EA023475B1

EA023475B1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pFK4, ENSURING SYNTHESIS OF RECOMBINANT PEPTIDE RL4, WHICH IS ANALOGUE OF HUMAN KAPPA-CASEIN FRAGMENT, RECOMBINANT STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI XL1-BLUE/pFK4 AND RECOMBINANT PEPTIDE RL, ANALOGUE OF HUMAN KAPPA-CASEIN FRAGMENT, WHICH POSSESSES APOPTOTIC ACTIVITY WITH RESPECT TO CANCER CELLS

Info

Publication number: EA023475B1
Application number: EA201201337A
Authority: EA
Inventors: Мирослава Олеговна Потапенко; Анна Валентиновна Савельева; Александр Сергеевич Фомин; Галина Павловна Трошкова; Ольга Александровна Коваль; Елена Владимировна Кулигина; Дмитрий Владимирович Семенов; Владимир Александрович Рихтер
Priority date: 2012-10-08
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2016-06-30
Also published as: EA201201337A1

Abstract

The invention relates to recombinant plasmid DNA, which ensures increased yield of recombinant peptide RL4, containing fragment of human kappa-casein, recombinant strain of Escherichia coli (deposited at CEMTC ICBFM SB RAS under number EMTC 1347), which produces recombinant peptide RL4, analogue of human kappa-casein with increased yield, and recombinant peptide RL4, possessing increased apoptotic activity with respect to tumour cells, which consists of three components: N-terminal polyhistidine sequence MRGSHHHHHHGS, the residue of methionine, introduced into construction for possibility of cleaving polyhistidine sequence, and fragment of human kappa-casein from 49 to 122 a.r. The invention can be applied in biotechnology.

Description

Изобретение относится к рекомбинантной плазмидной ДНК с фрагментами каппа-казеина человека, обеспечивающей синтез рекомбинантного пептида - аналога каппа-казеина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к опухолевым клеткам, рекомбинантному штамму ЕксйейсЫа сой - продуценту пептида - аналога каппа-казенина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к опухолевым клеткам и рекомбинантному пептиду - аналогу каппа-казенина человека, обладающему апоптотической активностью по отношению к опухолевым клеткам, и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генетической и белковой инженерии.The invention relates to recombinant plasmid DNA with fragments of human kappa-casein, which provides the synthesis of a recombinant peptide - an analogue of human kappa-casein, which has apoptotic activity against tumor cells, a recombinant strain of Exeissa soya - a producer of a peptide - an analogue of kappa-caseinopen human, in relation to tumor cells and a recombinant peptide - an analog of human kappa-casenin with apoptotic activity in relation to tumors m cells, and it can be used in biotechnology, particularly in genetic and protein engineering.

Одним из возможных перспективных подходов для эффективного лечения опухолей могут стать препараты, способные избирательно вызывать апоптоз в раковых клетках, не повреждая здоровые клетки организма.One of the possible promising approaches for the effective treatment of tumors can be drugs that can selectively cause apoptosis in cancer cells without damaging healthy cells in the body.

Известно, что молоко человека содержит белки и пептиды, вызывающие апоптотическую гибель клеток аденокарциномы молочной железы МСР-7 [1]. Один из таких проапоптотических пептидов был выделен из молока, имеет молекулярную массу 8.6 кДа, содержит установленную последовательность из 74 аминокислотных остатков, в которую входит протеолитический фрагмент каппа-казеина с 63 по 123 аминокислотный остаток, и получил название лактаптин (патент КИ 2317304 С1. 2008) [2]. Данный пептид (лактаптин) индуцирует гибель клеток МСР-7 при минимальной концентрации 10 мкг/мл. При этом прекращается пролиферация клеточной культуры и в течение 12 ч погибает около 10% клеток. Повышение концентрации пептида в среде до 100 мкг/мл приводит к гибели 50-70% клеток аденокарциномы молочной железы МСР-7 в течение 12 ч.It is known that human milk contains proteins and peptides that cause apoptotic death of MCP-7 mammary adenocarcinoma cells [1]. One of these proapoptotic peptides was isolated from milk, has a molecular weight of 8.6 kDa, contains an established sequence of 74 amino acid residues, which includes a proteolytic fragment of kappa-casein from 63 to 123 amino acid residues, and is called lactaptine (patent KI 2317304 C1. 2008 ) [2]. This peptide (lactaptin) induces the death of MCP-7 cells at a minimum concentration of 10 μg / ml. At the same time, cell culture proliferation ceases and about 12% of the cells die within 12 hours. An increase in the concentration of the peptide in the medium to 100 μg / ml leads to the death of 50-70% of MCP-7 breast adenocarcinoma cells within 12 hours.

Однако, доступность природного пептида является низкой, а стоимость получения очень высокой.However, the availability of the natural peptide is low and the cost of production is very high.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является рекомбинантный аналог (лактаптин КР2) природного пептида, сконструированный и рассчитанный на основании результатов ΜΑΡΌΙ-ΤΟΡ массспектрометрии, касающихся наиболее вероятной первичной структуры природного пептида (патент КИ 2401307 С1. 2010) [3].The closest analogue (prototype) is a recombinant analogue (lactaptin KP2) of a natural peptide, designed and calculated based on the results of ΤΟΡ-ΤΟΡ mass spectrometry regarding the most probable primary structure of a natural peptide (KI patent 2401307 C1. 2010) [3].

Наиболее близкими аналогами (прототипами) являются также рекомбинантная плазмидная ДНК рРК2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппаказеина человека, в клетках ЕксйейсЫа сой, с молекулярной массой 2,1 МДа и размером 3164 п.о., содержащая плазмидный вектор ρΟδΌΙ, гидролизованный по 8ай и В§1й сайтам и содержащий сайт инициации репликации плазмиды рВК322, промотор фага Т7 и уникальные сайты рестрикции ЕсоК I (1595), Β§1 II (1613), 8а1 I (1985), Ρκΐ I (1995), Ηίηά III (2000), С1а I (2053); В§1 й-8а1 I фрагмент размером 372 п.о., включающий стартовый кодон, сегмент, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток и олигопептид с последовательностью ΟΟδΗΗΗΗΗΗ, и стоп-кодон; генетические маркеры: АМРг - ген ампициллин резистентности (ген бетта-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации ЕксйейсЫа сой, а также рекомбинантный штамм ЕксйейсЫа сой ХЬ1В1ие/рРК2 - продуцент рекомбинантного пептида, аналога фрагмента каппа-казеина человека (лактаптин КР2) [3]. Первичная структура КР2 соответствует структуре фрагмента каппа-казеина человека (с 23 по 134 аминокислотный остаток) с шестью дополнительными остатками гистидина на С-конце. Рекомбинантный аналог лактаптина КЬ2 также индуцирует апоптоз клеток МСР-7. КР2 индуцирует диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий клеток МСР-7 и приводит к активации инициаторных каспаз 8, 9 и эффекторной каспазы 7 [4]. Активация каскада каспаз в конечном итоге приводит к протеолитическому расщепления различных клеточных белков и вызывает широкий спектр морфологических изменений, характерных для клеток, подвергающихся апоптозу. Выход белка после его очистки аффинной хроматографией на Νί-ΝΤΑ агарозе составляет 150 мкг из 500 мл культуры клеток ЕксйейсЫа сой.The closest analogs (prototypes) are also recombinant plasmid DNA pRK2, which provides the synthesis of a recombinant peptide, which is an analogue of the human kappa casein fragment, in Exeissaia cells, with a molecular weight of 2.1 MDa and a size of 3164 bp, containing the plasmid vector ρΟδΌΙ, hydrolyzed at the 8th and Bg1th sites and containing the replication initiation site of plasmid pBK322, the T7 phage promoter and unique restriction sites EcoK I (1595), ,§1 II (1613), 8a1 I (1985), Ρκΐ I (1995), Ηίηά III (2000), C1a I (2053); B§1 st-8a1 I fragment of 372 bp, including a start codon, a segment encoding a fragment of human kappa-casein from 24 to 134 amino acid residues and an oligopeptide with the sequence ΟΟδΗΗΗΗΗΗ, and a stop codon; genetic markers: AMPg is the ampicillin resistance gene (beta-lactamase gene), which determines ampicillin resistance during the transformation of Exeisensois, as well as the recombinant Exeisoia Xb1B1ie / pRK2 strain, which produces the recombinant peptide, an analogue of the human kappa-3 kappa 3 kappa-casein fragment (kappa-casein) ]. The primary structure of KP2 corresponds to the structure of a fragment of human kappa-casein (from 23 to 134 amino acid residues) with six additional histidine residues at the C-terminus. The recombinant analogue of lactaptin K2 also induces apoptosis of MCP-7 cells. KP2 induces the dissipation of the transmembrane potential of the mitochondria of MCP-7 cells and leads to the activation of initiator caspases 8, 9 and effector caspase 7 [4]. Activation of the caspase cascade ultimately leads to proteolytic cleavage of various cellular proteins and causes a wide range of morphological changes characteristic of cells undergoing apoptosis. The protein yield after purification by affinity chromatography on S-agarose is 150 μg out of 500 ml of Exjuice Soya cell culture.

Недостатком прототипов является невысокий уровень синтеза рекомбинантного аналога (лактаптина КР2) природного пептида и его недостаточная апоптическая активность в отношении раковых клеток. Одностадийная хроматографическая очистка приводит к снижению качества пептида и ограничивает возможность его использования для промышленного производства субстанции медицинского назначения. Техническим результатом заявляемого изобретения является создание плазмиды, обеспечивающей увеличение синтеза рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека, и создание более продуктивного (с более высоким выходом целевого пептида) бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный пептид - аналог каппа-казеина человека, обладающего более высокой апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.The disadvantage of prototypes is the low level of synthesis of the recombinant analogue (lactaptin KP2) of the natural peptide and its lack of apoptotic activity against cancer cells. One-step chromatographic purification leads to a decrease in the quality of the peptide and limits the possibility of its use for the industrial production of medical substances. The technical result of the claimed invention is the creation of a plasmid that provides an increase in the synthesis of a recombinant peptide that is an analogue of a fragment of human kappa-casein, and the creation of a more productive (with a higher yield of the target peptide) bacterial producer strain, which allows to obtain a recombinant peptide - an analogue of human kappa-casein, with higher apoptotic activity against cancer cells.

Указанный технический результат достигается получением рекомбинантной плазмидной ДНК рРК4, обеспечивающей синтез рекомбинантного пептида КР4, являющегося аналогом фрагмента каппаказеина человека, с молекулярной массой 2,41 МДа и размером 3653 п.о., содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, следующие элементы:The indicated technical result is achieved by the production of recombinant plasmid DNA rPK4, which provides the synthesis of the recombinant peptide KP4, which is an analogue of a fragment of human kappa casein, with a molecular weight of 2.41 MDa and a size of 3653 bp, containing in accordance with the physical and genetic map shown in FIG. 2, the following items:

Ват ΗΡΗίηά III - фрагмент плазмидной ДНК рРК4 размером 264 п.о., имеющий нуклеотидную последовательность и кодируемую ею аминокислотную последовательность, представленные на фиг. 1 а, и состоящий из трех компонентов, кодирующих последовательность: пептида с аминокислотной последовательностью ΜКΟδΗΗΗΗΗΗΟδ, остатка метионина, введенного в конструкцию для возможности отщепления полигистидиновой последовательности и фрагмента каппа-казеина с 49 по 122 аминокислотный остаток;Wat ΗΡΗίηά III is a 264 bp fragment of rRK4 plasmid DNA having the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by it, shown in FIG. 1a, and consisting of three components encoding a sequence: a peptide with the ΜКΟδΜδ amino acid sequence, a methionine residue introduced into the construct to allow cleavage of the polyhistidine sequence and a kappa-casein fragment from 49 to 122 amino acid residues;

- 1 023475 фрагмент плазмидного вектора рЦЕ30, обеспечивающий эффективную экспрессию фрагмента каппа-казеина человека и содержащий:- 1 023475 fragment of the plasmid vector pCE30, providing efficient expression of a fragment of human kappa-casein and containing:

а) сайт инициации репликации плазмиды рВР322;a) the site of initiation of replication of plasmid pBP322;

б) промотор бактериофага Т5;b) the promoter of the bacteriophage T5;

в) генетические маркеры: АМРг - ген ампициллин резистентности (ген β-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации ЕзсйепсЫа сой;c) genetic markers: AMRg — the ampicillin resistance gene (β-lactamase gene), which determines ampicillin resistance during transformation of Exeptidae;

г) уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Ауа I (2), Есо Р (89), Ват ΗΙ (146), Ηίηά III (380), Ысо I (1053), Ара Ы (1585), Ара Ы (2083), Ара и (3329).d) unique recognition sites by restriction endonucleases having the following coordinates: Aua I (2), Eco P (89), Wat ΗΙ (146), Ηίηά III (380), Iso I (1053), Ara Ы (1585), Ara Ы (2083), Ara and (3329).

Указанный технический результат достигается также получением рекомбинантного штамма бактерий ЕзсйепсЫа сой ХЬ1-В1ие/рРК4, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК рРК4 по п.1 формулы и депонированного в Межинститутском Центре коллективного пользования СО РАН Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур (КЭМТК) ИХБФМ СО РАН под номером № ЭМТК 1347 (справка о депонировании прилагается), - продуцента пептида РЬ4 - аналога фрагмента каппа-казеина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.The indicated technical result is also achieved by the production of a recombinant strain of bacteria Ezseepsysoi Xb1-B1ie / rPK4 containing recombinant plasmid DNA rRK4 according to claim 1 and deposited at the Interinstitutional Center for Collective Use of the SB RAS Collection of Extremophilic Microorganisms and Typical Cultures (KEMTK) SB RAS number No. EMTK 1347 (a statement of the deposit is attached), the producer of the peptide Pb4, an analogue of a fragment of human kappa-casein with apoptotic activity against cancer cells.

Указанный технический результат достигается также получением рекомбинантного пептида РЬ4 аналога фрагмента каппа-казеина человека, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: I, представленную на фиг. 16, состоящего из остатка метионина, фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 аминокислотный остаток и Νконцевой гистидиновой последовательности, имеющего молекулярную массу 10,2 кДа и обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.The indicated technical result is also achieved by the preparation of a recombinant peptide P4 analogue of a fragment of human kappa-casein, including the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of 8EC GO N0: I shown in FIG. 16, consisting of a methionine residue, a fragment of human kappa-casein from 49 to 122 amino acid residues, and a terminal histidine sequence having a molecular weight of 10.2 kDa and having apoptotic activity against cancer cells.

Трансформация полученной плазмидой клеток ЕзсйепсЫа сой обеспечивает синтез рекомбинантного пептида, аналога фрагмента каппа-казеина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам, с выходом белка не менее 6,8 мг на 1 л культуры клеток ЕзсйепсЫа сой (не менее 20% от суммарного содержания белка клеток).Transformation of the Excepsoi cells obtained by the plasmid provides the synthesis of a recombinant peptide, an analogue of a fragment of human kappa-casein, which has apoptotic activity against cancer cells, with a protein yield of at least 6.8 mg per 1 liter of Expexsoi cell culture (at least 20% of the total cell protein content).

Сведения, поясняющие сущность изобретенияInformation explaining the invention

Генно-инженерными методами получают плазмиду рРК4, несущую ген, кодирующий рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, созданный на основе последовательности ДНК, кодирующей фрагмент каппа-казеина человека с 49 по 122 (РЬ4) аминокислотный остаток и гистидиновый олигопептид.Genetically engineered to obtain the plasmid pKK4 carrying the gene encoding the recombinant peptide, an analogue of the human kappa-casein fragment, based on the DNA sequence encoding the human kappa-casein fragment from 49 to 122 (Pb4) amino acid residue and histidine oligopeptide.

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды рРК4 являются:The starting genetic material for the construction of the recombinant plasmids pRK4 are:

а) плазмидный вектор рЦЕ30 [5], обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, его экспрессию под контролем раннего промотора Т5 ДНК-полимеразы;a) plasmid vector pCE30 [5], which ensures the insertion of a DNA fragment encoding a fragment of human kappa-casein, its expression under the control of the early T5 promoter of DNA polymerase;

б) фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент каппа-казеина с 49 по 122 аминокислотный остаток, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матрицы рекомбинантной плазмидной ДНК рОГОВЕКА содержащий фрагмент каппа-казеина человека РК2 большей длины, и олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих наличие в амплификационном фрагменте сайтов рестрикции Ват Ш и Ηίηά IIIb) a DNA fragment encoding a fragment of kappa-casein with a 49 to 122 amino acid residue, which is obtained in the polymerase chain reaction using a ROGOVEK recombinant plasmid DNA as a template containing a longer length human kappa-casein fragment PK2, and oligonucleotide primers that ensure the presence of amplification fragment of the restriction sites Wat Sh and Ηίηά III

5’ТАТАООАТССАТСТАТТАТСТСССАААТ (серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ват Ш, подчеркиванием выделен кодон, кодирующий метионин, введенный в конструкцию после нуклеотидной последовательности, кодирующей шесть остатков гистидина); и5’TATAAOOATSSATSTATTATSTSSSSAAAT (the site of restriction endonuclease Wat III is grayed out, the codon encoding methionine introduced into the construct after the nucleotide sequence encoding six histidine residues is underlined); and

(серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ηίηά III, подчеркиванием выделен введенный терминирующий кодон).(the site of the restriction endonuclease Ηίηά III is highlighted in gray, the introduced termination codon is underlined).

Клетки Е.сой ВЬ21(НЕ3), несущие ген РНК-полимеразы фага Т5 под индуцибельным 1асИУ5 промотором, трансформируют сконструированной плазмидой рРК4 и выращивают в течение ночи. Ночную культуру (1/100) засевают в свежую среду ΥΤχ2 с ампициллином (100 мкг/мл). Синтез РНК-полимеразы индуцируют добавлением изопропилтиогалактазида до концентрации 0,3 мМ в тот момент, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста. Индуцированные клетки растят 18 ч при температуре 30°С, после чего собирают центрифугированием при 5000д. Индуцированные клетки Е.сой ВЬ21(НЕ2)/рРК4 используют для очистки рекомбинантного фрагмента каппа-казеина человека с помощью аффинной хроматографии. В результате получают рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, имеющий молекулярную массу около 10 кДа, состоящий из Ν-концевой гистидиновой последовательности, остатка метионина и фрагмента каппа-казеина человека (с 49 по 122 аминокислотный остаток -РЬ4). Полученный пептид, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 2 для фрагмента № 4 (фиг. 1), обладает апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека.The E. coli B21 (HE3) cells carrying the T5 phage RNA polymerase gene under the inducible 1acIU5 promoter are transformed with the constructed plasmid pRK4 and grown overnight. An overnight culture (1/100) is seeded in fresh medium ΥΤχ2 with ampicillin (100 μg / ml). The synthesis of RNA polymerase is induced by the addition of isopropylthiogalactazide to a concentration of 0.3 mM at the moment when the culture reaches the medium logarithmic phase of growth. Induced cells grow 18 hours at a temperature of 30 ° C, after which they are collected by centrifugation at 5000 d. Induced E. coli B21 (HE2) / pKK4 cells are used to purify the recombinant fragment of human kappa-casein using affinity chromatography. The result is a recombinant peptide, an analogue of a human kappa-casein fragment, having a molecular weight of about 10 kDa, consisting of a β-terminal histidine sequence, a methionine residue and a human kappa-casein fragment (from 49 to 122 amino acid residue -PB4). The resulting peptide, including the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of 8EC EC GO N0: 2 for fragment No. 4 (Fig. 1), has apoptotic activity against human cancer cells.

Полученный штамм Е.сой ХР1-В1ие/рРК4 не является зоопатогенным и фитопатогенным, депонирован в Межинститутском Центре коллективного пользования СО РАН Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур (КЭМТК) ИХБФМ СО РАН и характеризуется следующими при- 2 023475 знаками:The obtained E. coli strain XP1-B1ie / rRK4 is not zoopathogenic and phytopathogenic; it was deposited at the Interinstitutional Center for Collective Use of the SB RAS. The collection of extremophilic microorganisms and typical cultures (KEMTK) of the Institute of Chemical Physics and Chemistry is characterized by the following characters: 2023475

Культурально-морфологические признаки: клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Ийко - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или ЬВ бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5.Cultural and morphological signs: small, thickened, rod-shaped cells, gram-negative, non-spore-bearing. Cells grow well on simple nutrient media. When growing on Iiko agar, the colonies are round, smooth, pressed, muddy, shiny, gray, the edge is even. When growing on liquid media (on a minimal medium with glucose or LB broth) they form an intense smooth haze. Cells grow at a temperature of 37 ° C with an optimum pH of 6.8 to 7.5.

Продукт, синтезируемый штаммом: рекомбинантный пептид, являющийся аналогом фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 аминокислотный остаток с Ν-концевой гистидиновой последовательностью и обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.The product synthesized by the strain: a recombinant peptide that is an analogue of a fragment of human kappa-casein from 49 to 122 amino acid residue with a Ν-terminal histidine sequence and having apoptotic activity against cancer cells.

Активность (продуктивность) штамма: при культивировании в бульоне Лурия при 30°С после индукции 0,3 мМ ИПТГ уровень продукции целевого белка через 18 ч составляет 28 мг из 1 л суспензионной культуры клеток Е.сой ВЬ21(ИЕ3)/рРК4, проведено более 20 пассажей.The activity (productivity) of the strain: when cultured in Luria broth at 30 ° C after induction with 0.3 mM IPTG, the level of production of the target protein after 18 h is 28 mg from 1 l of cell suspension culture E.soi B21 (IE3) / rPK4, more than 20 passages.

Способ определения активности штамма: активность штамма определяется по апоптотической активности очищенного рекомбинантного пептида, аналога фрагмента каппа-казеина человека, по отношению к раковым клеткам, например клеткам аденокарциномы молочной железы человека линии МСР-7.Method for determining strain activity: strain activity is determined by the apoptotic activity of the purified recombinant peptide, an analogue of a human kappa-casein fragment, in relation to cancer cells, for example, MCP-7 human breast adenocarcinoma cells.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: лиофилизация, низкотемпературное замораживание в бульоне Лурия, содержащем 25% глицерина.Method, conditions and composition of media for long-term storage of strain: lyophilization, low-temperature freezing in Luria broth containing 25% glycerol.

Способ, условия и состав сред для размножения: культивировать при 37°С на агаре Лурия с ампициллином (100 мкг/мл) или в бульоне Лурия с ампициллином (100 мкг/мл).Method, conditions and composition of the media for propagation: cultured at 37 ° C on Luria agar with ampicillin (100 μg / ml) or in Luria broth with ampicillin (100 μg / ml).

Условия и состав среды для ферментации: бульон Лурия с ампициллином (100 мкг/мл), индукция ИПТГ (0,3 мМ).The conditions and composition of the fermentation medium: Luria broth with ampicillin (100 μg / ml), IPTG induction (0.3 mmol).

Генетические особенности штамма: клетки проявляют устойчивость к ампициллину (100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды.Genetic features of the strain: cells show resistance to ampicillin (100 μg / ml), due to the presence of the plasmid.

Рекомендуемые условия хранения: при 4°С на минимальном агаре с ампициллином (100 мкг/мл).Recommended storage conditions: at 4 ° C on minimal agar with ampicillin (100 μg / ml).

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:The invention is illustrated by the following graphic materials:

На фиг. 1а приведена нуклеотидная последовательность, а на фиг. 1б - кодируемая ею аминокислотная последовательность Ват ΗΙ/Ηίηά ΙΙΙ-фрагмента плазмиды рРК4, кодирующая фрагмент каппаказеина человека с 49 по 122 аминокислотный остаток с Ν-концевой гистидиновой последовательностью. На фиг. 2 представлена физическая и генетическая карта плазмиды рРК4. РК4 ген, кодирующий рекомбинантный аналог каппа-казеина человека, КВ8 - сайт посадки рибосом, Т5 - промотор фага Т5, АМРгген устойчивости к ампициллину; указаны некоторые сайты рестрикции. На фиг. 3 приведена электрофореграмма в 12% 8И8-ПААГ белков фракций, полученных последовательным выделением аналога лактаптина КЬ4 аффинной хроматографией на Νί-ΝΤΑ сефарозе и ионообменной хроматографией на 8Рсефарозе и МасгоРгер ИЕАЕ.In FIG. 1a shows the nucleotide sequence, and FIG. 1b is the amino acid sequence of the Bat ΗΙ / Ηίηά ΙΙΙ fragment of plasmid pRK4 encoded by it, encoding a fragment of human kappa casein from 49 to 122 amino acid residue with the Ν-terminal histidine sequence. In FIG. 2 shows the physical and genetic map of the plasmid pRK4. PK4 gene encoding a recombinant analogue of human kappa-casein, KB8 is the site of ribosome landing, T5 is a promoter of the phage T5, AMPg is ampicillin resistance gene; some restriction sites are indicated. In FIG. Figure 3 shows the electrophoregram in 12% of 8I8-PAG of fraction proteins obtained by sequential isolation of the Lactaptin analog K4 by affinity chromatography on S-Sepharose and ion exchange chromatography on 8Psepharose and MasgoReger IEEA.

Дорожки: 1 - белковые-маркеры, молекулярная масса в кДа приведена слева, 2 - рекомбинантный аналог лактаптина КТ2 (17 кДа), 3 -белки супернатанта лизата клеток-продуцентов Е.сой, трансформированных плазмидой рРК4 и культивированных с индукцией ИПТГ, 4 - белки, не взаимодействующие с Νί-ΝΤΑ сефарозой, 5 - белки, элюируемые 50 мМ имидазола, 6 - белки, элюируемые 200 мМ имидазола, 7 - белки, элюируемые 6М гуанидин-НС1 с 0.1М ЭДТА, 8 - белки, не взаимодействующие с 8Р-сефарозой (дорожка 7), 9 - белки фракции, содержащей КЬ4, элюируемые с 8Р-сефарозы в градиенте мочевины и №С1, 10 - белки фракции, содержащей КЬ4 (дорожка 9), элюируемые при нанесении на сорбент МасгоРгер ИЕАЕ, 11 - белки, элюируемые в градиенте мочевины и №С1 с МасгоРгер ИЕАЕ. Ниже приведены конкретные примеры выполнения изобретения.Lanes: 1 - protein markers, molecular weight in kDa is shown on the left, 2 - recombinant analogue of lactaptin KT2 (17 kDa), 3 -proteins of the supernatant of the lysate of E. soy producer cells transformed with pRK4 plasmid and cultured with IPTG induction, 4 - proteins not interacting with Νί-ΝΤΑ Sepharose, 5 - proteins eluted with 50 mM imidazole, 6 - proteins eluted with 200 mM imidazole, 7 - proteins eluted with 6M guanidine-HC1 with 0.1 M EDTA, 8 - proteins that do not interact with 8P- Sepharose (lane 7), 9 — proteins of the fraction containing K4, eluted from 8P-Sepharose in a urea gradient, and Nos. C1, 10 — proteins of the fraction containing Kb4 (lane 9) eluted when applied to the MasgoRger IEEAE sorbent, 11 — proteins eluted in the urea gradient and No. C1 with MasgoRger IEEA. The following are specific examples of carrying out the invention.

Пример 1. Технология конструирования плазмиды рРК4.Example 1. The technology of constructing plasmids pRK4.

На основе результатов секвенирования Ν-конца лактаптина, выделенного из женского молока, была выбрана аминокислотная последовательность каппа-казеина, которая с наибольшей вероятностью соответствует последовательности природного лактаптинаBased on the results of sequencing the конца-terminus of lactaptin isolated from human milk, the amino acid sequence of kappa-casein was selected, which is most likely to correspond to the sequence of natural lactaptine

ΥΥνΡΧίίνΊ'νΥΟΤΝΓΥΟΗΚΡΑΙΑΙΝΝΡννΡΠ-η,ΎΛΧΡΛνΛΚΡΗ.ΛΟΙΡΟ ΚΟΥΓΡΝ3ΙΙΡΡΤΥνΚΚΡΝ1.ΗΡ8ΓΙ А1РР (фрагмент № 4).ΥΥνΡΧίίνΊ'νΥΟΤΝΓΥΟΗΚΡΑΙΑΙΝΝΡννΡΠ-η, ΎΛΧΡΛνΛΚΡΗ.ΛΟΙΡΟ ΚΟΥΓΡΝ3ΙΙΡΡΤΥνΚΚΡΝ1.ΗΡ8ΓΙ A1РР (fragment No. 4).

В качестве источника гена, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, использовали плазмидную ДНК рРК2, использованную для получения рекомбинантного аналога КТ2 и содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующие фрагменты ДНК каппа-казеина № 4. Амплификацию гена, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, проводили методом ПЦР с использованием Тас| ДНКполимеразы (ЗАО Биосан, ИХБФМ СО РАН), которая позволяет синтезировать продукты с частотой мутаций около 1х10^-4 ошибок/нуклеотид. Для синтеза фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент каппаказеина человека, в реакционную смесь добавляли праймерыThe gene encoding the human kappa-casein fragment was used plasmid DNA pRK2 used to obtain the recombinant CT2 analogue and containing the nucleotide sequence encoding DNA fragments of kappa-casein No. 4. Amplification of the gene encoding the human kappa-casein fragment was performed by PCR using tas | DNA polymerase (ZAO Biosan, Institute of Bioorganic Chemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences), which allows synthesizing products with a mutation frequency of about 1x10 ^-4 errors / nucleotide. Primers were added to the reaction mixture to synthesize a DNA fragment encoding a human kappa casein fragment.

(серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ват ΗΙ, подчеркиванием выделен кодон, кодирующий метионин, введенный в конструкцию после нуклеотидной последовательности, кодирующей шесть остатков гистидина) и(the site of Wat ΗΙ restriction endonuclease is highlighted in gray, the codon encoding methionine introduced into the construct after the nucleotide sequence encoding six histidine residues is underlined) and

- 3 023475 (серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ηίηά III, курсивом выделен введенный терминирующий кодон), соответствующих 5'- и 3'-концу ДНК, кодирующей фрагмент каппа-казеина с 49 по 122 аминокислотный остаток, и обеспечивающих в амплификационном фрагменте наличие сайтов рестрикции Ват ΗΙ и Ηίηά III.- 3,023,475 (the эндηά III restriction endonuclease site is highlighted in gray, the termination codon introduced is shown in italics), corresponding to the 5'- and 3'-end of the DNA encoding a kappa-casein fragment with 49 to 122 amino acid residues, and providing sites in the amplification fragment restriction of Wat ΗΙ and Ηίηά III.

Реакцию проводили с использованием технологии горячего старта в амплификаторе Ма81егсуе1ег βίτιάίοηΐ (ЕррегкогГ. США). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 мин при 95°С; 30 циклов - 15 с при 95°С, 30 с при 58°С, 20 с при 72°С; заключительная стадия - 5 мин при 72°С.The reaction was carried out using the hot start technology in a Ma81egsue1eg βίτιάίοηΐ thermocycler (Erregogogg. USA). Conditions for PCR: preliminary denaturation - 5 min at 95 ° C; 30 cycles - 15 s at 95 ° C, 30 s at 58 ° C, 20 s at 72 ° C; final stage - 5 min at 72 ° C.

Продукты амплификации, кодирующие фрагмент каппа-казеина человека, расщепляли рестриктазами Ват Ш и Ηίηά III в реакционной смеси, содержащей рестрикционный буфер ТапдоТМ, 10 ед. активности Ват Ш и 20 ед. активности Ηίηά III. Аналогично проводили обработку рестриктазами ДНК векторной плазмиды рЦЕ30. Реакцию вели 3 ч при 37°С. После этого ПЦР-фрагмент и линеаризованный вектор очищали электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью набора СеηЕ1иΐе Се1 ΕχΙπ-ιαΙίοη Κίΐ (§1§та, США) в соответствии с рекомендациями производителя.Amplification products encoding a fragment of human kappa-casein were digested with restriction enzymes Wat III and Ηίηά III in a reaction mixture containing TapdoTM restriction buffer, 10 units. activity of Wat Sh and 20 units. Ηίηά III activity. The restriction enzymes were treated with DNA of the vector plasmid pCE30. The reaction was carried out for 3 hours at 37 ° C. After that, the PCR fragment and the linearized vector were purified by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, followed by DNA isolation using the CeηE1 and Ce1 ΕχΙπ-ιαΙίοη набора kit (§1§, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations.

Лигирование фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, и векторной ДНК проводили в стандартных условиях [6].Ligation of a DNA fragment encoding a fragment of human kappa-casein and vector DNA was performed under standard conditions [6].

Пример 2. Получение штамма-продуцента фрагментов каппа-казеина человека - продуктов плазмиды рРК4.Example 2. Obtaining a producer strain of fragments of human kappa-casein - products of plasmid pRK4.

Клетки Е.соП ХЬ1-В1ие трансформировали сконструированной плазмидой рРК4, имеющей фаговый промотор Т5 под контролем двух последовательностей 1ас оператора, который узнается РНК полимеразой Е.сой. Трансформированные клетки Е.соП выращивали в течение ночи. Ночную культуру (1/100) засевали в свежую среду ΥΤχ2 с ампициллином (100 мкг/мл). Экспрессию целевого белка индуцировали добавлением изопропилтиогалактазида до концентрации 0,3 мМ в тот момент, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста. Индуцированные клетки растили 18 ч при температуре 30°С, после чего собирали центрифугированием при 5000д и анализировали методом электрофореза по Лэммли [7] в 12%-ном 8И8-полиакриламидном геле (ПААГ).E.coP X1-B1ie cells were transformed with the constructed plasmid pRK4 having the T5 phage promoter under the control of two sequences of the 1ac operator, which is recognized by E. coi RNA polymerase. Transformed E. col cells were grown overnight. An overnight culture (1/100) was seeded into fresh ΥΤχ2 medium with ampicillin (100 μg / ml). The expression of the target protein was induced by the addition of isopropylthiogalactazide to a concentration of 0.3 mM at the moment when the culture reaches the medium logarithmic growth phase. Induced cells were grown for 18 h at a temperature of 30 ° С, after which they were collected by centrifugation at 5000 d and analyzed by Laemmli electrophoresis [7] in a 12% 8I8-polyacrylamide gel (PAAG).

Результаты этого анализа (электрофорез и иммуноблот в 12% 8И8-ПААГ лизатов клеток Е.соП ХЕ1-В1ие, трансформированных плазмидой рРК4 в присутствие индуктора ИПТГ и без него), показали наличие в индуцированной культуре клеток Е.сой ХЕ1-В1ие/рРК4 дополнительного белка с молекулярной массой около 10 кДа, который отсутствовал в контрольных лизатах клеток Е.сой ХЬ1-В1ие/рРК4.The results of this analysis (electrophoresis and immunoblot in 12% 8I8-PAGE of E.coP XE1-B1ie cell lysates transformed with pRK4 plasmid in the presence and absence of an IPTG inducer) showed the presence of an additional protein in the E. coli XE1-B1ie / pPK4 induced cell culture with a molecular weight of about 10 kDa, which was absent in the control lysates of E. coli Xb1-B1ie / pPK4 cells.

Пример 3. Технология очистки рекомбинантного пептида КЕ4 - аналога фрагмента каппа-казеина человека из клеток Е.сой ХЬ1-В1ие/рРК4.Example 3. The technology of purification of the recombinant peptide KE4 - an analogue of a fragment of human kappa-casein from E. coli Xb1-B1ie / pPK4 cells.

Индуцированные клетки Е.сой ХЬ1-В1ие/рРК4 использовали для очистки рекомбинантных фрагментов каппа-казеина человека с помощью аффинной хроматографии на Νί-ΝΤΑ сефарозе (Вю^-к США), согласно инструкции производителя.Induced E. coli Xb1-B1ie / pPK4 cells were used to purify recombinant fragments of human kappa-casein by affinity chromatography on Νί-ΝΤΑ Sepharose (Vu ^ -c United States), according to the manufacturer's instructions.

Для этого клетки Е.сой осаждали из культуральной среды центрифугированием при 5000д 30 мин при температуре 4°С. Биомассу суспендировали в 5 объемах лизирующего буфера (50 мМ ^-фосфатный буфер рΗ 9.0, 300 мМ №С1, 10 мМ имидазол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 10 мМ 2меркаптоэтанол, 4М мочевина). Клетки лизировали ультразвуком с использованием дезинтегратора УЗДН-1 У4.2, с генератором 22 кГц (5 подходов по 30 с, 200-300 А, с охлаждением во льду в перерывах между подходами). Лизат центрифугировали 30 мин при 10000д при 4°С.For this, E. soy cells were precipitated from the culture medium by centrifugation at 5000 d for 30 min at a temperature of 4 ° C. The biomass was suspended in 5 volumes of lysis buffer (50 mM S-phosphate buffer pΗ 9.0, 300 mM No. C1, 10 mM imidazole, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mM 2 mercaptoethanol, 4M urea). Cells were lysed by ultrasound using a UZDN-1 U4.2 disintegrator, with a 22 kHz generator (5 sets of 30 s, 200-300 A, with ice cooling in between sets). The lysate was centrifuged for 30 min at 10,000 d at 4 ° C.

Супернатант наносили на хроматографическую колонку, упакованную 10 мл Νί-ΝΤΑ сефарозы (Ргойш1у [МАС Вю^-к США) и уравновешенную лизирующим буфером, со скоростью 1 мл/мин. Не связавшиеся с сорбентом белки элюировали лизирующим буфером. Для удаления неспецифически сорбирующихся белков Е.сой проводили предварительную элюцию лизирующим буфером, содержащим 50 мМ имидазола. Аналог лактаптина элюировали лизирующим буфером, содержащим 200 мМ имидазола, а затем проводили дополнительную элюцию в денатурирующих условиях буфером, содержащим 6М гуанидина гидрохлорида и 0,1М ЭДТА. Полученные белковые фракции диализовали против воды (две смены по 18 ч при 5°С) и анализировали 8И8 электрофорезом в ПААГ по Лэммли [7] в восстанавливающих условиях. Пример такой очистки приведен на фиг. 4. Фракции, содержащие рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, концентрировали ионообменной хроматографией на 8Рсефарозе.The supernatant was applied to a chromatographic column packed with 10 ml of Νί-ΝΤΑ Sepharose (Rhoish1u [MAS Vu ^ -c United States) and equilibrated with lysis buffer at a rate of 1 ml / min. Proteins not bound to the sorbent were eluted with lysis buffer. To remove nonspecifically sorbed proteins, E. soi was preliminarily eluted with a lysis buffer containing 50 mM imidazole. The lactaptin analogue was eluted with a lysis buffer containing 200 mM imidazole, and then elution was carried out under denaturing conditions with a buffer containing 6 M guanidine hydrochloride and 0.1 M EDTA. The obtained protein fractions were dialyzed against water (two shifts of 18 h at 5 ° С) and analyzed by 8I8 electrophoresis in PAGE according to Laemmli [7] under reducing conditions. An example of such cleaning is shown in FIG. 4. Fractions containing a recombinant peptide, an analogue of a fragment of human kappa-casein, were concentrated by ion exchange chromatography on 8 Psepharose.

Определение концентрации белка в препарате рекомбинантного аналога лактаптина проводили по методу Брэдфорд [8, 9]. Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (8егуа, США).The protein concentration in the preparation of the recombinant lactaptin analog was determined by the Bradford method [8, 9]. To build a calibration curve, bovine serum albumin was used (8egua, USA).

Определение концентрации белка показывает, что общий выход составляет 10,3 мг рекомбинантного аналога КЬ4 из 1,5 л культуры клеток ЕксйейсЫа сой.Determination of protein concentration shows that the total yield is 10.3 mg of the recombinant analogue of K4 from 1.5 l of the culture of the cells of Exxialis soya.

Пример 4. Исследование апоптотической активности рекомбинантного пептида КЕ4 - аналога фрагмента каппа-казеина человека по отношению к раковым клеткам.Example 4. The study of the apoptotic activity of the recombinant peptide KE4 - an analogue of a fragment of human kappa-casein in relation to cancer cells.

Для оценки апоптотической активности рекомбинантного пептида -аналога фрагмента каппаказеина человека использовали клетки аденокарциномы молочной железы человека линии МСР-7 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург). Клетки МСР-7 куль- 4 023475 тивировали в среде ΙΜΌΜ с 10 мМ Ь-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина в присутствии 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в культуральных флаконах с площадью поверхности дна 25 см². Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева по стандартной методике [10]. Для анализа влияния аналогов лактаптина на жизнеспособность клеток 2,5х10³ клеток МСР-7 в 100 мкл среды ΚΡΜΙ-1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки теленка и 20 мМ буфера Нерек, культивировали в лунках 96 луночного плоскодонного планшета в стандартных условиях (37°С, 5% СО₂, 95% влажности) в течение 24 ч (экспоненциальная фаза роста, 50% монослой). К культуральной среде добавляли рекомбинантные аналоги лактаптина в 100 мкл среды с сывороткой и инкубировали 72 ч, после чего оценивали морфологические изменения с помощью световой микроскопии и анализировали жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста [11]. Для этого содержащую препарат среду удаляли, в лунки добавляли по 100 мкл среды ΚΡΜΙ-1640 без сыворотки, содержащей МТТ в концентрации 0,5 мг/мл. Клетки ΜСР-7 инкубировали в присутствии МТТ в течение 4 ч при температуре 37°С, затем среду с МТТ удаляли. Формазан растворяли в ДМСО и определяли оптическую плотность раствора при длине волны 570 нм на планшетном сканере ΜτιΙΐίκΚαη КС, ТЬеттоТаЬ® (США).To assess the apoptotic activity of the recombinant peptide-analogue of the human kappa casein fragment, cells of the human breast adenocarcinoma of the MCP-7 line were used (Russian Collection of Vertebrate Cell Cultures, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg). MCP-7 cells were cultured in 0 medium with 10 mM L-glutamine and 40 μg / ml gentamicin in the presence of 10% fetal cattle serum at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ in culture bottles with an area of bottom surface 25 cm ² . Counting the number of cells was carried out in the Goryaev chamber according to the standard method [10]. To analyze the effect of lactaptine analogues on cell viability 2.5 × 10 ³ MCP-7 cells in 100 μl of среды-1640 medium containing 5% fetal calf serum and 20 mM Nerek buffer, were cultured in wells of a 96 well flat-bottom plate under standard conditions (37 ° C , 5% CO ₂ , 95% humidity) for 24 hours (exponential growth phase, 50% monolayer). Recombinant lactaptin analogs in 100 μl of serum medium were added to the culture medium and incubated for 72 h, after which morphological changes were evaluated using light microscopy and cell viability was analyzed using the MTT test [11]. For this, the medium containing the preparation was removed, 100 μl of ΚΡΜΙ-1640 medium without serum containing MTT at a concentration of 0.5 mg / ml was added to the wells. ΜСР-7 cells were incubated in the presence of MTT for 4 h at 37 ° С, then the medium with MTT was removed. Formazan was dissolved in DMSO and the optical density of the solution was determined at a wavelength of 570 nm on a flat-panel scanner ΜτιΙΐίκΚαη KS, TettoTab® (USA).

Результаты эксперимента представлены в таблице и показывают, что инкубация ΜСΡ-7 в присутствии фрагмента № 4 наиболее эффективно снижала жизнеспособность клеток (на 42,7 % при концентрации 0,07 мг/мл, 48 ч инкубации). Снижение жизнеспособности под действием аналога лактаптина сопровождалось морфологическими изменениями, характерными для апоптоза клеток в культуре: откреплением от пластиковой подложки, конденсацией цитоплазмы и ядер и появлением вторичных некротических клеток, окрашиваемых трипановым синим.The experimental results are presented in the table and show that incubation of ΜCΡ-7 in the presence of fragment No. 4 most effectively reduced cell viability (by 42.7% at a concentration of 0.07 mg / ml, 48 hours of incubation). The decrease in viability under the action of the lactaptine analog was accompanied by morphological changes characteristic of cell apoptosis in culture: detachment from a plastic substrate, condensation of the cytoplasm and nuclei, and the appearance of secondary necrotic cells stained with trypan blue.

Из данных таблицы видно, что подавление жизнеспособности клеток ΜСΡ-7 под действием аналогов лактаптина снижается с уменьшением концентрации аналогов в среде. Концентрация, при которой происходит снижение жизнеспособности клеток на 50% (ИК₅₀), составляет 0,08 мг/мл для КБ4 аналога, в то время как для КБ2 эта концентрация 0,45 мг/мл. Для белка КБ4 с расчетной массой 10,2 кДа это составляет ~7,8 мкМ.The data in the table show that the suppression of the viability of ΜСΡ-7 cells under the action of lactaptine analogues decreases with a decrease in the concentration of analogues in the medium. The concentration at which the cell viability is reduced by 50% (IC ₅₀ ) is 0.08 mg / ml for KB4 analogue, while for KB2 this concentration is 0.45 mg / ml. For KB4 protein with an estimated mass of 10.2 kDa, this is ~ 7.8 μM.

Таким образом достигнут заявленный технический результат, а именно создана плазмида, обеспечивающая увеличение синтеза рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппаказеина человека, и создан более продуктивный (с более высоким выходом целевого пептида) бактериальный штамм-продуцент, позволяющий получать рекомбинантный пептид - аналог каппа-казеина человека, обладающего более высокой апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.Thus, the claimed technical result was achieved, namely, a plasmid was created that provides an increase in the synthesis of a recombinant peptide that is an analogue of a human kappa casein fragment, and a more productive (with a higher yield of the target peptide) bacterial producer strain is created that allows one to obtain a recombinant peptide - an analogue of kappa-casein a person with a higher apoptotic activity against cancer cells.

ТаблицаTable

Данные о жизнеспособности клеток ΜСΡ-7, инкубированных 48 ч в полной культуральной среде в присутствии различных концентраций рекомбинантных аналогов лактаптина КБ2 и КБ4Data on the viability of ΜСΡ-7 cells incubated for 48 h in a complete culture medium in the presence of various concentrations of recombinant analogues of lactaptin KB2 and KB4

ИК₅„IR ₅ „ ИКдо IKdo Концентрация аналога КЬ4 в культуральной среде, мг/мл Concentration analogue K4 in cultural medium, mg / ml 0,028 0,028 0,042 0,042 0,07 0,07 0,08 0.08 0,13 0.13 Жизнеспособность клеток МСР-7, % Cell viability MCP-7,% 92,9 92.9 84,4 84,4 57,4 57.4 Концентрация аналога КЬ2 в культуральной среде, мг/мл Concentration analogue K2 in cultural medium, mg / ml о,1 oh 1 0,2 0.2 0,3 0.3 0,4 0.4 0,5 0.5 0,6 0.6 0,45 0.45 0,73 0.73 Жизнеспособность клеток МСР-7, % Cell viability MCP-7,% 108,5 108,5 67,0 67.0 63,3 63.3 48,9 48.9 41,3 41.3 37,6 37.6

Примечание. За 100% принята жизнеспособность клеток ΜСΡ-7, инкубированных в отсутствии аналога лактаптинаNote. The viability of ΜСΡ-7 cells incubated in the absence of a lactaptin analogue was taken as 100%

Источники научно-технической и патентной информацииSources of scientific, technical and patent information

1. Некипелая В.В., Семенов Д.В., Потапенко М.О., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Романова И.В., Рихтер В.А. Лактаптин - белок человеческого молока, индуцирующий апоптоз клеток аденокарциномы ΜСΡ7//Докл. Академии Наук, 2008, т. 419, № 2, с. 268-271.1. Nekipelaya V.V., Semenov D.V., Potapenko M.O., Kuligina E.V., Kit Yu.Ya., Romanova I.V., Richter V.A. Lactaptin is a protein of human milk that induces apoptosis of ΜCΡ7 adenocarcinoma cells // Dokl. Academy of Sciences, 2008, v. 419, No. 2, p. 268-271.

2. Власов В.В., Рихтер В.А., Семенов Д.В., Некипелая В.В., Кулигина Е.В., Потапенко М.О. Пептид, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека//патент КЛ № 2317304, 2008, бюл. № 5.2. Vlasov V.V., Richter V.A., Semenov D.V., Nekipelaya V.V., Kuligina E.V., Potapenko M.O. The peptide with apoptotic activity against human cancer cells // patent KL No. 2317304, 2008, bull. Number 5.

3. Тикунова Н.В., Семенов Д.В., Бабкина И.Н., Кулигина Е.В., Коваль О.А., Фомин А.С, Матвеева В.А., Матвеев А.Л., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК рРК2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина, способ получения рекомбинантного пептида и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обла- 5 023475 дающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам//патент РФ № 2401307 С1, 2010, бюл. № 28.3. Tikunova N.V., Semenov D.V., Babkina I.N., Kuligina E.V., Koval O.A., Fomin A.S., Matveeva V.A., Matveev A.L., Matveev L.E., Richter V.A. Recombinant plasmid DNA rRK2, providing synthesis of a recombinant peptide that is an analogue of a kappa-casein fragment, a method for producing a recombinant peptide and a recombinant peptide, an analogue of a human kappa-casein fragment, possessing apoptotic activity against cancer cells // RF patent No. 2401307 // C1, 2010, bull. Number 28.

4. §ешеиоу Ό.ν., Ротш Ά.8., КиЬдша Е.У., Коуа1 О.А., МаАееуа У.А., ВаЪкша Ι.Ν., Пкииоуа Ν.ν., КюШег ν.Α. РесотЪшай апа1одие8 о! иоуе1 тйк рго-арорЮйс рерйбе 1ас1арЬп апб (Ьеи еГГес! оп сиЬигеб Ьитап се118.//ТЬе Рго1еш 1оита1, 2010, ν. 29 (3), р. 174-180.4. § шеesheiou Ό.ν., Rothsch Ά.8., Kiudsha E.U., Koua1 O.A., MaAeeua U.A., Vaaksha Ι.Ν., Pkiooua Ν.ν., Küsheg ν.Α. Respect apaodie8 o! ее 1-го го--ар ар ар ар ор ре ре 1 ас ас ас ар ап ап ап ((((Ь Ь Ь е ап ап ап ап ап ап ап ап 11 11.

5. ТЬе О1Ае.\рге88юш81. А ЬапбЪоок Гог ЫдЬ 1е\'е1 ехрге88юп апб рипйсаЬоп оГ 6хШ8-1аддеб рго1еш8. РГЙЬ ебйюп. 06/2003.5. Thy O1Ae. \ Rge88ush81. And Lapbok Gog is 1E \ 'e1 expr88yp apb ripisoop OG 6xW8-1debde rgo1esh8. RGYB. 06/2003.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.6. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook D. Molecular cloning. M .: Mir, 1984.

7. ЬаеттЪ и.К. С1еаνаде оГ 8йис1ига1 рго1ет8 бийид (Ье а88етЪ1у оГ (Ье Ьеаб оГ Ъас1егюрЬаде Т4//№Пиге. 1970, ν. 227 (5259), р. 680-685.7. Lett. I.K. Claevade oG 8lis1a1 rgo1et8 biyid (L e a88et1u oG (Lé baab oG bac1gürde T4 // No. Pigeon. 1970, v. 227 (5259), p. 680-685.

8. Государственная фармакопея Российской Федерации, XII издание, часть 1, 2007. Определение белка (ОФС 42-0053-07).8. State Pharmacopoeia of the Russian Federation, XII edition, part 1, 2007. Determination of protein (OFS 42-0053-07).

9. ВгабГогб М.М. (1976) Апа1. ВюсЬет. 72: 248-254.9. VgabGogb M.M. (1976) Apa1. It is. 72: 248-254.

10. И8е оГ Ьтрап Ъ1ие 8(аш апб 1Ье Ьетосу1оте1ег (о бе(епшпа(е (о(а1 се11 соип(8 апб \ааЬ1е се11 питЪег. Зфта. 1996, р. 1702.10. UEFE EXTREME BOIL 8 (al. Apb 1bE bFeo1e1e1 (o e e (ea (e (a (a1 ce11 soip) (8 apb \ aa1e111111e. Zfta. 1996, p. 1702.

11. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ / Е.М. Трещалина, О.С. Жукова, Г.К. Герасимова, Н.В. Андронова, А.М. Гарин//Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ; под общ. ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. с. 637-651.11. Guidelines for the study of the antitumor activity of pharmacological substances / E.M. Treschalina, O.S. Zhukova, G.K. Gerasimova, N.V. Andronova, A.M. Garin // Guidance on the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances; under the general. ed. RU. Khabrieva. - 2nd ed., Revised. and add. - M.: Medicine, 2005.S. 637-651.

Список последовательностей <110> Федеральное государственное бюджетное учреждение наукиList of sequences <110> Federal State Budgetary Institution of Science

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) <120> Рекомбинантная плазмидная ДНК рРК4, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида КЬ4, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека, рекомбинантный штамм бактерий ЕзскеггсЫа соИ ХИ-В1ие/рРК4 и рекомбинантный пептид К£4 аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам <160> 2 <210> 2 <211> 264 <212> ΌΝΑ <213> Ното заргепз <400> 1Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences peptide K £ 4 analogue of a fragment of human kappa-casein with apoptotic activity in relation to cancer cells <160> 2 <210> 2 <211> 264 <212> ΌΝΑ <213> Noto zargetz <400> 1

аСд ASD ада hell дда dda Ссд Ssd саС caS сас sas сас sas сас sas саС caS сас sas дда dda Ссс Sss аСд ASD Сас Sas СаС CaS 45 45 Мес Month Агд Agd С1у C1u Зег Zeg Н13 H13 Ηίδ Ηίδ ΗΪ5 ΗΪ5 НЪз Bj ΗΪ3 ΗΪ3 Ηί$ Ηί $ С1у C1u Зег Zeg МеС MeC Туг Tug Туг Tug 1 one 5 5 10 10 15 fifteen дед grandfather сса ssa аас aas аде hell СаС CaS ссС ssS сас sas сас sas дда dda асе ace аас aas ССд SSD Сас Sas саа saa сдс sds 90 90 Уа1 Ya1 Рго Rgo Азп Azp Зег Zeg Туг Tug Рго Rgo Туг Tug Туг Tug С1у C1u ТЬг Tht Азп Azp Ъеи Bj Туг Tug С1п C1p Агд Agd 20 twenty 25 25 30 thirty ада hell сса ssa дсС dss аСа aSa дса dsa асе ace аас aas ааС aaS сса ssa сас sas дед grandfather ссс sss сдс sds аса asa сас sas 135 135 Агд Agd Рго Rgo А1а A1a Не Not А1а A1a Не Not Азп Azp Азп Azp Рго Rgo Туг Tug Уа1 Ya1 Рго Rgo Агд Agd ТЬг Tht Туг Tug 35 35 40 40 45 45 СаС CaS дса dsa аас aas сса ssa дсс dss дса dsa дсс dss адд add сса ssa саС caS дсс dss саа saa асе ace ссС ssS сад garden 180 180 Туг Tug А1а A1a Азп Azp Рго Rgo А1а A1a Уа1 Ya1 Уа1 Ya1 Агд Agd Рго Rgo ΗΪ5 ΗΪ5 А1а A1a С1п C1p Не Not Рго Rgo С1п C1p 50 fifty 55 55 60 60 сдд sdd саа saa Сас Sas сСд csd сса ssa ааС aaS аде hell сас sas сса ssa ссс sss асе ace дСд dsd дса dsa сдс sds сдс sds 225 225 Агд Agd С1п C1p Туг Tug Ъеи Bj Рго Rgo Азп Azp Зег Zeg Ηίδ Ηίδ Рго Rgo Рго Rgo ТЬг Tht Уа1 Ya1 Уа1 Ya1 Агд Agd Агд Agd

70 7570 75

сса аас Рго Азп ssa aas Rgo Azp ссд саС сса Сса ССС аСС дсс асе ссс сса Саа ssd saS ssa ssa sss ssss ssss sss sss sss ssa ssa 264 264 Ъеи НЪз Bjb Рго Зег РЬе Не А1а Не Рго Рго * Rgo Zeg Rye Ne A1a Ne Rgo Rgo * 80 80 85 85 <210> <210> 2 2 <211> <211> 88 88 <212> <212> РЕТ PET <213> <213> Ното But that заръепз zarjepz <400> <400> 2 2

МеС Агд 1 MeS Agd 1 <31у <31u Зег ΗΪ3 5 Zeg ΗΪ3 5 НЪз Bj ΗΪ8 ΗΪ8 Ηίβ ΗΪ3 Ηίβ 10 Ηίβ ΗΪ3 Ηίβ 10 О1у O1u Зег Zeg МеС MeC Туг Tug Туг 15 Tug fifteen Уа1 Ya1 Рго Rgo Азп Azp Зег Zeg Туг Tug Рго Rgo Туг Tug Туг Tug <31у <31u ТЬг Tht Азп Azp Ъеи Bj туг tug О1п O1p Агд Agd 20 twenty 25 25 30 thirty Агд Agd Рго Rgo А1а A1a Не Not А1а A1a Не Not Азп Azp Азп Azp Рго Rgo Туг Tug Уа1 Ya1 Рго Rgo Агд Agd ТЬг Tht Туг Tug 35 35 40 40 45 45 Туг Tug А1а A1a Азп Azp Рго Rgo А1а A1a Уа1 Ya1 Уа1 Ya1 Агд Agd Рго Rgo ΗΪ8 ΗΪ8 А1а A1a Θΐη Θΐη Не Not Рго Rgo С1п C1p 50 fifty 55 55 60 60 Агд Agd (31п (31p Туг Tug Ъеи Bj Рго Rgo Азп Azp Зег Zeg ΗΪ3 ΗΪ3 Рго Rgo Рго Rgo ТН.г T.N.g Уа1 Ya1 Уа1 Ya1 Агд Agd Агд Agd 65 65 70 70 75 75 Рго Rgo Азп Azp Ъеи Bj Ηί3 Ηί3 РГО RGO Бег Run РЬе Pb Не Not А1а A1a 11е 11th Рго Rgo Рго Rgo * * 80 80 85 85

- 6 023475- 6,023,475

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

1) фрагмент Ват I П/Ι Ιίικί III размером 264 п.о., имеющий нуклеотидную последовательность 8Ер Ιϋ ΝΟ: 1, которая кодирует указанный пептид РР4 с аминокислотной последовательностью 8Ер Ιϋ ΝΟ: 2;1) a fragment of Wat I P / Ι Ιίικί III measuring 264 bp with the nucleotide sequence of 8 Ep Ιϋ ΝΟ: 1, which encodes the indicated peptide PP4 with the amino acid sequence of 8 Ep Ιϋ ΝΟ: 2;

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕК4, обеспечивающая увеличенный выход рекомбинантного пептида ЙБ4 с аминокислотной последовательностью 8Ер Ιϋ ΝΟ: 2, который является аналогом фрагмента каппа-казеина человека и состоит из трех компонентов: Ν-концевой полигистидиновой последовательности МКО8НННННИО8, остатка метионина, введенного в конструкцию для возможности отщепления полигистидиновой последовательности, и фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 а.о., и который обладает увеличенной апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам, причем указанная ДНК характеризуется молекулярной массой 2,41 МДа и размером 3653 п.о. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, следующие элементы:1. Recombinant plasmid DNA pEK4, providing an increased yield of the recombinant peptide YB4 with the amino acid sequence of 8Ep Ιϋ ΝΟ: 2, which is an analogue of the human kappa-casein fragment and consists of three components: the кон-terminal polyhistidine sequence of MKO8NNNNIO8, the methionine residue introduced into the construct the possibility of cleavage of the polyhistidine sequence, and a fragment of human kappa-casein from 49 to 122 a.a., and which has increased apoptotic activity against cancer cells, and the DNA is characterized by a molecular weight of 2.41 MDa and a size of 3653 bp and contains in accordance with the physical and genetic map shown in FIG. 2, the following items:

2. Рекомбинантный штамм бактерии ЕзсйепсЫа сой ХБ1-В1ие/рЕК4, продуцирующий с увеличенным выходом рекомбинантный пептид РР4 с аминокислотной последовательностью 8Рр ГО ΝΟ: 2, причем штамм содержит рекомбинантную плазмидную ДНК рЕК4 по п.1 и депонирован в КЭМТК ИХБФМ СО РАН под номером ЭМТК 1347.2. Recombinant strain of the bacterium Exeptenia HB1-B1ie / pEK4 producing, with an increased yield, the recombinant peptide PP4 with the amino acid sequence 8Pp GO ΝΟ: 2, and the strain contains the recombinant plasmid DNA pEX4 according to claim 1 and deposited in CEMPT ICB RAS 1347.

2) фрагмент плазмидного вектора ррЕ30, обеспечивающий эффективную экспрессию фрагмента каппа-казеина человека и содержащий:2) a fragment of the plasmid vector ppE30, providing efficient expression of a fragment of kappa-casein of the person and containing:

а) сайт инициации репликации плазмиды рВЙ322;a) the site of initiation of replication of plasmid pBY322;

в) генетический маркер АМРг - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации ЕзсйепсЫа сой;c) the genetic marker AMPg is the ampicillin resistance gene (β-lactamase gene), which determines the resistance to ampicillin during transformation of Exercis soya;

г) уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Ανα I (2), Есо ΡΙ (89), Ват Н1 (146), НМ III (380), Νο I (1053), Ара Ы (1585), Ара Ы (2083), Ара Ы (3329).d) unique recognition sites by restriction endonucleases having the following coordinates: Ανα I (2), Eco ΡΙ (89), Wat H1 (146), NM III (380), Iο I (1053), Ara S (1585), Ara S (2083), Ara Y (3329).

3. Рекомбинантный пептид РР4 с аминокислотной последовательностью 8Рр ГО ΝΟ: 2, который является аналогом фрагмента каппа-казеина человека, имеет молекулярную массу 10,2 кДа, состоит из трех компонентов: Ν-концевой полигистидиновой последовательности МКО8ННННННО8, остатка метионина, введенного в конструкцию для возможности отщепления полигистидиновой последовательности, и фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 а.о. и обладает увеличенной апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.3. The recombinant peptide PP4 with the amino acid sequence 8Pp GO ΝΟ: 2, which is an analogue of the human kappa-casein fragment, has a molecular weight of 10.2 kDa, consists of three components: the цевой-terminal polyhistidine sequence of MKO8HHHHHHNO8, the methionine residue introduced into the construct for the possibility of cleavage of the polyhistidine sequence, and a fragment of human kappa-casein from 49 to 122 a.a. and has increased apoptotic activity against cancer cells.

акд akd ада hell дда dda кед sneaker сак sack сас sas сак sack сас sas сак sack сас sas дда dda ксс css акд akd как as как as 45 45 Мек Mek Агд Agd СЬу Sue Зег Zeg НЬз Hb НЬз Hb НЬз Hb НЬз Hb НЬз Hb НЬз Hb СЬу Sue Зег Zeg Мек Mek Туг Tug Туг Tug 1 one 5 5 10 10 15 fifteen дкд dkd сса ssa аак aac аде hell как as сск ssk как as как as дда dda асе ace аак aac ккд ccd кас cas саа saa сдк sdk 90 90 Уа1 Ya1 Рго Rgo Азп Azp Зег Zeg Туг Tug Рго Rgo Туг Tug Туг Tug СЬу Sue ТЬг Tht Азп Azp Ьеи Bie Туг Tug С1п C1p Агд Agd 20 twenty 25 25 30 thirty ада hell сса ssa дек Dec аса asa дса dsa акк acc аак aac аак aac сса ssa как as дьд dd сск ssk сдс sds аса asa как as 135 135 Агд Agd Рго Rgo А1а A1a Не Not А1а A1a Не Not Азп Azp Азп Azp Рго Rgo Туг Tug Уа1 Ya1 Рго Rgo Агд Agd ТЬг Tht Туг Tug 35 35 40 40 45 45 как as дса dsa аас aas сса ssa дек Dec дка dka дкк dkk адд add сса ssa сак sack дсс dss саа saa акк acc сск ssk сад garden 180 180 Туг Tug А1а A1a Азп Azp Рго Rgo АЬа Aba Уа1 Ya1 УаЬ Yb Агд Agd Рго Rgo НЬз Hb А1а A1a С1п C1p 11е 11th Рго Rgo С1п C1p 50 fifty 55 55 60 60 сдд sdd саа saa кас cas скд skd сса ssa аак aac аде hell сас sas сса ssa ссс sss аск ask дкд dkd дка dka сдк sdk сдс sds 225 225 Агд Agd С1п C1p Туг Tug Ьеи Bie Рго Rgo Азп Azp Зег Zeg НЬз Hb Рго Rgo Рго Rgo ТЬг Tht Уа1 Ya1 Уа1 Ya1 Агд Agd Агд Agd 65 65 70 70 75 75 сса ssa аас aas скд skd сак sack сса ssa кса ksa ккк kkk акк acc дсс dss акс ax ссс sss сса ssa каа kaa 264 264 Рго Rgo Азп Azp Ьеи Bie НЬз Hb Рго Rgo Зег Zeg РЬе Pb 11е 11th АЬа Aba Не Not Рго Rgo Рго Rgo * * 80 80 85 85