EA035522B1 - Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides - Google Patents
Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides Download PDFInfo
- Publication number
- EA035522B1 EA035522B1 EA201592048A EA201592048A EA035522B1 EA 035522 B1 EA035522 B1 EA 035522B1 EA 201592048 A EA201592048 A EA 201592048A EA 201592048 A EA201592048 A EA 201592048A EA 035522 B1 EA035522 B1 EA 035522B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rsv
- amino acid
- seq
- fusion
- protein
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 152
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 144
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 135
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 27
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 270
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 205
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 143
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 129
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 128
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 89
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 52
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 33
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 25
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims description 8
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102200094096 rs28941785 Human genes 0.000 claims 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 5
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 43
- 102220320732 rs1554306350 Human genes 0.000 description 40
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 39
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 33
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 32
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 27
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 102220277122 rs1469561474 Human genes 0.000 description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 17
- 102220082314 rs863224177 Human genes 0.000 description 17
- 102200083206 rs80338798 Human genes 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 9
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 7
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 241001559185 Mammalian rubulavirus 5 Species 0.000 description 6
- 102400001093 PAK-2p27 Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 102220087238 rs541028076 Human genes 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220370332 c.200C>T Human genes 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- -1 enhancer (s) Chemical class 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 229960001521 motavizumab Drugs 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 101100491335 Caenorhabditis elegans mat-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100495256 Caenorhabditis elegans mat-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102220499787 Carbonic anhydrase 2_N67H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220499772 Carbonic anhydrase 2_N67L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220499774 Carbonic anhydrase 2_N67Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100029604 Interferon alpha-inducible protein 27, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220509369 Myeloid differentiation primary response protein MyD88_N67A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSSSSSSS SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K aluminum;potassium;phosphate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 102220346476 c.199A>T Human genes 0.000 description 1
- 102220411695 c.201C>A Human genes 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000030500 lower respiratory tract disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 102220227375 rs200294578 Human genes 0.000 description 1
- 102220101251 rs377614167 Human genes 0.000 description 1
- 102220053377 rs727504500 Human genes 0.000 description 1
- 102220192067 rs886057201 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- C07K14/135—Respiratory syncytial virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области медицины. Настоящее изобретение, в частности, относится к рекомбинантному F-полипептиду RSV до слияния и к его применениям, например, в иммуногенных композициях.The present invention relates to the field of medicine. The present invention, in particular, relates to a recombinant RSV F polypeptide prior to fusion and to its uses, for example, in immunogenic compositions.
Предпосылки изобретенияBackground of the invention
Респираторный синцитиальный вирус (RSV) представляет собой оболочечный вирус с несегментированной одноцепочечной РНК с негативной полярностью из семейства Paramyxoviridae, рода Pneumovirus. По оценкам в мире ежегодно наблюдается 64 миллионов инфекций RSV, которые приводят к 160000 смертей (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). Наиболее тяжело заболевание протекает, в частности, у недоношенных детей, пожилых индивидуумов и индивидуумов с ослабленным иммунитетом. У детей младше 2 лет RSV является наиболее распространенным возбудителем заболеваний респираторного тракта, который является причиной примерно 50% госпитализаций вследствие респираторных инфекций, с пиком госпитализации, наблюдающимся в 2-4-месячном возрасте. Сообщалось, что практически все дети к двухлетнему возрасту были инфицированы RSV. Повторные инфекции в течение жизни связаны с малоэффективным врожденным иммунитетом. У пожилых людей уровень тяжести заболевания, вызванного RSV, смертности и заболеваемости занимают второе место, уступая лишь инфекциям, вызываемым непандемическим гриппом А.Respiratory syncytial virus (RSV) is an enveloped, unsegmented single-stranded RNA virus with negative polarity from the Paramyxoviridae family, genus Pneumovirus. An estimated 64 million RSV infections occur worldwide each year, resulting in 160,000 deaths (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). The most severe disease occurs, in particular, in premature infants, elderly individuals and individuals with weakened immune systems. In children younger than 2 years of age, RSV is the most common causative agent of respiratory tract disease, accounting for approximately 50% of hospital admissions due to respiratory infections, with a peak in hospital admissions at 2-4 months of age. It was reported that virtually all children were infected with RSV by the age of two. Repeated infections during life are associated with ineffective innate immunity. In the elderly, RSV severity, mortality and morbidity are second only to non-pandemic influenza A infections.
Для инфицирования клетки-хозяина RSV, подобно другим оболочечным вирусам, таким как вирус гриппа и HIV, требуют слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина. Что касается RSV, консервативный белок слияния (F-белок RSV) подвергает слиянию вирусные мембраны и клеточные мембраны клетки-хозяина. В современных моделях на основе исследований парамиксовирусов F-белок RSV исходно уложен в конформацию до слияния. Во время проникновения в клетку предшествующая слиянию конформация подвергается рефолдингу и конформационным изменениям до своей конформации после слияния. Таким образом, F-белок RSV представляет собой метастабильный белок, который управляет слиянием мембран путем сочетания необратимого рефолдинга белка с соприкосновением мембран при помощи исходного фолдинга в метастабильную форму (конформация до слияния), которая в дальнейшем подвергается дискретным/стадийным конформационным изменениям до конформации с более низкой энергией (конформации после слияния).In order to infect a host cell, RSV, like other enveloped viruses such as influenza and HIV, requires fusion of the viral membrane with the host cell membrane. With respect to RSV, a conserved fusion protein (RSV F protein) fuses the viral membranes and the cell membranes of the host cell. In modern models based on studies of paramyxoviruses, the F-protein RSV is initially folded into a conformation before fusion. During cell penetration, the pre-fusion conformation undergoes refolding and conformational changes to its post-fusion conformation. Thus, the F-protein RSV is a metastable protein that controls membrane fusion by combining irreversible refolding of the protein with membrane contact using the initial folding into a metastable form (conformation before fusion), which subsequently undergoes discrete / stepwise conformational changes to a conformation with more low energy (conformation after fusion).
Очевидно, исходя из электронной микроскопии RSV-F, что существуют значительные структурные различия между тримером F до слияния и после слияния, которые недавно были подтверждены с помощью кристаллографии (McLellan J.S. et al. Science 340(6136):1113-7 (2013) и McLellan J.S. et al. Science 342(6158): 592-8 (2013)). Эти наблюдения указывают на то, что F-белок RSV до слияния и после слияния отличается в антигенном отношении (Calder L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)).It is clear from RSV-F electron microscopy that there are significant structural differences between the pre-fusion and post-fusion trimer F, which have recently been confirmed by crystallography (McLellan JS et al. Science 340 (6136): 1113-7 (2013) and McLellan JS et al Science 342 (6158): 592-8 (2013)). These observations indicate that the RSV F protein before fusion and after fusion is different antigenically (Calder L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)).
Вакцина против инфекции RSV в настоящее время не доступна, хотя и очень желательна. Кандидаты вакцин на основе F-белка RSV оказались неэффективными вследствие проблем, например, связанных со стабильностью, чистотой, воспроизводимостью и эффективностью. Как указывали выше, кристаллические структуры выявили значительное конформационное изменение между состояниями до слияния и после слияния. Величина перестройки предполагала, что только часть антител, направленных на конформацию RSV-F после слияния будет способна к перекрестной реакции с нативной конформацией шиловидного отростка до слияния на поверхности вируса. Соответственно, усилия для получения вакцины против RSV сосредотачивались на разработке вакцин, которые содержат формы F-белка RSV до слияния (см., например, WO 20101149745, WO 2010/1149743, WO 2009/1079796, WO 2012/158613). Однако данные усилия не дали стабильных F-полипептидов RSV до слияния, которые можно было бы использовать в качестве кандидатов для испытания у людей.A vaccine against RSV infection is not currently available, although highly desirable. The RSV F-protein vaccine candidates have proven ineffective due to problems, for example, related to stability, purity, reproducibility and efficacy. As indicated above, the crystal structures showed a significant conformational change between the pre-fusion and post-fusion states. The magnitude of the rearrangement suggested that only a fraction of antibodies targeting the RSV-F conformation after fusion would be able to cross-react with the native styloid conformation before fusion on the virus surface. Accordingly, efforts to obtain an RSV vaccine have focused on the development of vaccines that contain the pre-fusion forms of the RSV F protein (see, for example, WO 20101149745, WO 2010/1149743, WO 2009/1079796, WO 2012/158613). However, these efforts have not yielded stable pre-fusion RSV F polypeptides that could be used as candidates for human trials.
Краткое описание настоящего изобретенияBrief description of the present invention
Настоящее изобретение представляет стабильные, рекомбинантные полипептиды слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) до слияния, т.е. F-полипептиды RSV, которые являются стабильными в конформации до слияния. F-полипептиды RSV по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются растворимыми. В некоторых вариантах осуществления полипептиды являются мембранно-связанными. Настоящее изобретение также представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-полипептиды RSV до слияния согласно настоящему изобретению, и векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот.The present invention provides stable, recombinant respiratory syncytial virus (RSV) fusion polypeptides (F) prior to fusion, i.e. F-RSV polypeptides that are stable in conformation prior to fusion. The RSV F polypeptides of the present invention contain at least one epitope that is specific for the pre-fusion conformation of the F protein. In some embodiments, the RSV F polypeptides are soluble prior to fusion. In some embodiments, the polypeptides are membrane-bound. The present invention also provides nucleic acid molecules encoding RSV F-polypeptides prior to fusion according to the present invention, and vectors containing such nucleic acid molecules.
Настоящее изобретение также относится к композициям, предпочтительно иммуногенным композициям, содержащим F-полипептид RSV, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, и к их применению в индуцировании иммунного ответа против F-белка RSV, в частности их применению в качестве вакцины. Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования у субъекта иммунного ответа против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающим введение субъекту эффективного количества F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты. Предпочтительно индуцированный иммунный ответ характеризуется выработкой нейтрализующих антител к RSV и/или защитным иммунитетом против RSV. В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования у субъекта выработки антител к F-белку респираторного синцити- 1 035522 ального вируса (RSV), включающий введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей F-полипептид RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты.The present invention also relates to compositions, preferably immunogenic compositions, comprising an RSV F polypeptide, a nucleic acid molecule and / or a vector, and their use in inducing an immune response against the RSV F protein, in particular their use as a vaccine. The present invention also relates to methods of inducing in a subject an immune response against a respiratory syncytial virus (RSV), comprising administering to the subject an effective amount of an RSV F polypeptide prior to fusion, a nucleic acid molecule encoding said RSV F polypeptide and / or a vector containing said nucleic acid molecule acid. Preferably, the induced immune response is characterized by the production of neutralizing antibodies to RSV and / or protective immunity against RSV. In specific aspects, the present invention relates to a method of inducing in a subject the production of antibodies to the F protein of the respiratory syncytic virus (RSV), comprising administering to the subject an effective amount of an immunogenic composition comprising the RSV F polypeptide prior to fusion, a nucleic acid molecule encoding said F-RSV polypeptide and / or a vector containing said nucleic acid molecule.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1: А) гель-фильтрационная хроматограмма, полученная с использованием колонки Superdex200, элюата A2_F24 N67I+S215P из ионообменной колонки. Стрелки указывают точки элюации стандартного белка (1 - тироглобулин 669 кДа, 2 - ферритин 440 кДа и 3 - IgG 150 кДа); В) анализ SDSPAGE F-белка до слияния, содержащего пик от хроматограммы SEC, в восстанавливающих условиях.FIG. 1: A) Gel filtration chromatogram obtained using a Superdex200 column, eluate A2_F24 N67I + S215P from an ion exchange column. Arrows indicate the elution points of the standard protein (1 - thyroglobulin 669 kDa, 2 - ferritin 440 kDa and 3 - IgG 150 kDa); B) SDSPAGE analysis of the F-protein prior to fusion containing the peak from the SEC chromatogram under reducing conditions.
Фиг. 2: вестерн-блоттинг NativePAGE с загрузкой образцов, содержащих: 1) супернатант из клеток, экспрессирующих конструкцию до слияния с изолейциновой застежкой (S) F43; 2) супернатант из клеток, экспрессирующих главным образом тримерный (верхняя полоса) F-белок после слияния RSV; и 3) очищенный тримерный А2 _F24 N67I до слияния.FIG. 2: Western blotting NativePAGE with loading samples containing: 1) supernatant from cells expressing the construct before fusion with isoleucine zipper (S) F43; 2) supernatant from cells expressing mainly trimeric (upper lane) F-protein after RSV fusion; and 3) purified trimeric A2_F24 N67I prior to fusion.
Фиг. 3: уровни экспрессии конструкций с точечными мутациями по отношению к немутировавшему A2_ F24.FIG. 3: Expression levels of point mutation constructs relative to non-mutated A2_ F24.
На фиг. 4 представлены результаты способа, описанного в примере 6(А), определяющего температуру, при которой происходит 50% потеря связывания CR9501; (В) представлено сравнение стабильности F до слияния (A2_F24 N67I+S215P) и немодифицированного эктодомена при определении по 50% потере связывания специфического антитела CR9501 до слияния.FIG. 4 shows the results of the method described in Example 6 (A), determining the temperature at which there is a 50% loss of CR9501 binding; (B) shows a comparison of the stability of F before fusion (A2_F24 N67I + S215P) and unmodified ectodomain as determined by 50% loss of binding of specific antibody CR9501 before fusion.
Фиг. 5: результаты анализа Octet, представляющие зависимую от времени хранения потерю связывания специфического антитела CR9501 до слияния по отношению к конструкциям до слияния: А) A2_F24 (SEQ ID NO: 19), В) A2_F24 K465Q, С) A2_F24 S46G, D) A2_F24 N67I и E) A2_F24 E92D на 1, 5 и 33 дни.FIG. 5: Octet assay results showing storage time-dependent loss of binding of specific antibody CR9501 before fusion versus pre-fusion constructs: A) A2_F24 (SEQ ID NO: 19), B) A2_F24 K465Q, C) A2_F24 S46G, D) A2_F24 N67I and E) A2_F24 E92D on days 1, 5 and 33.
Фиг. 6: результаты анализа Octet, представляющие зависимую от времени хранения потерю связывания специфического моноклонального антитела CR9501 до слияния по отношению к конструкциям до слияния: A) A2_F24 K465Q, В) A2_F24 K465Q+N67I, С) A2_F24 S46G, D) A2_F24 S46G+E92D, Е) A2_F24 S46G+N67I, F) A2_F24 E92D, G) A2_F24 S46G+E92D, H) A2_F24 N67I+E92D и I) A2_F24 E92D+S215P на 1, 5 и 33 дни.FIG. 6: Octet assay results showing the storage time-dependent loss of binding of specific monoclonal antibody CR9501 before fusion versus pre-fusion constructs: A) A2_F24 K465Q, B) A2_F24 K465Q + N67I, C) A2_F24 S46G, D) A2_F24 S46G + E92D, E) A2_F24 S46G + N67I, F) A2_F24 E92D, G) A2_F24 S46G + E92D, H) A2_F24 N67I + E92D and I) A2_F24 E92D + S215P for 1, 5 and 33 days.
Фиг. 7: титры VNA у мышей на 6 неделе после прайм-бустерного введения на 0 и 4 неделе иммуногенов в дозах согласно табл. 14.FIG. 7: VNA titers in mice at 6 weeks after prime-boost administration at 0 and 4 weeks of immunogens at doses according to table. fourteen.
Фиг. 8: титры VNA хлопковых крыс на 7 неделе после прайм-буста на 0 и 4 неделе иммуногенами и дозами согласно табл. 15.FIG. 8: VNA titers of cotton rats at 7 weeks after prime boost at 0 and 4 weeks with immunogens and doses according to table. 15.
Фиг. 9: вирусная нагрузка в легких и носу на 5 день после i.n. контрольного заражения с использованием RSV.FIG. 9: viral load in the lungs and nose 5 days after i.n. challenge using RSV.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Белок слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) участвует в слиянии вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина, которое требуется для инфицирования. МРНК F RSV транслируется в белок-предшественник из 574 аминокислот, обозначенный F0, который содержит последовательность сигнального пептида на N-конце (например, аминокислотные остатки 1-26 с SEQ ID NO: 1), которая удаляется сигнальной пептидазой в эндоплазматическом ретикулуме. F0 отщепляется в двух сайтах (между аминокислотными остатками 109/110 и 136/137) с помощью клеточных протеаз (в частности, фурином) в транс-Гольджи, при этом удаляется короткая гликозилированная вставочная последовательность (также обозначенная как участок p27, содержащий аминокислотные остатки от 110 до 136, и образуется два домена или субъединицы, обозначенные F1 и F2. Домен F1 (аминокислотные остатки 137-574) содержит гидрофобный пептид слияния на своем N-конце, и С-конец содержит трансмембранный (ТМ) (аминокислотные остатки 530-550) и цитоплазматический участок (аминокислотные остатки 551-574). Домен F2 (аминокислотные остатки 27-109) ковалентно связан с F1 двумя дисульфидными мостиками. Гетеродимеры F1-F2 подвергаются сборке в вирионе в виде гомотримеров.Respiratory syncytial virus (RSV) fusion protein (F) is involved in the fusion of the viral membrane with the host cell membrane, which is required for infection. RSV F mRNA is translated into a 574 amino acid precursor protein designated F0, which contains a signal peptide sequence at the N-terminus (eg, amino acid residues 1-26 of SEQ ID NO: 1) that is removed by a signal peptidase in the endoplasmic reticulum. F0 is cleaved at two sites (between amino acid residues 109/110 and 136/137) by cellular proteases (in particular furin) in the trans-Golgi, thereby removing a short glycosylated insert sequence (also referred to as the p27 region containing amino acid residues from 110 to 136, and two domains or subunits designated F1 and F2 are formed.The F1 domain (amino acid residues 137-574) contains a hydrophobic fusion peptide at its N-terminus, and the C-terminus contains a transmembrane (TM) (amino acid residues 530-550 ) and the cytoplasmic region (amino acid residues 551-574). The F2 domain (amino acid residues 27-109) is covalently linked to F1 by two disulfide bridges. F1-F2 heterodimers are assembled in the virion in the form of homotrimers.
Вакцина против инфекции RSV в настоящее время не существует, хотя и является очень желательной. Одним потенциальным подходом к получению вакцины является субъединичная вакцина на основе очищенного F-белка RSV. Однако, для этого подхода желательно, чтобы очищенный F-белок RSV находился в конформации, которая подобна конформации F-белка RSV в состоянии до слияния, который стабилен в течение продолжительного периода, и может быть получен в достаточных количествах. Кроме того, для вакцины на основе субъединицы необходимо осуществить усечение F-белка RSV путем делеции трансмембранного (ТМ) и цитоплазматического участка с получением растворимого секретируемого F-белка (sF). Поскольку участок ТМ отвечает за заякоривание в мембране и тримеризацию, незаякоренный растворимый F-белок является в значительной степени более лабильным, чем белок полной длины, и будет с легкостью подвергаться рефолдингу в конечное состояние после слияния. Для получения растворимого F-белка в стабильной конформации до слияния, который демонстрирует высокие уровни экспрессии и высокую стабильность, необходимо, таким образом, стабилизировать конформацию до слияния.A vaccine against RSV infection does not currently exist, although it is highly desirable. One potential vaccine approach is a subunit vaccine based on the purified RSV F protein. However, for this approach, it is desirable that the purified RSV F protein be in a conformation that is similar to that of the RSV F protein in a pre-fusion state that is stable over an extended period and can be produced in sufficient quantities. In addition, for a subunit vaccine, it is necessary to truncate the RSV F protein by deleting the transmembrane (TM) and cytoplasmic region to obtain a soluble secreted F protein (sF). Since the TM site is responsible for membrane anchoring and trimerization, unanchored soluble F-protein is significantly more labile than full-length protein and will readily undergo refolding to the final state after fusion. To obtain a soluble F-protein in a stable pre-fusion conformation that exhibits high expression levels and high stability, it is therefore necessary to stabilize the pre-fusion conformation.
Стабилизация F-белка другого парамиксовируса в конформации до слияния была успешно выполнена для вируса парагриппа типа 5 (PIV5). Yin et al. (Nature 439: 38-44 (2006)) таким образом стабилизи- 2 035522 ровали структуру F-белка до слияния PIV-5 с помощью мутации сайта расщепления фурином в F0, что блокировало процессинг в F1 и F2. Кроме того, трансмембранный (ТМ) и цитоплазматический домен были замещены широко известным петлевым доменом тримеризации: GCN4pII. Этот домен образует тримерную спиральную суперспиральную структуру и является модификацией встречающегося в природе димерного спирального суперспирального пептида GCN4 (O'Shea et al., Science 243: 538-542 (1989)). Пептид GCN4-pII, в котором аминокислотная последовательность лейциновой застежки GCN4 была замещена изолейциновыми остатками в каждом положении a и d гептада, как показано, образует трехцепочечную параллельную альфа-петлевую суперспираль (Harbury et al., Science 262: 1401-1407 (1993)).Stabilization of the F-protein of another paramyxovirus in pre-fusion conformation has been successfully performed for parainfluenza virus type 5 (PIV5). Yin et al. (Nature 439: 38-44 (2006)) thus stabilized the F-protein structure prior to PIV-5 fusion by mutating the furin cleavage site in F0, which blocked processing in F1 and F2. In addition, the transmembrane (TM) and cytoplasmic domains have been replaced by the well-known loop trimerization domain: GCN4pII. This domain forms a trimeric coiled supercoiled structure and is a modification of the naturally occurring dimeric coiled supercoiled peptide GCN4 (O'Shea et al., Science 243: 538-542 (1989)). The GCN4-pII peptide in which the amino acid sequence of the GCN4 leucine zipper has been substituted with isoleucine residues at each position a and d of the heptad has been shown to form a three-stranded parallel alpha-loop supercoil (Harbury et al., Science 262: 1401-1407 (1993)) ...
Для стабилизации F RSV в конформации до слияния использовали ту же стратегию, такую как, например, мутация в сайте расщепления фурином, и слияние эктодомена RSV-F с доменом тримеризации GCN4pII (как раскрыто, например, в WO 2010/149743, WO 2010/149745, WO 2009/079796, WO 2012/158613) или с доменом тримеризации фибритина (MCLellan et al., Nature Struct. Biol.17: 2-248-250 (2010)). Этот домен фибритина или 'Foldon' получен из фибритина Т4 и описан ранее в качестве искусственного встречающегося в природе домена тримеризации (Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)). Однако эти усилия не привели к получению стабильного белка RSV-F до слияния. Более того, эти усилия даже не привели к получению кандидатов, пригодных для испытания у людей.To stabilize the RSV F in the pre-fusion conformation, the same strategy was used, such as, for example, a mutation at the furin cleavage site and the fusion of the RSV-F ectodomain with the GCN4pII trimerization domain (as disclosed, for example, in WO 2010/149743, WO 2010/149745 , WO 2009/079796, WO 2012/158613) or with a fibritin trimerization domain (MCLellan et al., Nature Struct. Biol. 17: 2-248-250 (2010)). This fibritin domain or 'Foldon' is derived from T4 fibritin and has been previously described as an artificial naturally occurring trimerization domain (Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)). However, these efforts did not result in a stable RSV-F protein prior to fusion. Moreover, these efforts have not even resulted in candidates suitable for human testing.
Настоящее изобретение далее представляет стабильные рекомбинантные F-полипептиды RSV до слияния, т.е. F-полипептиды RSV, которые являются стабилизированными в конформации до слияния. В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, были введены и/или объединены несколько стадий модификации для получения упомянутых стабильных растворимых F-полипептидов RSV до слияния. Стабильные F-полипептиды RSV до слияния по настоящему изобретению находятся в конформации до слияния, т.е. они содержат (демонстрируют) по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния. Эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния, представляет собой эпитоп, который не представлен в конформации после слияния. Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают, что конформация F-белка RSV до слияния может содержать эпитопы, которые являются такими же, как эпитопы на F-белке RSV, экспрессируемые на встречающихся в природе вирионах RSV, и таким образом, может предоставлять преимущества для активизации защитных нейтрализующих антител.The present invention further provides stable recombinant RSV F polypeptides prior to fusion, i. E. F-RSV polypeptides that are stabilized in conformation prior to fusion. In the research that led to the present invention, several modification steps were introduced and / or combined to obtain said stable soluble RSV F-polypeptides prior to fusion. The pre-fusion stable F-RSV polypeptides of the present invention are in a pre-fusion conformation, i.e. they contain (exhibit) at least one epitope that is specific for the conformation of the F-protein prior to fusion. An epitope that is specific for the pre-fusion conformation of the F protein is an epitope that is not present in the post-fusion conformation. Without being bound by a particular theory, it is believed that the conformation of the RSV F protein prior to fusion may contain epitopes that are the same as the epitopes on the RSV F protein expressed on naturally occurring RSV virions, and thus may provide advantages for enhancing protective neutralizing antibodies.
В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 54, ОЭК2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 55, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 56 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 62, ОЭК2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 63 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 64 (далее в этом документе упоминаемый как CR9501), и/или специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 58, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 59, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 60 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 66, CDR2участок легкой цепи с SEQ ID NO: 67 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 68 (упоминаемый как CR9502). CR9501 и CR9502 содержат вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, и таким образом, связывающие специфичности антител 58С5 и 30D8, соответственно, которые, как было показано ранее, специфично связываются с F-белком RSV в его конформации до слияния, но не в конформации после слияния (см. WO 2012/006596).In certain embodiments, the polypeptides of the present invention comprise at least one epitope that is recognized by a specific monoclonal antibody prior to fusion, comprising a heavy chain CDR1 region of SEQ ID NO: 54, an OEC2 heavy chain region of SEQ ID NO: 55, CDR3- heavy chain region with SEQ ID NO: 56 and CDR1 light chain region with SEQ ID NO: 62, OEC2 light chain region with SEQ ID NO: 63 and CDR3 light chain region with SEQ ID NO: 64 (hereinafter in this document referred to as CR9501), and / or a specific monoclonal antibody prior to fusion containing the heavy chain CDR1 region of SEQ ID NO: 58, the heavy chain CDR2 region of SEQ ID NO: 59, the heavy chain CDR3 region of SEQ ID NO: 60 and a light chain CDR1 region of SEQ ID NO: 66, a light chain CDR2 region of SEQ ID NO: 67 and a light chain CDR3 region of SEQ ID NO: 68 (referred to as CR9502). CR9501 and CR9502 contain variable regions of the heavy and light chains, and thus binding the specificities of antibodies 58C5 and 30D8, respectively, which, as previously shown, specifically bind to the F-protein RSV in its pre-fusion conformation, but not in the post-fusion conformation (see WO 2012/006596).
В определенных вариантах осуществления рекомбинантные F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается по меньшей мере одним специфичным моноклональным антителом до слияния, как описано выше, и полипептиды являются тримерными.In certain embodiments, the recombinant RSV F polypeptides prior to fusion contain at least one epitope that is recognized by at least one specific monoclonal antibody prior to fusion as described above, and the polypeptides are trimeric.
В определенных вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215.In certain embodiments, the stable RSV F polypeptides prior to fusion according to the present invention comprise an amino acid residue mutation at position 67 and / or an amino acid residue mutation at position 215.
В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 67 подвергают мутированию до гидрофобной аминокислоты.In some embodiments, the amino acid at position 67 is mutated to a hydrophobic amino acid.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.In some embodiments, stable RSV F polypeptides prior to fusion in accordance with the present invention comprise an N or T amino acid residue mutation at position 67 and / or an S amino acid residue mutation at position 215.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат домен F1 и домен F2 и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, которая связывает указанный домен F1 с указанным доменом F2, где полипептиды дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.In some embodiments, the stable F-RSV polypeptides prior to fusion according to the present invention comprise an F1 domain and an F2 domain and a binding sequence of 1 to 10 amino acid residues that links said F1 domain to said F2 domain, wherein the polypeptides further comprise an amino acid mutation residue N or T at position 67 and / or a mutation of amino acid residue S at position 215.
В определенных вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат усеченный домен F1 и домен F2 и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, связывающую указанный усеченный домен F1 с указанным доменом F2, где полипептиды дополнительно содержат мутацию аминокислотного ос- 3 035522 татка N или T в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.In certain embodiments, the stable F-RSV polypeptides prior to fusion according to the present invention comprise a truncated F1 domain and an F2 domain and a binding sequence of 1 to 10 amino acid residues linking said truncated F1 domain to said F2 domain, wherein the polypeptides further comprise a mutation amino acid residue 3 035522 tata N or T at position 67 and / or a mutation of amino acid residue S at position 215.
Таким образом, полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию в домене F1 и/или домене F2 по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV в F-белкеThus, the polypeptides of the present invention contain at least one stabilizing mutation in the F1 domain and / or F2 domain as compared to the F1 and / or F2 RSV domain in the F protein
RSV дикого типа.Wild type RSV.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 (N/T67I) в I и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215 в P (S215P).In some embodiments, the RSV F polypeptides, prior to fusion, comprise an N or T amino acid residue mutation at position 67 (N / T67I) in I and / or an S amino acid residue mutation at position 215 in P (S215P).
Известно, что RSV существуют в виде одного серотипа, имеющего две антигенные подгруппы: А и В. Аминокислотные последовательности зрелых процессированных F-белков двух групп являются идентичными на приблизительно 93%. Как используется во всей настоящей заявке, положения аминокислот приведены в отношении к последовательности F-белка RSV из штамма А2 (SEQ ID NO: 1). Как используется в настоящем изобретении, выражение аминокислота в положении x F-белка RSV, таким образом, означает аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении x в F-белке RSV штамма А2 RSV с SEQ ID NO: 1. Необходимо отметить, что в системе нумерации, используемой в настоящей заявке, 1 относится к N-концевой аминокислоте незрелого F0-белка (SEQ ID NO: 1). При использовании штамма RSV, отличного от штамма А2, положения аминокислот F-белка следует нумеровать по отношению к нумерации F-белка штамма А2 SEQ ID NO: 1 с помощью выравнивания последовательностей другого штамма RSV с F-белком с SEQ ID NO: 1 со вставкой гэпов, при необходимости. Выравнивание последовательностей можно выполнять с помощью способов, хорошо известных в данной области, например, с помощью CLUSTALW, Bioedit или CLC Workbench.It is known that RSV exists as a single serotype having two antigenic subgroups: A and B. The amino acid sequences of the mature processed F proteins of the two groups are approximately 93% identical. As used throughout this application, the amino acid positions are given in relation to the sequence of the F protein RSV from the A2 strain (SEQ ID NO: 1). As used in the present invention, the expression amino acid at position x of the RSV F protein thus means the amino acid corresponding to the amino acid corresponding to the amino acid at position x in the RSV F protein of RSV A2 strain with SEQ ID NO: 1. It should be noted that in the numbering system, used in this application, 1 refers to the N-terminal amino acid of the immature F0 protein (SEQ ID NO: 1). When using an RSV strain other than A2 strain, the amino acid positions of the F protein should be numbered relative to the F protein numbering of the A2 strain SEQ ID NO: 1 by aligning the sequences of the other RSV strain with the F protein SEQ ID NO: 1 with insert gaps, if necessary. Sequence alignment can be performed using methods well known in the art, for example using CLUSTALW, Bioedit, or the CLC Workbench.
Аминокислота в соответствии с настоящим изобретением может быть любой из двадцати встречающихся в природе (или 'стандартных' аминокислот) или их вариантов, таких как, например, Dаминокислоты (D-энантиомеры аминокислот с хиральным центром), или любым вариантом, которые не встречаются в природе в белках, таких как норлейцин. Стандартные аминокислоты можно разделить на несколько групп, исходя из их свойств. Важными факторами являются заряд, гидрофильность или гидрофобность, размер и функциональные группы. Эти свойства являются важными для структуры белков и белок-белковых взаимодействий. Некоторые аминокислоты обладают специфическими свойствами, такие как цистеин, который может образовывать ковалентные дисульфидные связи (или дисульфидные мостики) с другими цистеиновыми остатками, пролин, который индуцирует повороты полипептидного остова, и глицин, который является более гибким, чем другие аминокислоты. В табл. 11 представлены аббревиатуры и свойства стандартных аминокислот.The amino acid in accordance with the present invention can be any of the twenty naturally occurring (or 'standard' amino acids) or variants thereof, such as, for example, D-amino acids (D-enantiomers of amino acids with a chiral center), or any variant that does not occur in nature in proteins such as norleucine. Standard amino acids can be divided into several groups based on their properties. The important factors are charge, hydrophilicity or hydrophobicity, size and functional groups. These properties are important for protein structure and protein-protein interactions. Some amino acids have specific properties, such as cysteine, which can form covalent disulfide bonds (or disulfide bridges) with other cysteine residues, proline, which induces polypeptide backbone turns, and glycine, which is more flexible than other amino acids. Table 11 shows the abbreviations and properties of standard amino acids.
Опытному специалисту следует принять во внимание, что мутации можно осуществлять с белком при помощи стандартных методик молекулярной биологии. Результатом мутаций в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является повышенные уровни экспрессии и/или повышенные стабилизации F-полипептидов RSV до слияния по сравнению с F-полипептидами RSV, которые не содержат данную (данные) мутацию (мутации).The skilled artisan should take into account that mutations can be made to a protein using standard molecular biology techniques. Mutations in accordance with the present invention preferably result in increased levels of expression and / or increased stabilization of the RSV F polypeptides prior to fusion compared to RSV F polypeptides that do not contain the given mutation (s).
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются растворимыми.In some embodiments, the RSV F polypeptides are soluble prior to fusion.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния дополнительно содержат гетерологичный домен тримеризации, связанный с упомянутым усеченным доменом F1. В соответствии с настоящим изобретением было показано, что путем связывания гетерологического домена тримеризации с С-концевым аминокислотным остатком усеченного домена F1, необязательно объединенного со связывающей последовательностью, связывающей домен F1 и F2, и стабилизирующей (стабилизирующими) мутацией (мутациями), представлены F-полипептиды RSV, которые демонстрируют высокую экспрессию и которые связываются со специфичными антителами до слияния, указывая, что полипептиды находятся в конформации до слияния. Кроме того, F-полипептиды RSV стабилизированы в конформации до слияния, т.е. даже после процессинга полипептидов они по-прежнему связаны со специфичными антителами CR9501 и/или CR9502 до слияния, указывая, что специфический эпитоп до слияния сохраняется.In some embodiments, the RSV F polypeptides, prior to fusion, further comprise a heterologous trimerization domain linked to said truncated F1 domain. In accordance with the present invention, it has been shown that by linking the heterologous trimerization domain to the C-terminal amino acid residue of the truncated F1 domain, optionally combined with a binding sequence linking the F1 and F2 domains and stabilizing (stabilizing) mutation (s), F polypeptides are provided RSVs that show high expression and that bind to specific antibodies prior to fusion, indicating that the polypeptides are in pre-fusion conformation. In addition, RSV F polypeptides are stabilized in pre-fusion conformation, i. E. even after processing the polypeptides, they still bind to specific antibodies CR9501 and / or CR9502 prior to fusion, indicating that the specific epitope is retained prior to fusion.
В дополнительных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат одну или несколько дополнительных мутаций (по сравнению с F-белком RSV дикого типа), выбранных из группы, состоящей из:In additional embodiments, the RSV F polypeptides prior to fusion contain one or more additional mutations (as compared to the wild type RSV F protein) selected from the group consisting of:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении 46;(a) mutating the amino acid residue at position 46;
(b) мутации аминокислотного остатка в положении 77;(b) mutating the amino acid residue at position 77;
(c) мутации аминокислотного остатка в положении 80;(c) mutating the amino acid residue at position 80;
(d) мутации аминокислотного остатка в положении 92;(d) mutating the amino acid residue at position 92;
(e) мутации аминокислотного остатка в положении 175;(e) mutating the amino acid residue at position 175;
(f) мутации аминокислотного остатка в положении 184;(f) mutating the amino acid residue at position 184;
(g) мутации аминокислотного остатка в положении 185;(g) mutating the amino acid residue at position 185;
(h) мутации аминокислотного остатка в положении 201;(h) mutating the amino acid residue at position 201;
(i) мутации аминокислотного остатка в положении 209;(i) mutating the amino acid residue at position 209;
(j) мутации аминокислотного остатка в положении 421;(j) mutating the amino acid residue at position 421;
(k) мутации аминокислотного остатка в положении 426;(k) mutating the amino acid residue at position 426;
- 4 035522 (l) мутации аминокислотного остатка в положении 465;- 4035522 (l) mutations of the amino acid residue at position 465;
(m) мутации аминокислотного остатка в положении 486;(m) mutating the amino acid residue at position 486;
(n) мутации аминокислотного остатка в положении 487 и (o) мутации аминокислотного остатка в положении 508.(n) mutating the amino acid residue at position 487; and (o) mutating the amino acid residue at position 508.
В предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько дополнительных мутаций выбраны из группы, состоящей из:In preferred embodiments, the one or more additional mutations are selected from the group consisting of:
(a) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G (S46G);(a) mutating the S amino acid residue at position 46 into G (S46G);
(b) мутации аминокислотного остатка K в положении 77 в E (K77E);(b) mutating amino acid residue K at position 77 to E (K77E);
(c) мутации аминокислотного остатка K в положении 80 в E (K80E);(c) mutating the amino acid residue K at position 80 to E (K80E);
(d) мутации аминокислотного остатка E в положении 92 в D (E92D);(d) mutating amino acid residue E at position 92 to D (E92D);
(e) мутации аминокислотного остатка N в положении 175 в P (N175P);(e) mutating amino acid residue N at position 175 into P (N175P);
(f) мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N (G184N);(f) mutating amino acid residue G at position 184 to N (G184N);
(g) мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N (V185N);(g) mutating the V amino acid residue at position 185 to N (V185N);
(h) мутации аминокислотного остатка K в положении 201 в Q (K201Q);(h) mutating the amino acid residue K at position 201 into Q (K201Q);
(i) мутации аминокислотного остатка K в положении 209 в Q (K209Q);(i) mutating the amino acid residue K at position 209 in Q (K209Q);
(j) мутации аминокислотного остатка K в положении 421 в N (K421N);(j) mutating amino acid residue K at position 421 to N (K421N);
(k) мутации аминокислотного остатка N в положении 426 в S (N426S);(k) mutating amino acid residue N at position 426 to S (N426S);
(l) мутации аминокислотного остатка K в положении 465 в E или Q (K4 65Q);(l) mutating the amino acid residue K at position 465 into E or Q (K4 65Q);
(m) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N (D4 86N);(m) mutating amino acid residue D at position 486 to N (D4 86N);
(n) мутации аминокислотного остатка E в положении 487 в Q, N или I (E487Q/N/I) и (o) мутации аминокислотного остатка K в положении 508 в E (K508E).(n) mutating amino acid residue E at position 487 in Q, N, or I (E487Q / N / I); and (o) mutating amino acid residue K at position 508 in E (K508E).
Снова необходимо отметить, что для положений аминокислотных остатков отсчет выполняется по отношению к SEQ ID NO: 1. Специалист сможет определить соответствующие аминокислотные остатки в F-белках других штаммов RSV.Again, it should be noted that the positions of the amino acid residues are counted in relation to SEQ ID NO: 1. The skilled person will be able to determine the corresponding amino acid residues in the F proteins of other RSV strains.
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере две мутации (по сравнению с F-белком RSV дикого типа). В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере двумя мутациями являются мутация аминокислоты N или T в положении 67 в I (N/T67I) и мутация аминокислоты S в положении 215 в P (S215P).In certain embodiments, the RSV F polypeptides, prior to fusion, contain at least two mutations (compared to wild type RSV F protein). In preferred embodiments, the at least two mutations are the N or T amino acid mutation at position 67 in I (N / T67I) and the S amino acid mutation at position 215 in P (S215P).
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из:In certain embodiments, the RSV F polypeptides prior to fusion comprise at least one additional mutation selected from the group consisting of:
(a) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G;(a) mutating the amino acid residue S at position 46 in G;
(b) мутации аминокислотного остатка K в положении 77 в E;(b) mutating amino acid residue K at position 77 in E;
(c) мутации аминокислотного остатка K в положении 80 в E;(c) mutating the amino acid residue K at position 80 in E;
(d) мутации аминокислотного остатка E в положении 92 в D;(d) mutating amino acid residue E at position 92 in D;
(e) мутации аминокислотного остатка N в положении 175 в P;(e) mutating amino acid residue N at position 175 in P;
(f) мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N;(f) mutating the amino acid residue G at position 184 to N;
(g) мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N;(g) mutating the V amino acid residue at position 185 to N;
(h) мутации аминокислотного остатка K в положении 201 в Q;(h) mutating the amino acid residue K at position 201 in Q;
(i) мутации аминокислотного остатка K в положении 209 в Q;(i) mutating the amino acid residue K at position 209 in Q;
(j) мутации аминокислотного остатка K в положении 421 в N;(j) mutating amino acid residue K at position 421 to N;
(k) мутации аминокислотного остатка N в положении 426 в S;(k) mutating amino acid residue N at position 426 in S;
(l) мутации аминокислотного остатка K в положении 465 в E или Q;(l) mutating the amino acid residue K at position 465 into E or Q;
(m) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N;(m) mutating amino acid residue D at position 486 to N;
(n) мутации аминокислотного остатка E в положении 487 в Q, N или I и (o) мутации аминокислотного остатка K или R в положении 508 в E.(n) mutating amino acid residue E at position 487 in Q, N, or I; and (o) mutating amino acid residue K or R at position 508 in E.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат по меньшей мере три мутации.In certain embodiments, the polypeptides contain at least three mutations.
В определенных вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).In certain embodiments, the heterologous trimerization domain comprises the amino acid sequence EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3). In some embodiments, the heterologous trimerization domain comprises the amino acid sequence GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат усеченный домен F1. Как используется в данном документе, усеченный домен F1 относится к домену F1, который не является доменом F1 полной длины, т.е. где на N-конце или С-конце один или несколько аминокислотных остатков были удалены. В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере трансмембранный домен и цитоплазматический хвост были удалены для обеспечения экспрессии продукта в виде растворимого эктодомена.As described above, in some embodiments, the polypeptides of the present invention comprise a truncated F1 domain. As used herein, a truncated F1 domain refers to an F1 domain that is not a full length F1 domain, i.e. where at the N-terminus or C-terminus, one or more amino acid residues have been removed. In accordance with the present invention, at least the transmembrane domain and cytoplasmic tail have been removed to allow for the expression of the product as a soluble ectodomain.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 495 в Fбелке RSV (обозначенного SEQ ID NO: 1), т.е. С-концевая часть домена F1, начиная с аминокислотного остатка 496 (обозначенного SEQ ID NO: 1) была удалена. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 513 в F-белке RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519,In some embodiments, the F1 domain is truncated after amino acid residue 495 in the F protein of RSV (designated by SEQ ID NO: 1), i.e. The C-terminal portion of the F1 domain starting at amino acid residue 496 (designated by SEQ ID NO: 1) has been deleted. In some embodiments, the F1 domain is truncated after amino acid residue 513 in the RSV F protein. In some embodiments, the F1 domain is truncated after amino acid residue 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519,
- 5 035522- 5 035522
520, 521, 522, 523, 525 или 525.520, 521, 522, 523, 525 or 525.
В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 4 домена F1 RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID NO: 4 и связан с аминокислотным остатком 495 домена F1 RSV.In some embodiments, the trimerization domain is linked to amino acid residue 4 of the F1 domain of RSV. In some embodiments, the trimerization domain comprises SEQ ID NO: 4 and is linked to amino acid residue 495 of the F1 domain of RSV.
В некоторых других вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID NO: 3 и связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV.In some other embodiments, the trimerization domain is linked to amino acid residue 513 of the F1 domain of RSV. In some embodiments, the trimerization domain comprises SEQ ID NO: 3 and is linked to amino acid residue 513 of the F1 domain of RSV.
В некоторых вариантах осуществления домен F1, который является необязательно усеченным, и домен F2 связаны при помощи связывающей последовательности, которая связывает С-концевую аминокислоту домена F2 с N-концевой аминокислотой (необязательно усеченного) домена F1. В некоторых вариантах связывающая последовательность (или линкер) содержит от 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно от 2 до 9 аминокислотных остатков, предпочтительно от 3 до 8 аминокислотных остатков, предпочтительно от 4 до 7 аминокислотных остатков, более предпочтительно линкер содержит 5 или 6 аминокислотных остатков. В данной области техники известны несколько конформационно нейтральных линкеров, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением без нарушения конформации F-полипептидов RVS до слияния. В предпочтительных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5).In some embodiments, the F1 domain, which is optionally truncated, and the F2 domain are linked by a binding sequence that links the C-terminal amino acid of the F2 domain to the N-terminal amino acid of the (optionally truncated) F1 domain. In some embodiments, the linking sequence (or linker) contains 1 to 10 amino acid residues, preferably 2 to 9 amino acid residues, preferably 3 to 8 amino acid residues, preferably 4 to 7 amino acid residues, more preferably the linker contains 5 or 6 amino acid residues ... Several conformationally neutral linkers are known in the art that can be used in accordance with the present invention without disrupting the conformation of the RVS F polypeptides prior to fusion. In preferred embodiments, the linker comprises the amino acid sequence GSGSG (SEQ ID NO: 5).
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма А2 RSV с SEQ ID NO: 1.In some embodiments, the F1 domain and / or the F2 domain are from strain A RSV. In some embodiments, the F1 and / or F2 domain is derived from the A2 strain of RSV with SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A RSV с SEQ ID NO: 69.In some embodiments, the F1 domain and / or F2 domain are derived from RSV strain A with SEQ ID NO: 69.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма В RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма В RSV SEQ ID NO: 2.In some embodiments, the F1 domain and / or the F2 domain are from strain B RSV. In some embodiments, the F1 and / or F2 domain is from strain B RSV SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из одного штамма RSV. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются химерными полипептидами, т.е. содержат домены F1 и F2, которые происходят из разных штаммов RSV.In some embodiments, the F1 and / or F2 domain is derived from a single RSV strain. In some embodiments, the RSV F polypeptides prior to fusion are chimeric polypeptides, i. E. contain domains F1 and F2, which are derived from different RSV strains.
В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии F-полипептидов RSV до слияния настоящего изобретения повышен по сравнению с эктодоменом F-полипептида RSV дикого типа (т.е. без трансмембранного или цитоплазматического участка) без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен по меньшей мере в 5 раз, предпочтительно до 10 раз. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен более чем в 10 раз.In some embodiments, the expression level of the RSV F polypeptides prior to fusion of the present invention is increased compared to the ectodomain of the wild type RSV F polypeptide (i.e., no transmembrane or cytoplasmic region) without mutation (s). In some embodiments, the expression level is increased at least 5-fold, preferably up to 10-fold. In some embodiments, the expression level is increased more than 10-fold.
F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением являются стабильными, т.е. не изменяются с легкостью в конформацию после слияния при процессинге полипептидов, таком как, например, очистка, циклы замораживания-оттаивания и/или хранение и т.д.F-RSV polypeptides prior to fusion in accordance with the present invention are stable, i. E. do not readily change into conformation after fusion by polypeptide processing such as, for example, purification, freeze-thaw cycles and / or storage, etc.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением имеют повышенную стабильность при хранении при 4°C по сравнению с Fполипептидом RSV без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления полипептиды являются стабильными при хранении при 4°C в течение по меньшей мере 30 дней, предпочтительно по меньшей мере 60 дней, предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, даже более предпочтительно по меньшей мере 1 года. Под стабильными при хранении подразумевается, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным для специфичного антитела до слияния (например, CR9501) при хранении полипептида в растворе (например, среде для культивирования) при 4°C в течение по меньшей мере 30 дней, например, как определено с помощью способа, описанного в примере 7 или 9. В некоторых вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно в течение по меньшей мере 1 года при хранении F-полипептидов RSV до слияния при 4°C.In some embodiments, the RSV F polypeptides prior to fusion in accordance with the present invention have improved storage stability at 4 ° C compared to the RSV F polypeptide without mutation (s). In some embodiments, the polypeptides are storage stable at 4 ° C for at least 30 days, preferably at least 60 days, preferably at least 6 months, even more preferably at least 1 year. By storage stable, it is meant that the polypeptides still exhibit at least one epitope that is specific for the specific antibody prior to fusion (e.g. CR9501) when the polypeptide is stored in solution (e.g., culture medium) at 4 ° C for about at least 30 days, for example, as determined by the method described in Example 7 or 9. In some embodiments, the polypeptides exhibit at least one specific epitope prior to fusion for at least 6 months, preferably for at least 1 year when storing RSV F-polypeptides prior to fusion at 4 ° C.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением обладают повышенной стабильностью при воздействии теплом по сравнению с F-полипептидами RSV без указанной (указанных) мутации (мутаций). В определенных вариантах осуществления Fполипептиды RSV до слияния являются термостабильными в течение по меньшей мере 30 мин при температуре 55°C, предпочтительно при 58°C, более предпочтительно при 60°C. Под термостабильными подразумевается, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния после воздействия повышенной температурой в течение по меньшей мере 30 мин (т.е. температуры 55°C или выше), например, как определено с помощью способа, описанного в примере 6.In some embodiments, RSV F polypeptides according to the present invention have increased stability when exposed to heat compared to RSV F polypeptides without the specified (s) mutation (s). In certain embodiments, the RSV F polypeptides prior to fusion are thermostable for at least 30 minutes at 55 ° C, preferably 58 ° C, more preferably 60 ° C. By thermostable is meant that the polypeptides still exhibit at least one specific epitope prior to fusion after being exposed to an elevated temperature for at least 30 minutes (i.e., a temperature of 55 ° C or higher), for example, as determined by the method, described in example 6.
В определенных вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния после воздействия от 1 до 6 циклов замораживания-размораживания в подходящей буферной смеси.In certain embodiments, the polypeptides display at least one specific epitope prior to fusion after exposure to 1 to 6 freeze-thaw cycles in a suitable buffer.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептид RSV до слияния по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-52 и 71-89. В определенных вариантах осуществления F-полипептид RSV до слияния по настоящему изобретению состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-52 и 71-89.In some embodiments, the RSV F polypeptide prior to fusion of the present invention comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21-52 and 71-89. In certain embodiments, the RSV F polypeptide prior to fusion of the present invention consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21-52 and 71-89.
- 6 035522- 6 035522
Как используется во всей настоящей заявке, нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5' до 3' и аминокислотные последовательности от N-конца к С-концу, как принято в данной области.As used throughout this application, the nucleotide sequences are presented in the direction from 5 'to 3' and amino acid sequences from the N-terminus to the C-terminus, as is customary in the art.
В некоторых вариантах осуществления кодируемые полипептиды в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат лидерную последовательность, также называемую как сигнальная последовательность или сигнальный пептид, соответствующую аминокислотам 1-26 в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 69. Она представляет собой короткий (длиной как правило, 5-30 аминокислот) пептид, присутствующий на N-конце большинства вновь синтезируемых белков, которые предназначены для поступления в секреторный путь. В некоторых вариантах осуществления полипептиды в соответствии с настоящим изобретением не содержат лидерную последовательность.In some embodiments, the encoded polypeptides of the present invention further comprise a leader sequence, also referred to as a signal sequence or signal peptide, corresponding to amino acids 1-26 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 69. It is is a short (usually 5-30 amino acids long) peptide present at the N-terminus of most newly synthesized proteins that are intended to enter the secretory pathway. In some embodiments, the polypeptides of the present invention do not comprise a leader sequence.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат HIS-метку. His-метка или полигистидиновая метка представляет собой аминокислотный мотив в белках, который состоит из по меньшей мере пяти остатков (H) гистидина, часто на N- или С-конце белка, который обычно используют для целей очистки.In certain embodiments, the polypeptides contain a HIS tag. A His-tag or polyhistidine tag is an amino acid motif in proteins that consists of at least five (H) histidine residues, often at the N- or C-terminus of a protein, which is commonly used for purification purposes.
В определенных вариантах осуществления полипептиды не содержат HIS-метку. В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было показано, что при удалении HIS-метки уровень экспрессии и стабильность повышаются по сравнению с полипептидами с HIS-меткой.In certain embodiments, the polypeptides do not contain a HIS tag. In accordance with the present invention, it has surprisingly been shown that when the HIS tag is removed, the expression level and stability are increased compared to the HIS tagged polypeptides.
Настоящее изобретение дополнительно представляет молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением.The present invention further provides nucleic acid molecules encoding RSV F polypeptides in accordance with the present invention.
В предпочтительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, являются оптимизированными по кодонам для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. Способы оптимизации по кодонам известны или были описаны ранее (например, WO 96/09378). Последовательность считается оптимизированной по кодонам, если по меньшей мере один кодон, не являющийся предпочтительным, по сравнению с последовательностью дикого типа замещен кодоном, который является более предпочтительным. В данном документе кодон, не являющийся предпочтительным, представляет собой кодон, который используется менее часто в организме, чем другой кодон, кодирующий такую же аминокислоту, и кодон, являющийся более предпочтительным, представляет собой кодон, который используется более часто в организме, чем кодон, не являющийся предпочтительным. Частоту использования кодонов для конкретного организма можно найти в таблицах частоты использования кодонов, таких как в http://www.kazusa.or.jp/codon. Предпочтительно более одного кодона, не являющегося предпочтительным, предпочтительно большинство или все кодоны, не являющиеся предпочтительными, замещают кодонами, которые являются более предпочтительными. Предпочтительно наиболее часто используемые кодоны в организме используются в оптимизированной по кодонам последовательности. Замещение предпочтительными кодонами, как правило, приводит к более высокой экспрессии.In preferred embodiments, nucleic acid molecules encoding the polypeptides of the present invention are codon optimized for expression in mammalian cells, preferably human cells. Codon optimization techniques are known or have been previously described (eg, WO 96/09378). A sequence is considered codon-optimized if at least one non-preferred codon over the wild-type sequence has been replaced with a more preferred codon. As used herein, a non-preferred codon is a codon that is used less frequently in the body than another codon encoding the same amino acid, and a codon that is more preferred is a codon that is used more frequently in the body than a codon. not preferred. The organism-specific codon frequency can be found in codon frequency tables such as at http://www.kazusa.or.jp/codon. Preferably, more than one non-preferred codon, preferably most or all of the non-preferred codons, are replaced with more preferred codons. Preferably, the most commonly used codons in the body are used in a codon-optimized sequence. Substitution with preferred codons generally results in higher expression.
Специалисту в данной области будет понятно, что несколько различных молекул полинуклеотидов и нуклеиновых кислот могут кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности генетического кода. Также понятно, что специалисты в данной области могут при помощи традиционных методик проводить нуклеотидные замены, которые не влияют на последовательность полипептида, кодируемую молекулами нуклеиновых кислот, для отражения частоты использования кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды будут экспрессироваться. Следовательно, если конкретно не указано иное, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК, могут включать в себя или могут не включать в себя интроны.The person skilled in the art will understand that several different polynucleotide and nucleic acid molecules can encode the same polypeptide as a result of degeneracy of the genetic code. It is also understood that those skilled in the art can, using conventional techniques, make nucleotide substitutions that do not interfere with the polypeptide sequence encoded by the nucleic acid molecules to reflect the frequency of codon usage by any particular host in which the polypeptides will be expressed. Therefore, unless specifically indicated otherwise, a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence includes all nucleotide sequences that are degenerate versions of each other and that encode the same amino acid sequence. Nucleotide sequences that encode proteins and RNA may or may not include introns.
Последовательности нуклеиновых кислот можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать de novo с помощью синтеза ДНК, который можно проводить с использованием стандартных процедур при помощи компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).Nucleic acid sequences can be cloned using standard molecular biology techniques or obtained de novo using DNA synthesis, which can be performed using standard procedures from companies providing DNA synthesis and / or molecular cloning services (e.g. GeneArt, GenScripts, Invitrogen , Eurofins).
Настоящее изобретение также представляет векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше.The present invention also provides vectors containing a nucleic acid molecule as described above.
Таким образом, в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением является частью вектора. Такими векторами можно легко манипулировать с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, и например, их можно сконструировать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. Кроме того, многие векторы можно использовать для трансформации эукариотических клеток, и они будут интегрироваться целиком или частично в геном таких клеток, что приведет в результате к стабильным клеткам-хозяевам, содержащим в их геноме необходимую нуклеиновую кислоту. Используемый вектор может представлять собой любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно использовать для транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Подходящими векторами в соответствии с настоящим изобретением являются, например, аденовекторы, та- 7 035522 кие как Ad26 или Ad35, альфавирус, парамиксовирус, вирус осповакцины, вирус герпеса, ретровирусные векторы и т.д. Специалист в данной области может выбрать подходящие векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения функциональным образом.Thus, in certain embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention is part of a vector. Such vectors can be easily manipulated using methods well known to the person skilled in the art, and for example, they can be engineered to be capable of replication in prokaryotic and / or eukaryotic cells. In addition, many vectors can be used to transform eukaryotic cells, and they will integrate in whole or in part into the genome of such cells, resulting in stable host cells containing the necessary nucleic acid in their genome. The vector used can be any vector that is suitable for cloning DNA and that can be used to transcribe a nucleic acid of interest. Suitable vectors according to the present invention are, for example, adenovectors such as Ad26 or Ad35, alphavirus, paramyxovirus, vaccinia virus, herpes virus, retroviral vectors, etc. One skilled in the art can select suitable expression vectors and insert the nucleic acid sequences of the present invention in a functional manner.
Клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-полипептиды RSV до слияния, также образуют часть настоящего изобретения. F-полипептиды RSV до слияния можно получить с помощью технологии рекомбинантной ДНК, включающей экспрессию молекул в клеткаххозяевах, например клетках яичников китайского хомячка (CHO), линиях опухолевых клеток, клетках BHK, клеточных линиях человека, таких как клетки HEK293, клетки PER.C6 или клетках дрожжей, грибов, насекомых и т.п. или трансгенных животных, или растений. В некоторых вариантах осуществления клетки происходят из многоклеточного организма, в некоторых вариантах осуществления они происходят из позвоночных или беспозвоночных. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки человека. В целом получение рекомбинантных белков, таких как F-полипептиды RSV до слияния по настоящему изобретению, в клетке-хозяине предусматривает введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид в экспрессируемом формате, в клетку-хозяина, культивирование клеток в условиях, способствующих экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты и обеспечение экспрессии полипептида в указанной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок в экспрессируемом формате, может находиться в форме кассеты экспрессии и обычно требует последовательностей, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты, таких как энхансер(ы), промотор, сигнал полиаденилирования и т.п. Специалист в данной области осведомлен о том, что разные промоторы можно использовать для обеспечения экспрессии гена в клетках-хозяевах. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получать из разных источников, в том числе, вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или получать искусственным путем.Host cells containing nucleic acid molecules encoding RSV F polypeptides prior to fusion also form part of the present invention. Pre-fusion RSV F polypeptides can be produced by recombinant DNA technology involving the expression of molecules in host cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, tumor cell lines, BHK cells, human cell lines such as HEK293 cells, PER.C6 cells, or cells of yeast, fungi, insects, etc. or transgenic animals or plants. In some embodiments, the cells are derived from a multicellular organism, in some embodiments they are derived from vertebrates or invertebrates. In some embodiments, the cells are mammalian cells. In some embodiments, the cells are human cells. In general, the production of recombinant proteins, such as RSV F-polypeptides prior to fusion according to the present invention, in a host cell involves the introduction of a heterologous nucleic acid molecule encoding a polypeptide in an expressed format into a host cell, culturing the cells under conditions conducive to the expression of the nucleic acid molecule and ensuring expression of the polypeptide in said cell. A nucleic acid molecule encoding a protein in an expression format can be in the form of an expression cassette and typically requires sequences to facilitate the expression of the nucleic acid such as enhancer (s), promoter, polyadenylation signal, and the like. One of ordinary skill in the art is aware that different promoters can be used to drive gene expression in host cells. Promoters can be constitutive or regulated and can be obtained from various sources, including viruses, prokaryotic or eukaryotic sources, or obtained artificially.
Среды для культивирования клеток доступны от различных поставщиков, и подходящую среду можно стандартно выбрать для клетки-хозяина для экспрессии белка, представляющего интерес, в данном случае F-полипептидов RSV до слияния. Подходящая среда может содержать или может не содержать сыворотку.Cell culture media are available from various suppliers, and a suitable medium can be routinely selected for the host cell to express the protein of interest, in this case RSV F polypeptides, prior to fusion. A suitable medium may or may not contain serum.
Гетерологической молекулой нуклеиновой кислоты (также называемой в данном документе как 'трансген') является молекула нуклеиновой кислоты, которая в природе не присутствует в клеткехозяине. Ее вводят, например, в вектор с помощью стандартных методик молекулярной биологии. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. Это можно выполнить, например, путем помещения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген(ы), под контроль промотора. Можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Многие промоторы можно использовать для экспрессии трансгена (трансгенов), и они известны специалисту, например, такие промоторы могут включать промоторы вирусов, млекопитающих, синтетические промоторы и т.п. Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (патент США № 5385839), например, предранний промотор CMV, например, содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV. Сигнал полиаденилирования, например, сигнал polyA гена бычьего гормона роста (патент США № 5122458) может располагаться позади трансгена(ов). В качестве альтернативы, несколько широко используемых векторов экспрессии доступны в данной области и их получают из коммерческих источников, например, серии векторов pcDNA и pEF Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т.д., которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии белка, представляющего интерес, или для получения подходящих промоторов и/или последовательностей терминаторов транскрипции, последовательностей polyA и т.п.A heterologous nucleic acid molecule (also referred to herein as a 'transgene') is a nucleic acid molecule that is not naturally present in a host cell. It is introduced, for example, into a vector using standard molecular biology techniques. The transgene is usually operably linked to expression control sequences. This can be accomplished, for example, by placing the nucleic acid encoding the transgene (s) under the control of a promoter. Additional regulatory sequences can be added. Many promoters can be used to express the transgene (s) and are known to those skilled in the art, for example, such promoters can include viral, mammalian, synthetic promoters, and the like. A non-limiting example of a suitable promoter for obtaining expression in eukaryotic cells is the CMV promoter (US Pat. No. 5,385,839), eg, the CMV immediate early promoter, eg, containing nucleotides -735 to +95 from the CMV immediate early gene enhancer / promoter. A polyadenylation signal, for example the polyA signal of the bovine growth hormone gene (US Pat. No. 5,122,458) may be located behind the transgene (s). Alternatively, several commonly used expression vectors are available in the art and are obtained from commercial sources, for example, the pcDNA and pEF Invitrogen series of vectors, pMSCV and pTK-Hyg from BD Sciences, pCMV-Script from Stratagene, etc., which can be used to recombinantly express a protein of interest or to generate suitable promoters and / or transcription terminator sequences, polyA sequences, and the like.
Культура клеток может представлять собой любой тип культуры клеток, в том числе адгезивную культуру клеток, например, клетки, прикрепленные к поверхности культурального флакона или к микроносителям, а также суспензионную культуру. Манипуляции с суспензионными культурами наиболее крупного масштаба проводят в периодическом процессе или процессе с подпиткой, поскольку они являются наиболее простыми для управления и увеличения масштаба. В настоящее время непрерывные процессы на основе принципов перфузии становятся более распространенными и они также являются подходящими. Подходящие питательные среды хорошо известны специалисту в данной области и могут, как правило, быть получены из коммерческих источников в больших количествах или произведены по заказу согласно стандартным протоколам. Культивирование можно проводить, например, в чашках, роллерфлаконах или в биореакторах, используя периодические, подпитываемые, непрерывные системы и т.п. Известны подходящие условия для культивирования клеток (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973) и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).The cell culture can be any type of cell culture, including an adhesive cell culture, for example, cells attached to the surface of a culture flask or to microcarriers, and a suspension culture. The largest scale suspension cultures are handled in a batch or fed-batch process as they are the easiest to manage and scale up. Currently, continuous processes based on perfusion principles are becoming more common and are also suitable. Suitable culture media are well known to the person skilled in the art and can generally be obtained from commercial sources in large quantities or manufactured to order according to standard protocols. The cultivation can be carried out, for example, in dishes, roller bottles or bioreactors using batch, fed, continuous systems and the like. Suitable conditions for cell culture are known (see, for example, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973) and RI Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).
Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие F-полипептиды RSV до слияния и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, как описано выше. Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие F-полипептид RSV до слияния, который демонстрирует эпитоп, присутствующий в конформации F-белка RSV до слияния, но отсутствует в конформации послеThe present invention also provides compositions comprising pre-fusion RSV F polypeptides and / or a nucleic acid molecule and / or a vector as described above. The present invention also provides compositions comprising a pre-fusion RSV F polypeptide that exhibits an epitope present in the pre-fusion RSV F protein conformation but is absent after
- 8 035522 слияния. Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, кодирующие такой F-полипептид RSV до слияния. Настоящее изобретение также представляет иммуногенные композиции, содержащие F-полипептиды RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, как описано выше. Настоящее изобретение также представляет применение стабилизированного F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования у субъекта иммунного ответа к Fбелку RSV. Дополнительно представлены способы индуцирования у субъекта иммунного ответа к Fбелку RSV, предусматривающие введение субъекту F-полипептида RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением. Также представлены Fполипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования иммунного ответа у субъекта к F-белку RSV. Также представлено применение F-полипептидов RSV до слияния, и/или молекул нуклеиновой кислоты, и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением для получения лекарственного средства для применения в индуцировании у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV.- 8 035522 mergers. The present invention also provides compositions comprising a nucleic acid molecule and / or a vector encoding such an RSV F polypeptide prior to fusion. The present invention also provides immunogenic compositions comprising pre-fusion RSV F polypeptides and / or a nucleic acid molecule and / or a vector as described above. The present invention also provides the use of a stabilized RSV F-polypeptide prior to fusion, a nucleic acid molecule and / or a vector according to the present invention for inducing an immune response in a subject to an RSV F protein. Additionally provided are methods of inducing an immune response to an RSV F protein in a subject, comprising administering to the subject a RSV F polypeptide prior to fusion and / or a nucleic acid molecule and / or a vector in accordance with the present invention. Also provided are pre-fusion RSV F polypeptides, nucleic acid molecules, and / or vectors according to the present invention for inducing an immune response in a subject to the RSV F protein. Also provided is the use of RSV F polypeptides prior to fusion and / or nucleic acid molecules and / or vectors according to the present invention for the preparation of a medicament for use in inducing an immune response in a subject to an RSV F protein.
F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты или векторы по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения (профилактики) и/или для лечения инфекций RSV. В определенных вариантах осуществления предупреждение и/или лечение может быть направлено на группы пациентов, которые восприимчивы к инфекции RSV. Такие группы пациентов включают без ограничений, например, пожилых (например, >50 лет, >60 лет и предпочтительно >65 лет), молодых (например, <5 лет <1 лет), госпитализированных пациент и пациентов, которые получали лечение противовирусными соединениями, но проявили недостаточный ответ на лечение противовирусными соединениями.Pre-fusion RSV F polypeptides, nucleic acid molecules or vectors of the present invention can be used to prevent (prevent) and / or treat RSV infections. In certain embodiments, prevention and / or treatment can be directed to groups of patients that are susceptible to RSV infection. Such patient populations include, without limitation, for example, the elderly (eg,> 50 years old,> 60 years old, and preferably> 65 years old), young (eg, <5 years old <1 years old), hospitalized patients, and patients who have received treatment with antiviral compounds. but showed insufficient response to treatment with antiviral compounds.
F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновых кислот и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением можно использовать, например, в самостоятельном лечении и/или профилактике заболевания или состояния, вызванного RSV, или в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими средствами лечения, такими как (существующими или будущими) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.Pre-fusion RSV F polypeptides, nucleic acid molecules and / or vectors according to the present invention can be used, for example, in the self-treatment and / or prevention of a disease or condition caused by RSV, or in combination with other prophylactic and / or therapeutic agents. such as (existing or future) vaccines, antiviral agents and / or monoclonal antibodies.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способы предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции RSV с использованием F-полипептидов RSV до слияния, молекул нуклеиновых кислот и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением. В конкретном варианте осуществления способ предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции RSV предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектора, описанных выше.The present invention further provides methods for preventing and / or treating RSV infection in a subject using pre-fusion RSV F polypeptides, nucleic acid molecules and / or vectors in accordance with the present invention. In a specific embodiment, a method for preventing and / or treating RSV infection in a subject comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of an RSV F polypeptide prior to fusion, a nucleic acid molecule and / or a vector as described above.
Терапевтически эффективное количество относится к количеству полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, которое является эффективным для предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения заболевания или состояния, возникшего в результате инфекции, вызванной RSV. Предупреждение охватывает подавление или уменьшение распространения RSV, или подавление или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией, вызванной RSV. Уменьшение интенсивности, как используется в данном документе, может относиться к уменьшению видимых или ощутимых симптомов заболевания, виремии или других поддающихся измерению проявлений инфекции гриппа.A therapeutically effective amount refers to an amount of a polypeptide, nucleic acid molecule, or vector that is effective to prevent, ameliorate, and / or treat a disease or condition resulting from an RSV infection. Prevention encompasses suppressing or reducing the spread of RSV, or suppressing or reducing the manifestation, development, or progression of one or more symptoms associated with RSV infection. Decrease in intensity, as used herein, may refer to a decrease in visible or palpable symptoms of illness, viremia, or other measurable manifestations of influenza infection.
Для введения субъектам, таким как люди, в настоящем изобретении могут использоваться фармацевтические композиции, содержащие F-полипептид RSV до слияния, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В настоящем контексте выражение фармацевтически приемлемый означает, что носитель или наполнитель в используемых дозировках и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или вредных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). F-полипептиды RSV или молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают путем стерильной фильтрации или с помощью других способов, широко известных из уровня техники. Затем растворы лиофилизируют или расфасовывают по контейнерам, предназначенным для лекарственных форм. pH раствора обычно находится в диапазоне от pH 3,0 до pH 9,5, например от pH 5,0 до pH 7,5. F-полипептиды RSV обычно находятся в растворе, имеющем подходящий фармацевтически приемлемый буфер, и композиция может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV можно составлять в виде инъекционного препарата.For administration to subjects such as humans, pharmaceutical compositions comprising a pre-fusion RSV F polypeptide, a nucleic acid molecule and / or a vector as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient may be used in the present invention. In the present context, the expression pharmaceutically acceptable means that the carrier or excipient at the dosages and concentrations used will not cause any undesirable or deleterious effects in the subjects to whom they are administered. Such pharmaceutically acceptable carriers and excipients are well known in the art (see Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, AR Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). RSV F polypeptides or nucleic acid molecules are preferably formulated and administered as a sterile solution, although lyophilized preparations are also possible. Sterile solutions are prepared by sterile filtration or other methods well known in the art. Then the solutions are lyophilized or packaged in containers intended for dosage forms. The pH of the solution is usually in the range from pH 3.0 to pH 9.5, for example from pH 5.0 to pH 7.5. RSV F polypeptides are typically in solution having a suitable pharmaceutically acceptable buffer, and the composition may also contain a salt. A stabilizing agent such as albumin may optionally be present. In certain embodiments, a detergent is added. In certain embodiments, RSV F polypeptides can be formulated as an injectable preparation.
В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением доIn some embodiments, the implementation of the composition in accordance with the present invention before
- 9 035522 полнительно содержит один или несколько адъювантов. Адъюванты, известные из уровня техники, дополнительно повышают иммунный ответ к применяемой антигенной детерминанте. Выражения адьювант и иммуностимулятор используют в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа к F-полипептидам RSV по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции на основе масляных эмульсий (или композиции типа масло в воде), в том числе сквален-водных эмульсий, таких как MF59 (см., например, WO 90/14837); составы с сапонинами, такие как, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); производные бактерий или микроорганизмов, примерами которых являются монофосфорил липид A (MPL), 3-О-деацилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие токсины бактерий или их мутантные формы, такие как термолабильный энтеротоксин LT из Е. coli, холерный токсин CT и т.п.; белки эукариотов (например, антитела или их фрагменты (например, направленные против самого антигена или CD1a, CD3, Cd7, CD80) и лиганды к рецепторам (например, CD40L, GMCSF, GCSF и др.), которые стимулируют иммунный ответ при взаимодействии с клетками реципиентов. В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат в качестве адъюванта алюминий, например, в форме гидроксида алюминия, фосфата алюминия, фосфата алюминия-калия или их комбинации в концентрациях 0,05-5 мг, например 0,075-1,0 мг алюминия из расчета на дозу.- 9 035522 additionally contains one or more adjuvants. Adjuvants known in the art further enhance the immune response to the antigenic determinant used. The expressions adjuvant and immunostimulant are used interchangeably herein and are defined as one or more substances that stimulate the immune system. In this context, an adjuvant is used to enhance the immune response to the RSV F polypeptides of the present invention. Examples of suitable adjuvants include aluminum salts such as aluminum hydroxide and / or aluminum phosphate; compositions based on oil emulsions (or compositions of the type oil in water), including squalene-water emulsions, such as MF59 (see, for example, WO 90/14837); formulations with saponins such as, for example, QS21 and immunostimulatory complexes (ISCOMS) (see, for example, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); derivatives of bacteria or microorganisms, examples of which are monophosphoryl lipid A (MPL), 3-O-deacylated MPL (3dMPL), oligonucleotides containing the CpG motif, ADP-ribosylating toxins of bacteria or their mutant forms, such as heat labile enterotoxin LT from E. coli , CT cholera toxin and the like; eukaryotic proteins (for example, antibodies or their fragments (for example, directed against the antigen itself or CD1a, CD3, Cd7, CD80) and ligands for receptors (for example, CD40L, GMCSF, GCSF, etc.) that stimulate the immune response when interacting with cells In certain embodiments, the compositions of the present invention contain aluminum as an adjuvant, for example, in the form of aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum-potassium phosphate, or a combination thereof at concentrations of 0.05-5 mg, for example 0.075-1.0 mg aluminum per dose.
F-полипептиды RSV до слияния можно также вводить в комбинации с наночастицами или конъюгированными с наночастицами, такими как, например, полимерами, липосомами, виросомами, вирусподобными частицами. F-полипептиды до слияния можно комбинировать с наночастицами, инкапсулировать в наночастицах или конъюгировать с наночастицами с адъювантом или без него. Инкапсулирование в липосомы описано, например, в документе US 4235877. Конъюгирование с макромолекулами раскрыто, например, в документах US 4372945 или US 4474757.F-RSV polypeptides before fusion can also be administered in combination with nanoparticles or conjugated to nanoparticles, such as, for example, polymers, liposomes, virosomes, virus-like particles. F-polypeptides, prior to fusion, can be combined with nanoparticles, encapsulated in nanoparticles, or conjugated to nanoparticles with or without adjuvant. Encapsulation in liposomes is described, for example, in US 4235877. Conjugation to macromolecules is disclosed, for example, in US 4372945 or US 4474757.
В других вариантах осуществления композиции не содержат адъюванты.In other embodiments, the compositions do not contain adjuvants.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет способы получения вакцины против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающие обеспечение композиции в соответствии с настоящим изобретением и помещение ее в фармацевтически приемлемую композицию. Выражение вакцина относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, который является эффективным для индуцирования у субъекта определенной степени иммунитета к определенному патогенному микроорганизму или заболеванию, которые приведут, по меньшей мере, к снижению (до полного отсутствия включительно) тяжести, продолжительности или другого проявления симптомов, связанных с инфекцией патогенным микроорганизмом или заболеванием. В настоящем изобретении вакцина содержит эффективное количество F-полипептида RSV до слияния и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептид RSV до слияния, и/или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, который приводит к образованию иммунного ответа к F-белку RSV. Это обеспечивает способ предупреждения тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, приводящего к госпитализации, и снижает частоту осложнений, таких как пневмония и бронхиолит у субъекта вследствие инфекции и репликации RSV. Выражение вакцина согласно настоящему изобретению подразумевает, что она представляет собой фармацевтическую композицию, и, таким образом, как правило, включает фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель. Она может содержать или не содержать дополнительные активные ингредиенты. В определенных вариантах осуществления она может представлять собой комбинированную вакцину, которая дополнительно содержит другие компоненты, которые индуцируют иммунный ответ, например, против других белков RSV и/или против других возбудителей инфекции. Введение дополнительных активных компонентов можно, например, осуществлять путем отдельного введения или путем введения комбинации продуктов из вакцин по настоящему изобретению и дополнительных активных компонентов.In certain embodiments, the present invention provides methods for preparing a respiratory syncytial virus (RSV) vaccine comprising providing a composition of the present invention and placing it in a pharmaceutically acceptable composition. The expression vaccine refers to an agent or composition containing an active ingredient that is effective to induce in a subject a certain degree of immunity to a particular pathogenic microorganism or disease, which will lead to at least a decrease (up to and including complete absence) of the severity, duration or other manifestation symptoms associated with infection with a pathogenic microorganism or disease. In the present invention, the vaccine contains an effective amount of a pre-fusion RSV F-polypeptide and / or a nucleic acid molecule encoding a pre-fusion RSV F-polypeptide and / or a vector containing said nucleic acid molecule that results in an immune response to the RSV F-protein ... This provides a method for preventing severe lower respiratory tract disease leading to hospitalization and reduces the incidence of complications such as pneumonia and bronchiolitis in a subject due to RSV infection and replication. The expression vaccine according to the present invention is meant to be a pharmaceutical composition, and thus typically includes a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient. It may or may not contain additional active ingredients. In certain embodiments, it can be a combination vaccine that further comprises other components that induce an immune response, for example, against other RSV proteins and / or against other infectious agents. The introduction of additional active ingredients can, for example, be carried out by separate administration or by administering a combination of vaccine products of the present invention and additional active ingredients.
Композиции можно вводить субъекту, например субъекту-человеку. Суммарная доза Fполипептидов RSV в композиции для однократного введения может, например, составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг, например 1 мкг - 1 мг, например 10-100 мкг. Определение рекомендуемой дозы будет осуществляться в процессе эксперимента и является стандартным для специалистов в данной области.The compositions can be administered to a subject, for example a human subject. The total dose of F-RSV polypeptides in a single administration composition may, for example, be from about 0.01 to about 10 mg, for example 1 μg-1 mg, for example 10-100 μg. Determination of the recommended dose will be carried out during the experiment and is standard for specialists in this field.
Введение композиций в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как внутрикожное, внутримышечное, подкожное, чрескожное введение или введение через слизистые, например, интраназальное, пероральное и т.п. В одном варианте осуществления композицию вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту известны различные возможности введения композиции, например вакцины, для индуцирования иммунного ответа к антигену (антигенам), присутствующему в вакцине.Administration of compositions in accordance with the present invention can be accomplished using standard routes of administration. Non-limiting embodiments include parenteral administration such as intradermal, intramuscular, subcutaneous, transdermal, or transmucosal administration, eg, intranasal, oral, and the like. In one embodiment, the composition is administered by intramuscular injection. The skilled person is aware of various possibilities for administering a composition, for example a vaccine, to induce an immune response to an antigen (s) present in the vaccine.
Субъект, как используется в данном документе, предпочтительно представляет собой млекопитающее, например грызуна, например мышь, хлопкового хомяка или примата, кроме человека, или человека.A subject, as used herein, is preferably a mammal, such as a rodent, such as a mouse, cotton hamster or primate, non-human or human.
- 10 035522- 10 035522
Предпочтительно субъект представляет собой субъекта-человека.Preferably, the subject is a human subject.
Полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот, векторы и/или комбинации можно также вводить в виде прайма или в виде буста в гомологичном или гетерологичном режиме прайм-буст. При проведении бустерной вакцинации обычно такую бустерную вакцину будут вводить одному и тому же субъекту с промежутком от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев после введения композиции субъекту в первый раз (которое в данном случае называется первичной вакцинацией). В некоторых вариантах осуществления введение включает прайм и по меньшей мере одно бустерное введение.Polypeptides, nucleic acid molecules, vectors and / or combinations can also be administered as a prime or as a boost in a homologous or heterologous prime-boost mode. In a booster vaccination, typically such a booster vaccine will be administered to the same subject at intervals of one week to one year, preferably two weeks to four months, after administration of the composition to the subject for the first time (which in this case is called primary vaccination). In some embodiments, the administration comprises a prime and at least one booster administration.
Кроме того, полипептиды по настоящему изобретению можно использовать в качестве диагностического средства, например, для проверки иммунного статуса индивидуума путем определения способности антител в сыворотке такого индивида к связыванию с полипептидами по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к in vitro диагностическому способу для выявления у пациента присутствия инфекции RSV, при этом указанный способ включает стадии: a) приведение в контакт биологического образца, полученного от указанного пациента, с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением; и b) выявление присутствия комплексов антитело-полипептид.In addition, the polypeptides of the present invention can be used as a diagnostic tool, for example, to check the immune status of an individual by determining the ability of antibodies in the serum of such an individual to bind to the polypeptides of the present invention. The present invention also relates to an in vitro diagnostic method for detecting the presence of RSV infection in a patient, the method comprising the steps of: a) contacting a biological sample obtained from said patient with a polypeptide according to the present invention; and b) detecting the presence of antibody-polypeptide complexes.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способ стабилизации конформации Fполипептида RSV до слияния, включающий введение одной или нескольких мутаций в домен F1 и/или F2 RSV, по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV дикого типа, где одна или несколько мутаций выбраны группы, состоящей из:The present invention further provides a method for stabilizing the conformation of an F-polypeptide RSV prior to fusion, comprising introducing one or more mutations into the F1 and / or F2 domain of RSV as compared to the F1 and / or F2 wild-type RSV domain, wherein one or more mutations are selected from the group consisting of :
(a) стабилизирующей мутации, которая блокирует вращение домена HRA в участке, прилегающем к консервативному дисульфидному мостику 69-212, при это указанный мостик содержит аминокислотные остатки 66-68 и 214-216, (b) мутации в спирали (в С-конце домена F2), содержащей аминокислотные остатки 76-98 в С-конце домена F2;(a) a stabilizing mutation that blocks rotation of the HRA domain in the region adjacent to the conserved disulfide bridge 69-212, said bridge containing amino acid residues 66-68 and 214-216, (b) mutations in the helix (at the C-terminus of the domain F2) containing amino acid residues 76-98 at the C-terminus of the F2 domain;
(c) мутации, которая снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB (N-концевой конец HRB), содержащего аминокислоты 486, 487 и 489; и (d) стабилизирующей мутации в участке HRA.(c) a mutation that reduces the repulsion of negative charges between the upper portions of the HRB stem (N-terminal end of the HRB) containing amino acids 486, 487 and 489; and (d) a stabilizing mutation in the HRA region.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 67.In certain embodiments, the HRA hinge mutation is at position 67.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 215.In certain embodiments, the HRA hinge mutation is at position 215.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 66 или 68 и/или в положении 214 или 216.In certain embodiments, the HRA hinge mutation is at position 66 or 68 and / or at position 214 or 216.
В определенных вариантах осуществления мутация в спирали находится в положении 77.In certain embodiments, the mutation in the helix is at position 77.
В определенных вариантах осуществления мутация в спирали находится в положении 80.In certain embodiments, the mutation in the helix is at position 80.
В определенных вариантах осуществления аминокислотный остаток в положении 77 и/или 80 изменяется в отрицательно заряженную аминокислоту.In certain embodiments, the amino acid residue at position 77 and / or 80 is changed to a negatively charged amino acid.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 92.In certain embodiments, the mutation is at position 92.
В определенных вариантах осуществления мутация, которая снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB, содержит аминокислоты 486, 487, 489.In certain embodiments, the mutation that reduces the repulsion of negative charges between the upper portions of the HRB stem region comprises amino acids 486, 487, 489.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 489.In certain embodiments, the mutation is at position 489.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 486.In certain embodiments, the mutation is at position 486.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует бета-повороты между аминокислотными остатками 175-193.In certain embodiments, the mutation stabilizes beta turns between amino acid residues 175-193.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует поворот в положении 175.In certain embodiments, the mutation stabilizes the turn at position 175.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует поворот в положении 184-185.In certain embodiments, the mutation stabilizes the turn at position 184-185.
Стабилизированные F-полипептиды RSV до слияния, получаемые и/или полученные с помощью такого способа, также образуют часть настоящего изобретения, а также варианты их применения, как описано выше.Pre-fusion stabilized F-RSV polypeptides obtained and / or obtained by such a method also form part of the present invention, as well as their uses as described above.
Далее настоящее изобретение поясняют следующими примерами. Данные примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для пояснения настоящего изобретения.The present invention is further illustrated by the following examples. These examples do not limit the present invention in any way. They serve only to illustrate the present invention.
ПримерыExamples of
Пример 1. Получение стабильных F-полипептидов RSV до слияния - линкеры и домены тримеризацииExample 1. Preparation of stable RSV F-polypeptides before fusion - linkers and trimerization domains
В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, стабилизированные варианты растворимых F-белков (sF) до слияния конструировали путем стабилизации двух основных участков, которые инициируют рефолдинг. Первой стратегией было блокирование пептида слияния в его положении и предотвращение его высвобождения из головного участка путем фиксации и соединения доменов F1-F2 с помощью короткой петли. Высвобождение пептида слияния можно предотвратить с помощью перенесения ковалентного соединения N-конца F1 к С-концу F2. Как показано в этом примере, подвергли испытаниям ряд разных линкеров. Вставка 5-аминокислотной петли между F1 и F2, в частности, содержащейIn the study that led to the present invention, stabilized variants of soluble F-proteins (sF) prior to fusion were constructed by stabilizing two major sites that initiate refolding. The first strategy was to block the fusion peptide in its position and prevent its release from the head region by fixing and joining the F1-F2 domains with a short loop. The release of the fusion peptide can be prevented by transferring the covalent bond of the N-terminus of F1 to the C-terminus of F2. As shown in this example, a number of different linkers were tested. Insertion of a 5-amino acid loop between F1 and F2, in particular containing
- 11 035522 аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5), была наиболее успешной. Этот линкер конструировали, исходя из расстояния, определенного в 3D модели гомологии, которая была получена для RSV-F типа А2 на основе выравнивания последовательности с F-последовательностью вируса парагриппа 5 типа, для которого опубликована 3D структура (Yin et. al., 2006).11,035,522 amino acid sequence GSGSG (SEQ ID NO: 5) was the most successful. This linker was constructed based on the distance determined in the 3D homology model that was obtained for RSV-F type A2 based on the sequence alignment with the F sequence of the parainfluenza virus type 5 for which the 3D structure was published (Yin et al., 2006) ...
AAA47881FIV5AAA47881FIV5
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTMELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYT
ACO833ulHRSVA2refACO833ulHRSVA2ref
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYT
AAA47881PIV8AAA47881PIV8
FIVVKLMPTIDSPISGCNI—TSISSYNATVTKLLQPIGENLETIRNQLIP--TRRRRRFUS HRSVIBFIVVKLMPTIDSPISGCNI — TSISSYNATVTKLLQPIGENLETIRNQLIP - TRRRRRFUS HRSVIB
SVITIELSNIKET--KCNGTDTKVKLIKC)ELiDKYKHAVTELQIjIjMQNTFAAMNRARREAPSVITIELSNIKET - KCNGTDTKVKLIKC) ELiDKYKHAVTELQIjIjMQNTFAAMNRARREAP
AGO83 3ulHRSVA2refAGO83 3ulHRSVA2ref
SVITIELSNIKKN--KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTFATNNRARRELPSVITIELSNIKKN - KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTFATNNRARRELP
AAA47881FIV5AAA47881FIV5
FAGWIGLAALGVATAAQVTAAVALVKANENAAA ILNLKNAIQFAGWIGLAALGVATAAQVTAAVALVKANENAAA ILNLKNAIQ
FUS HRSVIB uYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLFUS HRSVIB uYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALL
ACO833 IHRSVAzrftfACO833 IHRSVAzrftf
Re MN YΤΝΝΝΑΚΚ ΓΗ VI LjNKKRKRRELGl·'LLGVGNALASGVAVSK VNHLEGEVNKIKSALLRe MN YΤΝΝΝΑΚΚ ΓΗ VI LjNKKRKRRELGl · 'LLGVGNALASGVAVSK VNHLEGEVNKIKSALL
AAA47881PIV5AAA47881PIV5
KTNAAVADWQATQSLGTAVQAVQDHINSVVSPAITAANCKAQDAIIGSILMLY LTELTTKTNAAVADWQATQSLGTAVQAVQDHINSVVSPAITAANCKAQDAIIGSILMLY LTELTT
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFOQMNSRLLESTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFOQMNSRLLE
AGO83 3ulHRSVA2refAGO83 3ulHRSVA2ref
STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLESTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLE
AAA47881PIV5AAA47881PIV5
IFHNQITNP-ALSPITIQALRILLGSTLPTWEKSFNTQISAAELLSSGLLTGQrVGLDLIFHNQITNP-ALSPITIQALRILLGSTLPTWEKSFNTQISAAELLSSGLLTGQrVGLDL
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
ITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVOIVROQSYSIMSIIITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVOIVROQSYSIMSII
ACO83 3 1HRSVA2rsfACO83 3 1HRSVA2rsf
ITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKLMSNNVOIVROQSYSIMSIIITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDOKKLMSNNVOIVROQSYSIMSII
AAA47881PIVSAAA47881PIVS
TYMQMVIKIELPTLTVQPATQIIDLATISAFI—NNQEVMAQL—PTRvMVTG--SLIQATYMQMVIKIELPTLTVQPATQIIDLATISAFI — NNQEVMAQL — PTRvMVTG - SLIQA
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
KEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFF
ACO83301HRSVA2rAfACO83301HRSVA2rAf
KEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNIcLTRTDRGWYCDNAGSVSFFKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNIcLTRTDRGWYCDNAGSVSFF
AAA47881PIV.5AAA47881PIV.5
YPASQCTITPNTVYcRYNDAQVLSDDTMACLQGN---LTRCTFSPVVGSFLTRFVLFDGIYPASQCTITPNTVYcRYNDAQVLSDDTMACLQGN --- LTRCTFSPVVGSFLTRFVLFDGI
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
BOADTCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITsLGACO83301HRSVA2refBOADTCKVOSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITsLGACO83301HRSVA2ref
POAETCKVOSNRVFcDTMNSLTLPSEVNLcNVDIFNPKYDcKIMTSKTDVSSSVITSLGΆΑΑ47881PIV5POAETCKVOSNRVFcDTMNSLTLPSEVNLcNVDIFNPKYDcKIMTSKTDVSSSVITSLGΆΑΑ47881PIV5
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
AIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKG
ACO833ulHRSVA2refACO833ulHRSVA2ref
AIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKOEGKSLYVKGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKOEGKSLYVKG
AAA47881BIV5 “OILSIDPLDISONLAAVNKSLSDALOHLAOS DTYLSALTSATTTS —VLSIIAAAA47881BIV5 “OILSIDPLDISONLAAVNKSLSDALOHLAOS DTYLSALTSATTTS —VLSIIA
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
EBIINYYDBLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIEBIINYYDBLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTII
AGO83301HRSVA2refAGO83301HRSVA2ref
EPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTII
AAA47881BIV5AAA47881BIV5
ICLGSLGLILIILLSVWWKLLTIWANRNRMENFVYHKICLGSLGLILIILLSVWWKLLTIWANRNRMENFVYHK
FUS HRSVIBFUS HRSVIB
IVIIWLLsLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSKIVIIWLLsLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
ACO833ulHRSVA2refACO833ulHRSVA2ref
IVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
VYANCRS-MLCKCMOPAAVILOPSVYANCRS-MLCKCMOPAAVILOPS
PVTVIDMYKCVSLOLDNLRFTITOLANVTYNSTIPVTVIDMYKCVSLOLDNLRFTITOLANVTYNSTI
MGTIIQFLVVSCLLAGAGSLDFAALMQIGVIFTNVROLMYYTEASSAMGTIIQFLVVSCLLAGAGSLDFAALMQIGVIFTNVROLMYYTEASSA
- 12 035522- 12 035522
Выравнивание между F-последовательностью HRSV типа А и В с PIV5 (верхняя последователвноств), которую исполвзовали для конструирования модели гомологии RSV-F до слияния. Другим нестабильным участком является второй гептадный повтор (HRB), который образует тримерный спиральный участок стебля в F-белке до слияния. Делеция трансмембранного домена (ТМ) в растворимом F-белке дополнительно дестабилизирует этот участок, что было восполнено добавлением различных гетерологических доменов тримеризации. Полностью процессированный зрелый эктодомен RSV-F сливали на Сконце с различными доменами тримеризации и в различных положениях (т.е. домен F1 усекали по различным аминокислотным остаткам).Alignment between the F-sequence of HRSV type A and B with PIV5 (upper sequence), which was used to construct a model of RSV-F homology before fusion. Another unstable region is the second heptad repeat (HRB), which forms a trimeric helical region of the stem in the F-protein prior to fusion. Deletion of the transmembrane domain (TM) in the soluble F-protein further destabilizes this site, which was made up for by the addition of various heterologous trimerization domains. The fully processed mature RSV-F ectodomain was fused at the C-terminus with different trimerization domains and at different positions (i.e., the F1 domain was truncated at different amino acid residues).
Несколько конструкций получали на основе штаммов А2 или В1 RSV. Различные домены тримеризации связывали с доменом F1 RSV, который усекали по различным положениям. Домены тримеризации, которые исследовали, включали мотив фибритина (содержащий аминокислотную последовательность: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4), и мотив фибритин длинный, более длинный, растянутый на N-конце домен фибритина, который включает его встречающиеся в природе спиральные участки (содержащие аминокислотную последовательность: sslqgdvqalqeagyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl (SEQ ID NO: 6), которые добавляли к F1-домену RSV в рамке (в регистре) с предполагаемым гептадным повтором участка HRB.Several constructs were obtained based on the A2 or B1 RSV strains. Different trimerization domains were linked to the F1 domain of RSV, which was truncated at different positions. The trimerization domains that were investigated included the fibritin motif (containing the amino acid sequence: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4), and the fibritin motif is a long, longer, extended at the N-terminus fibritin domain, which includes its naturally occurring helical regions (containing the amino acid sequence: sslqgdvqalqeagyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl (SEQ ID NO: 6), which were added to the F1 domain of RSV in frame (in register) with the putative heptad repeat of the HRB region.
Полученные дополнительные конструкции содержали гептадные идеальные спиральные тримерные суперспирали или домен изолейциновой застежки (IZ) (Suzuki et al., Protein Engineering 11: 1051-1055 (1998)), содержащие аминокислотную последовательность: IEAIEKK (SEQ ID NO: 7). В соответствии с настоящим изобретением использовали различные домены IZ, обозначенные как изолейциновая застежка (L), содержащая аминокислотную последовательность (I)ekkieaiekkieaiekkieaieaiekkiea (SEQ ID NO: 8), и изолейциновая застежка (S), содержащая аминокислотную последовательность ΕΚΚΙΕΑΙΕΚΚΙΕΑΙΕΚΚΙΕΑ (SEQ id NO: 3).The resulting additional constructs contained heptade ideal helical trimeric supercoils or isoleucine zipper domain (IZ) (Suzuki et al., Protein Engineering 11: 1051-1055 (1998)) containing the amino acid sequence: IEAIEKK (SEQ ID NO: 7). In accordance with the present invention, various IZ domains, designated as isoleucine zipper (L), containing the amino acid sequence (I) ekkieaiekkieaiekkieaieaiekkiea (SEQ ID NO: 8) and isoleucine zipper (S) containing the amino acid sequence ΕΚΚΙΕΑΙΕΚΚΙΕΑΙΕΚΚΙΕΑ (SEQ id NO: 3 ).
Эти домены IZ сопоставимы по структуре с GCN4, однако домены IZ не являются встречающимися в природе последовательностями, а сконструированы для того, чтобы быть оптимальными доменами тримеризации и поэтому более стабильными.These IZ domains are structurally comparable to GCN4, however, the IZ domains are not naturally occurring sequences, but are designed to be optimal trimerization domains and therefore more stable.
Дополнительные конструкции получали с другими известными доменами тримеризации:Additional constructs were made with other known trimerization domains:
GCN4IIGCN4II
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 9)EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 9)
Оптимизированный GCN4IIOptimized GCN4II
EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID NO: 10) Матриллин -1 (длинная версия)EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID NO: 10) Matrillin -1 (long version)
EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO:EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO:
11)eleven)
Матриллин - 1 которая версия, которая содержит только домен застежки:Matrillin - 1 which version that contains only the clasp domain:
EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 12)EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 12)
Получали следующие конструкции:Received the following designs:
конструкция F18 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID NO: 4), связанный с аминокислотным остатком 513 домена F1.construct F18 contained a fibritin trimerization domain (SEQ ID NO: 4) linked to amino acid residue 513 of the F1 domain.
Конструкция F19 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID NO: 4), связанный с аминокислотным остатком 499 домена F1.Construct F19 contained a fibritin trimerization domain (SEQ ID NO: 4) linked to amino acid residue 499 of the F1 domain.
Конструкция F20 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), связанный с аминокислотным остатком 516 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB для оптимизации гидрофобной природы гептадных положений и облегчения слияния с доменом IZ с сохранением рамки считывания.Construct F20 contained an isoleucine zipper domain (L) (SEQ ID NO: 8) linked to amino acid residue 516 of the F1 domain and containing additional modifications in the HRB to optimize the hydrophobic nature of the heptade positions and to facilitate in-frame fusion with the IZ domain.
Конструкция F21 также содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), но связанный с аминокислотным остатком 501 домена F1 и без дополнительных модификаций в участке HRB.Construct F21 also contained an isoleucine zipper domain (L) (SEQ ID NO: 8), but linked to amino acid residue 501 of the F1 domain and without further modifications in the HRB region.
Конструкция F22 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), связанный с аминокислотным остатком 495 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB.Construct F22 contained an isoleucine zipper domain (L) (SEQ ID NO: 8) linked to amino acid residue 495 of the F1 domain and containing additional modifications in HRB.
Конструкция F23 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), связанный с аминокислотным остатком 495.Construct F23 contained an isoleucine zipper (S) domain (SEQ ID NO: 3) linked to amino acid residue 495.
Конструкция F46 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), но связанный с более длинным эктодоменом RSV-F, т.е. домен F1 усекали после аминокислотного остатка 513.Construct F46 contained an isoleucine zipper (S) domain (SEQ ID NO: 3), but linked to the longer RSV-F ectodomain, i.e. the F1 domain was truncated after amino acid residue 513.
Все конструкции содержали HIS-метку.All constructs contained a HIS tag.
Конструкции исследовали в отношении уровней экспрессии, стабильности при хранении и связывания с антителом CR9501. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи и CDR тяжелой и легкой цепи этого антитела приведены ниже. CR9501 содержит связывающие участки антител, обозначенных как 58C5 в WO2012/006596.The constructs were investigated for expression levels, storage stability and binding to the CR9501 antibody. The amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions and the heavy and light chain CDRs of this antibody are shown below. CR9501 contains binding sites for the antibodies designated 58C5 in WO2012 / 006596.
Конструкции синтезировали и оптимизировали по кодонам в Gene Art (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Конструкции клонировали в pCDNA2004 или создавали при помощи стандартных спосоThe constructs were synthesized and codon-optimized at Gene Art (Life Technologies, Carlsbad, CA). The constructs were cloned into pCDNA2004 or created using standard methods
- 13 035522 бов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР, и секвенировали. Используемой системой экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в течение 5 дней при 37°C и 10% CO2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°C до использования.- 13,035,522 bins widely known in the art, including site-directed mutagenesis and PCR, and sequenced. The expression system used was 293 Freestyle cells (Life Technologies). Cells were transiently transfected with 293Fectin (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions and cultured for 5 days at 37 ° C and 10% CO 2 . The culture supernatant was collected and centrifuged for 5 min at 300 g to remove cells and cellular debris. The centrifuged supernatant was then sterile filtered with a 0.22 µm vacuum filter and stored at 4 ° C until use.
Супернатанты с 5 дня оценивали в отношении экспрессии F-белка с помощью вестерн-блоттинга, используя моноклональное антитело CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепи антитела к F RSV мотавизумаб (обозначенного как CR9503). Приблизительные уровни экспрессии конструкций F-белка RSV до слияния определяли с использованием CR9503, вторичного антитела, конъюгированного с IR-красителем, к иммуноглобулину человека (Li-Cor, Линкольн, Небраска) или HRP-конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания). Затем определяли количества белка с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV, или визуально на глаз, или с использованием системы Odyssey CLx для инфракрасной визуализации. Альтернативно использовали количественный октет (интерферометрия BioLayer) для определения концентрации белка в супернатантах. Для определения стабильности конструкций и выявления положительных или отрицательных влияющих стабилизирующих эффектов введенных мотивов тримеризации, конструкции, способные к связыванию с CR9501, обрабатывали в диапазоне температур от 45 до 65°C в течение 30 мин для исследования стабильности эпитопа CR9501.Supernatants from day 5 were assessed for F-protein expression by Western blotting using monoclonal antibody CR9503, which contains the variable regions of the heavy and light chains of the anti-F RSV antibody motavizumab (designated CR9503). The approximate expression levels of RSV F protein constructs prior to fusion were determined using CR9503, an IR dye-conjugated secondary antibody to human immunoglobulin (Li-Cor, Lincoln, Nebraska) or an HRP-conjugated mouse anti-human IgG antibody (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Protein amounts were then determined using a dilution series of purified RSV standard protein, either visually by eye or using the Odyssey CLx infrared imaging system. Alternatively, a quantitative octet (BioLayer interferometry) was used to determine the protein concentration in the supernatants. To determine the stability of the constructs and to reveal the positive or negative influencing stabilizing effects of the introduced trimerization motifs, the constructs capable of binding to CR9501 were treated in the temperature range from 45 to 65 ° C for 30 min to study the stability of the CR9501 epitope.
Эта процедура подробно описана в примере 8. Результаты обобщены в табл. 1.This procedure is described in detail in example 8. The results are summarized in table. 1.
Таблица 1. Экспрессия и стабильность конструкций F RSV с различными мотивами тримеризацииTable 1. Expression and stability of F RSV constructs with different trimerization motives
^Стабильность определяли, как описано в примере 7; ND: не определяли.^ Stability was determined as described in example 7; ND: not determined.
1 Уровень экспрессии определяли с помощью вестерн-блоттинга, как описано в примере 1. 1 Expression level was determined using Western blotting as described in example 1.
Как можно увидеть в табл. 1, единственными конструкциями, которые экспрессировались, были вариант фибритина (F18) и F23. Несмотря на то, что F18 был тримерным и демонстрировал экспрессию, он был нестабильным при хранении при 4°C. В противоположность этому F23 был стабильным при 4°C, связывался со специфичными антителами до слияния, но, по-видимому, был мономерным. Таким образом, оба варианта F18 и F23 использовали для оптимизации стабильности и тримеризации.As you can see in table. 1, the only constructs that were expressed were fibritin variant (F18) and F23. Despite the fact that F18 was trimeric and showed expression, it was unstable when stored at 4 ° C. In contrast, F23 was stable at 4 ° C, bound to specific antibodies prior to fusion, but appeared to be monomeric. Thus, both F18 and F23 were used to optimize stability and trimerization.
Затем получали несколько конструкций, в которых пептид слияния на N-конце F1 был прикреплен путем слияния с С-концом домена F2. Все конструкции содержали His-метку.Several constructs were then obtained in which the fusion peptide at the N-terminus of F1 was attached by fusion to the C-terminus of the F2 domain. All constructs contained a His-tag.
Получали несколько конструкций, в том числе конструкции, в которых сайты расщепления фурином подвергали мутации, что приводило к образованию растворимого F-белка, который по-прежнему содержал пептид p27 (т.е. F12, F15.1 и F17). В других конструкциях участок из 27 остатков (петля P27), который отщеплялся от предшественника F0, замещали альтернативной закрытой петлей или связывающей последовательностью: с помощью замещения участка RSV-F 'гомологичным' участком PIV-5 F, Fбелком до слияния, который получали и успешно кристаллизовали (F25), или путем замещения участка минимальной (GS)n петлей, которая бы связывала с помощью мостика концы F2 и F1 (F24), или путем замещения участка центральным консервативным участком RSV-G (F26). Моделирование гомологии RSV-F на основе PIV-5 и измерений in silico привело в результате к выбору минимальной петли из 5 аминокислотных остатков между остатками 108 и 136. В качестве линкера выбирали остатки Gly (G) и Ser (S), которые являются гибкими и полярными и имеют высокую вероятность быть внесенными (F24). Кроме того, F137 подвергали мутации в S, поскольку локальные модификации, вызванные петлей, могли смещать гидрофобный F и вызывать нестабильности. Это представлено ниже. Также R106 подвергали мутированию в Q и замещали 27 остатков (109-135), используя GSGSG.Several constructs were made, including constructs in which furin cleavage sites were mutated, resulting in a soluble F-protein that still contained the p27 peptide (ie, F12, F15.1 and F17). In other constructs, the 27 residue region (loop P27) that was cleaved from the precursor F0 was replaced with an alternative closed loop or binding sequence: by replacing the RSV-F region with a 'homologous' region PIV-5 with F, F protein before fusion, which was obtained and successfully crystallized (F25), either by replacing the region with a minimal (GS) n loop that would bridge the ends of F2 and F1 (F24), or by replacing the region with a centrally conserved RSV-G region (F26). Simulation of RSV-F homology based on PIV-5 and in silico measurements resulted in the selection of a minimum loop of 5 amino acid residues between residues 108 and 136. Gly (G) and Ser (S) residues were chosen as a linker, which are flexible and polar and highly likely to be introduced (F24). In addition, F137 was mutated in S, since local modifications caused by the loop could displace hydrophobic F and cause instabilities. This is shown below. Also R106 was mutated to Q and replaced with 27 residues (109-135) using GSGSG.
PAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRR136FLGFLLGVGPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRR 136 FLGFLLGVG
PAANNQAR GSGSGRi36SLGFLLGVGPAANNQAR GSGSGRi 36 SLGFLLGVG
- 14 035522- 14 035522
Как представлено в табл. 2, все варианты не демонстрировали экспрессию или демонстрировали очень низкую экспрессию, за исключением варианта с короткой петлей GSGSG (F24), которая демонстрировала намного более высокую экспрессию (44 мкг/мл) по сравнению с конструкцией на основе F дикого типа RSV, т.е. подобной конструкцией, но без указанного линкера (F11). F24, который являлся тримерным, был, однако, нестабильным при хранении подобно всем другими вариантам с С-конценвым мотивом тримеризации фибритина. Все варианты содержали HIS-метку.As presented in table. 2, all variants showed no or very low expression, with the exception of the short loop GSGSG (F24) variant, which showed much higher expression (44 μg / ml) compared to the wild-type F-based RSV construct, i.e. ... a similar construction, but without the specified linker (F11). F24, which was trimeric, was, however, unstable on storage, like all other variants with the C-terminal fibritin trimerization motif. All variants contained a HIS tag.
Таблица 2. Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с различными линкерами F1-F2Table 2. Expression and stability of constructs based on F RSV with various linkers F1-F2
^Стабильность определяли, как описано в примере 7.^ Stability was determined as described in example 7.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1The expression level was determined as described in example 1
Затем, наиболее подходящие модификации комбинировали для поиска оптимальных Fполипептидов до слияния. Комбинации получали из вариантов с петлей GSGSG, С-концевым усечением F1 и добавлением мотива фибритина (SEQ ID NO: 4) или изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) (см. табл. 3).Then, the most suitable modifications were combined to search for the optimal F polypeptides prior to fusion. Combinations were made from variants with GSGSG loop, F1 C-terminal truncation and addition of fibritin motif (SEQ ID NO: 4) or isoleucine fastener (S) (SEQ ID NO: 3) (see Table 3).
Таблица 3. Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с комбинациями оптимизаций согласно табл. 1 и 2Table 3. Expression and stability of constructs based on F RSV with combinations of optimizations according to table. 1 and 2
ND - не определено.ND - undefined.
^Стабильность при хранении, как определяли в примере 7.^ Storage stability as determined in Example 7.
*Термостабильность, как определяли в примере 8. Уровень экспрессии определяли с помощью вестерн-блоттинга (описано в примере 1)* Thermal stability as determined in example 8. Expression level was determined using Western blotting (described in example 1)
Добавление петли GSGSG всегда повышало экспрессию функциональных конструкций, а также термостабильность белка. Комбинация петли GSGSG с усеченным F и мотивом изолейциновой застежки (S) (F43, F47) продемонстрировала высокую экспрессию, термостабильность и значительную стабильность в хранении при 4°C. Однако, эти варианты были по-прежнему мономерными. Мотив тримеризации с изолейциновой застежкой (S) демонстрировал более высокую экспрессию с вариантом F, который представлял собой F, усеченный на С-конце в положении 495 (сравните F43 с F56 и F23 с F46). В противоположность этому, для вариантов с доменом тримеризации фибритина усечение в положении 513 продемонстрировало высокую экспрессию по сравнению с усечением в положении 495, которое не демонстрировало экспрессии (сравните F24 с F44).The addition of the GSGSG loop has always increased the expression of functional constructs, as well as the thermal stability of the protein. The combination of a GSGSG loop with a truncated F and an isoleucine fastener (S) motif (F43, F47) has shown high expression, thermal stability and significant storage stability at 4 ° C. However, these variants were still monomeric. The trimerization motif with isoleucine fastening (S) showed higher expression with variant F, which was F truncated at the C-terminus at position 495 (compare F43 with F56 and F23 with F46). In contrast, for variants with a fibritin trimerization domain, truncation at position 513 showed high expression compared to truncation at position 495, which did not show expression (cf. F24 vs F44).
Поскольку HIS-метку могла нарушать нативный фолдинг тримеров, то конструировали вариантыSince the HIS tag could violate the native folding of the trimers, the variants were designed
- 15 035522 без HIS-метки для фибритина и варианта изолейциновой застежки (S) (табл. 4).- 15 035522 without HIS-tag for fibritin and isoleucine zipper variant (S) (Table 4).
Таблица 4. Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с HIS-меткой и без HIS-меткиTable 4. Expression and stability of F RSV-based constructs with and without HIS-tag
^Стабильность при хранении определяли, как описано в примере 7;^ Storage stability was determined as described in Example 7;
термостабильность определяли, как описано в примере 8;thermal stability was determined as described in example 8;
ND: не определено.ND: undefined.
Удивительным являлось то, что делеция HIS-метки повышала экспрессию в F47. Более того, для F47 она немного повышала содержание тримеров и для F24 она умеренно повышала только уровень экспрессии.Surprisingly, deletion of the HIS tag increased expression in F47. Moreover, for F47 it slightly increased the content of trimers, and for F24 it moderately increased only the expression level.
Затем, изучали несколько альтернативных доменов тримеризации и усечений в комбинации со стабилизированным петлей GSGSG вариантом F (F47) (см. табл. 5). Все варианты имеют петлю GSGSG и содержат HIS-метку.Then, several alternative trimerization and truncation domains were examined in combination with the stabilized GSGSG loop variant F (F47) (see Table 5). All variants have a GSGSG loop and contain a HIS tag.
Таблица 5. Экспрессия и стабильность вариантов на основе F RSV с альтернативными доменами _____________________________тримеризации_________________________________Table 5. Expression and stability of variants based on F RSV with alternative domains _____________________________ trimerization _________________________________
Связывание антитела определяли как связывание в день сбора клеток (как описано в примере 7); + указывает связывание;Antibody binding was defined as binding on the day of cell harvest (as described in Example 7); + indicates binding;
- указывает отсутствие связывания.- indicates no binding.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. ND: не определено.Expression level was determined as described in example 1. ND: not determined.
Только домен матриллина 1 (Dames-SA et. al., Nat. Struc. Biol., 5(8), 1998), который содержит и Nконцевой домен застежки, и С-концевую часть с остатками цистеина, которые могут потенциально образовывать дисульфидные мостики между тримерами, как было обнаружено, способен к более высоким уровням экспрессии, чем F47 (табл. 5, матриллин длинный). Более того, вариант с мотивом тримериации матриллина длинного демонстрирует тримерные F-белки. Однако, продукт не связывался со специфическим Mab CR9501 до слияния и также демонстрировал гексамерные молекулы, которые делают домен тримеризации матриллина 1 не подходящим для получения тримерного нативного F-белка. Никакой из мотивов застежки на основе матриллина или на основе GCN4II не демонстрировал повышенной экспрессии или стабильности по отношению к F47 (табл. 5, матриллин короткий, GCN4II-оптимизированный). Снова усечение на 495 приводит к более высоким уровням экспрессии. Добавление мотива GCN4, который содержал оптимизированную триггерную последовательность, не продемонстрировало экспрессии.Only the matrillin 1 domain (Dames-SA et. Al., Nat. Struc. Biol., 5 (8), 1998), which contains both an N-terminal zipper domain and a C-terminal portion with cysteine residues that can potentially form disulfide bridges between trimmers was found to be capable of higher expression levels than F47 (Table 5, matrillin long). Moreover, the variant with the trimerization motif of matrillin long demonstrates trimeric F proteins. However, the product did not bind to the specific Mab CR9501 prior to fusion and also exhibited hexameric molecules that render the trimerization domain of matrillin 1 unsuitable for the preparation of a trimeric native F protein. None of the matrillin-based or GCN4II-based fastener motifs showed increased expression or stability with respect to F47 (Table 5, matrillin short, GCN4II-optimized). Again truncation at 495 results in higher levels of expression. The addition of the GCN4 motif, which contained the optimized trigger sequence, showed no expression.
GCN4 II представляет собой домен тримеризации, который успешно используют для стабилизацииGCN4 II is a trimerization domain that has been used successfully to stabilize
- 16 035522 тримера вируса парагриппа типа 5 до слияния (Yin et al., Nature 439:38-44, 2006) и его испытывали другие для стабилизации F RSV до слияния (как раскрыто, например, в WO 2010/149743, WO 2010/14975, WO 2009/079796, WO2010/158613). Домен тримеризации GCN4II оценивали и сравнивали с другими конструкциями, которые содержат домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) или домен фибритина (SEQ ID NO: 4) (результаты представлены в табл. 6). Эти варианты также сравнивали с другими модификациями, т.е. коротким линкером на основе одной мутации лизина и L512K. Все варианты содержали HIS-метку.16 035522 parainfluenza virus type 5 trimers prior to fusion (Yin et al., Nature 439: 38-44, 2006) and has been tested by others to stabilize the RSV F before fusion (as disclosed, for example, in WO 2010/149743, WO 2010 / 14975, WO 2009/079796, WO2010 / 158613). The GCN4II trimerization domain was evaluated and compared with other constructs that contain an isoleucine zipper (S) domain (SEQ ID NO: 3) or a fibritin domain (SEQ ID NO: 4) (results are shown in Table 6). These variants were also compared with other modifications, i.e. a short linker based on one mutation of lysine and L512K. All variants contained a HIS tag.
Экспрессия и стабильность вариантов F RSV с замещением GCN4II, L512K и p27 (один аминокислотный линкер (K) между F1 и F2)Expression and stability of RSV F variants with GCN4II, L512K and p27 substitution (one amino acid linker (K) between F1 and F2)
Таблица 6.Table 6.
Стабильность при хранении определяли, как описано в примере 7; уровни экспрессии определяли, как описано в примере 1; термостабильность определяли, как описано в примере 8; ND: не определено.Storage stability was determined as described in Example 7; expression levels were determined as described in example 1; thermal stability was determined as described in example 8; ND: undefined.
Короткая связь между F1 и F2, по-видимому, сопоставима с петлей GSGSG. Добавление мотива GCN4II не приводит в результате к какой-либо экспрессии F-белка в какой-либо из исследованных конструкций (т.е. ни в последовательности F RSV А2, описанной в WO2 010/149743 или WO 2010/149745, ни в последовательности F RSV А2, используемой в соответствии с настоящим изобретением, ни последовательности F RSV B1).The short link between F1 and F2 appears to be comparable to the GSGSG loop. The addition of the GCN4II motif does not result in any expression of the F protein in any of the investigated constructs (i.e., neither in the RSV A2 F sequence described in WO2 010/149743 or WO 2010/149745, nor in the F RSV A2 used in accordance with the present invention, nor the sequence F RSV B1).
Было показано, в соответствии с настоящим изобретением, что введение этих двух типов модификаций, т.е. введение связывающей последовательности и гетерологического домена тримеризации, было недостаточно для обеспечения экспрессии стабильного тримерного F-белка до слияния. Помимо этих двух основных участков нестабильности, которые были стабилизированы, т.е. HRB и пептида слияния, как описано выше, другие участки в F-белке до слияния также способствуют значительному рефолдингу и/или вносят значительный рефолдинг в F после слияния, и можно оптимизировать больше положений в последовательности для остановки рефолдинга F-белка до слияния. Таким образом, разные аминокислотные остатки в домене HRA и HRB и во всех доменах, которые контактируют с этими участками в F до слияния, подвергали мутированию для повышения структурной стабильности до слияния, как описано в следующих примерах.It has been shown, in accordance with the present invention, that the introduction of these two types of modifications, i.e. the introduction of a binding sequence and a heterologous trimerization domain was insufficient to ensure the expression of a stable trimeric F protein prior to fusion. In addition to these two main areas of instability that have been stabilized, i.e. HRB and a fusion peptide, as described above, other regions in the pre-fusion F protein also promote significant refolding and / or introduce significant refolding in F after fusion, and more positions in the sequence can be optimized to stop the F protein from refolding before fusion. Thus, different amino acid residues in the HRA and HRB domain and in all domains that contact these regions in F prior to fusion were mutated to increase structural stability prior to fusion, as described in the following examples.
Пример 2. Получение стабильных F-полипептидов RSV до слияния стабилизирующие мутацииExample 2. Preparation of stable RSV F polypeptides prior to fusion stabilizing mutations
Поскольку содержание тримеров (для конструкции F47) и стабильность при хранении (для конструкции F24) не были оптимальными, создавали дополнительные варианты, которые содержали точечные мутации для повышения уровней экспрессии, стабильности и нативной тримерной структуры. Результаты представлены в табл. 7 и 8.Since the content of trimers (for construct F47) and storage stability (for construct F24) were not optimal, additional variants were created that contained point mutations to increase expression levels, stability, and native trimeric structure. The results are presented in table. 7 and 8.
- 17 035522- 17 035522
Таблица 7. Экспрессия и стабильность вариантов F47-Table 7. Expression and stability of F47- variants
ND: не определено; уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. Термостабильность определяли, как описано в примере 8ND: not defined; the expression level was determined as described in example 1. Thermostability was determined as described in example 8
Номенклатура мутаций на основе последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1).Nomenclature of mutations based on wild-type sequence (SEQ ID NO: 1).
Все конструкции являются вариантами F47-: тип А2, мотив изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), линкер GSGSG; точка терминации 495, без HIS-метки (SEQ ID NO: 16). Как представлено в табл. 7, многие мутации повышали экспрессию F47-, но только вариант F47_S46G одновременно демонстрировал более высокий уровень тримеров, помимо высокой экспрессии.All constructs are variants F47-: type A2, isoleucine fastener motif (S) (SEQ ID NO: 3), GSGSG linker; termination point 495, without HIS-tag (SEQ ID NO: 16). As presented in table. 7, many mutations increased the expression of F47-, but only the F47_S46G variant simultaneously showed higher levels of trimers, in addition to high expression.
В табл. 8 представлены результаты экспрессии и стабильности вариантов для F24. Все варианты представляли собой RSV типа А2, с мотивом фибритина, линкером GSGSG; точкой терминации 513, без HIS-метки.Table 8 shows the results of expression and stability of variants for F24. All variants were RSV type A2, with fibritin motif, GSGSG linker; termination point 513, without HIS-tag.
- 18 035522- 18 035522
Т аблица 8. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F24- (SEQ ID NO: 19)Table 8. Expression and stability of variants A2_F24- (SEQ ID NO: 19)
- 19 035522- 19 035522
Помеченные * конструкции подвергали тестированию в отношении тримеризации, и было установлено, что все являлись тримернымиConstructs marked * were tested for trimerization and all were found to be trimeric
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. Конечная стабильность представлена в данном документе в виде процента связывания антитела до слияния (CR9501) через 5 дней хранения при 4°C по отношению к 1 дню; стабильность фазовой ассоциации определяют, как описано в примере 9.The expression level was determined as described in example 1. The final stability is presented herein as the percentage of antibody binding before fusion (CR9501) after 5 days of storage at 4 ° C versus 1 day; phase association stability is determined as described in Example 9.
Многие мутации повышали экспрессию A2_F24-. Для большинства мутаций наблюдали видимую взаимосвязь между повышенной экспрессией на фоне F47- (табл. 7) и на фоне A2_F24- (табл. 8). N67I оказывала более положительное влияние на экспрессию F на фоне A2_F24-. Наиболее значимого повышения экспрессии достигали с использованием единичных точечных мутаций: S46G, S215P, N67I, K80E, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, K77E, K201Q, N426S и K465Q. При первичном скрининге с помощью анализа конечной стабильности (пример 7) варианты с наиболее высокой экспрессией также демонстрировали лучшую стабильность при хранении (E92D, K465Q, K465E, N426S, S46G, S215P и N67I). Для того чтобы оценить, действительно ли эти мутации стабилизировали конформацию до слияния, супернатанты культур разводили до 5 и 10 мкг/мл, исходя из результатов количественного вестерн-блоттинга, и их хранили до 33 дней при 4°C. В качестве точечных мутантов только N67I и S215P были полностью стабильны со временем (см. пример 9).Many mutations increased the expression of A2_F24-. For most mutations, a visible relationship was observed between increased expression against the background of F47- (Table 7) and against the background of A2_F24- (Table 8). N67I had a more positive effect on F expression against the background of A2_F24-. The most significant increase in expression was achieved using single point mutations: S46G, S215P, N67I, K80E, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, K77E, K201Q, N426S and K465 On initial screening by end-point stability assay (Example 7), the highest expressed variants also showed better storage stability (E92D, K465Q, K465E, N426S, S46G, S215P and N67I). In order to assess whether these mutations actually stabilized the conformation prior to fusion, culture supernatants were diluted to 5 and 10 μg / ml, based on the results of quantitative Western blotting, and stored for up to 33 days at 4 ° C. As point mutants, only N67I and S215P were completely stable over time (see example 9).
Затем несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и надлежащую стабильность конформации до слияния, комбинировали для того чтобы оценить, были ли стабилизации аддитивными или имели ли возможный синергетический эффект (табл. 9).Several mutations that showed high expression and appropriate conformational stability prior to fusion were then combined to assess whether the stabilizations were additive or if they had a possible synergistic effect (Table 9).
Таблица 9. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F24 с двумя дополнительными мутациямиTable 9. Expression and stability of A2_F24 variants with two additional mutations
- 20 035522- 20 035522
Стабильность при хранении относится к анализу фазовой ассоциации, представленной в примере 9.Storage stability refers to the phase association assay presented in Example 9.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1.The expression level was determined as described in example 1.
Все варианты являлись вариантами F24-: А2 типа, мотив фибритина, линкер GSGSG; точка терминации 513, связывание со всеми Mab, без HIS-метки (SEQ ID NO: 19).All variants were F24- variants: A2 type, fibritin motif, GSGSG linker; termination point 513, binding to all Mabs, no HIS tag (SEQ ID NO: 19).
При комбинировании ранее выявленных точечных мутаций можно было наблюдать очень интересные синергетические эффекты в отношении уровней экспрессии с комбинациями, включающими N67I в качестве наиболее эффективной. Все полученные двойные мутанты независимо от того, была ли включена N67I или S215P, были стабильными спустя более 30 дней при хранении при 4°C (пример 9). Неожиданным образом, было установлено, мутация N67I оказывала наиболее сильный эффект на уровни экспрессии F до слияния при включении в двойные мутанты. Также комбинации с мутациями S215P приводили к умеренной экспрессии. Выбирали комбинацию N67I с S215P, поскольку она приводила к очень высокому уровню экспрессии и поскольку обе точечные мутации были стабильными при хранении. Кроме того, было отмечено, что N67I и S215P обладали способностью стабилизировать некоторые мутанты, которые в качестве единичных мутаций были нестабильными, указывая на то, что участок, где эти две мутации встречались, является центральным для конформационных изменений, которым подвергается белок во время перехода к конформации после слияния.When combining previously identified point mutations, very interesting synergistic effects on expression levels could be observed with combinations including N67I as the most effective. All obtained double mutants, regardless of whether N67I or S215P was included, were stable after more than 30 days when stored at 4 ° C (example 9). Surprisingly, the N67I mutation was found to have the strongest effect on pre-fusion F expression levels when incorporated into double mutants. Also, combinations with S215P mutations resulted in moderate expression. The combination of N67I with S215P was chosen because it resulted in a very high level of expression and because both point mutations were storage stable. In addition, it was noted that N67I and S215P had the ability to stabilize some mutants that were unstable as single mutations, indicating that the site where these two mutations met is central to the conformational changes that the protein undergoes during the transition to conformations after fusion.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением было показано, что, по меньшей мере, некоторые мутации приводили в результате к повышенным уровням экспрессии и повышенной стабилизации белка RSV до слияния. Предполагается, что эти явления связаны. Мутации, описанные в этом примере, все в результате приводили к повышенному продуцированию F-полипептидов до слияния. Только выбор этих полипептидов оставался стабильным при длительном хранении (смотри пример 9). Используемый анализ стабильности основывается на потере специфического эпитопа CR9501 до слияния в верхней части F до слияния в анализе связывания и он может быть недостаточно чувствительным для определения всех вкладов в стабильность всего белка. Мутации, для которых наблюдали только повышенную экспрессию, являются, таким образом (вероятно стабилизирующими), потенциальными мутациями, которые можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями для получения Fконструкции до слияния с высокой стабильностью и высокими уровнями экспрессии.Thus, in accordance with the present invention, at least some mutations have been shown to result in increased levels of expression and increased stabilization of the RSV protein prior to fusion. It is assumed that these phenomena are related. The mutations described in this example all resulted in increased production of F-polypeptides prior to fusion. Only the selection of these polypeptides remained stable during long-term storage (see example 9). The stability assay used is based on the loss of a specific CR9501 epitope prior to fusion at the top of the F before fusion in a binding assay and may not be sensitive enough to determine all contributions to overall protein stability. Mutations for which only increased expression was observed are thus (probably stabilizing) potential mutations that can be combined with other stabilizing mutations to produce an F construct prior to fusion with high stability and high expression levels.
Затем проверяли, была ли способна двойная мутация N67I -S215P, подобно единичным мутациям, стабилизировать точечные мутации, которые, как единичные мутации считались нестабильными на основании использованных критериев. Выбирали дополнительные мутации на основе подходящих уровней экспрессии и стабильности в соответствии с табл. 8. Разрабатывали и исследовали в отношении уровней экспрессии и стабильности варианты тройных мутантных RSV-F (табл. 10).It was then tested whether the N67I-S215P double mutation, like single mutations, was capable of stabilizing point mutations that, as single mutations, were considered unstable based on the criteria used. Selected additional mutations based on appropriate expression levels and stability in accordance with table. 8. Variants of triple mutant RSV-Fs were developed and investigated in terms of expression levels and stability (Table 10).
Таблица 10. Экспрессия и стабильность вариантов F24_N67I +S215P с одной __________________дополнительной мутацией__________________Table 10. Expression and stability of F24_N67I + S215P variants with one additional __________________ mutation __________________
- 21 035522- 21 035522
Все варианты были вариантами A2_F24_N67I +S215P А2 типа, мотив фибритина, линкер GSGSG; точка терминации 513, связывание со всеми Mab, без HIS-метки (SEQ ID NO: 21).All variants were variants A2_F24_N67I + S215P A2 type, fibritin motif, GSGSG linker; termination point 513, binding to all Mabs, no HIS tag (SEQ ID NO: 21).
Стабильность относится к анализу фазовой ассоциации, представленной в примере 9.Stability refers to the phase association assay presented in Example 9.
+ означает <10% потери связывания CR9501 через 5 дней; ++ означает <5% потери связывания CR9501 через 5 дней; +++ означает 0% потери связывания CR9501 через 5 дней.+ means <10% loss of CR9501 binding after 5 days; ++ means <5% loss of CR9501 binding after 5 days; +++ means 0% loss of CR9501 binding after 5 days.
Снова наблюдали аддитивный эффект в отношении уровнией экспрессии. Как ожидалось, тройные мутанты D479N и E487R экспрессируют при несколько меньших уровнях, поскольку единичные мутанты также находились среди наиболее низких из выбранных мутаций (табл. 8). В связи со стабилизирующим эффектом мутации N67I+S215P, дополнительные мутации, которые являются нестабильными в качестве единичных мутаций, приводили к образованию стабильных вариантов F до слияния при добавлении к фону A2_F24 N67I+S215P. Некоторыми наиболее иллюстративными примерами являются тройные мутанты с дополнительной V185N, G184N или E487N, которые демонстрировали высокую экспрессию, но низкую стабильность в качестве единичных мутантов (табл. 8), но демонстрировали даже более высокую экспрессию и были высокостабильными при добавлении к фону A2_ F24 N67I+S215P.Again, an additive effect was observed on expression levels. As expected, the triple mutants D479N and E487R expressed at slightly lower levels, since the single mutants were also among the lowest of the selected mutations (Table 8). Due to the stabilizing effect of the N67I + S215P mutation, additional mutations that are unstable as single mutations resulted in stable pre-fusion F variants when added to the A2_F24 N67I + S215P background. Some of the most illustrative examples are triple mutants with additional V185N, G184N or E487N, which showed high expression but low stability as single mutants (Table 8), but showed even higher expression and were highly stable when added to the background A2_ F24 N67I + S215P.
Стабилизирующие мутации также стабилизируют белок RSV-F из других штаммов и также в процессированном варианте FStabilizing mutations also stabilize the RSV-F protein from other strains and also in the processed F variant
Несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и значительную стабильность конформации до слияния, использовали в отношении F-белков RSV из других штаммов (SEQ ID NO: 69 и 70) и использовали в отношении варианта F RSV А2 без мутаций в сайте расщепления фурином (F18: SEQ ID NO 71) для оценки являются ли модификации универсальным решением для стабилизации F RSV до слияния (табл. 11).Several mutations that showed high expression and significant conformational stability prior to fusion were used for RSV F proteins from other strains (SEQ ID NOs: 69 and 70) and used for RSV A2 variant F without furin cleavage site mutations (F18: SEQ ID NO 71) to evaluate whether the modifications are a universal solution to stabilize the RSV F before fusion (Table 11).
Таблица 11. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F18 с дополнительными мутациями и F из штамма B1 (SEQ ID NO: 2) и CL57-v224 типа А (SEQ ID NO: 69)Table 11. Expression and stability of A2_F18 variants with additional mutations and F from strain B1 (SEQ ID NO: 2) and CL57-v224 type A (SEQ ID NO: 69)
- 22 035522- 22 035522
Экспрессию белка (концентрация в супернатанте временно трансфицированных клеток) определяли с помощью количественной методики Octet.Protein expression (concentration in the supernatant of transiently transfected cells) was determined using the quantitative method Octet.
* Относительную экспрессию нормализуют по отношению к экспрессии A2_F24_N67I, S215P, E487Q (seq ID #33) * * Стабильность - выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°C в течение 5 дней, относительно дня сбора клеток. Концентрации определяли с помощью количественной методики Octet с использованием антитела CR9501. NA - данные отсутствуют: связывания CR9501 не выявили.* Relative expression normalized to the expression of A2_F24_N67I, S215P, E487Q (seq ID # 33) * * Stability - expressed as% protein concentration determined after storage at 4 ° C for 5 days, relative to the day of cell harvest. Concentrations were determined using the Octet quantitative method using the CR9501 antibody. NA - no data: no CR9501 binding was detected.
При введении ранее выявленных точечных мутаций в A2_F18 (SEQ ID No. 71), стабильность и уровни экспрессии были сопоставимыми с вариантом одноцепочечного F24 (SEQ ID No. 21), который содержал короткую петлю между F1 и F2. Снова наблюдали синергизм, демонстрируя более высокую экспрессию и стабильность при добавлении мутаций к вариантам, которые содержали N67I или двойную мутацию N67I, S215P. Двойная точечная мутация N67I, S215P не только стабилизировала F до слияния штамма А2, но также F до слияния штамма В1 и CL57-v224 (табл. 11).By introducing previously identified point mutations in A2_F18 (SEQ ID No. 71), the stability and expression levels were comparable to the single-stranded F24 variant (SEQ ID No. 21), which contained a short loop between F1 and F2. Synergy was again observed, showing higher expression and stability when mutations were added to variants that contained N67I or the N67I, S215P double mutation. The double point mutation N67I, S215P not only stabilized F before the fusion of the A2 strain, but also F before the fusion of the B1 strain and CL57-v224 (Table 11).
Стабилизирующие мутации также стабилизируют полноразмерный белок RSV-FStabilizing mutations also stabilize the full length RSV-F protein
Несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и значительную стабильность конформации до слияния в растворимой версии RSV-F, соответствующей эктодомену, использовали по отношению к полноразмерному белку RSV-F. Мутации вводили в полноразмерный RSV-F с наличием или без мутаций в сайте отщепления фурином. Ни один домен тримеризации не сливался с этими вариантами (табл. 12).Several mutations that showed high expression and significant pre-fusion conformational stability in the soluble version of RSV-F corresponding to the ectodomain were used with respect to the full-length RSV-F protein. Mutations were introduced into full-length RSV-F with or without mutations at the furin cleavage site. None of the trimerization domains fused with these variants (Table 12).
Таблица 12. Экспрессия и стабильность вариантов полноразмерных версий A2_F18 и A2_F24 с дополнительными мутациямиTable 12. Expression and stability of variants of full-length versions A2_F18 and A2_F24 with additional mutations
- 23 035522- 23 035522
Уровень экспрессии определяли с помощью FACS. N.D. - не определено.Expression level was determined using FACS. N.D. - undefined.
* все варианты основаны на последовательности F-белка RSV А2.* all variants are based on the sequence of the F-protein RSV A2.
* * по сравнению с белком дикого типа кратность увеличения MFI в отношении 9503.* * compared to wild-type protein, the fold increase in MFI in relation to 9503.
Стабильность определяли с помощью тепловой обработки клеток HET293T в течение 5-10 мин при 46, 55,3, 60°C.Stability was determined by heat treatment of cells with HET293T for 5-10 min at 46, 55.3, 60 ° C.
*** обозначение для данных стабильности - снижение связывания до слияния - связывание специфического Mab CR9501 после нагревания до 46°C (например, дикий тип) + небольшое снижение связывания CR9501 после нагревания до 46°C, но не в той же степени, как дикого типа ++ без изменения в связывании CR9501 до 60°C включительно, при 60°C некоторое снижение связывания CR9501 +++ без изменения в связывании CR9501 при 60°C*** designation for stability data - decreased binding before fusion - binding of specific Mab CR9501 after heating to 46 ° C (e.g. wild type) + slight decrease in binding of CR9501 after heating to 46 ° C, but not to the same extent as wild type ++ without change in binding of CR9501 to 60 ° C inclusive, at 60 ° C some decrease in binding of CR9501 +++ without change in binding of CR9501 at 60 ° C
Ранее выявленные стабилизирующие точечные мутации также были стабилизирующими в полноразмерном F-белке. Повышение уровня экспрессии было менее выраженным, но демонстрировало ту же тенденцию. Это может быть вызвано различным фоном, при котором вводили мутации, но причина может также быть в различной методике количественной оценки (FACS по сравнению с вестернблоттингом) и биологическим максимумом экспрессии вследствие рециклинга поверхностных белков. Введение связывающей последовательности (или короткой петли) повышало экспрессию и стабильность, и точечные мутации оказывали то же действие. Точечные мутации не были или вряд ли были синергетическими с короткой петлей (подобно тому, как было обнаружено для растворимого белка (табл. 9-11)).Previously identified stabilizing point mutations were also stabilizing in the full-length F protein. The increase in the level of expression was less pronounced, but showed the same trend. This may be due to a different background in which the mutations were introduced, but it could also be due to different quantification techniques (FACS versus Western blotting) and biological maximum expression due to recycling of surface proteins. The introduction of a binding sequence (or short loop) increased expression and stability, and point mutations had the same effect. Point mutations were not or unlikely to be synergistic with the short loop (similar to that found for soluble protein (Tables 9-11)).
Поскольку точечная мутация в положении 67 оказывала такой положительный эффект в отношении уровня экспрессии и стабильности, все аминокислотные замены исследовали в отношении этого положения для изучения того, были ли выбраны наиболее оптимальные положения или можно было бы улучшить эти положения (табл. 13).Since the point mutation at position 67 had such a positive effect in terms of expression level and stability, all amino acid substitutions were examined at this position to investigate whether the most optimal positions were chosen or if these positions could be improved (Table 13).
- 24 035522- 24 035522
Таблица 13. Анализ полной замены экспрессии и стабильности для положения 67 . на фоне A2_F24Table 13. Analysis of complete substitution of expression and stability for position 67. on background A2_F24
* Относительная экспрессия - концентрацию белка определяли с помощью метода количественного октета с использованием антитела CR9503 и экспрессию по отношению к концентрации A2_F24 (SEQ ID #19) * * Стабильность - выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°C в течение 5 и 10 дней, относительно дня сбора клеток. Концентрации определяли с помощью количественной методики Octet с использованием антитела CR9501. NA - данные отсутствуют: связывания CR9501 не выявили.* Relative Expression - Protein concentration was determined by the quantitative octet method using CR9503 antibody and expression relative to A2_F24 concentration (SEQ ID # 19) * * Stability - expressed as% protein concentration determined after storage at 4 ° C for 5 and 10 days, relative to the day of cell harvest. Concentrations were determined using the Octet quantitative method using the CR9501 antibody. NA - no data: no CR9501 binding was detected.
Как представлено в табл. 13, преимущественно гидрофобные остатки и, в частности, Ile, Leu и Met в положении 67 могли повышать экспрессию и стабильности. Не представляет собой остаток, который в наибольшей степени повышал экспрессию и стабильность. Остатки Glu и Gln, самый маленький остаток Gly и положительно заряженные остатки Arg и Lys обладали наибольшим дестабилизирующим эффектом в положении 67 в отношении конформации до слияния.As presented in table. 13, predominantly hydrophobic residues, and in particular Ile, Leu and Met at position 67, could increase expression and stability. Does not represent the residue that maximizes expression and stability. The Glu and Gln residues, the smallest Gly residue, and the positively charged Arg and Lys residues had the greatest destabilizing effect at position 67 with respect to the pre-fusion conformation.
В соответствии с настоящим изобретением мутации аминокислот, которые стабилизируют конформацию F-белка RSV до слияния, можно группировать в различные категории, которые стабилизируют конформацию различным образом. Стратегии для стабилизации F до слияния основаны на модели гомологии RSV-F, которая была основана на кристаллической структуре PIV5 (Yin et. al., 2006) и выравнивании на странице 27.In accordance with the present invention, amino acid mutations that stabilize the conformation of the RSV F protein prior to fusion can be grouped into different categories that stabilize the conformation in different ways. Strategies for stabilizing F prior to fusion are based on the RSV-F homology model, which was based on the crystal structure of PIV5 (Yin et. Al., 2006) and alignment on page 27.
Аминокислотные остатки 67 и 215Amino acid residues 67 and 215
Аминокислотные остатки в положениях 67 и 215 являются очень близкими по 3D структуре модели до слияния и кристаллической структуры после слияния. Остатки являются близкими по консервативному дисульфидному мостику в верхней части участка DIII, который образует шарнир, по которому участок HRA подвергается рефолдингу в удлиненный суперспиральный растянутый спиральный тример. Мутации в этом участке будут влиять на функцию шарнира и, таким образом, мутации, которые были введены, стабилизируют конформацию до слияния с помощью блокады шарнирной функции.The amino acid residues at positions 67 and 215 are very similar in the 3D structure of the pre-fusion model and the post-fusion crystal structure. The residues are close to the conserved disulfide bridge at the top of the DIII region, which forms the hinge at which the HRA is refolded into an elongated supercoiled stretched helical trimer. Mutations in this region will affect the function of the hinge and thus the mutations that have been introduced stabilize the pre-fusion conformation by blocking the hinge function.
Аминокислотные остатки 77, 80Amino acid residues 77, 80
Аминокислотные остатки в положениях 77 и 80 расположены в длинной спирали (остатки 76-98) на С-конце F2, который находится в непосредственном контакте с группой вторичных структур в DIII на Nконце F1, который подвергается рефолдингу в длинную суперспиральную структуру конформации после слияния. Поскольку эти два участка подлежат разделению во время рефолдинга с конформации до слияния в конформацию после слияния, аминокислоты в этом участке, которые предотвращают это разделение, стабилизировали бы конформацию до слияния. Поскольку эти два участка должны разделяться во время рефолдинга, некоторые из остатков можно оптимизировать для усиления взаимодействия. Примером отталкивания, которое наблюдалось, являлось отталкивание между положительно заряженным Lys80. Мутация Lys80 до отрицательно заряженного остатка Glu повышала экспрессию F до слияния. Вследствие последовательного перехода к конформации после слияния эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например N67I и S215P, для получения полного эффектаThe amino acid residues at positions 77 and 80 are located in a long helix (residues 76-98) at the C-terminus of F2, which is in direct contact with a group of secondary structures in DIII at the N-terminus of F1, which undergoes refolding into a long supercoiled structure of conformation after fusion. Since these two regions are subject to separation during refolding from a pre-fusion conformation to a post-fusion conformation, the amino acids in this region that prevent this separation would stabilize the pre-fusion conformation. Since the two regions must separate during refolding, some of the residues can be optimized to enhance interaction. An example of repulsion that has been observed was the repulsion between positively charged Lys80. The Lys80 mutation to a negatively charged Glu residue increased the expression of F prior to fusion. Due to the sequential transition to conformation after fusion, these mutations can be combined with other stabilizing mutations, such as N67I and S215P, to obtain the full effect
- 25 035522 этой стабилизации, как показано в табл. 10.- 25 035522 this stabilization, as shown in table. ten.
Аминокислотный остаток 92Amino acid residue 92
Аминокислотный остаток в положении 92 также расположен в длинной спирали (остатки 76-98) на С-конце F2, который находится в непосредственном контакте с группой вторичных структур в DIII на Nконце F1, который подвергается рефолдингу в длинную суперспиральную структуру конформации после слияния.The amino acid residue at position 92 is also located in a long helix (residues 76-98) at the C-terminus of F2, which is in direct contact with a group of secondary structures in DIII at the N-terminus of F1, which undergoes refolding into a long supercoiled structure of conformation after fusion.
При отделении спирали от участка HRA, он передвигается к участку DIII, который содержит эпитоп Synagis (эпитоп II) (Arbiza et al., J. Gen. Virol. 73:2225-2234, 1992), и отрицательно заряженный Glu92 перемещается очень близко к положительно заряженному Arg282 в положении после конформации. Мутации, которые уменьшают это перемещение, будут стабилизировать конформацию до слияния. Мутация Glu92 в консервативный остаток Asp будет уменьшать перемещение, поскольку он не сможет достигнуть Arg282.When the helix separates from the HRA region, it moves to region DIII, which contains the Synagis epitope (epitope II) (Arbiza et al., J. Gen. Virol. 73: 2225-2234, 1992), and the negatively charged Glu92 moves very close to positively charged Arg282 in position after conformation. Mutations that reduce this movement will stabilize the conformation prior to fusion. The mutation of Glu92 into a conserved Asp residue will reduce translocation as it cannot reach Arg282.
Аминокислотные остатки 486, 487Amino acid residues 486, 487
Аминокислотные остатки 486, 487 и 489 в верхней части HRB в конформации до слияния создают мутацию отрицательно заряженного фрагмента Glu487 в Asn или Ile, повышающую экспрессию F до слияния. Мутации Asp486 в Asn или Gln и/или Glu489 в Asn, Ile или Gln будут иметь такой же самый эффект. Вследствие последовательного перехода к конформации после слияния, эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например, N67I и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в табл. 10, например, D486N.Amino acid residues 486, 487 and 489 at the top of the HRB in the pre-fusion conformation create a mutation of the negatively charged Glu487 fragment in Asn or Ile, increasing the expression of F before fusion. Mutations of Asp486 to Asn or Gln and / or Glu489 to Asn, Ile or Gln will have the same effect. Due to the sequential transition to the conformation after fusion, these mutations can be combined with other stabilizing mutations, for example, N67I and S215P, to obtain the full effect of this stabilization, as shown in table. 10, for example D486N.
Аминокислотные остатки 175, 184, 185Amino acid residues 175, 184, 185
Для рефолдинга от конформации до слияния в конформацию после слияния участок между остатком 175 и 193 необходимо преобразовать от петли - бета-шпильки в спираль.For refolding from conformation to fusion to post-fusion conformation, the region between residues 175 and 193 needs to be converted from a loop - beta hairpin to a helix.
Этот участок демонстрирует наиболее существенный структурный переход. Часть этого участка фактически имеет наиболее высокую степень прогнозирования образования альфа-спирали. Фактические спиральные структуры в модели до слияния представлены ниже выделением серого цвета. Весь данный участок преобразуется в одну большую спираль, когда он подвергается рефолдингу в конформацию после слияния. В нижней последовательности остатки выделены серым цветом с наиболее высокой степенью прогнозирования образования спирали на основе Agadir (http://agadir.crg.es/). Из этого сравнения ясно, что С-концевая часть, которая сохраняется в бета-шпильке в конформации до слияния (остатки 187-202), имеет высокую склонность к образованию альфа-шпильки.This section demonstrates the most significant structural transition. Part of this region actually has the highest degree of predicting the formation of an alpha helix. The actual spiral structures in the pre-fusion model are shown below in gray shading. This entire region is transformed into one large helix when it is refolded into a conformation after fusion. In the lower sequence, the residues are highlighted in gray with the highest degree of prediction of spiral formation based on Agadir (http://agadir.crg.es/). From this comparison, it is clear that the C-terminal portion, which is retained in the beta-hairpin in a conformation before fusion (residues 187-202), has a high tendency to form an alpha-hairpin.
150 160 170 180 190 200 210150 160 170 180 190 200 210
SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSC hhhhhh hhhhhhh hhhhh sssssss ssssssss hhhhhhhhSGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSC hhhhhh hhhhhhh hhhhh sssssss ssssssss hhhhhhhh
SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSC
Последовательность остатков 150-212 RSV-F представлена выше. На второй строке вторичные структуры верхней строки указаны с помощью h (для спирали) и s (для нитей) на основании 3D модели гомологии PIV-5. Спирали выделены серым затенением. Нижняя строка является той же самой последовательностью, в которой спирали затенены серым цветом, на основе свойств спирали последовательности.The sequence of residues 150-212 RSV-F is shown above. On the second row, the secondary structures of the top row are indicated with h (for helix) and s (for strands) based on the PIV-5 homology 3D model. The spirals are shaded gray. The bottom row is the same sequence in which the spirals are grayed out based on the properties of the sequence spiral.
Таким образом, пролин вводили в положение 175 для стабилизации этого поворота и для предотвращения рефолдинга в спираль, которая в качестве единичной мутации повысила уровень экспрессии, указывая, что она стабилизирует конформацию до слияния и обеспечивает лучший процессинг белка. Для поворота в шпильке (остатки 184, 185) в базе данных Brookhaven проводили поиск в отношении структурно гомологичной шпильки от стабильного белка, который не подвергается рефолдингу. Была обнаружена высокая структурная гомология с петлей шпильки в протеинкиназе А (код pdb 3FHI). В соответствии с выравниванием, представленным ниже, остатки 184 Gly или 185Val замещали Asn для того, чтобы стабилизировать этот поворот и предотвратить его рефолдинг.Thus, proline was introduced at position 175 to stabilize this turn and to prevent refolding into the helix, which, as a single mutation, increased expression, indicating that it stabilizes the pre-fusion conformation and provides better protein processing. For hairpin rotation (residues 184, 185), the Brookhaven database was searched for a structurally homologous hairpin from a stable protein that does not undergo refolding. High structural homology was found with the hairpin loop in protein kinase A (pdb code 3FHI). In accordance with the alignment below, residues 184 Gly or 185Val were replaced by Asn in order to stabilize this turn and prevent it from refolding.
IWSLSNGVSVLTSKV HRAblb2 178-192IWSLSNGVSVLTSKV HRAblb2 178-192
EMDVYVNNEWATSVG 3fhi:B 179-193EMDVYVNNEWATSVG 3fhi: B 179-193
Эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например, N67I и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в табл. 10.These mutations can be combined with other stabilizing mutations, for example N67I and S215P, to obtain the full effect of this stabilization, as shown in table. ten.
Аминокислотные остатки 421, 426 и 46Amino acid residues 421, 426 and 46
Аминокислотные остатки в положениях 421 и 426 расположены в петле в участке DII. Остаток S46 расположен на нити, которая переходит от DI к DIII. Аминокислотный остаток в положении 426 подвергали мутации в серин и аминокислотный остаток в положении 46 подвергали мутации в глицин. Эти мутации повышали стабильность и уровни экспрессии до слияния.The amino acid residues at positions 421 and 426 are located in a loop in the DII region. The remainder of S46 is located on a strand that goes from DI to DIII. The amino acid residue at position 426 was mutated to serine and the amino acid residue at position 46 was mutated to glycine. These mutations increased stability and expression levels prior to fusion.
Аминокислотный остаток 465Amino acid residue 465
Аминокислотный остаток Lys465 расположен в другом участке, который проходит через большое конформационное изменение. Lys465 расположен на перекрещенной петле, которая связывает верхнюю часть участка DII с HRB. Поскольку участок HRB движется от нижней части к верхней часть и образует комплексы с HRA для образования пучка из шести спиралей, перекрещенная петля также перемещается сThe amino acid residue Lys465 is located in another region that goes through a large conformational change. Lys465 is located on a crossed loop that links the top of the DII region to HRB. As the HRB section moves from the bottom to the top and complexes with the HRA to form a bundle of six helices, the crossed loop also moves with
- 26 035522 верхней части в нижнюю часть. Эта петля должна, таким образом, быть метастабильной для обеспечения отделения DII и смены положения в другом окружении. Lys465 на перекрещенной петле расположен непосредственно рядом с Lys445 на участке DII. Мутация Lys465 в Gln или Glu нейтрализует отталкивание и повышало стабильность и уровни экспрессии F до слияния.- 26 035522 from the top to the bottom. This loop must, therefore, be metastable in order to allow DII separation and repositioning in a different environment. Lys465 on the crossed loop is located directly next to Lys445 on the DII site. The Lys465 mutation in Gln or Glu neutralizes repulsion and increased the stability and levels of F expression prior to fusion.
Пример 3. Экспрессия F-белка до слиянияExample 3. Expression of F-protein before fusion
Плазмиды экспрессии, кодирующие рекомбинантный F-белок RSV до слияния, создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР. Используемой системой для экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies, Ренфрушир, Великобритания). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали во встряхивателе-инкубаторе в течение 5 дней при 37°C и 10% CO2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°C до использования.Expression plasmids encoding the recombinant RSV F protein prior to fusion were generated using standard techniques well known in the art, including site-directed mutagenesis and PCR. The expression system used was 293Freestyle cells (Life Technologies, Renfrewshire, UK). Cells were transiently transfected with 293Fectin (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions and cultured in a shaker incubator for 5 days at 37 ° C and 10% CO 2 . The culture supernatant was collected and centrifuged for 5 min at 300 g to remove cells and cellular debris. The centrifuged supernatant was then sterile filtered with a 0.22 µm vacuum filter and stored at 4 ° C until use.
Пример 4. Очистка F-белка RSV до слиянияExample 4. Purification of the RSV F-protein prior to fusion
Рекомбинантные полипептиды очищали с помощью 2-стадийного протокола очистки с применением катион-обменной колонки для первичной очистки, а затем колонки superdex200 для завершающей стадии с удалением остаточных примесей. Для исходного ионобменной стадии супернатант культуры разбавляли 2 объемами по 50 мМ NaOAc, pH 5,0 и пропускали через 5 мл колонку HiTrap Capto S при скорости 5 мл в минуту. Затем колонки отмывали 10 объемами, соответствующими объему колонки (CV), по 20 мМ NaOAc, 50 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5 и элюировали 2 CV по 20 мМ NaOAc, 1M NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5. Элюат концентрировали с помощью концентратора-центрифуги, а затем белок очищали с помощью колонки superdex200 с использованием 40 мМ Tris, 500 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 7,4, в качестве подвижного буфера. На фиг. 1А представлена хроматограмма с гель-фильтрационной колонки и главный пик содержит F-белок RSV до слияния. Фракции, содержащие этот пик, снова объединяли и концентрацию белка определяли при OD280 и сохраняли при 4°C до использования. На фиг. 1В представлен сокращенный результат анализа SDS-PAGE конечного препарата белка, и можно видеть, что чистота составляла >95%. Идентичность полосы подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и специфических к F-белку антител (не показано).Recombinant polypeptides were purified using a 2-step purification protocol using a cation exchange column for primary purification followed by a superdex200 column for the final step to remove residual impurities. For the initial ion exchange stage, the culture supernatant was diluted with 2 volumes of 50 mM NaOAc, pH 5.0 and passed through a 5 ml HiTrap Capto S column at a rate of 5 ml per minute. Then the columns were washed with 10 volumes corresponding to the column volume (CV), 20 mM NaOAc, 50 mM NaCl, 0.01% (v / v) tween20, pH 5 and eluted with 2 CVs of 20 mM NaOAc, 1M NaCl, 0 , 01% (v / v) tween20, pH 5. The eluate was concentrated using a centrifuge concentrator, and then the protein was purified using a superdex200 column using 40 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.01% (v / v .) tween20, pH 7.4, as a rolling buffer. FIG. 1A is a chromatogram from a gel filtration column and the main peak contains the RSV F protein prior to fusion. Fractions containing this peak were pooled again and the protein concentration was determined at OD280 and stored at 4 ° C until use. FIG. 1B is an abbreviated SDS-PAGE analysis of the final protein preparation and it can be seen that the purity was> 95%. Band identity was confirmed by Western blotting and F-protein specific antibodies (not shown).
Пример 5. NativePAGEExample 5. NativePAGE
Для исходного определения мультимерного состояния F-полипептидов до слияния в соответствии с настоящим изобретением супернатанты культур от временно трансфицированных клеток анализировали в гель-системе NativePAGE Bis-Tris (Life Technologies). Затем гели подвергали блоттингу с использованием iBlot technolog в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Антитело CR9503, специфичное к F-белку RSV (последовательность приведена ниже в табл. 17), использовали в качестве первичного зонда для выявления F-белка RSV до слияния, а затем использовали HRPконъюгированное мышиное антитело к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания) или IRDye800CW-конъюгированное аффинно очищенное антитело к IgG человека (кроличье) (Rockland Immunochemicals, Гилбертсвилл, Пенсильвания). Блоты проявляли с использованием стандартной пленки (Codak) или с использованием инфракрасной системы для визуализации Odyssey CLx. На фиг. 2 представлен анализ NativePAGE супернатантов от мономерного F47- (линия 1), F-белка RSV после слияния и первично тримерного F-белка RSV (линия 2) и очищенного F-белка RSV до слияния (линия 3), показывающий, что после очистки только тримерные молекулы присутствуют в препарате F-белка RSV до слияния, поскольку он мигрирует подобным образом к тримерной полосе после слияния. Это также подтверждается объемом элюирования из гель-фильтрационной колонки (фиг. 1А).For the initial determination of the multimeric state of F-polypeptides prior to fusion in accordance with the present invention, culture supernatants from transiently transfected cells were analyzed in a NativePAGE Bis-Tris gel system (Life Technologies). The gels were then blotted using iBlot technolog according to the manufacturer's instructions (Life Technologies). An antibody CR9503 specific for the RSV F protein (sequence is shown below in Table 17) was used as a primary probe to detect the RSV F protein prior to fusion, followed by an HRP conjugated mouse anti-human IgG antibody (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA. ) or IRDye800CW-conjugated affinity purified antibody to human IgG (rabbit) (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA). Blots were developed using standard film (Codak) or using an Odyssey CLx infrared imaging system. FIG. 2 shows a NativePAGE analysis of supernatants from monomeric F47- (lane 1), RSV F-protein after fusion and primary trimeric RSV F-protein (lane 2) and purified RSV F-protein before fusion (line 3), showing that after purification only the trimeric molecules are present in the preparation of the RSV F protein prior to fusion because it migrates in a similar manner to the trimeric band after fusion. This is also confirmed by the elution volume from the gel filtration column (FIG. 1A).
Пример 6. Количественный вестерн-блоттингExample 6. Quantitative Western Blotting
Для количественного определения конструкций F-белка RSV до слияния использовали количественный вестерн-блоттинг.Quantitative Western blotting was used to quantify the RSV F protein constructs prior to fusion.
Разбавления супернатантов культур прогоняли в 4-12% (вес/объем) градиентных гелях Bis-Tris NuPAGE (Life Technology) и проводили блоттинг с помощью технологии iBlot (Life Technology). Блоты инкубировали с CR9503 (как описано выше) и проявляли с использованием конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания) или IRDye800CWконъюгированного аффинно очищенного антитела к IgG человека (кроличье) (Rockland Immunochemicals, Гилбертсвилл, Пенсильвания). Количества белка затем определяли с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV или с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey CLx или на глаз. На фиг. 3 можно увидеть эффекты по отношению к конструкции A2_F24 (SEQ ID NO: 19) по показателю общих уровней экспрессии. Было показано, что единичные мутации повышали уровень экспрессии до 5 раз. Если создавали двойные мутанты по некоторым из этих мутаций, то могли наблюдаться синергетические эффекты и в некоторых случаях дополнительное повышение экспрессии до 11 раз по сравнению с A2_F24.Culture supernatant dilutions were run on 4-12% (w / v) Bis-Tris NuPAGE gradient gels (Life Technology) and blotted using iBlot (Life Technology). Blots were incubated with CR9503 (as described above) and developed using conjugated mouse anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) or IRDye800CW conjugated affinity purified anti-human IgG (rabbit) (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA). Protein amounts were then determined using a dilution series of purified RSV standard protein or using an Odyssey CLx infrared imaging system or by eye. FIG. 3, the effects can be seen on construct A2_F24 (SEQ ID NO: 19) in terms of overall expression levels. It was shown that single mutations increased the expression level up to 5-fold. If double mutants were created for some of these mutations, then synergistic effects could be observed and in some cases an additional increase in expression up to 11 times compared to A2_F24.
Пример 7. Анализ конечной стабильностиExample 7. Analysis of final stability
Подтверждение конформации до слияния экспрессируемых полипептидов в соответствии с настоящим изобретением выполняли с помощью технологии интерферометрии BioLayer (Octet) с использова- 27 035522 нием специфичных антител CR9501 или CR9502 до слияния, или неконформационного специфического антитела CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепи мотавизумаба. Антитела биотинилировали с помощью стандартных протоколов и иммобилизировали на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio, Портсмут, Великобритания). Процедура заключалась в следующем. После уравновешивания сенсоров в кинетическом буфере (ForteBio) в течение 60 с наконечники переносили в PBS с 5 мкг/мл предпочтительного антитела. Загрузку проводили в течение 250 с. Затем включали другую стадию уравновешивания в течение 200 с в кинетическом буфере. В конечном итоге наконечники переносили в супернатант культуры для экспрессии, содержащий F-полипептиды RSV до слияния и записывали ответ связывания (нм) через 1200 с. Эта фаза также обозначается как фазовая ассоциация. Это выполняли непосредственно после сбора клеток (1 день), а также спустя 5 дней (5 день) и разницу в связывании CR9501 использовали в качестве скринингового средства для выявления мутаций, способных стабилизировать конформацию до слияния. Конструкцию считали стабильной, если наблюдали менее 20% потери связывания на 5 день, а если наблюдали менее 20% потери связывания, ее считали нестабильной. Стабильные конструкции затем подвергали более строгому исследованию при необходимости. Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).Confirmation of the pre-fusion conformation of the expressed polypeptides according to the present invention was performed using BioLayer (Octet) interferometric technology using a pre-fusion specific antibodies CR9501 or CR9502, or a non-conformational specific antibody CR9503 that contains the variable regions of the heavy and light chains of motavizumab. Antibodies were biotinylated using standard protocols and immobilized on streptavidin biosensors (ForteBio, Portsmouth, UK). The procedure was as follows. After equilibration of the sensors in kinetic buffer (ForteBio) for 60 s, the tips were transferred to PBS with 5 μg / ml of the preferred antibody. The download was carried out for 250 s. Then included another stage of equilibration for 200 s in kinetic buffer. Finally, the tips were transferred to the expression culture supernatant containing the RSV F polypeptides prior to fusion, and the binding response (nm) was recorded at 1200 s. This phase is also referred to as phase association. This was done immediately after harvesting the cells (day 1) and also after 5 days (day 5) and the difference in binding of CR9501 was used as a screening agent to identify mutations capable of stabilizing the pre-fusion conformation. A construct was considered stable if less than 20% loss of binding was observed on day 5, and if less than 20% loss of binding was observed, it was considered unstable. The stable constructs were then subjected to more rigorous testing as needed. Data analysis was performed using ForteBio Data Analysis 6.4 software (ForteBio).
Пример 8. Анализ термостабильностиExample 8. Analysis of thermal stability
Стабилизирующий потенциал введенных характеристик в F-полипептиды RSV определяли по тепловому стрессу. Для этой цели супернатант культур от временно трансфицированных клеток или очищенный белок нагревали с использованием диапазона температур. Образцы затем охлаждали на льду для предотвращения дополнительных индуцированных теплом конформационных изменений и инкубировали с антителом CR9501 в системе по технологии Octet, как описано в примере 7. Ответы, полученные в конце фазовой ассоциации при различных температурах, изображали на графике в виде функции температуры и приближали с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Prism. Это приводило к определению температуры, где уровень связывания антител составляет 50% от максимума и эту величину можно было использовать для сравнению различных конструкций в отношении термостабильности до слияния. На фиг. 4 сравнивают немодифицированный эктодомен (SEQ ID NO: 13) и конструкцию A2_F24 N67I + S215P (SEQ ID NO: 21). Можно заметить, что индуцированный температурой стресс оказывал меньший эффект на конструкцию A2_F24 N67I+S215P (SEQ ID NO: 21) по сравнению с немодифицированным эктодоменом. Таким образом, можно сделать заключение, что стабилизирующие мотивы, введенные в полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, т.е. сайт тримеризации, линкер F1-F2 и 2 точечные мутации, приводили к более стабильному F-белку до слияния.The stabilizing potential of the introduced characteristics into RSV F-polypeptides was determined by heat stress. For this purpose, culture supernatant from transiently transfected cells or purified protein were heated using a temperature range. Samples were then chilled on ice to prevent additional heat-induced conformational changes and incubated with CR9501 antibody in an Octet system as described in Example 7. Responses obtained at the end of phase association at various temperatures were plotted as a function of temperature and approximated with using nonlinear regression using Prism software. This led to the determination of a temperature where the level of antibody binding is 50% of the maximum and this value could be used to compare different constructs with respect to heat stability before fusion. FIG. 4 compares the unmodified ectodomain (SEQ ID NO: 13) and construct A2_F24 N67I + S215P (SEQ ID NO: 21). It can be seen that temperature-induced stress had less effect on the construct A2_F24 N67I + S215P (SEQ ID NO: 21) compared to the unmodified ectodomain. Thus, it can be concluded that the stabilizing motifs introduced into the polypeptides according to the present invention, i. E. a trimerization site, an F1-F2 linker and 2 point mutations resulted in a more stable F-protein prior to fusion.
Пример 9. Анализ стабильности фазовой ассоциацииExample 9. Analysis of the stability of phase association
Для определения стабильности различных точечных мутаций использовали анализ связывания Octet, разновидность ранее описанного анализа конечной стабильности (пример 7). Анализ фазовой ассоциации выполняли вследствие очень высоких уровней экспрессии некоторых точечных мутантов, поскольку он более строгий и полностью предотвращает смещение уровня экспрессии. Также использовали антитело CR9501, однако вместо выбора связывающего ответа в конце фазовой ассоциации использовали всю кривую ассоциации для снижения потенциального смещения концентраций конечного анализа. Это выполняли с использованием значений из всей фазовой ассоциации эксперимента с помощью указанных точечных мутаций A2_F24. Данные восполняли за счет количества связанного антитела на чипе. Измерения выполняли в 1, 5 и 33 дни, и сравнивали формы кривых по этим трем дням. Если получали идентичные кривые, то конструкцию считали стабильной, а если нет, то нестабильной. На фиг. 5 можно увидеть анализ четырех различных вариантов. Нестабильные белковые конструкции до слияния можно выявить с помощью зависимой от времени потери связывания CR9501 (A2_F24, K465Q, S46G), в то время как стабильные конструкции до слияния (N67I) не демонстрировали такого снижения. Мутация E92D, по-видимому, попадала в группу между двумя мутациями, имеющими промежуточную стабильность, поскольку наблюдали лишь незначительные изменения в форме кривой. На фиг. 6 выбранные точечные мутации комбинировали для получения двойных мутантов и их анализировали. Как можно увидеть, различные мутации проявляли различные фенотипы в отношении стабильности и индуцирования стабильности. Если полипептиды содержат мутации K465Q или S46G по отдельности или в комбинации, все трое, т.е. два единичный и двойной мутанты, являются нестабильными и связывание специфического антитела до слияния со временем теряется. Если мутацию S46G комбинируют с E92D, которая ранее, как было показано, имеет промежуточную стабильность в виде единичной мутации, изменения стабильности могло не наблюдаться, указывая, что мутация E92D не может корректировать нестабильные белковые конструкции. Если мутацию N67I комбинировали с мутацией S46G или E92D, то результатом была полностью стабильная конструкция. Это могло также наблюдаться, если мутацию S215P комбинировали с мутацией E92D, показывая уникальный потенциал этих двух мутаций для стабилизации нестабильных конструкций до слияния.To determine the stability of various point mutations, the Octet binding assay, a variation of the previously described endpoint stability assay (Example 7), was used. Phase association analysis was performed due to the very high expression levels of some point mutants, as it is more stringent and completely prevents expression level bias. The CR9501 antibody was also used, however, instead of choosing the binding response at the end of the phase association, the entire association curve was used to reduce potential concentration bias in the final assay. This was done using values from the entire phase association of the experiment using the indicated A2_F24 point mutations. The data was replenished by the amount of bound antibody on the chip. Measurements were performed on days 1, 5 and 33, and the shapes of the curves were compared for these three days. If identical curves were obtained, then the structure was considered stable, and if not, then unstable. FIG. 5 you can see the analysis of four different options. Unstable pre-fusion protein constructs can be identified by time-dependent loss of CR9501 binding (A2_F24, K465Q, S46G), while pre-fusion stable constructs (N67I) did not show such a decrease. The E92D mutation appeared to fall into the group between two mutations with intermediate stability, as only minor changes in the shape of the curve were observed. FIG. The 6 selected point mutations were combined to produce double mutants and analyzed. As can be seen, the different mutations showed different phenotypes in terms of stability and stability induction. If the polypeptides contain the K465Q or S46G mutations individually or in combination, all three, i.e. the two single and double mutants are unstable and the binding of the specific antibody before fusion is lost over time. If the S46G mutation is combined with E92D, which has previously been shown to have intermediate stability as a single mutation, no change in stability may be observed, indicating that the E92D mutation cannot correct unstable protein constructs. If the N67I mutation was combined with the S46G or E92D mutation, the result was a completely stable construct. This could also be observed if the S215P mutation was combined with the E92D mutation, showing the unique potential of the two mutations to stabilize unstable constructs prior to fusion.
Пример 10. Количественный анализ с использованием OctetExample 10. Quantification using Octet
Для определения концентрации F-белка RSV в супернатантах клеточных культур использовали количественный метод на основе Octet. Антитела CR9501 и CR9503 биотинилировали с помощью стандартных протоколов и иммобилизовали на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio, Портсмут, ВеликоAn Octet-based quantitative method was used to determine the concentration of RSV F-protein in cell culture supernatants. Antibodies CR9501 and CR9503 were biotinylated using standard protocols and immobilized on streptavidin biosensors (ForteBio, Portsmouth, Veliko
- 28 035522 британия). После этого покрытые биосенсоры блокировали в супернатанте ложно-трансфицированных клеточных культур. Количественный эксперимент выполняли следующим образом: температура 30°C, скорость встряхивания 1000 об./мин, время анализа 300 с. Концентрацию белка в супернатанте клеточной культуры рассчитывали с помощью стандартной кривой. Стандартную кривую получали для каждого покрытого антитела с использованием белка A2_F24_N67I+S215P (SEQ ID# 21), разбавленного в супернатанте ложно-трансфицированных клеточных культур. Измерения проводили в день сбора супернатанта (1 день) и после хранения супернатанта при 4°C в течение 5 дней или дольше. Разницу в концентрации, определенную с помощью CR9501, использовали в качестве скринингового средства для выявления мутаций, способных к стабилизации конформации до слияния. Конструкция считалась стабильной, если наблюдалось менее чем 20% снижение определяемой концентрации на 5 день. Анализ данных выполняли с помощью компьютерной программы ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).- 28 035522 UK). The coated biosensors were then blocked in the mock-transfected cell culture supernatant. The quantitative experiment was performed as follows: temperature 30 ° C, shaking speed 1000 rpm, analysis time 300 s. The protein concentration in the cell culture supernatant was calculated using a standard curve. A standard curve was obtained for each coated antibody using the A2_F24_N67I + S215P protein (SEQ ID # 21) diluted in the mock-transfected cell culture supernatant. Measurements were performed on the day of collection of the supernatant (day 1) and after storing the supernatant at 4 ° C for 5 days or longer. The difference in concentration, determined by CR9501, was used as a screening agent to identify mutations capable of stabilizing the conformation prior to fusion. A construct was considered stable if there was less than a 20% decrease in detectable concentration on day 5. Data analysis was performed using the ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio) computer program.
Пример 11. Анализ FACS и термостабильностьExample 11. FACS Analysis and Thermal Stability
Плазмиды экспрессии, кодирующие рекомбинантный полноразмерный F-белок RSV, создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР. Клетки HEK293-T временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в течение 48 ч при 37°C и 10% CO2. Клетки отделяли от чашек для культивирования с помощью буфера FACS (5 мМ EDTA, 1% FBS в PBS), отмывали и ресуспендировали в том же буфере. Клетки окрашивали в отношении поверхностного Fбелка RSV с использованием биотинилированных антител CR9501 или CR9503, с последующим окрашиванием APC-меченым стрептавидином. Для дифференцировки живых и мертвых клеток пропидия йодид добавляли в суспензию клеток в конце процедуры окрашивания. Клетки анализировали на FACS Canto (BD Biosciences) в соответствии со стандартными способами, хорошо известными любому специалисту в данной области. Анализ данных выполняли с использование программного обеспечения FlowJo 9.0 (Tree Star Inc.). Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) рассчитывали для популяции живых APCположительных клеток.Expression plasmids encoding the recombinant full length RSV F protein were generated using standard techniques well known in the art, including site-directed mutagenesis and PCR. HEK293-T cells were transiently transfected with 293Fectin (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions and cultured for 48 h at 37 ° C and 10% CO 2 . Cells were detached from culture dishes using FACS buffer (5 mM EDTA, 1% FBS in PBS), washed and resuspended in the same buffer. Cells were stained for surface RSV F protein using biotinylated antibodies CR9501 or CR9503, followed by staining with APC-labeled streptavidin. To differentiate living and dead cells, propidium iodide was added to the cell suspension at the end of the staining procedure. Cells were analyzed on the FACS Canto (BD Biosciences) according to standard methods well known to those of skill in the art. Data analysis was performed using FlowJo 9.0 software (Tree Star Inc.). The mean fluorescence intensity (MFI) was calculated for a population of living APC-positive cells.
Стабилизирующий потенциал введенных характеристик в полноразмерный мембранно-связанный F RSV определяли по тепловому стрессу. Через 48 ч после трансфекции клетки отделяли от чашек культивирования, как описано выше, и суспензию клеток нагревали в течение 5-10 мин с использованием диапазона температур (37, 46, 55,3, 60°C). Клетки затем окрашивали и анализировали с помощью FASC, как описано выше. MFI рассчитывали для популяции живых APC-положительных клеток. Процент APCположительных клеток рассчитывали для популяции живых клеток. Окрашивание с помощью CR9503 приводило к подобным MFI и % APC-положительных клеток в образцах, подвергнутых тепловому шоку возрастающими температурами. Окрашивание с помощью CR9501 уменьшало образцы клеток, трансфицированных нестабильными белками. Потеря связывания CR9501 указывала на потерю F-белка RSV до слияния на поверхности клетки.The stabilizing potential of the introduced characteristics into the full-length membrane-bound F RSV was determined by heat stress. 48 h after transfection, the cells were detached from the culture dishes as described above, and the cell suspension was heated for 5-10 min using the temperature range (37, 46, 55.3, 60 ° C). The cells were then stained and analyzed by FASC as described above. MFI was calculated for a population of live APC-positive cells. The percentage of APC positive cells was calculated for a population of living cells. Staining with CR9503 resulted in similar MFI and% APC positive cells in heat shock samples with increasing temperatures. CR9501 staining reduced samples of cells transfected with unstable proteins. Loss of CR9501 binding indicated loss of RSV F protein prior to cell surface fusion.
Пример 12. Доклиническая оценка иммуногенности F до слиянияExample 12. Preclinical evaluation of immunogenicity of F before fusion
Для определения иммуногенности стабилизированного F RSV до слияния (A2F24, N67I, S215P) (SEQ ID NO: 21) мышей иммунизировали в соответствии с табл. 14 0,5 или 5 мкг в прайм-бустерном режиме на 0 неделе и на 4 неделе. Как представлено на фиг. 7, мыши, иммунизированные F до слияния, демонстрировали более высокие титры VNA, чем мыши, иммунизированные F после слияния RSV.To determine the immunogenicity of stabilized RSV F before fusion (A2F24, N67I, S215P) (SEQ ID NO: 21), mice were immunized according to table. 14 0.5 or 5 mcg in prime booster mode at week 0 and week 4. As shown in FIG. 7, mice immunized with F before fusion exhibited higher VNA titers than mice immunized with F after RSV fusion.
____________Таблица 14. Схема иммунизации_________________________ Table 14. Immunization schedule _____________
Затем хлопковых крыс иммунизировали двумя различными дозами RSV-F в конформации после слияния и до слияния (табл. 15). Животных иммунизировали i.m. на 0 неделе и 4 неделе. На фиг. 8 представлены высокие титры нейтрализующих антител в день контрольного заражения (7 неделя).Cotton rats were then immunized with two different doses of RSV-F in post-fusion and pre-fusion conformation (Table 15). The animals were immunized with i.m. at 0 weeks and 4 weeks. FIG. 8 shows the high titers of neutralizing antibodies on the day of challenge (week 7).
- 29 035522- 29 035522
Таблица 15. Группы, иммуноген и доза для определения иммуногенности и эффективности у _____________________хлопковых крыс ___________________Table 15. Groups, immunogen and dose for determining immunogenicity and efficacy in _____________________ cotton rats ___________________
Вирусную нагрузку в легких и носу определяли через пять дней после контрольного заражения (см. фиг. 9).Viral load in the lungs and nose was determined five days after challenge (see Fig. 9).
Показано, что F-полипептиды до слияния в соответствии с настоящим изобретением способны индуцировать мощный иммунный ответ, который снижал вирусную нагрузку в легких и даже в носу.It has been shown that F polypeptides, prior to fusion in accordance with the present invention, are capable of inducing a potent immune response that lowers viral load in the lungs and even in the nose.
Таблица 16. Стандартные аминокислоты, аббревиатуры и свойстваTable 16. Standard amino acids, abbreviations and properties
Таблица 17. Последовательности антителTable 17. Antibody Sequences
- 30 035522- 30 035522
Аминокислотная последовательность нескольких конструкций F RSV до слияния приведена ниже. Следует отметить, что нумерация аминокислот в различных конструкциях, описанных в данном документе, основана на последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая означает, что все аминокислоты с 1 положения до 108 положения включительно конструкций до слияния соответствуют положениям аминокислот 1-108 последовательности дикого типа, где нумерация аминокислот с 138 положения до конца смещена на 22 аминокислоты, т.е. L138 в последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1) соответствует L116 во всех конструкциях до слияния. Это связано с тем фактом, что была выполнена делеция в конструкциях до слияния, т.е. вставка линкера GSGSG, при этом фактическая нумерация F1 не является одинаковой между конструкциями. Таким образом, нумерация, используемая по отношению к специфическим мутациям в соответствии с настоящим изобретением, например, S215P, относится к положению аминокислоты в последовательности дикого типа.The amino acid sequence of several RSV F constructs prior to fusion is shown below. It should be noted that the amino acid numbering in the various constructs described herein is based on the wild-type sequence (SEQ ID NO: 1), which means that all amino acids from position 1 to 108 inclusive of the constructs prior to fusion correspond to amino acid positions 1-108 wild-type sequences, where the amino acid numbering from position 138 to the end is shifted by 22 amino acids, i.e. L138 in the wild-type sequence (SEQ ID NO: 1) corresponds to L116 in all constructs prior to fusion. This is due to the fact that a deletion was performed in the pre-fusion constructs, i.e. insertion of a GSGSG linker where the actual F1 numbering is not the same between constructs. Thus, the numbering used in relation to specific mutations in accordance with the present invention, for example S215P, refers to the position of the amino acid in the wild-type sequence.
ПоследовательностиSequences
Полноразмерная последовательность F-белка RSV А2 (SEQ IDFull length sequence of F protein RSV A2 (SEQ ID
NO: 1)NO: 1)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN
IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN
VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Полноразмерная последовательность F-белка RSV Bl (SEQ IDFull length sequence of RSV Bl F protein (SEQ ID
NO: 2)NO: 2)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN
IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN
VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML
- 31 035522- 31 035522
TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIWLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGI NNIAFSKTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIWLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGI NNIAFSK
SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3
EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAEKKIEAIEKKIEAIEKKIEA
SEQ ID NO: 4SEQ ID NO: 4
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO: 5SEQ ID NO: 5
GSGSGGSGSG
F8: RSV A2, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 13)F8: RSV A2, wild type ectodomain (SEQ ID NO: 13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHHHHHHHHMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHHHHHHHH
Fll: RSV Bl, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 14)Fll: RSV Bl, wild type ectodomain (SEQ ID NO: 14)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLHHHHHHHHMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLHHHHHHHH
F47: RSV A2, стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO: 15)F47: Linker stabilized RSV A2, IZ (S) (SEQ ID NO: 15)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI
- 32 035522- 32 035522
ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHH HHHASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHH HHH
F47-: RSV A2 , стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO: 16)F47-: Linker stabilized RSV A2, IZ (S) (SEQ ID NO: 16)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGG
F43: RSV Bl, стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO: 17)F43: Linker stabilized RSV Bl, IZ (S) (SEQ ID NO: 17)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHH HMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHH H
F24: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 18)F24: RSV Bl, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 18)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT
- 33 035522- 33 035522
DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRHHHHHHDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPVEHAPRD GHEWHEW
A2_F24: RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 19)A2_F24: RSV A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 19)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 20)F24-: Linker stabilized RSV Bl, fibritin (SEQ ID NO: 20)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 21)A2_F24 N67I + S215P: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 21)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
- 34 035522- 34 035522
F24-N67I+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 22)F24-N67I + S215P: RSV Bl, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 22)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+E92D: RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 23)A2_F24 N67I + E92D: RSV A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 23)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+E92D RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 24)F24 - N67I + E92D RSV Bl, stabilized by linker, fibritin (SEQ ID NO: 24)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+K465Q RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 25)A2_F24 N67I + K465Q RSV A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 25)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN
- 35 035522- 35 035522
IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRIKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+K465Q RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 26)F24- N67I + K465Q RSV Bl, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 26)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GQNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GQNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S46G RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 27)A2_F24 N67I + S46G RSV A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 27)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+S46G RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 28)F24- N67I + S46G RSV Bl, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 28)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFGALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFGALRTGWYTSVITIELSN IKE1KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM
- 36 035522- 36 035522
SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT
DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT
DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE
GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD
GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 E92D+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 29)A2_F24 E92D + S215P: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 29)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-E92D+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 30)F24-E92D + S215P: RSV Bl, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 30)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K508E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 31)A2_F24 N67I + S215P + K508E: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 31)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE
- 37 035522- 37 035522
GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLSAIGGYIPEAPRDGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLSAIGGYIPEAPRD
GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487I: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 32)A2_F24 N67I + S215P + E487I: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 32)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSD1FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSD1FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 33)A2_F24 N67I + S215P + E487Q: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 33)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVIT IELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPI VNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND QKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNI CLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKI MTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYY VNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIP EAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVIT IELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPI VNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND QKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNI CLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKI MTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYY VNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIP EAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 34)A2_F24 N67I + S215P + E487N: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 34)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDNFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDNFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+D486N: A2, стабилизированный линкером,A2_F24 N67I + S215P + D486N: A2, stabilized by linker,
- 38 035522 фибритин (SEQ ID NO: 35)- 38,035522 fibritin (SEQ ID NO: 35)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 36)A2_F24 N67I + S215P + K465E: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 36)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GESLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GESLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 37)A2_F24 N67I + S215P + K465Q: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 37)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N426S: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 38)A2_F24 N67I + S215P + N426S: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 38)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI
- 39 035522- 39 035522
ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASSKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASSKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K421N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 39)A2_F24 N67I + S215P + K421N: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 39)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTNCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTNCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K209Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 40)A2_F24 N67I + S215P + K209Q: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 40)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNQQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNQQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K201Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 41)A2_F24 N67I + S215P + K201Q: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 41)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDQQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDQQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT
- 40 035522- 40 035522
DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT
DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE
GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD
GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+V185N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 42)A2_F24 N67I + S215P + V185N: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 42)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGNSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGNSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+G184N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 43)A2_F24 N67I + S215P + G184N: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 43)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNNVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNNVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N175P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 44)A2_F24 N67I + S215P + N175P: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 44)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTPKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTPKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD
- 41 035522- 41 035522
GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E92D: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 45)A2_F24 N67I + S215P + E92D: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 45)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K80E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 46)A2_F24 N67I + S215P + K80E: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 46)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIEQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIEQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K77E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 47)A2_F24 N67I + S215P + K77E: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 47)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIELIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIELIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+S46G: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 48)A2_F24 N67I + S215P + S46G: A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 48)
- 42 035522- 42 035522
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV S4 6G A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 49)A2_F24: RSV S4 6G A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 49)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV K465Q A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 50)A2_F24: RSV K465Q A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 50)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV N67I A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 51)A2_F24: RSV N67I A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 51)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAVL ASHLAVS
- 43 035522- 43 035522
CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV E92D A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 52)A2_F24: RSV E92D A2, linker stabilized fibritin (SEQ ID NO: 52)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
Полноразмерная последовательность белка F RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 69)Full length RSV protein F sequence CL57-v224 (SEQ ID NO: 69)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSNMELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Эктодомен, RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 70)Ectodomain, RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 70)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEMELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE
- 44 035522- 44 035522
VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY
VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA
FIRKSDELLFIRKSDELL
PreF, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 71)PreF, RSV A2, fibritin (SEQ ID NO: 71)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 72)PreF N67I S215P, RSV A2, fibritin (SEQ ID NO: 72)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P, RSV Bl, фибритин (SEQ ID NO: 73)PreF N67I S215P, RSV Bl, fibritin (SEQ ID NO: 73)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
RSV N67I S215P, RSV CL57-v224, фибритин (SEQ ID NO: 74)RSV N67I S215P, RSV CL57-v224, fibritin (SEQ ID NO: 74)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGT DAKVKLIKQE LDKYKNAVTE LQLLMQS T PAANNRARRE L PRFMNYT LNNTKNNNMELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGT DAKVKLIKQE LDKYKNAVTE LQLLMQS T PAANNRARRE L PRFMNYT LNNTKNNN
- 45 035522- 45 035522
VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreFL N67I S215P, RSV Bl, фибритин, петля (SEQ ID NO: 22)PreFL N67I S215P, RSV Bl, fibritin, loop (SEQ ID NO: 22)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLS T FLMELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLS T FL
PreFL N67I S215P, RSV CL57-v224, фибритин, петля (SEQ ID NO: 75)PreFL N67I S215P, RSV CL57-v224, fibritin, loop (SEQ ID NO: 75)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLS T FLMELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLS T FL
PreF N67I S215P E487Q, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 76)PreF N67I S215P E487Q, RSV A2, fibritin (SEQ ID NO: 76)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY
- 46 035522- 46 035522
VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLA
FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P K201N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 77)PreF N67I S215P K201N, RSV A2, fibritin (SEQ ID NO: 77)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDNQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDNQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P E92D, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO:78)PreF N67I S215P E92D, RSV A2, fibritin (SEQ ID NO: 78)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P D486N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 79)PreF N67I S215P D486N, RSV A2, fibritin (SEQ ID NO: 79)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
Fwt N67I S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 80)Fwt N67I S215P, membrane-bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 80)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN
- 47 035522- 47 035522
VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N67I S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 81)Fsl N67I S215P, membrane-linked F RSV, A2 (SEQ ID NO: 81)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 82)Fwt N67I S215P E92D, membrane-bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 82)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N67I S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 83)Fsl N67I S215P E92D, membrane bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 83)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVNG
- 48 035522- 48 035522
CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 84)Fwt N67I S215P E487Q, membrane-bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 84)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N67I S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 85)Fsl N67I S215P E487Q, membrane-bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 85)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 86)Fwt N67I S215P D486N, membrane-bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 86)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK
- 49 035522- 49 035522
LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSNLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N67I S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 87)Fsl N67I S215P D486N, membrane-bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 87)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 88)Fwt N67I S215P S46G, membrane-bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 88)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSNMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N67I S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 89)Fsl N67I S215P S46G, membrane bound F RSV, A2 (SEQ ID NO: 89)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTMELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT
- 50 035522- 50 035522
DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE
GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM
ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
CR9501, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 53):CR9501 Heavy Chain (SEQ ID NO: 53):
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTP SLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCQVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTP SLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501, легкая цепь (SEQ ID NO: 61):CR9501 light chain (SEQ ID NO: 61):
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFT GSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFT GSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CR9502, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 57):CR9502 Heavy Chain (SEQ ID NO: 57):
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQK IQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCEVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQK IQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502, легкая цепь (SEQ ID NO: 65):CR9502 light chain (SEQ ID NO: 65):
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSG SNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWK SHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECSQSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSG SNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWK SHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
Claims (31)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13165402 | 2013-04-25 | ||
PCT/EP2014/058353 WO2014174018A1 (en) | 2013-04-25 | 2014-04-24 | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201592048A1 EA201592048A1 (en) | 2016-04-29 |
EA035522B1 true EA035522B1 (en) | 2020-06-29 |
Family
ID=48326107
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA202090675A EA039803B1 (en) | 2013-04-25 | 2014-04-24 | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
EA201592048A EA035522B1 (en) | 2013-04-25 | 2014-04-24 | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA202090675A EA039803B1 (en) | 2013-04-25 | 2014-04-24 | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10899800B2 (en) |
EP (2) | EP2988780B1 (en) |
JP (1) | JP6469081B2 (en) |
KR (1) | KR102236497B1 (en) |
CN (2) | CN110590916A (en) |
AP (1) | AP2015008815A0 (en) |
AR (1) | AR096113A1 (en) |
AU (1) | AU2014259474B2 (en) |
CA (1) | CA2910067C (en) |
CL (1) | CL2015003124A1 (en) |
CY (1) | CY1121600T1 (en) |
DK (1) | DK2988780T3 (en) |
EA (2) | EA039803B1 (en) |
ES (1) | ES2715378T3 (en) |
HK (1) | HK1220124A1 (en) |
HR (1) | HRP20190175T1 (en) |
HU (1) | HUE041659T2 (en) |
IL (1) | IL242186B (en) |
LT (1) | LT2988780T (en) |
ME (1) | ME03442B (en) |
MX (1) | MX361774B (en) |
MY (2) | MY181066A (en) |
PE (1) | PE20151867A1 (en) |
PH (1) | PH12015502377B1 (en) |
PL (1) | PL2988780T3 (en) |
PT (1) | PT2988780T (en) |
RS (1) | RS58436B1 (en) |
SG (1) | SG11201508567XA (en) |
SI (1) | SI2988780T1 (en) |
TR (1) | TR201902513T4 (en) |
TW (1) | TWI663175B (en) |
WO (1) | WO2014174018A1 (en) |
ZA (1) | ZA201507912B (en) |
Families Citing this family (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2009333484B2 (en) | 2008-12-09 | 2014-12-11 | Novavax, Inc. | Modified RSV F proteins and methods of their use |
US11446374B2 (en) | 2008-12-09 | 2022-09-20 | Novavax, Inc. | Modified RSV F proteins and methods of their use |
US9738689B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-08-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
RU2761631C2 (en) | 2013-03-13 | 2021-12-13 | Дзе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эс Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз | Rsv proteins in pre-confluence conformation and use thereof |
TR201902513T4 (en) * | 2013-04-25 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides. |
MY171210A (en) | 2013-06-17 | 2019-10-02 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
WO2016160166A1 (en) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Immunogenic rsv polypeptides |
EP3319633B1 (en) | 2015-07-07 | 2020-11-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv |
BR112017028449A2 (en) * | 2015-07-07 | 2018-09-04 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | stabilized soluble rsv f polypeptides |
US10538557B2 (en) | 2015-09-02 | 2020-01-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized viral class I fusion proteins |
CN108697790B (en) * | 2015-09-03 | 2022-02-18 | 诺瓦瓦克斯股份有限公司 | Vaccine compositions with improved stability and immunogenicity |
CN108738312A (en) | 2015-12-23 | 2018-11-02 | 辉瑞公司 | Rsv f protein mutant |
EP3892273A3 (en) * | 2016-02-03 | 2021-12-22 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination products for the treatment of rsv |
CA3015570A1 (en) | 2016-03-29 | 2017-10-05 | Peter Kwong | Substitutions-modified prefusion rsv f proteins and their use |
KR102506895B1 (en) * | 2016-04-05 | 2023-03-08 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F protein |
EA201892250A1 (en) * | 2016-04-05 | 2019-03-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | VACCINE AGAINST RSV |
WO2017207477A1 (en) | 2016-05-30 | 2017-12-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
AU2017272504A1 (en) * | 2016-05-30 | 2018-11-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion RSV F proteins |
CN108265079A (en) * | 2017-01-02 | 2018-07-10 | 刘昕 | A kind of preparation method of novel respiratory tract syncytial virus pre-F fusion protein carriers |
MA47787A (en) | 2017-03-15 | 2020-01-22 | Modernatx Inc | RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE |
EP3595676A4 (en) | 2017-03-17 | 2021-05-05 | Modernatx, Inc. | Zoonotic disease rna vaccines |
RU2019130167A (en) | 2017-04-04 | 2021-05-05 | Юниверсити Оф Вашингтон | SELF-ASSEMBLY PROTEIN NANOSTRUCTURES EXPOSING F-PROTEINS OF PARAMIXOVIRUS AND / OR PNEUMOVIRUS AND THEIR APPLICATION |
JP2020519663A (en) * | 2017-05-17 | 2020-07-02 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーJanssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
WO2019053109A1 (en) * | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Method for the safe induction of immunity against rsv |
WO2019148101A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Modernatx, Inc. | Rsv rna vaccines |
AU2019238171A1 (en) | 2018-03-19 | 2020-09-24 | Novavax, Inc. | Multivalent influenza nanoparticle vaccines |
US20210401969A1 (en) * | 2018-10-29 | 2021-12-30 | Emory University | Rsv virus-like particles and methods of use thereof |
JOP20210106A1 (en) | 2018-11-13 | 2023-01-30 | Janssen Vaccines And Prevention B V | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
CN109851678A (en) * | 2019-03-07 | 2019-06-07 | 苏州宇之波生物科技有限公司 | A kind of inferior stable state bovine respiratory syncytial virus of improvement merges DNA molecular and its application of precursor F protein matter and coding |
CA3140234A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine |
BR112021022087A2 (en) | 2019-05-15 | 2021-12-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Coadministration of seasonal influenza vaccine and adenovirus-based respiratory syncytial virus vaccine |
CN114502572A (en) | 2019-09-04 | 2022-05-13 | 华盛顿大学 | Self-assembled protein nanostructures displaying paramyxovirus and/or pneumovirus F proteins and uses thereof |
CN111303245B (en) * | 2020-02-21 | 2023-06-27 | 成都奥达生物科技有限公司 | Anti-syncytial virus membrane fusion inhibitor |
AU2021250630A1 (en) | 2020-04-02 | 2022-10-20 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized vaccine compositions |
IL299515A (en) | 2020-06-29 | 2023-02-01 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vaccine combination against respiratory syncytial virus infection |
CN112220921B (en) * | 2020-08-25 | 2022-08-16 | 北京交通大学 | Combined vaccine for respiratory syncytial virus infection |
JP2022060169A (en) | 2020-10-02 | 2022-04-14 | ファイザー・インク | Cell culture process for rsv f protein production |
WO2022175479A1 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections |
CN114195867B (en) * | 2021-12-15 | 2024-05-03 | 北京交通大学 | RSV pre-fusion F protein, expression plasmid, cell strain and RSV vaccine composition |
WO2023110618A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins |
WO2024067725A1 (en) * | 2022-09-29 | 2024-04-04 | 北京百邑无忧科技发展有限公司 | Respiratory syncytial virus recombinant fusion protein with prefusion conformation, and preparation method therefor and use thereof |
WO2024069420A2 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising an rsv f protein trimer |
CN116478296B (en) * | 2022-10-17 | 2024-02-23 | 厦门大学 | Truncated respiratory syncytial virus F proteins and uses thereof |
WO2024089633A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Pfizer Inc. | Rna molecules encoding rsv-f and vaccines containing them |
WO2024089634A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions against influenza and rsv |
CN116284266B (en) * | 2022-11-21 | 2024-01-19 | 怡道生物科技(苏州)有限公司 | Mutant respiratory syncytial virus pre-fusion F protein and application thereof |
WO2024127181A1 (en) | 2022-12-11 | 2024-06-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions against influenza and rsv |
CN116785421B (en) * | 2023-08-21 | 2024-01-09 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | mRNA vaccine of bovine respiratory syncytial virus and application thereof |
CN117736278A (en) * | 2023-12-25 | 2024-03-22 | 英诺特(唐山)生物技术有限公司 | Kit and detection method for detecting respiratory syncytial virus infection |
CN117586357B (en) * | 2024-01-19 | 2024-07-09 | 北京安百胜生物科技有限公司 | Respiratory Syncytial Virus (RSV) polypeptides having immunogenicity |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011008974A2 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Novartis Ag | Rsv f protein compositions and methods for making same |
WO2011050168A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof |
WO2012006596A2 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Calmune Corporation | Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use |
WO2012158613A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Novartis Ag | Pre-fusion rsv f antigens |
Family Cites Families (82)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
JPH0832638B2 (en) | 1989-05-25 | 1996-03-29 | カイロン コーポレイション | Adjuvant formulation comprising submicron oil droplet emulsion |
FR2705686B1 (en) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | New defective adenoviruses and corresponding complementation lines. |
JP3816518B2 (en) | 1994-06-10 | 2006-08-30 | ジェンベク、インコーポレイティッド | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
US5851806A (en) | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
US5965541A (en) | 1995-11-28 | 1999-10-12 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
US5786464C1 (en) | 1994-09-19 | 2012-04-24 | Gen Hospital Corp | Overexpression of mammalian and viral proteins |
AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
US5837520A (en) | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
SI0833934T2 (en) | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
US5891690A (en) | 1996-04-26 | 1999-04-06 | Massie; Bernard | Adenovirus E1-complementing cell lines |
US6485958B2 (en) | 1996-07-01 | 2002-11-26 | Gencell Sa | Method for producing recombinant adenovirus |
FR2751343B1 (en) | 1996-07-16 | 1998-12-18 | Transgene Sa | PROCESS FOR THE PRESERVATION OF INFECTIOUS RECOMBINANT VIRUSES, AQUEOUS VIRAL SUSPENSION, AND USE AS A MEDICAMENT |
US6083716A (en) | 1996-09-06 | 2000-07-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
US7732129B1 (en) | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
KR100503701B1 (en) | 1996-11-20 | 2005-07-26 | 인트로겐 테라페티스, 인코퍼레이티드 | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
JP2000509614A (en) | 1997-03-04 | 2000-08-02 | バクスター インターナショナル インコーポレイテッド | Adenovirus E1-complementation cell line |
US6020191A (en) | 1997-04-14 | 2000-02-01 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression |
US6210683B1 (en) | 1997-09-05 | 2001-04-03 | Merck & Co., Inc. | Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines |
KR100991683B1 (en) | 1998-02-17 | 2010-11-04 | 쉐링 코포레이션 | Methods for concentrating virus preparations |
US5981225A (en) | 1998-04-16 | 1999-11-09 | Baylor College Of Medicine | Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same |
US6113913A (en) | 1998-06-26 | 2000-09-05 | Genvec, Inc. | Recombinant adenovirus |
AU1729600A (en) | 1998-11-16 | 2000-06-05 | Introgen Therapeutics, Inc. | Formulation of adenovirus for gene therapy |
US6225289B1 (en) | 1998-12-10 | 2001-05-01 | Genvec, Inc. | Methods and compositions for preserving adenoviral vectors |
ES2354578T3 (en) | 1999-05-17 | 2011-03-16 | Crucell Holland B.V. | ADENOVIRUS HUMAN SEROTIPO RECOMBINANT AD26. |
US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
DE19955558C2 (en) | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanent amniocyte cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors |
AU4346101A (en) | 2000-03-07 | 2001-09-17 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus formulations |
CA2415688A1 (en) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Anand Rao | Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals |
AUPR878401A0 (en) | 2001-11-09 | 2001-12-06 | Biota Holdings Ltd | Methods for identifying or screening anti-viral agents |
CA2469491A1 (en) | 2001-12-12 | 2003-06-19 | Kerrie Setiawan | Composition for viral preservation |
MXPA04006995A (en) | 2002-01-18 | 2005-07-13 | Schering Ag | Stabilized formulations of adenovirus. |
US20030180936A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
IL164802A0 (en) | 2002-04-25 | 2005-12-18 | Crucell Holland Bv | Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof |
MXPA04008891A (en) | 2002-04-25 | 2004-11-26 | Crucell Holland Bv | Means and methods for the production of adenovirus vectors. |
US20050196854A1 (en) | 2002-05-14 | 2005-09-08 | Konz John O.Jr. | Methods of adenovirus purification |
SE0202110D0 (en) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
CA2496918A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Introgen Therapeutics Inc. | Chromatographic methods for adenovirus purification |
SE0301998D0 (en) | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
PL2163260T3 (en) | 2004-01-23 | 2017-12-29 | Msd Italia S.R.L. | Chimpanzee adenovirus vaccine carriers |
CN1922308A (en) | 2004-02-23 | 2007-02-28 | 克鲁塞尔荷兰公司 | Virus purification methods |
ATE412737T1 (en) | 2005-04-11 | 2008-11-15 | Crucell Holland Bv | VIRUS CLEANING WITH ULTRAFILTRATION |
US20100143302A1 (en) | 2006-03-16 | 2010-06-10 | Crucell Holland B.V. | Recombinant Adenoviruses Based on Serotype 26 and 48, and Use Thereof |
US20090110695A1 (en) | 2006-03-27 | 2009-04-30 | Menzo Jans Emko Havenga | Compositions Comprising a Recombinant Adenovirus and an Adjuvant |
EP2099486A2 (en) | 2006-11-30 | 2009-09-16 | Government Of The United States Of America, As Represented by the Secretary | Codon modified immunogenic compositions and methods of use |
US7901388B2 (en) | 2007-07-13 | 2011-03-08 | Bacoustics, Llc | Method of treating wounds by creating a therapeutic solution with ultrasonic waves |
SG188813A1 (en) * | 2007-12-24 | 2013-04-30 | Id Biomedical Corp Quebec | Recombinant rsv antigens |
WO2010014975A2 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Academia Sinica | Use of microrna signatures for assessing risk levels of neuroblastoma patients |
MX2011004292A (en) | 2008-11-03 | 2011-05-31 | Crucell Holland Bv | Method for the production of adenoviral vectors. |
CA3108979A1 (en) | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof |
KR20120093811A (en) | 2009-06-24 | 2012-08-23 | 아이디 바이오메디컬 코포레이션 오브 퀘벡 | Vaccine |
AU2010264688A1 (en) | 2009-06-24 | 2012-01-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Recombinant RSV antigens |
EA023179B1 (en) | 2009-08-13 | 2016-05-31 | Круселл Холланд Б.В. | Antibodies against human respiratory syncytial virus (rsv) and methods of use |
CN102791852B (en) | 2009-10-15 | 2014-05-07 | 克鲁塞尔荷兰公司 | Method for the purification of adenovirus particles |
MX2012004221A (en) | 2009-10-15 | 2012-06-08 | Crucell Holland Bv | Process for adenovirus purification from high cell density cultures. |
EA023816B1 (en) | 2010-02-15 | 2016-07-29 | Круселл Холланд Б.В. | METHOD FOR THE PRODUCTION OF Ad26 VIRUS PARTICLES |
WO2013135615A1 (en) | 2012-03-12 | 2013-09-19 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
AU2013237424B2 (en) | 2012-03-22 | 2017-07-06 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against RSV |
JP2013247240A (en) | 2012-05-25 | 2013-12-09 | Gigaphoton Inc | Laser device |
WO2014005643A1 (en) | 2012-07-05 | 2014-01-09 | Okairos Ag | Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides |
US9738689B2 (en) * | 2013-03-13 | 2017-08-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
RU2761631C2 (en) | 2013-03-13 | 2021-12-13 | Дзе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эс Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз | Rsv proteins in pre-confluence conformation and use thereof |
CN105189547B (en) | 2013-04-15 | 2020-01-17 | 扬森疫苗与预防公司 | Human antibodies that bind to RSV G protein |
TR201902513T4 (en) | 2013-04-25 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides. |
MY171210A (en) | 2013-06-17 | 2019-10-02 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
JP6685903B2 (en) | 2013-07-25 | 2020-04-22 | アバター・メディカル・エルエルシー | RSV pre-fusion F protein that is conformationally stabilized |
EA202091315A3 (en) | 2013-08-05 | 2021-06-30 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | HUMAN ANTIBODIES BINDING G-PROTEIN RSV |
CA2923352C (en) | 2013-09-19 | 2022-05-03 | Crucell Holland B.V. | Stable adenovirus formulations |
KR102506895B1 (en) * | 2016-04-05 | 2023-03-08 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F protein |
EA201892250A1 (en) | 2016-04-05 | 2019-03-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | VACCINE AGAINST RSV |
-
2014
- 2014-04-24 TR TR2019/02513T patent/TR201902513T4/en unknown
- 2014-04-24 CA CA2910067A patent/CA2910067C/en active Active
- 2014-04-24 ES ES14719022T patent/ES2715378T3/en active Active
- 2014-04-24 EP EP14719022.7A patent/EP2988780B1/en active Active
- 2014-04-24 AP AP2015008815A patent/AP2015008815A0/en unknown
- 2014-04-24 MY MYPI2015703748A patent/MY181066A/en unknown
- 2014-04-24 PL PL14719022T patent/PL2988780T3/en unknown
- 2014-04-24 CN CN201910911639.8A patent/CN110590916A/en active Pending
- 2014-04-24 PE PE2015002278A patent/PE20151867A1/en unknown
- 2014-04-24 LT LTEP14719022.7T patent/LT2988780T/en unknown
- 2014-04-24 MX MX2015014890A patent/MX361774B/en active IP Right Grant
- 2014-04-24 PT PT14719022T patent/PT2988780T/en unknown
- 2014-04-24 HU HUE14719022A patent/HUE041659T2/en unknown
- 2014-04-24 RS RS20190170A patent/RS58436B1/en unknown
- 2014-04-24 EA EA202090675A patent/EA039803B1/en unknown
- 2014-04-24 AU AU2014259474A patent/AU2014259474B2/en active Active
- 2014-04-24 ME MEP-2019-73A patent/ME03442B/en unknown
- 2014-04-24 KR KR1020157032796A patent/KR102236497B1/en active IP Right Grant
- 2014-04-24 EA EA201592048A patent/EA035522B1/en unknown
- 2014-04-24 JP JP2016509467A patent/JP6469081B2/en active Active
- 2014-04-24 US US14/786,955 patent/US10899800B2/en active Active
- 2014-04-24 EP EP18205858.6A patent/EP3488864A1/en active Pending
- 2014-04-24 CN CN201480023229.5A patent/CN105188745B/en active Active
- 2014-04-24 WO PCT/EP2014/058353 patent/WO2014174018A1/en active Application Filing
- 2014-04-24 SG SG11201508567XA patent/SG11201508567XA/en unknown
- 2014-04-24 SI SI201431056T patent/SI2988780T1/en unknown
- 2014-04-24 DK DK14719022.7T patent/DK2988780T3/en active
- 2014-04-25 TW TW103115087A patent/TWI663175B/en active
- 2014-04-25 AR ARP140101738A patent/AR096113A1/en unknown
-
2015
- 2015-10-13 PH PH12015502377A patent/PH12015502377B1/en unknown
- 2015-10-20 IL IL242186A patent/IL242186B/en active IP Right Grant
- 2015-10-22 CL CL2015003124A patent/CL2015003124A1/en unknown
- 2015-10-23 ZA ZA2015/07912A patent/ZA201507912B/en unknown
-
2016
- 2016-07-13 HK HK16108218.1A patent/HK1220124A1/en unknown
-
2018
- 2018-11-29 MY MYPI2018002243A patent/MY201791A/en unknown
-
2019
- 2019-01-28 HR HRP20190175TT patent/HRP20190175T1/en unknown
- 2019-03-13 CY CY20191100303T patent/CY1121600T1/en unknown
-
2020
- 2020-12-18 US US17/126,128 patent/US20210101940A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-08-23 US US17/821,694 patent/US20230265127A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011008974A2 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Novartis Ag | Rsv f protein compositions and methods for making same |
WO2011050168A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof |
WO2012006596A2 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Calmune Corporation | Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use |
WO2012158613A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Novartis Ag | Pre-fusion rsv f antigens |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
J. S. MCLELLAN, M. CHEN, M. G. JOYCE, M. SASTRY, G. B. E. STEWART-JONES, Y. YANG, B. ZHANG, L. CHEN, S. SRIVATSAN, A. ZHENG, T. ZH: "Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, vol. 342, no. 6158, 1 November 2013 (2013-11-01), pages 592 - 598, XP055132637, ISSN: 00368075, DOI: 10.1126/science.1243283 * |
J. S. MCLELLAN, M. CHEN, S. LEUNG, K. W. GRAEPEL, X. DU, Y. YANG, T. ZHOU, U. BAXA, E. YASUDA, T. BEAUMONT, A. KUMAR, K. MODJARRAD: "Structure of RSV Fusion Glycoprotein Trimer Bound to a Prefusion-Specific Neutralizing Antibody", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, vol. 340, no. 6136, 31 May 2013 (2013-05-31), pages 1113 - 1117, XP055077617, ISSN: 00368075, DOI: 10.1126/science.1234914 * |
M. MAGRO, V. MAS, K. CHAPPELL, M. VAZQUEZ, O. CANO, D. LUQUE, M. C. TERRON, J. A. MELERO, C. PALOMO: "Neutralizing antibodies against the preactive form of respiratory syncytial virus fusion protein offer unique possibilities for clinical intervention", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 109, no. 8, 21 February 2012 (2012-02-21), pages 3089 - 3094, XP055067859, ISSN: 00278424, DOI: 10.1073/pnas.1115941109 * |
YIN HSIEN-SHENG ET AL: "Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable, prefusion conformation", NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP UK, LONDON, vol. 439, no. 7072, 1 January 2006 (2006-01-01), London, pages 38 - 44, XP002503490, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/NATURE04322 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210101940A1 (en) | Stabilized Soluble Pre-Fusion RSV F Polypeptides | |
US10294279B2 (en) | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides | |
EA035909B1 (en) | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides | |
CN113164583A (en) | Stable pre-fusion RSV F proteins | |
KR20190012193A (en) | The stabilized fusion-pre-RSV F protein | |
OA17539A (en) | Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides. | |
NZ713371B2 (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
NZ752808A (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
NZ752808B2 (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
NZ714594B2 (en) | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides | |
OA17598A (en) | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |