EA010240B1 - 1-alpha-fluoro-25-hydroxy-16,23e-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol and use for treatment thereof - Google Patents

Abstract

The use of 1-alpha-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, for the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of benign prostatic hyperplasia (BPH) and associated symptoms.

Description

Настоящее изобретение относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо20-эпихолекальциферола (соединения А) для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН) и ассоциированных симптомов. Кроме того, изобретение относится к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН) и ассоциированных симптомов введением 1αфтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола в количестве, эффективном для профилактики и/или лечения указанного заболевания, отдельно или в комбинации с другими активными агентами.The present invention relates to the use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo20-epicholecalciferol (compound A) for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia (BPH) and associated symptoms. The invention further relates to a method for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia (BPH) and associated symptoms by administering 1α-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol in an amount effective for prevention and / or treating said disease, alone or in combination with other active agents.

ВРН является частым заболеванием у людей пожилого возраста, которым заболевают приблизительно 50% мужчин в возрасте 60 лет и 90% в возрасте 85 лет. ВРН представляет собой специфическое гистопатологическое образование, которое характеризуется гиперплазией клеток стромы и эпителия.BPH is a common disease in the elderly, which affects about 50% of men aged 60 and 90% at the age of 85. BPH is a specific histopathological formation, which is characterized by hyperplasia of stromal and epithelial cells.

Уже более ста лет считается, что двумя этиологическими факторами патогенеза ВРН являются старение организма и наличие функциональных семенников. Однако по мере накопления сведений о предстательной железе, эта концепция представляется недостаточной, поскольку она не учитывает все аспекты патогенеза ВРН. В регуляции роста предстательной железы существенную роль играют дополнительные этиологические факторы. Например, получено доказательство того, что рост предстательной железы непосредственно контролируется специальными ростовыми факторами, которые продуцируются клетками самой железы, действующими локальным образом на соседние клетки по паракринному механизму или на продуцирующие клетки железы по аутокринному механизму. Следовательно, в настоящее время много внимания уделяется разработке стратегии лечения, основанной на ингибировании внутрипростатических ростовых факторов.For more than a hundred years, it is believed that two etiological factors in the pathogenesis of BPH are the aging of the body and the presence of functional testes. However, with the accumulation of information about the prostate gland, this concept seems insufficient, since it does not take into account all aspects of the pathogenesis of BPH. An additional etiological factor plays a significant role in the regulation of prostate growth. For example, evidence has been obtained that the growth of the prostate gland is directly controlled by special growth factors that are produced by the cells of the gland itself, acting locally on neighboring cells by the paracrine mechanism or on the producing cells of the gland by the autocrine mechanism. Therefore, much attention is currently being paid to developing a treatment strategy based on the inhibition of intraprostatic growth factors.

ВРН является обычной причиной хронических симптомов недостаточности функции мочевого тракта, которые влияют на фазу заполнения (симптомы раздражения) и на фазу опорожнения (обструктивный синдром) цикла мочеиспускания. Эти симптомы затрагивают социальные, психологические, домашние и профессиональные, физические и сексуальные стороны жизни пациента и оказывают сильное негативное воздействие на качество жизни. Кроме того, ВРН может вызывать более острые урологические осложнения, прежде всего острую задержку мочи (АИК), часто наблюдающиеся более серьезные осложнения ВРН и не столь часто рецидивирующие инфекции мочевого тракта, дилатацию (расширение) верхней области мочевого тракта, образование камней в мочевом пузыре и рецидивирующую гематурию.BPH is a common cause of chronic symptoms of urinary tract insufficiency, which affect the filling phase (irritation symptoms) and the emptying phase (obstructive syndrome) of the urination cycle. These symptoms affect the social, psychological, domestic and professional, physical and sexual aspects of the patient’s life and have a strong negative effect on the quality of life. In addition, BPH can cause more acute urological complications, especially acute urinary retention (AIK), more frequent complications of BPH and less frequent recurrent urinary tract infections, dilatation (expansion) of the upper urinary tract, the formation of stones in the bladder and recurrent hematuria.

Лечение ВРН связано с чрезвычайно высоким социальными расходами, которые только в США составляли в 1993 г. 4 биллиона долларов и прогнозируются в объеме 26 биллионов долларов в 2003 г.BPH treatment is associated with extremely high social costs, which in the United States alone amounted to $ 4 billion in 1993 and are projected to be $ 26 billion in 2003.

Современная схема лечения ВРН включает пероральный прием ингибиторов 5а-редуктазы (финастерида и дутастерида, недавно разрешенных ΕΌΑ) и антагонистов α 1-рецептора (теразозин, доксазозин, тамсулозин, а также силодозин, А1О-8507Ь, КВх-2258 и т.п.). Каждый из этих терапевтических подходов обладает как преимуществами, так и недостатками, которые связаны с различными механизмами действия. В то время как антагонисты α 1-рецептора с высокой эффективностью снижают симптомы, относящиеся к симптомам недостаточности мочевого тракта (ЬИТЗ), эти средства неэффективны в отношении снижения объема предстательной железы и, следовательно, не пригодны для предупреждения хирургического вмешательства. Напротив, ингибиторы 5а-редуктазы, такие, как финастерид и дутастерид, снижают образование дигидротестостерона (ЭНТ), снижают размер предстательной железы и позволяют исключить хирургическое вмешательство. Кроме того, последние результаты клинических испытаний (в течение 7 лет) по предупреждению рака предстательной железы, в которых принимало участие более 18000 здоровых мужчин пожилого возраста, показали, что финастерид может предотвращать или замедлять развитие рака предстательной железы (см. Тйошрзоп Ι.Μ. и др., Νο\ν Епд1ап6 1оитпа1 о£ Мебюше, 349, 215-224 (2003)). Однако, как и ожидалось (см. КаззаЫап У.8., Ьапсе!, 361, 60-62 (2003)), финастерид обладает антиандрогенными побочными действиями в отношении половой функции, такими, как снижение потенции, влечения и гинекоматия, что существенно снижает возможность его применения в качестве агента, предупреждающего развитие опухоли. Кроме того, лечение финастеридом ассоциируется с повышенным выявлением высокозлокачественного рака предстательной железы, возможно потому, что при индуцированном финастеридом низкоандрогенном состоянии происходит отбор наиболее агрессивных, андроген-нечувствительных злокачественных клеток (см. Зсатбшо Р.Т., №\ν Епд1апб 1оитпа1 о£ Мебюше, 349, 297-299 (2003)).The current treatment regimen for BPH includes oral administration of 5a-reductase inhibitors (finasteride and dutasteride, recently approved ΕΌΑ) and α 1 receptor antagonists (terazosin, doxazosin, tamsulosin, as well as silodosin, A1O-8507b, KBx-2258, etc.) . Each of these therapeutic approaches has both advantages and disadvantages associated with various mechanisms of action. While antagonists of the α 1 receptor reduce the symptoms related to the symptoms of urinary tract insufficiency (LCH) with high efficiency, these drugs are ineffective in reducing prostate volume and, therefore, are not suitable for the prevention of surgical intervention. In contrast, 5a-reductase inhibitors, such as finasteride and dutasteride, reduce the formation of dihydrotestosterone (ENT), reduce the size of the prostate gland, and prevent surgery. In addition, the latest results of clinical trials (over 7 years) for the prevention of prostate cancer, in which more than 18,000 healthy elderly men took part, have shown that finasteride can prevent or slow down the development of prostate cancer (see Tjoshrzop Ι.Μ. et al., Νο \ ν д ап 1 па ап 6 оит оит оит оит о о Меб Меб Mebush, 349, 215-224 (2003)). However, as expected (see KazzaYap U.8., Lapse !, 361, 60-62 (2003)), finasteride has antiandrogenic side effects with regard to sexual function, such as decreased potency, desire and gynecomatology, which significantly reduces the possibility of its use as an agent that prevents the development of a tumor. In addition, treatment with finasteride is associated with an increased detection of high-grade prostate cancer, possibly because with the low-androgenic state induced by finasteride, the selection of the most aggressive, androgen-insensitive malignant cells occurs (see Zsatbsho R.T., no. 349, 297-299 (2003)).

Таким образом, существует настоятельная необходимость в новом классе лекарственных средств для терапии ВРН, которые способны предотвратить острую задержку мочи и одновременно исключить связанное с этим хирургическое вмещательство, т. е. снижают андроген-индуцированный рост предстательной железы и не оказывают прямого воздействия на андрогенные рецепторы (АК), и, следовательно, не обладают анти-андрогенными простатическими и экстрапростатическими побочными действиями, например, побочным действием на сексуальные аспекты жизни пациента. Благодаря блокированию сигналов от местных ростовых факторов предстательной железы такие лекарственные средства могут применяться не только для лечения ВРН, но и для профилактики рака предстательной железы, возможно без отбора АК-нечувствительных злокачественных клонов.Thus, there is an urgent need for a new class of drugs for the treatment of BPH that can prevent acute urinary retention and at the same time eliminate the associated surgical interventions, i.e., reduce androgen-induced growth of the prostate gland and do not directly affect androgen receptors ( AK), and therefore do not have anti-androgenic prostatic and extraprostatic side effects, for example, side effects on the sexual aspects of a patient’s life but. Due to the blocking of signals from local growth factors of the prostate gland, such drugs can be used not only for the treatment of BPH, but also for the prevention of prostate cancer, possibly without selection of AK-insensitive malignant clones.

- 1 010240- 1 010240

Как указано в тексте заявки, заявители установили, что не обладающий гиперкальцемическим действием, хорошо переносимый аналог витамина Б₃, 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферол (соединение А), является первым примером такого лекарственного средства, поскольку это соединение может воздействовать на ВРН независимым от андрогенного рецептора способом, оказывая влияние на многие пути, контролирующие клеточный рост ВРН, включая пролиферацию предстательной железы, опосредованную ростовыми факторами.As indicated in the text of the application, the applicants found that not having a hypercalcemic effect, a well-tolerated analogue of vitamin B ₃ , 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20epicholecalciferol (compound A), is the first an example of such a drug, since this compound can affect BPH in an independent of the androgen receptor way, affecting many pathways controlling the cell growth of BPH, including proliferation of the prostate mediated by growth factors.

1,25-Дигидроксивитамин ϋ₃ [1,25(ОН)2О₃], активированная форма витамина Б₃, представляет собой секостероидный гормон, который не только играет центральную роль в формировании костной ткани и метаболизме кальция, но и принимает участие в регуляции иммунного ответа, дифференцировке и апоптозе многих типов клеток, включая злокачественные клетки.1,25-Dihydroxyvitamin ϋ ₃ [1,25 (OH) 2O ₃ ], an activated form of vitamin B ₃ , is a secosteroid hormone that not only plays a central role in bone formation and calcium metabolism, but also takes part in the regulation of immune response, differentiation and apoptosis of many types of cells, including malignant cells.

Однако проблемой терапевтического использования кальцитриола является его природная способность индуцировать гиперкальцемию и гиперфосфатемию. В связи с этим разработаны аналоги кальцитриола, сохраняющие биологическую активность, но лишенные гиперкальцемического побочного действия.However, the problem of the therapeutic use of calcitriol is its natural ability to induce hypercalcemia and hyperphosphatemia. In this regard, analogues of calcitriol have been developed that preserve biological activity, but are devoid of hypercalcemic side effects.

В ϋ8 5939408 и ЕР 808833 заявлен ряд аналогов 1,25(ОНДВз, включая 1а -фтор-25-гидрокси16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол (соединение А). В ИЗ 5939408 и ЕР 808833 описано, что эти соединения индуцируют дифференцировку и ингибируют пролиферацию различных линий клеток кожи и раковых клеток и применяются для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз, неопластические заболевания, такие, как лейкоз, рак молочной железы и заболевания сальной железы, такие, как угри, себорейный дерматит и остеопороз.No. 8 5939408 and EP 808833 disclose a number of analogues of 1.25 (ONDV3, including 1a-fluoro-25-hydroxy16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol (compound A). In FR 5939408 and EP 808833 are described, that these compounds induce differentiation and inhibit the proliferation of various skin cell lines and cancer cells and are used to treat hyperproliferative skin diseases such as psoriasis, neoplastic diseases such as leukemia, breast cancer and sebaceous diseases such as acne, seborrheic dermatitis and osteoporosis.

В последнее время в ряде работ заявителя неожиданно установлено, что в отличие от других аналогов 1,25(ОНДВ3, соединение АRecently, in a number of works of the applicant it has been unexpectedly found that, unlike other analogues of 1.25 (ONDV3, compound A

существенно снижает рост клеток предстательной железы человека ίη νίΐτο благодаря индукции апоптоза и подавляет рост предстательной железы ίη νίνο, не оказывая воздействия на уровни тестостерона и дигидротестостерона. Кроме того, такое ингибирование роста предстательной железы достигается при введении доз, не вызывающих гиперкальцемию. Таким образом, соединение А является эффективным фармакологическим агентом для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.significantly reduces the growth of human prostate cells ίη νίΐτο due to the induction of apoptosis and inhibits the growth of the prostate gland ίη νίνο without affecting testosterone and dihydrotestosterone levels. In addition, such inhibition of prostate growth is achieved with the introduction of doses that do not cause hypercalcemia. Thus, compound A is an effective pharmacological agent for the treatment of benign prostatic hyperplasia.

Как описано в примерах, соединение А снижает размер предстательной железы. Кроме того, аналогично финастериду соединенеие А снижает пролиферативную активность тестостерона ίη νίΐτο и ίη νίνο. Однако существенно, что в отличие от финастерида соединение А не ингибирует активность 5аредуктазы типа 1 и типа 2 и может подавлять клеточный рост при ВРН, индуцированный не только тестостероном, но и дигитротестостероном. Эти антиандрогенные свойства соединения А не зависят от взаимодействия с рецептором АР, поскольку установлено, что соединение А не связывается с АР или не проявляет активности агониста или антагониста АР. Кроме того, соединение А не оказывает влияния на секрецию полового гормона. Кроме того, как установлено в наших исследованиях, соединение А не оказывает существенного влияния на уровень РЗА и, таким образом, при лечении соединением А не возникает опасность маскировки этого важного признака возможного рака предстательной железы.As described in the examples, compound A reduces the size of the prostate gland. In addition, like finasteride, compound A reduces the proliferative activity of testosterone ίη νίΐτο and ίη νίνο. However, it is significant that, unlike finasteride, compound A does not inhibit the activity of 5-reductase type 1 and type 2 and can inhibit cell growth in BPH induced not only by testosterone, but also by digitrotestosterone. These antiandrogenic properties of Compound A are independent of the interaction with the AP receptor, since it has been found that Compound A does not bind to AP or does not exhibit AR agonist or antagonist activity. In addition, compound A does not affect the secretion of sex hormone. In addition, as established in our studies, compound A does not have a significant effect on the level of RPA and, therefore, when treating with compound A, there is no danger of masking this important sign of possible prostate cancer.

Еще одно существенное преимущество соединения А состоит в том, что при испытаниях ίη νίνο это лекарственное средство, в отличие от финастерида, способно ингибировать рост базальных клеток и стимулированный тестостероном рост клеток мочевого пузыря, и, следовательно, такое лекарственное средство может найти применение для профилактики и/или лечения дисфункции мочевого пузыря у человека. При исследованиях ίη νίνο на мочевом пузыре крысы с обструкцией выходного отверстия, как модели дисфункции мочевого пузыря, установлено лечебное действие соединения А. Такое свойство соединения А представляет несомненный интерес, поскольку дисфункция мочевого пузыря является частым и болезненным осложнением при ВРН. Таким образом, соединение А способно снижать размеры предстательной железы и уменьшать интенсивность дисфункции мочевого пузыря, т.е. вызвать улучшение функции мочевого пузыря и снижать интенсивность симптомов ВРН, ассоциированных с мочевым пузырем, при одновременном непосредственном воздействии соединения А на предстательную железу и мочевой пузырь. Предполагается, что такое действие оказывается независимо от улучшения симптомов мочевого пузыря, которое, как предполагается, является просто результатом снижения размеров предстательной железы. Симптомы мочевого пузыря включают сверхактивированный мочевой пузырь, а показатели улучшения функции мочевого пузыря включают снижение сокращений непустого пузыря и остаточнойAnother significant advantage of compound A is that, when tested ίη νίνο, this drug, in contrast to finasteride, is able to inhibit the growth of basal cells and testosterone-stimulated growth of bladder cells, and, therefore, such a drug can be used for prevention and / or treating human bladder dysfunction. In studies of ίη νίνο on rat bladder with outlet obstruction, as a model of bladder dysfunction, the therapeutic effect of compound A was established. This property of compound A is of undoubted interest, since bladder dysfunction is a frequent and painful complication of BPH. Thus, compound A is able to reduce the size of the prostate gland and reduce the intensity of bladder dysfunction, i.e. cause an improvement in the function of the bladder and reduce the intensity of the symptoms of BPH associated with the bladder, with the simultaneous direct effect of compound A on the prostate gland and bladder. It is believed that this action is independent of an improvement in bladder symptoms, which is supposed to be simply the result of a reduction in the size of the prostate gland. Bladder symptoms include over-activated bladder, and indicators of improvement in bladder function include a decrease in non-empty bladder contractions and residual

- 2 010240 мочи.- 2 010240 urine.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Едиен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы. В объем изобретения включены также фармацевтически приемлемые сложные эфиры и соли соединения А.Thus, the present invention relates to the use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23Udien-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia. Pharmaceutically acceptable esters and salts of compound A are also within the scope of the invention.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.The invention also relates to the use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia glands.

Изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациентов, которые нуждаются в такой профилактике или лечении, включающему введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.The invention also relates to a method for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in patients who require such prophylaxis or treatment, comprising administering a therapeutically effective amount of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27 bisgomo-20- epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.The invention also relates to the use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia.

Изобретение также включает 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир для применения при профилактике и/или лечении доброкачественной гиперплазии предстательной железы.The invention also includes 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof for use in the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий. Изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий у пациентов, которые нуждаются в такой профилактике или лечении, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.The invention also relates to the use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in the absence of antiandrogenic prostatic and extraprostatic side effects. The invention also relates to a method for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in the absence of antiandrogenic prostatic and extraprostatic side effects in patients who require such prophylaxis or treatment, said method comprising administering a therapeutically effective amount of 1a-fluoro-25-hydroxy-16 , 23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof.

Изобретение также относится к применению 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы наряду с одновременной профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря. Изобретение относится также к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы наряду с одновременной профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря у пациентов, которые нуждаются в такой профилактике или лечении, причем указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.The invention also relates to the use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia along with the simultaneous prophylaxis and / or treatment for bladder dysfunction. The invention also relates to a method for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia along with the simultaneous prophylaxis and / or treatment of bladder dysfunction in patients who require such prophylaxis or treatment, said method comprising administering a therapeutically effective amount of 1a-fluoro-25- hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof.

1а-Фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол является известным соединением, которое получают, как описано в И8 5939408, включенном в описание заявки в качестве ссылки.1a-Fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bis-homo-20-epicholecalciferol is a known compound which is prepared as described in I8 5939408, incorporated by reference in the application description.

Сложные эфиры включают фармацевтически приемлемые лабильные сложные эфиры, которые гидролизуются в организме с высвобождением соединения А.Esters include pharmaceutically acceptable labile esters that hydrolyze in the body to release Compound A.

Соли соединения А включают аддукты и комплексы, которые образуются при взаимодействии с ионами щелочных и щелочно-земельных металлов и их солями, такими, как ионы натрия, калия и кальция и их соли, такие, как хлорид кальция, малонат кальция и т.п.Salts of Compound A include adducts and complexes which are formed upon interaction with alkali and alkaline earth metal ions and their salts, such as sodium, potassium and calcium ions and their salts, such as calcium chloride, calcium malonate and the like.

Соединение А или его соль или сложный эфир можно применять при монотерапии или их можно вводить в комбинации с известными агентами, активными в отношении ВРН, например, с агентом, блокирующим альфа-адренергический рецептор, с таким, как антагонист α 1-рецептора (например, теразозин, доксазозин или тамсулозин или также силодозин, АЮ-8507Ь или КВх-2258) или ингибитор 5αредуктазы (например, финастерид или дутастерид). Термин «агент, активный в отношении ВРН» включает агенты, обладающие активностью или относительно которых известно, что они обладают активностью, при лечении или профилактике ВРН, такие как соединения, указанные выше. Компоненты, входящие в состав комбинации, смешивают с соединением А или его солями или сложными эфирами в различных соотношениях и вводят раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов. Соответствующие дозы известных терапевтических агентов легко определяются спецалистом в данной области. Комбинация соединения А с двумя или более (например, тремя) соединениями, активными в отношении ВРН, может представлять собой, например, комбинацию антагониста а1-рецептора и ингибитора 5а-редуктазы. При введении в комбинации с соединением А (или его соли или сложного эфира) компоненты комбинации можно использовать в более низких дозах по сравнению с использованием такого компонента отдельно, даже при субтерапевтической дозе.Compound A or a salt or ester thereof can be used in monotherapy or can be administered in combination with known BPH active agents, for example, an alpha adrenergic receptor blocking agent, such as an α 1 receptor antagonist (e.g. terazosin, doxazosin or tamsulosin, or also silodosin, AY-8507b or KBx-2258) or a 5α-reductase inhibitor (e.g. finasteride or dutasteride). The term “BPH active agent” includes agents that are active or relatively known to be active in the treatment or prophylaxis of BPH, such as the compounds described above. The components of the combination are mixed with compound A or its salts or esters in various ratios and administered separately, sequentially or simultaneously in separate or combined pharmaceutical formulations. Appropriate doses of known therapeutic agents are readily determined by one skilled in the art. The combination of compound A with two or more (for example, three) BPH active compounds can be, for example, a combination of an a1 receptor antagonist and a 5a reductase inhibitor. When administered in combination with compound A (or a salt or ester thereof), the components of the combination can be used at lower doses compared to using such a component alone, even at a subtherapeutic dose.

- 3 010240- 3 010240

Таким образом, изобретение также включает применение, указанное выше, где лекарственное средство вводят раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов, включающих второй агент, активный в отношении ВРН.Thus, the invention also includes the use of the above, wherein the drug is administered separately, sequentially or simultaneously as separate or combined pharmaceutical formulations comprising a second BPH active agent.

Таким образом, изобретение включает применение 1а-атор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира в комбинации со вторым агентом, активным в отношении ВРН, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.Thus, the invention includes the use of 1a-ator-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof in combination with a second BPH active agent to produce a drug intended for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia.

Изобретение относится также к способу профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациента, который нуждается в такой профилактике или лечении, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов, включающих второй агент, активный в отношении ВРН.The invention also relates to a method for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in a patient who needs such prophylaxis or treatment, the method comprising administering a therapeutically effective amount of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene26,27-bis-homo- 20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, separately, sequentially or simultaneously in separate or combined pharmaceutical formulations comprising a second BPH active agent.

Указанные комбинации обычно получают для применения в форме фармацевтических составов. Полученные таким образом фармацевтические составы также являются объектом настоящего изобретения.These combinations are usually prepared for use in the form of pharmaceutical formulations. The pharmaceutical compositions thus obtained are also an object of the present invention.

Дозы и последовательность введения активных ингредиентов в фармацевтические составы по изобретению могут изменяться таким образом, чтобы количество активного ингредиента являлось эффективным для обеспечения требуемого терапевтического ответа с учетом конкретного пациента, композиции и способа введения, причем указанное количество активного ингредиента должно быть нетоксичным для пациента. Доза соединения А может составлять от 0,1 до 300 мкг в сутки, например, 50-150 мкг в сутки, например, 75 или 150 мкг в сутки. Стандартные дозы предпочтительно содержат 50-150 мкг, например, 75 или 150 мкг и предпочтительно вводятся один раз в сутки.Dosages and the sequence of administration of the active ingredients in the pharmaceutical compositions of the invention can be varied so that the amount of the active ingredient is effective to provide the desired therapeutic response, taking into account the particular patient, composition and route of administration, the indicated amount of the active ingredient being non-toxic to the patient. The dose of compound A can be from 0.1 to 300 μg per day, for example, 50-150 μg per day, for example, 75 or 150 μg per day. Unit doses preferably contain 50-150 μg, for example 75 or 150 μg, and are preferably administered once a day.

Конкретно предпочтительная доза соединения А является той максимальной дозой, которая переносится пациентом и не вызывает гиперкальцемии или других нежелательных побочных действий, таких, как гиперкальциурия. Предпочтительно соединение А вводят в концентрации от приблизительно 0,001 мкг до приблизительно 100 мкг на кг массы тела, от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 мкг/кг или от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мкг/кг массы тела. Интервалы вышеуказанных значений также являются частью настоящего изобретения.A particularly preferred dose of Compound A is that maximum dose that is tolerated by the patient and does not cause hypercalcemia or other undesirable side effects, such as hypercalciuria. Preferably, compound A is administered at a concentration of from about 0.001 μg to about 100 μg per kg body weight, from about 0.001 to about 10 μg / kg, or from about 0.001 to about 100 μg / kg body weight. The ranges of the above values are also part of the present invention.

Как отмечалось выше, соединение А можно вводить в виде фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, однако предпочтительно соединение А применяют как таковое, т. е. не в виде сложного эфира или соли.As noted above, compound A can be administered as a pharmaceutically acceptable salt or ester, however, preferably, compound A is used as such, i.e., not as an ester or salt.

Указанные дозы можно принимать в виде соответствующего фармацевтического состава однократным введением, многократным введением или в виде препаратов с контролируемым высвобождением для достижения наиболее эффективных результатов, предпочтительно перорально один или два раза в день (предпочтительно один раз в день), например, в течение месяца. В некоторых ситуациях для достижения требуемого терапевтического ответа может оказаться достаточной альтернативная доза.The indicated doses can be taken in the form of an appropriate pharmaceutical composition by single administration, multiple administration or in the form of controlled release preparations to achieve the most effective results, preferably orally once or twice a day (preferably once a day), for example, for a month. In some situations, an alternative dose may be sufficient to achieve the desired therapeutic response.

Выбор точных доз и состава и наиболее благоприятной схемы лечения зависит от фармакологических свойств состава, природы и тяжести состояния, подлежащего лечению, и физического и умственного состояния реципиента.The choice of exact doses and composition and the most favorable treatment regimen depends on the pharmacological properties of the composition, nature and severity of the condition to be treated, and the physical and mental state of the recipient.

Типичные способы доставки включают пероральный, парентеральный (включая подкожный, внутримышечный и внутривенный), ректальный, трансбуккальный (включая сублингвальный), легочный, чрескожный и интраназальный способы, наиболее предпочтителен пероральный способ. Введение бывает непрерывным и прерывистым (например, в виде струйной инъекции).Typical delivery methods include the oral, parenteral (including subcutaneous, intramuscular and intravenous), rectal, buccal (including sublingual), pulmonary, transdermal and intranasal methods, the most preferred oral method. The introduction is continuous and intermittent (for example, in the form of a jet injection).

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей 1а-фтор-25-гидрокси16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир, и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising 1a-fluoro-25-hydroxy16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia.

Изобретение также относится к упакованному составу, который включает фармацевтическую композицию, содержащую 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир, и фармацевтически приемлемый носитель, и содержит инструкции по применению композиции для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.The invention also relates to a packaged composition, which comprises a pharmaceutical composition comprising 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier, and contains instructions for using the composition for the treatment of benign prostatic hyperplasia.

Как отмечалось выше, такие композиции можно получать для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) введения, прежде всего в форме жидких растворов или суспензий; для перорального или трансбуккального введения, прежде всего в форме таблеток или капсул; для легочного или интраназального введения, прежде всего в форме порошков, назальных капель или аэрозолей; и для ректального или чрескожного введения.As noted above, such compositions can be prepared for parenteral (subcutaneous, intramuscular or intravenous) administration, especially in the form of liquid solutions or suspensions; for oral or buccal administration, especially in the form of tablets or capsules; for pulmonary or intranasal administration, especially in the form of powders, nasal drops or aerosols; and for rectal or transdermal administration.

Композиции обычно можно вводить в форме стандартных доз и можно получать любым методом, известным в фармацевтике, например, как описано в ВетшЦоп'х Рйаттасеийса1 8с1еисе8, 17^4Ь ей., Маск РиЫщЫид Сотраиу, Еайои, РА (1985). Составы для парентерального введения могут содержать в качестCompositions can usually be administered in unit dosage form and can be prepared by any method known in the art of pharmaceuticals, for example, as described in Vetschop's Rhattaceis1 8c1eise8, 17 ^4b ., Musk Ryschidid Sotraiu, Eyoi, RA (1985). Formulations for parenteral administration may contain as

- 4 010240 ве эксципиентов стерильную воду или солевой раствор, алкиленгликоли, такие, как пропиленгликоль, полиалкиленгликоли, такие, как полиэтиленгликоль, масла растительного происходения, гидрогенированные нафталины и т.п. Составы для назального ведения являются твердыми и могут содержать эксципиенты, например, лактозу или декстран, или могут представлять собой водные или масляные растворы для применения в форме назальных капель или дозированных спреев. Типичные эксципиенты для трансбуккального применения включают сахара, стеарат кальция, стеарат магния, предварительно желатинизированный крахмал и т.п.- 4 010240 excipients, sterile water or saline, alkylene glycols such as propylene glycol, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, vegetable oils, hydrogenated naphthalenes, etc. Formulations for nasal administration are solid and may contain excipients, for example, lactose or dextran, or may be aqueous or oily solutions for use in the form of nasal drops or metered sprays. Typical buccal excipients include sugars, calcium stearate, magnesium stearate, pregelatinized starch, and the like.

Композиции для перорального введения могут включать один или более физиологически приемлемых носителей и/или эксципиентов и могут находиться в твердом или жидком состоянии. Таблетки и капсулы получают с использованием связующих агентов, например, сиропа, аравийской камеди, желатина, сорбита, трагаканта или поливинилпирролидона; наполнителей, таких, как лактоза, сахароза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин; замасливателей, таких, как стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль или оксид кремния; и ПАВ, таких, как лаурилсульфат натрия. Жидкие композиции могут содержать обычные добавки, такие, как суспендирующие агенты, например, сироп сорбита, метилцеллюлозу, сахарный сироп, желатин, карбоксиметилцеллюлозу или пищевые жиры; эмульгаторы, такие как лецитин или аравийская камедь; растительные масла, такие как миндальное масло, кокосовое масло, жир печени трески или арахисовое масло; консерванты, такие как бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ). Жидкие композиции можно инкапсулировать, например, в желатин для получения стандартных форм.Compositions for oral administration may include one or more physiologically acceptable carriers and / or excipients and may be in solid or liquid state. Tablets and capsules are prepared using binding agents, for example, syrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinylpyrrolidone; fillers such as lactose, sucrose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine; lubricants, such as magnesium stearate, talc, polyethylene glycol or silica; and surfactants such as sodium lauryl sulfate. Liquid compositions may contain conventional additives such as suspending agents, for example, sorbitol syrup, methyl cellulose, sugar syrup, gelatin, carboxymethyl cellulose or edible fats; emulsifiers such as lecithin or gum arabic; vegetable oils such as almond oil, coconut oil, cod liver oil or peanut butter; preservatives such as bottled hydroxyanisole (BHA) and bottled hydroxytoluene (BHT). Liquid compositions can be encapsulated, for example, in gelatin to obtain standard forms.

Предпочтительные твердые формы для перорального применения включают таблетки, двухкамерные твердые капсулы и мягкие желатиновые капсулы (ЗЕС). Особый интерес представляют ЗЕС капсулы, поскольку они обладают явным преимуществом по сравнению с двумя другими формами (см. Зеадег Н., Зой де1айи сарки1ек: а κοίπΐίοη ίο тапу 1аЫейид ртоЫетк, Рйагтасеийса1 Тее1то1оду. 9 (1985)). К таким преимуществам ЗЕС капсул относятся : а) в ЗЕС капсулах оптимизирована однородность лекарственной формы, поскольку лекарственное средство растворяют и диспергируют в жидкости, которую затем точно дозируют по капсулам, б) лекарственные средства в виде ЗЕС капсул обладают хорошей биосовместимостью, поскольку лекарственное средство растворяется, солюбилизируется или диспергируется в водной или масляной среде и, следовательно, при высвобождении в организме эти растворы растворяются или эмульгируются с образованием дисперсий лекарственного средства с большой площадью поверхности, в) предотвращается деградация лекарственных средств, которые чувствительны к окислению при длительном хранении, поскольку сухая оболочка из мягкого желатина представляет собой барьер для диффузии кислорода.Preferred oral solid forms include tablets, two-chamber hard capsules, and soft gelatine capsules (WEUs). Of particular interest are WEU capsules, since they have a distinct advantage over the other two forms (see Zeadeg N., Zoya deiayi sarki1ek: κοίπΐίοη ί т у ей 1 1 1,,,,,,, Р аг се, та 1 се се.. К к к к 9 9 (1985)). Such advantages of WEU capsules include: a) the uniformity of the dosage form is optimized in WEU capsules, since the drug is dissolved and dispersed in a liquid, which is then accurately metered into capsules, b) drugs in the form of WEU capsules have good biocompatibility, since the drug dissolves, solubilizes or disperses in an aqueous or oily medium and, therefore, upon release in the body, these solutions dissolve or emulsify to form dispersions of the lobe GOVERNMENTAL means with a large surface area, c) preventing degradation of drugs that are sensitive to oxidation during long storage because the dry shell of soft gelatin provides a barrier to oxygen diffusion.

Состав сухой оболочки обычно включает приблизительно 40-60% желатина, приблизительно 2030% пластификатора (такого, как глицерин, сорбит или пропиленгликоль) и приблизительно 30-40% воды. Кроме того, состав может также включать другие компоненты, такие как консерванты, красители, замутнители и ароматизаторы. Жидкое содержимое капсулы включает твердое лекарственное средство, растворенное, солюбилизированное или диспергированное (в смеси с суспендирующим агентом, таким, как пчелиный воск, гидрогенизированное касторовое масло или полиэтилегликоль 4000) или жидкое лекарственное средство в носителе или комбинации носителей, таких, как минеральное масло, растительные масла, триглицериды, гликоли, полиолы и ПАВ.The composition of the dry shell usually includes about 40-60% gelatin, about 2030% plasticizer (such as glycerin, sorbitol or propylene glycol) and about 30-40% water. In addition, the composition may also include other components, such as preservatives, colorants, opacifiers and flavorings. The liquid contents of the capsule include a solid drug, dissolved, solubilized or dispersed (mixed with a suspending agent such as beeswax, hydrogenated castor oil or polyethylene glycol 4000) or a liquid drug in a carrier or combination of carriers, such as mineral oil, vegetable oils, triglycerides, glycols, polyols and surfactants.

В типичном составе используются мягкие желатиновые капсулы 2 размера, белого цвета, непрозрачные, овальной формы, содержащие жидкий состав, включающий в качестве активного ингредиента соединение А, растворенное в миглиоле 812 (триглицерид, содержащий С₈-С₁₂жирные кислоты из фракционированного кокосового масла) в смеси с бутилированным гидроксианизолом (ВНА) и бутилированным гидрокситолуолом (ВНТ) в качестве консервантов. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать от 0,01 до 25 мг, например, 75 или 150 мкг соединения А. Мягкие желатиновые капсулы следует хранить при температуре 2-8°С без доступа света.Typical formulations use soft gelatin capsules of 2 sizes, white, opaque, oval in shape, containing a liquid composition comprising, as active ingredient, compound A dissolved in migliol 812 (triglyceride containing C ₈ -C ₁₂ fatty acids from fractionated coconut oil) mixed with bottled hydroxyanisole (BHA) and bottled hydroxytoluene (BHT) as preservatives. Soft gelatin capsules may contain from 0.01 to 25 mg, for example 75 or 150 μg of compound A. Soft gelatin capsules should be stored at a temperature of 2-8 ° C without light.

Составы, содержащие соединение А или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир необязательно в комбинации со вторым агентом, активным в отношении ВРН, получают смешиванием ингредиентов.Compositions containing compound A or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, optionally in combination with a second BPH active agent, are prepared by mixing the ingredients.

Составы предпочтительно получают в атмосфере азота при желтом свете.The compositions are preferably obtained in a nitrogen atmosphere under yellow light.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами и фигурами.The present invention is illustrated by the following examples and figures.

На фиг. 1 показано ингибирование пролиферации клеток ВРН кальцитриолом и соединением А (соед. А).In FIG. 1 shows inhibition of BPH cell proliferation by calcitriol and compound A (Comp. A).

Фиг. 1А. Инкубация в присутствии кальцитриола (кружки) или соединения А (квадраты) при возрастающих концентрациях от 10^-18 до 10^-7 М в течение 48 ч вызывает существенное дозозависимое ингибирование роста клеток ВРН (*Р<0,01 по сравнению с контролем). Анализ по программе АБЬНТ показывает, что два секостероида проявляют одинаковое максимальное ингибирование (1_макс = 43±1%), однако характеризуются различным значением ингибирующей активности (соединение А: -1од 1С₅₀-15,8±0,5; кальцитриол: -1од 1С₅₀ = 10,2±0,6; Р<0,005). Результаты представлены в процентах ингибирования (среднее±ЗЕМ) по сравнению с относительными контролями в трех различных экспериментах при трехкратFIG. 1A. Incubation in the presence of calcitriol (circles) or compound A (squares) at increasing concentrations from 10 ^-18 to 10 ^-7 M for 48 h causes a significant dose-dependent inhibition of BPH cell growth (* P <0.01 compared to the control). Analysis using the ABNT program shows that two secosteroids exhibit the same maximum inhibition (1 _max = 43 ± 1%), but are characterized by different inhibitory activity (compound A: -1ode 1C ₅₀ -15.8 ± 0.5; calcitriol: -1ode 1C ₅₀ = 10.2 ± 0.6; P <0.005). The results are presented as percent inhibition (mean ± ZEM) compared to the relative controls in three different triple experiments

- 5 010240 ном повторе.- 5 010240 nom repeat.

На фиг. 1Б представлено влияние соединения А при возрастающих концентрациях (от 10^-18 до 10^-7 М) на пролиферацию клеток ВРН, стимулированных Т (10 нМ, квадраты), КОР (10 нг/мл, кружки) или Ие8(1-3)1СР-1 (10 нг/мл, треугольники). Соединение А также вызывает существенное ингибирование (*Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными Т или СР) роста клеток ВРН в присутствии всех стимулирующих агентов с одинаковым значением I _макс = 66,6±7,3%. Однако соединение А более эффективно при ингибировании действия Т (-1од 1С₅₀ =16,4±0,6) по сравнению с двумя другими ростовыми факторами (Ое8(1-3)ЮР-1: -1од 1С₅₀ =12,7±0,6; и КОР: -1од 1С₅₀ = 14,2±0,6; Р<0,0001). Результаты представлены в % отклонения (среднее±8ЕМ) от максимальной стимуляции в трех различных экспериментах при трехкратном повторе.In FIG. 1B presents the effect of compound A at increasing concentrations (from 10 ^-18 to 10 ^-7 M) on the proliferation of BPH cells stimulated by T (10 nM, squares), BOR (10 ng / ml, circles) or IE8 (1-3) 1CP -1 (10 ng / ml, triangles). Compound A also causes significant inhibition (* P <0.01 compared to cells treated with T or CP) of BPH cell growth in the presence of all stimulating agents with the same value of I _max = 66.6 ± 7.3%. However, compound A is more effective in inhibiting the action of T (-1Ode 1C ₅₀ = 16.4 ± 0.6) compared with two other growth factors (Oe8 (1-3) UR-1: -1One 1C ₅₀ = 12.7 ± 0.6; and KOR: -1Od 1C ₅₀ = 14.2 ± 0.6; P <0.0001). The results are presented in% deviation (mean ± 8EM) from maximum stimulation in three different experiments with triplicate.

На фиг. 2 показано действие соединения А, ацетата ципротерона и финастерида на рост клеток ВРН, стимулированных андрогеном. Клетки ВРН инкубировали в течение 48 ч в присутствии соединения А (1 нМ) или антиандрогенов (финастерида, Р, 1 нМ, ацетата ципротерона, Сур, 100 нМ) в присутствии Т (10 нМ, фиг. 2 А) или ΌΗΤ (10 нМ, фиг. 2В). На рисунке приведены также результаты, полученные с использованием нестимулированных клеток ВРН (фиг. 2А). Результаты представлены в процентах отклонения (среднее±8ЕМ) по сравнению с относительными контролями в трех различных экспериментах при четырехкратном повторе. Соединение А и ацетат ципротерона существенно блокируют рост клеток, индуцированный Т и ΌΗΤ, в то время как финастерид проявлял активность только в отношении клеток, стимулированных Т. *Р<0,01 по сравнению с контролем, °Р<0,01 по сравнению с клетками, стимулированными андрогеном.In FIG. Figure 2 shows the effect of compound A, cyproterone acetate and finasteride on the growth of BPH cells stimulated by androgen. BPH cells were incubated for 48 h in the presence of compound A (1 nM) or antiandrogens (finasteride, P, 1 nM, cyproterone acetate, Sur, 100 nM) in the presence of T (10 nM, Fig. 2 A) or ΌΗΤ (10 nM) , Fig. 2B). The figure also shows the results obtained using unstimulated BPH cells (Fig. 2A). The results are presented in percent deviation (mean ± 8EM) compared with the relative controls in three different experiments with a four-fold repetition. Compound A and cyproterone acetate significantly block cell growth induced by T and ΌΗΤ, while finasteride was only active against T. stimulated cells. * P <0.01 compared to control, ° P <0.01 compared to androgen-stimulated cells.

На фиг. 3 показано отсутствие агонистических или антагонистических свойств у соединения А в отношении рецептора АК человека. Клетки линии РС3, недостаточные по АК, устойчиво трансфектировали АК человека и помещали в 24-луночные планшеты с плотностью 2х10⁴ клеток в лунке. Через 24 ч клетки трансфектировали АК-респонсивной плазмидой рЬ8РР и через 48 ч клетки инкубировали в присутствии возрастающих концентраций ΌΗΤ (квадраты) или соединения А (кружки) (фиг. 3А), или при фиксированной концентрации ΌΗΤ (3 нМ) в присутствии бикалутамида (квадраты) или соединения А (кружки) (фиг. 3В) в течение 18 ч. Результаты (средние значения по данным трех экспериментов) представлены в виде процента биолюминесценции на мкг общего белка. При оценке агонистической активности за 100% люциферазной активности принимали активность фермента в присутствии 100 нМ ΌΗΤ (фиг. 3А), в то время как при оценке антагонистической активности за 100% люциферазной активности принимали активность фермента при 3 нМ ΌΗΤ (фиг. 3В).In FIG. 3 shows the absence of agonistic or antagonistic properties of compound A with respect to the human AK receptor. PC3 cells deficient in AK were stably transfected with human AK and placed in 24-well plates with a density of 2x10 ⁴ cells per well. After 24 hours, cells were transfected with AK-responsive plasmid p8PP and after 48 hours the cells were incubated in the presence of increasing concentrations of β (squares) or compound A (circles) (Fig. 3A), or at a fixed concentration of β (3 nM) in the presence of bicalutamide (squares) ) or compound A (circles) (Fig. 3B) for 18 hours. Results (average values from three experiments) are presented as percent bioluminescence per μg of total protein. When evaluating agonistic activity, the enzyme activity in the presence of 100 nM ΌΗΤ was taken as 100% of luciferase activity (Fig. 3A), while when assessing antagonistic activity, the enzyme activity at 3 nM приним was taken as 3 nM ΌΗΤ (Fig. 3B).

На фиг. 4 показано ингибирование роста вентральной предстательной железы крысы соединением А или финастеридом.In FIG. Figure 4 shows the inhibition of growth of the rat ventral prostate by Compound A or finasteride.

Фиг. 4А. Кастрированным крысам, инъецированным энантатом Т (30 мг/кг/неделя), вводили перорально в течение 5 дней в неделю (две недели подряд) носитель или соединение А в возрастающих дозах (10, 30, 100 и 300 мкг/кг) или финастерид (Р, 10 и 40 мг/кг). Массу вентральной предстательной железы представляли в % отклонения (среднее±8ЕМ) от массы железы интактных крыс, получавших носитель (^ЛР<0,05, *Р<0,01 по сравнению с контрольными крысами, °Р<0,01 по сравнению с крысами, получавшими Т).FIG. 4A. Castrated rats injected with T enanthate (30 mg / kg / week) were orally administered for 5 days per week (two consecutive weeks) with vehicle or compound A in increasing doses (10, 30, 100 and 300 μg / kg) or finasteride ( P, 10 and 40 mg / kg). The mass of the ventral prostate was represented as% deviation (mean ± 8EM) from the gland mass of intact rats treated with vehicle ( ^L P <0.05, * P <0.01 compared to control rats, ° P <0.01 compared to rats given T).

Фиг. 4В. Интактным взрослым крысам перорально вводили в течение одного месяца (5 раз в неделю, всего 27 введений в месяц) носитель (контроль) или соединение А в возрастающих дозах (10, 30, 100 и 300 мкг/кг) или финастерид (Р, 10 и 40 мг/кг). Массу вентральной предстательной железы представляли в % отклонения (среднее±8ЕМ) от массы железы контрольных интактных крыс, получавших носитель (*Р<0,01 по сравнению с контрольными крысами).FIG. 4B. Carrier (control) or compound A in increasing doses (10, 30, 100 and 300 mcg / kg) or finasteride (P, 10 and 40 mg / kg). The mass of the ventral prostate was represented as% deviation (mean ± 8EM) from the gland mass of the control intact rats receiving the vehicle (* P <0.01 compared to control rats).

На фиг. 5 показано действие соединения А и финастерида на экспрессию гена кластерина в вентральной предстательной железе крысы.In FIG. Figure 5 shows the effect of compound A and finasteride on the expression of the clusterin gene in the rat ventral prostate.

Фиг. 5А. Нозерн-блоттинг (гибридизация с радиоактивным зондом) экспрессии мРНК кластерина в вентральной предстательной железе интактных крыс, получавших носитель (трек 1), или орхиэктомированных крыс (трек 2). На треках 3-6 показана экспрессия гена кластерина у орхиэктомированных крыс, получавших в течение двух недель энантат Т (30 мг/кг) и получавших перорально носитель (трек 3), соединение А (300 мкг/кг, трек 4, и 100 мкг/кг, трек 5) или финастерид (40 мг/кг, трек 6). В каждый трек вносили по 10 мкг общей РНК. Соответствующая экспрессия ΟΛΡΩΗ (гель, окрашенный этидийбромидом) приводится ниже на блоте. Блот представлен для двух отдельных экспериментов.FIG. 5A. Northern blotting (hybridization with a radioactive probe) of clusterin mRNA expression in the ventral prostate of intact rats receiving vehicle (track 1) or orchiectomized rats (track 2). Tracks 3–6 show the expression of the clusterin gene in orchiectomized rats receiving T-enanthate (30 mg / kg) for two weeks and receiving an oral carrier (track 3), compound A (300 μg / kg, track 4, and 100 μg / kg, track 5) or finasteride (40 mg / kg, track 6). 10 μg of total RNA was added to each track. The corresponding expression of ΟΛΡΩΗ (gel stained with ethidium bromide) is given below on the blot. The blot is presented for two separate experiments.

Фиг. 5В. Нозерн-блоттинг (гибридизация с радиоактивным зондом) экспрессии мРНК кластерина в вентральной предстательной железе взрослых интактных крыс, получавших перорально в течение 1 месяца (5 раз в неделю, 27 введений) носитель (трек 1), соединение А в возрастающих дозах (10, 30 мкг/кг, треки 2 и 3) или финастерид (40 мг/кг, трек 4). В каждый трек вносили по 10 мкг общей РНК. Соответствующая экспрессия САРОЙ (гель, окрашенный этидийбромидом) приводится ниже на блоте. Блот представлен для двух отдельных экспериментов.FIG. 5B. Northern blotting (hybridization with a radioactive probe) of clusterin mRNA expression in the ventral prostate of adult intact rats given orally for 1 month (5 times a week, 27 injections) vehicle (track 1), compound A in increasing doses (10, 30 μg / kg, tracks 2 and 3) or finasteride (40 mg / kg, track 4). 10 μg of total RNA was added to each track. Corresponding expression of CAPA (ethidium bromide stained gel) is shown below on the blot. The blot is presented for two separate experiments.

На фиг. 6 показаны морфологические изменения при действии соединения А на вентральную предстательную железу кастрированных крыс и крыс, получавших Т (фиг. 5А, В, С и Е). Характерные изоIn FIG. 6 shows the morphological changes in the action of compound A on the ventral prostate gland of castrated rats and rats treated with T (Fig. 5A, B, C and E). Characteristic

- 6 010240 бражения получены с использованием поперечных срезов цельных предстательных желез, иммуноокрашенных моноклональными антителами к крысиному кластерину и вторично окрашенных гематоксилином. У крыс, кастрированных четырьмя днями ранее и получавших носитель, кластериновая метка обнаруживается в цитоплазме атрофических кубоидных эпителиальных клетках (фиг. А, 10х). После двухнедельного приема Т (фиг. В, 10х) кластериновая метка практически не обнаружена. Напротив, кластеринположительные клетки все еще присутствуют в организме крыс, обработанных Т и различными дозами соединения А (100 мкг/кг, фиг. С, 300 мкг/кг, фиг. Е, черные стрелки). На фиг. Ό и Е показаны срезы, соответствующие срезам на фиг. С и Е с целью выявления фрагментации ДНК, которую определяли методом однонитевого концевого мечения дУТФ (4ИТР) (метод ΤυΝΕΕ), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ). При двухнедельной обработке (9 введений) соединением А (100 мкг/кг, фиг. Ό, 300 мкг/кг, фиг. Е) наблюдается индуцирование массивного апоптоза в большинстве клеток эпителия и стромы. Следует отметить (черные стрелки), что апоптозу подвергаются все кластеринположительные клетки, а в значительной части клеток, не содержащих кластерина, также наблюдается фрагментация ядра.- 6 010240 ferments obtained using transverse sections of whole prostate glands immunostained with monoclonal antibodies to rat clusterin and secondarily stained with hematoxylin. In rats castrated four days earlier and treated with a vehicle, a clusterin label is found in the cytoplasm of atrophic cuboid epithelial cells (Fig. A, 10x). After a two-week intake of T (Fig. B, 10x), a clusterin label was practically not detected. In contrast, cluster-positive cells are still present in rats treated with T and various doses of Compound A (100 μg / kg, Fig. C, 300 μg / kg, Fig. E, black arrows). In FIG. Ό and E show slices corresponding to slices in FIG. C and E in order to detect DNA fragmentation, which was determined by the method of single-stranded end labeling of dUTP (4ITP) (ΤυΝΕΕ method), mediated by terminal deoxynucleotidyl transferase (TBT). In a two-week treatment (9 administrations) with compound A (100 μg / kg, Fig. Ό, 300 μg / kg, Fig. E), massive apoptosis was induced in most epithelial and stromal cells. It should be noted (black arrows) that all clusterin-positive cells undergo apoptosis, and in a significant part of the cells that do not contain clusterin, fragmentation of the nucleus is also observed.

На фиг. 7 показаны морфологические изменения при действии соединения А и финастерина на предстательную железу интактных взрослых крысIn FIG. 7 shows morphological changes in the action of compound A and finasterol on the prostate gland of intact adult rats.

Фиг. 7А, В, Ό, Ε, Е и Н - характерные изображения получены с использованием поперечных срезов цельных предстательных желез, иммуноокрашенных моноклональными антителами к крысиному кластерину и вторично окрашенных гематоксилином. На фиг. 7А (10х) первичные антитела отсутствуют. На фиг. 7В (10х) показано, что у необработанных взрослых крыс только немногие, отдельные эпителиальные клетки в некоторых железах содержат метку (черные стрелки). Напротив, в предстательных железах крыс, обработанных возрастающими концентрациями соединения А, кубоидные эпителиальные клетки, имеющие признаки атрофии, содержат кластерин, который проявляется дозозависимым образом (см. черные стрелки, 10 мкг/кг, фиг. 7Ό; 30 мкг/кг, фиг. 7Е; 100 мкг/кг, фиг. 7Е, 10х). Аналогичные результаты были получены с использованием финастерида (40 мг/кг, фиг. 7Н, 10х).FIG. 7A, B, Ό, Ε, E and H - characteristic images were obtained using cross sections of whole prostate glands immunostained with monoclonal antibodies to rat clusterin and secondarily stained with hematoxylin. In FIG. 7A (10x) primary antibodies are absent. In FIG. 7B (10x) shows that in untreated adult rats there are only a few, individual epithelial cells in some glands contain a label (black arrows). In contrast, in the prostate glands of rats treated with increasing concentrations of Compound A, cuboidal epithelial cells with signs of atrophy contain clusterin, which appears in a dose-dependent manner (see black arrows, 10 μg / kg, Fig. 7Ό; 30 μg / kg, Fig. 7E; 100 μg / kg, Fig. 7E, 10x). Similar results were obtained using finasteride (40 mg / kg, Fig. 7H, 10x).

На фиг. 7С, С и I показаны серийные срезы, соответствующие срезам на фиг. 7В, Ό и Е, соответственно, с целью выявления фрагментации ДНК, которую определяли методом однонитевого концевого мечения дУТФ (άυΤΡ) (метод ΤυΝΕΕ), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ). Следует отметить (черные стрелки), что апоптозу подвергаются все кластерин-положительные клетки, и даже в значительной части клеток, не содержащих кластерина, также обнаруживается фрагментация ядра.In FIG. 7C, C, and I show serial sections corresponding to the sections in FIG. 7B, Ό and E, respectively, in order to detect DNA fragmentation, which was determined by the single-stranded end labeling of dUTP (άυΤΡ) (ΤυΝΕΕ method), mediated by terminal deoxynucleotidyl transferase (TBT). It should be noted (black arrows) that all clusterin-positive cells undergo apoptosis, and even in a significant part of the cells that do not contain clusterin, fragmentation of the nucleus is also detected.

На фиг. 8 показаны результаты испытания на хроническую токсичность у собак. Явное снижение массы предстательной железы наблюдается через 9 месяцев лечения соединением А по сравнению в животными, получавшими плацебо.In FIG. Figure 8 shows the results of a chronic toxicity test in dogs. An apparent decrease in prostate mass is observed after 9 months of treatment with Compound A compared to animals receiving placebo.

На фиг. 9 показаны результаты испытания на хроническую токсичность у собак. Снижение массы предстательной железы после выздоровления при лечении соединением А по сравнению в животными, получавшими плацебо.In FIG. Figure 9 shows the results of a chronic toxicity test in dogs. The reduction in prostate mass after recovery with Compound A treatment compared to placebo-treated animals.

На фиг. 10 показано действие соединения А на рост клеток мочевого пузыря, стимулированный тестостероном, мч = мочевой пузырь человека.In FIG. Figure 10 shows the effect of compound A on bladder cell growth stimulated by testosterone, ppm = human bladder.

На фиг. 11 показано действие соединения А при сравнении с другими соединениями на рост стимулированных и базальных клеток мочевого пузыря. Т 10 нМ = тестостерон, Е 1 нМ = финастерид.In FIG. 11 shows the effect of compound A when compared with other compounds on the growth of stimulated and basal cells of the bladder. T 10 nM = testosterone, E 1 nM = finasteride.

На фиг. 12 показано действие витамина Ό на массу мочевого пузыря.In FIG. 12 shows the effect of vitamin Ό on the mass of the bladder.

На фиг. 13 показано действие витамина Ό на частоту непроизвольного сокращения незаполненного (мочевого пузыря).In FIG. 13 shows the effect of vitamin Ό on the frequency of involuntary contraction of an empty (bladder).

На фиг. 14 показано действие витамина Ό на амплитуду непроизвольного сокращения незаполненного (мочевого пузыря).In FIG. 14 shows the effect of vitamin Ό on the amplitude of involuntary contraction of an unfilled (bladder).

На фиг. 15 показано действие витамина Ό на давление при мочеиспускании.In FIG. Figure 15 shows the effect of vitamin Ό on urinary pressure.

На фиг. 16 показано действие витамина Ό на остаточную мочу.In FIG. 16 shows the effect of vitamin Ό on residual urine.

На фиг. 17 показано действие витамина Ό на частоту сократительного ответа полосок мочевого пузыря при стимуляции электрическим полем.In FIG. Figure 17 shows the effect of vitamin Ό on the frequency of the contractile response of bladder strips when stimulated by an electric field.

ПримерыExamples

Пример 1. Действие соединения А на клетки ВРН ίη νίΐτο.Example 1. The effect of compound A on BPH cells ίη νίΐτο.

Материалы и методыMaterials and methods

МатериалыMaterials

Минимальная незаменимая среда (МЕМ), ΌΜΕΜ-Ρ12, 1:1, смесь, среда Хэма Е12, физиологический раствор с фосфатным буфером (РВ8), бычий сывороточный альбумин (БСА), фракция V, глутамин, генетицин, коллагеназа типа IV, витамин Ό₃, тестостерон (Т), дигидротестостерон (ИНТ), ацетат ципротерона, восстановленная форма в-никотинамидадениндинуклеотид-3'-фосфата (НАДФ), дитиотреит (ДТТ), фенилметилсульфонифторид (РМ8Е) и набор для измерения кальцемии получены на фирме 81дта (81Ьош8, МО). Набор для определения белка получен на фирме Βίο-Каб ЬаЬогаФпек, 1пс. (Негси1е§, СА). Фетальная телячья сыворотка (ЕВ8) получена на фирме υηίραΐΐι (ВеЛогб, иК). Моноклональные антитела анти-кластерин крысы (моноклональный мышиный 1дС), специфичные к бета-цепи, получены наMinimum Essential Medium (MEM), ΌΜΕΜ-Ρ12, 1: 1, mixture, Ham E12 medium, saline with phosphate buffer (PB8), bovine serum albumin (BSA), fraction V, glutamine, geneticin, type IV collagenase, vitamin Ό ₃ , testosterone (T), dihydrotestosterone (INT), cyproterone acetate, reduced form of β-nicotinamide adenine dinucleotide-3′-phosphate (NADP), dithiothreit (DTT), phenylmethyl sulfonifluoride (PM8E) and a calcemia measurement kit (81 MO). A kit for determining protein was obtained at the company Kab-BaLaogaFpek, 1 ps. (Negi1e§, CA). Fetal calf serum (EB8) was obtained from υηίραΐΐι (VeLogb, IK). Monoclonal antibodies of rat anti-clusterin (monoclonal mouse 1dC) specific for the beta chain were obtained on

- 7 010240 фирме υΡδΤΆΤΕ Вю1есйпо1оду (Ьаке ΡΙαοίά. ΝΥ). Набор Арор Тад Κ11 для концевого мечения ίη κίΐη (метод 18ЕЬ) получен на фирме Опсог (МО. США). Клетки СНО 1827 и СНО 1829 получены на фирме 8егопо 1п1егпайопа1 (Женева. Швейцария). 1пк1аде1 р1ик получен на фирме Раскагб (81. Бошк. МО). Финастерид (очищенный препарат) (17в-(№трет-бутил)карбамоил-4-аза-5а-андрост-1-ен-3-он) любезно предоставлен фирмой Мегск 8йагр & Пойте йпЬогаЮпек (Райнау. Νυ). Бикалутамид любезно предоставлен фирмой Ак1та2епеса (Ак1га2епеса. Милан. Италия). Аналог 1а-фтор-25-гидрокси-16.23Е-диен-26.27бисгомо-20-эпихолекальциферола (соединения А) получен на фирме Вюхе11 (Вюхе11. Милан. Италия). Фактор роста кератиноцитов (ΚΟΕ) получен на фирме Рерго Тесй ЕС (Лондон. Англия). а инсулинподобный фактор роста-1 человека |Оек(1-3)ЮН-1| получен на фирме ОгоРер Ытйеб (Аделаида. Австралия). Набор ΡΟΌ для определения гибели клеток ш κίΐη методом однонитевого концевого мечения άυΤΡ (метод ΤυΝΕΕ). опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ΤάΤ). получали на фирме Росйе П1адпокйс8 Согрогайоп (1пЙ1апароЙ8. ΙΝ). Пластиковая посуда для клеточных культур получена на фирме Еа1соп (Охпагй. СА). Одноразовые фильтрующие модули для получения питательной среды получены из ΡΒΙ 1п1егпа1юпа1 (Милан. Италия). Липофектамин 2000 и среда Орй-Мет I для трансфекции люциферазы получены на фирме 1пуйгодеп. Ы1е Τесйηо1од^е8 (8ап ОшНапо Мйапеке. Милан. Италия). Пластинки для тонкослойной хроматографии (ТСХ) получены на фирме Мегск (ПагшкПй. Германия). Энантат тестостерона (энантат Т) получен на фирме Оеутопа1 (Ападш. Италия). Набор Соа1-АСоип1 для определения общего тестостерона получали на фирме МеФса1 8ук1ет (Оепоуа 81гирра. Италия). Систему для [¹²⁵Ι] анализа лютеинизирующего гормона крысы (гЬН) получали на фирме Атегкйат Ρйа^тас^а Вю1есй (Ρ^8са1а^ау. N1).- 7 010240 to the company υΡδΤΆΤΕ Vyuyesypoduodu (Lake ΡΙαοίά. ΝΥ). The Aror Tad Κ11 kit for end labeling ίη κίΐη (method 18EB) was obtained from Opsog (MO, USA). CHO 1827 and CHO 1829 cells were obtained at 8egopo 1p1egpayopa (Geneva, Switzerland). 1pk1ade1 p1ik obtained at the company Raskagb (81. Bosch. MO). Finasteride (purified preparation) (17c- (No. ter-butyl) carbamoyl-4-aza-5a-androst-1-en-3-one) was kindly provided by the company Megsk 8yagr & Sing ypYogaUpek (Rainau. Νυ). Bicalutamide is kindly provided by Ak1ta2epes (Ak1ga2epesa. Milan. Italy). An analogue of 1a-fluoro-25-hydroxy-16.23E-diene-26.27 bisgomo-20-epicholecalciferol (compound A) was obtained from Vuehe 11 (Vuehe 11, Milan. Italy). Keratinocyte growth factor (ΚΟΕ) was obtained at the company Rergo Theseus EC (London. England). and human insulin-like growth factor-1 | Oek (1-3) UN-1 | obtained at Ogorer Ytjeb (Adelaide. Australia). Set ΡΟΌ for determining cell death w κίΐη by the method of single-stranded end labeling άυΤΡ (method ΤυΝΕΕ). mediated by terminal deoxynucleotidyl transferase (ΤάΤ). received at the company Rosie P1adpokys8 Sogrogayop (1pY1aparoY8. ΙΝ). Plastic dishes for cell cultures obtained at the company Ea1sop (Ohpagy. CA). Disposable filter modules for obtaining a nutrient medium are obtained from ΡΒΙ 1n1egpa1yupa (Milan. Italy). Lipofectamine 2000 and Ory-Met I medium for transfection of luciferase were obtained at 1 Puygodep. L1e йesyηo1od ^ e8 (8ap OshNapo Myapeke. Milan. Italy). Plates for thin layer chromatography (TLC) were obtained from Megsk (Pagschkp. Germany). Testosterone enanthate (T enanthate) was obtained at Oeutopa1 firm (Apad. Italy). A set of Coa1-ACoip1 for determining total testosterone was obtained at MeFsa1 8uk1et (Oepoua 81girra. Italy). A system for [ ¹²⁵ S] analysis of rat luteinizing hormone (hHH) was obtained at the company Ategyat Hya ^ tas ^ a Vu1esy (V ^ 8ca1a ^ ay. N1).

Клетки ВРНBPH cells

Клетки ВРН человека получали. культивировали и использовали. как описано ранее в статье Сгексюй С. и др.. 1оигпа1 о! С’1пйса1 апй Епйосппо1оду Ме1аЬо11кт. 85. 2576-2583 (2000). Клетки получали из тканей предстательной железы. взятых у пяти пациентов. которые подвергались надлобковой аденомэктомии ВРН (операции по удалению аденомы предстательной железы). после обсуждения и утверждения в местном комитете по этике. Пациенты не получали какого-либо фармакологического лечения в течение трех месяцев перед проведением хирургической операции.Human BPH cells were obtained. cultivated and used. as described earlier in the article Szheksyu S. et al. S1pysa1 apy Epiopododu Me1aLo11kt. 85.2576-2583 (2000). Cells were obtained from prostate tissue. taken from five patients. who underwent suprapubic adenomectomy of BPH (surgery to remove prostate adenoma). after discussion and approval by the local ethics committee. Patients did not receive any pharmacological treatment for three months before surgery.

Клетки линии СНО-1827 и СНО-1829. трансфектированные 5а-редуктазойCells of the SNO-1827 and SNO-1829 lines. transfected with 5a reductase

Клетки СНО-1827 и СНО-1829. трансфектированные 5а-редуктазой типа 1 (5аР-1) или типа 2 (5аР-2). соответственно. (см. 81еегк ^.. Его1оду. 58. 17-24 (2001)) культивировали в среде Хема Г12. содержащей 5% ГС8.CHO-1827 and CHO-1829 cells. transfected with 5a-reductase type 1 (5aR-1) or type 2 (5aR-2). respectively. (see 81 eegk ^ .. His1od. 58. 17-24 (2001)) were cultivated in the medium of Hem G12. containing 5% HS8.

Клетки линии РС3. трансфектированные АРCell line PC3. transfected AR

Клетки РС3 аденокарциномы предстательной железы человека. устойчиво трансфектированные плазмидой р5НЬйАР-А. содержащей андрогенный рецептор человека (йАР). как описано ранее (см. Вопассогк1 Ь. и др.. Епйосгшо1оду. 141. 3172-3182 (2000)). культивировали во флаконах площадью 75 см² на среде Хема Г-12. содержащей 50 мкг/мл генетицина. 10% ГС8. пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 мг/мл).Human PC3 adenocarcinoma cells. stably transfected with plasmid p5HyAP-A. containing the human androgen receptor (yAR). as previously described (see Vopassogk1. et al., Episode 1. 141. 3172-3182 (2000)). cultivated in vials with an area of 75 cm ² on Hem G-12 medium. containing 50 μg / ml geneticin. 10% HS8. penicillin (100 units / ml) and streptomycin (100 mg / ml).

Ткани ВРНBPH fabrics

Ткани предстательной железы для анализа связывания получали от пациентов. которые подвергались надлобковой аденомэктомии ВРН (операции по удалению аденомы предстательной железы). Пациенты не получали какого-либо фармакологического лечения в течение трех месяцев перед проведением хирургической операции. После хирургической операции ткани немедленно погружали в жидкий азот и хранили при -80°С до проведения анализа.Prostate tissue for binding analysis was obtained from patients. who underwent suprapubic adenomectomy of BPH (surgery to remove prostate adenoma). Patients did not receive any pharmacological treatment for three months before surgery. After surgery, tissues were immediately immersed in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until analysis.

Ткани крысыRat tissue

Вентральные предстательные железы крыс быстро вырезали. взвешивали и быстро замораживали в сухом льду. Иммуногистохимические эксперименты проводили на смежных криостатических срезах толщиной 14 мкм с целью прямого сравнения морфологии ткани. экспрессии кластерина и локализации апоптоза методом ΤυΝΕΕ. Для экстрации общей ДНК и вестерн-блоттинга (гибридизации белка с меченым зондом) использовали вентральные предстательные железы. полученные из 4-6 животных.The ventral prostate glands of rats were rapidly excised. weighed and quickly frozen in dry ice. Immunohistochemical experiments were performed on adjacent cryostatic sections with a thickness of 14 μm in order to directly compare tissue morphology. clusterin expression and localization of apoptosis using the ΤυΝΕΕ method. For extraction of total DNA and Western blotting (protein hybridization with a labeled probe), ventral prostate glands were used. derived from 4-6 animals.

Анализ пролиферации клеток ВРНBPH Cell Proliferation Assay

Для анализа клеточной пролиферации 4х 10⁴ клеток ВРН высевали в 12-луночные планшеты в соответствующей питательной среде. выдерживали в среде. не содержащей красного красителя и сыворотки и содержащей 0.1% БСА. в течение 24 ч. а затем обрабатывали стимулирующим агентом в течение 48 ч. Клетки в среде. не содержащей фенолового красного и сыворотки и содержащей 0.1% БСА. использовали в качестве контроля. Затем клетки трипсинизировали и каждую экспериментальную точку получали после измерения на гемоцитометре. вычисляя среднее значение по данным. полученным по меньшей мере в шести различных участках каждой лунки. как описано ранее (см. Сгексюй С. и др.. 1оигпа1 о! С11шса1 апй Епйосппо1оду Ме1аЬо11кт. 85. 2576-2583 (2000). Эксперименты проводили с использованием возрастающих концентраций (от 10^-18 до 10^-7 М) кальцитриола или соединения А в присутствии или в отсутствие фиксированной концентрации Т (10 нМ). ΚΟΕ или Пе8(1-3)1ОГ-1 (10 нг/мл). Анализ клеточного роста проводили также с использованием фиксированной концентрации андрогенов (10 нМ) в приFor analysis of cell proliferation, 4 × 10 ⁴ BPH cells were plated in 12-well plates in an appropriate culture medium. kept in the environment. not containing red dye and serum and containing 0.1% BSA. for 24 hours and then treated with a stimulating agent for 48 hours. Cells in the medium. phenol red and serum free and containing 0.1% BSA. used as a control. Then the cells were trypsinized and each experimental point was obtained after measurement on a hemocytometer. calculating the average value from the data. obtained in at least six different sections of each well. as previously described (see Szheksuy S. et al. 1OiGiP1O! C11hci1 apy Epiospodiu Me1aOo11ct. 85. 2576-2583 (2000). The experiments were carried out using increasing concentrations (from 10 ^-18 to 10 ^-7 M) of calcitriol or compound And in the presence or absence of a fixed concentration of T (10 nM). ΚΟΕ or Pe8 (1-3) 1OG-1 (10 ng / ml). Cell growth analysis was also performed using a fixed concentration of androgens (10 nM) at

- 8 010240 сутствии или в отсутствие соединения А (1 нМ, 10 нМ) или анти-андрогенов финастерида (Г, 1 нМ) и ацетата ципротерона (Сур, 100 нМ). Анализ клеточного роста проводили также с использованием фиксированной концентрации Т (10 нМ) или СЕ (10 нг/мл) в присутствии или в отсутствие соединения А (10 нМ). В этом эксперименте каждую экспериментальную точку определяли по данным трех различных экспериментов при трехкратном или четырехкратном повторе. Результаты представлены в процентах отклонения (среднее±8ЕМ) по сравнению с максимальным стимулированием Т или СЕ.- 8 010240 in the absence or absence of compound A (1 nM, 10 nM) or the anti-androgens of finasteride (G, 1 nM) and cyproterone acetate (Sur, 100 nM). Cell growth analysis was also performed using a fixed concentration of T (10 nM) or CE (10 ng / ml) in the presence or absence of compound A (10 nM). In this experiment, each experimental point was determined from three different experiments in triplicate or quadruple repetition. The results are presented in percent deviation (mean ± 8EM) compared with the maximum stimulation of T or CE.

Концевое мечение ίη кйи (метод 18ЕЬ)End tagging ίη kyi (18EB method)

Метод 18ЕЬ проводили на клетках ВРН с использованием набора реагентов Арор Тад, включающего пероксидазу, для определения апоптоза ίη δίΐιι. по методике производителя. Клетки инкубировали в присутствии Т (10 нМ), КСЕ (10 нг/мл) или Ос8(1-3)!СЕ-1 (10 нг/мл) в присутствии или в отсутствие соединения А (10 нМ). Процент апоптозных клеток (число окрашенных клеток, деленное на общее число клеток) рассчитывали по меньшей мере в пяти участках каждого среза при анализе пяти различных срезов. Результаты представлялили как среднее±8ЕМ по результатам трех различных экспериментов.Method 18EB was performed on BPH cells using an Aror Tad reagent kit including peroxidase to determine apoptosis ίη δίΐιι. according to the manufacturer’s methodology. Cells were incubated in the presence of T (10 nM), KSE (10 ng / ml) or Os8 (1-3)! CE-1 (10 ng / ml) in the presence or absence of compound A (10 nM). The percentage of apoptotic cells (the number of stained cells divided by the total number of cells) was calculated in at least five areas of each section when analyzing five different sections. The results were presented as mean ± 8EM from the results of three different experiments.

Анализ ингибирования 5а-редуктазы5a-reductase inhibition assay

Анализ ингибирования 5а-редуктазы проводили на клетках СНО-1827, трансфектированных 5аВ-1, или на клетках СНО-1829, трансфектированных 5аВ-2, как описано ранее (см. Сиагпа А. и др., 1оита1 οί Меб1сша1 Сйет1к1гу, 43, 3718-3735 (2000)). Соединение А добавляли в концентрации от 10^-9 до 10^-5 М, в качестве контрольного ингибитора в каждом эксперименте использовали финастерид.Inhibition analysis of 5a-reductase was carried out on CHO-1827 cells transfected with 5aB-1, or on CHO-1829 cells transfected with 5aB-2, as described previously (see Siagpa A. et al., 1it1 furniture 1, 1 Kit1ku, 43, 37188 -3735 (2000)). Compound A was added at a concentration of 10 ^-9 to 10 ^-5 M, finasteride was used as a control inhibitor in each experiment.

Анализ связыванияBinding analysis

Анализ связывания цитозольными фракциями фрагментов ВРН проводили, как описано ранее (см. Сгексюй С. и др., Епйосйпо1оду, 144, 3046-3057 (2003), (при конечной концентрации белка 1,8 мг/мл). Фракции цитозоля инкубировали в присутствии возрастающей концентрации (0,125, 0,25, 0,5, 1 нМ) [³Н]-В1881 (удельная активность 83,5 Ки/ммоль) в отсутствии или в присутствии [³Н]-В1881 (1 нМ), возрастающих концентраций немеченого В1881 (10^-1 -10^-6 М), ИНТ (10^-10-10^-6 М), Т (10^-10-10^-6 М), бикалутамида (10^-10-10^-4 М) и соединения А (10^-10-10^-4М). Для предотвращения связывания В1881 с рецептором прогестерона в каждую пробирку добавляли 1мкМ ацетонида триамцинолона. Разделение связанного и несвязанного лиганда проводили, как описано ранее (см. Сгексюй С. и др., Епйосгшо1оду, 144, 3046-3057 (2003)). Содержание белка определяли по методу Бредфорда с использованием БСА в качестве стандарта.The analysis of the binding of cytosolic fractions to BPH fragments was carried out as described previously (see Szheksuy S. et al., Episode 1, 144, 3046-3057 (2003), (at a final protein concentration of 1.8 mg / ml). Cytosol fractions were incubated in the presence of increasing concentration (0.125, 0.25, 0.5, 1 nM) [ ³ N] -B1881 (specific activity 83.5 Ci / mmol) in the absence or presence of [ ³ N] -B1881 (1 nM) increasing concentrations unlabeled B1881 (10 ^-1 -10 ^-6 M), INT (10 ^-10 -10 ^-6 M), T (10 ^-10 -10 ^-6 M), bicalutamide (10 ^-10 -10 ^-4 M) and compounds a (10 ^-10 -10 ^-4 M). to prevent V1881 progesterone receptor binding in each 1 μM triamcinolone acetonide was added to the test tube. The separation of the bound and unbound ligand was carried out as described previously (see S. Hexuy et al., Episode 1, 144, 3046-3057 (2003)). The protein content was determined by the Bradford method using BSA as standard.

Анализ активности люциферазыAnalysis of luciferase activity

Клетки РС3, устойчиво трансфектированные АВ человека, помещали в 24-луночные планшеты при плотности 2х10⁴ в среде Хема Е12, содержащей 10% ЕС8. Через 24 ч клетки транфектировали (в количестве по 750 нг в лунку) плазмидой рЬ8РР, содержащей последовательность дикого типа ММТУ-ЬТВ, связанную с геном люциферазы светляка (см. РаххадН М. и др., Апа1уйса1 Вюсйет1кйу, 204, 315-323 (1992)) при использовании липофектамина 2000 (1 мг/мл) по методике производителя. Через 48 ч клетки инкубировали в присутствии ΌΗΤ (10^-12-10^-6 М) или бикалутамида (10^-9-10^-5 М) в присутствии 3 нМ ΌΗΤ и эквимолярной концентрации соединения А в течение 18 ч. Стероиды и аналог соединения А растворяли в этаноле. Трансфектированные клетки, инкубированные в присутствии этанола, использовали только в качестве положительного контроля.PC3 cells stably transfected with human AB were placed in 24-well plates at a density of 2x10 ⁴ in Hem's E12 medium containing 10% EC8. After 24 hours, the cells were transfected (in an amount of 750 ng per well) with plasmid p8PP containing the wild-type sequence MMTU-LTP linked to the firefly luciferase gene (see M. RakhkhadN et al., Apauysa Vusyet1kyu, 204, 315-323 (1992 )) when using lipofectamine 2000 (1 mg / ml) according to the manufacturer's method. After 48 hours, cells were incubated in the presence of ΌΗΤ (10 ^-12 -10 ^-6 M) or bicalutamide (10 ^-9 -10 ^-5 M) in the presence of 3 nM ΌΗΤ and an equimolar concentration of compound A for 18 hours. Steroids and an analogue of compound A dissolved in ethanol. Transfected cells incubated in the presence of ethanol were used only as a positive control.

Анализ активности люциферазы проводили на люминометре Бертольда по методике производителя (Ьисйегаке Аккау 8ук1ет, фирма Рготеда, Милан, Италия). Клетки лизировали непосредственно в планшете добавлением 200 мкл буферного раствора для лизиса. Активность люциферазы определяли в 20 мкл клеточного лизата через 10 с после добавления 100 мкл люциферина. Общий белок определяли в 20 мкл клеточного лизата. Проводили по меньшей мере три независимых анализа при двойном повторе.The analysis of luciferase activity was carried out on a Bertold luminometer according to the manufacturer's method (Lysiegake Akkau 8uk1et, firm Rgoteda, Milan, Italy). Cells were lysed directly in the plate by adding 200 μl of lysis buffer solution. Luciferase activity was determined in 20 μl of cell lysate 10 s after adding 100 μl of luciferin. Total protein was determined in 20 μl of cell lysate. At least three independent double-repeat analyzes were performed.

Результатыresults

При инкубации клеток ВРН в присутствии возрастающих концентраций кальцитриола или соединения А наблюдается ингибирование роста клеток (фиг. 1А). Оба соединения ингибируют дозозависимым образом клеточную пролиферацию. Анализ по программе АТЬЕ1Т (см. Эе Ьеап А. и др., Атепсап 1оита1 οί РПук1о1оду, 235, Е97-Е102 (1978)) показал, что несмотря на незначительное статистическое различие величин максимального ингибирования роста клеток кальцитриолом и соединением А (соед. А на фигурах) (I _макс = 43±1%), эти соединения отличаются по относительной активности, т.е. у соединения А относительная активность на несколько единиц логарифма выше по сравнению с кальцитриолом (соединение А: -1од 1С₅₀ =15,8+0,3; кальцитриол: -1од 1С₅₀ =10,2±0,6, Р<0,005).Upon incubation of BPH cells in the presence of increasing concentrations of calcitriol or compound A, inhibition of cell growth is observed (Fig. 1A). Both compounds inhibit cell proliferation in a dose-dependent manner. The analysis according to the ATE1T program (see EE Leap A. et al., Atepsap 1oit1 οί RPuk1o1odu, 235, E97-E102 (1978)) showed that despite the insignificant statistical difference in the values of the maximum inhibition of cell growth by calcitriol and compound A (compound A (compound A) in the figures) (I _max = 43 ± 1%), these compounds differ in relative activity, i.e. for compound A, the relative activity is several logarithmic units higher compared to calcitriol (compound A: -1ode 1C ₅₀ = 15.8 + 0.3; calcitriol: -1ode 1C ₅₀ = 10.2 ± 0.6, P <0.005) .

Пролиферация клеток ВРН существенно увеличивается (р <0,01) в присутствии тестостерона (Т) (156±8%) и ростовых факторов (СЕ), таких как (Иек(1-3)1СЕ-1 (194±6%) или КСЕ (183±5%). При стимулировании клеточного роста в присутствии Т или СЕ в течение 48 ч (фиг. 1В) ингибирующее действие соединения А становится более выраженным (I _макс = 66,6±7,3%). Математический анализ (см. Эе Ьеап А. и др., Атепсап 1оита1 οί Рйукю1оду, 235, Е97-Е102 (1978)) графиков ингибирования показывает, что соединение А более эффективно в отношении клеток ВРН, стимулированных Т (-1од 1С₅₀к=16,4±0,6), чем двумя другими ростовыми факторами (-1од 1С₅₀к-12,7±0,6 в случае Иек(1-3)1СЕ-1 и -1од 1С₅₀к=14,2±0,6 в случае КСЕ, соответственно, Р<0,0001).BPH cell proliferation increases significantly (p <0.01) in the presence of testosterone (T) (156 ± 8%) and growth factors (CE), such as (Iek (1-3) 1CE-1 (194 ± 6%) or KSE (183 ± 5%). When cell growth is stimulated in the presence of T or CE for 48 hours (Fig. 1B), the inhibitory effect of compound A becomes more pronounced (I _max = 66.6 ± 7.3%). see E. E. Leap et al., Atepsap 1oit1 οί Ryukyuodu, 235, E97-E102 (1978)) of the inhibition schedules shows that Compound A is more effective against BPH cells stimulated by T (-1Od 1C ₅₀ k = 16.4 ± 0.6) than the other two and growth factors (-1ode 1C ₅₀ k-12.7 ± 0.6 in the case of IEC (1-3) 1CE-1 and -1ode 1C ₅₀ k = 14.2 ± 0.6 in the case of KSE, respectively, P < 0.0001).

- 9 010240- 9 010240

Соединение А (1 нМ) проявляет антагонистическое действие не только в отношении пролиферации клеток ВРН, стимулированных Т и ΌΤΗ, но и в некоторой степени в отношении клеток, стимулированных ацетатом ципротерона (Сур, 100 нМ, фиг. 2А и 2В), который является антагонистом АК. Напротив, ингибитор 5а-редуктазы финастерид (Е, 1 нМ) проявляет антагонистическое действие только в отношении клеточного роста, индуцированного Т (фиг. 2А). Кроме того, соединение А снижает рост даже тех клеток, которые не были стимулированы анти-андрогеном (фиг. 2А).Compound A (1 nM) exhibits an antagonistic effect not only with respect to proliferation of BPH cells stimulated by T and ΌΤΗ, but also to some extent with respect to cells stimulated with cyproterone acetate (Sur, 100 nM, Fig. 2A and 2B), which is an antagonist AK In contrast, the 5a-reductase inhibitor finasteride (E, 1 nM) exerts an antagonistic effect only against T-induced cell growth (Fig. 2A). In addition, compound A reduces the growth of even those cells that have not been stimulated by anti-androgen (Fig. 2A).

Для оценки потенциальных антиандрогенных свойств соединения А в дополнение к ингибированию роста клеток ВРН, нами исследовалось его связывание с рецептором АК. Во-первых, мы исключили возможность связывания соединения А с АК благодаря исследованию конкурентного связывания в гомогенатах ВРН человека с использованием в качестве меченого лиганда синтетического андрогена [³Η]К1881. Анализ данных по программе ΕΙΟΑΝΏ (см. Мипкоп Р.1. и др., Апа1уйса1 ВюсйешщНу, 107, 220239 (1980)) показал, что немеченый К1881, ΌΗΤ, Т и антагонист АК бикалутамид полностью подавляют связывание [³Н]-К1881 (табл. I). И, наоборот, соединение А не конкурирует за связывание (рецептора АК) с [³Н]-К1881 при любой исследуемой концентрации (табл. I). Эти результаты были подтверждены и дополнены при анализе репортерного гена люциферазы. В клетках РС3, экспрессирующих полный ген АК, связанный с репортеным геном люциферазы, ΌΗΤ стимулировал дозозависимое увеличение люциферазной активности (ЕС₅₀ =2±1,3 нМ, фиг. 3А), в то время как бикалутамид ингибировал активность, стимулированную ΌΗΤ (1С₅₀ =194±80 нМ, фиг. 3В). В этой системе увеличение концентрации соединения А не стимулирует и не ингибирует увеличение люциферазной активности, опосредованное АК (фиг. 3). Наконец, с целью выявить взаимосвязь между соединением А и биосинтезом ΌΗΤ, активного метаболита Т, были проведены эксперименты с использованием клеток СНО, трансфектированных 5а-редуктазами типа 1-й типа 2. Результаты сравнивали с данными, полученными при действии финастерида (Е). В то время как Е ингибирует конверсию Т в ΌΗΤ с ожидаемыми величинами 1С₅₀ (для 5а-редуктазы типа 1 1С₅₀ =659±100 нМ, для 5а-редуктазы типа 2 1С₅₀ =53,7±11 нМ, п=3), соединение А не конкурирует ни с одним из изоферментов вплоть до микромолярного уровня (данные не приводятся).To assess the potential antiandrogenic properties of compound A, in addition to inhibiting the growth of BPH cells, we studied its binding to the AK receptor. First, we ruled out the possibility of binding of compound A to AK due to the study of competitive binding in human BPH homogenates using synthetic androgen [ ³ Η] K1881 as a labeled ligand. An analysis of the data on the program ΕΙΟΑΝΏ (see Mipcop R.1. Et al., Apauysa1 VusyeshschNu, 107, 220239 (1980)) showed that unlabeled K1881, ΌΗΤ, T and the antagonist AK bicalutamide completely suppress the binding of [ ³ H] -K1881 ( table I). Conversely, compound A does not compete for binding (AK receptor) to [ ³ H] -K1881 at any concentration studied (Table I). These results were confirmed and supplemented by analysis of the luciferase reporter gene. In PC3 cells expressing the full AK gene associated with the reported luciferase gene, ΌΗΤ stimulated a dose-dependent increase in luciferase activity (EC ₅₀ = 2 ± 1.3 nM, Fig. 3A), while bicalutamide inhibited активность-stimulated activity (1C ₅₀ = 194 ± 80 nM, Fig. 3B). In this system, an increase in the concentration of compound A does not stimulate or inhibit the increase in luciferase activity mediated by AK (Fig. 3). Finally, in order to identify the relationship between Compound A and the biosynthesis of ΌΗΤ, the active metabolite T, experiments were performed using CHO cells transfected with 5a-reductases of type 1 type 2. The results were compared with data obtained with finasteride (E). While E inhibits the conversion of T to ΌΗΤ with the expected values of 1C ₅₀ (for 5a-reductase type 1 1C ₅₀ = 659 ± 100 nM, for 5a-reductase type 2 1C ₅₀ = 53.7 ± 11 nM, n = 3) Compound A does not compete with any of the isoenzymes up to the micromolar level (data not shown).

Лиганд АК Ligand AK Константы сродства (Ка нмоль/л) Affinity Constants (Ka nmol / L) К1818 K1818 0,16±0,06 0.16 ± 0.06 ОНТ ONT 0,07+0,03 0.07 + 0.03 Т T 1,89±0,94 1.89 ± 0.94 Бикалутамид Bicalutamide 159±82 159 ± 82 Соединение А Compound A >100000 > 100,000

Таблица I. Константы сродства агонистов андрогена (К1881, ΌΗΤ, Τ), антагониста (бикатуамида) и соединения А в гомогенатах ВРН человека по данным конкурентного связывания с радиоактивным меченым лигандом [³Н]-К1881.Table I. The affinity constants of androgen agonists (K1881, ΌΗΤ, Τ), antagonist (bikatuamida) and compound A in human BPH homogenates according to competition binding to the radioactive labeled ligand [ ³ H] -K1881.

По данным метода 18ЕЬ (п=3, табл. II), соединение А подавляет клетки ВРН, по меньшей мере частично, благодаря активации программированной гибели клеток. Процентное содержание апоптотических ядер существенно возрастает (270%) после инкубации в присутствии соединения А (10 нМ) в течение 48 ч (Р<0,01 по сравнению с контролем). Напротив, при обработке клеток Т (10 нМ) или факторами роста (ОЕ, 10 нг/мл) значительно (Р<0,01) снижается число апоптотических клеток ВРН по сравнению с необработанными клетками (^е8(1-3)IОЕ-I = -42%, КОЕ = -54%, Т = -27%). Однако даже в присутствии ОЕ или Т соединение А вызывает достоверный (более 250%) и значительный (Р<0,01) рост числа КЕЬположительных клеток ВРН. Апоптотический индекс (%)According to the 18Eb method (n = 3, Table II), compound A suppresses BPH cells, at least in part, due to the activation of programmed cell death. The percentage of apoptotic nuclei increases significantly (270%) after incubation in the presence of compound A (10 nM) for 48 h (P <0.01 compared to the control). In contrast, when processing T cells (10 nM) or growth factors (OE, 10 ng / ml), the number of apoptotic BPH cells decreases significantly (P <0.01) compared to untreated cells (^ e8 (1-3) IOE-I = -42%, CFU = -54%, T = -27%). However, even in the presence of OE or T, compound A causes a significant (more than 250%) and significant (P <0.01) increase in the number of KEB-positive BPH cells. Apoptotic Index (%)

Контроль The control Соединение А Compound A Контроль The control 18,55±О,8 18.55 ± 0.8 68,44±1,26^а 68.44 ± 1.26 ^a ϋβ₃(1-3)ΙΟΡ-Ιϋβ ₃ (1-3) ΙΟΡ-Ι 10,69±0,6^а 10.69 ± 0.6 ^a 45,85±0,66^а’^б’^в 45.85 ± 0.66 ^a ' ^b ' ⁱⁿ КОР KOR 8,5±0,42^а 8.5 ± 0.42 ^a 44,46±0,57^а'^б,в 44.46 ± 0.57 ^a ' ^{b, c} Т T 13,56±0,72^а 13.56 ± 0.72 ^a 49,0611,87^’“ 49.0611.87 ^ ’“

Таблица II. Действие соединения А (10 нМ), ростовых факторов (ОЕ, 10 нг/мл), или Т (10 нМ) на фрагментацию ДНК в клетках ВРН. Апоптотический индекс (%) означает количество окрашенных ядер по данным ^ЕЬ в клетках ВРН в каждом из по меньшей мере пяти отдельных участков на срезе. Результаты представлены в виде среднего±8ЕМ в трех раздельных экспериментах. Соединение А способно вызывать апоптоз в необработанных клетках ВРН, а также в клетках ВРН, одновременно инкубированных в присутствии ростовых факторов (ОЕ) или Т (а: Р<0,01 по сравнению с контролем, б: Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными соединением А, в: Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными ОЕ или Т).Table II. The effect of compound A (10 nM), growth factors (OE, 10 ng / ml), or T (10 nM) on DNA fragmentation in BPH cells. Apoptotic index (%) means the number of stained nuclei according to ^ Eb in BPH cells in each of at least five separate sections on the slice. The results are presented as mean ± 8EM in three separate experiments. Compound A is capable of inducing apoptosis in untreated BPH cells, as well as in BPH cells simultaneously incubated in the presence of growth factors (OE) or T (a: P <0.01 compared to the control, b: P <0.01 compared to cells treated with compound A, B: P <0.01 compared with cells treated with OE or T).

Пример 2. Антипролиферативные свойства соединения А на моделях роста предстательной железы ίη νίνο.Example 2. Antiproliferative properties of compound A in models of prostate growth ίη νίνο.

Методики испытаний на животныхAnimal Testing Procedures

Самцов крыс 8ргадие ЭаМеу (возрастом 28 сут) приобретали в Сйаг1е8 ККег ЬаЬога1опе8 (Са1со,Male rats, 8gadie EaMeu (28 days old), were acquired in Cialis erythrocytes Kex Ь Lebola eryte8 (Ca

- 10 010240- 10 010240

Ьессо, Италия). Все описанные испытания на животных проводилсь в соответствии с принятыми стандартами по обращению с животными. Кастрацию проводили через мошонку при анестезии кетамином/ксилазином. Через трое суток после кастрации крыс (5-8 животных в группе) обрабатывали или не обрабатывали энантатом Т (30 мг/кг) двумя отдельными подкожными инъекциями один раз в неделю. В течение 5 дней первой недели и 4 дней второй недели крысам перорально вводили носитель (миглиол 812), соединение А (10, 30, 100 и 300 мг/кг) или финастерид (10 и 40 мг/кг), всего 9 ввведений, и через 1 сутки животных забивали.Besso, Italy). All described animal tests were carried out in accordance with accepted standards for the treatment of animals. Castration was performed through the scrotum under anesthesia with ketamine / xylazine. Three days after castration, rats (5-8 animals in the group) were treated or not treated with T enanthate (30 mg / kg) with two separate subcutaneous injections once a week. For 5 days of the first week and 4 days of the second week, the rats were orally administered with vehicle (migliol 812), compound A (10, 30, 100 and 300 mg / kg) or finasteride (10 and 40 mg / kg), a total of 9 injections, and after 1 day the animals were killed.

В другом варианте интактным взрослым самцам Зртадие Эа\\'1еу (массой 250 г) вводили перорально носитель (миглиол 812), соединение А (10, 30, 100 и 300 мг/кг) или финастерид (10 и 40 мг/кг) по схеме 5 дней в неделю в течение 5 последовательных недель и двух дополнительных дней в течение шестой недели, всего 27 ввведений, если не указано иное. После завершения каждого эксперимента у животных отбирали кровь для анализа на содержание кальция и гормонов.In another embodiment, an intact adult male Zrtadie Ea \\ '1eu (weighing 250 g) was administered orally with a carrier (migliol 812), compound A (10, 30, 100 and 300 mg / kg) or finasteride (10 and 40 mg / kg) 5 days a week for 5 consecutive weeks and two additional days for the sixth week, a total of 27 injections, unless otherwise indicated. After the completion of each experiment, blood was collected from animals for analysis on the content of calcium and hormones.

Анализ методом нозерн-гибридизацииNorthern hybridization analysis

Общую РНК экстрагировали с использованием набора РИАРак! фирмы Мо1еси1аг §у81еш (8ап О1едо,СА). Блотинг, введение метки, условия гибридизации и зонды (полноразмерной кДНК кластерина длиной 1,5 Ко и полноразмерной кДНК ΟΑΡΌΗ длиной 1,2 Ко) получали по описанным методикам (Ве!ΐπζζί и др., Вюсйешюа1 1оита1, 257, 293-296 (1989) и МапиеШ и др., ВюсйешШту апб Се11 Вю1оду, 72, 515-521 (1994)). Считывание авторадиограмм проводили денситометрическим сканированием на денситометре ЬКВ ИИтаксап ХЬ.Total RNA was extracted using the RIARak kit! Firm Mo1eci1ag §u81esh (8ap O1edo, CA). Blotting, labeling, hybridization conditions and probes (full-length cDNA of clusterin 1.5 ko long and full-size cDNA 1,2 1.2 ko long) were obtained by the described methods (Be! Ϊ́πζζί et al., Vusyeshyu1 1oyta1, 257, 293-296 (1989 ) and MapieSh et al., VusyeshShtu apb Ce11 Vyuodu, 72, 515-521 (1994)). Autoradiograms were read by densitometric scanning on a LKV and Itaxap XB densitometer.

ИммуногистохимияImmunohistochemistry

Все криостатированные срезы, полученные из контрольных или обработанных крыс, обрабатывали параллельно, как описано ранее (АЧапсоНе и др., 1оитпа1 о! Епбоспшпо1оду, 167, 197-204 (2000)). В каждом эксперименте анализировали три альтернативных среза предстательных желез трех разных крыс. В отрицательных контролях, полученных при отсутствии в реакционной среде специфических антител, не наблюдалось специфического окрашивания. Вторичное окрашивание проводили гематоксилином, покровные стекла обрабатывали набором Еикй! (фирма О.Кшб1ет ОшЬН&Со, Германия). Цифровые цветные снимки с большим увеличением снимали ПЗС-камерой через микроскоп.All cryostatic sections obtained from control or treated rats were processed in parallel, as described previously (AChapsoNe et al., Proposal et al., 167, 197-204 (2000)). In each experiment, three alternative sections of the prostate glands of three different rats were analyzed. In the negative controls obtained in the absence of specific antibodies in the reaction medium, no specific staining was observed. Secondary staining was performed with hematoxylin, coverslips were treated with Eiky! (company O. Kshb1et Oshn & Co, Germany). High-resolution digital color photographs were taken with a CCD camera through a microscope.

Анализ фрагментации ДНК ίη Ши (метод ТиИЕБ)Ίη Shi DNA fragmentation analysis (TiIEB method)

Фрагментацию ДНК в криостатировнных срезах предстательной железы, выявленную методом однонитевого концевого мечения дУТФ (бИТР) (ΤϋΝΕΕ), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ), проводили с использованием набора для детектирования гибели клеток ίη кйи (фирма ΡΟΌ, ВосНе) по рекомендациям производителя. Положительные по методу ТиИЕЬ апоптотические ядра регистрировали в виде цифровых цветных снимков с большим увеличением при съемке ПЗСкамерой через микроскоп.DNA fragmentation in cryostatized sections of the prostate revealed by single-stranded end-labeling with dUTP (BITP) (ΤϋΝΕΕ) mediated by terminal deoxynucleotidyl transferase (TBT) was performed using the ίη Kyi cell death detection kit (manufacturer ΡΟΌ, VosNe). Apoptotic nuclei positive according to the method of TIIE were recorded in the form of digital color images with a large increase when taking a CCD camera through a microscope.

Вторичное окрашивание проводили эозином, покровные стекла обрабатывали набором ЕикШ (фирма О.К1пб1ег ОшЬН&Со, Германия).Secondary staining was performed with eosin, coverslips were treated with an EikSn kit (O. K1pb1eg Oshbn & Co, Germany).

Определение кальцияCalcium determination

Уровень кальция определяли с использованием коммерческого набора для колориметрического анализа (фирма ЗЦша) по методике производителя.Calcium levels were determined using a commercial colorimetric assay kit (company SCa) according to the manufacturer's method.

Определение тестостерона и тЬНDetermination of testosterone and tHN

Уровни гормонов Т и тЬН определяли с использованием коммерческих наборов для радиоиммуноанализа по методикам производителя. Для измерения уровня Т в сыворотке (крови) образцы сначала добавляли к 4 объемам диэтилового эфира, перемешивали при аккуратном перевертывании пробирки в течение 15 мин и затем центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин. Водную фазу замораживали сухим льдом, органическую фазу отделяли и упаривали досуха в атмосфере азота. Высушенный остаток переносили в буферный раствор для анализа (1 об./1 об., пробы, взятые у интактных крыс; 4 об./1 об., пробы, взятые у кастрировнных крыс).The hormones T and bH were determined using commercial kits for radioimmunoassay according to the manufacturer's methods. To measure the level of T in serum (blood), the samples were first added to 4 volumes of diethyl ether, stirred by carefully turning the tubes over for 15 minutes and then centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. The aqueous phase was frozen with dry ice, the organic phase was separated and evaporated to dryness in a nitrogen atmosphere. The dried residue was transferred to a buffer solution for analysis (1 vol./ 1 vol., Samples taken from intact rats; 4 vol. / 1 vol., Samples taken from castrated rats).

Статистический анализStatistical analysis

Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ΑΝΟνΑ и в соответствующих случаях парных или непарных критериев Стьюдента. Данные по связыванию (с рецептором) анализировали с использованием программы ЬЮАИО (Мипкоп и др., Апа1убса1 ВюсйешШту, 107, 139-220 (1980)).Statistical analysis was performed using one-way analysis of variance ΑΝΟνΑ and, where appropriate, paired or unpaired student criteria. Binding data (with the receptor) was analyzed using the LUAIO program (Mipcop et al., Apaubsa1 Wusieshtu, 107, 139-220 (1980)).

Компьютерную программу АБЬНТ (Эе Ьеап А. и др., Ашепсап 1оитпа1 о! Рйу8ю1оду, 235, Е97-Е102 (1978)) использовали для анализа сигмоидных кривых зависимости доза-ответ для оценки значений ингибирования на уровне половины от максимального значения (1С₅₀) и величин стимулирования на уровне половины от максимального значения (ЕС₅₀), а также максимального ингибирующего (I _макс) и стимулирующего (Е_макс) действия. Данные представляли в виде среднее±8ЕМ.The ABBNT computer program (Ee Leap A. et al., Ashepsap 1oopt1 o! Ryu8yuodu, 235, E97-E102 (1978)) was used to analyze sigmoidal dose-response curves to estimate half-inhibition values from the maximum value (1С ₅₀ ) and stimulation values at half the maximum value (EC ₅₀ ), as well as the maximum inhibitory (I _max ) and stimulating (E _max ) actions. Data were presented as mean ± 8EM.

Результатыresults

Для анализа антипролиферативных свойств соединения А на моделях роста предстательной железы ш у1уо кастрированных и интактных крыс обрабатывали возрастающими концентрациями соединения А (10-300 мкг/кг) или финастерида (10, 40 мг/кг). Как показано на фиг. 4А, кастрация существенно снижает массу вентральной предстательной железы, в то время как двухнедельная обработка энантатом тестосте- 11 010240 рона (Т) (30 мг/кг) не только полностью восстанавливает, но даже стимулирует ее рост. Соединение А в любых испытанных дозах полностью подавляет Т-стимулированное разрастание (гипертрофию) предстательной железы, снижая массу вентральной предстательной железы до более низкого уровня, чем у необработанных крыс. Аналогичные результаты получены при использовании финастерида (10, 40 мг/кг). При обработке интактных взрослых крыс соединением А в течение одного месяца наблюдается значительное снижение массы вентральной предстательной железы, причем максимальное снижение (30%) наблюдается при наиболее высокой из использованных доз (300 мкг/мг). При этой дозе ингибирующее действие соединения А на рост предстательной железы сопоставимо с действием финастерида в дозе 10 или 40 мг/кг (фиг. 4В). Во всех экспериментах при пероральном введении различных доз соединения А очень низкая гиперкальцемия наблюдалась только при введении наиболее высокой дозы (300 мкг/мг) (табл. III). При этом не наблюдалось других заметных побочных действий.To analyze the antiproliferative properties of compound A in prostate growth models, castrated and intact rats were treated with increasing concentrations of compound A (10-300 μg / kg) or finasteride (10, 40 mg / kg). As shown in FIG. 4A, castration significantly reduces the mass of the ventral prostate, while a two-week treatment with test enanthate testosterone ron (T) (30 mg / kg) not only completely restores, but even stimulates its growth. Compound A in any doses tested completely suppresses T-stimulated proliferation (hypertrophy) of the prostate, reducing the mass of the ventral prostate to a lower level than untreated rats. Similar results were obtained using finasteride (10, 40 mg / kg). When treating intact adult rats with compound A for one month, a significant decrease in the mass of the ventral prostate gland was observed, and the maximum decrease (30%) was observed at the highest dose used (300 μg / mg). At this dose, the inhibitory effect of compound A on prostate growth is comparable to that of finasteride at a dose of 10 or 40 mg / kg (Fig. 4B). In all experiments, when various doses of compound A were orally administered, very low hypercalcemia was observed only when the highest dose (300 μg / mg) was administered (Table III). No other significant side effects were observed.

Кальцемия Calcemia Контроль The control 10,2±0,16 10.2 ± 0.16 Соединение А 10 мкг/кг Compound A 10 μg / kg 10,16±0,24 10.16 ± 0.24 Соединение А 30 мкг/кг Compound A 30 μg / kg 9,87±0,15 9.87 ± 0.15 Соединение А 100 мкг/кг Compound A 100 μg / kg 10,55±0,18 10.55 ± 0.18 Соединение А 300 мкг/кг Compound A 300 μg / kg 1О,85±О,1 1О, 85 ± О, 1

Таблица III. Кальцемия (мг/дл) у кастрированных крыс с заместительной терапией тестостероном после введения различных доз (10, 30, 100, 300 мкг/кг) соединения А. Соединение А ни в одном из случаев не изменяет уровень калия в плазме (крови) у кастрированных крыс с заместительной терапией энантатом тестостерона (30 мг/кг/неделя) по сравнению с контролем. Аналогичные результаты получены на интактных крысах (данные не приводятся). Результаты представлены в виде среднего значения±ЗЕМ, полученного для крыс в данной группе.Table III. Calcemia (mg / dl) in castrated rats with testosterone replacement therapy after administration of various doses (10, 30, 100, 300 μg / kg) of compound A. Compound A in no case changes the level of potassium in plasma (blood) in castrated rats with testosterone enanthate replacement therapy (30 mg / kg / week) compared with the control. Similar results were obtained on intact rats (data not shown). The results are presented as mean ± ZEM obtained for rats in this group.

С целью получить более полное представление о молекулярных механизмах процесса снижения массы предстательной железы, индуцированного соединением А, исследовали экспрессию гена кластерина и биосинтез белка, а также проводили анализ морфологических признаков апоптоза с использованием однонитевого концевого мечения дУТФ (ДЙТР), опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (ТбТ) (метод ТОНЕЙ). Кластерин представляет собой убиквитарный (повсеместно присутствующий) продукт гена, принимающий самое непосредственное участие в остановке клеточного цикла и атрофии, экспрессия которого подавляется андрогенами. На фиг. 5А показана экспрессия мРНК кластерина в предстательной железе (по результатам нозерн-анализа) у орхиэктомированных крыс, получавших или не получавших Т. Кастрация существенно повышает относительное содержание мРНК кластерина, в то время как обратное действие вызывается при двухнедельном введении Т. Стимулирующее введение различных концентраций соединения А (300 и 100 мкг/кг) или Е (40 мг/кг) частично подавляет снижение экспресии гена кластерина, индуцированное ведением Т. У интактных крыс (фиг. 5В) введение различных концентраций соединения А (30 и 100 мкг/кг) в течение месяца индуцирует устойчивое повышение экспрессии гена кластерина в предстательной железе, которое сопоставимо или даже превышает рост экспрессии, индуцируемый при введении 40 мг/кг Е.In order to gain a better understanding of the molecular mechanisms of the prostate mass reduction process induced by compound A, we studied the expression of the clusterin gene and protein biosynthesis, as well as the analysis of morphological signs of apoptosis using single-stranded end labeling of DUTP (DTP) mediated by terminal deoxynucleotidyl transferase (TbT) (TONEY method). Clusterin is a ubiquitous (ubiquitous) gene product that is directly involved in stopping the cell cycle and atrophy, the expression of which is suppressed by androgens. In FIG. 5A shows the expression of clusterin mRNA in the prostate gland (according to the Northern analysis) in orchiectomized rats that received or did not receive T. Castration significantly increases the relative content of clusterin mRNA, while the opposite effect is caused by a two-week administration of T. Stimulating administration of various concentrations of the compound A (300 and 100 μg / kg) or E (40 mg / kg) partially inhibits the reduction of clusterin gene expression induced by T. administration. In intact rats (Fig. 5B), administration of various concentrations of the compound (30 and 100 mg / kg) for one month to induce stable overexpression of clusterin gene in the prostate gland, which is comparable or even higher than the expression of growth induced when administered 40 mg / kg E.

Местная экспрессия кластерина в предстательной железе орхиэктомированных крыс показана на фиг. 6. Кастрация вызывает заметную и широко развитую атрофию в предстательной железе и почти все кубоидные эпителиальные клетки, выстилающие просвет железы, дают положительную реакцию на кластерин (фиг. 6А). Т-заместительная терапия (фиг. 6В) обращает морфологические признаки атрофии и достоверно снижает количество окрашенного кластерина. Указанное воздействие исключается при одновременном введении соединения А (фиг. 6С и Е). На фиг. 6Ό и Е показаны результаты анализа методом ΤϋΝΕΕ срезов, соседних с теми, которые показаны на фиг. 6С и Е. При обработке соединением А (100 мкг/кг, фиг. 6Ό, и 300 мкг/кг, фиг. 6Е) наблюдается явная фрагментация ядер в клетках эпителия и стромы, а апоптоз можно обнаружить в кластерин-положительных и кластерин-отрицательных клетках. На фиг. 7А и В (два первых среза) показана морфология предстательной железы интактных крыс при окраске на присутствие кластерина в отсутствии (фиг. 7А) или в присутствии (фиг. 7В) первичных антител. Следует отметить, что в предстательной железе необработанных взрослых крыс практически отсутствует кластериновая метка (фиг. 7В), а также не наблюдается признаков фрагментации ядра (метод ТОНЕЙ, фиг. 7С). Напротив, обработка различными дозами соединения А вызывает экспрессию кластерина (фиг. 7Ό-Ε) и апоптоз (фиг. 7С, С и I). На фиг. 7Е для сравнения показано действие финастерида (40 мг/кг) на наличие кластерин-положительной окраски в срезах предстательной железы.Local expression of clusterin in the prostate gland of orchiectomized rats is shown in FIG. 6. Castration causes a noticeable and widely developed atrophy in the prostate gland and almost all cuboidal epithelial cells lining the gland of the gland give a positive reaction to clusterin (Fig. 6A). T-replacement therapy (Fig. 6B) reverses the morphological signs of atrophy and significantly reduces the amount of stained clusterin. The indicated effect is excluded with the simultaneous administration of compound A (Fig. 6C and E). In FIG. 6Ό and E show the results of the analysis by the ΤϋΝΕΕ method of slices adjacent to those shown in FIG. 6C and E. When treated with compound A (100 μg / kg, Fig. 6Ό, and 300 μg / kg, Fig. 6E), there is a clear fragmentation of the nuclei in the cells of the epithelium and stroma, and apoptosis can be detected in clusterin-positive and clusterin-negative cells. In FIG. 7A and B (the first two sections) shows the morphology of the prostate gland of intact rats when stained for the presence of clusterin in the absence (Fig. 7A) or in the presence (Fig. 7B) of primary antibodies. It should be noted that in the prostate gland of untreated adult rats there is practically no clusterin label (Fig. 7B), and no signs of nuclear fragmentation are observed (TONEY method, Fig. 7C). On the contrary, treatment with different doses of compound A causes the expression of clusterin (Fig. 7Ό-Ε) and apoptosis (Fig. 7C, C and I). In FIG. 7E shows for comparison the effect of finasteride (40 mg / kg) on the presence of clusterin-positive color in sections of the prostate gland.

С целью исключить возможность снижения роста предстательной железы ίη νίνο соединением А за счет воздействия на функцию гипофиза или семенников у кастрированных и интактных крыс измеряли уровень лютеинизирующего гормона (тйН) и Т в сыворотке (крови). Как и следовало ожидать (табл. ГУА), кастрация существенно снижает уровень Т и в то же время повышает уровень тйН в сыворотке (крови). Введение энантата Т (30 мг/кг) в течение двух недель полностью обращает действие орхиэктомии. При пероральном введении соединения А (100 и 300 мкг/кг) кастрированным крысам, прошедшим курс заместительной Т-терапии, наблюдается незначительное влияние на уровни тйН и Т в сыворотке (крови). Аналогичные результаты были получены у интактных крыс (табл. IVΒ). Действительно, приIn order to exclude the possibility of reducing the growth of the prostate gland ίη νίνο by compound A due to the effect on the function of the pituitary or testes in castrated and intact rats, the levels of luteinizing hormone (tyN) and T in serum (blood) were measured. As expected (table. GUA), castration significantly reduces the level of T and at the same time increases the level of tyN in serum (blood). The introduction of enanthate T (30 mg / kg) for two weeks completely reverses the effect of orchiectomy. With the oral administration of compound A (100 and 300 μg / kg) to castrated rats undergoing T-replacement therapy, a slight effect on serum (blood) tyN and T levels is observed. Similar results were obtained in intact rats (Table IVΒ). Indeed, for

- 12 010240 длительном введении (в течение 1 месяца) соединения А (10, 30, 100 мкг/кг) или Р (40 мг/кг) у интактных крыс не наблюдается изменения уровня тЬН и Т в сыворотке (крови).- 12 010240 long-term administration (within 1 month) of compound A (10, 30, 100 μg / kg) or P (40 mg / kg) in intact rats, there was no change in serum (blood) tH and T levels.

Таблица ΤΥΑTable ΤΥΑ

КЫ1 KY1 Т T Контроль (интактные крысы) Control (intact rats) 2,36+0,46 2.36 + 0.46 11,5+2,44 11.5 + 2.44 Кастрированные крысы Castrated Rats 20,64±б’ 20.64 ± b ’ 0,9±0,32* 0.9 ± 0.32 * Кастрированные крысы + Т-терапия Castrated rats + T-therapy 2,08±0,36 2.08 ± 0.36 21,25±4,12 21.25 ± 4.12 Кастрированные крысы + Т-терапия + соединение А, 100 мкг/кг Castrated rats + T-therapy + compound A, 100 mcg / kg 1,8+0,2 1.8 + 0.2 11,13±1,02 11.13 ± 1.02 Кастрированные крысы + Т-терапия + соединение А, 300 мкг/кг Castrated rats + T-therapy + Compound A, 300 mcg / kg 3,15±0,65 3.15 ± 0.65 15,73±2,75 15.73 ± 2.75

Таблица ТУБTUBE table

ИБН IBN т t Контроль (интактные крысы) Control (intact rats) 2±0,16 2 ± 0.16 11,98+2,87 11.98 + 2.87 Финастерид Finasteride 2,2+4 2.2 + 4 18,11±3,23 18.11 ± 3.23 Соединение А, 10 мкг/кг Compound A, 10 μg / kg 2,22±0,25 2.22 ± 0.25 19,13±3,83 19.13 ± 3.83 Соединение А, 30 мкг/кг Compound A, 30 mcg / kg 2,32±0,36 2.32 ± 0.36 9,39±2 9.39 ± 2 Соединение А, 100 мкг/кг Compound A, 100 μg / kg 1,96±0,13 1.96 ± 0.13 11+2,14 11 + 2.14

Таблица IV. Содержание тЬН (нг/мл) и Т (нМ) в сыворотке (крови) кастрированных крыс при Тзаместительной терапии (табл. 1УА) или у интактных крыс (табл. 1УБ) после терапии различными дозами соединения А.Table IV. The content of tHN (ng / ml) and T (nM) in the serum (blood) of castrated rats during substitution therapy (Table 1UA) or in intact rats (Table 1UB) after treatment with different doses of compound A.

1УА. Кастрация существенно снижает уровень Т в сыворотке (крови) ( Р<0,01 по сравнению с контролем) и одновременно увеличивает уровень тЬН ( Р<0,05 по сравнению с контролем). После введения энантата Т (30 мг/кг/неделя) уровни тЬН и Т восстанавливаются. Соединение А при всех испытанных дозах оказывает незначительное влияние на уровни тЬН и Т.1UA. Castration significantly reduces the level of T in serum (blood) (P <0.01 compared with the control) and at the same time increases the level of TB (P <0.05 compared with the control). After administration of T enanthate (30 mg / kg / week), the levels of Tb and T are restored. Compound A at all doses tested had a negligible effect on tH and T levels.

1УБ. Длительное введение (в течение 1 месяца) Р (40 мг/кг) или соединения А (10, 30, 100 мкг/кг) не приводит к изменению уровней гЬН и Т в сыворотке (крови) у интактных крыс.1UB. Prolonged administration (within 1 month) of P (40 mg / kg) or compound A (10, 30, 100 μg / kg) does not lead to a change in serum (blood) levels of Hb and T in intact rats.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение А снижает размеры предстательной железы у интактных крыс в большей степени по сравнению с финастеридом. Кроме того, аналогично финастериду соединение А отменяет пролиферативную активность тестостерона ίη νίΐτο и ίη νίνο. Однако в отличие от финастерида соединение А не ингибирует активность 5а-редуктазы типа 1 или типа 2 и может предотвращать рост клеток ВРН, индуцированный не только Т, но и ОНТ. Эти анти-андрогенные свойства соединения А не зависят от взаимодействия с ΑΒ поскольку установлено, что соедидение А не связываетя с ΑΒ, а воздействует на клетки РС3, трансфектированные ΑΒ, в качестве агониста или антагониста ΑΒ. Кроме того, соединение А не оказывает влияния на секрецию полового гормона, поскольку при испытаниях на крысах уровни гонадотропина и Т в плазме (крови) не изменяются при ежедневном введении соединения А в течение до одного месяца. Следовательно, соединение А подавляет взаимодействие рецептора ΑΒ с лигандом. Не вдаваясь в теоретические аспекты, можно предположить, что такое действие осуществляется благодаря прерыванию передачи сигнала от тестостерона к ростовому фактору.The results obtained indicate that compound A reduces the size of the prostate in intact rats to a greater extent compared with finasteride. In addition, like finasteride, compound A cancels the proliferative activity of testosterone ίη νίΐτο and ίη νίνο. However, unlike finasteride, compound A does not inhibit the activity of 5a-reductase type 1 or type 2 and can prevent the growth of BPH cells induced not only by T, but also by OHT. These anti-androgenic properties of compound A are independent of the interaction with ΑΒ since it was established that compound A does not bind to ΑΒ, but acts on PC3 cells transfected with в as an agonist or antagonist of ΑΒ. In addition, compound A does not affect the secretion of sex hormone, since in tests on rats the levels of gonadotropin and T in plasma (blood) do not change with the daily administration of compound A for up to one month. Therefore, compound A inhibits the interaction of receptor ΑΒ with the ligand. Without going into theoretical aspects, it can be assumed that such an action is carried out due to the interruption of signal transmission from testosterone to growth factor.

В очень низких концентрациях соединение А способно полностью подавлять (оказывать антагонистическое действие) не только Т-стимулированную пролиферацию клеток ВРН, но и пролиферацию, индуцированную двумя наиболее важными внутрипростатическими ростовыми факторами, ЮР-1 и КСР. Кроме того, даже в присутствии Т или СР соединение А индуцирует апоптоз в клетках ВРН. Запрограммированная гибель клеток, индуцированная соединением А, наблюдается также в предстательной железе как интактных, так и Т-обработанных орхиэктомированных крыс, и характеризуется диффузной картиной фрагментации ДНК с сопутствующим увеличением экспрессии гена кластерина и белка. Кластерин является белком, который в предстательной железе строго регулируется андрогенами (ΒοΙΙιιζζί и др., Βίοοΐιοιηίοαΐ .Тоита1, 257, 293-296 (1989)). Хотя функция кластерина до конца не установлена, уровень этого белка заметно увеличивается при атрофии предстательной железы (ΒοΙΙιιζζί и др., Опсодепе, 21, 43284334 (2002) и Βеΐΐиζζ^ и др., .Тоита1 οί Епбосппо1оду, 132, 361-367 (1992)) и апоптозе ^5&ον и др., Лоигпа1 οί Вю1одка1 СНетМгу. 278, 11590-11600 (2003)). Таким образом, индукция кластерина при терапии соединением А согласуется со способностью этого соединения ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз в предстательной железе.At very low concentrations, compound A is able to completely suppress (exert an antagonistic effect) not only T-stimulated proliferation of BPH cells, but also proliferation induced by the two most important intraprostatic growth factors, UR-1 and CSR. In addition, even in the presence of T or CP, compound A induces apoptosis in BPH cells. Programmed cell death induced by compound A is also observed in the prostate gland of both intact and T-treated orchiectomized rats and is characterized by a diffuse pattern of DNA fragmentation with a concomitant increase in the expression of the clusterin gene and protein. Clusterin is a protein that is strictly regulated by androgens in the prostate gland (ΒοΙΙιιζζί et al., Βίοοΐιοιηίοαΐ. Toyota 1, 257, 293-296 (1989)). Although the function of clusterin has not been fully established, the level of this protein increases markedly with atrophy of the prostate gland (ΒοΙΙιιζζί et al., Osodepe, 21, 43284334 (2002) and ΐΐеζиζζ ^ et al., Toyota1 οб Epbospoduoda, 132, 361-367 (1992 )) and apoptosis ^ 5 & ον et al., Loigpa1 οί Vyuododka SNetMgu. 278, 11590-11600 (2003)). Thus, the induction of clusterin during therapy with compound A is consistent with the ability of this compound to inhibit proliferation and induce apoptosis in the prostate gland.

Таким образом, полученные результаты показывают, что соединение А является эффективным в отношении снижения роста клеток предстательной железы в различных экспериментальных моделях.Thus, the results show that compound A is effective in reducing the growth of prostate cells in various experimental models.

Пример 3. Снижение массы предстательной железы у здоровых собак, обработанных соединением А.Example 3. The reduction in prostate mass in healthy dogs treated with compound A.

Испытания на токсичность проводили в течение 9 месяцев на четырех группах собак, самцов породы гончих, которым ежедневно вводили через желудочный зонд соединение А в дозах 0,5 мкг, 1,5 мкг и 5 мкг/кг массы тела/сут ( в носителе миглиол 812) или один носитель. После введения препарата у группы, получавшей максимальную дозу (5 мкг), следовал период реабилитации в течение двух месяцев, после чего измеряли массу предстательной железы. При завершении испытаний наряду с весьма благоприятными данными по токсичности после завершения курса приема соединения А (см. фиг. 8) и после реаToxicity tests were carried out for 9 months on four groups of dogs, male beagle breeds, who were daily injected with a compound A dose of 0.5 μg, 1.5 μg and 5 μg / kg body weight / day through a gastric tube (in the carrier migliol 812 ) or one medium. After administration of the drug, the group receiving the maximum dose (5 μg) followed by a rehabilitation period of two months, after which the mass of the prostate gland was measured. Upon completion of the tests, along with very favorable toxicity data after completion of the course of taking compound A (see Fig. 8) and after

- 13 010240 билитации (см. фиг. 9) у животных наблюдалась более низкая масса предстательной железы. Результаты после реабилитации обрабатывали статистически с использованием однофакторного критерия Стьюдента и установили наличие существенной разницы в действии соединения А и носителя (Р<0,05). Эти результаты также демонстрируют способность соединения А снижать массу предстательной железы ίη νίνο.- 13 010240 bilitation (see Fig. 9) in animals a lower prostate mass was observed. The results after rehabilitation were statistically processed using the one-factor student criterion and established the presence of a significant difference in the action of compound A and the carrier (P <0.05). These results also demonstrate the ability of compound A to reduce prostate mass ίη νίνο.

Пример 4. Пероральная лекарственная форма в виде мягкой желатиновой капсулы.Example 4. An oral dosage form in the form of a soft gelatin capsule.

Капсулы для перорального введения получали в атмосфере азота в желтом свете, при этом одну мягкую желатиновую капсулу заполняли смесью, содержащей от 0,01 до 25,0 мг соединения А в 150 мг фракционированного кокосового масла (например, миглиола 812), 0,015 мг бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и 0,015 мг бутилированного гидроксианизола (ВНА). Капсулы получали по следующей методике:Capsules for oral administration were obtained under a nitrogen atmosphere in yellow light, while one soft gelatin capsule was filled with a mixture containing from 0.01 to 25.0 mg of compound A in 150 mg of fractionated coconut oil (for example, migliol 812), 0.015 mg of butylated hydroxytoluene (BHT) and 0.015 mg of butylated hydroxyanisole (BHA). Capsules were prepared according to the following procedure:

1) ВНТ и ВНА суспендировали в фракционированном кокосовом масле (например, миглиоле 812) и нагревали при перемешивании приблизительно при 50°С до полного растворения,1) BHT and BHA were suspended in fractionated coconut oil (for example, migliol 812) and heated with stirring at approximately 50 ° C until completely dissolved,

2) в полученном на стадии 1 растворе при 50°С растворяли соединение А,2) in the solution obtained in stage 1 at 50 ° C, compound A was dissolved,

3) раствор, полученный на стадии 2, охлаждали до комнатной температуры,3) the solution obtained in stage 2 was cooled to room temperature,

4) полученным на стадии 3 раствором заполняли мягкие желатиновые капсулы.4) the solution obtained in stage 3 was filled in soft gelatin capsules.

Все стадии проводили в атмосфере азота и без доступа дневного света.All stages were carried out in a nitrogen atmosphere and without access to daylight.

Пример 4А. Пероральная лекарственная форма в виде мягкой желатиновой капсулы.Example 4A Oral dosage form in the form of a soft gelatin capsule.

Капсулы для перорального введения получали в атмосфере азота в желтом свете, при этом одну мягкую желатиновую капсулу заполняли смесью, содержащей 150 мкг соединения А в 150 мг фракционированного кокосового масла (например, миглиола 812), 0,015 мг бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и 0,015 мг бутилированного гидроксианизола (ВНА).Capsules for oral administration were obtained under a yellow atmosphere in a nitrogen atmosphere, while one soft gelatin capsule was filled with a mixture containing 150 μg of compound A in 150 mg of fractionated coconut oil (for example, migliol 812), 0.015 mg of butylated hydroxytoluene (BHT), and 0.015 mg of bottled hydroxyanisole (BHA).

Пример 4Б. Пероральная лекарственная форма в виде мягкой желатиновой капсулы.Example 4B. Oral dosage form in the form of a soft gelatin capsule.

Капсулы для перорального введения получали в атмосфере азота в желтом свете, при этом одну мягкую желатиновую капсулу заполняли смесью, содержащей 75 мкг соединения А в 150 мг фракционированного кокосового масла (например, миглиола 812), 0,015 мг бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) и 0,015 мг бутилированного гидроксианизола (ВНА).Capsules for oral administration were obtained under nitrogen in yellow light, while one soft gelatin capsule was filled with a mixture containing 75 μg of compound A in 150 mg of fractionated coconut oil (for example, migliol 812), 0.015 mg of butylated hydroxytoluene (BHT) and 0.015 mg of bottled hydroxyanisole (BHA).

Пример 5. Снижение массы предстательной железы в организме человека при проведении клинических испытаний.Example 5. The decrease in the mass of the prostate gland in the human body during clinical trials.

Определение действия соединения А (1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола) на пациентов с ВРН проводили методом двойного контроля при случайной выборке и методом параллельных групп при введении плацебо.Determination of the effect of compound A (1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol) on patients with BPH was carried out using the double control method with random sampling and the parallel group method with placebo.

При отборе пациентов для проведения испытаний в качестве основного критерия использовали результаты диагностики взрослых пациентов на наличие ВРН и объем предстательной железы >40 мл по результатам трансректальной ультразвуковой диагностики (ТКИ8).When selecting patients for testing, the results of diagnostics of adult patients for the presence of BPH and the volume of the prostate gland> 40 ml according to the results of transrectal ultrasound diagnostics (TKI8) were used as the main criterion.

Статистические методыStatistical Methods

Анализ первичной эффективности лечения планировалось провести на пациентах для протокольных исследований (РР), а для подтверждения полученных результатов аналогичные испытания предполагалось провести на волонтерах (1ТТ). Пациентов категории РР отбирали случайной выборкой, причем все пациенты соответствовали протокольным критериям, прошли полный курс обследования без нарушений основного протокола и имели достоверную оценку объема предстательной железы. Пациентов категории 1ТТ отбирали методом случайной выборки, причем все пациенты получали по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства, а объем предстательной железы у отобранных пациентов соответствовал базовой линии. Волонтеры проходили клинические испытания в течение 12 недель.An analysis of the primary effectiveness of the treatment was planned to be carried out on patients for protocol studies (PP), and to confirm the results obtained, similar tests were supposed to be carried out on volunteers (1TT). Patients of the PP category were selected by random sampling, and all patients met the protocol criteria, underwent a full course of examination without violating the main protocol and had a reliable estimate of the volume of the prostate gland. Patients of the 1TT category were selected by random sampling, with all patients receiving at least one dose of the study drug, and the prostate volume in the selected patients corresponded to the baseline. Volunteers underwent clinical trials for 12 weeks.

Все случайно выбранные пациенты, получившие по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства, прошли оценку на безопасность анализа.All randomly selected patients who received at least one dose of the test drug were evaluated for safety analysis.

Сравнение в группе проводили по базовой линии для всех пациентов описательным способом. Данные обрабатывали с использованием хи-квадрат критерия для категорийных переменных и дисперсионного анализа ΑΝΟνΑ для непрерывных переменных.The comparison in the group was performed according to the baseline for all patients in a descriptive way. Data were processed using the chi-square test for categorical variables and analysis of variance ΑΝΟνΑ for continuous variables.

Описательную статистику рассчитывали обычными методами: средняя величина, стандартное отклонение, минимальные и максимальные значения непрерывных переменных и абсолютные значения и относительные частоты категорийных переменных. Описательную статистику использовали при оценке каждого введения и каждого посещения в неделю.Descriptive statistics were calculated by conventional methods: mean, standard deviation, minimum and maximum values of continuous variables, and absolute values and relative frequencies of categorical variables. Descriptive statistics were used to evaluate each introduction and each visit per week.

Учреждения, включающие менее 4 пациентов, объединяли.Institutions comprising less than 4 patients were combined.

За переменную величину первичной эффективности принимали изменение объема предстательной железы в процентах, который определяли методом централизованной ядерно-магнитной томографии (МК1) при аксиальном сканировании. Для анализа данных использовали метод ΑΝΟνΑ с учетом результатов лечения и учреждений, в которых зарегистрированы полученные результаты.The percentage of the prostate gland volume, which was determined by the method of centralized nuclear magnetic tomography (MK1) during axial scanning, was taken as a variable of primary efficiency. For data analysis, the ΑΝΟνΑ method was used taking into account the results of treatment and the institutions in which the results were recorded.

Пациенты получали капсулы, содержащие 150 мкг (см. пример 4 А, за исключением капсул, содержащих плацебо), один раз в сутки по утрам. Срок лечения составлял 12 недель. Количество пациентов, проходивших испытания, указано ниже.Patients received capsules containing 150 μg (see Example 4A, with the exception of capsules containing placebo), once a day in the morning. The treatment period was 12 weeks. The number of patients tested is listed below.

- 14 010240- 14 010240

Соединение А Compound A Плацебо Placebo Всего пациентов Total patients Случайно выбранные пациенты Randomly selected patients 57 57 62 62 119 119 Реальное число пациентов Real number of patients 56 (98,3%) 56 (98.3%) 60 (96,8%) 60 (96.8%) 116 (97,5%) 116 (97.5%) Испытание прервано или утрачен контроль Test interrupted or lost control 0 0 2 (3,2%) 2 (3.2%) 2(1,7%) 2 (1.7%) Неудовлетворительное терапевтическое действие Poor therapeutic effect 1 (1,8%) 1 (1.8%) 0 0 1 (0,8%) 1 (0.8%)

Изменение объема предстательной железы (%), определенное методом аксиального сканирования.The change in the volume of the prostate gland (%) determined by the method of axial scanning.

Процентное изменение объема предстательной железы у пациентов с соответствующей патологией (РР) составляло -1,89+5,2 в группе пациентов, получавших соединение А, и 4,99+5,99 у группы пациентов, получавших плацебо, с достоверным значением Р < 0,0001 в пользу соединения А. Разность между этими значениями (соединение А минус плацебо) составляет -7,24 с доверительным интервалом 95% от -9,54 до -4,94. Роль медучреждения также является существенной (р=0,0176). Аналогичный анализ испытаний на волонтерах подтверждает полученные результаты (р=0,0176), т.е. соединение А более эффективно снижает объем предстательной железы по сравнению с плацебо.The percentage change in prostate volume in patients with appropriate pathology (PP) was -1.89 + 5.2 in the group of patients receiving compound A, and 4.99 + 5.99 in the group of patients receiving placebo, with a significant value of P < 0.0001 in favor of compound A. The difference between these values (compound A minus placebo) is -7.24 with a confidence interval of 95% from -9.54 to -4.94. The role of the medical institution is also significant (p = 0.0176). A similar analysis of tests on volunteers confirms the results obtained (p = 0.0176), i.e. Compound A more effectively reduces prostate volume compared to placebo.

У пациентов с базовой линией объема предстательной железы >80 мл разница между группами пациентов, получавших лекарственное средство (р<0,0001), является более очевидной по сравнению с пациентами, у которых базовая линия объема предстательной железы составляет <60 мл (р=0,0320), прежде всего у пациентов категории РР.In patients with a baseline of prostate volume> 80 ml, the difference between the groups of patients receiving the drug (p <0.0001) is more obvious than patients who have a baseline of prostate volume <60 ml (p = 0 , 0320), primarily in patients of the PP category.

У пациентов в возрасте 61-70 лет разница, всегда в пользу соединения А, была более очевидна по сравнению с пациентами более старшего возраста (>70 лет). Действительно, у волонтеров (ΙΤΤ) разница между группами у пациентов старше 70 лет составляет р=0,0540 по сравнению с р=0,0001 у других групп пациентов.In patients aged 61-70 years, the difference, always in favor of Compound A, was more evident compared with older patients (> 70 years). Indeed, in volunteers (ΙΤΤ), the difference between groups in patients older than 70 years is p = 0.0540 compared to p = 0.0001 in other groups of patients.

Пациенты, чувствительные к лекарственному средствуDrug Sensitive Patients

У категории РР процент чувствительных к соединению А пациентов составлял 27,5%, изменений не наблюдалось у 65% и только 7,5% пациентов оказались нечувствительными к лечению. В группе, получавших плацебо, число чувствительных к лечению пациентов равно нулю, фактически пациенты разделились поровну на группу, где изменений не наблюдалось, и группу нечувствтельных к лечению (50% в каждой группе). Сравнение процентных величин с использованием хи-квадрат критерия подтвердило результаты обследования, полученные в виде первичной эффективности переменного р<0,0001, что соединение А более эффективно снижает объем предстательной железы по сравнению с плацебо.In the PP category, the percentage of patients sensitive to Compound A was 27.5%, no changes were observed in 65%, and only 7.5% of the patients were insensitive to treatment. In the placebo group, the number of treatment-sensitive patients was zero, in fact, the patients were divided equally into a group where no changes were observed, and a group of treatment-insensitive (50% in each group). Comparison of percentages using the chi-square criterion confirmed the results of the survey, obtained in the form of a primary efficacy variable p <0.0001, which compound A more effectively reduces the volume of the prostate compared with placebo.

Результаты, полученные у категории ΙΤΤ, подтверждают, что процент пациентов, чувствительных к лечению в группе, получавших соединение А, составляет 28,8%, а разница по критерию хи-квадрат составляет р<0,0001.The results obtained in category подтверж confirm that the percentage of patients who are sensitive to treatment in the group receiving compound A is 28.8%, and the difference according to the chi-square criterion is p <0.0001.

У пациентов категории РР, чувствительных к лечению, среднее снижение объема предстательной железы по сравнению с базовой линией составляет -6,88±2,5, а среднее отклонение у пациентов без изменений составляет -0,35±2,3 в группе пациентов, получавших соединение А, по сравнению с 0,40±2,0 у группы пациентов, получавших плацебо. У пациентов, нечувствительных к лечению, среднее отклонение составляет 3,93±0,8 в группе пациентов, получавших соединение А, и 7,48±4,9 у группы пациентов, получавших плацебо, что подтверждает более высокую эффективность соединения А в отношении регулирования размеров и снижения объема предстательной железы.In patients sensitive to treatment category PP, the average decrease in prostate volume compared with the baseline is -6.88 ± 2.5, and the average deviation in patients without changes is -0.35 ± 2.3 in the group of patients receiving compound A, compared with 0.40 ± 2.0 in the group of patients receiving placebo. In patients insensitive to treatment, the average deviation is 3.93 ± 0.8 in the group of patients receiving compound A, and 7.48 ± 4.9 in the group of patients receiving placebo, which confirms the higher effectiveness of compound A with respect to regulation size and volume reduction of the prostate gland.

Процентное изменение объема предстательной железы, определенное центрированным параксиальным и промежуточным сканированиемPercentage change in prostate volume determined by centered paraxial and intermediate scan

Контрольные анализы параксиального и промежуточного изображения подтвердили результаты, полученные при аксиальном сканировании. У контингета РР при получении параксиального изображения процент изменения составляет -1,30±6,9 в группе пациентов, получавших соединение А, по сравнению с 2,57±6,8 у группы пациентов, получавших плацебо, р=0,0172. При промежуточном сканировании процент изменения составляет -0,22±9,6 в группе пациентов, получавших соединение А, по сравнению с 6,18±10,9 у группы пациентов, получавших плацебо, р=0,0028. У волонтеров (ΙΤΤ), прошедших курс лечения, также наблюдалось существенное различие в снижении объема предстательной железы в пользу соединения А.Control analyzes of the paraxial and intermediate images confirmed the results obtained by axial scanning. In the PP contingent, when receiving a paraxial image, the percentage change is -1.30 ± 6.9 in the group of patients receiving compound A, compared with 2.57 ± 6.8 in the group of patients receiving placebo, p = 0.0172. In the intermediate scan, the percentage change is -0.22 ± 9.6 in the group of patients receiving compound A, compared with 6.18 ± 10.9 in the group of patients receiving placebo, p = 0.0028. Volunteers (ΙΤΤ) who underwent treatment also showed a significant difference in reducing prostate volume in favor of compound A.

Общий уровень Р8А и гормона в сыворотке (крови)The total level of P8A and hormone in serum (blood)

У контингента РР среднее изменение содержания Р8А в группе пациентов, получавших соединение А, составляло 0,23±1,3, а у группы пациентов, получавших плацебо, 0,43±1,7. При этом между группами пациентов, прошедших курс лечения, не наблюдалось никакого существенного различия (р=0,2722).In the PP contingent, the average change in the P8A content in the group of patients receiving compound A was 0.23 ± 1.3, and in the group of patients receiving placebo, 0.43 ± 1.7. Moreover, between the groups of patients who underwent treatment, there was no significant difference (p = 0.2722).

У контингента РР также не наблюдалось существенной разницы между группами по содержанию тестостерона (р=0,2150). В группе пациентов, получавшей соединение А, среднее значение составляло 0,07±1,5, а у группы пациентов, получавших плацебо, 0,22±1,4.The PP contingent also did not show a significant difference between the groups in terms of testosterone content (p = 0.2150). In the group of patients receiving compound A, the average value was 0.07 ± 1.5, and in the group of patients receiving placebo, 0.22 ± 1.4.

У контингента РР между группами, прошедшими курс лечения, не наблюдалось разницы в содержании дигидротестостерона (р=0,7257 у контингента РР). В группе пациентов, получавшей соединениеIn the PP contingent, there was no difference in the dihydrotestosterone content between the treatment groups (p = 0.7257 in the PP contingent). In the group of patients treated with the compound

- 15 010240- 15 010240

А, наблюдаемое среднее изменение составляло -30,77±227,71, а у группы пациентов, получавших плацебо -166,76±490,26.And, the observed mean change was -30.77 ± 227.71, and in the group of patients receiving placebo -166.76 ± 490.26.

Не наблюдалось разницы в содержании ЬН гормона (р=0,9220 у контингента РР), в группе пациентов, получавших соединение А, среднее изменение составляло -0,02±1,7, а у группы пациентов, получавших плацебо, -0,00±1,8.There was no difference in the content of LH hormone (p = 0.9220 in the contingent PP), in the group of patients receiving compound A, the average change was -0.02 ± 1.7, and in the group of patients receiving placebo -0.00 ± 1.8.

Наблюдаемые средние изменения содержания Р8А и гормона приблизительно равны нулю, за исключением ΌΗΤ, т.е. соединение А не изменяет уровень гормона. Аналогичные результаты получены и в группе волонтеров (ΙΤΤ).The observed average changes in the content of P8A and the hormone are approximately equal to zero, with the exception of ΌΗΤ, i.e. Compound A does not change the level of the hormone. Similar results were obtained in the group of volunteers (ΙΤΤ).

БезопасностьSecurity

Количество пациентов, у которых наблюдалась по меньшей мере одна неблагоприятная реакция, составляло 31 (17 в группе пациентов, получавших соединение А, и 14 в группе пациентов, получавших плацебо). По этой причине из испытаний не выбыл ни один пациент, только у одного пациента из группы, получавших плацебо, наблюдался серьезный симптом в виде острого холецистита (с последующей госпитализацией).The number of patients who had at least one adverse reaction was 31 (17 in the group of patients receiving compound A and 14 in the group of patients receiving placebo). For this reason, not a single patient dropped out of the tests, only one patient from the placebo group had a serious symptom in the form of acute cholecystitis (with subsequent hospitalization).

Количество пациентов с неблагоприятными симптомами в связи с лечением соединением А составляло 3 чел. (5,26%), в то время как число пациентов с неблагоприятными симптомами в связи с плацебо составляло 6 чел. (9,68%). Симптомы в связи с соединением А включали головокружение, головную боль, снижение либидо и приливы, в то время как симптомы в связи с плацебо включали увеличение в моче фосфата, головную боль, обморок, снижение либидо (3 пациента), гиперкальциурию, эректильную дисфункцию и приливы.The number of patients with adverse symptoms in connection with treatment with compound A was 3 people. (5.26%), while the number of patients with adverse symptoms due to placebo was 6 people. (9.68%). Symptoms associated with compound A included dizziness, headache, decreased libido and hot flashes, while symptoms associated with placebo included increased urinary phosphate, headache, fainting, decreased libido (3 patients), hypercalciuria, erectile dysfunction and hot flashes. .

Симптомы кальциурии, зарегистрированные в течение всего курса испытаний в группе, получавшей соединение А, незначительно отличались от тех, которые наблюдались в группе, получавших плацебо.Symptoms of calciuria recorded throughout the course of the trials in the group receiving compound A did not differ significantly from those observed in the group receiving placebo.

ЗаключениеConclusion

Результаты описанного выше краткосрочного испытания концепции о воздействии соединения А на размер предстательной железы у пациентов с ВРН свидетельствуют об эффективности лекарственного средства. При анализе первичной переменной лечения, а именно при оценке размеров предстательной железы, установлено значительное различие между соединением А и плацебо, и таким образом подтверждается тот факт, что исследуемое лекарственное средство способно блокировать развитие заболевания. Профиль безопасности вполне удовлетворительный, поскольку отсутствует разница между побочными действиями в случае приема соединения А и плацебо, а в группе пациентов, получавших соединение А, не наблюдается серьезных побочных действий. У исследуемого лекарственного средства не выявлено никаких антиандрогенных свойств, оно не влияет на уровень Р8А и не оказывает существенного действия на гомеостаз кальция.The results of the short-term test of the concept described above on the effect of compound A on the size of the prostate in patients with BPH indicate the effectiveness of the drug. When analyzing the primary treatment variable, namely, when assessing the size of the prostate gland, a significant difference was established between compound A and placebo, and thus the fact that the test drug is able to block the development of the disease is confirmed. The safety profile is quite satisfactory because there is no difference between side effects in the case of taking compound A and placebo, and in the group of patients treated with compound A, there are no serious side effects. No antiandrogenic properties were detected in the studied medicinal product, it does not affect the level of P8A and does not have a significant effect on calcium homeostasis.

Пример 6. Активность соединения А в отношении роста и функции клеток мочевого пузыря.Example 6. The activity of compound A in relation to the growth and function of bladder cells.

Установлено, что соединение А является эффективным в отношении ингибирования роста базальных и стимулируемых тестостероном клеток мочевого пузыря. Указанная активность 1а-фтор-25гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола (соединение А или соед. А на фиг.) в отношении стимулированных клеток, ранее не описанная, является дозозависимой и составляет 1,6±7х 10¹⁵ (см. фиг. 10 и фиг. 11).Compound A was found to be effective in inhibiting the growth of basal and testosterone-stimulated bladder cells. The indicated activity of 1a-fluoro-25hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol (compound A or compound A in Fig.) In relation to stimulated cells, not previously described, is dose-dependent and is 1.6 ± 7x 10 ¹⁵ (see. Fig. 10 and Fig. 11).

Указанное действие существенно превышает действие анти-андрогена финастерида, который находит широкое применение для лечения заболеваний мочеполового тракта (фиг. 11).The specified action significantly exceeds the action of the anti-androgen finasteride, which is widely used for the treatment of diseases of the genitourinary tract (Fig. 11).

Пример 7. Действие соединения А на дисфункцию мочевого пузыря в модели обструкции выходного отверстия мочевого пузыря.Example 7. The effect of compound A on bladder dysfunction in the model of obstruction of the outlet of the bladder.

Описание экспериментаExperiment description

1. Материалы.1. Materials.

1.1 Животные.1.1 Animals.

Самки крыс 8ргадие-Эате1еу, массой 200-250 гFemale rats 8gradie-Eate1eu, weighing 200-250 g

1.2 Группы.1.2 Groups.

Группа А: крысы ВОО, получавшие соединение А в течение 2 недель, начиная с дня первого после создания обструкции (п=12).Group A: SBI rats treated with Compound A for 2 weeks, starting from the first day after obstruction (n = 12).

Группа Б: крысы ВОО, получавшие носитель в течение 2 недель, начиная с дня первого после создания обструкции (п=12).Group B: SBI rats treated with the vehicle for 2 weeks, starting from the first day after the creation of obstruction (n = 12).

Группа В: ложно оперированные крысы, получавшие соединение А в течение 2 недель, начиная с дня первого после создания обструкции (п=12).Group B: mock-operated rats treated with compound A for 2 weeks, starting from the first day after the creation of obstruction (n = 12).

1.3 Методы обследования.1.3 Methods of examination.

а) Цистометрия (через ~18 ч после последнего введения лекарственного средства/носителя, через 12 ч после удаления лигатуры, создающей обструкцию) животных, находящихся в сознании.a) Cystometry (~ 18 hours after the last injection of the drug / carrier, 12 hours after the removal of the ligature creating the obstruction) in animals that are conscious.

б) Измерение массы мочевого пузыря.b) Measurement of the mass of the bladder.

в) Исследования ш уйго.c) Research w uygo.

2. Методы.2. Methods.

- 16 010240- 16 010240

2.1 Обструкция мочевого пузыря (ВОО).2.1 Bladder obstruction (SBI).

Мочевой пузырь и уретромочепузырное соединение извлекали через разрез в нижней части брюшины по средней линии. Вдоль мочеточника помещали металлический стержень толщиной 0,9 мм и вокруг уретры и стержня обматывали шелковую лигатуру 3-0, затем стержень удаляли. Ложную хирургию проводили аналогичным образом, но без лигатуры. Через 13 суток лигатуру удаляли, в купол мочевого пузыря вводили катетер и проводили подкожную катетеризацию.The bladder and urethro-bladder junction were removed through a midline incision in the lower part of the peritoneum. A 0.9 mm thick metal rod was placed along the ureter and 3-0 silk ligature was wrapped around the urethra and the rod, then the rod was removed. False surgery was performed in a similar manner, but without ligature. After 13 days, the ligature was removed, a catheter was inserted into the bladder dome and subcutaneous catheterization was performed.

2.2 Цистометрия.2.2 Cystometry.

На следующее утро после введения катетера проводили цистометрическое обследование без применения анестезии или механического удерживания в камере для обследования метаболизма. Количество выходящей мочи измеряли с использованием сборника жидкости, соединенного с датчиком механического смещения. Мочевой пузырь непрерывно наполняли солевым раствором при комнатной температуре. Катетер также соединяли с датчиком давления. После периода стабилизации в течение 30-60 мин, когда достигался воспроизводимый режим мочеиспускания, в течение 30 мин регистрировали следующие параметры: базальное давление мочевого пузыря, давление мочеиспускания, пороговое давление, интервал мочеиспускания, объем и незаполненные сокращения. Количество остаточной мочи определяли вручную трижды после завершения цистометрии. Емкость мочевого пузыря рассчитывали по результатам измерений.The next morning after the introduction of the catheter, a cystometric examination was performed without the use of anesthesia or mechanical retention in the chamber to examine the metabolism. The amount of urine output was measured using a fluid collector connected to a mechanical displacement sensor. The bladder was continuously filled with saline at room temperature. The catheter was also connected to a pressure transducer. After a stabilization period of 30-60 minutes, when a reproducible urination regimen was reached, the following parameters were recorded for 30 minutes: basal bladder pressure, urination pressure, threshold pressure, urination interval, volume and unfilled contractions. The amount of residual urine was determined manually three times after completion of cystometry. The bladder capacity was calculated according to the measurement results.

2.3. Исследования ίη νίΐτο.2.3. Research ίη νίΐτο.

2.3.1. Получение препаратов.2.3.1. Receiving drugs.

После завершения цистометрии крыс умерщвляли асфикцией моноксидом углерода с последующим обескровливанием. Брюшную полость вскрывали в нижнем отделе по разрезу ниже средней линии, а затем открывали симфиз. Мочевой пузырь осторожно отрезали, немедленно помещали в охлажденный раствор Кребса и разрезали на полоски.After completion of cystometry, rats were sacrificed by carbon monoxide asphyxiation followed by bleeding. The abdominal cavity was opened in the lower section along the section below the midline, and then the symphysis was opened. The bladder was carefully cut off, immediately placed in a chilled Krebs solution and cut into strips.

2.3.2. Регистрация механической активности.2.3.2. Registration of mechanical activity.

Мочевой пузырь и уретру отделяли в области шейки мочевого пузыря и среднюю треть детрузора разрезали на полукруглые полоски (1x2x5 мм). Все препараты использовали немедленно после извлечения. Полоски помещали в ванночки для тканей объемом 5 мл, содержащие раствор Кребса. Раствор Кребса поддерживали при температуре 37°С и через раствор непрерывно пропускали смесь О₂/СО₂ (95%/5%), поддерживая рН 7,4. Полоски подвешивали между двумя Ь-образными крючками с использованием шелковой лигатуры. Один крючок соединяли с подвижным устройством, позволяющим регулировать пассивное натяжение, а другой - с датчиком механического смещения Сгазз ЕТ03С (фирма Стазе 1п81гитеп18 Со, МА, США). Изометрическое натяжение регистрировали на полиграфе Стазе (7Ό). После монтажа препаратов полоски натягивали с пассивным напряжением 4 мН (одинаковым для всех препаратов) и уравновешивали в течение 45-60 мин перед проведением дальнейших экспериментов.The bladder and urethra were separated in the neck of the bladder and the middle third of the detrusor was cut into semicircular strips (1x2x5 mm). All preparations were used immediately after extraction. The strips were placed in 5 ml tissue baths containing Krebs solution. The Krebs solution was maintained at a temperature of 37 ° C and a mixture of O ₂ / CO ₂ (95% / 5%) was continuously passed through the solution, maintaining a pH of 7.4. Strips were hung between two b-hooks using silk ligatures. One hook was connected to a movable device, allowing to regulate passive tension, and the other to a Sgaz ET03C mechanical displacement sensor (Stase 1p81gitep18 So, MA, USA). Isometric tension was recorded on a Staz polygraph (7Ό). After mounting the preparations, the strips were pulled with a passive voltage of 4 mN (the same for all preparations) and balanced for 45-60 minutes before further experiments.

2.3.3. Стимуляция электрическим полем.2.3.3. Electric field stimulation.

Стимуляцию электрическим полем (ЕЕ8) проводили при использовании двух платиновых электродов, установленных на противоположных концах полосок ткани, и источника Стазе 848 или 888, который обеспечивал подачу одиночных прямоугольных колебательных импульсов при выбранных частотах. Продолжительность серии импульсов составляла 5 с, продолжительность импульса 0,8 мс, интервал между стимуляциями составлял 2 мин. Полярность электродов меняли после каждого импульса с помощью переключателя.Electric field stimulation (EE8) was performed using two platinum electrodes mounted on opposite ends of the tissue strips, and a Stase 848 or 888 source, which provided the supply of single rectangular vibrational pulses at the selected frequencies. The duration of a series of pulses was 5 s, the pulse duration was 0.8 ms, and the interval between stimulations was 2 min. The polarity of the electrodes was changed after each pulse using a switch.

Методика проведения испытаний.Testing procedure.

Каждый эксперимент начинали с выдерживания препаратов в растворе Кребса с высокой концентрацией К⁺ (124 нМ) до получения двух воспроизводимых сокращений. Затем проводили следующие эксперименты:Each experiment was started by keeping the preparations in a Krebs solution with a high concentration of K ⁺ (124 nM) until two reproducible contractions were obtained. Then conducted the following experiments:

а) проводили электрическую стимуляцию нервов и регистрировали ответную частотную реакции в присутствии или в отсутствие атропина;a) electrical nerve stimulation was performed and the response frequency response was recorded in the presence or absence of atropine;

б) получали графики концентрационной зависимости для карбахола и АТФ.b) received graphs of the concentration dependence for carbachol and ATP.

Результатыresults

Для анализа способности соединения А регулировать и лечить дисфункцию мочевого пузыря использовали модель искусственной обструкции выходного отверстия мочевого пузыря у крыс. Цель таких испытаний состояла в определении способности аналога витамина Ό₃ (1а-фтор-25-гидрокси-16,23Едиен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола, соединения А) в дозе 150 мкг/кг/сут предотвращать гипертрофию и дисфункцию мочевого пузыря, такую, как сверхактивность мочевого пузыря.To analyze the ability of compound A to regulate and treat bladder dysfunction, a rat artificial bladder outlet obstruction model was used. The purpose of such tests was to determine the ability of a vitamin аналог ₃ analogue (1a-fluoro-25-hydroxy-16,23Udien-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol, compound A) at a dose of 150 μg / kg / day to prevent urinary hypertrophy and dysfunction bladder, such as overactive bladder.

В этой модели вокруг выходного отверстия мочевого пузыря с вставленным катетером хирургическим способом помещали лигатуру, затем катетер удаляли и мочевой пузырь испытывали на повышенную устойчивость уретры. Крысы подвергались непрерывной цистометрии для оценки функции мочевого пузыря. Кроме того, исследовались сократительные свойства изолированных препаратов мочевого пузыря по ответной реакции на стимуляцию нерва электрическим полем (ЕЕ8) и на экзогенные стимулы ίη νίΐτο.In this model, a ligature was placed surgically around the outlet of the bladder with the inserted catheter, then the catheter was removed and the bladder was tested for increased urethral stability. Rats underwent continuous cystometry to assess bladder function. In addition, the contractile properties of isolated bladder preparations were studied in response to nerve stimulation by an electric field (EE8) and to exogenous stimuli ίη νίΐτο.

При этом исследовались следующие цистометрические параметры (фиг. 12-16):In this case, the following cystometric parameters were studied (Fig. 12-16):

- 17 010240 давление при мочеиспускании (максимальное давлением в мочевом пузыре во время мочеиспускания), емкость мочевого пузыря (остаточный объем после опорожнения плюс объем солевого раствора, который вливали, чтобы вызвать опорожнение), объем мочеиспускания (объем вытесненной мочи), остаточная моча (объем мочевого пузыря минус объем мочеиспускания), частота и амплитуда спонтанно возникающих изменений внутрипузырного давления (непустые сокращения).- 17 010240 pressure during urination (maximum pressure in the bladder during urination), bladder capacity (residual volume after emptying plus the volume of saline that was poured to cause emptying), urination volume (volume of displaced urine), residual urine (volume bladder minus the volume of urination), the frequency and amplitude of spontaneously occurring changes in intravesical pressure (non-empty contractions).

В этой модели исследуемый аналог оказывал лечебное воздействие на функцию мочевого пузыря. Это действие наблюдается у нормального мочевого пузыря и сохраняется на модели обструкции выходного отверстия мочевого пузыря. Существенные различия при сравнении с введением носителя прежде всего наблюдались в следующих параметрах:In this model, the studied analogue had a therapeutic effect on the function of the bladder. This action is observed in a normal bladder and is stored on the model of obstruction of the outlet of the bladder. Significant differences when compared with the introduction of the media were primarily observed in the following parameters:

частота и амплитуда самопроизвольных непустых сокращений (фиг. 13 и 14), остаточная моча (отсутствие при введении соединения А, фиг. 16), давление мочеиспускания (фиг. 15).the frequency and amplitude of spontaneous nonempty contractions (Figs. 13 and 14), residual urine (absence with the introduction of compound A, Fig. 16), urination pressure (Fig. 15).

Кроме того, лечебное воздействие на функцию мочевого пузыря подтверждали при следующих испытаниях ίη υιΙιό:In addition, the therapeutic effect on the function of the bladder was confirmed in the following tests ίη υιΙιό:

ответ на К⁺, ответ на ЕЕЗ (фиг. 17), ответ на карбахол.response to K ⁺ , response to EEZ (Fig. 17), response to carbachol.

Наконец, наблюдалось небольшое снижение массы мочевого пузыря при введении соединения А (фиг. 12).Finally, a slight decrease in bladder mass was observed with the administration of compound A (FIG. 12).

Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения соединения А ( в дозе от 50 мкг до 300 мкг, что эквивалентно от 0,725 до 5 мг/кг) для профилактики и лечения дисфункции мочевого пузыря, например, сверхактивного мочевого пузыря, который наблюдается у пациентов с ВРН.The results obtained indicate the possibility of using compound A (at a dose of 50 μg to 300 μg, which is equivalent to 0.725 to 5 mg / kg) for the prevention and treatment of bladder dysfunction, for example, overactive bladder, which is observed in patients with BPH.

В примерах используются следующие сокращения:The following abbreviations are used in the examples:

Т тестостеронT testosterone

ОНТ дигидротестостеронONT dihydrotestosterone

ВРН доброкачественная гиперплазия предстательной железыBPH benign prostatic hyperplasia

РР пациенты с соответствующей патологиейPP patients with appropriate pathology

ΙΤΤ волонтерыΙΤΤ volunteers

ΑΝΟνΑ дисперсионный анализΑΝΟνΑ analysis of variance

ΤΚϋ8 трансректальное ультразвуковое исследованиеΤΚϋ8 transrectal ultrasound

ВОО обструкция выходного отверстия мочевого пузыряSBI obstruction of the outlet of the bladder

АК андрогенные рецепторыAK androgen receptors

Р8А специфичный антиген предстательной железыP8A specific antigen of the prostate gland

Все упомянутые в описании сноски, включая патенты и патентные заявки, включены в текст заявки в качестве ссылок в полном объеме.All footnotes mentioned in the description, including patents and patent applications, are incorporated into the text of the application by reference in full.

Если не указано иное, предполагается, что слово включает и его варианты, такие, как включающий и включая используемые в описании заявки и пунктах в формулы изобретения, означают включение изложенного (заявленного) целого числа или стадии или группы целых чисел, а не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел или стадий.Unless otherwise indicated, the word is intended to include its variations, such as including and including those used in the description of the application and the claims, mean the inclusion of the stated (claimed) integer or stage or group of integers, and not the exclusion of any other an integer or group of integers or stages.

Заявка, частью которой является настоящее описание и пункты формулы изобретения, может использоваться как приоритетная по отношению к любой последующей заявке. Пункты формулы изобретения такой последующей заявки могут относиться к любому описанному отличительному признаку или комбинации признаков. Они могут иметь форму продукта, композиции, способа или могут использовать пункты формулы изобретения и могут включать, например, без ограничений, следующие пункты.The application, of which the present description and claims are a part, can be used as a priority in relation to any subsequent application. The claims of such a subsequent application may relate to any distinguishing feature or combination of features described. They may take the form of a product, composition, method, or may use the claims and may include, for example, without limitation, the following claims.

Claims (25)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Применение 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.1. The use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia . 2. Применение по п.1, где лекарственное средство вводят раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов со вторым агентом, активным в отношении ВРН.2. The use according to claim 1, where the drug is administered separately, sequentially or simultaneously in the form of separate or combined pharmaceutical formulations with a second agent active against BPH. 3. Применение 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира в комбинации со вторым агентом, активным в отношении ВРН, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.3. The use of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof in combination with a second BPH active agent for the manufacture of a medicament, intended for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia. - 18 010240- 18 010240 4. Применение по п.2 или 3, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор.4. The use according to claim 2 or 3, where the second agent, active against BPH, means an agent that blocks the alpha-adrenergic receptor. 5. Применение по п.4, где агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор, выбирают из ряда теразозин, доксазозин, тамсулозин, силодозин, А1О-8507Б и ВВх-2258.5. The use according to claim 4, where the alpha-adrenergic receptor blocking agent is selected from the range of terazosin, doxazosin, tamsulosin, silodosin, A1O-8507B and BBx-2258. 6. Применение по п.2 или 3, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает ингибитор 5αредуктазы.6. The use according to claim 2 or 3, where the second agent, active against BPH, means a 5α reductase inhibitor. 7. Применение по п.6, где ингибитор 5а-редуктазы выбирают из ряда финастерид и дутастерид.7. The use according to claim 6, where the 5a-reductase inhibitor is selected from a number of finasteride and dutasteride. 8. Применение по любому из пп.1-7, где 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир получают в виде стандартной дозы.8. The use according to any one of claims 1 to 7, wherein 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof is obtained in unit dosage form. 9. Применение по п.8, где стандартная доза 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20эпихолекальциферола содержит от 50 до 150 мкг указанного соединения.9. The use of claim 8, where the standard dose of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20epicholecalciferol contains from 50 to 150 μg of the compound. 10. Применение по любому из пп.1-9 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий.10. The use according to any one of claims 1 to 9 for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in the absence of antiandrogenic prostatic and extraprostatic side effects. 11. Применение по любому из пп.1-10 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы одновременно с сопутствующей профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря.11. The use according to any one of claims 1 to 10 for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia simultaneously with concomitant prophylaxis and / or treatment of bladder dysfunction. 12. Применение фармацевтического состава, включающего 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы.12. The use of a pharmaceutical composition comprising 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene 26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof and a pharmaceutically acceptable carrier thereof for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia glands. 13. Применение фармацевтического состава по п.12, где 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир получают в виде стандартной дозы.13. The use of the pharmaceutical composition according to item 12, where 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27 bisgomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof is obtained in unit dosage form. 14. Применение фармацевтического состава по п.13, где стандартная доза 1а-фтор-25-гидрокси16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола содержит от 50 до 150 мкг указанного соединения.14. The use of the pharmaceutical composition according to item 13, where the standard dose of 1a-fluoro-25-hydroxy16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol contains from 50 to 150 μg of the compound. 15. Применение состава по пп.12-14, где фармацевтический состав дополнительно включает второй агент, активный в отношении ВРН.15. The use of the composition according to claims 12-14, wherein the pharmaceutical composition further comprises a second agent active against BPH. 16. Способ профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациентов, нуждающихся в такой профилактике или лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира.16. A method for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in patients requiring such prophylaxis or treatment, comprising administering a therapeutically effective amount of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof. 17. Способ профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы у пациентов, нуждающихся в такой профилактике или лечении, включающий введение терапевтически эффективного количества 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира раздельно, последовательно или одновременно в виде раздельных или комбинированных фармацевтических составов в смеси со вторым агентом, активным в отношении ВРН.17. A method for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in patients requiring such prophylaxis or treatment, comprising administering a therapeutically effective amount of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof, separately, sequentially or simultaneously, in separate or combined pharmaceutical formulations in admixture with a second BPH active agent. 18. Способ по п.17, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор.18. The method of claim 17, wherein the second BPH active agent is an alpha adrenergic receptor blocking agent. 19. Способ по п.18, где агент, блокирующий альфа-адренергический рецептор, выбирают из ряда теразозин, доксазозин, тамсулозин, силодозин, АЮ-8507Б и ВВх-2258.19. The method of claim 18, wherein the alpha adrenergic receptor blocking agent is selected from the range of terazosin, doxazosin, tamsulosin, silodosin, AY-8507B and BBx-2258. 20. Способ по п.17, где второй агент, активный в отношении ВРН, означает ингибитор 5αредуктазы.20. The method according to 17, where the second agent active against BPH means a 5α reductase inhibitor. 21. Способ по п.20, где ингибитор 5а-редуктазы выбирают из ряда финастерид и дутастерид.21. The method according to claim 20, where the 5a-reductase inhibitor is selected from a number of finasteride and dutasteride. 22. Способ по любому из пп.16-21, где 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир получают в виде стандартной дозы.22. The method according to any one of claims 16-21, wherein 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof is obtained as a unit dose. 23. Способ по п.22, где стандартная доза 1а-фтор-25-гидрокси-16,23Е-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферола содержит от 50 до 150 мкг указанного соединения.23. The method according to item 22, where the standard dose of 1a-fluoro-25-hydroxy-16,23E-diene-26,27-bishomo-20-epicholecalciferol contains from 50 to 150 μg of the indicated compound. 24. Способ по любому из пп.16-23 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при отсутствии антиандрогенных простатических и экстрапростатических побочных действий.24. The method according to any one of paragraphs.16-23 for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia in the absence of antiandrogenic prostatic and extraprostatic side effects. 25. Способ по любому из пп.16-23 для профилактики и/или лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы одновременно с сопутствующей профилактикой и/или лечением дисфункции мочевого пузыря.25. The method according to any one of paragraphs.16-23 for the prevention and / or treatment of benign prostatic hyperplasia simultaneously with concomitant prophylaxis and / or treatment of bladder dysfunction.