EA025377B1 - Дейтерированный n-этил-n-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, его соли и их применение - Google Patents

Дейтерированный n-этил-n-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, его соли и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA025377B1
EA025377B1 EA201390081A EA201390081A EA025377B1 EA 025377 B1 EA025377 B1 EA 025377B1 EA 201390081 A EA201390081 A EA 201390081A EA 201390081 A EA201390081 A EA 201390081A EA 025377 B1 EA025377 B1 EA 025377B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
laquinimod
deuterium
pharmaceutically acceptable
treatment
Prior art date
Application number
EA201390081A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390081A1 (ru
Inventor
Виктор Пирятинский
Авитал Лаксер
Original Assignee
Тева Фармасьютикал Индастриз Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45439026&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA025377(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Тева Фармасьютикал Индастриз Лтд. filed Critical Тева Фармасьютикал Индастриз Лтд.
Publication of EA201390081A1 publication Critical patent/EA201390081A1/ru
Publication of EA025377B1 publication Critical patent/EA025377B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C07D215/56—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3 with oxygen atoms in position 4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/455—Nicotinic acids, e.g. niacin; Derivatives thereof, e.g. esters, amides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/465—Nicotine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4704—2-Quinolinones, e.g. carbostyril
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/5545—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having eight-membered rings not containing additional condensed or non-condensed nitrogen-containing 3-7 membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Quinoline Compounds (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к дейтерированному N-этил-N-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамиду, его солям и применениям.

Description

Настоящее изобретение относится к способу лечения человека, страдающего аутоиммунным заболеванием, включающему введение человеку 0,2-2,0 мг в сутки дейтерий-обогащенного соединения, имеющего структуру
где каждый из К4-К40 независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из К|-П|0 представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемой соли, эффективной для лечения пациента.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции снижения образования необязательно дейтерированного 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида у человека, включающему введение человеку терапевтически эффективного количества дейтерийобогащенного соединения, имеющего структуру
где каждый из К4-К40 независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из Р1-Р1) представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемой соли, где снижение образования происходит относительно образования 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2оксо-Л-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида при введении эквивалентного молярного количества не обогащенного дейтерием лаквинимода.
Кроме того, настоящее изобретение относится к смеси по меньшей мере двух дейтерийобогащенных соединений, каждое из которых имеет структуру
- 1 025377
где каждый из К4-К40 независимо представляет собой Н или Ό и каждое по меньшей мере из двух дейтерий-обогащенных соединений содержит Ό в различных Щ-Кю, или их фармацевтически приемлемых солей.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь соединений или их фармацевтически приемлемых солей, описанную в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь
a) дейтерий-обогащенного лаквинимода или его фармацевтически приемлемой соли;
b) по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого носителя и
c) соединения, имеющего структуру
присутствующего в количестве, меньшем 0,1% в расчете на объединенную массу соединения и дейтерийобогащенного лаквинимода.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, причем способ включает:
a) получение партии дейтерий-обогащенного лаквинимода или его фармацевтически приемлемой соли;
b) определение с помощью устройства общего количества необязательно дейтерированного 5-хлор4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида, присутствующего в партии дейтерий-обогащенного лаквинимода или его фармацевтически приемлемой соли; и
c) получение фармацевтической композиции с использованием партии, только при условии, если определено, что партия имеет менее 0,1 мас.% необязательно дейтерированного 5-хлор-4-гидрокси-1метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3 -карбоксамида.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения утвержденной для продажи партии фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, причем способ включает:
a) получение партии фармацевтической композиции;
b) определение с помощью устройства общего количества необязательно дейтерированного 5-хлор4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида в образце партии и
c) утверждение партии для продажи только при условии, если определено, что образец партии содержит менее 0,1 мас.% необязательно дейтерированного 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида относительно объединенной массы лаквинимода и 5-хлор-4гидрокси-1 -метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3 -карбоксамида.
Кроме того, настоящее изобретение относится к дейтерий-обогащенному соединению, имеющему структуру
где каждый из Щ-Кю независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из Κι-Κι0 представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемой соли, для применения в количестве 0,2-2 мг в сутки для лечения аутоиммунного заболевания у человека.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен профиль средняя концентрация в плазме-время для ΌΕΕΛΟ. образующегося из лаквинимода по сравнению с соединением 2 после перорального введения крысам в дозе 0,2 мг/кг.
На фиг. 2 представлен профиль средняя концентрация в плазме-время для лаквинимода по сравнению с соединением 2 после перорального введения крысам в дозе 0,2 мг/кг.
- 2 025377
На фиг. 3 представлено сравнение группового среднего показателя при МОС-индуцированном ЕАЕ у мышей, которым вводили две дозы лаквинимода и соединения 1, 2 и 3 в различных дозах.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу лечения человека, страдающего аутоиммунным заболеванием, включающему введение человеку 0,2-2,0 мг в сутки дейтерий-обогащенного соединения, имеющего структуру
где каждый из К1-К10 независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из К1-К10 представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемой соли, эффективной для лечения пациента.
В одном из вариантов осуществления способа дейтерий-обогащенное соединение представляет собой
или фармацевтически приемлемую соль.
В другом варианте осуществления способа дейтерий-обогащенное соединение представляет собой
или фармацевтически приемлемую соль.
В другом варианте осуществления способа дейтерий-обогащенное соединение представляет собой
или фармацевтически приемлемую соль.
В другом варианте осуществления способа аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, волчаночный артрит, болезнь Крона или ревматоидный артрит.
В другом варианте осуществления способа аутоиммунное заболевание представляет собой рассеян- 3 025377 ный склероз.
В другом варианте осуществления способа введение дейтерий-обогащенного соединения является более эффективным при лечении аутоиммунного заболевания, чем введение эквивалентного молярного количества не обогащенного дейтерием лаквинимода.
В другом варианте осуществления способа уровень необязательно дейтерированного 5-хлор-4гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида, образующегося у человека после введения дейтерий-обогащенного соединения, является сниженным по сравнению с уровнем 5-хлор4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида, образующегося, когда человеку вводят эквивалентное молярное количество не обогащенного дейтерием лаквинимода.
В другом варианте осуществления способа уровень необязательно дейтерированного 5-хлор-4гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида снижен по меньшей мере на 50%.
В другом варианте осуществления способа уровень необязательно дейтерированного 5-хлор-4гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида снижен по меньшей мере на 90%.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции снижения образования необязательно дейтерированного 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида у человека, включающему введение человеку терапевтически эффективного количества дейтерийобогащенного соединения, имеющего структуру
где каждый из Κι-Кю независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из Κι-Κι0 представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемой соли, где снижение образования происходит относительно образования 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида после введения эквивалентного молярного количества не обогащенного дейтерием лаквинимода.
В одном варианте осуществления способа уровень необязательно дейтерированного 5-хлор-4гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида снижен по меньшей мере на 50% по сравнению с уровнем 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3карбоксамида, образующегося, когда человеку вводят эквивалентное молярное количество не обогащенного дейтерием лаквинимода.
В другом варианте осуществления способа уровень необязательно дейтерированного 5-хлор-4гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида снижен по меньшей мере на 90%.
Кроме того, настоящее изобретение относится к смеси по меньшей мере двух дейтерийобогащенных соединений, каждое из которых имеет структуру
где каждый из ГО-Кю независимо представляет собой Н или Ό и каждый по меньшей мере из двух дейтерий-обогащенных соединений содержит Ό в различных ГО-Кю, или их фармацевтически приемлемых солей.
В одном из вариантов осуществления смеси одно из по меньшей мере двух дейтерий-обогащенных соединений имеет структуру
или ее фармацевтически приемлемые соли.
В другом варианте осуществления смеси одно из по меньшей мере двух дейтерий-обогащенных со- 4 025377 единений имеет структуру
или ее фармацевтически приемлемые соли.
В другом варианте осуществления смеси одно из по меньшей мере двух дейтерий-обогащенных соединений имеет структуру
или ее фармацевтически приемлемые соли.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь соединений или их фармацевтически приемлемых солей, описанную в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь
a) дейтерий-обогащенного лаквинимода или его фармацевтически приемлемой соли;
b) по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого носителя и
c) соединения, имеющего структуру
присутствующего в количестве, которое составляет менее 0,1% в расчете на общую массу соединения и дейтерий-обогащенного лаквинимода.
В одном варианте осуществления фармацевтической композиции соединение присутствует в количестве менее 3 м.д. или менее 2 м.д. в расчете на общую массу соединения и дейтерий-обогащенного лаквинимода.
В другом варианте осуществления фармацевтической композиции дейтерий-обогащенный лаквинимод имеет структуру
где каждый из К1-К10 независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из К1-К10 представляет собой Ό, или ее фармацевтически приемлемые соли.
В другом варианте осуществления фармацевтической композиции в дейтерий-обогащенном лаквинимоде или фармацевтически приемлемой соли, каждый из К1 -К5 представляет собой Ό и каждый из ГОКи, представляет собой Н.
В другом варианте осуществления фармацевтической композиции в дейтерий-обогащенном лаквинимоде или фармацевтически приемлемой соли каждый из К1 -К5 представляет собой Н и каждый из ГОбК10 представляет собой Ό.
В другом варианте осуществления фармацевтической композиции в дейтерий-обогащенном лаквинимоде или его фармацевтически приемлемой соли каждый из К1-К10 представляет собой Ό.
В другом варианте осуществления фармацевтической композиции фармацевтическая композиция имеет форму таблетки.
В другом варианте осуществления фармацевтической композиции после приема внутрь человеком фармацевтическая композиция обеспечивает сниженный уровень необязательно дейтерированного 5хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида, образующегося у человека, относительно уровня 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3- 5 025377 карбоксамида, образующегося, когда человек принимает внутрь эквивалентное молярное количество не обогащенного дейтерием лаквинимода.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, причем способ включает:
a) получение партии дейтерий-обогащенного лаквинимода или его фармацевтически приемлемой соли;
b) определение с помощью устройства общего количества необязательно дейтерированного 5-хлор4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида, присутствующего в партии дейтерий-обогащенного лаквинимода или его фармацевтически приемлемой соли; и
c) получение фармацевтической композиции с использованием партии, только если определено, что партия имеет менее 0,1 мас.% необязательно дейтерированного 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ыфенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения утвержденной для продажи партии фармацевтической композиции, описанной в настоящем описании, причем способ включает:
a) получение партии фармацевтической композиции;
b) определение с помощью устройства общего количества необязательно дейтерированного 5-хлор4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида в образце партии и
c) утверждение партии для продажи, только если определено, что образец партии содержит менее 0,1 мас.% необязательно дейтерированного 5-хлор-4-гидрокси-1-метил-2-оксо-Ы-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамида относительно объединенной массы лаквинимода и необязательно дейтерированного 5-хлор-4-гидрокси-1 -метил-2-оксо-Л-фенил-1,2-дигидрохинолин-3 -карбоксамида.
Кроме того, настоящее изобретение относится к дейтерий-обогащенному соединению, имеющему структуру
где каждый из К4-К40 независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из Ц-Що представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемым солям для применения в количестве 0,2-2 мг в сутки для лечения аутоиммунного заболевания у человека.
Под любым диапазоном, описанным в настоящем описании, понимают, что все сотые, десятые и целые единичные количества в этом диапазоне прямо описаны как часть изобретения. Таким образом, например, от 0,01 до 50 мг означает, что в варианты осуществления настоящего изобретения включены единичные количества 0,02, 0,03, ..., 0,09; 0,1, 0,2, ..., 0,9 и 1, 2, ..., 49 мг.
Дейтерий (Ό или 2Н) представляет собой стабильный нерадиоактивный изотоп водорода и имеет атомную массу 2,0144. Атом водорода в соединении встречается в природе в качестве смеси изотопов 1Н (водород или протий), Ό (2Н или дейтерий) и Т (3Н или тритий). Природное содержание дейтерия составляет 0,0156%. Таким образом, соединение с уровнем дейтерия в любом положении атома водорода в соединении, который увеличен до уровня, превышающего его природное содержание 0,0156%, является новым относительно его необогащенного аналога.
Как используют в рамках изобретения, дейтерий-обогащенное соединение означает, что содержание дейтерия в любом значимом положении соединения превышает природное содержание дейтерия в этом положении в некотором количестве соединения. Значимое положение соединения, как используется выше, представляет собой положение, которое обозначают как Н в изображении химической структуры соединения, когда оно не обогащено дейтерием. Встречающийся в природе, как используется выше, относится к содержанию дейтерия, которое присутствовало бы в соответствующем положении в соединении, если бы соединение было получено без какой-либо намеренной стадии увеличения содержания дейтерия. Таким образом, в дейтерий-обогащенном соединении содержание дейтерия в любом из его значимых положений может находиться в диапазоне от более чем 0,0156 до 100%. Примерами способов получения дейтерий-обогащенного соединения являются замена водорода дейтерием или синтез соединения с помощью дейтерий-обогащенных исходных материалов.
Обеспечение 100% дейтерирования в каком-либо значимом положении соединения в количестве миллиграмм или более может быть трудным. Таким образом, понятно, что некоторый процент водорода может, тем не менее, присутствовать, даже если в химической структуре прямо указан атом дейтерия. Таким образом, когда химическая структура содержит Ό, соединение, соответствующее структуре, является дейтерий-обогащенным в положении, обозначенном Ό.
Характеристика соединения относится к любому качеству, которое соединение проявляет, например пики или время удержания при определении 'Н-ядерной магнитной спектроскопией, массспектроскопией, инфракрасной, ультрафиолетовой или флуоресцентной спектрофотометрией, газовой
- 6 025377 хроматографией, тонкослойной хроматографией, высокоэффективной жидкостной хроматографией, элементным анализом, испытанием Эймса, растворимость, стабильность и любое другое качество, которое может быть определено аналитическим способом. После того как характеристики соединения известны, информацию можно использовать, например, для скрининга или испытания на присутствие соединения в образце.
Как используют в рамках изобретения, фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент представляет собой носитель или эксципиент, который пригоден для применения у человека и/или животных без чрезмерных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение и аллергический ответ) в соответствии с приемлемым соотношением польза/риск.
Как используют в рамках изобретения, лекарственное вещество относится к активному ингредиенту в лекарственном продукте, который обеспечивает фармакологическую активность или другой прямой эффект при диагностике, излечении, смягчении, лечении или предупреждении заболевания или влияет на структуру или какую-либо функцию организма человека или животных.
Как используют в рамках изобретения, лекарственный продукт относится к готовой дозированной форме, содержащей лекарственное вещество, а также по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Как используют в рамках изобретения, выделенное соединение представляет собой соединение, выделенное из неочищенной реакционной смеси с последующим актом подтверждения выделения. Акт выделения обязательно вовлекает отделение соединения от других известных компонентов неочищенной реакционной смеси, причем некоторым примесям, неизвестным побочным продуктам и остаточным количествам других известных компонентов неочищенной реакционной смеси позволяют остаться. Очистка является примером акта подтверждения выделения.
Как используют в рамках изобретения, композиция, которая свободна от химической структуры, означает, что композиция содержит, если содержит, количество указанной химической структуры, которое не может быть устранено после намеренного действия, предназначенного для устранения присутствия химической структуры в композиции.
Как используют в рамках изобретения, исследование стабильности относится к исследованиям, проводимым через конкретные временные интервалы и в различных окружающих условиях (например, температура и влажность), чтобы определить, происходит ли и в какой степени происходит деградация лекарственного продукта в течение его предполагаемого срока хранения. Конкретные условия и время исследования являются такими, что они усиливают условия, которым, как ожидают, лекарственный продукт будет подвергнут на протяжении его срока хранения. Например, детальные требования для исследований стабильности готовых фармацевтических препаратов кодифицированы в 21 С.Р.К § 211.166, полное содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Как используют в рамках изобретения, приблизительно в контексте числовой величины или диапазона означает ±10% от указанной или заявленной числовой величины или диапазона.
Лаквинимод представляет собой низкомолекулярное соединение, имеющее следующую химическую структуру:
Лаквинимод представляет собой оральный иммуномодулятор, который обладает терапевтическим эффектом в различных экспериментальных воспалительных/аутоиммунных моделях на животных, таких как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ), модель на животных для рассеянного склероза (Μδ), индуцируемый натриевой солью декстран-сульфата натрия (Όδδ) колит для воспалительного заболевания кишечника, диабетические мыши без ожирения (ΝΟΌ) для диабета типа I (ΙΌΌΜ), экспериментальный аутоиммунный неврит (ΕΑΝ) для синдрома Г ийома-Барре, системная красная волчанка (δΗΕ), волчаночный нефрит, волчаночный артрит, болезнь Крона и ревматоидный артрит. Терапевтическая активность лаквинимода в этих моделях является результатом различных механистических эффектов, включая снижение инфильтрации лейкоцитов в ткани-мишени путем модулирования опосредуемой хемокинами адгезии Т-клеток, модулирование баланса цитокинов, подавление МНС класса II, приводящего к изменению представления антигенов, и эффектов на суб-популяции дендритных клеток.
Фармацевтически приемлемая соль лаквинимода, а также дейтерированных соединений, описанных в настоящем описании, включает соль с литием, натрием, калием, магнием, кальцием, марганцем, медью, цинком, алюминием и железом. Составы солей лаквинимода и способ их получения описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2005/0192315 и публикации международной заявки РСТ № \УО 2005/074899, которые включены в настоящую заявку в качестве ссылок.
Стандартная лекарственная форма может содержать одно соединение или смесь соединений. Стан- 7 025377 дартную лекарственную форму можно получать для пероральных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки и гранулы.
Лаквинимод, а также дейтерированные соединения, описанные в настоящем описании, можно вводить в смеси с пригодными фармацевтическими разбавителями, наполнителями, эксципиентами или носителями (в совокупности называемыми в настоящем описании фармацевтически приемлемыми носителями), пригодным образом выбранными с учетом предполагаемой формы введения и в соответствии с общепринятой фармацевтической практикой. Единица предпочтительно имеет форму, подходящую для перорального введения. Лаквинимод, а также дейтерированные соединения, описанные в настоящем описании, можно вводить отдельно, но обычно их смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и вводят совместно в форме таблетки или капсулы, липосомы или в качестве агломерированного порошка. Примеры подходящих твердых носителей включают лактозу, сахарозу, желатин и агар. Капсулы или таблетки можно легко изготавливать и их можно изготавливать так, чтобы их было легко проглатывать или разжевывать; другие твердые формы включают гранулы и нерасфасованные порошки. Таблетки могут содержать пригодные связующие вещества, смазывающие вещества, дезинтегрирующие вещества, красители, вкусовые добавки, обеспечивающие текучесть веществ и обеспечивающие плавление веществ. Например, для перорального введения в единичной дозированной форме таблетки или капсулы активный лекарственный компонент может быть комбинирован с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как лактоза, желатин, агар, крахмал, сахароза, глюкоза, метилцеллюлоза, гидрофосфат кальция, сульфат кальция, маннит, сорбит, микрокристаллическая целлюлоза и т.п. Пригодные связующие вещества включают крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза или β-лактоза, кукурузный крахмал, природные и синтетические камеди, такие как гуммиарабик, трагакант или альгинат натрия, повидон, карбоксиметилцеллюлозу, полиэтиленгликоль, воски и т.п. Смазывающие вещества, используемые в этих дозированных формах, включают олеат натрия, стеарат натрия, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, стеариновую кислоту, стеарилфумарат натрия, тальк и т.п. Дезинтегрирующие вещества включают, но не ограничиваются ими, крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую смолу, кроскармеллозу натрия, натрий-крахмалгликолят и т.п.
Конкретные примеры способов, фармацевтически приемлемых носителей и эксципиентов, которые можно использовать для изготовления пероральных дозированных форм по настоящему изобретению, описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2005/0192315, публикациях международной заявки РСТ №№ АО 2005/074899, АО 2007/047863 и АО 2007/146248.
Общие способы и композиции для получения дозированных форм, пригодных в настоящем изобретении, описаны в следующих ссылках: 7 Мойегп РЪаттасеиДск, СЪар1ет8 9 апй 10 (Вапкег & Р1юйс5. ЕЙ1ΐοτδ, 1979); РЬаттасеийса1 Эо8аде Роттк: ТаЬ1е18 (ЫеЬеттап е1 а1., 1981); Апзек ПИгойисОоп ίο РЬаттасеиОса1 Эо8аде Роттз 2пй Еййюп (1976); РетнщЮп'з РЬагтасеийса1 §с1епсе8, 17ί1 ей. (Маск РиЬШЫпд Сотрапу, ЕазЮп, Ра., 1985); Айеапсез ш РЬагтасеийса1 §шепсе8 (Этай Сапйейоп, Тгеуог 1опе8, Ейз., 1992); Айуапсез ш РЬаттасеийса1 §шепсе8 Уо1 7. (Оа\ай Сапйейоп, Тгеуог 1опе8, 1ате8 МсСшйу, Ейз., 1995); Асщеоиз ро1утегю Соа11пд8 Гог РЬагтасеийса1 Оо8аде Рогт8 (Огид8 апй Ше РЬагтасеийса1 §с1епсе8, 8епе8 36 (1ате8 МсШийу, Ей., 1989); РЬагтасеийса1 РаШсн1а1е Сатеге: ТЬегареийс АррНса(1оп8: Эгнд8 апй Ше РЬаттасеийса1 §с1епсе8, Уо1 61 (А1аШ Ко11апй, Ей., 1993); Эгид ОеПуегу Ш Ше Са8(го1п1е8(1па1 Тгас1 (ЕШ8 Нотгеоой Воок8 ш Ше Вю1одюа1 8с1епсе8. §епе8 ш РЬаттасеийса1 Тес1по1оду; ЕС. Нагйу, δ.δ. Оау18, СПуе С. АЙ8оп, Ей8.); Мойегп РЬаттасеийс8 Эгнд8 апй Ше РЬагтасеийса1 8с1епсе8, Уо1. 40 (СПЬеП δ. Вапкег, СЬп8ШрЬег Т. КЪойе8, Ей8.). Эти ссылки включены в настоящую заявку в качестве ссылок в полном объеме.
Метаболиты химических соединений как собственных, так и фармацевтических, образуются в качестве части природного биохимического процесса деградации и выведения соединений. Скорость деградации соединения является важным определяющим фактором длительности и интенсивности его действия. Определение профиля метаболитов фармацевтических соединений, метаболизма лекарственных средств является важной частью разработки лекарственных средств, ведущей к пониманию каких-либо нежелательных побочных эффектов.
Метаболизм лаквинимода
Было показано, что лаквинимод медленно метаболизируется СУР3А4 (цитохром Р450 3А4) с образованием нескольких второстепенных метаболитов, и некоторые из них могут подвергаться дальнейшему метаболизму в метаболических реакциях 2 фазы. См., например, Тцуе88оп еί а1. СуЮсНготе Р450 3А4 18 Ше та.)ог еп/уте ге8роп81Ь1е Гог Ше теШЬоШт оГ 1адшттой, а поуе1 штцпотойШаЮг, Эгид Ме1аЬо118т апй О18ро8Йюп, Уо1. 33, Ыо. 6, раде8 866-872. ЭЕБАО (дезэтиллаквинимод; 5-хлор-4-гидрокси-1метил-2-оксо-Н-фенил-1,2-дигидрохинолин-3-карбоксамид), имеющий следующую химическую структуру, является одним из окислительных метаболитов лаквинимода.
Кроме того, клинические данные показали, что уровни ОЕБЛО в организме человека находятся в определенном постоянном соотношении с уровнями лаквинимода в значениях как Стах, так и ЛИС. Такое поведение указывает на то, что образование метаболита ОЕБЛО имеет РК со скорость-лимитированым образованием.
Ниже описаны эксперименты, демонстрирующие, что дейтерированная форма лаквинимода является более устойчивой к метаболическим изменениям, опосредуемым системами цитохромов Р450. Дейтерирование связи С-Н, подлежащей окислению, может изменить путь метаболизма лекарственных средств (метаболическое переключение). Метаболическая схема ниже иллюстрирует более медленное опосредуемое СУР3А4 образование ОЕБЛО в случае дейтерированного лаквинимода
Дейтерирование фенильной части может влиять на положение амидной связи относительно каталитического центра СУР перед окислением α-углерода этильной группы. Это может объяснить, почему дейтерированный лаквинимод с различным дейтерированием в этильной и/или фенильной частях приводит, например, к сниженному образованию необязательно дейтерированного ОЕЬАр.
БЕБАО как примесь
ОЕБЛО также является нежелательным синтетическим побочным продуктом синтеза лаквинимода. Какая-либо активность ОЕБ-ЛО не охарактеризована полностью. Также, в целом, предпочтительно минимизировать количество примесей в лекарственном веществе и конечном лекарственном продукте.
ОЕБЛО как примесь в лекарственном веществе лаквинимоде натрий исследуют с помощью способа ВЭЖХ, и в спецификации эта примесь указана в количестве не более 0,1%. СМР-партии лекарственного вещества лаквинимода натрий были исследованы, и было выявлено, что уровни ОЕБЛО в этих партиях составляют менее 3 м.д. Таким образом, сходные параметры предполагаются для лекарственного продукта, содержащего соединения по настоящему изобретению.
Было разработано несколько аналитических и биоаналитических способов для определения концентраций необязательно дейтерированного ОЕБЛО. Современные биоаналитические способы для анализа необязательно дейтерированного ОЕБ-ЛО в различных матрицах основаны на ЬС-М§ и имеют чувствительность на низком уровне в плазме в пг/мл.
Настоящее изобретение станет более понятным с помощью последующих экспериментальных деталей, однако специалистам в данной области будет понятно, что конкретные подробно описанные эксперименты только иллюстрируют изобретение, более полно описанное в формуле изобретения, которая следует после них.
Экспериментальные детали Пример 1. Получение дейтерированного лаквинимода.
Стадия 1. Синтез дейтерированного Ν-этиланилина.
N-этил-0 5 -анилин
Ы-этил-[>5-анилин
- 9 025377
Ν-Ό5 -этиланилин
Ν-Ό11 -этиланилин
Анилин (0,01 моль) растворяли в толуоле (10 мл), охлаждали до 0°С в атмосфере азота и добавляли уксусный ангидрид (0,02 моль) одной порцией. Охлаждающую баню удаляли и смесь перемешивали в течение 90 мин, а затем упаривали на роторном испарителе. Промежуточное соединение ацетанилид сушили в вакууме, а затем растворяли в ТНР (20 мл) и охлаждали при 0°С в атмосфере азота. Добавляли алюмогидрид лития (0,025 моль) в течение 25 мин. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч, а затем охлаждали. Добавляли силикагель (3 г), а затем добавляли 1М раствор ΝαΟΗ (1,8 г). Смесь перемешивали в течение 30 мин, а затем фильтровали через слой сульфата натрия. Осадок на фильтре промывали диэтиловым эфиром и органическую фазу концентрировали на роторном испарителе с получением указанных в заголовке соединений.
Стадия 2. Синтез дейтерированного лаквинимода Шэтил-ШБ5-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид (соединение 1)
ШБ5-этил-Шфенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид (соединение 2)
ШБ5-этил-ШБ5-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1 -метил-2-оксохинолин-3 -карбоксамид (соединение 3)
Ν-этиланилин (0,01 моль) и МС'ОСА (1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3карбоновая кислота) (2,03 г, 0,008 моль) перемешивали в дихлорметане (32 мл) и добавляли триэтиламин (4,2 мл). Смесь охлаждали на бане лед/вода в атмосфере азота и капельно добавляли тионилхлорид (1,33
г) в течение 30 мин. Смесь перемешивали при 0°С в течение дополнительных 3 ч, а затем экстрагировали
- 10 025377 холодной водной 1М серной кислотой. Органическую фазу экстрагировали 1М раствором ΝαΟΗ и водную фазу немного концентрировали на роторном испарителе для удаления следовых количеств органических растворителей. Добавляли 5М НС1 до рН 1-1,5 и полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин. Выпавший в осадок продукт фильтровали, промывали водой и сушили в вакууме. Затем получали дейтерированный лаквинимод (выход 86-93%).
Стадия 3. Получение натриевой соли дейтерированного лаквинимода.
Дейтерированный лаквинимод, полученный на стадии 2, суспендировали в этаноле и обрабатывали 20% водным раствором ΝαΟΗ. Выпавшую в осадок натриевую соль перемешивали в течение 3 ч, фильтровали и промывали этанолом. Высушивание в вакууме обеспечивало натриевую соль дейтерированного лаквинимода (выход 92-94%). Идентичность и чистоту подтверждали с помощью ЯМР, М8 и ВЭЖХ.
Изотопная чистота и анализ дейтерированных соединений 1-3
Соединение Изотопная чистота (ЬС/МЗ/М5) Анализ
1 100,Ой 94, 0Й
2 100,Ой 95, 4%
3 100,Ой 95, 6%
Пример 2. Анализ ЭЕЕЛО.
ЭЕЕЛО образуется в качестве метаболита у грызунов, а также в организме человека при введении лаквинимода. Было разработано несколько аналитических и биоаналитических способов для определения концентраций ЭЕЬАО в качестве типичного метаболита. Современные биоаналитические способы для анализа ИЕЬАЦ в различных матрицах основаны на ЬС-М8 и имеют чувствительность на низком уровне в плазме в пг/мл.
Следующие условия использовали для определения ИЕЬАЦ в плазме человека. Плазму очищали с помощью интерактивной 8РЕ после осаждения раствором коллоидного диоксида кремния ЬиИОХ Л8-40 с последующим анализом ВЭЖХ с детекцией М8/М8.
Условия 1
Устройство ЬС/МЗ/МЗ 5С1ЕХ, ОТКАР4000 ВЭЖХ ЗЫтабгн Ргот1пепсе Контроллер системы: ЗЫтабги СВМ-20А Насосы: Насос А: ЗЫтабги ΪΧ-20Αϋ Насос В: ЗЫтабди ЬС-20АЭ Насос С: ЗЫтабди ЬС-20АВ Автоматический пробоотборник:
ЗЫтасЗги 31В-20АС Сушильный шкаф колонки: ЗЫтабги. СТО-
20АС
Система получения данных Апа1уаб 1.4.2 или более поздняя версия
Колонка для анализа с интерактивным фильтром Иабегз Зуттебгу ЗЫе1б. РР18, 3,5 мкм, 2,1*100 мм, 0,2-мкм фильтр ДачеПп (ТНегто Е1ес5гоп Согр., Νο. 88200) или эквивалент
Колонка для ЗРЕ РЬепотепех С18-Е, 20 мкм, 2*20 мм
Температура колонки 30°С
Температура автоматического пробоотборника 15°С
Объем инжекции 180 мкл
Время прогона -7 мин (включая интерактивную ЗРЕ и анализ)
Индекс разведения Нет
Подвижная фаза Раствор А: 0,01% ТРА в воде Раствор В: 0,01% ТРА в МеОН
Промывочная жидкость 1 200 мМ РСА в воде
Промывочная жидкость 2 Ацетон
Предварительная обработка А (насос А) 0,01% ТРА в воде
Предварительная обработка Б (насос В) 0,01% ТРА в МеОН
- 11 025377
Условия 2
Устройство ЕС/МЗ/МЗ 5С1ЕХ, ОТВАР4000 ВЭЖХ ЗЫтабги Ргопыпепсе Контроллер системы: ЗЫтабги СВМ-20А Насосы: Насос А: ЗЫтабги. ЬС-20АЭ Насос В: ЗЫтабги ЛС-20АО Насос С: ЗЫтабги ЬС-20АВ Автоматический пробоотборник:
З-Ьдтабги 51Ь-20АС Сушильный шкаф колонки: ЗЫта^ги СТО-
2 0АС
Система получения данных Апа1узб 1.4.2 или более поздняя версия
Колонка для анализа с интерактивным фильтром Мабегз Зуттебгу ЗЫеМ КР18, 3,5 мкм, 2,1*100 мм, 0,2-мкм фильтр СауеПп (ТЬегто Е1есбгоп Согр., Νο. 88200) или эквивалент
Колонка для ЗРЕ РНепотепех С18-Е, 20 мкм, 2*20 мм
Температура колонки 30°С
Температура автоматического пробоотборника 15°0
Объем инжекции 160 мкл
Время прогона -7 мин (включая интерактивную ЗРЕ и анализ)
Индекс разведения Нет
Подвижная фаза Раствор А: 0,01% ТЕА в воде Раствор В: 0,01% ТЕА в МеОН
Промывочная жидкость 1 200 мМ РСА в воде
Промывочная жидкость 2 Ацетон
Предварительная обработка А (насос А) 0,01% ТЕА в воде
Предварительная обработка В (насос В) 0,01% ТЕА в МеОН
ΩΕΕΛΟ в плазме крыс также определяли в следующих условиях. Плазму очищали с помощью интерактивной 8РЕ после осаждения с раствором коллоидного диоксида кремния ЬиЭОХ Άδ-40 с последующим анализом ВЭЖХ с детекцией М8/М8.
Устройство ЬС/МЗ/МЗ 5С1ЕХ, ОТЕАР4000 ВЭЖХ ЗЫтабси Рготтпепсе Контроллер системы: ЗМтабги СВМ-20А Насосы: Насос А: ЗЫта^сц ЕС-2 ОМ Насос В: ЗЕбтадги ΕΟ-20ΑΌ Насос С: ЗЫтабги ЬС-20АВ Автоматический пробоотборник:
ЗЫтааси 31Ь-20АС Сушильный шкаф колонки: ЗЫтабги СТО-
2 0АС
Система получения данных Ап.а1узб 1.4.2 или более поздняя версия
Колонка для анализа с интерактивным фильтром Иабегз Зуттебгу 5Ые10 КР18, 3,5 мкм, 2,1*100 мм, 0,2-мкм фильтр ДачеПп (ТНегто Е1есбгоп Согр., Νο. 88200) или эквивалент
Колонка для ЗРЕ РНепотепех С18-Е, 20 мкм, 2*20 мм
Температура колонки 30°С
Температура автоматического пробоотборника 15°С
Объем инжекции 8 0 мкл
- 12 025377
Время прогона -7 мин (включая интерактивную ЗРЕ и анализ)
Индекс разведения Нет
Подвижная фаза Раствор А: 0,01% ТЕА в воде Раствор В: 0,01% ТЕА в МеОН
Промывочная жидкость 1 200 мМ РСА в воде
Промывочная жидкость 2 Ацетон
Предварительная обработка А (насос А) 0,01% ТЕА в воде
Предварительная обработка В (насос В) 0,01% ТЕА в МеОН
Пример 3. Фармакокинетическая и частичная метаболическая оценка.
Основными задачами были количественное определение соединения 1, соединения 2, соединения 3 и лаквинимода в плазме крыс с использованием биоаналитического способа ЬС/Μδ/Μδ;
охарактеризация фармакокинетического профиля соединения 1, соединения 2, соединения 3 и лаквинимода после перорального (РО) введения в дозе 0,2 мг/кг;
измерение концентраций ОРРАр во взятых образцах плазмы.
Уровень дозы, выбранный в этом примере, использовали в фармакологическом исследовании, ранее проводимом для лаквинимода.
Общий замысел
Использовали крыс с канюлей в правой общей яремной вене в виде полиэтиленовой трубки. В прижизненной части трем самкам крыс с канюлями вводили каждое из четырех исследуемых соединений в дозе 0,2 мг/кг.
Взятие крови от крыс для получения плазмы проводили в пять различных моментов времени. Концентрации соединения 1, соединения 2, соединения 3, лаквинимода и БЕЬАр определяли в этих образцах плазмы с использованием применимых способов ЬС/Μδ/Μδ.
Материалы.
Исследуемые соединения.
a) Ы-этил-Ы-Б5-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, натриевая соль (соединение 1), полученный по примеру 1.
Молекулярная масса: 383,8.
Внешний вид: белый порошок.
Хранение: 2-8°С в защищенном от света месте.
Чистота: предполагается 100% чистота.
b) Ы-Б5-этил-Ы-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, натриевая соль (соединение 2), полученный по примеру 1.
Молекулярная масса: 383,8.
Внешний вид: белый порошок.
Хранение: 2-8°С в защищенном от света месте.
Чистота: предполагается 100% чистота.
c) Ы-В5-этил-Ы-Б5-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, натриевая соль (соединение 3), полученный по примеру 1.
Молекулярная масса: 388,8.
Внешний вид: белый порошок.
Хранение: 2-8°С в защищенном от света месте.
Чистота: предполагается 100% чистота. ά) Лаквинимод, натриевая соль.
Молекулярная масса: 378,8.
Внешний вид: белый порошок.
Хранение: контролируемая комнатная температура (15-25°С) в защищенном от света месте.
Анализ ВЭЖХ: 100,8%.
Чистота: предполагается 100% чистота.
Носитель.
Вода, высокая чистота (Б1гес4 р, полученная в лаборатории).
Другие материалы.
Изофлуран для анестезии (ЬОКАЫЕ®, АВВОТТ).
ЕБТА (этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль дигидрат, δίθηκι АЫпсЬ, продукт №
Е4884-100д).
Гепарин, натриевая соль от Рогсте 1п1ез1та1 Мисоза, δίθηκι АЫпсЬ, продукт № И9399-25КИ).
Тест-система.
- 13 025377
Описание животных.
Вид: крыса.
Линия: 8Ό (крысы 8ртадие Оа\у1еу СО).
Статус здоровья: 8РР.
Заказанный возраст: 8 недель.
Число животных: 20 самок с канюлями.
Заказанный диапазон массы: 200-225 г.
Акклиматизация: по меньшей мере 3 суток.
На начало введения
Число животных: 12 самок с канюлями.
Приблизительный возраст: 9 недель.
Обоснование выбора тест-системы.
Крысы 8Ό являются пригодным видом и линией грызунов для фармакокинетических исследований, и они допустимы регулирующими органами. Кроме того, фармакокинетический профиль лаквинимода у крыс 8ртадие Оа\у1еу хорошо охарактеризован.
Система идентификации.
Каждое животное идентифицировали с помощью несмываемых обозначений на теле. Клетки обозначали индивидуальными картами, на которых были указаны линия, коды животных, код группы, дата и время введения лекарственных средств, исследуемый образец и код исследования.
Конкретный график содержания.
Содержание животных до и после введения дозы.
Животных содержали в комнате с контролируемыми окружающими условиями в групповой клетке после поступления в лабораторию. Крыс приспосабливали к индивидуальным поликарбонатным или полисульфонатным клеткам с опилками в качестве подстилки для пола.
Окружающие условия.
Контролирующие устройства устанавливали для поддержания температуры при 21±3°С и относительной влажности при 30-70%. Цикл свет/темнота из 12 ч на свету/12 ч в темноте поддерживался автоматически.
Питьевая вода.
Водопроводную воду, отфильтрованную через 0,2-мкм фильтр, давали без ограничений. Воду стандартным образом анализировали (один раз в три месяца) на общее содержание микробов и на отсутствие Ркеийотоиак аетидтока, ЕксйейсЫа сой и ОоЧпйшт врв.
Кормление.
Автоклавированный корм для грызунов АЙготт ΥΡΡ1 предоставляли без ограничений на протяжении исследования. Корм периодически анализировали.
Подстилка.
Использовали автоклавированную подстилку ЫОКОСЕЬ (8Ανΐ, древесная стружка). Качество материала подстилки проверено изготовителем.
Известно, что в корме, воде или подстилке не было примесей на уровнях, которые могли препятствовать задачам исследования.
Замысел эксперимента.
Акклиматизация.
Каждое животное было исследовано квалифицированным персоналом и проходимость канюли проверяли по возможности взять образец крови после получения животного. Животным, сочтенным имеющими хорошее состояние здоровья, позволяли акклиматизироваться в течение по меньшей мере 3 суток. Всем животным проводилось подробное физикальное обследование ответственным ветеринаром в последний день периода акклиматизации.
Рандомизация.
После периода акклиматизации животных, сочтенных имеющими хорошее состояние здоровья и пригодными для исследования, включали в исследование исходя из их массы тела. При распределении на группы случайным образом массы тела животных находились в пределах ±20% от общего среднего значения.
Организация уровня дозирования животных и режима лечения.
- 14 025377
Таблица 1
Распределение животных с канюлями в экспериментальные группы
Код группы Объем дозы [мл/кг] Исследуемый образец для введения [0,2 мг/кг *, РО] Дозированная форма [0,04 мг/мл*] Размер группы/Коды животных
Группа 1С 5 Соединение 1 Соединение 1 3/1-3
Группа 2С 5 Соединение 2 Соединение 2 З/4-б
Группа ЗС 5 Соединение 3 Соединение 3 3/7-9
Группа 4С Лаквинимод натрий Лаквинимод натрий 3/10-12
*Доза основана на форме свободной кислоты недейтерированного лаквинимода.
Для соединения 1 и соединения 2 соотношение молекулярных масс исследуемых образцов составляло 1,0757. Для соединения 3 соотношение молекулярных масс исследуемых образцов составило 1,0898. Для лаквинимода натрий соотношение молекулярных масс составило 1,0616. Эти поправочные коэффициенты применяли для поправки на концентрации, эквивалентные свободной кислоте недейтерированного лаквинимода.
Пероральное введение проводили путем кормления через желудочный зонд в объеме дозировки 5 мл/кг с использованием затупленной иглы для кормления из нержавеющей стали (Роррег & §оп5, США). Массу тела измеряли до введения дозы и дозы вычисляли исходя из индивидуальной массы тела.
Обоснование выбора дозы и пути введения.
Уровень дозы, выбранный в этом исследовании, уже использовали в фармакологическом исследовании, ранее проводимом для лаквинимода. Путь введения является пероральным, поскольку этот путь является предполагаемым путем введения человеку.
Приготовление составов и измерение достигаемой концентрации
Приготовление растворов для дозирования.
Подходящее количество исследуемого образца отвешивали и растворяли в воде (носителе) для достижения требуемой концентрации, которая в каждом случае была эквивалентна 0,04 мг/мл свободной кислоты недейтерированного лаквинимода.
Растворение исследуемых образцов обеспечивали путем осторожного качания, перемешивания, встряхивания на низкой скорости или с помощью устройства для облучения ультразвуковым излучением. Не использовали поправочный коэффициент для поправки на чистоту.
Хранение и стабильность составов.
Все растворы для дозирования хранили при 2-8°С в плотно закрытых контейнерах из желтого стекла в защищенном от света месте. Перед применением составы извлекали из холодильника, а затем им позволяли достигнуть окружающей комнатной температуры (15-25°С). Растворы для дозирования были признаны стабильными в течение по меньшей мере 48 ч, исходя из данных стабильности сходных растворов для дозирования лаквинимода.
Достигнутая концентрация растворов для дозирования.
Перед введением лаквинимода концентрации в растворах для дозирования определяли с помощью утвержденных способов ВЭЖХ с УФ-детекцией в дублированных образцах, взятых из растворов. Достигнутые концентрации находились в пределах ±10% от номинальных концентраций.
Клиническое наблюдение
Смертность, признаки заболевания или тяжелой реакции на лечение документировали.
Взятие образцов крови, получение плазмы.
Взятие крови от животных проводили в следующие моменты времени: 1, 2, 4, 8 и 24 ч после дозирования, как детально представлено в таблице ниже. Истинное время взятия образцов записывали.
Таблица 2
Момент времени взятия крови
Коды животных 1 ч 2 ч 4 ч 8 ч 24 ч
1-12 да да да да да
Взятие крови от крыс с канюлями.
Каждое животное прочно держали. После удаления пробки осуществляли доступ через отверстие канюли с помощью соответствующей затупленной иглы, вставленной в шприц, содержащий РВ§. После отбора приблизительно 100 мкл крови шприц заменяли чистым гепаринизированным шприцом. Для приготовления плазмы отбирали приблизительно 250 мкл крови. Первую 100-мкл фракцию крови возвращали и животным через катетер вводили 250 мкл РВ§. Катетер заполняли гепаринизированным раствором
- 15 025377 глицерина (100 МЕ/мл), приготовленным смешиванием 10 мл исходного гепарина (200 МЕ/мл) с 10 мл стерильного глицерина (6=1,26 г/мл). Образцы крови сразу перемешивали и помещали на лед.
Получение плазмы.
Центрифугирование проводили настолько быстро, насколько это было осуществимо, и не более чем через 40 мин после взятия.
Цельную кровь центрифугировали при 2500 д в течение 10 мин при 4°С, и отделенную плазму переносили в предварительно обозначенные полипропиленовые трубки и трубки замораживали при -70°С в пределах 70 мин после взятия крови.
Замороженные образцы переносили в биоаналитическую лабораторию для определения концентрации лаквинимода, где их хранили при номинальной температуре -70°С до анализа.
Биоанализ образцов плазмы.
Концентрации исследуемых образцов (соединение 1, соединение 2, соединение 3 и лаквинимод) и концентрацию ОЕБ-ЛО определяли в образцах плазмы с использованием надежного анализа ЬС/Μδ/Μδ.
Анализ фармакокинетических данных.
Фармакокинетические параметры вычисляли и оценивали средние уровни в плазме против времени.
Из данных средняя концентрация в плазме-время (среднее значение от трех животных в каждый момент времени) для соединения 1, соединения 2, соединения 3 и лаквинимода определяли следующие фармакокинетические параметры:
Параметр Определение
лис(С-Ь) Площадь под кривой концентрация в плазме- время от нулевого момента времени до времени последней поддающейся выявлению концентрации (ΐζ)
лис(с-“) Площадь под кривой концентрация в плазме- время от нулевого момента времени до бесконечности
Стах Максимальная наблюдаемая концентрация в плазме
бтах Время максимальной наблюдаемой концентрации в плазме
11/2 Кажущееся терминальное время полувыведения
Обобщение результатов
Как показано в табл. 3-6 ниже и на фиг. 2, средняя концентрация в плазме дейтерий-обогащенного лаквинимода сравнима со средней концентрацией в плазме не обогащенного дейтерием лаквинимода.
Профили концентрация-время исследуемых образцов не отличались значительно. Максимальные средние концентрации достигались через 1 или 2 ч после введения и варьировали от 703 до 798 нг/мл. Средние концентрации снижались до 194-227 нг/мл через 24 ч после введения дозы. Величины АИО для лаквинимода, соединения 1, соединения 2 и соединения 3 составляли 15506,0, 13783,4, 12289,8 и 15750,2 соответственно, также указывая на отсутствие значимых отличий в экспозиции.
Таблица 3
Индивидуальные и средние параметры РК для лаквинимода у крыс после перорального введения в дозе 0,2 мг/кг
Параметр РК Стах (нг/мл) Ттах Сч) Τΐ/2 (ч) лис1азс (ч*нг/мл) Аис1п£ (ч*нг/мл)
Крыса № 10 770,0 2,0 12, 0 11013,8 14691,6
Крыса № 11 774,8 1,0 12, 4 12659,7 17141,8
Крыса № 12 838,8 2,0 10, 9 11487,3 14684,6
Среднее значение 794,5 1,7 11, 8 11720,3 15506, 0
ЗТБЕУ 38, 4 0, 6 0,8 847, 3 1416, 6
- 16 025377
Таблица 4
Индивидуальные и средние параметры РК для соединения 1 у крыс после перорального введения в дозе 0,2 мг/кг
Параметр РК Стах (нг/мл) т», (ч) Т1/2 <ч) Аис1азь (ч*нг/мл) дис1п£ (ч*нг/мл)
Крыса № 1 730, 7 2,0 12, 1 10011,7 13617,9
Крыса № 2 611, 9 2,0 9,5 8039,3 9733,8
Крыса № 3 809, 5 2,0 10, 0 10061,6 12447,9
Крыса № 13 944, 9 1,0 13, 4 13681,5 19333,9
Среднее значение 774, 3 1,8 11, 3 10448,5 13783,4
ЗТРЕУ 139, 8 0, 5 1,8 2352,1 4042,2
Таблица 5
Индивидуальные и средние параметры РК для соединения 2 у крыс после перорального введения в дозе 0,2 мг/кг
Параметр РК Стах (нг/мл) Ттаи (ч) Τΐ/2 (ч) лис1а^ (Ч*НГ/МЛ) Аис1п£ (ч*нг/мл)
Крыса № 4 827, 6 1, 0 13, 6 10422,1 14699,6
Крыса № 5 551, 4 2, 0 13,4 8741,6 12439,0
Крыса № 6 816, 2 2, 0 14, 6 11975,3 11975,3
Крыса № 15 703, 6 2,0 13, 6 10045,4 10045,4
Среднее значение 724,7 1,8 13, 8 10296, 1 12289,8
ЗТРЕУ 128,4 0, 5 0,5 1331, 0 1911,9
Таблица 6
Индивидуальные и средние параметры РК для соединения 3 у крыс после перорального введения в дозе 0,2 мг/кг
Параметр РК Стах (нг/мл) ттах (ч) Τΐ/2 (Ч) Аис1а5р (ч*нг/мл) Аис1п£ (ч*нг/мл)
Крыса № 7 728,9 2,0 12,7 11280,4 15225,2
Крыса № 8 833,2 1,0 12, 0 5317,8 14845,1
Крыса № 9 904,3 1,0 11, 6 11156,0 14643,7
Крыса № 17 907,5 1,0 11,5 12110,0 15790,7
Крыса № 18 800,4 2,0 14, 4 12471,5 18246, 2
Среднее значение 834,9 1,4 12, 4 10467,1 15750,2
ЗТБЕУ 75, 0 0,5 1,2 2931,2 1462, 1
Как показано в табл. 7 и 8 ниже и на фиг. 1, количества ΌΕΡΛΟ. образующегося после перорального введения дейтерий-обогащенного лаквинимода, является более низким, чем количество ПЕТАЦ, образовавшегося после введения не обогащенного дейтерием лаквинимода. В среднем, можно наблюдать приблизительно десятикратное снижение концентраций ПЕЬАЦ, измеренных в плазме животных, которым вводили соединение 2, по сравнению с плазмой животных, которым вводили лаквинимод. В первой группе средние концентрации ПЕЬАЦ находились в диапазоне от 18,3 до 75,4 пг/мл, а в группе, в которой вводили лаквинимод, они находились в диапазоне от 142 до 878 пг/мл. В обеих группах наиболее низкая концентрация ПЕЬАЦ была измерена через 1 ч после введения и концентрации ПЕЬАЦ возрастали вплоть до взятия последнего образца через 24 ч после введения дозы.
- 17 025377
Таблица 7
Индивидуальные и средние параметры РК для ОЕБАО, образовавшегося из лаквинимода, у крыс после перорального введения в дозе 0,2 мг/кг
Параметр РК (пг/мл) Ттах (ч) А17С1азЬ (ч*пг/мл)
Крыса »10 654 24 10369,0
Крыса №11 1123 24 14606,5
Крыса № 12 858 24 13266,5
Среднее значение 878,3 24 12747,3
ΞΤϋΕν 235, 2 0 2165,9
Таблица 8
Индивидуальные и средние параметры РК для БЕЬАО, образовавшегося из соединения 2, у крыс после перорального введения в дозе 0,2 мг/кг
Параметр РК Стах (пг/мл) Стах (ч) АТТСуаз!; (ч*пг/мл)
Крыса № 4 62, 0 24 1106, 0
Крыса № 5 82, 5 24 1065,3
Крыса № 6 77, 3 24 1125,5
Крыса № 15 79, 9 24 1318,8
Среднее значение 75, 4 24 1153,9
ΞΤΌΕν 9,2 0 112, 8
Результаты исследования демонстрируют, что дейтерий-обогащенный лаквинимод снижает образование БЕЬАО при сохранении сходного профиля концентрация в плазме-время с профилем для недейтерированного лаквинимода.
Пример 4. Оценка эффективности дейтерированного лаквинимода (соединения 1, 2 и 3) при индуцированном ΜΟΟ (миелиновый гликопротеин олигодендроцитов) ЕАЕ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит).
Целью этого исследования была оценка эффективности трех дейтерированных форм лаквинимода, соединений 1, 2 и 3, по сравнению с лаквинимодом с использованием ΜΟΟ-индуцированного ЕАЕ у мышей С57ВЬ/6.
ЕАЕ является общепризнанной моделью на животных для рассеянного склероза, и индукция с помощью ΜΟΟ у С57ВЬ/6 является устоявшейся моделью.
Общий замысел.
Заболевание индуцировали у мышей путем инъекции энцефалитогенной эмульсии.
Соединения 1, 2 и 3 в дозе 10 мг/кг, лаквинимод в дозе 10 и 25 мг/кг или носитель вводили с начала исследования (0 сутки) до завершения исследования (30 сутки). Во всех группах введение проводили перорально каждые сутки.
Материалы:
соединения 1, 2 и 3 получали, как описано в примере 1; лаквинимод, изготовленный в Теуа; очищенная вода (БбесЕР, МПНроге); коклюшный токсин: §1§та, код № 2980, партия 044К1449;
ΜΟΟ 35-55: ΜηΓ ΝοναΙίώ;. партия № 90016-71-1;
полный адъювант Фрейнда (СРА): §1§та, код: Р-5881, партия 104К8930; физиологический раствор: Μηί-ΌΕΜΟ 8.А, код 05029, партия № 0101610;
ΜусοЪасΐе^^ит 1иЪегси1о818 Н37 КА (ΜΤ): ΜηΓ-ΩίΓοο.
Вид, линия и поставщик.
В исследовании использовали здоровых нерожавших небеременных самок мышей линии С57ВЬ/6, полученных от Наг1ап Атта1 Вгеебшд СеШег, Израиль, 26.01.2010. При поступлении животные весили 15-22 г и их возраст составлял приблизительно 7-8 недель. Массу тела животных регистрировали в день доставки. Явно здоровых животных произвольным образом определяли в исследуемые группы до начала введения. Мышей индивидуально идентифицировали с использованием ушных бирок. Карты с цветной кодировкой на каждой клетке давали информацию, включающую номер клетки, номер группы и идентификационный номер. Соблюдали условия содержания и ухода за животными.
- 18 025377
Индукция ЕАЕ.
ЕАЕ индуцировали путем инъекции энцефалитогенной смеси (эмульсии), состоящий из ΜΘΟ (150,0 мкг/мышь) и СРА, обогащенного М. 1иЬегси1о818 (1 мг/мл СРА).
Эмульсию объемом 0,2 мл инъецировали подкожно в бока мышей.
Коклюшный токсин инъецировали внутрибрюшинно в день индукции и через 48 ч (общее количество составляло 0,1+0,1=0,200 мкг/мышь в объеме дозирования 0,2 мл).
Мышей распределяли в 6 групп введения: носитель, лаквинимод (25 мг/кг и 10 мг кг) и соединения 1, 2 и 3, каждое по 10 мг/кг.
Приготовление и введение энцефалитогенной эмульсии.
Масляная часть: СРА (содержащий 1 мг/мл МТ).
Жидкая часть: 15,0 мг ΜΘΟ разбавляли в 10,0 мл нормального физиологического раствора с получением исходного раствора 1,5 мг/мл ΜΟΟ. Эмульсию получали из равных частей масляной и жидкой частей (1:1) в двух шприцах, соединенных друг с другом зажимом Леура, переносили в инсулиновый шприц и 0,2 мл инъецировали в правый бок каждой мыши.
Приготовление и введение коклюшного токсина.
мкл коклюшного токсина (200 мкг/мл) добавляли к 21,945 мл физиологического раствора, получая 500 нг/мл. Коклюшный токсин вводили внутрибрюшинно в день инъекции энцефалитогена и через 48 ч (100,0 нг/0,2 мл/мышь х 2=200,0 нг/мышь).
Приготовление и введение исследуемых составов.
Лаквинимод в концентрации 2,5 мг/мл приготавливали в очищенной воде для уровня дозировки 25,0 мг/кг. Исследуемый состав хранили при 2-8°С до применения в желтых бутылях. Мышам в группе 25 мг/кг лаквинимода вводили лаквинимод в объемном уровне дозы 200 мкл/мышь путем кормления через желудочный зонд один раз в сутки (как показано в табл. 4Ь).
Концентрацию 1,0 мг/мл лаквинимода приготавливали в очищенной воде для традиционного лаквинимода или соединений 1, 2 и 3 для уровня дозировки 10,0 мг/кг. Исследуемые составы хранили при 28°С в желтых бутылях до применения.
Мышам в группе 10 мг/кг лаквинимода вводили традиционный лаквинимод в объемном уровне дозы 200 мкг/мышь путем кормления через желудочный зонд один раз в сутки. Введение исследуемых соединений проводили аналогичным образом. Носитель (дважды дистиллированная вода) вводили в группе отрицательного контроля (группа № 1) аналогичным образом.
Заболеваемость и смертность.
Всех животных исследовали раз в сутки для установления, если какое-либо из них было умирающим. Мышей взвешивали раз в неделю.
Клинические признаки ЕАЕ.
Мышей наблюдали каждые сутки, начиная с 10 суток после индукции ЕАЕ, и оценивали клинические признаки ЕАЕ. Показатели регистрировали на картах наблюдения в соответствии со степенями, описанными в табл. 4а ниже.
Таблица 4а
Оценка клинических признаков ЕАЕ
Показатель Признаки Описание
0 Нормальное поведение Без неврологических признаков
1 Вялый хвост Часть хвоста или весь хвост вялые и отвисшие
2 Выпр ями т е л ь ный рефлекс Животное имеет трудности в перекатывании на его конечности, если его положить на спину
3 Слабость задних конечностей Шатающаяся походка - когда мышь ходит, задние конечности неустойчивы
4 Паралич задних конечностей Мышь волочит ее задние конечности, но способна передвигаться с использованием передних конечностей
5 Полный паралич Мышь не может передвигаться, выглядит худой и истощенной
6 Умирание/смерть
- 19 025377
Заболеваемость
Всех мышей с показателем 1 и выше считали заболевшими. Когда появлялись первые клинические признаки, всем мышам давали корм, пропитанный водой, который помещали в различных местах на подстилке клетки. Для вычисления показатель животных, которые были умерщвлены или погибли (6), продолжали записывать.
Интерпретация результатов
Вычисление заболеваемости (доля заболевших).
Количество больных животных в каждой группе суммировали. Заболеваемость вычисляли как возникновение заболевания у каждой мыши \
Количество мышей в группе /
Процентное ингибирование в соответствии с заболеваемостью вычисляли как Ингибирование (%) заболеваемости = _ Количество больных мышей в группе введения \ ' Количество больных мышей в контрольной группе/ х
Вычисление уровня смертности/умирания (доля умерших).
Количество погибших или умирающих животных в каждой группе суммировали. Смертность от заболевания вычисляли как
Смертность от заболевания = _ / Количество погибших или умирающих мышей в группе введения \ 'Количество погибших или умирающих мышей в контрольной группе/
Процентное ингибирование в соответствии со смертностью вычисляли как Ингибирование (%) смертности = _ А Количество погибших или умирающих мышей в группе введения \ ' Количество погибших или умирающих мышей в контрольной группе /
Вычисление продолжительности заболевания.
Среднюю продолжительность заболевания, выраженную в сутках, вычисляли как Средняя продолжительность = _ / Σ продолжительность заболевания у каждой мыши \ \ Количество мышей в группе /
Вычисление средней задержки возникновения заболевания.
Среднее значение времени возникновения заболевания, выраженное в сутках, вычисляли как Среднее время возникновения = _ / Σ Время возникновения заболевания каждой мыши \ \ Количество мышей в группе /
Среднюю задержку возникновения, выраженную в сутках, вычисляли вычитанием среднего времени возникновения заболевания в контрольной группе из среднего времени возникновения заболевания в исследуемой группе.
Вычисление среднего максимального показателя и процентного ингибирования.
Средний максимальный показатель (ММ§) для каждой группы вычисляли как
ΜΜδ _ / Σ Максимальный показатель для каждой мыши \
Количество мышей в группе
Процентное ингибирование в соответствии с ММ§ вычисляли как (, ММ3 в группе введения
I
1x100
Ингибирование (%) ММ3 :
ММ8 в контрольной группе
Вычисление группового среднего показателя и процентного ингибирования.
Суточные показатели для каждой мыши в исследуемой группе суммировали и вычисляли индивидуальный средний суточный показатель (1М§) как
ΙΜ8 ( показатель для мыши \ ' Период наблюдения (сутки) /
Средний групповой показатель (СМ§) вычисляли как
СМ3 - ί Σ Для каждой мыши \ \ Количество мышей в группе/
Процентное ингибирование вычисляли как ί СМ3 в группе введения \ ,__
Ингибирование (%) СМ3 - (1- —— -:-1x100 ' СМ3 в контрольной группе/
Обобщение результатов заболеваемости, смертности, ММ§, СМ§, продолжительности заболевания, времени возникновения заболевания и активности в каждой группе представлены в табл. 4Ь ниже.
- 20 025377
Таблица 4Ь
Смертность, заболеваемость, ΜΜδ, ΟΜδ, продолжительность и время возникновения активности ЕАЕ по сравнению с носителем
Введение Смерт- ность Заболева- емость £ ингибирование 1 Величина ММ3 % ингибирование 2 Величина СМ3 % ингибирование 3 Средняя продолжи- тельность (сутки) Среднее время возник- новения (сутки)
Носитель Вода 0/15 14/15 3,2±1,3 2,21±0,98 19,1±5,5 11,9±5,5
Лаквинимод (25 мг/кг) 0/15 4/15 71,4% 1,3±1,8 59, 4% (р<0,001) 0,5+0,13 97,7% (р<0,001) 3,0±5,8 (р<0,001) 28,0±5,8 (р<0,001)
Лаквинимод (10 мг/кг) 0/15 9/15 35, 7% 2,1±1,9 34, 4% (р=0,17) 1,14±0,5 48, 4% (р=0,01) 9,3±8,3 (р<0,001) 21,б±8,4 (р<0,001)
Соединение 2 (10 мг/кг) 0/15 13/15 7,1% 2,1±1,3 34, 4% (р=0,02) 0,79+0, 2 64,3% (р=0,001) 13,2±7,7 (р=0,004) 15, 3±6, 8 (р=0,01)
Соединение 3 (10 мг/кг) 0/15 10/15 28, 6% 1,6±1,б 50, 1% (р=0,01) 0,89+0,94 59, 7% (р=0,001) 9,б±9,4 (р=0,001) 21,5±9,3 (р<0,001)
Соединение 1 (10 мг/кг) 0/15 8/15 42,9% 1,5±1,7 53, 1% (р=0,01) 0,74+0,86 бб, 5% (р<0,001) 7,9±8,2 (<0,001) 22,1±8,9 (р<0,001)
Заболеваемость и смертность.
В контрольной группе, в которой вводили носитель, 14/15 мышей были больны вследствие ЕАЕ. В группе, в которой вводили лаквинимод (10 мг/кг), 9/15 мышей были больны по сравнению с 13/15, 10/15 и 8/15 в группах, в которых вводили соединения 2, 3 и 1 соответственно. 4/15 мышей были больны в группе положительного контроля, в которой вводили 25 мг/кг лаквинимода. Ни в одной из групп введения не наблюдали смертности.
Во всех группах, в которых вводили лаквинимод (10 мг/кг), происходила задержка появления клинических признаков с возникновением от 15,3 до 22,1 суток по сравнению с контрольной группой (возникновение через 11,9±5,5 суток). Длительность клинических признаков ЕАЕ в этих группах введения по сравнению с контрольной группой, в которой вводили носитель, составляла от 7,9 до 13,2 суток по сравнению с 19,1±5,5 сутками в контрольной группе.
Средний максимальный показатель (ΜΜδ) и групповой средний показатель (ΟΜδ).
ΜΜδ и ΟΜδ в группе отрицательного контроля, в которой вводили носитель, составляли 3,2±1,3 и 2,2±1,0 соответственно. Группа положительного контроля, в которой вводили лаквинимод (25 мг/кг), проявляла ингибирование ЕАЕ 59,4% и 97,7% согласно ΜΜδ (показатель 1,3±1,8) и ΟΜδ (показатель 0,5±0,1) соответственно.
Когда группы, в которых вводили соединение 1, 2 и 3, сравнивали с лаквинимодом, не наблюдали значимых отличий в активности. Однако существовала тенденция к тому, что в группах, в которых вводили соединение 1, 2 и 3, активность была выше, чем в группах лаквинимода.
Как показано на фиг. 3, по шкале ΟΜδ группа лаквинимода (10 мг/кг) проявляла активность 48,4% по сравнению с активностью 64,3, 59,7 и 66,5% в группах, в которых вводили соединение 2, 3 и 1 соответственно.
Обсуждение
Результаты исследования показывают, что дейтерий-обогащенный лаквинимод снижает образование метаболитов, в частности необязательно дейтерированного ОЕЬАО, при сохранении сходного профиля концентрация в плазме-время с профилем недейтерированного лаквинимода.
Результаты исследования также показывают, что дейтерий-обогащенный лаквинимод является настолько же активным или более активным, чем лаквинимод в отношении ингибирования клинических признаков ЕАЕ. Результаты исследования позволяют разработать параметры дозирования для дейтерийобогащеного лаквинимода.
Пример 5. Оценка ίη νίΐτο лаквинимода и соединения 2 в качестве индукторов экспрессии цитохрома Р450 в культивируемых гепатоцитах человека.
1. Введение.
Задачей этого исследования было изучение эффектов обработки первичных культур свежих гепатоцитов человека лаквинимодом или соединением 2 на экспрессию ферментов СУР.
Было показано, что культивируемые гепатоциты являются надежной тест-системой для оценки индуктивных эффектов NСΕ. Гепатоциты можно выделять из нетрансплантируемой печени человека (В_)отп55оп с1 а1., (2003), ТЬе οοηάιιαΐ οί ίη νίΐτο апб ίη νίνο бтид-бтид ίηΐοταοΐίοη $ΐιι6ίο$: а РЬаттасеийса1
РекеатсЬ апб Μ;·ιηιιΓ;κΐιιΐΌΓ$ οί Атепса (ΡΗΡΜΑ) регкресйуе. Эгид ΜеΐаЬ Όίδροδ 31:815-832; Μιι6γ;·ι апб
Ρίπίοηδοη, (2001), Риераи-Нюн οΓ Ьеρаΐοсуΐеδ, ш Ситтек Ρτοΐο^ΐδ ш ΤοχΡο^ν, νοίιιιικ 2 (Μа^ηеδ ΜΌ еб)
- 21 025377 ιιηίΐ 14.2, 13 ρ, Ιοίιη \УПсу и δοηδ, 1пс., №\у Уогк, №\у Уогк) и культивировать в виде смыкающегося монослоя (ЬеС1иу5е с! а1., (1994), Рогтайоп оГ сх1епк1ус сапайси1аг псйуогкк Ьу га1 йсраЮсу1ск сийигеб ίη со11адсп-капб^1сй сопйдитайоп. Ат ί Рйукю1 266 (Сс11 Рйу8ю1. 35): С1764-С1774). После культивирования в течение от двух до трех суток эти клетки восстанавливают их морфологическую целостность, и обработка прототипными индукторами приводит к индукции соответствующих ферментов СУР (ЬсС1иу8с с! а1., (1996), Сийигеб га1 йераЮсуЗек, ίη Рйагтассийса1 Вю!ссйпо1оду. Уо1. 8, Мобс1к Гог Аккскктд Эгид АЬкогр6оп апб Мс!аЬо1кт. (Вогсйагб! КТ, \УПкоп О и §тйй Р сбк) рр. 121-159, Р1сшт Ргекк, №\у Уогк; КоЬсйкоп с! а1., (2000), Ιη уйго 1пЫЬйюп апб шбисйоп оГ Ьитаη йерайс суЮсйготс Р450 сп/утск Ьу тобаЛпб. Эгид Мс1аЬ Экрок 28:664-671; Мабаη с! а1., (2003), ЕГГсск оГ ргоЮ1ур1са1 тюгокота1 сн/утс шбиссгк оп суЮсйготс Р450 схргсккюп ίη сийигеб йитап йсра!осу!ск. Эгид Мс1аЬ Экрок 31:421-431). По этой причине является приемлемым использование культивируемых гепатоцитов человека для определения возможных ЫСЕ, вызывающих индукцию ферментов СУР.
Это исследование было спланировано так, чтобы иметь возможность классифицировать какие-либо индуктивные эффекты исследуемых изделий относительно двух механистически различных и клинически значимых индукторов СУР, а именно омепразола (активатор АйК и индуктор СУР1А2) и рифампина (агонист РХК и индуктор СУР3А4) (Рагкшкоп апб Одбую, (2008), ВюйапкПогтабоп оГ хспоЬюйск, ίη Сакагей & Эои11'к Тохюо1оду, Тйс Ваыс 8сюпсс оГ Рокопк. 8сусп!й Ебйюп (К1аакксп СЭ еб) рр. 161-304, Тйс МсОгате НШ Сотратск, 1пс., №\у Уогк). Для этого один препарат культивированных гепатоцитов человека из одной печени обрабатывали один раз в сутки в течение трех последовательных суток ЭМ8О (0,1% об./об., контроль в виде носителя), одной из пяти концентраций лаквинимода (0,01, 0,05, 0,1, 1 или 10 мкМ) или соединением 2 (0,01, 0,05, 0,1 или 10 мкМ).
После обработки клетки инкубировали ίη кйи с маркерными субстратами для анализа Одеалкилирования фенацетина (маркер для СУР1А2) и 1'-гидроксилирования мидазолама (маркер для СУР3А4/5) с помощью ЬС/Μδ/Μδ. После инкубации ίη кйи указанные гепатоциты из указанных групп введения собирали с помощью ТКко1 для выделения РНК, которую анализировали с помощью цКТ-РСК для оценки эффекта лаквинимода и соединения 2 на уровни мРНК СУР1А2 и СУР3А4. Схема исследования, тест-система и выбор и концентрация маркерных субстратов, использованные в этом исследовании, были основаны на рекомендациях РЭА'к ЭгаП Ошбапсе ЭоснтеШ оп Эгид 1п!сгас!юп §!ибюк-8!ибу ЭсК1дп, Эа1а Апа1укк, апб 1трйсайопк Гог Эоктд апб ЬаЬсйпд апб снггсШ РЭА ге\ас\у агйс1ск (Рооб апб Эгид Абтткйаиот (2006), Эгай Ошбапсе Гог 1пбнк1гу: Эгид Шсгасйоп §!ибюк-8!ибу Эсыдп, Эа1а Апа1укк, апб 1трйсайопк Гог Эоктд апб ЬаЬсйпд, рр 55, И.8. ЭсраПтеШ оГ Нсайй апб Нитап §сгуюск, КоскуШе, МЭ; Ниапд с! а1., (2008), №\у Ега ίη Эгид 1п!сгасйопк Еуа1иайоп: И8 Рооб апб Эгид Абтткйаиоп Ирба!с оп СУР Ем/утск, Тгапкройсгк, апб !йс Ошбапсе Ргосскк. ί С1ш Рйагтасо1 48: 662-670; 2йапд с! а1., (2009), Ргсбюйпд Эгид-Эгид 1п!сгас!юпк: Ап РЭА Рсгкрссйус. Тйс ААР§ 1оигпа1 11:300-306) апб !йс РйКМА рсгкрссйус оп сп/утс шбисйоп (Сйи с! а1., (2009), Ιη уйго апб ίη νί\Ό шбисйоп оГ суЮсйготс Р450: а кигусу оГ !йс сиггсп! ргасйсск и гесоттепбайопк: а Рйагтассийса1 Кекеагсй и МапиГас!игсгк оГ Атепса (РйКМА) рсгкрссйсс. Эгид Мс!аЬ Экрок 27029 (87рр) бог 10.1124/бтб.109.0270).
2. Материалы и способы.
2.1. Материалы.
2.1.1. Анализы активности ферментов.
Фермент Используемый реагент Название Изготовитель
СУР1А2 Субстрат Фенацетин 31дта-А1б.г1сА
Метаболит субстрата Ацетаминофен 3 ί дтаа - А1 с!г ΐ сН
Внутренний стандарт Ацетаминофен-сЦ Ргорг1е1;агу з.п£огтаЫоп
СУРЗА4/5 Субстрат Мидазолам 5 ί дтаа - А16.Г ί сА
Метаболит субстрата 1'-гидроксимидазолам СегЫЫапЪ
Внутренний стандарт 1'-гидроксимидазолам-04 Ргорг1ебагу ίη£огта£ΐоп
2.1.2. Другие способы анализа.
Анализ Название Изготовитель
ф(Т-ПЦР Не содержащая РНК-азу вода РтзАег ЗстепШРтс
- 22 025377
дЕТ-ПЦР Высокопроизводительный набор для обратной транскрипции кДНк с ингибитором РНК-азы АррЫеб Втозузбетз
ςΒΤ-ПЦР Универсальный основной набор ТадМап АррЫеб Вгозузбетз
ςΚΤ-ПЦР Анализ экспрессии генов ТачМап АррЫеб ВФозузбетз
дКТ-ПЦР Реагент ΤΚΙζοΙ 1пУ1бгодеп
ςΗΤ-ПЦР Хлороформ ПзНег 3οίοη£ί£ίο
дРТ-ПЦР 2-пропанол ПзЬег 5с1епб1£1с
ςΗΤ-ПЦР Этанол, крепость 200 5 ί дгпа - А1 бг ί сН
ςΡΤ-ПЦР IX трис-ЕЭТА, рН 8.0 АшЫоп
ςΡΤ-ПЦР Набор КЫеазу τηΐηί Огадеп
дКТ-ПЦР Набор ДНК-аз без РНК-аз (Надей
ςΡΤ-ПЦР Протеиназа - К Отадеп
дКТ-ПЦР Набор ΚΝΑ 6000 Иапо ЬаЪСЫр АдИепб ТесЬпоТодтез
2.1.3. Другие реагенты.
Название Изготовитель
Ацетонитрил ПзАег ЗсгепМ£ίο
Ацетат аммония $1дта-А1с1г1сН
Диоксид углерода Не1деб Саз
Дексаметазон 51дта-А1с1г1сЬ
ΏΜ3Ο 51дта-А1бгίοΗ
ЕЭТА 51дта-А1с1г1сЬ
Этанол ПзДег ЗлепПКс
Муравьиная кислота ЕМ Зсдепсе
ΙΤ3+ ΒΌ В1О5С1епсез
Г-аргинин 51дта-А1с1г1сЬ
Ъ-глутамин 51дта-А1бгίοΗ
Хлорид магния 31дта-А1с1г1сЬ
Метанол ПзДег ЗлепПКс
Метиленхлорид (дихлорметан) 31дта-А1бг1сН
Мибефрадил 51дта-А1с1г1сЬ
Модифицированная среда Игла (МСМ) (Модификация Эг. СЪее) 1пУ1бгсдеп
Омепразол 31дта-А1бг1сЬ
Пенициллин-Стрептомицин (Реп-3£гер) Ιηνίбгодеп
Гидроксид калия ЫзЬег 5οίθπ6ί£ίο ог Сепбезб
Фосфат калия (одноосновный и двухосновный) МаШпскгобб Вакег
Рифампин 31дта-А1бг1сЬ
Бикарбонат натрия 31дта-А10г1сЬ
Карбонат натрия Пвкег δοΐεηϋΐίίο
Раствор хлорида натрия (протестированный на эндотоксины) 51дта-А10г1сб
Гидроксид натрия Пзкег Зс1епк1£1с
Стерильная высокочистая вода ХепоТесй
Сахароза Зхдта-АЫЫсЪ
Тимидин 31дта-А1бг1сА
Тт З1дта-А1бг1сп
2.2. Тест-система.
В этом исследовании использовали один препарат свежевыделенных гепатоцитов человека (далее обозначаемых как Н971), поставляемых ХепоТееН. ТЬС: 16825 \Уе51 116* §1тее1, Ьепеха, К§ 66219.
- 23 025377
2.2.1. Обработка культивируемых гепатоцитов человека.
Культуры гепатоцитов обрабатывали каждые сутки в течение трех последовательных суток и культивировали согласно δΟΡ Й5021.01 (ХепоТесй, ЬЬС) и ранее описанным способам (КоЬеПкоп еί а1., (2000), 1п уйго тЫЬйюп апб шбисбоп оГ йитап йерайс су1осйготе Р450 еп/утек Ьу тобаГтЪ. Эгид ΜеίаЬ Э1крок 28:664-671; Μабаи еί а1., (2003), ЕПсс1к оГ ргоЮ1ур1са1 т1сгокота1 еп/уте шбисегк оп суЮсйготе Р450 ехргеккюп ш сиЙигеб йитап йераίοсуίек. Эгид ΜеίаЬ Экрок 31:421-431; Рапк еί а1., (2009), 1п уйго ййиЬйюп апб тбисПоп оГ йитап Йуег суЮсйготе Р450 (СУР) еп/утек Ьу тйпаДргап. Эгид ΜеίаЬ Экрок 37:2045-2054). Культуры обрабатывали дополненной МСМ (каждую лунку обрабатывали 0,2 мл), содержавшей 0,1% ΌΜδΟ (носитель, отрицательный контроль), одну из пяти концентраций лаквинимода (0,01, 0,05, 0,1, 1 или 10 мкМ) или соединения 2 (0,01, 0,05, 0,1, 1 или 10 мкМ), мибефрадил (10 мкМ) или один из двух индукторов ферментов СУР, а именно омепразол (100 мкМ) и рифампин (10 мкМ) в качестве положительных контролей.
2.2.2. Выделение РНК из культивируемых гепатоцитов человека, очистка и количественное определение.
Приблизительно через 24 ч после последней обработки гепатоциты лизировали в реагенте ТК1/о1 после инкубаций с маркерным субстратом ш кНи, и клеточные лизаты хранили при -75±5°С. Для препарата гепатоцитов человека Н971 среду из шести лунок на группу обработки аспирировали и в каждую лунку добавляли приблизительно 132 мкл ТК1/о1. Клеточные лизаты смешивали путем повторяющегося пипетирования. Из клеточных лизатов выделяли тотальную РНК с использованием протокола ТЫ/о1 (Шуйтодец) и очищали с использованием набора КЯеаку Μίπί Κίί (О1адеп 1пс.) в соответствии с δΟΡ Й6161.02. Качество и концентрацию РНК определяли путем измерения поглощения при 260 и 280 нм на устройстве для считывания планшетов ВюТек δνικ^ν НТ (ВюТек Шкйцтепк, 1пс.) с программным обеспечением КС4 δ^диаίи^е (уегкюп 3.4 Кеу 21, ВюТек 1пк1пт1еп1к, 1пс.) в соответствии с δΟΡ Й616202. Анализ целостности РНК проводили с помощью набора ΚΝΑ 6000 №ию Аккау Κίί на ЛдйеШ 2100 Вюапа1у/ег (ЛдйеШ Тесйпо1од1ек, 1пс.) в соответствии с δΟΡ Й6162.02. Одноцепочечную кДНК получали из РНК с КТ Μакίе^ Μίχ с использованием программы термоциклирования АВ 7300 Кеа1 Типе РСК δукίет или программы термоциклирования системы АВ 7900НТ Еак1 Кеа1 Тиле РСК δукίет (Аррйеб ВюкукЮтк) в соответствии с δΟΡ Й6160.04. КТ Μакίе^ Μίχ состоит из 10Х буфера КТ, 25Х дезокси-ЭТР, 10Х смеси случайных гексамеров, ингибитора РНКаз (20 Е/мкл), обратной транскриптазы Μιι1ΐίδ^^ (50 Е/мкл) и не содержащей РНКаз воды. Смесь КТ Μакίе^ Μίχ добавляли к каждому образцу РНК для полного набора компонентов реакции. В анализы не включали контроли в виде матрицы (КГС). Для реакций КГС вместо образца РНК добавляли не содержащую РНКаз воду. Полученные образцы кДНК хранили при -20±5°С перед анализом дКТ-ПЦР.
2.3. Исследуемые образцы.
Лаквинимод натрий приготавливали в соответствии с методиками, описанными в патенте США № 6077851, и соединение 2 приготавливали согласно методикам, описанным в примере 1.
Лаквинимод Соединение 2
Хранение Хранение в закрытом Хранение в закрытом.
исследуемого виде при 2-8 °С в виде при 2-8 °С в
образца защищенном от света и влаги месте защищенном от света и влаги месте
Полученное количество 53,09 мг 50,58 мг
Молекулярная масса 378,78 г/моль (натриевая соль) 356,80 г/моль (свободная кислота) 383 г/моль
Чистота 100% 95, 4%
Внешний вид Белый порошок Светло-желтый
Растворитель, Высокочистая Высокочистая
использованный для растворения стерильная вода стерильная вода
Концентрация 0,01, 0,05, 0,1, 1, 0,01, 0,05, 0,1, 1
исходных растворов 2, 10 и 20 мМ и 10 мМ
- 24 025377
Концентрация 0,01, 0,05, 0,1, 1, 0,01, 0,05, 0,1, 1
рабочих растворов 2, 10 и 20 мкМ и 10 мкМ (исходный
(исходный раствор, раствор,
разбавленный в разбавленный в
дополненной среде дополненной среде
МСМ; конечная МСМ; конечная
концентрация ΌΜ5Ο в концентрация ϋΜ5Ο в
культуральной среде культуральной среде
= 0, ОП об./об.) = 0, 01% об./об.)
Хранение исходных растворов -20±5°С -20±5°С
Раствор лаквинимода или соединения 2 (10 мМ в высокочистой стерильной воде) приготавливали растворением соответствующего количества либо лаквинимода, либо соединения 2, в высокочистой стерильной воде. Для лаквинимода 10 мМ исходный раствор разбавляли высокочистой стерильной водой до 2, 1 и 0,1 мкМ. Далее 1 мкМ раствор разбавляли высокочистой стерильной водой до 0,05 и 0,01 мМ. Для соединения 2 10 мМ исходный раствор затем разбавляли высокочистой стерильной водой до 1 и 0,1 мкМ. Далее 1 мкМ раствор разбавляли высокочистой стерильной водой до 0,05 и 0,01 мМ. Растворы лаквинимода и соединения 2 (все мМ концентрации) разделяли на достаточное количество аликвот для использования по отдельности в исследовании и защищали от света с помощью желтой стеклянной тары или алюминиевой фольги и хранили замороженными (-20±5°С) с датой истечения срока два месяца.
Перед обработкой каждые сутки аликвоту исходных растворов лаквинимода и соединения 2 доводили до комнатной температуры и осторожно качали или встряхивали при низкой скорости. Затем исходные растворы лаквинимода (0,01, 0,05, 0,1, 1 и 10 мМ) и соединения 2 (0,01, 0,05, 0,1, 1 и 10 мМ) разбавляли в культуральной среде (разведение 1:1000) и полученный раствор с рабочей дозой добавляли к культурам гепатоцитов с получением конечных концентраций лаквинимода (0,01, 0,05, 0,1, 1 и 10 мкМ) и соединения 2 (0,01, 0,05, 0,1, 1 и 10 мкМ) в течение 2 ч после разведения (приблизительно от 15 до 65 мин). Перед применением на гепатоцитах проводили качественную визуальную оценку исходных растворов и дозируемых растворов для определения растворимости в тест-системе.
Непосредственно перед обработкой на каждые сутки обработки и непосредственно перед инкубацией маркерных субстратов использованную культуральную среду (использованная среда после дозирования) собирали из групп обработки носителем, лаквинимодом и соединением 2. Приблизительно 150 мкл собирали из каждой из трех лунок каждой из вышеупомянутых групп и объединяли для каждого образца до конечного объема приблизительно 450 мкл. Эти образцы использованной среды анализировали на остаточный лаквинимод, соединение 2 и деэтилированный метаболит (ΌΕΌΑ0).
2.4. Положительные контроли и носитель.
Для обработки гепатоцитов использовали следующие химические реагенты или носители:
Химический реагент Ката- ложный номер Номер партии Условия хранения3 Носитель Чистота Постав- щик
ϋΜ3Ο Ц2650 079К2305 089К2310 Комнатная темпера- тура Не применялся Не применимо 31дша- А1^г1сЬ
Омепразол 0104 079К1584 от 2 до 8°С ЭМЗО 99¾ Зддгпа- А10Г1сЬ
Рифампин Р.3501 115К1498 -20±5°С ЭМЗО 100% 31дша- А1^г1сЬ
Мибефрадил М5441 026К47034 Комнатная темпера- тура Высокочистая вода 99% 51дта- ΑΙύΓΐοή
а Условия хранения соединения в чистом виде.
Омепразол и рифампин и растворяли в ΌΜδΟ так, чтобы конечная концентрация ΌΜδΟ в культуральной среде составляла 0,1% об./об. Мибефрадил приготавливали в высокочистой стерильной воде. Согласно δΟΡ Ό5021.01 (ХепоТесЬ, ЬЬС) свежие растворы носителя и положительных растворов приготавливали из исходного раствора менее чем за 2 ч до обработки каждый день обработки (приблизительно от 15 до 65 мин).
2.5. Условия анализа.
2.5.1. Инкубация ίη Ши маркерных субстратов с культивируемыми гепатоцитами человека.
Инкубации гепатоцитов с маркерными субстратами проводили в соответствии с δΟΡ Ό5041.02.
- 25 025377
Приблизительно через 24 ч после последней обработки использованную среду аспирировали из лунок и каждую лунку промывали два раза предварительно нагретой (37±2°С) свежей культуральной средой. Среду аспирировали из лунок и реакции начинали добавлением 200 мкл предварительно нагретой среды, содержавшей маркерный субстрат, в каждую лунку. Культуральные многолуночные планшеты помещали в увлажненную камеру для культивирования (37±1°С при относительной влажности 95%, 95/5% воздух/СО2) и инкубации проводили в течение 30 мин (табл. 1). Через 30 мин аликвоту (150 мкл) смеси для инкубации удаляли и добавляли в лунку 96-луночного планшета, содержавшего 300 мкл стоп-реагента (ацетонитрил) и внутренний стандарт (табл. 2). Смеси тщательно перемешивали и позволяли им стоять в течение по меньшей мере 15 мин при 2-8°С. Образцы центрифугировали при 2000/д в течение 10 мин при 2-8°С и фракции супернатанта анализировали с помощью ЬС/Μδ/Μδ. Для каждого анализа инкубации проводили в условиях, указанных в табл. 1.
Таблица 1
Обобщение условий анализа для измерения активности микросомальных ферментов СУР
Фермент Субстрат Концентрация субстрата (мкМ) Растворитель субстрата (об./об., конечная концентрация при инкубации) Время инкубации (мин)
СУР1А2 Фенацетин 100 Метанол (0,4 %) 30
СУРЗА4/5 Мидазолам 30 Метанол (1%) 30
Объем инкубации = 200 мкл.
Таблица 2
Обобщение анализа метаболитов жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией
Фермент Мониторируемый метаболит Режим ионизации® Аналитический ЗОР, которому следовали Внутренний стандарт Концент- рация внутрен- него стандарта (нг/мл)1:1
СУР1А2 Ацетаминофен Ε5Ι- Ь3120,0& Ацетаминофен- 300
СУРЗА4/ 5 1'- гидроксимида- золам Ε3Ι + Ъ3170,05 1'- гидроксимида- золам-е1з 1000
а Указывает на тип ионизации (т.е. электрораспылительная ионизация [ΕδΙ]) и полярность (+ или -).
ь Величина указывает на исходную концентрацию внутреннего стандарта. Эту концентрацию разбавляли в 15 раз, когда добавляли к инкубируемой смеси после остановки.
Стандарты и образцы контроля качества сходным образом получали с добавлением стандартов в виде аутентичных метаболитов.
2.6. Аналитические способы.
2.6.1. Способы ЬС/Μδ/Μδ.
Все анализы проводили с помощью проверенных способов ЬС/Μδ/Μδ. Методики, использованные для анализа каждого метаболита, соответствовали применимым δΟР для аналитических способов ЬС/Μδ/Μδ и обобщенно представлены в табл. 2. Оборудование для Μδ представляло собой либо ΑΒΙ δ^χ (АррНеб В^оδуδΐетδ/Μ^δ δί'ΊΕΧ) АР1 4000, либо устройство АР1 3000 с насосами для ВЭЖХ δΐιίιηαύζιι и системами автоматических пробоотборников.
Фермент Мониторируемый метаболит Устройство АР1а Колонка ВЭЖХ
0ΥΡ1Α2 Ацетаминофен 3000 Иабегз
СУРЗА4/5 1' - 4000 Аб1апб13 6С18
гидроксимидазолам (5-мкм, 100
мм χ 2,1 мм)
а Модель системы ЬС/Μδ/Μδ от АррПеб В^оδуδΐетδ/Μ^δ δί'ΊΕΧ.
ь Всем колонкам для ВЭЖХ предшествовала защитная колонка РЬепотепех Ьипа С-8 (4,0/2,0 мм).
- 26 025377
Использовали стандарты в виде аутентичных метаболитов и во всех анализах в качестве внутренних стандартов использовали дейтерированные метаболиты. Инкубация в нулевой момент времени служила в качестве пустых образцов. Анализ образцов, интеграцию и представление результатов проводили в соответствии с δΟΡ Й8013.02, Й8020.02 и Й8011.02 (ХепоТесЬ, ЬЬС) соответственно.
Метаболиты количественно определяли с помощью стандартной калибровочной кривой на основе обратного вычисления взвешенной (1/х), линейной, среднеквадратичной регрессии. Регрессионная аппроксимация была основана на соотношении пиков анализируемого образца и внутреннего стандарта, вычисленного для стандартных калибровочных образцов, которые получали из стандартов в виде аутентичных метаболитов. Площади пиков интегрировали с помощью системы обработки данных Аррйеб Βίο5Υ5^ιη5/Μϋδ δСIЕX Лпа1у51 ба!а 5У51ет версии 1.4.2.
2.6.2. Анализ мРНК.
Количественную ОТ-ПЦР проводили в соответствии с δΟΡ Й6160.04 (ХепоТесЬ, ЬЬС) и протоколом Аррйеб Вю8у81ет8. Каждую ПЦР проводили в трех экземплярах. Смесь праймеров получали для каждого анализа экспрессии генов. Типичная смесь праймеров содержала универсальную основную смесь ТадМап ИтуегзЦ Маз1ег Μίχ (1Х), набор для анализа экспрессии генов (1Х, 900 нМ прямой и обратный праймеры) и не содержащую РНКаз воду. Реакционную смесь получали добавлением смеси праймеров к кДНК. Некоторый процент образцов (не менее 10%) включал ЫАС. (ЫАС представляют собой образцы РНК, которые не подвергают обратной транскрипции и используют, чтобы показать, что мРНК, а не геномная ДНК, является источником флуоресцентного сигнала в ПЦР). Реакционные смеси анализировали на системе для детекции последовательностей Аррйеб В1о8у81ет8 Кеа1 Нте РСК (АВ 7300 или АВ 7900НТ). Относительное количество кДНК-мишени по сравнению с количеством контрольной кДНК (САРЭН) определяли способом ДДС1 (Аррйеб В1о8у81ет8 Изег Вийейп #2). Относительное количество показывает изменение экспрессии мРНК в исследуемом образце относительно экспрессии мРНК в контрольном образце (например, ΌΜδΟ). Этот способ предполагает, что эффективность амплификации мишени и эффективность амплификации эндогенного контроля приблизительно равны.
2.7. Обработка данных.
Данные обрабатывали и наносили на график с помощью компьютерной программы Μ^с^ο8οй Ехсе1 2003 (Μ^с^080Й 1пс.). Индивидуальные скорости реакции из сходных групп обработки усредняли и для этих групп с п>3 определяли стандартное отклонение. Кратность увеличения определяли делением скорости ферментативной реакции для каждой группы обработки на скорость ферментативной реакции для контроля в виде носителя. Процент от положительного контроля вычисляли по следующему уравнению:
Процент от положительного контроля _ (Активность исследуемого образца на обработанных клетках - активность контроля в виде носителя) (активность положительного контроля - активность контроля в виде носителя)
X 100
Для цКТ-ПЦР данные обрабатывали с использованием программного обеспечения δе^иеηсе Эе(есйоп δу8ΐет (δΌδ) δοΠ\γа^е версии 1.4 для относительного количественного определения (Аррйеб Вюзуз(епъ). Это программное обеспечение анализирует относительную экспрессию гена с использованием сравнительного способа С1 (ДДС1), который соотносит сигнал ПЦР от транскрипта-мишени с сигналом ПЦР от мишени в необработанном контроле. Сигналы как обработанного образца, так и необработанного контроля нормализуют к эндогенному контролю (САРЭН). на экспрессию которого обработка не влияет и экспрессия которого является постоянной на протяжении исследования ткани. Результаты этого способа выражают в качестве процентного изменения экспрессии относительно экспрессии транскриптамишени в необработанном контроле. Вычисления являются следующими.
1. ДС1 = С1 (мишень) - С1 (эндогенный контроль).
2. ДДС! = ДС1 (обработанный образец) - ДС1 (необработанный контроль).
3. Кратность изменения экспрессии = 2-ДДС1.
Алгоритм в программном обеспечении автоматически удаляет резко отклоняющиеся значения из анализа. Критерии для принятия данных представляют собой специализированные критерии Аррйеб В1о8у81ет8. Резко отклоняющимися значениями считают лунки с величинами С!, которые значительно отличаются от осоциированных с ними дублирующих лунок и, как правило, они представляют собой лунки, в которых амплификация не происходит в достаточной степени или не происходит совсем.
Уровень экспрессии мРНК относительно положительного контроля вычисляли следующим образом:
Процент от положительного контроля = _ [(кратность изменения в обработанном образце)-1 ] χ [(кратность изменения в положительном контроле)-1]
3. Результаты и обсуждение.
Эффекты обработки гепатоцитов человека лаквинимодом и соединением 2 на активность ферментов СУР и уровни мРНК представлены в табл. 3-7. Если нет иных указаний, данные на фигурах и в таблицах представлены в качестве среднего значения ± стандартное отклонение для данных от инкубаций в трех экземплярах одного препарата клеток человека, округленных до трех значимых цифр. Средняя кратность увеличения обобщенно представлена в табл. 4 и 6. Кратность увеличения представлена либо в
- 27 025377 качестве доли от контроля, либо в качестве кратности увеличения относительно контроля, где контроль относится к соответствующим обработанным носителем образцам. Кратность увеличения округляли до трех значимых цифр. Сравнение исследуемого образца с прототипным индуктором (процент от положительного контроля) представлено в табл. 5 и 7, и оно округлено до трех значимых цифр.
Таблица 3
Активность СУР: эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом, соединением 2 или прототипными индукторами на активность ферментов цитохрома Р450 (СУР) ίη δίΐιι
Активность фермента (пмоль/мг белка/мин)е
Обработка Концентрация О- деалкилирование фенацетина (СУР1А2) 1' - гидроксилироваыие мидазолама (СУРЗА4/5}
Диметил- сульфоксид 0,1% (об./оО.) 2,99±0,13 0,195±0,011
Лаквинимод 0,01 мкМ 25,2±0,3 0,180±0,023
Лаквинимод 0,05 мкМ 54,0±4,5 0,161±0,013
Лаквинимод 0, 1 мкМ 65,1±1,9 0,151±0,002
Лаквинимод 1 мкМ 131±12 0,106±0,004
Лаквинимод 10 мкМ 183±7 0,0957±0,0067
Соединение 2 0,01 мкМ 22,1±2,7 0,179±0,006
Соединение 2 0/05 мкМ 31,б±2,6 0,151±0,009
Соединение 2 0,1 мкМ 48,2± 2,4 0,14010,010
Соединение 2 1 мкМ 90,8±11,5 0,109±0,010
Соединение 2 10 мкМ 180+8 0,10110,003
Омепразол 100 мкМ 84,9±5,4 ΝΆ
Мибефрадил 10 мкМ 11,3±2,1 ΝΑ
Рифампин 10 мкМ ΝΑ 0,941±0,019
а Величины представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для трехкратного определения на препарате гепатоцитов человека Н971, округленные до трех значимых цифр.
- 28 025377
Таблица 4
Кратность изменения активности СУР: эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом, соединением 2 или прототипными индукторами на активность ферментов цитохрома
Р450 (СУР) ιη 8йи
Кратность изменения®
Обработка Концентрация 0- деалкилирование фенацетина (СУР1А2) 1'- гидроксилирование мидазолама (СУРЗА4/5)
Диметил- сульфоксид 0,1% (об./об.) 1,00 1, 00
Лаквинимод 0,01 мкМ 8,43 0, 92
Лаквинимод 0,05 мкМ 18, 06 0, 82
Лаквинимод 0, 1 мкМ 21,75 0, 78
Лаквинимод 1 мкМ 43, 79 0, 54
Лаквинимод 10 мкМ 61, 02 0, 49
Соединение 2 0,01 мкМ 7,39 0, 91
Соединение 2 0,05 мкМ 10, 54 0, 77
Соединение 2 0,1 мкМ 16, 12 0, 72
Соединение 2 1 мкМ 30, 36 0, 56
Соединение 2 10 мкМ 60, 21 0, 51
Омепразол 100 мкМ 28, 38 МА
Мибефрадил 10 мкМ 3,76 ΝΑ
Рифампин 10 мкМ ΝΑ 4, 82
а Величины представляют собой результаты для препарата гепатоцитов человека Н971, округленные до трех значимых цифр.
Таблица 5
Процент активности СУР относительно положительного контроля: эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом, соединением 2 или прототипными индукторами на активность ферментов цитохрома Р450 (СУР) ίη ы1п
Процент от положительного контроля3
Обработка Концентрация 0- деалкилирование фенацетина (СУР1А2) 1' - гидроксилирование мидазолама (СУРЗА4/5)
Диметил- сульфоксид 0,1% (об./об.) 0 0
Лаквинимод 0,01 мкМ 27, 1 -2,04
Лаквинимод 0,05 мкМ 62, 3 -4, 63
Лаквинимод 0, 1 мкМ 75, 8 -5, 89
Лаквинимод 1 мкМ 156 -12,0
Лаквинимод 10 мкМ 219 -13,4
Соединение 2 0,01 мкМ 23, 3 -2,24
Соединение 2 0,05 мкМ 34, 9 -5, 94
Соединение 2 0,1 мкМ 55, 2 -7,46
Соединение 2 1 мкМ 107 -11,5
Соединение 2 10 мкМ 216 -12,7
Омепразол 100 мкМ 100 Νϋ
Мибефрадил 10 мкМ 10, 1 Νϋ
Рифампин 10 мкМ Νϋ 100
а Величины представляют собой результаты для препарата гепатоцитов человека Н971, округленные до трех значимых цифр.
Νϋ - не определено.
Для СУР1А2 положительным контролем является омепразол и контролем в виде Носителя является ΏΜδΟ.
Для СУР3А4/5 положительным контролем является рифампин и контролем в виде носителя является ΏΜδΟ.
- 29 025377
Таблица 6
Кратность увеличения уровня мРНК: эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом, соединением 2 или прототипными индукторами на уровни мРНК микросомального цитохрома Р450 (СУР) при определении дКТ-ПЦР (после инкубаций ίη κίΐι.ι)
Кратность увеличения9
Обработка Концентрация СУР1А2 СУРЗА4
Диметилсульфоксид 0,1% (об./об.) 1,00 1,00
Лаквинимод 0,01 мкМ 4,22 0, 621
Лаквинимод 0,05 мкМ 7,90 0, 347
Лаквинимод 0,1 мкМ 9, 50 0, 427
Лаквинимод 1 мкМ 16, 8 0,286
Лаквинимод 10 мкМ 20,5 0, 636
Соединение 2 0,01 мкМ 2,84 0, 437
Соединение 2 0,05 мкМ 4,98 0, 428
Соединение 2 0, 1 мкМ 7,20 0, 339
Соединение 2 1 мкМ 13,1 0, 252
Соединение 2 10 мкМ 24,3 0, 689
Омепразол 100 мкМ 8,58 ΝΤ
Мибефрадил 10 мкМ 0, 423 ΝΤ
Рифампин 10 мкМ ΝΤ 4, 63
а Величины представляют собой результаты для препарата гепатоцитов человека Н971, округленные до трех значимых цифр.
ΝΤ - не исследовали согласно замыслу эксперимента.
Таблица 7
Процент мРНК относительно положительного контроля: эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом, соединением 2 или прототипными индукторами на уровни мРНК микросомального цитохрома Р450 (СУР) при определении дКТ-ПЦР (после инкубаций ίη κίίι.ι)
Процент от положительного контроля3
Обработка Концентрация СУР1А2 СУРЗА4
Диметилсульфоксид 0, 1¾ (об./об.) 0 0
Лаквинимод 0, 01 мкМ 42,5 -10, 4
Лаквинимод 0,05 мкМ 91, 1 -18, 0
Лаквинимод 0,1 мкМ 112 -15, 8
Лаквинимод 1 мкМ 209 -19, 7
Лаквинимод 10 мкМ 257 -10, 0
Соединение 2 0,01 мкМ 24,2 -15, 5
Соединение 2 0, 05 мкМ 52,5 -15, 8
Соединение 2 0,1 мкМ 81,7 -18, 2
Соединение 2 1 мкМ 159 -20, 6
Соединение 2 10 мкМ 307 -8, 57
Омепразол 100 мкМ 100 Νϋ
Мибефрадил 10 мкМ -7, 61 N0
Рифампин 10 мкМ 100
а Величины представляют собой результаты для препарата гепатоцитов человека Н971, округленные до трех значимых цифр.
ΝΏ - не определено.
Для СУР1Л2 положительным контролем является омепразол и контролем в виде носителя является ЭМ8О.
Для СУР3Л4/5 положительным контролем является рифампин и контролем в виде носителя является ЭМ8О.
3.1. Жизнеспособность и морфология культивируемых гепатоцитов.
На момент выделения жизнеспособность препарата гепатоцитов человека составляла 70,9%. В процессе и после периода адаптации в течение 72 ч культуру исследовали каждые сутки с помощью свето- 30 025377 вой микроскопии и определяли, что она была морфологически нормальной со степенью смыкания, достаточной для обработки исследуемым и контрольным образцами. В течение 24 ч после последней обработки гепатоциты фотографировали, чтобы документировать их морфологические признаки и какиелибо явные признаки токсичности исследуемых образцов. Типичные микрофотографии сохранены на оборудовании для испытаний. На этих микрофотографиях показано, что, главным образом, гепатоциты человека, обработанные носителем (ΌΜ8Ο), лаквинимодом и соединением 2 или известными индукторами СУР, проявляли нормальную морфологию гепатоцитов. До и в ходе обработки культуры гепатоцитов человека образовывали смыкающиеся монослои с несколькими межклеточными пространствами; они были кубовидными и содержали целые клеточные мембраны и гранулярную цитоплазму с одним или двумя расположенными по центру ядрами. Обработка культуры гепатоцитов человека Н971 лаквинимодом, соединением 2 или лаквинимодом и мибефрадилом не приводила к изменениям морфологии клетки.
3.2. Эффект лаквинимода и соединения 2 на активность СУР1А2 человека и уровни мРНК.
Определение активности фенацетин-Ο-деалкилазы (СУР1А2).
В культивируемых гепатоцитах человека деацелирование фенацетина катализируется СУР1А2, который является основным индуцируемым омепразолом ферментом СУР. Эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом или соединением 2 на активность фенацетин-О-деалкилазы (СУР1А2) ίη 8Йи представлены в табл. 3 и обобщенно представлены в табл. 4. Обработка культивируемых гепатоцитов человека омепразолом один раз в сутки в течение трех последовательных суток вызывала увеличение активности фенацетин-О-деалкилазы (СУР1А2), в среднем, в 28,4 раз.
Обработка культуры гепатоцитов Н971 лаквинимодом (вплоть до 10 мкМ) вызывала зависимое от концентрации увеличение, вплоть до 61,0 раз, активности СУР1А2 по сравнению с контролем в виде носителя. При исследованных концентрациях (от 0,01 до 10 мкМ) лаквинимод имел эффективность, составляющую от 21,7 до 291% относительно положительного контроля омепразола, в отношении индукции активности СУР1А2. Кроме того, обработка один раз в сутки в течение трех последовательных суток мибефрадилом отдельно приводила к увеличению активности СУР1А2 в 3,76 раз.
Более того, обработка культуры гепатоцитов Н971 соединением 2 (вплоть до 10 мкМ) вызывала зависимое от концентрации увеличение активности СУР1А2 вплоть до 60,2 раз по сравнению с контролем в виде носителя. В исследованных концентрациях (от 0,01 до 10 мкМ) соединение 2 имело активность от 23,3 до 216% относительно положительного контроля омепразола, в отношении индукции активности СУР1А2.
Определение уровней мРНК СУР1А2.
Эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом и соединением 2 на экспрессию мРНК СУР1А2 представлены в табл. 6. Обработка культивируемых гепатоцитов человека омепразолом один раз в сутки в течение трех последовательных суток вызывала увеличение уровней мРНК СУР1А2, в среднем, в 8,58 раз.
Аналогично активности СУР1А2 обработка культуры гепатоцитов Н971 лаквинимодом (вплоть до 10 мкМ) вызывала зависимое от концентрации увеличение уровней мРНК СУР1А2 вплоть до 20,5 раз по сравнению с контролем в виде носителя. В исследуемых концентрациях (от 0,01 до 10 мкМ), лаквинимод имел эффективность от 42,5 до 257% относительно положительного контроля омепразола, в отношении индукции уровней мРНК СУР1А2. В противоположность активности СУР1А2 обработка один раз в сутки в течение трех последовательных суток мибефрадилом отдельно вызывала снижение уровней мРНК СУР1А2 57,7% по сравнению с контролем.
Более того, обработка культуры гепатоцитов Н971 соединением 2 (вплоть до 10 мкМ) вызывала зависимое от концентрации увеличение вплоть до 24,3 раз уровней мРНК СУР1А2 по сравнению с контролем в виде носителя. В использованных концентрациях (от 0,01 до 10 мкМ) соединение 2 имело эффективность от 24,2 до 307% относительно положительного контроля омепразола в отношении индукции уровней мРНК СУР1А2.
3.3. Эффект лаквинимода и соединения 2 на активность СУР3А4/5 человека и уровни мРНК СУР3А4.
Определение активности мидазолам-1'-гидроксилазы (СУР3А4/5).
В культивируемых гепатоцитах человека 1'-гидроксилирование мидазолама катализируется СУР3А4/5. СУР3А4 является основным индуцируемым рифампином ферментом СУР. Эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом и соединением 2 на активность мидазолам1'-гидроксилазы (СУР3А4/5) ίη 8Йи представлены в табл. 3 и обобщенно представлены в табл. 4. Обработка культивируемых гепатоцитов рифампином один раз в сутки в течение трех последовательных суток вызывала увеличение (в 4,82 раз) активности мидазолам-1'-гидроксилазы.
Обработка культуры гепатоцитов Н971 либо лаквинимодом (вплоть до 10 мкМ), либо соединением 2 (вплоть до 10 мкМ) вызывала зависимое от концентрации снижение активности СУР3А4/5 на 50,9 и 48,2% соответственно по сравнению с контролем в виде носителя.
Определение уровней мРНК СУР3А4.
Эффекты обработки культивируемых гепатоцитов человека лаквинимодом и соединением 2 на экспрессию мРНК СУР3А4 представлены в табл. 6. Обработка культивируемых гепатоцитов человека один
- 31 025377 раз в сутки в течение трех последовательных суток рифампином вызывала увеличение в 4,63 раза уровней мРНК СУР3Л4.
Аналогично активности СУР3Л4/5 обработка культуры гепатоцитов либо Н971 лаквинимодом (вплоть до 10 мкМ), либо соединением 2 (вплоть до 10 мкМ) вызывала зависимое от концентрации снижение на 36,4 и 31,1% по сравнению с контролем в виде носителя, соответственно, уровней мРНК СУР3Л4.
Определение соотношения соединения 2 или лаквинимода и ИЕБАр.
Концентрации соединения 2, лаквинимода и ЭБЕЛО измеряли в аликвотах использованных сред из среды, собранной непосредственно перед обработкой в каждый день обработки и непосредственно перед инкубацией маркерных субстратов.
Концентрация образовавшегося ОЕБЛО была приблизительно в 2 раза более высокой в среде с лаквинимодом по сравнению со средой с соединением 2. В концентрациях, в которых проводили обработку либо соединения 2, либо лаквинимода, составляющих 10 мкМ, соотношение соединение 2:ЭЕЕЛО составляло, в среднем, 40,9, в то время как соотношение лаквинимодГОЕЬЛр, в среднем, составляло 15,7. Это соответствует приблизительно 3-кратному увеличению образования ОЕЕЛО из лаквинимода по сравнению с соединением 2 и объясняется присутствием дейтерия в этильной части, которое приводит к более медленному Ν-деэтилированию.
4. Заключение.
В заключение, в условиях, когда прототипные индукторы вызывали ожидаемое и надлежащее увеличение активности и уровней мРНК СУР, обработка вплоть до 10 мкМ лаквинимодом или соединением 2 (дейтерированный аналог лаквинимода) вызывала сходное зависимое от концентрации увеличение активности СУР1Л2 и уровней мРНК и зависимое от концентрации снижение активности СУР3Л4/5 и уровней мРНК СУР3Л4, но наблюдали приблизительно 3-кратное отличие в соотношении соединение 2:ЭЕЕЛО относительно соотношения лаквинимодГОЕЬЛр.

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения человека, страдающего аутоиммунным заболеванием, включающий введение человеку 0,2-2,0 мг в сутки дейтерий-обогащенного соединения, имеющего структуру где каждый из К.1-К.Ю независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из Κι-Κι0 представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемой соли, эффективной для лечения пациента.
  2. 2. Способ по п.1, где дейтерий-обогащенное соединение представляет собой или его фармацевтически приемлемую соль.
  3. 3. Способ по п.2, где дейтерий-обогащенное соединение представляет собой
    - 32 025377 или его фармацевтически приемлемую соль.
  4. 4. Способ по п.2, где дейтерий-обогащенное соединение представляет собой или его фармацевтически приемлемую соль.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, волчаночный артрит, болезнь Крона или ревматоидный артрит.
  6. 6. Способ по п.5, где аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз.
  7. 7. Применение дейтерий-обогащенного соединения, имеющего структуру где каждый из К1-К10 независимо представляет собой Н или Ό и по меньшей мере один из К1-К10 представляет собой Ό, или его фармацевтически приемлемой соли в количестве 0,2-2 мг в сутки для лечения аутоиммунного заболевания у человека.
  8. 8. Применение по п.7, где дейтерий-обогащенное соединение имеет структуру или представляет собой его фармацевтически приемлемую соль.
EA201390081A 2010-07-09 2011-07-08 Дейтерированный n-этил-n-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, его соли и их применение EA025377B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39929710P 2010-07-09 2010-07-09
PCT/US2011/043383 WO2012006538A1 (en) 2010-07-09 2011-07-08 Deuterated n-ethyl-n-phenyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chloro-1-methyl-2-oxoquinoline-3-carboxamide, salts and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390081A1 EA201390081A1 (ru) 2013-07-30
EA025377B1 true EA025377B1 (ru) 2016-12-30

Family

ID=45439026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390081A EA025377B1 (ru) 2010-07-09 2011-07-08 Дейтерированный n-этил-n-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, его соли и их применение

Country Status (19)

Country Link
US (3) US8580819B2 (ru)
EP (2) EP3213636A1 (ru)
JP (2) JP2013535437A (ru)
KR (1) KR20130092558A (ru)
CN (2) CN102984939A (ru)
AR (1) AR082150A1 (ru)
AU (1) AU2011274496B2 (ru)
BR (1) BR112013000599A2 (ru)
CA (1) CA2804986A1 (ru)
CL (1) CL2013000063A1 (ru)
EA (1) EA025377B1 (ru)
IL (1) IL251600A0 (ru)
MX (1) MX2013000333A (ru)
NZ (1) NZ606587A (ru)
PE (1) PE20130396A1 (ru)
SG (2) SG10201505236YA (ru)
UY (1) UY33504A (ru)
WO (1) WO2012006538A1 (ru)
ZA (1) ZA201300956B (ru)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5832716B2 (ja) * 2005-10-19 2015-12-16 テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド ラキニモドナトリウムの結晶，及びその製造方法
AR061348A1 (es) 2006-06-12 2008-08-20 Teva Pharma Preparados estables de laquinimod
ES2600920T3 (es) 2007-12-20 2017-02-13 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Preparaciones estables de laquinimod
BR112012000568A2 (pt) * 2009-06-19 2015-10-06 Teva Pharma tratamento da esclerose múltipla com laquinimod
RS54707B1 (en) * 2009-07-30 2016-08-31 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. TREATMENT OF CROWN LAKVINIMOD DISEASE
US9585878B2 (en) 2009-08-10 2017-03-07 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Treatment of BDNF-related disorders using laquinimod
ES2601819T3 (es) * 2010-03-03 2017-02-16 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Tratamiento de la artritis lúpica usando laquinimod
PT2542079E (pt) * 2010-03-03 2014-07-18 Teva Pharma Tratamento da artrite reumatoide com uma combinação de laquinimod e metotrexato
KR20130006640A (ko) * 2010-03-03 2013-01-17 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 라퀴니모드를 이용한 루푸스 신장염의 치료
BR112013000599A2 (pt) 2010-07-09 2016-07-05 Teva Pharma deuterado n-etil-n-fenil-1,2-di-hidro-4-hidroxi-5-cloro-1-metil-2-oxoquinolino-3-carboxamida, os seus sais e suas utilizações
CN103974704A (zh) 2011-10-12 2014-08-06 泰华制药工业有限公司 以拉喹莫德和芬戈莫德的组合治疗多发性硬化症
US9161935B2 (en) * 2012-02-03 2015-10-20 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Use of laquinimod for treating Crohn's disease patients who failed first-line anti-TNF therapy
WO2013123419A1 (en) 2012-02-16 2013-08-22 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. N-ethyl-n-phenyl-1,2-dihydro-4,5-di-hydroxy-1-methyl-2-oxo-3-quinoline carboxamide, preparation and uses thereof
TW201350467A (zh) 2012-05-08 2013-12-16 Teva Pharma Ｎ－乙基－４－羥基－１－甲基－５－（甲基（２，３，４，５，６－五羥基己基）胺基）－２－側氧－ｎ－苯基－１，２－二氫喹啉－３－甲醯胺
TW201400117A (zh) 2012-06-05 2014-01-01 Teva Pharma 使用拉喹莫德治療眼發炎疾病
TW201410244A (zh) 2012-08-13 2014-03-16 Teva Pharma 用於治療ｇａｂａ媒介之疾病之拉喹莫德（ｌａｑｕｉｎｉｍｏｄ）
JP2015535287A (ja) 2012-11-07 2015-12-10 テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド ラキニモドのアミン塩
WO2014086284A1 (zh) * 2012-12-04 2014-06-12 上海医药集团股份有限公司 一类氘代3-氰基喹啉类化合物、其药用组合物、制备方法及其用途
CA2901849A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Crystals of laquinimod sodium and improved process for the manufacture thereof
MX2015010967A (es) 2013-03-14 2015-10-26 Teva Pharma Formulaciones transdermicas de laquinimod.
CN103145562B (zh) * 2013-03-18 2015-06-17 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种n-乙基苯胺的制备方法
KR20170005434A (ko) 2014-04-29 2017-01-13 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 높은 장애 상태를 갖는 재발-완화형 다발성 경화증(rrms) 환자 치료용 라퀴니모드
SI3347006T1 (sl) * 2015-03-20 2022-11-30 Gaba Therapeutics Inc. Devterirani analogi etifoksina, njihovi derivati in njihova uporaba
US11861914B2 (en) * 2019-08-28 2024-01-02 Nissan Motor Co., Ltd. Object recognition method and object recognition device
US11534434B2 (en) 2019-11-15 2022-12-27 Karuna Therapeutics, Inc. Xanomeline derivatives and methods for treating neurological disorders
KR20220118419A (ko) * 2019-12-19 2022-08-25 액티브 바이오테크 에이비 과도한 혈관신생과 관련된 안구 질병의 치료를 위한 화합물
GB202006390D0 (en) * 2020-04-30 2020-06-17 Aqilion Ab Novel treatments

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077851A (en) * 1998-04-27 2000-06-20 Active Biotech Ab Quinoline derivatives
US20100055072A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-04 Auspex Pharmaceuticals, Inc. 2-oxo-1,2-dihydro-quinoline modulators of immune function

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE52670B1 (en) 1981-03-03 1988-01-20 Leo Ab Heterocyclic carboxamides,compositions containing such compounds,and processes for their preparation
SE9801474D0 (sv) 1998-04-27 1998-04-27 Active Biotech Ab Quinoline Derivatives
US6121287A (en) 1998-07-15 2000-09-19 Active Biotech Ab Quinoline derivatives
SE9802550D0 (sv) 1998-07-15 1998-07-15 Active Biotech Ab Quinoline derivatives
SE9802549D0 (sv) 1998-07-15 1998-07-15 Active Biotech Ab Quinoline derivatives
US6133285A (en) 1998-07-15 2000-10-17 Active Biotech Ab Quinoline derivatives
AU775995B2 (en) 1999-06-07 2004-08-19 Nycomed Gmbh Novel preparation and administration form comprising an acid-labile active compound
SE0201778D0 (sv) 2002-06-12 2002-06-12 Active Biotech Ab Process for the manufacture of quinoline derivatives
US7560557B2 (en) 2002-06-12 2009-07-14 Active Biotech Ag Process for the manufacture of quinoline derivatives
US6875869B2 (en) 2002-06-12 2005-04-05 Active Biotech Ab Process for the manufacture of quinoline derivatives
US8314124B2 (en) 2004-02-06 2012-11-20 Active Biotech Ab Crystalline salts of quinoline compounds and methods for preparing them
SE0400235D0 (sv) 2004-02-06 2004-02-06 Active Biotech Ab New composition containing quinoline compounds
US7514068B2 (en) 2005-09-14 2009-04-07 Concert Pharmaceuticals Inc. Biphenyl-pyrazolecarboxamide compounds
JP5832716B2 (ja) 2005-10-19 2015-12-16 テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド ラキニモドナトリウムの結晶，及びその製造方法
AR061348A1 (es) 2006-06-12 2008-08-20 Teva Pharma Preparados estables de laquinimod
CA2686545C (en) 2007-04-19 2010-11-02 Concert Pharmaceuticals Inc. Deuterated morpholinyl compounds
ES2600920T3 (es) 2007-12-20 2017-02-13 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Preparaciones estables de laquinimod
JP2011001308A (ja) * 2009-06-19 2011-01-06 Research Foundation Itsuu Laboratory 重水素化カルボスチリル化合物
BR112012000568A2 (pt) 2009-06-19 2015-10-06 Teva Pharma tratamento da esclerose múltipla com laquinimod
RS54707B1 (en) 2009-07-30 2016-08-31 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. TREATMENT OF CROWN LAKVINIMOD DISEASE
US9585878B2 (en) 2009-08-10 2017-03-07 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Treatment of BDNF-related disorders using laquinimod
ES2601819T3 (es) 2010-03-03 2017-02-16 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Tratamiento de la artritis lúpica usando laquinimod
KR20130006640A (ko) 2010-03-03 2013-01-17 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 라퀴니모드를 이용한 루푸스 신장염의 치료
PT2542079E (pt) 2010-03-03 2014-07-18 Teva Pharma Tratamento da artrite reumatoide com uma combinação de laquinimod e metotrexato
WO2012006544A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. 5-chloro-4-hydroxy-1-methyl-2-oxo-n-phenyl-1,2-dihydroquinoline-3-carboxamide, salts and uses thereof
BR112013000599A2 (pt) 2010-07-09 2016-07-05 Teva Pharma deuterado n-etil-n-fenil-1,2-di-hidro-4-hidroxi-5-cloro-1-metil-2-oxoquinolino-3-carboxamida, os seus sais e suas utilizações
NZ611628A (en) 2010-12-07 2015-06-26 Teva Pharma Use of laquinimod for reducing fatigue, improving functional status, and improving quality of life in multiple sclerosis patients

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077851A (en) * 1998-04-27 2000-06-20 Active Biotech Ab Quinoline derivatives
US20100055072A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-04 Auspex Pharmaceuticals, Inc. 2-oxo-1,2-dihydro-quinoline modulators of immune function

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TUVESSON et al. "CYTOCHROME P450 3A4 IS THE MAJOR ENZYME RESPONSIBLE FOR THE METABOLISM OF LAQUINIMOD, A NOVEL IMMUNOMODULATOR", DRUG METABOLISM AND DISPOSITION, 2005, Vol. 33, pages 866-872 pg. 867, Fig. 1, pg. 868, Table 1, Fig. 2, pg. 869, Fig. 3, M6, pg. 868, col. 2, para 7 to pg. 869, col. 1, para 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2013000333A (es) 2013-02-26
US8580819B2 (en) 2013-11-12
BR112013000599A2 (pt) 2016-07-05
CN102984939A (zh) 2013-03-20
IL251600A0 (en) 2017-06-29
US20120010238A1 (en) 2012-01-12
US20140343096A1 (en) 2014-11-20
CA2804986A1 (en) 2012-01-12
US20140051723A1 (en) 2014-02-20
ZA201300956B (en) 2014-04-30
UY33504A (es) 2012-02-29
CN104610144A (zh) 2015-05-13
NZ606587A (en) 2015-03-27
AU2011274496A1 (en) 2013-02-28
AU2011274496B2 (en) 2016-03-10
WO2012006538A8 (en) 2013-05-23
WO2012006538A1 (en) 2012-01-12
JP2017014238A (ja) 2017-01-19
PE20130396A1 (es) 2013-04-19
EP2597954A1 (en) 2013-06-05
EP3213636A1 (en) 2017-09-06
AR082150A1 (es) 2012-11-14
CL2013000063A1 (es) 2013-05-03
EA201390081A1 (ru) 2013-07-30
SG10201505236YA (en) 2015-08-28
SG186948A1 (en) 2013-02-28
EP2597954A4 (en) 2014-01-01
JP2013535437A (ja) 2013-09-12
US9102620B2 (en) 2015-08-11
KR20130092558A (ko) 2013-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025377B1 (ru) Дейтерированный n-этил-n-фенил-1,2-дигидро-4-гидрокси-5-хлор-1-метил-2-оксохинолин-3-карбоксамид, его соли и их применение
US20180140592A1 (en) 5-chloro-4-hydroxy-1-methyl-2-oxo-n-phenyl-1,2-dihydroquinoline-3-carboxamide, salts and uses thereof
EA024523B1 (ru) Фармацевтическая композиция для лечения болезни шарко-мари-тута и родственных с ней расстройств
US9951076B2 (en) Deuterated pentylenetetrazoles for improving cognitive function
TW201350467A (zh) Ｎ－乙基－４－羥基－１－甲基－５－（甲基（２，３，４，５，６－五羥基己基）胺基）－２－側氧－ｎ－苯基－１，２－二氫喹啉－３－甲醯胺
EA011484B1 (ru) Тетразольные производные и способы лечения расстройств, связанных с метаболизмом
Carreño et al. Immunomodulatory actions of a kynurenine-derived endogenous electrophile
Flores-Miranda et al. Accumulation and elimination of enrofloxacin and ciprofloxacin in tissues of shrimp Litopenaeus vannamei under laboratory and farm conditions
CN114409597B (zh) 一种青藤碱衍生物及其制备方法与应用
WO2012074120A1 (ja) 滑脳症治療剤
Zakharova et al. The effect of ELOVL6 fatty acid elongase inhibition on the expression of genes associated with the metastasis of breast cancer
WO2016069949A1 (en) Compositions and formulations of methylerthritol phosphate pathway inhibitors and uses thereof
JP7219387B1 (ja) ４－（２，４－ジフルオロフェニル）－２－（１ｈ－インドール－３－イル）－４－オキソ－ブタン酸のｒ体
EP3822267B1 (en) Polymorph of hdac6-selective inhibitor and application thereof
US20230117938A1 (en) Compositions and methods for treating diseases, disorders and conditions involving trinucleotide repeats
US20110269716A1 (en) Antioxidant compounds and methods of their use
CN111434337A (zh) 罗丹宁衍生物在治疗代谢性疾病中的应用
CN117430562A (zh) 一种4-甲基-2-氧代-3,6-二氢嘧啶类化合物及其制备方法和应用
Pandraud A Genetic and Functional Investigation of Inherited Neuropathies: Charcot-Marie Tooth Disease and Brown-Vialetto-Van Laere Syndrome
WO2016055607A1 (en) Benzothiazole derivative useful in the treatment of chagas disease

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU