EA017995B1 - Антиген, связанный с вариантами рака легкого и лимфомами - Google Patents

Антиген, связанный с вариантами рака легкого и лимфомами Download PDF

Info

Publication number
EA017995B1
EA017995B1 EA201070179A EA201070179A EA017995B1 EA 017995 B1 EA017995 B1 EA 017995B1 EA 201070179 A EA201070179 A EA 201070179A EA 201070179 A EA201070179 A EA 201070179A EA 017995 B1 EA017995 B1 EA 017995B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
domain
acid sequence
antibody
regions
Prior art date
Application number
EA201070179A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070179A1 (ru
Inventor
Дарио Нери
Алессандра Вилла
Эвелин Трачсел
Яша-Николай Рибак
Original Assignee
Филоджен С.П.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Филоджен С.П.А. filed Critical Филоджен С.П.А.
Publication of EA201070179A1 publication Critical patent/EA201070179A1/ru
Publication of EA017995B1 publication Critical patent/EA017995B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1054—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1069—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from blood cells, e.g. the cancer being a myeloma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к участнику связывания, который связывает изоформу фибронектина с дополнительным доменом A (ED-А), для выявления и лечения рака легкого и лимфомы.

Description

Настоящее изобретение относится к выявлению и лечению рака легкого. Настоящее изобретение также относится к выявлению и лечению лимфом. Изобретение включает использование участника связывания, который связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина, особенно участника связывания, который связывает домен ΕΌ-Ά фибронектина.
Ангиогенез характеризуется ростом новых кровеносных сосудов от существующих кровеносных сосудов и редко встречается у взрослых индивидуумов, но является характерной чертой многих заболеваний, включая рост солидных опухолей. Опухолям требуется ангиогенез для роста свыше нескольких миллиметров в диаметре, и опухоли могут индуцировать ангиогенез путем секреции различных ростовых факторов, например фактора роста сосудистого эндотелия (УБОЕ). Новые кровеносные сосуды, образованные в результате ангиогенеза, обозначаются как неоваскуляризация опухоли, и сильная неоваскуляризация является характерной чертой агрессивной опухоли.
Фибронектин (ΕΝ) представляет собой гликопротеин и широко экспрессируется в различных нормальных тканях и жидкостях организма. Он является компонентом внеклеточного матрикса (ЕСМ) и играет роль во многих биологических процессах, включая клеточную адгезию, миграцию клеток, гемостаз, тромбоз, заживление ран, дифференцировку тканей и опухолевую трансформацию.
Различные изоформы ΕΝ продуцируются в результате альтернативного сплайсинга трех областей (ΕΌ-Α, ΕΌ-Β, ШС8) первичного транскрипта пре-мРНК ΕΝ, процесса, который модифицируется цитокинами и внеклеточным рН (Βαίζα, 1988; Сагиешо11а, 1989; ΒοΓδί, 1990; ΒοΓδί, 1995). Фибронектин содержит два глобулярных дополнительных домена типа III, которые могут подвергаться альтернативному сплайсингу: ΕΌ-Α и ΕΌ-Β (Е1геисй-Сои8!аи!, 1995, Нуиек, 1990, Какраг е! а1., 2006). Домены ΕΌ-Α фибронектина мыши и фибронектина человека идентичны на 96,7% (различия между двумя последовательностями из 90 аминокислот есть только в 3 аминокислотах, см. фиг. 2).
Экспрессия ΕΌ-Α фибронектина описана в опухолевых клетках и солидных опухолях на уровне мРНК при раке молочной железы (1асоЬ§ е! а1., 2002, Ма!§ито!о е! а1., 1999) и раке печени (Оуата е! а1., 1989, Тау1аи е! а1., 1994) и на уровне выделенного белка в фибросаркоме, рабдомиосаркоме и меланоме фога е! а1., 1987).
На иммуногистохимическом уровне присутствие ΕΌ-Α выявлено во внеклеточном матриксе (ЕСМ) одонтогенных опухолей (Не1кш11еипо е! а1., 1991) и гепатоцеллюлярной карциномы (Коикоийк е! а1., 1995). Напротив, ΕΌ-Α выявлен в строме злокачественных неоплазий молочной железы (КоикоиШ е! а1., 1993) и в кровеносных сосудах и базальных мембранах хорошо дифференцированной почечно-клеточной карциномы (ЬоЫ е! а1., 1995). Однако в малодифференцированной почечно-клеточной карциноме (ЬоЫ е! а1., 1995) и в папиллярной карциноме щитовидной железы (8сагршо е! а1., 1999) ΕΌ-Α выявлен в кровеносных сосудах, базальных мембранах и строме опухолей. Описано также присутствие ΕΌ-Α в сосудистой сети глиом (Нога е! а1., 1998). Таким образом, паттерн экспрессии ΕΌ-Α, описанный для различных типов опухолей, существенно варьируется.
В настоящем описании заявители показали, что ΕΌ-Α избирательно экспрессируется во вновь образованных сосудах опухолей легкого, включая опухоли мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого. Так как опухолевые кровеносные сосуды легкодоступны для вводимых внутривенно терапевтических агентов (№п аиб Β^ίσκ!! 2005, ВуЬак е! а1., 2006, Тйогре, 2004, ТгасЙ5е1 аиб №гк 2006), связывающие молекулы, такие как молекулы антител, которые связывают Α-ΕΝ и/или ΕΌ-Α фибронектина, представляют собой новые агенты, которые могут быть использованы для получения лекарственного средства для лечения рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого.
Кроме того, в настоящем описании заявители показали, что ΕΌ-Α избирательно экспрессируется во вновь образованных сосудах лимфом. Так как опухолевые кровеносные сосуды легкодоступны для вводимых внутривенно терапевтических агентов (Νοη аиб Β^скηе11. 2005, ВуЬак е! а1., 2006, Тйогре, 2004, ТгасЙ5е1 аиб №гк 2006), связывающие молекулы, такие как молекулы антител, которые связывают Α-ΕΝ и/или ΕΌ-Α фибронектина, представляют собой новые агенты, которые могут быть использованы для получения лекарственного средства для лечения лимфом.
Терапия неоваскуляризации опухолей (терапия, направленная на сосуды опухолей) является многообещающим подходом к лечению опухолей. Терапия, направленная на сосуды опухолей, проводится с целью нарушения васкуляризации в самой опухоли, снижения кровотока для лишения поступления кислорода и питательных веществ в опухоль, что вызывает гибель опухолевых клеток.
В настоящем описании предлагаются антитела против ΕΌ-Α, которые селективно узнают вновь образованные кровеносные сосуды опухолей легкого, включая мелкоклеточные опухоли легкого и немелкоклеточные опухоли легкого.
В настоящем описании дополнительно предлагаются антитела против ΕΌ-Α, которые селективно узнают вновь образованные кровеносные сосуды лимфом.
В этом изобретении предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает дополнительный домен Α (ΕΌ-Α) изоформы фибронектина (Α-ΕΝ), для получения лекарственного средства для лечения рака легкого. В изобретении предлагается также применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина, для получения
- 1 017995 лекарственного средства для лечения рака легкого.
В этом изобретении предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает дополнительный домен Α (ΕΌ-Α) изоформы фибронектина (Α-ΕΝ), для получения лекарственного средства для лечения лимфомы. В изобретении предлагается также применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина, для получения лекарственного средства для лечения лимфомы.
В изобретении дополнительно предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина, для доставки к вновь образованным сосудам опухоли легкого молекулы, конъюгированной с участником связывания. В изобретении также предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина, для доставки к вновь образованным сосудам опухоли легкого молекулы, конъюгированной с участником связывания. Участник связывания может быть использован для получения лекарственного средства для доставки такой молекулы.
В изобретении дополнительно предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина, для доставки к вновь образованным сосудам лимфомы молекулы, конъюгированной с участником связывания. В изобретении также предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина, для доставки к вновь образованным сосудам лимфомы молекулы, конъюгированной с участником связывания. Участник связывания может быть использован для получения лекарственного средства для доставки такой молекулы.
В изобретении предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина, для получения диагностического продукта для использования в диагностике рака легкого. В изобретении предлагается также применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина, для получения диагностического продукта для использования в диагностике рака легкого.
В изобретении предлагается применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина, для получения диагностического продукта для использования в диагностике лимфомы. В изобретении предлагается также применение участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина, для получения диагностического продукта для использования в диагностике лимфомы.
В изобретении дополнительно предлагается способ определения или диагностики рака легкого у человека или животного, включающий стадии:
(a) введения человеку или животному участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина; и (b) определения присутствия или отсутствия участника связывания в легком организма человека или животного, где локализация участника связывания в легком указывает на наличие рака легкого.
В изобретении дополнительно предлагается способ определения или диагностики лимфомы у человека или животного, включающий стадии:
(a) введения человеку или животному участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина; и (b) определения присутствия или отсутствия участника связывания в лимфатической системе организма человека или животного, где локализация участника связывания в лимфатической системе человека или животного указывает на наличие лимфомы.
В настоящем изобретении предлагается способ лечения рака легкого у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего участника связывания, например молекулу антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина. В настоящем изобретении предлагается также способ лечения рака легкого у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего участника связывания, например молекулу антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина.
В настоящем изобретении предлагается способ лечения лимфомы у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего участника связывания, например молекулу антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина. В настоящем изобретении предлагается также способ лечения лимфомы у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего участника связывания, например молекулу антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина.
В изобретении предлагается способ доставки молекулы к вновь образованным сосудам опухоли легкого человека или животного, включающий введение человеку или животному участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина, где участник связывания конъюгирован с молекулой. В изобретении предлагается также способ доставки молекулы к вновь образованным сосудам опухоли легкого человека или животного, включающий введение человеку или животному участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Α фибронектина,
- 2 017995 где участник связывания конъюгирован с молекулой.
В изобретении предлагается способ доставки молекулы к вновь образованным сосудам лимфомы человека или животного, включающий введение человеку или животному участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина, где участник связывания конъюгирован с молекулой. В изобретении предлагается также способ доставки молекулы к вновь образованным сосудам лимфомы человека или животного, включающий введение человеку или животному участника связывания, например молекулы антитела, которая связывает ΕΌ-Ά фибронектина, где участник связывания конъюгирован с молекулой.
Участник связывания для применения по изобретению может представлять собой антитело, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина и/или ΕΌ-Ά фибронектина, включающее одну или более областей, определяющих комплементарность (СОВк), антитела Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 или 69, или их вариантов. Предпочтительно участник связывания для применения по изобретению представляет собой антитело, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина и/или ΕΌ-Ά фибронектина, включающее одну или более областей, определяющих комплементарность (ί,ΌΒδ). антитела В2, С5, Ό5, С8, Е8, В7 или 69, или их вариантов. Наиболее предпочтительно участник связывания для применения по изобретению представляет собой антитело, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина и/или ΕΌ-Ά фибронектина, включающее одну или более областей, определяющих комплементарность (СЭВк), антитела Е8 или его вариантов.
Участник связывания для применения по изобретению может включать набор Н и/или Ь СЭВк антитела Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 или 69 или набор Н и/или Ь СЭВк антитела Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 или 69 с десятью или менее, например одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью аминокислотными заменами в раскрытом наборе Н и/или Ь СЭВк. Предпочтительно участник связывания для применения по изобретению включает набор Н и/или Ь СЭВк антитела В2, С5, Ό5, С8, Е8, В7 или 69 с десятью или менее, например одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью аминокислотными заменами в раскрытом наборе Н и/или Ь СЭВк. Предпочтительно участник связывания для применения по изобретению включает набор Н и/или Ь СЭВк антитела Е8 с десятью или менее, например одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью аминокислотными заменами в раскрытом наборе Н и/или Ь СЭВк.
Потенциально могут быть сделаны замены любого остатка в наборе СЭВк и они могут быть в СЭВ1, СЕВ2 и/или (ΌΙ6.
Например, участник связывания для применения по изобретению может включать одну или более СЭК.8, как описано в настоящем документе, например СЭВ3, и необязательно также 6ΕΚ.1 и СЭВ2 с образованием набора СЭВк.
Участник связывания для применения по изобретению может также включать молекулу антитела, например молекулу антитела человека. Участник связывания обычно включает домен УН или УЪ антитела. Домены УН участников связывания также предлагаются для применения по изобретению. В каждом из УН и УЪ доменов находятся области, определяющие комплементарность (СЭВк), и области каркаса (ЕВк). Домен УН включает набор НСЭВк, а домен УЪ включает набор ЬСОВк. Молекула антитела может включать домен УН антитела, включающий УН СЭВ1, СЭВ2 и СЭВ3 и каркас. Альтернативно или также она может включать домен УЕ антитела, включающий УЪ СЭВЕ СЭВ2 и СЭВ3 и каркас. В настоящем документе описаны домены УН и УЪ и СЭВк антител Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Ε8 и 69. Все последовательности УН и УЪ, последовательности СОВ, наборы СЭВк, наборы НСЭВк, и наборы ЬСОВк, раскрытые в настоящем описании, представляют собой варианты осуществления участника связывания для применения по изобретению. Как описано в настоящем документе, набор СЭВк, включает СЭВЕ С.ПВ2 и СЭВ3. Таким образом, набор НСЭВ5 относится к НСЭВ1, НС.ПВ2 и НСОВ3, а набор ЬСОВк относится к ЬСПВ1, ЬСПВ2 и ЬСПВ3. Если не указано иное, набор СЭВк включает НС.ПВ5 и ЬСОВк. Участник связывания для применения по изобретению может включать домен УН антитела, включающий области, определяющие комплементарность, НСЭВ1, НС.ПВ2 и НСЭВ3 и каркас, где НСЭВ1 представляет собой 8ΕΟ ΙΌ N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113 и где необязательно НС.ПВ2 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 4 и/или НСЭВ3 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 5. Предпочтительно НС.ПВ1 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 23, 33, 43, 53, 73, 83 или 103. Наиболее предпочтительно НСПВ1 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 83.
Обычно домен УН составляет пару с доменом УЪ для обеспечения антигенсвязывающего сайта, хотя, как обсуждается далее ниже, для связывания антигена может быть использован или домен УН, или УЬ, поодиночке. Таким образом, участник связывания для применения по изобретению может дополнительно включать домен УЪ антитела, включающий области, определяющие комплементарность ЬС0В1, ЬСПВ2 и ЬСПВ3 и каркас, где ЬСПВ1 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116 и где необязательно ЬСПВ2 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 7 и/или БС0В3 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 8. Предпочтительно ЬСПВ1 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 26, 36, 46, 56, 76, 86 или 106. Более предпочтительно ЬСПВ1 представляет собой 8Ε0 ΙΌ N0: 86.
Участник связывания для применения по изобретению может представлять собой выделенную молекулу антитела против ΕΌ-Α фибронектина, включающую домен УН и домен УЪ, где домен УН включает каркас и набор областей, определяющих комплементарность НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, и где домен
- 3 017995
УЪ включает области, определяющие комплементарность ЬСОК1. БСОК2 и ЬСЭК3 и каркас, и где НСИК1 обладает аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НС0К2 обладает аминокислотной последовательностью 8Е0 Ш N0: 4, НСЭК3 обладает аминокислотной последовательностью 8Е0 Ю N0: 5, БС0К1 обладает аминокислотной последовательностью 8Е0 Ш N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116; БС0К2 обладает аминокислотной последовательностью 8Е0 Ш N0: 7 и ЕСИК3 обладает аминокислотной последовательностью 8Е0 Ш N0: 8.
Одна или более СЭКк или набор СЭКк антитела могут быть вставлены в каркас (например, в каркас антитела человека) для предоставления молекулы антитела для применения по изобретению. Области каркаса могут включать сегменты последовательностей гена зародышевой линии человека. Таким образом, каркас может быть подогнан к зародышевой линии за счет того, что один или более остатков в каркасе заменены для соответствия с остатками в эквивалентном положении в каркасе, наиболее сходном с каркасом зародышевой линии человека. Участник связывания для применения по изобретению может представлять собой выделенную молекулу антитела, обладающую доменом УН, включающим набор НСЭКк в каркасе зародышевой линии человека, например ΌΡ47. Обычно участник связывания обладает также доменом УЪ, включающим набор НСЭКк в каркасе зародышевой линии человека, например, включающим набор ЬСИКк, например, в каркасе зародышевой линии человека. Каркас зародышевой линии человека домена УЬ может представлять собой ΌΡΚ22.
Домен УН для применения по изобретению может иметь аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 или 111. Предпочтительно домен УН для применения по изобретению имеет аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 21, 31, 41, 51, 71, 81 или 101. Наиболее предпочтительно домен УН для применения по изобретению имеет аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 81. Домен УЪ для применения по изобретению может иметь аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 или 112. Предпочтительно домен УЪ для применения по изобретению имеет аминокислотную последовательность 8Е0 Ю N0: 22, 32, 42, 52, 72, 82 или 102. Наиболее предпочтительно домен УЪ для применения по изобретению имеет аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 82.
Участник связывания для применения по изобретению может представлять собой одноцепочечный Τν (ксТу), включающий домен УН и домен УЪ, соединенные через пептидный линкер. Специалист в данной области техники может выбрать подходящую длину и последовательность линкера, например, по меньшей мере 5 или 10 аминокислот в длину, до приблизительно 15, 20 или 25 аминокислот в длину. Линкер может иметь последовательность С88СС (8Е0 ГО N0: 28). ксТу может состоять из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 9 или включать ее.
Альтернативно, участник связывания для применения по изобретению может включать антигенсвязывающий сайт в молекуле, не являющейся антителом, обычно предлагаемый как одна или более СЭКк, например набор СЭКк в каркасном белке, не являющемся антителом. Участники связывания, включая молекулы антител и молекулы, не являющиеся антителами, описаны более подробно в настоящем описании в другом месте.
Участник связывания для применения по изобретению может быть конъюгирован с молекулой, которая обладает биологической или цитотоксической активностью. Альтернативно, участник связывания для применения по изобретению может быть конъюгирован с радиоактивным изотопом. Как еще одна альтернатива, участник связывания для применения по изобретению может быть помечен определяемой меткой.
Эти и другие аспекты изобретения описываются дополнительно более подробно ниже.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано иммуногистохимическое окрашивание срезов первичных опухолей легкого антителом Ό5 ксТу против ЕЭ-А. В колонке 1 показана классификация рака легкого: А: мелкоклеточный рак легкого, В: немелкоклеточные типы рака легкого, С: сквамозноклеточная карцинома, Ό: аденокарцинома, Е: бронхоальвеолярная карцинома и Т: крупноклеточная карцинома. В колонках 2 и 3 показано иммуногистохимическое определение ЕО-А на срезах тканей опухолей легкого различных подтипов. Срезы тканей, представленные в колонках 2 и 3 для каждого подтипа, получены от одного и того же образца опухоли. Иммуногистохимическое окрашивание (более темные линии) выявило интенсивный характер окрашивания сосудов в срезах первичных опухолей как в А: мелкоклеточный рак легкого, так и в В: немелкоклеточные типы рака легкого, (С: сквамозноклеточная карцинома, Ό: аденокарцинома, Е: бронхоальвеолярная карцинома и Т: крупноклеточная карцинома).
На фиг. 2 показано выравнивание между А: ЕИ-А человека (верхняя последовательность) и В: ЕИ-А мыши (нижняя последовательность). Звездочки указывают на положения аминокислот, где аминокислоты ЕИ-А человека и ЕИ-А мыши идентичны.
На фиг. 3А показана нуклеотидная последовательность тяжелой цепи (УН) антитела Н1 против ЕИА (8Е0 ГО N0: 12). Нуклеотидная последовательность СЭК1 тяжелой цепи антитела Н1 против ЕИ-А подчеркнута. Нуклеотидная последовательность СЭК2 тяжелой цепи антитела Н1 против ЕИ-А представлена курсивом и подчеркнута. Нуклеотидная последовательность СИКЗ тяжелой цепи антитела Н1 против ЕИ-А представлена жирным шрифтом и подчеркнута. В: представлена нуклеотидная последова
- 4 017995 тельность линкера антитела Н1 против ΕΌ-Α (8ΕΟ ГО N0: 14). С: показана нуклеотидная последовательность легкой цепи (УЛ) антитела Н1 против ΕΌ-Α (8Ε0 ГО N0: 13). Нуклеотидная последовательность 0ΌΡ1 легкой цепи антитела Н1 против ΕΌ-Α подчеркнута. Нуклеотидная последовательность СЭЕ2 легкой цепи антитела Н1 против ΕΌ-Α представлена курсивом и подчеркнута. Нуклеотидная последовательность 0ΌΡ3 легкой цепи антитела Н1 против ΕΌ-Α представлена жирным шрифтом и подчеркнута.
На фиг. 4А показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи (УН) антитела Н1 против ΕΌ-Α (8Ε0 ГО N0: 1). Аминокислотная последовательность 0ΌΡ1 тяжелой цепи (8Ε0 ГО N0: 3) антитела Н1 против ΕΌ-Α подчеркнута. Аминокислотная последовательность 0ΌΡ2 тяжелой цепи (8Ε0 ГО N0: 4) антитела Н1 против ΕΌ-Α представлена курсивом и подчеркнута. Аминокислотная последовательность 0ΌΡ3 тяжелой цепи (8Ε0 ГО N0: 5) антитела Н1 против ΕΌ-Α представлена жирным шрифтом и подчеркнута. В: представлена аминокислотная последовательность линкера антитела Н1 против ΕΌ-Α (8Ε0 ГО N0: 11). С: показана аминокислотная последовательность легкой цепи (УЛ) антитела Н1 против ΕΌ-Α (8Ε0 ГО N0: 2). Аминокислотная последовательность 0ΌΡ1 легкой цепи (8Ε0 ГО N0: 6) антитела Н1 против ΕΌ-Α подчеркнута. Аминокислотная последовательность 0ΌΡ2 легкой цепи (8Ε0 ГО N0: 7) антитела Н1 против ΕΌ-Α представлена курсивом и подчеркнута. Аминокислотная последовательность 0ΌΡ3 легкой цепи (8Ε0 ГО N0: 8) антитела Н1 против ΕΌ-Α представлена жирным шрифтом и подчеркнута.
Терминология
Фибронектин.
Фибронектин представляет собой антиген, подвергаемый альтернативному сплайсингу, и известен ряд альтернативных изоформ фибронектина, как описано в настоящем описании в другом месте. Дополнительный домен Α (ΕΌΑ или ΕΌ-Α) известен также как ΕΌ, дополнительный повтор А типа III (ΕΙΙΙΑ) или ΕΌΙ. Последовательность ΕΌ-Α человека опубликована КотиЫШй е! а1. (1984), №.1с1с1с Αοίάκ Век. 12, 5853-5868, и Рао1е11а е! а1. (1988), №.1с1ею Ααάκ Век. 16, 3545-3557. Последовательность ΕΌ-Α человека доступна также в базе данных δ^ίκκΡτοΐ как аминокислоты 1631-1720 (фибронектин типа-ΙΙΙ 12; дополнительный домен 2) аминокислотной последовательности, положенной на хранение под номером доступа Р02751. Последовательность ΕΌ-Α мыши доступна в базе данных δ^ίκκΡτοΐ как аминокислоты 17211810 (фибронектин типа-ΙΙΙ 13; дополнительный домен 2) аминокислотной последовательности, положенной на хранение под номером доступа Р11276.
Изоформа ΕΌ-Α фибронектина (Α-ΕΠ) содержит дополнительный домен Α (ΕΌ-Α). Последовательность Α-ΕΉ человека может быть выведена из соответствующей последовательности предшественника фибронектина человека, которая доступна в базе данных δΜκκΡτοΐ под номером доступа Р02751. Последовательность Α-ΕN мыши может быть выведена из соответствующей последовательности предшественника фибронектина мыши, которая доступна в базе данных δ^ίκκΡτοΐ под номером доступа Р11276. Α-ΕN может представлять собой изоформу ΕΌ-Α фибронектина человека. ΕΌ-Α может представлять собой дополнительный домен А фибронектина человека.
ΕΌ-Α представляет собой последовательность из 90 аминокислот, которая вставлена в фибронектин (ЕЙ) в результате альтернативного сплайсинга и локализована между доменами 11 и 12 ΕN (Βοτκί е! а1., 1987, 1. Се11 Βίοί., 104, 595-600). ΕΌ-Α преимущественно отсутствует в форме ΕN в плазме крови, но распространен в ходе эмбриогенеза, ремоделинга тканей, фиброза, при пересадке сердца и росте солидных опухолей.
Альтернативный сплайсинг.
Альтернативный сплайсинг относится к осуществлению различных паттернов сплайсинга первичного транскрипта РНК с ДНК с получением различных мРНК. После вырезания интронов селекцией можно определить, какие экзоны будут соединяться вместе с образованием мРНК. Альтернативный сплайсинг ведет к продукции различных изоформ, содержащих различные экзоны и/или различное количество экзонов. Например, одна изоформа может включать дополнительную аминокислотную последовательность, соответствующую одному или более экзонам, которые могут включать один или более доменов.
Лимфома.
Так описывается тип рака, который вовлекает клетки иммунной системы, называемые лимфоцитами, и характеризуется аномальной пролиферацией этих клеток. Существует много различных подтипов лимфом, и они могут быть сгруппированы в две основные категории: лимфомы Ходжкина и неходжкинские лимфомы. Лимфомы Ходжкина развиваются из особой аномальной линии дифференцировки Влимфоцитов, тогда как неходжкинские лимфомы могут происходить из аномальных либо В-, либо Т- или М< клеток и отличаются уникальными генетическими маркерами. Лимфома Беркитта является примером В-клеточной неходжкинской лимфомы. Как обозначается в настоящем описании, лимфома может быть первичной лимфомой. Как обозначается в настоящем описании, лимфома может быть лимфомой Ходжкина или неходжкинской лимфомой. Предпочтительно, как обозначается в настоящем описании, лимфома представляет собой первичную лимфому Ходжкина или первичную неходжкинскую лимфому.
- 5 017995
Рак легкого.
Так описывается малигнизированная трансформация и экспансия легочной ткани. Типы рака легкого могут быть сгруппированы в две главные категории: типы мелкоклеточного рака легкого (мелкоклеточная карцинома) и типы немелкоклеточного рака легкого. Подтипами немелкоклеточного рака легкого являются сквамозноклеточная карцинома, аденокарцинома (адено-карцинома) и крупноклеточная карцинома. Бронхоальвеолярная карцинома является подтипом аденокарциномы. Как обозначается в настоящем описании, рак легкого может быть первичным раком легкого. Опухоль легкого является опухолью в легком животного (например, человека), которая является результатом развития рака легкого. Как обозначается в настоящем описании, опухоль легкого может быть первичной опухолью легкого.
Первичная опухоль.
Так описывается опухоль в том месте, где опухоль появилась впервые (первичное место). Первичные опухоли иногда распространяются вне места их происхождения (первичного места) с образованием вторичных опухолей (метастазов) в других местах в организме животного, и это распространение обозначается как метастазирование.
Участник связывания.
Так описывается один участник пары молекул, которые связывают друг друга. Участники пары связывания могут иметь природное происхождение или полностью либо частично продуцироваться синтетически. Один участник пары молекул обладает на своей поверхности областью или полостью, которая связывает и, следовательно, комплементарна конкретной пространственной и полярной организации другого участника пары молекул. Примерами типов связывающих пар являются антиген-антитело, биотин-авидин, гормон-гормональный рецептор, рецептор-лиганд, фермент-субстрат. Настоящее изобретение касается типов реакций антиген-антитело.
Участник связывания обычно включает молекулу, обладающую антигенсвязывающим сайтом. Например, участник связывания может представлять собой молекулу антитела или белок, не являющийся антителом, который включает антигенсвязывающий сайт.
Антигенсвязывающий сайт может быть обеспечен посредством размещения областей, определяющих комплементарность (СИКе), в каркасных белках, не являющихся антителами, таких как фибронектин или цитохром В и т.д. (Наап & Маддое, 2004; Ко1бе, 1998; Иудтеи, 1997), или путем рандомизации или мутирования аминокислотных остатков петли в каркасном белке для придания специфичности связывания желаемой мишени. Каркасы для конструирования новых связывающих сайтов в белках подробно обсуждаются Иудтеи е! а1. (1997). Каркасные белки - миметики антител раскрыты в патенте νθ/0034784, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, в котором изобретатели описывают белки (миметики антител), которые включают домен типа III фибронектина, обладающий по меньшей мере одной рандомизированной петлей. Подходящий каркас, в который вставляют одну или более СИКе, например набор НСИКе, может быть обеспечен любым доменным членом надсемейства генов иммуноглобулинов. Каркас может быть белком человека или белком не от человека. Преимущество каркасного белка, не являющегося антителом, состоит в том, что он может обеспечить антигенсвязывающим сайтом молекулу каркаса, которая имеет меньший размер и/или более проста в получении, чем, по меньшей мере, некоторые молекулы антител. Малый размер участника связывания может придавать полезные физиологические свойства, такие как способность к вхождению в клетки, глубине проникновения в ткани или достижению мишеней без других структур, или связывание с белковыми полостями антигена-мишени. Использование антигенсвязывающих сайтов в каркасных белках, не являющихся антителами, обсуждается в статье Vеее, 20 04. Типичными являются белки, обладающие стабильным остовом и одной или более вариабельными петлями, в которых аминокислотная последовательность петли или петель прицельно или рандомизированно мутирована для создания антигенсвязывающего сайта, который связывает антиген-мишень. Такие белки включают 1дО-связывающие домены белка А из 8. аитеие, трансферрин, тетранектин, фибронектин (например, домен типа III 10 фибронектина) и липокалины. Другие подходы включают синтетические микротела (8е1есоге ОшЬН), основанные на циклотидах - малых белках, обладающих внутримолекулярными дисульфидными связями.
В дополнение к последовательностям антитела и/или антигенсвязывающего сайта участник связывания для применения по изобретению может включать другие аминокислоты, например, образующие пептид или полипептид, такой как домен укладки, или для придания молекуле другой функциональной характеристики в дополнение к способности связывать антиген. Участники связывания для применения по изобретению могут нести определяемую метку, или могут быть конъюгированы с токсином или с частью для направленной доставки, или с ферментом (например, через пептидильную связь или линкер). Например, участник связывания может включать каталитический сайт (например, в ферментативном домене), а также антигенсвязывающий сайт, где антигенсвязывающий сайт связывается с антигеном и таким образом направляет каталитический сайт на антиген. Каталитический сайт может ингибировать биологическую функцию антигена, например, путем расщепления.
Хотя, как отмечалось, СИКе могут нести каркасы, не являющиеся антителами, структура для включения СИК или набора СИКе должна обычно представлять собой последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или ее существенную часть, в которой СИК или набор СИКе локализован в положе
- 6 017995 нии, соответствующем СЭЯ или набору СЭЯк вариабельных доменов природных УН и УЪ антитела, кодируемых реорганизованными генами иммуноглобулинов. Структура и локализация вариабельных доменов иммуноглобулинов может быть определена со ссылкой на КаЬа!, 1987, и его модернизированного варианта, доступного в настоящее время в Интернете (на сайте шшшпо.Ьте.тти.еби или по поиску КаЬа! с использованием любой системы поиска).
Под областью СИЯ или СИЯ подразумевается указание гипервариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, как определено КаЬа! е! а1. (1987) (КаЬа!, 1991а, и более поздние издания). Антитело обычно содержит 3 СЭЯк тяжелой цепи и 3 СЭЯк легкой цепи. Термин СИЯ или СЭЯк используется в настоящем описании для указания соответственно случаю одной или нескольких из этих областей или даже всех этих областей, которые содержат основную часть аминокислотных остатков, ответственных за связывание с аффинностью антитела к антигену или к эпитопу, который узнается.
Среди шести коротких последовательностей СИЯ третья СИЯ тяжелой цепи (НСЭЯ3) имеет более высокую величину вариабельности (более высокие различия, по существу, обусловлены механизмами организации генов, которые их вызывают). Она может быть настолько короткой как 2 аминокислоты, хотя известный наиболее длинный размер составляет 26. Функционально НСЭЯ3 частично играет роль в детерминации специфичности антитела (8еда1, 1974; Атй, 1986; Сйо!Ыа, 1987; Сйо!Ыа, 1989; Са!оп, 1990; Бйатоп, 1990а; Бйатоп, 1990Ь; КаЬа! е! а1., 1991Ь).
Молекула антитела.
Так описывается иммуноглобулин, либо природный, либо частично или полностью полученный синтетическим путем. Термин также покрывает любой полипептид или белок, включающий антигенсвязывающий сайт антитела. В настоящем описании должно быть понятно, что изобретение не относится к антителам в их природной форме, что означает, что они не находятся в их природном окружении, но что их можно выделить или получить из природных источников путем очистки или, кроме того, получить путем генетической рекомбинации или химического синтеза, и что они могут затем содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже. Фрагменты антител, которые включают антигенсвязывающий сайт антитела, включают, но не ограничиваются этим, молекулы антител, такие как ТаЬ, ТаЬ', ЕаЬ'-8Н, кеТу, Εν, бАЬ, Еб, и диатела.
Можно применять моноклональные и другие антитела и использовать технологии рекомбинантных ДНК для получения других антител или гибридных молекул, которые связывают антиген-мишень. Такие способы могут включать вставку ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или СЭЯк антитела, к константным областям или к константным областям плюс области каркаса отличного иммуноглобулина, см., например, патенты ЕР-А-184187, СВ 2188638А или ЕР-А-239400 и огромное количество более поздней литературы. Гибридома или другая клетка, продуцирующая антитело, может быть предметом генетической мутации или других изменений, которые могут или не могут изменить специфичность связывания продуцируемых антител.
Так как антитела могут быть модифицированы рядом способов, термин молекула антитела должен быть истолкован как покрывающий любого участника связывания или вещества, обладающего антигенсвязывающим сайтом антитела с требуемыми специфичностью и/или связыванием антигена. Таким образом, этот термин покрывает фрагменты и производные антител, включая любой полипептид, включающий антигенсвязывающий сайт антитела, будет ли он природным или полностью или частично синтетическим. Включаются, следовательно, гибридные молекулы, включающие антигенсвязывающий сайт антитела, или эквивалент, соединенные с другим полипептидом (например, происходящим от другого вида или принадлежащим к другому классу или подклассу антител). Клонирование и экспрессия гибридных антител описываются в патентах ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023 и в огромном количестве более поздней литературы.
Дополнительные способы, доступные в области техники конструирования антител, делают возможным выделение антител человека и гуманизированных антител. Например, гибридомы человека могут быть получены, как описано Коп!егтапп & ЭиЬе1 (2001). Фаговый дисплей, другой принятый способ создания участников связывания, подробно описан во многих публикациях, таких как патент νθ 92/01047 (обсуждаемый дополнительно ниже) и патенты США ϋδ 5969108, ϋδ 5565332, ϋδ 5733743, ϋδ 5858657, ϋδ 5871907, υδ 5872215, ϋδ 5885793, ϋδ 5962255, ϋδ 6140471, ϋδ 6172197, ϋδ 6225447, ϋδ 6291650, ϋδ 6492160, ϋδ 6521404 и Коп!егтапп & ЭиЬе1 (2001). Трансгенные мыши, у которых гены мышиных антител инактивированы и функционально заменены на гены антител человека при сохранении интактными других компонентов иммунной системы мыши, могут быть использованы для выделения антител человека (Мепбех, 1997).
Синтетические молекулы антител могут быть созданы путем экспрессии генов, созданных посредством олигонуклеотидов, синтезированных и собранных в подходящих экспрессионных векторах, например, как описано Кпарр1к е! а1. (2000) или КгеЬк е! а1. (2001).
Показано, что фрагменты целого антитела могут осуществлять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются (1) ЕаЬ фрагмент, состоящий из доменов УЬ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Еб фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ш) Εν фрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН одного антитела; (ίν) бАЬ фрагмент ^атб, 1989; МеСайеПу, 1990; Но1!, 2003), который состоит из
- 7 017995 домена УН или УЬ; (ν) выделенные области СЭР; (νί) Р(аЬ')2 фрагменты, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух соединенных РаЬ фрагментов, (νίί) одноцепочечные молекулы Ρν (κοΕν), где домен УН и домен УЬ соединены пептидным линкером, который позволяет двум доменам связываться с образованием антигенсвязывающего сайта (Βίτά 1988; Нийоп, 1988); (νίίί) биспецифичные одноцепочечные димеры Ρν (РСТ/ϋδ 92/09965) и (ίχ) диатела, мультивалентные или мультиспецифичные фрагменты, сконструированные путем слияния генов (\УО 94/13804; НоШдег, 1993а). Молекулы Ρν, 8θΡν или диател могут быть стабилизированы путем включения дисульфидных мостиков, соединяющих домены УН и УЬ (Вейег, 1996). Могут быть также созданы минитела, включающие 8θΡν, соединенный с доменом СН3 (Ни, 1996). Другими примерами связывающих фрагментов являются РаЬ', которые отличаются от РаЬ фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена СН1 тяжелой цепи, включая один или более цистеинов, от шарнирной области антитела, и РаЬ'-8Н, который представляет собой РаЬ' фрагмент, в котором остаток(тки) цистеина константных доменов несет свободную тиоловую группу.
Фрагменты антител для применения по изобретению могут быть получены, начиная от любых описанных в настоящем документе молекул антител, например молекул антител, включающих домены УН и/или УЬ, или СИВк любых описанных в настоящем документе антител, с помощью методов, таких как гидролиз с помощью ферментов, таких как пепсин или папаин, и/или путем расщепления дисульфидных связей с помощью химического восстановления. Другим способом фрагменты антител настоящего изобретения могут быть получены с помощью методов генетической рекомбинации, также хорошо известных специалисту в данной области техники, или с помощью пептидного синтеза с помощью, например, автоматического пептидного синтезатора, такого как применяемые компанией ЛррБеб В|О5у51ет5, и т.д., или с помощью синтеза и экспрессии нуклеиновой кислоты.
Функциональные фрагменты антител по настоящему изобретению включают любой функциональный фрагмент, чей период полужизни повышен путем химической модификации, особенно пэгилирования, или путем включения в липосому.
бЛЬ (домен антитела) представляет собой малый мономерный антигенсвязывающий фрагмент антитела, а именно вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела (Но11, 2003). УН бЛЬ существует в природе у камелидов (например, верблюдов, лам) и может быть получена путем иммунизации камелида антигеном-мишенью, выделения антигенспецифических В-клеток и прямого клонирования генов бЛЬ из индивидуальных В-клеток. 6ЛЬ§ продуцируются также в клеточной культуре. Их малый размер, хорошая растворимость и температурная стабильность делает их особенно физиологически пригодными и подходящими для селекции и формирования сродства. Участник связывания по настоящему изобретению может представлять собой бЛЬ, включающий домен УН или УЬ, по существу, как представлено в настоящем документе, или домен УН или УЬ, включающий набор СИВк домен УН или УЬ, по существу, как представлено в настоящем документе.
Применяемое в настоящем описании выражение по существу, как представлено относится к характеристикам) соответствующих СИВк УН или УЬ домена участников связывания, описанных в настоящем документе, являются ли они идентичными или крайне сходными с конкретными областями, последовательность которых представлена в настоящем описании. Как описано в настоящем документе, выражение крайне сходны в отношении конкретной(ных) области(тей) одного или более вариабельных доменов рассматривается как то, что от 1 до приблизительно 5, например от 1 до 4, включая от 1 до 3 или от 1 до 2 или 3, или 4 аминокислотные замены могут быть сделаны в СИВ и/или УН, или УЬ домене.
Биспецифические или бифункциональные антитела образуют вторую генерацию моноклональных антител, в которых две различные вариабельные области объединены в одной и той же молекуле (Но1Бдег, 1999). Их использование продемонстрировано как в области диагностики, так и в области терапии, благодаря их способности индуцировать новые эффекторные функции или направленно доставлять некоторые молекулы на поверхность опухолевых клеток. Когда предполагается использовать биспецифические антитела, это могут быть общепринятые биспецифические антитела, которые могут быть получены различными способами (НоШдег, 1993Ь), например получены химически или химерным гибридом, или это могут быть любые из биспецифических фрагментов антител, указанных выше. Эти антитела могут быть получены с помощью химических методов (С1епше, 1987; Верр, 1995) или методов на уровне организма (81аег/, 1986; Бигекй, 1986), но также с помощью способов генной инженерии, которые позволяют форсировать гетеродимеризацию и таким образом содействовать процессу очистки искомого антитела (Мегсйапб, 1998). Примеры биспецифических антител включают антитела по технологии ΒίΤΕ™, в которых могут быть использованы связывающие домены двух антител с различной специфичностью и прямо соединены через короткие гибкие пептиды. Это объединяет два антитела на короткой единственной полипептидной цепи. Диатела и 5сРу могут быть сконструированы без области Рс с использованием только вариабельных доменов, потенциально снижая эффекты антиидиотипической реакции.
Биспецифические антитела могут быть сконструированы как полный 1дС, как биспецифический РаЬ'2, как РаЬ' ПЭГ, как диатела или также как биспецифический 5сРу. Кроме того, два биспецифических антитела могут быть соединены с использованием общепринятых методов, известных в данной области техники, с образованием четырехвалентных антител.
Биспецифические диатела в противоположность биспецифическим полным антителам могут быть
- 8 017995 также особенно приемлемы, так как они могут быть легко сконструированы и экспрессированы в Е. сой. Диатела (и многие другие полипептиды, такие как фрагменты антител) с подходящей специфичностью сродства могут быть легко отобраны из библиотек с использованием фагового дисплея (νθ 94/13804). Если одно плечо диатела намереваются сохранять постоянным, например, со специфичностью, направленной против антигена-мишени, то библиотека может быть создана, когда другое плечо варьируется и отбирается антитело с подходящей специфичностью.
Биспецифические полные антитела могут быть получены альтернативными методами конструирования, как описано в статье КИдотау, 1996.
В данной области техники доступны различные методы получения антител против антигенамишени. Антитела могут быть моноклональными антителами, особенно происходящими от человека, мыши, гибридного или гуманизированного происхождения, которые могут быть получены в соответствии со стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники.
В целом, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно сослаться на способы, которые описаны, в частности, в руководстве Άηίίϋοάίβδ (Наг1о\г апб Байе, 1988), или на метод получения гибридом, описанный КоЫег апб Мбйеш, 1975.
Моноклональные антитела могут быть получены, например, из клетки животного, иммунизированного против Α-ΕΝ, или одного из его фрагментов, содержащих эпитоп, узнаваемый указанными моноклональными антителами, например фрагмент, включающий или состоящий из ΕΌ-Α, или пептидный фрагмент ΕΌ-Α. Α-ΕΝ или один из его фрагментов может продуцироваться главным образом в соответствии с обычными рабочими методами, с помощью генетической рекомбинации, начиная с последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей в кДНК последовательность, кодирующую Α-ΕΝ или его фрагмент, путем пептидного синтеза, начиная с последовательности аминокислот, включающей пептидную последовательность Α-ΕΝ и/или его фрагмента.
Моноклональные антитела могут, например, быть очищены на аффинной колонке, на которой предварительно иммобилизован Α-ΕΝ или один из его фрагментов, содержащих эпитоп, узнаваемый указанными моноклональными антителами, например фрагмент, включающий или состоящий из ΕΌ-Α, или пептидный фрагмент ΕΌ-Α. Моноклональные антитела могут быть очищены хроматографией на протеине А и/или С с последующей ионообменной хроматографией или без нее с целью устранения в них остаточных белковых загрязнений, а также ДНК и ЕР8 с последующей эксклюзионной хроматографией на геле сефарозы или без нее для устранения потенциальных агрегатов, обусловленных присутствием димеров или других мультимеров. Все эти методы могут использоваться одновременно или последовательно.
Антигенсвязывающий сайт.
Так описывается часть молекулы, которая связывается со всем или частью антигена-мишени и комплементарна им. В молекуле антитела это обозначается как антигенсвязывающий сайт антитела и включает часть антитела, которая связывается со всем или частью антигена-мишени и комплементарна им. Когда антиген большой, антитело может связываться только с конкретной частью антигена и эта часть называется эпитопом. Антигенсвязывающий сайт антитела может быть обеспечен одним или более вариабельными доменами антитела. Антигенсвязывающий сайт антитела может включать вариабельную область легкой цепи (УЪ) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (УН) антитела.
Выделенные.
Это относится к состоянию, в котором участники связывания для применения по изобретению или нуклеиновая кислота, кодирующая такие участники связывания, должны обычно быть в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, участники связывания, домены УН и/или УЪ по настоящему изобретению могут быть предложены выделенными и/или очищенными, например, из их природного окружения, по существу в чистой или гомогенной форме, или в случае нуклеиновой кислоты в свободной или по существу свободной от нуклеиновой кислоты или генов, отличных по происхождению от последовательности, кодирующей полипептид с требуемой функцией. Выделенные участники и выделенная нуклеиновая кислота должны быть свободны или по существу свободны от материала, с которым они связаны в природе, такого как другие полипептиды или нуклеиновые кислоты, с которыми они находятся в их природном окружении, или в окружении, в котором их получают (например, в клеточной культуре), когда такое получение осуществляется с помощью метода рекомбинантных ДНК, применяемых ίη νίΐτο или ίη νίνο. Участники и нуклеиновая кислота могут быть составлены с разбавителями или адъювантами и все еще для практических целей быть выделенными, например участники должны быть обычно смешаны с желатином или другими носителями, если используются для покрытия лунок планшетов для микротитрования для использования в иммунотестах либо должны быть смешаны с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями при использовании для диагностики и терапии. Участники связывания могут быть гликозилированными либо природно, либо системами гетерологичных эукариотных клеток (например, клетками СНО или Ν8Θ (ЕСАСС 85110503)), или они могут быть (например, если продуцируются экспрессией в прокариотной клетке) негликозилированными.
В изобретении могут быть также использованы гетерогенные препараты, включающие молекулы антител. Например, такие препараты могут представлять собой смеси антител с полноразмерными тяже
- 9 017995 лыми цепями и тяжелыми цепями с отсутствием С-концевого лизина с различными степенями гликозилирования и/или с дериватизированными аминокислотами, такими как при циклизации Ν-концевой глютаминовой кислоты с образованием остатка пироглютаминовой кислоты.
Один или более участников связывания для антигена, например А-ΕΝ или ΕΌ-А фибронектина, могут быть получены путем введения в контакт библиотеки участников связывания по изобретению и антигена или его фрагмента, например фрагмента, включающего или состоящего из ΕΌ-А, или пептидного фрагмента ΕΌ-А, и отбора одного или более участников связывания библиотеки, способных связывать антиген.
Может быть проведен скрининг библиотеки антител с использованием повторяющегося скрининга колоний на фильтре (1СЕ8). При 1СЕ8 бактерии, содержащие ДНК, кодирующую белки с некоторыми специфичностями связывания, выращивают в жидкой среде и, как только достигается стадия экспоненциального роста, несколько миллиардов из них распределяют на подложке для роста, состоящей из подходящим образом предварительно обработанного мембранного фильтра, который инкубируется до тех пор, пока не появляются полностью конфлюэнтные колонии бактерий. Второй субстрат-ловушка состоит из другого мембранного фильтра, предварительно увлажненного и покрытого желаемым антигеном.
Мембранный фильтр-ловушку затем помещают на чашку, содержащую подходящую культуральную среду, и покрывают фильтром для роста поверхностью, покрытой бактериальными колониями, направленными наверх. Полученный, таким образом, сэндвич инкубируют при комнатной температуре в течение приблизительно 16 ч. Таким способом можно получить экспрессию генов, кодирующих фрагменты 8сЕу антител, с распространяющимся действием, так что улавливаются те фрагменты, которые специфически связываются с антигеном, который присутствует на мембране-ловушке. Мембраналовушка затем обрабатывается для определения связанных 5сЕу фрагментов антител с обычным использованием для этой цели колориметрических способов.
Положение окрашенных пятен на фильтре-ловушке позволяет вернуться к соответствующим бактериальным колониям, которые присутствуют на мембране для роста и продуцируют уловленные фрагменты антител. Такие колонии собирают и выращивают, и бактерии - несколько миллионов из них распределяют на новой культуральной мембране, повторяя процедуры, описанные выше. Аналогичные циклы затем осуществляют до тех пор, пока позитивные сигналы на мембране-ловушке будут соответствовать единичным позитивным колониям, каждая из которых представляет собой потенциальный источник фрагментов моноклональных антител, направленных против антигена, используемого для селекции. 1СЕА8 описан, например, в патенте АО 0246455, включенном в настоящее описание в качестве ссылки. Библиотека может быть также представлена на частицах или молекулярных комплексах, например на реплицируемых генетических модулях, таких как частицы бактериофагов (например, Т7) или других системах представления ίη νίίτο, причем каждая частица или молекулярный комплекс содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую представленный на них вариабельный домен УН антитела, и необязательно также представленный домен УБ, если он присутствует. Фаговый дисплей описан в патенте АО 92/01047 и, например, в патентах США ϋδ 5969108, ϋδ 5565332, ϋδ 5733743, ϋδ 5858657, ϋδ 5871907, И8 5872215, υδ 5885793, ϋδ 5962255, ϋδ 6140471, ϋδ 6172197, ϋδ 6225447, ϋδ 6291650, ϋδ 6492160 и ϋδ 6521404, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
После селекции участников связывания, способных связывать антиген и быть представленными на бактериофаге или других частицах библиотеки либо молекулярных комплексах, нуклеиновую кислоту можно отделить от бактериофага или другой частицы либо молекулярного комплекса, представляющих указанный отобранный участник связывания. Такая нуклеиновая кислота может быть использована при последующей продукции участника связывания или вариабельного домена УН или УЪ антитела путем экспрессии нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, полученной от бактериофага или другой частицы либо молекулярного комплекса, предоставляющих указанного отобранного участника связывания.
Вариабельный домен УН антитела с аминокислотной последовательностью вариабельного домена УН антитела указанного отобранного участника связывания может быть предложен в выделенной форме, как может быть предложен участник связывания, включающий такой домен УН.
Способность к связыванию А-ΕΝ или ΕΌ-А фибронектина или другого антигена-мишени либо изоформы может быть дополнительно протестирована, например, по способности конкурировать, например, с любым из антител против ΕΌ-А Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Ε1, В7, Е8 или 09 за связывание с А-ΕΝ или фрагментом А-ΕΝ, например, ΕΌ-А фибронектина.
Участник связывания для применения по изобретению может связывать А-ΕΝ и/или ΕΌ-А фибронектина специфически. Участник связывания по настоящему изобретению может связывать А-ΕΝ и/или ΕΌ-А фибронектина с тем же самым сродством, что и антитело против ΕΌ-А Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Ε8, Ε1, В7, Е8 или 09, например, в формате 5сЕ\'. или с более высоким сродством. Участник связывания для применения по изобретению может связывать А-ΕΝ и/или ΕΌ-А фибронектина с Кс 3х 10-8 М или с более высоким сродством. Предпочтительно участник связывания для применения по изобретению связывает А-ΕΝ и/или ΕΌ-А фибронектина с Кс 2х10-8 М или с более высоким сродством. Более предпочтительно
- 10 017995 участник связывания для применения по изобретению связывает Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина с Кс 1,7х 10-8 М или с более высоким сродством. Еще более предпочтительно участник связывания для применения по изобретению связывает Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина с Кс 1,4х10-8 М или с более высоким сродством. Наиболее предпочтительно участник связывания для применения по изобретению связывает Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина с Кс 3х 10-9 М или с более высоким сродством.
Участник связывания по настоящему изобретению может связываться с тем же самым эпитопом на Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина, что и антитело против ΕΌ-Ά Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 или 69.
Участник связывания для применения по изобретению может не проявлять какого-либо существенного связывания с молекулами, отличными от Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина. В частности, участник связывания может не связываться с другими изоформами фибронектина, например изоформой ΕΌ-Β и/или изоформой ШС8 фибронектина.
Раскрытые в настоящем описании варианты молекул антител могут быть получены и использованы в настоящем изобретении. Способы, требуемые для осуществления замен в аминокислотных последовательностях СЭКк, УН или УЪ доменах и участниках связывания, обычно доступны в данной области техники. Могут быть получены варианты последовательностей с заменами, которые могут или не могут быть предсказаны как имеющие минимальный или благоприятный эффект на активность, и они могут быть протестированы на способность связывать Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина и/или на любое другое желаемое свойство.
Варианты аминокислотных последовательностей вариабельных доменов любого из УН и УЪ доменов, чьи последовательности конкретно раскрыты в настоящем описании, могут быть применены по настоящему изобретению, как это обсуждается. Конкретные варианты могут включать одно или более изменений аминокислотной последовательности (добавление, делецию, замену и/или вставку аминокислотного остатка), может быть менее приблизительно 20 изменений, менее приблизительно 15 изменений, менее приблизительно 10 изменений или менее приблизительно 5 изменений, может быть 5, 4, 3, 2 или 1. Изменения могут быть осуществлены в одной или более областях каркаса и/или в одной или более СИКк. Изменения обычно не приводят к потере функции, так что участник связывания, включающий измененную таким образом аминокислотную последовательность, может сохранять способность связывать Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина. Например, он может сохранять те же количественные характеристики связывания, что и участник связывания без сделанных изменений, например, при измерении в описанном в настоящем документе тесте. Участник связывания, включающий измененную таким образом аминокислотную последовательность, может иметь улучшенную способность связывать Ά-ΕΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина.
Новые области УН или УЪ, несущие модифицированные последовательности СИКк для применения по изобретению, могут быть созданы с использованием неспецифического мутагенеза одного или более выбранных генов УН и/или УЪ с созданием мутаций в полном вариабельном домене. В некоторых вариантах осуществления делают одну или две аминокислотные замены в полном вариабельном домене или наборе СИКк. Другим методом, который может быть использован, является мутагенез, направленный на области СИКк генов УН или УЪ.
Как отмечалось выше, аминокислотная последовательность СИК по существу, как представлено в настоящем описании, может быть осуществлена как СИК в вариабельном домене антитела человека или его существенной части. Последовательности НСИК3 по существу, как представлено в настоящем описании, представляют собой варианты осуществления настоящего изобретения и, например, каждая из них может быть осуществлена как НСИК3 в вариабельном домене тяжелой цепи человека или его существенной части.
Вариабельные домены, применяемые в изобретении, могут быть получены или могут происходить от любой зародышевой линии или реорганизованного вариабельного домена человека либо могут представлять собой синтетический вариабельный домен на основе консенсусных или действительных последовательностей известных вариабельных доменов человека. Вариабельный домен может происходить от антитела, продуцируемого не человеком. Последовательность СИК для применения по изобретению (например, СИК3) может быть введена в репертуар вариабельных доменов с отсутствующей СИК (например, СИК3) с использованием метода рекомбинантных ДНК. Например, Магкк с1 а1. (1992) описывают методы продукции репертуаров вариабельных доменов антител, в которых консенсусные праймеры, направленные на 5'-конец или прилегающие к нему нуклеотиды области вариабельного домена, используют в соединении с консенсусными праймерами к третьей области каркаса генов УН человека для предоставления репертуара вариабельных доменов УН с отсутствующей СИК3. Магкк с1 а1. дополнительно описывают, как этот репертуар может быть соединен с СИК3 конкретного антитела. Используя аналогичные способы, происходящие от СИК3 последовательности настоящего изобретения, могут быть смешаны с репертуарами доменов УН или УЪ с отсутствующей СИК3, и смешанные полные домены УН или УЪ соединены с родственным доменом УЪ или УН с предоставлением участников связывания для применения по изобретению. Репертуар может быть затем представлен в подходящей системе хозяина, такой как
- 11 017995 система фагового дисплея патента νθ 92/01047, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме или в любом из большого объема литературных источников, включая Кау, \νίη1сг & МсСаГГсПу (1996), так что могут быть выбраны подходящие участники связывания. Репертуар может состоять из любых из более 104 индивидуальных участников, например по меньшей мере 105, по меньшей мере 106, по меньшей мере 107, по меньшей мере 108, по меньшей мере 109 или по меньшей мере 1010 участников.
Сходно одна или более или все три СИК.8 могут быть вставлены в репертуар доменов УН или УЪ, скрининг которых затем проводят на участниках связывания или участниках связывания для Ά-ΡΝ или ΕΌ-Ά фибронектина.
Могут быть применены одна или более из НСИК.1, НСЭК2 и НСИКЗ антитела Н1, В2, С5, И5, Е5, С8, Р8, Р1, В7, Е8 или С9 либо набор НСИК.8 и/или могут быть применены одна или более из X ЬСИК.1, ЬСИК.2 и ЬСИКЗ антитела Н1, В2, С5, И5, Е5, С8, Р8, Р1, В7, Е8 или 09 либо набор ЬСИКк антитела Н1, В2, С5, И5, Е5, С8, Р8, Р1, В7, Е8 или 09.
Сходно могут быть применены другие УН и УЪ домены, наборы СИК.8 и наборы НСИК.8 и/или наборы ЬСИК.8, раскрытые в настоящем описании.
Ά-ΓΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина могут быть использованы для скрининга участников связывания, например молекул антител, для использования при получении лекарственного средства для лечения рака легкого. Скрининг может представлять собой скрининг репертуара, как раскрыто в настоящем документе в другом месте.
Ά-ΓΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина могут быть также использованы для скрининга участников связывания, например молекул антител, для использования при получении лекарственного средства для лечения лимфомы. Скрининг может представлять собой скрининг репертуара, как раскрыто в настоящем документе в другом месте.
Существенная часть вариабельного домена иммуноглобулина может включать по меньшей мере три области СЭК совместно с их промежуточными областями каркаса. Часть может также включать по меньшей мере приблизительно 50% любой или обеих первой и четвертой областей каркаса, причем 50% являются С-концевыми 50% первой области каркаса и Ν-концевыми 50% четвертой области каркаса. Дополнительные остатки на Ν-концевом или С-концевом конце основной части вариабельного домена могут представлять собой остатки, обычно не связанные с природными областями вариабельных доменов. Например, конструкция участников связывания по настоящему изобретению, сделанная методами рекомбинантных ДНК, может приводить к введению Ν- или С-концевых остатков, кодируемых линкерами, введенными для облегчения клонирования или при других стадиях метода. Другие стадии метода включают введение линкеров для соединения вариабельных доменов, раскрытых в настоящем описании в другом месте, с дополнительными белковыми последовательностями, включая константные области антител, другие вариабельные домены (например, при продукции диател), или с выявляемыми/функциональными метками, как обсуждалось более подробно в настоящем описании в другом месте.
Хотя участники связывания могут включать пару доменов УН и УЪ, в изобретении могут также использоваться одиночные связывающие домены на основе последовательностей либо УН, либо УЪ домена. Известно, что одиночные иммуноглобулиновые домены, особенно домены УН, способны связывать антигены-мишени специфичным образом, например, см. обсуждение 6АЬ§ выше.
В случае любого из одиночных связывающих доменов эти домены могут быть использованы для скрининга комплементарных доменов, способных образовывать двухдоменного участника связывания, способного связывать Λ-ΓΝ и/или ΕΌ-Ά фибронектина. Этого можно достичь методами скрининга фагового дисплея с использованием так называемого иерархического двойного комбинаторного подхода, как раскрыто в патенте νθ 92/01047, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, при котором используют индивидуальную колонию, содержащую клон либо Н, либо Ь цепи, для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (Ь или Н), и полученного двухцепочечного участника связывания отбирают в соответствии с методами фагового дисплея, такими как описаны в этой ссылке. Этот метод также раскрыт в Маткк, 1992.
Участники связывания для использования в настоящем изобретении могут дополнительно включать константные области антитела или их части, например константные области антитела человека или их части. Например, домен УЪ может быть присоединен своим С-концом к константным доменам легкой цепи антитела, включающим цепи Ск или Ολ, например Ολ. Сходным образом, участник связывания на основе домена УН может быть присоединен своим С-концом ко всей или части (например, домену СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина, берущей начало от любого изотипа антитела, например 1д0, 1дА, ΙβΕ и 1дМ, и любого из подклассов изотипа, особенно 1д01 и 1д04. В вариантах осуществления настоящего изобретения пригоден также любой синтетический или иной вариант константной области, который обладает этими свойствами и стабилизирует вариабельные области.
Участники связывания для использования в изобретении могут быть помечены выявляемой или функциональной меткой. Метка может представлять собой любую молекулу, которая создает или может быть индуцирована к созданию сигнала, включая, но не ограничиваясь этим, люминофоры, радиоактивные метки, ферменты, хемилюминесцентные агенты или фотосенсибилизаторы. Так, связывание может
- 12 017995 быть выявлено и/или измерено путем определения флуоресценции или люминесценции, радиоактивности, ферментативной активности или поглощения света. Выявляемые метки могут быть присоединены к антителам для использования в изобретении с помощью традиционных химических методов, известных в данной области техники.
Существует множество методов, с помощью которых метка может создавать сигнал, обнаруживаемый внешними устройствами, например, путем визуальной оценки, по электромагнитному излучению, теплу и с помощью химических реагентов. Метка может быть также присоединена к другому участнику связывания, который связывает антитело для использования в изобретении, или к основе.
Меченые участники связывания, например 8сРу, меченные выявляемой меткой, могут быть использованы для диагностики ίη νίνο, ех νίνο или ίη νίΐτο и/или терапевтически.
Например, меченные радиоактивностью участники связывания (например, участники связывания, конъюгированные с радиоизотопом) могут быть использованы для радиодиагностики и радиотерапии. Радиоизотопы, которые могут быть конъюгированы с участником связывания для использования в изобретении, включают такие изотопы, как 94тТс, 99тТс, 186Ве, 188Ке, 203РЬ, 57Са, 68Са, 478с, 'ίη. 97Ви, 62Си, 64Си, 86Υ, 88Υ, 90Υ, 121δη, 161ТЬ, 1538т, 166Ηο, 105ВЙ, 177Ьи, 123Ι, 124Ι, 1251 и 131Ι.
Например, участник связывания для использования в изобретении, меченный выявляемой меткой, может быть использован для выявления, диагностики или мониторинга рака легкого у человека или животного.
Альтернативно, участник связывания для использования в изобретении, меченный выявляемой меткой, может быть использован для выявления, диагностики или мониторинга лимфомы у человека или животного.
Участник связывания по настоящему изобретению может быть использован для получения диагностического продукта для использования в диагностике рака легкого.
Участник связывания по настоящему изобретению может быть использован для получения диагностического продукта для использования в диагностике лимфомы.
В настоящем изобретении предлагается способ выявления или диагностики рака легкого у человека или животного, включающий стадии:
(a) введения человеку или животному участника связывания по настоящему изобретению, например, меченного выявляемой меткой, который связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина и/или ΕΌ-Α фибронектина; и (b) определения наличия или отсутствия участника связывания в легком организма человека или животного, где нахождение участника связывания в легком человека или животного указывает на наличие рака легкого.
В настоящем изобретении также предлагается способ выявления или диагностики лимфомы у человека или животного, включающий стадии:
(a) введения человеку или животному участника связывания по настоящему изобретению, например, меченного выявляемой меткой, который связывает изоформу ΕΌ-Α фибронектина и/или ΕΌ-Α фибронектина; и (b) определения наличия или отсутствия участника связывания в лимфатической системе организма человека или животного, где нахождение участника связывания в лимфатической системе человека или животного указывает на наличие лимфомы.
При мечении участника связывания выявляемой меткой наличие или отсутствие выявляемой метки может быть определено путем определения метки.
В настоящем изобретении могут быть применены конъюгат или гибрид с участником связывания для использования по изобретению и молекула, которая проявляет биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени в повреждениях, и антитело, направленное против компонента внеклеточного матрикса, находящегося в таких повреждениях. Например, биоцидная или цитотоксическая молекула может представлять собой интерлейкин-2 (ИЛ-2), доксорубицин, интерлейкин-12 (ИЛ-12), интерферон-γ (ИФН-γ), фактор некроза опухолей α (ФНОа) или тканевый фактор (предпочтительно укороченный). Такие конъюгаты могут быть использованы терапевтически, например, для лечения лимфомы, как указано выше в настоящем описании. Альтернативно, такие конъюгаты могут быть использованы терапевтически для лечения рака легкого, как указано выше в настоящем описании.
Получение и использование гибридов или конъюгатов участников связывания с биоцидными или цитотоксичными молекулами описано, например, в патенте \¥О 01/62298, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.
В изобретении предлагается способ лечения рака легкого, причем способ включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего участника связывания для использования по изобретению.
В изобретении также предлагается способ лечения лимфомы, причем способ включает введение
- 13 017995 индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего участника связывания для использования по изобретению.
Участник связывания может представлять собой конъюгат (1) молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени за счет клеточного взаимодействия, и (и) участника связывания с изоформой ЕЭ-А фибронектина и/или ЕЭ-А фибронектина.
В изобретении предлагается использование участника связывания для применения в изобретении для получения лекарственного средства для лечения рака легкого.
В изобретении также предлагается использование участника связывания для применения в изобретении для получения лекарственного средства для лечения лимфомы.
Участник связывания может быть конъюгирован или соединен с молекулой, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие, как описано в настоящем описании. Участник связывания может представлять собой конъюгат (1) молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени за счет клеточного взаимодействия, (и) участника связывания с фибронектином человека по настоящему изобретению.
В настоящем описании также описан конъюгат (1) молекулы, которая оказывает биоцидное или цитотоксическое действие на клетки-мишени за счет клеточного взаимодействия, (и) участника связывания с фибронектином человека для использования по настоящему изобретению. Такой конъюгат предпочтительно включает гибридный белок, включающий биоцидную или цитотоксическую молекулу и указанный участник связывания или, когда участник связывания является двухцепочечным или многоцепочечным, гибридный белок, включающий биоцидную или цитотоксическую молекулу и компонент с полипептидной цепью указанного участника связывания. Предпочтительно участник связывания представляет собой одноцепочечный полипептид, например одноцепочечную молекулу антитела, такую как ксЕт. В изобретении может быть использован гибридный белок, включающий биоцидную или цитотоксическую молекулу и одноцепочечную молекулу Εν антитела. Биоцидная или цитотоксическая молекула, которая оказывает свое действие на клетки-мишени путем клеточного взаимодействия, может взаимодействовать непосредственно с клетками-мишенями, может взаимодействовать со связанным с мембраной рецептором на клетке-мишени или нарушать электрохимический потенциал клеточной мембраны. Молекулы, которые взаимодействуют со связанным с мембраной рецептором, включают хемокины, цитокины и гормоны. Соединения, которые нарушают электрохимический потенциал клеточной мембраны, включают гемолизин, ионофоры, лекарственные средства, действующие на ионные каналы. В иллюстративных предпочтительных вариантах осуществления такой молекулой является интерлейкин-2, тканевый фактор (предпочтительно укороченный) и доксорубицин. В других вариантах осуществления могут использоваться интерлейкин 12, интерферон-гамма, ΙΡ-10 и фактор некроза опухолей-альфа (ΤΝΕ-α).
Как дополнительно обсуждается ниже, участник специфического связывания представляет собой предпочтительно антитело или включает сайт антитела для связывания антигена. Удобно, чтобы участник специфического связывания мог быть одноцепочечным полипептидом, таким как одноцепочечное антитело. Это обеспечивает легкое получение гибридного белка, включающего одноцепочечное антитело и биоцидную или цитотоксическую молекулу (например, интерлейкин-2 или тканевый фактор). Сайт антитела для связывания антигена может быть обеспечен путем ассоциации домена УН антитела и домена УЬ антитела в отдельных полипептидах, например в полном антителе или во фрагменте антитела, таком как РаЬ или диатело. Когда участник специфического связывания представляет собой двухцепочечную или многоцепочечную молекулу (например, ЕаЬ или антитело целиком соответственно), биоцидная или цитотоксическая молекула может быть присоединена в виде гибридного полипептида к одной или более полипептидным цепям участника специфического связывания.
Участник связывания может быть конъюгирован с биоцидной или цитотоксической молекулой с помощью пептидной связи, например, внутри гибридного полипептида, включающего указанную молекулу и участника специфического связывания или компонент его полипептидной цепи; см. ТашдисЫ е! а1. (1983) №щ.1гс 302, 305-310; МаЕЭ-А е! а1. (1983) ВюсЬет. ВюрЬук. Век. Сотт. 115: 1040-1047; Эеток с1 а1. (1983) №с1. АсИк Век. 11: 4307-4323 по поводу информации о последовательности ИЛ-2, пригодной для получения гибридного полипептида, включающего ИЛ-2. Информация о последовательности укороченного тканевого фактора представлена 8сатра!1 е! а1. (1987) ВюсЬеттЬу 26: 5234-5238 и Ви! е! а1. (1991) 1. Вю1. СЬет. 226: 15719-15725. Другие средства конъюгации включают химическую конъюгацию, в особенности поперечную сшивку, с помощью бифункционального реагента (например, при использовании ЭОиВЕЕ-ВЕА6Е№Т8™ Стокк-1шктд Веадеп!к 8е1ес1юп Сшбе, Р1егсе).
Когда желательно медленное высвобождение, например, когда биоцидная или цитотоксическая молекула представляет собой доксорубицин или другую молекулу, которая нарушает электрохимический потенциал клеточной мембраны, химическая конъюгация может быть осуществлена посредством образования Шиффова основания (имина) между первичной аминогруппой участника специфического связывания (полипептида, такого как антитело или фрагмент антитела) и частью окисленного сахара (даунозамина) биоцидной или цитотоксической молекулы, такой как доксорубицин.
Также в настоящем описании описана выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая участника
- 14 017995 связывания для использования по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота может включать ДНК и/или РНК. Нуклеиновая кислота может кодировать СЭК или набор СЭК или домен УН либо домен УЪ или сайт антитела, связывающий антиген, или молекулу антитела, например 5сРу или 1дС. например 1дС1, как определено выше. Нуклеотидные последовательности могут кодировать домены УН и/или УЪ, как раскрыто в настоящем описании.
В настоящем описании дополнительно описаны конструкты в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессионных кассет, которые включают по меньшей мере один полинуклеотид, как описано выше.
Описана также рекомбинантная клетка-хозяин, которая включает один или более конструктов, как описано выше. Описаны предлагаемая нуклеиновая кислота, кодирующая любые СОК или набор СЭК либо домен УН или домен УЪ либо сайт антитела, связывающий антиген, или молекулу антитела, например ксРу или 1дС1 или 1дС4, а также способ получения кодируемого продукта, причем способ включает экспрессию с кодирующей нуклеиновой кислотой. Экспрессия может быть легко осуществлена культивированием при подходящих условиях рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту. После продукции путем экспрессии домен УН или УЪ или участник связывания может быть выделен и/или очищен с помощью любого подходящего метода и затем быть использован подходящим образом.
Нуклеиновая кислота может включать ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Ссылка на нуклеотидную последовательность, как изложено в настоящем описании, охватывает молекулу ДНК с определенной последовательностью и охватывает молекулу РНК с определенной последовательностью, в которой и заменяет Т, если в контексте не требуется иное.
Описывается также метод получения вариабельного домена УН антитела, причем метод включает индукцию экспрессии с кодирующей нуклеиновой кислотой. Такой метод может включать культивирование клеток-хозяев в условиях для получения указанного вариабельного домена УН антитела.
Метод получения может включать стадию выделения и/или очистки продукта. Метод получения может включать составление продукта в композицию, включающую по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый эксципиент.
Системы для клонирования и экспрессии полипептида во множестве различных клеток-хозяев хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, клетки млекопитающих, клетки растений, нитевидные грибы, дрожжевые и бакуловирусные системы и трансгенные растения и животные. Экспрессия антител и фрагментов антител в прокариотных клетках прочно обосновалась в данной области техники; в качестве обзора см., например, Р1иск11шп, 1991. Обычным бактериальным хозяином является Εχοΐί.
Для специалистов в данной области техники также может быть полезна экспрессия в эукариотных клетках в культуре в качестве варианта получения участника связывания, например СНабб & ί.Ίιαιηο\ν (2001), Лпбсг5сп & Кгиттеп (2002), Ъатск & Т1юта5 (2001). Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области техники для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЪа, клетки почки детеныша хомячка, клетки меланомы мыши N80, клетки миеломы крысы ΥΒ2/0, клетки почки эмбриона человека, клетки сетчатки эмбриона человека и многие другие.
Могут быть выбраны или сконструированы удобные векторы, содержащие подходящие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности в соответствии с условиями. Векторы могут быть плазмидами, например фагемидой, или вирусными, например фаговыми, в соответствии с условиями. Дополнительные подробности см., например, в 8атЬгоок & Кп55е11 (2001). Многие известные методы и протоколы для работы с нуклеиновыми кислотами, например, для получения конструктов нуклеиновых кислот, мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов и анализа белков, подробно описаны в Ли5иЬе1. 1999.
Клетка-хозяин может содержать нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем описании. Такая клетка-хозяин может находиться ίη νίίτο и может находиться в культуре. Такая клетка-хозяин может находиться ίη νίνο. Нахождение клетки-хозяина ίη νίνο может обеспечивать внутриклеточную экспрессию участника связывания для использования в настоящем изобретении в качестве интрател, или внутриклеточных антител. Интратела могут быть использованы для генной терапии.
Описывается также метод введения раскрытой в настоящем описании нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин. Для введения может быть использован любой доступный метод. В случае эукариотных клеток подходящие методы включают трансфекцию с помощью фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана, электропорации, опосредуемую липосомами трансфекцию и трансдукцию с помощью ретровируса или других вирусов, например коровьей оспы, или, в случае клеток насекомых, бакуловируса. Для введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин, в особенности эукариотную клетку, может использоваться система на основе вируса или плазмиды. Плазмидная система может поддерживаться эписомально или может быть встроена в хромосому клетки-хозяина или в искусственную хромосому. Встраивание может быть либо
- 15 017995 случайной, либо направленной интеграцией одной или более копий в один или множество локусов. В случае бактериальных клеток подходящие методы могут включать трансформацию с помощью хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с помощью бактериофага.
Включение может сопровождаться вызванной или разрешенной экспрессией с нуклеиновой кислотой, например, путем культивирования клеток-хозяев в условиях экспрессии гена. Очистка экспрессированного продукта может быть достигнута методами, известными специалисту в данной области техники.
Нуклеиновая кислота может быть интегрирована в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграции может способствовать включение последовательностей, которые способствуют рекомбинации с геномом, в соответствии со стандартными методами.
Описывается также метод, который включает использование конструкта, как указано выше для экспрессионной системы, для экспрессии участника связывания или полипептида, как указано выше.
Участники связывания для использования в настоящем изобретении конструируют для использования в методах диагностики или лечения человеческих или животных индивидуумов, например человека. Участников связывания для использования в изобретении можно использовать для диагностики или лечения лимфомы.
Альтернативно, участников связывания для использования в изобретении можно использовать для диагностики или лечения рака легкого.
Соответственно в изобретении предлагаются методы лечения, включающие введение участника связывания в виде предлагаемых фармацевтических композиций, включающих такой участник связывания, и использование такого участника связывания для получения лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающей составление участника связывания с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и должны быть адаптированы специалистом в данной области техники в соответствии с природой и способом введения выбранного (выбранных) активного (активных) соединения (соединений).
Участники связывания для использования в настоящем изобретении обычно должны вводиться в форме фармацевтической композиции, которая может включать по меньшей мере один компонент, кроме участника связывания. Так, фармацевтические композиции по настоящему изобретению и для использования в соответствии с настоящим изобретением могут включать, помимо активного ингредиента, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие вещества, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие вещества должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Конкретная природа носителя или другого вещества должна зависеть от пути введения, который может быть пероральным, ингаляционным или инъекционным, например внутривенным.
В настоящем изобретении также предусматриваются фармацевтические композиции для перорального введения, например, нанотел и т.д. Такие пероральные составы могут находиться в форме таблетки, капсулы, порошка, жидкости или в полужидкой форме. Таблетка может включать твердый носитель, такой как желатин или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции обычно включают жидкий носитель, такой как вода, нефтепродукт, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть также включены физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или другого сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.
Для внутривенной инъекции или инъекции в больное место активный ингредиент должен находиться в форме парентерально приемлемого водного раствора, который не является пирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в соответствующей области техники способны легко приготовить подходящие растворы с использованием, например, изотоничных носителей, таких как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. В соответствии с условиями могут быть использованы консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Специалистам в данной области техники известно много методов получения фармацевтических составов; см., например, ЯоЫизои, 1978.
Композицию можно вводить отдельно или в сочетании с другими видами лечения, одновременно или последовательно, или в виде объединенного препарата с другим терапевтическим агентом или агентами, в зависимости от подлежащего лечению состояния.
Участник связывания для использования в настоящем изобретении может использоваться в качестве части сочетанной терапии вместе с дополнительным лечебным компонентом. Сочетанное лечение можно использовать для достижения значительного синергичного действия, особенно при сочетании участника связывания для использования в настоящем изобретении с одним или более другими лекарственными средствами. Участника связывания для использования в настоящем изобретении можно вводить одновременно или последовательно, или в виде объединенного препарата с другим терапевтическим агентом или агентами для лечения одного или более состояний, перечисленных в настоящем описании.
Например, участника связывания для использования в изобретении можно использовать в сочетании с существующим терапевтическим агентом для лечения лимфомы.
Существующие терапевтические агенты для лечения неходжкинских лимфом включают ритукси
- 16 017995 маб и цитоксан, гидроксирубицин (адриамицин), онковин (винкристин) и преднизон в сочетании (режим химиотерапии СНОР).
Существующие терапевтические агенты для лечения ходжкинских лимфом включают адриамицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин в сочетании (режим химиотерапии ЛБУО).
Альтернативно, участника связывания для использования в изобретении можно использовать в сочетании с существующим терапевтическим агентом для лечения рака легкого.
Существующие терапевтические агенты для лечения немелкоклеточных вариантов рака легкого включают цисплатин или карбоплатин в сочетании с гемцитабином, паклитакселем, доцетакселем, этопозидом или винорельбином. Существующие терапевтические агенты для лечения мелкоклеточных вариантов рака легкого включают цисплатин или этопозид отдельно или в сочетании с карбоплатином, гемцитабином, паклитакселем, винорельбином, топотеканом или иринотеканом.
Участника связывания для использования в изобретении и один или более из указанных выше дополнительных лекарственных компонентов можно использовать для получения лекарственного средства. Лекарственное средство может быть предназначено для раздельного или совместного введения индивидууму и соответственно может включать участника связывания и дополнительный компонент в виде объединенного препарата или в виде раздельных препаратов. Раздельные препараты можно использовать для облегчения раздельного и последовательного или одновременного введения, и это позволяет вводить компоненты разными путями, например пероральным и парентеральным введением.
В соответствии с настоящим изобретением предлагаемые композиции можно вводить млекопитающим. Введение может производиться в терапевтически эффективном количестве, которое является достаточным для проявления положительного действия на больного. Такое положительное действие может представлять собой, по меньшей мере, смягчение по меньшей мере одного симптома. Действительное вводимое количество и скорость, и расписание по времени введения должны зависеть от природы и тяжести того, что подлежит лечению, конкретного млекопитающего, подлежащего лечению, клинического состояния индивидуального больного, причины нарушения, места доставки композиции, типа участника связывания, метода введения, расписания введения и других факторов, известных практикующим врачам. Назначение лечения, например, принятие решений о дозах и т.д. находится в компетенции врачей общего профиля и других врачей и может зависеть от тяжести симптомов и/или прогрессии подлежащего лечению заболевания. Подходящие дозы антитела хорошо известны в данной области техники (Ьейегтаии, 1991 и Вадейа^е, 1991). Можно использовать конкретные дозы, указанные в этих публикациях или в Рйуе1С1аи'е Эеек КеГегеисе (2003), в соответствии с типом вводимого лекарственного средства. Терапевтически эффективное количество или подходящую дозу участника связывания для использования в изобретении можно определить путем сравнения его активности ίη νίίτο и активности ίη νίνο на животной модели. Известны методы экстраполяции эффективных доз у мышей и других тестируемых животных на человека. Конкретная доза должна зависеть от ряда факторов, включая то, предназначено ли антитело для диагностики, профилактики или лечения, размер и локализацию подлежащей лечению области, конкретную природу антитела (например, полное антитело, фрагмент или диатело) и природу любой выявляемой метки или другой молекулы, присоединенной к антителу. Обычная доза антитела должна находиться в диапазоне от 100 мкг до 1 г при системных введениях и от 1 мкг до 1 мг при местных нанесениях. Можно вводить вначале более высокую ударную дозу и затем одну или более меньшие дозы. Антитело может представлять собой полное антитело, например, изотипа ^С1 или ^С4. Оно представляет собой дозу для однократного лечения взрослого больного, которая может быть пропорционально подогнана для детей и младенцев, а также подогнана для других форматов антитела пропорционально молекулярной массе. Лечение может быть повторено с интервалами в сутки, дважды в неделю, неделю или месяц по усмотрению врача. Лечение может производиться каждые две-четыре недели при подкожном введении и каждые четыре-восемь недель при внутривенном введении. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лечение является периодическим, и период между введениями составляет приблизительно две недели или более, например приблизительно три недели или более, приблизительно четыре недели или более или приблизительно раз в месяц. В других вариантах осуществления изобретения лечение может производиться до и/или после хирургической операции и может быть осуществлено введением или нанесением непосредственно в анатомический сайт хирургического лечения.
Специалистам в данной области техники должны быть ясны дополнительные аспекты вариантов осуществления изобретения с учетом настоящего раскрытия, включая следующие экспериментальные иллюстративные примеры.
Экспериментальная часть
Материалы и методы.
Антитела.
Выделение фрагмента есΡν (Ь19) антитела против ΕΌ-В было описано ранее (Ρίηί е! а1., 1998). Исходное антитело против ΕΌ-Ά выделяли из библиотеки ЕТН-2 с помощью опубликованных процедур (Сюуаппош, Ыис1е1с. Λαά Кеееагсй, 2001, 29(5):Ε27). Созревание сродства исходного антитела против ΕΌ-Ά, дающее высокоаффинные антитела против ΕΌ-Ά, описывается в следующем разделе.
- 17 017995
Формирование сродства исходного антитела против ΕΌ-Α.
Исходное антитело против ΕΌ-Α (антитело, берущее начало от ЕТН-2) было использовано в качестве матрицы для конструирования библиотеки формирования сродства. Изменения в последовательности УН СБК1 (зародышевая линия ΌΡ47) и УБ СИК1 (зародышевая линия ΌΡΚ22) библиотеки вводили с помощью ПЦР с использованием частично вырожденных праймеров ^'-СТССАСССТСССССАСССАССТСАТМХХМХХМХХССТАААССТСААТССАСА-Х (ЛЕ) ГО
ΝΟ: 17) для УН и 5'-ССА66ТТТСТ6СТ66ТАССА66СТААМИМИ1ХММХК6СТААСАСТСТ6АСТ66СССТ6С-3' (8Ε0 ГО ΝΟ: 18) для УБ (все олигонуклеотиды были получены от Орегоп Вю1есйпо1од1е8, Со1одпе, Германия) в процессе, который создает случайные мутации в положениях 31, 32 и 33 УН СИРТ и в положениях 31, 31а и 32 УБ СИРЕ
Сочетания УНУБ собирали в формате зсЕу с помощью сборки ПЦР с использованием праймеров БМВ31опд (5'-СА66АААСА6СТАТ6АССАТ6АТТАС-3') (ЛЕ) ГО ΝΟ: 19) и Гске(]1оид (5'6АС6ТТА6ТАААТ6ААТТТТСТ6ТАТ6А66-3') (3ΕΟ ГО ΝΟ: 20) с использованием в качестве матриц очищенных в геле сегментов УН и БН. Собранные фрагменты УН-УБ дважды гидролизовали с помощью №о1/№11 и клонировали в гидролизованный №о1/№11 фагемидный вектор ρ№Ν1 (НоодепЬоот е( а1., 1991). Полученный продукт лигирования электропорировали в электрокомпетентные клетки Е. со11 ТС-1 по (УФ е( а1., 2000) с получением библиотеки, содержащей 1,5х107 индивидуальных клонов антител, которые подвергали скринингу на антитела, которые связывают ΕΌ-Α с улучшенным сродством.
Отбор антител против ΕΌ-Α.
Описанную выше библиотеку антител подвергали скринингу с помощью анализа В1Асоге на антитела, которые связывают ΕΌ-Α с большим сродством, чем исходное антитело против ΕΌ-Α. Использованный в анализе В1Асоге антиген (11А12) содержит домен ΕΌ-Α фибронектина человека и имеет следующую аминокислотную последовательность (3ΕΟ ГО ΝΟ: 120):
ΜΚΞΥΗΤΕΙΠΚΡδΟΜΏνΤΟνΟϋΝΞίενΚΗΙ,ΡεθδΡνΤΟΥΚνΤΤΤΡΚΝαΡΟΡΤΚΤΚΤΆΟΡΟΏΤΕΜ ΤΙΕΕΣΟΡΤνΕΥννΞνΥΑΟΝΡΞΰΕΞΟΡΒνΟΤΑνΤΝΙΟΚΡΚΞΕΑΕ'ΤϋνηνΟείΚΙΑΗΕεΡΟβΟνδ ΚΥΚ.νΤΥ33ΡΕΠσΐΗΕΕΕΡΑΡΟΟΕΕϋΤΑΕΕ0βΕΚΡ53ΕΥΤν3ννΑΕΗΟΟΜΞ50ΡΕΙΞΤ03ΤΑΙΡ ΑΡΤΟΕΚΕΤΟνΤΡΤΕΕδΑΟΗΤΡΡΝνΟΙ,Ί’εΥΚνκνΤΡΚΕΚΤΟΡΜΚΕΙΚΙΕΑΡϋΞΞΞνννΞΟΙ.ΜνΑΤ ΚΥΕνΞνΥΑΕΚϋΤΕΤ3ΗΡΑΟθννΤΤΕΕΝνΒ3ΗΗΗΗΗΗ
Нуклеотидная последовательность антигена (11А12) (3ΕΟ ГО ΝΟ: 121) является следующей: аъдадаЪссХассдаасадаааЪЪдасааассаЪсссадаЬдсаадЬдассдаЬднЬсаддасааса дсаБ^адБдБсаад^ддсБдсс’еБсаадЪЪссссЬдБ^'асЪддЪСасададБаассассасС.сссаа аааБддассаддассаасааааасЁаааасЁдсаддЕссадаЬсааасадаааЪдасЕаЪБдааддс •Ыздсадсссасад^ддадБа-Ь.дБддБУ.ад'Ед^сЪаЪдсЬсадааЬссаадсддадададС.садссЕс БддБЪсадасБдсадБаассаасаЪБдаБсдсссБаааддасБддсаЪБсасБдаЪдЪдда^д^сда ЪБссаЬсаааасъдсСЪдддааадсссасаддддсаадЪБЬссаддБасадддБдассБасесдадс ссБдаддаБддааБссаЬдадсБаБ'Ьссс-ЬдсассгдаЕддБдаадаадасасГ.дсададсСдсаад дссБсадассдддБ^сБдад^асасадБсад^дБддБ^дссБУдсасдаБдаБаБддададссадсс ссБдаБЪддаасссадЪссасадсЪаЪБссЬдсассаасЪдассБдаадБ'Ьсас'ЬсаддБсасассс асаадссъдадсдсссадъддасассасссаа£д1:1:садс1:са<гЬдда1:а£сдадС.дсдддСдассс ссааддадаадассддассааБдааадаааБсаасЬ£€дсБссЪдасадс^саБссдСддББд1:аБс аддасЕЕаЕддИддесассаааЁаЁдаад-ЬдадЕдЕсИаИдсЕсИИааддасас^Е-Сдасаадсада ссадсЕсадддадЕ£дС.сас:сас1:с£ддадааЁдЁ.садаЕсЕса1:саеса11сасса1:сасБаа
Нуклеотидную последовательность антигена амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции ВатН1 и Вд111 на 5'- и 3'-концах соответственно. Полученный продукт ПЦР и вектор ρΟΕ12 (ΟΙΑΟΕΝ) гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами ВатН1 и Вд111 и затем лигировали в реакционной смеси при соотношении вставки к вектору 3:1. Полученный вектор секвенировали для проверки правильности последовательности.
Антиген получали следующим образом.
Электрокомпетентную предварительную культуру ТС1 в 10 мл 2ТУ, Атр, 1% глюкозы электропорировали в присутствии 1 мкл минипрепарата ДНК 11А12. Предварительную культуру затем разбавляли 1:100 (8 мл в 800 мл 2ТУ, Атр, 0,1% глюкозы) и выращивали до ОП600 0,4-0,6, после чего индуцировали 1РТС в течение ночи. На следующий день клетки осаждали центрифугированием и супернатант фильтровали (М1Шроге 0,22 мкм). После центрифугирования и осветления культурального бульона 11А12 очищали с помощью колонки Нйгар на ВСЖХ. Колонку Νί/ регенерировали следующим образом: колонку промывали 5 об. колонки (СУ) 42Ο с последующим нанесением 3 СУ 0,5 М ЭДТА/0,2 М трис рН 8 для вымывания старого никеля из колонки. После этого колонку промывали 5 СУ 42Ο. Колонку затем вновь загружали 2 СУ 100 мМ Νί8Ο4 с последующей промывкой колонки несколькими СУ 42Ο. Колонку затем уравновешивали 5 СУ буфера для лизиса (20 мМ имидазол/250 мМ №С1/ЗФР рН 7,4). Клеточный лизат фильтровали (М1Шроге 0,45 мкм) и наносили на колонку (вручную). Колонку затем вновь помещали на ВСЖХ и буферу для лизиса давали протекать до достижения стабильного (постоянного) УФ
- 18 017995 сигнала, приблизительно 3 СУ. Затем запускали программу элюции: градиент от 0 до 100% буфера для элюции (400 мМ имидазол/250 мМ ЫаС1/ЗФР рН 7,4) в 5 СУ. Фракции, содержащие элюированный антиген, объединяли и диализовали в ЗФР в течение ночи.
Экспрессия и очистка антител против ΕΌ-А.
Антитела против ΕΌ-А экспрессировали и очищали следующим образом. Электрокомпетентную предварительную культуру ТС1 в 10 мл 2ΤΥ, Атр, 1% глюкозы электропорировали в присутствии 1 мкл минипрепарата ДНК одного из антител против ΕΌ-А. Предварительную культуру затем разбавляли 1:100 (8 мл в 800 мл 2ΤΥ, Атр, 0,1% глюкозы) и выращивали до ОП600 0,4-0,6, после чего индуцировали 1РТС в течение ночи. На следующий день клетки осаждали центрифугированием и супернатант фильтровали (Μί11ίροΐΌ 0,22 мкм). 8сРу очищали на колонке протеина А-сефарозы и для элюции с колонки 8сРу8 использовали триэтиламин. Фракции, содержащие элюированные 8сРу8, диализовали в ЗФР в течение ночи при 4°С. Фракции 8сРу затем наносили на колонку супердекса 75 при скорости потока ЗФР 0,5 мл/мин и собирали фракции 0,25 мл. Для анализа ШАтоте использовали мономерные фракции.
Анализ ΒΙΛ^ιό 1.
Микроматрицу ΒΙΛ^ιό промывали в течение ночи при скорости потока 5 мкл/мин буфером ΗΒ8ΕΡ В1Ас0кБ, 0,01 М Нерез рН 7,4, 0,15 М ЫаС1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20 (этот же буфер используется для тестирования). Антиген (11А12) разбавляли до концентрации 50 мкг/мл в ацетатном буфере (рН 4,0) и СООН группы на микроматрице активировали введением 50 мкл смеси Ν-гидроксисукциниммида (ΝΗ8) и этил-Ы-(диметиламинопропил)карбодиимида (БОС). На микроматрицу наносили 40 мкл антигена 11А12 и оставшиеся свободные группы СООН блокировали 30 мкл этаноламина. После фильтрации на 0,22-мкм фильтре на микроматрицу наносили 20 мкл каждого индивидуального бактериального супернатанта и в реальном времени отслеживали взаимодействие с антигеном.
Анализ ΒΙΛοθγο 2.
коП, ко££ и Кс исходного антитела против ΕΌ-А и антител против ΕΌ-А В2, С5, Ό5, С8, Р8, В7 и С9 оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Микроматрицу уравновешивали в течение ночи тем же буфером, который используется во время тестирования, при скорости потока буфера 5 мкл/мин. Всю процедуру покрытия проводили при этой скорости потока. Антиген 11А12 разбавляли 1:25 ацетатным буфером рН 4,00 (поставляемым В1АСОКГ) до конечной концентрации 20 мкг/мл. Затем смешивали ΝΗ8 и РОС и наносили 50 мкл для активации СООН групп на микроматрице СМ5. После этого наносили 40 мкл антигена (продолжительность этой операции 40''). Затем наносили 30 мкл этаноламина для блокирования реакционной способности возможных свободных СООН.
Каждый образец тестировали при скорости потока 20 мкл/мин. Наносили 20 мкл неразбавленного мономерного белка (как он сходит при гельфильтрации). Давали пройти диссоциации в течение приблизительно 200''. Затем наносили 10 мкл 10 мМ НС1 для регенерации микроматрицы. Повторяли нанесение мономерного белка при разных разведениях, т.е. при разведении 1:2 (в ЗФР) с последующей регенерацией с помощью НС1. После этого производили третье нанесение белка при разведении 1:4 с последующей регенерацией вновь с помощью НС1. Величины Εη, к<,££ и Кс для каждого антитела против ΕΌ-А оценивали с помощью программы ΒIАеνа1иа!^οη.
Иммуногистохимия срезов лимфомы.
Срезы лимфомы Рамоса фиксировали в холодном ацетоне (-20°С) в течение 10 мин и стекла оставляли сохнуть при комнатной температуре (КТ) в течение 30 мин. Стекла затем погружали в ТВ8 на период от 5 до 10 мин и обратную сторону стекол сушили с помощью бумаги, не прикасаясь к срезам. После этого производили блокирование срезов с помощью >1000 мкл 20% фетальной сыворотки телят (РС8) в ТВ8 (50 мМ трис, 100 мМ №С1 с доведенным рН 7,4, 0,01% апротинин) в течение 30 мин. Блокирующий раствор сливали и срезы погружали в ТВ8 на 5 мин. Затем к срезам добавляли 100 мкл первичного антитела зсРν Р8 (~20 нг/мкл) с меткой тус вместе с 10 мкл биотинилированного антитела 9Е10 против тус (ОП 0,25, разбавленного 1:20), разбавленного в ТВ8/3% БСА. В качестве отрицательного контроля служил срез лимфомы Рамоса, который иммуногистохимически окрашивали таким же образом, но без первичного антитела, т.е. антитела 8сРν Р8 против ΕΌ-А с меткой тус. Стекла инкубировали во влажной камере в течение 1 ч. Стекла промывали ТВ8 с последующим добавлением стрептавидина-щелочной фосфатазы, разбавленной 1:150 в ТВ8/3% БСА, и инкубацией во влажной камере в течение 30 мин. Стекла затем промывали ТВ8 дважды в течение 5 мин и обратную сторону стекол сушили бумагой. 500 мкл субстрата Раз! Кеб (5 мг порошка Раз!Кеб добавляли к 5 мл раствора Раз! Кеб [49 мл трис-НС1, 0,1 М, рН 8,2; 1,0 мл Ν,Ν-диметилформамида; 10 мг нафтол А8-МХ фосфата и 50 мкл раствора левамизода (1,0 мл 0,1 М трис-НС1 рН 8,2, 240,8 мг порошка левамизола)) и фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, после чего добавляли к каждому стеклу и стекла инкубировали во влажной камере в течение 15 мин. Стекла промывали дважды деионизированной водой путем прямого нанесения деионизированной воды на каждый срез с помощью пластиковой пастеровской пипетки и затем оставляли в воде. Стекла затем переносили в раствор гематоксилина Гиллиса на 50 мин с последующим быстрым переносом в воду и промывкой водой 6 раз. Наконец, стекла монтировали с помощью среды для монтирования 01усегде1 ^а^Су^та^^ Ο1οδ!ιυρ, Дания) и анализировали с помощью микроскопа ΛχίονΌΓΐ 8100 ТУ (Саг1
- 19 017995
Ζе^κκ. Ее1йЬас11. Швейцария) с использованием программы Αχίονίκίοπ (Саг1 Ζе^κκ).
Иммуногистохимическое окрашивание срезов рака легкого.
Срезы мелкоклеточного рака легкого (мелкоклеточная карцинома) и нескольких немелкоклеточных вариантов рака легкого (плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома, бронхоальвеолярная карцинома и крупноклеточная карцинома) иммуногистохимически окрашивали антителом ^Εν против ΕΌ-Α с меткой тус, как описано ранее (см., например, Вгаск е! а1., 2006). Вкратце, срезы инкубировали с антителом ^Εν Ό5 против ΕΌ-Α (конечная концентрация 2-15 мкг/мл) и со вторичным антителом (моноклональным антителом 9Е10 против тус) одновременно. Связанные антитела выявляли с помощью кроличьего антитела против иммуноглобулина мыши (Па^су^та^и, 01οκΙπ.ιρ, Дания) и затем мышиного комплекса щелочная фосфатаза - моноклональное антитело против щелочной фосфатазы (ΌΗΐ^.νΙοιηΗΐίοη). В качестве субстрата фосфатазы использовали ΕηκΙ Веб (81дта) и срезы подкрашивали гематоксилином (81дта). Наконец, срезы монтировали с помощью 01усегде1 (Па^су^та^! ΟΙοκΙπιρ, Дания) и анализировали с помощью микроскопа ЛхюуеП 8100 ТУ (Саг1 Ζе^κκ. ЕеИЬасй, Швейцария) с использованием программы Αχίονίκίοη (Саг1 Ζе^κκ).
Результаты.
Отбор антител против ΕΌ-Α.
Анализ ΒΙΑ^ιό 1.
Анализ ΒΙΑ^ιό дал график для каждого антитела против ΕΌ-А, который анализировали для определения сродства антитела к антигену следующим образом. Ось х каждого графика соответствует времени, а ось у соответствует единицам резонанса (величина, которая указывает на сродство связывания тестируемого антитела к антигену, покрывающему микроматрицу ΒΙΑ^ιό). Каждый график дает 3 пика и 1 минимум, которые соответствуют изменениям буфера и поэтому не имеют отношения к интерпретации результатов.
Восходящая часть каждого графика представляет собой фазу ассоциации. Чем круче кривая в этой части графика, тем быстрее происходит ассоциация антитела с антигеном. Нисходящая часть каждого графика представляет собой фазу диссоциации антитела от антигена. Чем более пологой является кривая в этой части графика, тем медленнее происходит диссоциация антитела от антигена.
Все антитела Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 и 09 против ΕΌ-Α показали более пологую кривую диссоциации по сравнению с исходным антителом против ΕΌ-Α, от которого они берут свое начало, что указывает на то, что они связывают ΕΌ-Α и, следовательно, также Α-ЕЫ с большим сродством, чем исходное антитело. Из всех тестированных антител против ΕΌ-Α графики для антител Е5, Е1, Е8 и Н1 показывали наиболее пологие кривые диссоциации. Кривые ассоциации антител Н1, С5, Ό5, Е5, С8, Е8 и Е1 были более пологими по сравнению с исходным антителом против ΕΌ-Α, в то время как кривая ассоциации, наблюдавшаяся для антител В2, В7, Е8 и 09, была такой же крутой, как и кривая ассоциации, наблюдавшейся для исходного антитела против ΕΌ-Α. Однако, поскольку для анализа ΒΙΑ^ιό антител Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 и 09 использовали бактериальные супернатанты индуцированных ΙΡΤΟ клеток Е. сο1^ ТО-1, концентрация тестируемых образцов антител была неизвестна, но наиболее вероятно, ниже концентрации исходного антитела против ΕΌ-Α в образце, использованном для сравнения. Следовательно, кривая ассоциации для антител Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 и 09 может быть искусственно заниженной из-за низкой концентрации антитела в образцах, использованных для анализа ΒΙΑ^ιό. Однако, поскольку концентрация не оказывает значительного влияния на диссоциацию антитела от его антигена-мишени в анализе ΒΙΑ^ιό, пологие кривые диссоциации, наблюдаемые для антител Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Е8, Е1, В7, Е8 и 09, показывают, что эти антитела связывают ΕΌ-Α со сродством, по меньшей мере, равным, а возможно, и более высоким по сравнению со сродством исходного антитела против ΕΌ-Α.
Анализ ΒΙΑ^ιό 2.
Величины 1οη, 1ο[ΐ и Кс для каждого антитела против ΕΌ-Α оценивали с помощью программы ΒIΑеуа1иа1юп. Величины 1οη, 1ο[ΐ и Кс исходного антитела против ΕΌ-Α и антител против ΕΌ-Α В2, С5, Ό5, С8, Е8, В7 и 09 для антигена 11А12 представлены в табл. 2. Все антитела против ΕΌ-Α В2, С5, Ό5, С8, Е8, В7 и 09 имеют лучшие величины Кс к антигену 11А12 по сравнению с исходным антителом против ΕΌ-Α, от которого они берут начало, что указывает на то, что они связывают ΕΌ-Α и, следовательно, также и Α-ΕΜ с большим сродством, чем исходное антитело против ΕΌ-Α.
Иммуногистохимия срезов лимфомы.
Иммуногистохимическое окрашивание срезов первичной человеческой лимфомы Рамоса (неходжкинская В-клеточная лимфома [лимфома Буркитта]) антителом ^Εν Е8 против ΕΌ-Α показало сильное и специфичное окрашивание новообразованной сосудистой сети. Напротив, в отрицательном контроле, в котором первичную лимфому Рамоса окрашивали при идентичных условиях, за исключением отсутствия антитела ^Εν Е8 против ΕΌ-Α, окрашивание первичной лимфомы Рамоса не дало окраски, включая окрашивание новообразованной сосудистой сети. Это показывает, что антитела ^Εν против ΕΌ-Α по настоящему изобретению являются специфически направленными на новообразованную сосудистую сеть лимфом. Поэтому ΕΌ-Α может служить в качестве общей мишени для участника связывания (например, антитела) на основе стратегии направленной доставки в лимфому.
- 20 017995
Иммуногистохимия срезов рака легкого.
В целом, трудно найти все опухолевые антитела в пределах определенного класса рака, например герсептин окрашивает лишь 20% вариантов рака молочной железы. На фиг. 1 показано, что антитело Р8 против ЕЭ-А специфически локализуется в новообразованной сосудистой сети и мелкоклеточного рака легкого, и немелкоклеточного рака легкого. Немелкоклеточные раки легкого составляют ~75-85% всех вариантов рака легкого, в то время как мелкоклеточные раки легкого составляют ~15-25%. На фиг. 1 дополнительно продемонстрировано, что антитело против ЕЭ-А специфически локализуется во всех тестированных подтипах немелкоклеточного рака легкого, а именно плоскоклеточной карциноме, аденокарциноме, бронхоальвеолярной карциноме и крупноклеточной карциноме. Таким образом, результаты, показанные на фиг. 1, неожиданно демонстрируют, что антитело против ЕЭ-А, Р8 окрашивает все тестированные гистологические типы рака легкого. Следовательно, ЕЭ-А может служить в качестве общей мишени для участника связывания (например, антитела) на основе стратегии направленной доставки в рак легкого.
Секвенирование.
Все антитела Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Р8, Р1, В7, Е8 и 69 против ЕЭ-А являются антителами ксРу, и их секвенировали с помощью традиционных методов. Нуклеотидная последовательность антитела Н1 против ЕЭ-А показана на фиг. 3. Аминокислотная последовательность антитела Н1 против ЕЭ-А показана на фиг. 4.
Предпочтительные нуклеотидные последовательности, кодирующие УН и/или УЪ антител В2, С5, Ό5, Е5, С8, Р8, Р1, В7, Е8 и 69 против ЕЭ-А, идентичны нуклеотидным последовательностям, кодирующим УН и/или УЪ антитела Н1 против ЕЭ-А, за исключением того, что нуклеотидные последовательности, кодирующие Н1 СЭК1к легкой (УЬ) и тяжелой (УН) цепей, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими СЭКТк легкой (УЬ) и тяжелой (УН) цепей, перечисленными в табл. 1, для соответствующего антитела.
Предпочтительные нуклеотидные последовательности, кодирующие УН и/или УЪ диатела ксРу Р8 против ЕО-А, идентичны нуклеотидным последовательностям, кодирующим УН и/или УЪ антитела Н1 против ЕЭ-А, за исключением того, что нуклеотидные последовательности, кодирующие Н1 60К1к легкой (УЬ) и тяжелой (УН) цепей, заменены нуклеотидными последовательностями, кодирующими СЭКТк легкой (УЪ) и тяжелой (УН) цепей, перечисленными в табл. 1 для антитела Р8 против ЕЭ-А. Предпочтительная нуклеотидная последовательность, кодирующая линкер, соединяющий УН и УЪ диатела ксРу Р8 против ЕЭ-А, представляет собой ддд1ссад1ддсдд1 (8Е6 Ш N0: 29).
Антитела В2, С5, Ό5, Е5, С8, Р8, Р1, В7, Е8 и 69 против ЕЭ-А имеют аминокислотные последовательности, идентичные аминокислотным последовательностям антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что аминокислотные последовательности Н1 СЭКТк легкой (УЬ) и тяжелой (УН) цепей заменены аминокислотными последовательностями легкой (УЬ) и тяжелой (УН) цепей СОКТк, перечисленными в табл. 1, для соответствующего антитела. Аминокислотная последовательность диатела ксРу Р8 против ЕЭ-А идентична аминокислотным последовательностям антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что аминокислотные последовательности Н1 СЭКТк легкой (УЬ) и тяжелой (УН) цепей заменены аминокислотными последовательностями легкой (УЬ) и тяжелой (УН) цепей СЭКТк, перечисленными в табл. 1 для антитела Р8 против ЕЭ-А, а аминокислотная последовательность линкера в Н1 заменена линкерной аминокислотной последовательностью 68866 (8Е6 Ш N0: 28).
Аминокислотная последовательность домена УН (8Е6 Ш N0: 21) антитела В2 против ЕЭ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что УН СЭК1 Н1 заменена 8ЕС) ГО N0: 23.
Аминокислотная последовательность домена УН (8Е6 Ш N0: 41) антитела С5 против ЕЭ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что УН СЭК1 Н1 заменена 8ЕС) ГО N0: 43.
Аминокислотная последовательность домена УН (8Е6 Ш N0: 51) антитела Ό5 против ЕЭ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что УН СЭК1 Н1 заменена 8ЕС) ГО N0: 53.
Аминокислотная последовательность домена УН (8Е6 Ш N0: 61) антитела Е5 против ЕЭ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что УН СЭК1 Н1 заменена 8ЕС) ГО N0: 63.
Аминокислотная последовательность домена УН (8Е6 Ш N0: 71) антитела С8 против ЕЭ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что УН СЭК1 Н1 заменена 8ЕС) ГО N0: 73.
Аминокислотная последовательность домена УН (8Е6 Ш N0: 81) антитела Р8 против ЕЭ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ЕО-А, за исключением того, что УН СЭК1 Н1 заменена 8Е6 Ш N0: 83. Домен УН диатела Р8 против ЕЭ-А имеет такую же аминокислотную последовательность, что и домен УН антитела Р8 против ЕЭ-А (т.е. 8Е6 Ш N0: 81).
Аминокислотная последовательность домена УН (8Е6 Ш N0: 91) антитела Р1 против ЕЭ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ЕЭ-А, за исключением того,
- 21 017995 что УН ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 93.
Аминокислотная последовательность домена УН (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 101) антитела В7 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УН СОК1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 103.
Аминокислотная последовательность домена УН (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 111) антитела Е8 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УН СОК1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 113.
Аминокислотная последовательность домена УН (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 31) антитела 09 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УН антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УН С0К1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 33.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 22) антитела В2 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 26.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 42) антитела С5 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 46.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 52) антитела Ό5 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 56.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 62) антитела Е5 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 66.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 72) антитела С8 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 76.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 82) антитела Ε8 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 86. Домен УБ диатела Ε8 против ΕΌ-А имеет такую же аминокислотную последовательность, что и домен УБ антитела Ε8 против ΕΌ-А (т.е. δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 82).
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 92) антитела Ε1 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 96.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 102) антитела В7 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ С1Ж1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 106.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 112) антитела Е8 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ С1Ж1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 116.
Аминокислотная последовательность домена УБ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 32) антитела 09 против ΕΌ-А идентична аминокислотной последовательности домена УБ антитела Н1 против ΕΌ-А, за исключением того, что УБ ί.’ΌΒ1 Н1 заменена δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 36.
Необязательно аминокислота в положении 5 домена УН антител Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Ε8, Ε1, В7, Е8, 09 против ΕΌ-А и диатела ^Εν Ε8 может представлять собой остаток лейцина (Б), а не остаток валина (У), как показано на фиг. 4А. Кроме того, альтернативно аминокислота в положении 18 домена УБ антител Н1, В2, С5, Ό5, Е5, С8, Ε8, Ε1, В7, Е8, 09 против ΕΌ-А и диатела хсБу Ε8 может представлять собой остаток аргинина (Я), а не остаток лизина (К), как показано на фиг. 4С.
Ссылки.
Все ссылки, цитированные в любом месте настоящего описания, включая ссылки, цитированные в любом месте выше, включены, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме и для всех целей.
Атй е! а1. (1986), 8с1епсе, 233: 747-753.
Апбегзеп е! а1. (2002) Ситтеп! Ορίηίοη ίη Вю!есйпо1о§у, 13: 117.
Аи8иЬе1 е! а1. (1999) 411' ебз., δΙιοΠ Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду: А Сотрепбшт оГ МеШобз Ггот Сштеп! Рто!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ίοΐιη АПеу & δοηκ.
Вадзйатее Κ.Ό. е! а1. (1991) АпйЬобу, [ттипосоп)ида1е5 апб Яабюрйагтасеийса1з, 4: 915-922.
Вака е! а1. (1988), ΕΕΒδ Бей., 228: 42-44.
ВйсЫег е! а1. (1999), 1. Iттиηο1. МеШобз, 231, 239-248.
В1гб е! а1. (1988) δν'ϊν'ΐινν'. 242, 423-426.
Вогз1 е! а1. (1987), 1. Се11. Вю1., 104, 595-600.
Вогз1 е! а1. (1990), ΕΕΒδ Бе!!., 261: 175-178.
Вогз1 е! а1. (1995), 1. ВюБСЬет., 270: 6243-6245.
Вогз1 е! а1. (1998), Εχρ. Се11 Кез., 240, 244-251.
Вгаск е! а1. (2006), С1ш. Сапсег Кез., 12, 3200-3208.
- 22 017995
Сатето11а е! а1. (1989), 1. Се11. Вю1., 108: 1139-1148.
Са!оп е! а1. (1990), 1. 1ттипо1., 144: 1965-1968.
Скабб е! а1. (2001), Сиггеп! Оршюп ш В1о!ескпо1о§у, 12: 188-194.
Ско!к1а е! а1. (1987), 1. Мо1. Вю1., 196: 901-917.
Ско!к1а е! а1. (1989), Ыа!иге, 342: 877-883.
Эеуок е! а1. (1983), Ыис1. Ас1бк Яек. 11: 4307-4323.
ГГгепск-Сопйап! (1995), Ехр. Се11 Яек., 221, 261-271.
Сюуаппопк Ыис1е1с. Ас1б Яекеагск, 2001, 29(5): Е27.
С1епше М.1. е! а1., 1987, 1. 1ттипо1., 139, 2367-2375.
Наап е! а1. (2004), ВюСеп!игу, 12(5): А1-А6.
Напакап е! а1. (2000), Се11, 100, 57-70.
Наг1о\у апб Ьапе, АпйЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б δр^^пд НагЬог.
КогпЬНк!! е! а1. (1984), №1с1ею Ас1бк Яек., 12, 5853-5868.
ЬаЬога!огу, Со1б δр^^пд НагЬог N. Υ., р. 726, 1988.
Не1к1пке1то е! а1. (1991), Уйско\ук Агск. В Се11 Ра!ко1. 1пс1. Мо1. Ра!ко1., 61, 101-109.
НоШдег апб ВоЫеп, 1999, Сапсег апб те!ак!ак1к геу., 18: 411-419.
НоШдег е! а1. (1993а), Ргос. N311. Асаб. δά. ϋδΛ, 90 6444-6448.
НоШдег е! а1. (1993Ь), Сиггеп! Ор1шоп Вю!ескпо1., 4, 446-449.
Но1! е! а1. (2003) Тгепбк ш Вю!ескпо1о§у, 21, 484-490.
НоодепЬоот е! а1. (1991), №1с1ею Ас1бк Яек., 19 (15) 4133-7.
Ни е! а1. (1996), Сапсег Яек., 56, 3055-3061.
Ник!оп е! а1. (1988) РNАδ ϋδΛ, 85, 5879-5883.
Нупек, Я.О. (1990). Е1ЬгопесНпк (№\у Υо^к: δр^^пде^-Vе^1ад).
1асоЬк е! а1. (2002), Нит. Ра!ко1., 33, 29-38.
КаЬа! е! а1. (1987) δе^иепсек оГ Рго!ешк оГ 1ттипо1од1са1 1п!егек!. 411' ЕбШоп. ϋδ Оерайтеп! оГ Неа1!к апб Нитап δе^ν^сек.
КаЬа! е! а1. (1991а), δе^иепсек оГ РгсИешк оГ 1ттипо1одюа1 1п!егек!, 51к Ебйюп. ϋδ Оерайтеп! оГ Неа1!к апб Нитап δе^ν^сек, РиЬкс δе^ν^се, МН, '№акЫпд1оп, (а).
КаЬа! е! а1. (1991Ь), 1. 1ттипо1., 147: 1709-1719.
Какраг е! а1. (2006), 1п!. 1. Сапсег, 118, 1331-1339.
Кпарр1к е! а1., (2000) 1. Мо1. Вю1., 296, 57-86.
КоЫег апб М11к!ет, №!иге, 256: 495-497, 1975.
Ко1бе е! а1. (1998), 1оигпа1 оГ Мо1еси1аг Вю1оду, 284: 1141-1151.
Коп!егтапп е! а1. (2001), δ, АпйЬобу Епдшееппд, δр^^пде^-Vе^1ад №\у Υо^к, ЬЬС; ΙδΕΝ: 3540413545.
Коикоикк е! а1. (1993), 1. διιόπιχίΌ^. Су!о1. Ра1ко1., 25, 285-295.
Коикоикк е! а1. (1995), ШЛайтс!. Ра!ко1., 19, 37-43.
КгеЬк е! а1. (2001), 1оита1 оГ 1ттипо1одюа1 Ме!кобк, 254, 67-84.
Ьатск Ι.ν. апб Ткотак Ό.ν. (2001) Сиггеп! Оршюп т Вю!ескпо1оду, 12: 411-418.
Ьебегтапп ЕЛ. е! а1. (1991) 1п!. 1. Сапсег, 47: 659-664.
ЬоЫ е! а1. (1995), 1п!. 1. Сапсег, 63, 442-449.
МаЕЭ-А е! а1. (1983) Вюскет. Вюркук. Яек. Сотт., 115: 1040-1047.
Ма!кито!о е! а1. (1999), 1рп. 1. Сапсег Яек., 90, 320-325.
МсСайейу е! а1., (1990) №!иге, 348, 552-554.
Мепбе/, М. е! а1., (1997) №Пиге Сепе!, 15(2): 146-156.
Мегскапб е! а1., 1998 №11иге Вю!еск., 16: 677-681.
Νοπ, Ό., апб В1скпе11, Я. (2005), №11 Яеν Сапсег, 5, 436-446.
Ждгеп е! а1. (1997), Сиггеп! Оршюп ш δ!^ис!и^а1 Вю1оду, 7: 463-469.
Оуата е! а1. (1989), 1. Вю1. Скет., 264, 10331-10334.
Рао1е11а е! а1. (1988), №с1ею Аабк Яек., 16, 3545-3557.
Ит е! а1. (1998), 1. Вю1. Скет., 273, 21769-21776.
Р1иск!кип (1991), Вю/Тескпо1оду, 9: 545-551.
Яейег е! а1. (1996), №11иге Вю!еск, 14, 1239-1245.
Яерр е! а1., 1995 1. Нета!., 377-382.
Шбдеуау е! а1. (1996), Рго!еш Епд., 9, 616-621.
ЯоЬшкоп еб., δикίа^пеб апб Соп!го11еб Яе1еаке Эгид Эекуегу δук!етк, Магсе1 Эеккег 1пс., №\у Υо^к, 1978.
Яоекк е! а1. (2006), №11иге Рго!осо1к, 1, 192-199.
ЯиГ е! а1. (1991) 1. Вю1. Скет., 226: 15719-15725.
ЯуЬак е! а1. (2005), №!. МеЛобк, 2, 291-298.
ЯуЬак е! а1. (2006), СкетМебСкет., 2, 22-40.
δатЬ^оок апб Яикке11, Мо1еси1аг С1ошпд: а ЬаЬога!огу Мапиа1: 3гб ебкюп, 2001, Со1б δр^^пд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк.
- 23 017995
8саграб е! а1. (1987) В1осЬет1к!гу, 26: 5234-5238.
8сагрто е! а1. (1999) 1. РаШо1., 188, 163-167.
8сЬеигег е! а1. (2005), Рго!еоткк, 5, 3035-3039.
8еда1 е! а1. (1974), ΡΝΑ8, 71:4298-4302.
8Ьагоп е! а1. (1990а), ΡΝΆ8, 87:4814-4817.
8Ьагоп е! а1. (1990Ь), 1. 1ттипо1., 144:4863-4869.
811асс1 е! а1. (2003), Рго!еот1ск, 5, 2340-2350.
81аегх И.Б. апб Βеνаη М.1. 1986, ΡΝΆ8, 83.
8игекЬ е! а1., 1986, Ме!Ьоб Епхуто1., 121: 210-228.
ТашдисЫ е! а1. (1983) №!иге, 302, 305-310.
Тат1ап е! а1. (1994), Ιη!. 1. Сапсег, 56, 820-825.
Теггапа е! а1. (1987), Сапсег Век., 47, 3791-3797.
ТЬогре (2004), С1т. Сапсег Век., 10, 415-427.
ТгасЬке1 е! а1. (2006), Αάν. Бгид Оебт. Веν., 58, 735-754.
У1!1 е! а1. (2000), Мебюбк Епхуто1., 326, 480-505.
\\ агб е! а1. (1989), ХаИПА 341, 544-546.
Уекк 1п: ВюСеп!игу, ТЬе Вегпк!ет Верой оп ВюВиктекк, 12(42), Α1-Α7, 2004.
Таблица 1
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности СБВ1к тяжелой цепи (УН) и легкой цепи (УЬ) антител против ΕΌ-Α , со сформированным сродством
Антитело С0В1 (УН) СОЮ (УЬ)
Н1 ССС ссс АСС тст ССС тсс
в к К (ЗЕО ю N0: 3) 5 А V [ЗЕС 10 N0: 6)
В2 ссс сст ААС СТС ССТ ттт
А А К (ЗЕО ΙΟ N0: 2Й) V А Г (ЗЕО 10 N0: 26)
С5 ссс АТТ АСТ ттс САТ ТТТ
в I Т (8Е<2 ю N0: 43) г. н Г (5ΕΩ 10 N0: 46)
0.5 СТС АТС ААС ААТ зет ТТТ
V М К {ЗЕС 10 N0: 53) N А Т (ЗЕС Ю N0; 56)
Е5 АСТ ССТ тст СТТ ССС САТ
т с 3 [5Е0 ю N0: 63) ь А Η (5Е<2 Ю N0: 66)
С8 стт САС АСТ стт ССТ ТТТ
ь <2 Т (ЗЕО ΙΟ N0: 73) I. Р Г Ю N0; 76)
ЕЙ СТС ттт АСС АТС ссс ТТТ
ь Р Т (5Е<2 ю N0: 83) м Р В (5Е«2 Ю N0: 86)
Е1 ТАС ссс ССТ ссс сст ТТТ
0 (АшЬег) А К (ВЕС 10 МС : 93) А Р Г (5ЕС Ю N0: 36)
В7 САТ ттт САТ ' СТС сст ТТТ
И в В (5Е0 10 N0: 103) ь А Г (ΞΕΟ Ю N0: 106)
Е8 САТ АТС САТ тсс тст ТТТ
В м Η (ЗЕЙ 10 N0: ИЗ) 5 3 Г ю N0: 116)
С9 САТ АТС САС АСТ сст ттт
н м О (ЗЕО 10 N0: 33) т А Е* (5Е0 10 N0: 36)
Таблица 2
Данные оценки В1Лсоге

Claims (43)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение антитела, которое связывает изоформу фибронектина с дополнительным доменом Α (ΕΌ-Α), для получения лекарственного средства для лечения рака легкого, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСОВ1, НСЭВ2 и НСОВ3, где НСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСОВ2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4 и НСОВ3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕО Ю ΝΟ: 5; или где домен УН включает области НСОВ1, НСЭВ2 и НСОВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСОВ1, НСЭВ2 и НСОВ3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЬСОВ1, ЬСОВ2 и ЬСОВ3, где ЬСОВ1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЬСОВ2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7 и ЬСОВ3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕО Ю ΝΟ: 8; или где домен УЪ включает области ЬСОВ1, ЬСОВ2 и ЬСОВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЬСОВ1, ЬСОК2 и ЬСОВ3, указанными выше.
  2. 2. Применение антитела, которое связывает изоформу фибронектина с дополнительным доменом Α
    - 24 017995 (ΕΌ-Ά), для получения лекарственного средства для лечения лимфомы, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСОК1, НСЭК2 и НСОК3, где НСЭК1 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСЭК2 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 4 и НСГОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 5; или домен УН включает области НСГОЕЕ НСГОЕ2 и НСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСГОЕЕ НСГОЕ2 и НСОК3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, где ЪСОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЪСОК2 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 7 и ЪСОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8; или где домен УЪ включает области ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, указанными выше.
  3. 3. Применение по п.2, где лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.
  4. 4. Применение по любому из пп.1-3, где антитело конъюгировано с выявляемой меткой.
  5. 5. Применение по любому из пп.1-3, где антитело конъюгировано с молекулой, которая обладает биоцидной или цитотоксической активностью.
  6. 6. Применение по любому из пп.1-3, где антитело конъюгировано с радиоизотопом.
  7. 7. Применение антитела, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина, для получения лекарственного средства для доставки в опухоль легкого молекулы, конъюгированной с антителом, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСГОКЕ НСЭК2 и НСОК3, где НСГОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСЭК2 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 4 и НСЭК3 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 5; или домен УН включает области НСГОКЕ НСЭК2 и НСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСГОКЕ НСГОК2 и НСОК3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, где ЪСОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЪСОК2 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 7 и ЪСОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8; или где домен УЪ включает области ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, указанными выше.
  8. 8. Применение антитела, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина, для получения лекарственного средства для доставки в лимфому молекулы, конъюгированной с антителом, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСГОКЕ НСГОК2 и НСОК3, где НСГОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСЭК2 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 4 и НСЭК3 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 5; или домен УН включает области НСГОКЕ НСЭК2 и НСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСГОКЕ НСГОК2 и НСОК3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, где ЪСОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЪСОК2 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 7 и ЪСОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8; или где домен УЪ включает области ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЪСОК1, ЪСОК2 и ЪСОК3, указанными выше.
  9. 9. Применение по п.8, где лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.
  10. 10. Применение по любому из пп.7-9, где молекула представляет собой выявляемую метку.
  11. 11. Применение по любому из пп.7-9, где молекула обладает биоцидной или цитотоксической активностью.
  12. 12. Применение по любому из пп.7-9, где конъюгированная молекула представляет собой радиоизотоп.
  13. 13. Применение по любому из пп.1-12, где каркасная область домена УН получена из каркасной области зародышевой линии человека.
  14. 14. Применение по п.13, где домен УН имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 1,
    21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 или 111.
  15. 15. Применение по любому из пп.1-14, где каркасная область домена УЪ получена из каркасной области зародышевой линии человека.
  16. 16. Применение по п.15, где домен УЪ имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2,
    22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 или 112.
  17. 17. Применение по любому из пп.1-16, где антитело представляет собой одноцепочечный Εν.
  18. 18. Применение по любому из пп.1-16, где антитело представляет собой диатело.
  19. 19. Применение антитела, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина, для получения диагно
    - 25 017995 стического продукта для диагностики рака легкого, где антитело включает домен УН и домен УЬ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСОК.1, НСЭК2 и НСОК3, где НСОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НС.ОК2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 4 и НС.ОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 5; или домен УН включает области НСОК1, НСГОК2 и НСГОЕ3. содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСОК1, НСГОК2 и НСОК3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЬС0К1, ЬС0К2 и ЬСОК3, где ЬСОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЬС0К2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 7 и ЬС0К3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 8; или где домен УЪ включает области ЬСГОКЕ ЬС0К2 и ЬС0К3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЬСГОКЕ ЬС0К2 и ЬС0К3, указанными выше.
  20. 20. Применение антитела, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина, для получения диагностического продукта для диагностики лимфомы, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСОК1, НС.ОК2 и НСОК3, где НСОК1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НС.ОК2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 4 и НС.ОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 5; или домен УН включает области НС0К1, НСГОК2 и НСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСОК1, НСГОК2 и НСОК3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЬС0К1, ЬС0К2 и ЬСОК3, где ЬСГОК1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЬС0К2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 7 и ЬС.ОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 8; или где домен УЪ включает области ЬСГОКЕ ЬС0К2 и ЬС0К3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЬСГОКЕ ЬС0К2 и ЬС0К3, указанными выше.
  21. 21. Применение по п.20, где лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.
  22. 22. Способ выявления или диагностики рака легкого у человека или животного, включающий стадии:
    (a) введения человеку или животному антитела, которое связывает изоформу ΕΌ-Ά фибронектина; и (b) выявления наличия или отсутствия антитела в легком организма человека или животного, где локализация антитела связывания в легком человека или животного указывает на наличие рака легкого, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСОК.1, НС0К2 и НСОК3, где НС0К1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НС0К2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 4 и НС0К3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 5; или домен УН включает области НСГОКЕ НС0К2 и НСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСОК.1, НС0К2 и НС0К3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЬСОК.1, ЬС0К2 и ЬС0К3, где ЬС0К1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЬСОК2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 7 и ЬС0К3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 8; или где домен УЪ включает области ЬСГОКЕ ЬС0К2 и ЬС0К3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЬСОК.1, ЬС0К2 и ЬС0К3, указанными выше.
  23. 23. Способ выявления или диагностики лимфомы у человека или животного, включающий стадии:
    (a) введения человеку или животному антитела, которое связывает изоформу ЕЭ-Л фибронектина; и (b) выявления наличия или отсутствия антитела в лимфатической системе организма человека или животного, где локализация антитела в лимфатической системе человека или животного указывает на наличие лимфомы, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСОК.1, НС0К2 и НСОК3, где НС0К1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НС0К2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 4 и НС.ОК3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 5; или домен УН включает области НСГОКЕ НС0К2 и НСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСОК.1, НС0К2 и НС0К3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЬСОК.1, ЬС0К2 и ЬС0К3, где ЬС0К1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЬСОК2 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 7 и ЬС0К3 имеет аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 8; или где домен УЬ включает области ЬСОК1, ЬСОК2 и ЬСОК3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЬС0К1, ЬС0К2 и ЬС0К3, указанными выше.
  24. 24. Способ по любому из пп.22, 23, где антитело конъюгировано с выявляемой меткой.
    - 26 017995
  25. 25. Способ по любому из пп.22, 23, где антитело конъюгировано с радиоизотопом.
  26. 26. Способ лечения рака легкого у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего антитело, которое связывает изоформу ЕЭ-А фибронектина, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, где НСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0: 4 и НСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 5; или домен УН включает области НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЬСЭВ1, ЬСЭВ2 и ЬСЭВ3, где ЬСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЬСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7 и ЬСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8; или где домен УЪ включает области ЬСЭВ1, ЬСЭВ2 и ЬСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЬСЭВ1, ЬСЭВ2 и ЬСЭВ3, указанными выше.
  27. 27. Способ лечения лимфомы у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, включающего антитело, которое связывает изоформу ЕЭ-А фибронектина, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, где НСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4 и НСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 5; или домен УН включает области НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЬСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЬСЭВ3, где ЬСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЪСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7 и ЬСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8; или где домен УЪ включает области ЬСЭВ1, ЬСЭВ2 и ЬСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЬСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЬСЭВ3, указанными выше.
  28. 28. Способ по п.27, где лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.
  29. 29. Способ по любому из пп.26-28, где антитело конъюгировано с выявляемой меткой.
  30. 30. Способ по любому из пп.26-28, где антитело конъюгировано с молекулой, которая обладает биоцидной или цитотоксической активностью.
  31. 31. Способ по любому из пп.26-28, где антитело конъюгировано с радиоизотопом.
  32. 32. Способ доставки молекулы к новообразованной сосудистой сети опухоли легкого у человека или животного, включающий введение человеку или животному антитела, которое связывает изоформу ЕЭ-А фибронектина, где антитело конъюгировано с молекулой, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, где НСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4 и НСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 5; или домен УН включает области НСЭВ1, НСЭК2 и НСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЪСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЪСЭВ3, где ЪСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЪСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7 и ЪСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8; или где домен УЪ включает области ЪСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЪСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЪСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЪСЭВ3, указанными выше.
  33. 33. Способ доставки молекулы к новообразованной сосудистой сети лимфомы у человека или животного, включающий введение человеку или животному антитела, которое связывает изоформу ЕЭ-А фибронектина, где антитело конъюгировано с молекулой, где антитело включает домен УН и домен УЪ и где домен УН включает каркасную область и области, определяющие комплементарность, НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, где НСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, НСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4 и НСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 5; или домен УН включает области НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с НСЭВ1, НСЭВ2 и НСЭВ3, указанными выше, и где домен УЪ включает каркасную область и области ЪСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЪСЭВ3, где ЪСЭВ1 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116, ЪСЭВ2 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7 и ЪСЭВ3 имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8; или где домен УЪ включает области ЪСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЪСЭВ3, содержащие десять или менее аминокислотных замен по сравнению с ЪСЭВ1, ЪСЭВ2 и ЪСЭВ3, указанными выше.
    - 27 017995
  34. 34. Способ по п.ЗЗ, где лимфома представляет собой лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.
  35. 35. Способ по любому из пп.32-34, где молекула представляет собой выявляемую метку.
  36. 36. Способ по любому из пп.32-34, где молекула обладает биоцидной или цитотоксической активностью.
  37. 37. Способ по любому из пп.32-34, где молекула представляет собой радиоизотоп.
  38. 38. Способ по любому из пп.22-37, где каркасная область домена УН получена из каркасной области зародышевой линии человека.
  39. 39. Способ по п.38, где домен УН имеет аминокислотную последовательность 8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 1, 21, 31,
    41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 или 111.
  40. 40. Способ по любому из пп.22-39, где каркасная область домена УЪ получена из каркасной области зародышевой линии человека.
  41. 41. Способ по п.40, где домен УЪ имеет аминокислотную последовательность 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, 22, 32,
  42. 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 или 112.
    42. Способ по любому из пп.22-41, где антитело представляет собой одноцепочечный Ру.
  43. 43. Способ по любому из пп.22-41, где антитело представляет собой диатело.
EA201070179A 2007-07-25 2008-07-24 Антиген, связанный с вариантами рака легкого и лимфомами EA017995B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95176507P 2007-07-25 2007-07-25
PCT/IB2008/002536 WO2009013619A2 (en) 2007-07-25 2008-07-24 The ed-a antigen of fibrinogen is associated with the neovas culature of tumor metastases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070179A1 EA201070179A1 (ru) 2010-06-30
EA017995B1 true EA017995B1 (ru) 2013-04-30

Family

ID=40085445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070179A EA017995B1 (ru) 2007-07-25 2008-07-24 Антиген, связанный с вариантами рака легкого и лимфомами

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20100183506A1 (ru)
EP (2) EP2612869B1 (ru)
JP (2) JP5204228B2 (ru)
KR (1) KR101781638B1 (ru)
CN (2) CN103212072B (ru)
AU (2) AU2008278702B2 (ru)
BR (1) BRPI0812765B8 (ru)
CA (1) CA2691218C (ru)
EA (1) EA017995B1 (ru)
ES (2) ES2534726T3 (ru)
HK (2) HK1185816A1 (ru)
WO (1) WO2009013619A2 (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA018985B1 (ru) * 2007-04-02 2013-12-30 Филоджен С.П.А. Новый антиген, ассоциированный с новообразованными сосудами опухолевых метастазов
ES2646228T3 (es) * 2007-10-30 2017-12-12 Philogen S.P.A. Un antígeno asociado con artritis reumatoide
CA2748401C (en) 2009-01-07 2017-09-12 Philogen S.P.A. Antigens associated with endometriosis
ES2640981T3 (es) * 2009-08-05 2017-11-07 Philogen S.P.A. Selección como diana de neovasculatura de médula ósea
WO2012057613A1 (en) * 2010-10-26 2012-05-03 Umc Utrecht Holding B.V. Method for preventing myocardial infarction-related complications
CA2842053C (en) * 2011-07-27 2018-01-16 Philogen S.P.A. Il-12 immunoconjugate
ES2743423T3 (es) 2012-10-03 2020-02-19 Philogen Spa Conjugado de anticuerpos para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria intestinal
SG10201805706XA (en) * 2013-12-12 2018-08-30 Umc Utrecht Holding Bv Immunoglobulin-like molecules directed against fibronectin-eda
BR112017012509A2 (pt) * 2014-12-12 2018-06-05 Encare Biotech B V moléculas similares à imunoglobulina direcionadas contra fibronectina-eda
WO2017009469A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Philogen S.P.A. Il22 immunoconjugates
EP3525828A1 (en) 2016-10-17 2019-08-21 Pfizer Inc Anti-edb antibodies and antibody-drug conjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
AU2018281871B2 (en) 2017-06-07 2022-07-28 Philogen S.P.A. Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins
PL237087B1 (pl) 2017-10-25 2021-03-08 Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu Sposób diagnozowania nowotworów układu chłonnego
WO2019185792A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Philogen S.P.A Cancer treatment using immunoconjugates and immune check-point inhibitors
WO2020249757A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Philogen S.P.A Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha
EP4185615A1 (en) 2020-07-22 2023-05-31 Philogen S.p.A. Treatment of pulmonary hypertension
WO2023175077A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Philogen S.P.A Anti-ed-a antibodies for the treatment of pulmonary hypertension

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0603735A2 (en) * 1992-12-22 1994-06-29 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B-cell antigen receptor complex
US5420012A (en) * 1989-05-08 1995-05-30 Locus Genex Oy Method for the detection of reactive conditions
WO2008120101A2 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Philogen S.P.A. The ed-a antigen of fibrinogen is associated with the neovasculature of tumour metastases

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB9206318D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Cambridge Antibody Tech Binding substances
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US6492160B1 (en) 1991-05-15 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6225447B1 (en) 1991-05-15 2001-05-01 Cambridge Antibody Technology Ltd. Methods for producing members of specific binding pairs
US5962255A (en) 1992-03-24 1999-10-05 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing recombinant vectors
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5872215A (en) 1991-12-02 1999-02-16 Medical Research Council Specific binding members, materials and methods
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
WO2000034784A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US8623373B2 (en) 2000-02-24 2014-01-07 Philogen S.P.A. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
CA2404919A1 (en) * 2000-04-06 2002-10-01 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Diagnostic and therapeutic agents for rheumatoid arthritis
IT1317108B1 (it) 2000-12-06 2003-05-26 Philogen Srl Processo per la selezione di frammenti anticorporali anti-angiogenesi,frammenti anticorpali anti-angiogenesi cosi' ottenuti e loro uso.
EP1224943A1 (en) * 2001-01-19 2002-07-24 Crucell Holland B.V. Fibronectin as a tumor marker detected by phage antibodies
US7560095B2 (en) 2003-04-22 2009-07-14 A & G Pharmaceutical, Inc. Cancer specific monoclonal antibodies
WO2006026020A2 (en) * 2004-07-30 2006-03-09 Adeza Biomedical Corporation Oncofetal fibronectin as a marker for disease and other conditions and methods for detection of oncofetal fibronectin
US7785591B2 (en) * 2004-10-14 2010-08-31 Morphosys Ag Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies
ES2640981T3 (es) * 2009-08-05 2017-11-07 Philogen S.P.A. Selección como diana de neovasculatura de médula ósea
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5420012A (en) * 1989-05-08 1995-05-30 Locus Genex Oy Method for the detection of reactive conditions
EP0603735A2 (en) * 1992-12-22 1994-06-29 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B-cell antigen receptor complex
WO2008120101A2 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Philogen S.P.A. The ed-a antigen of fibrinogen is associated with the neovasculature of tumour metastases

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OYAMA F. ET AL.: "Oncodevelopmental regulation of the alternative splicing of fibronectin pre-messenger RNA in human lung tissues", CANCER RESEARCH 15 FEB 1990, vol. 50, no. 4, 15 February 1990 (1990-02-15), pages 1075-1078, XP002513749, ISSN: 0008-5472, Discussion, first fig. 4 *
RYBAK JASCHA-N. ET AL.: "The extra-domain A of fibronectin is a vascular marker of solid tumors and metastases", CANCER RESEARCH 15 NOV. 2007, vol. 67, no. 22, 15 November 2007 (2007-11-15), pages 10948-10957, XP002499090, ISSN: 1538-7445, the whole document *
VARTIO T. ET AL.: "Differential expression of the ED sequence-containing form of cellular fibronectin in embryonic and adult human tissues", 1 November 1987 (1987-11-01), 19871101, XP002499094, "Materials and methods - Cell cultures and tissues" "antibodies against Fn" *
VILLA ALESSANDRA ET AL.: "A high-affinity human monoclonal antibody specific to the alternatively spliced EDA domain of fibronectin efficiently targets tumor neo-vasculature in vivo", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER. JOURNAL INTERNATIONAL DU CANCER 1 JUN 2008, vol. 122, no. 11, 1 June 2008 (2008-06-01), pages 2405-2413, XP002499091, ISSN: 1097-0215, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009013619A3 (en) 2009-04-30
EP2167541A2 (en) 2010-03-31
EP2612869A2 (en) 2013-07-10
CN103212072A (zh) 2013-07-24
JP2010534237A (ja) 2010-11-04
CN101754978A (zh) 2010-06-23
EP2167541B1 (en) 2012-12-19
HK1185816A1 (en) 2014-02-28
JP5705893B2 (ja) 2015-04-22
US20150030536A1 (en) 2015-01-29
ES2534726T3 (es) 2015-04-27
BRPI0812765B1 (pt) 2019-04-24
CA2691218A1 (en) 2009-01-29
BRPI0812765A2 (pt) 2015-04-14
WO2009013619A2 (en) 2009-01-29
KR20100051676A (ko) 2010-05-17
AU2014203612A1 (en) 2014-07-17
BRPI0812765B8 (pt) 2022-12-27
CA2691218C (en) 2018-04-24
HK1144094A1 (en) 2011-01-28
AU2008278702A1 (en) 2009-01-29
ES2398536T3 (es) 2013-03-20
US20100183506A1 (en) 2010-07-22
JP5204228B2 (ja) 2013-06-05
KR101781638B1 (ko) 2017-09-25
CN101754978B (zh) 2013-06-05
EP2612869B1 (en) 2015-01-14
AU2014203612B2 (en) 2015-12-03
EP2612869A3 (en) 2013-10-30
JP2013100351A (ja) 2013-05-23
CN103212072B (zh) 2015-07-22
AU2008278702B2 (en) 2014-07-31
EA201070179A1 (ru) 2010-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017995B1 (ru) Антиген, связанный с вариантами рака легкого и лимфомами
KR102618312B1 (ko) 항muc16 항체 및 그의 용도
CA3085960C (en) Antibodies to tumour antigens
CN100352501C (zh) Cripto阻断抗体及其用途
EP2209805B1 (en) An antigen associated with rheumatoid arthritis
EP3856771A1 (en) Dll3 binding proteins and methods of use
EA018985B1 (ru) Новый антиген, ассоциированный с новообразованными сосудами опухолевых метастазов
JP2006517109A (ja) アンフィレグリン抗体ならびに癌および乾癬を処置するためのその使用
JP2004531263A (ja) 特異的結合タンパク質およびその使用
MXPA04004857A (es) ANTICUERPOS DE COLáGENA HUMANIZADOS Y METODOS RELACIONADOS.
JP2020509737A (ja) 新規な組換え型二機能性融合タンパク質、その調製方法および用途
CN105492024A (zh) Met结合剂及其用途
KR101442323B1 (ko) 항-연장된 ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체, 이의 유도체 및 용도
US10202442B2 (en) Antigen associated with lung cancers and lymphomas
CN107207590A (zh) 抗cxcl12抗体分子及其用途
KR20220157686A (ko) 항-bcam 항체 또는 그의 항원 결합 단편

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM