EA013183B1 - Синтетические молекулярные конструкции - Google Patents
Синтетические молекулярные конструкции Download PDFInfo
- Publication number
- EA013183B1 EA013183B1 EA200601753A EA200601753A EA013183B1 EA 013183 B1 EA013183 B1 EA 013183B1 EA 200601753 A EA200601753 A EA 200601753A EA 200601753 A EA200601753 A EA 200601753A EA 013183 B1 EA013183 B1 EA 013183B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- synthetic molecular
- group
- molecular structure
- boreau
- cells
- Prior art date
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 193
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 80
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 52
- -1 5-amino pentyl Chemical group 0.000 claims description 24
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims description 22
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 21
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 19
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical class 0.000 claims description 19
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 18
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 17
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 13
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 13
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 13
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 150000008163 sugars Chemical group 0.000 claims description 12
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M Vaccenic acid Natural products CCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC([O-])=O UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M 0.000 claims description 10
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- ZQPPMHVWECSIRJ-MDZDMXLPSA-N elaidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-MDZDMXLPSA-N 0.000 claims description 10
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 10
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L adipate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC([O-])=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 8
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical group CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims description 7
- 150000008103 phosphatidic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 claims description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000003142 primary aromatic amines Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 6
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 claims description 5
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CNVZJPUDSLNTQU-UHFFFAOYSA-N Petroselaidic acid Natural products CCCCCCCCCCCC=CCCCCC(O)=O CNVZJPUDSLNTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims description 5
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 claims description 5
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-N cis-vaccenic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC(O)=O UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-N 0.000 claims description 5
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- CNVZJPUDSLNTQU-SEYXRHQNSA-N petroselinic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C/CCCCC(O)=O CNVZJPUDSLNTQU-SEYXRHQNSA-N 0.000 claims description 5
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 5
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims description 5
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 claims description 5
- UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N trans-vaccenic acid Chemical compound CCCCCC\C=C\CCCCCCCCCC(O)=O UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N 0.000 claims description 5
- QVSVMNXRLWSNGS-UHFFFAOYSA-N (3-fluorophenyl)methanamine Chemical compound NCC1=CC=CC(F)=C1 QVSVMNXRLWSNGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 claims description 4
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 4
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 3
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- PCBKWKNYISJGPJ-BUHFOSPRSA-N (3E)-3-hexadecenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC\C=C\CC(O)=O PCBKWKNYISJGPJ-BUHFOSPRSA-N 0.000 claims 2
- PJHOFUXBXJNUAC-KTKRTIGZSA-N (Z)-hexadec-7-enoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCC(O)=O PJHOFUXBXJNUAC-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims 2
- KVXIRQZWCOAYRD-QXMHVHEDSA-N 16:1(5Z) Chemical compound CCCCCCCCCC\C=C/CCCC(O)=O KVXIRQZWCOAYRD-QXMHVHEDSA-N 0.000 claims 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 12
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 129
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 105
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 60
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 39
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- PPMPLIBYTIWXPG-UHFFFAOYSA-N Glycolipid A Natural products CCCCCCCC(CC(O)=O)OC(=O)CC(CCCCCCC)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O PPMPLIBYTIWXPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- PPMPLIBYTIWXPG-MSJADDGSSA-N L-rhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(CC(O)=O)OC(=O)CC(CCCCCCC)O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O PPMPLIBYTIWXPG-MSJADDGSSA-N 0.000 description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 18
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 102100027286 Fanconi anemia group C protein Human genes 0.000 description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 16
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 15
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 7
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 101150086837 pic gene Proteins 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 6
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 5
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 208000025661 ovarian cyst Diseases 0.000 description 5
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100226116 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) esa-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AFSHUZFNMVJNKX-CLFAGFIQSA-N 1,2-dioleoylglycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC AFSHUZFNMVJNKX-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 3
- 102100040610 Dynein regulatory complex subunit 4 Human genes 0.000 description 3
- 101000816970 Homo sapiens Dynein regulatory complex subunit 4 Proteins 0.000 description 3
- 208000036758 Postinfectious cerebellitis Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N diphosphatidyl glycerol Natural products OP(O)(=O)OCC(OP(O)(O)=O)COP(O)(O)=O FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 150000002313 glycerolipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 3
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- ZVRMGCSSSYZGSM-CCEZHUSRSA-N (E)-hexadec-2-enoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\C(O)=O ZVRMGCSSSYZGSM-CCEZHUSRSA-N 0.000 description 2
- FVCSARBUZVPSQF-UHFFFAOYSA-N 5-(2,4-dioxooxolan-3-yl)-7-methyl-3a,4,5,7a-tetrahydro-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1C(C(OC2=O)=O)C2C(C)=CC1C1C(=O)COC1=O FVCSARBUZVPSQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 2
- 101150116295 CAT2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100326920 Caenorhabditis elegans ctl-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100494773 Caenorhabditis elegans ctl-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100112369 Fasciola hepatica Cat-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 2
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 2
- 101100005271 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cat-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100126846 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) katG gene Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 101150072179 ATP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000006409 Acacia auriculiformis Species 0.000 description 1
- 101100003366 Arabidopsis thaliana ATPA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100392078 Caenorhabditis elegans cat-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000010205 Cola acuminata Nutrition 0.000 description 1
- 244000228088 Cola acuminata Species 0.000 description 1
- 235000015438 Cola nitida Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000271559 Dromaiidae Species 0.000 description 1
- 102100021649 Elongator complex protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710088235 Envelope glycoprotein C homolog Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100065219 Homo sapiens ELP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000010410 Nogo Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010077641 Nogo Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710173681 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000018614 Uromodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010027007 Uromodulin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 101150105046 atpI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009582 blood typing Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000546 effect on cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- GIGAVEHCPDOYLJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;propan-2-ol;hydrate Chemical compound O.CC(C)O.CCOC(C)=O GIGAVEHCPDOYLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002298 globosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000003019 phosphosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220036542 rs144706057 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 125000002593 sialoyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- UJMBCXLDXJUMFB-GLCFPVLVSA-K tartrazine Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=NN(C=2C=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)C(=O)C1\N=N\C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 UJMBCXLDXJUMFB-GLCFPVLVSA-K 0.000 description 1
- 229960000943 tartrazine Drugs 0.000 description 1
- 235000012756 tartrazine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004149 tartrazine Substances 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0641—Erythrocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Laminated Bodies (AREA)
Abstract
Изобретение относится к синтетическим молекулам, которые спонтанно и стабильно включаются в липидные бислои, в том числе клеточные мембраны. Конкретно, хотя и не исключительно, изобретение относится к применению этих молекул в качестве синтетических мембранных якорей или синтетических молекулярных конструкций для осуществления качественных и количественных изменений в экспрессии клеточных поверхностных антигенов.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к синтетическим молекулам, которые самопроизвольно и стабильно включаются в липидные бислои, включающие клеточные мембраны. В частности, хотя и не исключительно, изобретение относится к применению этих молекул в качестве синтетических «мембранных якорей» или синтетических молекулярных конструкций для осуществления качественных и количественных изменений в экспрессии антигенов клеточной поверхности.
Уровень техники
Антигены клеточной поверхности опосредуют ряд взаимодействий между клетками и их окружающей средой. Эти взаимодействия включают в себя взаимодействие клетка-клетка, взаимодействия клетка-поверхность и взаимодействия клетка-растворенное вещество. Антигены клеточной поверхности опосредуют также внутриклеточную передачу сигнала.
Клетки характеризуются качественными и количественными различиями в экспрессированных антигенах клеточной поверхности. Качественные и количественные различия в экспрессированных антигенах клеточной поверхности изменяют как функцию клетки (способ действия), так и функциональность клетки (оказываемое действие).
Способность осуществлять качественные и/или количественные изменения в антигенах клеточной поверхности, экспрессированных клетками, имеет диагностическую и терапевтическую ценность. Трансгенные и нетрансгенные методы осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой, являются известными.
Окрашивание белка является нетрансгенным методом осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой. Этот метод использует способность ΟΡΙ-связанных белков спонтанно прикрепляться к клеточной мембране через их липидные хвосты. Метод, изложенный в описании, сопровождающем международную патентную заявку № РСТ/И8 98/15124 (\УО 99/05255), включает в себя стадию встраивания ΟΡΙ-связанного белка, выделенного из биологического источника, в мембрану. Выделенные ΟΡΙ-прикрепленные белки указываются как обладающие необычной способностью реинтегрироваться с мембраной поверхности клетки.
Клетки существуют в водной окружающей среде. Клеточная мембрана является липидным бислоем, который служит в качестве полупроницаемого барьера между цитоплазмой клетки и этой водной окружающей средой. Локализацию антигенов на клеточной поверхности можно также достичь посредством применения гликолипидов в качестве «мембранных якорей».
Способ, изложенный в описании, сопровождающем международную патентную заявку № РСТ/ΝΖ 02/00214 (\УО 93/034074), включает в себя стадию встраивания регулируемого количества гликолипида в мембрану. Количество встроенного гликолипида регулируют для обеспечения клеток требуемым уровнем экспрессии антигена.
Способ, изложенный в описании, сопровождающем международную патентную заявку № РСТ/ΝΖ 03/00059 (\УО 93/087346), включает в себя стадию встраивания модифицированного гликолипида в мембрану в качестве «мембранного якоря». Модифицированный гликолипид обеспечивает локализацию антигенов на поверхности клетки или поликлеточной структуры. Тем самым клетке или поликлеточной структуре могут быть приданы новые характеристики.
Эти методы обычно включают в себя выделение гликолипида или связанного с гликолипидом антигена из биологического источника. Выделение гликолипидов или связанных с гликолипидом антигенов из биологических источников является дорогим, изменяемые и поддающиеся выделению количества их часто ограничены. Терапевтическое применение получаемых из зоологических источников реагентов является особенно проблематичным, особенно, когда реагент или его продукты-производные нужно ввести субъекту, являющемуся человеком.
Предпочтительными являются синтетические молекулы, для которых риск загрязнения зоопатогенными агентами может быть исключен. Описаны синтетические аналоги для существующих в природе гликолипидов и синтетических неогликолипидов. Однако синтетический гликолипид, который нужно применять в качестве «мембранного якоря», должен быть способен спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой из водной окружающей среды. Полезность синтетических гликолипидов в диагностических или терапевтических применениях дополнительно ограничивается теми синтетическими гликолипидами, которые могут образовывать раствор в солевом растворе.
Органические растворители и/или поверхностно-активные вещества, применяемые для облегчения растворения гликолипидов в солевом растворе, должны быть биосовместимыми. Растворители и поверхностно-активные вещества часто должны быть исключены или быстро удалены, так как они могут быть вредными для некоторых клеточных мембран. Удаление растворителей или поверхностно-активных веществ из таких препаратов может быть проблематичным.
Повреждение клеточных мембран должно быть исключено, особенно, когда подача клеток или поликлеточных структур ограничена, например эмбрионов, или клетки являются особенно восприимчивыми к нарушению, например гепатоциты.
Здесь существует потребность в водорастворимых синтетических молекулах, которые являются функционально эквивалентными существующим в природе гликолипидам и связанных с гликолипидами
- 1 013183 антигенам в отношении их способности спонтанно и стабильно включаться в липидные бислои, включая клеточные мембраны. Обеспечение такими синтетическими молекулами может устранить ограничения гликолипидов и связанных с гликолипидами антигенов, выделенных из биологических источников, и облегчить их способность осуществлять качественные и/или количественные изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой.
Задачей данного изобретения является обеспечение таких синтетических молекул и метода для их получения. Следующей задачей данного изобретения является предоставление синтетических молекул для применения в диагностических и терапевтических применениях. Предшествующие задачи должны быть истолкованы отдельно от настоящей задачи, чтобы, по меньшей мере, обеспечить общественность полезным выбором.
Сущность изобретения
В первом аспекте изобретение заключается в применении молекулы структуры В-82-Б в качестве синтетического «мембранного якоря» или при получении синтетических молекулярных конструкций, где
В представляет собой химически реакционноспособную функциональную группу;
32 - спейсер, связывающий В с Ь; и
Ь - липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включающих цера мид.
Предпочтительно В выбран из группы, включающей в себя бис-(Ы-гидроксисукцинимидил), бис-(4нитрофенил), бис-(пентафторфенил), бис-(пентахлорфенил).
Предпочтительно 32 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат (Аб)) и -СО(СЩ)3СО-.
Предпочтительно В и 32 являются связанными сложноэфирными связями.
Предпочтительно Ь представляет собой липид, выбранный из группы, включающей в себя диацили диалкилглицеролипиды, включая глицерофосфолипиды. Более предпочтительно Ь выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученного из одной или нескольких транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно Ь выбран из группы, состоящей из 1,2-О-диолеоил-§и-глицеро-3фосфатидилэтаноламина (ΌΟΡΕ), 1,2-О-дистеарил-8и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (Ό8ΡΕ) и рац1,2-диолеоилглицерина (ЭОС).
Предпочтительно Ь представляет собой глицерофосфолипид, и молекула его включает в себя структуру
где η равно 3-5 и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно η равно 3. В конкретных вариантах осуществления молекула имеет структуру
обозначенную Аб-ΌΟΡΕ; структуру
обозначенную δρι-Аб-ЭОРЕ, или структуру
- 2 013183
О о
обозначенную Άά-ΌδΡΕ.
М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να', К+ или ΝΗ4 +.
Во втором аспекте изобретение заключается в синтетической молекулярной конструкции структуры Е-81-82-Ь, где
Е представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина;
δ1-δ2 представляет собой спейсер, связывающий Е с Ь; и
Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды, и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включая церамид.
Предпочтительно молекула является водорастворимой.
Предпочтительно молекула спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор молекулы контактирует с липидным бислоем. Более предпочтительно молекула стабильно включается в липидный бислой.
Предпочтительно Е, δ1, δ2 и Ь ковалентно связаны.
Предпочтительно Е выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов), лецитинов, авидинов и биотина. Наиболее предпочтительно Е выбран из группы, состоящей из существующих в природе и синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).
Предпочтительно Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды. Более предпочтительно Ь выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно Ь выбран из группы, состоящей из 1,2-О-диолеоил-§и-глицеро-3фосфатидилэтаноламина (ΌΟΡΕ), 1,2-О-дистеарил-8и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (ΌδΡΕ) и рац1,2-диолеоилглицерина (ΌΟΟ).
Предпочтительно Ь представляет собой глицерофосфолипид и молекула его включает в себя суб структуру
где η равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно η равно 3.
δ1-δ2 выбран так, чтобы образовывалась водорастворимая синтетическая молекулярная конструк ция.
В первом варианте осуществления Е представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп. Предпочтительно Е представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более единиц сахаров. Более предпочтительно Е представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила олигосахаридов. Более предпочтительно Е выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара
Са1ЫАса1-3(Риса1-2)еа1р; Са1а1-ЗСа(р; Са!р; Са1а1- 3 013183
3(Еиса1-2)(За1р; МеиАса2-36а1р; ЫеиАса2-6(За1р; Еиса1-2Са1р; Са1р14С1сМАср1-6(Са1р1-4С1сМАср1-3)Са1р; Риса1-2Са1р1-461сМАср1-6(Риса120а1р1-461сЫАср1-3)0а1р; Еиса1-2еа1р1-4©1сЫАср1-6(МеиАса2-ЗСа1р14С1сЫАср1-3)Оа1р; МеиАса2-ЗСа1р1-4О1сЫАср1-6(№иАса2-ЗСа1р14С1сЫАср1“3)Са1р; Са1а1-ЗСа1р1-4С1с; Са1МАср1-ЗСа1а1-4Са1р1-4С1с;
Са1МАса1-36а1МАср1-Зеа1а1-4Са1р1-4С1с или еа1МАср1-ЗСа1МАср1-ЗСа1а1
4Са1р1-4С1с.
Когда Р представляет собой гликотоп, Ь представляет собой глицерофосфолипид и 82 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- и
СО(СН20НСО(СН2)5СО-. предпочтительно 81 представляет собой С3-5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила. Более предпочтительно 81 представляет собой 3-аминопропил.
Во втором варианте осуществления Р представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность. Предпочтительно Р представляет собой углевод, белок или липид с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности. Более предпочтительно Р имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах. Еще более предпочтительно Р имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия. Наиболее предпочтительно компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессируемым в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
В третьем варианте осуществления Р представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество. Предпочтительно Р представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно Р представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
В конкретных вариантах осуществления водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру
обозначенную Атр1и-кр-Аб-ООРЕ (I); структуру
обозначенную Атри-кркр1-Аб-ООРЕ (II); структуру
обозначенную Атри-кр-Аб-П8РЕ (III); структуру
- 4 013183
обозначенную Β.,,,,,-φ-Λά-ΟΘΡΕ (VI); структуру
обозначенную ΗτρΗ-8ρ-Αά-ΌΟΡΕ (VII); структуру
обозначенную Нди-8р-Аб-ЭОРЕ (VIII); структуру
обозначенную Οα1β1-δρ-Αά-ΌΟΡΕ (IX); структуру
он обозначенную Еиш. 1-26α1β|-361οΝΑοβ|-36α1β|-461οΝΑο-5ρ-Α6-ΟΟΡΕ (XII); или структуру
обозначенную Ευεα1-2Οα1β1-3(Ευεα1-4)Ο1εΝΑε-δρ-Αά-ΌΟΡΕ (XIII).
М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να', К+ или ΝΗ4 +.
В третьем аспекте изобретение заключается в методе получения синтетической молекулярной кон
- 5 013183 струкции Г-81-82-Ь, включающем в себя стадии:
1) реакцию активатора (А) с липидом (Ь) с образованием активированного липида (А-Ь);
2) дериватизацию антигена (Г) для получения производного антигена (Е-81) и
3) конденсацию А-Ь с Г-81 для получения молекулы; в которой
А представляет собой активатор, выбранный из группы, включающей в себя бис-(Ыгидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис-(пентафторфенил), бис-(пентахлорфениловые) эфиры карбодиовых кислот (С3-С7);
Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды; и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включающих в себя церамид;
Г представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина, и
81-82 представляет собой спейсер, связывающий Г с Ь, где 81 выбран из группы, включающей в себя первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин, и 82 отсутствует или выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат) и -СО(СН2)5СО-.
Предпочтительно молекула является водорастворимой.
Предпочтительно молекула спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор молекулы контактирует с липидным бислоем. Более предпочтительно молекула стабильно включается в липидный бислой.
Предпочтительно Г, 81, 82 и Ь являются ковалентно связанными.
Предпочтительно Г выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов), лецитинов, авидинов и биотина. Наиболее предпочтительно Г выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).
Предпочтительно Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды. Более предпочтительно Ь выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот: транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно Ь выбран из группы, состоящей из 1,2-О-диолеоил-8и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (ΌΟΡΕ), 1,2-О-дистеарил-8и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (Ό8ΡΕ) и рац-1,2диолеоилглицерина (ΌΟΟ).
Предпочтительно Ь представляет собой глицерофосфолипид, и молекула его включает в себя структуру
О О О
X где η равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно η равно 3.
Предпочтительно А(К-82) и 81 выбраны так, чтобы образовывалась водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция.
В первом варианте осуществления Г представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп. Предпочтительно Г представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев сахаров. Более предпочтительно Г представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботераозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила олигосахаридов. Наиболее предпочтительно Г выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара
Са1МАса1-3(Риса1-2)Са1р; Са1а1-36а1р; Оа!р; Са1а1- 6 013183
3(Еиса1-2)Са1р; ΝβιιΑθα2-3Θ3ΐβ; ЫеиАса2-6<За1Р; Еиса1-2Са!р; 6аф1401οΝΑοβ1-6(θ3ΐβ1-4θ!οΝΑοβ1-3)Θ3ΐβ; Ρυοα1-2θ3ΐβ1-4ΘΙοΝΑϋβ1-6(Ρυοα12<3θΙβ1-4(3ΙοΝΑοβ1-3)Θ31β; Ρυοα1-2θ3ΐβ1-4ΘΙοΝΑοβ1-6(ΝβυΑσα2-3Θ3ΐβ14Θ1οΝΑοβ1 -3)ΘβΙβ; МеиАс<х2-ЗОаф1 -4Θ!οΝΑοβ1 -6(МеиАса2-ЗСа1р1 46ΙοΝΑοβ1 -3)Θ3ΐβ; 6а1а1 -36а1р1-4С1с; ΘθΙΝΑοβΙ -ЗСа1а1 -4θ3ΐβ1 -461с; Θ3ΐΝΑθα1-3θ3ΐΝΑοβ1-3Θ3ΐα1-4θ3ΐβ1-4ΘΙο или <39ΐΝΑοβ1-363ΐΝΑοβ1-3Θ8ΐα14<3βΙβ1-4ΘΙβ.
Когда Ρ представляет собой гликотоп, Ь представляет собой глицерофосфолипид и 82 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- (например, А представляет собой бис-(М-гидроксисукцинимидил)адипат), предпочтительно 81 представляет собой С3-5 аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила). Более предпочтительно 81 представляет собой 3-аминопропил.
Во втором варианте осуществления Ρ представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность. Предпочтительно Ρ представляет собой углевод, белок или липид с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности. Более предпочтительно Ρ имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах. Еще более предпочтительно Ρ имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия. Наиболее предпочтительно компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессируемым в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
В третьем варианте осуществления Ρ представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество. Предпочтительно Ρ представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно Ρ представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
В конкретных вариантах осуществления водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру
обозначенную Атри-8р-Аб-ЭОРЕ (I); структуру
обозначенную Атри-8р8р1-Аб-ООРЕ (II); структуру
обозначенную Атри-5р-Аб-П8РЕ (III); структуру
- 7 013183
обозначенную В^-зр-Аё-БОРЕ (VI); структуру
обозначенную Нтри-8р-Аё-БОРЕ (VII); структуру
обозначенную Нди-§р-Аё-БОРЕ (VIII); структуру
обозначенную СафБкр-Аё-БОРЕ (IX); структуру
обозначенную Риса1-2Са1в1-3С1сХАсв1-3Са1в1-4С1сХАс-8р-Аё-БОРЕ (XII); или структуру
обозначенную Риса1-2Са1в1-3(Риса1-4)С1сХАс-8р-Аё-БОРЕ (XIII).
М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να', К+ или ΝΗ4 +.
В четвертом аспекте изобретение относится к водорастворимой синтетической молекулярной кон
- 8 013183 струкции, полученной методом согласно третьему аспекту изобретения.
В пятом аспекте изобретение относится к методу осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессируемых клеточной или поликлеточной структурой, включающему стадию
1) контактирования суспензии клеточной или поликлеточной структуры с синтетической молекулярной конструкцией согласно второму аспекту или четвертому аспекту изобретения в течение времени и при температуре, достаточных для осуществления качественного и/или количественного изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеточной или поликлеточной структурой.
Предпочтительно клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
Предпочтительно концентрация водорастворимой синтетической молекулярной конструкции в суспензии находится в диапазоне 0,1-10 мг/мл.
Предпочтительно температура находится в диапазоне 2-37°С. Более предпочтительно температура находится в диапазоне 2-25°С. Наиболее предпочтительно температура находится в диапазоне 2-4°С.
В первом варианте осуществления клеткой является эритроцит.
В этом варианте осуществления предпочтительно Р выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара
Са1ЫАса1-3(Еиса1-
2)Са1р; Са1а1-ЗСа1р; <3а1₽; Са1а1-3(Риса1-2)Оа1р; ЫеиАса2-36а1р; ΝβυΑοα2· 6<3а1р: Еиса1-20а1Р; Оа1Р1-461сНАсР1-6(Са1р1-4О1сМАср1-3)Оа1Р; Еиса12Оа1р1-4О1сМАср1-6(Еиса1-2<За1р1-4О1сМАср1-3)6а1р; Еиса1-20а1р1-
4ΘΙοΝΑοβ1 -6(МеиАса2-ЗСа1р1 -4ΘΙθΝΑοβ1 -3)<3а1р; МеиАса2-30а^1 40ΙοΝΑθβ1-6(ΝβυΑοα2-3Θ3ΐβ1-40ΙοΝΑοβ1-3)63ΐβ; еа1а1-30аф1-461с;
ΟθΙΝΑοβΙ -ЗСа1а1-40а^1 -4С1с; ΟβΙΝΑοαΙ -3(За1ЫАсР1 -ЗСа1а1 -46аф1-4С1с или Θ3<ΝΑοβ1-3θ3ΐΝΑοβ1-3©3ΐα1-4(33!β1-4ΘΙο.
Предпочтительно синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя
Атри-ар-Ас1-ООРЕ (I); Атри-арар^Аб-ООРЕ (II);
Атри-ар-Ас1-08РЕ (III); Втри-ар-Аб-ООРЕ (VI); Нтри-ар-Аб-ООРЕ (VII); Нди-зр-Ас1ООРЕ (VIII); ΟθΙβ,-δρ-Αά-ΌΟΡΕ (IX); Еиса1-2Са1р1-ЗС1сМАср1-36а1рг 4ΘΙοΝΑο-5ρ-Αύ-ϋΟΡΕ (XII) и Еиса1-2Оа1р1-3(Еиса1-4)С1сЫАс-зр-Аб-ООРЕ (XIII).
Во втором варианте осуществления поликлеточной структурой является эмбрион.
В этом варианте осуществления предпочтительно Р представляет собой молекулу присоединения, где молекула присоединения имеет аффинность в отношении компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.
Компонентом, экспрессируемым на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндотелия, может быть экспрессируемый в природе компонент или экзогенно включаемый компонент.
Предпочтительно синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя
Атри-δρ-Αά-ΟΟΡΕ (I); Атри-8рар1-Ас1-00РЕ (II);
Атри-ар-Аб-05РЕ (III); В1ри-ар-Ас!-ООРЕ (VI); Нтри-ар-Аб-ООРЕ (VII); Нди-ар-Ас1ϋΟΡΕ (VIII); Θθίβρδρ-Αά-ΟΟΡΕ (IX); Ευοα1-2Θ3ΐβ1-36ΙοΝΑοβ1-3ΰθΙβι4ΘΙοΝΑο-5ρ-Α<Ι-ΟΟΡΕ (XII) и Еиса1-26а1р1-3(Еиса1-4)О1сМАс-ар-Ас1-0ОРЕ (XIII).
Третьим вариантом осуществления клетки является эритроцит.
В этом варианте осуществления предпочтительно Р представляет собой лиганд для молекулы связывания, где присутствие молекулы связывания является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно Р представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
В шестом аспекте изобретение заключается в клеточной или поликлеточной структуре, включающей в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию согласно второму или четвертому аспекту изобретения.
Предпочтительно клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
В первом варианте осуществления клеткой является эритроцит, включающий в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя
Атри-5р-Ас1-ООРЕ
- 9 013183 (I) ; А^-зрзрз-АД-БОРЕ (II); Атрй-$р-АД-БЗРЕ (III); Втрй-зр-АД-ООРЕ (VI); Нтрйзр-АД-БОРЕ (VII); Нди-зр-АД-БОРЕ (VIII); <За1р,-зр-АД-ООРЕ (IX); Еиса12Оа1р1-361сИАср1-36а1р|-461сМАс-зр-Ас1-БОРЕ (XII) и Риса1-20а(р13(Еиса1-4)С1сМАс-зр-АД-БОРЕ (XIII).
Во втором варианте осуществления клеткой является эмбрион, включающий в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из
Атри-зр-АД-БОРЕ {)); Атризрзр^АД-ООРЕ (И); Атрй-зр-АД-08РЕ (III); Втри-зр-АД-БОРЕ (VI); Нтрй-зр-АДБОРЕ (VII); Нд„-зр-АД-БОРЕ (VIII); 6а1ргзр-АД-Б0РЕ (IX); Еиса1-26а1₽1ЗБ1сМАср1-ЗСа1рг401сМАс-зр-АД-ООРЕ (XII) и Еиса1-2<За1р1-3(Еиса1-
4)О1сЫАс-8р-АД-БОРЕ (XIII).
В седьмом аспекте изобретение заключается в наборе, включающем в себя высушенный препарат или раствор молекулы согласно первому аспекту изобретения, или высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции согласно второму или четвертому аспекту изобретения.
Предпочтительно молекула согласно первому аспекту изобретения выбрана из группы, состоящей из АД-БОРЕ; хр1-АД-БОРЕ и аД-Б8РЕ.
Предпочтительно водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция согласно второму или четвертому аспекту изобретения выбрана из группы, состоящей из
Атри-зр-АД-БОРЕ (I); АТри-Зрзр1-АД-БОРЕ (II) ; Атри-зр-АД-БЗРЕ (III); Втрй-зр-АД-БОРЕ (VI); Нтрй-зр-АД-БОРЕ (VII); НДЙ- зр-АД-ϋΟΡΕ (VIII); 6а1ргзр-АД-ООРЕ (IX); Еиса1-26а1Р1-3<31сЫАср1-30а!рг
4С1сЫАс-8р-АД-ООРЕ (XI!) и Еиса1-2<За1р1-3(Еиса.1-4)С1сЫАс-зр-Ас1-ООРЕ (XIII).
В восьмом аспекте изобретение заключается в наборе, включающем в себя суспензию в суспендирующем растворе клеток или поликлеточных структур согласно шестому аспекту изобретения.
Предпочтительно суспендирующий раствор, по существу, не содержит липид.
Предпочтительно клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
Предпочтительно клетки являются эритроцитами, которые в природе не экспрессируют А- или Вантиген и включают в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из
Атри-зр-АД-БОРЕ (I); Атри-зрертАД-БОРЕ (II); Атри-зр-АД-БЗРЕ (III) ; ΒηΜ-ερ-Αά-ϋΟΡΕ (VI); Н,рй-5р-АД-БОРЕ (VII); Нди-зр-АД-ООРЕ (VIII);
Са1р,-зр-Ас1-ООРЕ (IX); Еиса1 -2 С а 1р 1 -ЗС1сИАср1 -ЗОа1р|-4О1сМАс-зр-АДϋΟΡΕ (XII) и Еиса1-26а1р1-3(Еиса1-4)С1сМАс-зр-АД-БОРЕ (XIII).
Более предпочтительно клетки являются контролями чувствительности.
В девятом аспекте изобретение заключается в фармацевтическом препарате, включающем в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции согласно второму или пятому аспекту изобретения.
Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.
Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.
В десятом аспекте изобретение заключается в фармацевтическом препарате, включающем в себя клетки или поликлеточные структуры согласно шестому аспекту изобретения.
Предпочтительно клетки или поликлеточные структуры имеют человеческое или мышиное происхождение.
Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.
Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.
Подробное описание
Синтетические молекулярные конструкции изобретения спонтанно и стабильно включаются в липидный бислой, такой как мембрана, когда раствор молекулы контактируют с липидным бислоем. Без намерения быть связанным с теорией считают, что встраивание в мембрану липидных концов липида (Ь) термодинамически является предпочтительным. Считается, что последующее отделение диссоциацией синтетической молекулярной конструкции от липидной мембраны термодинамически не является предпочтительной. Неожиданным образом обнаружено, что синтетические молекулярные конструкции, идентифицированные здесь, являются водорастворимыми.
Синтетические молекулярные конструкции применяют для трансформации клеток, что приводит к
- 10 013183 качественным и/или количественным изменениям в экспрессированных поверхностных антигенах. Должно быть понятно, что трансформация клеток согласно изобретению отличается от трансформации клеток генной инженерией. Изобретение обеспечивает фенотипическую трансформацию клеток без генетической трансформации.
В контексте данного изобретения термин «трансформация» в отношении к клеткам применяют для указания на встраивание или включение в клеточную мембрану экзогенно полученных синтетических молекулярных конструкций, чтобы тем самым осуществить качественные и/или количественные изменения в клеточных поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой.
Синтетические молекулярные конструкции изобретения включают в себя антиген (Р), связанный с липидной частью (или остатком) (Ь) через спейсер (81-82). Синтетические молекулярные конструкции можно получить конденсацией первичного аминоалкильного, вторичного алифатического аминоалкильного или первичного ароматического аминного производного антигена с активированным липидом. Описан обзор методов получения неогликоконъюгатов (Βονίη, N. Вюсйет. 8ое. 8утр., 69, 143-160).
Требуемую фенотипическую трансформацию можно достичь с применением синтетических молекулярных конструкций.
Требуемую фенотипическую трансформацию можно достичь с применением синтетических молекулярных конструкций изобретения одностадийным методом или двухстадийным методом. В одностадийном методе водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция (Р-81-82-Ь) включает в себя поверхностный антиген в качестве Р.
В двухстадийном методе синтетическая молекулярная конструкция (Р-81-82-Ь) включает в себя антиген (Р), который служит в качестве функциональной группы, с которой поверхностный антиген может быть связан после встраивания синтетической молекулярной конструкции в мембрану. Функциональной группой может быть такая группа, как лецитин, авидин или биотин. При применении в двухстадийном методе синтетическая молекулярная конструкция действует в качестве синтетического мембранного якоря.
Согласно изобретению первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин и активатор липида выбирают для обеспечения образования синтетической молекулярной конструкции, которая является водорастворимой и будет спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой, когда раствор синтетической молекулярной конструкции контактирует с липидным бислоем.
В контексте данного изобретения термин «водорастворимый» означает, что образуется стабильная, однофазная система, когда синтетическую молекулярную конструкцию контактируют с водой или солевым раствором (таким как РВ8) в отсутствие органических растворителей или поверхностно-активных веществ, и термин «раствор» имеет соответствующее значение.
В контексте данного изобретения фраза «стабильно включается» означает, что синтетические молекулярные конструкции включаются в липидный бислой или мембрану с минимальным последующим обменом между липидным бислоем или мембраной и водной внешней окружающей средой липидного бислоя или мембраны.
Выбор первичного аминоалкила, вторичного алифатического аминоалкила или первичного ароматического амина и активатора зависит от физико-химических свойств антигена (Р), который нужно связать с липидом (Ь).
Специалисту в данной области должно быть понятно, что для неспецифического взаимодействия, такого как взаимодействие между диацил- или диалкилглицеролипидом и мембраной, структурные изомеры и стереоизомеры существующих в природе липидов могут быть функционально эквивалентными. Например, авторами изобретения предполагается, что фосфатидат (3-фосфат диацилглицерина) может быть заменен 2-фосфатом диацилглицерина. Кроме того, авторами изобретения предполагается, что абсолютная конфигурация фосфатидата может быть либо К-, либо 8-конфигурацией.
Авторы изобретения определили, что для получения синтетических молекулярных конструкций изобретения, в которых антиген (Р) представляет собой олигосахарид, выбранный из группы гликотопов для А-, В- и Н-антигенов групп крови АВО, первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин и активатор должны быть выбраны так, чтобы обеспечить образование альтернативных структур 81-82 для водорастворимой синтетической молекулярной конструкции (Р-81-82-Ь), где Р представляет собой углевод (или другой антиген) с одинаковыми физикохимическими свойствами с углеводной частью А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО, и Ь представляет собой глицерофосфолипид, 81 выбран из -Ο(ΟΗ2)ηΝΗ- и 82 выбран из -О(СН2)ПСО- или -0Ο(ΟΗ2)^ΝΗΟΟ(ΟΗ2)ηΟΟ- (η, т независимо равны 2-5).
Специалисту в данной области должно быть понятно, что после того, как структура спейсера (81-82) определена для данного класса антигенов, такая же структура спейсера может быть принята для получения синтетических молекулярных конструкций других классов антигена с подобными физикохимическими свойствами.
Например, структура спейсера для синтетических молекулярных конструкций (Р-81-82-Ь), где Р представляет собой гликотоп А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО, может быть структурой спейсе- 11 013183 ра, выбранного для получения синтетических молекулярных конструкций других антигенов с физикохимическими свойствами, подобными гликотопам А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО.
В принципе гликотопом широкого диапазона связанных с группой крови гликолипидов или гликопротеинов может быть антиген (Е) синтетической молекулярной конструкции Е-81-82-Ь, где 81-82-Ь является идентичной или эквивалентной соответствующей части синтетических молекулярных конструкций, обозначенных
Атри-8р-Аб-ООРЕ (I); Атри-δρερ,Аб-ООРЕ (II); Атри-зр-Ас1-05РЕ (III); Втри-$р-Ас1-ООРЕ (VI); Нтри-зр-Ас1-00РЕ (VII); Ндн-вр-Аб-ООРЕ (VIII); 6а]рг8р-Аб-ООРЕ(1Х); Риса1-2Са1р1-ЗС1сЫАср1ЗСа1рг4в1сМАс-8р-Ас1-ООРЕ(Х(1) и Гиса1-2Са1р1-3(Риса1-4)О1сМАс-5р-АбΟΟΡΕ(ΧΙΙΙ).
Структуры известных связанных с группой крови гликолипидов и гликопротеинов (см. ссылки) представлены в нижеследующем перечне.
Гликолипиды* (*В общем, почти для всех примеров А-антигенов концевой сахар А ΟαΙΝΑο может быть заменен сахаром В Са1. Кроме того, отсутствие либо А-, либо В-детерминанты создает эквивалентную детерминанту Н).
А-6-1 ба ΙΝΑοαΙ->30а1р1->30ΙοΝΑσβ1->36а1р1->4ΘΙοβ1Сег
А-6-2
Рйса1
А-7-2 (А1еу) <За1ИАса1->3(За1р1->461сМАср1->3(За1р1->4(31ср1-*1Сег
Еиса1 Рйса1
А-7-1 (ΑΙβ6) <За1ЫАса1->ЗСа1р1->ЗО1сЫАср1-+36а1р1-*4©1сР1-*1Сег
Ф Ф
Еиса1 Пгса1
А-7-4
6а(ЫАса1->ЗСа1р1->3(За1МАср'1->ЗОа1а1->4Са1р1-»4в1ср1“>1Сег
Ф
Риса1
А-8-2 <Эа1ИАса1->3©а1р1->4б1сМАср1->3(Эа1р1-»4СЭ1сМАср1->36а1р1->461ср1->1Сег
Я1са1
А-9-3
- 12 013183
А-12-2
Ρϋοαΐ
Ф
Θ3ΐΝΑοα1->3θ3ΐβ1->4ΘΙοΝΑεβ1 θ (За Ιβ1-±4<3 ΙοΝΑοβΙ ->3Θ8ΐβ1->40Ιοβ1->10®Γ
Са1Г4Ас <χ1 ->3ва1р1 ->4С1с ΝΑ=β1 ΐ
Н1са1
Α-14-2
Ηιοαΐ
Са1ЫАса1»ЗСа1Лт4е!сМАс61й °ββΙβ1-Μ<3&>ΝΑοβ1-»3β9ΐβ1-Μ6Ι<;β1-ΗΟθΓ
ΘαΜ\οα1->33αΙβ(-ΜΖ^ΝΑθΒ1->3ΘαΙΒ1~>45ΙοΝΑ£β1 т
Εύοα1
16-2 йюа1
6а№са1-»ЭОД1-МЗД№ср1 $
'ΟιφΊ-ΗΟΗΚΑα !И-»Зваа1-»4вк! НАср1 -*Звв1Ц-*4вЮр-|-»1Свг
Я*са1
Лактоз ил це рам ид
Саф1-ИО1ср1->4Сег
Г ематозид/Смз
МеиАса2->ЗСа1р1->401ср1->1Сег
Лактотриаоэилцерамид (31сМАср1-13Са1р1->4<31ср1-»1Сег
Глоботриаозилцерамид/Р
Са1а1->4<За1р1-,4<Э1ср1->1Сег
Глобозид/Р
ΟθΙΝΑοβΙ—>3<3а1а.1->4Са1р1-14(Э1ср1-И Сег
Параглобозид/неолактотетраозилцерамид
Са1р1-+4С1сНАср1-»313а1р1~>461ср1->1Сег
1.ео-4/лактотетраозил церам ид
Оа1р1 ->3<3ΙοΝΑοβ1 -»3(3θ!β1 ->401ср1 ->1 Сег
- 13 013183
Сиалоилпараглобозид/сиалоилнеолактотетраозилцерамид
(За Ιβ1->3<3!οΝΑοβ1 н>3(3а [β!->4<31с β1->1 Сег
Риса!
(За 431 ->4(31с ΝΑοβ1 ->36а !β1->4<3Ιοβ1->1 Сег 3
Т Риса!
(За Ιβ1-Н01с ΝΑοβ1->ЗСа Ιβ1-ΜΘΙοβ1->1€θ г 2 т
Риса!
Са(р1->ЗС>1с1\1Аср1^3(За1р1->4(31сР1->1Сег ΐ
Риса!
Сиалил
№иАса2-*3(За !β1 ->46!οΝΑοβ1 ->3(3а1р1 —>4<31с β1 ->1 Сег 3 ΐ
Риса!
Сиалил Ье^-б/антиген жулудочно-кишечного рака (С1СА или Са 29-9) №иАса2-»3(За1₽1->3(3ΙοΝΑοβ1->3(3ар1 ^4(3!с β1->1 Сег ΐ
Еиса1
Дисиалоил !_еа-7
- 14 013183
ΝβιιΑ3<χ2 ΐ
63ΐβ1->36ΙοΝΑοβ1^3θ31β1-»4αΐθβ1->1θΘΓ ΐτ
ЫеиАса2 Ейса1 иЛе
Оа1р1 ->3<Э1с ΝΑο β1 ->ЗСа Ιβ1 -э4С1ср1^1 Сег
Риса1 Нюа1
Ьеу-б (Эа Ιβ1 ->461с ΝΑο β1 ->ЗОа101 ->4С1с β1 ->1 Сег ΐΐ
Ейса1 Риса1
Р-подобный
Са1НАср1->ЗСа1р1->4(31сНАср1->36а1р1->461ср1->1Сег
Антиген Форссмана
6а1МАса1-»36а1МАср1->ЗСа1а1->46а1р1->4О(ср1-+1Сег
Эритроцит Саб θ3ΐΝΑοβ1->4Θ3ΐβ1->4ΘΙθΝΑθβ1->3ΘθΙβ1->4β1οβ1->10βΓ
Ψ
ЫеиАса2
Антиген гепатокарциномы Саб
ΟβΙΝΑοβΙ ->46а!р1 ->3 Θ8ΐΝΑοβ1->463|β1-+46Ιοβ1 ->1 Сег
3 т т
ЫеиАса2 №иАса2
Ρι
Оакх1->4(Эа131->4в1сЫАср1->36а1Э1->4в1сР1->1Сег
ЬКЕ/'СЦ 7/88ЕА-4
ЫеиАса2->36а1р1->30а1МАср1->36а1а1->4(Эа131->4С1ср1->1Сег
- 15 013183
В-6-1 ба1а1-»Зба1р1->36!сЦАсР1-»30а1₽1->4в1ср1->1Сег
Еиса1 н-е-4
Оа Ιβ 1 ->3(3а ΙΝΑο β 1 -»3ба1а1 ->4Θθ1β1 ->4Θ1οβ1 ->1 Сег 2 τ
Ейса!
В-6-2 ба кх 1 ->36а1Р 1 ->4С!с ΝΑοβ 1 ->36а1р 1 ->4ΟΙοβ 1 ->1 Сег ΐ
Риса1
В1еь-7
Са1а1->ЗСа1р1->ЗС1сМАср1->ЗСа!р1->431с₽1->1Сег ΐτ
Еиса1Еиса1
В1еу-7
Сакх1->36а1р1-»4С1сМАср1^30а!р1->4С1ср1->1Сег тт
Рйса1 Ейса.1
Антиген ί/лакто-Ы-нор-гексаозилцерамид <3 а I β 1 ->4ΘΙοΝΑοΙβ 1 ->ЗСа1р1 ->4<31сМАср1-тЗСа1р 1 ->4С 1ср 1 -> 1 Сег
Сиалил-нор-гексаозилцерамид/сиалоиллакто-М-нор-гексаозилцерамид
МеиАса2->ЗСа1р1-»4(31сНАс1р1->3(Эа1р1->461сМАср1-»ЗСа1р1->4<31ср1
->1Сег
- 16 013183
Ье*-7
6а1Р1-»4е1с1ЧАс1₽1->30а1р1->361сНАсР1-»ЗСа1р1^4С1с₽1->1Сег
I
Н1Са1
Н-8-3
6а1р1-+зеа1Г1Аса1->зеа1р1-^С!сГ1Ас01->36а!р1-»4е1ср1-+1Сег Т ?
Еиса1 Ейса1
Ье’-а
Са1р1^4е1сМАсР1->Зеа1р1->461сГ4АсР1-»ЗСа1р1-+4С1сР1^1Сег ? ?
Ρίιοαΐ Риса1
1_еь-8
Оа1р1->ЗСкЬ1Аср1->3<Эа1р1-»ЗС1с1ЧАср1->3(За1р1->4С(сР'!-»1Сег т т
РисоИ Гиса1
Ье*-11 β3ΐρΐ->3ΘΙοΝΑι:β1->·3α0ΐβ1-4·3Θ[οΝΑοβ1-»·3β8ΐβ1^·3Ο6ΝΑοβ1-+3(33ΐβ1->46Ιοβ1-+1ΟβΓ
4 4 т т т
Риса1 Н1са1 Еиса1
В-8-2
Θ8ΐα1-»·3Θ3ΐβ1->461οΝΑββ1->3Θ3ΐβ1->46ΙοΝΑοβ1-»·3Θ3ΐβ1->4ΘΙοβ1->10θΓ I
1=иса1
Антиген I (Эа1₽1-»461с№с₽1 е θ3ΐβ1_>43ΙοΝΑββ1-^3Θ3ΐβ1->43Ιθβ1->10θΐ θ8ΐβ1->4ΘΙοΝΑοβ1 3
1_ес-9 (фукозилированная главная цепь)
- 17 013183
Оа1р1->ЗО1сЫАор1 6 30а!р1 ->ЗО 1с ΝΑε β1 ->ЗОа1р1 ->4О!с β1—>1 Сег Оа1р1->4<31сИАср1
Т
ЕЬса!
1.ес-9 (фукозилированная боковая цепь)
Ευοαΐ ф
<33ΐβ1->4ΘΙοΝΑοβ1θ
Оа1р1 ->3(31с№зр1->ЗОа1р1 -ИС1с р1 -> 1 Сег <38ΐρΐ->3ΘΙοΝΑοβ13 νΐΜ-2 (□а1₽1->4С1сМАс₽1->ЗОа1Р1-»4в1сМАор1-»ЗСа!р1->4С1сЫАс₽1-иЗСа1₽1-М01с₽1-»1Сег
3 т г
ЫеиАса2 Еиса1
Антиген эритроцита ΡΙ
Ниса1 г
Θ3ΐβ1->40!οΝΑοβ1 θ
Оа1р1->4ΘΙοΝΑοβ1 ^ЗСа Ιβ·1^4Θ[οβ1-±1 Сег θ8ΐβ1->4ΘΙοΝΑοβ1 3 ΐ
ΝβυΑρα2 еа1Э1-^1с№зр1->Зеа|₽1-^В1сЫМ1^зеа1р1~>4в1оНАср1->Зва₽1->4(31сР1-»1Сег - з т
Αιβα1
Т Нюа!
Т А1са1
- 18 013183
В-12-2
Я|С<х1
Оа1а1 —>ЗСа1р1->4(31сМАср1 θ Са£1-МС1сЫАс|М->ЗСа1Э1-»4е1ср1-+1Сег
СаЫ —>3<3а|р1—>4б1сИАср13 т
Πιοαί
В-14-2
Риса1
6акП->36ар1^4ИсЫАс₽1 в (За1₽1->4С1сМйс₽1-+36а1В1-»4(31срИ-1Сег
ВаЫ-*ЗВа1р1->461сНпср1-*36аа1-*46!сКАср1 3
Т
Ηιοαΐ
В-16-2
Н1са1 ваШ->31Эаа1-М<а:№:р1 θ 6а|01^(^Н4сС1-»Зее1|)1“*4<Э1сКА5Р1-»Зеа|р1-->4в1ср1-,1Сег ваЫ-,5Оа1р1-иЮ1сНАс₽1-»36аР1-Ив)с№сД13
Ηκαϊ
Ι-Активный полигликозилцерамид θ!β-46οΝβ-6 ΘΙβ-~4θσΝβ-6 <Э1р-4<ЭсМр~5
3ΐρ-40εΝβ-3<^β-4ΘοΝβ-33Ιβ-40θΝβ-35Ιβ-4βσΝβ-36ΙΜ|3<:Νβ-3Θ1β-4ΰοΝβ-3β1β-4ΘοΡ-10βι
О-Связанные гликопротеины
Са^1-»Зеа1ИАса1-»ЗвгЛГ1Г
ЫеиАса2
Дисиалотетрасахарид
Са^1 -»36а1ЫАса1 -ЭЗагЛНг
X I
ΝβυΑθα2 №иАса2
Олигосахарид с дисиалоильной группой ΝθΐΐΑϊα2->8ΝβιιΑϊα2 т
Оа1р1->36а ΙΝΑοα1->&ιίΤΐΓ
ЫеиАса2->8МеиАза2
Н-Активный трисахарид
Са Ιβ 1 —>30а ΙΝΑοαΙ ->3βγ/ΊΓιγ
ГЪса1
Сиалилированный Н-активный тетрасахарид
Оа1р1 ->30а11МАса1 —>£&гЛЬг
6
Пзса1 ΝβυΑοα2
Олигосахарид Саб
Оа1Маср1->4Са1р1->ЗСа_1ЫАса1н>&пТ11г
ИеиАса2
X
ИеиАса2
Олигосахарид ΟΙοΝΛο
- 19 013183
ΝβυΑοα2 ΐ
6а Ιβ1 ->36а ΙΝΑοαΙ ->8агЛ1йг
6а1р1->461сЫАс₽1
Олигосахарид муцина/А-активный гликопротеин
Рйса1 т 2 6а ΙΝΑοαΙ->36а131->36а^1Аса1->5&|Лпг
4.
63ΐβ1->4ΘΙθΝΑοβ1
А-активный гликопротеин-6а кисты яичника
ΘθΙΝΑοαΙ ^36а1₽1-»361с ΝΑο 31->ЗеаЧ31->36а1Ыаса1-Э&Л1Г т Πιοα1
А-активный гликопротеин-6Ь кисты яичника <Эа1ИАса1 ->3<3а1р1 ->46ΙοΝΑοβ1 —>30а1р1 ->36а1Ыаса1 ~>&О1Г 2 т
Риса!
Ьеа-активный гликопротеин-7 кисты яичника
Είιοαΐ ΐ
6а Ιβ1 ->36!с ΝΑοβ 1 ->36а Ιβ 1 ->461с ЫАс β 1 т 6аф1 ~>36а ΙΙ^οαΙ ->3βιΗϊιγ
Ьеа-активный гликопротеин-10 кисты яичника
ΡΙιοαΙ
4.
68ΐβ1^·36ΙοΝΑοβ1->3Θ3ΐβ1->46ΙοΝΑοβ1
Т 6а1р1“>361с1№ф1->36а1р1-+36а11&са1->Зэ|7К1г ί
Нюа1
А-активный гликопротеин-18 кисты яичника
Рйса1 Рйса.1
I ΐ Оа1МАса1->ЗОа1р1-+4в1сМАс₽1 ΟθΙβΙ-^ΟΙοΝΑεβί т 4 θ 6 (За Ιβ1 ->3ΘΙα ΝΑοβ 1 ->40а1Р 1 ->3ΘΙοΝΑοβ1 ->3(3а Ιβ1 ->ЗОа!МАса1-+ЭэгГ11Г
ΘθΙΝΑοαΙ->3<3^Ιβ1ΝΑοβ 1 ΐ ΐ Еиса1 Н1са1
Ν-связанные гликопротеины
Тип комплекса/стабильная к щелочи цепь
ИеиАса2
X
Оа Ιβ 1—>461с ΝΑο β 1->2Ма ηαΐ '«Ь _ ΘΙοΝΑϋβΙ—>4Μ3ηβ1->4ΘΙοΝΑοβ1—>461οΝΑοβ1—>Αΐη
6а1р1-+461сМАсР1->2Мапа1 ΐ
ΝβΐίΑοα2
Риса1 _6
- 20 013183
Гибридный тип
Мапа1 % чгч.
Мапа1 МапВ1->4<3ΙοΝΑοβ1->4<3ΙοΝΑοβ1-->Азп <Эа1р1~»4О1сМАс₽1->2Мапа1
Гликопротеин Тамма-Хорсфалла
Тип с высоким содержанием манноза
Мапа1->2Мапа1 ’Ч
Мала!
Ζ»
Мапа1->2Мапа1 '6
Ма пр1->4О1с ΝΑο βΐ —>4О1с ΝΑο β1->Αεη ζ3
Мапа1 ->2Ма гкх1 ->2Ма ηα1
Дисиалилфоетальный антиген эритроцита
ЫАаЗ
ΟΙβ4ΘοΝβ3(ΟΙβ4ΘοΝβ3)<ΟΙβ4ΘοΝβ2Μα6
Сс Νβ4Μβ4<3οΝβ4<3οΝβΑδη т <·>Ιβ4ΘθΝβ3ΘΙβ4(3θΝβ2Μα3
ΝΑα6
Трисиалоилфоетальный антиген эритроцита (дисиалоильная группа на разветвлении)
ΝΑα6ΝΑα3
X ΟΙβ40ο Νβ3(0 Ιβ4Οθ Νβ3)4ΟΙβ4Οο Νβ2Μα6
X
Ос Νβ4Μβ40ο Νβ4ΟοΝβΑεη ΐ ^Ιβ4ΟοΝβ3Ο!β4Θο Νβ2Μα3
ΝΑα.6
Монофукозилмоносиалилфоетальный антиген эритроцита (фукозилированная главная цепь) ΝΑα3 ф
ΘΙβ40θ Νβ3(<3Ιβ4Θο Νβ3)4ΟΙβ40οΝβ2Μα6
X
Ос Νβ4Μβ40οΝβ40ο ΝβΑεη
Ф ^ίβ4Οο Νβ3ΘΙβ46ο Νβ2Μα3
Ρα2
- 21 013183
Монофукозилмоносиалилфоетальный антиген эритроцита (дисиалильная группа на разветвлении) Еа2
ΘΙβ46οΝβ3(ΟΙβ4ΘοΝβ3)4Θ!β4<3οΝβ2Μα6
ΘοΝβ4Μβ4<3οΝβ4ΘοΝβΑ5Π
Т ^Ιβ46οΝβ3<31β40οΝβ2Μα3 ΝΑα6
Монофукозилдисиалилфоетальный антиген эритроцита (дисиалильная группа на разветвлении) ΝΑα6ΝΑα3
ΘΙβ4βοΝβ3(Θίβ4ΘοΝβ3)4<31β4ΘοΝβ2Μα6 ч/
Ос Νβ4Μβ4Οο Νβ40ο ΝβΑδη ΐ
^Ιβ4ΟοΝβ361β46ο Νβ2Μα3
Εά2
Дифукозилфоетальный антиген эритроцита
Ρα2
Φ
ΟΙβ4(3οΝβ3(αΐβ4ΘοΝβ3)46Ιβ4ΘοΝβ2Μα6
Φ
Θο Νβ4Μβ4Θο Νβ4<3ο ΝβΑίη
Τ ^Ιβ4ΘοΝβ3<3Ιβ4<3θΝβ2Μα3
Ρα2
Фоетальлактозаминогликан (ΘΙοΝΑΰβΙ—>3<3а1р1—Μ/6ΙθΝΑθβ1->2Μ8ηα1
Ь β
Саф1—>4Θ!οΝΑςβ1—>4Мапр1—ΜΘΙοΝΑοβΙ—>40ΙοΝΑοβ1->Α3η ?
Сар1->4<31сГ4Азр1-Э-3<За1р1^4С1сНАср1->2Мапа1
Лактозаминогликан зрелой клетки <3Ιβ4<3θΝβ6 С134СсЩб 6Ιβ4ΟθΝβ6 (3Ιβ4(3οΝβ3)ΌΙβ4(θεΝβ3δ!β4)2ΟοΝβ3<5ΐβ4θΕΝβ3ΘΙβ40ο^3^Ιβ4ΐ3οΙφ3(3Ιβ4(3ο^2Μα6
ΟΙβ4ΘοΝβ4ΜΜ6οΝβ46οΝβΑ3π ΐ
ΟΙβ40θΝβ30Ιβ46θΝβ3ψ|β4θ6Νβ301β40οΝβ2Μα3
ΟοΝβ6 ΟοΝβδ ΐ τ ΟΙβ461β4
Монофукозилмоносиалоильный антиген зрелого эритроцита
ΟΙβ4(3οΝβ6 ©Ιβ40εΝβ6 Οφ40οΝββ (<3Ρ4<3οΝβ3/αρ4(<3ε Νβ33!β4)Ι(3ο Μβ36Ιβ4δθΝβ3(3Ιβ4βθΗβ36[β40ο Νβ3Θϊβ4Οο Νβ2Μα6Ρ»6
44* βΙβ40οΝβ4Μβ4®οΝβ4(3ΰίφΑ3η ^Ιβ4θοΝβ3εΐβ40σΝβ3^1β4<3ΕΝβ36Ιβ42θΝβ2Μα3 ΝΜ3 ΟοΝβ6 6σΝβ6 ? Τ ΟΙβ4<31β4
Монофукозилмоносиалоильный антиген зрелого эритроцита
ΘΙβ4<3οΝβ6 (31β4<3 <31β4ΘοΝβ6 (0[₽4СсМЭЗГб1₽4(ОсН₽ЗО1р4^с Ιβ40οΝβ30Ιβ4<3οΜβ3<^1β40οΝβ301β40οΝβ2Μα^ Ρα6 6(β46οΝβ4Μβ40βΝβ46οΝβΑ3ΐ ^β43σΝβ30Ιβ46οΝβ3^Ιβ40οΝβ36Ιβ46ο Νβ2Μα3 ΝΑχ6 &Νβ6 ΟοΝβδ <3!β! 0!β4
- 22 013183
Дифукозильный антиген зрелого эритроцита θφ46οΝββ ΘΙβ4€εΝβ6 61β46οΝβδ (Θ₽40οΝβ3ί6Ιβ4(βοΝβ301β4ίβοΝβ351β40οΝβ30Ιβ40σ^3(Ιΐβ46οΝβ30Ιβ4<ϊοΝβ2Μα^ Е=ст6 <31{МСсЧ34МВ4СсЧ34СэсЩАзп ^1β48οΝβ3^Ιβ4<3οΝβ3ψ]β40οΝβ3ΘΙβ46οΝβ2Μα3
Γα2 ΟοΝβΒ ΘοΝβθ ΐ ΐ (31β4 <31(34
Ключ: 61 = ϋ-ба!, 6с = Ό-ΟΙο, 6οΝ = ϋ-ΘΙοΝΑο, Μ = ϋ-Мап, Ε = Ь-Еис, ΝΑ = ΝθιιΑο.
Специалисту должно быть понятно, что синтетические молекулярные конструкции (Р-81-82-Ь) изобретения, где Р представляет собой олигосахарид, можно применять в качестве «синтетических гликолипидов» и замещений для гликолипидов, полученных из биологических (ботанических и зоологических) источников.
В контексте данного изобретения термин «гликолипид» означает липид, содержащий углевод амфипатического характера, включающий в себя гликозилированные глицеролипиды, такие как гликозилированные фосфоглицериды и гликозилглицериды; гликозилированные сфинголипиды (нейтральные гликолипиды), такие как гликозилцерамиды или цереброзиды; и ганглиозиды (кислотные гликолипиды).
В контексте данного изобретения фраза «связанный с гликолипидом антиген» означает липид, содержащий углевод, в котором антиген (например, белок) связан с гликолипидом через углеводную часть молекулы. Примеры связанных с гликолипидом антигенов включают в себя СР1-связанные белки.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что гликолипид сам является антигеном. Термин и фраза «гликолипид» и «связанный с гликолипидом антиген» применяют для проведения различия между существующими в природе молекулами, у которых антигеном является гликолипид, и существующими в природе молекулами, у которых антиген связан с гликолипидом через углеводную часть гликолипида. По аналогии синтетические молекулярные конструкции изобретения могут быть описаны в качестве как «синтетических гликолипидов», так и синтетических мембранных якорей до степени, при которой антигеном может быть синтетический гликолипид рег ке или антиген присоединен к синтетическому гликолипиду.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что углеводная часть гликолипида может быть модифицирована и связана с другими антигенами методами, изложенными в описании, сопровождающим международную патентную заявку № РСТ/ΝΖ 2003/00059 (опубликована как \УО 03087346).
В контексте данного описания изобретения термин «гликотоп» применяют для обозначения антигенной детерминанты, расположенной на углеводной части гликолипида. Классификация гликолипидных антигенов в серологии групп крови основана на структуре углеводной части гликолипида.
В серологии групп крови известно, что концевыми сахарами гликотопов А-антигенов являются СаШАса1-3(Риса1-2)Са1р и концевыми сахарами гликотопов В-антигенов являются Са1а1-3(Риса12)6;·ι1β. Включение в мембрану ВВС водорастворимых синтетических молекулярных конструкций изобретения, в которых Р представляет собой 6аШАса1-3(Риса1-2)6а1в или Са1а1-3(Риса1-2)6а1в, дает ВВС, которые являются серологически эквивалентными А-антигену или В-антигену, экспрессируемому ВВС, соответственно.
Концевые три сахара углеводной части присутствующего в природе А- или В-антигена являются детерминантой определения групп крови А и В. Концевые четыре или пять сахаров углеводной части присутствующего в природе А- или В-антигена являются детерминантой подгрупп крови А типа 1 А и типа 2 А и т.д. Соответственно этому, ВВС, включающие синтетические молекулярные конструкции изобретения, можно применять для характеризации и проведения различий между реагентами типирования крови (антителами) различной специфичности.
Водорастворимые синтетические молекулярные конструкции изобретения, которые исключают углеводную часть, рассматриваются изобретением. Антигены, другие, чем углеводы или олигосахариды, но со сходными физико-химическими свойствами, могут заменять Р в описанных «синтетических гликолипидах».
Синтетические молекулярные конструкции изобретения, которые включают в себя антиген Р с физико-химическими свойствами, отличными от физико-химических свойств углеводов или олигосахаридов, также рассматриваются авторами изобретения. Водорастворимые синтетические молекулярные конструкции, включающие в себя эти антигены, можно получить выбором разных спейсеров.
Преимущества, обеспечиваемые синтетическими молекулярными конструкциями данного изобретения, будут повышаться при применении на практике изобретений, изложенных в описаниях международных патентных заявок №№ РСТ/ΝΖ 02/00212 (опубликована как \УО 03/034074) и РСТ/ΝΖ 03/00059 (опубликована как XVО 03087346). Описания, сопровождающие эти заявки, включены здесь в качестве ссылки.
Синтетические молекулярные конструкции преодолевают многие из ограничений применяемых
- 23 013183 природных гликолипидов на практике этих изобретений. Конкретным преимуществом синтетических молекулярных конструкций является их превосходящая активность и способности быть пригодными для применения при трансформации клеток при пониженных температурах, например 4°С.
Как описано здесь, не все структуры спейсера (81-82) могут обеспечивать получение синтетической молекулярной конструкции (Е-81-82-Ь), которая является водорастворимой и спонтанно и стабильно включается в липидный бислой, такой как клеточная мембрана. Обнаружено, что синтетические молекулярные конструкции, обозначенные Л|р[|-5р-липид (IV) и Л.|р[|-РАА-ООРЕ (V), не являются водорастворимыми и/или не способны спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой, такой как клеточная мембрана.
обозначенная А^-зр-липид (IV).
обозначенная Л.Г|)[|-РАА-ООРЕ (V), где х, у = 0,05-0,2.
Изобретение теперь будет иллюстрировано ссылкой на нижеследующие неограничивающие примеры и фигуры прилагаемых графических материалов.
На фиг. 1 показаны результаты анализа Ωίαιηοά сохраняемых в Се11йаЬ™ клеток, трансформированных раствором природного гликолипида А для трансформации (Ъ к К.) при 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2 мг/мл, 2 мг/мл* и 1 мг/мл. Применяемыми антисыворотками являются албаклон (верх) и биоклон (низ). (* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не промывали после инкубации, его оставляли на ночь и промывали на следующий день (день 2)).
На фиг. 2 показаны результаты анализа И1атеб сохраняемых в Се11з1аЬ™ клеток, трансформированных раствором природного гликолипида В для трансформации (Ь к К) при 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2 мг/мл, 2 мг/мл* и 1 мг/мл. Применяемыми антисыворотками являются албаклон (верх) и биоклон (низ). (* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не промывали после инкубации, его оставляли на ночь и промывали на следующий день (день 2)).
На фиг. 3 показан анализ ЕАС8 после трансформации ίη νίίτο Ье(а-Ь)-эритроцитов человека природным ЬеЬ-6-гликолипидом на протяжении времени при трех температурах трансформации, 37°С (верх), 22°С (середина) и 4°С (низ).
На фиг. 4 показаны результаты анализа И1атеб клеток, трансформированных при 4°С раствором для трансформации Л.г|)[|-5р-Аб-ООРЕ (I) (Ь к К (слева направо)): промытые, 0,08 мг/мл; не промытые, 0,08 мг/мл; промытые, 0,05 мг/мл; не промытые, 0,05 мг/мл; промытые, 0,03 мг/мл и не промытые, 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-А.
На фиг. 5 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты И1атеб анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации Л.|р[|-5р-Аб-ООРЕ (I) (Ь к К): 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-А.
На фиг. 6 в левом столбце показаны результаты И1атеб анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации В.|р[|-5р-Аб-ООРЕ (VI) (Ь к К): промытые, 0,6 мг/мл; не промытые, 0,6
- 24 013183 мг/мл; промытые, 0,3 мг/мл; не промытые, 0,3 мг/мл; промытые, 0,15 мг/мл и не промытые, 0,15 мг/мл; в правом столбце показаны результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации Втри-кр-Аё-БОРЕ (VI) (Ь к В): промытые, 0,08 мг/мл; не промытые, 0,08 мг/мл; промытые, 0,05 мг/мл; не промытые 0,05 мг/мл; промытые, 0,03 мг/мл и не промытые, 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-В.
На фиг. 7 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации В.|р[|-кр-Аё-ООРЕ (VI) (Ь к В): 0,6, 0,3 и 0,15 мг/мл.
На фиг. 8 показаны результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией Лт|)[|-5р-Аё-ООРЕ (I) и В|р[|-кр-Аё-ООРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ь к В) содержат клетки, промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-Л и анти-В. Лунки 3 и 4 (Ь к В) содержат клетки, не промытые Л 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 9 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией А^кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|-крАё-ЭОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 10 показаны результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией Атри-кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|-кр-Аё-ООРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ъ к В) содержат клетки, промытые А 0,07 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 11 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией А^кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|кр-Аё-БОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 12 показаны результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией Атри-кр-Аё-БОРЕ (I) и Втри-кр-Аё-БОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ъ к В) содержат клетки, промытые А 0,06 А + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 13 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией А^кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|кр-Аё-БОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 14 показаны результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией А^кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|-кр-Аё-ООРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ъ к В) содержат клетки, промытые А 0,06 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 15 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией А^кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|кр-Аё-БОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 16 показаны результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией Атри-кр-Аё-БОРЕ (I) и Втри-кр-Аё-БОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ъ к В) содержат клетки, промытые А 0,05 А + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 17 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией Атри-кр-Аё-БОРЕ (I) и Втрикр-Аё-БОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 18 показаны результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией А^кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|-кр-Аё-ООРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ъ к В) содержат клетки, промытые А 0,05 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (Ь ΐο В) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фиг. 19 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Б1атеё анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией А^кр-Аё-БОРЕ (I) и В.|р[|кр-Аё-БОРЕ (VI). Лунки 1 и 2 (Ь к В) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
Сравнительные примеры.
Сравнительные примеры не образуют часть заявленного изобретения. Сравнительные примеры описывают трансформацию эритроцитов природными гликолипидами.
- 25 013183
Сравнительный пример 1. Получение природных гликолипидов.
Очистка ВЭЖХ.
В первой стадии колонки заполняли сухим диоксидом кремния (15-25 мкм) перед каждым опытом. Можно применять относительно нечистые образцы при анализе ВЭЖХ, поскольку диоксид кремния можно разгрузить вместе с теоретически высоким уровнем необратимо связанных загрязняющих примесей.
Гликолипиды разделяли на силикагеле с подвижной фазой повышенной пористости. Программой был линейный градиент, начинающийся 100% смесью 80:20:1 (об./об.) хлороформ-метанол-вода и кончающийся 100% смесью 40:40:12 (об./об.) хлороформ-метанол-вода.
Применяемым оборудованием ВЭЖХ была система ЗЫтабги, способная перекачивать и смешивать четыре отдельных растворителя при программированных отношениях. Поскольку хлороформ, метанол и вода испаряются с разными скоростями, была разработана программа, при помощи которой компоненты растворителя не смешивали перед подачей для ВЭЖХ.
Четыре разные жидкости для ВЭЖХ ЗЫтабки смешивали быстрым отбором «выстрелом» их по очереди из каждой из четырех бутылей. «Выстрелы» хлороформа и воды непосредственно друг за другом в линиях могут вызвать проблемы смешиваемости. Метанол был «прослойкой» между этими двумя несмешиваемыми компонентами. Кроме того, воду предварительно смешивали с метанолом в отношении 1:1 для дополнительного предотвращения появления проблем со смешиваемостью.
Сравнительный пример 2. Трансформация эритроцитов природными гликолипидами. Агглютинация.
Трансформацию эритроцитов определяли агглютинацией с применением системы микротипирования Όίαιηοά-ΙΌ помимо применения общепринятой пробирочной серологии. Карты типирования Э1атеб АВО не применяли. Применяемыми картами были содержащие Ν;·ιί.Ί. ферментную пробу и не содержащие радиоактивное вещество карты агглютинина, которые предварительно не загружали какой-либо антисывороткой или другими реагентами. Это позволяет применять специфические антисыворотки в обеих методологиях.
Таблица 1 Гель-карты
Изготовитель Каталог геГ
Э|атес1 Содержащие ЫаС1, ферментную пробу и не содержащие радиоактивное вещество карты агглютинина
Сравнительное испытание проводили между пробирочной серологией и системой Э|атеб для установления эффективности двух систем. Клетки трансформировали при 25°С в течение 4 ч. Для измерения эквивалентности примеряли анти-А-сыворотки сераклон и альбаклон. Результаты показаны в приведенной ниже табл. 3.
Таблица 2 Антисыворотки, применяемые при сравнении пробирочной серологии с системой Э1атеб
Изготовитель Каталог геТ Партия Дата окончания
Албаклон, 5ΝΒΤ8 Анти-А Ζ0010770 12.12.04
Сераклон, Βΐοΐββΐ 801320100 1310401 12.04.03
Таблица 3 Результаты агглютинации, сравнивающие пробирочную серотологию с системой Эгатеб
| Гликолипид А (мг/мл) | ||||||
| 10 | 5 | 2 | 1 | 0 | ||
| Пробирка | Албаклон | 3+ | 2+ | 0 | 0 | 0 |
| Сераклон | 3+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | |
| О|атеб | Албаклон | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 |
| Сераклон | 3+ | 2+ | 1 + | 0 |
В этом эксперименте доказали, что система Э|ашеб является более чувствительной к более слабым реакциям, чем пробирочная серотология с сераклоном анти-А, но не с албаклоном. Эти реагенты изготовляют различно и, таким образом, не предполагается, что они выполняют анализ идентично. Однако тот факт, что комбинация пробирочной серотологии с сераклоном анти-А не давала положительный результат, вероятно, является результатом интерпретации оператора. Более слабые реакции заведомо трудно оценить в баллах и разница между 1+ и 0 может быть трудно различимой в пробирках.
- 26 013183
Оптимизация.
Изучали влияние изменения концентрации гликолипидов, температуры инкубации, продолжительности инкубации, разбавителя и раствора для хранения на жизнеспособность клеток. Эффективность и стабильность трансформации определяли агглютинацией соответствующим антителом.
Таблица 4 Определяемая пробирочной серологией агглютинация клеток, трансформированных природным гликолипидом А на протяжении различного времени и при разных температурах
| 10 | 5 | 2 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 0,0001 | 0 | |
| Сераклон (37°С в | 3+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | |||
| течение 1,5 часа) Сераклон (25°С в течение 4 часов) | 4+ | 3+ | 2+ | 1 + | νν+ | 0 | 0 0 | 0 |
Концентрация гликолипида.
Эксперименты с начальной трансформацией проводили с очень очищенным (ВЭЖХ) образцом Ьеьгликолипида и менее чистым образцом гликолипида группы крови А. Трансформацию проводили при 37°С в течение 2,5 ч.
Образец гликолипида А содержал другие липидные примеси и, таким образом, сравнительно меньше молекул группы крови А по массе, чем образец Ьеь-гликолипида эквивалентной концентрации (мас./об.). По-видимому это подтверждается фактом, что более высокие концентрации гликолипида А, чем Ьеь-гликолипида, требовались для получения эквивалентной оценки агглютинации в баллах (см. табл. 6).
Уровень примеси в образце гликолипида А может также способствовать более низкой стабильности на протяжении периода 62 дней - А-трансформированные клетки «умирали» при самой высокой концентрации (получившие самую высокую дозу примеси).
Таблица 5
Анти-А и анти-Ьеь, применяемые при начальном тестировании трансформации природным гликолипидом
| Изготовитель | Каталог геТ | Номер партии | Дата окончания |
| Αη(ϊ-Α | |||
| Зегас!опе, Βίοίβδί | 801320100 | 1310401 | 12.04.03 |
| Апй-1_еь | |||
| СЗЬ | 12801 |
Таблица 6 Стабильность ВВС, трансформированных природным гликолипидом А и Ьеь, оцениваемая агглютинацией пробирочной серологией на протяжении периода 62 дней
| Гликолипи д (мг/мл) | 1_ев | А | ||||
| День 1 | День 25 | День 62 | День 1 | День 25 | День 62 | |
| 10 5 2 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0 | 4+ 4+ 3+ 4+ 3+ 2+ 2+ 2+ 0 | 2+ 2+ 2+ 0 0 | 2-3+ 2-3+ 1-2+ 2+ 0 0 0 0 0 | 3+ 2+ 0 0 0 0 0 0 0 | 2+ 2+ 1 + 1 + О | ? νν+ 0 0 0 |
Указанные выше клетки оценивали также для гемолиза и эти результаты приводятся ниже в табл. 7.
- 27 013183
Таблица 7 Гемолиз, подсчитываемый визуально
День 1 - в супернатанте первого промывания после трансформации; дни 25 и 62 - в растворе консервации клеток перед тем, как клетки ресуспендируют после хранения. Шкала подсчета в баллах аналогична шкале агглютинации от 4+ до 0; 11111111 - сильно гемолизованные, ййй - очень гемолизованные, Ей умеренно гемолизованные, й - среднегемолизованные, те - слабогемолизованные и 0 - гемолиз не виден.
| Концентрация гликолипида (мг/мл) | Гемолиз 1_еь А День 1 День 25 День 62 День 1 День 25 День 62 | |||||
| 10 5 2 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 Контроль | й Ий VI VI й | 0 0 0 0 0 | й ййй ййй ййй И йй й й й | й VI VI й й | й 0 0 0 й | погибли йй ййййй йййй ййй |
Можно обнаружить, что эти результаты показывают, что гемолиз клеток ассоциирован с трансформацией с высокими концентрациями гликолипида. Не ясно, является ли лежащим в основе этого механизма разрыв мембраны плазмы большими количествами встраиваемого гликолипида, скорость такого встраивания или это, возможно, обусловлено количеством ассоциированных примесей. Однако оказалось, что результаты для Ьеь на день 62 поддерживают первое объяснение.
Образец Ьеь был очень очищенным перед растворением, он был порошком чистого белого цвета и поэтому маловероятно, что гемолиз был обусловлен вредным влиянием примесей. Из данных ясно видно, что на день 62 степень имеющего место гемолиза уменьшается в соответствии со снижением концентрации гликолипида.
Температура инкубации.
Эксперименты проводили для исследования возможных механизмов снижения гемолиза КБ С во время стадии встраивания. Предыдущие эксперименты показали, что гемолиз снижался при более высоких концентрациях гликолипида, чем при более низких концентрациях, и, считается, что гемолиз может быть также связан со скоростью встраивания гликолипида. Поскольку считается, что температура влияет на скорость встраивания, эксперименты проводили для сравнения трансформации при 37°С с трансформацией при комнатной температуре (к.т.; 25°С).
Поскольку предполагается, что скорость снижается, когда снижается температура, период инкубации для эксперимента при к.т. был 4 ч. Гемолиз оценивали визуально и считали в баллах после встраивания. Тесты серологии также проводили на клетках. Результаты показаны в табл. 8.
Таблица 8 Влияние температуры инкубации на гемолиз и агглютинацию во время встраивания гликолипидов в мембраны КВС. Гемолиз оценивали в баллах визуально при каждой из трех промывок
| Гликолипид (мг/мл) | Гемолиз | Серология | ||||||
| К.т. | 37°С | К.т. | 37°С | |||||
| Промыв 1 | Промыв 2 | Промыв 3 | Промыв 1 | Промыв 2 | Промыв 3 | |||
| 10 | VI | 0 | 0 | йй | νν | 0 | 2+ | 2+ |
| 1 | № | 0 | 0 | йй | й | ννι | 1 + |
Продолжительность промывки.
Инкубацию при 37°С проводили в течение 1 и 2 ч и ее влияние на гибель и трансформацию клеток оценивали агглютинацией подходящим антителом.
- 28 013183
Таблица 9
Антисыворотки, применяемые при различных продолжительностях опытов инкубации
| Изготовитель | Каталог геГ | Номер партии | Дата окончания |
| Албаклон, 8ΝΒΤ8 | Анти-А | Ζ0010770 | 12.12.04 |
| Биоклон, ОСО | Анти-А, эксп. реагент | ОЕУ01Ю2 | - |
| Албаклон, 8ΝΒΤ8 | Анти-В | Ζ0110670 | 01.07.05 |
| Биоклон, ОСО | Анти-В, эксп. реагент | ОЕУ01103 | - |
Таблица 10
Влияние времени инкубации на агглютинацию клеток, трансформированных природными гликолипидами
| Гликолипид | Концентрация (мг/мл) | Албаклон 1 час 2 часа | Биоклон 1 час | 2 часа | |
| А | 10 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
| 5 | 4+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
| 2 | 4+ | 3+ | 3+ | 2+ | |
| 1 | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | |
| 0,5 | 2+ | 2+ | 1 + | «+ | |
| В | 10 | 3+ | 2+ | 4+ | 1 + |
| 5 | 3+ | 2+ | 3+ | 2+ | |
| 2 | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | |
| 1 | 1 + | 1 + | И/+ | ||
| 0,5 | 1 + | ν/+ |
Эти результаты показывают, что повышение продолжительности инкубации во время встраивания природных гликолипидов не повышает агглютинацию. Фактически, баллы счета агглютинации снижаются после 2 ч инкубации. Это может быть обусловлено дестабилизацией мембраны или возвращением гликолипидов обратно в раствор.
Разбавитель.
Эксперименты проводили также для определения, может ли замена раствора для разведения гликолипида снижать гемолиз. Рабочую эффективность РВ8 сравнивали с рабочей эффективностью 2хРВ8 и 2% бычьего сывороточного альбумина (Β8Α) в РВ8. Клетки инкубировали при 37°С в течение 1,5 ч. Результаты показаны в табл. 11.
Таблица 11
Исследование по влиянию на гемолиз замены растворов для разведения гликолипидов во время встраивания гликолипидов в мембраны КВС
| Концентрация гликолипида (мг/мл) | Раствор для разведения гликолипида | ||
| РВЗ | 2 х РВЗ | 2% ВЗА в РВЗ | |
| 40 | ήήή | ЙЬН | ήήή |
| 30 | ήΗΗ | Γιήή | ΙίΗΙί |
| 20 | ΙίΙίΙί | 1лЫ1 | ΙίΙίΙί |
| 10 | ΙίΙίΙί | ήήή | |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
Стабильность.
После того как гликолипиды групп крови А и В были очищены ВЭЖХ до приемлемого уровня, проводили эксперимент для нахождения подходящих концентраций для проведения опытов по стабильности.
- 29 013183
Таблица 12
Исследование ранней стабильности клеток, трансформированных природным гликолипидом А
| Эксп | День | А | ||||||||
| 10 | 5 | 2 | 1 | 0.1 | 0,01 | 0,001 | 0,0001 | 0 | ||
| 1 | 7 | 4+ | 3-4+ | 1 + | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 43 | 3+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 3 | 50 | 1 + | 0 | 0 | 0 | |||||
| 4 | 60 | 3+ | 1 + | 0 | ||||||
| 5 | 67 | νντ | ννν | |||||||
| 6 | 74 | 2+ | 0 | 0 | ||||||
| 7 | 81 | 2+ | 1 + | 0 |
Таблица 13
Антисыворотки, применяемые в испытаниях стабильности (табл. 14 и 15)
| Изготовитель | Каталог ге( | Номер партии | Дата окончания |
| Албаклон, 3ΝΒΤ3 Биоклон, ОСО Албаклон, 3ΝΒΤ3 Биоклон, ОСй | Анти-А Анти-А, экспер. реагент Анти-В Анти-В, экспер. реагент | Ζ0010770 ОЕУ01102 Ζ0110670 РЕУОИОЗ | 12.12.04 01.07.05 |
Таблица 14 Пробирочная серология О ВВС, трансформированных гликолипидом А, для установления подходящих концентраций для проведения испытаний стабильности
и 2 Трансформация при 25°С в течение 4 ч.
Таблица 15 Пробирочная серотология О ВВС, трансформированных гликолипидом В, для установления подходящих концентраций для проведения испытаний на стабильность
Два набора клеток трансформировали при различных концентрациях природного гликолипида А. Трансформацию проводили при 25°С. Один набор клеток тестировали в течение длительного времени и один набор клеток тестировали еженедельно на агглютинацию. Результаты агглютинации, проводимой пробирочной серологией и П1ате4, показаны ниже в табл. 16. Все клетки хранили в Се11з1аЬ™ в бутылях с плоскими основаниями. Клетки обнаружили от минимального гемолиза до отсутствия гемолиза в любой точке времени.
- 30 013183
Таблица 16 Результаты агглютинации клеток, трансформированных различными концентрациями природного гликолипида А. Результаты получали с применением албаклона анти-А
| Гликолипид А (мг/мл) | ||||||
| 10 | 5 | 2 | 1 | 0.1 | Контроль | |
| Длительное тестирование День 1 Пробир. | 4+ | 3+ | 2+ | 1 + | +\ν | 0 |
| ОЁатеб | 3+ | 3+ | 0 | 0 | 0 | |
| День 17 Пробир. | 3+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | |
| ОЁатеб | 3+ | 2+ | 1 + | 0 | 0 | |
| Еженедельное тестирование День 1 Пробир. | 3+ | 2+ | 0 | 0 | ||
| О1а теб | 3+ | 0 | 0 | 0 | ||
| День 8 Пробир. | 1 + | 0 | 0 | 0 | ||
| ОЁатеб | 3+ | 0 | 0 | 0 | ||
| День 15 Пробир. | 1 + | 0 | 0 | 0 | ||
| О1атеб | 3+ | 2+ | 0 | 0 | ||
| День 22 Пробир. | 3+ | 0 | 0 | 0 | ||
| ϋ !а теб | 3+ | 0 | 0 | 0 | ||
| День 29 Пробир. | *+« | *0 | *0 | ‘0 | ||
| ОЁатеб | *3+ | ‘0 | ‘0 | ‘0 | ||
| День 36 Пробир. | * | * | * | ‘0 | ||
| ОЁатеб | *з+ | *0 | *0 | ‘0 | ||
| День 43 Пробир. | * | * | * | ‘0 | ||
| ОЁатеб | * | * | * | ‘0 |
* Албаклон, тогда как во все других опытах применяли сераклон анти-А.
Раствор для хранения.
Сравнение двух растворов для хранения клеток, Сс1ргс5о1 (С8Ь) и Се11йаЬ™ (ЭЁатеб) проводили для тестирования их относительных способностей поддерживать модифицированные ВВС.
Испытывали стабильность ВВС, трансформированных растворами антигенов групп крови А и В с различными концентрациями, при хранении в двух разных растворах для хранения клеток - Се11йаЬ™ и Акеуеге™.
В серологическом тестировании применяли антисыворотки А и В из двух разных источников.
Все клетки тестировали с применением стандартной платформы пробирочной серотологии в течение до 42 дней, при таком времени реакции агглютинации клеток становились слишком трудными для ручного счета (см. табл. 17 для результатов А и табл. 18 для результатов В).
Тестирование гель-карт ЭЁатеб проводили до 56 дней для клеток, сохраняемых в АИеуегк, и прерывали в день 63 вследствие грибковым загрязнением (несмотря, однако, на повторение позитивных оценок в баллах).
Хранение клеток в Се11§!аЬ™ продолжали в течение до 70 дней до тестирования, они были все же жизнеспособными в этой точке (см. фиг. 1 для результатов А и фиг. 2 для результатов В).
Реагенты, применяемые в испытании стабильности, показаны в табл. 13.
- 31 013183
Таблица 17 Результаты испытания пробирочной серологией стабильности клеток, трансформированных с изменяемыми концентрациями гликолипида А и хранимых либо в Се1к1аЬ™, либо в А1зе\'ег5™
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-А Биоклон анти-А (8ΝΒΤ8) (ОСО-разработанный реагент) | |||||||||
| Раствор для трансформации | (мг/мл) | ||||||||||
| 10 | 5 | 2 | 2* | 1 | 10 | 5 | 2 | 2* | 1 | ||
| 2 | ΑΙεβνβΓδ | 4+ | 3+ | 2+ | 1 + | νν+ | 3+ | 3+ | 1 + | 1 + | 0 |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 4+ | 3+ | 1 + | 1 + | 3+ | 3+ | 2+ | 1 + | 0 | |
| 8 | ΑΙεβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 1 + | 1 + | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + | 0 |
| Се118(аЬ™ | 4+ | 4+ | 3+ | 2+ | 1 + | 3+ | 3+ | 2+ | «+ | 0 | |
| 14 | ΑΙδβνβΓβ | 4+ | 3+ | 2+ | 2+ | νν+ | 2+ | 1 + | и+ | ννν | 0 |
| Се11з(аЬ™ | 4+ | 3+ | 3+ | 2+ | 3+ | 2+ | ννν | 0 | |||
| 21 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | 0 |
| Се1151аЬ™ | 3+ | 3+ | 2+ | + | +* | 2+ | ♦+ | ++ | ♦♦ | 0 | |
| 28 | ΑΙδβνβΓδ | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + | 0 | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + | 0 |
| Се1181аЬ™ | 2+’* | 2+* | ++ | 0 | 1 + | Λ+ | 0 | 0 | 0 | ||
| 36 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | 3+ | 3+ | 2+ | 1 + | 1 + |
| Се11з1аЬ™ | з+*+ | 2+” | ++ | +♦ | ++ | 3+** | *+ | ++ | ++ | ||
| 42 | ΑΙδβνβΓε | 3+ | 3+ | 1 + | 0 | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + | |
| Се11з1аЬ™ | 4+++ | 4+++ | + 4 | ++ | 4 + | +♦ | ++ | 4+ | ++ | 0 |
* раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не отмывали после инкубации, его оставляли на ночь и отмывали на следующий день положительная оценка клеток в баллах, но число клеток уменьшается (оценка в баллах становится невозможной)
Таблица 18
Серологические результаты испытания стабильности клеток, трансформированных с измененяемыми концентрациями гликолипида В и сохраняемых либо в Се11йаЬ™, либо в А1^егз™
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-В (8ΝΒΤ3) | Биоклон анти-В (ОСО-разработанный реагент) | |||||||||
| Раствор для | трансформации ( | мг/мл) | ||||||||||
| 10 | 5 | 2 | 2* | 1 | 10 | 5 | 2 | 2* | 1 | |||
| 2 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 3+ | 1 + | 1 + | 1 + | 2+ | 1 + | 1 + | 1 + | 0 | |
| Се11з1аЬ™ | 3+ | 3+ | 2+ | 2+ | 1 + | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | νν+ | ||
| 8 | ΑΙδβνβΓδ | 1 + | 1 + | νν+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Се11з1аЬ™ | 2+ | 1 + | 0 | 1 + | 1 + | М/+ | 0 | 0 | ||||
| 14 | ΑίεβνβΓδ | 2+ | 2+ | 0 | νν+ | 0 | 0 | 1 + | 1 + | 2+ | 0 | |
| Се11з1аЬ™ | 1 + | νν+ | 0 | 0 | 0 | 2+ | 2+ | «+ | 1 + | 1 + | ||
| 21 | ΑΙδβνβΓδ | + + | 4+ | 44 | + 4 | +♦ | 1 | 1 | 4 + | ++ | + 4 | |
| Се11з(аЬ™ | + + | 4+ | +4 | 44 | *♦ | + | + | Ψ | 44 | 44 | ||
| 28 | ΑΙεβνβΓδ | 2+ | 1 + | νν+ | 0 | 0 | 2+ | 1 + | 2+ | 0 | 0 | |
| Се11з1аЬ™ | ++ | ++ | 44 | 0 | 0 | ++ | 0 | + 4 | 44 | 0 | ||
| 36 | ΑΙδβνθΓδ | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + | |
| Се11з1аЬ™ | ++ | + + | + 4 | 44 | 4 + | 4-4 | ++ | +4 | 44 | 44 | ||
| 42 | ΑΙδβνβΓδ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | νν+ | |||
| Се11з1аЬ™ | ++ | 4+ | + 4 | ++ | + + | +♦ | 4 + | ++ | +4 | +4 |
* раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не отмывали после инкубации, его оставляли на ночь и отмывали на следующий день ++ положительная оценка клеток в баллах, но число клеток уменьшается (оценка в баллах становится невозможной)
- 32 013183
ГАС8-анализ встраивания гликолипида.
Проводили трансформацию Ье(а-Ь)-тромбоцитов человека природным ЬеЬ-6-гликолипидом на протяжении времени при трех температурах трансформации (37, 22 и 4°С) (фиг. 3). Природный ЬеЬ-6гликолипид растворяли в плазме и применяли для трансформации ВВС при конечной концентрации 2 мг/мл и конечной суспензии 10%.
Реакционную способность определяли ГАС8-анализом с применением гамма-анти-ЬеЬ. (Уровень серологического детектирования был приблизительно 102 молекул. Встраивание природных гликолипидов при 4°С в течение 8 ч не поддавалось детектированию агглютинацией антителами). Проецирование кривой скорости встраивания из ГАС8-анализа не указывало, что скорость встраивания при 4°С могла достичь уровней детекции агглютинации через 24 ч.
Инкубация при низкой температуре.
Трансформацию ВВС природным гликолипидом А или В проводили при 37°С в течение 1 ч и 2°С в течение варьируемых интервалов. Клетки агглютинировали биоклоном анти-А или биоклоном анти-В. Результаты представлены в табл. 19 и 20.
Таблица 19
Результаты И1атей сравнения трансформации природным гликолипидом А при 37°С в течение 1 ч и 2°С в течение варьируемых интервалов
| Темп. | Время (часы) | Природный гликолипид А (мг/мл) | ||||
| 10 | 5 | 2 | 1 | 0 | ||
| 37°С | 1 | 3+ | 3+ | 2-3+ | 2+ | 0 |
| 2°С | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 8 | 1-2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 24 | 2-3+ | 2+ | 1-2+ | 0 | 0 | |
| 48 | 3+ | 2-3+ | 2-3+ | 0 | 0 | |
| 72 | 3-4+ | 3+ | 2+ | 0 | 0 |
Таблица 20
Результаты И1атей сравнения трансформации природным гликолипидом В при 37°С в течение 1 ч и 2°С в течение варьируемых интервалов
| Темп. | Время (часы) | Природный гликолипид А (мг/мл) | ||||
| 10 | 5 | 2 | 1 | 0 | ||
| 37°С | 1 | 3+ | 2-3+ | 2+ | 0 | 0 |
| 2°С | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 24 | 1 + | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 48 | 2+ | 1-2+ | 0 | 0 | 0 | |
| 72 | 2+ | 1 + | 0 | 0 | 0 |
Скорость трансформации является медленной как для природного гликолипида А, так и для природного гликолипида В, что демонстрируется отрицательными оценками в баллах агглютинации после 1 ч при 2°С. Значительное встраивание было показано при 37°С для этого интервала времени.
Встраивание природного гликолипида А при 2°С требовало 48 ч для достижения такого же уровня встраивания, который можно получить трансформацией при 37°С. После этого времени дальнейшее встраивание не наблюдалось. Подобным же образом встраивание природного гликолипида В при 2°С не было таким же быстрым, как трансформация при 37°С. Подсчет агглютинации в баллах не повышался при продолженной инкубации и, таким образом, оказалось, что встраивание достигло максимума в этой точке времени для этих концентраций.
Примеры
В примерах описана трансформация эритроцитов синтетическими молекулярными конструкциями изобретения. В контексте этих примеров термин «синтетические гликолипиды» применяют для обозначения этих конструкций.
- 33 013183
Пример 1. Получение синтетических гликолипидов.
Материалы и методы.
Анализы ТСХ проводили на пластинах силикагеля 60 Р254 (Мегск), соединения детектировали окрашиванием 8% фосфорной кислотой в воде с последующим нагреванием при температуре выше чем 200°С. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 (0,2-0,63 мм, Мегск) или сефадексе ЬН20 (Атегкйат). 1Н ЯМР-спектры снимали на спектрометре Брукер ΌΒΧ-500. Химические сдвиги указываются в м.д. (δ) относительно СЭ3ОО.
Синтез активированного 1,2-диолеоил-8и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (ΌΟΡΕ) и 1,2дистереоил-8и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (Ό8ΡΕ) (глицерофосфолипиды).
К раствору бис-(М-гидроксисукцинимидил)адипата (а) (70 мг, 205 мкмоль) в сухом Ν,Νдиметилформамиде (1,5 мл) добавляли ΌΟΡΕ или Ό8ΡΕ (Ь) (40 мкмоль) в хлороформе (1,5 мл) с последующим добавлением триэтиламина (7 мкл). Смесь выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем нейтрализовали уксусной кислотой и частично концентрировали в вакууме.
Колоночная хроматография (сефадекс ЬН-20, смесь 1:1 хлороформ-метанол, 0,2% уксусной кислоты) остатка дала активированный липид (А-Ь) (37 мг, 95%) в виде бесцветного сиропа; ТСХ (хлороформметанол-вода, 6:3:0,5): К(=0,5 (ΌΟΡΕ-А), К(=0,55 (ΌδΡΕ-А).
Ή ЯМР (СПС13/СП3ОП, 2:1), δ:
ϋΟΡΕ-Α- 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,39 (м, 1Н, -ОСН2СНО-СН2О-), 4,58 (дд,
1Н, 6=3,67, 6=11,98, -ССООНСН-СНО-СНгО-), 4,34 (дд, 1Н, 6=6,61, 6=11,98, ССООНСН-СНО-СН2О-), 4,26 (м, 2Н, РО-СН^-СНг-ЫНг), 4,18 (м, 2Н, -СН^ОР),
3,62 (м, 2Н, ΡΟ-ΟΗ2-ΟΗ2-ΝΗ2), 3,00 (с, 4Н, О№ис), 2,8 (м, 2Н, -СН^-СО (Аб),
2,50 (м, 4Н, гхССН^-СО), 2,42 (м, 2Н, -СЬЦ-СО (Аб), 2,17 (т, 8Н,
СН=СН-СЦ.-), 1,93 (Μ. 4Н, СОСНгСНаСНгСНзСО), 1,78 (м, 4Н, 2х(СОСН2СНг), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,04 (м, 6Н, 2 СН3).
Ό8ΡΕ-Α - 5,39 (м, 1Н, -ОСН2СНО-СН2О-), 4,53 (дд, 1Н, 6=3,42, 6=11,98, СС00НСН-СНО-СН2О-), 4,33 (дд, 1Н, 6=6,87, 6=11,98, -ССООНСН-СНОСН2О-), 4,23 (Μ, 2Н, ΡΟ-ΟΗ2-ΟΗ2-ΝΗ2), 4,15 (м, 2Н, -СН^ОР), 3,61 (м, 2Н, РОСНа-СНЦ-ЫНг), 3,00 (с, 4Н, 0Ы8ис), 2,81 (м, 2Н, -СРЦ-СО (Αά), 2,48 (м, 4Н, 2χ(-0Η^-0Ο), 2,42 (м, 2Н, -СРЦ-СО (Аб), 1,93 (м, 4Н, СОСНгСН^СН^СНгСО), 1,78 (м, 4Н, 2х(СОСН2СН£-), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,04 (м, 6Н, 2 СНз).
Конденсация активированного ΌΟΡΕ (или ΌδΡΕ) с аминопропилгликозидом.
К раствору активированного ΌΟΡΕ (или ΌδΡΕ) (А-Ь) (33 мкмоль) в Ν,Ν-диметилформамиде (1 мл) добавляют 30 мкмоль 8ιΐ8-8|-ΝΗ2 (Ρ-8ι-ΝΗ2) и 5 мкл триэтиламина. Например, 8ид может быть любым аминопропилгликозидом (Ρ-8ι-ΝΗ2) либо трисахарида Са1МАса1-3(Риса1-2)Са1в (А-гликотоп) (Р), либо трисахариада Са1а1-3(Риса1-2)Са1в (В-гликотоп) (Р).
Смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Колоночная хроматография (сефадекс ЬН-20 в смеси 1:1 хлороформ-метанол, затем силикагель в смеси 4:3:1 об./об./об.) этилацетатизопропанол-вода) смеси обычно дает 85-90% синтетической молекулярной конструкции, например, АΤρи-8ρ-Αб-^ΟΡΕ (I) или АΤρИ-8ρ-Αб-^ΟΡΕ (VI).
Ή ЯМР ^ΌΠ3^Ό3ΟΌ, 1:1), δ:
Агри-зр-Αά-ΌΟΡΕ (I) - 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,43-5,37 (м, 2Н, Н-1 (θβΙΝΗΑο) и -ОСНг-СНО-СН2О-), 5,32 (д, 1 Η, Н-1, 6=3,5 Н-1 Рис), 2,50 (м, 4Н,
2х(-СНа-СО), 2,40 (м, 4Н, СОСНгСН2СН2СНЦСО), 2,20 (м, 8Н, 2х(-СНг
СН=СН-СНа-), 2,1 (с, ЗН, ΝΗΑο), 1,92 (м, 2Н, -О-СНгСНЦСНг-ЫН), 1,8 (т, ЗН,
- 34 013183
СОСНгСЩСЩСНгСО и 2х(СОСН2СН2-), 1,43, 1.47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2),
1.40 (д, ЗН, ΰ= 6,6, СН3 Еис), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
ΑτρΗ-δρδρ,-Αά-ΟΟΡΕ (II) - 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,43-5,37 [м, 2Н, Н-1 (ΘβΙΝΗΑύ) и -ОСН2-СНО-СН2О-], 5,32 (д, 1 Η, Н-1, 4=3,6 Н-1 Еис), 2,50 (м, 4Н, 2х(-СН2-СО), 2,40-2,32 (и, 6Н, СОСЩСНгСНзСН^СО и СОСНа- <βρι), 2,18 [м, 8Н, 2х(-СН2-СН=СН-СН2-)], 2,1 (с, ЗН, ΝΗΑο), 1,95 (м, 2Н, О-СНгСЩСНг-ΝΗ),
1,8 [м, ЮН, СОСНгСЩСНгСНгСО, 2х(СОСН2СН2-...), -СОСНгСН^СНгЬЫН-],
1,68 (м, 2Н, СОССНДзСНгСНгИН-), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 42Н, 22 СН2), 1,37 (д, ЗН, 4=5,6, СНз Рис), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
Атри-ер-Αά-ϋΟΡΕ (III) - 5,42-5,38 (м, 2Н, Н-1 (ΘθΙΝΗΑο) и -ОСН2-СНОСН2О-), 5,31 (д, 1Н, Н-1, 4=3,5 Н-1 Рис), 2,48 [м, 4Н, 2х(-СН2-СО)], 2,42 (м, 4Н, СОСН^СНгСНгСЩСО), 2,18 (с, ЗН, ЫНАс), 1,95 (м, 2Н, О-СНгСЕЦСНгΝΗ), 1,8 [т, 8Н, ΟΟΟΗ^Η^ΟΗ/^ΟΟ и 2х(СОСН2СНг-), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 56Н, 28 СН2), 1,38 (д, ЗН, ΰ= 6,6, СН3 Рис), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
Втри-зр-Ас1-ООРЕ (VI) - 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,42-5,38 (м, 2Н, Н-1 (Оа1) и -ОСН2-СНО-СН2О-], 5,31 (д, 1Н, Н-1, 4=3,7 Н-1 Рис), 2,48 1м, 4Н, 2х(СНг-СО)], 2,39 (м, 4Н, СОСЩСНгСНгСНаСО), 2,18 [м, 8Н, 2х(-СНг-СН=СНСНЦ-), 1,93 (м, 2Н, О-СНгСНгСНг-ИН), 1,8 [т, 8Н, СОСНгСН^СНгСН2СО и гхГСОСНгСНг-П, 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,36 (д, ЗН, 4= 6,6, СН. Рис), 1,05 (Μ, 6Н, 2 СН3).
Нтри-зр-Аб-ООРЕ (VII) - 5,5 [м, 4Н, 2х(-СН=СН-)], 5,4 (м, 1Н, -ОСНгСНО-СНгО-), 5,35 (д. 1Н, Н-1, 4=3,2, Н-1 Рис), 4,65, 4,54 (2д, 4=7,4, 4=8,6, Н1 Оа1, Н-1 ΟΙοΝΗΑο), 4,46 (дд, 1Н 4=3,18, 4=12, -ССООНСН-СНО-СН2О-), 4,38-4,28 (м, 2Н, Н-5 Еис, ССООНСН-СНО-СН2О-), 2,48 [м, 4Н, 2χ(-0ϋ>-00)],
2.40 (Μ, 4Н, СОСНгСНгСНгСНгСО), 2,18 [Μ, 8Н, 2х(-СНг-СН=СН-СН2-)], 2,08 (с, ЗН, ΝΗΑο), 1,92 (м, 2Н, Ο-ΟΗ2ΟΕ^ΟΗ2-ΝΗ), 1,82-1,72 [м, 8Н,
СОСНгСНгСН^СНгСО и гхЮОСНгСЕЦ-)], 1,48, 1,45 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2),
1,39 (д, ЗН, 4=6,5, СН3 Еис), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
НдИ-зр-Ад-ООРЕ (VIII) - 5,49 (м, 4Н, 2х(-СЦ=СН-), 5,37 (м, 1Н, -ОСН2СНО-СН2О-), 5,24 (д, 1Н, Н-1, ΰ=2,95, Н-1 Еис), 4,46 (д, 4=7,34, Н-1 6а1), 2,48 [м, 4Н, 2х(-СНг-СО)], 2,42-2,35 (м, 4Н, С0СНгСН2СН2СШС0). 2,17 [м, 8Н, 2х(-СН2-СН=СН-СНя-)], 1,95 (м, 2Н, О-СН2СЩСН2-НН), 1,8-1,74 [м, 8Н, СОСНгСНгСНгСНгСО и 2х(СОСНгСЩ-)]. 1,45, 1,41 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2),
1,39 (д, ЗН, 4=6,5, СН3 Еис), 1,03 (м, 6Н, 2 СН3).
<За1р-зр-АсЮОРЕ (IX) - 5,51 [м, 4Н, 2х(-СН=СН-)], 5,4 (м, 1Н, -ОСН2СНО-СН2О-), 4,61 (дд, 1Н 4=3,18, 4=12, -ССООНСН-СНО-СН2О-), 4,41 (д, 4=7,8, Н-1 Са1), 4,37 (дд, 1Н, 4=6,6, 4=12, -ССООНС1±:СНО-СН2О-), 2,50 [м, 4Н, гхС-СНЦ-СО)], 2,40 (м, 4Н, СОСНгСНгСНгСЕЦСО), 2,20 [м, 8Н, 2х(-СЩСН=СН-СНг)], 1,97 (м, 2Н, О-СНгСШСННЧН), 1,82-1,72 [м, 8Н,
СОСНгСНгСН^СНгСО и 2χ(ΟΟΟΗ2ΟΗτ)], 1,48, 1,45 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
Пример 2. Растворимость синтетических гликолипидов.
Для применения при трансформации клеток первым критерием для того, чтобы синтетические гликолипиды были удовлетворительными, является то, чтобы они были растворимыми в водных растворителях, например забуференном фосфатом солевом растворе. Сначала применяли ряд методик, включающих в себя нагревание и обработку ультразвуком, для достижения максимума растворимости испытуе
- 35 013183 мых синтетических гликолипидов (табл. 21).
Синтетический гликолипид должен быть способен встраиваться в мембрану и быть распознаваемым для подходящего антитела для трансформации, чтобы детектироваться агглютинацией. Первоначальные тесты на молекулы должны были устанавливать растворимость и тем самым элиминировать те молекулы, которые были неподходящими для применения при трансформации клеток.
Результаты этих первоначальных тестов представлены в табл. 22.
Таблица 21 Диапазон испытанных синтетических гликолипидных молекул
Липидные хвостовые части ϋΟΡΕ
Βτρ„-9ρ-Α6-ϋΟΡΕ(νΐ)
АТрИ-8р-Ас1-ООРЕ (I)
ΘβΙβ-ερ-Αά-ϋΟΡΕ (IX)
Нди-зр-Аб-ООРЕ (VIII)
Ητρη-ερ-Αό-ϋΟΡΕ (VII)
Αγρ,,-ερερ^Αά-ΟΟΡΕ (II)
Втри-ΡΑΑ-ϋΟΡΕ (V)
Различные липидные хвостовые части
ΑΤρ„-ερ-Ιίρίά (IV) _
Таблица 22
Растворимость синтетических гликолипидов в горячем РВ8 и способность их к трансформации
Синтетические Растворимость в воде Способность к гликолипиды детектируемой трансформации
Ατρ„-ερ-Ιίρί6 (IV) Нет Нет
ВТрИ-РАА-ООРЕ (V) Нет Нет
Βτρ„-ερ-Αά-ΟΟΡΕ(νΐ) Есть Есть
Ат₽и-зр-Ас1-ООРЕ (I) Есть Есть
ΟθΙβ-ερ-Αά-ϋΟΡΕ (IX) Есть Нет
ΗΑ„-5ρ-Αά-ϋΟΡΕ (VIII) Есть Нет
НТрИ-8р-А0-ООРЕ (VII) Есть Есть
Агри-ερερι-Αά-ΟΟΡΕ (II) Есть Есть
АТрц-5Р-Аб-О5РЕ(111) Есть Есть
Считали, что отсутствие детектируемой трансформации для Саф-кр-Аб-ООРЕ (IX) и Нди-кр-АбΌΟΡΕ (VIII) обусловлено неспособностью антитела узнавать гликотоп этих синтетических молекул. Ат|)[|кр-липид (IV) имеет моноацильную, а не диацильную хвостовую часть и было предположено, что не имелось встраивания этой синтетической молекулы в мембранный бислой.
Пример 3. Низкотемпературная трансформация КВС синтетическими гликолипидами Ат|)[|-8р-АбΌΟΡΕ (I) и Втри-кр-Аб-ΌΟΡΕ (VI).
КВС являются здоровыми при хранении при 4°С и, считается, что подобным же образом являются здоровыми при трансформации при 4°С. На основании предыдущих исследований (см. сравнительные примеры) и исследований других авторов (Зсйетаг/тапп, 2000) не предполагалось, что довольно высокая скорость встраивания синтетических гликолипидов может иметь место при 4°С. Эти исследования проводили с природными гликолипидами. Удивительно, что эти исследования не предсказали поведение синтетических гликолипидов изобретения.
Хотя и без желания быть связанными с теорией, считают, что в исследованиях 8с11\\'агхтапп низкая скорость встраивания природных гликолипидов может быть обусловлена физико-химическими свойствами хвостовой части природного гликолипида, сфинголипида и жирной кислоты.
Диацильная хвостовая часть гликолипида может быть важной в определении скорости встраивания.
- 36 013183
Некоторые диацильные хвостовые части могут сохранять более высокую текучесть при более низких температурах. В альтернативном случае, домен мембраны плазмы, в который диацильный хвост этих гликолипидов встраивается, может сохранять эту более высокую текучесть.
Известно, что сфинголипидные хвосты природных гликолипидов скапливаются в жестких доменах и эти домены могут не позволить дальнейшее включение гликолипида при низких температурах. Синтетические гликолипиды с цис-ненасыщенными диацильными хвостами могут быть благоприятными для применения.
Впервые была оценена трансформация ВВС синтетическими гликолипидами с различными липидными хвостами (табл. 22 и 24).
Таблица 23 Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 24-27
| Анти-А Изготовитель | Каталог ге( | Номер партии | Дата окончания |
| Албаклон, | Ζ0010770 | 12.12.04 | |
| 8ΝΒΤ8 | Экспериментальный | 01102 | |
| Биоклон, ОСО | реагент | ||
| Анти-в | Номер партии | Дата окончания | |
| Изготовитель | Каталог геТ | Ζ0110600 | 27.04.03 |
| Албаклон, | 01103 | ||
| 8ΝΒΤ8 | Экспериментальный | ||
| Биоклон, ОСО | реагент |
Таблица 24 Оценка встраивания различных липидных хвостов агглютинацией приемлемыми антисыворотками
* - сплаттер
- 37 013183
Затем оценивали трансформацию КВС синтетическими гликолипидами А.|р[|-5р-АД-БОРЕ (I) и Вт|)[|хр-АД-БОРЕ (VI) при 4°С (табл. 25-28). Эти трансформации были направлены на получение клеток, экспрессирующих низкие уровни гликотопов А, В или А и В («слабые клетки для А, В и АВ»).
Для получения «слабых клеток для А и В» растворы для трансформации (20 мкл А.|р[|-хр-АД-БОРЕ (I) при 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл и В.|р[|-хр-АД-БОРЕ (VI) при 0,6, 0,3, 0,15, 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл) в 1хРВ8 смешивали с промытой эритроцитарной массой КВС группы О (60 мкл).
Для получения «слабых клеток для АВ» растворы для трансформации (20 мкл А1ри-8р-АД-БОРЕ (I) при 0,07, 0,06 и 0,05 мг/мл и В.|р[|-хр-АД-БОРЕ (VI) при 0,3 и 0,2 мг/мл) в 1хРВ8 смешивали с промытой эритроцитарной массой КВС группы О (60 мкл). Комбинациями были
Аури зр-Αά-ϋΟΡΕ (I) при 0,07 мг/мл + Втри-8р-Ас1-00РЕ (VI) при 0,3 мг/мл; Атри-8рΑά-ϋΟΡΕ (I) при 0,07 мг/мл + Втри-8р-Ас1-00РЕ (VI) при 0,2 мг/мл; Атрй-вр-АдБОРЕ (I) при 0,06 мг/мл + Втри-зр-Ас1-ООРЕ (VI) при 0,3 мг/мл; Атри-8р-Ас1ϋΟΡΕ (I) при 0,06 мг/мл + Втри-8р-Ас1-00РЕ (VI) при 0,2 мг/мл; АтрИ‘8р-Ас1ϋΟΡΕ (I) при 0,05 мг/мл + Втри-зр-Ас1-00РЕ (VI) при 0,3 мг/мл и Атри-8р-Ас1БОРЕ (I) при 0,05 мг/мл + Втри-8р-Ас1-БОРЕ (VI) при 0,2 мг/мл.
Клетки и растворы для трансформации помещали в холодильник при 4°С. Смешивание пипеткой проводили с интервалами. Клетки удаляли для тестирования через интервалы времени против подходящих антисывороток и тестировали как в промытых, так и непромытых состояниях (т.е. промытые образцы имели удаленный раствор для трансформации).
Спустя 48 ч к клеткам добавляли Се1рге8о1™, так чтобы конечное отношение клетки :неклетки было 3:5 (об./об.). Клетки продолжали тестировать через интервалы времени. Тестирование прерывали через 10 дней, так как клетки становились коричневыми.
Это изменение цвета может быть приписано ряду факторов, включающих в себя следующие факторы: клетки были уже возраста 21 дня, когда их трансформировали; 48-часовая трансформация была в РВ8, но не в Се1ргехо1™, поэтому клетки в течение этого времени подвергались стрессу; и с клетками могли неправильно обращаться при транзите между лабораториями трансформации и тестирования. Это можно уменьшить трансформацией клеток в Се1ргехо1™, в противоположность РВ8.
Таблица 25 Результаты Б1атеД КВС со слабой экспрессией А, трансформированных при 4°С против анти-А
| Время | Атри-зр-АД-БОРЕ (I) (мг/мл) | |||||
| Промытые | Непромытые | |||||
| 0,08 | 0,05 | 0,03 | 0,08 | 0,05 | 0,03 | |
| 2 час | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 час | 1 + | 0 | 0 | 2+ | 0 | 0 |
| 6 час | 2+ | 0 | 0 | 2+ | 0 | 0 |
| 8 час | 2+ | 0 | 0 | 2-3+ | 0 | 0 |
| 12 час | 2-3+ | 0 | 0 | 3+ | 1 + | 0 |
| 24 час | 3-4+ | 1 + | 0 | 3-4+ | 2+ | 0 |
| 30,5 час | 3-4+ | 1 + | 0 | 3-4+ | 2+ | 0 |
| 48 час | 2+ | 0 | 4+ | 2+ | 0 | |
| 72 час | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 2-3+ | 0 |
| 96 час | 4+ | 2-3+ | 0 | 4+ | 2-3+ | 0 |
| День 7 | 3-4+ | 2+ | 0 | |||
| День 10 | 3-4+ | 2+ | 0 |
- 38 013183
Таблица 26
Результаты Ωίαιηοά ЕБС со слабой экспрессией В, трансформированных при 4°С против анти-В
| Время | Втри-ар-Ай-ООРЕ (VI) (мг/мл) | |||||
| Промытые | Непромытые | |||||
| 0,6 | 0,3 | 0,15 | 0,6 | 0,3 | 0,15 | |
| 2 час | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 час | 0 | 0 | 0 | 1 + | 0 | 0 |
| 6 час | νν+ | 0 | 0 | 1 + | 0 | 0 |
| 8 час | 2+ | 0 | 0 | 2+ | νν+ | 0 |
| 12 час | 2+ | и+ | 0 | 2-3+ | 2+ | 0 |
| 24 час | 4+ | 3+ | 2+ | 4+ | 3+ | 2+ |
| 30,5 час | 4+ | 2-3+ | 0 | 4+ | 2-3+ | «+ |
| 48 час | 4+ | 3+ | 1 + | 4+ | 3+ | 2+ |
| 72 час | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
| 96 час | 4+ | 3-4+ | 2-3+ | 4+ | 3-4+ | 2-3+ |
| День 7 | 4+ | 2-3+ | 0 | |||
| День 10 | 4+ | 2+ | 0 |
Таблица 27
Результаты Ωίαιηοά ЕВС со слабой экспрессией АВ, трансформированных при 4°С в блок-титре против анти-А
| День | Втри-зр-АйϋΟΡΕ (VI) (мг/мл) | Аурр-ар-Ай-ООРЕ (VI) (мг/мл) | |||||
| Промытые | Непромытые | ||||||
| 0,07 | 0,06 | 0,05 | 0,07 | 0,06 | 0,05 | ||
| 1 | 0,3 | 2+ | 1-2+ | νν+ | 2-3+ | 2+ | 1 + |
| 0,2 | 2+ | 1-2+ | 0 | 2-3+ | 2+ | 1 + | |
| 5 | 0,3 | 2+ | 1-2+ | 1 + | 2-3+ | 2+ | 1-2+ |
| 0,2 | 2+ | 1-2+ | М/+ | 2-3+ | 2+ | 1-2+ | |
| 8 | 0,3 0,2 | 2-3+ 2-3+ | 2+ 2+ | 2+ 1-2+ |
Таблица 28
Результаты Ωίαιηοά ЕВС со слабой экспрессией АВ, трансформированных при 4°С в блок-титре против анти-В
| День | Втри-бР’АЙϋΟΡΕ (VI) (мг/мл) | Атри-зр-Ай-ϋΟΡΕ (VI) (мг/мл) | |||||
| Промытые | Непромытые | ||||||
| 0,07 | 0,06 | 0,05 | 0,07 | 0,06 | 0,05 | ||
| 1 | 0,3 | 3+ | 3+ | 2+ | 3+ | 3+ | 2-3+ |
| 0,2 | 1 + | 1-2+ | 0 | 2+ | 2+ | 1-2+ | |
| 5 | 0,3 | 2+ | 2+ | 1 + | 2+ | 2+ | 2+ |
| 0,2 | 0 | νν+ | ννι | 1 + | νν+ | ννν | |
| 8 | 0,3 | 2+ | 2+ | 2+ | |||
| 0,2 | 1 + | 1 + | 0 |
Пример 4. Эффективность трансформации ЕВС встраиванием синтетических гликолипидов А^-зрΑά-ΌΟΡΕ (I) и В . ,.-зр-Ай-ЭОРЕ (VI).
Растворы-супернатанты после трансформации (из А.|р1[|-5р-Ай-ЭОРЕ (I) при 0,08 мг/мл, 0,05 мг/мл и
- 39 013183
0,3 мг/мл и Втри-ар-Лб-ЭОРЕ (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли неразбавленными и при разведении 1:2 к промытой, эритроцитарной массе КВС (60 мкл). Пробирки инкубировали при 37°С на водяной бане в течение 1 ч, причем перемешивание проводили каждые 15 мин.
Трансформированные КВС промывали 3хРВ§ и затем суспендировали в Се1к!аЬ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Таблица 29
Пробирочный серологический тест
| Конц, перед трансформацией (мг/мл) | Оценка а баллах |
| Атри-зр-Ас1-ООРЕ (1) при 0,08 | 0 |
| 1:2 Атри-зр-Аб-ООРЕ (1) при 0,08 | 0 |
| Атри-ар-Ас1-ООРЕ (1) при 0,05 | 0 |
| 1:2 Атрв-зр-Аб-00РЕ (I) при 0,05 | 0 |
| Атри-©р-Ас1-ООРЕ (I) при 0,03 | 0 |
| 1:2 Атри-зр-Ас1-ООРЕ (I) при 0,03 | 0 |
| Βτρ„-5ρ-Αά-ϋΟΡΕ (VI) при 0,60 | νν/+ |
| 1:2 Втри-бр-Ас1-ООРЕ (VI) при 0,60 | 0 |
Оценка в баллах, проведенная с раствором-супернатантом после трансформации (из раствора перед трансформацией 0,08 мг/мл), не является одинаковой с оценкой в баллах раствора для трансформации 0,3 мг/мл при первом пассаже (ет+). Эти результаты указывают, что >75% молекул встраивается в мембраны КВС при первом пассаже.
Кроме того, растворы после трансформации концентрировали 20х и сравнивали соответственно с растворами трансформации известной концентрации. Тестировали только растворы после трансформации, полученные из растворов 0,08 мг/мл Атр1и-5р-Лб-ЭОРЕ (I) и 0,6 мг/мл Втр[|-5р-Лб-ООРЕ (VI).
Растворы после трансформации (20 мкл) диализовали (размер пор 500 Да) против деионизированной воды в течение 2 дней. Образцы оставляли для сушки в вытяжном шкафу в течение 10 дней. В конце этого времени их переносили в колбу роторного испарителя и устанавливали на роторный испаритель для вращения при включении вакуума с нагреванием на протяжении ночи.
Образцы сушили на водяной бане при 40°С и промывали в меньшие сосуды смесью 2:1 хлороформметанол, получая оставшиеся значительные количества высушенного клеточного материала. Промывочные растворы хлороформ-метанол, 2:1, сушили, промывали снова в тест-пробирки смесью 2:1 хлороформ-метанол и сушили. Эти образцы снова растворяли в 1 мл 1 хРВ8 и применяли для экспериментов по трансформации. Клеточный материал на дне склянок промывали водой в другой набор пробирок.
Растворы после трансформации (из А.|р[|-5р-Лб-ООРЕ (I) при 0,08 мг/мл и В.|р[|-5р-Лб-ООРЕ (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли к промытой, эритроцитарной массе КВС (60 мкл). Параллельно растворы для трансформации (Атр1[|-5р-Лб-ООРЕ (I) при 0,08 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,03 мг/мл и Втр1и-5р-Лб-ЭОРЕ (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли к высушенной, эритроцитарной массе КВС (60 мкл).
Пробирки инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 1 ч, причем перемешивание проводили каждые 15 мин. Трансформированные КВС промывали 3хРВ8 и затем суспендировали в Се11а1аЬ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Таблица 30
Серология Э|атеб
| Концентрация (мг/мл) | Оценка в баллах |
| Ατρ11-$ρΆά-ΟΟΡΕ (1) при 0,08 | 3+ |
| Ατρ«-®ρ-Αά-ΟΟΡΕ (1) при 0,05 | 2+ |
| ΑτρΗ-5ρ-Αά-ΟΟΡΕ (1) при 0,03 | 1 + |
| Из АТрЯ-зр-А<1-ООРЕ (1) при 0,08 | 0 |
| Втри-δρ-Αά-ΟΟΡΕ (VI) при 0,60 | 4+ |
| ΒΤρ„-8ρ-ΑάΌΟΡΕ (VI) при 0,60 | 0 |
Эти результаты позволяют предположить, что имеется недостаточное число молекул в растворе после трансформации, даже когда концентрация 20х , чтобы быть детектированными серологией.
Пример 5. Трансформация мышиных КВС синтетическим гликолипидом Нтр[|-5р-Лб-ООРЕ (VII).
Мышиные клетки трансформировали при 37°С в течение 1 ч.
- 40 013183
Таблица 31
Реагенты анти-Н, применяемые для получения результатов, приведенных в табл. 32 и 33
| Антисыворотка | Изготовитель | Партия |
| Анти-Н 1дМ | Ьарапезе Кеб Сгозз | ΗΙΚΟ-75 |
| иЕА | Ьогпе 1.аЬога1опез | 11549Е О.О.Е. 06.2004 |
| ΒΙο-ΙίΕΑ | ΕΥ 1аЬз | 201105-2 |
Таблица 32
Пробирочная серология
| Клетки | Антисыворотки Н | |||
| 1дМ | иЕА | Βίο-υΕΑ | ||
| Т = 0 | Т = 20 | |||
| Мышиные КВС (- контроль) | 0 | 0 | 0 | |
| Мышиные КВС + 0,01 мг/мл Нтризр-Ас!-ООРЕ (VI!) | 0 | |||
| Мышиные КВС + 0,05 мг/мл'Нтриερ-Αά-ϋΟΡΕ (VII) | 1 + | |||
| Мышиные КВС + 0,1 мг/мл Нтри-зрΑά-ϋΟΡΕ (VII) | 3+ | |||
| Мышиные КВС + 0,25 мг/мл Н,рвзр-Αά-ϋΟΡΕ (VII) | 4+ | 1 + | ||
| Мышиные КВС + 1 мг/мл Нгри-зрΑό-ϋΟΡΕ (VII) | 2+ | 2+ | ||
| Человеческие О КВС (+ контроль) | 4+ | 1 + | 2/3+ | 4+ |
Таблица 33
Ωίαιηοά
| Клетки | Оценка в баллах |
| Мышиные КВС + 0,01 мг/мл Нтри-зрΑά-ϋΟΡΕ (VII) | 0 |
| Мышиные ВВС + 0,05 мг/мл Нтри-зрΑό-СЮРЕ (VII) | 0 |
| Мышиные КВС + 0,1 мг/мл Нтри-8рАб-ϋΟΡΕ (VII) | 2+ |
| Мышиные КВС + 0,25 мг/мл Нтрв-5РΑά-ϋΟΡΕ (VII) | 3+ |
Пример 6. Трансформация КВС фильтрованным синтетическим гликолипидом А.фц-δρ-Αά-ΟΟΡΕ (I).
Некоторое количество Λ,.ρ,Γδρ-ΑΦΟΟΡΕ (I) фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Для исследования того, будет ли трансформация одинаковой, с этим продуктом проводили сравнительный опыт.
Таблица 34
Анти-А, применяемая для получения результатов, представленных в табл. 35
| Изготовитель | Каталог ге( | Номер партии | Дата окончания |
| Биоклон, ОСО | Экспериментальный реагент | 01102 |
- 41 013183
Таблица 35 Колоночная агглютинация ВВС А, трансформированных с варьируемыми концентрациями фильтрованного в стерильных условиях А^кр-Аё-БОРЕ (I) по сравнению с нефильтрованным Атри-кр-Аё-БОРЕ (I)
| Концентрация (мг/мл) | Фильтрованный в стерильных условиях АТрн-8р-АсРООРЕ (I) | Нефильтрованный Ατρ„-8ρ-Αά-ϋΟΡΕ (1) |
| 0,2 | 4+ | 4+ |
| 0,1 | 4+ | 3-4+ |
| 0,05 | 2-3+ | 2-3+ |
| 0,01 | 0 | 0 |
| Контроль при 37°С Контроль при 25°С | О о |
Эти результаты не показывают значительное различие между двумя препаратами А^кр-Аё-БОРЕ (I) и позволяют предположить, что фильтрование через фильтр 0,2 мкМ не удаляет молекулы или не изменяет состав или свойства жидкости до точки, которая влияет на трансформацию.
Пример 7. Хранение трансформированных клеток.
Для исследования того, изменяет ли хранение при 4 или 37°С результаты агглютинации трансформированных Атри-кр-Аё-БОРЕ (I) и природным гликолипидов О ВВС, идентифицированные как клетки «син-А» и «прир-А» соответственно, эти клетки делили на две части и суспендировали до 5% в Се11к1аЬ™.
Одну партию клеток хранили при 4°С и другую партию хранили при 37°С на водяной бане. Оценивали агглютинацию трансформированных клеток после хранения (табл. 36).
Таблица 36
| Время | Платфор- | Темп. | Син-А | Прир-А | Контроль | |
| (час) | ма | (°С) | Атри-зр-Аё-ООРЕ (1) при 0,1 мг/мл | При 1 мг/мл | При 10 мг/мл | |
| 0 | Пробирка | 3+ | 0 | 1-2+ | 0 | |
| 20 | Колонка | 4 37 | 4+ 4+ | 0 0 | 3+ 3+ | 0 0 |
| 44 | Колонка | 4 37 | 4+ 4+ | 3+ 3+ | 0 0 |
Пример 8. Трансформация ВВС синтетическими А- и В-антигенными гликолипидами с разными неуглеводными структурами.
Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные А^кр-Аё-БОРЕ (I), Атри-кр1кр2-АёБОРЕ (II), Атри-кр-Аё-БЗРЕ (III) и В.|р[|-кр-Аё-ООРЕ (VI), получали согласно методу, описанному в примере 1 с необходимыми модификациями.
Промытую эритроцитарную массу эритроцитов (ВВС) группы О (3 об.ч.) и раствор синтетического гликолипида (1 об.ч., варьируемые концентрации) добавляли в пробирку Эппендорфа. Пробирку инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 1 ч, перемешивая содержимое каждые 15 мин. Трансформированные ВВС промывали 3хРВ8 и затем суспендировали в Се11к1аЬ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Результаты пробирочного серологического теста и Б1атеё гель-карт для ВВС, трансформированных различными синтетическими молекулярными конструкциями, представлены в табл. 38.
Результаты стабильности ВВС, трансформированных различными синтетическими гликолипидами при различных концентрациях, представлены в табл. 39-44.
- 42 013183
Таблица 37
Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 38-44
| Антисыворотки | Изготовитель | Партия |
| Албаклон анти-А | 8ΝΒΤ8 | Ζ0010770-ϋ.Ο.Ε. 12.12.04 |
| Биоклон анти-А | Огбто 0(адпо8Ис5 | 01102 - ϋ.Ο.Μ. 16.05.02 |
| Албаклон анти-В | 8ΝΒΤ8 | Ζ0110670- О.О.Е. 12.12.04 |
| Биоклон анти-В | Ог(Ко 0!адпоз11св | 01102-ϋ.Ο.Μ. 16.05.02 |
Таблица 38
Сравнение трансформации ВВС при применении А-антигенных синтетических гликолипидов при разных концентрациях
| Синтетич. гликолипид | Конц, мг/мл | Антисыворотка А | |||
| Албаклон анти-А | Биоклон анти-А | ||||
| Пробирка | 01атеб | Пробирка | О|атеб | ||
| Атри-зр-АбϋΟΡΕ (I) | 0,25 | н.о. | 4+ | н.о. | 4+ |
| 0,1 | н.о. | 4+/3+ | н.о. | 4+/3+ | |
| 0,05 | \м+ | 2+ | 2+ | 2+ | |
| 0,04 | νν+ | н.о. | 1 + | н.о. | |
| 0,03 | 0 | н.о. | н.о. | ||
| 0,02 | 0 | н.о. | 0 | н.о. | |
| 0,01 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Атри-зр-Абϋ8ΡΕ (III) | 0,25 | н.о. | 0 | н.о. | 0 |
| 0.1 | н.о. | 0 | н.о. | 0 | |
| 0,05 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 0,04 | 0 | н.о. | 0 | н.о. | |
| 0,03 | 0 | н.о. | 0 | н.о. | |
| 0,02 | 0 | н.о. | 0 | н.о. | |
| 0,01 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| ΑτρΗ-δΡίδΡϊ* Аб-ϋΟΡΕ (II) | 0,25 | н.о. | 4+ | н.о. | 4+ |
| 0,1 | н.о. | 4+ | н.о. | 4+/3+ | |
| 0,05 | 0 | 3+ | 0 | 3+ | |
| 0,04 | 0 | н.о. | 0 | н.о. | |
| 0,03 | 0 | н.о. | 0 | н.о. | |
| 0,02 | 0 | н.о. | 0 | н.о. | |
| 0,01 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Инкубир. контроль | - | 0 | н.о. | 0 | н.о. |
| Лаборат. контроль | * | 0 | н.о. | 0 | н.о. |
Аббревиатура: н.о. - не определяли
- 43 013183
Таблица 39
Исследование стабильности ВВС, трансформированных Λ.,.,,,,-φ-Λά-ΟΟΡΕ (I) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-А | Биоклон анти-А | ||||
| Концентрация трансформг | раствора для 1ЦИИ (мг/мл) | ||||||
| 1 | 0,5 | 0,25 | 1 | 0,5 | 0,25 | ||
| 2 | ΑίδβνβΓβ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+° | 4+и | 4+и |
| Се11з1аЬ|м | 4+ | 4+ | 3+ | 4+и | 4+ | 4+и | |
| 10 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 2+ | 2+ | 4+и | 4+ | 3+ |
| Се1181аЬ,м | 4+и | 3+” | 2+ | 4+и | 4+и | 4+ | |
| 17 | А1зеуегз | 4+ | 4+ | 4+ | 4+и | 4+° | 4+и |
| Се11з1аЬ'м | 4+ | 4+ | 4+ | 4+и | 4+и | 4+и | |
| 24 | ΑΙεβνβΓβ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
| Се11з1аЬ'м | 4+ | 4+ | 4+ | 4+и | 4+ | 4+ |
Аббревиатура: - сплаттер
Таблица 40
Исследование стабильности ВВС, трансформированных Атри-кр-Ай-ЭОРЕ (I) при низких концентрациях (0,1, 0,05 и 0,025 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-А | Биоклон анти-А | ||||
| Концентрация раствора для трансформации (мг/мл) | |||||||
| 0,1 | 0,05 | 0,025 | 0,1 | 0,05 | 0,025 | ||
| 2 | ΑίδβνβΓδ | 3+/2+ | 1 + | 1 +/νν+ | 2+ | 2+/1 + | 1 + |
| Се11з1аЬ'м | 3+/2+ | 2+ | 1 + | 3+/2+ | 3+/2+ | 2+ | |
| 8 | ΑΙδβνβΓδ | 2+ | 1 + | \ν+ | 3+/2+ | 2+ | 2+ |
| Се11з1аЬ™ | 2+ | 1+/И/+ | ννν | 3+5 | 2+ | 1 + | |
| 15 | А1зеуегз | 2+ | 1 + | 0 | 3+ | 2+ | ννν |
| Се11з1аЬ|м | 4+ | νν+ | 0 | 4+ | 4+ | 1 + | |
| 22 | ΑΙββνβΓδ | 2+ | 2+ | 0 | 3+ | 2+ | νν+ |
| Се11з1аЬт*“ | 4+ | 4+ | 1 + | 4+ | 4+ | 1 + | |
| 44 | Αΐ3βνβΓ3 | н.о. | Н.О. | н.о. | Н.О. | Н.О. | н.о. |
| Се1!з1аЬ™ | 4+ | 2+ | νν+ | 4+ | 2+ | νν+ |
Аббревиатура: не определяли, 0 -сплаттер
- 44 013183
Таблица 41
Исследование стабильности ВВС, трансформированных А.|р1[|-5р-Аб-ЭОРЕ (I) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли на ЭЁатеб гель-картах
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-А | Биоклон анти-А | ||||
| Концентрация раствора для трансформации (мг/мл) | |||||||
| 1 | 0,5 | 0,25 | 1 | 0,5 | 0,25 | ||
| 2 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4* |
| Се1151аЬ'“ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 10 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
| Се11з1аЬ|К* | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 17 | А1зеуега | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
| СеПзкаЬ™ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 24 | ΑΙδβνβτβ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ |
| СеИз1аЬ™ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 45 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
| Се11з1аЬ|М | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 59 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | ||
| Се11з1аЬ!М | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 73 | ΑΙδβνβΓδ | ||||||
| Се11з(аЬ'“ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 88 | ΑΙδβνβΓδ | ||||||
| Се11з1аЬ|М | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования, контрольные опыты прекращали.
Таблица 42
Исследование стабильности ВВС, трансформированных А.|р1[|-5р-Аб-ЭОРЕ (I) при низких концентрациях (0,1, 0,05 и 0,025 мг/мл). Агглютинацию определяли на ЭЁатеб гель-картах
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-А | Биоклон анти-А | ||||
| Концентрация раствора для трансформации (мг/мл) | |||||||
| 0,1 | 0,05 | 0,025 | 0,1 | 0,05 | 0,025 | ||
| 2 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 1 + |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 1 + | |
| 8 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1 + |
| Се1151аЬ,м | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1 + | |
| 15 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+/2+ | 1 + |
| Се1181аЬ1М | 4+ | 4+ | 0 | 4+ | 4+ | 1 + | |
| 22 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 3+/2+ | 0 | 4+ | 3+ | и+ |
| Се11з1аЬ||И | 4+ | 4+ | 0 | 4+ | 4+ | 1 + | |
| 29 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | и<+ |
| Се11в1аЬ™ | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 2+ | |
| 43 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 4+/3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1 + | |
| 50 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 3+ | νν | 4+ | 4+· | 2+ |
| СеМЙаЬ™ | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+ | 1 + | |
| 57 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 3+/2+ | 4+ | 4+ | ||
| Се11в(аЬ|М | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 3+ | уу+ | |
| 63 | ΑΙδβνβΓδ | ||||||
| Се11в(аЬ1М | 4+/3+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 0 | |
| 71 | ΑΙδβνβΓδ | ||||||
| Се11б1аЬ|М | 4+/3+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 0 | |
| 86 | ΑΙδβνβΓδ | ||||||
| Се11б1аЬ™ | 4+/3+ | 2+ | 0 | 4+ | 3+ | 0 |
Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования, контрольные опыты прекращали.
- 45 013183
Таблица 43
Исследование стабильности ВВС, трансформированных Λ.,.ρ,,-φ-Λά-ΟΟΡΕ (VI) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-А | Биоклон анти-А | ||||
| Концентрация раствора для трансформации (мг/мл) | |||||||
| 1 | 0,5 | 0,25 | 1 | 0,5 | 0,25 | ||
| 2 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 3+ | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + |
| Се118(аЬ™ | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | |
| 9 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 3+ | 2+ |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
| | 16 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
| Се1181аЬ™ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
| 23 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
| СеНЙаЬ* | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 30 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 3+ | 2+ | з+° | 3+ΰ | 2+ | |
| 37 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 2+ | 1 + | 3+ | 2+ | 1 + |
| Се11в1аЬ‘м | 3+ | 3+ | 2+/1 + | 4+и | 3+ | 1 + | |
| 44 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 3+ | 1 + | 3+ | 3+ | |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 4+ | н,о. | 4+ | 4+ | +* | |
| 51 | ΑΙδβνβΓδ | 3+ | 3+ | 2+ | 4+ | 3+ | 2+ |
| СеПз^аЬ™ | 4+ | 4+ | н.о. | 4+ | 4+ | 2+ |
Аббревиатуры: 0 - сплаттер
Таблица 44
Исследование стабильности ВВС, трансформированных ВΤρИ-8р-Αά-^ΟРΕ (VI) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли на Э|атей гель-картах
| День | Раствор для хранения клеток | Албаклон анти-А Биоклон анти-А | |||||
| Концентрация раствора для трансформации (мг/мл) | |||||||
| 1 | 0,5 | 0,25 | 1 | 0,5 | 0,25 | ||
| 2 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
| Се11з1аЬ||Л | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
| 9 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ |
| Се11з1аЬ|М | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 16 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 1 + |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 23 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
| Се11б1аЬ™ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 30 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
| Се11з1аЬ™ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 37 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ |
| Се11з1аЬ,м | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 44 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 3+ |
| СеНз^аЬ'^ | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 4+/3+ | |
| 51 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 3+ |
| СеПз1аЬ,м | 4+ | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 58 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 1 + | 4+ | 2+ | ||
| СеЙ81аЬ,м | 4+ | 4+ | 2+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
| 72 | ΑΙδβνβΓδ | 4+ | 2+ | 4+ | 3+ | ||
| Се11з1аЬ'м | 4+ | 4+ | 3+/2+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 87 | ΑΙδβνβΓδ | ||||||
| ΓΟβίϊδΰΕ™ | 4+ | 4+/3+ | 1 + | 4+ | 4+/3+ | 2+/1 + | |
| 116 | ΑΙδβνβΓδ | ||||||
| Се11б1аЬ'м | 4+ | 3+ | 0 | 4+ | 4+/3+ | 1 + |
- 46 013183
Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования, контрольные опыты прекращали.
Пример 9. Трансформация эритроцитов Н-антигенными синтетическими гликолипидами.
Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные Н|р1[|-5р-Ай-ООРЕ (VII), Нди-8р-АйΌΟΡΕ (VIII) и Саф-кр-Ай-ЭОРЕ (IX), получали согласно методу, описанному в примере 1, с необходимыми модификациями.
Промытую эритроцитарную массу мышиных ЕВС (3 об.ч.) и растворы синтетических гликолипидов (1 об.ч. варьирующихся концентраций) добавляли к пробирке Эппендорфа. Пробирку инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 1 ч, перемешивая каждые 15 мин. Трансформированные ЕВС промывали ЗхРВС и затем суспендировали в Се1к!аЬ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Результаты пробирочной серологии и анализа на Ωίαιικά гель-картах для ЕВС, трансформированных различными синтетическими гликолипидами, представлены в табл. 46. Результаты показывают, что три сахара (Н^) требуется для детектирования анти-Н ЦМ. по меньшей мере, применяемым реагентом.
Таблица 45 Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 46
| Антисыворотки | Изготовитель | Партия |
| Анти-Н 1дМ | 1арапезе Рей Сгозз | ΗΙΚΟ-75 |
| ВЕА | 1_огпе 1_аЬога1опез | 11549Е ϋ.Ο.Ε.06.2004 |
| Βϊο-υΕΑ | ΕΥ ЬаЬз | 201105-2 |
Таблица 46 Сравнение трансформации ЕВС с применением Н-антигенных синтетических гликолипидов с различными гликотопами, приготовленными при различных концентрациях
Синтетич. Конц. Н-антисыворотка
| гликолипид | мг/мл | 1д м | ΙΙΕΑ | Βϊο-иеа | ||
| Пробирка | ϋίθΓηεά | Пробирка ТО | Пробирка Т20 | Пробирка | ||
| Нтри-зр-АйϋΟΡΕ (VII) | 1 | н.о. | Н.о. | 2+ | Н.О. | 2+ |
| 0,25 | 4+ | 3+ | н.о. | н.о. | 1 + | |
| 0,1 | 3+ | 2+ | Н.О. | н.о. | Н.О. | |
| 0,05 | 1 + | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | |
| 0,01 | 0 | 0 | Н.о. | н.о. | н.о. | |
| НдВ-8р-АЙϋΟΡΕ (VIII) | 0,25 | 0 | н.о. | Н.о. | н.о. | н.о. |
| 0,1 | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | н.о. | |
| 0,05 | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | н.о. | |
| 0,01 | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | н.о. | |
| Оа1р-зр-АйϋΟΡΕ (IX) | 0,25 | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | н.о. |
| 0,1 | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | н.о. | |
| 0,05 | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | н.о. | |
| 0,01 | 0 | н.о. | н.о. | н.о. | н.о. | |
| О клетки человека | 4+ | н.о. | 1 + | 2/3+ | 4+ | |
| Инкубиров энный контроль | 0 | н.о. | 0 | 0 | Н.О. | |
| Лаборат. контроль | 0 | н.о. | н.о. | Н.О. | н.о. |
Аббревиатура: н.о. - не определяли
Пример 10. Встраивание синтетических липидов Нди-8р-Ай-ООРЕ (VIII) и Саф-кр-Ай-ЭОРЕ (IX) в мышиные эритроциты.
Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные Нда-8р-Ай-ЭОРЕ (VIII) и Саф-зр-АйЭОРЕ (IX), получали согласно методу, описанному в примере 1, с необходимыми модификациями.
- 47 013183
Мышиные ВВС промывали 3х в 1хРВ8. 30 мкл эритроцитарной массы ВВС смешивали с 30 мкл Нда-кр-Аё-БОРЕ (VIII) и 30 мкл эритроцитарной массы ВВС смешивали с 30 мкл Саф-кр-Аё-БОРЕ (IX) соответственно. Обе синтетические молекулярные конструкции применяли при концентрации 1,0 мг/мл. 30 мкл 1хРВ8 добавляли к 30 мкл эритроцитарной массы ВВС для действия в качестве контрольной группы. Клетки инкубировали в течение 90 мин во встряхиваемой водяной бане при 37°С. ВВС промывали 3х в 1хРВ8.
Три группы эритроцитарной массы ВВС инкубировали в равном объеме лецитина ИЕА-1 в течение 30 мин при комнатной температуре. Лецитин получали в 1хРВ8 при концентрации 1 мг/мл. 50 мкл 3% клеточной суспензии вращали в течение 15 с в иммунофуге при низкой скорости. Результаты считывали пробирочной серологией. Результаты представлены в табл. 48. Результаты показывают, что ни анти-Н ^М, ни ИЕА-1 не детектирует два сахара (Нди).
Таблица 47 Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 48
| Антисыворотки | Изготовитель | Партия |
| Биотест анти-Н | ΒίοΙθδί АС | |
| иЕА | ΕΥ 1_аЬз | 201105-2 |
Таблица 48
Мышиные ВВС, трансформированные Са13-кр-Аё-БОРЕ или Нди-кр-Аё-БОРЕ, оцененные агглютинацией
| Тип клеток | Встроенная молекула | С1ЕА-1 | Мышиный 1дМн |
| Мышиные ВВС | <Эа1р (1 мг/мл) | 0 | н.о. |
| Мышиные ВВС | Нди (1 мг/мл) | 0 | 0 |
| Мышиные ВВС | Контроль (РВЗ) | 0 | 0 |
| ВВС человека | Контроль (РВ5) | 4+ | 3+ |
Аббревиатуры: и.о. - не определяли
Пример 11. Получение контролей чувствительности.
Синтетические гликолипиды изобретения можно применять при получении «контролей чувствительности» (называемых также «клетками контроля качества», «контролями серологии» или «контролями способа»), как описано в описании, прилагаемом к международной патентной заявке № РСТ/ΝΖ 02/00214 (\УО 03/034074). Синтетические гликолипиды обеспечивают преимущество, состоящее в том, что трансформация ВВС может быть достигнута при пониженных температурах.
Растворы для трансформации ВВС.
Применяют два исходных раствора.
Раствор 1: 1 мг/мл А^кр-Аё-БОРЕ (I), суспендированного в растворе Се1ргеко1™.
Раствор 2: 5 мг/мл Бтри-кр-Аё-БОРЕ (VI), суспендированного в растворе Се1ргеко1™.
Гликолипиды получали в виде белого сухого порошка. Гликолипиды в этой форме (заключенные в герметизированный контейнер при регулируемой температуре) являются стабильными в течение неограниченного периода времени. Гликолипиды суспендируют в растворе (например, Се1ргеко1™) по массе, чтобы приготовить растворы для трансформации.
После того как растворы для трансформации получают при С8Ь, их фильтруют (через фильтр 0,22 мк МI^^ЕX®-СV) в асептических условиях.
Процессинг ВВС.
Доноров ВВС обрабатывают с применением устройства-центрифуги для мойки с непрерывным потоком в асептических условиях. Доноров ВВС промывают в забуференном солевом растворе, затем в растворе Се1ргеко1™. РС¥ доноров ВВС измеряют на анализаторе Весктап СоиЙег АсТ Б1ГТ Объем доноров затем регулируют до 50% объема эритроцитарной массы (РСУ) добавлением Се1ргеко1™.
Трансформация ВВС для получения «клеток со слабой экспрессией АВ».
ВВС промывают в буферном солевом растворе и Се1ргеко1™. Клетки суспендируют в растворе Се1ргеко1™ до >50% РС¥. РС¥ эритроцитов измеряют с применением Весктап СоиЙег АсТ ΩίΓΓ. Массу раствора эритроцитов определяют взвешиванием.
Количество А^кр-Аё-БОРЕ (I), В.|р[|-кр-Аё-ООРЕ (VI) и Се1ргеко1™ для трансформации вычисляют с применением следующих уравнений:
- 48 013183 а= РхГ с=Р-(1 -Р)-а-Ь где а равно количеству Атри-δρ-Αά-ΌΟΡΕ (I), которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл),
Ь равно количеству Втри-δρ-Αά-ΌΟΡΕ (VI), которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл), с равно количеству СсфгсюГ™. которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл), чтобы развести клетки до 50% ΡСV,
Р равно ΡΟΫ раствора эритроцитов,
Е равно конечной требуемой концентрации гликолипида, равно концентрации исходного раствора гликолипида.
Для определения количества гликолипида и Се1ρ^е8ο1™, которое нужно добавить к объемной массе образца эритроцитов, каждое из чисел а, Ь и с умножают на объем эритроцитов. К объемной массе образца в асептических условиях добавляют Атри-δρ-Αά-ΌΟΡΕ (I), β-φ.-φ-Αά-ΟΟΡΕ (VI) и ΤοΙρίΌδοΓ™.
Образец инкубируют в течение 3 ч при 20°С в регулируемых температурных условиях и постоянном осторожном перемешивании. В конце периода 3 ч в асептических условиях отбирают образец эритроцитов и образец тестируют для подтверждения трансформации КВС. Определение группы крови проводят с применением методик пробирочной реакции агглютинации, агглютинации на керамической плитке или технологии колоночной агглютинации (ί'ΆΤ).
Образец эритроцитов инкубируют в течение 3 ч при 2-8°С в регулируемых температурных условиях и постоянном осторожном перемешивании в течение 18 ч. В конце 3-часового периода в асептических условиях отбирают образец эритроцитов и образец тестируют для подтверждения трансформации эритроцитов. Определение группы крови проводят с применением пробирочной методики, методики на керамической плитке и СΑΤ.
Трансформированные эритроциты промывают с применением метода центрифугирования с непрерывным потоком в асептических условиях и с применением раствора ίχΙρίΌδοΓ™. Измеряют ΡСV промытых эритроцитов и величину регулируют до 50% ΡΟΫ добавлением раствора ίχΙρίΌδοΓ™.
Препарат и его распределение.
В асептических условиях объем трансформированных КВС объединяют с объемом имитирующей разбавитель плазмы (8ΡΌ). Плазма может содержать моноклональные и поликлональные антитела. Антитела выбирают согласно требуемым характеристикам контролей чувствительности. Плазма может дополнительно содержать тартразин и бычий сывороточный альбумин.
Определение группы и скрининг антител проводят на образцах массы с применением пробирочной методики, методики на керамической плитке и СΑΤ. Затем смесь трансформированных КВС-δΡΟ в асептических условиях распределяют в пробирки ВО Vасиίа^ηе^ и пробирки соответственно метят.
Тестирование валидности.
Клетки со слабой экспрессией АВ, продуцированные с применением синтетических гликолипидов (обозначенных Α^ν в табл. 51-53), применяли для обоснования диапазона платформ для тестирования параллельно с существующими в природе клетками со слабой экспрессией А, В и АВ.
Таблица 49
Реагенты и карты, применяемые при валидации тестирования
| Метод | Реагент | ||
| Пробирки | Эпиклон | ||
| Плитки | Эпиклон | ||
| Κβΐ | Изготовитель и тип | Партия | Дата окончания |
| САТ 1 | ОСО ВюХ/ие ΑΒϋ/Κβν | АВК528А | 16.06.05 |
| САТ 2 | ОСО ВюУие ΑΒΟ/Ρβν | АВР521А | 06.05.06 |
| САТЗ | ОСО ВюУие ΑΒϋ/ΑΒΟ | АСС255А | 24.05.05 |
| САТ 4 | О|ате6 ΙΟ-ΜΤ3 | 50092.10.02 | Апр.-05 |
| САТ 5 | Типирование донора ϋίθπιβά Ю-МТ8 | 51051.05.04 | Май-05 |
| САТ 6 | Типирование реципиента О|атес1 Ю-МТ8 | 50053.07,02 | Апр.-05 |
| САТ 7 | Типирование клеточного столбика О|атес! Ю-МТ8 | 50961.08.03 | Июль-05 |
- 49 013183
Таблица 50
Методология платформы тестирования для валидации тестирования
| Плитка | 1 капля 3% клеток, 2 капли реагента, 15 мин при к.т. во влажной камере |
| Пробирка | 2 капли при к.т., 10 мин |
| Ю-МТЗ | Как по инструкциям изготовителя с применением ϋΗ-2 |
| В|'оУие | Как по инструкциям изготовителя с применением 0,8% ΡΟϋ |
Таблица 51
Результаты валидации всех методов против анти-А
| Клетка | Тип | Платформа тестирования | ||||||||
| Пробирка | Плит- ка | САТ 1 | САТ 2 | САТ 3 | САТ 4 | САТ 5 | САТ 6 | САТ 7 | ||
| 1 | А, | νν+ | 0 | 2+ | 1 + | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 2 | Αχ | νν+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 3 | Α3Β | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
| 4 | Αχ | «+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 5 | АгВ | 3+ | 3+ | 4+ | 3+ | 3+ | 1 + | 2+ | 3+ | |
| 6 | Αχ | И/+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 7 | Αχ | 1 + | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 8 | Αχ | νν+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 9 | Ах | 0 | 0 | 1 + | 1 + | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 10 | Αχ | «+ | 0 | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 11 | Аз | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 1 + | 1 + | 3+ | |
| 12 | А3В | 3+ | 3+ | 3+ | 3+ | 2+ | «+ | И/+ | 2+ | |
| 13 | Вз | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 14 | Вз | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 15 | А„ВЖ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
Таблица 52
Результаты валидации всех методов против анти-В
| Клетка | Тип | Плате | эорма тестирования | |||||||
| Пробирка | Плит- ка | САТ 1 | САТ 2 | САТ 3 | САТ 4 | САТ 5 | САТ 6 | САТ 7 | ||
| 1 | Αχ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 2 | Αχ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 3 | А, В | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 4+ |
| 4 | Ах | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 5 | АгВ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 4+ | |
| 6 | Ах | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 7 | Αχ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 8 | Αχ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 9 | Αχ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 10 | Αχ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 11 | Аз | О | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 12 | А3В | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | |
| 13 | Вз | 2+ | 2+ | 3+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ |
| 14 | Вз | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1 + | 1 + | 2+ |
| 15 | А^В^ | 3+ | 3+ | 1 + | 1 + | 1 + | 0 | 0 | 0 | 0 |
- 50 013183
Таблица 53
Результаты валидации всех методов против анти-АВ
Исследовали возможности осуществлять количественные и качественные различия в антигенах клеточной поверхности экспрессированными типами клеток, другими, чем КВС. Способность повышать адгезию эмбрионов к эндометриальным клеткам принимали как модельную систему.
Синтетические молекулы можно применять в качестве синтетических мембранных якорей и/или синтетических молекулярных конструкций. Следовательно, их можно применять также в способе повышения имплантации эмбрионов, как описано в международной патентной заявке № РСТ/ΝΖ 2003/000059 (опубликована как \УО 03/087346), которая включена в качестве ссылки.
Трансформация эндотелиальных клеток.
Встраивание водорастворимой синтетической молекулярной конструкции.
Получали суспензию отдельных эндометриальных эпителиальных клеток. Эндометриальные клетки промывали 3х ресуспендированием в СМЕ НВ88 и центрифугированием при 2000 об./мин в течение 3 мин.
Препарат промытых клеток ресуспендировали в 50 мкл М2.
Получали пробирки микроцентрифуги, причем каждая из них содержала 50 мкл раствора 5М/мл эндометриальных клеток. К отдельным пробиркам эндометриальных клеток добавляли 50 мкл синтетических гликолипидов А^.^-хр-АД-БОРЕ (I) или β.φ,-хр-АД-БОРЕ (VI) или 50 мкл М2 добавляли к контрольным клеткам. Клетки инкубировали в течение 90 мин при 37°С на смесителе. Эндометриальные клетки промывали 3х ресуспендированием в среде СМЕ НВ88 и центрифугированием при 2000 об./мин в течение 3 мин. Препарат промытых клеток ресуспендировали в 50 мкл М2. Тест на встраивание с применением флуоресцентного зонда: 50 мкл соответствующего первичного мышиного моноклонального антитела добавляли к каждой пробирке. Каждую пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Клетки промывали 3х в среде М2. 10 мкл мышиного антиАдС ЕГГС добавляли к каждой пробирке. Пробирки инкубировали при комнатной температуре в темных условиях в течение 10 мин. Эндометриальные клетки помещали на предметные стекла и рассматривали под флуоресцентным микроскопом. Тест для прямой агглютинации: 5 мкл каждой группы клеток помещали на отдельные предметные стекла микроскопа. К каждой 5 мкл капле клеток добавляли 5 мкл соответствующего антитела. Клетки осторожно смешивали на предметном стекле в течение 2 мин. Агглютинацию визуально наблюдали под микроскопом. Результаты представлены в табл. 55.
- 51 013183
Таблица 54
Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 55
| Антисыворотки | Изготовитель | |
| Биоклон анти-А | Огбзо О|адпо8Гю5 | 01102. ϋ.Ο.Μ. 16.05.02 |
| Биоклон анти-В | Ог(Ьо ϋίβρηοδΓιοδ | Оеуе1ортеп1а1 геадегй |
Таблица 55 Эндометриальные клетки, трансформированные АΤρИ-8р-Аб-^ΟΡΕ (I) или ВΤρИ-8р-Аб-^ΟΡΕ (VI), визуализируемые с применением флуоресценции
| Тип клеток | Встроенный антиген | Антитело 1и | Флуоресцентный подсчет после инкубации с зондом 1дР1ТС | Реакция агглютинации, определяемая микроскопической визуализацией |
| Эндометриальные клетки | Атри-зр-Ас1ϋΟΡΕ (1)(1 мг/мл) | Биоклон анти-А | 4+ | 4+ |
| Эндометриальные клетки | Βτρκ-ερ-ΑάЭОРЕ (У1)(1 мг/мл) | Биоклон анти-В | 1 + | 3+ |
| Эндометриальные клетки | Контроль (среда М2) | Биокпон анти-А | 0 | 0 |
Модификация эмбриона.
Встраивание водорастворимой синтетической молекулярной конструкции.
Прозрачную зону эмбрионов удаляли обработкой эмбрионов 9,5% протаназой в термостате при 37°С в течение 6 мин или до тех пор, пока не будут удалены все зоны. Микрокапли получали добавлением 5 мкл синтетического гликолипида А.ιр[ι-8р-Аб-^ΟΡΕ (I) или Втри-кр-Аб-ΌΟΡΕ (VI) при концентрации 1 мг/мл к 45 мкл капле среды М2, покрытой минеральным маслом. Все группы эмбрионов инкубировали в 50 мкл микрокапель в течение 1 ч при 37°С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали 3х средой М2.
Тест на встраивание.
Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп помещали в микрокаплю соответствующего антитела и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали 3х средой М2.
Эмбрионы из всех экспериментальных и контрольных групп помещали в микрокапли антимышиного ЕГГС (разведение 1:50 антимышиного ЕГГС в М2) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали 3х средой М2. Эмбрионы помещали на предметные стекла микроскопа в 5 мкл каплю М2 и капли покрывали маслом.
Предметные стекла изучали под флуоресцентным микроскопом. Результаты представлены в табл. 56 и 57. Отрицательный результат для трансформации В.ιр[ι-8р-Аб-^ΟΡΕ (VI) относят к отсутствию чувствительности у антитела 1°.
Таблица 56 Эмбрионы, трансформированные Атри-кр-Аб-ΟΟΡΕ (I), визуализуемые с применением флуоресценции
| Тип клеток | Встроенный антиген | Антитело 1° | Флуоресцентный подсчет после инкубации с зондом 1дГ1ТС | Морфология эмбриона через 24 час. после встраивания |
| Эмбрионы | Атри-зр-АбΰΟΡΕ (ί) | Биоклон анти-А | 2+/1 + | Становится видимой |
| Эмбрионы | Контроль | Биоклон анти-А | 0 | Становится видимой |
- 52 013183
Таблица 57
Эмбрионы, трансформированные Атри-κρ-Λά-ΌΟΡΕ (I) или В^-кр-Аб-ООРЕ (VI), визуализуемые с применением флуоресценции
| Тип клеток | Встроенный антиген | Антитело 1° | Флуоресцентный подсчет после инкубации с зондом 1дЕ1ТС | Морфология эмбриона через 24 час. после встраивания |
| Эмбрионы | Атри-вр-АбϋΟΡΕ (1) | Биоклон анти-А | 2+ | н.о. |
| Эмбрионы | Втри-зр-АбϋΟΡΕ (VI) | Биоклон анти-В | 0 | н.о. |
| Эмбрионы | Контроль (среда М2) | Биоклон анти-А | 0 | н.о. |
Аббревиатуры: н.о. - не определяли
Повышенное прикрепление трансформированных эндотелиальных клеток к модифицированным эмбрионам.
Модифицированные эмбрионы (ΒίοΟ-Ανίάίη-Βίο1§ΟΒ и ΒίοΟ-Ανίάίη-Βίο1§ΜΑ) получали согласно методам, описанным в описании, сопровождающем международную патентную заявку № РСТ/ΝΖ 03/000059 (опубликована как ^003/087346).
Получали два вогнутых предметных стекла, одно с двумя лунками эндометриальных клеток, в которые встроен синтетический гликолипид Атри-8р-Аб-ЭОРЕ (I), и другое с двумя лунками эндометриальных клеток, в которые встроен синтетический гликолипид Втри-кр-Аб-ЭОРЕ (VI).
Две группы эмбрионов переносили в каждое из вогнутых предметных стекол.
Предметное стекло 1 эмбрионы Атри/1дСв эмбрионы Атри/1дМА
Предметное стекло 2 эмбрионы Втр11/1д(Зв эмбрионы Втри/1дМА
Эмбрионы окружали эндометриальными клетками. Лунки покрывали минеральным маслом и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. С применением ручных пипеток с широким просветом каждую группу эмбрионов осторожно переносили в свежую каплю среды М2. Эмбрионы осторожно промывали. Эмбрионы осторожно переносили в 2 мкл среды М2 на маркированном предметном стекле микроскопа. Каждую каплю покрывали минеральным маслом.
Определяли число эндотелиальных клеток, прилипших к эмбрионам в каждой группе, под центральной плоскостью фокуса на микроскопе О1утрик. Число клеток, прилипших к каждому эмбриону, регистрировали. Результаты представлены в табл. 58.
Таблица 58
Эндотелиальные клетки, трансформированные Лт|)[|-кр-Аб-ООРЕ (I) или В.|р[|-5р-Аб-ООРЕ (VI), и эмбрионы, модифицированные ΒίοΟ-Ανίάίη-Βίο1§ΟΒ или ΒίοΟ-Ανίάίη-Βίο1§ΜΑ.
Оценка по прикреплению эндометриальных клеток к эмбрионам
| Тип клеток | Трансформированные эндометриальные клетки | Модифицированные эмбрионы | Среднее число эндометриальных клеток, прикрепленных к модифицированным эмбрионам |
| Эндометриальные клетки | Атри-8р-Ас1-ООРЕ (I) | ΒϊοΟ-Ανϊ6ϊη-Βίο^Ο“ | 2,3 |
| ΒίοΟ-Ανϊάϊη-ΒϊοΙςΜ* | 7.25 | ||
| Эндометриальные клетки | Втри-зр-Аб-ООРЕ (VI) | В1оО-АукИп-В1о1д6ь | 6,7 |
| ВюС-Ау|б1п-В1о1дМА | 3,4 |
Когда в предшествующем описании приведена ссылка на целые числа или компоненты, имеющие известные эквиваленты, то такие эквиваленты включены здесь как-будто указанные индивидуально.
Хотя изобретение было описано путем примеров и со ссылкой на возможные его варианты осуществления, должно быть понятно, что к ним могут быть сделаны усовершенствования и/или модификации, не выходящие за пределы объема или сущности изобретения.
Ссылки
АЬе К., МсК1ЬЬт Ι.Μ. & Ηакοтο^^ §.Ь. (1983) Т11С тοηοс1οηа1 αηΐίόοά}· б1гес!еб ΐο 6ίΓικο5\'1αΚ6 1уре 2
- 53 013183 скат (Еиса1^2Са1)1^4[Еисс1^3]С1сМАс; Υ бе1егтшап1). I. Вю1. Скет. 258: 11793-11797.
Абатапу А.М., В1итеп£е1б О.О., 8аЬо В. & МсСгеагу I. (1983) А сагкокубпИе 81гис1ига1 уапагИ оГ ММ д1усорго1ет (д1усоркогт А). I. В1о1. Скет. 258:11537-11545.
В1апскагб Ό., СаПгоп РР., Роите! В., МоипйеиШ I.. уап На1Ьеек Н. & 'УЪедепШай РР.С. (1983) Рптагу з1гпс1пге оГ 1ке ойдозасскапбе бе1егттап1 оГ Ь1ооб дгоир Саб зресШсйу, I. Вю1. Скет. 258:7691-7695.
Рикиба М., Ье11 А. & Рикиба М., (1984а) 8йис1иге оГ Ге1а1 1ас1озаттод1усап. Тке сагкокубпИе то1е1у оГ Ьапб 3 1зо1а1еб Ггот китап итЬ1кса1 согб егу1кгосу1ез. I. Вю1. Скет. 259:4782-4791.
Рикиба М., Ье11 А., Оа!ез РЕ. & Рикиба М. (1984Ь) 81гпс1пге оГ Ьгапскеб 1ас1озаттод1усап, 1ке сагЬокубпИе то1е1у оГ Ьапб 3 1зо1а1еб Ггот абик китап егу1кгосу1ез. I. Вю1. Скет. 259:8260-3273.
Рикиба М., ЬанГГепЬегдег М., 8азак1 Н., Кодегз М.Е. & Ье11 А., (1987) 81гпс1пгез оГ поуе1 з1а1у1а1еб Окпкеб окдозасскаг1без 1зо1а1еб Ггот китап егу1кгосу1е д1усоркоппз.1. Вю1. Скет. 262:11952-11957.
Рикиба М.Ы., Ье11 А., Оа!ез РЕ., \Уи Р., К1оск РС. & Рикиба М. (1985) 81гис1игез оГ д1усозрЫпдокр1бз 15о1а1еб Ггот китап дгапи1осу1ез. Тке ргезепсе оГ а зепез оГ кпеаг ро1у^-асе1у11ас1озатту1сегаппбе апб кз ыдшйсапсе т д1усокр1бз оГ \гко1е Ь1ооб се11з. I. Вю1. Скет. 260: 1067-1082.
СШагб В.К., В1апскагб Ό., Воикоигз РР., СаПгоп РР., уап Кшк РА., Категкпд РР., V1^едепιкаΠ РР.С. & Магсиз Э.М. (1988) 81гпс1пге оГ а дапдкотбе \\йк Саб Ь1ооб дгоир апйдеп асйуку. Вюскет1зйу, 27: 4601-4604.
Накотоп 8.Р, Мибе1тап Е., Ьеуегу 8.В. & Каппад1 К. (1984) Ыоуе1 Гисойр1бз ассити1айпд т китап абепосагстота. I. С1усШр1бз \νί11ι б1- ог 1пй.1созу1а1еб !уре 2 скат. I. ВюР Скет. 259; 4672-4680.
НапЙапб Р. (1975) Скагас1епзайоп оГ В апб Н Ь1ооб дгоир асйуе д1усозрк1пдойр1бз Ггот китап В егу!кгосу1е тетЬгапез. Скет. Ркуз. Ь1р1бз. 15:105-124.
НапЙапб Р., Когбо\\'1с/ М., Мегтапп Н., Едде Н., Оакго\\'зк| и., Ре1ег-Ка1а1пйс I. & Оакго\\'зк| I. (1984) Рипйсайоп апб зйисШгез оГ Ьгапскеб Ь1ооб-дгоир-В-асЙуе д1усозрЫпдо11р1бз Ггот китап егу!кгосу1е тетЬгапез. Еиг. I. Вюскет. 145: 531-542.
НапЙапб Р., Когбо\\'1сх М., Ре1ег-Ка1а1кпс I., РГашъскппб! С., СгаМогб К.Р, Сгакат Н.А. & Едде Н. (1986) [ттипоскетМгу оГ !ке ЬеМз Ь1ооб-дгоир зуз1ет: 1зо1айоп апб зйисШгез оГ ЬеМз-с асйуе апб ге1а!еб д1усозрк1пдойр1бз Ггот !ке р1азта оГ Ь1ооб-дгоир О Ье(а-Ь-) попзесгеЮгз. Агск. Вюскет. В1оркуз. 246: 655-672.
Нйата Ν., Тзиуиока К., Ы Υ.Τ., Тапака М., 8епо Т., ОкиЬо Υ., Рикиба Υ., Πηνιη Н. & Каппад1 К. (1990) Сапд1юз1без апб з1а1од1усорго1етз саггушд а гаге Ь1ооб дгоир апйдеп бе1егттап1 Саб, аззос1а1еб \νίΐ1ι китап сапсегз аз бе1ес1еб Ьу зресШс топос1опа1 апйЬоб1ез. Сапсег Кез. 50: 5497-5503.
Каппад1 К., М.1бе1тап Е., Ьеуегу 8.В., & Накотоп 8.Р (1982) А зепез оГ китап згу1кгосу1ез д1усозрЫпдокр1бз геасйпд !о !ке топос1опа1 апйЬобу бйес1еб !о а беуе1ортеп!а11у гедик-Иеб апйдеп, 88ЕА-1. I. Вю1. Скет. 257: 14865-14874.
Ке\\йх 8., Сгор Н.Р, Коза К. & Кое1ске Ό. (1995) Апй=Рг со1б адд1ийшпз гесодшзе пптипоботтагИ α2,3- ог а2,6-з1а1у1 дгоирз оп д1усоркоппз. С1усосоп. I. 12: 714-720.
Козс1е1ак I., МШег-Робгаха Н., Кгапхе К. & Р1азек А. (1976) Ьок-Шоп апб скагас!епзайоп оГ ро1у(д1усозу1)сегат1без (теда1од1усокр1бз) \\йк А, Н, апб I Ь1ооб дгоир асЙуШез. Еиг. I. Вюскет. 71:9-18.
Ьате К.А. (1994) ^кеб соттеШагу. С1усоЬю1 4: 759-767.
Ыбо\\'зка Е., Ьик М. & Ьакг XV. (1980) Сотрапзоп оГ а1ка11-1аЬбе ойдозасскапбе скатз оГ М апб N Ь1ооб-дгоир д1усорерйбез Ггот китап егу1кгосу1е тетЬгапе. СагЬокубг. Кез. 79: 103-113.
Ь1оуб К.О. & КаЬа! Е.А. (1968) Iттипоскет^са1 з1пб1ез оп Ь1ооб дгоирз. ХЬЬ Ргорозеб зйисШгез Гог !ке сагкокубпИе рогкопз оГ Ь1ооб дгоир А, В, Н, ЬеМза, апб ЬеМзЬ зпкз1апсез. Ргос. Νη11. Асаб. 8т И8А. 61: 1470-1477.
ЬипбЫаб А. (1977) Иппагу д1усорго1етз, д1усорерйбез, апб ойдозасскапбез. Ш: Тке С1усосоп)пда1ез Ебз Ного\\'кх М.Р & Р1дтап V. Уо1 1: 441-458.
Мадпаш РЬ., Шззоп В., Вгосккаиз М., 2орГ Ό., 81ер1е\\'з1й Ζ., Корго\\'зк| Н. & СтзЬигд V. (1986) А топос1опа1 апйЬобу-бейпеб апйдеп аззоскИеб \νίΐ1ι дазйот1езйпа1 сапсег 1з а дапдкоз1бе согИапйпд зк-11у1а!еб 1ас1о-№Гисореп1аозе II. I, ВюР Скет. 257:14365-14369.
М.1бе1тап Е., РикизЫ Υ., Ьеуегу 8.В., Н1диск1 Т. & Накотоп 8.Р (1986) №уе1 Гисокр1бз оГ китап абепосагстота: б1зк-11оу1 Ьеа апйдеп (Ш4РисШ4№иАсГУ3№иАсЬс4) оГ китап со1опю абепосагстота апб !ке топос1опа1 апйЬобу (РН7) бейшпд 11пз з1гпс1пге. I. ВюР Скет. 261:5487-5495.
81от1апу А., ΖбеЬзка Е. & 81от1апу В.Ь. (1984) 81гпс1пгез оГ !ке пеийа1 ойдозасскапбез 1зо1а1еб Ггот А-асЙуе китап даз(г1с тист. I. Вю1. Скет. 259:14743-14749.
Таказак1 8., Уатазкка К. & КоЬа!а А. (1978) Тке зидаг скат зйисШгез оГ АВО Ь1ооб дгоир асйуе д1усоргсИетз оЫатеб Ггот китап егу1кгосу!е тетЬгапе. I. ВюР Скет, 253: 6086-6091.
Тапака М., Ьпке У.Е. & Апбегзоп В. (1984) 8йис1игез оГ ойдозасскапбез с1еауеб Ьу Ьазе-Ьогокубпбе Ггот ап I, Н, апб Ьеа асйуе оуапап суз! д1усорго1ет. ВюсЫт. Вюркуз. Ас!а. 798: 283-290.
Ткотаз Ь.В. & νίπζΕτ К.1. (1969) 81гпс1пга1 з1пб1ез оп китап егу1кгосу!ез д1усорго1ет. А1кай-1аЬйе ойдозасскапбез. I. Вю1: Скет, 244: 5943-5946.
Vаίктз №.М. (1966) В1ооб дгоир зиЬз!апсез. 8тепсе. 152:172-181.
- 54 013183
УокЫта Н., Гиййтауг Η. & КоЬа!а А. (1980) 81гис1иге8 о£ (Не а5рагадте-1ткей кидаг сНапъ о£ д1усорНопп А. 1. Вю1. Скет. 255: 9713-9718.
Claims (74)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция структурыГ-81-82-Ь, где Г выбран из группы, состоящей из углеводов;81-82 представляет собой спейсер, связывающий Г с Ь;Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды; иГ, 81, 82, Ь ковалентно связаны.
- 2. Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацилглицеролипидов.
- 3. Синтетическая молекулярная конструкция по п.2, где Ь выбран из группы, состоящей из фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5гексадеценовой кислоты, цис-7-гексадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13докозеновой кислоты.
- 4. Синтетическая молекулярная конструкция по п.3, где липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот.
- 5. Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где Ь выбран из группы, состоящей из 1,2-О- диолеоил-8п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (ΌΟΡΕ) и 1,2-О-дистеарил-кп-глицеро-3фосфатидилэтаноламина (Ό8ΡΕ).
- 6. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-5, где Ь представляет собой глицерофосфолипид, и синтетическая молекулярная конструкция включает в себя субструктуру о о О где η равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н.
- 7. Синтетическая молекулярная конструкция по п.6, где η равно 3.
- 8. Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где синтетическая молекулярная конструкция спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор синтетической молекулярной конструкции контактирует с липидным бислоем.
- 9. Синтетическая молекулярная конструкция по п.8, где синтетическая молекулярная конструкция стабильно включается в липидный бислой.
- 10. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-9, где Г выбран из группы, состоящей из синтетических гликотопов.
- 11. Синтетическая молекулярная конструкция по п.10, где Г представляет собой синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев сахаров.
- 12. Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где Г представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда олигосахаридов лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила.
- 13. Синтетическая молекулярная конструкция по п.12, где Г выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахараСа1МАса1-3(Еиса1-2)Оа1р; Са1а130а!р; Са1Р; Са1а1-3(Еиса1-2)Са1Р; ЫеиАса2-ЗСа!р; ЫеиАса2-60а!р; Еиса1-2С5а1р; Са! р1-4С1сМАср1-6(Са1р1-4С1сЫАср1-3)Са1р; Риса1-2Са1р1-4С1сМАср1-6(Еиса1-23а1р14С1сМАср1-3)Са1Р; Риса1-23а1р1-431сЦАср1-б(МеиАса2-ЗЗа1р1-431сМАср1-3)За1р; ЫеиАса2-ЗСа1р1-431сМАср1-6(МеиАса2-ЗСа1р1-4С1сЫАср1-3)Са1р; 3а1а1-33а1р1431с; За1НАср1-30а1а1-43а1р1-431с; За1ЫАса1-ЗЗа1ЦАср1-ЗЗа1а1-43а1р1-401с или Са1МАср1-36а1ЫАср1-36а1а1-46а1Р1-431с.
- 14. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-13, где, когда Г представляет собой гликотоп, Ь представляет собой глицерофосфолипид и 82 выбран из группы, включающей в себя- 55 013183СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН;),СО- и -С(О(С11;),\НСО)(С11;),СО-.
- 15. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-14, где 81 представляет собой С35аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-амино пентила.
- 16. Синтетическая молекулярная конструкция по п.15, где 81 представляет собой 3-аминопропил.
- 17. Синтетическая молекулярная конструкция по п.14, имеющая структуру обозначенную Атри-8р-Аб-ЭОРЕ (I), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как №+, К+ или ΝΗ4 +.
- 18. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру обозначенную Атри-8р8Р1-Аб-ЭОРЕ (II), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Νη', К+ или ΝΗ4 +.
- 19. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру обозначенную Атри-5р-Аб-Э8РЕ (III), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как №1'. К+ или ΝΗ4 +.
- 20. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру обозначенную Втр[|-5р-Аб-ООРЕ (VI), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим- 56 013183 одновалентным катионом, таким как Να', К+ или ΝΗ4 +.
- 21. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру обозначенную Н.|р[|-хр-АД-БОРЕ (VII), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να', К+ или ΝΗ4 +.
- 22. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру обозначенную Нди-хр-АД-БОРЕ (VIII), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να+, К+ или ΝΗ4 +.
- 23. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру (СНгЬСНз (СНУтСНз обозначенную Са1β1-хр-АД-^ОΡЕ (IX), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να+, К+ или ΝΗ4 +.
- 24. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру обозначенную Еисα1-2Са1β1-3С1сNАсβ1-3Са1β1-4С1сNАс-хр-АД-^ОΡЕ (XII), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να', К+ или ΝΗ4 +.
- 25. Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру обозначенную Еисα1-2Са1β1-3(Еисα1-4)С1сNАс-хр-АД-^ОΡЕ (XIII), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Να', К+ или ΝΗ4 +.
- 26. Способ получения водорастворимой синтетической молекулярной конструкции структуры Е-81- 57 01318382-Ь, включающий в себя следующие стадии: реакцию активатора (А) с липидом (Ь) с образованием активированного липида (А-Ь); дериватизацию антигена (Ρ) с получением дериватизированного антигена (Ρ-81) и конденсацию А-Ь с Ρ-81 с получением конструкции, в которойА представляет собой активатор, выбранный из группы, включающей в себя бис-(Ыгидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис-(пентафторфенил), бис-(пентахлорфениловые) эфиры карбодиовых кислот (С3-С7);Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды;Ρ выбран из группы, состоящей из углеводов;81-82 представляет собой спейсер, связывающий Ρ с Ь, где 81 выбран из группы, включающей в себя первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин, и 82 отсутствует или выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат) и СО(СН2)5СО-; иΡ, 81, 82 и Ь ковалентно связаны.
- 27. Способ по п.26, где Ь представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацилг лицеролипидов.
- 28. Способ по п.27, где Ь выбран из группы, состоящей из фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7гексадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты.
- 29. Способ по п.28, где липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот.
- 30. Способ по п.26, где Ь выбран из группы, состоящей из 1,2-О-диолеоил-§и-глицеро-3фосфатидилэтаноламина (ПОРЕ) и 1,2-О-дистеарил-§п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (Ό8ΡΕ).
- 31. Способ по любому из пп.26-30, где Ь представляет собой глицерофосфолипид и синтетическая молекулярная конструкция включает в себя субструктуру где η равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н.
- 32. Способ по п.31, где η равно 3.
- 33. Способ по любому из пп.26-32, где Ρ представляет собой синтетический гликотоп.
- 34. Способ по п.33, где Ρ представляет собой синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев сахаров.
- 35. Способ по п.26, где Ρ представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда олигосахаридов лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила.
- 36. Способ по п.35, где Ρ выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара6а1МАссс1-3(Еиса1-2)6а1р; Са1а1-ЗСа1р; 6а1р; Са1а1-3(Еиса1-2)Са1 β; ИеиАса2-ЗСа!р; ЫеиАса2-6Са!р; Риса1-2Са1р; Са1р1-4С1сЫАср1-6(<За1р1-4С1сМАср1-3)Са1р; Еиса1-2Са1р1-4С1сМАср1-6(Риса1-26а1р1-461сНАср1-3)Са1р; Риса1-2Са!р1-4в1сЫАср1-6(ЫеиАса2-Зба1р1-4С31сМАср1-3)СЗа1Р; ЫеиАса2-ЗСа1р1-4С1сМАср16(ЫеиАса2-ЗСа1р1-4С1сМАср1-3)Оа1р; Са1а1-ЗСа1р1-4е1с; Са1МАср1-ЗСа1а1-4Са1р14О1с; Оа1МАса1-36а1МАср1-ЗСа(а1-4Са1р1-4С1с или Са1ЫАср1-ЗСа1МАср1-ЗСа1а140а|р1-4С1с.
- 37. Способ по любому из пп.26-36, где, 82 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- и СО(СН2)5Р1НСО(СН2)5СО-.
- 38. Способ по любому из пп.26-37, где 81 представляет собой С3-5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила.
- 39. Способ по п.38, где 81 представляет собой 3-аминопропил.
- 40. Водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция, полученная способом по любому из пп.26-39.
- 41. Способ осуществления качественных и/или количественных изменений в поверхностных анти- 58 013183 генах, экспрессируемых клеточной или поликлеточной структурой, включающий стадию контактирования суспензии клеточной или поликлеточной структуры с водорастворимой синтетической молекулярной конструкцией по любому из пп.1-25 или 40 в течение времени и при температуре, достаточных для осуществления качественного и/или количественного изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеточной или поликлеточной структурой.
- 42. Способ по п.41, где клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
- 43. Способ по п.41 или 42, где концентрация водорастворимой синтетической молекулярной конструкции в суспензии находится в диапазоне 0,1-10 мг/мл.
- 44. Способ по любому из пп.41-43, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с водорастворимой синтетической молекулярной конструкцией при температуре в диапазоне 237°С.
- 45. Способ по п.44, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с раствором водорастворимого синтетического мембранного якоря или водорастворимой синтетической молекулярной конструкции при температуре в диапазоне 2-25°С.
- 46. Способ по п.45, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с раствором водорастворимого синтетического мембранного якоря или водорастворимой синтетической молекулярной конструкции при температуре в диапазоне 2-4°С.
- 47. Способ по любому из пп.41-46, где Р выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахараСа1МАса1-3(Еиса1-2)<За1р; Са1а1-ЗСа1р; Са1р;6а1а1-3(Еиса1-2)Саф; ЫеиАса2-36а1Р; ЫеиАса2-6(За1Р; Гиса1-2Са1р; Са1р1-4С1сЫАср1-6(Са1р1-461сМАср1-3)6а1р; Еиса1-2Са1р1-461с№ср1-6(Риса1-2Са1р-М<31сМАср1-3)Са1р; Риса1-2Оа1р1-4С1сМАср1-6(МеиАса2-ЗСа1р1-461сМАср1-3)(За1р; №иАса.2-3(За1 β1 -4ΘΙοΝΑοβ1 -6(№иАса2-ЗСа1р1 -4ΟΙοΝΑεβ1 -3)θ3ΐβ; Са1сс1 -ЗСа1₽1 -4С!с; Са ΙΝΑοβΙ ЗСа1а1-4Са^1-4С1с; θ8ΐΝΑοα1-3Θ3ΐΝΑοβ1-3Θ3ΐα1-4θ3ΐβ1-46Ιο или 6βΙΝΑοβ13Θ3ΐΝΑοβ1-3θ3ΐα1-4θ3ΐβ1-46Φ.
- 48. Способ по п.47, где Р выбран из группы гликотопов, состоящей из олигосахаридов СаШАса13(Риса1-2)Са1р и 6а1а1-3(Риса1-2)6а1р.
- 49. Способ по п.41, где синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себяАтри- зр-Αά-ΟΟΡΕ (I) ι Атри- ερερ-ι-Αά-ΟΟΡΕ (II); А1ри-зр-Ас1ϋ8ΡΕ (III); Втр(,-ар-Ас1-БОРЕ (VI); Нтри-зр-Ас1-ООРЕ (VII); Η.„-δρ-Αά-ϋΟΡΕ (VIII); Са1рδρ-Αά-БОРЕ (IX); Ευοα1-2Θ3Ιβ1-3ΘΙοΝΑοβ1-3θ3ΐβΓ4ΘΙοΝΑο-δρ-Αΰ-ΟΟΡΕ (XII) и Еиса12Са^1-3(Еиса1-4)С1сМАс-вр-Ас1-ООРЕ (XIII).
- 50. Способ по п.41, где клеточной или поликлеточной структурой является эмбрион.
- 51. Способ по п.50, где Р представляет собой молекулу присоединения, где молекула присоединения имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.
- 52. Способ по п.51, где компонент, экспрессированный на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессированным в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
- 53. Способ по п.41, где клеточной или поликлеточной структурой является эритроцит.
- 54. Способ по п.53, где Р представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния.
- 55. Способ по п.54, где Р представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
- 56. Клеточная или поликлеточная структура, включающая водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию по любому из пп.1-25 или 40.
- 57. Клеточная или поликлеточная структура по п.56, где клеточная или поликлеточная структура имеет человеческое или мышиное происхождение.
- 58. Клеточная или поликлеточная структура по п.56 или 57, где клеточной или поликлеточной структурой является эритроцит, включающий водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя- 59 013183БОРЕ (VI); НТри-5р-АД-БОРЕ (VII); Нли-зр-АД-БОРЕ (VIII); Са1р,-зр-АДГООРЕ (IX); Риса1-263ΐβ1-3ΰΙοΝΑοβ1-3Θ3ΐβι-4ΘΙοΝΑο-5ρ-ΑάΌΟΡΕ (XII) и Еиса1-2Са1р1-3(Еиса1-4)01сЫАс-зр-АД-БОРЕ (XIII).
- 59. Клеточная или поликлеточная структура по п.56 или 57, где клеточной или поликлеточной структурой является эмбрион, включающий водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себяАтри-бр-АД-БОРЕ (I); Атри-8р8р1-АД-БОРЕ (II); Атри-зр-АД-Б5РЕ (III); Вгри-8р-АДБОРЕ (VI); НТр„-5р-Аб-БОРЕ (VII); Нди-5р-АД-БОРЕ (VIII); Оа1р,-$р-АД-БОРЕ(1Х); Еиса12Оа1р1-301сЫАср1-Зеа1рг401сЫАс-зр-АД-БОРЕ (XII) и Еиса1-2Са1р1-3(Еиса1-4)61сМАс-зр-АД-БОРЕ (XIII).
- 60. Набор, включающий в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции по любому из пп.1-25 или 40.
- 61. Набор по п.60, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-25 или 40 выбрана из группы, состоящей изΑΤρ„-ερАД-БОРЕ (I); Атри-8рзр1-АД-БОРЕ (II); Атри-зр-АД-Б8РЕ (III); Втри-зр-АД-БОРЕ (VI); Нтриερ-АД-БОРЕ (VII); Нли-5р-АД-БОРЕ (VIII); Са1рг8р-АД-БОРЕ (IX); Еиса1-20а1р1ЗО1сМАср1-ЗСа1р,-4С1сМАс-8р-АД-БОРЕ (XII) и Еиса1-2Оа1р1-3(Еиссе1-4)О1сЫАс-8рАД-БОРЕ (XIII).
- 62. Набор, включающий в себя суспензию в суспендирующем растворе клеток или поликлеточных структур по любому из пп.56-59.
- 63. Набор по п.62, где суспендирующий раствор, по существу, не содержит липид.
- 64. Набор по п.62 или 63, где клеточная или поликлеточная структура имеет человеческое или мышиное происхождение.
- 65. Набор по любому из пп.62-64, где клетками являются эритроциты, которые в природе не экспрессируют А- или В-антиген и включают в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей изАурц“ ερ-Αΰ-БОРЕ (I) ι Атри- δρδρ,-Αά-ϋΟΡΕ (II) 1 Атри” 5Р-А0-О8РЕ (III); ВуРИзр-АД-БОРЕ (VI); Н,ри-ар-АД-БОРЕ (VII); Нди-8р-АД-БОРЕ (VIII); ОаЩгзр-АД-БОРЕ (IX); Риса1-20а1р1-ЗО1сМАср1-36а1р!-4С1с1МАс-8р-АД-Б0РЕ (XII) и Еиса1-26а1р1-3(Еиса1-4)ΘΙοΝΑο-8ρ-Αά-ϋΟΡΕ (XIII).
- 66. Набор по п.62, где суспендирующий раствор дополнительно содержит одно или несколько антител.
- 67. Набор по п.62, где клетки являются контролями чувствительности.
- 68. Фармацевтический препарат, включающий в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции по любому из пп.1-25 или 40.
- 69. Фармацевтический препарат по п.68, где фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.
- 70. Фармацевтический препарат по п.68, где фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.
- 71. Фармацевтический препарат, включающий в себя клетки или поликлеточные структуры по любому из пп.56-59.
- 72. Фармацевтический препарат по п.71, где клетки или поликлеточные структуры имеют человеческое происхождение.
- 73. Фармацевтический препарат по п.71 или 72, где фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.
- 74. Фармацевтический препарат по п.71 или 72, где фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NZ53186604 | 2004-03-22 | ||
| NZ53794105 | 2005-01-28 | ||
| PCT/NZ2005/000052 WO2005090368A1 (en) | 2004-03-22 | 2005-03-22 | Synthetic membrane anchors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200601753A1 EA200601753A1 (ru) | 2007-04-27 |
| EA013183B1 true EA013183B1 (ru) | 2010-02-26 |
Family
ID=34993634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200601753A EA013183B1 (ru) | 2004-03-22 | 2005-03-22 | Синтетические молекулярные конструкции |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US8013131B2 (ru) |
| EP (1) | EP1735323B1 (ru) |
| JP (1) | JP5456250B2 (ru) |
| CN (1) | CN1938325B (ru) |
| AU (3) | AU2005223715A1 (ru) |
| CA (1) | CA2560781C (ru) |
| DK (1) | DK1735323T3 (ru) |
| EA (1) | EA013183B1 (ru) |
| ES (1) | ES2654578T3 (ru) |
| IL (1) | IL178008A (ru) |
| NZ (2) | NZ587442A (ru) |
| WO (1) | WO2005090368A1 (ru) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008030115A2 (en) * | 2006-09-06 | 2008-03-13 | Elena Korchagina | Fluorescent cell markers |
| US8013131B2 (en) | 2004-03-22 | 2011-09-06 | Kode Biotech Limited | Synthetic membrane anchors |
| US10858384B2 (en) | 2004-03-22 | 2020-12-08 | Kode Biotech Limited | Synthetic molecule constructs |
| AU2011202876B2 (en) * | 2006-09-06 | 2011-09-01 | Kode Biotech Limited | Fluorescent cell markers |
| US20080160003A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-07-03 | University Of Delaware | Fertility Enhancement Using Lipid Carriers and Bioactive Molecules |
| CA2685269C (en) | 2007-04-27 | 2014-07-08 | Kode Biotech Limited | Carbohydrate-lipid constructs and their use in preventing or treating viral infection |
| US8394594B2 (en) * | 2007-09-11 | 2013-03-12 | Kode Biotech Limited | Peptide-lipid constructs and their use in diagnostic and therapeutic applications |
| AU2008297660B2 (en) * | 2007-09-11 | 2013-10-24 | Kode Biotech Limited | Peptide-lipid constructs and their use in diagnostic and therapeutic applications |
| US10919941B2 (en) | 2007-10-12 | 2021-02-16 | Kode Biotech Limited | Functional lipid constructs |
| JP5580202B2 (ja) * | 2007-10-12 | 2014-08-27 | コード バイオテック リミテッド | 機能性脂質構築物 |
| AU2013201431B2 (en) * | 2007-10-12 | 2015-02-19 | Kode Biotech Limited | Functional lipid constructs |
| WO2010039049A1 (en) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Kode Biotech Limited | Method of modifying the immune response |
| US11052141B1 (en) | 2008-10-02 | 2021-07-06 | Kode Biotech Limited | Method of modifying the immune response |
| AU2008362921B2 (en) | 2008-10-13 | 2012-07-26 | Semiotik Llc | Multiligand constructs |
| US10408717B2 (en) | 2009-06-29 | 2019-09-10 | Nicolai Vladimirovich Bovin | Printing of FSL constructs |
| CA2766110C (en) | 2009-06-29 | 2018-07-17 | Nicolai Vladimirovich Bovin | Printing of fsl constructs |
| GB2500854B (en) * | 2011-01-06 | 2019-04-17 | Vladimirovich Bovin Nicolai | Biosurface engineering |
| US10942184B2 (en) | 2012-10-23 | 2021-03-09 | Caris Science, Inc. | Aptamers and uses thereof |
| BR112015009138A2 (pt) | 2012-10-23 | 2020-10-20 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings, S.A.R.L. | métodos para caracterizar um câncer |
| AU2013361323B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-09-06 | Caris Science, Inc. | Compositions and methods for aptamer screening |
| WO2015084187A1 (en) * | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Nicolai Bovin | Functionalizing nanofibres |
| US10457706B2 (en) | 2014-11-21 | 2019-10-29 | Stephen Micheal Henry | Multivalent ligand-lipid constructs |
| US10544842B2 (en) * | 2017-03-24 | 2020-01-28 | Ford Global Technologies, Llc | One-way clutch for a vehicle |
| MX2020012534A (es) | 2018-05-27 | 2021-04-28 | Biolinerx Ltd | Agi-134 combinado con un inhibidor de punto de control para el tratamiento de tumores solidos. |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001091805A2 (en) * | 2000-06-02 | 2001-12-06 | Bracco Research Usa | Compounds for targeting endothelial cells |
| WO2004045583A1 (ja) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Nipro Corporation | リポソーム |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0102319B1 (de) * | 1982-07-23 | 1987-08-19 | Ciba-Geigy Ag | Verwendung von Muramylpeptiden oder deren Analogen zur Prophylaxe und Therapie von Virusinfektionen |
| US5334583A (en) | 1982-07-23 | 1994-08-02 | Ciba-Geigy Corp. | Use of sugar derivatives for the prophylaxis and treatment of virus infections |
| US4622294A (en) * | 1985-02-08 | 1986-11-11 | Kung Viola T | Liposome immunoassay reagent and method |
| US4873322A (en) * | 1986-01-24 | 1989-10-10 | Ciba-Geigy Corporation | Saccharide derivatives and processes for their manufacture |
| IT1229514B (it) | 1989-01-30 | 1991-09-03 | Farmhispania S A A Montme | Glicoconiugati anfifilici sintetici per impiego neurologico. |
| US5108921A (en) | 1989-04-03 | 1992-04-28 | Purdue Research Foundation | Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules |
| JP3408271B2 (ja) | 1992-07-17 | 2003-05-19 | 生化学工業株式会社 | 糖のアミノ化法 |
| US5329029A (en) | 1992-11-05 | 1994-07-12 | Wan Barbara Y | Phosphatidylalkanolamine derivatives and their use in generating phospholipid conjugates |
| US5854218A (en) * | 1993-05-14 | 1998-12-29 | Cytel Corporation | Sialyl Lex analogues as inhibitors of cellular adhesion |
| US5344583A (en) * | 1993-08-26 | 1994-09-06 | Dotolo Research Corp. | Composition for removing nail enamel from artificial nails |
| JP3942205B2 (ja) | 1995-07-24 | 2007-07-11 | 生化学工業株式会社 | 神経疾患の治療剤 |
| DE19624345B4 (de) * | 1996-06-19 | 2004-12-23 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt | Acylierte Kohlenhydrate mit mindestens einer mit dem Kohlenhydrat veretherten Carboxyalkyl-Gruppe, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung in Waschmitteln |
| US5973128A (en) | 1996-11-22 | 1999-10-26 | The Hospital For Sick Children Research And Development Lp | Glycolipid mimics and methods of use thereof |
| AU8505398A (en) | 1997-07-23 | 1999-02-16 | Northeastern University | Methods for enhancing or reducing preimplantation embryo survival rates |
| US5962423A (en) | 1998-08-07 | 1999-10-05 | The Governors Of The University Of Alberta | Treatment of bacterial dysentery |
| WO2001040796A2 (en) | 1999-11-29 | 2001-06-07 | Thermo Hybaid Gmbh | Glycoarrays on the surface of biochips |
| AU785017B2 (en) | 2000-01-10 | 2006-08-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of disease |
| US7101859B2 (en) | 2000-01-10 | 2006-09-05 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of lipid conjugates in the treatment of diseases |
| US20060189568A1 (en) | 2000-01-10 | 2006-08-24 | Saul Yedgar | Use of lipid conjugates in the treatment of infection |
| DE60143052D1 (de) * | 2000-11-10 | 2010-10-21 | Univ Waseda | Lipid vom carbonsäuretyp |
| US7678574B2 (en) | 2001-10-16 | 2010-03-16 | Kiwi Ingenuity Limited | Sensitivity controls for blood serology prepared from modified cells |
| NZ518163A (en) * | 2002-04-05 | 2005-04-29 | Kiwi Ingenuity Ltd | Embryo modified with a glycolipid to enhance implantation into the endometrium |
| US7989602B2 (en) * | 2003-11-18 | 2011-08-02 | The Malaghan Institute Of Medical Research | Synthetic molecules having immune activity |
| US8013131B2 (en) | 2004-03-22 | 2011-09-06 | Kode Biotech Limited | Synthetic membrane anchors |
| JP4639055B2 (ja) | 2004-05-20 | 2011-02-23 | 公益財団法人野口研究所 | ベロ毒素中和剤としてのスフィンゴ糖脂質類似体 |
| JP2006241095A (ja) | 2005-03-04 | 2006-09-14 | National Univ Corp Shizuoka Univ | フィラグリン合成促進剤および紫外線傷害緩和剤 |
| US8183214B2 (en) | 2005-09-21 | 2012-05-22 | Kode Biotech Limited | Cell surface coating with hyaluronic acid oligomer derivative |
-
2005
- 2005-03-22 US US10/593,829 patent/US8013131B2/en active Active
- 2005-03-22 AU AU2005223715A patent/AU2005223715A1/en not_active Abandoned
- 2005-03-22 WO PCT/NZ2005/000052 patent/WO2005090368A1/en active Application Filing
- 2005-03-22 EA EA200601753A patent/EA013183B1/ru unknown
- 2005-03-22 DK DK05722123.6T patent/DK1735323T3/en active
- 2005-03-22 CA CA2560781A patent/CA2560781C/en active Active
- 2005-03-22 NZ NZ587442A patent/NZ587442A/en unknown
- 2005-03-22 EP EP05722123.6A patent/EP1735323B1/en active Active
- 2005-03-22 ES ES05722123.6T patent/ES2654578T3/es active Active
- 2005-03-22 NZ NZ550705A patent/NZ550705A/en unknown
- 2005-03-22 JP JP2007504907A patent/JP5456250B2/ja active Active
- 2005-03-22 CN CN200580009170.5A patent/CN1938325B/zh active Active
-
2006
- 2006-09-11 IL IL178008A patent/IL178008A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-07-20 AU AU2010203099A patent/AU2010203099B2/en active Active
- 2010-07-20 AU AU2010203098A patent/AU2010203098B2/en active Active
-
2011
- 2011-05-03 US US13/067,021 patent/US8637473B2/en active Active
-
2013
- 2013-12-17 US US14/108,749 patent/US9353349B2/en active Active
-
2016
- 2016-05-30 US US15/168,144 patent/US9809614B2/en active Active
-
2017
- 2017-11-06 US US15/804,427 patent/US10414786B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001091805A2 (en) * | 2000-06-02 | 2001-12-06 | Bracco Research Usa | Compounds for targeting endothelial cells |
| WO2004045583A1 (ja) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Nipro Corporation | リポソーム |
Non-Patent Citations (5)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2010203099A1 (en) | 2010-08-12 |
| DK1735323T3 (en) | 2017-12-11 |
| IL178008A0 (en) | 2006-12-31 |
| US20070197466A1 (en) | 2007-08-23 |
| WO2005090368A1 (en) | 2005-09-29 |
| NZ587442A (en) | 2012-02-24 |
| JP2007530532A (ja) | 2007-11-01 |
| EP1735323A1 (en) | 2006-12-27 |
| US20160333044A1 (en) | 2016-11-17 |
| EA200601753A1 (ru) | 2007-04-27 |
| AU2005223715A1 (en) | 2005-09-29 |
| CN1938325B (zh) | 2015-07-15 |
| CN1938325A (zh) | 2007-03-28 |
| AU2010203098B2 (en) | 2012-07-12 |
| EP1735323B1 (en) | 2017-08-30 |
| AU2010203098A1 (en) | 2010-08-12 |
| CA2560781C (en) | 2011-10-11 |
| US9809614B2 (en) | 2017-11-07 |
| US8013131B2 (en) | 2011-09-06 |
| CA2560781A1 (en) | 2005-09-29 |
| US20140186950A1 (en) | 2014-07-03 |
| US9353349B2 (en) | 2016-05-31 |
| IL178008A (en) | 2011-10-31 |
| NZ550705A (en) | 2010-12-24 |
| JP5456250B2 (ja) | 2014-03-26 |
| AU2010203099B2 (en) | 2012-12-06 |
| US8637473B2 (en) | 2014-01-28 |
| ES2654578T3 (es) | 2018-02-14 |
| US20110213134A1 (en) | 2011-09-01 |
| US20180057518A1 (en) | 2018-03-01 |
| EP1735323A4 (en) | 2009-11-04 |
| US10414786B2 (en) | 2019-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA013183B1 (ru) | Синтетические молекулярные конструкции | |
| EP2201025B1 (en) | Functional lipid constructs | |
| US10858384B2 (en) | Synthetic molecule constructs | |
| AU2008297660A1 (en) | Peptide-lipid constructs and their use in diagnostic and therapeutic applications | |
| Slivka et al. | Influence of the Lipid Moiety Structure on the Insertion/Release of Glycolipids in/from the Cell: A Study with Synthetic Analogs | |
| US11052141B1 (en) | Method of modifying the immune response | |
| AU2013201431B2 (en) | Functional lipid constructs | |
| US20170218027A1 (en) | Functional lipid constructs |