EA011749B1 - A process for the production of human growth hormone and use serum-free cell culture medium for mammalian cells expressing human growth hormone - Google Patents

Abstract

This invention relates to a process for the production of human growth hormone and use serum-free medium for culturing mammalian cells expressing human growth hormone.

Description

Настоящее изобретение относится к области культивирования клеток млекопитающих в условиях отсутствия в культуре сыворотки, в частности изобретение связано с культивированием клеток, продуцирующих рекомбинантные белки, такие, например, как гормон роста человека (ЬОН).The present invention relates to the field of cultivation of mammalian cells in the absence of serum in the culture, in particular, the invention relates to the cultivation of cells producing recombinant proteins, such as, for example, human growth hormone (HOH).

Основа изобретенияThe basis of the invention

Настоящее изобретение связано со средой, не содержащей сыворотки, предназначенной для роста и поддержания клеток млекопитающего в культуре.The present invention relates to a serum-free medium intended for the growth and maintenance of mammalian cells in culture.

Клеточная культура широко используется в настоящее время для получения различных биологически активных продуктов, таких как вирусные вакцины, моноклональные антитела, не являющиеся антителами иммунорегуляторы, факторы роста полипептидов, гормоны, ферменты, опухолеспецифические антигены и т.д. Указанные вещества продуцируются нормальными или трансформированными и генетически модифицированными клетками.Cell culture is widely used at present to obtain various biologically active products, such as viral vaccines, monoclonal antibodies, non-antibodies, immunoregulators, growth factors of polypeptides, hormones, enzymes, tumor-specific antigens, etc. These substances are produced by normal or transformed and genetically modified cells.

В прошлом культуральную среду для культивирования клеток дополняли сывороткой, которая служила универсальным питательным веществом для роста и поддержания всех линий клеток млекопитающего, которые продуцируют биологически активные продукты. Иммунная сыворотка содержит гормоны, факторы роста, транспортные белки, факторы прикрепления и распластывания, питательные вещества, микроэлементы и так далее. Культуральная среда обычно содержала приблизительно до 10% животной сыворотки, такой как эмбриональная бычья сыворотка (ЕВ8), также называемая эмбриональной сывороткой теленка (ЕС8).In the past, cell culture media was supplemented with serum, which served as a universal nutrient for the growth and maintenance of all mammalian cell lines that produce biologically active products. Immune serum contains hormones, growth factors, transport proteins, attachment and spreading factors, nutrients, trace elements and so on. The culture medium typically contained up to about 10% animal serum, such as fetal bovine serum (EB8), also called calf fetal serum (EC8).

Несмотря на широкое применение, сыворотка имеет множество ограничений в применении. Она содержит высокие уровни множества белков, влияющих на ограничение процентного количества представляющего интерес белка, продуцируемого клетками. Данные белки, полученные из сыворотки, должны быть отделены от продукта во время выполнения стадий процесса, такого как выделение представляющего интерес белка, что затрудняет способ и увеличивает затраты.Despite its widespread use, serum has many limitations in use. It contains high levels of a multitude of proteins that influence the limitation of the percentage of the protein of interest produced by the cells. These proteins derived from whey must be separated from the product during the process steps, such as isolating the protein of interest, which complicates the process and increases costs.

Побочное действие В8Е (губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота), трансмиссивного нейродегенеративного заболевания крупного рогатого скота с продолжительным латентным или инкубационным периодом, ставит вопрос о регуляторном участии использования сыворотки животного происхождения в продуцировании биологически активных продуктов.The side effect of B8E (bovine spongiform encephalopathy), a transmissible neurodegenerative disease in cattle with a long latent or incubation period, raises the question of the regulatory involvement of the use of animal serum in the production of biologically active products.

Следовательно, существует большая потребность в разработке альтернативной среды, не содержащей сыворотку животного, которая поддерживает рост клеток и сохраняет их в процессе продуцирования биологически активных продуктов.Therefore, there is a great need to develop an alternative medium that does not contain animal serum, which supports cell growth and preserves them in the process of producing biologically active products.

Как правило, культуральная клеточная среда содержит множество компонентов различных категорий, таких как аминокислоты, витамины, соли, жирные кислоты и другие соединения.Typically, the cell culture medium contains many components of various categories, such as amino acids, vitamins, salts, fatty acids and other compounds.

Аминокислоты.Amino acids.

Например, в патенте США № 6048728 (Ιη1ο\ν и др.) описано, что в среде для культивирования клеток могут быть использованы следующие аминокислоты: аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, триптофан, тирозин, треонин и валин.For example, US Pat. No. 6,048,728 (Ιη1ο \ ν, etc.) describes that the following amino acids can be used in a cell culture medium: alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine , lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, tryptophan, tyrosine, threonine and valine.

Витамины.Vitamins

В патенте США № 2003/0096414 (Сюсатоие и др.) или в патенте США № 5811299 (Кеииег и др.) описано, например, что в среде для культивирования клеток могут быть использованы следующие витамины: биотин, пантотенат, холин хлорид, фолиевая кислота, миоиноцитол, ниациномид, пиридоксин, рибофлавин, витамин В12, тиамин, путресцин.In US patent No. 2003/0096414 (Syusatoie et al.) Or in US patent No. 5811299 (Keeg and others) it is described, for example, that the following vitamins can be used in a cell culture medium: biotin, pantothenate, choline chloride, folic acid , myoinocytol, niacinomide, pyridoxine, riboflavin, vitamin B12, thiamine, putrescine.

Соли.Salt.

В патенте США № 6399381 (В1ит и др.), например, описана среда, содержащая СаС1₂, КС1, МдС1₂, №С1. мононатрийфосфат, двухосновный натрий фосфат, селенит натрия, Си8О₄, Ζπί’1₂. Другим примером документа, в котором описаны неорганические соли, которые могут быть использованы в среде для культивирования клеток, является патент США № 2003/0153042 (Лгпо1б и др.), в котором описана среда, содержащая СаС1₂, КС1, МдС1₂, ИаС1, мононатрийфосфат, двухосновный фосфат натрия, СиС1₂-2Н₂О, ΖηΟ₂.In US patent No. 6399381 (B1it and others), for example, describes a medium containing CaCl ₂ , KC1, MDC1 ₂ , No. C1. monosodium phosphate, dibasic sodium phosphate, sodium selenite, Si8O _4, Ζπί'1 _2. Another example of a document which describes inorganic salts that can be used in the cell culture medium is US patent № 2003/0153042 (Lgpo1b et al.), Which discloses a medium comprising SaS1 _2, KC1 MdS1 ₂ IaS1, monosodium phosphate, dibasic sodium phosphate, CuCl ₂ -2H ₂ O, ΖηΟ ₂ .

Жирные кислоты.Fatty acid.

Жирные кислоты, про которые известно, что они используются в культуральной среде, представляют собой арахидоновую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, так же как и метилбетациклодекстрин, см., например, патент США № 5045468 (ЭагПег). Нужно отметить, что циклодекстрин, по существу, не является липидом, но он способен образовывать комплекс с липидами, и, таким образом, он используется для повышения растворимости липидов в среде для культивирования клеток.The fatty acids known to be used in the culture medium are arachidonic acid, linoleic acid, oleic acid, lauric acid, myristic acid, as well as methyl betacyclodextrin, see, for example, US Pat. No. 5,045,468 (EagPeg). It should be noted that cyclodextrin is essentially not a lipid, but it is able to form a complex with lipids, and thus, it is used to increase the solubility of lipids in a cell culture medium.

Другими компонентами, применяемыми, в частности, в среде для культивирования клеток, не содержащей иммунной сыворотки, являются такие соединения, как глюкоза, глутамин, Иа-пируват, инсулин или этаноламин (см., например, ЕР 274445), или защитный агент, такой как Р1итошс Е68. Р1итошс® Е68 (известный также как Ро1охатег 188) представляет собой блокирующий сополимер этиленоксидаOther components used, in particular, in an immune serum-free cell culture medium, are compounds such as glucose, glutamine, Ia-pyruvate, insulin or ethanolamine (see, for example, EP 274445), or a protective agent such like P1itoshs E68. P1itoshs® E68 (also known as Po1ochateg 188) is a blocking copolymer of ethylene oxide

- 1 011749 (ЕО) и пропиленоксида (РО).- 1 011749 (EO) and propylene oxide (PO).

Стандартные основные среды также известны специалисту в данной области. Такие среды уже содержат несколько компонентов среды, упомянутой выше. Примерами таких сред, которые нашли широкое распространение, являются модифицированная Дульбекко среда Игла (ΌΜΕΜ), ΌΜΕΜ Е12 (1:1), питательная смесь Нат'к ΝιιΙποηΙ Ш1х1иге Е-10, среда ΒΡΜΙ (Вокте11 Рагк Μетο^^а1 ΙηκΙίΙιιΚ Μеά^ит), среда Μί,ΌΒ 131, или среда ^ййаш'к Μеάшт Ε. Данные коммерческие среды доступны, например, от С1Ьео, 1пуйгодеп.Standard basic media are also known to those skilled in the art. Such media already contain several components of the media mentioned above. Examples of such media that are widely used are Dulbecco’s modified environment Igla (ΌΜΕΜ), ΌΜΕΜ E12 (1: 1), the nutrient mixture Nat'k ΝιιΙποηΙ Ш1х1иге E-10, medium ΒΡΜΙ (Vokte11 Ragk Μetο ^^ a1 ΙηκΙίΙιιΚ Μеά ^ it ), Wednesday Μί, ΌΒ 131, or Wednesday ^ yyash'k Μеάшт Ε. These commercial environments are available, for example, from Clio, 1 Puigodep.

Металлы, такие как цинк (Ζη) и медь (Си), вовлечены в метаболические взаимодействия (Уа11ее и Еа1сйик, 1993 или Ьшйпег, 1991).Metals, such as zinc (Ζη) and copper (Cu), are involved in metabolic interactions (Va11ee and Ea1syk, 1993 or Zhypeg, 1991).

Цинк играет существенную роль в структуре и функции большого количества макромолекул и большинства ферментативных реакций. Он играет роль катализатора, сокатализатора или структурную роль в специфическом сворачивании белков. Ζη-АТФ необходим для синтеза пиридоксин-5-фосфата и динуклеотида флавин-аденозин (ΕΑΌ), двух коферментов, необходимых для биогенного синтеза амина и метаболизма моноаминоксидазы.Zinc plays a significant role in the structure and function of a large number of macromolecules and most enzymatic reactions. It plays the role of a catalyst, cocatalyst, or a structural role in the specific folding of proteins. Ζη-ATP is required for the synthesis of pyridoxine-5-phosphate and flavin-adenosine dinucleotide (ΕΑΌ), two coenzymes necessary for the biogenic synthesis of amine and metabolism of monoamine oxidase.

Активность цинка в предохранении биологических структур от повреждения свободными радикалами может осуществляться благодаря нескольким факторам: поддержанию соответствующего уровня металлобелков, которые также являются ловушками от свободных радикалов, в качестве существенного компонента супероксиддисмутазы, в качестве защитного агента для тиолов и в предотвращении взаимодействия химических групп с железом с образованием свободных радикалов.The activity of zinc in protecting biological structures from damage by free radicals can be due to several factors: maintaining an appropriate level of metal proteins, which are also traps from free radicals, as an essential component of superoxide dismutase, as a protective agent for thiols, and in preventing the interaction of chemical groups with iron with the formation of free radicals.

В дополнение к этому, наличие Ζη предотвращает перекисное окисление липидов. Цинк также является эффектором полимеризации тубулина и действует ίη νίίτο на образование и стабилизацию актинового волокна. Цинк является также компонентом мотива цинковых пальцев ДНК-связанных белков, которые являются общим мотивом в транскрипционных белках.In addition, the presence of Ζη prevents lipid peroxidation. Zinc is also an effector of tubulin polymerization and acts ίη νίίτο on the formation and stabilization of actin fiber. Zinc is also a component of the zinc finger motif of DNA-related proteins, which are a common motif in transcription proteins.

Ионы цинка существуют главным образом в виде комплексов с белками и нуклеиновыми кислотами и принимают участие во всех аспектах промежуточного метаболизма, трансмиссии и регуляции экспрессии генетической информации, хранении, синтезе и действии пептидных гормонов и структурном поддержании хроматина и биологических мембран.Zinc ions exist mainly in the form of complexes with proteins and nucleic acids and are involved in all aspects of the intermediate metabolism, transmission and regulation of the expression of genetic information, storage, synthesis and action of peptide hormones and structural maintenance of chromatin and biological membranes.

Медь также является важным микроэлементом для функционирования многих клеточных ферментов. Ионы меди могут принимать особые окислительно-восстановительные состояния, окисляя Си (II) или восстанавливая Си (I), позволяя металлу играть ведущую роль в клеточной физиологии в качестве каталитического кофактора в окислительно-восстановительной химии ферментов. Медь функционирует в группе оксидаз, которые включают в себя цитохром-С-оксидазу, тирозиназу, дофамин-βмонооксигеназу, аминоксидазы и лизилоксидазу. Медь принимает участие также в митохондриальном дыхании, гомеостазе железа в качестве компонента церулоплазмина, в удалении свободных радикалов и поперечном связывании эластина.Copper is also an important trace element for the functioning of many cellular enzymes. Copper ions can take on special redox states by oxidizing Cu (II) or reducing Cu (I), allowing the metal to play a leading role in cellular physiology as a catalytic cofactor in the redox chemistry of enzymes. Copper functions in a group of oxidases, which include cytochrome C oxidase, tyrosinase, dopamine β-monooxygenase, aminoxidase and lysyl oxidase. Copper is also involved in mitochondrial respiration, iron homeostasis as a component of ceruloplasmin, in the removal of free radicals and cross-linking of elastin.

Среда, не содержащая сыворотку, включающая в себя ионы металла, такие как ионы цинка или меди, известна специалистам в данной области, например, из патента США № 6048728 (1п1о\у и др.), патента США № 4767704 (С^е1апй и др.) или Международной заявки XVО 01/16294 (ЫГе Тес11гю1ощек 1пс.) Однако в этих документах не приведено данных об эффекте увеличения продуктивности при добавлении этих ионов в определенных концентрациях в стандартную продуцирующую среду.A serum-free medium including metal ions, such as zinc or copper ions, is known to those skilled in the art, for example, from US Pat. No. 6,048,728 (1n1o and others), US Patent No. 4,767,704 (C ^ e1apy and etc.) or the International application XVO 01/16294 (Ы Т Т есес111111ощощощощ 1ps.) However, these documents do not provide data on the effect of increased productivity when these ions are added in certain concentrations to a standard production medium.

Для усовершенствования и поставки биологически активных продуктов, таких как лечебные белки или вакцины, необходим большой выход продукта. Соответствующими клетками, широко применяемыми для получения полипептидов, являются клетки яичника китайского хомячка (СНО).To improve and supply biologically active products, such as therapeutic proteins or vaccines, a large yield of product is required. Corresponding cells that are widely used to produce polypeptides are Chinese hamster ovary (CHO) cells.

Клетки СНО впервые были культивированы Риск (1. Ехр. Μеά. 108, 945, 1958) из материала биопсии яичника самки китайского хомячка. Из этих первоначальных клеток было получено несколько линий клеток с различными характеристиками. Одна из этих линий клеток СНО, СНО-К1, представляет собой пролинзависимую линию и является диплоидной по дигидрофолатредуктазному гену (ПНЕВ). Другой линией, полученной из указанной линии клеток, является линия клеток СНО, дефицитная по ПНЕВ (СНО υυκ В11) (ΡΝΑ8 77, 1980, 4216-4220), которая характеризуется потерей функции ПНЕВ вследствие мутации в одном ПНЕВ-гене и последующей потерей другого гена.CHO cells were first cultured by Risk (1. Exp. Ge. 108, 945, 1958) from biopsy material from an ovary of a female Chinese hamster. From these initial cells, several cell lines with different characteristics were obtained. One of these CHO cell lines, CHO-K1, is a proline-dependent line and is diploid in the dihydrofolate reductase gene (PNEU). Another line obtained from the indicated cell line is the SNE cell line deficient in PNEU (SNO υυκ B11) (ΡΝΑ8 77, 1980, 4216-4220), which is characterized by the loss of PNEU function due to a mutation in one PNEU gene and subsequent loss of another gene .

Следующими клетками, часто используемыми для продуцирования белков, предназначенных для введения в человеческий организм, являются линии клетки человека, такие как линия клеток фибросаркомы человека НТ1080 или линия эмбриональных клеток почки человека 293.The following cells, often used to produce proteins intended for introduction into the human body, are human cell lines, such as the human fibrosarcoma cell line HT1080 or the human kidney embryonic cell line 293.

Мышиная линия клеток С127 также часто применяется для продуцирования рекомбинантных белков (Сайет и др., 1989; Ока и Вирр, 1990).The C127 mouse cell line is also often used to produce recombinant proteins (Sayet et al., 1989; Oka and Virr, 1990).

Одним из представляющих интерес лечебных белков является гормон роста. Гормон роста человека (11СН). известный также как соматропин (ΙΝΝ) или соматотропин, представляет собой белковый гормон, продуцируемый и секретируемый соматотропными клетками передней доли гипофиза. Гормон роста человека играет ключевую роль в соматическом росте в детском возрасте и в метаболизме в период совершеннолетия посредством его воздействия на метаболизм белков, углеводов и липидов.One of the therapeutic proteins of interest is growth hormone. Human Growth Hormone (11CH). Also known as somatropin (ΙΝΝ) or somatotropin, it is a protein hormone produced and secreted by somatotropic cells of the anterior pituitary gland. Human growth hormone plays a key role in somatic growth in childhood and in metabolism during adulthood through its effect on the metabolism of proteins, carbohydrates and lipids.

Гормон роста человека представляет собой единичную полипептидную цепь, состоящую из 191 аминокислоты (Ве\\'1у и др, 1972), имеющую две дисульфидные связи, одну между Сук-53 и Сук-165,Human growth hormone is a single polypeptide chain consisting of 191 amino acids (Be \\ '1y et al, 1972), having two disulfide bonds, one between Suk-53 and Suk-165,

- 2 011749 образующую большую петлю в молекуле, и другую - между Сук-182 и Сук-189, образующую малую петлю вблизи С-концевого участка. Последовательность ДНК, которая подтвердила аминокислотную последовательность белка, была описана Магйа1 и др. (1979). Очищенный 11СН. в его лиофилизованной форме, представляет собой белый аморфный порошок. Он легко растворяется (в концентрации >10 мг/л) в водных буферах при рН в интервале от 6,5 до 8,5.- 2 011749 forming a large loop in the molecule, and another between Suk-182 and Suk-189, forming a small loop near the C-terminal portion. The DNA sequence that confirmed the amino acid sequence of the protein was described by Magya1 et al. (1979). Purified 11CH. in its lyophilized form, it is a white amorphous powder. It is readily soluble (at a concentration of> 10 mg / L) in aqueous buffers at pH in the range from 6.5 to 8.5.

В растворе 11СН существует преимущественно как мономер, с незначительной фракцией в виде димеров и олигомеров с большим молекулярным весом. При определенных условиях 11СН может быть индуцирован в виде, образующем большее количество димеров, тримеров и высших олигомеров.In a solution, 11CH exists predominantly as a monomer, with an insignificant fraction in the form of dimers and oligomers with a high molecular weight. Under certain conditions, 11CH can be induced in the form forming a larger number of dimers, trimers and higher oligomers.

Известно несколько производных ЙСН, включая производные природного происхождения, варианты и продукты метаболизма, продукты деградации преимущественно биосинтетического 11СН и генноинженерных производных ЙСН, получаемых генетическими способами. Одним из примеров производного 11СН природного происхождения является СН-У, разновидность гормона роста, обнаруженного в плаценте. Другой представитель генного локуса описан у СНсп и др. (1989). Любое производное ЙСН, включая производные, приспособленные к длительному пребыванию в организме, могут быть использованы для целей настоящего изобретения, пока у них сохраняется биологическая активность 11СН.Several derivatives of JSN are known, including derivatives of natural origin, variants and metabolic products, degradation products of predominantly biosynthetic 11CH and genetically engineered derivatives of JSN obtained by genetic methods. One example of a naturally occurring 11CH derivative is CH-U, a type of growth hormone found in the placenta. Another representative of the gene locus is described by SNSP et al. (1989). Any derivative of JSN, including derivatives adapted for a long stay in the body, can be used for the purposes of the present invention, as long as they retain the biological activity of 11CH.

Метионил-йСН был первой формой ЙСН, полученной посредством технологии рекомбинантной ДНК. Данное соединение является в действительности производным ЙСН, имеющим дополнительный остаток метионина на Ν-концевом участке (Сос66с1 и др., 1979).Methionyl-yCH was the first form of YSH obtained by recombinant DNA technology. This compound is actually a YSN derivative having an additional methionine residue at the Ν-terminal site (Сос66с1 et al., 1979).

Описана обнаруженная как в гипофизе, так и в кровотоке разновидность 11СН природного происхождения, называемая 20-К-йСН (Бе\\зк и др., 1978; Бетак и др., 1980). Данное соединение, у которого недостает 15 аминокислотных остатков, от С1и-32 до С1п-46, появляется при альтернативном сплайсинге мессенджер-рибонуклеиновой кислоты (Эе№1о и др., 1981). Данное соединение обладает многими, но не всеми биологическими свойствами 11СН.A variety of 11CH of natural origin, found in the pituitary gland and in the bloodstream, is called 20-K-CHF (Be \\ zk et al., 1978; Betak et al., 1980). This compound, which lacks 15 amino acid residues, from C1i-32 to C1p-46, appears during alternative splicing of messenger ribonucleic acid (Ee # 1o et al., 1981). This compound has many, but not all, biological properties of 11CH.

20-К-йСН производится в гипофизе и секретируется в кровь. Он составляет приблизительно 5% гормона роста, вырабатываемого взрослым человеком, и приблизительно 20% гормона роста, вырабатываемого в детском возрасте. Он имеет такую же стимулирующую рост активность, что и гормон роста, и, как было выявлено, имеет величину липолитической активности, большую или равную активности формы в 22 кДа. Он связывается с рецепторами гормона роста с аффинностью, равной аффинности гормона роста в 22 кДа, и имеет одну десятую долю лактогенной (пролактиноподобной) биологической активности по сравнению с гормоном в 22 кДа. В отличие от гормона в 22 кДа, 20-к-йСН имеет слабую антиинсулиновую активность.20-K-CHF is produced in the pituitary gland and is secreted into the blood. It accounts for approximately 5% of the growth hormone produced by an adult, and approximately 20% of the growth hormone produced in childhood. It has the same growth-promoting activity as growth hormone, and, as has been revealed, has a lipolytic activity value greater than or equal to the activity of the form of 22 kDa. It binds to growth hormone receptors with an affinity equal to the growth hormone affinity of 22 kDa, and has one tenth of the lactogenic (prolactin-like) biological activity compared to the hormone of 22 kDa. Unlike the hormone of 22 kDa, 20-k-CHF has a weak anti-insulin activity.

Некоторое количество производных 11СН является результатом протеолитической модификации молекулы. Начальный путь метаболизма молекулы ЙСН включает протеолиз. Область ЙСН вокруг остатков 130-150 чрезвычайно подвержена протеолизу, и выявлено несколько производных ЙСН, имеющих однонитевые разрывы или делеции в данной области (1Ъог1асик-иккшд, 1987). Данная область располагается в большой петле ЙСН, и расщепление пептидной связи приводит к возникновению двух цепей, которые соединены посредством дисульфидной связи около Сук-53 и Сук-165. Было выявлено, что многие из этих двухцепочечных образований имеют повышенную биологическую активность (81пдй и др., 1974). Многие производные гормона роста человека были получены искусственно с помощью ферментов. Ферменты трипсин и субтилизин, а также другие ферменты были использованы для модификации 11СН в различных местах по всей длине молекулы (Ье^1к и др., 1977; СгаГГ и др., 1982). Одно такое производное, называемое двухцепочечным анаболическим белком (2-САР), получили с помощью контролируемого протеолиза ЙСН трипсином (Вескег и др., 1989). Было обнаружено, что 2-САР имеет биологические свойства, совершенно отличные от той интактной молекулы ЙСН, в которой стимулирующая рост активность молекулы ЙСН в основном сохранялась, а действие на углеводный метаболизм в основном было аннулировано.A certain amount of 11CH derivatives is the result of proteolytic modification of the molecule. The initial pathway for the metabolism of the JS molecule involves proteolysis. The JS region around residues 130–150 is extremely prone to proteolysis, and several JS derivatives with single-strand breaks or deletions in this region have been identified (1Bog1asik-ikkdsd, 1987). This region is located in the large loop of the JSN, and cleavage of the peptide bond leads to the appearance of two chains that are connected via a disulfide bond near Suk-53 and Suk-165. It was found that many of these double-stranded formations have increased biological activity (81pd et al., 1974). Many derivatives of human growth hormone were obtained artificially using enzymes. The enzymes trypsin and subtilisin, as well as other enzymes, were used to modify 11CH in various places along the entire length of the molecule (Le ^ 1k et al., 1977; SgGG et al., 1982). One such derivative, called a double-stranded anabolic protein (2-CAP), was obtained using controlled proteolysis of JS with trypsin (Weskeg et al., 1989). It was found that 2-CAP has biological properties that are completely different from that of the intact JS molecule, in which the growth-promoting activity of the JS molecule was mainly preserved, and the effect on carbohydrate metabolism was mainly canceled.

Аспарагиновые и глутаминовые остатки в белках в соответствующих условиях подвержены реакциям дезамидирования. Было показано, что гипофизарный ЙСН подвергается данному типу реакций, приводящих к превращению Акп-152 в аспарагиновую кислоту, а также, в меньшей степени, к превращению С1п-137 в глутаминовую кислоту (Бе\\зк и др., 1981). Выявлено, что дезамидированный ЙСН имеет измененную чувствительность к протеолизу под действием фермента субтилизина, что указывает на то, что дезамидирование может иметь физиологическое значение в направленном протеолитическом расщеплении 11СН. Известно, что биосинтетический ЙСН деградирует при определенных условиях хранения, приводя к дезамидированию у другого аспарагина (Акп-149). Это представляет собой основной сайт дезамидирования, но дезамидирование у Акп-152 также наблюдалось (Вескег и др., 1988). Дезамидирования у С1п-137 в биосинтетическом ЙСН не обнаруживали.Asparagine and glutamine residues in proteins are subject to deamidation reactions under appropriate conditions. It was shown that pituitary JSF undergoes this type of reaction, leading to the conversion of Akp-152 to aspartic acid, and also, to a lesser extent, to the conversion of Sl-137 into glutamic acid (Be \\ zk et al., 1981). It was revealed that deamidated JSN has an altered sensitivity to proteolysis under the action of the subtilisin enzyme, which indicates that deamidation may have physiological significance in the directed proteolytic cleavage of 11CH. It is known that biosynthetic JSD degrades under certain storage conditions, leading to deamidation in another asparagine (Akp-149). This represents the main site of deamidation, but deamidation in Akp-152 has also been observed (Weskeg et al., 1988). No deamidations were observed in C1-137 in biosynthetic JSF.

Метиониновые остатки в белках чувствительны к окислению в основном сульфоксидом. Оба, и вырабатываемый гипофизом, и биосинтетический ЙСН подвергаются сульфоксидированию у Ме(-14 и Ме(125 (Вескег и др., 1988). Было выявлено, что окисление у Ме(-170 происходит в вырабатываемом гипофизом ЙСН, но не в биосинтетическом ЙСН. Оба, и дезамидированный ЙСН, и Ме(-14-сульфоксид-йСН, как было выявлено, проявляют полную биологическую активность (Вескег и др., 1988).Methionine residues in proteins are sensitive to oxidation mainly by sulfoxide. Both the pituitary gland and the biosynthetic JSN undergo sulfoxidation in Me (-14 and Me (125 (Weskeg et al., 1988). It was found that Me (-170 oxidizes in the pituitary gland produced by JSN, but not in the biosynthetic JSN Both both deamidated YSN and Me (-14-sulfoxide-ySN were found to exhibit full biological activity (Weskeg et al., 1988).

- 3 011749- 3 011749

Получены усеченные формы БОН, каждый посредством действия ферментов или с помощью генетических способов. У 2-САР, генерированного с помощью контролируемого действия трипсина, удалены первые восемь остатков у Ν-концевого участка БОН. Другие усеченные варианты БОН получены с помощью модификации гена прежде экспрессии его в подходящего хозяина. Первые 13 остатков были удалены, давая в результате производное, имеющее особенные биологические свойства (Оетйет и др., 1986), в котором полипептидная цепь не разъединена.Truncated forms of BON are obtained, each through the action of enzymes or through genetic methods. In 2-CAP generated by the controlled action of trypsin, the first eight residues at the Ν-terminal portion of the BON were removed. Other truncated BON variants are obtained by modifying a gene before expressing it in a suitable host. The first 13 residues were removed, resulting in a derivative having special biological properties (Oetiet et al., 1986), in which the polypeptide chain is not disconnected.

Хотя гормон роста человека первоначально был получен из гипофизов, взятых у трупов, данные препараты не были электрофоретически гомогенны, и антитела, появляющиеся в сыворотке пациентов, обработанных препаратами приблизительно 50% чистоты, иммуногенетически классифицировались как неактивные компоненты. Технология рекомбинантных ДНК дает возможность без ограничения продуцировать БОН в целом ряде различных систем. Очищению БОН из культуральной среды способствует наличие лишь небольшого количества примесных белков. Фактически было показано, что ЙОН может быть очищен в масштабе лаборатории посредством одной стадии очистки на колонке НРЬС с обращенной фазой (Ныиид е! а1. (1989).Although human growth hormone was originally obtained from pituitary glands taken from corpses, these preparations were not electrophoretically homogeneous, and antibodies appearing in the serum of patients treated with preparations of approximately 50% purity were immunogenetically classified as inactive components. Recombinant DNA technology makes it possible to produce BON without restriction in a number of different systems. The purification of BON from the culture medium is facilitated by the presence of only a small amount of impurity proteins. In fact, it has been shown that JON can be purified on a laboratory scale through a single purification step on a reverse phase HPLC column (Nyyid e! A1. (1989).

Рекомбинантный гормон роста человека, гБОН, был продуцирован производителем 8етоио 1п1егпа1юиа1 8.А. как 8ΕΚ.Ο8ΤΙΜ®, и было получено ускоренное одобрение ΡΌΑ на применение этого продукта для лечения пациентов с потерей веса и истощением среди больных СПИДом. 8ΑΙΖΕΝ® представляет собой рекомбинантный гормон роста человека, предназначенный для детей с дефицитом ОН, при синдроме Тернера у девочек, а также при хронической почечной недостаточности у детей. ΡΚΌΤΚΌΡΙΝ®, полученный Оеиеи!есБ, 1ис. (8ои!Б 8аи Ртаисксо, СА), незначительно отличается по структуре от природной последовательности БОН, имеет дополнительный остаток метионина вблизи Ν-концевого участка. Рекомбинантный БОН главным образом поставляется во флаконах, содержащих БОН плюс дополнительный наполнитель, например глицин и маннит, в лиофилизованной форме. Предусмотренный сопутствующий растворитель во флаконе дает возможность пациенту получать продукт желаемой концентрации до введения дозы. Рекомбинантный БОН может также поставляться другими хорошо известными способами, такими как заранее заполненный шприц, и так далее.The recombinant human growth hormone, gBON, was produced by the manufacturer 8ethoio 1p1egpa1uia1 8.A. as 8ΕΚ.Ο8ΤΙΜ®, and accelerated approval ΡΌΑ has been received for the use of this product for the treatment of patients with weight loss and malnutrition among AIDS patients. 8ΑΙΖΕΝ® is a recombinant human growth hormone intended for children with OH deficiency in Turner syndrome in girls, as well as in chronic renal failure in children. ΡΚΌΤΚΌΡΙΝ®, received by Oeeee! ECB, 1f. (8oi! B 8ai Rtaiskso, CA), slightly different in structure from the natural sequence of BON, has an additional methionine residue near the Ν-terminal site. Recombinant BON is mainly supplied in vials containing BON plus an additional excipient, for example glycine and mannitol, in lyophilized form. The prescribed concomitant solvent in the vial enables the patient to obtain the product of the desired concentration before the dose is administered. Recombinant BON can also be supplied by other well-known methods, such as a pre-filled syringe, and so on.

В основном не наблюдали значительного различия в фармакокинетике или биологической активности природной рекомбинантной последовательности БОН, рекомбинантного Ν-метионил-БОН или продуцируемого гипофизом человека субстрата (Мооге и др., 1988; 1отдеи88ои и др., 1988).Basically, there was no significant difference in the pharmacokinetics or biological activity of the natural recombinant sequence of BON, the recombinant Ν-methionyl-BON, or the substrate produced by the human pituitary gland (Mooge et al., 1988; 1dedei 88oi et al., 1988).

Принимая во внимание различные медицинские показания, при которых используется гормон роста, существует необходимость в действенном и надежном способе продуцирования значительного количества его в культуре клеток, в частности в способе, в котором используется культура клеток, не содержащая сыворотки.Given the various medical indications that use growth hormone, there is a need for an effective and reliable method of producing a significant amount of it in a cell culture, in particular a method in which a serum-free cell culture is used.

Среда, не содержащая сыворотки, была описана в данной области.Serum-free medium has been described in the art.

Например, в патенте США № 6162643 описана базальная среда, не содержащая сыворотки, именуемая НЕСК-109, содержащая незначительные количества сульфата меди и хлорида цинка. Данная среда специально предназначена для первичной и вторичной культур обычных клеток человека, таких как кератиноцид, с целью генерации ткани для трансплантации человеку. Экспрессия рекомбинантных беков человека в линии клеток ш νίΙΐΌ в данном патенте США не упоминается.For example, US Pat. No. 6,162,643 describes a serum-free basal medium called HECK-109, containing minor amounts of copper sulfate and zinc chloride. This medium is specifically designed for primary and secondary cultures of ordinary human cells, such as keratinocide, in order to generate tissue for human transplantation. The expression of recombinant human becks in the w νίΙΐΌ cell line is not mentioned in this US patent.

В патенте США № 5324656 описана базальная среда, не содержащая сыворотки, так называемая МСЭВ120 и МСЭВ131М, содержащая незначительные количества сульфата меди и хлорида цинка. Данная среда специально предназначена для культивирования ш νίΙΐΌ мышечных сателлитных клеток человека с целью предотвращения дифференцировки данных клеток. Продуцирование рекомбинантных белков человека не предусмотрено в рамках настоящего документа.US Pat. No. 5,324,656 describes a serum-free basal medium, the so-called MSEV120 and MSEV131M, containing minor amounts of copper sulfate and zinc chloride. This medium is specifically designed for the cultivation of human muscle satellite cells in order to prevent differentiation of these cells. The production of recombinant human proteins is not provided for in this document.

В документе ОВ 2196348 описана синтетическая среда для культивирования ш νίΙΐΌ клеток гибридомы и миеломы. Среда содержит медь, цинк и ионы железа. Культивирование клеток гибридомы и миеломы в данной среде проводится исключительно с целью получения моноклональных антител.Document OV 2196348 describes a synthetic medium for the cultivation of w νίΙΐΌ cells of hybridoma and myeloma. The medium contains copper, zinc and iron ions. The cultivation of hybridoma and myeloma cells in this medium is carried out exclusively with the aim of obtaining monoclonal antibodies.

В патенте США № 6103529 предложен состав для культивирования ш νίΙΐΌ клеток животного происхождения в не содержащей сыворотки культуральной клеточной среде. Клетки животного происхождения могут быть использованы для продуцирования вирусов, моноклональных антител, гормонов или факторов роста. Однако продуцирование гормона роста в данном документе не предусмотрено.US Pat. No. 6,103,529 proposes a composition for culturing w νίΙΐΌ cells of animal origin in a serum-free cell culture medium. Cells of animal origin can be used to produce viruses, monoclonal antibodies, hormones, or growth factors. However, the production of growth hormone is not provided in this document.

В патенте США № 6048728 описана не содержащая белков среда для культивирования клеток, включая в себя Со-, Ζιτ- и Ре-ионы для культивирования клеток животного происхождения, с тем, чтобы получать, например, натуральные или рекомбинантные продукты, такие как антитела. Продуцирование таких продуктов посредством культивируемых клеток не включает в себя гормоны роста или факторы роста, которые упоминаются исключительно как составляющие среды, не содержащей сыворотки, для увеличения роста клеток в культуре.US Pat. No. 6,048,728 describes a protein-free cell culture medium, including Co-, Ζιτ - and Re-ions for culturing animal cells, in order to obtain, for example, natural or recombinant products, such as antibodies. The production of such products through cultured cells does not include growth hormones or growth factors, which are referred solely as constituents of serum-free medium, to increase cell growth in culture.

В патенте США № 5316938 описана биохимически охарактеризованная среда для культивирования для клеток яичника китайского хомячка (СНО), содержащая цитрат железа, сульфат цинка и сульфат меди и называемая \УСМ5. Среда специально предназначена для продуцирования антитела и !РА в клетках СНО.US Pat. No. 5,316,938 describes a biochemically characterized culture medium for Chinese Hamster Ovary (CHO) cells containing iron citrate, zinc sulfate and copper sulfate and is called \ USM5. The medium is specifically designed for the production of antibodies and! RA in CHO cells.

- 4 011749- 4 011749

В патенте США № 5122459 описан способ продуцирования рекомбинантных белков в культуральной среде, не содержащей сыворотки, содержащей ионы цинка и железа, особенно пригодной для культивирования клеток СНО. Продуцирование гормона роста не предусматривалось в этом документе.US Pat. No. 5,222,959 describes a method for producing recombinant proteins in a serum-free culture medium containing zinc and iron ions, particularly suitable for culturing CHO cells. The production of growth hormone was not provided for in this document.

Таким образом, проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, связана с обеспечением не содержащей сыворотки среды для культивирования клеток, для эффективного продуцирования гормона роста, в частности гормона роста человека (БОН).Thus, the problem underlying the present invention is related to the provision of a serum-free cell culture medium for the efficient production of growth hormone, in particular human growth hormone (BON).

Краткое изложение изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение основано на усовершенствовании среды для культивирования клеток, не содержащей компонентов, получаемых из сыворотки животного происхождения, и в то же время высокоэффективной для роста клеток и поддержания клеток млекопитающих в культуре, в частности дающей возможность продуцирования рекомбинантных белков.The present invention is based on the improvement of a medium for culturing cells that does not contain components derived from animal serum, and at the same time highly effective for cell growth and maintenance of mammalian cells in culture, in particular enabling the production of recombinant proteins.

Таким образом, в первом аспекте изобретение связано со средой для культивирования клеток, не содержащей компонентов, полученных из сыворотки животного происхождения, содержащей цинк и/или медь в незначительных количествах. Предпочтительно среда согласно изобретению сверх этого содержит ионы железа в незначительных количествах.Thus, in a first aspect, the invention relates to a cell culture medium containing no components derived from animal serum containing small amounts of zinc and / or copper. Preferably, the medium according to the invention in addition contains iron ions in small quantities.

Во втором аспекте изобретение связано со способом продуцирования гормона роста человека, включающим в себя стадию экспрессии культивируемой клеткой гормона роста человека в среде согласно изобретению.In a second aspect, the invention relates to a method for producing human growth hormone, comprising the step of expressing a human growth hormone cultured in a cell in a medium according to the invention.

Третий аспект изобретения связан с использованием среды согласно изобретению для продуцирования гормона роста человека.A third aspect of the invention relates to the use of a medium according to the invention for the production of human growth hormone.

Четвертый аспект изобретения связан с использованием среды согласно изобретению для поддержания клеток в культуре в течение фазы продуцирования гормона роста человека.A fourth aspect of the invention relates to the use of a medium according to the invention for maintaining cells in culture during the production phase of human growth hormone.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг. 1 показан профиль продуктивности гБОН, полученный в фазе продуцирования при непрерывном добавлении различных элементов по 10 мкМ в культуральную среду ΌΜΕΜ (ВБ = роллерфлакон, Н1-Н14 = дни от 1 до 14 фазы продуцирования).In FIG. Figure 1 shows the productivity profile of gBON obtained in the production phase by continuously adding various elements of 10 μM to the culture medium ΌΜΕΜ (WB = roller bottle, H1-H14 = days from 1 to 14 production phases).

На фиг. 2 показаны средние величины продуктивности гБОН, выраженные в мг гБОН на роллерфлакон, полученные в фазе продуцирования при непрерывном добавлении металлов (никель, барий, кобальт, хром) по 10 мкМ в культуральную среду ΌΜΕΜ.In FIG. Figure 2 shows the average productivity of gBON, expressed in mg gBON per roller bottle, obtained in the production phase with the continuous addition of metals (nickel, barium, cobalt, chromium) of 10 μM in culture medium ΌΜΕΜ.

На фиг. 3 показаны средние величины продуктивности гБОН, увеличенные по сравнению с контролем, получаемые в факторном плане эксперимента для тестирования комбинаций цинка (Ζη 0,5 мкМ), меди (Си 0,02 мкМ), селена (8е 0,050 мкМ), марганца (Μη 0,001 мкМ) и цитрата железа (4,8 мкМ).In FIG. Figure 3 shows the average values of gBON productivity, increased in comparison with the control, obtained in the factorial design of the experiment for testing combinations of zinc (Ζη 0.5 μM), copper (Cu 0.02 μM), selenium (8е 0.050 μM), manganese (Μη 0.001 μM) and iron citrate (4.8 μM).

На фиг. 4 показаны результаты факторного плана эксперимента для определения результата смешивания металлических микроэлементов (Ζη 0,5 мкМ, Си 0,02 мкМ и цитрат железа 4,8 мкМ) и аминокислот: глутамина (О1п 4,8 мМ), серина (8ег 0,49 мМ) и цистеина (Сук 0,29 мМ).In FIG. Figure 4 shows the results of the factorial design of the experiment to determine the result of mixing metallic microelements (Ζη 0.5 μM, Cu 0.02 μM and iron citrate 4.8 μM) and amino acids: glutamine (O1n 4.8 mm), serine (8eg 0.49 mM) and cysteine (Bitch 0.29 mM).

На фиг. 5 показано действие различных концентраций меди, в комбинации с цинком и цитратом железа (Ζη 0,5 мкМ, Ре цитрат 4,8 мкМ), на продуктивность гБОН в ΌΜΕΜ.In FIG. Figure 5 shows the effect of various concentrations of copper, in combination with zinc and iron citrate (Ζη 0.5 μM, Re citrate 4.8 μM), on the productivity of gBON in ΌΜΕΜ.

На фиг. 6 показано действие различных концентраций цинка в сочетании с медью и цитратом железа (Си 0,02 мкМ, Ре цитрат 4,8 мкМ) на продуктивность гБОН в ΌΜΕΜ.In FIG. Figure 6 shows the effect of various concentrations of zinc in combination with copper and iron citrate (Cu 0.02 μM, Re citrate 4.8 μM) on the productivity of gBON in ΌΜΕΜ.

На фиг. 7 показано суммарное действие в отношении увеличения продуктивности гБОН, получаемого при добавлении меди, цинка и цитрата железа (Ζη 1,5 и 0,5 мкМ, Си 0,02 мкМ и цитрат железа 4,8 мкМ), в качестве добавок к ΌΜΕΜ на основании различных экспериментов с продуцирующими гБОН клетками С127.In FIG. 7 shows the total effect in relation to the increase in the productivity of gBON obtained by adding copper, zinc and iron citrate (Ζη 1.5 and 0.5 μM, Cu 0.02 μM and iron citrate 4.8 μM), as additives to ΌΜΕΜ per based on various experiments with gBON-producing C127 cells.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение основано на усовершенствовании среды для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки животного происхождения.The present invention is based on the improvement of a cell culture medium that does not contain animal serum.

Согласно настоящему изобретению среда для культивирования клеток, не содержащая сыворотку животного происхождения, включает в себя цинк (Ζη) в диапазоне концентраций от 0,2 до 1,75 мкМ, и/или медь (Си) в диапазоне концентраций от 10 до 75 нМ, и/или ионы железа (Ре) в диапазоне концентраций от 3 до 10 мкМ.According to the present invention, the cell culture medium not containing animal serum includes zinc (Ζη) in a concentration range from 0.2 to 1.75 μM, and / or copper (Cu) in a concentration range from 10 to 75 nM, and / or iron ions (Fe) in the concentration range from 3 to 10 μM.

Как показано на примерах ниже, добавление Ζη и/или Си в незначительных количествах к стандартной среде приводит к увеличению продуктивности клеток, экспрессирующих представляющий интерес секретируемый белок.As shown in the examples below, the addition of Ζη and / or Cu in small amounts to the standard medium leads to an increase in the productivity of cells expressing the secreted protein of interest.

Добавление обоих металлов, и Ζη и Си, в указанных выше концентрациях приводит к увеличению продуктивности рекомбинантного гормона роста человека (ОН) в клетках С127 до более чем 60% от контроля (те же клетки, культивируемые в стандартной среде ΌΜΕΜ). Когда ОН-экспрессирующие клетки культивировали в среде, содержащей Ζη, Си и ионы Ре в указанных выше концентрациях, продуктивность увеличивалась приблизительно до 70% по сравнению с контролем.The addition of both metals, and Ζη and Cu, in the above concentrations leads to an increase in the productivity of recombinant human growth hormone (OH) in C127 cells to more than 60% of the control (the same cells cultured in standard medium ΌΜΕΜ). When OH-expressing cells were cultured in a medium containing Ζη, Cu and Fe ions at the above concentrations, productivity increased to approximately 70% compared to the control.

Предпочтительные области концентраций ионов металла в среде согласно изобретению следующие.Preferred concentration ranges of metal ions in the medium according to the invention are as follows.

Цинк приблизительно 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,5, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1, 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1.6, 1,65, 1,7, 1,75 мкМ.Zinc approximately 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.5, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1, 1.05, 1.1, 1.15, 1.2, 1.25, 1.3, 1.35, 1.4, 1.45, 1.5, 1.55, 1.6, 1.65, 1.7, 1.75 μM.

- 5 011749- 5 011749

Предпочтительно, чтобы цинк составлял приблизительно 0,5 или приблизительно 1,5 мкМ. Предпочтительно также, чтобы цинк включался в виде сульфата цинка.Preferably, the zinc is approximately 0.5 or approximately 1.5 μM. It is also preferred that the zinc is included as zinc sulfate.

Медь составляет приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75 нМ.Copper is approximately 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, or 75 nM.

Предпочтительно, чтобы медь составляла приблизительно 25 нМ. Предпочтительно также, чтобы медь включалась в виде сульфата меди.Preferably, the copper is approximately 25 nM. It is also preferred that the copper is included as copper sulfate.

Ионы железа составляют приблизительно 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 4,8, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мкМ.Iron ions are approximately 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 4.8, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 or 10 μM.

Предпочтительно, чтобы ионы железа составляли приблизительно 5 или 6 мкМ. Ионы железа предпочтительно могут быть включены в виде цитрата железа и/или нитрата железа, и, кроме того, предпочтительно, чтобы цитрат железа рассматривался как содержащий большую часть ионов железа в среде культивирования клетки. Среда может содержать, например, около 5 мкМ цитрата железа и около 1 мкМ нитрата железа.Preferably, the iron ions are approximately 5 or 6 μM. Iron ions may preferably be included in the form of iron citrate and / or iron nitrate, and it is further preferred that iron citrate is considered to contain most of the iron ions in the cell culture medium. The medium may contain, for example, about 5 μM iron citrate and about 1 μM iron nitrate.

В предпочтительном воплощении среда дополнительно содержит компоненты основной среды. Предпочтительно, чтобы среда содержала модифицированную Дульбекко среду Игла (ΌΜΕΜ) в качестве основной среды. Композиция стандартной среды ΌΜΕΜ описана в примере ниже.In a preferred embodiment, the medium further comprises components of the basic medium. Preferably, the medium contains Dulbecco's modified Eagle medium (ΌΜΕΜ) as the main medium. The composition of the standard medium ΌΜΕΜ is described in the example below.

Второй аспект настоящего изобретения связан со способом продуцирования белка, включающим в себя стадию культивирования клетки, экспрессирующей представляющий интерес белок в среде согласно изобретению.A second aspect of the present invention relates to a method for producing a protein, comprising the step of culturing a cell expressing a protein of interest in a medium according to the invention.

Стадия культивирования способа согласно изобретению может быть проведена в любых подходящих внешних условиях, таких как чашки Петри, Т-колбы или роллер-флаконы, но таким же образом стадия культивирования может проводиться в сосуде, имеющем больший объем, таком, например, как биореактор.The cultivation step of the method according to the invention can be carried out under any suitable external conditions, such as Petri dishes, T-flasks or roller bottles, but in the same way, the cultivation step can be carried out in a vessel having a larger volume, such as, for example, a bioreactor.

Белок согласно изобретению может быть экспрессирован при использовании любого промотора, который подходит для конкретного типа культивируемой клетки. В особо предпочтительном воплощении белок экспрессируется из металлотионеинового (ΜΤ) промотора. Если для продуцирования белка используются мышиные клетки, в качестве промотора предпочтителен мышиный промотор МТ-1.The protein of the invention can be expressed using any promoter that is suitable for a particular type of cultured cell. In a particularly preferred embodiment, the protein is expressed from a metallothionein (ΜΤ) promoter. If murine cells are used to produce protein, the MT-1 murine promoter is preferred as the promoter.

Предпочтительно, чтобы способ дополнительно включал в себя стадию сбора среды, содержащей представляющий интерес белок.Preferably, the method further includes the step of collecting the medium containing the protein of interest.

В предпочтительном воплощении способ дополнительно включает в себя стадию выделения представляющего интерес белка.In a preferred embodiment, the method further includes the step of isolating the protein of interest.

В другом предпочтительном воплощении способ дополнительно включает в себя разработку рецептуры выделенного белка с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции.In another preferred embodiment, the method further includes formulating the isolated protein with a pharmaceutically acceptable carrier to formulate a pharmaceutical composition.

В третьем аспекте изобретение связано с применением среды согласно изобретению для продуцирования представляющего интерес полипептида.In a third aspect, the invention relates to the use of a medium according to the invention for the production of a polypeptide of interest.

В четвертом аспекте изобретение связано с применением среды согласно изобретению для поддержания клеток в культуре в течение фазы продуцирования представляющего интерес полипептида.In a fourth aspect, the invention relates to the use of a medium according to the invention for maintaining cells in culture during the production phase of a polypeptide of interest.

Клетки, используемые в рамках различных аспектов настоящего изобретения, предпочтительно представляют собой клетки млекопитающих. Они могут быть клетками человека или клетками животного. Примеры клеток млекопитающих, которые можно культивировать способом согласно настоящему изобретению, включают в себя, например, мышиные клетки С127, клетки 3Т3, клетки СО8, клетки остеосаркомы человека, клетки ΜΒί.'-5. клетки ВНК, клетки УЕВО, клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка), клетки НЕК 293, клетки гНЕК 293, клетки нормальных фибробластов человека, стромальные клетки, гепатоциты или клетки РЕВ.С6. Примеры гибридом, которые можно культивировать способом согласно настоящему изобретению, включают в себя, например, клетки ΌΑ4.4, клетки 123А, клетки 127 А, клетки ΟΑΜΜΑ и клетки 67-9-В.The cells used in various aspects of the present invention are preferably mammalian cells. They can be human cells or animal cells. Examples of mammalian cells that can be cultured by the method of the present invention include, for example, C127 mouse cells, 3T3 cells, CO8 cells, human osteosarcoma cells, ΜΒί .'-5 cells. BHK cells, UEVO cells, CHO cells (Chinese hamster ovary cells), HEK 293 cells, gNEK 293 cells, normal human fibroblast cells, stromal cells, hepatocytes or RE.C6 cells. Examples of hybridomas that can be cultured by the method of the present invention include, for example, клетки4.4 cells, 123A cells, 127 A cells, ΟΑΜΜΑ cells and 67-9-B cells.

Предпочтительно культивирование мышиных клеток С127 согласно настоящему изобретению.Preferably, culturing C127 murine cells according to the present invention.

Клетки, культивируемые согласно настоящему изобретению, могут расти в суспензии или, в случае зависимых от прикрепления клеток, прикрепленными к твердой основе.Cells cultured according to the present invention can grow in suspension or, in the case of attachment-dependent cells, attached to a solid base.

Микроносители и диски Б1Ьга-Се1® используют для культивирования клеток млекопитающих для роста прикрепленных, или заякоренных, клеток, и они используются, в числе общепринятых технологических платформ, для индустриального продуцирования белков (см., например, Войак и др., 1987; РеШ и др., 1994).The microcarriers and disks B1Ba-Ce1® are used for the cultivation of mammalian cells for the growth of attached or anchored cells, and they are used, among the generally accepted technological platforms, for the industrial production of proteins (see, for example, Voiac et al., 1987; Res and et al. 1994).

Способ предпочтительно подходит для продуцирования представляющего интерес полипептида. Среду согласно изобретению используют, таким образом, для продуцирования представляющего интерес полипептида или белка, который может представлять собой любой полипептид, низкомасштабное или крупномасштабное продуцирование которого желательно.The method is preferably suitable for the production of a polypeptide of interest. The medium of the invention is thus used to produce a polypeptide of interest or protein, which may be any polypeptide whose small-scale or large-scale production is desired.

Представляющим интерес полипептидом может быть, например, природно секретируемый белок, обычный цитоплазматический белок, обычный трансмембранный белок или гуманизированное антитело или антитело человека. Когда представляющий интерес белок представляет собой природный цитоплазматический или природный трансмембранный белок, белок предпочтительно подвергают генноинженерной модификации с тем, чтобы он стал растворимым и секретируемым, т. е. посредством размеThe polypeptide of interest may be, for example, a naturally secreted protein, a conventional cytoplasmic protein, a conventional transmembrane protein, or a humanized or human antibody. When the protein of interest is a natural cytoplasmic or natural transmembrane protein, the protein is preferably genetically engineered to become soluble and secreted, i.e., by size

- 6 011749 щения сигнального пептида перед белком или его фрагментом (растворимым или внеклеточным).- 6 011749 signaling peptide in front of the protein or its fragment (soluble or extracellular).

Представляющий интерес полипептид может иметь любое происхождение. Предпочтительно представляющие интерес полипептиды происходят из организма человека и более предпочтительно представляющие интерес белки обладают лечебным действием.The polypeptide of interest may be of any origin. Preferably, the polypeptides of interest are derived from the human body, and more preferably the proteins of interest have a therapeutic effect.

Предпочтительно, чтобы представляющий интерес белок был выбран из гормона, цитокинсвязанного белка, интерферона, растворимого рецептора или антитела.Preferably, the protein of interest is selected from a hormone, a cytokine-bound protein, interferon, a soluble receptor, or an antibody.

Белки с лечебным действием, которые могут быть продуцированы способом согласно изобретению, включают в себя, например, хорионический гонадотропин, фолликулостимулирующий гормон, лутропин-хориогонадотропный гормон, тиреостимулирующий гормон, гормон роста, в частности гормон роста человека, интерфероны (например, интерферон бета-1а, интерферон бета-1Ь), рецепторы интерферона (например, рецептор интерферона гамма), ΤΝΡ-рецепторы р55 и р75 и их растворимые варианты, ТАС1рецептор и его Бе-слитые белки, интерлейкины (например, интерлейкин-2, интерлейкин-11), интерлейкинсвязывающие белки (например, интерлейкин-18-связывающий белок), анти-СП11а-антитела, эритропоэтин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитовмакрофагов, пептидные гормоны гипофиза, менопаузальный гонадотропин, инсулиноподобные факторы роста (например, соматомедин-С), фактор роста кератиноцитов, полученный из клеточной линии глиальных клеток нейротрофический фактор, тромбомодулин, основной фактор роста фибробластов, инсулин, фактор VIII, соматропин, морфогенетический белок-2 кости, фактор роста из тромбоцитов, гирудин, эпоиетин, рекомбинантный слитый белок ЬБА-3/1дС1, глюкоцереброзидаза и мутеины, фрагменты, растворимые формы, функциональные производные, их слитые белки.Proteins with a therapeutic effect that can be produced by the method according to the invention include, for example, chorionic gonadotropin, follicle-stimulating hormone, lutropin-choriogonadotropin hormone, thyroid-stimulating hormone, growth hormone, in particular human growth hormone, interferons (e.g. interferon beta-1a , interferon beta-1b), interferon receptors (for example, the gamma interferon receptor), β-receptors p55 and p75 and their soluble variants, TAC1 receptor and its Unbound proteins, interleukins (e.g. interleukin-2, inter neukin-11), interleukin-binding proteins (e.g., interleukin-18-binding protein), anti-SP11a antibodies, erythropoietin, colony-stimulating granulocyte factor, colony-stimulating granulocyte macrophage factor, peptide hormones of the pituitary gland, menopausal gonadotropin, somatoninodin, ), keratinocyte growth factor, obtained from the glial cell line, neurotrophic factor, thrombomodulin, the main fibroblast growth factor, insulin, factor VIII, somatropin, morphogenetic protein-2 ti, platelet derived growth factor, hirudin, epoietin, recombinant fusion protein BA-3 / 1dS1, glucocerebrosidase, and muteins, fragments, soluble forms, functional derivatives, fusion proteins thereof.

В предпочтительных воплощениях полипептид выбран из группы, состоящей из хорионического гонадотропина (СО), фолликулостимулирующего гормона (ББН), лутропин-хориогонадотропного гормона (ЬН), тиреостимулирующего гормона (ТБН), гормона роста человека (ЮН), интерферонов (например, интерферона бета-1а, интерферона бета-1Ь), рецепторов интерферона (например, рецептора гаммаинтерферона), ΤNБ-рецепторов р55 и р75, интерлейкинов (например, интерлейкина-2, интерлейкина-11), интерлейкинсвязывающих белков (например, интерлейкин-18-связывающего белка), анти-СЭ11аантител и мутеинов, фрагментов, растворимых форм, функциональных производных, их слитых белков.In preferred embodiments, the polypeptide is selected from the group consisting of chorionic gonadotropin (CO), follicle-stimulating hormone (BBN), lutropin-choriogonadotropin hormone (BH), thyroid-stimulating hormone (TBN), human growth hormone (UN), interferon (e.g., interferon b 1a, interferon beta-1b), interferon receptors (e.g. gamma interferon receptor), ΤNB receptors p55 and p75, interleukins (e.g. interleukin-2, interleukin-11), interleukin-binding proteins (e.g., interleukin-18 binding protein), anti-s 11aantitel and muteins, fragments, soluble forms, functional derivatives, fusion proteins.

Далее, предпочтительные представляющие интерес полипептиды включат в себя, например, эритропоэтин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов, пептидные гормоны гипофиза, менопаузальный гонадотропин, инсулиноподобные факторы роста (например, соматомедин-С), фактор роста кератиноцитов, полученный из линии глиальных клеток нейротрофический фактор, тромбомодулин, основной фактор роста фибробластов, инсулин, фактор VIII, соматропин, морфогенетический белок-2 кости, фактор роста из тромбоцитов, гирудин, эпоиетин, рекомбинантный слитый белок ЬБА-3ЛдС1, глюкоцереброзидаза и мутеины, фрагменты, растворимые формы, функциональные производные, их слитые белки.Further preferred polypeptides of interest include, for example, erythropoietin, colony stimulating factor granulocytes, colony stimulating factor granulocyte macrophages, peptide hormones of the pituitary gland, menopausal gonadotropin, insulin-like growth factors (e.g. somatomedin-C), keratinocyte growth factor cell neurotrophic factor, thrombomodulin, the main fibroblast growth factor, insulin, factor VIII, somatropin, bone morphogenetic protein-2, thrombotic growth factor itov, hirudin, epoietin, recombinant fusion protein BA-3LdS1, glucocerebrosidase, and muteins, fragments, soluble forms, functional derivatives, fusion proteins thereof.

Если будет разработана рецептура представляющего интерес белка, продуцируемого способом согласно изобретению, с фармацевтически приемлемым носителем, то результатом способа будет фармацевтическая композиция.If a formulation of the protein of interest produced by the method of the invention with a pharmaceutically acceptable carrier is developed, the result of the process will be a pharmaceutical composition.

Формулировка фармацевтически приемлемый подразумевает включение любого носителя, который не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента и который не токсичен для организма хозяина, которому данный препарат вводится. Например, для парентерального введения активный белок(белки) может быть заключен в форму стандартной дозы для инъекций, в сочетании с носителем, таким как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.A pharmaceutically acceptable formulation is intended to include any carrier that does not affect the effectiveness of the biological activity of the active ingredient and which is not toxic to the host organism to which the drug is administered. For parenteral administration, for example, the active protein (s) may be enclosed in a unit dosage form for injection, in combination with a carrier such as saline, dextrose solution, serum albumin and Ringer's solution.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению может затем вводиться индивидууму различными способами. Способы введения включают в себя внутрикожный, трансдермальный (например, медленное введение состава), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, оральный, внутричерепной, эпидуральный, местный, ректальный и интраназальный способы. Любой другой терапевтически эффективный способ введения может быть использован, например абсорбция через эпителиальные или эндотелиальные ткани, или с использованием генной терапии, при которой пациенту вводится молекула ДНК, кодирующая активный агент (например, с помощью вектора), что приводит к тому, что активный агент экспрессируется и секретируется ίη νίνο. Кроме того, белок(белки) согласно изобретению может быть введен вместе с другими компонентами биологически активных агентов, таких как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, наполнители, носители, растворители и среды для лекарств.The pharmaceutical composition according to the invention can then be administered to an individual in various ways. Methods of administration include intradermal, transdermal (e.g., slow administration of the composition), intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, oral, intracranial, epidural, local, rectal and intranasal methods. Any other therapeutically effective route of administration can be used, for example, absorption through epithelial or endothelial tissues, or using gene therapy, in which a DNA molecule encoding an active agent (for example, using a vector) is injected into the patient, resulting in the active agent expressed and secreted ίη νίνο. In addition, the protein (s) of the invention can be administered together with other components of biologically active agents, such as pharmaceutically acceptable surfactants, excipients, carriers, solvents and drug media.

Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) активный белок(белки) должен входить в рецептуру в качестве раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка, вместе с фармацевтически приемлемым парентеральным наполнителем (например, вода, физиологический раствор, раствор декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Состав стерилизуют с помощью обычно используемых технологий.For parenteral administration (e.g., intravenous, subcutaneous, intramuscular), the active protein (s) must be formulated as a solution, suspension, emulsion or lyophilized powder, together with a pharmaceutically acceptable parenteral excipient (e.g. water, saline, dextrose solution) and additives that maintain isotonicity (e.g., mannitol) or chemical stability (e.g., preservatives and buffers). The composition is sterilized using commonly used techniques.

- 7 011749- 7 011749

Согласно настоящему изобретению значительное предпочтение отдается использованию среды согласно изобретению для продуцирования гормона роста.According to the present invention, considerable preference is given to using the medium according to the invention for the production of growth hormone.

СН может быть нативным, т.е. СН природного происхождения. Предпочтительно, чтобы СН, который должен быть продуцирован, был гормоном человека. Так как СН является растворимым секретируемым белком, он высвобождается в супернатант клеточной культуры либо посредством его природного сигнального пептида, либо посредством гетерологичного сигнального пептида, т. е. сигнального пептида, полученного из другого секретируемого белка, который может быть более эффективным в конкретно применяемой экспрессирующей системе.CH can be native, i.e. CH of natural origin. Preferably, the HF to be produced is a human hormone. Since CH is a soluble secreted protein, it is released into the cell culture supernatant either through its natural signal peptide or through a heterologous signal peptide, i.e., a signal peptide derived from another secreted protein, which may be more effective in the particular expression system used .

Термин гормон роста используется в данном документе в качестве синонима термину СН. Данный термин включает в себя природный или нативный СН, рекомбинантно продуцируемый СН, а также различные СН, подробно описанные в разделе ''Основы изобретения. Термин ''СН, используемый в данном документе, дополнительно включает в себя мутеины, функциональные производные, активные фракции, слитые белки, пермутированные по кругу белки и соли СН. СН предпочтительно представляет собой гормон роста человека, но может также быть другой разновидности, в частности гормоном роста млекопитающих.The term growth hormone is used herein as a synonym for the term CH. This term includes natural or native CH, recombinantly produced CH, as well as various CH, described in detail in the section `` Fundamentals of the invention. The term `` CH ', as used herein, further includes muteins, functional derivatives, active fractions, fusion proteins, circularly permuted proteins and CH salts. CH is preferably a human growth hormone, but may also be of a different variety, in particular mammalian growth hormone.

Используемый в данном документе термин мутеины относится к аналогам СН, в которых один или более аминокислотных остатков природного СН заменены другими аминокислотными остатками или удалены, или один или более аминокислотных остатков добавлены к природной последовательности СН, без значительного уменьшения активности результирующих продуктов по сравнению с СН дикого типа. Данные мутеины получают посредством известного синтеза и/или посредством техники сайтспецифического мутагенеза, или любыми другими подходящими для этого техническими приемами.As used herein, the term muteins refers to analogues of CH in which one or more amino acid residues of natural CH are replaced or removed, or one or more amino acid residues are added to the natural sequence of CH, without significantly reducing the activity of the resulting products compared to wild CH type. These muteins are obtained by known synthesis and / or by the site-specific mutagenesis technique, or by any other suitable technique.

Мутеины в соответствии с настоящим изобретением включают в себя белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которые в жестких условиях гибридизуются с ДНК или РНК, кодирующими СН. ДНК, кодирующие СН, известны из предшествующего уровня техники. Термин жесткие условия относится к условиям гибридизации и последовательной промывки, которые специалист в данной области традиционно относит к жестким. См. Ли8иЬе1 и др., Сштеи! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Βίо1оду, выше, 1п1ег5С1епсе. Ν.Υ., § 6.3 и 6.4 (1987, 1992). Не ограничиваясь данными примерами, жесткие условия включают в себя условия промывания при 12-20°С ниже расчетной Тт гибрида при изучении, например, в 2х88С и 0,5% 8И8 в течение 5 мин, 2х88С и 0,1% 8И8 в течение 15 мин; 0,1х88С и 0,5% 8И8 при 37°С в течение 30-60 мин и затем 0,1х88С и 0,5% 8И8 при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисту в данной области понятно, что жесткие условия зависят также от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (например, в 10-40 оснований) или смеси олигонуклеотидных зондов. Если использовать смесь зондов, предпочтительно использование тетраметилхлоридаммония (ТМАС) вместо 88С. См. Аи8иЬе1, выше.Muteins in accordance with the present invention include proteins encoded by a nucleic acid, such as DNA or RNA, which under stringent conditions hybridize with DNA or RNA encoding CH. DNAs encoding HF are known in the art. The term stringent conditions refers to hybridization and sequential flushing conditions, which the specialist in this field traditionally refers to stringent. See Li8iLe1 et al., Stews! ArgoCoil ίη Mo1ci1ag Βίo1odu, above, 1n1eg5C1epse. Ν.Υ., § 6.3 and 6.4 (1987, 1992). Not limited to these examples, stringent conditions include washing conditions at 12-20 ° C below the calculated TT of the hybrid when studied, for example, in 2x88C and 0.5% 8I8 for 5 min, 2x88C and 0.1% 8I8 for 15 min; 0.1x88C and 0.5% 8I8 at 37 ° C for 30-60 minutes and then 0.1x88C and 0.5% 8I8 at 68 ° C for 30-60 minutes. One skilled in the art will recognize that stringent conditions also depend on the length of the DNA sequences, oligonucleotide probes (for example, 10-40 bases) or a mixture of oligonucleotide probes. If you use a mixture of probes, it is preferable to use tetramethylchloridammonium (TMAC) instead of 88C. See Ai8iBe1, above.

Идентичность, определяемая посредством сравнения последовательностей, отражает взаимосвязь между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями. Вообще идентичность основана на точном соответствии нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте двух полинуклеотидов или двух полипептидных последовательностей, соответственно, по всей длине сравниваемых последовательностей.Identity determined by sequence comparison reflects the relationship between two or more polypeptide sequences or two or more polynucleotide sequences. In general, identity is based on the exact correspondence of the nucleotide to the nucleotide or amino acid for the amino acid of two polynucleotides or two polypeptide sequences, respectively, along the entire length of the compared sequences.

Для последовательностей, между которыми нет точного соответствия, можно определить % идентичности. Обычно две последовательности, которые нужно сравнить, выравнивают для получения максимальной корреляции между последовательностями. Данный способ может включать в себя вставки гэпов в любой, одной или обеих последовательностях, увеличивающие степень выравнивания. % идентичности можно определить по всей длине каждой из последовательностей, которые сравнивали (так называемое глобальное выравнивание), что, в частности, удобно для последовательностей одинаковой или очень похожей длины, или более короткой, чем определяемая длина (так называемое локальное выравнивание), что более подходит для последовательностей неравной длины.For sequences between which there is no exact match,% identity can be determined. Typically, the two sequences to be compared are aligned to maximize the correlation between the sequences. This method may include inserting gaps in any, one or both sequences, increasing the degree of alignment. % identity can be determined along the entire length of each of the sequences that were compared (the so-called global alignment), which, in particular, is convenient for sequences of the same or very similar length, or shorter than the determined length (the so-called local alignment), which is more suitable for sequences of unequal length.

Способы сравнения идентичности и гомологии двух или более последовательностей хорошо известны в данной области. Так, например, имеющиеся в распоряжении программы \У15соп5ш 8ес.|иепсе Апа1у§18 Раскаде, версия 9.1 (Иеуегеих 1. и др., 1984), например программы ΒΕ8ΤΕΙΤ и САР, могут быть использованы для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности и % гомологии между двумя полипептидными последовательностями. В программе ΒΕ8ΤΕΙΤ используется алгоритм локальной гомологии 8тй11 и \Уа1еппап (1981), и она лучше всего обнаруживает единственную область подобия между двумя последовательностями. Другие программы для определения идентичности и/или подобия между последовательностями также известны в данной области, например семейство программ ВЬА8Т (АЮсйЫ 8.Е. и др., 1990, А11ксНи1 8.Е. и др., 1997, доступные на домашней странице NСΒI на \\л\лу.псЫ.п1т.ш11.доу) и ЕА8ТА (Реагкоп ХУЛ., 1990).Methods for comparing the identity and homology of two or more sequences are well known in the art. So, for example, the programs at the disposal of \ U15sop5sh 8ec. | Iepse Apa1u§18 Raskade, version 9.1 (Jeuegeih et al., 1984), for example, the ΒΕ8ΤΕΙΤ and САР programs, can be used to determine% identity between two polynucleotides and% identity and% homology between two polypeptide sequences. The ΒΕ8 программе program uses the local homology algorithm 8π11 and \ Wa1eppap (1981), and it best detects a single region of similarity between two sequences. Other programs for determining the identity and / or similarity between sequences are also known in the art, for example, the BAB8T family of programs (AYUSYY 8.E. et al., 1990, A11xNi1 8.E. et al., 1997, available on the NCI homepage on \\ l \ lu.psy.p1t.sh11.dow) and EA8TA (Reagkop HUL., 1990).

Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, в достаточной мере повторяющую последовательность СН так, чтобы он имел в основном активность, подобную СН. Один тип активности СН представляет собой его способность связываться с СН-рецептором. До тех пор пока мутеин имеет существенную связывающую активность с СН-рецептором (СНВ), он может рассматриAny such mutein preferably has an amino acid sequence that sufficiently repeats the sequence of CH so that it has mainly activity similar to CH. One type of CH activity is its ability to bind to the CH receptor. As long as mutein has significant binding activity to the CH receptor (START), it can consider

- 8 011749 ваться как имеющий существенно подобную ОН активность. Таким образом, можно определить то, имеет ли любой данный мутеин существенно сходную с ОН активность, посредством стандартных экспериментов, включая, например, простой конкурентный сэндвич-анализ такого мутеина, для определения того, связывается ли он с соответствующим образом меченным СНВ или клетками, экспрессирующими СНВ, такой анализ как радиоиммунологический анализ или ЕЬГБА.- 01 01749 as having substantially similar OH activity. Thus, it is possible to determine whether any given mutein has substantially similar OH activity through standard experiments, including, for example, a simple competitive sandwich assay of such a mutein, to determine whether it binds to appropriately labeled START or cells expressing START, an analysis such as radioimmunological analysis or EHBA.

В предпочтительном воплощении любой такой мутеин имеет по меньшей мере 40% идентичности или гомологии с аминокислотной или ДНК-последовательностью СН. Такие последовательности известны в данной области, например ΩοΝοΙο и др., 1981 или Магйа1 и др., 1979.In a preferred embodiment, any such mutein has at least 40% identity or homology with the amino acid or DNA sequence of CH. Such sequences are known in the art, for example, ΩοΝοΙο et al., 1981 or Magya 1 et al., 1979.

Более предпочтительно он имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90 или 95% идентичности или гомологии с аминокислотной или ДНК-последовательностью СН.More preferably, it has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or most preferably at least 90 or 95% identity or homology with the amino acid or DNA sequence of CH.

Предпочтительные замены для мутеинов согласно настоящему изобретению представляют собой те, которые известны как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов СН могут включать в себя синонимичные аминокислоты в пределах группы, которая имеет достаточно сходные физико-химические свойства, так, чтобы при заменах между представителями в пределах группы сохранялась биологическая функция молекулы (Сгап!йаш, 1974). Ясно, что вставки и делеции аминокислот также могут иметь место в определенных выше последовательностях без изменения их функции, в частности если вставки или делеции состоят только из нескольких аминокислот, например меньше тридцати, и предпочтительно меньше десяти, и не удаляются или не замещаются аминокислоты, которые необходимы для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, продуцируемые посредством таких делеций и/или вставок, входят в объем, охватываемый настоящим изобретением.Preferred substitutions for the muteins of the present invention are those that are known as conservative substitutions. Conservative amino acid substitutions of CH polypeptides can include synonymous amino acids within a group that has fairly similar physicochemical properties, so that the biological function of the molecule is preserved during substitutions between representatives within the group (Cgapyash, 1974). It is clear that insertions and deletions of amino acids can also occur in the sequences defined above without changing their function, in particular if the insertions or deletions consist of only a few amino acids, for example less than thirty, and preferably less than ten, and amino acids that are not removed or not replaced necessary for functional conformation, for example, cysteine residues. Proteins and muteins produced by such deletions and / or insertions are included in the scope of the present invention.

Термин слитый белок относится к полипептиду, содержащему СН, или мутеину, или его фрагменту, слитому с другим белком, который, например, имеет продолжительное время пребывания в жидкой среде организма. СН может, таким образом, быть слит с другим белком, полипептидом или прочим, например с иммуноглобулином или его фрагментом. Ее-участки ГдС пригодны для получения слитых с иммуноглобулином белков. Слитые с Гд белки описаны, например, в патентах ЕР 314317 А1 (Сеиеи1есй) или ЕР 0325224 А2 (2ушодеие!1С8 1пс.).The term fusion protein refers to a polypeptide containing CH, or a mutein, or a fragment thereof, fused to another protein, which, for example, has a long residence time in the body’s liquid medium. CH can thus be fused to another protein, polypeptide or the like, for example, an immunoglobulin or a fragment thereof. Its GdC sites are suitable for the production of fusion proteins with immunoglobulin. Proteins fused with HD are described, for example, in the patents EP 314 317 A1 (Sieie1esy) or EP 0325224 A2 (2 archives! 1C8 1ps.).

Под активными фракциями СН или мутеинов и слитых белков в настоящем изобретении предусмотрен любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы, отдельно или вместе с ассоциированными молекулами или связанными с ними остатками, например сахаром или фосфатными остатками, или агрегаты белковой молекулы или остатки сахара сами по себе, определяющие указанную фракцию, имеют, по существу, схожую с СН активность.Under the active fractions of CH or muteins and fusion proteins, the present invention provides for any fragment or precursors of the polypeptide chain of a protein molecule, alone or together with associated molecules or associated residues, such as sugar or phosphate residues, or protein molecule aggregates or sugar residues per se determining the specified fraction have essentially similar activity with CH.

Если СН согласно изобретению будет использоваться в качестве фармацевтической композиции, такая фармацевтическая композиция может быть использована для лечения и/или предотвращения ряда заболеваний или нарушений. Такие заболевания или нарушения предпочтительно связаны с недостаточным эндогенным продуцированием СН. Очищенный СН может быть использован, например, для лечения и/или предупреждения дефицита СН, истощения при СПИДе, липодистрофии (называемой также синдромом НАВБ-НГУ ассоциированной дистрофией/дисметаболизмом), или синдрома укороченной тонкой кишки, в частности, в педиатрии. Кроме того, заболевания, при которых может быть показано введение гормона роста, включают в себя цирроз печени, недостаток роста у взрослых, атеросклероз, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, остеоартрит, сердечную кахексию, застойную сердечную недостаточность, хроническую почечную недостаточность, восстановление или мобилизацию клеток крови, мужское бесплодие, мобилизацию гематопоэтических стволовых клеток, множественный склероз, инсульт, множественную системную атрофию или злокачественную опухоль.If the HF according to the invention is used as a pharmaceutical composition, such a pharmaceutical composition can be used to treat and / or prevent a number of diseases or disorders. Such diseases or disorders are preferably associated with insufficient endogenous production of HF. Purified HF can be used, for example, to treat and / or prevent HF deficiency, AIDS depletion, lipodystrophy (also called NAVB-NSU syndrome associated dystrophy / dysmetabolism), or a shortened small bowel syndrome, in particular in pediatrics. In addition, diseases in which the administration of growth hormone may be indicated include liver cirrhosis, adult growth failure, atherosclerosis, Crohn's disease and ulcerative colitis, osteoarthritis, cardiac cachexia, congestive heart failure, chronic renal failure, recovery or mobilization blood cells, male infertility, hematopoietic stem cell mobilization, multiple sclerosis, stroke, multiple systemic atrophy or cancer.

Имея теперь полное описание данного изобретения, специалист в данной области оценит, что подобное можно воспроизвести в пределах широкого круга эквивалентных параметров, концентраций и условий без отступления от сущности и рамок изобретения и без чрезмерного экспериментирования.Having now a complete description of the invention, one skilled in the art will appreciate that such a thing can be reproduced within a wide range of equivalent parameters, concentrations and conditions without departing from the spirit and scope of the invention and without undue experimentation.

Несмотря на то что данное изобретение описано в связи с его специфическими воплощениями, следует понимать, что возможны и другие модификации. Настоящий патент подразумевает любые вариации, применения или приспособления изобретения, в целом следующие принципам данного изобретения и включающие такие отступления от настоящего описания, которые подпадают под обычную практику в рамках области, к которой относится изобретение, и которые могут быть использованы в отношении основных признаков, сформулированных выше в данном документе, в объеме, охватываемом прилагаемой формулой изобретения.Although this invention is described in connection with its specific embodiments, it should be understood that other modifications are possible. The present patent is intended to include any variations, applications or adaptations of the invention, generally following the principles of the present invention and including such derogations from the present description that fall under normal practice within the scope of the invention, and which can be used in relation to the main features formulated above in this document, to the extent covered by the attached claims.

Все ссылки, указанные в данном документе, включая журнальные статьи или краткие обзоры, опубликованные или неопубликованные в США, или иностранная заявка на патент, опубликованная в США, или иностранные патенты, или любые другие ссылки полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, включая все данные, таблицы, рисунки и текст, представленные в указанных ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, упоминаемых документов, цитируемых в рамках ссылок, приведенных в данном документе, также в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки.All references cited herein, including journal articles or synopsis published or unpublished in the United States, or a foreign patent application published in the United States, or foreign patents, or any other references are fully incorporated into this description by reference, including all data , tables, figures and text presented in these links. In addition, the full contents of the references referred to in the documents cited in the context of the references cited in this document are also fully incorporated into the present description by reference.

- 9 011749- 9 011749

Ссылка на известные стадии способа, традиционно используемые стадии способов, известные способы или традиционно используемые способы никоим образом не означает, что какой бы то ни было аспект, описание или воплощение настоящего изобретения уже были раскрыты, описаны или рекомендованы в релевантной области.Reference to known method steps, traditionally used process steps, known methods or conventionally used methods does not in any way mean that any aspect, description or embodiment of the present invention has already been disclosed, described or recommended in the relevant field.

Вышеизложенное описание специфических воплощений должно настолько основательно раскрывать общую природу изобретения, чтобы другие могли, применяя знания в пределах данной области, (включая содержания ссылок, указанных в данном документе), без труда модифицировать и/или адаптировать для различных применений данные специфические воплощения без чрезмерного экспериментирования, без уклонения от основной концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации предусмотрены в рамках эквивалентных воплощений, раскрытых на основе концепции и методов, представленных в данном документе. Должно быть понятно, что фразеология или терминология данного документа служит для описания, а не ограничения изобретения, так что терминология или фразеология настоящего описания должны интерпретироваться специалистом в данной области лишь как руководство, которое в сочетании с навыками рядового специалиста в данной области позволят реализовать изобретение.The above description of specific embodiments should thoroughly disclose the general nature of the invention so that others can, using knowledge within this field (including the contents of the references cited in this document), easily modify and / or adapt these specific embodiments for various applications without undue experimentation without deviating from the basic concept of the present invention. Therefore, such adaptations and modifications are contemplated within the scope of equivalent embodiments disclosed based on the concepts and methods presented herein. It should be clear that the phraseology or terminology of this document is used to describe, and not limit, the invention, so that the terminology or phraseology of the present description should be interpreted by a specialist in this field only as a guide that, combined with the skills of an ordinary specialist in this field will allow to realize the invention.

Пример. Усовершенствование новой, не содержащей сыворотки продуцирующей среды для С127 клеток, экспрессирующих 11СН.Example. Improvement of a new serum-free production medium for C127 cells expressing 11CH.

1. Введение.1. Introduction.

В данном исследовании описана экспериментальная работа, связанная с усовершенствованием продуцирующей культуральной среды (ΌΜΕΜ, модифицированная Дульбекко среда Игла) посредством добавок следовых количеств элементов металлов. В результате данного усовершенствования было получено поразительное увеличение продуктивности г-йСН в культуре клеток С127.This study describes the experimental work related to the improvement of the producing culture medium (ΌΜΕΜ, Dulbecco's modified Eagle medium) through the addition of trace amounts of metal elements. As a result of this improvement, a striking increase in the productivity of g-CHF in a C127 cell culture was obtained.

В следующей табл. 1 представлен суммарный эффект композиции ΌΜΕΜ и усовершенствования, который продемонстрирован в рамках данного примера.In the following table. Figure 1 shows the cumulative effect of composition ΌΜΕΜ and the enhancement demonstrated as part of this example.

Таблица 1Table 1

Композиция ростовой среды, ΌΜΕΜ и продуцирующей средыThe composition of the growth medium, ΌΜΕΜ and production medium

компоненты Components Среда роста мг/л Growth medium mg / L ЭМЕМ, мг/л EMEM, mg / l Продуцирую щая среда мг/л Production medium mg / L аминокислоты amino acids Ь-АЛАНИН B-alanine 49,45 49.45 Ь-АРГИНИН нсь B-arginine 227,5 227.5 84,0 84.0 84, 0 84, 0 Ь-АСПАРАГИН Н₂ОL-ASPARAGIN N ₂ O 27,50 27,50 Ь-АСПАРТАТ B-aspartate 21,65 21.65 Ъ-ЦИСТЕИН НС1 Н₂ОKommersant НС1 Н ₂ О 17,56 17.56 Ь-ЦИСТИН 2НС1 B-cystine 2ns1 31,29 31.29 62,0 62.0 62,0 62.0 Ъ-ГЛЮТАМАТ GLUTAMATE 40,35 40.35 Ъ-ГЛУТАМИН B-glutamine 693,5 693.5 584,0 584.0 584,0 584.0 ГЛИЦИН GLYCINE 43,75 43.75 30,0 30,0 30, 0 30, 0 Ь-ГИСТИДИН НС1, Н₂ОB-Histidine HC1, H ₂ O 41,48 41.48 42,0 42.0 42,0 42.0 Ъ-ГИДРОКСИПРОЛИН B-hydroxyproline 6, 50 6, 50 Ъ-ИЗОЛЕЙЦИН B-isoleucine 114,5 114.5 105,0 105.0 105,0 105.0 Ь-ЛЕЙЦИН B leucine 119,1 119.1 105,0 105.0 105,0 105.0 Д-ЛИЗИН-НС1 D-LYSIN-NS1 151,3 151.3 146,0 146.0 146,0 146.0 Ъ-МЕТИОНИН B-methionine 52,24 52.24 30,0 30,0 30,0 30,0 Ь-ФЕНИЛАЛАНИН B-phenylalanine 70,48 70.48 66, 0 66, 0 66,0 66.0 Ь-ПРОЛИН B-proline 37,25 37.25 Ь-СЕРИН B-serine 39,25 39.25 42,0 42.0 42,0 42.0 Ь-ТРЕОНИН B-threonine 93, 45 93, 45 95,0 95.0 95,0 95.0 Ъ-ТРИПТОФАН B-tryptophan 15,02 15.02 16,0 16,0 16,0 16,0 Ь-ТИР03ИН 2Яа 2Н₂ОL-TYR03IN 2Ha 2H ₂ O 75,79 75.79 104,0 104.0 104,0 104.0 Ь-БАЛИН B-balin 92, 85 92, 85 93, 0 93, 0 93,0 93.0 СОЛИ SALTS ХЛОРИД КАЛЬЦИЯ CALCIUM CHLORIDE 121,0 121.0 200 200 200 200 Ге(ИОз) з-9Н₂ОGe (IOz) s-9H ₂ O 0,050 0,050 0,1 0.1 0,1 0.1 СУЛЬФАТ ЖЕЛЕЗА 7Н₂ОIRON SULPHATE 7Н ₂ О 1,251 1,251 КС1 KC1 334,2 334.2 400 400 400 400 ХЛОРИД МАГНИЯ MAGNESIUM CHLORIDE 40,94 40.94 МдЗОа АНГИДРИД MDZOA ANHYDRID 48,84 48.84 97 97 97 97

- 10 011749- 10 011749

Ма₂НРО«Ma ₂ NRA " 71,02 71.02 СЕЛЕНИТ НАТРИЯ 5Н₂ОSODIUM SELENIUM 5Н ₂ О 0,030 0,030 ΝθΌΙ ΝθΌΙ 7500 7500 6400 6400 6400 6400 ЫаН₂РО₄ Н₂ОJan ₂ RO ₄ H ₂ O 62,5 62.5 125 125 125 125 ΝβΗΟΟ₃ ΝβΗΟΟ ₃ 1200 1200 3700 3700 3700 3700 ХЛОРИД лития Lithium CHLORIDE 1,00 1.00 Ζη3Ο₄·7Η₂ΟΖη3Ο ₄ · 7Η ₂ Ο 0,432 0.432 0,144 0.144 УГЛЕВОДЫ CARBOHYDRATES Ό-ГЛЮКОЗА Ό-Glucose 3650 3650 4500 4500 4500 4500 ВИТАМИНЫ VITAMINS АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА VITAMIN C 0,500 0,500 БИОТИН BIOTIN 0,1035 0.1035 ХОЛИН ХЛОРИД CHOLINE CHLORIDE 11,48 11.48 4,00 4.00 4,00 4.00 ВИТАМИН В12 VITAMIN B12 1, 68 1, 68 Са ПАНТОТЕНАТ CA Pantothenate 2,34 2,34 4, 00 4:00 4,00 4.00 ФОЛИЕВАЯ КИСЛОТА FOLIC ACID 3, 65 3, 65 4, 00 4:00 4,00 4.00 1-ИНОЗИТ 1-INOZIT 17,1 17.1 7,00 7.00 7,00 7.00 НИКОТИНАМИД NICOTINAMID 2,27 2.27 4,00 4.00 4, 00 4:00 ПАРА-АМИН0БЕН30ЙНАЯ КИСЛОТА PARA AMINO BENBENIC ACID 1, 00 one hundred ПИРИДОКСАЛ-НС1 PIRIDOXAL-NS1 0,25 0.25 4,00 4.00 4,00 4.00 ПИРИДОКСИН НС1 Pyridoxine HC1 4,531 4,531 РИБОФЛАВИН RIBOFLAVIN 0,419 0.419 0, 40 0, 40 0,40 0.40 ТИАМИН НС1 Thiamine HC1 2,92 2.92 4, 00 4:00 4,00 4.00 ЛИПИДЫ LIPIDS ЛИНОЛЕВАЯ КИСЛОТА LINOIC ACID 0,042 0,042 ЛИПОЕВАЯ КИСЛОТА LITTLE ACID 0,205 0.205 МЕТИЛЛИНОЛЕАТ METILLINOLEATE 0,1 0.1 РАЗНОЕ OTHER ЦИТРАТ ЖЕЛЕЗА IRON CITRATE 122,5 122.5 1,22 1.22 ХЕПЕС HEPES 3600 3600 ГИПОКСАНТИН Hypoxanthine 2, 900 2, 900 ЖЕЛЕЗО (II) ά-ГЛЮКОНАТ ДИГИДРАТ IRON (II) ά-Gluconate Dihydrate 4,820 4,820 Ь-ГЛЮТАТИОН B-glutathione 0,500 0,500 МЕ РКАПТОЭТАНОЛ ME RKAPTOETHANOL 0,234 0.234 ПИРУВАТ НАТРИЯ Pyruvate Sodium 57,00 57.00 110, 0 110, 0 110,0 110.0 ПУТРЕСЦИН, 2НС1 PUTRESCIN, 2CH1 0, 241 0, 241 ТИМИДИН Thymidine 0, 505 0, 505 ДЕТЕРГЕНТЫ DETERGENTS ЭТАНОЛАМИН (как основание) Ethanolamine (as base) 6,25 6.25 МИКРОЭЛЕМЕНТЫ Micronutrients ХЛОРИД СЕРЕБРА SILVER CHLORIDE 0,0000044 0.0000044 ХЛОРИД БАРИЯ 2Н₂ОBARIUM CHLORIDE 2H ₂ O 0, 002 0, 002 ХЛОРИД КОБАЛЬТА 6Н₂ОCOBALT CHLORIDE 6H ₂ O 0, 002 0, 002 ХРОМ СУЛЬФАТ КАЛИЯ CHROMIUM SULPHATE POTASSIUM 0, 001 0, 001 БРОМИД КАЛИЯ POTASSIUM BROMIDE 0,0001 0.0001 ЙОДИД КАЛИЯ POTENTIUM IODIDE 0,0001 0.0001 МОЛИБДЕНОВАЯ КИСЛОТА (Молибдат аммония 4НгО) MOLYBDENIC ACID (Ammonium molybdate 4Ngo) 0,0001 0.0001 ФТОРИД НАТРИЯ SODIUM FLUORIDE 0, 004 0, 004 МЕТАВАНДАТ АММОНИЯ METAVANDATE AMMONIA 0,0006 0,0006 НИТРАТ НИКЕЛЯ 6Н₂ОNICKEL NITRATE 6H ₂ O 0,0002 0,0002 ХЛОРИД РУБИДИЯ RUBIDIUM CHLORIDE 0,00001 0.00001 ДИХЛОРИД ОЛОВА 2НзО TIN Dichloride 2Nzo 0,0001 0.0001 СУЛЬФАТ МЕДИ 5Н₂ОCOPPER SULFATE 5H ₂ O 0,0064 0.0064 0,0064 0.0064 ХЛОРИД МАГНИЯ 4Н₂ОMAGNESIUM CHLORIDE 4H ₂ O 0,0001 0.0001 ОКСИД ТИТАНА TITANIUM OXIDE 0,001 0.001 ДОПОЛНЕНИЯ ADDITIONS РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА RECOMBINANT HUMAN INSULIN 10 мг/л 10 mg / l ФИЗИЧЕСКИЕ УСТАНОВКИ PHYSICAL INSTALLATIONS рН pH 7,1+0,1 7.1 + 0.1 7,0+0,2 7.0 + 0.2 7,0±0,2 7.0 ± 0.2 ОСМОТИЧЕСКАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ (тозт/кг) OSMOTIC CONCENTRATION (tozt / kg) 325+25 325 + 25 330+30 330 + 30 330±30 330 ± 30

- 11 011749- 11 011749

2. Материалы и способы.2. Materials and methods.

Реагенты и растворы.Reagents and solutions.

Все химические реагенты были получены от Мегск®: сульфат цинка (Ζη8Ο₄·7Η₂Ο), сульфат меди (Си8О₄-5Н₂О), хлорид бария (ВаС1у2Н₂О), хлорид кобальта (СоС1у6Н₂О), хромсульфат калия (К[Сг (8ОбН₄)₂(Н₂О)₂ф6Н₂О), нитрат никеля (№(ИО₃)у6 Н₂О), селенит натрия (Иа₂8еО₃^5Н₂О).All chemicals were obtained from Megsk®: zinc sulfate (Ζη8Ο ₄ · 7Η ₂ Ο), copper sulfate (Cu8О ₄ -5Н ₂ О), barium chloride (ВаС1у2Н ₂ О), cobalt chloride (СС1у6Н ₂ О), potassium chromosulfate ( K [Cr (8ObH ₄ ) ₂ (H ₂ O) ₂ ph6H ₂ O), nickel nitrate (No. (IO ₃ ) y6 H ₂ O), sodium selenite (Ia ₂ 8eO ₃ ^ 5H ₂ O).

Цитрат железа (РеС₆Н₅О₇ 81дта®, номер по каталогу Р3388) использовали в качестве источника железа.Iron citrate (FeC ₆ H ₅ O ₇ 81 dta®, catalog number P3388) was used as a source of iron.

Смесь микроэлементов для ростовой среды (100000Х) предоставлена ДЯН® Вюкаепсек.A mixture of microelements for the growth medium (100000X) was provided by DYAN® Vyukaepsek.

Все растворы микроэлементов для опытов готовили в виде концентрированных растворов в дистиллированной воде и стерилизованных путем фильтрования через 0,2 мкм фильтр.All solutions of trace elements for the experiments were prepared in the form of concentrated solutions in distilled water and sterilized by filtration through a 0.2 μm filter.

Добавление различных анализируемых добавок (растворы металлов и т. д.) в разных экспериментах проводили непосредственно в свежую культуральную среду.The addition of various analyzed additives (metal solutions, etc.) in different experiments was carried out directly in a fresh culture medium.

Культуры клеток.Cell culture.

Генетически модифицированные мышиные клетки С127 (АТСС СЯЬ 1616) использовали для экспрессии рекомбинантного гормона роста человека (гЬСН). Вектор основан на ВРУ69Т, содержащем множественно клонированный сайт рВЯ322 и содержащем мини-ген гЬСН в 1,6 т.п.н. под контролем мышиного промотора металлотионеина-1 (МТ-1). В экспериментах использовали культуры, полученные в ХУогкищ Се11 Вапк из разных серий, продуцирующих гкСН.Genetically modified murine C127 cells (ATCC CAB 1616) were used to express recombinant human growth hormone (gHCH). The vector is based on BPU69T containing the plurally cloned pBYA322 site and containing the 1.6 kb mini-gene gSN. under the control of the mouse promoter metallothionein-1 (MT-1). The cultures used in the experiments were obtained in Khuogishche Ce11 Vapk from different series producing hkSN.

Культуру клеток инкубировали при 36±0,5°С и 0,4 об/мин в 2125 см роллер-флаконах, содержащих 375±15 мл культуральной среды, или в 1700 см² роллер-флаконах, содержащих 300 мл культуральной среды.The cell culture was incubated at 36 ± 0.5 ° C and 0.4 rpm in 2125 cm roller bottles containing 375 ± 15 ml of culture medium, or in 1700 cm ² roller bottles containing 300 ml of culture medium.

Культурная среда.The cultural environment.

Культуральной средой, используемой для фазы продуцирования гЬСН, была ЭМЕМ с 4,5 г/л глюкозы, забуференной бикарбонатом натрия (3,7 г/л).The culture medium used for the gFH production phase was EMEM with 4.5 g / L glucose buffered with sodium bicarbonate (3.7 g / L).

Титрование гЬСН.Titration

Измерение гЬСН в культуральной среде проводили ежедневно посредством титрования НРЬС с обращенной фазой.Measurement of hBS in the culture medium was performed daily by reverse phase titration of HBS.

Материалы.Materials

8упс11горак ЯР4, 100x4,6 мм внутренний диаметр, 30А Са!. № С4Я103-10 (Еккгот).8ups11gorak YaR4, 100x4.6 mm inner diameter, 30A Ca !. No. С4Я103-10 (Ekkgot).

Яекоигсе ЯРС 1 мл, 30x6,4 мм внутренний диаметр, 15 мкм, арт. 17-1181-01, ЛтегШат Вюкаепсек.Yaekoigs YaRS 1 ml, 30x6.4 mm inner diameter, 15 microns, art. 17-1181-01, LtegSat Vyukaepsek.

8утте!гу 300, 50x4,6 мм внутренний диаметр, С4 5 мкм, Р/Ν 186000287 (\Уа!ег5).8utte! Gu 300, 50x4.6 mm inner diameter, C4 5 μm, P / Ν 186000287 (\ Wa! Eg5).

Реагенты.Reagents

Трифторуксусная кислота (ТФУ) (Р1егсе, Са!. № 28904 или эквивалент).Trifluoroacetic acid (TFU) (P1egse, Ca !. No. 28904 or equivalent).

Ацетонитрил (АСИ) (Мегск 1,00030 или эквивалент).Acetonitrile (ASI) (Megsk 1,00030 or equivalent).

Очищенная вода, Р\¥ (например, вода М1Шр, или эквивалент).Purified water, P \ ¥ (for example, water M1Shr, or equivalent).

Гелий.Helium.

Растворы.Solutions.

Подвижная фаза А: ТФУ 0,08% в Н₂О (об./об.).Mobile phase A: TFA 0.08% in H ₂ O (v / v).

К необходимому количеству объема воды Р\У в градуированной колбе добавляли ТФУ согласно следующей таблице. Взбалтывали и прикрепляли этикетку.To the required amount of water volume P \ U in a graduated flask was added TFA according to the following table. Shook and affixed the label.

ОБЪЕМ ФАЗЫ А VOLUME OF PHASE A ОБЪЕМ воды МГЬЫО VOLUME OF WATER MGYO ОБЪЕМ ТФУ VOLUME OF TFU 1 л 1 liter 1 л 1 liter 0,8 мл 0.8 ml 0,5 л 0.5 l 0,5 л 0.5 l 0,4 мл 0.4 ml 0,25 л 0.25 L 0,25 л 0.25 L 0,2 мл 0.2 ml

Подвижная фаза В: ТФУ 0,08% в ацетонитриле (об./об.).Mobile phase B: TFA 0.08% in acetonitrile (v / v).

К необходимому количеству объема Р\¥ воды в объемной колбе добавляли ТФУ, согласно следующей таблице. Взбалтывали и прикрепляли этикетку.To the required amount of volume P \ ¥ water in a volumetric flask was added TFA, according to the following table. Shook and affixed the label.

ОБЪЕМ ФАЗЫ В VOLUME OF PHASE IN ОБЪЕМ ΆΟΝ VOLUME ΆΟΝ ОБЪЕМ ТФУ VOLUME OF TFU 1 л 1 liter 1 л 1 liter 0,8 мл 0.8 ml 0,5 л 0.5 l 0,5л 0,5l 0,4 мл 0.4 ml 0,25 л 0.25 L 0,25 л 0.25 L 0,2 мл 0.2 ml

Параметры хроматографии.Chromatography parameters.

Элюирование градиентом: сначала смесью фаза А/фаза В 60/40, в конце фаза А/фаза В 20/80. Градиент завершается за 5 мин (небольшие вариации зависят от используемого оборудования).Gradient elution: first with a mixture of phase A / phase B 60/40, at the end phase A / phase B 20/80. The gradient is completed in 5 minutes (small variations depend on the equipment used).

Объем инжекции 50 мкл.The injection volume is 50 μl.

Регистрация: УФ-поглощение при 215 нм.Registration: UV absorption at 215 nm.

Калибровочная кривая: стандартный образец г-ЬСН при 10, 50, 100, 120 и 150 мкг/мл.Calibration curve: g-LCH standard sample at 10, 50, 100, 120 and 150 μg / ml.

Концентрацию образца г-ЬСН определяли посредством сравнения с концентрацией стандартного образца г-ЬСН.The concentration of the g-LCH sample was determined by comparison with the concentration of the standard g-LCH sample.

Продуктивность СН.Productivity CH.

Продуктивность выражается как мг гЬСН на роллер-флакон. Приблизительные данные представляют собой концентрацию гЬСН при сборе клеток (что измеряли посредством НРЬС) и полное количествоProductivity is expressed as mg hSN per roller bottle. The approximate data are the concentration of hBS during cell collection (as measured by HPLC) and the total amount

- 12 011749 роллер-флаконов при сборе клеток. Обычно роллер-флакон во время фазы сбора содержит приблизительно 10⁹ клеток.- 12 011749 roller bottles when collecting cells. Typically, the roller bottle during the collection phase contains approximately 10 ⁹ cells.

3. Результаты.3. Results.

В первых сериях экспериментов анализировали действие высокой концентрации кобальта (20 мкМ СоС1₂-6Н₂О) при периодическом добавлении его в культуральную среду. Добавление кобальта проводили во время двух замен среды на начальной стадии (промывка и ΡΜ=продуцирующая среда, т.е. 0 точка фазы сбора) и в промежуточной стадии (сборы 6 и 7) фазы продуцирования в одной серии. Результаты (не показаны) свидетельствуют о том, что промотор активен и может быть модулирован.In the first series of experiments, the effect of a high concentration of cobalt (20 μM CoC1 ₂ -6H ₂ O) was analyzed with periodic addition of it to the culture medium. The addition of cobalt was carried out during two medium changes at the initial stage (washing and ΡΜ = producing medium, i.e., 0 point of the collection phase) and in the intermediate stage (collections 6 and 7) of the production phase in one series. Results (not shown) indicate that the promoter is active and can be modulated.

Увеличение продуктивности дополнительно подтверждали при использовании других металлических элементов. Проводили анализ, соответственно, с барием (ВаС1₂-2Н₂О), кобальтом (СоС1₂-6Н₂О), хромом (К[Сг(8О₆Н₄)₂(Н₂О)₂]-6Н₂О) и никелем (N1 (ЫО₃)₂-6Н₂О), в концентрациях 10 мкМ, непрерывно добавлявшихся непрерывно в среду. Результаты данного эксперимента изображены на фиг. 1 и 2.The increase in productivity was further confirmed using other metal elements. The analysis was carried out, respectively, with barium (BaCl ₂ -2H ₂ O), cobalt (CoCl ₂ -6H ₂ O), chromium (K [Cr (8O ₆ H ₄ ) ₂ (H ₂ O) ₂ ] -6H ₂ O) and nickel (N1 (NO ₃ ) ₂ -6H ₂ O), at concentrations of 10 μM, continuously added continuously to the medium. The results of this experiment are depicted in FIG. 1 and 2.

На фиг. 1 показано количество БОН, секретируемое экспрессирующими БОН клетками С127, при культивировании в среде, содержащей анализируемые элементы в течение времени эксперимента (14 дней). На фиг. 2 показаны средние значения продуктивности, достигаемые для каждого анализируемого элемента. Полученная средняя продуктивность продолжает увеличение процентного соотношения по сравнению с контролем, т.е. величиной без следовых количеств элементов, в пределах между 1,1% для бария и 32,4% для кобальта. Также было отмечено, что продуктивность гБОН растет от 9 до 32,5% по сравнению с контрольной величиной при непрерывном способе введения кобальта по сравнению с периодическим. Ни барий, ни хром не вызывали увеличения продуктивности при исследуемых концентрациях в ΌΜΕΜ. Измерения в присутствии следовых количеств отдельных элементов ΌΜΕΜ дополняли микроэлементами Ζη, Си, 8е и Со в концентрациях, представленных ниже в табл. 2. Данные концентрации соответствуют концентрациям элементов металлов в среде роста. Увеличение продуктивности гБОН, достигаемое посредством добавления в ΌΜΕΜ следовых количеств элементов, показано в табл. 2.In FIG. Figure 1 shows the amount of BON secreted by C127-expressing BON cells when cultured in a medium containing analyzed elements during the experiment (14 days). In FIG. 2 shows the average values of productivity achieved for each analyzed element. The obtained average productivity continues to increase the percentage compared with the control, i.e. without trace amounts of elements, between 1.1% for barium and 32.4% for cobalt. It was also noted that the productivity of gBON increases from 9 to 32.5% compared with the control value with a continuous method of introducing cobalt compared to periodic. Neither barium nor chromium caused an increase in productivity at the studied concentrations in ΌΜΕΜ. Measurements in the presence of trace amounts of individual elements ΌΜΕΜ were supplemented with trace elements Ζη, Cu, 8e, and Co at the concentrations presented in the table below. 2. These concentrations correspond to the concentrations of metal elements in the growth medium. The increase in GBON productivity achieved by adding ΌΜΕΜ trace amounts of elements is shown in Table. 2.

Таблица 2table 2

Увеличение продуктивности гБОН в процентах при изучении эффекта ионов металлов в ΌΜΕΜ при указанных концентрациях в мкМThe increase in GBON productivity in percent when studying the effect of metal ions in ΌΜΕΜ at the indicated concentrations in μM

Ион And he КОНЦЕНТРАЦИЯ (мкМ) CONCENTRATION (μM) % УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ % INCREASED PRODUCTIVITY Ζη Ζη 1,50300 1,50300 12,10% 12.10% Си Si 0,02560 0,02560 37,50% 37.50% 5е 5th 0,11400 0.11400 -3,10% -3.10% Со With 0,00840 0,00840 -3,20% -3.20%

Нужно отметить, что в случае цинка оцениваемая концентрация в 1,5 мкМ является причиной феномена отшелушивания, т.е. отделения клеточного монослоя от пластического субстрата роллерфлаконов. В некоторых случаях данный пилинг ведет к потере культуры на последних стадиях сбора клеток (особенно между сборами клеток 12-14). Феномен отшелушивания может быть получен при использовании соответствующих сосудов для культуры клеток, таких как роллер-флаконы компании Сотί秮 под торговой маркой Се11Ьтб®.It should be noted that in the case of zinc, an estimated concentration of 1.5 μM is the cause of the exfoliation phenomenon, i.e. separation of the cell monolayer from the plastic substrate of the roller bottles. In some cases, this peeling leads to a loss of culture in the last stages of cell collection (especially between cell harvests 12-14). The exfoliation phenomenon can be obtained by using appropriate cell culture vessels, such as Sotn®® roller bottles under the trademark Ce11btb®.

Измерение взаимодействия между металлами.Measurement of the interaction between metals.

Основываясь на действии меди и цинка на уровень продуцирования БОН, проводили план факторных экспериментов для проверки возможного комбинированного действия металлов.Based on the effect of copper and zinc on the level of production of BON, we conducted a plan of factor experiments to test the possible combined effect of metals.

Статистический анализ результатов показан в табл. 3. Наблюдали стойкий синергический эффект в отношении продуктивности (р<0,0001) при использовании Си и Ζη совместно.Statistical analysis of the results is shown in table. 3. A persistent synergistic effect was observed with respect to productivity (p <0.0001) when using Cu and Ζη together.

Таблица 3Table 3

Статистические анализы 3-факторного плана факторного исследованияStatistical analyzes of a 3-factor plan of factor research

Анализ изменения продуктивности Productivity Change Analysis Источник A source Сумыа квадратов Sumy Squares О£ About £ Средний квадрат Average square Г-коэф G-coefficient Р-велич P-magnitude А:медь A: copper 406, 143 406, 143 1 one 406,143 406,143 350,74  350.74 0,0000 0.0000 В:цинк B: zinc 84,6308 84,6308 1 one 84,6308 84,6308 73,09 73.09 0,0000 0.0000 С:с£г1 вода C: c £ r1 water 0,626472 0.626472 1 one 0,626472 0.626472 0,54 0.54 0,4807 0.4807 АВ AB 47,7896 47,7896 1 one 47,7896 47,7896 41,27 41.27 0,0001 0.0001 АС AC 2,49008 2,49008 1 one 2,49008 2,49008 2, 15 2, 15 0,1766 0.1766 вс sun 0,438906 0.438906 1 one 0,438906 0.438906 0,38 0.38 0,5534 0.5534 Суммарная ошибка Total error 10,4215 10,4215 9 nine 1,15795 1,15795 Суммарно (корр.) Total (corr.) 552,541 552,541 15 fifteen

В-квадрат=98,1139%.B squared = 98.1139%.

В-квадрат (скорректированный для б.Г.)=96.8565%.B-square (adjusted for bg) = 96.8565%.

Отшелушивание наблюдали во всех культурах, обработанных цинком при концентрации 1,5 мкМ, независимо от того, присутствует ли медь или нет.Exfoliation was observed in all cultures treated with zinc at a concentration of 1.5 μM, whether copper was present or not.

- 13 011749- 13 011749

Последовательные планы факторных экспериментов проводили для изучения совместного действия цинка и меди, когда концентрацию цинка уменьшали (Ζη 0,5 мкМ) и добавляли другие микроэлементы в среду роста, такие как магний, селен или цитрат железа, которые могут увеличивать продуктивность и адгезию культур к субстрату.Subsequent plans of factor experiments were carried out to study the combined effect of zinc and copper, when the zinc concentration was reduced (Ζη 0.5 μM) and other trace elements were added to the growth medium, such as magnesium, selenium or iron citrate, which can increase the productivity and adhesion of the cultures to the substrate .

Непрерывный рост продолжался от общей стартовой точки продуктивности, приблизительно 20 мг тйСН на флакон, с конечными значениями около 70 мг тйСН/КВ, по сравнению с 30 мг тйСН в контрольной культуре со стандартной ΌΜΕΜ (не показано). Средние значения увеличения продуктивности СН (т.е. продуктивности, измеренной в мг/КВ на 14 день) по сравнению с контролем показаны на фиг. 3.Continuous growth continued from the overall starting point of productivity, approximately 20 mg tySN per bottle, with final values of about 70 mg tySN / KV, compared with 30 mg tySN in a control culture with standard ΌΜΕΜ (not shown). Average values of increasing CH productivity (i.e., productivity measured in mg / KB on day 14) compared to the control are shown in FIG. 3.

В данных сериях экспериментов феномен отшелушивания уменьшался.In these series of experiments, the phenomenon of exfoliation was reduced.

Добавление аминокислот.The addition of amino acids.

Исследование действия аминокислот проводили для того, чтобы определить, ограничено ли увеличение продуктивности 11СН наличием любой аминокислоты. В табл. 4 показано процентное отношение в сборе клеток после двух дней культивирования в среде с добавлением и без добавления цинка и меди.A study of the action of amino acids was carried out in order to determine whether the increase in 11CH productivity is limited by the presence of any amino acid. In the table. Figure 4 shows the percentage of cell harvest after two days of culture in a medium with and without zinc and copper.

Таблица 4 Процентное отношение концентрации аминокислот в необработанной среде в сборе клеток после двух дней культивирования, созданной из культур, поддерживаемых стандартной ΌΜΕΜ или ΌΜΕΜ, дополненной Ζη 0,5 мкМ, Си 0,02 мкМ и цитратом железа 4,8 мкМTable 4 The percentage of amino acids in the untreated medium in the collection of cells after two days of cultivation, created from cultures supported by standard ΌΜΕΜ or ΌΜΕΜ, supplemented with Ζη 0.5 μm, Cu 0.02 μm and iron citrate 4.8 μm

АМИНОКИСЛОТА AMINO ACID СТАНДАРТНАЯ βΜΕΜ STANDARD βΜΕΜ ДОПОЛНЕННАЯ ϋΜΕΜ ADDED ϋΜΕΜ Ь-глутамин B-glutamine 31% 31% 13% thirteen% Ъ-серин B-serine 28% 28% 11% eleven% Ь-цистин B-cystine 20% twenty% 13% thirteen% остаточные Ьаминокислоты residual amino acids 50%-100% 50% -100% 39%-86% 39% -86%

Смесь меди, цинка и цитрата железа (Ζη 0,5 мкМ, Си 0,02 мкМ и цитрат железа 4,8 мкМ) анализировали в комбинациях с теми аминокислотами, которые расходуются в наибольшем количестве: Ь-глутамин (С1п 4,8 мМ), Ь-серин (§ет 0,49 мМ) и Ь-цистеин (Сук 0,29 мМ). Результаты показаны на фиг. 4.A mixture of copper, zinc and iron citrate (Ζη 0.5 μM, Cu 0.02 μM and iron citrate 4.8 μM) was analyzed in combination with those amino acids that are consumed in the greatest amount: L-glutamine (C1.8 4.8 mmol) , B-serine (§ 0.49 mM) and b-cysteine (Bitch 0.29 mM). The results are shown in FIG. 4.

Положительного действия на продуктивность любой из тестируемых аминокислот не наблюдали, как раздельно, так и в смеси.A positive effect on the productivity of any of the tested amino acids was not observed, either separately or in a mixture.

Когда металлы добавляли совместно с аминокислотами, наблюдали только незначительное действие на продуктивность: легкий положительный эффект от глутамина (от 78,2 до 81,1%) и отрицательный эффект от цистеина (от 78,2 до 69,9%). Такие различия не рассматривались как существенные.When metals were added together with amino acids, only a slight effect on productivity was observed: a slight positive effect from glutamine (from 78.2 to 81.1%) and a negative effect from cysteine (from 78.2 to 69.9%). Such differences were not considered significant.

Продуктивность несомненно различается в культурах, обработанных смесью металлов в ΌΜΕΜ (средняя величина приблизительно 50 мг тйСН/КВ на сбор клеток) от культур, не содержащих металлы (приблизительно 30 мг тйСН/КВ на сбор клеток). Принимая во внимание эти результаты, не считали необходимым модифицировать исходную аминокислотную композицию продуцирующей среды.Productivity undoubtedly differs in cultures treated with a mixture of metals in ΌΜΕΜ (average value of approximately 50 mg tySH / KV per cell collection) from cultures not containing metals (approximately 30 mg tySCH / KV per cell collection). Given these results, it was not considered necessary to modify the original amino acid composition of the producing medium.

Эффект титрования меди и цинка.The effect of titration of copper and zinc.

Для того чтобы измерить оптимальную концентрацию меди, эксперимент проводили, удерживая концентрацию цитрата железа (4,8 мкМ) и концентрацию цинка (0,5 мкМ) постоянными и варьируя концентрацию меди (фиг. 5).In order to measure the optimal concentration of copper, the experiment was carried out by keeping the concentration of iron citrate (4.8 μM) and the concentration of zinc (0.5 μM) constant and varying the concentration of copper (Fig. 5).

Как показано на фиг. 5, эксперимент зависимости доза-эффект подтвердил, что оптимальная концентрация меди, добавляемой в ΌΜΕΜ, составляет 25,6 нМ при указанных концентрациях цинка и цитрата железа.As shown in FIG. 5, the dose-response experiment confirmed that the optimal concentration of copper added in ΌΜΕΜ is 25.6 nM at the indicated concentrations of zinc and iron citrate.

В другом эксперименте концентрацию цитрата железа (4,8 мкМ) и меди (0,025 мкМ) удерживали постоянными и варьировали концентрацию цинка (фиг. 6): уровень максимальной продуктивности наблюдали (плато) при концентрациях цинка выше 200 нМ, стабилизация продуктивности наблюдалась на уровне приблизительно на 60% выше средней контрольной величины.In another experiment, the concentration of iron citrate (4.8 μM) and copper (0.025 μM) was kept constant and the zinc concentration was varied (Fig. 6): the maximum productivity level was observed (plateau) at zinc concentrations above 200 nM, productivity stabilization was observed at approximately 60% above the average control value.

Краткое изложение результатовSummary of Results

На фиг. 7 суммированы результаты, полученные с ионами Ζη и Си в незначительных концентрациях совместно с ионами железа или без них.In FIG. 7 summarizes the results obtained with Ζη and Cu ions in insignificant concentrations together with or without iron ions.

Нижеследующие величины были получены на основе данных, полученных по увеличению продуктивности посредством добавления в среду ΌΜΕΜ следовых количеств металлических элементов:The following values were obtained on the basis of data obtained by increasing productivity by adding trace amounts of metal elements to the medium ΌΜΕΜ:

цинк 1,5 мкМ: 10,3±5,0%, цинк 0,5 мкМ: 16,8±1,6%, медь 0,02 мкМ: 32,1±9,4%, цинк 1,5 мкМ + медь 0,02 мкМ: 66,3±16%, цинк 0,5 мкМ + медь 0,02 мкМ: 61,2% (±10%), цинк 0,5 мкМ + медь 0,02 мкМ + цитрат железа 4,8 мкМ: 69,4±19%.1.5 μM zinc: 10.3 ± 5.0%, 0.5 μM zinc: 16.8 ± 1.6%, 0.02 μM copper: 32.1 ± 9.4%, 1.5 μM zinc + copper 0.02 μM: 66.3 ± 16%, zinc 0.5 μM + copper 0.02 μM: 61.2% (± 10%), zinc 0.5 μM + copper 0.02 μM + iron citrate 4.8 μM: 69.4 ± 19%.

Принимая во внимание эти данные, нижеследующая смесь является оптимальной в качестве присадки к среде ΌΜΕΜ.Considering these data, the following mixture is optimal as an additive to the medium ΌΜΕΜ.

- 14 011749- 14 011749

Медь в качестве сульфата меди (Си8О₄-5Н₂О) при 25 нМ.Copper as copper sulfate (Cu8O ₄ -5H ₂ O) at 25 nM.

Цинк в качестве сульфата цинка (Ζη8Ο₄·7Η₂Ο), между 50 и 1500 нМ с предпочтительными концентрациями от 200 до 500 нМ.Zinc as zinc sulfate (Ζη8Ο ₄ · 7Η ₂ Ο), between 50 and 1500 nM with preferred concentrations of 200 to 500 nM.

Цитрат железа при концентрации ионов от 4,8 мкМ до конечной концентрации приблизительно в 6 мкМ, с учетом того, что нитрат железа уже присутствует в ΌΜΕΜ.Iron citrate at an ion concentration of 4.8 μM to a final concentration of approximately 6 μM, given that iron nitrate is already present in ΌΜΕΜ.

Заключение.Conclusion

Использование ионов меди, цинка и железа в незначительных количествах в качестве добавок к среде ΌΜΕΜ увеличивает продуктивность гРСН более чем на 50% по сравнению со стандартной ΌΜΕΜ.The use of insignificant amounts of copper, zinc, and iron ions as additives to the medium ΌΜΕΜ increases the efficiency of SRS by more than 50% compared to the standard ΌΜΕΜ.

СсылкиReferences

1. А1!ксРи1 Б.Р. е! а1., 1. Μοί. Вю1., 215, 403-410, 1990.1. A1! KsRi1 B.R. e! A1., 1. Μοί. Vue1., 215, 403-410, 1990.

2. Άτηοίά е! а1. И8 2003/0153042.2. Άτηοίά e! a1. I8 2003/0153042.

3. АикиЬе1 е! а1., Ситтеп! РгоШсоР ίη Μο^αι1;·ΐΓ Βίο1θβν. кирга, 1п1ег5С1епсе. Ν.Υ., § 6.3 апй 6.4 (1987, 1992).3. AIKIBE1 e! A1., Sittep! РГО ШСОР ίη Μο ^ αι1; · ΐΓ Βίο1θβν. Kirga, 1p1eg5S1epse. Ν.Υ., § 6.3 apy 6.4 (1987, 1992).

4. А1!ксРи1 Б.Р. е! а1., №.1с1е1С Ас1йк Кек., 25:389-3402, 1997.4. A1! KsRi1 B.R. e! A1., No. 1s1e1S As1yk Kek., 25: 389-3402, 1997.

5. Вескег е! а1., В^есйшЕ Арр1. ВюсРет. 10:326 (1988).5. Veskeg e! a1., B ^ Ex Arp1. VusRet. 10: 326 (1988).

6. Ве\\'1у е! а1., Ιηΐ. 1. РерРйе апй Рго!ет Кек. 4:281-287 (1972).6. Be \\ '1u e! A1., Ιηΐ. 1. RerRye apy Rgo! Et Kek. 4: 281-287 (1972).

7. В1ит е! а1. И8 6399381.7. V1it e! a1. I8 6399381.

8. ΒοΡак е! а1. 1987, ΒοΡак Ζ., Ка^шт А. е! а1. (1987), Νο\ό1 апс1тогаде таРгсек ίοτ кикрепкюп си1!иге οί таттаРап се11к Β^οрοίуте^к. 26 Бирр1:Б205-213.8. ΒοΡak e! a1. 1987, ΒοΡak Ζ., Ka ^ unit A. e! a1. (1987), \ο \ ό1 aps1 and then targsek ίοτ kikrepkup si1! Ige ίί tattaRap se11k Β ^ р ί ί ^ ^. 26 Birr1: B205-213.

9. Сайег Μ.Ι., Раск1ат Т.1., Ροη§ Р.С., БшИ-тй К.А., Иеу. Вю1. Б!апй. 1989; 70:101-7.9. Sayeg Μ.Ι., Rask1at T.1., Ροη§ R.S., BshI-ty K.A., Yeh. Vu1. B! Apy. 1989; 70: 101-7.

10. СРеп е! а1., Се^тЦк 4:479-497 (1989).10. Sep e! A1., Ce ^ tZk 4: 479-497 (1989).

11. Сюсагопе е! а1. И8 2003/0096414.11. Syusagope e! a1. I8 2003/0096414.

12. С1еуе1апй е! а1. И8 4767704.12. S1eue1apy e! a1. I8 4767704.

13. ИагПег И8 5045568.13. YagPeg I8 5045568.

14. ЭеШЮ е! а1., ШсШс Ас1йк Кек. 9:3719 (1981).14. EESHU e! A1., ShsShs As1yk Kek. 9: 3719 (1981).

15. Иеуетеих 1. е! а1., ШсШс Ас1йк Кек, 12, 387-395, 1984.15. Jehueteh 1. e! A1., ShsShs As1yk Kek, 12, 387-395, 1984.

16. Сей1ет е! а1., Εη^ατηο1ο^ 118:720 (1986).16. This e! A1., Εη ^ ατηο1ο ^ 118: 720 (1986).

17. Сοеййеί е! а1., №!ите, 281:544 (1979).17. Soyeyeί e! A1., No. !, 281: 544 (1979).

18. СтаРГе! а1., 1. Вю1. СРет. 257:2365 (1982).18. STARGE! A1., 1. Vu1. Sr. 257: 2365 (1982).

19. Сгап!Рат е! а1., Баепсе. νο1. 185, рр. 862-864 (1974).19. Cgap! Rat e! A1., Baepse. νο1. 185, pp. 862-864 (1974).

20. Нкшпд е! а1., Β^ο!есΡнοίοду, 7:267 (1989).20. Nkspd e! a1., Β ^ ο! Yesterday, 7: 267 (1989).

21. Ιιι1ον е! а1. ИБ 6048728.21. Ιιι1ον e! a1. IB 6048728.

22. ίο^ι·^^·! е! а1., РРаттаток Τοχκο1. 63:129 (1988).22. ίο ^ ι · ^^ ·! e! A1., Rattatok Τοχκο1. 63: 129 (1988).

23. Бетак е! а1., Εη^ατηο1ο^, 101:1587 (1977).23. Betak e! A1., Εη ^ ατηο1ο ^, 101: 1587 (1977).

24. БеЮк е! а1., 1. Вю1. СРет. 253:2679 (1978).24. Beyuk e! A1., 1. Vu1. Sr. 253: 2679 (1978).

25. Бетак е! а1., Εη^ατηο1ο^, 104:1256 (1979).25. Betak e! a1., Εη ^ ατηο1ο ^, 104: 1256 (1979).

26. Бетак е! а1., ВюсРет. ВюрРук. Кек. Сотт. 92:511 (1980).26. Betak e! A1., VusRet. VyurRuk. Kek. Sott. 92: 511 (1980).

27. БеЮк е! а1., 1. Вю1. СРет. 256:11645 (1981).27. Beyuk e! A1., 1. Vu1. Sr. 256: 11645 (1981).

28. Ьтйпег Μ.Ο. 1991. ВюсРетНРу οί отррег. №\ν ΥοΑ, Р1епит ргекк (ΝχίΡοοΡ).28. йtypeg Μ.Ο. 1991. VusRetNRu οί otrreg. No. \ ν ΥοΑ, P1epit rgekk (ΝχίΡοοΡ).

29. ΜηΠίη1 е! а1., Баепсе, 205:602-607 (1979).29. ΜηΠίη1 e! A1., Baepse, 205: 602-607 (1979).

30. Μοοπο е! а1., Εη^ατηο1ο^, 122:2920 (1988).30. Μοοπο e! A1., Εη ^ ατηο1ο ^, 122: 2920 (1988).

31. ΝονχΡ Ό., К1т Б.-Н., ΡηηΙιιζζί С., Ке/ийаду Б., ΌίηηΐΌ11ο С., апй КиЬтк!ет Μ. (1999) 1ттипйу 10, 127-136.31. ΝονχΡ Ό., K1t B.-N., ΡηηΙιιζζί S., Ke / iyadu B., ΌίηηΐΌ11ο S., apy Kıtk! Et. (1999) 1ttyu 10, 127-136.

32. Ока Μ.8., Кирр К.С. Вюргосекк ТесРгю1. 1990; 10:71-92.32. Oka Μ.8., Kirr K.S. Würgosekk TesRgyu 1. 1990; 10: 71-92.

33. Реат^й ΜеίРοйк Εη/утοί. 1990; 183:63-98.33. Reat ^ y ΜеίРойк Εη / utοί. 1990; 183: 63-98.

34. Ре!!1 Б.А., Бадек А.С. е! а1. (1994) ТРгее-йппепкюпа1 таттаРан се11 дгоМР οη ηοη\νο\Όη рοίуек!е^ РаЬпс й1ккк Β^ο!есРнοί Ргод. 10 (5):548-550.34. Re !! 1 B.A., Badek A.S. e! a1. (1994) TRGeeppeCup1 tattaRan se11 dGoMR οη ηοη \ νο \ Όη рίίуек! Е ^ Раппс и1ккк Β ^ ο! 10 (5): 548-550.

35. Риск е! а1., ЗБхрМей. 108, 945, 1958.35. Risk e! A1., ZBhrMey. 108, 945, 1958.

36. Кеппег е! а1. ИБ 5811299.36. Keppeg e! a1. IB 5811299.

37. БтдР е! а1., Εнйοс^^нοίοду, 94:883 (1974).37. Btdr e! A1., Onews ^^ New Year, 94: 883 (1974).

38. ΤΡο^α^-υ^ί^, Nеи^οенйοс^^нοίοду, 43:233 (1987).38. ^ο ^ α ^ -υ ^ ί ^, Neu ^ ooooooooo ^^ here, 43: 233 (1987).

39. Vаίίее В.Б. апй Ра1сРик К.Н. 1993. ТРе ЬюсРетка1 Ьак1к οί /тс рРукю^ду. РРукю^дюД геу1е^к, 73, 79-118.39. Vaee VB apy Ra1sRik K.N. 1993. TERE Р Р етка 1 1 1 ак ак 1 к ί ί т т с р ук. Rukuyu ^ duD geu1e ^ k, 73, 79-118.

40. ΕР 274445.40. ΕP 274445.

41. ΕР 314317 А1.41. ΕP 314317 A1.

42. ΕР 0325224 А2.42. ΕP 0325224 A2.

43. АО 01/16294.43. AO 01/16294.

Claims (15)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Способ продуцирования гормона роста человека, включающий стадию культивирования клеточной линии, экспрессирующей гормон роста, в культуральной среде, не содержащей компонентов, полученных из сыворотки животных, причем среда содержит цинк в концентрации в интервале от 0,2 до 1,75 мкМ, медь в концентрации в интервале от 10 до 75 нМ и ионы железа в концентрации в интервале от 1 до 10 мкМ, где клетки представляют собой мышиные клетки С127 и среда дополнительно содержит компоненты основной среды.1. A method of producing human growth hormone, comprising the step of culturing a cell line expressing growth hormone in a culture medium containing no components derived from animal serum, the medium containing zinc in a concentration in the range from 0.2 to 1.75 μM, copper in a concentration in the range of 10 to 75 nM and iron ions in a concentration in the range of 1 to 10 μM, where the cells are C127 mouse cells and the medium additionally contains components of the basic medium. 2. Способ по п.1, где среда содержит цинк в концентрации 0,2 мкМ.2. The method according to claim 1, where the medium contains zinc in a concentration of 0.2 μm. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где среда содержит цинк в концентрации 0,5 мкМ.3. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the medium contains zinc in a concentration of 0.5 μm. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где среда содержит цинк в виде сульфата цинка.4. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the medium contains zinc in the form of zinc sulfate. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где среда содержит медь в концентрации 25 нМ.5. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the medium contains copper at a concentration of 25 nm. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где среда содержит медь в виде сульфата меди.6. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the medium contains copper in the form of copper sulfate. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где среда содержит ионы железа в концентрации 5 или 6 мкМ.7. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the medium contains iron ions in a concentration of 5 or 6 μm. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где среда содержит ионы железа в виде цитрата железа и/или нитрата железа.8. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the medium contains iron ions in the form of iron citrate and / or iron nitrate. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где основная среда представляет собой модифицированную Дульбекко среду Игла (ΌΜΕΜ).9. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the main environment is a modified Dulbecco environment Needle (ΌΜΕΜ). 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где гормон роста человека экспрессируется под контролем металлотионеинового (МТ) промотора.10. The method according to any one of the preceding paragraphs, where the human growth hormone is expressed under the control of the metallothionein (MT) promoter. 11. Способ по п.10, где металлотионеиновый промотор представляет собой мышиный МТ-1промотор.11. The method of claim 10, where the metallothionein promoter is a murine MT-1 promoter. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий в себя стадию выделения гормона роста человека из культуры клеток.12. The method according to any one of the preceding paragraphs, further comprising the step of isolating human growth hormone from the cell culture. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий стадию очистки гормона роста человека.13. The method of claim 12, further comprising the step of purifying human growth hormone. 14. Применение среды, как она определена в любом из пп.1-9, для продуцирования гормона роста человека.14. The use of the medium, as defined in any one of claims 1 to 9, for the production of human growth hormone. 15. Применение среды, как она определена в любом из пп.1-9, для поддержания клеток в культуре в течение фазы продуцирования гормона роста человека.15. The use of the medium, as defined in any one of claims 1 to 9, for maintaining cells in culture during the phase of production of human growth hormone.