EA031400B1

EA031400B1 - Улучшение вкуса пива посредством комбинации дрожжей pichia и различных сортов хмеля

Info

Publication number: EA031400B1
Application number: EA201490551A
Authority: EA
Inventors: Софи Саренс; Ян Хендрик Свигерс
Original assignee: Кр. Хансен А/С
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2018-12-28
Also published as: US20170183612A1; AU2012300785B2; MX352345B; DK2751250T3; ES2674601T3; TR201807687T4; AU2012300785A1; JP2014525257A; WO2013030398A1; CA2847467C; NZ620946A; US20140234480A1; EP2751250B1; MX2014002251A; EA201490551A1; US10544385B2; BR112014004375A2; CA2847467A1; CN103781896A; PL2751250T3

Abstract

Изобретение основано на обнаружении того, что дрожжи Pichia kluyveri обладают предпочтительными свойствами, пригодными для производства пива. В частности, дрожжи Pichia kluyveri можно комбинировать с нормальными штаммами пивных дрожжей, такими как Saccharomyces cerevisiae и различными сортами хмеля в процессе ферментации с получением синергетического действия, а именно повышенной продукции сложных эфиров в ферментационном продукте. Более конкретно, дрожжи можно использовать для получения повышенных уровней изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата, этилвалерата, этилбутирата, этилдеканоата и этилоктаноата в пиве. Кроме того, дрожжи Pichia kluyveri по-разному взаимодействуют с различными сортами хмеля, таким образом, вкусовые характеристики пива можно настаивать с использованием различных комбинаций дрожжей Pichia kluyveri и различных сортов хмеля. Настоящее изобретение относится к способу варки пива с использованием дрожжей Pichia kluyveri, дрожжей Saccharomyces cerevisiae и по меньшей мере одного сорта хмеля, а также к пиву, получаемому таким способом, и применению дрожжей Pichia kluyveri по изобретению.

Description

Изобретение относится к области пивоварения и улучшению вкуса пива. В частности, изобретение относится к способу варки пива, включающему стадию ферментации охмеленного сусла дрожжами Pichia spp., причем существует взаимодействие хмеля со штаммом дрожжей Pichia spp., улучшающее вкус пива.

Уровень техники

Различные сорта пива содержат многие вкусоароматические соединения, получаемые при дрожжевой ферментации из ячменного солода, хмеля и другого сырья. Однако дрожжевая ферментация составляет основную часть процесса пивоварения, так как во время ферментации образуются наиболее важные вкусоароматические соединения. Ферментация представляет собой процесс, при котором дрожжи метаболизируют простые сахара в сусле в этанол и диоксид углерода. Однако эти компоненты вносят относительно незначительный вклад в основной вкус пива. Ароматические и вкусовые характеристики пива являются результатом незначительных летучих вкусоароматических соединений, продуцируемых дрожжами во время ферментации.

Другим важным фактором является хмель. Существует два типа хмеля, используемого в пивоварении: горький хмель и ароматный хмель. Горький хмель используют для светлых сортов пива для придания дополнительной горечи пиву. Ароматный хмель используют для специальных сортов пива для улучшения вкуса.

Использование заквасочных культур является общепринятой практикой в производстве дрожжей. Однако чистый штамм дрожжей часто не объединяет все оптимальные характеристики, желательные для пивоварения, так как существует две основные задачи использования конкретных штаммов дрожжей при производстве пива: улучшение эффективности способа получения и получение хорошего качества конечного продукта (Saerens et al., 2010).

Кроме того, современная тенденция в пищевой промышленности и производстве напитков представляет собой производство напитков, которые поддерживают здоровье человека. Например, пивоваренная промышленность финансировала исследование, направленное на получение сортов пива с меньшим содержанием спирта и сахара.

Для обеспечения хорошего качества пива снижение плохих вкусоароматических добавок и повышение желаемых вкусоароматических добавок являлись важным вопросом для пивоваренной промышленности. Снижение плохих вкусоароматических добавок сконцентрировано на низкой продукции диацетила, нежелательного вкусоароматического соединения в пиве с ароматом жженого сахара. Наиболее желаемые вкусоароматические соединения в пиве представляют собой сложные эфиры и высшие спирты, придающие фруктовый аромат пиву (Verstrepen et al., 2003). Наиболее важные вкусообразующие сложные эфиры в пиве представляют собой сложные ацетатные эфиры, такие как этилацетат (похожий на растворитель аромат) и изоамилацетат (банановый аромат) и сложные этиловые эфиры, такие как этилгексаноат и октаноат (яблочный аромат). Наиболее важный высший спирт представляет собой изоамиловый спирт (банановый аромат).

Вследствие возрастающей потребности в более здоровой пище и напитках снижение этанола и углеводов в алкогольных напитках, в частности в пиве и вине, представляет собой значимый коммерческий интерес. Существующие способы получения слабоалкогольного, со сниженным содержанием алкоголя и безалкогольного пива, т.е. модифицированной ферментации или удаления этанола после ферментации, приводят к похожему на сусло вкусу или потери ароматических компонентов соответственно (Zufall and Wackerbauer, 2000). В не содержащем алкоголь лагерном пиве отсутствие этанола (менее 0,1%) усиливает любые посторонние похожие на сусло привкусы в пиве, получаемому способом контактирования при низких температурах.

Улучшение органолептического качества напитков и разработку новых напитков можно проводить посредством биологического вкусоароматического вещества (Vanderhaegen et al., 2003). Эта техника основана на получении и трансформации вкусоароматических соединений и предшественников вкусоароматических соединений биологическими способами, такими как использование специальных штаммов дрожжей. Общепринято пивовары выделяют два типа дрожжей для пивоварения: дрожжи верховой ферментации и дрожжи низовой ферментации в зависимости от их применения для получения эля и лагерного пива соответственно. Дрожжи верховой и низовой ферментации принадлежат к роду Saccharomyces: S. cerevisiae (дрожжи верховой ферментации) и S. pastorianus (дрожжи низовой ферментации). Дрожжи низовой ферментации используют для получения пильзенского пива, которое составляет 90% пива, получаемого во всем мире. Другие 10% представляют собой специальные сорта пива, получаемые посредством дрожжей низовой ферментации. В Бельгии (а теперь также и в США) для получения сортов пива ламбик и гейзе используют другие виды дрожжей Brettanomyces bruxellensis (Verachtert et al., 1989). Это значительно отличается от винодельческой промышленности, причем используют много не относящихся к Saccharomyces штаммов для усиления природного характера спонтанной ферментации (Domizio et al., 2011). Такие штаммы в настоящее время являются коммерчески доступными для винодельческой промышленности от компаний, таких как Christian Hansen и Lallemand.

Международная патентная заявка WO 2009/110807 относится к штаммам дрожжей для применения

- 1 031400 в процессах ферментации и способе улучшения вкуса в ферментационном продукте с использованием не относящемуся к Saccharomyces штамму дрожжей. WO 2009/110807 относится к ферментации вина, в нем не указано применение не относящихся к Saccharomyces видов для варки пива. Исследования изучения влияния не относящихся к Saccharomyces видов на уровень сложных эфиров и высших спиртов в пиве не проводились. Также только в нескольких исследованиях описано влияние дрожжей на ароматические вещества хмеля в пиве. К настоящему времени в трех исследованиях описывают влияние вида Saccharomyces или вида Brettanomyces по повышение уровня терпеноидов хмеля в пиве (King and Dickinson, 2003, Daenen et al., 2007 и Takoi et al., 2010).

В международной патентной заявке WO 2008/077986 описан способ получения алкогольных напитков с повышенным и/или различным содержанием ароматических терпенов с использованием генетически модифицированных микроорганизмов, экспрессирующих гены, которые кодируют монотерпенсинтетазу, для ферментации алкогольных напитков. В этом WO 2008/077986 Pichia указана в списке теоретически возможных штаммов дрожжей (наряду с другими штаммами дрожжей, такими как, например, Saccharomyces) для ферментации алкогольных напитков (пиво указывают в качестве примера наряду с другими алкогольными напитками, такими как вино, кава, шампанское, сидр и саке).

Другими словами, использование Pichia spp. для получения пива явно не раскрыто в WO 2008/077986.

В патенте ГДР DD 288619 A5 описано применение дрожжей Pichia для ферментации пивного сусла. К пивному суслу не добавляют хмель.

Понимание биологических процессов, которые контролируют наличие и количество соединений в процессе ферментации, является крайне желательным. В частности, возможность регулировать количество и тип сложных ацетатных эфиров в пиве являлась бы очень благоприятной для пивоваров. Регуляция количества сложных эфиров и высших спиртов и, в частности, изоамилацетата в комбинации с ароматическими веществами хмеля в пиве обеспечит развитие новых способов, позволяющим пивоварам более точно изменять количества таких желаемых вкусоароматических добавок в их продукте. Такой способ, таким образом, будет представлять значительную коммерческую ценность. В дополнение к этому улучшение вкуса может являться пригодным способом получения слабоалкогольного, со сниженным содержанием алкоголя или безалкогольного пива. Проблема получения слабоалкогольного, со сниженным содержанием алкоголя или безалкогольного пива заключается в похожем на сусло вкусе или потери ароматизирующих соединений вследствие удаления этанола или вследствие низкой плотности сусла.

Таким образом, существует необходимость в улучшенных способах усиления желаемых вкусоароматических добавок в пиве.

Сущность изобретения

Задача, подлежащая решению посредством настоящего изобретения, относится к получению нового способа варки пива, причем содержание желаемых вкусоароматических соединений, таких как сложные эфиры и высшие спирты, является повышенным.

Решение основано на неожиданных открытиях авторами изобретения, что с использованием способа, включающего ферментацию охмеленного сусла штаммом дрожжей Pichia spp. предварительно или во время ферментации охмеленного сусла общепринятыми пивоваренными дрожжами, можно получать пиво с улучшенными вкусовыми характеристиками.

Таким образом, первый аспект изобретения относится к способу варки пива, включающему стадии:

a) получения сусла;

b) добавления по меньшей мере одного сорта хмеля с получением охмеленного сусла;

c) ферментации охмеленного сусла первым штаммом дрожжей, причем первый штамм дрожжей представляет собой штамм дрожжей Pichia spp., и

d) ферментации охмеленного сусла вторым штаммом дрожжей с получением пива, причем второй штамм дрожжей принадлежит к группе, состоящей из вида Saccharomyces и вида Brettanomyces.

Второй аспект настоящего изобретения относится к пиву, получаемому способом по первому аспекту изобретения.

Третий аспект настоящего изобретения относится к использованию вида Pichia для улучшения вкуса пива.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к использованию вида Pichia для варки пива.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны концентрации ацетальдегида в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) и на 13-й день (д13). Конт. контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 2 - концентрации ацетальдегида в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) и на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 3 - концентрации этилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

- 2 031400 на фиг. 4 - концентрации этилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 5 - концентрации изобутилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 6 - концентрации изобутилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 7 - концентрации изоамилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 8 - концентрации изоамилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. последовательная ферментация;

на фиг. 9 - концентрации гексилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 10 - концентрации гексилацетата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 11 - концентрации этилпропионата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 12 - концентрации этилпропионата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 13 - концентрации этилбутирата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 14 - концентрации этилбутирата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 15 - концентрации этилвалерата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 16 - концентрации этилвалерата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 17 - концентрации этилгексаноата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 18 - концентрации этилгексаноата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 19 - концентрации этилоктаноата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 20 - концентрации этилоктаноата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 21 - концентрации этиладеканоата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 22 - концентрации этилдеканоата в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 23 - концентрации изобутанола в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 24 - концентрации изобутанола в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - кон

- 3 031400 трольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 25 - концентрации изоамиловый спирт концентрации в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 20°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. - контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 26 - концентрации изоамилового спирта в ферментационных продуктах последовательного и контрольного типов ферментации при 22°C, получаемые на 5-й день (д5) на 13-й день (д13). Конт. контрольная ферментация и непрер. - последовательная ферментация;

на фиг. 27 - концентрации ацетальдегида в готовом пиве;

на фиг. 28 - концентрации этилацетата в готовом пиве;

на фиг. 29 - концентрации изоамилацетата в готовом пиве;

на фиг. 30 - концентрации этилпропионата в готовом пиве; на фиг. 31 - концентрации этилбутирата в готовом пиве; на фиг. 32 - концентрации этилвалерата в готовом пиве; на фиг. 33 - концентрации этилгексаноата в готовом пиве; на фиг. 34 - концентрации этилоктаноата в готовом пиве; на фиг. 35 - концентрации этилдеканоата в готовом пиве; на фиг. 36 - концентрации изобутанола в готовом пиве; на фиг. 37 - концентрации изоамилового спирта в готовом пиве;

на фиг. 38 - концентрации тиолов 3-меркаптогексанола и 3-меркаптогексилацетата в пиве, получаемом с использованием Pichia.

Подробное описание изобретения

Определения.

Термин сусло в настоящем описании имеет общепринятое в данной области значение и относится к сладкой жидкости, экстрагируемой способом затирания солода при пивоварении.

Как применяют в настоящем описании, термин пиво относится, по меньшей мере, к видам пива, получаемым из заваренного солода, получаемого из осоложенного зерна, а также заваренного солода, получаемого из неосоложенного зерна, и заваренного солода, получаемого из смеси осоложенного и неосоложенного зерна. Термин пиво также относится к видам пива, получаемым с использованием добавок, и к видам пива со всеми возможными содержаниями спирта.

Термин пиво со сниженным содержанием алкоголя в настоящем описании относится к пиву с содержанием спирта от 1,2 до 4,2% объемного содержания спирта (ABV).

Термин слабоалкогольное пиво в настоящем описании относится к пиву с содержанием спирта от 0,5 до 1,2% ABV.

Термин безалкогольное пиво в настоящем описании относится к пиву с содержанием спирта менее 0,5% ABV.

Термин охмеленное сусло в настоящем описании относится к суслу, к которому добавляют хмель до кипения или после кипения сусла.

Термин генетически модифицированный организм в настоящем описании имеет значение, как определено 1996 Organic Trade Association, и относится к организму, такому как микроорганизм, такой как дрожжи, который получили способами, которые изменяют молекулярную или клеточную биологию организма средствами, которые являются невозможными в естественных условиях или естественными способами.

Термин генетически немодифицированный в настоящем описании относится к микроорганизму, который не содержит гетерологичных генов.

В настоящем контексте термин мутант следует понимать как штамм, получаемый из штамма по изобретению, например генетической инженерией, радиационной и/или химической обработкой. Предпочтительно мутант представляет собой функционально эквивалентный мутант, например мутант, который обладает, по существу, аналогичными или улучшенными свойствами (например, в отношении повышения желаемых вкусоароматический соединений пива) по сравнению с материнским штаммом. Такой мутант является частью настоящего изобретения. В частности, термин мутант относится к штамму, получаемому путем подвергания штамма по изобретению любой общепринято используемой мутагенной обработке, включая обработку химическим мутагеном, таким как этанметансульфонат (EMS) или Nметил-Ы'-нитро-Ы-нитрогуанидин (NTG), УФ-излучением, или к спонтанно возникающему мутанту. Мутант можно подвергать нескольким мутагенным обработкам (однократную обработку следует понимать как одну стадию мутагенеза с последующей стадией скрининга/отбора), но в настоящем изобретении предпочтительно проводят не более 20, или не более 10 или не более 5 обработок (или стадий скрининга/отбора). В предпочтительном мутанте по изобретению менее 5% или менее 1%, или даже менее 0,1% нуклеотидов в дрожжевом геноме заменяли другим нуклеотидом и удаляли по сравнению с материнским штаммом.

В настоящем контексте термин вариант следует понимать как штамм, который является функционально эквивалентным штамму по изобретению, например, обладающий, по существу, аналогичными или улучшенными свойствами (например, в отношении повышения желаемых вкусоароматических со

- 4 031400 единений).

Такие варианты, которые можно идентифицировать советующими способами скрининга, являются частью настоящего изобретения.

Использование терминов в форме единственного числа и аналогичных объектов ссылки в отношении описываемого изобретения (в частности, в отношении следующей ниже формулы изобретения) следует интерпретировать, как включающее формы единственного и множественного числа, если в настоящем описании не указано иное, или явно не противоречит контексту. Термины состоящий, обладающий, включающий и содержащий следует интерпретировать как неограничивающие термины (т.е. означающие включая, но не ограничиваясь), если не указано иное.

Подразумевают, что перечисление диапазонов значений в настоящем описании служит только в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, находящееся в диапазоне, если в настоящем описании не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы его отдельно перечисляли в настоящем описании. Все способы, описываемые в настоящем описании, можно проводить в любом подходящем порядке, если в настоящем описании не указано иное, или иным образом не противоречит контексту. Использование любого и всех примеров или иллюстративного языка (например, в частности), полученного в настоящем описании, предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Язык в описании не следует интерпретировать как указание на какой-либо незаявленный элемент как существенный для практического выполнения изобретения.

Осуществление и аспекты изобретения.

Способ варки пива хорошо известен специалистам, и его можно кратко охарактеризовать следующим образом: получают солод из сухого проросшего злакового зерна (в основном ячменя или пшеницы) и измельченного в крупку, которая может содержать неосоложенные добавки. Крупку затирают (смешивают с водой и замачивают), чтобы обеспечивать возможность ферментам в солоде трансформировать крахмал в сахара. Частицы зерна и добавки отделяют от жидкого сусла способом, называемым фильтрация. Стадии получения и затирки солода можно пропускать, добавляя воду к экстракту солода. После добавления хмеля и/или других ингредиентов, таких как травы и сахара, сусло кипятят (после кипячения также можно добавлять хмель), охлаждают и насыщают воздухом. Затем сусло переносят в бродильный чан и подвергают ферментации, добавляя пивные дрожжи. За первичной ферментацией, продолжающейся, как правило, от 5 до 10 суток, может следовать стадия вторичной ферментации с использованием дополнительных пивных дрожжей. После ферментации свежее пиво или зеленое пиво выдерживают, необязательно фильтруют и насыщают углекислотой.

К суслу добавляют хмель для компенсации сладости солода горечью и придания пиву желаемых вкусов и ароматов. Существует несколько сортов, включая, но, не ограничиваясь ими, Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл, Эроика, Галена, Глетчер, Гринбург, Горизонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь, Традиция, Браво, Калипсо, Челан, Комет, Эльдорадо, Сан-Хуан рубиновый, Сатус, Сонет Голдинг, Супер Галена, Тилликум, Гибридний Бремлинг, Пилигрим, Хеллертау Геркулес, Хеллертау Магнум, Хеллертау Таурус, Меркур, Опал, Смарагд, Хеллертау ароматный, Кохату, Ракау, Стелла, Стиклебракт, Саммер Сааз, Саммер Альфа, Супер Прайд, Топаз, Ваи-ити, Бор, Джанга, Маринка, Премиант, Сладек, Штирийский Атлас, Штирийская Аврора, Штирийский Бобек, Штирийская Целея, Сибилла и Сорачи Эйс.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что определенные штаммы дрожжей Pichia spp., когда их комбинируют совместно с добавлением различных сортов хмеля в сусло, обладают предпочтительными свойствами, пригодными в процессе ферментации пивоварения. В частности, штаммы дрожжей Pichia spp. усиливают желаемые вкусоароматические вещества хмеля, когда охмеленное сусло ферментируют с использованием штаммов дрожжей Pichia spp. с последующей ферментацией охмеленного сусла штаммом дрожжей, общепринято используемом для пивоварения, включая дрожжи родов Saccharomyces и Brettanomyces.

На основании полного анализа вкусоароматических веществ всех типов ферментации, перечисленных в примерах ниже, ясно видно, что почти каждое измеряемое соединение содержалось в высоких концентрациях при последовательных типах ферментации по сравнению с контрольными типами ферментации. Это означает, что штамм Pichia spp. оказывает значительное влияние на вкусовые характеристики конечного пива, так как единственным отличием между последовательным и контрольным типами ферментации являлось добавление Pichia spp. в начале ферментации. Вследствие того, что значительные повышения выявляли для всех желаемых вкусоароматических соединений, таких как изоамилацетат и изобутилацетат, и этилпропионат и этилвалерат, это демонстрирует огромный потенциал применения

- 5 031400

Pichia spp. в пивоваренной промышленности. В частности, для слабоалкогольного, со сниженным содержанием алкоголя и безалкогольного пива усиление фруктового вкуса может маскировать обычно присутствующий вкус сусла. Поскольку это является развивающимся рынком, огромный потенциал является доступным для применения Pichia spp. в таких типах ферментации пива.

Способ варки пива по изобретению включает стадии:

a) получения сусла;

d) ферментации охмеленного сусла вторым штаммом дрожжей с получением пива, причем второй штамм дрожжей принадлежит к группе, состоящей из видов Saccharomyces и видов Brettanomyces. Этим способом можно улучшать вкусоароматические соединения и оптимизировать вкусовые характеристики пива посредством добавления различных сортов хмеля, как продемонстрировано в примерах.

В одном из предпочтительных вариантов выполнения настоящего изобретения стадию c) и стадию d) проводят последовательно, т.е. охмеленное сусло сначала инокулируют штаммом дрожжей Pichia spp. B подходящих для ферментации условиях, а затем охмеленное сусло инокулируют вторым штаммом дрожжей в подходящих для ферментации условиях.

В более предпочтительном варианте выполнения ферментации на стадии c) дают возможность проходить в течение периода по меньшей мере 12 ч, таком как в течение по меньшей мере 24 ч, таком как в течение по меньшей мере 36 ч, таком как в течение по меньшей мере 48 ч, таком как в течение по меньшей мере 60 ч, таком как по меньшей мере 72 ч, до инокуляции вторым штаммом дрожжей на стадии d). В наиболее предпочтительном варианте выполнения, ферментации на стадии c) дают возможность проходить в течение по меньшей мере 36 ч.

Частью настоящего изобретения является то, что с использованием различных сортов хмеля можно получать различные вкусовые характеристики пива. По меньшей мере один сорт хмеля можно выбирать из списка, состоящего из Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл, Эроика, Галена, Глетчер, Гринбург, Горизонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь и Традиция, но использование дополнительных сортов хмеля также является частью изобретения.

В предпочтительном варианте выполнения по меньшей мере один сорт хмеля выбран из группы, состоящей из Сааз, Нельсон Совин, Каскад и Аммариллио.

По меньшей мере один сорт хмеля также можно выбирать из списка, состоящего из Браво, Калипсо, Челан, Комет, Эльдорадо, Сан-Хуан рубиновый, Сатус, Сонет Голдинг, Супер Галена, Тилликум, Гибридний Бремлинг, Пилигрим, Хеллертау Геркулес, Хеллертау Магнум, Хеллертау Таурус, Меркур, Опал, Смарагд, Хеллертау ароматный, Кохату, Ракау, Стелла, Стиклебракт, Саммер Сааз, Саммер Альфа, Супер Прайд, Топаз, Ваи-ити, Бор, Джанга, Маринка, Премиант, Сладек, Штирийский Атлас, Штирийская Аврора, Штирийский Бобек, Штирийская Целея, Сибилла и Сорачи Эйс.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения ферментацию на стадии c) проводят при температуре от около 12 до около 28°C.

В более предпочтительном варианте выполнения температура ферментации на стадии c) составляет от около 20 до около 22°C. Наиболее предпочтительно температура ферментации на стадии c) составляет около 20°C.

Предпочтительно штамм дрожжей Pichia spp. оставляют в культуре для ферментации во время ферментации со вторым штаммом дрожжей. Однако штамм дрожжей Pichia spp. также можно удалять до инокуляции вторым штаммом дрожжей способом, известным специалисту.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения стадию c) и стадию d) проводят одновременно посредством совместной инокуляции первого штамма дрожжей стадии c) и второго штамма дрожжей стадии d).

В предпочтительном варианте выполнения вторая стадия ферментации на стадии d) продолжается по меньшей мере 12 ч, в частности по меньшей мере 24 ч, в частности по меньшей мере 48 ч, в частности по меньшей мере 72 ч, в частности по меньшей мере 96 ч, в частности по меньшей мере 120 ч.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения штамм дрожжей Pichia spp. представляет собой генетически немодифицированный штамм дрожжей.

В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения штамм дрожжей Pichia spp. представляет собой штамм дрожжей Pichia kluyveri.

Предпочтительно штамм дрожжей Pichia kluyveri выбран из группы, состоящей из штаммов Pichia

- 6 031400 kluyveri PK-KR1 и PK-KR2, которые University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, New Zealand депонировали 24 августа 2006 года в National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Australia и которым присваивали номера доступа V06/022711 и V06/022712 соответственно и их мутантов и вариантов. Штаммы описаны в международной патентной заявке WO 2009/110807.

В еще одном другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения второй штамм дрожжей выбран из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus и Brettanomyces bruxellensis. Предпочтительно второй штамм дрожжей представляет собой штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения пиво представляет собой слабоалкогольное, со сниженным содержанием алкоголя или безалкогольное пиво.

В другом предпочтительном варианте выполнения использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) повышает содержание по меньшей мере одного вкусоароматического соединения, выбранного из группы, состоящей из изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата, этилвалерата, этилоктаноата и этилдеканоата, по меньшей мере на 50%, так как по меньшей мере на 100%, так как по меньшей мере на 150%, так как по меньшей мере на 200%, так как по меньшей мере на 250%, так как по меньшей мере на 300%.

Предпочтительно использование Pichia spp. штамм дрожжей на стадии c) повышает содержание по меньшей мере одного вкусоароматического соединения, выбранного из группы, состоящей из изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата и этилвалерата, по меньшей мере на 50%, так как по меньшей мере на 100%, так как по меньшей мере на 150%, так как по меньшей мере на 200%, так как по меньшей мере на 250%, так как по меньшей мере на 300%.

В еще одном другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) повышает содержание по меньшей мере двух или более вкусоароматических соединений, выбранных из группы, состоящей из изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата, этилвалерата, этилоктаноата и этилдеканоата, по меньшей мере на 50%, так как по меньшей мере на 100%, так как по меньшей мере на 150%, так как по меньшей мере на 200%, так как по меньшей мере на 250%, так как по меньшей мере на 300%.

Предпочтительно использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) повышает содержание по меньшей мере двух или более вкусоароматических соединений, выбранных из группы, состоящей из изоамилацетата, изобутилацетат, этилпропионата и этилвалерата, по меньшей мере на 50%, так как по меньшей мере 100%, так как по меньшей мере на 150%, так как по меньшей мере на 200%, так как по меньшей мере на 250%, так как по меньшей мере на 300%.

В другом наиболее предпочтительном варианте выполнения использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) повышает содержание тиола 3-меркаптогексилацетата по меньшей мере на 10%, так как по меньшей мере на 20%, так как по меньшей мере на 30%, так как по меньшей мере на 40%, так как по меньшей мере на 50%.

Термины повышает содержание по меньшей мере одного вкусоароматического соединения и повышает содержание тиола 3-меркаптогексилацетата можно рассматривать как неотъемлемые свойства использования Pichia spp., как обсуждается ниже.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, когда по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой Сааз, и ферментацию на стадии c) проводят при температуре около 20°C, использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) повышает уровень этилдеканоата по меньшей мере на 50% больше по сравнению с тем, когда по меньшей мере один сорт хмеля представляет собой Каскад, Нельсон Совин или Амарилло.

В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения, когда по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой Нельсон Совин, и ферментацию на стадии c) проводят при температуре около 20°C, использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) повышает уровень этилдеканоата по меньшей мере на 50% больше по сравнению с тем, когда по меньшей мере один сорт хмеля представляет собой Каскад или Амарилло.

В дополнительном варианте выполнения изобретения, когда по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой Каскад или Нельсон Совин, и ферментацию на стадии c) проводят при температуре около 20°C, использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) повышает уровень этилвалерата по меньшей мере на 50% больше по сравнению с тем, когда по меньшей мере один сорт хмеля представляет собой Амарилло и Сааз.

В случае дополнительного варианта выполнения, когда по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой Каскад, и ферментацию на стадии c) проводят при температуре около 20°C, использование штамма дрожжей Pichia на стадии c) повышает уровень этилгексаноата и этилоктаноат по меньшей мере на 50% больше по сравнению с тем, когда по меньшей мере один сорт хмеля представляет собой Нельсон Совин, Амарилло или Сааз. В еще одном варианте выполнения изобретения, когда по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой любой сорт, выбранный из группы, состоящей из Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл,

- 7 031400

Эроика, Галена, Глетчер, Гринбург, Горизонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь и Традиция, использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) приведет к вкусовым характеристикам уровней вкусоароматических соединений изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата и этилвалерата, которые отличаются от вкусовых характеристик, получаемых в результате использования штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c), когда сорт хмеля на стадии b) представляет собой любой другой сорт, выбранный из группы, состоящей из Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл, Эроика, Галена, Глетчер, Гринбург, Горизонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь и Традиция.

В дополнительном варианте выполнения изобретения, когда по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой любой сорт, выбранный из группы, состоящей из Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл, Эроика, Галена, Глетчер, Гринбург, Горизонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь, Традиция, Браво, Калипсо, Челан, Комет, Эльдорадо, Сан-Хуан рубиновый, Сатус, Сонет Голдинг, Супер Галена, Тилликум, Гибридний Бремлинг, Пилигрим, Хеллертау Геркулес, Хеллертау Магнум, Хеллертау Таурус, Меркур, Опал, Смарагд, Хеллертау ароматный, Кохату, Ракау, Стелла, Стиклебракт, Саммер Сааз, Саммер Альфа, Супер Прайд, Топаз, Ваи-ити, Бор, Джанга, Маринка, Премиант, Сладек, Штирийский Атлас, Штирийская Аврора, Штирийский Бобек, Штирийская Целея, Сибилла и Сорачи Эйс, использование штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c) приводит к вкусовым характеристикам уровня вкусоароматических соединений изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата и этилвалерата, которые отличаются от вкусовых характеристик, получаемых в результате использования штамма дрожжей Pichia spp. на стадии c), когда сорт хмеля на стадии b) представляет собой любой другой сорт, выбранный из группы, состоящей из Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл, Эроика, Галена, Глетчер, Гринбург, Горизонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь, Традиция, Браво, Калипсо, Челан, Комет, Эльдорадо, Сан-Хуан рубиновый, Сатус, Сонет Голдинг, Супер Галена, Тилликум, Гибридний Бремлинг, Пилигрим, Хеллертау Геркулес, Хеллертау Магнум, Хеллертау Таурус, Меркур, Опал, Смарагд, Хеллертау ароматный, Кохату, Ракау, Стелла, Стиклебракт, Саммер Сааз, Саммер Альфа, Супер Прайд, Топаз, Ваи-ити, Бор, Джанга, Маринка, Премиант, Сладек, Штирийский Атлас, Штирийская Аврора, Штирийский Бобек, Штирийская Целея, Сибилла и Сорачи Эйс.

Изобретение во втором аспекте относится к пиву, получаемому способом по первому аспекту.

Пиво по изобретению может содержать детектируемые количества дрожжей Pichia spp. Хотя, в некоторых случаях дрожжи удаляют из пива после ферментации.

Однако использование Pichia spp. придает пиву вкусовые характеристики, отличные от известного уровня техники, как продемонстрировано в настоящем описании в примерах, и, таким образом, пиво, получаемое с использованием Pichia spp. и различных сортов хмеля само по себе является новым.

Пиво, сваренное с использованием Pichia spp., обладает различными вкусовыми характеристиками, когда используют различные сорта хмеля. Например, уровень этилдеканоата повышают по меньшей мере более чем на 50%, когда используют хмель Сааз, по сравнению с тем, когда используют Каскад, Нельсон

- 8 031400

Совин или Амарилло, и повышают по меньшей мере на 50%, когда используют Нельсон Совин, по сравнению с тем, когда используют Каскад или Амарилло при ферментации, проводимой при 20°C (см. фиг. 21). Концентрация этилвалерата повышают по меньшей мере на 50%, когда используют хмель Каскад или Нельсон Совин, по сравнению с тем, когда используют Амарилло или Сааз при ферментации, проводимой при 20°C (см. фиг. 15). Концентрации этилгексаноата и этилоктаноата повышают по меньшей мере на 15%, когда используют хмель Каскад, по сравнению с тем, когда используют хмель Нельсон Совин, Амарилло или Сааз при ферментации, проводимой при 20°C (см. фиг. 17 и 19).

Также предусмотрено, что пиво, сваренное с использованием Pichia spp., содержит детектируемые количества тиолов (в частности, 3-меркаптогексилацетата (3МНА) и 3-меркаптогексан-1-ола (3МН)), такие как описанные для вина в WO 2009/110807.

Примеры

Пример 1. Вещества и способы.

Схема ферментации.

Лабораторные испытания ферментации проводили в 500 мл сусла. Сусло получали с использованием экстракта пшеничного солода (Brewferm). Экстракт солода смешивали с водой с получением исходного содержания сахара 10°P. 4 раза 3 л сусла кипятили с 4 различными сортами хмеля: Нельсон Совин, Амарилло, Сааз и Каскад. К суслу добавляли гранулы хмеля в закрытом фильтре для кофе и кипятили его в течение 30 мин для экстрагирования вкусоароматических соединений хмеля и придания горечи пиву. Гранулы хмеля добавляли до получения 23 EBU. После кипячения из сусла удаляли фильтры для кофе и переносили сусло в 1 л бутылки, которые закрывали водными затворами.

Для одного сорта хмеля проводили 4 типа ферментации. Использовали две температуры ферментации: 20C и 22°C. Для каждой температуры ферментации проводили 2 различные инокуляции: одну бутылку инокулировали Pichia kluyveri PK-KR1 (для последовательной инокуляции) и вторую бутылку инокулировали коммерческим штаммом пшеничных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Safbrew WB-06 (Lesaffre) (контрольная ферментация) по рекомендациям поставщика. Оба штамма дрожжей инокулировали при 5 миллионах клеток на мл. В табл. 1 приведен обзор схема ферментации.

Таблица 1. Схема ферментации

Для последовательной инокуляции штаммом пшеничных дрожжей (Safbrew WB-06) инокулировали через 2 суток инокулированные Pichia kluyveri ферменты для завершения ферментации. Все типы ферментации завершались через 13 суток. Образцы получали на 5-й день и сутки 13.

Для измерения ацетальдегида сложных ацетатных эфиров, сложных этиловых эфиров и высших спиртов в ферментационных продуктах использовали парофазную газовую хроматографию с пламенноионизационной детекцией (GC-FID). Образцы ферментации центрифугировали, после чего собирали 2 мл во флаконы. Затем образцы анализировали на калиброванной системе Perkin Elmer GC, снабженной автозаборником проб из свободного пространства над продуктом. GC была оснащена колонкой DBWAXETR (длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина слоя 0,5 пм, Agilent Technologies, Germany). Использовали инжектор с делением и без деления потока и поддерживали при 180°C. Перед вспрыском образцы нагревали в течение 30 мин при 70°C в автозаборнике проб из свободного пространства (температура иглы: 110°C). В качестве газа носителя использовали гелий. После начала при 60°C через 2 мин температуру термостата повышали от 60 до 230°C при 45°^мин и в конечном итоге поддерживали при 230°C в течение 5 мин. Во время GC-программы поддерживали постоянную скорость потока (10 мл/мин) газа носителя (He). Температуру FID сохраняли постоянной при 220°C соответственно. Результаты анализировали с использованием программного обеспечения Turbochrom.

Анализ этанола.

Этанол измеряли с использованием набора Ethanol Enzymatic Bioanalysis от Boehringer Mannheim. Результаты.

Лабораторные типы ферментации проводили на пшеничном сусле с использованием различных сортов хмеля и инокулировали Pichia kluyveri в течение 2 суток, после чего добавляли пшеничные пивные дрожжи Saccharomyces cerevisiae для исследования влияния последовательной инокуляции в сочетании с различными сортами хмеля на вкус пива. В качестве контроля проводили типы ферментации с использованием только пшеничных пивных дрожжей S. cerevisiae. Последовательный и контрольный типы ферментации останавливали через 13 суток. Образцы получали на 5-й день и сутки 13, а затем анализировали вкусоароматические соединения и концентрацию этанола.

Анализ вкусоароматических соединений всех продуктов ферментации проводили с использованием

- 9 031400 парофазной GC-FID, как описано в веществах и способах. Результаты показаны на фиг. 1 и 2 (альдегиды), фиг. 3-10 (сложные ацетатные эфиры), фиг. 11-16 (короткоцепочечные сложные этиловые эфиры), фиг. 17-22 (среднецепочечные сложные этиловые эфиры) и фиг. 23-26 (высшие спирты).

Концентрации этанола измеряли набором (см. вещества и способы). Результаты концентраций этанола представлены в табл. 2.

Таблица 2. Концентрации этанола в ферментационных продуктах на 13-й день последовательной и контрольной ферментации при 20 и 22°C

	20°С	20°С
Сааз конт.	2,9	3, 1
Сааз непр.	3,3	3,4
Нельсон Совин конт.	3, 5	3, 5
Нельсон Совин непр.	3, 7	3,3
Какскад конт.	3, 7	3, 3
Какскад непр.	3, 6	3, 0
Амарилло конт.	4,0	4,2
Амарилло непр.	3, 8	3, 6

Конт. - контрольная ферментация, непр. - последовательная ферментация.

Заключение.

Для последовательной инокуляции Pichia kluyveri в качестве первого и пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве второго штамма дрожжей в 500 мл мелкомасштабных типах ферментации пшеничного пива с использованием различных сортов хмеля продемонстрировали заметные различия вкуса в зависимости от сорта хмеля по сравнению с нормальной контрольной ферментацией пива только с использованием пивных дрожжей S. cerevisiae. Впервые продемонстрировано, что последовательная инокуляция Pichia kluyveri и Saccharomyces cerevisiae обладает усиливающим вкус эффектом при ферментации пива. Кроме того, различие вкусовых характеристик можно продемонстрировать для всех измеряемых вкусоароматических соединений, когда используют различные сорта хмеля.

Концентрации ацетальдегида являлись всегда выше при последовательной инокуляции по сравнению с контрольной ферментацией (см. фиг. 1-2). Однако в конце ферментации аналогичные значения получали для последовательной и контрольной ферментации. Вследствие того, что для пивоваров нежелательны слишком высокие концентраций этого соединения в пиве, эффект последовательной инокуляции является незначительным.

Наибольшие различия вкусоароматических соединений выявляли для сложных эфиров. Если внимательно изучить концентрации сложных ацетатных эфиров, в частности концентрацию изоамилацетата, который представляет собой желаемое фруктовое вкусоароматическое соединение, она значительно повышалась при последовательной инокуляции по сравнению с контролем. Вероятно, ферментация при 20°C является более благоприятной, чем при 22°C. Концентрация являлась наибольшей при ферментации с добавлением хмеля Амарилло.

Также концентрации изобутилацетата значительно повышались при последовательных типах ферментации. Ферментация при 20°C снова оказалась лучше в отношении продуцирования этого соединения, чем ферментация при 22°C.

Этилацетат, который представляет собой отрицательное соединение в высоких концентрациях, но легко маскируемое другими сложными ацетатными эфирами, также повышался при последовательных типах ферментации, но только в двукратном количестве по сравнению с контролями. При ферментации с хмелем сорта Каскад получали меньше этилацетата по сравнению со всеми типами ферментации.

Гексилацетат повышался только немного при всех типах последовательной ферментации по сравнению с контрольными типами ферментации.

Для короткоцепочечных сложных этиловых эфиров получали наиболее неожиданные результаты, так как этилпропионат и этилвалерат почти полностью не образовывались при контрольной ферментации. Однако получали высокие концентрации при последовательных типах ферментации (до 1 м.д.). В отношении этилбутирата эффект наблюдали только при добавлении хмеля Сааз и Нельсон Совин для последовательных типов ферментации.

Концентрации этилгексаноата и этилоктаноата повышались только при последовательных типах ферментации при добавлении хмеля Каскад. Однако для этилдеканоата концентрации являлись значительно выше при последовательных типах ферментации при добавлении хмеля Сааз и Нельсон Совин. Различие между контрольным и последовательным типами ферментации являлось более чем в 10 раз.

Высшие спирты представляют собой единственные соединения, концентрации которых значительно не повышались при последовательных типах ферментации по сравнению с контрольными типами ферментации.

- 10 031400

Пример 2.

Крупномасштабные испытания варки пива проводили на пивоваренном заводе для исследования возможности использовать Pichia kluyveri для пивоваренной промышленности, в частности в отношении вкуса.

Вещества и способы.

Способ ферментации.

Контрольное пиво и пиво Pichia получали в масштабе 15 гл на пивоваренном заводе. Сусло состояло из сортов солода, характерных для светлого эля, и используемый сорт хмеля представлял собой Каскад. Для инокуляции Pichia kluyveri PK-KR1 использовали 15 гл сусла. Показатель инокуляции рассчитывали как равный 1-2 миллионам клеток на мл. Каждые сутки отбирали образец для измерения количества клеток (см. табл. 3) и проводили анализ вкусоароматических соединений в конечном пиве.

Таблица 3. Подсчет клеток Pichia kluyveri PK-KR1 во время первых 3 суток ферментации.

Сутки	Подсчет клеток
0	2,00Е+06
1	2,00Е+06
2	1,00Е+07
3	7,00Е+05

На сутки 3 добавляли нормальные пивные дрожжи (дрожжи London Ale от White Labs). Дрожжи уже использовали для получения одной партии пива, и, таким образом, они являлись оптимальными для этой варки (2-е поколение). Дрожжи добавляли при продувке воздухом через варящееся пиво. Таким образом, было возможно получать представление о запахе варящегося пива при добавлении пивных дрожжей. Запах являлся очень фруктовым (банановым, ананасовым).

Ферментацию проводили по тех пор, пока дрожжи полностью не усваивали сахар. После этого зеленое пиво созревало при 7-8°C с течение, по меньшей мере, недели.

На сутки 8 ферментацию завершали и снижали температуру ферментации до 8°C. После ферментации пиво созревало в течение 7 суток с дрожжами все еще в ферментере. На сутки 15 дрожжи удаляли и снижали температуру до 2°C. Еще через три недели пиво фильтровали, пастеризовали и разливали по бутылкам.

Анализ вкусоароматических соединений.

Парофазную газовую хроматографию с пламенно-ионизационнымой детекцией (GC-FID) использовали для измерения ацетальдегида, сложных ацетатных эфиров, сложных этиловых эфиров и высших спиртов в ферментационных продуктах. Образцы ферментации центрифугировали, после чего собирали 2 мл во флаконы. Затем образцы анализировали с использованием калиброванной системы Perkin Elmer GC, снабженной автозаборником проб из свободного пространства над продуктом.

GC была оснащена колонкой DB-WAXETR (длиной 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщиной 0,5 пм, Agilent Technologies, Germany). Использовали инжектор с делением и без деления потока и поддерживали при 180°C. Образцы нагревали в течение 30 мин при 70°C в автозаборнике проб из свободного пространства перед впрыском (температура иглы: 110°C). В качестве газа носителя использовали гелий. После начала при 60°C через 2 мин температуру термостата повышали от 60 до 230°C при 45^oC/мин и в конечном итоге поддерживали при 230°C в течение 5 мин. Во время GC-программы поддерживали постоянную скорость потока (10 мл/мин) газа носителя (He). Температуру FID сохраняли постоянной при 220°C соответственно. Результаты анализировали с использованием программного обеспечения Turbochrom.

Анализ тиолов.

Анализ тиолов проводили в Hill Laboratories, Hamilton, New Zealand. Измеряли два соединения: 3меркаптогексан-1-ол (ревень, экзотический фрукт) и 3-меркаптогексилацетат (маракуйя).

Результаты.

Анализ вкусоароматических соединений конечного продукта проводили на трех образцах: 1) контрольное пиво - Jubilaeum 01, 2) фильтрованное пиво и 3) нефильтрованное пиво (см. фиг. 27 до 38).

Анализ вкусоароматических соединений ясно демонстрирует, что пиво, получаемое ферментацией дрожжами Pichia kluyveri, содержит повышенные концентрации вкусоароматических соединений. В частности, сложные эфиры изоамилацетат (фиг. 29), этилпропионат (фиг. 30), этилвалерат (фиг. 32), этилоктаноат (фиг. 34) и этилдеканоат (фиг. 35) повышаются в значительных количествах. Эти сложные эфиры обуславливают фруктовый вкус в пиве и, таким образом, являются наиболее важными. Эти результаты также демонстрируют, что получение пива при крупномасштабном производстве (15 гл), что представляет собой огромное увеличение масштаба, начиная с лабораторного, подтверждает увеличение фруктового привкуса в пиве. Это означает, что на пивоваренных заводах можно использовать Pichia kluyveri при крупномасштабной варке пива и быть также уверенным в эффекте дрожжей в отношении пива.

Контрольное пиво и пиво Pichia также анализировали в отношении тиоловых вкусоароматических

- 11 031400 соединений. Измеряли два соединения: 3-меркаптогексанол (ревень, экзотический фрукт) и 3меркаптогексилацетат (маракуйя) (см. фиг. 38). Впервые документально подтверждено, что Pichia kluyveri может трансформировать 3-меркаптогексанол в 3-меркаптогексилацетат в пиве и в значительной степени. Как можно видеть на фиг. 38, Pichia kluyveri использует 3-меркаптогексан-1-ол для продуцирования 3-меркаптогексилацетата, и это в большем количестве по сравнению с тем, когда использовали только штамм пивоваренных дрожжей Saccharomyces (контрольное пиво).

Депозиты.

University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, New Zealand депонировали штаммы Pichia kluyveri PK-KR1 и PK-KR2 24 августа 2006 года в National Measurement Institute, 51-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Australia, и им присваивали номера доступа V06/022711 и V06/022712 соответственно, как описано в WO 2009/110807.

Ссылки

Daenen L, Saison D, Sterckx F, Delvaux FR, Verachtert H, and Derdelinckx G. (2008)

Screening and evaluation of the glucoside hydrolase activity in Saccharomyces and Brettanomyces brewing yeasts. J Appl Microbiol 104:478-488.

Domizio P, Romani C, Lencioni L, Comitini F, Gobbi M, Mannazzu I, and Ciani M. (2011)

Outlining a future for non-Saccharomyces yeasts: selection of putative spoilage wine strains to be used in combination with Saccharomyces cerevisiae for grape juice fermentation. Int J Food Microbiol. 147:170-80.

King AJ, and Dickinson RJ. (2003) Biotransformation of hop aroma terpenoids by ale and lager yeasts. FEMS Yeast Res 3:53-62.

Saerens SMG, Duong CT, and Nevoigt E. (2010) Genetic improvement of brewer's yeast:

current state, perspectives and limits. Appl Microbiol Biotechnol 86:1195-1212.

Takoi K, Koie K, Itoga Y, Katayama Y, Shimase M, Nakayama Y, and Watari J. (2010)

Biotranformation of hop-derived monoterpene alcohols by lager yeast and their contribution to the flavour of hopped beer. J Agric Food Chem 58:5050-5058.

Verachtert H, Kumara HMC, Dawoud E (1989) Yeast in mixed cultures with emphasis on lambic beer brewing. In: Verachtert H, De Mot R (eds) Yeast—biotechnology and biocatalysis. Dekker, New York, pp 429-478.

Verstrepen KJ, Derdelinckx G, Dufour JP, Winderickx J, Thevelein JM, Pretorius IS, and

Delvaux FR. (2003) Flavor-active esters: adding fruitiness to beer. J Biosci Bioeng 96:110118.

Zufall C, and Wackerbauer К (2000) Process engineering parameters for the dealcoholisation of beer by means of falling film evaporation and its influence on beer quality. Monatsschrift fOr Brauwissenschaft 53:124-137.

WO 2008/077986

WO 2009/110807

DD 288619

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ варки пива, включающий стадии:

a) получения сусла;

c) ферментации охмеленного сусла первым штаммом дрожжей, причем первый штамм дрожжей

- 12 031400 представляет собой штамм дрожжей Pichia kluyveri, и

d) ферментации охмеленного сусла вторым штаммом дрожжей с получением пива, причем второй штамм дрожжей представляет собой штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2. Способ по п.1, в котором стадию c) и стадию d) проводят последовательно.

3. Способ по п.2, в котором ферментация на стадии c) продолжается по меньшей мере 12 ч, в частности по меньшей мере 24 ч, в частности по меньшей мере 36 ч, в частности по меньшей мере 48 ч, в частности по меньшей мере 60 ч, в частности по меньшей мере 72 ч, до начала ферментации на стадии d).

4. Способ по п.1, в котором стадию c) и стадию d) проводят одновременно посредством совместной инокуляции охмеленного сусла первым и вторым штаммом дрожжей.

5. Способ по пп.1-3, в котором стадия d) продолжается по меньшей мере 24 ч, в частности по меньшей мере 36 ч, в частности по меньшей мере 48 ч, в частности по меньшей мере 72 ч, в частности по меньшей мере 96 ч, в частности по меньшей мере 120 ч.

6. Способ по пп.1-3, в котором указанный по меньшей мере один сорт хмеля выбран из группы, включающей Сааз, Нельсон Совин, Каскад и Амарилло.

7. Способ по пп.1-3, в котором ферментацию на стадии c) проводят при температуре от около 12 до около 28°C.

8. Способ по п.7, в котором ферментацию на стадии c) проводят при температуре от около 20 до около 22°C.

9. Способ по п.1, в котором штамм Pichia kluyveri выбран из группы, состоящей из Pichia kluyvery PK-KR1 и Pichia kluyvery PK-KR2, депонированных в National Measurement Institute с депозитарным номером V06/022711 и V06/022712 соответственно.

10. Способ по любому предшествующему пункту, в котором пиво представляет собой слабоалкогольное, со сниженным содержанием алкоголя или безалкогольное пиво.

11. Способ по любому предшествующему пункту, в котором ферментация штаммом дрожжей Pichia kluyvery повышает содержание в пиве по меньшей мере одного вкусоароматического соединения, выбранного из группы, состоящей из изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата, этилвалерата, этилоктаноата и этилдеканоата по меньшей мере на 50%.

12. Способ по любому предшествующему пункту, в котором ферментация штаммом дрожжей Pichia kluyvery повышает содержание в пиве тиола 3-меркаптогексилацетата по меньшей мере на 10%.

13. Способ по любому из пп.1-5, 7-12, в котором по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой любой сорт, выбранный из группы, включающей сорта Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл, Эроика, Галена, Глетчер, Гринбург, Горизонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь, Традиция, Браво, Калипсо, Челан, Комет, Эльдорадо, Сан-Хуан рубиновый, Сатус, Сонет Голдинг, Супер Галена, Тилликум, Гибридний Бремлинг, Пилигрим, Хеллертау Геркулес, Хеллертау Магнум, Хеллертау Таурус, Меркур, Опал, Смарагд, Хеллертау ароматный, Кохату, Ракау, Стелла, Стиклебракт, Саммер Сааз, Саммер Альфа, Супер Прайд, Топаз, Ваи-ити, Бор, Джанга, Маринка, Премиант, Сладек, Штирийский Атлас, Штирийская Аврора, Штирийский Бобек, Штирийская Целея, Сибилла и Сорачи Эйс.

14. Применение штамма дрожжей Pichia kluyveri для повышения содержания по меньшей мере одного вкусоароматического соединения, выбранного из группы, состоящей из изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата, этилвалерата, этилоктаноата и этилдеканоата и тиола 3-меркаптогексилацетата в пиве, полученном из охмеленного сусла, ферментированного вторым штаммом дрожжей, представляющим собой штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

15. Применение по п.14, в котором штамм Pichia kluyveri выбран из группы, состоящей из Pichia kluyvery PK-KR1 и Pichia kluyvery PK-KR2, депонированных в National Measurement Institute с депозитарным номером V06/022711 и V06/022712 соответственно.

16. Применение по п.14 или 15, в котором пиво представляет собой слабоалкогольное, со сниженным содержанием алкоголя или безалкогольное пиво.

17. Применение по любому из пп.14-16, в котором содержание по меньшей мере одного вкусоароматического соединения, выбранного из группы, состоящей из изоамилацетата, изобутилацетата, этилпропионата, этилвалерата, этилоктаноата и этилдеканоата повышается по меньшей мере на 50%.

18. Применение по любому из пп.14-17, в котором содержание тиола 3-меркаптогексилацетата повышается по меньшей мере на 10%.

19. Применение по любому из пп.14, 16-18, в котором указанный по меньшей мере один сорт хмеля на стадии b) представляет собой любой сорт, выбранный из группы, состоящей из Атанум, Амарилло, Аполло, Каскад, Сентениаль, Чинук, Цитра, Кластер, Колумб, Кристалл, Эроика, Галена, Глетчер, Грин

- 13 031400 бург, Г оризонт, Либерти, Миллениум, Маунт Худ, Маунт Рейнир, Ньюпорт, Наггет, Палисад, Сантиам, Симко, Стерлинг, Саммит, Томагавк, Ультра, Авангард, Ворриор, Вилламетт, Зевс, Адмирал, Брюэрс Голд, Буллион, Челленджер, Ферст Голд, Фагглс, Голдингс, Геральд, Нортдаун, Нозерн Брюэр, Феникс, Пилот, Пионер, Прогресс, Таргет, Уитбред Голдинг Вэрайети, Галлертау, Херсбрукер, Сааз, Теттнанг, Шпальт, Фо Кер Франсэз, Галактика, Грин Буллет, Мотуик, Нельсон Совин, Пацифик гем, Пацифик Джейд, Пацифика, Гордость Рингвуд, Ривак, Южный крест, Люблин, Магнум, Перле, Польнишер Люблин, Сапфир, Сатус, Селект, Штриссельшпальт, Штирийсклшл Голдингз, Тардиф де Бургонь, Традиция, Браво, Калипсо, Челан, Комет, Эльдорадо, Сан-Хуан рубиновый, Сатус, Сонет Голдинг, Супер Галена, Тилликум, Гибридний Бремлинг, Пилигрим, Хеллертау Геркулес, Хеллертау Магнум, Хеллертау Таурус, Меркур, Опал, Смарагд, Хеллертау ароматный, Кохату, Ракау, Стелла, Стиклебракт, Саммер Сааз, Саммер Альфа, Супер Прайд, Топаз, Ваи-ити, Бор, Джанга, Маринка, Премиант, Сладек, Штирийский Атлас, Штирийская Аврора, Штирийский Бобек, Штирийская Целея, Сибилла и Сорачи Эйс.

20. Применение по п.19, в котором указанный по меньшей мере один сорт хмеля выбран из группы, включающей Сааз, Нельсон Совин, Каскад и Амарилло.

Ацетальдегид 20С 20° С конт. с5 □ 20 С непр. с5 20° С конт. с13 □20° С непр. с13

Фиг. 1

Фиг. 2

- 14 031400

Фиг. 3

Этилацетат22С 22°С конт. с5

Е322°С непр. с5 22°С конт.

□ 22 °C непр.

Фиг. 4

Фиг. 5

- 15 031400

Фиг. 6

Изоамилацетат 20С — 12

S 10

8

Saaz Nelson Cascade Amarillo

Фиг. 7 iB20°CKOHT. c5

I □ 20°C непр. c5 20°C конт. c13 !D20°C непр. c13

Изоамилацетат 22C

Фиг. 8 22°C конт. c5

22°C непр. ci

- 16 031400

Этилпропионат 20С

Фиг. 11 □ 20Снепр.с15

I 20C K0HT.d13 i □ 20CHenp.d13

- 17 031400

Этилпропионат 22С

Фиг. 12

Этилбутират 20С ί 20°С конт. с5 О20°С непр. с5 20°С конт. с13 □ 20°С непр. cl|'

Фиг. 13

Фиг. 14

- 18 031400

Этилвалерат 20С

I 20°С конт. с5 : □ 20°С непр. с5 20 °C конт. с13 □ 20°С непр. с1с ,__________________________________________________________________________________________________________________________I

Фиг. 15

Фиг. 16

- 19 031400

Этилгексаноат 22С □22 °C непр. с5, 22°С конт. de о I □ 22 С непр. с13

Фиг. 18

Этилоктаноат 20С

I 20°С конт. с5 □ 20°С непр. с5 20°С конт. с13 ;а20°Снепр. с13

Фиг. 19

- 20 031400

Фиг. 21

Этилдеканоат 22С 22°С конт. с5

Ξ 22°С непр. с5 22°С конт. c1ji □ 22°С непр. с13

Фиг. 22

- 21 031400

Изобутанол 22С 22°С конт. с5 i

О 22°С непр. с5 I 22°С конт. с13 □ 22°С непр. с13

Фиг. 24

Фиг. 25

Фиг. 26

- 22 031400

Фиг. 28

Фиг. 29

- 23 031400

Этилпропионат

Фиг. 30

Фиг. 31

Фиг. 32

- 24 031400

Фиг. 33

Этилоктаноат

Фиг. 34

Этилдеканоат

Фиг. 35

- 25 031400

Фиг. 36

Фиг. 37

100,00 90,00 Ιο 80,00 S с 70,00 о 60,00 Z 50,00 со о 40,00 30,00 Σ ω 20,00 о со 10,00 0,00

Фиг. 38

О