EA035207B1 - ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET-21a(+) - ПРОДУЦЕНТ СОМАТОТРОПИНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО МОНОМЕРНОЙ ФОРМЫ - Google Patents
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET-21a(+) - ПРОДУЦЕНТ СОМАТОТРОПИНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО МОНОМЕРНОЙ ФОРМЫ Download PDFInfo
- Publication number
- EA035207B1 EA035207B1 EA201791989A EA201791989A EA035207B1 EA 035207 B1 EA035207 B1 EA 035207B1 EA 201791989 A EA201791989 A EA 201791989A EA 201791989 A EA201791989 A EA 201791989A EA 035207 B1 EA035207 B1 EA 035207B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- growth hormone
- plasmid dna
- escherichia coli
- pet
- cells
- Prior art date
Links
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 17
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 102220012914 rs397516364 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220066015 rs794726955 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 abstract description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 abstract description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 40
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710129874 ATPase PAAT Proteins 0.000 description 1
- 102100038740 Activator of RNA decay Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100033869 Sodium-coupled neutral amino acid transporter 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003160 anti-catabolic effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000492 insulin antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- FJYCIMTWDRJSQU-UHFFFAOYSA-N phenoxymethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)COC1=CC=CC=C1 FJYCIMTWDRJSQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000026313 regulation of carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108090000589 ribonuclease E Proteins 0.000 description 1
- 102220100914 rs202148988 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для производства гормона роста человека. Предложена плазмидная ДНК для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli, представленная вектором pET-21a(+), последовательность с T7 промотора по lac-оператор модифицирована и охарактеризована SEQ ID NO: 3, содержащим вставку гена, кодирующего белок, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, оптимизированного по кодонному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli. Также предложен штамм-продуцент гормона роста человека, на основе клеток Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных описанной плазмидной ДНК. Использование предложенных изобретений позволяет достичь значительного увеличения выхода мономерной формы соматотропина до 80%.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для производства гормона роста человека.
Гормон роста человека (соматотропин, соматропин, соматотропный гормон) - один из гормонов передней доли гипофиза. Вызывает выраженное ускорение линейного (в длину) роста, в основном, за счет роста длинных трубчатых костей конечностей. Соматотропин оказывает мощное анаболическое и антикатаболическое действие, усиливает синтез белка и тормозит его распад, а также способствует снижению отложения подкожного жира, усилению сгорания жира и увеличению соотношения мышечной массы к жировой. Кроме того, соматотропин принимает участие в регуляции углеводного обмена - он вызывает выраженное повышение уровня глюкозы в крови и является одним из антагонистов инсулина по действию на углеводный обмен. Описано также его действие на островковые клетки поджелудочной железы, иммуностимулирующий эффект, усиление поглощения кальция костной тканью и др.
Терапевтическое применение соматотропина.
1. Для лечения нарушений роста у детей.
2. Для лечения нервных расстройств. В некоторых работах показано, что соматотропин улучшает память и познавательные функции, особенно у больных с недостаточностью соматотропной функции гипофиза, и что введение соматотропина может улучшать настроение и самочувствие больных с низким уровнем соматотропина в крови.
3. Для профилактики старческих заболеваний.
4. Применение в спортивной медицине в качестве анаболического препарата.
Для получения соматотропина известно использование многих штаммов Escherichia coli - продуцентов на основе клеток
W3110 (RU2287574C2, RU2433185C2, RU2337968C2, CN103173440 (A), AU731758 (В2), US5496713 (A), W02005067601 (А2), US5932439 (А), ЕР0587427 (Al), CN104561020 (А)), К-12 (294, Х1776, ВЕ1201, RV3O8, MKD3207) (RU2337968C2, US4859600 (A), RU2287574C2, RU2433185C2, US4874703 (А), ЕР0089666 (А2), RU2031121C1), JM (83, 101, 105, 109) (ЕА200601793А1, W02005067601 (А2), JPH0771495 (В2), AU731758 (В2)), В (RU2433185C2, ЕР0089666 (А2))> МТ (012, 1067510853) (AU731758 (В2), US5496713 (A), JPH09216832 (А)), НВ 101 (JPS60234584 (А), ЕР0587427 (Al), US4518690 (А)), МС1061 (JPH0771495 (В2), US6010875 (А)), АТСС №39384, 39386 (ЕР0173215 (А2)), D1210 (ЕР0067540 (А2)), НМ 10011-НМ 10020 (KR20020080108 (A)), YK537 (CN103882015 (В)), chil776 (W02005067601 (А2)), JA221 (W02005067601 (А2)), С41 (DE3), С43 (De3) (CN103882015 (В)), К802 (RU1248280), Rosetta, Rosetta (DE3) (CN103882015 (В)), BL21, BL21 (DE3) (RU2002133932A, WO2014046484 (Al), CN103882015 (В), WO2011103325 (Al), NZ555206 (А), W02004005335 (А2), US2010041153 (Al), US2011237509 (Al), W02009057622 (Al).
В ряде таких штаммов получаемый целевой белок - секретируемый либо накапливаемый в периплазматическом пространстве, однако больший выход белка возможно получить, если белок накапливается в тельцах включения. Штаммы с таким типом накопления соматотропина составляют часть приведенных выше. Однако от качества получаемых телец включения зависит выход белка, пригодного для применения, мономеров соматотропина, при дальнейшей очистке. Задачей, на решение которой направлено создание настоящего изобретения, является создание штамма-продуцента соматотропина, позволяющего получить больший выход мономерной формы соматотропина по сравнению с известными штаммами.
Известен штамм-продуцент соматотропина на основе клеток E.coli BL21(DE3) и вектора рЕТ22Ь(+), белок синтезируется без His-тага, в тельцах включения (RU 2002133932 A). Данный штамм, а также содержащаяся в нем плазмида являются прототипом.
Авторами настоящего изобретения выявлено с использованием штамма на основе клеток E.coli BL21(DE3) и вектора рЕТ-21(+), белок синтезируется без His-тага, в тельцах включения, что специфичное изменение Т7 промотора и lac-оператора позволяет достичь значительного увеличения выхода мономерной формы соматотропина на 34%, с 46 до 80%.
Технический результат от использования созданных плазмидной ДНК и штамма в значительном увеличении выхода мономерной формы соматотропина. Данный технический эффект достигается благодаря изменению кинетики накопления целевого белка в клетке за счет внесения специфичных мутаций в Т7 промотор и lac-оператор плазмидной ДНК.
Технический результат от использования группы изобретений выражается также в расширении
- 1 035207 спектра плазмид и штаммов-продуцентов для получения соматотропина, что немаловажно, учитывая широкое применение данного белка. Клинический опыт показал, что оптимизируя лечение низкорослости, целесообразно иметь в арсенале несколько аналогичных фармацевтических препаратов, получаемых различными технологиями или даже методами. Длительное лечение (годами) одним препаратом соматотропина вызывает в организме уменьшение чувствительности к нему (http://xn--80aqkgbchgfn.xn-plai/poluchenie-gormona-rosta-v-biotehno).
Сущность изобретения
Предложена плазмидная ДНК pET-21a(+)somat для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli, представленная вектором рЕТ-21а(+), последовательность с Т7 промотора по lac-оператор охарактеризована SEQ ID NO: 3, содержащим вставку гена, кодирующего белок гормон роста человека, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, оптимизированного по кодонному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli. Последовательность с Т7 промотора по lacоператор вектора рЕТ-21а(+), охарактеризованная SEQ ID NO: 3, является модифицированной, в Т7 промотор введена мутация A6G, в lac-оператор - мутации T22G, T23G. Последовательность расположения элементов в плазмидной ДНК понятна среднему специалисту в данной области.
Оптимизация по кодонному составу для организма экспрессии целевого гена может быть осуществлена вручную либо с использованием специализированного программного обеспечения, например, на сайте molbiol.ru либо encorbio.com/protocols/Codon.htm, на основе аминокислотной последовательности белка.
Также предложен штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET-21a(+) - продуцент гормона роста человека, на основе клеток Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных описанной плазмидной ДНК.
Изобретение проиллюстрировано следующими графическими материалами.
Фиг. 1 - графики, демонстрирующие кинетику накопления соматотропина при индукции экспрессии кодирующего его гена в клетках штамма-продуцента с вариантами строения Т7 промотора и lacоператора: ось абсцисс - время, ч, ось ординат - процент целевого белка от общего; график, построенный по точкам - кинетика накопления соматотропина при строении Т7 промотора и lac-оператора, как охарактеризовано SEQ ID NO: 4, построенный по треугольникам - как охарактеризовано SEQ ID NO: 2, построенный по квадратам - как охарактеризовано SEQ ID NO: 3.
Фиг. 2 - электрофореграмма плазмидной ДНК pET-21a(+)somat, 0,8% агарозный гель: 1 - маркер молекулярного веса DNA ladder GeneRuler 1 kb; 2 - отрицательный контроль - данная плазмидная ДНК без обработки рестриктазами; 3-6 - данная плазмидная ДНК, обработанная рестриктазой: 3 - HindIII; 4 BglII; 5 - NdeI; 6 - XhoI;
Фиг. 3 - электрофореграмма плазмидной ДНК pET-21a(+)somat, 0,8% агарозный гель: 1 - маркер молекулярного веса DNA ladder GenRuler 1 kb; 2 - отрицательный контроль - данная плазмидная ДНК без обработки рестриктазами; 3-8 - данная плазмидная ДНК, обработанная рестриктазами: 3 - HindIII+BglII; 4 - HindIII+NdeI; 5 - HindIII+XhoI; 6 - BglII+NdeI; 7 - BglII+XhoI; 8 - NdeI+XhoI.
Авторами настоящего изобретения проведены лабораторные исследования, подтверждающие возможность реализации охарактеризованных изобретений. Полученные результаты исследований проиллюстрированы следующими примерами.
Пример 1. Создание плазмидной ДНК pET-21a(+)somat - вариантов с различиями в Т7 промоторе и lac-операторе.
1.1. Создание нуклеотидной последовательности, кодирующей гормон роста человека, и вариантов фрагмента плазмидной ДНК рЕТ-21а(+) с Т7 промотора по lac-оператор.
Аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, характеризующую гормон роста человека, без сигнальной последовательности переводили в нуклеотидную с одновременной кодонной оптимизацией для экспрессии в клетках E.coli с использованием программы на сайте molbiol.ru и добавлением старт- и стоп-кодона, в одном из вариантов двух стоп-кодонов, а также сайтов рестрикции, фланкирующих получаемый ген. Рассчитанную нуклеотидную последовательность синтезировали химическим методом с помощью синтезатора ДНК aSm-800 (БИОССЕТ, Россия).
Был синтезирован также фрагмент плазмидной ДНК рЕТ-21а(+), ограниченный сайтами рестрикции BglII и XbaI, содержащий Т7 промотор и lac-оператор, а именно три его варианта, содержащие, соответственно, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 4, характеризующие варианты фрагмента плазмидной ДНК рЕТ-21а(+) с Т7 промотора по lac-оператор, (1) без мутаций, (2) с мутацией A6G в Т7 промоторе и с мутациями T22G, T23G в lac-операторе, (3) с мутацией C7G в Т7 промоторе и с мутацией Т16С в lac-операторе.
1.2. Создание вариантов плазмидной ДНК pET-21a(+)somat.
Полученные фрагменты ДНК, а также вектор рЕТ-21а(+) (Novagen, США) обрабатывали соответствующими рестриктазами по инструкции к данным ферментам. Далее полученные фрагменты очищались с использованием препаративного электрофореза и использовались в реакции лигирования.
Осуществлялась реакция лигирования очищенных рестрицированных фрагментов ДНК в очищенный рестрицированный вектор последовательно. Реакционная смесь содержала 2 мкл очищенного рестрицированного фрагмента ДНК, 3,5 мкл 10Х буфера для лигазы (1X буфер содержит 10 мМ Tris-HCl (pH
- 2 035207
7,5 при 37°С), 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)) (Thermo
Fisher Scientific Inc.), 3,5 мкл 50% полиэтиленгликоля 4000, 1 мкл рестрицированного вектора, 5 мкл Т4 лигазы (Thermo Fisher Scientific Inc.). Реакционная смесь доводилась до 35 мкл безнуклеазной водой и инкубировалась при 22°С в течение 4 ч. Ферментативная реакция останавливалась инкубацией реакционной смеси при 65°С в течение 15 мин.
Смесь очищали от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине в течение 10 мин.
1.3. Создание штамма (вариантов) на основе клеток Escherichia coli DH10B/R для амплификации полученной плазмидной ДНК (вариантов).
Подготавливали компетентные клетки Escherichia coli штамма DH10B/R (Gibko BRL, США) с генотипом F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) <p80dlacZAM 15 AlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 A(ara,leu)769 galU galK/- rpsL nupG и далее осуществляли их трансформацию полученной лигазной смесью.
Подготавливали клетки Е. coli для трансформации полученной плазмидной ДНК - получали компетентные клетки следующим образом. Инкубировали клетки при +37°С в течение 16 ч в 5 мл L-бульона, содержащего 1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый. Разводили культуру свежим L-бульоном в 50-100 раз и выращивали на качалке при +37°С до оптической плотности 0,2-0,3 при длине волны 590 нм. При достижении оптической плотности более 0,3 культуру разводили свежим L-бульоном до оптической плотности 0,1 и растили 30 мин. Переносили 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждали клетки при +4°С на 5000 g в течение 10 мин. Супернатант сливали, клетки ресуспендировали в 50 мл 0,1М CaCl2, охлажденного на льду. Инкубировали клетки 20 мин на льду. Осаждали клетки в течение 10 мин при 5000 об/мин, +4°С. Супернатант сливали, клетки ресуспендировали в 3 мл 0,1М CaCl2, охлажденного на льду.
Трансформацию полученных компетентных клеток осуществляли методом электропорации. Использовали электропоратор Eporator (Eppendorf, Германия) и стерильные кюветы для электропорации (Eppendorf, Германия) объемом 100 мкл, щель 1 мм.
К 12 мкл компетентных клеток добавляли 1 мкл десятикратно разведенной лигазной смеси, осуществляли перемешивание и перенос в кювету, которую помещали в электропоратор. Трансформацию проводили при электрическом импульсе напряженностью 1,7 кВ длительностью 5 мс. После трансформации клетки помещали в 1 мл SOC-среды (2% бактотриптон; 0,5% дрожжевой экстракт; 10 мМ NaCl; 2,5 мМ KCl; 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4; 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при 37°С, после чего вмазывали в LB-агар с антибиотиком на чашке Петри и инкубировали 16 ч при 37°С.
Выросшие на чашке Петри с ампициллином клоны E.coli анализировали на наличие используемой в настоящем эксперименте плазмидной ДНК, с одновременным переносом анализируемых клонов клеток E.coli на отдельные чашки Петри с селективной средой. Из таких клонов выделяли плазмидную ДНК и анализировали секвенированием с использованием специфичных праймеров. Это позволило отобрать клоны-продуценты разработанных плазмидных ДНК (вариантов). Данные штаммы использовали для получения вариантов плазмидной ДНК pET-21a(+)somat.
1.4. Получение вариантов плазмидной ДНК pET-21a(+)somat.
Наработку и выделение плазмидной ДНК осуществляли следующим образом.
Единичную колонию клеток продуцента плазмид E.coli, выращенную на LB-агаре в чашке Петри с добавлением ампициллина, инокулировали в стандартную жидкую среду LB (Gibko BRL, США), 2-10 мл, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, и осуществляли ферментацию при 37°С в термостатированном шейкере роторного типа в течение 16 ч при 250 об/мин. Полученную культуру бактериальных клеток осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при +4°С. Удаляли супернатант и из осадка клеток выделяли плазмидную ДНК с помощью набора для выделения плазмидной ДНК (Цитокин, Россия), по инструкции к набору. Выделенную плазмидную ДНК анализировали электрофорезом в 0,8%-м агарозном геле.
Пример 2. Создание штамма-продуцента соматотропина преимущественно мономерной формы.
2.1. Создание штамма-продуцента гормона роста человека на основе клеток Escherichia coli BL21(DE3) (вариантов).
Выделенными согласно описанной в примере 1 методике вариантами плазмидной ДНК pET21a(+)somat с различиями в строении Т7 промотора и lac-оператора трансформировали клетки E.coli штамма BL21(DE3) (Invitrogen, USA), с генотипом F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3), содержащие в геноме /.De3 лизоген и мутацию rne131. Мутированный ген me (rne131) кодирует усеченную форму РНКазы Е, что уменьшает внутриклеточное разрушение мРНК, приводя к увеличению ее ферментативной стабильности. Ion- и ompT-мутации по генам протеаз позволяют получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.
Получали компетентные клетки E.coli BL21(DE3) и трансформировали их полученной плазмидной ДНК (вариантами), как описано в примере 1, вместо десятикратно разведенной лигазной смеси использовали раствор плазмиды в воде. Выросшие клоны проверяли на наличие целевой плазмидной ДНК с
- 3 035207 использованием секвенирования выделенной плазмидной ДНК. В итоге выбрали клон клеток E.coli, который далее использовали для получения гормона роста человека (штамм-продуцент), варианты.
2.2. Выявление штамма-продуцента соматотропина преимущественно мономерной формы из созданных вариантов.
2.2.1. Индукция синтеза соматотропина в штамме-продуценте (вариантах).
Индукцию экспрессии получали и с использованием ИПТГ, и 0,2% лактозы.
2.2.1.1. При индукции синтеза соматотропина 0,2% лактозой по методу Штудиера.
Для культивирования полученных штаммов-продуцентов использовали стандартную агаризованную LB-среду, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и глюкозу в концентрации 1%, для блокирования неспецифической экспрессии.
Индукцию экспрессии проводили при достижении культурой клеток оптической плотности 0,6-0,8 оптических единиц при длине волны 600 нм.
Для автоиндукции экспрессии по методу Штудиера использовали среду PYP-5052, состоящую из 1% пептона (Gibco, США), 0,5% дрожжевого экстракта (Gibco, США), 50 мМ Na2HPO4, 50 мМ K2HPO4, 25 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0,5% глицерола, 0,05% глюкозы и 0,2% лактозы, в качестве индуктора использовали 0,2% лактозу (Studier FW. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 2005 May; 41(l):207-34).
В среду PYP-5052, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, инокулировали единичную колонию штамма-продуцента (варианта). Ферментацию проводили при +37°С в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об/мин в течение 14 ч до отсутствия существенного изменения ОП600 за 1 ч. Отбирали аликвоту на анализ экспрессии гена, кодирующего соматотропин, методом электрофореза в ПААГ, каждый час, по окончании индукции биомассу осаждали центрифугированием при 9000 g.
2.2.1.2. При индукции синтеза соматотропина ИПТГ.
Индукцию экспрессии гена с использованием ИПТГ осуществляли следующим образом.
Инкубировали клетки единичной колонии штамма-продуцента (вариантов) при +37°С в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об/мин в течение 16 ч в LB среде (1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый), содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Разводили культуру свежей LB средой в 50 раз и выращивали в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об/мин +37°С до достижения культурой клеток оптической плотности 0,6-0,8 оптических единиц при длине волны 600 нм. После этого осуществляли индукцию экспрессии рекомбинантного гена добавлением ИПТГ к культуре до конечной концентрации от 1 до 2 мМ. Индукцию проводили в течение 14 ч, отбирали пробу для анализа с использованием SDS-PAGE каждый час, по окончании индукции биомассу осаждали центрифугированием.
2.2.2. Анализ отобранных проб.
Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид, из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком 7 раз по 30 с с интервалом в 30 с (частота ультразвука составляет 22 кГц), отбирали пробу на анализ SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis with Sodium dodecyl sulfate). Процент содержания целевого белка от общего белка при использовании анализируемых трех штаммовпродуцентов соматотропина приведен на графиках фиг. 1.
Лизат центрифугировали 10 мин при +4°С, 5000 g. Отбирали пробу надосадочной жидкости (супернатанта) и осадка для анализа локализации белка и оценки его растворимости с использованием SDSPAGE. Анализ продемонстрировал нерастворимость полученного соматотропина.
2.2.1.3. Описание кинетики накопления соматотропина.
Кинетика накопления соматотропина в клетках штамма-продуцента (вариантов) была выявлена с использованием дензитометрического сканирования электрофореграмм спектра белков, полученного из лизатов клеток E.coli штамма-продуцента (вариантов) после индукции экспрессии, с помощью программы ImageJ и оказалась сходной при индукции экспрессии 0,2% лактозой и ИПТГ (от 1 до 2 мМ) и приведена на фиг. 1.
2.2.2. Рефолдинг.
После окончания индукции осажденную биомассу лизировали с помощью 3 циклов соникации по 30 с с перерывом в 2 мин на льду. Затем трехкратно отмывали тельца включения 0,2М дезоксихолятом натрия, что позволяло получить препарат без примесей бактериальных эндотоксинов.
Растворяли тельца включения в 8М растворе мочевины, затем осуществляли рефолдинг белка в буфере для рефолдинга (0,1М Tris рН 8,0, 0,2 мМ ЭДТА) с 0,.5М L-аргинином.
Проводили хроматографическую очистку полученного раствора белка. Около 1200 мл обессоленного супернатанта помещали на 20 мл S-Sepharose колонку, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl рН 8.0. Колонку отмывали 200 мл 50 мМ Tris рН 8.0, белок элюировали 160 мл линейного градиента 50 мМ Tris рН 8.0 1М NaCl. Фракция очищенного на S-Sepharose гормона роста человека была помещена на S-100 колонку (2,5x80 см), предварительно уравновешенную фосфатным буфером. Собирали фракции по 1 мл, анализировали электрофоретически в 20% ПААГ-ДДс-Na, фракции с целевым белком объединяли, кон- 4 035207 центрацию белка в них определяли по методу Бредфорд. Колонку откалибровывали с использованием 10 мг бычьего сывороточного альбумина, овальбумина и соевого трипсинового ингибитора.
Формы соматотропина анализировали с использованием электрофореза в ПААТ при нанесении препаратов рефолдированного соматотропина, полученных с использованием трех штаммов и двух типов индукторов.
Удалось получить наибольший процент мономерной формы соматотропина, 80%, при использовании штамма-продуцента со строением Т7 промотора и lac-оператора, как охарактеризовано SEQ ID NO: 3. 46% мономерной формы соматотропина получили с использованием штамма-продуцента со строением Т7 промотора и lac-оператора, как охарактеризовано SEQ ID NO: 2, т.е. оригинального для вектора рЕТ21а(+). При внесении же мутаций в данные элементы, как охарактеризовано SEQ ID NO: 4, получили значительное уменьшение выхода мономерной формы соматотропина при рефолдинге до 21%. Полученные данные подтверждают нетривиальность предложенного решения.
Таким образом, оптимальным для получения высокого процента мономерной формы соматотропина является использование штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pET-21a(+)co строением Т7 промотора и 1ас-оператора плазмидной ДНК рЕТ-21а(+), как охарактеризовано SEQ ID NO: 3.
Пример 3. Характеристика штамма-продуцента соматотропина преимущественно мономерной формы.
3.1. Рестрикционный анализ.
Из полученного штамма-продуцента мономерной формы соматотропина выделяли плазмидную ДНК, как описано выше.
При обработке выделенной плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции наблюдали картину, приведенную на фиг. 2 и 3, которая характеризует созданный штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы. Соответствие полученных результатов ожидаемым было подтверждено.
3.2. Культуральные характеристики.
Культуральные свойства: грамотрицательные прямые палочки размером 1,1-1,5-2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Интервал pH 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают лактозу, арабинозу и галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, но гидролизуют мочевину.
Ростовые характеристики: клетки растут в интервале температур от 8 до 43 °C, интервал для культивирования 28-38°С, оптимум роста при 37°С.
Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях культивирования: клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин. На агаризованной среде колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно.
Claims (2)
1. Плазмидная ДНК pET-21a(+)somat для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli на основе вектора рЕТ-21а(+), который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, включающую участок с Т7 промотора, имеющего мутацию A6G, по lac-оператор, имеющий мутации T22G и T23G включительно, и также содержит ген, кодирующий белок гормона роста человека, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 и оптимизированный по ко до иному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli, причем на границе Т7 промотора и lac-оператора расположен элемент GG.
2. Штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pET-21a(+), содержащий плазмидную ДНК по п.1, продуцент гормона роста человека.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201791989A EA035207B1 (ru) | 2017-10-08 | 2017-10-08 | ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET-21a(+) - ПРОДУЦЕНТ СОМАТОТРОПИНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО МОНОМЕРНОЙ ФОРМЫ |
| PCT/RU2018/050040 WO2019070162A1 (ru) | 2017-10-08 | 2018-04-12 | Штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201791989A EA035207B1 (ru) | 2017-10-08 | 2017-10-08 | ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET-21a(+) - ПРОДУЦЕНТ СОМАТОТРОПИНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО МОНОМЕРНОЙ ФОРМЫ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201791989A1 EA201791989A1 (ru) | 2019-04-30 |
| EA035207B1 true EA035207B1 (ru) | 2020-05-15 |
Family
ID=65994906
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201791989A EA035207B1 (ru) | 2017-10-08 | 2017-10-08 | ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET-21a(+) - ПРОДУЦЕНТ СОМАТОТРОПИНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО МОНОМЕРНОЙ ФОРМЫ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA035207B1 (ru) |
| WO (1) | WO2019070162A1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2233879C1 (ru) * | 2002-12-17 | 2004-08-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина |
| RU2465315C1 (ru) * | 2011-08-08 | 2012-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Амбер" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPBS-St9, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СОМАТОТРОПИНА, И ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ДЛЯ ПРОДУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПИНА |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101527528B1 (ko) * | 2012-09-19 | 2015-06-19 | 한국표준과학연구원 | 가용성 재조합 단백질의 생산, 추출 및 정제 방법 |
| CN103882015B (zh) * | 2013-12-17 | 2015-12-02 | 吉林省奇健生物技术有限公司 | 一种高效表达人生长激素的重组工程菌及构建方法和应用 |
-
2017
- 2017-10-08 EA EA201791989A patent/EA035207B1/ru unknown
-
2018
- 2018-04-12 WO PCT/RU2018/050040 patent/WO2019070162A1/ru active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2233879C1 (ru) * | 2002-12-17 | 2004-08-10 | Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина |
| RU2465315C1 (ru) * | 2011-08-08 | 2012-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Амбер" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPBS-St9, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СОМАТОТРОПИНА, И ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ДЛЯ ПРОДУКЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПИНА |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DETABASE GenBank: 1HWH_A, 10.10.2012 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201791989A1 (ru) | 2019-04-30 |
| WO2019070162A1 (ru) | 2019-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ284204B6 (cs) | Zvyšování sekrece polypeptidů | |
| JPH04502916A (ja) | 精製した毛様体神経栄養因子 | |
| WO2007107882A2 (en) | Method for purifying granulocyte-colony stimulating factor | |
| CN113121704B (zh) | 基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗 | |
| ES2284677T3 (es) | Superproduccion de proteinas y peptidos biologicamente activos dependiente de fago. | |
| CN112745385A (zh) | 重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用 | |
| CA1341015C (en) | Outer membrane protein f of pseudomonas aeruginosa | |
| CN111925452A (zh) | 猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
| CN111808176A (zh) | 牛疱疹病毒抗原组合物及其应用 | |
| CN111303275A (zh) | 一种重组人生长激素及其制备方法与药物应用 | |
| CN111378638A (zh) | 幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法 | |
| KR20030045032A (ko) | 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자의제조방법과 맥관형성 촉진을 위한 그 용도 | |
| Gingras et al. | Molecular cloning and characterization of a radial spoke head protein of sea urchin sperm axonemes: involvement of the protein in the regulation of sperm motility | |
| EA035207B1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET-21a(+) - ПРОДУЦЕНТ СОМАТОТРОПИНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО МОНОМЕРНОЙ ФОРМЫ | |
| RU2453602C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pЕТ22b(+)/SLURP-1, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-1, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)/SLURP-1-ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-1 ЧЕЛОВЕКА | |
| CN114989266A (zh) | 一种非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫抑制相关氨基酸位点及其应用 | |
| CN110819645B (zh) | 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用 | |
| JP2002503106A (ja) | 細菌フェロモンおよびその使用 | |
| CN115975969A (zh) | 转氨酶及用于制备西他列汀或其中间体的用途 | |
| KR100241182B1 (ko) | 인간 성장호르몬의 발현벡터 및 그를 이용한 인간 성장호르몬의 제조방법 | |
| RU2728237C1 (ru) | Генетическая конструкция, кодирующая предшественник белка YB-1 человека, штамм Escherichia coli - продуцент предшественника белка YB-1 человека, способ микробиологического синтеза этого предшественника | |
| RU2583307C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/slurp-2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-2, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3) pET22b(+)/slurp-2- ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-2 ЧЕЛОВЕКА | |
| CN113957026B (zh) | 一种用于生产重组人IL-1ra的工程菌株及制备方法和应用 | |
| RU2512527C2 (ru) | ИСКУССТВЕННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА, ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pJZZ-A, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА В Escherichia coli И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pJZZ-A-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека |