EA021584B1 - Ингибитор рецептора фактора роста фибробластов-3 (fgfr-3) и его применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к изолированному антителу или фрагменту антитела, которое специфично связывается с FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) человека или с его мутантными формами. Дополнительные варианты осуществления включают фармацевтические композиции, содержащие указанное антитело, и способы применения указанного антитела для лечения рака.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунологии и лечению рака. В частности, настоящее изобретение направлено на антитело человека, которое связывается с рецептором фактора роста фибробластов 3 (РОРК-3) человека (8ЕО ГО N0:11). РОРК также известен как СЭ333, АСН, СЕК2, Н8РОРК-3ЕХ и ТТК4.

Было показано, что РОРК-3 вовлечен в развитие рака, включая множественную миелому, карциному мочевого пузыря и уротелиальную карциному. Связывание лиганда РОР с рецептором вызывает димеризацию рецептора и аутофосфорилирование, что приводит к последующей активации эффекторных молекул. Передача сигнала через РОРК-3 может регулировать широкий спектр клеточных активностей, таких как пролиферация, дифференцировка, миграция, выживаемость/апоптоз, регуляция цитоскелета и цитокинов и эндоцитоз/экзоцитоз. Повышенную активность передачи сигнала через РОРК-3 считают важным событием, которое дает опухолевым клеткам преимущество в росте или выживаемости и, таким образом, способствует развитию злокачественной опухоли.

Полноразмерный РОРК-3 имеет две сплайсированные формы, названные РОРК-3(ШЬ) и РОРК3(111с), которые возникают в результате присутствия альтернативных экзонов, кодирующих третий 1дОподобный домен РОРК-3. Описаны также мутантные формы РОРК-3, возникающие вследствие ошибок при репликации ДНК или трансляции. Учитывая активную роль пути передачи сигнала через РОРК-3 в широком диапазоне заболеваний, включая рак, существует потребность в механизме, который позволит регулировать этот путь.

Были описаны антитела против РОРК-3, которые блокируют связывание лиганда (КаисЬепЬетдет, К. е! а1., 1. ΒίοΙ. Сйеш., 3 октября 2003 г.; 278(40):38194-205). Были описаны антитела против РОРК-3, которые связываются как с РОРК-3 дикого типа, так и с его мутантными формами (Маг1те/-Тоггесиабгаба. 1. е! а1., С1ш. Сапсег Ке8., 1 сентября 2005 г.; 11(17):6280-90; Тгибе1 8. е! а1., Β1οοά, 15 мая 2006 г.; 107 (10): 4039-46).

Были описаны антитела против РОРК-3, которые ингибируют опосредованную лигандом активацию передачи сигнала через РОРК-3 и ингибируют опосредованный РОРК-3 рост опухоли (Ттибе1 8. е! а1., Β1οοά, 15 мая 2006 г.; 107 (10):4039-46). Были описаны антитела против РОРК-3, которые усиливают противоопухолевое действие цисплатина при введении в виде комбинированной терапии ГОееут Ό. е! а1., ААСК, 21-24 октября 2007 г.; ^апд, е! а1., Е0КТС, 22-26 октября 2008 г.).

Тем не менее, в данной области существует потребность в антагонистическом антителе, которое обладает одним или несколькими из следующих свойств: оно высокоспецифично к обеим сплайсированным формам РОРК-3 (РОРК-3(111Ь) и РОРК-3(111с)), оно интернализует РОРК-3 и предпочтительно также вызывает деградацию РОРК-3(111Ь) и РОРК-3(111с) или их мутантных форм, и оно усиливает терапевтическую эффективность и обращает химиорезистентность при применении в комбинации с химиотерапевтическим цитотоксическим средством. Дополнительно, указанное антитело предпочтительно также активно по отношению к мутантным формам РОРК-3, блокирует связывание РОР-лигандов с РОРК-3, ингибирует индуцированную лигандом передачу сигнала через РОРК-3, ингибирует опосредованные РОРК-3 клеточные активности или ингибирует рост опухоли ίη νί!το и ίη νίνο.

Антитело согласно настоящему изобретению удовлетворяет указанные потребности. Указанное антитело высокоспецифично к обеим сплайсированным формам РОРК-3 (РОРК-3(111Ь) и РОРК-3(111с)), интернализует РОРК-3 и, предпочтительно, также вызывает деградацию рецептора при связывании данного антитела с рецепторами РОРК-3 или мутантными формами рецептора в клетках, экспрессирующих данный рецептор, усиливает терапевтическую эффективность и обращает химиорезистентность при применении в комбинации с химиотерапевтическим цитотоксическим средством, а также указанное антитело активно по отношению к мутантным формам РОРК-3, блокирует связывание РОР-лигандов с РОРК-3, ингибирует индуцированную лигандом передачу сигнала через РОРК-3, ингибирует опосредованные РОРК-3 клеточные активности и ингибирует рост опухоли ίη νί!το и ίη νίνο.

Настоящее изобретение относится к изолированному антителу, которое специфично связывается с РОРК-3(111Ь) и РОРК-3(111с) человека.

Предпочтительно указанное антитело представляет собой антитело человека, имеющее К_с, равную приблизительно 1х 10^-8 М или менее при комнатной температуре (20-25°С).

Предпочтительно указанное антитело специфично связывается с доменом 2 РОРК-3 человека (8ЕЦ ГО N0:12).

Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению, которое специфично связывается с РОРК-3(111Ь) и РОРК-3(111с) человека, содержит гипервариабельный участок 1 тяжелой цепи (СЭКН1), имеющий последовательность ОУМРТ8УО18 (8ЕЦ ГО N0:1), гипервариабельный участок 2 тяжелой цепи (СЭКН2), имеющий последовательность \УУ8ТУХОЭТХУАО1<ЕОО (8ЕЦ ГО N0:2), гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (СЭКН3), имеющий последовательность УБОУУО8ГООУУУОМЭУ (8Е0 ГО N0:3), гипервариабельный участок 1 легкой цепи (СЭКЫ), имеющий последовательность ООХХ1ОЭК8УН (8Е0 ГО N0:4), гипервариабельный участок 2 легкой цепи (СЭКР2), имеющий последовательность БЭТЕКР8 (8Е0 ГО N0:5), и гипервариабельный участок 3 легкой цепи (СЭКР3), имеющий последовательность ОУ\УЭ8О8ЭНУУ (8ЕЦ ГО N0:6).

Предпочтительно антитело может содержать последовательность аминокислот вариабельной облас- 1 021584 ти тяжелой цепи

Εν0Ενθ2αΑΕνΚΚΡΟΑ5νκν5ΟΚΑ5ΟΥΜΓΤ3Υ6Ι3ΜνΚ0ΑΡθςαΣΕΜΜΟΜν5ΤΥΝ5ΟΤΝΥΑ0Κ

ЕОеКУТУТТОТЗТЗТАУМЕЬКЗЕКЗЕОТАУУУСАКУЬбУУОЗЮетУУСМОУИСОСТТУТУЗЗ (ЗЕО Ιϋ N0:7) и последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи ОЗУЬТОРРЗЬЗУАРСКТАТРТСССМЫЮОКЗУНИУКОКРСОАРУХЛ/МУЕОТЕРРЗбТРЕКМЗС ЗЫРСЫТАТЬТРТКУЕАСОЕАОУУСОУТОЗСЗОНУУГесеТКЬТУЬС (ЗЕО Π)Ν0:8>.

Предпочтительно указанное антитело может содержать последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи

ЕУ0Ъ703САЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУМЕТ5УС15ИУК0АРС0СЬЕИМСт/ЗТУНСОТЫУА0К Γ06ΚντνΤΤΟΤ5Τ5ΤΑΥΜΕΕΚ5ΕΚ5ΕΟΤΑνΥΥ0ΑΚνΕ6ΥΥΟ5ΙΟ0ΥΥΥ3ΜθνΜ60εΤΤντν$5 (ЗЕО Ю N0:7) или последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи

05УЬТ0РР5Ь5УАРСКТАТРТСеСШ1СОК5УНИУК(2КРС(ЭАРЦ1Л7М¥1,ОТЕКР5С1РЕКМ5С ЗПРСНТАТЬИТЕУЕАСОЕАОУУСОУИОЗСЗОНУУЕеССТКЬТУЬС (ЗЕО Ю N0:8).

Константную область тяжелой цепи антитела можно получить из 1дС1 человека или из фрагмента антитела, который связывает РОРК-3. Предпочтительно указанное антитело содержит тяжелую цепь с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:9 и легкую цепь с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:10. Предпочтительно указанное антитело содержит тяжелую цепь с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:9 и легкую цепь с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:10 или связывающий РОРК-3 фрагмент антитела.

Антитело может также содержать две тяжелые цепи с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:9 и две легкие цепи с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:10. Антитело может также содержать две тяжелые цепи с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:9 и две легкие цепи с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:10. Предпочтительно антитело содержит две тяжелые цепи с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:9 и две легкие цепи с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:10 или связывающий РОРК-3 фрагмент антитела.

Антитело может содержать связывающий фрагмент, который способен нейтрализовать РОРК-3 человека.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение направлено на изолированное антитело или фрагмент антитела, при этом указанное антитело конкурирует за связывание с внеклеточным доменом РОРК-3 в конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе ЕЬ18А с конкурирующим антителом, при этом указанное конкурирующее антитело связывает РОРК-3 с К_с, равной приблизительно 1х10^-8 М или менее при комнатной температуре (20-25°С).

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу, которое связывается с мутантными формами РОРК-3.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

Настоящее изобретение также относится к продукту, включающему антитело или фрагмент антитела и дополнительное противораковое средство для комбинированного лечения для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии.

В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела предназначены для применения в качестве лекарственного средства. В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела предназначены для применения для лечения рака. В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела применяют в качестве лекарственного средства для лечения рака, когда рак представляет собой рак мочевого пузыря или множественную миелому.

В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела применяют для лечения рака совместно с другим средством. Антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению можно вводить пациенту одновременно, раздельно или последовательно с эффективным количеством другого средства. Настоящее изобретение может включать фармацевтическую композицию, содержащую соединение совместно с фармацевтически приемлемым носителем и возможно другими терапевтическими ингредиентами.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака у пациента, включающему введение указанному пациенту эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению. Рак может представлять собой рак мочевого пузыря или множественную миелому. В другом аспекте настоящее изобретение включает способ лечения рака у пациента, включающий одновременное, раздельное или последовательное введение пациенту эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению и другого средства. Другое средство может представлять собой цисплатин.

Соответственно, антитело согласно настоящему изобретению связывается природными и мутант- 2 021584 ными формами РОРК-3 и индуцирует деградацию РОРК-3, оно способно ингибировать опухоли путем воздействия на опухолевые клетки, а также компоненты стромы, и имеет большое терапевтическое значение для лечения рака.

Термин антитело включает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидные цепи, две идентичные тяжелые цепи (Н) и две идентичные легкие цепи (Ь), связанные друг с другом дисульфидной связью. Отдельные цепи могут образовывать домены, имеющие сходные размеры (110-125 аминокислот) и структуры, но различные функции.

Изолированное антитело представляет собой антитело, которое (1) было частично, в существенной степени или полностью очищено от смеси компонентов; (2) было идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонентов его природного окружения; (3) является моноклональным; (4) свободно от других белков того же вида; (5) экспрессируется клеткой отличного вида животного или (6) не встречается в природе. Контаминирующие компоненты природного окружения представляют собой материалы, которые будут препятствовать диагностической или терапевтической пользе антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Примеры изолированных антител включают антитело, которое подвергли афинной очистке, антитело, которое было получено из гибридомной или другой линии клеток ίη νίίτο, или антитело человека, полученное из трансгенной мыши.

Термин моноклональное антитело в данном изобретении относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, например отдельные антитела, составляющие указанную популяцию, по существу, идентичны за исключением возможных встречающихся в природе мутаций или незначительных посттрансляционных модификаций, которые могут у них присутствовать. Моноклональные антитела высокоспецифичны, направлены против одного антигенного сайта (также известного как детерминанта или эпитоп). Более того, в противоположность препаратам обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант, каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение моноклональное указывает на характер антитела, как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и оно не должно рассматриваться как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом.

Термин антитело человека в данном изобретении включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевой линии человека, описанным у КаЬа1 с1 а1., С1ю11йа с1 а1., и Магйп, выше. Антитело человека согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные неспецифическим или сайт-направленным мутагенезом ίη νίίτο или посредством соматической мутации ίη νίνο), например, в областях, определяющих комплементарность (гипервариабельных участках). Антитело человека может иметь по меньшей мере одно положение, в котором присутствует с заменой аминокислотного остатка, например, на усиливающий активность аминокислотный остаток, которая не кодируется последовательностью иммуноглобулина зародышевой линии человека. Тем не менее, не предполагается, что в данном изобретении термин антитело человека включает антитела, в которых последовательности гипервариабельного участка, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека.

Формулировка рекомбинантное антитело человека включает антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных способов, таких как, например, антитела, экспрессированные с применением рекомбинантного вектора экспрессии, которым трансфицировали клетку-хозяина, антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека, антитела, выделенные из животного, которое является трансгенным в отношении генов иммуноглобулина человека, или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека.

Легкая цепь может содержать один вариабельный домен (сокращенно обозначенный в данном изобретении УЪ) и/или один константный домен (сокращенно обозначенный в данном изобретении СЬ). Легкие цепи антител представляют собой либо легкие цепи каппа (к), либо легкие цепи лямбда (λ). Ссылка на УЪ в данном изобретении предполагается включающей вариабельные участки как из легких цепей типа каппа (Ук), так и из легких цепей типа лямбда (νλ). Тяжелая цепь также может содержать один вариабельный домен (сокращенно обозначенный в данном изобретении УН) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (СН1, СН2, СН3 и СН4). У человека изотипы представляют собой 1§А, 1§И, 1дЕ, 1§О и 1дМ, при этом 1§А и 1§О дополнительно подразделяются на субклассы или субтипы (1дА_1-2 и 1§О_4-4).

Настоящее изобретение охватывает антитела, принадлежащие к любым из упомянутых выше клас- 3 021584 сов или субклассов. 1дС человека представляет собой предпочтительный изотип антитела согласно настоящему изобретению. В каждом из УЪ и УН находятся три участка, названных гипервариабельными или определяющими комплементарность участками (СЭР), которые окружены менее вариабельными участками, названными каркасными участками (сокращенно обозначенными в данном изобретении РК).

Аминокислоты относят к конкретному гипервариабельному участку или домену в соответствии с условным обозначением КаЪа! (КаЪа!, е! а1., Αηη. ΝΥ Асай. δει. 190:382-93 (1971); КаЪа!, е! а1., Зедиеисез о£ Рго1еш8 о£ 1ттиио1одюа1 1и1еге81, пятое издание, Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, номер публикации ΝΙΗ 91-3242 (1991)), или с условным обозначением СНоЙиа (С. СЬо1Ыа и А.М. Ьезк, I. Мо1. Вю1. 196 (4): 901-917 (1987)) или МаШи (МаШи, А.С.К. Ассеззшд (Не КаЪа! АийЪойу Зедиеисе Эа1аЬа5е Ъу СотрШег ΡΚΟΤΕΙΝδ: §1тис1иге, Риисйои аий Сеиейсз, 25 (1996), 130-133.)

Каждый УН и УЪ состоит из трех гипервариабельных участков и четырех РК, расположенных в направлении от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: РК1-СОК1-РК2-СОК2-РК3СОК3-РК4. Часть антитела, состоящая из доменов УЪ и УН, обозначается как Ρν (вариабельный фрагмент) и образует сайт связывания антигена. Одноцепочечный Ρν СсБе) представляет собой фрагмент антитела, содержащий домен УЪ и домен УН в виде одной полипептидной цепи, при этом Ν-конец одного домена и С-конец другого домена соединены гибким линкером (см., например, патент США № 4946778 (Ьайиет е! а1.), АО 88/09344 (НизЮи е! а1.)).

Фрагменты обладают характеристиками связывания такими же или сравнимыми с характеристиками для целого антитела. Подходящие фрагменты антитела включают любой фрагмент, который содержит часть гипервариабельного (т.е. определяющего комплементарность) участка, достаточную для специфичного связывания, и имеет достаточную аффинность, чтобы ингибировать рост клеток. Такие фрагменты могут включать, например, один или оба РаЪ-фрагмента или Р(аЪ')₂-фрагмент. Предпочтительно фрагменты антитела содержат все шесть гипервариабельных участков целого антитела, хотя функциональные фрагменты, содержащие не все такие участки, как, например, три, четыре или пять гипервариабельных участков, также включены.

Предпочтительные фрагменты представляют собой одноцепочечные антитела, или Ρν-фрагменты. Более предпочтительные фрагменты представляют собой двухвалентные фрагменты. Одноцепочечные антитела представляют собой полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи, с соединяющим их друг с другом линкером или без него. Таким образом, Ρν-фрагменты включают весь антигенсвязывающий активный центр антитела. Данные цепи можно получить в бактериях или в эукариотических клетках.

РаЪ (антигенсвязывающий фрагмент) относится к фрагментам антитела, состоящим из доменов УЪ, СЬ, УН, СН1. Фрагменты, полученные после расщепления только папаином называют РаЪ, и в них не сохраняется шарнирная область тяжелой цепи. После расщепления пепсином получаются различные РаЪ-фрагменты, в которых сохраняется шарнирная область тяжелой цепи. Фрагменты, в которых дисульфидные связи между цепями остались интактными, называют Р(аЪ')₂, тогда как отдельный РаЪ'фрагмент получают, когда дисульфидные связи не сохраняются. Р(аЪ')2-фрагменты обладают более высокой авидностью к антигену, чем моновалентные РаЪ-фрагменты.

Рс (фрагмент, способный к кристаллизации) обозначает часть или фрагмент антитела, который включает парные константные домены тяжелой цепи. В антителе класса 1дС, например, Рс содержит домены СН2 и СН3. Рс антител класса 1дА или 1дМ дополнительно содержит домен СН4. Рс ассоциирован со связыванием Рс-рецептора, активацией комплемент-опосредованной цитотоксичности и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС). В антителах, таких как антитела класса 1дА и 1дМ, которые представляют собой комплексы множества 1дС-подобных белков, для образования комплекса требуются константные домены Рс.

Шарнирная область отделяет РаЪ- и Рс-области антитела, обеспечивает при этом подвижность РаЪфрагментов относительно друг друга и относительно Рс, а также включает множество дисульфидных связей для ковалентного связывания двух тяжелых цепей.

Таким образом, антитело согласно настоящему изобретению включает, но не ограничено ими, природные антитела, антитела человека, рекомбинантные антитела человека, моноклональные антитела, расщепленные фрагменты, двухвалентные фрагменты, такие как (РаЪ')₂, моновалентные фрагменты, такие как РаЪ, одноцепочечные антитела, одноцепочечные Εν (8сΡν), однодоменные антитела, поливалентные одноцепочечные антитела, бивалентные одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (й1аЪой1е8), тривалентные одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (1г1аЬой1е5) и т.п., которые специфично связываются с антигенами.

Антитело согласно настоящему изобретению специфично к РСРК-3. Специфичность антитела означает селективное узнавание указанным антителом конкретного эпитопа антигена. Антитело может проявлять как селективность к определенному виду, так и к определенной молекуле, или может быть селективным только по отношению к молекуле и связываться с РСРК-3 более чем одного вида. Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с РСРК-3 человека, мыши, крысы, собаки и/или кролика. Предпочтительно указанное антитело связывается с РСРК-3 человека. Были разработаны такие форматы антител, которые сохраняют специфичность связывания, но которые также проявляют другие

- 4 021584 свойства.

Антитело согласно настоящему изобретению, например, может быть моноспецифичным, биспецифичным или полиспецифичным. Биспецифичные антитела (ВкАЬ) представляют собой антитела, которые проявляют две различные специфичности связывания антигена или имеют два антигенсвязывающих сайта. Полиспецифичные антитела проявляют более чем две различные специфичности связывания антигена или содержат более чем два антигенсвязывающих сайта. Если антитело проявляет более чем одну специфичность, узнаваемые эпитопы могут принадлежать одному антигену или более чем одному антигену.

Специфичность антител к РОРК-3 можно определить на основании аффинности и/или авидности. Аффинность, представленная константой равновесия для диссоциации антигена от антитела (К_с), представляет собой меру силы связывания между антигенной детерминантой и сайтом связывания на антителе. Авидность представляет собой меру силы связывания между антителом и антигеном. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и сайтом связывания антигена на молекуле антитела, так и с валентностью антитела, которая представляет собой количество сайтов связывания антигена для конкретного эпитопа. Антитела обычно связываются с константой диссоциации (К_с), равной от приблизительно 10-5 до приблизительно 10-11 моль/л (например, К_с<100 М). Любую К_с, большую чем приблизительно 10-4 моль/л, как правило, считают показателем неспецифичного связывания: чем меньше значение К_с, тем сильнее связывание между антигенной детерминантой и сайтом связывания на антителе.

В некоторых аспектах антитело согласно настоящему изобретению связывается с РОРК-3 с К_с, предпочтительно равной приблизительно 1х10^-8 М или менее, более предпочтительно приблизительно 1х 10^-9 М или менее, более предпочтительно приблизительно 1х10^-10 М или менее и наиболее предпочтительно приблизительно 1 х 10^-11 М или менее. См. табл. 1.

Таблица 1

Аффинности связывания антитела 1 со сплайсированными вариантами РОРК-3 человека и мыши

	% (М)
ЕСЕК-З(II1Ь> человека	7,2*1О'10
ЕСЕК-3(II1с) человека	1,4х1О’10
ЕСГЕ-З(ШЬ) мыши	Не определена
ГЗГК-З <Шс) мыши	2,2хЮ“10

В некоторых аспектах антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно имеет К_с, равную от приблизительно 5,0х10^-10 до приблизительно 1,5х10^-11 М, от приблизительно 1,0х10^-10 до приблизительно 1,0х10^-11 М или от приблизительно 1,5х10^-11 до приблизительно 7,5х10^-10 М.

В данном изобретении термины блокирует связывание и ингибирует связывание применяются взаимозаменяемо и относятся к блокированию/ингибированию связывания цитокина с рецептором, что приводит к полному или частичному ингибированию или снижению биологической функции сигнального пути цитокина/рецептора. Блокирование/ингибирование связывания РОР с РОРК-3 оценивают путем измерения полного или частичного ингибирования или уменьшения одного или нескольких показателей активности РОР ίη νίίτο или ίη νίνο, таких как связывание с рецептором, ингибрующее воздействие на клеточный рост, хемотаксис, апоптоз, внутриклеточное фосфорилирование белка или передача сигнала. Способность блокировать связывание РОР с РОРК-3 можно измерить с помощью ЕЬ18А, как описано в данном изобретении. Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антагонист, который блокирует рецептор РОРК-3, при индуцированной лигандом активации живых клеток. Анализы на связывание можно осуществить, применяя целый ряд способов, известных в данной области, включающих, но не ограниченных ЕЬ18А. В данном изобретении формулировка конкурирует за связывание относится к случаю, когда антитело уменьшает связывание или передачу сигнала по меньшей мере на приблизительно 20, 30, 50, 70 или 90%, что измеряют с помощью способа, доступного в данной области, например, с помощью конкурентного ЕЬ18А или путем измерения К_с с помощью В1Асоге, при этом не предполагается, что антитело полностью предотвращает связывание.

Последовательность аминокислот тяжелой цепи показана в 8ЕЦ ГО N0:9. Последовательность аминокислот легкой цепи показана в 8ЕЦ ГО N0:10. В другом аспекте антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных областей любого из гипервариабельных участков антитела 1.

Антитело согласно настоящему изобретению также включает такие антитела, свойства связывания которых были улучшены путем направленной мутации, с помощью способов созревания аффинности, фагового дисплея или перетасовки цепей. Аффинность и специфичность можно модифицировать или улучшить путем мутирования остатков гипервариабельной области и/или каркасных остатков и скрининга сайтов связывания антигена, обладающих желательными свойствами (см., например, Уапд е1 а1., ί. Мо1. Βίο1. 254:392-403 (1995)). Одним способом является неспецифический мутагенез отдельных остатков или комбинаций остатков таким образом, что в популяции в противном случае идентичных сайтов связывания антигена обнаруживаются в определенных положениях подгруппы от двух до двадцати от- 5 021584 личных аминокислот. В качестве альтернативы, мутации в ряде остатков можно осуществить с помощью способов ошибочно-направленной ПЦР (см., например, Наууктк е! а1., 1. Μοί. Βίοί. (1992), 226:889 96). В другом примере, векторы для фагового дисплея, содержащие гены вариабельной области тяжелой и легкой цепи, можно репродуцировать в мутаторных штаммах Е.сой (см., например, йо\у е! а1., 1. Μοί. Βίοί. 250:359 68 (1996)).

Процесс селекции ίη νίΐτο затем можно подходящим способом применять для скрининга таких дополнительных последовательностей аминокислот вариабельной области для обнаружения РаЬфрагментов, обладающих заявленной перекрестной реактивностью ίη νίίτο. Таким образом, были идентифицированы дополнительные РаЬ-фрагменты, которые подходят для получения гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно замена аминокислот в каркасных областях ограничена одним, двумя или тремя положениями в пределах одной или каждой из каркасных последовательностей, описанных в данном изобретении. Предпочтительно замена аминокислот в пределах гипервариабельных участков ограничена одним-тремя положениями в пределах одного или каждого гипервариабельного участка, более предпочтительно осуществляют замену аминокислот в одном или двух положениях в пределах одного или каждого гипервариабельного участка. Дополнительно предпочтительно, чтобы замена аминокислот осуществлялась по одному или двум положениям аминокислот в гипервариабельных участках вариабельной области тяжелой цепи. Подходящая методика комбинирования замен в гипервариабельной области и каркасе для получения альтернативных антител согласно настоящему изобретению с применением антитела, описанного в данном изобретении в качестве исходного антитела, приведена в ТОи е! а1., 1. Μοί. Βίοί., 294:151-162.

Антитело согласно настоящему изобретению можно получить с помощью способов, известных в данной области. Данные способы включают иммунологические способы, описанные у ΚοΙι^Γ и ΜίίκΚίη в Ыа!иге 256:495-497 (1975) и СатрЬей в ΜοηοΟοηηί ΛηίΦούν ТесНш^^у, ТЬе РгоДис!юи аий СЬагас!епζαΐίοη ο£ Κοάеи! аЫ Ηитаи ^Ьи^тая, у Βισάοη е! аЦ ред., ^аЬο^а!ο^у ТесЬтдиек ίη ВюсЬет18йу ;шД ΜοΚαιίηΓ Βίοίοβ\·. том 13, ЕЕеу^ег БОенсе РиЬИкЬегк, Амстердам (1985); а также способ рекомбинантной ДНК, описанный у Нике е! аЦ в БОенсе 246:1275-1281 (1989).

Антитела человека также можно получить, применяя различные методики, известные в данной области, включая библиотеки фагового дисплея (Ήοο^ιΛοοιη и ТОт!ег, 1. Μοί. Βίοί. 227:381 (1991); Магкк е! аЦ 1. Μοί. Βίοί. 222:581 (1991)). Методики, описанные в Сοίе е! аЦ и Βοете^ е! аЦ также доступны для получения моноклональных антител человека (Сοίе е! ак, ΜοηοΠοηηί ΑηίΦο^κ ;·ιηά С;шсег ТЬегару, Αίаи К. Ь155, с. 77 (1985) и Βοете^ е! аЦ 1. Iттииοί. 147(1):86-95 (1991)). Антитело согласно настоящему изобретению, секретированное субклонами, можно выделить или очистить из культуральной среды или перитонеальной жидкости с помощью обычных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, белок А-сефароза, гидроксиапатитовая хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует антитело согласно настоящему изобретению, получают с помощью стандартных способов молекулярной биологии.

Настоящее изобретение также включает клетки-хозяева для их трансформирования векторами и экспрессии антител.

Предпочтительные клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, такие как клетки миеломы мыши N80 (несекретирующие (о)), клетки 293 и СНО и другие линии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомные клетки. Можно использовать другие эукариотические хозяева, такие как дрожжи.

Известны векторы для экспрессии белков в бактериях, особенно в Εχοίί. Такие векторы включают векторы РАТН, описанные у ^^есктаηи и Тζадοίο£Γ ίη 1. Βίοί. СЬет. 260:1513-1520 (1985). Данные векторы включают последовательности ДНК, которые кодируют антранилатсинтетазу (ТгрЕ), за которой на карбоксильном конце следует полилинкер. Другие векторные системы экспрессии основаны на бетагалактозидазе (рЕХ); лямбда РЬ; связывающем мальтозу белке (ρΜΑΕ) и глутатион-Б-трансферазе (рС8Т). См. Семе 67:31 (1988) и РерйДе КекеагсЬ 3:167 (1990).

Доступны векторы, подходящие для экспрессии в дрожжах. Подходящий пример представляет собой плазмиду лямбда 2АР. Также известны подходящие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих. Такие векторы включают хорошо известные производные БУ-40, аденовируса, полученные из ретровируса последовательности ДНК и челночные векторы, полученные из комбинации функциональных векторов млекопитающих, таких как описанные выше, и функциональные плазмиды и фаговую ДНК.

Векторы, подходящие для настоящего изобретения, содержат по меньшей мере один регуляторный элемент, который связан с последовательностью или фрагментом ДНК, который нужно экспрессировать. Указанный регуляторный элемент вставляют в вектор, чтобы контролировать и регулировать экспрессию клонированной последовательность ДНК.

После экспрессии в клетке-хозяине, культивированной в подходящей среде, полипептид, который нужно экспрессировать, можно получить из среды и очистить с помощью способов, известных в данной области. Если полипептид или пептид не секретируется в культуральную среду, клетки-хозяева лизируют перед выделением и очисткой.

- 6 021584

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитело, нуклеиновую кислоту, вектор или клетку-хозяина согласно настоящему изобретению совместно с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или разбавителем. Фармацевтическая композиция может включать дополнительное терапевтическое средство. Указанное дополнительное средство может представлять собой химиотерапевтическое средство, например, цисплатин.

Термин носитель при использовании в данном изобретении включает фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, которые нетоксичны в используемых дозировках и концентрациях для клетки или млекопитающего, которое подвергают их действию. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный рН-буферный раствор. В другом аспекте настоящего изобретения антитела против РОРК-3 или фрагменты антител могут быть соединены химическим или биосинтетическим способом с противоопухолевыми средствами или детектируемыми генерирующими сигнал средствами, особенно когда антитело интернализуется. Антитело к РОРК-3 может ингибировать активацию рецептора (фосфорилирование РОРК-3), а также активацию молекул, расположенных ниже по пути передачи сигнала, включая фосфорилированную МАРК и фосфорилированную АКТ в некоторых раковых клетках, таких как раковые клетки мочевого пузыря, что приводит к ингибированию способности клеток пролиферировать.

Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с природным РОРК-3 или с его сплайсированными формами или мутантами. Формулировка сплайсированные формы РОРК-3 обозначает формы экзонов, кодирующих третий 1дО-подобный домен РОРК-3, названные РОРК-3(ШЬ) и РОРК3(111с). Мутантный РОРК-3 включает такие формы рецептора, которые были изменены в результате репликации ДНК или ошибок трансляции. Мутации могут представлять собой мутации с приобретением функций, которые повышают активность мутантных рецепторов с помощью механизмов, таких как конститутивная активация, увеличенное время полужизни и повышенная чувствительность к лиганду.

Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с доменом 2 РОРК-3 дикого типа (8ЕЦ ГО N0:12). Остаток аргинина в положении 173 последовательностей РОРК-3 человека и мыши не обнаруживается в других членах семейства, что позволяет предложить, что этот остаток, вероятно, отвечает за специфичность антитела 1 к РОРК-3.

Антитело согласно настоящему изобретению вызывает деградацию РОРК-3. Деградация означает расщепление рецептора таким образом, что он больше не может осуществлять функцию передачи сигнала.

Антитело согласно настоящему изобретению может нейтрализовать активацию РОРК-3. Нейтрализация рецептора означает инактивирование свойственной рецептору киназной активности, необходимой для передачи сигнала. Нейтрализация, например, может произойти в результате блокирования антителом доступа некоторых эпитопов к лиганду или в результате изменения конформации РОРК-3 некоторым способом, благодаря чему лиганд, особенно РОР, не может активировать рецептор, даже если он может связаться с рецептором. Понижающая регуляция может осуществляться, когда на поверхности клеток, которые экспрессируют РОРК-3, снижается количество рецепторов РОРК-3, например, в результате стимулировании интернализации или деградации рецептора, или ингибировании экспрессии РОРК-3. Следовательно, нейтрализация приводит к различным эффектам, включая ингибирование, уменьшение, инактивирование и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенеза (возникновения кровеносных сосудов, прорастания и метастазирования), подвижности клеток и метастазирования (адгезии клеток и инвазивности).

Одной мерой нейтрализации РОРК-3 является ингибирование тирозин-киназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы можно определить, применяя хорошо известные способы; например, путем измерения уровня аутофосфорилирования рекомбинантного рецептора с киназной активностью и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, анализ фосфорилирования полезен для определения нейтрализующих антител в контексте настоящего изобретения. Фосфорилирование можно обнаружить, например, применяя антитело, специфичное к фосфотирозину, в анализе способом ЕЫ8А или на вестерн-блоте. Некоторые анализы на тирозинкиназную активность описаны у Рапек е! а1., 1. РЬагшасок Ехр. ТЬег. 283:1433-44 (1997) и ВаИеу е! а1., ЬЬе 8с1. 62:143-50 (1998).

Дополнительно, антитело согласно настоящему изобретению может ингибировать передачу сигнала самими опухолевыми клетками, так как многие опухолевые клетки содержат РОРК-3 на своей поверхности. Антитело согласно настоящему изобретению можно применять для лечения млекопитающего, нуждающегося в этом. Лечение заболевания означает ингибирование заболевания, купирование или задержку его развития; ослабление заболевания или ослабление выраженности симптомов заболевания.

Антитело и композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака. Рак может представлять собой рефракторный рак или впервые возникший рак. Виды рака включают, но не ограничены перечисленными, рак мозга, легких, плоскоклеточный рак, рак мочевого пузыря, желудочнокишечного тракта, поджелудочной железы, груди, головы, шеи, почечно-клеточный рак, рак почки, яичников, предстательной железы, толстой кишки, колоректальный рак, рак пищевода, гинекологический рак (овариальный, эндометриальный), рак предстательной железы, желудка или щитовидной железы, лейкоз и лимфому. Дополнительно, виды рака, которые можно лечить антителом и композициями со- 7 021584 гласно настоящему изобретению, включают множественную миелому, колоректальную карциному, саркому Юинга, хориокарциному.

Введение осуществляют любым подходящим путем введения, включая инъекцию, инфузию, пероральный, парентеральный, подкожный, внутримышечный или внутривенный пути введения.

Способ лечения, описанный в данном изобретении, можно осуществить, применяя совместное введение антитела с другим лекарственным средством, таким как противоопухолевые средства. Противоопухолевое лекарственное средство может включать малые органические молекулы. Примеры таких малых органических молекул включают цитотоксические и/или химиотерапевтические средства, такие как таксол, доксорубицин, актиномицин-Ό, цисплатин, метотрексат, иринотекан (СРТ-111), гемцитабин, оксиплатин, фторурацил (5-РИ), лейковорин (ЬИ), цисплатин, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, эпотилон, цисплатин/карбоплатин и пегилированный адриамицин. Предпочтительное лечение согласно настоящему изобретению представляет собой введение антитела совместно с цисплатином.

Противоопухолевое средство также может представлять собой облучение, источник облучения может быть либо внешним (дистанционная лучевая терапия - ЕВКТ), либо внутренним (брахитерапия - ВТ) по отношению к пациенту, которого лечат. Доза вводимого антибластомного средства зависит от множества факторов, включая, например, тип средства, тип и тяжесть опухоли, от которой лечат, и путь введения средства. Настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной дозой.

Введение антител к РОРК-3 совместно с другими антителами и/или способами лечения можно осуществлять одновременно или раздельно, одним и тем же или различными путями, в один и тот же или различные моменты времени. Дополнительно, антитело можно конъюгировать с одним или несколькими другими средствами для введения.

Способы лечения, описанные в данном изобретении, можно применять для лечения любого подходящего млекопитающего, включая приматов, таких как обезьяны и люди, лошадей, коров, котов, собак, кроликов и грызунов, таких как крысы и мыши. Предпочтительно млекопитающее, которое нужно лечить, представляет собой человека.

Примеры

Следующие примеры предложены исключительно в качестве иллюстрации и не предполагаются каким-либо образом ограничивающими объем настоящего изобретения. Приведенные примеры не включают подробные описания обычных способов, которые используют для конструирования векторов и плазмид, вставки генов, кодирующих полипептиды, в такие векторы и плазмиды или введения плазмид в клетки-хозяева. Такие способы хорошо известны средним специалистам в данной области и описаны во множестве публикаций, включая 8ашЬтоок, 1., РпЮск Е.Р. и Маша05, Т. (1989), Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2-е издание, Со1Д Зртшд НагЬог ЬаЬогаЮту Рге88.

Пример 1.

Получение специфичного к РОРК-3 антагонистического антитела.

Рекомбинантный РОРК-Рс человека, рекомбинантный РОР человека, синтезированные на заказ праймеры, рестрикционные ферменты и ДНК-полимеразы можно получить от поставщиков или получить известными способами.

Библиотеку интактных РаЬ человека в бактериофагах подвергали пэннингу против внеклеточного домена РОРК-3 человека с помощью пробирок, покрытых 10 мкг рекомбинантных белков внеклеточного домена РОРК-3(Шс)-(ЕСО)-Рс - согласно опубликованным протоколам пэннинга. Удержанные в процессе пэннинга фаги элюировали, и такими удержанными фагами инфицировали бактериальные клеткихозяева. Собирали фаги, продуцированные клетками-хозяевами. Повторяли описанные выше процедуры еще один раз. Переносили отдельные колонии инфицированных клеток-хозяев в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл/лунку 2хУТАО, и растили фаги в присутствии 10 мкл М13КО7 фага-помощника (5х 10¹⁰ бляшкообразующих единиц/мл). Инкубировали планшеты при 37°С в течение 30 мин без встряхивания, а затем 30 мин при встряхивании (100 об/мин). Получали осадки клеток путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 мин, ресуспендировали в 200 мкл 2χΥΤΑΚ и инкубировали при 30°С при встряхивании (100 об/мин) в течение ночи. Центрифугировали планшеты при 2500 об/мин в течение 10 мин. Переносили супернатанты в чистые планшеты и смешивали с 6х блокирующим буфером (18% молоко/ФБР) в течение 1 ч. Фаговые клоны подвергали скринингу, используя анализы связывания и блокирования ЕЫ8А, описанные ниже. Отбирали клоны фагов, которые связываются с РОРК-3(111Ь) или РОРК-3(111с), затем из этой совокупности отбирали такие клоны, которые блокируют связывание рецепторов с лигандом РОР-1. Определяли последовательности ДНК клонов, которые как связываются, так и блокируют рецептор, с помощью стандартных методик секвенирования. Сохраняли каждую уникальную последовательность ДНК, и соответствующий фаговый клон обозначали как фаг-кандидат, блокирующий РОРК-3. Из данных фагов-кандидатов получали растворимые РаЬ. Повторяли анализы связывания и блокирования ЕЫ8А, используя очищенные РаЬ, чтобы подтвердить блокирующую активность. На основе подтвержденных блокаторов РаЬ разрабатывали полноразмерные антитела путем клонирования гипервариабельных участков (8ЕЦ ΙΌ N0:1-6) в каркас 1дО1 человека согласно опубликованным методикам. Анализ связывания ЕЫ8А применяли для определения связывания антитела 1 с рекомбинантны- 8 021584 ми растворимыми белками внеклеточного домена РОРК-1(111Ь), РОРК-1(111с), РОРК-2(111Ь), РОРК-2(111с) и РОРК-4. Отбирали антитела, которые проявили высокую аффинность связывания как с Ь, так и с с сплайсированными формами РОРК-3, но низкую аффинность связывания с другими рецепторами РОРК.

Пример 2.

Антитело 1.

Антитело 1 можно получить путем биосинтеза в подходящей системе экспрессии млекопитающего, с применением хорошо известных способов, и полученное антитело можно очистить с помощью хорошо известных способов.

Последовательности аминокислот для антитела 1 приведены ниже.

Таблица 2

	Тяжелая цепь	Легкая цепь
СОЕ1	ΟΥΜΡΤ5ΥΟΙ3 (5Е(2 Ю N0:1)	ΟΟΝΝΙΟϋΚΞνΗ (ЗЕО Ю N0:4)
С0Е2	Μν5ΤΥΝ6βΤΝΥΑΟΚΡ06 (ЗЕО Ю N0:2)	ХДТЕКРЗ (ЗЕО Ю N0:5)
ΟϋΚ3	νΤ6ΥΥ05Ι0<3ΥΥΥ(3ΜΏν (ЗЕО Ю N0:3)	0νΗϋ8Ο3ΟΗνν (ЗЕО 10 N0:6)
V	Е7ССУ03САЕ7ККРС-А5УК73СКА86 ΥΜΕΤ5Υ6IЗНУКОАРСОбЬЕИМСМУЗ ΤΥΝ6ΟΤΝΥΑ0ΚΓ(26ΚντνΤΤΏΤ3Τ5Τ АУМЕЕКЗЬКЗЕОТАУУУСАКУЬСУУО 51ϋ6ΥΥΥ3ΜϋνΝ005ΤΤντν3 5 (ЗЕО Ιϋ N0:7)	ОЗУЬТОРРЗЪЗУАРСКТАТЕТССС NNIегж 3νΗΜΥΕΟΚΡΟΟΑΡУ Е7М Υ ЮТЕКР561ΡΕΚΜ3Ο5ΝΡΟΝΤΑΤΣ ΤΙΤΚνΕΑΟΏΕΑ0ΥΥ00νΝϋ563ΟΗ УУРСеСТКЕТУЬб (ЗЕО ю N0:8)
Целая цепь	ЗЕО ΙΕ N0:9	ЗЕО Ю N0:10

Способы анализа

Анализ связывания ЕЬ18А.

Рекомбинантные РОРК наносили на 96-луночные планшеты при концентрации 1 мкг/мл в ФБР при комнатной температуре в течение 2 ч. Промывали планшеты 3 раза 0,2% Тгееп-20/ФБР и блокировали в 5% молоке/ФБР в течение 2 ч перед использованием. В планшет добавляли фаги, РаЬ или антитела и делали серию разведений в 0,2% Тгееп-20/ФБР. Инкубировали планшет при комнатной температуре в течение дополнительных 2 ч. Захваченные молекулы детектировали, применяя подходящее доступное для приобретения вторичное антитело, согласно рекомендациям поставщика.

Анализ блокирования ЕЬ18А.

Рекомбинантные РОР наносили на микротитрационные планшеты 1шши1оп® 2В (ТЬегшоЬаЬ 8уз1еш8, Франклин, Массачусетс) при концентрации 0,5-2 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре. Промывали планшеты 0,2% Т\\ееп-20/ФБР и блокировали в 5% молоке/ФБР в течение 2 ч перед использованием. Делали серию разведений фагов, РаЬ или антител в 5 мкг/мл гепарина, 5% молока, ФБР. Добавляли растворимые рекомбинантные белки ЕСИ (внеклеточного домена) РОРК-3(111Ь) или (111с), меченные с Рс, до конечной концентрации 1 мкг/мл. Инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 1 ч перед тем, как перенести на покрытые РОР-1 планшеты, и инкубировали при комнатной температуре в течение дополнительных 2 ч. Планшеты промывали 3 раза 0,2% Тетееп-20/ФБР. Связавшиеся рецепторы детектировали, используя раствор моноклонального антитела против Рс человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (НКР), полученный согласно инструкциям поставщика. Активность блокирования приводила к уменьшению сигналов.

Аффинность связывания антитела 1 с РОРК-3(111Ь) и РОРК-3(111с) человека и мыши.

Кинетику связывания антитела с РОРК-3(111Ь) и (111с) определяли, используя биосенсор В1аСоге® 3000 (В1аСоге, 1пс., Пискатавэй, Нью-Джерси), при комнатной температуре, следуя стандартным протоколам, предложенным производителем. Краткое описание результатов, приведенное в таблице 1, указывает на то, что антитело связывается с обеими сплайсированными формами Ь и с РОРК-3 человека, а также перекрестно взаимодействует в полной мере с рецептором РОРК-3(111с) мыши с аффинностью менее чем 10-9 М.

Специфичность антитела 1 к связанному с мембраной РОРК-3.

кДНК РОРК-3(111с) мыши клонировали в вектор экспрессии рВАВЕ, содержащий селективный маркер - ген устойчивости к пуромицину. Осуществляли ретровирусную экспрессию полученных плазмид в клетках Ь6. Клетки подвергали селекции и культивировали в среде ИМЕМ, содержащей 10% РВ8 и 2 мкг/мл пуромицина. Суспендировали клетки Ь6, экспрессирующие РОРК-3, в 1% БСА/ФБР.

Добавляли антитело 1 до конечных концентраций 1-30 мкг/мл.

После одночасового инкубирования на льду клетки промывали 1% БСА/ФБР и инкубировали с подходящим вторичным детектирующим антителом или РаЬ-фрагментами в том же буфере в течение 1 ч на льду. Контрольные образцы окрашивали только вторичным антителом. Все образцы анализировали,

- 9 021584 применяя проточный цитометр РАС8уайаде 8Е (ВИ Вюкшепсек). Антитело 1 оказалось специфичным к РОРК-3, о чем свидетельствовали сигналы положительного окрашивания только для клеток, трансфицированных РОРК-3 (К3-Ь6), но не для исходных клеток Ьб, отрицательных по РОРК-3.

Эмбриональные клетки почки человека (НЕК) 293, 293ГесОп, среду Ргеек!у1е 293 и среду ΘρΐίΜΕΜ можно приобрести у 1пуйгодеп (Карлсбад, Калифорния). Среды для аффинной очистки на белке-А можно приобрести у ОЕ НеаНЪсаге. Разработали конструкцию ДНК для РОРК(ШЬ)-Рс.

Получение РОРК-3(111Ь)-Рс, РОРК-3(111Ь)-Рс с укороченными 1д-доменами и мутантов РОРК3(111Ь)-Рс с заменой одного остатка на аланин.

Границы домена РОРК-3(111Ь) можно определить на основании трехмерной модели внеклеточного домена (ЕСИ) РОРК-3(111Ь), а также известных кристаллических структур РОРК. Разработали пять укороченных конструкций ЕСИ РОРК-3(111Ь), а именно Ό1 (25-148), Ό2 (149-245), Ό3 (250-372), Ό1-2 (25245) и Ό2-3 (149-372), наряду с Ό1-3 (25-372) РОРК-3(111Ь) дикого типа. Конструкции субклонировали в вектор рО8 с Рс-меткой, встроенной в 3'-конец сайта множественного клонирования, и подтверждали последовательности. Двадцать остатков РОРК-3(111Ь) вблизи от предполагаемого участка связывания лиганда, а также остатки, вовлеченные в связывание гепарина и димеризацию рецептора, выбирали на основании известной модели ЕСИ РОРК-3(111Ь) и структуры РОРК-3(111с). Мутанты с заменой одного остатка на аланин ЕС.П РОРК-3(111Ь) получали с помощью перекрывающихся ПЦР, используя конструкцию с полноразмерным ЕСИ РОРК(111Ь) в качестве матрицы, а затем субклонировали в вектор рО8-Рс. Мутанты с укороченным доменом и мутанты с заменой остатков на аланин временно экспрессировали в клетках 293 после трансфекции с применением 293Гес0п™ (ЧпуПгодеп). Культуральные супернатанты собирали через 6 дней после трансфекции и Рс, содержащие указанные белки, очищали путем пропускания через аффинную колонку с белком-А, буфер заменяли на ФБР, производили количественный анализ и оценивали с помощью анализа на электрофорезе в ПААГ/ДСН для подтверждения целостности конструкции.

Среднемасштабный анализ связывания РОРК-3(111Ь)-Рс.

Очищенный раствор антитела 1 разбавляли до концентрации 2 мг/мл в ФБР. Восстанавливали влагосодержание Μ8Ό 8и1Го-ТАО ПН8-Ек1ег (Меко8са1е Эхксоуегу, #К91АЛ2), Ν-гидроксисукцинимидового эфира трис-бипиридин-рутения, с помощью холодной дистиллированной воды до концентрации 10 нмоль/мкл. Для реакции использовали молярное отношение Μ8Ό 8и1Го-ТАО NН8-Ε5ΐе^ к антителу 1 12:1. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре с защитой от света в течение 2 ч. Непрореагировавший Μ8Ό 8и1Го-ТАО NН8-Ε5ΐе^ удаляли от конъюгированного антитела 1, применяя обессоливающую смолу. Антитело 1, конъюгированное с рутением, хранили при -80°С. Концентрацию конъюгированного антитела 1 определяли, используя бычий сывороточный альбумин для построения стандартной кривой.

Укороченный, мутантный РОРК-3(111Ь)-Рс или РОРК-3(ШЬ)-Рс дикого типа разбавляли в фосфатносолевом буферном растворе (ФБР) до 5 мкг/мл. На стандартные 96-луночные планшеты наносили рецептор в концентрации 25 нг/лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Для блокирования неспецифичного связывания в лунках, в каждую лунку добавляли 150 мкл 5% Μ8Ό В1оскег А (Μе5о8са1е Э15соуегу, #К93Ва-1). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Блокирущий раствор удаляли и планшеты промывали пять раз 200 мкл ФБР, рН 7,4, 0,02% Т\уееп®-20. Серии трехкратных разведений (250-0,001 нм) меченного рутением антитела 1 добавляли в объем, равный 25 мкл, в трех повторениях для каждого тестируемого белка. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре при легком помешивании и защите от света свободное меченное рутением антитело удаляли с помощью еще пяти промывок в ФБР, рН 7,4, 0,02% Т\уееп-20, 200 мкл на лунку. После этой промывки в каждую лунку добавляли 150 мкл 1х буфера для считывания (Μе5о8са1е Э15соуегу, #К92ТС-2). При электрохимическом возбуждении рутениевая метка на связанном антителе испускала люминесцентное излучение на 620 нм. Сигналы электрохемилюминесценции (ЕСЬ) детектировали с помощью камеры на базе устройства с зарядовой связью (ПЗС-камеры) в планшет-ридере 8ЕСТОК 1тадег 2400 (Μе5о8са1е Ихксоуегу, #1250) и выражали в виде ЕСЬИ. Сигналы ЕСЬ наносили на график в программном обеспечении ОгарЬРаб Рп$т версии 5.0. Значения К_с рассчитывали с помощью метода подгонки нелинейной кривой регрессии в функции программного обеспечения один сайт специфичное связывание. Связывание меченного рутением антитела 1 с РОРК-3(111Ь)-Рс дикого типа использовали в качестве стандарта для анализа относительной аффинности связывания укороченных или мутантных РОРК, которую наносили на график в виде процента от связывания дикого типа.

Анализ связывания ЕЬ18А ΜаЬ В9.

Лунки 96-луночного микротитрационного планшета ЕЬ18А покрывали в течение ночи 200 нг моноклонального антитела В9 против РОРК-3 (8ап1а Сги/ кс-13121) в 100 мкл ФБР, рН 7,2, при легком помешивании при 4°С. После покрытия раствор антитела сливали и лунки блокировали 100 мкл фосфатносолевого буферного раствора с 0,1% Т\уееп (ФБРТ) и 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 2 ч при комнатной температуре при легком помешивании. После блокирования лунки промывали 5 раз 200 мкл ФБРТ. Затем добавляли серии трехкратных разведений (100-0,006 нм) мутантного РОРК- 10 021584

3(111Ъ)-Рс или РОРК-3(111Ъ)-Рс дикого типа в 100 мкл ФБРТ с 1% БСА в трех повторениях для каждого тестируемого белка и инкубировали при легком помешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки снова промывали 5 раз 200 мкл ФБРТ. Разведенные 1:5000 в 100 мкл ФБРТ с 5% БСА 1дО против антител мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (ИКР), инкубировали в каждой лунке в течение 1 ч при комнатной температуре, при легком помешивании. Лунки промывали последние 5 раз 200 мкл ФБРТ, затем проявляли с помощью 100 мкл хромогенного субстрата для пероксидазы 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМВ) в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1н. Н₂80₄ на лунку. Поглощение измеряли спектрофотометрически на 450 нм. Результаты считывания поглощения наносили на график в программном обеспечении ОтарЬРаб Ргып® версии 5.0. Значения К_с рассчитывали с помощью метода подгонки нелинейной кривой регрессии в функции программного обеспечения один сайт специфичное связывание. Связывание В9 с РОРК-3(111Ъ)-Рс дикого типа использовали в качестве стандарта для анализа относительной аффинности связывания укороченных или мутантных РОРК, которую наносили на график в виде процента от связывания дикого типа.

Молекулярное моделирование РОРК-3(111Ъ) человека.

Для определения направления исследований мутагенеза создали трехмерную модель доменов 2 и 3 ЕСГО РОРК-3(111Ъ), применяя 8У188-М0ИЕР®. Последовательности РОРК-3(111Ъ) человека и РОРК3(111с) человека выравнивали, используя способ СБиЗТАБЛУ®. и модель сконструировали, используя рентгеновскую кристаллическую структуру РОРК-3(111с) в качестве шаблона (номер в банке данных белков 1ΚΥ7).

Эпитоп антитела 1 содержится во втором иммуноглобулин-подобном (1д) домене РОРК-3.

Сайты связывания лиганда на рецепторах семейства РОРК содержатся в пределах трех Ν-концевых 1д-доменов, которые определяют внеклеточный домен (СЬе11а1аЬ, с1 а1., 1. ΒίοΙ. Сйет. 1999, Эсс. 3; 274 (49): 34785-34794). Чтобы определить, который из трех 1д-доменов включает эпитоп антитела 1, получили набор укороченных доменов. Последовательности ДНК, кодирующие 1д-домены человека, укорачивали с получением различных форм и экспрессировали в виде гомодимерных слитых белков с Рс человека. Кодированные белки очищали из кондиционированного супернатанта временно трансфицированных клеток, и гомодимерную структуру каждого очищенного укороченного домена подтверждали с помощью ПААГ/ДСН. Затем проверяли связывание укороченных доменов с антителом 1 в среднемасштабном анализе связывания (Мею 8са1е Н18соуету, Гейтесбург, Мэриленд). Хотя антитело 1 не проявило детектируемого связывания с укороченными доменами Ό1 и Ό3, оно показало существенное связывание с укороченными доменами Ό1-2 и Ό2, что определили в среднемасштабном анализе связывания (Мею 8са1е Н1юоуету, Гейтесбург, Мэриленд) и с помощью В1Асоте™ (Рйатташа, Пискатавэй, Нью-Джерси). В9 узнавало конформационно чувствительный эпитоп в домене 1 рецептора, следовательно, ожидали, что укороченные домены, содержащие домен 1, будут связывать антитело, если вся его структура не нарушена. Укороченные домены Ό1 и Ό1-2 проявили существенное связывание с контрольным МаЪ В9, что подтвердило структурную целостность этих двух белков, при определении в среднемасштабном анализе связывания (Мею 8са1е Н1юоуету, Гейтесбург, Мэриленд) и с помощью В1Асоге™ (Рйаттааа, Пискатавэй, Нью-Джерси). Результаты связывания укороченных доменов выявили, что второго 1ддомена РОРК-3 достаточно для связывания антитела 1, и таким образом, этот домен содержит остатки, важные для эпитопа.

Определение аминокислот РОРК-3 в пределах эпитопа, узнаваемого антителом 1.

Построили трехмерную модель доменов 2 и 3 ЕСИ РОРК-3(111Ъ) на основании кристаллической структуры РОРК-3(111с). На основании молекулярной модели и введения мутации с заменой одного остатка на аланин идентифицировали двадцать аминокислот (Ό160, К161, К162, Б163, Б164, У166, Р167, Р220, К223, Ό244, N170, Т171, К158, К173, К175, К205, К207, Б246, Е247, 8249) в пределах второго домена РОРК-3, расположенные поблизости или непосредственно вовлеченные в связывание лиганда, димеризацию рецептора или связывание гепарина.

Определили последовательность домена 2 РОРК-3 дикого типа (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 12). Каждую указанную аминокислоту по отдельности мутировали на аланин путем сайт-направленного мутагенеза и экспрессировали в контексте белка РОРК(111Ъ)-Рс с целым ЕСГО Кодированные мутантные белки очищали из кондиционированного супернатанта, временно трансфицированных клеток, и подтверждали гомодимерную структуру каждого очищенного мутанта с помощью ПААГ/ДСН.

Остаток считали важным для эпитопа, если его замена на аланин, описанная выше, приводила к существенной потере связывания с антителом 1. Все мутантные белки, которые проявили существенную потерю связывания, затем проверяли на связывание с МаЪ В9, чтобы проверить на наличие грубых изменений в общей структуре белка. Из 20 исследованных положений, замена аргинина на аланин в положении 173 (К173А) приводила к почти полной потере связывания с антителом 1 (снижение связывания >90% по сравнению с диким типом); тогда как при других заменах связывание сохранялось (снижение связывания <20% по сравнению с диким типом). Последующее тестирование показало, что связывание с МаЪ В9 не нарушалось заменой К173А, что позволило предложить, что в положении 173 находится остаток, важный для специфичного узнавания рецептора антителом 1. Аффинность антитела 1 к мутанту

- 11 021584

К173А определяли с помощью анализа В1Асоге®. Связывание антитела 1 с мутантом К173А было в 7 раз хуже, чем аффинность указанного антитела к белку дикого типа.

Сравнение последовательностей показало, что остаток аргинина в положении 173 последовательностей РОРК-3 человека и мыши отсутствует у других членов семейства, позволяя предположить, что этот остаток может отвечать за специфичность в отношении РОРК-3, проявляемую антителом 1.

Антагонистическое антитело к РОРК-3 блокирует опосредованное РОРК-3(ШЬ) и РОРК-3(111с) связывание РОР и передачу сигнала в клетке.

Результаты указанного выше анализа блокирования ЕЫЗА показали, что антитело 1 блокирует связывание РОР-1/РОРК-3 с 1С₅₀ в диапазоне 1-10 нМ. Клетки Ьб, экспрессирующие РОРК-3, описанные выше, применяли для проверки активности данного антитела по отношению к передаче сигнала РОРК-3 в живых клетках. Экспрессирующие РОРК-3 клетки Ьб переводили в состояние покоя в течение ночи в среде с очень низкой концентрацией сыворотки (0,1%). На следующий день клетки разделяли на пять образцов с одинаковым количеством клеток. Образцы 1 и 2 обрабатывали в течение 1 ч изотипически сходным неспецифичным контрольным антителом (200 нМ) и антителом 1 (200 нМ), соответственно. Образец 3 подвергали воздействию 0,б нМ РОР-9 в течение 15 мин. Образцы 4 и 5 сначала обрабатывали в течение 1 ч изотипически сходным неспецифичным контрольным антителом (200 нМ) и антителом 1 (200 нМ), соответственно, а затем подвергали воздействию 0,б нМ РОР-9 в течение 15 мин. После таких обработок и воздействий, клетки лизировали и подвергали их электрофорезу в ПААГ/ДСН и вестернблотингу. Проверяли активацию РОРК-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Антитело 1 отдельно ни ослабляло, ни усиливало сигналы активированного РОРК-3 и МАРК, а воздействие лиганда РОР-9 усиливало сигналы активированного РОРК-3 и МАРК в той же степени. Таким образом, данные результаты демонстрируют, что антитело 1 представляет собой антагонист, который блокирует рецептор РОРК-3 при индуцированной лигандом активации в живых клетках.

РОРК-3 на поверхности клетки интернализуется при связывании с антителом 1.

Антитело 1 запускает интернализацию РОРК-3, что является механизмом негативной модуляции передачи сигнала через данный рецептор. Чтобы это проверить, пометили указанное антитело коммерчески доступным красителем А1еха Р1иог® (1иуйгодеи) с целью проследить положение комплекса антитело 1/РОРК-3. Конъюгировали антитело 1 и изотипически сходное неспецифичное контрольное антитело с флуоресцентным красителем.

Экспрессирующие РОРК-3 клетки Ьб переводили в состояние покоя в течение ночи в среде с очень низкой концентрацией сыворотки (0,1%).

Клетки разделяли на 8 образцов с одинаковым количеством клеток и высевали в лунки б-луночного культурального планшета. Данные образцы подвергали трем различным процедурам: 1) связыванию, при котором клетки инкубировали с 1 мл 200 нМ конъюгированных антител в течение 1 ч при 4°С. Такая температура слишком низка для эндоцитоза, но благоприятна для взаимодействия антитело-антиген; 2) интернализации, при которой клетки инкубировали с 1 мл 200 нМ конъюгированных антител в течение 1 ч при 37°С. Эта температура позволяет эндоцитоз; 3) снятию антител, при котором клетки обрабатывали 1 мл 0,2 М глицина-0,15 М ЫаС1, рН 3, в течение 30 мин при 4°С. При таких условиях антитела, которые не интернализовались, не могут больше связываться с поверхностным рецептором и высвобождаются в среду. Восемь образцов трансфицированных РОРК-3 клеток Ьб обрабатывали согласно следующему протоколу: образец 1 инкубировали с конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4°С; образец 2 инкубировали с конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4°С, после чего следовало снятие антитела; образец 3 обрабатывали конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37°С; образец 4 обрабатывали конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37°С, после чего следовало снятие антитела; образец 5 обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4°С; образец б обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4°С, после чего следовало снятие антитела; образец 7 обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37°С; образец 8 обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37°С, после чего следовало снятие антитела. После данных обработок все клетки промывали три раза 1 мл ледяного ФБР и использовали систему визуализации в инфракрасной области Обуккеу для детектирования относительной интенсивности флуоресценции. Зарегистрированные показания для образцов 1-8 приведены далее: 1,5, 0,б, 1,1, 1, 3,3, 1,5, 5 и 5,8. Условия, в которых обрабатывали образцы 1 и 5, допускают связывание антитело-поверхность клетки, но не интернализацию. Условия, в которых обрабатывали образцы 2 и б, не допускают ни связывание с поверхностью клетки, ни интернализацию. Условия, в которых обрабатывали образцы 3 и 7, допускают связывание с поверхностью клетки и интернализацию. Условия, в которых обрабатывали образцы 4 и 8, допускают интернализацию, но не связывание с поверхностью клетки. Сигналы, полученные от образцов 1-4, а также образца б, считали фоновыми вследствие неспецифичности.

Для некоторых образцов после инкубирования осуществляли этап кислотной промывки для снятия связанных с поверхностью антител, без воздействия на антитела, которые переместились в клетки.

- 12 021584

Это позволяло осуществить количественный анализ интернализованных антител. Помеченное аналогичным способом контрольное антитело (неспецифичное 1дО человека) не удерживалось вне зависимости от температуры инкубации или присутствия этапа промывки. При этом антитело 1 удерживалось при обеих температурах перед промывкой, после промывки оставалось только то, с которым инкубировали при 37°С; что демонстрирует интернализацию указанного антитела клетками.

Антитело 1 вызывает деградацию рецептора РОРК-3 в клетках.

ОРМ-2 представляет собой линию клеток, изначально выделенную из раковых клеток множественной миеломы. Известно, что клетки ОРМ-2 экспрессируют рецепторы РОРК-3, несущие точечную мутацию К650Е с приобретением функции. Клетки ОРМ-2 переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% РВ8) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на 5 групп. Клетки из группы 1 сразу лизировали и лизат хранили при -20°С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу, следовательно, обозначили как образец в момент времени 0 ч. В каждой из групп 2-5 было по 3 образца с равным количеством клеток, названных образец А, В и С группы 2, 3, 4 и 5. Образцы А групп 2-5 не подвергали какой-либо дополнительной обработке, но инкубировали при 37°С. Образцы В групп 2-5 обрабатывали 30 нг/мл РОР-1 при 37°С. Образцы С групп 2-5 обрабатывали 30 мкг/мл антитела 1 при 37°С. Все образцы группы 2 лизировали через 1 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20°С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 1 ч. Все образцы группы 3 лизировали через 4 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20°С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 4 ч. Все образцы группы 4 лизировали через 8 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20°С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 8 ч. Все образцы группы 5 лизировали через 24 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20°С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 24 ч. Когда все лизаты были готовы, их подвергали электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу. Сигналы РОРК-3 группы 1 и всех образцов группы 2 были аналогичными. В группе 3 сигналы РОРК-3 образцов А и С были аналогичными таковым для группы 1; однако сигнал образца В был значительно ниже. В группе 4 сигнал РОРК-3 образца А был аналогичным таковому для группы 1; однако сигналы образцов В и С были значительно ниже. В группе 5 сигнал РОРК-3 образца А был ниже, чем таковой для группы 1; однако сигналы образцов В и С практически отсутствовали. Следовательно, аналогично РОР-1, который, как известно, вызывает деградацию РОРК, антитело 1 также способно вызывать деградацию РОРК-3 зависимым от времени образом; это свойство, как полагают заявители, до сих пор не было показано.

Антитело 1 вызывает уменьшение количества мутантного рецептора РОРК-3 на поверхности клетки.

Большинство активирующих РОРК-3 мутаций, идентифицированных при раке мочевого пузыря, расположено во внеклеточном домене рецептора. Данные мутации (например, К248С или 8249С) приводят к возникновению нового неспаренного остатка цистеина, что приводит к образованию связанных дисульфидными связями димеров РОРК-3 независимо от наличия лиганда. Наиболее частые мутации представляют собой 82490 У375С и К248С, которые в совокупности составляют 91% всех мутаций РОРК-3 при раке мочевого пузыря. Вдобавок, 8249С на РОРК-3(111с) также приводит к конститутивной активации РОРК3(111с). Антитело 1 может способствовать интернализации и уменьшению количества не только РОРК-3 дикого типа (^Т), но также наиболее распространенных связанных с опухолью мутантов РОРК-3.

Для получения линий клеток ΝΙΗ-3Τ3 и Ва/Р3, стабильно экспрессирующих каждый из трех наиболее распространенных мутантных вариантов РОРК-3 и РОРК-3 дикого типа, клонировали кДНК, кодирующую полноразмерный РОРК-3(ШЬ) или (111с) человека, в ретровирусный вектор рМ8СУриго (С1оп1сск БаЬогаЮпск. Маунтин-Вью, Калифорния) с получением рМ8СУриго-РОРК-3(111Ь) или (111с). Определенные мутации, т.е. 8249С, У375С и К248С, вводили в кДНК с помощью ЦюкСЬаиде (81га1адепе, ЛаХойя, Калифорния). Для получения клеток ΝΙΗ3Τ3 и Ва/Р3, стабильно экспрессирующих РОРК-3 дикого типа или мутантный РОРК-3, трансфицировали различными конструкциями рМ8СУпео упаковывающие клетки РЬоешх-Есо (АТСС, Манассас, Вирджиния) путем липофекции с помощью ЫроГес1аш1п (1пуйгодеп). Ретровирус собирали и использовали для инфицирования клеток ΝΙΗ-3Τ3 и Ва/Р3. После селекции на 2 мкг/мкл пуромицина в течение двух недель, клетки, экспрессирующие дикий тип или мутантный РОРК-3, окрашивали конъюгированным с А1еха Р1иог 488 антителом против РОРК-3 человека и анализировали, применяя сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (РАС8).

Для индуцирования антителом 1 интернализации/уменьшения количества мутантного РОРК-3 и РОРК-3 дикого типа на поверхности клетки в лунки 6-луночных культуральных планшетов (Сок1аг, #3598) высевали 1,5х10⁵ клеток ΝΙΗ-3Τ3, экспрессирующих мутантный РОРК-3 (№Н-3Т3-мутантный РОРК-3), в 2 мл культуральной среды (ИМЕМ (1пуйгодеп), дополненной 10% (в объемном отношении) эмбриональной телячей сыворотки (РС8) (1пуйгодеп); 2 мМ Ь-глутамином (1пуйгодеп); 100 ед./500 мл пенициллина О и 100 мкг/500 мл стрептомицина (1пуйгодеп). Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37°С при 95% относительной влажности и 5% (в объемном отношении) СО₂. Затем добавляли в лун- 13 021584 ки антитело 1 до конечной концентрации 5 мкг/мл. После двухчасовой обработки культуральную среду удаляли из лунок и добавляли в них 1 мл свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток (СЬеткощ #δ-014-Β). Клетки собирали в центрифужные пробирки после инкубирования в течение 5 мин при комнатной температуре и промывали один раз культуральной средой, а затем еще один раз промывали буфером для связывания (ΌΡΒδ с 1% (в отношении веса к объему) БСА и 0,01% (в отношении веса к объему) азида натрия). Перед окрашиванием клеток, антитело против РОРК-3, которое узнает эпитоп, отличный от эпитопа антитела 1, метили А1еха Р1иог 488 (Мо1еси1аг РгоЬек, Юджин, Орегон), применяя набор для мечения моноклональных антител, согласно рекомендациям производителя. 100 мкл буфера для связывания, содержащего 2 мкг/мл меченного А1еха Р1иог 488 антитела, добавляли к клеткам, а затем инкубировали в течение 60 мин на льду. Клетки затем промывали один раз буфером для связывания и ресуспендировали в ΌΡΒδ, содержащем 2 мкг/мл йодида пропидия (чтобы окрасить мертвые клетки). Количество молекул РОРК-3, оставшихся на поверхности клеток, анализировали с помощью РАС8анализа и собирали данные для 10000 событий для каждого образца.

Средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток отражает количество молекул РОРК-3, которые остались на поверхности клеток после обработки антителом 1. Процент уменьшения количества РОРК-3 на поверхности клеток рассчитывали путем деления средней интенсивности флуоресценции обработанных антителом 1 клеток на среднюю интенсивность флуоресценции обработанных 1дО1 человека клеток. Антитело 1 значительно уменьшало количество как РОРК-3 дикого типа, так и мутантного РОРК-3 на поверхности клеток.

Для анализа пролиферации клеток Ва/Р3-РОРК3 высевали 80000 клеток/лунку в среду КРМ1 1640 с добавлением 10% РВ§. Антитело 1 добавляли при концентрации от 0,005 до 10 мкг/мл с гепарином (§1етСе11 ТесЬпо1од1ек, Ванкувер, Канада). После инкубирования в течение 72 ч клетки обрабатывали 20 мкл (2 мкКи)/200 мкл метил-³Н-тимидина в течение 6 ч при 37°С, 5% СО₂. Клетки собирали и считывали включение ³Н-тимидина. Антитело 1 значительно ингибировало пролиферацию Ва/Р3-РОРК-3-К248С.

Антагонистическое антитело к РОРК-3 ингибирует передачу сигнала РОР в экспрессирующих РОРК-3 опухолевых клетках ίη νίΙΐΌ.

Идентифицировали опухолевые линии клеток, которые экспрессируют РОРК-3 дикого типа (111Ь и/или 111с) или мутантный РОРК-3(111Ь и/или 111с), применяя проточную цитометрию, при этом антитело 1 выступало в качестве первичного антитела. Три линии клеток опухоли мочевого пузыря, КТ112, КТ4 и ВРТС905, проявили существенную экспрессию РОРК-3. Клетки ОРМ-2, которые, как известно, экспрессируют рецепторы РОРК-3, несущие точечную мутацию К650Е с приобретением функции, также проявили высокий уровень экспрессии в данном исследовании. Обнаружили, что две дополнительные линии клеток, ОЕО и РАОИ, экспрессируют умеренные, но при этом существенные уровни рецептора. Характеристики пути передачи сигнала через РОРК-3 в данных опухолевых клетках получали, применяя вестерн-блоттинг.

ОРМ-2 представляет собой линию клеток, полученную из опухолей множественной миеломы человека. Клетки ОРМ-2 переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% РВ§) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на четыре образца с равным количеством клеток. Отставляли и хранили образец 1 при 37°С в течение 1 ч в качестве контрольного образца. Инкубировали образец 2 с 200 нМ антитела 1 при 37°С в течение 1 ч. Оставляли образец 3 при 37°С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,2 нМ лиганда РОР-9 при 37°С в течение 15 мин. Инкубировали образец 4 с 200 нМ антитела 1 при 37°С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,2 нМ РОР-9 при 37°С в течение 15 мин. Далее, лизировали все четыре образца и подвергали их ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу. Измеряли активацию РОРК-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Измеряли активацию эффекторной молекулы МАРК, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной МАРК. Измеряли активацию эффекторной молекулы Ак1, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной Акр Сигналы фосфорилированного РОРК-3 из образцов 2 и 4 были сравнимы с таковыми для образца 1, который представляет нестимулированное состояние рецептора. Сигнал образца 3 был более чем в три раза сильнее, чем таковой для образца 1. Можно прийти к заключению, что антитело 1 антагонизирует влияние РОР-9 на активацию РОРК-3. Сигналы фосфорилированной МАРК для образцов 2 и 4 были сравнимы с сигналами для образца 1, который представляет нестимулированное состояние рецептора. Сигнал образца 3 был более чем в два раза сильнее, чем для образца 1.

Можно прийти к заключению, что антитело 1 антагонизирует влияние РОР-9 на активацию МАРК. ОЕО представляет собой линию клеток, полученную из колоректальных опухолей человека. Указанные клетки переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% РВ§) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на шесть образцов с равным количеством клеток. Отставляли и хранили образец 1 при 37°С в течение 1 ч в качестве контрольного образца. Инкубировали образец 2 с 200 нМ изотипически сходного неспецифичного контрольного антитела при 37°С в течение 1 ч. Инкубировали образец 3 с 200 нМ антитела 1 при 37°С в течение 1 ч. Оставляли образец 4 при 37°С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,67 нМ лиганда РОР-1 при 37°С в течение 15 мин. Инкубировали образец 5 с 200 нМ контрольного антитела при 37°С в течение 1 ч, затем

- 14 021584 этот образец подвергали воздействию 0,67 нМ РОР-1 при 37°С в течение 15 мин. Инкубировали образец 6 с 200 нМ антитела 1 при 37°С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,67 нМ РОР-1 при 37°С в течение 15 мин. Лизировали все шесть образцов и подвергали их электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу. Измеряли активацию РОРК-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Образцы 1, 2 и 4 проявили одинаково низкие уровни фосфорилированного РОРК-3, тогда как лишь образец 3 проявил значительно более сильные сигналы, соответствующие всем трем видам молекул. Следовательно, 1) воздействие РОР-9 увеличивает фосфорилирование РОРК-3; 2) антитело 1 антагонизирует указанное увеличение; 3) антитело 1 отдельно не проявляет какую-либо агонистическую активность.

КТ-112 представляет собой линию клеток, полученную из опухолей мочевого пузыря человека. Указанные клетки переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% РВ8) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на четыре образца с равным количеством клеток. Отставляли и хранили образец 1 при 37°С в течение 1 ч в качестве контрольного образца. Инкубировали образец 2 с 200 нМ антитела 1 при 37°С в течение 1 ч. Оставляли образец 3 при 37°С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 1,3 нМ лиганда РОР-1 при 37°С в течение 15 мин. Инкубировали образец 4 с 200 нМ антитела 1 при 37°С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,13 нМ РОР-1 при 37°С в течение 15 мин. Далее, лизировали все четыре образца и подвергали 10% каждого лизированного образца электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестернблоттингу. Измеряли активацию эффекторной молекулы МАРК, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной МАРК. Измеряли активацию эффекторной молекулы Ак1. нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной Ак!. Подвергали остальные 90% каждого лизата иммунопреципитации. Смешивали образец с доступным для приобретения антителом против РОРК-3 при 4°С в течение 4-16 ч, чтобы позволить антителу связаться с рецепторами РОРК-3 в лизатах, а затем извлекали РОРК-3, связанный с антителом против РОРК-3, путем смешивания 20 мкг смеси гранул с белком А-белком О (50:50, в объемном отношении) с образцами при 4°С в течение ночи. Эти гранулы промывали 3 раза в ФБР перед осуществлением ПААГ/ДСН и вестернблоттинга. Измеряли активацию РОРК-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Образцы 1, 2 и 4 проявили одинаково низкие уровни фосфорилированного РОРК-3 и фосфорилированной МАРК, тогда как лишь образец 3 проявил значительно более сильные сигналы, соответствующие всем трем видам молекул. Следовательно, 1) воздействие РОР-1 повышает фосфорилирование РОРК-3 и МАРК; 2) антитело 1 антагонизирует данное повышение; 3) антитело 1 отдельно не проявляет какую-либо агонистическую активность. В образце 4 сигнал фосфорилированной Ак! был слабее, чем в остальных образцах, что указывает на то, что антитело 1 может также антагонизировать передачу сигнала через Ак!

Клетки ОЕ0 использовали для получения шести образцов, описанных выше, затем их лизировали и подвергали электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу, описанным выше. Тем не менее, измеряли активацию эффекторной молекулы МАРК, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной МАРК. Измеряли активацию эффекторной молекулы Ак!, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной Ак!. Образцы 1, 2, 3 и 6 проявили одинаково низкие уровни фосфорилированной МАРК, тогда как образцы 4 и 5 проявили значительно более сильные сигналы, соответствующие всем трем видам молекул. Следовательно, 1) воздействие РОР-1 увеличивает фосфорилирование МАРК; 2) антитело 1 антагонизирует указанное увеличение; 3) антитело 1 отдельно не проявляет какую-либо агонистическую активность.

Антитело 1 ингибирует рост и выживаемость опухолевых клеток ίη νίίτο.

Анализ пролиферации клеток применяют, чтобы показать ингибиторное действие антитела 1 на рост опухолевых клеток. Монослой клеток КТ112 переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% эмбриональной бычьей сыворотки, 5 мкг/мл гепарина) в течение 24-72 ч. Клетки разделяли на 4 образца. Добавляли РВ8 (эмбриональную бычью сыворотку) в образец 1 до конечной концентрации 10% (в объемном отношении). Оставляли образец 2 в обедненной среде. Добавляли РОР-1 в образец 3 до конечной концентрации 1 нМ. Добавляли антитело 1 в образец 4 до конечной концентрации 200 нМ, инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Далее, добавляли РОР-1 до конечной концентрации 1 нМ. После подготовки образцов 1-4, как описано выше, инкубировали образцы в термостате для культуры ткани при 37°С и 5% СО₂ (в объемном отношении) в течение 48 ч. Рост клеток прослеживали, применяя стандартный анализ включения 3Н-тимидина. Рост опухолевых клеток ускорялся в два раза, когда клетки КТ112 стимулировали ίη νίνο 1 нМ экзогенного РОР-1. Данный эксперимент также показал, что антитело 1 эффективно снижает этот экзогенно стимулированный рост.

Анализ в мягком агаре, также известный как анализ образования колоний или колониегенный анализ, применяют, чтобы показать ингибиторное действие антитела 1 на выживаемость опухолевых клеток. Клетки КТ112, которые растили в мягком агаре, содержащем 200 нМ антитела 1 (в культуральной среде с 10% РВ8), образовывали на приблизительно 50% меньше колоний, чем клетки, которые растили в мягком агаре, содержащем только культуральную среду с 10% РВ8, или содержащем 200 нМ изотипически сходного неспецифичного контрольного антитела (в культуральной среде с 10% РВ8). Этот анализ показал действие антитела 1, направленное против выживаемости опухолевых клеток. Антитело 1 оказывает

- 15 021584 противоопухолевое действие на несущие РОРК-3 солидные опухоли.

Ксенотрансплантатные модели опухоли КТ112 и ОЕО разрабатывали с помощью обычных способов, в которых 1-20 млн опухолевых клеток, смешанных с 0-100% Матригелем (МаРтде1), инъецировали подкожно каждой самке бестимусной голой мыши. Лечение антителом начинали, когда средний объем подкожных опухолей достигал приблизительно 400 мм². Обе соответствующие опухолевым линиям клеток КТ112 и ОЕО ксенотрансплантатные опухоли эффективно ингибировались лечением путем внутрибрюшинной инъекции три раза в неделю 40 мг/кг антитела 1, по сравнению с теми же типами опухолей в контрольных группах. Для того чтобы продемонстрировать, что данные эффекты происходят в результате изменения пути передачи сигнала через РОРК-3, проводили исследование эффективности, применяя ортотопическую модель опухоли РС-3, в которой опухолевые клетки были лишены передачи сигнала через РОРК-3, что предположили по отрицательным результатам вестерн-блоттинга фосфорилирования рецептора РОРК-3. Ортотопическую модель РС-3 получали путем инъецирования трансфицированных люциферазой клеток РС-3 (РС-3ЬР) непосредственно в верхнюю долю предстательной железы мышей Νιι/ηιι (самцы, 7-8 недель, 1х10⁶ клеток/мышь) путем хирургического вмешательства. Через две недели после имплантации клеток регистрировали биолюминесцентные изображения животных со стороны брюшка (животные лежали на спине) и осуществляли количественный анализ, применяя систему ΐνΐδ, согласно рекомендациям производителя (СаНрет Ы£е 8с1епсе8, Хопкинтон, Массачусетс). Мышей с удачными имплантатами произвольно разделяли на группы, чтобы вводить им внутрибрюшинно различные тестируемые средства по заранее определенному расписанию. Сигналы, зарегистрированные с помощью ΐνΐδ, использовали в качестве идентификаторов опухолевой массы и регистрировали их еженедельно. Статистический анализ осуществляли, применяя дисперсионный анализ повторных измерений. Антитело 1 не оказало существенного влияния на рост опухолей РС-3. Следовательно, антитело 1 ингибирует рост только тех солидных опухолей, в которых есть функциональные пути передачи сигнала через РОРК-3.

Антитело 1 оказывает противоопухолевое действие на миелоидные опухоли с мутантными рецепторами РОРК-3.

ОРМ-2 и КМ8-11 представляют собой экспрессирующие РОРК-3 линии клеток множественной миеломы. Вдобавок, рецепторы в обеих линиях клеток представляют собой мутанты, несущие по одной точечной мутации: К650Е в ОРМ-2 и Υ373С в КМ8-11. Две указанные мутации представляют собой мутации с приобретением функции, и они повышают активность мутантных рецепторов посредством таких механизмов, как конститутивная активация, увеличение времени полужизни и повышение чувствительности к лиганду. Создавали ксенотрансплантатную модель ОРМ-2 с помощью обычных способов, в которых 1-20 млн опухолевых клеток, смешанных с 0-100% матригелем, инъецировали подкожно каждой самке бестимусной голой мыши. Лечение инъекциями начинали, когда средний объем подкожных опухолей достигал приблизительно 400 мм². Введение осуществляли 3 раза в неделю. Измеряли объемы опухолей 3 раза в неделю. Последнее измерение осуществляли через 4 недели лечения. Средний размер опухоли животных, которых лечили антителом 1, был на 64% меньше, чем таковой у контрольной группы. Применяли критерий Стьюдента. Значение р было меньше чем 0,0001. Следовательно, открытие было высокозначимым. Модель приживления кости КМ8-11 создали, как описано у Χίη X. е1 а1., СПп Сапсег Ке8. 15 августа 2006 г.; 12(16):4908-15. Лечение антителом начинали через 1 неделю после инъекций опухолевых клеток. Введение осуществляли 3 раза в неделю. Измеряли сигналы, испускаемые опухолевыми клетками, несколько раз во время исследования. Последнее измерение осуществляли через 33 дня после первой инъекции. Средний сигнал для животных, которых лечили антителом 1, составлял 1/4 от такового для контрольных животных. Применяли логарифмический ранговый критерий (Мап!е1-Сох). Значение р составляло 0,0002. Следовательно, открытие было высокозначимым. В обеих моделях лечение интраперитонеальными инъекциями 40 мг/кг антитела 1 три раза в неделю значительно ингибировало рост опухоли по сравнению с контрольными группами. Антитело 1, похоже, первое проявило противоопухолевую активность ш У1уо против опухолевых клеток, которые несут как К650Е, так и Υ373С мутантные формы РОРК-3.

Антитело 1 повышает терапевтическую эффективность цитотоксических средств.

Цисплатин представляет собой широко используемое цитотоксическое средство в методах лечения рака. Он вызывает образование поперечных связей в ДНК и индуцирует апоптоз клеток. Исследовали терапевтическую пользу комбинирования цисплатина с антителом против РОРК-3 в трех ксенотрансплантатных моделях опухоли мочевого пузыря. Ксенотрансплантатные модели опухолей КТ112, КТ4 и ВРТС905 получали с помощью обычных способов, в которых 1-20 млн опухолевых клеток, смешанных с 0-100% матригелем, инъецировали подкожно каждой самке бестимусной голой мыши. Лечение антителом начинали, как только средний объем подкожных опухолей достигал приблизительно 400 мм². Осуществляли инъекции 40 мг/кг антитела 1 и максимально переносимой дозы (МТЭ) цисплатина три раза в неделю. Измеряли объемы опухолей 3 раза в неделю до окончания исследований. Краткое описание результатов для модели опухоли КТ112 приведено в следующей таблице.

- 16 021584

Таблица 3

Отдельные объемы опухолей КТ-112 (мм³) - лечение цисплатином

Лечение	День 1	День 8	День 15	День 22	День 29	День 36	День 42
Солевой раствор и8Р, среднее	181,2	288,7	560,6	909,9	1346,4	1758,6	2211,0
± стандартная ошибка среднего	9,0	18,3	33,5	79,5	133,5	177,4	224,7

цисплатином с таковой для комбинации цисплатин-антитело 1. Значение р составляло 0,018. Следовательно, влияние антитела 1 на повышенную эффективность цисплатина было высокозначимым.

Краткое описание результатов для модели опухоли КТ4 приведено в следующей таблице.

Таблица 4

Отдельные объемы опухолей КТ4 (мм³) - лечение цисплатином

Лечение	День 1	День 8	День 15	День 22	День 29	День 36	День 42
Солевой раствор и$Р, среднее	186,0	314,9	624,5	899,6	1351,9	1813,2	2441,2
±стандартная ошибка среднего	9,0	26,2	43,9	58,7	104,6	194,2	270,0
Антитело 1, среднее	209,1	289,8	500,9	670,6	913,0	1163,6	1496,0
± стандартная ошибка среднего	12,2	19,5	42,0	75,С	117,4	136,9	186,9
Цисплатин, среднее	195,4	253,4	374,0	511,9	675,8	840,5	1024,5

цисплатином с таковой для комбинации цисплатин-антитело 1. Значение р составляло 0,0162. Следовательно, влияние антитела 1 на повышенную эффективность цисплатина было высокозначимым.

Краткое описание результатов для модели опухоли ВРТС905 приведено в следующей таблице.

- 17 021584

Таблица 5

Отдельные объемы опухолей ВРТС-905 (мм³) - лечение цисплатином

Лечение	День 0	День 3	День 7	День 14	День 21	День 28	День 35	День 42
Солевой раствор ГОР, среднее	189,0	239,4	285,3	470,3	756,9	1227,3	1812,8	2649,5
± стандартная ошибка среднего	11,1	17,0	20,5	57,8	76,7	134,3	225,9	367,5
Антитело 1, среднее	191,9	220,5	252,3	334,2	527,2	727,7	932,5	1346,8
± стандартная ошибка среднего	11,9	18,0	18,3	27,8	52,4	77,5	104,1	187,9
Цисплатин, среднее	192,1	211,4	243,4	286,7	395,0	511,6	615,5	829,6
± стандартная ошибка среднего	14,2	15,3	18,7	33,9	56,6	81,2	116,9	165,1
Антитело 1 + цисплатин, среднее	212,1	225,9	237,1	275,3	280,0	311,6	311,4	331,4
± стандартная ошибка среднего	12,6	16,2	21,7	22,1	52,1	81,2	97,7	137,6

Осуществляли дисперсионный анализ повторных измерений. Сравнивали эффективность лечения цисплатином с таковой для комбинации цисплатин-антитело 1. Значение р составляло 0,0209. Следовательно, влияние антитела 1 на повышенную эффективность цисплатина было высокозначимым.

Ни одно из животных не погибло в результате лечения на протяжении всех описанных исследований, что позволило предложить, что добавление антитела 1 к максимальной переносимой дозе цисплатина повышает эффективность последнего, не вызывая значительного усугубления неблагоприятного действия двух указанных лекарственных средств.

- 18 021584

Список последовательностей <110> £11 ЬП1у <120> ИНГИБИТОРЫ РЕЦЕПТОРА ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ-3 (ГСБЕ-З) И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ <130> Х18531 <160> 12 <170> РаЬег.Ып νβΕΒίοη 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 1

С1у Туг МеЬ РЬе ТЬг Зег Туг СЬу Не Зег

10 <210> 2 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 2

Тгр Уа1 Зег ТКг Туг Азп С1у Азр ТЬг Азп Туг А1а СЬп Ьуз РЬе С1п 15 10 15

С1у <210> 3 <211> П <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 3

Уа1 Ьеи СЬу Туг Туг Азр Зег Не Аер СЬу Туг Туг Туг СЬу МеЪ Азр 15 10 15

УаЬ <210> 4 <211> 11

- 19 021584 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 4

С1у С1у Азп Азп 11е С1у Азр Ьуз Зег Уа1 Шз 15 10 <210> 5 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Синтетическая <400> 5

Ьеи Азр ТЬг С1и Агд Рго Зет

5 <210> 6 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 6

С1п Уа1 Тгр Азр Зег СЬу Зег Азр Шз УаЬ Уа1 1 5 10 <210> 7 <211> 126 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 7

С1и УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег 1 5

Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз 20

СЬу Не Зег Тгр УаЬ Агд С1п 35

СЬу Тгр УаЬ Зег ТЬг Туг Азп 50 55

СЬп СЬу Агд Уа1 ТЬг Уа1 ТЬг 65 70

С1у АЬа СЬи Уа1 Ьуз Ьуз Рго 10

АЬа Зег СЬу Туг МеЬ РЬе ТЬг 25 30

АЬа Рго С1у С1п СЬу Ьеи 61и 40 45

СЬу Азр ТЬг Азп Туг А1а С1п 60

ТЬг Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг 75

С1у

Зег

Тгр

Ьуз

АЬа

А1а

Туг

МеЬ

РЬе

Туг

- 20 021584

мее СЬи

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Зег

СЬи

Азр

ТНг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

АЬа Агд

УаЬ

Ьеи

СЬу

Туг

Туг

Азр

Зег

Ые

Азр

СЬу

Туг

Туг

Туг

СЬу

100

105

110

МеЬ Азр

УаЬ

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

ТНг

ТНг

УаЬ

ТНг

УаЬ

Зег

Зег

115

120

125

<2Ь0>

8

<211>

109

<212>

Белок

<213> ;

Искусственная

ΐ последовательность

<22С>

<223>

Синтетическая

<400>

8

СЬп Зег

УаЬ

Ьеи

ТНг

еьп

Рго

Рго

Зег

Ьеи

5ег

УаЬ

АЬа

Рго

СЬу

Ьуэ

1

5

10

15

ТНг АЬа

ТНг

РНе

ТНг

Суз

С1у

СЬу

Азп

Азп

Ые

СЬу

Азр

Ьуз

Зег

УаЬ

20

25

30

Шз Тгр

Туг

Агд

61п

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

УаЬ

Ьеи

УаЬ

Мен

Туг

35

40

45

Ьеи Азр

ТНг

СЬи

Агд

Рго

Зег

СЬу

Ые

Рго

СЬи

Агд

МеН

Зег

СЬу

Зег

50

55

60

Азп РНе

61у

Азп

ТНг

АЬа

ТЬг

Ьеи

ТНг

Ые

ТНг

Агд

УаЬ

СЬи

АЬа

СЬи

65

70

75

80

Азр СЬи

АЬа

Азр

Туг

Туг

Суз

СЬп

УаЬ

Тгр

Азр

Зег

СЬу

Зег

Азр

Шз

85

50

95

УаЬ УаЬ

РНе

СЬу

СЬу

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТНг

УаЬ

Ьеи

СЬу

100

105

<210>

9

<211>

456

<2 12>

Белок

<213>

Искусственная последовательность

<220>

<223>

Синтетическая

<400>

9

01и УаЬ

С1П

Ьеи

УаЬ

сьп

Зег

СЬу

АЬа

СЬи

УаЬ

Ьуз

Ьуз

Рго

СЬу

АЬа

1

5

10

15

Зег УаЬ

Ьуз

УаЬ

Зег

Суз

Ьуз

АЬа

Зег

СЬу

Туг

Мер

РНе

ТНг

Зег

Туг

20

25

30

СЬу Не

Зег

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

АЬа

Рго

СЬу

СЬп

СЬу

Ьеи

СЬи

Тгр

МеН

35

40

45

СЬу Тгр

УаЬ

Зег

ТНг

Туг

Азп

СЬу

Азр

ТНг

Азп

Туг

АЬа

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п С1у Агд Уа1 ТЬг Уа1 ТЬг ТЬг Аар ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг

70 75 80

МеЬ С1и Ьеи Агд Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а УаЬ Туг Туг Суз

90 95

А1а Агд Уа1 Ьеи С1у Туг Туг Азр Зег 11е Азр С1у Туг Туг Туг С1у 100 105 110

МеЬ Аер Уа1 Тгр С1у С1п 61у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег 115 120 125

ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг 130 135 140

Зег С1у СЬу ТЬг А1а А1а Ьеи СЬу Су® Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго

145 150 155 160

С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег 61у УаЬ

165 170 175

Шз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег 180 185 190

Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг Туг 11е 195 200 205

Суз Азп Уа1 Азп Шз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 210 215 220

С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а

225 230 235 240

Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго

245 250 255

Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 260 265 270

Уа1 Азр Уа1 Зег Н1э С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 275 280 285

Азр С1у Уа1 О1и Уа1 Шз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 61и С1п 290 295 300

Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег УаЬ Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Шз С1п

305 310 315 320

Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз А1а

325 330 335

Ьеи Рго АЬа Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго 340 345 350

Агд С1и Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи МеЬ ТЬг 355 360 365

Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег 370 375 380

Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп 01у 61п Рго СЬи Азп Азп Туг 385 390 395 400

- 22 021584

Ьуз

Ткг

Т1)Г

Рго

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

Рке

Рке

Ьеи

Туг

405

410

415

Зег

Ьуз

Ьеи

Ткг

УаЬ

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

СЬп

СЬп

СЬу

Азп

УаЬ

Рке

420

425

430

Зег

Суз

Зег

УаЬ

Мек

НЬз

СЬи

АЬа

Ьеи

НЬз

АЗП

НЬз

Туг

Ткг

СЬп

Ьуз

435

440

445

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

450 455 <210> 10 <2Ы> 214 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая

<400> 10

СЬп

Зег

УаЬ

Ьеи

Ткг

СЬп

Рго

Рго

Зег

Ьеи

Зег

УаЬ

АЬа

Рго

СЬу

Ьуз

1

5

10

15

ТЬг

АЬа

Ткг

Рке

Ткг

Суз

СЬу

СЬу

Азп

Азп

Ые

СЬу

Азр

Ьуз

Зег

УаЬ

20

25

30

НЬз

Тгр

Туг

Агд

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

УаЬ

Ьеи

УаЬ

Мек

Туг

35

40

45

Ьеи

Азр

ТНг

СЬи

Агд

Рго

Зег

СЬу

ЬЬе

Рго

СЬи

Агд

Мек

Зег

СЬу

Зег

50

55

60

Азп

Рке

СЬу

Азп

Ткг

АЬа

Ткг

Ьеи

Ткг

Не

Ткг

Агд

УаЬ

СЬи

АЬа

СЬи

65

70

75

80

Азр

сьи

АЬа

Азр

Туг

Туг

Суз

СЬп

УаЬ

Тгр

Азр

Зег

СЬу

Зег

Азр

НЬз

85

90

95

УаЬ

Уа1

Рке

СЬу

СЬу

СЬу

Ткг

Ьуз

Ьеи

Ткг

УаЬ

Ьеи

СЬу

СЬп

Рго

Ьуз

100

105

ыо

АЬа

АЬа

Рго

Зег

УаЬ

Ткг

Ьеи

Рке

Рго

Рго

Зег

Зег

СЬи

СЬи

Ьеи

СЬп

115

120

125

АЬа

Азп

Ьуз

АЬа

Ткг

Ьеи

УаЬ

Суз

Ьеи

Ые

Бег

Азр

Рке

Туг

Рго

СЬу

130

135

140

АЬа

УаЬ

Ткг

УаЬ

АЬа

Тгр

Ьуз

АЬа

Азр

Бег

Зег

Рго

УаЬ

Ьуз

АЬа

СЬу

145

150

155

160

УаЬ

СЬи

ТЬг

Ткг

Ткг

Рго

Зег

Ьуз

СЬп

Бег

Азп

Азп

Ьуз

Туг

АЬа

АЬа

165

170

175

Зег

Зег

Туг

Ьеи

Зег

Ьеи

Ткг

Рго

СЬи

СЬп

Тгр

Ьуз

Зег

НЬз

Агд

Зег

180

185

190

Туг

Зег

Суз

СЬп

УаЬ

Ткг

НЬз

СЬи

СЬу

Зег

Ткг

УаЬ

СЬи

Ьуз

Ткг

УаЬ

195

200

205

А1а Рго АЬа СЬи Суз Бег 210

- 23 021584

<210> 11 <2Ы> 795 <212> Белок

<213> Ното

заръепз

<400> 11

Мек

01у

АЬа

Рго

А1а

Суз

А1а

Ьеи

АЬа

Ьеи

Суз

УаЬ

АЬа

УаЬ

А1а

Не

1

5

10

15

Уа1

АЬа

61у

А1а

Зег

Зег

СЬи

Зег

Ьеи

СЬу

ТЫ

61и

СЬп

Агд

УаЬ

УаЬ

20

25

30

С1у

Агд

А1а

АЬа

61и

Уа1

Рго

61у

Рго

С1и

Рго

СЬу

СЬп

СЬи

Ьеи

УаЬ

35

40

45

РЬе

61у

Зег

61у

Азр

А1а

УаЬ

61и

Ьеи

Зег

Суз

Ргс·

Рго

Рго

СЬу

СЬу

50

55

60

СЬу

Рго

МеЪ

СЬу

Рго

ТЬг

УаЬ

Тгр

УаЬ

Ьуз

Азр

СЬу

ТЬг

еьу

Ьеи

УаЬ

65

70

75

80

Рго

Зег

С1и

Агд

νβι

Ьеи

УаЬ

СЬу

Рго

СЬп

Агд

Ьеи

УаЬ

Ьеи

Азп

А1а

85

90

95

Зег

НЬЗ

С1и

Азр

Зег

СЬу

АЬа

Туг

Зег

Суз

Агд

СЬп

Агд

Ьеи

ТЬг

Агд

100

105

110

Уа1

Ьеи

Суз

НЬз

РЬе

Зег

УаЬ

Агд

УаЬ

ТЬг

Азр

АЬа

Рго

Зег

Зег

СЬу

115

120

125

Азр

Азр

СЬи

Азр

СЬу

С1и

Азр

СЬи

АЬа

СЬи

Азр

ТЬг

СЬу

УаЬ

Азр

ТЬг

130

135

140

61 у

А1а

Рго

Туг

Тгр

ТЬг

Агд

Рго

С1и

Агд

МеЪ

Азр

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

145

150

155

160

А1а

Уа1

Рго

АЬа

АЬа

Азп

ТЬг

УаЬ

Агд

РЬе

Агд

Суз

Рго

АЬа

А1а

61у

165

170

175

Азп

Рго

ТЬг

Рго

Зег

Не

Зег

Тгр

Ьеи

Ьуз

Азп

СЬу

Агд

СЬи

РЬе

Агд

180

185

190

С1у

СЬи

НЬз

Агд

Не

СЬу

СЬу

11е

Ьуз

Ьеи

Агд

НЬз

СЬп

СЬп

Тгр

Зег

195

200

205

Ьеи

Уа1

МеЪ

СЬи

Зег

УаЬ

Уа1

Рго

5ег

Азр

Агд

СЬу

Азп

Туг

ТЬг

Суз

210

215

220

Уа1

УаЬ

С1и

Азп

Ьуз

РЬе

С1у

Зег

Не

Агд

СЬп

ТЫ

Туг

ТЬг

Ьеи

Азр

225

230

235

240

Уа1

Ьеи

61и

Агд

Зег

Рго

НЬз

Агд

Рго

Не

Ьеи

СЬп

АЬа

СЬу

Ьеи

Рго

245

250

255

А1а

Азп

С1п

ТЬг

А1а

УаЬ

Ьеи

СЬу

Зег

Азр

УаЬ

сьи

РЬе

НЬз

Суз

Ьуз

260

265

270

Уа1

Туг

Зег

Аар

А1а

Рго

НЬз

Не

СЬп

Тгр

Ьеи

Ьуз

НЬз

УаЬ

С1и

УаЬ

275

280

285

Азп

61у

Зег

Ьуз

УаЬ

СЬу

Рго

Азр

СЬу

ТЬг

Рго

Туг

УаЬ

ТЬг

Уа1

Ьеи

- 24 021584

- 25 021584

Туг Туг	Ьуз	Ьуз	ТЬг 645	ТЬг Азп	СЬу Агд	Ьеи Рго УаЬ 650	Ьуз	Тгр	МеС 655	АЬа
Рго СЬи	АЬа	Ьеи	РЬе	Азр Агд	УаЬ Туг	ТЬг НЬз Зег	Азр	УаЬ	Зег	РЬе
		660			665			670
СЬу УаЬ	Ьеи	Ьеи	Тгр	СЬи 11е	РЬе ТЬг	Ьеи СЬу СЬу	Зег	Рго	Туг	Рго
	675				680		685
СЬу Не	Рго	УаЬ	СЬи	СЬи Ьеи	РЬе Ьуз	Ьеи Ьеи Ьуз	СЬи	СЬу	НЬз	Агд
690				695		700
Мег Азр	Ьуз	Рго	АЬа	Азп Суз	ТЬг НЬз	Азр Ьеи Туг	МеС	11е	МеС	Агд
705				710		715				720
СЬи Суз	Тгр	НЬз	АЬа	АЬа Рго	Зег Агд	Рго ТЬг РЬе	Ьуз	Ьеи	УаЬ	СЬи
			725			730			735
Азр Ьеи	Азр	Агд	УаЬ	Ьеи ТЬг	УаЬ ТЫ	Зег ТЬг Азр	СЬи	Туг	Ьеи	Азр
		740			745			750
Ьеи 5ег	АЬа	Рго	РЬе	СЬи Туг	Зег Рго	СЬу СЬу СЬп	Азр	ТЬг	Рго	Зег
	755				760		765
Зег Зег	Зег	Зег	СЬу	Азр Азр	Зег УаЬ	РЬе АЬа НЬз	Азр	Ьеи	Ьеи	Рго
770				775		780
Рго АЬа	Рго	Рго	Зег	Зег СЬу	СЬу Зег	Агд ТЬг
785				790		795
<210>	12
<211>	100
<212> :	Белок
<2ьз> :	Ногпо	зартепз
<400>	12
АЬа Рго	Туг	Тгр	ТЬг	Агд Рго	СЬи Агд	МеС Азр Ьуз	ьуз	Ьеи	Ьеи	АЬа
Ь			5			10			15
УаЬ Рго	АЬа	АЬа	Азп	ТЬг УаЬ	Агд РЬе	Агд Суз Рго	АЬа	АЬа	СЬу	Азп
		20			25			30
Рго ТЬг	Рго	Зег	11е	Зег Тгр	Ьеи Ьуз	Азп СЬу Агд	СЬи	РЬе	Агд	СЬу
	35				40		45
СЬи НЬз	Агд	Ые	СЬу	С1у 11е	Ьуз Ьеи	Агд НЬз СЬп	СЬп	Тгр	Зег	Ьеи
50				55		60
УаЬ МеС	СЬи	Зег	УаЬ	УаЬ Рго	Зег Азр	Агд СЬу Азп	Туг	ТЬг	Суз	УаЬ
65				70		75				80
УаЬ СЬи	Азп	Ьуз	РЬе	СЬу Зег	11е Агд	СЬп ТЬг Туг	ТЬг	Ьеи	Азр	УаЬ
			85			90			95
Ьеи СЬи	Агд	Зег
		100

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антитело или его фрагмент, которое специфично связывается с РОРК-3(ШЬ) и РОРК-3(111с) человека, содержащее СИКН1, имеющий последовательность ОУМРТ8УО18 (8ЕЦ ГО N0:1), СИКН2, имеющий последовательность \УУ8ТУНООТНУА0КР0О (8ЕЦ ГО N0:2), СЭКН3, имеющий последовательность УБОУУО8ГООУУУОМЭУ (8ЕЦ ГО N0:3), СИКЫ, имеющий последовательность ООУМОЭКЯУН (8ЕЦ ГО N0:4), СИКЬ2, имеющий последовательность ЬИТЕКРЗ (8ЕЦ ГО N0:5), и С0КБ3, имеющий последовательность ЦУХУЭЗОГОНУУ (8ЕЦ ГО N0:6).
2. 2. Антитело по п.1, где антитело содержит последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи

   ЕУОЬУОЗОАЕУККРаАЗУКУЗСКАЗСУМРТЗУСХЗМУЕОАРСОСЬЕИМСИУЗТУИеОТЫУАОК

   РООЕУТУТТОТЗТЗТАУМЕЬЕЗЬКЗЕПТАУУУСАЕУЬОУУРЗГОСУУУаМПТИОдСТТУТУЗЗ (ЗЕО ГО N0:7),

   - 26 021584 и последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи

   ОЗУЬТОРРЗЬЗУАРаКТАТРТСОСШ1аПКЗУНИУКОКР<ЮАРУ1ЛГМУ1ЛЭТЕ£РЗа1РЕКМЗС

   ЗМРет1ТАТЬТ1ТЕ7ЕАСОЕАОУУСОТОВЗСЗПНУУРСОСТКЬТ7ЬС.
3. 3. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является антителом человека, имеющим К приблизительно 1х 10^-8 Μ или менее при комнатной температуре (20-25°С).
4. 4. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое специфически связывается с доменом 2 РОРК-3 человека (8Е0 ГО N0:12).
5. 5. Фармацевтическая композиция для использования при лечении рака, содержащая эффективное количество антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
6. 6. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного средства для лечения рака.