EA016866B1 - Vaccine for specific prophylaxis of influenza - Google Patents
Vaccine for specific prophylaxis of influenza Download PDFInfo
- Publication number
- EA016866B1 EA016866B1 EA201100723A EA201100723A EA016866B1 EA 016866 B1 EA016866 B1 EA 016866B1 EA 201100723 A EA201100723 A EA 201100723A EA 201100723 A EA201100723 A EA 201100723A EA 016866 B1 EA016866 B1 EA 016866B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vaccine
- influenza
- proposed
- antigens
- ratio
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в вакцинопрофилактике, в частности для профилактики гриппа.The invention relates to medicine and can be used in vaccination, in particular for the prevention of influenza.
Уровень техникиState of the art
На протяжении последних десятилетий вакцины против гриппа постоянно совершенствовались с целью уменьшения реактогенности, но при этом зачастую снижалась иммуногенность, что заставляло разработчиков искать более совершенные формы презентации вирусных антигенов в составе вакцин или вводить в состав вакцин адъюванты.Over the past decades, influenza vaccines have been constantly improved in order to reduce reactogenicity, but immunogenicity is often reduced, which forced developers to look for better presentation forms of viral antigens in vaccines or to introduce adjuvants in vaccines.
К настоящему времени для активной профилактики гриппа в основном применяют расщепленные (Ваксигрипп (Санофи, Франция), Флюарикс (ГлаксоСмиткляйн, Бельгия) и виросомальные (Инфлексал (Берна, Швейцария), Инвивак (Солвей, Голландия)) вакцины. Однако существующие вакцины имеют ряд недостатков. Так, вакцины Ваксигрипп и Флюарикс обладают повышенной реактогенностью при сравнительно невысокой иммуногенности и индуцируют преимущественно гуморальный иммунитет. При этом они практически не индуцируют клеточный иммунитет, который очень важен для защиты организма от вируса гриппа.Currently, for active prophylaxis of influenza, split vaccines (Vaksigripp (Sanofi, France), Fluarix (GlaxoSmithklein, Belgium) and virosomal (Inflexal (Bern, Switzerland), Invivak (Solvey, Holland)) vaccines are mainly used. However, existing vaccines have several disadvantages Thus, the vaccines Vaksigripp and Fluariks have increased reactogenicity with relatively low immunogenicity and induce mainly humoral immunity, while they practically do not induce cellular immunity, which is very important for shields the body from the flu virus.
В состав вакцин Инфлексал и Инвивак не входят внутренние антигены (белок нуклеокапсида и мембранный белок), вследствие чего указанные вакцины также не способны активно индуцировать клеточный иммунитет. Кроме того, для формирования виросом в этих вакцинах применяют искусственный липид лецитин, что недостаточно технологично: количество образующихся виросом ниже по сравнению с использованием вирусных фосфолипидов, при этом качество упаковки гемагглютинина в виросомах, содержащих лецитин, существенно хуже.Inflexal and Invivac vaccines do not include internal antigens (nucleocapsid protein and membrane protein), as a result of which these vaccines are also not able to actively induce cellular immunity. In addition, the artificial lipid lecithin is used for the formation of virosomes in these vaccines, which is not technologically advanced: the amount of virosomes formed is lower compared to the use of viral phospholipids, and the quality of hemagglutinin packaging in virosomes containing lecithin is significantly worse.
Наиболее близким аналогом вакцины в соответствии с настоящим изобретением является виросомальная расщепленная вакцина Грифор, описанная в публикации Мельников С.Я. и др. Разработка и доклинические исследование виросомальной расщепленной гриппозной вакцины нового поколения Грифор. ЖМЭИ. 2009. № 1, с. 21-26. Указанная вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и представляет собой смесь высокоочищенных протективных поверхностных и внутренних антигенов вирусов гриппа типа А и типа В. В публикации не приведено соотношение поверхностного антигена (гемагглютинина) к внутренним антигенам (белок нуклеокапсида и мембранный белок) и не обсуждается влияние этого соотношения на реактогенность препарата. Кроме того, в статье не раскрыто соотношение гемагглютинина и фосфолипидов в составе виросом. Размер виросом в описанной в статье вакцины не был определен с достаточной точностью. По приблизительным оценкам он находится в пределах от 90 до 180 нм.The closest analogue of the vaccine in accordance with the present invention is the virosomal split vaccine Grifor, described in the publication Melnikov S.Ya. et al. Development and preclinical study of virosomal split influenza vaccine of the new generation Greifor. ZhMEI. 2009. No. 1, p. 21-26. The indicated vaccine has high antigenic and immunogenic activity and is a mixture of highly purified protective surface and internal antigens of influenza viruses of type A and type B. The publication does not show the ratio of surface antigen (hemagglutinin) to internal antigens (nucleocapsid protein and membrane protein) and does not discuss the effect this ratio on the reactogenicity of the drug. In addition, the ratio of hemagglutinin and phospholipids in virosomes is not disclosed in the article. The virosome size in the vaccine described in the article has not been determined with sufficient accuracy. According to rough estimates, it ranges from 90 to 180 nm.
Таким образом, существует потребность в создании усовершенствованных вакцин для вакцинопрофилактики на основе подробного исследования влияния размера виросом, соотношения гемагглютинина к внутренним антигенам и соотношения гемагглютинина и вирусных фосфолипидов на реактогенность и иммуногенность препарата.Thus, there is a need to create improved vaccines for vaccination based on a detailed study of the effect of virosome size, the ratio of hemagglutinin to internal antigens and the ratio of hemagglutinin and viral phospholipids on the reactogenicity and immunogenicity of the drug.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
На фиг. 1 представлено микроскопическое изображение вакцины в соответствии с настоящим изобретением.In FIG. 1 is a microscopic image of a vaccine in accordance with the present invention.
На фиг. 2 представлена электрофореграмма полуфабрикатов (моновалентов) вакцины в соответствии с настоящим изобретением.In FIG. 2 is an electrophoregram of a semi-finished product (monovalent) of a vaccine in accordance with the present invention.
Описание изобретенияDescription of the invention
Авторы настоящего изобретения установили, что недостатки существующего уровня техники могут быть преодолены созданием вакцины, включающей собственные вирусные фосфолипиды, полученные в процессе расщепления вирионов. Было обнаружено, что применение собственных фосфолипидов вместо липида лецитина приводит к более эффективному и количественному образованию виросом.The authors of the present invention have found that the disadvantages of the existing prior art can be overcome by creating a vaccine that includes its own viral phospholipids obtained in the process of splitting virions. It was found that the use of proprietary phospholipids instead of lecithin lipid leads to a more efficient and quantitative virosome formation.
Было установлено, что оптимальный результат по антигенной активности на животных был получен с виросомальными структурами размером 100-150 нм. Виросомальные структуры меньшего размера (50-90 нм) обладали более низкой антигенной активностью, а структуры размером от 160 до 200 нм в существенной мере задерживались при стерилизующей фильтрации препарата и, таким образом, снижали выход лекарственной формы.It was found that the optimal result of antigenic activity in animals was obtained with virosomal structures 100-150 nm in size. Smaller virosomal structures (50-90 nm) had lower antigenic activity, and structures ranging in size from 160 to 200 nm were significantly delayed by sterilizing filtration of the drug and, thus, reduced the yield of the dosage form.
Содержание фосфолипидов в предлагаемом препарате, превышающее отношение гемагглютинин: фосфолипиды 1:4, приводит к увеличению аггрегативности препарата и увеличению его реактогенности. Соотношение гемагглютинин:вирусные фосфолипиды менее 1:2 приводит к тому, что виросомальные структуры не образуются с высоким выходом, а упаковка гемагглютинина в них является неупорядоченной. В результате этого стабильность в процессе хранения препарата с таким соотношением гемагглютинин:фосфолипиды неудовлетворительно низкая.The content of phospholipids in the proposed drug, exceeding the ratio of hemagglutinin: phospholipids 1: 4, leads to an increase in the aggregation of the drug and an increase in its reactogenicity. The ratio of hemagglutinin: viral phospholipids less than 1: 2 leads to the fact that virosomal structures do not form in high yield, and the packaging of hemagglutinin in them is disordered. As a result, the stability during storage of the drug with such a hemagglutinin: phospholipid ratio is unsatisfactory.
Было также установлено, что применение методики расщепления вирусов детергентом октилглюкозидом позволяет выделить внутренние антигены (белок нуклеокапсида и мембранный белок) в максимально нативном состоянии, что позволяет достигать повышения их иммуногенности по сравнению с известным уровнем техники. Было установлено, что если соотношение гемагглютинина и внутренних антигенов превышает 1:2,5, то полученный препарат обладает повышенной реактогенностью. Если соотношение гемагглютинин:внутренние антигены становится менее 1:0,5, то препарат индуцирует низкийIt was also found that the use of the method of viral cleavage with octyl glucoside detergent allows one to isolate internal antigens (nucleocapsid protein and membrane protein) in the most native state, which allows to increase their immunogenicity compared to the prior art. It was found that if the ratio of hemagglutinin and internal antigens exceeds 1: 2.5, then the resulting preparation has increased reactogenicity. If the ratio of hemagglutinin: internal antigens becomes less than 1: 0.5, then the drug induces a low
- 1 016866 уровень клеточного иммунитета у лабораторных животных и обладает неудовлетворительной протективной активностью.- 1 016866 level of cellular immunity in laboratory animals and has an unsatisfactory protective activity.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается вакцина для профилактики гриппа, представляющая собой смесь поверхностных и внутренних антигенов вирусов гриппа типа А и В, полученная расщеплением очищенных вирионов детергентом октилгликозидом, в которой поверхностные антигены представлены в виде виросом размером 100-150 нм, включающих в свой состав собственные вирусные фосфолипиды, и внутренние антигены представлены в виде мицелл, при соотношении гемагглютинина к внутренним антигенам 1:(0,5-2,5) и соотношении гемагглютинина к вирусным фосфолипидам 1:(2-4), и имеющая коэффициент профилактической эффективности по меньшей мере 75% и индекс эффективности от 6,5 до 8,5.The present invention provides a vaccine for the prevention of influenza, which is a mixture of surface and internal antigens of influenza viruses of type A and B, obtained by cleaving the purified virions with octyl glycoside detergent, in which surface antigens are presented in the form of virosomes with a size of 100-150 nm, including intrinsic viral phospholipids and internal antigens are presented in the form of micelles, with a ratio of hemagglutinin to internal antigens of 1: (0.5-2.5) and a ratio of hemagglutinin to viral phospholipids of 1: (2-4), and having a coefficient of prophylactic efficacy of at least 75% and efficiency index of from 6.5 to 8.5.
В результате проведенных исследований было установлено, что вакцина, характеризуемая вышеуказанными признаками, обладает более высокой иммуногенностью и протективной активностью, а также пониженной реактогенностью по сравнению с вакцинами известного уровня техники. Также создание вакцины в соответствии с настоящим изобретением расширяет арсенал противогриппозных вакцин за счет использования новых методов очистки и стабилизации антигенов.As a result of the studies, it was found that the vaccine characterized by the above features has a higher immunogenicity and protective activity, as well as reduced reactogenicity compared to vaccines of the prior art. Also, the creation of a vaccine in accordance with the present invention expands the arsenal of influenza vaccines through the use of new methods of purification and stabilization of antigens.
Технические результаты изобретения достигаются за счет применения разработанной авторами технологии расщепления и очистки антигенов, раскрытой в патенте РФ 2283139 (опубл. 10.09.2006). В результате применения этой технологии поверхностные антигены в составе предлагаемой вакцины представлены в виде виросом, а внутренние антигены - в виде мицелл с полным сохранением их антигенной нативности.The technical results of the invention are achieved through the application of the technology developed by the authors for cleavage and purification of antigens, disclosed in the patent of the Russian Federation 2283139 (publ. 09/10/2006). As a result of the application of this technology, surface antigens in the composition of the proposed vaccine are presented in the form of virosomes, and internal antigens in the form of micelles with the complete preservation of their antigenic nativeness.
Внутренние антигены вируса гриппа, выделенные с максимальным сохранением их молекулярной структуры, чрезвычайно важны для формирования противогриппозного клеточного иммунитета у вакцинируемых людей, что способствует усилению перекрестного иммунитета против дрейфующих штаммов вируса гриппа.The internal antigens of the influenza virus isolated with the maximum preservation of their molecular structure are extremely important for the formation of influenza cellular immunity in vaccinated people, which enhances cross-immunity against drifting strains of the influenza virus.
Морфологический анализ методом электронной микроскопии (пример 1) показал, что в вакцине в соответствии с настоящим изобретением поверхностные антигены представлены в виде виросом размером 100-150 нм. Анализ состава полипептидов (пример 3) показал, что в вакцине соотношение гемагглютинина и внутренних антигенов находится в диапазоне 1:(0,5-2,5). Анализ состава фосфолипидов (пример 2) показал, что отношение гемагглютинина к фосфолипидам составляет 1:(2-4).Morphological analysis by electron microscopy (example 1) showed that in the vaccine in accordance with the present invention, surface antigens are presented as virosomes with a size of 100-150 nm. Analysis of the composition of the polypeptides (example 3) showed that in the vaccine the ratio of hemagglutinin and internal antigens is in the range of 1: (0.5-2.5). Analysis of the composition of phospholipids (example 2) showed that the ratio of hemagglutinin to phospholipids is 1: (2-4).
Оценки иммуногенных и протективных свойств вакцины в соответствии с настоящим изобретением были получены в результате исследования реакции иммунной системы и организма в целом на экспериментальных животных, а также испытания вакцины на добровольцах.Evaluation of the immunogenic and protective properties of the vaccine in accordance with the present invention were obtained by studying the reaction of the immune system and the body as a whole in experimental animals, as well as testing the vaccine in volunteers.
В результате исследований, описанных в примере 3, было установлено, что вакцина вызывает образование гемагглютинирующих антител у животных с незначительными колебаниями по различным серотипам вируса гриппа, что свидетельствует об эффективности предлагаемой вакцины.As a result of the studies described in example 3, it was found that the vaccine causes the formation of hemagglutinating antibodies in animals with slight fluctuations in various serotypes of the influenza virus, which indicates the effectiveness of the proposed vaccine.
Проведенные доклинические исследования на животных (белых мышах, морских свинках, кроликах) позволили сделать следующие выводы:Conducted preclinical studies in animals (white mice, guinea pigs, rabbits) led to the following conclusions:
по показателям острой и хронической токсичности вакцина для лабораторных животных является нетоксичным и безвредным препаратом;in terms of acute and chronic toxicity, the vaccine for laboratory animals is a non-toxic and harmless drug;
в условиях хронического эксперимента на лабораторных животных выявлено, что вакцина хорошо переносится, не вызывает изменений в поведении, соматических и вегетативных реакций, а также не оказывает местно-раздражающего действия, т.е. обладает низкой реактогенностью.in the conditions of a chronic experiment in laboratory animals, it was found that the vaccine is well tolerated, does not cause changes in behavior, somatic and autonomic reactions, and also does not have a local irritant effect, i.e. possesses low reactogenicity.
На основании I фазы клинического исследования на добровольцах (пример 5А) были сделаны следующие выводы.Based on the first phase of a clinical study on volunteers (example 5A), the following conclusions were made.
1. Иммунизация предлагаемой вакциной не сопровождалась развитием нежелательных явлений в поствакцинальном периоде, а возникшие слабовыраженные общие и местные реакции были кратковременны и не вызывали ухудшения состояния здоровья привитых, что свидетельствовало о безопасности препарата и его низкой реактогенности.1. Immunization with the proposed vaccine was not accompanied by the development of adverse events in the post-vaccination period, and the mild general and local reactions that occurred were short-term and did not cause a deterioration in the health status of the vaccinated, which indicated the safety of the drug and its low reactogenicity.
2. Иммунизация добровольцев вакциной обеспечила следующие показатели иммуногенности к вирусу гриппа типов Α(Η1Ν1), Α(Η3Ν2) и В:2. Immunization of volunteers with a vaccine provided the following immunogenicity indicators for influenza virus types Α (Η1Ν1), Α (Η3Ν2) and B:
уровень сероконверсии 55, 50 и 45%;seroconversion levels of 55, 50 and 45%;
уровень серопротекции 95, 90 и 100%;seroprotection levels of 95, 90 and 100%;
кратность прироста антител 3,8; 3,5 и 2,7 соответственно.the increase in antibody growth is 3.8; 3.5 and 2.7, respectively.
Эти результаты свидетельствуют о высокой иммуногенности предлагаемой вакцины.These results indicate a high immunogenicity of the proposed vaccine.
На основании II фазы клинического исследования на добровольцах (пример 5Б) были сделаны следующие выводы.Based on the II phase of a clinical study on volunteers (example 5B), the following conclusions were made.
1. Вакцинация добровольцев предлагаемой вакциной в дозе 45 мкг и вакциной сравнения в дозе 45 мкг не сопровождалась развитием тяжелых местных и общих реакций в поствакцинальном периоде, а возникшие слабовыраженные реакции были кратковременны и не вызывали ухудшения состояния здоровья привитых, что свидетельствовало о безопасности препарата.1. Vaccination of volunteers with the proposed vaccine at a dose of 45 μg and the comparison vaccine at a dose of 45 μg was not accompanied by the development of severe local and general reactions in the post-vaccination period, and the mild reactions that occurred were short-term and did not cause a deterioration in the health of the vaccinated, which indicated the safety of the drug.
2. Однократная внутримышечная иммунизация добровольцев предлагаемой вакциной в дозе 45 мкг и вакциной сравнения (Ваксигрип, Санофи Пастер, Франция) в дозе 45 мкг позволила обеспечить сле2. A single intramuscular immunization of volunteers with the proposed vaccine at a dose of 45 μg and the comparison vaccine (Vaxigrip, Sanofi Pasteur, France) at a dose of 45 μg allowed to provide
- 2 016866 дующие показатели иммуногенности к вирусу гриппа серотипов Η1Ν1, Η3Ν2 и В.- 2 016866 further indicators of immunogenicity to influenza virus of serotypes Η1Ν1, Η3Ν2 and B.
Предлагаемая вакцина в дозе 45 мкг обеспечивает:The proposed vaccine at a dose of 45 mcg provides:
уровень сероконверсии 93,3, 88,4 и 77,4%;the level of seroconversion of 93.3, 88.4 and 77.4%;
уровень серопротекции 90,6, 93 и 75,2%;the level of seroprotection is 90.6, 93 and 75.2%;
кратность прироста антител 17,4; 10,0 и 6,8 соответственно.the increase in antibody growth is 17.4; 10.0 and 6.8, respectively.
Вакцина сравнения в дозе 45 мкг обеспечивает:A 45 mcg comparison vaccine provides:
уровень сероконверсии 94,8, 92,2 и 82,3%;the level of seroconversion of 94.8, 92.2 and 82.3%;
уровень серопротекции 96,1, 94,4 и 84,4%;the level of seroprotection 96.1, 94.4 and 84.4%;
кратность прироста антител 24,8; 11,0 и 11,5 соответственно.the increase in antibody growth is 24.8; 11.0 and 11.5 respectively.
В результате изучения длительности сохранения поствакцинального иммунитета было показано, что уровень сохранения величины титров антител у добровольцев, привитых предлагаемой вакциной, был выше по отношению к титрам антител у добровольцев, привитых вакциной сравнения.As a result of studying the duration of preservation of post-vaccination immunity, it was shown that the level of conservation of antibody titers in volunteers vaccinated with the proposed vaccine was higher relative to antibody titers in volunteers vaccinated with the comparison vaccine.
Полученные результаты показали, что иммуногенность предлагаемой вакцины соответствует всем критериям, содержащимся в рекомендациях Комитета патентованных медицинских продуктов Евросоюза (Сопсер! рарег оп 1Пс геущюп оР 1Пс СРМР/В^Р по1с Рог дшбаисе оп ΝοΙο Рог дшбаисе оп ΙιαηηοπίζαΙίοη оР гес.|шгетеЩ5 Рог шДие^а уассшек. СРМР/В^Р/214/96, СРМР/Е^Р/1045/01СРМР ЕМЕА):The results showed that the immunogenicity of the proposed vaccine meets all the criteria contained in the recommendations of the Committee of Patented Medical Products of the European Union (Sopcer! ^ a Wasshess. CPMP / B ^ P / 214/96, CPMP / E ^ P / 1045/01 CPMP EMEA):
Частота серопротекции = % с титрами анти-ГА выше 1:40.Seroprotection rate =% with anti-HA titers above 1:40.
Частота сероконверсии = % с 4-кратным нарастанием титра анти-ГА после вакцинации в сравнении с титром до вакцинации, или % с титром анти-ГА после вакцинации выше 1:40 среди имевших до вакцинации титр анти-ГА менее 1:10.Seroconversion rate =% with a 4-fold increase in the anti-HA titer after vaccination compared to the titer before vaccination, or% with the anti-GA titer after vaccination is higher than 1:40 among those who had before the vaccination an anti-GA titer of less than 1:10.
Фактор конверсии = средняя кратность увеличения СГТ (СГТпосле/СГТдо).Conversion factor = average rate of increase in CHH (CHT after / CHTdo).
Иммуногенность предлагаемой вакцины в отношении сохранения титров поствакцинальных антител выше, чем у вакцины сравнения.The immunogenicity of the proposed vaccine in relation to the preservation of titers of post-vaccination antibodies is higher than that of the comparison vaccine.
Результаты III фазы клинического исследования на добровольцах (пример 5В) позволили рассчитать профилактическую эффективность предлагаемой вакцины, коэффициент эффективности которой в отношении лабораторно-подтвержденного гриппа составляет не ниже 75%, а индекс эффективности равен 6,5-8,5. Предпочтительно коэффициент эффективности равен 85-90%, а индекс эффективности 7,07,5.The results of the III phase of a clinical study on volunteers (example 5B) made it possible to calculate the prophylactic effectiveness of the proposed vaccine, the efficiency coefficient of which against laboratory-confirmed influenza is not less than 75%, and the efficiency index is 6.5-8.5. Preferably, the efficiency ratio is 85-90%, and the efficiency index is 7.07.5.
Высокие показатели профилактической эффективности предлагаемой вакцины по сравнению с известными зарубежными и отечественными вакцинами обусловлены несколькими причинами. Во-первых, в состав предлагаемой вакцины входят виросомы, которые способны увеличивать длительность поствакцинального иммунитета. Кроме того, в состав предлагаемой вакцины входят нативные мицеллы внутренних антигенов (мембранного белка и белка нуклеокапсида), которые помимо поверхностных антигенов способны индуцировать существенный уровень клеточного иммунитета. Наличие клеточного иммунитета существенно увеличивает защиту организма от вируса гриппа.The high prophylactic efficacy of the proposed vaccine compared with the known foreign and domestic vaccines is due to several reasons. Firstly, the composition of the proposed vaccine includes virosomes, which can increase the duration of post-vaccination immunity. In addition, the composition of the proposed vaccine includes native micelles of internal antigens (membrane protein and nucleocapsid protein), which in addition to surface antigens can induce a significant level of cellular immunity. The presence of cellular immunity significantly increases the body's defense against the influenza virus.
Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, подтверждающими достижение его технических результатов.The invention is illustrated by the following examples, confirming the achievement of its technical results.
Для исследований использовали экспериментальные серии вакцины с содержание гемагглютинина серотипов А (Η1Ν1 и Η3Ν2) от 10(±1,1) до 15(±2,2) мкг, серотипа В - 15±2,2 мкг в одной прививочной дозе. Для конструирования вакцины использовали следующие вакцинные штаммы вируса гриппа: штамм В/Брисбен/60/08 (В), штамм А/Калифорния/7/2009 (Η1Ν1), штамм А/Перт/16/09 (Η3Ν2).For research, we used experimental vaccine series with a hemagglutinin content of serotypes A (Η1Ν1 and Η3 от2) from 10 (± 1.1) to 15 (± 2.2) μg, of serotype B - 15 ± 2.2 μg in one vaccination dose. The following vaccine strains of the influenza virus were used to construct the vaccine: strain B / Brisbane / 60/08 (B), strain A / California / 7/2009 (Η1Ν1), strain A / Perth / 16/09 (Η3Ν2).
Пример 1. Морфологические исследования полуфабрикатов (моновалентов) вакцины и готовой лекарственной формы вакцины.Example 1. Morphological studies of semi-finished products (monovalents) of the vaccine and the finished dosage form of the vaccine.
Морфологические изучения полуфабрикатов (моновалентов) вакцины и готовой лекарственной формы вакцины проводили методом электронной микроскопии с использованием технологии негативного контрастирования с использованием микроскопа 1ео1 100С с увеличением 50000 раз.Morphological studies of the semi-finished products (monovalents) of the vaccine and the finished dosage form of the vaccine were carried out by electron microscopy using negative contrast technology using a 1o1 100C microscope with an increase of 50,000 times.
Для объективной оценки структурных особенностей вакцины был проведен сравнительный морфологический анализ следующих препаратов:For an objective assessment of the structural features of the vaccine, a comparative morphological analysis of the following drugs was carried out:
1) полуфабриката вакцины, серотипа Α(Η1Ν1);1) prefabricated vaccine, serotype Α (Η1Ν1);
2) полуфабриката вакцины, серотипа Α(Η3Ν2);2) prefabricated vaccine, serotype Α (Η3Ν2);
3) полуфабриката вакцины, серотипа В;3) prefabricated vaccine, serotype B;
4) готовая лекарственная форма вакцины в соответствии с изобретением;4) the finished dosage form of the vaccine in accordance with the invention;
5) очищенного и концентрированного препарата вирионов вируса гриппа серотипа Α(Η1Ν1), из которого получен соответствующий полуфабрикат;5) a purified and concentrated preparation of influenza virus virions of serotype Α (Η1Ν1), from which the corresponding semi-finished product was obtained;
6) очищенного и концентрированного препарата вирионов вируса гриппа серотипа Α(Η3Ν2), из ко6) a purified and concentrated preparation of influenza virus virions of serotype Α (Η3Ν2), from
- 3 016866 торого получен соответствующий полуфабрикат;- 3 016866 which received the corresponding semi-finished product;
7) очищенного и концентрированного препарата вирионов вируса гриппа серотипа В, из которого получен соответствующий полуфабрикат.7) a purified and concentrated preparation of virions of the influenza virus serotype B, from which the corresponding semi-finished product is obtained.
В процессе работы было исследовано 18 электронно-микроскопических сеточек, содержащих вышеперечисленные материалы, и просмотрено 500 полей зрения. Из указанного числа полей зрения были выбраны те, которые содержали структуры, наиболее типичные для данного препарата.In the process, 18 electron microscopic nets containing the above materials were examined and 500 fields of view were examined. From the indicated number of visual fields, those were selected that contained the structures most typical for this drug.
При исследовании препаратов электронной микроскопией выявлены морфологические различия между вирионами вируса гриппа серотипов Α(Η1Ν1), Α(Η3Ν2) и В, с одной стороны, и вирусоспецифическими структурами - виросомами, содержавшимися в полуфабрикатах предлагаемой вакцины, полученных из соответствующих серотипов вируса гриппа, с другой.An electron microscopy study of the preparations revealed morphological differences between influenza virus virions of serotypes Α (Η1Ν1), Α (Η3Ν2) and B, on the one hand, and virus-specific structures - virosomes contained in semi-finished products of the proposed vaccine obtained from the corresponding influenza virus serotypes, on the other .
Содержавшиеся в полуфабрикатах предлагаемой вакцины виросомы характеризовались относительной мономорфностью и меньшими размерами по сравнению с вирионами соответствующих серотипов вируса гриппа. Виросомы имели преимущественно шаровидную форму и диаметр от 100 до 150 нм (фиг. 1). Гемагглютинины, выявляемые на поверхности виросом, имели четко выраженную морфологию, вертикальную ориентировку относительно липидной мембраны и достаточно плотную упаковку. В полуфабрикатах предлагаемой вакцины кроме виросом были обнаружены также мицелярные образования, состоящие из структурированного мембранного белка и из структур нуклеокапсида вируса гриппа.Virosomes contained in the semi-finished products of the proposed vaccine were characterized by relative monomorphism and smaller sizes compared to the virions of the corresponding influenza virus serotypes. Virosomes had a predominantly spherical shape and a diameter of 100 to 150 nm (Fig. 1). Hemagglutinins detected on the surface of virosomes had a distinct morphology, vertical orientation relative to the lipid membrane, and fairly dense packing. In the semi-finished products of the proposed vaccine, in addition to virosomes, mycelial formations consisting of a structured membrane protein and structures of the influenza nucleocapsid were also found.
Пример 2. Определение количества фосфолипидов.Example 2. Determination of the amount of phospholipids.
Определение количества фосфолипидов в предлагаемой вакцине проводилось с помощью коммерческого диагностического набора фирмы 8сп11пс1 Ωίαβηοδίίοδ (Италия, каталожный номер 17320).The determination of the amount of phospholipids in the proposed vaccine was carried out using a commercial diagnostic kit of the company 8sp11ps1 Ωίαβηοδίίοδ (Italy, catalog number 17320).
Метод основан на том, что под действием фосфолипазы-0 фосфолипиды гидролизуются до холина и фосфатидной кислоты. Затем холин окисляется холиноксидазой до бетаина и перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и производными фенола с образованием комплекса красного цвета. Оптическая плотность образующегося стабильного комплекса пропорциональна содержанию фосфолипидов в пробе. Калибровочные стандарты фосфолипидов (3 мг/мл) прилагаются в составе набора. Расчет количества фосфолипидов в составе предлагаемой вакцины проводился путем сравнения оптической плотности калибровочного стандарта и образцов вакцины. Согласно полученным результатам в различных полуфабрикатах вакцины (различные серотипы) отношение содержания гемагглютинина к содержанию фосфолипидов в 1 мл препарата существенно различалось. Наибольшее количество фосфолипидов (отношение 1:4) наблюдалось в полуфабрикатах серотипа В. В полуфабрикатах серотипов Η1Ν1 и Η3Ν2 это соотношение было в диапазоне 1:(2-3). Следует отметить, что это соотношение зависело также и от конкретной партии полуфабриката и зависело от технологии осаждения внутренних структур из полуфабриката. В конечном сведенном препарате вакцины соотношение гемагглютинина к фосфолипидам было в диапазоне 1:(2-4).The method is based on the fact that under the action of phospholipase-0 phospholipids are hydrolyzed to choline and phosphatidic acid. Then, choline is oxidized by choline oxidase to betaine and hydrogen peroxide, which in the presence of peroxidase reacts with 4-aminoantipyrine and phenol derivatives to form a red complex. The optical density of the resulting stable complex is proportional to the content of phospholipids in the sample. Calibration standards for phospholipids (3 mg / ml) are included in the kit. The calculation of the amount of phospholipids in the composition of the proposed vaccine was carried out by comparing the optical density of the calibration standard and vaccine samples. According to the results obtained, in different semi-finished products of the vaccine (different serotypes), the ratio of hemagglutinin to phospholipids in 1 ml of the drug was significantly different. The highest amount of phospholipids (1: 4 ratio) was observed in the semi-finished products of serotype B. In the semi-finished products of the serotypes Η1Ν1 and Η3Ν2, this ratio was in the range 1: (2-3). It should be noted that this ratio also depended on the particular batch of the semi-finished product and depended on the technology of deposition of internal structures from the semi-finished product. In the final mixed vaccine preparation, the ratio of hemagglutinin to phospholipids was in the range of 1: (2-4).
Пример 3. Изучение состава полипептидов в полуфабрикатах вакцины и препаратах очищенных вирионов.Example 3. The study of the composition of the polypeptides in semi-finished vaccines and preparations of purified virions.
Для сравнительного изучения состава полипептидов в полуфабрикатах вакцины и препаратах очищенных вирионов был использован метод электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в нередуцирующих условиях. Исследования проводились согласно МУК 4.1/4.2.558.96.For a comparative study of the composition of polypeptides in semi-finished vaccines and preparations of purified virions, we used the electrophoresis method in 10% polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate under non-reducing conditions. The studies were carried out in accordance with MUK 4.1 / 4.2.558.96.
Для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы генно-инженерных продуктов применяют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (8Ό8) в нередуцирующих условиях с последующей окраской геля как Кумасси ярко-голубым К.-250. Образование комплекса 8Ό8 с белком устраняет различия между белками, связанные с их зарядом, и переводит молекулы белков в конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы белка. При соблюдении этих условий подвижность белков отражает их молекулярные массы.To determine the purity, homogeneity, and molecular weight of genetically engineered products, the method of vertical polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) with sodium dodecyl sulfate (8-8) is used under non-reducing conditions, followed by coloring of the gel with Coomassie bright blue K.-250. The formation of a 8–8 complex with a protein eliminates the differences between the proteins associated with their charge and translates the protein molecules into a conformation in which the Stokes radius is a function of the molecular weight of the protein. Under these conditions, the mobility of proteins reflects their molecular weights.
Полимеризацию геля ведут в ячейке, образованной стеклами и прокладками, определяющими размер и толщину геля. Сборку ячейки проводят в соответствии с инструкцией по работе с конкретным типом прибора для вертикального электрофореза. Описание метода проводится на примере аппарата Протеан 11 (Био-Рад, США). Для данного прибора размеры стекол ячейки составляют: внешнее стекло 22x20 см, внутреннее стекло - 20x20 см. Размеры прокладок: длина - 20 см, ширина - 18 см, толщина 0,75-1,0 мм. При наличии приборов с другими характеристиками необходимо внести соответствующие коррективы в постановку испытаний.The gel is polymerized in a cell formed by glasses and gaskets that determine the size and thickness of the gel. The cell assembly is carried out in accordance with the instructions for working with a specific type of device for vertical electrophoresis. The method is described using the example of the Protean 11 apparatus (Bio-Rad, USA). For this device, the dimensions of the cell glass are: outer glass 22x20 cm, inner glass - 20x20 cm. Gasket sizes: length - 20 cm, width - 18 cm, thickness 0.75-1.0 mm. If instruments with other characteristics are available, appropriate adjustments should be made to the test setup.
Для проведения электрофореза нижнюю камеру аппарата для электрофореза заполняют электродным буферным раствором и вставляют в нее электрофоретическую ячейку с гелем. Верхний резервуар заполняют электродным буферным раствором, удаляют из лунок пузырьки воздуха. Под слой буферного раствора в лунку вносят исследуемые образцы. Электрофорез проводят при температуре 10-14°С в режиме постоянного тока. При прохождении фронта красителя через концентрирующий гель сила тока составляет 10-12,5 мА на 1 см2 сечения геля (20-25 мА/гель). После вхождения фронта красителя в нижний разделяющий слой на 5-7 мм силу тока увеличивают до 20 мА на 1 см2 сечения геля (40 мА/гель). После продвижения красителя на 14 см от нижнего края концентрирующего геля ток отключают, отделяют гель от стекол ячейки и переносят в кювету для окрашивания. Для того чтобы можно было выявитьFor electrophoresis, the lower chamber of the electrophoresis apparatus is filled with electrode buffer solution and an electrophoretic cell with gel is inserted into it. The upper tank is filled with electrode buffer solution, air bubbles are removed from the wells. Under the buffer solution layer, test samples are introduced into the well. Electrophoresis is carried out at a temperature of 10-14 ° C in direct current mode. When the front of the dye passes through the concentration gel, the current strength is 10-12.5 mA per 1 cm 2 of the gel cross section (20-25 mA / gel). After the front of the dye enters the lower separating layer by 5-7 mm, the current strength is increased to 20 mA per 1 cm 2 of the gel cross section (40 mA / gel). After the dye is moved 14 cm from the lower edge of the concentration gel, the current is turned off, the gel is separated from the glass of the cell and transferred to a cuvette for staining. In order to be able to identify
- 4 016866 присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель полностью не обрезают, оставляя 0,5-10 мм. В случае необходимости можно обрезать часть нижнего геля по фронту красителя. Нанесение образцов на гель проводят в следующем порядке. В лунки 1 и 10 вносят соответствующий (с бета-меркаптоэтанолом или без) буфер для приготовления образцов, разбавленный деионизованной водой в 4 раза. В лунки 2 и 9 вносят по 7 мкл смеси стандартных белков, например, фирмы Фармация, Швеция. В остальные лунки вносят исследуемые образцы. При окрашивании Кумасси ярко-голубым В-250 вносят попарно такие объемы образца, чтобы количество белка в них составляло соответственно 10 и 40 мкг. При окрашивании геля нитратом серебра в зависимости от препарата в лунки вносят 2-5 мкг белка. Параллельно в одну из лунок вносят 0,002-0,01 мкг белка (в зависимости от чувствительности выявления минимальных количеств белка в данных условиях).- 4 016866 the presence of aggregates and other components not included in the gel in the test sample, the concentrating gel is not completely cut off, leaving 0.5-10 mm. If necessary, you can trim part of the lower gel along the front of the dye. The application of the samples to the gel is carried out in the following order. Appropriate (with or without beta-mercaptoethanol) sample preparation diluted 4 times with deionized water is added to wells 1 and 10. In wells 2 and 9 contribute 7 μl of a mixture of standard proteins, for example, the company Pharmacy, Sweden. The remaining samples contribute test samples. When Coomassie is stained with bright blue B-250, such sample volumes are added in pairs so that the amount of protein in them is 10 and 40 μg, respectively. When staining the gel with silver nitrate, depending on the preparation, 2-5 μg of protein is added to the wells. In parallel, 0.002-0.01 μg of protein is added to one of the wells (depending on the sensitivity of detecting minimal amounts of protein under given conditions).
Для окрашивания геля Кумасси ярко-голубым В-250 и его последующего обесцвечивания гель фиксируют 1 ч в фиксирующем растворе, после чего окрашивают в течение 16 ч. Затем окрашивающий раствор сливают, гель 2-3 раза споласкивают обесцвечивающим раствором и помещают в аппарат для обесцвечивания, заполненный обесцвечивающим раствором. Обесцвечивание проводят в течение 15 мин при напряжении 24 В. Гель вынимают из аппарата для обесцвечивания и споласкивают раствором для обесцвечивания и деионизованной водой. Сканирование обесцвеченного геля проводили с помощью аппарата Ое1 Эоск 170-8170.To stain Kumassi gel with bright blue B-250 and its subsequent bleaching, the gel is fixed for 1 hour in a fixing solution, then stained for 16 hours, then the staining solution is drained, the gel is rinsed 2-3 times with a bleaching solution and placed in a bleaching device, filled with bleach solution. Bleaching is carried out for 15 minutes at a voltage of 24 V. The gel is removed from the bleaching apparatus and rinsed with a bleaching solution and deionized water. The bleached gel was scanned using an Oe1 Eosk 170-8170 apparatus.
В процессе анализа в одном и том же геле проводили сравнительный анализ полипептидов препаратов полуфабрикатов одного серотипа вируса гриппа, а также препаратов очищенных вирионов, из которых был получен соответствующий полуфабрикат.In the process of analysis in the same gel, a comparative analysis of polypeptides of semi-finished products of the same serotype of the influenza virus, as well as preparations of purified virions, from which the corresponding semi-finished product was obtained, was carried out.
Эти результаты представлены на электрофореграмме (фиг. 2).These results are presented on an electrophoregram (Fig. 2).
Из представленных результатов следует, что в составе полуфабриката вакцины в соответствии с изобретением обнаруживаются те же полипептиды, что и в препарате очищенных вирионов, из которых был получен этот полуфабрикат. Но соотношение полипептида НА0 к полипептиду М1 в полуфабрикатах было значительно выше такового в препарате очищенных вирионов.From the presented results it follows that in the composition of the semi-finished product of the vaccine in accordance with the invention, the same polypeptides are found as in the preparation of purified virions from which this semi-finished product was obtained. But the ratio of the HA0 polypeptide to the M1 polypeptide in the semi-finished products was significantly higher than that in the preparation of purified virions.
Соотношение поверхностных и внутренних антигенов в предлагаемой вакцине меняется в зависимости от серотипа вируса, а также от технологических условий получения конкретной серии. Так в процессе получения полуфабриката очищенные вирионы разрушаются детергентом и поверхностные антигены, липиды вирусной мембраны, а также мембранный белок перешли в растворимое состояние. После удаления детергента и части вирусных липидов поверхностные антигены образовали псевдовирусные структуры виросомы, а мембранный белок образовал мицеллярные структуры различного размера. На конечной стадии технологического процесса, а именно стерилизующей фильтрации, часть наиболее крупных мицелл мембранного белка была задержана стерилизующей мембраной и, таким образом, не попала в состав полуфабриката вакцины.The ratio of surface and internal antigens in the proposed vaccine varies depending on the serotype of the virus, as well as on the technological conditions for obtaining a specific series. So in the process of obtaining a semi-finished product, the purified virions are destroyed by a detergent and surface antigens, lipids of the viral membrane, as well as the membrane protein, become soluble. After removal of the detergent and part of the viral lipids, surface antigens formed pseudovirus structures of the virosome, and the membrane protein formed micellar structures of various sizes. At the final stage of the technological process, namely, sterilizing filtration, part of the largest membrane protein micelles was retained by the sterilizing membrane and, thus, did not enter into the composition of the prefabricated vaccine.
Таким образом, экспериментально установлено, что соотношение гемагглютинина и внутренних антигенов составляет 1:(0,5-2,5).Thus, it was experimentally established that the ratio of hemagglutinin and internal antigens is 1: (0.5-2.5).
Пример 4. Доклинические исследования на животных.Example 4. Preclinical studies in animals.
Доклинические исследования безопасности предлагаемой вакцины в соответствии с настоящим изобретением проводят на основании методических рекомендаций Министерства здравоохранения и социального развития РФ Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов утверждены и введены в действие Приказом директора ФГБУ ГИСК им. Л. А. Тарасевича Минздравсоцразвития России от 31.12.2010 № 46-ОД.Preclinical studies of the safety of the proposed vaccine in accordance with the present invention are carried out on the basis of methodological recommendations of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation. Clinical trials of the efficacy and safety of new immunobiological drugs are approved and put into effect by order of the director of the FSBI GISK named after L. A. Tarasevich of the Ministry of Health and Social Development of Russia dated December 31, 2010 No. 46-OD.
А) Оценка острой токсичности предлагаемой вакцины.A) Assessment of acute toxicity of the proposed vaccine.
Изучение острой токсичности вакцины в соответствии с изобретением было проведено на 40 мышах массой 18-20 г, рандомизированных на 2 группы - опытную и контрольную. Мышам контрольной группы однократно внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл физиологического раствора, а опытной группе 10 мышам внутрибрюшинно вводили предлагаемую вакцину в дозе по 2250 мкг/кг (45 мкг/мышь) по гемагглютинину и 10 мышам - в дозе по 0,65 мкг/кг (0,013 мкг/мыши). Общая продолжительность наблюдения за животными при определении острой токсичности составила 7 дней.A study of the acute toxicity of the vaccine in accordance with the invention was carried out on 40 mice weighing 18-20 g, randomized into 2 groups - experimental and control. 0.5 ml of physiological saline was injected intraperitoneally once into the control group mice, and the proposed vaccine was injected intraperitoneally with the vaccine at a dose of 2250 μg / kg (45 μg / mouse) per hemagglutinin and 10 mice at a dose of 0.65 μg / kg (0.013 μg / mouse). The total duration of observation of animals in determining acute toxicity was 7 days.
На 2-е сутки дислокацией шейных позвонков были умерщвлены по 4 мыши из опытной и контрольной групп, вскрыты и осмотрены. У всех этих мышей были забраны внутренние органы, взвешены и помещены в 10% формалин для дальнейших гистологических исследований. За мышами опытной и контрольной групп было продолжено наблюдение. Состояние мышей оценивали по внешнему виду, поведению, изменению массы тела и пищевой активности. За время наблюдения гибели белых мышей при однократном введении предлагаемой вакцины в дозе по 2250 мкг/кг и 0,65 мкг/кг не отмечено.On the 2nd day, 4 mice from the experimental and control groups were euthanized by dislocation of the cervical vertebrae, opened and examined. All of these mice had their internal organs taken, weighed and placed in 10% formalin for further histological studies. The mice of the experimental and control groups were continued to observe. The condition of the mice was evaluated by their appearance, behavior, changes in body weight and nutritional activity. During the observation of the death of white mice with a single injection of the proposed vaccine at a dose of 2250 μg / kg and 0.65 μg / kg was not observed.
На 8-е сутки 4-х мышей умерщвляли, проводили патологоанатомическую оценку внутренних органов и отбирали пробы крови. После взвешивания внутренних органов и определения их массы на момент забоя вычисляли коэффициенты масс (КМ) внутренних органов, после чего был проведен статистический анализ КМ и оценена достоверность полученных результатов с помощью критерия Стьюдента.On the 8th day, 4 mice were sacrificed, pathological anatomical evaluation of internal organs was performed, and blood samples were taken. After weighing the internal organs and determining their mass at the time of slaughter, the mass coefficients (KM) of the internal organs were calculated, after which a statistical analysis of the KM was carried out and the reliability of the results was evaluated using Student's criterion.
За период наблюдения за группой животных гибели белых мышей не отмечено. У экспериментальных животных не изменялись поведение, двигательная активность, аппетит. Место нанесения препаратов у всех опытных мышей чистое, без воспаления и раздражения. Данные измерения массы тела мышейDuring the observation of a group of animals, the death of white mice was not observed. In experimental animals, behavior, motor activity, and appetite did not change. The place of application of drugs in all experimental mice is clean, without inflammation and irritation. Mouse body weight measurement data
- 5 016866 опытной группы на 2 и 8 сутки не отличалась от показателей массы тела животных контрольных групп больше чем на 5-8% (табл. 1).- 5 016866 of the experimental group on days 2 and 8 did not differ from the body mass indices of animals in the control groups by more than 5-8% (Table 1).
Таблица 1Table 1
Динамика изменения массы тела мышей после введения предлагаемой вакциныThe dynamics of changes in body weight of mice after administration of the proposed vaccine
Анализ динамики результатов морфологических показателей крови при однократном введении предлагаемой вакцины в дозе 0,65 мкг/кг и 2250 мкг/кг не выявил изменений.Analysis of the dynamics of the results of morphological parameters of blood with a single injection of the proposed vaccine at a dose of 0.65 μg / kg and 2250 μg / kg revealed no changes.
Б) Оценка хронической токсичности предлагаемой вакцины.B) Assessment of the chronic toxicity of the proposed vaccine.
При оценке хронической токсичности в качестве контроля служили экспериментальные животные, которым в качестве плацебо вводили физиологический раствор (0,85% раствор натрия хлорида). Наблюдение за животными проводили ежедневно после введения препарата. Оценивали общее состояние, двигательную активность, поедание корма.In assessing chronic toxicity, experimental animals served as a placebo and received physiological saline (0.85% sodium chloride solution) as a placebo. Observation of animals was carried out daily after administration of the drug. Assessed the general condition, physical activity, eating food.
Изучение хронической токсичности вакцины было проведено на 40 мышах массой 18-20 г, рандомизированных на 2 группы - опытную и контрольную. Мышам контрольной группы подкожно вводили по 0,2 мл физиологического раствора, а опытной группе ежедневно в течение 14 суток подкожно вводили по 0,2 мл вакцины в суммарной дозе 2250 мкг/кг по гемагглютинину (45 мкг/20 г мыши). Общая продолжительность наблюдения за животными при определении острой токсичности составила 15 дней.A study of the chronic toxicity of the vaccine was carried out on 40 mice weighing 18-20 g, randomized into 2 groups - experimental and control. 0.2 ml of physiological saline was subcutaneously injected into the control group mice, and 0.2 ml of the vaccine was administered subcutaneously daily for 14 days at a total dose of 2250 μg / kg hemagglutinin (45 μg / 20 g mouse) subcutaneously. The total duration of observation of animals in determining acute toxicity was 15 days.
Внутрибрюшинное введение изучаемого препарата во всех дозах не вызывало гибели экспериментальных животных, во время наблюдения за животными не отмечено изменение двигательной активности, достоверно значимого изменения веса, аппетита, не было отмечено воспалительных явлений или раздражения слизистой.Intraperitoneal administration of the studied drug in all doses did not cause the death of experimental animals, during observation of the animals there was no change in motor activity, no significant change in weight, appetite, no inflammatory phenomena or irritation of the mucosa were noted.
На 1-е сутки дислокацией шейных позвонков были умерщвлены по 4 мыши из опытной и контрольных групп, вскрыты и осмотрены. У всех этих мышей были забраны внутренние органы, взвешены и помещены в 10% формалин для дальнейших гистологических исследований. За мышами опытной и контрольной групп было продолжено наблюдение.On the 1st day, 4 mice from the experimental and control groups were euthanized by dislocation of the cervical vertebrae, opened and examined. All of these mice had their internal organs taken, weighed and placed in 10% formalin for further histological studies. The mice of the experimental and control groups were continued to observe.
На 15-е сутки 4 мышей умерщвляли, проводили патологоанатомическую оценку внутренних органов и отбирали пробы крови. После взвешивания внутренних органов и определения их массы на момент забоя вычисляли коэффициенты масс (КМ) внутренних органов, после чего был проведен статистический анализ КМ и оценена достоверность полученных результатов с помощью критерия Стьюдента (табл. 2).On the 15th day, 4 mice were killed, pathological anatomical evaluation of the internal organs was performed, and blood samples were taken. After weighing the internal organs and determining their mass at the time of slaughter, the mass coefficients (KM) of the internal organs were calculated, after which a statistical analysis of the KM was carried out and the reliability of the results was evaluated using Student's criterion (Table 2).
Таблица 2 Динамика изменения массы тела мышей после введения предлагаемой вакцины в течение 14 сутокTable 2 The dynamics of changes in body weight of mice after the introduction of the proposed vaccine for 14 days
Следовательно, длительное подкожное введение предлагаемой вакцины не вызывало выраженного токсического эффекта у белых мышей за время наблюдения, это подтверждается данными морфологического и биохимического исследования крови.Therefore, prolonged subcutaneous administration of the proposed vaccine did not cause a pronounced toxic effect in white mice during the observation period, this is confirmed by the data of morphological and biochemical blood tests.
В) Оценка местно-раздражающего действия вакцины (мышиная модель).C) Assessment of the local irritant effect of the vaccine (mouse model).
Местно-раздражающее действие вакцины оценивали на мышах в плантарном тесте путем введенияThe local irritant effect of the vaccine was evaluated in mice in a plantar test by administration
- 6 016866 вакцины в подушечку задней лапки. Опытной группе № 1 вводили вакцину однократно в подушечку задней лапки в объеме 50 мкл (0,05 мкг/кг, 1/10 человеческой дозы). Опытной группе № 2 вводили вакцину однократно в подушечку задней лапки в объеме 50 мкл (0,025 мкг/кг, 1/20 человеческой дозы).- 6 016866 vaccines in the small pad of the hind paw. Experimental group No. 1 was injected with the vaccine once in the hind paw pad in a volume of 50 μl (0.05 μg / kg, 1/10 of the human dose). Experimental group No. 2 was injected with the vaccine once in the paw of the hind paw in a volume of 50 μl (0.025 μg / kg, 1/20 human dose).
Неспецифическую воспалительную реакцию на введение вакцины оценивали с 24 ч и до 7 суток включительно. Индекс данной реакции определяли как процент прироста массы опытной лапки после введения вакцины по отношению к массе контрольной лапки, в которую вводили физиологический раствор (табл. 3).A non-specific inflammatory response to vaccine administration was evaluated from 24 hours to 7 days, inclusive. The index of this reaction was determined as the percentage of weight gain of the experimental paw after administration of the vaccine in relation to the weight of the control paw into which physiological saline was injected (Table 3).
Таблица 3 Результаты по оценке местно-раздражающего действия вакцины в плантарном тестеTable 3 The results of the evaluation of the local irritant effect of the vaccine in the plantar test
Представленные данные свидетельствуют, что предлагаемая вакцина не вызывает местных воспалительных реакций на месте введения.The data presented indicate that the proposed vaccine does not cause local inflammatory reactions at the injection site.
Г) Оценка местно-раздражающего действия предлагаемой вакцины (кролики).D) Assessment of the local irritant effect of the proposed vaccine (rabbits).
Определение местно-раздражающего действия проводили на модели глаз кроликов по модифицированному методу Драйза. В группе по оценке местно-раздражающего действия вакцины использовали 3 кролика. Контролем служил левый глаз, в который капали по 50 мкл физиологического раствора, а в правый глаз на слизистую оболочку капали по 50 мкл изучаемого вакцинного препарата в дозе 45 мкг/2,5 кг кролика. Препарат наносили за веко кролика и придерживали веки закрытыми в течение 1 с. Реакцию регистрировали через 24, 48, 72 ч и на 7 сутки. Исследуемый материал оказывает раздражающее действие на глаза, если у 3 или более животных из опытной группы наблюдалась положительная реакция.Determination of the local irritant effect was carried out on a model of rabbit eyes using the modified Dryse method. 3 rabbits were used in the local irritant vaccine evaluation group. The control was the left eye, in which 50 μl of physiological saline was dripped, and 50 μl of the studied vaccine preparation at a dose of 45 μg / 2.5 kg of rabbit was dripped into the right eye on the mucous membrane. The drug was applied over the rabbit eyelid and kept the eyelids closed for 1 s. The reaction was recorded after 24, 48, 72 hours and on the 7th day. The test material is irritating to the eyes if 3 or more animals from the experimental group had a positive reaction.
При регистрации результатов конъюнктивальной пробы у 1-го кролика через 24 ч отмечалось расширение сосудов конъюнктивы, которое исчезало в течение последующих суток. У остальных кроликов применение предлагаемой вакцины не вызывало местного раздражающего действия.When registering the results of a conjunctival test in the 1st rabbit after 24 hours, the expansion of the vessels of the conjunctiva was noted, which disappeared over the next day. In other rabbits, the use of the proposed vaccine did not cause a local irritant effect.
Д) Изучение антигенной активности предлагаемой вакцины.E) Study of the antigenic activity of the proposed vaccine.
Готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексигласовой доски, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают, оставляют при температуре 20±2°С на 30 мин, затем в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре 20±2°С в течение 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции.Double dilutions of sera are prepared in the wells of the Plexiglass board, starting from 1:10 to 1: 640 and above in a volume of 0.2 ml. 0.2 ml of the working dose of antigen (4 AE) is added to each dilution of serum. The mixture is shaken, left at a temperature of 20 ± 2 ° C for 30 minutes, then 0.4 ml of a 1% suspension of chicken red blood cells are added to each well. The mixture is re-shaken, left at a temperature of 20 ± 2 ° C for 40-45 min (until the erythrocytes settle in the control), after which the reaction results are recorded.
При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации. Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки. Препарат считают специфичным, если он не реагирует в РТГА с гетерологичной сывороткой.In the presence of specific antibodies in the serum, erythrocyte agglutination is delayed. The maximum dilution, causing a complete delay in hemagglutination, is taken as the serum titer. Hemagglutination inhibition indicates the type of antigen and serum taken; the absence of a delay in hemagglutination indicates a mismatch in the type of serum taken. The drug is considered specific if it does not react in rtga with heterologous serum.
Для сравнительного изучения на мышах антигенной активности вакцин против гриппа шести беспородным белым мышам массой 18-20 г двукратно внутрибрюшинно с интервалом 14 суток вводили по 0,5 мл вакцины. Через 12-14 суток после повторной иммунизации полученные сыворотки мышей исследовали с гомологичными антигенами вакцины в РТГА согласно МУ 3.3.2.1758-03 Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа, утв. 28 сентября 2003 г.For a comparative study of the antigenic activity of influenza vaccines in mice, six outbred white mice weighing 18-20 g were injected twice intraperitoneally with an interval of 14 days, 0.5 ml of the vaccine. 12-14 days after re-immunization, the obtained mouse sera were examined with homologous vaccine antigens in RTGA according to MU 3.3.2.1758-03 Methods for determining the quality indicators of immunobiological preparations for the prevention and diagnosis of influenza, approved. September 28, 2003
Препарат должен вызывать нарастание антител в титрах не ниже 1:40 к каждому из трех входящих в ее состав штаммов вирусов гриппа типа А и В. В качестве контроля брали смесь сывороток от 2-3 неиммунных мышей.The drug should cause an increase in antibodies in titers of at least 1:40 to each of the three strains of influenza viruses type A and B included in its composition. A mixture of sera from 2-3 non-immune mice was taken as a control.
Результаты изучения антигенной активности предлагаемой вакцины и вакцины сравнения представлены в табл. 4.The results of a study of the antigenic activity of the proposed vaccines and comparison vaccines are presented in table. 4.
- 7 016866- 7 016866
Таблица 4Table 4
Антигенная активность предлагаемой вакцины и вакцины сравнения против гриппаAntigenic activity of the proposed vaccine and comparison vaccine against influenza
Полученные результаты свидетельствуют о том, что вакцина обладает более высокой антигенной активностью, чем вакцина сравнения.The results obtained indicate that the vaccine has a higher antigenic activity than the comparison vaccine.
Пример 5. Клинические исследования на добровольцах.Example 5. Clinical studies on volunteers.
А) Первая фаза клинических исследований (изучение безопасности и иммуногенности на ограниченном контингенте добровольцев).A) The first phase of clinical trials (the study of safety and immunogenicity on a limited contingent of volunteers).
Целью клинического исследования было изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности препарата.The aim of the clinical study was to study the reactogenicity, safety, and immunogenicity of the drug.
В клиническом исследовании приняли участие 40 человек, в возрасте от 18 до 50 лет, полностью соответствующие критериям включения и исключения протокола клинических исследований. Методом случайной выборки все добровольцы были разделены на 2 группы. В 1 группе 20 человек были привиты предлагаемой вакциной с содержанием гемагглютинина (НА) - 45 мкг/доза - по 15 мкг НА штаммов вирусов гриппа серотипов Η1Ν1, Η3Ν2 и В. Во 2-й группе (контрольной) - 20 человек, в качестве плацебо получили раствор натрия хлорида изотонического в объеме 0,5 мл.The clinical study involved 40 people, aged 18 to 50 years, fully meeting the criteria for inclusion and exclusion of the clinical trial protocol. By random sampling, all volunteers were divided into 2 groups. In group 1, 20 people were inoculated with the proposed vaccine containing hemagglutinin (HA) - 45 μg / dose - 15 μg in HA of influenza virus strains of serotypes Η1Ν1, Η3Ν2 and B. In the 2nd group (control) - 20 people, as a placebo received a solution of sodium isotonic chloride in a volume of 0.5 ml.
Вакцину вводили однократно внутримышечно (в дельтовидную мышцу). Наблюдение за добровольцами проводили в течение 28 дней после вакцинации.The vaccine was administered once intramuscularly (into the deltoid muscle). Monitoring of volunteers was carried out within 28 days after vaccination.
При лабораторно-инструментальном исследовании общего и биохимического анализов крови, общего анализа мочи, общих 1дМ и ЦЛ установлено, что все показатели были в пределах нормы. Вакцинация не сопровождалась развитием нежелательных явлений у добровольцев в поствакцинальном периоде, а возникшие слабовыраженные местные и общие реакции были кратковременны и не вызывали ухудшения состояния здоровья привитых, что свидетельствует о низкой реактогенности и безопасности вакцины. Иммуногенность предлагаемой вакцины (табл. 5) определяли в соответствии с указаниями, приведёнными в МУ 3.3.2.1758-03, Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа, утв. 28 сентября 2003 г.In laboratory and instrumental studies of general and biochemical blood tests, general urine analysis, total 1dM and CL showed that all indicators were within normal limits. Vaccination was not accompanied by the development of adverse events in volunteers in the post-vaccination period, and mild local and general reactions that occurred were short-term and did not cause a deterioration in the health status of the vaccinated, which indicates a low reactogenicity and safety of the vaccine. The immunogenicity of the proposed vaccine (table. 5) was determined in accordance with the guidelines given in MU 3.3.2.1758-03, Methods for determining the quality indicators of immunobiological preparations for the prevention and diagnosis of influenza, approved. September 28, 2003
Таблица 5Table 5
Оценка иммуногенности предлагаемой вакциныEvaluation of the immunogenicity of the proposed vaccine
ФС - фактор сероконверсии.FS is a seroconversion factor.
СРМР - соответствие требованиям СРМР.CPMP - compliance with the requirements of CPMP.
На основании I фазы клинического исследования были сделаны следующие выводы.Based on phase I of the clinical study, the following conclusions were made.
1. Иммунизация предлагаемой вакциной не сопровождалась развитием нежелательных явлений в поствакцинальном периоде, а возникшие слабовыраженные общие и местные реакции были кратковременны и не вызывали ухудшения состояния здоровья привитых, что свидетельствовало о безопасности препарата.1. Immunization with the proposed vaccine was not accompanied by the development of adverse events in the post-vaccination period, and the mild general and local reactions that occurred were short-term and did not cause a deterioration in the health status of the vaccinated, which indicated the safety of the drug.
2. К 28 дню поствакцинального периода наблюдалось снижение среднего уровня общего 1дЕ (Рср 0-28<0,001), что, вероятно, связано с входящими в состав вакцины специфическими структурами2. By the 28th day of the post-vaccination period, there was a decrease in the average level of total 1de (P cf 0-28 <0.001), which is probably due to the specific structures included in the vaccine
- 8 016866 виросомами, способными изменять соотношение Т111/Т112 в сторону Т111.- 8 016866 virosomes capable of changing the ratio of T111 / T112 in the direction of T111.
3. Иммунизация добровольцев вакциной обеспечила следующие показатели иммуногенности к вирусу гриппа типов Α(Η1Ν1), Α(Η3Ν2) и В:3. Immunization of volunteers with a vaccine provided the following indicators of immunogenicity to influenza virus types Α (Η1Ν1), Α (Η3Ν2) and B:
уровень сероконверсии 55, 50 и 45%;seroconversion levels of 55, 50 and 45%;
уровень серопротекции 95, 90 и 100%;seroprotection levels of 95, 90 and 100%;
кратность прироста антител 3,8; 3,5 и 2,7 соответственно.the increase in antibody growth is 3.8; 3.5 and 2.7, respectively.
У добровольцев с исходным титром антител, меньшим или равным 1:20, после вакцинации предлагаемой вакциной наблюдался 4-кратный прирост антител в 100% случаев к вирусу гриппа типа Α (Η1Ν1) и В и в 70% - к вирусу гриппа типа Α (Η3Ν2).In volunteers with an initial antibody titer of less than or equal to 1:20, after vaccination with the proposed vaccine, a 4-fold increase in antibodies was observed in 100% of cases against influenza virus type Α (Η1Ν1) and B and in 70% - against influenza virus type Α (Η3Ν2 )
Б) Вторая фаза клинических исследований (изучение безопасности и иммуногенности на расширенном контингенте добровольцев).B) The second phase of clinical trials (the study of safety and immunogenicity on an expanded contingent of volunteers).
В простом слепом сравнительном клиническом исследовании приняли участие 300 волонтеров, по 150 человек на каждой базе, полностью соответствующие критериям включения и исключения протокола. Методом случайного распределения все добровольцы были поделены на 2 группы.In a simple blind comparative clinical study, 300 volunteers took part, 150 people at each base, fully meeting the criteria for inclusion and exclusion of the protocol. By random distribution, all volunteers were divided into 2 groups.
В 1 группе 50 человек были привиты вакциной с содержанием гемагглютинина 45 мкг/доза - по 15 мкг гемагглютинина штаммов вирусов гриппа серотипов Η1Ν1, Η3Ν2 и В.In group 1, 50 people were vaccinated with a vaccine containing hemagglutinin of 45 μg / dose - 15 μg of hemagglutinin of influenza virus strains of serotypes Η1Ν1, Η3Ν2 and B.
В 2 группе 50 человек были привиты препаратом сравнения (вакциной Ваксигрип) с содержанием гемагглютинина - 45 мкг/доза - по 15 мкг гемагглютинина штаммов вирусов гриппа серотипов Η1Ν1, Η3Ν2 и В.In group 2, 50 people were vaccinated with a comparison drug (Vaxigrip vaccine) with a hemagglutinin content of 45 μg / dose - 15 μg of hemagglutinin of influenza virus strains of serotypes Η1Ν1, Η3Ν2 and B.
Полученные при исследовании данные позволили сделать следующие выводы.The data obtained during the study led to the following conclusions.
1. Вакцинация добровольцев предлагаемой вакциной в дозе 45 мкг и вакциной сравнения в дозе 45 мкг не сопровождалась развитием тяжелых местных и общих реакций в поствакцинальном периоде, а возникшие слабовыраженные реакции были кратковременны и не вызывали ухудшения состояния здоровья привитых, что свидетельствовало о безопасности препарата.1. Vaccination of volunteers with the proposed vaccine at a dose of 45 μg and the comparison vaccine at a dose of 45 μg was not accompanied by the development of severe local and general reactions in the post-vaccination period, and the mild reactions that occurred were short-term and did not cause a deterioration in the health of the vaccinated, which indicated the safety of the drug.
2. Однократная внутримышечная иммунизация добровольцев предлагаемой вакциной в дозе 45 мкг и вакциной сравнения в дозе 45 мкг позволила обеспечить следующие показатели иммуногенности к вирусу гриппа серотипов Η1Ν1, Η3Ν2 и В.2. A single intramuscular immunization of volunteers with the proposed vaccine at a dose of 45 μg and the comparison vaccine at a dose of 45 μg allowed to provide the following immunogenicity indicators for the influenza virus serotypes Η1Ν1, Η3Ν2 and B.
Предлагаемая вакцина в дозе 45 мкг обеспечивает уровень сероконверсии 93,3%, 88,4% и 77,4%;The proposed vaccine at a dose of 45 μg provides a seroconversion level of 93.3%, 88.4% and 77.4%;
уровень серопротекции 90,6%, 93% и 75,2%;seroprotection rate of 90.6%, 93% and 75.2%;
кратность прироста антител 17,4; 10,0 и 6,8 соответственно.the increase in antibody growth is 17.4; 10.0 and 6.8, respectively.
Вакцина сравнения в дозе 45 мкг обеспечивает уровень сероконверсии 94,8, 92,2 и 82,3;A 45 μg reference vaccine provides a seroconversion level of 94.8, 92.2 and 82.3;
уровень серопротекции 96,1, 94,4 и 84,4%;the level of seroprotection 96.1, 94.4 and 84.4%;
кратность прироста антител 24,8; 11,0 и 11,5 соответственно.the increase in antibody growth is 24.8; 11.0 and 11.5 respectively.
Полученные результаты показали, что иммуногенность предлагаемой вакцины, а также вакцины сравнения практически одинаковы и соответствуют всем критериям СРМР ЕМЕА.The results showed that the immunogenicity of the proposed vaccine, as well as the comparison vaccine, are almost the same and meet all the criteria for CPMP EMEA.
Согласно рекомендациям ВОЗ инактивированные гриппозные вакцины должны быть изучены на предмет длительности поствакцинального иммунитета на период 6 месяцев, т.е. 180 дней. В результате изучения длительности сохранения поствакцинального иммунитета было показано, что уровень сохранения величины титров антител у добровольцев, привитых предлагаемой вакциной, был выше по отношению к титрам антител у добровольцев, привитых вакциной сравнения (табл. 6).According to WHO recommendations, inactivated influenza vaccines should be studied for the duration of post-vaccination immunity for a period of 6 months, i.e. 180 days. As a result of studying the duration of preservation of post-vaccination immunity, it was shown that the level of conservation of antibody titers in volunteers vaccinated with the proposed vaccine was higher relative to antibody titers in volunteers vaccinated with the comparison vaccine (Table 6).
- 9 016866- 9 016866
Таблица 6Table 6
Оценка длительности поствакцинального иммунитетаEstimation of the duration of post-vaccination immunity
В) Третья фаза клинических исследований (изучение профилактической эффективности).C) The third phase of clinical trials (the study of preventive efficacy).
Профилактическую эффективность вакцины оценивали по двум показателям: индексу эффективности и коэффициенту эффективности в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96.The prophylactic efficacy of the vaccine was evaluated by two indicators: the efficiency index and the efficiency coefficient in accordance with sanitary rules SP 3.3.2.561-96.
Для изучения профилактической эффективности предлагаемой вакцины в многоцентровом, контролируемом, проспективном, рандомизированном исследовании приняли участие около 6000 добровольцев (мужчины и женщины) в возрасте от 18 лет и старше, рандомизированные в две группы. Основная группа добровольцев (группа вакцинированных) была привита предлагаемой вакциной в дозе 45 мкг, группе наблюдения вакцину не вводили.To study the prophylactic efficacy of the proposed vaccine in a multicenter, controlled, prospective, randomized study, about 6000 volunteers (men and women) aged 18 years and older were randomized in two groups. The main group of volunteers (vaccinated group) was vaccinated with the proposed vaccine at a dose of 45 μg, the vaccination group was not administered.
В соответствии с рекомендациями заболевание грипп диагностировали на основании клинических данных. Для подтверждения клинического диагноза грипп среди вакцинированных и невакцинированных участников исследования проведены лабораторно-серологические исследования парных сывороток в первые дни заболевания и через 14-21 день, а также оценены клиническое течение и тяжесть заболевания. Общая продолжительность наблюдения для каждого участника клинического исследования составила не менее 6 месяцев.In accordance with the recommendations of the disease, the flu was diagnosed on the basis of clinical data. To confirm the clinical diagnosis of influenza among vaccinated and unvaccinated study participants, laboratory-serological studies of paired sera were carried out in the first days of the disease and after 14-21 days, and the clinical course and severity of the disease were evaluated. The total follow-up for each participant in the clinical trial was at least 6 months.
Проведенный в сформированных группах добровольцев анализ заболеваемости гриппом в эпидемический сезон 2007-2008 гг. позволил рассчитать, что профилактическая эффективность предлагаемой вакцины составляет по меньшей мере 79,5% при индексе эффективности, равном по меньшей мере 6,8.An analysis of the incidence of influenza in the epidemic season 2007-2008 carried out in the formed groups of volunteers allowed to calculate that the prophylactic efficacy of the proposed vaccine is at least 79.5% with an efficiency index equal to at least 6.8.
Профилактическую эффективность вакцины оценивали по двум показателям:The prophylactic efficacy of the vaccine was evaluated by two indicators:
индекс эффективности: К=Ь/а, где К - индекс эффективности;efficiency index: K = b / a, where K is the efficiency index;
а - заболеваемость на 1000 среди вакцинированных;a - incidence per 1000 among vaccinees;
Ь - заболеваемость на 1000 среди невакцинированных.B - incidence per 1000 among unvaccinated.
коэффициент эффективности: Е=100х(Ь-а)%/Ь, где Е - коэффициент эффективности;efficiency coefficient: E = 100x (b-a)% / b, where E is the efficiency coefficient;
а - заболеваемость среди вакцинированных;a - incidence among vaccinees;
Ь - заболеваемость среди невакцинированных.B - incidence among unvaccinated.
В случае заболевания и лабораторного подтверждения диагноза грипп у добровольцев была сопоставлена заболеваемость, оценены клиническое течение и тяжесть заболевания, возникновение осложнений.In the case of the disease and laboratory confirmation of the diagnosis of influenza in volunteers, the incidence was compared, the clinical course and severity of the disease, the occurrence of complications were evaluated.
В основной и контрольной группах добровольцев на всем протяжении исследования проводили оценку заболеваемости и тяжести клинического течения гриппа, а также осуществляли дифференциальную диагностику гриппа с другими вирусными и бактериальными инфекциями. Грипп диагностировали на основании клинических данных, а именно выявления основных симптомов: высокая температура, достигающая 39-40°С, длительностью около 3-4 дней; озноб; насморк; першение и боль в горле; сухой, лающий кашель, который сохранялся в течение 2 недель; общая выраженная слабость, недомогание, разбитость; боль и ломота в мышцах и суставах; одышка; боль при движении глаз; конъюнктивит.Throughout the study, in the main and control groups of volunteers, the incidence and severity of the clinical course of influenza was assessed, as well as differential diagnosis of influenza with other viral and bacterial infections was carried out. Influenza was diagnosed on the basis of clinical data, namely the identification of the main symptoms: high temperature, reaching 39-40 ° C, lasting about 3-4 days; chills; runny nose sore and sore throat; dry, barking cough that persisted for 2 weeks; general expressed weakness, malaise, weakness; pain and aches in muscles and joints; dyspnea; pain when moving the eyes; conjunctivitis.
Кроме того, для подтверждения клинического диагноза грипп среди вакцинированных и невакцинированных участников исследования проведены лабораторно-серологические исследования парных сывороток в первые дни заболевания и через 14-21 день, а также оценены клиническое течение и тяжесть заболевания. Общая продолжительность наблюдения для каждого участника клинического исследования составила не менее 6 месяцев.In addition, to confirm the clinical diagnosis of influenza among vaccinated and unvaccinated study participants, laboratory-serological studies of paired sera were carried out in the first days of the disease and after 14-21 days, and the clinical course and severity of the disease were evaluated. The total follow-up for each participant in the clinical trial was at least 6 months.
- 10 016866- 10 016866
Проведенный анализ заболеваемости гриппом и ОРВИ в эпидемический сезон 2007-2008 гг. у привитых добровольцев и наблюдательной группы (невакцинированные) в Санкт-Петербурге, Томске и Перми позволил рассчитать профилактическую эффективность предлагаемой вакцины, коэффициент эффективности которой в отношении лабораторно-подтвержденного гриппа составляет 86,5%, а индекс эффективности 7,4.The analysis of the incidence of influenza and SARS in the epidemic season 2007-2008. vaccinated volunteers and the monitoring group (unvaccinated) in St. Petersburg, Tomsk, and Perm made it possible to calculate the prophylactic effectiveness of the proposed vaccine, the coefficient of effectiveness for laboratory-confirmed influenza is 86.5%, and the effectiveness index is 7.4.
Ранее в России в рамках государственных испытаний проводилась оценка профилактической эффективности различных зарубежных вакцин против гриппа. В результате этого исследования было показано, что для вакцины Инфлювак (Солвей Фарма, Голландия) индекс эффективности составил 4,5, а коэффициент эффективности - 77,7%. Для вакцины Ваксигрип (Санофи Пастер, Франция) коэффициент эффективности вакцины составил 79%, а индекс эффективности составил 4,7.Earlier in Russia, as part of state trials, the preventive effectiveness of various foreign influenza vaccines was evaluated. As a result of this study, it was shown that for the Influvac vaccine (Solvey Pharma, Holland), the efficacy index was 4.5, and the efficacy ratio was 77.7%. For the Vaxigrip vaccine (Sanofi Pasteur, France), the vaccine's efficacy ratio was 79%, and its efficacy index was 4.7.
Вакцина Грипол (Петровакс, Россия) является наиболее применяемой отечественной вакциной. В ходе государственных испытаний было установлено, что данная вакцина имеет коэффициент эпидэффективности 59,3%; а индекс эпидэффективности равен 2,0.Gripol vaccine (Petrovax, Russia) is the most used domestic vaccine. During state trials, it was found that this vaccine has an epidemiological coefficient of 59.3%; and the epidemiological efficiency index is 2.0.
Приведенные выше результаты исследований подтверждают более высокие показатели профилактической эффективности предлагаемой вакцины по сравнению с известными зарубежными и отечественными вакцинами.The above research results confirm higher prophylactic efficacy of the proposed vaccine in comparison with the known foreign and domestic vaccines.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201100723A EA016866B1 (en) | 2011-06-06 | 2011-06-06 | Vaccine for specific prophylaxis of influenza |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201100723A EA016866B1 (en) | 2011-06-06 | 2011-06-06 | Vaccine for specific prophylaxis of influenza |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201100723A1 EA201100723A1 (en) | 2012-07-30 |
| EA016866B1 true EA016866B1 (en) | 2012-08-30 |
Family
ID=46614803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201100723A EA016866B1 (en) | 2011-06-06 | 2011-06-06 | Vaccine for specific prophylaxis of influenza |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA016866B1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1652914A1 (en) * | 2004-10-27 | 2006-05-03 | Berna Biotech AG | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and Hepatitis B virus |
| RU2008119501A (en) * | 2005-10-18 | 2009-11-27 | Новавакс, Инк. (Us) | FUNCTIONAL VIRUS-RAISING PARTICLES OF INFLUENZA (VLPS) |
-
2011
- 2011-06-06 EA EA201100723A patent/EA016866B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1652914A1 (en) * | 2004-10-27 | 2006-05-03 | Berna Biotech AG | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and Hepatitis B virus |
| RU2008119501A (en) * | 2005-10-18 | 2009-11-27 | Новавакс, Инк. (Us) | FUNCTIONAL VIRUS-RAISING PARTICLES OF INFLUENZA (VLPS) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MEL'NIKOV S.Ya. i dr. Razrabotka i doklinicheskoe issledovanie virosomal'noy rasscheplennoy grippoznoy vaktsiny novogo pokoleniya "Grifor®". Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii, 2009, Ôäû 1, s. 21-26 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201100723A1 (en) | 2012-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11547673B1 (en) | Coronavirus vaccine | |
| CN101815505B (en) | Virosomes comprising hemagglutinin derived from an influenza virus produced in a cell line, compositions, methods of manufacturing, use thereof | |
| CN110381994A (en) | For inducing the RNA of the nucleosides modification for the immune response for being directed to zika virus | |
| PT2651436E (en) | Mycobacterium antigenic composition | |
| KR20070116650A (en) | Novel composition | |
| US11986518B2 (en) | Immunogenic compositions | |
| EA024074B1 (en) | Aqueous adjuvant composition comprising a non-ionic isotonicity agent, immunogenic composition and kit based thereon and process for preparing an immunogenic composition | |
| US20220259618A1 (en) | Agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in liquid form (variants) | |
| JP6941566B2 (en) | Vaccine containing immobilized virus particles | |
| JPH10511649A (en) | Peptide p277 analogs and pharmaceutical compositions containing the same for the treatment or diagnosis of diabetes | |
| Homhuan et al. | Virosome and ISCOM vaccines against Newcastle disease: preparation, characterization and immunogenicity | |
| CN107296793A (en) | Liposomal formulation suitable for treating or preventing tuberculosis | |
| KR20070095881A (en) | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus | |
| EP2889040A1 (en) | Vaccine formulation against toxoplasma gondii infection | |
| EA016866B1 (en) | Vaccine for specific prophylaxis of influenza | |
| Kimoto | Development of a safe and effective novel synthetic mucosal adjuvant SF-10 derived from physiological metabolic pathways and function of human pulmonary surfactant | |
| US3485721A (en) | Process for growing mycoplasma pneumonial organisms | |
| MX2013003451A (en) | Generation of virosome particles. | |
| Huang et al. | Production of egg yolk antibody against A. fumigatus and its therapeutic potential for treating A. fumigatus keratitis | |
| FR2499410A1 (en) | VACCINE AGAINST ENZOOTIC ABORTION IN EWES AND METHOD FOR PREPARING SAME | |
| RU2523614C1 (en) | Vaccine against influenza and method for its preparation | |
| EP2039764A1 (en) | Truncated secretory aspartyl proteinase 2 | |
| JP2013540797A (en) | Immunogenic composition comprising Shigella lipopolysaccharide and outer membrane protein | |
| US7892562B2 (en) | Methods of inducing TH-1 immune responses to HIV-1 by administering UV/psoralen-treated desialated inactiviated HIV-1 virions deficient in CD55 and CD59 | |
| AU2018386128B2 (en) | Vaccine compositions and methods of making same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Registration of a licence in a contracting state | ||
| PZ4A | Registration of pledge of rights to a eurasian patent | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| PZ4A | Registration of pledge of rights to a eurasian patent | ||
| PZ4A | Registration of pledge of rights to a eurasian patent | ||
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| PZ4A | Registration of pledge of rights to a eurasian patent | ||
| PZ4A | Registration of pledge of rights to a eurasian patent |