EA032051B1

EA032051B1 - Способ идентификации в микробиомах и отдельных бактериальных геномах композиции бактериальных генов, участвующих в синтезе и метаболизме различных нейроактивных соединений

Info

Publication number: EA032051B1
Application number: EA201700159A
Authority: EA
Inventors: Ольга Викторовна АВЕРИНА; Валерий Николаевич ДАНИЛЕНКО; Алексей Сергеевич Ковтун
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2019-03-29
Also published as: EA201700159A1

Abstract

Изобретение относится к способу идентификации бактериальных генов, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений в микробиомах и отдельных геномах бактерий, в частности в микробиоме кишечника человека. Может быть использовано в медицине, медицинской микробиологии и неврологии. В способе используется набор из 45 пар олигонуклеотидов (праймеров) для ПЦР анализа общей геномной ДНК. Праймеры подобраны к десяти ключевым генам, кодирующим ферменты, участвующие в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений: серотонина, дофамина, гистамина, мелатонина, гамма-аминомасляной кислоты, тирамина, спермидина, масляной кислоты, газотрансмиттера NO, выявленные в геномах 27 доминирующих видов бактерий кишечной микробиоты человека. Разработанные пары праймеров можно использовать для отдельного поиска выборочных генов нейроактивных соединений в отдельных геномах бактерий и для мониторинга целого микробиома. Предлагаемые наборы пар праймеров можно применять в качестве диагностических систем для исследования микробиоты в норме и при патологиях. Праймеры сконструированы таким образом, что их можно использовать для определения уровня транскриптов отдельных генов с применением метода ПЦР анализа в режиме реального времени.

Description

Изобретение относится к способам идентификации бактериальных генов нейроактивных соединений в метагеномах кишечника человека и в отдельных бактериальных геномах.

В последние десятилетия проведены многочисленные научные и клинические исследования микробного сообщества человека. Было выявлено, что ключевую роль в поддержании общего гомеостаза организма и здоровья человека играет кишечная микробиота. Общий геном бактерий кишечника микробиом включает 400 тыс. генов, что в 12 раз больше генома человека [Eckburg P.B. et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 2005; 308: 1635-1638]. Структура и состав микробиоты кишечника отражают природный отбор обоих: микроба и человека через комплекс конкурентных и симбиотических взаимосвязей и зависят от большого числа факторов. Кишечную микробиоту, также, рассматривают как эндокринный орган за способность производить сотни, если не тысячи гуморальных агентов [Brown J. M. Et al.The gut microbial endocrine organ: bacterially-derived signals driving cardiometabolic diseases. Annu Rev Med. 2015. 66: 343-359]. У здорового человека микробиота кишечника сбалансирована и поддерживает общий гомеостаз организма. Изменения в биоразнообразии и высокая временная нестабильность микробиоты характерны для ряда желудочно-кишечных заболеваний, болезней обмена веществ, неврологических заболеваниях и других патологий [Young V.B. The intestinal microbiota in health and disease. Opin Gastroenterol. 2012. 28: 63-69]. В настоящее время рассматривается влияние микробиоты кишечника на функционирование оси мозг-кишечник, опосредующей двунаправленную коммуникацию между ЦНС и энтеральной нервной системой кишечника, что расширяет ее до оси микробиотакишечник-мозг (ОМКМ). Эта ось представляет уже сложную сеть коммуникаций между самим кишечником, кишечной микробиотой и мозгом и охватывает функции иммунной, эндокринной, нервной систем и неспецифического природного иммунитета [Mayer E.A. Gut feelings: the emerging biology of gutbrain communication. Nat. Rev. Neurosci. 2011. 12: 453 - 466; Bravo J. A. et al. Communication between gastrointestinal bacteria and the nervous system. Current Opinion in Pharmacology. 2012. 12: 667-672; Stilling R.M. et al. Microbes do have a significant impact on epigenetic regulation in the host's gut epithelium and immune system, Microbial genes, brain & behaviour-epigenetic regulation of the gut-brain axis. Genes Brain Behav. 2014. 13: 69-86]. Через сложную систему интерактивных и симбиотических сигнализаций между хозяином и микроорганизмами кишечная микробиота участвует в регуляции нейро-химических и нейрометаболических процессов и имеет влияние на многие фундаментальные аспекты центральной нервной системы, включая реакции на стресс, рост и выживание нейронов, пластичность, экспрессию рецепторов и нейротрансмиссию [Heijtz R.D. et al. Normal gut microbiota modulates brain development and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. 108: 3047-3052; Tillisch K. The effects of gut microbiota on CNS function in humans. Gut Microbes. 2014. 5(3): 404-410]. Важный механизм связи между кишечной микробиотой и ЦНС реализуется через взаимодействие низкомолекулярных метаболитов бактерий, входящих в состав нормального микробиоценоза, с чувствительными (сенсорными) нервными окончаниями в области синапса их с эпителиальными клетками слизистой кишечника, проводя висцеральные сообщения из кишечника в мозг [De Vadder F. et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 2014. 156: 84-96]. Нейромедиаторы, продуцируемые в достаточном количестве, и другие молекулы микробного происхождения, имеют потенциал модуляции активности блуждающего нерва - основного нерва, соединяющего ЭНС с ЦНС, и впоследствии влиять на функции головного мозга. Также, секретируемые бактериями нейромодуляторы стимулируют специфические эпителиальные клетки кишечника к высвобождению молекул, модулирующих нейропередачу в энтеральной нервной системе, впоследствии оказывая влияние на мозг и поведение человека. [Grenham S. Et al. Brain-gut-microbe communication in health and disease. Front Physiol. 2011; 2: 1-15; Khanna S. et al. A clinician's primer on the role of the microbiome in human health and disease. Mayo Clin. Proc. 2014. 89: 107-114; Yano J.M. et al. Indigenous bacteria from the gut microbiota regulate host serotonin biosynthesis. Cell. 2015. 161: 264-276]. Известна способность некоторых представителей кишечной микробиоты человека синтезировать и секретировать различные нейроактивные вещества, в том числе нейромедиаторы и гормоноподобные соединения. Изучением этой способности и связей между микробиотой и ЦНС занимается новая область науки - микробная эндокринология. [Lyte M. The role of microbial endocrinology in infectious disease. J. Endocrinol. 1993. 137: 343-345]. У ряда бактерий выявлена способность синтезировать серотонин, дофамин, норадреналин, ацетилхолин и другие холины, гистамин и другие амины [Roshchina V.V. Evolutionary considerations of neurotransmitters in microbial, plant and animal cells. In:

Lyte M., Freestone P.P., editors. Microbial endocrinology, interkingdom signaling in infectious disease and health. New York: Springer. 2010. P. 17-52; Clarke G. et al. Gut microbiota: the neglected endocrine organ. Mol. Endocrinol. 2014. 28: 1221-1238; Lyte M. et al. Microbial Endocrinology: The Microbiota-Gut-Brain Axis in Health and Disease. Book. Series: Advances in Experimental Medicine and Biology, Subseries: Microbial Endocrinology. 2014. 817: 436; Oleskin A.V. et al. Role of neuromediators in the functioning of the human microbiota: business talks among microorganisms and the microbiota-host dialogue. Microbiolog. 2016. 85(1): 325]. Важные комменсалы кишечной микробиоты бифидобактерии и лактобациллы способны метаболизировать глутамат (наиболее распространенный возбуждающий нейротрансмиттер) в гаммааминомасляную кислоту [Barrett E. et al. γ-Aminobutyric acid production by culturable bacteria from the human intestine. J. Appl Microbiol. 2012. 113(2): 411-417; Yunes R.A et al. GABA production and structure of

- 1 032051 gadB/gadC genes in Lactobacillus and Bifidobacterium strains from human microbiota, Anaerobe. 2016. 42: 197-204]. Кроме нейротрансмитеров бактерии в кишечнике способны производить ряд биологически активных соединений, оказывающих различное действие на нервную систему. Например, было показано, что некоторые бактерии способны вырабатывать полиамин - спермидин, который способен оказывать благотворное влияние на память [Eisenberg Т. et al. Induction of autophagy by spermidine promotes longevity. Nat Cell Biol. 2009. 11(11): 1305-1314; Gupta V.K. et al. Restoring polyamines protects from age-induced memory impairment in an autophagy dependent manner. Nat Neurosc 2013].

Кишечные бактерии могут продуцировать нейромедиатор - тирамин. Lactobacillus brevis и Enterococcus species способны декарбоксилировать тирозин в тирамин [Lucas P. et al. The tyrosine decarboxylase operon of Lactobacillus brevis IOEB 9809: characterization and conservation in tyramine-producing bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 2003. 229: 65-71]. Аминокислоты микробного происхождения участвуют в образовании нервных клеток, улучшают проводимость и возбудимость нейронов [Sharon G. et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Cell Metabolism. 2014. 20: 719-730]. Среди продуцентов микробных аминокислотных нейромедиаторов наиболее важными являются лактобактерии и бифидобактерии, являющиеся ценными пробиотиками [Oleskin A.V. et al. Role of neuromediators in the functioning of the human microbiota:business talks among microorganisms and the microbiota-host dialogue. Microbiolog. 2016. 85(1): 3-25].

Оксид азота, образуемый в результате метаболизма бактерий, играет важную роль в межклеточной передаче сигнала, являясь газотрансмиттером. Участвует в регуляции моторной активности кишечника и активно влияет на нервную проводимость в кишечнике [CulottaD.E. et al. NO news is good news. Science. 1992. 258:1862-1865]. Кишечные бактерии являются ключевым источником короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), таких как масляная, пропионовая, уксусная и другие кислоты. Хотя эти вещества не являются классическими нейроактивными соединениями, они действуют на функционирование нейронов другим путем. Наиболее активной является масляная кислота, которая действует как мощный ингибитор деацетилаз и влияет на экспрессию нейротрофического фактора в гиппокампе [Davie J.R. Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate . J. Nutr. 2003.133: 2485-2493].

На различных моделях животных неоднократно было показано влияние микроорганизмов на состояние тревожности, депрессии и различных аспектов когнитивной функции [Desbonnet L.et al.. The probiotic Bifidobacteria infantis: An assessment of potential antidepressant properties in the rat. J. Psych. Research. 2009. 43:164-174; Perez-Burgos A. et al. Psychoactive bacteria Lactobacillus rhamnosus (JB-1) elicits rapid frequency facilitation in vagal afferents. Am J. Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2013. 304: 211 -220]. На группе здоровых волонтеров в условиях клиники было апробировано влияние приема пробиотической смеси (Lactobacillus helveticus и Bifidobacterium longum) в течение 30 дней на такие поведенческие проявления как беспокойство и депрессия. У испытуемых пациентов было отмечено улучшение психического состояния [Messaoudi et al. Beneficial psychological effects of a probiotic formulation Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 in healthy human volunteers. Gut Microbes. 2011. 2(4): 256261].

Изменения состава и количества симбиотической микробиоты могут сопровождаться нарушениями развития и функций мозга, ответственных за поведенческие процессы. В то же время нервнопсихические и поведенческие изменения могут приводить к стабильной или обратимой модификации структуры кишечной микробиоты и, как следствие, к нарушению продукции ею соответствующих гормонов и медиаторов, регулирующих активность тех или иных участков мозга [StillingR.M. et al. Microbes do have a significant impact on epigenetic regulation in the host's gut epithelium and immune system, Microbial genes, brain & behaviour-epigenetic regulation of the gut-brain axis. Genes Brain Behav. 2014. 13: 69-86].

Для исследования и мониторинга состояния микробиоты кишечника в настоящее время используется комплекс современных подходов, основанных на метагеномных, протеомных, метаболомных и биоинформатических технологиях. Микробиом кишечника (совокупность генов всех микроорганизмов микробиоты кишечника) изучается с помощью высокотехнологичных методов секвестрования. С помощью генетических платформ типа GS FLX (Roche), HiSeq 2000 (Illumina), SOLiD™ 4 System (Applied Biosystems) проводятся глубокие исследования микробиома на основании анализа секвенированных генов 16S рРНК и других генов микроорганизмов, что позволяет получать более целостную картину взаимодействия представителей кишечного микробиоценоза с организмом хозяина. Важной целью изучения микробиома кишечника является исследование динамики изменений композиции кишечной микробиоты в норме и при патологии, а также поиск ассоциаций с развитием различных состояний и заболеваний. Новые технологии метагеномного анализа микробиома человека создали огромные предпосылки и большие надежды в изучении связи микробиота-кишечник-мозг. К настоящему времени собран огромный массив данных метагеномных исследований кишечной микробиоты людей в норме и при различных патологиях, проживающих в различных регионах мира, который доступен в различных хранилищах информации, в Национальном Центре Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) и в других ресурсах. Создан каталог генов микробиома кишечника взрослого человека [Qin J. et al. A human gut microbial gene cataloque established by HMP Consortium. Nuture. 2010. 464: 59-67]. Исследована первичная кишечная микробиота детей и сформирован каталог генов кишечного микробиома ре- 2 032051 бенка [Gritz E.C. et al. The human neonatal gut microbiome; a brief review. Frontiers in Pediatrics. 2015. 3(17):

1-12]. Однако отдельной доступной информации о бактериальных генах, кодирующих нейроактивные соединения, в составе кишечных метагеномов пока не было представлено.

Задачей данного изобретения является разработка способа быстрой молекулярно-генетической идентификации в исследуемых микробиомах и бактериальных геномах ключевых функциональных бактериальных генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе и метаболизме ряда нейроактивных соединений: серотонина, дофамина, гистамина, мелатонина, гамма-аминомасляной кислоты, тирамина, спермидина, масляной кислоты, газотрансмиттера NO.

В заявленном изобретении предложен разработанный набор праймеров, подобранных к десяти ключевым генам нейроактивных соединений, выявленных в геномах доминирующих видов бактерий кишечной микробиоты человека, для ПЦР анализа общей геномной ДНК микробиома.

Предлагаемые олигонуклеотиды и способ идентификации генов имеют преимущества по сравнению с применением дорогостоящих методов секвенирования общей геномной ДНК бактерий и дальнейшего метагеномного анализа с использованием различных биоинформатических программ, и могут быть использованы в любой современной клинической лаборатории, имеющей приборы для амплификации ДНК. Предлагаемый методический подход позволяет проводить мониторинг метаболического потенциала микробиоты кишечника человека как в норме, так и патологиях, связанных с нервно-психическими нарушениями.

Техническим результатом изобретения является возможность быстро и точно проводить в режиме ПЦР, ПЦР в реальном времени анализ количественного содержания бактериальных генов, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений, в исследуемом микробиоме. Также, техническим результатом является простота в исполнении, надежность, потребность в небольшом количестве исследуемого материала.

Указанный технический результат достигается за счет того, что предложен способ идентификации в микробиомах и отдельных бактериальных геномах композиции бактериальных генов, участвующих в синтезе и метаболизме различных нейроактивных соединений, и характеризующийся тем, что для идентификации проводят амплификацию бактериальной геномной ДНК с использованием наборов разработанных 45 пар олигонуклеотидов, представленных в табл. 4, подобранных к десяти ключевым генам нейроактивных соединений, представленных в табл. 1, выявленных в геномах 27 видов бактерий, представленных в табл. 5, причем ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, размер полученного продукта, указанного в табл. 4, определяют с помощью ДНК-маркера.

1. Отбор доминирующих видов бактерий кишечной микробиоты человека.

В последние годы для исследования и мониторинга состояния микробиоты кишечника используется комплекс современных подходов, основанных на метагеномных, метаболомных и биоинформатических технологиях. С помощью анализов большого количества метагеномов кишечной микробиоты от различных здоровых людей, выполненных в различных лабораториях мира, было выявлено значительное филогенетическое разнообразие в составе кишечной микробиоты, однако, с доминированием ряда филов, родов и даже, видов бактерий [Arumugam M. et al. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature. 2011. 473: 174-180; Schloissnig S. et al. Genomic variation landscape of the human gut microbiome. Nature. 2013. 493: 45-50]. Предполагается, что метаболиты и структурные компоненты доминирующих бактерий могут оказывать существенное влияние, как на иммунную, так и нервную систему человека. Нами было отобрано 32 рода бактерий, относящиеся к доминирующим филам: Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, наиболее представленные в составе кишечной микробиоты здорового человека. Далее, был составлен список видов бактерий, которые превалировали в кишечной микробиоте здорового взрослого человека и чаще встречались в составе первичной кишечной микробиоте здорового ребенка первого года жизни. Доступные в базе данных NCBI геномы бактерий этих видов были использованы для поиска генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений.

2. Создание каталога бактериальных генов нейроактивных соединений.

Поиск ключевых бактериальных ферментов, участвующих в синтезе и деградации нейроактивных соединений проводили с использованием широкого анализа доступной научной литературы и анализа метаболических путей известных нейроактивных соединений (нейротрасмиттеров), представленных в базе данных KEGG PATHWAY http://www.genome.jp/kegg/pathway.html, С помощью базы данных NCBI был создан каталог из 59 бактериальных генов, продукты которых участвуют в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений. Из этого каталога были отобраны 10 наиболее важных генов, кодирующих белки, участвующие в синтезе и метаболизме: серотонина, дофамина, гистамина, гамма-аминомасляной кислоты, нейромедиаторных аминокислот, спермидина, короткоцепочечных жирных кислот, газотрансмиттера NO (табл. 1 (пример 1)).

3. Отбор представителей родов бактерий кишечной микробиоты, содержащих наибольшее количество ключевых генов нейроактивных соединений.

Для отбора бактериальных родов, содержащих наибольшее количество генов, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений, был проведен метагеномный анализ кишечной микробиоты здорового человека. Анализ проводился с использованием программы NEUROHUNTER

- 3 032051 (https://github.com/Alexey-Kovtun/Neurohunter/tree/master) и каталога ортологов отобранных генов нейроактивных соединений, разработанные авторами изобретения.

На первом этапе был проанализирован собранный метагеном. Для этого из базы данных консорциума Human Microbiome Project (http://hmpdacc.org/) были взяты геномы 508 бактерий, изолированные из микробиоты кишечника здорового человека. Из всех доступных контигов (22342) был составлен общий метагеном. С помощью программы NEUROHUNTER этот метагеном был проанализирован с настройкой минимального порога идентичности 60%. Такой порог позволяет определять гомологичные аминокислотные последовательности в геномах бактерий одного рода. В результате анализа было идентифицировано 57 генов из 59 анализируемых. Не были найдены только два гена, кодирующие ферменты фенилаланин-4-гидроксилазу и тирозин гидроксилазу.

На втором этапе было проанализировано 148 метагенома из базы данных консорциума Human Microbiome Project (http://hmpdacc.org/). Анализ проводился также с помощью программы NEUROHUNTER с настройкой минимального порога идентичности 60%. В результате анализа было идентифицировано 52 гена из 59 анализируемых. Не удалось идентифицировать гены, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе дофамина, серотонина, мелатонина, тирамина и NO. Обобщенный результат метагеномного анализа приведен в табл. 2.

С помощью используемой программы также были определены рода бактерий, в которых исследуемые гены встречались наиболее часто (рисунок 1). Из них были отобраны восемь родов бактерий: Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Escherichia, Eubacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus (таблица 3), у представителей которых был проведен поиск десяти ключевых генов для нейроактивных соединений.

4. Разработка олигонуклеотидов к ключевым генам, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений, выявленных у различных видов бактерий кишечной микробиоты человека.

Секвенирование геномов бактерий, как отдельных штаммов, так и входящих в состав микробиома (метагенома), является дорогостоящей процедурой. Поэтому, для удешевления анализа кишечных метагеномов, мы предлагаем использование метода ПЦР анализа. Для поиска генов нейроактивных соединений в исследуемых образцах ДНК с помощью этого метода нами были разработаны специфические олигонуклеотиды (праймеры), подобранные к генам бактерий различных видов. Используя базу данных NCBI, в доступных геномах наиболее распространенных видов бактерий отобранных восьми родов (таблица 3) был проведен поиск 10 наиболее важных генов нейроактивные соединения (таблица 1). Это гены, кодирующие дофа-декарбоксилазу, тирозин-декарбоксилазу, тирозин-гидроксилазу, гистидиндекарбоксилазу, глутамат-декарбоксилазу, моноамин-оксидазу, бутирил-СоА-дегидрогеназу, спермидин-синтазу, синтазу оксида азота, серотонин N-ацетилтрансферазу. Все гены, выявленные в геномах различных бактерий, указаны в таблице 4. Для поиска ортологов к генам использовали программу Microbial Nucleotide BLAST (blastn). Оказалось, что некоторые гены - ортологи из различных штаммов, относящихся к одному виду, содержат нуклеотидные полиморфизмы, поэтому, олигонуклеотиды подбирались к их консервативным участкам. Специфические праймеры подбирали с помощью программы Primer3Plus (ht1p://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3manager.cgi) с учетом размера образуемого фрагмента и температуры отжига. Образуемый праймерами продукт не должен был превышать 250 п.н., что важно для использования данных праймеров при ПЦР анализе кДНК микробиоты в режиме реального времени. Для всех праймеров температура отжига составляла 58°. Всего было разработано 50 пар праймеров (табл. 4), подобранных к генам из геномов 27 видов бактерий (табл. 6) доминирующих родов. Праймеры были сгруппированы в пять наборов (табл. 5). Три набора включают пары праймеров к различным генам и два набора содержат пары праймеров, подобранные к одному гену. Была проведена биоинформатическая валидация качества разработанных праймеров с использованием каталога генов метагеномов кишечника человека (http://meta.genomics.cn/meta/home). Нуклеотидные последовательности праймеров объединяли в fasta-файл, в который вошло 90 нуклеотидных последовательностей, включая реверс-комплементарные. Далее, с помощью программы bowtie2 последовательности праймеров были картированы на нуклеотидные последовательности генов из каталога. Праймеры картировались на нуклеотидные последовательности аналогичных генов.

Осуществление изобретения

Идентификация отобранных 10 генов (табл. 1), участвующих в синтезе и метаболизме различных нейроактивных соединений, как в исследуемых кишечных метагеномах, так и в отдельных бактериальных геномах, осуществляется с помощью ПЦР анализа исследуемой ДНК с использованием разработанных пар праймеров (таблица 4).

Для быстрого выделения бактериальной общей геномной ДНК из образцов кала используют коммерческий набор QIAamp® Fast DNA Stool Mini kit (Qiagen, Германия), следуя инструкции производителя. Выделение геномной ДНК из анализируемого штамма бактерии проводят в соответствии с инструкцией производителя коммерческого набора Bacterial Genomic DNA Isolation Kit (Qiagen, Promega, Norgen).

Далее, ПЦР анализ исследуемых образцов ДНК проводят с применением специальных наборов для проведения ПЦР анализа на приборе - амплификаторе. Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл

- 4 032051

10хПЦР буфера (10Х High Fidelity PCR Buffer с 15 mM MgCl₂), 10 мкл смеси 2mM dNTPs, 5 мкл DMSO, 0.3 мкг геномной ДНК и 1 мкл (1.25 и) фермента. Олигонуклеотидные праймеры в паре добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси. Параметры ПЦР реакции: 95°С в течение 5 мин (лизис клеток и денатурация геномной ДНК); затем 35 циклов амплификации - 94°С - 1 мин (денатурация), 58°С в течение 50 с (отжиг олигонуклеотидов), 72°С - 40 с, (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагментов при 72°С - 10 мин, хранение при 4°С.

Результаты амплификации учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 1% агарозном геле. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye (Fermentas), перемешивают и 10 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в камере для горизонтального электрофореза. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на трансиллюминаторе. В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер GeneRuler™ 50+ п.н. (Fermentas).

Оценка результатов

Результатом ПЦР анализа исследуемых образцов ДНК с использованием разработанных праймеров является наличие ПЦР продукта необходимого размера (табл. 4) для каждой пары праймеров, выявленные методом электрофореза в 1% агарозном геле.

Пример 1. Формирование каталога бактериальных генов и их продуктов, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений.

С помощью доступных научных литературных источников и баз данных KEGGPATHWAY http://www.genome.jp/kegg/pathway.html, были проанализированы метаболические пути синтеза и деградации различных нейроактивных веществ у бактерий и отобраны ключевые ферменты, участвующие в этих процессах. И с помощью базы данных NCBI создан каталог, в который вошли 59 генов, кодирующие эти ферменты. Из этого списка генов были отобраны наиболее важные гены, кодирующие белки, участвующие в синтезе и метаболизме: серотонина, дофамина, гистамина, мелатонина, гаммааминомасляной кислоты, тирамина, спермидина, масляной кислоты, газотрансмиттера NO (табл. 1).

Пример 2. Отбор доминирующих родов бактерий кишечной микробиоты, содержащих наибольшее количество ключевых генов нейроактивных соединений.

Для отбора доминирующих родов бактерий использовались опубликованные данные метагеномного анализа кишечной микробиоты здоровых людей, выполненные в различных лабораториях мира. В основном, опирались на работы по изучению видового биоразнообразия кишечной микробиоты здорового человека [Arumugam M, et al. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature. 2011; 473: 174-180; Schloissnig S. et al. Genomic variation landscape of the human gut microbiome. Nature. 2013; 493:45-50] и где использовалась большая выборка анализируемых метагеномов (более 260 метагеномов). В результате анализа было отобрано 32 рода бактерий, относящихся к доминирующим филам: Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria. Далее отбирались рода бактерий кишечной микробиоты, содержащие наибольшее количество ключевых генов нейроактивных соединений. Для этого был проведен метагеномный анализ кишечной микробиоты здоровых людей. Анализ проводился с помощью программы NEUROHUNTER (https://github.com/Alexey-Kovtun/ Neurohunter/tree/master) и созданного каталога ортологов к отобранным генам нейроактивных соединений, разработанные авторами изобретения. На первом этапе был проанализирован собранный метагеном. Для этого из базы данных консорциума Human Microbiome Project (http://hmpdacc.org/) были взяты геномы 508 бактерий, изолированные из микробиоты кишечника здорового человека. Из всех доступных контигов (22342) был составлен общий метагеном. С помощью разработанной программы этот метагеном был проанализирован с настройкой минимального порога идентичности 60%. Такой порог позволяет определять гомологичные аминокислотные последовательности в геномах бактерий одного рода. В результате анализа было идентифицировано 57 генов из 59 анализируемых. Не были найдены только два гена, кодирующие ферменты фенилаланин-4гидроксилазу и тирозин гидроксилазу.

На втором этапе были проанализированы 148 метагеномов из базы данных консорциума Human Microbiome Project (http://hmpdacc.org/). Анализ проводился также программой NEUROHUNTER с настройкой минимального порога идентичности 60%. В результате анализа было идентифицировано 52 гена из 59 анализируемых. Не удалось идентифицировать гены, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе дофамина, серотонина, мелатонина, тирамина и NO. Обобщенный результат метагеномного анализа приведен в табл. 2.

С помощью используемой программы были определены рода бактерий, в которых исследуемые гены встречались наиболее часто (рисунок 1). Из них нами было отобрано восемь доминирующих рода бактерий: Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Escherichia, Eubacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Streptococcus (таблица 3).

Пример 3. Разработка олигонуклеотидов к ключевым генам, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений, выявленных у различных видов бактерий кишечной микробиоты.

Используя базу данных NCBI, в доступных геномах наиболее распространенных видов бактерий

- 5 032051 отобранных восьми родов (таблица 3), был проведен поиск 10 ключевых генов, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений (таблица 1). Это гены, кодирующие дофа-декарбоксилазу, тирозин-декарбоксилазу, тирозин-гидроксилазу, гистидин-дёкарбоксилазу, глутамат-декарбоксилазу, моноамин-оксидазу, бутирил-СоА-дегидрогеназу, спермидин-синтазу, синтазу оксида азота, серотонин Nацетилтрансферазу. Все гены, выявленные в геномах бактерий, относящихся к 27 различным видам (таблица 5), указаны в табл. 4. Для поиска ортологов к генам использовали программу Microbial Nucleotide BLAST (blastn). Оказалось, что некоторые ортологи из различных штаммов, принадлежавших одному виду, содержали нуклеотидные полиморфизмы, поэтому, олигонуклеотиды (праймеры) подбирались к их консервативным участкам. Специфические праймеры подбирали с помощью программы Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3manager .cgi) с учетом размера образуемого фрагмента и температуры отжига. Образуемый праймерами продукт не должен был превышать 250 п.н., что важно при использовании праймеров для ПЦР анализа кДНК микробиоты в режиме реального времени. Для всех праймеров температура отжига составляла 58°. Всего было разработано 45 пар праймеров, включающие прямые и обратные олигонуклеотиды, которые указаны в табл. 4. Отдельный список нуклеотидных последовательностей всех ПЦР продуктов, образуемых праймерами, прилагается.

Праймеры были сгруппированы в шесть наборов (табл. 6). В каждый набор входят праймеры к генам из различных геномов, но кодирующих один фермент. Три набора включают пары праймеров к различным генам и два набора содержат пары праймеров, подобранные к одному гену.

ПЦР анализ исследуемых образцов ДНК с использованием разработанных праймеров проводят с применением специальных наборов для проведения ПЦР анализа на приборе - амплификаторе. Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл 10хПЦР буфера (10Х High Fidelity PCR Buffer with 15 mM MgCl₂), 10 мкл смеси 2mM dNTPs, 5 мкл DMSO, 0.3 мкг геномной ДНК и 1 мкл (1.25 и) фермента. Олигонуклеотидные праймеры добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси. Параметры ПЦР реакции: 95°С в течение 5 мин (лизис клеток и денатурация геномной ДНК); затем 35 циклов амплификации - 94°С - 1 мин (денатурация), 58°С в течение 0.5 мин (отжиг олигонуклеотидов), 72°С - 40 с. (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагментов при 72°С - 10 мин, хранение при 4°С. Результаты амплификации учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 1% агарозном геле. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye (Fermentas), перемешивают и 10 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в камере для горизонтального электрофореза. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на трансиллюминаторе. В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер GeneRuler™ 50+ п.н. (Fermentas).

Пример 4. Биоинформатическая валидация разработанных праймеров.

Была проведена биоинформатическая валидация качества разработанных праймеров с использованием каталога генов метагеномов кишечника человека http://meta.genomics.cn/meta/home). Нуклеотидные последовательности праймеров объединяли в fasta-файл, в который вошло 90 последовательностей, включая реверс-комплементарные. Далее, с помощью программы bowtie2 последовательности праймеров были картированы на нуклеотидные последовательности генов из каталога. Праймеры картировались на нуклеотидные последовательности аналогичных генов.

а) Таблицы.

Таблица 1. Список ключевых ферментов, кодируемых бактериальными генами, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений

№	Кодируемый белок	Функция	Нейроактивное соединение
Биогенные амины и их предшественники
1	Т ирозин-гидроксилаза	Синтез дофамина	Дофамин
2	Дофа-декарбоксилаза	Синтез дофамина и серотонина	Дофамин, серотонин
3	Моноамин-оксидаза	Метаболизм дофамина, норадреналина и серотонина	Дофамин, норадреналин, серотонин
4	Г лутамат-декарбоксилаза	Синтез ГАМК	ГАМК
5	Г истидин-декарбоксилаза	Синтез гистамина	Гистамин
6	Серотонин Nацетилтрансфераза	Метаболизм серотонина для последующего синтеза мелатонина	Мелатонин
7	Спермидин-синтаза	Синтез спермидина	Спермидин
Жирные кислоты
8 ¹	1 Бутирил-СоА-дегидрогеназа	\| Синтез масляной кислоты	\| Масляная кислота
Г азотрансмиттер
9 \| Синтаза оксида азота	\| Синтез NO	\| NO
Нейромедиаторные аминокислоты
10 \| Тирозин-декарбоксилаза	\| Синтез тирамина	\| Тирамин

- 6 032051

Таблица 2. Распределение генов для 59 ферментов по частоте их встречаемости в собранном метагеноме и 148 метагеномах из базы данных

> 90%¹ 148 метагеномов & собранного метагенома	10-90% 148 метагеномов & собранного метагенома	<10% 148 метагеномов & собранного метагенома	Отсутствуют
Г лутаматдекарбоксилаза, γ-аминобутират антипортер, Серотонин Nацетилтрансфераза, Фосфолипаза А2, Фосфотрансацетилаза, Бутирил-СоАдегидрогеназа, Г лутатионпероксид аза, Каталаза, Супероксиддисмутаза, Холоилглицингидролаза, Спермидинсинтаза, Аминодеоскихоризматсинтаза, субъединица 1, Аминодеоскихоризмат-	Моноаминоксидаза, Гистидиндекарбоксилаза, Ацетилсеротонин Ометилтрансфераза, Триптофан-2,3диоксигеназа, Кинуренин-3 монооксигеназа, Хинолинатфосфорибозилтрансфераза, Изомераза линолевой кислоты, путь синтеза ВI², путь синтеза В2, путь синтеза В6, путь синтеза В7³	Допадекарбоксилаза⁴, Синтаза оксида азота⁴, Кинурениназа⁴, Гистамин Nметилтрансфераза⁴, /3 субъединица никотинового ацетилхолинового рецептора, Пропионил-СоА-синтетаза, Тирозиндекарбоксилаза⁴, Глутатионредуктаза, Глутатион-8-трансфераза, Транскрипционный активатор tenA, Опероновый репрессор биотина⁴	Фенилаланин-4гидроксилаза, тирозингидроксилаза
синтаза, субъединица 2

¹ - фермент найден в > 90% 148 метагеномов,

- найден полный путь синтеза, за исключением транскрипционного активатора tenA, ³ - найден полный путь синтеза, за исключением оперонового репрессора биотина, ⁴ - фермент найден только в собранном метагеноме.

Таблица 3. Список родов бактерий, для которых в исследуемых метагеномах было выявлено наибольшее количество генов нейроактивных соединений

Филы	Рода
Bacteroidetes	Bacteroides
Firmicutes	Clostridium Enterococcus Eubacterium Lactobacillus Streptococcus Ruminococcus
Actinobacteria	Bifidobacterium
Proteobacteria	Escherichia

- 7 032051

Таблица 4. Олигонуклеотиды для поиска в геномах и метагеномах бактериальных генов, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений

г tnmcutes

PrateQQscterifi

Lwaiaw г irmicwes

E. fasciwm

±. Ыгсдщ·

1'

E memopniaK

TGC GTAGGC GTTAC AACTTC

25. iragili:

Fmiiit-Kez

Ε. faeciura

Prtfe&bacKria sfacferoideigs

Б fra^ilE

Fii'micure^ ? A.v-1·;

май®

Pror&zpacTsria

C. spor&psnes

г. Ль’пшя

L piiirwum

Б.

И. »йя

Д а.чгъ'ЛтГ&та

-1ΓΓ7??.Ώ.5ΛΓ>':-·?λ

Ωί- .4'··· _ϊ? IT

CAGGTCCAGCATCACGTCT,'

CGCCAGATACAAAGAC.ACCA

AGCGC GTGTAC TCCATCAGT

T AC TGC ААСАСААССТСАС-С

GC TGCTIGGAGC GTAAGAAC ‘

CGGTGACGGAGGTGTATCA

CTGAAGAGGCTGA TAG ACC 4

TCATCC AGCAACACCATACC

C GGACTTCAAAC CCAATACC

CGTGAAAGGAAGCATTTAC GG

GCTGGCACGCAATACAGTTA

CTCCGT AATCCTGCCGTTG

GGC GATATGCAGTCACACCT

CGAGC GGGTGC ATATTTAC T'

CT GGAAGGGAATGGTGATGT'

CGlGGAGATTGACCAGAAGA

C GATTGAAGCС CC GACTAACT

TGC GTGCTCIATTGGCGTAT.

caaggaaccatctgcgacaa

CGCTAAGAGAACGAATGGAG i

GCTTC TTGTAAGTGAGCATGC

GCTG TGC AAGTG^AGGATGTL'

CC GTTGTTC GTGGGTATTC T

TGAACTC AC TGC C GATT C TG

C-CTTGGTCGAGATCGTGAAT

AATCC. C.TGAC GAAC AAC GAG'

TAGCG-A4GAT GGTTC CGTTC

GAGC GCAC AAAAGAAGTAGC

GATGC TGGTGTATGGGAAAC

CATCGGAACGTC CAC CATC

CAAGAAC ACCACC AGC ATCC

GCAC C TGATGACGAACACTT.·

GATAGCCAGCC GAAATAAC G

C AAGGAACC ATCTGC GAGAA

ATGCCTGCTCTATTGGC GT A

GTAGCT TI GAT GGGC GAT TG

GCTCCC GTTACAAATGTTC C

TTGC.GCC TGCATGTAGATAG

GTCAAGGACGTGAACGACAC

ACTGGAACGTGAGC AAGGAG

GCTT АТС ICGTG1IGAIGTGG (opsuoro ’обратного)

AATC CTGGCGGTATC TTCGT'

T-AAGGCC-TCGTIATC 7GTC G

GAC GAGTGAC-TTCGG-CAAG

AACAGCC AGTAGCCTGAC G

I€ GGACA1 acGGAGGGAC Г

ATCGAAGTCCA·

AATGGGCTGTTGCC AT AATC T

CACAGTGGTTGTGGGCTGTA

ACCaGCGACTACAGCAGGI.

CCTTCATTGCCTACGITTCC

GGGG AAGTCTATIGTCAGC /

TC ACCGACA.AAACGGTGTAG

У GC AGATTGTC GAGATAC «.

C GC AAATGGAACC TGTAC G

C TCIGAACGTCTGC GTC TG

CTGTTCTGCTGGGCAATACC

AGGC.GTTGTAC ATCGTC C AG

CAC GTTCGACCTGATGACC.

GCAGCAGAITGAGCAGTACG

- 8 032051

Таблица 5. Доминирующие виды бактерий кишечной микробиоты, содержащие гены, участвующие в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений

№	Виды	Рода	Филы
1 2 3 4	В. fragilis В. vulgatus B.ovatus В. pectinophilus	Bacteroides	Bacteroidetes
5 6 7	С. sporogenes С. leptum С. asparagiforme	Clostridium	Firmicutes
8 9	Е. faecium Е. faecalis	Enterococcus
10 11 12	Е. rectale Е. eligens Е. hallii	Eubacterium
13 14 15	L. plantarum L. brevis L. reuteri	Lactobacillus
16	S. thermophilus	Streptococcus
17	S. epidermidis	Staphylococcus
18	R. torques	Ruminococcus
19 20 21 22 23 24 25 26	B. catenulatum B. adolescentis B. dentium B. angulatum B. longum B. breve B. pseudocatenulatum B. animalis subsp. lactis	Bifidobacterium	Actinobacteria
27	E. coll	Escherichia	Proteobacteria

Таблица 6. Наборы праймеров

Номер набора	Фермент	Количество пар праймеров
по генам	общее
1	Дофа-декарбоксилаза Тирозин-гидроксилаза Г истидин-декарбоксилаза	2 3 3	8
2	Серотонин Nацетилтрансфераза/ Арилалкиламин NАцетилтрансфераза Моноамин-оксидаза	6 3	9
3	Тирозин-декарбоксилаза	7	7
4	Глутамат-декарбоксилаза	10	10
5	Спермидин-синтаза Бутирил-СоА-дегидрогеназа Синтаза оксида азота	6 3 2	11

- 9 032051

Перечень нуклеотидных последовательностей участков гена, соответствующих ПЦР продукту, и локализация олигонуклеотидов на них:

Ген, кодирующий дофа декарбоксилазу:

Staphylococcus epidermidis

FP->

CAGGTCCAGC ATCACGTCTA TCATGGCTTG GAGACATTTT AACAACAGCA

AATAATATCC ATGCCTCTAA TTTTGCCAAT GCGACGCTGC CAATTAATAT

101 TGAGCGTAAT TTAATTAACT ACTTGGTAGG AAAAATCGGT TATGAGATCA

151 AACCGGCCGG TGGTGTCTTT GTATCTGGCG

RP

Escherichia coli

FP->

CTGCACTCCC TTTCAGCTTC CAGTGCTTCA CTGTAGGACG CATCATCAAT

TTTCGTGCCT TTGCTTTCGG CATAGCGTCG TAATTTATTT GCGTCAGCTT

101 CATTAAGTTC TAAAAGATGA TCGCGCAAAA GACCGATAAG CCTGCTTTO

151 TATATCTCAT AKTACAGCCC ACAACCACTG TG

RP тирозин декарбоксилазу:

Lactobacillus plantarum

FP-*

TGCCTGCTCT ATTGGCGTAT AACTATGCCA TGTTATGGAA TGGTAATAAC

GTGGCTTATG AATCTTCACC AGCAACGTCG CAAATGGAAG AAGAAGTTGG

101 CCAAGAATTT GCCCGATTAA TGGGTTATGA CTATGGCTGG GGCCACA7TG

151 TCGCAGATGG TTCCTTG

RP

Lactobacillus brevis

FP^

CAAGGAACCA TCTGCGACAk TGTGGCCCCA CCCATAGTCA TAACCCATTA

ACCGAGCAAA TTCTTGGCCA ACTTCTTCTT CCATTTGCGA CGTTGCTGGC

101 GAAGATTCAT AAGCCACGTT ATTACCATTC CATAACATGG CATAGTTATA

151 CGCCAATAGA GCAGGCAT

- RP

Enterococcus faecium

FP

CGTGAAAGGA AGCATTTACG GTAATGAATT CTTAACTTCA CATACTGACT

TTGCTATCCC AGACTATGGC AACAGCCCAT TGCAATTCGT GAACCAACTA

101 GGATTCTCAG ATGAAGAATG GAACCGTGCC GGAAAAGTAA CTGTATTGCG

151 TGCCAGC

RP

Enterococcus faecalis

FP

CGACAAAGAA ATCGAAGTCC ЛСACATTAAC TCATCCAGAC TTCAACATGG

TTGACTATGT GTTTAAAGAA AAAGGCAACG ATGATTTAGT AGCAATGAAC

101 AAATTAAACC ATGATGTATA TGACTATGCA TCATACGTTA AAGGAAATAT

151 TTACAACAAC GAATTCATTA CTTCACATAC TGACTTTGCT ATTCCJGL47T

201 ATGGCAACAG CCCATT

RP

Clostridium sporogenes

FP

GTAGCTTTGA TGGGCGATTG GTTAGTAAGT ACATTTGATC AAAATGCCAC

AGGCAGAGAT AATTCCAGTG CAGCAAAGCT TGAGGAAGAA ACCATAAATT

101 TATTAAAGCA GCTTTTGGGG TTGCCGGAAA CATATTCGGG AACATTTGTA

151 ACGGGAGC

RP

Streptococcus thermophilus

FP-*

GCGCGACGTG ATTTCATACT TCGCGACATA CGTCTTTGAA AAAGGTGCAG

ATATTCCTGC ATTATTGGGT GCATATATTC TTGAAGGTTC AAAAGCTGGC

101 GCAACTGCTG CATCAGTATG GGCTGCTCAT AAGACATTAC CACTGAACGT

151 TACTGGCTAT GGAAAGTTAG TCGGGGCTTC AATCG

RP

Bifidobacterium catenulatum

FP

TGCGTAGGCG TTACAACTTC CCATTCCGGC TGGTTCCGAA GCATGGACTC

CGTCTGTTGG GCTAGGTCGA TGCCGTGGGT CACCATATCA CTGATCTGAT

- 10 032051

101 CCGTCCCCAA CGTCTGCAGG GTGAGCCATA ATTTCAGGCT GCGCGCGGGG

151 CGGGTCAGTT CAATGCCCCA TTCCCAATAG ETGATTTCTC CGTTCTCTGC

201 G

RP тирозин гидроксилазу:

Bacteroides fragilis

FP-»

CCAACATAGT CGTTCCATTG CCATGACATT GCTATGGTAT ACACGCACAT

AATCCTCATG AACAGGGTAG AGAGCCTGAG CTCTTTGTAC AGCCTTGATA

101 AATAATTTCC CCATATTCTT GAAAAAATTG ACAATGTGTT GATTAAGAAG

151 CCAAGGAACA TGGCAAAATA AATCGTGAAT CATATCAGGA AAAAGAGAAA

201 AATCGTCATA TTGAGATGGA CGAAGGCATG

RP

E. faecium

FP-»

CGCTAAGAGA ACGAATCCAC TATTTTGATG ATATACACAC TAAAATCTAT

GAAGCACGTA CAAATCACGA AGACGAAAGC AAATTAGGAT TAGCTCAACA

101 ACGAATATTT GAATGGCTGA ATACGAATAC TGAGCAAGAA CCGTTAAGAG

151 CAATTAGTAA TCTTTTTGAA TTTGGAACGA AGCATTGGTT TAACGCTGTA

201 GAAAAGGATG CTGACTTACA AGAAGC «- RP

E. coli

FP-»

ACTGGAACGT GAGCAAGGAG ACTTAAAAAT CTATCTGTCT AGCATTGAGC

GTTCTATAGA GAGCCTAGAG GATAAAGTTA ATCGTATAAA GAATGAGG/

101 ATTCATGATA TTAAGGACGA TATATCCTTC TTAAAATCTT GGTTGAAAAX

151 TGTTGGTAAA ATTGCCACAT CAACACGAGA TAAGC «- RP гистидин декарбоксилазу:

В. fragilis

FP-»

TGTAGCGAAG GATCGTTGTG AGAAGAACGA TGCGTATCTC GGGCAAGTCA

ACCTGATGAA AGCCTCGTCT TTTTGCGGAC AGAATGGAGC CATCTGGGGA

101 TTTGACCTGG CGATGCACGA TGACATTGCC AAAAGGAAAG AGATGCCTAT

151 CTACATGCAG GCGCAA <- RP

Lactobacillus reuteri

FP-*

ATTGAACCGC CTGGGATAGA ATCAACCGGC ATTGAAACGT AAGGTGCTAC

GGTAATTGCA TTACCAATTT GACCTGGTTC CATCATTGCA TGAGCAAAGC

101 CGATCCATGA ACCCTTGAAT GAGGTATTAG CATCTTGACC ACACTCAGCA

151 ATTGACTTAG CAATTGCCTT ACGACGACCC TTAAGGTATT CAATTAATTC

201 ATCTTCATTA GGTGTTTCCC ATACACCAGC АТС <- RP моноаминоксидазу:

Bifidobacterium longum

FP->

CAAGAACACC ACCAGCATCC CCACCCTCGG CAATCCGCCG ATCGTGCCGG

ACTGCTGGAT CTACGTGCAG GACCCGGGCT ACAAGGTCGG ACGTCTGCAG

101 ATCTTCAACA ACTGGAGCCC GTACCTGGTC AAGGACGTGG ACGACACCGT

151 GTGGATCGGT CTCGAGTACT TCTGCGAGGA GGGCGACTCG TTCTGGAAC4

201 TGAGCGAGGA GGATGTCAC <- RP

Bifidobacterium breve

FP

TCGAAGTATG CAGGGTAGGC CTTCTTCACG CGTTCACGGT GGGAGTCGAG

GACCTCATCC GGGCCATTGA TCACGCGCAT GCGGGTGAGC TCGGAAATGG

101 CGAACTTGGT GGCGTCTTCC TCACTCATGT TCCAGAAGGA ATCACCCTCT

151 TCGCAGAAGT ACTCCAGACC AACCCACACG GTGTCGTTCA CGTCCTTGAC

- RP

E. coli

FP->

TCATCCAGCA ACACCATACC GTGGGCGTCT TTAATGGGTT GCCAGGAGAG

CAGTTTGTTG TTTTGCAGAT CCACCACCGC TTCGATGATA TGTTTGCCGT

101 CGAGCATAAT GACGTCGGCT TTGCGCGGCT GGTCAACCGG TTTGTTTTCC

151 AGCGCAAACG CCCAGACAGC TTCTTTATCT GGCGGTAGCA GGGAGATCTC

201 AGTAAAACGG GTATTGGGTT TGAAGTCCG

- 11 032051

RP глутамат декарбоксилазу:

Bacteroides vulgates

FP^

GCGGTTTTCA GGTTGTTTGG GAAAAGTTCG CCCAACTTTG GCAAATTGAA

ATGCGCCAAG TACCTCTCAC CTTGGACAAA ACCACTCTGG ACCCCGAAGA

101 AGCACTGAAG ATGTGTGACG AGAACACCAT CTGCATCGTC CCCATCCAAG

151 GTGTGACATG GACAGGTTTG AACGATGACG TGGAAGCGTT GGACAAAGCA

201 CTGGATGCCT АСА

RP

Bacteroides ovatus

FP^

AATCCCTGAC GAACAACGAC ACGCATCACT ACATAATCTT CCAGTTTAGA

AGGCAATGTA TAAGCAGGAA CCATCCAACC ATGTTGAGAT AGTTTGTCTT

101 GCAAATCATA CAAAGTCCAT TTGGCGCTCT TTGCATATTC CGGTTTCAGA

151 TACCAGATGA ATAGCGGGTT CACAACATCT TCTGAGTAGT TAACGA4CGG

201 AACCATCTTG GCTA <- RP

C. sporogenes

FP^

GAGCGCACAA AAGAAGTAGC TATGTATATT TCAAAAGAAC TTGAAAACAC

GGGATTATTC AGTATATATA ATGATGGCAG TAATCTTCCT ATAGTTTGCT

101 ATAAACTAAA AGAACAATCT AAAGTGAAGT GGAATCTTTA TGATTTAGCA

151 GATAGACTAG CTATGAAAGG TTGGCAAATA CCTGCTTACC CCCT

RP

E. faecium

FP^

GCTCTGCAAG TGAGGATGTT GACTTGCCTA AATATAAGAA TCCATTGAAC

CACGAATTGC TTATCAATTA GTACAAGACG AGATGTTGGA TGAAGGAAAT

101 GCGCGATTAA ACTTAGCTAC TTTTTGTCAA ACGTATATGG AACCTGAAGC

151 AGTGAAATTG ATGACCCAAA CGTTAGAAAA AAATGCAATT GATAAATCAG 201 AATACCCACG AACAACGG

RP

L. brevis

FP-*

TGAACTCACT GCCGATTCTG ATCGCGAATG GACCCTCTAC GATTTATCCG

ATCGGTTATT AATGAAGGGC TGGCAGGTTC CCACCTATCC CTTACCAAAA

101 AACATGACGG ACCGCGTTAT TCAACGGATC GTGGTTCGGG CTGACTTTGG

151 TATGAGTATG GCCCACGACT TTATTGATGA TCTAACCCAA GCCATTCACG

201 ATCTCGACCA AGC

RP

L. plantarum

FP->

GCACCTGATG ACGAACACTT TACGGGTACC TCTACGATTG GCTCCTCTGA

AGCTTGTATG TTAGGCGGTT TAGCAATGAA ATTCGCCTGG CGTAAACGCG

101 CTCAAGCGGC AGGTTTAGAT CTGAATGCCC ATCGACCTAA CCXCGTTATT

151 TCGGCTGGCT АТС

RP

Bifidobacterium adolescentis

FP-»

ACTTCTCCCA GCACACCTGC ACGGCGCTGC TCATCACCAG ATTCGGATGA

TCGGTCGGCA GGTCGGCCTT TTCGCGGGCT TCCTTCCAAC GGCGCTTCAA

101 CGCGAGTCCG CCCAGCATGC AAGCTTCCGA CGAGCCGL4TG GTGGAGGTTC

151 CGATG «- RP

Bifidobacterium dentium

FP->

AGCGCGTGTA CTCCATCAGT ACCTCCGGAC ACAAGTACGG TCTGGTCTAC

CCGGGCCTGG GCTGGGTGGT ATGGCGTGAG ACCGCCGACC TGCCGGAAAG

101 CCTGATCTTC AAGGTGAGCT ATCTGGGCGG CGAAATGCCG ACCTTTGCGC

151 TGAACTTCTC CCGCCCCGGC GCTCAGGTGC TGTTGCAGTA <- RP

Bifidobacterium angulatum

FP

TGCAGATTGT CGAGATACGC TACGCAGGCC TTGAGATCCT TAAGGAACGA

TTCGGCCAGA TCATGGCTGA ACCCGTTGCG CACCACGATG CGTTGCACGG

101 TCACATCGGT CAGATCGACC GGCATCGGAT ATGCCGGCAC CAGCCATCCC

151 TTCATGCGCA GGCGATCCTG CAGATCGZ4C AGGTTCCATT TGCG *- RP

- 12 032051

E. coli

FP-*

CTCTGAACGT CTGCGTCTGC GCGGCTGGCA GGTTCCGGCC TTCACTCTCG

GCGGTGAAGC CACCGACATC GTGGTGATGC GCATTATGTG TCGTCGCGGC

101 TTCGAAATGG ACTTTGCTGA ACTGTTGCTG GAAGACTACA AAGCCTCCCT

151 GAAATATCTC AGCGATCACC CGAAACTGCA GGGTATTGCC CAGCAGAACA 201 G

RP бутирил-СоА-дегидрогеназу:

В. longum

FP->

AGGCGTTCTA CATCGTCCAG CAGGGCATAG CGGACGCGGC CACCGTGGAC

GACGTGATGA AGTACAGCCT CGGCCGCCGC TGGAACCTGG TCGGCCCGAT

101 CGCCAGCATC GATCTCGGCG GACTCGACGT GTTCTACAAC ATCAGCACCT

151 ACCTGTTCGA CGACA <- RP

B. breve

FP->

CACGTTCGAC CTGATGACCA G4ATCGGCAA GAAACCGGCG AAACTCAACA

AGGAATCGCT CGGATTCATC GGCAACCGAC TGCAGATGGC GGTGCTGCGC

101 GAGGAATTCC ATATCATTCA GGAAGGCATC GCGGACGCGG CCACCGTGGA

151 TGACGTG/IFG AAGTACAGCC TCGGC

RP

Bifidobacterium pseudocatenulatum

FP-»

ACTTCGACTA GCGGCATCAG ATGCGCAGGA TTCCAGAAAT GAGCCACCAC

AAAGCGTTCC GGGTGCTTCA GCACAGATTG GATTGCGGTT GGGCCCAATC

101 CGGAAGTGTT TGTCGCAAAG ATCGCATCGA CCGGCGCGTA CTGCTCAATC

151 TGCTGC <- RP спермидин синтазу:

Bacteroides pectinophilus

FP->

GACGAGTGAG TTCGGCAAGG TGCTTGTCCT TGACGGCGAG CTTATGATTA

CACAGAAGGA TGAATTTATC TATCATGAGA TGATTACGCA TGTGCCGATG

101 GCCGTGCATC CGCATGTCAG GGATGTGCTT GTGATAGGTG CGGGTGATGG

151 CGGAACTATC AGGG <- RP

Eubacterium rectale

FP

AACAGCCAGT AGCCTGACGG ACAGGTTGGA ATATGTGCCT GATATACCCT

GCTTATAGGA AATGATTTAT ACACCTTTCT GTGCATTTTC CGGCACTCAA

101 GCTCATCCTC ATCATAAAAA GGACTGCCGT GCTGGTAAAC CATGATTCCA

151 TCATCCTTTA GTGCCTTATA ACAGCTTCCG TAAAACTCTT TTGTGAAA4G

201 TCCCTCCGTA TGTCCGA <- RP

Eubacterium eligens

FP->

CCTGCTTGGA GCGTAAGAAC CTTAATGCAT CTGAATTATA AATGTGCACT

CTCTCATCTT CTAATCCTGA TGCCGTCTCT GGAAAATACT CCCTGCACAC

101 ATCAACAAAC ATGTTGTCCT GTTCAACTAT GTCAATATTT TCGATATTGT

151 CATACTGCAA CAGTTCCTTT GATACACCTC CGTCACCG

RP

Clostridium leptum

FP1 CGAGCGGGTG CATATTTACT ATGAGGATGG ATTGAAGTTT ATCCGCTCCA

AGGAAAACGA GTACGACCTG ATTATCGTGG ATTCCACCGA TCCCTTCGGC

101 CCCGGAGAGG GCCTGTTCAC CAAGGAGTTT TACGGCAACT GCTATAAGGC

151 GCTGAAAGAG GACGGCATCA T

RP

B. longum

FP1 CTGGAAGGGA ATGGTGATGT CCTGATACGC ATCGACCATG ATCACGTCGT

ACTTGTCATG CGAGGCGGCG AGCCAGGCTC GGCCGTCATA CGTGGTCACG

101 GGGATGTCGG CGGGCTCATC GAAGTATTCG CCGGCCAGAT CGGTGATCTT

151 CTGGTCAATC TCCACG <- RP

- 13 032051

E. coli

FP-*

AATCCTGGCG GTATCTTCGT CGCACAAAAC GGCGTCTGCT TTTTACAGCA

GGAAGAAGCC ATCGACAGCC ATCGCAAACT CAGCCATTAC TTCAGCGACG

101 TTGGCTTTTA TCAGGCGGCG ATCCCGACCT ATTACGGCGG TATCATGACT

151 TTTGCATGGG CGACAGATAA CGACGCCTTA

RP синтазу оксида азота:

E. faecalis

FP->

ACCAGCGACT ACACCAGGTY CTGTGACAGT AATCCAACCT AGACCAGCAA

ACACAATATC CGTTTTTTCT TTCACGGAAA ATTCAAAGCG CACTAATTCA

101 GGAAACTCAG CGACTTCATC GGCACGTGGG GGCTGCAATA AGCCACCAAC

151 ATGTTTTTCA TAAAAAGCAT CGGCGGTTGC TGTTTTTGTT CGGTGTAAAT

201 TTAAGTCATT GGAAACGTAG GCAATGAAGG <- RP

E. faecium

FP-»

GGGGAAGTCT ATTGTCAGCG TTGTTTCAGA TTACGCCATT ATAATGAGAT

CCAAGATGTC TCATTGACGG ATGACGACTT TTTGCGCTTA CTGAATGAAT

101 TAGGGCAAAA AGATGCATTG ATCGTCAATG TGGTGGATAT TTTTGACTTC

151 AATGGTTCAC TAATCCCAGG ACTACACCGT TTTGTCGGTG A <- RP серотонин N- ацетилтрансферазу/арилалкиламин N-ацетилтрансферазу:

Ruminococcus torques

FP->

CCGAAGAGAT GATGAAGCAG CGGGCTCTTA AGATTCGGGA ATTGTTTTTT

GTGGCGGTTG ACAGAAAAAG CGGTGAAGTG GCAGGTTTTT TGAATGGTCT

101 GGCAACGGAC GGGGATTGTT TGAAAGATGA ATTTTTCAGG AATGCAGACT

151 TGCATGATCC GACAGGTGAT AACGTGATGA TACTCGGTCT TGCAGTTTTG

201 CCGAAGTACC GGGGAATCGG AGTGGCATCA G <- RP

Eubacterium hallii

FP1 CCATTTCTGG CTGATGTGTG AGGAAGAGAA AGTAATTGCG TTTGTAGATG

GAATGGTAAC GGATGAAAAA AATCTGACAG ATGAAATGTA TGAGAAGGCT

101 TGCCTTCATG ATGAAAAGGG AGCGTGGCAG ATGATTTTCG GAGTAAATAC

151 ATTGCCGAAA TATCGAAGAC AGGGCTATGC GGAAAAGCTG CTTCGCTACG

201 CAATCAATG

RP

Clostridium asparagiforme

FP1 CCATTTCTGG CTGATGTGTG AGGAAGAGAA AGTAATTGCG TTTGTAGATG

GAATGGTAAC GGATGAAAAA AATCTGACAG ATGAAATGTA TGAGAAGGCT

101 TGCCTTCATG ATGAAAAGGG AGCGTGGCAG ATGATTTTCG GAGTAAATAC

151 ATTGCCGAAA TATCGAAGAC AGGGCTATGC GGAAAAGCTG CTTCGCTACG

201 CAATCAATG +- RP

Bifidobacterium, animalis subsp. lactis

FP1 AGATGATACT CGGCGTCAAC ACCGCACCCA TGTACCAGCA TCGTGGCTGT

GCCTCGTTCC TTATGCGCCA CGTGATTCTC GACAGCGCGC TTTCGCACAG

101 GCACGGCATC GTGCTCGCCT GCAAGGAGAA AATGTTGCCA TTCTACAGCT

151 CGTTCGGGTT CATTGACGAG GGCCGCAGCC AATCCGTGCA CGGCAATGCG

201 GTGTGGCACC AGATGCGTCT GCCATTCACC ACCT

- RP

B. pseudocatenulatum

FP1 GACGACCAAC GAAAAGGACT TGGCCGACGT CATGTATGAG GATGTTTCCA

TGCATGACGA GCAGGGTGAT TGGCAGATGA TTTTCGGCGT GGACGTGGCT

101 CCCGTCTACC AGCATCGCGG TTGCGCCAGC TATCTGCTGC GTCGTGTGAT

151 CCTTGATTCG ACGATTGCCG GACGCAAAGG CATTGTGCTG ACTTGTAAGG

201 AACGTCTTGT CGGATTTTAC GC

RP

S. thermophilus

FP1 GCCTCCTTGA CTAGCATTAG GAGTTACCTT GTAGAATAAG TCATCTGTAA

GATATCGTTC CGAAATCACA GGTCCTTCGA TATAATCAGC TACAGTGCCA

101 TCAATTTCAG CAATTAGGAA AGTATCGCAA ATTGTCTCTA AACGCTCTGC

151 AAGAGCCTCT GGTGTAGCAG CCTCTTCAG +- RP

FP - Forward Primer - прямой праймер; RP - Reverse Primer - обратный праймер.

- 14 032051

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ идентификации в микробиомах и отдельных бактериальных геномах совокупности бактериальных генов, участвующих в синтезе и метаболизме нейроактивных соединений, характеризующийся тем, что для идентификации проводят амплификацию бактериальной геномной ДНК с использованием наборов разработанных 45 пар олигонуклеотидов, представленных в табл. 4, подобранных к десяти ключевым генам нейроактивных соединений, представленных в табл. 1, выявленных в геномах 27 видов бактерий, представленных в табл. 5, причем ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, размер полученного продукта, указанного в табл. 4, определяют с помощью ДНК-маркера.

Распределение генов нейроактивных соединений среди бактерий доминирующих родов по данным метагеномного анализа микробиома кишечника здоровых людей