EA035824B1 - Новые белки, специфичные к пиовердину и пиохелину - Google Patents

Новые белки, специфичные к пиовердину и пиохелину Download PDF

Info

Publication number
EA035824B1
EA035824B1 EA201791841A EA201791841A EA035824B1 EA 035824 B1 EA035824 B1 EA 035824B1 EA 201791841 A EA201791841 A EA 201791841A EA 201791841 A EA201791841 A EA 201791841A EA 035824 B1 EA035824 B1 EA 035824B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tyr
ser
leu
lys
arg
Prior art date
Application number
EA201791841A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791841A1 (ru
Inventor
Карстен Корвей
Хайке Штумп
Йохен Круйп
Бернхард Каландра
Астрид Рей
Натали Карст
Мишель Муре
Лоран Фрэсс
Кристин Роте
Андреа Аллерсдорфер
Александер Виденманн
Марлон Хиннер
Бредли Ландер
Кристиан Йензен
Мартин Хюльсмейер
Original Assignee
Пайерис Фармасьютикалс Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пайерис Фармасьютикалс Гмбх filed Critical Пайерис Фармасьютикалс Гмбх
Publication of EA201791841A1 publication Critical patent/EA201791841A1/ru
Publication of EA035824B1 publication Critical patent/EA035824B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

В изобретении предусматриваются мутеины hNGAL, которые связываются с членом семейства пиовердинов или пиохелином и могут использоваться в различных вариантах применения, в том числе фармацевтических вариантах применения, например, для подавления или ослабления роста P. aeruginosa. Изобретение также имеет отношение к способам получения одного или нескольких пиовердин- или пиохелин-связывающих мутеинов, описанных в данном документе, а также композициям, содержащим один или несколько из таких мутеинов. Настоящее раскрытие дополнительно относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие мутеины, а также к способам получения таких мутеинов и молекул нуклеиновых кислот. Кроме того, в изобретении раскрыты терапевтические и/или диагностические способы применения этих мутеинов, а также композиций, содержащих один или несколько таких мутеинов.

Description

I. Предпосылки создания изобретения
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) является оппортунистическим патогеном, который вызывает острые инфекции, преимущественно в сочетании с повреждениями тканей. P. aeruginosa образует биопленки на имплантированных устройствах и на легочных тканях пациентов с наследственным заболеванием муковисцидозом. Биопленочные инфекции с трудом поддаются лечению с помощью традиционных препаратов-антибиотиков. Однако исследования показали, что для надлежащего образования биопленки P. aeruginosa необходимо железо, и следовательно системы захвата железа являются потенциальными мишенями для препаратов против Pseudomonas.
P. aeruginosa способна извлекать железо из среды организма-хозяина с помощью секретируемых железосвязывающих сидерофоров, пиохелина и пиовердина. Пиовердин (Pvd) представляет собой пептид-связанный лиганд гидроксаматного и катехолатного типа, а пиохелин (Pch) является дериватизированным конъюгатом салицилата и двух молекул цистеина, имеющий функциональные группы фенольного, карбоксилатного и аминового лигандов. Была продемонстрирована роль Pvd и Pch в вирулентности P. aeruginosa с некоторыми указаниями на синергизм. Мутанты с двойным дефицитом, не способные вырабатывать оба сидерофора, являются намного более аттенуированными по вирулентности, чем любой мутант с одиночным дефицитом, не способный вырабатывать только один из двух сидерофоров (Takase et al., Infection and immunity, Apr.2 000, p.1834-1839). Кроме того, пиовердин выступает в роли сигнальной молекулы для контроля выработки нескольких факторов вирулентности, а также самого пиовердина; в то же время было высказано предположение, что пиохелин может быть частью системы получения двухвалентных металлов, таких как двухвалентное железо и цинк, для обеспечения патогенности P. aeruginosa в дополнение к трехвалентному железу (Visca et al., 1992).
Три структурно различных типа или группы пиовердинов были идентифицированы из нескольких штаммов P. aeruginosa: из Р. aeruginosa ATCC 15692 (Briskot et al., 1989, Liebigs Ann Chem, p. 375-384), из P. aeruginosa ATCC 27853 (Tappe et al., 1993, J. Prakt-Chem., 335, p.83-87) и из природного изолята P. aeruginosa R (Gipp et al., 1991, Z. Naturforsch, 46c, p.534-541). Более того, при сравнительных биологических исследованиях 88 клинических изолятов и двух штаммов из вышеупомянутых коллекций выявили три различные штаммоспецифичные пиовердин-опосредованные системы захвата железа (Cornelis et al., 1989, Infect Immun., 57, p.3491-3497; Meyer et al., 1997, Microbiology, 143, p.35-43), в соответствии с эталонными штаммами: P. aeruginosa ATCC 15692 (Pvd I типа или Pvd I), P. aeruginosa ATCC 27853 (Pvd II типа или Pvd II), а также клинические изоляты P. aeruginosa R и раб (Pvd III типа или Pvd III).
Каждый тип пиовердина имеет по три представителя (подтипа), отличающиеся боковой цепью, которая представляет собой сукцинил, сукцинамид или α-кетоглутарил, а именно сукцинил-Pvd I типа, сукцинамид-Pvd I типа, а-кетоглутарил-Pvd I типа, сукцинил-Pvd II типа, сукцинамид-Pvd II типа, акетоглутарил-Pvd II типа, сукцинил-Pvd III типа, сукцинамид-Pvd III типа и а-кетоглутарил-Pvd III типа.
Каждый штамм P. aeruginosa экспрессирует один тип Pvd, т.е. P. aeruginosa ATCC 15692 экспрессирует Pvd I типа, P. aeruginosa ATCC 27853 экспрессирует Pvd II типа, а Р. aeruginosa R и pa6 экспрессируют Pvd III типа, при этом каждый тип Pvd включает в себя всех трех представителей соответствующего типа, и каждый указанный штамм также экспрессирует пиохелин.
В связи с этим авторы определили пиовердины и пиохелин в качестве мишеней, которые являются критически важными для патогенности P. aeruginosa, и разработали специфичные ингибиторы для таких мишеней, как раскрыто в данном документе, т. е. для каждого типа Pvd, в том числе для трех представителей (подтипов) каждого типа, отличающихся боковой цепью (Pvd I s, Pvd I sa, Pvd I aKG, Pvd II s, Pvd II sa, Pvd II aKG, Pvd III s, Pvd III sa, Pvd III aKG), а также для Pch, и в каждом случае как для свободного сидерофора, так и для сидерофора со связанным железом, без создания сильного селективного давления, обусловленного традиционными антибиотиками. Кроме того, авторы выбрали ингибиторы, которые различают свободный пиохелин и пиохелин, нагруженный железом.
Настоящее изобретение было получено как результат деятельности, предпринятой от лица Pieris AG, Sanofi-Aventis и Sanofi-Pasteur Inc., которые являются участниками действующего соглашения о совместных исследованиях, и было сделано в рамках соглашения о совместных исследованиях.
II. Определения
В следующем перечне определены термины, фразы и сокращения, применяемые на всем протяжении настоящего описания. Предусмотрено, что все термины, приведенные и определенные в данном документе, охватывают все грамматические формы.
Выражение пиовердин, используемое в данном документе, означает флуоресцентный сидерофор, который продуцируется грамотрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa в условиях роста при недостатке железа и характеризуется высокой аффинностью к железу. Пиовердины состоят из трех структурных частей: дигидроксихинолинового хромофора, боковой цепи и вариабельной пептидной цепи. Фрагмент, представляющий собой пептидную цепь, участвует в распознавании рецепторов и связывании с ними. Были идентифицированы три различных Pvd, отличающиеся своей боковой цепью (I-III типы). Размер и аминокислотный состав типов пиовердина являются уникальными для каждого вида, также как и специфичность распознавания пиовердина. Были разграничены три штамма P. aeruginosa, каждый из
- 1 035824 которых вырабатывает отдельный тип пиовердина (I-III типы, фиг. 1) и когнатный рецептор FpvA.
Выражение пиохелин, используемое в данном документе, означает тиазолин-дериватизированный конъюгат салицилата и двух молекул цистеина и имеющий функциональные группы фенольного, карбоксилатного и аминового лиганда, который продуцируется Р. aeruginosa и солюбилизирует трехвалентное железо. Пиохелин представляет собой структурно уникальный сидерофор, обладающий фенолатным фрагментом, но не имеющим ни гидроксаматного, ни катехолатного фрагмента (см. фиг. 1).
Выражение поддающаяся выявлению аффинность, используемое в данном документе, означает способность связываться с выбранной мишенью с константой аффиности, как правило составляющей по меньшей мере приблизительно 10-5 М или меньше. Как правило, более низкие значения аффиности уже нельзя измерить обычными способами, такими как ELISA, и следовательно они имеют второстепенное значение.
Как используется в данном документе, аффинность связывания белка по настоящему раскрытию (например, мутеина липокалина 2 человека) или полипептида слияния на его основе к выбранной мишени (в данном случае пиовердин или пиохелин) можно измерять (и тем самым определить значения KD для комплекса мутеин-лиганд) с помощью множества способов, известных специалистам в данной области техники. Такие способы включают без ограничений флуоресцентное титрование, прямой ELISA, конкурентный ELISA, калориметрические способы, такие как изотермическая титрационная калориметрия (ITC) и поверхностный плазмонный резонанс (BIAcore). Такие способы являются общепринятыми в данной области техники и их примеры также подробно представлены ниже.
Также следует отметить, что на образование комплекса между соответствующим связывающимся веществом и его лигандом влияет множество различных факторов, таких как концентрации соответствующих партнеров по связыванию, наличие конкурентов, pH и ионная сила применяемой буферной системы, а также экспериментальный способ, применяемый для определения константы диссоциации KD (например, флуоресцентное титрование, прямой ELISA, конкурентный ELISA или поверхностный плазмонный резонанс, и это названы только некоторые из них), или даже математический алгоритм, который применяют для оценки экспериментальных данных.
Таким образом, специалисту в данной области также ясно, что значения KD (константа диссоциации комплекса, образуемого между соответствующим связывающимся веществом и его мишенью/лигандом) могут варьировать в пределах определенного экспериментального диапазона, зависящего от способа и экспериментальной установки, которую применяют для определения аффинности конкретного мутеина к данному лиганду. Это означает, что может наблюдаться незначительное отклонение в измеренных значениях KD или диапазоне допустимых значений, например в зависимости от того, было ли значение KD определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore), конкурентного ELISA или прямого ELISA.
Выражения мутеин, мутированный фрагмент (независимо белок или нуклеиновая кислота) или мутант, используемые в данном документе, относятся к замене, удалению или вставке одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот по сравнению с природной (дикого типа) нуклеиновой кислотой или эталонным каркасом белка. Указанный термин также включает фрагменты мутеина и варианты, описываемые в данном документе. Мутеины по настоящему раскрытию, их фрагменты или варианты предпочтительно сохраняют функцию связывания с пиовердином или пиохелином, как описано в данном документе.
Термин фрагмент, используемый в данном документе в связи с мутеинами по настоящему раскрытию, относится к белкам или пептидам, полученным из полноразмерного зрелого липокалина 2 человека, которые укорочены на N-конце и/или C-конце, т. е. с отсутствием по меньшей мере одной из Nконцевых и/или С-концевых аминокислот. Такие фрагменты могут включать по меньшей мере 10, например более 20 или 30 или более последовательных аминокислот из первичной последовательности зрелого липокалина 2 человека, и обычно поддаются выявлению при иммуноанализе на зрелый липокалин 2 человека. В целом, термин фрагмент, используемый в данном документе в отношении соответствующего белкового лиганда мутеина в соответствии с настоящим раскрытием, или комбинации в соответствии с настоящим раскрытием, или белка слияния, описанного в данном документе, относится к укороченным на N-конце и/или С-конце белковым или пептидным лигандам, которые сохраняют способность полноразмерного лиганда распознаваться и/или связываться мутеином в соответствии с настоящим раскрытием.
Термин мутагенез, используемый в данном документе, означает, что экспериментальные условия выбраны таким образом, что природная аминокислота в данном положении последовательности зрелого липокалина 2 человека, может быть замещена по меньшей мере одной аминокислотой, которая не присутствует в данном определенном положении в соответствующей природной полипептидной последовательности. Термин мутагенез также включает (дополнительную) модификацию длины сегментов последовательности с помощью удаления или вставки одной или нескольких аминокислот. Таким образом, в пределах объема настоящего раскрытия подразумевается, например, что одну аминокислоту в выбранном положении последовательности замещают отрезком из трех случайных мутаций, что приводит к вставке двух аминокислотных остатков по сравнению с длиной соответствующего сегмента в белке ди- 2 035824 кого типа. Такую вставку или делецию можно вводить независимо друг от друга в любых пептидных сегментах, которые могут подвергаться в настоящем раскрытии мутагенезу.
Термин случайный мутагенез означает, что заранее заданная одиночная аминокислота (мутация) не присутствует в определенном положении последовательности, однако при этом по меньшей мере две аминокислоты могут внедряться с определенной вероятностью в заранее определенное положение последовательности во время мутагенеза.
Идентичность представляет собой свойство последовательностей, которое определяет их сходство или родство. Термин идентичность последовательностей или идентичность, используемый в настоящем раскрытии, означает процентную долю попарно идентичных остатков после (гомологичного) выравнивания последовательности полипептида по настоящему раскрытию с рассматриваемой последовательностью относительно числа остатков в более длинной из этих двух последовательностей. Идентичность последовательностей измеряют путем деления числа идентичных аминокислотных остатков на общее число остатков и умножения произведения на 100.
Термин гомология используется в данном документе в своем обычном значении и включает идентичные аминокислоты, а также аминокислоты, которые считаются консервативными заменами (например, замена глутаматного остатка на аспартатный остаток) в эквивалентных положениях в линейной аминокислотной последовательности полипептида по настоящему раскрытию (например, любом мутеине по настоящему раскрытию).
Процентную долю гомологии последовательностей или идентичности последовательностей можно определять в данном документе, например, с применением программы BLASTP, версия blastp 2.2.5 (от 16 ноября 2002 г.; см. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402). В соответствии с данным вариантом осуществления процентная доля гомологии основана на выравнивании целых полипептидных последовательностей (матрица: BLOSUM 62; стоимость гэпов: 11,1; предельное значение установлено на 10-3), в том числе пропептидных последовательностей, предпочтительно с применением в качестве эталона при попарном сравнении каркаса белка дикого типа. Его рассчитывают как процентную долю числа положительных значений (гомологичных аминокислот), указанных в качестве результата в выходной информации программы BLASTP, деленного на общее число аминокислот, выбранных программой для выравнивания.
В частности, чтобы определить, соответствует ли аминокислотный остаток аминокислотной последовательности мутеина, отличающегося от человеческого липокалина 2 дикого типа, определенному положению в аминокислотной последовательности человеческого липокалина 2 дикого типа, специалист в данной области может применять средства и способы, хорошо известные из уровня техники, например, выравнивание, либо вручную, либо с применением компьютерных программ, таких как BLAST2.0, что обозначает Средство поиска основного локального выравнивания, или ClustalW, или любую другую подходящую программу, которая применима для создания выравниваний последовательностей. Соответственно, человеческий липокалин 2 дикого типа может выступать в роли последовательности, найденной в базе данных или эталонной последовательности, в то время как аминокислотная последовательность мутеина, отличающегося от человеческого липокалина 2 дикого типа, описанного в данном документе, выступает в роли запрашиваемой последовательности. Термины эталонная последовательность и последовательность дикого типа используются в данном документе взаимозаменяемо.
Г эпы представляют собой промежутки при выравнивании, которые являются результатом добавлений или делеций аминокислот. Таким образом, две копии абсолютно одинаковой последовательности характеризуются 100% идентичностью, а последовательности, которые являются менее высококонсервативными и имеют делеций, добавления или замены, могут характеризоваться более низкой степенью идентичности последовательностей. Специалистам в данной области техники будет понятно, что несколько компьютерных программ доступны для определения идентичности последовательностей с применением стандартных параметров, например, Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 33893402), Blast 2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410) и Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197).
Термин вариант, используемый в настоящем раскрытии, относится к производным белка или пептида, которые включают модификации аминокислотной последовательности, например, путем замены, делеций, или вставки, или химической модификации. Такие модификации в некоторых вариантах осуществления не снижают функциональность белка или пептида. Такие варианты включают белки, где одна или несколько аминокислот были замещены их соответствующими D-стереоизомерами или аминокислотами, отличными от природных 20 аминокислот, например такими как орнитин, гидроксипролин, цитруллин, гомосерин, гидроксилизин, норвалин. Однако такие замены также могут быть консервативными, т.е. аминокислотный остаток замещают химически подобным аминокислотным остатком. Примерами консервативных замен являются замещения в пределах представителей следующих групп: 1) аланин, серин и треонин; 2) аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; 3) аспарагин и глутамин; 4) аргинин и лизин; 5) изолейцин, лейцин, метионин и валин; а также 6) фенилаланин, тирозин и триптофан.
Под нативной последовательностью липокалина 2 человека понимают липокалин 2 человека, который имеет такую же аминокислотную последовательность, как и соответствующий полипептид при- 3 035824 родного происхождения. Таким образом, нативная последовательность липокалина 2 человека может характеризоваться аминокислотной последовательностью соответствующего природного липокалина 2 человека. Такой полипептид с нативной последовательностью можно выделять из природного источника или можно получать с помощью рекомбинантных способов или способов синтеза. Термин полипептид с нативной последовательностьюохватывает, в частности, природные усеченные или секретируемые формы липокалина 2 человека, природные вариантные формы, такие как формы, полученные в результате альтернативного сплайсинга, и природные аллельные варианты липокалина 2 человека. Выражение вариант полипептида означает биологически активный полипептид, имеющий последовательность, по меньшей мере на приблизительно 50, 60, 70, 80% или по меньшей мере на приблизительно 85% идентичную аминокислотной последовательности полипептида с нативной последовательностью. Такие варианты включают например полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавлены на N- или С- конце полипептида. Как правило, вариант имеет последовательность, по меньшей мере на приблизительно 70%, в том числе по меньшей мере на приблизительно 80%, например по меньшей мере на приблизительно 85% идентичную аминокислотной последовательности, в том числе по меньшей мере на приблизительно 90% идентичную аминокислотной последовательности или по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности полипептида с нативной последовательностью.
Термин положение, в случае использования в соответствии с настоящим раскрытием, означает либо положение аминокислоты в пределах аминокислотной последовательности, описанной в данном документе, либо положение нуклеотида в пределах последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе. Для понимания терминов соответствует или соответствующий, используемых в данном документе в контексте положений в аминокислотной последовательности одного или нескольких мутеинов, соответствующее положение определяется не только числом предыдущих нуклеотидов/аминокислот.
Соответственно, положение данной аминокислоты в соответствии с настоящим раскрытием, которая может подвергаться замене, может варьировать вследствие удаления или добавления аминокислот в любом другом месте в (мутантном или дикого типа) липокалине 2 человека. Аналогично, положение данного нуклеотида в соответствии с настоящим раскрытием, который может подвергаться замене, может варьировать вследствие делеций или дополнительных нуклеотидов в любом другом месте в 5'нетранслируемой области (UTR) мутеина или человеческого липокалина 2 дикого типа, в том числе в промоторе и/или любых других регуляторных последовательностях или гене (в том числе экзонах и интронах).
Таким образом, что касается соответствующего положения в соответствии с настоящим раскрытием, предпочтительно понимать, что положения нуклеотидов/аминокислот могут отличаться по указанному числу, а не по аналогичным соседним нуклеотидам/аминокислотам, хотя указанные соседние нуклеотиды/аминокислоты, которые могут подвергаться замене, удалению или добавлению, также охватывают одно или несколько соответствующих положений.
Кроме того, что касается соответствующего положения в мутеине на основании эталонного каркаса в соответствии с настоящим раскрытием, предпочтительно понимать, что положения нуклеотидов/аминокислот структурно соответствуют положениям в каком-то другом месте в мутеине или человеческом липокалине 2 дикого типа, даже если они могут отличаться по указанному числу.
Термины органическая молекула или малая органическая молекула, используемые в данном документе для неприродной мишени, обозначает органическую молекулу, содержащую по меньшей мере два атома углерода, но предпочтительно не более 7 или 12, способных в вращению углеродных связей, с молекулярной массой в диапазоне от 100 до 2000 Да, предпочтительно от 100 до 1000 Да, и необязательно включающую в себя один или два атома металла.
Слова выявлять, выявление, поддающийся выявлению или осуществлять выявление, используемые в данном документе, понимаются как на количественном, так и на качественном уровне, а также как их сочетание. Таким образом, они включают количественные, полуколичественные и качественные измерения молекулы, представляющей интерес.
Выражение субъект означает позвоночное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека. Термин млекопитающее используется в данном документе по отношению к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, в том числе без ограничений к человеку, одомашненым и сельскохозяйственным животным, а также животным из зоопарков, животным, используемым в спорте, или домашним животным, таким как овцы, собаки, лошади, кошки, коровы, крысы, свиньи, обезьяны, такие как макаки-крабоеды и т.д., в качестве нескольких иллюстративных примеров. Предпочтительно в данном документе млекопитающим является человек.
Выражение эффективное количество означает количество, достаточное для получения благоприятных или требуемых результатов. Эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений.
Выражение образец определяют как биологический образец, взятый у любого субъекта. Биологические образцы включают без ограничений кровь, сыворотку крови, мочу, кал, семенную жидкость или ткань.
- 4 035824
III. Описание графических материалов
Фиг. 1: показана структура сидерофоров P. aeruginosa. На фиг. 1А-С показаны структуры трех пиовердинов P. aeruginosa. Фиг. 1А: структура Pvd I типа (см. Birskot et al., 1989); фиг. 1B: структура Pvd II типа (см. Birskot et al., 1989); фиг. 1С: структура Pvd III типа (Gipp et al., 1991); фиг. 1D: R, присоединенный к хромофорной части, может представлять собой сукцинильную, сукцинамидную или αкетоглутариловую боковую цепь; и фиг. 1E: структура пиохелина (Brandel et al., 2011).
Фиг. 2: представлены типичные измерения скорости ассоциации и скорости диссоциации с помощью поверхностного плазмонного резонанса связывания Pvd I s (+Fe) с мутеином липокалина под SEQ ID NO: 16 (фиг. 2А), связывание Pvd II s (+Fe) с мутеином липокалина под SEQ ID NO: 36 (фиг. 2В), связывание Pvd III (+Fe) с мутеином липокалина под SEQ ID NO: 53 (фиг. 2С) и связывание пиохелина ( + Fe) с SEQ ID NO: 62 (фиг. 2D). Кроме того, отсутствие связывания соответствующих сидерофоров при 1200 нМ (200 нМ для пиохелина) с отрицательным контролем липокалина под SEQ ID NO: 64 показано на фиг. 2Е-Н.
Фиг. 3: показан иллюстративный профиль специфичности и перекрестной реактивности для мутеина липокалина под SEQ ID NO: 35, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Показано специфичное связывание с сукцинил-, сукцинамид- и α-кетоглутарил-пиовердином II, при этом показано отсутствие связывания с пиовердинами I типа и III типа, пиохелином, энтеробактином и десфероксамином. Для всех анализируемых образцов применяются высокие концентрации, составляющие 2 мкМ.
Фиг. 4: показаны иллюстративные данные из анализа по подавлению роста. Фиг. 4А: для Pvd Iспецифичного мутеина под SEQ ID NO: 16 показано подавление роста у Pvd I-специфичного штамма P. aeruginosa (ATCC27853) по сравнению с контрольной культурой, выращиваемой без мутеина. Фиг. 4В: для Pvd II-специфичных мутеинов под SEQ ID NO: 19 и 36 показано подавление роста у Pvd IIспецифичного штамма P. aeruginosa (ATCC15692) по сравнению с контрольной культурой, выращиваемой без мутеина. SEQ ID NO: 36 характеризуется более высокой аффинностью связывания по сравнению с SEQ ID NO: 19, и для нее показано более высокое подавление роста. Фиг. 4С: для Pvd III-специфичного мутеина под SEQ ID NO: 53 показано подавление роста у Pvd III-специфичного штамма P. aeruginosa (ATCC33360) по сравнению с контрольной культурой, выращиваемой без мутеина. Фиг. 4D: для Pchспецифичных мутеинов под SEQ ID NO: 62 показано подавление роста у штамма P. aeruginosa с нокаутом по Pvd I (ATCC15692 ΔpvdA), захват железа у которого зависит от Pch, по сравнению с контрольной культурой, выращиваемой без мутеина. В данном анализе применяли мутеины липокаина из расчета 10 мкМ.
Фиг. 5: на модели Р. aeruginosa-индуцированной инфекции легких у мышей показано, что введение SEQ ID NO: 19 за 1 ч до и во время контрольного заражения бактериями предотвращает развитие инфекции у мышей дозозависимым образом. Значимый профилактический эффект наблюдали, начиная с введения SEQ ID NO: 19 из расчета 200 мкг/мышь, с максимальным эффектом из расчета 2000 мкг/мышь.
Фиг. 6: показана аминокислотная последовательность, экспрессируемая с целью кристаллизации, включающая стартовый метионин в положении 1, лизин в положении 2, гексагистидиновую метку в положении 3-8, линкерную область аминокислот DYDIPTT в положении 9-15 (SEQ ID NO: 132), сайт расщепления для протеазы вируса гравировки табака (TEV) ENLYFQG в положении 16-22 (SEQ ID NO: 133), за которым следует аминокислотная последовательность мутеина, представляющего интерес, начиная с положения 23 и далее.
На фиг. 7 показана структура комплекса SEQ ID NO: 31 -Pvd-Fe. Перекрытие двух молекул под SEQ ID NO: 31, т. е. цепи А и цепи В из асимметричной единицы.
Фиг. 8: показаны места взаимодействия SEQ ID NO: 31 и Pvd-Fe. Две молекулы из асимметричной единицы перекрываются. Изображены боковые цепи, взаимодействующие с Pvd-Fe.
Фиг. 9: показан состав Pvd. Атомы кислорода, участвующие в связывании железа, заключены в рамку.
IV. Подробное описание раскрытия
В настоящем раскрытии предусматривается полипептид, характеризующийся специфичностью связывания с пиовердином I, II, III типа или пиохелином, где полипептид предусматривает мутеин hNGAL, который связывается с пиовердином I, II, III типа или пиохелином с поддающейся выявлению аффинностью.
Термины липокалин 2 человека, или Lcn 2 человека, или NGAL человека, или hNGAL, используемые в данном документе, относятся к зрелому желатиназа-ассоциированному липокалину нейтрофилов (NGAL) человека с номером доступа в базе данных SWISS-PROT/UniProt P80188. Мутеин липокалина 2 человека по настоящему раскрытию может также обозначаться в данном документе как мутеин hNGAL. Аминокислотную последовательность, показанную под номером доступа в базе данных SWISS-PROT/UniProt Р80188, можно применять в качестве предпочтительной эталонной последовательности, более предпочтительно аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, применяют в качестве эталонной последовательности.
- 5 035824
В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL, связывающий пиовердин (I, II или III типа) или пиохелин с поддающейся выявлению аффинностью, может включать по меньшей мере одну аминокислотную замену нативного цистеинового остатка на другую аминокислоту, например сериновый остаток. В некоторых других вариантах осуществления мутеин, связывающий пиовердин или пиохелин с поддающейся выявлению аффинностью, может включать один или несколько ненативных цистеиновых остатков, замещающих одну или несколько аминокислот hNGAL дикого типа. В соответствии с дополнительным конкретным вариантом осуществления мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием включает в себя по меньшей мере две аминокислотные замены нативной аминокислоты на цистеиновый остаток, с образованием тем самым одного или двух цистеиновых мостиков. В некоторых вариантах осуществления указанный цистеиновый мостик может соединять по меньше мере две петлевые области. В данном документе используется определение этих областей согласно Flower (Flower, 1996, выше, Flower, et al., 2000, выше) и Breustedt et al. (2005, выше).
В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию не связывается с энтеробактином.
В одном аспекте настоящее раскрытие включает различные мутеины hNGAL, которые связывают пиовердин или пиохелин, по меньшей мере, с поддающейся выявлению аффинностью. В данном смысле пиовердин или пиохелин рассматриваются как неприродный лиганд эталонного hNGAL дикого типа, при этом неприродный лиганд относится к соединению, которое не связывается с человеческим липокалином 2 дикого типа при физиологических условиях. Путем конструирования hNGAL дикого типа с одной или несколькими мутациями в определенных положениях последовательностей авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что возможна высокая аффинность и высокая специфичность в отношении неприродного лиганда, пиовердина или пиохелина. В некоторых вариантах осуществления в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или даже больше нуклеотидных триплетах, кодирующих определенные положения последовательности в человеческом липокалине 2 дикого типа 1, можно осуществлять случайный мутагенез посредством замены в этих положениях на подгруппу нуклеотидных триплетов.
Кроме того, мутеины по настоящему раскрытию могут иметь мутированный аминокислотный остаток в любом одном или нескольких, в том числе по меньшей мере в одном, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати положениях последовательности, соответствующих определенным положениям последовательности линейной полипептидной последовательности hNGAL, таким как положения последовательности 28, 34, 36, 39-42, 44-47, 49, 52, 54-55, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134, 141 и 145 в линейной полипептидной последовательности NGAL человека (SEQ ID NO: 1).
Мутеин по настоящему раскрытию может включать аминокислотную последовательность дикого типа (природную) из исходного белкового каркаса (такого как hNGAL) за пределами мутированных положений аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием может также нести одну или несколько мутаций аминокислот в положении/положениях последовательности при условии, что такая мутация, по меньшей мере, существенным образом не препятствует активности связывания и укладке мутеина или не нарушает их. Такие мутации очень легко можно выполнять на уровне ДНК с применением общепринятых стандартных способов (Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Иллюстративными примерами изменений аминокислотной последовательности являются вставки или делеции, а также аминокислотные замены. Такие замены могут быть консервативными, т. е. аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком с химически подобными свойствами, в частности в отношении полярности, а также размера. Примерами консервативных замен являются замещения в пределах представителей следующих групп: 1) аланин, серин и треонин; 2) аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; 3) аспарагин и глутамин; 4) аргинин и лизин; 5) изолейцин, лейцин, метионин и валин; а также 6) фенилаланин, тирозин и триптофан. С другой стороны, также можно вводить неконсервативные изменения в аминокислотную последовательность. Кроме того, вместо замещения одиночных аминокислотных остатков также возможна либо вставка, либо удаление одной или нескольких непрерывных аминокислот из первичной структуры липокалина 2 человека при условии, что такие удаления или вставка приводят к образованию мутеина со стабильной укладкой/функционального мутеина (например, мутеины hNGAL с усеченным N- и С-концом). В таком мутеине, например, один или несколько аминокислотных остатков добавляют или удаляют на N- или Сконце полипептида. Как правило, такой мутеин может иметь аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 70%, в том числе по меньшей мере на приблизительно 80%, например по меньшей мере на приблизительно 85% идентичную аминокислотной последовательности зрелого hNGAL.
В качестве иллюстративного примера настоящее раскрытие также охватывает мутеины hNGAL, определяемые выше, в которых четыре аминокислотных остатка (G-N-I-K; положения 95-98; SEQ ID NO: 130) линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL были удалены (например, SEQ ID NO: 46).
Аминокислотная последовательность мутеина hNGAL, раскрытого в данном документе, характери
- 6 035824 зуется высокой степенью идентичности с последовательностью зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) по сравнению с идентичностью последовательности с другими липокалинами. В соответствии с данным общим контекстом аминокислотная последовательность мутеина по настоящему раскрытию, по меньшей мере, фактически аналогична аминокислотной последовательности природного hNGAL дикого типа при условии, что при выравнивании возможны гэпы (как определено ниже), которые являются результатом добавлений или удалений аминокислот. Соответствующая последовательность мутеина по настоящему раскрытию, которая является фактически аналогичной последовательностям зрелого hNGAL, в некоторых вариантах осуществления имеет последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную или гомологичную последовательности, по меньшей мере на 75% идентичную или гомологичную последовательности, по меньшей мере на 80% идентичную или гомологичную последовательности, по меньшей мере на 82% идентичную или гомологичную последовательности, по меньшей мере на 85% идентичную или гомологичную последовательности, по меньшей мере на 87% идентичную или гомологичную последовательности или по меньшей мере на 90% идентичную или гомологичную последовательности, в том числе по меньшей мере на 95% идентичную или гомологичную последовательности зрелого hNGAL при условии, что сохраняется измененное положение или последовательность и что возможны один или несколько гэпов.
Мутеин по настоящему раскрытию, используемый в данном документе, специфически связывается с мишенью (например, пиовердином или пиохелином), если он способен различать данную мишень и одну или несколько эталонных мишеней, поскольку специфичность связывания является не абсолютным, а относительным свойством. Специфичное связывание можно определять, например, на основании проведения вестерн-блоттинга, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-тестов, FACS, IHC и картирования с применением пептидов.
В одном варианте осуществления мутеины по настоящему раскрытию является слитым на их Nконце и/или С-конце с партнером по слиянию, представляющим собой белковый домен, который увеличивает время полужизни мутеина в сыворотке крови. В дополнительных конкретных вариантах осуществления белковый домен представляет собой Fc-часть иммуноглобулина, CH3-домен иммуноглобулина, СН4-домен иммуноглобулина, альбуминсвязывающий пептид или альбуминсвязывающий белок.
В другом варианте осуществления мутеины по настоящему раскрытию конъюгируют с соединением, которое увеличивает время полужизни мутеина в сыворотке крови. Более предпочтительно, мутеин конъюгируют с соединением, выбранным из группы, состоящей из молекулы полиалкиленгликоля, гидроэтилкрахмала, Fc-части иммуноглобулина, СНЗ-домена иммуноглобулина, СН4-домена иммуноглобулина, альбумин-связывающего пептида или альбумин-связывающего белка.
В еще одном варианте осуществления настоящее раскрытие относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую мутеин, раскрытый в данном документе. Настоящее раскрытие охватывает клетку-хозяина, содержащую указанную молекулу нуклеиновой кислоты.
Мутеины, специфичные к пиовердину
Исследование изолятов P. aeruginosa на данный момент способствовало классификации пиовердина на три различные типа (Meyer et al., Use of Siderophores to Type Pseudomonads: The Three Pseudomonas Aeruginosa Pyoverdine Systems, Microbiology, 1997; vol. 143 no. 135-43). Примерно 42% изолятов Р. aeruginosa имеют систему пиовердина, идентичную таковой Pvd I типа, 42% изолятов P. aeruginosa функционируют аналогично Pvd II типа, в то время как 16% изолятов P. aeruginosa принадлежат к Pvd III типа, соответственно (Cornelis et al., 1989а; табл. 4). Каждый тип имеет по три представителя (подтипа), отличающиеся боковой цепью, которая представляет собой сукцинил, сукцинамид или а-кетоглутарил, а именно сукцинил-Pvd I типа, сукцинамид-Pvd I типа, а-кетоглутарил-Pvd I типа, сукцинил-Pvd II типа, сукцинамид-Pvd II типа, а-кетоглутарил-Pvd II типа, сукцинил-Pvd III типа, сукцинамид-Pvd III типа и акетоглутарил-Pvd III типа.
Для борьбы с P. aeruginosa, вырабатывающей различные типы пиовердина, в настоящем раскрытии предусматриваются мутеины hNGAL, направленные против различных типов пиовердина. В настоящем раскрытии также предусмотрены полезные варианты применения таких мутеинов, способы получения пиовердин-связывающих мутеинов hNGAL, описанных в данном документе, а также композиции, содержащие такие мутеины. Пиовердин-связывающие мутеины hNGAL по настоящему раскрытию, а также их композиции можно применять в способах выявления пиовердина в образце или в способах связывания пиовердина в субъекте. Ранее не были описаны такие мутеины hNGAL, характеризующиеся этими признаками, связанными со способами применения, предусмотренными в настоящем изобретении.
Пиовердин не связывался природным hNGAL дикого типа, хотя природный лиганд hNGAL, энтеробактин, состыковывается с чашечкой hNGAL с высокой аффинностью. Таким образом, пиовердин представляет собой фактор вирулентности и скрытый сидерофор, который избегает распознавания с помощью hNGAL, что позволяет Р. aeruginosa вызывать инфекцию (Peek et al., Pyoverdine, the Major Siderophore in Pseudomonas aeruginosa, Evades NGAL Recognition, Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 2012).
- 7 035824
Соответственно целью настоящего раскрытия является получение мутеинов, происходящих из желатиназа-ассоциированного липокалина нейтрофилов человека (NGAL), также называемого липокалин 2 человека, при этом мутеины, в отличие от природного hNGAL дикого типа, характеризуются высокой специфичностью к пиовердину.
Иллюстративные мутеины, специфические к пиовердину
В одном аспекте настоящее раскрытие относится к новым мутеинам липокалина 2 человека (Lcn2 человека или hNGAL) со специфичным связыванием, которые являются специфичными в отношении одного типа пиовердина, такого как Pvd I типа, Pvd II типа или Pvd III типа.
Один вариант осуществления настоящего раскрытия относится к мутеину, который способен связывать один тип пиовердина с поддающейся выявлению аффинностью, например аффинностью, измеряемой по KD, составляющей приблизительно 200 нМ или меньше, например приблизительно 150 нМ или меньше.
В одном аспекте в настоящем раскрытии предусматривается мутеин hNGAL, который способен связывать Pvd I типа в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше, например 15 нМ или меньше, например при измерении с помощью инструмента Biacore T200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления один или несколько мутеинов hNGAL по настоящему раскрытию способны связывать сукцинил-Pvd I типа, сукцинамид-Pvd I типа и акетоглутарил-Pvd I типа в комплексе с железом и без такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше, например при измерении в анализе ELISA, фактически описанном в примере 5.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен ингибировать захват железа, опосредованный сукуцинил-пиовердином I типа, при значении IC50, составляющем приблизительно 150 нМ или меньше в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен подавлять рост бактерий штамма Pvd I в анализе, фактически описанном в примере 8.
В связи с этим настоящее раскрытие относится к полипептиду, где указанный полипептид предусматривает мутеин hNGAL, и указанный hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или даже больше мутированных аминокислотных остатков в положениях последовательности 28, 36, 39-41, 46, 49, 52, 54-55, 59, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 134 и 136 по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL, и при этом указанный полипептид связывает Pvd I типа, в том числе сукцинил-Pvd I типа, сукцинамид-Pvd I типа и а-кетоглутарил-Pvd I типа.
В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL, связывающий Pvd I типа по настоящему раскрытию, включает в себя в одном или нескольких положениях последовательности 36, 40-41, 49,52,68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) один или несколько из следующих мутированных аминокис лотных остатков:
Leu 36 Asn, Thr, Vai,
Trp или Phe; Ala 40 Gly, Asn, Thr или Phe; lie 41 Arg, Ala,
Thr, Phe или Trp; Gln 49 lie, Leu, Vai, Ala или Pro; Tyr 52
Met, Trp или Pro; Ser 68 -+ Asp, Vai или Glu; Leu 70 -+ Gln, Trp,
Asp или Thr; Arg 72 Trp, Ala, Ser, Leu, Pro или Glu; Lys 73
Asp, Leu, Ala, Glu или Asn; Asp 77 -+ Arg, Leu, Tyr, Ser, Gln, Thr, lie или Asn; Trp 79 -+ Gln, Asp, Ser, Arg, Met или Glu; Arg 81 -+ Gln, Gly, lie, Glu, His или Asp; Asn 96 -+ His, lie, Gly, Туг или Asp; Tyr 100 Lys, Glu, Asn, Ser, Phe или Tyr; Leu 103
Lys, Pro, Gln, His, Asp, Tyr, Glu, Trp или Asn; Tyr 106 His, Gln или Phe; Lys 125 -+ Arg, Ser, Trp, Tyr, Vai или Gly; Ser 127
Trp, Asn, Ala, Thr, Tyr, His, lie, Vai или Asp; Tyr 132 Trp, Asn, Gly или Lys; и Lys 134 -+ Asn, His, Trp, Gly, Gln или Asp.
в некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию включает в себя два или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или даже больше, или все мутированные аминокислотные остатки в данных положениях последовательности зрелого hNGAL.
Кроме того, мутеин hNGAL, связывающий Pvd I типа в соответствии с настоящим раскрытием, может также содержать следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 28 His; Lys 46 Glu;
Thr 54 -+ Vai или Ala; lie 55 -+ Vai; Lys 59^ Arg; Asn 65 -+ Asp или Gln; lie 80 -+ Thr; Cys 87 -+ Ser или Asn и Thr 136 -+ Ala.
- 8 035824
В некоторых дополнительных вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию, который связывается с Pvd I типа, включает в себя следующие аминокислотные замены по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Asn; Ala 40 -^Gly; lie 41 -+ Trp; Gln lie; Tyr 52 Met; Ser 68 Vai; Leu 70 Gln; Arg 72
Trp; Lys 73 Asp; Asp 77^ Leu; Trp 79 Gln; Arg 81 Gln; Cys
Ser; Asn 96 His; Tyr 100 Lys; Leu 103 His; Tyr 106
His; Lys 125 Arg; Ser 127 Trp; Tyr 132 Trp; Lys 134 Asp;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Thr; Ala 40 -^Gly; lie 41 -+ Phe; Gln
Leu; Tyr 52 Trp; Leu 70 Trp; Arg 72 Ala; Lys73
Leu; Asp 77^ Tyr; Trp 79 Asp; Arg 81 Gly; Cys 87 Ser; Asn lie; Tyr 100 Glu; Leu 103 His; Tyr 106 Gln; Lys125
Trp; Ser 127 Asn; Tyr 132 Asn; Lys 134 Gln;
Gln 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 ^Thr; lie 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gln; Arg72
Ser; Lys 73 Glu; Asp 77 Ser; Trp 79 Ser; Arg 81 lie; Cys
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Asn; Leu 103 Lys; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Ala; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gln 28 His; Leu 36 Phe; Ala 40 Asn; lie 41 Arg; Gln
Pro; Tyr 52 Met; Ser 68 Asp; Leu 70 Thr; Arg 72
Glu; Lys 73 Ala; Asp 77 Arg; Trp 79 Arg; Arg 81 lie; Cys
Ser; Asn 96 Tyr; Tyr 100 Lys; Leu 103 Pro; Tyr 106
Phe; Lys 125 Ser; Ser 127 Thr; Tyr 132 Trp; Lys 134 Gly;
- 9 035824
Gin 28 His; Ala 40 ^Gly; He 41 Trp; Gin 49 Vai; Tyr
Met; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu; Lys73
Leu; Asp 77 Arg; Trp 79 Met; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn
Asp; Tyr 100 Phe; Leu 103 Trp; Tyr 106 Gin; Lys125
Gly; Ser 127 Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134His;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Phe; He 41 Phe; Gin
Ala; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Trp; Arg 72
Leu; Lys 73 -+ Asn; Asp 77 -+ Gin; Trp 79 -+ Glu; Arg 81 -+ His; Cys
Ser; Asn 96 Tyr; Leu 103 Tyr; Tyr 106 His; Lys125
Vai; Ser 127 His; Tyr 132 Lys; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gin
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gin; Arg 72
Ser; Lys 73 Glu; Asp 77 Ser; Trp 79 Ser; He 80 Thr; Arg
He; Cys 87 Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Ser; Leu 103
Gin; Tyr 106 His; Lys 125 Tyr; Ser 127 He; Tyr 132 Gly;
Lys 134 -+ Asn;
Gin 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gin
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gin; Arg 72
Ser; Lys 73 Asp; Asp 77 Ser; Trp 79 Ser; Arg 81 He; Cys
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Asn; Leu 103 Asp; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Vai; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gin 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gin
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gin; Arg 72
Ser; Lys 73 Glu; Asp 77 Thr; Trp 79 Ser; Arg 81 He; Cys
Ser; Asn 96 Asp; Tyr 100 Asn; Leu 103 Glu; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Asp; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gin 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gin
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gin; Arg 72
Ser; Lys 73 Asp; Asp 77 Vai; Trp 79 Ser; Arg 81 He; Cys
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Asn; Leu 103 Asn; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Vai; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gin 28 His; Ala 40 -Hy; He 41 Trp; Gin 49 Leu; Tyr
Met; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu; Lys 73
Leu; Asp 77 Arg; Trp 79 Met; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn
Asp; Tyr 100 Ser; Leu 103 Trp; Tyr 106 Gin; Lys 125
Gly; Ser 127 Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134 His;
Gin 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gin
Pro; Tyr 52 Pro; Thr 54 Vai; Ser 68 Asp; Leu 70
Gin; Arg 72 Ser; Lys 73 Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Ser; Trp
Ser; He 80 Thr; Arg 81 He; Cys 87 Ser; Asn 96
- 10 035824
Gly; Туг 100 Ser; Leu 103 Gln; Tyr 106 His; Lys 125 Tyr;
Ser 127 Thr; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gln 28 His; Ala 40 ^Gly; He 41 Trp; Lys 46 Glu; Gln
-+ Leu; Tyr 52 -+ Met; Thr 54 -+ Ala; He 55 -+ Vai; Lys 59 -+
Arg; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu; Lys 73 Leu; Lys
Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Arg; Trp 79 Met; He 80
Thr; Arg 81 Glu; Ser 87 Asn; Asn 96 Asp; Tyr 100 Ser;
Leu 103 Trp; Tyr 106 Gln; Lys 125 Gly; Ser 127 Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134 His;
Leu 36 Trp; Asn 39 Asp; Ala 40 AThr; He 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Thr 54 Vai; Asn 65 Asp; Ser 68
Asp; Leu 70 Gln; Arg 72 Ser; Lys 73 Glu; Lys 75 Glu; Asp
Ser; Trp 79 Ser; He 80 Thr; Arg 81 He; Cys 87
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Ser; Leu 103 Gln; Tyr 106 His;
Lys 125 Tyr; Ser 127 Thr; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn; Thr
136 Ala;
Leu 36 Trp; Ala 40 -Hhr; He 41 Ala; Gln 49 Pro; Tyr
Pro; Thr 54 Vai; Asn 65 Asp; Ser 68 Asp; Leu70
Gln; Arg 72 Ser; Lys 73 Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Ser;Trp
Ser; He 80 Thr; Arg 81 He; Cys 87 Ser; Asn96
Gly; Tyr 100 Ser; Leu 103 Gln; Tyr 106 His; Lys 125Tyr;
Ser 127 Thr; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn; Thr 136 Ala;
Gln 28 His; Ala 40 -Hy; He 41 Trp; Lys 46 Glu;Gln
Leu; Tyr 52 Met; Thr 54 Ala; He 55 Vai; Lys59
Arg; Asn 65 Asp; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu;Lys
Leu; Lys 74 Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Arg; Trp79
Met; He 80 Thr; Arg 81 Glu; Ser 87 Asn; Asn 96 Asp;Tyr
100 Ser; Leu 103 Trp; Tyr 106 Gln; Lys 125 Gly; Ser127
Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134 His; или Gln 28 His; Ala 40 -Hy; He 41 Trp; Lys 46 Glu; Gln
-+ Leu; Tyr 52 -+ Met; Thr 54 -+ Ala; He 55 -+ Vai; Lys 59 -+
Arg; Asn 65 -+ Gln; Ser 68 -+ Vai; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Glu; Lys
Leu; Lys 74 Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Arg; Trp 79
Met; He 80 Thr; Arg 81 Glu; Ser 87 Asn; Asn 96 Asp; Tyr 100 Ser; Leu 103 Trp; Tyr 106 Gln; Lys 125 Gly; Ser 127 Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134 His.
В остаточной области, т.е. области, не относящейся к положениям последовательности 28, 36, 3941, 46, 49, 52, 54-55, 59, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 134 и 136, мутеин hNGAL по настоящему раскрытию может включать аминокислотную последовательность дикого типа (природную) за пределами мутированных положений аминокислотной последовательности.
В дополнительных конкретных вариантах осуществления мутеин в соответствии с настоящим раскрытием содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-18 или их фрагмента или варианта.
Аминокислотная последовательность мутеина hNGAL, связывающего Pvd I типа по настоящему раскрытию, может характеризоваться высокой идентичностью последовательности, например по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90%, в том числе по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-18.
Настоящее раскрытие также включает структурные гомологи мутеина hNGAL с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-18, структурные гомологи которых характеризуются гомологией аминокислотной последовательности или идентичностью последовательности, составляющих более чем приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более чем 95% по отношению к указанному мутеину hNGAL.
Мутеин hNGAL, связывающий Pvd I типа в соответствии с настоящим раскрытием, можно получить посредством мутагенеза природной формы липокалина 2 человека. В некоторых вариантах осуществления мутагенеза замена (или замещение) представляет собой консервативную замену. Однако любая замена, в том числе неконсервативная замена или одна или несколько из иллюстративных замен ниже, предусмотрена в том случае, если мутеин сохраняет свою способность связываться с Pvd I типа и/или он характеризуется идентичностью с впоследствии замещенной последовательностью в том отношении, что он характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или более высокой идентичностью с аминокислотной последовательностью зрелого липокалина 2 человека (номер доступа в базе данных SWISS-PROT P80188).
- 11 035824
В другом аспекте в настоящем раскрытии предусматривается мутеин hNGAL, который связывает
Pvd II типа в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше, например нМ или меньше, например при измерении с помощью инструмента Biacore T200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
В еще одних дополнительных вариантах осуществления один или несколько мутеинов hNGAL по настоящему раскрытию способны связывать сукцинил-Pvd II типа, сукцинамид-Pvd II типа и акетоглутарил-Pvd II типа в комплексе с железом и без такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше, например при измерении в анализе ELISA, фактически описанном в примере 5.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен ингибировать захват железа, опосредованный сукуцинил-пиовердином II типа, при значении IC50, составляющем приблизительно 150 нМ или меньше, в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен подавлять рост бактерий штамма Pvd II в анализе, фактически описанном в примере 8.
В некоторых других вариантах осуществления мутеин способен подавлять или ослаблять рост штаммов P. aeruginosa, экспрессирующих пиовердин II типа в анализе, фактически описанном в примере 10.
В данном отношении настоящее раскрытие относится к полипептиду, где указанный полипептид включает в себя мутеин hNGAL, и указанный hNGAL по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или даже больше мутированных аминокислотных остатков в положениях последовательности 28, 36, 40-41, 49, 52, 54, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134, и при этом указанный полипептид связывается с Pvd II.
В некоторых вариантах осуществления Pvd II типа-связывающий мутеин hNGAL по настоящему раскрытию включает в себя в одном или нескольких положениях последовательности 36, 40-41, 49, 52, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) один или несколько из следующих мутированных аминокислотных остатков:
Leu 3 6 -> Asn, Не или Vai; Ala 4 0
Glu, Gly, Asn, Thr или His; He 41 Arg, Vai или Thr; Gin 49
Gly, Ala или Pro; Tyr 52 -+ Asn, Gly, Trp или Pro; Ser 68 -+ Asp,
Arg или Glu; Leu 70 Arg или Trp; Arg 72 His, He, Ala, Ser или Gly; Lys 73 -+ Asn, Met, Pro, Phe, Gin или Arg; Asp 77 -+ His,
He, Met, Lys, Gly или Asn; Trp 79 -+ Ser, Tyr, Ala, Asp, Phe или Trp; Arg 81 Glu, Ser, Туг или Asp; Asn 96 Met, He, Arg, Asp, Lys, Asn или Ala; Tyr 100 -+ Lys, Glu, Asn, Ser, Phe или Tyr; Leu 103 Thr, He, Gin, Gly, Met, His, Trp или Vai; Tyr
106 -+ Met, Gin, Ala, He, Asn, Gly, Met или Phe; Lys 125 -+ Ala, Tie или Asn; Ser 127 Lys, Arg, Ser, Met, Asp или Asn; Tyr 132 -+ Met, Phe, Asn, Ala, He, Gly или Vai; и Lys 134 -+ Trp или Tyr.
В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию включает в себя два или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или даже больше, или все мутированные аминокислотные остатки в данных положениях последовательности зрелого hNGAL.
Кроме того, Pvd II типа-связывающий мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием может также содержать следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL: Gln 28 ^ His; Thr 54 ^ Ala; Asn 65 ^ Asp или Gln и Cys 87 ^ Ser.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию, который связывается с Pvd II типа, включает в себя следующие аминокислотные замены по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
- 12 035824
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Glu; lie 41 Vai; Gln 49 Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Lys 73 -+ Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 -+ Ser; Arg 81 -+ Glu; Cys 87 Ser; Tyr 100 Asn; Leu 103 Gln; Tyr 106 Met; Ser 127
Lys; Tyr 132 Gly; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Ala 40 Thr; lie 41 Ile; Gln 49 Gly; Tyr 52 -+ Asn; Ser 68 -+ Asp; Leu 70 -+ Arg; Arg 72 -+ lie; Lys 73 -+ Met; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn 96 Ile; Tyr 100 Asn; Leu 103 Thr; Tyr 106 Gln; Lys 125
Ile; Ser 127 Arg; Tyr 132 Met; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Ile; Ala 40 AThr; Ile 41 Vai; Gln
Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
Ala; Lys 73 Pro; Asp 77 Ile; Trp 79 Ser; Arg 81 Ser; Cys
Ser; Asn 96 Met; Tyr 100 Ser; Leu 103 Gly; Tyr 106
Ala; Lys 125 Lys; Tyr 132 Vai; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Ala 40 Asn; Gln 49 Ala; Tyr 52 Pro; Ser
Glu; Leu 70 Arg; Arg 72 Ser; Lys 73 Gln; Asp 77
Met; Trp 79 Ala; Arg 81 Tyr; Cys 87 Ser; Asn 96 Arg; Tyr
100 Pro; Leu 103 Thr; Tyr 106 lie; Lys 125 Lys; Ser 127
Met; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Ala 40 His; Gln 49 Ala; Tyr 52 Pro; Ser
Glu; Leu 70 Asp; Arg 72 Gly; Lys 73 Arg; Asp 77
His; Trp 79 -+ Trp; Arg 81 -+ Glu; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 -+ Arg; Tyr
100 Asp; Leu 103 Met; Tyr 106 Phe; Lys 125 Ala; Ser 127
Asp; Tyr 132 Asn; Lys 134 Trp;
Gln 28 - His; Leu 36 - Asn; Ala 40 - Gly; Ile 41 Arg; Gln
Pro; Tyr 52 -+ Trp; Ser 68 -+ Arg; Leu 70 Trp; Arg 72
Asn; Lys 73 Gln; Asp 77 Lys; Trp 79 Asp; Arg 81 Glu; Cys
Ser; Asn 96 Asp; Tyr 100 Thr; Leu 103 Trp; Tyr106
Asn; Lys 125 Asn; Ser 127 Met; Tyr 132 lie; Lys 134Tyr;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 ^Thr; lie 41 Thr;Gln
Gly; Tyr 52 Gly; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
Gly; Lys 73 Arg; Asp 77 Gly; Trp 79 Trp; Arg 81 Glu;Cys
Ser; Asn 96 Ala; Tyr 100 Trp; Leu 103 - lie; Tyr106 Gly; Lys 125 Lys; Ser 127 Asn; Tyr 132 Vai; Lys 134Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 - Glu; Ile 41 Vai;Gln
Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 -+ Ser; Arg 81 -+ Glu;Cys
Ser; Asn 96 Lys; Tyr 100 Asn; Leu 103 Vai; Tyr106
Met; Lys 125 Asn; Ser 127 Lys; Tyr 132 Gly; Lys 134Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; Ile 41 Vai;Gln
Gly; Tyr 52 -+ Pro; Ser 68 -+ Glu; Leu 70 Arg; Arg72
His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Ser; Arg 81 Glu;Cys
Ser; Leu 103 Gln; Tyr 106 Met; Ser 127 Lys; Tyr132
Vai; Lys 134 Trp;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Vai; Ala 40 -+ Thr; Ile 41 -+ Vai; Gln
Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Asp 77^ Asn; Trp 79 Phe; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn
Lys; Tyr 100 -+ His; Leu 103 -+ Gln; Tyr 106 -+ Met; Ser 127 -+
Lys; Tyr 132 Ala; Lys 134 Trp;
Gln 28 -+ His; Leu 36 Vai; Ala 40 Gly; Ile 41 Vai; Gln 49 Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Lys 73 -+ Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Trp; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Tyr 100 Asn; Leu 103 His; Tyr 106 Met; Ser 127
- 13 035824
Lys; Туг 132 Gly; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; lie 41 Ile; Gln
Gly; Tyr 52 Asn; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg 72 lie; Lys 73 Phe; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg 81 Asp; Cys
Ser; Leu 103 Met; Tyr 106 Gln; Lys 125 Ile; Ser 127
Arg; Tyr 132 Ile; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; lie 41 Ile; Gln
Gly; Tyr 52 Asn; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg 72 lie; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg 81 Asp; Cys
Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106 Gln; Lys 125 Ile; Ser 127
Arg; Tyr 132 Ile; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Glu; Ile 41 Vai; Gln
Gly; Tyr 52 Pro; Asn 65 Asp; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Arg 72 His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Phe; Arg
Glu; Cys 87 Ser; Asn 96 Lys; Tyr 100 Asn; Leu 103
Vai; Tyr 106 Met; Lys 125 Asn; Ser 127 Lys; Tyr 132 Gly;
Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Glu; Ile 41 Vai; Gln
Gly; Tyr 52 Pro; Asn 65 Gln; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Arg 72 His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Phe; Arg
Glu; Cys 87 Ser; Asn 96 Lys; Tyr 100 Asn; Leu 103
Vai; Tyr 106 Met; Lys 125 Asn; Ser 127 Lys; Tyr 132 Gly;
Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; lie 41 Ile; Gln
Gly; Tyr 52 Asn; Thr 54 Ala; Asn 65 Asp; Ser 68
Asp; Leu 70 Arg; Arg 72 Ile; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp
Tyr; Arg 81 Asp; Cys 87 Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106
Gln; Lys 125 Ile; Ser 127 Arg; Tyr 132 Ile; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; lie 41 Ile; Gln
Gly; Tyr 52 Asn; Thr 54 Ala; Asn 65 Gln; Ser 68
Asp; Leu 70 Arg; Arg 72 Ile; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp
Tyr; Arg 81 Asp; Cys 87 Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106
Gln; Lys 125 Ile; Ser 127 Arg; Tyr 132 Ile; Lys 134 Trp;
Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; Ile 41 Ile; Gln 49 Gly; Tyr
Asn; Thr 54 Ala; Asn 65 Asp; Ser 68 Asp; Leu 70
Arg; Arg 72 Ile; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg
Asp; Cys 87 Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106 Gln; Lys 125
Ile; Ser 127 Arg; Tyr 132 Ile; Lys 134 Trp; или
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; lie 41 Ile; Gln
Gly; Tyr 52 Asn; Asn 65 Gln; Ser 68 Asp; Leu 70
Arg; Arg 72 Ile; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg 81 -+ Asp; Cys 87 -+ Ser; Leu 103 -+ Thr; Tyr 106 -+ Gln; Lys 125 -+ lie; Ser 127 Arg; Tyr 132 Ile; Lys 134 Trp.
В остаточной области, т.е. области, не относящейся к положениям последовательности 28, 36, 4041, 49, 52, 54, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134, мутеин hNGAL по настоящему раскрытию может включать аминокислотную последовательность дикого типа (природную) за пределами мутированных положений аминокислотной последовательности.
В дополнительных конкретных вариантах осуществления мутеин в соответствии с настоящим раскрытием содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-37 или их фрагмента или варианта.
Аминокислотная последовательность Pvd II типа-связывающего мутеина hNGAL по настоящему раскрытию может характеризоваться высокой идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90%, в том числе по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-37.
Настоящее раскрытие также включает структурные гомологи мутеина hNGAL с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-37, структурные гомологи которых характеризуются гомологией аминокислотной последовательности или идентичностью последовательности, составляющих более чем приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более чем 95% по отношению к указанному мутеину hNGAL.
Pvd II типа-связывающий мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием можно получить
- 14 035824 посредством мутагенеза природной формы липокалина 2 человека. В некоторых вариантах осуществления мутагенеза замена (или замещение) представляет собой консервативную замену. Однако любая замена, в том числе неконсервативная замена или одна или несколько из иллюстративных замен ниже, предусмотрена в том случае, если мутеин сохраняет свою способность связываться с Pvd I типа и/или он характеризуется идентичностью с впоследствии замещенной последовательностью в том отношении, что он характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или более высокой идентичностью с аминокислотной последовательностью зрелого липокалина 2 человека (номер доступа в базе данных SWISS-PROT P80188).
В еще одном аспекте в настоящем раскрытии предусматривается мутеин hNGAL, который связывает Pvd III типа в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше, например 10 нМ или меньше, например при измерении с помощью инструмента Biacore T200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько мутеинов hNGAL по настоящему раскрытию способны связываться с сукцинилом Pvd III типа, сукцинамидом Pvd III типа и α-кетоглутарилом Pvd II типа, в комплексе с железом и без такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше, например при измерении в анализе ELISA, фактически описанном в примере 5.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен ингибировать захват железа, опосредованный пиовердином III типа, со значением IC50, составляющем приблизительно 150 нМ или меньше в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен подавлять рост бактерий штамма Pvd II в анализе, фактически описанном в примере 8.
В данном отношении настоящее раскрытие относится к полипептиду, где указанный полипептид включает в себя мутеин hNGAL, и указанный hNGAL по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или даже больше мутированных аминокислотных остатков в положениях последовательности 28, 36, 40-42, 45-47, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105-106, 125, 127, 132, 134 и 145, и при этом указанный полипептид связывается с Pvd III.
В некоторых вариантах осуществления Pvd III типа-связывающий мутеин hNGAL по настоящему раскрытию включает в себя в одном или нескольких положениях последовательности 36, 40-41, 49, 52, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) один или несколько из следующих мутированных аминокислотных остатков:
Leu 3 6 -+ Phe или Glu; Ala
-+ Trp, Leu или Arg; lie 41 -+ Met, Arg, Ala, Leu или Trp; Gln
His, Ile, Arg, Lys, Met или Pro; Tyr 52 Asn, Tyr, Arg,
I Ser или Met; Ser 68 -+ Asp, Asn, Glu или Gln; Leu 70 -+ Lys, Asn или Arg; Arg 72 -+ Leu, Arg, Gln или Tyr; Lys 73 -+ His, Leu, Ala,
Pro, Gln или Tyr; Asp 77 Ala, lie, Lys, Gln или Arg; Trp 79
Ser или Asp; Arg 81 His, Ala, Ser или Vai; Asn 96 Met, lie,
Arg, Gly, Leu или Vai; Tyr 100 -+ Ala, lie, Asn, Pro или Asp; Leu 103 Gln, Gly, Phe или Pro; Tyr 106 Glu; Lys 125 Trp или Thr; Ser 127 -+ Vai, His, lie, Phe или Ala; Tyr 132 -+ Phe; и Lys 134 Trp, Gln или Glu.
В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию включает в себя два или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или даже больше, или все мутированные аминокислотные остатки в данных положениях последовательности зрелого hNGAL.
Кроме того, Pvd III типа-связывающий мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием может также содержать следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 2 8 -+ His; Leu 42 -+ Arg;
Asp 45 Gly; Lys 46 Arg; Asp 47 Asn; Asn 65 Asp; Cys 87 Ser; Ser 105 Pro и Thr 145 Pro.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию, который связывается с Pvd III типа, включает в себя следующие аминокислотные замены по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
- 15 035824
Gln 28 His; Leu 36 Phe; Ala 40 Trp; lie 41 Met; Gln 49 His; Tyr 52 Asn; Ser 68 Glu; Leu 70 Lys; Arg 72
Gln; Lys 73 Ala; Asp 77^ He; Trp 79 Ser; Arg 81 His; Cys
Ser; Asn 96 He; Tyr 100 Asn; Leu 103 Gly; Tyr 106
Glu; Lys 125^ Trp; Ser 127 His; Tyr 132 Phe; Lys 134 Gln;
Gln 28 His; Leu 36 Phe; Ala 40 Arg; He 41 Trp; Gln
He; Tyr 52 Tyr; Ser 68 Gln; Leu 70 Asn; Arg 72
Trp; Lys 73 Leu; Asp 77^ Ala; Trp 79 Ser; Arg 81 Ser; Cys
Ser; Asn 96 Arg; Tyr 100 He; Leu 103 Pro; Tyr 106
Glu; Lys 125^ Thr; Ser 127 He; Tyr 132 Phe; Lys 134 Glu;
Gln 28 His; Leu 36 Phe; Ala 40 Leu; He 41 Leu; Gln
Arg; Tyr 52 Arg; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg72
Leu; Lys 73 Tyr; Asp 77^ He; Trp 79 Ser; Arg 81 Ala; Cys
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Ala; Leu 103 Phe; Tyr106
Glu; Lys 125^ Trp; Ser 127 Ala; Lys 134 Glu;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Phe; Ala 40 -+ Trp; lie 41 -+ Arg;Gln
Pro; Tyr 52 Ser; Ser 68 Asn; Leu 70 Arg; Arg72
Trp; Lys 73 Pro; Asp 77^ Arg; Trp 79 Ser; Arg 81 Ser;Cys
Ser; Asn 96 Met; Tyr 100 Pro; Leu 103 - Gly; Tyr 106 Glu; Lys 125^ Trp; Ser 127 Phe; Tyr 132 Phe; Lys 134 Glu;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Glu; Ala 40 -+ Leu; He 41 -+ Ala; Gln 49 Lys; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Gln; Trp 79 Asp; Arg 81 Ala; Cys 87 Ser; Asn 96 - Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 - Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Glu; Ala 40 -+ Leu; He 41 -+ Ala; Gln 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73
Gln; Asp 77^ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Vai; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 -+ Leu; He 41 -+ Thr; Gln 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73
Arg; Asp 77^ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Vai; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 Vai; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Gln 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73
His; Asp 77^ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Vai; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Gln 49 Lys; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73
Tyr; Asp 77^ Gln; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 Vai; Cys 87 Ser; Asn
-; Tyr 100 Glu; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 -+ Phe; Lys 134 -+ Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Leu
Arg; Gln 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg 81 Vai; Cys
Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Ser 105
Pro; Tyr 106 -+ Glu; Ser 127 -+ Vai; Tyr 132 -+ Phe; Lys 134 -+ Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 - Leu; He 41 Ala; Asp
- 16 035824
Asn; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg 81 Vai; Cys
-+ Ser; Asn 96 -+ Leu; Tyr 100 -+ Asp; Leu 103 -+ Gin; Ser 105 -+
Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Thr 145 Pro;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; lie 41 Ala; Asp 45 Gly; Lys 46 Arg; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68
Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg
181 Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103
Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe;
Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; lie 41 Ala; Leu
Arg; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Asn 65 Asp; Ser 68
Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg
Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103
Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe;
Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; lie 41 Ala; Asp
Asn; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Asn 65 Asp; Ser 68
Glu; Leu 70 -+ Arg; Lys 73 -+ His; Asp 77^ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg
-+ Vai; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 -+ Leu; Tyr 100 -+ Asp; Leu 103 -+
Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe;
Lys 134 Trp; Thr 145 Pro;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Asp 45 -+ Gly; Lys 46 -+ Arg; Gin 49 -+ Met; Tyr 52 -+ Met; Asn 65 -+
Asp; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp
Asp; Arg 81 Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100
Asp; Leu 103 Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai;
Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp; или
Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Leu 42 Arg; Gin
Met; Tyr 52 Met; Asn 65 Asp; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg 81 Vai; Cys
Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gin; Ser 105
Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp.
В остаточной области, т. е. области, не относящейся к положениям последовательности 28, 36, 4042, 45-47, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105-106, 125, 127, 132, 134 и 145, мутеин hNGAL по настоящему раскрытию может включать аминокислотную последовательность дикого типа (природную) за пределами мутированных положений аминокислотной последовательности.
В дополнительных конкретных вариантах осуществления мутеин в соответствии с настоящим раскрытием содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38-53 или их фрагмента или варианта.
Аминокислотная последовательность Pvd III типа-связывающего мутеина hNGAL по настоящему раскрытию может характеризоваться высокой идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90%, в том числе по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38-53.
Настоящее раскрытие также включает структурные гомологи мутеина hNGAL с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38-53, структурные гомологи которых характеризуются гомологией аминокислотной последовательности или идентичностью последовательности, составляющих более чем приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более чем 95% по отношению к указанному мутеину hNGAL.
Pvd III типа-связывающий мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием можно получить посредством мутагенеза природной формы липокалина 2 человека. В некоторых вариантах осуществления мутагенеза замена (или замещение) представляет собой консервативную замену. Однако любая замена, в том числе неконсервативная замена или одна или несколько из иллюстративных замен ниже, предусмотрена в том случае, если мутеин сохраняет свою способность связываться с Pvd I типа и/или он характеризуется идентичностью с впоследствии замещенной последовательностью в том отношении, что
- 17 035824 он характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или более высокой идентичностью с аминокислотной последовательностью зрелого липокалина 2 человека (номер доступа в базе данных
SWISS-PROT P80188).
Варианты применения мутеинов, специфичных к пиовердину
Пиовердины являются основными сидерофорами псевдомонад, таких как P. aeruginosa. Эксперименты in vitro свидетельствовали о потенциальной роли пиовердина P. aeruginosa в высвобождении железа из ферритрансферрина, однако способность пиовердина конкурировать за железо in vivo была продемонстрирована лишь недавно (Meyer et al., 1996, Infection and Immunity, 64, p. 518-523). С помощью мышиной модели ожоговой травмы было отмечено, что отсутствие выработки пиовердина у мутантов, выращенных из вирулентного родительского штамма, коррелировало с потерей вирулентности таких мутантов, и что вирулентность восстанавливалась при добавлении гомологичного пиовердина, происходящего из штамма дикого типа. Кроме того, добавление гетерологичного пиовердина не восстанавливало вирулентность последних мутантов. Таким образом, точное знание пиовердин-опосредованной системы захвата железа, использованной конкретным изолятом P. aeruginosa во время инфицирования, является предпосылкой для развития новых путей лечения инфекций Р. aeruginosa посредством бактериального метаболизма железа, например блокированием биосинтеза пиовердина или пиовердин-опосредованного транспорта железа.
Таким образом, в медицине существуют многочисленные возможные варианты применения пиовердин-связывающих мутеинов по настоящему раскрытию. В одном дополнительном аспекте настоящее раскрытие относится к применению пиовердин-связывающего мутеина, раскрытого в данном документе, для выявления пиовердина (I, II или III типа) в образце, а также соответствующего способа диагностики.
Настоящее раскрытие также включает применение одного или нескольких пиовердин-связывающих мутеинов, как описано в отношении образования комплекса с пиовердином (I, II или III типа).
Таким образом, в другом аспекте настоящего раскрытия раскрытые мутеины используются для выявления пиовердина (I, II или III типа). Такое применение может включать стадии приведения в контакт одного или нескольких указанных мутеинов, в подходящих условиях, с образцом, предположительно содержащим пиовердин, способствуя тем самым образованию комплекса между мутеинами и пиовердином (I, II или III типа), и выявления комплекса с помощью подходящего сигнала.
Поддающийся выявлению сигнал может быть вызван меткой, как объяснялось выше, или изменением физических свойств вследствие связывания, т.е. самого образования комплекса. Одним примером является поверхностный плазмонный резонанс, значение которого меняется во время связывания партнеров по связыванию, из которых один иммобилизован на поверхности, такой как золотая фольга.
Пиовердин-связывающие мутеины, раскрытые в данном документе, можно также использовать для отделения пиовердина (I, II или III типа). Такое применение может включать стадии приведения в контакт одного или нескольких указанных мутеинов, в подходящих условиях, с образцом, предположительно содержащим пиовердин (I, II или III типа), способствуя тем самым образованию комплекса между мутеинами и пиовердином (I, II или III типа), и отделения комплекса от образца.
При использовании раскрытых мутеинов для выявления пиовердина, а также отделения пиовердина (I, II или III типа), мутеины и/или пиовердин, или их домен или фрагмент можно иммобилизовать на подходящей твердой фазе.
В еще одном аспекте в настоящем раскрытии описывается диагностический или аналитический набор, содержащий пиовердин-связывающий мутеин в соответствии с настоящим раскрытием.
В дополнение к его применению в диагностике, в еще одном аспекте настоящее раскрытие охватывает применение пиовердин-связывающего мутеина по настоящему раскрытию или композиции, содержащей такой мутеин, для связывания пиовердина (I, II или III типа) у субъекта и/или подавления или ослабления роста Р. aeruginosa у субъекта.
В еще одном аспекте в настоящем раскрытии описывается способ связывания пиовердина (I, II или III типа) у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества одного или нескольких пиовердин-связывающих мутеинов по настоящему раскрытию или одной или нескольких композиций, содержащих такие мутеины.
В еще одном аспекте настоящее раскрытие включает способ подавления или ослабления роста P. aeruginosa у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества одного или нескольких пиовердин-связывающих мутеинов по настоящему раскрытию или одной или нескольких композиций, содержащих такие мутеины.
Мутеины, специфичные к пиохелину
Кроме того, в настоящем раскрытии удовлетворяется потребность в альтернативных ингибиторах пиохелина путем предоставления мутеинов hNGAL, которые связываются с пиохелином, и их полезных вариантах применения. Соответственно, в настоящем раскрытии также обеспечиваются способы получения и применения пиохелин-связывающих мутеинов, описанных в данном документе, а также композиции, которые можно применять в способах выявления пиохелина в образце или в способах связывания пиохелина у субъекта. Ранее не были описаны такие мутеины hNGAL, характеризующиеся этими при- 18 035824 знаками, связанными со способами применения, предусмотренными в настоящем изобретении.
Иллюстративные мутеины, специфичные к пиохелину
В одном аспекте настоящее раскрытие связано с мутеином hNGAL, который связывает пиохелин в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше, например 1 нМ или меньше, например при измерении с помощью инструмента Biacore Т200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько мутеинов hNGAL по настоящему раскрытию способны связываться с пиохелином в комплексе с железом, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 500 нМ или меньше, например при измерении в анализе ELISA, фактически описанном в примере 5.
В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько мутеинов hNGAL по настоящему раскрытию способны связываться с пиохелином без комплекса с железом, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше, например при измерении в анализе ELISA, фактически описанном в примере 5.
В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько мутеинов hNGAL по настоящему раскрытию способны связываться с пиохелином в комплексе с железом и без такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше, например при измерении в анализе ELISA, описанном в примере 5.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен ингибировать захват железа, опосредованный пиохелином, со значением IC50, составляющим приблизительно 150 нМ или меньше в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В некоторых вариантах осуществления мутеин способен подавлять бактериальный рост нокаута Pvd I (ΔρνόΛ) в анализе, фактически описанном в примере 8.
В данном отношении настоящее раскрытие относится к полипептиду, где указанный полипептид включает в себя мутеин hNGAL, и указанный hNGAL по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или даже больше мутированных аминокислотных остатков в положениях последовательности 28, 34, 36, 40-41, 44-46, 49, 52, 54, 65, 68, 70, 72-74, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134 и 141, и при этом указанный полипептид связывается с пиохелином.
В некоторых вариантах осуществления пиохелин-связывающий мутеин hNGAL по настоящему раскрытию включает в себя в одном или нескольких положениях последовательности 36, 40-41, 49, 52, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) один или несколько из следующих мутированных аминокислотных остатков:
Leu 3 6 -+ His, Met или Vai; Ala 4 0 -+ lie, Gin, Туг или Phe; lie 41 -+ Leu, His или Trp; Gin 49 -+ His,
Arg, Ser или Ala; Tyr 52 -+ Leu, Trp или Pro; Ser 68 -+ Asp или
His; Leu 70 -+ Arg или Trp; Arg 72 -+ His, Tie, Ala, Ser или Gly; Lys 73 -+ Asn, Met, Pro, Phe, Gin или Arg; Asp 77 -+ Arg, Thr, Pro или Asp; Trp 79 -+ Ala, Arg, Lys или Asp; Arg 81 -+ Thr, Tie или
Trp; Asn 96 -+ Met, Asn, Pro или Ala; Tyr 100 -+ Gly, His или Glu; Leu 103 -+ Gly, Met, His или Gin; Tyr 106 -+ Met, Gly, Arg или Trp; Lys 125 -+ Trp, Phe, Gly или Leu; Ser 127 -+ Arg, Trp, Asp или Tie; Tyr 132 -+ Ala, Glu или Thr; и Lys 134 -+ Leu, Vai, Asn или Phe.
В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию включает в себя два или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или даже больше, или все мутированные аминокислотные остатки в данных положениях последовательности зрелого hNGAL.
Кроме того, пиохелин-связывающий мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием может также содержать следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gin 28 -+ His; Vai 34 -+ Leu;
Glu 44 -+ Gly; Asp 45 -+ Gly; Lys -+ Arg or Tyr; Asn 65 -+ Asp; lie 80 -+ Thr; Cys 87 -+ Ser; Leu 94 -+ Phe; Vai 108 -+ Ala; Phe 123 -+ Ser и Thr 141 -+ Ala.
В некоторых дополнительных вариантах осуществления мутеин hNGAL по настоящему раскрытию, который связывается с пиохелином, включает в себя следующие аминокислотные замены по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
- 19 035824
Gln 28 His; Ala 40 lie; lie 41 Leu; Gln 49 His; Tyr
Leu; Ser 68 His; Leu 70 Thr; Arg 72 Lys; Lys 73
Trp; Asp 77^ He; Trp 79 Ser; Arg 81 His; Cys 87 Ser; Asn
Met; Tyr 100 Asn; Leu 103 His; Tyr 106 Met; Lys 125^
Trp; Ser 127 Asp; Tyr 132 Glu; Lys 134 Leu;
Gln 28 His; Leu 36 His; Ala 40 Gln; He 41 Trp; Gln
Arg; Tyr 52 Trp; Ser 68 Asp; Leu 70 Asp; Arg 72
Ala; Lys 73 He; Asp 77^ His; Trp 79 Arg; Arg 81 Thr; Cys
Ser; Tyr 100 His; Leu 103 Gly; Tyr 106 Gly; Lys 125^
Phe; Ser 127 He; Tyr 132 Ala; Lys 134 Phe;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Met; Ala 40 -+ Phe; He 41 -+ His; Gln 49 Ser; Tyr 52 Pro; Ser 68 His; Leu 70 Pro; Arg 72 Trp; Lys 73 Ala; Asp 77^ Ala; Trp 79 Lys; Arg 81 He; Cys
Ser; Asn 96 Ala; Tyr 100 Gly; Leu 103 Met; Tyr 106
Trp; Lys 125^ Gly; Ser 127 Trp; Tyr 132 Thr; Lys 134 Vai;
Gln 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Tyr; He 41 Trp; Gln
Ala; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg 72 Игр; Lys 73 Arg;
Asp 77^ Arg; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Trp; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 -+
Pro; Tyr 100 Glu; Leu 103 Gln; Tyr 106 Arg; Lys 125^ Leu;
Ser 127 Arg; Tyr 132 Ala; Lys 134 Asn;
Gln 28 His; Vai 34 Leu; Leu 36 Met; Ala 40 Phe; He
His; Gln 49 Ser; Tyr 52 Pro; Ser 68 His; Leu 70
Pro; Arg 72 Trp; Lys 73 Ala; Asp 77^ Ala; Trp 79 Lys; He
Thr; Arg 81 He; Cys 87 Ser; Asn 96 Ala; Tyr 100
Gly; Leu 103 Met; Tyr 106 Trp; Phe 123 Ser; Lys 125 Gly; Ser 127 Trp; Tyr 132 Thr; Lys 134 Vai; Thr 141 Ala;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Met; Ala 40 -+ Phe; He 41 -+ His; Gln 49 Ser; Tyr 52 Pro; Ser 68 His; Leu 70 Pro; Arg 72 Trp; Lys 73 Ala; Asp 77^ Ala; Trp 79 Lys; He 80 Thr; Arg 81 He; Cys 87 Ser; Asn 96 Ala; Tyr 100 Gly; Leu 103
Met; Tyr 106 Trp; Phe 123 Ser; Lys 125^ Gly; Ser 127 Trp; Tyr 132 Thr; Lys 134 Vai;
Gln 28 His; Leu 36 His; Ala 40 Gln; lie 41 Trp; Asp 45 Gly; Lys 46 Arg; Gln 49 Arg; Tyr 52 Trp; Ser 68
Asp; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Ala; Lys 73 -+ lie; Asp 77^ Leu; Trp
Arg; Arg 81 Thr; Cys 87 Ser; Tyr 100 His; Leu 103
Gly; Tyr 106 Gly; Lys 125^ Phe; Ser 127 He; Tyr 132 Ala;
Lys 134 -+ Phe;
Gln 28 His; Leu 36 His; Ala 40 Gln; lie 41 Trp; Glu 44 Gly; Lys 46 Tyr; Gln 49 Arg; Tyr 52 Trp; Ser 68
Asp; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Ala; Lys 73 -+ lie; Lys 74 -+ Glu; Asp
His; Trp 79 Arg; Arg 81 Thr; Cys 87 Ser; Leu 94
Phe; Tyr 100 His; Leu 103 Gly; Tyr 106 Gly; Vai 108 Ala;
Lys 125^ Phe; Ser 127 lie; Tyr 132 Ala; Lys 134 Phe; или
Leu 36 His; Ala 40 Gln; lie 41 Trp; Asp 45 Gly; Lys 46 Arg; Gln 49 Arg; Tyr 52 Trp; Asn 65 Asp; Ser 68
Asp; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Ala; Lys 73 -+ lie; Asp 77^ Leu; Trp
Arg; Arg 81 Thr; Cys 87 Ser; Tyr 100 His; Leu 103
Gly; Tyr 106 Gly; Lys 125^ Phe; Ser 127 He; Tyr 132 Ala;
Lys 134 Phe.
В остаточной области, т.е. области, не относящейся к положениям последовательности 28, 34, 36, 40—41, 44-46, 49, 52, 54, 65, 68, 70, 72-74, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134 и 141, мутеин hNGAL по настоящему раскрытию может включать в себя аминокислотную последовательность дикого типа (природную) за пределами мутированных положений аминокислотной последовательности.
В дополнительных конкретных вариантах осуществления мутеин в соответствии с настоящим раскрытием содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-63 или их фрагмента или варианта.
Аминокислотная последовательность пиохелинсвязывающего мутеина hNGAL по настоящему рас- 20 035824 крытию может характеризоваться высокой идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90%, в том числе на по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-63.
Настоящее раскрытие также включает структурные гомологи мутеина hNGAL с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-63, структурные гомологи которых характеризуются гомологией аминокислотной последовательности или идентичностью последовательности, составляющих более чем приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более чем 95% по отношению к указанному мутеину hNGAL.
Пиохелин-связывающий мутеин hNGAL в соответствии с настоящим раскрытием можно получить посредством мутагенеза природной формы липокалина 2 человека. В некоторых вариантах осуществления мутагенеза замена (или замещение) представляет собой консервативную замену. Однако любая замена, в том числе неконсервативная замена или одна или несколько из иллюстративных замен ниже, предусмотрена в том случае, если мутеин сохраняет свою способность связываться с Pvd I типа и/или он характеризуется идентичностью с впоследствии замещенной последовательностью в том отношении, что он характеризуется по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или более высокой идентичностью с аминокислотной последовательностью зрелого липокалина 2 человека (номер доступа в базе данных SWISS-PROT P80188).
2. Варианты применения мутеинов, специфичных к пиохелину
Пиохелин (Pch) является одним из двух основных сидерофоров, вырабатываемых и секретируемых Pseudomonas aeruginosa для ассимиляции железа. Он хелатирует железо во внеклеточной среде и транспортирует его в клетку с помощью специфичного транспортера наружной мембраны, FptA. Pch в значительной степени хелатирует двухвалентные металлы, такие как Zn(II) (pZn=11,8 при p[H] 7,4) и Cu(II) (pCu=14,9 при р[Н] 7,4) и образует главным образом комплексы 1:2 (M2+/Pch). Сидерофоры не только задействованы в перемещении железа (III), но и с большей вероятностью проявляют другие специфичные биологические функции в тонком гомеостазе металлов в микроорганизмах.
Таким образом, в медицине существуют многочисленные возможные варианты применения мутеинов с аффинностью связывания к пиохелину по настоящему раскрытию. В одном дополнительном аспекте настоящее раскрытие относится к применению такого мутеина, раскрытого в данном документе, для выявления пиохелина в образце, а также соответствующего способа диагностики.
Настоящее раскрытие также включает в себя применение одного или нескольких мутеинов с аффинностью связывания к пиохелину, как описано в отношении образования комплекса с пиохелином.
Таким образом, в другом аспекте настоящего раскрытия раскрытые мутеины используются для выявления пиохелина. Такое применение может включать стадии приведения в контакт одного или нескольких указанных мутеинов, в подходящих условиях, с образцом, предположительно содержащим пиохелин, способствуя тем самым образованию комплекса между мутеинами и пиохелином, и выявления комплекса с помощью подходящего сигнала.
Поддающийся выявлению сигнал может быть вызван меткой, как объяснялось выше, или изменением физических свойств вследствие связывания, т. е. самого образования комплекса. Одним примером является поверхностный плазмонный резонанс, значение которого меняется во время связывания партнеров по связыванию, из которых один иммобилизован на поверхности, такой как золотая фольга.
Мутеины, раскрытые в данном документе, можно также использовать для отделения пиохелина. Такое применение может включать стадии приведения в контакт одного или нескольких указанных мутеинов, в подходящих условиях, с образцом, предположительно содержащим пиохелин, способствуя тем самым образованию комплекса между мутеинами и пиохелином, и отделения комплекса от образца.
При использовании раскрытых мутеинов для выявления пиохелина, а также отделения пиохелина, мутеины и/или пиохелин или их домен или фрагмент можно иммобилизовать на подходящей твердой фазе.
Соответственно, можно определить наличие или отсутствие молекулы, такой как пиохелин, например в образце, а также ее концентрацию или содержание.
В еще одном аспекте в настоящем раскрытии описывается диагностический или аналитический набор, содержащий мутеин с аффинностью связывания к пиохелину в соответствии с настоящим раскрытием.
В дополнение к его применению в диагностике, в еще одном аспекте настоящее раскрытие охватывает применение такого мутеина по настоящему раскрытию или композиции, содержащей такой мутеин, для связывания пиохелина у субъекта и/или подавления или ослабления роста P. aeruginosa у субъекта.
В еще одном аспекте в настоящем раскрытии описывается способ связывания пиохелина у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества одного или нескольких мутеинов с аффинностью связывания к пиохелину по настоящему раскрытию или одной или нескольких композиций, содержащих такой мутеин.
- 21 035824
В еще одном аспекте настоящее раскрытие включает способ подавления или ослабления роста P.
aeruginosa у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества одного или нескольких мутеинов с аффинностью связывания к пиохелину по настоящему раскрытию или одной или нескольких композиций, содержащих такой мутеин.
С. Композиции, содержащие пиовердин-связывающий мутеин и/или пиохелин-связывающий мутеин и комбинацию мутеинов
P. aeruginosa представляет собой вид бактерии, которая широко распространена в окружающей среде и способна вызывать очень серьезные инфекции у пациентов в предрасполагающих условиях, таких как кистозный фиброз. P. aeruginosa синтезирует два основных сидерофора, пиовердин (Pvd) и пиохелин (Pch), для обеспечения своих потребностей в железе (III). Считается, что биопленочный способ роста является определяющим для персистентных инфекций P. aeruginosa (Costerton et al., 1999; Singh et al., 2000), а двойная экспрессия генов Pvd и Pch необходима для нормального развития биопленки (Banin et al., 2005).
Учитывая, что P. aeruginosa продуцирует впечатляющее количество факторов вирулентности, причем все они выполняют роль в ее патогенности, предпочтительной стратегией для эффективного подавления вирулентности P. aeruginosa является направленность на несколько факторов вирулентности.
Для данной цели настоящее раскрытие охватывает применение (i) первого мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину I типа, (ii) второго мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину II типа, (iii) третьего мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину III типа, и/или (iv) четвертого мутеина или его полипептида, специфичных к пиохелину, для связывания пиовердина I, II, III типа и/или пиохелина у субъекта. Такое применение предусматривают стадию введения субъекту эффективного количества (i) первого мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину I типа, (ii) второго мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину II типа, (iii) третьего мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину III типа, и/или (iv) четвертого мутеина или его полипептида, специфичных к пиохелину. Настоящее раскрытие также рассматривает применение (i) первого мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину I типа, (ii) второго мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину II типа, (iii) третьего мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину III типа, и/или (iv) четвертого мутеина или его полипептида, специфичных к пиохелину, для предотвращения или уменьшения захвата железа P. aeruginosa у субъекта посредством пиохелина и/или пиовердина. Аналогично, в настоящем раскрытии раскрывается применение (i) первого мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину I типа, (ii) второго мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину II типа, (iii) третьего мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину III типа, и/или (iv) четвертого мутеина или его полипептида, специфичных к пиохелину, для лечения или ослабления инфекции P. aeruginosa и/или образования биопленки у субъекта. В некоторых дополнительных вариантах осуществления инфекция P. aeruginosa может представлять собой острую или хроническую инфекцию.
Первый, второй, третий и/или четвертый мутеины или их полипептиды можно вводить в комбинации, в том числе одновременно, совместно или последовательно. В некоторых вариантах осуществления первый, второй, третий и/или четвертый мутеины или их полипептиды можно включать в композицию, которую можно вводить. Композиция может включать эффективное количество первого, второго, третьего и/или четвертого мутеинов или их полипептидов в качестве активных компонентов, в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым вспомогательным средством, разбавителем или носителем. Первый, второй, третий и/или четвертый мутеины или их полипептиды также можно вводить независимо друг от друга, в том числе с индивидуальными интервалами в независимых временных точках.
В некоторых вариантах осуществления используемый в настоящем раскрытии мутеин, специфичный к пиовердину (I, II или III типа), способен связываться с пиовердинами (соответственно I, II или III типа) с поддающейся выявлению аффинностью, т.е. с константой диссоциации, составляющей по меньшей мере 200 нМ, в том числе приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 25 нМ или приблизительно 15 нМ. В некоторых вариантах осуществления используемый в настоящем раскрытии мутеин, специфичный к пиовердину, способен связываться с пиохелином с поддающейся выявлению аффинностью, т.е. с константой диссоциации, составляющей по меньшей мере 200 нМ, в том числе приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 25 нМ или приблизительно 15 нМ. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления мутеин из комбинации в соответствии с настоящим раскрытием связывается соответственно с пиовердином (I, II или III типа) или пиохелином, с константой диссоциации пиовердина (I, II или III типа соответственно) или пиохелина, составляющей по меньшей мере приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 0,1 нМ, приблизительно 10 пМ или даже меньше. Таким образом, в настоящем раскрытии обеспечивается комбинация (i) мутеина hNGAL, который характеризуется поддающейся выявлению аффинностью к пиовердину I типа (Pvd I s, sa, aKG +/-Fe), (ii) мутеина hNGAL, который характеризуется поддающейся выявлению аффинностью к пиовердину II типа (Pvd II s, sa, aKG +/-Fe), (iii) мутеина hNGAL, который характеризуется поддающейся выяв- 22 035824 лению аффинностью к пиовердину III типа (Pvd III s, sa, aKG +/-Fe) и/или (iv) мутеина hNGAL, который характеризуется поддающейся выявлению аффинностью к пиохелину (Pch +/- Fe).
Дополнительные детали в отношении мутеинов hNGAL с поддающейся выявлению аффинностью к пиовердину можно найти в разделе А настоящего раскрытия.
В особо предпочтительном варианте осуществления мутеин, который является специфичным к пиовердину I типа, показан в любой из SEQ ID NO: 2-18. В особо предпочтительном варианте осуществления мутеин, который является специфичным к пиовердину II типа, показан в любой из SEQ ID NO: 1937. В особо предпочтительном варианте осуществления мутеин, который является специфичным к пиовердину III типа, показан в любой из SEQ ID NO: 38-53.
Дополнительные детали в отношении мутеинов hNGAL с поддающейся выявлению аффинностью к пиохелину были раскрыты в разделе В настоящего раскрытия.
В предпочтительном варианте осуществления мутеин, который является специфичным к пиохелину, показан в любой из SEQ ID NO: 54-63.
Настоящее раскрытие также относится к композиции, содержащей по меньшей одно из следующего: (i) первый мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину I типа, (ii) второй мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину II типа, (iii) третий мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину III типа, и (iv) четвертый мутеин или его полипептид, специфичные к пиохелину, композицию которых можно использовать в способе связывания пиовердина I, II, III типа и/или пиохелина.
Настоящее раскрытие относится к комбинации первого мутеина или его полипептида или композиции, второго мутеина или его полипептида или композиции, третьего мутеина или его полипептида или композиции и/или четвертого мутеина или его полипептида или его композиции. Один из этих мутеинов может связываться с пиовердином (I, II или III типа) в качестве неприродной мишени с поддающейся выявлению аффинностью. Один из этих мутеинов может связываться с пиохелином в качестве неприродной мишени с поддающейся выявлению аффинностью. Таким образом, соответствующий мутеин связывается соответственно с пиовердином I, II, III типа или пиохелином в качестве неприродной мишени. Термин неприродная мишень относится к соединению, которое не связывается с соответствующим липокалином (hNGAL дикого типа) в физиологических условиях. Например, первый мутеин или его полипептид или композиция связывается с пиовердином (I, II или III типа) или пиохелином, и второй, третий или четвертый мутеин или их полипептид или композиция может связываться соответственно с пиохелином или другим типом пиовердина, или наоборот. Комбинацию первого, второго, третьего и/или четвертого мутеинов или их полипептидов или композиций можно представлять в различных формах и направлениях.
В еще одном аспекте в настоящем раскрытии описывается способ связывания пиовердина I, II, III типа и/или пиохелина у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества композиции, которая содержит по меньшей мере одно из следующего: (i) мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину I типа, (ii) мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину II типа, (iii) мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину III типа, и (iv) мутеин или его полипептид, специфичные к пиохелину. В некоторых вариантах осуществления такая композиция содержит два или более, например три или даже все из (i)-(iv).
В еще одном аспекте настоящее раскрытие включает в себя способ подавления или ослабления роста P. aeruginosa у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества композиции, которая содержит по меньшей мере одно из следующего: (i) мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину I типа, (ii) мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину II типа, (iii) мутеин или его полипептид, специфичные к пиовердину III типа, и (iv) мутеин или его полипептид, специфичные к пиохелину. В некоторых вариантах осуществления такая композиция содержит два или более, например три или даже все из (i)-(iv).
Настоящее раскрытие также включает применение (i) первого мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину I типа, (ii) второго мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину II типа, (iii) третьего мутеина или его полипептида, специфичных к пиовердину III типа, и/или (iv) четвертого мутеина или его полипептида, специфичных к пиохелину, для образования комплекса с пиовердином I, II, III типа и/или пиохелином.
Таким образом, в другом аспекте настоящего раскрытия раскрытые мутеины или полипептиды можно использовать для выявления пиовердина и пиохелина. Такое применение может включать стадии приведения в контакт одного или нескольких указанных мутеинов или полипептидов, в подходящих условиях, с образцом, предположительно содержащим пиовердин и/или пиохелин, способствуя тем самым образованию комплекса соответственно между мутеинами или полипептидами и пиовердином и/или между мутеинами и пиохелином, и выявления комплекса с помощью подходящего сигнала.
Поддающийся выявлению сигнал может быть вызван меткой, как объяснялось выше, или изменением физических свойств вследствие связывания, т.е. самого образования комплекса. Одним примером является поверхностный плазмонный резонанс, значение которого меняется во время связывания партнеров по связыванию, из которых один иммобилизован на поверхности, такой как золотая фольга.
Мутеины или полипептиды, раскрытые в данном документе, можно также использовать для отде- 23 035824 ления пиовердина и/или пиохелина. Такое применение может включать стадии приведения в контакт одного или нескольких указанных мутеинов, в подходящих условиях, с образцом, предположительно содержащим пиовердин и/или пиохелин, способствуя тем самым образованию комплекса соответственно между мутеинами и пиовердином и/или между мутеинами и пиохелином, и отделения комплекса от образца.
При использовании раскрытых мутеинов или полипептидов для выявления пиовердина и/или пиохелина, а также отделения пиовердина и/или пиохелина, мутеины и/или пиовердин и пиохелин или их домен или фрагмент можно иммобилизовать на подходящей твердой фазе.
Соответственно можно определить наличие или отсутствие пиовердина и/или пиохелина, например в образце, а также их концентрацию или уровень содержания.
В другом аспекте в настоящем раскрытии предусматривается набор из частей. Набор включает в себя, в одном или нескольких контейнерах, отдельно или совместно, мутеин или полипептид, специфичные к пиовердину I типа, или их композицию, мутеин или полипептид, специфичные к пиовердину II типа, или их композицию, мутеин или полипептид, специфичные к пиовердину III типа, или их композицию, и/или мутеин или полипептид, специфичные к пиохелину, или их композицию. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления набор содержит первый контейнер, который включает первый мутеин или полипептид, специфичные к пиовердину I типа, или их композицию, второй контейнер, который включает в себя второй мутеин или полипептид, специфичные к пиовердину II типа, или их композицию, третий контейнер, который включает в себя третий мутеин или полипептид, специфичные к пиовердину III типа, или их композицию и/или третий контейнер, который включает в себя четвертый мутеин или полипептид, специфичные к пиохелину, или их композицию. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно включает в качестве его неотъемлемой части или в качестве одного или нескольких отдельных документов информацию, относящуюся к содержанию или набору и к применению мутеинов или их полипептидов. В некоторых вариантах осуществления набор может включать одну или несколько композиций, которые разработаны для разбавления в разбавителе. Такой разбавитель, например стерильный разбавитель, можно также включать в набор, например в контейнере.
D. Мутеины по настоящему раскрытию
При использовании в данном документе в контексте мутеинов по настоящему раскрытию, которые связываются с пиовердином или пиохелином, термин специфичный к подразумевает, что мутеин направлен соответственно против пиовердина или пиохелина, связывается или реагирует с ними. Таким образом, под выражениями направляясь к, связываясь с или вступая в реакцию с подразумевается, что мутеин специфически связывается соответственно с пиовердином или пиохелином. Термин специфически в данном контексте означает, что мутеин вступает в реакцию с пиовердиновым белком или пиохелиновым белком, как описано в данном документе, и фактически не реагирует с другим белком. Термин другой белок подразумевает любой белок, не относящийся соответственно к пиовердиновому или пиохелиновому белку, в том числе белки, тесно связанные с пиовердином или пиохелином или гомологичные им, против которых направлены мутеины, раскрытые в данном документе. Однако пиовердиновые или пиохелиновые белки, фрагменты и/или варианты от видов, отличных от человека, таких как описаны в контексте определения субъект, не исключаются термином другой белок. Термин фактически не связывается означает, что мутеин по настоящему раскрытию не связывается с другим белком, т.е. характеризуется перекрестной реактивностью, составляющей менее 30%, предпочтительно 20%, более предпочтительно 10%, особо предпочтительно менее 9, 8, 7, 6 или 5%. Вступает ли мутеин в реакцию специфически, как определено в данном документе выше, можно легко исследовать, помимо прочего, с помощью сравнения реакции мутеина липокалина по настоящему раскрытию с пиовердином или пиохелином и реакции указанного мутеина(ов) с другим белком(ами). Специфичное связывание можно также определять, например, на основании проведения вестерн-блоттинга, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMAтестов, FACS, IHC и картирования с применением пептидов.
Аминокислотная последовательность мутеина в соответствии с настоящим раскрытием характеризуется высокой идентичностью последовательности по отношению к липокалину 2 человека, по сравнению с идентичностью последовательностей с другим липокалином (также см. выше). В данном общем контексте аминокислотная последовательность мутеина из комбинации в соответствии с настоящим раскрытием по меньшей мере фактически аналогична аминокислотной последовательности соответствующего липокалина (hNGAL дикого типа). Соответствующая последовательность мутеина из комбинации в соответствии с настоящим раскрытием фактически аналогична последовательности зрелого hNGAL, например, идентична по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 90%, в том числе по меньшей мере на 95% последовательности зрелого hNGAL. Разумеется, в данном отношении мутеин по настоящему раскрытию может содержать, для сравнения, замены, как описано в данном документе, которые придают мутеину способность связываться соответственно с пиовердином I, II, III типа или пиохелином. Обычно мутеин hNGAL включает в себя одну или несколько мутаций, по отношению к нативной последовательности hNGAL, -аминокислот в четырех петлях на открытом конце лиганд-связывающего сайта hNGAL. Как объяснялось выше, такие области необ- 24 035824 ходимы при определении специфичности связывания мутеина с пиовердином I, II, III типа или пиохелином. Полученный из мутеина hNGAL или его гомолог может иметь один, два, три, четыре или более мутированных аминокислотных остатков в любом положении последовательности в N-концевой области и/или в трех пептидных петлях ВС, DE и FG, организованных на конце β-бочковидной структуры, которая расположена напротив природного связывающего кармана.
Мутеин в соответствии с настоящим раскрытием включает в себя одну или несколько, например две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или даже двадцать замен по сравнению с соответствующим нативным алином hNGAL, при условии, что такой мутеин будет способен связываться соответственно с пиовердином или пиохелином. Например, мутеин может иметь замену в положении, соответствующем отдаленному положению (т.е. в соответствующем положении) hNGAL. В некоторых вариантах осуществления мутеин из комбинации в соответствии с настоящим раскрытием включает в себя по меньшей мере две аминокислотные замены, в том числе 2, 3, 4, 5 или даже более аминокислотных замен нативной аминокислоты на аргининовый остаток. Соответственно нуклеиновая кислота из белка эталонного каркаса, как описано в данном документе, является целью мутагенеза для образования мутеина, который способен связываться соответственно с пиовердином I, II, III типа или пиохелином.
Кроме того, мутеин по настоящему раскрытию может содержать гетерологичную аминокислотную последовательностью на его N- или С-конце, предпочтительно С-конце, такую как Strep-tag, например метку Strep II без нарушения биологической активности (связывания со своей мишенью, например соответственно пиовердином или пиохелином) мутеина.
В частности, для определения того, соответствует ли аминокислотный остаток аминокислотной последовательности мутеина, отличающегося от hNGAL дикого типа, определенному положению в аминокислотной последовательности hNGAL дикого типа, специалист может использовать средства и способы, хорошо известные в данной области техники, например выравнивания, либо вручную либо с помощью компьютерных программ, таких как BLAST2.0, которая означает средство поиска основного локального выравнивания, или ClustalW, или любая другая подходящая программа, которая применима для создания выравниваний последовательностей. Соответственно, hNGAL дикого типа может выступать в роли последовательности, найденной в базе данных или эталонной последовательности, в то время как аминокислотная последовательность мутеина, отличающегося от hNGAL дикого типа, описанного в данном документе, выступает в роли запрашиваемой последовательности. Термины эталонная последовательность и последовательность дикого типа используются в данном документе взаимозаменяемо.
В некоторых вариантах осуществления замена (или замещение) представляет собой консервативную замену. Несмотря на это, любая замена, в том числе неконсервативная замена или одна или несколько из нижеприведенных иллюстративных замен, рассматривается в том случае, если мутеин сохраняет свою способность связываться соответственно с пиовердином I, II, III типа или пиохелином, и/или он характеризуется идентичностью с впоследствии замещенной последовательностью в том отношении, что он по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или больше идентичный исходной последовательности.
Как правило, консервативные замены представляют собой следующие замены, приведенные в соответствии с аминокислотой, подлежащей мутированию, при этом за каждой следует одно или несколько замещений, которые можно считать консервативными:
Ala
-A Gly, Ser, Vai; Arg Lys; Asn Gln, His; Asp -A Glu; Cys -A Ser; Gln Asn; Glu -A Asp; Gly -A Ala; His -A Arg, Asn, Gln; Ile
-A Leu, Vai; Leu -A Ile, Vai; Lys -A Arg, Gln, Glu; Met -A Leu, Tyr, Ile; Phe -A Met, Leu, Tyr; Ser Thr; Thr —> Ser; Trp —> Tyr; Tyr Trp, Phe; Vai -A Ile, Leu.
Другие замены также допустимы и их можно определить эмпирически или в соответствии с другими известными консервативными или неконсервативными заменами. В качестве дополнительного ориентира приведены следующие восемь групп, каждая из которых содержит аминокислоты, которые обычно можно принимать в качестве консервативных замен одной на другую:
аланин (Ala), глицин (Gly);
аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu);
аспарагин (Asn), глутамин (Gln);
аргинин (Arg), лизин (Lys);
изолейцин (Ile), лейцин (Leu), метионин (Met), валин (Val);
фенилаланин (Phe), тирозин (Tyr), триптофан (Trp);
серин (Ser), треонин (Thr) и цистеин (Cys), метионин (Met).
Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то можно вводить более су
- 25 035824 щественные изменения, такие как следующие, или как дополнительно описано ниже в ссылке к классам аминокислот, и подвергать продукты скринингу на наличие требуемой характеристики. Примерами таких более существенных изменений являются:
Ala —> Leu, Не; Arg Gln; Asn Asp, Lys,
Arg, His; Asp —> Asn; Cys —> Ala; Gln —> Glu; Glu —> Gln; His —> Lys; He —> Met, Ala, Phe; Leu —> Ala, Met, норлейцин; Lys —> Asn; Met —> Phe; Phe —> Vai, He, Ala; Trp Phe; Tyr Thr, Ser; Vai —> Met, Phe, Ala.
Существенных изменений биологических свойств hNGAL достигают с помощью выбора замен, которые значительно различаются по своему воздействию на сохранение: (a) структуры полипептидного остова в участке замены, например как лист или спиральная конформация, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте мишени или (c) величину боковой цепи. Природные остатки делятся на группы на основе общих свойств боковой цепи: (1) гидрофобные: норлейцин, метионин, аланин, валин, лейцин, изолейцин; (2) нейтральные гидрофильные: цистеин, серии, треонин; (3) кислые: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; (4) основные: аспарагин, глутамин, гистидин, лизин, аргинин; (5) остатки, которые влияют на ориентацию боковой цепи: глицин, пролин; и (6) ароматические: триптофан, тирозин, фенилаланин.
Неконсервативные замены повлекут за собой обмен члена одного из этих классов на другой класс. Любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании надлежащей конформации hNGAL, также может быть замещен, как правило серином, для повышения устойчивости к окислению молекулы и предупреждения аберрантного сшивания. С другой стороны, для повышения ее устойчивости можно добавить цистеиновую связь(и).
Любую мутацию, в том числе вставку, как описано выше, можно выполнить очень легко в нуклеиновой кислоте, например на уровне ДНК с помощью общепринятых стандартных способов. Иллюстративными примерами изменений аминокислотной последовательности являются вставки или делеции, а также аминокислотные замены. Такие замены могут быть консервативными, т. е. аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком с химически подобными свойствами, в частности в отношении полярности, а также размера. Примерами консервативных замен являются замещения в пределах представителей следующих групп: 1) аланин, серии и треонин; 2) аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; 3) аспарагин и глутамин; 4) аргинин и лизин; 5) изолейцин, лейцин, метионин и валин; и 6) фенилаланин, тирозин и триптофан. С другой стороны, также можно вводить неконсервативные изменения в аминокислотную последовательность. Кроме того, вместо замещения одиночных аминокислотных остатков также возможна вставка или удаление одной или нескольких непрерывных аминокислот с первичной структурой hNGAL при условии, что эти делеции или вставки приводят к образованию мутеина со стабильной укладкой/функционального мутеина.
Модификации аминокислотной последовательности предусматривают направленный мутагенез положений одиночных аминокислот для упрощения субклонирования мутированного гена hNGAL или его частей с помощью включения в состав сайтов расщепления для определенных рестрикционных ферментов. Кроме того, эти мутации также можно включить для дополнительного повышения аффинности мутеина к конкретной мишени, такой как пиовердин или пиохелин. Кроме того, мутации можно вводить для модулирования определенных характеристик мутеина, например, чтобы повысить стабильность укладки, стабильность в сыворотке крови, устойчивость белка или растворимость в воде, или чтобы снизить при необходимости склонность к агрегации. Например, природные цистеиновые остатки можно мутировать в другие аминокислоты для предотвращения образования дисульфидных мостиков. Также можно намеренно мутировать другое положение аминокислотной последовательности на цистеин для введения новых реакционных групп, например для конъюгации с другими соединениями, такими как полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтиловый крахмал (HES), биотин, пептиды или белки, или для образования неприродных дисульфидных связей. Полученный тиоловый фрагмент можно использовать для PEGилирования или HESилирования мутеина, например для увеличения времени полужизни соответствующего мутеина в сыворотке крови.
Также можно мутировать другие положения аминокислотной последовательности на цистеин для введения новых реакционных групп, например для конъюгации с другими соединениями, такими как полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтиловый крахмал (HES), биотин, пептиды или белки, или для образования неприродных дисульфидных связей.
В некоторых вариантах осуществления, в случае если вышеуказанные фрагменты конъюгируют с мутеином по настоящему раскрытию, конъюгация с боковой цепью аминокислоты может быть предпочтительной. Подходящие боковые цепи аминокислот можно встретить в природе в аминокислотной последовательности hNGAL или их можно ввести с помощью мутагенеза. В случае если подходящий сайт связывания вводят с помощью мутагенеза, то одной возможностью является замещение аминокислоты в соответствующем положении на цистеиновый остаток.
По отношению к мутеину липокалина 2 человека иллюстративные возможности такой мутации для
- 26 035824 введения цистеинового остатка в аминокислотную последовательность липокалина, в том числе мутеина липокалина 2 человека, включают введение цистеинового (Cys) остатка по меньшей мере в одно из положений последовательности, которые отвечают положениям последовательности 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 или 158 человеческой последовательности NGAL дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, где мутеин по настоящему раскрытию липокалина 2 человека имеет последовательность, в которой по сравнению с последовательностью с номером доступа к банку данных SWISSPROT/UniProt P80188 цистеин был замещен на другой аминокислотный остаток, соответствующий цистеин можно повторно вводить в последовательность. В качестве иллюстративного примера цистеиновый остаток в положении аминокислоты 87 можно вводить в таком случае с помощью восстановления в цистеин, который изначально присутствует в последовательности с номером доступа SWISS-PROT P80188. Полученный тиоловый фрагмент в боковой цепи любых положений аминокислоты 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 и/или 158 можно использовать для PEGилирования или HESилирования мутеина, например для повышения времени полужизни соответствующего мутеина липокалина 2 человека в сыворотке крови.
В другом варианте осуществления для получения подходящих боковых цепей аминокислот для конъюгирования одного из вышеуказанных соединений с мутеином в соответствии с настоящим раскрытием можно вводить искусственные аминокислоты с помощью мутагенеза. Как правило, эти искусственные аминокислоты разрабатывают для повышения реакционной способности и, таким образом, для облегчения конъюгации с требуемым соединением. Одним примером такой искусственной аминокислоты, которую можно вводить с помощью искусственной tRNA, является параацетилфенилаланин.
Для некоторых вариантов применения мутеинов, раскрытых в данном документе, может быть предпочтительным использовать их в форме белков слияния. В некоторых вариантах осуществления мутеин по настоящему раскрытию является слитым на N-конце или С-конце с белком, белковым доменом или пептидом, например сигнальной последовательностью и/или аффинной меткой.
Аффинные метки, такие как Strep-tag® или Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766), myc-tag, FLAG-tag, His6-tag или HA-tag, или белки, такие как глутатион^-трансфераза, которые также способствуют легкому выявлению и/или очистке рекомбинантных белков, являются дополнительными примерами подходящих партнеров по слиянию. Наконец, белки с хромогенными или флуоресцентными свойствами, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или желтый флуоресцентный белок (YFP), также являются подходящими партнерами по слиянию для мутеинов по настоящему раскрытию.
Как правило, можно метить мутеины по настоящему раскрытию соответствующим химическим соединением или ферментом, которые прямо или косвенно образуют поддающееся выявлению соединение или сигнал в химической, физической, оптической или ферментативной реакции. Примером физической реакции, и в то же время оптической реакции/маркера, является эмиссия флуоресценции при облучении или эмиссия рентгеновских лучей при использовании радиоактивной метки. Щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и β-галактозидаза являются примерами ферментативных меток (и в то же время оптических меток), которые катализируют образование хромогенных продуктов реакции. Как правило, все метки, широко используемые для антител (кроме тех, которые используются исключительно с фрагментом сахара в части Fc иммуноглобулинов) также можно использовать для конъюгации с мутеинами по настоящему раскрытию. Мутеины по настоящему раскрытию также можно конъюгировать с любым подходящим терапевтически активным средством, например, для целенаправленной доставки таких средств в конкретную клетку, ткань или орган, или для избирательного воздействия на клетки, например опухолевые клетки, без воздействия на окружающие нормальные клетки. Примеры таких терапевтически активных средств включают радионуклиды, токсины, небольшие органические молекулы и терапевтические пептиды (такие как пептиды, выступающие в роли агонистов/антагонистов рецептора клеточной поверхности, или пептиды, конкурирующие за сайт связывания белка с конкретной клеточной мишенью). Однако мутеины по настоящему раскрытию можно также конъюгировать с терапевтически активными нуклеиновыми кислотами, такими как молекулы антисмысловых нуклеиновых кислот, небольшие интерферирующие РНК, микро-РНК или рибозимы. Такие конъюгаты можно получать с помощью способов, хорошо известных в данной области техники.
Как отмечено выше, в некоторых вариантах осуществления мутеин по настоящему раскрытию можно конъюгировать с фрагментом, который увеличивает время полужизни мутеина в сыворотке крови (по данному вопросу см. также публикацию РСТ WO 2006/56464, где такие стратегии конъюгации описаны в отношении мутеинов желатиназа-ассоциированного липокалина нейтрофилов человека с аффинностью связывания CTLA-4). Фрагментом, который увеличивает время полужизни в сыворотке крови, может быть молекула полиалкиленгликоля, гидроксиэтиловый крахмал, молекулы жирных кислот, таких как пальмитиновая кислота (Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol. Rev. 52, 1-9), часть Fc иммуноглобулина, домен CH3 иммуноглобулина, домен СН4 иммуноглобулина, альбумин-связывающий пептид или альбумин-связывающий белок, трансферрин, и это названы лишь некоторые из них. Альбумин-связывающий белок может представлять собой бактериальный альбумин-связывающий белок, антитело, фрагмент ан
- 27 035824 титела, в том числе доменные антитела (см., например, патент США 6696245), или мутеин со активностью связывания по отношению к альбумину. Соответственно, подходящие партнеры по конъюгации для увеличения времени полужизни мутеина по настоящему раскрытию включают альбумин-связывающий белок, например бактериальный альбумин-связывающий домен, такой как таковой стрептококкового белка G (Konig, Т., & Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Другими примерами альбуминсвязывающих пептидов, которые можно использовать в качестве партнера по конъюгации, являются например таковые, имеющие консенсусную последовательность Cys-Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, где Xaai представляет собой Asp, Asn, Ser, Thr или Trp; Хаа2 представляет собой Asn, Gln, His, Ile, Leu или Lys; Xaa3 представляет собой Ala, Asp, Phe, Trp или Tyr и Хаа4 представляет собой Asp, Glly, Leu, Phe, Ser или Thr, как описано в патентной заявке США № 2003/0069395 или Dennis et al. (SEQ ID NO: 131; Dennis, M. S., Zhang, M., Meng, Y. G., Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. & Damico, L. A. (2002) J Biol Chem 277, 35035-35043).
В соответствии с другими вариантами осуществления сам альбумин (Osborn, B.L. et al., 2002, J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548) или биологически активный фрагмент альбумина можно использовать в качестве партнера по конъюгации мутеина по настоящему раскрытию. Термин альбумин включает все альбумины млекопитающих, такие как сывороточный альбумин или альбумин бычьей сыворотки или альбумин крысы. Альбумин или его фрагмент можно получить рекомбинантным путем, как описано в патенте США № 5728553 или Европейских патентных заявках №№ EP 0330451 и EP 0361991. Рекомбинантный альбумин человека (Recombumin®) Novozymes Delta Ltd. (Ноттингем, Великобритания) можно конъюгировать или сливать с мутеином по настоящему раскрытию для увеличения времени полужизни мутеина.
Если альбумин-связывающий белок представляет собой фрагмент антитела, то он может представлять собой доменное антитело. Доменные антитела (dAb) разрабатывают для обеспечения точного контроля биофизических свойств и времени полужизни in vivo с целью создания оптимального профиля безопасности и эффективности продукта. Доменные антитела коммерчески доступны, например, от компании Domantis Ltd. (Кембридж, Великобритания, и Массачусетс, США).
С помощью трансферрина в качестве фрагмента для увеличения времени полужизни мутеинов по настоящему раскрытию мутеин можно генетически сливать с N- или С-концом негликозилированного трансферрина, или обоими. Негликозилированный трансферрин имеет время полужизни 14-17 дней, а трансферриновый белок слияния будет аналогичным образом иметь увеличенное время полужизни. Трансферриновый переносчик также обеспечивает высокую биодоступность, биораспределение и стабильность в кровотоке.
Данная технология коммерчески доступна от компании BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, Пенсильвания, США). Рекомбинантный трансферрин человека (DeltaFerrin™) для применения в качестве белкового стабилизатора/партнера для увеличения времени полужизни также коммерчески доступен от компании Novozymes Delta Ltd. (Ноттингем, Великобритания).
Если часть Fc иммуноглобулина используется с целью увеличения времени полужизни мутеинов по настоящему раскрытию, то можно использовать технологию SynFusion™, коммерчески доступную от компании Syntonix Pharmaceuticals, Inc (Массачусетс, США). Применение данной технологии слияния Fc способствует созданию биофармацевтических препаратов более длительного действия, и например может состоять из двух копий мутеина, связанного с Fc-областью антитела для улучшения фармакокинетики, растворимости и эффективности производства.
Еще одной альтернативой увеличению времени полужизни мутеинов по настоящему раскрытию является слияние с N- или С-концом мутеинов длинных, бесструктурных, гибких последовательностей с высоким содержанием глицина (например, полиглицина с приблизительно 20-80 последовательными глициновыми остатками). Данный подход, раскрытый например в WO 2007/038619, также был назван rPEG (рекомбинантный PEG).
Если в качестве партнера по конъюгации используется полиалкиленгликоль, то полиэтиленгликоль может быть замещенным, незамещенным, линейным или разветвленным. Он также может быть активированным полиалкиленовым производным. Примерами подходящих соединений являются молекулы полиэтиленгликоля (PEG), как описано в WO 99/64016, в патенте США № 6177074 или в патенте США № 6403564 по отношению к интерферону, или как описано для других белков, таких как PEGмодифицированная аспарагиназа, PEG-аденозиндезаминаза (PEG-ADA) или PEG-супероксиддисмутаза (см., например, Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-14 8). Молекулярный вес такого полимера, например полиэтиленгликоля, может варьировать от приблизительно 300 до приблизительно 70000 Да, в том числе, например, полиэтиленгликоль с молекулярным весом приблизительно 10000, приблизительно 20000, приблизительно 30000 или приблизительно 40000 Да. Кроме того, как описано например в патентах США №№ 6500930 или 6620413, углеводные олиго- и полимеры, такие как крахмал или гидроксиэтилкрахмал (HES), можно конъюгировать с мутеином по настоящему раскрытию с целью увеличения времени полужизни в сыворотке крови.
- 28 035824
Кроме того, раскрытый в данном документе мутеин можно сливать с фрагментом, который может придавать новые характеристики мутеинам по настоящему раскрытию, такие как ферментативная активность или аффинность связывания по отношению к другим молекулам. Примерами подходящих партнеров по слиянию являются щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глутатион^-трансфераза, альбуминсвязывающий домен белка G, белок А, фрагменты антител, домены олигомеризации или токсины.
В частности, можно сливать мутеин, раскрытый в данном документе, с активным сайтом отдельного фермента таким образом, чтобы оба компонента полученного в результате белка слияния совместно выступали в роли данной терапевтической мишени. Связывающий домен мутеина присоединяется к мишени, вызывающей заболевание, способствуя подавлению биологической функции мишени доменом фермента.
Настоящее раскрытие также относится к молекулам нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), которые включают в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие мутеины по настоящему раскрытию. Поскольку вырожденность генетического кода допускает замены определенных кодонов на другие кодоны, определяющие одну и ту же аминокислоту, то настоящее раскрытие не ограничено определенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин, описанный в данном документе, но охватывает все молекулы нуклеиновых кислот, которые включают нуклеотидные последовательности, кодирующие функциональный мутеин. В данном отношении в настоящем раскрытии предусматриваются нуклеотидные последовательности, кодирующие некоторые мутеины по настоящему раскрытию, как показано в SEQ ID NO: 65-126.
В одном варианте осуществления настоящего раскрытия способ включает воздействие на молекулу нуклеиновой кислоты мутагенеза в нуклеотидных триплетах, кодирующих по меньшей мере одну или даже несколько положений последовательности, соответствующих положениям последовательности 28, 34, 36, 39-42, 44-47, 49, 52, 54-55, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134, 141 и 145 линейной полипептидной последовательности NGAL человека (SEQ ID NO: 2).
Настоящее раскрытие также включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутеины по настоящему раскрытию, которые включают в себя дополнительные мутации за пределами указанных положений последовательности экспериментального мутагенеза. Такие мутации часто являются устойчивыми и оказывается могут даже быть предпочтительными, например если они способствуют повышенной эффективности укладки, стабильности в сыворотке крови, термостабильности или аффиности связывания с лигандами мутеинов.
Молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в настоящей заявке, можно функционально связывать с регуляторной последовательностью (или регуляторными последовательностями) для обеспечения экспрессии молекулы данной нуклеиновой кислоты.
Молекулу нуклеиновой кислоты, такую как ДНК, обозначают как способную экспрессировать молекулу нуклеиновой кислоты или способную обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности, если она включает в себя элементы последовательности, которые содержат информацию, относящуюся к регуляции транскрипции и/или трансляции, и при этом такие последовательности функционально связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид. Функциональная связь представляет собой связь, в которой регуляторные элементы последовательности и последовательность, подлежащая экспрессии, связаны так, что обеспечивается экспрессия генов. Точная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии генов, может варьировать у разных видов, однако как правило такие области включают в себя промотор, который у прокариот содержит собственно промотор, т.е. элементы ДНК, направляющие инициацию транскрипции, а также элементы ДНК, которые при транскрипции в РНК будут сигнализировать об инициации трансляции. Эти промоторные области в норме включают 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как -35/-10 боксы и элемент Шайна-Дальгарно у прокариот или ТАТА-бокс, СААТпоследовательности и 5'-кэпирующие элементы у эукариот. Такие области также могут включать энхансерные и репрессорные элементы, а также транслируемый сигнал и лидерные последовательности для направления нативного полипептида в конкретный компартмент клетки-хозяина.
Кроме того, 3'-некодирующие последовательности могут содержать регуляторные элементы, участвующие в терминации транскрипции, полиаденилировании и т.п. Однако если эти последовательности терминации не являются достаточно функциональными в определенной клетке-хозяине, то их можно заменить сигналами, функциональными в данной клетке.
Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию может включать в себя регуляторную последовательность, такую как промоторная последовательность. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию включает в себя промоторную последовательность и последовательность терминации транскрипции. Подходящими промоторами прокариот являются, например, промотор tet, промотор lacUV5 или промотор Т7. Примерами промоторов, пригодных для экспрессии в эукариотических клетках, являются промоторы SV40 или промотор CMV.
Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему раскрытию могут также быть частью вектора или средства клонирования любого другого типа, такого как плазмида, фагмида, фаг, бакуловирус, космида или искусственная хромосома.
- 29 035824
В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты включена в фазмиду. Фазмидный вектор означает вектор, кодирующий умеренный фаг, такой как М13 или f1, или его функциональную часть, слитую с cDNA, представляющей интерес. После суперинфекции бактериальных клеток хозяев данным фагмидным вектором и соответствующим хелперным фагом (например, М13К07, VCS-M13 или R408) вырабатываются частицы интактных фагов, обеспечивая тем самым физическое связывание кодируемой гетерологичной cDNA со ее соответствующим полипептидом, выявляемом на поверхности фага (см., например, Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424, или Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93).
Такие средства клонирования могут включать в себя, кроме вышеописанных регуляторных последовательностей и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин, как описано выше, последовательности репликации и регуляторные последовательности, полученные от видов, сопоставимых с клеткой-хозяином, которая используется для экспрессии, а также селективные маркеры, придающие селективный фенотип трансформированным или трансфицированным клеткам. Большое количество подходящих клонируемых векторов известны в данной области техники и коммерчески доступны.
Молекулу ДНК, кодирующую мутеин, как описано в данном документе, в частности клонируемый вектор, содержащий кодирующую последовательность такого мутеина, можно трансформировать в клетку-хозяина, способную экспрессировать ген. Трансформацию можно выполнить с помощью стандартных методик. Таким образом, настоящее раскрытие также направлено на клетку-хозяина, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, как раскрыто в данном документе.
Трансформированные клетки-хозяева культивируют в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей белок слияния по настоящему раскрытию. Подходящими клетками-хозяевами могут быть прокариотические, такие как Escherichia coli (E. coli) или Bacillus subtilis, или эукариотические, такие как Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, клетки насекомых SF9 или High5, иммортализованные линии клеток млекопитающих (например, клетки HeLa или клетки СНО) или первичные клетки млекопитающих.
Настоящее раскрытие также относится к способу получения мутеина или его полипептида, как описано в данном документе, где мутеин или полипептид, фрагмент мутеина или полипептида или белок слияния мутеина или полипептида и другого полипептида получают начиная с нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин или полипептид, посредством способов генной инженерии. Способ можно осуществлять in vivo, мутеин или полипептид можно получать, например, в бактериальном или эукариотическом организме-хозяине и затем выделять из данного организма-хозяина или его культуры. Также можно получать белок in vitro, например с помощью системы трансляции in vitro.
При получении мутеина или его полипептида in vivo нуклеиновую кислоту, кодирующую такой мутеин или полипептид, вводят в подходящий бактериальный или эукариотический организм-хозяин посредством технологии рекомбинантной ДНК (как уже изложено выше). Для данной цели клетку-хозяина сначала трансформируют клонирующим вектором, который включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин, как описано в данном документе, с помощью общепринятых стандартных способов. Затем клетку-хозяина культивируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию гетерологичной ДНК и, таким образом, синтез соответствующего полипептида. Впоследствии полипептид извлекают либо из клетки, либо из среды для культивирования.
В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, такую как ДНК, раскрытую в настоящей заявке, можно функционально связывать с другой молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию для обеспечения экспрессии белка слияния по настоящему раскрытию. В данном отношении функциональная связь представляет собой связь, в которой элементы последовательности первой молекулы нуклеиновой кислоты и элементы последовательности второй молекулы нуклеиновой кислоты соединяют таким образом, чтобы обеспечить экспрессию белка слияния в виде одного полипептида.
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления природную дисульфидную связь между Cys 76 и Cys 175 можно удалить в мутеинах hNGAL по настоящему раскрытию. Соответственно, такие мутеины можно получать в клеточном компартменте, имеющем восстанавливающую окислительновосстановительную среду, например, в цитоплазме грамотрицательных бактерий.
В случае если мутеин по настоящему раскрытию включает в себя внутримолекулярные дисульфидные связи, предпочтительно направлять образующийся полипептид в клеточный компартмент, имеющий окисляющую окислительно-восстановительную среду, с помощью соответствующей сигнальной последовательности. Такая окисляющая среда может быть представлена периплазмой грамотрицательных бактерий, таких как Е. coli, во внеклеточной среде грамположительных бактерий или в просвете эндоплазматической сети эукариотических клеток, и обычно она способствует образованию структурных дисульфидных связей.
Однако также можно получить мутеин или его полипептид по настоящему раскрытию в цитозоле клетки-хозяина, предпочтительно Е. coli. В данном случае мутеин или полипептид можно непосредственно получить в растворимом или уложенном состоянии, или извлечь в форме телец включения, с последующей ренатурацией in vitro. Дополнительным вариантом является применение конкретных штам- 30 035824 мов хозяина, имеющих окисляющую внутриклеточную среду, которая может обеспечить таким образом образование дисульфидных связей в цитозоле (Venturi et al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8.).
Однако мутеин или полипептид, описанные в данном документе, необязательно можно конструировать или получать только с помощью генной инженерии. Наоборот, такой мутеин или полипептид можно также получить с помощью химического синтеза, такого как метод твердофазного пептидного синтеза Меррифильда или с помощью транскрипции и трансляции in vitro. Например, является возможным, чтобы перспективные мутации выявляли с помощью молекулярного моделирования и затем синтезировали требуемый (разработанный) полипептид in vitro и исследовали активность связывания в отношении I, II, III типа или пиохелина. Способы твердофазного и/или жидкофазного синтеза белков хорошо известны в данной области техники (см., например, Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43).
В другом варианте осуществления мутеин или полипептид по настоящему раскрытию можно получать с помощью транскрипции/трансляции in vitro с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области техники.
Опытному специалисту будут понятны способы, полезные для получения мутеинов или их полипептидов, предполагаемых настоящим раскрытием, однако такие белковые последовательности или последовательности нуклеиновых кислот в явной форме в данном документе не раскрыты. В качестве общих сведений такие модификации аминокислотной последовательности включают, например, направленный мутагенез положений одиночных аминокислот для упрощения субклонирования мутированного гена hNGAL или его частей с помощью включения в состав сайтов расщепления для определенных рестрикционных ферментов. Кроме того, такие мутации также можно включать в состав для дополнительного повышения аффинности мутеина к своей мишени (например, соответственно пиовердину или пиохелину). Кроме того, мутации можно вводить для модулирования определенных характеристик мутеина с тем, чтобы повысить стабильность укладки, стабильность в сыворотке крови, устойчивость белка или растворимость в воде или чтобы снизить при необходимости склонность к агрегации. Например, природные цистеиновые остатки можно мутировать в другие аминокислоты для предотвращения образования дисульфидных мостиков.
Мутеины или их полипептиды, раскрытые в данном документе, и их производные можно использовать во многих областях, аналогичного антителам или их фрагментам. Например, мутеины можно использовать для мечения ферментом, антителом, радиоактивным веществом или любой другой группой, имеющей биохимическую активность или определенные характеристики связывания. При выполнении этого их соответствующие мишени или их конъюгаты или белки слияния можно выявлять или приводить в контакт с ними. Кроме того, мутеины или их полипептиды по настоящему раскрытию могут применяться для выявления химических структур посредством общепринятых аналитических способов (например, ELISA или вестерн-блот) или с помощью микроскопии и иммуносенсоров. В данном отношении сигнал детекции может быть получен непосредственно с помощью подходящего конъюгата мутеина или белка слияния или опосредованно с помощью иммунохимической детекции связанного мутеина посредством антитела.
Дополнительные цели, преимущества и характеристики по настоящему раскрытию будут очевидны специалистам в данной области техники при изучении следующих примеров и сопровождающих их фигур, которые не носят ограничивающий характер. Таким образом следует понимать, что несмотря на то, что настоящее раскрытие определенным образом раскрыто с помощью иллюстративных вариантов осуществления и необязательных характеристик, за модификацией и изменением раскрытий, осуществляемых в данном документе, можно обращаться к специалистам в данной области техники, и такие модификации и изменения находятся в пределах объема настоящего раскрытия.
V. Примеры
Пример 1. Очистка и биотинилирование сидерофоров Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa продуцирует три группы пиовердинов, т. е. пиовердин I типа, пиовердин II типа и пиовердин III типа. Каждая группа имеет три формы, различающиеся боковой цепью, которая представляет собой сукцинил, сукцинамид или α-кетоглутарил. Кроме того, P. aeruginosa продуцирует пиохелин. Все десять сидерофоров могут образовывать комплексы с железом в форме Fe3+.
Для выбора и скрининга мутеинов, представляющих интерес, сидерофоры можно биотинилировать. Биотинилирование выполняли в отношении варианта сукцинила пиовердина I типа в боковой цепи сукцинила, в отношении варианта сукцинила пиовердина II типа в боковой цепи L-орнитина и в отношении варианта сукцинила пиовердина III типа, главным образом в боковой цепи глицина. Пиохелин биотинилировали в фенольном кольце.
Пример 2. Выбор мутеинов, специфически связывающихся с сидерофорами P. aeruginosa
Библиотеки на основе hNGAL, созданные с помощью случайного мутагенеза зрелого hNGAL, использовали для выбора мутеинов, специфически связывающихся с различными сидерофорами Р. aeruginosa. Биотинилированный и железосодержащий сукцинил Pvd I, сукцинил Pvd II и сукцинил Pvd III, а также биотинилированный пиохелин, не содержащий железа, использовали в независимых способах фагового дисплея и выбора.
- 31 035824
2x1012 фагмид из этих библиотек инкубировали с 200 или 500 нМ или 1 мкМ биотинилированной мишени. Парамагнитные гранулы, покрытые нейтравидином или стрептавидином, использовали для захвата мишени/фагмидных комплексов, которые затем выделяли с помощью магнита. Несвязанные фагмиды удаляли промыванием гранул PBST или PBS. Связанные фагмиды сначала элюировали с помощью 300 мкл 70 мМ триэтиламина в течение 10 мин, после чего выполняли немедленную нейтрализацию супернатанта с помощью 100 мкл 1 М Трис-Cl с pH 6,0. После одного промежуточного цикла промывания остаточные фагмиды элюировали с помощью 100 мМ глицина с pH 2,2 в течение 10 мин, после чего выполняли немедленную нейтрализацию с помощью 50 мкл 0,5 М Трис-основания. Обе элюционные фракции объединяли и использовали для инфицирования 4 мл XLl-голубой культуры Е. coli (OD550 0,45-0,6) для реамплификации. После инкубации в течение 30 мин при перемешивании, бактерии собирали центрифугированием при 5000xg в течение 2 мин, ресуспендировали в 1 мл среды 2xYT и помещали на три больших планшета с агаром LB/Amp (10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, pH 7,5, 15 г/л агара, 100 мкг/мл ампициллина). Планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 32°С. Инфицированные клетки соскребали с агаровых планшетов с помощью 50 мл среды 2xYT, обогащенной 100 мкг/мл ампициллина (2xYT/Amp). 50 мл среды 2xYT/Amp вводили с соответствующим объемом бактериальной суспензии для достижения OD550 0,08. Культуру инкубировали при температуре 37°С на шейкере (160 об/мин) до достижения OD550 0,5 и затем инфицировали хелперными фагами (1,5x1ο11 pfu) при инкубации в течение 15 мин при осторожном перемешивании и в течение 45 мин на шейкере при температуре 37°С. Затем добавляли канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл с целью выбора бактерий, инфицированных хелперными фагами. В конечном итоге экспрессию мутеинов pIII-hNGAL индуцировали добавлением 25 нг/мл ангидротетрациклина.
Через 15 ч инкубации при температуре 24°С супернатант культуры удаляли центрифугированием (5000xg в течение 20 мин). Затем 20 мл супернатанта пропускали через полиэфирсульфоновую мембрану с размером пор 0,22 мкм. К фильтрату добавляли 5 мл раствора, содержащего 20% (вес./об.) PEG-8000 и 15% (вес./об.) NaCl в воде, и осторожно смешивали. Перед центрифугированием в течение 20 мин при 4°С и 5000xg раствор инкубировали в течение 30 мин на льду. Осадок, содержащий фагмиды, растворяли в 1 мл буфера, содержащего 200 мМ борной кислоты, 160 мМ NaCl и 1 мМ EDTA. Нерастворенные частицы удаляли центрифугированием (5000xg в течение 5 мин). Супернатант переносили в чистую пробирку и смешивали с 200 мкл раствора, содержащего 20% (вес./об.) PEG-8000 и 15% (вес./об.) NaCl в воде. Раствор инкубировали в течение 30 мин на льду и затем осажденные фагмиды собирали центрифугированием (5000xg в течение 5 мин). Фагмиды ресуспендировали в PBS, обогащенном 50 мМ бензамидина, и использовали для следующего цикла выбора фагмид.
Выполняли четыре последовательных цикла выбора.
Использовали различные условия промывания: i) восемь раз с помощью 1 мл PBS/T, 5 мин инкубации для каждой стадии промывания во всех 4 циклах выбора, ii) число циклов промывания увеличивали от 1 до 4 циклов, iii) быстрые стадии промывания изменяли за счет 5 мин стадий инкубации-промывания и число стадий промывания увеличивали от цикла к циклу.
Фагмидную ДНК получали из клеток Е. coli, инфицированных с помощью продукта четвертого цикла выбора, и кассету мутеина hNGAL выделяли расщеплением ДНК с использованием BstXl и последующей очистки с помощью электрофореза в агарозном геле стандартными способами (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual). Кассету мутеина hNGAL вставляли в аналогичный разрезанный вектор, который обеспечивает выработку бактериями мутеинов hNGAL под контролем тетрациклинового промотора. CaCl2-компетентные TG1-F' клетки трансформировали с помощью лигирующей смеси и помещали на планшеты LB/Amp.
Для оптимизации Pvd I, Pvd II, Pvd III и Pch-специфичных мутеинов создавали дополнительные библиотеки на основе мутеина под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и затем под SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 45. Библиотеки создавали с помощью способов на основе смещенной рандомизации выбранных положений или полимеразной цепной реакции (ПЦР) сниженной точности. Выбор мутеинов выполняли как описано, но с повышенной строгостью.
Для облегчения экспрессии в эукариотических клетках удаляли потенциальные сайты Nгликозилирования (Asn-X-Ser/Thr).
Кроме того, для дополнительной оптимизации устойчивости вводили мутации.
Пример 3. Выявление мутеинов, специфически связывающихся с соответствующими сидерофорами P. aeruginosa, с помощью скрининга ELISA высокой производительности
Отдельные колонии использовали для внесения среды 2xYT/Amp и роста в течение ночи (14-18 ч.) до достижения устойчивой фазы. Затем 50 мкл 2xYT/Amp вводили из культур устойчивой фазы и инкубировали в течение 3 ч при 37°С и затем смещали до 22°С до достижения OD595 0,6-0,8. Выработку мутеинов индуцировали добавлением 10 мкл среды 2xYT/Amp, обогащенной 1,2 мкг/мг ангидротетрациклина. Культуры инкубировали при 22°С до следующего дня. После добавления 40 мкл 5% (вес./об.) BSA в PBS/T и инкубации в течение 1 ч при 25°С культуры были готовы для использования в скрининговых
- 32 035824 анализах.
Специфичное связывание выделенных мутеинов с соответствующими сидерофорами-мишенями изучали с помощью покрытия смеси нейтравидина и стрептавидина в соотношении 1:1 (5 мкг/мл в PBS) в течение ночи при 4°С на микротитрационных планшетах. После блокирования в течение 1ч с помощью 2% BSA в PBST соответствующий биотинилированный сидерофор-мишень, используемый для выбора, захватывали на покрытых микротитрационных планшетах при концентрации 1,5-2,5 мкг/мл в PBS/T. Планшеты, аналогичным образом покрытые биотинилированным альдостероном, использовали при скрининге в качестве отрицательной контрольной мишени. Затем 20 мкл BSA-блокированных культур добавляли в покрытый микротитрационный планшет, содержащий захваченную мишень или альдостерон, и инкубировали в течение 1 ч при 25°С. Связанные мутеины выявляли в течение 1 ч после инкубации с использованием антитела к Т7, конъюгированного с пероксидазой хрена (Merck KgaA, Дармштадт), или антитела к Streptag, конъюгированного с пероксидазой хрена (IBA, Геттинген). Для количественного определения добавляли 20 мкл флуорогенного пероксидазного субстрата QuantaBlu и определяли флуоресценцию при длине волны возбуждения 320 нм и длине волны излучения 430 нм. Затем секвенировали мутеины, специфически связывающиеся с соответствующими сидерофорами-мишенями.
Для выбора мутеинов с повышенной аффинностью и устойчивостью выполняли скрининг i) со сниженной концентрацией антигенов и/или ii) с конкуренцией с небиотинилированной мишенью и/или iii) с инкубированием супернатанта для скрининга при 65°С или 70°С перед добавлением к целевому планшету и/или iv) с использованием форматов обратного скрининга, где мутеины захватывали с использованием Streptag на микротитрационных планшетах, покрытых антителом к Streptag, добавляли различные концентрации биотинилированной мишени и выявляли с помощью экстравидина-HRP (Sigma Aldrich, St. Louis, МО).
Пример 4. Экспрессия мутеинов
Уникальные мутеины экспрессировали с использованием С-концевой последовательности SAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 127; в том числе использовали SA-линкер и Strep-tag® II, WSHPQFEK (SEQ ID NO: 128) в Е. coli в среде 2YT-Amp для очистки мутеинов после экспрессии с помощью аффинной хроматографии с использованием стрептактина и препаративной эксклюзионной хроматографии.
Пример 5. Аффинность мутеинов по отношению к растворимым сидерофорам P. aeruginosa, определенная на основе ELISA
Связывание мутеинов в растворе анализировали с помощью ELISA связывания в растворе, принцип которого был следующим: исследуемый мутеин в постоянной концентрации инкубировали с лигандами в различных концентрациях (Pvd I s, sa, aKG +/-Fe/Pvd II s, sa, aKG +/-Fe/Pvd III s, sa, aKG +/Fe/Pch +/-Fe) в течение 1 ч. После этой предварительной инкубации в растворе аликвоту смеси мутеин/лиганд переносили на планшет для ELISA с биотилинированными Pvd I s ( + Fe), Pvd II s ( + Fe), Pvd III s (+Fe) или Pch, иммобилизованными с использованием нейтравидина, для измерения остаточной концентрации свободных мутеинов. Концентрацию свободных (не связанных с лигандами) мутеинов определяли с помощью количественной настройки ELISA.
Подробно, 384-луночный планшет, пригодный для измерений флуоресценции (Greiner FLUOTRAC™ 600 с черным плоским дном, с высокой степенью связывания) покрывали 20 мкл нейтравидина при концентрации 5 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°С. После промывания покрытые нейтравидином лунки блокировали 100 мкл блокирующего буфера, содержащего 0,1% Tween 20 и 2% BSA (PBS-T/BSA), в течение 1 ч при комнатной температуре. После повторного промывания 20 мкл биотинилированного пиовердина или пиохелина в блокирующем буфере в концентрации 1 мкг/мл добавляли в течение 1 ч при комнатной температуре и избыточный реагент удаляли.
Мутеины в фиксированной концентрации инкубировали в растворе с лигандом в различной концентрации (Pvd I s, sa, aKG + /-Fe/Pvd II s, sa, aKG +/-Fe/Pvd III s, sa, aKG +/-Fe/Pch +/-Fe) с использованием подходящей исходной концентрации, которую серийно разбавляли в соотношении 1:3 до пикомолярного диапазона в PBS-T/BSA. Через 1 ч после инкубации при комнатной температуре 20 мкл реакционной смеси переносили в 384-луночный планшет, на который иммобилизовали биотинилированный пиовердин или пиохелин для захвата несвязанных (свободных) мутеинов в течение 20 мин при комнатной температуре. Для обеспечения трансформации считываемых показателей ELISA в абсолютные концентрации свободных мутеинов, стандартную кривую, содержащую различные концентрации мутеинов, получали в PBS-T/BSA, и также инкубировали в течение 20 мин на том же планшете ELISA.
Остаточные супернатанты снимали и 20 мкл антитела к hNGAL, меченого HRP, добавляли в заранее определенной оптимальной концентрации в PBS-T/BSA и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитело к hNGAL получали иммунизацией кроликов смесью мутеинов и после этого объединяли с HRP с помощью набора (EZ-link Plus Activated Peroxidase, Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя для получения конъюгата антитело-HRP. После промывания, к каждой лунке добавляли 20 мкл флуорогенного субстрата HRP (QuantaBlu, Thermo) и реакцию продолжали в течение 15-60 мин. Интенсивность флуоресценции каждой лунки на планшете считывали с помощью микропланшета-ридера для флуоресценции (Tecan или Molecular Devices). Для оценки данных концен
- 33 035824 трацию мутеина, с (мутеина))гее, рассчитывали на основе результатов стандартной кривой и откладывали на графике в зависимости от концентрации лиганда, с(лиганда). Для получения концентрации лиганда, при которой образование комплекса лиганд/мутеин блокировали на 50% (IC50), кривые подбирали с помощью нелинейной регрессии с использованием модели связывания в одном участке в соответствии с с(мутеина)free=c(мутеина)tot/(1+с(лиганда)/IC50)), при этом общая концентрация меченого вещества с(мутеина\щ и значение IC50 служили в качестве свободных параметров. Подбор кривых выполняли с помощью компьютерной программы GraphPad Prism 4.
Полученные значения IC50 обобщены в табл. 1A-D. Мутеины, выбранные против биотинилированного и железосодержащего сукцинила Pvd I, сукцинила Pvd II и сукцинила Pvd III, соответственно связывали со всеми подтипами соответствующей группы Pvd, т. е. мутеинами, выбранными против биотинилированного и железосодержащего сукцинила Pvd I, связанными с аналогичной аффинностью с сукцинилом Pvd I, сукцинамидом, -α-кетоглутарилом в комплексе с ионом железа или без такового, мутеинами, выбранными против биотинилированного и железосодержащего сукцинила Pvd II, связанными с аналогичной аффинностью с сукцинилом Pvd II, -сукцинамидом, -α-кетоглутарилом в комплексе с ионом железа или без такового, и мутеинами, выбранными против биотинилированного и железосодержащего сукцинила Pvd III, связанными с аналогичной аффинностью с сукцинилом Pvd III, -сукцинамидом, -αкетоглутарилом в комплексе с ионом железа или без такового. Большинство выбранных мутеинов связаны с сопоставимой аффинностью со всеми подтипами соответствующей группы в комплексе с ионом железа или без такового.
Отбор против биотинилированного пиохелина, не содержащего железо, приводил к мутеинам липокалина, связывающимся предпочтительно с пиохелином, не содержащим железо, таким как мутеины липокалина под SEQ ID NO: 56 и 57, связывающиеся с двух-трехзначной наномолярной аффинностью с железосодержащим Pch и со слабой аффинностью с железосодержащим Pch или не связывающиеся вообще, и к мутеинам липокалина, таким как под SEQ ID NO: 55, связывающимся предпочтительно с железосодержащим пиохелином.
Оптимизация аффинности SEQ ID NO: 56 приводила к образованию мутеинов липокалина, связывающихся с повышенной аффинностью с Pch, не содержащим железо, и не связывающихся вообще или связывающихся со слабой аффинностью с железосодержащим Pch, где оптимизация аффиности SEQ ID NO: 55 приводила к образованию мутеинов липокалина, связывающихся с повышенной более чем в 75 раз аффинностью с Pch, не содержащим железо, а также с однозначной наномолярной аффинностью с железосодержащим Pch.
Таким образом, после завершения выбора и оптимизации мутеинов липокалина лишь четыре различные мутеина могли связываться со всеми 10 подтипами сидерофоров P. Aeruginosa в комплексе с ионом железа и без такового (Pvd I s, sa, aKG +/-Fe; . Pvd II s, sa, aKG +/- Fe; Pvd III s, sa, aKG +/- Fe; Pch +/- Fe).
Таблица 1А. Связывание мутеинов с сукцинилом, сукцинамидом, -α-кетоглутарилом +/-Fe3+ ________сидерофора пиовердина I P. aeruginosa в растворе
ELISA связывания в растворе IC50: нМ
Pvd I s (+Fe) Pvd I sa (+Fe) Pvd I aKG (+Fe) Pvd I s (-Fe) Pvd I sa (-Fe) Pvd I aKG (-Fe)
SEQ ID NO: 2 24 19 13 26 19 13
SEQ ID NO: 4 97 43 91 57 28 50
SEQ ID NO: 5 97 49 73 57 32 42
SEQ ID NO: 6 44 30 37 48 31 36
SEQ ID NO: 7 173 126 59 290 129 53
SEQ ID NO: 8 2,38 1, 33 2,15 2,3 0,98 1,8
SEQ ID NO: 9 3,3 1,37 2,4 3,7 1,6 2,9
SEQ ID NO: 10 3,4 1, 1 2,87 3, 8 0,92 2,9
SEQ ID NO: 11 2,97 1, 9 2,57 4 2 3,1
SEQ ID NO: 12 6, 8 4,7 6, 4 6, 9 4,8 5,6
SEQ ID NO: 13 0,5 0,27 0,37 0, 36 0,2 0,24
SEQ ID NO: 14 2,4 1,7 3,1 2,4 1,1 2,2
SEQ ID NO: 15 1,1 0,59 1,2 0, 86 0,42 0,69
SEQ ID NO: 16 1,3 0, 84 1,6 1 0,63 0,83
SEQ ID NO: 18 5,3 2,2 3,9 2,8 1,8 2,5
- 34 035824
Таблица 1В. Связывание мутеинов с сукцинилом, сукцинамидом, -α-кетоглутарилом +/- Fe3+ _____растворимого сидерофора пиовердина II P. aeruginosa в растворе
ELISA связывания в растворе
IC50: Pvd II (+Fe) нМ
s Pvd II sa (+Fe) Pvd II aKG (+Fe) Pvd II s (-Fe) Pvd II sa (-Fe) Pvd II aKG (-Fe)
SEQ ID NO: 19 30 36 21 23 42 34
SEQ ID NO: 20 48 40 85 63 40 89
SEQ ID NO: 26 0,34 0, 39 1,3 0,45 0,45 0,75
SEQ ID NO: 27 0,78 1,53 1,97 1,02 1,12 1,4
SEQ ID NO: 28 0,91 1,75 2,25 1,14 1,5 1,65
SEQ ID NO: 29 0,68 1, 5 1,9 0,95 1,2 1,6
SEQ ID NO: 30 0,29 0,53 3 0,4 0,3 2,85
SEQ ID NO: 31 0,29 0,29 1,1 0,38 0,35 0,64
SEQ ID NO: 32 0,27 0,32 1,25 0,42 0,37 0,72
SEQ ID NO: 33 0,28 0, 32 1,3 0,4 0,32 0,7
SEQ ID NO: 34 0,29 0, 32 1,6 0,27 0,32 1,2
SEQ ID NO: 35 0,33 0,39 0,76 0,34 0,42 0,99
SEQ ID NO: 36 0,33 0,39 0,76 0,34 0,42 0,99
SEQ ID NO: 37 0,19 0,28 2,1 0,2 0,3 1,4
Таблица 1С. Связывание мутеинов с сукцинилом, сукцинамидом, -α-кетоглутарилом +/- Fe3+ _____________сидерофора пиовердина III P. aeruginosa в растворе________
ELISA связывания в растворе IC50: нМ
Pvd III s (+Fe) Pvd III sa (+Fe) Pvd III aKG (+Fe) Pvd III s (-Fe) Pvd III sa (- Fe) Pvd III aKG (-Fe)
SEQ ID NO: 39 146 147 23 95 94 23
SEQ ID NO: 42 35 15 78 25 7,2 69
SEQ ID NO: 43 0,31 0,25 1,4 0, 6 0,46 1,90
SEQ ID NO: 44 0,35 0,26 0,93 0,35 0,21 1,10
SEQ ID NO: 45 0,75 0,43 1,50 0,41 0,46 1,70
SEQ ID NO: 46 0,69 0,30 1,02 0,44 0,30 1,20
SEQ ID NO: 47 0,37 0,30 0,82 0, 17 0,28 0,58
SEQ ID NO: 48 0,28 0,22 0,95 0,29 0,24 0,64
SEQ ID NO: 49 0,32 0,27 0,79 0,21 0,27 0,62
SEQ ID NO: 50 0,29 0,35 0,95 0,29 0,37 0,82
SEQ ID NO: 51 0,37 0,37 0,97 0,35 0,34 1,1
SEQ ID NO: 52 0,32 0,31 1 0,31 0,31 1
SEQ ID NO: 53 0,21 0,25 0,54 0, 19 0,63 0,33
Таблица 1D. Связывание мутеинов с сидерофором пиохелина +/-Fe3+ P. aeruginosa в растворе
ELISA связывания в растворе IC50: нМ
pch (+Fe) pch (-Fe)
SEQ ID NO: 55 361 н/д
SEQ ID NO: 56 н/д 51
SEQ ID NO: 57 н/д 147
SEQ ID NO: 58 н/д 10
SEQ ID NO: 59 н/д 11
SEQ ID NO: 60 8,6 45
SEQ ID NO: 61 5,1 42
SEQ ID NO: 62 4,7 26
SEQ ID NO: 63 5,6 26
Для распределения аффинности с высокой производительностью использовали тот же самый анализ, однако с менее различающимися концентрациями лиганда.
Пример 6. Аффинность связывания мутеинов с сидерофорами Р. aeruginosa, определенная в Biacore
В анализе на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) использовали инструмент Biacore T200 (GE Healthcare) для измерения аффинности связывания мутеинов с сукцинилом, сукцина- 35 035824 мидом, -α-кетоглутарилом пиовердина I в комплексе с ионом железа, или с сукцинилом, -сукцинамидом, -α-кетоглутарилом пиовердина II в комплексе с ионом железа, сукцинилом, сукцинамидом, -αкетоглутарилом пиовердина III в комплексе с ионом железа. Мутеины, выбранные для связывания с пиовердинами и отрицательным контролем (SEQ ID NO: 64), биотинилировали в течение 2 ч при комнатной температуре, используя соответствующий излишек EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo, Cat# 21329), после этого проводили отделение не вступившего в реакцию биотина с использованием вращающегося планшета для обессоливания Zeba (Thermo, № по кат. 21329) в соответствии с инструкциями производи теля.
В анализе аффинности SPR биотинилированные мутеины и отрицательный контроль захватывали на сенсорный чип САР с помощью набора Biotin CAPture (GE Healthcare): Сенсорный чип CAP предварительно иммобилизовали с помощью олигонуклеотида ssDNA. Неразбавленный реагент Biotin CAPture (стрептавидин, конъюгированный с комплементарным олигонуклеотидом ss-DNA) наносили со скоростью потока 2 мкл/мин в течение 300 с. Затем 1-100 мкг/мл биотинилированных мутеинов или отрицательного контроля наносили в течение 300 с при скорости потока 5 мкл/мин. Эталонный канал загружали только реагентом Biotin CAPture.
Для определения аффинности связывания четыре-пять разбавлений соответствующих представителей Pvd (Pvd I, II, III, в том числе сукцинила, сукцинамида, -α-кетоглутарила +Fe) в концентрации, находящейся в диапазоне 5-2000 нМ, получали в буфере HBS-EP+ (GE Healthcare) и наносили на подготовленную поверхность чипа. Применяя скорость нанесения 30 мкл/мин, использовали подход для оценки кинетики за один цикл и за несколько циклов, при времени контакта с образцом 120-180 с и времени диссоциации 900-2400 с. Отсутствие связывания с отрицательным контролем под SEQ ID NO: 64 подтверждали с помощью высокой концентрации (например, 1200 нМ) соответствующего Pvd.
После иммобилизации лиганда, для анализа с применением оценки кинетики за один цикл все 4-5 концентраций Pvd перед контролем диссоциации применяли последовательно в возрастающем порядке. Для анализа с применением оценки кинетики за несколько циклов применяли 4 разбавления Pvd, при этом каждая следовала за фазой диссоциации. Все измерения выполняли при температуре 25°С. Восстановления поверхности сенсорного чипа САР достигали введением 6 М Gua-HCl с 0,25 М NaOH, с последующим дополнительным промыванием подвижным буфером и периодом стабилизации 120 с. Данные оценивали с помощью компьютерной программы Biacore T200 Evaluation (V 1.0). Применяли двойное сравнение с образцом. Для подбора исходных данных использовали модель связывания в соотношении 1:1.
Полученные константы скорости реакции для выбора мутеинов липокалина обобщены в табл. 2А-С. Мутеины липокалина можно получать для каждой группы Pvd, связывающегося в диапазоне от субнаномолярных до небольших однозначных наномолярных значений со всеми подтипами соответствующей группы Pvd. Однако природный лиганд Fe-энтеробактина hNGAL дикого типа не связывался Pvdспецифичными мутеинами липокалина.
Таблица 2А. Константы скорости реакции Pvd I-специфичных мутеинов липокалина с сукцинилом сукцинамидом и -α-кетоглутарилом Pvd I в комплексе с Fe3+
Pvd I s (+Fe) Pvd I sa (+Fe) Pvd I k (+Fe) Feэнтеробактин
SEO ID kon [1/Mc] kOff [1/c] KD [нМ] kon [1/Mc ] kOff [1/c] KD [нМ] kon [1/Mc] kOff [1/c] KD [нМ] KD [нМ]
SEQ ID NO: 8 5,37E+04 1,79E04 3,33 1,11E + 05 l,20E04 1,06 4,74E+0 4 2,35E04 4,95 нет связ.
SEQ ID NO: 9 3,31 E+04 3,30E04 9,97 8,02E + 04 2,57E04 3,20 3,80E+0 4 5,32E04 14,03 нет связ.
SEQ ID NO: 10 3,47E+04 4,78E04 13,78 8,63E + 04 3,04E04 3,52 5,02E+0 4 6,31E04 12,57 нет связ.
SEQ ID NO: 11 2,84E+04 4,04E04 14,22 6, 76E + 04 2,97E04 4,40 3,48E+0 4 5,86E04 16, 84 нет связ.
SEQ ID NO: 13 1,17E+05 6,15E05 0,53 1,65E + 05 4,24E05 0,26 9,51E+0 4 8,37E05 0,88 нет связ.
SEQ ID NO: 16 3,56E+04 1,88E04 5,28 5,43E + 04 1,56E04 2,87 3,14E+0 4 2,54E04 8,10 нет связ.
Таблица 2В. Константы скорости реакции Pvd II-специфичных мутеинов липокалина с сукцинилом ______ сукцинамидом и -α-кетоглутарилом Pvd II в комплексе с Fe3+_______
Pvd II s (+Fe) Pvd II sa (+Fe) Pvd II k (+Fe) Fe-энтеробактин
SEO ID kon [1/Mc] kOff [1/c] KD [нМ] kOn [1/Mc] kOff [1/c] KD [нМ] kOn [1/Mc] kOff [1/c] KD [нМ] KD [нМ]
SEQ ID NO: 32 1,15E+06 1,09E-03 0, 94 1,37E+ 06 9,55E04 0,7 1,09E+ 05 3,74E04 3,44 нет связ.
SEQ ID NO: 33 l,23E+06 l,25E-03 1, 02 1,41E+ 06 1,04E03 0,74 9,93E+ 04 4,16E04 4,19 нет связ.
SEQ ID NO: 35 1,31E+05 4,59E-05 0,35 2,48E+ 05 4,58E05 0,18 4,35E+ 04 1,49E04 3,42 нет связ.
SEQ ID NO: 36 1,10E+05 4,30E-05 0,39 1,38E+ 05 3,67E05 0,27 2,86E+ 04 5,62E05 1,97 нет связ.
- 36 035824
Таблица 2С. Константы скорости реакции Pvd Ш-специфичных мутеинов липокалина с сукцинилом _________сукцинамидом и -α-кетоглутарилом Pvd III в комплексе с Fe3+_________
Pvd III s (+Fe) Pvd III sa (+Fe) Pvd III k (+Fe) Fe-энтеробактин
SEO ID kon [1/Mc] kof f [ 1/c] KD [нМ] ^on [1/Mc] kof f [1/C] KD [нМ] kon [1/Mc] ^of f [1/C] KD [нМ] KD [нМ]
SEQ NO: ID 43 7,05E+04 1,58E-04 2,24 3,52E+ 04 1,07E04 3,04 5,73E+ 04 3,03E04 5,29 h . о .
SEQ NO: ID 44 5,62E+04 1,42E-04 2,53 3,03E+ 04 8,90E05 2,94 4,82E+ 04 2,71E- 04 5,64 H . о .
SEQ NO: ID 45 5,90E+04 1,59E-04 2,70 3,27E+ 04 9,91E05 3,03 4,73E+ 04 3,30E04 6, 99 H . о .
SEQ NO: ID 46 8,32E+04 1,66E-04 2,00 4,36E+ 04 6,90E05 1,58 7,67E+ 04 2,41E04 3,15 H . о.
SEQ NO: ID 47 7,89E+04 7,91E-05 1,00 1,28E+ 05 2,52E05 0,20 2,92E+ 04 2,62E04 8,97 H . о.
SEQ NO: ID 48 6,70E+04 1,06E-04 1,58 1,48E+ 05 9,51E- 05 0,64 2,72E+ 04 1,58E- 04 5,81 H . о.
SEQ NO: ID 49 6,88E+04 1,05E-04 1,52 1,34E+ 05 1,12E04 0,84 2,81E+ 04 4,29E05 1,53 H . о.
SEQ NO: ID 53 5,10E+04 4,19E-05 0,82 6,73E+ 04 3,90E05 0,58 3,88E+ 04 1,40E04 3,60 нет связ.
Кроме того, отсутствие связывания с различными сидерофорами, не принадлежащими к соответствующей подгруппе пиовердина (I, II, III) и ММР-9, подтверждали с помощью вышеописанного анализа с помощью внесения высоких концентраций (>1 мкМ) следующих анализируемых веществ на иммобилизованный мутеин: Fe-энтеробактина, дефероксамина, пиохелина, пиовердинов из соответствующих подгрупп, проформы ММР-9 и активированного ММР-9. Обобщение этого анализа представлено в табл. 3.
Для определения констант скорости реакции и образующейся KD для взаимодействия мутеина под SEQ ID NO: 62 с Pch +Fe мутеин или отрицательный контроль под SEQ ID NO: 64 иммобилизовали на поверхности чипа СМ5 с помощью стандартного химического анализа аминов. Поверхность чипа активировали с помощью EDC и NHS. Затем 5 мкг/мл раствора мутеина или отрицательного контроля в 10 мМ ацетата с pH 4,0 наносили при скорости потока 10 мкл/мин до достижения высокого уровня иммобилизации, составляющего приблизительно 2000 RU. Остаточные активированные группы гасили этаноламином. Эталонные каналы обрабатывали EDC/NHS, а затем этаноламином (холостая иммобилизация).
Для определения аффиности, пять разбавлений пиохелина (+Fe) получали в буфере HBS-P+ и наносили на подготовленную поверхность чипа. Анализ связывания проводили при времени контакта 180 с, времени диссоциации 1200-1800 с и скорости потока 30 мкл/мин. Измерения выполняли при 25°С. Восстановление поверхности иммобилизованных мутеинов достигали тремя последовательными введениями 10 мМ Gly-HCl с pH 1,5 (120 с), после дополнительного промывания подвижным буфером и периода стабилизации. Данные оценивали с помощью компьютерной программы Biacore T200 Evaluation (V 1.0). Применяли двойное сравнение с образцом. Для подбора исходных данных использовали модель связывания в соотношении 1:1.
Полученная константа скорости реакции для SEQ ID NO: 62 показана в табл. 2D.
С помощью того же самого анализа, отсутствие связывания с сидерофорами, отличающимися от пиохелина и ММР-9, подтверждали с помощью нанесения высоких концентраций (>1 мкМ) следующих анализируемых веществ на иммобилизованный мутеин SEQ ID NO: 62: Fe-энтеробактина, дефероксамина, пиовердина, проформы ММР-9 и активированного ММР-9. Обобщение результатов показано в табл. 3.
Таблица 2D. Константы скорости реакции пиохелина, специфичного к мутеину липокалина, под SEQ ID NO: 62 по отношению к пиохелину, образующему комплекс с Fe3+
pch (+Fe)
SEO ID kon [1/Mc] kOff [1/c] Kd [hM]
SEQ ID NO: 62 2,25E+06 6,43E-04 0,29
Таблица 3. Специфичность связывания мутеинов липокалина с Pvd I, Pvd II, Pvd III или пиохелином
Pvd I s (+Fe) Pvd II s (+Fe) Pvd III s (+Fe) pch (+Fe) Энтеробактин (+Fe) Дефероксамин Проформа ММР-9 Активи- ровании й ММР-9
SEQ ID NO: 16 + - - - - - - -
SEQ ID NO: 36 - + - - - - - -
SEQ ID NO: 53 - - + - - - - -
SEQ ID NO: 62 - - - + - - - -
SEQ ID NO: 64 - - - - + - - -
- 37 035824
Пример 7. Функциональное исследование мутеинов, связывающихся с сидерофорами P. aeruginosa;
ингибирование захвата железа
Для определения подавления функционального захвата железа в живых бактериях, мутеины липокалина, связывающиеся с Р. aeruginosa, в концентрации диапазона доз инкубировали в течение 1 ч со 100 нМ сидерофора, содержащего радиоактивное железо, в буфере Трис HCl 50 мМ с pH 8,0 перед инкубацией в течение 30 мин с бактериями в конечной концентрации, составляющей OD=1, при 595 нм в 96луночном планшете. Затем бактерии фильтровали с помощью сборщика клеток через 96-луночный фильтровальный планшет GF/B, предварительно инкубированный с раствором полиэтиленимина в концентрации 5%, и промывали 3 раза буфером Трис. После фильтрования и сушки в каждую фильтровальную лунку перед подсчетом добавляли 30 мкл сцинтиляционного коктейля. При использовании железосодержащего пиовердина сидерофор инкубировали в течение 15 мин с 55Fe-Cl3 в буфере Трис с соотношением пиовердина и железа 4:1 в 200 мкМ конечном растворе. Для нагрузки пиохелина радиоактивным железом, 40 мкл раствора 55FeCl3 в концентрации, составляющей 0,25 мМ в HCl 0,5 н., добавляли к метаноловому раствору пиохелина в концентрации 1 мМ. Через 15 мин времени инкубации добавляли 940 мкл Трис HCl 50 мМ с pH 8,0, с получением 20 мкМ раствора 55Fe-Pch с соотношением пиохелина и железа 2:1. Бактерии получали следующим образом: в 10 мл культуры, полученной в течение ночи в среде Мюллера-Хинтона, вводили выделенный клон, центрифугировали, промытый осадок ресуспендировали в 25 мл среды сукцината и инкубировали при встряхивании в течение 2 ч. Одновременно в 20 мл среды Мюллера-Хинтона вводили 5 мл культуры, полученной в течение ночи, и инкубировали при встряхивании в течение 2 ч для использования в качестве фонового уровня захвата железа. Затем 25 мл культур бактерий центрифугировали и промывали соответствующей средой перед суспендированием осадка в буфере Трис HCL 50 мМ с pH 8,0, и измеряли OD при 595 нм для получения конечной концентрации в анализе, составляющей OD=1.
Процент включения рассчитывали для каждой точки концентрации, а подавление рассчитывали с помощью компьютерной программы для внутреннего пользования. Для данного расчета максимальное содержание захвата железа основано на значении, полученном в минимальной среде сукцината, не содержащей какого-либо мутеина липокалина, а фоновое значение получали в обогащенной среде Мюллера-Хинтона, где рецептор сидерофора не экспрессировался.
Таблица 4. Мутеины липокалина блокировали захват Р. aeruginosa, как иллюстративно показано для _________мутеинов липокалина под SEQ ID NO: 16, 37, 53 и 62_________
SEQ ID Захват железа IC50: нМ
Pvd I s Pvd I sa Pvd I aKG
SEQ ID NO: 16 121 123 183
Pvd II s Pvd II sa Pvd II aKG
SEQ ID NO: 37 118 107 51
Pvd III s Pvd III sa Pvd III aKG
SEQ ID NO: 53 74 32 8
Pch
SEQ ID NO: 62 54
Пример 8. Функциональное исследование мутеинов, связывающихся с сидерофорами P. aeruginosa; подавление роста
Подавление бактериального роста определяли по инкубированию мутеинов, связывающихся с сидерофорами P. aeruginosa в среде сукцината, обработанной Chelex, обогащенной раствором примесных элементов и 0,1 мг/мл BSA с бактериальной культурой MS, разбавленной до конечного значения OD 0,05 при 595 нм в черном 96-луночном планшете с прозрачным дном. Планшет инкубировали в течение ночи при температуре 37°С, встряхивая через каждые 20 мин и считывая значения OD при 595 нм в ридере IEMS MF от Thermo Labsystem. Подавление роста иллюстративно показано для штамма Pvd I и Pvd Iспецифичного мутеина под SEQ ID NO: 16 на фиг. 4А, для штамма Pvd II и Pvd II-специфичного мутеина под SEQ ID NO: 19 и под SEQ ID NO: 36 на фиг. 4В, для штамма Pvd III и Pvd III-специфичного мутеина под SEQ ID NO: 53 на фиг. 4С и для Pvd I-нокаутированного (\pvdA) штамма, зависимого от пиохелина для захвата железа для роста, и пиохелин-специфичного мутеина под SEQ ID NO: 62 на фиг. 4D. В качестве контроля выступал бактериальный рост без мутеина липокалина.
Пример 9. Оценка устойчивости мутеинов
Для оценки температуры плавления в качестве общего показателя общей устойчивости сидерофорспецифичные мутеины (под SEQ ID NO: 13-18; 26, 31-36; 47-53; 58-62) при концентрации белка 1 мг/мл в PBS (Gibco) изучали (25-100°С) при 1°С/мин с помощью капиллярного инструмента nanoDSC (CSC 6300, ТА Instruments). Температуру плавления (Tm) рассчитывали, исходя из отображенной термограммы с помощью интегрированной компьютерной программы Nano Analyze.
Полученные температуры плавления, а также начало плавления для мутеинов липокалина (под SEQ ID NO: 13-18; 26, 31-36; 47-53; 58-62) приведены в табл. 5A-D ниже. Для всех групп Pvd, а также для му- 38 035824 теинов липокалина pch Tm в диапазоне 70°С, наилучший мутеин липокалина для каждого типа Pvd и pch в диапазоне от 68 до 74°С можно выбрать с указанием соответствующей устойчивости молекул.
Таблица 5А. Tm и начало плавления Pvd I-специфичных мутеинов липокалина, как определено с помощью nanoDSC nanoDSC
SEQ ID Tm °C Начало
SEQ ID NO: 13 59 51
SEQ ID NO: 14 61 51
SEQ ID NO: 15 68 59
SEQ ID NO: 16 69 60
SEQ ID NO: 17 61 53
SEQ ID NO: 18 61 54
Таблица 5В. Tm и начало плавления Pvd II-специфичных мутеинов липокалина, как определено с помощью nanoDSC______ nanoDSC
SEQ ID Tm °C Начало
SEQ ID NO: 26 65 58
SEQ ID NO: 31 67 60
SEQ ID NO: 32 64 56
SEQ ID NO: 33 67 61
SEQ ID NO: 34 67 56
SEQ ID NO: 35 71 63
SEQ ID NO: 36 70 61
Таблица 5С. Tm и начало плавления Pvd Ш-специфичных мутеинов липокалина, как определено с помощью nanoDSC_______ nanoDSC
SEQ ID Tm °C Начало
SEQ ID NO: 47 62 53
SEQ ID NO: 48 64 55
SEQ ID NO: 49 59 50
SEQ ID NO: 50 61 52
SEQ ID NO: 51 62 53
SEQ ID NO: 52 59 49
SEQ ID NO: 53 68 59
Таблица 5D. Tm и начало плавления pch-специфичных мутеинов липокалина, как определено с помощью nanoDSC nanoDSC
SEQ ID Tm °C Начало
SEQ ID NO: 58 63 51
SEQ ID NO: 59 60 54
SEQ ID NO: 60 68 56
SEQ ID NO: 61 69 63
SEQ ID NO: 62 74 63
Для оценки устойчивости во время хранения и замораживания/размораживания мутеины в концентрации 1 мг/мл в PBS инкубировали в течение 1 недели при температуре 37°С или подвергали циклам замораживания/размораживания. Активный мутеин определяли с помощью количественного ELISA. Мономерный белок определяли с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. Иллюстративные данные для SEQ ID NO: 16, 36, 53, 62 показаны в табл. 6.
Для определения активности белков применяли следующий ELISA: 384-луночный планшет, пригодный для измерений флуоресценции (Greiner FLUOTRAC™ 600, с черным плоским дном, с высокой степенью связывания) покрывали 20 мкл нейтравидина (Thermo Scientific) при концентрации 5 мкг/мл в PBS в течение ночи при температуре 4°С. После промывания покрытые нейтравидином лунки блокировали 100 мкл блокирующего буфера (2% об./вес BSA в PBS, содержащем 0,1% об./об. Tween 20) в течение 1 ч. После повторного промывания добавляли 20 мкл биотинилированного и железосодержащего сукцинила пиовердина I, сукцинила пиовердина II, сукцинила пиовердина III или биотинилированного
- 39 035824 пиохелина 1 мкг/мл в блокирующем буфере. Планшет промывали и 20 мкл соответствующим образом разбавленного белкового стандарта, эталонного образца, не подвергнутого стрессовому воздействию, или образца, подвергнутого стрессовому воздействию, переносили в планшет ELISA и инкубировали. Для количественного определения связанного с планшетом белка планшет ELISA промывали, удаляли остаточные супернатанты и добавляли 20 мкл антитела к hNGAL, меченого HRP, в заранее определенной оптимальной концентрации в блокирующем буфере и инкубировали. После промывания в каждую лунку добавляли 20 мкл флуорогенного субстрата HRP (QuantaBlu, Pierce) и реакцию продолжали в течение 2030 мин. Интенсивность флуоресценции каждой лунки планшета считывали с помощью микропланшетаридера для флуоресценции (Tecan).
Если не указано иное, то все стадии инкубации выполняли в течение 1 ч при комнатной температуре, и после каждой стадии инкубации планшет промывали пять раз 100 мкл буфера PBS-T (PBS, 0,05% Tween 20) с помощью моечной машины Biotek ELx405 select CW.
Для вышеописанного ELISA получали калибровочную кривую, включающую 11 разбавлений, обычно находящихся в диапазоне 0,008-500 нг/мл, и для каждого образца получали три различных независимых разбавления в пределах линейного диапазона калибровочной кривой. Для разбавления использовали блокирующий буфер, необязательно обогащенный 1% плазмой крови человека или мышиных.
Калибровочную кривую подбирали с помощью модели 4-параметрической логистической (4PL) нелинейной регрессии и использовали для расчета активных концентраций белка для исследуемых образцов. Определяемые активные концентрации белка сравнивали с образцом, не подвергнутым стрессовому воздействию, хранящемуся в той же концентрации и в той же матрице.
Аналитическую эксклюзионную хроматографию выполняли в системе HPLC Agilent с двумя колонками Superdex 75 5/150 GL (GE Healthcare) в ряду, использующем PBS (Gibco) в качестве элюента, при скорости потока 0,3 мл/мин.
Для оценки устойчивости при хранении в плазме мутеины в концентрации 0,5 мг/мл инкубировали в течение 1 недели при 37°С в плазме крови человека, мыши и крысы. Активный мутеин определяли с помощью описанного количественного ELISA.
Все исследуемые мутеины липокалина оказались устойчивыми при всех исследуемых условиях.
Таблица 6. Устойчивость после 3 циклов замораживания/размораживания (F/T); через 1 неделю хранения в PBS при 37°С и через 1 неделю хранения в плазме крови человека (hu), мыши (mu) или крысы, определяемая по восстановлению активности в qELISA и содержанию мономеров в аналитическом
SEC: устойчивы в qELISA=100 +/- 15%; устойчивы в aSEC=100 +/- 5% (извлечение площади пика мономеров, сравниваемой с эталонным образцом, не подвергнутым стрессовому воздействию); для всех образцов, в том числе эталонных образцов, определяли содержание мономеров на 100% площади.
3xF/T, -20°C, 1 мг/мл 1 неделя PBS, 37°C, 1 мг/мл 1 неделя плазма крови человека, 37°С 1 неделя плазма крови мыши, 37°С 1 неделя плазма крови крысы, 37°С
Мутеин Сидерофор восстановления активности в qELISA % мономера в aSEC восстановления активности в qELISA % мономера в aSEC % восстановления активности в qELISA
SEQID NO: 16 Pvd I 102 98 86 98 86 100 100
SEQID NO: 3 6 Pvd II 99 101 104 98 93 91 110
SEQID NO: 53 Pvd III 98 99 107 102 92 83 101
SEQID NO: 62 pch 107 100 95 104 97 102 95
Пример 10. Эффективность in vivo мутеинов липокалина в мышиной модели
У мышей изучали профилактический эффект SEQ ID NO: 19 после внутривенного (в/в) введения при Р. aeruginosa-индуцированной легочной инфекции.
SEQ ID NO: 19 вводили за 1 ч до инфицирования и во время инфекции. Бактериальную нагрузку в легких оценивали через 24 ч после инфицирования.
Штаммом, используемым в данном исследовании, был Р. aeruginosa (ATCC27853). Начиная с P. aeruginosa, хранящегося при температуре -80°С в смеси PBS/15% глицеринг, культуру, полученную в течение ночи, хранили при температуре 37°С при встряхивании в бульоне Мюллера-Хинтона, после чего добавляли субкультуру (100 мкл культуры, полученной в течение ночи, +100 мл МНВ) до конца логарифмической фазы роста. Культуру промывали дважды и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере для замораживания при 1Е+09 CFU/мл. Для каждого эксперимента размораживали новый флакон и инокулят исследовали по числу жизнеспособных клеток.
Самцов мышей линии Swiss в возрасте 7-8 недель (5 животных/группа), приобретенных в Janvier la
- 40 035824 boratories (Route des chenes secs, 53940 Le Genest Saint Ile, Франция), до использования акклиматизировали в течение по меньшей мере 5 дней. Животных держали при температуре 22±2°С при относительной влажности 40-70% и 12-15 сменах свежего воздуха/час. Световой цикл 12/12 ч: световая фаза с 7.00 до 19.00 (нормальный цикл). Показания температуры и относительной влажности непрерывно фиксировали. Содержали по 5 животных на клетку и обеспечивали свободный доступ к воде и стандартному рациону (стандартный рацион АО4 С (SAFE)). Все эксперименты проводили с разрешения этического комитета Sanofi R&D (CEPAL).
Легочную инфекцию индуцировали с помощью интраназальной атаки мышей линии Swiss 1,E+07 CFU/мышь P.aeruginosa в концентрации 50 мкл NaCl 0,9%.
SEQ ID NO: 19 в концентрациях 200, 400, 1000 или 2000 мкг/мышь вводили за 1 ч до инфицирования и во время инфекции с помощью в/в болюса.
Через 24 ч после инфицирования животных выводили из эксперимента и определяли, а также выражали в log10 CFU/мл в виде среднего ± ст. ош. сред, знач., количество бактерий из легочных гомогенатов.
Статистический анализ выполняли с помощью SAS v9.2. Для представления фигур использовали компьютерную программу Excel 2003. Сравнения доз SEQ ID NO: 19 в зависимости от носителя оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим использованием критерия Дуннетта (ZAR J.H., Biostatistical Analysis, Prentice Hall International Editions, 4eme edition, 1999.; C.W. Dunnett, A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. Amer. Statist. Assoc, 50 (1955), pp. 1096-1121, 1955).
В модели Р. aeruginosa-индуцированной легочной инфекции у мышей вводили SEQ ID NO: 19 за 1 ч до и во время бактериальной атаки, и SEQ ID NO: 19 предотвращала развитие инфекции у мышей дозозависимым образом. Значимый профилактический эффект наблюдали для SEQ ID NO: 19, начиная с концентрации 200 мкг/мышь, с максимальным эффектом при концентрации, составляющей 2000 мкг/мышь.
Пример 11. Кристаллизация
Для определения трехмерной структуры белка SEQ ID NO: 31 в комплексе с Pvd-Fe применяли следующую процедуру.
Последовательность белка, обозначенную на фиг. 6, клонировали в плазмиде рЕТ-24а и экспрессировали в виде конструкции сайта распознавания на N-конце меченой 6His-TEV протеазы.
Плазмиду использовали для трансформации клеток Е. coli BL21(DE3) Star и полученные клоны вводили в среду Overnight Express Instant ТВ (Novagen), а клетки собирали через 47 ч после инкубации при температуре 18°С при перемешивании со скоростью 200 об./мин при конечном значении OD600, составляющем 4,7. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 1 мМ MgCl2, 1 мМ ТСЕР, 5% глицерина и 20 мМ Трис с pH 7,4 и лизировали с помощью стандартной ультразвуковой процедуры. Полученный экстракт удаляли с помощью низкоскоростного центрифугирования и супернатант фильтровали через мембрану 22 нм перед загрузкой в 5 мл колонку Ni NTA (Qiagen), предварительно уравновешенную 100 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 100 мМ буфера HEPES с pH 8. Белок элюировали линейным градиентом имидазола от 10 до 300 мМ и дополнительно диализировали в течение ночи в 100 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 100 мМ буфера HEPES с pH 8. Белок концентрировали до 20 мг/мл и загружали в гель-фильтрационную колонку Superdex 75 (GE). Полученный белок диализировали в 100 мМ NaCl, 10 мМ буфера HEPES pH 8 в течение ночи в присутствии протеазы TEV (соотношение 1/50) для удаления 6His N-концевой метки с последующей стадией очистки отрицательной Ni NTA, как описано выше, для разделения отделенного белка. Конечный белок концентрировали до значения 12 мг/мл в 100 мМ NaCl, 50 мМ HEPES с pH 7,5 предварительно делили на аликвоты, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С для дальнейшего использования.
Для кристаллизации белок инкубировали с Pvd-Fe в 10-кратной молярной концентрации в течение ночи и помещали для исследования кристаллизации, проводимой в планшетах формата SBS, где 100 нл капель белка смешивали с 100 нл раствора для исследования кристаллизации в экспериментах формата сидячих капель при диффузии паров при 20 и 4°С. Выявили несколько пиков кристаллизации и условия кристаллизации дополнительно оптимизировали для получения хорошо дифрагирующих кристаллов с качеством, определенным рентгенографическим методом.
Качество дифракции кристаллов оценивали с помощью источника рентгеновских лучей в синхротроне и лучшие дифрагирующие кристаллы получали в условиях 20% PEG3350 и 0,2 М LiSO4 при 20°С. Лучшие кристаллы защищали с помощью криопротекции повышением концентрации PEG3350 до 35%, затем мгновенной заморозки в жидком азоте и набор данных 1,8 А собирали при температуре 100 К.
Рентгенографические данные обрабатывали с помощью MOSFLM, структуру белка определяли способом молекулярного замещения с использованием pdb 1LKE в качестве модели поиска и структурную модель дополнительно очищали до качества Rfree=0,233 - R=0,200 в Р41212 с 2 тройными белковыми комплексами на асимметричную единицу.
Структура белка представляла собой классический каркас липокалина с Pvd-Fe, связанным с обои- 41 035824 ми мутеиновыми белками в асимметричной единице, фиг. 7. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании Pvd-Fe, анализировали и представляли на фиг. 8. Атомы кислорода Pvd, непосредственно связывающие Fe, выявляли и представляли на фиг. 9.
Настоящее изобретение относится к полипептиду, характеризующемуся специфичностью связывания с пиовердином I, II, III типа или пиохелином, где полипептид содержит мутеин hNGAL, который связывается с пиовердином I, II, III типа или пиохелином с поддающейся выявлению аффинностью.
В одном варианте осуществления мутеин hNGAL содержит мутированный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 28, 34, 36, 39-42, 44-47, 49, 52, 54-55, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134, 141 и 145 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления указанный мутеин способен связывать пиовердин I типа в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше при измерении с помощью инструмента Biacore T200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связываться с сукцинилом Pvd I типа, сукцинамидом Pvd I типа и α-кетоглутарилом Pvd I типа, в комплексе с железом и без такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше при измерении в анализе ELISA, фактически описанном в примере 5.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен ингибировать захват железа, опосредованный пиовердином I типа, со значением IC50, составляющим приблизительно 150 нМ или меньше в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен подавлять бактериальный рост штамма Pvd I в анализе, фактически описанном в примере 8.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит мутированный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 28, 36, 39-41, 46, 49, 52, 54-55, 59, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 134 и 136 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит по меньшей мере один из следующих мутированных аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Leu 36
-+ Asn, Thr, Vai, Trp или Phe; Ala 40 -+ Gly, Asn, Thr или Phe; He 41 -+ Arg, Ala, Thr, Phe или Trp; Gln 49 -+ Tie, Leu, Vai, Ala или Pro; Tyr 52 -+ Met, Trp или Pro; Ser 68 -+ Asp, Vai или Glu;
Leu 70 -+ Gln, Trp, Asp или Thr; Arg 72 -+ Trp, Ala, Ser, Leu, Pro или Glu; Lys 73 -+ Asp, Leu, Ala, Glu или Asn; Asp 77 -+ Arg, Leu,
Tyr, Ser, Gln, Thr, He или Asn; Trp 79 -+ Gln, Asp, Ser, Arg, Met или Glu; Arg 81 -+ Gln, Gly, He, Glu, His или Asp; Asn 96 -+ His, He, Gly, Туг или Asp; Tyr 100 -+ Lys, Glu, Asn, Ser, Phe или Tyr; Leu 103 -+ Lys, Pro, Gln, His, Asp, Tyr, Glu, Trp или
Asn; Tyr 106 -+ His, Gln или Phe; Lys 125 -+ Arg, Ser, Trp, Tyr,
Vai или Gly; Ser 127 -+ Trp, Asn, Ala, Thr, Tyr, His, He, Vai или Asp; Tyr 132 -+ Trp, Asn, Gly или Lys; и Lys 134 -+ Asn, His,
Trp, Gly, Gln или Asp.
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 28 -+ His; Lys 46 -+ Glu; Thr 54 -+ Vai или Ala; He 55
-+ Vai; Lys 5Arg; Asn 65 -+ Asp или Gln; He 80 -+ Thr; Cys 87 -+ Ser или Asn и Thr 136 -+ Ala.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 мутированный аминокислотный остаток в положениях последовательности 28, 36, 39-41, 46, 49, 52, 54-55, 59, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 134 и 136 линейной полипептидной последовательности зрелого белка NGAL человека (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит один из следующих наборов аминокислотных замен по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
- 42 035824
Gln 28 His; Leu 36 Asn; Ala 40 -^Gly; He 41 Trp; Gln
He; Tyr 52 Met; Ser 68 Vai; Leu 70 Gln; Arg 72
Trp; Lys 73 Asp; Asp 77^ Leu; Trp 79 Gln; Arg 81 Gln; Cys
Ser; Asn 96 His; Tyr 100 Lys; Leu 103 His; Tyr 106
His; Lys 125 Arg; Ser 127 Trp; Tyr 132 Trp; Lys 134 Asp;
Gln 28 His; Leu 36 Thr; Ala 40 -Hy; He 41 Phe; Gln
Leu; Tyr 52 Trp; Leu 70 Trp; Arg 72 Ala; Lys 73
Leu; Asp 77^ Tyr; Trp 79 Asp; Arg 81 Gly; Cys 87 Ser; Asn 96 -+ lie; Tyr 100 -+ Glu; Leu 103 -+ His; Tyr 106 -+ Gln; Lys 125 -+ Trp; Ser 127 Asn; Tyr 132 Asn; Lys 134 Gln;
Gln 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gln; Arg 72
Ser; Lys 73 Glu; Asp 77 Ser; Trp 79 Ser; Arg 81 He; Cys
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Asn; Leu 103 Lys; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Ala; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Phe; Ala 40 -+ Asn; lie 41 -+ Arg; Gln
Pro; Tyr 52 Met; Ser 68 Asp; Leu 70 Thr; Arg 72
Glu; Lys 73 Ala; Asp 77 Arg; Trp 79 Arg; Arg 81 He;Cys
Ser; Asn 96 Tyr; Tyr 100 Lys; Leu 103 Pro; Tyr106
Phe; Lys 125 Ser; Ser 127 Thr; Tyr 132 Trp; Lys 134Gly;
Gln 28 His; Ala 40 -Hy; He 41 Trp; Gln 49 Vai;Tyr
Met; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu; Lys73
Leu; Asp 77 Arg; Trp 79 Met; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser;Asn
Asp; Tyr 100 Phe; Leu 103 Trp; Tyr 106 Gln; Lys125
Gly; Ser 127 Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134His;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Vai; Ala 40 -+ Phe; He 41 -+ Phe; Gln 49 Ala; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Trp; Arg 72
Leu; Lys 73 Asn; Asp 77 Gln; Trp 79 Glu; Arg 81 His; Cys
Ser; Asn 96 Tyr; Leu 103 Tyr; Tyr 106 His; Lys 125
Vai; Ser 127 His; Tyr 132 Lys; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gln; Arg 72 Ser; Lys 73 Glu; Asp 77 Ser; Trp 79 Ser; He 80 Thr; Arg
He; Cys 87 Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Ser; Leu 103
Gln; Tyr 106 His; Lys 125 Tyr; Ser 127 He; Tyr 132 Gly;
Lys 134 -+ Asn;
Gln 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 -Hhr; He 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gln; Arg 72 Ser; Lys 73 Asp; Asp 77 Ser; Trp 79 Ser; Arg 81 He; Cys
- 43 035824
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Asn; Leu 103 Asp; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Vai; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gln 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 -VThr; Ile 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gln; Arg 72
Ser; Lys 73 Glu; Asp 77 Thr; Trp 79 Ser; Arg 81 lie; Cys
Ser; Asn 96 Asp; Tyr 100 Asn; Leu 103 Glu; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Asp; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gln 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 -VThr; lie 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Ser 68 Asp; Leu 70 Gln; Arg 72
Ser; Lys 73 Asp; Asp 77 Vai; Trp 79 Ser; Arg 81 lie; Cys
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Asn; Leu 103 Asn; Tyr 106
His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Vai; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gln 28 His; Ala 40 ^Gly; lie 41 Trp; Gln 49 Leu; Tyr
Met; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu; Lys 73
I Leu; Asp 77 Arg; Trp 79 Met; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn
Asp; Tyr 100 Ser; Leu 103 Trp; Tyr 106 Gln; Lys 125
Gly; Ser 127 Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134His;
Gln 28 His; Leu 36 Trp; Ala 40 ^Thr; lie 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Thr 54 Vai; Ser 68 Asp; Leu70
Gln; Arg 72 Ser; Lys 73 Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Ser; Trp
Ser; lie 80 Thr; Arg 81 lie; Cys 87 Ser; Asn96
Gly; Tyr 100 Ser; Leu 103 Gln; Tyr 106 His; Lys 125 Tyr;
Ser 127 Thr; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn;
Gln 28 His; Ala 40 ^Gly; lie 41 Trp; Lys 46 Glu; Gln
-+ Leu; Tyr 52 -+ Met; Thr 54 -+ Ala; lie 55 -+ Vai; Lys 59 -+
Arg; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu; Lys 73 Leu; Lys
Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Arg; Trp 79 Met; lie 80
Thr; Arg 81 Glu; Ser 87 Asn; Asn 96 Asp; Tyr 100 Ser;
Leu 103 Trp; Tyr 106 Gln; Lys 125 Gly; Ser 127 Tyr; Tyr
132 Trp; Lys 134 His;
Leu 36 Trp; Asn 39 Asp; Ala 40 ^Thr; lie 41 Thr; Gln
Pro; Tyr 52 Pro; Thr 54 Vai; Asn 65 Asp; Ser 68
Asp; Leu 70 Gln; Arg 72 Ser; Lys 73 Glu; Lys 75 Glu; Asp
Ser; Trp 79 Ser; lie 80 Thr; Arg 81 lie; Cys 87
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Ser; Leu 103 Gln; Tyr 106 His; Lys 125 Tyr; Ser 127 Thr; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn; Thr 136 Ala;
Leu 36 Trp; Ala 40 ^Thr; lie 41 Ala; Gln 49 Pro; Tyr 52 Pro; Thr 54 Vai; Asn 65 Asp; Ser 68 Asp; Leu 70
Gln; Arg 72 -+ Ser; Lys 73 -+ Glu; Lys 75 -+ Glu; Asp 77 -+ Ser; Trp 79 Ser; lie 80 Thr; Arg 81 lie; Cys 87 Ser; Asn 96
Gly; Tyr 100 Ser; Leu 103 Gln; Tyr 106 His; Lys 125 Tyr;
Ser 127 Thr; Tyr 132 Gly; Lys 134 Asn; Thr 136 Ala;
Gln 28 -+ His; Ala 40 -^Gly; lie 41 -+ Trp; Lys 46 -+ Glu; Gln
-+ Leu; Tyr 52 -+ Met; Thr 54 -+ Ala; lie 55 -+ Vai; Lys 59 -+
Arg; Asn 65 -+ Asp; Ser 68 -+ Vai; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Glu; Lys
-+ Leu; Lys 74 -+ Glu; Lys 75 -+ Glu; Asp 77 -+ Arg; Trp 79 -+
Met; lie 80 Thr; Arg 81 Glu; Ser 87 Asn; Asn 96 Asp; Tyr
100 -+ Ser; Leu 103 -+ Trp; Tyr 106 -+ Gln; Lys 125 -+ Gly; Ser 127 Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134 His; или
Gln 28 His; Ala 40 ^Gly; lie 41 Trp; Lys 46 Glu; Gln
Leu; Tyr 52 Met; Thr 54 Ala; lie 55 Vai; Lys 59
Arg; Asn 65 Gln; Ser 68 Vai; Leu 70 Asp; Arg 72 Glu; Lys
Leu; Lys 74 Glu; Lys 75 Glu; Asp 77 Arg; Trp 79
Met; lie 80 Thr; Arg 81 Glu; Ser 87 Asn; Asn 96 Asp; Tyr
100 Ser; Leu 103 Trp; Tyr 106 Gln; Lys 125 Gly; Ser 127
Tyr; Tyr 132 Trp; Lys 134 His.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-18 или их фрагмента или варианта.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связывать пиовердин II типа в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше при измерении с помощью инструмента Biacore T200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
- 44 035824
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связываться с сукцинилом
Pvd II типа, сукцинамидом Pvd II типа и α-кетоглутарилом Pvd II типа, в комплексе с железом и без такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше при измерении в анализе ELISA, фактически описанном в примере 5.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен ингибировать захват железа, опосредованный пиовердином II типа, со значением IC50, составляющем приблизительно 150 нМ или меньше в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен подавлять бактериальный рост штамма Pvd II в анализе, фактически описанном в примере 8.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен подавлять рост штаммов P. aeruginosa, экспрессирующих пиовердин II типа в анализе, фактически описанном в примере 9.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит мутированный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 28, 36, 40-41, 49, 52, 54, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит по меньшей мере один из следующих мутированных аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Leu 3 6
Asn, Не или Vai; Ala 40 Glu, Gly, Asn, Thr или His; He 41
Arg, Vai или Thr; Gln 49 Gly, Ala или Pro; Tyr 52 Asn, Gly, Trp или Pro; Ser 68 -+ Asp, Arg или Glu; Leu 70 -+ Arg или Trp; Arg 72 -+ His, He, Ala, Ser или Gly; Lys 73 -+ Asn, Met, Pro, Phe, Gln или Arg; Asp 77 -+ His, He, Met, Lys, Gly или Asn; Trp 79 Ser, Tyr, Ala, Asp, Phe или Trp; Arg 81 Glu, Ser, Tyr или Asp; Asn 96 -+ Met, He, Arg, Asp, Lys, Asn или Ala; Tyr 100
Lys, Glu, Asn, Ser, Phe или Tyr; Leu 103 Thr, lie, Gln, Gly, Met, His, Trp или Vai; Tyr 106 -+ Met, Gln, Ala, He, Asn, Gly, Met или Phe; Lys 125 -+ Ala, He или Asn; Ser 127 -+ Lys, Arg, Ser, Met, Asp или Asn; Tyr 132 Met, Phe, Asn, Ala, He, Gly или Vai и Lys 134 -+ Trp или Tyr.
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL: Gln 28 ^ His; Thr 54 ^ Ala; Asn 65 ^ Asp или Gln и Cys 87 ^ Ser.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 мутированный аминокислотный остаток в положениях последовательности 28, 36, 40-41, 49, 52, 54, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого белка NGAL человека (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит один из следующих наборов аминокислотных замен по сравнению с линейной полипептидной последовательностью природного hNGAL дикого типа:
- 45 035824
Gin 28 His; Leu 36 Val; Ala 40 Glu; He 41 Val; Gin
Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Ser; Arg 81 Glu; Cys
Ser; Tyr 100 Asn; Leu 103 Gin; Tyr 106 Met; Ser 127
Lys; Tyr 132 Gly; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Ala 40 Thr; He 41 He; Gin 49 Gly; Tyr 52 Asn; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg 72 lie; Lys 73
Met; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn 96 He; Tyr 100 Asn; Leu 103 Thr; Tyr 106 Gin; Lys 125
He; Ser 127 Arg; Tyr 132 Met; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 He; Ala 40 Hhr; He 41 Val; Gin
Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
Ala; Lys 73 Pro; Asp 77 lie; Trp 79 Ser; Arg 81 Ser; Cys
Ser; Asn 96 Met; Tyr 100 Ser; Leu 103 Gly; Tyr 106
Ala; Lys 125 Lys; Tyr 132 Val; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Ala 40 Asn; Gin 49 Ala; Tyr 52 Pro; Ser
-+ Glu; Leu 70 -+ Arg; Arg 72 -+ Ser; Lys 73 -+ Gin; Asp 77 -+ Met; Trp 79 Ala; Arg 81 Tyr; Cys 87 Ser; Asn 96 Arg; Tyr
100 Pro; Leu 103 Thr; Tyr 106 He; Lys 125 Lys; Ser 127
Met; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Ala 40 His; Gin 49 Ala; Tyr 52 Pro; Ser
-+ Glu; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Gly; Lys 73 -+ Arg; Asp 77 -+ His; Trp 79 Trp; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn 96 Arg; Tyr
100 Asp; Leu 103 Met; Tyr 106 Phe; Lys 125 Ala; Ser 127
Asp; Tyr 132 Asn; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Asn; Ala 40 Gly; He 41 Arg; Gin
Pro; Tyr 52 Trp; Ser 68 Arg; Leu 70 Trp; Arg 72
Asn; Lys 73 -+ Gin; Asp 77 -+ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Glu; Cys
Ser; Asn 96 Asp; Tyr 100 Thr; Leu 103 Trp; Tyr 106
Asn; Lys 125 Asn; Ser 127 Met; Tyr 132 He; Lys 134 Tyr;
Gin 28 His; Leu 36 Val; Ala 40 Hhr; He 41 Thr; Gin 49 Gly; Tyr 52 Gly; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg72
Gly; Lys 73 Arg; Asp 77 Gly; Trp 79 Trp; Arg 81 Glu;Cys
Ser; Asn 96 Ala; Tyr 100 Trp; Leu 103 He; Tyr106
Gly; Lys 125 -+ Lys; Ser 127 -+ Asn; Tyr 132 -+ Val; Lys 134 -+Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Val; Ala 40 Glu; He 41 Val;Gin
Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg72
His; Lys 73 -+ Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 -+ Ser; Arg 81 -+ Glu;Cys
Ser; Asn 96 Lys; Tyr 100 Asn; Leu 103 Val; Tyr 106
Met; Lys 125 Asn; Ser 127 Lys; Tyr 132 Gly; Lys 134 Trp;
- 46 035824
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; He 41 Vai; Gin 49 Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Lys 73 -+ Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 -+ Ser; Arg 81 -+ Glu; Cys
Ser; Leu 103 Gin; Tyr 106 Met; Ser 127 Lys; Tyr 132
Vai; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; lie 41 Vai; Gin
Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Asp 77^ Asn; Trp 79 Phe; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn
Lys; Tyr 100 His; Leu 103 Gin; Tyr 106 Met; Ser 127
Lys; Tyr 132 Ala; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 - Gly; He 41 Vai; Gin 49 Gly; Tyr 52 Pro; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Arg 72
His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Trp; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Tyr 100 Asn; Leu 103 His; Tyr 106 Met; Ser 127
I Lys; Tyr 132 Gly; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; He 41 He; Gin 49 Gly; Tyr 52 Asn; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg 72
He; Lys 73 Phe; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg 81 Asp; Cys
Ser; Leu 103 Met; Tyr 106 Gin; Lys 125 lie; Ser 127
Arg; Tyr 132 He; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; lie 41 lie; Gin
Gly; Tyr 52 Asn; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg 72
He; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg 81 Asp; Cys
Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106 Gin; Lys 125 He; Ser 127
Arg; Tyr 132 He; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Glu; He 41 Vai; Gin
-+ Gly; Tyr 52 -+ Pro; Asn 65 -+ Asp; Ser 68 -+ Glu; Leu 70 -+
Arg; Arg 72 His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Phe; Arg 81 Glu; Cys 87 Ser; Asn 96 Lys; Tyr 100 Asn; Leu 103
Vai; Tyr 106 Met; Lys 125 Asn; Ser 127 Lys; Tyr 132 Gly;
Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 - Glu; He 41 Vai; Gin
Gly; Tyr 52 Pro; Asn 65 Gin; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Arg 72 His; Lys 73 Asn; Asp 77^ Asn; Trp 79 Phe; Arg
Glu; Cys 87 Ser; Asn 96 Lys; Tyr 100 Asn; Leu 103
Vai; Tyr 106 Met; Lys 125 Asn; Ser 127 Lys; Tyr 132 Gly;
Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; He 41 He; Gin
Gly; Tyr 52 Asn; Thr 54 Ala; Asn 65 Asp; Ser 68
Asp; Leu 70 -+ Arg; Arg 72 -+ lie; Lys 73 -+ Arg; Asp 77^ His; Trp
Tyr; Arg 81 Asp; Cys 87 Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106
Gin; Lys 125 He; Ser 127 Arg; Tyr 132 He; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; He 41 He; Gin
Gly; Tyr 52 Asn; Thr 54 Ala; Asn 65 Gin; Ser 68
Asp; Leu 70 Arg; Arg 72 lie; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp
Tyr; Arg 81 Asp; Cys 87 Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106
Gin; Lys 125 He; Ser 127 Arg; Tyr 132 He; Lys 134 Trp;
Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; He 41 He; Gin 49 Gly; Tyr
-+ Asn; Thr 54 -+ Ala; Asn 65 -+ Asp; Ser 68 -+ Asp; Leu 70 -+
Arg; Arg 72 He; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg
Asp; Cys 87 Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106 Gin; Lys 125
He; Ser 127 Arg; Tyr 132 He; Lys 134 Trp; или
Leu 36 Vai; Ala 40 Thr; He 41 He; Gin 49 Gly; Tyr
-+ Asn; Thr 54 -+ Ala; Asn 65 -+ Gin; Ser 68 -+ Asp; Leu 70 -+
Arg; Arg 72 He; Lys 73 Arg; Asp 77^ His; Trp 79 Tyr; Arg
Asp; Cys 87 Ser; Leu 103 Thr; Tyr 106 Gin; Lys 125
He; Ser 127 Arg; Tyr 132 He; Lys 134 Trp.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-37 или их фрагмента или варианта.
В другом варианте осуществления указанный мутеин способен связывать пиовердин III типа в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше при измерении с помощью инструмента Biacore T200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связываться с сукцинилом Pvd III типа, сукцинамидом Pvd III типа и α-кетоглутарилом Pvd III типа, в комплексе с железом и без
- 47 035824 такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше при измерении в анализе, фактически описанном в примере 5.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен ингибировать захват железа, опосредованный пиовердином III типа, со значением IC50, составляющем приблизительно 150 нМ или меньше в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен подавлять бактериальный рост штамма Pvd III в анализе, фактически описанном в примере 8.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит мутированный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 28, 36, 40-42, 45-47, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105-106, 125, 127, 132, 134 и 145 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит по меньшей мере один из следующих мутированных аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Leu 36
-+ Phe или Glu; Ala 40 -+ Trp, Leu или Arg; He 41 -+ Met, Arg, Ala, Leu или Trp; Gln 49 -+ His, He, Arg, Lys, Met или Pro; Tyr 52 -+ Asn, Tyr, Arg, Ser или Met; Ser 68 -+ Asp, Asn, Glu или Gln; Leu 70 -+ Lys, Asn или Arg; Arg 72 -+ Leu, Arg, Gln или Tyr; Lys 73 -+ His, Leu, Ala, Pro, Gln или Tyr; Asp 77 -+ Ala, He, Lys, Gln или Arg; Trp 79 -+ Ser или Asp; Arg 81 -+ His, Ala, Ser или Vai; Asn 96 -+ Met, He, Arg, Gly, Leu или Vai; Tyr 100 -+ Ala, He, Asn, Pro или Asp; Leu 103 -+ Gln, Gly, Phe или Pro; Tyr 106 -+ Glu; Lys 125 -+ Trp или Thr; Ser 127 -+ Vai, His, He, Phe или Ala; Tyr 132 -+ Phe и Lys 134 -+ Trp, Gln или Glu.
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 28 -+ His; Leu 42 -+ Arg; Asp 45 -+ Gly; Lys 46 -+ Arg;
Asp 47 -+ Asn; Asn 65 -+ Asp; Cys 87 -+ Ser; Ser 105 -+ Pro и Thr 145 -+ Pro.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 мутированный аминокислотный остаток в положениях последовательности 28, 36, 40-42, 45-47, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105-106, 125, 127, 132, 134 и 145 линейной полипептидной последовательности зрелого белка NGAL человека (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит один из следующих наборов аминокислотных замен по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Phe; Ala 40 -+ Trp; He 41 -+ Met; Gln
-+ His; Tyr 52 -+ Asn; Ser 68 -+ Glu; Leu 70 -+ Lys; Arg 72 -+
Gln; Lys 73 -+ Ala; Asp 77^ He; Trp 79 -+ Ser; Arg 81 -+ His; Cys
-+ Ser; Asn 96 -+ He; Tyr 100 -+ Asn; Leu 103 -+ Gly; Tyr 106 -+
Glu; Lys 125^ Trp; Ser 127 -+ His; Tyr 132 -+ Phe; Lys 134 -+ Gln;
- 48 035824
Gln 28 His; Leu 36 Phe; Ala 40 Arg; Ile 41 Trp; Gln
Ile; Tyr 52 Tyr; Ser 68 Gln; Leu 70 Asn; Arg 72
Trp; Lys 73 -+ Leu; Asp 77^ Ala; Trp 79 -+ Ser; Arg 81 -+ Ser; Cys
Ser; Asn 96 Arg; Tyr 100 lie; Leu 103 Pro; Tyr 106
Glu; Lys 125^ Thr; Ser 127 Ile; Tyr 132 Phe; Lys 134 Glu;
Gln 28 His; Leu 36 Phe; Ala 40 Leu; Ile 41 Leu; Gln 49 Arg; Tyr 52 Arg; Ser 68 Asp; Leu 70 Arg; Arg 72
Leu; Lys 73 Tyr; Asp 77^ lie; Trp 79 Ser; Arg 81 Ala; Cys
Ser; Asn 96 Gly; Tyr 100 Ala; Leu 103 Phe; Tyr 106
Glu; Lys 125^ Trp; Ser 127 Ala; Lys 134 Glu;
Gln 28 His; Leu 36 Phe; Ala 40 Trp; lie 41 Arg; Gln
Pro; Tyr 52 Ser; Ser 68 Asn; Leu 70 Arg; Arg 72
Trp; Lys 73 Pro; Asp 77^ Arg; Trp 79 Ser; Arg 81 Ser; Cys
Ser; Asn 96 Met; Tyr 100 Pro; Leu 103 Gly; Tyr 106
Glu; Lys 125^ Trp; Ser 127 Phe; Tyr 132 Phe; Lys 134 Glu;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; Ile 41 Ala; Gln
Lys; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73
His; Asp 77^ Gln; Trp 79 Asp; Arg 81 Ala; Cys 87 Ser; Asn
Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; Ile 41 Ala; Gln 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73
Gln; Asp 77^ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Vai; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; Ile 41 Thr; Gln 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73
Arg; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg 81 Vai; Cys 87 Ser; Asn
Vai; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; Ile 41 Ala; Gln
Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys73
His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg 81 Vai; Cys 87 Ser; Asn
Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gln 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; Ile 41 Ala; Gln
Lys; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys73
Tyr; Asp 77^ Gln; Trp 79 Asp; Arg 81 Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 -; Tyr 100 Glu; Leu 103 Gln; Tyr 106 Glu; Ser 127
Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
- 49 035824
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Leu
Arg; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Lys 73 -+ His; Asp 77^ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Vai; Cys
Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gin; Ser 105
Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Asp
Asn; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg 81 Vai; Cys
Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gin; Ser 105
Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp; Thr 145 Pro;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Asp
Gly; Lys 46 Arg; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Ser 68
Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg
Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103
Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe;
Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Leu
Arg; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Asn 65 Asp; Ser 68
Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg
Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103
Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe;
Lys 134 Trp;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Asp
Asn; Gin 49 Met; Tyr 52 Met; Asn 65 Asp; Ser 68
Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp 79 Asp; Arg
Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103
Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe;
Lys 134 Trp; Thr 145 Pro;
Gin 28 His; Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Asp 45 -+ Gly; Lys 46 -+ Arg; Gin 49 -+ Met; Tyr 52 -+ Met; Asn 65 -+
Asp; Ser 68 Glu; Leu 70 Arg; Lys 73 His; Asp 77^ Lys; Trp
Asp; Arg 81 Vai; Cys 87 Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100
Asp; Leu 103 Gin; Ser 105 Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai;
Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp; или
Leu 36 Glu; Ala 40 Leu; He 41 Ala; Leu 42 Arg; Gin
Met; Tyr 52 Met; Asn 65 Asp; Ser 68 Glu; Leu 70
Arg; Lys 73 -+ His; Asp 77^ Lys; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Vai; Cys
Ser; Asn 96 Leu; Tyr 100 Asp; Leu 103 Gin; Ser 105
Pro; Tyr 106 Glu; Ser 127 Vai; Tyr 132 Phe; Lys 134 Trp.
В другом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38-53 или их фрагмента или варианта.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связывать пиохелин в комплексе с железом при KD, составляющей приблизительно 20 нМ или меньше при измерении с помощью инструмента Biacore T200 в анализе, фактически описанном в примере 6.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связываться с пиохелином в комплексе с железом, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 500 нМ или меньше при измерении в анализе, фактически описанном в примере 5.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связываться с пиохелином без комплекса с железом, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше при измерении в анализе, фактически описанном в примере 5.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL способен связываться с пиохелином в комплексе с железом или без такового, с аффинностью, измеренной по значению IC50, составляющему приблизительно 200 нМ или меньше при измерении в анализе, фактически описанном в примере 5.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен ингибировать захват железа, опосредованный пиохелином, со значением IC50, составляющем приблизительно 150 нМ или меньше в формате конкурентного ELISA, фактически описанного в примере 7.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL способен подавлять бактериальный рост нокаута
- 50 035824 (ApvdA) в анализе, фактически описанном в примере 8.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит мутированный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 28, 34, 36, 40-41, 44-46, 49, 52,
54, 65, 68, 70, 72-74, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134 и 141 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит по меньшей мере один из следующих мутированных аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Leu 36
-+ His, Met или Vai; Ala 40 -+ He, Gln, Туг или Phe; Не 41 -+ Leu, His или Trp; Gln 49 His, Arg, Ser или Ala; Tyr 52 Leu, Trp или Pro; Ser 68 -+ Asp или His; Leu 70 -+ Arg или Trp; Arg 72
His, He, Ala, Ser или Gly; Lys 73 Asn, Met, Pro, Phe, Gln или Arg; Asp 77 -+ Arg, Thr, Pro или Asp; Trp 7 9 -+ Ala, Arg, Lys или Asp; Arg 81 -+ Thr, lie или Trp; Asn 96 -+ Met, Asn, Pro или
Ala; Tyr 100 -+ Gly, His или Glu; Leu 103 -+ Gly, Met, His или
Gln; Tyr 106 Met, Gly, Arg или Trp; Lys 125 Trp, Phe, Gly или Leu; Ser 127 -+ Arg, Trp, Asp или lie; Tyr 132 -+ Ala, Glu или Thr и Lys 134 Leu, Vai, Asn или Phe.
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность мутеина hNGAL содержит следующую замену по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 28 His; Vai 34 - Leu; Glu 44 - Gly; Asp 45 - Gly;
Lys -+ Arg or Tyr; Asn 65 -+ Asp; He 80 -+ Thr; Cys 87 -+ Ser; Leu 94 Phe; Vai 108 Ala; Phe 123 Ser и Thr 141 Ala.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 мутированный аминокислотный остаток в положениях последовательности 28, 34, 36, 40-41, 44-46, 49, 52, 54, 65, 68, 70, 72-74, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134 и 141 линейной полипептидной последовательности зрелого белка NGAL человека (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL содержит один из следующих наборов аминокислотных замен по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL:
Gln 28 His; Ala 40 Не; Не 41 Leu; Gln 49 His; Туг
-+ Leu; Ser 68 -+ His; Leu 70 -+ Thr; Arg 72 -+ Lys; Lys 73 -+
Trp; Asp 77^ He; Trp 79 Ser; Arg 81 His; Cys 87 Ser; Asn
- Met; Tyr 100 - Asn; Leu 103 - His; Tyr 106 - Met; Lys 125^
Trp; Ser 127 Asp; Tyr 132 Glu; Lys 134 Leu;
Gln 28 His; Leu 36 His; Ala 40 Gln; He 41 Trp; Gln
Arg; Tyr 52 Trp; Ser 68 Asp; Leu 70 Asp; Arg 72
Ala; Lys 73 He; Asp 77^ His; Trp 79 Arg; Arg 81 Thr; Cys
Ser; Tyr 100 His; Leu 103 Gly; Tyr 106 Gly; Lys 125^
Phe; Ser 127 -+ Tie; Tyr 132 -+ Ala; Lys 134 -+ Phe;
Gln 28 -+ His; Leu 36 -+ Met; Ala 40 -+ Phe; He 41 -+ His; Gln 49 Ser; Tyr 52 Pro; Ser 68 His; Leu 70 Pro; Arg 72 Trp; Lys 73 Ala; Asp 77^ Ala; Trp 79 Lys; Arg 81 He; Cys 87 Ser; Asn 96 Ala; Tyr 100 Gly; Leu 103 Met; Tyr 106
- 51 035824
Trp; Lys 125^ Gly; Ser 127 -+ Trp; Tyr 132 -+ Thr; Lys 134 -+ Vai;
Gin 28 -+ His; Leu 36 -+ Vai; Ala 40 -+ Tyr; He 41 -+ Trp; Gin
-+ Ala; Ser 68 -+ Asp; Leu 70 -+ Arg; Arg 72 +Trp; Lys 73 -+ Arg;
Asp 77^ Arg; Trp 79 -+ Asp; Arg 81 -+ Trp; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 -+
Pro; Tyr 100 -+ Glu; Leu 103 -+ Gin; Tyr 106 -+ Arg; Lys 125^ Leu;
Ser 127 -+ Arg; Tyr 132 -+ Ala; Lys 134 -+ Asn;
Gin 28 -+ His; Vai 34 -+ Leu; Leu 36 -+ Met; Ala 40 -+ Phe; He 41 -+ His; Gin 49 -+ Ser; Tyr 52 -+ Pro; Ser 68 -+ His; Leu 70 -+ Pro; Arg 72 -+ Trp; Lys 73 -+ Ala; Asp 77^ Ala; Trp 79 -+ Lys; He
-+ Thr; Arg 81 -+ He; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 -+ Ala; Tyr 100 -+
Gly; Leu 103 -+ Met; Tyr 106 -+ Trp; Phe 123 -+ Ser; Lys 125 -+ Gly; Ser 127 -+ Trp; Tyr 132 -+ Thr; Lys 134 -+ Vai; Thr 141 -+ Ala;
Gin 28 -+ His; Leu 36 -+ Met; Ala 40 -+ Phe; He 41 -+ His; Gin
-+ Ser; Tyr 52 -+ Pro; Ser 68 -+ His; Leu 70 -+ Pro; Arg 72 -+ Trp; Lys 73 -+ Ala; Asp 77^ Ala; Trp 79 -+ Lys; He 80 -+ Thr; Arg 81 -+ Tie; Cys 87 -+ Ser; Asn 96 -+ Ala; Tyr 100 -+ Gly; Leu 103 -+ Met; Tyr 106 -+ Trp; Phe 123 -+ Ser; Lys 125^ Gly; Ser 127 -+ Trp; Tyr 132 -+ Thr; Lys 134 -+ Vai;
Gin 28 -+ His; Leu 36 -+ His; Ala 40 -+ Gin; He 41 -+ Trp; Asp 45 -+ Gly; Lys 46 -+ Arg; Gin 49 -+ Arg; Tyr 52 -+ Trp; Ser 68 -+ Asp; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Ala; Lys 73 -+ Tie; Asp 77^ Leu; Trp 79 -+ Arg; Arg 81 -+ Thr; Cys 87 -+ Ser; Tyr 100 -+ His; Leu 103 -+
Gly; Tyr 106 -+ Gly; Lys 125^ Phe; Ser 127 -+ He; Tyr 132 -+ Ala;
Lys 134 -+ Phe;
Gin 28 -+ His; Leu 36 -+ His; Ala 40 -+ Gin; Tie 41 -+ Trp; Glu
-+ Gly; Lys 46 -+ Tyr; Gin 49 -+ Arg; Tyr 52 -+ Trp; Ser 68 -+
Asp; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Ala; Lys 73 -+ Tie; Lys 74 -+ Glu; Asp
-+ His; Trp 79 -+ Arg; Arg 81 -+ Thr; Cys 87 -+ Ser; Leu 94 -+
Phe; Tyr 100 -+ His; Leu 103 -+ Gly; Tyr 106 -+ Gly; Vai 108 -+ Ala;
Lys 125^ Phe; Ser 127 -+ Tie; Tyr 132 -+ Ala; Lys 134 -+ Phe; или
Leu 36 -+ His; Ala 40 -+ Gin; lie 41 -+ Trp; Asp 45 -+ Gly; Lys
-+ Arg; Gin 49 -+ Arg; Tyr 52 -+ Trp; Asn 65 -+ Asp; Ser 68 -+ Asp; Leu 70 -+ Asp; Arg 72 -+ Ala; Lys 73 -+ Tie; Asp 77^ Leu; Trp 79 -+ Arg; Arg 81 -+ Thr; Cys 87 -+ Ser; Tyr 100 -+ His; Leu 103 -+ Gly; Tyr 106 -+ Gly; Lys 125^ Phe; Ser 127 -+ He; Tyr 132 -+ Ala; Lys 134 -+ Phe.
В другом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54-63 или их фрагмента или варианта.
В другом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-63 или их фрагмента или варианта.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL содержит один или несколько неприродных цистеиновых остатков, замещающих одну или несколько аминокислот hNGAL дикого типа.
В другом варианте осуществления указанный мутеин hNGAL содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену нативного цистеинового остатка другой аминокислотой.
В другом варианте осуществления указанная аминокислота представляет собой сериновый остаток.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL конъюгируют с соединением, выбранным из группы, состоящей из органической молекулы, ферментативной метки, радиоактивной метки, окрашенной метки, флуоресцентной метки, хромогенной метки, люминесцентной метки, гаптена, дигоксигенина, биотина, цитостатистического средства, токсина, комплекса металла, металла и коллоидного золота.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL является слитым на N-конце и/или С-конце с партнером по слиянию, который представляет собой белок или домен белка или пептид.
В другом варианте осуществления мутеин hNGAL конъюгируют с соединением, которое увеличивает время полужизни полипептида в сыворотке крови.
В другом варианте осуществления полипептид содержит соединение, которое продлевает время полужизни в сыворотке крови, выбранное из группы, состоящей из молекулы полиалкиленгликоля, гидроэтилкрахмала, части Fc иммуноглобулина, домена CH3 иммуноглобулина, домена СН4 иммуноглобулина, альбумин-связывающего пептида или альбумин-связывающего белка.
В другом варианте осуществления полиалкиленгликоль представляет собой полиэтилен (PEG) или его активированное производное.
В другом варианте осуществления охватывается молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нук- 52 035824 леотидную последовательность, кодирующую любой из полипептидов, упомянутых в данном документе.
В другом варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты функционально связывают с регуляторной последовательностью для обеспечения экспрессии указанной молекулы нуклеиновой кислоты.
В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержится в векторе или в фагмидном векторе.
В другом варианте осуществления охватывается клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты любой из нуклеиновых кислот, упомянутых в данном документе.
В другом варианте осуществления охватывается способ получения полипептида, описанного в данном документе, где полипептид получают, начиная с нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, посредством способов генной инженерии.
В другом варианте осуществления полипептид получают в бактериальном или эукариотическом организме-хозяине и выделяют из данного организма-хозяина или его культуры.
В другом варианте осуществления охватывается композиция, содержащая один или несколько полипептидов, выбранных из группы, состоящей из (i) полипептида, специфичного к пиовердину I типа, (ii) полипептида, специфичного к пиовердину II типа, (iii) полипептида, специфичного к пиовердину III типа, и (iv) полипептида, специфичного к пиохелину.
В другом варианте осуществления композиция содержит один или несколько полипептидов, выбранных из группы, состоящей из (i) полипептида, специфичного к пиовердину I типа, (ii) полипептида, специфичного к пиовердину II типа, (iii) полипептида, специфичного к пиовердину III типа, и (iv) полипептида, специфичного к пиохелину.
В другом варианте осуществления композиция содержит три или четыре полипептида, выбранных из группы, состоящей из (i) полипептида, специфичного к пиовердину I типа, (ii) полипептида, специфичного к пиовердину II типа, (iii) полипептида, специфичного к пиовердину III типа, и (iv) полипептида, специфичного к пиохелину.
В другом варианте осуществления композиция содержит полипептид, специфичный к пиовердину I типа.
В другом варианте осуществления композиция содержит полипептид, специфичный к пиовердину II типа.
В другом варианте осуществления композиция содержит полипептид, специфичный к пиовердину III типа.
В другом варианте осуществления композиция содержит полипептид, специфичный к пиохелину.
В другом варианте осуществления указанная композиция дополнительно включает в себя по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное средство, разбавитель или носитель.
В другом варианте осуществления способ получения пиовердина I, II, III типа и/или пиохелина у субъекта предусматривает введение указанному субъекту эффективного количества любой из композиций, упомянутых в данном документе.
В другом варианте осуществления охватывается способ подавления или ослабления роста P. aeruginosa у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества любой из композиций, упомянутых в данном документе.
В другом варианте осуществления включен набор, содержащий один или несколько контейнеров, отдельно или совместно, и любую из композиций, упомянутых в данном документе.
В другом варианте осуществления охватывается применение (i) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином I типа, (ii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином II типа, (iii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином III типа, и/или (iv) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиохелином, для связывания с пиовердином I, II, III типа и/или пиохелином у субъекта.
В другом варианте осуществления охватывается применение (i) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином I типа, (ii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином II типа, (iii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином III типа, и/или (iv) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиохелином, для предотвращения или уменьшения захвата железа P. aeruginosa пиовердином и/или пиохелином у субъекта.
В другом варианте осуществления охватывается применение (i) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином I типа, (ii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином II типа, (iii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином III типа, и/или (iv) полипептида в соответст- 53 035824 вии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиохелином, для лечения или ослабления биопленочной инфекции P. aeruginosa у субъекта.
В другом варианте осуществления биопленочная инфекция Р. aeruginosa представляет собой острую или хроническую инфекцию.
В другом варианте осуществления указанные первый, второй, третий и/или четвертый полипептиды вводят в комбинации, в том числе одновременно, совместно или последовательно.
В другом варианте осуществления указанный первый, второй, третий и/или четвертый полипептиды вводят независимо друг от друга, в том числе с индивидуальными интервалами времени в независимых временных точках.
В другом варианте осуществления охватывается комбинация (i) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином I типа, (ii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином II типа, (iii) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиовердином III типа, и/или (iv) полипептида в соответствии с любым полипептидом, упомянутым в данном документе, способным связываться с пиохелином.
Варианты осуществления, описанные в данном документе, можно подходящим образом применять на практике в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, специально не описанных в данном документе. Таким образом, например, термины содержащий, в том числе и т.д. следует понимать широко и без ограничений. Кроме того, термины и выражения, используемые в данном документе, были использованы в качестве терминов описания, а не ограничения, и отсутствует какоелибо намерение при использовании таких терминов и выражений исключать любые эквиваленты показанных и описанных характеристик или их частей, однако считается, что эти различные модификации возможны в пределах объема заявляемого изобретения. Таким образом, следует понимать, что несмотря на то, что варианты осуществления настоящего раскрытия определенным образом были раскрыты с помощью предпочтительных вариантов осуществления и необязательных характеристик, за их модификацией и вариантами можно обращаться к специалистам в данной области техники, и такие модификации и изменения считаются находящимися в объеме настоящего раскрытия. Все патенты, патентные заявки, учебники и рецензируемые публикации, описанные в данном документе, включены с помощью ссылки во всей своей полноте. Кроме того, если определение или использование термина в источнике, который включен в данный документ с помощью ссылки, не согласуется или противоречит определению этого термина, представленного в данном документе, то используется определение этого термина, представленного в данном документе, и не используется определение этого термина в источнике. Каждый из более узких видов или субродовых группировок, находящихся в пределах основного раскрытия, также образует часть настоящего изобретения. Это включает в себя основное описание изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, устраняющими любой объект из данного рода, независимо от того, упоминается ли исключенный материл в данном документе специально или нет. Кроме того, если характеристики описаны с точки зрения групп Маркуша, то специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящим раскрытие также тем самым описывается с точки зрения любого индивидуального члена или подгруппы членов группы Маркуша. Дополнительные варианты осуществления будут очевидны из следующей формулы изобретения.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Полипептид, характеризующийся специфичностью связывания с пиовердином I, II, III типа или пиохелином, где полипептид содержит мутеин hNGAL, который связывается с пиовердином I, II, III типа или пиохелином с KD 200 нМ или меньше, где мутеин hNGAL содержит мутированный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 28, 34, 36, 39-42, 44-47, 49, 52, 54-55, 65, 68, 70, 72-75, 77, 79-81, 87, 96, 100, 103, 106, 108, 123, 125, 127, 132, 134, 141 и 145 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) и, где мутеин имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 90% последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-63.
  2. 2. Полипептид по п.1, где полипептид содержит мутеин, который имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-63.
  3. 3. Полипептид по п.1, где полипептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-63.
  4. 4. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1.
  5. 5. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.4.
  6. 6. Способ получения полипептида по п.1, где полипептид получают, начиная с нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, посредством способов генной инженерии.
  7. 7. Композиция, содержащая один или несколько полипептидов, выбранных из группы, состоящей
    - 54 035824 из (i) полипептида по п.1, специфичного к пиовердину I типа, (ii) полипептида по п.1, специфичного к пиовердину II типа, (iii) полипептида по п.1, специфичного к пиовердину III типа, и (iv) полипептида по
    п.1, специфичного к пиохелину.
  8. 8. Способ связывания пиовердина I, II, III типа и/или пиохелина у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту эффективного количества композиции по п.7.
  9. 9. Набор, содержащий в одном или нескольких контейнерах, отдельно или совместно, полипептид по п.1, специфичный к пиовердину I типа, или композицию, содержащую его, полипептид по п.1, специфичный к пиовердину II типа, или композицию, содержащую его, полипептид по п.1, специфичный к пиовердину III типа, или композицию,содержащую его, и/или полипептид по п.1, специфичный к пиохе лину, или композицию, содержащую его.
  10. 10. Применение (i) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином I типа, (ii) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином II типа, (iii) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином III типа, и/или (iv) полипептида по п.1, способного связываться с пиохелином, для связывания с пиовердином I, II, III типа и/или пиохелином у субъекта.
  11. 11. Применение (i) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином I типа, (ii) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином II типа, (iii) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином III типа, и/или (iv) полипептида по п.1, способного связываться с пиохелином, для связывания с пиовердином I, II, III типа и/или пиохелином у субъекта, для предотвращения или уменьшения захвата железа Р. aeruginosa у субъекта посредством пиохелина и/или пиовердина.
  12. 12. Применение (i) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином I типа, (ii) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином II типа, (iii) полипептида по п.1, способного связываться с пиовердином III типа, и/или (iv) полипептида по п.1, способного связываться с пиохелином для лечения или облегчения протекания у субъекта биопленочной инфекции P. aeruginosa.
  13. 13. Комбинация двух или более полипептидов по п.1.
EA201791841A 2015-02-18 2016-02-16 Новые белки, специфичные к пиовердину и пиохелину EA035824B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15305242 2015-02-18
PCT/EP2016/053226 WO2016131804A1 (en) 2015-02-18 2016-02-16 Novel proteins specific for pyoverdine and pyochelin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791841A1 EA201791841A1 (ru) 2018-01-31
EA035824B1 true EA035824B1 (ru) 2020-08-17

Family

ID=52595246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201791841A EA035824B1 (ru) 2015-02-18 2016-02-16 Новые белки, специфичные к пиовердину и пиохелину

Country Status (28)

Country Link
US (8) US9884898B2 (ru)
EP (1) EP3259282A1 (ru)
JP (1) JP6843754B2 (ru)
KR (1) KR20170116158A (ru)
CN (1) CN107660211A (ru)
AR (1) AR103714A1 (ru)
AU (1) AU2016221816B2 (ru)
BR (1) BR112017017530A2 (ru)
CA (1) CA2976687A1 (ru)
CL (1) CL2017002082A1 (ru)
CO (1) CO2017009433A2 (ru)
CR (1) CR20170425A (ru)
DO (1) DOP2017000191A (ru)
EA (1) EA035824B1 (ru)
EC (1) ECSP17061751A (ru)
GT (1) GT201700184A (ru)
HK (1) HK1245293A1 (ru)
IL (1) IL254013A0 (ru)
MA (1) MA41072A1 (ru)
MX (1) MX2017010628A (ru)
PE (1) PE20171652A1 (ru)
PH (1) PH12017501473A1 (ru)
SG (1) SG11201706621SA (ru)
TN (1) TN2017000348A1 (ru)
TW (1) TW201636364A (ru)
UY (1) UY36561A (ru)
WO (1) WO2016131804A1 (ru)
ZA (1) ZA201705257B (ru)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101974044B1 (ko) 2009-12-07 2019-04-30 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 주어진 표적에 대한 친화성을 갖는 인간의 리포칼린 2의 뮤테인
MX2016015235A (es) 2014-05-22 2017-06-29 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Nuevos polipeptidos de union especifica y usos de los mismos.
RU2720688C2 (ru) 2015-01-28 2020-05-12 ПИЕРИС ФАРМАСЬЮТИКАЛС ГмбХ Новые белки, специфические в отношении ангиогенеза
EA035824B1 (ru) * 2015-02-18 2020-08-17 Пайерис Фармасьютикалс Гмбх Новые белки, специфичные к пиовердину и пиохелину
JP6783797B2 (ja) 2015-05-04 2020-11-11 ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー 抗がん融合ポリペプチド
WO2016177762A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Proteins specific for cd137
RS64002B1 (sr) 2015-05-18 2023-03-31 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Anti-kancerski fuzioni polipeptid
CA2982034A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (gpc3)
EP3115371A1 (en) 2015-07-07 2017-01-11 Sanofi Fusion molecules
EA035586B1 (ru) 2015-11-30 2020-07-10 Пиерис Острелиа Пти Лтд. Новые антиангиогенные слитые белки
TW201725212A (zh) 2015-12-10 2017-07-16 第一三共股份有限公司 特異性於降鈣素基因相關胜肽的新穎蛋白
WO2018087108A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-17 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Proteins specific for cd137
WO2020018807A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 The Regents Of The University Of Colorado Methods, systems and compositions for the novel use of enterobactin to treat iron deficiency and related anemia
EP3946417A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 Pieris Pharmaceuticals GmbH Inhaled administration of lipocalin muteins

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004060918A1 (en) * 2002-12-16 2004-07-22 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detecting lipocalin
WO2011149962A1 (en) * 2010-05-24 2011-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant ngal proteins and uses thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01215289A (ja) 1988-02-22 1989-08-29 Toa Nenryo Kogyo Kk 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
US5728553A (en) 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
CA2233725A1 (en) 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
ATE307597T1 (de) 1998-06-08 2005-11-15 Hoffmann La Roche Verwendung von peg-ifn-alpha und ribavirin zur behandlung chronischer hepatitis c
US6403564B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Schering Corporation Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection
US7211395B2 (en) 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US7892827B2 (en) 2004-11-26 2011-02-22 Pieris Ag Compound with affinity for the cytotoxic T lymphocyte-associated antigen (CTLA-4)
WO2007038619A2 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Amunix, Inc. Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof
EP3381933B1 (en) 2008-06-24 2020-06-03 Technische Universität München Muteins of hngal and related proteins with affinity for a given target
EP2920202B1 (en) 2012-11-19 2018-08-29 Pieris Pharmaceuticals GmbH Novel specific-binding polypeptides and uses thereof
CN103074303A (zh) * 2012-12-27 2013-05-01 中国人民解放军第三军医大学 产生抗人ngal特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体与应用
EA035824B1 (ru) * 2015-02-18 2020-08-17 Пайерис Фармасьютикалс Гмбх Новые белки, специфичные к пиовердину и пиохелину
EP3115371A1 (en) 2015-07-07 2017-01-11 Sanofi Fusion molecules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004060918A1 (en) * 2002-12-16 2004-07-22 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detecting lipocalin
WO2011149962A1 (en) * 2010-05-24 2011-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant ngal proteins and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLMES, M.A. ; PAULSENE, W. ; JIDE, X. ; RATLEDGE, C. ; STRONG, R.K.: "Siderocalin (Lcn 2) Also Binds Carboxymycobactins, Potentially Defending against Mycobacterial Infections through Iron Sequestration", STRUCTURE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 13, no. 1, 1 January 2005 (2005-01-01), AMSTERDAM, NL, pages 29 - 41, XP027638481, ISSN: 0969-2126 *
M. FLUCKINGER, H. HAAS, P. MERSCHAK, B. J. GLASGOW, B. REDL: "Human Tear Lipocalin Exhibits Antimicrobial Activity by Scavenging Microbial Siderophores", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., vol. 48, no. 9, 1 September 2004 (2004-09-01), pages 3367 - 3372, XP055190970, ISSN: 00664804, DOI: 10.1128/AAC.48.9.3367-3372.2004 *
MARY E. PEEK, ABHINAV BHATNAGAR, NAEL A. MCCARTY, SUSU M. ZUGHAIER: "Pyoverdine, the Major Siderophore in Pseudomonas aeruginosa, Evades NGAL Recognition", INTERDISCIPLINARY PERSPECTIVES ON INFECTIOUS DISEASES, vol. 9, no. 3, 1 January 2012 (2012-01-01), pages 126 - 10, XP055190936, ISSN: 1687708X, DOI: 10.1155/2012/843509 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180371037A1 (en) 2018-12-27
AU2016221816B2 (en) 2020-07-02
EP3259282A1 (en) 2017-12-27
CL2017002082A1 (es) 2018-04-27
CO2017009433A2 (es) 2017-11-30
EA201791841A1 (ru) 2018-01-31
BR112017017530A2 (pt) 2018-04-17
US10329334B2 (en) 2019-06-25
WO2016131804A1 (en) 2016-08-25
CN107660211A (zh) 2018-02-02
MX2017010628A (es) 2017-12-07
JP6843754B2 (ja) 2021-03-17
IL254013A0 (en) 2017-10-31
ECSP17061751A (es) 2017-10-31
MA41072A1 (fr) 2018-10-31
TW201636364A (zh) 2016-10-16
HK1245293A1 (zh) 2018-08-24
CR20170425A (es) 2017-11-22
GT201700184A (es) 2018-10-24
US20180030101A1 (en) 2018-02-01
SG11201706621SA (en) 2017-09-28
CA2976687A1 (en) 2016-08-25
KR20170116158A (ko) 2017-10-18
AR103714A1 (es) 2017-05-31
US20170267734A1 (en) 2017-09-21
AU2016221816A1 (en) 2017-10-12
US20180037619A1 (en) 2018-02-08
US20180086799A1 (en) 2018-03-29
PH12017501473A1 (en) 2018-01-29
JP2018506979A (ja) 2018-03-15
PE20171652A1 (es) 2017-11-13
US9884898B2 (en) 2018-02-06
US10072056B2 (en) 2018-09-11
US20180037618A1 (en) 2018-02-08
ZA201705257B (en) 2019-06-26
US10118952B2 (en) 2018-11-06
TN2017000348A1 (en) 2019-01-16
DOP2017000191A (es) 2017-09-29
US20180371038A1 (en) 2018-12-27
US20180346532A1 (en) 2018-12-06
US10065998B2 (en) 2018-09-04
UY36561A (es) 2016-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10072056B2 (en) Proteins specific for pyoverdine and pyochelin
CA2817779C (en) Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (gpc3)
RU2756318C2 (ru) Мутеины липокалина 2 человека с аффинностью в отношении глипикана-3 (gpc3)
US10947284B2 (en) Fusion molecules
AU2009264214A1 (en) Muteins of hNGAL and related proteins with affinity for a given target
JP2018532372A (ja) Ｌａｇ−３に特異的な新規タンパク質
AU2013224694B2 (en) MUTEINS OF hNGAL AND RELATED PROTEINS WITH AFFINITY FOR A GIVEN TARGET

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU