EA015943B1 - Пептидное соединение с антимикробной активностью, полученное из bacillus clausii, и его применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к пептидному соединению с биологической активностью, которое, в частности, обладает антимикробными свойствами, которое включает аминокислотную последовательность: Phe-Dhb-Ala-Val-Dha-Phe-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Gly-Glu-Dhb-Gly-Ala-Phe-Asn-Ala-Phe-Ala, где Dhb представляет дидегидроаминобутират; Dha представляет дидегидроаланин; Abu представляет аминобутират, а также к способу получения такого соединения и его применению.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидному соединению с биологической активностью, в частности, обладающему антимикробными свойствами, его получению и к его применениям.

Известно, что определенные живые микроорганизмы, когда вводятся людям или животным, способны оказывать благоприятное воздействие на здоровье организма, в частности, продуцируя антимикробные вещества.

Такие организмы обычно называют пробиотическими организмами.

Многочисленные исследования показали благоприятные воздействия этих пробиотических организмов на людей или животных, в особенности при лечении желудочно-кишечных нарушений, таких как диарея, острая диарея и диарея, связанная с использованием лекарственных препаратов.

Пробиотические организмы, наиболее изученные до настоящего времени, являются молочнокислыми бактериями, но было также сообщено, что другие живые организмы могут иметь благоприятное воздействие на здоровье.

Эти другие организмы включают, например, ВасШик киЫШк, ВасШик НсНеш Гопгик, ВасШик соади1ап8, ВасШик сегеик, ВасШик с1аикн, ВасШик ро1уГегтеп1апк.

Среди них ВасШик с1аикн использовались много лет в фармацевтическом препарате, продаваемом под тортовой маркой Еп!егодегтша®.

Этот фармацевтический препарат предназначен, в частности, для борьбы с желудочно-кишечными нарушениями и включает смесь четырех штаммов ВасШик с1аикн.

Антимикробная биологическая активность этих пробиотических организмов обычно связана с естественным продуцированием соединений с антимикробной активностью, таких как лантибиотики. Таким образом, штаммы ВасШик с1аикн, 81гер1отусек ти!апк, ЬасЮсоссик 1асйк продуцируют соответственно субтилин, мутацины и низины соответственно.

Многочисленные антибиотики используются в настоящее время как терапевтические вещества для лечения инфекционных болезней, но болезнетворные организмы становятся все более устойчивыми к фармацевтическим препаратам, которые используются. Некоторые из них, как уже известно, устойчивы ко многим препаратам, и иногда чрезвычайно трудно лечить инфекции, которые они вызывают.

Поэтому постоянно разыскиваются новые молекулы, имеющие антибиотические свойства.

Цель изобретения состоит в том, чтобы удовлетворить этому требованию, предлагая соединение с антимикробной активностью, полученное из ВасШик с1аикн.

Первый объект изобретения относится к соединению с антимикробной активностью.

Второй объект изобретения относится к способу получения соединения с антимикробной активностью по изобретению.

Третий объект изобретения относится к фармацевтическому препарату, содержащему соединение с антимикробной активностью по изобретению.

Четвертый объект изобретения относится к использованию соединения с антимикробной активностью по изобретению.

Согласно первому аспекту изобретение относится к соединению с антимикробной активностью.

Таким образом, молекула, продуцируемая ВасШик с1аикн, которая показывает антимикробную активность, была выделена и охарактеризована.

Соединение по изобретению с антимикробной активностью имеет природу пептида и может быть получено из культуры ВасШик с1аикн в подходящей питательной среде вплоть до споруляции, сбора супернатанта культуры после центрифугирования и фильтрации и экстракции фракции с антимикробной активностью и соединение включает следующую последовательность аминокислот и аминокислотных производных: Рйе-0йЬ-А1а-Уа1-Пйа-Рйе-А1а-АЬи-Рго-61у-А1а-61у-61и-0йЬ-61у-А1а-Рйе-Акп-А1а-Рйе-А1а, в которой ИНЬ представляет собой дидегидроаминобутират; ЭНа представляет собой дидегидроаланин; АЬи представляет собой аминобутират.

Соединение по изобретению, которое является, главным образом, активным против грамположительных бактерий, может быть получено из ВасШик с1аикн и имеет молекулярную массу 2107,5 Да, определенную масс-спектрометрией с лазерно-десорбционной ионизацией в присутствии матрицы и с времяпролетным масс-анализатором с ионизацией электрораспылением (метод МАЬО1 ТОР и Е81).

Согласно другой характеристике соединение по изобретению является лантибиотиком и имеет лантиониновые мостики и измененные аминокислоты в пептидной последовательности.

Соединение по изобретению обладает двумя лантиониновыми мостиками, один между аланином в положении 3 и аланином в положении 7 и другой между аланином в положении 16 и аланином в положении 21.

Кроме того, метил-лантиониновый мостик присутствует между остатком аминобутирата в положении 8 и аланином в положении 11. Четвертый мостик присутствует между С-концевой группой аминовинилцистеина и остатком аланина в положении 19.

Представленное с имеющимися мостиками соединение по изобретению имеет следующую последовательность:

- 1 015943 |-----------------8-----------------1

РЬе - ЦЬЬ - А1а - Уа1 - ИНа - РЬе - А1а - АЬи - Рго - 61у - А1а - 61у - 61и - - 61у - А1а - РЬе - Азп - А1а - РЬе - А1а - ΝΗ - СН=СНI__д I '-⁵——' —⁸— в которой Ока, Э11Ь и АЬи определены выше.

Согласно второму аспекту изобретение относится к способу получения соединения с антимикробной активностью по изобретению.

Согласно изобретению соединение по изобретению может быть извлечено из ВасШиз е1аизй следующим способом. Способ получения соединения по изобретению включает стадии культивирования штаммов ВасШиз с1аизй в подходящей питательной среде вплоть до споруляции штаммов;

сбор супернатанта от культивирования после центрифугирования и фильтрации;

экстракции полученной фракции твердой фазой и элюирование.

В случае необходимости, полученная фракция, которая соответствует молекуле изобретения, может быть очищена высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Согласно другому варианту соединение по изобретению может быть получено обычным химическим синтезом, способами, известными специалисту в технологии.

Соединение по изобретению показывает антимикробную активность против грамположительных бактерий. В частности, оно показало антимикробную активность против 8. аигеиз, Еп1егососсиз Гаеешт, М1сгососсиз зр., Ьас1ососсиз 1асйз, С1оз1пйшт ШГйсйе, С1оз1пйшт регГппдепз, Ыз1епа топосу (одепез и грамположительных бактерий ротовой полости.

Вследствие его лантиобиотического характера соединение по изобретению может показать более широкий спектр биологической активности, например противовирусной, противопаразитарной или иммуномодулирующей активности.

Следовательно, соединение по изобретению может применяться для приготовления лекарственных продуктов.

Таким образом, согласно другому аспекту изобретение относится к лекарственным продуктам, которые содержат соединение по изобретению.

Эти лекарственные продукты находят применение в терапии, в частности при лечении и профилактике инфекционных болезней.

Эти лекарственные продукты также находят применение при лечении и (или) профилактике кишечных нарушений, например при лечении и профилактике кишечного дисбиоза и эндогенного витаминного нарушения, так же как при дополнительном лечении для восстановления кишечной бактериальной флоры, которая была изменена в результате антибиотикотерапии или химиотерапии.

Они также находят применение при профилактике и лечении диареи, в частности специфической острой диареи и диареи, связанной с использованием лекарственных продуктов.

Согласно другому аспекту изобретение относится к фармацевтическим препаратам, включающим как действующее начало соединение по изобретению для лечения и (или) профилактики патологий, описанных выше. Эти фармацевтические препараты содержат эффективную дозу соединения по изобретению, так же как по меньшей мере один фармацевтически эффективный эксципиент.

Указанные эксципиенты выбирают согласно фармацевтической форме и желаемого пути введения из традиционных эксципиентов, которые известны специалисту в технологии.

В фармацевтических препаратах по настоящему изобретению для перорального, подъязычного, подкожного, внутримышечного, внутривенного, топического, местного, эндотрахеального, носового, трансдермального или ректального введения, соединение может применяться в дозировочных единицах, смешанное с обычными фармацевтическими инертными наполнителями для введения животным и людям для профилактики или для лечения упомянутых выше нарушений или болезней.

Соответствующие дозировочные единицы включают формы для перорального пути введения, такие как таблетки, мягкие или твердые капсулы, порошки, гранулы и пероральные растворы или суспензии; подъязычные, защечные, эндотрахеальные, внутриглазные, носовые и формы ингаляционного введения; местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные или внутривенные формы введения; ректальные формы введения, и имплантаты. Для местного применения соединения по изобретению могут использоваться в кремах, гелях, мазях или лосьонах.

Композиция по изобретению может вводиться наиболее подходящим путем и в дозе, которая зависит, в частности, от природы инфекции, от типа рассматриваемого организма, от возраста организма, веса и общего состояния, от получаемого сопутствующего лечения, так же как от реакции организма на лечение и от терапевтического обоснования.

- 2 015943

В общем для введения людям препарат применяется перорально в форме фармацевтического препарата спор. Например, доза может составлять приблизительно 10х10⁹ спор ежедневно, например от 1 до 8х10⁹ спор ежедневно, в частности 2,4 или 6х10⁹ спор ежедневно, в единственной дозе или в нескольких дозах.

Могут быть особые случаи, в которых более высокие или более низкие дозы являются адекватными; такие дозы также представляются в рамках изобретения.

Согласно другому из его аспектов изобретение относится к применению соединения по изобретению для получения лекарственного продукта, предназначенного для профилактики и (или) лечения патологий, описанных выше.

Согласно другому из его аспектов изобретение также относится к методу лечения вышеизложенных патологий, который включает введение больному эффективной дозы соединения по изобретению.

Согласно другому аспекту соединение по изобретению может также использоваться как добавка в косметических и пищевых препаратах.

Согласно этому применению соединение по изобретению добавляют в количестве, достаточном, чтобы ингибировать увеличение бактериального роста в косметическом или пищевом препаратах и, таким образом, обеспечить их сохранение.

Примеры, данные ниже, иллюстрируют изобретение, хотя не ограничивают его.

1. Получение молекулы.

Получение супернатанта.

Штамм О/С ВаеШи8 с1аи8п (полученный из фармацевтического препарата, продаваемого под торговой маркой ЕЩсгодстипа®) культивируют в течение трех дней на питательной среде Мие11ег Ηίηΐοη при 37°С и 180 об/мин до тех пор, пока споруляция штамма не будет иметь место.

Культуру затем центрифугируют и супернатант фильтруют с использованием мембраны с размером пор 0,45 мкм, чтобы удалить любые остаточные клетки.

Экстракция.

Соединение с антимикробной активностью экстрагируют на твердой фазе на патроне 8ер Рак р1и§ С18 (\Уа1ег5). Для этого 150 мл супернатанта, полученного в предыдущей стадии, наносят на патрон и элюируют 100%-ным метанолом после трех последовательных промывок с помощью 25 мМ ΝΗ·Ηί.Ό₃. рН 8; 25 мМ ΝΗ.-ΗίΌ^ рН 8+10%-ный метанол и 25 мМ ΝΗ.-ιΗίΌ^ рН 8+50%-ный метанол.

Все активные фракции, элюированные 100%-ным метанолом, объединяют и концентрируют вакуумным испарением до тех пор, пока не получают фактор сокращения объема 10.

Концентрат хранят при -20°С. Никакой потери активности не наблюдалось после 6 месяцев хранения в этих условиях.

Очистка.

Очистку до состояния гомогенности вещества, извлеченного твердой фазой, выполняют ВЭЖХ.

Первую полупрепаративную стадию выполняют на колонне С4 8упсйгораек 100х8 мм. Фракции элюата, которые показывают антимикробную активность, собирают и объединяют. Чистота соединения, полученного в конце этой стадии, больше 80% и выход в экстракции-очистке составляет приблизительно 6 мг I^-1 супернатанта.

Вторую аналитическую стадию выполняют на колонне С1 ΒίδοΙιοΓΓ 150x4,6 мм. Фракции элюата, которые показывают антимикробную активность, собирают и объединяют. Чистота соединения, полученного в конце этой стадии, больше 90%.

2. Структурное исследование.

Определение веса молекулы.

Очищенное соединение, полученное в примере 1 выше, имеет молекулярный вес 2107,5 Да, определенный масс-спектрометрией, используя метод МАБЭ ΤΘΕ, и подтвержденный масс-спектрометрией, используя метод Ε8Ι.

УФ/видимый спектр поглощения.

Соединение по изобретению поглощает в ультрафиолете и имеет, в частности, пик при 265 нм, совместимый с наличием ароматических аминокислот в его структуре.

Аминокислотный состав.

После полного гидролиза под действием 5,7Ν НС1, под вакуумом, в течение 16 ч при 115°С, наличие различных аминокислот определяют в структуре очищенного соединения.

Исследование различных энантиомерных форм аминокислот.

Энантиомерные Ь и Ό формы аминокислот, которые составляют последовательность соединения с антимикробной активностью, были исследованы после полного кислотного гидролиза, дериватизацией с №-(2,4-динитро-5-фторфенил)-Е-аланинамидом (реактив Мерфи) согласно методу, описанному 8хокап (1. СйгошаФ., 1988, 444, с. 115-122). Результаты указывают, что все остатки аминокислот, которые составляют антибиотическую молекулу, являются энантиомерами Ь формы.

- 3 015943

Влияние ферментативных или химических обработок на структуру.

Полная потеря активности после ферментативной обработки проназой подтверждает пептидный характер нового антибиотического соединения.

Дисульфидные мостики исключаются, так как цистеин-специфический анализ оказался отрицательным. Напротив, наличие лантиониновых мостиков, чувствительных к восстановительной обработке в щелочной среде (Меуег, Апа1. Вюсйет, 223, с. 185-190, 1994), может объяснить потерю активности, наблюдаемую в присутствии β-меркаптоэтанола после структурной модификации, обнаруженной ВЭЖХ с обращенными фазами. Снижение, только частичное, в активности, измеренное в конце менее интенсивной обработки, такой как инкубация при нейтральном рН в присутствии 25 мМ дитиотреитола (ΌΤΤ), может быть результатом определенного восстановления дидегидроаминокислот, присутствующих в структуре. Эти наблюдения позволяют сформулировать гипотезу, согласно которой антимикробная молекула, произведенная ВасШик с1аи8и, является лантибиотиком. Это семейство антибиотиков обычно характеризуется наличием лантиониновых мостиков и модифицированных аминокислот в их структуре.

Секвенирование природной молекулы.

Секвенирование выполнено с использованием автоматического секвенатора Ргосйе 492 А (Аррйеб Вюкук1ет), посредством ступенчатой деградации Эдмана, начиная с Ν-конца. Полученные фенилтиогидантоиновые (ФТГ) производные аминокислоты анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами на микроколонке С18. Секвенирование антибиотической молекулы, в естественном состоянии, блокируют в конце первой стадии химической деградации Эдмана. Единственный идентифицированный остаток соответствует фенилаланину, который занимает Ν-концевое положение.

Секвенирование молекулы после химической модификации.

Информация, касающаяся потенциальной последовательности нового антимикробного вещества, произведенного ВасШик с1аи8и, полученная из последовательности кодирующего гена, соединенная с информацией, полученной из анализа аминокислотного состава и из поведения в восстанавливающей среде, показывает наличие посттрансляционных модификаций, характерных для лантибиотиков.

Наличие дидегидроаминокислот и лантиониновых мостиков в структуре является началом блокирования секвенирования молекулы в естественном состоянии. Дегидроаминокислоты, такие как Э11а (дидегидроаланин) и Э11Ь (дидегидроаминобутират), дезаминируются во время химической деградации Эдмана и, таким образом, блокируют прогресс секвенирования. Эти те же самые остатки Э11а и Э11Ь не обнаруживаются анализом аминокислотного состава после полного кислотного гидролиза по тем же самым причинам, а их дезаминирование делает неэффективной реакцию дериватизации с б-аминохинолил-Νгидроксисукцинимидил карбаматом (АЭС) (^а!етк), специфической для функции первичного амина.

С целью преодоления проблем, связанных с присутствием модифицированных аминокислот и лантиониновых мостиков, двойная химическая реакция была применена к пептидному антибиотику до его секвенирования. Используемый метод был заимствован из работы Смита (διηίΐΐι). Еиг. 1. Вюсйет. 2000, 267, р. 6810-6816. С этой целью 50 нмоль очищенного пептида загружают в 10 мкл Н₂О+4 мг NаВΗ₄. Добавляют 190 мкл раствора для денатурирования с антиоксидантом (570 мг хлорида гуанидина+0,1 мл Νэтилморфолина, доведенного водой Н₂О до рН 8,5 к конечному объему 1 мл), затем реакционную смесь культивируют в потоке Ν₂ в течение 72 ч при 37°С.

Эта обработка специфично восстанавливает дидегидроаминокислоты, не повреждая лантиониновые мостики.

Таким образом, восстановленный пептид выделяют на колонке РгокогЬ (Регкш Е1тег), снабженной мембраной РУЭЕ. После промывки мембраны 200 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК), пептид, адсорбированный на этой подложке, подвергают второму восстановлению в присутствии этантиола, добавление 20 мкл раствора, включающего 280 мкл метанола+200 мкл Н₂О+65 мл №1ОН+60 мкл этантиола, в течение 1 ч при 50°С.

Ковалентная структура антибиотической молекулы, произведенной ВасШик с1аики.

Ковалентная структура находится в согласии со всеми полученными данными. Молекулярная масса, вычисленная на основе масс моноизотопных остатков, составляет 2107,5 Да. Антимикробная молекула, секретируемая ВасШик с1аикп, является лантибиотиком, обладающим 4 лантиониновыми мостиками и метил-лантионином, так же как 3 остатками дидегидроаминокислоты, в структуре. Структура находится в согласии с найденной массой, 2107,5 Да, с результатами, полученными после выполнения химических модификаций на молекуле, и с последовательностью аминокислот, выведенной на основе гена, который кодирует ее продукцию, найденного в В. с1аикп. Структура была подтверждена анализом ЯМР.

Другие три штамма (Ν/Β, 8ΙΝ, Τ) ВасШик с1аикй, присутствующие в фармацевтическом препарате ЕШетодеттша®, показали тот же самый профиль антимикробной активности, как штамм О/С.

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептидное соединение, которое имеет антимикробную активность и может быть получено культивированием БасШиз с1аизй в подходящей питательной среде вплоть до споруляции, сбором супернатанта от культивирования после центрифугирования и фильтрации и экстракцией фракции с антимикробной активностью, где указанное соединение характеризуется следующей аминокислотной формулой:

   РЬе - ЦЬЬ - А1а - Уа1 - ОЬа - РЬе - А1а - АЬи - Рго - 61у - А1а - С1у - С1и - ОЬЬ - 61у - А1а - РЬе - Азп - А1а - РЬе - А1а - ЫН - СН-СНэв которой ИНЬ представляет дидегидроаминобутират;

   □На представляет дидегидроаланин и

   АЬи представляет аминобутират.
2. 2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно имеет молекулярный вес 2107,5 Да.
3. 3. Соединение по п.1 или 2, отличающееся тем, что аминокислотные остатки являются энантиомерами Б формы.
4. 4. Способ получения соединения по любому из пп.1-3, который включает следующие стадии: культивирование штаммов БасШиз с1аи8п в подходящей питательной среде вплоть до споруляции штаммов;

   сбор супернатанта из культивирования после центрифугирования и фильтрации;

   экстракция твердой фазой полученной фракции и элюирование;

   очистка полученной фракции высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), при необходимости.
5. 5. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного продукта, предназначенного для лечения и/или профилактики кишечных нарушений или инфекционных болезней.
6. 6. Применение по п.5 для лечения и/или профилактики кишечного дисбиоза и эндогенного витаминого нарушения для восстановления кишечной бактериальной флоры, измененной в результате антибиотикотерапии или химиотерапии, для лечения и профилактики диареи, в частности острой диареи или диареи, связанной с использованием лекарственных продуктов.
7. 7. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве добавки в косметических или пищевых препаратах.