants with the modB construct, the transformation was repeated five times, and 16 putative transgenic shoots / seedlings were regenerated. T1 semen analysis was performed to determine the content of DPA and DHA.

С целью получения другого семени, содержащего ДПК и не содержащего ДГК, генетическая конструкция, которая представляла собой вариант Конструкции modB без гена Δ4-десатуразы, была получена следующим образом. Были синтезированы два фрагмента ДНК, фрагмент ЭПК-ДПК 1 и фрагмент ЭПКДРК 2 (Geneart, Германия) с подходящими рестрикционными сайтами. Промежуточный клонирующий вектор, pJP3660, был получен клонированием фрагмента AatII-MluI фрагмента ЭПК-ДПК 1 в сайты AscIAatII вектора, обозначенного 11ABHZHC_GA7-frag_d6D_pMS, причем данный вектор ранее применялся при конструировании GA7-modB, содержащего кассету Δ6-десатуразы. Далее получали pJP3661 клонированием фрагмента PmeI-PspOMI pJP3660 в сайты PmeI-PspOML modB. После этого собирали вектор ДПК, pJP3662 (фиг. 4), путем клонирования фрагмента BsWI-PspOMI фрагмента ЭПК-ДПК 2 в сайтыIn order to obtain another seed containing DPC and not containing DHA, the genetic construct, which was a variant of the ModB construct without the Δ4 desaturase gene, was obtained as follows. Two DNA fragments were synthesized, an EPA-DPK 1 fragment and an EPKDRK 2 fragment (Geneart, Germany) with suitable restriction sites. An intermediate cloning vector, pJP3660, was obtained by cloning the AatII-MluI fragment of the EPA-DPK 1 fragment into the AscIAatII sites of the vector designated 11ABHZHC_GA7-frag_d6D_pMS, which vector was previously used in the construction of GA7-modB containing the Δ6 desaturase cassette. Next, pJP3661 was obtained by cloning the PmeI-PspOMI pJP3660 fragment into the PmeI-PspOML modB sites. Thereafter, the DPK vector, pJP3662 (Fig. 4), was collected by cloning the BsWI-PspOMI fragment of the EPA-DPK 2 fragment into the sites

- 72 037184- 72 037184

BsiWI-PspOMI pJP3661. Данный вектор содержал гены биосинтеза жирных кислот, кодирующие ферменты, которые превращают олеиновую кислоту в DPAω3 и соответствующую ω6 жирную кислоту. Полученную в результате конструкцию применяли для трансформации В. juncea и В. napus. Получено семя потомства, содержащее до 35% ДПК в общем содержании жирных кислот в липиде семени.BsiWI-PspOMI pJP3661. This vector contained genes for fatty acid biosynthesis, encoding enzymes that convert oleic acid to DPAω3 and the corresponding ω6 fatty acid. The resulting construct was used to transform B. juncea and B. napus. The seed of the offspring was obtained, containing up to 35% of the WPC in the total content of fatty acids in the lipid of the seed.

При анализе методом ЯМР масла, экстрагированного из семян растения, вырабатывающего ДГК, по меньшей мере 95% наблюдаемой ДГК присутствовало в положении sn-1,3 молекул ТАГ.When analyzed by NMR of the oil extracted from the seeds of a plant producing DHA, at least 95% of the observed DHA was present at the sn-1,3 position of the TAG molecules.

Таблица 17Table 17

Состав жирных кислот в масле семян из семян T1 B.juncea, трансформированных Т-ДНК из GA7Composition of fatty acids in seed oil from B. juncea T1 seeds transformed with T-DNA from GA7

Семя Т1 № Seed T1 No. ф и f and § ф и § f and £ и £ and её и her and < «э <"Uh do и do and ф 8 do и f 8 do and 3 сё и 3 and < © сч < © сч 40 S гч ф и 40 S hh f and т 8 ф η и t 8 φ η and 3 ф и 3 f and а w> ф ГЧ и and w> f GH and 3 л и 3 l and 3 ф и 3 f and сё и that and ф гч и f gh and JT1-4-A-1 JT1-4-A-1 5,0 5.0 0,2 0.2 2,7 2.7 23,5 23.5 3,4 3.4 17,0 17.0 0,7 0.7 24,8 24.8 0,7 0.7 2,0 2.0 1,1 1.1 0,2 0.2 0,8 0.8 4,0 4.0 0,6 0.6 2,4 2.4 9,9 9.9 JT1-4-A-2 JT1-4-A-2 4,3 4.3 0,3 0.3 2,6 2.6 37,2 37.2 3,2 3.2 11,0 11.0 0,3 0.3 22,1 22.1 0,7 0.7 0,9 0.9 1,3 1,3 0,2 0.2 1,4 1.4 3,2 3.2 0,3 0.3 9,4 9.4 0,0 0.0 JT1-4-A-3 JT1-4-A-3 5,6 5.6 0,3 0.3 2,7 2.7 20,8 20.8 3,7 3.7 16,0 16.0 0,6 0.6 24,4 24.4 0,7 0.7 2,0 2.0 0,9 0.9 0,2 0.2 1,1 1.1 4,5 4.5 0,7 0.7 3,1 3.1 11,4 11.4 JT1-4-A-4 JT1-4-A-4 4,6 4.6 0,4 0,4 2,8 2.8 36,2 36.2 3,4 3.4 10,6 10.6 0,3 0.3 24,5 24.5 0,8 0.8 9,9 9.9 1,7 1.7 0,2 0.2 0,3 0.3 0,5 0.5 0,0 0.0 2,5 2.5 0,0 0.0 JT1-4-A-5 JT1-4-A-5 5,0 5.0 0,2 0.2 3,2 3.2 20,3 20.3 3,6 3.6 13,7 13.7 0,7 0.7 25,9 25.9 0,7 0.7 2,0 2.0 0,9 0.9 0,2 0.2 1,3 1,3 4,4 4.4 1,5 1.5 1,6 1.6 13,5 13.5 JT1-4-A-6 JT1-4-A-6 4,8 4.8 0,4 0,4 3,4 3.4 37,9 37.9 3,7 3.7 7,4 7.4 0,4 0,4 19,9 19.9 0,9 0.9 1,4 1.4 1,4 1.4 0,1 0.1 0,8 0.8 1,9 1.9 0,4 0,4 13,9 13.9 0,0 0.0 JT1-4-A-7 JT1-4-A-7 5,6 5.6 0,3 0.3 3,0 3.0 26,2 26.2 4,0 4.0 8,9 8.9 0,3 0.3 26,6 26.6 0,6 0.6 1,8 1.8 1,0 1.0 0,1 0.1 1,8 1.8 3,7 3.7 1,3 1,3 2,2 2.2 н,з n, s JT1-4-A-8 JT1-4-A-8 4,8 4.8 0,4 0,4 2,9 2.9 40,3 40.3 3,4 3.4 7,8 7.8 0,3 0.3 22,2 22.2 0,8 0.8 1,4 1.4 1,3 1,3 0,1 0.1 0,8 0.8 2,4 2.4 0,4 0,4 9,6 9.6 0,0 0.0 JT1-4-A-9 JT1-4-A-9 7,1 7.1 0,3 0.3 3,6 3.6 17,7 17.7 4,3 4.3 17,9 17.9 0,7 0.7 23,1 23.1 1,0 1.0 2,1 2.1 0,8 0.8 0,2 0.2 1,5 1.5 3,6 3.6 0,8 0.8 2,0 2.0 11,9 11.9 JT1-4-A-10 JT1-4-A-10 5,1 5.1 0,2 0.2 4,2 4.2 22,3 22.3 3,4 3.4 19,5 19.5 0,7 0.7 21,7 21,7 0,8 0.8 1,5 1.5 0,9 0.9 0,2 0.2 1,7 1.7 7,8 7.8 0,9 0.9 1,0 1.0 6,5 6.5 JT1-4-A-11 JT1-4-A-11 5,0 5.0 0,5 0.5 2,8 2.8 37,6 37.6 4,0 4.0 7,1 7.1 0,4 0,4 19,2 19.2 0,7 0.7 1,9 1.9 1,4 1.4 0,2 0.2 0,5 0.5 1,6 1.6 0,3 0.3 15,5 15.5 0,0 0.0 JT1-4-A-12 JT1-4-A-12 5,2 5.2 0,3 0.3 3,0 3.0 28,2 28.2 4,0 4.0 9,2 9.2 0,3 0.3 27,4 27.4 0,6 0.6 1,9 1.9 0,9 0.9 0,1 0.1 1,5 1.5 3,2 3.2 1,1 1.1 1,8 1.8 10,2 10.2 JT1-4-A-13 JT1-4-A-13 5,4 5.4 0,2 0.2 3,0 3.0 16,7 16.7 4,1 4.1 9,9 9.9 0,6 0.6 29,9 29.9 0,7 0.7 2,2 2.2 1,0 1.0 0,2 0.2 1,7 1.7 2,0 2.0 1,1 1.1 2,0 2.0 17,9 17.9 JT1-4-A-14 JT1-4-A-14 5,1 5.1 0,4 0,4 3,1 3.1 30,0 30.0 4,0 4.0 11,5 11.5 0,3 0.3 27,7 27,7 0,7 0.7 2,2 2.2 1,0 1.0 0,1 0.1 0,6 0.6 2,4 2.4 0,8 0.8 1,3 1,3 7,8 7.8 JT1-4-A-15 JT1-4-A-15 5,1 5.1 0,4 0,4 2,5 2.5 34,2 34.2 3,6 3.6 6,9 6.9 0,6 0.6 20,4 20.4 0,7 0.7 1,6 1.6 1,1 1.1 0,2 0.2 0,6 0.6 4,7 4.7 0,9 0.9 15,2 15.2 0,0 0.0 JT1^-B-1 JT1 ^ -B-1 5,5 5.5 0,2 0.2 2,7 2.7 18,9 18.9 4,0 4.0 17,6 17.6 0,8 0.8 24,1 24.1 0,8 0.8 2,2 2.2 1,0 1.0 0,2 0.2 1,2 1,2 4,6 4.6 0,9 0.9 2,2 2.2 11,5 11.5 JT1-4-B-2 JT1-4-B-2 5,5 5.5 0,2 0.2 2,7 2.7 20,2 20.2 4,0 4.0 14,3 14.3 0,5 0.5 25,5 25.5 0,7 0.7 1,7 1.7 0,9 0.9 0,2 0.2 1,6 1.6 8,7 8.7 1,3 1,3 2,2 2.2 8,5 8.5 JT1-4-B-3 JT1-4-B-3 5,3 5.3 0,3 0.3 3,6 3.6 34,1 34.1 3,5 3.5 35,0 35.0 0,6 0.6 9,3 9.3 0,8 0.8 0,2 0.2 1,4 1.4 0,4 0,4 0,6 0.6 0,9 0.9 0,1 0.1 0,3 0.3 2,1 2.1 JT1-4-B-4 JT1-4-B-4 5,3 5.3 0,3 0.3 3,1 3.1 25,2 25.2 3,6 3.6 17,0 17.0 0,7 0.7 24,1 24.1 0,7 0.7 1,9 1.9 1,0 1.0 0,2 0.2 0,8 0.8 4,3 4.3 0,5 0.5 2,3 2,3 7,8 7.8 JTI-4-B-5 JTI-4-B-5 5,5 5.5 0,5 0.5 2,2 2.2 30,1 30.1 4,6 4.6 10,2 10.2 0,5 0.5 21,7 21,7 0,6 0.6 1,4 1.4 1,1 1.1 0,2 0.2 0,9 0.9 2,4 2.4 0,5 0.5 16,1 16.1 0,0 0.0 JT1-4-B-8 JT1-4-B-8 6,2 6.2 0,5 0.5 1,9 1.9 33,1 33.1 4,0 4.0 30,0 30.0 0,5 0.5 12,7 12.7 0,6 0.6 0,3 0.3 1,3 1,3 0,4 0,4 1,4 1.4 0,9 0.9 0,1 0.1 4,4 4.4 0,0 0.0 JT1-4-B-13 JT1-4-B-13 5,6 5.6 0,3 0.3 2,8 2.8 20,9 20.9 3,9 3.9 11,9 11.9 0,4 0,4 27,0 27.0 0,7 0.7 2,0 2.0 1,0 1.0 0,2 0.2 1,7 1.7 2,3 2,3 0,7 0.7 4,1 4.1 13,5 13.5

Образцы масла из семян дополнительно содержали 0,1% С14:0; 0,1-0,2% С16:3; 0,0-0,1% каждой из С20:1Δ13, С20:3ω6 и С20:4ω6; 0,3-0,4% С22:0; не содержали С22:1 и С22:2ω6; содержали 0,2% С24:0 и 0,2-0,4% С24:1.The seed oil samples additionally contained 0.1% C14: 0; 0.1-0.2% C16: 3; 0.0-0.1% of each of C20: 1Δ13, C20: 3ω6 and C20: 4ω6; 0.3-0.4% C22: 0; did not contain C22: 1 and C22: 2ω6; contained 0.2% C24: 0 and 0.2-0.4% C24: 1.

Таблица 18Table 18

Состав жирных кислот липида из семян Т1 (пул) B.juncea, трансформированных Т-ДНК из GA7-modB. Липиды дополнительно содержали около 0,1% каждой из 14:0, 16:3, 20:1d13 и 16:2, а 22:1 не была обнаруженаLipid fatty acid composition from T1 seeds (pool) B. juncea transformed with T-DNA from GA7-modB. Lipids additionally contained about 0.1% of each of 14: 0, 16: 3, 20: 1d13 and 16: 2, and 22: 1 was not detected

СемяSeed

JT1-2JT1-2

JT1-3JT1-3

JT1-4JT1-4

JT1-5JT1-5

JT1-6 © - ®б!JT1-6 © - ®b!

ф ф di еёсёf f di eesho

G U U 2 QG U U 2 Q

UU

4,2 0,3 2,5 42,4 3,227,74.2 0.3 2.5 42.4 3.2 27.7

4,5 0,3 2,7 44,6 3,126,84.5 0.3 2.7 44.6 3.126.8

5,1 0,3 3,2 26,8 3,517,45.1 0.3 3.2 26.8 3.5 17.4

4,7 0,4 2,4 41,6 3,428,44.7 0.4 2.4 41.6 3.4 28.4

4,8 0,4 2,3 37,3 3,330,24.8 0.4 2.3 37.3 3.3 30.2

0,1 16,4 0,6 0,0 1,20,10.1 16.4 0.6 0.0 1.20.1

0,1 14,8 0,7 0,0 1,20,10.1 14.8 0.7 0.0 1.20.1

0,5 22,8 0,7 2,5 1,10,20.5 22.8 0.7 2.5 1.10.2

0,1 15,8 0,7 0,0 1,20,10.1 15.8 0.7 0.0 1.20.1

0,4 13,2 0,7 0,2 1,40,30.4 13.2 0.7 0.2 1.40.3

0,0 0,0 0,0 0,3 0,00,00.0 0.0 0.0 0.3 0.00.0

0,0 0,0 0,0 0,3 0,00,00.0 0.0 0.0 0.3 0.00.0

0,0 0,0 1,2 0,3 2,90,70.0 0.0 1.2 0.3 2.90.7

0,0 0,0 0,0 0,3 0,00,00.0 0.0 0.0 0.3 0.00.0

0,0 0,0 0,7 0,3 0,60,1 ? о -? ?0.0 0.0 0.7 0.3 0.60.1? about -? ?

М «Л V}Ф ri ri сч учri гч гч О и гчсч и и ииM «L V} F ri ri count uchri hh hh O and ghsch i and ai

0,0 0,0 0,2 0,4 0,00,00.0 0.0 0.2 0.4 0.00.0

0,0 0,0 0,2 0,4 0,00,00.0 0.0 0.2 0.4 0.00.0

0,0 0,1 0,2 0,3 2,87,20.0 0.1 0.2 0.3 2.87.2

0,0 0,0 0,2 0,4 0,00,00.0 0.0 0.2 0.4 0.00.0

0,0 0,3 0,2 0,5 2,60,00.0 0.3 0.2 0.5 2.60.0

Таблица 19Table 19

Состав жирных кислот масла семян Т1(единичных) B.juncea, трансформированных Т-ДНК из GA7-modBComposition of fatty acids in T1 seed oil (single) B. juncea transformed with T-DNA from GA7-modB

о about $ $ ф f ГЧ MS «ч "H 3 3 3 3 ф f а but < < ф 8 f 8 3 3 3 3 я I 3 3 3 3 ф f сё that ОО OO < < ф f < < Ф F Семя Т1 № Seed T1 No. и and чи chi и and и and гч rh и and о about и and и and и and и and JT1-4-A-1 JT1-4-A-1 5,0 5.0 0,2 0.2 2,7 2.7 23,5 23.5 3,4 3.4 17,0 17.0 0,7 0.7 24,8 24.8 0,7 0.7 2,0 2.0 1,1 1.1 0,2 0.2 0,8 0.8 4,0 4.0 0,6 0.6 2,4 2.4 9,9 9.9 JT1-4-A-2 JT1-4-A-2 4,3 4.3 0,3 0.3 2,6 2.6 37,2 37.2 3,2 3.2 11,0 11.0 0,3 0.3 22,1 22.1 0,7 0.7 0,9 0.9 1,3 1,3 0,2 0.2 1,4 1.4 3,2 3.2 о,з oh h 9,4 9.4 0,0 0.0 JT1-4-A-3 JT1-4-A-3 5,6 5.6 0,3 0.3 2,7 2.7 20,8 20.8 3,7 3.7 16,0 16.0 0,6 0.6 24,4 24.4 0,7 0.7 2,0 2.0 0,9 0.9 0,2 0.2 1,1 1.1 4,5 4.5 0,7 0.7 3,1 3.1 11,4 11.4 JT1-4-A-4 JT1-4-A-4 4,6 4.6 0,4 0,4 2,8 2.8 36,2 36.2 3,4 3.4 10,6 10.6 0,3 0.3 24,5 24.5 0,8 0.8 9,9 9.9 1,7 1.7 0,2 0.2 0,3 0.3 0,5 0.5 0,0 0.0 2,5 2.5 0,0 0.0 JT1-4-A-5 JT1-4-A-5 5,0 5.0 0,2 0.2 3,2 3.2 20,3 20.3 3,6 3.6 13,7 13.7 0,7 0.7 25,9 25.9 0,7 0.7 2,0 2.0 0,9 0.9 0,2 0.2 1,3 1,3 4,4 4.4 1,5 1.5 1,6 1.6 13,5 13.5 JT1-4-A-6 JT1-4-A-6 4,8 4.8 0,4 0,4 3,4 3.4 37,9 37.9 3,7 3.7 7,4 7.4 0,4 0,4 19,9 19.9 0,9 0.9 1,4 1.4 1,4 1.4 0,1 0.1 0,8 0.8 1,9 1.9 0,4 0,4 13,9 13.9 0,0 0.0 JT1-4-А-7 JT1-4-A-7 5,6 5.6 о,з oh h 3,0 3.0 26,2 26.2 4,0 4.0 8,9 8.9 0,3 0.3 26,6 26.6 0,6 0.6 1,8 1.8 1,0 1.0 0,1 0.1 1,8 1.8 3,7 3.7 1,3 1,3 2,2 2.2 11,3 11.3 JT1-4-A-8 JT1-4-A-8 4,8 4.8 0,4 0,4 2,9 2.9 40,3 40.3 3,4 3.4 7,8 7.8 0.3 0.3 22,2 22.2 0,8 0.8 1,4 1.4 1,3 1,3 0,1 0.1 0,8 0.8 2,4 2.4 0,4 0,4 9,6 9.6 0,0 0.0

- 73 037184- 73 037184

JT1-4-A-9 JT1-4-A-9 7,1 7.1 0,3 0.3 3,6 3.6 17,7 17.7 4,3 4.3 17,9 17.9 0,7 0.7 23,1 23.1 1,0 1.0 2,1 2.1 0,8 0.8 0,2 0.2 1,5 1.5 3,6 3.6 0,8 0.8 2,0 2.0 11,9 11.9 JT1-4-A-10 JT1-4-A-10 5,1 5.1 0,2 0.2 4,2 4.2 22,3 22.3 3,4 3.4 19,5 19.5 0,7 0.7 21,7 21,7 0,8 0.8 1,5 1.5 0,9 0.9 0,2 0.2 1,7 1.7 7,8 7.8 0,9 0.9 1,0 1.0 6,5 6.5 JT1-4-А-11 JT1-4-A-11 5,0 5.0 0,5 0.5 2,8 2.8 37,6 37.6 4,0 4.0 7,1 7.1 0,4 0,4 19,2 19.2 0,7 0.7 1,9 1.9 1,4 1.4 0,2 0.2 0,5 0.5 1,6 1.6 0,3 0.3 15,5 15.5 0,0 0.0 JT1-4-A-12 JT1-4-A-12 5,2 5.2 0,3 0.3 3,0 3.0 28,2 28.2 4,0 4.0 9,2 9.2 0,3 0.3 27,4 27.4 0,6 0.6 1,9 1.9 0,9 0.9 0,1 0.1 1,5 1.5 3,2 3.2 1,1 1.1 1,8 1.8 10,2 10.2 JT1-4-A-13 JT1-4-A-13 5,4 5.4 0,2 0.2 3,0 3.0 16,7 16.7 4,1 4.1 9,9 9.9 0,6 0.6 29,9 29.9 0,7 0.7 2,2 2.2 1,0 1.0 0,2 0.2 1,7 1.7 2,0 2.0 1,1 1.1 2,0 2.0 17,9 17.9 JTM-A-14 JTM-A-14 5,1 5.1 0,4 0,4 3,1 3.1 30,0 30.0 4,0 4.0 11,5 11.5 0,3 0.3 27,7 27,7 0,7 0.7 2,2 2.2 1,0 1.0 0,1 0.1 0,6 0.6 2,4 2.4 0,8 0.8 1,3 1,3 7,8 7.8 JT1-4-A-15 JT1-4-A-15 5,1 5.1 0,4 0,4 2,5 2.5 34,2 34.2 3,6 3.6 6,9 6.9 0,6 0.6 20,4 20.4 0,7 0.7 1,6 1.6 1,1 1.1 0,2 0.2 0,6 0.6 4,7 4.7 0,9 0.9 15,2 15.2 0,0 0.0 JT1-4-B-1 JT1-4-B-1 5,5 5.5 0,2 0.2 2,7 2.7 18,9 18.9 4,0 4.0 17,6 17.6 0,8 0.8 24,1 24.1 0,8 0.8 2,2 2.2 1,0 1.0 0,2 0.2 1,2 1,2 4,6 4.6 0,9 0.9 2,2 2.2 11,5 11.5 JT1-4-B-2 JT1-4-B-2 5,5 5.5 0,2 0.2 2,7 2.7 20,2 20.2 4,0 4.0 14,3 14.3 0,5 0.5 25,5 25.5 0,7 0.7 1,7 1.7 0,9 0.9 0,2 0.2 1,6 1.6 8,7 8.7 1,3 1,3 2,2 2.2 8,5 8.5 JT1-4-B-3 JT1-4-B-3 5,3 5.3 о,3 oh, 3 3,6 3.6 34,1 34.1 3,5 3.5 35,0 35.0 0,6 0.6 9,3 9.3 0,8 0.8 0,2 0.2 1,4 1.4 0,4 0,4 0,6 0.6 0,9 0.9 0,1 0.1 0,3 0.3 2,1 2.1 JT1-4-B-4 JT1-4-B-4 5,3 5.3 0,3 0.3 3,1 3.1 25,2 25.2 3,6 3.6 17,0 17.0 0,7 0.7 24,1 24.1 0,7 0.7 1,9 1.9 1,0 1.0 0,2 0.2 0,8 0.8 4,3 4.3 0,5 0.5 2,3 2,3 7,8 7.8 JT1-4-B-5 JT1-4-B-5 5,5 5.5 0,5 0.5 2,2 2.2 30,1 30.1 4,6 4.6 10,2 10.2 0,5 0.5 21,7 21,7 0,6 0.6 1,4 1.4 1,1 1.1 0,2 0.2 0,9 0.9 2,4 2.4 0,5 0.5 16,1 16.1 0,0 0.0 JT1-4-B-6 JT1-4-B-6 5,6 5.6 0,3 0.3 2,5 2.5 19,5 19.5 3,8 3.8 15,2 15.2 0,5 0.5 27,7 27,7 0,6 0.6 2,1 2.1 0,9 0.9 0,2 0.2 1,1 1.1 3,7 3.7 0,6 0.6 3,3 3.3 11,1 11.1 JT1-4-B-7 JT1-4-B-7 5,9 5.9 0,5 0.5 2,0 2.0 29,9 29.9 4,0 4.0 11,2 11.2 0,3 0.3 26,2 26.2 0,6 0.6 11,5 11.5 1,4 1.4 0,2 0.2 0,3 0.3 0,4 0,4 0,0 0.0 4,1 4.1 0,1 0.1 JT1-4-B-8 JT1-4-B-8 6,2 6.2 0,5 0.5 1,9 1.9 33,1 33.1 4,0 4.0 30,0 30.0 0,5 0.5 12,7 12.7 0,6 0.6 о,з oh h 1,3 1,3 0,4 0,4 1,4 1.4 0,9 0.9 0,1 0.1 4,4 4.4 0,0 0.0 JT1-4-B-9 JT1-4-B-9 4,9 4.9 0,2 0.2 3,4 3.4 24,6 24.6 3,0 3.0 18,5 18.5 0,3 0.3 26,2 26.2 0,8 0.8 1,3 1,3 1,1 1.1 0,2 0.2 2,0 2.0 5,5 5.5 0,6 0.6 0,8 0.8 5,2 5.2 JTM-B-10 JTM-B-10 5,2 5.2 0,3 0.3 2,7 2.7 19,0 19.0 4,0 4.0 12,0 12.0 0,6 0.6 30,5 30.5 0,7 0.7 1,6 1.6 1,0 1.0 0,2 0.2 1,7 1.7 4,9 4.9 1,1 1.1 3,0 3.0 10,2 10.2 JT1-4-B-11 JT1-4-B-11 4,8 4.8 0,2 0.2 3,0 3.0 23,7 23,7 3,1 3.1 18,1 18.1 0,6 0.6 23,5 23.5 0,7 0.7 1,6 1.6 1,2 1,2 0,2 0.2 1,5 1.5 4,5 4.5 0,8 0.8 1,6 1.6 9,6 9.6 JT1-4-B-12 JT1-4-B-12 5,0 5.0 0,2 0.2 2,6 2.6 19,6 19.6 3,4 3.4 12,5 12.5 0,6 0.6 26,9 26.9 0,8 0.8 3,1 3.1 1,1 1.1 0,2 0.2 0,9 0.9 5,6 5.6 0,9 0.9 3,5 3.5 11,7 11.7 ГГ1^-В-13 GG1 ^ -V-13 5,6 5.6 0,3 0.3 2,8 2.8 20,9 20.9 3,9 3.9 11,9 11.9 0,4 0,4 27,0 27.0 0,7 0.7 2,0 2.0 1,0 1.0 0,2 0.2 1,7 1.7 2,3 2,3 0,7 0.7 4,1 4.1 13,5 13.5 JT1-4-B-14 JT1-4-B-14 5,1 5.1 0,3 0.3 3,1 3.1 25,5 25.5 3,3 3.3 16,7 16.7 0,7 0.7 23,9 23.9 0,8 0.8 1,8 1.8 1,2 1,2 0,2 0.2 0,9 0.9 2,6 2.6 0,4 0,4 2,9 2.9 9,2 9.2 JT1-4-B-15 JT1-4-B-15 5,6 5.6 0,3 0.3 2,7 2.7 19,5 19.5 4,1 4.1 14,0 14.0 0,8 0.8 24,6 24.6 0,7 0.7 2,7 2.7 0,9 0.9 0,2 0.2 0,7 0.7 9,4 9.4 1,3 1,3 2,5 2.5 8,5 8.5

Образцы масла семян дополнительно содержали 0,1% С14:0; 0,1-0,2% С16:3; по 0,0-0,1% каждой из С20:1Δ13, С20:3ω6 и С20:4ω6; 0,3-0,4% С22:0; не содержали С22:1 и С22:2ω6; содержали 0,2% С24:0 и 0,2-0,4% С24:1.The seed oil samples additionally contained 0.1% C14: 0; 0.1-0.2% C16: 3; 0.0-0.1% each of C20: 1Δ13, C20: 3ω6 and C20: 4ω6; 0.3-0.4% C22: 0; did not contain C22: 1 and C22: 2ω6; contained 0.2% C24: 0 and 0.2-0.4% C24: 1.

Таблица 20Table 20

Состав жирных кислот масла из единичных семян Т2 Bjuncea, трансформированной Т-ДНК из GA7 modB. Липиды дополнительно содержали 0,1-0,2% С16:1Δ9, С16:3 и С20:2ω6, 0,5-0,6% С20:0, не содержали С20:3ω6, С20:4ω6 и С22:2ω6Fatty acid composition of oil from single seeds of T2 Bjuncea transformed with T-DNA from GA7 modB. Lipids additionally contained 0.1-0.2% C16: 1Δ9, C16: 3 and C20: 2ω6, 0.5-0.6% C20: 0, did not contain C20: 3ω6, C20: 4ω6 and C22: 2ω6

Семя №Seed No.

4,4 1,7 36,3 2,9 5,6 1,9 39,1 3,14.4 1.7 36.3 2.9 5.6 1.9 39.1 3.1

5,5 1,8 42,3 3,2 5,6 1,5 36,8 3,7 4,6 1,7 36,3 2,7 4,9 1,8 38,3 3,1 4,7 1,7 36,2 3,0 4,8 2,2 41,0 3,0 5,8 1,7 36,6 3,7 4,8 2,1 47,1 2,9 5,1 1,7 37,4 3,3 4,7 1,8 37,3 2,7 4,9 2,0 37,9 3,0 4,7 1,6 35,7 3,2 4,7 1,8 37,6 3,4 5,3 1,6 35,3 3,55.5 1.8 42.3 3.2 5.6 1.5 36.8 3.7 4.6 1.7 36.3 2.7 4.9 1.8 38.3 3.1 4, 7 1.7 36.2 3.0 4.8 2.2 41.0 3.0 5.8 1.7 36.6 3.7 4.8 2.1 47.1 2.9 5.1 1 , 7 37.4 3.3 4.7 1.8 37.3 2.7 4.9 2.0 37.9 3.0 4.7 1.6 35.7 3.2 4.7 1.8 37.6 3.4 5.3 1.6 35.3 3.5

4,9 1,7 39,4 3,3 5,0 1,8 38,5 3,1 5,1 1,8 39,5 2,9 4,8 1,8 38,2 3,2 5,0 2,0 39,7 2,9 4,7 1,6 36,0 3,34.9 1.7 39.4 3.3 5.0 1.8 38.5 3.1 5.1 1.8 39.5 2.9 4.8 1.8 38.2 3.2 5, 0 2.0 39.7 2.9 4.7 1.6 36.0 3.3

6,2 2,1 32,0 4,46.2 2.1 32.0 4.4

33

7: 77: 7

00 « ОС и и С и00 "OS and and C and

8,3 0,5 22,0 1,4 8,4 0,4 18,9 1,28.3 0.5 22.0 1.4 8.4 0.4 18.9 1.2

9,9 0,3 24,0 5,9 9,4 0,3 19,6 0,6 7,2 0,3 22,6 1,0 7,4 0,3 20,2 0,8 8,2 0,4 20,9 0,7 9,8 0,2 27,0 4,2 9,1 0,3 21,3 0,99.9 0.3 24.0 5.9 9.4 0.3 19.6 0.6 7.2 0.3 22.6 1.0 7.4 0.3 20.2 0.8 8, 2 0.4 20.9 0.7 9.8 0.2 27.0 4.2 9.1 0.3 21.3 0.9

7,4 0,2 23,9 4,8 7,7 0,3 20,7 0,97.4 0.2 23.9 4.8 7.7 0.3 20.7 0.9

7,9 0,4 20,6 1,1 7,1 0,4 20,1 1,17.9 0.4 20.6 1.1 7.1 0.4 20.1 1.1

6,9 0,3 22,4 0,7 7,8 0,3 23,7 0,66.9 0.3 22.4 0.7 7.8 0.3 23.7 0.6

8,1 0,5 21,1 0,8 7,7 0,3 21,1 0,78.1 0.5 21.1 0.8 7.7 0.3 21.1 0.7

7,8 0,4 20,5 0,8 9,0 0,2 22,2 0,67.8 0.4 20.5 0.8 9.0 0.2 22.2 0.6

7,8 0,4 21,1 0,7 7,9 0,4 20,2 0,77.8 0.4 21.1 0.7 7.9 0.4 20.2 0.7

8,3 0,3 23,7 0,68.3 0.3 23.7 0.6

7,2 0,6 19,4 1,27.2 0.6 19.4 1.2

1,2 0,4 0,3 4,21.2 0.4 0.3 4.2

1,3 0,5 0,3 2,51.3 0.5 0.3 2.5

1,5 0,2 0,4 0,51.5 0.2 0.4 0.5

1,4 1,4 0,3 1,91.4 1.4 0.3 1.9

1,5 0,7 0,3 2,11.5 0.7 0.3 2.1

1,3 0,8 0,3 2,71.3 0.8 0.3 2.7

1,3 0,9 0,3 2,91.3 0.9 0.3 2.9

1,8 0,3 0,3 0,51.8 0.3 0.3 0.5

1,4 0,8 0,3 1,51.4 0.8 0.3 1.5

1,7 0,2 0,3 0,51.7 0.2 0.3 0.5

1,4 0,8 0,3 2,51.4 0.8 0.3 2.5

1,3 0,5 0,3 4,31.3 0.5 0.3 4.3

1,3 0,6 0,3 4,11.3 0.6 0.3 4.1

1,4 1,3 0,3 3,01.4 1.3 0.3 3.0

1,5 1,2 0,2 1,71.5 1.2 0.2 1.7

1,2 0,7 0,3 3,11.2 0.7 0.3 3.1

1,4 0,8 0,3 2,01.4 0.8 0.3 2.0

1,3 0,8 0,2 2,31.3 0.8 0.2 2.3

1,5 1,0 0,3 1,71.5 1.0 0.3 1.7

1,4 0,7 0,3 2,11.4 0.7 0.3 2.1

1,3 0,7 0,3 2,31.3 0.7 0.3 2.3

1,5 1,2 0,3 1,71.5 1.2 0.3 1.7

1,2 0,6 0,4 2,21.2 0.6 0.4 2.2

0,6 0,1 0,1 0,0 0,4 0,1 0,2 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,3 0,2 0,2 0,0 0,3 0,1 0,2 0,0 0,5 0,2 0,2 0,0 0,5 0,2 0,2 0,0 0,0 0,1 0,2 0,0 0,3 0,1 0,2 0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,4 0,1 0,2 0,0 0,6 0,1 0,1 0,0 0,5 0,1 0,1 0,0 0,5 0,2 0,1 0,0 0,3 0,2 0,1 0,0 0,5 0,2 0,1 0,0 0,3 0,2 0,1 0,0 0,3 0,2 0,1 0,0 0,2 0,1 0,2 0,0 0,4 0,2 0,1 0,0 0,3 0,2 0,1 0,0 0,3 0,2 0,1 0,0 0,5 0,3 0,2 0,00.6 0.1 0.1 0.0 0.4 0.1 0.2 0.0 0.0 0.0 0.2 0.0 0.3 0.2 0.2 0.0 0, 3 0.1 0.2 0.0 0.5 0.2 0.2 0.0 0.5 0.2 0.2 0.0 0.0 0.1 0.2 0.0 0.3 0 , 1 0.2 0.0 0.0 0.0 0.2 0.0 0.4 0.1 0.2 0.0 0.6 0.1 0.1 0.0 0.5 0.1 0.1 0.0 0.5 0.2 0.1 0.0 0.3 0.2 0.1 0.0 0.5 0.2 0.1 0.0 0.3 0.2 0, 1 0.0 0.3 0.2 0.1 0.0 0.2 0.1 0.2 0.0 0.4 0.2 0.1 0.0 0.3 0.2 0.1 0 , 0 0.3 0.2 0.1 0.0 0.5 0.3 0.2 0.0

1,8 0,3 12,1 0,0 1,5 0,4 12,6 0,0 0,4 0,4 1,5 0,0 1,6 0,4 13,1 0,0 2,2 0,3 14,4 0,0 1,7 0,3 13,7 0,0 2,0 0,3 14,2 0,0 0,7 0,3 2,2 0,0 1,2 0,4 12,7 0,0 0,5 0,3 1,5 0,0 1,6 0,4 13,6 0,0 2,2 0,3 12,3 0,0 2,1 0,3 12,6 0,0 1,9 0,3 14,0 0,0 1,8 0,3 11,4 0,0 1,9 0,3 13,9 0,0 1,7 0,3 12,3 0,0 2,0 0,3 13,1 0,0 1,6 0,3 10,2 0,0 1,7 0,3 13,3 0,0 1,9 0,3 12,2 0,0 1,8 0,3 12,7 0,0 1,6 0,4 17,6 0,01.8 0.3 12.1 0.0 1.5 0.4 12.6 0.0 0.4 0.4 1.5 0.0 1.6 0.4 13.1 0.0 2, 2 0.3 14.4 0.0 1.7 0.3 13.7 0.0 2.0 0.3 14.2 0.0 0.7 0.3 2.2 0.0 1.2 0 , 4 12.7 0.0 0.5 0.3 1.5 0.0 1.6 0.4 13.6 0.0 2.2 0.3 12.3 0.0 2.1 0.3 12.6 0.0 1.9 0.3 14.0 0.0 1.8 0.3 11.4 0.0 1.9 0.3 13.9 0.0 1.7 0.3 12, 3 0.0 2.0 0.3 13.1 0.0 1.6 0.3 10.2 0.0 1.7 0.3 13.3 0.0 1.9 0.3 12.2 0 , 0 1.8 0.3 12.7 0.0 1.6 0.4 17.6 0.0

- 74 037184- 74 037184

Таблица 21Table 21

Состав жирных кислот масла из единичных семян Т3 B.juncea, трансформированной Т-ДНК из GA7 modB. Семена дополнительно содержали по 0,1-0,2% каждой из С16:3, С20:1Δ13, С20:2ω6. Не обнару жены С20:3ω6, С20:4ω6, С22:2ω6, С22:5ω6 и С22:6ω3 ιλFatty acid composition of oil from single seeds of T3 B. juncea transformed with T-DNA from GA7 modB. The seeds additionally contained 0.1-0.2% each of C16: 3, C20: 1Δ13, C20: 2ω6. I have not found a wife C20: 3ω6, C20: 4ω6, C22: 2ω6, C22: 5ω6 and C22: 6ω3 ιλ

ΙΛ .У.ΙΛ.

У__У_У__У__У_У__У__У__У__У__У__У__У_У__У__У__У_У__У.Y__Y_Y__Y__Y_Y__Y__Y__Y__Y__Y__Y__Y_Y__Y__Y__Y_Y__Y.

1 one 4,8 4.8 0,4 0,4 2,8 2.8 38,4 38.4 3,7 3.7 5,7 5.7 0,4 0,4 18,0 18.0 0,7 0.7 1,о 1, o 1,5 1.5 1,1 1.1 о,3 oh, 3 1,4 1.4 0,4 0,4 0,3 0.3 1,4 1.4 0,5 0.5 2 2 4,3 4.3 0,4 0,4 3,0 3.0 43,3 43.3 3,6 3.6 5,2 5.2 0,2 0.2 18,5 18.5 0,7 0.7 0,8 0.8 1,7 1.7 1,4 1.4 0,3 0.3 1,2 1,2 0,3 0.3 0,2 0.2 1,2 1,2 0,3 0.3 12,4 12.4 3 3 4,6 4.6 0,4 0,4 2,8 2.8 33,1 33.1 4,1 4.1 5,1 5.1 0,4 0,4 18,5 18.5 0,7 0.7 1,2 1,2 1,4 1.4 1,1 1.1 0,3 0.3 1,6 1.6 0,5 0.5 0,3 0.3 1,4 1.4 0,4 0,4 20,8 20.8 4 four 4,5 4.5 0,4 0,4 2,9 2.9 39,5 39.5 3,3 3.3 6,3 6.3 0,4 0,4 18,5 18.5 0,8 0.8 1,2 1,2 1,5 1.5 1,0 1.0 0,3 0.3 1,7 1.7 0,3 0.3 0,2 0.2 1,8 1.8 0,3 0.3 14,2 14.2 5 five 4,9 4.9 0,5 0.5 2,8 2.8 32,2 32.2 3,9 3.9 4,7 4.7 0,3 0.3 20,7 20,7 0,8 0.8 1,2 1,2 1,4 1.4 2,0 2.0 0,3 0.3 1,4 1.4 0,5 0.5 0,3 0.3 1,2 1,2 0,4 0,4 19,4 19.4 6 6 4,3 4.3 0,3 0.3 3,0 3.0 38,1 38.1 3,2 3.2 5,8 5.8 03 03 19,4 19.4 0,7 0.7 1,1 1.1 1,5 1.5 1,2 1,2 0,3 0.3 1,5 1.5 0,4 0,4 0,2 0.2 1,3 1,3 0,4 0,4 14?) 14?) 7 7 5,4 5.4 0,5 0.5 3,2 3.2 29,3 29.3 4,0 4.0 4,6 4.6 0,4 0,4 18,6 18.6 0,9 0.9 1,7 1.7 1,3 1,3 1,2 1,2 0,4 0,4 1,6 1.6 0,7 0.7 0,3 0.3 1,4 1.4 0,5 0.5 22,9 22.9 8 8 5,2 5.2 0,5 0.5 3,7 3.7 34,5 34.5 4,1 4.1 4,5 4.5 0,3 0.3 17,2 17.2 1,0 1.0 1,4 1.4 1,4 1.4 1,5 1.5 0,4 0,4 1,4 1.4 0,6 0.6 0,3 0.3 1,2 1,2 0,5 0.5 19,4 19.4 9 nine 5,3 5.3 0,5 0.5 3,4 3.4 33,4 33.4 3,7 3.7 4,6 4.6 0,3 0.3 17,6 17.6 0,9 0.9 1,7 1.7 1,2 1,2 1,1 1.1 0,4 0,4 1,5 1.5 0,6 0.6 0,2 0.2 1,2 1,2 0,5 0.5 20,7 20,7 10 ten 4,6 4.6 0,4 0,4 3,0 3.0 39,5 39.5 3,5 3.5 5,1 5.1 0,3 0.3 17,8 17.8 0,8 0.8 0,8 0.8 1,6 1.6 1,4 1.4 0,4 0,4 1,3 1,3 0,4 0,4 0,3 0.3 1,3 1,3 0,4 0,4 11 eleven 4,3 4.3 0,4 0,4 3,1 3.1 41,7 41,7 3,5 3.5 5,6 5.6 0,2 0.2 19,0 19.0 0,7 0.7 0,9 0.9 1,6 1.6 1,3 1,3 0,3 0.3 1,4 1.4 0,3 0.3 0,2 0.2 1,5 1.5 0,3 0.3 12,7 12.7 12 12 4,8 4.8 0,5 0.5 2,8 2.8 33,8 33.8 4,0 4.0 5,3 5.3 0,4 0,4 18,2 18.2 0,7 0.7 1,4 1.4 1,3 1,3 1,2 1,2 0,3. 0.3. 1,6 1.6 0,6 0.6 0,3 0.3 1,3 1,3 0,4 0,4 20,1 20.1 13 thirteen 4,4 4.4 0,4 0,4 3,5 3.5 40,3 40.3 3,5 3.5 5,2 5.2 0,2 0.2 19,1 19.1 0,7 0.7 1,0 1.0 1,5 1.5 1,6 1.6 0,3 0.3 1,4 1.4 0,4 0,4 0,2 0.2 1,4 1.4 0,3 0.3 13,8 13.8 14 14 4,8 4.8 0,4 0,4 3,2 3.2 36,1 36.1 3,7 3.7 5,9 5.9 0,3 0.3 19,9 19.9 0,7 0.7 1,4 1.4 1,3 1,3 1,1 1.1 0,3 0.3 1,9 1.9 0,5 0.5 0,2 0.2 1,7 1.7 0,3 0.3 15,4 15.4 1S 1S 4,0 4.0 0,3 0.3 2,8 2.8 37,2 37.2 3,2 3.2 4,9 4.9 0,3 0.3 19,6 19.6 0,8 0.8 0,9 0.9 1,6 1.6 1,5 1.5 0,4 0,4 1,3 1,3 0,5 0.5 0,3 0.3 1,1 1.1 0,4 0,4 17,9 17.9 1« one" 4,5 4.5 0,4 0,4 3,8 3.8 36,7 36.7 3,2 3.2 4,5 4.5 0,2 0.2 19,0 19.0 0,9 0.9 1,1 1.1 1,4 1.4 1,8 1.8 0,4 0,4 1,2 1,2 0,5 0.5 0,2 0.2 1,0 1.0 0,5 0.5 17,8 17.8 17 17 5,2 5.2 0,4 0,4 2,8 2.8 27,8 27.8 3,7 3.7 5,3 5.3 0,5 0.5 18,3 18.3 0,8 0.8 1,7 1.7 1,3 1,3 1,0 1.0 0,4 0,4 1,9 1.9 0,7 0.7 0,3 0.3 1,7 1.7 0,5 0.5 24,7 24.7 18 18 5,4 5.4 0,6 0.6 2,8 2.8 31,7 31.7 4,1 4.1 4,6 4.6 0,3 0.3 18,5 18.5 0,8 0.8 1,3 1,3 1,3 1,3 1,4 1.4 0,4 0,4 1,4 1.4 0,6 0.6 0,2 0.2 1,3 1,3 0,4 0,4 21,8 21.8 19 19 6,4 6.4 0,6 0.6 2,7 2.7 30,3 30.3 3,5 3.5 4,1 4.1 0,4 0,4 16,1 16.1 0,8 0.8 2,1 2.1 1,1 1.1 0,9 0.9 0,4 0,4 1,4 1.4 0,7 0.7 0,2 0.2 1,1 1.1 0,5 0.5 25,8 25.8 20 twenty 4,3 4.3 0,3 0.3 3,2 3.2 39,2 39.2 3,3 3.3 5,7 5.7 0,2 0.2 20,1 20.1 0,7 0.7 0,9 0.9 1,6 1.6 1,7 1.7 0,3 0.3 1,3 1,3 0,3 0.3 0,2 0.2 1,3 1,3 0,3 0.3 14,1 14.1

Пример 9. Дальнейший анализ трансформированных растений и полевые испытания.Example 9. Further analysis of transformed plants and field trials.

Гибридизационный анализ методом саузерн-блоттинга проводили для отобранных растений Т2 В. napus, трансформированных Т-ДНК из конструкции GA7-modB. ДНК, экстрагированную из образцов ткани растения, расщепляли несколькими рестрикционными ферментами для гибридизационного анализа методом саузерн-блоттинга. Радиоактивный зонд, соответствующий части Т-ДНК, гибридизовали с пятнами, которые промывали в строгих условиях, и пятна приводили в контакт с пленкой, чтобы обнаружить полосы гибридизации. Некоторые из образцов продемонстрировали единичные полосы гибридизации для каждой из смесей после расщепления рестрикционными ферментами, что соответствовало единичным инсерциям Т-ДНК в растениях, в то время как другие продемонстрировали две полосы, а следующие снова продемонстрировали несколько полос Т-ДНК, что соответствовало 4-6 инсерциям. Количество полос гибридизации, наблюдаемых в саузерн-блоттинг анализе, хорошо соотносилось с количеством копий Т-ДНК в трансгенных растениях, определенным методом цифровой ПЦР, до количества копий около 3 или 4. При количестве копий большем чем около 5 метод цифровой ПЦР был менее на дежным.Hybridization analysis by Southern blotting was performed for selected T2 plants of B. napus transformed with T-DNA from the GA7-modB construct. DNA extracted from plant tissue samples was digested with several restriction enzymes for hybridization analysis by Southern blotting. A radioactive probe corresponding to a portion of the T-DNA was hybridized to the spots, which were washed under stringent conditions, and the spots were contacted with the film to detect hybridization bands. Some of the samples showed single hybridization bands for each of the mixtures after restriction enzyme digestion, which corresponded to single insertions of T-DNA in plants, while others showed two bands, and the following again showed several T-DNA bands, which corresponded to 4-6 insertions. The number of hybridization bands observed in Southern blot analysis correlated well with the copy number of T-DNA in transgenic plants as determined by digital PCR, up to a copy number of about 3 or 4. With a copy number greater than about 5, digital PCR was less reliable. ...

Некоторые из отобранных линий использовали в качестве доноров пыльцы при скрещивании с сериями из около 30 различных сортов В. napus с различным фоновым генотипом. Дальнейшие обратное скрещивание проводили, чтобы определить, являются ли множественные инсерции Т-ДНК генетически связанными или нет, и позволить сегрегацию генетически несвязанных трансгенных локусов. Таким образом были отобраны линии, содержащие единичные трансгенные локусы.Some of the selected lines were used as pollen donors when crossed with series of about 30 different varieties of B. napus with different background genotypes. Further backcrossing was performed to determine if multiple T-DNA insertions were genetically linked or not, and to allow segregation of genetically unrelated transgenic loci. Thus, lines were selected containing single transgenic loci.

Однопраймерные реакции ПЦР проводили в трансгенных линиях с применением праймеров, смежных с левыми и правыми границами Т-ДНК, и любые линии, демонстрирующие присутствие обращенных повторов Т-ДНК, отбрасывали.One-primer PCR reactions were performed in transgenic lines using primers adjacent to the left and right boundaries of the T-DNA, and any lines showing the presence of reverse T-DNA repeats were discarded.

Некоторое количество трансгенных линий продемонстрировало задержку цветения, тогда как у других было снижено семяобразование и, таким образом, снижен выход семян на растение после выращивания в теплице, что согласовалось со сниженной мужской или женской фертильностью. Исследовали морфологию цветка в этих растениях и наблюдали, что в некоторых случаях раскрытие семенных коробочек и высвобождение пыльцы от пыльников задерживалось таким образом, что рыльца пестика удлинялись до раскрытия семенных коробочек и высвобождения пыльцы, таким образом отдаляя пыльники от рылец. Полная фертильность могла бы быть восстановлена искусственным опылением. Кроме того, определяли жизнеспособность пыльцы в момент раскрытия семенных коробочек и высвобождения пыльцы с помощью окрашивая красителями для определения жизнеспособности ФДА и ПЙ (пример 1), и показано, что она была снижена в некоторых линиях, тогда как в большинстве трансгенных линий жизнеспособность пыльцы составила около 100% от жизнеспособности в контрольных растениях дикого типа. В качестве дальнейшего анализа для выявления возможной причины уменьшения выхода семени с некоторых растений, анализировали содержание и состав жирных кислот в цветочных почках, включая пыльники и рыльца/пестики некоторых растений Т3 и Т4. ДГК не была обнаружена в экстрагированных липидах, указывая на то, что гены в генетической конструкции не экспрессировались в цветочных почках в процессе развития растения, и исключая это как причину сниженного выхода семян.A number of transgenic lines showed delayed flowering, while others showed reduced seed production and thus reduced seed yield per plant after greenhouse cultivation, consistent with reduced male or female fertility. Investigated the morphology of the flower in these plants and observed that in some cases the opening of the seed pods and the release of pollen from the anthers was delayed in such a way that the stigmas of the pistil lengthened until the discs opened and the pollen was released, thus moving the anthers away from the stigmas. Full fertility could be restored by artificial pollination. In addition, the viability of pollen was determined at the moment of opening the seed pods and the release of pollen using staining dyes to determine the viability of PDA and PI (example 1), and it was shown that it was reduced in some lines, while in most transgenic lines the viability of pollen was about 100% of the viability in wild-type control plants. As a further analysis to identify the possible cause of the decrease in seed yield from some plants, the content and composition of fatty acids in flower buds, including the anthers and stigmas / pistils of some T3 and T4 plants, were analyzed. DHA was not detected in the extracted lipids, suggesting that genes in the genetic construct were not expressed in flower buds during plant development, and excluding this as a cause of reduced seed yield.

- 75 037184- 75 037184

Содержание масла измеряли методом ЯМР, и определяли уровень ДГК в общем содержании жирных кислот для семян Т2. Трансгенные линии, содержащие менее чем 6% ДГК, отбрасывали. Количество копий Т-ДНК в образцах листьев растений поколений T1, T2 и Т3 определяли методом цифровой ПЦР (пример 1).Oil content was measured by NMR, and the level of DHA in total fatty acids was determined for T2 seeds. Transgenic lines containing less than 6% DHA were discarded. The number of T-DNA copies in leaf samples of plants of generations T1, T2 and T3 was determined by digital PCR (example 1).

Отобранные партии семян Т3 и Т4 высевали в поле на двух участках в Виктории, Австралия, каждую в рядах длиной 10 м с плотностью высева 10 семян/м. Отобранные партии семян включали полученную из В003-5-14 линию, которая демонстрирует уровни ДГК в пуле семени около 8-11% и уровни ДГК для индивидуальных семян Т2 до около 19%, с количеством копий Т-ДНК 3 в растении Т0. Кроме того, отобранные партии семян включали полученные из В0050-27 линии, которые продемонстрировали уровни ДГК в семенах Т2 свыше 20%, и количество копий Т-ДНК 1 или 2 в растениях Т2. Семена, высеваемые в поле, прорастали и давали побеги с той же скоростью, что и семена дикого типа. Растения, выращенные из большинства, но не всех высеянных партий семян, были фенотипически нормальными, например демонстрировали морфологию, скорость роста, высоту растений, мужскую и женскую фертильность, жизнеспособность пыльцы (100%), образование семян, размер и морфологию стручков, которые были по существу такими же, как у контрольных растений дикого типа, выращенных в таких же условиях. Выход семян на растение был сходен с выходом для контрольных растений дикого типа, выращенных в таких же условиях. Другие образцы семени высевали на больших площадях для массового производства отобранных трансгенных линий. Общее содержание ДГК в урожае собранных семян составляло по меньшей мере 30 мг/г семян.Selected lots of T3 and T4 seeds were sown in the field at two sites in Victoria, Australia, each in rows 10 m long with a seeding density of 10 seeds / m. Selected lots of seeds included a line derived from B003-5-14 that showed DHA levels in the seed pool of about 8-11% and DHA levels for individual T2 seeds up to about 19%, with a T-DNA 3 copy number in the T0 plant. In addition, the selected seed lots included lines derived from B0050-27, which showed DHA levels in T2 seeds in excess of 20% and a T-DNA copy number of 1 or 2 in T2 plants. Seeds sown in the field germinated and sprouted at the same rate as wild-type seeds. Plants grown from most but not all seeded seed lots were phenotypically normal, for example, showed morphology, growth rate, plant height, male and female fertility, pollen viability (100%), seed formation, size and morphology of pods that were essentially the same as wild-type control plants grown under the same conditions. The seed yield per plant was similar to that of wild-type control plants grown under the same conditions. Other seed samples were sown in large areas for mass production of the selected transgenic lines. The total DHA content of the harvested seed was at least 30 mg / g seed.

Квалифицированным специалистам в данной области будет понятно, что многочисленные вариации и/или модификации изобретения могут быть осуществлены, как раскрыто в конкретных вариантах, без отхода от духа или контекста изобретения в его широком смысле. Представленные варианты, таким образом, следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, но не ограничивающие.Those skilled in the art will understand that numerous variations and / or modifications of the invention may be made as disclosed in specific embodiments without departing from the spirit or context of the invention in its broadest sense. The options presented are therefore to be considered in all respects as illustrative and not restrictive.

Любое обсуждение документов, действий, материалов, устройств, изделий, и т.п., которое включено в настоящий документ, предназначено исключительно для целей обеспечения контекста для настоящего изобретения. Не следует делать допущение, что любые или все эти вопросы образуют часть известного уровня техники или представляли собой общедоступное знание в области, к которой относится настоящее изобретение, в том виде, в котором оно существовало до даты приоритета каждого из пунктов формулы данной заявки.Any discussion of documents, acts, materials, devices, articles, and the like that is included in this document is intended solely for the purpose of providing context for the present invention. It should not be assumed that any or all of these issues form part of the prior art or constitute public knowledge in the field to which the present invention pertains, as it existed prior to the priority date of each of the claims of this application.

- 76 037184- 76 037184

Ссылки.Links.

Abbadi et al. (2004) Plant Cell 16: 2734-2748.Abbadi et al. (2004) Plant Cell 16: 2734-2748.

Abbott et al. (1998) Science 282:2012-2018.Abbott et al. (1998) Science 282: 2012-2018.

Agaba et al. (2004) Marine Biotechnol. (NY) 6:251-261.Agaba et al. (2004) Marine Biotechnol. (NY) 6: 251-261.

Alvarez et al. (2000) Theor Appl Genet 100:319-327.Alvarez et al. (2000) Theor Appl Genet 100: 319-327.

Armbrust et al. (2004) Science 306:79-86.Armbrust et al. (2004) Science 306: 79-86.

Baumlein et al. (1991) Moi. Gen. Genet. 225:459-467.Baumlein et al. (1991) Moi. Gen. Genet. 225: 459-467.

Baumlein et al. (1992) Plant J. 2:233-239.Baumlein et al. (1992) Plant J. 2: 233-239.

Beaudoin et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6421-6426.Beaudoin et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 6421-6426.

Belide et al. (2002) Curr. Biol. 12:684-688(2013) Plant Cell Tiss Organ Cult. 113:543-553.Belide et al. (2002) Curr. Biol. 12: 684-688 (2013) Plant Cell Tiss Organ Cult. 113: 543-553.

Berberich. et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36:297-306.Berberich. et al. (1998) Plant Mol. Biol. 36: 297-306.

Broun et al. (1998) Plant J. 13:201-210.Broun et al. (1998) Plant J. 13: 201-210.

Brown et al. (2002) Biochem J. 364:795-805.Brown et al. (2002) Biochem J. 364: 795-805.

Chan et al. (2006) Nature Biotechnology 28:951-956.Chan et al. (2006) Nature Biotechnology 28: 951-956.

Chapman et al. (2004) Gen. Dev. 18:1179-1186.Chapman et al. (2004) Gen. Dev. 18: 1179-1186.

Chen et al. (2004) The Plant Cell 16:1302-1313.Chen et al. (2004) The Plant Cell 16: 1302-1313.

Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15: 653-657.

Cheng et al. (2010) Transgenic Res 19:221-229.Cheng et al. (2010) Transgenic Res 19: 221-229.

Cho et al. (1999a) J. Biol. Chem. 274:471-477.Cho et al. (1999a) J. Biol. Chem. 274: 471-477.

Cho et al. (1999b) J. Biol. Chem. 274:37335-37339.Cho et al. (1999b) J. Biol. Chem. 274: 37335-37339.

Christie (1982) J. Lipid Res. 23:1072-1075.Christie (1982) J. Lipid Res. 23: 1072-1075.

Darnude et al. (2006). Proc Natl Acad Sci USA 103: 9446-9451.Darnude et al. (2006). Proc Natl Acad Sci USA 103: 9446-9451.

Denic and Weissman (2007) Cell 130:663-677.Denic and Weissman (2007) Cell 130: 663-677.

Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:4105-4113.Domergue et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 4105-4113.

Domergue et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 35115-35126.Domergue et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 35115-35126.

Domergue et al. (2005) Biochem. J. 1 389:483-490.Domergue et al. (2005) Biochem. J. 1 389: 483-490.

Dunoyer et al. (2004) The Plant Cell 16:1235-1250.Dunoyer et al. (2004) The Plant Cell 16: 1235-1250.

Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:1019-1027.Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1019-1027.

Gamez et al. (2003) Food Res International 36: 721-727.Gamez et al. (2003) Food Res International 36: 721-727.

Garcia-Maroto et al. (2002) Lipids 37:417-426.Garcia-Maroto et al. (2002) Lipids 37: 417-426.

Girke et al. (1998) Plant J. 15:39-48.Girke et al. (1998) Plant J. 15: 39-48.

- 77 037184- 77 037184

Harayama (1998). Trends Biotechnol. 16: 76-82.Harayama (1998). Trends Biotechnol. 16: 76-82.

Hastings et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14304-14309.Hastings et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 14304-14309.

Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-922.Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6: 915-922.

Hoffmann et al. (2008) J Biol. Chem. 283:22352-22362.Hoffmann et al. (2008) J Biol. Chem. 283: 22352-22362.

Hong et al. (2002a) Lipids 37:863-868.Hong et al. (2002a) Lipids 37: 863-868.

Horiguchi et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39:540-544.Horiguchi et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39: 540-544.

Huang et al. (1999) Lipids 34:649-659.Huang et al. (1999) Lipids 34: 649-659.

Inagaki et al. (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:613-621.Inagaki et al. (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem. 66: 613-621.

Kajikawa et al. (2004) Plant Mol. Biol. 54:335-52.Kajikawa et al. (2004) Plant Mol. Biol. 54: 335-52.

Kajikawa et al. (2006) FEBS Lett 580:149-154.Kajikawa et al. (2006) FEBS Lett 580: 149-154.

Kereszt et al. (2007) Nature Protoc 2:948-952.Kereszt et al. (2007) Nature Protoc 2: 948-952.

Kim et al. (2005) Plant Cell. 2005 1073-89.Kim et al. (2005) Plant Cell. 2005 1073-89.

Knutzon et al. (1998) J. Biol Chem. 273:29360-6.Knutzon et al. (1998) J. Biol Chem. 273: 29360-6.

Koletzko et al. (1988) Am. J. Clin. Nutr. 47:954-959Koletzko et al. (1988) Am. J. Clin. Nutr. 47: 954-959

Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:393-405.Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 393-405.

Lassner (1995) Plant Physiol. 109:1389-94.Lassner (1995) Plant Physiol. 109: 1389-94.

Leonard et al. (2000) Biochem. J. 347:719-724.Leonard et al. (2000) Biochem. J. 347: 719-724.

Leonard et al. (2000b) Biochem. J. 350:765-770.Leonard et al. (2000b) Biochem. J. 350: 765-770.

Leonard et al. (2002) Lipids 37:733-740.Leonard et al. (2002) Lipids 37: 733-740.

Lewsey et al. (2007) Plant J. 50:240-252.Lewsey et al. (2007) Plant J. 50: 240-252.

Lo et al. (2003) Genome Res. 13:455-466.Lo et al. (2003) Genome Res. 13: 455-466.

Lu and Kang (2008) Plant Cell Rep. 27:273-8.Lu and Kang (2008) Plant Cell Rep. 27: 273-8.

Mallory et aL (2002) Nat. Biotech. 20:622-625.Mallory et al (2002) Nat. Biotech. 20: 622-625.

Marangoni et al. (1995) Trends in Food Sci. Technol. 6: 329-335.Marangoni et al. (1995) Trends in Food Sci. Technol. 6: 329-335.

Meesapyodsuk et al. (2007) J Biol Chem 282:20191-20199.Meesapyodsuk et al. (2007) J Biol Chem 282: 20191-20199.

Meng et al. (2008) J. Gen. Virol. 89:2349-2358.Meng et al. (2008) J. Gen. Virol. 89: 2349-2358.

Meyer et al. (2003) Biochem. 42:9779-9788.Meyer et al. (2003) Biochem. 42: 9779-9788.

Meyer et al. (2004) Lipid Res 45:1899-1909.Meyer et al. (2004) Lipid Res 45: 1899-1909.

Michaelson et al. (1998a) J. Biol. Chem. 273:19055-19059.Michaelson et al. (1998a) J. Biol. Chem. 273: 19055-19059.

Michaelson et al. (1998b) FEBS Lett. 439:215-218.Michaelson et al. (1998b) FEBS Lett. 439: 215-218.

Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497.Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497.

Napier et al. (1998) Biochem. J. 330:611-614.Napier et al. (1998) Biochem. J. 330: 611-614.

- 78 037184- 78 037184

Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453.

Parker-Barnes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8284-8289,Parker-Barnes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 8284-8289,

Pereira et al. (2004a) Biochem. J. 378:665-671.Pereira et al. (2004a) Biochem. J. 378: 665-671.

Pereira et al. (2004b) Biochem. J. 384:357-366.Pereira et al. (2004b) Biochem. J. 384: 357-366.

Perrin et al. (2000) Mol Breed 6:345-352.Perrin et al. (2000) Mol Breed 6: 345-352.

Petrie et al. (2010a) Metab. Eng. 12:233-240.Petrie et al. (2010a) Metab. Eng. 12: 233-240.

Petrie et al. (2010b) Plant Methods 11:6:8.Petrie et al. (2010b) Plant Methods 11: 6: 8.

Petrie et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.Petrie et al. (2012) Transgenic Res. 21: 139-147.

Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol - Plant 40:1-22.Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol - Plant 40: 1-22.

Qi et al. (2002) FEBS Lett. 510:159-165.Qi et al. (2002) FEBS Lett. 510: 159-165.

Qi et al. (2004) Nat. Biotech. 22: 739-745.Qi et al. (2004) Nat. Biotech. 22: 739-745.

Qiu et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:31561-31566.Qiu et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 31561-31566.

Reddy and Thomas (1996) Nat. Biotech. 14:639-642,Reddy and Thomas (1996) Nat. Biotech. 14: 639-642,

Reddy et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:293-300.Reddy et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 293-300.

Robert et al. (2005) Func. Plant Biol. 32:473-479.Robert et al. (2005) Func. Plant Biol. 32: 473-479.

Robert et al. (2009) Marine Biotech 11:410-418.Robert et al. (2009) Marine Biotech 11: 410-418.

Ruiz-Lopez et al. (2012) Transgenic Res. 21:139-147.Ruiz-Lopez et al. (2012) Transgenic Res. 21: 139-147.

Sahaet al. (2006) Plant Physiol. 141:1533-1543.Sahaet al. (2006) Plant Physiol. 141: 1533-1543.

Saito et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:1813-1818.Saito et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267: 1813-1818.

Sakuradani et al. (1999) Gene 238:445-453.Sakuradani et al. (1999) Gene 238: 445-453.

Sato et al. (2004) Crop Sci. 44: 646-652.Sato et al. (2004) Crop Sci. 44: 646-652.

Sakuradani et al. (2005) Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:648-654.Sakuradani et al. (2005) Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 648-654.

Sayanova et al. (2006) J Biol Chem 281: 36533-36541.Sayanova et al. (2006) J Biol Chem 281: 36533-36541.

Sayanova et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4211-4216.Sayanova et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 4211-4216.

Sayanova et al. (2003) FEBS Lett. 542:100-104.Sayanova et al. (2003) FEBS Lett. 542: 100-104.

Sayanova et al. (2006) Planta 224:1269-1277.Sayanova et al. (2006) Planta 224: 1269-1277.

Sayanova et al. (2007) Plant Physiol 144:455-467.Sayanova et al. (2007) Plant Physiol 144: 455-467.

Shukla et al. (2002) J. Amer. Oil Chem. Soc. 79:965-969.Shukla et al. (2002) J. Amer. Oil Chem. Soc. 79: 965-969.

Singh et al. (2005) Curr. Opin. in Plant Biol. 8:197-203.Singh et al. (2005) Curr. Opin. in Plant Biol. 8: 197-203.

Speranza et al. (2012) Process Biochemistry (In Press).Speranza et al. (2012) Process Biochemistry (In Press).

Sperling et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:3801-3811.Sperling et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267: 3801-3811.

Sperling et al. (2001) Arch. Biochm. Biophys. 388:293-8.Sperling et al. (2001) Arch. Biochm. Biophys. 388: 293-8.

- 79 037184- 79 037184

Sprecher et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477.Sprecher et al. (1995) J. Lipid Res. 36: 2471-2477.

Spychalla et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:1142-1147.Spychalla et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 1142-1147.

Tonon et al. (2003) FEBS Lett. 553:440-444.Tonon et al. (2003) FEBS Lett. 553: 440-444.

Trautwein (2001) European J. Lipid Sci. and Tech. 103:45-55.Trautwein (2001) European J. Lipid Sci. and Tech. 103: 45-55.

Tvrdik (2000) J. Cell Biol. 149:707-718,Tvrdik (2000) J. Cell Biol. 149: 707-718,

Venegas-Caleron et al. (2010) Prog. Lipid Res. 49:108-119.Venegas-Caleron et al. (2010) Prog. Lipid Res. 49: 108-119.

Voinnet et al. (2003) Plant J. 33:949-956.Voinnet et al. (2003) Plant J. 33: 949-956.

Wallis and Browse (1999) Arch. Biochem. Biophys. 365:307-316.Wallis and Browse (1999) Arch. Biochem. Biophys. 365: 307-316.

Watts and Browse (1999b) Arch. Biochem. Biophys. 362:175-182.Watts and Browse (1999b) Arch. Biochem. Biophys. 362: 175-182.

Weiss et al. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293:95:106.Weiss et al. (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293: 95: 106.

Weng et al., (2004) Plant Molecular Biology Reporter 22:289-300.Weng et al., (2004) Plant Molecular Biology Reporter 22: 289-300.

Whitney et al. (2003) Planta 217:983-992.Whitney et al. (2003) Planta 217: 983-992.

Wood (2009) Plant Biotechnol J. 7:914-24.Wood (2009) Plant Biotechnol J. 7: 914-24.

Wu et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1013-1017.Wu et al. (2005) Nat. Biotech. 23: 1013-1017.

Yang et al. (2003) Planta 216:597-603.Yang et al. (2003) Planta 216: 597-603.

Zank et al. (2002) Plant J. 31:255-268.Zank et al. (2002) Plant J. 31: 255-268.

Zank et al, (2005) WO 2005/012316Zank et al, (2005) WO 2005/012316

Zhang et al. (2004) FEBS Lett. 556:81-85.Zhang et al. (2004) FEBS Lett. 556: 81-85.

Zhang et al. (2006) 20:3255-3268.Zhang et al. (2006) 20: 3255-3268.

Zhang et al. (2007) FEBS Letters 581: 315-319.Zhang et al. (2007) FEBS Letters 581: 315-319.

Zhang et al, (2008) Yeast 25:21-27.Zhang et al, (2008) Yeast 25: 21-27.

Zhou et al. (2007) Phytochem. 68:785-796.Zhou et al. (2007) Phytochem. 68: 785-796.

Zhou et al. (2008) Insect Mol Biol 17: 667-676.Zhou et al. (2008) Insect Mol Biol 17: 667-676.

Zou et al. (1997) Plant Cell. 9:909-23.Zou et al. (1997) Plant Cell. 9: 909-23.

Claims (28)

1. Экстрагированный растительный липид, содержащий жирные кислоты в этерифицированной форме, причем жирные кислоты включают олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, ω6 жирные кислоты, включающие линолевую кислоту (ЛК), ω3 жирные кислоты, включающие α-линолевую кислоту (АЛК), докозапентаеновую кислоту (ДПК), стеаридоновую кислоту (СДК), эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК) и эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК), причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 7 до 35%.1. Extracted plant lipid containing fatty acids in esterified form, the fatty acids include oleic acid, palmitic acid, ω6 fatty acids including linoleic acid (LA), ω3 fatty acids including α-linoleic acid (ALA), docosapentaenoic acid ( DPA), stearidonic acid (SDA), eicosapentaenoic acid (EPA) and eicosatetraenoic acid (ETA), and the level of DPA in the total fatty acid content of the extracted lipid ranges from 7 to 35%. 2. Липид по п.1, отличающийся тем, что характеризуется по меньшей мере одним из следующих признаков:2. Lipid according to claim 1, characterized in that it is characterized by at least one of the following features: i) уровень пальмитиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 2 до 15% или от около 3 до около 10%, ii) уровень миристиновой кислоты (С14:0) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет около 0,1%, iii) уровень олеиновой кислоты в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 1 до около 30%, от около 3 до около 30%, от около 6 до около 30%, от 1 до около 20%, от около 30 до около 60%, от около 45 до около 60%, около 30% или от около 15 до около 30%, iv) уровень линолевой кислоты (ЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 35%, от около 4 до около 20%, от около 4 до 17% или от около 5 до около 10%,i) the level of palmitic acid in the total fatty acid of the extracted lipid is about 2 to 15% or about 3 to about 10%, ii) the level of myristic acid (C14: 0) in the total fatty acid of the extracted lipid is about 0.1 %, iii) the level of oleic acid in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 1 to about 30%, from about 3 to about 30%, from about 6 to about 30%, from 1 to about 20%, from about 30 to about 60%, about 45 to about 60%, about 30%, or about 15 to about 30%, iv) the level of linoleic acid (LA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is about 4 to about 35%, about 4 to about 20%, about 4 to 17%, or about 5 to about 10%, v) уровень α-линоленовой кислоты (АЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, от около 7 до около 40%, от около 10 до около 35%, от около 20 до около 35%, от около 4 до 16% или от около 2 до 16%, vi) уровень γ-линоленовой кислоты (ГЛК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее 4, менее чем около 3, менее чем около 2, менее чем около 1, менее чем около 0,5%, от 0,05 до 7%, от 0,05 до 4%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%, vii) уровень стеаридоновой кислоты (СДК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 10, менее чем около 8, менее чем около 7, менее чем около 6, менееv) the level of α-linolenic acid (ALA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 4 to about 40%, from about 7 to about 40%, from about 10 to about 35%, from about 20 to about 35%, about 4 to 16%, or about 2 to 16%, vi) the level of γ-linolenic acid (GLA) in the total fatty acids of the extracted lipid is less than 4, less than about 3, less than about 2, less than about 1, less than about 0.5%, 0.05 to 7%, 0.05 to 4%, 0.05 to about 3%, or 0.05 to about 2%, vii) stearidonic acid (SDA) level in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than about 10, less than about 8, less than about 7, less than about 6, less - 80 037184 чем около 4, менее чем около 3%, от около 0,05 до около 7%, от около 0,05 до около 6%, от около 0,05 до около 4%, от около 0,05 до около 3%, от около 0,05 до около 10% или от 0,05 до около 2%, viii) уровень эйкозатетраеновой кислоты (ЭТК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 6, менее чем около 5, менее чем около 4, менее чем около 1, менее чем около 0,5%, от около 0,05 до около 6%, от около 0,05 до около 5%, от около 0,05 до около 4%, от около 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%, ix) уровень эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 4%, менее чем около 2, менее чем около 1%, от 0,05 до 4%, от 0,05 до 3%, или от 0,05 до около 2%, или от 0,05 до около 1%,80 037184 than about 4, less than about 3%, from about 0.05 to about 7%, from about 0.05 to about 6%, from about 0.05 to about 4%, from about 0.05 to about 3%, about 0.05 to about 10%, or 0.05 to about 2%, viii) the level of eicosatetraenoic acid (ETA) in the total fatty acids of the extracted lipid is less than about 6, less than about 5, less than about 4, less than about 1, less than about 0.5%, from about 0.05 to about 6%, from about 0.05 to about 5%, from about 0.05 to about 4%, from about 0, 05 to about 3% or from 0.05 to about 2%, ix) the level of eicosatrienoic acid (ETRA) in the total fatty acids of the extracted lipid is less than 4%, less than about 2, less than about 1%, from 0, 05 to 4%, 0.05 to 3%, or 0.05 to about 2%, or 0.05 to about 1%, х) уровень эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 4 до 15%, менее чем 4%, менее чем около 3, менее чем около 2%, от 0,05 до 10%, от 0,05 до 5%, от 0,05 до около 3% или от 0,05 до около 2%, xi) уровень докозагексаеновой кислоты (ДГК) в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем 2% или от 0,05 до около 2%, xii) липид содержит менее чем 0,1% ω6-докозапентаеновой кислоты (22:5 д⁴·⁷·¹⁰·¹³·¹⁶) в общем содержании жирных кислот, xiii) уровень общих насыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 25%, от около 4 до около 20%, от около 6 до около 20%, от около 6 до около 12%, xiv) уровень общих мононенасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 4 до около 40%, около 4 до около 35%, от около 8 до около 25%, от 8 до около 22%, от около 15 до около 40% или от около 15 до около 35%, xv) уровень общих полиненасыщенных жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 20 до около 75%, от 30 до 75%, от около 50 до около 75%, около 60, около 65, около 70, около 75% или от около 60 до около 75%, xvi) уровень общих ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от около 35 до около 50%, от около 20 до около 35%, от около 6 до 20%, менее чем 20, менее чем около 16, менее чем около 10%, от около 1 до около 16%, от около 2 до около 10% или от около 4 до около 10%, xvii) уровень общих ω6 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет менее чем около 10, менее чем около 8, менее чем около 6%, менее чем 4%, от около 1 до около 20%, от около 1 до около 10%, от 0,5 до около 8% или от 0,5 до 4%, при этом указанные ω6 жирные кислоты представляют собой сумму всех ω6 жирных кислот, кроме ЛК, в экстрагированном липиде, выраженную в процентах от общего содержания жирных кислот в экстрагированном липиде, xviii) уровень общих ω 3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 36 до около 65%, от 36 до около 70%, от 40 до около 60%, от около 30 до около 60%, от около 35 до около 60%, от 40 до около 65%, от около 30 до около 65%, от 35 до около 65%, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65 или около 70%, xix) уровень общих ω 3 жирных кислот в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 21 до около 45%, от 21 до около 35%, от около 23 до около 35%, от около 25 до около 35%, от около 27 до около 35%, около 23, около 25, около 27, около 30, около 35, около 40 или около 45%, при этом указанные ω3 жирные кислоты представляют собой сумму всех ω3 жирных кислот, кроме АЛК, в экстрагированном липиде, выраженную в процентах от общего содержания жирных кислот в экстрагированном липиде, хх) соотношение общих ω6 жирных кислот к общим ω3 жирным кислотам в экстрагированном липиде составляет от около 1,0 до около 3,0, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 1,0, около 0,1, от около 0,10 до около 0,4 или около 0,2, xxi) соотношение общих ω6 жирных кислот (xvii) к общим ω3 жирным кислотам (xix) в экстрагированном липиде составляет от около 1,0 до около 3,0, от около 0,02 до около 0,1, от около 0,1 до около 1, от около 0,1 до около 0,5, менее чем около 0,50, менее чем около 0,40, менее чем около 0,30, менее чем около 0,20, менее чем около 0,15, около 0,02, около 0,05, около 0,1, около 0,2 или около 1,0, xxii) общие жирные кислоты в экстрагированном липиде содержат менее чем 1,5% С20:1, менее чем 1% С20:1 или около 1% С20:1, xxiii) содержание триацилглицерида (ТАГ) в экстрагированном липиде составляет по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере 95% (мас./мас.), от около 70 до около 99% (мас./мас.) или от около 90 до около 99% (мас./мас.), xxiv) липид содержит диацилглицерид (ДАГ), причем ДАГ содержит ДПК, xxv) по меньшей мере 70% этерифицированной ДГК и/или ДПК в составе ТАГ находится в положении sn-1 или sn-3 ТАГ и xxvi) уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет око-x) The level of eicosapentaenoic acid (EPA) in the total fatty acids of the extracted lipid is 4 to 15%, less than 4%, less than about 3, less than about 2%, from 0.05 to 10%, from 0.05 up to 5%, from 0.05 to about 3%, or from 0.05 to about 2%, xi) the level of docosahexaenoic acid (DHA) in the total fatty acid content of the extracted lipid is less than 2% or from 0.05 to about 2 %, xii) the lipid contains less than 0.1% ω6-docosapentaenoic acid (22: 5 d ^{4 7 10 13 16} ) in the total fatty acids, xiii) the level of total saturated fatty acids in the total fatty acids of the extracted lipid is from about 4 to about 25%, from about 4 to about 20%, from about 6 to about 20%, from about 6 to about 12%, xiv) the level of total monounsaturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 4 to about 40%, about 4 to about 35%, about 8 to about 25%, 8 to about 22%, about 15 to about 40%, or about 15 days about 35%, xv) the level of total polyunsaturated fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 20 to about 75%, from 30 to 75%, from about 50 to about 75%, about 60, about 65, about 70 , about 75% or about 60 to about 75%, xvi) the level of total ω6 fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from about 35 to about 50%, from about 20 to about 35%, from about 6 to 20% , less than 20, less than about 16, less than about 10%, from about 1 to about 16%, from about 2 to about 10%, or from about 4 to about 10%, xvii) the level of total ω6 fatty acids in the total content fatty acids of the extracted lipid is less than about 10, less than about 8, less than about 6%, less than 4%, about 1 to about 20%, about 1 to about 10%, 0.5 to about 8% or from 0.5 to 4%, while the indicated ω6 fatty acids are the sum of all ω6 fatty acids, except LA, in the extracted lipid, expressed as a percentage of the total sodium retention of fatty acids in the extracted lipid, xviii) the level of total ω 3 fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from 36 to about 65%, from 36 to about 70%, from 40 to about 60%, from about 30 to about 60 %, about 35 to about 60%, 40 to about 65%, about 30 to about 65%, 35 to about 65%, about 35, about 40, about 45, about 50, about 55, about 60, about 65 or about 70%, xix) the level of total ω 3 fatty acids in the total fatty acid content of the extracted lipid is from 21 to about 45%, from 21 to about 35%, from about 23 to about 35%, from about 25 to about 35%, about 27 to about 35%, about 23, about 25, about 27, about 30, about 35, about 40, or about 45%, wherein said ω3 fatty acids are the sum of all ω3 fatty acids other than ALA, in the extracted lipid, expressed as a percentage of the total fatty acids in the extracted lipid, xx) the ratio of total ω6 fatty acids to total ω3 fatty acids in the extract the lipid is from about 1.0 to about 3.0, from about 0.1 to about 1, from about 0.1 to about 0.5, less than about 0.50, less than about 0.40, less than about 0.30, less than about 0.20, less than about 0.15, about 1.0, about 0.1, about 0.10 to about 0.4, or about 0.2, xxi) ratio of total ω6 fatty acids (xvii) to total ω3 fatty acids (xix) in the extracted lipid is from about 1.0 to about 3.0, from about 0.02 to about 0.1, from about 0.1 to about 1, from about 0.1 to about 0.5, less than about 0.50, less than about 0.40, less than about 0.30, less than about 0.20, less than about 0.15, about 0.02, about 0.05, about 0.1, about 0.2, or about 1.0, xxii) the total fatty acids in the extracted lipid contain less than 1.5% C20: 1, less than 1% C20: 1, or about 1% C20 : 1, xxiii) the content of triacylglyceride (TAG) in the extracted lipid is at least about 70, at least about 80, at least about 90, at least 95% (w / w), from about 70 d about 99% (w / w) or about 90 to about 99% (w / w), xxiv) lipid contains diacylglyceride (DAG), and DAG contains DPA, xxv) at least 70% esterified DHA and / or DPC in the TAG is in position sn-1 or sn-3 TAG and xxvi) the level of DPC in the total fatty acid content of the extracted lipid is about - 81 037184 ло 7, около 8, около 9, около 10, около 12, около 15, около 18, около 20, около 22, около 24, около 26, около 28, около 31, от около 7 до около 31%, от около 7 до около 28%, от около 10 до 35%, от около 10 до около 30%, от около 10 до около 25%, от около 10 до около 22%, от около 14 до 35%, от около 16 до- 81 037184 lo 7, about 8, about 9, about 10, about 12, about 15, about 18, about 20, about 22, about 24, about 26, about 28, about 31, from about 7 to about 31%, about 7 to about 28%, about 10 to 35%, about 10 to about 30%, about 10 to about 25%, about 10 to about 22%, about 14 to 35%, about 16 to 35%, от около 16 до около 30%, от около 16 до около 25% или от около 16 до около 22%.35%, about 16 to about 30%, about 16 to about 25%, or about 16 to about 22%. 3. Липид по п.2, отличающийся тем, что уровень ДГК составляет менее чем 0,5% от общего содержания жирных кислот экстрагированного липида.3. The lipid of claim 2, wherein the DHA level is less than 0.5% of the total fatty acid content of the extracted lipid. 4. Липид по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что является компонентом масла, полученного из масличной культуры.4. Lipid according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it is a component of an oil obtained from an oilseed crop. 5. Липид по п.4, отличающийся тем, что масло получено из растений рода Brassica или растений рода Camelina, в частности С. sativa.5. Lipid according to claim 4, characterized in that the oil is obtained from plants of the genus Brassica or plants of the genus Camelina, in particular C. sativa. 6. Способ получения экстрагированного растительного липида по любому из пп.1-5, включающий стадии:6. A method of obtaining an extracted plant lipid according to any one of claims 1 to 5, comprising the steps of: I) получения части растения, содержащей липид, включающий профиль жирных кислот по любому из пп.1-5, при этом часть растения содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:I) obtaining a plant part containing a lipid comprising a fatty acid profile according to any one of claims 1 to 5, wherein the plant part contains exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes: a) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,a) ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, b) Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,b) Δ 15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, c) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,c) Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, d) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза,d) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, e) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза,e) ω3-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, f) Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза,f) Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, g) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза,g) Δ12-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, h) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза,h) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, i) ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза или j) ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными направлять экспрессию указанных полинуклеотидов в клетке части растения, иi) ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, or j) ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5- elongase, each polynucleotide is operably linked to one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a cell of a plant part, and II ) экстракции липида из части растения, причем уровень ДПК в общем содержании жирных кислот экстрагированного липида составляет от 7 до 35%, при этом одна или более клеток части растения содержат по меньшей мере около на 25% больше ω3 жирных кислот, чем соответствующие клетки без экзогенных полинуклеотидов.Ii) extraction of a lipid from a plant part, wherein the level of DPA in the total fatty acid content of the extracted lipid is from 7 to 35%, wherein one or more cells of the plant part contain at least about 25% more ω3 fatty acids than the corresponding cells without exogenous polynucleotides. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что часть растения представляет собой семя.7. A method according to claim 6, wherein the plant portion is a seed. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что семя представляет собой семя Brassica napus, B. juncea или С. sativa.8. A method according to claim 7, wherein the seed is the seed of Brassica napus, B. juncea or C. sativa. 9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что часть растения содержит экзогенные полинуклеотиды, кодирующие Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу и/или Δ 15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5-элонгазу.9. A method according to any one of claims 6 to 8, characterized in that the plant part contains exogenous polynucleotides encoding Δ12 desaturase, ω3 desaturase and / or Δ15 desaturase, Δ6 desaturase, Δ5 desaturase, Δ6 elongase and Δ5- elongase. 10. Способ по любому из пп.6 или 9, отличающийся тем, что указанные ферменты имеют следующие активности:10. A method according to any one of claims 6 or 9, characterized in that said enzymes have the following activities: i) Δ6-десатураза предпочтительно осуществляет десатурацию α-линоленовой кислоты (АЛК) относительно линолевой кислоты (ЛК), ii) Δ6-элонгаза также обладает активностью Δ9-элонгазы, iii) Δ12-десатураза также обладает активностью Δ15-десатуразы, iv) Δ6-десатураза также обладает активностью Δ8-десатуразы,i) Δ6-desaturase preferably desaturates α-linolenic acid (ALA) relative to linoleic acid (LA), ii) Δ6-elongase also has Δ9-elongase activity, iii) Δ12-desaturase also has Δ15-desaturase activity, iv) Δ6- desaturase also has Δ8-desaturase activity, v) Δ8-десатураза также обладает активностью Δ6-десатуразы, vi) Δ 15-десатураза также обладает активностью ω3-десатуразы в отношении ГЛК, vii) ω3-десатураза также обладает активностью Δ 15-десатуразы в отношении ЛК, viii) ω3-десатураза осуществляет десатурацию ЛК и/или ГЛК, ix) ω3-десатураза осуществляет десатурацию ГЛК относительно ЛК,v) Δ8-desaturase also has a Δ6-desaturase activity, vi) Δ 15-desaturase also has an ω3-desaturase activity against GLA, vii) ω3-desaturase also has a Δ15-desaturase activity against LA, viii) ω3-desaturase performs desaturation of LA and / or GLA, ix) ω3-desaturase performs desaturation of GLA relative to LA, х) одна или более или все десатуразы обладают более высокой активностью по отношению к ацилКоА чем по отношению к ацил-ФХ (ацил-фосфатидилхолин), xi) Δ6-десатураза обладает более высокой активностью Δ6-десатуразы в отношении АЛК, чем в отношении к ЛК, xii) Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении АЛК-КоА чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, xiii) Δ6-десатураза обладает по меньшей мере в 2 раза более высокой Δ6-десатуразной активностью, по меньшей мере в 3 раза более высокой активностью, по меньшей мере в 4 раза более высокой активностью или по меньшей мере в 5 раз более высокой активностью в отношении АЛК чем в отношении ЛК,x) one or more or all desaturase has a higher activity towards acylKoA than towards acyl-PC (acyl-phosphatidylcholine), xi) Δ6-desaturase has a higher activity of Δ6-desaturase towards ALA than towards LA , xii) Δ6-desaturase has a higher activity against ALA-CoA than against ALA attached to the sn-2 position of PC, xiii) Δ6-desaturase has at least 2 times higher Δ6-desaturase activity, at least 3 times higher activity, at least 4 times higher activity, or at least 5 times higher activity against ALA than against LA, - 82 037184 xiv) Δ6-десатураза обладает более высокой активностью в отношении АЛК-КоА чем в отношении- 82 037184 xiv) Δ6-desaturase has a higher activity against ALA-CoA than against АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, xv) Δ6-десатураза обладает по меньшей мере в 5 раз или 10 раз более высокой Δ6-десатуразной активностью в отношении АЛК-КоА чем в отношении АЛК, присоединенной к положению sn-2 ФХ, xvi) десатураза представляет собой фронт-энд десатуразу и xvii) Δ6-десатурαза не обладает обнаруживаемой активностью Δ5-десатуразы в отношении ЭТК.ALA attached to the sn-2 position of PC, xv) Δ6-desaturase has at least 5-fold or 10-fold higher Δ6-desaturase activity against ALA-CoA than against ALA attached to the sn-2 position of PC, xvi ) desaturase is a front-end desaturase; and xvii) Δ6-desaturase has no detectable Δ5-desaturase activity against ETA. 11. Способ по любому из пп.6-10, отличающийся тем, что экзогенные полинуклеотиды ковалентно соединены в молекулу Т-ДНК, которая интегрирована в геном клеток части растения, причем количество таких молекул Т-ДНК, интегрированных в геном клеток части растения, составляет одну, две или три.11. The method according to any one of claims 6-10, characterized in that the exogenous polynucleotides are covalently linked into a T-DNA molecule, which is integrated into the genome of the cells of the plant part, and the number of such T-DNA molecules integrated into the genome of the cells of the plant part is one, two or three. 12. Способ по любому из пп.6-11, отличающийся тем, что дополнительно включает обработку экстрагированного липида для повышения уровня ДПК в процентном выражении от общего содержания жирных кислот, причем обработка включает фракционирование, перегонку или переэтерификацию, в частности, с получением метиловых или этиловых эфиров ДПК или комбинацию указанных методов.12. The method according to any one of claims 6-11, characterized in that it further comprises treating the extracted lipid to increase the level of DPA as a percentage of the total fatty acid content, and the treatment includes fractionation, distillation or transesterification, in particular, to obtain methyl or ethyl esters WPC or a combination of these methods. 13. Растение масличной культуры, содержащее липид по любом из пп.1-5, в семени, или его часть, включающие экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:13. Oilseed plant containing a lipid according to any one of claims 1 to 5, in a seed, or part thereof, comprising exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes: i) Δ12-десатураза, ω3-десатурαза и/или Δ15-десатурαза, Δ6-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгαза, ii) Δ12-десатураза, ω3-десатурαза и/или Δ15-десатурαза, Δ8-десатурαза, Δ5-десатурαза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгαза, iii) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза или iv) ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более специфическими для семени промоторами, способными направлять экспрессию указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения.i) Δ12-desaturase, ω3-desaturαse and / or Δ15-desaturαza, Δ6-desaturase, Δ5-desaturαza, Δ6-elongαse and Δ5-elongαse, ii) Δ12-desaturase, ω3-desaturαse and / or Δ15-desaturαse, Δ8- desaturase, Δ5-desaturαse, Δ9-elongase and Δ5-elongase, iii) ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturαse, Δ6-elongase and Δ5-elongase or iv) ω3-desaturase and / or Δ15 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturαse, Δ9 elongase and Δ5 elongase, each polynucleotide being operably linked to one or more seed specific promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a developing plant seed. 14. Растение или его часть по п.13, включащие экзогенные полинуклеотиды, кодирующие Δ12десатуразу, ω3-десатуразу и/или Δ15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ6-элонгазу и Δ5элонгазу.14. The plant or part thereof according to claim 13, comprising exogenous polynucleotides encoding Δ12 desaturase, ω3 desaturase and / or Δ15 desaturase, Δ6 desaturase, Δ5 desaturase, Δ6 elongase and Δ5elongase. 15. Растение по п.13 или 14, которое представляет собой Brassica napus, В. juncea или Camelina sativa, причем зрелое семя указанного растения содержит ДПК в количестве по меньшей мере около 28 мг на 1 г семян.15. A plant according to claim 13 or 14, which is Brassica napus, B. juncea or Camelina sativa, wherein the mature seed of said plant contains WPC in an amount of at least about 28 mg per gram of seed. 16. Клетка растения по любому из пп.13-15, содержащая экзогенные полинуклеотиды, кодирующие один из следующих наборов ферментов:16. A plant cell according to any one of claims 13-15, containing exogenous polynucleotides encoding one of the following sets of enzymes: i) Δ12-десaтурaзa, ω3-десатурαза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгαза, ii) Δ12-десатураза, ω3-десатурαза и/или Δ15-десатурαза, Δ8-десатурαза, Δ5-десатурαза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгαза, iii) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза или iv) ω3-десатураза и/или Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более специфическими для семени промоторами, способными направлять экспрессию указанных полинуклеотидов в развивающемся семени растения.i) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturαse, Δ6-elongαse and Δ5-elongαse, ii) Δ12-desaturase, ω3-desaturαse and / or Δ15-desaturase, Δ8 -desaturationαza, Δ5-desaturαza, Δ9-elongase and Δ5-elongase, iii) ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturαza, Δ6-elongase and Δ5-elongase, or iv) ω3-desaturase, and / or Δ 15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturαse, Δ9-elongase and Δ5-elongase, each polynucleotide being operably linked to one or more seed-specific promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a developing plant seed. 17. Семя растения, которое получено из растения по любому из пп.13 или 15 и содержит липид по любому из пп.1-5.17. A plant seed which is obtained from a plant according to any one of claims 13 or 15 and contains a lipid according to any one of claims 1 to 5. 18. Семя по п.17, которое представляет собой зрелое, собранное семя Brassica napus, В. juncea или Camelina sativa, содержащее влагу от около 4 до около 15 мас.%, причем содержание ДПК в указанном семени составляет по меньшей мере около 28 мг на 1 г семян.18. The seed of claim 17, which is a mature, harvested seed of Brassica napus, B. juncea, or Camelina sativa having a moisture content of about 4 to about 15% by weight, the WPC content of said seed being at least about 28 mg. for 1 g of seeds. 19. Способ получения экстрагированного растительного липида по любому из пп.1-5, включающий следующие стадии:19. A method for producing an extracted plant lipid according to any one of claims 1 to 5, comprising the following steps: i) получение семени по п.17 или 18 и ii) экстракцию липида из семени.i) obtaining a seed according to claim 17 or 18; and ii) extracting the lipid from the seed. 20. Способ получения растения, содержащего липид по любому из пп.1-5, включающий:20. A method for producing a plant containing a lipid according to any one of claims 1-5, comprising: а) количественное определение уровня ДПК в липиде, который образуется в одной или более частях множества растений, причем каждое растение содержит по меньшей мере один экзогенный полинуклеотид, кодирующий один из следующих наборов ферментов;a) quantifying the level of duodenum in a lipid that is formed in one or more parts of a plurality of plants, each plant containing at least one exogenous polynucleotide encoding one of the following sets of enzymes; i) ω3-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза, ii) Δ 15-десатураза, Δ6-десатурαза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгαза и Δ5-элонгаза, iii) Δ12-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгαза, iv) Δ12-десатурαза, ω3-десатурαза и/или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатурαза, Δ6-элонгαзаi) ω3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, ii) Δ 15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase, iii) Δ12-desaturase , Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongαza, iv) Δ12-desaturαza, ω3-desaturase and / or Δ 15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturαza, Δ6-elongαse - 83 037184 и Δ5-элонгаза,- 83 037184 and Δ5-elongase, v) ω3-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vi) Δ 15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, vii) Δ12-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, viii) Δ12-десатураза, ω3-десатураза и/или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, ix) ω3-десатураза или Δ 15-десатураза, Δ6-десатураза, Δ5-десатураза, Δ6-элонгаза и Δ5-элонгаза или х) ω3-десатураза или Δ15-десатураза, Δ8-десатураза, Δ5-десатураза, Δ9-элонгаза и Δ5-элонгаза, причем каждый полинуклеотид функционально связан с одним или более промоторами, способными направлять экспрессию указанных полинуклеотидов в клетке части растения, иv) ω3 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, vi) Δ 15 desaturase, Δ8 desaturase, Δ5 desaturase, Δ9 elongase and Δ5 elongase, vii) Δ12 desaturase , Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, viii) Δ12-desaturase, ω3-desaturase and / or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5-elongase, ix ) ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, Δ6-elongase and Δ5-elongase; or x) ω3-desaturase or Δ15-desaturase, Δ8-desaturase, Δ5-desaturase, Δ9-elongase and Δ5- elongase, each polynucleotide is operably linked to one or more promoters capable of directing the expression of said polynucleotides in a cell of a plant part, and б) идентификацию растения среди множества растений, одна или более частей которого содержат липид по любому из пп.1-5, иb) identifying a plant among a plurality of plants, one or more parts of which contain a lipid according to any one of claims 1 to 5, and в) получение потомства от идентифицированного растения или его семян.c) obtaining offspring from an identified plant or its seeds. 21. Способ получения семян, включающий:21. A method of obtaining seeds, including: а) выращивание в поле одного или более растений по любому из пп.13-15, которые образуют семена по п.17 или 18, иa) growing in the field one or more plants according to any one of claims 13-15, which form seeds according to claim 17 or 18, and б) сбор урожая семян указанных растений.b) harvesting the seeds of these plants. 22. Способ получения липида по любому из пп.1-5, включающий получение семян способом по п.21 и экстракцию липида из указанных семян, который имеет общий выход ДПК по меньшей мере 60 кг ДПК на 1 га.22. A method for producing a lipid according to any one of claims 1-5, comprising obtaining seeds by a method according to claim 21 and extracting a lipid from said seeds, which has a total WPC yield of at least 60 kg WPC per 1 ha. 23. Жмых, полученный из семян по п.17 или 18, или из семян, полученных от растения по любому из пп.13-15.23. Oil cake obtained from seeds according to claim 17 or 18, or from seeds obtained from a plant according to any one of claims 13-15. 24. Композиция, содержащая липид по любому из пп.1-5 в комбинации со стандартным, известным, нетоксичным приемлемым для использования в пищевых продуктах или сельском хозяйстве носителем, адъювантом или растворителем, таким как фосфатно-солевой буфер, вода, этанол, полиолы, растительные масла, увлажняющий агент или эмульсия, такая как эмульсия вода/масло, а также с изотоническим агентом, сахаром, натрием хлоридом, подсластителями, вкусовыми добавками и ароматизаторами, витаминами, жирными кислотами, протеинами или витаминами, другими ингредиентами для пищевых продуктов или кормов, причем указанная композиция находится в форме, выбранной из таблеток, капсул, проглатываемой жидкости или порошка, инъекционной форме или в форме мази или крема для местного применения для использования в пищевой промышленности или сельском хозяйстве.24. A composition comprising a lipid according to any one of claims 1 to 5 in combination with a standard, known, non-toxic food or agricultural acceptable carrier, adjuvant or solvent such as phosphate buffered saline, water, ethanol, polyols, vegetable oils, a moisturizing agent or emulsion such as a water / oil emulsion, but also with an isotonic agent, sugar, sodium chloride, sweeteners, flavors and aromas, vitamins, fatty acids, proteins or vitamins, other food or feed ingredients, wherein said composition is in a form selected from tablets, capsules, swallowable liquid or powder, injectable form, or in the form of a topical ointment or cream for use in the food industry or agriculture. 25. Корм, содержащий липид по любому из пп.1-5, растение или часть растения по любому из пп. 13-15, растительные клетки по п. 16, семена по п.17 или 18, жмых по п.23 или их комбинацию.25. Feed containing a lipid according to any one of claims 1 to 5, a plant or part of a plant according to any one of claims. 13-15, plant cells according to claim 16, seeds according to claim 17 or 18, cake according to claim 23, or a combination thereof. 26. Способ получения корма, включающий смешивание липида по любому из пп.1-5, растения или части растения по любому из пп.13-15, растительных клеток п.16, семян по п.17 или 18 или жмыха по п.23 по меньшей мере с еще одним кормовым ингредиентом.26. A method of producing food, comprising mixing a lipid according to any one of claims 1-5, a plant or plant part according to any one of claims 13-15, plant cells of claim 16, seeds according to claim 17 or 18, or a cake according to claim 23 with at least one other feed ingredient. 27. Способ получения пищевого продукта, включающий смешивание липида по любому из пп.1-5, растения или части растения по любому из пп.13-15, растительных клеток по п.16, семян по п.17 или 18 или жмыха по п.23 по меньшей мере с еще одним пищевым ингредиентом.27. A method of producing a food product, comprising mixing a lipid according to any one of claims 1-5, a plant or a part of a plant according to any one of claims 13-15, plant cells according to claim 16, seeds according to claim 17 or 18, or a cake according to claim .23 with at least one other food ingredient. 28. Применение липида по любому из пп.1-5 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, при котором ПНЖК оказывают благоприятное воздействие.28. Use of a lipid according to any one of claims 1 to 5 for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a condition in which PUFAs have a beneficial effect.