EA016731B1 - Изоформа человеческой альфа-енолазы, антитело к указанной изоформе и способы их применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новым фосфорилированным изоформам α-енолазы в трансформированных клеточных линиях панкреатического происхождения и антителам, связывающим такие изоформы, которые обнаруживаются в сыворотках пациентов с аденокарциномой панкреатического протока человека (PDA). Указанные изоформы и антитела могут использоваться для диагностики и лечения PDA и других видов рака.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым способам диагностики и лечения рака человека, в частности рака панкреатического происхождения.

Предпосылки создания изобретения

Аденокарцинома панкреатического протока (ΡΌΑ) представляет собой наиболее распространенный вид рака поджелудочной железы и является четвертой причиной смертности от рака в Соединенных Штатах и Европе. Большинство пациентов умирает в течение 12 месяцев и лишь 2% доживает до 5 лет после постановки этого диагноза. Основным подходом в ведении пациентов с ΡΌΑ является панкреатэктомия и химиотерапия, однако они обеспечивают лишь незначительный эффект с точки зрения выживания пациентов (Ьайеги Ό. апб 1а££ее М., 2005; К1еей 1. е! а1., 2006).

Несмотря на усовершенствование способов хирургического и терапевтического ведения указанных больных (включая использование моноклональных антител, вакцин и химиотерапии), для целей ранней диагностики ΡΌΑ имеется все еще немного маркеров, которые к тому же являются и малонадежными. Наиболее широко используемым серологическим маркером для диагностики рака поджелудочной железы является сиалилированный групповой антиген крови Ьеетщ СА19-9, но его использование в основном направлено на мониторинг ответа организма на терапию, а не на диагностику ΡΌΑ. Фактически, этот антиген может также присутствовать в повышенных концентрациях в сыворотке больных, пораженных доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы (например, в случае хронического панкреатита или обструкции желчных путей), что может давать ложные позитивные результаты, и, соответственно, не всегда может использоваться, поскольку он совсем не экспрессируется у 5-10% населения (Окизака Т. е! а1., 2006).

В этой связи проводятся интенсивные разработки альтернативных биомаркеров с целью оценки возможности их использования для диагностики ΡΌΑ, с тем чтобы можно было ограничить применение таких инвазивных процедур, как биопсия и гистопатологический анализ (Воиуе! М., 2004; Вгапб В., 2001; Соддиъ М., 2005; Ьеипд Т. е! а1., 2005), а также для оценки предлагаемых для лечения лекарственных средств (Сойеп 8. апб Мегоро1 Ν., 2002; Лтепо Α. апб Н1ба1до М., 2006).

В последнее время использовались различные методики для идентификации предполагаемых биомаркеров ΡΌΑ, с использованием крупномасштабного анализа экспрессии белков (на основе оценки уровня РНК или белка). В частности, использовались протеомические методики для выявления антигенов, которые проявляют гуморальный ответ в сыворотках пациентов с ΡΌΑ, при сравнении белков, которые разделяются двумерным гель-электрофорезом (2-ΌΕ), распознаваемых сывороточными антителами от раковых больных и идентифицируемых с использованием масс-спектрометрии (Согд Α. е! а1., 2004; Сгайат Ό. е! а1., 2005). Варианты такого подхода для выделения, отбора и характеристики белков описаны в литературе различными авторами, например 8ΕΒΡΑ (К1абе С. е! а1., 2001), ΡВОТΕОМΕX (Ь1сй!еп1е18 В. е! а1., 2003) или 8ΡΕΑΒ (Инетт В. е! а1., 2003).

В основе всех этих методик лежит один общий подход, заключающийся в признании того факта, что за счет характеристики В-клеточного репертуара против антигенов, специфически экспрессируемых злокачественными опухолями (так называемая раковая иммунома человека), будет возможно определить специфические мишени, которые вовлекаются в процессы иммунологического надзора и иммунологической коррекции при раке, и понять механизмы, ведущие к неконтролируемой клеточной пролиферации и метастазированию (Эгаке С. е! а1., 2006; Όιιππ С. е! а1., 2004).

Предполагалось, что иммунотерапия может предоставить ценный подход для лечения рака поджелудочной железы (Ьайеги Ό. апб .Тайсе М., 2005). Фактически, был составлен перечень возможных ΡΌΑспецифических белков на основе данных об их повышенной экспрессии на уровне РНК (XVО 04/55519) или по результатам крупномасштабного протеомического анализа образцов сыворотки и/или панкреатических образцов (Вйа!!асйагууа 8. е! а1., 2004; Сао Ό. е! а1., 2005; Сессош Ό. е! а1., 2003; Сйеп В. е! а1., 2005; СгопЬогд М. е! а1., 2006; Нопба К. е! а1., 2005; Коотеп 1. е! а1., 2005; Робпдиех 1. е! а1., 2005; 8йеп 1. е! а1., 2004; ВозТу С. апб Соддшз М., 2005; 8шйа Ρ. е! а1., 1999; Уи Υ. е! а1., 2005). Предполагаемые для диагностики ΡΌΑ белки сыворотки представляют собой гамма-фибриноген (В1оотз!оп М. е! а1., 2006), белок ΌΕΑΌ-Ьох 48 (Х1а О. е! а1., 2005), М1С-1 (Коортапп 1. е! а1., 2004), РТН-родственный белок (Воиуе! М. е! а1., 2001) и кальретикулин (Нопд 8. е! а1., 2004).

Однако все еще имеется потребность в надежных биомаркерах для раннего выявления ΡΌΑ и ее дифференцированной диагностики от других патологий поджелудочной железы или других видов рака.

- 1 016731

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что сыворотки от пациентов с ΡΌΑ, в сравнении с сыворотками от здоровых индивидуумов или от индивидуумов, пораженных другими патологиями, содержат антитела, направленные против специфических белков, которые экспрессируются в клеточной линии, происходящей из панкреатического рака. Присутствие этих белков было подтверждено с использованием очищенных антител, специфичных к таким белкам в экстрактах, полученных из нормальных тканей поджелудочной железы и тканей поджелудочной железы с ΡΌΑ.

Основным объектом настоящего изобретения являются новые ΡΌΆ-ассоциированные изоформы человеческой альфа-енолазы (ΕΝΟΑ), которые фосфорилированы по меньшей мере в трех положениях и которые были также выявлены в одной из новых изоформ альфа-енолазы.

Другим объектом настоящего изобретения являются антитела, связывающие эти фосфорилированные изоформы ΕΝΟΑ и, соответственно, позволяющие дифференцировать их от других изоформ ΕΝΟΑ. Указанные антитела могут быть представлены в любом подходящем формате, таком как моноклональные антитела (в частности, человеческие моноклональные антитела) и фрагменты антител.

Белки, которые были определены как ΡΌΑ-ассоциированные согласно настоящему изобретению, и связывающие их антитела (а также любые другие специфические средства для их детекции) могут использоваться в способах диагностики ΡΌΑ, а также для идентификации агентов для лечения ΡΌΑ. В частности, основанная на антителах детекция ΡΌΑ-ассоциированных фосфорилированных изоформ ΕΝΟΑ в биологических образцах (таких как сыворотка или биопсийные образцы), получаемых от пациента, может использоваться в способах диагностики ΡΌΑ, для оценки прогрессирования заболевания или для оценки эффективности лекарственных средств для лечения ΡΌΑ.

Другие объекты настоящего изобретения включают наборы для диагностики ΡΌΑ, для оценки прогрессирования заболевания или для оценки эффективности лекарственных средств для лечения ΡΌΑ, а также наборов, включающих по меньшей мере один из ΡΌΑ-ассоциированных белков согласно настоящему изобретению и/или связывающих их антител.

Другие объекты настоящего изобретения, включающие те объекты, которые имеют отношение к определению и использованию специфических анти-альфа-енолазных антител в диагностике и лечении рака поджелудочной железы, приведены в представленном ниже описании.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схематическая иллюстрация метода 8ΕΚΡΑ, применяемого для характеристики ΡΌΑассоциированных белковых антигенов и антител с использованием ΟΡ-ΡΑΟ-1 клеток (опухолевые клетки) и сывороток от пациентов с ΡΌΑ (опухоль) или контрольных доноров (здоровых доноров).

Фиг. 2Α. 2-ΌΕ гель, полученный с использованием белкового экстракта из клеток клеточной линии ΟΡ-ΡΑΟ-1, в рамках теста на выявление ΡΌΑ-ассоциированной экспрессии белка. Белки указанного клеточного экстракта разделяют в геле на основании их молекулярной массы и показателя р1 и далее визуализируют с использованием окрашивания серебром. На чертеже показано положение пятен, выявляемых методом вестерн-блоттинга в сыворотке пациентов с ΡΌΑ, но не выявляемых в контрольных сыворотках (наименование конкретного белка, соответствующее каждому из приведенных номеров, представлено в табл. 1).

Фиг. 2В. Гистограммы, показывающие процент сывороток от пациентов (где их число в каждой группе обозначено показателем п), пораженных хроническим панкреатитом (ΟΡ) или ΡΌΑ на разных стадиях заболевания (II, III, IV), которые содержат антитела, распознающие указанные ΡΌΑассоциированные белки. Полное наименование белков, соответствующих приведенным сокращениям, приведено в табл. 1.

Фиг. 3. Сопоставление (выравнивание) белковых последовательностей человеческой альфа-енолазы (ΕΝΟΑ; δνΚδΡΚΟΤ, номер доступа Р06733; 8ΕΟ ГО N0:1) и человеческой гамма-енолазы (ΕΝΟΟ δν^δΡΕΟΤ, номер доступа Р09104; 8Ε0 ГО ΝΟ:2) (аминокислоты, которые идентичны в обоих белках, помечены тогда как те аминокислоты, которые являются консервативными, помечены .). Подчеркнуты те пептидные последовательности, которые были идентифицированы методами массспектрометрии в соответствующих пятнах в 2-ΌΕ геле и которые были использованы для отнесения определенных изоформ ΕΝΟΑ к таким пятнам.

Фиг. 4. Положения сайтов фосфорилирования (выделены жирным шрифтом, с подчеркиванием) в белковой последовательности человеческой альфа-енолазы (ΕΝΟΑ), предсказанные на основе различных алгоритмов и/или идентифицированные экспериментально (см. описание соответствующих ссылок, для приведенных под белковой последовательностью малых букв). Пептиды, идентифицированные в ΕΝΟΑ как фосфорилированные в ΕΝΟΑ изоформе 3, показаны в виде прямоугольника, обозначенного сплошной линией. Пептиды, идентифицированные как нефосфорилированные в ΕΝΟΑ изоформе 3, показаны в виде прямоугольника, обозначенного пунктирной линией.

Фиг. 5Α. Выявление шести изоформ альфа-енолазы (ΕΝΟΑ 1, 2, 3, 4, 5, 6) разными способами. Положения ΕΝΟΑ 1/2 и 3 показаны белыми стрелками.

Фиг. 5В. Выявление шести изоформ альфа-енолазы (ΕΝΟΑ 1, 2, 3, 4, 5, 6) в белковых экстрактах из ткани нормальной поджелудочной железы или из ткани поджелудочной железы пациента с ΡΌΑ, кото

- 2 016731 рые были перенесены на мембрану и затем протестированы методом вестерн-блоттинга с использованием анти-ΕΝΟΑ, в качестве первичного антитела. Положения ΕΝΟΑ 1/2 изоформ показаны белыми стрелками. Для целей контрольной оценки количества белка, содержащегося в геле и перенесенного на мембрану, указанную мембрану зондируют кроличьим поликлональным антителом против актина человека (разбавление 1:10000, 8щта Сйет1са1 Со.).

Фиг. 6. Выявление шести изоформ альфа-енолазы (пятна 1, 2, 3, 4, 5, 6) в экстрактах клеток СЕ-РАС-1 с использованием 2-ΟΕ геля и вестерн-блоттинга на основе (в качестве первичного антитела) пула сывороток от пациентов с РЭА. с или без предварительной адсорбции с рекомбинантной человеческой альфа-енолазой (+τΕΝΘΑ или -τΕΝΘΑ). Альтернативно, мембрану подвергают предварительной обработке фосфатазой (+ХРР-аза) перед проведением вестерн-блоттинга с использованием (в качестве первичного антитела) пула из сывороток от пациентов с ΡΩΑ.

Подробное описание изобретения

Комбинированное использование биохимических и протеомических подходов может позволить идентификацию и оценку индивидуальных белков, присутствующих в биологических образцах, отобранных в состоянии болезни. В данном случае этот тип анализа первоначально был направлен на рак (ΡΩΑ) и были использованы два источника ассоциированных с болезнью молекул: клеточная линия ^Ε-ΡΑ^1), полученная на основе клеток аденокарциномы панкреатического протока (ΡΩΑ) человека и сыворотки человека, полученной из большой панели, пациентов с ΡΩΑ, которые потенциально содержат антитела, ассоциированные с ΡΩΑ-онкогенезом и/или его прогрессированием.

Профиль иммунореактивных белков, выявленных в экстрактах ^-ΡΑ^1 вестерн-блоттингом указанных сывороток, сравнивали с результатами, полученными с использованием сывороток от разных контрольных популяций (здоровые субъекты, пациенты с опухолями, отличными от ΡΩΑ, пациенты с хроническим панкреатитом), с тем чтобы установить ΡΩΑ-ассоциированные антитела-кандидаты и родственные антигены в СΕ-ΡΑС-1 протеоме (фиг. 1).

Было показано, что антитела против ограниченного числа белков, обладающих вполне определенной биологической активностью (включая метаболические ферменты и цитоскелетные белки), присутствуют селективно в сыворотке пациентов с ΡΩΑ, указывая на то, что эти белки являются ΡΩΑассоциированными и индуцируют образование ίη νίνο антител у пациентов с ΡΩΑ, но не у здоровых субъектов и не у пациентов с другими, отличными от ΡΩΑ видами рака.

Белки и антитела, которые определяются как Ρ^Α-ассоциированные, согласно настоящему изобретению (и любые другие специфические средства их выявления) могут использоваться в способах ΡΩΑдиагностики, а также для идентификации агентов для лечения ΡΩΑ.

Была определена панель ΡΩΑ-ассоциированных человеческих белков (включающих альфа-енолазу, триосефосфатизомеразу, дегидрогеназу-1 сетчатки, глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназу, фактор элонгации Ти и изоцитратдегидрогеназу, цитоскелетный кератиновый белок 10 типа 1, Кофилин 1; фиг. 2В и табл. 1) с использованием 2-ΟΕ и масс-спектрометрии для разделения и анализа белков в качестве антигенов для антител, специфически присутствующих в сыворотке пациентов с ΡΩΑ. Кроме того, очищенные антитела против данных антигенов подтвердили их дифференциальную экспрессию и в этой связи применимость любого основанного на этих белках способа для их детекции (включая сыворотки, полностью или частично очищенные антитела, препараты поликлональных антител и пептиды) с целью ранней диагностики ΡΩΑ и для оценки прогрессирования этого вида рака у пациентов.

Указанные белки могут использоваться, по отдельности или в сочетании, в качестве биомаркеров для ранней диагностики ΡΩΑ и для оценки прогрессирования этого вида рака у пациентов. Среди указанных биомаркеров ΕΝΟΑ 1/2 (альфа-енолаза, изоформа 1 и изоформа 2) и СОЕ1 (Кофилин 1), идентифицированные с использованием 2-ΟΕ и вестерн-блоттинга, являются, по всей видимости, самыми надежными ΡΩΑ-ассоциированными белковыми антигенами.

Как показано в приведенных примерах, антитела, связывающие такие ΡΟΑ-ассоциированные антигены, могут использоваться для перечисленных выше целей. Таким образом, способы, включающие детекцию таких антигенов и/или антител в биологическом образце (таком как сыворотка, биоптат или белковые экстракты клеток/тканей), могут использоваться для ранней диагностики ΡΩΑ и оценки прогрессирования ΡΩΑ у пациентов.

Характеристика ΡΟΑ-ассоциированных антигенов, за исключением одного описанного ниже случая, не может быть распространена на любую посттрансляционную модификацию ΡΩΑ-ассоциированных белков. Полученные данные позволяют полагать, что любое антитело или пептид, специфически связывающиеся либо с эпитопом, общим для всех изоформ данного антигена (как в случае очищенных антител, показанных в табл. 1, правая колонка), либо только с одной или несколькими изоформами, содержащими ΡΩΑ-ассоциированную посттрансляционную модификацию (как модификации, присутствующие в сыворотке пациентов с ΡΩΑ и выявляемые в ходе прогрессирования ΡΩΑ; см. фиг. 2В), могут использоваться для постановки диагноза ΡΩΑ и оценки прогрессирования этого заболевания.

- 3 016731

В связи с поставленной задачей создания новых терапевтических соединений для лечения ΡΌΑ способы, включающие детекцию ΡΌΆ-ассоциированных антигенов и антител (а также их связывающие свойства) в биологических образцах, могут также использоваться с целью оценки разрабатываемых лекарственных средств для лечения ΡΌΆ. Этот подход может быть применен в тестах, в которых присутствие ΡΌΆ-ассоциированных белков и/или антител может сравниваться с изоформами ΕΝΟΑ (ΕΝΟΑ 1/2), как показано в примерах.

Изменения в указанных свойствах, которые могут быть установлены с использованием биохимических и протеомических технологий, описанных в приведенных ниже примерах и представленных в литературе и которые включают воздействие исследуемым соединением, могут указывать на наличие биологического пути, ведущего к ΡΌΑ-онкогенезу и метастазированию. Так, например, возможно подтвердить наличие ΡΌΑ-специфической активности соединения по исчезновению первичных антител против ΡΌΑ-ассоциированных антигенов сыворотки у пациентов или на животных моделях, а также по снижению количества пятен, выявляемых вестерн-блоттингом в клеточных экстрактах с использованием антигенспецифических антител.

Исследуемые соединения могут быть направлены на любую потенциальную терапевтическую мишень ΡΌΑ, включая те из них, которые были определены в рамках настоящего изобретения как ΡΌΑ-ассоциированные белки (такие как СОЕ 1 или ΕΝΟΑ 1/2). Так, например, указанные соединения могут быть представлены в форме антител, связывающихся с ними (в целом или с определенными изоформами), или в виде малых молекул, меняющих их экспрессию или посттрансляционную модификацию, за счет модуляции активности ферментов, модифицирующих их. Кроме того, было обнаружено, что антитела, связывающие человеческую альфа-енолазу, такие как мышиные моноклональные антитела, ингибируют ίη νίίτο рост и пролиферацию трансформированных клеточных линий панкреатического происхождения, презентирующих шесть изоформ альфа-енолазы (в частности, включающих ΕΝΟΑ 1/2, выявленную по методу вестерн-блоттинга в сыворотке пациентов с ΡΌΑ). Указанный ингибирующий эффект на рост и пролиферацию ίη νίίτο наблюдается также в случае трансформированной клеточной линии не панкреатического происхождения, презентирующей шесть таких изоформ альфа-енолазы, за исключением одного: они презентируют только три нефосфорилированные указанные изоформы (пример 3; фиг. 5В; таблица IV), что, предположительно, указывает на возможность использования антиΕΝΟΑ антител для лечения ΡΌΑ.

Такие потенциальные терапевтические свойства могут быть далее оценены в рамках любого теста на пролиферацию панкреатических клеток с использованием клеточных линий или животных моделей для подтверждения эффекта разных соединений, таких как пептиды, пептидные аналоги и малые молекулы, с точки зрения их воздействия на сигнальную трансдукцию (Вакег С. еί а1., 2002; Ваиег Т. еί а1., 2005; Вгипз С. еί а1., 2000; Ьее Ь. еί а1., 2002; ^еν^ίζк^ Α. апб МкНаш Ε., 2006; Οίη Υ. еί а1., 1995; Υеζ11е1уеν М. еί а1., 2004; ВиЬю^к|иейа В. еί а1., 2006). Кроме того, была продемонстрирована возможность использования сочетаний соединений, направленных против разных молекулярных мишеней, для лечения рака поджелудочной железы более эффективно, чем это было ранее. Так, например, введение химиотерапевтического агента вместе с ингибиторами киназ, специфичных для рецепторов клеточной мембраны, приводит к ингибированию роста при раке поджелудочной железы человека в эксперименте и к значительному пролонгированию выживания, как показано на модели животных (Ύο1<οί Ν. еί а1., 2005). Альтернативно, было показано, что в том случае, когда два или более антител, направленных на вирусную или человеческую мишень, объединяют в фармацевтической композиции, полученная композиция может демонстрировать улучшенную терапевтическую и/или диагностическую эффективность, демонстрируя не только аддитивный, но также и синергический эффект (Ьод1епЬегд Т., 2007).

Фармацевтическая композиция, включающая антитела против ΡΌΑ-ассоциированных белков (таких как ΕΝΟΑ 1/2), может вводиться людям с терапевтической и диагностической целью. Таким образом, способы лечения или диагностики ΡΌΑ могут включать введение фармацевтических композиций, содержащих антитела против ΡΌΑ-ассоциированных белков (таких как ΕΝΟΑ 1/2).

Указанные композиции могут включать стандартные фармацевтические наполнители и могут вводиться в виде однократной дозы или множественных доз и/или с использованием подходящих устройств, различными способами введения: внутримышечно, внутривенно, подкожно, местно, через слизистую, в составе неразлагаемых/биодеградируемых матричных материалов или с использованием систем доставки лекарственных средств в форме частиц. В частности, указанная композиция может позволять эффективное введение в поджелудочную железу или в любые другие ткани, где присутствуют ΡΌΑ-ассоциированные белки.

Фармацевтическая композиция должна обеспечивать доставку терапевтически или профилактически эффективного количества соединения субъекту, что позволит данному соединению проявлять свою активность в течение достаточного периода времени. Желаемый эффект заключается в улучшении состояния пациента с ΡΌΑ за счет контроля роста и пролиферации ΡΌΑ путем снижения по меньшей мере одного из клинических проявлений ΡΌΑ. Так, например, указанная композиция должна вводиться в эффективном количестве от примерно 0,005 до примерно 50 мг/кг/вес тела, в зависимости от способа введения и от состояния индивидуума.

- 4 016731

В случае композиций, применяемых с диагностической целью, указанное соединение должно выявляться с использованием методик, обычно установленных в клинических и исследовательских лабораториях для выявления вирусов в биологических образцах (таких как, например, ЕЫ8Л или другие методы серологического анализа) или в случае введения субъекту ίη νίνο по меньшей мере через 1, 2, 5, 10, 24 ч или более после введения. Указанная детекция ΡΌΑ-ассоциированных белков и/или антител может быть выполнена с использованием ΡΌΆ-ассоциированных белков и/или антител согласно настоящему изобретению, с проведением впоследствии или в сочетании с ней известных методик и процедур, которые были установлены для диагностики ΡΌΆ.

Клиническая разработка и использование антител для терапии и/или диагностики ΡΌΆ должны основываться на данных оценки фармакокинетики и фармакодинамики антител (ЬоЬо Е. е! а1., 2004), а также на результатах исследования их доклинической и клинической безопасности (ТаЬп/ί М. апб ΡίδΚοδ Ь., 2007) и соответствия международным требованиям по производству и контролю качества моноклональных антител для терапевтического и диагностического использования ίη νίνο на людях (Наглк В. е! а1. 2004).

Наборы для ΡΌΆ-диагностики у пациента могут включать один или несколько определенных выше ΡΌΆ-ассоциированных белков и/или антител, а также любое другое соединение, позволяющее их детектировать, согласно настоящему изобретению. Указанные наборы могут включать немеченные/меченые антигены, антитела или субстраты, которые модифицируются после взаимодействия с таким антигеном (например, в случае соединений, идентифицированных как обладающих ферментативной активностью).

В числе мишеней гуморальной реакции на ΡΌΆ особый интерес представляет тот факт, что новые фосфорилированные изоформы альфа-енолазы распознаются ΡΌΆ-сывороткой. Новые изоформы человеческой альфа-енолазы (ΕΝΟΑ) подвергаются фосфорилированию по меньшей мере в трех положениях, всего было идентифицировано семь сайтов фосфорилирования (фиг. 4). Значимость этих данных подтверждается фактом выявления двух высокофосфорилированных изоформ ΕΝΟΑ (ΕΝΟΑ 1/2) с использованием сыворотки, полученной от пациентов с ΡΌΑ, или тканей поджелудочной железы, также полученных от пациентов с ΡΌΑ (фиг. 2В, 5 и 6; табл. I и II). При этом, как показано, пациенты с ΡΌΑ имеют антитела, которые способны специфически связывать высокофосфорилированные изоформы ΕΝΟΑ согласно настоящему изобретению.

Приведенные примеры показывают, что, несмотря даже на то что в последовательности ΕΝΟΑ могут быть фосфорилированы несколько положений, фактически существенно фосфорилирование вполне определенного сочетания остатков треонина, серина и тирозина, в обоих клеточных линиях и в ΡΌΑтканях, выявляемое человеческими антителами, продуцируемыми у пациентов с ΡΌΑ. В частности, фосфорилирование в положениях треонина 55, тирозина 57, тирозина 200, тирозина 236, треонина 237, тирозина 257 и серина 419 присутствует в изоформе ΕΝΟΑ 3, которая демонстрирует, как и ΕΝΟΑ 1/2, профиль белкового фосфорилирования, меняющийся при обработке фосфатазами. Аналогичные изменения в фосфорилировании белка могут использоваться для диагностики ΡΌΑ и для оценки прогрессирования этого заболевания с использованием биологических образцов, получаемых от пациента.

В варианте подхода, альтернативного относительно полных ΕΝΟΑ 1/2 изоформ, возможно создавать полученные из ΕΝΟΑ одиночные пептиды, включающие их белковые последовательности, или библиотеки и их сочетания, которые содержат такие же фосфорилированные остатки, что и ΕΝΟΑ 1/2, как показано на фиг. 4 (см. приведенные в рамке последовательности). Способы создания и использования таких фосфорилированных белков и пептидов описаны в литературе (Сопгабк Т. е! а1., 2002; И8 5763164; \\Ό 97/30097).

Количество и эффект посттрансляционных модификаций в изоформах альфа-енолазы (в частности, в ΕΝΟΑ 1/2) могут быть также подтверждены с использованием известных процедур (Ка1ите Ό. е! а1., 2003; МаеЫба К. е! а1., 2003; Мапп М. е! а1., 2002; Викй 1. е! а1., 2005; Мойпа Н. е! а1., 2007; 8е1ппе1/1е К. апб \Ы!е Р., 2006; \и 1. е! а1., 2005) в ΡΌΑ-ассоциированных и контрольных образцах. В ΕΝΟΑ 1/2 могут присутствовать дополнительные фосфорилированные положения и/или дополнительные модификации, известные для ΕΝΟΑ (табл. III), которые релевантны для антигенности и биологической активности этих изоформ, а также для целей их детекции изоформ-специфическими антителами. Посттрансляционная модификация, ассоциированная со специфическим стадиями/типами заболевания, может быть выявлена с помощью нескольких способов, включающих непосредственный анализ различающихся изоформ белков или антител, содержащих специфические модификации, как было показано для других белков (БбЬегд Ό. е! а1., 2005; Мапбе11 1., 2003).

Антитела, в частности моноклональные антитела, которые определяются согласно их связыванию с белковыми изоформами, дифференциально экспрессируемыми в не-ΡΌΑ/ΡΌΑ белковых экстрактах в рамках 2-ОР-процедуры и вестерн-блоттинга, могут использоваться при лечении тех видов рака, которые имеют анлогичный профиль, по данным анализа в 2-ΌΕ и вестерн-блоттинга. Так, антитела, связывающие альфа-енолазу (в целом, или ее специфические фосфорилированные изоформы, в частности), могут использоваться при изготовлении фармацевтических композиций для лечения ΡΌΑ и в терапевтических стратегиях, используемых применительно к пациентам с ΡΌΑ или раковым больным, которые демонстрируют аналогичный профиль экспрессии альфа-енолазы (т.е. экспрессируют новые изоформы человече

- 5 016731 ской альфа-енолазы согласно настоящему изобретению, которые фосфорилированы по меньшей мере в 3 положениях).

Антитела могут использоваться для детекции или лечения тех видов рака (например, РИА), которые характеризуются присутствием в сыворотке пациентов фосфорилированных изоформ альфа-енолазы. Такие антитела могут быть получены при использовании любой известной в данной области методики идентификации, характеристики и продукции антител для терапевтических или диагностических целей (1а1и М. с1 а1., 2007; ЬаГДу Е. аиб Зобоуег К., 2005). Указанные антитела могут быть получены в любом белковом формате, соответствующем функциональным антителам, а именно: в виде полноразмерных антител (таких как моноклональные антитела, в частности человеческие или гуманизированные моноклональные антитела), в виде фрагментов антител, антигенсвязывающих белков и других сконструированных белков и пептидов слияния на основе антител, которые описаны в литературе под разными наименованиями, такими как 8сГу (одноцепочечный фрагмент вариабельного участка), ЕаЬ (гетеродимер тяжелой/легкой цепи вариабельного участка), димерные антитела, выделенные тяжелые или легкие цепи, пентамерные антитела или биспецифические антитела.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть улучшены, применительно к определенным свойствам, путем конъюгации (с использованием химических линкеров или полимеров) или слияния с терапевтическими, стабилизирующими агентами, метками или диагностическими агентами. Примерами таких агентов являются детектируемые меченые молекулы (например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, токсин, атом металла, хемилюминесцентное соединение, биолюминесцентное соединение, биотин, субстрат фермента или фермент), которые могут присоединяться. ΕΝΟΑспецифическая активность также может быть повышена путем слияния с другим терапевтическим белком, таким как белок или полимер, меняющий метаболизм и/или стабильность в рамках диагностического или терапевтического применения.

Способы отбора и конструирования белковых фрагментов, лигандов и соответствующих линкеров, а также процедуры и стратегии конструирования, очистки, детекции и использования белков слияния описаны в литературе (ΝίΗκοη с1 а1., 1997; Аррйсабоик ОГ СЫшепс Оеиек Апб НуЬпб РгсИешк. Мебюбк Еихуто1. Уо1. 326-328, Асабешк Ргекк, 2000; \УО 01/77137) и доступны в клинических и исследовательских лабораториях. Так, например, указанный белок слияния может содержать последовательности, распознаваемые антителами, доступными в коммерческом варианте (включая фрагменты, такие как полигистидин, ЕЬАО, с-Мус или НА фрагменты), которые могут облегчать идентификацию ίη νίνο и/или ίη νίΐτο белка слияния или его очистку. Другие белковые последовательности могут быть легко идентифицированы по процедуре прямого флуоресцентного анализа (как в случае зеленого флуоресцентного белка) или с использованием специфических субстратов или ферментов (например, с использованием сайтов протеолитического расщепления).

Антитела, распознающие РЭА-спедифические белковые последовательности (такие как ΕNОΑ 1/2), или любые другие белковые последовательности, полученные на основе таких антител, могут быть экспрессированы в виде рекомбинантного белка с использованием соответствующих векторов для трансформации клеток-хозяев, где указанные клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, и которые будут позволять секрецию желательного рекомбинантного белка. Способы получения таких белков включают культивирование клеток-хозяев, трансформированных векторами экспрессии, включающими кодирующие последовательности, в условиях, подходящих для экспрессии белка, и восстановление белка из культуры клеток-хозяев.

Векторы, используемые для экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах, описаны в соответствующих руководствах и обзорах, где, в частности, уделяется внимание способам клонирования и получения рекомбинантных белков (в частности, это работы из серии А Ртасбса1 Арртоасй, опубликованной Оксфордским Университетом (ОхГогб υηίν. Ргекк) (^NΑ С1ошид 2: Ехртеккюи 8ук1етк. 1995; ^NΑ С1ои1ид 4: Маттайаи 8ук1етк. 1996; Рго1ет ЕхргеккюгГ. 1999; РгсЛеш РилДсабои Тесйшдиек, 2001)). Могут быть добавлены дополнительные белковые последовательности к желательной форме антитела (ЗсГу, ЕаЬ, фрагмент антитела, полноразмерное человеческое антитело и т.п.) или это может быть вставка, замещение или удаление одной или нескольких внутренних аминокислот. Указанные методики могут также использоваться для дальнейшей структурной и функциональной характеристики и оптимизации трапевтических свойств белков, в целом, и антител, в частности (К1т З. е1 а1., 2005).

Ниже настоящее изобретение описывается с использованием соответствующих примеров, которые не следует трактовать как ограничивающие каким-либо образом настоящее изобретение.

- 6 016731

Примеры

Пример 1.

Детекция ΡΌΆ-ассоциированных гуморальных антигенов в протеоме клеточной линии СР-РАС-1. Материалы и методы.

Человеческая сыворотка.

Образцы сыворотки выделяют из венозной крови пациентов, при наличии информированного согласия таких пациентов, и от здоровых доноров в соответствии с протоколом, разрешенным Этическим Комитетом для применения в клинических институтах. Образцы хранят при температуре -80°С до использования.

Сыворотку получают от 70 пациентов с ΡΌΑ (31 мужчина, 39 женщин; в возрасте 32-86 лет; средний возраст ± стандартное отклонение: 67±11), которые были объединены в группы, на основании выявленных у них клинических стадий, при оценке стадий согласно общепринятой классификации (Рапа 8. с1 а1., 2004) и классификации ЫСС (υηίοη 1п1сгпа11опа1 Соп1ге 1е Сапсег), следующим образом: 17 человек на стадии II (отсутствие метастаз, отмечается умеренная дифференцировка), 17 человек на стадии III (отсутствие метастаз, слабая дифференцировка) и 36 человек на стадии IV (наличие удаленных метастаз, недифференцированная ткань).

Реактивность указанных образцов сыворотки сравнивают с результатами ее оценки у 40 здоровых субъектов, которые были использованы в качестве контролей и которые не имели в анамнезе рака или аутоиммунного заболевания (14 мужчин, 26 женщин; возраст в диапазоне 57-77; средний возраст ± стандартное отклонение: 70±7). Дополнительно, реактивность этих образцов сыворотки сравнивают с результатами ее оценки у 30 пациентов с раком, отличным от ΡΌΑ (9 пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, 12 пациентов с раком молочной железы, 8 пациентов с раком толстой кишки и 1 пациент с раком яичника; 11 мужчин, 19 женщин; возрастной диапазон 44-79; средний возраст ± стандартное отклонение 66±10) и у 15 пациентов с хроническим панкреатитом (9 мужчин, 6 женщин, возрастной диапазон 49-76; средний возраст ± стандартное отклонение: 59±8).

По возрасту и распределению по половому признаку в различных группах пациентов, у которых отбирались образцы сыворотки, не было выявлено статистически значимых различий, как следовало из оценки в рамках непарного 2-параметрового т-теста Стьюдента. И только в группе пациентов с хроническим панкреатитом распределение по возрасту (но не по полу) в двух указанных группах существенно различалось, поскольку это заболевание в основном поражает людей в более молодом возрасте (в среднем, в возрасте около 44 лет), чем ΡΌΑ.

Клеточные линии и получение клеточных экстрактов.

Клетки (10⁷) из клеточной линии СР-ΡΑС-1 (ЕСАСС, кат. № 91112501), полученные из аденокарциномы панкреатического протока (8сйоитасйег К. е1 а1., 1990), собирают и промывают сбалансированным солевым раствором Хэнкса (81дта Сйет1са1 Со., 81. Ьош8, МО, и8А). Осадок подвергают лиофильной сушке в течение ночи и хранят при температуре -80°С. Далее полученный осадок ресуспендируют в 200 мкл регидратирующего буфера [5 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% (вес./об.) ΟΗΑΡ8 (81дта Сйетюа1 Со.), 2 об.% РС буфер 3-10 ЫЬ (ОЕ Неа11йсаге Вю-8с1епсе§, ирр§а1а, 8\гебеп). 80 мМ ДТТ (8щта Сйетюа1 Со.)] и следовые количества бомфенолового синего (81дта Сйетюа1 Со.). Концентрацию белка определят по методу Брэдфорда (Вю-Каб БаЬогаЮпеЦ.

Двумерный гель-электрофорез (2-ЭЕ).

100 мкг белкового экстракта из клеток линии СΕ-ΡΑС-1 наносят, при регидратации геля, на РС полосы размером 7 см (рН 3-10 ΝΕ), применяемые в гелях для аналитического и препаративного электрофореза. Изоэлектрофокусирование ДЕЕ) проводят в системе РОрйог ШЕ (ОЕ Неа11йсаге Вю-8с1епсе§), используя градиент напряжения до 5000 В, и всего 16000 В-ч. Перед проведением ДСН-ПААГ, РС полосы уравновешивают в течение 15 мин раствором, содержащим Трис/НС1-6уфер (50 мМ; рН 8,8), мочевину (6 М), глицерин (30 об.%), ДСН (2% (вес./об.)) и ДТТ (2% (вес./об.)) и затем в течение еще 5 мин в том же буфере, но содержащем иодацетамид (2,5% (вес./об.)) и бромфеноловый синий, вместо ДТТ. Для проведения электрофореза во втором направлении используют полосы размером 7 см на основе малоразмерных NиΡΑ6Е® Ыоуех® 4-12% ВЦ-ТЩ 2оот® сформованных гелей Дпуйгодеп, Огошпдеп 1йе №1йег1апб8) с использованием системы Ыоуех Х-Се11 II™ М1ш-се11 ([пуйгодеп) при постоянном напряжении 200 В и затем переносят на нитроцеллюлозную мембрану НуЬопб ЕСЬ (СЕ Неа11йсаге Вю-8с1епсе§) с использованием модуля для блоттинга Ыоуех Х-Се11 II™ (ШуНю^еи) или процедуры серебряного окрашивания для дальнейшего масс-спектрометического анализа (8йеусйепко А. е1 а1., 1996).

Значения рI в полученных пятнах белков определяют с учетом их положения на 2-ЭЕ геле при использовании рН-градиентных калибровочных кривых, предоставляемых СЕ НеаНйсаге Вю-8с1епсе§. Молекулярный вес белков рассчитывают, сравнивая их миграцию с миграцией соответствующих стандартов 8ееВ1ие Ρ1ιΐ52 ΡΐΌ5Ειίικ6 Дпуйгодеп) с известным молекулярным весом. Снимки картины, получаемой в 2ЭЕ гелях, делают с помощью Iтаде8саηηе^ (СЕ Неа11йсаге Вю-8с1епсе§) и записывают в формате ТГЕЕ в рамках программного обеспечения 'ТтадеМайег ЬаЬксап Vе^ 3.00 (СЕ Неа11йсаге Вю-8с1епсе§).

- 7 016731

Вестерн-блот анализ.

Мембраны инкубируют в течение 15 ч при температуре 4°С в блокирующем буфере, состоящем из ТВ8 с содержанием 5% обезжиренного сухого молока, после чего инкубируют в течение 4 ч с сывороткой (1:200, делают рабочее разбавление с использованием ТВ8, содержащего 0,05% Твин 20 и 5% обезжиренного сухого молока). После промывки мембраны инкубируют с конъюгированным с пероксидазой хрена (НИР) кроличьим антителом против человеческого иммуноглобулина С (1дС) (8аи1а Сгих Вю1ес1то1оду) в разбавлении 1: 1000 в течение 90 мин при комнатной температуре.

Альтернативно, для целей вестерн-блот анализа с использованием очищенных первичных антител нитроцеллюлозные мембраны подвергают блоттингу в рамках процедуры с использованием 2-ΌΕ гелей и затем зондируют антителами в разбавлении 1:1000, используя либо мышиное антитело [такое как моноклональные антитела против енолазы 19/12⁸ (субклон, полученный из клона 19/12, описанный Мо8еа1о 8. е( а1., 2000), против триосефосфатизомеразы 1 (АЬиоуа СогрогаДои), против кератина 10 (Сйеткои 1и(егиа1юиа1), против фактора элонгации (и (АЬиоуа Согрогайои)], либо кроличье антитело [такое как поликлональные антитела против альдегиддегидрогеназы 1 (СНспйсоп 1и1сгиа11оиа1). против глюкозо-6фосфат-1-дегидрогеназы (Вс(Пу 1 1аЬога1оДе8), против изоцитратдегидрогеназы (Вюдеиекщ Иб) и против кофилина 1 (Се11 81диайид)] в течение 1 ч при температуре 25°С. Далее, указанные мембраны инкубируют в течение 1 ч со специфическим вторичным НКР-конъюгированным кроличьим антителом, либо против мышиного 1дС, либо против кроличьего 1дС (8ап1а Сгих Вю(есйио1оду) в соответствии с инструкциями производителя.

Вестерн-блот анализ панкреатических тканей проводят с использованием в совокупности 30-50 мг свежезамороженной ткани, которая была гомогенизирована (Т18 Ьащс ШйаТштах) на льду в 400 мкл лизирующего буфера, содержащего 50 мМ Трис/НС1, рН 7,4, 150 мМ ЫаС1, 1% ΝΡ40, 1% Тритон Х-100, 1 мМ ДТТ, 10 мкл/мл ингибирующего коктейля, 1 мМ РМ8Р (где все реагенты получены от компании 8щша Сйеш1са1 Со.) и 10 мкл/мл смеси нуклеаз (СЕ НеаИйсаге Вю-8с1епсе5). После озвучивания в ультразвуковом дезинтеграторе (Шексйег ИР2008, 3x40 с, с амплитудой до 40%, цикл 0,5) указанную смесь центрифугируют (13000 об/мин, при температуре 4°С в течение 30 мин). 20 мкг белкового экстракта, отобранного из супернатанта, после оценки уровня белка по методу Брэдфорда (Вю-Каб ЬаЬога1ог1е8) разделяют на малых пластинах NиРАСΕ® №уех® 4-12% Вй-Тгй со сформованным гелем (1иуйгодеи) и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, как было описано выше.

Для иммунодетекции используют ЕСЬ (ЕиИаисеб СйетПитшексеисе, СЕ НеаИйсаге Вю-8с1еисе5) и далее проводят ауторадиографию на пленке (НурегШт) (СЕ НеаИйсаге Вю-8с1еисе5). Снимки обработанных пленок делают с использованием 1таде8саииег (СЕ НеаИйсаге Вю-8с1еисе5), записывают в формате Т1РР в рамках программного обеспечения 1тадеМа81ег ЬаЬксаи Уег 3.00 (СЕ Неаййсаге Вю-8с1еисе5) и анализируют с использованием программного обеспечения Ийаде МаЦег 2Ό Е1йе, версия 3.1 (СЕ Неаййсаге Вю-8с1еисе5).

Идентификация белка масс-спектрометрией (М8).

Для проведения М8-анализа соответствующие пятна в препаративных 2-ЭЕ гелях вырезают и анализируют по методу ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы/времяпролетного анализа частиц (МАИО1-ТОР) и, при необходимости, проводят также оценку по методу ионизации электронапылением (Е81).

Белки обесцвечивают, выдерживая в течение ночи с раствором 25 мМ бикарбоната аммония и 50% ацетонитрила, и затем расщепляют в геле трипсином (Рготеда, Мабщои, ΑΙ, И8А) согласно описанной ранее процедуре (Не11таи и. е( а1., 1995). В случае анализа в формате МАИШ-ТОР М8 0,5 мкл каждой из пептидных смесей наносят на целевой диск и высушивают на воздухе. Затем к высушенному образцу добавляют 0,5 мкл матричного раствора (1% (вес./об.) а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 30% ацетонитриле, 0,1% ТФУ) и снова все высушивают. Спектры регистрируют с использованием спектрометра Вгикег КеДех III МАИШ-ТОР. Интрепретацию М8-спектров продуктов расщепления белка проводят по методу оценки пептидных отпечатков (РМР) с использованием программного обеспечения М8-РН (Ыр://рго8рес1ог.ис8реби; СИатгаб Ό. е( а1., 2004).

В рамках М8/М8 экспериментов смесь пептидов после трипсиновой обработки подвергают обессоливанию и концентрируют с использованием устройства 21рТ(р_С|₈ (МДйроге). После элюции с использованием 60% метанола плюс 1% муравьиной кислоты, 4,5 мкл пептидной смеси после трипсиновой обработки вводят в боросиликатный капилляр с золотым покрытием (Ргохеои Вюкуйетк) и анализируют с использованием масс-спектрометрической ионной ловушки ИСО ТИегто (ТйегтоРшшдаи), соединенной с источником Е81. Подачу напряжения на капилляр устанавливают на уровне 46 В и напряжение в процедуре распыления поддерживают на уровне 1,8 кВ. Самые стабильные сигналы, получаемые в ходе масс-спектрального сканирования в полном диапазоне, улавливаются и фрагментируются в рамках низкоэнергетической диссоциации, вызванной столкновением (СГО), при нормализации энергии столкновения в диапазоне от 22 до 24%.

- 8 016731

Некоторые белки идентифицируют также по процедуре ЬС-М8/М8 с использованием массспектрометрической ионной ловушки ЬСО ВЕСА ХР Р1и8 (ТйеттоИпшдап), снабженной источником ионов для ЕЗ1. Хроматографическое разделение и затем МЗ-анализ проводят на колонке С18 Ьипа, с размерами 150x2,0 мм (Рйепотепех) с использованием апаратной части Зитуеуот (аутосэмплер и насос) (ТйеттоЕшшдап), рассчитанной на инъецируемый объем 10 мкл и скорость течения 200 мкл/мин.

Для анализа всех данных, полученных в формате МЗ/МЗ, используют программное обеспечение Вю\тогк5 3.0 (ТйеттоЕшшдап) и полученные последовательности сравнивают с последовательностями человеческих белков, имеющимися в базах данных ЕВ1, с использованием программного обеспечения ЕАЗТА (ййр://^^те.еЫ.ас.ик/йа81а33/; 1ойи8оп В. е! а1., 2005).

Статистический анализ.

Все статистические данные обрабатывают с использованием программного обеспечения СтарйРаб Рп5ш Зой^ате. Приведенные данные представляют собой среднее значение ± ЗЕМ (статистическая ошибка среднего значения). Используют неспареный 2-параметровый 1-тест для оценки значимости экспрессии разных белков в тканях, отобранных из организма с РОА, и в нормальных панкреатических тканях. Двустороннее значение показателя Р<0,05 рассматривают как статистически значимое.

Результаты.

Протеома на основе клеточной линии СЕ-РАС-1, которая часто используется в качестве модели РЭА-ассоциированной экспрессии белка и клеточной пролиферации (Войте! М. е! а1., 2001; 8хере5Йа/1 К. е! а1., 2005), была использована для идентификации присутствия белков и антител, которые ассоциированы с РОА, при использовании сыворотки от пациентов с РОА в качестве источника первичных антител.

Белковые экстракты из указанной клеточной линии анализируют в формате 2-ЭЕ, определяя репрезентативную двумерную карту при проведении окрашивания серебром. Этот подход позволяет отделить белки, содержащиеся в данном экстракте в качестве пятен, которые могут быть отнесены в нужную группу, согласно их интенсивности и положению в 2-ЭЕ геле, и в случае которых могут быть приблизительно определены количество, молекулярный вес и р1 соответствующих белков.

Далее, 2-ЭЕ гели переносят на мембрану для их последующего анализа по процедуре вестернблоттинга с использованием панели сывороток, взятых либо от пациентов с РЭЛ. либо от пациентов без РЭЛ (включая здоровых субъектов, пациентов, пораженных другими видами рака, а также пациентов с хроническим панкреатитом). Сравнение разных картин полученных пятен (а также между снимками пятен после окрашивания серебром и соответствующими пятнами после вестерн-блоттинга в 2-ЭЕ гелях) позволяет идентифицировать РЭА-ассоциированные пятна, которые могут быть впоследствии охарактеризованы, например, в рамках масс-спектрометрического анализа белковых фрагментов, экстрагированных из таких пятен с использованием ферментов, осуществляющих расщепление белков в контролируемых условиях (фиг. 1).

На основе данного подхода отобрали десять пятен, которые были охарактеризованы как соответствующие белкам, которые уникально распознаются сывороточными антителами от пациентов с РЭА (фиг. 2А). Указанный анализ был ограничен человеческими 1дС антителами, поскольку вторичные антитела, которые при этом использовались, специфичны именно для данного изотипа. Указанные десять пятен вырезали из препаративных гелей и анализировали в рамках процедуры МАЬП1-ТОЕ МЗ для идентификации, каким человеческим белкам они соответствуют. При использовании данного подхода девять разных белков были идентифицированы как РПА-ассоциированные антигены. Две пары пятен соответствовали изоформам одного белка, а одно пятно содержало последовательности, принадлежавшие к двум разным белкам, которые были недостаточно полно разделены в рамках 2-ЭЕ. И все такие пятна отсутствовали или были практически невыявляемыми в вестерн-блоттинге, проводимом с использованием контрольных сывороток. Первичные антитела, связывающие один или несколько белков из указанных пятен, были идентифицированы в большом проценте сывороток, полученных от пациентов с РЭА (табл. I).

Среди РПА-ассоциированных антигенных белков может быть проведено разграничение между двумя категориями белков в соответствии с типом биологической активности, по которой они идентифицируются, согласно литературным данным. Первая группа белков включает метаболические ферменты: альфа-енолазу (присутствует в двух пятнах, где каждое соответствует специфической изоформе), триосефосфатизомеразу (присутствует в двух пятнах, где каждое соответствует специфической изоформе), дегидрогеназу-1 сетчатки, глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназу, фактор элонгации Ти и изоцитратдегидрогеназу. Вторая группа белков была охарактеризована как преимущественно скелетно-мышечные белки: скелетно-мышечный кератин 10 типа I и кофилин 1.

В дополнение к результатам, полученным использованием клеток СЕ-РАС-1 и человеческих сывороток, провели сравнение в рамках вестерн-блоттинга панкреатических экстрактов, которые были получены от здоровых субъектов и пациентов с РЭА, с использованием для анализа очищенных антител против указанных выше белков (но не человеческой сыворотки) в качестве первичных антител. Анализ такого рода позволяет провести количественное определение суммарного белка (а не только определенных изоформ), и его результаты показывают, что эти белки подвергаются суперэкспрессии, в разной степени, в панкреатических тканях, полученных из биоптатов от пациентов с РЭА (табл. I).

- 9 016731

Диагностическую ценность указанных белков (и присутствие в ΡΌΑ сыворотке специфических белков против них) далее оценивали путем дифференцированного выявления присутствия пятен для каждого из белков в сыворотках, полученных от пациентов с ΡΌΑ, но сгруппированных в соответствии со стадией заболевания, а также с использованием сывороток от больных с хроническим панкреатитом, в качестве контролей.

Результаты вестерн-блот анализа показали, что присутствие и количество аутоантител против разных белков неравномерно распределяется у пациентов на разных стадиях ΡΌΑ (фиг. 2В). Аутоантитела против большинства белков отсутствуют в контрольных сыворотках, тогда как частота выявления содержащих их ΡΌΑ сывороток повышается у пациентов с ΡΌΑ на стадии II, для большинства исследованных белков (ниже 25%), за единственным исключением ΕΝΟΑ 1/2. Указанная частота проявления в профиле продукции аутоантител подтверждается для большинства развитых стадий заболевания, где снова аутоантитела против изоформ альфа-енолазы представляли особый интерес, поскольку демонстрировали постоянное повышение частоты выявления на стадии III и стадии IV ΡΌΑ.

Выводы.

Серологический подход, объединяющий метод оценки профиля экспрессии в рамках 2-ΌΕ для клеточной линии клеток опухоли поджелудочной железы человека ^Ρ-ΡΑ^1) и вестерн-блот анализ (при использовании, в качестве первичных антител, человеческого ^С из сыворотки от пациентов с ΡΌΑ), позволяет идентифицировать ограниченное число человеческих белков и их изоформ, против которых у пациентов с ΡΌΑ развивается специфический гуморальный ответ. При наличии единственного исключения (ΑΕ1Α1) экспрессия этих белков подвергается позитивной регуляции в оцениваемых биоптатах от пациентов с ΡΌΑ.

Кроме того, образование антител против указанных ΡΌΑ-ассоциированных белков, по всей видимости, по меньшей мере для некоторых антигенов, значительно повышается на развитых стадиях заболевания.

Приведенные результаты демонстрируют применимость серологических подходов в поиске и идентификации возможных маркеров для ранней диагностики ΡΌΑ, которые, в данном случае, преимущественно являются внутриклеточными. Механизм, посредством которого иммунная система взаимодействует с внутриклеточными белками, неизвестен, но он может зависеть от уникального окружения, создаваемого опухолью, так что данное окружение может, в свою очередь, менять локализацию внутриклеточных ферментов в опухолевых клетках.

Кофилин 1 (СОР1) играет роль в ремоделировании актина, подвижности и при раке, за счет активности в качестве как актин-деполимеризующего фермента вовлекается в формирование инвадоподиума (УатадисЫ Н. е! а1., 2005) и, возможно, требуется для направления опухолевой клетки в ответ на хемотаксическую стимуляцию или стимуляцию ростовыми факторами (Моипспппс С. е! а1., 2004). Суперэкспрессия СОР1 ранее выявлялась на моделях животных с ΡΌΑ (Сессоп Ό. е! а1., 2003; §1пЬа Ρ. е! а1., 1999).

Альфа-енолаза представляет собой высококонсервативный метаболический фермент, обладающий множеством свойств и выявляемый в разных контекстах (ВапсЬоН V., 2001; ΡίακΙ М. е! а1., 2005; Тетег В. е! а1., 2007). Этот фермент может экспрессироваться на поверхности клеток в качестве рецептора плазминогена (Еоре/-Л1етапу В. е! а1., 2003) и далее распознаваться В-клетками, действуя как потенциальный активатор В-клеток (ВаЬи I. е! а1.,, 2002). Были выявлены две ее изоформы при аденокарциноме панкреатического протока, но не были описаны их молекулярные свойства с точки зрения посттрансляционных модификаций (БЬеп I. е! а1., 2004).

Аутоантитела против альфа-енолазы, существующие в виде одной изоформы или множества изоформ (но без доказательства наличия специфической экспрессии фосфорилированных изоформ ΕΝΟΑ), были идентифицированы на многих биологических моделях и при использовании определенных моделей заболеваний, таких как ассоциированная с раком ретинопатия (Абатик С. е! а1., 1998; Α6!ηπ8 С. е! а1., 1996), немелкоклеточный рак легкого и другие виды рака, кроме панкреатического рака (\УО 07/072219; И8 20070172487: Не Ρ. е! а1., 2007), цирроз печени (ΑΡίδαιν! Ν. е! а1., 1997), энцефалопатии (Рищ Α. е! а1., 2005) и аутоиммунные заболевания (Ва11о! Ε. е! а1., 2003; Водбапок Ό. е! а1., 2004; СЙ1Й8 V. е! а1., 2001). Свойства альфа-енолазы и специфичных для альфа-енолазы антител или аутоантител исследовались с использованием методики проявления фагов (Αγ/π В. е! а1., 1997; Кетр Ε. е! а1., 2002) или соответствующих пептидов (Абатик С. е! а1., 1998; Ба!о Ν. е! а1., 2000; ^а1!ет М. е! а1., 1995; РиЩ Α. е! а1., 2005).

Результаты данного исследования показывают, что специфические изоформы альфа-енолазы и антитела для их выявления являются особенно полезным инструментом для диагностики ΡΌΑ, ввиду частоты и специфичности продукции аутоантител против двух специфических изоформ этого белка (ΕΝΟΑ 1/2) в сыворотке пациентов с ΡΌΑ (табл. I и фиг. 2В). Указанные антитела могут быть специфичными для эпитопа, который является общим для всех или, чаще, для определенных изоформ (как в случае очищенных антител, использованных в эксперименте) или эпитопа, отличающего ΡΌΑ-ассоциированные изоформы от других изоформ (которые, например, присутствуют в ΡΌΑ сыворотке). Кроме того, прогрессирование ΡΌΑ от II стадии к IV стадии характеризуется очень существенным повышением продукции аутоантител против ΕΝΟΑ 1/2, что указывает на возможную прямую корреляцию с размером опухоли и ее способностью к росту.

- 10 016731

Более детальный анализ таких изоформ важен не только для установления прогностической ценности аутоантител для диагноза РИА, но также для более глубокого понимания молекулярных механизмов, связывающих их с РИА, а также возможных терапевтических подходов в случае данного рака.

Пример 2.

Анализ изоформ альфа-енолазы, выявленных с помощью аутоантител в клетках СЕ-РАС-1.

Материалы и методы.

М8-анализ.

Пятна вырезают из препаративных 2-ΌΕ гелей и анализируют с использованием процедуры ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы/времяпролетного анализа частиц (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ). Белки обесцвечивают при выдерживании в течение ночи в растворе 0,025 моль/л бикарбоната аммония и 50% ацетонитрила и затем расщепляют в геле при обработке трипсином (Рготеда, МаШзоп, VI), как было описано ранее (Не11тап и. е! а1., 1995). Для проведения процедуры ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ М8 по 0,5 мкл каждой пептидной смеси наносят на целевой диск и оставляют для сушки на воздухе. Затем к высушенному образцу добавляют 0,5 мкл матричного раствора (1% (вес./об.) а-циано-4-гидроксикоричная кислота в 30% ацетонитриле, 0,1% ТФУ) и снова все высушивают. Спектры регистрируют с использованием спектрометра Вгикег ВеПех III ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ (Вгетеп, Сегтапу). Интерпретацию М8-спектров продуктов расщепления белка проводят при анализе пептидных отпечатков пальцев (РМЕ) с использованием программного обеспечения М8-ЕЙ.

Анализ фосфорилирования.

Анализ белковой последовательности человеческой альфа-енолазы проводят с использованием следующих продуктов программного обеспечения, доступного через Интернет: Ие1Рйо5 [ййрУА^те.сЬз.Ши.йк/зеМсез/; (В1от N. е! а1., 1999)], №1РйозК [ййрУА^те.сЬз.Ши.йк/зеМсез/; (В1от N. е! а1., 2004)], бЬРТМ |11ир://4ЬРТМ.тЬс.пс1и.е4и.1\\7; (Бее Τ. е! а1., 2006)], РР8Р [Ййр://Ьюш1огта11с5.1сйиз!с.огд/РР8Р/; (Хие Υ. е! а1., 2006)] и СР8 [й!1р://Ью1п1огта11с5.1сй-и5!с.огд/др5 тееЬ/ргеШс!.рйр; (Хие Υ. е! а1., 2005)].

Фосфатазную обработку проводят с использованием ХРР-азы (Νο\ν Епд1апб Вю 1аЬз Шс.), как описали Ямагата с соавт. (Аашада1а А. е! а1., 2002), при внесении в указанную процедуру следующих изменений. Осажденные клетки СЕ-РАС-1 (30х10⁶) ресуспендируют в течение 15 ч в 1 мл лизирующего буфера (1% (вес./об.) №-40, 1% (вес./об.) ДСН, 50 мМ Трис, рН 7,6 и 150 мМ №1С1-протеазного ингибирующего коктейля). Полученный лизат (120 мкл, соответствующий 2 мг белка) доводят до конечного объема 1240 мкл деионизированной водой, затем добавляют 20 мкл 20 мМ раствора МдС1₂ и 20 мкл ХРРазного буфера. После каждого добавления раствор осторожно перемешивают. Далее смесь разделяют на аликвоты и к каждой аликвоте добавляют по 600 единиц ХРР-азы. После перемешивания аликвоты инкубируют в течение 15 ч при температуре 30°С. Белки осаждают ацетоном и хлороформом и проводят анализ в 2-ΌΕ (см. пример 1).

Выявление фосфопротеинов на основе красителя проводят в 2-ΌΕ гелях с использованием флуоресцентного красителя для фосфопротеинов РгоЦ (Мо1еси1аг РгоЬез), а также с помощью окрашивания по процедуре 8урго ВиЬу (Вю-К.аф с целью выявления суммарных белков, в соответствии с инструкциями производителя и с литературными данными (νυ 1. е! а1., 2005). В общих чертах, процедура состоит в том, что после 2-ΌΕ проводят окрашивание Рго-Ц. вначале фиксируя гели в смеси 50% метанола/10% уксусной кислоты в течение 30 мин. Затем гель промывают дистиллированной водой и подвергают окрашиванию Рго-0 О1атоп4 красителем на фосфопротеины в течение 4 ч. Удаление окрашивания проводят путем последовательной промывки 50 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, содержащим 20% ацетонитрил, перед окрашиванием флуоресцентным красителем 8урго ВиЬу (в течение ночи).

Анализ экспрессии изоформ ΕΝΟΑ в биоптатах панкреатической ткани.

Панкреатические ткани получают путем отбора биопсийных образцов либо от здоровых индивидуумов, либо от пациентов с РИА (стадия II) и далее гомогенизируют (Т18 Ьазю υ1!^аΤи^^аx, КА) на льду, в 400 мкл лизирующего буфера, содержащего 5 моль/л мочевины, 2 моль/л тиомочевины, 4% (вес./об.) СНАР8, 2 об.% КС буфера, в нелинейном диапазоне, рН 3-10, 0,08 моль/л дитиотреитола (ДТТ), 10 мкл/мл нуклеазной смеси и следовые количества бромфенолового синего красителя. После озвучивания в ультразвуковом дезинтеграторе (Н1е1зсйег ИР2008, 3x40 с, амплитуда 40%, цикл 0,5 Н1е1зсйег ИИгазошсз СтЬН), полученную смесь центрифугируют (13000 об/мин, 30 мин при температуре 4°С) с белковым раствором, содержащимся в супернатанте.

Концентрацию белка определяют по методу Брэдфорда. 30 мкг белкового экстракта разделяют на малых пластинах NиΡΑСΕ® №хех® 4-12% Бис-Трис со сформованным гелем, переносят на нитроцеллюлозную мембрану, инкубируют в течение ночи при температуре 4°С с моноклональным антителом против альфа-енолазы 19/12⁸ (Мозса!о 8. е! а1., 2000) и выявляют по процедуре вестерн-блоттинга, описанной в примере 1.

- 11 016731

Получение рекомбинантной формы ΕΝΟΑ с гистидиновым фрагментом (γΕΝΘΑ).

Рекомбинантный белок выделяют и очищают из клеток Ε.οοίί, трансфицированных плазмидой, которая кодирует последовательность человеческой ΕΝΟΑ (при отсутствии лишь первых девяти аминокислот), слитую с гистидиновым фрагментом. В общих чертах, процедура состоит в том, что бактериальные клетки собирают из 1 л культуры путем центрифугирования и осадок ресуспендируют в 20 мл нативного связующего буфера (ΝΒΒ, 20 мМ фосфат натрия и 500 мМ хлорид натрия, рН 7,8) при добавлении лизоцима (100 мкг/мл) и 0,7% саркозила. Суспензию помещают на медленную качалку при температуре 4°С на 15 мин. Клеточный лизат озвучивают на льду с десятью 40-секундными паузами, при высокой интенсивности. Далее, лизат центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4°С для осаждения нерастворимой фракции, которую ресуспендируют в 10 мл гуанидинового лизирующего буфера (6 М гидрохлорид гуанидина, 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, рН 7,8), обогащенного ингибиторами протеаз, в течение 10 мин при комнатной температуре. Указанный лизат вносят в предварительно уравновешенную колонку (колонка с Νί-ΝΤΑ-агарозой, 1пу|1го§сп) и оставляют для связывания со смолой на 30 мин при температуре 4°С при слабом вращении. После этого смолу промывают два раза ΝΒΒ и два раза нативным промывочным буфером (Ν^Β; ΝΒΒ при рН 6,0). Элюцию проводят с использованием 10 мл имидазольного элюирующего буфера (350 мМ, рН 6) для получения рекомбинантной ΕΝΟΑ с гистидиновым фрагментом (γΕΝΘΑ). Элюированные фракции диализуют в стерильной воде и далее лиофилизируют и ресуспендируют в стерильном апирогенном фосфатнобуферном растворе Дульбекко (ΌΡΒ8, 81дта). Аликвоты хранят при температуре -20°С. Уровень эндотоксинов составляет менее 0,03 МЕ/мл, по данным лимулюс-теста на лизат (Ругодеп!; Βίο \У11Шаксг).

Анализ экспрессии изоформ ΕΝΟΑ в СΕ-ΡΑС-1 с использованием сывороток пациента и процедур вестерн-блоттинга.

2-ΌΕ гели с ^-ΡΑ^1 переносят путем электроблоттинга на нитроцеллюлозную мембрану НуЬопб Εί,Έ (ΟΕ Неа11йсаге), как описано выше. После блокирования в течение 1 ч с использованием ΤΒ8, содержащего 5% обезжиренного сухого молока, блоты инкубируют с пулом из трех сывороток пациентов с ΕΝΟΑ 1/2+ (в разбавлении 1:100 в ΤΒ8) в разных условиях.

В серии экспериментов указанный пул сывороток вначале инкубируют в течение 15 ч при температуре 4°С на качалке с 20 мкг/мл рекомбинантной альфа-енолазы (γΕΝΘΑ) перед инкубацией с мембраной. В другой серии экспериментов мембрану вначале инкубируют с 2 мл ФБР, содержащего 600 единиц λΡΡ-азы, 40 мкл 20 мМ раствора МпС1₂ и 40 мкл λΡΡ-азного буфера в течение 15 ч при температуре 30°С. Мембраны снова блокируют в течение 1 ч, промывают три раза в течение 15 мин ΤΤΒ8 и инкубируют с пулом сывороток (разбавление 1:100).

Связывание антител в сыворотке с изоформами ΕΝΟΑ выявляют с использованием противочеловеческих антител по процедуре вестерн-блоттинга, как было описано в примере 1. В качестве контрольной процедуры для оценки количества иммобилизованного ΕΝΟΑ мембрану подвергают повторному зондированию мышиными моноклональными антителами против енолазы 19/12⁸ (см. пример 1).

Результаты.

После демонстрации того факта, что две изоформы человеческой альфа-енолазы специфически выявляются антителами в сыворотке пациентов с ΡΌΑ, были исследованы свойства, характерные для таких изоформ (и любой другой изоформы этого белка, которая присутствует в клетках ^-ΡΑ^1) с использованием разных подходов.

Результаты, полученные при сравнении вестерн-блотов, полученных с использованием очищенного антитела против альфа-енолазы или сывороток от разных пациентов с ΡΌΑ, при проведении серебряного окрашивания 2-ΌΕ гелей и масс-спектрометрического анализа показали наличие 4 дополнительных пятен, соответствующих дополнительным формам изоформам альфа-енолазы, не ассоциированных с ΡΌΑ, в 2-ΌΕ гелях, которые имеют такой же молекулярный вес, но при создании экспериментальных условий со сниженными значениями р1, в сравнении с вариантом ΕΝΟΑ 1/2 (табл. II). Эти данные были получены с использованием клеточных экстрактов из клеток ^-ΡΑ^1 или М^аΡаСа-2 при анализе в 2-ΌΕ гелях.

Пептиды, полученные из таких пятен, были идентичны фрагментам ΕΝΟΑ (и четко отличались от высоко аналогичной человеческой гамма-енолазы; фиг. 3), подтверждая данные о том, что пятна, выявляемые при вестерн-блоттинге, должны соответствовать изоформам ΕΝΟΑ, где только ΕΝΟΑ 1/2 ассоциированы с ΡΌΑ. Посттрансляционные модификации представляют собой такие свойства, которые зачастую отличают одну изоформу от другой. Предварительный анализ, исключавший, по всей видимости, гликозилирование (ввиду ограниченных изменений в молекулярном весе), показал возможность модификаций путем фосфорилирования (на основании выявленного снижения показателя р1).

Последовательность человеческой альфа-енолазы содержит несколько остатков тирозина, серина и треонина, которые являются потенциальными мишенями для фосфорилирования различными киназами. Эта гипотеза была протестирована путем экспозиции белкового экстракта с фосфатазой, характеризующейся широким диапазоном активности, перед разделением в 2-ΌΕ, с тем чтобы определить, выявляются ли какие-либо изменения в интенсивности пятен с использованием независимых от фосфорилирования антител, как это было описано для других белков (Китаг Υ. е! а1., 2004). Фактически, интенсивность пя

- 12 016731 тен ΕΝΟΑ, соответствующих самым кислым изоформам (которыми являются ΡΌΑ-ассоциированные ΕΝΟΑ 1/2 и ΕΝΟΑ изоформа 3; табл. II), четко снижается в клеточных экстрактах СЕ-РАС-1 при их предварительной обработке фосфатазой. Кроме того, масс-спектрометрический анализ ΕΝΟΑ изоформы 3 (более распространенной, чем ΕΝΟΑ 1/2) показывает, что остатки 55, 57, 200, 236, 237, 257 и 419 фосфорилированы в этой изоформе (фиг. 4).

В предшествующих работах по фосфорилированию альфа-енолазы ίη νίνο или ίη уйго (Соорег 1. е! а1., 1984; Εί^ηϋτοάΐ Ε. е! а1., 1983; Магсик К. е! а1., 2000; Викй 1. е! а1., 2005; §!акук Т. е! а1., 2005; Мойна Н. е! а1., 2007) не указывалось, что, например, в целом, по меньшей мере три специфических остатка могут быть одновременно фосфорилированы и что, в частности, остатки 55, 57, 200, 236, 237, 257 и 419 могут быть выявлены в изоформах ΕΝΟΑ в фосфорилированном состоянии. Кроме того, сочетание фосфорилированных остатков в ΕΝΟΑ изоформе 3 трудно прогнозировать в рамках компьютеризированного анализа белковой последовательности ΕΝΟΑ из-за большого числа возможных сайтов для фосфорилирования (фиг. 4). Однако нельзя исключать возможность того, что ΕΝΟΑ изоформа 3 может содержать дополнительные сайты, не выявляемые на данной стадии масс-спектрометрическим анализом, но ΕΝΟΑ 1/2 должна содержать модифицированные в посттрансляционном режиме остатки (вероятнее всего, также фосфорилированные, что следует из значения р1 и результатов обработки фосфатазой), которые будут отличать ее от ΕΝΟΑ изоформы 3.

Следует также отметить, что более чем один из пептидов, полученных из ΕΝΟΑ изоформы 3, для которых определялось наличие фосфорилирования и которые содержат возможные сайты фосфорилирования, не демонстрируют такой модификации. Так, например, тирозин 44, специфически идентифицированный, по имеющимся в литературе сообщениям, как фосфорилированный в установленной лейкозной линии Т-клеток (Викй 1. е! а1., 2005), не был выявлен в фосфорилированном состоянии в ΕΝΟΑ изоформе 3. Аналогично, остаток 57 был идентифицирован как фосфорилированный в сочетании с остатком 63 (Мойпа Н. е! а1., 2007), но не с остатком 55, как в ΕΝΟΑ изсформе 3 (фиг. 4).

Последующий анализ фосфорилирования изоформ ΕΝΟΑ был проведен с использованием ΡΌΑсывороток и ΕΝΟΑ-специфических антител при сравнении снимков, полученных по процедуре вестернблоттинга, со снимками, сделанными в 2-ΌΕ геле с использованием красителей на суммарный белок (окрашивание серебром или красителем 8урго РнЬу) или специфического окрашивания на фосфопротеины (Рго-0 О1ашопб). Результаты указанного анализа подтвердили, что только ΕΝΟΑ 1/2 и 3 фосфорилируются в клетках СΕ-ΡΑС-1 (фиг. 5Α; табл. II).

Экспрессия ΕΝΟΑ была протестирована по процедуре вестерн-блоттинга с использованием тканей, полученных от пациентов с ΡΌΑ после хирургии (стадия II; п=7), и нормальной панкреатической ткани (п=1) с использованием антитела против енолазы, связывающегося со специфическим эпитопом, общим для всех шести изоформ, выявляемых в сыворотке пациентов с ΡΌΑ. В шести из семи биопсийных образов от пациентов с ΡΌΑ были выявлены все шесть изоформ ΕΝΟΑ, тогда как в нормальной панкреатической ткани четко выявлялись только четыре изоформы (ΕΝΟΑ 3, 4, 5 и 6) (фиг. 5В). Таким образом, можно сделать вывод, что только у пациентов с ΡΌΑ образуются антитела против ΕΝΟΑ 1/2 и что также эти формы подвергаются в значительной мере суперэкспрессии в панкреатических тканях при ΡΌΑ.

Реактивность сывороток от пациентов с ΡΌΑ против фосфорилированной ΕΝΟΑ далее исследовали с использованием экстрактов клеток СΕ-ΡΑС-1 при проведении 2-ΌΕ и вестерн-блоттинга, с тем чтобы прояснить, направлена ли данная реактивность специфически против фосфорилированных изотопов. Поскольку сыворотки от пациентов с ΡΌΑ взаимодействовали со всеми шестью изоформами, они могут содержать антитела, реактивные как с фосфорилированными, так и с нефосфорилированными эпитопами.

В первой серии экспериментов сыворотки подвергают предварительной инкубации с рекомбинантной человеческой ΕΝΟΑ, которая не содержит фосфорилированных остатков, с тем чтобы посмотреть, будет ли экспозиция с ΕΝΟΑ антигенами менять способность сыворотки распознавать изофсрмы ΕΝΟΑ в эталонной панкретической клеточной линии. Фактически, 2-ΌΕ в рамках вестерн-блот анализа выявил, что в случае нефосфорилированной ΕΝΟΑ значительно снижается реактивность только для изоформ 3, 4, 5 и 6, но не затрагивается реактивность ΕΝΟΑ 1/2 изоформ. Эти данные были подтверждены в другой серии экспериментов, где мембрану преинкубировали с фосфатазой (λΡΡ-аза), с тем чтобы показать, что исследуемые сыворотки пациентов содержат антитела, которые специфически реагируют с фосфорилированными изоформами ΕΝΟΑ 1/2. В отсутствие λΡΡ-азы исследуемые сыворотки распознавали все изоформы ΕΝΟΑ, тогда как λΡΡ-азная обработка заметно снижала реактивность сывороток с ΕΝΟΑ 1/2 (фиг. 6).

Тот факт, что моноклональное антитело против ΕΝΟΑ выявляется во всех изоформах, и в обработанных, и в необработанных мембранах (данные не приведены), указывает на то, что антитела в сыворотках от пациентов с ΡΌΑ специфически взаимодействуют с фосфорилированными изоформами ΕΝΟΑ 1/2.

- 13 016731

Выводы.

При использовании различных протеомических подходов было идентифицировано множество изоформ ΕΝΟΑ и антител против них (Лйатнз 6. е! а1., 1998; Лйатнз 6. е! а1., 1996; ЛкЕахуа Ν. е! а1., 1997; Ва11о! Ε. е! а1., 2003; ВгуЬот М. е! а1., 2005; ЬиЬес 6. е! а1., 2003; Ο'Ό\\λόγ Ό. е! а1., 2002). Однако в этих сообщениях не приводится четкого подтверждения наличия ассоциации между состоянием фосфорилирования и способностью к продукции аутоантител против специфических изоформ в ходе прогрессирования ΡΌΑ.

В других статьях приводятся данные об изменении интенсивности и/или числа выявляемых пятен, соответствующих альфа-енолазе, при использовании, например, вестерн-блоттинга в 2-ΌΕ гелях для анализа сывороток от пациентов, ассоциированных с конкретной обработкой клеток (Ва!у I. е! а1., 2005; Во!1аНсо Ь. е! а1., 1993; Капато!о Τ. е! а1., 2002) или с определенными заболеваниями (Вуг|а1зеп I. е! а1., 1999; С1аизег К. е! а1., 1995; ШкашзЫ Τ. е! а1., 2006; Тапака Υ. е! а1., 2006; И8 20070172487), что, предположительно, указывает на вовлечение в процесс посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование.

В других сообщениях человеческая альфа-енолаза рассматривается как один из нескольких белков, которые подвергаются суперэкспрессии в ΡΌΑ-образцах при анализе с использованием 2-ΌΕ гелей, что подтверждается на уровне мРНК и результатами иммуногистохимического анализа, однако в указанных работах не рассматривается фосфорилирование, как специфическая модификация, характеризующая изоформы альфа-енолазы, ассоциированные с ΡΌΑ (\νΟ 04/55548; 8йеп I. е! а1., 2004; ШкашзЫ Τ. е! а1., 2006; М1кипуа К. е! а1., 2007).

Среди большого числа посттрансляционных модификаций, выявленных в альфа-енолазе (табл. III), фосфорилирование представляет собой такую модификацию, которая была выявлена как ш у1уо, так и ш уйго, согласно приведенным ранее сообщениям (Соорег I. е! а1., 1984; Сонззепз Ρ. е! а1., 1985; Б1депЬгоШ Ε. е! а1., 1983; 6о1йеп Α. е! а1., 1986). Однако в последнее время были обнаружены две фосфорилированные изоформы альфа-енолазы при использовании 20-гелей и коммерчески доступного антитела против фосфотирозина (клон 4610, код 05-321; Вюто1), а также при масс-спектометрическом анализе, в тромбоцитах человека (Магсиз К. е! а1., 2000). Один фосфорилированный вариант альфа-енолазы был обнаружен в клетках, обработанных Τ6Ρ^!8 1 (клеточная линия МСР-7), с использованием 2О-гелей, радиоактивной метки и масс-спектрометрии (8!азук Τ. е! а1., 2005) или в клетках МIЛΡаСа (клеточная линия рака поджелудочной железы), где фосфорилирование енолазы снижалось после обработки флавоноидами (Ьее Ь. е! а1., 2002). Кроме того, два сайта фосфорилирования локализованы в тирозиновых остатках (44 и 286; Ризй I. е! а1., 2005) или в остатках тирозина и серина (57 и 63; Мойпа Н. е! а1., 2007).

Однако ни в одном из этих документов не указывается о наличии ассоциации ΡΌΑ с дополнительным фосфорилированием изоформ альфа-енолазы, которая уже была фосфорилирована по меньшей мере в трех положениях, а также не рассматриваются в этом контексте связывающие их антитела.

Пример 3.

Эффекты антител, связывающихся с альфа-енолазой, на рост и пролиферацию трансформированных клеточных линий, экспрессирующих фосфорилированные изоформы альфа-енолазы.

Материалы и методы.

Тест на пролиферацию клеточных линий.

Тест ш У1!го на клеточную пролиферацию проводят с использованием указанных клеточных линий при высеве 2-10х10³ клеток/ячейку в 96-ячеечных микропланшетах в полной культуральной среде для клеток (ΚΡМI-1640 с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка), при наличии или в отсутствие моноклонального антитела против альфа-енолазы 72/1 (Мозса!о 8. е! а1., 2000) или мышиного ^61 изотипа, соответствующего контрольного моноклональному антителу (Β.&Ό 8уз!ет5), используемого в качестве отрицательного контроля.

Через 44 или 68 ч к каждой ячейке добавляют 20 мкл раствора метилтетразолия (МТТ; 5 мг/мл) и все выдерживают еще в течение 4 ч при температуре 37°С. Затем среду отбирают и клетки растворяют в ДМСО. Планшеты анализируют, определяя на спектрофотометре поглощение при длине волны 540 нм.

Результаты.

Эффекты антитела против альфа-енолазы на рост клеточных линий, демонстрирующих разный профиль экспрессии альфа-енолазы, по данным анализа в 2-ΌΕ и вестерн-блоттинга, тестируют при измерении уровня включения МВС соединения, которое включается в жизнеспособные клетки и коррелирует с активным клеточным ростом, метаболизмом и пролиферацией.

С использованием колориметрического теста, основанного на оценке включения \^;ίΤΤ, было продемонстрировано выраженное ингибирование клеточной пролиферации в трансформированных клеточных линиях, которые экспрессируют все шесть изоформ, независимо от их происхождения, панкреатического или из другого источника, отличного от поджелудочной железы. Показано, что в случае использования контрольного моноклонального антитела, соответствующего ^61 изотипу, или клеточной линии, не экспрессирующей указанные три фосфорилированные изоформы ΕΝΟΑ, эффект является минимальным (табл. IV).

- 14 016731

Таким образом, анти-альфа-енолазные антитела способны ингибировать (по меньшей мере, частично) рост и пролиферацию клеточных линий, характеризующихся специфическим профилем фосфорилирования альфа-енолазы, выявляемой в ΡΒΑ-ассоциированных биологических образцах (таких как сыворотки или биопсийные ткани).

Выводы.

альфа-енолаза, несмотря на то что она считается цитоплазматическим белком, может экспрессироваться в виде биологически активного белка на поверхности клеток (Аг/а В. еί а1., 1997; Вегдтап Α. еί а1., 1997; Мозса^ 8. еί а1. 2000; Ьоре/^етапу К. еί а1., 2003), а также в виде растворимого фактора (ВаЬи I. еί а1., 2002; Бети Α. еί а1., 2005).

Данные тестирования ίη νίίτο показывают, что рост трансформированных клеточных линий замедляется при связывании антител с эпитопами, присутствующими в изоформах альфа-енолазы, экспрессируемых во внеклеточном пространстве (в виде рецептора клеточной поверхности и/или в виде растворимого белка), только в том случае, если клеточные линии экспрессируют фосфорилированные изоформы альфа-енолазы.

Таким образом, моноклональное антитело, которое специфически связывается с клетками, презентирующими фосфорилированные изоформы альфа-енолазы, может ингибировать пролиферацию трансформированных клеточных линий. Указанный механизм контроля клеточной пролиферации функционирует, по всей видимости, не только при ΡΏΑ, но также в случае других видов рака, демонстрирующих такие молекулярные характеристики, и может рассматриваться за счет действия соответствующих моноклональных антител в контексте терапевтического применения в случае рака, такого как изготовление лекарственных средств для лечения ΡΏΑ и способы диагностики и лечения пациентов с ΡΏΑ.

Таблица I

Белки, распознаваемые сыворотками от пациентов с ΡΏΑ как антигены

Вестерн-блоттинг в 2-ОЕ и масс-спектрометрический анализ экстрактов клеток линии СГ-РАС-1	Вестерн—блоттинг панкреатических экстрактов0
Описание (5К153РЯОТ, локус, N доступа)	Четко выявляемые пятна (Юа	Пятна, которые распознаются сыворотками от	Образцы нормальной панкреатической ткани	Образцы от пациентов с РОА (значение Р)с
Здоровых субъектов (%)	Пациентов с заболеванием, отличным от ΡϋΑ (%)	Паци- ентов с РОА (%)
Альфа-енолаза (ΕΝΟΑ ΗϋΜΑΝ, Р06733)	2 (ΝΟ.1 и 2)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	41/70 (58%)	13,5±0,2	33±7 (<0,05)
Триосефосфатизомераза (ΤΚΙ5 ΗϋΜΑΝ, Р60174)	2 (ΝΟ.3 и 4)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	16/70 (23%)	15,5±0,6	28±3 (<0,05)
Скелетномышечный кератин 10, тип 1 (К1С10 ΗϋΜΑΝ, Р13645)	1 (ΝΟ.5)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	15/70 (21%)	3,5±0,6	33±4 «0, 005)
Дегидрогеназа 1 сетчатки (АД1А1 ΗϋΜΑΝ, Р00352)	1 (N0.6)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	14/70 (20%)	21,2±0,6	18+1 (=0,05)
Глюкозо-6фосфат-1дегидрогеназа (С6РО ΗϋΜΑΝ, Р11413)	1 (ΝΟ.7)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	9/70 (13%)	0,6+0,06	17,5±5 (<0,05)
Фактор элонгации Ти (ΕΓΤϋ ΗϋΜΑΝ, Р49411)	1 (N0.8)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	8/70 (11%)	2+0, 6	32+9 (<0,05)
Изоцитратдегидрогеназа (ЮНС ΗϋΜΑΝ, 075874)	1 (ΝΟ.9)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	9/70 (10%)	3±0, 6	28±8 (<0,05)
Трансгелин-2 (ТАСД2_НиМАЫ, Р37802)	1“ (N0.10)	0/40 (0%)	0/30 (0%)	19/70 (27%)	Νϋ	N0
Кофилин 1 (СОГ1 ΗϋΜΑΝ, Р23528)	9+0, 6	42±5 (<0,005)

ΝΏ - не определяли.

^а Определены при окрашивании серебром и по процедуре вестерн-блоттинга в 2-ΌΕ гелях как ΡΌΑ-специфические (см. положение пятен с соответствующими номерами, показанное на фиг. 1В).

^Ь Вестерн-блоттинг проводят с антителами, специфичными для каждого белка. Интенсивность линий, указывающих реактивность, выражена в произвольных единицах нормализованной интенсивности линий (среднее значение результатов трех экспериментов ± 8ΕΜ).

^с Статистическую значимость нормализованной интенсивности линий для выбранных белков оценивают с использованием парного двустороннего критерия Стьюдента.

^б Белки, локализованные вместе в одном пятне.

- 15 016731

Таблица II

Идентификация изоформ ΕΝΟΑ, распознаваемых сыворотками от пациентов с ΡΩΑ

	2-ОЕ и масс-спектрометрия	2-ОЕ и анализ фосфорилирования
Пятно ΕΝΟΑ, N	Мол е куляр ный вес (кДа)а	Значение р1ь	Балльный показатель соответствия пептидов0 (степень охвата последовательности, %)	Интенсивность пятен, по данным вестерн-блоттинга (% от общей интенсивности)
Без ХРРазы	600 Ед. ЛРРазы
1	49, 2	6, 16	290 (18%)	8,5%	0%
2	49,0	6, 30	365 (2 4%)	10, 9%	1,9%
3	48, 9	6, 58	595 (39%)	15,1%	6,2%
4	48, 9	6, 80	1007 (60%)	65,5%	91,9%
5	48, 9	7,26	1127 (65%)
е	48, 8	7,60	449 (27%)

ЬС-М8/М8 анализ ^а Значение, полученное для человеческой, не модифицированной в посттрансляционном режиме альфа-енолазы, составляет 47 кД;

^ь Значение, полученное для человеческой, не модифицированной в посттрансляционном режиме альфа-енолазы, составляет 7,0;

^с Суммарный балльный показатель для ионов от всех недмилицированных пептидов.

Таблица III

Выбранные литературные данные, относящиеся к описанию посттрансляционных модификаций альфа-енолазы, кроме фосфорилирования

Модификация	Цитируемая работа
Ацетилирование	1иаЬа£а Н еС а1., 2005
Цитруллинирование	Κίηΐοοή А еС а!., 2005
Модификация по ϋδ опара гиновой кислоте	Такала Т еЬ а1., 2006
Модификация 4гидроксиноненалом	Каррйайп К а1.,2006
Нитратная модификация	Сазоп1 Г еЪ а1.,2005; Капзк! О ей а1., 2005; ЗЫп 3 е£ а1., 2004
Оксидация	ВиРЬег£1е1с( ей а1., 2006; Савйедпа А ей а1., 2002; ТзЬИ Т апд ЦсЫс1а К, 2004; Рег1и1д1 М е£ а1., 2005
Тирозилирование	Ανρθΐη Ц ер а1., 2004

- 16 016731

Таблица IV

Результаты теста ш νίίΓο на пролиферацию

	Ингибирование роста клеток (%)	Изоформы ΕΝΟΑ
(выявляемые вестерн-	по 2-
блоттингу ОЕ)	в
Клеточная линия - Происхождение - Депозитарный номер - Ссылка на релевантную работу	Анти-ΕΝΟΑ антитело, 48 часов	Контрольное 1дС, 48 часов	1	2	3	4	5	6
ВхРС-3 - Слабо дифференцированная ΡΩΑ - ЕСАСС Νο. 93129816 - Тап М ек а!., 1986	37%)	0%	+	+	+	+	+	+
СР-РАС-1 - Дифференцированная ΡΏΑ - ЕСАСС Νο. 91112501 - ЗсНоцтаскег ек а1., 1990	29%	0%)	+	+	+	+	+	+
МФа-Ра-Са-2 - Недифференцированная ΡϋΑ ЕСАСС ΝΟ. 85062806 - Уипхз А е. а!., 1977	38%	0%	+	+	+	+	+	+
иэз? - Клеточная линия лимфомы - ЕСАСС ΝΟ. 85011640 - Г1зс1эег 0 ек а1., 1980	38%	5%	+	+	+	+	+
МСЕ-7 - Аденокарцинома молочной железы - ЕСАСС Νο. 86012803 - Зои1е еС а1., 1973	15% (2%)	0% (0%)	-	-	-	+	+	+

- 17 016731

Список цитированной литературы

Айатиз С ек а1. (1998). С Аикойпипип, 11, 671-7.

Айатиз ΰ ек а1. (1996) . СИп 1ттипо1 1п1типорак!по1, 78, 120-9.

Аксзана N ек а!., (1997). 7 Нерако!, 26, 845-51.

Агга В ек а1., (1997). ТРготЬ Наетозк, 78, 1097-103.

Аххат Б ек а1.

(2004) .

Ргокеотйсз, 4, 2397-407.

ВаЬи 73 ек а1.

(2002).

СИп Гттипо!, 104, 293-304.

Вакег СН ек а1.

(2002) .

Сапсег Нез, 62

1996-2003.

Ва11ок Е ек а1.

(2003).

СИп СЬет, 49

634-43.

Ваку ЛИ ек а1. (2005). ВхосЬет О, 389, 785-95.

Ваиег ТИ ек а1. (2005). Сапсег Нез, 65, 7775-81.

ВЬаккасЪагууа 3 ек а1. (2004). ИеорХазка, 6, 674-86.

Вегдтап А ек а1., (1997). ГЕВЗ Ъекк, 417, 17-20.

В1от N ек а1. (1999). Ц Μοί ΒίοΙ, 294, 1351-62.

В1от N ек а1. (2004). Ргокеотссз, 4, 1633-49.

В1оотзкоп И ек. а1. (2006). Сапсег Вез, 66, 2592-9.

Водаапоз ив ек а1. (/004). О Аигопттипе ΰί3, 1, 4.

ВоккаИсо ЬА ек а1. (1993). Агкег1Озс1ег ТЬготЬ, 13, 264-75.

Вой-хек И (2004). Апп Зигд 0псо1, 11, 637-8.

ΒουνεΟ М ек. а1. (2001) . 7 СИп Епйосгхпо! МекаЬ, 86, 310-6.

Вгапй Н. (2001). Сапсег ΰ, 7, 287-97.

Вгипз СО ек а1. (2000). Сапсег Кез, 60, 2926-35.

ВгуЬогп М ек а1. (2005). Везрхг Вез, 6, 118.

Виккег£1е1О ϋΑ ек а1. (2006). ЫеигоЫо! ОЙз, 22, 223-32.

Вугда1зеп I ек а1. (1999). Мо1 Ншп Вергой, 5, 748-56.

Сао О ек а1. (2005). Мой РакЪо1, 18, 752-61.

Сазоп! Г ек а1. (2005). Л ΒίοΙ СЬет, 280, 16295-304,

Сазкедпа А ек а1. (2002). 7 ЦеигосНет, 82, 1524-32.

Сессопх О ек а1. (2003). Е1ескхор)1О1:ез1з, 24, 4291-303.

СЬатгай Ц ек а1., (2004). Ргокеотгсз. 4: 619-28.

СНеп В ек а1. (2005). Мо1 Се11 Ргокеопйсз, 4, 523-33.

С1аизег К ек а1. (1995). Ргос Иак1 Асаб 5сй ОЗА, 92, 5072-6.

- 18 016731

СоЬеп 5 апд Мегоро! N(2002). Ιπϋ Л СазЕго1пЕе8Ё Сапсег,32, 91-106.

Сопгадз Т еЕ а1. ¢2002). ВЕоскет Вхоркуэ Кез Соттип, 290,885-90.

Соорег Л еЕ а1. (1984). Л Βΐοΐ Скет, 259, 7835-41.

Соиззепз Р еЁ а!. ¢1985). Мо1 Се11 ΒίοΙ, 5, 2753-63.

ϋβπιιτ А еЕ а1., (2005) Се11 Тхззие Кез, 322, 299-311.

Огаке С еЁ а1. (2006). Αάν 1ттипо1, 90, 51-81.

ϋυηη С еЕ а1. (2004). 1ттип±Еу, 21/ 137-48.

ЕдЬегд О еЕ а1. (2005) . Л Βϊοΐ Скет, 280, 8961-73ЕхдепЬгобЕ Е еЕ а1. (1983). ЕтЬо Л, 2, 1565-70.

ГагЕа 3 еЕ а1. (2004). ЗетЕп ЯоепЕдепо1, 39, 397-411.

ЕЕзскег О еЕ а1., ¢1980). Л 1ттипо1. 125:463-5.

Ειι^ίί А еЕ а1., (2005) . Л. ИеигоЕтт. 162 : 130-6.

СЕёНёЗ ν&ί еЕ а1_Т (2001). Л 1тгезЕЕд Мед, 49, 138-45.

СоддЕпз М (2005) . Л С1Еп 0псо1, 23, 4524-31.

Со1деп А еЕ а!., (198-6), Ргос МаЕ1 Асад ЗсЕ ЦЗА, 83, 852- 6.

Согд А еЕ а1. (2004). РгоЕеотЕсз, 4, 3665-85.

Сгакат ΏΒ еЕ а1. (2005). Л РкузЕо!, 563, 1-9.

СгспЬохд М еЕ а1. (2006), Мо1 Се11 РгоЕеотЕсз, 5, 157-71.

НахгЕз К еЕ а1. (2004) . Эгид 0еуе1ортепЕ Везеагск. 61, 137-154.

Не Р еЕ	а1., (2007). Сапсег Зс1. 98 : 1234-1240.
Не11тап	и еЕ а1. (1995)	. Апа1	Βίοскет,	224, 451-5.
Нопда К	еЕ а1. ¢2005),	Сапсег	Вез, 65,	10613-22.
Нопд ЗН	еЕ а1. (2004).	Сапсег	Вез, 64,	5504-10.
1зк£Е Т	апд ОсЫда К	(2004).	Скет В.ез	Τοχϊαοί, 17,	1313- 22
ТмаЪаЕа	Н еЕ а1. (2005)	. РгоЕеотЕсз, 5,	4653-64.

Лахп М еЕ а1., (2007). Тхепдз В1оЕескпо1.25: 307-16.

Лтепо А апд Н1да1до М (2006). Мо1 Сапсег Ткег, 5, 787-96.

ЛоЬпзоп К еЕ а1., (2005). МеЕкодз. 35: 223-36.

Ка1ите 0Е еЕ а1. (2003). Сигг Ορΐη Скет ВЕо1, 7, 64-9.

КапатоЕо Т еЕ а1. (2002). ЕгпЬо Л, 21, 1219-30.

КапзкЕ Л еЕ а1. (2005). Ат Л ΡΗγδΐοΙ НеагЕ С1гс РЪуз1о1, 288, Н371-81.

Каррйакп В еЕ а1. (2006). Ехр Еуе Вее. 83: 165-75.

Кетр ЕН еЕ а1. (2002) . ВЁосЬет Вхоркуз Кее Соттип, 298, 169-77.

Κϊγπ 3 еЕ а!., (2005). Мо1 Се11з. 20: 17-29.

ΚίηΙοοΚ А еЕ а1, (2005), АгЕкгхЕхз Вез Ткег, 7, В1421-9.

К1аде СЗ еЕ а1. (2001). РгобеотЕсз, 1, 890-8.

К1ееЕ Л еЕ а!,, (2006). Рапсгеаз, 33 : 111-118.

Коотеп ЛИ еЕ а1. (2005). СИп Сапсег Вез, 11,1110-8.

Коортапп Л еЕ а1. (2004). С1Еп Сапсег Вез, 10, 2386-92.

Китах Υ еЕ а1. (2004). РгоЕеотЕсз, 4, 1672-83.

ЬаЕЕ1у Е апд Зодоуег В, (2005). Нит АпЕхдодЕез. 14: 33-55.

Ъакеги ϋ апд Ла££ее Е, (2005). ЫаЕ Βίϊν Сапсег, 5 : 459-67.

Ьее Ь еЕ а1. (2002). АпЕЕсапсег Вез. 22 : 1615-27.

Лее Т еЕ а1, (2006). Мис1ехс Асхдз Вез. 34 : ϋ622-7.

Ьеипд Т еЕ а1. (2005). Иог1д Л СазЕгсепЁего1. 11: 5075-8.

ΣθνίΕζΛί А апд ВИзкапЕ Е. (2006). Аппи Ββν Вхоскет. 75: 93-109.

Ъ1скЕеп£е1з В еЕ а1. (2003), ΒίοαΗίιη ВхорНуз АсЕа. 1646:21-31.

ЬоЬо Е еЕ а1., (2004). Л РИаггп Зсх. 93: 2645-68.

ЪодбепЬегд Т, (2007). Тгепдз В1оГесЬпо1. 0οί:10.1016/]. ТОЪГесН.2007.07.005.

Ьорег-А1етапу В εΐ а1. (2003). ТЬгогпЬ Наетозб. 90: 724-33.

ЬиЬес С еЕ а1. (2003). Ргод ЫеигоЫс!. 69: 193-211.

МасНхда К еЕ а1. (2003). Мо1 Се11 РгоЕестЕсз. 2: 215-33.

МапдеИ ЛИ. (2003). Ат Л РаЕНо!. 163: 1687-98.

Мапп М еЕ а1. (2002). Тгепдз ВхоЕескпо1. 20 : 261-8.

Магсиз К еЕ а1. (2000). Е1есЕгоркогезхз. 21: 2622-36.

МЕкигЕуа К еЕ а1,, (2007). 1пЕ Л 0псо1. 30 : 849-855.

МоИпа Н еЕ а1., (2007). Ргос. ЫаЕ1. Асад. ЗсЕ. и.5.А. 104: 2199-2204.

МозсаЕо 5 еЕ а1. (2000). Еиг Л 1ттипо1. 30 : 3575-84.

МоипеЕтпе 3 еЕ а1. (2004). Л Се11 В1о1. 166 : 697-708.

КакапЕзЬ! Т еЕ а1. , (2006) . Л СкгатаЕодг В Апа1уЕ Тес В1отед Ех£е 5сх.838: 15-20.

- 19 016731

ΝίΐΕΞοη О ек а1., (1997) . Ргокехп Ехрг Риг1£. 11:1-16,

О’Оиуег ϋ ек а1. (2002), АгсЬ РЬуз1о1 ВтосЬет. 110: 94-8, Окизака Т ек а1., (2006), СОР С Рапсгеаз. 7: 332-6.

РапсЬоП V. (2001). Се11 Мо1 Ь1£е Зек. 58 : 902-20.

Рег1и1д1 М ек а1. (2005) . Мо1 Се11 Ргокеошхсз. 4: 1849- 61.

Ргазк М ек а1, (2005). Аска ΒίοοΑίπι Ро1. 52 : 507-13.

ςίη У ек а1. (1995). 1пк σ Сапсег. 60: 694-700.

Кодпдиег ЛА ек а1. (2005) . Иог1с1 О Зигд, 29: 297-305.

Козку С апс! Соддкпз М (2005). МекРоЙз Мо1 Мей. 103:189-97.

КиЫо-У1дие1га В ек а! ., (2006) . С11П Сапсег Кез . 12 : 4 652-61. ЕизЬ Л ек а1. (2005). Цак В1окес11по1, 23, 94-101.

Закс N ек а1. (2000) . Сапсег СЬетокЬег РЬагтасо1. 46 Зирр1: 386-90 ЗсЬте1г1е К а па ИЫке Е (2006). Сигг Ορίη В1окес11по1, 17:406-14 ЗсЬоитаскег К ек а1. (1990) . Ргос Нак1 Асас! 3с1 ОЗА. 87:4012-6

ЗЬеп Ц ек а1. (2004). Сапсег Кез, 64, 9018-26.

ЗИеускепко А ек а1. (1996). Апа1 СНет. 68 : 850-8.

ЗЬкп 3 ек а1. (2004). Ргокеот1сз. 4 : 3359-68.

31пЬа Р ек а1. (1999). Е1ескгорЬогез1з. 20 : 2952-60.

Зои1е Н ек а1., (1973). Д Цак1 Сапсег 1пзк. 51: 1409-16.

Зказук Т ек а1. (2005). Μοί ΒίοΙ Се11. 16: 4765-80.

ЗгерезЬаг! К ек а1. (2005). Рапсгеаз. 31: 275-82,

Такака Т ек а1. (2006). ВхосНет ВхорЬуз Кез Соттип, 344:263-71

Тапака У ек а1. (2006). МхсгоЫо! 1ттипо1. 50 : 117-26.

Теггтег В ек а1., (2007). Аикохтт Кеухеиз. 6: 176-182.

ϋη«ίη Κϋ ек а1. (2003). Ргокеотхсз. 3 : 45-55.

Иа1кег М ек а1. (1995). С Аикокттип. 8 : 931-45.

Ни О ек а1. (2005). Е1ескгор11огез1з, 26, 225-37.

Х1а	0 ек	а1	. (2005)	. ВхосЬет ВхорИуз Кез	Соттип, 330: 526-32
Хие	У ек	а1	. (2006)	» ВМС В1о±п£огтаРьсзг	7 : 163.
Хие	У ек	а1	. (2005)	. ЫисХехс Ас16б Р.ез.	33: И184-7.
УатадаРа	А	ек а1. (	2002), Рго^еотгсз. 2	: 1267-76.

УатадисМ Н ек а1. (2005). σ Се11 ΒίοΙ. 168: 441-52.

ΥθζΗβΙγθν МУ ек а1. (2004). С11п Сапсег Кез. 10 : 8028-36

Уоко1 N ек а!., (2005). Сапсег Кез. 65: 10371-10380.

Уи У ек а1. (2005). 0псо1оду 68: 79-86.

Уип13 А ек а1. (1977). 1пк О Сапсег, 19:128-35.

- 20 016731

Список последовательностей <110> НгЬоуах Б1ОЬесйпо1од1ез ЗА

Βΐοΐίηβ 01адпозк1С1 З.Я.Ь.

<120> НОВЫЕ АНТИГЕНЫ И АНТИТЕЛА, АССОЦИИРОВАННЫЕ С АДЕНОКАРЦИНОМОЙ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ПРОТОКА <130> РАГ05_аепо1уаг_И0 <150> ЕР 06121552.1 <151> 2006-09-29 <150> ЕР 05126726-6 <151> 2006-12-20 <160> 2 <170> РаЬепЫп νβΓδίοη 3.3 <210> 1 <211> 434 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 1

Мек 1

Зег

Не

Ьеи

Ьуз 5

11е

ΗΪ5 А1а

Агд

С1и 10

11е

Рке

Азр

Зег

Агд 15

С1у

С1 у

Азп

Рго

Тпг

7а1

С1и

7а1

Аур

Ьеи

Рке

Ткг

Зег

Ьуз

Ьеи

Рке

Агд

20

25

30

А1а

А1а

Уа1

Рго

Зег

С1у

А1а

Зег

Ткг

С1у

Не

Туг

С1и

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

Ьеи

Агд

Азр

Азп

Азр

Ьуз

Ткг

Агд

Туг

Мек

О1у

Ьуз

<31 у

Уа1

Зег

Ьуз

50

55

60

А1а

Уа1

С1и

Н1з

11е

Азп

Ьуз

Ткг

11е

А1а

Рго

А1а

Ьеи

Уа1

Зег

Ьуз

65

70

75

80

ьуз

Ьеи

А$п

Уа1

Ткг

С1и

С1п

С1и

Ьуз

Пе

Азр

Ьуз

Ьеи

Мек.

11е

Ии

85

90

95

Мек.

Азр

С1у

Ткг

С1и

Азп

Ьуз

Зег

Ьуз

РНе

С1у

А1а

А5Л

А1а

11е

Ьеи

100

105

но

С1у

Уа1

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

Суз

Ьуз

А1а

С1у

А1а

Уа1

С1и

Ьуз

С1у

Уа1

115

120

125

Рго

Ьеи

Туг

Агд

ΗΪ3

Т1е

А1а

Азр

Ьеи

А1а

С1у

Азп

Зег

С1и

11е

130

135

140

- 21 016731

Ьеи 145

Рго

ν*ι

Рго А1а

РЬе 150

Азп Уа1

Не Азп

С1у 155

С1у

Зег

Мез

А1а

01у 160

Азп

Ьуз

Ьеи

А1а

Мес

С1п

31и

РЬе

Ме*

Не

Ьеи

Рго

Уа1

С1у

А1а

А1а

165

170

175

Азп

РЬе

Агд

С1и

А1а

МеС.

Агд

11е

С1у

А1а

С1и

Уа]

Туг

Н13

Азп

Ьеи

180

185

190

ьуз

АЗП

11е

Ьуз

С1и

Ьуз

Туг

С1у

Ьуз

Азр

А1а

ТЬг

Азп

Уа1

С1у

195

200

205

Азр

С1и

01у

О1у

РЬе

А1а

Рго

Азл

11е

Ьеи

С1и

Азп

Ьуз

С1и

С1у

Ьеи

210

215

220

С1и

Ьеи

Ьеи

Ьуз

ТЬг

А1а

11е

С1у

Ьуз

А1а

С1у

Туг

ТЬг

Азр

Ьуз

Уа1

225

230

235

240

Уа1

Не

С1у

Ме*

Азр

Уа1

А1а

А1а

Зег

С1и

РЬе

РЬе

Аге

Зег

С1у

Ьуз

245

250

255

Туг

Азр

Ьеи

Азр

РЬе

Ьуз

Зег

Рго

Азр

Азр

Рго

Зег

Агс|

Туг

11е

Зег

260

265

270

Рго

Азр

С1п

Ьеи

А1а

Азр

Ъеи

Туг

Ьуз

Зег

РЬе

11е

Ьуз

Азр

Туг

Рго

275

280

285

Уа1

7а1

Зег

Не

С1и

АЗр

РГО

РЬе

Азр

01п

Азр

Азр

Тгр

С1у

А1а

Тгр

290

295

300

С1п

Ьуз

РЬе

ТЬг

А1а

Зег

А1а

С1у

Не

Θΐη

Уа1

Уа1

С1у

Азр

Азр

ьеи

305

310

315

320

ТЬг

Уа1

ТЬг

Азп

Рго

Ьуз

Агд

11е

А1а

Ьуз

А1а

Уа1

Аза

61и

Ьуз

Зег

325

330

335

Суз

Азп

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Уа1

Азп

С1п

11е

СИу

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

340

345

350

Зег

Ьеи

С1п

А1а

Суз

Ьуз

Ьеи

А1а

С1п

А1а

Азп

С] у

Тгр

С1у

Уа1

МеС

355

360

365

Уа1

Зег

Н1з

Агд

Зег

С1у

С1и

ТЬг

С1и

Азр

ТЬг

РЬе

Не

А1а

Азр

ьеи

370

375

380

Уа1

7а1

С1у

Ьеи

Суз

ТЬг

С1у

61п

Не

Ьуз

ТЬг

ЗЬу

А1а

Рго

Суз

Агд

385

390

395

400

- 22 016731

5ег С1и Агд Ьеи А1а Ьуз Туг Азп Б1п Ьеи Ьеи Агд Не С1и С1и С1и

405 410415

Ьеи С1у Зег Ьуз А1а Ьуз РЬе А1а С1у Агд Азп РЬе Агд Азп Рго Ьеи

420 425430

А1а Ьуз <210 2 <211>434 <212> Белок <213> Ното эар1епз <400>2

МеЕ 1

Зег

Не

С1и

Ьуз 5

Не

Тгр

А1а

Агд

31и 10

Не

Ьеи

Азр

Зег

Агд 15

<31у

Азп

Рго

ТЬг

Уа1

С1и

Уа1

Азр

Ьеи

Туг

ТЬг

А1а

Ьуз

С1у

Ьеи

РЬе

Агд

20

25

30

А1а

А1а

Уа1

Рго

Зег

С1у

А1а

Зег

ТЬг

С1у

Не

Туг

С1и

А1а

Ьеи

С1и

35

40

45

Ьеи

Агд

Азр

С1у

Азр

Ьуз

ΰΐη

Агд

Туг

Ьеи

С1у

Ьуз

01у

Уа1

Ьеи

ьуз

50

55

60

А1а

Уа1

А8р

Н13

Не

Азп

Зег

ТЬг

11е

А1а

Рго

А1а

Ьеи

Не

Зег

Зег

65

70

75

80

СЬу

Ьеи

Зег

Уа1

Уа1

С1и

С1п

СЬи

Ьуз

Ьеи

Азр

Азп

Ьеи

МеЕ

Ьеи

О1и

85

90

95

Ьеи

Азр

С1у

ТЬг

С1и

Азп

Ьуз

Зег

Ьуз

РЬе

С1у

А1а

Аза

А1а

11е

Ьеи

100

105

НО

С1у

Зег

Ьеи

А1а

7а1

Су5

Ьуз

А1а

СЬу

А1а

А1а

(Пи

Агд

С1и

Ьеи

115

120

125

Рго

Ьеи

Туг

Агд

Н13

Не

А1а

С1п

Ьеи

А1а

С1у

Азп

Зег

Азр

Ьеи

Не

130

135

140

Ьеи

Рго

1/а1

Рио

А1а

РЬе

Азп

7а1

Не

Азп

С1у

С1у

Зег

Н13

А1а

С1у

145

150

155

160

Азп

Ьуз

Ьеи

А1а

МеЬ

С1п

С1и

РЬе

Мес

11е

Ьеи

Рго

Уа1

С1у

А1а

С1и

165

170

175

- 23 016731

Зег

Рке

Агд

Азр 180

А1а

Мек

Агд

Ьеи О1у 185

А1а

С1и

Уа1

Туг

Нгз 190

Ткг

Ьеи

Ьуз

С1у

Уа1

11е

Ьуз

Азр

Ьуз

Туг

С1у

Ьуз

Азр

А1а

ТЬг

Азп

Уа1

С1у

195

200

205

Азр

С1и

С1у

С1у

РЬе

А1а

Рго

Азп

Не

Ьеи

С1и

Азп

Зег

С1и

А1а

Ьеи

210

215

220

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1и

А1а

Не

Азр

Ьуз

А1а

61у

Туг

ты

С1и

Ьуз

Не

225

230

235

240

7а1

Не

С1у

Мек

Азр

Уа1

А1а

А1а

Зег

С1и

РЬе

Туг

Агд

Азр

С1у

Ьуз

245

250

255

Туг

Азр

Ьеи

Азр

Рке

Ьуз

Зег

Рго

ТЬг

Азр

Рго

Зег

Агд

Туг

11е

Ткг

260

265

270

С1у

Азр

С1п

Ьеи

С1у

А1а

Ьеи

Туг

С1п

Азр

РЬе

УаЬ

Агд

Азр

Туг

Рго

275

280

285

Уа1

ν^ι

Зег

11ё

51 и

Азр

Рго

Рке

Азр

СХп

Азр

Азр

Тгр

А1а

А1а

Тгр

290

295

300

Зег

Ьуз

РЬе

ТЬг

А1а

Азп

Ца1

С1у

11е

С1п

11е

7а1

С1у

Аэр

Азр

Ьеи

305

310

315

320

Ткг

Уа1

Ткг

Азп

Рго

Ьуз

Агд

Не

С1и

Агд

А1а

7а1

С1и

С1и

Ьуз

А1а

325

330

335

Суз

Азп

Суз

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьуз

7а1

Азп

31п

Не

С1у

Зег

Уа1

Ткг

С1и

340

345

350

А1а

11е

С1п

А1а

Суз

Ьуз

Ьеи

А1а

С1п

С1и

Азп

С1у

Тгр

С1у

Уа1

Мек

355

360

365

Уа1

Зег

Н13

Агд

Зег

01 у

(Ни

ТЬг

С1и

Азр

ТЬг

РЬе

Не

А1а

Азр

Ьеи

370

375

380

Уа1

Уа1

С1у

Ьеи

Суз

Ткг

С1у

С1п

Не

Ьуз

ТЬг

С1у

А1 а

Рго

Суз

Агд

385

390

395

400

Зег

О1и

Агд

Ьеи

А1а

Ьуз

Туг

Азп

С1п

Ьеи

МеЬ

Агд

Не

С1и

С1и

С1и

405

410

415

Ьеи

С1у

Азр

С1ц

А1а

Агд

Рке

А1а

С1у

Н13

Азп

Рке

Агд

Азп

Рго

Зег

420

425

430

Уа1 Ьеи

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изоформа человеческой альфа-енолазы, отличающаяся тем, что она имеет 8Ер ГО N0: 1 и фосфорилирована по меньшей мере в 3 положениях, выбранных из треонина 55, тирозина 57, тирозина 200, тирозина 236, треонина 237, тирозина 257 и серина 419.
2. 2. Антитело, которое специфически связывается с изоформой альфа-енолазы по п.1.
3. 3. Антитело по п.2, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело или фрагмент антитела.
4. 4. Антитело по п.2 или 3, отличающееся тем, что оно слито или конъюгировано с молекулой, содержащей выявляемую метку.
5. 5. Применение изоформы человеческой альфа-енолазы по п.1 или антитела по пп.2-4 для диагностики аденокарциномы панкреатического протока.
6. 6. Способы диагностики аденокарциномы панкреатического протока (ГОА), включающие детекцию изоформы человеческой альфа-енолазы по п.1 и/или детекцию антитела по пп.2-4.
7. 7. Наборы для диагностики аденокарциномы панкреатического протока (ГПА), включающие изоформу человеческой альфа-енолазы по п.1 и/или антитело по пп.2-4.
8. 8. Применение антитела по пп.2-4 для получения фармацевтических композиций для лечения аденокарциномы панкреатического протока.
9. 9. Фармацевтическая композиция для лечения аденокарциномы панкреатического протока, включающая антитело по пп.2-4.