EA017441B1 - Вакцинация против гриппа по схеме многократного введения с использованием безадъювантной дозы - Google Patents

Abstract

Вакцинацию против гриппа проводят по схеме многократного введения вакцины, где (i) первую дозу вводят вместе с адъювантом и (ii) последующую дозу вводят либо без адъюванта, либо с другим адъювантом. Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективному применению схемы двухдозового введения вакцины, которое позволяет избежать необходимости введения двойного количества данного адъюванта.

Description

(57) Вакцинацию против гриппа проводят по схеме многократного введения вакцины, где (ί) первую дозу вводят вместе с адъювантом и (и) последующую дозу вводят либо без адъюванта, либо с другим адъювантом. Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективному применению схемы двухдозового введения вакцины, которое позволяет избежать необходимости введения двойного количества данного адъюванта.

017441 Β1

Все цитируемые здесь документы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретения

Настоящее изобретение относится к области изготовления вакцин для защиты от инфекций, вызываемых вирусом гриппа.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время вакцинацию против гриппа проводят путем введения пациентам одной дозы вакцины один раз в год, за исключением первой вакцинации, которую проводят в возрасте 8 лет или раньше путем введения двух доз с интервалом по меньшей мере в четыре недели.

Считается (см., например, ссылку 1), что при пандемии, когда население не имеет иммунитета против нового штамма вируса гриппа, необходимо также применять схему вакцинации с введением двух доз.

Требования к введению двух доз состоят в том, что при фиксированной подаче антигена количество доз, которое может быть введено, должно составлять половину от количества, которое может быть введено в однодозовой схеме вакцинации. Поэтому было предложено использовать меньшее количество антигена на дозу и для компенсации такого снижения количества антигена использовать адъювант.

Если при вакцинации с введением одной дозы адъювантной вакцины не вырабатывается достаточного иммунного ответа, то может оказаться необходимым введение двух доз, но при этом возникает другая проблема, связанная с доставкой адекватного количества адъюванта. В случае, когда необходимо приготовить сотни миллионов доз адъювантных вакцин, эта проблема приобретает исключительную важность, особенно при применении синтетических адъювантов.

Целью настоящего изобретения является решение этой проблемы или сведение ее до минимума.

Описание сущности изобретения

В соответствии с настоящим изобретением вакцинацию против гриппа проводят по схеме многократного введения вакцины, где (1) первую дозу вводят вместе с адъювантом, а (ίί) последующую дозу вводят либо без адъюванта, либо с другим адъювантом. Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективному применению схемы двухдозового введения вакцины, которое позволяет избежать необходимости введения двойного количества данного адъюванта. Первая и последующая дозы должны быть предпочтительно введены одним и тем же способом (например, путем внутримышечной инъекции), тогда как в исследовании, описанном в работе [2], применяется схема трехкратного введения дозы, где в качестве третьей дозы служила бустер-доза без адъюванта, которую вводили в слизистую для того, чтобы определить, влияет ли парентеральная иммунизация мышей (в область спины или шеи) на иммуногенность адъювантной вакцины.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу иммунизации пациента против инфицирования вирусом гриппа, где указанный способ включает стадии (1) введения дозы вакцины на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом и (ίί) введения дополнительной дозы вакцины на основе вируса гриппа уже без этого адъюванта. Такая дополнительная доза может не содержать адъюванта либо она может содержать второй адъювант, отличающийся от первого адъюванта.

Настоящее изобретение также относится к набору, включающему (1) первую вакцину на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом и (ίί) вторую вакцину на основе вируса гриппа без этого адъюванта. Настоящее изобретение также относится к применению (ί) первой вакцины на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом и (ίί) второй вакцины на основе вируса гриппа без этого адъюванта, в целях приготовления вакцины против гриппа для многократного введения. Вторая вакцина может не содержать адъюванта либо она может содержать второй адъювант, отличающийся от первого адъюванта.

Настоящее изобретение также относится к способу проведения иммунизации пациента против инфицирования вирусом гриппа, где указанному пациенту предварительно вводят дозу вакцины на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом и где указанный способ включает стадию введения данному пациенту дополнительной дозы вакцины на основе вируса гриппа, но без введения этого адъюванта. Такая дополнительная доза может не содержать адъюванта либо она может содержать второй адъювант, отличающийся от первого адъюванта.

Настоящее изобретение также относится к применению безадъювантной вакцины на основе вируса гриппа в целях приготовления лекарственного средства для иммунизации пациента против инфицирования вирусом гриппа, где указанному пациенту предварительно вводят адъювантную вакцину на основе вируса гриппа. Настоящее изобретение также относится к применению второй адъювантной вакцины на основе вируса гриппа в целях приготовления лекарственного средства для иммунизации пациента против инфицирования вирусом гриппа, где указанному пациенту предварительно вводят первую адъювантную вакцину на основе вируса гриппа и где указанные адъюванты в первой и второй вакцинах на основе вируса гриппа не являются одинаковыми.

- 1 017441

Описанные способы, наборы и применения являются особенно предпочтительными в случае, если дозы гемаглютинина при двух вакцинациях меньше, чем стандартные дозы, а именно 15 мкг/штамм/дозу, поскольку настоящее изобретение позволяет снизить требования, предъявляемые к антигену и адъюванту.

Антиген вируса гриппа.

Вакцины, используемые в настоящем изобретении, включают антиген вируса гриппа. Такой антиген обычно выделяют из вирионов вируса гриппа, но в качестве альтернативы могут быть использованы антигены, такие как гемаглютинин и нейраминидаза, которые могут быть экспрессированы в рекомбинантном хозяине (например, в клеточной линии насекомых с использованием бакуловирусного вектора) и использованы в очищенной форме [3-5]. Однако в основном антигены выделяют из вирионов.

Антиген может быть получен в форме живого вируса или более предпочтительно в форме инактивированного вируса. Химические методы инактивации вируса включают обработку эффективным количеством одного или нескольких нижеследующих агентов, таких как детергенты, формальдегид, формалин, β-пропиолактон или УФ-облучение. Дополнительные химические методы инактивации включают обработку метиленовым синим, псораленом, карбоксифуллереном (С60) или любыми их комбинациями. Специалистам известны и другие методы инактивации вируса, такие как, например, обработка двумя соединениями, такими как этиламин и ацетилэтиленимин, или гамма-облучение. Продукт ЮТЬЕХАЕ™ представляет собой инактивированную вакцину на основе целого вириона.

При использовании инактивированного вируса вакцина может содержать целый вирион, расщепленный вирион или очищенные поверхностные антигены (включая гемаглютинин, а обычно также включая нейраминидазу).

Обычно в каждой дозе вакцины, вводимой по схеме многократной вакцинации, должна использоваться одна и та же форма антигена; так, например, в такой схеме вакцинации не должна вводиться вакцина на основе расщепленного вириона в первой дозе и вакцина на основе целого вириона во второй дозе.

Вирионы могут быть собраны из вирус-содержащих жидкостей различными методами. Так, например, способ очистки может включать зональное центрифугирование с использованием раствора линейного градиента сахарозы, который включает детергент, разрушающий вирионы. Антигены, после их необязательного разведения, могут быть очищены путем диафильтрации.

Расщепленные вирионы получают путем обработки вирионов детергентами (например, этиловым эфиром, полисорбатом 80, дезоксихолатом, три-Х-бутилфосфатом, Тритоном Х-100, Тритоном N101, бромидом цетилтриметиламмония, тергитолом NΡ9 и т.п.) с получением субвирионных препаратов, включая процесс расщепления Твином-эфиром. Методы расщепления вирусов гриппа хорошо известны специалистам, см., например, работы [6-11] и т.п. Расщепление вируса, независимо от того, является ли он инфекционным или нет, обычно осуществляют путем разрушения или фрагментации целого вируса в результате обработки расщепляющим агентом в концентрации, достаточной для расщепления такого вируса. Дизрупция приводит к полной или частичной солюбилизации вирусных белков и, тем самым, к нарушению целостности вируса. Предпочтительными расщепляющими агентами являются неионогенные и ионогенные (например, катионогенные) поверхностно-активные вещества, например алкилгликозиды, алкилтиогликозиды, ацилсодержащие сахара, сульфобетаины, бетаины, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, N,N-диалкилглюкамиды, гекамег, алкилфеноксиполиэтоксиэтанолы, соединения четвертичного аммония, саркозил, СТАВ (цетилбромиды триметиламмония), три-N-бутилфосфат, цетавлон, соли миристилтриметиламмония, липофектин, липофектамин и ΌΟΤ-МА, октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (например, поверхностно-активные вещества Тритон, такие как Тритон Х-100 или Тритон N101), сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (поверхностно-активные вещества Твин), полиоксиэтиленэфиры, сложные полиоксиэтиленэфиры и т.п. В одной из подходящих процедур расщепления используется последовательное действие дезоксихолата натрия и формальдегида, и расщепление может происходить в процессе преварительной очистки вириона (например, в растворе градиента плотности сахарозы). Таким образом, указанный способ расщепления может включать осветление вирионсодержащего материала (для удаления невирионного материала), концентрирование собранных вирионов (например, методом адсорбции, таким как СаНРОд-адсорбция), отделение целых вирионов от невирионного материала), расщепление вирионов с использованием расщепляющего агента в стадии центрифугирования в градиенте плотности (например, с использованием градиента сахарозы, содержащего расщепляющий агент, такой как дезоксихолат натрия), а затем фильтрацию (например, ультрафильтрацию) для удаления нежелательных материалов. Расщепленные вирионы могут быть с успехом ресуспендированы в изотоническом растворе хлорида натрия, забуференном фосфатом натрия. Продукты ВЕОР1УАС™, РЬиАШХ™, ΕΕυΖΟΝΕ™ и ΕΕυδΗΙΕΕΌ™ представляют собой расщепленные вакцины.

Вакцины на основе очищенных поверхностных антигенов включают поверхностные антигены вируса гриппа, такие как гемаглютинин, а обычно также нейраминидазу. Методы получения этих белков в очищенной форме хорошо известны специалистам. Продукты ΕΤυνίΚΙΝ™, АОК1РРАЕ™ и ШРЬиУАС™ представляют собой субъединичные вакцины.

- 2 017441

Антигены вируса гриппа могут быть также представлены в форме виросом [12] (вирусоподобных липосомных частиц, не содержащих нуклеиновой кислоты), как в продуктах ЮТЬЕХАЬУ™ и ΙΝνΑνΑί.'™. однако в настоящем изобретении предпочтительно не использовать виросомы. Так, например, в некоторых вариантах изобретения антиген вируса гриппа не представлен в форме виросомы.

Вирус гриппа может быть аттенюированным. Вирус гриппа может быть термочувствительным. Вирус гриппа может быть холодоустойчивым. Эти три отличительных признака являются особенно ценными при использовании живого вируса в качестве антигена.

Штаммы вируса гриппа, применяемые в вакцинах, мутируют от сезона к сезону. В настоящее время, в период между пандемиями, в вакцины обычно включают два штамма вируса гриппа Α (Η1Ν1 и Η3Ν2) и один штамм вируса гриппа В, а обычно используются трехвалентные вакцины. Эти вакцины могут быть использованы в настоящем изобретении, но особенно подходящими они являются для вакцинации против вирусов, штаммы которых вызывают пандемии (т. е. штаммы, против которых у вакцинируемого реципиента и всего населения нет иммунитета), например, такие как штаммы подтипа Η2, Η5, Η7 или Η9 (в частности, штаммы вируса гриппа А), а вакцины против штаммов гриппа, вызывающих пандемию, могут быть моновалентными либо они могут быть получены на основе нормальной трехвалентной вакцины с добавлением штамма, вызывающего пандемию. Однако в зависимости от сезона и от природы антигена, включенного в вакцину, такая вакцина согласно изобретению может обеспечить защиту от одного или нескольких белков гемаглютинина вируса гриппа А подтипов Η1, Η2, Η3, Η4, Η5, Η6, Η7, Η8, Η9, Η10, Η11, Η12, Η13, Η14, Η15 или Η16. Настоящее изобретение может обеспечивать защиту от одной или нескольких ΝΑ вируса гриппа А подтипов N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 или N9.

Другими штаммами, которые с успехом могут быть включены в указанные композиции, являются штаммы, резистентные к противовирусной терапии (например, резистентные к лечению озелтамивиром [13] и/или занамивиром), включая резистентные штаммы, вызывающие пандемию [14].

Настоящее изобретение является особенно подходящим для иммунизации против пандемических штаммов. Отличительными признаками штаммов вируса гриппа, которые могут вызывать вспышку пандемии, являются то, что (а) такой штамм содержит новый гемаглютинин, отличающийся от гемаглютининов человеческих штаммов, обычно циркулирующих в кровотоке, т.е. он не обнаруживается у человека в течение десяти дней (например, Η2) или он вообще ранее не обнаруживался у человека (например, Η5, Η6 или Η9, которые обычно обнаруживаются только у птиц), а это значит, что у человека не вырабатывается иммунный ответ против гемаглютинина указанных штаммов; (Ь) этот штамм может передаваться от человека к человеку при контакте (горизонтальная передача); (с) он является патогенным для человека. Для иммунизации против гриппа в условиях пандемии предпочтительно использовать вирусный гемаглютинин типа Η5, такой как штамм Ы5Ш. Другими возможными штаммами являются Η5№, №N2, Η2№, И7Ю и И7Ш и любые другие штаммы, которые могут вызывать пандемию. Что касается белка подтипа Η5, то такой вирус может входить в кладистическую группу (кладу) ΗΑ, т.е. кладу 1, кладу 1', кладу 2 или кладу 3 [15], а особенно подходящими являются клады 1 и 3.

Обычно каждая доза вакцины, вводимая по схеме многократной вакцинации, имеет по меньшей мере один гемаглютинин одного и того же подтипа, например, в настоящем изобретении не используется моновалентная вакцина И5Ю для первой дозы, и не используется моновалентная вакцина №N2 для второй дозы.

Композиции согласно изобретению могут включать антиген(ы) одного или нескольких (например, 1, 2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, включая вирус гриппа А и/или вирус гриппа В. Если вакцина включает более чем один штамм вируса гриппа, то различные штаммы обычно культивируют по отдельности и смешивают, а затем вирусы собирают и получают антигены. Таким образом, способ согласно изобретению может включать стадию смешивания антигенов более чем одного штамма вируса гриппа. Однако при пандемии может оказаться предпочтительной моновалентная вакцина.

Вирус гриппа может представлять собой мутантный вирус и может быть получен методами обратной генетики. Методы обратной генетики (например, [16-20]) позволяют получать вирусы гриппа с нужными геномными сегментами ίη νίίτο с использованием плазмид. Обычно такие методы включают экспрессию (а) молекул ДНК, кодирующих нужные вирусные молекулы РНК, например, с промоторов ροΙΙ и (Ь) молекул ДНК, кодирующих вирусные белки, например, с промоторов ροΙΙΙ, в результате чего такая экспрессия ДНК обоих типов в клетках приводит к сборке полностью интактного инфекционного вириона. ДНК предпочтительно обеспечивает экспрессию всех вирусных РНК и белков, однако для получения некоторых РНК и белков может быть также использован вирус-помощник. Предпочтительными являются методы с применением плазмид, где используются отдельные плазмиды для получения каждой вирусной РНК [21-23], и в этих методах также используются плазмиды для экспрессии всех или некоторых (например, только белков РВ1, РВ2, РА и №) вирусных белков, причем в некоторых методах используются до 12 плазмид.

- 3 017441

Для уменьшения числа необходимых плазмид в недавно разработанном способе [24] было объединено множество кластеров транскрипции РНК-полимеразы I (для синтеза вирусной РНК) на одной плазмиде (например, последовательностей, кодирующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 вРНК-сегментов вируса гриппа А) и множество белок-кодирующих областей с промоторами РНК-полимеразы II на другой плазмиде (например, последовательностей, кодирующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 мРНК-транскриптов вируса гриппа А). Предпочтительные аспекты метода, описанного в работе [24] включают: (а) мРНКкодирующие области РВ1, РВ2 и РА на одной плазмиде и (Ь) все 8 вРНК-кодирующих сегментов на одной плазмиде. Задача может быть еще более облегчена, если в одну плазмиду включить сегменты ΝΑ и НА, а в другую плазмиду включить шесть других сегментов.

Для кодирования вирусных РНК-сегментов в качестве альтернативы промоторам ро11 можно использовать промоторы полимеразы бактериофагов [25]. Так, например, обычно используются промоторы полимераз 8Р6, Т3 или Т7. Благодаря видоспецифичности промоторов ро11 для клеток многих типов (например, МОСК) более подходящими являются промоторы полимеразы бактериофагов, хотя такая клетка также должна быть трансфицирована плазмидой, кодирующей экзогенный фермент полимеразу.

В других методах для одновременного кодирования вирусных РНК и экспрессируемых мРНК из одной матрицы могут быть использованы двойные промоторы, состоящие из ро11 и ро111 [26, 27].

Так, например, вирус, в частности вирус гриппа А, может включать один или несколько РНКсегментов вируса А/РК/8/34 (обычно 6 сегментов от А/РК/8/34, где сегменты НА и N происходят от штамма вируса коровьей оспы, т.е. мутантного вируса (6:2)), особенно если этот вирус культивируют в яйцах. Этот вирус может также включать один или несколько РНК-сегментов от вируса Α/Ψ8Ν/33 или от другого вирусного штамма, используемого для генерирования мутантных (реассортированных) вирусов в целях получения вакцинного препарата. Обычно препарат настоящего изобретения обеспечивает защиту против штамма, который может передаваться от человека к человеку, а поэтому, геном этого штамма обычно включает по меньшей мере один РНК-сегмент, происходящий от вируса гриппа млекопитающих (например, у человека). Он может включать сегмент N8, который происходит от вируса птичьего гриппа.

Вирусы, используемые в качестве источника антигенов, могут быть выращены либо в яйцах, либо в клеточной культуре. В стандартном современном методе культивирования вируса гриппа используются куриные яйца с развивающимся эмбрионом, не содержащие специфических патогенов (8РР), и из содержимого этих яиц (аллантоисной жидкости) выделяют вирус. Однако совсем недавно вирусы были культивированы в клеточной культуре животных, и этот метод культивирования является предпочтительным с точки зрения быстроты его осуществления и отсутствия аллергической реакции у пациента. Если культивирование вируса осуществляют в яйцах, то в аллантоисную жидкость яиц вместе с вирусом могут быть введены одна или несколько аминокислот [11].

При использовании клеточной культуры субстратом для культивирования вируса обычно является клеточная линия млекопитающего. Подходящими клетками млекопитающих являются, но не ограничиваются ими, клетки хомячка, крупного рогатого скота, приматов (включая человека и обезьян) и собак. Могут быть использованы клетки различных типов, такие как клетки почек, фибробласты, клетки сетчатки, клетки легких и т.п. Примерами подходящих клеток хомячков являются клеточные линии, обозначаемые ВНК21 или НКСС. Подходящими клетками обезьян являются, например, клетки Африканской зеленой мартышки, например клетки почек, как в клеточной линии Уего. Подходящими клетками собак являются, например, клетки почек, как в клеточной линии МОСК. Таким образом, подходящими клеточными линиями являются, но не ограничивается ими МОСК; СНО; 293Т; ВНК; Уето; МКС-5; РЕК.С6; ^У1-38 и т.п. Предпочтительными клеточными линиями млекопитающих для культивирования вирусов гриппа являются клетки МОСК [28-31], выделенные из почек собак Ма61и ЭатЬу; клетки Уето [32-34], выделенные из почек Африканской зеленой мартышки (Сетсорййесик аеОиорО или клетки РЕК.С6 [35], выделенные из ретинобластов человеческих эмбрионов. Эти клеточные линии являются общедоступными, например они могут быть взяты из Американской коллекции типовых клеточных культур (АТСС) [36], из клеточного депозитария Сопе11 [37] или из Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС). Так, например, в АТСС имеются различные другие клетки Уего, имеющие каталожные номера ССЬ-81, ССЬ-81.2, СКЬ-1586 и СКЬ-1587, и клетки МОСК, имеющие каталожный номер ССЬ-34. Клетки РЕК.С6 имеются в ЕСАСС под депозитарным номером 96022940. Альтернативно, вирус может быть культивирован на птичьих клеточных линиях (см., например, работы [38-40]), включая клеточные линии уток (например, выделенные из сетчатки уток) или кур, однако такие клеточные линии являются менее предпочтительными, чем клеточные линии млекопитающих. Примерами птичьих клеточных линий являются стволовые клетки птичьих эмбрионов [38, 41] и клетки сетчатки уток [39]. Подходящими стволовыми клетками птичьих эмбрионов являются клеточные линии ЕВх, происходящие от стволовых клеток куриных эмбрионов, ЕВ45, ЕВ14 и ЕВ14-074 [42]. Могут быть также использованы фибробласты куриных эмбрионов (СЕЕ).

- 4 017441

Наиболее предпочтительными клеточными линиями для культивирования вирусов гриппа являются клеточные линии МОСК. Оригинальная клеточная линия МОСК имеется в АТСС под номером ССЬ-34, но могут быть также использованы и производные этой клеточной линии. Так, например, в работе [28] описана клеточная линия МОСК, которая была адаптирована для культивирования в суспензионной культуре (МОСК 33016, депонированная под номером Ό8Μ АСС 2219). Аналогичным образом, в работе [43] описана клеточная линия МОСК, которая была культивирована в суспензионной бессывороточной культуре (В-702, депонированная под номером РЕЕМ ВР-7449). В работе [44] описаны неонкогенные клетки МОСК, включая клетки МОСК-8 (АТСС РТА-6500), МОСК-8Р101 (АТСС РТА-6501), МОСК-8Р102 (АТСС РТА-6502) и МОСК-8Р103 (РТА-6503). В работе [45] описаны клеточные линии МОСК, обладающие высокой чувствительностью к инфекции, включая клетки МОСК.5Р1 (АТСС СКЕ-12042). Могут быть использованы любые из этих клеточных линий МОСК.

При культивировании вируса на клеточной линии млекопитающего композиция должна в основном не содержать яичных белков (например, овальбумина и овомукоида) и куриной ДНК, что будет способствовать снижению аллергенности.

Если вирус культивируют на клеточной линии, то культура для размножения вируса, а также вирусный инокулят, используемый для инициации культивирования, предпочтительно не должны содержать (т.е. должны быть протестированы и должны давать негативный результат в тесте на контаминацию вирусом) вируса простого герпеса, респираторно-синцитиального вируса, вируса парагриппа 3, коронавируса 8АКБ, аденовируса, риновируса, реовирусов, полиомавирусов, бирнавирусов, цирковирусов и/или парвовирусов [46]. Особенно предпочтительным является отсутствие вирусов простого герпеса.

Для выращивания на клеточной линии, такой как клетки МОСК, вирус может быть культивирован на клетках в суспензионной культуре [47-49] или в адгезионной культуре. Одной из подходящих клеточных линий МОСК для получения суспензионной культуры является МОСК 33016 (депонированная под номером О8М АСС 2219). В качестве альтернативы может быть использована культура с микроносителем.

Клеточные линии, поддерживающие репликацию вируса гриппа, предпочтительно культивируют в бессывороточной культуральной среде и/или в среде, не содержащей белков. С точки зрения настоящего изобретения такая среда представляет собой бессывороточную среду, в которой отсутствуют какие-либо добавки, происходящие от сыворотки человека или животного. Следует отметить, что термин не содержащий белков относится к культурам, в которых размножение клеток происходит в отсутствие белков, факторов роста, других белковых добавок и несывороточных белков, но в которых могут присутствовать, но необязательно, такие белки, как трипсин или другие протеазы, необходимые для культивирования вируса. Сами клетки, растущие в таких культурах, обычно не содержат белков.

Клеточные линии, поддерживающие репликацию вируса гриппа, предпочтительно культивируют при температуре ниже 37°С [50] в процессе репликации вируса, например при 30-36°С.

Способ размножения вируса в культивированных клетках обычно включает стадии инокуляции культивированных клеток культивируемым штаммом; культивирования инфицированных клеток в течение периода времени, необходимого для размножения вируса, например, определяемого по титру вируса или экспрессии антигена (например, через 24-168 ч после инокуляции); и сбора размноженного вируса. Культивированные клетки инокулируют вирусом (количество которого выражают в б.о.е. или в ТСГО₅₀) в отношении 1:500-1:1, предпочтительно 1:100-1:5, более предпочтительно 1:50-1:10. Вирус добавляют к клеточной суспензии или наносят на монослой клеток, и этот вирус абсорбируют на клетках по меньшей мере в течение 60 мин, а обычно в течение менее чем 300 мин, предпочтительно 90-240 мин, при 2540°С, а более предпочтительно 28-37°С. Для увеличения содержания вируса в собранных супернатантах культуры инфицированная клеточная культура (например, монослои) может быть удалена либо путем замораживания-оттаивания, либо под действием ферментов. Затем собранные жидкости либо инактивируют, либо хранят в замороженном виде. Культивированные клетки могут быть инфицированы при множественности заражения (ш.ол.) примерно 0,0001-10, предпочтительно 0,002-5, более предпочтительно 0,001-2. Еще более предпочтительно клетки инфицируют при ш.ол примерно 0,01. Инфицированные клетки могут быть собраны через 30-60 ч после инфицирования. Предпочтительно клетки собирают через 34-48 ч после инфицирования. Еще более предпочтительно клетки собирают через 38-40 ч после инфицирования. Для высвобождения вируса во время культивирования клеток в основном добавляют протеазы (обычно трипсин), причем такие протеазы могут быть добавлены на любой подходящей стадии культивирования.

Гемаглютинин (НА) представляет собой главный иммуноген в инактивированных вакцинах против гриппа, и дозы вакцин стандартизируют исходя из уровней НА, обычно измеряемых с помощью анализа, проводимого методом простой радиальной иммунодиффузии (8КТО). Современные вакцины обычно содержат 15 мкг НА на штамм, хотя также используются и более низкие дозы, например, для детей или в случаях пандемий. Были использованы дробные дозы, такие как 1/2 (т.е. 7,5 мкг НА на штамм), 1/4 и 1/8 [51, 52], а также более высокие дозы (например, дозы 3х или 9х [53, 54]). Таким образом, вакцины могут включать 0,1-150 мкг НА, предпочтительно 0,1-50 мкг, например 0,1-20 мкг, 0,1-15 мкг, 0,1-10 мкг, 0,17,5 мкг, 0,5-5 мкг и т.п. на штамм вируса гриппа. Конкретными дозами являются, например, приблизи

- 5 017441 тельно 45, приблизительно 30, приблизительно 15, приблизительно 10, приблизительно 7,5, приблизительно 5, приблизительно 3,8, приблизительно 1,9, приблизительно 1,5 мкг на штамм и т.п. Эти более низкие дозы являются наиболее предпочтительными, если в вакцине присутствует адъювант, как описано в настоящем изобретении.

В случае использования живых вакцин дозу измеряют не количеством содержащегося НА, а как среднюю цитопатогенную дозу, инфицирующую тканевую культуру (ТСШ₅₀), и такая ТСШ₅₀ обычно составляет 10⁶-10⁸ (предпочтительно 10^6,5-10^7,5) на штамм.

НА, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой природный НА, присутствующий в вирусе, либо он может быть модифицированным. Так, например, известно, что для удаления детерминант (например, гиперосновных областей, окружающих сайт расщепления между НА1 и НА2), которые сообщают этому вирусу высокую патогенность у птиц, НА необходимо модифицировать, поскольку эти детерминанты могут так или иначе препятствовать размножению вируса в яйцах.

Композиции согласно изобретению, в частности расщепленная вакцина или вакцина на основе поверхностного антигена, могут включать детергент, например поверхностно-активное вещество, такое как сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана (известное как Твин), октоксинол (такой как октоксинол-9 (Тритон Х-100) или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол), бромид цетилтриметиламмония (СТАВ) или дезоксихолат натрия. Детергент может присутствовать только в следовых количествах. Таким образом, вакцина может включать менее чем 1 мг/мл каждого из таких соединений, как октоксинол-10, а-токоферилбисукцинат и полисорбат 80. Другими остаточными компонентами, присутствующими в следовых количествах, могут быть антибиотики (например, неомицин, канамицин, полимиксин В).

Инактивированная, но не целая клеточная вакцина (например, расщепленная вирусная вакцина или очищенная вакцина на основе поверхностного антигена) может включать матриксный белок для обеспечения дополнительных Т-клеточных эпитопов, локализованных в этом антигене. Таким образом, нецелая клеточная вакцина (в частности, расщепленная вакцина), которая включает гемаглютинин и нейраминидазу, может дополнительно содержать матриксный белок М1 и/или М2 или его фрагмент(ы). Если присутствует матриксный белок М1, то такой матриксный белок должен присутствовать предпочтительно на детектируемом уровне. Может также присутствовать нуклеопротеин.

ДНК клетки-хозяина

Если вирус размножают на клеточной линии, то на практике обычно стараются минимизировать количество остаточной ДНК клеточной линии в конечном вакцинном препарате в целях минимизации какой-либо онкогенной активности ДНК. Так, например, при культивировании вируса на клеточной линии композиция предпочтительно должна содержать менее чем 10 нг (предпочтительно менее чем 1 нг, более предпочтительно менее чем 100 пг) остаточной ДНК клетки-хозяина на дозу, хотя могут присутствовать следовые количества ДНК клетки-хозяина. Средняя длина любой остаточной ДНК клетки-хозяина предпочтительно составляет менее чем 500 п.н., например менее чем 400 п.н., менее чем 300 п.н., менее чем 200 п.н., менее чем 100 п.н. и т.п. В общих чертах, ДНК клетки-хозяина, которую необходимо исключить из композиции согласно изобретению, представляет собой ДНК длиной более чем 100 п.н.

В настоящее время измерение уровня остаточной ДНК клетки-хозяина является стандартным требованием регуляторных органов для биологических исследований и может быть осуществлено специалистом в данной области. Для измерения уровня ДНК обычно проводят анализ, утвержденный Регуляторными органами [55, 56]. Рабочие параметры утвержденного анализа могут быть описаны математическими и количественными терминами, при этом указываются возможные источники ошибки. Анализ обычно оценивают на его параметры, такие как надежность, точность и специфичность. После калибровки анализа (например, на известные стандартные количества ДНК клетки-хозяина) и его оценки может быть проведена рутинная процедура измерения количества ДНК. Могут быть применены три основных метода количественной оценки ДНК: методы гибридизации, такие как саузерн-блот- или слот-блотанализы [57]; методы иммуноанализов, такие как система ТйгезйоН™ 8уз1ет [58]; и количественная ПЦР [59]. Все эти методы известны специалистам, хотя точные параметры каждого метода могут зависеть от рассматриваемой клетки-хозяина, например от выбора зондов для гибридизации, выбора праймеров и/или зондов для амплификации и т.п. Система ТйгезйоИ™. разработанная компанией Мо1еси1аг Эеу1се5. представляет собой количественный анализ для определения пикограммовых уровней полноразмерной ДНК, и этот анализ был использован для мониторинга уровней примесной ДНК в биофармацевтике [58]. Типичный анализ включает не специфическое по отношению к последовательности образование реакционного комплекса, содержащего белок, связывающийся с биотинилированной оцДНК; конъюгированное с уреазой антитело против оцДНК и ДНК. Все компоненты анализа включены в полный набор для анализа полноразмерной ДНК, поставляемый производителем. Количественные ПЦР-анализы для детектирования остаточной ДНК клетки-хозяина предлагаются различными коммерческими поставщиками, например, такими как АррТес™ ЬаЬогаЮгу Зетукез, ВюКейапсе™, АИйеа Тес1то1още5 и т.п. Сравнение анализа хемилюминесцентной гибридизации и системы ТйгезйоН™ для оценки полноразмерной ДНК, проводимое для измерения уровня загрязнения человеческой вирусной вакцины ДНК клетки-хозяина,

- 6 017441 можно найти в работе [60].

Примесная ДНК может быть удалена во время получения вакцины стандартными методами очистки, например хроматографией и т.п. Удаление остаточной ДНК клетки-хозяина может быть более эффективным при обработке нуклеазой, например, с использованием ДНКазы. Стандартный метод снижения уровня примесной ДНК клетки-хозяина описан в работах [61] и [62], и этот способ включает двухстадийную обработку, сначала ДНКазой (например, бензоназой), которая может быть проведена во время культивирования вируса, а затем катионным детергентом (например, СТАВ), которая может быть проведена в процессе дизрупции вириона. Обработка алкилирующим агентом, таким как β-пропиолактон, может быть также проведена для удаления ДНК клетки-хозяина, предпочтительно она может быть также проведена для инактивации вирионов [63].

Предпочтительными являются вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на 15 мкг гемаглютинина, а именно вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на объем 0,25 мл. Более предпочтительными являются вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на 50 мкг гемаглютинина, а именно вакцины, содержащие <10 нг (например, <1 нг, <100 пг) ДНК клетки-хозяина на объем 0,5 мл.

Адъювант(ы).

Способ согласно изобретению включает предварительное введение адъювантной вакцины. Другие вакцины могут быть безадъювантными либо они могут быть адъювантными, но содержат другой адъювант, отличающийся от предварительно вводимого адъюванта. Такой(ие) адъювант(ы) может(ут) действовать как усилитель иммунных ответов (гуморальных и/или клеточных), вырабатываемых у пациента, которому вводят указанную композицию.

Подходящими адъювантами, используемыми в первой вакцине и необязательно в других вакцинах, являются, но не ограничивается ими, следующие.

Композиция, содержащая минеральные соли, включая соли кальция и соли алюминия (или их смеси). Солями кальция являются фосфат кальция (например, частицы САР, описанные в работе [64]). Солями алюминия являются гидроксиды, фосфаты, сульфаты и т.п., где указанные соли имеют любую подходящую форму (например, они могут представлять собой гель, кристаллическое вещество, аморфное вещество и т.п.). Предпочтительной является адсорбция на этих солях. Композиции, содержащие минеральные соли, могут быть также получены в виде частиц соли металла [65]. Соли алюминия, используемые в качестве адъювантов, более подробно описаны ниже.

Эмульсия типа масло-в-воде, более подробно описанная ниже.

Иммуностимулирующий олигонуклеотид, более подробно описанный ниже.

3-О-Деацилированный монофосфорил-липид А (3ЙМРБ, также известный как МРЬ^ТМ), более подробно описанный ниже.

Соединение имидазохинолина, такое как имиквимод (В-837) [66,67], резиквимод (В-848) [68] и их аналоги; и их соли (например, гидрохлоридные соли). Более подробное описание иммуностимулирующих имидазохинолинов можно найти в работах [69-73].

Соединение тиосемикарбазона, такое как соединение, описанное в работе [74]. Методы приготовления, получения и скрининга активных соединений также описаны в работе [74]. Тиосемикарбазоны являются особенно эффективными для стимуляции продуцирования цитокинов, таких как ΤΝΡ-α, человеческими мононуклеарными клетками периферической крови.

Нуклеозидный аналог, такой как:

(а) изаторабин (ΑΝΑ-245; 7-тиа-8-оксогуанозин)

о о и его пролекарства;

(b) ΑΝΑ975;

(c) ΑΝΑ-025-1;

(ά) ΑΝΑ380;

(е) соединения, описанные в работах [75-77];

(1) соединение, имеющее формулу

где каждый из В1 и В₂ независимо представляет собой Н, галоген, -ЛВ_аВ_Ь, -ОН, С1_-6алкокси, замещенный С1_-6алкокси, гетероциклил, замещенный гетероциклил, С_6-1₀арил, замещенный С_6-1₀арил, С1_-6алкил или замещенный С1_-6алкил;

- 7 017441

К₃ либо отсутствует, либо представляет собой Н, С_1-балкил, замещенный С_1-балкил, Сб-юарил, замещенный С₆.1с>арил, гетероциклил или замещенный гетероциклил;

каждый из К₄ и К₅ независимо представляет собой Н, галоген, гетероциклил, замещенный гетероциклил, -С(О)-В,|· С_1-балкил, замещенный С_1-балкил или Кд и К₅, взятые вместе, образуют 5-членное кольцо, как К_4-5

связывание осуществляется посредством связей, обозначенных---;

каждый из Х₁ и Х₂ независимо представляет собой Ν, С, О или 8;

К₈ представляет собой Н, галоген, -ОН, С_1-балкил, С_2-балкенил, С_2-балкинил, -ОН, -ЫК_аК_ь, -(СН₂)_П-О-К_с, -О-(С_1-балкил), -8(О)_рК_е или -С(О)-К₄;

К₉ представляет собой Н, С_1-балкил, замещенный С_1-балкил, гетероциклил, замещенный гетероциклил или К_9а, где К_9а представляет собой

связывание осуществляется посредством связей, обозначенных---;

каждый из К_1с и К₁₁ независимо представляет собой Н, галоген, С_1-балкокси, замещенный С_1-балкокси, -ЫК_аК_ь или ОН;

каждый из К_а и К_ь независимо представляет собой Н, С_1-балкил, замещенный С_1-балкил, -С(О)К_б, Сб-1сарил;

каждый К_с независимо представляет собой Н, фосфат, дифосфат, трифосфат, С_1-балкил или замещенный С1-балкил;

каждый Κι независимо представляет собой Н, галоген, С_1-балкил, замещенный С_1-балкил, С_1-балкокси, замещенный С_1-балкокси, Ν^, -ЫН(С_1-балкил), -NН(замещенный С_1-балкил), -Ы(С_1-балкил)₂, -МН(замещенный С_1-балкил)₂, С_б-1сарил или гетероциклил;

каждый К_е независимо представляет собой Н, С_1-балкил, замещенный С_1-балкил, С_б-1сарил, замещенный С_б-1сарил, гетероциклил или замещенный гетероциклил;

каждый К_Г независимо представляет собой Н, С_1-балкил, замещенный С_1-балкил, -С(О)К,_|. фосфат, дифосфат или трифосфат;

каждый η независимо равен С, 1, 2 или 3;

каждый р независимо равен с, 1 или 2; или (д) фармацевтически приемлемая соль любого из соединений (а)-(Г), таутомер любого из соединений (а)-(Г) или фармацевтически приемлемая соль указанного таутомера.

Соединение триптантрина, такое как соединение, описанное в работе [78]. Методы приготовления, получения и скрининга активных соединений также описаны в работе [78]. Тиосемикарбазоны являются особенно эффективными для стимуляции продуцирования цитокинов, таких как ΤΝΤ-α, человеческими мононуклеарными клетками периферической крови.

Локсорибин (7-аллил-8-оксогуанозин) [79].

Соединения, описанные в работе [8с], включая соединения ацилпиперазина, соединения индолдиона, соединения тетрагидроизохинолина (ТН1Ц), соединения бензоциклодиона, соединения аминоазавинила, соединения аминобензимидазолхинолинона (АВ1Ц) [81, 82], соединения гидрафталамида, соединения бензофенона, соединения изоксазола, соединения стерола, соединения хиназилинона, соединения пиррола [83], соединения антрахинона, соединения хиноксалина, соединения триазина, соединения пиразолпиримидина и соединения бензазола [84].

Соединения, описанные в работе [85], включая 3,4-ди(1Н-индол-3-ил)-1Н-пиррол-2,5-дионы, аналоги стауроспорина, дериватизированные пиридазины, хромен-4-оны, индолиноны, хиназолины и нуклео зидные аналоги.

Производное фосфата аминоалкилглюкозаминида, такое как КС-529 [8б, 87].

Фосфазен, такой как поли[ди(карбоксилатфенокси)фосфазен] (РСРР), описанный, например, в работах [88 и 89].

Низкомолекулярные усилители иммунного ответа (8ΜΙΡ), такие как №-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №,№-диметил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-этил-Ы2-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; №-метил-1-(2-метилпропил)-Ы2-пропил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

1-(2-метилпропил)-Ы2-пропил-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

№-бутил-1 -(2-метилпропил)-1Н-имидазо [4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

№-бутил-Ы2-метил-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

№-метил-1-(2-метилпропил)-Ы2-пентил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

№-метил-1-(2-метилпропил)-Ы2-проп-2-енил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

- 8 017441

1-(2-метилпропил)-2-[(фенилметил)тио]-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин;

1- (2-метилпропил)-2-(пропилтио)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин;

2- [[4-амино-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-ил](метил)амино]этанол; 2-[[4-амино-1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-ил](метил)амино]этилацетат;

4-амино-1-(2-метилпропил)-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он;

М2-бутил-1-(2-метилпропил)-Ы4,М4-бис-(фенилметил)-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин; М2-бутил-М2-метил-1-(2-метилпропил)-Ы4,М4-бис-(фенилметил)-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4диамин;

М2-метил-1-(2-метилпропил)-Ы4,М4-бис-(фенилметил)-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин;

М2,М2-диметил-1-(2-метилпропил)-Ы4,М4-бис-(фенилметил)-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4диамин;

1-{4-амино-2-[метил(пропил)амино]-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил}-2-метилпропан-2-ол; 1-[4-амино-2-(пропиламино)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-ил]-2-метилпропан-2-ол и М4,М4-дибензил-1-(2-метокси-2-метилпропил)-Ы2-пропил-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2,4-диамин.

Сапонины (глава 22 работы [131]), которые представляют собой гетерологичную группу гликозидов стерола и тритерпеноидных гликозидов, обнаруженных в коре, листьях, стеблях, корнях и даже в цветках растений широкого ряда. Были проведены крупномасштабные исследования действия сапонина, выделенного из коры мыльного дерева Ош11а1а каропапа, в качестве адъюванта. Сапонин может также представлять собой коммерчески доступный препарат, приготовленный из 8тйах огпа1а (сарсаприллы), СуркорЫ11а рашси1а1а (качима метельчатого) и 8аропапа оШаапайк (мыльного корня). Препаратами на основе сапониновых адъювантов являются очищенные препараты, такие как 0821. а также липидные препараты, такие как 18СОМ. 0821 имеется в продаже под торговым знаком 8бти1оп™. Сапониновые композиции были очищены с помощью ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. С применением этих методов были идентифицированы конкретные очищенные фракции, включая 087, 0817, 0818, 0821, ОН-А, ОН-В и ОН-С. Предпочтительным сапонином является 0821. Метод получения 0821 описан в работе [90]. Сапониновые композиции могут также содержать стерол, такой как холестерин [91]. Могут быть также использованы комбинации сапонинов и холестеринов, образующие однородные частицы, называемые иммуностимулирующими комплексами (18СОМ) (глава 23 работы [131]). 18СОМ также обычно включают фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. В 18СОМ могут присутствовать любые известные сапонины. Предпочтительно 18СОМ включает один или несколько 0ш1А, ОНА и ОНС. 18СОМ более подробно описаны в работах [91-93]. 18СОМ могут, но необязательно, не содержать дополнительного детергента [94]. Описание получения адъювантов на основе сапонина можно найти в работах [95] и [96].

Бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины (например, термолабильный энтеротоксин ЬТ Е.сой, холерный токсин СТ или коклюшный токсин РТ) и их детоксифицированные производные, такие как мутантные токсины, известные как БТ-К63 и ЬТ-К.72 [97]. Использование детоксифицированных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве адъювантов для введения в слизистую описано в работе 98, а в качестве адъювантов для парентерального введения - в работе [99].

Биоадгезивы и мукоадгезивы, такие как микросферы с этерифицированной гиалуроновой кислотой [100] или хитозан и его производные [101].

Микрочастицы (т.е. частицы диаметром от ~100 нм до ~150 мкм, более предпочтительно диаметром от ~200 нм до ~30 мкм или от ~500 нм до ~10 мкм), образованные из материалов, которые являются биологически разлагаемыми и нетоксичными (например, из поли(а-гидроксикислоты), полигидроксимасляной кислоты, полиортоэфира, полиангидрида, поликапролактона и т.п.), при этом предпочтительным является сополимер лактида и гликолида, где указанные микрочастицы обработаны, но необязательно, веществом, сообщающим этим микрочастицам отрицательно заряженную поверхность (например, ДСН) или положительно заряженную поверхность (например, катионным детергентом, таким как СТАВ).

Липосомы (главы 13 и 14 работы [131]). Примеры липосомных препаратов, которые могут быть использованы в качестве адъювантов, описаны в работах [102-104].

Полиоксиэтиленэфиры и сложные полиоксиэтиленэфиры [105]. Такие препараты также включают поверхностно-активные вещества, а именно сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана в комбинации с октоксинолом [106], а также полиоксиэтиленалкиловые эфиры или сложные эфиры в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [107]. Предпочтительные полиоксиэтиленэфиры выбраны из группы, состоящей из полиоксиэтилен-9-лаурилового эфира (лаурета 9), полиоксиэтилен-9-стеарилового эфира, полиоксиэтилен-8стеарилового эфира, полиоксиэтилен-4-лаурилового эфира, полиоксиэтилен-35-лаурилового эфира и полиоксиэтилен-23-лаурилового эфира.

- 9 017441

Мурамиловые пептиды, такие как Ν-ацетилмурамил-Ь-треонил-Б-изоглутамин (Шт-МБР), Ν-ацетилнормурамил-Ь-аланил-Б-изоглутамин (йот-МБР), №ацетилглюказаминил-№ацетилмурамил-ЬА1-Б-изоглю-Ь-А1а-дипальмитоксипропиламид (БТР-БРР или Терамид™), Ν-ацетилмурамил-Ьаланил-Б-изоглутаминил-Ь-аланин-2-(1 '-2'-дипальмитоил-8и-глицеро-3 -гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ).

Препарат на основе протеосомы внешнего мембранного белка, приготовленный из первой грамотрицательной бактерии, в комбинации с препаратом на основе липосахарида (ЛПС), приготовленным из второй грамотрицательной бактерии, где указанные препараты на основе протеосом внешнего мембранного белка и ЛПС образуют стабильный нековалентный адъювантный комплекс. Такими комплексами являются ΐνΧ-908, комплекс, состоящий из внешней мембраны №Й5Спа тешидШШк и ЛПС. Такие препараты были использованы в качестве адъювантов для приготовления вакцин против гриппа [108].

Полимер полиоксидония [109, 110] или другое производное Ν-окисленного полиэтиленпиперазина. Метилинозин-5'-монофосфат (М1МР) [111].

Соединение полигидроксилированного пирролизидина [112], такое как соединение, имеющее формулу сщон где Л выбран из группы, включающей водород, прямую или разветвленную, незамещенную или замещенную, насыщенную или ненасыщенную ацильную, алкильную (например, циклоалкильную), алке нильную, алкинильную и арильную группы, или его фармацевтически приемлемая соль или производное.

Примерами являются, но не ограничиваются ими, казуарин, казуарин-6-а-Б-глюкопираноза,

3-эпи-казуарин, 7-эпиказуарин, 3,7-диэпиказуарин и т.п.

Лиганд СБ1й. такой как а-гликозилцерамид [113-120] (например, а-галактозилцерамид), фитосфингозин-содержащие а-гликозилцерамиды, ОСН, ΚΡΝ7000 [(2§,3§,4Л)-1-О-(а-Б-галактопиранозил)-2-(№гексакозаноиламино)-1,3,4-октадекантриол], №ΟΝΥ-101, 3-О-сульфогалактозил церамид и т.п.

Гамма-инулин [121] или его производное, такое как альгаммулин.

Соединение формулы I, II или III или его соль

[122], такие как ЕЛ

803732, ЕЛ 804053, ЕЛ 804058, определенные в работе

ЕЛ 804059, ЕЛ 804442, ЕЛ 804680, ЕЛ 804764, ЕЛ 803022 или ЕЛ 804057, например

803058, ЕЛ

- 10 017441

Производные липида А ЕкскепсЫа со11, такие как ОМ-174 (описанные в работах [123] и [124]).

Препарат, состоящий из катионного липида и (обычно нейтрального) со-липида, такого как бромид аминопропил-диметил-миристоилокси-пропанаминия дифитаноилфосфотидилэтаноламин (УахТесЕи™) или бромид аминопропил-диметил-бис-додецилокси-пропанаминия-диолеоилфосфатидилэтаноламин (ОАР-ОЬКГЕ: ИОРЕ). Предпочтительными являются препараты, содержащие соли (±)-Ν-(3 -аминопропил)-^№диметил-2,3-бис-(син-9-тетрадеценилокси)-1-пропанаминия [125].

Соединения, содержащие липиды, связанные с фосфат-содержащим ациклическим остовом, такие как антагонист ΊΈΚ4 Е5564 [126, 127]

Эти и другие активные вещества, обладающие адъювантной активностью, более подробно обсуждаются в работах [131] и [132].

Адъювантом(ами), используемым(и) в настоящем изобретении, может(ут) быть модуляторы и/или агонисты ловушко-подобных рецепторов (ТЬК). Так, например, они могут представлять собой агонисты одного или нескольких человеческих белков ТЬК1, ТЬК2, ТЬК3, ТЬК4, ТЬК7, ТЬК8 и/или ТЬК9. Предпочтительными агентами являются агонисты ТЬК7 (например, имидазохинолины) и/или ТЬК9 (например, СрО-олигонуклеотиды). Эти агенты могут быть использованы для активации природных механизмов вырабатывания иммунитета.

Одна вакцина может включать два или более указанных адъювантов.

Антигены и адъюванты, присутствующие в композиции, обычно представляют собой смесь.

Соль алюминия в качестве адъюванта.

Могут быть использованы известные адъюванты, такие как гидроксид алюминия и фосфат алюминия. Эти названия являются травиальными и используются лишь для удобства, поскольку ни одно из них точно не отражает истинную структуру присутствующего химического соединения (например, см. главу 9 работы [131]). В настоящем изобретении могут быть использованы любые гидроксидные или фосфатные соединения, которые обычно используются в качестве адъювантов.

Адъюванты, известные как гидроксид алюминия, обычно представляют собой оксигидроксидные соли алюминия, которые обычно являются, по меньшей мере частично, кристаллическими. Оксигидроксид алюминия, который может быть представлен формулой А1О(ОН), может отличаться от других соединений алюминия, таких как гидроксид алюминия А1(ОН)₃, на что указывает инфракрасная (ИК) спектроскопия, в частности присутствие полосы поглощения при 1070 см^-1 и яркое плечо спектра при 30903100 см^-1 (глава 9 в работе [131]). Степень кристалличности адъюванта, а именно гидроксида алюминия, определяется шириной дифракционной полосы на середине (половине высоты) пика (^НН), при этом частицы с низкой степенью кристалличности обнаруживают значительно большее уширение линии, что обусловлено меньшим размером кристаллов. Площадь поверхности увеличивается по мере увеличения величин \УНН. а адъюванты с большими величинами \УНН обнаруживают большую способность к адсорбции антигена. Для адъювантов, а именно гидроксида алюминия, характерна филаментная морфология (например, на что указывает микрофотография, сделанная на просвечивающем электронном микроскопе). р1 адъювантов типа гидроксида алюминия обычно составляет приблизительно 11, т.е. сам адъювант имеет положительный поверхностный заряд при физиологическом рН. Сообщалось, что адъюванты типа гидроксида алюминия имеют адсорбционную емкость 1,8-2,6 мг белка на 1 мг А1⁺⁺⁺ при рН 7,4.

Адъюванты, известные как фосфат алюминия, обычно представляют собой гидроксифосфаты алюминия, которые также часто содержат небольшое количество сульфата (т.е. сульфата гидроксифосфата алюминия). Они могут быть получены путем осаждения, и во время такого осаждения соли на степень замещения гидроксила фосфатом влияют условия проведения реакции и концентрация. Гидроксифосфаты обычно имеют молярное отношение РО₄/А1, составляющее 0,3-1,2. Гидроксифосфаты могут отличаться от обычного А1РО₄ присутствием гидроксильных групп. Так, например, полоса ИК-спектра при 3164 см^-1 (например, при нагревании до 200°С) указывает на присутствие структурных гидроксилов (глава 9 работы [131]).

Молярное отношение РО₄/А1³⁺ адъюванта типа фосфата алюминия обычно составляет 0,3-1,2, предпочтительно, 0,8-1,2, более предпочтительно 0,95±0,1. Фосфат алюминия обычно представляет собой аморфоное вещество, а особенно, если оно присутствует в виде гидроксифосфатных солей. Типичным адъювантом является аморфный гидроксифосфат алюминия, имеющий молярное отношение РО₄/А1³⁺, составляющее 0,84-0,92, где количество А1³⁺ составляет 0,6 мг/мл. Фосфат алюминия обычно имеет форму частиц (например, пластинчатую морфологию, на что указывает микрофотография, сделанная на про

- 11 017441 свечивающем электронном микроскопе). После адсорбции любого антигена диаметр таких частиц обычно составляет 0,5-20 мкм (например, приблизительно 5-10 мкм). Сообщалось, что адъюванты типа фосфата алюминия имеют адсорбционную емкость 0,7-1,5 мг белка на 1 мг А1⁺⁺⁺ при рН 7,4.

Точка нулевого заряда (Р2С) фосфата алюминия обратно пропорциональна степени замещения гидроксила фосфатом, и эта степень замещения может варьироваться в зависимости от условий проведения реакции и концентрации реагентов, используемых для получения солей путем осаждения. ΡΖΟ также изменяется при изменении концентрации свободных ионов фосфата в растворе (чем больше концентрация фосфата, тем более кислотным является фосфат алюминия в точке нулевого заряда (РΖС)) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (который сообщает фосфату алюминия при РΖС большую основность). Фосфаты алюминия, используемые в настоящем изобретении, обычно имеют РΖС 4,0-7,0, более предпочтительно 5,0-6,5, например приблизительно 5,7.

Суспензии солей алюминия, используемые для получения композиций согласно изобретению, могут содержать буфер (например, фосфат или гистидин или трис-буфер), но это требуется не всегда. Суспензии предпочтительно являются стерильными и апирогенными. Суспензия может включать свободные ионы водного фосфата, например, присутствующие при концентрации 1,0-20 мМ, предпочтительно

5-15 мМ, более предпочтительно примерно 10 мМ. Эти суспензии могут также содержать хлорид натрия.

В настоящем изобретении может быть использована смесь гидроксида алюминия и фосфата алюминия. В этом случае содержание фосфата алюминия может превышать содержание гидроксида алюминия, например их массовое отношение может составлять по меньшей мере 2:1, например, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1 и т.п.

Концентрация А1⁺⁺⁺ в композиции для введения пациенту предпочтительно составляет менее чем 10 мг/мл, например <5, <4, <3, <2, <1 мг/мл и т.п. Предпочтительная концентрация составляет 0,3-1 мг/мл. Предпочтительная максимальная концентрация составляет 0,85 мг/дозу.

Адъюванты типа эмульсии масло-в-воде.

Было обнаружено, что эмульсии масло-в-воде являются особенно подходящими для их использования в целях сообщения адъювантных свойств вакцинам против вируса гриппа. Различные эмульсии такого типа известны специалистам, и эти эмульсии обычно включают по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где указанное(ые) масло(а) и поверхностноактивное(ые) вещество(а) является(ются) биологически разлагаемым(ыми) (подвергаются метаболизму) и биологически совместимым(ыми). Масляные капельки в данной эмульсии обычно имеют диаметр менее чем 5 мкм и даже могут иметь субмикронный диаметр, при этом такой небольшой размер может быть достигнут на микрофлюидизаторе, в результате чего образуются стабильные эмульсии. При этом предпочтительно, чтобы капельки имели размер менее чем 220 нм, поскольку они могут быть подвергнуты стерилизации на фильтре.

В настоящем изобретении могут быть использованы масла, такие как масло животного происхождения (например, рыбий жир) или растительное масло. Источниками растительных масел являются орехи, семена и зерно. Чаще всего используются арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло, а репрезентативным является ореховое масло. Может быть использовано масло жожоба, например, полученное из бобов растения жожоба. Маслами, полученными из семян, являются сафлоровое масло, масло из семян хлопчатника, масло из семян подсолнечника, кунжутное масло и т.п. Что касается группы масел, полученных из зерна, то наиболее часто используется кукурузное масло, однако может быть также использовано масло, полученное из других зерновых, таких как пшеница, овес, рожь, рис, полевичка абиссинская и тритикале (гибрид ржи и пшеницы) и т.п. Эфиры С_6-10 жирных кислот и глицерина и 1,2-пропандиола, хотя они обычно не присутствуют в маслах из семян растений, могут быть получены путем гидролиза, сепарирования и этерификации подходящих веществ, выделенных из орехового масла и масла из семян. Жиры и масла, выделенные из молока млекопитающих, подвергаются метаболизму, а поэтому они могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. Процедуры сепарирования, очистки, омыления и другие методы, необходимые для получения чистых масел из источников животного происхождения, хорошо известны специалистам. Большинство рыб содержит подвергающиеся метаболизму масла, которые могут быть легко выделены. Так, например, в настоящем изобретении могут быть использованы масло печени трески, масло печени акулы и китовый жир, такой как спермацеты, которые представляют собой некоторые репрезентативные жиры рыб. Ряд масел с разветвленными цепями синтезируют биохимическим методом в виде изопреновых С₅-звеньев, и такие масла обычно называются терпеноидами. Масло из печени акулы содержит разветвленные ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, либо 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который является особенно предпочтительным. Предпочтительным маслом также является сквалан, насыщенный аналог сквалена. Жиры рыб, включая сквален и сквалан, являются коммерчески доступными либо они могут быть получены методами, известными специалистам. Другими предпочтительными маслами являются токоферолы (см. ниже). Могут быть использованы смеси масел.

Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по их ГЛБ (гидрофильнолипофильному балансу). Предпочтительные поверхностно-активные вещества согласно изобретению

- 12 017441 имеют ГЛБ по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, более предпочтительно по меньшей мере 16. В настоящем изобретении могут быть использованы поверхностно-активные вещества, которыми являются, но не ограничивается ими, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемые Твинами), в частности полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЭО), пропиленоксида (ПО) и/или бутиленоксида (ВО), имеющиеся в продаже под торговым знаком ЭОХУРАХ™. такие как линейные блок-сополимеры ЭО/ПО; октоксинолы, которые могут варьироваться по числу повторяющихся этокси(окси-1,2-этандиильных)групп, причем особый интерес представляет октоксинол-9 (Тритон Х-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (ЮЕРАЬ ΟΑ-630/ΝΡ-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); этоксилаты нонилфенола, такие как препараты серии тергитол™ №; эфиры жирной кислоты и полиоксиэтилена, полученные из лауриловых, цетиловых, стеариловых и олеиловых спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Вгу), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Βγι) 30); и сложные эфиры сорбитана (хорошо известные как 8ΡΑΝ), такие как триолеат сорбитана (8раи 85) и монолаурат сорбитана. Предпочтительными являются неионогенные поверхностно-активные вещества. Предпочтительными поверхностноактивными веществами, предназначенными для их включения в эмульсию, являются Твин 80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана), 8раи 85 (триолеат сорбитана), лецитин и Тритон Х-100.

Могут быть использованы смеси поверхностно-активных веществ, например смеси Твина 80/8раи 85. Подходящей также является комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (Твин 80) и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Тритон Х-100). Другая подходящая комбинация включает лаурет 9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.

Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (мас.%) составляют:

сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана (такой как Твин 80) 0,01-1%, в частности примерно 0,1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Тритон Х-100 или другие детергенты ряда Тритонов) 0,001-0,1%, в частности 0,005-0,02%;

эфиры полиоксиэтилена (такие как лаурет 9) 0,1-20%, предпочтительно 0,1-10%, в частности 0,1-1% или примерно 0,5%.

Конкретными адъювантами типа эмульсии масло-в-воде, используемыми в настоящем изобретении, являются, но не ограничивается ими, следующие.

Субмикронная эмульсия сквалена, Твина 80 и 8раи 85. Данная эмульсия может иметь следующий состав по объему: приблизительно 5% сквалена, приблизительно 0,5% полисорбата 80 и приблизительно 0,5% 8раи 85. Данная эмульсия имеет следующий состав по массе: 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% 8раи 85. Этот адъювант известен как МЕ59 [128-130], более подробно описанный в главе 10 работы [131] и в главе 12 работы [132]. Эмульсия МЕ59 преимущественно включает ионы цитрата, например 10 мМ натрийцитратный буфер.

Эмульсия сквалена, токоферола и Твина 80. Данная эмульсия может включать забуференный фосфатом физиологический раствор. Указанная эмульсия может также включать 8раи 85 (например, 1%) и/или лецитин. Эти эмульсии могут содержать 2-10% сквалена, 2-10% токоферола и 0,3-3% Твина 80, а массовое отношение сквален:токоферол предпочтительно составляет <1, что позволяет получить более стабильную эмульсию. В данной эмульсии отношение сквалена и Твина 80 по объему может составлять приблизительно 5:2. Одна из таких эмульсий может быть получена путем растворения Твина 80 в РВ8 с получением 2% раствора, последующим смешиванием 90 мл этого раствора со смесью 5 г ЭЬ-атокоферола и 5 мл сквалена и микрофлюидизации данной смеси. Полученная эмульсия может иметь субмикронные масляные капельки, средний диаметр которых составляет 100-250 нм, а предпочтительно примерно 180 нм.

Эмульсия сквалена, токоферола и детергента Тритон (например, Тритон Х-100). Указанная эмульсия может также включать 36-МРЬ (см. ниже). Эта эмульсия может содержать фосфатный буфер.

Эмульсия, содержащая полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Тритон (например, Тритон Х-100) и токоферол (например, сукцинат а-токоферола). Указанная эмульсия может включать эти три компонента в массовом отношении примерно 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Тритона Х-100 и 100 мкг/мл сукцината а -токоферола), и такие концентрации должны включать любую долю этих компонентов исходя из содержания антигенов. Указанная эмульсия может также включать сквален. Указанная эмульсия может также включать 36-МРЬ (см. ниже). Водная фаза может содержать фосфатный буфер.

Эмульсия сквалана, полисорбата 80 и полоксамера 401 (Р1игоше™ Ь121). Такая эмульсия может быть приготовлена в забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,4. Эта эмульсия является подходящим носителем для доставки мурамилдипептидов и используется вместе с треонил-МЭР в адъюванте 8АР-1 [133] (0,05-1% Тйг-МЭР, 5% сквалан, 2,5% Р1игошс Ь121 и 0,2% полисорбата 80). Указанная эмульсия может быть также использована без Тйг-МЭР, как в адъюванте АР [134] (5% сквалана, 1,25% Р1игошс Ь121 и 0,2% полисорбата 80). Предпочтительной является микрофлюидизация.

- 13 017441

Эмульсия, содержащая сквален, водный растворитель, гидрофильное неионогенное поверхностноактивное вещество алкиловый эфир полиоксиэтилена (например, цетостеариловый эфир полиоксиэтилена [12]) и гидрофобное неионогенное поверхностно-активное вещество (например, сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннида, такой как моноолеат сорбитана или 8рап 80). Указанная эмульсия предпочтительно является термообратимой и/или имеет по меньшей мере 90% масляных капелек (по объему) размером менее чем 200 нм [135]. Такая эмульсия может также включать один или несколько следующих компонентов, таких как альдит, криопротективный агент (например, сахар, такой как додецилмальтозид и/или сахароза) и/или алкилполигликозид. Такие эмульсии могут быть лиофилизованными.

Эмульсия, содержащая 0,5-50% масла, 0,1-10% фосфолипида и 0,05-5% неионогенного поверхностно-активного вещества. Как описано в работе [136], предпочтительными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидилглицерин, фосфатидиновая кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Предпочтительными являются субмикронные капельки.

Субмикронная эмульсия масло-в-воде, состоящая из масла, не подвергающегося метаболизму (такого как легкое минеральное масло), и по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества (такого как лецитин, Твин 80 или 8рап 80). Могут быть включены добавки, такие как сапонин 0ш1А, холестерин, конъюгат сапонин-липофил (такой как СР1-0100, описанный в работе [137] и полученный путем присоединения алифатического амина к дезацилсапонину через карбоксильную группу глюкуроновой кислоты), бромид диметилдиоктадециламмония и/или ^№диоктадецил-Ы,№бис-(2гидроксиэтил)пропандиамин.

Эмульсия, в которой сапонин (например, ΟιιίΙΑ или 0821) и стерол (например, холестерин) связаны друг с другом в виде спиральных мицелл [138].

Эмульсия, содержащая минеральное масло, неионогенный липофильный этоксилированный жирный спирт и неионогенное гидрофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена) [139].

Эмульсия, содержащая минеральное масло, неионогенный гидрофильный этоксилированный жирный спирт и неионогенное липофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена) [139].

Эмульсия может быть смешана с антигеном для немедленного приема. Таким образом, адъювант и антиген могут содержаться по отдельности в виде упакованной или специально приготовленной вакцины, готовой для введения конечного препарата. Антиген обычно получают в водной форме так, чтобы вакцина, в конечном счете, была приготовлена путем смешивания двух жидкостей. Объемное отношение двух смешиваемых жидкостей может варьироваться (например, в пределах 5:1-1:5), но в основном оно составляет приблизительно 1:1.

После смешивания антигена и адъюванта антиген гемаглютинина обычно остается в водном растворе, но может сам распределяться вдоль границы раздела масло/вода. Обычно в масляную фазу эмульсии входит, если вообще входит, небольшое количество гемаглютинина.

Если композиция включает токоферол, то могут быть использованы любые из α-, β-, γ-, δ-, ε- или ξтокоферолов, а предпочтительными являются α-токоферолы. Токоферол может присутствовать в нескольких формах, например в форме различных солей и/или изомеров. Такими солями являются органические соли, такие как сукцинат, ацетат, никотинат и т.п. Могут быть использованы Ό-α-токоферол и ЭЬ -α-токоферол. Токоферолы включают в вакцины, которые преимущественно предназначены для введения пожилым пациентам (например, в возрасте 60 лет или старше), поскольку сообщалось, что витамин Е оказывает положительное воздействие на иммунный ответ у пациентов этой группы [140]. Токоферолы также обладают антиоксидантными свойствами, которые могут способствовать стабилизации эмульсий [141]. Предпочтительным α-токоферолом является ИЬ-а-токоферол, а предпочтительной солью этого токоферола является сукцинат. Было обнаружено, что сукцинатная соль взаимодействует с ΤΝΕ-родственными лигандами ίη νίνο. Кроме того, известно, что сукцинат α-токоферола является совместимым с вакцинами против гриппа и может быть использован в качестве консерванта вместо соединений ртути [10].

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды.

Иммуностимулирующими олигонуклеотидами могут быть нуклеотидные модификации/аналоги, такие как фосфортиоатные модификации, и эти олигонуклеотиды могут быть двухцепочечными или (за исключением РНК) одноцепочечными. В работах [142-144] описаны возможные замены в аналогах, например замена гуанозина 2'-дезокси-7-деазагуанозином. Адъювантный эффект СрС-олигонуклеотидов также обсуждается в работах [145-150]. Последовательность СрС, такая как мотив СТССТТ или ТТССТТ, может быть направлена на ТБК9 [151]. Последовательность СрС может быть специфичной в отношении индуцирования иммунного ТМ-ответа, например такая последовательность, как СрС-Α ΘΌΝ (олигодезоксинуклеотид), либо она может быть более специфичной в отношении индуцирования Вклеточного ответа, например такая последовательность, как СрС-Β ΘΌΝ. СрС-Α и СрС-Β ΘΌΝ обсуждаются в работах [152-154]. При этом предпочтительно СрС представляет собой СрС-Α ΘΌΝ.

- 14 017441

СрС-олигонуклеотид предпочтительно конструируют так, чтобы 5'-конец был доступен для распознавания рецептора. Две СрС-олигонуклеотидные последовательности могут быть, но необязательно, присоединены у их З'-концов с образованием иммуномеров. См., например, работы [151] и [155-157]. Подходящим СрС-адъювантом является СрС7909, также известный как РтоМипе™ (Со1еу РйаттасеиИса1 Стоир, 1пс.).

В качестве альтернативы применению СрС-последовательностей или дополнительно к такому применению могут быть использованы ТрС-последовательности [158]. Эти олигонуклеотиды могут не содержать неметилированных СрС-мотивов.

Иммуностимулирующий олигонуклеотид может быть обогащен пиримидином. Так, например, он может содержать более чем один тимидиновый нуклеотид (например, ТТТТ, как описано в работе [158]) и/или он может иметь нуклеотидную последовательность, содержащую >25% тимидина (например, >35, >40, >50, >60, >80% и т.п.). Так, например, он может содержать более чем один цитозиновый нуклеотид (например, СССС, как описано в работе [158]) и/или он может иметь нуклеотидную последовательность, содержащую >25% цитозина (например, >35, >40, >50, >60, >80% и т.п.). Эти олигонуклеотиды могут не содержать неметилированных СрС-мотивов.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере 20 нуклеотидов. Они могут содержать менее чем 100 нуклеотидов.

З-де-О-Ацилированный монофосфорил-липид А.

ЗбМРЬ (также известный как З-де-О-ацилированный монофосфорил-липид А или З-О-дезацил-4'монофосфорил-липид А) представляет собой адъювант, в котором положение 3 восстанавливающего концевого глюкозамина в монофосфорил-липиде А является деацилированным. ЗбМРЬ был получен из не содержащего гептозы мутанта 8а1топе11а тшпе801а, и такой ЗбМРЬ по своей химической структуре аналогичен липиду А, за исключением того, что он не содержит не устойчивую к воздействию кислоты фосфорильную группу и не устойчивую к воздействию основания ацильную группу. Он активирует линии дифференцировки моноцитов/макрофагов и стимулирует высвобождение нескольких цитокинов, включая 1Ь-1, 1Ь-12, ΤΝΡ-α и СМ-С8Р (см. также работу [159]). Получение ЗбМРЬ было впервые описано в работе [160].

ЗбМРЬ может иметь форму смеси родственных молекул, структуры которых варьируются в зависимости от степени ацилирования (т.е. они могут иметь З, 4, 5 или 6 ацильных цепей, которые могут иметь различную длину). Два глюкозаминовых моносахарида (также известных как 2-дезокси-2аминоглюкоза) являются Ν-ацилированными во 2-положении атома углерода (т.е. в положениях 2 и 2'), а также являются О-ацилированными в З'-положении. Группа, присоединенная к атому углерода во 2-положении, имеет формулу -ΝΗ^Θ-ΟΗ₂-ΟΚ.¹Κ.¹. Группа, присоединенная к атому углерода во 2'-положении, имеет формулу -ΝΗ-ίΌ-ί.Ή2-ί.'Β²Β². Группа, присоединенная к атому углерода в З'-положении, имеет формулу -О-СО-СН2-СК^ЗК^З. Репрезентативная структура представляет собой

где каждая из групп К¹, К² и К^З независимо представляет собой -(СН₂)_П-СН_З. Величина п предпочтительно составляет 8-16, более предпочтительно 9-12, а наиболее предпочтительно 10.

Каждая из групп К¹, К² и К^З может независимо представлять собой: (а) -Н; (Ь) -ОН или (с) -О-СО-К⁴, где К⁴ представляет собой либо -Н, либо -(СН₂)_т-СН_З, где величина т предпочтительно составляет 8-16, более предпочтительно, 10, 12 или 14. Во 2-положении т предпочтительно равно 14. В 2'-положении т предпочтительно равно 10. В З'-положении т предпочтительно равно 12. Таким образом, группами К^1', К^2' и К^З' являются предпочтительно -О-ацильные группы додекановой кислоты, тетрадекановой кислоты или гексадекановой кислоты.

Если все К¹, К² и К^З представляют собой -Н, то ЗбМРЬ имеет только З ацильные цепи (по одной в каждом из положений 2, 2' и З'). Если только две из групп К¹, К² и К^З представляют собой -Н, то ЗбМРЬ может иметь 4 ацильные цепи. Если только одна из групп К¹, К² и К^З представляет собой -Н, то ЗбМРЬ может иметь 5 ацильных цепей. Если ни одна из групп К¹, К² и К^З не является -Н, то ЗбМРЬ может иметь 6 ацильных цепей. Адъювант ЗбМРЬ, используемый в настоящем изобретении, может представ

- 15 017441 лять собой смесь указанных форм с 3-6 ацильными цепями, однако в смесь предпочтительно включать 3йМРЬ с 6 ацильными цепями, в частности, для того, чтобы гексаацильная цепь составляла по меньшей мере 10 мас.% от всего 3ЙМРБ, например >20, >30, >40, >50% или более. Было обнаружено, что 3ЙМРБ с 6 ацильными цепями представляет собой наиболее активную форму адъюванта.

Таким образом, наиболее предпочтительной формой 3ЙМРБ для ее включения в композиции согласно изобретению является

Если 3йМРЬ используется в форме смеси, то указания на количества или концентрации 3ЙМРБ в композициях согласно изобретению относятся к объединенным молекулам 3ЙМРБ в смеси.

В водных условиях 3йМРЬ может образовывать мицеллярные агрегаты или частицы различных размеров, например диаметром <150 или >500 нм. В настоящем изобретении могут быть использованы любая или обе эти формы, а наилучшие частицы могут быть отобраны с помощью рутинного анализа. Предпочтительными для использования в настоящем изобретении являются более мелкие частицы (например, достаточные для получения прозрачной водной суспензии 3ЙМРБ), поскольку они обладают наилучшей активностью [161]. Предпочтительные частицы имеют средний диаметр менее чем 220 нм, более предпочтительно менее чем 200, или менее чем 150, или менее чем 120 нм, и такие частицы могут даже иметь средний диаметр менее чем 100 нм. Однако в большинстве случаев средний диаметр составляет не менее чем 50 нм. Такие частицы имеют достаточно небольшой размер, а поэтому могут быть стерилизованы на фильтре. Диаметр частиц может быть оценен рутинным методом динамического рассеяния света, позволяющим выявлять средний диаметр частиц. Если диаметр частиц указан как х нм, то обычно распределение частиц составляет в среднем указанное значение, и по меньшей мере 50% (например, >60, >70, >80, >90% или более) этих частиц будет иметь диаметр в пределах ±25%.

3йМРЬ может быть преимущественно использован в комбинации с эмульсией масло-в-воде. В основном все 3йМРЬ могут быть локализованы в водной фазе эмульсии.

3йМРЬ может быть использован в чистом виде или в комбинации с одним или несколькими другими соединениями. Так, например, известно, что 3ЙМРБ может быть использован в комбинации с сапонином 0821 [162] (в эмульсии масло-в-воде [163]), с иммуностимулирующим олигонуклеотидом, с 0821 и иммуностимулирующим олигонуклеотидом, с фосфатом алюминия [164], с гидроксидом алюминия [165] или фосфатом алюминия и гидроксидом алюминия.

Предпочтительные методы усиления адъювантных свойств.

Схемы введения доз согласно изобретению включают первое введение адъювантой вакцины против гриппа. Предпочтительными адъювантами, используемыми в этой первой вакцине, являются эмульсии масло-в-воде.

- 16 017441

Вторая доза, используемая в схеме 2-дозового введения, предпочтительно вводится без адъюванта. В качестве альтернативы она может быть введена с адъювантом, который отличается от адъюванта, присутствующего в первой дозе. Если первая доза в качестве адъюванта содержит эмульсию масло-в-воде, то предпочтительным адъювантом, используемым во второй, адъювант-содержащей дозе, является соль алюминия.

Фармацевтические композиции.

Композиции согласно изобретению являются фармацевтически приемлемыми и обычно присутствуют в водной форме. Помимо антигена (и адъюванта, если он используется), такие композиции могут включать и другие компоненты, например такими компонентами обычно являются один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и/или наполнителей. Подробное обсуждение таких компонентов можно найти в работе [166].

Указанная композиция может включать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Однако предпочтительно, чтобы вакцина, по существу, не содержала (т.е. содержала менее чем 5 мкг/мл) соединения ртути, например тиомерсала [10, 167]. Более предпочтительными являются вакцины, не содержащие ртути. Особенно предпочтительными являются вакцины, не содержащие консервантов.

Для регуляции тоничности в композицию предпочтительно включать физиологическую соль, такую как соль натрия. Предпочтительным является хлорид натрия (№С1), который может присутствовать в количестве 1-20 мг/мл. Другими солями, которые могут присутствовать, являются хлорид калия, бифосфат калия, дегидрат динатрийфосфата, хлорид магния, хлорид кальция и т.п.

Композиции обычно имеют осмомоляльность, составляющую 200-400 мОсм/кг, предпочтительно 240-360 мОсм/кг, более предпочтительно 290-310 мОсм/кг. Ранее сообщалась, что осмомоляльность не влияет на боль, вызываемую вакцинацией [168], но тем не менее ее предпочтительно поддерживать в этом интервале.

Композиции могут включать один или несколько буферов. Типичными буферами являются фосфатный буфер; трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (в частности, с гидроксидом алюминия, используемого в качестве адъюванта) или цитратный буфер. Обычно буферы содержатся в концентрации 5-20 мМ.

рН композиции обычно составляет 5,0-8,1, а чаще всего 6,0-8,0, например 6,5-7,5 или 7,0-7,8. Поэтому способ согласно изобретению может включать стадию коррекции рН основной массы вакцины до ее упаковки.

Такая композиция предпочтительно является стерильной. Указанная композиция предпочтительно является апирогенной, например она содержит <1 ЭЕ (эндотоксиновых единиц, стандартная мера) на дозу, а предпочтительно <0,1 ЭЕ на дозу. Эта композиция предпочтительно не содержит глютена.

Указанная композиция может включать материал для одной иммунизации либо она может включать материал для множества иммунизаций (т.е. набор из дробных доз). Материалы для дробных доз предпочтительно включают консерванты. В качестве альтернативы (или в дополнение) включению консерванта в композиции для введения дробных доз, такие композиции могут содержаться в контейнере, имеющем асептический адаптер для удаления материала.

Вакцины против гриппа обычно вводят в объеме примерно 0,5 мл, хотя детям (например, в возрасте до 36 месяцев) может быть введена половинная доза (т.е. примерно 0,25 мл).

Композиции и наборы предпочтительно хранят при 2-8°С. Они не должны быть замороженными. В идеальном случае они должны быть защищены от прямого воздействия света.

Наборы согласно изобретению.

Настоящее изобретение включает наборы, содержащие первую и другую вакцины против гриппа. Одним из компонентов такого набора является первая адъювантная вакцина, а другим компонентом такого набора является вторая вакцина, необязательно содержащая адъювант. Эти два компонента могут содержаться по отдельности либо они могут быть введены пациенту, по существу, в различные периоды времени.

Каждая отдельная вакцина в данном наборе может присутствовать в форме, готовой к употреблению, либо она может быть приготовлена для немедленного приема. Такая форма для немедленного приема позволяет отдельно хранить адъювант и антиген вплоть до их применения, что является особенно ценным при использовании эмульсии масло-в-воде в качестве адъюванта.

Если вакцину приготавливают в форме для немедленного приема, то ее компоненты в наборе могут быть физически отделены друг от друга, и такое разделение может быть осуществлено различными методами. Так, например, два компонента могут присутствовать в двух отдельных контейнерах, таких как сосуды. Содержимое этих двух сосудов может быть затем смешано, например, путем удаления содержимого одного сосуда и его добавления в другой сосуд или путем отдельного удаления содержимого обоих сосудов и их смешивания в третьем контейнере. В предпочтительном варианте один из компонентов указанного набора присутствует в шприце, а другой - в контейнере, таком как сосуд. Шприц (например, с иглой) может быть использован в целях введения его содержимого в другой контейнер для смешивания, а затем эта смесь может быть набрана в шприц. Смешанное содержимое шприца может быть затем введено пациенту, обычно с помощью новой стерильной иглы. Упаковка одного компонента в шприце по

- 17 017441 зволяет избежать необходимости использования отдельного шприца для введения композиции пациенту.

В другом предпочтительном варианте два компонента вакцины находятся в одном и том же шприце, но отдельно, например в двухкамерном шприце, таком как шприц, описанный в работах [169-176] и т.п. При приведении этого шприца в действие (например, во время введения вакцины пациенту) содержимое двух камер смешивается. Такое устройство позволяет избежать необходимости проведения отдельной стадии смешивания во время его применения.

Если вакцину приготавливают для немедленного приема, то ее компоненты обычно присутствуют в водной форме. В некоторых вариантах один компонент (обычно антигенный, но не адъювантный) присутствует в сухой форме (например, в лиофилизованной форме), а другой компонент присутствует в водной форме. Два компонента могут быть смешаны для реактивации сухого компонента и получения водной композиции для ее введения пациенту. Лиофилизованный компонент обычно присутствует в сосуде, но не в шприце. Осушенными компонентами могут быть стабилизаторы, такие как лактоза, сахароза или маннит, а также их смеси, например смеси лактозы/сахарозы, смеси сахарозы/маннита и т.п. В одном из возможных устройств используется водный адъювантный компонент в предварительно заполненном шприце и лиофилизованный антигенный компонент в сосуде.

Упаковка, композиций или компонентов набора.

Подходящими контейнерами для композиций согласно изобретению (или компонентов набора) являются сосуды, шприцы (например, одноразовые шприцы), спреи для интраназального введения и т.п. Такие контейнеры должны быть стерильными.

Если композиция/компонент присутствует в сосуде, то такой сосуд предпочтительно должен быть изготовлен из стекла или пластика. Такой сосуд предпочтительно стерилизуют, а затем в него добавляют композицию. Во избежание проблем, связанных с возникновением аллергии у пациентов на латекс, такие сосуды предпочтительно герметично закрывают пробкой, не содержащей латекса, при этом предпочтительно, чтобы латекс отсутствовал во всех упаковочных материалах. Такой сосуд может включать одну дозу вакцины либо он может включать более чем одну дозу (сосуд для многоразового введения доз), например, 10 доз. Предпочтительно, чтобы эти сосуды были изготовлены из прозрачного стекла.

Сосуд может иметь крышку (например, люэровский наконечник), сделанную так, чтобы содержимое предварительно заполненного сосуда могло быть введено через крышку, содержимое шприца могло быть введено в сосуд (например, для разведения в нем лиофилизованного материала), а содержимое сосуда могло быть введено обратно в шприц. После удаления шприца из сосуда к этому шприцу может быть подсоединена игла, и композиция может быть введена пациенту. Крышка предпочтительно расположена внутри герметика или покрытия так, чтобы такой герметик или покрытие могли быть удалены для обеспечения доступа к крышке. Сосуд может иметь крышку, позволяющую удалять его содержимое в асептических условиях, в частности в сосудах для многократного введения доз.

Если композиция/компонент упакованы в шприц, то такой шприц может иметь подсоединенную к нему иглу. Если игла не подсоединена, то она может быть помещена отдельно для последующего подсоединения к шприцу и его использования. Такая игла может быть помещена в футляр. Предпочтительными являются безопасные иглы. Обычно используются 1-дюймовые иглы калибра 23, 1-дюймовые иглы калибра 25 и 5/8-дюймовые иглы калибра 25. Для облегчения регистрации шприцы могут быть снабжены отрывными этикетками, на которых могут быть напечатаны номер партии, время года заболевания гриппом и дата истечения срока службы вакцины. Предпочтительно, чтобы поршень в шприце имел стопор для предупреждения случайного выпадения поршня из шприца во время аспирации. Шприцы могут иметь крышку из латексного каучука и/или поршень. Одноразовые шприцы содержат одну дозу вакцины. Обычно шприц имеет колпачок для герметизации наконечника до подсоединения к нему иглы, и этот колпачок предпочтительно изготавливают из бутилового каучука. Если шприц и иглу упаковывают по отдельности, то такую иглу предпочтительно снабжают футляром из бутилового каучука. Предпочтительными являются шприцы, имеющиеся в продаже под торговым знаком Τίρ-Ьок™.

Для облегчения введения детям контейнеры могут быть маркированы с указанием половинной дозы по объему. Так, например, шприц, содержащий дозу 0,5 мл, может иметь отметку, указывающую на объем 0,25 мл.

При использовании стеклянного контейнера (например, шприца или сосуда) предпочтительно, чтобы такой контейнер был изготовлен из боросиликатного стекла, но не из натриево-кальциевого стекла.

Набор или композиция могут быть упакованы (например, в одной упаковке) вместе с вкладышем, включающим подробное описание вакцины, например инструкции по ее введению, подробное описание антигенов, содержащихся в вакцине, и т.п. Инструкции могут также включать предупреждения, например, о наличии раствора адреналина, легкодоступного в случае анафилактической реакции после вакцинации и т.п.

Способы лечения и способы введения вакцины.

Композиции согласно изобретению могут быть использованы для введения человеку. Иммунный ответ, индуцируемый способами согласно изобретению, обычно включает гуморальный ответ, предпочтительно протективный гуморальный ответ. Методы оценки гуморальных ответов, нейтрализующей способности и степени защиты после введения вакцины против гриппа хорошо известны специалистам. Ис

- 18 017441 следования, проводимые с участием человека, показали, что титры антител против гемаглютинина вируса гриппа человека коррелируют с их защитным действием (титр, при котором наблюдается ингибирование гемаглютинации в пробе сыворотки, составляющий примерно 30-40, дает приблизительно 50% защиту от инфицирования гомологичным вирусом) [177]. Гуморальные ответы обычно измеряют по ингибированию гемаглютинации, а также по микронейтрализации, простой радиальной иммунодиффузии (8Κ1Ό) и/или простому радиальному гемолизу (8КН). Техника проведения этих анализов хорошо известна специалистам.

Композиции согласно изобретению могут быть введены различными методами. Наиболее предпочтительным методом иммунизации является внутримышечная инъекция (например, в руку или в ногу), но могут быть применены и другие способы введения, включая подкожные, интраназальные [178-180], пероральные [181], внутрикожные [182, 183], чрескожные, трансдермальные инъекции [184] и т.п.

Вакцины согласно изобретению могут быть использованы для лечения детей и взрослых. В настоящее время вакцины против гриппа рекомендуют для иммунизации детей и взрослых, например, начиная с возраста в 6 месяцев. Так, например, возраст пациента может составлять менее чем 1 год, 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или по меньшей мере 55 лет. Предпочтительными пациентами для введения вакцин являются пожилые люди (например, >50 лет, >60 лет, предпочтительно >65 лет), дети (например, <5 лет), госпитализированные пациенты, медицинский персонал, сотрудники военных ведомств и рядовые военные, беременные женщины, хронические больные, пациенты с иммунодефицитом, пациенты, которым было введено противовирусное соединение (например, озелтамивир или занамивир; см. ниже) за 7 дней до введения вакцины; люди, страдающие аллергией на яйца, и люди, путешествующие заграницу. Однако указанные вакцины являются подходящими не только для этих групп лиц и, по существу, могут быть использованы для введения всему населению. При пандемиях такие вакцины желательно вводить людям всех возрастных групп.

Предпочтительные композиции согласно изобретению удовлетворяют 1, 2 или 3 критериям эффективности в соответствии с руководством СРМР (Комитета по патентованным лекарственным препаратам). Для взрослых людей (18-60 лет) такими критериями являются: (1) серологическая защита >70%; (2) серологическая конверсия >40%; и/или (3) увеличение СМТ (среднего геометрического титра) в >2,5 раза. Для пожилых людей (>60 лет) такими критериями являются:

(1) серологическая защита >60%;

(2) серологическая конверсия >30% и/или (3) увеличение СМТ в >2 раза.

Эти критерии основаны на исследованиях с открытой меткой, проводимых по меньшей мере для 50 пациентов.

Лечение осуществляют по схеме введения дробных доз. Как упоминалось выше, в различных дозах обычно используется одна и та же форма антигена и по меньшей мере один гемаглютинин одного и того же подтипа. При этом предпочтительно, чтобы все дозы были введены либо парентерально, либо через слизистую. Такие дозы обычно вводят одним и тем же способом введения, например парентерально, а именно путем внутримышечной (1.т.) инъекции.

Дробные дозы обычно вводят с перерывом по меньшей мере в 1 неделю (например, по меньшей мере примерно через 2 недели, примерно через 3 недели, примерно через 4 недели, примерно через 6 недель, примерно через 8 недель, примерно через 10 недель, примерно через 12 недель, примерно через 16 недель и т.п.).

Схемами введения доз согласно изобретению являются предпочтительно схемы 2-дозового введения. Дополнительные дозы могут быть введены позже при наступлении времени года, на которое приходится пик заболеваемости гриппом, обычно в формате введения 1 дозы, но в соответствии с настоящим изобретением стандартная иммунизация в данное время года (например, в течение одного периода времени, составляющего 6 или 12 месяцев) включает введение 2 доз. В рассмотренной схеме введение дополнительных доз (например, 3- или 4-й дозы) не является предпочтительным, поскольку в этом случае необходимо введение дополнительного антигена. Однако если в указанной схеме предусматривается введение 3-й дозы, то эта третья доза может быть такой же, как и первая доза, после которой вводится вторая доза, либо она может быть такой же, как вторая доза, например такая схема может включать введение адъювантной, адъювантной и безадъювантной дозы либо введение адъювантной, безадъювантной и безадъювантной дозы.

Вакцины, полученные способом согласно изобретению, могут быть введены пациентам, по существу, одновременно (например, во время медицинской консультации или во время визита к лечащему врачу или в центр вакцинации) с другими вакцинами, например, по существу, одновременно с введением вакцины против кори, вакцины против паротида, вакцины против коревой краснухи, вакцины против паротида-коревой краснухи, вакцины против ветряной оспы, ассоциированной вакцины против паротида-коревой краснухи, вакцины против дифтерии, вакцины против столбняка, вакцины против коклюша, вакцины против дифтерии-столбняка-коклюша, конъюгированной вакцины против Н.тПиепхае типа Ь, вакцины на основе инактивированного полиовируса, вакцины против вируса гепатита В, менингококко

- 19 017441 вой конъюгированной вакцины (такой как тетравалентная вакцина А-С-^135-У), вакцины против респираторно-синцитиального вируса, пневмококковой конъюгированной вакцины и т.п. Введение вакцины в основном одновременно с пневмококковой вакциной или с менингококковой вакциной является особенно подходящим для пожилых пациентов.

Аналогичным образом, вакцины согласно изобретению могут быть введены пациентам в основном одновременно (например, во время медицинской консультации или во время визита к лечащему врачу) с введением противовирусного соединения, в частности противовирусного соединения, обладающего активностью, направленной против вируса гриппа (например, с озелтамивиром и/или занамивиром). Такими противовирусными соединениями являются ингибиторы нейраминидазы, такие как (3В,4В,58)-4ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота или 5-(ацетиламино)-4[(аминоиминометил)амино]-2,6-ангидро-3,4,5-тридезокси-О-глицеро-О-галактонон-2-енойная кислота, включая их сложные эфиры (например, этиловые эфиры) и их соли (например, фосфатные соли). Предпочтительным противовирусным соединением является (3В,4В,58)-4-ацетиламино-5-амино-3-(1этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота, а также их этиловый эфир и фосфат (1:1), также известный как фосфат озелтамивира (ТАМ1РЬи™).

Общие определения.

Термин содержащий охватывает понятие включающий, а также составляющий; например, композиция, включающая X, может состоять исключительно из X либо она может включать какойлибо дополнительный компонент, например Χ+Υ.

Термин по существу не исключает понятия полностью; например, данная композиция, которая по существу, не содержит Υ, может абсолютно не содержать Υ. Если это необходимо, то слово по существу может быть исключено из определений настоящего изобретения.

Термин примерно, относящийся к численным значениям х, означает, например, х±10%.

Если это не оговорено особо, то в способе, включающем стадию смешивания двух или более компонентов, не требуется соблюдения какого-либо конкретного порядка смешивания. Таким образом, компоненты могут быть смешаны в любом порядке. В случае присутствия трех компонентов два компонента могут быть объединены друг с другом, а затем полученная комбинация может быть объединена с третьим компонентом и т. п.

Если при культивировании клеток используются материалы животного происхождения (в частности, материалы, полученные от коров), то они должны быть выделены из источников, не зараженных трансмиссивной губчатой энцефалопатией (Т8Е), в частности не зараженных коровьей губчатой энцефалопатией (В8Е). В целом, предпочтительно, чтобы клетки были культивированы при полном отсутствии материалов животного происхождения.

Если соединение вводят в организм как часть композиции, то такое соединение может быть альтернативно заменено подходящим пролекарством.

Если в методах конструирования мутантного вируса или в методах обратной генетики используется клеточный субстрат, то предпочтительно, чтобы такой субстрат был разрешен к применению для приготовления человеческой вакцины, например, в соответствии с общим положением главы 5.2.3 Европейской фармакопеи.

Краткое описание графического материала

На фигуре проиллюстрирован ЕЫ8А-анализ 1дС-ответов против НА у мышей, которым вводили различные вакцины против гриппа.

Способы осуществления настоящего изобретения

Гемаглютинин был выделен из штамма Н5Ы1 вируса птичьего гриппа и был приготовлен для внутримышечной инъекции при концентрации 0,2 мкг на дозу (в объеме 50 мкл на дозу). Были приготовлены две вакцины: первая вакцина была безадъювантной; а вторая в качестве адъюванта содержала эмульсию МР59 в отношении 1:1 по объему. Вакцины были введены четырем группам самок мышей Ва1Ь/с в возрасте 8 недель, на дни 0 и 28. На 14- и 42-й дни у мышей брали кровь и проводили ЕЫБА-анализ на вырабатывание иммунных ответов против НА. Результаты представлены ниже (см. также фигуру).

Группа	А	В	С	О
День 0	Без адъюванта	МГ59	Без адъюванта	МГ5 9
День 28	Без адъюванта	Без адъюванта	МГ59	МГ59
Титр (день 14)	13	313	6	271
Респонденты	3/10	10/10	3/10	10/10
Титр (день 42}	7125	75922	42219	148831
Респонденты	10/10	10/10	10/10	10/10

- 20 017441

Таким образом, адъювант позволяет увеличить число респондентов после первой иммунизации (при сравнении групп А и В). Включение адъюванта в любую или в обе дозы приводит к вырабатыванию специфического гуморального ответа против НА, уровень которого значительно превышает уровень ответа, индуцированного двумя дозами безадъювантной вакцины (при сравнении групп В, С и Ό с группой А). Кроме того, животным, иммунизованным адъювантной вакциной, может быть введена бустер-доза безадъювантной вакцины, в результате чего достигаются более высокие титры, чем титры, обнаруживаемые при введении безадъювантной вакцины и бустер-дозы адъювантной вакцины (при сравнении групп В и С). Хотя абсолютные титры у группы В были ниже, чем у группы Ό, однако такой ответ был более чем адекватным. Таким образом, типы адъюванта могут быть сохранены для использования только в первой дозе при 2-дозовой схеме введения.

Следует отметить, что настоящее изобретение описано только в целях иллюстрации и в него могут быть внесены модификации, не выходящие за рамки существа и объема настоящего изобретения.

Библиография

Содержание указанных работ вводится в настоящее описание посредством ссылки.

[1] Но1тез е! а1. (2005). 8с1епсе, 309:989.

[2] Сиу е! а1. (1998). С1т. О|адп. ЬаЬ. 1ттипо1. 5:732-6.

[3] ЭДО 96/37624.

[4] ЭДО 98/46262.

[5] ЭДО 95/18861.

[6] ЭДО 02/28422.

[7] ЭДО 02/067983.

[8] ЭДО 02/074336.

[9] ЭДО 01/21151.

[10] ЭДО 02/097072.

[11] ЭДО 2005/113756.

[12] Нискпейе е! а1. (2003). Ме11юйз Епхуто1. 373:74-91.

[13] Нег1осйег е! а1. (2004). 1. 1пГес!. ϋΐδ. 190(9):1627-30.

[14] Ье е! а1. (2005). Ыа!иге. 437(7062):1108.

[15] ЭДог1й Неа1!1 Огдатзайоп (2005). Етегдтд 1пГес1юи5 Пкеазез. 11(10):1515-21.

[16] НоГГтапп е! а1. (2002). Уассте. 20:3165-3170.

[17] 8иЬЬагао е! а1. (2003). У1го1оду. 305:192-200.

[18] Ьт е! а1. (2003). Уйо1о§у. 314:580-590.

[19] О/ак1 е! а1. (2004). 1. Упо1. 78:1851-1857.

[20] ЭДеЬЬу е! а1. (2004). Ьапсе!. 363:1099-1103.

[21] ЭДО 00/60050.

[22] ЭДО 01/04333.

[23] И8 6649372.

[24] Ыеитапп е! а1. (2005). Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. И8А. 102:16825-9.

[25] ЭДО 2006/067211.

[26] ЭДО 01/83794.

[27] НоГГтапп е! а1. (2000). У1го1о§у. 267(2):310-7.

[28] ЭДО 97/37000.

[29] Вгапйз е! а1. (1999). Όον. Вю1. 81апй. 98:93-100.

[30] На1репп е! а1. (2002). Уассте. 20:1240-7.

[31] Тгее е! а1. (2001). Уассте. 19:3444-50.

[32] КлЧпег е! а1. (1998). Уассте. 16:960-8.

[33] Клйпег е! а1. (1999). 1)е\. Вю1. 81апй. 98:101-110.

[34] ВгиЫ е! а1. (2000). Уассте. 19:1149-58.

[35] Раи е! а1. (2001). Уассте. 19:2716-21.

[36] 1Шр://\\л\лу.а1сс.огд/ [37] ййр://1оси8.итйп).ейи/ [38] ЭДО 03/076601.

[39] ЭДО 2005/042728.

[40] ЭДО 03/043415.

[41] ЭДО 01/85938.

[42] ЭДО 2006/108846.

[43] ЕР-А-1260581 (ЭДО 01/64846).

[44] ЭДО 2006/071563.

[45] ЭДО 2005/113758.

[46] ЭДО 2006/027698.

[47] ЭДО 97/37000.

[48] ЭДО 03/023021.

- 21 017441 [49] νθ 03/023025.

[50] νθ 97/37001.

[51] νθ 01/22992.

[52] Нейте е! а1. (2004). Уйиз Вез. 103(1-2):163-71.

[53] Тгеапог е! а1. (1996). 1. 1пГес!. Б1з. 173:1467-70.

[54] Кейе1 е! а1. (1996). СЛп. Б1адп. ЬаЬ. 1ттипо1. 3:507-10.

[55] БипйЫай (2001). Вю!есйпо1оду апй Αι^ΐΓ^ό В1осйет1зГгу. 34:195-197.

[56] Сшйапсе Гог 1пйизГгу: В1оапа1у!1са1 МеГЛой УаййаЛоп. и.8. БерагГтеп! оГ НеаЛЛ апй Нитап 8егу1сез Еоой апй Бгид Αйтт^зΐ^а!^оη Сеп!ег Гог Бгид Еуа1иаЛоп апй Везеагсй (СБЕВ) Сеп!ег Гог Уе!егтагу МеФсте (СУМ). Мау 2001.

[57] Л е! а1. (2002). В|о1ес11пк.|иез. 32:1162-7.

[58] Впддз (1991). 1. Рагеп!ег 8с1. Тесйпо1. 45:7-12.

[59] БаЬцат е! а1. (1998). Нит Сепе Тйег. 9:1173-80.

[60] Бок!еГГ е! а1. (2001).Вю1одка1з. 29:123-32.

[61] ЕР-В-0870508.

[62] И8 5948410.

[63] νθ 2007/052163.

[64] И8 6355271.

[65] νθ 00/23105.

[66] И8 4680338.

[67] И8 4988815.

[68] νθ 92/15582.

[69] 8!ап1еу (2002). СЛп. Ехр. Бегта!о1. 27:571-577.

[70] ν е! а1. (2004). Αιιΐι\ιπι1 Вез. 64(2):79-83.

[71] УазЛакоз е! а1. (2000). Се11 1ттипо1. 204(1):64-74.

[72] патенты И8 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5482936, 5494916, 5525612, 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 6660735, 6660747, 6664260, 6664264, 6664265, 6667312, 6670372, 6677347, 6677348, 6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000 и 6924293.

[73] 1опез (2003). Сигг. Орш. ГпуезЛд Бгидз. 4:214-218.

[74] νθ 2004/060308.

[75] И8 6924271.

[76] И8 2005/0070556.

[77] И8 5658731.

[78] νθ 2004/064759.

[79] И8 5011828.

[80] νθ 2004/87153.

[81] И8 6605617.

[82] νθ 02/18383.

[83] νθ 2004/018455.

[84] νθ 03/082272.

[85] νθ 2006/002422.

[86] 1окпзоп е! а1. (1999). Вюогд. Мей. Скет. Бей. 9:2273-2278.

[87] Еуапз е! а1. (2003). Ехрей Веу. Уасстез. 2:219-229.

[88] Αпй^^апоν е! а1. (1998). Вюта!епа1з. 19:109-115.

[89] Раупе е! а1. (1998). Αйν Бгид Бейуегу Веу1ете. 31:185-196.

[90] И8 5057540.

[91] νθ 96/33739.

[92] ЕР^-0109942.

[93] νθ 96/11711.

[94] νθ 00/07621.

[95] Вагг е! а1. (1998). Αйνапсей Бгид Бейуегу Веу1етез. 32:247-271.

[96] 8)о1апйеге1 е! а1. (1998). Αйνапсей Бгид БеЛуегу Веу1етез. 32:321 -338.

[97] Р1//а е! а1. (2000). 1п!. 1. Мей. М1сгоЫо1. 290:455-461.

[98] νθ 95/17211.

[99] νθ 98/42375.

[100] 8тдй е! а1. (2001). 1. Соп!. Ве1еазе. 70:267-276.

[101] νθ 99/27960.

[102] И8 6090406.

[103] И8 5916588.

[104] ЕР^-0626169.

[105] νθ 99/52549.

- 22 017441 [106] АО 01/21207.

[107] АО 01/21152.

[108] АО 02/072012.

[109] Эуакопоуа е! а1. (2004). 1п!. 1ттипорйагтасо1. 4(13):1615-23.

[110] ЕВ-2859633.

[111] 81дпоге1й & Наббеп (2003). Ιηΐ. 1ттипорйагтасо1. 3(8): 1177-86.

[112] АО 2004/064715.

[113] Эе ЫЬего е! а1., №11иге Веу1еик 1ттипо1оду, 2005, 5:485-496 [114] И8 5936076.

[115] Ок1 е! а1., 1. Сйп. 1пуекйд., 113: 1631-1640.

[116] И8 2005/0192248.

[117] Уапд е! а1., Апдеи. Сйет. 1п!. Еб., 2004, 43:3818-3822.

[118] АО 2005/102049.

[119] Сокк е! а1., к Ат. Сйет. 8ос., 2004, 126:13602-13603.

[120] АО 03/105769.

[121] Соорег (1995). Рйагт. В1о!есйпо1. 6:559-80.

[122] АО 03/011223.

[123] Мега1б1 е! а1. (2003). Уассте. 21:2485-2491.

[124] Ра.)ак е! а1. (2003). Уассте. 21:836-842.

[125] И8 6586409.

[126] Аопд е! а1. (2003). к Сйп. Рйагтасо1. 43(7):735-42.

[127] И8 2005/0215517.

[128] АО 90/14837.

[129] Робба & Эе1 Сшбке (2003). Ехрей Веу. Уасстек. 2:197-203.

[130] Робба (2001). Уассте. 19:2673-2680.

[131] Уассте Эечдп: Тйе 8иЬиш! апб Аб]иуап! Арргоасй (ебк. Роие11 & Ыеитап) Р1епит Ргекк 1995 (Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х).

[132] Уассте АбщуапО: Ргерагайоп Ме!йобк апб Векеагсй Рго!осо1к (Уо1ите 42 ок Ме!йобк т Мо1еси1аг Мебкте кепек). Ι8ΒΝ: 1-59259-083-7. Еб. О'Надап.

[133] А1йкоп & Вуагк (1992). Век 1ттипо1. 143:519-25.

[134] Напйагап е! а1. (1995). Сапсег Век. 55:3486-9.

[135] И8 2007/014805.

[136] АО 95/11700.

[137] И8 6080725.

[138] АО 2005/097181.

[139] АО 2006/113373.

[140] Нап е! а1. (2005). 1трас! ок Уйатт Е оп 1ттипе Еипсйоп апб 1пкесйоик Э|кеакек т !йе Адеб а! №.11пНоп. 1ттипе кипсйопк апб Неа1!й ЕигоСопкегепсе, Рапк, 9-10 .Типе 2005.

[141] И8 6630161.

[142] Капб1та11а е! а1. (2003). №.1с1ею Ас1бк Векеагсй. 31:2393-2400.

[143] АО 02/26757.

[144] АО 99/62923.

[145] Кпед (2003). Уинге Мебкте. 9:831-835.

[146] МсС1икк1е е! а1. (2002). ЕЕМ8 1ттипо1оду апб Меб1са1 М1сгоЫо1оду. 32:179-185.

[147] АО 98/40100.

[148] И8 6207646.

[149] И8 6239116.

[150] И8 6429199.

[151] Капб1та11а е! а1. (2003). Вюсйет1са1 8оОе1у Тгапкасйопк. 31 (рай 3):654-658.

[152] В1аские11 е! а1. (2003). к 1ттипо1. 170:4061-4068.

[153] Кпед (2002). Тгепбк 1ттипо1. 23:64-65.

[154] АО 01/95935.

[155] Капб1та11а е! а1. (2003). ВВВС. 306:948-953.

[156] Вйада! е! а1. (2003). ВВВС. 300:853-861.

[157] АО 03/035836.

[158] АО 01/22972.

[159] Тйотркоп е! а1. (2005). к Ьеикос Вю1. 78: 'Тйе 1ои-!ох1сйу уегктпк ок ЬР8, МРЬ® аб]иуап1 апб ВС529, аге екйаеп! аб]иуап!к ког СЭ4+ Т се11к'.

[160] ИК ра!еп! аррйсайоп СВ-А-2220211.

[161] АО 94/21292.

[162] АО 94/00153.

[163] АО 95/17210.

- 23 017441 [164] АО 96/26741.

[165] АО 93/19780.

[166] Оеппаго (2000) Вет1пд!оп: Тке 8с1епсе апй Ргасйсе оГ Ркагтасу. 20^!Н βάίΐίοη, 18В№ 0683306472.

[167] ВапхкоГГ (2000). 1ттипо1оду Ьейегз. 71:91-96.

[168] №пу е1 а1. (2001). Vасс^ηе. 27:3645-51.

[169] АО 2005/089837.

[170] И8 6692468.

[171] АО 00/07647.

[172] АО 99/17820.

[173] И8 5971953.

[174] И8 4060082.

[175] ΕΡ-Α-0520618.

[176] АО 98/01174.

[177] Ро!!ег & ОхГогй (1979). Вг. Мей. Ви11. 35: 69-75.

[178] ОгеепЬаит е! а1. (2004). νηΠικ. 22:2566-77.

[179] 2игЬпддеп е! а1. (2003). Ехрей Вет. νηΠικδ. 2:295-304.

[180] Рккслк (2003). I. Αт. Ркагт. Αδ^. (Аа§к ОС). 43:728-30.

[181] Мапп е! а1. (2004). Vасс^ηе. 22:2425-9.

[182] Ыа1реип е! а1. (1979). Αт. I. РиЬкс. ИеаИЬ. 69:1247-50.

[183] ИегЬег! е! а1. (1979). I. 1пГес!. ϋΐδ. 140:234-8.

[184] Скеп е! а1. (2003). Vасс^ηе. 21:2830-6.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ иммунизации пациента против инфицирования вирусом гриппа, где иммунизация предусматривает стадии (1) введения дозы вакцины на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом, который содержит эмульсию типа масло-в-воде; и (ίί) введения дополнительной дозы вакцины на основе вируса гриппа, не содержащей адъювант либо содержащей второй адъювант, отличающийся от первого адъюванта.
2. 2. Способ по п.1, где дозу на стадии (ί) и/или дополнительную дозу вводят посредством внутримышечной инъекции.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где дополнительная доза не содержит адъювант.
4. 4. Способ по п.1 или 2, где дополнительная доза содержит адъювант, отличающийся от первого адъюванта.
5. 5. Набор для иммунизации против гриппа, включающий (ί) первую вакцину на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом, который содержит эмульсию типа масло-в-воде, для внутримышечной инъекции и (ίί) вторую вакцину на основе вируса гриппа, не содержащую адъювант либо содержащую второй адъювант, отличающийся от первого адъюванта.
6. 6. Применение (ί) первой вакцины на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом, который содержит эмульсию типа масло-в-воде, для внутримышечной инъекции и (ίί) второй вакцины на основе вируса гриппа, не содержащей адъювант либо содержащей второй адъювант, отличающийся от первого адъюванта, в изготовлении набора для иммунизации пациента против гриппа.
7. 7. Способ иммунизации пациента против инфицирования вирусом гриппа, где указанному пациенту предварительно вводят внутримышечным путем вакцину на основе вируса гриппа в комбинации с первым адъювантом, который содержит эмульсию типа масло-в-воде, и затем вводят пациенту дополнительную дозу вакцины на основе вируса гриппа, не содержащей адъювант либо содержащей второй адъювант, отличающийся от первого адъюванта.
8. 8. Способ по п.7, где дополнительную дозу вводят посредством внутримышечной инъекции.
9. 9. Способ по любому из пп.1-4, 7 и 8, где указанные вакцины содержат гемаглютинин в количестве менее 15 мкг/штамм/вакцину.
10. 10. Способ по любому из пп.1-4 и 7-9, где указанные вакцины на основе вируса гриппа содержат антиген вируса гриппа, происходящий из вируса гриппа А подтипа Η1, Η2, Η3, Η5, Η7 или Η9.
11. 11. Способ по любому из пп.1-4 и 7-10, где эмульсия типа масло-в-воде включает сквален.
12. 12. Способ по любому из пп.1-4 и 7-10, где эмульсия типа масло-в-воде включает моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, триолеат сорбитана, лецитин или октоксинол-9.
13. 13. Набор по п.5, где указанные вакцины содержат гемаглютинин в количестве менее 15 мкг/штамм/вакцину.
14. 14. Набор по п.5 или 13, где указанные вакцины на основе вируса гриппа содержат антиген вируса гриппа, происходящий из вируса гриппа А подтипа Η1, Η2, Η3, Η5, Η7 или Η9.
15. 15. Набор по любому из пп.5, 13 или 14, где эмульсия типа масло-в-воде включает сквален.
16. 16. Набор по любому из пп.5, 13 или 14, где эмульсия типа масло-в-воде включает моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, триолеат сорбитана, лецитин или октоксинол-9.

    - 24 017441
17. 17. Применение по п.6, где указанные вакцины содержат гемаглютинин в количестве менее 15 мкг/штамм/вакцину.
18. 18. Применение по п.6 или 17, где указанные вакцины на основе вируса гриппа содержат антиген вируса гриппа, происходящий из вируса гриппа А подтипа Н1, Н2, Н3, Н5, Н7 или Н9.
19. 19. Применение по любому из пп.6, 17 или 18, где эмульсия типа масло-в-воде содержит сквален.
20. 20. Применение по любому из пп.6, 17 или 18, где эмульсия типа масло-в-воде содержит моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, триолеат сорбитана, лецитин или октоксинол-9.