EA024907B1

EA024907B1 - Интеллектуальная упаковка для выявления микроорганизмов

Info

Publication number: EA024907B1
Application number: EA201101582A
Authority: EA
Inventors: М. С. Кристина Нерин де ла Пуэрта; Лаура Гутиэррес Бартоломе; Кристина Санчес Харабо
Original assignee: Универсидад Де Сарагоса
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2016-11-30
Also published as: CA2765632A1; CA2765632C; SG10201402029WA; EP2428580A1; SG175942A1; ES2534838T3; MX2011011711A; PE20120641A1; AU2010244344B2; KR101721712B1; MY184059A; EA201101582A1; PT2428580E; BRPI1011297A2; NZ596884A; UA106751C2; DK2428580T3; IL216168A; US8741596B2; US20120135455A1

Abstract

Изобретение относится к новой интеллектуальной упаковке, разработанной с использованием нового материала, включающего твердую подложку из частично полярного адсорбента, пропитанную раствором ванилина, который позволяет визуально выявлять рост микроорганизмов в различных видах продуктов без необходимости прямого контакта с микроорганизмом или средой, его содержащей.

Description

Изобретение относится к области пищевых, химико-фармацевтических и косметических продуктов. В частности, оно касается нового материала, состоящего из твердой подложки из частично полярного адсорбента, пропитанного раствором ванилина и его использования в качестве колориметрического индикатора для выявления присутствия микроорганизмов в продуктах питания, косметических средствах или фармацевтических товарах.

Предпосылки создания изобретения

Каждый год в мире происходит бесчисленное количество случаев госпитализации из-за пищевых токсикоинфекций, возникающих в результате присутствия микроорганизмов.

Со своей стороны, потребители XXI века требуют пищевые продукты с высоким органолептическим качеством и большой пищевой ценностью, а значит, подвергшиеся минимальной обработке, в отличие от обычных продуктов. Очевидно, что применение менее жестких условий обработки приводит к возрастанию микробиологической опасности, и поскольку разнообразие микробного поведения становится критичным, постольку необходимо знать о реальной возможности выживания и размножения остаточных микробов в каком-либо продукте для того, чтобы точно определять его срок годности или микробиологические факторы риска, которые хотел бы допустить производитель.

Изучение попадания и распространения патогенных организмов в пищевых продуктах является, на самом деле, одной из приоритетных задач Европейского содружества в области безопасности пищи. Ее целью является определение рисков, действительно существующих для пищевых продуктов, а также применение микробиологических критериев и параметров безопасности пищевых продуктов для некоторых типов продовольствия.

В настоящее время на рынке нет рыночных материалов с натуральными веществами, способных визуально выявлять в упакованных продуктах широкий спектр микроорганизмов. Следовательно, ни потребитель, ни оптовые, ни розничные продавцы не могут определить, заражены упакованные продукты микроорганизмами, или нет. В случае патогенных микроорганизмов эта ситуация создает серьезную опасность для здоровья. Для того чтобы их контролировать, необходимо прибегать к микроскопическому исследованию и микробиологическому анализу или высеву на селективные культуральные среды, что предполагает большие затраты сил, времени и материалов. Далее, эти методы разрушительны, после них анализируемый продукт больше нельзя использовать в коммерческой цепочке; они занимают очень долгое время, поскольку время культивирования длится до тех пор, пока не станет возможно подсчитать титр микроорганизмов, а именно от 2 до 7 дней, не считая времени, необходимого на предварительное обогащение культуры. Такие анализы также требуют значительных лабораторных расходов. В любом случае, такие анализы проводятся на случайной выборке достоверного количества образцов, но их никогда нельзя сделать для каждого отдельно упакованного продукта, так что всегда есть возможный риск микробного заражения продукта, не выявленного производителем или конечным потребителем. В фармакологии риск значительно больше, так как проблема такого характера выявляется тогда, когда вред уже нанесен, и часто непоправимый.

В последние годы в ответ на запросы потребителей в отношении срока годности, сохранения их свойств, свежести, внешнего вида продуктов и т.п. были разработаны системы упаковки продуктов питания. С другой стороны, современные методы маркетинга требуют привлекательной упаковки, сообщающей потребителю нечто, позволяющее выбрать данный продукт. Во-вторых, упаковки развивались с годами, отвечая глубоким изменениям в образе жизни, и упаковочная индустрия должна была соответствовать этим изменениям.

Упаковки должны, среди прочих, выполнять следующие функции: вмещать пищевой продукт;

защищать пищевой продукт от физического, химического и микробиологического воздействия; сохранять качество и полезные свойства пищи; предотвращать подделки;

поддерживать продукт в состоянии, соответствующем установленным нормам коммерческой реализации;

показывать и идентифицировать продукт информировать потребителей о свойствах продукта питания;

продлевать сроки годности и т.п.

В последнее время в связи с новыми требованиями потребительского спроса возникли два новых направления в упаковке - активная упаковка и интеллектуальная упаковка. Активную и интеллектуальную упаковки можно рассматривать как следующее поколение в упаковке продуктов питания.

Активные материалы и предметы в контакте с пищевыми продуктами определены в соответствии с Европейской директивой 1935/2004 как те, что предназначены для увеличения срока хранения или поддержания или улучшения состояния упакованных продуктов и которые созданы с избирательным включением компонентов, пропускающих вещества к упакованной пище или ее окружению или адсорбирующих вещества от пищевых продуктов или окружающей их среды. В последние годы созданы значительные достижения в области активной упаковки, опубликовано было много работ, касающихся этого пред- 1 024907 мета (Робпдие/, А., Вайе, К., Νσίιι, С. (2007), ТЬе ике οί па1ига1 ойк ак апЬш1стоЫа1 8о1иЬоп8 еккепйа1 ίη рарег раскадтд. Рай II. Ргодгекк ш Отдашс Соайпдк 60 (1): 33-38), Робпдие/, А., №тт, С., апб Вай1е, К. (2008). Νην аппатоп-Ъакеб асйуе рарег раскадтд адашк! Р1и/ориккЮ1ошГег Гооб кройаде. 1оитпа1 оГ АдйсиЬита1 апб Рооб СЬет181гу 56 (15)), Боре/, Р., ЗапсЬе/ С., ВаЙ1е, К., апб №пп, С. (2007Ъ). Осуе1ортеп1 оГ йех1Ъ1е апЙ1тсгоЫа1 Гйтк икшд еккепйа1 ойк ак асйуе адепй. 'Чоита1 оГ АдйсиЬшй апб Рооб СЬет181гу 55 (21): 8814-8824) Оийетге/, Ь., ЗапсЬе/ С., ВаЙ1е, К.; №пп, С. (2009). Νην апйт1стоЫа1 асйуе раскаде Гог Ъакегу ртобисй. Тгепбк ш Рооб Заепсе & ТесЬпо1оду 20 (2): 92-99).

Что касается интеллектуальных упаковок, ее задачи другие, что и определяет их выделение с учетом специального назначения. Их действие дает возможность осуществить мечту потребителей в современном мире о том, что упаковка сама сообщает о качестве продукта, который в ней находится, или о событиях, происходивших при его приготовлении, действуя как информатор о возможной порче или разрушении, а также о неправильном хранении, транспортировке или распространении. Согласно Директиве 1935/2004 интеллектуальные упаковочные средства определяются как те материалы, которые контролируют состояние упакованных продуктов питания или окружающей их среды.

Интеллектуальной упаковкой, будем считать такую, в которой используются свойства или компоненты пищевых продуктов или упаковочного материала как показатели качества пищи и ее происхождения; до настоящего времени используются в основном временно-температурные индикаторы, индикаторы микробиологического качества, индикаторы кислорода и двуокиси углерода.

Таким образом, интеллектуальная упаковка определяется как та, что отслеживает состояние упакованной пищи путем сообщения информации о качестве упакованной пищи при транспортировке и хранении, указанное состояние пищи означает физиологические процессы (дыхание фруктов и свежих овощей); химические процессы (окисление жиров); физические процессы (зачерствение хлеба, усыхание); микробиологические аспекты (повреждение микроорганизмами) и заражение (насекомыми).

Эти упаковки представляют огромный интерес для пищевой промышленности, и доказательством этому служит то большое количество усилий, направленных на развитие и исследования этого вида упаковки.

Внутри этой группы находятся упаковки, несущие этикетки, красители или эмалевые покрытия, которые используются как индикаторы качества, сохранности или обработки упакованного продукта. Они основаны на физико-химических, ферментативных или других реакциях, в основном приводящих к изменению цвета в устройстве, что указывает на повреждение или изменение, имевшие место в пищевом продукте.

Таким образом, возможность применения взаимодействия между пищей и упаковкой можно начать использовать в положительном смысле, например, для блокирования или ингибирования причин порчи пищи.

Многие из существующих интеллектуальных индикаторов очень полезны для индустрии упаковки продовольствия, такие как временно-температурные индикаторы, показатели целостности упаковки, микробного роста, аутентичности упаковки и т.д. Некоторые из них являются собственностью компаний, но только малая часть коммерчески используется, наиболее известны временно-температурные индикаторы.

Имеется не так много ссылок, относящихся к развитию интеллектуальной упаковки, которая способна быстро и эффективно выявлять наличие микроорганизмов в продуктах питания при их приобретении или потреблении. В связи с тем, что поглощение испорченной пищи с микробиологической точки зрения является одной из самых главных причин заболевания (пищевого отравления), зараженные упакованные продукты важно выявлять рано, т.е. до потребления. Поэтому продавец может вовремя их удалить, и потребители смогут избежать их потребления без риска для здоровья.

В известных разработках в отношении этого типа интеллектуальных упаковок требуется прямой контакт между микроорганизмом и датчиком, действующим как интеллектуальная упаковка, как, например, в патентах ЕР 1326653, \УО 03093784, \УО 2008026119 (К1тЪег1у-С1агк ^ойбдабе, ΙΝΟ), где используется хромогенный детектор, или в заявке \УО 0013009 ЦоЬпкоп МайЬеу РиЪйс ЫтЪеб Сотрапу), где комплексные соединения металлов используются как подложки для осуществления реакции. В работе ПекЪогбек, ί.: ΤΌΝίνΕ, Ь РтеуоЕ А. Аппа1ек РтапсоЪек РЬаттасеийдиек 1972, 30 (7-8), 507-518 используется цветная реакция ванилина в серной и фосфорной кислотах для определения наличия липидов при исследованиях бактерий, и в конце выявляется присутствие жирных кислот с помощью методов тонкослойной хроматографии и газовой хроматографии. И опять, в этой разработке для проведения реакции необходим прямой контакт между бактерией и реактивом. Далее, система производства индикаторов такого типа очень сложная, что затрудняет их изготовление в промышленных масштабах. Более того, механизм реакции очень сложный, и требует сначала создания окрашенного соединения, которое исчезнет при контакте с микроорганизмами. Кроме того, соединения, используемые в качестве хромогенов, являются химическими веществами, которые, в некоторых случаях, для того, чтобы началась реакция,

- 2 024907 требуют специальных условий, таких как закисление, или комплексными химическими соединениями, ряд которых не может сегодня применяться в контакте с пищевыми продуктами, или имеются строгие ограничения по их концентрации. В любом случае в качестве основных хромогенных соединений используются природные соединения, гораздо меньше соединений используются в качестве пищевых добавок, что дает технологические преимущества и пользу для здоровья.

В свете недостатков упаковок, описанных выше, авторы настоящего изобретения после большого исследования разработали новый материал, который включает твердый носитель из частично полярного адсорбента, пропитанный раствором ванилина, который можно использовать в качестве колориметрического индикатора для выявления микроорганизмов в упакованных продуктах разного рода.

Ванилин (3-метокси-4-гидроксибензальдегид), разрешенный как пищевая добавка, может успешно выявлять рост микроорганизмов с помощью простой и легко определяемой хромогенной реакции. Он также действует в составе сенсора без необходимости находиться в прямом контакте с пищей или упакованным продуктом, однако чтобы это произошло, необходимо наличие небольшого количества влаги в газовой фазе.

Ванилин является природным соединением, обнаруженным во многих овощах, особенно, в стручках ванили. В промышленности его получают из эвгенола, основного составляющего гвоздичного масла. Также, его получают путем окисления лигнина, сложного полимера, находящегося в древесине растений.

Ванилин широко используется как отдушка в продуктах питания, особенно в выпечке. Он также используется в фармацевтике в качестве стимулятора желудочной деятельности, и в парфюмерии.

В уровне техники известно несколько работ, в которых также приводится использование ванилина в качестве предшественника других реактивов, но для этого необходим длительный процесс синтеза и смешивание с такими растворителями, как этанол, и такими реактивами, как концентрированная соляная кислота, пиперидин, йодистый метил и другие. Например, в документе \УО 2008026119 ванилин не является основным компонентом изобретения, и в происходящей реакции изменения цвета он требует присутствия другого соединения.

Другие методы, используя ванилин в качестве детектора наличия микроорганизмов, нуждаются в сильном закислении среды НС1 с недостатками, которые из этого следуют, а также они способны выявлять наличие только тех микроорганизмов, которые способны образовывать индол. Так, источник Рег1ш, Н.Т апб КагаЪшег (IV. ЕисНбек 1954, 14, 345-353) описывает среду, содержащую триптофан, как способ выделения Е.соН и Р.уи1даг18 из смеси, основанный на различии в образовании индола из триптофана. Одновременно с этим они также разработали реагент для постановки индольного теста. В этих условиях они используют добавку 0,25% раствора ванилина в концентрированной соляной кислоте для образования фиолетовой окраски с индолом при прямом контакте и в жидкой фазе. Значит, индол-образующие микроорганизмы должны быть обнаружены в указанном растворе, образуя индол, что приводит к хромогенной реакции.

В свете указанных недостатков одним из главных преимуществ настоящего изобретения является именно использование безвредного природного соединения, пищевой добавки, каким является ванилин, и возможность выявлять наличие микроорганизмов без необходимости прямого контакта между микроорганизмом и упаковочным материалом.

Его применение нацелено на разрешение проблемы, связанной с большим риском для общества, а именно, наличия патогенных микроорганизмов в продуктах питания, фармацевтических и косметических товарах и в других упакованных продуктах.

Предлагаемый материал включается в материал для упаковки продуктов питания или любых других продуктов, восприимчивых к загрязнению микроорганизмами, так что с помощью легко распознаваемого изменения цвета (от бесцветного до пурпурного) потребитель способен отказаться от продукта и избежать потребления пищи или использования продуктов, зараженных или загрязненных микроорганизмами, вредными для здоровья.

С другой стороны, это система, которая вносит огромный вклад в контроль качества упакованных товаров путем своевременного удаления загрязненных партий, тем самым предотвращая их попадание к конечному потребителю, а также предотвращая проблемы и убытки из-за возможных возвратов. Области использования, связанные с разработкой и развитием этого нового метода, могут быть, с одной стороны, индустрия упаковки, которая отвечала бы за производство и вывод на рынок материала, включенного в упаковку, а с другой стороны, пищевая, косметическая или фармацевтическая индустрия. В этих областях имеют дело с оптимизацией расположения данного материала внутри упаковки, учитывая промышленный упаковочный процесс, для обеспечения размещения, которое будет легко заметно конечному потребителю и которое не будет мешать упакованному продукту или затруднять промышленный упаковочный процесс.

Главным преимуществом использования такого индикатора, какой представлен в данном изобретении, является возможность известить потребителя о том, что пища, которую он или она готовы съесть, или продукт, который он или она готовы использовать, не свободны от микроорганизмов в момент приобретения и употребления, исходя из этого и поэтому он или она могут воздержаться от потребления его и отказаться от продукта.

- 3 024907

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - нанесение сенсорного материала на полипропиленовую пленку. Культура Е.соН.

Фиг. 2 - нанесение сенсорного материала на бумажные фильтры в отсутствие микроорганизмов (контроль), со средой культивирования (левая колонка) и без среды (правая колонка).

Фиг. 3 - нанесение сенсорного материала на клейкую бумажную этикетку. Культура Е.соН.

Фиг. 4 - нанесение сенсорного материала на бумажные фильтры в присутствии микроорганизмов (Е.соН) или в отсутствие микроорганизмов (контроль). Средой выращивания является среда МюллерХинтона.

Фиг. 5 - график дней, необходимых для появления цвета на различных средах (Мюллер-Хинтон, ΤδΑ, МЕА) для различных микроорганизмов.

Фиг. 6 - нанесение сенсорного материала на бумажный фильтр при различных рН в культуре без микроорганизмов, среда Мюллер-Хивтон.

Фиг. 7 - график изменения концентрации ванилина от времени а) в отсутствие микроорганизмов (контроль); Ь) СапФНа а1Ысап8; с) §1арНу1ососси8 аигеик; Н) 8а1топе11а сНо1ега8Ш8.

Объект изобретения

Во-первых, объектом изобретения является материал, содержащий твердую подложку из частично полярного адсорбента, пропитанного раствором, содержащим ванилин.

Еще одним объектом изобретения является использование указанного материала в качестве колориметрического индикатора для визуального определения роста микроорганизмов, причем указанный индикатор для формирования изменения цвета не требует прямого контакта с микроорганизмами или со средой, содержащей их.

Наконец, объектом изобретения также является использование ванилина в качестве колориметрического реактива для визуального выявления роста микроорганизмов.

Описание изобретения

Настоящим изобретением заявляется новая интеллектуальная упаковка, сконструированная из нового материала, который позволяет визуально выявлять рост микроорганизмов в продуктах различной природы без прямого контакта с организмом или средой, содержащей его.

Таким образом, в главном аспекте изобретения рассматривается указанный материал, который состоит из твердой подложки из частично полярного адсорбента, пропитанного раствором, содержащим ванилин.

Наличие ванилина в составе материала позволяет выявлять рост микроорганизмов за счет простой и легко распознаваемой хромогенной реакции. Изменение цвета (с бесцветного на пурпурный) в условиях тестирования четко отражает присутствие микроорганизмов, как в чистой культуре на чашках Петри, так и в пищевых продуктах, например, в самодельном майонезе без консервантов, в лекарствах или косметических товарах.

Ванилин является природным соединением, которое реагирует на присутствие микроорганизмов. В отсутствие ванилина цветная реакция не происходит. Реакция является необратимой, и образуемая окраска увеличивает свою интенсивность по мере продолжения микробного роста.

В одном из вариантов исполнения изобретения раствор ванилина содержит этанол. Минимальная концентрация ванилина, необходимая для того, чтобы увидеть цветную реакцию, составляет 10%, предпочтительное содержание ванилина в этаноле - примерно от 10 до 50%.

Реакция нуждается в водной среде или, как минимум, влаге, чтобы быть видимой, устойчивой и необратимой и таким образом служить колориметрическим детектором. Следовательно, твердая подложка должна быть сделана из частично полярного адсорбирующего материала, способного удерживать влагу, выделяемую в паровой фазе самими пищевыми продуктами, предпочтительно использовать бумагу или картон.

В случае, когда ванилин включается в гидрофобную среду, реакция не будет постоянной из-за того, что жидкость будет конденсироваться на гидрофобной подложке и, хотя она будет сходным образом окрашиваться, она не сохранится, поскольку капля конденсата упадет под действием силы тяжести. Следовательно, при такой подложке результат не будет необратимым и стабильным.

Как отмечено выше, описанные признаки материала изобретения делают его пригодным для визуального выявления микробного роста, следовательно, другим ключевым аспектом изобретения является использование этого нового материала в качестве колориметрического индикатора для визуального выявления наличия микроорганизмов.

Реакция индикатора проходит в газовой (паровой) среде, следовательно, ванилин не нуждается в прямом контакте с микроорганизмом или со средой, содержащей его. Таким образом, индикатор и микроорганизмы могут быть отделены друг от друга, при контакте между ними только через газовую среду.

Тот факт, что индикатору не требуется прямой контакт с организмом, дает очень большие преимущества, и это важное отличие его от индикаторов, известных в настоящее время, поскольку при данном способе вещества, выделяемые микроорганизмами в процессе их метаболизма, достигают газовой среды и через нее они доходят до индикатора, где и происходит хромогенная реакция. Это позволяет поместить индикатор на крышку или приклеить на упаковочный материал, или сделать его частью упаковочного

- 4 024907 материала, но на некотором расстоянии. Материал имеет также то преимущество, что при тех же условиях, т.е. действие в газовой среде, он реагирует на наличие микроорганизмов в любой части продукта, где бы они не находились, не ограничиваясь частью или фракцией такового, как в случае, когда требуется непосредственный контакт.

Более того, тот факт, что изменение цвета происходит вследствие переноса или диффузии веществ от микроорганизмов в газовую среду, позволяет достичь высокой чувствительности, что означает, что индикатор реагирует на появление самых первых колоний микроорганизмов в среде.

В присутствии концентраций микробов, равных или больше чем 10 колониеобразующих единиц на мл или мг (КОЕ/мл, КОЕ/мг) пищевых продуктов, содержащих микроорганизмы, индикатор необратимо меняет окраску от бесцветной (или белой, в зависимости от бумаги или твёрдой подложки) до розовофиолетовой. Интенсивность окраски зависит от концентрации микроорганизмов. Индикатор позволяет проводить визуальное определение роста широкого спектра микроорганизмов, таких, как плесени, дрожжи и/или бактерии.

Все микроорганизмы, образующие индол в процессе своего метаболизма, реагируют с ванилином. Кроме того, другие микроорганизмы, не производящие индол в процессе своего метаболизма, такие, как 8а1тоие11а и Ркеийотоиак крр, также дают положительную идентификационную реакцию с ванилином, в силу чего реакция не будет индол-ванилин специфичной, а может быть определена как более общая реакция азотсодержащие вещества-ванилин.

Выявление микроорганизмов интеллектуальным сенсором или системой заявляемого изобретения, может выполняться в запакованном продукте. Упакованный продукт может быть разным по своей природе, предпочтительнее это пища, фармацевтический или косметический продукт.

В отдельных вариантах реализации интеллектуальная система, образуемая из материала, служащего индикатором, может быть использована как собственно упаковочный материал или материал может быть прикреплен в виде бумажной наклейки, предпочтительно самоклеющейся, помещённой на внутренней поверхности упаковки, который может быть пластиковым или из другого материала, так, чтобы материал был в контакте с атмосферой, образующейся внутри упаковки. В области наклейки упаковка должна быть из прозрачного и бесцветного материала, для того чтобы можно было видеть изменение окраски, которое произойдёт в присутствии микроорганизмов.

Наконец, другой важный аспект изобретения заключается в использовании ванилина в качестве колориметрического реактива для визуализации обнаружения роста микроорганизмов в газовой среде, т.е. без прямого контакта между ванилином и микроорганизмом.

Примеры

В экспериментальных условиях была исследована активность индикатора на основе различных материалов подложек. Это позволило четко визуализировать действие индикатора на макроскопическом уровне.

На фиг. 1 показано применение в культуре Е.сой полипропиленовой (ПП) пленки, пропитанной раствором ванилина. Изменения цвета не наблюдалось, хотя использованная постановка была та, что разрабатывалась для данного индикатора.

Причина отсутствия ответа (изменение цвета) состоит в том, что данный материал не адсорбировал влагу или вещества или, что то же самое, реакция с составом, содержащим ванилин, не поддерживалась на этой подложке, поскольку происходила в не полярной среде, пропитавшей полипропилен (НИ). На самом деле присутствовал окрашенный ореол, покрывавший НН, но в конечном итоге он конденсировался и стекал с НН, показывая, что эта неполярная или неадсорбирующая подложка непригодна для использования в качестве подложки для данного индикатора.

На фиг. 2 представлены проведенные контрольные опыты (без микроорганизмов), в которых были использованы несколько подложек из бумажных фильтров, смоченных раствором ванилина в присутствии среды культивирования (левая колонка) и в её отсутствие (правая колонка). Ноказано, что в отсутствие микроорганизмов наличие среды культивирования недостаточно для развития реакции.

На фиг. 3 показано применение индикаторного материала согласно изобретению на самоклеющейся этикетке для определения наличия микроорганизмов в культуре Е.сой, в результате чего наблюдалось изменение цвета индикатора.

На фиг. 4 показано применение индикаторного материала на нескольких подложках из бумажных фильтров в различных культурах Е.сой и контрольной культуре, т.е. без микроорганизмов. Средой культивирования служила среда Мюллер-Хинтона. Было установлено, что окрашивание индикаторов происходит во всех культурах Е.сой, тогда как в контрольной культуре окрашивание не появлялось.

Для расширения исследования была проведена оценка поведения заявленного в изобретении материала в присутствии широкого ряда микроорганизмов, с целью определения минимальной концентрации, необходимой для нормальной работы индикатора.

Были проведены исследования по изучению эффективности индикатора в присутствии следующих микроорганизмов:

Грибы:

ЛкрегдШш йауик (Испанская коллекция типов культур - Зрашкй Туре СиЙиге Сойесйои, СЕСТ,

- 5 024907

2687);

РетсШШт гос.|иеГогЦ (Коллекци культур грибов - СиИите Со11есйои оГ Рии§1, ΙΒΤ, 21319);

Еитойит герепз (ΙΒΤ 1800);

РетсШшт 1з1апШсит (СЕСТ 2762);

РетсШшт аттипе (ΙΒΤ 21314);

РетсШшт ехраизит;

РетсШшт па1д1оуеп818.

Дрожжи:

СапШФа а1Ысап8 (Американская коллекция типов культур - Атепсап Туре СиИите Со11есИоп. АТСС, 64550);

ИеЬагуотусез Иапзепи (СЕСТ 10353);

2удозассИатотусе5 тоихи (СЕСТ 11928);

Во1туЙ8 сшетеа.

Бактерии:

Еп1етососси8 ГаесаНз (АТСС 29212);

Ыз1епа топосуЮдепез (АТСС 7644);

ВасШиз сегеиз (СЕСТ 495);

81арИу1ососсиз аигеиз (АТСС 29213);

5>а1топе11а сИо1егаезшз (СЕСТ 4000);

Уегзпна еШегосоШтса (СЕСТ 4315);

ЕзсИепсШа соН (АТСС 29252);

Рзеийотопаз аегидтоза (АТСС 27853).

Положительные реакции наблюдались как среди бактерий, так и среди грибов и дрожжей. Из протестированных микроорганизмов, дававших положительную реакцию, в табл. 1 указаны те, у которых значение концентрации микроорганизмов может быть легко выявлено в зависимости от концентрации внесенных клеток и от времени, необходимом для изменения цвета индикатора.

Таблица 1

Изменение цвета в единицах концентрации

Бактерии	Дни инкубации	МСС (КОЕ на мг/мл)	МСЭ (КОЕ на мг/мл)
Р. аегидтоза	1 2 3	10 10 10	10' 10² 10
Е. соН	1	10	10'
	2	10	ю²
	3	10	10
Е. ГаесаНз	1	10	Ιο⁵
	2	10	ю²
	3	10	10²
	4	10	10
В. сегеиз	1	10	До⁵
	2	10	ю⁴
	3	10	10²
	4	10	ю²
8. аигеиз	1	10	>10⁷
	2	ю	ю⁵
	3	10	ю⁴
	4	10	ю⁴
Υ. еЫегоеоПНса	1 2 3 4	10 10 10 10	>10' >10⁷ ю⁷ 10⁶

МСС: минимальная концентрация при засеве;

МСИ: минимальная обнаруживаемая концентрация.

Исследования были завершены изучением воздействия различных сред культивирования на изменение цвета адсорбирующей подложки, содержащей индикатор. Ввиду больших затрат ресурсов из

- 6 024907 большого количества культур авторы изобретения выбрали два микроорганизма в качестве представителей в каждой группе и три универсальных среды культивирования, которые поддерживают рост всех микроорганизмов, но с разным содержанием белка в качестве различающей характеристики. Выбранными средами были среда Мюллер-Хинтона (М.Н.), агар с солодовым экстрактом (М.Е.А.) и Триптонсоевый агар (Т.8.А.). Время исследования составило один год. В табл. 2 и 3 указаны выбранные микроорганизмы и среды культивирования. Различия в составе сред культивирования отражают различия в концентрациях питательных веществ, и, таким образом, моделируется ситуация в пищевых продуктах, в которых питательные вещества для микроорганизмов отличаются друг от друга.

Таблица 2

Микроорганизмы

Группа	Микроорганизмы	Среда культивирования
Г рамположительная	В. сегеиз, Е. /аесаИз	М.Н., М.Е.А., Т.5.А.
Г рамотрицательные	Р. аеги&пояа, В. с(ю1ега$т$	М.Н., М.Е.А., Т.8.А.
Дрожжи	С сйЫсапз	М.Н., М.Е.А., Т.8.А.
Грибы	Α.βανιχ;, Р. годие/огА	М.Н., М.Е.А., Т.8.А.

Таблица 3

Состав различных использованных для культивирования сред

	Мюллер- Хинтон	Триптон-соевый агар	Декстрозный агар Сабуро	Агар с солодовым экстрактом
	Крахмал 1,5 г	Хлорид натрия 5г	0(+)Глюкоза 40 г	Солодовый экстракт 13 г
	Мясная вытяжка 2 г	Казеиновый пептон 15 г	Хлорамфеникол 50 мг	Декстрин 2,5 г
	Гидролизат казеинового пептона	Соевый пептон 5 г	Смесь пептонов Юг	Пептон желатиновый 5 г
		Агар 15 г	Агар 15 г	Агар 15 г
Конечный рН	7,2	7,3+/- 0,2		5,5+/-0,2

Графики на фиг. 5 показывают количество дней, которые потребовались фильтру достичь окончательной, особенно черной окраски (пурпурной или очень насыщенной фиолетовой) для разных микроорганизмов на разных изученных средах. Согласно наблюдениям, насыщенность цвета зависела от концентрации микроорганизмов.

Исходя из этого исследования, было сделано заключение, что среда, в которой происходил рост микроорганизмов, значительно влияет на изменение цвета. Это изменение происходило быстрее в среде Мюллер-Хинтона с наибольшим содержанием азотистых веществ, за ней идёт Триптон-соевая среда и Среда с солодовым экстрактом, в которых изменения происходили медленнее.

Главное различие между этими средами состоит в содержании азотистых соединений. В случае среды Мюллер-Хинтона мясо и казеин обеспечивают азотистыми соединениями, витаминами, углеродом, серой и аминокислотами. Триптон-соевый агар, ферментный перевар бобов сои, поставляет азот, витамины и соли, в то время как агар с солодовым экстрактом содержит много полисахаридов, а в качестве единственного источника азота имеет пептон и в меньших количествах, чем в других двух средах. Это влияет на интенсивность реакции, протекающей с ванилином, и таким образом меняется цвет, поскольку в тех случаях, когда микроорганизмы растут быстро, из-за того, что они находят большое количество питательных веществ, реакция развивается быстрее, вызывая изменение цвета в индикаторе раньше по времени и интенсивнее, чем за то же время в других случаях.

Авторы изучили механизм протекающей реакции, показав, что микроорганизмы, выделяющие в ходе метаболизма индол, дают положительную реакцию, на основе чего можно предположить, что окрашивающее вещество является результатом химической реакции между индолом и ванилином. Однако микроорганизмы, не выделяющие индол, такие как 8а1тоие11а и Ркеиботоиак 8рр, также дают положительную реакцию с ванилином.

Были проделаны дополнительные анализы с целью продемонстрировать эффективность ванилина для выявления микроорганизмов и было установлено, что изменение окраски не обусловлено изменением рН или наличием СО₂, выделяемого микроорганизмами. Н в процессе метаболизма. В этих исследованиях авторы изобретения выбрали для культивирования среду Мюллер-Хинтон, поскольку во всех случаях она давала самое быстрое изменение окраски.

- 7 024907

Действие СО₂.

Микроорганизмы в процессе роста и дыхания выделяют СО₂. Поскольку это соединение широко распространено и ввиду его летучести, авторы исследовали его воздействие на цвет, развивающийся на наклейках, пропитанных ванилином.

Это достигалось приготовлением чашек с питательной средой и наклейками, пропитанными изучаемым раствором ванилина, но без присутствия микроорганизмов. Инкубация чашек производилась в анаэробных контейнерах и в анаэробных и микроаэрофильных условиях, при использовании пакетов, образующих эту атмосферу.

Чашки в контейнерах не запечатывались герметично, поэтому СО₂ мог проникать в чашки.

Тестирование проводилось с тремя параллельными пробами и показало, что через 50 дней инкубирования при 37°С чашек со средой Мюллер-Хинтон и фильтров с ванилином, изменения цвета на дисках не наблюдалось.

Следовательно, было сделано заключение, что изменение цвета не вызвано присутствием СО2.

Действие рН.

рН среды изменяли на поверхности. В три чашки была добавлена уксусная кислота, а в другие три ΝαΟΗ и наблюдалось, будет ли в отсутствие микроорганизмов происходить воздействие этих кислых или щелочных соединений на индикатор. Спустя три месяца наблюдений оказалось, что изменение цвета не происходит. Прямого контакта фильтров с закисляющими и защелачивающими реагентами не было.

В следующем исследовании кислота и щелочь были добавлены непосредственно на фильтр, на который предварительно был нанесён ванилин. В остальном подготовка чашек была одинаковой для всех проб, без посева микроорганизмов. Здесь также не было изменения цвета.

Дополнительно к этим исследованиям кислота и основание были непосредственно добавлены к смеси ванилина со спиртом, и фильтры, пропитанные этой смесью, были помещены на чашки, как это было во всех предыдущих опытах.

Спустя месяц не наблюдалось изменения цвета ни на одном из фильтров. Было сделано заключение, что изменение цвета индикатора не вызывается изменением рН. Спустя три месяца всё ещё не наблюдалось изменения цвета.

Однако, когда рН среды культивирования по существу менялась через 5 дней, было отмечено изменение цвета образцов, находившихся в газовой фазе со средой при рН 12 и рН 10 (фиг. 6).

Рост микроорганизмов также вызывал изменение в конечном значении рН среды, при основном значении рН около 10.

Анализ соединений, ответственных за изменение цвета.

С помощью хроматографических методов был проведен анализ превращения ванилина и новых соединений, которые появились после реакции.

Для выяснения превращения ванилина использовались методы 8РМЕ (метод твердофазной микроэкстракции) и СС-М8 (метод газохроматографической масс-спектрометрии).

Как можно видеть (фиг. 7), во всех случаях идёт снижение концентрации ванилина. Это снижение было больше в случаях с 8. аигеиз и 8. еЬо1ега8Ш8, тех микроорганизмов, которые вызывают также более быстрое и более интенсивное изменение цвета.

С помощью этих методов авторы не смогли определить наличие новых соединений, ответственных за изменение цвета, т.е. возможно, что получаемое окрашенное соединение не летучее. Однако снижение концентрации ванилина указывает на то, что его реакция с соединением, образующимся при росте микроорганизмов, имеет место, вследствие чего появляется новое окрашенное соединение.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Упаковка для пищевых, фармацевтических или косметических продуктов, служащая для выявления роста бактерий, грибов и дрожжей в указанных пищевых, фармацевтических или косметических продуктах, содержащихся в упаковке, характеризующаяся тем, что она содержит визуально воспринимаемый колориметрический сенсор для выявления микроорганизмов в газовой среде внутри упаковки без прямого контакта сенсора, содержащегося в упаковке, с продуктами, помещенными в упаковку, при этом указанный сенсор выполнен в виде твердой подложки из полярного адсорбента, способного впитывать влагу, с поверхностным слоем, содержащим ванилин, и этот поверхностный слой получен путем пропитки твердой подложки раствором, содержащим по крайней мере 10% ванилина, при этом по крайней мере часть упаковки, возле которой помещен указанный сенсор, является прозрачной.
2. Упаковка по п.1, характеризующаяся тем, что поверхностный слой дополнительно содержит этанол.
3. Упаковка по п.2, характеризующаяся тем, что поверхностный слой получен путем пропитки твердой подложки раствором, который содержит по меньшей мере 10% ванилина в этаноле.
4. Упаковка по п.3, характеризующаяся тем, что поверхностный слой получен путем пропитки твердой подложки раствором, который содержит ванилин в этаноле в концентрации от 10 до 50%.
5. Упаковка по пп.1-4, характеризующаяся тем, что твердая подложка изготовлена из бумаги или

- 8 024907 картона.
6. Упаковка по пп.1-5, характеризующаяся тем, что материал сенсора помещен на крышку упаковки или приклеен к внутренней поверхности упаковки.
7. Применение упаковки по любому из предшествующих пунктов для визуального выявления роста микроорганизмов в пищевых, фармацевтических и косметических продуктах в газовой среде внутри упаковки без прямого контакта сенсора, помещенного с внутренней стороны упаковки, с продуктами, содержащимися в упаковке.