EA022764B1 - СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ПОЛУЧЕНИЯ (R)-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ω-ТРАНСАМИНАЗЫ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам скрининга, получения и характеризации (R)-селективных ω-трансаминаз, к полученным таким образом трансаминазам и к их применению в различных способах переаминирования.

Description

Настоящее изобретение относится к способам скрининга, характеризации и получения (К)специфических ω-трансаминаз, к полученным таким образом ω-трансаминазам и к их применению в различных способах переаминирования.

Хиральные амины играют важную роль в фармацевтической, агрохимической и химической промышленности. Они часто используются в качестве промежуточных соединений или синтонов для получения различных физиологически, например, фармацевтически активных веществ, таких как производные цефалоспоринов или пирролидинов. Из большого числа хиральных аминов, применяемых в различных целях, физиологически активной является фактически только одна оптически активная форма, такая как (К)- или (8)-энантиомер. Поэтому существует необходимость в разработке способов получения хиральных аминов в оптически активной форме.

Эти потребности могут быть частично удовлетворены благодаря получению хиральных аминов путем кристаллизации диастереомерных солей посредством добавления хиральных карбоновых кислот (Вгеиег е! а1., Апде\уапб1е СЬет1е (2004) 116, 806-843). В других химических методах используется энантиоселективный синтез, осуществляемый путем восстановления прохиральных предшественников с двойными С=И-связями.

В последнее время из нескольких ферментативных методов, применяемых для синтеза оптически активных аминокислот и аминов, особое внимание привлекают методы с использованием сотрансаминаз (ω-ТА) благодаря их способности осуществлять асимметрический синтез оптически активных аминов, которые часто используются в качестве структурных блоков для получения множества фармацевтических средств.

ω-Трансаминазы представляют собой РЬР (перидоксалфосфат)-зависимые ферменты, которые катализируют реакции переноса аминогрупп. При использовании ω-трансаминаз, так называемые энантиообогащенные и/или чистые оптически активные амины могут быть, главным образом, продуцированы посредством реакции с применением двух стратегий: (ί) асимметрического синтеза исходных из кетонов, и (ίί) кинетического разделения исходных из рацемических аминов. Хотя ω-трансаминазы в основном обладают хорошей энантиоселективностью, однако обычно они не используются для асимметрического синтеза, хотя теоретически в данном случае можно ожидать 100% выхода. Одним из конкретных требований при осуществлении асимметрического синтеза с использованием ω-трансаминаз является сдвиг равновесия в сторону продукта, особенно при использовании аминокислоты, подобной аланину, в качестве аминодонора, поскольку в данном случае равновесие смещается в сторону субстратов (кетона, аланина), а не в сторону продуктов (амина, пирувата); другим требованием является достижение стереоселективности фермента, что не всегда происходит в случае использования ω-трансаминаз. Поэтому сотрансаминазы используются, главным образом, для кинетического разделения рацемических аминов, при котором достижение энантиоселективности не является необходимым условием. Таким образом, хотя были проведены исследования по кинетическому разделению рацемических аминов, ограничение выхода, который составляет максимум 50%, существенно мешает их применению. С другой стороны, для асимметрического синтеза требуются методы, позволяющие изменять нежелательный сдвиг равновесия в сторону синтеза отдельных энантиомеров оптически чистых аминов, для которого было разработано несколько методов, что и явилось одной из ключевых предпосылок создания эффективных способов, позволяющих использовать трансаминазы в промышленном масштабе. Такие методы описаны в заявке \УО 2007/093372.

В ЕР0987332 А1 описан способ продуцирования оптически активных аминосоединений, а именно (К)-аминосоединений, с использованием микробного фермента, в частности (К)-селективной ω-трансаминазы, выделенной из Ат1ЬтоЬас!ег 8р. В ЕР1038953 А1 описана другая (К)-селективная ω-трансаминаза, которая, однако, была выделена из МусоЬас!етшт аитиш.

1\уа8а1<1 а! а1. (Вю!есЬпо1. Ье!., 2003 (25), 1843-1846), Ко8/е1е\У8к1 а! а1. (Αάν. 8уп1Ь. Са!а1., 2008 (350), 2761-2766) и 1\уа8а1и а! а1. (Арр1. МютоЬюк Вю!есЬпо1., 2006 (69), 499-505) раскрывают К-специфическую трансаминазу из Ат1ЬтоЬас!ег 8р. Идентификацию микроорганизмов, обеспечивающих пригодные (8)или (К)-селективные со-трансаминазы, обычно осуществляют путем отбора микроорганизмов, выделенных, например, из образцов почвы, и обогащения ими культуры (ίιιη е! а1., Арр. МютоЬюк Вю!есЬпо1., 2004 (70), 2529-2534 и 8Ып е! а1. (Вю8с. Вю!есЬпо1. ВюсЬет. 2001 (65), 1782-1788)). В частности, все описанные К-селективные ω-трансаминазы были получены путем обогащения культуры. Такие методы требуют много времени, поскольку для их эффективного осуществления часто предпочтительна сверхэкспрессия фермента в гетерологичном организме, подобного Е8сЬепсЬ1а сой. Для этого требуется выделение генной последовательности из организмов дикого типа, но клонирование ДНК не всегда является успешным и представляет собой очень длительный процесс.

В частности, в ходе процесса разработки или идентификации нового фермента ω-ТА очистка фермента и характеризация его ферментативных свойств представляет особый интерес. Однако, поскольку активность ω-ТА обычно определяют лабораторными методами, такими как ВЭЖХ или капиллярный электрофорез (СЕ), то определение свойств фермента чаще носит ограничительный характер.

Как правило, по сравнению с (8)-селективными ω-трансаминазами число доступных (К)- 1 022764 селективных ω-трансаминаз еще более ограничено. Это находится в резком противоречии с высокой потребностью в (К)-селективных ω-трансаминазах, которые являются наиболее пригодными для асимметрического синтеза (К)-энантиомеров различных хиральных аминов. Таким образом, существует потребность в обеспечении дополнительными (К)-селективными ω-трансаминазами и средствами и способами их получения в целях продуцирования К-энантиомеров, в частности оптически активных аминов, например, для фармацевтического или агрохимического применений, что в настоящее время является либо недоступным, либо считается экономически невыгодным процессом, особенно в промышленном масштабе.

По этой причине настоящее изобретение, основанное на данной технической проблеме, обеспечивает простые, быстрые и надежные средства и способы идентификации, характеризации и получения (К)селективных ω-трансаминаз, в частности продуцирования желаемых (К)-энантиомеров, предпочтительно в оптически чистой форме, которые являются предпочтительно пригодными для идентификации, характеризации и получения в промышленном масштабе.

Настоящее изобретение решает эти технические проблемы путем предоставления идеи, сформулированной в независимых пунктах формулы изобретения, в частности в пунктах формулы изобретения, относящихся к способам, продуктам и их применению.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет конкретный вариант осуществления способа получения (К)-селективных со-трансаминаз (также называемых ω-ТА), включающего следующие стадии:

a) обеспечение по меньшей мере одной запрашиваемой последовательности биомолекулы, по меньшей мере одной трансаминазы или лиазы, предпочтительно трансаминазы или лиазы, которые принадлежат к РЬР-зависимым ферментам укладки типа IV, и по меньшей мере одного банка биомолекул;

b) поиск в банке биомолекул с помощью запрашиваемой последовательности биомолекулы в целях идентификации группы первых последовательностей биомолекул-мишеней, где указанные первые последовательности биомолекул-мишеней по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 32% идентичны запрашиваемой последовательности биомолекул, как вычислено на уровне аминокислотной последовательности;

c) отбор в группе первых последовательностей биомолекул-мишеней группы вторых последовательностей биомолекул-мишеней, которые не содержат на уровне аминокислотной последовательности по меньшей мере один из следующих мотивов аминокислотных последовательностей (с1)-(с3):

с1) в положениях 95-97 аминокислотную последовательность Туг-Ха1-Ха2, где Ха1 представляет собой аминокислоту 11е, Vа1, Ьеи, Ме1, РЬе и Ха2 представляет собой аминокислоту Агд или Ьуз, или с2) в положениях 97-99 аминокислотную последовательность Тут-Хаа-Οίη, где Хаа представляет собой предпочтительно обычную аминокислоту, и в области от положения 105 до положения 111, предпочтительно в положениях 107-109 аминокислотную последовательность Агд-Хаа-Ха3, где Ха3 представляет собой аминокислоту, предпочтительно Шз, или с3) в положении 38 ТЬг, в положении 97 Ьуз и в положениях 107-109 аминокислотную последовательность Агд-Ха4-Ха5, где Ха4 представляет собой аминокислоту, предпочтительно О1у, и Ха5 представляет собой аминокислоту, предпочтительно Туг, и которые содержат:

с4) в положении 95 аминокислоту, не являющуюся Туг, Агд, Ьуз, или в положении 95 аминокислоту Туг, но в положении 97 аминокислоту, не являющуюся Агд или Ьуз, и с5) в положении 40 аминокислоту, не являющуюся Ьуз или Агд, и с6) в области от положения 161 до положения 165, предпочтительно в положении 163, аминокислоту Ьуз, для идентификации группы вторых последовательностей биомолекул-мишеней, и

6) обеспечение, предпочтительно получение, биомолекулы, имеющей вторую последовательность биомолекул-мишеней, идентифицированную на стадии (с), и представляющей собой или кодирующей, по меньшей мере частично, белок, обладающий активностью (К)-селективной ω-трансаминазы.

Термин биомолекула, представляющая собой или кодирующая, по меньшей мере частично, белок, предпочтительно означает, что указанная биомолекула может или представлять собой белок, обладающий активностью (К)-селективной ω-трансаминазы, или, в случае, когда данная биомолекула представляет собой нуклеотидную последовательность, по меньшей мере часть указанной нуклеотидной последовательности кодирует указанный белок, предпочтительно полноразмерный белок. Соответственно в случае, когда обеспеченная биомолекула представляет собой молекулу нуклеотидной последовательности, по меньшей мере часть указанной молекулы нуклеотидной последовательности кодирует белок, обладающий активностью (К)-селективной ω-трансаминазы, благодаря чему другая часть указанной нуклеотидной молекулы может иметь некоторые другие функции, например регуляторную или репликативную функцию. Таким образом, термин обеспечение биомолекулы, имеющей вторую последовательность биомолекулы-мишени, идентифицированную на стадии (с) и представляющую собой или кодирующую, по меньшей мере частично, белок, обладающий активностью (К)-селективной ω-трансаминазы, предпочтительно эквивалентен термину получение биомолекулы, имеющей вторую последовательность биомолекулы-мишени, идентифицированную на стадии (с), которая может представлять собой белок, обла- 2 022764 дающий активностью (К)-селективной со-трансаминазы, или которая может представлять собой молекулу нуклеотидной последовательности, которая включает последовательность, кодирующую указанный белок, при условии, что такой белок обладает активностью (К)-селективной ω-трансаминазы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии (с2) положение мотива Агд-Хаа-ХаЗ может смещаться на 1-2 аминокислоты от положений 107-109, то есть эти аминокислоты могут присутствовать в положениях 105-111.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения на стадии (с6) Ьуз в положении 163 может смещаться на 1-2 аминокислоты, то есть эта аминокислота может присутствовать в положениях 161-165.

В контексте настоящего описания каждая аминокислотная последовательность, в частности мотив аминокислотной последовательности или последовательность ДНК, или данный мотив последовательности ДНК всегда записываются в направлении от аминоконца до карбоксиконца или в направлении 5'^3', если это не оговорено особо. Предпочтительно последовательности, представленные в данном направлении, всегда указываются как непрерывные последовательности нуклеотидов, без интронов, или непрерывные последовательности аминокислот, в зависимости от обстоятельств.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одной запрашиваемой последовательностью биомолекул, по меньшей мере одной трансаминазы, используемой на стадии (а), предпочтительно является (К)-селективная ω-трансаминаза. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одну запрашиваемую последовательность биомолекулы по меньшей мере одной трансаминазы, используемой на стадии (а), выбирают из группы, состоящей из (К)-селективной ω-трансаминазы, аминотрансферазы с разветвленной аминокислотной цепью (ВСАТ) и Ό-аминокислотной трансаминазы (ОАТА). Предпочтительной аминотрансферазой с разветвленной аминокислотной цепью является аминотрансфераза, полученная из Е. сой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одной запрашиваемой последовательностью биомолекулы по меньшей мере одной лиазы, используемой на стадии (а), является аминодезоксихоризмат-лиаза (АОСЬ).

Настоящее изобретение относится способу получения (К)-селективной ω-трансаминазы, являющемуся быстрым, эффективным, простым, надежным и нетрудоемким. Следовательно, настоящее изобретение дает возможность идентифицировать и получить (К)-селективную ω-трансаминазу, что до настоящего времени было неизвестно или недоступно, открывая множество путей обеспечения хиральных аминов, предпочтительно (К)-энантиомеров, в частности очень эффективных путей асимметрического синтеза. Об этом явно свидетельствует тот факт, что даже белки с низкой степенью идентичности последовательности, например только 35%, известной (К)-селективной ω-трансаминазе, в противоположность ожиданиям, фактически представляют собой (К)-селективные ω-трансаминазы. Особенно преимущественным и неожиданным в способе настоящего изобретения является то, что он дает возможность обеспечить предпочтительно (К)-селективные ω-трансаминазы из АзрегдШиз 1еггеи8 и МсзогЫ/оЬшт 1ой, благодаря чему трансаминаза из АзрегдШиз представляет собой первую эукариотическую ω-трансаминазу, и она превращает в субстраты с (К)-селективностью.

В основу настоящего изобретения, главным образом, была положена техническая идея, заключающаяся в том, что белки или кодирующие их нуклеотидные последовательности даже с низкой степенью идентичности последовательностей известным последовательностям трансаминаз или лиаз, в частности (К)-селективных ω-трансаминаз, могут быть использованы в качестве потенциального источника для идентификации и получения (К)-селективных ω-трансаминаз, где предполагаемые (К)-селективные ωтрансаминазы скринируют и получают путем выявления нежелательных белков и тем самым позитивного отбора белков, обнаруживающих конкретные мотивы последовательностей в аминокислотной последовательности, которой может быть приписана желаемая ферментативная активность. Таким образом, в настоящем изобретении для идентификации и получения (К)-селективных ω-трансаминаз специально используются конкретные структурные признаки, в частности отсутствие и присутствие конкретных аминокислот в предполагаемой (К)-селективной ω-ТА.

В соответствии с этим на первой стадии (а) настоящего способа запрашиваемую последовательность биомолекулы по меньшей мере одной трансаминазы или лиазы, например известной (К)селективной со-трансаминазы, или по меньшей мере одной характерной части последовательности такой лиазы или трансаминазы, предпочтительно (К)-специфической со-трансаминазы, которая предпочтительно может быть использована для идентификации РЬР-зависимого фермента укладки типа IV, обеспечивают вместе по меньшей мере с одним банком биомолекул. Предпочтительно запрашиваемая последовательность биомолекулы представляет собой ОКЕ (открытая рамка считывания) трансаминазы или лиазы, в частности (К)-селективной ω-ТА, кодирующую нуклеотидную последовательность или ее характерную часть. В другом варианте осуществления изобретения указанная запрашиваемая последовательность биомолекулы представляет собой саму ОКЕ-аминокислотную последовательность или ее характерную часть.

В контексте настоящего изобретения характерной частью запрашиваемой последовательности био- 3 022764 молекулы по меньшей мере одной трансаминазы или лиазы, в частности известной (К)-селективной ωтрансаминазы, является последовательность биомолекулы, которая в форме ее молекулы последовательности ДНК гибридизуется в соответствующих условиях с полноразмерной запрашиваемой последовательностью биомолекулы, в частности с ДНК-последовательностью ОКЕ.

Методы гибридизации нуклеиновых кислот, таких как ДНК, хорошо известны и описаны, например, в руководстве Мо1еси1аг С1ошид, ΤΗτά Εάίίίοη (2001); Ме11юб8 Тот Сеиета1 апб Мо1еси1аг Вас1етю1оду, ΆδΜ Рге88 (1994); 1ттипо1оду теОюбз тапиа1, Асабетю Рге88 (Мо1еси1аг) и во многих других известных руководствах.

Ниже описаны примеры гибридизации в жестких условиях. Фильтр с иммобилизованной на нем нуклеиновой кислотой и нуклеиновую кислоту, используемую в качестве зонда, инкубируют в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х88С (750 мМ хлорид натрия и 75 мМ цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5Х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/л денатурированной ДНК спермы лосося, при 42°С в течение ночи. После инкубации фильтр промывают в 0,2Х растворе 88С (примерно при 65°С). Такие жесткие условия гибридизации могут быть изменены путем коррекции концентрации формамида (условия становятся менее жесткими по мере снижения концентрации формамида) и путем изменения концентрации солей и температуры.

Г ибридизацию в условиях низкой жесткости осуществляют, например, путем инкубации фильтра с иммобилизованной на нем нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой, используемой в качестве зонда, в растворе, содержащем 6Х88СЕ (20Х88СЕ: 3 моль/л хлорида натрия, 0,2 моль/л дигидрофосфата натрия и 0,02 моль/л ΕΌΤΑ, рН 7,4), 0,5% ДСН, 30% формамида и 100 мкг/л денатурированной ДНК спермы лосося при 37°С в течение ночи и промывки фильтра IX раствором §§С, содержащим 0,1% ДСН (50°С).

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения термин по меньшей мере одна запрашиваемая последовательность биомолекулы по меньшей мере одной трансаминазы или лиазы следует понимать как последовательность биомолекулы, которая пригодна для отбора последовательностей биомолекул в соответствии с присутствием или отсутствием мотивов последовательностей (с1)-(с6), как идентифицировано в данном описании. Соответственно такая запрашиваемая последовательность представляет собой последовательность для скрининга и идентификации таких последовательностей биомолекул, которые на уровне аминокислотной последовательности не содержат по меньшей мере один из мотивов аминокислотных последовательностей (с1)-(с3) и которые содержат на аминокислотном уровне мотивы последовательностей (с4)-(с6). Такая запрашиваемая последовательность биомолекулы может быть включена в качестве информации об аминокислотной последовательности или в качестве информации о молекуле ДНК-последовательности или о последовательности ДНК.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения характерная часть запрашиваемой последовательности биомолекулы, используемой на стадии (а), включает, предпочтительно состоит из области от положения 30 до положения 170, более предпочтительно от положения 30 до положения 120 ОКЕ трансаминазы, предпочтительно (К)-селективной ω-трансаминазы или лиазы.

На следующей стадии (Ь) в банке биомолекул осуществляют поиск запрашиваемой последовательности биомолекулы для идентификации группы первых последовательностей биомолекул-мишеней, имеющей, по меньшей мере, минимальную степень идентичности последовательностей, которые по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 25%, предпочтительно на 32%, предпочтительно по меньшей мере на 33%, более предпочтительно на 34%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 36%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичны запрашиваемой последовательности биомолекулы, основанной на уровне аминокислотной последовательности, и где указанная группа первых биомолекул-мишеней представляет собой первый отбор из банка биомолекул, используемого на стадии (а). Указанная степень идентичности последовательностей представляет собой идентичность последовательностей, оцененную предпочтительно между последовательностями, по меньшей мере, характерной части последовательности, предпочтительно, по существу, полноразмерной последовательности, в частности полноразмерной ОКЕ запрашиваемой последовательности биомолекулы и, по меньшей мере, характерной частью последовательности, предпочтительно, по существу, полноразмерной последовательности, в частности полноразмерной ОКЕ скринируемых последовательностей биомолекул. После проведения указанной стадии (Ь) в этой группе первых последовательностей биомолекулы-мишени на стадии (с) проводят отбор таких последовательностей, которые не содержат в качестве мотива последовательности (с1) в положениях 95-97 аминокислотную последовательность Туг-Ха1Ха2, где Ха1 представляет собой аминокислоту 11е, Уа1, Ьеи, Ме1, РЬе и Ха2 представляет собой аминокислоту Агд или Ьу8, или которые не содержат в качестве мотива последовательности (с2) в положениях 97-99 аминокислотную последовательность Тут-Хаа-С1и, где Хаа предпочтительно представляет собой обычную аминокислоту, и в области 105-111, предпочтительно в положениях 107-109 аминокислотную последовательность Агд-Хаа-Ха3, где Ха3 представляет собой обычную аминокислоту, предпочтительно Ηΐ8, или которые не содержат в качестве мотива последовательности (с3) в положении 38 аминокислоту

- 4 022764

ТЬг, в положении 97 аминокислоту Ьу8, и в положениях 107-109 аминокислотную последовательность Агд-Ха4-Ха5, где Ха4 предпочтительно представляет собой обычную аминокислоту, предпочтительно С1у, и Ха5 предпочтительно представляет собой обычную аминокислоту, предпочтительно Туг; что дает возможность дифференцировать и отделять эти последовательности от последовательностей, которые имеют по меньшей мере один из мотивов последовательностей (с1), (с2) или (с3), идентифицированных выше. На другой последующей или одновременной стадии отбора осуществляют отбор таких последовательностей биомолекул, которые соответствуют мотиву последовательности (с4), где в положении 95 присутствует другая аминокислота, не являющаяся Туг, Агд, Ьу8, или в положении 95 присутствует аминокислота Туг, и в положении 97 присутствует аминокислота, не являющаяся Агд и Ьуз; и которые соответствуют мотиву последовательности (с5), где в положении 40 присутствует аминокислота, не являющаяся Ьу8 и Агд; и мотиву последовательности (с6), в области от положения 161 до положения 165, в которой предпочтительно в положении 163 присутствует по меньшей мере одна аминокислота Ьу8 и предпочтительно одна аминокислота Ьу8, где указанная стадия дает возможность проводить отбор и идентификацию группы последовательностей второй биомолекулы-мишени. Группа последовательностей второй биомолекулы-мишени, идентифицированных и скринированных для идентифицированных выше мотивов последовательностей, представляет собой последовательности биомолекул, представляющих собой или кодирующих белок, обладающий активностью (К)-селективной ω-трансаминазы.

В контексте настоящего изобретения трансаминаза представляет собой пиридоксалфосфатзависимый фермент, катализирующий перенос аминогрупп, предпочтительно классифицированный в укладку типа IV. Трансаминазы классифицированы в соответствии с Системой классификации ферментов Е.С. 2.6.1.Х. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения трансаминаза представляет собой (К)-селективную трансаминазу, в частности в предпочтительном варианте осуществления ω-трансаминазу. В контексте настоящего изобретения белком, обладающим активностью (К)-селективной ω-трансаминазы, является белок, который в соответствующих реакционных условиях катализирует перенос азотных групп, таких как аминогруппы, передаваемые от донора к акцептору, например, как это в состоянии делать (К)-селективная (л(омега)-трансаминаза (бета-аланин-пируваттрансаминазы). В контексте настоящего изобретения (К)-селективная ω-трансаминаза является предпочтительным ферментом, классификационным кодом Е.С.2.6.1.18.

В контексте настоящего изобретения термин оптически активный хиральный амин относится к такому же понятию, как термин энантиомерно активный хиральный амин. Эти термины, в частности, означают препарат, который, по существу, не содержит даже в более предпочтительном варианте осуществления нежелательного энантиомера. Соответственно оптически активный хиральный амин, по существу, содержит избыток одного энантиомера или даже состоит только из одного энантиомера.

В частности, в контексте настоящего изобретения оптически активный хиральный амин имеет оптическую чистоту по меньшей мере 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8%, в частности по меньшей мере 99,9%.

В настоящем изобретении оптическая чистота выражена в % избытка одного энантиомера по отношению к другому энантиомеру. Таким образом, оптическая чистота в % означает отношение разности концентраций (К)- и (§)-энантиомеров к сумме концентраций указанных знантиомеров (оптическая чистота А в %=([А]-[В]):([А]+[В])х 100, где А и В представляют собой концентрации (К)- и (§)энантиомеров или наоборот).

В контексте настоящего изобретения банк биомолекул представляет собой источник самих биомолекул или набор данных о последовательностях биомолекул, в частности данных о последовательностях полинуклеотидов или полипептидов.

В контексте настоящего изобретения биомолекулой предпочтительно является полинуклеотидная молекула, несущая генетическую информацию, в частности молекула ДНК. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения биомолекулой является полипептид, в частности белок, содержащий ряд аминокислот. Таким образом, банк биомолекул может представлять собой или физический источник биомолекул, в частности банк генов, например библиотеку кДНК или геномную библиотеку, или совокупность данных об указанных биомолекулах, в частности совокупность данных о последовательностях, например об аминокислотных последовательностях или полинуклеотидных последовательностях, в частности о последовательностях ДНК.

Настоящее изобретение также относится к последовательностям биомолекул, аминокислотным последовательностям, полинуклеотидным последовательностям или нуклеотидным последовательностям, в частности к последовательностям ДНК, где указанный термин, с одной стороны, означает физическое вещество рег 8е, что означает белок, полипептид или молекулу ДНК, и, с другой стороны, несет в себе информацию об указанном химическом веществе, которая в случае полинуклеотида указывает на тип, порядок и число нуклеотидов, присутствующих в данном полинуклеотиде, и в случае полипептида на тип, порядок и число отдельных аминокислот, образующих данный полипептид.

В контексте настоящего изобретения термины биомолекула, молекула ДНК, полинуклеотидная молекула, полипептид или белок означают химические вещества рег 8е. В данном случае настоящее

- 5 022764 изобретение конкретно относится к информации об аминокислотной последовательности, о последовательности ДНК, о полинуклеотидной последовательности или о последовательности биомолекулы, при этом она не относится к физической форме биомолекулы, но скорее к содержащейся в ней информации, то есть к типу, порядку и числу ее составляющих, а именно аминокислот или нуклеотидов.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления (А) на стадиях (а)-(с) настоящее изобретение относится к банку биомолекул, представляющему собой совокупность данных о последовательностях, в одном варианте осуществления о полинуклеотидных последовательностях, в частности о последовательностях ДНК, или в другом варианте осуществления об аминокислотных последовательностях, где поиск указанных полинуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляют на стадии (Ь) с применением соответствующих инструментов выравнивания последовательностей, предпочтительно программы ВЬА8Т, которая представляет собой основной инструмент поиска путем локального выравнивания, проводимого в целях идентификации группы последовательностей первых биомолекулмишеней (А115сЬц1, 8.Р. е! а1., 1990. 1. Μοί. ΒίοΙ., 215:403; А1!5сйи1, 8.Р. е! а1., 1997, Ыис1е1с Αοίά Кее., 25:3389-3402). Другими подходящими программами являются программы САР, ВЕ8ТР1Т и РА8ТА, входящие в пакет программ \У15соп5И1 Сеиейсз 8оЙ№аге Раскаде (Сеиейсз Сотри1ег Сгоир (ССС), Μαάίδοη. ν1, И8А). На дополнительной стадии (с) группу идентифицированных последовательностей первых биомолекул подвергают дополнительным стадиям отбора, в процессе которых мотивы идентифицированных последовательностей используют для идентификации и негативного отбора мотивов последовательностей (с1)-(с3) и позитивного отбора мотивов последовательностей (с4)-(с6) желательной последовательности биомолекул. После идентификации второй группы последовательностей биомолекул авторами настоящего изобретения была использована информация об указанных последовательностях в целях получения соответствующих молекул олиго- или полинуклеотидов, например праймеров для гибридизации, а также в целях скрининга и физического отбора молекул последовательностей ДНК из банка биомолекул, где указанные молекулы ДНК кодируют ферменты, идентифицированные во второй группе. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления информация о последовательностях, полученная на стадии (с), может быть использована для клонирования соответствующего гена из библиотеки геномных ДНК или кДНК и экспрессии белка, например в Е. сой, 8ас15сйаготусе5 сегеу151ае, РюЫа ра51ог15 или т.п. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения информацию о последовательностях, полученную на стадии (с), используют для синтеза бе иоуо желаемой (К)селективной ω-трансаминазы. В таком предпочтительном варианте осуществления информацию о последовательностях, полученную на стадии (с), возможно использовать для синтеза гена, например, с оптимизированной встречаемостью кодонов и стабильной мРНК и для клонирования и экспрессии такого гена. Согласно такому предпочтительному варианту осуществления в качестве по меньшей мере одного банка биомолекул на стадии (а) возможно использовать любой банк биомолекул, содержащий информацию о последовательностях ДНК или информацию об аминокислотных последовательностях. В данном случае банк биомолекул содержит информацию о последовательностях ДНК, где любая указанная информация транслируется в информацию об аминокислотных последовательностях для последующей обработки на стадиях (Ь)-(с), в которых аминокислотные последовательности используют в качестве запрашиваемых последовательностей биомолекул и в качестве мотивов аминокислотной последовательности; или на стадиях (Ь)-(с), которые проводят в банке последовательностей ДНК с использованием запрашиваемых последовательностей биомолекул и мотивов последовательностей (с1)-(с6), подвергнутых обратной трансляции в последовательность ДНК.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения идея настоящего изобретения применяется в варианте осуществления (В) на стадии (а), проводимой с использованием банка биомолекул в физическом формате банка генов, в частности генной библиотеки, такой как библиотека кДНК, метагеномная или геномная библиотека, где используются молекулы ДНК, кодирующие всю или, по меньшей мере, характерную часть по меньшей мере одной (К)-селективной ω-трансаминазы для поиска, идентификации и отбора группы последовательностей первых биомолекул, в частности молекул последовательности ДНК, которые, как рассчитано на уровне аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 32% идентичны запрашиваемой последовательности молекулы ДНК. Последующую стадию (с) предпочтительно осуществляют в указанной группе первых молекул ДНК с использованием нуклеотидных молекул-праймеров, позволяющих идентифицировать и проводить позитивный и негативный отбор желаемых мотивов последовательностей (с1)-(с6).

В контексте настоящего изобретения термин мотив последовательности означает специфические селективные признаки аминокислотной последовательности предполагаемой (К)-селективной ωтрансаминазы, как конкретно идентифицировано на стадии (с) заявленного способа. В частности, первым мотивом последовательности (с1) является мотив последовательности, который был идентифицирован в положениях 95-97, имеющих аминокислотную последовательность Туг-Ха1-Ха2 в указанном порядке, где Ха1 представляет собой аминокислоту 11е, Уа1, Ьеи, Ме!, Рйе и Ха2 представляет собой аминокислоту Агд или Ьу5; и который согласно настоящему изобретению не должен присутствовать в конечной отобранной последовательности биомолекулы. Вторым мотивом последовательности (с2) является мотив

- 6 022764 последовательности, который был идентифицирован в положениях 97-99, имеющих аминокислотную последовательность Туг-Хаа-С1и в указанном порядке, где Хаа представляет собой любую аминокислоту; и в положениях 105-111, предпочтительно в положениях 107-109, имеющих аминокислотную последовательность Агд-Хаа-Ха3, в указанном порядке, где Хаа представляет собой любую аминокислоту и Ха3 предпочтительно представляет собой аминокислоту Шз, причем указанный мотив также не должен присутствовать в конечной отобранной последовательности биомолекулы. Третьим мотивом последовательности (с3) является мотив последовательности, характеризующийся присутствием ТЬг в положении 38, Ьуз в положении 97, и присутствием аминокислотной последовательности Агд-Ха4-Ха5 в положениях 107-109, где Ха4 предпочтительно представляет собой аминокислоту С1у, и Ха5 предпочтительно представляет собой аминокислоту Туг, причем указанный мотив (с3) не должен присутствовать в конечной отобранной последовательности биомолекул.

Четвертый мотив последовательности (с4) должен иметь в положении 95 другую аминокислоту, не являющуюся Туг, Агд, Ьуз, или он должен иметь Туг в положении 95, но в положении 97 он не должен иметь Агд или Ьуз, что позволяет идентифицировать предполагаемую (К)-селективную ω-трансаминазу, полученную согласно настоящему изобретению. Пятый мотив последовательности (с5), присутствующий в полученной и идентифицированной предполагаемой (К)-селективной ω-трансаминазе, должен иметь в положении 40 аминокислоту, не являющуюся Ьуз и Агд. Шестой мотив последовательности (с6), присутствующий в полученной и идентифицированной (К)-селективной ω-ТА, должен иметь в области от положения 161 до положения 165 по меньшей мере одну аминокислоту Ьуз, предпочтительно одну аминокислоту Ьуз, и в положении 163 предпочтительно аминокислоту Ьуз.

В контексте настоящего изобретения идентификация и определение локализации положений аминокислот описаны ниже. Первые последовательности биомолекул-мишеней подвергают выравниванию, предпочтительно множественному выравниванию друг с другом и с запрашиваемой последовательностью биомолекулы. Выравнивание может быть осуществлено с использованием стандартной компьютерной программы для выравнивания, такой как 8ТКАР, в частности С1из1а1^. предпочтительно С1из1а1\У3О. В другом варианте осуществления выравнивание этих последовательностей можно также осуществлять попарно, то есть каждую первую последовательность биомолекулы-мишени можно сопоставить с запрашиваемой последовательностью биомолекулы. В предпочтительном варианте осуществления первые последовательности биомолекулы-мишени можно сопоставить с ВСАТ Е. сой. В другом предпочтительном варианте осуществления первую последовательность биомолекулы-мишени можно сопоставить с другой запрашиваемой последовательностью биомолекулы, используемой в настоящем изобретении, например (К)-селективной ω-трансаминазы.

Нумерация положений аминокислот, представленных в настоящем изобретении, определяется положением соответствующего мотива последовательности в запрашиваемой последовательности биомолекулы, используемой в качестве позиционного стандарта. Описанное в данном описании сопоставление соответствующих положений аминокислот осуществляют путем выравнивания последовательностей первой биомолекулы-мишени с последовательностями мотивов, присутствующих в запрашиваемой последовательности биомолекулы.

В качестве примера, в целях идентификации положений 95-99 в предполагаемой ω-трансаминазе, которые были проанализированы на отсутствие мотивов (с1)-(с3) и на присутствие мотива (с4), в качестве стандарта для указания положений использовали известную аминокислотную последовательность ВСАТ Е. сой от положения 92 до положения 100, а именно последовательность Т§АУ1КРЫ (5>ЕО ГО N0: 9). Известная аминокислотная последовательность от положения 35 до положения 42, а именно последовательность УРЕОШСУ (5>ЕО ГО N0: 10) ВСАТ Е. сой имеет О в положении 38 для мотива последовательностей (с3) и (с5). Аминокислотная последовательность ΌνΟΜΟνΝΡ в аминокислотной последовательности ВСАТ Е. сой (5>ЕО ГО N0: 11) от положения 104 до положения 111 имеет мотив (с3) в положениях 105-111. Аминокислотная последовательность РТААΚАООN в положениях 159-167 известной последовательности ВСАТ Е. сой (5>Е0 ГО N0: 12) имеет в положении 163 аминокислоту К в мотиве последовательности (с6).

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная биомолекула представляет собой белок и последовательность биомолекулы представляет собой аминокислотную последовательность. Соответственно в одном из предпочтительных вариантов изобретения банком биомолекул является банк, в частности база данных, где указанным банком является банк, содержащий собранную информацию о различных белках, в частности информацию о конкретных аминокислотных последовательностях. Предпочтительными банками являются база данных белков NСΒI, база данных ишРгоЖВ/ЗдаззРго! и база данных итРгоЖВ/ТгЕМВЬ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения биомолекула также может представлять собой молекулу ДНК и последовательность биомолекулы может представлять собой последовательность ДНК. Соответственно в одном из вариантов осуществления банком биомолекул является банк, в частности база данных, в которой собрана информация о различных полинуклеотидных последовательностях, в частности о последовательностях ДНК.

- 7 022764

В предпочтительном варианте осуществления изобретения применяется способ, описанный выше, где банком биомолекул является база данных биомолекул, и поиск в этой базе данных биомолекул осуществляют, как описано на стадии (Ь) с помощью программы выравнивания последовательностей биомолекул, в частности ВЬЛ§Т. В предпочтительном варианте осуществления предусматривается, что если банком биомолекул является база данных, то эту базу данных скринируют на стадии (Ь) либо на любую аминокислотную последовательность, если такой базой данных биомолекул является база данных аминокислотных последовательностей, либо на последовательность ДНК, если такой базой данных биомолекул является база данных последовательностей ДНК.

В настоящим изобретением предусмотрена конечная стадия (6) для обеспечения биомолекулы, предпочтительно молекулы ДНК или молекулы аминокислотной последовательности, то есть белка, либо путем синтеза трансаминазы бе ηονο, либо путем выделения из существующего банка генов полинуклеотидов, кодирующих желаемую трансаминазу, с помощью праймеров, где полинуклеотиды определены на основе вторых последовательностей биомолекул. Полученные полинуклеотиды, в частности молекулы последовательности ДНК, экспрессируют в соответствующих условиях в культуральной среде, подходящей для экспрессии желаемой трансаминазы.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга и идентификации (К)-селективной ωтрансаминазы, включающему вышеописанные стадии (а)-(с), в частности обеспечение по меньшей мере одной запрашиваемой последовательности биомолекулы, по меньшей мере одной (К)-селективной ωтрансаминазы и по меньшей мере одного банка биомолекул; поиск в банке биомолекул запрашиваемой последовательности биомолекулы для идентификации группы первых последовательностей биомолекулмишеней, где первые последовательности биомолекул по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 25% и более предпочтительно на 32% идентичны запрашиваемой последовательности биомолекулы, как рассчитано на уровне аминокислотной последовательности; отбор в группе первых последовательностей биомолекул-мишеней, которые не содержат на уровне аминокислотной последовательности каких-либо мотивов последовательностей (с1)-(с3), а именно мотива (с1), имеющего в положениях 95-97 аминокислотную последовательность Туг-Ха1-Ха2, где Ха1 представляет собой аминокислоту 11е, Уа1, Ьеи, Ме1. РЬе и Ха2 представляет собой аминокислоту Лтд или Ьуз, или мотива (с2), имеющего в положениях 9799 аминокислотную последовательность Тут-Хаа-ΟΙη, где Хаа представляет собой любую аминокислоту, и в области от положения 105 до положения 111, предпочтительно в положениях 107-109, аминокислотную последовательность Агд-Хаа-Ха3, где Ха3 представляет собой аминокислоту, предпочтительно Шз, или мотива (с3), имеющего ТЬг в положении 38, Ьуз в положении 97, и в положении 107-109 аминокислотную последовательность Агд-Ха4-Ха5, где Ха4 представляет собой аминокислоту, предпочтительно О1у, и Ха5 представляет собой аминокислоту, предпочтительно Туг, и которые содержат мотивы (с4), (с5) и (с6), а именно мотив (с4), который имеет на аминокислотном уровне в положении 95 другую аминокислоту, не являющуюся Туг, Агд, Ьуз, либо в положении 95 аминокислоту Туг, и в положении 97 аминокислоту, не являющуюся Агд или Ьуз; мотив (с5), который в положении 40 не имеет Ьуз или Агд, и мотив (с6), который в области от положения 161 до положения 165, предпочтительно в положении 163 имеет Ьуз, чтобы идентифицировать группу вторых последовательностей биомолекул, которые представляют собой последовательности биомолекул (К)-селективной ω-ТА.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к (К)селективным ω-трансаминазам, которые могут быть получены с применением способов согласно изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к белкам и к последовательностям ДНК, в частности к молекулам ДНК, кодирующим указанный белок, происходящий из МезогЫ/оЬипп 1οΐϊ и АзретдЫиз 1еттеиз, последовательности которых представлены в §ЕЦ ГО N0: 1 и 2 для МезогЫ/оЬшт 1оЬ и §ЕЦ ГО N0: 3 и 4 для АзретдЫиз 1еттеиз. В конкретном и в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение предусматривает, что (К)-селективные ω-трансаминазы, которые могут быть получены или получены согласно настоящему изобретению, например трансаминазы, которые были идентифицированы в §ЕЦ ГО N0: 1 и 3, могут быть использованы в реакции переаминирования, в частности они могут быть использованы в способе получения оптически активного хирального амина, предпочтительно (К)энантиомера хирального амина, включающем осуществление реакции по меньшей мере одного аминоакцептора и по меньшей мере одного аминодонора с (К)-селективной ω-трансаминазой согласно изобретению, в частности §ЕЦ ГО N0: 1 или 3, и получение оптически активного хирального амина. В предпочтительном варианте осуществления способ получения оптически активного хирального амина представляет собой асимметрический синтез, осуществляемый с использованием соединения, содержащего кетогруппу, предпочтительно кетон, и аминодонора. В другом предпочтительном варианте осуществления способ синтеза осуществляют посредством кинетической реакции разделения. Аминодонором предпочтительно является смесь рацемических аминов, и аминоакцептором предпочтительно являются кетоны, используемые в качестве продуктов извлечения.

В предпочтительном варианте осуществления оптически активный хиральный амин синтезируют из кетонов с использованием (К)-селективной ω-трансаминазы согласно изобретению методом асимметрического синтеза, где степень превращения в требуемый оптически активный хиральный амин, то есть

- 8 022764 (К)-энантиомер, составляет по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98, 99, 99,5% и наиболее предпочтительно 100%.

В другом предпочтительном варианте осуществления (К)-селективную ω-трансаминазу согласно изобретению используют в кинетической реакции разделения рацемических аминов, где степень превращения в требуемый оптически активный хиральный амин, то есть (8)-энантиомер, предпочтительно составляет по меньшей мере 30, 40, 45, 46, 47, 48, 49%, в частности 50%.

Концентрации для анализа оптической чистоты и степени превращения могут быть определены, например, с помощью ВЭЖХ, капиллярного электрофореза (КЭ), газовой хроматографии (ГХ) или оптическими или флуориметрическими методами.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения оптически активного хирального амина, включающему осуществление реакции аминоакцепторного соединения, содержащего кетогруппу, и рацемической смеси амина в присутствии трансаминазы, в частности (К)-селективной ω-трансаминазы, предпочтительно трансаминазы согласно изобретению, с получением (8)-энантиомера хирального амина.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения оптически активного хирального амина, в частности (К)-энантиомера указанного амина, включающему осуществление реакции аминоакцепторного соединения, содержащего кетогруппу, и аминодонора в присутствии (К)-селективной ω-трансаминазы, в частности трансаминазы, которая может быть синтезирована согласно настоящему изобретению, с получением (К)-энантиомера указанного амина.

В контексте настоящего изобретения аминоакцептором является молекула, способная принимать аминогруппу, переносимую от аминодонора посредством трансаминазы, в частности ω-трансаминазы. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аминоакцептор содержит функциональную кетоновую группу.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аминоакцептор выбран из группы, состоящей из фенилпировиноградной кислоты и ее соли, пировиноградной кислоты и ее соли, ацетофенона, 2-кетоглутарата, 3-оксобутирата, 2-бутанона, 3-оксопирролидина (3-ОР), 3пиридилметилкетона (3-РМК), этилового эфира 3-оксомасляной кислоты (3-ОВЕЕ), метилового эфира 3оксопентановой кислоты (3-ОРМЕ), Ν-1-Ьое-оксопиперидинона, Ы-1-Ьос-3-оксопирролидина (В3ОР), 3оксопиперидина, ^1-Ьос-3-оксопиперидина (В3ОР1), 1-СЬ/-3-оксопиперидина (С3ОР1), 1-С6/-3оксопирролидина (С3ОР), алкил-3-оксобутаноатов, метоксиацетона и 1-оксотетралона.

В контексте настоящего изобретения аминодонором является молекула, способная переносить аминогруппу на аминоакцептор под действием трансаминазы, в частности ω-трансаминазы. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанным аминодонором является амин или аминокислота.

В особенно предпочтительном варианте осуществления аминодонор выбран из группы, состоящей из β-аланина, аланина, α-метилбензиламина (α-МВА), глутамата, фенилаланина, глицина, 3аминобутирата, изопропиламина, 2-аминобутирата и γ-аминобутирата или их солей, например хлорида любого из указанных соединений. В особенно предпочтительном варианте осуществления полученным кетоновым продуктом может быть фенилпировиноградная кислота и ее соль, пировиноградная кислота и ее соль, глиоксиловая кислота и ее соль, ацетофенон, 2-кетоглутарат, ацетон, 3-оксобутират, 2-бутанон, 3-оксопирролидин (3-ОР), 3-пиридилметилкетон (3-РМК), этиловый эфир 3-оксомасляной кислоты (3ОВЕЕ), метиловый эфир 3-оксопентановой кислоты (3-ОРМЕ), Ν-1-Ьос-оксопиперидинон и ^1-Ьос-3оксопирролидин (В3ОР), или их соли, например хлорид любого из этих соединений.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу получения оптически активного хирального амина, выбранного из группы аминов, имеющих оптически активную аминогруппу, в частности аминов с алкильными группами, разветвленными алкильными группами или с арилалкильными группами. Более конкретно, указанные амины, в частности моно- или бициклические амины, представляют собой аминопроизводные 5-6-членных циклических углеводородов или 8-, О- или Ν-замещенных гетероциклических углеводородов, или ароматические амины, в частности алкил- или алкоксизамещенные ароматические амины. В предпочтительном варианте осуществления полученные хиральные амины выбраны из группы, состоящей из фенилаланина, аланина, 3-аминопиперидина, алкил3-аминобутаноатов, 3-аминопирролидина (3-АР), 3-пиридил-1-этиламина (3-РЕА), ^1-Ьос-3аминопирролидина (В3АР), ^1-Ьос-3-аминопиперидина (Β3ΑΡί), 1-СЬ/-3-аминопиперидина (С3АР1), 1СЬ/-3-аминопирролидина (С3АР), этилового эфира 3-аминомасляной кислоты (3-АВМЕ), метилового эфира 3-аминопентановой кислоты (3-АРМЕ), α-метилбензиламина (α-МВА), 1-аминотетралина, 3,4диметоксифенилацетона, а-метил-4-(3-пиридил)бутанамина, γ-аминобутирата, глутамата, изопропиламина, β-аминобутирата, втор-бутиламина, метоксиизопропиламина, производных 3-аминопирролидина, 1-^Вос-3-аминопиперидина, цефалоспорина и производных цефалоспорина.

В особенно предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции 3ОР с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-3АР.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции 3-РМК

- 9 022764 с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-3-РЕА.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции 3ОВЕЕ с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-3АВЕЕ.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции 3ОРМЕ с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-3АРМЕ.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции В3ОР с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-В3АР.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции Β3ΘΡί с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (Κ)-Β3ΑΡί.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции С3ОР1 с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-С3АРт

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции С3ОР с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-С3АР.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции ацетофенона с (К)-селективной ω-трансаминазой и аминодонором, с получением оптически активного (К)-аΜΒΑ.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение включает проведение реакции аминоакцептора, в частности моно- или бициклических 5-6-членных циклических углеводородов, содержащих оксогруппу, или из 8-, О- или Ν-замещенных гетероциклических углеводородов, или ароматических аминов, в частности алкил- или алкоксизамещенных ароматических аминов, с аминодонором и (К)селективной ω-трансаминазой, с получением аминов, в частности моно- или бициклических аминов, например аминопроизводных 5-6-членных циклических углеводородов или 8-, О- или Ν-замещенных гетероциклических углеводородов, или ароматических аминов, в частности алкил- или алкокси-замещенных ароматических аминов, например, в (К)-форме.

В особенно предпочтительном варианте осуществления аминоакцептор и аминодонор подвергают реакции с трансаминазой в водной среде, например в физиологическом буфере. В особенно предпочтительном варианте осуществления реакцию переаминирования осуществляют при рН от 5 до 9, в частности от 7 до 8,5. В особенно предпочтительном варианте осуществления реакцию осуществляют при температуре 10-65°С, предпочтительно 20-50°С, например при 18-25°С, и предпочтительно при комнатной температуре или при 34-39°С, в частности 37°С. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молярное отношение аминоакцептора к аминодонору составляет 1:1-1:5, в частности 1:1-1:2. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментативная активность может составлять от 1 до 20000 мкмоль/мин.

Настоящее изобретение также относится к способу анализа трансаминазы, в частности к способу характеризации свойств трансаминазы, включающему следующие стадии:

ί) обеспечение заряженного аминоакцептора, заряженного аминодонора и трансаминазы, предпочтительно ω-трансаминазы, и наиболее предпочтительно (К)-селективной ω-трансаминазы, которые могут быть синтезированы способом согласно изобретению;

ίί) осуществление реакции аминоакцептора и аминодонора с трансаминазой в реакционной среде и тем самым ίίί) определение проводимости реакционной среды в первом наборе реакционных условий;

ίν) после проведения стадии ίίί) определение проводимости реакционной среды во втором наборе реакционных условий с последующим вычислением по меньшей мере двух величин проводимости, отражающих свойства трансаминазы.

В процессе проведения катализируемой трансаминазой и предпочтительно ω-ТА-катализируемой реакции заряженных субстратов, например аминодонора, предпочтительно амина, и аминоакцептора, и предпочтительно кетокислоты, например пирувата, проводимость снижается, поскольку в данном случае образуются незаряженный кетон и цвиттерионный аминокомпонент, предпочтительно аминокислота, например аланин.

кетон цвиггерионные/ незаряженные продукты

Λ © рГОсоо кето кислота

зженные ) страты

Способ анализа согласно изобретению позволяет осуществлять простой мониторинг прохождения реакции. Во избежание получения слишком высоких исходных значений проводимости наиболее предпочтительно использовать буфер с низкой проводимостью, в частности буфер на основе СНЕ8 (Ν- 10 022764 циклогексил-2-аминоэтансульфоновой кислоты) с низкой проводимостью.

Калибровка проводимости может быть предпочтительно осуществлена путем имитации различных превращений. В качестве примера для пары стандартных субстратов, таких как α-метилбензиламин и пируват, 1 мМ превращение соответствует изменению 44 мкС. Сравнение измеренных скоростей реакции с помощью капиллярного электрофореза давало превосходное подтверждение надежности способа согласно изобретению. Клеточные экстракты не оказывали какого-либо значительного влияния на эффективность способа согласно изобретению. Поскольку пируват является наиболее распространенным аминоакцептором фактически для всех ω-ТА, то этот способ может быть применен в исследованиях трансаминазной активности в отношении различных аминодоноров. Кроме того, может быть также получена информация об энантиоселективности данного фермента.

В данном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу анализа трансаминазы, в частности к способу характеризации свойств трансаминазы, которые позволяют проводить анализы на активность трансаминазы в зависимости, например, от величины рН или температуры реакционной среды, а также анализы на стабильность реакции, на влияние добавок или состава буферов.

Согласно настоящему способу анализа первое измерение проводимости реакционной среды осуществляют в первом наборе реакционных условий и затем осуществляют по меньшей мере одно второе измерение проводимости реакционной среды для сравнения двух полученных величин проводимости и для анализа величин активности и свойств трансаминазы. Снижение проводимости указывает на активность трансаминазы согласно изобретению в трансаминазной реакции. Медленное снижение, ускоренное снижения или отсутствие снижения проводимости позволяет сделать выводы о свойствах трансаминазы.

В контексте настоящего изобретения набором реакционных условий является предпочтительно набор реакционных условий, выбранный из группы, состоящей из температуры, величины рН и состава реакционной среды, предпочтительно реакционных условий, идентифицированных выше, за исключением концентрации выделенных веществ и продуктов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения набор реакционных условий сохраняют постоянным в течение всего периода прохождения реакции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения набор реакционных условий может быть изменен в течение всего периода прохождения реакции.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к такому способу анализа трансаминазы, в котором реакционной средой является буфер с низкой проводимостью. В особенно предпочтительном варианте осуществления указанного способа заряженным аминоакцептором является пируват.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ анализа трансаминазы осуществляют после получения (К)-селективной ω-трансаминазы согласно изобретению, и такой способ согласно изобретению может быть применен не только для получения новых и ценных (К)селективных ω-трансаминаз, но также для определения их свойств.

Другими предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются объекты изобретения, представленные в зависимых пунктах формулы изобретения.

Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих примерах и в прилагаемом списке последовательностей.

8Еф ГО N0: 1 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (ОКБ) (К)-селективной ω-ТА, происходящей из Мсзойй/оЬинп Ιοίί;

8Еф ГО N0: 2 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую 8Еф ГО N0: 1;

8Еф ГО N0: 3 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (ОКБ) (К)-селективной ω-ТА, происходящей из АкретдШик (сггсщ;

8ЕС ГО N0: 4 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую 8Еф ГО N0: 3;

8Еф ГО N0: 5 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КБ) (К)-селективной ω-трансаминазы, происходящей из МусоЬас1епит аигит;

8ЕС ГО N0: 6 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую 8Еф ГО N0: 5;

8Еф ГО N0: 7 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КБ) (К)-селективной ω-трансаминазы, происходящей из Аг1йгоЬас1ег §р.;

8ЕС ГО N0: 8 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую 8Еф ГО N0: 7;

8Еф ГО N0: 9 представляет собой мотив последовательности ВСАТ Е. сой, используемый для определения аминокислот в положениях 95-99;

8Еф ГО N0: 10 представляет собой мотив последовательности ВСАТ Е. сой, используемый для определения аминокислоты в положении 38;

8Еф ГО N0: 11 представляет собой мотив последовательности ВСАТ Е. сой, используемый для определения аминокислоты в положении 107;

8Еф ГО N0: 12 представляет собой мотив последовательности ВСАТ Е. сой, используемый для определения аминокислоты в положении 163;

8Еф ГО N0: 13 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из РешсШшт сйтукодеиит;

- 11 022764 §ЕЦ ГО N0: 14 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (ОКБ) 8ЕЦ ГО N0: 13;

§ЕЦ ГО N0: 15 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из АврегдШив шдег;

§ЕЦ ГО N0: 16 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (ОКЕ) 8ЕЦ ГО N0: 15;

§ЕЦ ГО N0: 17 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ΤΑ, происходящую из АврегдШив огу/ае;

§ЕЦ ГО N0: 18 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 17;

§ЕЦ ГО N0: 19 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из АврегдШив Гит1да1ив;

§ЕЦ ГО N0: 20 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 19;

§ЕЦ ГО N0: 21 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из №оваг№гуа ГйеНеп;

§ЕЦ ГО N0: 22 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 21;

§ЕЦ ГО N0: 23 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из С1ЬЬеге11а /еае,§ЕЦ ГО N0: 24 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 23;

§ЕЦ ГО N0: 25 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из Нурйотоиав иерШишт;

§ЕЦ ГО N0: 26 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 25;

§ЕЦ ГО N0: 27 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из МевогЫ/оЬшт 1ой МАЕЕ303099;

§ЕЦ ГО N0: 28 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 27;

§ЕЦ ГО N0: 29 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из КовеоЬас1ег ер.;

§ЕЦ ГО N0: 30 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 29;

§ЕЦ ГО N0: 31 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из Магшотоиав ер.;

§ЕЦ ГО N0: 32 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 31;

§ЕЦ ГО N0: 33 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из КЫ/оЬшт еШ;

§ЕЦ ГО N0: 34 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 33;

§ЕЦ ГО N0: 35 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из КкойоГегах Гетгейисепв;

§ЕЦ ГО N0: 36 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 35;

§ЕЦ ГО N0: 37 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из 1апиавсЫа ер.;

§ЕЦ ГО N0: 38 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 37;

§ЕЦ ГО N0: 39 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из йаЬгеп/1а а1ехапйги;

§ЕЦ ГО N0: 40 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 39;

§ЕЦ ГО N0: 41 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из Вигк1ю1йепа ер.;

§ЕЦ ГО N0: 42 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) 8ЕЦ ГО N0: 41;

§ЕЦ ГО N0: 43 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из Вигк1ю1йепа сепосераша;

§ЕЦ ГО N0: 44 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ)

- 12 022764

ЗЕр ΙΌ N0: 43;

ЗЕР ΙΌ N0: 45 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из альфа-протеобактерии;

ЗЕР ГО N0: 46 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) ЗЕр ГО N0: 45;

ЗЕР ГО N0: 47 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из гамма-протеобактерии;

ЗЕр ГО N0: 48 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) ЗЕр ГО N0: 47;

ЗЕр ГО N0: 49 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую (К)-селективную ω-ТА, происходящую из МусоЬас!етшт уапЬаа1епи и

ЗЕр ГО N0: 50 представляет собой полноразмерную аминокислотную последовательность (0КЕ) ЗЕр ГО N0: 49.

На фиг. 1 представлена хроматограмма В3АР1, полученного методом стандартного синтеза; на фиг. 2 представлена хроматограмма В3АР1, полученного методом асимметрического синтеза согласно изобретению;

на фиг. 3 представлена хроматограмма С3АР, полученного методом асимметрического синтеза согласно изобретению;

на фиг. 4 представлена хроматограмма МРРА, полученного методом асимметрического синтеза согласно изобретению;

на фиг. 5 представлена хроматограмма В3АР, полученного методом асимметрического синтеза согласно изобретению.

Примеры

Пример 1. Идентификация (К)-селективных ω-трансаминаз.

Аминокислотную последовательность (К)-селективной ω-ТА МусоЬас!егшт аигит, представленную в ЕР 1038953 А1 (ЗЕр ГО N0: 5) и аминокислотную последовательность (К)-селективной ω-ТА Аг!ЬгоЬас!ег зр., представленную в ЕР 0987332 А1 (ЗЕр ГО N0: 7), использовали в качестве запрашиваемой последовательности биомолекулы. В данном примере используемым банком биомолекул является опубликованная база данных белков NСВI (Ьбр://(в.псЬЕп1т.тЬ.доу/риЬте6 (13 июля 2009 г.).

Используя программу поиска ВЬАЗТ с аминокислотной последовательностью ω-ТА из М. аигит или Аг1ЬгоЬас!ег зр. (ЗЕр ГО N0: 5 или 7) в качестве запрашиваемой и используя стандартные параметры (оценочная матрица ВЬ0ЗИМ62, длина слова: 3, штрафы на пробел: пробел на наличие - 11, пробел на удлинение - 1), идентифицировали группу из 100 различных аминокислотных последовательностей, из различных организмов, которые все были минимум на 30% идентичны запрашиваемой последовательности.

Для ВЬАЗТ неизбыточные белковые последовательности (пг) (Ьбр://Ь1азЕ псЬЕ п1т. тЬ. доу/В1аз(. сд1?РК00КАМ=Ь1аз1р&ВЕАЗТ_Р К0СКАМЗ=Ь1аз1р&РАСЕ_ТУРЕ=В1аз1ЗеагсЬ&ЗН0^_ИЕРАиЕТЗ оп&Е1\К Е0С ЫазЕюте) использовали 13 июля 2009 г. В этой первой группе из 100 различных аминокислотных последовательностей, представляющих собой первые последовательности биомолекул-мишеней, путем поиска мотивов последовательностей были выявлены и идентифицированы последовательности, которые не содержат мотивов последовательностей с1), с2) или с3) и которые содержат мотивы последовательностей с4)-с6). Была идентифицирована 21 0КЕ, которые перечислены ниже в табл. 1.

- 13 022764

Таблица 1

Νο.	Организмы-источники	% идентичности Α5-ωΤΑ МАчо-ТА 5Е<2 ГО7 5Е(3 ГО6	(база данных А1СВ1)
1	АзрегдШиз 1агтеи$ ΝΙΗ2624	44	40	115385557
2	РвпкПИит скгузодепит ИЛзсол&л 54-1255	44	42	211591081
3	АврегдШиз тдег	40	36	145258936
4	АзрагдШиз огугве ΡΙΒ40	41	40	169768191
5	АзрегдШиз Гит&а1из А1293	41	38	70986662

6	Ыеозапогуа Пзскеп ΝΡΡί. 181	41	38	119483224
7	С/ЬРагеНа гаае РН-1	40	39	46109763
8	Нуркотопаз пер!итит АТСС 15444	44	40	114797240
9	МусоЬас1елит уапЬаа/епн ΡΥΡ-1	50	91	120405468
10	МезогЫгоЫит 1оЧ МАРР303099	38	37	13471580
11	МезогЛггоЫит ΙοΙί	35	37	20604076
12	ВозеоЬа&ег зр. МЕО193	37	37	86137542
13	Маппотопаз зр. МЕО121	36	34	87122653
14	РМгоЫит е№ С!АТ 652	33	32	190895112
15	РкосМегах /етгедисапз Т119	38	36	89899273
16	ЗаппазсЫа зр. СС81	37	32	89053613
17	ЬаЬгепгк а/ехалОл/ ОРИ-11	42	36	ЕЕЕ43073
18	ВигккоМепа зр. 383	32	32	78059900
19	виЛйойела сепосерэаа ΗΙ2424	36	33	АВК12047
20	Альфа-протеобакгерия НТСС2255	36	34	ΖΡ 01448442
21	Гамма-протеобактерия	27	26
	МусоЬас1елит аигит	49	100	ΘΕΟ ГО 5
	Аг1кгоЬас1ег зр.	100	49	8ЕО ГО 7

А8: АзрегдШиз §р.,

МА: МусоЪас1епит аигит.

Пример 2. Получение и анализ трансаминаз, происходящих из АкрегдШик 1еггеи8, МусоЪайегшт уаиЪаа1епй и МеюгЫ/оЬшш 1ой.

2.1. ω-ТА из МусоЪайегшт уаиЪаа1епи, номер 9 в табл. 1 (§ЕЦ ГО N0: 49 и 50), из АкрегдШик 1еггеи8, номер 1 в табл. 1 (8ЕЦ ГО N0: 3 и 4) и МеюгЫ/оЪшш 1ой, номер 11 в табл. 1 (8ЕЦ ГО N0: 1 и 2) были получены и использованы в форме, адаптированной с точки зрения встречаемости кодонов (для Е. сой), для экспрессии указанных трансаминаз в ЕксйейсЫа сой. Трансаминаза из МусоЪайегшт уаиЪаа1епй далее обозначается Муа-ТА, трансаминаза из АкрегдШик 1еггеи8 обозначается А1е-ТА и трансаминаза из Ме5ог1й/оЪшш 1ой обозначается М1о-ТА.

2.2. Анализ на ацетофенон.

В анализе на ацетофенон, проводимом с использованием 2,5 мМ амина и 2,5 мМ пирувата при рН 7,5 и 30°С, Муа-ТА и А1е-ТА превращались в (К)-а-МВА по меньшей мере в 100 раз быстрее, чем в (§)энантиомер.

Анализ: мониторинг увеличения абсорбции ацетофенона, образующегося в процессе реакции, проводили на длине волны 245 нм.

М1о-ТА не превращался ни в (К)-а-МВА, ни в (§)-а-МВА.

Затем тестировали другие амины в присутствии пирувата или α-кетоглутарата, используемых в качестве аминоакцепторов (10 мМ амин, 10 мМ пируват, 0,1 мМ РЬР, фосфатный буфер рН 7,5, инкубацию в течение 24 ч при 30°С, анализ методом тонкослойной хроматографии).

Превращение наблюдалось для 2-аминогептана, 2-аминопентана, 1,3-диметилбутиламина и 4фенил-2-аминобутана. Также детектировалось минимальное превращение изопропиламина.

Какого-либо превращения с использованием других аминодоноров, таких как Ό-аланин, Ь-валин, γаминобутират, этиламин, бензиламин, путресцин, 2-амино-3-метилбутан и 3,3-диметил-2-аминобутан, не наблюдалось.

Таким образом, было обнаружено, что все три белка представляют собой ω-ТА.

При использовании (К)- и (§)-2-аминогексана в качестве субстрата заметное превращение наблюдалось только для (К)-энантиомера. Таким образом, М1о-ТА также представляет собой (К)-селективную ωТА. Какой-либо ОАТА-активности (активность Ό-аминокислота-трансаминазы)) или ВСАТ-активности (активности аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью) для всех трех белков не наблюдалось.

2.3. Анализ проводимости 1-Л-Ъос-3-аминопирролидин (В3АР), 1-Л-Ъос-3-аминопиперидин.

(В3АР1) и 1-СЪ/-3-аминопиперидин (С3АР1) также использовали в качестве субстратов для определения относительной активности этих веществ в отношении субстрата-модели α-МВА.

Ход реакции амина и пирувата (при рН 7,5 оба субстрата заряжены) в аланин и кетон (кетон не заряжен, аланин представляет собой цвиттерионное соединение и не влияет на проводимость) подвергали мониторингу кинетики проводимости, что позволяет вычислить степень превращения.

- 14 022764

Перед началом реакции проводили вычисление различных уровней превращения в зависимости от различных концентраций аланина, пирувата, кетона и амина.

Снижение проводимости при превращении 1 мМ α-МВА, В3АР, В3АР1 и С3АР1 составляло 44, 50, 48,5 и 49,3 мкСм.

А дополнение к трем рекомбинантно экспрессированным трансаминазам тестировали коммерчески доступную (К)-селективную АТА-117, поставляемую Собех18, в следующих реакционных условиях: 50 мМ буфер СНЕ§, рН 7,5, рН корректировали с использованием ΒΙδ-ΤΚΙδ (=бис-(2-гидроксиэтил)аминотрис-(гидроксиметил)метан), 0,1 мМ РЬР, 5-6 мМ амина и пирувата, при температуре реакции 25°С.

Превращение субстратов было показано для А1е-ТА. Относительная активность в отношении (К)-аМВА составляла 2% для (К)-В3АР и (К,§)-С3Ар1 и 1 % для (К)-В3АРг

2.4. Определение энантиоселективности при асимметрическом синтезе аминов (К)-селективных ωТА, происходящих из А8рег§Ши8 1еггеи8 и Ме8ог1й/оЬц.ип 1об.

Независимый метод показал, что М1о и А1е-ТА являются (К)-селективными и обладают способностью превращать субстраты в требуемые продукты с превосходной энантиоселективностью.

Окончательное подтверждение (К)-энантиоселективности обоих трансаминаз было проведено при асимметрическом синтезе различных аминов с последующим определением их оптической чистоты.

В качестве аминодонора использовали 100-кратный избыток аланина. Превращение оценивали не точно, а путем приблизительной оценки. В других экспериментах могут быть проведены различные методы с увеличением степени превращения (РОС). Для обеих трансаминаз была получена высокая или очень высокая энантиоселективность, за исключением С3АР1, для которой была получена только очень низкая энантиоселективность.

Таблица 2

	АЪе-ТА	ΜΙο-ΤΑ
Амин	% э.и.	% превращения	% Э.И.	% превращения
В ЗАР	99,8	40+20	-	-
СЗАР	99,6	40+20	-	-
Β3ΑΡί	>99,9	30±20	-	-
СЗАР1	49	30±20 '	-	-
МРРА	-	-	98	15+10

Методы.

Трансаминазы экспрессировали в Е. соН ВЬ21.

Культуральную среду (50 мл среды ЬЭ-Атр) индуцировали 0,2% рамнозой, и когда оптическая плотность (ΟΌ) составила 0,5, среду культивировали в течение 12 ч при 25°С. Затем клетки промывали фосфатно-натриевым буфером, центрифугировали, суспендировали в 1 мл фосфатно-натриевого буфера (рН 7,5) и замораживали в виде 200 мкл аликвот.

Для биокатализа ко всем аликвотам добавляли 5 мкл 500 мМ раствора кетона в ДМСО, 22 мг Όаланина и 10 мкл 10 мМ РЬР. Реакционную смесь доводили до общего объема 500 мкл добавлением 50 мМ фосфатно-натриевого буфера (рН 7,5). Реакционные смеси инкубировали в течение ночи при 25°С и 500 об/мин. Для определения энантиомерного избытка посредством СЕ к 400 мкл образца добавляли 200 мкл 1н. ЫаОН, экстрагировали 400 мкл дихлорметана и затем органическую фазу отделяли. После этого органическую фазу экстрагировали 100 мкл 5 мМ триэтиламмоний-фосфатного буфера (рН 3). Затем полученную водную фазу вводили в СЕ.

Протокол разделения.

Оборудование: капиллярный электрофорез: колонка СЕ-СарШаге: высота 30 см, внутренний диаметр 50 мкм, температура 15°С.

Промывка: триэтиламмоний-фосфатным буфером рН 3, 1 мин, 30 фунт/кв.дюйм.

Промывка: 5% в высокой степени сульфированным циклодекстрином (Ηδαί',Ό или ΗδγΕΌ), 1 мин, 10 фунт/кв.дюйм.

Впрыск: 5-10 с, 1 фунт/кв.дюйм.

Пропитка водой.

Разделение: напряжение 10 или 15 кВ.

Детекция: МРРА, С3АР и С3АИ на 200 нм; В3АР, В3АИ на 190 нм.

- 15 022764

Условия разделения.

Таблица 3

	Разделяющий сегмент Есм]	Хиральный селектор	Время миграции [мин]	Напряжение при разделении
3-амин	К.-амин
МРРА	10	Η3γ€ϋ	2,4	2,8	15 кВ
ВЗАР	10	нзусо	4,55	б , 1	15 кВ
ВЗАРг	20	ΗΒγΟΌ	12,0	12,4	15 кВ
СЗАР	20	нйасо	10,2	11,3	10 кВ
СЗАР1	20	нзасо	6,8	7,2	15 кВ

Пример 4. Получение и анализ всех трансаминаз, идентифицированных в табл. 1.

4.1. Экспрессия и очистка трансаминаз.

Оптимизированные по кодонам открытые рамки считывания, кодирующие белки, представленные в табл. 1 под номерами 1, 2, 3, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18 и 21, встраивали в вектор рСА8ТОЫ между сайтами рестрикции Ыйе1 и ВатН1 с применением стратегии независимого от лигирования клонирования. Оптимизированные по кодонам ОКБ, кодирующие все остальные белки, по порядку субклонировали в рЕТ-22Ь. Трансформированные штаммы ВЬ21 (ΌΕ3) Е. сой культивировали в 400 мл среды ЬВ, в которую добавляли ампициллин (100 мкг/мл). Сначала клетки инкубировали при 37°С на ротационном шейкере до тех пор, пока ОЭ₆₀₀ не достигала 0,7. Затем клетки индуцировали путем добавления 0,2% рамнозы (рСА8ТОЫ) или 0,1 мМ 1РТС (рЕТ-22Ь) соответственно, и за это время инкубации температура снижалась до 20°С. После индуцирования инкубацию продолжали еще 20 ч. Для оценки экспрессии через определенные интервалы времени после индуцирования брали аликвоты.

Клеточный осадок (влажная масса ~3 г) два раза промывали фосфатным буфером (рН 7,5, 50 мМ), содержащим 0,1 мМ РЬР, при 4°С. После измельчения (на френч-прессе) клеточную суспензию центрифугировали (4000хд, 30 мин) и полученный супернатант пропускали через 0,5-мкм фильтр и затем хроматографировали. Хроматографию осуществляли на устройстве АКТА Риййег (СЕ Неаййсаге). Отфильтрованный клеточный экстракт наносили на 5-мл колонку с сефарозой 1МАС (8ерйаго5е™ 6) Ра5! Р1о№ (СЕ Неаййсаге). Колонку промывали со скоростью потока 5 мл/мин 10 колоночными объемами 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 300 мМ ЫаС1, 0,1 мМ РЬР и 30 мМ имидазола (во избежание неспецифического связывания), и фермент АТА элюировали 10 колоночными объемами фосфатного буфера (рН 7,5, 50 мМ), содержащего 300 мМ ЫаС1, 0,1 мМ РЬР и 300 мМ имидазола (со скоростью потока 5 мл/мин). Ферментсодержащие фракции объединяли и обессоливали с помощью гельхроматографии с использованием 20 мМ трицинового буфера, рН 7,5, содержащего 0,01 мМ РЬР. Очищенные ферменты хранили при 4°С.

Количество каждого белка, очищенного приблизительно из 3 г клеток (сырой массы), приведено ниже в табл. 4.

Таблица 4

Номер	Источник фермента	Выход белка после очистки (мг)
1	АврегдШи® (еггеиз	В.6
2	РепгсШшт сЬгузодепит	26.2
3	АервгдП1иэ П|дег
4	ЛзрагдШиз огугае	20.6
5	АзрегдШиз Тит1да1и®	14.8
6	МеозаЛогуа бзсЬеп	23.3
7	Сэ|’ЬЬеге11а геае	4.8
8	ЧурРотопаз пер1игнит	8.5
9	МусоЬас1епит уапЬаа1епи	8.9
10	МезогЬ1гоЬ<ит Ιοίΐ МАРР303099	5.9
11	Мевог1и'гоЫит Ιοϋ	5.3
12	^озеоЬаСТег эр.	27.5
13	Маптопаз эр.	23.7
14	ЧЫгоЬ1ит е(|1	5.5
15	Р№ос1о(егах /егпгебисепз	7.5
16	/аппазсШа ер.	24.8
17	.аЬгегаа а1ехапс)п1	12.5
18	ЗиПФоМепа зр.	41.6
19	ЗигкОоМепа сепосерагаа
20	Ал ьфа-лротео бактерия
21	Памма-протеобактерия	2.6

4.2. Характеризация специфичности (К)-селективной ω-ТА к субстрату.

Для определения активности в отношении α-метилбензиламина (α-МВА) при первоначальном скрининге экспрессированных белков проводили анализ с использованием ацетофенона, где раствор 2,5 мМ (К)- или (8)-а-МВА и пирувата подвергали реакции в присутствии очищенного фермента и определяли корреляцию увеличения оптической плотности на 245 нм с образованием ацетофенона. Проводимость аминов, таких как 2-аминогексан, 4-фенил-2-аминобутан и 1-Ы-Вос-3-аминопирролидин, подвер- 16 022764 гали мониторингу, используя следующий анализ на проводимость: раствор, содержащий 10 мМ амина и пирувата, подвергали реакции в присутствии очищенной аминтрансаминазы и определяли снижение проводимости в зависимости от степени превращения субстрата.

Для исследования ОАТА- и ВСАТ-активности измеряли снижение уровня ΝΛΌΗ на спектрофотометре при длине волны 340 нм, используя следующий анализ на связывание дегидрогеназы: раствор 5 мМ α-кетоглутаровой кислоты и Ό-аланина подвергали реакции в присутствии очищенной трансаминазы, 1 ед./мл лактат-дегидрогеназы и 0,5 мМ NΛ^Η для измерения ОАТА-активности. Для измерения ВСАТ-активности использовали раствор, содержащий 5 мМ 3-метил-2-оксомасляной кислоты и Ьглутамата, 10 мМ хлорида аммония, 1 ед/мл глутамат-дегидрогеназы и 0,5 мМ NΛ^Η.

Все реакции проводили в 20 мМ трициновом буфере, рН 7,5, содержащем 0,01 мМ РЬР. рН буфера корректировали добавлением 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ена.

Результаты представлены ниже в табл. 5.

Таблица 5

Специфические активности для различных субстратов

Субст- раты	Пируват 1	Пируват 2	Пируват 3	Пируват 4	2К6 О-А1а	мое
номер	η	3	β	5	β	8	β	5
1	15.2	<0.001	2.01	<0001	9.7	<0.001	0,031	<0.001	<0.001	0.003
г	1.3	<0.001	1.1	0.044	5.6	<0.001	0.264	<0.001	<0.001	<0.001
3	4
4	3.7	0.001	1.4	0.023	52	0.002	0051	0.002	<0.001	<0.001
&	4.1	<0.001	2.4	<0.001	4.5	<0.001	0.009	<0.001	<0.001	0.005
$	45	<0.001	7.4	<0.001	6.0	<0 001	0.013	<0,001	<0.001	0.005
7	18·«	<0,001	10.8	<0.001	8.2	<0,001	<0.001	<0,001	<0.001	0.018

8	36	<0.001	37	0.225	20.7	<0.001	0.163	<0.001	<0.001	0.012
9	4.7	<0.001	5.6	<0.001	26	<0.001	<0 001	<о.оо1	<0.001	о.ооз
10	0.011	<0.001	0.003	<0.001	0.010	<0.001	0.001	<0.001	0.004	0.004
11	0.013	<0.001	0.124	<0.001	0.002	<о.оот	<0 001	<0.001	<0.001	0.005
12	0.003	<0.001	0.001	<0.001	0.001	<0.001	0.001	<0.001	0.003	0.002
13	0.002	<0.001	0 020	<0 001	0.003	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	0.003
14	0.867	<0.001	0.012	<0.001	0.260	<0.001	<0.001	<0.001	0 020	0.016
15	0.056	<0.001	0.001	<0.001	0.307	<0.001	<0.001	<0.001	0.010	0.098
16	0.059	0.007	0.071	0.002	0.370	0.068	0.022	<0.001	0.062	0.020
17	0,060	0.003	0.073	0.001	0.120	0.027	0.205	0.002	0.063	0.023
18	0.017	<0.001	0.002	<0-001	1.1	0.007	<0.001	<0.001	<0.001	0.001
19	»)
20
21	0.026	<0.001	0.610	0.004	0.034	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	0.031

- Аминогексан,

- Ь-МВА,

- 4-фенил-2-аминобутан,

- 1^-Вос-3-аминопирролидин,

2КО - 2-кетоглутарат,

I)-.\1а - Ό-аланин,

I.-(Ян - Ь-глутамат,

МОВ - 3-метил-2-оксомасляная кислота.

Номера в первом столбце соответствуют номерам в табл. 1.

Все измерения проводили, по меньшей мере, в дубликатах.

Отклонение одного измерения от средней величины составляет <10%.

а) Измерение не могло быть проведено, поскольку в процессе экспрессии выход белка был очень низким/белок был нестабильным в процессе очистки.

4.3. Асимметрический синтез (К)-аминов 1-4 (см. выше примечания к табл. 5) с ω-ТА из АзрегдШиз 1еггеи8, МезогЫ/оЬшт 1ой и МусоЪайегшт уапЪаа1еии.

Асимметрический синтез осуществляли при 30°С в течение 24 ч в фосфатно-натриевом буфере (100 мМ, рН 7), содержащем моногидрат пиридоксил-5'-фосфата (РЬР) (1 мМ) и NΛ^+(1 мМ) в 1,5-мл пробирках Эппендорфа.

о кетон ®-ТА аланин пируват

ΝΗ₂ амин лактат

Ч)Н КАЕ глюконоеая

Реакционная смесь содержала 50 мМ кетон, Ь-аланин (5 экв., 250 мМ), лактат-дегидрогеназу, выделенную из коровьего сердца (90 ед.), глюкозу (150 мМ) и глюкозо-дегидрогеназу (15 ед.). ω-ТА, проис- 17 022764 ходящую из А8регдШи8 !еггеи8, Ме8ог1й/оЬшт 1о!1 и МусоЬас!егшт νаηЬаа1еη^^ (номера 1, 11 и 9 в табл. 1), экспрессировали в Е. соН ВЬ21, как описано выше, замораживали в виде аликвот и непосредственно использовали в качестве биокатализатора в виде цельных клеток без дополнительной очистки. Степень превращения измеряли путем детектирования образованных аминов (1, газовая хроматография (ГХ); 2-4, капиллярный электрофорез (КЭ)). Хиральный анализ 2-4 осуществляли с помощью КЭ, как описано выше. Величину энантиомерного избытка (% э.и.) для 1 определяли с помощью ГХ. После экстракции амина этилацетатом проводили дериватизацию с образованием трифторацетамида путем добавления 20кратного избытка ангидрида трифторуксусной кислоты. После продувки азотом для удаления избытка ангидрида и остаточной трифторуксусной кислоты дериватизированное соединение растворяли в этилацетате (50 мкл) и исходное вещество отделяли на системе 81ιίιη;·ιύζιι ОС14А, которая была снабжена колонкой с гептакис(2,3-ди-О-ацетил-6-О-трет-бутилдиметилсилил)-в-циклодекстрином (25 мх0,25 мм). Время удерживания составляло 16,0 мин ((8)-1) и 16,2 мин ((8)-2) при градиенте температуры в печи 80°С/10 мин//20°С//180°С/10 мин. Результаты представлены ниже в табл. 6.

Таблица 6

Обрадованные амины	ω-ΤΑ	Превращение [%] ь	Энантиомерный избыток [% э.и.Р]с
1	АСе	32	>99
1	М1о	41	>99
1	Μνβ	35	>99
2	АСе	15	>99
2	М1о	1	95,0
2	Μνδ	2	>99
3	АСе	14	>99
4	АСе	11	>99

^a) Условия реакции: 50 мМ кетон, 250 мМ П-аланин, 100 мМ фосфатно-натриевый буфер, рН 7,0, 1 мМ РЬР, 1 мМ \А1)П. Побочный продукт пируват, образовавшийся в процессе реакции, удаляли с использованием лактат-гидрогеназы (Ί,Ι)Ι I). Для подачи кофактора на повторный цикл использовали глюкозо-дегидрогеназу (ООН).

^b) Превращение не оптимизировали. Отклонение одного измерения от средней величины не превышало 10%. Соединение 4 превращалось только под действием А!е-ТА.

^c) (К)-энантиомеры.

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения (К)-селективной ω-трансаминазы, включающий следующие стадии:

   a) обеспечение по меньшей мере одной последовательности биомолекулы для поиска по меньшей мере одной трансаминазы или лиазы и по меньшей мере одного банка биомолекул;

   b) поиск в банке биомолекул с помощью указанной последовательности биомолекулы для поиска в целях идентификации группы первых последовательностей биомолекул-мишеней, где указанные первые последовательности биомолекул-мишеней по меньшей мере на 20% идентичны указанной последовательности биомолекулы для поиска, как рассчитано на уровне аминокислотной последовательности;

   c) отбор в группе первых последовательностей биомолекул-мишеней группы вторых последовательностей биомолекул-мишеней, которые не содержат на уровне аминокислотной последовательности по меньшей мере один из следующих мотивов аминокислотных последовательностей (с1)-(с3):

   с1) в положениях 95-97 аминокислотную последовательность Туг-Ха1-Ха2, где Ха1 представляет собой аминокислоту 11е, Уа1, Ьеи, Ме!, РЬе и Ха2 представляет собой аминокислоту Агд или Ьу8, или с2) в положениях 97-99 аминокислотную последовательность Туг-Хаа-О1п, где Хаа представляет собой аминокислоту, и в области от положения 105 до положения 111 аминокислотную последовательность Агд-Хаа-Ха3, где Ха3 представляет собой аминокислоту, предпочтительно Ηΐ8, или с3) в положении 38 ТЬг, в положении 97 Ьу8 и в положениях 107-109 аминокислотную последовательность Агд-Ха4-Ха5, где Ха4 представляет собой аминокислоту, предпочтительно О1у, и Ха5 представляет собой аминокислоту, предпочтительно Туг, и которые содержат:

   с4) в положении 95 аминокислоту, не являющуюся Туг, Агд, Ьу8, или в положении 95 аминокислоту Туг, но в положении 97 аминокислоту, не являющуюся Агд или Ьу8, и с5) в положении 40 аминокислоту, не являющуюся Ьу8 или Агд, и с6) в области от положения 161 до положения 165 аминокислоту Ьу8, для идентификации группы вторых последовательностей биомолекул-мишеней, и

   ά) обеспечение биомолекулы, имеющей вторую последовательность биомолекулы-мишени, идентифицированную на стадии (с), и представляющей собой или кодирующей, по меньшей мере частично, белок, обладающий активностью (К)-селективной ω-трансаминазы.
2. 2. Способ скрининга (К)-селективной ω-трансаминазы, включающий стадии (а)-(с) по п.1.

   - 18 022764
3. 3. Способ по п.1 или 2, где указанная биомолекула представляет собой белок и последовательность биомолекулы представляет собой аминокислотную последовательность.
4. 4. Способ по п.1 или 2, где биомолекула представляет собой молекулу ДНК и последовательность биомолекулы представляет собой последовательность ДНК.
5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где банк биомолекул представляет собой базу данных биомолекул и поиск в указанной базе данных биомолекул на стадии (Ь) осуществляют с помощью программы выравнивания последовательностей биомолекул, в частности ВЬА§Т.
6. 6. Способ по любому из пп.1, 3-5, где молекулу белка или ДНК, обеспеченную на стадии (б), получают синтезом бе ηονο.
7. 7. Способ по любому из пп.1, 2 и 4, где банк биомолекул представляет собой банк генов и поиск в указанном банке генов на стадии (Ь) осуществляют с использованием молекулы с последовательностью ДНК для поиска.
8. 8. Способ по п.7, где на стадии (с) используют праймеры с ДНК-последовательностью для отбора группы вторых последовательностей биомолекул.
9. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная последовательность биомолекулы для поиска представляет собой последовательность, представляющую всю функциональную (К)-селективную ω-трансаминазу или ее часть.
10. 10. (К)-селективная ω-трансаминаза, которая может быть получена по любому из способов по пп.1 и 3-9, предпочтительно выбранная из группы последовательностей биомолекул, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1-4.
11. 11. Способ определения характеристик трансаминазы, в частности для характеризации свойств трансаминазы, включающий следующие стадии:

    ί) обеспечение заряженного аминоакцептора, заряженного аминодонора и трансаминазы;

    ίί) осуществление реакции аминоакцептора и аминодонора с трансаминазой в реакционной среде и тем самым ίίί) определение проводимости реакционной среды в первом наборе реакционных условий;

    ίν) после проведения стадии ίίί) определение проводимости реакционной среды во втором наборе реакционных условий с получением по меньшей мере двух величин проводимости, отражающих свойства трансаминазы.
12. 12. Способ по п.11, где проводимость реакционной среды определяют по меньшей мере три раза, по меньшей мере, в третьем наборе реакционных условий.
13. 13. Способ по п.11 или 12, где наборы реакционных условий являются одинаковыми.
14. 14. Способ по любому из пп.11-13, где реакционная среда представляет собой буфер с низкой проводимостью.
15. 15. Способ по любому из пп.11 или 14, где заряженный аминоакцептор представляет собой пируват.
16. 16. Способ получения (К)-селективной ω-трансаминазы по любому из пп.1 и 3-9, где после получения (К)-селективной ω-трансаминазы осуществляют способ определения характеристик указанной (К)селективной ω-трансаминазы по любому из пп.11-15.
17. 17. Способ скрининга (К)-селективной ω-трансаминазы по любому из пп.2-9, где после скрининга (К)-селективной ω-трансаминазы осуществляют способ определения характеристик указанной (К)селективной ω-трансаминазы по любому из пп.11-15.
18. 18. Способ получения оптически активного хирального амина, включающий осуществление реакции по меньшей мере одного аминоакцептора и по меньшей мере одного аминодонора с (К)-селективной ω-трансаминазой по п.10 и получение оптически активного хирального амина.