EA027039B1 - Композиции с высокой концентрацией антител - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение описывает стерильные жидкие составы для доставки высококонцентрированного иммуноглобулина к склеростину, содержащие иммуноглобулин к склеростину, ацетатную соль и сахарозу, и способы их использования.

Description

Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/334986, поданной 14 мая 2010 г. и включенной во всей своей полноте в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

Жидкие композиции с высокой концентрацией антител используют для доставки доз в очень малом объеме. Однако композиции с высокой концентрацией белка обуславливают определенные проблемы. Одна из проблем заключается в нестабильности по причине образования частиц. Другая проблема заключается в повышенной вязкости как результат многочисленных межмолекулярных взаимодействий, вызванных макромолекулярной природой антител. Композиции с высокой вязкостью трудно производить, забирать в шприцы и вводить. Применение силы в производстве вязких композиций приводит к избыточному образованию пены, что, в свою очередь, ведет к денатурации и инактивации активных биопрепаратов.

Патент США № 6875432 и публикации заявок на патенты США №№ 2006/0182740, 2007/0172479 и 2008/0160014 описывают композиции антител и способы их получения. Ни одна из этих публикаций не описывает представленные здесь антитела.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к стерильному жидкому составу для доставки высококонцентрированного иммуноглобулина к склеростину, имеющему абсолютную вязкость примерно 10 сП или менее, содержащему:

(a) иммуноглобулин к склеростину в концентрации от 70 до 120 мг/мл и (b) ацетат кальция в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ, где иммуноглобулин к склеростину содержит аминокислотные последовательности:

(I) 8ЕО ГО N0: 86 и 8ЕО ГО N0: 84; или (II) 8ЕО ГО N0: 182 и 8ЕО ГО N0: 180; или (ΐΐΐ) 8ЕО ГО N0: 208 и 8ЕО ГО N0: 207; или (ίν) 8ЕО ГО N0: 216 и 8ЕО ГО N0: 214; или (ν) 8ЕО ΙΌ N0: 220 и 8ЕО ΙΌ N0: 218; и (c) сахарозу в количестве от 4 до 6% в/о.

В одном из вариантов осуществления состав дополнительно содержит ацетатный буфер в концентрации от 5 до 15 мМ.

В другом варианте ацетатный буфер представляет собой ацетат натрия.

Еще в одном варианте осуществления состав имеет общую осмолярность менее 350 мОсм/л.

В одном из вариантов осуществления иммуноглобулин в составе присутствует в концентрации, равной по меньшей мере 120 мг/мл.

В еще одном варианте абсолютная вязкость состава составляет 8 сП или менее.

В другом варианте абсолютная вязкость состава составляет 6 сП или менее.

В еще одном варианте значение рН состава составляет от 4,5 до 6.

В другом варианте значение рН состава составляет от 5 до 5,5.

Настоящее изобретение также относится к способу снижения вязкости состава иммуноглобулина к склеростину, где способ включает добавление ацетата кальция в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ и сахарозы в количестве от 4 до 6% в/о к составу иммуноглобулина к склеростину, содержащему иммуноглобулин в концентрации от 70 до 200 мг/мл, где иммуноглобулин к склеростину содержит аминокислотные последовательности:

(ί) 8ЕО ГО N0: 86 и 8ЕО ГО N0: 84; или (11) 8ЕО ГО N0: 182 и 8ЕО ГО N0: 180; или (ΐΐΐ) 8ЕО ГО N0: 208 и 8ЕО ГО N0: 207; или (ίν) 8ЕО ΙΌ N0: 216 и 8ЕО ΙΌ N0: 214; или (ν) 8ЕО ΙΌ N0: 238 и 8ЕО ΙΌ N0: 236;

где вязкость состава с ацетатом кальция понижена по сравнению с вязкостью состава антитела без ацетата кальция.

В одном из вариантов осуществления способа иммуноглобулин в содержит аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 86 и/или 8Е0 ΙΌ N0: 84.

Настоящее изобретение также относится к стерильному жидкому составу для доставки высококонцентрированного иммуноглобулина к склеростину, который имеет абсолютную вязкость, равную 10 сП или менее, содержащему:

(a) антитело с тяжелыми цепями 8Е0 ГО N0: 90 и легкими цепями 8Е0 ГО N0: 88 в концентрации от 70 до 200 мг/мл;

(b) ацетат кальция в концентрации от 1 до 20 мМ и (c) сахарозу в количестве от 4 до 6% в/о.

Настоящее изобретение относится к стерильному жидкому составу для доставки высококонцентрированного иммуноглобулина к склеростину, содержащему:

(а) иммуноглобулин к склеростину в концентрации от 70 до 200 мг/мл, где иммуноглоублин содер- 1 027039 жит аминокислотные последовательности:

(ί) ЗЕО ГО N0: 86 и ЗЕО ГО N0: 84; или (ίί) ЗЕО ГО N0: 182 и ЗЕО ГО N0: 180; или (Ш) ЗЕО ГО N0: 208 и ЗЕО ГО N0: 207; или (ιν) ЗЕО ГО N0: 216 и ЗЕО ГО N0: 214; или (ν) ЗЕО ГО N0: 220 и ЗЕО ГО N0: 218; и (Ь) ацетат кальция в концентрации от 1 до 20 мМ, где ацетат кальция снижает абсолютную вязкость состава по меньшей мере на 10% по сравнению с вязкостью состава антитела без ацетата кальция.

В одном из вариантов осуществления иммуноглобулин в составе к склеростину присутствует в концентрации 90 мг/мл.

Настоящее изобретение также относится к применению терапевтически эффективного количества состава для получения лекарственного средства для лечения пациента при необходимости восстановления кости.

В одном из вариантов осуществления восстановление кости представляет собой заживление перелома, заживление без срастания, замедленное заживление со срастанием и реконструкция костей лица.

В любом описанном здесь диапазоне конечные точки диапазона включены в диапазон. Однако описание также предусматривает одинаковые диапазоны, в которых исключены нижняя и/или верхняя конечная точка. Дополнительные детали и вариации изобретения будут очевидны специалистам в данной области из всей заявки, включая графические материалы и детальное описание, и все такие детали и вариации являются аспектами данного изобретения. Подобным образом, описанные здесь характеристики изобретения могут быть рекомбинированы в дополнительные варианты воплощения изобретения, которые также рассматриваются как аспекты изобретения, независимо от того, указана ли такая комбинация характеристик в качестве аспекта или варианта воплощения изобретения в заявке. Кроме того, только те ограничения, которые описаны в тексте данной заявки как критические для изобретения, должны рассматриваться таковыми; варианты изобретения без ограничений, которые не были описаны в данной заявке как критические, относятся к аспектам изобретения.

Детальное описание изобретения

Данное изобретение описывает композиции, включающие высокие концентрации антитела, содержащего кальциевые соли и/или ацетаты или буферы для снижения вязкости, способы использования таких композиций и контейнеры или наборы, включающие такие композиции.

I. Антитела по изобретению.

В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело к склеростину в композиции присутствует в концентрации по меньшей мере примерно 70 мг/мл, примерно 71 мг/мл, примерно 72 мг/мл, примерно 73 мг/мл, примерно 74 мг/мл, примерно 75 мг/мл, примерно 76 мг/мл, примерно 77 мг/мл, примерно 78 мг/мл, примерно 79 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 129 мг/мл, примерно 130 мг/мл, примерно 131 мг/мл, примерно 132 мг/мл, примерно 132 мг/мл, примерно 133 мг/мл, примерно 134 мг/мл, примерно 135 мг/мл, примерно 136 мг/мл, примерно 137 мг/мл, примерно 138 мг/мл, примерно 139 мг/мл, примерно 140 мг/мл, примерно 141 мг/мл, примерно 142 мг/мл, примерно 143 мг/мл, примерно 144 мг/мл, примерно 145 мг/мл, примерно 146 мг/мл, примерно 147 мг/мл, примерно 148 мг/мл, примерно 149 мг/мл, примерно 150 мг/мл, примерно 151 мг/мл, примерно 152 мг/мл, примерно 153 мг/мл, примерно 154 мг/мл, примерно 155 мг/мл, примерно 156 мг/мл, примерно 157 мг/мл, примерно 158 мг/мл, примерно 159 мг/мл или примерно 160 мг/мл и может находиться в диапазоне до, например, примерно 300 мг/мл, примерно 290 мг/мл, примерно 280 мг/мл, примерно 270 мг/мл, примерно 260 мг/мл, примерно 250 мг/мл, примерно 240 мг/мл, примерно 230 мг/мл, примерно 220 мг/мл, примерно 210 мг/мл, примерно 200 мг/мл, примерно 190 мг/мл, примерно 180 мг/мл или примерно 170 мг/мл. Любой диапазон с комбинацией указанных выше конечных точек предусмотрен, включая, но не ограничиваясь, от примерно 70 до примерно 250 мг/мл, от примерно 70 до примерно 200 мг/мл, от примерно 70 до примерно 160 мг/мл, от примерно 100 до примерно 250 мг/мл, от примерно 100 до примерно 200 мг/мл или от примерно 100 до примерно 180 мг/мл.

Антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-1, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-13, АТ-14, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-18, АТ-19, АТ-20, АТ-21, АТ-22, АТ-23 и АТ-24 были описаны ранее в публикации заявки на патент США 2007/0110747, содержание которой, включая список последовательностей, включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки.

Описанные здесь антитела к склеростину связываются со склеростином с ЗЕО ГО N0: 1 и К_с 10^-6 или менее, или 10^-7 или менее, или 10^-8 или менее, или 10^-9 или менее (чем ниже значение, тем больше аффинность связывания). Аффинность может быть определена любым известным в науке способом, включая анализ В1асоге.

В некоторых типичных вариантах воплощения изобретения антитело включает тяжелые и/или легкие цепи любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-21, АТ-23 или АТ-24. Аминокислотные последовательности зрелых легких цепей антител полной длины АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-19, АТ-23 и АТ-2 4, включая

- 2 027039 константный участок, представлены 8ЕО ГО N0: 8, 22, 32, 42, 52, 62, 80, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 166, 176, 184, 70, 210 222 и 246 соответственно. Аминокислотные последовательности зрелых тяжелых цепей антител полной длины АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-23 и АТ-24, включая константный участок, представлены 8ЕЕ) ГО N0: 10, 24, 34, 44, 54, 64, 82, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 168, 178, 186, 72, 224 и 248 соответственно.

Соответствующие последовательности кДНК, кодирующие легкие цепи антител полной длины АТА, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-23 и АТ-24, включая константный участок, представлены 8ЕО ГО N0: 7, 21, 31, 41, 51, 61, 79, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 165, 175, 183, 69, 209, 221 и 245 соответственно. Соответствующие последовательности кДНК, кодирующие тяжелые цепи антител полной длины, включая константный участок антител АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-23 и АТ-24, представлены 8ЕЕ) ГО N0: 9, 23, 33, 43, 53, 63, 81, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 167, 177, 185, 71, 211, 223 и 247 соответственно.

В других типичных вариантах воплощения изобретения антитело включает вариабельный участок тяжелой и/или легкой цепи любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-19, АТ-21, АТ-23 или АТ-24. Например, антитело включает 8Е0 ГО N0: 14 (АТ-1 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 12 (АТ-1 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 68 (АТ-15 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 66 (АТ-15 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 86 (АТ-5 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 84 (АТ-5 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 154 (АТ-16 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 152 (АТ-16 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 182 (АТ-14 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 180 (АТ-14 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 208 (АТ-19 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 207 (АТ-19 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 216 (АТ-20 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 214 (АТ-20 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 220 (АТ-23 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 218 (АТ-23 вариабельный участок легкой цепи); или 8Е0 ГО N0: 238 (АТ-22 вариабельный участок тяжелой цепи) и/или 8Е0 ГО N0: 236 (АТ-22 вариабельный участок легкой цепи).

В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело включает СОК с последовательностями 8ЕЕ) ГО N0: 1-5 (АТ-А и АТ-1 СОК), или 15-20 (АТ-В СОК), или 25-30 (АТ-С СОК), или 35-40 (АТ-Ό СОК), или 45-50 (АТ-2 СОК), или 55-60 (АТ-3 и АТ-15 СОК), или 73-78 (АТ-4 и АТ-5 СОК), или 91-96 (АТ-6 СОК), или 101-106 (АТ-7 СОК), или 111-116 (АТ-8 СОК), или 121-126 (АТ-9 СОК), или 131-136 (АТ-10 СОК), или 141-146 (АТ-11 и АТ-16 СОК), или 159-164 (АТ-12 СОК), или 169-174 (АТ-13 и АТ-14 СОК), или 187-192 (АТ-17 и АТ-18 СОК), или 201-206 (АТ-19, АТ-20 и АТ-23 СОК), или 225-229 (АТ-21 и АТ-22 СОК), или 239-244 (АТ-24 СОК).

В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело включает аминокислотные последовательности, полученные путем экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих кДНК, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь, или, с другой стороны, вариабельный участок тяжелой и/или легкой цепи любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-23 или АТ-24, как это описано в тексте данной заявки. В любой описанной здесь композиции в некоторых вариантах воплощения изобретения антитело представлено тетрамерным иммуноглобулином, состоящим из двух тяжелых цепей и двух легких цепей.

В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело включает СОК любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ16, АТ-19, АТ-23 или АТ-24 и включает тяжелую и/или легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична тяжелой и/или легкой цепи антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-О, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-23 или АТ-24 соответственно. В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело включает СОК любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-О, АТ2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-23 или АТ24 и включает тяжелую и/или легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична тяжелой и/или легкой цепи антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-15, АТ-16, АТ-19, АТ-23 или АТ-24 соответственно.

В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело:

1) сохраняет любой один, два, три, четыре, пять или шесть СОКН1, СОКН2, СОКН3, СОКЬ1, СОКЕ2 и/или СОКЬ3 любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-1, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-13, АТ-14, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-18, АТ-19, АТ-20, АТ21, АТ-22, АТ-23 или АТ-24, в некоторых случаях включая одну или две мутации в таких СОК,

2) сохраняет все СОКН1, СОКН2, СОКН3 или вариабельный участок тяжелой цепи любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-1, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ- 3 027039

12, АТ-13, АТ-14, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-18, АТ-19, АТ-20, АТ-21, АТ-22, АТ-23 или АТ-24, в некоторых случаях включая одну или две мутации в таких СГОР,

3) сохраняет все СИКЫ, ΟΌΚΤ2, СЭКБ-З или вариабельный участок легкой цепи любого антитела АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-Ό, АТ-1, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-13, АТ-14, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-18, АТ-19, АТ-20, АТ-21, АТ-22, АТ-23 или АТ-24, в некоторых случаях включая одну или две мутации в таких СОК,

4) связывается с одной и той же самой антигенной детерминантой склеростина, что и антитело АТА, АТ-В, АТ-С, АТ-ϋ, АТ-1, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ13, АТ-14, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-18, АТ-19, АТ-20, АТ-21, АТ-22, АТ-23 или АТ-24, например, как это определено с помощью рентгеновской кристаллографии, или аминокислотой с петлей, образованной аминокислотами 86-111 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 249; и/или

5) конкурирует с антителом АТ-А, АТ-В, АТ-С, АТ-ϋ, АТ-1, АТ-2, АТ-3, АТ-4, АТ-5, АТ-6, АТ-7, АТ-8, АТ-9, АТ-10, АТ-11, АТ-12, АТ-13, АТ-14, АТ-15, АТ-16, АТ-17, АТ-18, АТ-19, АТ-20, АТ-21, АТ22, АТ-23 или АТ-24 за связывание со склеростином более чем примерно на 75%, более чем примерно на 80%, или более чем примерно на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95%.

В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело включает все три СОК легкой цепи, вариабельный участок зрелой легкой цепи, все три СОК тяжелой цепи, вариабельный участок зрелой тяжелой цепи, все шесть СОК или вариабельный участок зрелой легкой цепи и зрелой тяжелой цепи. В некоторых типичных вариантах воплощения изобретения два СОК легкой цепи из антитела могут быть скомбинированы с третьим СОК легкой цепи из другого антитела. С другой стороны, СИКЫ из одного антитела может быть скомбинирован с СОКЬ2 из другого антитела и СОКЬ3 из третьего антитела, в частности, в случаях с высокой степенью гомологичности СОК. Подобным образом, два СОК тяжелой цепи из антитела могут быть скомбинированы с третьим СОК тяжелой цепи из другого антитела, или СИКН1 из одного антитела может быть скомбинирован с СИКН2 из другого антитела и СИКН3 из третьего антитела, в частности, в случаях с высокой степенью гомологичности СОК.

Термин антитело обозначает интактное антитело или его связующийся фрагмент. Антитело может включать полную молекулу антитела (включая поликлональные, моноклональные, химерные, гуманизированные легкие и/или тяжелые цепи полной длины цепи или версии цепей человека), или включать ее антигенсвязующий фрагмент. Фрагменты антитела включают фрагменты Р(аЬ')₂, РаЬ, РаЬ', Ρν, Рс и Рб и могут быть включены в однодоменные антитела, одноцепочечные антитела, макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, ν-NΑК и Ы5-5сРу (см., например, НоШидег апб Нибвои, №1игс Вю1есЬпо1оду, 23(9): 1126-1136 (2005)).

Выделенное антитело в контексте данной заявки обозначает антитело, которое было идентифицировано и сепарировано от компонента в своей естественной среде. Загрязняющие (примесные) компоненты в естественной среде представляют собой материалы, которые могут помешать диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и такие материалы могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В определенных вариантах воплощения изобретения антитело будет очищаться (1) до значения более 95 вес.% антитела и наиболее преимущественно более чем 99 вес.%; (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Νконцевой или внутренней аминокислотной последовательности; или (3) до достижения однородности, определяемой способом электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси синего или преимущественно серебрянки. Изолированное и встречающееся в природе антитело включает антитело ίη δίίπ в рекомбинантных клетках, при этом по меньшей мере один компонент естественной среды антитела будет отсутствовать. Как правило, изолированное антитело будут получать по меньшей мере с одним этапом очистки.

Иммуноглобулин или нативное антитело представлено тетрамерным гликопротеином. Во встречающемся в природе иммуноглобулине каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (примерно 50-70 кДа). Аминотерминальный участок каждой цепи включает вариабельный (V) участок с примерно 100-110 или более аминокислотами, которые преимущественно ответственны за распознавание антигена. Карбоксильный терминальный участок каждой цепи определяет константный участок, преимущественно ответственный за эффекторную функцию. Иммуноглобулины могут принадлежать к различным классам в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей. Тяжелые цепи классифицируют как мю (μ), дельта (Δ), гамма (γ), альфа (α) и эпсилон (ε), и определяют изотип антитела как 1дМ, 1§ϋ, 1§О, 1дА и 1дЕ соответственно. Многие из них могут быть разделены на подклассы или изотипы, например 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4, 1дА1 и 1дА2. Различные изотипы обладают различными эффекторными функциями, например изотипы 1§О1 и 1§О3 обладают антителозависимой клеточной цитотоксичной активностью (АЗКЦ). Легкие цепи человека классифицируют как каппа (к) и лямбда (λ) легкие цепи. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные участки соединены 1 участком, содержащим примерно 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает Ό участок, включающий примерно 10 или более аминокислот. См. в целом, РиибатеиЫ 1ттиио1оду, СЬ. 7 (Раи1,

- 4 027039 ей., 2пй ей. Кауеп Ргекк, Ν.Υ. (1989)).

Аллотипы являются вариациями последовательности антитела, часто в константном участке и могут быть иммуногенными и кодироваться специфическими аллелями у человека. Аллотипы были идентифицированы для пяти генов ЮНС человека, а именно 10Н01, ЮНО2, ЮНО3, ЮНА2 и ЮНЕ, и обозначены как О1т, 02т, 03т, А2т и Ет соответственно. Известно по меньшей мере 18 Ош аллотипов: п01т(1), п01т(2), 01т (1, 2, 3, 17) или 01т (а, х, Г, ζ), 02т (23) или 02т (п), 03т (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или 03т (Ы, с3, Ь5, Ь0, Ь3, Ь4, к, 1, д1, с5, и, ν, д5). Существует два аллотипа А2т: А2т(1) и А2т(2).

Термин гипервариабельный участок обозначает аминокислотные остатки из определяющего комплементарность участка или СОК (т.е. остатки 24-34 (Ь1), 50-56 (Ь2) и 89-97 (Ь3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи, как это описано в КаЬа1 е1 а1., Зедиепсек оГ Рго1етк оГ 1ттипо1од1са1 1п1егек1, 5'¹' Ей. РиЬйс Неа11Ь 8ег\1се. Ναΐίοπαϊ 1п51ки1ек оГ Неа11Ь, Ве1Ьекйа, Мй. (1991)). Даже отдельный СОК может распознать и связать антиген, но с меньшей аффинностью, чем полный антигенсвязующий сайт, содержащий все СОК.

Альтернативное определение остатков из гипервариабельной петли описано в СЬо1Ыа е1 а1., 1. Мо1.Вю1. 196: 901-917 (1987) как остатки 26-32 (Ь1), 50-52 (Ь2) и 91-96 (Ь3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи.

Остатки каркасного участка или РК представлены остатками вариабельного домена в отличие от остатков гипервариабельного участка.

Фрагменты антитела включают участок интактного иммуноглобулина, преимущественно антигенсвязывающего или вариабельного участка интактного антитела, и включают мультиспецифические (биспецифические, триспецифические и т.д.) антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты иммуноглобулинов могут быть получены с использованием рекомбинантных способов ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных антител.

Неограничивающие примеры фрагментов антитела включают РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, Ρν (вариабельный участок), доменные антитела (дАт, содержащие домен УН) (^агй е1 а1., №1иге 341:544-546, 1989), фрагменты определяющих комплементарность участков (СОК), одноцепочечные антитела (ксР\\ содержащий домены УН и УЪ на одной полипептидной цепи) (Вий е1 а1., 8с1епсе 242:423-426, 1988, и Ник1оп е1 а1., Ргос. №11. Асай. δα. υδΑ 85:5879-5883, 1988, в некоторых случаях включая полипептидный линкер; и в некоторых случаях мультиспецифический, 0гиЬег е1 а1., 1. 1ттипо1. 152:5368 (1994)), фрагменты одноцепочечного антитела, диател (домены УН и УЪ на одной полипептидной цепи, которая сопряжается комплементарно с доменами УЪ и УН другой цепи) (ЕР 404097; \УО 93/11161; и НоШпдег е1 а1., Ргос. №11. Асай. δα. υδΑ, 90:6444-6448 (1993)), триател, тетрател, минител (δοΡν, слитого с СН3 посредством пептидного линкера (без шарнирного участка) или посредством шарнирного участка 1д0) (О1аГкеп, е1 а1., Рго1еш Епд Эек δе1. 2004 Арг; 17(4):315-23), линейных антител (тандемные сегменты Рй (УН-СН1-УНСН1) (2ара1а е1 а1., Рго1ет Епд., 8(10):1057-1062 (1995)); хелатных рекомбинантных антител (сгАЬ, который может связываться с двумя прилегающими антигенными детерминантами на одном и том же антигене) (№τί е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 246:367-73, 1995), бител (биспецифический ΡаЬ-ксΡν) или трител (триспецифический ΡаЬ-(ксΡν) (2)) (ЪсЬоофапк е1 а1., 1. 1ттипо1. 165:7050-57, 2000; ^Шетк е1 а1., 1. СЬгота1одг В Апа1у1 ТесЬпо1 Вютей ЫГе δ^. 786:161-76, 2003), интрател (Вюсса, е1 а1., ЕМВО 1. 9:101-108, 1990; Со1Ьу е1 а1., Ргос №11 Асай δα ^А. 101:17616-21, 2004), которые также могут включать последовательности для клеточной сигнализации, сохраняющие или направляющие антитело внутрь клетки (МЬакЬПкаг е1 а1., ЕМВО 1 14:1542-51, 1995; \УЬее1ег е1 а1., ΡΑδЕВ 1. 17:1733-5, 2003), транстел (проникающие через клетку антитела, содержащие домен белковой трансдукции (РТО), слитый с ксРт (Непд е1 а1., Мей Нуро1Ьекек. 64:1105-8, 2005), нанотел (вариабельный домен тяжелой цепи примерно 15 кДа) (Сог^Ке1атоζо е1 а1., Сапсег КекеагсЬ 64:2853-57, 2004), небольших модульных иммунопрепаратов ДМ1Р) (ЛУО 03/041600, публикация патента США 20030133939 и публикация патента США 20030118592), белка, слитого с антигенсвязующим доменом иммуноглобулина, антитела верблюдовых (в которых УН рекомбинируется с константным участком, который содержит шарнирный участок, домены СН1, СН2 и СН3) (Оекту1ег е1 а1., 1. Вю1. СЬет. 276:26285-90, 2001; Е\уег1 е1 а1., ВюсЬетНЬу 41:3628-36, 2002; публикация патентов США № 20050136049 и 20050037421), антитела, содержащего УНН, тяжелой цепи антитела (НСАЬ, гомодимеров двух тяжелых цепей со структурой Н2Ь2), или вариантов или их производных, и полипептидов, содержащих, по меньшей мере, участок иммуноглобулина, достаточного для придания надлежащего связывания антигена полипептиду, таким как последовательность СОК, с сохранением требуемой биологической активности антителом.

В контексте данного изобретения термин вариант обозначает полипептидную последовательность антитела, содержащую по меньшей мере одну замену, делецию или вставку аминокислоты в вариабельном участке или фрагменте, эквивалентном вариабельному участку, при условии, что такой вариант сохраняет требуемую аффинность связывания или биологическую активность. Кроме того, антитела, как это описано в тексте данной заявки, могут иметь модификации аминокислот в константном участке для модификации эффекторной функции антитела, включая время полужизни или выведение, АЗКЦ и/или КЗЦ. Такие модификации могут улучшать фармакокинетику или повышать эффективность антитела в

- 5 027039 лечении, например, рака. См. §Ые1Й8 е! а1., 1. ΒίοΙ. СНст.. 276 (9):6591-6604 (2001) (включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). В случае 1§С1 модификации в константном участке, в частности в шарнирном участке или СН2, могут повышать или снижать эффекторную функцию, включая АЗКЦ и/или КЗЦ. В других вариантах воплощения изобретения константный участок 1§С2 модифицирован для снижения образования агрегата антитело-антиген. В случае 1§С4 модификации в константном участке, в частности в шарнирном участке, могут снижать образование полуантител.

Термин модификация при использовании к антителам или описанным здесь полипептидам, включает, но не ограничивается, изменения одной или более аминокислот (включая замены, вставки или делеции); химические модификации, которые не влияют на активность связывания гепсидина; ковалентную модификацию путем конъюгации с терапевтическими или диагностическими агентами; мечение (например, радионуклидами или различными ферментами); ковалентное присоединение полимера, такое как пэгилирование (дериватизация с полиэтиленгликолем) и вставку или замещение путем химического синтеза не встречающихся в природе аминокислот. В некоторых вариантах воплощения изобретения модифицированные полипептиды (включая антитела) по изобретению сохраняют связующие свойства немодифицированных молекул по изобретению.

Термин производное при использовании в контексте антител или полипептидов по изобретению обозначает антитела или полипептиды, модифицированные ковалентно путем конъюгации с терапевтическими или диагностическими агентами, мечения (например, радионуклидами или различными ферментами), ковалентным присоединением полимера, таким как пэгилирование (дериватизация полиэтиленгликолем), и вставкой или замещением путем химического синтеза не встречающихся в природе аминокислот. В некоторых вариантах воплощения изобретения производные по изобретению сохраняют связующие свойства недериватизированных молекул по изобретению.

Способы получения биспецифических или других мультиспецифических антител известны в науке и включают химическое перекрестное связывание, использование лейциновых молний [Ко51е1иу е! а1., 1. 1ттипо1. 148:1547-1553, 1992]; способ диатела [НоШидег е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асай. δα. υδΑ 90:6444-48, 1993]; димеры 8сРу [СгиЬег е! а1., 1. 1ттиио1. 152: 5368, 1994], линейные антитела |Ζ;·ιρ;·ιΙ;·ι е! а1., Рго1еш Еид. 8:1057-62, 1995]; и хелатные рекомбинантные антитела [№й е! а1., 1. Мо1. Вю1. 246:367-73, 1995].

Белки и небелковые агенты могут быть конъюгированы с антителами с использованием известных в науке способов. Способы конъюгации включают прямое связывание, связывание посредством ковалентно присоединенных линкеров и связывание со специфическими связующимися парами (например, авидин-биотин). Такие способы включают, например, способы, описанные в Сгееийе1й е! а1., Саисег Ке5еагсй 50, 6600-6607 (1990) для конъюгации доксорубицина и способы, описанные в Агиои е! а1., Αάν. Ехр. Мей. Вю1. 303, 79-90 (1991) и Кще^а е! а1., Мо1. Вю1. (υδδΚ) 25, 508-514 (1991) для конъюгации соединений платины.

В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные здесь антитела и фрагменты антител получают, например, из встречающихся в природе антител или библиотек фаговых дисплеев РаЬ или 5сРν. Фраза гуманизированное антитело обозначает антитело, полученное из последовательности антитела, не принадлежащего человеку, как правило, моноклонального антитела грызунов, и включает модификации, придающие последовательности свойства последовательности человека. С другой стороны, гуманизированное антитело может быть получено из химерного антитела.

Фрагменты антитела включают фрагмент доменного антитела (дАТ) (Аагй е! а1., ШЩге 341:544546, 1989), состоящий из домена У_Н, линейные антитела включают пару тандемных сегментов Рй (У_НС_Н1-У_Н-С_Н1), образующих пару антигенсвязующих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими ^ара1а е! а1., Рго1еш Еид. 8:1057-62 (1995)); минитело, состоящее из 5сРν, слитого с СН3 посредством пептидного линкера (без шарнирного участка) или посредством шарнирного участка 1дС, было описано в О1аГ5еи, е! а1., Рго1еш Еид Эе5 δе1. 2004 Арг; 17(4):315-23; макситело обозначает двухвалентные 8сРν, ковалентно присоединенные к участку Рс иммуноглобулина, см., например, Ргейепскз е! а1., Рго1еш Еидшеегшд, Пе51ди & δе1есйοи, 17:95-106 (2004) и Ро\\ег5 е! а1., 1оигиа1 оГ 1ттиио1одюа1 Ме1йой5, 251:123-135 (2001); антитела с тяжелой цепью, например домен УН_Н или Н₂Ь₂ (обозначаются как антитела с тяжелой цепью или НСАЬ); или У_НН верблюдовых (см., например, КеюЬтаи, е! а1., 1. 1ттиио1. Мейюй5 1999, 231:25-38, Ое5ту1ег е! а1., 1. Вю1. Сйет. 276:26285-90, 2001, Е\\ег1 е1 а1., Вюсйетг5йу 41:3628-36, 2002; нанотело (Сог1е/-Ке1ато/о е! а1., Саисег Ке5еагсй 64:2853-57, 2004); интратела являются одноцепочечными антителами, демонстрирующими внутриклеточную экспрессию, которые могут манипулировать выработкой белка внутри клетки (Вюсса, е! а1., ЕМВО 1. 9:101-108, 1990; Со1Ьу е! а1., Ргос ЫаЙ Асай δ^ ГОА 101:17616-21, 2004, Мйа5ййкаг е! а1., ЕМВО 1. 14:1542-51, 1995, АНее1ег е! а1. (РΑδЕΒ 1. 17:1733-5. 2003); транстела являются антителами, проникающими через клетку, в которых домены трансдукции белка (ΡΤΌ) слиты с одноцепочечным вариабельным фрагментом (5сР\') антител Неид е! а1., (Мей НуроЛе5е5. 64:1105-8, 2005); δМIΡ или белки, слитые со связующим доменом иммуноглобулина, специфичные относительно белка-мишени, представлены одноцепочечными полипептидами, включающими антигенсвязующий домен, слитый с доменами иммуноглобулина, необходимыми для выполнения антителом его эффекторных функций. См., например, АО 03/041600, публикацию патента США 20030133939 и публикацию патента США 20030118592.

- 6 027039

II. Соли кальция и ацетаты или буфера.

Было выявлено, что добавление относительно низких концентраций кальция ацетата к композициям с выбранным антителом снижает вязкость композиции. Термин вязкость в контексте данного изобретения обозначает абсолютную вязкость. Абсолютная вязкость, называемая иногда динамической или простой вязкостью, является продуктом кинематической вязкости и плотности жидкости

Абсолютная вязкость = Кинематическая вязкость х Плотность.

Единицы кинематической вязкости представлены Ь²/Т, где Ь - длина, а Т - время. В целом кинематическая вязкость выражается в сантистоксах (сСт). Единица СИ кинематической вязкости представлена мм²/с, что составляет 1 сСт. Абсолютная вязкость выражается в единице сантипуаз (сП). Единица СИ абсолютной вязкости представлена как миллипаскаль в секунду (мПа-с), при этом 1 сП = 1 мПа-с.

Подобные измерения вязкости могут проводиться ежечасно (например, в течение 1-23 ч), ежедневно (например, в течение 1-10 дней), еженедельно (например, в течение 1-5 недель), или ежемесячно (например, в течение 1-12 месяцев), или ежегодно (например, в течение 1-2 лет, 1-3 лет) после добавления агента, снижающего вязкость, в композицию антитела. Измерения вязкости могут проводиться при хранении при температуре введения, например 2-8°С или 25°С (комнатная температура). В некоторых вариантах воплощения изобретения абсолютная вязкость жидкости или восстановленной жидкой композиции при температуре хранения и/или введении составляет 15 сП или менее, или 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 сП или менее.

В некоторых вариантах воплощения изобретения вязкость белковой композиции измеряют до и после добавления кальциевой соли и/или ацетатной соли (и/или буфера). Способы измерения вязкости хорошо известны в науке и включают, например, использование капиллярного вискозиметра или вискозиметра с конусом и плитой. Могут использоваться любые способы при условии использования одного и того же способа для сравнения исследуемой и эталонной композиций.

Вязкость композиции антитела может быть снижена путем добавления кальциевой соли и/или ацетатной соли (и/или буфера) в композицию. Вязкость композиции с антителом может быть снижена примерно на 5%, примерно на 10%, примерно на 15%, примерно на 20%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 35%, примерно на 40%, примерно на 45%, примерно на 50%, примерно на 55%, примерно на 60%, примерно на 65%, примерно на 70%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 85% и примерно на 90% в сравнении с вязкостью сопоставимой композиции с антителом при отсутствии кальциевой соли и/или ацетатной соли (и/или буфера).

Типичные кальциевые соли включают, не ограничиваясь, кальция ацетат, кальция карбонат и кальция хлорид. В некоторых вариантах воплощения изобретения кальциевая соль находится в концентрации по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мМ. В определенных вариантах воплощения изобретения концентрация кальциевой соли не превышает 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мМ. Любой диапазон, включающий комбинацию указанных выше конечных точек, предусмотрен, включая, но не ограничиваясь, от примерно 0,5 до примерно 10 мМ, от примерно 5 до примерно 10 мМ или от примерно 5 до примерно 15 мМ. В некоторых вариантах воплощения изобретения кальциевая соль присутствует в концентрации, снижающей вязкость композиции антитела по меньшей мере на 30, 40, 50, 60% или более в сравнении с этой же композицией антитела без ацетатной соли и/или буфера, или достигается вязкость 10 сП или менее, или 9, 8, 7, 6 или 5 сП или менее. В определенных вариантах воплощения изобретения кальциевую соль добавляют при низких концентрациях, чтобы не повлиять отрицательным образом на белковую композицию. Например, при концентрациях кальция хлорида или магния хлорида 20 мМ или более белки могут образовывать гель при низких температурах хранения (например, 28°С). В соответствии с этим концентрация кальциевой соли обычно выбирается таковой, чтобы снижать вязкость при указанной температуре хранения отдельной композиции.

Во всех представленных здесь диапазонах концентрация катиона, аниона или соли представлена финальной концентрацией жидкости или восстановленной жидкой композиции, предназначенной для введения. В любом описанном здесь диапазоне конечные точки диапазона включены в диапазон. Однако описание также предусматривает одинаковые диапазоны, в которых исключены нижняя и/или верхняя конечная точка.

В некоторых вариантах воплощения изобретения описанная здесь композиция включает, кроме добавления кальциевой соли, ацетатный буфер в концентрации по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15 мМ. В некоторых вариантах воплощения изобретения концентрация не превышает 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. Любой диапазон, включающий комбинацию указанных выше конечных точек, предусмотрен, включая, но не ограничиваясь, от примерно 5 до примерно 15 мМ или от примерно 5 до примерно 10 мМ. Буфер преимущественно добавляют в концентрации с поддержанием рН примерно 5-6, или 5-5,5, или 4,5-5,5. Если кальциевая соль в композиции представлена кальция ацетатом, в некоторых вариантах воплощения изобретения общая концентрация ацетата составляет от примерно 10 до примерно 50 мМ или от примерно 20 до примерно 40 мМ.

В некоторых аспектах композиция включает общую концентрацию ацетатной соли, составляющей по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В некоторых вариантах воплощения

- 7 027039 изобретения концентрация ацетата не превышает примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 мМ. Любой диапазон, включающий комбинацию указанных выше конечных точек, предусмотрен, включая, но не ограничиваясь, от примерно 10 до примерно 50 мМ, от примерно 20 до примерно 50 мМ, от примерно 20 до примерно 40 мМ, от примерно 30 до примерно 50 мМ, или от примерно 30 до примерно 75 мМ. В некоторых вариантах воплощения изобретения ацетатная соль или буфер включает кальция ацетат и/или натрия ацетат. С другой стороны, в некоторых вариантах воплощения изобретения ацетатная соль присутствует в концентрации, снижающей вязкость композиции антитела по меньшей мере на 30, 40, 50, 60% или более в сравнении с этой же композицией антитела без ацетатной соли и/или буфера, или достигается вязкость 10 сП или менее, или 9, 8, 7, 6 или 5 сП или менее. Например, раствор, содержащий 10 мМ кальция ацетата, будет содержать 20 мМ ацетатного аниона и 10 мМ кальциевого катиона, по причине двухвалентной природы катиона кальция, в то время как раствор, содержащий 10 мМ натрия ацетата, будет содержать 10 мМ натриевого катиона и 10 мМ ацетатного аниона.

В некоторых вариантах воплощения изобретения общая концентрация ионов (катионов и анионов) в растворе составляет по меньшей мере 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ, 75 мМ, 80 мМ или 85 мМ. В некоторых вариантах воплощения изобретения общая концентрация ионов не превышает примерно 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ, 75 мМ, 80 мМ, 85 мМ, 90 мМ, 95 мМ, 100 мМ, 110 мМ, 120 мМ, 130 мМ, 140 мМ, 150 мМ, 160 мМ, 170 мМ, 180 мМ, 190 мМ или 200 мМ. Любой диапазон, включающий комбинацию указанных выше конечных точек, предусмотрен, включая, но не ограничиваясь. от примерно 30 до примерно 60 мМ, или от примерно 30 до примерно 70 мМ, или от примерно 30 до примерно 80 мМ, или от примерно 40 до примерно 150 мМ, или от примерно 50 до примерно 150 мМ. Например, раствор 10 мМ кальция ацетата будет содержать 30 мМ общей концентрации ионов (10 мМ катионов и 20 мМ анионов).

В любой из описанных выше композиций в некоторых вариантах воплощения изобретения общая осмоляльность не превышает 500 мОсм/л, 450 мОсм/л, 400 мОсм/л или 350 мОсм/л, и преимущественно значение близко к изотоничности, например 250-350 мОсм/л.

В композицию могут быть дополнительно включены другие вспомогательные вещества, известные в науке или описанные в тексте данной заявки.

III. Вспомогательные вещества в композиции.

Белковые композиции обычно вводят парентерально. При парентеральном введении композиции должны быть стерильными. Стерильные разбавители включают жидкости, являющиеся фармацевтически приемлемыми (безопасными и нетоксичными для введения человеку) и использоваться для приготовления жидкой композиции, такой как восстановленная композиция после лиофилизации. Типичные разбавители включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (ВАН). рН забуференный раствор (например, фосфатный забуференный физиологический раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. Разбавители могут включать водные растворы солей и/или буферы.

Вспомогательные вещества являются добавками, которые включают в композицию для улучшения или повышения стабильности, доставки и возможности производства лекарственного препарата. Независимо от причины включения вспомогательные вещества являются интегральным компонентом лекарственного препарата и, следовательно, должны быть безопасны и хорошо переноситься пациентами. Для белковых препаратов выбор вспомогательных веществ особенно важен, т.к. они могут влиять на эффективность и иммуногенность препарата. Таким образом, белковые композиции должны быть разработаны с соответствующим выбором вспомогательных веществ, предоставляющих подходящую стабильность, безопасность и возможность производства.

Описанные здесь вспомогательные вещества организованы по химическому типу или их функциональной роли в композициях. При обсуждении вспомогательного вещества каждого типа приведено краткое описание способа стабилизации. Учитывая приведенные здесь руководства и принципы, специалист в данной области легко сможет изменять количество вспомогательного вещества без повышения вязкости до нежелательного уровня. Вспомогательные вещества могут быть выбраны для достижения требуемой осмоляльности (т.е. изотоничности, гипотоничности или гипертоничности) финального раствора, рН, требуемой стабильности, устойчивости к агрегации или деградации, или образованию осадка, защите от условий замораживания, лиофилизации или высоких температур, или других свойств. В науке известен целый ряд вспомогательных веществ. Типичные вспомогательные вещества включают соли, аминокислоты, другие агенты, изменяющие тоничность, сурфактанты, стабилизаторы, наполнители, криопротекторы, лиопротекторы, антиоксиданты, ионы металлов, хелатные агенты и/или консерванты.

Кроме того, если отдельное вспомогательное вещество указано в композиции, например, в виде процентов (%) в/о, специалистам в данной области будет очевидно, что также предусмотрен эквивалент молярной концентрации данного вспомогательного вещества.

А. Буферы.

Диапазон рН для оптимальной стабильности должен быть идентифицирован заранее до исследования разработки состава. Было показано, что могут использоваться несколько способов, такой как изучение повышенной стабильности и калориметрический скрининг (Кетте1е К.Ь. 1г., с1 а1., Вюсйет181гу,

- 8 027039

38(16): 5241-7 (1999)). Как только закончена разработка состава, лекарственный препарат должен быть произведен и содержаться в соответствии с ранее определенной спецификацией в течение срока хранения. Таким образом, буферные агенты практически всегда используют для контроля рН в композиции.

Органические кислоты, фосфаты и Трис часто использовали в композициях белков (табл. 1). Буферная способность буферных агентов максимальна при рН, равном рК_а, и снижается при увеличении рН или снижении от данного значения. Девяносто процентов буферной способности существует в пределах одного значения рН, равного рК_а. Буферная способность также повышается пропорционально повышению концентрации буфера.

При выборе буфера следует учитывать несколько факторов. Первый и самый важный: вид буфера и его концентрация должны быть определены на основе значения рК_а и требуемого рН композиции. Важным является и обеспечение совместимости буфера с белковым препаратом, другими вспомогательными веществами композиции, а также отсутствие катализации любых реакций распада. Недавно было показано, что полианионные карбоксилатные буферы, такие как цитрат и сукцинат, образуют ковалентные аддукты с остатками боковых цепей белков. Третий важный аспект, который следует учитывать, заключается в ощущении покалывания и раздражении, которые может вызывать буфер. Например, известно, что цитрат вызывает чувство покалывания при введении (Баигзеп Т., е1 а1., Ва§1С Сйп РЬагшасо1 Τοχΐεοί., 98(2): 218-21 (2006)). Потенциал стягивания и раздражения больше у препаратов, вводимых подкожно и внутримышечно, при этом раствор препарата остается на месте в течение относительно длительного времени, чем при внутривенном введении, когда препарат быстро растворяется в крови при введении. Для композиций, вводимых напрямую внутривенной инфузией, общее количество буфера (и любого другого компонента композиции) необходимо мониторить. Например, сообщалось, что ионы калия, введенные в форме буфера калия фосфата, могут индуцировать явления со стороны сердечно-сосудистой системы у пациента (Но11апбег-Кобп§ие7 ТС., е1 а1., Ат. Раш. РЬу§1С1ап., 73(2): 283-90 (2006)).

Таблица 1

Часто используемые буферные агенты и их значения рК_а

Буфер	рка	Пример лекарственного препарата
Ацетат	4,8	Неупоген, Неуласта
Сукцинат	рКа1 = 4,8, рКа2 = 5,5	Актиммун
Цитрат	рКа1 =3,1, рКа2 = 4,8, рКа3 =6,4	Хумира
Гистидин (имидазол)	6, 0	Ксолаир
Фосфат	рКа1 =2,15, рКа2 = 7,2, рКа3 = 12,3	Энбрел (жидкая композиция)
Трис	8,1	Лейкин

Буферная система, присутствующая в композиции, выбирается таким образом, чтобы она была физиологически совместимой и поддерживала необходимый рН.

рН буферное соединение может присутствовать в любом количестве, подходящем для поддержания рН композиции на предустановленном уровне. рН буферный агент, например ацетат, может находиться в концентрации от 0,1 до 1000 мМ (1М). В одном варианте воплощения изобретения рН буферный агент находится в количестве по меньшей мере 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700 или 900 мМ. В другом варианте воплощения изобретения концентрация рН буферного агента составляет от 1, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 до 100 мМ. В еще одном варианте воплощения изобретения концентрация рН буферного агента составляет от 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 или 40 до 50 мМ. В еще одном варианте воплощения изобретения концентрация рН буферного агента составляет 10 мМ.

Другие типичные рН буферные агенты, используемые для забуференизации композиции, включают, не ограничиваясь, глицин, глутамат, сукцинат, фосфат, ацетат и аспартат. В качестве буферных агентов могут использоваться такие аминокислоты, как гистидин и глутаминовая кислота.

В. Стабилизаторы и наполнители.

Стабилизаторы включают класс соединений, которые могут служить в качестве криопротекторов, лиопротекторов и стеклообразующих агентов. Криопротекторы действуют для стабилизации белков во время замораживания или когда белки находятся в замороженном состоянии при низких температурах. Лиопротекторы стабилизируют белки в лиофилизированной твердой лекарственной форме путем сохранения естественных конформационных свойств белка во время стадий дегидратации при лиофилизиро- 9 027039 вании. Свойства стекловидного состояния были классифицированы как прочный или хрупкий, в зависимости от релаксационных свойств как функции от температуры. Важно, чтобы криопротекторы, лиопротекторы и стеклообразующие агенты оставались в той же самой фазе, что белок, для оказания влияния на стабильность. Сахара, полимеры и полиолы попадают в эту категорию и иногда играют все три роли.

Полиолы охватывают класс вспомогательных веществ, который включает сахара (например, маннитол, сахарозу, сорбитол) и другие полигидридные спирты (например, глицерин и пропиленгликоль). Полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ) включен в эту категорию. Полиолы обычно используют как стабилизирующие вспомогательные вещества и/или агенты для улучшения изотоничности в жидких и лиофилизированных белковых композициях для парентерального введения. Полиолы могут защищать белки от физического и химического распада.

Типичные полиолы С₃-С₆ включают пропиленгликоль, глицерин, треозу, треитол, эритрозу, эритритол, рибозу, арабинозу, арабитол, ликсозу, мальтитол, сорбитол, сорбозу, глюкозу, маннозу, маннитол, левулозу, декстрозу, мальтозу, трегалозу, фруктозу, ксилитол, инозитол, галактозу, ксилозу, фруктозу, сахарозу, 1,2,6-гексантриол и т.п. Сахара высших порядков включают декстран, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Восстанавливающие сахара, такие как фруктоза, мальтоза или галактоза, окисляются легче, чем невосстанавливающие сахара. Дополнительные примеры сахароспиртов включают глюцитол, мальтитол, лактитол или изомальтулозу. Дополнительные типичные лиопротекторы включают глицерин и желатин, сахара меллибиозу, мелезитозу, раффинозу, маннотриозу и стахиозу. Примеры восстанавливающих сахаров включают глюкозу, мальтозу, лактозу, мальтулозу, изомальтулозу и лактулозу. Примеры невосстанавливающих сахаров включают невосстанавливающие гликозиды полигидроксильных соединений, выбираемых из сахароспиртов и других полиспиртов с неразветвленной цепью. Моногликозиды включают соединения, полученные путем снижения дисахаридов, таких как лактоза, мальтоза, лактулоза и мальтулоза.

В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные здесь композиции также включают стабилизатор (или комбинацию стабилизаторов), который добавляется в композицию. Термин стабилизатор обозначает вспомогательное вещество, способное предотвращать агрегацию или иную физическую деградацию (например, автолиз, дезамидирование, окисление и т.д.) в водном растворе и твердом состоянии. Стабилизаторы, обычно используемые в фармацевтических композициях, включают, но не ограничиваются, сахарозу, трегалозу, маннозу, мальтозу, лактозу, глюкозу, раффинозу, целлобиозу, гентиобиозу, изомальтозу, арабинозу, глюкозамин, фруктозу, маннитол, сорбитол, глицин, аргинин НС1, полигидроксильные соединения, включая такие полисахариды, как декстран, крахмал, гидроксиэтиловый крахмал, циклодекстрины, Ν-метилпирролиден, целлюлозу и гиалуроновую кислоту натрия хлорид [СагрсШсг с1 а1., Эсус1ор. Βίο1. 81аибагб 74:225, (1991)]. В одном варианте воплощения изобретения стабилизатор вводят в концентрации от примерно 0 до примерно 40% в/о. В другом варианте воплощения изобретения стабилизатор вводят в концентрации по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 или 40% в/о. В другом варианте воплощения изобретения стабилизатор вводят в концентрации примерно от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 до примерно 10% в/о. В еще одном варианте воплощения изобретения стабилизатор вводят в концентрации от примерно 2 до примерно 6% в/о. В еще одном варианте воплощения изобретения стабилизатор вводят в концентрации примерно 4% в/о. В еще одном варианте воплощения изобретения стабилизатор вводят в концентрации примерно 6% в/о.

При необходимости, композиции также включают соответствующие количества агентов, регулирующих объем и осмоляльность, подходящих для формирования лиофилизированной лепешки. Наполнители могут быть кристаллическими (например, маннитол, глицин) или аморфными (например, сахароза, полимеры, такие как декстран, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза). Другие типичные наполнители включают лактозу, сорбитол, трегалозу или ксилитол. В дополнительном варианте воплощения изобретения наполнитель вводят в концентрации от примерно 0 до примерно 10% в/о. В другом варианте воплощения изобретения наполнитель вводят в концентрации по меньшей мере 0,2, 0,5, 0,7, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 или 9,5% в/о. В еще одном варианте воплощения изобретения наполнитель находится в концентрации примерно 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 до 5,0% в/о для получения механически и фармацевтически стабильной лепешки.

С. Сурфактанты.

Белковым молекулам свойственно взаимодействовать с поверхностями, делая их восприимчивыми к адсорбции и денатурации на поверхностях воздух-жидкость, пробирка-жидкость и жидкость-жидкость (силиконовое масло). Такой путь деградации, как отмечалось, был обратнозависим от концентрации белка и приводил к образованию растворимого и нерастворимого белкового агрегата или потери белка из раствора посредством адсорбции на поверхностях. Кроме адсорбции поверхностью контейнера, поверхностно-индуцированная деградация усиливается при физическом воздействии, что может ожидаться во время транспортировки и обращения с продуктом.

Сурфактанты обычно используют в белковых композициях для предотвращения поверхностноиндуцированной деградации. Сурфактанты являются амфипатическими молекулами со способностью конкурирующих белков для прилегающих поверхностей. Гидрофобные участки молекул сурфактантов

- 10 027039 оккупируют положения соприкосновения (например, воздух/жидкость), в то время как гидрофобные участки молекул остаются ориентированными к растворителю. При достаточных концентрациях (обычно в диапазоне критической мицеллярной концентрации детергента) поверхностный слой молекул сурфактанта служит для предотвращения адсорбции белковых молекул на поверхности. Таким образом, сводится к минимуму поверхностно-индуцированная деградация. Наиболее часто используемые сурфактанты представлены эфирами жирных кислот, полиэтоксилатами сорбитана, т.е. полисорбатом 20 и полисорбатом 80 (например, Авонекс®, Нейпоген®, Неуласта®). Последние отличаются только в длине алифатической цепи, придающей молекулам С-12 и С-18 гидрофобный характер соответственно. Согласно этому полисорбат-80 более поверхностно активен и имеет меньшую критическую мицеллярную концентрацию, чем полисорбат-20. Сурфактант полоксамер 188 использовали в нескольких представленных на рынках продуктах, таких как Гонал-Р®, Нордитропин® и Овидрел®.

Детергенты также могут влиять на термодинамическую конформационную стабильность белков. Опять-таки, эффекты отдельного вспомогательного вещества будут специфичны для отдельных белков. Например, было показано, что полисорбаты снижают стабильность некоторых белков и повышают стабильность других. Дестабилизация детергентом белков может быть рационализирована относительно гидрофобных хвостов молекул детергента, которые могут участвовать в специфическом связывании с частично или полностью нескрученными белками. Такие типы взаимодействий могут вызвать смещение в конформационном равновесии относительно одного отдельного белкового состояния (т.е. повышение воздействия гидрофобных участков белковой молекулы в комплементе для связывания полисорбата). С другой стороны, если нативное состояние белка обладает несколькими гидрофобными поверхностями, связывание детергента с белком в нативном состоянии может стабилизировать конформацию.

Другой аспект полисорбатов состоит в том, что они восприимчивы к окислительной деградации. Часто, в качестве сырьевых материалов, они содержат достаточное количество пероксидов для окисления остатков боковых цепей белка, особенно метионина. Потенциал окислительного повреждения, возникающий при добавлении стабилизатора, указывает на то, что в композициях следует использовать наименьшие эффективные концентрации вспомогательных веществ. Для сурфактантов эффективная концентрация для отдельного белка будет зависеть от механизма стабилизации. Было постулировано, что если механизм стабилизации сурфактантом включает предотвращение поверхностной денатурации, эффективная концентрация будет примерно равна критической мицеллярной концентрации детергента. И наоборот, если механизм стабилизации обусловлен специфическими взаимодействиями белок-детергент, эффективная концентрация сурфактанта будет примерно равна концентрации белка и стехиометрии взаимодействия (Капйо1рЬ Т.^., е! а1., РЬатш Вю1есЬпо1., 13:159-75 (2002)).

Кроме того, сурфактанты могут быть добавлены в соответствующих количествах для предотвращения поверхностно-обусловленной агрегации во время замораживания и высушивания [СЬапд, В, 1. РЬатш. 8с1. 85:1325, (1996)]. Типичные сурфактанты включают анионные, катионные, неионные, цвиттерионные и амфотерные сурфактанты, включая сурфактанты, полученные из представленных в природе аминокислот. Анионные сурфактанты включают, не ограничиваясь, натрия лаурилсульфат, диоктил натрия сульфосукцинат и диоктил натрия сульфонат, хенодезоксихолевую кислоту, Ν-лауроилсаркозин натриевую соль, лития додецилсульфат, 1-октансульфоновой кислоты натриевую соль, натрия холат гидрат, натрия дезоксихолат и гликодезоксихолевой кислоты натриевую соль. Катионные сурфактанты включают, не ограничиваясь, бензалкония хлорид или бензетония хлорид, цетилпиридиния хлорида моногидрат и гексадецилтриметиламмония бромид. Цвиттер-ионные сурфактанты включают, не ограничиваясь, СНАР8, СНАР8О, 8В3-10 и 8В3-12.

Неионные сурфактанты включают, не ограничиваясь, дигитонин, Тритон Х-100, Тритон Х-114, Твин-20 и Твин-80. В другом варианте воплощения изобретения сурфактанты включают лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен гидрогенированное касторовое масло 10, 40, 50 и 60, глицерина моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, соевый лецитин и другие фосфолипиды, такие как ЭОРС. ОМРО, ЭМРС и ЭОРО: эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу.

Описанные здесь композиции могут дополнительно включать такие сурфактанты, отдельным образом или в смеси в различных соотношениях. В одном варианте воплощения изобретения сурфактант вводят в концентрации от примерно 0 до примерно 5% в/о. В другом варианте воплощения изобретения сурфактант вводят в концентрации, по меньшей мере, 0,001, 0,002, 0,005, 0,007, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,6, 0,7, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 или 4,5% в/о. В другом варианте воплощения изобретения сурфактант вводят в концентрации от примерно 0,001 до примерно 0,5% в/о. В еще одном варианте воплощения изобретения сурфактант вводят в концентрации от примерно 0,004, 0,005, 0,007, 0,01, 0,05 или 0,1 до примерно 0,2% в/о. В еще одном варианте воплощения изобретения сурфактант вводят в концентрации от примерно 0,01 до примерно 0,1% в/о.

В других вариантах воплощения изобретения снижение вязкости достигается при относительно небольшом количестве сурфактанта или его отсутствии, например 0,1% или менее общего количеств сурфактанта, или 0,05% или менее, или 0,01% или менее.

- 11 027039

Ό. Аминокислоты.

Аминокислоты используют в белковых композициях в качестве буферов, наполнителей, стабилизаторов и антиоксидантов. Гистидин и глутаминовая кислота используются для буферизации белковых композиций при диапазоне рН 5,5-6,5 и 4,0-5,5 соответственно. Группа имидазола гистидина имеет рК_а = 6,0 и карбоксильная группа боковой цепи глутаминовой кислоты имеет рК_а 4,3, что делает их подходящими для буферизации в соответствующих диапазонах рН. Глутаминовая кислота присутствует в некоторых композициях (например, Стемген®). Гистидин обычно присутствует в представленных на рынке белковых композициях (например, Ксолаир®, Герцептин®, Рекомбинате®). Он представляет хорошую альтернативу цитрату, буферу, известному как вызывающий чувство покалывания после инъекции. Интересным является тот факт, что гистидин, как сообщалось, обладает стабилизирующим эффектом при использовании в высоких концентрациях в жидкой и лиофилизированной композиции (СЬеп В, е! а1., РЬагт Рс5.. 20(12): 1952-60 (2003)). Отмечается, что гистидин (до 60 мМ) снижает вязкость композиции с высокой концентрацией такого антитела. Однако в этом же исследовании авторы отмечали повышенную агрегацию и обесцвечивание в композициях, содержащих гистидин, во время исследований замораживания-оттаивания антитела в контейнерах из нержавеющей стали. Авторы связали это с эффектом ионов железа, высвобождаемых при коррозии стальных контейнеров. Другой факт, который следует учитывать, представлен тем, что гистидин повергается фотоокислению в присутствии ионов металлов (ТотЪа М, е! а1., ВюсЬетМгу, 8(12): 5149-60 (1969)). Использование метионина в качестве антиоксиданта в композициях оказывается многообещающим; отмечалась его эффективность относительно целого ряда окислительных стрессов (Ьат Х.М., е! а1., 1. РЬагт 8ск, 86(11): 1250-5 (1997)).

Аминокислоты глицин, пролин, серии и аланин стабилизируют белки. Глицин обычно используют как наполнитель в лиофилизированных композициях (например, Неумега®, Генотропин®, Хуматроп®). Была показана эффективность аргинина как эффективного агента в ингибировании агрегации, а также использовании его в жидкой и лиофилизированной композициях (например, Активаз®, Авонекс®, Энбрел® раствор).

Е. Антиоксиданты.

Окисление белковых остатков возникает в результате различных причин. В отсутствие добавления специфических антиоксидантов предотвращение окислительного повреждения белка включает тщательный контроль целого ряда факторов в ходе процесса производства и хранения продукта, такого как атмосферный кислород, температура, воздействие света и химическое загрязнение. Наиболее часто используемые фармацевтические антиоксиданты являются восстанавливающими агентами, кислородными/не содержащими радикалы скавенжерами или хелатными агентами. Антиоксиданты в терапевтических белковых композициях должны быть растворимы в воде и оставаться активными в течение периода хранения продукта.

Восстанавливающие агенты и кислородные/не содержащие радикалы скавенжеры действуют путем абляции активного кислорода в растворе. Хелатные агенты, такие как ЭДТА, могут быть эффективными при связывании следовых загрязнителей-металлов, способствующих образованию свободного радикала. Например, ЭДТА использовали в жидкой композиции кислого фактора роста фибробластов для ингибирования каталитического окисления металлического иона в остатках цистеина. ЭДТА использовали в представленных на рынке продуктах, таких как Кинерет® и Онтак®. Однако сами по себе антиоксиданты могут индуцировать другие ковалентные или физические изменения в белке. В литературе сообщен целый ряд таких случаев. Восстанавливающие агенты (такие как глутатион) могут вызвать разрушение межмолекулярных дисульфидных связей, что может привести к перемещению дисульфида. В присутствии ионов переходных металлов аскорбиновая кислота и ЭДТА способствовали окислению метионина в целом ряде белков и пептидов (Акегк Мб., апб ОеГеНрр15 М.К. Рерббек аиб Рго!е1пк ак Рагеп!ега1 8о1иЬопк. Ιη: РЬагтасеибса1 Рогти1абои Оеуе1ортеп1 оГ Рерббек апб Рго!е1пк. 8νеη Ргок)аег, Ьагк Ноудаагб, ебЬогк. РЬагтасеибса1 8с1епсе. Тау1ог апб Ргапак, ИК (1999)); Ргапккоп 1.К., 1. РЬагт. 8сг 86(9): 4046-1050 (1997); Υίη 1., е! а1., РЬагт Ке8., 21(12): 2377-83 (2004)). Сообщалось, что натрия тиосульфат снижает уровни окисления метионина, вызванного светом и температурой в гЬиМаЬ НЕК2; однако в этом исследовании также сообщалось об образовании аддукта тиосульфат-белок (Ьат Х.М., Υаηд Ι.Υ., е! а1., 1. РЬагт 8ск 86(11): 1250-5 (1997)). Выбор соответствующего антиоксиданта производится на основе специфического стресса и чувствительности белка.

Р. Ионы металлов.

В целом, ионы переходных металлов нежелательны в белковых композициях, поскольку они могут катализировать реакции физического и химического распада в белках. Однако отдельные ионы металлов включены в композиции, т.к. они являются кофакторами для белков и в суспензиях композиций белков, где они образуют координационные комплексы (например, цинк в суспензии инсулина). Недавно было показано, что использование ионов кальция (10-120 мМ) ингибировало изомеризацию аспартатной кислоты в изоаспартатную кислоту (\У0 2004/039337).

Два примера, в которых ионы металлов придают стабильность или повышают активность в белках, представлены дезоксирибонуклеазой человека (рчДНКаза, Пулмозим®) и фактором ΥΙΙΙ. В случае с

- 12 027039 рчДНКазой, ионы Са'² (до 100 мМ) повышали стабильность фермента посредством специфического сайта связывания (СЬеп В, е! а1., 1. РЬагт. δει., 88(4): 477-82 (1999)). По сути, удаление ионов кальция из растворов с использованием ЭДТА вызвало повышение дезамидации и агрегации. Однако данный эффект отмечался только для ионов Са²'; другие двухвалентные катионы Мд'², Мп'² и Ζη'² дестабилизировали рчДНКазу. Подобные эффекты отмечались для фактора VIII. Ионы Са'² и δτ⁺² стабилизировали белок, в то время как другие ионы Мд'², Мп'² и Ζη'², Си'² и Ре⁺² дестабилизировали фермент (Ра1оиго8, А., е! а1., Ιη!. I. РЬагт., 155, 121-131 (1997). В отдельном исследовании с фактором VIII существенное повышение в скорости агрегации отмечалось в присутствии ионов А1'³ (Эегг1ск Τ.δ., е! а1., I. РЬагт. δει., 93(10): 2549-57 (2004)). Авторы отмечают, что другие вспомогательные вещества, такие как буферные соли, часто загрязнены ионами А1'³ и указывают на необходимость использования вспомогательного вещества надлежащего качества в композициях.

С. Консерванты.

Консерванты необходимы при разработке парентеральных композиций множественного применения, которые подразумевают более одного извлечения из одного и того же контейнера. Первичная функция их заключается в ингибировании роста микроорганизмов и обеспечения стерильности продукта во время периода хранения или соблюдения условий использования лекарственного препарата. Часто используемые консерванты включают фенол, бензиловый спирт, метакрезол, алкил парабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен, бензалкония хлорид и бензетония хлорид. Другие примеры соединений с антибактериальной активностью консерванта включают октадецилдиметилмензил аммония хлорид, гексаметония хлорид. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как бутиловый спирт, фенол, бензиловый спирт; атехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол. Несмотря на то, что консерванты используют давно, разработка белковых композиций, включающих консерванты, может быть проблематичной. Консерванты практически всегда обладают дестабилизирующим эффектом (агрегацией) на белки, и это стало основным фактором в ограничении их использования в белковых композициях с множественными дозами (Коу δ, е! а1., I. РЬатт. δει., 94(2): 382-96 (2005)).

Шприц для введения с множественными дозами включает композиции с консервантами. Например, композиции чГР представлены на рынке в данный момент. Нордитропин® (жидкость, Νονο ΝοτάίδΤ), Нутропин Ар® (жидкость, Сепеп!есЬ) и Генотропин (лиофилизированный - картридж с двойной камерой, РЬатташа & Ир)оЬп) содержат фенол, в то время как Соматроп® (Ε1ί ЬШу) включает т-крезол.

Во время разработки дозировки композиции с консервантами следует учитывать несколько аспектов. Эффективная концентрация консерванта в препарате должна быть оптимизирована. Это требует тестирования отдельного консерванта в лекарственной форме с диапазонами концентраций, которые придают противобактериальную эффективность без нарушения стабильности белка. Например, три консерванта были подвергнуты успешному скринингу в разработке жидкой композиции для рецептора интерлейкина-1 (тип I) с использованием дифференциально сканирующей калориметрии (ДСК). Консерванты были ранжированы на основе их влияния на стабильность при концентрациях, обычно используемых в представленных на рынке продуктах (Кетте1е К.Ь. Ιτ., е! а1., РЬагт. Кек., 15(2): 200-8 (1998)).

Некоторые консерванты могут вызвать реакции в месте введения, что является другим фактором, требующим учета при выборе консерванта. В клинических исследованиях, направленных на оценку консервантов и буферов в Нордитропине, ощущение боли было ниже в композициях, содержащих фенол и бензиловый спирт в сравнении с композиций с т-крезолом (Карре1даагй А.М., Ногт Кек. 62 δυρρ1 3:98103 (2004)). Интересным является то, что среди обычно используемых консервантов бензиловый спирт обладает анестезирующими свойствами (Мшодие δ.Ο, апй δυη Э.А.. Апек!Ь Апа1д., 100(3): 683-6 (2005)).

IV. Наборы.

Как дополнительный аспект, изобретение описывает наборы, включающие одну или более описанных здесь композиций, упакованных таким образом, что это облегчает их использование для введения субъектам. В одном варианте воплощения изобретения такой набор включает описанную здесь композицию (например, композицию, включающую любое описанное здесь антитело), упакованную в контейнер, такой как герметично закрытый флакон, сосуд, ампула однократного или многократного использования, предварительно заполненный шприц или предварительно наполненное устройство для инъекций, в некоторых случаях с этикеткой, размещенной на контейнере или включенной в упаковку с описанием соединения или композиции и способа использования. В одном аспекте соединение или композиция упакованы в виде дозированной лекарственной формы. Набор может дополнительно включать устройства, подходящие для введения композиции специфическим путем введения. Преимущественно набор включает этикетку с описанием использования описанного здесь антитела или описанной здесь композиции.

V. Дозы.

Режим введения доз, используемый в способе лечения описанного здесь состояния, будет определен лечащим доктором с учетом различных факторов, модифицирующих действие препаратов, например возраста, массы тела, состояния, пола и диеты пациента, степени тяжести инфекции, времени введения и других клинических факторов. В различных аспектах ежедневный режим заключается в диапазоне 0,1-50 мг препарата антитела на 1 кг массы тела (рассчитывается как масса белка, без химической модифика- 13 027039 ции). В некоторых вариантах воплощения изобретения доза составляет от примерно 0,5 до 20 мг/кг или примерно 0,5-10 мг/кг.

Композиции обычно вводят парентерально, например внутривенно, подкожно, внутримышечно, посредством аэрозоля (интрапульмонально или ингаляционно), или посредством депо для долгосрочного высвобождения. В некоторых вариантах воплощения изобретения композицию вводят внутривенно, сначала болюсно, потом путем продолжительной инфузии для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного препарата. В других вариантах воплощения изобретения композицию вводят в виде однократной дозы. Специалист в данной области легко сможет оптимизировать эффективные дозы и режимы введения с помощью надлежащей медицинской практики и с учетом клинического состояния отдельного пациента. Частота введения дозы будет зависеть от фармакокинетических параметров агентов и пути введения. Оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в данной области в зависимости от путей введения и требуемой дозы. См., например, РепипдЮпУ РЬаттасеи1юа1 8с1спсс5. 18ΐ1ι Ей. (1990, Маек РиЬккШид Со., ЕаЧоп, РА 18042) стр. 1435-1712, содержание которой включено сюда посредством ссылки. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, степень высвобождения ίη νίνο, скорости клиренса ίη νίνο введенных агентов. В зависимости от пути введения, подходящая доза может быть рассчитана в соответствии с массой тела, площадью поверхности тела или размера органа. Необходимы дополнительные расчеты для определения соответствующей дозы для лечения, включающей каждую из указанных выше композиций, такие расчеты могут использоваться специалистом в данной области без неоправданных экспериментов, особенно в свете информации о дозе и описанных здесь анализах, а также фармакокинетических данных, отмеченных в ходе клинических исследований человека, описанных выше. Соответсвующая доза может быть установлена посредством общепринятых анализов для определения уровней доз в крови в сочетании с соответствующими данными ответа на дозу. Финальный режим приема доз будет определен лечащим врачом с учетом различных факторов, модифицирующих действие препаратов, например специфической активности препаратов, степени тяжести повреждения и реакции пациента, возраста, состояния, массы тела, пола и диеты пациента, степени тяжести инъекции, времени введения и других клинических факторов. Поскольку исследования проводятся в данный момент, возникает дополнительная информация о соответствующих уровнях дозы и продолжительности лечения для различных заболеваний и состояний.

VI. Терапевтическое использование композиции.

Описанные здесь композиции используют для лечения или профилактики связанных с костью нарушений, таких как связанные с костью нарушения, ассоциированные с аномальной активностью остеобластов или остеокластов. В некоторых вариантах воплощения изобретения композицию вводят субъекту, страдающему от связанного с костью нарушения, выбираемого из группы, состоящей из следующих заболеваний: ахондроплазия, клейдокраниальный дизостоз, энхондроматоз, фиброзная дисплазия, болезнь Гоше, гипофосфатемический рахит, синдром Марфана, множественный наследственный экзостоз, нейрофиброматоз, незавершенный остеогенез, остеопетроз, остеопойкилоз, склеротические поражения, псевдоартрит, пиогенный остеомиелит, периодонтальная болезнь, потеря кости, вызванная противоэпилептическими препаратами, первичный или вторичный гиперпаратироидизм, синдром наследственного гиперпаратироидизма, потеря кости, вызванная состоянием невесомости, остеопороз у мужчин, постменопаузальная потеря кости, остеоартрит, почечная остеодистрофия, инфильтративные нарушения кости, потеря кости в ротовой полости, остеонекроз челюсти, ювенильная болезнь Паджета, мелореостоз, метаболическая болезнь кости, мастоцитоз, серповидноклеточная анемия/болезнь, потеря кости, вызванная трансплантацией органов, потеря кости, вызванная трансплантацией почки, системная красная волчанка, анкилозирующий спондилит, эпилепсия, ювенильный артрит, талассемия, мукополисахаридоз, болезнь Фабри, синдром Тернера, синдром Дауна, синдром Клайнфельтера, лепра, болезнь Пертеса, подростковый идиопатический сколиоз, мультисистемное воспалительное заболевание младенцев, синдром Уинчестера, болезнь Менкеса, болезнь Уилсона, ишемическая костная болезнь (такая как болезнь Легг-КальвеПертеса или региональные мигрирующий остеопороз), состояния анемии, состояния, вызванные стероидами, потеря кости, вызванная глюкокортикоидами, потеря кости, вызванная гепарином, нарушения костного мозга, цинга, нарушение питания, дефицит кальция, остеопороз, остеопения, алкоголизм, хроническое заболевание печени, постменопаузальное состояние, хронические воспалительные состояния, ревматоидный артрит, воспалительная болезнь кишечника, язвенный колит, воспалительный колит, болезнь Крона, олигоменорея, аменорея, беременность, сахарный диабет, гипертироидизм, нарушения щитовидной железы, нарушения паращитовидной железы, болезнь Кушинга, акромегалия, гипогонадия, иммобилизация или дисфункция, синдром симпатической рефлекторной дистрофии, региональный остеопороз, размягчение костей, потеря кости, связанная с заменой сустава, ВИЧ-ассоциированная потеря кости, потеря кости, вызванная недостатком гормона роста, потеря кости, вызванная кистозным фиброзом, потеря кости, вызванная химиотерапией, потеря кости, вызванная опухолью, потеря кости, вызванная раком, потеря кости, вызванная абляционной терапией гормонами, множественная миелома, потеря кости, вызванная препаратами, нервозная анорексия, потеря кости лица, вызванная заболеванием, потеря кости черепа, вызванная заболеванием, потеря кости челюсти, вызванная заболеванием, потеря кости свода черепа, вызванная заболеванием, потеря кости, вызванная старением, потеря костей лица, вызван- 14 027039 ная старением, потеря кости черепа, вызванная старением, потеря кости челюсти, вызванная старением, потеря кости свода черепа, вызванная старением, или потеря кости, вызванная полетом в космос.

В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные здесь композиции используют для улучшения результатов ортопедических процедур, стоматологических процедур, имплантации, замены сустава, забора кости, косметической операции на кости и восстановления кости, такого как заживление перелома, заживление без срастания, замедленное заживление со срастанием и реконструкция костей лица. Одна или несколько композиций могут вводиться до, во время и/или после процедуры, замены, отбора, операции или восстановления.

Композиция не обязательно должна лечить пациента от нарушения или полностью защищать от возникновения связанного с костью нарушения для достижения преимущественного биологического ответа. Композиция может использоваться профилактически, обозначая защиту, в целом или частично, от связанного с костью нарушения или его симптома. Композиция также может использоваться терапевтически для снижения, в целом или частично, связанного с костью нарушения или его симптома, или для защиты, в целом или частично, от дальнейшего прогрессирования связанного с костью нарушения или его симптома. На самом деле, материалы и способы по изобретению особенно используют для повышения минеральной плотности кости и поддержания повышенной минеральной плотности кости в течение периода времени.

Одно или несколько введений описанной здесь композиции может проводиться в течение периода лечения, например, от примерно 1 до примерно 12 месяцев (например, примерно 2 месяца, примерно 3 месяца, примерно 4 месяца, примерно 5 месяцев, примерно 6 месяцев, примерно 7 месяцев, примерно 8 месяцев, примерно 9 месяцев, примерно 10 месяцев или примерно 11 месяцев). В некоторых вариантах воплощения изобретения субъекту вводят одну или более доз композиции для поддержания минеральной плотности кости. Термин поддержание минеральной плотности кости в контексте данного изобретения обозначает, что повышенная минеральная плотность кости после первичной дозы композиции не падает ниже примерно 1% до примерно 5% в ходе примерно 6 месяцев, примерно 9 месяцев, примерно 1 года, примерно 18 месяцев, примерно 2 лет или в течение жизни пациента. Очевидно, что пациент может потребовать другие фазы лечения для повышения плотности кости и поддержания плотности кости.

Кроме того, может быть преимущественным введение множественных доз в композиции или отдельных введений доз в зависимости от режима лечения, выбранного для отдельного пациента. Композиция может быть введена периодически в течение периода времени одного года или менее (например, 9 месяцев или менее, 6 месяцев или менее или 3 месяцев или менее). В этом отношении композиция может быть введена человеку каждые примерно 7 дней, или 2 недель, или 3 недель, или 1 месяца, или 5 недель, или 6 недель, или 7 недель, или 2 месяцев, или 9 недель, или 10 недель, или 11 недель, или 3 месяцев, или 13 недель, или 14 недель, или 15 недель, или 4 месяцев, или 17 недель, или 18 недель, или 19 недель, или 5 месяцев, или 21 недель, или 22 недель, или 23 недель, или 6 месяцев, или 12 месяцев.

VII. Комбинированная терапия.

Лечение патологии путем комбинации двух или более агентов, поражающих один и тот же патоген, или биохимический путь иногда приводит к большей эффективности и снижает побочные эффекты при использовании терапевтически релевантной дозы каждого агента поодиночке. В некоторых случаях эффективность комбинации препаратов аддитивна (эффективность комбинации примерно равна сумме эффектов каждого препарата отдельно), но в некоторых случаях эффект может быть синергичным (эффект комбинации больше, чем сумма эффектов каждого препарата отдельно). В контексте данного изобретения термин комбинированная терапия обозначает два соединения, которые могут быть доставлены одним способом, например одновременно, или если одно из соединений вводят вначале с последующим введением второго агента, т.е. последовательно. Необходимый результат может быть представлен субъективным снижением одного или более симптомов или объективным идентифицируемым улучшением у реципиента после введения дозы.

В некоторых вариантах воплощения изобретения композицию вводят вместе со стандартными препаратами для лечения пониженной минеральной плотности кости. В контексте данного изобретения термин стандартные препараты обозначает лечение, являющееся общепринятым докторами для определенного типа пациента с диагностированным типом заболевания. В некоторых вариантах воплощения изобретения стандартные препараты выбирают из группы, состоящей из антирезорбтивных препаратов, костеобразующего агента, антагониста рецептора эстрогена (включая, не ограничиваясь, ралоксифен, базедоксифен и лазофоксифен) и препарата со стимулирующим эффектом на остеокласты. В некоторых вариантах воплощения изобретения антирезорбтивный препарат включает, не ограничиваясь, бифосфонат (включая, не ограничиваясь, алендронат, ризендронат, ибадронат и золендронат), эстроген или аналог эстрогена, селективный модулятор рецептора эстрогена (8ЕКМ) и источник кальция, Тиболон, кальцитонин, кальцитриол и гормонозаместительную терапию. В некоторых вариантах воплощения изобретения костнообразующий агент включает, не ограничиваясь, паратиреоидный гормон (ПТГ) или его пептидный фрагмент, ПТГ-родственный белок (ПТГ-рб), костный морфогенетический белок, остеогенин, ΝαΡ. агонист РОЕ₂, статин и лиганд ΚΑΝΚ (ΚΑΝΚΕ). В некоторых вариантах воплощения изобретения препарат со стимулирующим эффектом на остеокласты включает, не ограничиваясь, витамин Ό, или

- 15 027039 производное витамина Ό, или его миметик.

В некоторых вариантах воплощения изобретения композицию вводят субъекту при противопоказании описанного здесь лечения стандартными препаратами.

Примеры

Пример 1. Кальция ацетат снижает эффективную вязкость композиций с антителом к склеростину.

мл выбранного антитела к склеростину (75,7 мг/мл) было диализировано относительно 2 л 10 мМ Па(ОАе) и 9% сахарозы при 4°С в течение 2 ч. Выбранное антитело к склеростину (75,7 мг/мл) было сконцентрировано до примерно 160 мг/мл и разбавлено водой до примерно 140 мг/мл и 120 мг/мл. Определенное поглощение разведенных образцов составило 120, 142 и 157 мг/мл соответственно.

мкл 1,0М Са(ОАс)₂ было добавлено до 1 мл 120 мг/мл, 140 мг/мл и 160 мг/мл образцов. Абсолютная вязкость, рН и осмоляльность образцов были определены (см. табл. 2). Абсолютная вязкость образцов (500 мкл) измеряется с использованием вискозиметра с конусом и плоскостью ВгоокйеЫ ЬУ-ЭУП со шпинделем СРЕ-40 с температурой соответствующей пробирки для образцов, которая регулируется циркулирующей водяной баней при постоянном значении 25°С.

Таблица 2

Образец	Вязкость (сП)	рН	Осмоляльность
120 мг/мл (контроль)	18	5.3	375
120 мг/мл + 10 мМ Са(ОАс)2	8,4	5.4	398
142 мг/мл + 10 мМ Са(ОАс)2	17	5.4	450
157 мг/мл + 10 мМ Са(ОАс)2	36	5.4	610

Результаты показали, что 10 мМ Са(ОАс)₂, введенные в жидкую композицию выбранного антитела, снижали вязкость примерно на половину. Данный эксперимент проводился для каждого антитела АТ-4, АТ-5, АТ-13, АТ-14, АТ-19, АТ-20 и АТ-23.

Пример 2. Коррекция композиции.

мл выбранного антитела к склеростину (75,7 мг/мл) было диализировано относительно 2 л 10 мМ Па(ОАе) и 6% сахарозы или 4% сахарозы при 4°С в течение 2 ч. Затем каждая композиция с сахарозой была сконцентрирована с использованием фильтров Аш1еоп примерно до 140 мг/мл, затем разведена водой до указанных концентраций (т.е. 120 мг/мл, 140 мг/мл и 160 мг/мл). Значения поглощения разведенных образцов были определены и составили 124 мг/мл (4% сахарозы), 119,5 мг/мл (6% сахарозы), 137,5 мг/мл (4% сахарозы) и 142 мг/мл (6% сахарозы) соответственно.

мкл 1,0М Са(ОАс)₂ было добавлено к 1 мл образцов. Вязкость, рН и осмоляльность образцов были определены (см. табл. 3).

Таблица 3

Образец	мМ	мг/мл	рН	Осмоляль- ность	Вязкость (сП)
120 мг/мл + 10 мМ СаОАС + 4% сахарозы	10	124	5,285	214	6,2
120 мг/мл + 10 мМ СаОАС + 6% сахарозы	10	119, 5	5,25	282	5,7
140 мг/мл + 10 мМ СаОАС + 4% сахарозы	10	137.5	5, 303	231	9,5
140 мг/мл + 10 мМ СаОАС + 6% сахарозы	10	142	5, 307	294	11

Анализ был повторен следующим образом: 10 мл выбранного антитела к склеростину (75,7 мг/мл) было диализировано относительно 2 л 10 мМ Па(ОАе), 6% сахарозы или 4% сахарозы при 4°С в течение 2 ч. Каждая композиция с сахарозой была сконцентрирована с использованием фильтра Аш1еоп примерно до 140 мг/мл, затем разведена водой до указанных концентраций (т.е. 70 мг/мл, 100 мг/мл и 120 мг/мл). Определенные значения поглощения разведенных образцов составили 71 мг/мл (4% сахароза), 68,2 мг/мл (6% сахарозы), 99,4 мг/мл (4% сахарозы), 100,5 мг/мл (6% сахарозы), 122 мг/мл (4% сахарозы) и 113 мг/мл (6% сахарозы) соответственно.

рН, осмоляльность и вязкость образцов были определены (см. табл. 4).

- 16 027039

Таблица 4

Образец	мМ	мг/мл	рН	Осмоляль- ность	Вязкость (сП)
70	мг/мл + 4%	сахарозы	10	71	5,205	154	3,5
70	мг/мл + 10	мМ СаОАС +	10	71	5, 233	183	2,2
4%	сахарозы
70	мг/мл 6% сахарозы	10	68,2	5,201	231	3,4
70	мг/мл + 10	мМ СаОАС +	10	68,2	5, 279	256	2,4
6%	сахарозы
100	мг/мл + 4%	сахарозы	10	99, 4	5,265	165	8,1
100	мг/мл + 10	мМ СаОАС	10	99, 4	5,288	191	4,1
+ 4%	сахарозы
100	мг/мл + 6%	сахарозы	10	100,5	5, 273	241	8,4
100	мг/мл + 10	мМ СаОАС	10	100,5	5, 303	270	4,3
+ 6%	сахарозы
120	мг/мл + 4%	сахарозы	10	122	5,295	177	15, 6
120	мг/мл + 10	шМ СаОАС	10	122	5, 306	202	6,9
+ 4%	сахарозы
120	мг/мл + 6%	сахарозы	10	113	5,3	249	15,4
120	мг/мл + 10	мМ СаОАС	10	113	5, 311	274	6, 6
+ 6% сахарозы

Понижение рН буфера Са(ОАс)₂ до 5,2 поддерживало все значения рН финальной композиции между 5,25 и 5,307.

Композиции с 4% сахарозой были ниже диапазона изотоничности (250-350 мОсм/кг), однако композиции с 6% сахарозой были около диапазона изотоничности.

Для дальнейшей оценки эффекта 6% сахарозы с 10 мМ Са(ОАс)₂ в снижении вязкости был повторен указанный выше анализ с дополнительными концентрациями антитела к склеростину до 160 мг/мл.

Образцы были приготовлены, как это описано выше, со следующими концентрациями: 120 мг/мл, 140 мг/мл и 160 мг/мл. 10 мкл 1,0М Са(ОАс)₂, рН 5,2, было добавлено к каждому образцу. рН, осмоляльность и вязкость образцов были определены (см. табл. 5).

Таблица 5

Образец	мМ	мг/мл	рН	Осмоляльность	Вязкость (сП)
100 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	107	5,285	271	4,3
100 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	107	5,285	277	4,3
120 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	120	5, 311	279	6,1
120 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	120	5, 311	278	6
140 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	145	5, 329	X	12
140 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	145	5, 329	309	11,7
160 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	168,7	5, 343	X	18,8
160 мг/мл + 10 мМ СаОАС +6% сахарозы	10	168,7	5, 343	X	18,8

Данный эксперимент проводился для каждого антитела АТ-4, АТ-5, АТ-13, АТ-14, АТ-19, АТ-20 и АТ-23.

Пример 3. Эффект кальция ацетата в других композициях с высоким содержанием белка.

В примере ниже определяли снижения кальция ацетатом вязкости композиций, содержащих высокую концентрацию белка, кроме антитела к склеростину.

Антитела, не являющиеся антителами к склеростину, #1-#5, как было определено, имели концентрацию 131,6 мг/мл, 94 мг/мл, 113,2 мг/мл, 50 мг/мл и 106,3 мг/мл соответственно. Термин антитело, не

- 17 027039 являющееся антителом к склеростину в контексте данного изобретения обозначает антитело, отличное от описанного здесь антитела к склеростину.

мкл 1,0М Са(ОАс)₂ было добавлено к 1 мл 5 образцов, указанных выше. Вязкость, рН и осмоляльность образцов были определены (см. табл. 6).

Таблица 6

Образец	мг/мл	Вязкость (сП)
Антитело, не являющееся антителом к склеростину #1	94	6, 8
Антитело, не являющееся антителом к склеростину #1 + 10 гаМ Са(ОАс)2	94	5, 10
Антитело, не являющееся антителом к склеростину #2	135	9,8
Антитело, не являющееся антителом к склеростину #2 + 10 гаМ Са(ОАс)2	135	8,3
Белок #1	50	3,3
Белок #1 + 10 мМ Са(ОАс)2	50	3,2
Белок #1	106, 3	16, 6
Белок #1 + 10 мМ Са(ОАс)2	106, 3	15, 6

Кальция ацетат не существенно снижал вязкость любого из образцов.

Пример 4. Эффект некальциевых солей на вязкость композиции с высоким содержанием антитела к склеростину.

Представленный ниже эксперимент проводили для определения способности некальциевых солей снижать вязкость композиции с антителом к склеростину.

Выбранное антитело к склеростину (такое же, как в примерах 1-2 выше) было сконцентрировано до ~130 мг/мл. 10 мкл 1,0М (МН₄)₂ЗО₄ или 1,0М М§8О₄ было добавлено к 1 мл образца антитела. Вязкость контроля была определена как 30 сП. Было определено, что М§8О₄ по существу снижал вязкость образца (М§8О₄+образец = 16 сП). (МН₄)₂ЗО₄ незначительно снижал вязкость образца.

Пример 5. Эффект других кальциевых солей на вязкость композиции с высоким содержанием антитела к склеростину.

Представленный ниже эксперимент проводили для определения способности других кальциевых солей, кроме кальция ацетата, снижать вязкость композиции с антителом к склеростину.

Выбранное антитело к склеростину (такое же, как в примерах 1-2 выше) было сконцентрировано до ~125 мг/мл. 10 мкл 25 мМ СаС1₂ или 25 мМ МдС1₂ было добавлено к 1 мл образца антитела. Вязкость контроля была определена как 18,5 сП. Было определено, что СаС1₂ и МдС1₂ по существу снижают вязкость образца (СаС1₂ + образец = 9 сП и МдС1₂ + образец = 8).

Пример 6. Эффект кальция ацетата на другое антитело к склеростину.

Данный эксперимент проводили для определения способности кальция ацетата снижать вязкость композиции с антителом к склеростину, включающей другое антитело к склеростину, чем в примерах 1-2 выше.

Выбранное антитело к склеростину было сконцентрировано до ~131 мг/мл. 10 мкл 1,0М Са(ОАс)₂ было добавлено к 1 мл образца антитела. Вязкость контроля была определена как 17,3 сП. Было выявлено, что Са(ОАс)₂ незначительно снижает вязкость образца (15,3 сП).

Многочисленные модификации и вариации при использовании изобретения станут очевидными для специалиста в данной области с учетом представленных здесь вариантов воплощения изобретения. Вследствие этого единственное ограничение, которое применимо к изобретению, представлено в прилагаемой формуле изобретения.

Все патенты США, публикации заявок на патенты США, заявки на патенты США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты и непатентные заявки, указанные в тексте данной заявки и/или перечисленные в Инструкции по применению, включены сюда во всей своей полноте посредством ссылок.

Исходя из вышеизложенного, станет очевидно, что, несмотря на то, что специфические варианты воплощения изобретения были описаны здесь только в иллюстративных целях, различные модификации могут быть произведены без отклонения от сущности и объема изобретения.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Стерильный жидкий состав для доставки высококонцентрированного иммуноглобулина к склеростину, имеющий абсолютную вязкость примерно 10 сП или менее, содержащий:

   - 18 027039 (a) иммуноглобулин к склеростину в концентрации от 70 до 120 мг/мл;

   (b) ацетат кальция в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ, где иммуноглобулин к склеростину содержит аминокислотные последовательности:

   (ί) 8ЕЦ ГО N0: 86 и 8ЕЦ ГО N0: 84; или (ίί) 8ЕЦ ΙΌ N0: 182 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 180; или (ш) ЗЕЦ ГО N0: 208 и 8ЕЦ ГО N0: 207; или (ίν) 8ЕЦ ГО N0: 216 и 8ЕЦ ГО N0: 214; или (ν) 8ЕЦ ГО N0: 220 и 8ЕЦ ГО N0: 218; и (c) сахарозу в количестве от 4 до 6% в/о.
2. 2. Состав по п.1, дополнительно содержащий ацетатный буфер в концентрации от 5 до 15 мМ.
3. 3. Состав по п.2, где ацетатный буфер представляет собой ацетат натрия.
4. 4. Состав по любому из пп.1-3, который имеет общую осмолярность менее 350 мОсм/л.
5. 5. Состав по любому из пп.1-4, содержащий иммуноглобулин в концентрации, равной по меньшей мере 120 мг/мл.
6. 6. Состав по любому из пп.1-5, где абсолютная вязкость состава составляет 8 сП или менее.
7. 7. Состав по п.6, где абсолютная вязкость состава составляет 6 сП или менее.
8. 8. Состав по пп.1-7, где значение рН состава составляет от 4,5 до 6.
9. 9. Состав по п.8, где значение рН состава составляет от 5 до 5,5.
10. 10. Способ снижения вязкости состава иммуноглобулина к склеростину, где способ включает добавление ацетата кальция в концентрации от примерно 1 до примерно 20 мМ и сахарозы в количестве от 4 до 6% в/о к составу иммуноглобулина к склеростину, содержащему иммуноглобулин в концентрации от 70 до 200 мг/мл, где иммуноглобулин к склеростину содержит аминокислотные последовательности:

    (ί) 8ЕЦ ГО N0: 86 и 8ЕЦ ГО N0: 84; или (ίί) 8ЕЦ ГО N0: 182 и 8ЕЦ ГО N0: 180; или (ΐΐΐ) ЗЕЦ ГО N0: 208 и 8ЕЦ ГО N0: 207; или (ίν) 8ЕЦ ГО N0: 216 и 8ЕЦ ГО N0: 214; или (ν) 8ЕЦ ГО N0: 238 и 8ЕЦ ГО N0: 236;

    где вязкость состава с ацетатом кальция понижена по сравнению с вязкостью состава без ацетата кальция.
11. 11. Способ по п.10, где иммуноглобулин содержит аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0: 86 и/или 8ЕЦ ГО N0: 84.
12. 12. Стерильный жидкий состав для доставки высококонцентрированного иммуноглобулина к склеростину, который имеет абсолютную вязкость, равную 10 сП или менее, содержащий:

    (a) иммуноглобулин с тяжелыми цепями 8ЕЦ ГО N0: 90 и легкими цепями 8ЕЦ ГО N0: 88 в концентрации от 70 до 200 мг/мл;

    (b) ацетат кальция в концентрации от 1 до 20 мМ и (c) сахарозу в количестве от 4 до 6% в/о.
13. 13. Стерильный жидкий состав для доставки высококонцентрированного иммуноглобулина к склеростину, содержащий:

    (a) иммуноглобулин к склеростину в концентрации от 70 до 200 мг/мл, где иммуноглоублин содержит аминокислотные последовательности:

    (ί) 8ЕЦ ГО N0: 86 и 8ЕЦ ГО N0: 84; или (ίί) 8ЕЦ ГО N0: 182 и 8ЕЦ ГО N0: 180; или (111) ЗЕЦ ГО N0: 208 и 8ЕЦ ГО N0: 207; или (ίν) 8ЕЦ ГО N0: 216 и 8ЕЦ ГО N0: 214; или (ν) 8ЕЦ ГО N0: 220 и 8ЕЦ ГО N0: 218; и (b) ацетат кальция в концентрации от 1 до 20 мМ, где ацетат кальция снижает абсолютную вязкость состава по меньшей мере на 10% по сравнению с вязкостью состава антитела без ацетата кальция.
14. 14. Состав по любому из пп.1-9, 12 или 13, содержащий иммуноглобулин в концентрации 90 мг/мл.
15. 15. Применение терапевтически эффективного количества состава по любому из пп.1-9 или 12-14 для получения лекарственного средства для восстановления кости.
16. 16. Применение по п.15, где восстановление кости представляет собой заживление перелома, заживление без срастания, замедленное заживление со срастанием и реконструкцию костей лица.