EA020130B1 - A ca6 antigen-specific antibody, cytotoxic conjugate comprising same and methods of using conjugate - Google Patents
A ca6 antigen-specific antibody, cytotoxic conjugate comprising same and methods of using conjugate Download PDFInfo
- Publication number
- EA020130B1 EA020130B1 EA200800642A EA200800642A EA020130B1 EA 020130 B1 EA020130 B1 EA 020130B1 EA 200800642 A EA200800642 A EA 200800642A EA 200800642 A EA200800642 A EA 200800642A EA 020130 B1 EA020130 B1 EA 020130B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- mean
- zeg
- carbon atoms
- amino acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
- A61K47/6877—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the antibody being an immunoglobulin containing regions, domains or residues from different species
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
- C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
- C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение направлено на мышиное моноклональное антитело против гликотопа СА6 и его гуманизованные или поверхностно-перестроенные варианты. Настоящее изобретение также направлено на эпитоп-связывающие фрагменты моноклонального антитела против гликотопа СА6, а также на эпитоп-связывающие фрагменты гуманизованных или поверхностно-перестроенных вариантов моноклонального антитела против гликотопа СА6.The present invention is directed to a murine monoclonal antibody against the CA6 glycotope and its humanized or surface rearranged variants. The present invention is also directed to epitope-binding fragments of a monoclonal anti-CA6 glycotope antibody, as well as to epitope-binding fragments of humanized or surface-rearranged variants of a monoclonal anti-CA6 glycotope.
Настоящее изобретение также направлено на цитотоксические конъюгаты, включающие агент, связывающий клетку, и цитотоксический агент, терапевтические композиции, включающие конъюгат, способы применения этих конъюгатов при ингибировании роста клеток и лечении заболеваний, а также набор, включающий цитотоксический конъюгат. В частности, агентом, связывающим клетку, является моноклональное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, который распознает и связывается с гликотопом СА6 или его гуманизованным или поверхностно-перестроенным вариантом.The present invention also provides cytotoxic conjugates comprising a cell binding agent and a cytotoxic agent, therapeutic compositions comprising a conjugate, methods for using these conjugates in inhibiting cell growth and treating diseases, and a kit comprising a cytotoxic conjugate. In particular, the cell binding agent is a monoclonal antibody or an epitope binding fragment thereof that recognizes and binds to the CA6 glycotope or its humanized or surface remodeled variant.
Уровень техникиState of the art
Предпринимались многочисленные попытки разработать противораковые терапевтические средства, специфически разрушающие заданные раковые клетки, но не повреждающие окружающие нераковые клетки и ткани. Такие терапевтические средства способны сильно улучшить лечение рака у пациентов.Numerous attempts have been made to develop anti-cancer therapeutic agents that specifically destroy targeted cancer cells, but do not damage surrounding non-cancer cells and tissues. Such therapeutic agents can greatly improve the treatment of cancer in patients.
Один из перспективных подходов состоит в том, чтобы соединить агент, связывающий клетку, типа моноклонального антитела с цитотоксическим препаратом (8е1а с1 а1, ίη 1тпшпосопщда1с5 189-236 (С. Уоде1, еб. 1987); Скоке е1 а1., ίη Татде1:еб Итидк 1-22 (Е. Со1бЬегд, еб. 1983); О|спсг е1 а1., ίη АйтЬобу теб1а1еб бекуегу кук1етк 1-23 (1. Воб^е11, еб. 1988); Р|е1ег8/ е1 а1., ίη АпкЬобу теб1а1еб бекуегу кук1етк 25-53 (1. Воб^е11, еб. 1988); Вито1 е1 а1., ίη АикЬобу теб1а1еб бекуегу кук1етк 55-79 (1. Воб^е11, еб. 1988)). В зависимости от агента, связывающего клетку, можно разработать такие цитотоксические конъюгаты, которые будут распознаваться и связываться только со специфическими типами раковых клеток, исходя из профиля экспрессии молекул, экспрессируемых на поверхности таких клеток.One promising approach is to combine a cell binding agent, such as a monoclonal antibody, with a cytotoxic drug (8е1а с1 a1, ίη 1тпшпосопщда1с5 189-236 (S. Uode1, eb. 1987); Skoke e1 a1., Ίη Tatde1: еб Itidk 1-22 (E. Co1bbegd, eb. 1983); O | csg e1 a1., Ίη Aytbobu te1a1eb bekuegu kuk1etk 1-23 (1. Wob ^ e11, eb. 1988); P | e1eg8 / e1 a1., Ίη Apkobu teb1ebek bekueg kuk1etk 25-53 (1. Wob ^ e11, eb. 1988); Vito1 e1 a1., Ίη Aikobobu teblaebu kuk1etk 55-79 (1. Vob ^ e11, eb. 1988)). Depending on the cell-binding agent, cytotoxic conjugates can be developed that will only be recognized and associated with specific types of cancer cells based on the expression profile of molecules expressed on the surface of such cells.
В таких цитотоксических конъюгатах использовались цитотоксические препараты, такие как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С и хлорамбуцил, присоединенные к целому ряду мышиных моноклональных антител. В некоторых случаях молекулы лекарств соединяли с молекулами антител через промежуточную молекулу-носитель типа сывороточного альбумина (Сатей е1 а1., 46 Саисет Век. 2407-2412 (1986); Оккама е1 а1., 23 Саисет Iттиηо1. Iттиηо1кег. 81-86 (1986); Еп6о е1 а1., 47 Самсет Век. 1076-1080 (1980), декстрана (ΗιιηνίΙζ е1 а1., 2 Арр1. Вюскет. 25-35 (1980); МатЫ е1 а1., 34 Вюскет. Ркагтасо1. 289-291 (1985); Οί11ιη;·ιη е1 а1., 46 Сагсег Век. 4886-4891 (1986); 8коуа1 е1 а1., 85 Ргос. №111. Асаб. 8ск 8276-8280 (1988) или полиглутаминовой кислоты (Ткикаба е1 а1., 73 1. ЫаИ. Са11с. 1пк£ 721-729 (1984); КаЮ е1 а1., 27 1. Меб. Скет. 1602-1607 (1984); Ткикаба е1 а1., 52 Вг. 1. Са11сег 111-116 (1985)).Such cytotoxic conjugates used cytotoxic drugs such as methotrexate, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinblastine, melphalan, mitomycin C and chlorambucil, coupled to a variety of murine monoclonal antibodies. In some cases, drug molecules were coupled to antibody molecules via an intermediate carrier molecule such as serum albumin (Satay e1 a1., 46 Saiset Vek. 2407-2412 (1986); Okkama e1 a1., 23 Saiset Ittiηo1 .ttiηo1keg. 81-86 (1986 ); Ep6o e1 a1., 47 Samset Century 1076-1080 (1980), dextran (ΗιιηνίΙζ e1 a1., 2 Arr1. Vyusket. 25-35 (1980); Maty e1 a1., 34 Vyusket. Rkagtaso. 289-291 (1985); Οί11ιη; · ιη e1 a1., 46 Sagseg Vek. 4886-4891 (1986); 8kou1 e1 a1., 85 Proc. No. 111. Asab. 8sk 8276-8280 (1988) or polyglutamic acid (Tkikaba e1 a1 ., 73 1. Liu. Sa11s. 1pc £ 721-729 (1984); KaYu e1 a1., 27 1. Furniture Sket. 1602-1607 (1984); Tkikaba e1 a1., 52 Br. 1. Sa11 seg 111-116 (1985)).
В качестве примера одного специфического конъюгата, подающего некоторые надежды, приводится конъюгат из антитела С242, направленного против антигена СашАд, экспрессированного на колоректальных и панкреатических опухолях, и производного майтансина ΌΜ1 (Ьш е1 а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А, 93: 8618-8623 (1996)). Изучение этого конъюгата ίη уйто показало, что он обладает высоким сродством связывания с СаηАд, экспрессированным на клеточной поверхности, при этом значение кажущейся Кб составляет 3х10-11 М, и обладает высокой цитотоксической активностью на СаηАд-положительные клетки, при этом значение 1С50 составляет 6х10-11 М. Цитотоксичность была зависимой от антигена, так как она блокировалась избытком неконъюгированных антител, а антиген-отрицательные клетки были в 100 с лишним раз менее чувствительными к конъюгату. Другие примеры конъюгатов типа антитело-ОМ1 с высоким сродством к соответствующим клеткам-мишеням и высокой антиген-селективной цитотоксичностью включают конъюгаты с 1ιι.ιΝ901. гуманизованным вариантом антитела к СИ56 человека; киМу9-6, гуманизованным вариантом антитела к СИ33 человека; киС242, гуманизованным вариантом антитела против эпитопа Мис1 СаηАд; ки1591, деиммунизованным антителом к Р8МА; трастузумаб, гуманизованным антителом к НсгЗ/псп; и биватузумаб, гуманизованным антителом к СЭ44у6.As an example of one specific conjugate, which offers some hope, the conjugate from the C242 antibody directed against the SashAD antigen expressed on colorectal and pancreatic tumors and the maytansine derivative ΌΜ1 (Ls e1 a1., Prg. Yab. Asc. 8618-8623 (1996)). The study of this ίη conjugate was removed and showed that it has a high binding affinity for CaηAD expressed on the cell surface, the apparent K b being 3x10 -11 M, and has high cytotoxic activity on CaηAD-positive cells, with a 1C 50 value 6x10 -11 M. Cytotoxicity was antigen-dependent, as it was blocked by an excess of unconjugated antibodies, and antigen-negative cells were more than 100 times less sensitive to the conjugate. Other examples of antibody-OM1 conjugates with high affinity for the corresponding target cells and high antigen-selective cytotoxicity include conjugates with 1ιι.ιΝ901. a humanized variant of the anti-human SI56 antibody; kiMu9-6, a humanized variant of the anti-human SI33 antibody; cis242, a humanized variant of the antibody against the epitope of MIS1 CaηAd; Ki1591, a immunized anti-P8MA antibody; trastuzumab, a humanized antibody to NSG3 / PSP; and bivatuzumab, a humanized anti-SE44u6 antibody.
Разработка дополнительных цитотоксических конъюгатов, специфически распознающих определенные типы раковых клеток, имеет важное значение для постоянного усовершенствования способов лечения больных раком.The development of additional cytotoxic conjugates that specifically recognize certain types of cancer cells is important for the continuous improvement of methods for treating cancer patients.
С этой целью настоящее изобретение направлено на разработку антител, распознающих и связывающихся с молекулами/рецепторами, экспрессированными на поверхности раковых клеток, и на разработку новых цитотоксических конъюгатов, включающих агенты, связывающие клетку, типа антител и цитотоксические агенты, специфически нацеленные на молекулы/рецепторы, экспрессированные на поверхности раковых клеток.To this end, the present invention is directed to the development of antibodies that recognize and bind to molecules / receptors expressed on the surface of cancer cells, and to the development of new cytotoxic conjugates including cell binding agents such as antibodies and cytotoxic agents specifically targeting molecules / receptors, expressed on the surface of cancer cells.
В частности, настоящее изобретение направлено на изучение характеристик нового сиалогликотопа СА6 на рецепторах муцина Мис1, экспрессируемых раковыми клетками, и на получение антител, предпочтительно гуманизованных антител, распознающих новый сиалогликотоп СА6 муцина Мис1, которые можно было бы использовать для ингибирования роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6, в качестве цитотоксического агента.In particular, the present invention is directed to the study of the characteristics of the new CA6 sialoglycotope on Mucin mucin receptors expressed by cancer cells, and to the production of antibodies, preferably humanized antibodies, recognizing the new Ca6 mucin Mucin sialoglycotope that could be used to inhibit the growth of cells expressing the CA6 glycotope as a cytotoxic agent.
- 1 020130- 1 020130
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Настоящее изобретение охватывает антитела, специфически распознающие и связывающиеся с новым сиалогликотопом СА6 рецепторов муцина Мис1, или их эпитоп-связывающие фрагменты. В другом воплощении настоящее изобретение охватывает гуманизованные антитела или их эпитопосвязывающие фрагменты, распознающие новый сиалогликотоп СА6 (гликотоп СА6 ) рецепторов муцина Мис1.The present invention encompasses antibodies that specifically recognize and bind to the new sialoglycotope CA6 of mucin Mis1 receptors, or their epitope-binding fragments. In another embodiment, the present invention encompasses humanized antibodies or their epitope-binding fragments that recognize the new CA6 (glycotope CA6) mialicin receptor sialoglycotope (CA6).
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение включает мышиное моноклональное антитело Ό86 к СА6 (антитело Ό86), а также поверхностно-перестроенные или гуманизованные варианты антитела Ό86, у которых выходящие на поверхность остатки антитела или его эпитопосвязывающих фрагментов на легких и тяжелых цепях заменены так, чтобы они были больше похожи на поверхности известных антител человека. Гуманизованные антитела и их эпитопосвязывающие фрагменты по настоящему изобретению обладают улучшенными свойствами в том, что они значительно менее иммуногенны (либо полностью не иммуногенны) в организме человека, которому они введены, чем их полностью мышиные варианты. Таким образом, гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты по настоящему изобретению специфически распознают новый сиалогликотоп на рецепторах муцина Мис1, т.е. гликотоп СА6, и в то же время не иммуногенны для человека. Эти гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты могут быть конъюгированы с лекарственным веществом типа майтансиноида с образованием пролекарства, обладающего специфической цитотоксичностью к антиген-экспрессирующим клеткам, направляя лекарство на сиалогликотоп СА6 Мис1. При этом цитотоксические конъюгаты, содержащие такие антитела и небольшие, сильно токсичные препараты (напр., майтансиноиды, таксаны, аналоги СС-1065), могут применяться в качестве терапевтических препаратов для лечения раковых опухолей типа опухолей молочной железы и яичников.In a preferred embodiment, the present invention includes a Ό86 anti-CA6 murine monoclonal antibody (Ό86 antibody), as well as surface-rearranged or humanized variants of варианты86 antibody in which the surface residues of the antibody or its epitope binding fragments on the light and heavy chains are replaced so that they are more similar to the surface of known human antibodies. The humanized antibodies and their epitope-binding fragments of the present invention have improved properties in that they are significantly less immunogenic (or completely non-immunogenic) in the human body to which they are administered than their fully murine variants. Thus, the humanized Ό86 antibodies and their epitope-binding fragments of the present invention specifically recognize the new sialoglycotope at the mucin Mis1 receptors, i.e. glycotope CA6, and at the same time not immunogenic for humans. These humanized antibodies and their epitope-binding fragments can be conjugated to a drug of the maytansinoid type to form a prodrug with specific cytotoxicity to antigen-expressing cells, directing the drug to the CA6 Mis1 sialoglycotope. Moreover, cytotoxic conjugates containing such antibodies and small, highly toxic drugs (e.g. maytansinoids, taxanes, analogs of CC-1065) can be used as therapeutic agents for the treatment of cancerous tumors such as breast and ovarian tumors.
Гуманизованные варианты антител Ό86 по настоящему изобретению полностью в нем охарактеризованы в отношении соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, последовательностей ДНК генов вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, идентификации участков СЭЯ, идентификации их поверхностных аминокислот и изложения способа их экспрессии в рекомбинантном виде.The humanized antibody variants Ό86 of the present invention are fully characterized in it with respect to the corresponding amino acid sequences of the variable regions of their light and heavy chains, DNA sequences of the genes of the variable regions of their light and heavy chains, identification of the SEC regions, identification of their surface amino acids and a presentation of the method for their expression in recombinant form.
В одном воплощении представлены гуманизованные антитела Ό86 или их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие тяжелую цепь, включающую участки СЭЯ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕЭ ГО N0: 1-3:In one embodiment, humanized Ό86 antibodies or their epitope-binding fragments comprising a heavy chain comprising SEA sites having the amino acid sequences represented by 8EE GO N0: 1-3:
ΥΝΜΗ (8ΕφΠ)ΝΟ: 1),ΥΝΜΗ (8ΕφΠ) ΝΟ: 1),
ΥΙΥΡΟΝΟΑΤΝΥΝ0ΚΓΚ6 (8Е<3 ГО N0: 2),ΥΙΥΡΟΝΟΑΤΝΥΝ0ΚΓΚ6 (8Е <3 GO N0: 2),
ΟΟδνΡΡΑΥ (8Е<Э ГО N0: 3), и содержащие легкую цепь, содержащую участки СЭЯ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕЭ ΙΌ N0: 4-6:ΟΟδνΡΡΑΥ (8Е <Э ГО N0: 3), and containing a light chain containing SEA sites having the amino acid sequences represented by 8ЕЭ ΙΌ N0: 4-6:
8АН88У8РМН (8Ε0ΙϋΝΟ:4),8AN88U8RMN (8Ε0ΙϋΝΟ: 4),
Т 8 5 Ь А 8 (8Е0 ГО N0: 5), (2рЯ88ЕРЬТ (8ЕЦ №N0: 6).T 8 5 L A 8 (8Е0 ГО N0: 5), (2рЯ88ЕРТ (8ЕЦ №N0: 6).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЭ ГО N0: 7 или 8ЕЭ ГО N0: 8:Also presented are humanized Ό86 antibodies and their epitope-binding fragments containing the variable region of the light chain having an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence represented by 8EE GO N0: 7 or 8EE GO N0: 8:
ф1УЕТф8РА1М8А8РОЕКУТ1ТС8АН88У8РМН9/РффКРОТ8РКЕ\У1¥8Т88ЕА8О νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ8ΚΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥ€φρΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Еф ГО N0:7)f1UETf8RA1M8A8ROEKUT1TS8AN88U8RMN9 / RffKROT8RKE \ U1 ¥ 8Т88ЕА8О νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ8ΚΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥ € φρΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Ef GO N0: 7)
ΕΐνΤΤφ8ΡΑΤΜ8Α8ΡΟΕΚνΤΙΤ08ΑΗ88ν8ΡΜΗΨΡφφΚΡΟΤ8ΡΚΕΨ1Υ8Τ88ΕΑ8Ο νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕϋΑΑΤΥΥ€φφΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Еф ГО N0: 8).ΕΐνΤΤφ8ΡΑΤΜ8Α8ΡΟΕΚνΤΙΤ08ΑΗ88ν8ΡΜΗΨΡφφΚΡΟΤ8ΡΚΕΨ1Υ8Τ88ΕΑ8Ο νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕϋΑΑΤΥΥ € φφΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Eph GO N0: 8).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЭ ГО N0: 9, 8ЕЕ) ГО N0: 10 или 8ЕЕ) ГО N0: 11:Also presented are humanized antibodies Ό86 and their epitope-binding fragments containing the variable region of the heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence represented by 8EE GO N0: 9, 8EE) GO N0: 10 or 8EE (GO) GO N0: 11:
φΑΥΕφφ8ΟΑΕΕνΚ8ΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗ\ννΚφΤΡΟφΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝρΚΡΚΟΚΑΤΕΤΑΟΡ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Εϋ8ΑνΥΡΟΑΚ.Οϋ8νΡΡΑΥ\νθφΟΤ ЕУТУ8А (8Еф ГО N0: 9) φΑφΕνφδΟΑΕννΚΡΟΑδνΚΜδΟΚΑδΟΥΤΓΤδΥΝΜΗΨνΚφΤΡαφΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡφΑΥΕφφ8ΟΑΕΕνΚ8ΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗ \ ννΚφΤΡΟφΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝρΚΡΚΟΚΑΤΕΤΑΟΡ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Εϋ8Α8ΥΡΟΑΚνΥΡΟΑΚ.Οϋ8νΡΡΑΥ \ νθφΟΤ ЕУТУ8А (8Еф ГО N0: 9) φΑφΕνφδΟΑΕννΚΡΟΑδνΚΜδΟΚΑδΟΥΤΓΤδΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡνΚΤΡ
ΟΝΟΑΤΝΥΝφΚΡφΟΚΑΤΕΤΑϋΤ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΕΟΑΚΟΟδνΡΓΑΥΨΟφσΤΟΝΟΑΤΝΥΝφΚΡφΟΚΑΤΕΤΑϋΤ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΕΟΑΚΟΟδνΡΓΑΥΨΟφσΤ
- 2 020130- 2 020130
БУТУЗА (8ΕΟΙΩΝΟ: 10) 0Α0Ενφ8ΟΑΕννΚΡΟΑ8νΚΜ8ΟΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗΨνΚ0ΤΡΟ0ΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡBUTUZA (8ΕΟΙΩΝΟ: 10) 0Α0Ενφ8ΟΑΕννΚΡΟΑ8νΚΜ8ΟΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗΨνΚ0ΤΡΟ0ΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡ
ΟΝ0ΑΤΝΥΝφΚΡ0ΟΚΑΤΕΤΑΕ)Ρ383ΤΑΥΜ0Ι88ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΓ0ΑΚ.ΟΌ8νΡΕΑΥΐνθ0ΟΤ БУТУЗА (δΕφΠΟΝΟ: 11).ΟΝ0ΑΤΝΥΝφΚΡ0ΟΚΑΤΕΤΑΕ) Ρ383ΤΑΥΜ0Ι88ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΓ0ΑΚ.ΟΌ8νΡΕΑΥΐνθ0ΟΤ BUTUZA (δΕφΠΟΝΟ: 11).
В другом воплощении представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно-перестроенную вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ΙΌ N0: 8:In another embodiment, humanized Ό86 antibodies and their epitope binding fragments comprising a humanized or surface rearranged variable region of a light chain having an amino acid sequence corresponding to 8EO ΙΌ N0: 8 are provided:
Е1УЕТ08РАТМ8А8РОЕВУТ1ТС8АН88У8РМНЗ¥Рр0КРОТ8РКБЗ¥1У8Т88БА8О νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥΟ00Κ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Е() ГО ΝΟ: 8).E1UET08RATM8A8ROEVUT1TS8AN88U8RMNZ ¥ Рр0КРОТ8РКБЗ ¥ 1У8Т88БА8О νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥΟ00Κ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Е () ГО ΝΟ: 8).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно-перестроенную вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ΙΌ N0: 10 или 8Е0 ΙΌ N0: 11, соот ветственно:Also presented are humanized antibodies Ό86 and their epitope binding fragments containing a humanized or surface rearranged variable region of the heavy chain having an amino acid sequence corresponding to 8E0 ΙΌ N0: 10 or 8E0 ΙΌ N0: 11, respectively:
9АфЕУ08ОАЕУУКРОА8УКМ8СКА8О¥ТРТ8УММНХ^УКфТРСфОЬЕ\¥1ОУ1УР ΟΝΟΑΤΝΥΝφΚΡφΟΚΑΤΕΤΑΟΤ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΡΕΑΚΟϋ8νΡΡΑΥτνθφΟΤ БУТУЗА (8Еф ГО N0:10)9AFEU08OAEUUUKROA8UKM8SKA8O ¥ ТРТ8УММНХ ^ УКфТРСфОЕ \ ¥ 1ОУ1УР ΟΝΟΑΤΝΥΝφΚΡφΟΚΑΤΕΤΑΟΤ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΡΕΑΚΟϋ8νΡΡΑΥτνθφΟΤ BUTUZA (8ef GO N0: 10)
0Α(2Εν08ΟΑΕννΚΡΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗλννΚ.0ΤΡΟ0ΟΕΕλΜΙΟΥΙΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝΟΚΡΟΟΚΑΤΕΤΑϋΡ888ΤΑΥΜρΐ88ΕΤ8ΕΟδΑνΥΡΟΑΚΟΏ8νΡΡΑΥΨΟΟΟΤ БУТУ8А (8Е<) Ιϋ ΝΟ: И).0Α (2Εν08ΟΑΕννΚΡΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗλννΚ.0ΤΡΟ0ΟΕΕλΜΙΟΥΙΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝΟΚΡΟΟΚΑΤΕΤΑϋΡ888ΤΑΥΜρΐ88ΕΤ8ΕΟδΑνΥΡΟΑΚΟΏ8νΡΡΑΥΨΟΟΟΤ BUTU8A (8Е <) Ιϋ ΝΟ: И).
Гуманизованные антитела Ό86 и их эпитопосвязывающие фрагменты по настоящему изобретению также могут включать замены аминокислотных остатков в легкой и/или тяжелой цепи по одному или нескольким положениям, представленным звездочками в табл. 1, которые представляют собой остатки на поверхности мышиного каркаса, находящиеся в пределах 5А от СБК, требующие замены на остаток человека. Например, первый аминокислотный остаток О в мышиной последовательности (8Е0 ΙΌ N0: 7) был заменен на Е (8Е0 ΙΌ N0: 8) при гуманизации антитела. Однако, вследствие близости этого участка к СБК, для сохранения аффинности антител может потребоваться обратная мутация на мышиный остаток о.The humanized Ό86 antibodies and their epitope-binding fragments of the present invention may also include substitutions of amino acid residues in the light and / or heavy chain at one or more positions represented by asterisks in Table. 1, which are residues on the surface of the mouse scaffold, located within 5A from SBC, requiring replacement by the remainder of the person. For example, the first amino acid residue O in the mouse sequence (8E0 ΙΌ N0: 7) was replaced by E (8E0 ΙΌ N0: 8) when the antibody was humanized. However, due to the proximity of this site to SBC, in order to maintain the affinity of antibodies, a reverse mutation on the murine residue o may be required.
Таблица 1Table 1
Это также показано в табл. 2, где представлено сопоставление поверхностных остатков вариабельной области с поверхностными остатками трех наиболее гомологичных вариабельных областей человека. Аминокислотные остатки в табл. 1 соответствуют подчеркнутым аминокислотным остаткам в табл. 2.This is also shown in table. 2, which presents a comparison of the surface residues of the variable region with the surface residues of the three most homologous variable regions of man. Amino acid residues in the table. 1 correspond to the underlined amino acid residues in table. 2.
Таблица 2table 2
Настоящее изобретение также предусматривает цитотоксические конъюгаты, включающие: (1) агента, связывающего клетку, распознающего и связывающегося с гликотопом СА6, и (2) цитотоксического агента. В цитотоксических конъюгатах агент, связывающий клетку, обладает высоким сродством кThe present invention also provides cytotoxic conjugates comprising: (1) a cell binding agent that recognizes and binds to the CA6 glycotope, and (2) a cytotoxic agent. In cytotoxic conjugates, the cell binding agent has a high affinity for
- 3 020130 гликотопу СА6, а цитотоксический агент обладает высокой степенью цитотоксичности для клеток, экспрессирующих гликотоп СА6, при этом цитотоксические конъюгаты настоящего изобретения образуют эффективные поражающие средства.- 3 020130 to the CA6 glycotope, and the cytotoxic agent has a high degree of cytotoxicity for cells expressing the CA6 glycotope, while the cytotoxic conjugates of the present invention form effective damaging agents.
В предпочтительном воплощении агентом, связывающим клетку, является антитело к СА6 или его эпитоп-связывающий фрагмент, более предпочтительно гуманизованное антитело к СА6 или его эпитопсвязывающий фрагмент, причем цитотоксический агент ковалентно присоединен, непосредственно или через расщепляемый или нерасщепляемый линкер, к антителу или его эпитоп-связывающему фрагменту. В более предпочтительных воплощениях агентом, связывающим клетку, является гуманизованное антитело Ό86 или его эпитоп-связывающий фрагмент, а цитотоксическим агентом является таксол, майтансиноид, СС-1065 или аналог СС-1065.In a preferred embodiment, the cell-binding agent is an anti-CA6 antibody or epitope-binding fragment thereof, more preferably a humanized anti-CA6 antibody or epitope-binding fragment thereof, the cytotoxic agent being covalently attached, either directly or via a cleavable or non-cleavable linker, to the antibody or its epitope binding fragment. In more preferred embodiments, the cell binding agent is a humanized antibody # 86 or an epitope binding fragment thereof, and the cytotoxic agent is taxol, maytansinoid, CC-1065, or an analogue of CC-1065.
В предпочтительных воплощениях изобретения агентом, связывающим клетку, является гуманизованное антитело к СА6, а цитотоксическим агентом является цитотоксический препарат, к примеру, майтансиноид или таксан.In preferred embodiments of the invention, the cell-binding agent is a humanized anti-CA6 antibody, and the cytotoxic agent is a cytotoxic drug, for example, maytansinoid or taxane.
Более предпочтительно агентом, связывающим клетку, является гуманизованное антитело Ό86 к СА6, а цитотоксическим агентом является соединение майтансина типа ΌΜ1 или ΌΜ4.More preferably, the cell binding agent is a humanized Ό86 anti-CA6 antibody, and the cytotoxic agent is a айт1 or типа4 type maytansine compound.
Настоящее изобретение также включает способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6. В предпочтительных воплощениях способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6, осуществляется ίη νίνο и приводит к гибели клеток, хотя включено и его применение ίη νίΐτο и ех νίνο.The present invention also includes a method of inhibiting the growth of cells expressing a CA6 glycotope. In preferred embodiments, the method of inhibiting the growth of cells expressing the CA6 glycotope is carried out by ίη νίνο and leads to cell death, although its use is included ίη νίΐτο and ex νίνο.
Настоящее изобретение также предусматривает терапевтическую композицию, включающую цитотоксический конъюгат и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.The present invention also provides a therapeutic composition comprising a cytotoxic conjugate and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Настоящее изобретение также включает способ лечения больных, страдающих раком, с помощью терапевтической композиции. В предпочтительных воплощениях цитотоксический конъюгат включает антитело к СА6 и цитотоксического агента. В более предпочтительных воплощениях цитотоксический конъюгат включает конъюгат гуманизованного антитела Ό86 с ΌΜ1, гуманизованного антитела Ό86 с ΌΜ4 или гуманизованного антитела Ό86 с таксаном, причем конъюгат вводится вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.The present invention also includes a method for treating cancer patients with a therapeutic composition. In preferred embodiments, the cytotoxic conjugate comprises an anti-CA6 antibody and a cytotoxic agent. In more preferred embodiments, the cytotoxic conjugate comprises a conjugate of a humanized antibody Ό86 with ΌΜ1, a humanized antibody Ό86 with ΌΜ4 or a humanized antibody Ό86 with taxane, the conjugate being administered together with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Настоящее изобретение также включает набор, включающий конъюгат антитела к СА6 с цитотоксическим агентом и инструкции по применению. В предпочтительных воплощениях антитело к СА6 представляет собой гуманизованное антитело Ό86, цитотоксическим агентом является соединение майтансина типа ΌΜ1 или ΌΜ4 либо таксан, а инструкции по применению предназначены для применения конъюгата при лечении больных, страдающих раком. Набор также может включать и компоненты, необходимые для приготовления фармацевтически приемлемой лекарственной формы, к примеру, разбавитель, если конъюгат находится в лиофилизованном состоянии или в концентрированном виде, а также для применения лекарственной формы.The present invention also includes a kit comprising a conjugate of an anti-CA6 antibody with a cytotoxic agent and instructions for use. In preferred embodiments, the anti-CA6 antibody is a Ό86 humanized antibody, the cytotoxic agent is a айт1 or ΌΜ4 type maytansine compound, or taxane, and the instructions for use are for use in conjugate treatment of cancer patients. The kit may also include the components necessary for the preparation of a pharmaceutically acceptable dosage form, for example, a diluent, if the conjugate is in a lyophilized state or in concentrated form, as well as for the use of the dosage form.
Настоящее изобретение также включает производные антител, которые специфически связываются с и распознают гликотоп СА6. В предпочтительных воплощениях производные антител получают путем перестройки поверхности или гуманизации антител, связывающихся с гликотопом СА6, при этом производные обладают пониженной иммуногенностью в отношении хозяина.The present invention also includes derivatives of antibodies that specifically bind to and recognize the CA6 glycotope. In preferred embodiments, antibody derivatives are obtained by rearranging the surface or humanizing antibodies that bind to the CA6 glycotope, the derivatives having reduced host immunogenicity.
Настоящее изобретение также предусматривает гуманизованные антитела или их фрагменты, которые дополнительно помечены для применения в исследованиях или в диагностике. В предпочтительных воплощениях метка представляет собой радиометку, флуорофор, хромофор, контрастирующее вещество или ион металла.The present invention also provides humanized antibodies or fragments thereof that are further labeled for use in research or in diagnosis. In preferred embodiments, the label is a radiolabel, fluorophore, chromophore, contrast agent or metal ion.
Также предусматривается способ диагностики, в котором данные меченные гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты вводятся пациенту, у которого есть подозрение на рак, и измеряется или отслеживается распределение метки в организме пациента.A diagnostic method is also provided in which these labeled humanized antibodies or epitope-binding fragments thereof are administered to a patient who is suspected of having cancer and the label distribution in the patient is measured or monitored.
Настоящее изобретение также предусматривает способы лечения больных, страдающих раком, путем введения конъюгата гуманизованного антитела по настоящему изобретению, одного или в сочетании с другими цитотоксическими или терапевтическими веществами. Рак может представлять собой, к примеру, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичников, рак эндометрия, остеосаркому, рак шейки матки, рак простаты, рак легких, синовиальную карциному, рак поджелудочной железы, саркому или карциному, при которой экспрессируется СА6, или другой вид рака, еще не известный, при котором преимущественно экспрессируется гликотоп СА6.The present invention also provides methods for treating cancer patients by administering a conjugate of the humanized antibody of the present invention, alone or in combination with other cytotoxic or therapeutic substances. The cancer may be, for example, breast cancer, colon cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, osteosarcoma, cervical cancer, prostate cancer, lung cancer, synovial carcinoma, pancreatic cancer, sarcoma or carcinoma in which CA6 is expressed, or another type of cancer, not yet known, in which the CA6 glycotope is predominantly expressed.
Если только не указано иначе, все ссылки и патенты, цитируемые в настоящем изобретении, включены путем отсылки.Unless otherwise indicated, all references and patents cited in the present invention are incorporated by reference.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
На фиг. 1 представлены результаты исследований, проведенных для определения способности антитела Ό86 к связыванию с поверхностью выбранных линий раковых клеток. Измеряли флуоресценцию клеток, инкубированных с первичным антителом Ό86 и с вторичными антителами против 1дС (Н+Ь) мыши, конъюгированными с Б1ТС, методом проточной цитометрии. Антитело Ό86 связывалось с клетками Саоу-3 (фиг. 1А) и Τ-47Ό (фиг. 1В) с кажущимся значением Ка, равным 1,848 и 2,586 нМ, соответственно. Клетки отрицательных по антигену линий 8Κ-ΟΥ-3 (фиг. 1С) и Со1о205 (фиг. 1Ό) не проявлялиIn FIG. Figure 1 presents the results of studies conducted to determine the ability of antibody Ό86 to bind to the surface of selected cancer cell lines. The fluorescence of cells incubated with primary antibody Ό86 and with secondary antibodies against mouse 1dC (H + b) conjugated with B1TS was measured by flow cytometry. Antibody Ό86 binds to Saow-3 cells (Fig. 1A) and Τ-47Ό (Fig. 1B) with an apparent Ka value of 1.848 and 2.586 nM, respectively. Cells of antigen-negative lines 8Κ-ΟΥ-3 (Fig. 1C) and Co1o205 (Fig. 1Ό) did not show
- 4 020130 специфичного к антигену связывания.- 4 020130 antigen-specific binding.
На фиг. 2 представлены результаты анализа экспрессии эпитопа методом дот-гибридизации. Лизаты клеток Саоу-3 (фиг. 2А и 2В), 8КМЕБ28 (фиг. 2С) и Со1о205 (фиг. 2И) индивидуально наносили на нитроцеллюлозные мембраны, а затем индивидуально инкубировали с проназой, протеиназой К, нейраминидазой или йодной кислотой. После этого мембраны подвергали иммуноблоттингу с антителом И86 (фиг. 2А), антителом СМ1 (фиг. 2В), антителом К.24 (фиг. 2С) или антителом С242 (фиг. 2И).In FIG. 2 presents the results of the analysis of epitope expression by dot-hybridization. Cell lysates of Saou-3 (Fig. 2A and 2B), 8KMEB28 (Fig. 2C) and Co1205 (Fig. 2I) were individually applied to nitrocellulose membranes, and then individually incubated with pronase, proteinase K, neuraminidase or iodic acid. After this, the membranes were subjected to immunoblotting with antibody I86 (Fig. 2A), antibody CM1 (Fig. 2B), antibody K.24 (Fig. 2C) or antibody C242 (Fig. 2I).
На фиг. 3 представлены результаты анализа экспрессии антигена И86 методом дот-гибридизации. Лизаты клеток Саоу-3 индивидуально наносили на мембраны РУЭЕ. а затем инкубировали в присутствии трифторметансульфоновой кислоты (ТРМ8А). После этого мембраны подвергали иммуноблоттингу с антителом СМ1 (1 и 2) или антителом И86 (3 и 4).In FIG. 3 presents the results of the analysis of the expression of I86 antigen by the method of dot hybridization. Saou-3 cell lysates were individually applied to RUEE membranes. and then incubated in the presence of trifluoromethanesulfonic acid (TPM8A). After this, the membranes were subjected to immunoblotting with antibody CM1 (1 and 2) or antibody I86 (3 and 4).
На фиг. 4 представлены результаты анализа гликотопов антигена И86. Лизаты клеток Саоу-3, предварительно обработанные Ν-гликаназой (Ы-д1у), О-гликаназой (О-д1у) и/или сиалидазой (8), наносили на нитроцеллюлозные мембраны, а затем подвергали иммуноблоттингу с антителом И86 или антителом СМ1 (νΝΤΚ Мис-1).In FIG. 4 presents the results of the analysis of glycotopes of antigen I86. Saou-3 cell lysates pretreated with гли-glycanase (Y-d1y), O-glycanase (O-d1y) and / or sialidase (8) were applied to nitrocellulose membranes and then subjected to immunoblotting with I86 antibody or CM1 antibody (νΝΤΚ Mies-1).
На фиг. 5 представлены результаты анализа антигена И86 методом вестерн-гибридизации. Лизаты клеток подвергали иммунопреципитации (1Р) и иммуноблоттингу с антителом И86. Антиген соответствует полосе белка >250 кДа, наблюдаемой у антиген-положительных клеток Саоу-3 (фиг. 5А и 5В) и Т47И (фиг. 5С). Отрицательные по антигену клетки линий 8К-ОУ-3 (фиг. 5И) и Со1о205 (фиг. 5Е) не проявляли этой полосы. После иммунопреципитации шарики с белком С из лизатов клеток Саоу-3 инкубировали с нейраминидазой (Ν) (фиг. 5А) или йодной кислотой (РА) (фиг. 5В). На том же геле разгоняли и контроли: антитело (α), проточные фракции лизатов до 1Р (Бук) и после 1Р (ЕТ). Иммунопреципитаты Саоу-3 также инкубировали с Ν-гликаназой (№д1у), О-гликаназой (О-д1у) и/или сиалидазой (8) (см. фиг. 5Е, на которой блот-мембраны альтернативно подвергались гибридизации с биотинилированным И86 и стрептавидин-НКР).In FIG. 5 presents the results of the analysis of I86 antigen by Western hybridization. Cell lysates were immunoprecipitated (1P) and immunoblotted with I86 antibody. The antigen corresponds to a protein band> 250 kDa observed in antigen-positive cells Saou-3 (Fig. 5A and 5B) and T47I (Fig. 5C). Antigen-negative cells of lines 8K-OU-3 (Fig. 5I) and Co1o205 (Fig. 5E) did not show this band. After immunoprecipitation, beads with protein C from lysates of Saou-3 cells were incubated with neuraminidase (Ν) (Fig. 5A) or iodic acid (RA) (Fig. 5B). The controls were also dispersed on the same gel: antibody (α), flow fractions of lysates up to 1P (Buk) and after 1P (ET). Saou-3 immunoprecipitates were also incubated with гли-glycanase (No. d1y), O-glycanase (O-d1y) and / or sialidase (8) (see Fig. 5E, on which the blot membranes were alternatively hybridized with biotinylated I86 and streptavidin -NKR).
На фиг. 6 представлены результаты иммунопреципитации и/или иммуноблоттинга лизатов клеток Саоу-3 (фиг. 6А) и НеЬа (фиг. 6В) с помощью антитела И86 или антитела СМ1. Перекрывание сигналов от СМ1 и И86 на вестерн-блотах означает, что антиген И86 находится на белке Мис1. У лизатов НеЬа раздвоение полосы Мис1 возникает из-за того, что экспрессия Мис1 управляется разными аллелями, которые отличаются по числу тандемных повторов.In FIG. Figure 6 shows the results of immunoprecipitation and / or immunoblotting of the lysates of Saou-3 cells (Fig. 6A) and HeLa (Fig. 6B) using I86 antibody or CM1 antibody. The overlapping of signals from CM1 and I86 on Western blots means that the I86 antigen is on the Mis1 protein. In Heb lysates, the split of the Mis1 band occurs due to the fact that the expression of Mis1 is controlled by different alleles, which differ in the number of tandem repeats.
На фиг. 7 представлена схема определения антител И86 методом сэндвич-ЕЬ18А (фиг. 7А) и стандартная кривая (фиг. 7В). Стандартная кривая была получена при известных концентрациях коммерчески доступных стандартов СА15-3 (при этом 1 ед. СА15-3 = 1 ед. И86).In FIG. 7 shows a diagram for the determination of I86 antibodies by the sandwich-E18A method (FIG. 7A) and the standard curve (FIG. 7B). A standard curve was obtained at known concentrations of commercially available CA15-3 standards (with 1 unit CA15-3 = 1 unit I86).
На фиг. 8 представлены стандартные кривые для количественного метода ЕБ18А. Стандартные кривые по сигналам детектирующего антитела (стрептавидин-НКР/биотин-И86) (фиг. 8С) определяли при известных концентрациях биотин-И86, захваченного нанесенным на планшет козьим антителом против 1дС мыши (фиг. 8А), либо нанесенного непосредственно на планшет для ЕБ18А (фиг. 8В).In FIG. Figure 8 shows standard curves for the quantitative EB18A method. The standard curves for the signals of a detecting antibody (streptavidin-NKR / biotin-I86) (Fig. 8C) were determined at known concentrations of Biotin-I86 captured on a goat anti-mouse 1dC antibody coated on a plate (Fig. 8A) or applied directly on an EB18A plate (Fig. 8B).
На фиг. 9 представлены последовательности кДНК и аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи (фиг. 9А) и тяжелой цепи (фиг. 9В) мышиного антитела И86. В каждой последовательности подчеркнуты три участка СИК (согласно определению Кабата).In FIG. Figure 9 shows the cDNA sequences and amino acid sequences of the variable regions of the light chain (Fig. 9A) and heavy chain (Fig. 9B) of the I86 mouse antibody. In each sequence, three sections of the LSS are underlined (as defined by Kabat).
На фиг. 10 представлены участки СИК легкой (фиг. 10А) и тяжелой цепи (фиг. 10В) мышиного антитела И86, определенные по правилам Кабата. Моделирование с помощью программы АЬМ дает несколько другую картину для участков СИК тяжелой цепи (фиг. 10С).In FIG. 10 shows the SIC sections of the light (Fig. 10A) and heavy chain (Fig. 10B) of the I86 mouse antibody determined according to the rules of Kabat. Modeling using the ABM program gives a slightly different picture for sections of the SIC of the heavy chain (Fig. 10C).
На фиг. 11 представлены аминокислотные последовательности легкой цепи (тиО86ЬС) (остатки 1-95 в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 7) и тяжелой цепи (тиО86НС) (остатки 1-98 в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 9) мышиного антитела И86, сопоставленные с эмбриональными последовательностями генов 1дУк ар4 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 23) и 1дУЪ 1558.41 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 24). Серым цветом обозначено расхождение последовательностей.In FIG. Figure 11 shows the amino acid sequences of the light chain (thiO86BC) (residues 1-95 in 8EC GO ΝΟ: 7) and the heavy chain (thiO86BC) (residues 1-98 in 8EC GO ΝΟ: 9) of the I86 mouse antibody, compared with the embryonic sequences of the 1dUK ap4 genes (8ETS GO ΝΟ: 23) and 1dUZ 1558.41 (8ETS GO ΝΟ: 24). Gray color indicates sequence discrepancy.
На фиг. 12 представлены десять последовательностей легких цепей и тяжелых цепей, наиболее гомологичных последовательностям легкой цепи (тиО86ЬС) и тяжелой цепи (тиО86НС) мышиного антитела И86, по которым имеются файлы разрешенных структур в базе данных Вгоокйауеи. Последовательности расположены в порядке от наибольшей до наименьшей гомологии.In FIG. Figure 12 shows ten sequences of light chains and heavy chains that are most homologous to the light chain (thO86bC) and heavy chain (thO86HCs) sequences of the murine antibody I86, for which there are files of allowed structures in the Vgokauei database. The sequences are arranged in order from greatest to least homology.
На фиг. 13 представлены данные и расчеты по поверхностной доступности для прогнозирования тех остатков вариабельных областей легкой цепи мышиного антитела И86, которые доступны с поверхности. Положения, имеющие среднюю поверхностную доступность в 25-35% и отмеченные как ??, подвергали второму циклу анализа. Вариабельные области легкой цепи (фиг. 13А) и вариабельные области тяжелой цепи (фиг. 13В) антитела И86.In FIG. 13 presents data and calculations on surface availability to predict those residues of the variable regions of the light chain of the I86 murine antibody that are accessible from the surface. The positions having an average surface availability of 25-35% and marked as ?? subjected the second cycle of analysis. The variable regions of the light chain (Fig. 13A) and the variable regions of the heavy chain (Fig. 13B) of the I86 antibody.
На фиг. 14 представлена карта экспрессионной плазмиды для млекопитающих ртИ86 ν1-0. Эту плазмиду использовали для создания и экспрессии рекомбинантных химерных и гуманизованных антител И86.In FIG. 14 shows a map of the expression plasmid for mammals rtI86 ν1-0. This plasmid was used to create and express recombinant chimeric and humanized I86 antibodies.
На фиг. 15 представлены аминокислотные последовательности вариабельных доменов легкой цепи (фиг. 15А) и тяжелой цепи (фиг. 15В) мышиного (тиО86) и гуманизованного (йиО86) (1.01 и 1.21) антитела И86.In FIG. 15 shows the amino acid sequences of the variable domains of the light chain (Fig. 15A) and the heavy chain (Fig. 15B) of the murine (TiO86) and humanized (uiO86) (1.01 and 1.21) I86 antibodies.
- 5 020130- 5 020130
На фиг. 16 представлена последовательность кДНК и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизованного антитела Ό86 (киО86)(1.01 и1 .21).In FIG. 16 shows the cDNA sequence and amino acid sequence of the variable region of the light chain of the humanized antibody Ό86 (kiO86) (1.01 and 1.21).
На фиг. 17 представлена последовательность кДНК и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи варианта 1.01 (фиг. 17А) и 1.21 (фиг. 17В) гуманизованного антитела Ό86 (ЬиБ86).In FIG. 17 shows the cDNA sequence and amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of variant 1.01 (Fig. 17A) and 1.21 (Fig. 17B) of the humanized antibody # 86 (Lb86).
На фиг. 18 представлены полученные методом проточной цитометрии кривые связывания мышиного Ό86 (шиОЗб), химерного Ό86 (сЮ86), варианта 1.01 (1шЭ86 ν1.01) и варианта 1.21 (1шЭ86 ν1.21) гуманизованного Ό86 из опыта, проведенного на клетках КВ. Авидности мышиных, химерных и гуманизованных (ν1.01 и ν1.21) антител Ό86 (тиО86 = 0,82 нМ, сЮ86 = 0,69 нМ, 1πΌ86ν1.01 = 0,82 нМ и 1шЭ86у1.21 = 0,85 нМ) сравнимы, свидетельствуя о том, что перестройка поверхности не привела к уменьшению авидности.In FIG. Figure 18 shows the flow cytometry binding curves of mouse Ό86 (siOZb), chimeric Ό86 (сУ86), variant 1.01 (1шЭ86 ν1.01) and variant 1.21 (1шЭ86 ν1.21) of humanized Ό86 from the experiment performed on KB cells. Avidity of murine, chimeric, and humanized (ν1.01 and ν1.21) antibodies Ό86 (TiO86 = 0.82 nM, cU86 = 0.69 nM, 1πΌ86ν1.01 = 0.82 nM and 1шЭ86у1.21 = 0.85 nM) comparable, indicating that the restructuring of the surface did not lead to a decrease in avidity.
На фиг. 19 представлены результаты анализа конкуренции за связывание антител тиО86, сЮ86. 1шЭ86у1.01 и 1шЭ86у1.21 с биотинилированным тиЭ86. Различные концентрации голых тиО86, сЮ86, 1шО86у1.01 и НиЭ86у1.21 комбинировали с 2 нМ биотин-тиО86 и стрептавидин-ΌΤΛΕ (вторичным антителом). Значения 1С50 (тиО86 = 1,9 нМ, сНЭ86 = 1,7 нМ, 1πΌ86ν1.01 = 3,0 нМ и 1πΌ86ν1.21 =In FIG. 19 presents the results of an analysis of the competition for the binding of antibodies tiO86, sU86. 1шЭ86у1.01 and 1шЭ86у1.21 with biotinylated thie86. Different concentrations of naked thiO86, cU86, 1shO86u1.01 and NiE86u1.21 were combined with 2 nM biotin-thO86 and streptavidin-ΌΤΛΕ (secondary antibody). Values of 1C 50 (thiO86 = 1.9 nM, sNE86 = 1.7 nM, 1πΌ86ν1.01 = 3.0 nM and 1πΌ86ν1.21 =
1.9 нМ) у всех антител были близкими, свидетельствуя о том, что гуманизация не привела к уменьшению авидности.1.9 nM) all antibodies were close, indicating that humanization did not lead to a decrease in avidity.
На фиг. 20 представлены результаты определения аффинности связывания неконъюгированного антитела Ό86 по сравнению с конъюгатом антитело Ό86-ΌΜ1. Результаты показали, что конъюгирование с ΌΜ1 не оказывает отрицательного эффекта на аффинность связывания антитела. Кажущееся значение К, у конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 (3,902 нМ) (Ό86-ΌΜ1) было слегка выше, чем у голого антитела (2,020 нМ) (Ό86).In FIG. 20 presents the results of determining the binding affinity of the unconjugated antibody Ό86 in comparison with the conjugate antibody Ό86-ΌΜ1. The results showed that conjugation with ΌΜ1 does not adversely affect antibody binding affinity. The apparent K value of the conjugate, the Ό86-ΌΜ1 antibody (3.902 nM) (Ό86-ΌΜ1) was slightly higher than that of the naked antibody (2.020 nM) (Ό86).
На фиг. 21 представлены результаты косвенного определения жизнеспособности клеток с помощью антитела Ό86 в присутствии и в отсутствие конъюгата антител против 1§С (Н+Ь) мыши с ΌΜ1 (2°АЬΌΜ1). Антиген-положительные клетки Саον-3 погибали зависящим от антитела Ό86 образом (1С50 =In FIG. Figure 21 shows the results of an indirect determination of cell viability using the Ό86 antibody in the presence and in the absence of a conjugate of antibodies against mouse IgG (H + L) with ΌΜ1 (2 ° ABΌΜ1). Antigen-positive Caον-3 cells died in a manner dependent on antibody Ό86 (1C 50 =
424.9 пМ) только в присутствии вторичного конъюгата (Ό86 + 2°Α^ΌΜ1).424.9 pM) only in the presence of a secondary conjugate (Ό86 + 2 ° Α ^ ΌΜ1).
На фиг. 22 представлены результаты анализа комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) антитела тиО86. Результаты показывают отсутствие эффекта типа СЭС у антитела Ό86 на клетки НРАС (фиг. 22А) и ΖΚ-75-1 (фиг. 2В).In FIG. 22 presents the results of the analysis of complement-dependent cytotoxicity (SES) antibodies tiO86. The results show the absence of an effect of SES type in antibody Ό86 on HPAC cells (Fig. 22A) and ΖΚ-75-1 (Fig. 2B).
На фиг. 23 представлены результаты анализа цитотоксичности ίη νίΐτο конъюгата антитело Ό86ΌΜ1 по сравнению со свободным майтансином. Клоногенным методом тестировали на цитотоксичность положительные по антигену Ό86 клетки раковых линий яичников (фиг. 23А), молочной железы (фиг. 23В), шейки матки (фиг. 23С) и поджелудочной железы (фиг. 23Ό) при непрерывном воздействии конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 (слева). Клетки этих линий таким же образом тестировали на чувствительность к майтансину при воздействии свободного майтансина в течение 72 ч (справа). При тестировании использовали следующие линии раковых клеток: из яичников - ОУСАК5, ТОУ-21О, Саον-4 и Саον-3; молочной железы - Τ47Ό, ВТ-20 и ВТ-483; шейки матки - КВ, НеЬа и \У18Н; поджелудочной железы НРАС, Н8766Т и НРАР-1Б.In FIG. 23 presents the results of the analysis of the cytotoxicity of ίη νίΐτο conjugate antibody Ό86ΌΜ1 in comparison with free maytansine. The лон86 antigen-positive cells of cancer lines of the ovaries (Fig. 23A), mammary gland (Fig. 23B), cervix (Fig. 23C) and pancreas (Fig. 23 фиг) under continuous exposure to the ци86-ΌΜ1 antibody conjugate were tested by the clonogenic method (left). Cells of these lines were tested in the same way for sensitivity to maytansine when exposed to free maytansine for 72 hours (right). During testing, the following cancer cell lines were used: from the ovaries - OUSAK5, TOU-21O, Caον-4 and Caον-3; mammary gland - Τ47Ό, BT-20 and BT-483; cervix uteri - KV, NeBa and \ U18H; pancreas HPAC, H8766T and HPAP-1B.
На фиг. 24 представлены результаты анализа цитотоксичности ίη νίΐτο конъюгата антитело Ό86ΌΜ1. При определении жизнеспособности клеток методом МТТ раковые клетки яичников (фиг. 24А, 24В и 24С), молочной железы (фиг. 24Ό и 24Е), шейки матки (фиг. 24Р и 240) и поджелудочной железы (фиг. 24Н и фиг 241) человека погибали зависящим от конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 образом. Голые Ό86 не оказывали отрицательного эффекта на рост этих клеток, свидетельствуя, что для цитотоксичности необходимо конъюгирование с ΌΜ1.In FIG. 24 presents the results of the analysis of the cytotoxicity of ίη νίΐτο conjugate antibody Ό86ΌΜ1. When determining cell viability by MTT, cancer cells of the ovaries (Fig. 24A, 24B and 24C), breast (Figs. 24Ό and 24E), cervix (Figs. 24P and 240) and pancreas (Fig. 24H and Fig. 241) of a person Antibody ΌΜ86-образом1 was killed in a conjugate-dependent manner. Naked Ό86 did not adversely affect the growth of these cells, suggesting that conjugation with ΌΜ1 is necessary for cytotoxicity.
На фиг. 25А представлены результаты исследования противоопухолевого действия ίη νίνο конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 на привитые подкожно опухоли ксенотрансплантатов КВ. Раковые клетки инокулировали в день 0, а первую обработку проводили в день 6. Обработку иммуноконъюгатом продолжали ежедневно до введения всех 5 доз. Контрольным животным, получавшим РВ8, делали эвтаназию после того, как объем опухоли превышал 1500 мм3. Конъюгат вводили в дозе 150 или 225 мкг/кг ΌΜ1, что соответствует концентрации антител 5,7 и 8,5 мг/кг, соответственно. Во время исследования регистрировали вес тела мышей (фиг. 25В).In FIG. 25A presents the results of a study of the antitumor effect of ίη νίνο conjugate antibody Ό86-ΌΜ1 on subcutaneous grafted tumors of xenografts KV. The cancer cells were inoculated on day 0, and the first treatment was performed on day 6. Treatment with the immunoconjugate was continued daily until all 5 doses were administered. Control animals treated with PB8 were euthanized after the tumor volume exceeded 1,500 mm 3 . The conjugate was administered at a dose of 150 or 225 μg / kg ΌΜ 1, which corresponds to an antibody concentration of 5.7 and 8.5 mg / kg, respectively. During the study, the body weight of the mice was recorded (FIG. 25B).
На фиг. 26 представлены результаты исследования противоопухолевого действия конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 на привитые подкожно ксенотрансплантаты опухолей. Клетки ОУСАК5 (фиг. 26А и 26В), ТОУ-21О (фиг. 26С и 26Ό), НРАС (фиг. 26С и 26Р) и НеБа (фиг. 260 и 26Н) инокулировали в день 0, а обработку иммуноконъюгатом проводили в день 6 и 13. Контрольным животным, получавшим РВ8, делали эвтаназию после того, как объем опухоли превышал 1000 мм3. Конъюгат вводили в дозе 600 мкг/кг ΌΜ1, что соответствует концентрации антител 27,7 мг/кг. Во время исследования регистрировали объем опухолей (фиг. 26А, 26С, 26Е и 260) и вес тела (фиг. 26В, 26Ό, 26Р и 26Н) мышей.In FIG. 26 presents the results of a study of the antitumor effect of the antibody Ό86-ΌΜ1 conjugate on subcutaneous grafted xenografts of tumors. OUSAC5 cells (Figs. 26A and 26B), TOU-21O (Figs. 26C and 26Ό), HPAC (Figs. 26C and 26P) and Heba (Figs. 260 and 26H) were inoculated on day 0, and immunoconjugate treatment was performed on day 6 and 13. Control animals treated with PB8 were euthanized after the tumor volume exceeded 1000 mm 3 . The conjugate was administered at a dose of 600 μg / kg ΌΜ1, which corresponds to an antibody concentration of 27.7 mg / kg. During the study, the tumor volume (Fig. 26A, 26C, 26E and 260) and body weight (Fig. 26B, 26Ό, 26P and 26H) of mice were recorded.
На фиг. 27 представлены результаты исследования действия конъюгата антитело ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 на внутрибрюшинные опухоли ОУСАК5. Раковые клетки вводили внутрибрюшинно в день 0, а обработку иммуноконъюгатом проводили в день 6 и 13. Животным делали эвтаназию после того, как потеря веса тела превышала 20%.In FIG. 27 presents the results of a study of the effect of the conjugate antibody ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 on intraperitoneal tumors of OUSAC5. Cancer cells were intraperitoneally administered on day 0, and immunoconjugate treatment was performed on days 6 and 13. Animals were euthanized after body weight loss exceeded 20%.
- 6 020130- 6 020130
На фиг. 28 представлена полученная методом проточной цитометрии кривая связывания из исследования аффинности связывания голых и конъюгированных с таксаном антител Ό86 на клетках НеЬа. Конъюгирование с таксаном (ММ1-202) не оказывает отрицательного эффекта на аффинность связывания антител. Кажущееся значение Κ,ι у конъюгата Ό86-ΜΜ1-202 (1,24 нМ) было слегка выше, чем у голого антитела Ό86 (620 пМ).In FIG. 28 shows the binding curve obtained by flow cytometry from a study of the binding affinity of naked and taxon conjugated antibodies Ό86 on Heb cells. Conjugation with taxane (MM1-202) does not adversely affect antibody binding affinity. The apparent Κ, ι value for the Ό86-ΜΜ1-202 conjugate (1.24 nM) was slightly higher than for the naked Ό86 antibody (620 pM).
На фиг. 29 представлено связывание ίη νίίτο и активность конъюгата гуманизованного варианта 1.01 антитела Ό86. Конъюгирование 1ιιιΌ86ν1.01 с ΌΜ4 оказывает незначительное влияние на авидность 1ιι.ιΌ86ν1.01 к клеткам КВ (фиг. 29А). Конъюгат 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 проявляет сильную цитотоксичность ίη νίίτο на экспрессирующие Ό86 клетки \У18Н. при этом значение 1С50 составляет 0,44 нМ (фиг. 29В).In FIG. 29 shows the binding of ίη νίίτο and the activity of the conjugate of the humanized variant 1.01 of the antibody Ό86. Conjugation of 1ιιιΌ86ν1.01 with ΌΜ4 has a negligible effect on the avidity of 1ιι.ιΌ86ν1.01 to KB cells (Fig. 29A). Conjugate 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 shows strong cytotoxicity of ίη νίίτο to expressing Ό86 cells \ U18H. the value of 1C 50 is 0.44 nm (Fig. 29B).
На фиг. 30 представлены результаты исследования действия ίη νίνο конъюгата 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 на модели рака поджелудочной железы НРАС. Конъюгат 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 проявляет сильную противоопухолевую активность, тогда как контрольный конъюгат В4-ЭМ4, мишень которого не экспрессируется на модели НРАС, практически не обладает активностью (фиг. 30А). Вводимая доза 200 мкг/кг не была токсичной для животных, о чем свидетельствует отсутствие потери веса (фиг. 30В).In FIG. 30 presents the results of a study of the action of ίη νίνο conjugate 1ιιιΌΌ86ν1.01-ΌΜ4 in the HPAC pancreatic cancer model. Conjugate 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 exhibits strong antitumor activity, while the control conjugate B4-EM4, whose target is not expressed on the HPAC model, has practically no activity (Fig. 30A). The administered dose of 200 μg / kg was not toxic to animals, as evidenced by the absence of weight loss (Fig. 30B).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Настоящее изобретение предусматривает, среди прочих особенностей, моноклональные антитела к СА6, гуманизованные антитела к СА6 и фрагменты антител к СА6. Каждое из антител и фрагментов антител настоящего изобретения предназначено для распознавания и связывания с гликотопом СА6 на поверхности клетки. Известно, что СА6 экспрессируется во многих типах опухолей человека: 95% серозных карцином яичников, 50% эндометриозных карцином яичников, 50% новообразований шейки матки, 69% новообразований эндометрия, 80% новообразований вульвы, 60% карцином молочной железы, 67% опухолей поджелудочной железы и 48% опухолей уротелиальных опухолей, но редко экспрессируется в нормальных тканях человека.The present invention provides, among other features, monoclonal antibodies to CA6, humanized antibodies to CA6 and fragments of antibodies to CA6. Each of the antibodies and antibody fragments of the present invention is designed to recognize and bind to the CA6 glycotope on the cell surface. It is known that CA6 is expressed in many types of human tumors: 95% of ovarian carcinomas of the ovaries, 50% of endometriotic ovarian carcinomas, 50% of cervical neoplasms, 69% of endometrial neoplasms, 80% of vulvar neoplasms, 60% of breast carcinomas, 67% of pancreatic tumors and 48% of tumors of urothelial tumors, but rarely expressed in normal human tissues.
В работе Кеагке еί а1., Ιηί. ί. Сапсег 88(6): 866-872 (2000) белок, на котором находится эпитоп СА6, был ошибочно идентифицирован, как белок в 80 кДа, содержащий Ν-связанный углевод, который содержит эпитоп СА6, когда они использовали супернатант гибридомы для его изучения. Используя очищенный Ό86, мы после этого показали, что эпитоп СА6 находится на О-связанном углеводе гликопротеида более 250 кДа, не связанного дисульфидными связями. Более того, гликопротеид был идентифицирован как муцин Мис1. Поскольку разные аллели Мис1 имеют различное число тандемных повторов в домене вариабельного числа тандемных повторов (νΝΤΚ), то клетки зачастую экспрессируют два разных белка Мис1 различного размера (Тау1ог-Рараб1шйпои, Вюсйеш. Вюрйук. Айа 1455(2-3): 301-13 (1999). Вследствие отличий по числу повторов в домене νΝΤΚ, а также отличий по гликозилированию, молекулярный вес Мис1 различается в зависимости от клеточной линии.In the work of Keagke eί a1., Ιηί. ί. Sapseg 88 (6): 866-872 (2000) the protein containing the CA6 epitope was mistakenly identified as a 80 kDa protein containing a Ν-linked carbohydrate that contains the CA6 epitope when they used the hybridoma supernatant to study it. Using purified Ό86, we then showed that the CA6 epitope is located on an O-linked carbohydrate of a glycoprotein of more than 250 kDa, not bound by disulfide bonds. Moreover, the glycoprotein has been identified as mucin Mis1. Since different Mis1 alleles have a different number of tandem repeats in the domain of the variable number of tandem repeats (νΝΤΚ), the cells often express two different Mis1 proteins of different sizes (Tau1og-Rarab1shypoi, Vyusyesh. Vyryuk. Aya 1455 (2-3): 301-13 ( 1999) Due to differences in the number of repeats in the νΝΤΚ domain, as well as differences in glycosylation, the molecular weight of Mis1 differs depending on the cell line.
Чувствительность иммунореактивности СА6 к йодной кислоте означает, что эпитоп СА6 является углеводным гликотопом. Кроме того, чувствительность иммунореактивности СА6 к обработке нейраминидазой из νίόπο с1ю1ега означает, что эпитоп СА6 является гликотопом, зависящим от сиаловой кислоты, то есть сиалогликотопом.The sensitivity of CA6 immunoreactivity to iodic acid means that the CA6 epitope is a carbohydrate glycotope. In addition, the sensitivity of CA6 immunoreactivity to treatment with neuraminidase from νίόπο с1ю1ег means that the CA6 epitope is a sialic acid-dependent glycotope, i.e. a sialoglycotope.
Подробные характеристики СА6 можно найти в примере 2 (см. ниже). Дополнительные подробности о СА6 можно найти в \УО 02/16401; νοηηοΛοτ^ еί а1., Ат. 1. Ра^Е 143(4): 1050-1054 (1993); 8ιηί11ι еί а1., Нитаη Аηί^Ьοά^е8 9: 61-65 (1999); Кеагке еί а1., Ιηί. 1. Саг1сег 88(6): 866-872 (2000); 8ιηί11ι еί а1., Ιηί. 1. буге^Е Ра^Б 20(3): 260-6 (2001) и 8ιηί11ι еί а1., Арр1. IттиηοЫ8ίοсйет. Μο1. [Ποροίοΐ. 10(2): 152-8 (2002).Detailed characteristics of CA6 can be found in Example 2 (see below). Additional details about CA6 can be found in \ UO 02/16401; νοηηοΛοτ ^ еί а1., At. 1. Ra ^ E 143 (4): 1050-1054 (1993); 8ιηί11ι еί а1., Nitaη Aηί ^ Lοά ^ e8 9: 61-65 (1999); Keagke eί a1., Ιηί. 1. Cag1seg 88 (6): 866-872 (2000); 8ιηί11ι eί a1., Ιηί. 1. Bouguer ^ E Ra ^ B 20 (3): 260-6 (2001) and 8ιηί11ι eί a1., Arp1. IttiηοЫ8ίοсset. Μο1. [Ποροίοΐ. 10 (2): 152-8 (2002).
Настоящее изобретение также включает цитотоксические конъюгаты, содержащие два первичных компонента. Первым компонентом является агент, связывающий клетку, который распознает и связывается с гликотопом СА6. Агент, связывающий клетку, должен распознавать сиалогликотоп СА6 на Мис1 с высокой степенью специфичности с тем, чтобы цитотоксические конъюгаты распознавали и связывались только с теми клетками, для которых они предназначены. Высокая степень специфичности позволяет конъюгатам действовать направленным образом с незначительными побочными эффектами, возникающими из-за неспецифического связывания.The present invention also includes cytotoxic conjugates containing two primary components. The first component is a cell-binding agent that recognizes and binds to the CA6 glycotope. The cell binding agent must recognize the CA6 sialoglycotope on Mis1 with a high degree of specificity so that the cytotoxic conjugates recognize and bind only to the cells for which they are intended. A high degree of specificity allows conjugates to act in a targeted manner with minor side effects resulting from nonspecific binding.
В следующем воплощении агент, связывающий клетку, по настоящему изобретению также распознает гликотоп СА6 с высокой степенью аффинности с тем, чтобы конъюгаты находились в контакте с клетками-мишенями в течение достаточного времени, позволяющего цитотоксической лекарственной части конъюгата действовать на клетку, и/или дающего конъюгатам достаточно времени, за которое они будут интернализованы клеткой.In a further embodiment, the cell binding agent of the present invention also recognizes a CA6 glycotope with a high degree of affinity so that the conjugates are in contact with the target cells for a sufficient time allowing the cytotoxic drug portion of the conjugate to act on the cell and / or giving the conjugates enough time for which they will be internalized by the cell.
В предпочтительном воплощении цитотоксические конъюгаты включают в качестве агента, связывающего клетку, антитело к СА6, более предпочтительно мышиное моноклональное антитело Ό86 к СА6. В более предпочтительном воплощении цитотоксические конъюгаты включают гуманизованное антитело Ό86 или его эпитоп-связывающий фрагмент. Антитело Ό86 способно распознавать СА6 с высокой степенью специфичности и направляет цитотоксический агент к аномальной клетке или ткани типа раковых клеток целенаправленным образом.In a preferred embodiment, the cytotoxic conjugates include, as a cell binding agent, an anti-CA6 antibody, more preferably a Ό86 anti-CA6 murine monoclonal antibody. In a more preferred embodiment, the cytotoxic conjugates include a humanized antibody # 86 or an epitope binding fragment thereof. Antibody Ό86 is able to recognize CA6 with a high degree of specificity and directs the cytotoxic agent to an abnormal cell or tissue such as cancer cells in a targeted manner.
Вторым компонентом цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения является цитотоксический агент. В предпочтительном воплощении цитотоксическим агентом является таксол, майтансиноидA second component of the cytotoxic conjugates of the present invention is a cytotoxic agent. In a preferred embodiment, the cytotoxic agent is taxol, maytansinoid
- 7 020130 типа ΌΜ1 или ΌΜ4, СС-1065 или аналог СС-1065. В предпочтительных воплощениях агенты, связывающие клетки, по настоящему изобретению ковалентно соединяются, непосредственно либо через расщепляемый или нерасщепляемый линкер, с цитотоксическим агентом.- 7 020130 type ΌΜ1 or ΌΜ4, SS-1065 or analogue of SS-1065. In preferred embodiments, the cell binding agents of the present invention are covalently coupled, either directly or via a cleavable or non-cleavable linker, to a cytotoxic agent.
Агенты, связывающие клетки, цитотоксические агенты и линкеры рассмотрены более подробно ниже.Cell binding agents, cytotoxic agents and linkers are discussed in more detail below.
Агенты, связывающие клеткиCell Binding Agents
Эффективность соединений настоящего изобретения в качестве терапевтических средств зависит от тщательного выбора соответствующего агента, связывающего клетку. Агенты, связывающие клетку, могут быть любого типа, известного в настоящее время или ставшего известным, причем не только пептиды. Агентом, связывающим клетку, может быть любое соединение, которое может связаться с клеткой как специфическим, так и неспецифическим образом. В общем, ими могут быть антитела (особенно моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины, молекулы переносчиков питательных веществ (к примеру, трансферрина) или любые другие молекулы либо вещества, связывающиеся с клетками.The effectiveness of the compounds of the present invention as therapeutic agents depends on the careful selection of an appropriate cell binding agent. Cell binding agents can be of any type currently known or known, not only peptides. A cell binding agent can be any compound that can bind to a cell in either a specific or non-specific manner. In general, they can be antibodies (especially monoclonal antibodies), lymphokines, hormones, growth factors, vitamins, nutrient carrier molecules (such as transferrin), or any other molecules or substances that bind to cells.
Более конкретные примеры агентов, связывающих клетку, которые можно использовать, включают:More specific examples of cell binding agents that can be used include:
(a) поликлональные антитела;(a) polyclonal antibodies;
(b) моноклональные антитела;(b) monoclonal antibodies;
(c) фрагменты антител типа БаЬ, БаЬ' и Р(аЬ')2, Ρν (Рагйат., 1. 1ттипо1. 131: 2895-2902 (1983); 8рппд е! а1., 1. 1ттипо1. 113: 470-478 (1974); ΝίκοηοίΡ е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйуз. 89: 230-244 (1960);(c) fragments of antibodies of the type BaB, BaB 'and P (aB') 2 , Ρν (Ragyat., 1. 1tipo1. 131: 2895-2902 (1983); 8pppd e! a1., 1. 1tipo1. 113: 470- 478 (1974); ΝίκοηοίΡ е! А1., Agsy. Vusyet. Vyruyuz. 89: 230-244 (1960);
(б) интерфероны (напр., α-, β-, γ-интерферон);(b) interferons (e.g. α-, β-, γ-interferon);
(е) лимфокины типа 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-6;(f) lymphokines of the type 1b-2, 1b-3, 1b-4, 1b-6;
(ί) гормоны, такие как инсулин, ТКН (тиреотропин-высвобождающий гормон), М8Н (меланоцитстимулирующий гормон), стероидные гормоны типа андрогенов и эстрогенов;(ί) hormones such as insulin, TKH (thyrotropin-releasing hormone), M8H (melanocyte-stimulating hormone), steroid hormones such as androgens and estrogens;
(д) факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как ЕСР, α-ТСР, РСР, УЕСР, С-С8Р, М-С8Р и СМ-С8Р (Витдезз, 1ттипо1оду Тобау 5: 155-158 (1984);(e) growth factors and colony-stimulating factors, such as ESR, α-TCP, PCP, UESR, S-S8P, M-S8P and SM-S8P (Vitdez, 1typodod Tobau 5: 155-158 (1984);
(й) трансферрин (О'КееГе е! а1., 1. Вю1. Сйет. 260: 932-937 (1985) и (ί) витамины, такие как фолат.(i) transferrin (O'KeeGe e! a1., 1. Vu1. Sit. 260: 932-937 (1985) and (ί) vitamins such as folate.
АнтителаAntibodies
Выбор надлежащего агента, связывающего клетку, является важным делом, которое зависит от того, какая популяция клеток должна стать мишенью, но в общем случае предпочтительны антитела, если имеется или может быть получено надлежащее антитело, более предпочтительно моноклональное антитело.The selection of the appropriate cell-binding agent is an important matter that depends on which population of cells should be targeted, but antibodies are generally preferred if the proper antibody is or can be prepared, more preferably a monoclonal antibody.
Методы моноклональных антител позволяют получить чрезвычайно специфические агенты, связывающие клетку, в виде специфических моноклональных антител. В данной области особенно хорошо известны методы получения моноклональных антител путем иммунизации мышей, крыс, хомяков или любых других млекопитающих соответствующим антигеном, к примеру, интактными клетками мишени, выделенными из клеток мишени антигенами, целыми вирусами, ослабленными целыми вирусами и такими вирусными белками, как белки оболочки вируса. Также можно использовать сенсибилизированные клетки человека. Другим методом получения моноклональных антител является использование фаговых библиотек 8сΡν (одноцепочечных вариабельных участков, в частности 8сΡν человека (напр., см. СтйТййз е! а1., И8 Ра!еп! №к. 5,885,793 и 5,969,108; МсСайейу е! а1., АО 92/01047; Ыттд е! а1., АО 99/06587).Monoclonal antibody methods provide extremely specific cell binding agents in the form of specific monoclonal antibodies. Methods for producing monoclonal antibodies by immunizing mice, rats, hamsters, or any other mammals with an appropriate antigen are particularly well known in the art, for example, intact target cells isolated from target cells by antigens, whole viruses attenuated by whole viruses and viral proteins such as proteins virus envelopes. Sensitized human cells can also be used. Another method for producing monoclonal antibodies is the use of 8cΡν phage libraries (single-stranded variable regions, in particular 8cΡν of a person (e.g. see StyTyz e! A1., I8 Ra! Ep! No. 5,885,793 and 5,969,108; MsSayeyu e! A1., AO 92/01047; Yttd e! A1., AO 99/06587).
Типичное антитело состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединяются дисульфидными связями. Вариабельная область представляет собой часть тяжелой цепи или легкой цепи антитела, которая отличается по последовательности от других антител и кооперативно участвует в связывании и специфичности каждого конкретного антитела к антигену. Обычно вариабельность не распределяется равномерно по вариабельным участкам антител. Как правило, она сосредоточена в трех сегментах вариабельной области, именуемых участками, определяющими комплементарность (СЭК), или гипервариабельными участками, как в легкой цепи, так и в тяжелой цепи. Очень консервативные части вариабельных областей называют каркасными участками. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат по четыре каркасных участка, которые в основном принимают конфигурацию β-листа, при этом каждый каркасный участок соединяется тремя участками СЭК, которые образуют петли, соединяющие структуры типа β-листа, а в некоторых случаях сами входят в эти структуры типа β-листа. Участки СЭК в каждой цепи удерживаются близко друг к другу каркасными участками, при этом участки СЭК из другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител (Е.А. КаЬа! е! а1. 8ес.|иепсе8 оГ Рто!е1пз оГ 1ттипо1од1са1 1п!егез!, Р1П11 Ебйюп, 1991, ΝΙΗ).A typical antibody consists of two identical heavy chains and two identical light chains that are connected by disulfide bonds. The variable region is part of the antibody heavy chain or light chain, which differs in sequence from other antibodies and cooperatively participates in the binding and specificity of each particular antibody to the antigen. Typically, the variability is not evenly distributed across the variable regions of the antibodies. As a rule, it is concentrated in three segments of the variable region, referred to as complementarity determining regions (SEC), or hypervariable regions, both in the light chain and in the heavy chain. Very conservative parts of the variable regions are called frame regions. The variable regions of the heavy and light chains contain four frame sections, which mainly take the shape of a β-sheet, with each frame section connecting three sections of the SEC, which form loops connecting structures of the β-sheet type, and in some cases they are included in these β-sheet type structures. SEC sections in each chain are held close to each other by frame sections, while SEC sections from the other chain contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies (E.A. Kaiba! E! A1. 8c. | Eepse8 oG Pto! E1nz oG 1tipo1od1ca1 1n! eges !, R1P11 Ebyup, 1991, ΝΙΗ).
Константная область входит в состав тяжелой цепи. Хотя она и не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но она выполняет различные эффекторные функции, такие как участие антитела в клеточной токсичности антител.The constant region is part of the heavy chain. Although it does not directly participate in the binding of the antibody to the antigen, it performs various effector functions, such as the participation of the antibody in the cellular toxicity of antibodies.
Подходящим моноклональным антителом для применения в настоящем изобретении является мышиное моноклональное антитело Ό86 (И.8. Ра!еп! №. 6,596,503; депонировано в АТСС под номером РТА-4449).A suitable monoclonal antibody for use in the present invention is a Ό86 murine monoclonal antibody (I.8. Ra! En! No. 6,596,503; deposited in ATCC under the number PTA-4449).
- 8 020130- 8 020130
Гуманизованные или поверхностно-перестроенные антитела Б86Humanized or surface-rearranged B86 antibodies
Предпочтительно в качестве агента, связывающего клетку, по настоящему изобретению используется гуманизованное антитело к СА6. Предпочтительным воплощением такого гуманизованного антитела является гуманизованное антитело Ό86 или его эпитоп-связывающий фрагмент.Preferably, a humanized anti-CA6 antibody is used as the cell binding agent of the present invention. A preferred embodiment of such a humanized antibody is the Ό86 humanized antibody or epitope binding fragment thereof.
Целью гуманизации является уменьшение иммуногенности чужеродного антитела типа мышиного антитела для введения его человеку, при сохранении полной аффинности связывания анигена и специфичности антитела.The aim of humanization is to reduce the immunogenicity of a foreign antibody such as a mouse antibody for administration to humans, while maintaining the full affinity of binding of the antigen and the specificity of the antibody.
Гуманизованные антитела могут быть получены при помощи нескольких технологий, таких как перестройка поверхности и пересадка участков СГОВ. В настоящем изобретении в технологии перестройки поверхности применяется сочетание молекулярного моделирования, статистического анализа и мутагенеза для изменения не входящих в СОВ поверхностей вариабельной области антител с тем, чтобы они были похожи на поверхности известных антител организма-хозяина.Humanized antibodies can be obtained using several technologies, such as surface remodeling and transplantation of SHOW sites. In the present invention, surface reconstruction technology uses a combination of molecular modeling, statistical analysis and mutagenesis to modify non-COB surfaces of the variable region of antibodies so that they look like surfaces of known antibodies of the host organism.
Подходы и методы перестройки поверхности антител, как и другие способы уменьшения иммуногенности антител в другом организме, изложены в И8 Ра1еи1 5639641 (Ребегаеи е! а1.), который включен в настоящее изобретение во всей полноте путем отсылки. Вкратце, в предпочтительном способе: (1) проводится сопоставление положений вариабельных областей тяжелой и легкой цепи ряда антител, чтобы получить такой набор выходящих на поверхность положений каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, в котором совмещенные положения всех вариабельных областей будут идентичными по меньшей мере на 98%; (2) определяется набор выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи для антитела (или его фрагмента) грызуна; (3) устанавливается набор выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, который более всего идентичен набору выходящих на поверхность аминокислотных остатков грызуна; (4) набор выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, определенный на стадии 2, заменяется набором выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, установленным на стадии 3, за исключением тех аминокислотных остатков, которые находятся в пределах 5А от любого атома любого остатка участков СОВ антитела грызуна; и (5) вырабатывается гуманизованное антитело грызуна, которое обладает специфичностью связывания. Антитела могут быть гуманизированы при помощи ряда других методов, в том числе пересадки СОВ (ЕР 0239400; \УО 91/09967; Ц.8. Ра!. N08. 5530101 и 5585089), гиперхимеризации или перестройки поверхности (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Раб1аи Е.А., 1991, Мо1еси1аг 1штипо1о§у 28(4/5): 489-498; 81ибшека 6.М. е! а1., 1994, Рто!еш Еидшеепид 7(6): 805-814; Во§и8ка М.А. е! а1., 1994, РNА8 91: 969-973) и перетасовки цепей (И8 Рак Νο. 5565332). Антитела человека могут быть получены рядом методов, известных в данной области, включая методы фагового дисплея. См. также И8 Ра!. N08. 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318; и публикации международных патентных заявок \УО 98/46645, \УО 98/50433, \УО 98/24893, \УО 98/16654, \УО 96/34096, \УО 96/33735 и \УО 91/10741 (данные ссылки включены путем отсылки во всей полноте).Approaches and methods for surface reconstruction of antibodies, as well as other methods of reducing the immunogenicity of antibodies in another organism, are described in I8 Ra1ei1 5639641 (Rebehei e! A1.), Which is incorporated herein by reference in its entirety. Briefly, in a preferred method: (1) the positions of the variable regions of the heavy and light chains of a series of antibodies are compared in order to obtain a set of surface and variable positions of the framework of the variable regions of the heavy and light chains in which the aligned positions of all the variable regions are identical at least by 98%; (2) a set of heavy and light chain variable regions emerging from the surface of the amino acid residues of the framework for the antibody (or fragment thereof) of a rodent is determined; (3) a set of amino acid residues of the framework of the heavy and light chain variable regions emerging on the surface is established, which is most identical to the set of rodent amino acids remaining on the surface; (4) the set of surface and heavy amino acid residues of the framework of the heavy and light chain variable regions defined in stage 2 is replaced by the set of heavy and light chain variable regions of the framework of the amino acid residues of the framework established in stage 3, with the exception of those amino acid residues that are within 5A from any atom of any remainder of the SOW regions of the rodent antibody; and (5) a humanized rodent antibody is produced that has binding specificity. Antibodies can be humanized using a number of other methods, including transplantation of SOW (EP 0239400; \ UO 91/09967; C.8. Ra !. N08. 5530101 and 5585089), hyperchimerization or surface remodeling (EP 0592106; EP 0519596; Rablai E.A., 1991, Mo1eci1ag 1shtipoigu 28 (4/5): 489-498; 81 error 6.M. e! A1., 1994, Mercury 7 (6): 805-814; Wo i8ka M.A. e! a1., 1994, PNA8 91: 969-973) and shuffling chains (I8 Cancer Νο. 5565332). Human antibodies can be obtained by a number of methods known in the art, including phage display methods. See also I8 Ra !. N08. 4444887, 4716111, 5545806 and 5814318; and publications of international patent applications \ UO 98/46645, \ UO 98/50433, \ UO 98/24893, \ UO 98/16654, \ UO 96/34096, \ UO 96/33735 and \ UO 91/10741 (these links are included by reference in its entirety).
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает гуманизованные антитела или их фрагменты, которые распознают новый сиалогликотоп (гликотоп СА6) на муцине Мис1. В другом воплощении гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты обладают дополнительной способностью к ингибированию роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6.In a preferred embodiment, the present invention provides humanized antibodies or fragments thereof that recognize a new sialoglycotope (CA6 glycotope) on Mis1 mucin. In another embodiment, humanized antibodies or their epitope-binding fragments have the additional ability to inhibit the growth of cells expressing the CA6 glycotope.
В более предпочтительных воплощениях представлены поверхностно-перестроенные или гуманизованные варианты антитела Ό86, у которых выходящие на поверхность остатки антитела или его фрагментов подвергаются замене на легких и тяжелых цепях с тем, чтобы они стали более похожими на поверхности известных антител человека. Гуманизованные антитела Ό86 или их эпитоп-связывающие фрагменты специфически распознают новый сиалогликотоп (гликотоп СА6) на муцине Мис1. Более предпочтительно гуманизованные антитела Ό86 или их эпитопосвязывающие фрагменты обладают дополнительной способностью к ингибированию роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6. Гуманизованное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент может быть конъюгировано с лекарственным препаратом типа майтансиноида с образованием пролекарства, обладающего специфической цитотоксичностью к экспрессирующим антиген клеткам, направляя лекарство на сиалогликотоп СА6 Мис1. Цитотоксические конъюгаты, включающие такие антитела и небольшие, сильно токсичные препараты (например, майтансиноиды, таксаны, аналоги СС-1065), могут применяться в качестве терапевтических препаратов для лечения раковых опухолей типа опухолей молочной железы и яичников.In more preferred embodiments, surface-rearranged or humanized variants of the Ό86 antibody are provided in which residues of the antibody or its fragments that come to the surface are replaced on light and heavy chains so that they become more similar to the surfaces of known human antibodies. Humanized 86 antibodies or their epitope-binding fragments specifically recognize a new sialoglycotope (CA6 glycotope) on Mis1 mucin. More preferably, humanized Ό86 antibodies or their epitope-binding fragments have the additional ability to inhibit the growth of cells expressing the CA6 glycotope. A humanized antibody or its epitope-binding fragment can be conjugated to a maytansinoid-type drug with the formation of a prodrug having specific cytotoxicity to antigen expressing cells, directing the drug to the CA6 Mis1 sialoglycotope. Cytotoxic conjugates, including such antibodies and small, highly toxic drugs (for example, maytansinoids, taxanes, analogues of CC-1065), can be used as therapeutic agents for the treatment of cancerous tumors such as breast and ovarian tumors.
Гуманизованные варианты антитела Ό86 по настоящему изобретению полностью в нем охарактеризованы в отношении соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, последовательностей ДНК генов вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, идентификации участков СОВ, идентификации их поверхностных аминокислот и изложения способа их экспрессии в рекомбинантном виде.The humanized variants of antibody Ό86 of the present invention are fully characterized in it with respect to the corresponding amino acid sequences of the variable regions of their light and heavy chains, DNA sequences of the genes of the variable regions of their light and heavy chains, identification of SOB regions, identification of their surface amino acids and a presentation of the method for their expression in recombinant form.
В одном воплощении представлены гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие тяжелую цепь, включающую участки СОВ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕЦ ГО NО: 1-3:In one embodiment, humanized antibodies or their epitope-binding fragments comprising a heavy chain comprising sections of SOW having amino acid sequences represented by 8EC GO NO: 1-3 are provided:
- 9 020130- 9 020130
При определении участков СЭВ тяжелой цепи с помощью моделирующей программы ЛЬМ они представлены 8ЕЦ ГО N0: 20-22:When determining the sections of the CMEA of the heavy chain using the modeling program LM they are presented 8EC GO N0: 20-22:
В том же воплощении гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты содержат легкую цепь, содержащую участки СЭВ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕС) ГО N0: 4-6:In the same embodiment, humanized antibodies or their epitope-binding fragments contain a light chain containing sections of CMEA having the amino acid sequences represented by 8ES) GO N0: 4-6:
Также представлены гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 7 или 8ЕО ГО N0: 8:Also presented are humanized antibodies and their epitope-binding fragments containing the variable region of the light chain having an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence represented by 8EC GO N0: 7 or 8EO GO N0: 8:
01УЕТф5РА1М8А8РОЕКУТ1ТС8АН88У8РМЮИГО0КРОТ8РКЕУаУ8Т88ЕА8(л01UETf5RA1M8A8ROEUKUT1TS8AN88U8RMYUIGO0KROT8RKEUaU8T88EA8 (l
УРАКГСг0808СТ8У8ЕТ18КМЕАЕОААТУУСфрК88РРЬТЕОАОТКЬЕЕКВ (8ЕЭ ΙΟΝΟ: 7)URAKGSg0808ST8U8ET18KMEAEOAAATUUSfrK88RRTEOAOOTKYEEV (8EE Э: 7)
ΕΐνΕΤφ8ΡΑΤΜ8Α8ΡΟΕΚνΤΙΤΓ8ΑΗ88ν8ΓΜΗΨΡς0ΚΡΟΤ8ΡΚΕ\νΐΥ8Τ88ΕΑ8Ο νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥ00ΡΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΒ (8ВД ГО N0: 8).ΕΐνΕΤφ8ΡΑΤΜ8Α8ΡΟΕΚνΤΙΤΓ8ΑΗ88ν8ΓΜΗΨΡς0ΚΡΟΤ8ΡΚΕ \ νΐΥ8Τ88ΕΑ8Ο νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥ00ΡΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΒ (8VD GO N0: 8).
Также представлены гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 9, 8ЕЦ ГО N0: 10 или 8ЕО ГО N0: 11:Also presented are humanized antibodies and their epitope binding fragments containing a variable region of the heavy chain having an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence represented by 8EC GO N0: 9, 8EC GO N0: 10 or 8EO GO N0: 11 :
ρΑΥΕςςδ0ΑΕΕνΒ8ΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗΨνκρΤΡθρθΕΕνΐ0ΥΙΥΡρΑΥΕςςδ0ΑΕΕνΒ8ΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗΨνκρΤΡθρθΕΕνΐ0ΥΙΥΡ
С1ШдАГЕА\фКЕКСтКАТ1ТА1)Р888ТАУМО1881гТ8Е1)8АУ\'ЕСАК(ГО8УРЕАУ’'Л'гС0СТS1ShdAgea \ fKEXtKAT1TA1) P888TAUMO1881 g T8E1) 8AU \ 'ESAK (GO8UREAU''L' g S0ST
ЬУТУ8А (8ЕЦ ГО N0: 9)LUTU8A (8EC GO N0: 9)
0Λ0Τ,νρ8ΟΛΕννΚΡθΛ8νΚ_\Ί80ΚΑ8Γ7ΥΤΕΤ8λΤΙΜΗΨνΚ0ΤΡΓι0ίίΕΕ\\'Ί6ϊΊΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝςΚΡφΟΚΑΤΕΤΑϋΤ888ΤΑΥΜςΐ88ΕΤ8Εϋ8ΑνΎΕαΑΒσθ8νΡΡΑΥΨΟ0ΟΤ БУТУЗА (ЗЕфШИО: 10)0Λ0Τ, νρ8ΟΛΕννΚΡθΛ8νΚ_ \ Ί80ΚΑ8Γ7ΥΤΕΤ8λΤΙΜΗΨνΚ0ΤΡΓι0ίίΕΕ \\ 'Ί6ϊΊΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝςΚΡφΟΚΑΤΕΤΑϋΤ888ΤΑΥΜςΐ88ΕΤ8Εϋ8ΑνΎΕαΑΒσθ8νΡΡΑΥΨΟ0ΟΤ BUTUZA (ZEPHIO: 10)
0ΑφΕνφ8ΟΑΕννΚΡ6Α8νΚΜ8εΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗ3ννΚφΤΡΟφσΕΕλνΐΟΥΙΥΡ 6Ν0ΑΤΝΥΝφΚΡφ0ΚΑΤΕΤΑ0Ρ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8ΕΌ8ΑνΥΡ€ΑΚ008νΡΡΑΥ\ν0φ6Τ БУТУЗА (ЗЕфГОЬЮ: 11).0ΑφΕνφ8ΟΑΕννΚΡ6Α8νΚΜ8εΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗ3ννΚφΤΡΟφσΕΕλνΐΟΥΙΥΡ 6Ν0ΑΤΝΥΝφΚΡφ0ΚΑΤΕΤΑ0Ρ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8ΕΌ8Α8ΥΡνΥΡ € ΑΚ008νΡΡΑΥ \ ν0φ6Τ BUTUZA (Zephgoy: 11).
В другом воплощении представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно-перестроенную вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0: 8:In another embodiment, humanized Ό86 antibodies and their epitope-binding fragments comprising a humanized or surface-rearranged variable region of a light chain having an amino acid sequence corresponding to 8EC GO N0: 8 are provided:
Е1УЕТОЗРАТМ8А8РОЕВУТ1ТС8АН88УЗРМН\УРф9КРОТ8РКЕ\У1У8Т88ЕАЗС νΡΛΚΕ6Π8680Τ8Υ8ΕΤ138ΜΕΑΕΟΛΑΤΥΥΟφφΚ88ΡΡΕΊΤΟΑΟΤΚΕΕΤ.ΚΚ.E1UETOZRATM8A8ROEVUT1TS8AN88UZRMN \ URf9KROT8RKE \ U1U8T88EAZS νΡΛΚΕ6Π8680Τ8Υ8ΕΤ138ΜΕΑΕΟΛΑΤΥΥΟφφΚ88ΡΡΕΊΤΟΑΟΤΚΕΕΤ.ΚΚ.
(ЗЕф ГО N0: 8).(Zef GO N0: 8).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно перестроенную вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0: 10 или 8ЕЦ ГО N0: 11, соответственно:Also presented are humanized antibodies Ό86 and their epitope-binding fragments containing a humanized or surface-rearranged variable region of the heavy chain having an amino acid sequence corresponding to 8EC GO N0: 10 or 8EC GO N0: 11, respectively:
- 10 020130 фАфЕУф8САЕУУКРСА8УКМ8СКА86УТЕТ8¥ПМН\УУКфТР63ОЬЕ!УЮТ1УР αΝ6ΛΤΝΎ'Ν0ΚΡϊχ}ΚΑΊ1.'[·ΑϋΤ888ΤΑΥΜφΙ55ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΓύ'ΛΡΟΟ8νΡ[ΑΥνίΌφΟΤ ЕУТУ8А (8Εφ Ю N0: 10) рЛфЕУфЗбЛЕУУЮ’ОАЗУКМЗСКАЗОУТГТЙ^Э/МНи-ТКфТРСфСЬЕМ'ЮУП’Р ΟΝ6ΑΤΝΥΝρΚΓφΟΚΑΤΕΤΑΟΡ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΡ€ΑΒσΒ8νΡΕΑΥ\¥ΟφΟΤ БУТУЗА (8Ε01ΟΝΟ: 11).- 10 020.13 thousand fAfEUf8SAEUUKRSA8UKM8SKA86UTET8 ¥ PMN \ UUKfTR63OE UYUT1UR αΝ6ΛΤΝΎ'Ν0ΚΡϊχ} ΚΑΊ1 '[· ΑϋΤ888ΤΑΥΜφΙ55ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΓύ'ΛΡΟΟ8νΡ [ ΑΥν ί ΌφΟΤ EUTU8A (8Εφ Yu N0: 10) rLfEUfZbLEUUYu'OAZUKMZSKAZOUTGTY ^ E / MSR-TKfTRSfSEM'YuUP'R ΟΝ6ΑΤΝΥΝρΚΓφΟΚΑΤΕΤΑΟΡ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΡ € ΑΒσΒ8νΡΕΑΥ!. \ ¥ ΟφΟΤ BUTUZA (8Ε01ΟΝΟ: 11).
Гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты по настоящему изобретению также могут включать такие варианты вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи, у которых поверхностные аминокислотные остатки человека вблизи от СЭВ заменены соответствующими поверхностными остатками тнЭ8б по одному или нескольким положениям, представленным звездочками в табл. 1 (нумерация по Кабату), чтобы сохранить аффинность связывания и специфичность тиЭБб.The humanized antibodies and their epitope-binding fragments of the present invention may also include such variants of the variable regions of the light and / or heavy chain in which the surface amino acid residues of a person near the CMEA are replaced by the corresponding surface residues of TNE8b at one or more positions represented by asterisks in the table. 1 (Kabat numbering) to maintain the binding affinity and specificity of thEBb.
Таблица 1Table 1
В настоящем изобретении раскрыты первичные аминокислотные последовательности и последовательности ДНК легких и тяжелых цепей антитела Ό86 и их гуманизованных вариантов. Однако рамки настоящего изобретения не ограничиваются антителами и фрагментами, содержащими эти последовательности. Наоборот, в настоящее изобретение включены все антитела и фрагменты, которые специфически связываются с САб как с уникальным опухолеспецифичным гликотопом на рецепторе Мис1.The present invention discloses primary amino acid sequences and DNA sequences of light and heavy chains of antibody No. 86 and their humanized variants. However, the scope of the present invention is not limited to antibodies and fragments containing these sequences. On the contrary, the present invention includes all antibodies and fragments that specifically bind to SAb as a unique tumor-specific glycotope at the Mis1 receptor.
Предпочтительно антитела и фрагменты, которые специфически связываются с САб, также являются антагонистами биологической активности этого рецептора. Более предпочтительно такие антитела также практически лишены активности агониста. Таким образом антитела и фрагменты антител настоящего изобретения могут отличаться от антитела Ό86 и его гуманизованных производных по аминокислотной последовательности каркаса, участков СОВ и/или легкой цепи и тяжелой цепи, и тем не менее попадать в рамки настоящего изобретения.Preferably, antibodies and fragments that specifically bind to SAb are also antagonists of the biological activity of this receptor. More preferably, such antibodies are also substantially devoid of agonist activity. Thus, antibodies and antibody fragments of the present invention may differ from the Ό86 antibody and its humanized derivatives in the amino acid sequence of the framework, SOC and / or light chain and heavy chain regions, and nevertheless fall within the scope of the present invention.
Участки СОВ антитела Ό86 были идентифицированы путем моделирования и были предсказаны их молекулярные структуры. Опять же, хотя участки СОВ и важны для распознавания эпитопа, но они не являются основными для антител и фрагментов по изобретению. Соответственно, предусмотрены антитела и фрагменты, обладающие улучшенными свойствами, которые получают, к примеру, при созревании аффинности антител настоящего изобретения.SOC sites of antibody Ό86 were identified by simulation and their molecular structures were predicted. Again, although the SOB regions are important for the recognition of the epitope, they are not essential for the antibodies and fragments of the invention. Accordingly, antibodies and fragments having improved properties are provided, which are obtained, for example, by maturing the affinity of the antibodies of the present invention.
Эмбриональный ген легкой цепи мыши 1дУк ар4 и эмбриональный ген тяжелой цепи мыши 1дУЪ 1558.41, из которых вероятно происходит Ό86, представлены на фиг. 11 в сопоставлении с последовательностью антитела Ό86. При сравнении идентифицированы вероятные соматические мутации в антителе Ό86, в том числе несколько в участках СЭВ.The mouse light chain embryonic gene 1dUp ap4 and the mouse heavy chain embryonic gene 1dUp 1558.41, of which Ό86 probably originated, are shown in FIG. 11 in comparison with the sequence of antibodies Ό86. When comparing, probable somatic mutations in the Ό86 antibody were identified, including several in the CMEA sites.
Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи антитела Ό86, а также последовательности участков СЭВ антитела Ό86 ранее не были известны и приводятся на фиг. 9А и 9В. Такая информация может использоваться для получения гуманизованных вариантов антитела Ό86.The sequences of the variable region of the heavy chain and light chain of the antibody Ό86, as well as the sequences of the CMEA portions of the antibody Ό86 were not previously known and are shown in FIG. 9A and 9B. Such information can be used to obtain humanized variants of the antibody Ό86.
Фрагменты антителAntibody fragments
Антитела настоящего изобретения включают как целые антитела, рассмотренные выше, так и эпитопосвязывающие фрагменты. В настоящем изобретении фрагменты антител охватывают любые части антитела, сохраняющие способность к связыванию с эпитопом, распознаваемым целым антителом, которые обычно именуются эпитопосвязывающими фрагментами. Примеры фрагментов антител включают, не ограничиваясь этим, фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2, Εν, одноцепочечные Εν (ксЕу), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Εν (άδΕν) и фрагменты, содержащие область V ИЛИ νΗ. Эпитопосвязывающие фрагменты, в том числе одноцепочечные антитела, могут включать одни только вариабельные области или в сочетании с полным участком или частью следующего шарнирного участка доменов Сн1, СН2 и Сн3.Antibodies of the present invention include both the whole antibodies described above and the epitope binding fragments. In the present invention, antibody fragments encompass any portion of an antibody that retains the ability to bind to an epitope recognized by the whole antibody, which is commonly referred to as epitope-binding fragments. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, fragments EaB, EaB 'and E (ab') 2 , Εν, single-stranded Εν (xEU), single-chain antibodies linked by disulfide bonds Εν (άδΕν), and fragments containing region V OR ν Η . Epitope-binding fragments, including single-chain antibodies, can include only variable regions or in combination with a complete region or part of the following hinge region of domains C n 1, CH 2 and C n 3.
Такие фрагменты могут содержать один или оба фрагмента ЕаЬ либо фрагмент Е(аЬ')2. Предпочтительно фрагменты антител содержат все шесть участков СЭВ полного антитела, хотя функциональными являются и фрагменты, содержащие не все такие участки, скажем, три, четыре или пять СЭВ. Кроме тоSuch fragments may contain one or both fragments of EaB or a fragment of E (ab ') 2 . Preferably, antibody fragments contain all six sections of the CMEA of the complete antibody, although fragments containing not all of such sections of, say, three, four or five CMEA are functional. Besides
- 11 020130 го, фрагменты могут принадлежать к любому или составлять комбинацию из представителей любого из следующих классов иммуноглобулинов: 1§С. 1дМ, 1дЛ, 1дО или 1дЕ, а также их подклассов.- 11 020130, fragments can belong to any or make up a combination of representatives of any of the following classes of immunoglobulins: 1§C. 1dM, 1dL, 1dO or 1dE, as well as their subclasses.
Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2 могут быть получены путем протеолитического расщепления с помощью таких ферментов, как папаин (фрагменты ЕаЬ) или пепсин (фрагменты Е(аЬ')2).Fragments EaB and E (ab ') 2 can be obtained by proteolytic cleavage using enzymes such as papain (fragments EaB) or pepsin (fragments E (a b') 2 ).
Одноцепочечные фрагменты Εν ЦеЕу) представляют собой эпитопосвязывающие фрагменты, содержащие по меньшей мере один фрагмент вариабельной области тяжелой (Ун) антитела, соединенный по меньшей мере с одним фрагментом вариабельной области легкой цепи (Уь) антитела. Линкером может быть короткий, гибкий пептид, выбранный таким образом, чтобы обеспечить правильную трехмерную укладку областей Уъ И Ун после их соединения с тем, чтобы сохранилась специфичность связывания с молекулой мишени того целого антитела, из которого получен одноцепочечный фрагмент антитела. Через линкер карбоксильный конец последовательности Уъ или Ун может ковалентно соединяться с аминокислотным концом комплементарной последовательности Уъ или Ун.Single-stranded fragments (Εν CeEy) are epitope-binding fragments containing at least one fragment of the variable region of a heavy (V n ) antibody, connected to at least one fragment of the variable region of the light chain (V b ) of an antibody. The linker can be a short, flexible peptide, selected in such a way as to ensure the correct three-dimensional folding of the U b and U n regions after their connection so that the binding specificity of the whole antibody from which the single-chain fragment of the antibody is obtained is preserved. Through a linker, the carboxyl end of the sequence Y b or U n can covalently connect to the amino acid end of the complementary sequence U b or U n .
Одноцепочечные фрагменты антител настоящего изобретения содержат аминокислотные последовательности, содержащие по меньшей мере одну из вариабельных областей или участков комплементарности (СЭК.) целых антител, описанных в настоящем описании, но не содержат некоторых или всех константных доменов этих антител. Эти константные домены не нужны для связывания антигена, но они составляют большую часть структуры целых антител. Поэтому одноцепочечные фрагменты антител могут преодолеть некоторые проблемы, связанные с использованием антител, содержащих часть или весь константный домен. Например, одноцепочечные фрагменты антител обычно свободны от нежелательных взаимодействий между биологическими молекулами и константной областью тяжелой цепи или иной нежелательной биологической активности. Кроме того, одноцепочечные фрагменты антител являются значительно меньшими, чем целые антитела, поэтому они могут обладать большей капиллярной проницаемостью, чем целые антитела, что позволяет им более эффективно располагаться на и связываться с антигенсвязывающими сайтами мишени. К тому же фрагменты антител могут быть получены в сравнительно большом количестве в прокариотических клетках, что облегчает их получение. Более того, сравнительно небольшой размер одноцепочечных фрагментов антител делает менее вероятным индукцию иммунного ответа у реципиента, чем целые антитела.Single chain antibody fragments of the present invention contain amino acid sequences containing at least one of the variable regions or complementarity regions (CECs) of the whole antibodies described herein, but do not contain some or all of the constant domains of these antibodies. These constant domains are not needed for antigen binding, but they make up most of the structure of whole antibodies. Therefore, single-chain antibody fragments can overcome some of the problems associated with the use of antibodies containing part or all of the constant domain. For example, single chain antibody fragments are usually free of undesirable interactions between biological molecules and the constant region of the heavy chain or other undesirable biological activity. In addition, single-chain antibody fragments are significantly smaller than whole antibodies, so they can have greater capillary permeability than whole antibodies, which allows them to more efficiently locate and bind to antigen-binding sites of the target. In addition, antibody fragments can be obtained in a relatively large number in prokaryotic cells, which facilitates their preparation. Moreover, the relatively small size of single-chain antibody fragments makes the induction of an immune response in a recipient less likely than whole antibodies.
Одноцепочечные фрагменты антител могут быть созданы методами молекулярного клонирования, библиотеки фагового дисплея антител или сходными методами, хорошо известными специалистам. Эти белки можно продуцировать, к примеру, в эукариотических или прокариотических клетках, включая бактерии. Эпитоп-связывающие фрагменты по настоящему изобретению также могут быть созданы различными методами фагового дисплея, известными в данной области. В методах фагового дисплея функциональные домены антител выставляются на поверхности частиц фага, несущих кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В частности, такой фаг может быть использован для дисплея эпитопосвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (напр., человека или мыши). Фаг, экспрессирующий эпитоп-связывающий домен, который связывается с нужным антигеном, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например, с помощью меченого антигена, связанного или фиксированного на твердой поверхности или шариках. Как правило, в этих методах используются нитчатые фаги, включая Гб и М13, при этом происходит экспрессия связывающих доменов из фага вместе с ЕаЬ, Εν или стабилизированными дисульфидными связями доменами Εν антител, слитыми рекомбинантным путем с белком гена III или гена УШ самого фага.Single chain antibody fragments can be created by molecular cloning, a phage antibody display library, or similar methods well known in the art. These proteins can be produced, for example, in eukaryotic or prokaryotic cells, including bacteria. The epitope-binding fragments of the present invention can also be created by various phage display methods known in the art. In phage display methods, the functional domains of antibodies are exposed on the surface of phage particles carrying the polynucleotide sequences encoding them. In particular, such a phage can be used to display epitope-binding domains expressed from a repertoire or combinatorial library of antibodies (e.g., human or mouse). A phage expressing an epitope binding domain that binds to the desired antigen can be selected or identified by antigen, for example, by labeled antigen bound or fixed to a solid surface or beads. As a rule, filamentous phages, including HB and M13, are used in these methods, and the binding domains from the phage are expressed together with EaB, Εν or stabilized disulfide bonds Εν domains of antibodies, recombinantly fused to the gene of the III gene or US gene of the phage itself.
Примеры методов фагового дисплея, которые могут быть использованы для получения эпитопосвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, включают методы, изложенные в Вппктап е! а1., 1995, ί. 1ттипо1. Ме!йоб§ 182: 41-50; Лшек е! а1., 1995, ί. 1ттипо1. Ме!йоб§ 184: 177-186; КеШеЬогоидф е! а1., 1994, Еиг. ί. 1ттипо1. 24: 952-958; Регыс е! а1., 1997, Оепе 187: 9-18; Вийоп е! а1., Абхапсе ίη 1ттипо1оду 57: 191-280; заявке РСТ Ыо. РСТ/ОВ91/01134; публикациях РСТ АО 90/02809, АО 91/10737, АО 92/01047, АО 92/18619, АО 93/11236, АО 95/15982, АО 95/20401 и И8 Ра!. Хох 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108; которые все включены в настоящее изобретение путем отсылки во всей полноте.Examples of phage display methods that can be used to produce the epitope-binding fragments of the present invention include those described in Exposure! A1., 1995, ί. 1ttypo1. Me! Job § 182: 41-50; Lshek e! A1., 1995, ί. 1ttypo1. Me! Job § 184: 177-186; KESHEOGOIDF e! A1., 1994, Eig. ί. 1ttypo1. 24: 952-958; Regys e! A1., 1997, Oepe 187: 9-18; Villop e! A1., Abhapse ίη 1typodod 57: 191-280; PCT application. PCT / OV91 / 01134; PCT publications AO 90/02809, AO 91/10737, AO 92/01047, AO 92/18619, AO 93/11236, AO 95/15982, AO 95/20401 and I8 Ra !. Hoch 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 and 5969108; which are all included in the present invention by reference in its entirety.
После селекции фага можно выделить участки фага, кодирующие фрагменты, и использовать их для создания эпитоп-связывающих фрагментов посредством экспрессии в выбранном организме хозяина, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий, используя методы рекомбинантной ДНК, например, как описано подробно ниже. Например, для получения фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2 можно использовать методы, известные в данной области типа тех, что изложены в публикации РСТ АО 92/22324; МиШпах е! а1., 1992, ВюТееНшсщех 12(6): 864-869; 8а^а1 е! а1., 1995, АЖ1 34: 26-34 и Ве!!ег е! а1., 1988, 8е1епее 240: 1041-1043; которые включены путем отсылки во всей полноте. Примеры методов, которые могут быть использованы для получения одноцепочечных Εν и антител, включают методы, описанные в И8. Ра!. Ыок. 4946778 и 5258498; Ин51оп е! а1., 1991, Ме!йоб§ ш Еп/уто1оду 203: 46-88; 81ш е! а1., 1993, РЫА8 90: 7995-7999; 8кетга е! а1., 1988, 8е1епее 240: 1038-1040.After selection of the phage, phage sections encoding the fragments can be isolated and used to create epitope-binding fragments by expression in the selected host organism, including mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast and bacteria, using recombinant DNA methods, for example, as described detail below. For example, to obtain fragments of EaB, EaB 'and E (ab') 2 , methods known in the art such as those described in PCT Publication AO 92/22324 can be used; MiShpah e! A1., 1992, VyTeyNshshshchekh 12 (6): 864-869; 8a ^ a1 e! A1., 1995, AJ1 34: 26-34 and Be !! ee e! A1., 1988, 8e1 and more than 240: 1041-1043; which are incorporated by reference in their entirety. Examples of methods that can be used to obtain single-stranded Εν and antibodies include the methods described in I8. Ra !. Yok. 4,946,778; and 5,258,498; In51op e! A1., 1991, Meobob w En / utodod 203: 46-88; 81sh e! A1., 1993, PYA8 90: 7995-7999; 8ketga e! A1., 1988, 8e1ee 240: 1038-1040.
Функциональные эквивалентыFunctional Equivalents
В рамки изобретения также входят функциональные эквиваленты антитела к СА6 и гуманизованного антитела к СА6. Термин функциональные эквиваленты охватывает антитела с гомологическими поFunctional equivalents of an anti-CA6 antibody and a humanized anti-CA6 antibody are also within the scope of the invention. The term functional equivalents encompasses antibodies homologous to
- 12 020130 следовательностями, химерные антитела, искусственные антитела и модифицированные антитела, к примеру, при этом каждый функциональный эквивалент определяется по способности к связыванию с СА6. Специалисты должны понимать, что группа молекул, называемых фрагментами антител, перекрывается с группой, именуемой функциональными эквивалентами. Способы получения функциональных эквивалентов изложены, к примеру, в заявке РСТ νθ 93/21319; европейской патентной заявке Νο. 239400; заявке РСТ νθ 89/09622; европейской патентной заявке Νο. 338745 и европейской патентной заявке ЕР 332,424; которые все включены во всей полноте путем отсылки.- 12 020130 sequences, chimeric antibodies, artificial antibodies and modified antibodies, for example, each functional equivalent being determined by its ability to bind to CA6. Professionals should understand that a group of molecules called antibody fragments overlaps with a group called functional equivalents. Methods of obtaining functional equivalents are described, for example, in PCT application νθ 93/21319; European patent application Νο. 239400; PCT application νθ 89/09622; European patent application Νο. 338745 and European patent application EP 332,424; which are all incorporated in their entirety by reference.
Антитела с гомологическими последовательностями представляют собой такие антитела, у которых аминокислотные последовательности гомологичны аминокислотной последовательности антитела к СА6 и гуманизованного антитела к СА6 по настоящему изобретению. Предпочтительно гомологичность относится к аминокислотной последовательности вариабельных областей антитела к СА6 и гуманизованного антитела к СА6 по настоящему изобретению. Гомологичность последовательности в применении к аминокислотной последовательности в настоящем изобретении определяется как то, что последовательность по меньшей мере на 90, 91, 92, 93 или 94%, более предпочтительно на 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична другой аминокислотной последовательности при определении, к примеру, методом поиска РА8ТА согласно Реагкоп аиб Ыршаи, Ргос. Ναΐί. Асаб. 8οί. И8А 85, 2444-2448 (1988).Antibodies with homologous sequences are those antibodies in which the amino acid sequences are homologous to the amino acid sequence of the anti-CA6 antibody and the humanized anti-CA6 antibody of the present invention. Preferably, homology refers to the amino acid sequence of the variable regions of the anti-CA6 antibody and the humanized anti-CA6 antibody of the present invention. The sequence homology as applied to the amino acid sequence in the present invention is defined as the fact that the sequence is at least 90, 91, 92, 93 or 94%, more preferably 95, 96, 97, 98, or 99% homologous to the other amino acid sequence when determining , for example, by the search method PA8TA according to Reagkop aib Yrshai, Prgos. Ναΐί. Asab. 8οί. I8A 85, 2444-2448 (1988).
В настоящем изобретении химерное антитело означает такое антитело, у которого различные части происходят из разных видов животных. Например, антитело, содержащее вариабельную область из мышиного моноклонального антитела вместе с константной областью иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны в данной области. Например, см. Моткой, 1985, 8с1еисе 229: 1202; Θί е! а1., 1986, ВюТес11пк.|иек 4: 214; О1Шек е! а1., 1989, 1. 1ттипо1. МеШобк 125: 191-202; И8 Ра!. Νοκ. 5807715, 4816567 и 4816397; которые включены в настоящее изобретение путем отсылки во всей полноте.In the present invention, a chimeric antibody means an antibody in which different parts come from different species of animals. For example, an antibody comprising a variable region from a murine monoclonal antibody together with a constant region of a human immunoglobulin. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. For example, see Motka, 1985, 8c1eise 229: 1202; Θί e! A1., 1986, VyuTes11pk. | Iek 4: 214; O1Shek e! A1., 1989, 1. 1ttypo1. Meshobk 125: 191-202; I8 Ra !. Νοκ. 5807715, 4816567 and 4816397; which are included in the present invention by reference in its entirety.
Гуманизованные формы химерных антител получают путем замены участков комплементарности (СЭВ), к примеру, из антитела мыши в каркасный домен человека, например, см. РСТ РиЬ. №. νθ 92/22653. Гуманизованные химерные антитела предпочтительно содержат константные области и вариабельные области, у которых участки комплементарности (СОВ) не происходят практически или исключительно из соответствующих участков антител человека, а происходят практически или исключительно из других млекопитающих.Humanized forms of chimeric antibodies are obtained by replacing complementarity sites (CMEA), for example, from a mouse antibody to a human framework domain, for example, see PCT PuB. No. νθ 92/22653. Humanitarianized chimeric antibodies preferably comprise constant regions and variable regions in which the complementarity regions (SOCs) do not occur almost exclusively from the corresponding human antibody regions but come almost exclusively from other mammals.
Искусственные антитела охватывают фрагменты ксРу. диантитела (б1аЬобу), триантитела (1г1аЬобу). тетрантитела (!е!гаЬобу) и тги (см. обзоры V^ηΐе^ О. апб МбКет С, 1991, №1иге 349: 293-299; Нибкоп Р.Е, 1999, Сиггеп! Ор1шоп ίη 1ттипо1оду 11: 548-557), которые все обладают способностью к связыванию антигена. У одноцепочечных фрагментов Εν (ксЕу) домены УН и Уь антитела соединяются гибким пептидом. Как правило, такой пептид-линкер состоит примерно из 15 аминокислот. Если линкер намного меньше, к примеру, из 5 аминокислот, то образуются диантитела, которые представляют собой двухвалентные димеры ксЕ\'. Если же линкер уменьшить до менее трех аминокислотных остатков, то образуются тримерные и тетрамерные структуры, называемые триантителами и тетрантителами. Наименьшей связывающей единицей антитела является участок СЭВ, как правило, это СЭВ2 тяжелой цепи, который обладает достаточно специфичным распознаванием и связыванием, так что его можно использовать отдельно. Такой фрагмент называют молекулярной единицей распознавания, или тги. Несколько таких тги можно соединить короткими пептидами-линкерами, при этом образуется искусственный связывающий белок с более высокой авидностью, чем у одиночного звена тги.Artificial antibodies span fragments of ccpu. diantibodies (b1a bobu), triantibodies (l1a bobu). tetrantibodies (! e! gaobu) and tgi (see reviews V ^ ηΐе ^ O. apb MbKet S, 1991, No. Iige 349: 293-299; Nibkop R.E., 1999, Siegep! Orlshop ίη 1typodod 11: 548-557 ), which all have the ability to bind antigen. In single-stranded fragments of Εν (xEy), the domains of H and Vy antibodies are joined by a flexible peptide. Typically, such a peptide linker consists of about 15 amino acids. If the linker is much smaller, for example, of 5 amino acids, then diantibodies are formed, which are divalent xE \ 'dimers. If the linker is reduced to less than three amino acid residues, then trimeric and tetrameric structures are formed, called triantibodies and tetrantibodies. The smallest binding unit of the antibody is the SEV region, as a rule, it is the SEV2 heavy chain, which has sufficiently specific recognition and binding, so that it can be used separately. Such a fragment is called the molecular unit of recognition, or tgi. Several such tgis can be joined by short linker peptides, with the formation of an artificial binding protein with a higher avidity than a single tgi link.
Функциональные эквиваленты по настоящей заявке также включают модифицированные антитела, напр., антитела, модифицированные ковалентным присоединением какой-нибудь молекулы к антителу. Так, модифицированные антитела охватывают такие антитела, которые подверглись модификации, напр., гликозилированию, ацетилированию, ПЭГилированию, фосфорилированию, амидированию, образованию известных защитных/блокирующих групп, протеолитическому расщеплению, присоединению к клеточному лиганду или другому белку и т.п. Ковалентное присоединение не мешает выработке антиидиотипического ответа антитела. Такие модификации могут осуществляться известными методами, включая, но не ограничиваясь этим, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и др. Кроме того, модифицированные антитела могут содержать одну или несколько необычных аминокислот.Functional equivalents of the present application also include modified antibodies, for example, antibodies modified by the covalent attachment of a molecule to an antibody. Thus, modified antibodies encompass antibodies that have undergone modification, e.g., glycosylation, acetylation, PEGylation, phosphorylation, amidation, the formation of known protective / blocking groups, proteolytic cleavage, attachment to a cell ligand or other protein, etc. Covalent attachment does not interfere with the development of an anti-idiotypic antibody response. Such modifications can be carried out by known methods, including, but not limited to, specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, etc. In addition, modified antibodies may contain one or more unusual amino acids.
Функциональные эквиваленты могут быть получены путем замены различных участков СЭВ на разных цепях в различных каркасах. Так, например, для данного набора СЭВ возможны разные классы антител при замене различных тяжелых цепей, при этом, к примеру, можно получить антитела типа 1дС1-4, 1дМ, 1дА1-2, Ι§Ό, 1дЕ и их изотипов. Также в рамках настоящего изобретения искусственные антитела могут быть получены встраиванием данного набора СЭВ в полностью синтетический каркас.Functional equivalents can be obtained by replacing different sections of CMEA on different chains in different frameworks. So, for example, for this set of CMEA different classes of antibodies are possible when replacing different heavy chains, while, for example, antibodies such as 1dC1-4, 1dM, 1dA1-2, Ι§Ι, 1de and their isotypes can be obtained. Also in the framework of the present invention, artificial antibodies can be obtained by embedding this set of CMEA in a fully synthetic framework.
Функциональные эквиваленты можно легко получить при помощи мутации, делении и/или вставки в пределах вариабельной и/или константной области последовательности, обрамляющей определенный набор СЭВ, используя широкий спектр методов, известных в данной области.Functional equivalents can easily be obtained by mutation, division and / or insertion within the variable and / or constant region of a sequence framing a specific set of CMEA using a wide variety of methods known in the art.
Фрагменты антител и функциональные эквиваленты по настоящему изобретению охватывают такие молекулы, которые обладают заметной степенью связывания с СА6 по сравнению с антителом Ό86. ЗаAntibody fragments and functional equivalents of the present invention encompass molecules that exhibit a noticeable degree of binding to CA6 compared to antibody Ό86. Per
- 13 020130 метная степень связывания включает все значения в интервале как минимум 10-100%, предпочтительно по меньшей мере 50, 60 или 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99% от связывающей способности мышиного антитела Ό86 к СА6.- 13 020130 an estimated degree of binding includes all values in the range of at least 10-100%, preferably at least 50, 60 or 70%, more preferably at least 75, 80, 85, 90, 95 or 99% of the mouse binding capacity antibodies Ό86 to CA6.
Усовершенствованные антителаEnhanced Antibodies
Участки СЭК имеют первостепенное значение для распознавания эпитопа и связывания антитела. Тем не менее, можно произвести изменения в остатках, входящих в состав СОК, без ухудшения способности антитела к распознаванию и связыванию со своим эпитопом. Например, можно произвести изменения, не влияющие на распознавание эпитопа, но повышающие сродство антитела к эпитопу.SEC sites are of primary importance for epitope recognition and antibody binding. Nevertheless, it is possible to make changes in the residues that make up the RNS without impairing the ability of the antibody to recognize and bind to its epitope. For example, you can make changes that do not affect the recognition of the epitope, but increase the affinity of antibodies to the epitope.
Так, в рамки настоящего изобретения также включены и усовершенствованные варианты мышиных и гуманизованных антител, которые тоже специфически распознают и связываются с СА6, предпочтительно с повышенной аффинностью.Thus, improved mouse and humanized antibodies that also specifically recognize and bind to CA6, preferably with increased affinity, are also included in the scope of the present invention.
В нескольких исследованиях изучались эффекты введения одной или нескольких замен аминокислот в различных положениях последовательности антитела, исходя из первичной последовательности антитела, на такие его свойства, как связывание и уровень экспрессии (Уапд ^.Р. е! а1., 1995, 1. Μοί. В1ο1., 254, 392-403; Набег С е! а1., 1998, Ргос. Ыаб. Асаб. 8οΐ. И8А, 95, 8910-8915; УаидЬап Т.1. е! а1., 1998, Ма1иге Вю!есЬпо1оду, 16, 535-539).Several studies have examined the effects of administering one or more amino acid substitutions at different positions of an antibody sequence, based on the primary sequence of an antibody, on its properties such as binding and expression level (Wapd ^ .P. B1ο1., 254, 392-403; Raid C e! A1., 1998, Proc. Yab. Asab. 8o. I8A, 95, 8910-8915; Waidap T.1. E! A1., 1998, Maigee Vu! Esbpododu , 16, 535-539).
В этих исследованиях создавались эквиваленты первичного антитела путем изменения последовательностей генов тяжелой и легкой цепи в районе СЭК1. СЭК2. СЭК3 или каркасной области, используя такие методы, как направленный мутагенез с помощью олигонуклеотидов, кассетный мутагенез, подверженная ошибкам реакция ПЦР, перетасовка ДНК или штаммы-мутаторы Е. сой (УаидЬап Т.1. е! а1., 1998, Ыа1иге Вю!есЬпо1оду, 16, 535-539; Абеу Ν.Β. е! а1., 1996, СЬар!ег 16, рр. 277-291, ίη РЬаде Э1кр1ау οί Рерйбек апб Рго!е1пк, Ебк. Кау В.К. е! а1., Асабешю Ргекк). Эти методы изменения последовательности первичного антитела привели к улучшению аффинности вторичных антител (Стат Н. е! а1., 1992, Ргос. №!1. Асаб. 8οΐ. И8А, 89, 3576-3580; Вобег Е.Т. е! а1., 2000, Ргос. №б. Асаб. 8сг И8А, 97, 10701-10705; Эау1ек 1. апб КтесЬтапп Ь., 1996, 1ттипо!есЬпо1оду, 2, 169-179; ТЬотркоп 1. е! а1., 1996, 1. Мо1. Вю1., 256, 77-88; 8Ьой М.К. е! а1., 2002, 1. Вю1. СЬет., 277, 16365-16370; Еигиката К. е! а1., 2001, 1. Вю1. СЬет., 276, 27622-27628).In these studies, equivalents of the primary antibody were created by changing the sequences of the heavy and light chain genes in the region of CEC1. SEC2. SEC3 or skeleton region using methods such as directed mutagenesis using oligonucleotides, cassette mutagenesis, error-prone PCR reaction, DNA shuffling, or mutant strains E. soi (Waidap T.1. E! A1., 1998, Ba1ige Vu! Esbodoododu , 16, 535-539; Abeu Ν.Β. e! A1., 1996, Сар! Ег 16, pp. 277-291, ίη Рёде Э1кр1ау οί Рерийбек apb Рго! Е1пк, Ебк. Kau V.K. е! А1 ., Asabeshu Rgekk). These methods of changing the sequence of the primary antibody led to an improvement in the affinity of secondary antibodies (Stat N. e! A1., 1992, Proc. No. 1. Asab. 8οΐ. I8A, 89, 3576-3580; Vobeg E.T. e! A1. , 2000, Proc. No. Asab. 8sg I8A, 97, 10701-10705; Eau1ek 1. apb Ktestapp b., 1996, 1type! Esbpoodu, 2, 169-179; Thotkop 1. e! A1., 1996, 1 .Mo1. Vu1., 256, 77-88; 8Loy M.K. e! A1., 2002, 1. Vu1. Szet., 277, 16365-16370; Eigikata K. e! A1., 2001, 1. Vy1 .Set., 276, 27622-27628).
При аналогичной стратегии направленного изменения одного или нескольких аминокислотных остатков антитела можно использовать описанные в настоящем изобретении последовательности антител для разработки антител к СА6 с улучшенными функциями, включая увеличение аффинности к СА6.With a similar strategy for the directed change of one or more amino acid residues of an antibody, the antibody sequences described in the present invention can be used to develop anti-CA6 antibodies with improved functions, including an increase in CA6 affinity.
К усовершенствованным антителам также относятся антитела, обладающие улучшенными характеристиками, которые получены стандартными методами иммунизации животных, получения гибридомы и отбора антител с определенными характеристиками.Enhanced antibodies also include antibodies with improved characteristics, which are obtained by standard methods of immunizing animals, obtaining hybridomas and selecting antibodies with specific characteristics.
Цитотоксические агентыCytotoxic agents
Цитотоксическим агентом в цитотоксическом конъюгате настоящего изобретения может быть любое соединение, вызывающее гибель клетки или клеточную смерть либо тем или иным образом снижающее жизнеспособность клетки. Предпочтительными цитотоксическими агентами являются, к примеру, майтансиноиды и аналоги майтансиноидов, таксоиды, СС-1065 и аналоги СС-1065, доластатин и аналоги доластатина, определенные ниже. Эти цитотоксические агенты подвергаются конъюгированию с антителами, фрагментами антител, функциональными эквивалентами, усовершенствованными антителами и их аналогами, как изложено в настоящем изобретении.The cytotoxic agent in the cytotoxic conjugate of the present invention can be any compound that causes cell death or cell death, or in one way or another reduces cell viability. Preferred cytotoxic agents are, for example, maytansinoids and maytansinoid analogues, taxoids, SS-1065 and analogues of SS-1065, dolastatin and dolastatin analogues, as defined below. These cytotoxic agents are conjugated to antibodies, antibody fragments, functional equivalents, advanced antibodies and their analogs, as set forth in the present invention.
Цитотоксические конъюгаты могут быть получены методами ш νίΙΐΌ. Для того чтобы соединить лекарственный препарат или пролекарство с антителом, используется соединительная группа. Подходящие соединительные группы хорошо известны в данной области и включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, подверженные пептидазам группы и подверженные эстеразам группы. Предпочтительными соединительными группами являются дисульфидные группы и тиоэфирные группы. Например, можно конструировать конъюгаты при помощи реакции обмена дисульфидов или образования тиоэфирной связи между антителом и препаратом или пролекарством.Cytotoxic conjugates can be obtained by methods w νίΙΐΌ. In order to combine a drug or prodrug with an antibody, a linking group is used. Suitable connecting groups are well known in the art and include disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, photolab groups, peptidase-prone groups and esterase-prone groups. Preferred connecting groups are disulfide groups and thioether groups. For example, conjugates can be constructed using a disulfide exchange reaction or the formation of a thioether linkage between an antibody and a drug or prodrug.
МайтансиноидыMaytansinoids
В число цитотоксических агентов, которые можно использовать в настоящем изобретении для образования цитотоксических конъюгатов, входят майтансиноиды и аналоги майтансиноидов. Примеры подходящих майтансиноидов включают майтансинол и аналоги майтансинола. Майтансиноиды представляют собой вещества, ингибирующие образование микротрубочек, которые сильно токсичны для клеток млекопитающих.Cytotoxic agents that can be used in the present invention to form cytotoxic conjugates include maytansinoids and maytansinoid analogues. Examples of suitable maytansinoids include maytansinol and maytansinol analogs. Maytansinoids are microtubule-inhibiting substances that are highly toxic to mammalian cells.
Примеры подходящих аналогов майтансинола включают аналоги с модифицированным ароматическим кольцом и аналоги с модификациями по другим положениям. Такие подходящие майтансиноиды раскрыты в И8 Ра!еп! Ν(Κ. 4424219, 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4331598, 4361650, 4362663,4364866,4450254,4322348,4371533,6333410,5475092,5585499 и 5846545.Examples of suitable maytansinol analogs include those with a modified aromatic ring and analogues with modifications to other positions. Such suitable maytansinoids are disclosed in I8 Ra! Ep! Ν (Κ. 4424219, 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4331598, 4361650, 4362663.4364866,4450254,4322348,4371533,6333410,5475092,5585499 and 5846545.
Конкретные примеры подходящих аналогов майтансинола с модифицированным ароматическим кольцом включают:Specific examples of suitable aromatic ring-modified maytansinol analogs include:
(1) С-19-дехлоро (И8 Ра!. №. 4256746) (получают восстановлением ансамитоцина Р2 с помощью(1) C-19-dechloro (I8 Ra !. No. 4256746) (obtained by restoring ansamitocin P2 using
- 14 020130- 14 020130
БАН);BAN);
(2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил) +/- С-19-дехлоро (И8 Ра1. Νοβ. 4361650 и 4307016) (получают деметилированием с помощью 81гер1отусев или АеОпотуесв либо дехлорированием с помощью ЬАН) и (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОЯ), +/- С-19-дехлоро (И8 Ра1. Νο. 4294757) (получают ацилированием с помощью хлорангидридов).(2) C-20-hydroxy (or C-20-demethyl) +/- C-19-dechloro (I8 Pa1. Βοβ. 4361650 and 4307016) (obtained by demethylation with 81 geri or AeOpotes or dechlorination with LAN) and ( 3) C-20-demethoxy, C-20-acyloxy (-OSA), +/- C-19-dechloro (I8 Ra1. 42ο. 4294757) (obtained by acylation with acid chlorides).
Конкретные примеры подходящих аналогов майтансинола с модификациями по другим положениям включают:Specific examples of suitable maytansinol analogues with modifications to other provisions include:
(1) С-9-8Н (И8. Ра1. Νο. 4424219) (получают при реакции майтансинола с Н28 или Р285);(1) C-9-8H (I8. Ra1. 44ο. 4424219) (obtained by the reaction of maytansinol with H 2 8 or P 2 8 5 );
(2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СН2ОЯ) (И.8. Ра1. Νο. 4331598);(2) C-14-alkoxymethyl (demethoxy / CH 2 OH) (I.8. Pa1. Νο. 4331598);
(3) С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (СН2ОН или СН2ОАс) (И8 Ра1. Νο. 4450254) (получают из №сагб1а);(3) C-14-hydroxymethyl or acyloxymethyl (CH 2 OH or CH 2 OAc) (I8 Pa1. Νο. 4450254) (obtained from Sagb1a);
(4) С-15-гидрокси/ацилокси (И8. Ра1. Νο. 4,364,866) (получают при превращении майтансинола с помощью ЕНгерЮтусев);(4) C-15-hydroxy / acyloxy (I8. Pa1. Νο. 4,364,866) (obtained by the conversion of maytansinol with ENHerutusev);
(5) С-15-метокси (И8 Ра1. Νοβ. 4313946 и 4315929) (выделяют из Тге\\!а ηιιάίΠοη);(5) C-15-methoxy (I8 Pa1. Νοβ. 4313946 and 4315929) (isolated from Tg \\! And ηιιάίΠοη);
(6) С-18-Ы-деметил (И8 Ра1. Νοβ. 4362663 и 4322348) (получают деметилированием майтансинола с помощью ЕНгерЮтусев); и (7) 4,5-дезокси (И8. Ра1. Νο. 4371533) (получают восстановлением майтансинола с помощью трихлорида титана/ЬАН).(6) С-18-Ы-demethyl (I8 Ra1. Νοβ. 4362663 and 4322348) (obtained by demethylation of maytansinol with the help of Engerutsev); and (7) 4,5-deoxy (I8. Pa1. Νο. 4371533) (obtained by reduction of maytansinol with titanium trichloride / LAN).
В предпочтительном воплощении в качестве цитотоксического агента цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения используют тиол-содержащий майтансиноид ΌΜ1, формально именуемый Ν2деацетил-Н2-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансином. ΌΜ1 представлен следующей структурной формулой I:In a preferred embodiment, the thiol-containing maytansinoid ΌΜ 1, formally referred to as Ν 2 deacetyl-H 2 - (3-mercapto-1-oxopropyl) maytansine, is used as the cytotoxic agent of the cytotoxic conjugates of the present invention. ΌΜ1 is represented by the following structural formula I:
В другом предпочтительном воплощении в качестве цитотоксического агента цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения используют тиол-содержащий майтансиноид Ν2-деацетил-Ν2-(4метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансин. ΌΜ4 представлен следующей структурной формулой II:In another preferred embodiment, the thiol-containing maytansinoid Ν 2- deacetyl-Ν 2 - (4-methyl-4-mercapto-1-oxopentyl) maytansine is used as the cytotoxic agent of the cytotoxic conjugates of the present invention. ΌΜ4 is represented by the following structural formula II:
В следующих воплощениях изобретения могут использоваться другие майтансины, в том числе тиол- и дисульфид-содержащие майтансиноиды, несущие моно- или диалкильное замещение на атоме углерода, несущем атом серы. К ним относятся майтансиноиды, содержащие в положении С-3, С-14гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь ацилированной аминокислоты с ацильной группой, несущей блокированную сульфгидрильную группу, причем атом углерода ацильной группы, несущей функциональную группу тиола, содержит один или два заместителя, которыми являются СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом одним из заместителей может быть Н, а ацильная группа имеет линейную цепь длиной по меньшей мере в три атома углерода между функциональной группой карбонила и атомом серы.In further embodiments of the invention, other maytansines may be used, including thiol and disulfide-containing maytansinoids bearing a mono- or dialkyl substitution on a carbon atom carrying a sulfur atom. These include maytansinoids containing at position C-3, C-14 hydroxymethyl, C-15-hydroxy or C-20-desmethyl the side chain of an acylated amino acid with an acyl group bearing a blocked sulfhydryl group, the carbon atom of an acyl group carrying a thiol functional group contains one or two substituents, which are CH 3 , C 2 H 5 , linear or branched alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or heterocycle aromatic or heterocyclic radical, one of the substituents may be H, and the acyl group has a linear chain with a length of at least three carbon atoms between the carbonyl functional group and the sulfur atom.
К таким дополнительным майтансинам относятся соединения, представленные формулой IIISuch additional maytansins include compounds represented by formula III
- 15 020130- 15 020130
где Υ' означает (С1П№-(С1СС1Б)Х С ЛоЦЗии...1).(СН СН-2НС С).В.(СН;1С)..СН· №8/. гдеwhere Υ 'means (С1П№- (С1СС1Б) Х С ЛОЦзии ... 1). (СН СН-2НС С) .В. (СН ; 1С) .. СН · No. 8 /. Where
К! и Κ2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероцикический радикал, при этом Κ2 может означать Н;TO! and Κ 2 independently of one another means CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or heterocyclic an aromatic or heterocyclic radical, wherein Κ 2 may mean H;
А, В, Ό означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;A, B, Ό mean cycloalkyl or cycloalkenyl containing 3-10 carbon atoms, simple or substituted aryl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7, Κ8, Κ9, Κ10, 1ц и К.|2 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;Κ 3 , Κ 4 , Κ 5 , Κ 6 , Κ 7 , Κ 8 , Κ 9 , Κ 10 , 1c and K. | 2 independently represent H, CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
1, т, η, о, р, с.|, г, 8, ΐ и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно; и1, t, η, o, p, s. |, R, 8, ΐ and and independently from each other mean 0 or an integer from 1 to 5, provided that at least two of them are not equal to 0 at the same time; and
Ζ означает Н, 8Κ или -СОК, где К означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал.Ζ means H, 8Κ or -COK, where K is linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, simple or substituted aryl, or heterocyclic aromatic or heterocyclic radical .
Предпочтительные воплощения формулы III включают соединения формулы III, у которыхPreferred embodiments of formula III include compounds of formula III in which
Κι означает метил, К2 означает Н, а Ζ означает Н;Κι means methyl, K 2 means H, and Ζ means H;
Κι и К2 означают метил, а Ζ означает Н;Κι and K 2 mean methyl, and Ζ means H;
Κι означает метил, К2 означает Н, а Ζ означает -8СН3;Κι means methyl, K 2 means H, and Ζ means -8CH 3 ;
Κι и К2 означают метил, а Ζ означает -8СН3.Κι and K 2 mean methyl, and Ζ means -8CH 3 .
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой БУ-Ь, IVΌ или БУ-Ό, Б:Such additional maytansins also include compounds represented by the formula BU-b, IVΌ or BU-Ό, B:
(ΐν-Ь) (ΐν-ϋ) (ΐν-οχ) где Υ означает (ΟΚ7Κ8)1(ΟΚ5Κ6^(ΟΚ3Κ4)ηΟΚ1Κ28Ζ, где(ΐν-b) (ΐν-ϋ) (ΐν-οχ) where Υ means (ΟΚ 7 Κ 8 ) 1 (ΟΚ5Κ 6 ^ (ΟΚ 3 Κ 4 ) η ΟΚ 1 Κ28Ζ, where
К! и Κ2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом Κ2 может означать Н;TO! and Κ 2 independently of one another means CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or heterocyclic an aromatic or heterocyclic radical, wherein Κ 2 may mean H;
Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;Κ 3 , Κ 4 , Κ 5 , Κ 6 , Κ 7, and Κ 8 are independently H, CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl, or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0;1, m and η independently from each other mean an integer from 1 to 5, while η can mean 0;
Ζ означает Н, 8Κ или -СОЕ, где Κ означает линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал; иΖ means H, 8Κ or -COE, where Κ means a linear or branched alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, simple or substituted aryl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical ; and
Μау означает майтансиноид, несущий в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь.Μau means a maytansinoid bearing at the position of C-3, C-14-hydroxymethyl, C-15-hydroxy or C-20-desmethyl side chain.
Предпочтительные воплощения формул ЕУ-Ь, ЕУ-Э и ^-Э, Ь включают соединения формул ЕУ-Ь, ЕУ-Э и у которыхPreferred embodiments of the formulas EU-b, EU-E and ^ -E, b include compounds of the formulas EU-b, EU-E and in which
Κι означает метил, Κ2 означает Н, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;Κι means methyl, Κ 2 means H, Κ 5 , Κ 6 , Κ 7 and Κ 8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ means H;
Κ1 и Κ2 означают метил, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;Κ1 and Κ2 mean methyl, Κ5, Κ6, Κ7 and Κ8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ means H;
Κ1 означает метил, Κ2 означает Н, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а ΖΚ1 means methyl, Κ2 means H, Κ5, Κ6, Κ7 and Κ8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ
- 16 020130 означает -8СН3;- 16 020130 means -8CH 3 ;
Κι и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает 8СН3.Κι and K 2 mean methyl, K 5 , K 6 , K 7 and K 8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ means 8CH3.
Предпочтительно цитотоксический агент представлен формулой 1У-Ь.Preferably, the cytotoxic agent is represented by formula 1U-b.
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой VSuch additional maytansins also include compounds represented by formula V
где Υ означает ^ΚγΚ^/Ο^ΚΟ^ΟΚβΚ^ΟΚιΚ^Ζ, гдеwhere Υ means ^ ΚγΚ ^ / Ο ^ ΚΟ ^ ΟΚβΚ ^ ΟΚιΚ ^ Ζ, where
Κι и К2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом К2 может означать Н;Κι and K 2 independently from each other mean CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical, wherein K 2 may be H;
К3, К4, К5, К6, К7 и К8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;K 3 , K 4 , K 5 , K 6 , K 7, and K 8 are independently H, CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl, or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0; и1, m and η independently from each other mean an integer from 1 to 5, while η can mean 0; and
Ζ означает Н, 8К или -СОК, где К означает линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал.Ζ means H, 8K or —COK, where K is a linear or branched alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, simple or substituted aryl or heterocyclic aromatic or heterocyclic radical.
Предпочтительные воплощения формулы V включают соединения формулы V, у которыхPreferred embodiments of formula V include compounds of formula V in which
К| означает метил, К2 означает Н, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;To | means methyl, K 2 means H, K 5 , K 6 , K 7 and K 8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ means H;
В1 и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;In 1 and K 2 mean methyl, K 5 , K 6 , K 7 and K 8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ means H;
К1 означает метил, К2 означает Н, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает -8СН3;K 1 means methyl, K 2 means H, K 5 , K 6 , K 7 and K 8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ means -8CH3;
К1 и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает 8СН3.K1 and K 2 mean methyl, K 5 , K 6 , K 7 and K 8 independently mean H, 1 and m are 1, η = 0, and Ζ means 8CH3.
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой VIБ, ^-0 или ^-0^:Such additional maytansins also include compounds represented by the formula VIB, ^ -0 or ^ -0 ^:
(У1-Б) (νΐ-ϋ) (νΐ-ϋ, Б) где Υ2 означает (СΚ7Κ8)1(СΚ5Κ6)т(СΚ3Κ4)ηСΚ1Κ28Ζ2, где(U1-B) (νΐ-ϋ) (νΐ-ϋ, B) where Υ 2 means (СΚ 7 Κ 8 ) 1 (СΚ 5 Κ 6 ) t (СΚ 3 Κ 4 ) ηСΚ1Κ 2 8Ζ 2 , where
К1 и К2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом К2 может означать Н;K1 and K2 independently of one another mean CH3, C2H5, linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical , while K2 may mean H;
К3, К4, К5, К6, К7 и К8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;K3, K4, K5, K6, K7 and K8 independently mean H, CH3, C2H5, linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0;1, m and η independently from each other mean an integer from 1 to 5, while η can mean 0;
Ζ2 означает 8К или -СОК, где К означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклическийΖ 2 is 8K or —COK, where K is linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, simple or substituted aryl, or heterocyclic aromatic or heterocyclic
- 17 020130 радикал; и- 17 020130 radical; and
Мау означает майтансиноид.Mau means maytansinoid.
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой VIISuch additional maytansins also include compounds represented by formula VII
где Υ2' означает (С1ии-(СВ.СкМС С)ЛКЗи<2т|)(СВ СВ-;).(С С).В.(СВ;1С)..СВ-В;8/;.where Υ 2 'means (S1ii- (SV.SkMS S) LKZi <2m |) (SV SV- ; ). (С С) .V. (SV ; 1C) .. SV-V; 8 / ; .
гдеWhere
В1 и В2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом В2 может означать Н;B1 and B 2, independently of one another, are CH 3 , C 2 H 5 , linear or branched alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical, wherein B2 may be H;
А, В и Ό независимо друг от друга означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;A, B and Ό independently from each other mean cycloalkyl or cycloalkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, simple or substituted aryl or heterocyclic aromatic or heterocycloalkyl radical;
В3, В4, В5, В6, В7, В8, В9, В10, Вп и В12 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;B 3 , B 4 , B 5 , B 6 , B 7 , B 8 , B 9 , B 10 , B p and B 12 independently mean H, CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
1, т, и, о, р, с.|. г, 8, ! и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно; и1, t, u, o, p, s. |. g, 8,! and and independently of one another, they mean 0 or an integer from 1 to 5, provided that at least two of them are not equal to 0 at the same time; and
Ζ2 означает 8В или -СОВ, где В означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал.Ζ 2 means 8B or —COW, where B means linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, simple or substituted aryl, or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical.
Предпочтительные воплощения формулы VII включают соединения формулы VII, у которых В! означает метил, а В2 означает Н.Preferred embodiments of formula VII include compounds of formula VII in which B! means methyl, and B 2 means N.
Вышеприведенные майтансиноиды могут быть конъюгированы с антителом Ό86 к СА6 либо его гомологом или фрагментом, причем антитело соединяется с майтансиноидом с помощью функциональной группы тиола или дисульфида, которая находится на ацильной группе боковой цепи ацилированной аминокислоты, находящейся в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила майтансиноида, причем ацильная группа боковой цепи ацилированной аминокислоты содержит функциональную группу тиола или дисульфида, которая находится на атоме углерода, содержащем один или два заместителя, которыми являются СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом одним из заместителей может быть Н, а ацильная группа имеет линейную цепь длиной, по меньшей мере, в три атома углерода между функциональной группой карбонила и атомом серы.The above maytansinoids can be conjugated with antibody Ό86 to CA6 or its homologue or fragment, the antibody being coupled to the maytansinoid using a thiol or disulfide functional group located on the acyl group of the acylated amino acid side chain at position C-3, C-14- hydroxymethyl, C-15-hydroxy or C-20-desmethyl maytansinoid, wherein the acyl group of the acylated amino acid side chain contains a thiol or disulfide functional group, which is located on the carbon atom, soda rusting one or two substituents, which are CH3, C2H5, linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical , one of the substituents may be H, and the acyl group has a linear chain with a length of at least three carbon atoms between the carbonyl functional group and the sulfur atom.
Предпочтительным конъюгатом настоящего изобретения является конъюгат, включающий антитело Ό86 к СА6 либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с майтансиноидом формулы VIIIA preferred conjugate of the present invention is a conjugate comprising an anti-CA6 antibody Ό86 or a homologue thereof or fragment conjugated to a maytansinoid of formula VIII
- 18 020130- 18 020130
где Υ1· означает (СЯ7Я8)1(СЯ9=Я10)р(С=С),А<)(СЯ5Я6)тОи(СЯ11=СЯ12)г(С=С)8В1(СЯ3Я4)пСЯ1Я28-, гдеwhere Υ1 · means (СЯ7Я 8 ) 1 (СЯ 9 = Я10) р (С = С), А <) (СЯ 5 Я6) ТОи (СЯ11 = СЯ1 2 ) г (С = С) 8 В 1 (СЯ3Я4) сСЯ1Я 2 8-, where
А, В и Ό независимо друг от друга означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;A, B and Ό independently from each other mean cycloalkyl or cycloalkenyl containing 3-10 carbon atoms, simple or substituted aryl or heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
Я3, Я4, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Я10, Яп и Я12 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал; иI 3 , I 4 , I 5 , I 6 , I 7 , I 8 , I 9 , I 10 , Ja and I 1 2 independently of one another mean H, CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl, containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical; and
1, т, п, о, р, с.|. г, β, ΐ и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно.1, t, n, o, p, s. |. g, β, ΐ and and independently from each other mean 0 or an integer from 1 to 5, provided that at least two of them are not equal to 0 at the same time.
Предпочтительно Я! означаетметил, а Я2 означает Н, либо Я! и Я2 означают метил.Preferably Me! means methyl, and I 2 means H, or I! and I 2 mean methyl.
Еще более предпочтительным конъюгатом настоящего изобретения является конъюгат, включающий антитело Ό86 к СА6 либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с майтансиноидом формулы ГС-Ь, IX-!) или ΕΧ-ϋ,Ε:An even more preferred conjugate of the present invention is a conjugate comprising an anti-CA6 antibody Ό86 or a homologue thereof or fragment conjugated to a maytansinoid of the formula HS-b, IX-!) Or ΕΧ-ϋ, Ε:
ΙΧ-Ь ΙΧ-ϋ 1Х-Э,Ь где Υ1 означает (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)пСЯ1Я2Е-, гдеΙΧ-b ΙΧ-ϋ 1X-E, b where Υ 1 means (CJ 7 I 8 ) 1 (CJ 5 I 6 ) t (CJ 3 I 4 ) n CJ 1 I 2 E-, where
Я1 и Я2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом Я2 может означать Н;I 1 and I 2, independently of one another denote CH 3, C 2 H 5, linear alkyl or alkenyl having from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl or alkenyl having from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical, wherein I 2 may be H;
Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;I 3 , I 4 , I 5 , I 6 , I 7 and I 8 independently mean H, CH 3 , C 2 H 5 , linear alkyl or alkenyl containing from 1 to 10 carbon atoms, branched or cyclic alkyl, or alkenyl containing from 3 to 10 carbon atoms, phenyl, substituted phenyl or a heterocyclic aromatic or heterocyclic radical;
1, т и п независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом п может означать 0; и1, m and n independently of each other mean an integer from 1 to 5, while n may mean 0; and
Мау означает майтансиноид, несущий в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь.Mau means a maytansinoid bearing at the C-3, C-14-hydroxymethyl, C-15-hydroxy or C-20-desmethyl position a side chain.
Предпочтительные воплощения формул Ш-Ь, Ш-Э и ГХ-ЭД включают соединения формул ГХ-Ь, ΣΧ-Ό и ГХ-ЭД, у которых:Preferred embodiments of the formulas SH-L, SH-E and GC-ED include compounds of the formulas GC-L, ΣΧ-Ό and GC-ED, in which:
Я1 означает метил, а Я2 означает Н, либо Я1 и Я2 означают метил;I 1 means methyl, and I 2 means H, or I 1 and I 2 mean methyl;
Я! означает метил, Я2 означает Н, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, т = 0;I! means methyl, I 2 means H, I 5 , I 6 , I 7 and I 8 independently mean H, 1 and m are 1, m = 0;
Я1 и Я2 означают метил, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п =0.H1 and H2 are methyl, I 5, I 6, I 7 and I 8 independently represent H, 1 and m are 1, n = 0.
Предпочтительно цитотоксический агент представлен формулой Ш-Ь.Preferably, the cytotoxic agent is represented by the formula III.
Еще одним предпочтительным конъюгатом настоящего изобретения является конъюгат, включающий антитело Ό86 к СА6 либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с майтансиноидом формулы XAnother preferred conjugate of the present invention is a conjugate comprising an anti-CA6 antibody Ό86 or a homologue thereof or fragment conjugated to a maytansinoid of formula X
- 19 020130- 19 020130
где заместители соответствуют определениям для приведенной выше формулы IX. Особенно предпочтительны любые из вышеописанных соединений, у которых К; означает Н, К2 - метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, а п = 0.where the substituents correspond to the definitions for the above formula IX. Particularly preferred are any of the above compounds in which K; means H, K 2 - methyl, K 5 , K 6 , K 7 and K 8 independently mean H, 1 and m are equal to 1, and n = 0.
Еще более предпочтительны любые из вышеописанных соединений, у которых К; и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, а п = 0.Even more preferred are any of the above compounds in which K; and K 2 mean methyl, K5, K6, K7 and K8 independently mean H, 1 and m are equal to 1, and n = 0.
Кроме того, предпочтительны Ь-аминоацильные стереоизомеры.In addition, b-aminoacyl stereoisomers are preferred.
В цитотоксических конъюгатах настоящего изобретения могут использоваться все майтансиноиды, приведенные в находящейся на рассмотрении патентной заявке США № 10/849,136 от 20 мая 2004 г. Все содержание патентной заявки США № 10/849,136 включено в настоящее изобретение путем отсылки.In the cytotoxic conjugates of the present invention, all maytansinoids described in pending US Patent Application No. 10 / 849,136 of May 20, 2004 can be used. The entire contents of US Patent Application No. 10 / 849,136 are incorporated herein by reference.
Дисульфид-содержащие соединительные группыDisulfide-containing connecting groups
Для соединения майтансиноида с агентом, связывающим клетку, типа антитела Ό86 майтансиноид должен включать соединительную часть. Соединительная часть содержит химическую связь, позволяющую высвобождение полностью активных майтансиноидов в определенном месте. Подходящие химические связи хорошо известны в данной области и включают дисульфидные связи, кислотолабильные связи, фотолабильные связи, подверженные пептидазам связи и подверженные эстеразам связи. Предпочтительными являются дисульфидные связи.To connect a maytansinoid with a cell binding agent, such as an Ό86 antibody, the maytansinoid must include a connecting part. The connecting part contains a chemical bond, allowing the release of fully active maytansinoids in a specific place. Suitable chemical bonds are well known in the art and include disulfide bonds, acid labile bonds, photolabile bonds, susceptible peptidases, and susceptible esterases. Disulfide bonds are preferred.
Соединительная часть также включает реакционно-способную химическую группу. В предпочтительном воплощении реакционно-способная химическая группа может быть ковалентно связана с майтансиноидом через дисульфидную связь соединительной части.The connecting part also includes a reactive chemical group. In a preferred embodiment, the reactive chemical group may be covalently linked to maytansinoid via a disulfide bond of the connecting part.
Особенно предпочтительными реакционно-способными химическими группами являются Νсукцинимидиловые эфиры и Ν-сульфосукцинимидиловые эфиры.Particularly preferred reactive chemical groups are Ν-succinimidyl ethers and Ν-sulfosuccinimidyl ethers.
Особенно предпочтительными майтансиноидами, включающими соединительную часть, содержащую реакционно-способную химическую группу, являются С-3-эфиры майтансинола и его аналогов, у которых соединительная часть содержит дисульфидную связь, а химическая реакционно-способная группа включает Ν-сукцинимидиловый эфир или Ν-сульфосукцинимидиловый эфир.Particularly preferred maytansinoids comprising a connecting part containing a reactive chemical group are C-3 esters of maytansinol and its analogues, in which the connecting part contains a disulfide bond and the chemical reactive group includes Ν-succinimidyl ether or Ν-sulfosuccinimidyl ether .
Многие положения на майтансиноидах могут служить для химической связи с соединительной частью. Например, следует ожидать, что будут полезными положение С-3, содержащее гидроксильную группу, положение С-14, модифицированное гидроксиметилом, положение С-15, модифицированное гидроксилом, и положение С-20, содержащее гидроксильную группу. Однако предпочтительным является положение С-3, а особенно предпочтительным является положение С-3 майтансинола.Many positions on maytansinoids can serve as a chemical bond with the connecting part. For example, it would be expected that the C-3 position containing the hydroxyl group, the C-14 position modified with hydroxymethyl, the C-15 position modified with hydroxyl, and the C-20 position containing the hydroxyl group would be useful. However, the C-3 position is preferred, and the C-3 position of maytansinol is particularly preferred.
Несмотря на то, что синтез эфиров майтансинола, содержащих соединительную часть, описан в отношении соединительных частей, содержащих дисульфидную связь, специалисты в этой области должны понимать, что в настоящем изобретении можно использовать соединительные части и с другими химическими связями (как описано выше), а также и другие майтансиноиды. Конкретные примеры других химических связей включают кислотолабильные связи, фотолабильные связи, подверженные пептидазам связи и подверженные эстеразам связи. Содержание патента США № 5208020, включенного в настоящее изобретение, предусматривает получение майтансиноидов, несущих такие связи.Despite the fact that the synthesis of maytansinol esters containing a connecting part is described with respect to connecting parts containing a disulfide bond, specialists in this field should understand that in the present invention, connecting parts with other chemical bonds can also be used (as described above), and also other maytansinoids. Specific examples of other chemical bonds include acid labile bonds, photolabile bonds susceptible to peptidase bonds and susceptible to esterase bonds. The contents of US patent No. 5208020 included in the present invention, provides for maytansinoids bearing such bonds.
Синтез майтансиноидов и их производных, содержащих дисульфидную часть, несущую реакционно-способную группу, описан в патентах США № 6441163 и 6333410 и заявке США № 10/161651, которые включены в настоящее изобретение путем отсылки.The synthesis of maytansinoids and their derivatives containing a disulfide moiety bearing a reactive group is described in US Pat. Nos. 6,441,163 and 6,333,410 and US Application No. 10/161651, which are incorporated herein by reference.
Майтансиноиды, содержащие реакционно-способные группы, к примеру, ΌΜ1, подвергают реакции с антителом, к примеру, антителом Ό86, получая цитотоксические конъюгаты. Такие конъюгаты могут быть очищены методом НРЬС или гель-фильтрации.Maytansinoids containing reactive groups, for example, ΌΜ1, are reacted with an antibody, for example, Ό86, to obtain cytotoxic conjugates. Such conjugates can be purified by HPLC or gel filtration.
Некоторые отличные схемы получения таких конъюгатов антитело-майтансиноид представлены в патенте США № 6333410 и заявках США № 09/867598, 10/161,651 и 10/024,290, которые включены в настоящее изобретение во всей полноте.Some excellent schemes for the preparation of such antibody-maytansinoid conjugates are presented in US Pat. No. 6,333,410 and US Applications Nos. 09/867598, 10 / 161.651 and 10 / 024,290, which are incorporated herein by reference in their entirety.
В общем, раствор антитела в водном буфере можно проинкубировать с молярным избытком майтансиноидов, содержащих дисульфидную часть, несущую реакционно-способную группу. Реакционную смесь можно остановить добавлением избытка амина (к примеру, этаноламина, таурина и др.). ЗатемIn general, a solution of an antibody in an aqueous buffer can be incubated with a molar excess of maytansinoids containing a disulfide moiety carrying a reactive group. The reaction mixture can be stopped by adding an excess of amine (for example, ethanolamine, taurine, etc.). Then
- 20 020130 конъюгат майтансиноид-антитело можно очистить методом гель-фильтрации.- 20 020130 maytansinoid-antibody conjugate can be purified by gel filtration.
Число молекул майтансиноида, связанных с одной молекулой антитела, можно определить по спектрофотометрическому измерению соотношения поглощения при 252 нм и 280 нм. Предпочтительно в среднем 1-10 молекул майтансиноида на молекулу антитела.The number of maytansinoid molecules bound to one antibody molecule can be determined by spectrophotometric measurement of the absorption ratio at 252 nm and 280 nm. Preferably, an average of 1-10 maytansinoid molecules per antibody molecule.
Конъюгаты антител с препаратами майтансиноидов можно исследовать на их способность к подавлению пролиферации различных нежелательных линий клеток ίη νίίτο. Например, для оценки цитотоксичности этих соединений можно с легкостью использовать такие клеточные линии, как клетки эпидермоидной карциномы человека А-431, клетки мелкоклеточного рака легких человека 8ν2, клетки опухоли молочной железы человека 8КВК3 и клетки лимфомы Беркитта №ипа1\\а. Клетки для исследования можно подвергнуть воздействию соединений на 24 ч и измерить долю выживших клеток прямо в опыте известными методами. Затем из полученных результатов можно вычислить значения 1С50.Antibody conjugates with maytansinoid preparations can be tested for their ability to suppress the proliferation of various undesirable cell lines ίη νίίτο. For example, to assess the cytotoxicity of these compounds, cell lines such as human A-431 human epidermoid carcinoma cells, 8ν2 human small cell lung cancer cells, 8KVK3 human breast tumor cells, and Burkitt’s lymphoma cells No. 1a can easily be used. Cells for research can be exposed to compounds for 24 hours and measure the proportion of surviving cells directly in the experiment by known methods. Then, from the obtained results, 1C 50 values can be calculated.
ПЭГ-содержащие соединительные группыPEG-containing connecting groups
Майтансиноиды также можно соединить с агентами, связывающими клетку, с помощью ПЭГсодержащих соединительных групп, как изложено в заявке США № 10/024,290. Такие содержащие ПЭГ соединительные группы растворимы как в воде, так и в неводных растворителях, и могут быть использованы для соединения одного или нескольких цитотоксических агентов с агентом, связывающим клетку. Примеры ПЭГ-содержащих соединительных групп включают гетеробифункциональные линкеры на основе ПЭГ, которые связываются с цитотоксическими агентами и агентами, связывающими клетку, на противоположных концах линкеров через функциональную сульфгидрильную или дисульфидную группу на одном конце и активный эфир на другом конце.Maytansinoids can also be combined with cell binding agents using PEG-containing connecting groups, as set forth in US Application No. 10 / 024,290. Such PEG-containing coupling groups are soluble in both water and non-aqueous solvents, and can be used to couple one or more cytotoxic agents with a cell binding agent. Examples of PEG-containing linking groups include PEG-based heterobifunctional linkers that bind to cytotoxic and cell-binding agents at opposite ends of the linkers via a sulfhydryl or disulfide functional group at one end and an active ester at the other end.
В качестве общего примера синтеза цитотоксического конъюгата с помощью ПЭГ-содержащей соединительной группы можно опять привести заявку США № 10/024290 в отношении конкретных деталей. Синтез начинается с реакции одного или нескольких цитотоксических агентов, несущих реакционноспособную группировку ПЭГ, с агентом, связывающим клетку, что приводит к вытеснению концевого активного эфира из каждой реакционноспособной молекулы ПЭГ аминокислотным остатком агента, связывающего клетку, с образованием цитотоксического конъюгата, включающего один или несколько цитотоксических агентов, ковалентно связанных с агентом, связывающим клетку, через ПЭГ-содержащую соединительную группу.As a general example of the synthesis of a cytotoxic conjugate using a PEG-containing connecting group, US application No. 10/024290 can again be given regarding specific details. The synthesis begins with the reaction of one or more cytotoxic agents carrying a reactive PEG moiety with a cell binding agent, which leads to the displacement of the terminal active ester from each reactive PEG molecule by the amino acid residue of the cell binding agent, with the formation of a cytotoxic conjugate comprising one or more cytotoxic agents covalently linked to a cell binding agent via a PEG-containing connecting group.
ТаксаныTaxanes
Цитотоксическим агентом в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению также может быть таксан или его производное.The cytotoxic agent in the cytotoxic conjugates of the present invention may also be taxane or a derivative thereof.
Таксаны представляют собой семейство соединений, включающее паклитаксель (таксол), натуральный цитотоксический препарат, и доцетаксель (таксотер), его полусинтетическое производное, то есть два соединения, которые широко применяются при лечении рака. Таксаны являются ядами для митотического веретена, которые ингибируют деполимеризацию тубулина, что ведет к гибели клетки. Хотя доцетаксель и паклитаксель являются полезными средствами при лечении рака, однако их противораковая активность ограничена вследствие неспецифической токсичности в отношении нормальных клеток. Кроме того, соединения типа паклитакселя и доцетакселя сами по себе не являются достаточно сильнодействующими для использования в конъюгатах с агентами, связывающими клетку.Taxanes are a family of compounds, including paclitaxel (taxol), a natural cytotoxic drug, and docetaxel (taxotere), its semi-synthetic derivative, that is, two compounds that are widely used in the treatment of cancer. Taxanes are poisons for the mitotic spindle that inhibit tubulin depolymerization, which leads to cell death. Although docetaxel and paclitaxel are useful in treating cancer, their anticancer activity is limited due to non-specific toxicity to normal cells. In addition, compounds such as paclitaxel and docetaxel alone are not potent enough for use in conjugates with cell binding agents.
Предпочтительным таксаном для получения цитотоксических конъюгатов является таксан формулы XIA preferred taxane for preparing cytotoxic conjugates is a taxane of formula XI
Способы синтеза таксанов, пригодных для цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения, вместе с методами конъюгирования таксанов с агентами, связывающими клетку, типа антител, подробно описаны в патентах США № 5416064, 5475092, 6372738 и 6436931 и заявках США № 10/024290, 10/144042, 10/207814, 10/210112 и 10/369563.Methods of synthesizing taxanes suitable for the cytotoxic conjugates of the present invention, together with methods for conjugating taxanes with cell binding agents, such as antibodies, are described in detail in US Pat. Nos. 5,416,064, 5,475,092, 6,373,738 and 6,436,931 and US Pat. Nos. 10/024290, 10/144042, 10/207814, 10/210112 and 10/369563.
Аналоги СС-1065Analogs SS-1065
Цитотоксическим агентом в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению также может быть СС-1065 или его производное.The cytotoxic agent in the cytotoxic conjugates of the present invention may also be CC-1065 or a derivative thereof.
СС-1065 является сильнодействующим противоопухолевым антибиотиком, который выделен из культуральной жидкости 81герЮ1пусе8 хе1ег1818. СС-1065 примерно в 1000 раз более активен ίη νίίτο, чем такие распространенные противораковые препараты, как доксорубицин, метотрексат и винкристин (В.К. Екиуам еί а1., Сагсег Кек.,42, 3532-3537 (1982)). СС-1065 и его аналоги раскрыты в патентах США № 6372738, 6340701, 5846545 и 5585499.CC-1065 is a potent antitumor antibiotic that has been isolated from the culture fluid 81geru1pu8e xe1eg1818. SS-1065 is about 1000 times more active than такиеη νίίτο than common anti-cancer drugs like doxorubicin, methotrexate and vincristine (V.K. Ekiyuam ea a1., Sagseg Kek., 42, 3532-3537 (1982)). SS-1065 and its analogues are disclosed in US patent No. 6372738, 6340701, 5846545 and 5585499.
- 21 020130- 21 020130
Цитотоксическая активность СС-1065 коррелирует с его алкилирующим действием и связыванием с ДНК или интеркалированием в ДНК. Эти две активности принадлежат разным частям молекулы. Так, алкилирующее действие присуще циклопропапирролоиндоловой (СР1) субъединице, а связывание с ДНК свойственно двум пирролоиндоловым субъединицам.The cytotoxic activity of CC-1065 correlates with its alkylating effect and binding to DNA or intercalation in DNA. These two activities belong to different parts of the molecule. Thus, the alkylating effect is inherent in the cyclopropapyrroloindole (CP1) subunit, and DNA binding is characteristic of two pyrroloindole subunits.
Несмотря на то, что СС-1065 как цитотоксический агент обладает некоторыми привлекательными характеристиками, он имеет ограничения при терапевтическом применении. Введение СС-1065 мышам вызывало отсроченную гепатотоксичность и приводило к смертельному исходу на 50-й день после однократной внутривенной дозы в 12,5 мкг/кг (У.Ь. Веую1бк е! а1., 1. АпйЬюйск, XXIX, 319-334 (1986)). Это ускорило попытки разработать аналоги, не вызывающие отсроченной гепатотоксичности, и был описан синтез более простых аналогов наподобие СС-1065 (М.А. \Уагрекокк| е! а1., I. Меб. Скет., 31, 590603(1988)).Despite the fact that CC-1065 as a cytotoxic agent has some attractive characteristics, it has limitations in therapeutic use. The administration of CC-1065 to mice caused delayed hepatotoxicity and was fatal on the 50th day after a single intravenous dose of 12.5 μg / kg (W.U. Veuu1bk e! A1., 1. Apyuysk, XXIX, 319-334 ( 1986)). This accelerated attempts to develop analogues that do not cause delayed hepatotoxicity, and the synthesis of simpler analogs like SS-1065 (M.A. \ Uagrekokk | e! A1., I. Meb. Sket., 31, 590603 (1988)) was described.
У следующей серии аналогов молекулу СР1 заменили молекулой циклопропабензиндола (СВ1) (Ό.Κ Водег е! а1., I. Огд. Скет., 55, 5823-5833 (1990); Э.Ь. Водег е! а1., ВюОгд. Меб. Скет. Ье!!., 1, 115-120 (1991)). Эти соединения сохраняют высокую активность ίη νίΙΐΌ исходного соединения, не вызывая отсроченной токсичности у мышей. Как и СС-1065, эти соединения являются алкилирующими реагентами, которые связываются с малой бороздкой ДНК ковалентным образом, вызывая гибель клетки. Но клиническая оценка наиболее перспективных аналогов, адозелесина и карзелесина, привела к неутешительным результатам (В.Е. Еок!ет е! а1., Iηνек!^даί^оηа1 №\ν Эгидк, 13, 321-326 (1996); I. \Уо1ГГ е! а1., С1т. Сзпссг Век., 2, 1717-1723 (1996)). Эти препараты проявляют слабые терапевтические эффекты вследствие их высокой системной токсичности.In the next series of analogues, the CP1 molecule was replaced by the cyclopropabenzindole (CB1) molecule (Ό.Κ Wedeg e! A1., I. Ogd. Sket., 55, 5823-5833 (1990); E. Bedeg e! A1., VyuGde Meb. Sket. Le !!., 1, 115-120 (1991)). These compounds retain the high activity ίη νίΙΐΌ of the parent compound without causing delayed toxicity in mice. Like CC-1065, these compounds are alkylating agents that bind to the small groove of DNA in a covalent manner, causing cell death. But the clinical evaluation of the most promising analogues, adolesesin and carzelesin, led to disappointing results (V.E. Eok! Et e! A1., Iηνek! ^ Yesί ^ оηа1 No. \ ν Egidk, 13, 321-326 (1996); I. \ Uo1GG e! A1., C1. Szpssg Vek., 2, 1717-1723 (1996)). These drugs exhibit mild therapeutic effects due to their high systemic toxicity.
Терапевтическая эффективность аналогов СС-1065 может быть сильно улучшена при изменении распределения ίη νί\Ό посредством направленной доставки на место опухоли, что приведет к уменьшению токсичности для остальных тканей и тем самым к снижению системной токсичности. Для достижения этой цели описаны конъюгаты аналогов и производных СС-1065 с агентами, связывающими клетку, специфически нацеленными на раковые клетки (патенты США № 5475092, 5585499, 5846545). Как правило, эти конъюгаты проявляют высокую, специфичную к мишени цитотоксичность ίη νίΙΐΌ и исключительную противоопухолевую активность на моделях привитых опухолей человека у мышей (В.У.1. Скал е! а1., Самсе!· Век., 55, 4079-4084 (1995)).The therapeutic efficacy of CC-1065 analogues can be greatly improved by changing the distribution of ίη νί \ Ό through targeted delivery to the tumor site, which will lead to a decrease in toxicity for other tissues and thereby a decrease in systemic toxicity. To achieve this goal, conjugates of analogues and derivatives of CC-1065 with cell-binding agents specifically targeting cancer cells have been described (US Pat. Nos. 5,457,092, 5,585,499, 5,846,545). As a rule, these conjugates exhibit high target specific cytotoxicity ίη νίΙΐΌ and exceptional antitumor activity in models of vaccinated human tumors in mice (V.U. 1. Skale e! A1., Samsa! · Vek., 55, 4079-4084 ( 1995)).
Способы синтеза аналогов СС-1065, пригодных для цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения, вместе с методами конъюгирования этих аналогов с агентами, связывающими клетку, типа антител, подробно описаны в патентах США № 5,475,092, 5,846,545, 5,585,499, 6,534,660 и 6,586,618 и заявках США № 10/116,053 и 10/265,452.Methods for the synthesis of CC-1065 analogs suitable for the cytotoxic conjugates of the present invention, together with methods for conjugating these analogs with cell-binding agents such as antibodies, are described in detail in US Pat. Nos. 5,475,092, 5,846,545, 5,585,499, 6,534,660 and 6,586,618 and US applications No. 10 / 116.053 and 10 / 265.452.
Другие препаратыOther drugs
Такие препараты, как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мельфалан, митомицин С, хлорамбуцил, каличамицин, тубулизин и его аналоги, дуокармицин и его аналоги, доластатин и его аналоги также пригодны для получения конъюгатов настоящего изобретения. Молекулы лекарств также можно соединить с молекулами антител через молекулу промежуточного носителя типа сывороточного альбумина. Соединения доксарубицин и данорубицин, как описано, к примеру, в и.8. 8епа1 №. 09/740991, также могут оказаться полезными цитотоксическими агентами.Preparations such as methotrexate, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinblastine, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, calicamycin, tubulizin and its analogues, duocarmycin and its analogues, dolastatin and its analogues are also suitable for preparing the conjugates of the present invention. Drug molecules can also be coupled to antibody molecules via an intermediate carrier molecule such as serum albumin. Compounds doxarubicin and danorubicin, as described, for example, in and. 8. 8epa1 no. 09/740991 may also be useful cytotoxic agents.
Терапевтические композицииTherapeutic Compositions
Настоящее изобретение также предусматривает терапевтические композиции, включающие:The present invention also provides therapeutic compositions comprising:
(а) эффективное количество одного или нескольких цитотоксических конъюгатов, (б) фармацевтически приемлемый носитель.(a) an effective amount of one or more cytotoxic conjugates; (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
Также настоящее изобретение предусматривает способ торможения роста выбранных популяций клеток, включающий контактирование искомых клеток или ткани, содержащей искомые клетки, с эффективным количеством цитотоксического конъюгата или терапевтического средства, включающего цитотоксический конъюгат, одного или в сочетании с другими цитотоксическими или терапевтическими средствами.The present invention also provides a method of inhibiting the growth of selected cell populations, comprising contacting the desired cells or tissue containing the desired cells with an effective amount of a cytotoxic conjugate or therapeutic agent including a cytotoxic conjugate, alone or in combination with other cytotoxic or therapeutic agents.
Настоящее изобретение также включает способ лечения субъекта, страдающего раком, с помощью терапевтической композиции настоящего изобретения.The present invention also includes a method of treating a subject suffering from cancer using the therapeutic composition of the present invention.
Цитотоксические конъюгаты могут быть исследованы в отношении активности и специфичности ίη νίΙΐΌ ранее описанными методами (напр., см. В.У.1. Скап е! а1., Самсег Век., 55, 4079-4084 (1995)). Противоопухолевую активность можно оценить на моделях привитых опухолей человека у мышей также ранее описанными методами (напр., см. Ьш е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 93: 8618-8623 (1996)).Cytotoxic conjugates can be investigated with respect to the activity and specificity of ίη νίΙΐΌ by previously described methods (e.g., see B.U. 1. Skap e! A1., Samseg Vek., 55, 4079-4084 (1995)). Antitumor activity can be evaluated on models of vaccinated human tumors in mice using the previously described methods as well (eg, see Ls e! A1., Proc. No. I. Asab. 8sk I8A, 93: 8618-8623 (1996)).
Подходящие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть установлены рядовым специалистом в данной области в соответствии с клинической ситуацией. В настоящем изобретении носители включают разбавители и наполнители.Suitable pharmaceutically acceptable carriers are well known and may be established by one of ordinary skill in the art in accordance with the clinical situation. In the present invention, carriers include diluents and fillers.
Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или наполнителей включают: (1) физраствор Дюльбекко с фосфатным буфером, рН 7,4, содержащий или не содержащий от 1 мг/мл до 25 мг/мл сывороточного альбумина человека; (2) 0,9% физраствор (0,9% раствор №С1); и (3) 5% раствор декстрозы; они могут также содержать антиоксидант типа триптамина и стабилизирующее вещество типа Т\уссп 20.Examples of suitable carriers, diluents and / or excipients include: (1) Dulbecco saline with phosphate buffer, pH 7.4, with or without 1 mg / ml to 25 mg / ml human serum albumin; (2) 0.9% saline (0.9% solution No. C1); and (3) 5% dextrose solution; they may also contain an antioxidant such as tryptamine and a stabilizing substance such as T \ usp 20.
Способ торможения роста выбранных популяций клеток может выполняться ίη νίϋΌ, ίη νί\Ό или ехThe method of inhibiting the growth of selected cell populations can be performed by ίη νίϋΌ, ίη νί \ Ό or ex
- 22 020130 νο. В настоящем изобретении торможение роста означает замедление роста клеток, снижение жизнеспособности клеток, причинение гибели клеток, лизирование клеток и индуцирование клеточной смерти как в течение короткого, так и продолжительного периода времени.- 22 020130 νο. In the present invention, growth inhibition means slowing down cell growth, decreasing cell viability, causing cell death, lysing cells and inducing cell death for both short and long periods of time.
Примеры применения т νίΙΐΌ включают обработку аутологического костного мозга перед трансплантацией его тому же пациенту с тем, чтобы уничтожить больные или злокачественные клетки; обработку костного мозга перед трансплантацией с тем, чтобы уничтожить компетентные Т-клетки и предотвратить отторжение трансплантата; обработку клеточных культур с тем, чтобы уничтожить все клетки за исключением нужных вариантов, не экспрессирующих антиген мишени; либо уничтожить варианты, экспрессирующие ненужный антиген.Examples of the use of t νίΙΐΌ include processing an autologous bone marrow before transplanting it to the same patient in order to destroy diseased or malignant cells; treating bone marrow before transplantation in order to destroy competent T cells and prevent transplant rejection; processing cell cultures in order to destroy all cells with the exception of the desired options that do not express the target antigen; either destroy variants expressing unnecessary antigen.
Условия неклинического применения ш νίΙΐΌ может легко установить рядовой специалист в данной области.Conditions for non-clinical use of w νίΙΐΌ can easily be established by an ordinary specialist in this field.
Примеры клинического применения ех νί\Ό заключаются в удалении раковых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга перед аутологической трансплантацией при лечении рака или при лечении аутоиммунных заболеваний; либо удалении Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологического или аллогенного костного мозга или ткани перед трансплантацией с тем, чтобы предотвратить отторжение трансплантата. Обработка может проводиться следующим образом. Костный мозг извлекают из пациента или иного индивидуума, а затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, в которую добавляют цитотоксического агента изобретения. Концентрации составляют от 10 мкМ до 1 пМ, на протяжении от 30 мин до 48 ч при 37°С. Точные условия концентрации и времени инкубации, т.е. дозировку, может легко установить рядовой специалист. После инкубации клетки костного мозга отмывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают в организм пациента путем внутривенной инфузии согласно известным методам. В тех случаях, когда пациенту проводят другую обработку, к примеру, курс абляционной химиотерапии либо облучение всего организма между извлечением костного мозга и обратным введением обработанных клеток, обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте, используя стандартное медицинское оборудование.Examples of clinical applications ex νί \ Ό are to remove cancer cells or lymphoid cells from the bone marrow before autologous transplantation in the treatment of cancer or in the treatment of autoimmune diseases; or removing T cells and other lymphoid cells from autologous or allogeneic bone marrow or tissue before transplantation in order to prevent transplant rejection. Processing can be carried out as follows. The bone marrow is removed from a patient or other individual, and then incubated in a medium containing serum to which the cytotoxic agent of the invention is added. Concentrations range from 10 μM to 1 pM, over a period of 30 minutes to 48 hours at 37 ° C. The exact conditions of concentration and incubation time, i.e. dosage, can be easily established by an ordinary specialist. After incubation, bone marrow cells are washed with serum-containing medium and returned to the patient by intravenous infusion according to known methods. In cases where the patient undergoes another treatment, for example, a course of ablative chemotherapy or irradiation of the whole organism between the extraction of bone marrow and the return of the treated cells, the treated bone marrow cells are stored frozen in liquid nitrogen using standard medical equipment.
Для клинического применения ш νί\Ό цитотоксический конъюгат изобретения должен храниться в виде раствора, который подвергают тестированию на стерильность и уровень эндотоксина. Примеры подходящих методик применения цитотоксических конъюгатов заключаются в следующем. Конъюгаты вводят внутривенно болюсом раз в неделю на протяжении 4 недель. Болюсные дозы вводятся в 50-100 мл физраствора, в который можно добавить 5-10 мл сывороточного альбумина человека. Дозировка составляет от 10 мкг до 100 мг за один раз внутривенно (от 100 нг до 1 мг/кг в день). Более предпочтительно дозировка составляет от 50 мкг до 30 мг. Наиболее предпочтительно дозировка составляет от 1 мг до 20 мг. После 4-недельного курса пациент может продолжать лечение по еженедельной схеме. Конкретные клинические методики в отношении способа применения, наполнителей, разбавителей, дозировки, времени и т.д. могут быть установлены рядовым специалистом в соответствии с клинической ситуацией.For clinical use, w νί \ Ό the cytotoxic conjugate of the invention should be stored as a solution, which is tested for sterility and endotoxin level. Examples of suitable techniques for using cytotoxic conjugates are as follows. Conjugates are administered intravenously by bolus once a week for 4 weeks. Bolus doses are administered in 50-100 ml of saline, in which 5-10 ml of human serum albumin can be added. The dosage is from 10 μg to 100 mg at a time intravenously (from 100 ng to 1 mg / kg per day). More preferably, the dosage is from 50 μg to 30 mg. Most preferably, the dosage is from 1 mg to 20 mg. After a 4-week course, the patient can continue treatment on a weekly basis. Specific clinical procedures regarding the method of application, excipients, diluents, dosage, time, etc. can be installed by an ordinary specialist in accordance with the clinical situation.
Примеры медицинских заболеваний, которые можно лечить в соответствии со способом уничтожения выбранных популяций клеток ш νί\Ό или ех νί\Ό, включают злокачественные опухоли любого типа, в том числе, к примеру, рак легких, молочной железы, толстой кишки, простаты, почек, поджелудочной железы, яичников, шейки матки и лимфатических органов, остеосаркому, синовиальную карциному, саркому или карциному, при которой экспрессируется СА6, и другие виды рака, еще неизвестные, при которых преимущественно экспрессируется гликотоп СА6; аутоиммунные заболевания, такие как системная волчанка, ревматоидный артрит и множественный склероз; отторжение трансплантата, к примеру, отторжение почечного трансплантата, отторжение печеночного трансплантата, отторжение легочного трансплантата, отторжение сердечного трансплантата и отторжение трансплантата костного мозга; реакцию трансплантат против хозяина; вирусные инфекции, такие как тУ-инфекция, ВИЧ-инфекция, СПИД и др.; и паразитарные инфекции, такие как жиардиаз, амебиаз, шистосомоз и др., что устанавливается рядовыми специалистами в данной области.Examples of medical diseases that can be treated in accordance with the method of killing selected populations of cells w νί \ Ό or ex νί \ Ό include malignant tumors of any type, including, for example, cancer of the lung, breast, colon, prostate, kidney , pancreas, ovaries, cervix and lymphatic organs, osteosarcoma, synovial carcinoma, sarcoma or carcinoma in which CA6 is expressed, and other types of cancer, still unknown, in which the CA6 glycotope is mainly expressed; autoimmune diseases such as systemic lupus, rheumatoid arthritis and multiple sclerosis; transplant rejection, for example, renal transplant rejection, liver transplant rejection, pulmonary transplant rejection, heart transplant rejection and bone marrow transplant rejection; transplant versus host reaction; viral infections, such as tu-infection, HIV infection, AIDS, etc .; and parasitic infections, such as giardiasis, amoebiasis, schistosomiasis, etc., which is established by ordinary specialists in this field.
НаборыSets
Настоящее изобретение также включает наборы, например, включающие описанный цитотоксический конъюгат и инструкции по применению цитотоксического конъюгата для уничтожения определенных типов клеток. Инструкции могут включать указания по применению цитотоксических конъюгатов ш νίΙΐΌ, 1п νί\Ό или ех νί\Ό.The present invention also includes kits, for example, including the described cytotoxic conjugate and instructions for using the cytotoxic conjugate to kill certain types of cells. Instructions may include directions for the use of cytotoxic conjugates w νίΙΐΌ, 1n νί \ Ό or ex νί \ Ό.
Как правило, набор имеет отсек, содержащий цитотоксический конъюгат. Цитотоксический конъюгат может находиться в лиофилизованном виде, жидком виде или ином виде, в котором его можно включить в набор. Набор также может содержать дополнительные элементы, необходимые для выполнения способа, описанного в инструкции к набору, как-то стерильный раствор для растворения лиофилизованного порошка, дополнительные реагенты, объединяемые с цитотоксическим конъюгатом перед введением его пациенту, и приспособления, помогающие вводить конъюгат пациенту.Typically, the kit has a compartment containing a cytotoxic conjugate. The cytotoxic conjugate may be in a lyophilized form, liquid form or other form in which it can be included in the kit. The kit may also contain additional elements necessary for performing the method described in the kit instructions, such as a sterile solution for dissolving the lyophilized powder, additional reagents combined with the cytotoxic conjugate before administration to the patient, and devices that help to administer the conjugate to the patient.
Дополнительные воплощенияAdditional embodiments
Настоящее изобретение также предусматривает моноклональные антитела, гуманизованные антитела и их эпитопосвязывающие фрагменты, которые дополнительно помечены для применения в исследованиях или в диагностике. В предпочтительных воплощениях метка представляет собой радиоактивThe present invention also provides monoclonal antibodies, humanized antibodies and their epitope binding fragments, which are additionally labeled for use in research or in diagnosis. In preferred embodiments, the label is a radioactive
- 23 020130 ную метку, флуорофор, хромофор, контрастирующее вещество или ион металла.- 23 020130 label, fluorophore, chromophore, contrast agent or metal ion.
Также предусматривается способ диагностики, в котором данные меченые антитела или их эпитопосвязывающие фрагменты вводятся субъекту, у которого есть подозрение на рак, и измеряется или отслеживается распределение метки в организме субъекта.A diagnostic method is also provided in which these labeled antibodies or epitope-binding fragments thereof are administered to a subject who is suspected of having cancer, and label distribution in the subject is measured or monitored.
ПримерыExamples
Широкие рамки данного изобретения лучше всего раскрываются на следующих примерах, которые не предназначаются для ограничения изобретения конкретными воплощениями.The broad scope of the present invention is best disclosed in the following examples, which are not intended to limit the invention to specific embodiments.
Пример 1. Идентификация положительных и отрицательных по антигену клеточных линий при анализе связывания методом проточной цитометрииExample 1. Identification of positive and negative antigenic cell lines in the analysis of binding by flow cytometry
Использовали анализ методом проточной цитометрии для локализации эпитопа СА6 антитела Ό86 на поверхности клеток. Линии клеток человека получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС) за исключением клеток ОУСАК5 (Кеагке е1 а1., ΙηΙ. 1. Сапсег 88(6): 866-872 (2000)), ОУСАК8 и 1СВОУ1 (Μ. 8еЛеп, Μа55асΗи5еΠ5 Сепега1 Но§рйа1). Все клетки культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640 с добавлением 4 мМ Ь-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех Вю8аепсе, КосИапб, ΜΕ) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (АИак ВЫощсаК Рой СоШпк, СО), которая в дальнейшем именуется культуральной средой. Клетки содержали в увлажнительном инкубаторе при 37°С, 5% СО2.Flow cytometry analysis was used to localize the CA6 epitope of antibody Ό86 on the cell surface. Human cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) with the exception of OUSAC5 cells (Keagke e1 a1., ΙηΙ. 1. Sapseg 88 (6): 866-872 (2000)), OUSAC8 and 1 CBOU1 (Μ. 8еЛеп, Μа55асΗи5еΠ5 Сепега1 No§rya1). All cells were cultured in ΚΡΜΙ 1640 medium with the addition of 4 mM L-glutamine, 50 U / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin (SatGeh Vu8aepse, KosIapb, ΜΕ) and 10% fetal calf serum (AIak Vysokoska Roy Soshpk, CO) hereinafter referred to as the culture medium. Cells were kept in a humidification incubator at 37 ° C, 5% CO2.
Клетки (1-2х10-5 клеток на лунку) инкубировали на льду в течение 3-4 ч вместе с серийными разведениями антитела Ό86, приготовленными на буфере РАС8 (2% козьей сыворотки, ΚΡΜΙ), в 96-луночных планшетах. Клетки осаждали в настольной центрифуге при 1500 об/мин 5 мин при 4°С. После удаления среды лунки снова заполняли 150 мкл буфера РАС8. Затем повторяли отмывку. РГТС-меченное козье антитело против ЦС мыши (1асккоп Гттипогекеагск) разводили 1:100 буфером РАС8 и инкубировали с клетками в течение 1 ч. на льду. Планшет закрывали фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивание сигнала. После двух отмывок клетки фиксировали 1% формальдегидом и анализировали на проточном цитометре.Cells (1-2x10 -5 cells per well) were incubated on ice for 3-4 hours together with serial dilutions of antibody Ό86 prepared on PAC8 buffer (2% goat serum, ΚΡΜΙ) in 96-well plates. Cells were besieged in a benchtop centrifuge at 1500 rpm for 5 min at 4 ° C. After removing the medium, the wells were again filled with 150 μl of PAC8 buffer. Then the washing was repeated. A RGTS-labeled goat anti-mouse CS antibody (1askcop Gttipogekeagsk) was diluted 1: 100 with PAC8 buffer and incubated with cells for 1 hour on ice. The tablet was covered with foil to prevent photobleaching of the signal. After two washes, the cells were fixed with 1% formaldehyde and analyzed on a flow cytometer.
Преимущественно эпитоп СА6 обнаруживался в линиях клеток, происходящих из яичников, молочной железы, шейки матки и поджелудочной железы (табл. 3), как и предполагалось по данным иммуногистохимии опухолей. Однако некоторые линии клеток из других типов опухолей проявляли ограниченную экспрессию СА6. Антитело Ό86 связывается с кажущимся значением К, в 135,6 пМ (на клетках РС-3, табл. 3). Максимальная средняя флуоресценция (табл. 3) на кривых связывания (фиг. 1) в положительных по антигену линиях клеток свидетельствует об относительной плотности антигена.The CA6 epitope was predominantly found in cell lines originating from the ovaries, mammary gland, cervix, and pancreas (Table 3), as suggested by the data of tumor immunohistochemistry. However, some cell lines from other types of tumors showed limited expression of CA6. Antibody Ό86 binds to an apparent K value of 135.6 pM (on PC-3 cells, Table 3). The maximum average fluorescence (Table 3) on the binding curves (Fig. 1) in antigen-positive cell lines indicates the relative density of the antigen.
Таблица 3Table 3
- 24 020130- 24 020130
* среднее значение максимальной относительной флуоресценции* average value of maximum relative fluorescence
Пример 2. Характеристика эпитопа Ό86Example 2. Characterization of the ит86 epitope
Свойства антигена СА6 антитела Ό86 анализировали методом иммуноблоттинга на дот-блотах лизатов СА6-положительных клеток (Саоу-3), подвергнутых расщеплению путем протеолитической и/или гликолитической обработки. В качестве положительного контроля тестировали другие антитела, распознающие целый ряд эпитопов, на лизатах антиген-положительных линий клеток (Саоу-3 и СМ1; Со1о205 и С242; 8КМЕБ28 и Я24). Антитело СМ1 распознает белковый эпитоп из домена с вариабельным числом тандемных повторов (УКТЯ) Мис-1, и поэтому оно служит контролем на белковый эпитоп. С242 связывается с новым гликотопом на Мис-1 (СапАд), связанным с сиаловой кислотой и специфичным для рака прямой и толстой кишки, который служит контролем на гликотоп на белке. Я24 связывается с ганглиозидом СЭ3. специфичным для меланомы, и поэтому служит контролем на гликотоп на небелковом каркасе.The properties of the CA6 antigen of antibody Ό86 were analyzed by immunoblotting on dot blots of lysates of CA6-positive cells (Saou-3), subjected to cleavage by proteolytic and / or glycolytic treatment. As a positive control, other antibodies that recognized a number of epitopes were tested on lysates of antigen-positive cell lines (Saou-3 and CM1; Co1o205 and C242; 8KMEB28 and Ya24). The CM1 antibody recognizes a protein epitope from a domain with a variable number of tandem repeats (UKTs) Mis-1, and therefore it serves as a control for a protein epitope. C242 binds to a new Mys-1 glycotope (SapAd), associated with sialic acid and specific for colorectal cancer, which serves as a control for the glycotope on the protein. Я24 binds to ganglioside SE3. specific to melanoma, and therefore serves as a glycotope control on a non-protein scaffold.
Клетки Саоу-3, Со1о205 и 8КМЕБ28 высеивали на чашки для тканевой культуры диаметром 15 см.Saou-3, Co1o205, and 8KMEB28 cells were seeded onto tissue culture dishes with a diameter of 15 cm.
- 25 020130- 25 020130
Культуральную среду (30 мл на чашку) меняли за день до лизирования. Модифицированный буфер В1РА (50 мМ трис-НС1 рН 7,б, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ ЭДТА, 1% ΝΡ40, 0,25% дезоксихолата натрия), ингибиторы протеаз (РМ8Е, пепстатин А, лейпептин и апротинин) и РВ8 предварительно охлаждали на льду. После отсасывания культуральной среды из чашек клетки дважды промывали 10 мл охлажденного РВ8. Все последующие операции выполнялись на льду и/или в холодной комнате при 4°С. После удаления последней порции РВ8 клетки лизировали в 1-2 мл лизирующего буфера (буфера В1РА с добавлением свежих ингибиторов протеаз до конечной концентрации 1 мМ РМ8Е, 1 мкМ пепстатина А, 10 мкг/мл лейпептина и 2 мкг/мл апротинина). Лизаты отделяли от чашек с помощью съемника и суспендировали, пропуская 5-10 раз через пипетку с иглой 18С. Лизаты вращали в течение 10 мин, а затем центрифугировали в микроцентрифуге до максимума (13000 об/мин) в течение 10 мин. Осадки отбрасывали, а в супернатантах определяли белок с помощью набора для метода Брэдфорда (ВюВаф.The culture medium (30 ml per cup) was changed the day before lysis. Modified B1PA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7, b, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% ΝΡ40, 0.25% sodium deoxycholate), protease inhibitors (PM8E, pepstatin A, leipeptin and aprotinin) and PB8 were pre-cooled on ice. After aspirating the culture medium from the dishes, the cells were washed twice with 10 ml of chilled PB8. All subsequent operations were performed on ice and / or in a cold room at 4 ° C. After removing the last portion of PB8, the cells were lysed in 1-2 ml of lysis buffer (B1PA buffer with fresh protease inhibitors added to a final concentration of 1 mM PM8E, 1 μM pepstatin A, 10 μg / ml leupeptin and 2 μg / ml aprotinin). Lysates were separated from the cups using a puller and suspended, passing 5-10 times through a pipette with a 18C needle. Lysates were rotated for 10 minutes and then centrifuged in a microcentrifuge to a maximum (13,000 rpm) for 10 minutes. Precipitation was discarded, and protein was determined in supernatants using the Bradford kit (WuWaf.
Лизаты (2 мкл) наносили пипеткой прямо на сухие нитроцеллюлозные мембраны 0,2 мкм. Их оставляли сохнуть на воздухе примерно на 30 мин. Мембраны нарезали на кусочки, содержащие по одному пятну. Пятна инкубировали в присутствии проназы (1 мг/мл фермента, 50 мМ трис рН 7,5, 5 мМ СаС12), протеиназы К (1 мг/мл фермента, 50 мМ трис рН 7,5, 5 мМ СаС12), нейраминидазы (20 мЕд/мл фермента, 50 мМ ацетата натрия рН 5, 5 мМ СаС12, 100 мкг/мл В8А) или перйодной кислоты (20 мМ, 0,5 М ацетат натрия рН 5) в течение 1 ч при 37°С. Реагенты приобретали у фирмы Воске (ферменты) и ν\νΡ (перйодную кислоту). Мембраны отмывали (5 мин) буфером Т-ТВ8 (0,1% Т\\ееп 20, 1Х ТВ8), блокировали в блокирующем буфере (3% В8А, Т-ТВ8) в течение 2 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи с первичным антителом (т.е. ПЗб, СМ1, С242, В24) при 2 мкг/мл в блокирующем буфере при 4°С. Мембраны отмывали три раза по 5 мин буфером Т-ТВ8, а затем инкубировали со вторым, конъюгированным с НВР козьим антителом против 1дС мыши (или человека) (1аск8ои 1ттииоге8еагск); разведение 1:2000 в блокирующем буфере, в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммуноблоты отмывали три раза и проявляли с помощью системы ЕСЬ (Атегккат).Lysates (2 μl) were pipetted directly onto 0.2 μm dry nitrocellulose membranes. They were left to air dry for about 30 minutes. Membranes were cut into pieces containing one spot each. The spots were incubated in the presence of pronase (1 mg / ml enzyme, 50 mm Tris pH 7.5, 5 mm CaCl 2 ), proteinase K (1 mg / ml enzyme, 50 mm Tris pH 7.5, 5 mm CaCl 2 ), neuraminidase (20 mU / ml of the enzyme, 50 mM sodium acetate pH 5, 5 mM CaCl 2 , 100 μg / ml B8A) or periodic acid (20 mM, 0.5 M sodium acetate pH 5) for 1 h at 37 ° C. Reagents were purchased from Voske (enzymes) and ν \ νΡ (periodic acid). The membranes were washed (5 min) with T-TB8 buffer (0.1% T \\ ehp 20, 1X TB8), blocked in blocking buffer (3% B8A, T-TB8) for 2 hours at room temperature and incubated overnight with a primary antibody (i.e., PZb, CM1, C242, B24) at 2 μg / ml in blocking buffer at 4 ° C. The membranes were washed three times for 5 min with T-TB8 buffer, and then incubated with a second goat-conjugated goat antibody against mouse 1dC (or human) (1ask8oy1ttioge8eagsk); 1: 2000 dilution in blocking buffer for 1 h at room temperature. Immunoblots were washed three times and developed using the ECb system (ATEGKKAT).
Иммуноблоты (фиг. 2) подвергнутых расщеплению контрольных лизатов показали, что сигнал СМ1 разрушается при протеолитической обработке, тогда как сигналы при гликолитической обработке не менялись, как и следовало ожидать от антитела, распознающего белковый эпитоп. Сигнал С242 разрушался как при протеолитической, так и при гликолитической обработке, как и следовало ожидать от антитела, распознающего гликотоп, находящийся на белке. Сигнал В24, на который не влияла протеолитическая обработка, устранялся при обработке нейраминидазой или перйодатом, как и следовало ожидать от антитела, распознающего ганглиозид. Иммуноблоттинг ПЗб на пятнах подвергнутого расщеплению лизата Саоν-3 проявлял потерю сигнала при обработке как протеолитическими, так и гликолитическими соединениями. Таким образом, как и С242, ПЗб связывается с углеводным эпитопом на белковом остове. Кроме того, сигнал при иммуноблоттинге ПЗб оказался чувствительным к обработке нейраминидазой. Следовательно, САб, как и СапАд, является гликотопом, связанным с сиаловой кислотой.The immunoblots (Fig. 2) of the cleaved control lysates showed that the CM1 signal is destroyed during proteolytic processing, while the signals during glycolytic processing did not change, as expected from an antibody recognizing a protein epitope. The C242 signal was destroyed both during proteolytic and glycolytic processing, as one would expect from an antibody recognizing a glycotope located on a protein. The B24 signal, which was not affected by proteolytic treatment, was eliminated by treatment with a neuraminidase or periodate, as one would expect from an antibody recognizing ganglioside. Immunoblotting of PZb on spots of Caoν-3 lysate cleaved showed a signal loss during treatment with both proteolytic and glycolytic compounds. Thus, like C242, PZb binds to the carbohydrate epitope on the protein backbone. In addition, the signal during PZb immunoblotting turned out to be sensitive to treatment with neuraminidase. Therefore, SAb, like SapAd, is a glycotope associated with sialic acid.
Для подтверждения углеводной природы САб лизат Саоν-3 наносили на мембрану Р^Е и обрабатывали дегликозилирующим реагентом, трифторметансульфоновой кислотой (ТЕМ8А), в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 5 мин. Блот промывали буфером Т-ТВ8 и подвергали иммуноблоттингу с СМ1 или с ПЗб (фиг. 3). Сигнал ПЗб разрушался при обработке кислотой, что дополнительно свидетельствует о том, что САб представляет собой гликотоп. Усиление сигнала СМ1 при обработке ТЕМ8А означает, что обработка кислотой не влияет на белок на фильтре и свидетельствует о том, что гликолитическая обработка демаскирует белковый эпитоп, распознаваемый СМ1.To confirm the carbohydrate nature of SAb, Caoν-3 lysate was applied to the P ^ E membrane and treated with a deglycosylating reagent, trifluoromethanesulfonic acid (TEM8A), in a nitrogen atmosphere at room temperature for 5 min. The blot was washed with T-TB8 buffer and subjected to immunoblotting with CM1 or with PZb (Fig. 3). The PZb signal was destroyed during acid treatment, which additionally indicates that SAb is a glycotope. The amplification of the CM1 signal during TEM8A processing means that acid treatment does not affect the protein on the filter and indicates that glycolytic treatment unmasks the protein epitope recognized by CM1.
Для дальнейшего выяснения структуры того углевода, на котором располагается САб, дот-блоты подвергали расщеплению Ν-гликаназой, О-гликаназой и/или сиалидазой (фиг. 4). Лизаты клеток Саоν-3 (100 мкг, 30 мкл) инкубировали при 100°С в течение 5 мин с 2,5 мкл денатурирующего буфера (С1уко). содержащего 8Ό8 и β-меркаптоэтанол. Затем денатурированные лизаты подвергали расщеплению с помощью 1 мкл Ν-гликаназы, О-гликаназы и/или сиалидазы А (С1уко) при 37°С в течение 1 ч. После этого подвергнутые расщеплению лизаты наносили (2 мкл) на нитроцеллюлозу и подвергали иммуноблоттингу, как описано выше.To further clarify the structure of the carbohydrate on which SAb is located, dot blots were digested with β-glycanase, O-glycanase and / or sialidase (Fig. 4). Lysates of Caoν-3 cells (100 μg, 30 μl) were incubated at 100 ° C for 5 min with 2.5 μl of denaturing buffer (C1uko). containing 8Ό8 and β-mercaptoethanol. Then the denatured lysates were digested with 1 μl of β-glycanase, O-glycanase and / or sialidase A (C1uko) at 37 ° C for 1 h. After that, the digested lysates were applied (2 μl) to nitrocellulose and subjected to immunoblotting as described above.
Ν-гликаназа не оказывала заметного влияния на сигналы иммуноблота ПЗб. Однако образцы, обработанные сиалидазой, не давали никакого сигнала. Поскольку О-гликаназа не способна расщеплять сиалилированные О-связанные углеводы без предварительной обработки сиалидазой, сигнал ПЗб в образцах, обработанных одной лишь О-гликаназой, не должен меняться. Напротив, для действия Ν-гликаназы не требуется предварительная обработка какими-либо гликозидазами. То, что обработка Ν-гликаназой не влияет на сигнал ПЗб, свидетельствует о том, что эпитоп САб, скорее всего, находится на сиалилированных цепях О-связанного углевода.Ν-glycanase did not significantly affect the immunoblot signals of PZb. However, samples treated with sialidase did not give any signal. Since O-glycanase is not capable of cleaving sialylated O-linked carbohydrates without pre-treatment with sialidase, the PZb signal in samples treated with O-glycanase alone should not change. In contrast, the action of гли-glycanase does not require pretreatment with any glycosidases. The fact that обработка-glycanase treatment does not affect the PZb signal indicates that the SAb epitope is most likely located on the sialylated chains of O-linked carbohydrate.
Пример 3. Выявление антигена, на котором находится эпитоп САбExample 3. Detection of the antigen on which the SAb epitope is located
Для идентификации антигена, на котором находится эпитоп САб, иммунопреципитаты ПЗб анализировали методами 8Э8-РАСЕ и вестерн-гибридизации. Супернатанты лизатов клеток (1 мл на образец, 3-5 мг белка) осветляли при помощи шариков с белком С (30 мкл), уравновешенных в 1 мл буфера В1РА в течение 1-2 ч, с вращением, при 4°С. Все последующие операции выполнялись на льду и/или в холодной комнате при 4°С. Шарики быстро (2-3 с) осаждали в микроцентрифуге. Осветленные супернатантыTo identify the antigen on which the SAb epitope is located, PZb immunoprecipitates were analyzed by 8E8-PACE and Western hybridization methods. Cell lysate supernatants (1 ml per sample, 3-5 mg protein) were clarified using beads with protein C (30 μl), equilibrated in 1 ml of B1PA buffer for 1-2 hours, with rotation, at 4 ° С. All subsequent operations were performed on ice and / or in a cold room at 4 ° C. Balls were quickly (2-3 s) precipitated in a microcentrifuge. Clarified supernatants
- 2б 020130 переносили в новые пробирки и инкубировали в течение ночи с 2 мкг Ό86, с вращением. В лизаты добавляли новые уравновешенные шарики с белком С (30 мкл) и инкубировали в течение 1 ч, с вращением. Суспензии шариков в лизатах подвергали кратковременному центрифугированию в микроцентрифуге и необязательно отбирали образцы лизатов после иммунопреципитации. Шарики отмывали 5-10 раз с помощью 1 мл буфера ШРА.- 2b 020130 was transferred to new tubes and incubated overnight with 2 μg Ό86, with rotation. New balanced beads with protein C (30 μl) were added to the lysates and incubated for 1 h, with rotation. Suspensions of beads in lysates were briefly centrifuged in a microcentrifuge, and lysate samples were optionally taken after immunoprecipitation. The balls were washed 5-10 times with 1 ml of SRA buffer.
Подвергнутые иммунопреципитации образцы Ό86 затем расщепляли с помощью 30 мкл нейраминидазы (20 мЕд нейраминидазы (Косйе), 50 мМ ацетата натрия рН 5, 5 мМ СаС12, 100 мкг/мл В8А) или 30 мкл перйодной кислоты (20 мМ перйодной кислоты (УАЕ), 0,5 М ацетата натрия рН 5) в течение 1 ч при 37°С. Затем их ресуспендировали в 30 мкл 2-кратного буфера для нанесения образцов (содержащего β-меркаптоэтанол). Шарики кипятили в течение 5 мин и супернатанты в буфере для нанесения образцов наносили на 4-12% или 4-20% гели с трис-глицином (ЗпуЦгодеп). Гели разгоняли в буфере для электрофореза методом Леммли при 125 В в течение 1,5 ч. Образцы гелей подвергали переносу в течение ночи при 20 мА, на нитроцеллюлозные мембраны 0,2 мкм при помощи установки для переноса М1ш Тгап8-Ь1о! (ВюЕаб). Мембраны подвергали иммуноблоттингу с Ό86, как описано выше в примере 2.Immunoprecipitated samples of Ό86 were then digested with 30 μl of neuraminidase (20 mU of neuraminidase (Cosye), 50 mM sodium acetate pH 5, 5 mM CaCl 2 , 100 μg / ml B8A) or 30 μl of periodic acid (20 mM periodic acid (UAE) , 0.5 M sodium acetate pH 5) for 1 h at 37 ° C. Then they were resuspended in 30 μl of 2-fold sample buffer (containing β-mercaptoethanol). The balls were boiled for 5 min and the supernatants in the sample buffer were applied onto 4–12% or 4–20% tris-glycine gels (ZpuGodep). The gels were dispersed in an electrophoresis buffer by the Lemmley method at 125 V for 1.5 hours. The gel samples were transferred overnight at 20 mA to 0.2 μm nitrocellulose membranes using an M1g Tgap8-L1o transfer system! (WuEab). The membranes were subjected to immunoblotting with Ό86, as described above in example 2.
В качестве альтернативы подвергнутые иммунопреципитации шарики сначала денатурировали, а затем подвергали энзиматическому расщеплению Ν-гликаназой, О-гликаназой и/или сиалидазой А (С1уко). Шарики ресуспендировали в 27 мкл инкубационного буфера и 2 мкл денатурирующего раствора (С1уко) и инкубировали при 100°С в течение 5 мин. После охлаждения до комнатной температуры добавляли раствор детергента (2 мкл) и инкубировали образцы с 1 мкл Ν-гликаназы, О-гликаназы и/или сиалидазы А при 37°С в течение 4 ч. После добавления 5-кратного буфера для нанесения образцов (7 мкл) образцы кипятили в течение 5 мин. Образцы подвергали 8Э8-РАСЕ и иммуноблоттингу, как описано выше.Alternatively, the immunoprecipitated beads were first denatured and then enzymatically cleaved with β-glycanase, O-glycanase and / or sialidase A (C1uko). The beads were resuspended in 27 μl of incubation buffer and 2 μl of denaturing solution (C1uko) and incubated at 100 ° C for 5 min. After cooling to room temperature, a detergent solution (2 μl) was added and samples were incubated with 1 μl of Ν-glycanase, O-glycanase and / or sialidase A at 37 ° C for 4 hours. After adding 5-fold sample buffer (7 μl) samples were boiled for 5 min. Samples were subjected to 8E8-PACE and immunoblotting as described above.
Ό86 вызывает иммунопреципитацию полосы белка >250 кДа, которая наблюдается в лизатах антиген-положительных клеток (фиг. 5А, В и С). В некоторых линиях клеток (Т-47Э) наблюдается двойная полоса. Полоса >250 кДа устранялась в иммунопреципитатах, обработанных нейраминидазой или перйодной кислотой (фиг. 5А и В), свидетельствуя о том, что эпитоп СА6 находится в полосе >250 кДа. Также оказалось, что полоса >250 кДа нечувствительна к обработке иммунопреципитатов нейраминидазой, что согласуется с тем, что СА6 располагается на О-связанном углеводе (фиг. 5Е). Дополнительным подтверждением того, что полоса в 250 кДа представляет собой антиген СА6, является то, что Ό86 не вызывает иммунопреципитации такой полосы из отрицательных по антигену Ό86 клеток (фиг. 5Ό и 5Е).Ό86 induces immunoprecipitation of a protein band> 250 kDa, which is observed in lysates of antigen-positive cells (Fig. 5A, B and C). In some cell lines (T-47E), a double band is observed. The band> 250 kDa was eliminated in immunoprecipitates treated with neuraminidase or periodic acid (Fig. 5A and B), indicating that the CA6 epitope is in the band> 250 kDa. It also turned out that the band> 250 kDa is insensitive to the treatment of immunoprecipitate with neuraminidase, which is consistent with the fact that CA6 is located on the O-linked carbohydrate (Fig. 5E). An additional confirmation that the 250 kDa band is CA6 antigen is that Ό86 does not cause immunoprecipitation of such a band of Ό86 antigen-negative cells (Figs. 5Ό and 5E).
Есть несколько доводов в пользу того, что антигеном СА6 является Мис1. Вследствие большого молекулярного веса и чувствительности к гликолитичсским ферментам, специфичным к О-связанным углеводам, кажется весьма вероятным, что антиген СА6 представляет собой муцин. Суперэкспрессия муцинов в опухолях хорошо изучена, особенно в опухолях молочной железы и яичников, что совпадает с основной реактивностью Ό86 в отношении опухолей. Более того, СА6, как и СапАд (сиалогликотоп на Мис1), не подвержен осаждению перйодной кислотой, свидетельствуя о том, что антиген СА6 сильно Огликозилирован. Тот факт, что в некоторых экспрессирующих Ό86 клеточных линиях Ό86 вызывал иммунопреципитацию двойной полосы >250 кДа, говорит о том, что СА6 представляет собой Мис1. Отличительной особенностью Мис1 у человека является наличие двух разных аллелей Мис1, отличающихся числом тандемных повторов, что приводит к экспрессии двух белков Мис1 различного молекулярного веса.There are several reasons why the CA6 antigen is Mis1. Due to its large molecular weight and sensitivity to glycolytic enzymes specific for O-linked carbohydrates, it seems very likely that the CA6 antigen is mucin. Overexpression of mucins in tumors has been well studied, especially in breast and ovarian tumors, which coincides with the main reactivity of Ό86 against tumors. Moreover, CA6, like SapAd (sialoglycotope on Mis1), is not susceptible to precipitation with periodic acid, indicating that the CA6 antigen is highly glycosylated. The fact that in some Ό86-expressing cell lines, Ό86 caused a double-band immunoprecipitation of> 250 kDa indicates that CA6 is Mis1. A distinctive feature of Mis1 in humans is the presence of two different Mis1 alleles, differing in the number of tandem repeats, which leads to the expression of two Mis1 proteins of different molecular weights.
Для проверки того, что СА6 находится на Мис1, иммунопреципитаты Ό86 из лизата Саоν-3 подвергали 8Э8-РАСЕ и иммуноблоттингу с антителом Ό86 или с антителом СМ1 к УЫТЕ Мис1. Как видно из фиг. 6А, СМ1 дает сильную реакцию с полосой >250 кДа, иммунопреципитацию которой вызывает Ό86. На фиг. 6В иммунопреципитаты Ό86 и СМ1 из лизата клеток неЬа проявляют все ту же двойную полосу >250 кДа при иммуноблоттинге как с Ό86, так и с СМ1. Эти результаты показывают, что эпитоп СА6 действительно локализуется на белке Мис-1. Двойная полоса от Ό86, наблюдавшаяся в клетках неЬа (и Т-47Э), может объясняться тем, что экспрессия Мис-1 управляется разными аллелями, имеющими различное число тандемных повторов.To verify that CA6 is located on Mis1, Ό86 immunoprecipitates from Caoν-3 lysate were subjected to 8E8-PACE and immunoblotting with Ό86 antibody or CM1 antibody to UIT Mis1. As can be seen from FIG. 6A, CM1 gives a strong reaction with a band> 250 kDa, immunoprecipitation of which causes Ό86. In FIG. 6B, the Ό86 and СМ1 immunoprecipitates from the neBa cell lysate exhibit the same double band> 250 kDa when immunoblotting with both Ό86 and СМ1. These results show that the CA6 epitope is indeed localized to the Mis-1 protein. The double band from Ό86 observed in HeLa (and T-47E) cells can be explained by the fact that the expression of Mis-1 is controlled by different alleles with different numbers of tandem repeats.
Несмотря на то что СМ1 и Ό86 связываются с одним и тем же белком Мис-1, они являются разными эпитопами. Химическое дегликозилирование дот-блотов лизата Саоν-3 с помощью трифторметансульфоновой кислоты (ТЕМ8А) устраняло сигнал Ό86 (фиг. 3). Однако та же обработка усиливала сигнал СМ1. Видимо, дегликозилирование выявило скрытые эпитопы для антитела СМ1. Более того, сравнение результатов по связыванию Ό86 и СМ1 методом проточной цитометрии (табл. 4) показывает, что эпитоп СА6 существует не на всех клетках, экспрессирующих Мис1. Интересно то, что эпитоп СА6 не экспрессируется на клетках линии Со1о205 (табл. 3), у которых на высоком уровне экспрессируется сиалогликотоп СапАд Мис1.Despite the fact that CM1 and Ό86 bind to the same Mis-1 protein, they are different epitopes. Chemical deglycosylation of dot blots of Caoν-3 lysate with trifluoromethanesulfonic acid (TEM8A) eliminated signal Ό86 (Fig. 3). However, the same processing amplified the CM1 signal. Apparently, deglycosylation revealed latent epitopes for the CM1 antibody. Moreover, a comparison of the results of binding of Ό86 and CM1 by flow cytometry (Table 4) shows that the CA6 epitope does not exist on all cells expressing Mis1. Interestingly, the CA6 epitope is not expressed on cells of the Co1O205 line (Table 3), in which the sialoglycotope SapAD Ad Mis1 is expressed at a high level.
- 27 020130- 27 020130
Таблица 4Table 4
* среднее значение максимальной относительной флуоресценции* average value of maximum relative fluorescence
Пример 4. Количественный анализ сбрасываемого эпитопа СА6Example 4. Quantitative analysis of discarded epitope CA6
Поскольку эпитоп СА6 располагается на молекуле Мис1, которая сбрасывается в кровоток у многих больных раком, то был предпринят количественный подход с целью определения того, не помешает ли такой уровень терапии с помощью антитела Ό86. Связывание циркулирующего антитела с антигеном обычно ведет к быстрому выведению таких комплексов из крови. Если значительная доля введенной дозы антитела быстро удаляется из кровотока, то уменьшится количество, достигающее опухоли, что приведет к снижению противоопухолевой активности терапевтического антитела. При конъюгировании антитела с сильнодействующим цитотоксическим соединением быстрый клиренс конъюгата способен повысить неспецифическую токсичность. Таким образом, в случае таких конъюгатов антител с небольшими веществами, как Ό86-ΌΜ1, можно ожидать, что высокий уровень сбрасываемого антигена вызовет снижение противоопухолевого эффекта и повышение ограничивающей дозировку токсичности.Since the CA6 epitope is located on the Mis1 molecule, which is discharged into the bloodstream in many cancer patients, a quantitative approach was taken to determine whether this level of therapy with the Ό86 antibody would interfere. The binding of a circulating antibody to an antigen usually leads to the rapid removal of such complexes from the blood. If a significant portion of the administered dose of the antibody is rapidly removed from the bloodstream, the amount reaching the tumor will decrease, which will lead to a decrease in the antitumor activity of the therapeutic antibody. When conjugating antibodies with potent cytotoxic compounds, rapid clearance of the conjugate is able to increase nonspecific toxicity. Thus, in the case of conjugates of antibodies with small substances such as Ό86-ΌΜ1, it can be expected that a high level of discharged antigen will cause a decrease in the antitumor effect and an increase in dosage-limiting toxicity.
Недавние клинические испытания терапевтических антител дали информацию о влиянии концентрации сбрасываемого антигена на фармакокинетику. Например, при клинических испытаниях антитела трастузумаб (НегсерИп), используемого для лечения экспрессирующего Ьег2/пеи метастазирующего рака молочной железы, фармакокинетика трастузумаба не менялась, когда уровень сбрасываемого Ьег2/пеи составлял менее 500 нг/мл (Редгат е! а1., 1. С1т. Опсо1. 16(8): 2659-71 (1998)). При молекулярном весе Ьег2/пеи 110 000 дальтон молярная концентрация сбрасываемого Ьег2/пеи менее 4,5 нМ почти не влияет на фармакокинетику.Recent clinical trials of therapeutic antibodies have provided information on the effect of dumped antigen concentration on pharmacokinetics. For example, in clinical trials of the trastuzumab antibody (NegSerIp), used to treat metastatic breast cancer expressing Le2 / pei, the pharmacokinetics of trastuzumab did not change when the level of discharged Le2 / pei was less than 500 ng / ml (Redgate e! A1., 1. C1 Opsoi. 16 (8): 2659-71 (1998)). With a molecular weight of Lb2 / pei of 110,000 daltons, the molar concentration of the discharged Lb2 / pei of less than 4.5 nM has almost no effect on pharmacokinetics.
В другом примере клинические испытания кантузумаб-мертансина (ЬиС242-ЭМ1) показали отсутствие корреляции между уровнем сбрасываемого СапАд (эпитопа С242) перед обработкой и фармакокинетикой клиренса антител (То1сЬег е! а1., 1. С1т. Опсо1. 21(2): 211-22 (2003)). Эпитоп СапАд, как и эпитоп СА6, распознаваемый Ό86, является уникальным опухолеспецифичным О-связанным сиалогликотопом на Мис1. Однако гетерогенность эпитопа СапАд затрудняет его количественное определение в молях. В генеральной популяции аллели Мис1 имеют разную длину в зависимости от числа тандемных повторов в домене с вариабельным числом тандемных повторов (УКГК). В каждом тандемном повторе имеется несколько сайтов О-гликозилирования. Сложности экспрессии СапАд способствует и колебания уровня собственной гликозилтрансферазной активности от клетки к клетке. Таким образом, даже у одного и того же пациента возможен широкий интервал числа эпитопов СапАд на молекуле Мис1. Более того, число эпитопов СапАд на одной молекуле Мис1 будет разным по всей популяции пациентов. По этой причине уровень сбрасываемого СапАд в образцах сыворотки измеряют методом сэндвич-ЕЬ18А, в котором сброшенный Мис1 с эпитопом СапАд фиксируется на С242 и детектируется при помощи системы биотинилированное антитело С242/стрептавидин-НКР. Сброшенный СапАд количественно выражают в стандартных единицах (ед.), пропорциональных количеству эпитопов на 1 мл сыворотки, а не в виде молярной концентрации Мис1. По аналогии такая же ситуация возникает и при количественном определении сброшенных эпитопов СА6. Напротив, у трастузумаба есть только один эпитоп на одну сбрасываемую молекулу Ьег2/пеи, что сильно упрощает количественное определение сбрасываемого антигена.In another example, clinical trials of cantuzumab-mertansin (LiC242-EM1) showed a lack of correlation between the level of discharged CAPAd (C242 epitope) before treatment and the pharmacokinetics of antibody clearance (Toccib e! A1., 1. CIt. Opso1. 21 (2): 211- 22 (2003)). The SapAD epitope, like the CA6 epitope recognized by Ό86, is a unique tumor-specific O-linked sialoglycotope on Mis1. However, the heterogeneity of the SapAD epitope makes it difficult to quantify it in moles. In the general population, Mis1 alleles have different lengths depending on the number of tandem repeats in a domain with a variable number of tandem repeats (CCGC). Each tandem repeat has several O-glycosylation sites. Difficulties in the expression of SapAd also contribute to fluctuations in the level of intrinsic glycosyl transferase activity from cell to cell. Thus, even in the same patient, a wide range of the number of SapAd epitopes on the Mis1 molecule is possible. Moreover, the number of SapAD epitopes on one Misc1 molecule will be different throughout the patient population. For this reason, the level of discharged SapAD in serum samples is measured by the E18A sandwich method, in which the discharged Mis1 with the SapAD epitope is fixed on C242 and detected by the biotinylated C242 / streptavidin-NKR antibody system. Dropped SapAD is quantitatively expressed in standard units (units), proportional to the number of epitopes per 1 ml of serum, and not as a molar concentration of Mis1. By analogy, the same situation arises in the quantification of discarded epitopes of CA6. In contrast, trastuzumab has only one epitope per one discharged Leb2 / pei molecule, which greatly simplifies the quantification of the discharged antigen.
Для того, чтобы установить связь между уровнем сбрасываемого эпитопа СА6 и уровнем, выявленным при клинических испытаниях трастузумаба и кантузумаб-мертансина, был разработан метод получения молярных концентраций таких сложных сбрасываемых эпитопов, как сиалогликотопы на Мис1. Во-первых, была составлена простая методика сэндвич-ЕЫ8А на Ό86. Схема метода представлена на фиг. 7А. Для фиксации Мис1 с эпитопом СА6 использовали Ό86. Поскольку каждая молекула Мис1 содержит несколько эпитопов СА6, то еще использовали биотинилированное антитело Ό86 в качестве трейсера. Биотинилированное Ό86, связавшееся с фиксированным СА6, детектировали с помощью стрептавидин-НКР, используя в качестве субстрата АВТ8. Эпитоп СА6 фиксировали из сыворотки больных раком яичников или из стандартов, полученных из коммерчески доступного набора для теста на Мис1 (СА15-3), который применяется для мониторинга сбрасываемого Мис1 у больных раком молочной железы. Содержание Ό86 в единицах на мл было произвольно приравнено к содержанию стандартов СА15-3 в единицах на мл.In order to establish a relationship between the level of dumped epitope CA6 and the level detected during clinical trials of trastuzumab and cantuzumab-mertansin, a method was developed for obtaining molar concentrations of such complex dumped epitopes as sialoglycotopes on Mis1. Firstly, a simple sandwich-ЕЫ8А methodology at Ό86 was compiled. The method diagram is shown in FIG. 7A. Фик86 was used to fix Mis1 with the CA6 epitope. Since each Mys1 molecule contains several CA6 epitopes, the Ό86 biotinylated antibody was also used as a tracer. Biotinylated Ό86 bound to fixed CA6 was detected using streptavidin-NKR using ABT8 as a substrate. The CA6 epitope was fixed from the serum of patients with ovarian cancer or from standards obtained from a commercially available MIS1 test kit (CA15-3), which is used to monitor the discharged MIS1 in patients with breast cancer. The content of Ό86 in units per ml was arbitrarily equated to the content of CA15-3 standards in units per ml.
На фиг. 7В представлены результаты метода сэндвич-ЕЬ18А на Ό86, для которых использовалиIn FIG. 7B presents the results of the sandwich-E18A method on Ό86, for which we used
- 28 020130 стандарты СА15-3. Полученная кривая очень близка к кривой, полученной со стандартами СА15-3 при определении СА15-3. Для того, чтобы перевести содержание Ό86 в единицах на мл в молярную концентрацию СА6, необходима стандартная кривая для биотинилированного Ό86, на которой сигнал переводится в пикограммы Ό86. При условии, что стехиометрия между эпитопом СА6 и биотинилированным Ό86 равна 1:1, а молекулярный вес биотинилированного Ό86 равен 160000 Да, можно рассчитать количество молей фиксированного СА6 в одном объеме внесенного образца.- 28 020130 CA15-3 standards. The resulting curve is very close to the curve obtained with CA15-3 standards when determining CA15-3. In order to convert the Ό86 content in units per ml to the molar concentration of CA6, a standard curve for biotinylated Ό86 is needed, on which the signal is converted to пик86 picograms. Provided that the stoichiometry between the CA6 epitope and the biotinylated Ό86 is 1: 1, and the molecular weight of the biotinylated Ό86 is 160,000 Da, the number of moles of fixed CA6 in one volume of the introduced sample can be calculated.
На фиг. 8А и В представлены два альтернативных способа получения стандартной кривой для биотинилированного Ό86. На фиг. 8А для фиксации биотинилированного Ό86 использовали козье поликлональное антитело против 1дС мыши, которое в свою очередь детектировали способом, идентичным тому, который использовался в методе сэндвич-ЕЬ18А на фиг. 7. В методе, представленном на фиг. 8В, биотинилированное Ό86 вносили непосредственно на планшет для ЕЫ8А и детектировали, как на фиг. 8А. Как видно из фиг. 8С, стандартные кривые для биотинилированного Ό86, полученные каждым способом, хорошо совпадают друг с другом.In FIG. 8A and B show two alternative methods for producing a standard curve for biotinylated Ό86. In FIG. 8A, a goat polyclonal antibody against mouse 1dC was used to fix biotinylated Ό86, which in turn was detected by a method identical to that used in the sandwich-E18A method in FIG. 7. In the method of FIG. 8B, biotinylated Ό86 was applied directly to the E8A plate and detected as in FIG. 8A. As can be seen from FIG. 8C, the standard curves for biotinylated Ό86 obtained by each method are in good agreement with each other.
В табл. 5 представлен анализ образцов сыворотки больных раком яичников на различные сбрасываемые антигены. Метод ЕЫ8А на СА125 обычно применяется для мониторинга лечения больных раком яичников путем измерения сбрасываемого СА125 в единицах на мл. Содержание СА125 было проставлено на образцах сыворотки. Метод ЕБ18А на СА15-3 обычно применяется для мониторинга лечения больных раком молочной железы путем измерения сбрасываемого Мис1 в единицах на мл с помощью фиксирующего и детектирующего антител, распознающих эпитопы, отличные от тех, которые распознает Ό86. В табл. 5 измеряли СА15-3 в образцах сыворотки больных раком яичников.In the table. Figure 5 presents the analysis of serum samples from patients with ovarian cancer for various discharged antigens. The EA8A method on CA125 is usually used to monitor the treatment of patients with ovarian cancer by measuring the discharged CA125 in units per ml. The CA125 content was affixed to serum samples. The EB18A method on CA15-3 is usually used to monitor the treatment of patients with breast cancer by measuring the discharged Mis1 in units per ml using fixing and detecting antibodies that recognize epitopes other than those recognized by Ό86. In the table. 5 measured CA15-3 in serum samples of patients with ovarian cancer.
Таблица 5Table 5
Определяли с помощью набора для ЕБ18АDetermined using the kit for EB18A
Определяли по коммерческим стандартам СА15-3 (1 ед. СА15-3 = 1 ед. Ό86) 3 стандартная кривая, козье антитело к 1дС мыши + биотин-086 4стандартная кривая, биотин-086Determined according to commercial standards CA15-3 (1 unit CA15-3 = 1 unit Ό86) 3 standard curve, goat antibody to mouse 1dC + biotin-086 4 standard curve, biotin-086
Для значений СА15-3, приведенных в табл. 5, использовали коммерчески доступный набор для иммуноферментного анализа СА15-3 от СаиАд О|адио511с5. Для значений 086 в единицах на мл стандартную кривую составляли, используя стандарты СА15-3 (из набора для иммуноферментного анализа СА153 от СаиАд ПхадиокЕск) методом сэндвич-ЕЬ18А. 086 в единицах на мл произвольно приравняли к единицам СА15-3 на мл. В двух последних столбцах рассчитано содержание сбрасываемого СА6 в пикомолях (пМ) по стандартным кривым для биотинилированного 086, приведенным на фиг. 8С.For CA15-3 values given in table. 5, a commercially available CA15-3 enzyme-linked immunosorbent assay kit from Ca-Ad O | aido511c5 was used. For values of 086 in units per ml, the standard curve was compiled using CA15-3 standards (from the CA153 enzyme-linked immunosorbent assay kit from SaiAd Phadiocesc) using the E18A sandwich method. 086 in units per ml was arbitrarily equated to units CA15-3 per ml. In the last two columns, the content of discharged CA6 in picomoles (PM) was calculated using the standard curves for biotinylated 086 shown in FIG. 8C.
Для количественного анализа уровня СаиАд использовали данные по уровню СаиАд в сыворотке у пациентов, принимавших участие в клиническом испытании кантузумаб-мертансина перед лечением (То1с11ег е1 а1., I. С1т. Опсо1. 21(2): 211-22 (2003)). Для составления стандартной кривой по стандартам СаиАд использовали методику ЕБ18А, аналогичную той, что описана для 086. Для фиксации стандартов СаиАд использовали С242. Фиксированный СаиАд детектировали с помощью биотинилированного антитела-трейсера С242, а затем проявляли с помощью стрептавидин-НКР, используя в качестве субстрата АВТ8. Стандартную кривую для биотинилированного С242 составляли так же, как и для биотинилированного 086, что дало возможность перевести единицы/мл в молярные концентрации циркулирующих эпитопов СаиАд. В табл. 6 приведены уровни СаиАд у пациентов из клинического испытания кантузумаб-мертансина вместе с соответствующими рассчитанными молярными концентрациями циркулирующего СаиАд.For a quantitative analysis of the level of CaIIAD, we used data on the level of CaIIAD in the serum of patients who took part in the clinical trial of cantuzumab-mertansin before treatment (To1c11eg e1 a1., I. C1t. Opso1. 21 (2): 211-22 (2003)). To compile a standard curve according to SaiAd standards, the EB18A methodology was used, similar to that described for 086. C242 was used to fix SaiAd standards. Fixed CaIIAd was detected using a C242 biotinylated antibody tracer, and then developed using streptavidin-NKR using ABT8 as a substrate. The standard curve for biotinylated C242 was made in the same way as for biotinylated 086, which made it possible to convert units / ml to molar concentrations of circulating CaIIAD epitopes. In the table. Figure 6 shows the SaiAd levels in patients from the clinical trial of cantuzumab-mertansin, together with the corresponding calculated molar concentrations of circulating SaiAd.
- 29 020130- 29 020130
Таблица 6Table 6
'уровень циркулирующего СапАд до лечения, измеренный методом сэндвич-ЕЫ8Л Стандартная кривая, козье антитело к βίΐ мыши + биотин-С242 Стандартная кривая, биотин-С242'level of circulating SapAd before treatment, measured by the sandwich method E8L Standard curve, goat anti-mouse βίΐ antibody + Biotin-C242 Standard curve, Biotin-C242
Сравнение уровня сброшенного СА6 в пМ у больных раком яичников с рассчитанным уровнем СацАд у СаиЛд-положительных больных раком показывает, что в общем уровень сброшенного СА6 близок уровню сброшенного СаηЛд. Более того, только в 2 из 16 образцов сыворотки больных раком яичников уровень СЛ6 может превышать 4,5 нМ (образцы 5 и 9, у которых сигнал выходил за пределы стандартной кривой), то есть тот уровень, при превышении которого наблюдалось изменение фармакокинетики герцептина в клинических испытаниях у 11ег2/пеи-положительных больных раком молочной железы. Уровень СаηЛд свыше 4,5 нМ наблюдался только у 3 из 37 больных из клинического испытания. В этом клиническом испытании отсутствовала корреляция между уровнем сброшенного СаηЛд и более быстрым клиренсом кантузумаб-мертансина. Однако у больного с наиболее высоким уровнем СаηЛд (31240 ед./мл) образец был взят всего лишь через 8 ч после переливания крови. Эти результаты свидетельствуют, что хотя и происходит сброс некоторых эпитопов Μιιο1 типа СА6 и СаηЛд у больных раком, но на таком уровне, который не мешает терапевтическому применению антител.Comparison of the level of discharged CA6 in PM in patients with ovarian cancer with the calculated level of SADAd in CaLD-positive cancer patients shows that in general, the level of discharged CA6 is close to the level of discharged CaηЛд. Moreover, in only 2 out of 16 serum samples of patients with ovarian cancer, the level of SL6 can exceed 4.5 nM (samples 5 and 9, in which the signal went beyond the standard curve), that is, the level above which a change in the pharmacokinetics of herceptin was observed in clinical trials in 11g2 / pei-positive breast cancer patients. A CaηLd level in excess of 4.5 nM was observed in only 3 of 37 patients from the clinical trial. In this clinical trial, there was no correlation between the level of discharged CaηLd and the faster clearance of cantuzumab-mertansin. However, the patient with the highest level of CaηLd (31,240 units / ml) was sampled only 8 hours after blood transfusion. These results indicate that although some epitopes of Μιιο1 type CA6 and CaηLd are reset in cancer patients, they are at a level that does not interfere with the therapeutic use of antibodies.
Пример 6. Клонирование вариабельных областей мышиного антитела Ό86Example 6. Cloning of the variable regions of murine antibodies Ό86
Такие мышиные моноклональные антитела, как Ό86, имеют ограниченную полезность в клинической обстановке, так как иммунная система человека признает их чужими. У пациентов быстро вырабаMurine monoclonal antibodies, such as ,86, have limited utility in the clinical setting, as the human immune system recognizes them as strangers. Patients are quickly cut
- 30 020130 тываются человеческие противомышиные антитела (НАМА), что приводит к быстрому клиренсу мышиных антител. По этой причине вариабельную область мышиного И86 (тиИ86) подвергали поверхностной перестройке, чтобы получить гуманизованные антитела И86 (ЬиИ86).- 30 020130 human anti-mouse antibodies (NAMAs) are being thrown, which leads to a rapid clearance of mouse antibodies. For this reason, the variable region of murine I86 (TiI86) was subjected to surface rearrangement to obtain humanized antibodies of I86 (Lyu86).
Вариабельные области мышиного антитела И86 клонировали методом ОТ-ПЦР. Тотальный препарат РНК выделяли из достигшей конфлуэнтности колбы Т175 с клетками гибридомы И86 с помощью набора КЫеаву тЭшргер фирмы О|адеп. Концентрацию РНК определяли методом УФспектрофотометрии, а реакции обратной транскрипции (ОТ) проводили при 4-5 мкг тотальной РНК с помощью набора Еирегвспр! II фирмы СЛот и праймеров в виде рандомизованных гексамеров.The variable regions of the murine I86 antibody were cloned by RT-PCR. The total RNA preparation was isolated from the confluent T175 flask with I86 hybridoma cells using the Keeavu TESherger kit from O | adep. RNA concentration was determined by UV spectrophotometry, and reverse transcription (RT) reactions were carried out at 4-5 μg of total RNA using the Eiregprspr kit! Slot II company and primers in the form of randomized hexamers.
Реакции ПЦР проводили с вырожденными праймерами по типу тех, что описаны в \¥апд Ζ. е1 а1., I. Iттипο1. Ме11тобв, 1ап. 13, 233(1-2): 167-77 (2000). Для вырожденных реакций ПЦР использовали непосредственно реакционную смесь ОТ. Использовали 3'-праймер легкой цепи НтбКЬ:PCR reactions were performed with degenerate primers according to the type described in \ ¥ update Ζ. e1 a1., I. Type 1. Me11tobv, 1ap. 13, 233 (1-2): 167-77 (2000). For degenerate PCR reactions, the RT reaction mixture was used directly. Used 3'-primer light chain NTbK:
ТАТАОАОСТСААОСТтеОАТООТОООААОАТООАТАСАОТТОСТСС (8ЕЦ ГОTATAOAOASTAAOSTteOATOOTOOOAAOATOOATASAOOTTOSTSS (8EC GO
N0: 25) и З'-праймер тяжелой цепи Ват1§01: СОАООАТССАТАбАСАСАТСССОПТСТСОТ’ТТТОбС (8Е() ГО ΝΟ: 26), а для 5'-концевых реакций ПЦР использовали праймер 8ас1 МК:N0: 25) and W1 heavy chain 3'-primer §01: SOAOOATSSATABASASATSSSOPSTSTSOT’TTTObC (8E () GO ΝΟ: 26), and 8ac1 MK primer was used for 5'-terminal PCR reactions:
ОСОАССТССАУАТТОТСМТЗАСМСАГОУСТМСА (8Еф 10 N0: 27) для легкой цепи и равную смесь праймеров ЕсоЮМШ: СТТССООААТТСЗАКОТЦМАОС!С8АО8АОТС (8Еф ГО N0: 28) и ЕсоК1МН2: СТТССОЦААТТС8АКОТНМАОСТО8АО8АОТСтеО (8ЕЦ ПЭ N0: 29) для тяжелой цепи (смешанные основания: Н = А+Т+С, 8 = О+С, ¥ = С+Т, К = О+Т, М = А+С, К. = Л+6, = А+Т, V = А+С+О, N = А+Т+О+С).OSOASSTSSAAUATTOTSMTZASMSAGOUSTMSA (8Ef 10 N0: 27) for the light chain and an equal mixture of primers ЕСОУМШ: СТТССООААТТСЗАКОТЦМАОС! С8AO8AOTS (8еф ГО N0: 28) and ЕСОК1МН2: СТТССОСОТЭЦОТЦО8ТЦОТЦОТЦО8ТЦОТЦОТЦОТЦО8ТЦОТЦОТЦОТАТО8Т8О of base 8 + C, 8 = O + C, ¥ = C + T, K = O + T, M = A + C, K. = L + 6, = A + T, V = A + C + O, N = A + T + O + C).
Реакции ПЦР были стандартными за исключением того, что в них добавляли 10% ИМ8О (реакционная смесь на 50 мкл содержала в конечной концентрации: 1Х буфер для ПЦР (ΡοΟκ), по 2 мМ каждого бХТР, по 1 мМ каждого праймера, 2 мкл реакции ОТ, 5 мкл ИМ8О и 0,5 мкл Тас.| (ΡοΟκ). Реакции ПЦР проводили на термоциклере ΜΙ Яевеагсй по программе, адаптированной из \¥апд Ζ. е1 а1., Т Iтти№1. Μ^οάβ, 1ап 13, 233(1-2): 167-77 (2000): 1) 94°С, 3 мин; 2) 94°С, 15 с; 3) 45°С, 1 мин; 4) 72°С, 2 мин; 5) цикл из 29 повторов со стадии 2; 6) заключительная стадия наращивания при 72°С, 10 мин. Продукты ПЦР клонировали в рВ1иевспр1 II ЕК+ (Ейайдепе), используя сайты рестрикционных ферментов, созданные ПЦР-праймерами. Клоны тяжелой и легкой цепи секвенировали при помощи сервиса ЕесрупдЫ.PCR reactions were standard except that 10% IM8O was added to them (the reaction mixture per 50 μl contained the final concentration: 1X PCR buffer (ΡοΟκ), 2 mM of each bChTR, 1 mM of each primer, 2 μl of the RT reaction , 5 μl IM8O and 0.5 μl Tac. | (ΡοΟκ). PCR reactions were carried out on a thermal cycler ΜΙ Yaevaegs according to a program adapted from (1-2): 167-77 (2000): 1) 94 ° C, 3 min; 2) 94 ° C, 15 s; 3) 45 ° C, 1 min; 4) 72 ° C, 2 min; 5) a cycle of 29 repetitions from stage 2; 6) the final stage of building at 72 ° C, 10 min. PCR products were cloned into pB1ievspr II EC + (Eydepe) using restriction enzyme sites created by PCR primers. Clones of the heavy and light chains were sequenced using the Esrupda service.
Для проверки 5'-концевых последовательностей кДНК дополнительно проводили ПЦР и клонирование. Последовательностей кДНК легкой цепи и тяжелой цепи И86, определенные из вырожденных ПЦР-клонов, запускали на вебсайт NСΒI с поисковой программой В1ав1 и сохраняли последовательности мышиных антител с представленной сигнальной последовательностью. По этим сигнальным пептидам составляли праймеры для ПЦР, используя консервативные отрезки между родственными последовательностями ДНК. В праймеры для сигнальной последовательности вводили рестрикционные сайты ΕсοЯI (табл. 7) и использовали их при реакциях ОТ-ПЦР, как описано выше.To verify the 5'-terminal cDNA sequences, PCR and cloning were additionally performed. The I86 light chain and heavy chain cDNA sequences determined from degenerate PCR clones were run on the NСΒI website with the B1av1 search program and the mouse antibody sequences with the presented signal sequence were saved. For these signal peptides, PCR primers were constructed using conserved segments between related DNA sequences. SCoJI restriction sites were introduced into the primers for the signal sequence (Table 7) and used in RT-PCR reactions as described above.
Таблица 7. Вырожденные праймеры для сигнальной последовательности И86Table 7. Degenerate primers for the I86 signal sequence
Секвенировали несколько индивидуальных клонов легкой и тяжелой цепи, чтобы выявить и устранить возможные ошибки в последовательности, внесенные полимеразой. Была получена только одна последовательность для клонов легкой цепи и тяжелой цепи при ОТ-ПЦР. Этого было достаточно, чтобы составить праймеры, способные амплифицировать последовательности легкой и тяжелой цепи мышиного И86, простирающиеся до сигнальной последовательности. Последующие клоны из этих дополнительных реакций ПЦР подтвердили 5'-концевые последовательности вариабельной области, которые были искажены первоначальными вырожденными праймерами. Совокупные результаты из различных клонов кДНК дали окончательные последовательности легкой и тяжелой цепи мышиного И86, приведенные на фиг. 9. Используя правила Кабата и определения ΑΒΜ, были идентифицированы три участка СИЯ легкой цепи и тяжелой цепи (фиг. 9 и 10). Поиск в базе данных ^Β^βΙ NСВI показал, что вариабельная область легкой цепи антитела тиИ86, скорее всего, происходит из мышиного эмбрионального гена ^Ук ар4, а вариабельная область тяжелой цепи, скорее всего, происходит из мышиного эмбрионального гена ^УЪ 1558.41 (фиг. 11).Several individual light and heavy chain clones were sequenced to identify and eliminate possible sequence errors introduced by polymerase. Only one sequence was obtained for clones of the light chain and heavy chain in RT-PCR. This was enough to make up primers capable of amplifying the murine I86 light and heavy chain sequences extending to the signal sequence. Subsequent clones from these additional PCR reactions confirmed the 5'-terminal sequences of the variable region, which were distorted by the initial degenerate primers. The combined results from various cDNA clones gave the final murine I86 light and heavy chain sequences shown in FIG. 9. Using the Kabat rules and definitions of ΑΒΜ, three sections of the SIA of the light chain and heavy chain were identified (Figs. 9 and 10). A search in the database ^ Β ^ βΙ NСВI showed that the variable region of the light chain of the TiI86 antibody most likely comes from the mouse embryonic gene ^ Yk ar4, and the variable region of the heavy chain most likely comes from the mouse embryonic gene ^ YB 1558.41 (Fig. . eleven).
Пример 7. Определение поверхностных остатков вариабельных областей антитела И86Example 7. Determination of surface residues of the variable regions of the antibody I86
Методы перестройки поверхности антител, описанные в Ребегаеп е1 а1. (1994) и ΡοβΗβΚη е1 а1. (1996), начинаются с прогнозирования поверхностных остатков вариабельных областей мышиного антитела. Поверхностный остаток определяется как такая аминокислота, у которой по меньшей мере 30% общей площади поверхности доступно для молекул воды. В отсутствие готовой структуры для поиска поверхностных остатков тиИ86 мы провели сопоставление 10 антител с наиболее гомологичными последовательностями в группе из 127 файлов структур антител (фиг. 12). Для этих совмещенных последовательAntibody surface remodeling methods described in Rebegaep e1 a1. (1994) and ΡοβΗβΚη e1 a1. (1996), begin by predicting the surface residues of the variable regions of a murine antibody. A surface residue is defined as such an amino acid in which at least 30% of the total surface area is accessible to water molecules. In the absence of a ready-made structure for the search for surface residues of TI86, we compared 10 antibodies with the most homologous sequences in the group of 127 antibody structure files (Fig. 12). For these combined follower
- 31 020130 ностей усредняли доступность для растворителя по каждому положению Кабата (фиг. 13А и В).Поверхностные положения со средним значением доступности между 25% и 35% подвергали второму циклу анализа путем сравнения подгруппы антител, содержащих два идентичных остатка с каждой стороны (фиг. 13А и В). После второго цикла анализа число предполагаемых поверхностных остатков тяжелой цепи 1Ш1О86 возросло с 21 до 23, при этом в список остатков, у которых расчетная поверхностная доступность составила более 30%, вошли Туг3 и Ьу823. В большей части наших поверхностноперестроенных антител использовалось определение Кабата для СОВ1 тяжелой цепи, но при расчетах для Ό86 нечаянно было использовано определение АЬМ, поэтому остаток Т28 тяжелой цепи не попал под определение поверхностного остатка каркасного района, как это могло бы быть в ином случае. Число поверхностных остатков легкой цепи уменьшилось из 16 до 15, так как расчетная поверхностная доступность А1а80 снизилась с 30,5 до 27,8% во втором цикле анализа. В целом вариабельные области тяжелой и легкой цепи тиО86 содержат 38 предполагаемых доступных с поверхности каркасных остатков.- 31 020130 sites averaged the availability for the solvent for each position of Kabat (Figs. 13A and B). Surface positions with an average value of availability between 25% and 35% were subjected to the second analysis cycle by comparing a subset of antibodies containing two identical residues on each side (Fig. . 13A and B). After the second analysis cycle, the number of putative surface residues of the 1H1O86 heavy chain increased from 21 to 23, while the list of residues with estimated surface availability of more than 30% included Ty3 and Li823. In most of our surface-converted antibodies, the Kabat definition for the SOB1 heavy chain was used, but in the calculations for Ό86 the definition of ABM was inadvertently used, therefore, the T28 residue of the heavy chain did not fall under the definition of the surface residue of the frame region, as it could otherwise be. The number of surface residues of the light chain decreased from 16 to 15, since the calculated surface availability of A1a80 decreased from 30.5 to 27.8% in the second analysis cycle. In general, the variable regions of the heavy and light chains of thiO86 contain 38 putative residues accessible from the surface of the frame.
Пример 8. Выбор антител человекаExample 8. The choice of human antibodies
Поверхностные положения вариабельной области мышиного Ό86 сравнивали с соответствующими положениями последовательностей антител человека в базе данных Кабата (1оЬи8ои С., \¥и ТТ. М.1с1е1с Ас1б8 Ве8. 1аи. 1, 29(1): 205-6 (2001). С помощью программы 8В (8еаг1е, 1998) для управления базой данных по антителам извлекали и совмещали поверхностные остатки тяжелой и легкой цепи из естественных пар антител человека. Для замены поверхностных остатков вариабельной области мышиного антитела Ό86 была выбрана поверхность вариабельной области антител человека с наиболее идентичными остатками на поверхности, при этом особое внимание уделялось положениям, находящимся в пределах 5А от СОВ.The surface positions of the murine variable region of Ό86 were compared with the corresponding positions of the human antibody sequences in the Kabat database (1oBi8oi S., \ ¥ and TT. M.1c1e1s As1b8 Be8. 1ai. 1, 29 (1): 205-6 (2001). Using the 8B program (8eag1e, 1998), the surface residues of the heavy and light chains were extracted and combined from natural pairs of human antibodies to manage the antibody database. To replace the surface residues of the variable region of murine antibody No. 86, the surface of the variable region of human antibodies with the most dentichnymi residues on the surface, with a special focus on the provisions that are within 5A of the COB.
Пример 9. Экспрессионный вектор для химерных и гуманизованных антителExample 9. Expression vector for chimeric and humanized antibodies
Парные последовательности легкой и тяжелой цепи клонировали в один и тот же экспрессионный вектор для млекопитающих. С помощью ПЦР-праймеров для вариабельных участков человека создавали рестрикционные сайты, позволяющие вставить сигнальную последовательность человека в клонирующий вектор рВ1ие8спр! II. После этого можно было клонировать вариабельные участки в экспрессионную плазмиду для млекопитающих с помощью ЕсοВI и В81^[ или НтбШ и АраI для легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно (фиг. 14). Вариабельные участки легкой цепи клонировали в одной рамке считывания с константной областью каппа ЦС человека, а вариабельные участки тяжелой цепи клонировали в последовательность константной области человека. В окончательных экспрессионных плазмидах экспрессия последовательностей кДНК легкой и тяжелой цепи управляется промоторами СМV человека.Paired light and heavy chain sequences were cloned into the same mammalian expression vector. Using PCR primers, restriction sites were created for human variable regions, which made it possible to insert the human signal sequence into the cloning vector pB1ie8spr! II. After that, it was possible to clone the variable regions into an expression plasmid for mammals using EcoBI and B81 ^ [or HtbS and AraI for the light chain and heavy chain, respectively (Fig. 14). The variable regions of the light chain were cloned in the same reading frame as the constant region of the kappa of human CS, and the variable regions of the heavy chain were cloned into the sequence of the constant region of the person. In the final expression plasmids, expression of the light and heavy chain cDNA sequences is driven by human CMV promoters.
Пример 10. Идентификация остатков, способных отрицательно повлиять на активность Ό86Example 10. Identification of residues that could adversely affect the activity of Ό86
В большинстве случаев гуманизации вплоть до настоящего времени строили молекулярную модель рассматриваемого антитела, чтобы идентифицировать остатки, находящиеся вблизи от СИВ, как возможные проблемные остатки. При все возрастающем количестве поверхностно-перестроенных антител для работы исторический опыт оказывается не менее эффективным для прогнозирования проблем, чем построение модели, поэтому для Ό86 не создавали никаких молекулярных моделей. Вместо этого поверхностные остатки Ό86 мыши сравнивали с остатками у ранее полученных поверхностноперестроенных антител и идентифицировали остатки, способные с низкой или высокой степенью риска повлиять на связывающую активность антитела. В доступных разрешенных структурах антител и молекулярных моделях от предыдущих случаев гуманизации неоднократно идентифицировались сходные группы остатков, находящиеся в пределах 5А от СИВ. Используя эти данные, в табл. 1 приведены остатки Ό86 мыши, которые могут находиться вблизи от и даже в пределах 5А от СИВ. Многие из этих положений подвергались замене и в предыдущих случаях гуманизации, но только лишь положение 74 в тяжелой цепи вызывало потерю связывающей активности.In most cases of humanization, until now, a molecular model of the antibody in question has been built to identify residues located close to the SIV as possible problem residues. With an ever-increasing number of surface-rearranged antibodies for work, historical experience is no less effective for predicting problems than building a model, so no molecular models were created for Ό86. Instead, mouse Ό86 surface residues were compared with residues from previously obtained surface-rearranged antibodies and residues capable of affecting the binding activity of the antibody were identified with a low or high risk. In the available resolved antibody structures and molecular models from previous cases of humanization, similar groups of residues within 5A of the SIW were repeatedly identified. Using these data, in table. Figure 1 shows the remnants of Ό86 mice, which can be close to and even within 5A of the SIV. Many of these positions were replaced in previous cases of humanization, but only position 74 in the heavy chain caused a loss of binding activity.
Мышиный остаток был оставлен в этой позиции у 1шС242 и 1шВ4 с тем, чтобы сохранить связывающую активность антитела мыши. С другой стороны, то же самое вложение подвергали замене на соответствующий остаток человека у гуманизованного 6.2С5С6 без потери активности (6.2С5С6 является антителом против ЮЕ1-В и часто именуется анти-С6). Хотя любой из остатков в табл. 1 может вызывать проблемы с гуманизованным антителом, но особое внимание следует уделять остатку Р73 из-за предыдущего опыта по этой позиции.The murine residue was left in this position at 1шС242 and 1шВ4 in order to preserve the binding activity of the mouse antibody. On the other hand, the same attachment was replaced with the corresponding human residue in the humanized 6.2C5C6 without loss of activity (6.2C5C6 is an anti-SEE-B antibody and is often referred to as anti-C6). Although any of the residues in the table. 1 may cause problems with a humanized antibody, but particular attention should be paid to the P73 residue due to previous experience with this position.
Пример 11. Выбор наиболее гомологичной поверхности антител человекаExample 11. The choice of the most homologous surface of human antibodies
Кандидатов на перестройку поверхности тиО86 из поверхностей антител человека извлекали из базы данных Кабата по последовательностям антител при помощи программы 8В. Эта программа служит интерфейсом для поиска только определенных положений остатков по всей базе данных антител. Чтобы сохранить естественные пары, поверхностные остатки легких и тяжелых цепей сравнивали вместе. Наиболее гомологичные поверхности антител человека из базы данных Кабата выстраивали по степени идентичности последовательностей. Верхние 3 поверхности при совмещении их программой 8В базы данных Кабата представлены в табл. 2. Затем эти поверхности сравнивали с целью идентификации тех поверхностей человека, которые требуют наименьших замен по остаткам, приведенным в табл. 1. Антитело 28Е4 против ВЦО) (Воисйег е! а1., 1997) требует наименьшего числа замен поверхностных остатков (всего 11), причем только 3 из них входят в список вероятных проблемных остатков. Поскольку антителоCandidates for the reconstruction of the surface of TiO86 from the surfaces of human antibodies were extracted from the Kabat database of antibody sequences using program 8B. This program serves as an interface for searching only certain positions of residues in the entire antibody database. To preserve natural vapors, surface residues of light and heavy chains were compared together. The most homologous surfaces of human antibodies from the Kabat database were built according to the degree of sequence identity. The top 3 surfaces when combined with the 8B program of the Kabat database are presented in table. 2. Then these surfaces were compared in order to identify those human surfaces that require the smallest substitutions according to the residues given in table. 1. Antibody 28E4 against VCO) (Voiseje e! A1., 1997) requires the least number of substitutions of surface residues (11 in total), and only 3 of them are on the list of probable problem residues. Because the antibody
- 32 020130- 32 020130
28Е4 человека обладает наиболее гомологичной поверхностью, оно и является самым лучшим кандидатом для поверхностной перестройки тиЭ86.Human 28E4 has the most homologous surface, and it is the best candidate for surface reorganization of thie86.
Пример 12. Конструирование последовательностей ДНК для гуманизованных антител Ό86Example 12. Construction of DNA sequences for humanized antibodies Ό86
Замены 11 поверхностных остатков у Ό86 осуществляли методом ПЦР-мутагенеза. ПЦР-мутагенез выполняли на клонах кДНК вариабельной области мышиного Ό86 для создания гена поверхностноперестроенного Ό86 человека. Чтобы произвести аминокислотные замены, необходимые для поверхностноперестроенного Ό86, составили набор праймеров для гуманизации, представленный ниже в табл. 8.Substitutions of 11 surface residues in Ό86 were carried out by PCR mutagenesis. PCR mutagenesis was performed on cDNA clones of the murine Ό86 variable region to create the surface-modified Ό86 human gene. To make the amino acid substitutions necessary for the surface-rearranged Ό86, we compiled a set of primers for humanization, presented below in table. 8.
Таблица 8Table 8
Реакции ПЦР были стандартными за исключением того, что в них добавляли 10% ΌΜ8Ο (реакционная смесь на 50 мкл содержала в конечной концентрации: 1Х буфер для ПЦР (Косйе), по 2 мМ каждого бЭТР, по 1 мМ каждого праймера, 100 нг матрицы, 5 мкл ΌΜ8Ο и 0,5 мкл Тад (Косйе). ПЦР проводили на термоциклере Μι Кезеагсй по следующей программе: 1) 94°С, 1 мин; 2) 94°С, 15 с; 3) 55°С, 1 мин; 4) 72°С, 1 мин; 5) цикл из 29 повторов со стадии 2; 6) заключительная стадия наращивания при 72°С, 4 мин. Продукты ПЦР расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами и клонировали в клонирующие векторы рВ1иезсг1р!. Клоны секвенировали для подтверждения аминокислотных замен.PCR reactions were standard except that 10% ΌΜ 8Ο was added to them (the reaction mixture per 50 μl contained the final concentration: 1X PCR buffer (Cosje), 2 mM of each BETR, 1 mM of each primer, 100 ng of the matrix, 5 μl ΌΜ8Ο and 0.5 μl Tad (Kosye). PCR was performed on a Μι Kezeagse thermal cycler according to the following program: 1) 94 ° C, 1 min; 2) 94 ° C, 15 s; 3) 55 ° C, 1 min; 4) 72 ° C, 1 min; 5) a cycle of 29 repetitions from stage 2; 6) the final stage of building at 72 ° C, 4 min. PCR products were digested with the appropriate restriction enzymes and cloned into the cloning vectors pB1ezsg1p !. Clones were sequenced to confirm amino acid substitutions.
Поскольку замена остатка Р73 тяжелой цепи вызывала проблемы в прошлом, то создавали варианта тяжелой цепи, один с Т73 из 28Е4 человека и другой, сохраняющий Р73 мыши. Остальные 10 поверхностных остатков заменяли из мышиных на остатки из 28Е4 человека у обоих вариантов гуманизованного Ό86 (табл. 2). Придерживаясь обычного способа наименования, наиболее гуманизованным является вариант 1.0, так как он содержит все 11 остатков из поверхности человека. Вариант тяжелой цепи, у которого остается Р73 мыши, получил название вариант 1.2 на тот случай, если потребуются другие варианты, так что вариант 1.1 зарезервирован для варианта, содержащего максимальное число мышиных остатков. Аминокислотные последовательности двух гуманизованных вариантов представлены совмещенными с аминокислотной последовательностью Ό86 мыши на фиг. 15А и В. Последовательности кДНК и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизованных вариантов 1.01 и 1.21 одинаковы и представлены на фиг. 16. Последовательности кДНК и аминокислотные последовательности тяжелой цепи гуманизованных вариантов 1.01 и 1.21 представлены на фиг. 17А и В.Since replacing the P73 residue of the heavy chain caused problems in the past, a heavy chain variant was created, one with T73 from 28E4 human and the other retaining mouse P73. The remaining 10 surface residues were replaced from murine by residues from 28E4 human in both variants of humanized Ό86 (Table 2). Adhering to the usual way of naming, the most humanized option is 1.0, since it contains all 11 residues from the surface of a person. The heavy chain variant in which P73 of the mouse remains is called variant 1.2 in case other variants are required, so variant 1.1 is reserved for the variant containing the maximum number of mouse residues. The amino acid sequences of the two humanized variants are shown to be aligned with the amino acid sequence No. 86 of the mouse in FIG. 15A and B. The cDNA sequences and amino acid sequences of the light chain variable region of the humanized variants 1.01 and 1.21 are the same and are shown in FIG. 16. The cDNA sequences and amino acid sequences of the heavy chain of the humanized variants 1.01 and 1.21 are shown in FIG. 17A and B.
Пример 13. Экспрессия в клетках СНО и выделение йиО86 и измерение аффинностиExample 13. Expression in CHO cells and isolation of iO86 and measurement of affinity
Для определения того, сохранили ли гуманизованные варианты Ό86 аффинность связывания тнЭ86. необходимо было экспрессировать и очистить антитела. Клетки СНО устойчиво трансфецировали химерным вариантом Ό86 (сйО86), содержащим константную область человека и вариабельную область мыши, либо ΗπΌ86ν1.01 или ΗπΌ86ν1.21.To determine whether the humanized variants of Ό86 retained the binding affinity of tnE86. it was necessary to express and purify antibodies. CHO cells were stably transfected with the Ό86 chimeric variant (ccO86) containing the human constant region and mouse variable region, either ΗπΌ86ν1.01 or ΗπΌ86ν1.21.
Клетки СНО ЭС44 (4,32х106 клеток на чашку) высеивали на чашки диаметром 15 см в неселективной среде (α-МЕМ + нуклеотиды (С1Ьсо) с добавлением 4 мМ Ь-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10% РВ8) и помещали в увлажнительный инкубатор при 37°С, 5% СО2. На следующий день клетки трансфецировали несущей сйО86 экспрессионной плазмидой по модифицированной версии методики Ро1уГес! ТгапзГесйоп, рекомендованной фирмой 01адеп. Из клеток отсасывали неселективную среду. Чашки промывали 7 мл подогретого (37°С) РВ8 и снова заполняли 20 мл неселективной среды. Плазмидную ДНК (11 мкг) разводили 800 мкл среды НуЬпбота 8ΡΜ (С1Ьсо). Затем в смесь ДНК/8ΡΜ добавляли 70 мкл реагента Ро1уГес! (01адеп). После этого смесь осторожно обрабатывали на вибрационной мешалке и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. В смесь добавляли неселективную среду (2,7 мл). Эту конечную смесь инкубировали с клетками на чашке в течение 24 ч.CHO ES44 cells (4.32x10 6 cells per dish) were plated on plates with a diameter of 15 cm in non-selective medium (α-MEM + nucleotides (C1bco) supplemented with 4 mM L-glutamine, 50 U / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin and 10% PB8) and placed in a humidification incubator at 37 ° C, 5% CO 2 . The next day, the cells were transfected with a CO86-bearing expression plasmid according to a modified version of the Po1yGes method! TgapzGesiop recommended by 01adep. A non-selective medium was aspirated from the cells. The cups were washed with 7 ml of heated (37 ° C) PB8 and again filled with 20 ml of non-selective medium. Plasmid DNA (11 μg) was diluted with 800 μl of Hubbot 8ΡΜ (Clbco) medium. Then, 70 μl of Po1uGes! Reagent was added to the DNA / 8ΡΜ mixture. (01adep). After that, the mixture was carefully processed on a vibrating mixer and incubated for 10 min at room temperature. Non-selective medium (2.7 ml) was added to the mixture. This final mixture was incubated with cells on a plate for 24 hours.
Из чашек удаляли трансфекционную смесь/среду, а затем обрабатывали клетки трипсином и просчитывали. Затем клетки высеивали в селективную среду (α-МЕМ + нуклеотиды с добавлением 4 мМ Ьглутамина, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 10% РВ8, 1,25 мг/мл С418) на 96-луночные планшеты (250 мкл на лунку) при различной плотности (1800, 600, 200 и 67 клеток на лунку). КлеткиThe transfection mixture / medium was removed from the dishes, and then the cells were treated with trypsin and counted. The cells were then plated in selective medium (α-MEM + nucleotides supplemented with 4 mM Lglutamine, 50 U / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin, 10% PB8, 1.25 mg / ml C418) in 96-well plates (250 μl per well) at different densities (1800, 600, 200 and 67 cells per well). Cells
- 33 020130 инкубировали в течение 2-3 недель, добавляя среду при необходимости. Лунки подвергали скринингу на уровень продукции антител количественным методом ЕЬ18А. 96-луночный планшет Iтти1οη 2НВ покрывали козьим Е(аЬ)2-антителом против 1дС человека (,Εκ1<κοη Iттиηο^еκеа^сЬ; 1 мкг на лунку в 100 мкл буфера из 50 мМ карбоната натрия рН 9,6) и инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре с покачиванием. Все последующие операции выполняли при комнатной температуре. Лунки отмывали два раза буфером Т-ТВ8 (0,1% Ъуеен 20, ТВ8) и блокировали в 200 мкл блокирующего буфера (1% В8А, Т-ТВ8) в течение 1 ч. Лунки отмывали два раза буфером Т-ТВ8. На отдельном планшете делали серийные разведения (1:2 или 1:3) стандарта антител ЕМ164 (100 нг/мл) и супернатантов культур в блокирующем буфере. Эти разведения (100 мкл) переносили на планшет для ЕЬ18А и инкубировали в течение 1 ч. Лунки отмывали 3 раза буфером Τ-ΊΒ8 и инкубировали со 100 мкл козьего Ес-АР против 1дС человека (Εκ1<κοη Iттиηο^еκеа^сЬ), разведенного 1:3000 блокирующим буфером, в течение 45 мин. После 5 отмывок буфером Т-ТВ8 лунки проявляли с помощью 100 мкл проявляющего реагента Р№Р (10 мг/мл; Р№Р = пнитрофенилфосфат, динатриевая соль, Р1егсе; в 0,1 М диэтаноламиновом буфере рН 10,3) в течение 25 мин. Измеряли поглощение при 405 нм на считывающем устройстве планшетов ЕЬ18А. Для определения уровня антител использовали значения поглощения (супернатантов культур) на линейном участке стандартной кривой.- 33 020130 was incubated for 2-3 weeks, adding medium if necessary. Wells were screened for antibody production using the E18A quantitative method. A 96-well plate of ITTI1οη 2HB was coated with goat E (aB) 2 antibody against human 1dC (Εκ1 <κοη ITTIηο ^ ekea ^ c; 1 μg per well in 100 μl of a buffer of 50 mM sodium carbonate pH 9.6) and incubated 1 , 5 hours at room temperature with shaking. All subsequent operations were performed at room temperature. The wells were washed twice with T-TB8 buffer (0.1% bween 20, TB8) and blocked in 200 μl of blocking buffer (1% B8A, T-TB8) for 1 h. The wells were washed twice with T-TB8 buffer. Serial dilutions (1: 2 or 1: 3) of standard EM164 antibodies (100 ng / ml) and culture supernatants in blocking buffer were made on a separate plate. These dilutions (100 μl) were transferred onto an E18A plate and incubated for 1 h. The wells were washed 3 times with Τ-ΊΒ8 buffer and incubated with 100 μl of goat Ec-AP against 1dC human (Εκ1 <κοη Ittiηο ^ ekea ^ cb), diluted 1: 3000 blocking buffer for 45 min. After 5 washes with T-TB8 buffer, the wells were developed using 100 μl of developing agent P # P (10 mg / ml; P # P = pnitrophenyl phosphate, disodium salt, P1egse; in 0.1 M diethanolamine buffer pH 10.3) for 25 min The absorbance at 405 nm was measured on an E18A plate reader. To determine the level of antibodies used values of absorption (supernatant of cultures) in the linear portion of the standard curve.
Наиболее продуктивные клоны, идентифицированные методом ЕЬ18А, затем субклонировали, размножали и замораживали клетки порциями для хранения.The most productive clones identified by the E18A method were then subcloned, expanded, and cells were frozen in storage portions.
Для экспрессирования 1ιι.ιΌ86ν1.01 и 1ιι.ιΌ86ν1.21 клетки СНО ΌΟ44 (Όγ. Ба\\тег1се Скакт, 0ο1ιιιηΝ3 ишуегкПу, ΝΥ) культивировали в среде α-МЕМ с рибонуклеозидами и дезоксирибонуклеозидами (кат. № 12571 фирмы ОФот, Оп-ιηά Шшй, №\ν ΥοιΈ). В среду добавляли 10% эмбриональной бычьей сыворотки (кат. № 8Н30071.03 фирмы НуС^е, Εο^ηη, υΤ), 1% гентамицина (кат. № 30-005-СВ фирмы МеШа1ес11, Нет^щ VА) и 2 мМ Ь-глутамина (К-ц1и() (кат. № 17-605Е фирмы Вю\У1й1акег, \Уа1кегкй11е, МО). Этот состав назвали полной средой СНО.In order to express 1ιι.ιΌ86ν1.01 and 1ιι.ιΌ86ν1.21, CHO ΌΟ44 cells (Όγ. Ba \\ tag1ce Skakt, 0ο1ιιιιηΝ3 ishuegkPu, ΝΥ) were cultured in α-MEM medium with ribonucleosides and deoxyribonucleosides (Cat. No. Op-12571 from OF company Ophthibionucleosides ιηά Shshy, No. \ ν ΥοιΈ). On Wednesday, 10% of fetal bovine serum (cat. No. 8Н30071.03 of the company НУС ^ е, Εο ^ ηη, υΤ), 1% gentamicin (cat. No. 30-005-SV of the company МеШа1ес11, No ^ Щ VA) was added and 2 mM were added. L-glutamine (K-ts1i () (cat. No. 17-605E of the company Vu \ U1y1akeg, \ Wa1kegky11e, MO). This composition was called the complete CHO medium.
Клетки СНО ΌΟ44 (5х106) трансфецировали 50 мкг ДНК плазмидны, несущей ЬиЭ86. Перед трансфекцией клетки извлекали из колб с трипсином (кат. № 15090-046 фирмы Ойто, Опий Шагй, ΝΥ) и промывали два раза средой α-МЕМ без добавок и без рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов (кат. № 12561 фирмы ОФто, Опий Шагй, ΝΥ). Ее назвали промывочной средой. Клетки смешивали с плазмидной ДНК в кюветах с расстоянием между электродами 0,4 см (кат. № 1652088 фирмы ВюКаб, Негси1ек, РА). Их ставили на лед на две минуты, а затем подавали разряд в 1000 мкФ и 260 вольт через прибор для электропорации фирмы ВюВай. После электропорации клетки инкубировали на льду две минуты. Затем клетки высеивали на пять 24-луночных планшетов (кат. № 3524 фирмы ΟοκΕπ) в полную среду СНО и держали в инкубаторе при 37°С, 5% СО2. Через 48 ч среду удаляли из лунок. Лунки промывали один раз промывочной средой и заполняли средой α-МЕМ без рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов (кат. № 12561 фирмы ОФто, Опий Шагй ΝΥ) с добавлением 1% гентамицина, 2 мМ Б-Дик 10% диализованной эмбриональной бычьей сыворотки (кат. № 26400-044 фирмы ОФто, Опий Ικ1πηά, ΝΥ) и 1,25 мг/мл генетицина (О418) (кат. № 11811 фирмы ОФто, Опий Шагй ΝΥ). Этот полный состав назвали селекционной средой. Клоны инкубировали в селекционной среде приблизительно две недели, после чего их подвергали скринингу на продукцию антител количественным методом ЕЫ8А. Затем наиболее продуктивные клоны субклонировали, размножали и замораживали клетки порциями для хранения.CHO ΌΟ44 cells (5 × 10 6 ) were transfected with 50 μg of plasmid DNA carrying LiE86. Before transfection, cells were removed from trypsin flasks (cat. No. 15090-046 from Oito, Opiy Shagy, ΝΥ) and washed twice with α-MEM medium without additives and without ribonucleosides and deoxyribonucleosides (cat. No. 12561 from OFto, Opiy Shagy, ΝΥ ) It was called flushing medium. Cells were mixed with plasmid DNA in cuvettes with a distance between the electrodes of 0.4 cm (Cat. No. 1652088 from VyuKab, Negsiek, RA). They were put on ice for two minutes, and then a discharge of 1000 uF and 260 volts was applied through the VuVai electroporation apparatus. After electroporation, the cells were incubated on ice for two minutes. Then the cells were plated on five 24-well plates (Cat. No. 3524 of the company ΟοκΕπ) in complete CHO medium and kept in an incubator at 37 ° C, 5% CO 2 . After 48 hours, the medium was removed from the wells. The wells were washed once with washing medium and filled with α-MEM medium without ribonucleosides and deoxyribonucleosides (Cat. No. 12561 from OPto, Opiy Shagy ΝΥ) with the addition of 1% gentamicin, 2 mM B-Dick 10% dialyzed fetal bovine serum (Cat. No. 26400 -044 from OFto, Opium Ικ1πηά, ΝΥ) and 1.25 mg / ml of geneticin (O418) (Cat. No. 11811 from OFto, Opiy Shagy ΝΥ). This complete composition was called a breeding medium. Clones were incubated in a selection medium for approximately two weeks, after which they were screened for antibody production using the E8A quantitative method. Then the most productive clones were subcloned, expanded and frozen in batch sizes for storage.
Чтобы получить достаточное количество антител для очистки, клетки размножали на чашках диаметром 15 см (~1х 106 клеток на чашку) в 30 мл селективной среды с добавлением сыворотки с ультранизким содержанием Ι§Θ (и11га Б-ον Ι§Θ ЕВ8; ОФот) и инкубировали в течение 1 недели. Супернатанты культур собирали в конические пробирки на 250 мл, центрифугировали в настольной центрифуге (2000 об/мин, 5 мин, 4°С), а затем стерилизировали фильтрованием через фильтровальную установку с диаметром пор 0,2 мкм.In order to obtain a sufficient amount of antibodies for purification, the cells were propagated on plates with a diameter of 15 cm (~ 1 × 10 6 cells per plate) in 30 ml of selective medium supplemented with serum with an ultra low content of Θ§Ι (and 11 g B-ον Ι§Θ EB8; OFot) and incubated for 1 week. Culture supernatants were collected in 250 ml conical tubes, centrifuged in a benchtop centrifuge (2000 rpm, 5 min, 4 ° C), and then sterilized by filtration through a filter unit with a pore diameter of 0.2 μm.
Для очистки Ό86 в профильтрованные супернатанты культур добавляли гранулы №1ОН до конечного рН 8,0. Колонку Н1Тгар ^Р^οίе^η А (АтегкЬат) с белком А уравновешивали в 20-50 колоночных объемах связывающего буфера. На колонку наносили супернатант с помощью перистальтического насоса. Затем колонку промывали 50 колоночными объемами связывающего буфера. Связавшиеся антитела элюировали из колонки с помощью элюирующего буфера (100 мМ уксусной кислоты, 50 мМ №С1, рН 3) в пробирки, стоящие в коллекторе фракций. Элюированные антитела нейтрализировали с помощью нейтрализирующего буфера (2 М К2НРО4, рН 10,0) и диализировали всю ночь в РВ8. Диализованные антитела фильтровали через шприц-фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Для определения конечной концентрации белка измеряли поглощение при 280 нм.For purification of Ό86, granules No. 1OH were added to the filtered supernatants of the cultures to a final pH of 8.0. Column H1Tgar ^ P ^ οίе ^ η A (ATEGKbat) with protein A was balanced in 20-50 column volumes of binding buffer. The supernatant was applied to the column using a peristaltic pump. Then the column was washed with 50 column volumes of binding buffer. Bound antibodies were eluted from the column using an elution buffer (100 mM acetic acid, 50 mM No. C1, pH 3) into tubes in the fraction collector. The eluted antibodies were neutralized using a neutralizing buffer (2 M K 2 NRA 4 , pH 10.0) and dialyzed overnight in PB8. The dialyzed antibodies were filtered through a syringe filter with a pore diameter of 0.2 μm. To determine the final protein concentration, absorbance was measured at 280 nm.
Аффинность очищенного ЬйдО сравнивали с тиО86 методом проточной цитометрии. В первой группе экспериментов непосредственно измеряли связывание с клетками экспрессирующей СА6 линии КВ. Как видно из фиг. 18, тиО86, сЮ86, 1πΌ86ν1.01 и Ьи^86ν1.21проявляют очень близкие аффинности с кажущимися значениями К,| 0,82 нМ, 0,69 нМ, 0,82 и 0,85 нМ, соответственно, свидетельствуя о том, что перестройка поверхности не повредила участки СОВ. Для проверки того, что варианты 1ιι.ιΌ86 сохраняют аффинность тиЭ86, проводили опыты по конкурентному связыванию. Преимущество этогоThe affinity of purified LybO was compared with thiO86 by flow cytometry. In the first group of experiments, binding to cells of the CB6 expressing CA6 line was directly measured. As can be seen from FIG. 18, tiO86, cU86, 1πΌ86ν1.01 and bi ^ 86ν1.21 exhibit very close affinities with apparent values of K, | 0.82 nM, 0.69 nM, 0.82 and 0.85 nM, respectively, indicating that surface restructuring did not damage sections of the SOW. In order to verify that the variants 1ιι.ιΌ86 retain the affinity of thE86, experiments on competitive binding were performed. Advantage of this
- 34 020130 формата состоит в том, что для антител мыши и антител человека используется одна и та же система детекции, то есть биотин-тиО86/стрептавидин-0ТАР. Результаты сравнения способности тиБ86. еЮ86. 1шБ86у1.01 и ЬиО86у1.21 к конкуренции с биотин-тиО86 методом конкурентного связывания представлены на фиг. 19. Кажущиеся значения ЕС50 равны 1,9 нМ, 1,7 нМ, 3,0 и 1,9 нМ для тиО86, сЮ86, 1шБ86у1.01 и ЬиО86у1.21, соответственно. Эти результаты свидетельствуют о том, что перестройка поверхности тиБ86 для получения гуманизованного Б86 почти не вызывает уменьшения аффинности связывания.- 34 020130 format consists in the fact that the same detection system is used for mouse antibodies and human antibodies, that is, biotin-thiO86 / streptavidin-0TAP. Comparison results for TiB86. eY86. 1Sb86y1.01 and LiO86y1.21 to competition with biotin-TiO86 by the competitive binding method are shown in FIG. 19. The apparent EC 50 values are 1.9 nM, 1.7 nM, 3.0 and 1.9 nM for TiO86, CuO86, 1BB86y1.01 and LiO86y1.21, respectively. These results indicate that the rearrangement of the surface of TiB86 to obtain a humanized B86 almost does not cause a decrease in binding affinity.
Пример 14. Получение цитотоксического конъюгата тиО86-ОМ1Example 14. Obtaining a cytotoxic conjugate thi86-OM1
Антитело тиБ86 (8 мг/мл) подвергали модификации при 8-кратном молярном избытке N сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноата (8РР) для введения дитиопиридильных групп. Реакцию проводили в смеси из 95% буфера А (50 мМ КР1, 50 мМ №С1, 2 мМ ЭДТА, рН 6,5) и 5% БМЛ в течение 2 ч при комнатной температуре. Слегка мутную реакционную смесь подвергали гель-фильтрации через колонку с NΑР или 8ерйа4ех 625 (уравновешенную в буфере А). Степень модификации определяли путем измерения поглощения антител при 280 нм и выделения 2-меркаптопиридина (8ру) под действием БТТ при 280 и 343 нм. Затем модифицированные тиБ86 подвергали конъюгированию при 2,5 мг антител/мл и 1,7-кратном молярном избытке ^-деацетил-Н2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансина (Ь-ОМ1) относительно 8ру. Реакцию проводили в смеси из буфера А (97%) и БМЛ (3%). Реакцию инкубировали при комнатной температуре в течение ночи ~20 ч. Мутную реакционную смесь центрифугировали (1162хд, 10 мин), а супернатант подвергали гель-фильтрации через колонки с NΑР-25 или 8300 (3 колонки для обессоливания подряд, 3x26/10, 625 среднего размера), уравновешенные в буфере В (IX РВ8, рН 6,5). Осадок отбрасывали. Конъюгат стерилизировали фильтрованием через фильтр 0,2 мкм МШех-6У и диализировали в буфере В на установке 8114е-А-Еухег. Число молекул БМ1, соединенных с молекулой 1111.1086, определяли измерением поглощения профильтрованного материала при 252 нм и 280 нм. Соотношение ОМ1/АЬ оказалось равным 4,36, а выход на стадии конъюгирования тиО86 составил 55%. Концентрация конъюгированного антитела составила 1,32 мг/мл. Очищенный конъюгат подвергали биохимическому исследованию методом эксклюзионной хроматографии (8ЕС), при этом оказалось, что он на 92% состоит из мономера. Анализ БМ1 в очищенном конъюгате показал, что 99% его ковалентно связано с антителом. На фиг. 20 анализ связывания конъюгата тиО86-ОМ1 и немодифицированного тиО86 с клетками Саоу-3 методом проточной цитометрии показал, что конъюгирование тиО86 приводит лишь к незначительному снижению аффинности.The TiB86 antibody (8 mg / ml) was modified with an 8-fold molar excess of N succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate (8PP) to introduce dithiopyridyl groups. The reaction was carried out in a mixture of 95% buffer A (50 mM KR 1 , 50 mM No. C1, 2 mM EDTA, pH 6.5) and 5% BML for 2 hours at room temperature. The slightly turbid reaction mixture was subjected to gel filtration through an NΑP or 8pp-4Ex 625 column (equilibrated in buffer A). The degree of modification was determined by measuring the absorption of antibodies at 280 nm and the allocation of 2-mercaptopropyridine (8pu) under the action of BTT at 280 and 343 nm. Then, the modified TiB86 were conjugated at 2.5 mg of antibodies / ml and a 1.7-fold molar excess of ^ -deacetyl-H 2 '- (3-mercapto-1-oxopropyl) maytansine (L-OM1) relative to 8pu. The reaction was carried out in a mixture of buffer A (97%) and BML (3%). The reaction was incubated at room temperature overnight for ~ 20 hours. The turbid reaction mixture was centrifuged (1162xd, 10 min), and the supernatant was subjected to gel filtration through NΑP-25 or 8300 columns (3 consecutive desalination columns, 3x26 / 10, 625 average size), balanced in buffer B (IX PB8, pH 6.5). The precipitate was discarded. The conjugate was sterilized by filtration through a 0.2 μm MSh-6U filter and dialyzed in buffer B in the 8114e-A-Eucheg installation. The number of BM1 molecules connected to the molecule 1111.1086 was determined by measuring the absorption of the filtered material at 252 nm and 280 nm. The OM1 / AB ratio turned out to be 4.36, and the yield at the stage of conjugation of TiO86 was 55%. The concentration of conjugated antibodies was 1.32 mg / ml. The purified conjugate was subjected to biochemical analysis by size exclusion chromatography (8ES), and it turned out that it was 92% monomer. Analysis of BM1 in the purified conjugate showed that 99% of it is covalently linked to the antibody. In FIG. 20 an analysis of the binding of the thiO86-OM1 conjugate and unmodified thiO86 to Saou-3 cells by flow cytometry showed that conjugation of thiO86 leads only to a slight decrease in affinity.
Пример 15. Цитотоксичность тиО86-0М1 ίη уйгоExample 15. Cytotoxicity of TiO86-0M1 ίη ugo
В виде голого антитела тиО86 не проявляло ингибирующего действия на пролиферацию или рост клеточных культур (фиг. 21). Однако при инкубации тиО86 с клетками в присутствии конъюгата БМ1 с козьим антителом против тяжелой и легкой цепи Ц6 мыши оно оказалось очень эффективным в наводке этого конъюгата и доставке его к клеткам, что приводило к косвенной цитотоксичности (фиг. 21). Для дальнейшей проверки присущей голому тиО86 активности проводили определение комплемент-зависимой цитотоксичности (СБС) с использованием тиО86. Клетки НРАС и ΖΒ-75-1 (25 000 клеток на лунку) высеивали на 96-луночные планшеты в присутствии 5% сыворотки человека или кролика и различных разведений тиО86 в 200 мкл среды КНВР (КРМЫ640, 0,1% В8А, 20 мМ НЕРЕ8 рН 7,2-7,4, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Клетки инкубировали 2 ч при 37°С. Затем в супернатант добавляли реагент А1атаг В1ие (10% от конечной концентрации) (ВЧозоигсе). Клетки инкубировали 5-24 ч, а затем измеряли флуоресценцию. Ό86 мыши не оказывало влияния на определение комплемент-зависимой цитотоксичности (СБС) (фиг. 22). Это свидетельствует о том, что терапевтическое применение тиО86 потребует конъюгирования с токсической эффекторной молекулой.As a naked antibody, thiO86 showed no inhibitory effect on the proliferation or growth of cell cultures (Fig. 21). However, upon incubation of thiO86 with cells in the presence of a BM1 conjugate with a goat antibody against the mouse heavy and light chain C6, it was very effective in inducing this conjugate and delivering it to the cells, which led to indirect cytotoxicity (Fig. 21). To further verify the inherent activity of naked thiO86, complement-dependent cytotoxicity (SBS) was determined using thiO86. HPAC and ΖΒ-75-1 cells (25,000 cells per well) were plated on 96-well plates in the presence of 5% human or rabbit serum and various dilutions of thiO86 in 200 μl of CNRP medium (CRM640, 0.1% B8A, 20 mM HEPE8 pH 7.2-7.4, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin). Cells were incubated for 2 hours at 37 ° C. Then, A1atag B1ie reagent (10% of the final concentration) was added to the supernatant (VChoseigs). Cells were incubated for 5-24 hours, and then fluorescence was measured. Ό86 mouse did not affect the determination of complement dependent cytotoxicity (SBS) (Fig. 22). This suggests that the therapeutic use of thiO86 will require conjugation with a toxic effector molecule.
Цитотоксичность конъюгированного с майтансиноидом антитела тиО86 изучали в 2-х разных форматах на различных 086-положительных линиях клеток. Проводили определение клоногенным методом, в котором клетки (1000-2500 клеток на лунку) высеивали на 6-луночные планшеты в 2 мл конъюгата, разведенного культуральной средой. Клетки подвергались непрерывному воздействию конъюгата при нескольких концентрациях, обычно от 3х10-11 М до 3х10-9 М, при инкубации в увлажнительной камере при 37°С и 6% С02 на протяжении 5-9 дней. Лунки отмывали РВ8 и окрашивали колонии раствором 1% хрустального фиолетового/10% формальдегида/РВ8. Несвязавшийся краситель затем тщательно смывали из лунок дистиллированной водой, а планшеты оставляли сушиться. Колонии просчитывали с помощью анатомического микроскопа ЬеЧса 8ιе^еоΖоот 4.The cytotoxicity of maytansinoid conjugated thiO86 antibody was studied in 2 different formats on different 086-positive cell lines. The determination was carried out by the clonogenic method, in which cells (1000-2500 cells per well) were plated on 6-well plates in 2 ml of conjugate diluted in culture medium. Cells were subjected to continuous exposure to the conjugate at several concentrations, usually from 3x10 -11 M to 3x10 -9 M, during incubation in a humidification chamber at 37 ° C and 6% C0 2 for 5-9 days. The wells were washed with PB8 and the colonies were stained with a solution of 1% crystal violet / 10% formaldehyde / PB8. The unbound dye was then washed thoroughly from the wells with distilled water, and the plates were allowed to dry. Colonies were counted using an anatomical microscope LeCe 8xe 4 eoot 4.
Эффективность посева (РЕ) определяли как число колоний, деленное на число посеянных клеток. Выживаемость рассчитывали как РЕ обработанных клеток, деленное на РЕ необработанных клеток. Концентрации Ι^0 определяли из графика выживаемости клеток в зависимости от молярной концентрации конъюгата. При определении клоногенным методом (фиг. 23) тиО86-ОМ1 эффективно вызывал гибель клеток Саоу-3 со значением Ι6?50 в 800 пМ. Антиген-отрицательные клетки А375 испытывали лишь незначительное влияние конъюгата при концентрации 3х10-9 М, то есть при самой высокой концентрации тиО86-ОМ1, свидетельствуя о том, что вызывающая гибель клеток активность конъюгата направлена именно на клетки, экспрессирующие антиген. Однако, несмотря на видимую чувствительность к майтанSeeding efficiency (PE) was defined as the number of colonies divided by the number of seeded cells. Survival was calculated as PE treated cells divided by PE untreated cells. Concentrations Ι ^ 0 were determined from the cell survival graph depending on the molar concentration of the conjugate. When determined by the clonogenic method (Fig. 23), thiO86-OM1 effectively caused the death of Saou-3 cells with a value of Ι6? 50 at 800 pM. Antigen-negative A375 cells experienced only a slight effect of the conjugate at a concentration of 3x10 -9 M, that is, at the highest concentration of thiO86-OM1, indicating that the cell death-causing activity of the conjugate is directed specifically to cells expressing the antigen. However, despite the apparent sensitivity to maytan
- 35 020130 сину, многие другие 086-положительные линии клеток оказались не особенно чувствительными к иммуноконъюгату. Все линии клеток шейки матки (НеЬа, КВ и \У18Н) оказались чувствительными к конъюгату, тогда как лишь ограниченное число линий клеток яичников и молочной железы проявляли какиелибо признаки цитотоксичности. Не была задета ни одна из линий клеток поджелудочной железы.- 35 020130 blue, many other 086-positive cell lines were not particularly sensitive to the immunoconjugate. All cervical cell lines (HeLa, KB, and V18H) were sensitive to the conjugate, while only a limited number of ovarian and mammary cell lines showed any signs of cytotoxicity. Not a single pancreatic cell line was affected.
При определении методом МТТ клетки высеивали на 96-луночные планшеты при плотности 10005000 клеток на лунку. Клетки сеяли вместе с серийными разведениями голого тиО86 или иммуноконъюгата ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 в 200 мкл культуральной среды. Образцы составляли в трех повторах. Смеси клеток с антителом/конъюгатом затем инкубировали в течение 2-7 дней, после чего оценивали жизнеспособность клеток с помощью МТТ ([3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид]). МТТ (50 мкг на лунку) вносили в супернатанты культур и оставляли инкубироваться на 3-4 ч при 37°С. Среду удаляли, а формазан МТТ солюбилизировали в О1Л8О (175 мкл на лунку). Измеряли поглощение при 540-545 нм. При определении жизнеспособности клеток методом МТТ (фиг. 24С) иммуноконъюгат эффективно вызывал гибель клеток Саον-3 со значением 1С50 в 1,61 нМ. Лунки с наиболее высокими концентрациями конъюгата не содержали жизнеспособных клеток в отличие от голого антитела, которое не оказывало никакого эффекта (фиг. 21 и фиг. 24).When determined by MTT, the cells were plated on 96-well plates at a density of 1,000,000 cells per well. Cells were seeded with serial dilutions of naked thiO86 or immunoconjugate ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 in 200 μl of culture medium. Samples were made in triplicate. Mixtures of cells with antibody / conjugate were then incubated for 2-7 days, after which cell viability was assessed using MTT ([3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]). MTT (50 μg per well) was added to the culture supernatants and allowed to incubate for 3-4 hours at 37 ° C. The medium was removed, and formazan MTT was solubilized in O1L8O (175 μl per well). The absorption was measured at 540-545 nm. When determining cell viability by MTT (Fig. 24C), the immunoconjugate effectively caused the death of Caον-3 cells with a value of 1C 50 of 1.61 nM. Wells with the highest conjugate concentrations did not contain viable cells, in contrast to the naked antibody, which had no effect (FIG. 21 and FIG. 24).
Результаты опытов методом МТТ на других линиях клеток слегка различались (фиг. 24А, В и Ό-Ι). Во многих случаях, хотя и наблюдалась некоторая цитотоксичность, однако конъюгат не смог вызвать полную гибель всей популяции клеток (за исключением клеток \У18Н). Особенно устойчивыми оказались клетки ВТ-20, ОУСАК5 и НРАС: в лунках с самой высокой концентрацией конъюгата (32 нМ) свыше 50% клеток все еще были жизнеспособными.The results of the MTT experiments on other cell lines were slightly different (Fig. 24A, B and Ό-Ι). In many cases, although some cytotoxicity was observed, the conjugate could not cause complete death of the entire cell population (with the exception of \ U18H cells). Cells BT-20, OUSAC5, and HPAC proved to be especially stable: in wells with the highest concentration of conjugate (32 nM), over 50% of the cells were still viable.
Пример 16. Противоопухолевая активность конъюгата ш νί\ΌExample 16. Antitumor activity of the conjugate w νί \ Ό
Чтобы продемонстрировать активность конъюгата ти^86-^Μ1 т νί\Ό, мышам 8СГО прививали ксенотрансплантаты опухолей человека. Была разработана подкожная модель клеточной линии КВ карциномы шейки матки человека. Клетки КВ культивировали ш νίΙΐΌ, собирали и вводили 5х106 клеток в 100 мкл лишенной сыворотки среды под правое плечо каждой мыши и оставляли расти в течение 6 дней до среднего объема опухоли в 144 ± 125 мм3, после чего начинали применять препарат. Мышам вводили либо РВ8, либо конъюгат при 150 мкг/кг ΌΜ1 или конъюгат при 225 мкг/кг ΌΜ1 (по 2 мыши на группу) внутривенно каждый день на протяжении 5 дней. Ежедневно отслеживали токсические реакции за время обработки. Отмечали объем опухоли (фиг. 25А) и соответствующий вес тела (фиг. 25В) на всем протяжении исследования.To demonstrate the activity of ty ^ 86- ^ ти1 t νί \ ί conjugate, xenografts of human tumors were inoculated into 8CGO mice. A subcutaneous model of the human cervical carcinoma cell line HF was developed. KB cells were cultured with νν, 5x10 6 cells were collected and injected in 100 μl of serum-free medium under the right shoulder of each mouse and allowed to grow for 6 days to an average tumor volume of 144 ± 125 mm 3 , after which the drug was started. Mice were either given PB8 or conjugate at 150 μg / kg ΌΜ1 or conjugate at 225 μg / kg ΌΜ1 (2 mice per group) intravenously every day for 5 days. Toxic reactions were monitored daily during treatment. Tumor volume (FIG. 25A) and corresponding body weight (FIG. 25B) were noted throughout the study.
У контролей, получавших РВ8, опухоли КВ росли быстро со временем удвоения около 4 дней. Напротив, обе группы мышей, получавших конъюгат, проявляли полную регрессию опухолей через 14 дней и 18 дней после начала обработки по группам с дозами в 150 мкг/кг, соответственно. При дозе в 150 мкг/кг отсрочка опухоли составила примерно 70 дней. Обработка при 225 мкг/кг приводила к излечению, поскольку не было признаков рецидива опухолей по завершении исследования на 120-й день. Как видно из фиг. 25В, мыши в группе 150 мкг/кг не проявляли потери веса, что свидетельствует о хорошей переносимости этой дозы. При самой высокой дозе мыши испытывали лишь временное снижение веса тела на 3%. За время 5-дневной обработки мыши не проявляли видимых признаков токсичности. В целом это исследование показывает, что при применении ти^86-^Μ1 возможно излечение мышей от привитых опухолей КВ при нетоксической дозе.In controls treated with PB8, KB tumors grew rapidly with a doubling time of about 4 days. In contrast, both groups of mice treated with the conjugate showed complete tumor regression 14 days and 18 days after the start of treatment in groups with doses of 150 μg / kg, respectively. At a dose of 150 mcg / kg, tumor delay was approximately 70 days. Treatment at 225 μg / kg resulted in cure, since there was no evidence of tumor recurrence at the end of the study on day 120. As can be seen from FIG. 25B, mice in the 150 μg / kg group did not show weight loss, indicating good tolerance to this dose. At the highest dose, the mice experienced only a temporary decrease in body weight of 3%. During the 5-day treatment, the mice did not show visible signs of toxicity. In general, this study shows that with ty ^ 86- ^ Μ1, mice can be cured of vaccinated KV tumors at a non-toxic dose.
Активность ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 также тестировали на нескольких моделях привитых подкожно ксенотрансплантатов (см. фиг. 26). Раковые линии клеток, использовавшиеся для прививки ксенотрансплантатов, проявляли различную чувствительность к майтансину ш νίΙΐΌ и плотность эпитопа СА6 (приведенная ниже табл. 9). Клетки ОУСАК5 и ТОУ-21С являются клеточными линиями рака яичников, НРАС является клеточной линией рака поджелудочной железы, НеЬа является клеточной линией рака шейки матки. Клетки ОУСАК5 и ТОУ-21С проявляли слабую экспрессию СА6, клетки НеЬа проявляли промежуточный уровень экспрессии СА6, а клетки НРАС проявляли экспрессию СА6 с высокой плотностью на поверхности. Клетки ТОУ-21С и НРАС чувствительны к майтансину, а клетки ОУСАК5 и НеЬа в 2,7 раза менее чувствительны.The activity of ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 was also tested on several models of subcutaneous xenografts grafted (see FIG. 26). The cancer cell lines used for xenograft inoculation showed different sensitivity to maytansine w νίΙΐΌ and the density of the CA6 epitope (Table 9 below). OUSAC5 and TOU-21C cells are ovarian cancer cell lines, HPAC is the pancreatic cancer cell line, HeLa is the cervical cancer cell line. OUSAC5 and TOU-21C cells showed weak expression of CA6, HeBa cells showed an intermediate level of CA6 expression, and HPAC cells showed high density CA6 expression on the surface. The TOU-21C and HPAC cells are sensitive to maytansine, and the OUSAC5 and HeLa cells are 2.7 times less sensitive.
- 36 020130- 36 020130
Таблица 9Table 9
*среднее значение максимальной относительной флуоресценции* average value of maximum relative fluorescence
Клетки этих 4-х линий культивировали ίη νίΐτο, собирали и вводили 1 х 107 клеток в 100 мкл лишенной сыворотки среды под правое плечо каждой мыши (по 6 мышей на модель) и оставляли расти в течение 6 дней до среднего объема опухоли в 57,6 ± 6,7 и 90,2 ± 13,4 мм3 для опытной и контрольной группы ОУСЛ^, соответственно, 147,1 ± 29,6 и 176,2 ± 18,9 мм3 для опытной и контрольной группы НРЛС, соответственно, 194,3 ± 37,2 и 201,7 ±71,7 мм3 для опытной и контрольной группы НеЬа, соответственно, и 96,6 ± 22,8 и 155,6 ± 13,4 мм3 для опытной и контрольной группы ТОУ-21С, соответственно, после чего начинали применять препарат. По каждой модели трем контрольным мышам вводили две еженедельные дозы РВ8 и трем опытным мышам вводили две еженедельные дозы конъюгата (600 мкг/кг ΌΜ1) внутривенно. Ежедневно отслеживали токсические реакции за время обработки и отмечали объем опухоли и вес тела на всем протяжении исследования. Эффективность конъюгата на различных моделях представлена на графике на фиг. 26А, С, Е и С, а соответствующий вес тела представлен на фиг. 26В, Ό, Р и Н. Клетки линий ОУСАЮ, ТОУ-21С и НРЛС образуют агрессивные опухоли, как видно у контролей РВ8 для каждой модели. На модели НеЬа наблюдался лаг-период около 3 недель перед началом экспоненциального роста. На всех моделях применение конъюгата Ό86-ΌΜ1 приводило к полной регрессии опухолей у всех мышей. На моделях ТОУ-21С, НРЛС и НеЬа мыши оставались свободными от опухолей через 61 день. На модели ОУСЛЕ5 происходил рецидив примерно через 45 дней после прививки опухоли. Таким образом, применение ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 на этой модели приводит к задержке роста опухоли приблизительно на 34 дня. Эта задержка роста существенна, так как клетки ОУСЛЕ5 менее чувствительны к майтансину и проявляют слабую экспрессию эпитопа СА6. На тех моделях, у которых более высокая плотность эпитопа СА6 либо большая чувствительность к майтансину, регрессия опухолей выражена сильнее. Нужно отметить, что вводили только 2 дозы. Ясно, что применявшаяся в этом исследовании схема дозировки не была токсичной для мышей, так как не наблюдалось снижения веса. Вероятно, можно было бы добиться излечения при дополнительных или более высоких дозах конъюгата.The cells of these 4 lines were cultured ίη νίΐτο, collected and injected 1 x 10 7 cells in 100 μl of serum-free medium under the right shoulder of each mouse (6 mice per model) and allowed to grow for 6 days to an average tumor volume of 57, 6 ± 6.7 and 90.2 ± 13.4 mm 3 for the experimental and control group of OSSL ^, respectively, 147.1 ± 29.6 and 176.2 ± 18.9 mm 3 for the experimental and control group of NRLS, respectively , 194.3 ± 37.2 and 201.7 ± 71.7 mm 3 for the experimental and control groups HeLa, respectively, and 96.6 ± 22.8 and 155.6 ± 13.4 mm 3 for the experimental and control groups TOU-21S, respectively, after which and use the drug. For each model, three weekly doses of PB8 were administered to three control mice and two weekly doses of conjugate (600 μg / kg ΌΜ1) were administered to three test mice intravenously. Toxic reactions were monitored daily during treatment and tumor volume and body weight were noted throughout the study. The effectiveness of the conjugate on various models is shown in the graph in FIG. 26A, C, E and C, and the corresponding body weight is shown in FIG. 26B, Ό, P, and N. Cells of the OUSAU, TOU-21C, and NRLS lines form aggressive tumors, as seen in the PB8 controls for each model. On the HeLa model, a lag period of about 3 weeks was observed before the start of exponential growth. On all models, the use of Ό86-ΌΜ1 conjugate led to complete regression of tumors in all mice. On the TOU-21C, NRLS and HeLa models, the mice remained tumor free after 61 days. In the OUSLE5 model, relapse occurred approximately 45 days after tumor inoculation. Thus, the use of ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 in this model leads to a delay in tumor growth by approximately 34 days. This growth retardation is significant, because OUSLE5 cells are less sensitive to maytansine and exhibit weak expression of the CA6 epitope. In those models with a higher CA6 epitope density or greater sensitivity to maytansine, tumor regression is more pronounced. It should be noted that only 2 doses were administered. It is clear that the dosage regimen used in this study was not toxic to mice since no weight loss was observed. It would probably be possible to cure with additional or higher doses of the conjugate.
Рак яичников у человека в большой степени является заболеванием брюшины. Клетки ОУСЛЮ растут агрессивно в качестве внутрибрюшинной (ВБ) модели у мышей 8СГО, образуя опухолевые узлы и асциты подобно заболеванию у человека. Чтобы продемонстрировать активность конъюгата на ВБ модели, ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 вводили мышам, несущим ВБ опухоли ОУСЛ^З (фиг. 27). Клетки ОУСЛ^З культивировали ίη νίΐτο, собирали и вводили 1х 107 клеток внутрибрюшинно. Опухоли оставляли расти в течение 6 дней, после чего начинали применять препарат. Мышам вводили раз в неделю на протяжении 2 недель либо РВ8, либо конъюгат Ό86-ΌΜ1 в дозе 600 мкг/кг ΌΜ1 и отмечали снижение веса в результате заболевания брюшины. Через 28 дней мыши в группе РВ8 потеряли более 20% веса тела и их подвергали эвтаназии. Животных в опытной группе забивали через 45 дней, после снижения веса тела более чем на 20%. Это исследование показывает, что ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 способен задержать развитие опухолей на агрессивной ВБ модели ОУСЛ^З несмотря на то, что клетки ОУСЛ^З менее чувствительны к майтансину и содержат мало эпитопов СА6 на одну клетку. Поскольку применявшаяся схема дозировки не вызывала видимых признаков токсичности, то весьма вероятно, что при дополнительных и более высоких дозах можно было бы добиться еще большей задержки развития опухолей или излечения.Ovarian cancer in humans is to a large extent a disease of the peritoneum. OSUSLA cells grow aggressively as an intraperitoneal (WB) model in 8SGO mice, forming tumor nodes and ascites like a human disease. To demonstrate the activity of the conjugate on the WB model, ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 was administered to mice bearing WB tumor OUSL ^ 3 (Fig. 27). OUSL ^ 3 cells were cultured ίη νίΐτο, and 1 × 10 7 cells were harvested and injected intraperitoneally. Tumors were left to grow for 6 days, after which they began to use the drug. Mice were injected once a week for 2 weeks with either PB8 or Ό86-ΌΜ1 conjugate at a dose of 600 μg / kg ΌΜ1 and weight loss due to peritoneal disease was noted. After 28 days, the mice in the PB8 group lost more than 20% of their body weight and were euthanized. Animals in the experimental group were killed after 45 days, after a decrease in body weight of more than 20%. This study shows that ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 is able to delay the development of tumors on the aggressive WB model of SUSL ^ 3, despite the fact that SUSL ^ S cells are less sensitive to maytansine and contain few CA6 epitopes per cell. Since the dosage scheme used did not cause visible signs of toxicity, it is highly likely that with additional and higher doses, an even greater delay in the development of tumors or cure could be achieved.
Пример 17. Синтез и характеристика цитотоксического конъюгата Э86-8РР-таксоид ММ1-202Example 17. Synthesis and characterization of the cytotoxic conjugate E86-8PP-taxoid MM1-202
Антитело пшЭ86 подвергали модификации с линкером из Ы-сульфосукцинимидил-4-нитро-2пиридил-пентаноата (88№Р). К 50 мг тиЭ86 в смеси из 90% буфера А и 10% ЭИЛ добавляли 10 эквивалентов 88№Р в ЭИЛ. Конечная концентрация антител составляла 8 мг/мл. Реакционную смесь переThe PSE86 antibody was modified with a linker from Y-sulfosuccinimidyl-4-nitro-2-pyridyl-pentanoate (88 # P). To 50 mg of thie86 in a mixture of 90% buffer A and 10% ESA, 10 equivalents of 88 # P in ESA were added. The final antibody concentration was 8 mg / ml. The reaction mixture
- 37 020130 мешивали в течение 4 ч при комнатной температуре, а затем подвергали очистке хроматографией на С25. Степень модификации антител определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм (антитело) и 325 нм (линкер), и она составила 3,82 линкера на антитело. Выход антител составил 43,3 мг, что равно 87%. Конъюгат тнО86-нитро 8РР подвергали конъюгированию с таксоидом ММ1-202 (1812 Р.16). Конъюгированию подвергали 42 мг в смеси из 90% буфера А и 10% ОМА. Таксоид вносили 4 порциями по 0,43 экв./линкер на протяжении около 20 ч. К этому времени реакционная смесь стала заметно мутной. После очистки на С25 полученный с выходом 64% конъюгат содержал 4,3 таксоида/антитело, и еще оставался примерно 1 эквивалент непрореагировавшего линкера. Чтобы израсходовать оставшийся линкер, к конъюгату добавляли 1 эквивалент цистеина и перемешивали в течение ночи. После добавления цистеина появлялся заметный желтоватый оттенок, означающий выделение тиопиридина. Реакционную смесь затем диализировали в буфере В с 0,01% Т\\ееп 20, после чего дополнительно диализировали в одном лишь буфере В в течение нескольких дней. Конечный конъюгат содержал 2,86 молекул/антитело. Выход антител составил 14,7 мг, что в целом равно 35%. При дальнейшем биохимическом исследовании конъюгата методом эксклюзионной хроматографии оказалось, что он содержит 89% мономера, 10,5% димера и 0,5% высокомолекулярных агрегатов.- 37 020130 was stirred for 4 hours at room temperature, and then subjected to purification by C25 chromatography. The degree of antibody modification was determined spectrophotometrically by absorbance at 280 nm (antibody) and 325 nm (linker), and it was 3.82 linkers per antibody. The yield of antibodies was 43.3 mg, which is 87%. The tnO86-nitro 8PP conjugate was conjugated to the taxoid MM1-202 (1812 P.16). 42 mg in a mixture of 90% buffer A and 10% OMA was conjugated. The taxoid was added in 4 portions of 0.43 equiv / linker for about 20 hours. By this time, the reaction mixture became noticeably cloudy. After purification at C25, the conjugate obtained in 64% yield contained 4.3 taxoids / antibody, and approximately 1 equivalent of unreacted linker remained. To consume the remaining linker, 1 equivalent of cysteine was added to the conjugate and stirred overnight. After the addition of cysteine, a noticeable yellowish tint appeared, indicating the release of thiopyridine. The reaction mixture was then dialyzed in buffer B with 0.01% T \\ ehp 20, after which it was further dialyzed in buffer B alone for several days. The final conjugate contained 2.86 molecules / antibody. The yield of antibodies was 14.7 mg, which is generally equal to 35%. A further biochemical study of the conjugate by size exclusion chromatography revealed that it contains 89% monomer, 10.5% dimer and 0.5% high molecular weight aggregates.
Результаты анализа связывания конъюгата тиО86-8РР-таксоид ММ1-202 в сравнении с антителом тиО86 на клетках НеЬа методом проточной цитометрии представлены на фиг. 28. Результаты свидетельствуют о том, что тиО86 сохраняет связывающую активность при конъюгировании с таксаном.The results of the analysis of binding of the TiO86-8PP-taxoid MM1-202 conjugate in comparison with the TiO86 antibody on HeBa cells by flow cytometry are presented in FIG. 28. The results indicate that thiO86 retains binding activity upon conjugation with taxane.
Пример 18. Активность конъюгата гуманизованного Ό86 ш νίΙΐΌ и ш νί\ΌExample 18. The activity of the conjugate of the humanized Ό86 w νίΙΐΌ and w νί \ Ό
Конструировали конъюгат 1шО86у1.01-8РОВ-ЭМ4. Этот конъюгат аналогичен описанному в примере 14 конъюгату тиО86-8РР-ОМ1 за исключением того, что у него компонент линкер/майтансин отличается по структуре в районе дисульфидной связи: конъюгат тиО86-8РР-ОМ1 содержит стерическое препятствие в виде одной метильной группы на несущем дисульфид углероде линкера со стороны антитела, тогда как конъюгат 8РЭВ-ЭМ4 содержит стерическое препятствие в виде двух метальных групп на несущем дисульфид углероде линкера со стороны майтансина.Conjugate 1shO86u1.01-8ROV-EM4 was constructed. This conjugate is similar to the thiO86-8PP-OM1 conjugate described in Example 14, except that its linker / maytansine component differs in structure in the region of the disulfide bond: the thiO86-8PP-OM1 conjugate contains a steric hindrance in the form of one methyl group on carbon disulfide linker from the side of the antibody, whereas the 8REB-EM4 conjugate contains a steric hindrance in the form of two methyl groups on the disulfide-bearing carbon of the linker from the side of maytansine.
Антитело 1шЭ86у1.01 (8 мг/мл) подвергали модификации при 8-кратном молярном избытке Мсукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноата (8РЭВ) для введения дитиопиридильных групп. Реакцию проводили в смеси из 95% буфера А (50 мМ КР1, 50 мМ №С1, 2 мМ ЭДТА, рН 6,5) и 5% этанола в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергали гель-фильтрации через колонку с 15 мл 8ерйабех С25 (уравновешенную в буфере А). Степень модификации определяли путем измерения поглощения антител при 280 нм и выделения 2-меркаптопиридина (8ру) под действием ΌΤΤ при 280 и 343 нм. Затем модифицированные тиЭ86 подвергали конъюгированию при 2,5 мг антител/мл и 1,7кратном молярном избытке ^-деацетил-Н2-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансина (Ь-ЭМ4) относительно 8ру. Реакцию проводили в смеси из буфера А (97%) и ОМА (3%). Реакцию инкубировали при комнатной температуре в течение ночи ~20 ч. В отличие от конъюгирования тиО86, реакционная смесь была прозрачной и ее сразу же подвергали гель-фильтрации через колонку с 15 мл NАР С25, уравновешенную в цитратном буфере (20 мМ цитрат, 135 мМ №С1, рН 5,5). Конъюгат стерилизировали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм МШех-СУ. Число молекул ЭМ4, соединенных с молекулой Ό86, определяли измерением поглощения профильтрованного материала при 252 нм и 280 нм. Соотношение ЭМ4/АЬ оказалось равным 3,2, а выход на стадии конъюгирования Ό86 составил 69%. Концентрация конъюгированного антитела составила 1,51 мг/мл. Очищенный конъюгат подвергали биохимическому исследованию методом эксклюзионной хроматографии (8ЕС), при этом оказалось, что он на 92% состоит из мономера. Анализ ЭМ4 в очищенном конъюгате показал, что >99% его ковалентно связано с антителом.The antibody 1shE86y1.01 (8 mg / ml) was modified with an 8-fold molar excess of Msuccinimidyl-4- (2-pyridyldithio) butanoate (8REV) to introduce dithiopyridyl groups. The reaction was carried out in a mixture of 95% buffer A (50 mM KR 1 , 50 mM No. C1, 2 mM EDTA, pH 6.5) and 5% ethanol for 1.5 h at room temperature. The reaction mixture was subjected to gel filtration through a column of 15 ml of 8eryabec C25 (equilibrated in buffer A). The degree of modification was determined by measuring the absorption of antibodies at 280 nm and the isolation of 2-mercaptopropyridine (8pu) under the action of ΌΤΤ at 280 and 343 nm. Then, the modified thie86s were conjugated at 2.5 mg of antibodies / ml and a 1.7-fold molar excess of ^ -deacetyl-H 2 - (4-methyl-4-mercapto-1-oxopentyl) maytansine (L-EM4) relative to 8pu. The reaction was carried out in a mixture of buffer A (97%) and OMA (3%). The reaction was incubated at room temperature overnight for ~ 20 hours. Unlike conjugation of thiO86, the reaction mixture was transparent and it was immediately subjected to gel filtration through a column of 15 ml of NAP C25, equilibrated in citrate buffer (20 mM citrate, 135 mM No. C1, pH 5.5). The conjugate was sterilized by filtration through a 0.22 μm filter MSHex-SU. The number of EM4 molecules connected to the Ό86 molecule was determined by measuring the absorption of the filtered material at 252 nm and 280 nm. The EM4 / AB ratio turned out to be 3.2, and the yield at the conjugation stage Ό86 was 69%. The concentration of conjugated antibodies was 1.51 mg / ml. The purified conjugate was subjected to biochemical analysis by size exclusion chromatography (8ES), and it turned out that it was 92% monomer. Analysis of EM4 in the purified conjugate showed that> 99% of it is covalently bound to the antibody.
На фиг. 29А анализ связывания конъюгата 1шО86у1.01-ЭМ4 и немодифицированного Ό86 с клетками КВ методом проточной цитометрии показал, что конъюгирование НнЭ86у1.01 практически не вызывает снижения аффинности. Опыты по связыванию проводили в основном, как описано для фиг. 20, за исключением того, что использовали клетки КВ, а не клетки Саον-3. Цитотоксичность 1шО86у1.01-ЭМ4 1п νίΙΐΌ тестировали в основном, как описано для фиг. 24С. Конъюгат 1шЭ86у1.01 вызывал гибель клеток νίδΗ со значением 1С50 в 4,4х10-10 М, тогда как неконъюгированное антитело НнЭ86у1.01 не проявляло цитотоксической активности.In FIG. 29A analysis of the binding of 1shO86y1.01-EM4 conjugate and unmodified Ό86 to KB cells by flow cytometry showed that conjugation of NnE86y1.01 practically does not cause a decrease in affinity. Binding experiments were carried out mainly as described for FIG. 20, except that KB cells were used, not Caον-3 cells. The cytotoxicity of 1SO86y1.01-EM4 1n νίΙΐΌ was tested mainly as described for FIG. 24C. Conjugate 1shE86y1.01 caused the death of νίδΗ cells with a value of 1C 50 in 4.4 × 10 -10 M, while the unconjugated antibody HnE86y1.01 did not show cytotoxic activity.
Активность 1шО86у1.01ЭМ4 ш νί\Ό тестировали на поджелудочной модели НРАС. Клетки НРАС инокулировали в день 0, а иммуноконъюгат вводили на 13-й день. Получавших РВ8 контрольных животных подвергали эвтаназии при превышении объема опухоли в 1000 мм3. Конъюгат вводили в дозе 200 мкг/кг или 600 мкг/кг ЭМ4, что соответствует концентрации антител в 15 и 45 мг/кг соответственно. Отмечали объем опухолей (фиг. 30А) и вес тела (фиг. 30В) мышей на протяжении исследования. Конъюгат 1шО86у1.01-ОМ4 проявлял сильную противоопухолевую активность при 200 мкг/кг ЭМ4 на всех мышах, достигая полной регрессии опухолей. Контрольный конъюгат В4-ЭМ4, распознающий антиген, который не экспрессируется на ксенотрансплантатах НРАС, практически не обладал активностью при 200 мкг/кг. Отсутствие потери веса тела (фиг. 30В) у мышей свидетельствует, что доза конъюгата в 200 мкг/кг находится ниже максимальной допустимой дозы. Этот результат показывает, что гуманизованный вариантActivity 1шО86у1.01ЭМ4 ш νί \ Ό was tested on the HPAC pancreatic model. HPAC cells were inoculated on day 0, and the immunoconjugate was administered on day 13. Received PB8 control animals were euthanized when the tumor volume exceeded 1000 mm 3 . The conjugate was administered at a dose of 200 μg / kg or 600 μg / kg EM4, which corresponds to an antibody concentration of 15 and 45 mg / kg, respectively. Tumor volume (FIG. 30A) and body weight (FIG. 30B) of mice were noted throughout the study. The 1shO86y1.01-OM4 conjugate showed strong antitumor activity at 200 μg / kg EM4 in all mice, achieving complete tumor regression. The B4-EM4 control conjugate, which recognizes an antigen that is not expressed on HPAC xenografts, had practically no activity at 200 μg / kg. The absence of body weight loss (Fig. 30B) in mice indicates that a conjugate dose of 200 μg / kg is below the maximum allowable dose. This result shows that the humanized option
- 38 020130- 38 020130
Ό86 способен опосредовать направленную доставку препарата типа майтансиноида, что приводит к сильной противоопухолевой активности.Ό86 is able to mediate targeted delivery of a maytansinoid-type drug, which leads to strong antitumor activity.
Перечень последовательностей <110> ИММЬЮНОДЖЕН, инк.Sequence Listing <110> IMMUNOGEN, Inc.
ПАЙН, ДжиллианPINE, Gillian
ЧАН, ФилипCHAN, Philip
ТАВАРЕС, Дэниэл <120> СПЕЦИФИЧНОЕ К АНТИГЕНУ СА6 АНТИТЕЛО, СОДЕРЖАЩИЙ ЕГО ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ КОНЪЮГАТ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ КОНЪЮГАТА <130> А8621 <150> 60/488,447 <151> 2003-07-21 <160> 63 <170> Ра(еп11п уегзюп 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> ПРТ <213> Миз тизсЫиз <400> 1TAVARES, Daniel <120> ANTI-BODY SPECIFIC TO CA6 ANTIGEN, CONTAINING ITS CYTOTOXIC CONJUGATE AND METHODS OF APPLICATION OF THE CONJUGATE <130> A8621 <150> 60 / 488,447 <151> 2003-07-21 <70603 63пе 63пе 63пе 63пе 63п113 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Misstep from <400> 1
8ег Туг Азп Ме11Пз8eg Tug Azp Me11Pz
5 <210> 2 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 25 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mizzies 1 of <400> 2
Туг Не Туг Рго С1у Азп О1у А1а ТЬг Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе ЬузTug Ne Tug Rgo C1u Azp O1u A1a Thg Azp Tug Azp O1n bb bb bb
10 1510 15
О1у <210> 3 <211> 8 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 3O1u <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Mizzies 1 of <400> 3
- 39 020130- 39 020130
61у Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг61y Azr Zeg Wa1 Rgo Rye A1a Tug
5 <210> 4 <211> 10 <212> ПРТ <213> МизтизсиЬз <400> 45 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Misfits <400> 4
Зег А1а ΗΪ3 8ег 8ег Уа1 8ег РЬе Мег ΗίβZeg A1a ΗΪ3 8eg 8eg Wa1 8eg Pbе Meg Ηίβ
5 10 <210> 5 <211> 7 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 55 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Miz tizsi1iz <400> 5
8ег ТЬг 8ег Зег Ьеи А1а 8ег8eg Tg 8eg Zeg Ley A1a 8eg
5 <210> 6 <211> 9 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 65 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Miz tizsi1iz <400> 6
О1п О1п Агд 8ег 8ег РЬе Рго Беи ТЬгO1n O1n Agd 8eg 8eg Rb Rgo Bei Thr
5 <210> 7 <211> 321 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <220>5 <210> 7 <211> 321 <212> PRT <213> Miz tizsi1iz <220>
<221> экзон <222> (1)..(321) <400> 7 саа ай дй с!с асе сад ιοί сса дса а(с а1д 1с( дса 1с1 сса ддд 48 СИп Пе Уа1 Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а Не Ме1 Зег А1а Зег Рго О1у 15 10 15<221> exon <222> (1) .. (321) <400> 7 saa ai dy s! With ase garden ιοί ssa dsa a (s a1d 1s (dsa 1s1 ssa ddd 48 Sip Pe Ua1 Lei Thr 61n Zeg Rgo A1a Not Me1 Zeg A1a Zeg Rgo O1u 15 10 15
- 40 020130 дад аад дСс асе а!а асе Сде ад! дес сас !са ад! дСа ад! йс а!д 96 СНи Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз 8ег А1а Нез Зег 8ег Уа1 8ег РЬе Ме! 20 2530 сас (дд йс сад сад аад сса ддс ас! Сс! ссс ааа с!с !дд ай !а!144- 40 020130 dad aad dSs ace ah! And ace Sde hell! des sas! sa hell! dSa hell! ys a! d 96 SNi LU Va1 Tg Not Tg Suz 8eg A1a Nez Zeg 8eg Wa1 8eg Rbе Me! 20 2530 sas (dd ys garden garden aad ssa dds as! Ss! Sss aaa s! S! Dd ah! A! 144
ΗΪ8 Тгр РЬе С1п С1п Ьуз Рго <Э1у ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045 аде аса !сс аде с!д де! !с! дда д!с ее! де! еде йс дд! ддс ад! 192ΗΪ8 Tgr Pb С C1n C1n уз Р Р го <<1 у Ь г ег ег Р Р го го уз Ь Ь Т р Не Т 40 40 35 4045 hell asa! Ss hell with! D de! !from! dda q! with her! de! food ys dd! dds hell! 192
8ег ТЬг 8ег 8ег Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе О1у СНу Зег 50 5560 дда !с! ддд асе !с! сас 1сС сГс аса а!с аде еда а!д дад дс! даа 240 СНу 8ег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме! СНи А1а СНи 65 70 7580 да! де! дсс асС !а! Сас !дс сад саа адд адС адС йс сед сСс асд 288 Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз 61 η СИп Агд Зег Зег РЬе Рго Ьеи ТЬг 85 9095 йс ддС дсС ддд асе аад сед дад сед ааа сде3218g Tg 8g 8g Lei A1a Zeg O1y Wa1 Prgo A1a Agd Rie O1u SNu Zeg 50 5560 dda! S! ddd d ace! s! САС 1сС СГс аса ah! with ada food a! d dad ds! yeah 240 SNU 8eg O1y Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Not Zeg Agd Me! SNi A1a SNi 65 70 7580 yes! de! DSS ACC! Ah! Sas! Ds garden saa add adS adS ys sed sss ssd 288 Azr A1a A1a Tg Tug Tug Suz 61 η SIP Agd Zeg Zeg Rie Rgo Ley Tg 85 9095 ys dds dss ddd dse ace aad sed dad sed aaa sde321
РЬе 61у А1а СНу ТЬг Ьуз Ьеи СНи Ьеи Ьуз АгдPb 61u A1a SNu Thb bb bbc bbc bb bb
100105 <210> 8 <211> 321 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>100 105 <210> 8 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> гуманизированная последовательность мышиного антитела <220><223> humanized murine antibody sequence <220>
<221> экзон <222> (1)..(321) <400> 8 дад ай дй сСс асе сад Сс! сса дса асе а!д !с! дса СсС сса ддд 48 СНи Не Уа1 Ьеи ТЬг О1п Зег Рго А1а ТЬг МеС Зег А1а Зег Рго О1у 15 1015 дад адд дСс асе аСа асе !дс ад! дсс сас !са ад! дСа ад! Йс аСд 96 О1и Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а Н1з Зег Зег Уа1 Зег РЬе МеС<221> exon <222> (1) .. (321) <400> 8 dad ay ss ss ace garden ss! ssa dsa ace a! d! s! dsa sss ssa ddd 48 SNi Ne Wa1 Lei Thr O1n Zeg Rgo A1a Thg MeS Zeg A1a Zeg Rgo O1u 15 1015 dad add dSs ace asa Asa ace! ds hell! dss sas! sa hell! dSa hell! Ys aSd 96 O1 and Aghd Ya1 Thr Not Tg Suz Zeg A1a H1z Zeg Zeg Ya1 Zeg Rye MeS
2530 сас Сдд !!с сад сад аад сса ддс ас! !с! ссс ааа с!с !дд ай !а!1442530 sas sdd !! s garden garden aad ssa dds as! !from! sss aaa s! s! dd ah! ah! 144
Из Тгр РЬе С1п СИп Ьуз Рго СНу ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045 аде аса Ссс аде сСд дсС Сс! дда дСс сс! дсС сдс йс дд! ддс адС192From Tgr Pb, Cnn, Sip, Zn, Rgos, Zn, Tg, Zeg, Rgos, Lzs, Tgr, Not Tug, 35 4045 Ada Asa Sss Ad Ssd DsS Ss! dda dss ss! dss sds ys dd! dds adS192
- 41 020130- 41 020130
Зег ТЬг Зег Зег Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе О1у О1у Зег 50 5560 ё§а (с( ддд ΐεΐ (ас (с( с(с аса а(с аде аде а(д дад дс( даа 240 О1у Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ме( О1и А1а О1и 65 70 7580 да( дс( дсс ас( (а( (ас (дс сад саа адд ад( ад( Кс ссд с(с асд 288 Акр А1а А1а ТЬг Туг Туг Сук <31п О1п Агд Зег Зег РЬе Рго Ьеи ТЬг 85 9095 пс дд( дс( ддд асе аад с(д дад с(д ааа сд(321Zeg Tg Zeg Zeg Lei A1a Zeg O1u Wa1 Prgo A1a Agd Rie O1u O1u Zeg 50 5560 §§a (s (ddd d ΐεΐ (as (s (s (s asa a (with adé adé (d dad ds (daa 240 O1u Zeg C1u Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Pe Zeg Zeg Me (O1i A1a O1i 65 70 7580 yes (ds (dss as ((a ((as (ds garden saa add hell (hell (Ks ssd (s asd 288 Acre A1a A1a Tg Tug Tug Suk <31n O1n Agd Zeg Zeg Rie Rgo Lei Thr 85 9095 ps dd (ds (ddd d ace aad s (d dad s (d aaa sd (321
РЬе О1у А1а О1у ТЬг Ьук Ьеи О1и Ьеи Ьук АгдPie O1u A1a O1u Th2 Luk Ley O1 and Ley Luke Agd
100105 <210> 9 <211> 351 <212> ПРТ <213> Миктикси1ик <220>100 105 <210> 9 <211> 351 <212> PRT <213> Miktiksi1ik <220>
<221> экзон <222> (1)..(351) <400> 9 сад дс( Ха( с(с сад сад (с( ддд дс( дад с(д д(д адд (с( ддд дсс 48 <31п А1а Туг Ьеи О1п СИп Зег О1у А1а (Ли Ьеи Уа1 Агд Зег О1у А1а 15 1015 (са д(д аад а(д (сс (дс аад дс( (с( ддс (ас аса (((асе ад( (ас 96 Зег Уа1 Ьук Ме( Зег Сук Ьук А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530 аа( а(д сас (дд д(а аад сад аса сс( дда сад ддс с(д даа (дд ай 144 Акп Ме( Ηΐκ Тгр Уа1 Ьук О1п ТЬг Рго О1у О1п <31у Ьеи О1и Тгр Пе 35 4045 дда (а( ай (а( сс( дда аа( дд( дс( ас( аас (ас аа( сад аад По 192 С1у Туг Пе Туг Рго <31 у Акп О1у А1а ТЬг Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе<221> exon <222> (1) .. (351) <400> 9 garden ds (Ha (s (s garden garden (s (ddd ds (dad s (d d (d add (s (ddd dss 48 < 31n A1a Tug Ley O1n Sip Zeg O1u A1a (Li Ley Wa1 Agd Zeg O1u A1a 15 1015 (sa d (d aad a (d (ss (ds aad ds) ((s (dds (ace as (((ace ad (( 96 Zeg Ya1 Luk Me (Zeg Suk Luk A1a Zeg S1y Tug Tg Pb Tg Zeg Tug 20 2530 aa (a (d sas (dd d (aad sad asa ss (dda sad dds s (d daa (dd ai 144 Akp Me ( Ηΐκ Тгр Уа1 Лук О1п Тг Рго О1у О1п <31у Ле О1и Тг Pe 35 4045 dda (a (ay (a (ss (dda aa (dd (ds (as) aas (as aa (garden aad Po 192 S1u Tug Pe Tug Rgo <31 y Akp O1y A1a Thb Azp Tug Azp O1n bz Pb
5560 аад ддс аад дсс аса йд ас( дса дас сса (сс (сс аде аса дсс (ас 240 Ьуз СИу Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Рго Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580 а(д сад а(с аде аде с(д аса (с( даа дас (с( дед д(с (а( Нс (д(2885560 aad dds aad dss asa id as (dsa das ssa (ss (ss ade asa dss (as 240 bc siu ba A1a bb baa bb A1a azr rgo zeg zeg bb baaa baa 65 70 7580 a (d garden a (with ade ade s (d asa (s (daa das (s) grandfather d (s (a (Hs (d (288
Ме( 61п Пе Зег Зег Ьеи ТЬг Зег <31и Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095 дса ада дда да( (сд д(с ссд Ш дс( (ас (дд ддс саа ддд ас( ей 336Me (61n Pe Zeg Zeg Ley Thg Zeg <31 and Azr Zeg A1a Wa1 Tug Rye Suz 85 9095 dsa ada dda yes (
- 42 020130- 42 020130
А1а Агд СИу Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг Тгр О1у СИп СИу ТЬг Ьеи 100 105 110 д!с ас! βίο !с! дса 351A1a Agd SIu Azr Zeg Va1 Prgo Pbu A1a Tug Tgr O1u SIp SIu Tgbb 100 100 110 110! βίο! s! dsa 351
Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1аWa1 Th2 Wa1 Zeg A1a
115 <210> 10 <211> 351 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>115 <210> 10 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> гуманизированная последовательность мышиного антитела <220><223> humanized murine antibody sequence <220>
<221> экзон <222> (1)..(351) <400> 10 сад дс! сад с(с д!д сад Гс1 ддд дс! дад д!д д!д аад ссс ддд дсс 48 О1п А1а СИп Ьеи Уа1 СИп Зег СИу А1а СИи Уа! Уа1 Ьуз Рго СИу А1а 15 1015 (са д(д аад а!д тсс !дс аад дс( (а ддс 1ас аса й! асе ад! (ас 96 Зег Уа1 Ьуз Мег Зег Суз Ьуз А1а Зег СИу Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг<221> exon <222> (1) .. (351) <400> 10 garden ds! garden s (s d! d garden Gs1 ddd ds! dad d! d d! d aad sss ddd dss 48 O1n A1a SIp Li Ya1 SIp Zeg SIu A1a SIa Wa! Wa1 yz Rgo SIu A1a 15 1015 (sa d (yes aaa ! d tss! ds aad ds ((and dds 1ac asa y! ase hell! (as 96 Zeg Wa1 bz Meg Zeg Suz bz A1a Zeg SIu Tug Tg Rb Tg Zeg Tug
2530 аа( а!д сае !дд д1а аад сад аса сс! дда сад ддс с!д даа !дд ай 144 Азп Ме! Н13 Тгр Уа1 Ьуз О1п ТЬг Рго СИу СИп СИу Ьеи О1и Тгр Не2530 aa (a! D sae! Dd d1a aad garden asa ss! Dda garden dds s! D daa! Dd ai 144 Azp Me! H13 Tgr Ya1 bz O1n Tg Rgo SIu SIp SIu Lei O1i Tg Not
4045 дда !а! ай !а! ее! дда аа! дд! дс! ас! аас !ас аа! сад аад йс 1924045 dda! A! ah! ah! her! dda aa! dd! ds! ace! aas! as aa! garden aad js 192
СИу Туг Не Туг Рго СИу Азп О1у А1а ТЬг Азп Туг Азп СИп Ьуз РЬеSIu Tug Ne Tug Rgo SIu Azp O1u A1a Thg Azp Tug Azp Sip bz Pb
5560 сад ддс аад дсс аса йд ас! дса дас аса !сс !сс аде аса дсс !ас 240 СИп О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580 а!д сад а!с аде аде с!д аса 1с1 даа дас Тс! дед д!с (а! йс !д!2885560 garden dds aad dss asa id id! dsa das asa! ss! ss ad asa dss! as 240 Sip O1u bz A1a Tg bie Tg A1a Azr Tg Zeg Zeg Zeg Tg A1a Tug 65 70 7580 a! d garden a! with ada ada c! d asa 1s1 daa das Ts! grandfather d! s (a! ys! d! 288
Ме! СИп Не Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе СузMe! Sip Not Zeg Zeg Ley Thg Zeg Zee SI Azr Zeg A1a Wa1 Tug Rye Suz
9095 дса ада дда да! !сд д!с ссд И! дс! !ас (дд ддс саа ддд ас! ей 336 А1а Агд СИу Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг Тгр СИу СИп СИу ТЬг Ьеи 100 105110 д(с ас! д!с Те! дсс3 519095 dsa hell dda yes! ! sd d! ssd And! ds! ! ac (dd dds saa ddd as! her 336 A1a Agd Siu Azr Zeg Wa1 Prgo Rie A1a Tug Tgr Siu Sip Siu Siu Tg Lei 100 105 110 d (with as! d! s Te! dss3 51
Уа1ТЬгУа1 Зег А1аVa1TbVa1 Zeg A1a
- 43 020130- 43 020130
115 <210> 11 <211> 351 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>115 <210> 11 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial sequence <220>
<223> гуманизированная последовательность мышиного антитела <220><223> humanized murine antibody sequence <220>
<221> экзон <222> (1)-.(351) <400> 11 са§ §с! сад с!с д!д сад (с! ддд де! дад £(ё аад ссс ёёё ё<^<221> exon <222> (1) -. (351) <400> 11 sa§ §c! garden s! s d! d garden (s! ddd d! dad d £ (ё aad sss ёё ё <^
О1п А1а О1п Ьеи Уа1 <Э1п Зег О1у А1а СИи Уа1 Уа1 Ьуз Рго О1у А1а 15 1015 (са д!д аад а!д !сс !дс аад дс! !с! ддс !ас аса й! асс а# !ас 96 Зег Уа1 Ьуз Ме! Зег Суз Ьуз А1а 8ег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег ТугО1п А1а О1п Леу Уа1 <Е1п Зег О1у А1а Си Уа1 Уа1 бз Рго О1у A1а 15 1015 (sa d! D aad a! D! Ss! Ds aad ds!! S! Dds! As asa y! Ass a #! As 96 Zeg Va1 Luz Me! Zeg Suz Luz A1a 8eg O1u Tug Tg Pb Tg Zeg Tug
2530 аа! а!д сас !дд д(а аад сад аса сс! дда сад ддс с!д 8аа !дд ай 144 Азп Ме! Шз Тгр Уа1 Ьуз СИп ТЬг Рго Сг1у О1п О1у Ьеи СИи Тгр Не2530 aa! a! d sas! dd d (and aad garden asa ss! dda garden dds s! d 8aa! dd ay 144 Azp Me!
4045 ада !а( ай !а! сс! £§а аа! дд! дс! ас! аас (ас аа! сад аад Ес 1924045 hell! A (ah! Ah! Ss! £ §a aa! Dd! Ds! As! Aas (as aa! Garden aad Es 192
О1у Туг Не Туг Рго СИу Азп С1у А1а ТЬг Азп Туг Азп С1п Ьуз РЬе 50 5560 сад ддс аад дсс аса йд ас! дса дас сса !сс !сс аде аса дсс !ас 240 О1п О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Рго Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580 а!д сад а!с аде аде с!д аса !с! даа дас !с! дед д!с !а! йс !д!288O1u Tug Ne Tug Rgo SIu Azp C1u A1a Thg Azp Tug Azp C1n bz Rb 50 5060 garden dds aad dss asa id as! dsa das ssa! ss! ss ad ade asa dss! as 240 O1n O1u bz A1a Tg bie Tg A1a Azr Rgo Zeg Zeg Zeg Tg A1a Tug 65 70 7580 a! d garden a! with ada hell! yeah das! s! grandfather d! s! a! ys! d! 288
Ме! О1п Не Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095 дса ада дда да! !сд д!с сед !й дс! 1ас (дд ддс саа ддд ас! ей 336Me! O1n Not Zeg Zeg Ley Thz Zeg SIi Azr Zeg A1a Wa1 Tug Rye Suz 85 9095 dsa hell dda yes! ! sd d! s sed! th ds! 1ac (dd dds saa ddd d as! Her 336
А1а Агд О1у Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг Тгр О1у СНп О1у ТЬг Ьеи 100 105110 д!с ас! д(с !с! дсс351A1a Agd O1y Azr Zeg Ya1 Prgo Rye A1a Tug Tgr O1y SNp O1u Tg Lei 100 105 110 d! S as! d (s! s! dss351
Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1аWa1 Th2 Wa1 Zeg A1a
115 <210> 12 <211> 15115 <210> 12 <211> 15
- 44 020130 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <4О0> 12- 44 020130 <212> PRT <213> Miz tizsi1iz <4O0> 12
01п Уа1 ТЬг А1а Не Рго Ьуз Рго О1у С1у А1а Зег Агд О1и Ьуз 15 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> ПРТ <213> Нотозар1епз <400> 1301n Ya1 Tyr A1a Not Prgo Luz Prgo O1y C1y A1a Zeg Agd O1i Luz 15 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Notozar1epz <400> 13
О1и Уа1 ТЬг А1а ТЬг Рго Агд Рго О1у О1у А1а Зег Зег СНи Ьуз 15 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> ПРТ <213> Нотозар1епз <400> 14O1 and Va1 Thr A1a Thr Prgo Agd Rgo O1u O1u A1a Zeg Zeg SNi bz 15 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Notozar1epz <400> 14
О1и Уа1 ТЬг СНу ТЬг Рго Агд Рго О1у СНу Азр Зег Агд О1и Ьуз 15 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> ПРТ <213> Нотозар1епз <400> 15O1 and Va1 Thr SNu Thr Rgo Agd Rgo O1u SNu Azr Zeg Agd O1i Luz 15 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Notozar1epz <400> 15
СНи Уа1 ТЬг СНу ТЬг Рго Агд Рго СНу О1у Азр Зег Агд О1и ЬузSNi Ya1 Thr SNu Thr Rgo Agd Rgo SNu O1u Azr Zeg Agd O1i Luz
10 15 <210 16 <211> 23 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400 1610 15 <210 16 <211> 23 <212> PRT <213> Mizzies 1 of <400 16
61п Туг СНп А1а Ьеи Агд Зег Ьуз Ьуз Рго СНу С1п О1п Ьуз Ьуз СНу61n Tug SNp A1a Ley Agd Zeg Luz Lgo Rgo SNu C1n O1n Lj Luz SNu
10 1510 15
- 45 020130- 45 020130
Рго Зег Зег Зег СИи О1п Зег <210> 17 <211> 23 <212> ПРТ <213> Ното зар^епз <400> 17Rgo Zeg Zeg Zeg SIi O1n Zeg <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Noto charge <enp <400> 17
О1п СИп Уа1 А1а Уа1 Ьуз Рго Ьуз Ьуз Рго СИу 01η СИп Ьуз О1п О1уO1n SIp Ya1 A1a Ya1 L3 Rgo L3 L3 Rgo SIu 01η LNL O1n O1y
10 1510 15
ТЬг Зег Зег 8ег О1и СИп Зег <210> 18 <211> 22 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 18Thr Zeg Zeg 8eg O1 and Sip Zeg <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Note zar1epz <400> 18
О1п Уа1 А1а Уа1 Ьуз Рго Ьуз Ьуз Рго СИу О1п О1п Ьуз СИп О1у О1и 15 10 15О1п Уа1 А1а Уа1 Luz Рgo Luz Luz Рgo SIu О1п О1п Luz SIp О1у О1и 15 10 15
Зег Зег Зег 61и С1п Зег <210> 19 <211> 22 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 19Zeg Zeg Zeg 61i С1п Зег <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Note zar1epz <400> 19
О1п Уа1 А1а Уа1 Ьуз Рго Ьуз Ьуз Рго О1у СИп О1п Ьуз СЬ СИу СИи 15 10 15O1n Va1 A1a Va1 bp Rgo bb bb Rg O1y Cp O1p bc Cbcr 15 10 15
Зег Зег Зег О1и СИп Зег <210> 20 <211> 10Zeg Zeg Zeg O1 and Sip Zeg <210> 20 <211> 10
- 46 020130 <212>- 46 020130 <212>
<213><213>
ПРТPRT
Миз шизси1из <400>Miz Shizzi1 of <400>
С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг 8ег Туг Азп Ме1 ΗΪ3 I 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 21С1у Туг Тг РЬе Тг 8г Туг Азп Ме1 ΗΪ3 I 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Miztis1iz <400> 21
Туг Не Туг Рго СИу Азп С1у А1а ТЬг АзпTug Not Tug Rgo SIu Azp C1u A1a Thg Azp
5 10 <210> 22 <211> 8 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 225 10 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Mizzies 1 of <400> 22
СИу Азр 8ег Уа1 Рго РЬе А1а ТугSIU Azr 8eg Wa1 Rgo Rye A1a Tug
5 <210> 23 <211> 95 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 235 <210> 23 <211> 95 <212> PRT <213> Mizzies1 of <400> 23
О1п Не Уа1 Ьеи ТЬг О1п 8ег Рго А1а Не Ме18ег А1а Зег Рго О1уO1n Ne Wa1 Lei Thr O1n 8eg Rgo A1a Ne Me18eg A1a Zeg Rgo O1u
10151015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеС 20 2530O1 and Luz Va1 Tg Not Tz Suz Zeg A1a Zeg Zeg Zeg Va1 Zeg Tug MeC 20 2530
ΗΪ3 Тгр РЬе СИп О1п Ьуз Рго СИу ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045ΗΪ3 Tgr Rie Sip O1n bz Rgo SIu Tg Zeg Rgo bz Ley Tg Not Tug 35 4045
Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СИу Уа1 Рго А1а Аге РЬе Зег СИу 8ег 50 5560Zeg Thb Zeg Azp Ley A1a Zeg SIu Ya1 Rgo A1a Age Rie Zeg SIu 8eg 50 5560
- 47 020130- 47 020130
01у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме!СИ и А1а О1и 65 70 75 8001y Zeg O1y Ty Zeg Tug Zeg Lei Thg Not Zeg Agd Me! SI and A1a O1i 65 70 75 80
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз СНп СИп Агд Зег Зег Туг Рго РгоAzr A1a A1a Thr Tug Tug Suz SNp Sip Agd Zeg Zeg Tug Rgo Rgo
90 95 <210> 24 <211> 98 <212> ПРТПРТ <213> Миз тизси1из <400> 2490 95 <210> 24 <211> 98 <212> PRTRT <213> Miz tiessi1 of <400> 24
СНп А1а Туг Ьеи Щп О1п Зег С1у А1а О1и Ьеи Уа1 Агд Зег О1у А1аSNp A1a Tug Ley Shchp O1n Zeg C1u A1a O1 and Ley Wa1 Agd Zeg O1u A1a
10151015
Зег Уа1 Ьуз Ме! Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530Zeg Wa1 Luz Me! Zeg Suz bz A1a Zeg C1u Tug Tg Pb Tg Zg Tug 20 2530
Азп Ме! Шз Тгр Уа1 Ьуз С1п ТЬг Рго О1у СНп О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045Azp Me! Shz Tgr Ya1 bz S1n Tg Prg O1y SNp O1u bn O1i Tgr Not 35 4045
О1у Туг Не Туг Рго О1у Азп О1у СИ у ТЬг Азп Туг Азп СИп Ьуз РЬе 50 5560O1y Tug Ne Tug Rgo O1u Azp O1u SI y Tg Azp Tug Azp Sip bz 50 5060
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр ТЪг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz O1y Luz A1a Tg Ley Tg A1a Azr Tg Zeg Zeg Zeg Tg A1g Tug 65 70 7580
Ме! СНп Не Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095Me! SNp Not Zeg Zeg Lei Thg Zeg SIi Azr Zeg A1a Wa1 Tug Rye Suz 85 9095
А1а Агд <210> 25 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>A1a Agd <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер<223> PCR primer
- 48 020130 <400> 25- 48 020130 <400> 25
1а(ададс1с аадсйдда! дд!дддаа§а 1дда!асад! (дд!дс 46 <210> 26 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>1a (adads1s aadsidda! Dd! Dddaa§a 1dda! Asad! (Dd! Ds 46 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 26 ддаддаСсса (адасадаСд дддд(д(сд1 ПСддс 36 <210> 27 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР праймер <400> 27 дддадсСсда уайдСдпйз астсапусйп са 32 <210> 28 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР праймер <220 <221> пнкс ГеаШге <222> (18)..(18) <223> η это а, с, д, или I <400 28 сйссддааС СсвагдСпта дсСдзадаад 1с 32 <210> 29 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность<223> PCR primer <400> 26 ddddaScca (adasada SDd dddd (d (sd1 PSDds 36 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220 <223> PCR primer <400> 27 dddadsSdda.sdypys ast ca 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220 <223> PCR primer <220 <221> pnx GeaShge <222> (18) .. (18) <223> η this is a , s, d, or I <400 28 sssddaaS SsvagdSpta dsSdzadaad 1s 32 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence
- 49 020130 <220>- 49 020130 <220>
<223> ПЦР праймер <220><223> PCR primer <220>
<221> гшзс ЕеаШге <222> (18)..(18) <223> η это а, с, или I <400> 29 сИссддаа! юзагдшта дс^задзад 35 <210> 30 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220><221> ghzs EeyaShge <222> (18) .. (18) <223> η is a, s, or I <400> 29 s Issddaa! usagdsta ds ^ zadzad 35 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Вырожденный праймер <400> 30<223> Degenerate primer <400> 30
Ш1§ааПс аа1аас(аса §£1£1ссас( 30 <210> 31 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>Ш1§ааПс аа1аас (аса § £ 1 £ 1ССас (30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> Вырожденный праймер <400> 31<223> Degenerate primer <400> 31
ПП£адс1с садайПса дсПсс1дс1 30 <210> 32 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>PP £ ads1c sadaiPSa dsPss1ds1 30 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 32 сда1§§дссс с(§сада§ас а§1дасса§а 40 <210> 33 <211> 28 <212> ДНК<223> PCR primer <400> 32 sda1§§dsss s (§gardening§as a1dassa 40 <210> 33 <211> 28 <212> DNA
- 50 020130 <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР праймер <400 33- 50 020130 <213> Artificial sequence <220 <223> PCR primer <400 33
ППсдсасд Гйсадс1сс а§сид§1 28 <210> 34 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>Ppsdsasd Gysads1ss aqsid§1 28 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400 34 садд1д1аса с(сссаадс( (а(с1сса§с а§1с1 35 <210 35 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220><223> PCR primer <400 34 sadd1d1asa s (cssaads ((a (c1cca§c§1c1 35 <210 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223 > ПЦР праймер <400 35 сда1д§дссс Пддхддадд сддсададас ад1§асса§а 40 <210> 36 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220><223> PCR primer <400 35 sda1d§ddss pddhdddd sdsadadas ad1§assaga 40 <210> 36 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 36 са§д>д1аса с(ссдадай дНс1сассс ад(с(ссадс аасса(д1с1 дсаш 56 <210> 37 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220><223> PCR primer <400> 36 sagd> d1ac s (give dNc1cassc hell (s (ccdc aassa (d1c1 dcac 56 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер<223> PCR primer
- 51 020130 <400> 37 §£сас1£са£ £1(а1££12а сссШсссс (§£ада 36 <210> 38 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>- 51 020130 <400> 37 § £ cac1 £ ca £ £ 1 (a1 £$ 12a sccsscc (§ £ hell 36 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 38 саа1са§са§ са1й£ае§с1 даада 25 <210> 39 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220><223> PCR primer <400> 38 saa1ca§sa§ sa1y £ aegs1 daada 25 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 39 §сс1сса1ес 1§с1еай§( §аеа 24 <210> 40 <211> 67 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220><223> PCR primer <400> 39 §cc1cca1ec 1§c1eai§ (§aea 24 <210> 40 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 40 са§е^аса с1ссса§£с1 са2с1с£.1§с а£1с1§££ес 1£а££1££1£ аа§ссс§е§§ 60 ссГсад! 67 <210> 41 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220><223> PCR primer <400> 40 sagе ^ asa s1sssa§ £ s1 sa2s1s £ .1§s а £ 1с1§ £$ uc 1 £ а £$ 1 £$ 1 £ аа§ссс§е§§ 60 ссГсад ! 67 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 41<223> PCR primer <400> 41
- 52 020130 (Цас1§сас асаса1сссс садсаса 27 <210> 42 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>- 52 020130 (Tsas1gasas asasa1ssss sadsasa 27 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 42 д1д1с1дсад 1саа1д1ддс сйдсссГдд аасйс(да( 40 <210> 43 <211> 40 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220><223> PCR primer <400> 42 d1d1s1dsad 1caa1d1dds sidsssGdd dac (yes (40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220>
<223> ПЦР праймер <400> 43 сдагдддссс йдШёадд сддсададас адгдасаада 40 <210> 44 <211> 107 <212> ПРТ <213> Миз тизстйиз <400> 44<223> PCR primer <400> 43 sdagddddsss Ш ад д д д сд 40 40 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Miztstyiz <400> 44
СИп Не Уа1 Ьеи ТЬг СИп Зег Рго А1а Не Ме1 Зег А1а РЬе Рго (ИуSip Ne Wa1 Lei Thp Sip Zeg Prog A1a Ne Meb Zeg A1a Pg Pro (Iu
10151015
СИи Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а ТЬг Зег Зег Уа1 Азп Туг Ме( 20 2530SIUy Ya1 Tyr Ne Tg Suz Zeg A1a Ty Zeg Zeg Ya1 Azp Tug Me (20 2530
ΗΪ3 Тгр РЬе СИп О1п Ьуз Рго СИу ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045ΗΪ3 Tgr Rie Sip O1n bz Rgo SIu Tg Zeg Rgo bz Ley Tg Not Tug 35 4045
Зег Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег СИу Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег О1у Зег 50 5560Zeg Zeg Zeg Azp Ley A1a Zeg SIu Ua1 Rgo A1a Agd Rye Zeg O1u Zeg 50 5560
СИу Зег СИу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме1 СИи А1а СИи 65 70 7580SIu Zeg SIu Thg Zeg Tug Zeg Ley Thg Not Zeg Agd Me1 SIi A1a SIi 65 70 7580
- 53 020130- 53 020130
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз СИп С1п Агд Зег Зег Туг Рго Не ТЬг 85 90 95Azr A1a A1a Thr Tug Tug Suz Sip S1p Agd Zeg Zeg Tug Rgo Not Tg 85 90 95
РЬе О1у Зег СИу ТЬг Ьуз Ьеи СИи Не Ьуз Агд 100 105 <210> 45 <211> 107 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <220>Pb e Oiu Zeg Siu Thr bz bie Sii Ne Neb Agd 100 105 <210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> Mizzies from <220>
<221> пйзс_Геа1иге <222> (1)..(1) <223> Хаа может быть любой природной аминокислотой <400> 45<221> pizs_Gea1ige <222> (1) .. (1) <223> Haa can be any natural amino acid <400> 45
Хаа Не Уа1 Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а Не Ме( Зег А1а Зег Рго СИу 15 1015Haa Ne Va1 Lea Tht 61n Zeg Rgo A1a Ne Me (Zeg A1a Zeg Rgo SIu 15 1015
СИи Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Азп НеSIUy Va1 Tg Not Tg Suz Zeg A1a Zeg Zeg Zeg Wa1 Zeg Azp Not
25302530
Н1з Тгр РЬе О1п СИп Ьуз Рго СИу ТЬг РЬе Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045Н1з Тгр Рее О1п SIp Luz Рgo SIu Тг Ре Рго Руь ёи Тг Not Туг 35 4045
Зег ТЬг Зег ТЬг Ьеи А1а Зег СИу Уа1 Рго С1у Агд РЬе Зег С1у Зег 50 5560Zeg Tg Zeg Tg Lye A1a Zeg SIu Wa1 Progo C1u Agd Pie Zeg C1u Zeg 50 5560
О1у Зег СИу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме! СИу А1а СИи 65 70 7580O1y Zeg SIu Thz Zeg Tug Zeg Ley Thg Not Zeg Agd Me! SIu A1a SIi 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п С1п Агд Зег СИу Туг Рго РЬе ТЬг 85 9095Azr A1a A1a Thr Tug Tug Suz O1n S1n Agd Zeg SIu Tug Rgo Rye Thb 85 9095
РЬе СИу Зег СИу ТЬг Ьуз Ьеи СИи Пе Ьуз Агд 100105 <210> 46Pie siu Zeg siu tg bz bie si pe ne baz agd 100 105 <210> 46
- 54 020130 <211> 107 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 46- 54 020130 <211> 107 <212> PRT <213> Mizshissi1 of <400> 46
Азр Пе О1п Ме1 ТЬг О1п Зег Рго А1а Пе Ме1 Зег А1а Зег Рго О1у 15 1015Azr Pe O1n Me1 Thr O1n Zeg Rogo A1a Pe Me1 Zeg A1a Zeg Rogo O1u 15 1015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг Ме( Ткг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме( 20 2530O1 and Luz Ya1 Thr Me (Tkz Suz Zeg A1a Zeg Zeg Zeg Ya1 Zeg Tug Me (20 2530
Туг Тгр Туг О1п СИп Ьуз Рго С1у Зег Зег Рго Агд Ьеи Ьеи Пе Туг 35 4045Tug Tgr Tug O1n SIP Luz Rgo C1u Zeg Zeg Rgo Agd Ley Ley Pe Tug 35 4045
Азр Зег ТЬг Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег С1у Зег 50 5560Azr Zeg Thr Azp Ley A1a Zeg SNU Ya1 Rgo Ya1 Agd Rye Zeg C1u Zeg 50 5560
СНу Зег СНу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Пе Зег Агд Ме( О1и А1а О1и 65 70 7580SNU Zeg SNU Thr Zeg Tug Zeg Ley Thr Pe Zeg Agd Me (O1i A1a O1i 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго Ьеи ТЬг 85 9095Azr A1a A1a Tg Tug Tug Suz O1n O1n Tgr Zeg Tg Tug Rgo Ley Tg 85 9095
РЬе СНу А1а СНу ТЬг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз Агд 100105 <210> 47 <211> 108 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 47PbE SNU A1a SNU Thr Luz Ley O1 and Ley Luz Agd 100105 <210> 47 <211> 108 <212> PRT <213> Mizziesi of <400> 47
СИп Пе Уа1 Ьеи ТЬг О1п Зег Рго А1а Пе Ме( Зег А1а Зег Рго СНуSip Pe Ya1 Lei Thr O1n Zeg Rgo A1a Pe Me (Zeg A1a Zeg Rgo SNu
10151015
СНи Ьуз Уа1 ТЬг Ме1 ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Туг Туг МеГ 20 2530SNG Ya1 Tg Me1 Tg Suz Zeg A1a Zeg Zeg Zeg Ya1 Tug Tug MeG 20 2530
Туг Тгр Туг 61п С1п Ьуз Рго СНу Зег Зег Рго Агд Ьеи Ьеи Пе Туг 35 4045Tug Tgr Tug 61p С1п Luz Rgo SNu Zeg Zeg Rgo Agd Ley Ley Pe Tug 35 4045
- 55 020130- 55 020130
Азр ТЬг 8ег Азп Ьеи А1а 8ег СНу Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег СНу Зег 50 5560Azr Thr 8eg Azp Ley A1a 8eg SNU Ya1 Rgo Ya1 Agd Rye Zeg SNu Zeg 50 5560
О1у Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд МеЧ О1и А1а О1и 65 70 7580O1y Zeg C1u Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Not Zeg Agd Mech O1i A1a O1u 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр 8ег Зег Туг Рго Рго Не 85 9095Azr A1a A1a Thr Tug Tug Suz O1n O1n Tgr 8eg Zeg Tug Rgo Rgo Not 85 9095
ТЬг РЬе О1у Уа1 СИ у ТЬг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз Агд 100105 <210> 48 <211> 105 <212> ПРТ <213> Мизти8Си1и5 <400> 48Thb Pb, Oi, Va1, SI, Ti, b, b, b, O, and b, b, Ag, 100105 <210> 48 <211> 105 <212> PRT <213> Mizti8Ci1u5 <400> 48
О1п Не Уа1 Зег ТЬг О1п 8ег Рго А1а Не МеЧ Зег А1а 8ег Рго О1у 15 1015O1n Not Va1 Zeg Thr O1n 8eg Rgo A1a Ne Meb Zeg A1a 8eg Rgo O1u 15 1015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг МеЧ ТЬг Суз 8ег А1а Зег Зег Зег Агд Зег Туг МеЧ 20 2530O1 and LU Va1 Tg Mech Tg Suz 8eg A1a Zeg Zeg Zeg Agd Zeg Tug Mech 20 2530
С1п Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у ТЬг Зег Рго Ьуз Агд Тгр Не Тут 35 4045С1п Тгр Туг О1п О1п Ьз Рго О1у Тг Zeg Рго ьз Агд Тг Not Here 35 4045
Азр ТЬг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег СНу Зег 50 5560Azr Thr Zeg Luz Ley A1a Zeg C1u Wa1 Prgo A1a Agd Rie Zeg SNu Zeg 50 5560
О1у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег МеЧ СИи А1а О1и 65 70 7580O1y Zeg O1u Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Not Zeg Zeg Sword SI A1a O1u 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Н1з (31 η Агд Зег 8ег Туг ТЬг РЬе (31у 85 9095Azr A1a A1a Thr Tug Tug Suz H1z (31 η Agd Zeg 8eg Tug Tg Pb (31u 85 9095
О1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз Агд 100105О1у С1у Тг Ьз Ье С1и Not НУз Агд 100105
- 56 020130 <210> 49 <211> 107 <212> ПРТ <213> Миз шияси1из <400> 49- 56 020130 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Miz Shiyashi 1 of <400> 49
О1п ТЬг Уа1 Ьеи Зег О1п Зег Рго А1а Не Ьеи Зег А1а Зег Рго О1уО1п Тг Уа1 Леи Зег О1п Зег Рго А1а Not Lei Зег A1а Зег Рго О1у
10151015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг Ме! ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 ТЬг Туг 11е 20 2530O1 and LU Va1 Thr Me! Tg Suz Agd A1a Zeg Zeg Zeg Ya1 Thg Tug 11e 20 2530
Н1з Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго О1у Зег Зег Рго Ьуз Зег Тгр Не Туг 35 4045Н1з Тгр Туг С1п С1п Luz Рgo О1у Зег Зег Рго БУЗ Зег Тгр Не Туг 35 4045
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег СНу Зег 50 5560A1a Thr Zeg Azp Ley A1a Zeg SNU Ya1 Rgo A1a Agd Rye Zeg SNu Zeg 50 5560
О1у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Уа1 <31и А1а СНи 65 70 7580O1y Zeg O1y Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Not Zeg Agd Ya1 <31 and A1a SNi 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз СНп Н13 Тгр Зег Зег Ьуз Рго Рго ТЬг 85 9095Azr A1a A1a Thr Tug Tug Suz SNp N13 Tg Zeg Zeg Zuz Rgo Rgo Tgr 85 9095
РЬе О1у СНу СНу ТЬг Ьуз Ьеи СНи Не Ьуз Агд 100105 <210> 50 <211> 107 <212> ПРТ <213> Миз шизси1из <400> 50Pb, O, y, n, v, n, b, b, b, b, b, c, n, b, b, a, b, 100, 105 <210> 50, <211> 107, <212>, PRT
СНп Зег Уа1 Ьеи Зег СНп Зег Рго А1а Не Ьеи Зег А1а Зег Рго СНуSNp Zeg Va1 Zey Zeg SNp Zeg Zgo A1a Not Ne Zeg A1a Zeg Zgo SNu
10151015
О1и Ьуз Уа1 Пе Ме! ТЬг Суз Зег Рго Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! 20 2530O1 and LU Va1 Pe Me! Thz Suz Zeg Rgo Zeg Zeg Zeg Wa1 Zeg Tug Me! 20 2530
СНп Тгр Туг СНп СНп Ьуз Рго СНу Зег Зег Рго Ьуз Рго Тгр Пе Тут 35 4045SNp Tgr Tug SNp SNp bz Rgo SNU Zeg Zeg Zg Rgo bg Rgo Tgr Pe Tut 35 4045
- 57 020130- 57 020130
Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а 8ег СЛу Уа1 Рго О1у Аг§ РЬе Зег С1у 01у 50 5560Zeg Tg Zeg Azp Ley A1a 8eg SLU Wa1 Prgo O1u Arg Rbie Zeg C1u 01u 50 5560
О1у Зег О1у ТЬг Зег РЬе Зег Ьеи ТЬг Не Зег СЛу Уа101и А1а О1и 65 70 7580O1y Zeg O1y Tg Zeg Rbie Zeg bie Tg Not Zeg SLU Ya101i A1a O1i 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п О1п Туг Зег Зег Ηίβ Рго Ьеи ТЬг 85 9095Azr A1a A1a Thr Tug Tug Suz C1n O1n Tug Zeg Zeg Ηίβ Prgo Ley Tg 85 9095
РЬе О1у О1у СЛу ТЬг Ьуз Ьеи СЛи Ьеи Ьуз Аг§ 100105 <210> 51 <211> 109 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 51Pie Oiu Oiu SLU Thr Luz Ley SLI Lye Luz Ar§ 100105 <210> 51 <211> 109 <212> PRT <213> Mizziesi of <400> 51
СЛи Азп Уа1 Ьеи ТЬг СЛп Зег Рго А1а Пе МеГ Зег А1а Зег Рго СЛу 15 1015SLI Azp Ya1 Ley Tg SLp Zeg Rgo A1a Pe MeG Zeg A1a Zeg Rgo SLU 15 1015
СЛи Ьуз Уа1 ТЬг Ме1 А1а Суз Аг§ А1а Зег 8ег Зег Уа1 Зег Зег ТЬг 20 2530CLOSE Ya1 Th1 Me1 A1a Suz Arg A1A Zeg 8eg Zeg Wa1 Zeg Zeg Thg 20 2530
Туг Ьеи №з Тгр Туг СЛп <31п Ьуз Зег СЛу А1а Зег Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 4045Tug Lei Noz Tgr Tug SLP <31n LZ Zeg SLU A1a Zeg Rgo Luz Ley Ley 35 4045
Пе Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Аг§ РЬе Зег 50 5560Pe Tug Zeg Thr Zeg Azp Ley A1a Zeg O1u Wa1 Prgo A1a Arg Rbe Zeg 50 5560
СЛу Зег СЛу Зег СЛу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Уа101и 65 70 7580SLU Zeg SLU Zeg SLU Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Pe Zeg Zeg Wa101i 65 70 7580
А1а О1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Туг Зег СЛу Туг Рго 85 9095A1a O1i Azr A1a A1a Tg Tug Tug Suz Oz O1p O1p Tug Zeg SLu Tug Rgo 85 9095
Ьеи ТЬг РЬе СЛу А1а СЛу ТЬг Ьуз Ьеи СЛи Ьеи Ьуз Ατβ 100105Ley Thj Rye SLu A1a Llub Thj Lj Lye Slie Lye Lj βτβ 100 105
- 58 020130 <210> 52 <211> 110 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 52- 58 020130 <210> 52 <211> 110 <212> PRT <213> Mizshissi 1 of <400> 52
Азр 11с Уа1 Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а Не МеС 8ег А1а Зег Теи 61 уAzr 11c Ya1 Lei Thr 61n Zeg Rogo A1a Ne MeC 8eg A1a Zeg Tei 61 y
10151015
61и Агд Уа1 ТЬг МеС ТЬг Суз ТЬг А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег 20 253061 and Agd Ya1 Tg MeS Tg Suz Tg A1a Zeg Zeg Zeg Wa1 Zeg Zeg Zeg 20 2530
Азп Ьеи Из Тгр Туг О1п 61п Ьуз Рго 61у Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр 35 4045Azp Ley Iz Tgr Tug O1n 61p Luz Rgo 61u Zeg Zeg Rgo Luz Ley Tgr 35 4045
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег 50 5560Not Tug Zeg Thr Zeg Azp Ley A1a Zeg O1u Wa1 Prgo A1a Agd Rye Zeg 50 5560
61у Зег 61у Зег 61у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег МеС 61и61u Zeg 61u Zeg 61u Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Not Zeg Zeg MeC 61i
70 758070 7580
А1а О1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Ηϊβ 61п Туг Из Агд Зег Рго 85 9095A1a O1i Azr A1a A1a Tg Tug Tug Suz Ηϊβ 61p Tug Iz Agd Zeg Rgo 85 9095
Туг ТЬг РЬе О1у 61у С1у ТЬг Ьуз Ьеи 61и Не Ьуз Агд А1а 100 105110 <210> 53 <211> 109 <212> ПРТ <213> МизшизсЫиз <400> 53Tug Thb Pb Oiu 61y C1u Thb Liu Liu 61i Ne Neb Agd A1a 100 105 110 <210> 53 <211> 109 <212> PRT <213> Mizssies from <400> 53
Азр Пе 61п Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а РЬе МеС А1а А1а Зег Рго 61у 15 10 15Azr Pe 61n Lye Thr 61n Zeg Rgo A1a Rye MeS A1a A1a Zeg Rgo 61u 15 10 15
61и Ьуз Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Зег Уа1 Зег Зег Зег 11е Зег Зег Зег 20 25 3061 and LU Va1 Tg Pe Tg Suz Zeg Va1 Zeg Zeg Zeg 11e Zeg Zeg Zeg 20 25 30
Азп Ьеи Из Тгр Туг 61п 61п Туз Зег 61и ТЬг Зег Рго Туз Рго ТгрAzp Ley From Tgr Tug 61p 61p Ace Zeg 61 and Tg Zeg Rgo Ace Rgo Tgr
- 59 020130- 59 020130
40454045
Не Туг О1у ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Уа1 Аг§ РЬе Зет 50 5560Not Tug O1y Thr Zeg Azp Ley A1a Zeg O1y Wa1 Prgo Va1 Arg Rie Zet 50 5560
О1у Зег О1у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ме101и 65 70 7580O1y Zeg O1y Zeg O1y Tg Zeg Tug Zeg Ley Tg Not Zeg Zeg Me101 and 65 70 7580
А1а <31и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п С1п Тгр Азп Зег Туг Рго 85 9095A1a <31i Azr A1a A1a Thr Tug Tug Suz O1p C1p Tgr Azp Zeg Tug Rgo 85 9095
Туг ТЬг РЬе О1у СЯу СЯу ТЬг Ьуз Ьеи СЯи Не Ьуз Аг§ 100105 <210> 54 <211> 117 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 54Tug Thl Pb Oiu Xiu Xiu Xiu Liu Liu Xi Ne bz Arg 100105 <210> 54 <211> 117 <212> PRT <213> Mizstsi1iz <400> 54
О1п Пе О1п Ьеи СЯп 61п Зег СЯу Рго СЯи Ьеи Уа1 Лг^ Рго СЯу А1а 15 1015О1п Пе О1п Ье СЯп 61п Зег СЯу Рго СЯи Лей Уа1 Лг ^ Рго Сяу А1а 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Пе Зег Суз Ьуз А1а Зег СЯу Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг 20 2530Zeg Wa1 Luz Pe Zeg Suz Luz A1a Zeg Syau Tug Tg Pb Tg Azr Tug 20 2530
Туг Пе ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз СЯп Агц Рго СЯу СЯи СЯу Ьеи СЯи Тгр Пе 35 4045Tug Pe ΗΪ3 Tgr Ya1 bk Syap Agz Rgo Syau Syai Syau Si Yai Syai Tg Pe 35 4045
СЯу Тгр Пе Туг Рго О1у Зег <31у Азп ТЬг Ьуз Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560XYu Tgr Pe Tug Rgo O1y Zeg <31u Azp Thr Luz Tug Azp O1i Luz Rye 50 5560
Ьуз СЯу Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580Bf bf bf baaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Ме! СЯп Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СЯи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095Me! Syap Ley Zeg Zeg Ley Thz Zeg Syai Azr Zeg A1a Ya1 Tug Rye Suz 85 9095
А1а Агд СЯу СЯу Ьуз РЬе А1а Ме1 Азр Туг Тгр О1у О1п СЯу ТЬг Зег 100 105 ПОA1a Agd XAU XAU BO RE A1a Me1 Azr Tug Tgr O1u O1n XAU Tg Zeg 100 105 PO
- 60 020130- 60 020130
Уа1ТЬгУа1 Зег Зег 115 <210> 55 <211> 122 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 55Ya1TbGaa1 Zeg Zeg 115 <210> 55 <211> 122 <212> PRT <213> Miestis1 from <400> 55
01п Уа1 СИп Ьеи СИп СИп Рго СИу А1а СИи Ьеи Ма1 Ьуз Рго О1у А1а 15 101501n Va1 Sip bie Sip sip rgo siu A1a si bie ma1 bb rgo o1u A1a 15 1015
8ег Уа1 Агд Ме1 8ег Суз Ьуз А1а 8ег СИу Туг ТЬг РЬе ТЬг Азп Туг 20 25308eg Va1 Agd Me1 8eg Suz Luz A1a 8eg SIu Tug Thb Pb Thb Azp Tug 20 2530
Азп Ме( Туг Тгр Уа1 Ьуз СИп Зег Рго СИу СИп О1у Ьеи СИи Тгр Пе 35 4045Azp Me (Tug Tgr Va1 Luz Sip Zeg Rgo SIu Sip O1u Ley Sii Tg Pe 35 3545
СИу Ие РЬе Туг Рго СИу Азп СИу Азр ТЬг 8ег Туг Азп СИп Ьуз РЬе 50 5560SIU IE Rye Tug Rgo SIu Azp SIu Azr Tg 8eg Tug Azp SIp Luz Rie 50 5560
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz Azr Luz A1a Tg Ley Tg A1a Azr Luz Zeg Zeg Azp Tg A1a Tug 65 70 7580
Ме1 СИп Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095Me1 Sip Ley Zeg Zeg Ley Thz Zeg SIi Azr Zeg A1a Wa1 Tug Tug Suz 85 9095
А1а Агд Зег СИу СИу Зег Туг Агд Туг Азр СИу СИу РЬе Азр Туг Тгр 100 105110A1a Agd Zeg SIu Siu Zeg Zug Tug Agd Tug Azr SIu Siu Siu Rye Azr Tug Tgr 100 105 110
СИу СИп СИу ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг С а1 Зег Зег 115120 <210> 56 <211> 119 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 56SIu SIp SIu SIu Thr Thb Thie Thr S a1 Zeg Zeg 115120 <210> 56 <211> 119 <212> PRT <213> Miztis1iz <400> 56
- 61 020130- 61 020130
01η С1у 01η Ьеи Οίη 01η Зег 01у А1а 01и Ьеи Уа1 Агд Рго 01у Зег 15 101501η C1u 01η Ley Οίη 01η Zeg 01u A1a 01 and Ley Wa1 Agd Rgo 01u Zeg 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Тут А1а РЬе Зег Зег РЬе 20 2530Zeg Wa1 Luz Ne Zeg Suz Luz A1a Zeg C1u Tut A1a Pb Zeg Zeg Zb Pb 20 2530
Тгр Уа1 Азп Тгр Уа1 Ьуз 01п Агд Рго 01у 01п 01у Ьеи 01и Тгр Не 35 4045Tgr Ya1 Azp Tgr Ya1 Luz 01p Agd Rgo 01u 01p 01u Ley 01i Tgr Not 35 4045
О1у Οίη II© Туг Рго О1у Азр О1у Азр Азп Ьуз Туг Азп О1у Ьуз РЬе 50 5560O1u Οίη II © Tug Rgo O1u Azr O1u Azr Azp Luz Tug Azp O1u Luz Ry 50 5560
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег ТЬг ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz O1y Luz A1a Tg Ley Tg A1a Azr Luz Zeg Zeg Tg Tg A1a Tug 65 70 7580
Ме101п Ьеи Туг Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095Ме101п Ьеи Туг Зег ёй Тьг Зег О1и Азр Зег A1а Уа1 Туг Рее Суз 85 9095
А1а Агд Зег О1у Азп Туг Рго Туг А1а Ме1 Азр Туг Тгр С1у О1п О1у 100 105110A1a Agd Zeg O1u Azp Tug Rgo Tug A1a Me1 Azr Tug Tgr C1u O1p O1u 100 105 110
ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 57 <211> 120 <212> ПРТ <213> МизшизсЫиз <400> 57Thr Zeg Va1 Thr Va1 Zeg Zeg 115 <210> 57 <211> 120 <212> PRT <213> Mizssies from <400> 57
О1п Уа101п Ьеи О1п О1п Зег О1у А1а О1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у А1аО1п Уа101п Ле О1п О1п Зег О1у А1а О1и Леу Уа1 Зу Рго О1у A1а
10151015
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530Zeg Va1 Luz Ley Zeg Suz Luz A1a Zeg O1y Tug Tg Pb Tg Zeg Tug 20 2530
Тгр Ме1 ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз О1п Агд Рго О1у Агд О1у Ьеи О1и Тгр Пе 35 4045Tgr Me1 ΗΪ3 Tgr Ya1 Luz O1n Agd Rgo O1y Agd O1u Ley O1i Tgr Pe 35 4045
О1у Агд II© Азр Рго Азп Зег О1у О1у ТЬг Ьуз Туг Азп О1и Ьуз РЬеO1y Agd II © Azr Rgo Azp Zeg O1u O1u Tg bz Tug Azp O1i bz Rb
- 62 020130- 62 020130
55605560
Ьуз Зег Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Рго 8ег 8ег ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz Zeg Luz A1a Tg Ley Tg Va1 Azr Luz Rgo 8eg 8eg Tg A1a Tug 65 70 7580
Ме! О1п Ьеи 8ег 8ег Ьеи ТЬг 8ег О1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095Me! О1п Леy 8eg 8eg Lei Тг 8eg О1и Азр Зег A1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095
А1а Агц Туг Азр Туг Туг О1у Зег Зег Туг РЬе Азр Туг Тгр О1у С1п 100 105110A1a Agz Tug Azr Tug Tug O1u Zeg Zeg Tug Rie Azr Tug Tgr O1u C1p 100 105 110
О1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег 8ег 115120 <210> 58 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 58O1y Thr Thr Ya1 Thb Ya1 Zeg 8eg 115120 <210> 58 <211> 121 <212> PRT <213> Mieschsi1 of <400> 58
СИи Уа1 О1п Ьеи О1п О1п Зег О1у Уа1 О1и Ьеи Уа1 Аг& А1а О1у Зег 15 1015SI Ua1 O1n Ley O1n O1n Zeg O1u Ya1 O1 and Ley Ya1 Ar & A1a O1u Zeg 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Ме1 Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Азп 20 2530Zeg Wa1 Luz Me1 Zeg Suz Luz A1a Zeg O1y Tug Tg Pb Tg Zeg Azp 20 2530
С1у Не Азп Тгр Уа1 Ьуз О1п Аг§ Рго СНу О1п СНу Ьеи СИи Тгр Не 35 4045С1у Не Апп Тгр Уа1 Luz О1п Аг§ Рго СНу О1п СНу ёи Си Тгр Не 35 4045
С1у Туг Азп Азп Рго О1у Азп С1у Туг Не А1а Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560C1u Tug Azp Azp Rgo O1u Azp C1u Tug Ne A1a Tug Azp O1i Luz Rye 50 5560
Ьуз СНу Ьуз ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580Zn Zn Zz Zz Zz Zz Zz Zeg Zz Al A1a Zn 65 70 7580
Ме101п Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а Уа1 Тут РЬе Суз 85 9095Ме101п еие д д д еи ег еи еи г З Zeg O1 and Azr Zeg A1a Wa1 Tut Pye Suz 85 9095
А1а Аг§ Зег СЛи Туг Туг О1у СНу Зег Туг Ьуз РЬе Азр Туг Тгр СНу 100 105110A1a Arg Zeg SLi Tug Tug O1y SNU Zeg Tug Bog Rye Azr Tug Tgr SNU 100 105110
- 63 020130- 63 020130
01п 01у ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1Зег 8ег 115 120 <210> 59 <211> 120 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 5901n 01y Tg Tht Thy Thr Va1Zeg 8eg 115 120 <210> 59 <211> 120 <212> PRT <213> Mizziesi of <400> 59
О1п Не О1п Ьеи Οίη О1п Зег О1у Рго О1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у А1аО1п Not О1п Лей Οίη О1п Зег О1у Рgo О1и Леу Уа1 Зу Рго О1у A1а
10151015
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг 20 2530Zeg Wa1 Luz Ne Zeg Suz Luz A1a Zeg O1u Tug Thr Pb Thr Azr Tug 20 2530
Туг Не Азп Тгр Ме1 Ьуз О1п Ьуз Рго О1у Οίη О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045Tug Ne Azp Tgr Me1 Luz O1n Luz Rgo O1u Οίη O1u Ley O1i Tgr Not 35 4045
С1у Тгр Не Азр Рго О1у Зег О1у Азп ТЬг Ьуз Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560C1y Tgr Ne Azr Rgo O1y Zeg O1u Azp Tg bz Tug Azp O1i bz Rb 50 5060
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz O1y Luz A1a Tg Ley Tg Wa1 Azr Tg Zeg Zeg Zeg Tg A1a Tug 65 70 7580
Ме1 С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095Ме1 С1п Ьеи Зег Зег ёи Тг Zeg О1и Азр Тг А1а Уа1 Туг Рее Суз 85 9095
А1а Агд О1и Ьуз ТЬг ТЬг Туг Туг Тут А1а Ме1 Азр Туг Тгр С1у О1п 100 105110A1a Agd O1 and Lj Tg Tg Tug Tug Tut A1a Me1 Azr Tug Tgr C1u O1p 100 105 110
О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1аO1y Thr Zeg Wa1 Thb Wa1 Zeg A1a
115120 <210> 60 <211> 120 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 60115120 <210> 60 <211> 120 <212> PRT <213> Miz tizsi1iz <400> 60
- б4 020130- b4 020130
01п Уа101η Ьеи ΟΙη Οίη Зег О1у А1а О1и Ьеи Ме1 Ьуз Рго 01у А1а 15 101501n Va101η Lye ΟΙη Οίη Zeg O1y A1a O1 and Lye Me1 Luz Progo 01u A1a 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Не 8ег Суз Ьуз А1а ТЬг О1у Туг ТЬг РЬе 8ег 8ег РЬе 20 2530Zeg Va1 Luz Ne 8eg Suz Luz A1a Tg O1u Tug Tg Pb 8b 8g 8b Pb 20 2530
Тгр Не О1и Тгр Уа1 Ьуз ΟΙη Агд Рго О1у Йз О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045Tgr Ne O1i Tgr Va1 Luz ΟΙη Agd Rgo O1u Yz O1u bj O1i Tgr Not 35 4045
О1у О1и Не Ьеи Рго О1у 8ег О1у О1у ТЬг ΗΪ3 Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560О1у О1и Not Ley Рgo О1у 8е О1у О1у Тг ΗΪ3 Туг Ап О1и Luz Рее 50 5560
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг РЬе ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz O1y Luz A1a Tg Pb Tg A1a Azr Luz Zeg Zeg Azp Tg A1a Tug 65 70 7580
Ме101п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095Ме101п Ьеи Зег Зег ёй Тг Zeg О1и Азр Зег A1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095
А1а Агд О1у ΗΪ3 Зег Туг Туг РЬе Туг Азр О1у Азр Туг Тгр О1у О1п 100 105110A1a Agd O1u ΗΪ3 Zeg Tug Tug Rye Tug Azr O1u Azr Tug Tgr O1u O1p 100 105 110
О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115120 <210> 61 <211> 124 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 61O1y Thr Zeg Za1 Thb Ya1 Zeg Zeg 115120 <210> 61 <211> 124 <212> PRT <213> Miesshi1 of <400> 61
О1п Уа1 С1п Ьеи О1п О1п Зег О1у А1а О1и Ьеи Уа1 Агд А1а О1у ЗегО1п Уа1 С1п Ле О1п О1п Зег О1у A1а О1и Ле Уа1 Агд A1а О1у Зег
10151015
Зег Уа1 Ьуз Ме1 Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530Zeg Va1 Luz Me1 Zeg Suz Luz A1a Zeg O1y Tug Tg Pb Tg Zeg Tug 20 2530
О1у Уа1 Азп Тгр Уа1 Ьуз О1п Агд Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045О1у Уа1 Азп Тгр Уа1 Luz О1п Агд Рго О1у О1п О1у Ле О1и Тгр Not 35 4045
О1у Туг Не Азп Рго О1у Ьуз О1у Туг Ьеи Зег Туг Азп О1и Ьуз РЬеO1y Tug Ne Azp Rgo O1y Luz O1u Tug Ley Zeg Tug Azp O1i Luz Rye
- 65 020130- 65 020130
55605560
Ьуз О1у Ьуз ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Агд Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz O1y Lj Tg Tg Ley Tg Va1 Azr Agd Zeg Zeg Zeg Tg A1a Tug 65 70 7580
Ме101п Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег (Ли Азр А1а А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095Ме101п еи Аг д д д З еи еи еи г З Zeg (Li Azr A1a A1a Wa1 Tug Rye Suz 85 9095
А1а Агд Зег РЬе Туг О1у СИу Зег Азр Ьеи А1а Уа1 Туг Туг РЬе Азр 100 105110A1a Agd Zeg Rye Tug O1u SIu Zeg Zeg Azr Ley A1a Wa1 Tug Tug Rye Azr 100 105110
Зег Тгр СИу СИп СИу ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег ЗегZeg Tgr SIu SIp SIu SIu Tg Tg Lei Tg Wa1 Zeg Zeg
115120 <210> 62 <211> 116 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 62115120 <210> 62 <211> 116 <212> PRT <213> Mizzies1 of <400> 62
СИп Уа1 О1п Ьеи СИп О1и Зег СИу А1а СИи Уа1 Ме1 Ьуз Рго СИу А1а 15 1015SIp Va1 O1n bie SIp O1i Zeg SIu A1a SIi Va1 Me1 Liu Rgo SIu A1a 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а ТЬг СИу Туг ТЬг РЬе Зег ТЬг ТугZeg Va1 Luz Ne Zeg Suz Luz A1a Tg Siu Tug Tg Rb Zeg Tg Tug
25302530
Тгр Не (Ли Тгр Уа1 Ьуз СИп Агд Рго СИу Ηίβ СИу Ьеи СИи Тгр Ие 35 4045 (Иу (Ли Не Ьеи Рго С1у Зег (Лу Зег ТЬг Туг Тут Азп (Ли Ьуз РЬе 50 5560Tgr Ne (Li Tgr Va1 Luz Sip Agd Rgo SIu Siu Ηίβ SIu Lye SIi Tgr Ie 35 4045
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг РЬе ТЬг А1а Азр ТЬг Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz O1y Luz A1a Tg Pb Tg A1a Azr Tg Zeg Zeg Azp Tg A1a Tug 65 70 7580
МеС СИп Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095MES SIP Ley Zeg Zeg Ley Thz Zeg SIi Azr Zeg A1a Wa1 Tug Tug Suz 85 9095
А1а Агд О1у Азр СИу Азп Туг СИу Туг Тгр СИу О1п (Лу ТЬг ТЬг Ьеи 100 105110A1a Agd O1u Azr SIu Azp Tug SIu Tug Tgr SIu O1p (Lu Tg Tg Tg Lei 100 105 110
- 66 020130- 66 020130
ТЬгУа13ег 8егThrUa13eg 8eg
115 <210> 63 <211> 116 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 63115 <210> 63 <211> 116 <212> PRT <213> Miz tizsi1iz <400> 63
О1п Уа1 О1п Ьеи О1п О1п Зег 01у А1а 01и Ьеи Уа1 Ατβ Рго О1у А1а 15 1015О1п Уа1 О1п Лей О1п О1п Зег 01у A1а 01и Леу Уа1 Ατβ Рго О1у A1а 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе Не Зег Туг 20 2530Zeg Wa1 Luz Ley Zeg Suz Luz A1a Zeg O1u Tug Tg Pb Not Ne Zeg Tug 20 2530
Тгр Не Азп Тгр Уа! Ьуз О1п Аг^ Рго С1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045Tgr Ne Azp Tgr Wa! L3 O1n Ar ^ Rgo C1y O1n O1y Ley O1 and Thr He 35 4045
С1у Азп Не Туг Рго 8ег Азр 8ег Туг ТЬг Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе 50 5560C1u Azp Ne Tug Rgo 8eg Azr 8eg Tug Tg Azp Tug Azp O1n bz Pb 50 5060
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг \'а1 Азр Ьуз Зег 8ег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580Luz Azr Luz A1a Tg Ley Tg \ 'a1 Azr Luz Zeg 8eg Zeg Tg A1a Tug 65 70 7580
МеГ О1п Ьеи Зег Зег Рго ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095MeG O1n Ley Zeg Zeg Rgo Thg Zeg C1 and Azr Zeg A1a Wa1 Tug Tug Suz 85 9095
ТЬг Аг§ Азр Азр Азп Туг СИу А1а МеГ Азр Туг Тгр О1у С1п 61у ТЬг 100 105 ПОTg Arg Azr Azr Azp Tug SIu A1a MeG Azr Tug Tgr O1u C1p 61u Tg 100 105 ON
ТЬгУа1ТЬгУа1TGUA1TGUA1
115115
Claims (33)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US2005/030115 WO2007024222A1 (en) | 2005-08-22 | 2005-08-22 | A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200800642A1 EA200800642A1 (en) | 2008-08-29 |
| EA020130B1 true EA020130B1 (en) | 2014-08-29 |
| EA020130B9 EA020130B9 (en) | 2014-10-30 |
Family
ID=37771883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200800642A EA020130B9 (en) | 2005-08-22 | 2005-08-22 | A ca6 antigen-specific antibody, cytotoxic conjugate comprising same and methods of using conjugate |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1917034A4 (en) |
| JP (1) | JP2009504193A (en) |
| CN (1) | CN101242855A (en) |
| AU (1) | AU2005335743A1 (en) |
| BR (1) | BRPI0520509A2 (en) |
| CA (1) | CA2615761A1 (en) |
| EA (1) | EA020130B9 (en) |
| EC (1) | ECSP088241A (en) |
| HK (1) | HK1211965A1 (en) |
| IL (2) | IL189628A0 (en) |
| MX (1) | MX2008002607A (en) |
| NO (1) | NO20080893L (en) |
| WO (1) | WO2007024222A1 (en) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014089177A2 (en) | 2012-12-04 | 2014-06-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines |
| US9844607B2 (en) | 2013-02-05 | 2017-12-19 | Sanofi | Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy |
| RU2015137856A (en) * | 2013-02-05 | 2017-03-13 | Санофи | IMMUNOLOGICAL VISUALIZING AGENT FOR USE IN ANTI-MEDICINE CONJUGATE TREATMENT |
| WO2014122529A1 (en) * | 2013-02-05 | 2014-08-14 | Sanofi | Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy |
| US9989524B2 (en) | 2013-02-05 | 2018-06-05 | Sanofi | Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy |
| US20160347856A1 (en) * | 2013-08-02 | 2016-12-01 | Sanofi | Use of Anti-MUC1 Maytansinoid Immunoconjugate Antibody for the Treatment of Solid Tumors |
| EP3188761A4 (en) | 2014-09-02 | 2018-04-18 | ImmunoGen, Inc. | Methods for formulating antibody drug conjugate compositions |
| CN116514903A (en) | 2014-09-03 | 2023-08-01 | 伊缪诺金公司 | Cytotoxic benzodiazepine derivatives |
| US9381256B2 (en) | 2014-09-03 | 2016-07-05 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic benzodiazepine derivatives |
| US20170189548A1 (en) | 2015-11-25 | 2017-07-06 | Immunogen, Inc. | Pharmaceutical formulations and methods of use thereof |
| US10918627B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-02-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs |
| RU2765098C2 (en) | 2017-02-28 | 2022-01-25 | Иммуноджен, Инк. | Maitanzinoid derivatives with self-splitting peptide linkers and their conjugates |
| US20180346488A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-12-06 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof |
| US11932650B2 (en) | 2017-05-11 | 2024-03-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis |
| US10640508B2 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers |
| EP3732178A1 (en) | 2017-12-28 | 2020-11-04 | ImmunoGen, Inc. | Benzodiazepine derivatives |
| WO2020247054A1 (en) | 2019-06-05 | 2020-12-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6596503B1 (en) * | 2000-08-18 | 2003-07-22 | East Carolina University | Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof |
| BRPI0410260A (en) * | 2003-05-14 | 2006-05-16 | Immunogen Inc | drug conjugate composition |
| BRPI0412879A8 (en) * | 2003-07-21 | 2015-12-15 | Immunogen Inc | CA6 ANTIGEN SPECIFIC CYTOTOXIC CONJUGATE AND METHODS OF ITS USE |
-
2005
- 2005-08-22 WO PCT/US2005/030115 patent/WO2007024222A1/en active Application Filing
- 2005-08-22 MX MX2008002607A patent/MX2008002607A/en not_active Application Discontinuation
- 2005-08-22 CA CA002615761A patent/CA2615761A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-22 CN CNA200580051368XA patent/CN101242855A/en active Pending
- 2005-08-22 BR BRPI0520509-3A patent/BRPI0520509A2/en not_active Application Discontinuation
- 2005-08-22 JP JP2008527882A patent/JP2009504193A/en not_active Withdrawn
- 2005-08-22 EA EA200800642A patent/EA020130B9/en not_active IP Right Cessation
- 2005-08-22 AU AU2005335743A patent/AU2005335743A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-22 EP EP05788869A patent/EP1917034A4/en not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-02-20 IL IL189628A patent/IL189628A0/en unknown
- 2008-02-20 NO NO20080893A patent/NO20080893L/en not_active Application Discontinuation
- 2008-03-05 EC EC2008008241A patent/ECSP088241A/en unknown
-
2015
- 2015-05-13 IL IL238798A patent/IL238798A0/en unknown
- 2015-12-31 HK HK15112923.0A patent/HK1211965A1/en unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PAYNE et al. (a) (PG PUB 20050123549 A1) 9 June 2005 (09.06 2005), Abstract and Summary of invetion in particular * |
| PAYNE et al. (b) (WO 2005/009369) 3 February 2005 (03.02.2005), Abstract and Summary of invetion in particular * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20080893L (en) | 2008-05-22 |
| WO2007024222A1 (en) | 2007-03-01 |
| AU2005335743A1 (en) | 2007-03-01 |
| HK1211965A1 (en) | 2016-06-03 |
| CA2615761A1 (en) | 2007-03-01 |
| IL238798A0 (en) | 2015-06-30 |
| CN101242855A (en) | 2008-08-13 |
| BRPI0520509A2 (en) | 2009-05-12 |
| EA020130B9 (en) | 2014-10-30 |
| EP1917034A1 (en) | 2008-05-07 |
| MX2008002607A (en) | 2008-03-19 |
| JP2009504193A (en) | 2009-02-05 |
| IL189628A0 (en) | 2008-06-05 |
| EP1917034A4 (en) | 2009-04-29 |
| EA200800642A1 (en) | 2008-08-29 |
| ECSP088241A (en) | 2008-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA020130B1 (en) | A ca6 antigen-specific antibody, cytotoxic conjugate comprising same and methods of using conjugate | |
| EA014640B1 (en) | Antibody or an epitope-binding fragment thereof that binds the ca6 glycotope and methods of using the same | |
| US9822183B2 (en) | CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same | |
| EA020324B1 (en) | Antibodies against epha2 receptor and use thereof | |
| EA021600B1 (en) | Antibodies against csf-1r | |
| JP2010508043A (en) | Methods for improving antibody production | |
| AU2008361352B2 (en) | Anti-extended Type I glycosphingolipid antibody, derivatives thereof and use | |
| AU2012201260B2 (en) | A CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same | |
| CN104804094A (en) | CA6 antigen-specificity cytotoxicity conjugate and application method thereof | |
| JP2012161321A (en) | Ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate, and method using the conjugate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Publication of the corrected specification to eurasian patent | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): MD |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |